【手続補正書】
【提出日】平成18年5月22日(2006.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】MIP-1α又はその機能的誘導体を有効成分とする樹状細胞前駆体の血中レベル上昇剤
【請求項２】ＭＩＰ−１αの機能的誘導体がBB−10010である請求項１記載の樹状細胞前駆体の血中レベル上昇剤
【請求項３】ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はBB−10010である請求項１記載の樹状細胞前駆体の血中レベル上昇剤
【請求項４】両親媒性高分子が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体である請求項３記載の樹状細胞前駆体の血中レベル上昇剤
【請求項５】両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α
【請求項６】両親媒性高分子で化学修飾されたBB−10010
【請求項７】両親媒性高分子が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体である請求項５又は６記載のＭＩＰ−１αの機能的誘導体
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、樹状細胞前駆細胞の血中レベル上昇剤及び該作用を有する両親媒性高分子で化学修飾された新規なアゴニスト誘導体に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
＜2＞骨髄由来樹状細胞前駆体の調整
B6マウスの大腿骨および脛骨より骨髄細胞を採取した。該骨髄細胞をナイコプレップで分離して骨髄単核球を採取した。該骨髄単核球をシャーレで10-12時間培養し、非付着骨髄単核球を回収した。該非付着骨髄単核球を磁気ビーズ標識c-kit 抗体と混合培養し、磁気細胞ソーター（MACS; MiltenyiBiotec社製）にてc-kit陽性細胞を分離した。該c-kit陽性細胞を 2.5 x 105 cells/ml の濃度にて、SCF(須藤先生（Toray社）より供与)、Flt3L（Immunex 社製）、GM-CSF（4 ng/ml）と IL-4（10 ng/ml）存在下で7-9日間培養したものを骨髄由来樹状細胞前駆体とした。該c-kit陽性細胞を2.5 x 105 cells/ml の濃度にて、 SCF(須藤先生（Toray社）より供与)、Flt3L（Immunex 社製）、GM-CSF（4 ng/ml）と IL-4（10 ng/ml）存在下で7-9日間培養したものを骨髄由来樹状細胞前駆体とした。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
＜４＞  抗原感作樹状細胞前駆体によるTリンパ球増殖反応測定
B6マウス脾臓細胞より、磁気細胞ソーター（MACS; MiltenyiBiotec社製）を用いてCD3陽性Tリンパ球を調製した。該Tリンパ球と該抗原感作樹状細胞前駆体（B16癌細胞株可溶化物で感作した骨髄由来樹状細胞前駆体）の比が1：20になるように混合し、IL-2、IL-7の存在下で24穴プレートにて培養した。該培養Tリンパ球を5日間培養後、2−3日おきに50％の培地を新鮮なものと交換することにより培養を継続した。７および14日目に該抗原感作樹状細胞前駆体を新たに加えることにより、該培養Tリンパ球の再感作を行った。培養21日目に該培養Tリンパ球を回収した。次いで96穴丸底培養プレート（Nunc社製）を用いて、該培養Tリンパ球をMMC処理したB16癌細胞株可溶化物で感作した該末梢血由来樹状細胞前駆体（P.acnes死菌あるいは精製MIP-1α投与マウス由来）、B16癌細胞株可溶化物で感作した該骨髄由来樹状細胞前駆体、EL4癌細胞株可溶化物で感作した該樹状細胞前駆体、未感作該樹状細胞前駆体あるいは癌細胞株可溶化物のみと混合し、37℃で4−5日間培養した。培養後、5 mg/ml のMMT（3-(4,5-dimethylthiazolyl-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)溶液を15μl／穴加え、37℃で4時間培養した。培養後、各穴の550 nm の吸光度を測定することにより、該Tリンパ球の増殖を測定した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
