(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホペプチドがアミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕを含み、ホスホペプチドで安定化された塩基性の無定形リン酸カルシウムを含有する安定なリン酸カルシウム複合体であって、
ここで、該安定なリン酸カルシウム複合体が、
（ｉ）ホスホペプチドの溶液を得る工程；および、
（ｉｉ）７を超えるｐＨにおいて、工程（ｉ）の溶液を、カルシウムおよび無機リン酸を含む溶液と混合する工程、
によって生産される、複合体。
【請求項２】
前記ホスホペプチドは、
【化１】
0004541455.tif 000008
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項に記載の複合体。
【請求項３】
前記ホスホペプチドは、アミノ酸配列
【化２】
0004541455.tif 000009
を含む請求の範囲第１項に記載の複合体。
【請求項４】
式［（ＰＰ）（ＣＰ）8］ｎで示され、ｎが１以上である請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の複合体であって、ここで、該ＰＰは前記ホスホペプチドであり、該ＣＰは前記リン酸カルシウムである、複合体。
【請求項５】
式［（ＰＰ）（ＣＰ）8］6で示される請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載の複合体であって、ここで、該ＰＰは前記ホスホペプチドであり、該ＣＰは前記リン酸カルシウムである、複合体。
【請求項６】
以下：
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で生じた該混合物をろ過する工程、および
（ｉｖ）乾燥して前記複合体を得る工程、
を含む請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の安定なアルカリリン酸カルシウム複合体を製造する方法。
【請求項７】
請求の範囲第６項の方法によって製造される請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記複合体がさらにフッ化物を含む、請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
活性成分として請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の複合体を含み、カルシウム、フッ化物、およびリン酸イオンを含むイオンを、目的部位に共に局在させるように適合された運搬媒介物。
【請求項１０】
練り歯磨き、歯磨き粉、液体歯磨剤、マウスウォッシュ、トローチ、チューインガム、デンタルペースト、歯肉マッサージクリーム、含嗽タブレット、および、乳製品の任意の一つである請求の範囲第９項に記載の運搬媒介物。
【請求項１１】
製剤用担体と請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の複合体を含む製剤学的組成物。
【請求項１２】
請求の範囲第１１項に記載の組成物、または抗齲食原性用途に適合した請求の範囲第９項または第１０項に記載の運搬媒介物を含む抗齲食原性組成物。
【請求項１３】
請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の複合体を含む補助食。
【請求項１４】
前記複合体が前記補助食中に０．１〜１００重量％で含まれる、請求の範囲第１３項に記載の補助食。
【請求項１５】
前記複合体が２重量％で前記補助食中に含まれる請求の範囲第１３項に記載の補助食。
【請求項１６】
齲歯を治療または予防するための、請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の複合体を含む組成物であって、このような治療が必要な被験者の歯またはガムへの投与に適切な、組成物。
【請求項１７】
局所的投与に適切な、範囲第１６項に記載の組成物。
【請求項１８】
骨を含む身体からのカルシウム損失、カルシウム欠乏症、または、カルシウム吸収不良に関連する１以上の症状を治療するための、請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項１９】
前記症状は骨粗鬆症または骨軟化症を含む請求の範囲第１８項に記載の組成物。
【請求項２０】
ホスホペプチドがアミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕを含み、ホスホペプチドで安定化された塩基性の無定形リン酸カルシウムを含有する安定なリン酸カルシウム複合体であって、
ここで、該安定なリン酸カルシウム複合体が、
（ｉ）ホスホペプチドの溶液を得る工程；および、
（ｉｉ）ｐＨ９において、工程（ｉ）の溶液を、カルシウムおよび無機リン酸を含む溶液と混合する工程、
によって生産される、複合体。
【発明の詳細な説明】
本発明は、無定形リン酸カルシウムがホスホペプチドで安定化された新規複合体に関する。この複合体は抗齲食原性を有し、カルシウムの生物学的利用性を増加し、カルシウム欠乏に関連する疾患を予防し治癒する補助食として利用できる。本発明の複合体の製造方法、齲歯、カルシウム代謝、骨疾患の治療方法および予防方法も提供される。
背景
齲歯
齲歯は、歯垢の歯原性バクテリアが食物糖を発酵して発生する有機酸が歯の硬組織を脱イオンすることによって開始される。
開発途上国の多くでは、フッ素化合物の利用によって齲歯の罹患率が減少したが、該疾患は依然大きな公衆衛生の問題である。１９９１年、オーストラリアの齲歯治療の概算経済負担額は、４７１，０００，０００ドルであり、慢性心臓疾患、高血圧または卒中を含む他の食物関連疾患よりも高い。
工業的食物製品の利用が増加している発展途上国では、齲歯の罹患率も増加している。最近の研究は、齲歯進行のリスクに関係する多くの人口統計的な変化を強調している。民族性や社会経済的地位の低さがハイリスクと関連する。疾患の全体にわたる厳しさと罹患率はこの集団で低下したが、このハイリスクな個々人の水準は変わらない。それゆえ齲歯は、特に民族性や社会経済的地位が低い集団では未だに公衆衛生の大きな問題である。これは、齲歯の発生率をより低下するためにフッ化物の効果を補足する非毒性の抗齲食原性薬剤の必要性を強調する。齲歯の罹病率を低下するために要求されるフッ化物の投与量を減ずる薬剤は、フッ化物に関する社会不安や現在の使用量でさえフッ素沈着を生ずる事実を考慮して特に望まれる。
抗齲食原性活性を示すと認められる食物群は、乳製品である（牛乳、濃縮ミルク、粉乳、チーズ）。米国特許第５，１３０，１２３号は、抗齲食原性活性を有する化合物カゼインを開示する。しかしながら、抗齲食原性薬剤としてのカゼインは、官能的性質が対立することおよび活性を得るためのレベルが極めて高いために使用されていない。
予備試験はトリプシンカゼインホスホペプチドが抗齲食原性活性に寄与するとし、これが米国特許第５，０１５，６２８号の主題となった。特に、ペプチド、Ｂｏｓ  αs1−カゼインＸ−５Ｐ（ｆ５９−７９）[１]、Ｂｏｓ  β−カゼインＸ−４Ｐ（ｆ１−２５）[２]、Ｂｏｓ  αs2−カゼインＸ−４Ｐ（ｆ４６−７０）[３]、Ｂｏｓ  αs2−カゼインＸ−４Ｐ（ｆ１−２１）[４]が、米国特許第５，０１５，６２８号に次のように開示されている。
0004541455.tif 000002
