(57)【要約】  本発明の目的は、医農薬分野における有用な抗体の製造に関して、細胞膜上の微量なタンパクを見つけ出し、その抗体を製造する方法を提供することにある。かかる本発明の目的は、ビスイミノビオチン化合物及びビスビオチン化合物から選択される少なくとも１種からなるラベル化剤を用いるラベル化タンパク質を有する細胞を得るラベル化工程、ラベル化タンパク質を含む固定化処理用の分解物を調製する分解工程、固定化処理用の分解物に含まれるラベル化タンパク質を、ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程、ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程、分析用の試料を分析し、ラベル化したタンパク質を同定する分析工程を有する同定方法により同定されたタンパク質を用いて抗体を製造することにより達成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラベル化されたタンパク質の同定方法であって、
以下の（１）から（５）の工程：
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程。
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程、
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程、
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程、
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程
を有することを特徴とするタンパク質の同定方法。
【請求項２】
前記工程（１）を、ビスイミノビオチン化合物及びビスビオチン化合物から選択される少なくとも１種からなるラベル化剤で、細胞の有する細胞膜上のタンパク質及び／または組織中の細胞外にあるタンパク質をラベル化して、ラベル化タンパク質を得るラベル化工程により行う、請求項１に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項３】
前記ラベル化剤が、下記一般式（１）
【化１】
2018151301.tif 000107
（式中Ａ、Ｄ、Ｅは２つのビシクロ環を結合するスペーサーであり、Ｅは分岐をとることのできる構造を表す。Ｊは硫黄原子、Ｓ＋−Ｏ−あるいはＳＯ２を表し、ＬはＮＨ、酸素原子またはメチレンを表し、ＸはＮＨあるいは酸素原子を表し、Ｙはタンパク質と結合を作る構造を表し、ＧはＥとＹを結合するスペーサーを表す。）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１または２に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項４】
前記一般式（１）において、
Ａはａ１−ａ２−ａ３−ａ４を表し、
Ｄはｄ１−ｄ２−ｄ３−ｄ４を表し、
ＥはＡ、Ｄ及びＧとの結合部としての窒素原子、炭素原子、ベンゼン環またはヘテロ環を含む基を表し、
Ｇはｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７を表し、
ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４はそれぞれ独立して窒素原子、酸素原子、カルボニル基、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−ＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−、−（ＣＦ２）ｎ−、ベンゼン環、ヘテロ環または結合を表し、
ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６、ｇ７はそれぞれ独立して窒素原子、酸素原子、カルボニル基、ニトロベンジル基、ジスルフィド結合、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、ベンゼン環、ヘテロ環または結合を表し、
Ｍｅはメチル基を表し、
上記各ｎはそれぞれ独立して０から９を表す、
（但し、Ｅがベンゼン環またはヘテロ環を有する場合、これらの環構造にＡ、Ｄ及びＧの少なくとも１つが結合することができる。）請求項３に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項５】
前記一般式（１）において、Ａ−Ｅ−Ｄがａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、ａ１〜ａ４、Ｅ、ｄ１〜ｄ４はそれぞれ独立して以下の表Ａ１から選択される、請求項３または４に記載のタンパク質の同定方法。
【表１】
2018151301.tif 000108
【請求項６】
前記一般式（１）において、Ａ−Ｅ−Ｄがａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、それぞれ独立して以下の表Ａ１から選択され、Ｇが、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して以下の表Ｇ１から選択される化合物である、請求項３または４に記載のタンパク質の同定方法（Ｌ、Ｊ、Ｘ、Ｙは一般式（１）と同様に定義される。
【表２】
2018151301.tif 000109
【表３】
2018151301.tif 000110
【請求項７】
前記一般式（１）において、Ａ−Ｅ−Ｄがａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、下の表Ａ２の組合せ１〜１１４から選択された１つであり、Ｇが、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して以下の表Ｇ１から選択される、請求項３または４に記載のタンパク質の同定方法。
【表４】
2018151301.tif 000111
【表５】
2018151301.tif 000112
【表６】
2018151301.tif 000113
【請求項８】
前記一般式（１）の化合物が、以下の表Ａ３〜表Ａ１０で表される化合物から選択される１種である請求項７に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物（以下の表Ａ３〜表Ａ１０に記載される化合物のそれぞれについて、Ｌ、Ｊ、Ｘ、Ｙは一般式（１）と同様に定義され、Ｇは、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して以下の表Ｇ１から選択される。）。
【表７】
2018151301.tif 000114
【表８】
2018151301.tif 000115
【表９】
2018151301.tif 000116
【表１０】
2018151301.tif 000117
【表１１】
2018151301.tif 000118
【表１２】
2018151301.tif 000119
【表１３】
2018151301.tif 000120
【表１４】
2018151301.tif 000121
【表１５】
2018151301.tif 000122
【請求項９】
前記表Ａ３〜表Ａ１０のそれぞれについて、Ｊが硫黄原子であり、Ｌが窒素原子であり、Ｙが活性エステル、マレインイミドまたはヒドラジドであり、Ｇが以下の表Ｇ２から選択される１つの基である（表Ｇ２におけるＥは一般式１記載のＥに結合することを、Ｙは一般式（１）のＹに結合することを表す）、請求項８に記載のタンパク質の同定方法。
【表１６】
2018151301.tif 000123
【請求項１０】
前記一般式（１）のＸがＮＨである、請求項９に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項１１】
前記一般式（１）のＸが酸素原子である、請求項９に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項１２】
前記ストレプトアビジン変異体は、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められ、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められている、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項１３】
標的タンパク質に対する抗体を製造する方法であって、
抗体製造用の標的タンパク質を用意する工程と、
前記標的タンパク質から、該標的タンパク質に対する抗体を製造する工程と、を有し、
前記抗体製造用の標的タンパク質として、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の同定方法により同定されたタンパク質を用いることを特徴とする標的タンパク質に対する抗体の製造方法。
【請求項１４】
一般式（１）で表されるビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物：
【化２】
2018151301.tif 000124
（式中Ａ、Ｄ、Ｅは２つのビシクロ環を結合するスペーサーであり、Ｅは分岐をとることのできる構造を表す。Ｊは硫黄原子、Ｓ＋−Ｏ−あるいはＳＯ２を表し、ＬはＮＨ、酸素原子またはメチレンを表し、ＸはＮＨあるいは酸素原子を表し、Ｙはタンパク質と結合を作る構造を表し、ＧはＥとＹを結合するスペーサーを表す。）
【請求項１５】
前記一般式（１）において、
Ａはａ１−ａ２−ａ３−ａ４を表し、
Ｄはｄ１−ｄ２−ｄ３−ｄ４を表し、
ＥはＡ、Ｄ及びＧとの結合部としての窒素原子、炭素原子、ベンゼン環またはヘテロ環を含む基を表し、
Ｇはｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７を表し、
ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４はそれぞれ独立して窒素原子、酸素原子、カルボニル基、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−ＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−、−（ＣＦ２）ｎ−、ベンゼン環、ヘテロ環または結合を表し、
ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６、ｇ７はそれぞれ独立して窒素原子、酸素原子、カルボニル基、ニトロベンジル基、ジスルフィド結合、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、ベンゼン環、ヘテロ環または結合を表し、
Ｍｅはメチル基を表し、
上記各ｎはそれぞれ独立して０から９を表す、
（但し、Ｅがベンゼン環またはヘテロ環を有する場合、これらの環構造にＡ、Ｄ及びＧの少なくとも１つが結合することができる。）
請求項１４に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物。
【請求項１６】
前記一般式（１）において、Ａ−Ｅ−Ｄがａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、ａ１〜ａ４、Ｅ、ｄ１〜ｄ４はそれぞれ独立して以下の表Ａ１から選択される、請求項１４または１５に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物。
【表１７】
2018151301.tif 000125
【請求項１７】
前記一般式（１）において、Ａ−Ｅ−Ｄがａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、ａ１〜ａ４、Ｅ、ｄ１〜ｄ４はそれぞれ独立して以下の表Ａ１から選択され、Ｇが、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して以下の表Ｇ１から選択される化合物である、請求項１４または１５に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物。
【表１８】
2018151301.tif 000126
【表１９】
2018151301.tif 000127
【請求項１８】
前記一般式（１）において、Ａ−Ｅ−Ｄがａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、下の表Ａ２の組合せ１〜１１４から選択された１つであり、Ｇが、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して以下の表Ｇ１から選択される、請求項１４または１５に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物。
【表２０】
2018151301.tif 000128
【表２１】
2018151301.tif 000129
【表２２】
2018151301.tif 000130
【請求項１９】
前記一般式（１）の化合物が、以下の表Ａ３〜表Ａ１０で表される化合物から選択される１種である請求項１８に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物（以下の表Ａ３〜表Ａ１０に記載される化合物のそれぞれについて、Ｌ、Ｊ、Ｘ、Ｙは一般式（１）と同様に定義され、Ｇは、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して以下の表Ｇ１から選択される）。
【表２３】
2018151301.tif 000131
【表２４】
2018151301.tif 000132
【表２５】
2018151301.tif 000133
【表２６】
2018151301.tif 000134
【表２７】
2018151301.tif 000135
【表２８】
2018151301.tif 000136
【表２９】
2018151301.tif 000137
【表３０】
2018151301.tif 000138
【表３１】
2018151301.tif 000139
【請求項２０】
前記表Ａ３〜表Ａ１０のそれぞれについて、Ｊが硫黄原子であり、Ｌが窒素原子であり、Ｙが活性エステル、マレインイミドまたはヒドラジドであり、Ｇが以下の表Ｇ２から選択される１つの基である（表Ｇ２におけるＥは一般式（１）のＥに結合することを、Ｙは一般式（１）のＹに結合することを表す）、請求項１９に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物。
【表３２】
2018151301.tif 000140
【請求項２１】
前記一般式（１）のＸがＮＨである請求項２０に記載のビスイミノビオチン化合物。
【請求項２２】
前記一般式（１）のＸが酸素原子である請求項２０に記載のビスビオチン化合物。
【請求項２３】
タンパク質のラベル化用の化合物であって、
前記ラベル化用の化合物が請求項１４乃至２２のいずれか１項に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物から選択された少なくとも１種であることを特徴とするタンパク質のラベル化用の化合物。
【請求項２４】
前記タンパク質のラベル化が、前記タンパク質の同定のために行われる請求項２３に記載のタンパク質のラベル化用の化合物。
【請求項２５】
前記タンパク質の同定が以下の工程を有する請求項２４に記載のタンパク質のラベル化用の化合物。
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程、
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程、
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程、
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程、及び
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程。
【請求項２６】
前記ストレプトアビジン変異体は前記ラベル化用の化合物よりもビオチンに対する親和性が低い、請求項２５に記載のラベル化用の化合物。
【請求項２７】
ラベル化タンパク質の同定用のストレプトアビジン変異体であって、
前記ラベル化タンパク質が、請求項１４乃至２２のいずれか１項に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物から選択された少なくとも１種によりラベル化されており、
前記ストレプトアビジン変異体は、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められ、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められている
ことを特徴とするラベル化タンパク質の同定用のストレプトアビジン変異体。
【請求項２８】
前記ラベル化タンパク質の同定が以下の工程を有する請求項２７に記載のラベル化タンパク質の同定用のストレプトアビジン変異体。
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程、
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程、
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程、
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程、及び
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程。
【請求項２９】
タンパク質のラベル化のためのラベル化用の化合物の使用であって、
前記ラベル化用の化合物が請求項１４乃至２２のいずれか１項に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物から選択された少なくとも１種であることを特徴とする使用。
【請求項３０】
前記タンパク質のラベル化が、前記タンパク質の同定のために行われる請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記タンパク質の同定が以下の工程を有する請求項３０に記載の使用。
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程、
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程、
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程、
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程、及び
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程。
【請求項３２】
前記ストレプトアビジン変異体は、前記ストレプトアビジン変異体は、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められ、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められている、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ラベル化タンパク質の同定のためのストレプトアビジン変異体の使用であって、
ラベル化タンパク質が請求項１４乃至２２のいずれか１項に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物から選択された少なくとも１種によりラベル化されており、
前記ストレプトアビジン変異体は、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められ、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められている
ことを特徴とする使用。
【請求項３４】
前記ラベル化タンパク質の同定が以下の工程を有する請求項３３に記載の使用。
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程、
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程、
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程、
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程、及び
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程。
【請求項３５】
タンパク質同定用のキットであって、
試料中のタンパク質をラベル化するためのラベル化用の化合物と、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められており、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体と、を有し、
前記ラベル化用の化合物が請求項１４乃至２２のいずれか１項に記載のビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物から選択された少なくとも１種であることを特徴とするキット。
【請求項３６】
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列の、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３１番目のＹ、３２番目のＥ、３３番目のＳ、３４番目のＡ、３５番目のＶ、３６番目のＧ、３７番目のＮ、３８番目のＧ、３９番目のＥ、４０番目のＳ、４１番目のＲ、４２番目のＹ、６７番目のＷ、７４番目のＡ、７６番目のＳ、７８番目のＴ、８０番目のＷ、９６番目のＷ、９８番目のＬ、１００番目のＳ、１０４番目のＥ、１０８番目のＷ、１０９番目のＫ、１１２番目のＬ及び１１６番目のＤからなる群から選択される少なくとも１箇所を変異させて、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体（但し、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対する変異がＹ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体及び前記変異がＹ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体を除く）。
【請求項３７】
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列の、３１番目のＹ、３２番目のＥ、３４番目のＡ、３５番目のＶ、３６番目のＧ、３８番目のＧ、３９番目のＥ、４０番目のＳ、４１番目のＲ、４２番目のＹ、６７番目のＷ、７４番目のＡ、７６番目のＳ、７８番目のＴ、８０番目のＷ、９６番目のＷ、９８番目のＬ、１００番目のＳ、１０８番目のＷ、１０９番目のＫ、１１２番目のＬ及び１１６番目のＤからなる群から選択される少なくとも１箇所を変異させて、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められている請求項３６に記載のストレプトアビジン変異体。
【請求項３８】
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列の、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３３番目のＳ、３７番目のＮ及び１０４番目のＥからなる群から選択される少なくも１箇所の変異を更に有する請求項３７に記載のストレプトアビジン変異体。
【請求項３９】
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対して、Ｙ１０Ｓ、Ｎ１１Ｄ、Ｎ１１Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１Ｃ、Ｓ１５Ｄ、Ｓ１５Ａ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｃ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｎ、Ｙ３１Ｆ、Ｙ３１Ｗ、Ｙ３１Ｈ、Ｓ３３Ｎ、Ｓ３３Ａ、Ｓ３３Ｇ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｔ、Ａ３４Ｇ、Ａ３４Ｓ、Ｖ３５Ａ、Ｖ３５Ｔ、Ｖ３５Ｎ、Ｖ３５Ｌ、Ｖ３５Ｉ、Ｇ３６Ａ、Ｇ３６Ｐ、Ｇ３６Ｓ、Ｎ３７Ｇ、Ｎ３７Ａ、Ｎ３７Ｓ、Ｎ３７Ｄ、Ｎ３７Ｅ、Ｎ３７Ｔ、Ａ３８Ｇ、Ａ３８Ｓ、Ｗ６７Ｆ、Ｗ６７Ｙ、Ａ７４Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｓ７６Ｒ、Ｓ７６Ａ、Ｓ７６Ｇ、Ｔ７８Ｓ、Ｔ７８Ｃ、Ｔ７８Ｖ、Ｙ７１Ｓ、Ｒ７２Ｋ、Ｔ７８Ａ、Ｗ８０Ｍ、Ｗ８０Ｌ、Ｅ８９Ｄ、Ｒ９１Ｋ、Ｗ９６Ｆ、Ｗ９６Ｌ、Ｌ９８Ｖ、Ｌ９８Ｆ、Ｓ１００Ｒ、Ｓ１００Ｉ、Ｓ１００Ｍ、Ｓ１００Ｌ、Ｓ１００Ｃ、Ｓ１００Ｋ、Ｓ１００Ｖ、Ｅ１０４Ｎ、Ｗ１０８Ｆ、Ｗ１０８Ｍ、Ｗ１０８Ｌ、Ｋ１０９Ｒ、Ｋ１０９Ｅ、Ｋ１０９Ｍ、Ｌ１１２Ｎ、Ｌ１１２Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｓ及びＤ１１６Ｈからなる群から選択される少なくとも１種の変異を有し、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められている請求項３６に記載のストレプトアビジン変異体（但し、前記変異が、Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体及び前記変異がＹ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体を除く）。
【請求項４０】
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対して、Ｎ１１Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１Ｃ、Ｓ１５Ａ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｃ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｎ、Ｙ３１Ｆ、Ｙ３１Ｗ、Ｙ３１Ｈ、Ｓ３３Ａ、Ｓ３３Ｇ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｔ、Ａ３４Ｇ、Ａ３４Ｓ、Ｖ３５Ａ、Ｖ３５Ｔ、Ｖ３５Ｎ、Ｖ３５Ｌ、Ｖ３５Ｉ、Ｇ３６Ａ、Ｇ３６Ｐ、Ｇ３６Ｓ、Ｎ３７Ａ、Ｎ３７Ｓ、Ｎ３７Ｄ、Ｎ３７Ｅ、Ｎ３７Ｔ、Ａ３８Ｇ、Ａ３８Ｓ、Ｗ６７Ｆ、Ｗ６７Ｙ、Ａ７４Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｓ７６Ｒ、Ｓ７６Ａ、Ｓ７６Ｇ、Ｔ７８Ｓ、Ｔ７８Ｃ、Ｔ７８Ｖ、Ｔ７８Ａ、Ｗ８０Ｍ、Ｗ８０Ｌ、Ｗ９６Ｆ、Ｗ９６Ｌ、Ｌ９８Ｖ、Ｌ９８Ｆ、Ｓ１００Ｒ、Ｓ１００Ｉ、Ｓ１００Ｍ、Ｓ１００Ｌ、Ｓ１００Ｃ、Ｓ１００Ｋ、Ｓ１００Ｖ、Ｗ１０８Ｆ、Ｗ１０８Ｍ、Ｗ１０８Ｌ、Ｋ１０９Ｒ、Ｋ１０９Ｅ、Ｋ１０９Ｍ、Ｌ１１２Ｎ、Ｌ１１２Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｓ及びＤ１１６Ｈからなる群から選択される少なくとも１種の変異を有し、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められている請求項３６に記載のストレプトアビジン変異体。
【請求項４１】
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対して、Ｙ１０Ｓ、Ｎ１１Ｄ、Ｓ１５Ｄ、Ｓ３３Ｎ、Ｎ３７Ｇ、Ｙ７１Ｓ、Ｒ７２Ｋ、Ｅ８９Ｄ、Ｒ９１Ｋ及びＥ１０４Ｎからなる群から選択される請求項４０に記載のストレプトアビジン変異体。
【請求項４２】
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対して、以下の変異の組合せ（１）〜（４２）からなる群から選択された一つを有し、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められている請求項３６に記載のストレプトアビジン変異体。
（１）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ、
（２）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ、
（３）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ、
（４）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ、
（５）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ、
（６）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ、
（７）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ／Ｎ３７Ｇ、
（８）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ、
（９）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ／Ｎ３７Ｇ、
（１０）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ／Ｎ３７Ｇ、
（１１）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｇ、
（１２）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｇ、
（１３）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｒ、
（１４）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｒ、
（１５）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｌ、
（１６）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｌ、
（１７）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｉ、
（１８）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｍ、
（１９）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｖ、
（２０）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｒ、
（２１）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｒ、
（２２）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｋ、
（２３）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｍ、
（２４）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｍ、
（２５）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｒ、
（２６）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｒ、
（２７）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｅ、
（２８）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｌ１１２Ｎ、
（２９）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｌ１１２Ｑ、
（３０）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３１）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３２）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３３）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３４）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３５）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３６）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３７）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３８）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３９）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（４０）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（４１）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ａ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、及び
（４２）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｔ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、農薬だけでなく、生物学的研究など多方面で有用な、細胞膜上の微量なタンパクである細胞表面タンパク質や組織の血管や間質に存在する間質タンパク質の同定方法、並びに同定されたタンパク質に対する抗体を製造する抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾患の治療に抗体医薬が目覚ましい効果を発揮している。それは抗体本来が持つ高い選択性による治療効果と低毒性に加え、実用に耐える製造や改変技術が蓄積されてきたことによる。しかし、抗体の標的タンパク質が明らかになった疾患は治療が進んでいるが、未だ標的となるタンパク質の見つかっていない疾患が多く存在する。
細胞表面タンパク質には、細胞認識、シグナル伝達系におけるタンパク質間相互作用、医薬に対する応答性等の生体機能において重要な役割を果たしているものが含まれていると考えられている。疾患に関連する細胞に特有の表面タンパク質を新たに同定し、それに対する抗体を得ることができれば、疾患に関連する細胞の特定、この細胞の機能の解析、この細胞の医薬に対する応答性等に関する研究、医薬の開発等に、有用な抗体を提供する
ことが可能となる。
また、組織・臓器の間質に含まれる細胞外マトリクスなどの間質タンパク質は、組織の主要構成細胞である実質細胞の機能を維持するために重要な働きを持つことが明らかになりつつある。これらの間質タンパク質を効率良く精製・同定することが、病態の解明や画期的な医薬品の開発に重要な情報を提供しうるものと期待されている。しかしながら、これらの間質に存在するタンパク質を容易かつ効率的に精製するための基盤技術は確立されておらず、病態に微量に存在する間質タンパク質の詳細な定性・定量解析は極めて困難であると言わざるをえない状況にある。
このような微量に存在する抗体医薬の開発に有用な創薬標的に対して、抗体製造用の新たな標的タンパク質を取得する試みがされているが、現在に至るまで、標的として有用な微量なタンパク質を見出し、その抗体を製造する方法は十分に確立されていない。
従来の標的タンパク質探索の方法としては、タンパク質をビオチンでラベル化する工程と、ラベル化されたタンパク質を、ビオチンと強く結合するストレプトアビジン（ＳＡ）を固定化したカラムで捕獲し、捕獲されたラベル化タンパク質をカラムから分離して、分析、同定する方法を挙げることができる。
しかし、生体内にはビオチン化されたタンパク質が多量に存在するため、分析のバックグラウンドを高くしており、微量のタンパクを十分に分析することができない場合がある。
非特許文献１には細胞表面タンパク質ならびに組織・臓器に含まれる間質タンパク質の解析方法について開示されている。非特許文献２には、ビオチン化合物を用いた細胞表面タンパク質ならびに組織・臓器に含まれる間質タンパク質の解析について開示されている。
一方、ビオチン化合物に関しては、特許文献１には、抗体分析用のビスビオチン化合物が開示されている。特許文献１には、抗体分析用のビスビオチン化合物に関して、以下の分子構造を有する化合物１７が開示されている。【０００３】
【化１】
2018151301.tif 000002
【０００４】
更に、特許文献２、非特許文献３、非特許文献４には、ビスイミノビオチン化合物が開示されている。更に、特許文献３、特許文献４、特許文献５には、ビスビオチン化合物について開示されている。しかしながら、これらの文献は、ビスビオチン化合物及びイミノビスビオチン化合物のタンパク質のラベル化剤としての用途、更には、ラベル化されたタンパク質を同定し、その抗体を製造することについてなんら開示も示唆もしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６１５３４４２号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１５／１２５８２０号
【特許文献３】国際公開第２００９／０８９２６２号
【特許文献４】国際公開第２００９／０８８６９４号
【特許文献５】国際公開第１９９９／６０４００号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bausch-Fluck D, Hofmann A, Bock T, Frei AP, Cerciello F, et al. (2015), A Mass Spectrometric-Derived Cell Surface Protein Atlas. PLoS One 10: e0121314.
