(57)【要約】  増幅候補領域に優先順位を設定してプライマーを設計した結果、プライマーを設計することができた増幅候補領域の数が所望数に達しなかった場合に、先に設定した優先順位の大局的特徴を維持しながら、プライマーの設計をやり直すことができるマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法が提供される。
2018061699.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域に対して、第１番目から第ｎ番目までの順序である第１の優先順位を付ける、第１の優先順位設定工程と、
前記第１の優先順位の順序に従って、前記第１の優先順位が第１番目の増幅候補領域から、順次、その増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、第１のプライマー設計工程と、
前記第１のプライマー設計工程においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ個として、ｍ≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ＜ｔであるとき、次の工程に進む、と決定する、第１の成否判定工程と、
前記ｎ個の増幅候補領域に対して、第１番目から第ｎ番目までの順序であって、第１の優先順位の順序とは異なる、第２の優先順位を付ける、第２の優先順位設定工程と、
前記第２の優先順位の順序に従って、前記第２の優先順位が第１番目の増幅候補領域から、順次、その増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、第２のプライマー設計工程と、
を含む、ゲノム上のｎ個の増幅候補領域のうちｔ個以上の増幅候補領域を増幅するためのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
前記第２の優先順位設定工程は、
前記ｎ個の増幅候補領域の識別情報および第１の優先順位情報が入力手段を介して入力されて、記憶手段に記憶され、
演算手段が前記第１の優先順位の順序で並べて、前記ｎ個の増幅候補領域を要素とする第１の順列を作成して、記憶手段に記憶し、
演算手段が前記第１の優先順位の順序で並べた前記ｎ個の増幅候補領域を、ｉ番目のブロックがｋｉ個の増幅候補領域を含むように、ｊ個のブロックに分割して、記憶手段に記憶し、
演算手段が前記ｊ個のブロックのうち、少なくとも１つのブロックの内部で、そのブロックに含まれる増幅候補領域を並び替えて、記憶手段に記憶し、
演算手段が１番目からｊ番目までのブロックを順に結合して、ブロック分割を解除して、第２の順列を作成し、前記第２の順列に含まれる前記ｎ個の増幅候補領域の順序を前記ｎ個の増幅候補領域の第２の優先順位とする工程である、
ゲノム上のｎ個の増幅候補領域のうちｔ個以上の増幅候補領域を増幅するためのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
ただし、ｎはｎ≧４を満たす整数であり、ｔは２≦ｔ≦ｎを満たす整数であり、ｍは０≦ｍ≦ｎを満たす整数であり、ｉは１≦ｉ≦ｊを満たす整数であり、ｊは２≦ｊ≦ｎ／２を満たす整数であり、ｋｉは２≦ｋｉ≦｛ｎ−２×（ｊ−１）｝を満たす整数である。
【請求項２】
前記第２のプライマー設計工程の後に、さらに、
前記第２のプライマー設計工程においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ’個として、ｍ’≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ’＜ｔであるとき、前記第２の優先順位設定工程に戻る、と決定する、第２の成否判定工程
を含む、請求項１に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
ただし、ｍ’は０≦ｍ’≦ｎを満たす整数である。
【請求項３】
前記第２の優先順位設定工程において、前記ブロック内で前記増幅候補領域の順序をランダムに変更する、請求項１または２に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチプレックスＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）に供するプライマーの設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年発達してきたＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；デオキシリボ核酸）シーケンサ等により遺伝子解析が手軽に行えるようになっている。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約がある。そこで、必要な特定の遺伝子領域のみをＰＣＲ増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的にＰＣＲ増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。【０００３】
マルチプレックスＰＣＲは少量のＤＮＡから複数の領域を効率よくＰＣＲ増幅することから、非侵襲的な出生前診断を行うために有用な技術である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡのような、数ｐｇ〜数十ｐｇ以下の少量ＤＮＡサンプルに対する直接的なマルチプレックスＰＣＲを確実に行うことができるプライマーセットを設計することは、相補性および特異性などのプライマー設計の条件が非常に厳しいため、難易度が高く、すべての増幅候補領域に対して、ＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計することができない場合がある。【０００５】
本発明者は、増幅候補領域に優先順位を設定した場合であって、その優先順位に従って、各増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計したときには、増幅候補領域に優先順位を設定しなかった場合に比べて、より多くの増幅候補領域に対してＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計することができる場合があることを示した。【０００６】
ところが、増幅候補領域に優先順位を設定した場合であっても、ＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計することができた増幅候補領域の数がそもそもジェノタイピングまたは染色体数定量などの解析に必要な領域数に比べて少なかったり、ＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計することができた増幅候補領域の数が解析に必要な領域数以上であっても、マルチプレックスＰＣＲを行った際にＰＣＲ増幅産物を得られた増幅対象領域の数が解析に必要な領域数に比べて少なかったりすることがあった。【０００７】
その際には、プライマーの設計をやり直すこととなるが、先に設定した優先順位がある意図に基づいたものである場合、その大局的特徴を変更しないことが望まれることがある。【０００８】
そこで、本発明は、増幅候補領域に優先順位を設定してプライマーを設計した結果、プライマーを設計することができた増幅候補領域の数が所望数に達しなかった場合に、先に設定した優先順位の大局的特徴を維持しながら、プライマーの設計をやり直すことができるマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プライマーの設計をやりなおす際に、増幅候補領域の優先順位を変更してプライマーの設計をやり直すことを知得し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は次の［１］〜［３］である。
［１］  ゲノムＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域に対して、第１番目から第ｎ番目までの順序である第１の優先順位を付ける、第１の優先順位設定工程と、
上記第１の優先順位の順序に従って、上記第１の優先順位が第１番目の増幅候補領域から、順次、その増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、第１のプライマー設計工程と、
上記第１のプライマー設計工程においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ個として、ｍ≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ＜ｔであるとき、次の工程に進む、と決定する、第１の成否判定工程と、
上記ｎ個の増幅候補領域に対して、第１番目から第ｎ番目までの順序であって、第１の優先順位の順序とは異なる、第２の優先順位を付ける、第２の優先順位設定工程と、
上記第２の優先順位の順序に従って、上記第２の優先順位が第１番目の増幅候補領域から、順次、その増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、第２のプライマー設計工程と、
を含む、ゲノム上のｎ個の増幅候補領域のうちｔ個以上の増幅候補領域を増幅するためのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
上記第２の優先順位設定工程は、
上記ｎ個の増幅候補領域の識別情報および第１の優先順位情報が入力手段を介して入力されて、記憶手段に記憶され、
演算手段が上記第１の優先順位の順序で並べて、上記ｎ個の増幅候補領域を要素とする第１の順列を作成して、記憶手段に記憶し、
演算手段が上記第１の優先順位の順序で並べた上記ｎ個の増幅候補領域を、ｉ番目のブロックがｋｉ個の増幅候補領域を含むように、ｊ個のブロックに分割して、記憶手段に記憶し、
演算手段が上記ｊ個のブロックのうち、少なくとも１つのブロックの内部で、そのブロックに含まれる増幅候補領域を並び替えて、記憶手段に記憶し、
演算手段が１番目からｊ番目までのブロックを順に結合して、ブロック分割を解除して、第２の順列を作成し、上記第２の順列に含まれる上記ｎ個の増幅候補領域の順序を上記ｎ個の増幅候補領域の第２の優先順位とする工程である、
