【手続補正書】
【提出日】平成18年7月14日(2006.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光基質と過酸化水素とｐ−ヨードフェノールとを含む測定試薬をＨＲＰと反応させ、この反応時に測定された発光量に基づいてＨＲＰの濃度を測定するＨＲＰの測定方法において、
化学発光基質は8-Amino-5-chloro-7-phenylpyrido(3,4-d)pyridazine-1,4(2H,3H)dioneであること
を特徴とするＨＲＰ測定方法。
【請求項２】
前記測定試薬における化学発光基質の濃度を０．００３〜０．００６ｍｍｏｌ／ｌとすることを特徴とする請求項１記載のＨＲＰ測定方法。
【請求項３】
前記測定試薬における過酸化水素の濃度を０．２５〜０．７５ｍｍｏｌ／ｌとすることを特徴とする請求項１または２記載のＨＲＰ測定方法。
【請求項４】
前記測定試薬におけるｐ−ヨードフェノールの濃度を０．２９〜０．３５ｍｍｏｌ／ｌとすることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のＨＲＰ測定方法。
【請求項５】
試料中のＨＲＰ濃度を請求項１から４のいずれか１項に記載のＨＲＰ測定方法によって測定し、この測定結果に基づき大腸菌群を測定することを特徴とする大腸菌群測定方法。
【請求項６】
前記ＨＲＰ測定における発光量の測定時間を１〜３０秒間とすることを特徴とする請求項５記載の大腸菌群測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＨＲＰ測定方法及び大腸菌群測定方法。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光反応を利用したＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase））の測定方法、そして測定に基づき大腸菌群を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
図１０は化学発光反応を利用した従来の大腸菌群の測定方法を説明した概略説明図である。この測定方法は４つの工程を有する。先ず、固相調製工程では（図１０（１））、ポリエチレン製の試験管に第一抗体を入れて固相化する。次いで、第一反応工程では（図１０（２））、前記固相化した試験管に予め超音波破砕した試料（抗原：大腸菌群）を加えて、特異的な反応（抗原抗体反応）を起こし、固相化抗体に抗原を結合する。次に、第二反応工程では（図１０（３））、酵素を標識した抗体（第二抗体）を添加し、抗原抗体反応を行う。抗原抗体反応終了後、洗浄を行い、液相中に残留した酵素標識抗体を除去する（図１０（４））。次に、化学発光反応工程では（図１０（５））、前記試験管に化学測定試薬を加えて発光反応を起こす（図１０（６））。発光量は標識酵素量に比例し、標識酵素量は抗原量（大腸菌群数）に比例するので、測定された発光量から間接的に大腸菌群数の定量が行なえる。このように、本測定法は、抗原が固相化抗体と酵素標識抗体に挟まれた形態となっているので、サンドイッチ法と呼ばれている。
【０００３】
かかる測定法の化学発光工程では、ルミノール−過酸化水素系の化学発光法によって抗体への標識酵素である西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase以下、発明の詳細な説明においてＨＲＰと称す）を定量している（特許文献１）。化学発光測定の実施例を図１１に示した。かかる結果から明らかなように、本測定法によるＨＲＰ濃度の検出限界は１×１０-11（ｍｍｏｌ／ｌ）程度であることがわかる。
【特許文献１】特開平６−１６９７９７号公報（段落番号（０００８）〜（００１７）及び図１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記測定方法によるＨＲＰ濃度の検出限界は１×１０-11（ｍｍｏｌ／ｌ）程度であり、これを大腸菌群数に換算すると概ね１００００（個／ｍｌ）であるが、現場サイドにおいてはさらなる低濃度の大腸菌の検出が望まれている。