【非特許文献２】Elia G1., Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins. Proteomics. 2008 Oct; 8(19):4012-24.
【非特許文献３】Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2015), 79(4), 640-642
【非特許文献４】Chemistry & Biology(2006), 13(2), 225-231
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞膜に微量に存在する細胞表面タンパク質（膜タンパク質ともいう）としては、以下のものが知られている。
（ａ）細胞の種類やその性質を見いだすための重要なマーカー分子を含む細胞表面タンパク質。
（ｂ）受容体等、細胞の外部から細胞内部への情報伝達のノード（入り口）になっており、かかる情報伝達の機能の解明に重要である細胞表面タンパク質。
（ｃ）抗体医薬品のターゲットとしての細胞表面タンパク質。
上記の（ａ）〜（ｃ）の細胞表面タンパク質に対する抗体を提供することは、細胞の種類やその性質の解明、細胞外から細胞内への情報伝達機能の解明、抗体医薬品の提供等においてきわめて有用である。特に、細胞の形態を維持した細胞の内部にあるタンパク質を標的にすることは、現状では困難であり、医薬用の抗体を製造するための細胞表面タンパク質を特定することは、抗体医薬の分野において意義が大きい。
また、細胞表面タンパク質に限らず、病態組織の血管などが含まれる間質タンパク質は、組織の実質細胞の機能維持や病態形成に重要な役割を果たすことが知られていることから、創薬における標的分子になりうる可能性が考えられており、その有効な検出・同定技術が注目されている。しかし、一般的にこれらの間質組織（血管を含む）を効率良く回収し、その中から有用なタンパク質を精製・同定する手段は殆ど確立されておらず、その技術開発が急務である。
本発明の課題は、医農薬分野における有用な抗体の製造に関して、細胞膜上あるいは組織内の血管・間質などに含まれる微量なタンパクを見つけ出し、その抗体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかるタンパク質の同定方法は、
以下の（１）から（５）の工程：
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程。
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程、
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程、
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程、
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程
を有することを特徴とする。
本発明にかかる標的タンパク質に対する抗体を製造する方法は、
抗体製造用の標的タンパク質を用意する工程と、
前記標的タンパク質から、該標的タンパク質に対する抗体を製造する工程と、
を有し、
前記抗体製造用の標的タンパク質として、上記の同定方法により同定されたタンパク質を用いる
ことを特徴とする。
上記同定方法に使用し得る本発明にかかるビスビオチン化合物またはビスイミノビオチン化合物は、以下の一般式（１）で表されることを特徴とする。【０００９】
【化２】
2018151301.tif 000003
【００１０】
（式中Ａ、Ｄ、Ｅは２つのビシクロ環を結合するスペーサーであり、Ｅは分岐をとることのできる構造を表す。Ｊは硫黄原子、Ｓ＋−Ｏ−あるいはＳＯ２を表し、ＬはＮＨ、酸素原子またはメチレンを表し、ＸはＮＨあるいは酸素原子を表し、Ｙはタンパク質と結合を作る構造を表し、ＧはＥとＹを結合するスペーサーを表す。）
本発明にかかる（ａ）タンパク質のラベル化用の化合物は、上記一般式（１）化合物から選択された少なくとも１種であることを特徴とする。
本発明にかかるラベル化タンパク質の同定用のストレプトアビジン変異体は、
前記ラベル化タンパク質が、上記一般式（１）で示される化合物から選択された少なくとも１種によりラベル化されており、
前記ストレプトアビジン変異体は、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められ、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められている
ことを特徴とする。
本発明にかかるタンパク質のラベル化のためのラベル化用の化合物の使用は、
前記ラベル化用の化合物が上記一般式（１）で示される化合物から選択された少なくとも１種であることを特徴とする。
本発明にかかるラベル化タンパク質の同定のためのストレプトアビジン変異体の使用は、
ラベル化タンパク質が上記一般式（１）で示される化合物から選択された少なくとも１種によりラベル化されており、
前記ストレプトアビジン変異体は、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められ、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められている
ことを特徴とする。
本発明にかかるタンパク質同定用のキットは、
試料中のタンパク質をラベル化するためのラベル化用の化合物と、アミノ酸配列の改変により前記ラベル化用の化合物との親和性が高められており、かつビオチンに対する親和性が天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体と、を有し、
前記ラベル化用の化合物が上記一般式（１）で示される化合物から選択された少なくとも１種であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞表面ならびに間質に存在するさまざまな微量タンパクを取得することができ、それらのタンパクから新たな抗体を効率よく製造することが可能となる。本発明の製造方法により得られる抗体は、医薬、農薬での利用ばかりでなく、生物学的研究にも貢献できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明にかかるタンパク質の同定方法は、細胞表面ならびに組織・臓器の間質タンパク質の同定方法であって、以下の（１）から（５）の工程を有する。
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程。
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程。
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程。
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程。
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程。
工程（１）は、以下の工程（１Ａ）により行うことができる。
（１Ａ）ビスイミノビオチン化合物及びビスビオチン化合物から選択される少なくとも１種からなるラベル化剤で、細胞の有する細胞膜上のタンパク質及び／または組織中の細胞外にあるタンパク質をラベル化して、ラベル化タンパク質を得るラベル化工程。
工程（１）におけるラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織は、工程（２）で用いる処理用の試料の形態として提供し、工程（２）において利用することができる。
【００１３】
以下、上記の各工程について説明する。
［工程（１Ａ）］（ラベル化工程）
工程（１）におけるラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織は、工程（１Ａ）により用意することができる。
ラベル化工程について説明する。ラベル化工程では、ビスイミノビオチン化合物あるいはビスビオチン化合物の少なくとも１種からなるラベル化剤でタンパク質がラベル化される。
病気の治療を目的とした抗体を製造するために、まず病態の原因となる特異的な細胞表面タンパク質（膜タンパク質）などを見つけ出すことが必要である。表面タンパク質は、細胞膜の脂質二重層の中に埋め込まれたり、脂質自体に結合した状態のタンパク質である。細胞表面タンパク質は、細胞の種類ごとに特徴的であることが知られている。また、ある種の細胞表面タンパク質が過剰に発現したり、アミノ酸種の変異を持った異常な細胞表面タンパク質が存在することで、細胞自体が異常になり疾患の原因となることが知られている。
そこで細胞ならびに組織・臓器に存在するタンパク質をラベル化し、正常な細胞・組織・臓器との違いを比較分析することで、病態に特有のタンパク質を見つけ出すことができる。
また、薬剤の作用メカニズムを明らかにするために、薬剤の結合する標的タンパク質などを同定することが必要である。そのため、薬理活性を示す細胞等に存在する標的タンパク質の同定に向けて、臓器・組織・細胞あるいはそれらの溶解液に、薬剤との結合誘導体（ビスイミノビオチン・ビスビオチン等との薬剤結合体）を作用させ、薬剤と強く結合するタンパクをプロテオーム解析等の手段を用いて見つけ出すことができる。
本発明でラベル化するとは、ラベル化剤をタンパク質と強く結合させることであり、共有結合や非共有結合で結合することができるが、共有結合で結合することがより好ましい。
本発明におけるビスイミノビオチン化合物とは、２つのイミノビオチンがスペーサー構造を介して結合したものであり、環内の硫黄が酸化された状態の構造も含んでいる。
本発明におけるビスビオチン化合物とは、２つのビオチンがスペーサー構造を介して結合したものであり、環内の硫黄が酸化された状態の構造も含んでいる。
ビスイミノビオチン化合物及びビスビオチン化合物としては、本発明において目的とするラベル化剤としての機能を有するものであれば、特に制限なく利用できる。
ビスイミノビオチン化合物及びビスビオチン化合物としては、以下の一般式（１）で表される化合物が好ましい。
【００１４】
【化３】
2018151301.tif 000004
【００１５】
一般式（１）中、Ａ、Ｄ、Ｅは２つのビシクロ環を結合するスペーサーであり、Ｅは分岐をとることのできる構造を表す。Ｊは硫黄原子、Ｓ＋−Ｏ−あるいはＳＯ２を表し、ＬはＮＨ、酸素原子またはメチレンを表し、ＸはＮＨあるいは酸素原子を表し、Ｙはタンパク質と結合を作る構造を表し、ＧはＥとＹを結合するスペーサーを表す。）
Ｌは、イミノビオチン部分やビオチン部分とスペーサーとしてのＡ、Ｄを、アミド結合、エステル結合またはＣ−Ｃ結合で結合させる基である。２つのＬは、異なる基であっても、同じ基であってもよいが、同じ基であることが好ましい。
ＡとＤは、同じであってもよいが、スペーサーの長さを調節するために異なるものでもよい。
Ｊは硫黄原子であれば一般式（１）の化合物はイミノビオチンあるいはビオチンである。Ｊとしての硫黄原子が酸化されてＳ＋−Ｏ−あるいはＳＯ２となった化合物も同様に利用することができる。
一般式（１）の化合物はＸがＮＨであればイミノビオチン化合物であり、Ｘが酸素原子であればビオチン化合物であり、両者は同様に利用することができる。
一般式（１）における２つのＪは同じ基であり、２つのＸは同じ基である。
一般式（１）で表される化合物の分子構造において不斉炭素が存在する場合、いずれの立体異性体の構造もとることができる。
本発明のビスイミノビオチンとビスビオチンのＡ、Ｅ、Ｄで表されるスペーサー構造は様々考えられるが、ストレプトアビジン４量体のＸ線構造データより、Ａ−Ｅ−Ｄの適切な長さを算出できる。すなわち、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）から、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン変異体、さらにそれらとのイミノビオチンやビオチン複合体であるＸ線構造データを取得した。それらはＰＤＢ  ＩＤとして、１ＤＦ８、１ＭＥＰ、３ＷＹＰ、３ＷＹＱ、３ＷＺＯ、３ＷＺＰ、３ＷＺＮ、３ＷＺＱ、３Ｘ００など１００以上が知られており、それらの構造を利用してドッキング解析をおこなった。まず、２つのＬ間を様々な長さの炭素鎖でつないだビスイミノビオチンあるいはビスビオチンを結合させ、ストレプトアビジン変異体とコンピューター上でドッキングさせたところ、２つのビシクロ環が同時に結合するためには、２つのＬ間の結合数が１３結合数以上であることが好ましいことがわかった。また、２１結合数以下であると、より効率的に２つのビシクロ環が同時にストレプトアビジン変異体と結合できることがわかった。すなわち、２つのＬをつなぐスペーサー構造の最小結合数が１３から２１の長さにあれば、ストレプトアビジン変異体に強固に結合させる当該の目的をより効果的に達成することができるので好ましい。
ここで最小結合数とは、２つのＬの間の結合数を数えるとき、環状構造などで何種類もの結合数が生じるとき、もっとも少ない結合数のことを意味する。
そのスペーサー構造は一部で環状構造、例えば脂環式構造や芳香環、ヘテロ環、縮合環をとることができるが、それに限定されるものではない。
【００１６】
Ａはａ１−ａ２−ａ３−ａ４を表し、かつ、ａ１、ａ２、ａ３、ａ４はそれぞれ独立して窒素原子、酸素原子、カルボニル基、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは０から９の整数を表す）、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−ＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−（Ｍｅはメチル基を表す）、−（ＣＦ２）ｎ−（ｎは０から９の整数を表す。）、ベンゼン環、ヘテロ環または結合を表すことが好ましい。
Ｄはｄ１−ｄ２−ｄ３−ｄ４を表し、かつ、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４はそれぞれ独立して窒素原子、酸素原子、カルボニル基、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは０から９の整数を表す）、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−、−ＣＨ（ＣＯＯＭｅ）−（Ｍｅはメチル基を表す）、−（ＣＦ２）ｎ−（ｎは０から９の整数を表す）、ベンゼン環、ヘテロ環または結合を表すことが好ましい。
ＧはＥとＹをつなぐスペーサーであり特に限定されるものではないが、ラベル化した表面タンパク質と固定化されたストレプトアビジンとの立体的なぶつかりをなくすために、スペーサーとしての適切な長さが必要である。Ｇからなるスペーサーが有する結合数は、１０以上が好ましく、１４以上がより好ましい。また、この結合数は、１１３以下が好ましく、５０以下がより好ましい。この結合数は、２つのＬの間の結合数と同様に定義され、
Ｇが環状構造などで何種類もの結合数が生じるときは、もっとも少ない結合数である最小結合数を意味する。
また、ラベル化する際にある程度の水溶性が求められるため、Ｇは親水性の構造を有することが好ましい。
Ｇからなるスペーサーは、還元、酸化、光、酵素、求核試薬、求電子試薬や有機金属試薬などで、切断される構造を有することができる。このような切断可能な構造は、目的とする切断効果を得ることができるものであれば特に限定されない。切断可能な構造は、詳しくは、Bioorganic & Medicinal Chemistry 20 (2012) 571に記載されており、この文献に記載の切断可能な構造から選択してＧからなるスペーサーに組み込むことができる。還元で切断される構造としてジスルフィド結合が良く知られており、光で切断される構造としてニトロベンジル構造が知られている。これらの結合をＧの構成に用いることができる。
Ｇは、これらの要件を満たす構造であれば様々な構造をとることができる。
Ｇはｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７を表し、かつ、ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５、ｇ６、ｇ７はそれぞれ独立して窒素原子、酸素原子、カルボニル基、ニトロベンジル基、ジスルフィド結合、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは０から９の整数を表す）、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ｎは０から９の整数を表す）、ベンゼン環、ヘテロ環または結合を表すことが好ましい。
Ａ、Ｄ、Ｇの好ましいヘテロ環としては、ピリジン環、ピリミジン環、トリアジン環、チオフェン環、フラン環、ピロール環、ピロリジン環、ピペリジン環、イミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、トリアゾール環構造、以下の構造式（２）で表されるヘテロ環などを挙げることができる。
【００１７】
【化４】
2018151301.tif 000005
【００１８】
Ａ、Ｄ及びＧにおいてそれぞれ独立して、ベンゼン環またはヘテロ環を選択した場合は、選択された環構造に対して、連結する２つの基を化学的に許容な任意の環構造の位置に置換することができる。
Ｅは側鎖を分岐させることのできる構造であれば特に限定されることはない。Ｅの分岐をとることのできる構造とは、構造ＡとＤの他に、Ｇと結合できることを意味する。
Ｅとしては、Ａ、Ｄ及びＧとの結合部としての窒素原子、炭素原子、ベンゼン環またはヘテロ環を含む基が好ましい。
Ｅがベンゼン環またはヘテロ環を有する基である場合は、これらの環構造にＡ、Ｄ及びＧの少なくとも１つが結合してもよい。
Ｅとしてベンゼン環またはヘテロ環そのものを選択した場合は、選択された環構造に対して、Ａ、ＤおよびＧは化学的に許容な任意の位置に置換することができる。好ましくは対称性の高い置換位置が好ましい。より具体的には、ベンゼン環であれば置換位置は１，３，５位であり、ピリジン環であれば置換位置は２，４，６位である。
Ｅとしての好ましいヘテロ環としては、ピリジン環、ピリミジン環、トリアジン環、チオフェン環、フラン環、ピロール環、ピロリジン環、ピペリジン環、イミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、トリアゾール環構造、上記構造式（２）で表されるヘテロ環などを挙げることができる。
Ａ−Ｅ−Ｄは、ａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、ａ１〜ａ４、Ｅ、ｄ１〜ｄ４はそれぞれ独立して以下の表Ａ１から選択されることが更に好ましい。
【００１９】
【表１】
2018151301.tif 000006
【００２０】
Ｇが、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して以下の表Ｇ１から選択されることが更に好ましい。
【００２１】
【表２】
2018151301.tif 000007
【００２２】
Ａ−Ｅ−Ｄは、ａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、ａ１〜ａ４、Ｅ、ｄ１〜ｄ４はそれぞれ独立して上記の表Ａ１から選択され。かつ、Ｇが、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して上記の表Ｇ１から選択されることが更に好ましい。
Ａ−Ｅ−Ｄがａ１−ａ２−ａ３−ａ４−Ｅ−ｄ４−ｄ３−ｄ２−ｄ１で表され、下の表Ａ２の組合せ１〜１１４から選択された１つであり、かつ、Ｇが、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して上記の表Ｇ１から選択されることが更に好ましい。
【００２３】
【表３】
2018151301.tif 000008
【００２４】
【表４】
2018151301.tif 000009
【００２５】
一般式（１）の化合物として、好ましい具体的な化合物を以下の表Ａ３〜Ａ１０に示す。表Ａ３〜１２のそれぞれについて、Ｌ、Ｊ、Ｘ、Ｙは一般式（１）と同様に定義される。
【００２６】
【表５】
2018151301.tif 000010
【００２７】
【表６】
2018151301.tif 000011
【００２８】
【表７】
2018151301.tif 000012
【００２９】
【表８】
2018151301.tif 000013
【００３０】
【表９】
2018151301.tif 000014
【００３１】
【表１０】
2018151301.tif 000015
【００３２】
【表１１】
2018151301.tif 000016
【００３３】
【表１２】
2018151301.tif 000017
【００３４】
上記表Ａ３〜Ａ１０に示す各化合物のＧは、それぞれ独立して、ｇ１−ｇ２−ｇ３−ｇ４−ｇ５−ｇ６−ｇ７で表され、ｇ１〜ｇ７はそれぞれ独立して先に記載して表Ｇ１から選択されることが更に好ましい。
上記表Ａ３〜Ａ１０に示す各化合物について、それぞれ独立して、Ｊが硫黄原子であり、Ｌが窒素原子であり、Ｙが活性エステル、マレインイミドまたはヒドラジドであり、Ｇが以下の表Ｇ２から選択される１つの基である（表Ｇ２におけるＥは一般式（１）のＥに結合することを意味する）ことが更に好ましい。
【００３５】
【表１３】
2018151301.tif 000018
【００３６】
Ｙで表されるタンパク質と結合を作る構造とは、共有結合や非共有結合で結合することができる構造を意味する。共有結合によりタンパク質との結合を作る構造は、タンパク質のアミノ基やＳＨ基が、付加や置換することにより共有結合を作ることができる構造であれば良い。また、非共有結合によりタンパク質との結合を作る構造としては、特定のタンパク質受容体と強い親和力を有する薬剤構造を挙げることができる。この薬剤構造は、ターゲットとしての受容体に応じて選択すればよく、特に限定されることはない。
タンパク質との共有結合を作る構造の好ましい具体的としては、活性エステル、酸クロライド、マレインイミド、ヒドラジド、ハロゲン化アルキル、イソチオシアネート、イソシアネート、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、フルオロエステルなどがあげられるがそれに限定されるものではない。
より具体的に活性エステルとは、カルボン酸のエステル部分がフェノール化合物、ヒドロキシピリジン、ヒドロキシキノリン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシマレイミド、２−ヒドロキシベンゾオキサゾール、２−ヒドロキシベンゾチアゾール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、または、これらのメルカプト化合物が挙げられるがそれに限定されるものではない。
【００３７】
一般式（１）で表される化合物は、後述する合成例を示す各実施例に示す方法、あるいは、各実施例に示す方法から容易に得ることができる方法を利用して合成することができる。
【００３８】
本発明にかかるビスビオチン化合物及びビスイミノビオチン化合物の少なくとも１種は、各種の薬学的に許容されている担体、賦形剤及び希釈剤の少なくとも１種を用いて製剤化することができる。この製剤化には、公知の担体、賦形剤及び希釈剤の少なくとも１種を用いた公知の製剤化方法が利用できる。すなわち、本発明にかかるビスビオチン化合物及びビスイミノビオチン化合物の少なくとも１種は、ラベル化処理用製剤の製造における有効成分として使用することができる。
ラベル化剤によりラベル化するタンパク質を有する細胞や組織としては、抗体製造等の目的とする用途に応じて選択すればよい。なお、ラベル化処理を行う組織は、臓器を構成しているものでもよい。
ラベル化処理する細胞としては、生体から分離培養された細胞（固定化細胞や浮遊細胞）、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、これらから分化した細胞、生体内にある細胞等を利用することができる。また、哺乳動物を含む動物から採取した、すなわち生体外に取り出した細胞、組織、臓器などをラベル化処理対象試料として利用することができる。更に、処理対象としての哺乳動物を含む病態モデル動物等のラベル化処理対象の部位、あるいは心臓等の循環器系からラベル化剤を投与して、目的とする細胞、組織、臓器等の部位をラベル化し、ラベル化した部位を動物から取り出してラベル化処理対象試料とすることができる。更に、外科的切除後の臓器、あるいは診断等で利用される血液細胞についても、一旦体外に取り出した後にラベル化処理することができる。この処理には、ヒト以外の哺乳動物を好適に利用することができる。例えば、後述する実施例で用いているように、ヒト以外の動物個体に対しても同様の処理をすることで、血管の基底膜や間質組織に存在する細胞外マトリクス等を利用することも出来る。
培養細胞のラベル化は、培養細胞を含む培養液中にラベル化剤を添加する方法、培養細胞を含む培養液を、ラベル化剤を含む溶液で置換する方法等を用いることができる。また、生体内（例えば、ヒト以外の動物）の細胞のラベル化は、生体内にラベル化剤を投入して、ラベル化した細胞や間質タンパク質を取り出す方法により行うことができる。後述する実施例に記載されるように、動物の血管にラベル化剤を投与して、血管細胞の有するタンパク質を循環器における血流に乗せて肝臓等の組織にまで到達させて、組織全体から、ラベル化タンパク質や細胞外マトリクスを取り出す方法も利用できる。
【００３９】
［工程（２）］（細胞及び／または組織の分解工程）
次に、細胞及び／または組織の分解工程について説明する。工程（２）では、ラベル化されたタンパク質を有する細胞及び／または組織を分解し、固定化処理用の分解物を得る。この固定化処理用の分解物を、固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と接触させ、この分解物に含まれるラベル化タンパク質を固定化ストレプトアビジン変異体と結合させる。
細胞及び／または組織を分解する方法としては、様々な方法を用いることができる。例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、界面活性剤の使用、酵素消化法、超音波処理、フレンチプレス、乳鉢による粉砕、ホモジナイザーによる破砕、ガラスビーズによる破砕など挙げられるが、特に限定されることはない。これらの方法は、単独で、２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４０】
［工程（３）］（固定化工程）
次に、固定化工程について説明する。
固定化工程に用いられる「固定相」とは、使用する溶媒に溶解しない構造体であり、好ましくは水に難溶の構造体である。
固定相として通常のタンパク固定化に用いられる担体が利用できる。具体的には、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、シリカゲル、セライト、ジルコニア、ゼオライト、モンモリロナイト・クレイ、チタニア、水酸化亜鉛、ジルコニア、アガロース、デキストラン、ポリアクリル酸、ポリイミン、ビニルポリマー類、ポリアクリルアミド、多糖類、セルロース、ジビニルベンゼンによって修飾されるポリスチレン、アクリレート／エチレングリコール・コポリマー、酸化アルミニウムなどが挙げられるがこれらに特定されるものではない。また固定相は、ビーズ、膜、モノリスなどの様々な形状で利用することができる。
ストレプトアビジン変異体を固定相に固定化する方法とは、固定相の反応性基と反応させることである。固定相には、ストレプトアビジン変異体を結合することができる反応性基を付与し、溶媒中でストレプトアビジン変異体と共有結合などで強い結合を形成することができる。
反応性基とは、活性エステル、酸クロライド、マレインイミド、ヒドラジド、ハロゲン化アルキル、イソチオシアネート、イソシアネート、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、フルオロエステルなどがあげられる。それらとタンパク質のアミノ基やSH基が、付加や置換することにより共有結合を作ることができる。また、カルボジイミド類やCDIなどの縮合剤により、結合させることもできる。さらに光や放射線による結合や、シランカップリング剤による結合も可能である。
固定化処理用の分解物に含まれるラベル化タンパク質は、固定相に固定化されているストレプトアビジン変異体と複合体を形成し、固定化されたストレプトアビジン変異体を介して固定相に固定化される。
ストレプトアビジン（Streptavidin）とは、ストレプトマイセスの一種Streptomyces avidiniiにより作られるタンパク質であり、分子量53,000ダルトンの４量体を形成し、１つのサブユニット当たり１分子のビオチンと非常に強く結合する特性がある。アビジンは同様にビオチンと非常に強く結合する卵白由来の糖鎖を持つ塩基性糖タンパクである。これらはビオチンによりラベル化されたタンパク質の固定化などに使用されている。
【００４１】
本発明では、ストレプトアビジンやアビジンではなく、天然型のストレプトアビジンに変異を加えビオチンとの結合力を弱めたストレプトアビジン変異体が使用される。