ゲノム上のｎ個の増幅候補領域のうちｔ個以上の増幅候補領域を増幅するためのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
ただし、ｎはｎ≧４を満たす整数であり、ｔは２≦ｔ≦ｎを満たす整数であり、ｍは０≦ｍ≦ｎを満たす整数であり、ｉは１≦ｉ≦ｊを満たす整数であり、ｊは２≦ｊ≦ｎ／２を満たす整数であり、ｋｉは２≦ｋｉ≦｛ｎ−２×（ｊ−１）｝を満たす整数である。
［２］  上記第２のプライマー設計工程の後に、さらに、
上記第２のプライマー設計工程においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ’個として、ｍ’≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ’＜ｔであるとき、上記第２の優先順位設定工程に戻る、と決定する、第２の成否判定工程を
含む、上記［１］に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
［３］  上記第２の優先順位設定工程において、上記ブロック内で上記増幅候補領域の順序をランダムに変更する、請求項１または２に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、増幅候補領域に優先順位を設定してプライマーを設計した結果、プライマーを設計することができた増幅候補領域の数が所望数に達しなかった場合に、先に設定した優先順位の大局的特徴を維持しながら、プライマーの設計をやり直すことができるマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することができる。【００１２】
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法によれば、再設計前に比べて、ＰＣＲ増幅に用いるプライマーを設計することができる増幅候補領域の数を多くすることができる場合があり、そのときには、ジェノタイピングまたは染色体数定量などの解析に必要な領域数を確保できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明における優先順位設定工程において用いるハードウェアを表す概念図である。
【図２】図２は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法の全体像を説明するフロー図である。
【図３】図３は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法における、第２の優先順位の設定方法を具体例によって説明する図である。
【図４】図４は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法における、第１の優先順位または第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法の第１の態様を説明するフロー図である。
【図５】図５は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法における、第１の優先順位または第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法の第２の態様を説明するフロー図である。
【図６】図６は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法における、第１の優先順位または第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法の第３の態様を説明するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、ＡおよびＢについて「Ａ〜Ｂ」はＡおよびＢを含む範囲を表す。
また、本発明において、増幅候補領域は、ゲノムＤＮＡ上の領域であって、ジェノタイピングまたは染色体数定量などの目的のためにＰＣＲ増幅する候補の領域をいうものとする。
【００１５】
以下では、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法について、適宜図を参照しながら、詳細に説明する。
【００１６】
［ハードウェア（実行装置）］
本発明における優先順位の設定方法を実行する装置（「ハードウェア」または「実行装置」ともいう。）について、図１を参照しながら説明する。
本発明において、優先順位の設定は、演算手段（ＣＰＵ；Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ，中央演算処理装置）１１、記憶手段（メモリ）１２、補助記憶手段（ストレージ）１３、入力手段（キーボード）１４、および表示手段（モニタ）１６を備えるハードウェア（装置）によって行われる。この装置は、さらに、補助入力手段（マウス）１５、および出力手段（プリンタ）１７等を備えていてもよい。
それぞれの手段について説明する。
入力手段（キーボード）１４は、装置に指示およびデータ等を入力する手段である。補助入力手段（マウス）１５は、入力手段（キーボード）１４に代えて、またはそれとともに、用いられる。
演算手段（ＣＰＵ）１１は、演算処理を行う手段である。
記憶手段（メモリ）１２は、演算手段（ＣＰＵ）１１の演算処理の結果を記憶したり、入力手段（キーボード）１４からの入力を記憶したりする手段である。
補助記憶手段（ストレージ）１３は、オペレーティングシステム、必要ローカス数を決定するためのプログラムなどを保存するストレージである。補助記憶手段（ストレージ）１３は、その一部を記憶手段（メモリ）１２を拡張するために用いることもできる（仮想メモリ）。
【００１７】
［マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法］
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法は、以下の工程を含む。
（１）  ゲノムＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域に対して、第１番目から第ｎ番目までの順序である第１の優先順位を付ける、第１の優先順位設定工程（図２の「第１の優先順位設定」）。ただし、ｎはｎ≧４を満たす整数である。
（２）  上記第１の優先順位の順序に従って、上記第１の優先順位が第１番目の増幅候補領域から、順次、その増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、第１のプライマー設計工程（図２の「第１のプライマー設計」）。
（３）  上記第１のプライマー設計工程においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ個として、ｍ≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ＜ｔであるとき、次の工程に進む、と決定する、第１の成否判定工程（図２の「プライマーを設計できた増幅候補領域の数ｍ」）。ただし、ｔは２≦ｔ≦ｎを満たす整数であり、ｍは０≦ｍ≦ｎを満たす整数である。
（４）  上記ｎ個の増幅候補領域に対して、第１番目から第ｎ番目までの順序であって、第１の優先順位の順序とは異なる、第２の優先順位を付ける、第２の優先順位設定工程（図２の「第２の優先順位設定」）。
（５）  上記第２の優先順位の順序に従って、上記第２の優先順位が第１番目の増幅候補領域から、順次、その増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、第２のプライマー設計工程（図２の「第２のプライマー設計」）。
さらに、所望により、次の工程を含んでもよい。
（６）  上記第２のプライマー設計工程においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ’個として、ｍ’≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ’＜ｔであるとき、上記第２の優先順位設定工程に戻る、と決定する、第２の成否判定工程（図２の「プライマーを設計できた増幅候補領域の数ｍ’」）。
以下では、各工程について説明する。
【００１８】
〈第１の優先順位設定工程Ｓ１１〉
図２中に「第１の優先順位設定工程」として示す。
第１の優先順位設定工程Ｓ１１では、ｎ個の増幅候補領域に対して、それぞれ、重複することなく、１番目からｎ番目までの順序を付ける。この順序は、プライマーを設計する際の順序となる。
この順序の付け方は、特に限定されるものではないが、例えば、以下のような方法がある。
【００１９】
《第１の優先順位の設定方法の具体例（１）》
同一染色体ＤＮＡ上のｎ箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段１２に記憶される。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ−ｊをｒｉ−ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、上記中点の座標値ｒｉ−ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する。
上記優先順位ｋ位を付ける工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
これにより、第１の優先順位を設定することができる。
【００２０】
優先順位の設定は、次のとおりとしてもよい。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する。
【００２１】
ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ−１、１≦ｊ≦ｋ−１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
【００２２】
上記優先順位の設定方法の具体例（１）は以下のように説明できる。
