(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に記載の配列を含む、単離核酸プロモーター。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼのコード配列（ＦＬＤ）をさらに含む、請求項１に記載の単離核酸プロモーターを含む単離核酸。
【請求項３】
前記コード配列が配列番号５の核酸配列を含む、請求項２に記載の単離核酸。
【請求項４】
メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼのコード配列（ＦＬＤ）を含む単離核酸であって、前記コード配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする配列を含む、単離核酸。
【請求項５】
配列番号５に記載の配列を含む、単離核酸。
【請求項６】
２．７Ｋｂの長さを有する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の単離核酸プロモーター、または請求項２〜６のいずれか１項に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項１に記載の単離核酸プロモーターを含む発現カセットであって、前記単離核酸プロモーターが、異種タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている、発現カセット。
【請求項１０】
３’終結配列をさらに含む、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記３’終結配列がＡＯＸ１遺伝子の終結配列である、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項１３】
請求項８に記載のベクター、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項１２に記載の発現ベクターのいずれかで形質転換された、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞。
【請求項１４】
ａ）請求項１に記載の単離核酸プロモーターを含む単離核酸を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に導入するステップであって、前記単離核酸プロモーターはその３’末端が異種遺伝子コード配列の５’末端に作動可能に連結し、前記異種遺伝子コード配列はその３’末端で、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで機能する終結配列の５’末端に作動可能に連結しているステップと、
ｂ）グリセロールまたはグルコースなどの適切な炭素源を有し、かつアンモニウム塩または水酸化アンモニウムなどの適切な窒素源を有する培地で、前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を増殖させるステップと、
ｃ）炭素源または窒素源が枯渇した後、前記異種遺伝子の発現を、メタノール或いはメチルアミンまたはメタノールおよびメチルアミンの両方の添加により誘導するステップ
とを含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで異種遺伝子コード配列の発現を指令する方法。
【請求項１５】
ａ）請求項１に記載の単離核酸プロモーターを含む単離核酸を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に導入するステップであって、前記単離核酸プロモーターはその３’末端が異種遺伝子コード配列の５’末端に作動可能に連結し、前記異種遺伝子コード配列はその３’末端で、メチロトローフ酵母で機能する終結配列の５’末端に作動可能に連結しているステップと、
ｂ）グリセロールまたはグルコースなどの適切な炭素源を有し、かつアンモニウム塩または水酸化アンモニウムなどの適切な窒素源を有する培地で、前記Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を増殖させるステップと、
ｃ）炭素源または窒素源が枯渇した後、上記異種遺伝子の発現を、ホルムアルデヒド、蟻酸、またはメチル化アミンの添加により誘導するステップ
とを含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで異種遺伝子コード配列の発現を指令する方法。
【請求項１６】
前記メチル化アミンがコリンである、請求項１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
Ｐｉｃｈｉａは、工業的および学術的関心の高い異種タンパク質の産生に広く使用されるメチロトローフ酵母である（Ｃｒｅｇｇ、１９９８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＣｒｅｇｇ、１９８８）。ＦＬＤは、炭素およびエネルギー源としてのメタノールの利用に重要な酵素である（Ｖｅｅｎｈｕｉｓら、１９８３）。メチロトローフ酵母では、メタノール代謝経路は、ほぼ同一であると考えられ、ペルオキシソームと呼ばれる細胞小器官に隔離された過酸化水素産生オキシダーゼのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）によるメタノールのホルムアルデヒドへの酸化で開始される。次いで、過酸化水素は、古典的ペルオキシソームマーカー酵素のカタラーゼにより、酸素および水に分解される。得られたホルムアルデヒドの一部が、キシルロース−５’−１リン酸と、第三のペルオキシソームメタノール経路酵素である、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）により触媒される反応で縮合する。この反応の生成物のグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）およびジヒドロキシアセトンは、次いで、ペルオキシソームを出て、キシルロース−５’−１リン酸を再生し、また３回のサイクル毎に正味１分子のＧＡＰも産生する回路に入る。ＧＡＰは、細胞増殖のための炭素骨格の生合成に使用される。別の部分のホルムアルデヒドはペルオキシソームを出て、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ）により蟻酸に酸化され、次いで、蟻酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）により二酸化炭素に酸化される。これらの両方の反応が、ＮＡＤＨ形の還元力を産生する。ＦＬＤ機能の１つのモデルは、ＦＬＤおよびＦＤＨにより産生されたＮＡＤＨが、メタノール上での増殖中の基本的なエネルギー源として作用する（Ｖｅｅｎｈｕｉｓら、１９８３）。第二モデルは、メタノール増殖のためのほとんどのエネルギーは、ＴＣＡ回路の酵素による、１つ以上のキシルロース−５’−１リン酸サイクル中間体の酸化から生じること、およびＦＬＤの基本的役割は、培地中の過剰のメタノールと共に蓄積する毒性ホルムアルデヒドから細胞を保護することであることを提唱する（Ｓｉｂｉｒｎｙら、１９９０）。
【０００２】
メタノールに加えて、ＦＬＤはまた、唯一の窒素源としてのあるメチル化アミン（例えばメチルアミンおよびコリン）の代謝にも関与している（Ｚｗａｒｔら、１９８０）。この経路では、アミン基が、最初にペルオキシソームアミンオキシダーゼにより遊離され、ホルムアルデヒドを放出し、これはさらにＦＬＤおよびＦＤＨにより酸化される。唯一の窒素源としてのメチルアミン上で増殖させると、高レベルのＦＬＤが過剰のグルコースの存在下でさえ誘導される。従って、メチルアミン代謝におけるＦＬＤの基本的な役割は、ホルムアルデヒドの毒性作用から細胞を保護することであって、炭素またはエネルギーを産生することではないようである。
【０００３】
ＦＬＤ合成は、唯一の炭素源およびエネルギー源としてのメタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンに対する応答において独立的に調節されている。従って、例えば、グルコースおよびアンモニウムイオン含有培地上で増殖している細胞でのみ低いレベルのＦＬＤが観察され、一方、メタノール−アンモニウムイオンまたはグルコース−メチルアミン培地上では、ＦＬＤレベルは高い。
【０００４】
Ｐｉｃｈｉａ系では、ほとんどの外来遺伝子が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓアルコールオキシダーゼ１遺伝子プロモーター（ＰＡＯＸ１）の転写調節下で発現され、その調節特徴は、この目的によく適している。このプロモーターは、グルコース、グリセロール、またはエタノールなどのほとんどの一般的な炭素源上での酵母の増殖中には堅く抑制されているが、メタノール上での増殖中は高度に誘導されている（Ｔｓｃｈｏｐｐら、１９８７；Ｓｔｒｏｍａｎ，Ｄ．Ｗ．らの米国特許第４，８５５，２３１号）。外来タンパク質の産生のために、ＰＡＯＸ１制御発現株を、最初に抑制炭素源上で増殖させてバイオマスを産生させ、次いで、唯一の炭素およびエネルギー源としてのメタノールに切り替え、外来遺伝子の発現を誘導する。ＰＡＯＸ１調節系の１つの利点は、遺伝子発現産物が細胞に毒性である外来遺伝子で形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、抑制条件下で増殖させることにより維持できることである。
【０００５】
多くのタンパク質が、ＰＡＯＸ１を使用して成功裡に産生されてきたが、このプロモーターは、全ての設定で適切または簡便であるわけではない。例えば、振盪フラスコ培養物では、メタノールは急速に蒸発し、メタノール濃度を監視し、化合物を繰返し培地に加えることは不便である。さらに、大量で高密度の発酵層培養物中でのＰＡＯＸ１制御発現株の増殖および誘導に必要な大量のメタノールの貯蔵は、火事の危険性がある。それ故、転写的に効率的で、かつより揮発性および可燃性の低い誘導物質により調節可能なＰＡＯＸ１に替わるプロモーターが必要である。本発明は、両方の特性を有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ）プロモーターを提供する。
【０００６】
さらに、抗生物質耐性遺伝子である選択マーカー以外の、メチロトローフ酵母で機能する選択マーカーが必要である。現在、ＺｅｏＲ遺伝子のみを、その遺伝子型に関係なくＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換するのに使用できる。さらに、ＺｅｏＲは、複数のコピーの発現ベクターを受容するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を直接選択（選択培地中のゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）の濃度を増加させることにより）するために使用できる唯一の遺伝子である。抗生物質Ｇ４１８に耐性を付与する第二の遺伝子（Ｇ４１８Ｒ）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの複数コピー発現株をスクリーニングできるが、その使用には、栄養要求性／生合成遺伝子選択マーカーも形質転換体を選択するためにベクターに含めなければならないことが要求される。本発明のＦＬＤ構造遺伝子は、メチロトローフ酵母細胞で選択マーカーとして使用し得、抗生物質に対する耐性は付与しない。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ）を含む単離核酸配列に関する。本発明の１つの実施形態において、単離核酸は、低ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号５に示したヌクレオチド配列、または配列番号１または５に示した配列に相補的な配列の少なくとも１つにハイブリッド化する配列を含む。
【０００８】
図７に示した制限地図を有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＦＬＤ遺伝子（ＦＬＤ１）および図１０の斜交平行線模様領域に示した制限地図を有するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤ遺伝子も提供される。
【０００９】
本発明の１つの実施形態において、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配列を有するメチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供される。本発明の別の実施形態において、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約８５％から約９５％の配列相同性もつコード配列を有するメチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供される。さらに別の実施形態において、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約９５％以上の配列相同性もつコード配列を有するメチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供される。配列番号１または配列番号５に示した配列を含む単離核酸も提供される。
【００１０】
本発明はまた、ＦＬＤプロモーターを含むメチロトローフ酵母由来の単離核酸も提供する。このプロモーターは、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較すると、約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配列を有するＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置する。別の実施形態において、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較すると、約８５％から約９５％の配列相同性もつコード配列を有するＦＬＤ遺伝子由来のＦＬＤプロモーターを含むメチロトローフ酵母由来の単離核酸が提供される。好ましい実施形態において、プロモーターは、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較すると、約９５％以上の配列相同性もつコード配列を有するＦＬＤ遺伝子由来である。特に例示されるのは、配列番号３に示される配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１プロモーターである。
【００１１】
