(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介してポリマー表面に結合している物質の前記ポリマー表面からの分離方法であって、
前記ポリマー表面は、下記（Ａ）で表される構造要素を少なくとも１つ含み、
【化１】
0004511674.tif 000003
（前記式中、ＸはＯであり、
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ同一または異なっていてもよく、Ｃ1-8アルキル基である）、
前記リンカーは、ポリアルキレングリコールで表され、
かつ、Ｃ1〜Ｃ3アルカノールからなる群から選択される極性有機溶媒を添加することにより前記リンカーと前記ポリマー表面との結合を切断することを特徴とする分離方法。
【請求項２】
前記有機溶媒が、メタノールである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が、６０体積％を超えない濃度の水溶液の形態で使用される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマー表面が、ポリメタクリル酸（C1-8アルキル）を備えている請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンカーを介して結合している物質をポリマー表面から分離する方法に関する。前記リンカーと前記ポリマー表面との結合は一種類あるいは複数種類の極性有機溶媒により切断され、かつ、本発明に係る前記リンカーは、水素結合を形成することが可能な少なくとも一つの構造要素を含む。その表面で本発明の方法による結合の切断が起こるポリマーは、好ましくはポリマー骨格鎖の側鎖に、ケト基もしくはカルボン酸基またはそれらの誘導体の形態であるカルボニル基を含む。
【０００２】
【従来の技術】
ある種のリンカーと前記のようなポリマー表面との相互作用の原理は、ＷＯ  ９８／４６６４８明細書に記載されている。（本出願で「リンカー」とは、化合物に含まれる原子団で、水素結合等により他の原子団と結合することができるものをいう。）リンカーにより修飾された表面とリンカーにより修飾された活性物質のどちらかまたは両方を利用することにより、例えば、液中から活性物質を除くために、またはそのような物質を液中にさらすために前記の原理を用いることができる。前記出願は、さらに、広範囲にわたる医療方法に関連して、前記相互作用原理の用途を開示している。すなわち、ポリマー表面と、前記ポリマー表面に結合し、かつ官能基を有するリンカーとを含む吸着システムを用いて、前記リンカーに存在する官能基と結合を形成する活性物質を、体液から除去することができる。活性物質を患者の全身に広げることは、潜在的な合併症や副作用を引き起こすおそれもある。しかし、前記のようなシステムによれば、活性物質をそのようにいたずらに広げることなく、患者の体内に活性物質を選択的に導入することができる。また、前記ＷＯ  ９８／４６６４８明細書に記載されている結合原理による前記ポリマー表面の修飾は、前記ポリマーが、例えば義肢（ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）、生理的液体のためのフィルター、および透析装置のような、生理学的システムに接触することを可能にする。前記のリンカーは、水素結合を形成することが可能な少なくとも一つの構造要素を持ち、前記表面に適用されると驚くべき高結合力を示す。前記リンカーに結合した物質は、温度を例えば７０℃まで上昇させても、水溶液で洗浄しても、たとえその水溶液が２ｍｏｌ／Ｌのグリシンや１ｍｏｌ／Ｌの尿素のような、またはｐＨ２から１３あるような高いイオン強度を持つものであったとしても、前記表面から除去することができない。
【０００３】
しかしながら、一定の用途においては、前記リンカーを介して結合している物質を、温和な条件で表面マトリクスから除去できることが好ましい。それは、例えば、診断あるいは研究用のサンプル液中に存在する前記物質を、前記リンカーに結合させて抽出した後、分析することが求められる場合があるからである。さらに、前記表面を、または前記リンカーに結合した物質を再利用する際に、それらを引き続き別個にまたは組み合わせて再利用できるよう、どちらかまたは両方の成分を消毒するためにも、分離は必要であろう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、マトリクス表面およびリンカーを介してそこに結合した物質を含むシステムにおいて、すべての成分の再利用を可能にするために、前記成分を、温和な条件で、サンプルを破壊せず、かつ単純で低コストに分離できる方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明では、前記目的を達成するために、前記システムを、極性有機溶媒にさらす。驚くべきことに、そのような溶媒は、それが希薄水溶液の状態であってさえ、前記ポリマー表面と、リンカーを介してそこに結合している物質との結合を切断するのに好適であった。前記表面と前記物質とは、結合切断後もそれらの官能基特有の物性を保持していた。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明により、リンカーおよびそのリンカーを介してそこに結合している化合物を除去できるポリマーとしては、例えば、ＷＯ  ９８／４６６４８明細書に記載されているものがある。前記ポリマーとしては、単独重合体あるいは共重合体が用いられる。前記ポリマーは、少なくとも一つのタイプのモノマーを原料に用いており、そのモノマーは、重合に関与し得る二重結合および重縮合に関与し得る官能基ならびに、ケトンもしくはカルボン酸またはそれらの誘導体の形態で存在する、重合反応に関与しないカルボニル基を有する。