上記ｎ箇所の増幅候補領域において、最小の座標値ｒｍｉｎを持つ増幅候補領域をＲｍｉｎとし、最大の座標値ｒｍａｘを持つ増幅候補領域をＲｍａｘとする。
まず、上記増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒｍａｘの２つの増幅候補領域のうち、一方に優先順位１位を付ける。すなわち、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位１位をつけるか、または、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位１位を付けることとなる。
【００２３】
次に、上記増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒｍａｘの２つの増幅候補領域のうち、上記優先順位１位を付けた一方を除く他方に優先順位２位を付ける。すなわち、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位１位をつけたときは、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位２位を付けることとなり、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位１位を付けたときは、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位２位を付けることとなる。
【００２４】
さらに、３個目以降ｈ個目の増幅候補領域については、既に１位から（ｈ−１）位までの優先順位が付けられているものとして、優先順位ｐ位が付けられた増幅候補領域Ｒｐおよび優先順位ｑ位が付けられた増幅候補領域Ｒｑの中点の座標値（ｒｐ＋ｒｑ）／２に最も近い座標値を持つ増幅候補領域に優先順位ｈ位を付ける。ここで、ｒｐおよびｒｑは、それぞれ、増幅候補領域Ｒｐおよび増幅候補領域Ｒｑの座標値である。
【００２５】
増幅候補領域Ｒｐおよび増幅候補領域Ｒｑの組合せが２組以上存在する場合は、無作為に１組を選択してもよいが、座標値が小さい方を優先する、または座標値が大きい方を優先する等のポリシーを採用してもよい。
【００２６】
座標値（ｒｐ＋ｒｑ）／２に最も近い座標値を持つ増幅候補領域が２箇所存在する場合は、無作為に１箇所を選択してもよいが、座標値が小さい方を優先する、または座標値が大きい方を優先する等のポリシーを採用してもよい。
【００２７】
なお、上記増幅候補領域Ｒｐおよび上記増幅候補領域Ｒｑの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在する。また、Ｒ１は優先順位１位が付けられたＲｍｉｎまたはＲｍａｘであり、Ｒ２は優先順位２位が付けられたＲｍｉｎまたはＲｍａｘである。
【００２８】
ｈは３≦ｈ≦ｎを満たす整数である。
ｐおよびｑは、１≦ｐ≦ｈ−１、１≦ｑ≦ｈ−１、かつ、ｐ≠ｑである。
ｒｐおよびｒｑはｒｍｉｎ≦ｒｐ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｑ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｐ≠ｒｑである。
【００２９】
第ｈの優先順位設定工程は、ｈ＝３からｈ＝ｎまで逐次繰り返す。
優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。
【００３０】
なお、増幅候補領域に対する優先順位の設定は、優先順位に重複が生じないように行う。
【００３１】
《第１の優先順位の設定方法の具体例（２）》
同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段１２に記憶される。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ−１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ−１および座標値ｒｋ−１を検索し、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔを算出し、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ−１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段１２に記憶し、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段１２に記憶し、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段１２に記憶する。
上記優先順位ｋ位を付ける工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
これにより、第１の優先順位を設定することができる。
【００３２】
優先順位の設定は次のとおりとしてもよい。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する。
【００３３】
ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ−１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
【００３４】
第１の優先順位の設定方法の具体例（２）は以下のように説明できる。
上記ｎ箇所の増幅候補領域において、最小の座標値ｒｍｉｎを持つ増幅候補領域をＲｍｉｎとし、最大の座標値ｒｍａｘを持つ増幅候補領域をＲｍａｘとする。
【００３５】
まず、上記増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒｍａｘの２つの増幅候補領域の間に存在し、ｒｍｉｎ≦ｒ１≦ｒｍａｘを満たす座標値ｒ１を持つ増幅候補領域Ｒ１に優先順位１位を付ける。すなわち、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位１位をつけてもよいし、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位１位を付けてもよいし、増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび増幅候補領域Ｒｍａｘのいずれとも異なる増幅候補領域に優先順位１位を付けてもよい。
Ｒ１の座標値ｒ１は、ｒｍｉｎ≦ｒ１≦ｒｍａｘを満たす限り、特に限定されないが、好ましくはｒ１＝ｒｍｉｎまたはｒ１＝ｒｍａｘであり、より好ましくはｒ１＝ｒｍｉｎである。
【００３６】
さらに、既に１位から（ｈ−１）位までの優先順位が付けられているものとして、所定の条件を満たす増幅候補領域に優先順位ｈ位を付ける。
上記所定の条件を満たす増幅候補領域は、以下のようにして決定される。
優先順位（ｈ−１）位が付けられた増幅候補領域Ｒｈ−１の座標値をｒｈ−１とし、それに閾値ｓを足した値「Ｓ＝ｒｈ−１＋ｓ」を考える。ここで、ｓはｓ＞０を満たす実数であり、本発明において「閾値」という場合がある。
増幅候補領域の座標値の最大値はｒｍａｘであることから、次の（１）および（２）の２つの場合に分けられる。
（１）Ｓ＝ｒｈ−１＋ｓ≦ｒｍａｘである場合
（２）Ｓ＝ｒｈ−１＋ｓ＞ｒｍａｘである場合
【００３７】
さらに、上記（１）の場合は、座標値ｒｈ−１＋ｓとｒｍａｘの間にまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するか否かにより、次の（１）−１および（１）−２の２つの場合に分けられる。
（１）−１  まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在する場合
（１）−２  まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在しない場合
【００３８】
上記（１）−１に該当する場合は、座標値が（ｒｈ−１＋ｓ）以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｈ位を付ける。
この場合においては、ｓは優先順位（ｈ−１）位の増幅候補領域Ｒｈ−１と優先順位ｈ位の増幅候補領域Ｒｈとの間の距離を表す。ｓが大きいほど、Ｒｈ−１とＲｈとの間の距離も大きくなり、通常、互いに及ぼす影響は小さくなる。
【００３９】
上記（１）−２または上記（２）に該当する場合は、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｈ位を付ける。
【００４０】
ｈは２≦ｈ≦ｎを満たす整数である。
ｓはｓ＞０を満たす実数であり、染色体ＤＮＡサイズ、または増幅候補領域の座標などに応じて適宜設定することができるが、好ましくは１００，０００以上、より好ましくは１，０００，０００以上、さらに好ましくは５，０００，０００以上である。
【００４１】
第ｈの優先順位設定工程は、ｈ＝２からｈ＝ｎまで逐次繰り返す。
優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。
【００４２】
なお、増幅候補領域に対する優先順位の設定は、優先順位に重複が生じないように行う。
【００４３】
〈第１のプライマー設計工程Ｓ１２／第２のプライマー設計工程Ｓ２２〉
図２中に「第１のプライマー設計工程」および「第２のプライマー設計工程」として示す。
後述する「第１の優先順位または第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法」において説明する。
なお、第１のプライマー設計工程においては、途中で、第１の優先順位を設定してもよい。例えば、後述する「第１の優先順位または第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法」で説明する第３の態様では、ｎ個の増幅候補領域のすべてに対してプライマー候補の塩基配列を設計した後、第１の優先順位を設定し、その順序で、逐次、プライマー候補からプライマーの選抜を行ってもよい。
【００４４】
〈第１の成否判定工程Ｓ１３／第２の成否判定工程Ｓ２３〉
図２中に「プライマーを設計できた増幅候補領域の数ｍ」および「プライマーを設計できた増幅候補領域の数ｍ’」として示す。