【０００５】
しかしながら、ルミノールと過酸化水素とを用いた化学発光測定に基づくＨＲＰの定量法では、１００００（個／ｍｌ）以下である低濃度領域の大腸菌群数の測定が困難である。
【０００６】
本発明は、かかる事情に鑑みなされたもので、その目的は低濃度のＨＲＰ及び大腸菌群を感度よく測定するＨＲＰ測定方法及び大腸菌群測定方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明のＨＲＰ測定方法は、化学発光基質と過酸化水素とｐ−ヨードフェノールとを含む測定試薬をＨＲＰと反応させ、この反応時に測定された発光量に基づいてＨＲＰの濃度を測定するＨＲＰの測定方法において、化学発光基質が8-Amino-5-chloro-7-phenylpyrido(3,4-d)pyridazine-1,4(2H,3H)dioneであることを特徴とする。
【０００８】
本発明のＨＲＰ測定方法によれば、化学発光基質にルミノールを用いたＨＲＰ測定方法よりも高いＳＮ比が得られるので、従来のＨＲＰ測定方法よりも感度良くＨＲＰを測定することができる。
【０００９】
特に、ＨＲＰ濃度が１×１０-14〜１×１０-10ｍｍｏｌ／ｌである領域におけるＳＮ比が従来の測定方法と比べ顕著に高くなる。したがって、前記ＨＲＰ濃度に対応した大腸菌群の測定を感度よく行なうことができる。例えば１００００個／ｍｌ以下、より具体的には例えば１０００〜１００００個／ｍｌの大腸菌群数を感度良く測定できる。このとき発光量の測定に際し、測定時間を１〜３０秒間とすると、ＳＮ比は最大となり、より一層感度よく大腸菌群の測定が行なえる。
【００１０】
また、ＨＲＰの測定に際し、測定試薬における化学発光基質の濃度は０．００３〜０．００６ｍｍｏｌ／ｌとするとよく、特に０．００５ｍｍｏｌ／ｌに設定すればＳＮ比は最大となる。さらに、前記測定試薬における過酸化水素の濃度は０．２５〜０．７５ｍｍｏｌ／ｌとするとよく、特に０．５０ｍｍｏｌ／ｌに設定すればＳＮ比は最大となる。また、前記測定試薬におけるｐ−ヨードフェノールの濃度は０．２９〜０．３５ｍｍｏｌ／ｌとするとよく、特に０．３０ｍｍｏｌ／ｌに設定すればＳＮ比は最大となる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＨＲＰ測定方法によれば、化学発光基質にルミノールを用いたＨＲＰ測定方法よりも高いＳＮ比が得られるので、従来のＨＲＰ測定方法よりも感度良くＨＲＰを測定することができる。特に、ＨＲＰ濃度が１０×１０-14〜１０×１０-10ｍｍｏｌ／ｌの領域におけるＳＮ比が従来の方法と比べ顕著に高くなる。したがって、この濃度領域に対応する大腸菌群の測定が感度よく行なえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１３】
（実施形態１）ＨＲＰの測定
発明者らは、ピリドピリダジン構造を有する化学発光基質8-Amino-5-chloro-7-phenylpyrido(3,4-d)pyridazine-1,4(2H,3H)dioneと過酸化水素とｐ−ヨードフェノールとを含有する測定試薬を用いた本発明のＨＲＰ測定方法の創出にあたり、先ず前記化学発光基質の測定試薬における最適な濃度の検討を行なった。ここでは、前記化学発光基質の濃度を変化させた測定試薬と既知濃度のＨＲＰ含有試料とを反応させて生じた発光反応をルミノメータ（ＵＰＤ−４０００（明電舎製））によって測定し、ＳＮ比を比較することで評価した。評価手順を以下に示した。
【００１４】
１）測定試薬の調製