前記ＣａＨＰＯ4と水酸化アパタイトとの組合せで用いる前記ホスホペプチドの先行試験が、抗齲食原性特性を有する新規ペプチドをもたらした。しかしながら、後の研究は、開示されたホスホペプチドの範囲内でＳｅｒ（Ｐ）クラスタ配列モチーフが、無定形リン酸カルシウムのウエイトを安定化する予期できぬ能力を有することを確かめた。前記ホスホペプチドと特に無定形リン酸カルシウムを安定化するＳｅｒ（Ｐ）モチーフの能力は全く予期されず、該出願人が知るいずれの公報に記載も開示もされていない。我々は、カゼインホスホペプチドによって安定化されたｘ≧１のリン酸カルシウムＣａ3（ＰＯ4）1.87（ＨＰＯ4）0.2ｘＨ2Ｏの無定形体が最も溶解性に優れ、非晶性リン酸カルシウムの塩基性形態であり、齲歯を防ぎカルシウムの生理的利用性を増加するリン酸カルシウムの優れた形態であることを見出した。無定形リン酸カルシウム（例えば、ＡＣＰ）は、ホスホペプチドの存在下に、ｐＨ７を越えた状態（好ましくは９．０）で、カルシウムイオン（例えば、ＣａＣｌ2）とリン酸イオン（例えば、ＮａＨＰＯ4）とを注意深く滴下して形成されなければならない。ＡＣＰが形成されると、ホスホペプチドは発生期の核に結合しホスホペプチド−ＡＣＰ複合体としてＡＣＰを安定化する。ホスホペプチドが無ければＡＣＰは溶液中で凝縮し、最も安定なリン酸カルシウム相と結晶水酸化アパタイト（ＨＡ）に数分以内に形を変える。ＨＡは不溶性で抗齲食原性活性を制限し、カルシウムの生物的利用性が低い。水酸化アパタイトより溶解性に優れるが、リン酸カルシウムＣａＨＰＯ4の酸性相はホスホペプチドとの結合が弱く歯の表面に十分に存在できず、それゆえ抗齲食原性活性が制限される。無定形リン酸カルシウムを安定化する前述したホスホペプチドと、特にＳｅｒ（Ｐ）モチーフの予期せぬ能力は、米国特許第５，０１５，６２８号に開示も示唆もされておらず、カルシウム治療および供給に優れる新規かつ明白な利点を有する安定化された無定形リン酸カルシウム複合体を生産する方法を初めて提供する。米国特許第５，０１５，６２８号は、前記ホスホペプチドによって安定化され、優れた抗齲食原性を付与するため歯の表面に局在しうることを我々が見出したｘ≧１のユニークな無定形カルシウムフルオライドホオスフェート相Ｃａ8（ＰＯ4）5ＦｘＨ2Ｏを開示しない。無定形リン酸カルシウム体を安定化する予期されぬ能力は本願発明の基礎をなす。
発明の要旨
１の見地において、本発明は、無定形リン酸カルシウムまたはホスホペプチドによって安定化されたその誘導体を含有する、該安定なリン酸カルシウム複合体を提供し、該ホスホペプチドは、Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−配列を含む。
一つの態様として、該複合体は、ホスホペプチド安定化無定形カルシウムフルオライドホスフェートを含む。
他の態様として、該複合体は、アルカリ性のｐＨで安定な可溶性複合体を提供するホスホペプチド安定化無定形リン酸カルシウムを含む。
該複合体がホスホペプチド安定化無定形カルシウムフルオライドホスフェートの形態をなす場合、カルシウムフルオライドホスフェートは、ｘ≧１である式［Ｃａ8（ＰＯ4）5ＦｘＨ2Ｏ）］である。
該複合体は、該複合体中に任意の成分として、更にＨＰＯ4を含んでもよい。このＨＰＯ4は、ＡＣＰクラスターの被覆材として作用する。該複合体が、安定化無定形リン酸カルシウムを含む安定化可溶性アルカリカルシウムホスフェート複合体の他の形態をとる場合、無定形リン酸カルシウムは、好ましくはｘ≧１である式［Ｃａ3（ＰＯ4）2ｘＨ2Ｏ］である。
ホスホペプチド（ＰＰ）はいずれに由来するものでもよく、コア配列Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−を含有するのであれば、ホスフィチン等の他の富リン酸タンパク質やカゼインのトリプシン消化、化学的または遺伝子組換えによって得られたものであってもよい。このコア配列の側面部の配列はいずれでもよい。しかしながら、αs1（５９−７９）［１］、β（１−２５）［２］、αs2（４６−７０）［３］またはαs2（１−２１）［４］に含まれるフランキング配列（flanking sequence）であることが好ましい。このフランキング配列は、１以上の残基の置換、削除、追加によって任意に改変されたものであってもよい。このフランキング部の配列やアミノ酸組成は、ペプチドの構造が維持される限りこれに制限されるものではなく、カルシウムと相互作用するホスホリルやカルボキシル基の全ては、選択フランキング部がモチーフの構造的な機能に寄与するように維持される。
この形成された複合体は、好ましくはｎが１以上、例えば６である式［（ＰＰ）（ＣＰ）8］nである。この複合体は、コロイド状の複合体であってもよい。
ホスホペプチドはＡＣＰクラスタに結合し、核形成や析出反応を開始する大きさへＡＣＰが成長することが害される準安定な溶液を製造する。このようにして、カルシウムやフッ化物イオンなどの他のイオンが例えば歯の表面におかれ、脱イオン症を防ぎ、齲歯の形成を防止する。
次いで、第２の見地によれば、本発明は、前記した安定なリン酸カルシウム複合体を提供し、複合体は、カルシウムに限定されずフッ化物イオンやリン酸イオンなどを共に目的部位に存在させる媒介物として作用する。好ましい態様では、この複合体は、優れた抗齲歯有効性を示す緩速放出無定形体である。
本発明の特に好ましい態様では、該安定なカルシウム複合体が、齲歯の治療や予防を補助する練り歯磨き、マウスウォッシュまたは口腔用製剤などの歯磨き剤に配合される。このカルシウム複合体は、組成物中０．０５〜５０重量％、より好ましくは１．０〜５０重量％である。口腔用組成物では、組成物中のＣＰＰ−ＡＣＰおよび／またはＣＰＰ−ＡＣＦＰの配合量が、０．０５〜５０重量％、より好ましくは１．０〜５０重量％である。前記薬剤を含有する本発明の口腔組成物は、練り歯磨き、歯磨き粉、液体歯磨き剤、マウスウォッシュ、トローチ、チューインガム、歯科用軟骨、歯肉マッサージクリーム、嗽剤、乳製品および他の食料品など歯磨き剤のように口腔に用いる種々の形態に使用しおよび調製することができる。本発明の口腔組成物は、更に特に口腔組成物を成型するための公知の配合物を含んでもよい。
本発明の非常に好ましい形態として、口腔組成物はマウスウォッシュやマウスリンス等の実質的に相応しい液体である。このような製剤で賦形剤は、一般に下記する湿潤剤を必要に応じて含む水−アルコール混合物である。一般に、アルコールに対する水の比は、およそ１：１から２０：１の範囲である。この製剤の形態で、水−アルコール混合液の全量は、７０〜９９．９重量％の範囲である。アルコールは、通常エタノールまたはイソプロパノールであり、エタノールが好ましい。
本発明の他の製剤やこのような液剤のｐＨは、通常５〜９の範囲であり、一般的には、７．０〜９．０である。このｐＨは、酸（例えば、クエン酸や安息香酸）や塩基（例えば、水酸化ナトリウム）または緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、安息香酸塩、炭酸塩または重炭酸塩、リン水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等）を用いて調整できる。
本発明の他の好ましい態様として、本発明の口腔組成物は、歯磨き粉、歯科用タブレット、練り歯磨き（歯科用クリーム）またはゲル歯磨き剤などの実質的に相応しい固体状またはペイスト状である。このような固体状またはペイスト状の口腔用製剤は、一般に歯科用研磨剤を含む。研磨剤としては、水不溶性のメタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム２水和物、無水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カルシウム、オルソリン酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム、酸化アルミニウム三水和物、焼成アルミナ、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、シリカ、ベントナイト、およびこれらの混合物が例示できる。他の研磨剤としては、メラミン−ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ウレア−ホルムアルデヒド、架橋ポリエポキサイド等の粒状の熱硬化性樹脂やポリエチレンがある。好ましい研磨剤は、粒子サイズが約５ミクロン以下、平均粒子サイズが約１．１ミクロン以下、表面積が５０，０００ｃｍ2／ｇｍ以下の結晶性シリカ、シリカゲルまたはコロイド状シリカまたは無定形アルミノケイ酸アルカリ金属塩複合体である。