前記ポリマーは、化１の構造を有することが好ましい。化１において、Ｒ1およびＲ2はアルキル基、アリール基または水素原子を表し、それぞれ同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は直鎖状であってもまたは枝別れしていても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。前記アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基ＸはＯ、ＮＲ3、またはＣＨ2の中から任意に選ばれる。Ｒ3は前記Ｒ1およびＲ2と同様に定義される官能基であり、Ｒ1およびＲ2とは同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は、特に好ましくは、直鎖状であるかまたは枝別れを有し、場合によっては置換基を有する炭素数１から８のアルキル基、例えばメチル基、エチル基またはプロピル基等である。場合によって存在する置換基としては、例えば、一個または複数個のハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素等、または水酸基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオール基等がある。前記アリール基は、特に好ましくは、単環式あるいは二環式の、場合によって置換基を含むアリール基である。場合によって含まれる置換基としては、一個または複数個のヘテロ原子等がある。前記特に好ましいアリール基としては、例えば、フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基、インデニル基またはイソインデニル基等がある。ヘテロ原子を含むアリール基としては、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎの中から選ばれるヘテロ原子を含む、炭素数３から９のヘテロアリール基がある。単環式ヘテロアリール基としては、例えば、ピロリル基、フリル基、チエニル基、イミダゾリル基、Ｎ−メチルイミダゾリル基、Ｎ−エチルイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基、キナゾリニル基、ナフチルピリジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基およびテトラゾリル基等がある。
【０００７】
前記各種のような官能基を含むポリマーで、好ましいものとしては、例えば、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリメタクリル酸エチル（ＰＥＭＡ）またはポリメタクリル酸プロピル等のポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で特に好ましいものは、ポリメタクリル酸メチルである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、前記ポリマーの構成要素を組み合わせた、または前記ポリマーの構成要素に他の一種または複数種のポリマーの構成要素を加えた構造の、共重合体も用いることができる。前記他のポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリルまたはポリアミド等がある。前記共重合体における、構成要素の比は、特に限定されない。前記共重合体における、カルボニル基を含むモノマー、例えばメタクリル酸アルキルの存在比は、好ましくは２０モル％以上、さらに好ましくは４０モル％以上、最適には６０モル％以上である。
【０００８】
本発明におけるポリマーの表面の形態は、本発明の原理により制限されるものではない。例えば、フィルム状、ホースのような中空体状、膜状、微粒子状等の形態のポリマーを用いることができる。各結合が切断されるより以前に、リンカーを介して前記ポリマー表面に結合している物質は、本システムの用途に応じて選択することができる。好ましくは、薬理学的または生理学的に活性な物質が用いられる。前記活性物質としては、例えば、タンパク質、核酸および細胞信号物質等がある。前記タンパク質としては、特に好ましくは、酵素、抗原、抗体、腫瘍マーカー、表面抗原、リガンド、レセプター、バクテリアもしくはウィルスの表面活性細胞片、または免疫伝達物質等である。前記薬理学的活性物質としては、例えば、抗凝血物質、代謝活性酵素、または、抗生物質、抗腫瘍剤もしくは酵素阻害剤のような合成医薬等がある。本システムに用いることができる物質の例は、ＷＯ  ９８／４６６４８明細書に詳細に記載されている。
【０００９】
前記方法により特定ポリマー表面との結合を切断することができるリンカーは、少なくとも二つの官能基Ｌ１およびＬ２を有する分子である。これらの官能基のうちの一つ（Ｌ１）は、水素結合を形成することが可能で、それにより前記リンカーを前記ポリマー表面に結合させる。官能基Ｌ２は、前記ポリマー表面に結合されるべき物質と、前記リンカーとの間に結合が形成されるように選択される。前記ポリマー表面に、複数種類の物質を同時に担持させるために、異なったＬ２基を持つ、複数種類のリンカーを選択することが可能である。しかしながら、同種あるいは異種の、複数個のＬ２基を同時に有する、ただ一種のリンカーを使用することも可能である。同様に、同種あるいは異種の、複数個のＬ１を同時に有するリンカーを使用することも可能である。Ｌ１およびＬ２は、炭素数１から２０の、アルキル鎖またはポリエーテルにより連結されていることが好ましい。前記官能基Ｌ１は、好ましくは、例えば、−ＯＨ基、−ＳＨ基、−ＮＨ基または、−ＰＨ基等の、極性水素原子を含む基である。この構造要素は、十分に水溶性であり、さらに構造要素Ｌ２を有する、リンカーとしての化合物中に存在することが好ましい。