8-Amino-5-chloro-7-phenylpyrido(3,4-d)pyridazine-1,4(2H,3H)dione sodium salt（和光純薬工業製codeNo.120-04891，以下、実施の形態においてＬ−０１２と称す）と過酸化水素とｐ−ヨードフェノールとをトリス緩衝液（０．０５ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ７．５）において以下の濃度となるように調製して測定試薬を得た。
【００１５】
Ｌ−０１２  0.002，0.005，0.01，0.05，0.1［ｍｍｏｌ／ｌ］
過酸化水素  0.5［ｍｍｏｌ／ｌ］
ｐ−ヨードフェノール  0.182［ｍｍｏｌ／ｌ］
２）発光量の測定とその評価  既知濃度１×１０-10［ｍｏｌ／ｌ］のＨＲＰ含有試料０．１ｍｌを前記調製した試薬１ｍｌと反応させた後にルミノメータ（ＵＰＤ−４０００（明電舎製））によって３０秒間発光量を測定した。そして、各測定値のＳＮ比を比較した。表１に各Ｌ−０１２濃度に対するＳＮ比を示した。
【００１６】
【表１】
2005052075.tif 000001
【００１７】
また、図１にＬ−０１２濃度とＳＮ比との関係を示した特性図を示した。かかる結果から明らかなように、Ｌ−０１２を用いた化学発光測定法に基づくＨＲＰ測定方法において、測定試薬におけるＬ−０１２の濃度は０．００３〜０．００６ｍｍｏｌ／ｌとするのが適当であり、特に０．００５（ｍｍｏｌ／ｌ）に設定するとＳＮ比が最大となることが確認できる。
【００１８】
次に、本発明のＨＲＰ測定方法に供される測定試薬に含まれる酸化剤である過酸化水素の最適な濃度について検討した。ここでは過酸化水素の濃度を変化させた測定試薬と既知濃度のＨＲＰとを反応させて生じた発光反応をルミノメータ（ＵＰＤ−４０００（明電舎製））によって測定し、ＳＮ比を比較することで評価した。評価手順を以下に示した。
【００１９】
１）測定試薬の調製  Ｌ−０１２と過酸化水素とｐ−ヨードフェノールとをトリス緩衝液（０．０５ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ７．５）において以下の濃度となるように調製して測定試薬を得た。
【００２０】
Ｌ−０１２  0.005［ｍｍｏｌ／ｌ］
過酸化水素  0.05，0.1，0.25，0.5，1.0［ｍｍｏｌ／ｌ］
ｐ−ヨードフェノール  0.182［ｍｍｏｌ／ｌ］
２）発光量の測定とその評価  既知濃度１×１０-10［ｍｏｌ／ｌ］のＨＲＰ含有試料０．１ｍｌを前記調製した測定試薬１ｍｌと反応させた後にルミノメータ（ＵＰＤ−４０００（明電舎製））によって３０秒間発光量測定した。そして、各測定値のＳＮ比を比較した。表２に各過酸化水素濃度に対するＳＮ比を示した。
【００２１】
【表２】
2005052075.tif 000002
【００２２】
また、図２に過酸化水素濃度とＳＮ比との関係を示した特性図を示した。かかる結果から明らかなように、Ｌ−０１２を用いた化学発光測定法に基づくＨＲＰ測定方法において、測定試薬における過酸化水素の濃度は０．２５〜０．７５ｍｍｏｌ／ｌとするのが適当であり、特に０．５０（ｍｍｏｌ／ｌ）に設定するとＳＮ比が最大となることが確認できる。
【００２３】
次に、本発明のＨＲＰ測定方法に供される測定試薬に含まれるエンハンサーであるｐ−ヨードフェノールの最適な濃度について検討した。ここではｐ−ヨードフェノール濃度を変化させた測定試薬と既知濃度のＨＲＰとを反応させて生じた発光反応をルミノメータ（ＵＰＤ−４０００（明電舎製））により測定し、ＳＮ比を比較することで評価した。評価手順を以下に示した。
【００２４】
１）測定試薬の調製  Ｌ−０１２と過酸化水素とｐ−ヨードフェノールとをトリス緩衝液（０．０５ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ７．５）において以下の濃度となるように調製して測定試薬を得た。
【００２５】
Ｌ−０１２  0.005［ｍｍｏｌ／ｌ］
過酸化水素  0.5［ｍｍｏｌ／ｌ］