視覚的に透明なゲルを得るには、シロイド７２（Syloid72）やシロイド７４（Syloid74）などの商標ＳＹＬＯＩＤで販売されるもの、サントセル１００（Santocel100）等の商標ＳＡＮＴＯＣＥＬで販売されるもの、アルミノケイ酸アルカリ金属塩などのコロイダルシリカの研磨剤を好ましく使用できる。これらは、一般に歯磨き剤に使用する液状ゲル化剤−溶液（水および／または湿潤剤）系の屈折率に近い屈折率を有するからである。
多くのいわゆる水不溶性研磨剤は、陰イオン性であることが相応しく、少量の可溶性物質を含有していてもよい。このように、不溶性メタリン酸ナトリウムは、ソープスディクショナリ  オブ  アプライドケミストリー（第４版、９巻、ページ５１０〜５１１）に示されるような適当な方法で形成される。マドレル塩（Madrell’s salt）やクロール塩（Kurrol’s salt）として知られる不溶性メタリン酸ナトリウムの形成は、更に好ましい。この不溶性メタリン酸ナトリウムは、水にわずかに溶解するに過ぎず、それゆえ一般に不溶性メタリン酸塩（IMP）である。この中には、微量の可溶性リン酸塩が不純物として含まれ、通常４重量％以下の少量である。可溶性リン酸塩の量は、不溶性メタリン酸塩には可溶性トリメタリン酸ナトリウムが含まれるが、所望により水洗で低減させまたは除去することができる。不溶性メタリン酸アルカリ金属は、材料の１％以下が３７クロンを越える粒子サイズの粉体で用いられる。
研磨剤は、通常、１０〜９９重量％で固体状またはペースト状組成物に使用される。好ましくは、練り歯磨き中に１０〜７５重量％、歯磨き粉中に約７０〜９９重量％で含まれる。練り歯磨きでは、研磨剤は、本質的にケイ質であり、約１０〜３０重量％の量で含まれる。他の研磨剤は、一般に約３０〜７５重量％である。
練り歯磨きにおいて、液状の賦形剤は、製剤中に約１０〜８０重量％の範囲で水や湿潤剤を含む。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールおよびポリプロピレングリコールが好ましい湿潤剤／担体として例示できる。水、グリセリンおよびソルビトールの液状混合物も好ましい。屈折率が重要である透明ゲルでは、水約２．５〜３０重量％、グリセリン約０〜７０重量％、ソルビトール約２０〜８０重量％であることが好ましい。
練り歯磨き、クリームおよびゲルでは、一般に約０．１〜１０重量％、より好ましくは０．５〜５重量％の割合で合成または天然のゲル化剤または増粘剤を含む。好ましい増粘剤は、ラポルテインダストリーリミテッドで製造されラポナイト（例えばＣＰ、ＳＰ２００２、Ｄ）として市販される合成コロイダルマグネシウムアルカリ金属シリケート複合体クレイや合成ヘクトライトである。ラポライトＤは、約５８．００重量％ＳｉＯ2、２５．４０重量％、ＭｇＯ2、３．０５重量％Ｎａ2Ｏ、０．９８重量％Ｌｉ2Ｏ、および水と微量の金属である。その比重は２．５３で、湿度８％での見かけのバルク密度は１．０ｇ／ｍｌである。
他の適当な増粘剤は、アイルランドコケ、イオタカラギナン、ガムトラガント、スターチ、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、ナトロソルとして市販）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および微細シロイド（例えば２４４）等のコロイダルシリカがある。可溶化剤は、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ヘキシレングリコールなどの保湿ポリオール、メチルセロソルブやエチルセルソルブなどのセルソルブ、植物油、オリーブ油、ヒマシ油やワセリン等の直鎖で少なくとも炭素約１２を含むワックス、アミルアセテート、エチルアセテート、ベンジルベンゾエートなどのエステルである。
通例では、経口用製剤は、適当なラベルがされたパッケージで販売または流通される。従って、マウスリンスのビンには、マウスリンスまたはマウスウォッシュ等と実質的に記載され、使用方法を指示したラベルを張る。そして、練り歯磨き、クリーム、ゲルは、一般には、練り歯磨き、ゲルまたは歯科用クリームなどと実質的に記載されたラベルを有するアルミニウム、ラインド鉛またはプラスチックの押し出しチューブに収められ、または内容物を計り出す加圧ディスペンサ、他の搾り出し、ポンプに収められる。
有機界面活性剤は、本発明の組成物に使用され予防作用を増強し、口腔での活性剤の完全かつ徹底的な分散を助け、より化粧品的な該組成物とする。この有機界面活性剤は、好ましくは本質的に陰イオン性、非イオン性、両性イオン性であり、該活性剤と相互作用しないことが好ましい。界面活性剤として、組成物に界面活性またはフォーミング性を付与する界面活性物質を用いることが好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、硬化ココナツ油脂肪酸のモノグリセリンモノ硫酸のナトリウム塩などの高級脂肪酸モノグリセリンエステルモノ硫酸の水溶性塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの高級アルキル硫酸、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホアセテート、１，２−ジヒドロキシプロパンスルホネートなどのアルキルアリル硫酸塩、脂肪酸、アルキルラジカル、アシルラジカルに１２〜１６の炭素を有する低級脂肪酸アミノカルボン酸化合物の実質的な飽和高級脂肪酸アシルアミド等がある。該アミドは、実質的に塩や同様の高級脂肪酸を含まないＮ−ラウロイルサルコシン、およびＮ−ラウロイル、Ｎ−ミリストイル、Ｎ−パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウムまたはエタノールアミン塩が例示される。本発明の口腔用組成物でのこれらサルコシナイト化合物の利用は、これらが酸性溶液における歯のエナメル質の溶解性を低減することに加えて、炭水化物分解によって口腔で酸を形成するのを抑制する効果を延長するため、特に好ましい。使用に適する非イオン性水可溶性界面活性剤は、疎水性長鎖（たとえば、約１２〜２０炭素原子の脂肪酸鎖）を有する種々の反応性水素含有化合物とエチレンオキサイドとの反応濃縮物が例示でき、該濃縮物（エトキサマー）は、ポリ（エチレンオキサイド）と脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸アミド、多価アルコール（例えば、ソルビタンモノステアレート）やポリプロピレンオキサイド（例えば、プルロニック材）等の親水性ポリオキシエチレン部を含む。
この界面活性剤は、通常、約０．１〜５重量％含まれる。該界面活性剤は本発明の活性剤の溶解性を促進し、それゆえ必要な可溶性湿潤剤の配合量を減ずることができる。
本発明の口腔用調製物に配合できる他の材料は、白化剤、防腐剤、シリコン、クロロフィル化合物および／または尿素、リン酸アンモニウ、ムおよびその混合物などのアンモニア化合物である。これらの補助材は、使用する場合は、要求される特性に反する影響を実質的に生じない量で該製剤に配合される。
適当な着香料や甘味料も使用できる。好ましい着香料としては、着香油があり、例えばスペアミント、ペッパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、クローバー、セージ、ユーカリ、マヨラマ、シナモン、レモン、オレンジのオイルやサリチル酸メチルがある。好ましい甘味料としては、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン（perillartine）、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニン、メチルエステル）、サッカリンなどがある。好ましくは、着香料や甘味料はそれぞれまたは共に製剤の約０．１〜５重量％以上である。
本発明の好ましい使用として、本発明の組成物を含有するマウスウォッシュや歯磨き剤などの本発明の口腔用組成物は、ｐＨ４．５〜９、一般的には約７．０〜９で、少なくとも２〜８週間またはそれ以上生涯、毎日、２日毎、３日毎、または好ましくは１日１〜３回というように歯やガムに規則的に適用されることが好ましい。