また本発明により、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸が提供される。３’終結配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較すると、約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配列を有するＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流に位置する。本発明の別の実施形態において、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較すると、約８５％から約９５％の配列相同性もつコード配列を有する遺伝子由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸が提供される。本発明の好ましい実施形態において、配列番号５に示した配列と比較すると、約９５％以上の配列相同性もつコード配列を有する遺伝子由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸が提供される。
【００１２】
また、ＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供され、ここでの該ＦＬＤ遺伝子は、配列番号２に示したアミノ酸配列と比較すると、約３０％から約４９％、または約５０％から約９０％、または約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する産物をコードする。
【００１３】
さらに、本発明はまた、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’終結配列の少なくとも１つを含む単離核酸を提供し、ここでの該ＦＬＤ遺伝子は、配列番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約３０％から約４９％、または約５０％から約９０％、または約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する産物をコードする。
【００１４】
さらに、本発明は、主題の単離核酸を含む発現カセット、ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１５】
また本発明により、メチロトローフ酵母において異種遺伝子の発現を指令する方法が提供される。該方法は、メチロトローフ酵母細胞に、メチロトローフ酵母から単離したＦＬＤプロモーターを含む単離核酸を導入することを含み、ここでの該プロモーターは、その３’末端で、異種遺伝子の５’末端に作動可能に連結し、該異種遺伝子は、その３’末端で、メチロトローフ酵母で機能する終結配列の５’末端に作動可能に連結している。メチロトローフ酵母細胞は、グリセロールまたはグルコースなどの適切な炭素源を有するおよびアンモニウム塩または水酸化アンモニウムなどの適切な窒素源を有する培地で増殖させる。炭素または窒素源が枯渇した後、該異種遺伝子の発現を、メタノールまたはメチルアミンまたはメタノールおよびメチルアミンの両方の添加により誘導する。発現は、ホルムアルデヒド、蟻酸、またはメチル化アミンの添加によっても誘導され得る。
【００１６】
ホルムアルデヒド耐性宿主細胞を選択する方法も本発明により提供される。該方法は、メチロトローフ酵母細胞を、ＦＬＤ遺伝子を含むベクターで形質転換させることを含み、該ＦＬＤ遺伝子は、その５’末端で、該酵母細胞で機能するＦＬＤプロモーターまたは異種プロモーターに作動可能に連結し、該ＦＬＤ遺伝子は、その３’末端で、該酵母細胞で機能する３’終結配列に作動可能に連結している。宿主細胞を、ホルムアルデヒドの存在下で増殖させ、ホルムアルデヒドの存在下で増殖する酵母細胞を選択する。
【００１７】
本発明はまた、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１）などのＦＬＤ遺伝子（ｆｌｄ）の欠損したメチロトローフ酵母株を提供する。また、ＦＬＤ遺伝子が欠損し、別の生合成遺伝子について栄養要求性である、メチロトローフ酵母株も提供される。
【００１８】
本発明により、メチロトローフ酵母で機能するＦＬＤプロモーターおよび３’終結配列を含む発現カセットを含むキットが提供される。少なくとも１つの制限部位が、ＦＬＤプロモーターと３’終結配列の間に位置し、よって異種遺伝子が挿入され得、プロモーターおよび３’終結配列に作動可能に連結され得る。キットには、メチロトローフ酵母中で複製するか、またはメチロトローフ酵母のゲノムに組込まれるベクターも含まれ、このベクターは、マーカー遺伝子および該カセットの挿入のための１つ以上の制限部位を含む。
【００１９】
さらに、本発明は、選択マーカーとしてのＦＬＤ遺伝子並びに発現カセットを含む発現ベクターを含むキットを提供する。発現カセットは、メチロトローフ酵母で機能するプロモーターおよび３’終結配列を含み、プロモーターと３’終結配列の間に位置する少なくとも１つの制限部位を有し、よって異種遺伝子が挿入され得、プロモーターおよび該３’終結配列に作動可能に連結され得る。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ）を含む単離核酸配列に関する。ＦＬＤ遺伝子の産物のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ホルムアルデヒドに対する耐性を付与する。本発明の１つの態様において、ＦＬＤコード配列を、メチロトローフ酵母細胞で選択マーカーとして機能させるために、それ自体の５’および３’調節領域と共に、または異種５’および３’調節領域と共に使用し得る。それ故、主題のＦＬＤコード配列は、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子の使用を回避したい場合に有利である。
【００２１】
本発明により、主題ＦＬＤ遺伝子は、選択マーカーとして使用でき、これは、ＺｅｏＲのように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の遺伝子型とは独立的に選択でき、ＺｅｏＲおよびＧ４１８Ｒのように、複数のコピーの発現ベクターを受容する株を直接選択するために使用できる。しかし、ＺｅｏＲおよびＧ４１８Ｒとは異なり、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに天然であり、抗生物質に対する耐性を付与しない。
【００２２】
本発明の１つの態様において、それぞれ図７に示した制限地図および図１０の斜交平行線模様領域を有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤ遺伝子が提供される。メタノールおよびメチルアミンに応答したＦＬＤ発現は、転写レベルで制御される。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＦＬＤ１）由来のＦＬＤ遺伝子は、そのヌクレオチド配列に関してさらに記載でき、その配列（配列番号１）が図４に示されている。ＦＬＤ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列は配列番号５に示す。
【００２３】
本発明の別の態様において、メチロトローフ酵母から単離されたＦＬＤ遺伝子由来の誘導性５’調節領域（本明細書では「ＦＬＤプロモーター」と同義語で使用する）が提供され、その５’調節領域は、メチロトローフ酵母細胞での異種遺伝子の効率的発現に有用である。対象であるＦＬＤ５’調節領域は、メタノール、ホルムアルデヒド、および蟻酸などの異なる炭素および／またはエネルギー源により強力かつ独立的に誘導される。ホルムアルデヒドも蟻酸も、真の意味で炭素源ではない。なぜなら、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、該化合物から炭素を利用せず、単にその酸化によってエネルギーを得るからである。対象であるＦＬＤ５’調節領域は、メチルアミン、コリン、および他のメチル化アミンなどの異なる窒素源によっても強力かつ独立的に誘導される。従って、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１プロモーターは、唯一の炭素源としてのメタノールにより（窒素源としての水酸化アンモニウムまたはアンモニウム塩と共に）、または唯一の窒素源としてのメチルアミンにより（炭素源としての炭素糖と共に）強力かつ独立的に誘導される。非誘導窒素源の例は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび水酸化アンモニウムを含む。非誘導炭素源の例は、グリセロールおよびグルコースを含む。
【００２４】
従って、本発明は、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。特に、図８に示した制限地図を有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ遺伝子（ＦＬＤ１）由来のプロモーターが例示される。好ましい実施形態において、ＦＬＤ１遺伝子プロモーターは、配列番号３に示したヌクレオチド配列を有する。また、図１０の斜交平行線模様領域に示した制限部位を有するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤプロモーターも例示される。
【００２５】
本発明はまた、メチロトローフ酵母由来ＦＬＤ３’終結配列も提供する。従って、本発明は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流に位置する約３００ヌクレオチド以上の配列を含む単離核酸を提供する。例えば、３’終結配列は、図４のヌクレオチド１２５５〜１５５５を含み得る（配列番号４）。本発明の別の実施形態において、３’終結配列は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ遺伝子由来であり、この遺伝子は、図１０に斜交平行線模様領域として示す。
【００２６】
配列番号３に示したＦＬＤ１プロモーターへの修飾は、メタノール、ホルムアルデヒド、または蟻酸誘導による、またはメチルアミン、コリンまたは他のメチル化アミン誘導による発現促進の特徴的特性を維持しているが、これは本発明の範囲内である。配列番号４に示した３’終結配列への修飾は、遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化させる特徴的特性を維持しているが、これも本発明の範囲内である。同様に、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１コード配列（図４、配列番号５）への修飾は、生物学的に活性なホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする特徴的特性を維持しているが、これも本発明の範囲内である。かかる修飾は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失および置換を含む。
【００２７】
本発明はまた、ＦＬＤ遺伝子を欠損したメチロトローフ酵母株、すなわちｆｌｄ変異体も提供する。かかる株は、メチロトローフ酵母細胞をニトロソグアニジンなどの変異原に曝露させ、唯一の炭素源としてメタノールおよび唯一の窒素源としてメチルアミンを利用できない株をスクリーニングすることにより作成し得る。次いで、補完および他の遺伝子技法を使用して、メチロトローフ酵母株がｆｌｄ変異体であることを確認し得る。本発明により、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｌｄ株が提供され、ＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１）と称する。ｆｌｄ変異体メチロトローフ酵母株は、生合成遺伝子について栄養要求性変異体であるか、または異なる選択マーカーを有する別の株に交雑し得る。例えば、本発明は、ＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ ｈｉｓ４）と称される、メタノール利用欠損（Ｍｕｔ−）であり、ヒスチジンに栄養要求性である（Ｈｉｓ−）Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母株を提供する。
【００２８】
ＦＬＤ遺伝子は、古典的な機能的補完技法を使用してメチロトローフ酵母から単離し得る。簡潔に述べると、メチロトローフ酵母由来のＤＮＡのゲノムライブラリーを、メチロトローフ酵母中で複製するベクターにクローン化する。ベクターを使用して、ｆｌｄ変異体であるメチロトローフ酵母を形質転換する。メタノール（または任意の上記の誘導剤）の存在下で増殖する細胞を、ゲノムライブラリーから機能性ＦＬＤ遺伝子を有するものとして選択する。ベクターを、補完酵母細胞から単離し、制限地図を作成する。ベクター挿入物の断片をサブクローニングし、ｆｌｄ変異体および単離したｆｌｄ変異体に依然として補完するより小さな断片を形質転換し得る。このベクターの挿入物をシークエンスし、ＦＬＤ遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定し得る。実施例２および３に記載のように、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子およびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ遺伝子の両方を機能的補完により単離した。
【００２９】
メチロトローフ酵母のＦＬＤ遺伝子のコード配列、プロモーターまたは３’終結配列に対応する核酸分子もまた、全ＦＬＤ１遺伝子、ＦＬＤ１遺伝子の全コード配列、またはＦＬＤ１コード配列の一部（断片およびオリゴヌクレオチドを含む）をプローブとして使用し、メチロトローフ酵母由来の核酸分子（群）とハイブリッド化することにより得られ得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ全ＦＬＤ遺伝子（配列番号１）、またはＦＬＤコード配列（図４、配列番号５）、または配列番号５に示したヌクレオチド配列の一部にハイブリッド化する核酸分子を、例えば、当業者に既知の技法によりゲノムライブラリーから単離できる。ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによる本発明のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ遺伝子に対応するゲノムＤＮＡ配列を得るに有用であると考えられる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、または汎用されている組換えＤＮＡ工学に関する無数の実験マニュアルのいずれかに提供されている。
【００３０】
対象ＦＬＤ遺伝子は、単離ＦＬＤゲノムクローンの制限エンドヌクレアーゼ消化により得られ得る。従って、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子の既知のヌクレオチドまたはアミノ酸配列（図４、配列番号１および２）を、単離された推定ＦＬＤゲノムクローンの核酸または推論アミノ酸配列に整列させ、単離ＦＬＤゲノムクローンの５’調節配列（すなわち、コード領域の翻訳開始コドンの上流の配列）、コード配列、および３’調節配列（すなわち、コード領域の翻訳終止コドンの下流の配列）を配置する。
【００３１】