ｐ−ヨードフェノール  0.182，0.20，0.25，0.30，0.35［ｍｍｏｌ／ｌ］
２）発光量の測定とその評価  既知濃度１×１０-10［ｍｏｌ／ｌ］のＨＲＰ含有試料０．１ｍｌを前記調製した測定試薬１ｍｌと反応させた後にルミノメータ（ＵＰＤ−４０００（明電舎製））によって３０秒間発光量測定した。そして、各測定値のＳＮ比を比較した。表３に各ｐ−ヨードフェノール濃度に対するＳＮ比を示した。
【００２６】
【表３】
2005052075.tif 000003
【００２７】
また、図３にｐ−ヨードフェノール濃度とＳＮ比との関係を示した特性図を示した。かかる結果から明らかなように、Ｌ−０１２を用いた化学発光測定法に基づくＨＲＰ測定方法において、測定試薬におけるｐ−ヨードフェノールの濃度は０．２９〜０．３５ｍｍｏｌ／ｌとするのが適当であり、特に０．３０ｍｍｏｌ／ｌに設定すればＳＮ比が最大となることが確認できる。
【００２８】
そして、以上のようにＬ−０１２と過酸化水素とｐ−ヨードフェノールの濃度を最適化したＨＲＰ測定法の測定性能をルミノール使用の従来法のものと比較した。評価手順を以下に示した。
【００２９】
１）ＨＲＰ含有試料の調製
０．１[ｍｏｌ／ｌ]のリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によってＨＲＰ濃度が１．０×１０-13，１．０×１０-12，１．０×１０-11，１．０×１０-10［ｍｏｌ／ｌ］となるようにＨＲＰ含有試料を調製した。
【００３０】
２）測定試薬の調製
ｉ）Ｌ−０１２含有測定試薬の調製  ０．０５［ｍｏｌ／ｌ］のトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で、Ｌ−０１２の濃度が０．００５［ｍｍｏｌ／ｌ］、過酸化水素の濃度が０．５［ｍｍｏｌ／ｌ］、ｐ−ヨードフェノールの濃度が０．３［ｍｍｏｌ／ｌ］となるように調製して測定試薬を得た。
【００３１】
ii）ルミノール含有測定試薬の調製  ０．１［ｍｏｌ／ｌ］のトリス緩衝液（ｐＨ７．５）において、ルミノールの濃度が０．０１２［ｍｍｏｌ／ｌ］、過酸化水素の濃度が０．５［ｍｍｏｌ／ｌ］、ｐ−ヨードフェノールの濃度が０．１８２［ｍｍｏｌ／ｌ］となるように調製して測定試薬を得た。
【００３２】
３）発光量の測定とその評価
前記濃度のＨＲＰ含有試料と前記調製した測定試薬１ｍｌとを反応させた後にルミノメータ（ＵＰＤ−４０００（明電舎製））によって５〜３５秒間発光量測定し、ＳＮ比を比較した（ブランクは０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液０．１ｍｌ）。表４に各測定試薬を使用したＨＲＰ濃度に対するＳＮ比を示した。
【００３３】
【表４】
2005052075.tif 000004
【００３４】
また、図４に本発明のＨＲＰ測定法と従来のＨＲＰ測定法におけるＨＲＰ濃度とＳＮ比との関係を示した特性図を示した。かかる結果から明らかなように、化学発光基質にＬ−０１２を使用した本発明のＨＲＰ測定法によれば、ルミノールを使用した従来のＨＲＰ測定法における限界測定濃度の１０分の１まで測定をでき、しかも高感度な測定が可能であることが確認できる。
【００３５】
このように、化学発光基質と過酸化水素とｐ−ヨードフェノールとを含む測定試薬をＨＲＰと反応させ、この反応時に測定された発光量に基づいてＨＲＰ濃度を測定するＨＲＰ測定方法において、化学発光基質に8-Amino-5-chloro-7-phenylpyrido(3,4-d)pyridazine-1,4(2H,3H)dioneを用いれば、従来のＨＲＰ測定方法よりも感度良くＨＲＰを測定することができることが示された。そして、測定に際し、測定試薬における化学発光基質の濃度を０．００３〜０．００６ｍｍｏｌ／ｌ、過酸化水素の濃度を０．２５〜０．７５ｍｍｏｌ／ｌ、ｐ−ヨードフェノールの濃度を０．２９〜０．３５ｍｍｏｌ／ｌとすると、より一層の感度良くＨＲＰを測定できることが示された。