第１の成否判定工程Ｓ１３では、第１のプライマー設計工程Ｓ１２においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ個として、ｍ≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ＜ｔであるとき、次の工程に進む、と決定する。
第２の成否判定工程Ｓ２３では、第２のプライマー設計工程Ｓ２２においてプライマーを設計することができた増幅候補領域の数をｍ’個として、ｍ’≧ｔであるとき、プライマーの設計を終了し、ｍ’＜ｔであるとき、次の工程に進む、と決定する。
ｔは２≦ｔ≦ｎを満たす整数である。ｔの値は、プライマーを設計することができた増幅候補領域の目標値であり、ジェノタイピングまたは染色体数定量などの解析の目的に合わせて、適宜設定することができる。
ｍは０≦ｍ≦ｎを満たす整数であり、ｍ’は０≦ｍ’≦ｎを満たす整数である。ｍおよびｍ’の値は、第１のプライマー設計工程Ｓ１２または第２のプライマー設計工程Ｓ２２でプライマーを設計することができた増幅候補領域の実績値である。本発明では、ｍ＜ｔであった場合に、ｍ’≧ｔとなるように、プライマーを設計しなおす。
【００４５】
〈第２の優先順位設定工程Ｓ２１〉
図２中に「第２の優先順位設定工程」として示す。
第２の優先順位設定工程Ｓ２１は、ｎ個の増幅候補領域の識別情報および第１の優先順位情報を入力手段を介して入力し、記憶手段１２に記憶する工程と、演算手段１１が上記ｎ個の増幅候補領域からなる群からｎ個の増幅候補領域を取り出して上記第１の優先順位の順序で並べて、上記ｎ個の増幅候補領域を要素とする第１の順列を作成して、記憶手段１２に記憶する工程と、演算手段１１が上記第１の優先順位の順序で並べた上記ｎ個の増幅候補領域を、ｉ番目のブロックがｋｉ個の増幅候補領域を含むように、ｊ個のブロックに分割し、記憶手段１２に記憶する工程、演算手段１１が上記ｊ個のブロックのうち、少なくとも１つのブロックの内部で、そのブロックに含まれる増幅候補領域を並び替え、記憶手段１２に記憶する工程と、演算手段１１が１番目からｊ番目までのブロックを順に結合して、ブロック分割を解除し、記憶手段１２に記憶する工程と、演算手段１１が上記ｎ個の増幅候補領域を要素とする第２の順列を作成し、記憶手段１２に記憶する工程と、を含む、上記第２の順列に含まれる上記ｎ個の増幅候補領域の順序を上記ｎ個の増幅候補領域の第２の優先順位とする工程である。
ただし、ｎはｎ≧４を満たす整数であり、ｔは２≦ｔ≦ｎを満たす整数であり、ｍは０≦ｍ≦ｎを満たす整数であり、ｉは１≦ｉ≦ｊを満たす整数であり、ｊは２≦ｊ≦ｎ／２を満たす整数であり、ｋｉは２≦ｋｉ≦｛ｎ−２×（ｊ−１）｝を満たす整数である。
【００４６】
第２の優先順位設定工程Ｓ２１においては、上記ブロック内で上記増幅候補領域の順序を変更する方法は特に限定されないが、ランダムシャッフリングまたはランダムパーミュテーションなどにより、ランダムに変更することが好ましい。また、１つのブロックに含まれる増幅候補領域の数は有限であるから、有限要素からランダムな順列を生成するアルゴリズムを利用することができる。このようなアルゴリズムとしては、例えば、フィッシャー−イェーツのシャッフルが挙げられる。
【００４７】
また、増幅候補領域を分割するブロックの数は、２個以上であれば特に限定されないが、１０個程度とすることが好ましい。
【００４８】
また、１つのブロックに含まれる増幅候補領域の数は、２個以上であれば特に限定されないが、増幅候補領域の総数の１／１０程度であることが好ましい。また、各ブロックに含まれる増幅候補領域の数の差は、１〜５個以内であることが好ましく、１〜３個以内であることがより好ましい。
【００４９】
《第２の優先順位設定工程の具体例に基づく説明》
以下では、図３を参照しながら、第２の優先順位設定工程Ｓ２１についてより具体的に説明する。なお、この具体例に限定されるものではない。
図３（ａ）にＸ１〜Ｘ９の９個の増幅候補領域を示す。
まず、図３（ｂ）に示すように、第１の優先順位に従ってＸ１〜Ｘ９の９個の増幅候補領域を並べる。ここでは、優先順位が座標値が小さい順に付けられているため、Ｘ１〜Ｘ９の順序で並べられる。
次に、図３（ｃ）に示すように、Ｘ１〜Ｘ９の９個の増幅候補領域を、１つのブロックが３つの増幅候補領域を含むように、３つのブロックに分割する。ここでは、１番目のブロックがＸ１〜Ｘ３の３個の増幅候補領域を、２番目のブロックがＸ４〜Ｘ６の３個の増幅候補領域を、３番目のブロックがＸ７〜Ｘ９の３個の増幅候補領域を、それぞれ含むように分割する。
次に、図３（ｄ）に示すように、各ブロック内で、増幅候補領域の順序を変更する。
次に、図３（ｅ）に示すように、各ブロックの順序を変更することなく、ブロック分割を解除して、増幅候補領域の新しい順列を得る。この順列に示される順位が第２の優先順位である。
【００５０】
［第１の優先順位または第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法］
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、第１の優先順位または第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法（以下、単に「優先順位設定後プライマー設計方法」）は、特に限定されるものではないが、以下に説明する３つの態様から選択することが好ましい。この場合、第１の優先順位を設定した後のプライマー設計方法と第２の優先順位を設定した後のプライマー設計方法とは、同じ態様であってもよいし、異なる態様であってもよい。
【００５１】
〈優先順位設定後プライマー設計方法の第１の態様〉
優先順位設定後プライマー設計方法の第１の態様（単に「第１の態様」という場合がある。）は、以下の（ａ）対象領域選択工程と、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程と、（ｃ）ローカルアラインメント工程と、（ｄ）第一段階選抜工程と、（ｅ）グローバルアラインメント工程と、（ｆ）第二段階選抜工程と、（ｇ）プライマー採用工程とを含む。
【００５２】
（ａ）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位の順に対象領域を選択する、対象領域選択工程。
（ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程。
（ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
（ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程。
（ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
（ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程。
（ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程。
【００５３】
ただし、上記（ａ）工程〜上記（ｇ）工程のうち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程の両工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行った後、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行ってもよいし、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行ってもよいし、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行ってもよい。
【００５４】
上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行う場合には、上記（ｅ）工程および上記（ｃ）工程は、それぞれ、下記（ｅ’）工程および下記（ｃ’）工程とすることが好ましい。
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
（ｃ’）上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
【００５５】
また、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ）工程は、下記（ｅ’）工程とすることが好ましい。
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
【００５６】
〈優先順位設定後プライマー設計方法の第２の態様〉
優先順位設定後プライマー設計方法の第２の態様（単に「第２の態様」という場合がある。）は、以下の（ａ１）対象領域選択第１工程と、（ｂ１）プライマー候補塩基配列作成第１工程と、（ｃ１）ローカルアラインメント第１工程と、（ｄ１）第一段階選抜第１工程と、（ｅ１）グローバルアラインメント第１工程と、（ｆ１）第二段階選抜第１工程と、（ｇ１）プライマー採用第１工程と、（ａ２）対象領域選択第２工程と、（ｂ２）プライマー候補塩基配列作成第２工程と、（ｃ２）ローカルアラインメント第２工程と、（ｄ２）第一段階選抜第２工程と、（ｅ２）グローバルアラインメント第２工程と、（ｆ２）第二段階選抜第２工程と、（ｇ２）プライマー採用第２工程と、を含む。
【００５７】
（ａ１）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第１の対象領域として選択する、対象領域選択第１工程。
（ｂ１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程。
（ｃ１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
（ｄ１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程。
（ｅ１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
（ｆ１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程。