対象ＦＬＤプロモーター、３’終結配列またはコード配列は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発により、過剰の５’フランキング配列、過剰のコード配列、または過剰の３’フランキング配列を有するゲノムクローンから作成し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発は、簡便な制限部位の導入に役立つ。Ｔ７−Ｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発キット（ＵＳＢ、クリーブランド、オハイオ）およびＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン、サンディエゴ、カリフォルニア）などのこの適用に特に適切な様々な市販で入手可能なキットがある。別法として、ＰＣＲプライマーを、対象ＦＬＤプロモーター、コード配列、および３’終結配列の直接的増幅を可能とするように規定できる。
【００３２】
同方法を使用して、当分野の通常の熟練者は、配列番号３に示したＦＬＤ１プロモーターの１つ以上の欠失断片を作成できる。配列番号３に示したヌクレオチド配列の連続部分を含み、メタノール、ホルムアルデヒド、または蟻酸誘導による発現促進能を保持するか、またはメチルアミン、コリンまたは他のメチル化アミン誘導による発現促進能を保持する任意および全ての欠失断片が本発明により考えられる。同様に、配列番号４および５に示した配列の連続部分を含み、それぞれ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の安定化能を保持するか、または生物学的に活性なＦＬＤをコードする能力を保持する任意および全ての欠失断片が本発明の範囲内である。
【００３３】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１プロモーター（そのヌクレオチド配列は、図４のヌクレオチド−５３７から−１として示す（配列番号３））に加えて、本発明は、他のメチロトローフ酵母のＦＬＤ遺伝子に対応する他のプロモーター配列に関する。本明細書に定義したように、メタノール、ホルムアルデヒド、または蟻酸誘導により発現を促進するか、またはメチルアミン、コリンまたは他のメチル化アミン誘導により発現を促進する、かかる関連配列は、ＦＬＤコード配列の翻訳開始コドンの上流でのその位置に関して記載され得、そのコード配列は図４に示したヌクレオチドコード配列（配列番号５）に対するヌクレオチドレベルでの相同性％に関して記載する。
【００３４】
別に、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤコード配列は、低ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、例示したＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子（配列番号１）またはＦＬＤ１コード配列（配列番号５）にハイブリッド化するその能力に関して定義され得る。それ故、本発明は、ＦＬＤ遺伝子に対応するプロモーター、コード領域または３’終結配列を含むメチロトローフ酵母から単離した核酸配列に関し、かかるＦＬＤ遺伝子のコード領域は、低ストリンジェントな条件下で、配列番号１または５に示したＦＬＤ遺伝子核酸配列、または配列番号１または５に示した配列に相補的な配列にハイブリッド化する。ＦＬＤ遺伝子（そのコード領域は配列番号１または５に示した配列とハイブリッド化する）のプロモーター、コード領域または３’終結配列は、ＦＬＤ遺伝子由来の該コード配列が、生物学的に活性なＦＬＤをコードする限り、または該ＦＬＤプロモーターが、エネルギー源としてのメタノール、ホルムアルデヒド、または蟻酸により、または唯一の窒素源としてのメチルアミン、コリンまたは他のメチル化アミンにより独立的に誘導される限り、配列番号１から５と比較して、１つ以上のヌクレオチド位置が異なり得る。さらに、主題３’終結配列は、３’終結配列がコード配列に作動可能に連結された場合にｍＲＮＡ転写物の安定化能を保持する限り、配列番号４と比較して、１つ以上のヌクレオチド位置が異なり得る。
【００３５】
「ハイブリッド形成」により、該核酸分子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（分子クローニング；実験マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９））により記載のように、慣用的なハイブリッド条件下でハイブリッド化することを意味する。
【００３６】
メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子（ゲノム配列）、およびＦＬＤコード配列は、慣用的なハイブリッド形成条件を使用して、ＦＬＤ１のコード領域またはその一部（配列番号１および５、並びに配列番号１および５に相補的な配列）へのハイブリッド形成により同定し得る。好ましくは、低ハイブリッド形成条件、例えば、３７℃で３０％ホルムアミド、次いで、室温で１×ＳＳＣ中および６０℃で１×ＳＳＣ中の洗浄などを使用する。低ストリンジェントな条件下で配列番号１または５にハイブリッド化する、約２ｋｂから約３．５ｋｂまたは約２．５ｋｂから約３．５ｋｂのサイズの範囲の推定ＦＬＤ遺伝子は、制限地図形成およびシークエンスによりさらに特徴づけ得る。プローブとしてプラスミドｐＹＧ１のＦＬＤ１遺伝子を使用し、かかる低ストリンジェント条件下でハイブリッド化させることにより、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ遺伝子を同定し得る。実施例３参照。
【００３７】
ＦＬＤプロモーターおよび３’終結配列もまた、ＦＬＤ遺伝子の対応するコード配列（これからプロモーターまたは３’終結配列が得られる）の、低ストリンジェント条件下で、図４に示したコード配列（配列番号１および５）、並びに配列番号１および５に対して相補的な配列にハイブリッド化する能力により規定され得る。
【００３８】
本発明のＦＬＤ構造遺伝子、プロモーター断片および終結配列もまた、本明細書に提供したヌクレオチド配列に対するヌクレオチドレベルでの相同性％に関して記載し得る。当業者が配列相同性を決定する目的で使用し得る核酸配列を比較および整列させる多くのコンピュータープログラムが存在する。例えば、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（リリース６．６、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、Ｃａ．）を、オープンギャップコスト１５および単位ギャップコスト１０として使用し得る。
【００３９】
本明細書に使用した配列相同性％値は、特に配列番号で示した一本鎖配列と比較した場合の、単離核酸の相同性％を含むだけでなく、特に配列番号、例えば配列番号５で示した一本鎖配列の相補的鎖と比較した場合の単離核酸の相同性％も含む。
【００４０】
従って、上記のようにパラメータを設定しＰＣ／Ｇｅｎｅプログラムなどのコンピュータープログラムを使用して、主題単離核酸を下記の通りに記載し得る。本発明の１つの実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるメチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含み、配列番号５に示したＦＬＤ遺伝子のヌクレオチド配列と比較して約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配列を有する、単離核酸が提供される。好ましい実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸は、配列番号５に示したＦＬＤ遺伝子のコード配列と比較して約８５％から約９５％の配列相同性をもつコード配列を有する。
【００４１】
最も好ましい実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸は、配列番号５に示したＦＬＤコード領域の配列と比較して約９５％以上の配列相同性をもつコード配列を有する。
【００４２】
本発明の別の態様において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子由来のプロモーターを含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）に位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約７０％から約８５％の配列相同性を有する。好ましい実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子由来のプロモーターを含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）に位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約８５％から約９５％の配列相同性を有する。
【００４３】
より好ましい実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子由来のプロモーターを含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）に位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約９５％以上の配列相同性を有する。任意の上記のプロモーターに関して、好ましくは、プロモーターは、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの直ぐ上流（５’）に位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明の別の態様において、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流（３’）に位置する約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約７０％から約８５％の配列相同性を有する。好ましい実施形態において、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流（３’）に約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約８５％から約９５％の配列相同性を有する。最も好ましい実施形態において、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流（３’）に位置する約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約９５％以上の配列相同性を有する。任意の上記の３’終結配列に関して、好ましくは、３’終結配列は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの直ぐ下流（３’）に位置する約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
前記の核酸配列に加えて、本発明は、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列および３’終結配列を含む単離核酸に関し、その産物は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約３０％から約４９％のアミノ酸配列同一性を有する。好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子由来であり、その産物は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約５０％から約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。より好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列および３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子由来であり、その産物は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。最も好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’終結配列を含む単離核酸はＦＬＤ遺伝子由来であり、その産物は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
【００４６】
本発明により、全ＦＬＤ遺伝子（すなわち、天然ＦＬＤプロモーターおよび天然３’終結配列に作動可能に連結したＦＬＤコード配列を含むゲノム配列）もまた、コード領域の産物の配列同一性により記載され得る。従って、本発明の１つの実施形態において、ＦＬＤ遺伝子の産物のアミノ酸配列が、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約３０％から約４９％の配列同一性を有するＦＬＤ遺伝子が提供される。好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子の産物のアミノ酸配列が、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約５０％から約９０％の配列同一性を有するＦＬＤ遺伝子が提供される。より好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約９０％以上の配列同一性をもつアミノ酸配列を有する産物をコードする。最も好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）を有する産物をコードする。
【００４７】
メチロトローフ酵母由来の推定ＦＬＤアミノ酸配列と、配列番号２として本明細書に提供されるＦＬＤアミノ酸配列の間の配列同一度を決定する目的で、ＢＬＡＳＴ２．０プログラム（Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、全てのパラメータを初期パラメータに設定して使用し得る。
【００４８】
単離ＦＬＤ核酸分子のヌクレオチド配列を決定するために、任意の様々な既知の技法を使用し得る。例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたは他のメチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む制限断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）などのベクターのポリリンカー部位にサブクローニングできる。次いで、これらのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔサブクローンは、二本鎖ジデオキシ法（Ｃｈｅｎら、（１９８５）ＤＮＡ、４；１６５）によりシークエンスできる。
【００４９】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ遺伝子配列に対応するメチロトローフ酵母ＦＬＤ遺伝子由来の５’調節配列、コード配列、および３’終結配列もまた、配列番号１、３、４、および５に示した配列由来のプライマーオリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅技法を適用することにより単離し得る。