【００３６】
（実施形態２）大腸菌群の測定
次いで、ＨＲＰ測定に基づく大腸菌群測定方法における発光量測定時間の最適化の検討を行なった。化学発光法に基づく測定において、反応を開始してから発光量の時間的変化は測定系によって異なっており、測定時間の設定は測定感度へ影響を与えることがある。そこで、大腸菌群の測定における発光量測定時間を以下の試験で最適化した。試験手順を以下に示した。
【００３７】
１）試料の調製  標準大腸菌ＪＣＭ１６４９Ｔ株を培養または凍結保存したものを任意濃度に調製し超音波破砕処理して菌体群を破砕した。
【００３８】
２）第一抗体の固相化  抗大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２をポリスチレンチューブに固相化した。
【００３９】
３）第二抗体の標識化  前記坑大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）にＨＲＰを標識した。
【００４０】
４）第一反応（抗原抗体反応）  前記ポリスチレンチューブに前記超音波破砕した試料を加えた後に室温にて６０分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００４１】
５）第二反応（抗原抗体反応）  次いで、前記ＨＲＰを標識したＦ（ａｂ’）を添加して室温にて３０分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００４２】
６）洗浄  滅菌済み蒸留水で固相を洗浄した（４ｍｌ×５回）。
【００４３】
７）発光量の測定  Ｌ−０１２含有測定試薬を投入後１８０秒間発光量の測定を行なった（明電舎製ルミノメータＵＰＤ−４０００を使用）。尚、前記測定試薬の調製は図４係る実験での調製要領に基づいた。
【００４４】
８）評価  ３０秒間隔のブランク（大腸菌群数  ０［個／ｍｌ］）と既知試料（標準大腸菌群数  １０００００［個／ｍｌ］）の発光量の比からＳＮ比を算出した。表５に各時間区分に対するＳＮ比を示した。
【００４５】
【表５】
2005052075.tif 000005
【００４６】
図５は測定時間と発光量との関係を示した特性図である。また、３０秒間毎のブランクと既知試料の発光量の比から算出したＳＮ比を図６に示した。図５及び図６に示された結果から明らかなように、Ｌ−０１２含有測定試薬を用いた大腸菌群数測定における発光量の測定時間は１〜３０秒の発光積分量によって求めたＳＮ比が最大となることが確認できる。
【００４７】
上記試験においては測定時間１〜３０秒間での発光積分量のＳＮ比が最大となることがわかったが、以下の試験では所定測定間で得た大腸菌群数の検量線のＳＮ比を比較した。試験手順は以下の通りである。
【００４８】
１）試料の調製  標準大腸菌ＪＣＭ１６４９Ｔ株を培養または凍結保存したものを所定濃度に調製し超音波破砕処理して菌体群を破砕した。尚、ここでは標準大腸菌群数が１０００，１００００，１０００００個／ｍｌとなるように試料を調製した。
【００４９】
２）第一抗体の固相化  抗大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２をポリスチレンチューブに固相化した。
【００５０】
３）第二抗体の標識化  前記坑大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）にＨＲＰを標識した。
【００５１】
４）第一反応（抗原抗体反応）  前記ポリスチレンチューブに前記調製した試料を加えた後に室温にて６０分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００５２】