＜５＞  マウスの腫瘍増殖における免疫の効果の検討
B6マウスのグループ（8匹／グループ）それぞれに、0日目、7日目の2回、B16癌細胞株可溶化物で感作した該末梢血由来樹状細胞前駆体（P.acnes死菌あるいは精製MIP-1α投与マウス由来）、B16癌細胞株可溶化物で感作した該骨髄由来樹状細胞前駆体、EL4癌細胞株可溶化物で感作した該樹状細胞前駆体、未感作該樹状細胞前駆体（各1 x 106 cells／マウス）、癌細胞株可溶化物のみあるいはPBSを腹側の皮下に注入した。14日後に該マウスの腹側の皮下にB16 癌細胞（各2 x 105 cells／マウス）を接種した。接種後3日おきに、腫瘍の面積を測定し、腫瘍の増殖を判定した。同時にマウスの生存日数も観察した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
＜７＞上記＜５＞において、B16癌細胞株可溶化物で感作した該末梢血由来樹状細胞前駆体（MIP-1α投与マウス由来）あるいは該骨髄由来樹状細胞前駆体で免疫したB6マウスのうち、B16癌細胞株接種後60日目に癌細胞が消失していたものについて、該マウスより脾臓細胞を採取した。該脾臓細胞のCD8陽性Tリンパ球を分離して（1 x106 cells）、MMC処理したB16癌細胞株（1 x 105 cells）と5日間培養した。96穴プレートに該培養Tリンパ球を連続希釈したものを100μl／穴ずつ加えた。次にB16 癌細胞株の細胞浮遊液を100μl／穴ずつ加えた。該プレートを37℃、10時間培養した。該プレートを遠心後、上清100μl／穴を新たな96穴プレートに移した。各穴に Cytotoxicity Detection Kit（LDH; ベーリンガーマンハイム社製）の反応液を100μl／穴ずつ加えた。該反応プレートを室温で30分反応させた後、プレート吸光度測定装置にて 490 nm の吸光度を測定することにより細胞傷害活性を測定した。MHC classI 機能阻害実験の場合は、B16 癌細胞を抗MHC classI抗体（抗 H2Kb/H2Db 抗体）あるいはコントロール抗体（抗 H2Dd 抗体）で添加前37℃、30分間、処理した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
＜８＞B6マウスに、0日目、7日目の2回、B16癌細胞株可溶化物で感作した該末梢血由来樹状細胞前駆体（P.acnes死菌あるいは精製MIP-1α投与マウス由来）、B16癌細胞株可溶化物で感作した該骨髄由来樹状細胞前駆体、EL4癌細胞株可溶化物で感作した該樹状細胞前駆体、未感作該樹状細胞前駆体（各1 x 106 cells／マウス）、癌細胞株可溶化物のみあるいはPBSを腹側の皮下に免疫した。二回目の免疫後7日目に、該免疫マウスより脾臓細胞を採取した。該脾臓細胞よりセルソーターを用いてCD4陽性細胞およびCD8陽性細胞T細胞を分離した。該T細胞をMMC処理したB16 癌細胞と混合し、24穴プレートを用いて48時間培養した。該培養細胞を用いて、細胞傷害活性を測定した。また該培養細胞の上清中のIFNγ濃度をIFNγELISAシステム（エンドジェン社製）を用いて測定した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
＜9＞  肺転移における効果の確認
B6マウスの尾静脈よりB16癌細胞（1 x 106 cells／マウス）を注入した。癌細胞注入後３日目，７日目に、B16癌細胞株可溶化物で感作した該末梢血由来樹状細胞前駆体（MIP-1α投与マウス由来）、B16癌細胞株可溶化物で感作した該骨髄由来樹状細胞前駆体、未感作該樹状細胞前駆体（各1 x 106 cells／マウス）、癌細胞株可溶化物のみあるいはPBSをそれぞれ尾静脈より注入した。癌細胞注入後21日目にマウス肺を摘出して、癌転移巣の数を測定して転移の程度を判定した。
以上