前記Ｌ１は、その末端がリンカーと結合されていることが特に好ましい。前記物質とリンカーとを結合する官能基（Ｌ２）としては、例えば、スクシンイミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｉｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、スクシンイミジルプロピオネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｉｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ニトロフェニルカルボネート（ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、トリシレート（ｔｒｉｓｙｌａｔｅ）、エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）またはマレインイミド（ｍａｌｅｉｎｉｍｉｄｅ）等がある。好適なリンカーを、活性物質と結合するように修飾することが可能なＬ２は、例えば、シアウォーターポリマーズインコーポレーション社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．）（２３０７スプリングブランチロード（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｒｄ．）、ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ（ＡＬ）３５８０１（米国））のカタログに記載されている。
リンカーとして用いられるのは、好ましくはポリアルキレングリコール、特に好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。さらに、ポリアルキレンイミン、ポリアルキレンアミンまたはポリアルキレンスルフィドおよびポリオキサジリン（ｐｏｌｙｏｘａｚｉｌｉｎｅｓ）等も好ましく用いられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコールの使用である。前記各種化合物は、５千から５万（５ｋＤａ〜５０ｋＤａ）の分子量を有することが好ましい。
【００１０】
本発明に係る極性有機溶媒は、極性の共有結合を有し、それが分子全体に電気双極子モーメントを分け与える分子である。本発明で使用する溶媒の、前記溶媒分子の、気相中での電気双極子モーメントは、好ましくは１．０デバイ（Ｄ）より大きく、さらに好ましくは１．４Ｄより大きく、最適には１．６Ｄより大きい。極性の酸素原子を有する官能基を含む、例えばアルカノールやエステル等の有機化合物を使用することが好ましい。前記アルカノールの炭素数および水酸基数は、いずれも３以下であることが好ましく、特に、メタノールを使用することが好ましい。
前記有機溶媒は、水溶液の状態で使用することが好ましい。前記水溶液の濃度は、好ましくは７０体積％より小さく、さらに好ましくは１０から５０体積％の間である。
場合によっては、前記溶媒は、前記リンカーに結合している前記物質と不可逆反応を起こさないように選択される。
前記リンカーに結合している物質の、前記表面からの分離は、前記リンカーを担持した表面を溶媒中に温置（ｉｎｃｕｂａｔｅ）するか、前記表面を洗浄するか、または通過流法（ｔｒｏｕｇｈ  ｆｌｏｗ  ｍｅｔｈｏｄ）により行うことができる。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００１２】
（実施例）
（ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）粒子に結合しているＰＥＧヒルジンの分離）
多孔性ＰＭＭＡ粒子を、二つの群に分け、それぞれＰＥＧヒルジンを担持させた。続いて、これを１０分間洗浄した。洗浄液としては、メタノールを様々な濃度で使用するか、または、比較試験では、生理食塩水を用いた。洗浄後の洗液から、生物学的機能試験により、分離されたヒルジンを検出した後、前記ヒルジンを回収した。
前記洗浄後の粒子は、ＰＥＧヒルジン溶液によりふたたび担持を行うことにより、その担持能力を調べた。前記メタノール洗液から再生したＰＥＧヒルジンは、これも、ＰＭＭＡ粒子との結合能を試験した。
メタノール濃度が４０％以下の希釈液を用いることにより、わずか１０分間の洗浄で、前記表面に結合していたＰＥＧヒルジンのうち、８０％を超える量を分離し、かつ再生することができた（表１および図１）。
【表１】
0004511674.tif 000002
精製したＰＭＭＡ粒子および再生したＰＥＧヒルジンの再利用可能性を、図２に示す。５０５０万の未使用および精製した粒子では、ＰＥＧヒルジンに対する結合能はほとんど同様であった。さらに、未使用ＰＥＧヒルジンの結合特性と、メタノール洗液から再生したＰＥＧヒルジンのそれとは同様であった。
すべての試験において、前記表面に固着されたＰＥＧヒルジンは機能的に活性であった。これは、トロンビン阻害能の試験により示された。
【００１３】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明の方法によれば、マトリクス表面およびリンカーを介してそこに結合した物質を含むシステムにおいて、そこに含まれる成分を、温和な条件で、サンプルを破壊せず、かつ単純で低コストに分離でき、すべての成分の再利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＥＧヒルジンの洗液からの回収率を表したグラフである。
【図２】ＰＭＭＡ粒子とＰＧＡヒルジンを分離した後の、両者の再利用可能性を表したグラフである。
【図１】
0004511674.tif 000004
【図２】
0004511674.tif 000005