（ｇ１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程。
【００５８】
（ａ２）優先順位が設定された増幅候補領域のうちまだ選択されていない増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第２の対象領域として選択する、対象領域選択第２工程。
（ｂ２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程。
（ｃ２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
（ｄ２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程。
（ｅ２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｆ２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程。
（ｇ２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程。
【００５９】
ただし、上記（ａ１）工程〜上記（ｇ１）工程のうち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程の両工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行った後、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００６０】
上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行う場合には、上記（ｅ１）工程および上記（ｃ１）工程は、それぞれ、下記（ｅ１’）工程および下記（ｃ１’）工程とすることが好ましい。
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
（ｃ１’）上記第二段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
【００６１】
また、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ１）工程は、下記（ｅ１’）工程とすることが好ましい。
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
【００６２】
ただし、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程のうち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程の両工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行った後、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行ってもよい。
【００６３】
上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行う場合には、上記（ｅ２）工程および上記（ｃ２）工程は、それぞれ、下記（ｅ２’）工程および下記（ｃ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｃ２’）上記第二段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
【００６４】
また、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ２）工程は、下記（ｅ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
【００６５】
さらに、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程までの各工程を繰り返す。
【００６６】
〈優先順位設定後プライマー設計方法の第３の態様〉
優先順位設定後プライマー設計方法の第３の態様（単に「第３の態様」という場合がある。）は、以下の（ａ−０）対象領域複数選択工程と、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程と、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程と、（ｄ−１）第１の第一段階選抜工程と、（ｅ−１）第１のグローバルアラインメント工程と、（ｆ−１）第１の第二段階選抜工程と、（ｇ−１）第１のプライマー採用工程と、（ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程と、（ｄ−２）第２の第一段階選抜工程と、（ｅ−２）第２のグローバルアラインメント工程と、（ｆ−２）第２の第二段階選抜工程と、（ｇ−２）第２のプライマー採用工程と、を含む。
【００６７】
（ａ−０）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が高い順に複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程。
（ｂ−０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程。
【００６８】
（ｃ−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
（ｄ−１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程。
（ｅ−１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｆ−１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程。
（ｇ−１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程。
【００６９】
（ｃ−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
（ｄ−２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程。
（ｅ−２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
（ｆ−２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程。
（ｇ−２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程。
【００７０】
ただし、上記（ｃ−１）工程〜上記（ｇ−１）工程のうち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程の両工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行った後、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００７１】
上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行う場合には、上記（ｅ−１）工程および上記（ｃ−１）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−１）工程および下記（ｃ’−１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｃ’−１）上記第１の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
【００７２】
また、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−１）工程は、下記（ｅ’−１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
【００７３】
ただし、上記（ｃ−２）工程〜上記（ｇ−２）工程のうち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程の両工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行った後、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００７４】
上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行う場合には、上記（ｅ−２）工程および上記（ｃ−２）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−２）工程および下記（ｃ’−２）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
（ｃ’−２）上記第２の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
【００７５】
また、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−２）工程は、下記（ｅ’−２）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
【００７６】
さらに、上記少なくとも１つの増幅候補領域が３つ以上の増幅候補領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、優先順位３位以降の第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す。
【００７７】
〈各工程の説明〉
優先順位設定後プライマー設計方法の第１〜第３の態様について、適宜、図４〜図６を参照しながら、各工程を説明する。
【００７８】
《対象領域選択工程》
本明細書において、対象領域選択工程Ｓ１０１（図４）、対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１（図５）、ならびに対象領域複数選択工程Ｓ３０１（図６）を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。