本発明の組成物は、トローチ剤、チューインガム、他の製品に、例えば、暖かいガムベースに攪拌し、または、要求される通常の可塑剤、軟化剤、糖、またはグルコース、ソルビトールなどの甘味料と共に、ポンティアナクゴム、ラバーラテックス、ビニライトレジン等で例示されるガムベースの外表面をコーティングすることによって配合できる。
他の態様として本発明の複合体は、０．１〜１００重量％、より好ましくは１〜５０重量％、最も好ましくは１〜１０重量％、特には２重量％を含有する補助食を形成するために使用される。この複合体は食料生産物にも使用される。
従って、第３の見地において、本発明は製剤学的に利用可能な担体と共に述べられたカルシウム複合体を含有する製剤学的組成物等の組成物を提供する。このような組成物は歯科用、抗齲食原性組成物、治療用組成物および補助食からなる群から選ばれる。歯科用組成物または、治療用組成物は、ゲル、溶液、固体、粉体、クリーム、トローチを形成しうる。治療用組成物は、タブレットまたはカプセルにも使用できる。
第４の見地において、複合体または本発明の組成物をこのような処置が必要な被検者の歯やガムに投与する段階を含む齲歯または虫歯の治療または予防方法を提供する。該複合体の局所投与が好ましい。
第５の見地において、本発明は、身体、特に骨からのカルシウム損失、カルシウム欠乏症、カルシウム吸収不良などに関連する１以上の疾患の治療方法に関する。このような疾患には、これに制限されるものではないが、骨粗しょう症や骨軟化症がある。
第６の見地において、本発明は前記したようにリン酸カルシウムの安定した複合体を生産する方法を提供し、次の段階を含む。
（ｉ）およそｐＨ９．０のホスホペプチド溶液を得、
（ｉｉ）ｐＨ約９．０でカルシウム、無機リン酸塩および任意にフッ化物を含有する溶液と（ｉ）とを混合し、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得た混合物をろ過し、および
（ｉｖ）該複合体を得るために乾燥する。
本発明の複合体は、骨折修復、接合点置換（joint replacement）、骨移植片または頭骸顔面外科の被検者等の、骨成長の促進が必要な被検者へのカルシウム補給として有用である。
これらの複合体は、食事不耐症、アレルギー、宗教上のまたは文化的要素などの理由により必要な食事性カルシウムを得るに足る量の食物を消費することを望まずまたは消費することができない被検者への補助食としても有用である。
本明細書は、特にヒトへの応用に関するが本発明は獣医学の目的にも使用できることは明白である。このようにすべての見地において、ウシ、ヒツジ、ウマおよび家禽、ネコ、イヌなどの飼育動物および動物園の動物、家畜に応用できる。
発明の詳細な説明
本発明を、制限することのない下記実施例を単に参照してより詳細に説明する。
実施例１ ＣＰＰ−ＡＣＰ及びＣＰＰ−ＡＣＦＰの調製
Ａ．  ＣＰＰ−ＡＣＰの調製
１０％（ｗ／ｖ）カゼイン（ムライ  ゴウルバーン，ビクトリア州，オーストラリア国(Murray Goulburn, Victoria, Australia)）またはカゼイン塩溶液を、ｐＨ８．０で調製した後、ｐＨをＮａＯＨの添加により８．０±０．１に制御しながら５０℃で２時間、カゼインの０．２％（ｗ／ｗ）濃度でトリプシンで消化した。消化後、溶液をＨＣｌの添加によりｐＨ４．６に調節し、沈殿を遠心または精密濾過によって除去した。しかしながら、溶液を、酸性化せずにｐＨ８．０で精密濾過することによって透明にしてもよい。次に、上清または精密濾液をＮａＯＨでｐＨ９．０に調節した後、ｐＨ９．０のＣａＣｌ2（１．６Ｍ）及びＮａ2ＨＰＯ4（１Ｍ）を、ＮａＯＨの添加によりｐＨを９．０±０．１に一定に維持しながら、常時攪拌しながらゆっくり添加した（≦１％ｖｏｌ／分）。ＣａＣｌ2及びリン酸ナトリウムを、それぞれ、１００ｍＭ及び６０ｍＭの最終濃度になるように添加した。カルシウム及びリン酸塩溶液を添加した後、溶液を０．１または０．２μｍのマイクロフィルター（セラミックまたは有機）で精密濾過し、溶液を５倍に濃縮した。次に、保持物質を１〜５容の蒸留水でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション後の保持物質を噴霧乾燥することによって、５０％ＣＰＰ及び４０％ＡＣＰ及び残りは水である白色粉末を製造した。ＣＰＰ−ＡＣＰ複合体のＣＰＰを逆相ＨＰＬＣ、配列分析及び質量分析で分析することによって、無定形リン酸カルシウムを安定化できかつ精密濾過及びダイアフィルトレーション中に保持されるペプチドは、Ｂｏｓ  αS1−カゼイン  Ｘ−５Ｐ（ｆ５９−７９）［１］、Ｂｏｓ  β−カゼイン  Ｘ−４Ｐ（ｆ１−２５）［２］、Ｂｏｓ  αS2−カゼイン  Ｘ−４Ｐ（ｆ４６−７０）［３］及びＢｏｓαS2−カゼイン  Ｘ−４Ｐ（ｆ１−２１）［４］、ならびにこれらのペプチドの切断され熱修飾された形態であることが明らかになった。
Ｂ．  ＣＰＰ−ＡＣＦＰの調製
１０％（ｗ／ｖ）カゼインまたはカゼイン塩溶液を、ｐＨ８．０±０．１で調製した後、５０℃で２時間、カゼインの０．２％（ｗ／ｗ）濃度でトリプシンで消化した。消化後、溶液をＨＣｌの添加によりｐＨ４．６に調節し、沈殿を遠心または精密濾過によって除去した。しかしながら、溶液を、酸性化せずにｐＨ８．０で精密濾過することによって透明にしてもよい。次に、上清または精密濾液をＮａＯＨでｐＨ９．０に調節した後、ｐＨ９．０のＣａＣｌ2（１．６Ｍ）及びＮａ2ＨＰＯ4（１Ｍ）を、ＮａＯＨの添加によりｐＨを９．０±０．１に一定に維持しながら、常時攪拌しながらゆっくり添加した（≦１％ｖｏｌ／分）。ＣａＣｌ2、リン酸ナトリウム及びＮａＦを、それぞれ、１００ｍＭ、６０ｍＭ及び１２ｍＭの最終濃度になるように添加した。カルシウム、リン酸塩及びフッ化物溶液を添加した後、溶液を０．１または０．２μｍのマイクロフィルター（セラミックまたは有機）で精密濾過し、溶液を５倍に濃縮した。次に、保持物質を１〜５容の蒸留水でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション後の保持物質を噴霧乾燥することによって、５０％ＣＰＰ及び４０％ＡＣＦＰ及び残りは水である白色粉末を製造した。
続いて、粉末状のＣＰＰ−ＡＣＦＰを蒸留水中で再構築して、高濃度溶液を製造した。例えば、ｐＨ９．０の６４０ｍＭ  Ｃａ、４００ｍＭ  リン酸塩及び８０ｍＭ  Ｆ（１，５２０ｐｐｍ  Ｆ-）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＣＰＰ−ＡＣＦＰ溶液、さらにはｐＨ９．０の１．２８Ｍ  Ｃａ、８００ｍＭ  リン酸塩及び１６０ｍＭ  Ｆ（３，０４０ｐｐｍ  Ｆ-）を含む２０％（ｗ／ｖ）ＣＰＰ−ＡＣＦＰ溶液を調製した。この溶液及びゲルは、フッ化物単独に比べて有意に大きな抗齲食原性を示し、このため、練り歯磨き及びマウスウォッシュへのならびに現在のフッ化物含有歯磨き剤及び医家用製品(professionally-applied product)の効能を向上する医家用途(professional application)用の優れた添加剤である。
実施例２ ＣＣＰ−ＡＣＰの構造研究
Ａ．  ＣＣＰ−ＡＣＰの構造及び相互作用
Ｓｅｒ（Ｐ）クラスター、即ち、配列モチーフ  Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−を含むカゼインホスホペプチドは、溶液中のリン酸カルシウムを顕著に安定化できる。イオン強度は一定であるが、様々なｐＨ、カルシウム及びリン酸塩濃度での０．１％（ｗ／ｖ）αS1（５９−７９）［１］を含む溶液を用いて、ペプチドのリン酸カルシウムとの相互作用の特徴を調べた。ペプチドは、表１に示されるように、１分子当たり最大２４個のＣａ及び１６個のＰｉと結合することが分かった。
様々なリン酸カルシウム相［ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）；リン酸８カルシウム（ＯＣＰ）；リン酸３カルシウム（ＴＣＰ）；無定形リン酸カルシウム（ＡＣＰ）；及びリン酸２カルシウム２水和物（ＤＣＰＤ）］に関するイオン活性産物を、拡張デバイ-ヒュッケル式