【００５０】
メチロトローフ酵母由来のＦＬＤプロモーター（その修飾または欠失断片も含む）の独立的誘導性の確認を、異種遺伝子のコード配列との特異的配列の転写および／または翻訳融合物の作成、キメラ遺伝子の適切な宿主への移行、および異種遺伝子の発現の検出により達成できる。発現の検出に使用したアッセイは、異種配列の性質に依存する。例えば、β−ラクタマーゼ（β−ｌａｃ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）により例示されるリポーター遺伝子は、キメラ作成物の転写および翻訳適合性の評価によく使用される。標準的なアッセイは、形質転換宿主細胞のリポーター酵素を高い感度で検出するために利用できる。
【００５１】
ＦＬＤプロモーター、３’終結配列およびその単離断片は、メチロトローフ宿主細胞での異種タンパク質の発現のための発現カセット（本明細書では「キメラ遺伝子」とも呼ばれる）および発現ベクターの作成に有用である。本明細書に使用した「異種タンパク質」または「異種ポリペプチド」は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ以外の任意のタンパク質またはポリペプチドを意味する。本明細書に使用した「異種遺伝子」は、ＦＬＤ以外の遺伝子を意味する。
【００５２】
本明細書に使用した「カセット」なる語は、特定の遺伝子を、ヌクレオチド配列に存在する１つ以上の調節配列に作動可能に連結するように挿入した場合に、該遺伝子を発現できるヌクレオチド配列を意味する。従って、例えば、発現カセットは、メタノールまたはメチルアミン誘導を通して発現されることが望ましい異種遺伝子を含み得る。それ故、本発明の発現カセットおよび発現ベクターは、メタノールまたはメチルアミン誘導時に任意の数の異種遺伝子の発現を促進するに有用である。
【００５３】
対象ＦＬＤプロモーターの制御下で外来タンパク質を発現させるための、および本発明の発現カセットおよびベクターに使用するための異種遺伝子のいくつかの例は、ヒト血清アルブミン、インベルターゼ、ウシリゾチーム、ヒトＥＧＦ、マウスＥＧＦ、アプロチニン、クニッツプロテアーゼ阻害剤、Ｂ型肝炎表面抗原、腫瘍壊死因子、破傷風毒素断片Ｃ、百日咳菌抗原Ｐ６９、ストレプトキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ属の種の結晶タンパク質毒素を含む。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓで発現され得る他の有用なタンパク質のリストについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．およびＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．１９９８）分子生物学の方法：Ｐｉｃｈｉａプロトコール、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー、第１７章、ｐ．２４９−２６１参照。任意および全てのコード配列が、本発明の発現カセットおよび発現ベクターに使用するための異種遺伝子として考えられる。
【００５４】
本発明の発現カセットは、５’から３’の方向に、異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したＦＬＤプロモーターを含む。好ましい実施形態において、異種遺伝子のコード配列は、さらに、その３’末端で、３’終結配列に作動可能に連結している。所望であれば、異種遺伝子によりコードされるポリペプチドの有効量を産生する発現を引き起こすに十分な、ＦＬＤ以外の遺伝子由来の追加の調節エレメントまたは該エレメントの一部が、キメラ作成物に含まれる。例えば、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を、異種遺伝子の産物の分泌が所望である場合に使用し得る。該配列は、広く知られており、容易に入手でき、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α交配因子プレプロ（αｍｆ）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列および異種遺伝子をコードするタンパク質由来の天然シグナル配列を含む。
【００５５】
発現カセットは、環状プラスミドまたは線形部位特異的組込みベクターなどのベクターを介して微生物宿主に挿入し得る。「作動可能に連結」なる語は、ＦＬＤプロモーター、構造遺伝子、および３’終結配列が、その正常な機能を実施するように連結および配置している近位を意味する。３’終結配列は、ポリアデニル化を誘発する配列などの配列が作動可能に連結している遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化させるように機能する構造遺伝子の終止コドンまでの３’配列である。３’終結配列は、ＰｉｃｈｉａまたはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａまたは他のメチロトローフ酵母から得られ得る。本発明の実践に有用なＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ  ３’終結配列の例は、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子およびＦＬＤ１遺伝子由来の終結配列を含む。
【００５６】
本発明により、メチロトローフ酵母から単離されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ遺伝子および他のＦＬＤ遺伝子を、宿主細胞での選択マーカーとして使用し得る。天然５’および３’調節配列を含む全ＦＬＤ遺伝子、またはＦＬＤ遺伝子以外の５’および３’調節領域に作動可能に連結したＦＬＤコード領域を、使用し得る。
【００５７】
ＦＬＤプロモーター、ＦＬＤコード配列および／またはＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸、該単離核酸を含む発現カセット、並びに、全ＦＬＤ遺伝子（ゲノム配列）またはＦＬＤ遺伝子以外の５’および３’調節領域に作動可能に連結したＦＬＤコード配列を、プラスミドなどのベクターに挿入し得る。ベクターは、好ましくは、メチロトローフ酵母で機能する選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカーは、メチロトローフ酵母に選択可能な表現型を付与し、該酵母の非形質転換細胞からの同定および選択を可能とする任意の遺伝子であり得る。選択マーカー系は、栄養要求性変異体Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株および宿主欠損を補完する野生型遺伝子を含み得る。かかる系の例は、ｈｉｓ４ Ｐｉｃｈｉａ株の補完に使用され得るＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４遺伝子、または、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓａｒｇ変異体の補完に使用し得るＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＲＧ４遺伝子を含む。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓで機能する他の選択マーカー遺伝子は、ＺｅｏＲ遺伝子、Ｇ４１８Ｒ遺伝子、および勿論、本発明のＦＬＤ遺伝子を含む。
【００５８】
本発明のベクターはまた、細菌中で機能する選択マーカー遺伝子も含み得る。加えられた細菌選択マーカーにより、細菌宿主細胞中でのベクターの増幅が可能となる。細菌選択マーカー遺伝子の例は、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔｒ）、ネオマイシン耐性、ヒグロマイシン耐性、およびゼオシン耐性（ＺｅｏＲ）を含む。
【００５９】
さらに、本発明のベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌中での複製および染色体外維持に関与する配列を含み得る。該配列の使用により、細菌中でのベクターの増幅、および従って大量のベクターＤＮＡの産生が可能となる。細菌複製起源の例は、コリシン、ｃｏｌ  Ｄ１、ｃｏｌ  Ｅ１、および当業者に既知の他の物を含む。
【００６０】
本発明のベクターはまた、Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｃｒｅｇｇの１９８９年６月６日に発行された米国特許第４，８３７，１４８号に記載のような自己複製配列（ＡＲＳ）を含み得る。米国特許第４，８３７，１４８号の開示は、完全に示したのと同じように本明細書に組込む。Ｃｒｅｇｇにより開示された自己複製配列は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでプラスミドを維持するに適切な手段を提供する。
【００６１】
別法として、環状プラスミド以外の組込みベクターを使用してもよい。該組込みベクターは、Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｃｒｅｇｇの１９８９年１１月２１日に発行された米国特許第４，８８２，２７９号に開示されている。’２７９号特許もまた、完全に示したのと同じように本明細書に組込む。主題プロモーター、３’終結配列、ＦＬＤ１マーカー遺伝子、および発現カセットと共に使用するに適切な組込みベクターは、少なくとも第一の挿入可能なＤＮＡ断片、選択マーカー遺伝子、および第二の挿入可能なＤＮＡ断片の連続的に並べられた配列を含む。異種構造遺伝子を含む発現カセットは、このベクターに、第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片の間に、マーカー遺伝子の前または後に挿入する。別法として、発現カセットは、ＦＬＤプロモーターが、構造遺伝子が作動可能に連結され得る挿入可能な断片の１つの中に含まれる場合、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成できる。
【００６２】
第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は、各々少なくとも約２００ヌクレオチド長であり、形質転換する種のゲノムＤＮＡの一部に相同的であるヌクレオチド配列を有する。挿入可能な断片は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの二倍体株を使用する場合、５０ヌクレオチド長という少ない長さであり得る。組込みベクターの様々な成分は、発現カセットおよび選択マーカー遺伝子が、第一の挿入可能なＤＮＡ断片の３’末端と、第二の挿入可能なＤＮＡ断片の５’末端の間に位置するように、連続的に並べられ線形ＤＮＡ断片を形成する。第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は互いに、親ゲノムの配向と同じように連続的に並べられた線形断片で配向している。
【００６３】
第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片として有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾が起こる天然ゲノム位置の別々の部分と相同的であるヌクレオチド配列である。例えば、ゲノム修飾がアルコールオキシダーゼ遺伝子の遺伝子座で起こる場合、使用される第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は、アルコールオキシダーゼ遺伝子遺伝子座の別々の部分に相同的である。第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片として使用できるヌクレオチド配列の例は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）遺伝子、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子などのデオキシリボヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、およびＨＩＳ４遺伝子が、米国特許第４，８５５，２３１号、および第４，８８５，２４２号に開示され、その両方を参考として本明細書に組込む。呼称ＤＡＳ１は、米国特許第４，８５５，２３１号および第４，８８５，２４２号で最初に使用されたＤＡＳ呼称と等価である。第一の挿入可能なＤＮＡ断片は、ＦＬＤプロモーターを含み得、このＦＬＤプロモーターも発現カセットの一部である。第二の挿入可能なＤＮＡ断片は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流の約３００塩基対で始まる３’フランキング配列を含み得る。
【００６４】
本発明のベクターおよびキメラ遺伝子は、当業者には既知の標準的な技法により作成でき、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、分子クローニング：実験マニュアル、または汎用されている組換えＤＮＡ工学に関する無数の実験マニュアルのいずれかに見出すことができる。様々な戦略が、ＤＮＡ断片のライゲートに利用でき、その選択は、ＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、当業者は容易に決定できる。
【００６５】
メチロトローフ酵母宿主細胞を、ＦＬＤプロモーターの制御下で、異種遺伝子を含む線形ＤＮＡ断片を用いて形質転換する場合、発現カセットは、一段階遺伝子置換などの当業者に既知の遺伝子置換法のいずれかにより宿主細胞ゲノムに組込まれる。Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、１９８３  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２０２およびＣｒｅｇｇら、１９８７  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：４７９。ＤＮＡベクターが環状プラスミドである場合、該プラスミドは、組込みを容易にするために線形にし得、次いで、付加によりメチロトローフ酵母ゲノムの同一または異なる遺伝子座に組込み得る。Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６。
【００６６】