【００７９】
（第１の態様：  対象領域選択工程Ｓ１０１）
図４において「対象領域選択」として示す。
第１の態様において、（ａ）対象領域選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位の順に対象領域を選択する工程である。
【００８０】
（第２の態様：  対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１）
図５において、「対象領域選択第１」および「対象領域選択第２」として示す。
第２の態様において、（ａ１）対象領域選択第１工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第１の対象領域として選択する工程であり、（ａ２）対象領域選択第２工程は、優先順位が設定された増幅候補領域のうちまだ選択されていない増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第２の対象領域として選択する工程である。
第２の態様では、増幅候補領域を優先順位の順に１つずつ選択する。
【００８１】
（第３の態様：  対象領域複数選択工程Ｓ３０１）
図６において、「対象領域複数選択」として示す。
第３の態様において、（ａ−０）対象領域複数選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が高い順に複数の対象領域を選択する工程である。
第３の態様では、増幅候補領域を優先順位の順に複数個選択する。好ましくは、優先順位が設定された全ての増幅候補領域を選択する。
【００８２】
《プライマー候補塩基配列作成工程》
プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２（図４）、プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２（図５）、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２（図６）を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成工程」という場合がある。
【００８３】
（第１の態様：  プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２）
図４において「プライマー候補塩基配列作成」として示す。
第１の態様において、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
【００８４】
（第２の態様：  プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２）
図５において「プライマー候補塩基配列作成第１」および「プライマー候補塩基配列作成第２」として示す。
第２の態様において、（ｂ１）プライマー候補塩基配列作成第１工程は、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程であり、（ｂ２）プライマー候補塩基配列作成第２工程は、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
第２の態様では１つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の１つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。
【００８５】
（第３の態様：  プライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２）
図６において「プライマー候補塩基配列複数作成」として示す。
第３の態様において、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する。
第３の態様では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。
【００８６】
（近傍領域）
対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の５’端から外側の領域、および対象領域の３’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
【００８７】
（プライマーの設計パラメータ）
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、融解温度（２本鎖ＤＮＡの５０％が解離して１本鎖ＤＮＡになる温度をいう。また、Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅに由来し、「Ｔｍ値」という場合もある。単位は「℃」である。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
【００８８】
・プライマーの長さ
プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
【００８９】
・プライマーのＧＣ含量
プライマーのＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
【００９０】
・プライマーのＴｍ値
プライマーのＴｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
プライマーのＴｍ値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下とする。
Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
【００９１】
・プライマーの塩基の偏り
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
【００９２】
・プライマーの３’末端
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
【００９３】
《特異性チェック工程》
「プライマー候補塩基配列作成工程」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体ＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
特異性のチェックは、染色体ＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体ＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、染色体ＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。
【００９４】
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
【００９５】
スコア、およびローカルアラインメント・スコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアとして、マッチ（相補塩基）＝＋１、ミスマッチ（非相補塩基）＝−１、インデル（挿入および／または欠失）＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定すること等が考えられる。
【００９６】
プライマー候補の塩基配列が染色体ＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、対象領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
【００９７】
《ローカルアラインメント工程》
本明細書において、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３（図４）、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３（図５）、ならびに第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３（図６）を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。
【００９８】
（第１の態様：  ローカルアラインメント工程Ｓ１０３）
図４において「ローカルアラインメント」として示す。
第１の態様において、（ｃ）ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【００９９】
（第２の態様：  ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３）
図５において「ローカルアラインメント第１」および「ローカルアラインメント第２」として示す。
第２の態様において、（ｃ１）ローカルアラインメント第１工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ２）ローカルアラインメント第２工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１００】
（第３の態様：  第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３）
図６において「第１のローカルアラインメント」および「第２のローカルアラインメント」として示す。
第３の態様において、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１０１】
（ローカルアラインメントの方法）
ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をｐ個として、重複を許して選択した場合は、「ｐＨ２＝ｐ＋１Ｃ２＝（ｐ＋１）！／２（ｐ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｐＣ２＝ｐ（ｐ−１）／２」通りである。
【０１０２】