５）第二反応（抗原抗体反応）  次いで、前記ＨＲＰを標識したＦ（ａｂ’）を添加して室温にて３０分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００５３】
６）洗浄  滅菌済み蒸留水で固相を洗浄した（４ｍｌ×５回）。
【００５４】
７）発光量の測定とその評価  前記試験管に測定試薬を投入後、１〜３０、６１〜９０、１２１〜１５０秒間の発光積分量測定（明電舎製ルミノメータＵＰＤ−４０００を使用）を行なった。そして、Ｌ−０１２含有測定試薬を用いた測定法の前記３０秒毎のＳＮ比を比較した。尚、測定試薬の調製は図４係る実験での調製要領に基づいた。表６に各測定時間及び各大腸菌群数に対するＳＮ比を示した。
【００５５】
【表６】
2005052075.tif 000006
【００５６】
また、図７に各測定時間における大腸菌群数とＳＮ比との関係を示した特性図を示した。かかる結果から明らかなように、若干ではあるが測定時間１〜３０秒間での測定が大腸菌群濃度の測定感度を向上させることがわかった。
【００５７】
次に、これまで最適化した条件のＬ−０１２含有測定試薬を用いた大腸菌群測定方法と従来法であるルミノール含有測定試薬を用いた大腸菌群測定法の感度比較を行なった。試験手順を以下の通りである。
【００５８】
１）試料の調製  標準大腸菌ＪＣＭ１６４９Ｔ株を培養または凍結保存したものを所定濃度に調製し超音波破砕処理して菌体群を破砕した。尚、ここでは標準大腸菌群数が１０００，１００００，１０００００個／ｍｌとなるように試料を調製した。
【００５９】
２）第一抗体の固相化  抗大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２をポリスチレンチューブに固相化した。
【００６０】
３）第二抗体の標識化  前記坑大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）にＨＲＰを標識した。
【００６１】
４）第一反応（抗原抗体反応）  前記ポリスチレンチューブに前記調製した試料を加えた後に室温にて６０分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００６２】
５）第二反応（抗原抗体反応）  次いで、前記ＨＲＰを標識したＦ（ａｂ’）を添加して室温にて３０分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００６３】
６）洗浄  滅菌済み蒸留水で固相を洗浄した（４ｍｌ×５回）。
【００６４】
７）発光量の測定とその評価  測定試薬投入５秒後から３０秒間の発光積分量を測定（明電舎製ルミノメータＵＰＤ−４０００を使用）し、各測定値のＳＮ比を算出した。そして、Ｌ−０１２含有測定試薬を用いた測定法とルミノール含有測定試薬を用いた測定法のＳＮ比を比較した。尚、測定試薬の調製は図４係る実験での試薬調製に基づいた。表７に各大腸菌群数及び各測定試薬に対するＳＮ比を示した。
【００６５】
【表７】
2005052075.tif 000007
【００６６】
また、図８に各測定試薬における大腸菌群数とＳＮ比との関係を示した特性図を示した。かかる結果から明らかなように、Ｌ−０１２含有測定試薬を用いた測定はルミノール含有測定試薬を用いた測定よりも若干ではあるが、低濃度の大腸菌群測定を感度よく行なえることがわかる。したがって、大腸菌群測定の高感度化が達成されたことが確認された。
【００６７】
次に、下水処理場における二次処理水を試料した場合の従来法と本発明の大腸菌群測定法の測定性能を比較した。
【００６８】
下水処理場においては処理水質レベルである１０００〜１００００個／ｍｌ程度の大腸菌群の測定能力が要求される。一方、合流式の下水処理場では、雨天時に流入水が増加し、処理能力以上となると簡易放流を行なう場合がある。これは最初沈殿池のみの処理を行なったものを塩素滅菌して放流するものである。このため、この処理水の大腸菌群数レベルは約１００００〜１０００００個／ｍｌと高くなる。大腸菌自動測定装置を使用した塩素注入制御を簡易処理水に応用する場合、簡易処理開始時に急激な水質の変動があるため、なるべく短時間での大腸菌群測定が求められることとなる。かかる背景からＬ−０１２含有測定試薬を用いた大腸菌群測定の短時間化を検討した。