本発明のベクターは、Ｃｒｅｇｇら１９８５により記載のスフェロプラスト技法、または欧州特許第３１２，９３４号に記載のＰｉｃｈｉａでの使用のために修飾されたＩｔｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４８：３４１の全細胞塩化リチウム酵母形質転換系などの既知の方法を使用してメチロトローフ酵母細胞に形質転換し得る。本発明のプラスミドまたは線形ベクターの形質転換に有用な他の刊行された方法は、ＣｒｅｇｇおよびＢａｒｒｉｎｇｅｒの米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；Ｄ．Ｗ．Ｓｔｒｏｍａｎらの米国特許第４，８７９，２３１号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５９：１１５を含む。電気穿孔およびＰＥＧ１０００全細胞形質転換手順も使用し得る。ＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ（１９８５）分子生物学の方法：Ｐｉｃｈｉａプロトコール、第３章、Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー、ｐ．２７−３９。
【００６７】
本発明により、主題発現カセットおよび発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。形質転換用酵母宿主は、任意の適切なメチロトローフ酵母であり得る。適切なメチロトローフ酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属、およびＰｉｃｈｉａ属の酵母などのメタノール上で増殖できる酵母を含むがこれに限定されない。このクラスの酵母を例示する種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ（１９８２）、メチロトローフの生化学、２６９に見出し得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍｏｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉは、本発明の実践に有用なメチロトローフ酵母の例である。好ましいメチロトローフ酵母はＰｉｃｈｉａ属である。特に好ましいのは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）；米国特許第４，８１８，７００号に開示されたＧＳ１９０（ＮＲＲＬ  Ｙ−１８０１４）；および米国特許第４，８１２，４０５号に開示されたＰＰＦ１（ＮＲＲＬ  Ｙ−１８０１７）である。ＧＳ１１５、ＧＳ１９０およびＰＰＦ１などの栄養要求性Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、選択を容易にするために本発明の実践に有利である。ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０およびＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３１などの野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、適切な形質転換マーカー遺伝子を選択、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを、スクロース上での増殖を可能とする株に形質転換させるためのＳＵＣ２の使用を選択する場合、または抗生物質耐性マーカーを使用、例えばＧ４１８およびゼオシンに対する耐性を使用する場合、同程度成功裡に使用し得る。
【００６８】
本発明のベクターを使用してＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓで異種タンパク質を大量に産生するために、２段階の高細胞密度のバッチ発酵を使用し得る。第一段階（増殖段階）中、Ｐｉｃｈｉａ宿主細胞を、グリセロールまたはグルコースなどの適切な炭素源、および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは他のアンモニウム塩などの適切な窒素源を含む規定最小培地中で培養し得る。水酸化アンモニウムも使用し得る。この第一段階で、異種遺伝子発現は抑制され、これにより細胞塊の細胞増殖および産生が可能となる。一旦抑制炭素または窒素源が枯渇すれば、メタノールまたはメチルアミン、または両方を加え、これは第二段階（産生段階）の異種遺伝子の発現を開始する。本発明により、メタノールおよびメチルアミンの両方を使用した誘導により、相乗効果が得られる。すなわち、遺伝子発現のレベルは、メタノールおよびメチルアミンの両方を誘導に使用すると、メタノール単独またはメチルアミン単独を誘導に使用する場合に比べて高くなる。
【００６９】
別法として、遺伝子発現は、エネルギー源としてのホルムアルデヒドまたは蟻酸または窒素源としてのコリンおよび他のメチル化アミンを使用して誘導され得る。メタノールを誘導に使用する場合、１％またはそれ以下の濃度で使用される。非常に少量から、ほとんど存在しない量が、発現の誘導に必要な全てである。ホルムアルデヒドを誘導に使用する場合、約１０ｍＭからのほぼ存在しない量までが使用され、ホルムアルデヒドは、１０ｍＭまたはそれ以上の量でＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに対して非常に毒性であることを心に留めておく。蟻酸も、１００ｍＭ以上の量でＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに対して非常に毒性である。メチルアミン、コリンまたは他のメチル化アミンを遺伝子発現の誘導に使用する場合、０．５％からほぼ存在しない量までが使用される。
【００７０】
宿主細胞は、摂氏（Ｃ）約３５℃から摂氏４℃までの範囲の温度で増殖し得る。好ましい細胞増殖温度は、摂氏３０℃である。細胞増殖のｐＨ範囲は、２．８から７．５であり、好ましい範囲は３．０から６．５である。メチロトローフ酵母細胞の増殖の条件および方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＣｒｅｇｇ（１９８８）分子生物学の方法：Ｐｉｃｈｉａプロトコール、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージーで徹底的に議論され、完全に示したのと同じように本明細書に取込む。
【００７１】
形質転換されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、形質転換後の前記の栄養要求性細胞を、必要な生化学産物（細胞の栄養要求性のために）の非存在下で培養し、新規表現型（「メタノール遅延」）を選択および検出するか、または形質転換体に含まれる耐性遺伝子の非存在下で酵母に毒性な抗生物質の存在下で培養することを含むがこれに限定されない適切な技法を使用して選択し得る。
【００７２】
以前に議論したように、主題ＦＬＤ遺伝子は、選択マーカーとして使用して、ホルムアルデヒド耐性を直接的に選択する目的でメチロトローフ酵母細胞を形質転換し得る。さらに、本発明は、宿主細胞に、本明細書に定義したＦＬＤプロモーターに作動可能に連結された、または異種プロモーターに作動可能に連結されたＦＬＤコード配列を含むベクターを導入することを含む、形質転換宿主細胞の直接的選択法を提供する。最適には、ＦＬＤコード配列もまた、その３’末端で、３’終結配列に作動可能に連結している。形質転換宿主細胞は、ホルムアルデヒドの存在下で増殖させ、耐性細胞を選択する。
【００７３】
耐性細胞の選択に使用されるホルムアルデヒドのレベルは、宿主細胞として使用した酵母株、およびＦＬＤ遺伝子の発現の駆動に使用したプロモーターに依存する。例えば、野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株および天然ＦＬＤプロモーターを使用する場合、約７ｍＭのホルムアルデヒドレベルが、直接的な選択には十分である。ｆｌｄ変異体Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、天然ＦＬＤプロモーターまたは異種プロモーター（すなわち、ＦＬＤプロモーター以外のプロモーター）と共に使用する場合、約２ｍＭのレベルが直接的な選択には十分である。
【００７４】
陽性形質転換体は、ＤＮＡ組込み部位の同定に特に有用であるサザンブロット解析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）により特徴づけられ得る。ノザン解析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用して、メタノール応答性およびメチルアミン応答性遺伝子発現を確認し得る。異種遺伝子産物はまた、既知の方法および同定した適切なレベルで所望の遺伝子産物を産生する単離物を使用してアッセイし得る。異種遺伝子産物に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用したイムノブロットも使用し得る。
【００７５】
本発明の別の態様は、メチロトローフ酵母細胞に、メチロトローフ酵母から単離したＦＬＤプロモーター（このプロモーターは、その３’末端で、異種遺伝子の５’末端に作動可能に連結している）を含む単離核酸を導入することを含む、メチロトローフ酵母での異種遺伝子の発現を指令する方法を提供する。最適には、異種遺伝子はまた、その３’末端で、メチロトローフ酵母で機能する３’終結配列の５’末端に作動可能に連結している。かかる単離核酸は、好ましくは、メチロトローフ酵母内で複製するか、または前記したようにメチロトローフ酵母のゲノムに組込まれるベクター内に存在する。メチロトローフ酵母細胞は、発現カセットまたは発現ベクターで形質転換され、次いで、細胞を、炭素源としてグリセロールまたはグルコースなどの糖、および窒素源としての水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、または他のアンモニウム塩を有する培地中で増殖させる。抑制炭素または窒素源が枯渇した後、異種遺伝子の発現を、メタノールまたはメチルアミンの添加により誘導する。別法として、遺伝子発現は、エネルギー源としてのホルムアルデヒドまたは蟻酸で、または窒素源としてのコリンおよび他のメチル化アミンで誘導され得る。慣用的な方法を使用して、培養培地（異種タンパク質が異種細胞から分泌される場合）またはメチロトローフ酵母細胞（異種タンパク質が分泌されていない場合）から異種タンパク質を単離する。
【００７６】
本発明はまた、本発明の発現カセットおよび発現ベクターを含むキットを提供する。本発明のこの態様において、メチロトローフ酵母由来の主題ＦＬＤプロモーターを含む発現カセット並びにＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子またはＦＬＤ遺伝子由来の３’終結配列などの３’終結配列を含むキットが提供される。少なくとも１つの制限部位および好ましくはマルチクローニングサイトが、ＦＬＤプロモーターと３’終結配列の間に簡便には位置し、よって異種遺伝子が挿入され得、プロモーターおよび３’終結配列に作動可能に連結され得る。キットはまた、メチロトローフ酵母中で複製するか、または前記したようにメチロトローフ酵母のゲノムに組込まれる、プラスミドなどのベクターを含み得る。好ましくは、ベクターは、マーカー遺伝子並びに発現カセットの挿入のための１つ以上の制限部位を含む。別に、キットは、ベクター内にすでに配置された発現カセットを含んでもよい。別の実施形態において、キットはまた、発現ベクターで形質転換され得、形質転換細胞が直接選択され得る酵母株を含み得る。選択マーカーおよび栄養要求酵母株の例は、前記している。本発明のこの態様のさらに別の実施形態において、キットはまた、β−ラクタマーゼなどのリポーター遺伝子に作動可能に連結したＦＬＤ１プロモーターなどの制御プラスミドを含み得る。該プラスミドは、単独で、または形質転換酵母株内で供給され得る。
【００７７】
本発明はまた、選択マーカーとしてのＦＬＤ遺伝子と共に発現ベクターを含むキットを提供する。ベクターは、自己複製ベクターでも組込みベクターでもよい。前記したように、ＦＬＤコード配列は、天然ＦＬＤ５’および／または３’調節配列の制御下にあり得るか、または異種５’および／または３’調節配列に作動可能に連結し得る。発現ベクターには、メチロトローフ酵母中で機能するプロモーター並びにメチロトローフ酵母中で機能する３’終結配列を含む発現カセットも存在する。発現カセット内の、５’調節配列と３’調節配列の間には、１つ以上の制限部位が存在し、よって異種遺伝子が挿入され得、調節配列の制御下に配置され得る。好ましい実施形態において、プロモーターおよび３’終結配列は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１遺伝子由来である。別の実施形態において、キットはさらに、５’調節領域に作動可能に連結したシグナル配列と共に、該発現カセットを有するベクターを含む。シグナル配列の末端と３’終結配列の間には、異種遺伝子の挿入ための少なくとも１つの制限部位が位置する。好ましくは、マルチクローニングサイトが、シグナル配列の末端と３’終結配列の５’末端の間に位置する。適切なシグナル配列の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α交配因子プレプロ（αｍｆ）、およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼシグナル配列（ＰＨＯ１）を含む。
【００７８】
本発明は、以下の具体的な実施例によりさらに説明され、これは本発明の範囲をいずれにしても限定するものではない。
【００７９】
（実施例）
以下の実施例で使用した株、プラスミド、および培地は、以下に示した組成を有する。
【００８０】
使用した野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０であった。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｌｄ１変異体株を、ニトロソグアニジンを使用して作成し、Ｄｒ．Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓｐｅｒｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｐｅｔｒｉｌｅｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、オクラホマ、米国）を通して得られた。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｌｄ１株のＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１）は、米国農務省の北部領域リサーチセンター（ＮＲＲＬ）、ピオリア、イリノイに＿＿で寄託され、寄託番号＿＿を割当てられた。ＭＳ１０５、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｌｄ１ ｈｉｓ４株は、ＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１）をＧＳ１１５（ｈｉｓ４）と交雑することにより作成した。ＭＳ１０５はまた、ＮＲＲＬに＿＿で寄託され、寄託番号＿＿を割当てられた。プラスミドｐＹＧ１およびｐＹＧ２は、ＮＲＲＬに＿＿で寄託され、寄託番号＿＿および＿＿をそれぞれ割当てられた。使用したＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ株は、ＣＢＳ４７３２であった。細菌組換えＤＮＡ操作は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＭＳ１０６１またはＤＨ５αで実施した。酵母株は、富化ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、０．４％グルコース）、または、硫酸アンモニウムおよびアミノ酸を含まない０．１７％酵母窒素ベース、炭素源（０．４％グルコースまたは０．５％メタノール）、および窒素源（０．５％硫酸アンモニウムまたは０．２５％塩化メチルアミン）からなる最小培地中で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ株は、必要であれば１００μｇ／ｍｌアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバート、カリフォルニア、米国）を補充したルリアブロス培地中で培養した。
