【手続補正書】
【提出日】平成18年5月15日(2006.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
毛髪関連細胞が、毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【従来の技術】
毛髪に関するアイデンティティーは非常に高く、毛髪が薄いことに、大きな負い目を感じる人は少なくない。この様な状況を背景に、種々の育毛剤、養毛剤が世に出されている。かかる育毛剤、養毛剤のメカニズムとしては、テストステロン−α−リダクターゼ阻害などが知られている（例えば、特許文献１参照）が、薄毛、脱毛のメカニズムがテストステロンの異常発現に尽くされているわけではなく、かかるテストステロン５αリダクターゼ阻害剤によって効を奏さない薄毛、脱毛も少なくない。同様の状況が発毛促進、或いは育毛作用のメカニズムについても存する。言い換えれば、テストステロンに起因しない薄毛、脱毛を的確に鑑別し、その対応策を講じることが望まれていた。一方、サイクリン類は細胞周期に関与した蛋白質であり、核酸合成に関与したり、細胞分裂を制御したりしていることが知られており（例えば、特許文献２、３参照）、そのファミリーとしてはＡ〜Ｉ及びＴが存することが知られている。サイクリン類と毛髪関連細胞との関連については、キューティクルの形成にはサイクリン依存性キナーゼが関与していること（例えば、非特許文献１参照）、或いは、サイクリン依存性キナーゼが、毛髪関連細胞をアポトーシスから保護していること（例えば、非特許文献２参照）が知られている。しかしながら、毛周期とサイクリン類の発現の間の関係については全く知られていない。又、前記サイクリン類の内、サイクリンＴ１の発現状況の変化を追うことにより、毛乳頭細胞や結合織鞘細胞などの毛髪関連細胞の細胞周期が判別出来ることも全く知られていなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
毛髪関連細胞の細胞周期を揃えて、同調培養する技術については既に知られており（山本卓也、宍戸まゆみ、荒瀬誠治（徳島大）、第５２回日本皮膚科学会西部支部総会（２０００年、徳島）、「同調化ラット髭外毛根鞘細胞の細胞周期移行に対するシクロスポリンＡの影響」参照）、汎用技術となっている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、テストステロン以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供することを課題とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【課題の解決手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、テストステロン以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現状況を指標とすることにより、メカニズムの鑑別が行え、且つ、この原理を利用して有効成分のスクリーニングが可能であることを見出し、発明を完成させるに至った。
（１）被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現状況を指標とすることを特徴とする、被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（２）毛髪関連細胞が、毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞であることを特徴とする、（１）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（３）毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現状況の比較結果を指標として鑑別することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（４）毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現の変化から細胞周期を測定し、被験物の共存下における細胞周期の方が、ベヒクル共存下における細胞周期よりも短い場合に於いて、前記被験物を育毛物質と鑑別することを特徴とする、（３）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（５）毛乳頭細胞及び／又は結合織鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、サイクリンＴ１の発現状況を測定し、該サイクリンＴ１の発現量を指標とすることを特徴とする、（３）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（６）（１）〜（５）何れか１項に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法にて、毛髪への影響を鑑別することを特徴とする、育毛剤の評価方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の被験物の毛髪への影響の鑑別法は、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞のサイクリンＴ１の発現を指標とすることを特徴とする。サイクリン類はサイクリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇが細胞周期を回すエンジンにあたるタンパク質として性格づけられており、サイクリンＴ１については、分化促進因子或いは増殖促進因子のスイッチのＯＮ／ＯＦＦに関与することが、本発明者らの検討では見出されている。本発明の鑑別法は、このサイクリンＴ１の発現状況を指標とするものであるが、その発現状況は、ウエスタンブロット、ノーザンブロットなどのブロットによって知ることが出来るし、或いは標識抗体などを用いた組織染色により知ることが出来る。抗サイクリンＴ１標識抗体は既に市販されているものが存するのでそれを購入して使用することが出来る。本発明者の検討によれば、後記実施例に示す如く、サイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現することが見出されている。この発現の推移を追うことにより、毛周期を判別することが出来る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
＜実施例１＞
成長期初期、成長期中期、退行期〜休止期のマウスの体毛を含む毛周辺組織を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後切片を作成し、脱パラフィンした後、ウサギ抗サイクリンＴ１免疫グロブリンＧ（何れも一次抗体）で免疫染色し、これを標識抗ウサギ免疫グロブリンＧ（二次抗体）でサンドイッチし、ＤＢＡで発色させた。この詳細な手技は下記に示す。切片の顕微鏡写真を図１に示す。これより、サイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現することが明らかになった。従って、経時的にサイクリンＴ１の発現状況を追うことにより、毛周期の全容が判別出来る。
（切片の処理の手技）
１．脱パラフィン
キシレン １０分ｘ３回、１００％ＥｔＯＨ ３分ｘ２回、９５％ＥｔＯＨ ３分、７０％ＥｔＯＨ ３分
２．抗原賦活
Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダコ社製）中で１２１℃、２０分間オートクレーブ、冷却後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄
３．３７℃で乾燥
４．内因性ペルオキシダーゼのブロック
５．ブロッキング
６．一次抗体（ウサギ抗サイクリンＩｇＧ）で４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ
７． ＰＢＳ（−）で１０分、３回洗浄
８．二次抗体（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗ウサギＩｇＧ）で３７℃、１．５時間
９． ＰＢＳ（−）で１５分、３回洗浄
１０．ＤＡＢ発色
１１．蒸留水で洗浄
１２．カウンターステイン（マイヤーのヘマトキシリン５分、流水３０分）
１３．脱水、封入
蒸留水洗浄、９５％ＥｔＯＨ ２分、１００％ＥｔＯＨ ２分ｘ２回、キシレン５分ｘ２回、封入
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
＜実施例２＞
実施例１の組織をラットの髭周囲の組織に変えて、同様の検討を行った。但し、抗原賦活は行わなかった。抗サイクリン免疫グロブリンＧとしては、ウサギ抗サイクリンＡ免疫グロブリンＧ、ウサギ抗サイクリンＤ１免疫グロブリンＧ及びウサギ抗サイクリンＴ１免疫グロブリンＧを用いた。結果を図２に示す。これより、ラットの髭周囲の組織に於いてもサイクリンＴ１は成長期中期後期に毛乳頭細胞結合織鞘細胞に於いて特異的に発現することが確認された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、テストステロン以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供することができる。