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を用いることによりイオン活性係数を算出し、イオン対  ＣａＨＰＯ40、ＣａＨ2ＰＯ4+、ＣａＰＯ4-及びＣａＯＨ+、Ｈ3ＰＯ4及びＨ2Ｏの解離及びイオン強度を考慮するコンピュータープログラムを用いて各ｐＨで遊離カルシウム及びリン酸塩濃度から決定した。ｐＨに関係なくペプチドに結合したリン酸カルシウムと有意に層間したイオン活性産物は、ＡＣＰ［Ｃａ3（ＰＯ4）1.87（ＨＰＯ4）0.2ｘＨ2Ｏ］に相当するものだけであることから、これはαS1（５９−７９）によって安定化される相であることが示された。このペプチドαS1（５９−７９）は、核形成及び沈殿に必要な臨界サイズまでのＡＣＰの成長を妨げる準安定溶液を生成する形成ＡＣＰクラスターに結合する。αS1（５９−７９）がＡＣＰに結合することによって、ｎが１以上である式：［αS1（５９−７９）（ＡＣＰ）8］nの単位を有するコロイド複合体が形成する。ＡＣＰの存在下でグルタルアルデヒドで架橋されるαS1（５９−７９）がポリアクリルアミドゲル電気泳動で６量体として泳動されるので、主な形態はｎ＝６であると考えられる。興味深いことに、この合成オクタペプチド  αS1（６３−７０）ＡｃＧｌｕ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−ＧｌｕＮＨＭｅのみが１分子、即ち（ＡＣＰ）4当たり１２個のＣａ及び８個のＰｉに結合し、さらに、αS1（５９−７９）のＮ末端αS1（５９−６３）、Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕに相当する合成ペプチド及びＣ末端αS1（７１−７８）、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎに相当する合成ペプチドは、表１に示されるようにリン酸カルシウムに結合しなかった。これらの結果から、立体特異性が全ＡＣＰ結合には必須であることが示される。
Ｂ．  ＮＭＲ研究
溶液中のタンパク質の可塑性は、卵黄由来のホスビチン及び歯の象牙質由来のホスホホリン(phosophophoryn)などのＳｅｒ（Ｐ）クラスター配列（−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−）を含むタンパク質に関する分光法から現れる顕著な特性である。リン酸化は、オーダリングのより高いレベルを促進するというよりはむしろ二次及び三次構造を不安定にすると考えられる。しかしながら、可塑性のあるリン酸化配列は、リン酸カルシウムに結合するとより規則的な立体配置をとる。カゼインの旋光分散（ＯＲＤ）、円二色性（ＣＤ）、流体力学及び31Ｐ核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）測定すべては、αS1−カゼイン及びβ−カゼインが溶液中でむしろ開放構造を有しており、この際多くのアミノ酸が溶剤に接しかつ比較的可塑性であることを示すものである。31Ｐ−ＮＭＲ緩和測定法から、Ｓｅｒ（Ｐ）残基はβ−カゼインでは比較的可動であることが示される。
我々は、構造優先性を示すＣａ2+の存在下でαS1（５９−７９）［１］の２Ｄ  1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて中間の及び長い範囲の核オーバーハウザー促進（ｎＯｅ）を示した。２種の構造領域が同定された。７２番目のＶａｌ及び７６番目のＶａｌ残基は、β−ターン立体配置に関係する。Ｓｅｒ（Ｐ）クラスターモチーフ  −Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−の一部にわたって広がる、６１番目のＧｌｕ及び６７番目のＳｅｒ（Ｐ）残基は、ループタイプの構造に関係する。カルシウムの存在下でのβ−カゼイン（１−２５）に関する２Ｄ  ＮＭＲ研究は、Ｓｅｒ（Ｐ）18のＣαＨ及びＧｌｕ20のＮＨ間の−Ｓｅｒ（Ｐ）17−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ21−モチーフ領域における中範囲のｎＯｅを示した。さらなる中範囲のｎＯｅとしては、Ｓｅｒ22のＣαＨ及びＴｈｒ24のＮＨ間の一が挙げられる。αS2−カゼイン（１−２１）［４］の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルからの結果から、−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−周辺のものなどの様々な残基が混乱していることが示された。さらに、Ｓｅｒ（Ｐ）8のＮＨ及びＧｌｕ10のＮＨ間に中範囲のｎＯｅが存在する。これは、−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−モチーフの中範囲のｎＯｅの更なる他の例である。
要約すると、ＮＭＲデータから、好ましい立体配置がカルシウムイオンの存在下において上記ペプチドでは存在することが示される。ＮＭＲ分光由来の圧迫(constraint)を用いたαS1（５９−７９）及びβ（１−２１）双方の分子モデリングから、ペプチドは、クラスターモチーフ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−のグルタミル及びホスホセリル側鎖の双方がＡＣＰのカルシウムイオンと一括して相互作用することを可能にする立体配置をとることが示された。
ＣＰＰ構造及び無定形リン酸カルシウムとの相互作用の関係を、表１に示される一連の合成ペプチド同族体及び類似体を用いて調べた。これらの研究から、クラスター配列−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−が主にＡＣＰとの相互作用に応答し、さらにすべての３個の近接するＳｅｒ（Ｐ）残基がＡＣＰとの最大の相互作用に必要であることが示された。
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実施例３ ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）を用いた構造研究
同様にして、我々は、ＨＡへのＣＰＰならびに合成同族体及び類似体の吸着を調べた（表２）。これらのデータからもまた、Ｓｅｒ（Ｐ）クラスター配列が高い親和結合性に関する主要な決定要因であり、さらにすべての３個の近接するＳｅｒ（Ｐ）残基が、表２に示されるようにかなりより低い親和定数Ｋを生じさせる、ＧｌｕまたはＡｓｐに置換された際でさえ、いずれか一の欠損として必須であることが確認される。
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興味深いことに、唾液で被覆されたＨＡ（ｓＨＡ）を用いてこれらのＨＡ吸着実験を繰り返したところ、ＨＡに対するペプチドの親和性は唾液タンパク質の存在によって若干減少したものの、Ｓｅｒ（Ｐ）クラスターモチーフは依然として吸着の主要な決定要因であることが明らかになった。これらの結果は、薄皮及び歯垢を有するＣＰＰの顕著な相互作用は静電性でありかつＣＰＰのＳｅｒ（Ｐ）クラスターモチーフによって仲介されると考えられることを示唆するものである。