【００８１】
（実施例１）
［Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損変異体の単離］
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ１）のクローニングの第一段階として、ＦＬＤ活性の特異的に欠損した変異体を探した。以前のメチロトローフ酵母の生化学的研究により、ＦＬＤが、炭素源としてのメタノールおよび窒素源としてのメチルアミンの両方に関与していることが示された（Ｚｗａｒｔ糖、１９８３）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｌｄ１変異体を探すために、ニトロソグアニジンで変異誘発した培養物を、炭素源としてメタノールおよび窒素源としてメチルアミンを利用できない株についてスクリーニングした。補完解析および他の古典的な遺伝子技法をＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ（１９９８）に記載の通りに実施した。単一の補完群に属する５つの変異体を同定した。
【００８２】
これらの５つの株をさらに、各株のメタノール誘導培養物から調製した抽出物での鍵となるメタノール経路酵素活性レベルを測定することにより調べた。これらの酵素は、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）、カタラーゼ、ジヒドロキシアセトン、シンターゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、ＦＬＤ、および蟻酸デヒドロゲナーゼを含んだ。酵素アッセイ用に、酵母株を、振盪フラスコ中で３０℃でＹＮＢ培地（アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない、ＤＩＦＣＯ）中で炭素源として０．５％メタノールおよび窒素源として０．５％硫酸アンモニウムを使用して増殖させた。培養物を、後期対数増殖期で収集し、細胞非含有抽出物を、Ｗａｔｅｒｈａｍら（１９９６）に記載の通りにガラスビーズを使用して調製した。細胞非含有抽出物のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法または標準物質としてウシ血清アルブミンを用いるピアスＢＣＡタンパク質アッセイキット（ロックフォード、イリノイ）を使用して決定した。アルコールオキシダーゼ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉら、１９９０）、カタラーゼ（Ｌｕｅｃｋ、１９６３）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＷａｉｔｅｓおよびＱｕａｙｌｅ、１９８１）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎら、１９７８）、および蟻酸デヒドロゲナーゼ（ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎら、１９７６）活性を、発表された方法により決定した。ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、Ｓｃｈｕｔｔｅら（１９７６）に記載のように飽和量のホルムアルデヒド、グルタチオン、およびＮＡＤの存在下で３４０ｎｎｍでＮＡＤＨ形成速度を追跡することにより分光光学的に測定した。反応混合物は、最終容量１．０ｍｌ中に、３３ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９から８．０）、２ｍＭグルタチオン、１ｍＭ  ＮＡＤ、１ｍＭホルムアルデヒド、および限定量の酵素を含んだ。３４０ｎｍでの吸光度変化率を、少なくとも２分間追跡し、活性を、ＮＡＤについて定数ε＝６．２２ｃｍ２／ｎｍｏｌを使用することにより計算した。アルコールオキシダーゼ活性は、μｍｏｌ／ｍｇ／分で表現し、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、μｍｏｌ／ｍｇ／分で表現した。ｎｍｏｌ／ｍｇ／分で表現したβ−ラクタマーゼ活性は、５６９ｎｍおよび３０℃で、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、１１．１ｍＭ  ＰＡＤＡＣを基質として使用して分光光学的にアッセイした（吸光係数４４．４０３ｃｍ−１Ｍ−１）。
【００８３】
表１に示したように、唯一の炭素源としてのメタノールおよび唯一の窒素源としての硫酸アンモニウム上での野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの増殖は、特異的に高レベルのＦＬＤ活性を誘導した（表１）。結果は、５つの変異体の各々について本質的に同一であり、変異体株ＧＳ２４１の１つについて表１に示す。各変異体は、検出不可能であったＦＬＤを除いてアッセイした全ての酵素について有意な活性レベルを含んだ。対照として、メタノール増殖野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、通常レベルのＦＬＤ活性を示し、そのＡＯＸ遺伝子が欠失し、その結果としてメタノール上で増殖できないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのメタノール誘導細胞も、かなりのレベルのＦＬＤ活性を含んだ。
【００８４】
変異体の表現型および生化学的特徴は、それらがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子に特に欠損しているという知見と一致した。１つの推定ｆｌｄ１株のＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１）を、全てのさらなる操作について選択した。
【００８５】
（実施例２）
［Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子の単離および特徴づけ］
機能的補完により推定ＦＬＤ１遺伝子をクローン化するために、Ｇ２４１株を最初に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）に交雑させて、メタノール利用欠損（Ｍｕｔ−）およびヒスチジン栄養要求性（Ｈｉｓ−）の両方である誘導体を得た。この交雑から生じた１つのＭｕｔ−Ｈｉｓ−株のＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ ｈｉｓ４）を、次いで、スフェロプラスト法を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐＹＭ８に作成した５から１０μｇのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリーを用いて形質転換した（Ｃｒｅｇｇら、１９８５；Ｌｉｕら、１９９５）。プラスミドｐＹＭ８は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＳＨＩＳ４）およびＥ．ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２に挿入されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ−特異的自己複製配列（ＰＡＲＳ１）からなる。約５０，０００のライブラリー形質転換体を、ＹＮＤ培地寒天上でＨｉｓ＋プロトトロフについて選択し、得られた選択クローンはさらに、Ｍｕｔ＋表現型についてＹＮＭプレート上で選択した。全ＤＮＡを、数百個のＨｉｓ＋Ｍｕｔ＋コロニーのプールから抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に使用した。このプロセスから回収された１つのプラスミドのｐＹＧ１は、ＭＳ１０５株を、Ｈｉｓ＋およびＭｕｔ＋の両方に再形質転換でき、さらに調べた。
【００８６】
ｐＹＧ１上での推定ＦＬＤ１遺伝子の位置を決定するために、プラスミドの制限地図を作成し、ベクターからの選択断片を、サブクローニングし、ＭＳ１０５株を補完する能力について試験した。組換えＤＮＡ法を、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載の通りに実施した。オリゴヌクレオチドを合成し、ＤＮＡシークエンスを、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、オレゴン、米国）で実施した。プラスミドは、サイズが１４．５ｋｂであり、６．８ｋｂの挿入断片を含むことが判明した（図２）。２．７ｋｂのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片は、ＭＳ１０５のＭｕｔ−欠損を補完するに十分であることが判明し、シークエンスした。ＤＮＡ配列は、長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定し、その推定産物は、他のアルコールデヒドロゲナーゼと強い類似性を示した。またこの配列により、遺伝子の５’末端近辺にイントロンの存在の可能性が示唆された。
【００８７】
イントロンの存在を確認するために、ＯＲＦのこの領域を、ｍＲＮＡから、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅し、産物のサイズおよび配列を、プラスミドｐＹＧ１上のゲノム断片のＰＣＲにより得られたものと比較した（図３）。ＰＣＲ反応は、ＫｒａｍｅｒおよびＣｏｅｎ（１９９５）により記載の通りに実施した。全Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＲＮＡを、Ｓｃｈｍｉｔｔら（１９９０）に従って単離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は以前に記載された通りに（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９２）、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＣＡＣＡＡＴＧＴＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧＴＣ−３’（５’プライマー）および５’−ＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＣＡＧ−３’（３’プライマー）を使用して実施した。
【００８８】
ゲノム産物は、２８４ｂｐ長であるが、ｃＤＮＡ産物は、１７０ｂｐよりも有意に短かった。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の整列により、ゲノムＤＮＡに存在した１１４ｂｐのセグメントは、ｃＤＮＡには存在しないことが実証された。さらに、推定イントロン／エキソン接合部の調査により、典型的な酵母スプライス接合部（５’接合部、５’−ＧＴＡＡＧＴ−３’；３’接合部、５’−ＹＡＧ−３’）および分岐点（５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’）（Ｄｏｍｄｅｙら、１９８４；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓら、１９９２）が判明した。１つのイントロンがそれ故、ＯＲＦのこの位置に存在する。最後に、ハイブリッド形成プローブとしてＯＲＦ由来の断片を使用して、野生型ゲノムＤＮＡの選択制限消化物のサザンブロットにより、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムは唯１つの遺伝子コピーを含むことが示された。
【００８９】
ＯＲＦのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を図４に示す。配列データは、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪから、アクセス番号ＡＦ０６６０５４で入手できる。ＯＲＦは、１，１３７ｂｐ長であり、計算分子量３９，８７０をもつ、３７９アミノ酸のタンパク質をコードする。イントロンは、推定メチオニンイニシエーターＡＴＧのＡの３’の１８ｂｐの位置（６アミノ酸）で開始し、１１４ｂｐ長である。グルコースおよびメタノール増殖野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞から、ＯＲＦ領域由来のＤＮＡ断片を使用して抽出された全ＲＮＡのノザンブロットは、メタノール−増殖細胞には高いレベルで存在するが、グルコース増殖細胞には存在しない約１．３ｋｂの１つのｍＲＮＡ種を示した（データは示していない）。全体的に、推定ＦＬＤ１遺伝子のコドン使用は、他の高度に発現されているＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子に典型的であった（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ、１９９３）。
【００９０】
ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩデータベースを、ＯＲＦ産物に対するアミノ酸配列類似性をもつ他のタンパク質についてスクリーニングした。推定ＦＬＤ１タンパク質（Ｆｌｄ１ｐ）の配列により、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ由来のグルタチオン依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼのそれと最も高い同一性（７１％）を示した（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓら、１９９２）（図５）。Ｃ．ｍａｌｔｏｓａは、ｎ−アルカン同化酵母であり、ＦＬＤは、ホルムアルデヒドの毒性効果から酵母を保護するに重要であると信じられている（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓら、１９９２）。推定Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ  ＦＬＤ産物の、クローン化ＯＲＦのそれへの高度な類似性は、このＯＲＦが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｆｌｄ１ｐをコードするさらなる支持を提供する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｆｌｄ１ｐ配列はまた、高等真核生物のアルコールデヒドロゲナーゼＩＩＩ（ＡＤＨＩＩＩ）タンパク質との高度な同一性（６５％ヒト；６３％、ウマ；６４％、ラット）、および他の高等真核生物（ＡＤＨ）との低いが有意な同一性が示された（ＨｏｌｍｑｕｉｓｔおよびＶａｌｌｅｅ、１９９１；Ｋｏｉｖｕｓａｌｏら、１９９８；Ｒａｔｈｎａｇｉｒｉら、１９９８）。最後に、Ｆｌｄ１ｐ配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤＨの推定アミノ酸配列とほとんど類似性を示さなかった。最も近い、１９％同一性は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤＨＩであった（Ｊｏｒｎｖａｌｌら、１９８７）。