天然型のストレプトアビジンのアミノ酸配列としては、Carlos E.Argarahal, etc., Nucleic Acids Research, Vol. 14, No. 4, 1986に開示されるシグナルペプチドを除いた配列番号１に示す野生型のアミノ酸配列、並びに、この野生型のストレプトアビジンのアミノ酸配列の１３番目から１３９番目の領域からなる国際公開第２０１５／１２５８２０号明細書及びTakeshi Sano、etc., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 47, Issue of November 24, pp. 28204-28209, 1995に開示のNatural Core Streptavidin (１２７アミノ酸残基、１３．３ｋＤａ)の以下の配列番号２のアミノ酸配列を挙げることができる。
配列番号１：
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly 
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp 
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys 
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln 
配列番号２：
Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
【００４２】
天然型のストレプトアビジンへの変異の導入及び変異体の生産は、国際公開第２０１５／１２５８２０号明細書等に記載される方法等の公知の方法により行うことができる。
結合力を弱めているとは、ストレプトアビジン変異体と天然ビオチン又はビオシチンとの結合性が、ストレプトアビジンと天然ビオチン又はビオシチンとの結合性と比較して低下していることを意味する。ストレプトアビジン変異体と天然ビオチン又はビオシチンとの親和性・結合性は、例えばBioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 79:4, 640-642 (2015）、Biochemical journal (1963) 89, 585に記載の方法等の公知の方法で測定することができる。また、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）や表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ解析）などにより評価することができる。
従って、変異位置と変異用に導入されるアミノ酸が選択されていれば、公知の方法によって天然型のストレプトアビジンへの変異体を製造することができ、得られた変異体の特性を公知の方法で確認することができる。
天然型のストレプトアビジンへの変異位置としては、ビオチンとの結合力を弱めるための変異を得ることができれば特に限定されない。変異には、少なくとも１つの変異位置におけるアミノ酸置換を用いることができる。変異位置の個数としては、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは３〜１０の範囲から選択することができる。
【００４３】
天然型のストレプトアビジンへの好ましい変異位置としては、配列番号２のアミノ酸配列における以下の変異位置グループＡを挙げることができる。
・変異位置グループＡ：
配列番号２の天然型ストレプトアビジンのアミノ酸配列のＮ末端（Ala）からのアミノ酸の個数とアミノ酸の公知の一文字表記で示す変異位置として、１０番目のＹ、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３３番目のＳ、３７番目のＮ、７１番目のＹ、７２番目のＲ、８９番目のＥ、９１番目のＲ及び１０４番目のＥ。
これらの変異位置の少なくとも一つを用いることができる。
変異位置グループＡの好ましい変異の組合せとしては以下の変異位置の組合せＡ及びＢを挙げることができる。
変異位置の組合せＡ：
Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ
変異位置の組合せＢ：
Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ
【００４４】
天然型のストレプトアビジンへの更に好ましい変異位置としては、配列番号２のアミノ酸配列における以下の変異位置グループＢを挙げることができる。
・変異位置グループＢ
配列番号２の天然型ストレプトアビジンのアミノ酸配列のＮ末端（Ala）からのアミノ酸の個数とアミノ酸の公知の一文字表記で示す変異位置として、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３１番目のＹ、３２番目のＥ、３３番目のＳ、３４番目のＡ、３５番目のＶ、３６番目のＧ、３７番目のＮ、３８番目のＧ、３９番目のＥ、４０番目のＳ、４１番目のＲ、４２番目のＹ、６７番目のＷ、７４番目のＡ、７６番目のＳ、７８番目のＴ、８０番目のＷ、９６番目のＷ、９８番目のＬ、１００番目のＳ、１０４番目のＥ、１０８番目のＷ、１０９番目のＫ、１１２番目のＬ及び１１６番目のＤ。
これらの変異位置の少なくとも一つを用いることができる。
なお、変異位置グループＢに含まれる変異位置に関して、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３３番目のＳ、３７番目のＮ及び１０４番目のＥ以外は、国際公開第２０１５／１２５８２０号明細書に開示されていない新規な変異位置である。これらの新規な変異位置から選択された少なくとも一つの変異位置を有する変異体、並びに、これらの新規な変異位置から選択された少なくとも一つの変異位置と国際公開第２０１５／１２５８２０号明細書に開示の変異位置の少なくとも一つを有する変異体は、新規な変異体である。
変異グループＢにおける好ましいアミノ酸置換として、以下のアミノ酸置換を挙げることができる。
Ｎ１１Ｄ、Ｎ１１Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１Ｃ、Ｓ１５Ｄ、Ｓ１５Ａ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｃ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｎ、Ｙ３１Ｆ、Ｙ３１Ｗ、Ｙ３１Ｈ、Ｓ３３Ｎ、Ｓ３３Ａ、Ｓ３３Ｇ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｔ、Ａ３４Ｇ、Ａ３４Ｓ、Ｖ３５Ａ、Ｖ３５Ｔ、Ｖ３５Ｎ、Ｖ３５Ｌ、Ｖ３５Ｉ、Ｇ３６Ａ、Ｇ３６Ｐ、Ｇ３６Ｓ、Ｎ３７Ｇ、Ｎ３７Ａ、Ｎ３７Ｓ、Ｎ３７Ｄ、Ｎ３７Ｅ、Ｎ３７Ｔ、Ａ３８Ｇ、Ａ３８Ｓ、Ｗ６７Ｆ、Ｗ６７Ｙ、Ａ７４Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｓ７６Ｒ、Ｓ７６Ａ、Ｓ７６Ｇ、Ｔ７８Ｓ、Ｔ７８Ｃ、Ｔ７８Ｖ、Ｙ７１Ｓ、Ｒ７２Ｋ、Ｔ７８Ａ、Ｗ８０Ｍ、Ｗ８０Ｌ、Ｅ８９Ｄ、Ｒ９１Ｋ、Ｗ９６Ｆ、Ｗ９６Ｌ、Ｌ９８Ｖ、Ｌ９８Ｆ、Ｓ１００Ｒ、Ｓ１００Ｉ、Ｓ１００Ｍ、Ｓ１００Ｌ、Ｓ１００Ｃ、Ｓ１００Ｋ、Ｓ１００Ｖ、Ｅ１０４Ｎ、Ｗ１０８Ｆ、Ｗ１０８Ｍ、Ｗ１０８Ｌ、Ｋ１０９Ｒ、Ｋ１０９Ｅ、Ｋ１０９Ｍ、Ｌ１１２Ｎ、Ｌ１１２Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｓ及びＤ１１６Ｈ。
グループＢから選択された変異位置とアミノ酸置換の具体的な好ましい組合せとして、以下の変異の組合せ（１）〜（４２）を挙げることができる。
（１）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ、
（２）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ、
（３）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ、
（４）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ、
（５）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ、
（６）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ、
（７）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ／Ｎ３７Ｇ、
（８）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ、
（９）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ／Ｎ３７Ｇ、
（１０）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ／Ｎ３７Ｇ、
（１１）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｇ、
（１２）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｇ、
（１３）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｒ、
（１４）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ７６Ｒ、
（１５）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｌ、
（１６）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｌ、
（１７）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｉ、
（１８）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｍ、
（１９）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｖ、
（２０）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｒ、
（２１）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｒ、
（２２）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｓ１００Ｋ、
（２３）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｍ、
（２４）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｍ、
（２５）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｒ、
（２６）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｒ、
（２７）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｋ１０９Ｅ、
（２８）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｌ１１２Ｎ、
（２９）Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｌ１１２Ｑ、
（３０）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３１）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３２）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３３）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３４）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３５）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３６）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｈ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３７）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３８）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｑ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（３９）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｔ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（４０）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、
（４１）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ａ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ、及び
（４２）Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｔ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ。
なお、変異位置グループＢに含まれる変異位置に関して、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３３番目のＳ、３７番目のＮ及び１０４番目のＥ以外は、国際公開第２０１５／１２５８２０号明細書に開示されていない新規な変異位置である。これらの新規な変異位置から選択された少なくとも一つの変異位置を有する変異体、並びに、これらの新規な変異位置から選択された少なくとも一つの変異位置と国際公開第２０１５／１２５８２０号明細書に開示の変異位置の少なくとも一つを有する変異体は、新規な変異体である。
従って、本発明にかかるストレプトアビジン変異体の第一の態様は、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列の、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３１番目のＹ、３２番目のＥ、３３番目のＳ、３４番目のＡ、３５番目のＶ、３６番目のＧ、３７番目のＮ、３８番目のＧ、３９番目のＥ、４０番目のＳ、４１番目のＲ、４２番目のＹ、６７番目のＷ、７４番目のＡ、７６番目のＳ、７８番目のＴ、８０番目のＷ、９６番目のＷ、９８番目のＬ、１００番目のＳ、１０４番目のＥ、１０８番目のＷ、１０９番目のＫ、１１２番目のＬ及び１１６番目のＤからなる群から選択される少なくとも１箇所を変異させて、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体（但し、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対する変異がＹ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体及び前記変異がＹ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体を除く）である。
本発明にかかるストレプトアビジン変異体の第二の態様は、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列の、３１番目のＹ、３２番目のＥ、３４番目のＡ、３５番目のＶ、３６番目のＧ、３８番目のＧ、３９番目のＥ、４０番目のＳ、４１番目のＲ、４２番目のＹ、６７番目のＷ、７４番目のＡ、７６番目のＳ、７８番目のＴ、８０番目のＷ、９６番目のＷ、９８番目のＬ、１００番目のＳ、１０８番目のＷ、１０９番目のＫ、１１２番目のＬ及び１１６番目のＤからなる群から選択される少なくとも１箇所を変異させて、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体である。
上記の本発明にかかるストレプトアビジン変異体の第二の態様は、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列の、１１番目のＮ、１５番目のＳ、３３番目のＳ、３７番目のＮ及び１０４番目のＥからなる群から選択される少なくも１箇所の変異を更に有してもよい。
本発明にかかるストレプトアビジン変異体の第三の態様は、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対して、Ｙ１０Ｓ、Ｎ１１Ｄ、Ｎ１１Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１Ｃ、Ｓ１５Ｄ、Ｓ１５Ａ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｃ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｎ、Ｙ３１Ｆ、Ｙ３１Ｗ、Ｙ３１Ｈ、Ｓ３３Ｎ、Ｓ３３Ａ、Ｓ３３Ｇ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｔ、Ａ３４Ｇ、Ａ３４Ｓ、Ｖ３５Ａ、Ｖ３５Ｔ、Ｖ３５Ｎ、Ｖ３５Ｌ、Ｖ３５Ｉ、Ｇ３６Ａ、Ｇ３６Ｐ、Ｇ３６Ｓ、Ｎ３７Ｇ、Ｎ３７Ａ、Ｎ３７Ｓ、Ｎ３７Ｄ、Ｎ３７Ｅ、Ｎ３７Ｔ、Ａ３８Ｇ、Ａ３８Ｓ、Ｗ６７Ｆ、Ｗ６７Ｙ、Ａ７４Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｓ７６Ｒ、Ｓ７６Ａ、Ｓ７６Ｇ、Ｔ７８Ｓ、Ｔ７８Ｃ、Ｔ７８Ｖ、Ｙ７１Ｓ、Ｒ７２Ｋ、Ｔ７８Ａ、Ｗ８０Ｍ、Ｗ８０Ｌ、Ｅ８９Ｄ、Ｒ９１Ｋ、Ｗ９６Ｆ、Ｗ９６Ｌ、Ｌ９８Ｖ、Ｌ９８Ｆ、Ｓ１００Ｒ、Ｓ１００Ｉ、Ｓ１００Ｍ、Ｓ１００Ｌ、Ｓ１００Ｃ、Ｓ１００Ｋ、Ｓ１００Ｖ、Ｅ１０４Ｎ、Ｗ１０８Ｆ、Ｗ１０８Ｍ、Ｗ１０８Ｌ、Ｋ１０９Ｒ、Ｋ１０９Ｅ、Ｋ１０９Ｍ、Ｌ１１２Ｎ、Ｌ１１２Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｓ及びＤ１１６Ｈからなる群から選択される少なくとも１種の変異を有し、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体（但し、前記変異が、Ｙ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体及び前記変異がＹ１０Ｓ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎからなる変異体を除く）である。
本発明にかかるストレプトアビジン変異体の第四の態様は、
天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対して、Ｎ１１Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１Ｃ、Ｓ１５Ａ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｃ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｎ、Ｙ３１Ｆ、Ｙ３１Ｗ、Ｙ３１Ｈ、Ｓ３３Ａ、Ｓ３３Ｇ、Ｓ３３Ｈ、Ｓ３３Ｔ、Ａ３４Ｇ、Ａ３４Ｓ、Ｖ３５Ａ、Ｖ３５Ｔ、Ｖ３５Ｎ、Ｖ３５Ｌ、Ｖ３５Ｉ、Ｇ３６Ａ、Ｇ３６Ｐ、Ｇ３６Ｓ、Ｎ３７Ａ、Ｎ３７Ｓ、Ｎ３７Ｄ、Ｎ３７Ｅ、Ｎ３７Ｔ、Ａ３８Ｇ、Ａ３８Ｓ、Ｗ６７Ｆ、Ｗ６７Ｙ、Ａ７４Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｓ７６Ｒ、Ｓ７６Ａ、Ｓ７６Ｇ、Ｔ７８Ｓ、Ｔ７８Ｃ、Ｔ７８Ｖ、Ｔ７８Ａ、Ｗ８０Ｍ、Ｗ８０Ｌ、Ｗ９６Ｆ、Ｗ９６Ｌ、Ｌ９８Ｖ、Ｌ９８Ｆ、Ｓ１００Ｒ、Ｓ１００Ｉ、Ｓ１００Ｍ、Ｓ１００Ｌ、Ｓ１００Ｃ、Ｓ１００Ｋ、Ｓ１００Ｖ、Ｗ１０８Ｆ、Ｗ１０８Ｍ、Ｗ１０８Ｌ、Ｋ１０９Ｒ、Ｋ１０９Ｅ、Ｋ１０９Ｍ、Ｌ１１２Ｎ、Ｌ１１２Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｓ及びＤ１１６Ｈからなる群から選択される少なくとも１種の変異を有し、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体である。
上記の本発明にかかるストレプトアビジン変異体の第四の態様は、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列の、Ｙ１０Ｓ、Ｎ１１Ｄ、Ｓ１５Ｄ、Ｓ３３Ｎ、Ｎ３７Ｇ、Ｙ７１Ｓ、Ｒ７２Ｋ、Ｅ８９Ｄ、Ｒ９１Ｋ及びＥ１０４Ｎからなる群から選択される少なくとも一つの変異を更に有してもよい。
本発明にかかるストレプトアビジン変異体の第五の態様は、天然型ストレプトアビジンの配列番号２のアミノ酸配列に対して、上記の変異の組合せ（１）〜（４２）からなる群から選択された一つを有し、ビオチンに対する親和性が前記天然型ストレプトアビジンよりも弱められているストレプトアビジン変異体である。
以上の配列番号２の天然型のアミノ酸配列からなるストレプトアビジンに対する変異は、配列番号１の天然型のアミノ酸配列からなるストレプトアビジン、あるいは配列番号１の天然型のアミノ酸配列の一部からなるストレプトアビジンへの対応する位置への変異の導入にも同様に利用することができる。例えば、配列番号２における１１番目のＮは、配列番号１では２３番目のＮであり、配列番号１の２３番目のＮに対してアミノ酸置換をすることで配列番号１のアミノ酸配列からなるストレプトアビジンに対して変異を導入することができる。
【００４５】
なお、上記のアミノ酸置換による変異の表示は、数字がアミノ酸配列中の変異位置を示し、数字の前の文字が天然型におけるアミノ酸を、数字の後の文字が変異用に導入されるアミノ酸を表す。各文字は周知のアミノ酸の一文字表記である。例えば、Ｎ２３Ｄとは、天然型のストレプトアビジンのアミノ酸配列のＮ末端からの２３番目のアミノ酸のＮ（アスパラギン）をＤ（アスパラギン酸）に変換したことを表す。
ビオチンとの結合力を弱めた結果、内在性のビオチン化タンパク質の、固定化したストレプトアビジン変異体への結合を効果的に低減し、あるいはこれらの結合を防ぎ、ビスイミノビオチン化合物やビスビオチン化合物でラベル化されたタンパク質を選択的に結合し、その結果、微量のタンパク質の同定が可能になる。
細胞内に内在性のビオチン化細胞内タンパク質が多量に存在すると、人為的にラベル化したタンパク質などと内在性のビオチン化細胞内タンパク質が、固定化処理用の分解物中に混入する。ビオチンとの結合力の強いストレプトアビジンを固定相に結合させ、分解物中からの人為的にラベル化したタンパク質などの捕捉用として使用すると、固定相に内在性のビオチン化細胞内タンパク質も同時に捕捉される。固定相から人為的にラベル化したタンパク質などを精製する際に、内在性のビオチン化細胞内タンパク質も一緒に精製される。その結果、一緒に精製された内在性のビオチン化細胞内タンパク質は、分析用試料に混入し、タンパク質の分析、同定を行う際のバックグランドとなる。混入した内在性のビオチン化細胞内タンパク質が多量であると、バックグランドの上昇を招き、目的とする人為的にラベル化したタンパク質の高精度での分析、同定を妨げる要因となる。
これに対して、本発明では人為的にラベル化したタンパク質の捕捉に、ビオチンに対する結合力が低下しているストレプトアビジン変異体を用いることで、固定相への内在性のビオチン化細胞内タンパク質の取り込みを抑え、分析、同定の際のバックグランドを低下させて、微量に存在するタンパク質の高精度での分析、同定を可能としている。
固定化処理用の分解物に対しては、希釈、タンパク質以外の成分の除去、添加剤の添加等、ストレプトアビジン変異体での処理用の前処理を、必要に応じて行うことができる。
固定化処理用の分解物と固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体との接触は、固定相の形態に応じた公知の方法を利用して行うことができる。例えば、ストレプトアビジン変異体を固定したビーズ等の固定相と固定化処理用の分解物とを反応槽内で混合し、所定時間これらを反応させる方法、ストレプトアビジン変異体を固定した固定相をカラムに充填し、そこに固定化処理用の分解物を通過させ、カラムに充填した固定相に固定されたストレプトアビジン変異体と固定化処理用の分解物を接触させる方法などを用いることができる。
ストレプトアビジン変異体を固定化した固定相と固定化処理用の分解物に含まれる人為的にラベル化したタンパク質を接触させることで、非共有結合での強い結合を作り、ストレプトアビジン変異体とラベル化タンパク質の複合体が形成され、固定相にラベル化タンパク質が結合する。ビスイミノビオチン化合物やビスビオチン化合物でラベル化されていないタンパク質、あるいは細胞や組織内の様々な成分は、固定相を洗浄することで容易に除去できる。
【００４６】
［工程（４）］（切出し工程）
次に、ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程について説明する。
切出し工程は、ラベル化タンパク質が固定化された固定相から様々な方法で、分析用の試料を切り出す工程である。この切り出しには、物理的、化学的、酵素反応的な方法を用いることができる。具体的には、還元、酸化、光、酵素、求核試薬、求電子試薬及び有機金属試薬等から選択した少なくとも１種を用いた切断処理あるいは分解処理を用いることができる。
例えば、タンパク質分解酵素で固定相に固定化されたタンパク質を分解する方法、超音波処理により物理的に切り出す方法、還元、酸化や光などで、タンパク質と、固定相に固定化されたラベル化剤との結合部位を切断したり、タンパク質を分解する方法などが挙げられるが、特に限定されるものではない。固定相に固定化されたラベル化剤からタンパク質を切り離す場合に、先に説明したように、Ｇに切断可能な構造を付与しておき、この切断可能な構造を利用しても良い。
タンパク質と、固定相に固定化されたラベル化剤との結合部位を切断する方法は、これらの結合の形態、すなわち共有結合か非共有結合により、定法から選択すればよい。受容体を、受容体との親和性を有する薬剤を介してラベル化した場合は、受容体と薬剤の種類に応じてこれらの切断方法を定法から選択することができる。
切り出しに利用する方法によって、分析用の試料の組成が異なる。
例えば、ラベル化剤とタンパク質の結合を切断する切り出し方法の場合には、異なる種類のタンパク質を含む試料を得ることができる。
また、タンパク質をランダムに分解するタンパク質分解酵素を用いた場合、タンパク質とストレプトアビジンがランダムに分解されて生じる種々のオリゴヌクレオチドを含む分解物を、分析用の試料として得ることができる。
【００４７】
［工程（５）］（分析工程）
次に、固定相から切り出された分析用のタンパク質を分析し、タンパク質を同定する工程について説明する。
固定相から切り出された分析用の試料の形態に応じた分析方法によって分析用の試料を分析し、分析結果から工程（１Ａ）においてラベル化したタンパク質を同定することができる。この分析工程には、公知の分析方法を利用することができる。また、分析方法は、試料に含まれる分析対象物の種類に応じて選択することができる。例えば、切り出されたタンパク質及び／またはその分解物としてオリゴペプチドの分子量をマススペクトルで測定する方法、切り出されたタンパク質及び／またはその分解物としてオリゴペプチドのアミノ酸配列を確認する方法等から選択して用いることができる。分析用の試料には、必要に応じて、希釈、精製または分析用の試薬との混合等の分析に必要な前処理を施してもよい。
分析結果、例えば、マススペクトルで得られた分子量や、アミノ酸分析で得られたアミノ酸配列から、ラベル化したタンパク質を同定することができる。すなわち、タンパク質の同定とは、得られた分子量のデータやアミノ酸配列からラベル化したタンパク質の種類を決定することである。このタンパク質の種類の決定には公知のデータベースを利用することができる。
例えば、トリプシンなどのタンパク質分解酵素プロテアーゼを用いて、固定相に結合したタンパク質を断片化してランダムなオリゴペプチド断片として切り出し、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によって断片ペプチド由来のイオンのマススペクトルを測定し、得られたマススペクトルデ−タを用いてタンパク質の公知の配列データベースで検索を行い、ラベル化したタンパク質を同定することができる。
利用できるデータベースとしては、公的なアクセスが可能である以下のデータベースを利用することができる。
・ウエブサイドデータベース：http://wlab.ethz.ch/cspa/#abstract
・文献：Bausch-Fluck D, Hofmann A, Bock T, Frei AP, Cerciello F, et al. (2015) ,
A Mass Spectrometric-Derived Cell Surface Protein Atlas. PLoS One 10: e0121314.