我々はまた、コンピューターシミュレーション技術及び合成ＨＡの単位セル同等物(unit cell coordinate)を用いてＨＡ、｛１００｝、｛０１０｝及び｛００１｝の３種の結晶グラフ面(crystallographic plane)上へのペプチドＳｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−のドッキングについても研究した。これらのシミュレーション研究から、ペプチド−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−は、｛１００｝面に、次に｛０１０｝面に結合するとより考えられることが明らかになった。したがって、Ｓｅｒ（Ｐ）クラスターモチーフは｛１００｝及び｛０１０｝面双方に結合でき、ゆえにカルシウム、リン酸塩及びヒドロキシルイオンが｛００１｝面に沈着できることにより、ｃ−軸のみに沿ったＨＡ結晶の成長を可能にする。したがって、これらの結果は、エナメル及び象牙質でのＨＡ結晶のｃ−軸成長を知り、説明することができる。コンピューターシミュレーションデータの詳細な調査から、最も相対的な結合エネルギーの大きい−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−コンフォーマーがグルタミル残基のカルボキシル基及びホスホセリル残基のホスホリｒ基がＨＡ表面に近接してこれらの基および表面のカルシウム原子が最大限に接触するようにＨＡ上に位置することが示される。
実施例４ ヒトｉｎ  ｓｉｔｕ研究におけるＣＰＰ−ＡＣＰの抗齲食原性活性
１．０％（ｗ／ｖ）ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液（ｐＨ７．０）のエナメル無機質脱落(demineralisation)の阻止能をヒトのｉｎ  ｓｉｔｕ齲歯モデルで研究した。このモデルは、歯垢が保持される部位を作るのに置かれる左右一対のエナメルスラブを有する除去可能な歯科矯正装置から構成される。発達したエナメル間の歯垢(inter-enamel plaque)（３〜５ｍｇ）は、細菌学的には正常な歯肉縁上の歯垢と同様であった。ショ糖溶液に３週間頻繁に暴露すると、ミュータンス連鎖球菌及び乳酸杆菌のレベルのならびに表面近く(sub-surface)のエナメル無機質脱落の増加によって、初期「齲食様」病巣が形成された。
１２人の被検者の右１対のエナメルスラブに１日に２回ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液を暴露したところ、左側の対照エナメルに比べてエナメルのロスが５１％±１９％減少した。対照歯垢では３２±１２マイクロモル／ｇカルシウム及び２０±１１マイクロモル／ｇ  Ｐｉを含んでいたのに対して、ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液に暴露された歯垢は７８±２２マイクロモル／ｇカルシウム、５２±２５マイクロモル／ｇ  Ｐｉ及び２．４±０．７ｍｇ／ｇ  ＣＰＰを含んでいた。このＣＰＰのレベルは、αS1（５９−７９）及びβ（１−２１）双方を認識する抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡによって決定した。歯垢の免疫細胞化学に染色されたセクションの電子顕微鏡写真から、ペプチドは微生物の表面上でさらには細胞外マトリックス内でも優勢に局在化することが明らかになった。
これらの結果はＣＰＰが発達する歯の歯垢中に入り込むことを示すものであるが、ＥＬＩＳＡによって決定される実際のレベルは、ホスファターゼ及びペプチダーゼ活性の作用による歯垢内のＣＰＰの破壊によって入り込んだものの真の提示ではないであろう。ＣＰＰ−ＡＣＰが歯垢内に入り込むことによって、歯垢カルシウムが２．４倍増加し、歯垢Ｐｉが２．６倍増加するが、この際、Ｃａ／Ｐｉ比はＡＣＰと一致する。
実施例５ マウスウォッシュの研究におけるＣＰＰ−ＡＣＰの抗齲食力
３．０％ＣＰＰ−ＡＣＰ（ｐＨ９．０）を含むマウスウォッシュを毎日３回使用する臨床試験から、歯肉上の歯垢のカルシウム含量（下前歯を除く）は、３日間マウスウォッシュを使用した後、１６９±１０３マイクロモル／ｇ乾燥重量から６１０±２３４マイクロモル／ｇにまで増加し、無機リン酸塩は２４２±６０マイクロモル／ｇ乾燥重量から５５１±１６４マイクロモル／ｇにまで増加することが示された。カルシウム及びリン酸塩のこれらのマウスウォッシュ後のレベルは、非無機質が脱落した歯肉上の歯垢について報告された最も高いレベルである。
観察される利点に関して報告されるメカニズムによって限定されることを望むものではないが、ＣＰＰ−ＡＣＰに関する抗齲食原性のメカニズムは無定形リン酸カルシウムが歯垢中に入り込み、これによりエナメルの無機質脱落が抑制され、かつ再無機質化(remineralisation)が促進されると考えられる。歯垢では、ＣＰＰ−ＡＣＰがカルシウム及びリン酸塩のレザバーとして作用し、遊離カルシウム及びリン酸イオン活性を緩衝することにより、歯のエナメルに関する過飽和の状態を維持するのであろう。ＣＰＰへのＡＣＰの結合性はｐＨに依存し、ｐＨ７．０未満ではほとんど結合しない。
実施例６ ＣＰＰ−ＡＣＰによるエナメル病巣の再無機質化
Ａ．  インビトロ研究
インビトロのエナメル無機質化システムを用いて、ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液によるヒトの第３大臼歯における人工病巣の再無機質化を研究した。このシステムを用いて、１．０％ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液が５６±２１％の無機質損失を交換した。０．１％ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液が３４±１８％の無機質損失を交換した。様々なｐＨ値（７．０〜９．０）の様々な量のＣＰＰ（０．１〜１．０％）、カルシウム（６〜６０ｍＭ）及びリン酸塩（３．６〜３６ｍＭ）を含む数多くの溶液をさらに調製した。次に、溶液における様々なリン酸カルシウム物質の活性及び上記一連の溶液のエナメル病巣再無機質化速度との関係を決定した。
様々な再無機質化溶液における中性イオン種であるＣａＨＰＯ40の活性は、病巣の再無機質化速度と非常に相関することが分かった。再無機質化プロセスに関する拡散係数は、仕込まれたマトリックスを介した中性分子の拡散の係数と一致する３×１０-10ｍ2ｓ-1で評価された。１．０％ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液で得られたエナメルの再無機質化速度は３．３×１０-2モルＨＡ／ｍ2／日であり、これは得られた再無機質化速度の最高であった。リン酸カルシウムイオン、特に中性のイオン対ＣａＨＰＯ40は、エナメル病巣に拡散した後、解離することにより、ＨＡに関する飽和度を上げるであろう。病巣内でのＨＡの形成によって、Ｈ3ＰＯ4を生成させ、これはそれ自体中性であるので、濃度勾配の下方に病巣から拡散するであろう。
これらの結果から、ＣＰＰが結合したＡＣＰである、ＣＰＰ［Ｃａ3（ＰＯ4）1.87（ＨＰＯ4）0.2ｘＨ2Ｏ］8が中性のイオン種である、酸の存在下で形成されるＣａＨＰＯ40のレザバーとして作用することが示される。この酸は、歯の歯垢の細菌によって生じうる；上記条件下では、ＣＰＰが結合したＡＣＰは歯垢のｐＨを緩衝し、カルシウム及びリン酸イオン、特にＣａＨＰＯ40を生じる。歯垢のＣａＨＰＯ40の増加は、ｐＨの低下を相殺し、これによりエナメルの無機質脱落を防止する。酸はまた、再無機質化中のエナメル病巣でのＨＡの形成によってＨ3ＰＯ4として歯垢中で生成する。したがって、これから、ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液が、より多量のＣａＨＰＯ40を生じるエナメル病巣再無機質化中に生成されるＨ3ＰＯ4を消費し、これにより病巣中の濃度勾配を維持するためこのような有効な再無機質化溶液である理由が説明される。したがって、これらの結果は、ＣＰＰが歯の表面でのＡＣＰの局在化によりエナメルの無機質脱落を阻害しかつ再無機質化を促進する報告される抗齲食メカニズムと一致する。
Ｂ．  ヒトのｉｎ  ｓｉｔｕの再無機質化研究
