【手続補正書】
【提出日】平成18年10月4日(2006.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】ペプチドが（i）成長ホルモン，(ii）ベータセルリン，(iii）インターロイキン−２，(iv）ニューロトロフィン−３または（v）アペリンである請求項１記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法、
（２）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である前記（１）記載の方法、
（３）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学的に製造されたペプチドである前記（２）記載の方法、
（４）ペプチドが（i）成長ホルモン，(ii）ベータセルリン，(iii）インターロイキン−２，(iv）ニューロトロフィン−３または（v）アペリンである前記（１）記載の方法、
（５）ペプチドが成長ホルモンである前記（１）記載の方法、
（６）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前記（１）記載の方法、
（７）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法、
（８）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法、
（９）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である前記（８）記載の製造法、
（１０）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前記（８）記載の製造法、
（１１）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法、
（１２）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をグリオキシル酸またはその塩と硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法、
（１３）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基を除去するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムと（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、
（１４）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基のジケトン体を除去するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、
（１５）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有しないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、および、
（１６）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
参考例２（大腸菌でのメチオニン残基を有するｈＧＨ（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）の発現）
参考例１で得た形質転換細胞を、５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５（消泡剤：三洋化成工業製）および５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、３．０％ハイケースアミノ、１．０％酵母エキス）を仕込んだ５００リットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約１２００クレット単位になった時点で１７．８５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２４リットルの３０％ブドウ糖を添加しながら培養を続け、５時間後に培養液を遠心分離して、約１２．３ｋｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５４６として平成９年１２月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８８として平成１１年９月２４日に国際寄託に移管された。また、上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号ＩＦＯ  １６１２４として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に平成９年１０月１６日に寄託されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
実施例４（ｈＧＨの特徴決定）
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例３で得られたｈＧＨに１００ｍＭＤＴＴを含むサンプルバッファ［Laemmli,Nature,227,680(1970)］を等量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクマシー・ブリリアント・ブルー(Coomassie Brilliant Blue)で染色した結果、約２２ＫＤａに単一のバンドが認められたことから、精製ｈＧＨは単一であることが確認された（図１）。
（ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１）。
【表１】
2000178297.tif 000001
（ｃ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのアミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表２）。
【表２】
2000178297.tif 000002
（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と一致した（表３）。
【表３】
2000178297.tif 000003
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
実施例８（Ｎ末端Ｍｅｔの除去)
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得た。この溶出液を１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素溶液、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液４９．５ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３７℃でゆっくり攪拌しながら２４時間反応させた。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１５０ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭ  ＭＥＳ［2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．７ｍｇのｈＧＨを得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
実施例９（Ｎ末端Ｍｅｔの除去)
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得た。この溶出液を２Ｍぎ酸、１０Ｍぎ酸ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液１０ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３０℃でゆっくり攪拌しながら３日間反応させた。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１００ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭ  ＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．０ｍｇのｈＧＨを得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
実施例１５
（メチオニン残基を有するヒトＢＴＣ（ヒトＭｅｔ−ＢＴＣ）の製造）
特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の実施例４〜６、８および１３に記載の方法に準じて、下記の方法でヒトＭｅｔ−ＢＴＣを製造した。
（大腸菌のヒトＢＴＣｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
ヒト・プロＢＴＣ（１−１４７アミノ酸残基）をコードする０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の実施例５に記載のプラスミドｐＴＢ１５１５から単離した。ＡＴＧ翻訳開始コドン（５’−ＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧ−３’；５’−ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ−３’）を有する合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲＩ部位に連結した後、生成した０．６Ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、Ｔ７プロモーター（Ｇｅｎｅ、５６巻、１２５頁（１９８７年））を含有するプラスミドｐＥＴ−３ｃ中へ挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構築した。
ヒトＢＴＣの８０アミノ酸残基（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１０−１〜図１０−２の１（Ａｓｐ）から８０（Ｔｙｒ）まで）をコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてプラスミドｐＴＢ１５０５、プライマーとして２個のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡ−３’；５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ−３’）を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２．０％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とする０．２５ＫｂＤＮＡ断片を単離した。この０．２５ＫｂＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモーターの下流にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しプラスミドｐＴＢ１５１６を得た（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１３参照）。
（大腸菌でのヒトＭｅｔ−ＢＴＣの発現）
大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、プラスミドｐＬｙｓＳをこの大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この菌体に上記参考例で得られたプラスミドｐＴＢ１５１６を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６を得た。
この形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、１００ｍｇ／リットル分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、７時間後に培養を終了した。この培養終了液を遠心分離して、約３４０ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
この形質転換大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６として平成４年４月２１日に通商産業省工業技術院生命工学工業研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ １５２８２として平成４年４月１６日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
上述の方法により取得したＮ末端にメチオニン残基を有するヒトベータセルリン（Ｍｅｔ−ＢＴＣ）１０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．２５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．２５ｇ、ピリジン ０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＢＴＣ画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＢＴＣ画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分をｐＨ６．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＢＴＣ画分をプールした。さらに、ＢＴＣ画分を０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml/分の流速で溶出した。ＢＴＣのフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣ約２．６ｍｇを得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
実施例１６（ＢＴＣの特徴決定）
ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例１５で得られたＢＴＣをSample buffer［Laemmli, ネイチャー(Nature), 227, 680 (1970)］に懸濁し100℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった（図２）。
ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたＢＴＣのｃＤＮＡの塩基配列から推定したＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表６）。
【表６】
2000178297.tif 000004
ｃ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＢＴＣのcＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表７）。
【表７】
2000178297.tif 000005
ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＢＴＣはcＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表８）。
【表８】
2000178297.tif 000006
ｅ)ＢＴＣの生物活性
精製品はモレキュラー・セル・バイオロジー、８、５８８（１９８８）に記載の方法により、BALB/C3T3 A31-714 クローン 4（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２、４６３（１９７３））を用いた活性測定を行い、標準品と同等の活性を有することを確認した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
実施例１７
特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）の参考例５の方法により取得したＮ末端にメチオニン残基を有するヒトインターロイキン−２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）５０ｍｇを４Ｍ尿素溶液４０ｍｌに溶解した後、１００ｍＭ硫酸銅２．５ｍｌ、グリオキシル酸  ２．５ｇ、ピリジン  ５．０ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＩＬ−２画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＩＬ−２画分をプールした。プールしたＩＬ−２画分を、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、３０〜８０％Ｂ（Ｂ＝２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、１７．３ｍｇのＩＬ−２画分を得た。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
実施例２３
特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）の参考例３記載の方法により、Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）を製造した。
Ｎ末端にメチオニンの付加したヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）５０ｍｇを３Ｍ尿素溶液８ｍｌに溶解し、０．２Ｍ硫酸銅  ０．４ｍｌ、グリオキシル酸  ０．５ｇ、ピリジン  １ｍｌの混合液を加え１０ｍにした後、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を４ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＮＴ−３画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないヒトニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）画分をプールした。プールしたＮＴ−３画分をｐＨ５．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２ＭＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２Ｍ  ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＮＴ−３画分をプールした。さらに、ＮＴ−３画分を０．１％ＴＦＡで平衡化した  Ｃ４Ｐ−５０（21.5ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、５ｍｌ/分の流速で溶出した。ＮＴ−３のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＮＴ−３の凍結乾燥粉末約５ｍｇを得た。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
実施例２４（ＮＴ−３の特徴決定）
ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの塩基配列から推定したＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１２）。
【表１２】
2000178297.tif 000007
b）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＮＴ−３のｃＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１３）。
【表１３】
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ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果ｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１４）。
【表１４】
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ｄ）ＮＴ−３の生物活性
実施例２３で得られたＮＴ−３についてＤＲＧ（ニワトリ有精卵をふ卵器で３７．５℃、８−１０日間揺卵して、胚発生を行った胎児から摘出した後神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ））を用いた生物活性測定を行い、ＣＨＯ細胞より得られたＮＴ−３と同等の活性を有することを確認した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
実施例２８
実施例２７で得られた形質転換細胞を、５．０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを用いて、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるように添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離し、約６６０ｇの湿菌体を取得し、−８０℃で凍結保存した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
実施例２９  ヒトアペリン−３６の取得
実施例２８で得た菌体５５０ｇに１０ｍＭ  ＥＤＴＡ＋１ｍＭ(ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐＨ６．０）溶液１５００ｍｌを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ＭＯＤＥＬ４５０）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）を行った。上澄液はプールし、沈殿は再び同様の操作を行った。プールした上澄液はｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyopearl 650Mカラム(30mmID×500mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の段階勾配で溶出を行い、５３０ｍｌのヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。
この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えながら濃縮を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）３５ｍｇを加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、反応液を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平衡化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開し、Ｓ−シアノ化されたヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、さらに、０．０６Ｎ濃度となるように１Ｎ苛性ソーダを加え、０℃で１５分間反応した。反応終了後、酢酸でｐＨ６．０に調整し、ヒトアペリン−３６を得た。この反応液を３Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ(21.5mmID×150mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０〜４０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ  リン酸緩衝液＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋３Ｍ尿素、ｐＨ６．５）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−３６を画分を得た。このヒトアペリン−３６画分を、さらに０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）で平衡化したＣ４Ｐ−５０(21.5mmID×300mmL、昭和電工)に通液し、吸着、洗浄した後、１５〜３０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％TFA）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−３６凍結乾燥粉末を得た。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトアペリン−３６のＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表１５）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
実施例３０（生物活性測定）
実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６を用いて、特願平10−271645号（特開2000-159798）の実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と同等の活性を有することを確認した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
実施例３1(Ｎ末端のメチオニン残基の除去)
実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６  ４ｍｇを３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸銅  ０．０５ｍｌ、グリオキシル酸  ０．０４６ｇ、ピリジン  ０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×250mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するヒトアペリン−３６画分をプールした。続いてこの画分に等量の ２Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ酢酸、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加し、３０℃で３日間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を４ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないヒトアペリン−３６画分をプールした。プールしたヒトアペリン−３６画分をｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ  ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×75mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ  ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、０．８ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした。さらに、ヒトアペリン−３６を０．１％ＴＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電工（株））に吸着した後、１５〜３０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml／分の流速で溶出した。ヒトアペリン−３６のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−３６を取得した。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、ｈＡ１０ＬのＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表１８）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実施例３２（生物活性測定）
実施例３１で取得したヒトアペリン−３６を用いて、特願平10−271645号（特開2000-159798）の実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と同等の活性を有することを確認した。