また、細胞膜ドメインを持つタンパク質の検索には、以下のドメインのデータベースを利用することができる。
・http://phobius.sbc.su.se/
・http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
なお、タンパク質の同定に利用するデータベースは上記のものに限定されず、公的アクセスが可能なものであれば、制限なく利用できる。
また、データベースには、既に種々のタンパク質のアミノ酸配列が登録されている。これらのアミノ酸配列を特異的に切り出す酵素（例えば、トリプシンでは、リジン、アルギニンで切断される）によって、これらのアミノ酸配列のどの部分が親ペプチドイオンとして産生され、これをＭＳ／ＭＳすることで、どのように断片化されるのかがデータとして存在している。これらの結果をマッチングし、確からしいペプチドを同定し、そこからタンパク質を同定することができる。
【００４８】
本発明にかかる抗体の製造方法は、抗体製造用の標的タンパク質を用意する工程と、標的タンパク質から、標的タンパク質に対する抗体を製造する工程と、を有する。
抗体製造用の標的タンパク質として、先に説明した同定方法により同定されたタンパク質が用いられる。
本発明の抗体の製造方法は、先に説明した同定方法を含むことができ、以下の工程（１）〜（６）を有することができる。
（１）ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を用意する工程。
（２）前記ラベル化タンパク質を有する細胞及び／または組織を分解して、前記ラベル化タンパク質を含む分解物を調製する分解工程。
（３）固定相に固定化されたストレプトアビジン変異体と前記分解物を接触させ、該分解物に含まれるラベル化タンパク質を、該ストレプトアビジン変異体を介して該固定相に固定化する固定化工程。
（４）前記ラベル化タンパク質が固定化された固定相から分析用の試料を切り出す切出し工程。
（５）前記分析用の試料を分析し、前記ラベル化したタンパク質を同定する分析工程。
（６）前記分析工程において同定されたタンパク質を創薬標的タンパク質として、該標的タンパク質に対する抗体を製造する工程。
工程（１）は、以下の工程（１Ａ）により行うことができる。
（１Ａ）ビスイミノビオチン化合物及びビスビオチン化合物から選択される少なくとも１種からなるラベル化剤で、細胞の有する細胞膜上のタンパク質及び／または組織中の細胞外にあるタンパク質をラベル化して、ラベル化タンパク質を得るラベル化工程。
分析工程において同定したタンパク質は、同定したタンパク質に対する抗体の製造における抗原として利用することができる。
【００４９】
抗体の製造には、動物に抗原（免疫原）を免疫して抗体を作る方法と動物への免疫を経ないで抗体を得る方法があり、前者はさらにポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の作製法に分けられる。後者はファージディスプレイ法と呼ばれる方法等が知られている。
ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギの他に、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ロバなど様々な哺乳動物や鳥類に抗原（免疫原）を繰り返し注射して、血液中に抗体を多量に産生させ、血液（血漿、血清）を回収し、それを、抗体を捕獲する酵素を固定化したカラムを用いる定法などによって精製して得ることができる。
モノクローナル抗体は、抗体を産生しているＢ細胞と不死化したがん細胞（ミエローマ）を人工的に融合させ、特定の抗体遺伝子を維持しながら半永久的に生存できる融合細胞（ハイブリドーマ）を作製し、このハイブリドーマの中から、結合親和性や特異性に優れた有用なモノクローナル抗体を産生する細胞を選択し、抗体を産生させることで得ることができる。
ファージディスプレイ法は、例えば、抗体の結合能を決めるＨ鎖とＬ鎖の可変領域を短いアミノ酸配列で繋いでファージ上に提示させたライブラリーを用い、標的分子に対して親和性を有する抗体を選択する技術であり、ファージを大腸菌に感染させ、抗体を産生することができる。なお、ファージに提示させるタンパク質としては、上述した動物が有する抗体由来のアミノ酸配列に限定するものではない。例えば、本発明にかかる同定方法により同定されたタンパク質あるいはこのタンパク質から得られる抗原に対して特異的な抗体（例えば、Ｈ鎖とＬ鎖の組合せ）を提示するファージを、ファージディスプレイ法を利用して調製し、こうして得られたファージを大腸菌等の細菌宿主に感染させて目的とする抗体を得ることができる。
【００５０】
本発明における抗体の製造方法に用いる各工程は特に限定されない。同定されたタンパク質の種類や抗原性（あるいは免疫原性）に応じて公知の方法から選択することができる。
こうして得られた抗体は、種々の目的とする用途に利用することができる、例えば、後述する実施例で同定されたＣＤ３０に対する抗体においては、がん治療（制癌剤）や、リウマチ、アレルギー疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、シェーグレン症候群、ループスエリテマトーデス等に対する抗体医薬としての用途が期待される。
【００５１】
一般式（１）で表される化合物の少なくとも１種は、タンパク質のラベル化用の化合物として使用することができる。一般式（１）で表される化合物によりラベル化されたタンパク質はタンパク質の同定方法、好ましくは先に挙げた工程（１）〜（５）を有するタンパク質の同定方法に好適に利用することができる。
上記のストレプトアビジン変異体は、ラベル化タンパク質の同定用のストレプトアビジン変異体として使用することができ、好ましくは先に挙げた工程（１）〜（５）を有するタンパク質の同定方法に好適に利用することができる。
上記のタンパク質のラベル化用の化合物の少なくとも１種と上記のストレプトアビジン変異体の少なくとも１種を用いて、タンパク質同定用のキットを作製することができる。
【実施例】
【００５２】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、「％」は特に断らない限り、質量基準である。
ＮＭＲ分析値は日本電子社製ＥＸ−２７０（２７０ＭＨｚ）を用いて測定した。
ＨＰＬＣ分析は、以下の２条件で行った。
分析条件Ａ
・カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ  １５０＊６ｍｍ
・流速：１ｍＬ／ｍｉｎ．
・カラム温度：４０℃
・検出波長：２５４ｎｍ
・移動相：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ
分析条件Ｂ
・カラム：ＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８  ７５＊２ｍｍ
・流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ．
・カラム温度：３５℃
・検出波長：２５４ｎｍ
・移動相：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ
グラジュエント条件は、例えば０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５と記載するが、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を８５％から３５％に１２分かけて減少させ、そのあと８５％に戻す条件を表す。【００５３】
［実施例１−１］
［Ｎ−Ｂｏｃ保護化イミノビオチンの合成］
イミノビオチン１１５ｍｇにメタノール１１ｍＬとトリフルオロ酢酸０．６ｍＬを加え、加熱還流を７．５時間行った。減圧濃縮して、目的反応生成物としてのイミノビオチンメチルエステルを固体として１９２ｍｇ得た。精製することなしに次の反応に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：7.8(1H,br.s), 7.2(1H, br.s), 4.7-4.8(1H, m), 4.5-4.6(1H, m), 3.7(3H, s), 3.2-3.3(1H, m), 2.8-3.0(2H, m),2.3-2.4(2H, t), 1.4-1.8(6H, m)
上記合成のイミノビオチンメチルエステルにクロロホルム２ｍＬとトリエチルアミン０．３ｍＬとＢｏｃ無水物を４１３ｍｇ加え室温で１夜撹拌した。クロロホルム４ｍＬを加え、水３ｍＬで洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して残渣を得た。
残渣に水酸化リチウム水和物９９ｍｇ（５当量）と水０．７ｍＬとメタノール２．５ｍＬを加え、室温で１夜撹拌した。減圧濃縮し残渣に５％クエン酸水溶液を５ｍＬ加えｐＨ５に調整した。クロロホルム１０ｍＬで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、目的反応生成物としてのＮ−Ｂｏｃ保護化イミノビオチン１０２ｍｇ（６３％）を得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：4.6-4.7(1H, m), 4.4-4.5(1H, m),3.2-3.3(1H, q),2.9-3.0(1H, dd), 2.8-2.9(1H, d), 2.2-2.4(2H, t), 1.4-1.8(6H, m), 1.49(9H, s)
［実施例１−２］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＭｅ  １の合成］【００５４】
【化５】
2018151301.tif 000019
【００５５】
実施例１−１で合成したＮ−Ｂｏｃイミノビオチン３６７ｍｇ（２．１当量）に脱水ＤＭＦ６ｍＬを加え、さらに縮合剤のＣＤＩ（１８２ｍｇ、２．２当量）とトリエチルアミン０．５５ｍＬ（４当量）を加えた。室温で２時間撹拌し、３，５−ビス（６−アミノヘキサンアミド）安息香酸メチルエステル・２トリフルオロ酢酸塩３１６ｍｇ（０．５１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液３ｍＬを加え、５０℃〜６０℃で３時間加熱撹拌した。減圧濃縮し、クロロホルム２０ｍＬと５％クエン酸１０ｍＬを加えた。不溶物が分離したので、水とクロロホルムを除き、メタノールに溶解した。クロロホルムと合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して残渣を得た。シリカゲルカラム（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１０／１から３／１）で精製し、３８３ｍｇの目的反応生成物としてのビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＭｅ  １（Ｍｅ＝メチル基）を得た。（収率７２％）
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.0(2H, s), 8.2(1H, s),8.0(2H, s), 7.95(2H, d), 7.90(2H, br.s), 7.6(1H, br.s), 4.5-4.6(2H, m), 4.2-4.3(2H, m), 3.84(3H, s), 3.1-3.3(2H, m), 2.95-3.1(4H, m), 2.8-2.9(4H, m), 2.25-2.35(4H, t), 2.0-2.1(4H, t), 1.2-1.7(24H, m), 1.35(18H, s)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１５．３分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝９０／１０（１８分）３０／７０）
［実施例１−３］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ    ２の合成］【００５６】
【化６】
2018151301.tif 000020
【００５７】
実施例１−２で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＭｅ  １  １８０ｍｇ（０．２２６ｍｍｏｌ）をメタノール１ｍＬに溶解し、水酸化リチウム水和物３５ｍｇ（４．８当量）と水０．３ｍＬを加え、４０℃で２時間加熱撹拌した。減圧濃縮し、０．５Ｎ塩酸でｐＨ５に調整した。析出した固体をろ取し、水２ｍＬで洗浄した。６０℃で減圧乾燥し、１３７ｍｇの目的反応生成物としてのビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ  ２を得た。（収率７７％）
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.9(2H, s), 8.2(1H, s), 8.0(2H, s), 7.8(2H, br.s), 7.7(2H, m), 4.5-4.6(2H, m), 4.35-4.45(2H, m), 3.15-3.3(2H, m), 3.0-3.1(4H, m), 2.8-2.9(4H, m), 2.25-2.35(4H, t), 2.0-2.1(4H, t), 1.2-1.7(24H, m), 1.37(18H, s)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１４．３分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝９０／１０（１８分）３０／７０）
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１２．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１８分）５／９５）
［実施例１−４］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）３の合成］【００５８】
【化７】
2018151301.tif 000021
【００５９】
実施例１−３で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ  ２  １３５ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ１ｍＬを加え、さらに縮合剤のＣＤＩ（２２．３ｍｇ、１．０５当量）を加えた。４０℃で１時間撹拌し、Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ−ａｍｉｎｅ（Ｓｈｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ  Ｎｏ；  
１２５５９４２−０６−３）  ３６ｍｇ（１当量）の脱水クロロホルム溶液０．７ｍＬを加え、室温で５時間撹拌した。減圧濃縮し、クロロホルム１０ｍＬとを加え、０．１Ｎ塩酸でｐＨ５に調整した。不溶物が分離したので、水とクロロホルムを除き、メタノールに溶解した。クロロホルムと合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して残渣を得た。シリカゲルカラム（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２０／１から５／１）で精製し、１２８ｍｇの目的反応生成物としてのビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＤＢＣＯ  ３を得た。（収率７５％）
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.2(1H, br.t), 8.0(1H, s), 7.95(1H, s), 7.75(2H, t), 7.3-7.7(12H, m), 5.05(1H, d), 4.55-4.65(2H, m), 4.3-4.4(3H, m), 4.1(1H, m), 3.64(1H, d), 3.4-3.5(4H, m), 3.2-3.3(2H, m), 3.16(4H, d), 2.95-3.1(4H, br.t), 2.8-2.9(4H, m), 2.5-2.6(1H, m), 2.2-2.35(4H, t), 2.0-2.1(4H, t), 1.8-2.0(1H, m), 1.2-1.7(24H, m), 1.4(18H, s)
ＨＰＬＣ  分析条件Ａ保持時間；１４．７分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１８分）５／９５）
［実施例１−５］
［１−［（１−Ａｚｉｄｏ−１５−ｏｘｏ−３，６，９，１２−ｔｅｔｒａｏｘａｐｅｎｔａｄｅｃａｎ−１５−ｙｌ）ｏｘｙ］−２，５−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅの合成］【００６０】
【化８】
2018151301.tif 000022
【００６１】
１５−Ａｚｉｄｏ−４，７，１０，１３−ｔｅｔｒａｏｘａｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  １００ｍｇ（０．３４ｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド４７ｍｇ（１．２当量）に脱水クロロホルム  ５ｍＬを加えた。さらに縮合剤のＥＤＣ塩酸塩１００ｍｇ  （１．５当量）を加え、室温で３時間撹拌し、目的反応生成物としての1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-2,5-pyrrolidinedioneを合成した。この溶液は精製することなく、次の反応に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）；3.71(2H, t), 3.60(2H, t), 3.6-3.5(12H, m), 2.92(2H, t), 2.81(4H, s)
［実施例１−６］
［1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-3-sulfonyl-2,5-pyrrolidinedioneの合成］【００６２】
【化９】
2018151301.tif 000023
【００６３】
15-Azido-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid  ３１０ｍｇ（１．０７ｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩２６６ｍｇ（１．１５当量）に脱水ＤＭＦ  ６．２ｍＬを加えた。さらに縮合剤のＥＤＣ塩酸塩２９６ｍｇ（１．４５当量）を加え、室温で５時間撹拌し、目的反応生成物としての1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-3-sulfonyl-2,5-pyrrolidinedioneを合成した。この溶液は精製することなく、次の反応に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）；4.0-3.9(1H, br.d), 3.71(2H, t), 3.60(2H, t), 3.6-3.5(12H, m), 3.1-3.3(2H, br.), 2.92(2H, t)
［実施例１−７］
［ビスイミノビオチン−ＤＢＣＯ−ＮＨＳ  ５の合成］【００６４】
【化１０】
2018151301.tif 000024
【００６５】
実施例１−４で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）  −ＤＢＣＯ  ３（３３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ１ｍＬに溶解し、５％トリフルオロ酢酸／クロロホルム溶液を０．７２ｍＬ加えた。さらに、実施例１−５で合成した、1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-2,5-pyrrolidinedione（１８ｍｇ、２当量）のクロロホルム溶液を加えた。室温で１夜撹拌し、縮合体ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＤＢＣＯ−ＮＨＳ  ４を得た。
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１４．５分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝７５／２５（１８分）３０／７０）
目的物の確認のため、Ｎ−メチルブチルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１５．３分に変化し、活性エステルであることを確認した。
反応液を乾燥窒素で濃縮し、残渣を精製することなしにトリフルオロ酢酸０．４ｍＬに溶解し、室温で１．５時間放置した。反応液を減圧濃縮し、目的のビスイミノビオチン−ＤＢＣＯ−ＮＨＳ  ５を４０ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）；10.0(2H, br.), 8.3-8.0(5H, m), 7.9-7.2(16H, m), 6.0-5.8(1H, m), 4.7-4.6(2H, m), 4.6-4.4(4H, m), 4.1-4.0(1H, m), 3.8-3.4(18H, m), 3.3-3.2(2H, m), 3.1-3.0(4H, br.q), 3.0-2.85(4H, m), 2.9-2.8(4H, m), 2.80(4H, s), 2.35-2.2(4H, br.t), 2.1-2.0(4H, t), 1.8-1.2(24H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．０分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝７５／２５（１８分）３０／７０）
目的物の確認のため、Ｎ−メチルブチルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１２．１分に変化し、活性エステル化合物であることを確認した。
［実施例１−８］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＤＢＣＯ−スルホＮＨＳ  ６の合成］【００６６】
【化１１】
2018151301.tif 000025
【００６７】
実施例１−４で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＤＢＣＯ  ３  ４０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ０．４ｍＬに溶解し、５％トリフルオロ酢酸／クロロホルム溶液を０．６５ｍＬ加えた。
さらに、実施例１−６で合成した、1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-3-sulfonyl-2,5-pyrrolidinedione２２ｍｇ（１．５当量）のＤＭＦ溶液を加えた。室温で３０分撹拌し、反応液を乾燥窒素で濃縮した。残渣を１Ｎ塩酸水溶液２ｍＬと０．５ｍＬで洗浄した後、減圧乾燥してアモルファス状の目的反応生成物としてのビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−スルホＮＨＳ  ６を５９ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）；11.8(1H, br.s), 10.0(2H, br.), 9.1(2H, br.s), 8.8(1H, br.s), 8.2-7.2(18H, m), 6.0-5.8(1H, m), 4.85-4.75(2H, m), 4.6-4.4(4H, m), 4.1-3.8(2H, m), 3.8-3.4(18H, m), 3.25-3.35(2H, m), 3.3-3.0(2H, m), 3.1-2.9(8H, m), 2.9-2.8(4H, m), 2.75(2H, d), 2.6-2.4(1H, m), 2.4-2.2(4H, br.t), 2.1-2.0(4H, t), 2.0-1.9(1H, m), 1.9-1.2(24H, m), 1.49(18H, s)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１３．８分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝７５／２５（１８分）３０／７０）
目的物の確認のため、Ｎ−メチルブチルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１５．３分に変化し、活性エステル化合物であることを確認した。
［実施例１−９］
［ビスイミノビオチン−ＤＢＣＯ−スルホＮＨＳ  ７の合成］【００６８】
【化１２】
2018151301.tif 000026
【００６９】
実施例１−８で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−スルホＮＨＳ  ３（４４ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸０．３８ｍＬに溶解し、室温で１時間放置した。反応液を減圧濃縮し、目的のビスイミノビオチン−スルホＮＨＳ  ７を５８ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）；10.0(2H, br.), 8.3-8.0(5H, m), 7.9-7.2(16H, m), 6.0-5.8(1H, m), 4.7-4.6(2H, m), 4.6-4.4(4H, m), 4.1-4.0(1H, m), 4.0-3.9(1H, m), 3.8-3.4(18H, m), 3.3-3.2(2H, m), 3.2-3.0(2H, br.), 3.1-3.0(4H, br.q), 3.0-2.85(4H, m), 2.9-2.8(4H, m), 2.35-2.2(4H, br.t), 2.1-2.0(4H, t), 1.8-1.2(24H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１０．３分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝７５／２５（１８分）３０／７０）
目的物の確認のため、Ｎ−メチルブチルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１２．１分に変化し、活性エステル化合物であることを確認した。
［実施例１−１０］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−アセチレン  ８の合成］【００７０】
【化１３】
2018151301.tif 000027
【００７１】
実施例１−３で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ  ２  （５００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ５ｍＬを加え、さらに縮合剤のＣＤＩ（１００ｍｇ、１．２７当量）を加えた。４５℃で１時間加熱撹拌し、2-(prop-2-yn-1-yloxy)ethan-1-amine  ３６ｍｇ（１．２当量）の脱水クロロホルム溶液０．２ｍＬを加え、室温で一夜撹拌した。減圧濃縮し、０．１Ｎ塩酸でｐＨ４に調整した。不溶物が分離したので、水層を除き、さらに水５ｍＬで洗浄し、残渣を減圧乾燥した。シリカゲルカラム（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２０／１から５／１）で精製し、１２８ｍｇの目的反応生成物としてのビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−アセチレン  ８を得た。（収率４９％）
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.97(2H, s), 8.4(1H, br.t), 8.0(1H, s), 7.95(1H, s), 7.74(2H, t), 7.65(3H, d), 4.6-4.5(2H, m), 4.35-4.25(2H, m), 4.16(2H, d), 4.1(1H, m), 3.56(2H, t), 3.45-3.35(3H, m), 3.25-3.15(1H, m), 2.95-3.1(4H, br.q), 2.9-2.75(4H, m), 2.45-2.2(4H, t), 2.1-2.0(4H, t), 1.2-1.7(24H, m), 1.4(18H, s)
［実施例１−１１］
［ビスイミノビオチン−トリアゾール−スルホＮＨＳ  １０の合成］【００７２】
【化１４】
2018151301.tif 000028
【００７３】
実施例１−１０で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−アセチレン  ８  （２０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦに溶解し、酢酸と酢酸銅とアスコルビン酸ナトリウムと実施例１−６で合成した1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-3-sulfonyl-2,5-pyrrolidinedione  １３ｍｇ（１．５当量）のＤＭＦ溶液を加えた。室温で１時間撹拌し、反応液を乾燥窒素で濃縮した。残渣を１Ｎ塩酸水溶液２ｍＬと０．６６ｍＬで洗浄した後、減圧乾燥してアモルファス状のビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−トリアゾール−スルホＮＨＳ  ９を得た。
ＨＰＬＣ保持時間；９．９分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝７０／３０（１２分）５５／４５）
目的物の確認のため、ブチルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１２．４分に変化し、活性エステル化合物であることを確認した。
次いで、精製することなしにトリフルオロ酢酸０．５５ｍＬを加え、室温で１時間放置し、減圧濃縮して、目的反応生成物としてのビスイミノビオチン−トリアゾール−スルホＮＨＳ  １０を３３ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）；10.0(2H, br.s.), 8.4(1H, br.t), 8.3(2H, br.s), 8.2-8.05(4H, m), 7.8(2H, br.t), 7.7-7.6(6H, br), 4.7-4.6(2H, m), 4.6-4.4(6H, m), 4.0-3.9(1H, br), 3.80(2H, t), 3.7(2H, t), 3.6-3.4(20H, m), 3.3-3.2(2H, m), 3.2-3.1(1H, br), 3.02(4H, q), 2.95-2.85(6H, m), 2.79(2H, d), 2.30(4H, t), 2.06(4H, t), 1.8-1.2(24H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；９．１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８０／２０（１２分）５５／４５）
目的物の確認のため、アミルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１２．４分に変化し、活性エステルであることを確認した。
［実施例１−１２］
［ビスイミノビオチン−トリアゾール−ＮＨＳ  １２の合成］【００７４】
【化１５】
2018151301.tif 000029
【００７５】
実施例１−１０で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−アセチレン  ８  （２０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦに溶解し、酢酸と酢酸銅とアスコルビン酸ナトリウムと実施例１−５で合成した1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-2,5-pyrrolidinedione  １３ｍｇ（２．０当量）のクロロホルム溶液を加えた。室温で２時間撹拌し、反応液を乾燥窒素で濃縮した。残渣を酢酸エチル０．３ｍＬと１Ｎ塩酸水溶液０．３ｍＬと０．１ｍＬで洗浄した後、減圧乾燥してアモルファス状のビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−トリアゾール−ＮＨＳ  １１を得た。
ＨＰＬＣ保持時間；１１．８分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝７０／３０（１２分）５５／４５）
目的物の確認のため、Ｎ−ブチルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１２．４分に変化し、活性エステル化合物であることを確認した。
次いで、トリフルオロ酢酸０．２ｍＬを加え、室温で１時間放置し、減圧濃縮して、目的反応生成物としてのビスイミノビオチン−トリアゾール−ＮＨＳ  １２  を３３ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）；10.0(2H, br.s.), 8.38(1H, br.t), 8.23(2H, br.s), 8.07(4H, s), 7.75(2H, br.t), 7.7-7.6(6H, br), 4.7-4.6(2H, m), 4.6-4.4(6H, m), 3.80(2H, t), 3.73(2H, t), 3.6-3.35(18H, m), 3.3-3.2(2H, m), 3.02(4H, br.q), 2.95-2.85(4H, m), 2.80(4H, s), 2.78(2H, d), 2.30(4H, t), 2.05(4H, t), 1.8-1.2(24H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；９．８分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８０／２０（１２分）５５／４５）
目的物の確認のため、アミルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１２．６分に変化し、活性エステルであることを確認した。
［実施例１−１３］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ    １３の合成］【００７６】
【化１６】
2018151301.tif 000030
【００７７】
methyl 3,5-bis(5-aminopentanamido)benzoate塩酸塩１．４４７ｇ（３．３１ｍｍｏｌ）と実施例１−１で合成したＮ−Ｂｏｃイミノビオチン２．５ｇ（７．２８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１−２と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＭｅ  １３を１．２８１ｇ（３８％）を得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.1(2H, s), 8.2(1H, s), 8.0(2H, s), 7.95(2H, d), 7.92(2H, br.s), 7.62(1H, br.s), 4.5-4.6(2H, m), 4.2-4.3(2H, m), 3.83(3H, s), 3.1-3.3(2H, m), 2.95-3.1(4H, m), 2.8-2.9(4H, m), 2.25-2.35(4H, t), 2.0-2.1(4H, t), 1.2-1.7(20H, m), 1.35(18H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；５．０３分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１−１４］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ  １４の合成］【００７８】
【化１７】
2018151301.tif 000031
【００７９】
実施例１−１３で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＭｅ  １３  ８８６．３ｍｇ（０．８７３ｍｍｏｌ）を用い、実施例１−３と同様に反応し、目的反応生成物として７０７．８ｍｇ（６５％）のビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ  １４を得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.92(2H, s), 8.21(1H, s), 8.0(2H, s), 7.79(2H, br.s), 7.7(2H, m), 4.5-4.6(2H, m), 4.35-4.45(2H, m), 3.15-3.3(2H, m), 3.0-3.1(4H, m), 2.8-2.9(4H, m), 2.25-2.35(4H, t), 2.0-2.1(4H, t), 1.2-1.7(20H, m), 1.37(18H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．７１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１−１５］
［ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−アセチレン  １５の合成］【００８０】
【化１８】
2018151301.tif 000032
【００８１】
実施例１−１４で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＣＯＯＨ  １４  ３５５．３ｍｇ（０．３５５ｍｍｏｌ）を用い、実施例１−１０と同様に反応し、目的反応生成物として５５．６ｍｇ（１４％）のビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−アセチレン  １５を得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.91(2H, s), 8.2(1H, s), 8.0(2H, s), 7.8(2H, br.s), 7.72(2H, m), 4.5-4.6(2H, m), 4.35-4.45(2H, m), 3.15-3.3(2H, m), 3.0-3.1(4H, m), 2.8-2.9(4H, m), 2.25-2.35(4H, t), 2.0-2.1(4H, t), 1.2-1.7(20H, m), 1.37(18H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．９１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１−１６］
［ビスイミノビオチン−トリアゾール−スルホＮＨＳ  １７の合成］【００８２】
【化１９】
2018151301.tif 000033
【００８３】
実施例１−１５で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−アセチレン  １５    ５１．８ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）と実施例１−６で合成した1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-3-sulfonyl-2,5-pyrrolidinedione  ３５．２ｍｇ（０．０７２ｍｍｏｌ、１．５当量）のＤＭＦ溶液を用いて、実施例１−１１と同様に反応し、ビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−トリアゾール−スルホＮＨＳ  １６を得た。
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．６８分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的物の確認のため、少量をブチルアミンと反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が５．０１に変化し、活性エステル化合物であることを確認した。
次いで、精製することなしにトリフルオロ酢酸と反応させ、目的反応生成物としてのビスイミノビオチン−トリアゾール−スルホＮＨＳ  １７を３０ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）；10.1(2H, br.s.), 8.4(1H, br.t), 8.3(2H, br.s), 8.2-8.05(4H, m), 7.82(2H, br.t), 7.7-7.6(6H, br), 4.7-4.6(2H, m), 4.6-4.4(6H, m), 4.0-3.9(1H, br), 3.80(2H, t), 3.7(2H, t), 3.6-3.4(20H, m), 3.3-3.2(2H, m), 3.2-3.1(1H, br), 3.02(4H, q), 2.95-2.85(6H, m), 2.79(2H, d), 2.30(4H, t), 2.06(4H, t), 1.8-1.2(20H, m)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；ブチルアミンと反応させた化合物４．０３分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例２−１］
［N,N-bis[(ethoxycarbonyl)methyl]-3-(tert-butoxycarbonylamino)propionylamideの合成］【００８４】
【化２０】
2018151301.tif 000034
【００８５】
3-(tert-butoxycarbonylamino)propanoic acid２．５ｇ（１３．３ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦに溶解し、縮合剤ＣＤＩ２．６ｇ（１．２当量）を加え、室温で３．５時間撹拌した。Bis[(ethoxycarbonyl)methyl]amine  ２．７３ｇ（１．０８当量）を加え、室温で一夜撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、酢酸エチル１５ｍＬを加え、５％クエン酸水溶液２０ｍＬと５ｍＬで洗浄した。さらに、水５ｍＬと飽和食塩水５ｍＬで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去後、ジイソプロピルエーテル１００ｍＬで結晶化し、ろ取した。減圧乾燥し、目的のN,N-bis[(ethoxycarbonyl)methyl]-3-(tert-butoxycarbonylamino)propionylamideを１．２６ｇ（２６％）得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；4.3-4.1(8H, m), 3.43(2H, q), 2.51(2H, t),1.43(9H, s), 1.35-1.25(6H, m)
［実施例２−２］
［N-(3-(tert-butoxycarbonylamino)propiony)iminodiacetic acidの合成］【００８６】
【化２１】
2018151301.tif 000035
【００８７】
実施例２−１で合成したN,N-bis[(ethoxycarbonyl)methyl]-3-(tert-butoxycarbonylamino)propionylamide  （１．２ｇ、３．３ｍｍｏｌ）をメタノール８．４ｍＬに溶解し、水酸化リチウム水和物４２０ｍｇ（３当量）と水１．７ｍＬを加え、６０℃で４．５時間加熱撹拌した。減圧濃縮し、６０℃で５時間減圧乾燥し、１．３ｇのN-(3-(tert-butoxycarbonylamino)propiony)iminodiacetic acidを得た。この化合物は精製することなく次の反応に用いた。
［実施例２−３］
［ビスビオチン−ＮＨ−Ｂｏｃ  １３の合成］【００８８】
【化２２】
2018151301.tif 000036
【００８９】
実施例２−２で合成したN-(3-(tert-butoxycarbonylamino)propiony)iminodiacetic acid  ３２５ｍｇとN-(4-Aminobutyl)biotinamide  ７７３ｍｇ（２．１当量）と乾燥ＤＭＦ６．５ｍＬとトリエチルアミン０．６ｍＬと縮合剤のＤＭＴ−ＭＭ（７８４ｍｇ、２．６５当量）を混合し、室温で一夜撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、５％クエン酸水溶液１４ｍＬとＮａＣｌを加え撹拌した。析出した不溶物を減圧乾燥し、シリカゲルカラム（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）で精製し、目的物のビスビオチン−ＮＨ−Ｂｏｃ  １３を１５７ｍｇ得た。収率１６％。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.7-8.6(1H, br.t), 8.25-8.15(1H, br.t), 6.7-6.6(1H, br.t), 6.38(4H, d), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.1(2H, m), 4.00(2H, s), 3.86(2H, s), 3.2-2.9(12H, m), 2.82(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.35(2H, t), 2.05(4H, t), 1.2-1.7(20H, m), 1.37(9H, s)
［実施例２−４］
［ビスビオチン−ＮＨ２・ＴＦＡ塩  １４の合成］【００９０】
【化２３】
2018151301.tif 000037
【００９１】
実施例２−３で合成したビスビオチン−ＮＨ−Ｂｏｃ  １３（８０ｍｇ，０．８９ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸０．４ｍＬに溶解し、室温で２．５時間撹拌した。トリフルオロ酢酸を減圧濃縮し、目的物のビスビオチン−ＮＨ２・ＴＦＡ塩１４を７５ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.69(1H, t), 8.20(1H, t), 7.8-7.6(5H, br.m), 4.31(2H, dd), 4.13(2H, dd), 4.04(2H, s), 3.90(2H, s), 3.2-2.9(12H, m), 2.82(2H, dd), 2.65-2.55(4H, m), 2.05(4H, t), 1.2-1.7(20H, m)
［実施例２−５］
［ビスビオチン−ＤＢＣＯ  １５の合成］【００９２】
【化２４】
2018151301.tif 000038
【００９３】
実施例２−４で合成した  ビスビオチン−ＮＨ２・ＴＦＡ塩  １４  （１１５ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ２．３ｍＬに溶解し、Dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester（Ｓｈｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）  ５０ｍｇ（１当量）とトリエチルアミン０．０５ｍＬを加え、室温で一夜撹拌した。さらに縮合剤ＨＢＴＵ（４８ｍｇ、１当量）を加え、２時間撹拌した。  乾燥窒素で溶媒を濃縮し、５％クエン酸水溶液１２ｍＬを加え、不溶物を得た。水層を廃棄し、水１ｍＬで洗浄した。不溶物を減圧乾燥後、シリカゲルカラム（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１０／１から３／１）で精製し、２７ｍｇの目的反応生成物としてのビスビオチン−ＤＢＣＯ  １５を得た。（収率２０％）
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.68(1H, br.t), 8.16(1H, br.t), 7.8-7.2(10H, m), 6.48(4H, d), 5.03(1H, d), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.1(2H, m), 3.96(2H, s), 3.83(2H, s), 3.5-3.3(2H, m), 3.17(2H, d), 3.2-2.9(10H, m), 2.82(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.25(2H, t), 2.25-2.1(1H, m), 2.04(4H, t), 2.0-1.85(1H, m), 1.8-1.2(20H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．２分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）５／９５）
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１３．７分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
［実施例２−６］
［ビスビオチン−ＤＢＣＯ−スルホＮＨＳ１６の合成］【００９４】
【化２５】
2018151301.tif 000039
【００９５】
実施例２−５で合成したビスビオチン−ＤＢＣＯ  １５  （２０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ０．２ｍＬに溶解し、トリフルオロ酢酸を０．０３ｍＬ加えた。さらに、実施例１−６で合成した、1-[(1-Azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-yl)oxy]-3-sulfonyl-2,5-pyrrolidinedione  ９ｍｇ（１．１当量）のＤＭＦ溶液を加えた。室温で３０分撹拌し、反応液を乾燥窒素で濃縮した。残渣を乾燥クロロホルム１ｍＬで２回洗浄した後、減圧乾燥してアモルファス状の目的反応生成物としてのビスビオチン−ＤＢＣＯ−スルホＮＨＳ  １６を３０ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）；8.0(1H, br.t), 8.3(1H, s), 8.18(1H, br.t), 8.0-7.2(13H, m), 6.4(2H, br), 5.87(1H, dd), 4.46(1H, dd), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.1(2H, m), 3.99(2H, s), 4.0-3.9(1H, br), 3.85(2H, s), 3.75-3.35(21H, m), 3.25-2.95(12H, m), 2.95-2.75(4H, m), 2.56(2H, d), 2.34(2H, t), 2.04(4H, t), 1.95-1.8(2H, m), 2.4-2.2(4H, br.t), 1.7-1.1(20H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．８分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
目的物の確認のため、ブチルアミンを反応させＨＰＬＣを測定したところ、保持時間が１３．２分に変化し、活性エステル化合物であることを確認した。
［実施例３−１］
［６−（（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｈｅｘｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅの合成］【００９６】
【化２６】
2018151301.tif 000040
【００９７】
６−Ｂｏｃ−アミノヘキサノール５．３ｇ（２４．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム５３ｍＬに溶解し、トリエチルアミン４．９３ｇ（４８．８ｍｍｏｌ）を加えた。氷冷下、ＭｓＣｌ３．６３ｇ（３１．７ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１日撹拌した。５％クエン酸水溶液３０ｍＬで２回洗浄し、さらに水２０ｍＬ、飽和食塩水２０ｍＬで洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮することで6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexyl methanesulfonateの粗製生物を８．７ｇ得た。この化合物は精製することなく次の反応に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：4.22(2H,t), 3.1(2H, q), 3.01(3H, s), 1.8-1.3(8H, m), 1.44(9H, s)
［実施例３−２］
［bis(6-tert-butoxycarbonylaminohexyl)amineの合成］【００９８】
【化２７】
2018151301.tif 000041
【００９９】
前記合成の6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexyl methanesulfonate  ０．８ｇ（２．７ｍｍｏｌ）をクロロホルム８ｍＬに溶解し、6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexylamine  ２．３５ｇ（１０．８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．５５ｇ（５．４ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流を１６時間行った。冷却後、反応液を５％クエン酸水溶液１５ｍＬで２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的のbis(6-tert-butoxycarbonylaminohexyl)amine  ０．５９ｇ（５３％）を得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：3.2-3.0(4H, br), 2.9-2.7(4H, br), 1.8-1.3(16H, m), 1.43(18H, s)
［実施例３−３］
［methyl 4-((bis(6-(tert-butoxycarbonylamino)hexyl) amino)methyl)benzoateの合成］【０１００】
【化２８】
2018151301.tif 000042
【０１０１】
前記合成のbis(6-tert-butoxycarbonylaminohexyl)amine  ０．５９ｇ（１．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム１５ｍＬに溶解し、４−ブロモメチル安息香酸０．４９ｇ（２．１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．２９ｇ（２．８ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流を７時間行った。冷却後、反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的のmethyl 4-((bis(6-(tert-butoxycarbonylamino)hexyl) amino)methyl)benzoate  ０．４９６ｇ（６２％）を得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：7.97(2H, d), 7.39(2H, d), 3.91(3H, s), 3.56(2H, s), 3.1(4H, br. q), 2.37(4H, t), 1.8-1.3(16H, m), 1.44(18H, s)
［実施例３−４］
［methyl 4-(bis(6-amino)hexyl) amino)methyl)benzoateの合成］【０１０２】
【化２９】
2018151301.tif 000043
【０１０３】
前記合成のmethyl 4-((bis(6-(tert-butoxycarbonylamino)hexyl) amino)methyl)benzoate  ０．７６ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸２ｍＬに溶解し、室温で１時間放置した。減圧濃縮し、残渣としてmethyl 4-(bis(6-amino)hexyl) amino)methyl)benzoateトリフルオロ酢酸塩粗製物１．７４ｇを得た。精製することなしに次反応に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：8.08(2H, d), 7.66(2H, d), 4.34(2H, s), 3.93(3H, s), 3.2-3.0(4H, br), 3.0-2.8(4H, br), 1.9-1.6(8H, m), 1.6-1.3(8H, m)
［実施例３−５］
［methyl 4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl) amino)methyl)benzoateの合成］【０１０４】
【化３０】
2018151301.tif 000044
【０１０５】
前記合成のmethyl 4-(bis(6-amino)hexyl) amino)methyl)benzoateトリフルオロ酢酸塩粗製物１．７４ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、ビオチン０．８２ｇ（３．４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１．６４ｇ（１６ｍｍｏｌ）を加えた。さらにＨＢＴＵ１．５３ｇ（４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１夜撹拌した。ＤＭＦを減圧濃縮し、残渣を希重曹水３０ｍＬで洗浄し、残渣を減圧乾燥した。さらにシリカゲルカラムで精製し目的のmethyl 4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl) amino)methyl)benzoateを556mg（２工程で６０％）得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.06(2H, d), 7.8-7.6(4H, m), 6.41(2H, s), 6.38(2H, s),  4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.88(3H, s), 3.5(2H, s), 3.2-3.0(2H, m), 3.0-2.9(4H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.33(4H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(28H, m)
［実施例３−６］
［4-((bis(6-(biotinyl amino)hexyl) amino)methyl)benzoic acidの合成］【０１０６】
【化３１】
2018151301.tif 000045
【０１０７】
前記合成のmethyl 4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl) amino)methyl)benzoate  ０．５５ｇ（０．６７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ  ３ｍＬに溶解し、水酸化リチウム水和物１７７ｍｇ（４．２ｍｍｏｌ）と水０．８ｍＬを加え、４０℃で８時間加熱撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、残渣に希塩酸を加え、ｐＨ７とした。クロロホルム３ｍＬを加え、析出した固体をろ取し、水２ｍＬで洗浄した。固体を減圧乾燥し目的の4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl) amino)methyl) benzoic acidを３８０ｍｇ（７０％）得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.83(2H, d), 7.74(2H, t), 7.29(2H, d), 6.51(2H, s), 6.37(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.51(2H, s), 3.2-3.0(2H, m), 3.0-2.9(4H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.33(4H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(28H, m)
［実施例３−７］
［tert-butyl 1-(4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa- 2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１０８】
【化３２】
2018151301.tif 000046
【０１０９】
前記合成の4-((bis(6-(biotinylamino) hexyl) amino)methyl) benzoic acid  ０．３３ｇ（０．４１ｍｍｏｌ）にＤＭＦ４０ｍＬを加え、tert-butyl 3-(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethoxy)propanoate  １７１ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１６６ｍｇ（１．６５ｍｍｏｌ）を加えた。さらにＨＢＴＵ  ２３４ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１夜撹拌した。ＤＭＦを減圧濃縮し、残渣を５％クエン酸水２０ｍＬと水２０ｍＬで洗浄し、残渣を減圧乾燥した。さらにシリカゲルカラムで精製し目的のtert-butyl 1-(4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl) -1-oxo-5,8,11-trioxa- 2-azatetradecan-14-oateを３１６ｍｇ（７２％）得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.9(2H, br.d), 7.74(2H, t), 7.65(2H, br. d), 6.42(2H, s), 6.37(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.6-3.4(12H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.40(2H, t), 2.04(4H, t), 1.8-1.2(28H, m), 1.39(9H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．６６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例３−８］
［1-(4-((bis(6-(biotinylamino) hexyl)amino)methyl)phenyl) -1-oxo-5,8,11-trioxa- 2-azatetradecan -14-oic acid］【０１１０】
【化３３】
2018151301.tif 000047
【０１１１】
前記合成のtert-butyl 1-(4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl) -1-oxo-5,8,11-trioxa- 2-azatetradecan-14-oate  ８０ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸０．３ｍＬに溶解し、室温で１時間放置した。減圧濃縮し、残渣として1-(4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl) -1-oxo-5,8,11-trioxa- 2-azatetradecan -14-oic acidトリフルオロ酢酸塩粗製物を得た。精製することなしに次反応に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；３．８３分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例３−９］
［1-(4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１１２】
【化３４】
2018151301.tif 000048
【０１１３】
前記合成の1-(4-((bis(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acidトリフルオロ酢酸塩粗製物をＤＭＦ  ３ｍＬに溶解し、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳナトリウム塩  ２４ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。さらにＤＩＣ  ２８５ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。ヘキサン２ｍＬとクロロホルム０．５ｍＬを加え、ガムを析出させ３０分静置した。溶媒を除去し、クロロホルム２ｍＬで２回洗浄し、減圧乾燥し、アモルファス状の1-(4-((bis(6-(biotinylamino) hexyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa- 2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを７４ｍｇ得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.0-7.9(4H, m), 7.8-7.6(4H, m), 6.4(2H, s), 6.36(2H, s), 4.4-4.25(4H, m), 4.15-4.1(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d), 3.69(2H, t), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.05(4H, t), 1.8-1.1(28H, m)
ＨＰＬＣの分析は、Ｎ−ブチルアミンと反応させ、ブチルアミドとして分析した。
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．２１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例４−１］
［methyl 4-(((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)-(6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexyl)amino)methyl)benzoateの合成）］【０１１４】
【化３５】
2018151301.tif 000049
【０１１５】
実施例３−１合成の6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexyl methanesulfonate  ２．０ｇ（６．７７ｍｍｏｌ）をクロロホルム２０ｍＬに溶解し、tert-butyl (7-aminoheptyl)carbamate  ２．７３ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１．８５ｇ（１８．３ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流を２２時間行った。冷却後、反応液を５％クエン酸水溶液１５ｍＬで２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、tert-butyl (6-((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)amino)hexyl)carbamate  のクロロホルム溶液を得た。その溶液に４−ブロモメチル安息香酸２．６４ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１．３７ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流を３時間行った。冷却後、クロロホルム１０ｍＬを追加し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ水２５ｍＬで２回洗浄し、飽和ＮａＣｌ水２０ｍＬで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的のmethyl 4-(((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)-(6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexyl)amino)methyl)benzoate  ８５５ｍｇ（２２％）を得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：7.97(2H, d), 7.39(2H, d), 3.91(3H, s), 3.56(2H, s), 3.2-3.0(4H, m), 2.37(4H, t), 1.8-1.3(18H, m), 1.44(18H, s)
［実施例４−２］
［methyl 4-(((7-(biotinyl amino)heptyl)-(6-(biotinyl amino)hexyl)amino)methyl)benzoateの合成）］【０１１６】
【化３６】
2018151301.tif 000050
【０１１７】
前記合成の4-(((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)-(6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexyl)amino)methyl)benzoate  ８４５ｍｇ（１．４６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−４と３−５に準じて合成を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-(((7-(biotinyl amino)heptyl)-(6-(biotinyl amino)hexyl)amino)methyl)benzoateを８８１ｍｇ（７３％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.92(2H, d), 7.8-7.6(2H, m), 7.45(2H, m), 6.41(2H, s), 6.34(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.84(3H, s),  
3.2-2.9(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.35(4H, br. t), 2.03(4H, t), 1.7-1.1(30H, m)
［実施例４−３］
［4-(((7-(biotinyl amino)heptyl)-(6-(biotinyl amino)hexyl)amino)methyl)benzoic acidの合成］【０１１８】
【化３７】
2018151301.tif 000051
【０１１９】
前記合成の4-(((7-(biotinyl amino)heptyl)-(6-(biotinyl amino)hexyl)amino)methyl)benzoate０．３２ｇ（０．３８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-(((7-(biotinyl amino)heptyl)-(6-(biotinyl amino)hexyl)amino)methyl)benzoic acid  を３０３ｍｇ（９８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.83(2H, d), 7.74(2H, br), 7.36(2H, d), 6.44(2H, s), 6.37(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.54(2H, s), 3.2-3.0(2H, m), 3.0-2.9(4H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.33(4H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(30H, m)
［実施例４−４］
［tert-butyl 1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl) -5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１２０】
【化３８】
2018151301.tif 000052
【０１２１】
前記合成の4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)benzoic acid  ３００ｍｇ（０．３６８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を２３７ｍｇ（６０％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.93(2H, d), 7.72(2H, br), 7.60(2H, d), 6.40(2H, s), 6.36(2H, s), 4.4-4.25(4H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.6-3.4(12H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.40(2H, t), 2.04(4H, t), 1.8-1.2(30H, m), 1.39(9H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．７７分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例４−５］