【００６９】
試験  免疫反応時間を第一反応２０分、第二反応５分とし、ブランク（大腸菌０個／ｍｌ）と１００００，１０００００，１００００００個／ｍｌに調製した標準大腸菌含有試料をそれぞれＬ−０１２含有測定試薬、ルミノール含有測定試薬を用いて発光量を測定し、各測定値のＳＮ比を求めて比較した。詳細な試験手順を以下に示した。
【００７０】
１）試料の調製  標準大腸菌ＪＣＭ１６４９Ｔ株を培養または凍結保存したものを所定濃度に調製し超音波破砕処理して菌体群を破砕した。尚、ここでは標準大腸菌群数が１００００，１０００００，１００００００個／ｍｌとなるように試料を調製した。
【００７１】
２）第一抗体の固相化  抗大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２をポリスチレンチューブに固相化した。
【００７２】
３）第二抗体の標識化  前記坑大腸菌群ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）にＨＲＰを標識した。
【００７３】
４）第一反応（抗原抗体反応）  前記ポリスチレンチューブに前記調製した試料を加えた後に室温にて２０分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００７４】
５）第二反応（抗原抗体反応）  次いで、前記ＨＲＰを標識したＦ（ａｂ’）を添加して室温にて５分間振とうした（２００ｒｐｍ）。
【００７５】
６）洗浄  滅菌済み蒸留水で固相を洗浄した（４ｍｌ×５回）。
【００７６】
７）発光量の測定と評価  測定試薬投入５秒後から３０秒間の発光積分量を測定（明電舎製ルミノメータＵＰＤ−４０００を使用）し、各測定値のＳＮ比を算出した。そして、Ｌ−０１２含有測定試薬を用いた測定法とルミノール含有測定試薬を用いた測定法のＳＮ比を比較した。尚、測定試薬の調製は図４係る実験での試薬調製に基づいた。表８に各大腸菌群数及び各測定試薬に対するＳＮ比を示した。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
また、図９に各測定試薬における大腸菌群数とＳＮ比との関係を示した特性図を示した。かかる結果から明らかなように、簡易処理水を対象とした大腸菌群の短時間測定を行なう場合でも、Ｌ−０１２含有測定試薬を用いた大腸菌群測定方法によれば、ルミノール含有測定試薬を用いた従来の大腸菌群測定方法よりも高感度な測定が可能であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】Ｌ−０１２濃度とＳ／Ｎ比との関係を示した特性図。
【図２】過酸化水素濃度とＳ／Ｎ比との関係を示した特性図。
【図３】ｐ−ヨードフェノール濃度とＳ／Ｎ比との関係を示した特性図。
【図４】Ｌ−０１２を使用したＨＲＰ測定法とルミノールを使用したＨＲＰ測定法におけるＨＲＰ濃度とＳＮ比との関係を示した特性図。
【図５】測定時間と発光量との関係を示した特性図。
【図６】３０秒間毎にブランクと大腸菌群数１０００００個／ｍｌの発光量の比から算出したＳＮ比の変化を示した特性図。
【図７】各測定時間（１〜３０秒，６１〜９０秒，１２１〜１５０秒）における大腸菌群数とＳＮ比との関係を示した特性図。
【図８】各測定試薬（Ｌ−０１２使用，ルミノール使用）における大腸菌群数とＳＮ比との関係を示した特性図。
【図９】各測定試薬（Ｌ−０１２使用，ルミノール使用）における大腸菌群数とＳＮ比との関係を示した特性図。
【図１０】化学発光反応を利用した従来の大腸菌群の測定方法を説明した概略説明図。
【図１１】ＨＲＰ濃度と発光量との関係を示した特性図。