【００９１】
（実施例３）
［Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ遺伝子の単離および特徴づけ］
推定Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ１遺伝子を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子について上記した同じ機能的補完戦略を使用して単離した。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡライブラリーは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓライブラリーと同じ方法で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターｐＹＭ８に作成した（Ｌｉｕら１９９５）。簡潔には、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａで部分消化し、５から２０ｋｂの断片についてサイズを選択した。これらの断片を、ｐＹＭ８のＢａｍＨＩ部位にライゲートした。ライブラリーは、約１００，０００の独立したＥ．ｃｏｌｉ形質転換体からなり、９０％以上が挿入断片を含む。挿入断片ＤＮＡの平均サイズは、約１０ｋｂであった。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムのサイズが１０，０００ｋｂであると仮定して、ライブラリーは、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡの約１００ゲノム等価物を含んだ。プラスミドを回収し、ＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ ｈｉｓ４）をＨｉｓ＋およびＭｕｔ＋表現型の両方に同時に再形質転換できるものについて解析した。これらの基準に適合する１つのプラスミドｐＹＧ２（図９）を、これらの研究に使用するために選択した。このプラスミドは、７．２ｋｂのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＤＮＡ挿入断片を含み、Ｍｕｔ補完活性は、２．４ｋｂ  ＳｐｈＩ断片内に存在することが判明した（図１０）。サザンブロット研究により、ベクターｐＹＧ１およびｐＹＧ２は、相同ＦＬＤ遺伝子を含むことが示された。かかるブロットの例は、図１１に示す。この実験で、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のゲノムＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ（Ｂ２）（レーン１から３）またはＣｌａＩ（Ｃ）（レーン４から６）で消化し、以下の標識プローブとハイブリッド化させた：ｐＹＧ２（レーン１および４）、ｐＹＭ８（レーン２および５）、またはｐＹＧ１（レーン３および６）。推定Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ１遺伝子を含むｐＹＧ２プローブは、高ストリンジェントでＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩ消化Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡとそれぞれハイブリッド化させた場合に、から１５ｋｂおよびから７ｋｂの主なバンドを生じた。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子を含むｐＹＧ１の、低ストリンジェント（３０％ホルムアミド、３７℃ハイブリッド形成、１×ＳＳＣ、室温洗浄）でのハイブリッド形成により、同サイズの主なハイブリッド形成バンドが生じた。これらのバンドは、ｐＹＭ８由来のベクター配列のハイブリッド形成に起因するものではない。なぜなら、ｐＹＭ８プローブは、同じ低ストリンジェントな条件下でＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡとのハイブリッド形成による主なバンドを全く示さなかったからである。
【００９２】
（実施例４）
［Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤ１ｐの熱安定性の比較］
クローン化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子が実際にＦＬＤをコードしているさらなる証拠は、その産物を、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤに対して熱安定性を比較することにより得られた。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓよりも有意に高い（４２℃対３０℃）最適増殖温度を有する関連メチロトローフ酵母である。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤは、それ故、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＦＬＤよりも有意に高い熱安定性を示すことが期待される。２つの酵母由来の推定ＦＬＤの熱安定性特性の比較により、遺伝子産物の同一性の強力な支持が提供される。この実験で、推定Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ１遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｌｄ１−１ ｈｉｓ４  ＭＳ１０５のメタノール増殖細胞中で発現され、各々のＦＬＤ活性の熱安定性は、株から調製した抽出物を、６０℃で、選択した期間インキュベートし、ＦＬＤ活性の減少速度を決定することにより評価した。遺伝子が実際にＦｌｄ１ｐをコードする場合、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに発現されるＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  Ｆｌｄ１ｐのＦＬＤ失活速度は、野生型Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  Ｆｌｄ１ｐのそれと類似し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子産物の失活速度は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｆｌｄ１ｐのそれと類似するはずである。
【００９３】
この比較を行うために、最初に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＦＬＤの熱安定性が有意に異なることを確立し、推定Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ１遺伝子をクローン化することが必要であった。熱安定性は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのメタノール増殖培養物から細胞非含有抽出物を調製し、それらを６０℃でインキュベートすることにより決定した。インキュベート中の選択した時間に、抽出物のサンプルを取り出し、ＦＬＤ活性についてアッセイした。図６に示したように、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＦＬＤ活性は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ活性よりも有意により熱に安定であった。
【００９４】
次いで、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａベクターｐＹＧ２から発現されたＦＬＤの熱安定性を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターｐＹＧ１由来のＦＬＤの熱安定性と比較した。図６に示したように、ＭＳ１０５（ｐＹＧ２）のＦＬＤは、野生型Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのそれと類似した熱失活速度を示し、一方、ＭＳ１０５（ｐＹＧ１）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのそれと類似した速度を示した。これらの結果は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ２４１株（およびＭＳ１０５）のＦＬＤ活性の特異的非存在、およびクローン化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＯＲＦおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ  ＦＬＤの一次アミノ酸配列の高度な類似性を実証した結果と合わせて、クローン化ＯＲＦは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｆｌｄ１ｐをコードすることが示された。
【００９５】
（実施例５）
［ＰＦＬＤ１の解析およびＰＡＯＸ１に対する比較］
ＰＦＬＤ１の転写制御下での遺伝子発現を調べるために、２つのベクターを作成した（図１）。両方のベクターが、β−ラクタマーゼ（β−ｌａｃ）をコードしている細菌ｂｌａ遺伝子に融合したＦＬＤ１のメチオニンイニシエーターＡＴＧコドンのちょうど５’から配列が始まっている０．６ｋｂ  ＭｕｎＩ−ＢａｍＨＩ断片、次いで、ＡＯＸ１転写ターミネーターを含む断片からなる同一の発現カセットを含んだ。ＭｕｎＩは人工的であり、ＦＬＤ１のメチオニンイニシエーターＡＴＧのちょうど５’からの配列と共に、ＭｕｎＩ部位を含んだオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲにより設置された。この位置での制限部位は、β−ラクタマーゼリポーター遺伝子の５’へのプロモーターの挿入を補助するのに必要であった。ＭｕｎＩ部位を選択した。なぜなら、ＭｕｎＩで作成したＤＮＡ末端は、ＥｃｏＲＩと適合性であり、試験ベクターのβ−ラクタマーゼリポーターのちょうど５’にすでにＥｃｏＲＩが存在していたからである。ＥｃｏＲＩ部位は、ＦＬＤ１遺伝子の３’末端には配置できなかった。なぜなら、ＦＬＤ１プロモーター領域は天然ＥｃｏＲＩ部位を有するからである。
【００９６】
１つのベクターのｐＳＳ０４０は、ＰＦＬＤ１断片内に独特なＮｓｉＩ制限部位を含んだ。この部位で切断し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換すると、ベクターは、ＰＦＬＤ１遺伝子座で効率的に組込まれた。この組込み事象の結果は、ＰＦＬＤ１−ｂｌａ発現カセットであり、これはまたＰＦＬＤ１断片の上流に天然ＦＬＤ１配列も含んだ（ＷＴ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ）。ＦＬＤ１の転写制御に必要な全ての配列がＦＬＤ１  ＯＲＦの５’に位置すると仮定すると、この株でのｂｌａおよびＦＬＤ１発現の調節は、ほぼ同一であるべきである。表２に示すように、これは、株でのβ−ｌａｃおよびＦＬＤ活性の相対レベルが、４つの発現試験培地中で増殖した細胞で類似していた点で真実のようであった。これらの４つの培地は、炭素および窒素源としてそれぞれ：（１）グルコースおよび硫酸アンモニウム（Ｇ／ＮＨ４＋）、（２）グルコースおよびメチルアミン（Ｇ／ＭＡ）、（３）メタノールおよび硫酸アンモニウム（Ｍ／ＮＨ４＋）、および（４）メタノールおよびメチルアミン（Ｍ／ＭＡ）を含んだ。期待される通り、β−ｌａｃおよびＦＬＤ活性は、Ｇ／ＮＨ４＋培地上で増殖した細胞で高度に抑制されていた。Ｇ／ＭＡまたはＭ／ＮＨ４＋培地上で増殖した細胞は、少なくとも１０倍以上のβ−ｌａｃおよびＦＬＤを含み、両酵素の最も高いレベルがＭ／ＭＡ培地で増殖させた細胞で観察された。
【００９７】
第二ベクターのｐＳＳ０５０は、選択マーカーとしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４遺伝子を含んだ。ＨＩＳ４内の独特なＳａｌＩ部位で切断し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで形質転換すると、このベクターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４遺伝子座で効率的に取込まれた。この組込み事象の結果は、０．６−ｋｂＰＦＬＤ１−断片のちょうど５’のｐＢＲ３２２由来の配列をもつＰＦＬＤ１−ｂｌａ発現カセットであった（ｐＢ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ）。この株のβ−ｌａｃ活性レベルと、ＷＴ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ株で観察された活性レベルの比較により、０．６ｋｂ断片は正常な調節に必要な全ての上流調節配列を含むかの評価が可能となった。表２は、各４つの発現試験培地中で増殖させた場合、ｐＢ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ株のβ−ｌａｃ活性レベルが、ＷＴ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ株で観察されたレベルの約２倍高かったことを示す。これらの結果は、正常な調節に必要なほとんどの配列が、ＰＦＬＤ１断片内に存在するが、ＰＦＬＤ１を約２倍の率で構成的に抑制するその配列は、ＰＦＬＤ１断片のいずれかの５’に存在し、０．６ｋｂ断片にはないことを示した。
【００９８】