シュガーレス（ソルビトール）チューイングガムに添加されるＣＰＰ−ＡＣＰのエナメル表面近くの病巣の再無機質化能を、無作為、クロスオーバー二重盲検試験(randomized, cross-over, double-blind study)で調べた。１０人の被検者に、６個の表面近くに無機質が脱落した病巣を有するヒト−エナメル、ハーフスラブ(human-enamel, half-slabs)が差し込まれた除去可能な口蓋歯科矯正装置(palatal appliance)をつけてもらった。各エナメルスラブのもう半分を湿潤化容器中に入れ、このトロールの無機質脱落病巣として使用した。本研究を４処置群、３．０％（ｗ／ｗ）ＣＰＰ−ＡＣＰを含むシュガーレスガム、１．０％（ｗ／ｗ）ＣＰＰ−ＡＣＰを含むシュガーレスガム、ＣＰＰ−ＡＣＰを含まないシュガーレスガム及びガムをかまない対照とした。ガムは２０分間、１日に４回噛ませた。この装置は上記２０分間及びガムを噛み終わった後さらに２０分間装着させた。各処置は１４日の期間であり、１０人の被検者にはそれぞれ、処置間に１週間あけて各処置を行った。各処置終了時に、エナメルスラブをはずし、各無機質脱落対照と対にし、包埋し、切片化して、マイクロラジオグラフィ及びコンピュータ支援によるデンシトメトリーイメージ(computer-assisted densitometric image)分析にかけて、再無機質化のレベルを測定した。シュガーレスガムによる処置によって、ガムを噛まなかった対照に比べて９．８２±１．８１％の再無機質化が得られたが、１．０％ＣＰＰ−ＡＣＰを含むガムでは１７．０６±２．４８％の再無機質化が得られ、及び３．０％ＣＰＰ−ＡＣＰのガムでは２２．７０±３．４０％の再無機質化が得られ、これらの値はすべて有意に異なっていた。これらの結果から、１．０％及び３．０％ＣＰＰ−ＡＣＰをシュガーレスガムに添加することによって表面近くのエナメルの再無機質化がそれぞれ７４％及び１３１％増加することが示された。
実施例７ ＣＰＰ−ＡＣＦＰマウスウォッシュの研究
マウスウォッシュの研究を行い、１日に３回使用される３．０％ＣＰＰ−ＡＣＦＰマウスウォッシュの歯肉上の歯垢のカルシウム、無機リン酸及びフッ化物イオンの増加能を決定した。４日間マウスウォッシュとして使用される３．０％ＣＰＰ−ＡＣＦＰ溶液は、ＣＰＰによって安定化された１９２ｍＭ結合カルシウムイオン、１２０ｍＭ結合リン酸イオン及び２４ｍＭ（４５６ｐｐｍ）の結合Ｆイオンを含んでいた。このマウスウォッシュを使用することによって、表３に示されるように、歯垢のカルシウムが１．９倍増加し、歯垢のリン酸塩が１．５倍増加し、さらに歯垢のフッ化物イオンが１８倍と劇的に増加した。
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歯垢のカルシウム、リン酸塩及びフッ化物におけるこれらの顕著な増加が分かったものの、歯石はどの被検者にも観察されなかったことから、歯垢のカルシウム、フッ化物、リン酸塩はＣＰＰによって無定形相として安定化されたままであり、結晶相に変換しないことが示唆された。ＣＰＰ−ＡＣＰによって得られたＣａ、リン酸塩及びフッ化物イオンの歯肉上の歯垢レベルのこれらの増加は、表３に示されるように、同様の期間、１日に２回ＣａＣＰＰ及び１０００ｐｐｍ  Ｆ（ＭＦＰ及びＮａＦ）の磨歯剤を用いた同様の研究で得られたものより顕著により大きい。これらの結果は、フッ化物イオン及びＣＰＰ−ＡＣＰとの間に顕著な相乗効果を示すものである。これは、磨歯剤等の口腔用組成物におけるフッ化物のレベルをさらに減少でき、これによりコストを節約できさらに高いフッ化物含量領域で生きる個人のフッ素沈着症の危険性を下げられるという点で特に好ましい。
実施例８ ＣＰＰ−ＡＣＰとフッ化物との相互作用
１．０％ＣＰＰ−ＡＣＰと５００ｐｐｍＦ-の相乗的な抗齲食原性効果をラット齲歯モデルで観察した。限外ろ過した１．０％ＣＰＰ、６０ｍＭ  ＣａＣｌ２，３６ｍＭリン酸ナトリウムおよび５００ｐｐｍＦ-（２６．３ｍＭ  ＮａＦ）を含むｐＨ７．０の溶液の分析により、ほとんど半分のフッ化物イオンがＣＰＰによって安定化されたＡＣＰ相と結合し、ＣＰＰ分子あたり２４のＣａ、１５のＰＯ4、および３のＦ分子を持つCa(PO4)5F.xH2Oの組成物である無定形フッ化リン酸カルシウム相を形成することを明らかにした。
観察された有効な効果に対する任意の提唱されたメカニズムによって限定されることを望まないが、我々はＣＰＰ−ＡＣＰ抗齲食原性メカニズムは、歯表面にＡＣＰが局在していることであり、それにより酸存在下で該ＡＣＰは解離してＣａおよびリン酸イオンを放出し、エナメル脱灰の予防および再無機化を促進するＨＡに関する飽和度を増加させるためと考察している。フッ化物の抗齲食原性メカニズムは歯表面にフッ化物イオンが局在することであり、特にＣａおよびリン酸イオン存在下における歯垢に生ずる。この局在はフッ化アパタイト（ＦＡ）の飽和度を増加し、次にＦＡでエナメルの再無機化を促進する。ＦＡ[Ca10(PO4)6F2]の調合物にとって、カルシウムおよびリン酸イオンはフッ化物イオンと共に歯表面で歯垢中に共存しているはずである。ＣＰＰ−ＡＣＰおよびＦの相乗的な抗齲食原性効果は、それゆえに事実上Ｃａ、ＰｉおよびＦを共存させうるＣＰＰによるＡＣＦＰの歯表面での局在に帰因している。
これは実施例７で説明したマウスウォッシュの研究で証明された。
ｐＨ７．０のＣＰＰの準安定性溶液を、顕著に高い濃度の無定形フッ化リン酸カルシウムを加えて調製した。例えば、６４０ｍＭ  Ｃａ、４００ｍＭリン酸、および８０ｍＭ  Ｆ（１，５２０ｐｐｍＦ-）を含むｐＨ７．０の１０％ｗ／ｖＣＰＰ−ＡＣＦＰ溶液を調製し、１．２８Ｍ  Ｃａ、８００ｍＭリン酸、および１６０ｍＭ  Ｆ（３，０４０ｐｐｍＦ-）を含むｐＨ７．０の２０％ＣＰＰゲルも同様に調製した。この溶液とゲルは、フッ化物のみと比較してかなり大きな抗齲食原性を示し、それゆえに練り歯磨きや口内洗浄剤への優れた添加剤であり、専門的応用のために現在のフッ化物含有歯磨剤および専門的応用品の効能を改良する。
本発明の複合体を含む調合物の特殊な例を以下に示す。
実施例９ ＣＰＰ−ＡＣＦＰを含む練り歯磨き調合物
調合物１
成分 ％  w/w
リン酸二カルシウム二水和物            ５０．０
グリセロール                          ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム  １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                １．５
ラウロイルサルコンナトリウム   ０．５
香料                                  １．０
サッカリンナトリウム                  ０．１
グルコン酸クロロヘキシジン            ０．０１
デキストラナーゼ                      ０．０１
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      １．００
水                                    バランス
調合物２
成分 ％  w/w
リン酸二カルシウム二水和物            ５０．０
ソルビトール                          １０．０
グリセロール                          １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム  １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                １．５
ラウロイルサルコンナトリウム   ０．５
香料                                  １．０
サッカリンナトリウム                  ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム          ０．３
グルコン酸クロロヘキシジン            ０．０１
デキストラナーゼ                      ０．０１
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ２．０
水                                    バランス
調合物３
成分 ％  w/w
リン酸二カルシウム二水和物            ５０．０