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。
さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１０３】
【表１】
2018061699.tif 000003
【０１０４】
例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
【０１０５】
【表２】
2018061699.tif 000004
【０１０６】
配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
【０１０７】
【表３】
2018061699.tif 000005
【０１０８】
表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。なお、表４中、マッチを「｜」で、ミスマッチを「：」で、それぞれ示す。
【０１０９】
【表４】
2018061699.tif 000006
【０１１０】
この（ペアワイズ）アラインメントには、マッチが９か所あり、ミスマッチが８か所あり、インデル（ギャップ）はない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、（＋１）×９＋（−１）×８＋（−１）×０＝＋１となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１１１】
《第一段階選抜工程》
本明細書において、第一段階選抜工程Ｓ１０４（図４）、第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４（図５）、ならびに第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４（図６）を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。
【０１１２】
（第１の態様：  第一段階選抜工程Ｓ１０４）
図４において「第一段階選抜」として示す。
第１の態様において、（ｄ）第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１１３】
（第２の態様：  第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４）
図５において「第一段階選抜第１」および「第一段階選抜第２」として示す。
第２の態様において、（ｄ１）第一段階選抜第１工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ２）第一段階選抜第２工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１１４】
（第３の態様：  第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４）
図６において「第１の第一段階選抜」および「第２の第一段階選抜」として示す。
第３の態様において、（ｄ−１）第１の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ−２）第２の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１１５】
（第１段階選抜の方法）
ローカルアラインメント・スコアの閾値（「第１の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
【０１１６】
ここで、上記「ローカルアラインメント」に示した例において、第１の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であり、第１の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１１７】
なお、本工程は、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３、ローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３、第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３、または第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３においてローカルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【０１１８】
《グローバルアラインメント工程》
本明細書において、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５（図４）、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５（図５）、ならびに第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５（図６）を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。
【０１１９】
（第１の態様：  グローバルアラインメント工程Ｓ１０５）
図４において「グローバルアラインメント」として示す。
第１の態様において、（ｅ）グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１２０】
（第２の態様：  グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５）
図５において「グローバルアラインメント第１」および「グローバルアラインメント第２」として示す。
第２の態様において、（ｅ１）グローバルアラインメント第１工程は、上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ２）グローバルアラインメント第２工程は、上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１２１】
（第３の態様：  第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５）
図６において「第１のグローバルアラインメント」および「第２のグローバルアラインメント」として示す。
第３の態様において、（ｅ−１）第１のグローバルアラインメント工程は、上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ−２）第２のグローバルアラインメント工程は、上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１２２】
（グローバルアラインメントの方法）
グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成工程」で作成したプライマー候補の全部（「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。）および既に採用したプライマーの全部（既に採用したプライマーが存在する場合に限る。）からなる群から２つのプライマーを取り出して、３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。
【０１２３】
グローバルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「ｘＨ２＝ｘ＋１Ｃ２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｘＣ２＝ｘ（ｘ−１）／２」通りである。
【０１２４】
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１２５】
例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字箇所）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
【０１２６】
【表５】
2018061699.tif 000007
【０１２７】
スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。なお、表６中、ミスマッチを「：」で示す。
【０１２８】
【表６】
2018061699.tif 000008
【０１２９】
この（ペアワイズ）アラインメントには、ミスマッチが３か所あり、マッチおよびインデル（ギャップ）はいずれもない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、（＋１）×０＋（−１）×３＋（−１）×０＝−３となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１３０】
《第二段階選抜工程》
本明細書において、第二段階選抜工程Ｓ１０６（図４）、第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６（図５）、ならびに第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６（図６）を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。
【０１３１】
（第１の態様：  第二段階選抜工程Ｓ１０６）
図４において「第二段階選抜」として示す。
第１の態様において、（ｆ）第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１３２】
（第２の態様：  第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６）
図５において「第二段階選抜第１」および「第二段階選抜第２」として示す。
第２の態様において、（ｆ１）第二段階選抜第１工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ２）第二段階選抜第２工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１３３】
（第３の態様：  第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６）