最後に、ＰＦＬＤ１制御下で産生されたβ−ｌａｃ活性レベルを、ｂｌａ発現がＰＡＯＸ１の転写制御下にある株のものと比較した（Ｗａｔｅｒｈａｍら、１９９７）。以前に報告されたように、ＰＡＯＸ１発現は、グルコース含有培地で強力に抑制され、メタノール含有培地で高度かつ特異的に誘導される（Ｔｓｃｈｏｐｐら、１９８７；Ｗａｔｅｒｈａｍら、１９９７）（表２）。同等なレベルのβ−ｌａｃが、Ｍ／ＮＨ４＋またはＭ／ＭＡ培地中で増殖させたＷＴ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ株の細胞に存在し、一方、ｐＢ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ株の細胞は、ＰＡＯＸ１−ｂｌａ株のレベルよりも有意に高いβ−ｌａｃレベルを含んだ。特に注目されるのは、Ｍ／ＮＨ４＋およびＭ／ＭＡ培地上のｐＢ−ＰＦＬＤ１−ｂｌａ株のβ−ｌａｃであり、これは一貫して、同培地上のＰＡＯＸ１−ｂｌａ株で観察されたものの約２倍であった。
【００９９】
（実施例６）
ＦＬＤ１遺伝子は、ホルムアルデヒドに対する耐性を付与する
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子を、ＺｅｏＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバート、カリフォルニア）を含むｐＰＩＣＺベクターに取込んだ。２つの該ｐＰＩＣＺ−ＦＬＤ１ベクターを作成した。１つに、ＦＬＤ１プロモーターを含む全ＦＬＤ１遺伝子、構造遺伝子および転写ターミネーターを挿入した（ｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１）。他方には、ＦＬＤ１構造遺伝子（および転写ターミネーター）を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ）プロモーター（ｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１）の制御下に配置した。これらの２つのプラスミドを、そのそれぞれのプロモーター断片（ＰＦＬＤ１、ＰＧＡＰ）内で線形化し、電気穿孔法により野生型およびＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ ｈｉｓ４）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換し、１００μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌでゼオシンに対する耐性についての選択した。低い方のゼオシン濃度は、１つの組込みＺｅｏＲベクターコピーを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体を選択し、一方、高い方のゼオシン濃度は、複数の組込みＺｅｏＲベクターコピーを有する形質転換体を選択する。各々の型の選択された形質転換体を、１００ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含むＹＰＤ培地プレート上および０から３０ｍＭの範囲の濃度のホルムアルデヒドを含むＹＰＤプレートのセットに画線した。対照として、ｐＰＩＣＺベクターのみで形質転換した（すなわちＦＬＤ１遺伝子を含まない）野生型およびＧＳ２４１株もまたプレート上に画線した。
【０１００】
ｐＰＩＣＺのみで形質転換したＭＳ１０５株は、１ｍＭホルムアルデヒドに対して耐性であった。１コピーのｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１を含むＭＳ１０５由来株は、１０ｍＭおよび５ｍＭホルムアルデヒドにそれぞれ耐性であり、一方、複数コピーのｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１を含むＭＳ１０５由来株は、３０ｍＭおよび１０ｍＭホルムアルデヒドに対してそれぞれ耐性であった。従って、ＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１ベクターは、ホルムアルデヒドに対する耐性の増加を付与した。さらに、追加の効果が明らかとなり、各々のベクターのコピー数の増加により、各ベクターの１コピーにより付与される耐性レベル以上に、ホルムアルデヒドに対する耐性レベルは増加した。
【０１０１】
ｐＰＩＣＺのみで形質転換した野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、５ｍＭホルムアルデヒドに対して耐性であった。野生型株は、ＦＬＤ１遺伝子の１つの天然コピーを含むので、この株に対するホルムアルデヒドの濃度は、期待されるよりも有意に高かった。１コピーのｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１を含む野生型由来株は、１０および５ｍＭホルムアルデヒドにそれぞれ耐性であり、一方、複数コピーのｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１を含む野生型由来株は、３０ｍＭホルムアルデヒドにそれぞれ耐性であった。従って、ｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１ではなくｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１ベクターは、ホルムアルデヒドに対する耐性の増加を付与した。さらなる効果も明らかとなり、各々のベクターのコピー数の増加は、各ベクターの１コピー以上に、ホルムアルデヒドに対する耐性レベルの増加を付与した。
【０１０２】
これらの形質転換実験は、ｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１ベクター並びにホルムアルデヒドに対する耐性を直接選択する野生型およびＭＳ１０５Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（対照としてゼオシン耐性の選択と共に）を用いて繰返した。ＭＳ１０５株では、２ｍＭホルムアルデヒドが形質転換体の選択に最適であった。この濃度のホルムアルデヒドは、１００μｇ／ｍｌゼオシン選択対照を用いて観察したのとほぼ同数の形質転換体を産生した。野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓには、７ｍＭホルムアルデヒドが、ｐＰＦＬＤ１−ＦＬＤ１ベクターをもつ形質転換体の選択に最適であった。この濃度は、１００μｇ／ｍｌのゼオシン選択対照を用いて観察したのとほぼ同数の形質転換体を産生した。形質転換体は、ｐＰＧＡＰ−ＦＬＤ１ベクターでは観察されなかった。
【０１０３】
これらの陽性結果に基づいて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターを作成した。ベクターは、異種遺伝子を挿入できるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）により分離されているＡＯＸ１プロモーターおよび転写ターミネーターを含むＤＮＡ断片からなる異種遺伝子発現カセットを含む。発現カセットの次に、ＰＧＡＰ−ＦＬＤ１遺伝子作成物を含むＤＮＡセグメントが続き、このセグメントの次に、ＡＯＸ１遺伝子の３’配列由来のＤＮＡ断片が続く。このセットのＤＮＡ断片を、細菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン、サンディエゴ、カリフォルニア）に挿入し、よってベクターはＥ．ｃｏｌｉで増殖させることができる。
【０１０４】
異種遺伝子をＭＣＳに挿入した後、得られたベクターを、制限酵素ＮｏｔＩで切断し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換できるＤＮＡ断片を細菌プラスミドから放出させる。断片を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型またはＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１）株に、電気穿孔法により形質転換し、形質転換体を、野生型株については７ｍＭホルムアルデヒドまたはＭＳ１０５  ｆｌｄ１株については２ｍＭを含むＹＰＤ培地プレート上で選択した。ベクター断片は、２つの方法の１つで、それ自体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに挿入する。第一は、ＡＯＸ１遺伝子を置換する遺伝子置換事象による。ホルムアルデヒドに対する耐性の増加に加えて、該遺伝子置換形質転換体は、ＡＯＸ１遺伝子の非存在に起因するメタノール上での非常に遅い増殖速度から、容易に表現型により同定できる。
【０１０５】
ベクターのそれ自体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに挿入する別の方法は、組込み前の同じ点での形質転換断片の線形化を含む。線形化後、形質転換ＤＮＡは、ベクターに示されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム遺伝子座のいずれかで１回の交差事象により組込むことができる。これらのゲノム領域は、ＦＬＤ１、ＡＯＸ１プロモーターおよびＡＯＸ１  ３’フランキング遺伝子座を含む。これらの部位のいずれかでの組込みにより、ホルムアルデヒドに対する耐性の増加以外は株表現型に変化は生じなかった。任意の方法でのこの断片の組込みにより、そのタンパク質産物を所望する異種遺伝子の例外を除く、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに外来性の抗生物質耐性遺伝子または任意の他の遺伝子の取り込みが生じないように注意することは重要である。
【０１０６】
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【０１０７】
（表１）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのメタノール利用欠損変異体の相対酵素活性レベル
【表１】
0004511728.tif 000002
ａ各酵素の活性は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのメタノール増殖培養物から調製した抽出物で観察される活性の％として表現する。略称は：ＡＯＸ、アルコールオキシダーゼ；ＣＡＴ、カタラーゼ；ＦＬＤ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ；ＦＤＨ、蟻酸デヒドロゲナーゼ；ＤＡＳ、ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ＤＡＫ、ジヒドロキシアセトンキナーゼである。
【０１０８】
ｂ決定せず。
【０１０９】
（表２）
ＰＦＬＤおよびＰＡＯＸ１の制御下でｂｌａを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の抽出物でのβ−ラクタマーゼ活性の比較
【表２】
0004511728.tif 000003
ａ各株は、炭素源としてグルコース（Ｇ）またはメタノール（Ｍ）および窒素源として硫酸アンモニウム（ＮＨ４＋）またはメチルアミン（ＭＡ）を含む培地中で増殖させた。
【０１１０】
ｂβ−ラクタマーゼ活性は、ｎｍｏｌ／ｍｇ／分として、および括弧内には、メタノールおよびメチルアミン上で増殖させた野生型ＰＦＬＤ１−ｂｌａ株で見られる活性の％として表現する。活性は、２つの独立的に形質転換した株を使用した３つの実験の平均を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、選択したプラスミドｐＨＷ０１８、ｐＳＳ０５０、ｐＫ３２１、およびｐＳＳ０４０の物理地図を提供する。
【図２】  図２は、ＦＬＤ１遺伝子含有ベクターｐＹＧ１の制限酵素地図である。
【図３】  図３Ａは、ＦＬＤ１遺伝子のエキソン解析を示す。非スプライス（ゲノム）およびスプライス（ｃＤＮＡ）ＤＮＡのＰＣＲから期待される産物の図が示される。ＰＣＲ反応に使用したハイブリッド化プライマーの位置は収束矢印として示す。
図３Ｂは、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ反応産物の電気泳動図である。ＰＣＲ反応は、以下を用いて実施した：レーン１、ゲノムＤＮＡ鋳型と両方のプライマー；レーン２、ｃＤＮＡ鋳型と両方のプライマー；レーン３、ｃＤＮＡ鋳型と５’プライマーのみ；レーン４、ｃＤＮＡ鋳型と３’プライマーのみ；レーン５、両方のプライマーでＤＮＡ鋳型はなし。側方のマーカーバンドは塩基対で示す。
【図４】  図４は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子およびその産物のヌクレオチドおよび推論アミノ酸配列である。
【図５】  図５は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ  ＦＬＤタンパク質の予測アミノ酸配列の比較である。配列をＰＣ遺伝子ソフトウェアを使用して整列させた。配列間の文字「＊」は、同一の残基を示す。文字「．」は、類似残基を示す。類似残基は、Ａ、Ｓ、Ｔ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｒ、Ｋ；Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ；Ｆ、Ｙ、Ｗとして規定する。
【図６】  図６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来の推定ＦＬＤ１遺伝子で形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の熱安定性をグラフで示す。株は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（■）；野生型Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（●）；Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＭＳ１０５（ｐＹＧ１）（□）；およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＭＳ１０５（ｐＹＧ２）（○）である。
【図７】  図７Ａは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＤ１遺伝子の制限地図である。
【図８】  図８は、ＰＦＬＤ１の制限地図である。
【図９】  図９は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＦＬＤ遺伝子含有ベクターｐＹＧ２の制限酵素地図である。
【図１０】  図１０は、ＦＬＤ遺伝子を含むＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＤＮＡ断片の制限地図である。
【図１１】 図１１は、ＢｇｌＩＩ（Ｂ２）（レーン１から３）またはＣｌａＩ（Ｃ）（レーン４から６）で消化し、以下のプローブ：ｐＹＧ２（レーン１および４）、ｐＹＭ８（レーン２および５）、またはｐＹＧ１（レーン３および６）とハイブリッド化させたＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のゲノムＤＮＡを示すサザンブロットである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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