［1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１２２】
【化３９】
2018151301.tif 000053
【０１２３】
前記合成のtert-butyl 1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  ８０ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と  ３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)(6-(biotinylamino)hexyl)amino)methyl)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS ester  を８３ｍｇ（４８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.89(2H, br.d), 7.77(2H, br.s), 7.52(2H, br.d), 6.4(4H, br), 4.4-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d), 3.69(2H, t), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.05(4H, t), 1.8-1.1(30H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；３．９２分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．３１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例５−１］
［7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl methanesulfonateの合成］【０１２４】
【化４０】
2018151301.tif 000054
【０１２５】
tert-butyl (7-hydroxyheptyl)carbamate  １．５ｇ（６．９ｍｍｏｌ）を用い、実施例３−１と同様に反応を行い、目的反応生成物としての7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl methanesulfonateを１．２９ｇ（６３％）得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：4.22(2H,t), 3.1(2H, q), 3.01(3H, s), 1.8-1.3(10H, m), 1.44(9H, s)
［実施例５−２］
［methyl 4-((bis(7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)amino)methyl)benzoateの合成］【０１２６】
【化４１】
2018151301.tif 000055
【０１２７】
前記合成の7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl methanesulfonate  １．２８ｇ（４．１ｍｍｏｌ）とtert-butyl (7-aminoheptyl)carbamate  １．７８ｇ（７．７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例４−１と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-((bis(7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)amino)methyl)benzoate  を０．９３ｇ（３８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：7.97(2H, d), 7.42(2H, d), 3.91(3H, s), 3.56(2H, s), 3.2-3.0(4H, m), 2.41(4H, t), 1.8-1.3(20H, m), 1.44(18H, s)
［実施例５−３］
［methyl 4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)benzoateの合成］【０１２８】
【化４２】
2018151301.tif 000056
【０１２９】
前記合成のmethyl 4-((bis(7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)amino)methyl)benzoate  ０．９８ｇ（１．６６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例４−２と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)benzoate  を０．３７６ｇ（２１％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.91(2H, d), 7.8-7.6(2H, m), 7.45(2H, m), 6.41(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.84(3H, s),  3.2-2.9(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.35(4H, br. t), 2.03(4H, t), 1.7-1.1(32H, m)
［実施例５−４］
［4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)benzoic acidの合成）］【０１３０】
【化４３】
2018151301.tif 000057
【０１３１】
前記合成のmethyl 4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)benzoate  ０．３７６ｇ（０．４４５ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としての4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)benzoic acid  を取得した。この化合物は精製することなしに次工程に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.81(2H, d), 7.72(2H, br), 7.34(2H, d), 6.44(2H, s), 6.37(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.54(2H, s), 3.2-3.0(2H, m), 3.0-2.9(4H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.33(4H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(32H, m)
［実施例５−５］
［tert-butyl 1-(4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１３２】
【化４４】
2018151301.tif 000058
【０１３３】
前記合成の4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)benzoic acid  を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(4-((bis(7-(biotinyl)heptyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を２２５ｍｇ（４７％２工程）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.93(2H, br.d), 7.72(2H, br), 7.60(2H, br.d), 6.35(2H, s), 6.36(2H, s), 4.4-4.25(4H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.6-3.4(12H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.40(2H, t), 2.04(4H, t), 1.8-1.2(32H, m), 1.39(9H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．８９分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例５−６］
［1-(4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１３４】
【化４５】
2018151301.tif 000059
【０１３５】
前記合成のtert-butyl 1-(4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  ７６ｍｇ（０．０７０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と  ３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(4-((bis(7-(biotinylamino)heptyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを５０ｍｇ（６０％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.92(2H, br.d), 7.78-7.76(4H, br), 6.6-6.3(4H, br), 4.4-4.25(4H, m), 4.15-4.1(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d), 3.69(2H, t), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.05(4H, t), 1.8-1.1(32H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．０１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．４２分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例６−１］
［methyl 4-(((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)-(8-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl)amino) methyl)benzoateの合成］【０１３６】
【化４６】
2018151301.tif 000060
【０１３７】
8-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl methanesulfonate  １．４ｇ（４．３３ｍｍｏｌ）とｍｅｔｈｙｌ  4-(((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)(8-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl)amino)methyl)benzoate  １．７４ｇ（７．６ｍｍｏｌ）を用い、実施例４−１と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-(((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)-(8-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl)amino) methyl)benzoate  を１．９８ｇ（２５．５％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：7.97(2H, d), 7.42(2H, d), 3.91(3H, s), 3.56(2H, s), 3.2-3.0(4H, m), 2.41(4H, t), 1.8-1.3(24H, m), 1.44(18H, s)
［実施例６−２］
［methyl 4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoateの合成］【０１３８】
【化４７】
2018151301.tif 000061
【０１３９】
前記合成の4-(((7-((tert-butoxycarbonyl)amino)heptyl)-(8-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl)amino) methyl)benzoate  ６６７ｍｇ（１．１０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例４−２と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoate  を３２１ｍｇ（３４％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.90(2H, d), 7.69(2H, t), 7.43(2H, m), 6.41(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.84(3H, s),  3.2-2.9(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.34(4H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(34H, m)
［実施例６−３］
［4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoic acidの合成］【０１４０】
【化４８】
2018151301.tif 000062
【０１４１】
前記合成のmethyl 4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoate  ３２１ｍｇ（０．３７４ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としての4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoic acidを取得した。この化合物は精製することなしに次工程に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.86(2H, d), 7.79(2H, br. t), 7.36(2H, d), 6.44(2H, s), 6.38(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.54(2H, s), 3.2-3.0(2H, m), 3.0-2.9(4H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.33(4H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(34H, m)
［実施例６−４］
［tert-butyl 1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１４２】
【化４９】
2018151301.tif 000063
【０１４３】
前記合成の4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoic acidを用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を３０４ｍｇ（７４％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.0-7.8(2H, br), 7.71(2H, br. t), 7.6-7.4(2H, br. t), 6.41(2H, s), 6.36(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.6-3.4(12H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.40(2H, t), 2.04(4H, t), 1.8-1.2(34H, m), 1.39(9H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；５．０５分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例６−５］
［1-(4-((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１４４】
【化５０】
2018151301.tif 000064
【０１４５】
前記合成の  tert-butyl 1-oxo-1-(4-(((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  ８２ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(4-((7-(biotinylamino)heptyl)-(8-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを６１ｍｇ（６８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.92(2H, br.d), 7.78-7.76(4H, br), 6.6-6.3(4H, br), 4.4-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d), 3.69(2H, t), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.05(4H, t), 1.8-1.1(34H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．２０分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．５６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例７−１］
［methyl 4-((bis(7-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl)amino)methyl)benzoateの合成］【０１４６】
【化５１】
2018151301.tif 000065
【０１４７】
8-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl methanesulfonate 3.0g(9.3mmol)とtert-butyl (7-aminooctyl)carbamate 3.97g(16.2mmol)を用い、実施例4-1と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-((bis(7-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl)amino)methyl)benzoate  を２．７６ｇ（４８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：7.97(2H, d), 7.42(2H, d), 3.91(3H, s), 3.56(2H, s), 3.2-3.0(4H, m), 2.41(4H, t), 1.8-1.3(28H, m), 1.44(18H, s)
［実施例７−２］
［methyl 4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoateの合成］【０１４８】
【化５２】
2018151301.tif 000066
【０１４９】
前記合成の4-((bis(7-((tert-butoxycarbonyl)amino)octyl)amino)methyl)benzoate  １．３８ｇ（２．２２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例４−２と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoate  を１．０９ｇ（５６％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.1-7.9(2H,br), 7.71(2H, t), 7.7-7.5(2H, br), 6.42(2H, s), 6.36(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.84(3H, s), 3.2-2.9(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.35(4H, br. t), 2.03(4H, t), 1.7-1.1(36H, m)
［実施例７−３］
［4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoic acidの合成］【０１５０】
【化５３】
2018151301.tif 000067
【０１５１】
前記合成のmethyl 4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoate  １．０９ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としての4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoic acid  を１．０５ｇ（９８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：7.85(2H, d), 7.75(2H, br), 7.37(2H, d), 6.44(2H, s), 6.37(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.54(2H, s), 3.2-3.0(2H, m), 3.0-2.9(4H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.33(4H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(36H, m)
［実施例７−４］
［tert-butyl 1-(4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１５２】
【化５４】
2018151301.tif 000068
【０１５３】
前記合成の4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)benzoic acid  １．０５ｇ（１．２３ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を８９１ｍｇ（６４％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.42(1H, br. T), 7.80(2H, d), 7.70(2H, t), 7.36(2H, d), 6.41(2H, s), 6.35(2H, s), 4.4-4.25(4H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.6-3.4(12H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.40(2H, t), 2.04(4H, t), 1.8-1.2(36H, m), 1.44(9H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；５．０９分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例７−５］
［1-(4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１５４】
【化５５】
2018151301.tif 000069
【０１５５】
前記合成のtert-butyl 1-(4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  ７５ｍｇ（０．０６７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(4-((bis(7-(biotinylamino)octyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを５０ｍｇ（６０％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.0-7.6(6H, m), 6.6-6.3(4H, br), 4.4-4.25(4H, m), 4.15-4.1(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d), 3.69(2H, t), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.05(4H, t), 1.8-1.1(36H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．３７分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．６９分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例８−１］
［methyl 3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)benzoateの合成］【０１５６】
【化５６】
2018151301.tif 000070
【０１５７】
methyl 3,5-bis(6-aminohexanamido)benzoate２塩酸塩３９２ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ）とビオチン４５２ｍｇ（１．８５ｍｍｏｌ）を用い、実施例１−２と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)benzoateを４１２ｍｇ（５８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.08(2H, s), 8.19(1H, s), 7.94(2H, d), 7.74(2H, t), 6.5-6.2(4H, br. s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.84(3H, s), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.30(4H, t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(24H, m)
［実施例８−２］
［3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)benzoic acidの合成］【０１５８】
【化５７】
2018151301.tif 000071
【０１５９】
前記合成のmethyl 3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)benzoate  ３１０ｍｇ（０．３６７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としての3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)benzoic acidを２８２ｍｇ（９３％）取得した。この化合物は精製することなしに次工程に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.99(2H, s), 8.15(1H, s), 7.85(2H, s), 7.75(2H, br. s), 6.44(2H, s), 6.36(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.30(4H, br. t), 2.04(4H, br. t), 1.7-1.1(24H, m)
［実施例８−３］
［tert-butyl 1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１６０】
【化５８】
2018151301.tif 000072
【０１６１】
前記合成法による3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)benzoic acid  ４９８ｍｇ（０．５９９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を４０７ｍｇ（６２％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.97(2H, s), 8.35(1H, br. t), 8.04(1H, s), 7.74(2H, br. t), 7.66(2H, d), 6.44(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.40(2H, t), 2.30(4H, br. t), 2.04(4H, br. t), 1.7-1.1(33H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１３．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
［実施例８−４］
［1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１６２】
【化５９】
2018151301.tif 000073
【０１６３】
前記合成のtert-butyl 1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  ４００ｍｇ（０．３６７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と  ３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを４９３ｍｇ取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.96(2H, s), 8.31(2H, br), 8.08(1H, s), 7.73(2H, br. t), 7.64(2H, d), 6.40(2H, s), 6.34(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d),3.7(2H, t), 3.6-3.4(10H, m), 3.4-3.3(2H, m), 3.2-2.8(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.29(4H, t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(24H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１２．０分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
［実施例９−１］
［methyl 3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoateの合成］【０１６４】
【化６０】
2018151301.tif 000074
【０１６５】
methyl 3,5-bis(6-aminopentanamido)benzoate２塩酸塩１．１３（３ｍｍｏｌ）とビオチン１．７６ｇ（７．２ｍｍｏｌ）を用い、実施例１−２と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoateを１．５ｇ（６３％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.08(2H, s), 8.19(1H, s), 7.94(2H, d), 7.74(2H, t), 6.5-6.2(4H, br. s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.84(3H, s), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.30(4H, t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(20H, m)
［実施例９−２］
［3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acidの合成］【０１６６】
【化６１】
2018151301.tif 000075
【０１６７】
前記合成のmethyl 3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoate  １．４８ｇ（１．８２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としての3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acidを１．４６ｇ（１００％）取得した。この化合物は精製することなしに次工程に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.07(2H, s), 8.17(1H, s), 7.90(2H, s), 7.80(2H, br. s), 6.42(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.30(4H, br. t), 2.04(4H, br. t), 1.7-1.1(20H, m)
［実施例９−３］
［tert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１６８】
【化６２】
2018151301.tif 000076
【０１６９】
前記合成法による3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acid  ７００ｍｇ（０．７８２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を５３７ｍｇ（５８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.98(2H, s), 8.33(1H, br. t), 8.04(1H, s), 7.74(2H, br. t), 7.66(2H, d), 6.5-6.2(4H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.40(2H, t), 2.31(4H, br. t), 2.05(4H, br. t), 1.7-1.1(29H, m)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１３．０分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
［実施例９−４］
［1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１７０】
【化６３】
2018151301.tif 000077
【０１７１】
前記合成のtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  ５２０ｍｇ（０．４７７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と同様に反応を行い、1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acidを４０４ｍｇ（８２％）得た。さらに、合成した1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid  １００ｍｇ（０．９９ｍｍｏｌ）を用い、実施例３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを１３５ｍｇ取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.98(2H, s), 8.31(2H, br), 8.08(1H, s), 7.76(2H, br. t), 7.64(2H, d), 6.40(2H, s), 6.34(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d),3.7(2H, t), 3.6-3.4(10H, m), 3.4-3.3(2H, m), 3.2-2.8(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, t), 2.05(4H, t), 1.7-1.1(20H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１０．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