ソルビトール                          １０．０
グリセロール                          １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム  １．０
ラウロイルジエタノールアミド          １．０
モノラウリン酸スクロース              ２．０
香料                                  １．０
サッカリンナトリウム                  ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム          ０．３
グルコン酸クロロヘキシジン            ０．０１
デキストラナーゼ                      ０．０１
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ５．０
水                                    バランス
調合物４
成分 ％  w/w
ソルビトール                          ２２．０
アイリッシュモス                      １．０
水酸化ナトリウム（５０％）            １．０
ガントレッツ                          １９．０
水（脱イオン化）                      ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム          ０．７６
サッカリンナトリウム                  ０．３
ピロリン酸塩                          ２．０
酸化アルミニウム三水和物              ４８．０
香油                                  ０．９５
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                ２．００
調合物５
成分 ％  w/w
ポリアクリル酸ナトリウム              ５０．０
ソルビトール                          １０．０
グリセロール                          ２０．０
香料                                  １．０
サッカリンナトリウム                  ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム          ０．３
グルコン酸クロロヘキシジン            ０．０１
エタノール                            ３．０
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ２．０
リノール酸                            ０．０５
水                                    バランス
実施例１０ マウスウォッシュ調合物
調合物１
成分 ％  w/w
エタノール                            ２０．０
香料                                  １．０
サッカリンナトリウム                  ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム          ０．３
グルコン酸クロロヘキシジン            ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド          ０．３
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ２．０
水                                    バランス
調合物２
成分 ％  w/w
ガントレッツＳ−９７                  ２．５
グリセリン                            １０．０
香油                                  ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム          ０．０５
グルコン酸クロロヘキシジン            ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド          ０．２
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ２．０
水                                    バランス
実施例１１ トローチ調合物
成分 ％  w/w
砂糖                                  ７５〜８０
コーンシロップ                        １〜２０
香油                                  １〜２
フッ化ナトリウム                      ０．０１〜０．０５
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ３．０
ステアリン酸マグネシウム              １〜５
水                                    バランス
実施例１２ 歯肉マッサージ調合物
成分 ％  w/w
白色ワセリン                          ８．０
プロピレングリコール                  ４．０
ステアリルアルコール                  ８．０
ポリエチレングリコール4000            ２５．０
ポリエチレングリコール400             ３７．０
モノステアリン酸スクロース            ０．５
グルコン酸クロロヘキシジン            ０．１
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ３．０
水                                    バランス
実施例１３ チューインガム調合物
成分 ％  w/w
ガムベース                            ３０．０
炭酸カルシウム                        ２．０
結晶ソルビトール                      ５３．０
グリセリン                            ０．５
香油                                  ０．１
ＣＰＰ−ＡＣＦＰ                      ２．０
水                                    バランス
実施例１４ 補助食
ＣＰＰ−ＡＣＦＰをくる病の鶏の餌に１．０重量％添加して、骨の付加成長に生物学的に有効なカルシウムを供給するＣＰＰ−ＡＣＰの能力を測定した。餌中の１．０重量％のＣＰＰ−ＡＣＰが、動物の成長プレート異常（growth plate abnormalities）の発症率を３４％減少させ、脛骨灰（tibial ash）において１７％増加させ、軟骨成長プレートにおいて２２％減少させ、これはＣＰＰのみに比べかなり大きく（表４）、生物学的に有効な食物カルシウムの供給と、骨付加成長を容易にする点でＣＰＰ−ＡＣＰがＣＰＰより優れていることを示している。
0004541455.tif 000007
本発明が目的を明確に理解するため詳細に解説してきたが、実施例は説明の目的のみであることを理解すべきである。分子生物学、歯科診断、もしくは関連分野および開示した本発明の範囲内の当業者にとって、本発明の実施形態の他の変更例が明白となるであろう。