図６において「第１の第二段階選抜」および「第２の第二段階選抜」として示す。
第３の態様において、（ｆ−１）第１の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ−２）第２の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１３４】
（第二段階選抜の方法）
グローバルアラインメント・スコアの閾値（「第２の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
【０１３５】
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアを第２の閾値未満とすることができる。
【０１３６】
ここで、上記「グローバルアラインメント工程」に示した例において、第２の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であり、第２の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１３７】
なお、本工程は、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５、グローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５、第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５、または第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５においてグローバルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【０１３８】
また、計算量を低減させるため、「グローバルアラインメント工程」および「第２段階選抜工程」の両工程を先に実施して、「第２段階選抜工程」を通過したプライマーの塩基配列の組合せに対して、「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」の両工程を実施することが好ましい。特に、対象領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【０１３９】
これは、「グローバルアラインメント工程」では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメント・スコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
【０１４０】
《増幅配列長チェック工程》
「第１段階選抜工程」および「第２段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
【０１４１】
《プライマー採用工程》
本明細書において、プライマー採用工程Ｓ１０７（図４）、プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７（図５）、ならびに第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７（図６）を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。
【０１４２】
（第１の態様：  プライマー採用工程Ｓ１０７）
図４において「プライマー採用」として示す。
第１の態様において、（ｇ）プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１４３】
（第２の態様：  プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７）
図５において「プライマー採用第１」および「プライマー採用第２」として示す。
第２の態様において、（ｇ１）プライマー採用第１工程は、上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ２）プライマー採用第２工程は、上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１４４】
（第３の態様：  第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７）
図６において「第１のプライマー採用」および「第２のプライマー採用」として示す。
第３の態様において、（ｇ−１）第１のプライマー採用工程は、上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ−２）第２のプライマー採用工程は、上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１４５】
（プライマー採用の方法）
プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
【０１４６】
例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
【０１４７】
【表７】
2018061699.tif 000009
【０１４８】
既に記載したように、配列番号１と配列番号２の組合せにおいて、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であるから、第１の閾値である「＋３」未満であり、また、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であるから、第２の閾値である「＋３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
【０１４９】
《他の増幅候補領域のプライマー設計》
１つの増幅候補領域に対してプライマーを採用した後、さらに次の優先順位の増幅候補領域に対してプライマーを設計してもよい。
第１の態様においては、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３から行う。次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の優先順位の増幅候補領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の優先順位の増幅候補領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、その増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３以降を行う。
第２の態様においては、対象領域選択第２工程Ｓ２１１から繰り返す。
第３の態様において、既に対象領域複数選択工程Ｓ３０１において選択した増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２において作成されているため、第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３から繰り返す。
【０１５０】
《プライマー等の設計における特徴点》
増幅候補領域に優先順位を付けた後のプライマー等の設計における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。
【実施例】
【０１５１】
［実施例１］
表８に示す増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計する。
本実施例では、８５箇所中、５３箇所以上の増幅候補領域に対してプライマーを設計することを目的とする。【０１５２】
【表８】
2018061699.tif 000010
【０１５３】
（第１の優先順位の設定）
表８に示す増幅候補領域Ｖ１〜Ｖ８５の座標値順に第１の優先順位を設定した。【０１５４】
（第１の優先順位設定後のプライマー設計）
第１の優先順位に従って、各増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計したところ、以下の５２箇所の増幅候補領域に対してプライマーを設計することができた。【０１５５】
【表９】
2018061699.tif 000011
【０１５６】
（第２の優先順位の設定）
増幅候補領域Ｖ１〜Ｖ８５を、座標値順に、２０箇所の増幅候補領域を含むブロック４個と５個所の増幅候補領域を含むブロック１個、すなわち、Ｖ１〜Ｖ２０を含むブロック１、Ｖ２１〜Ｖ４０を含むブロック２、Ｖ４１〜Ｖ６０を含むブロック３、Ｖ６１〜Ｖ８０を含むブロック４、およびＶ８１〜Ｖ８５を含むブロック５に分割した。
次に、各ブロック内でランダムパーミュテーションを行い、ブロック内の各増幅候補領域の順序をランダムに変更した順列を得た。
ブロック１〜５をこの順序で結合し、ブロック分割を解除して、Ｖ１〜Ｖ８５の増幅候補領域の順序を並び替えた順列を得た。
このＶ１〜Ｖ８５の順序を第２の優先順位とした。【０１５７】
（第２の優先順位設定後のプライマー設計）
第２の優先順位に従って、各増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計したところ、以下の５４箇所の増幅候補領域に対してプライマーを設計することができた。【０１５８】
【表１０】
2018061699.tif 000012
【符号の説明】
【０１５９】
１１  演算手段（ＣＰＵ）
１２  記憶手段（メモリ）
１３  補助記憶手段（ストレージ）
１４  入力手段（キーボード）
１５  補助入力手段（マウス）
１６  表示手段（モニタ）
１７  出力手段（プリンタ）
【図１】
2018061699.tif 000013
【図２】
2018061699.tif 000014
【図３】
2018061699.tif 000015
【図４】
2018061699.tif 000016
【図５】
2018061699.tif 000017
【図６】
2018061699.tif 000018
【配列表】
2018061699000001.app
【国際調査報告】
2018061699.tif 000019
2018061699.tif 000020
2018061699.tif 000021
2018061699.tif 000022