［実施例１０−１］
［tert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110-hexatriacontaoxa-2-azatridecahectan-113-oateの合成］【０１７２】
【化６４】
2018151301.tif 000078
【０１７３】
実施例９−２で合成の3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acid  ７００ｍｇ（０．７８２ｍｍｏｌ）とＡｍｉｎｏ−ｐｅｇ３６−ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ７００ｍｇ（０．７８２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110-hexatriacontaoxa-2-azatridecahectan-113-oate  を５３７ｍｇ（５８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.98(2H, s), 8.33(1H, br. t), 8.04(1H, s), 7.74(2H, br. t), 7.66(2H, d), 6.5-6.2(4H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.6-3.3(80H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.40(2H, t), 2.31(4H, br. t), 2.05(4H, br. t), 1.7-1.1(24H, m)
［実施例１０−２］
［1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110-hexatriacontaoxa-2-azatridecahectan-113-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１７４】
【化６５】
2018151301.tif 000079
【０１７５】
前記合成のtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110-hexatriacontaoxa-2-azatridecahectan-113-oate  ５２０ｍｇ（０．４７７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と同様に反応を行い、1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acidを４０４ｍｇ（８２％）得た。さらに、合成した1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid  １００ｍｇ（０．９９ｍｍｏｌ）を用い、実施例３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92,95,98,101,104,107,110-hexatriacontaoxa-2-azatridecahectan-113-oic acid sulfo-NHS esterを１３５ｍｇ取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.98(2H, s), 8.31(2H, br), 8.08(1H, s), 7.76(2H, br. t), 7.64(2H, d), 6.40(2H, s), 6.34(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d),3.7(2H, t), 3.6-3.4(76H, m), 3.4-3.3(2H, m), 3.2-2.8(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, t), 2.05(4H, t), 1.7-1.1(20H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１０．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
［実施例１１−１］
［tert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-dodecaoxa-2-azahentetracontan-41-oateの合成］【０１７６】
【化６６】
2018151301.tif 000080
【０１７７】
実施例９−２で合成の3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acid  ７００ｍｇ（０．７８２ｍｍｏｌ）とAmino-peg12-t-butyl ester  ７００ｍｇ（０．７８２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-dodecaoxa-2-azahentetracontan-41-oate  を５３７ｍｇ（５８％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.98(2H, s), 8.33(1H, br. t), 8.04(1H, s), 7.74(2H, br. t), 7.66(2H, d), 6.5-6.2(4H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.6-3.3(32H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.40(2H, t), 2.31(4H, br. t), 2.05(4H, br. t), 1.7-1.1(24H, m)
［実施例１１−２］
［1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-dodecaoxa-2-azahentetracontan-41-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１７８】
【化６７】
2018151301.tif 000081
【０１７９】
前記合成のtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-dodecaoxa-2-azahentetracontan-41-oate  ５２０ｍｇ（０．４７７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と同様に反応を行い、1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acidを４０４ｍｇ（８２％）得た。さらに、合成した1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid  １００ｍｇ（０．９９ｍｍｏｌ）を用い、３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-dodecaoxa-2-azahentetracontan-41-oic acid sulfo-NHS esterを１３５ｍｇ取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.98(2H, s), 8.31(2H, br), 8.08(1H, s), 7.76(2H, br. t), 7.64(2H, d), 6.40(2H, s), 6.34(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d),3.7(2H, t), 3.6-3.4(28H, m), 3.4-3.3(2H, m), 3.2-2.8(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, t), 2.05(4H, t), 1.7-1.1(20H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１０．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）３５／６５）
［実施例１２−１］
［methyl 3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoateの合成］【０１８０】
【化６８】
2018151301.tif 000082
【０１８１】
methyl 3-(4-((tert-butoxycarbonyl)amino)butanamido)-5-(5-((tert-butoxycarbonyl)amino)pentanamido)benzoate  １．３２（１．９６ｍｍｏｌ）とビオチン１．２０（４．９ｍｍｏｌ）を用い、実施例３−４と３−５と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoateを８６１ｍｇ（５５％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.1(2H, s), 8.18(1H, s), 7.94(2H, s), 7.8(2H, br. t), 6.41(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.84(3H, s), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, t), 2.05(4H, t), 1.7-1.1(18H, m)
［実施例１２−２］
［3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acidの合成］【０１８２】
【化６９】
2018151301.tif 000083
【０１８３】
前記合成のmethyl 3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoate  ８６１ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としての3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acidを６４３ｍｇ（７６％）取得した。この化合物は精製することなしに次工程に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.1(2H, s), 8.17(1H, s), 7.90(2H, s), 7.8(2H, br. t), 6.5-6.2(4H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, br. t), 2.06(4H, br. t), 1.7-1.1(18H, m)
［実施例１２−３］
［tert-butyl 1-oxo-1-(3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１８４】
【化７０】
2018151301.tif 000084
【０１８５】
前記合成法による3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)benzoic acid  ６３４ｍｇ（０．８０４ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-oxo-1-(3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を８５０ｍｇ（１００％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.03(1H, s), 10.00(1H, s), 8.34(1H, br. t), 8.05(1H, s), 7.9-7.6(2H, m), 7.67(2H, d), 6.42(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.40(2H, t), 2.31(4H, br. t), 2.05(4H, br. t), 1.7-1.1(27H, m)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．５４分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１２−４］
［1-oxo-1-(3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１８６】
【化７１】
2018151301.tif 000085
【０１８７】
前記合成のtert-butyl 1-oxo-1-(3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  １００ｍｇ（０．０９５ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と同様に反応を行い、1-oxo-1-(3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acidを得た。さらに、合成した1-oxo-1-(3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acidを用い、実施例３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-oxo-1-(3-(4-(biotinylamino)butanamido)-5-(5-(biotinylamino)pentanamido)phenyl)-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを９５ｍｇ取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.03(1H, s), 10.00(1H, s), 8.33(2H, br), 8.08(1H, s), 7.76(2H, br. t), 7.64(2H, d), 6.5-6.2(4H, br),  4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d), 3.7(2H, t), 3.6-3.4(10H, m), 3.4-3.3(2H, m), 3.2-2.8(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, t), 2.05(4H, t), 1.7-1.1(20H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；３．６５分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．０７分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１３−１］
［methyl 3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)benzoateの合成］【０１８８】
【化７２】
2018151301.tif 000086
【０１８９】
methyl 3,5-bis(4-((tert-butoxycarbonyl)amino)butanamido)benzoate  １．０ｇ（１．８６ｍｍｏｌ）とビオチン１．３６ｇ（５．５８ｍｍｏｌ）を用い、実施例３−４と３−５と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのmethyl 3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)benzoateを１．１３ｇ（７７％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.1(2H, s), 8.17(1H, s), 7.95(2H, s), 7.83(2H, br. t), 6.42(2H, s), 6.36(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.84(3H, s), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.29(4H, t), 2.03(4H, t), 1.7-1.1(16H, m)
［実施例１３−２］
［3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)benzoic acidの合成］【０１９０】
【化７３】
2018151301.tif 000087
【０１９１】
前記合成のmethyl 3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)benzoate  １．１３ｇ（１．４３ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−６と同様に反応を行い、目的反応生成物としての3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)benzoic acidを６５０ｍｇ（５９％）取得した。この化合物は精製することなしに次工程に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.1(2H, s), 8.16(1H, s), 7.95(2H, s), 7.83(2H, br. t), 6.6-6.2(4H, br. s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, t), 2.06(4H, t), 1.7-1.1(16H, m)
［実施例１３−３］
［tert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)buentanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０１９２】
【化７４】
2018151301.tif 000088
【０１９３】
前記合成法による3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)benzoic acid  ６５０ｍｇ（０．８３９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を８４５ｍｇ（９７％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.03(2H, s), 8.33(1H, br. t), 8.03(1H, s), 7.82(2H, br. t), 7.67(2H, s), 6.41(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.6-3.3(14H, m), 3.2-2.9(6H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.38(2H, t), 2.31(4H, br. t), 2.06(4H, br. t), 1.7-1.1(25H, m)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．４６分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１３−４］
［1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterの合成］【０１９４】
【化７５】
2018151301.tif 000089
【０１９５】
前記合成のtert-butyl 1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  １００ｍｇ（０．０９７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と同様に反応を行い、1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acidを得た。さらに、合成した1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid  を用い、実施例３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(3,5-bis(5-(biotinylamino)butanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS esterを１１２ｍｇ取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.03(2H, s), 8.32(2H, br), 8.08(1H, s), 7.75(2H, br. t), 7.66(2H, d), 6.6-6.2(4H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d),3.7(2H, t), 3.6-3.4(10H, m), 3.4-3.3(2H, m), 3.2-2.8(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.31(4H, t), 2.07(4H, t), 1.7-1.1(16H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；３．５３分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．００分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１４−１］
［Di-tert-butyl N-(4-(methoxycarbonyl)benzyl) iminodiacetateの合成］【０１９６】
【化７６】
2018151301.tif 000090
【０１９７】
Di-tert-butyl iminodiacetate  ２．５ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）をmethyl 4-bromomethylbenzoate  ３．１３ｇ（１３．７ｍｍｏｌ）にクロロホルム３０ｍＬを加え、さらにトリエチルアミン１．５４ｇ（１５．３ｍｍｏｌ）を加えた。６５℃で４時間加熱し、冷却後、クロロホルム４０ｍＬを加え、５％クエン酸水溶液４０ｍＬ、水３０ｍＬで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し目的反応生成物としてのDi-tert-butyl N-(4-(methoxycarbonyl)benzyl) iminodiacetateを１．４５ｇ（３６％）得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：7.99(2H, d), 7.48(2H, d), 3.95(2H, s), 3.91(3H, s), 3.41(4H, s), 1.46(9H, s)
［実施例１４−２］
［N-(4-(methoxycarbonyl)benzyl) iminodiacetic acidの合成］【０１９８】
【化７７】
2018151301.tif 000091
【０１９９】
前記合成のDi-tert-butyl N-(4-(methoxycarbonyl)benzyl) iminodiacetateを１．４４ｇ（３．７ｍｍｏｌ）に４Ｎ  ＨＣｌ／Ｄｉｏｘａｎｅ溶液９．２ｍＬを加え室温で２日放置した。析出した固体をろ取し、ジオキサン１０ｍＬで洗浄した。５０℃で減圧乾燥し目的反応生成物としてのN-(4-(methoxycarbonyl)benzyl) iminodiacetic acidを１．１６ｇ得た。精製することなしに次工程に用いた。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ５）：7.97(2H, d), 7.63(2H, d), 4.30(2H, br.s), 3.87(3H, s), 3.41(7H, br. s)
［実施例１４−３］
［methyl 4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)benzoateの合成］【０２００】
【化７８】
2018151301.tif 000092
【０２０１】
前記合成のN-(4-(methoxycarbonyl)benzyl) iminodiacetic acid  １．１５ｇ（３．６２ｍｍｏｌ）と4-(biotinylamino)butylamineトリフルオロ酢酸塩３．４２ｇ（８．０ｍｍｏｌ）にＤＭＦ２３ｍＬを加え、さらにトリエチルアミン２．２ｇ（２２ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ４．１２ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で４時間加熱撹拌した。ＤＭＦを濃縮後、氷冷下に１Ｎ塩酸水で中和した。分離したオイルを分離した後、水層をクロロホルム３０ｍＬで抽出した。分離したオイルと有機層を合わせて濃縮しシリカゲルカラムで精製し、目的反応生成物としてのmethyl 4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)benzoateを１．２８ｇ（９０％）得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.19(2H, br. S), 7.96(2H, d), 7.76(2H, t), 7.56(2H, d), 6.6-6.2(4H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.86(3H, s) , 3.2-2.9(10H, m), 2.79(2H, dd), 2.53(2H, d), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(20H, m)
［実施例１４−４］
［4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)benzoic acidの合成］【０２０２】
【化７９】
2018151301.tif 000093
【０２０３】
前記合成のmethyl 4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)benzoate  １．６７ｇ（１．９１ｍｍｏｌ）にメタノール７ｍＬと水２ｍＬと水酸化リチウム水和物０．２４ｇ（５．７ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で２．５時間加熱撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、１Ｎ塩酸で酸性とした。析出したガムを減圧乾燥し、目的反応生成物としての4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)benzoic acid  を１．４ｇ（８６％）アモルファスとして得た。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.3(2H, br. S), 7.95(2H, d), 7.73(2H, t), 7.55(2H, d), 6.6-6.3(4H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.8-3.6(2H, br), 3.2-2.9(10H, m), 2.79(2H, dd), 2.53(2H, d), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(20H, m)
［実施例１４−５］
［tert-butyl 1-(4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oateの合成］【０２０４】
【化８０】
2018151301.tif 000094
【０２０５】
前記合成の4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)benzoic acid  ０．３０ｇ（０．３５ｍｍｏｌ）  を用いて、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  を１０４ｍｇ（２７％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.5(1H, br. t), 8.1(2H, t), 7.9-7.7(4H, m), 7.44(2H, t), 6.41(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.15-4.1(2H, m), 3.69(2H, s), 3.6-3.4(16H, m), 3.2-2.9(10H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.40(2H, t), 2.04(4H, t), 1.8-1.2(20H, m), 1.38(9H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．３７分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１４−６］
［1-(4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-o ic acid sulfo-NHS esterの合成］【０２０６】
【化８１】
2018151301.tif 000095
【０２０７】
前記合成のtert-butyl 1-(4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oate  １００ｍｇ（０．０８９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例３−８と３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-(4-((bis(2-oxo-2-((4-(biotinylamino)butyl)amino)ethyl)amino)methyl)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-o ic acid sulfo-NHS esterを４４ｍｇ（４０％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：8.62(1H, br. t), 7.93(2H, br.d), 7.73(2H, br.t), 7.65(2H, br.d), 6.5-6.3(4H, br), 4.4-4.25(4H, m), 4.15-4.1(2H, m), 4.0-3.9(1H, br.d), 3.69(2H, m), 3.6-3.3(18H, m), 3.2-2.9(10H, m), 2.79(2H, dd), 2.58(2H, d), 2.05(4H, t), 1.8-1.1(20H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；３．５１分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
目的反応生成物は、Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。ブチルアミド体のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；３．９２分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１４−７］
［7-(3-(1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-amido)pyrrolidin-1-yl)-1-(2,4-difluorophenyl)-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydro-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acidの合成］【０２０８】
【化８２】
2018151301.tif 000096
【０２０９】
実施例8-4で合成の1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-oic acid sulfo-NHS ester 7mg（5.8μmol）を脱水ＤＭＦ  １ｍＬに溶解し、ニューキノロン系抗菌剤のTosufloxacin tosylate  ５ｍｇ（８．７μｍｏｌ）とトリエチルアミン２０μＬを加え、室温で１時間攪拌した。ＤＭＦを濃縮し、水１ｍＬで洗浄した。残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的反応生成物としての7-(3-(1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatetradecan-14-amido)pyrrolidin-1-yl)-1-(2,4-difluorophenyl)-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydro-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acidを3mg取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.76(2H, s), 8.81(1H, s), 8.34(2H, br), 8.15-8.0(3H, br), 7.85-7.7(3H, br), 7.66(2H, d), 7.58(2H, br. t), 7.33(2H, br. t), 6.42(2H, s), 6.36(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 3.56(2H, t), 3.5-3.4(10H, m), 3.4-3.3(2H, m), 3.2-2.9(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.27(6H, br. t), 2.04(4H, t), 1.7-1.1(24H, m)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．９２分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）５／９５）
［実施例１４−８］
［tert-butyl 17-(4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoateの合成］【０２１０】
【化８３】
2018151301.tif 000097
【０２１１】
4-(4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butanoic acid  ５００ｍｇ（１．６７ｍｍｏｌ）とtert-butyl 3-(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethoxy)propanoate  ３０９ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン  ５０７ｍｇ（５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  １０ｍＬに加え、さらにＥＤＣ塩酸塩４８１ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で一夜攪拌し、反応終了を確認後、溶媒を留去した。５％クエン酸とクロロホルムを加え、有機層を水洗、乾燥し濃縮して、目的反応生成物としてのtert-butyl 17-(4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoateを５７９ｍｇ（８５％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：9.57(1H, s), 7.31(1H, s), 6.3(1H, br), 5.55(1H, q), 4.11(2H, t), 3.98(3H, s), 3.69(2H, t), 3.6-3.4(12H, m), 2.49(2H, t), 2.42(2H, t), 2.3-2.2(2H, m), 1.55(3H, d), 1.44(9H, s)
［実施例１４−９］
［tert-butyl 17-(4-(1-((3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)benzoyl)oxy)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoateの合成］【０２１２】
【化８４】
2018151301.tif 000098
【０２１３】
実施例８−２で合成の（3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)benzoic acid  ３０７ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）と上記合成のtert-butyl 17-(4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoate  246ｍｇ（0.44mmol）を乾燥ＤＭＦに加えた。2-methyl-6-nitrobenzoic anhydrideとトリエチルアミンとジメチルアミノピリジンを用いて、常法に従い縮合し、目的反応生成物としてのtert-butyl 17-(4-(1-((3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)benzoyl)oxy)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoateを３０７ｍｇ（６１％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.1(2H, s), 8.15(1H, s), 8.01(2H, d), 7.91(1H, br.t), 7.74(2H, t), 7.61(1H, s), 7.25(1H, s), 6.49(1H, q), 6.40(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.0(4H, m), 3.96(3H, s), 3.54(2H, t), 3.47(2H, t), 3.45(10H, d), 3.39(2H, t), 3.2-2.9(8H, m), 2.81(2H, dd), 2.56(2H, d), 2.4-2.2(8H, m), 2.1-1.9(6H, m), 1.7-1.2(24H, m), 1.38(9H, s)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；６．１９分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）２０／８０）
［実施例１４−１０］
［1-((17-(4-(1-((3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)benzoyl)oxy)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoic acidsulfo-NHS esterの合成］【０２１４】
【化８５】
2018151301.tif 000099
【０２１５】
上記合成のtert-butyl 17-(4-(1-((3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)benzoyl)oxy)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoate  ２９５ｍｇ（０．２１５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸  １ｍＬに溶解し、室温で３０分攪拌した。ｔ−ｂｕｔｙｌ基の外れたことをＨＰＬＣで確認後、減圧濃縮して17-(4-(1-((3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)benzoyl)oxy)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoic acidを取得した。精製することなしに、実施例３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-((17-(4-(1-((3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)benzoyl)oxy)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-14-oxo-4,7,10-trioxa-13-azaheptadecanoic acidsulfo-NHS esterを３２７ｍｇ（定量的）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：10.1(2H, s), 8.17(1H, s), 8.01(2H, d), 7.95(2H, br.d), 7.75(2H, t), 7.61(1H, s), 7.25(1H, s), 6.49(1H, q), 6.42(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.0(4H, m), 3.96(3H, s), 3.93(1H, br), 3.70(2H, t), 3.49(10H, d), 3.45-3.3(8H, m), 3.25-2.95(10H, m), 2.95-2.8(4H, m), 2.60(2H, d), 2.4-2.2(6H, m), 2.04(4H, t), 1.95(2H, t), 1.7-1.2(24H, m)
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸５．２７分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）２０／８０）
目的反応生成物のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；４．８８分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）２０／８０）
Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ｂ）；ブチルアミド体５．６５分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（７分）２０／８０）
［実施例１４−１１］PB-15(還元切断)
［tert-butyl 1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-7,10-dimethyl-1,6,11-trioxo-15,18,21-trioxa-8,9-dithia-2,5,12-triazatetracosan-24-oateの合成］【０２１６】
【化８６】
2018151301.tif 000100
【０２１７】
（3,5-bis(6-(biotinylamino)hexanamido)- N-(2-aminoethyl)benzamide 177mg(0.18mmol)と2,5,21,21-tetramethyl-6,19-dioxo-10,13,16,20-tetraoxa-3,4-dithia-7-azadocosanoic acid  １２６ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）を用い、実施例３−７と同様に反応を行い、目的反応生成物としてのtert-butyl 1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-7,10-dimethyl-1,6,11-trioxo-15,18,21-trioxa-8,9-dithia-2,5,12-triazatetracosan-24-oateを85ｍｇ（36％）取得した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.98(2H, s), 8.39(1H, br.t), 8.2-8.0(3H, m), 7.74(2H, t), 7.68(2H, s), 6.41(2H, s), 6.35(2H, s), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m),  3.57(2H, t), 3.6-3.4(12H, m), 3.35-3.0(10H, m), 2.81(2H, dd), 2.57(2H, d), 2.40(2H, t), 2.30(4H, t), 2.04(4H, t), 1.7-1.2(30H, m), 1.39(9H, s)
ＨＰＬＣ分析条件Ａ保持時間；１１．５分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）５／９５）
［実施例１４−１２］PB-15(還元切断)
[1-((1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-7,10-dimethyl-1,6,11-trioxo-15,18,21-trioxa-8,9-dithia-2,5,12-triazatetracosan-24-oic acid sulfo-NHS esterの合成)【０２１８】
【化８７】
2018151301.tif 000101
【０２１９】
上記合成のtert-butyl 1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-7,10-dimethyl-1,6,11-trioxo-15,18,21-trioxa-8,9-dithia-2,5,12-triazatetracosan-24-oate  ８５ｍｇ（０．０６４ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸  １ｍＬに溶解し、室温で３０分攪拌した。t-butyl基の外れたことをＨＰＬＣで確認後、減圧濃縮して1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-7,10-dimethyl-1,6,11-trioxo-15,18,21-trioxa-8,9-dithia-2,5,12-triazatetracosan-24-oic acidを取得した。精製することなしに、実施例３−９と同様に反応を行い、目的反応生成物としての1-((1-(3,5-bis(6-(biotinyl)amino)hexanamido)phenyl)-7,10-dimethyl-1,6,11-trioxo-15,18,21-trioxa-8,9-dithia-2,5,12-triazatetracosan-24-oic acid sulfo-NHS esterを８４ｍｇ（９４％）取得した。
（目的反応生成物の分析値）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：9.97(2H, s), 8.37(1H, br.s), 8.2-8.0(3H, m), 7.74(2H, t), 7.67(2H, s), 6.4(3H, br), 4.35-4.25(2H, m), 4.2-4.05(2H, m), 4.0-3.9(1H, br), 3.71(2H, t), 3.6-3.4(12H, m), 3.35-3.0(12H, m), 2.9-2.75(4H, m), 2.56(2H, d), 2.30(4H, t), 2.04(4H, t), 1.7-1.2(30H, m)
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ａ）；９．９２分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）５／９５）
中間体の脱ｔ−ブチルエステルしたカルボン酸のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ａ）；１３．８分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）５５／４５）
目的反応生成物のＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ａ）；１３．２分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）５５／４５）
Ｎ−ブチルアミンと反応させＨＰＬＣの分析を行った。
ＨＰＬＣ保持時間（分析条件Ａ）；ブチルアミド体１５．４分（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＣＨ３ＣＮ＝８５／１５（１２分）５５／４５）【０２２０】
［実施例１５］
（ストレプトアビジン変異体固定化ビーズの作製）
ストレプトアビジンのＹ１０Ｓ／Ｙ７１Ｓ／Ｒ７２Ｋ／Ｅ８９Ｄ／Ｒ９１Ｋ／Ｅ１０４Ｎ／Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ｄ／Ｓ３３Ｎ／Ｎ３７Ｇを変異させたストレプトアビジン変異体ＣをＷＯ２０１５／１２５８２０号明細書に記載の方法で作成した。
ストレプトアビジン変異体Ｃを１５０μｇ／ｍＬとなるようにBinding buffer（０．１  Ｍ  リン酸緩衝液ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で希釈した。２ｍＬのＮＨＳセファロースビーズ（NHS-activate SepharoseＴＭ  4 Fast Flow、GE Healthcare）に１０ｍＬの１ｍＭ塩酸を加えて、混合した後、７００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。同様の操作を繰り返し、ビーズを活性化させた。ビーズに１０ｍＬのBinding Bufferを加えて、混合した後、７００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。平衡化したビーズに１５０μｇ／ｍＬのＣｕｐｉｄ溶液を加えて、４℃で１６時間転倒攪拌することで反応させた。その後、７００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、１０ｍＬのBlocking buffer（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．５  ＮａＣｌ、０．１  Ｍ  エタノールアミン）を加えて、４℃で２時間転倒攪拌した。７００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去後、１０ｍＬのBinding bufferを加えて、混合した後、７００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。７００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去後、１０ｍＬのWash buffer  （０．１Ｍ酢酸緩衝液  ｐＨ４．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を加えて、混合した後、７００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。Binding bufferとWash bufferでの洗浄を３回繰り返し、１ｍＬ  Binding bufferを添加し、５０％ｖ／ｖストレプトアビジン変異体Ｃ固定化ビーズとした。【０２２１】
［実施例１６］
（Ｋａｒｐａｓ細胞の表面タンパク質のラベル化）
７５ｃｍ２フラスコにて静置培養したヒトリンパ腫由来細胞Ｋａｒｐａｓの上清を除去し、１×ＰＢＳにて細胞を洗った。そこに実施例１−８で合成したビス（Ｂｏｃ−イミノビオチン）−ＤＢＣＯ−スルホＮＨＳ  ６の７２５μＭを、ＤＭＳＯ  ５０μＬに溶解し、１×ＰＢＳで希釈して５ｍＬとし、その溶液を添加した後、室温で１時間ラベル化反応させた。反応後、３００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４を添加し、ラベル化反応を停止した。ラベル化反応後の細胞を１５ｍＬチューブに回収し、細胞のペレットを１０ｍＬの１×ＰＢＳにて洗浄した。細胞のペレットに２ｍＬのlysis buffer（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．２％ｗ／ｖ  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２％ｖ／ｖ  ＮＰ−４０（Nonidet P-40）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、穏やかにピペッティングすることで懸濁した。その後、５分おきにＶｏｌｔｅｘで懸濁しつつ、氷上で３０分静置し、細胞を溶解した。溶解後、１．５ｍＬエッペンチューブ２本に分注し、室温、１３２００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、上清を新しい１．５ｍＬエッペンチューブに回収し、−３０℃で保存した。
次いで、還元アルキル化のために、１ｍＬのサンプルに１００ｍＭ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）を終濃度５ｍＭとなるように添加し、室温で１５分間静置した後、９５℃で１５分間静置した。次に、１００ｍＭ  ヨードアセトアミドを終濃度１０ｍＭとなるように添加し、室温で１５分間、暗室にて静置した。次に、１００ｍＭ  Ｌ−システインをヨードアセトアミドと等モルになるように添加し、室温で１５分間静置した。静置後、室温、１３０００ｇで１０分間遠心し、上清を新しい２  ｍＬチューブにラベル化タンパク質を回収した。【０２２２】
回収したラベル化タンパク質を、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）とヨードアセトアミドにて還元アルキル化した。アルキル化済サンプルを、実施例１５において作製したビーズと混合し、室温で２０分間転倒撹拌した。撹拌後のサンプルを、Ａ  ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．１％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、１％ｖ／ｖ  ＮＰ−４０）にて２回洗浄後、Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．１％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、２Ｍ  ＮａＣｌ）にて２回、Digestion buffer（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）にて８回行った。その後、２００μＬのDigestion bufferで懸濁し、８０μｇ／ｍＬ  トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて３７℃、１２００ｒｐｍで１６時間消化した。
そのトリプシン消化済サンプルを０．４５μｍ遠心式フィルターで濾過し、２．２μＬの１０％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を添加した。ペプチド回収チップ（OMIX C18 pipette tips、１０〜１００μＬ、Agilent Technologies）にて、ペプチドを回収し、減圧遠心濃縮機（ＣＣ−１０５、ＴＯＭＹ）にて溶媒を蒸発させた。乾燥させたペプチドサンプルを、２５μＬの２％ｖ／ｖアセトニトリル、０．１％ｖ／ｖ  ＴＦＡで再溶解し、実施例１８−１の表面タンパク質の同定に供した。【０２２３】
［参考例１］
従来法によるＫａｒｐａｓ細胞の表面タンパクのラベル化
野生型ストレプトアビジンを実施例１５と同様にビーズに固定化した。市販のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを用いて実施例１６と同様にＫａｒｐａｓ細胞の表面タンパク質のラベル化を行ない、ペプチドサンプルを取得し、実施例１８−１の表面タンパク質の同定に供した。【０２２４】
［実施例１７］
（マウス血管の表面タンパク質のラベル化−２）
実施例１−１１で合成したビスイミノビオチン−トリアゾール−スルホＮＨＳ  １０の７２５μＭを１５０μＬに溶解し、１×ＰＢＳで希釈して１５ｍＬとした溶液を、麻酔したマウスの左心室より１ｍＬ／ｍｉｎの速度で投与して還流した。環流後のマウスに対して、Quenching perfusion buffer（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０％ｗ／ｖ  Dextran40）にて再度環流し、表面タンパクと結合していないビスイミノビオチン−トリアゾール−スルホＮＨＳ  １０およびその分解物を洗浄した。還流終了後、マウスから肝臓を摘出し、lysis buffer（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１  ｔａｂｌｅｔ／５０ｍＬ  Complete EDTA free protease inhibitor cocktail（Roche））にて組織を均質化（ホモジネート）した。超音波破砕機（Vibra-CellＴＭ、SONICS）にてタンパク質を溶解させた後、９５℃、２０分間反応処理した。溶解しなかった残渣を、室温、１１０００ｒｐｍにて２０分間遠心し、上清サンプル溶液として実験に供した。上記サンプルからのラベル化タンパク質の回収・精製・タンパク質同定は実施例１６の方法に準じた。
［参考例２］
（従来法によるマウス血管の表面タンパクのラベル化）
野生型ストレプトアビジンを実施例１５と同様にビーズに固定化した。市販のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを用いて実施例１７と同様にマウス血管の表面タンパク質のラベル化を行ない、ペプチドサンプルを取得し、実施例１８−２の表面タンパク質の同定に供した。【０２２５】
［実施例１８−１］
（実施例１６と参考例１サンプルの表面タンパク質の同定）
実施例１６と参考例１で調整されたサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。オートサンプラーはＨＴＣ−ＰＡＬ（ＣＴＣ）、ＬＣ装置はUltiMate 3000（Dionex）、ＭＳ装置はQ ExactiveＴＭ（Thermo scientific）を使用した。シリカゲルキャピラリーカラム（Ｃ１８、２００ｍｍ×１００μｍ）にてペプチドを分離し、ＭＳ／ＭＳ解析を行った。移動相として、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（０．１％ギ酸、２％アセトニトリル）、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（０．１％ギ酸、９０％アセトニトリル）を用いた。実施例１６、１７と参考例１で得られたペプチドサンプルをＢｕｆｆｅｒ  Ａ  ２５μＬに溶解し、遠心により不要物を除去したものを解析サンプルとして、オートサンプラーに設置した。トラップカラム（Acclaim PepMap(R)  １００、７５μｍ×２ｃｍ、nanoViper、Ｃ１８、３μｍ、１００Å）にロードした後、２８０ｎＬ／ｍｉｎの流速でリニアグラジエント（Ａ：Ｂ＝９５：５ｔｏＡ：Ｂ＝３５：６５、１２０ｍｉｎ）でトラップカラムよりペプチドを溶出させた。なお、Ｑ  ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭでのスキャン条件は以下の表２の通りである。【０２２６】
【表１４】
2018151301.tif 000102
【０２２７】
取得したＭＳ／ＭＳスペクトルデータについては、Proteome Discoverer（Thermo Scientific）を用い、Mascotデータベースエンジンにより解析した。用いたデータベースはUniprot_humanのデータセットを利用した。ＭＳ／ＭＳの測定基準（クライテリア）については以下に示す。Maximum Missed Cleavage Site：2。Precursor mass tolerance:5 ppm。Fragment Mass Tolerance 0.01 Da。Dynamic Modification: Oxidation (Met), Acetyl (N-term)。Static Modification: Carbamidomethyl (Cys)。パーコレーターエンジンによるペプチドバリデーションの設定は以下に示す。Maximum Delta Cn：０．０５。Target FDR（False Positive Rate：擬陽性ヒット率）：０．０１（Strict）、０．０５（Relaxed）。Validation based on q-Value。
実施例１６のサンプルから同定されたタンパク質の上位３０種を以下の表３に示す。【０２２８】
【表１５】
2018151301.tif 000103
【０２２９】
１０位にtumor necrosis factor receptor family and tumor markerとして知られているＣＤ３０が検出された。
参考例１のサンプルから同定されたタンパク質の上位３０種を以下の表４に示す。【０２３０】
【表１６】
2018151301.tif 000104
【０２３１】
ＣＤ３０が検出されたが、その順位は２６番目であった。
［実施例１８−２］
（実施例１７と参考例２のサンプルの表面タンパク質の比較）
実施例１７と参考例２で調整されたサンプルを実施例１８−２と同様にＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
その上位１０タンパクの種類と同定量を以下の表５に示す。参考例２由来のサンプルでは内在性ビオチン化タンパクが、Pyruvate carboxylase、mitochondrialとPropionyl-CoA  carboxylase alpha chain、mitochondrialとMethylcrotonoyl-CoA  carboxylase subunit alpha、mitochondrialの３種が上位に検出されているのに対し、実施例１７由来のサンプルでは、Pyruvate carboxylase、mitochondrialが６位となり、検出量も大幅に減少した。また表面タンパク質が優先して検出されたことがわかる。【０２３２】
【表１７】
2018151301.tif 000105
【０２３３】
ビスイミノビオチンで表面タンパクをラベル化し、固定化されたストレプトアビジン変異体を用いることで、従来のビオチンと野生型ストレプトアビジンを用いる方法に比べ有意に内在性ビオチン化タンパクが減少し、表面タンパク質の分析精度が向上できることがわかった。
［実施例１９］
（抗ＣＤ３０抗体の作製）
実施例１８−１で同定されたＣＤ３０の抗体を作成するために、６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに、ＣＭＶプロモーター支配下にＣＤ３０遺伝子をコードするプラスミド（ｐＨＲｍ３０ｃ）を皮下に二回投与することで、ＤＮＡ免疫を実施した。その後、ＣＤ３０細胞外ドメインのリコンビナントタンパク質を２週間おきに静脈内投与し（２回）、追加免疫を実施した。抗原をブーストした３日後に脾臓を回収し、マウス由来のミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏとフュージョンした。培養上清中に含まれる抗体をＥＬＩＳＡにて測定し、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。得られたハイブリドーマをそれぞれクローニングし、モノクローナル抗体を得た。これらのモノクローナル抗体の膜上ＣＤ３０に対する結合性は、ＣＤ３０発現細胞を用いてフローサイトメトリーにより解析した。得られた結果を表６に示した。【０２３４】
【表１８】
2018151301.tif 000106
【０２３５】
フローサイトメトリーによる解析には、L540とKarpas299、Ramos細胞を用いた。
L540とKarpas299細胞はそれぞれ、ＣＤ３０を発現するポジティブコントロールとして利用し、Ramos細胞はネガティブのコントロールとした。
ＣＤ３０に対する各抗体を上記の３種類の細胞に添加した。また二次抗体として、ＰＥラベルしたヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体を添加した。
縦軸が細胞の数、横軸にＰＥの強度を示す。（ＣＤ３０の発現が強いものほど右側にシフトしている）上記の右側の実線にあたる細胞としてＬ５４０、左側の実線の細胞がKarpas299細胞、左側の点線の細胞が、Ramos細胞である。選択した抗体はいずれも、ＣＤ３０を発現する細胞に結合していることが分かった。【０２３６】
［実施例２０］
（ストレプトアビジン変異体の作製）
配列番号２の天然型アミノ酸配列に対するＮ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ変異体の作製は、ＷＯ２０１５／１２５８２０号明細書に記載の方法に準じて作成した。用いたオリゴDNAはQuikChange Site-Directed Mutagenesis kit（アジレントテクノロジーズ）の説明書に従い設計した。ポリメラーゼ連鎖反応にはKOD plus neo（東洋紡）を用いた。下記のプライマーを使用し、配列番号２の天然型アミノ酸配列からなる野生型ストレプトアビジンcDNAが挿入されたpET21aベクターを鋳型とし、Site-Directed Mutagenesis法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。その後、制限酵素DpnIにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
・Ｎ１１Ｄ変異導入用プライマーセット：
Fw: TTACCGGCACCTGGTATGATCAGCTGGGCAGCACCTTTATTGTG（配列番号：３）
RV: AAGGTGCTGCCCAGCTGATCATACCAGGTGCCGGTAATACCTGC（配列番号：４）
・Ｓ１５Ａ変異導入用プライマーセット：
Fw: GGTATGATCAGCTGGGCGCGACCTTTATTGTGACCGCCGGCGCAG（配列番号：５）
Rv: GCGGTCACAATAAAGGTCGCGCCCAGCTGatcATACCAGGTGCCG（配列番号：６）
・Ｓ３３Ａ変異導入用プライマーセット：
Fw: TGACCGGCACCTATGAAGCGGCCGTGGGTAATGCGGAAAGCCG（配列番号：７）
Rv: TCCGCATTACCCACGGCCGCTTCATAGGTGCCGGTCAGCGCACC（配列番号：８）
得られたＮ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ変異体の構造の確認は、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 79:4, 640-642 (2015）に記載の方法に従ってＸ線結晶構造解析で行った。得られたＸ線結晶構造解析データを以下に示す。【０２３７】
［Ｘ線結晶構造解析データ］
HEADER    ----                                    23-NOV-17   2018
COMPND    ---                                                        
REMARK 3
REMARK 3 REFINEMENT.
REMARK 3 PROGRAM     : REFMAC 5.8.0189  
REMARK 3 AUTHORS     : MURSHUDOV,SKUBAK,LEBEDEV,PANNU,
REMARK 3                 STEINER,NICHOLLS,WINN,LONG,VAGIN
REMARK 3
REMARK 3 REFINEMENT TARGET : MAXIMUM LIKELIHOOD
REMARK 3
REMARK 3 DATA USED IN REFINEMENT.
REMARK 3  RESOLUTION RANGE HIGH (ANGSTROMS) :   1.46
REMARK 3 RESOLUTION RANGE LOW  (ANGSTROMS) :  55.09
REMARK 3 DATA CUTOFF            (SIGMA(F)) : NONE
REMARK 3 COMPLETENESS FOR RANGE        (%) :  80.36
REMARK 3 NUMBER OF REFLECTIONS             :   20861
REMARK 3
REMARK 3 FIT TO DATA USED IN REFINEMENT.
REMARK 3 CROSS-VALIDATION METHOD          : THROUGHOUT
REMARK 3 FREE R VALUE TEST SET SELECTION  : RANDOM
REMARK 3 R VALUE     (WORKING + TEST SET) : 0.21891
REMARK 3 R VALUE            (WORKING SET) :  0.21752
REMARK 3 FREE R VALUE                     :  0.24607
REMARK 3 FREE R VALUE TEST SET SIZE   (%) :  4.8
REMARK 3 FREE R VALUE TEST SET COUNT      :  1041
REMARK 3
REMARK 3 FIT IN THE HIGHEST RESOLUTION BIN.
REMARK 3 TOTAL NUMBER OF BINS USED           :      20
REMARK 3 BIN RESOLUTION RANGE HIGH           :    1.465
REMARK 3 BIN RESOLUTION RANGE LOW            :    1.503
REMARK 3 REFLECTION IN BIN     (WORKING SET) :     1089
REMARK 3 BIN COMPLETENESS (WORKING+TEST) (%) :    58.19
REMARK 3 BIN R VALUE           (WORKING SET) :    0.416
REMARK 3 BIN FREE R VALUE SET COUNT          :       59
REMARK 3 BIN FREE R VALUE                    :    0.461
REMARK 3
REMARK 3 NUMBER OF NON-HYDROGEN ATOMS USED IN REFINEMENT.
REMARK 3 ALL ATOMS                :      970
REMARK 3
REMARK 3 B VALUES.
REMARK 3 FROM WILSON PLOT           (A**2) : NULL
REMARK 3 MEAN B VALUE      (OVERALL, A**2) :  22.320
REMARK 3 OVERALL ANISOTROPIC B VALUE.
REMARK 3 B11 (A**2):    -0.01
REMARK 3 B22 (A**2):    -0.01
REMARK 3 B33 (A**2):     0.02
REMARK 3 B12 (A**2):     0.00
REMARK 3 B13 (A**2):    -0.00
REMARK 3 B23 (A**2):     0.00
REMARK 3
REMARK 3 ESTIMATED OVERALL COORDINATE ERROR.
REMARK 3 ESU BASED ON R VALUE              (A): 0.083
REMARK 3 ESU BASED ON FREE R VALUE        (A): 0.085
REMARK 3 ESU BASED ON MAXIMUM LIKELIHOOD     (A):   0.067
REMARK 3 ESU FOR B VALUES BASED ON MAXIMUM LIKELIHOOD (A**2):1.888
REMARK 3
REMARK 3 CORRELATION COEFFICIENTS.
REMARK 3 CORRELATION COEFFICIENT FO-FC : 0.946
REMARK 3 CORRELATION COEFFICIENT FO-FC FREE: 0.939
REMARK 3
REMARK 3 RMS DEVIATIONS FROM IDEAL VALUES COUNT RMS WEIGHT
REMARK 3 BOND LENGTHS REFINED ATOMS (A): 953; 0.024; 0.020
REMARK 3 BOND LENGTHS OTHERS         (A): 820; 0.004; 0.020
REMARK 3 BOND ANGLES REFINED ATOMS (DEGREES): 1304; 2.118; 1.909
REMARK 3 BOND ANGLES OTHERS        (DEGREES): 1891; 1.121; 3.000
REMARK 3 TORSION ANGLES, PERIOD 1 (DEGREES): 122; 7.577; 5.000
REMARK 3 TORSION ANGLES, PERIOD 2 (DEGREES): 39; 29.700; 23.846
REMARK 3 TORSION ANGLES, PERIOD 3 (DEGREES): 125; 12.590; 15.000
REMARK 3 TORSION ANGLES, PERIOD 4 (DEGREES): 4; 9.460; 15.000
REMARK 3 CHIRAL-CENTER RESTRAINTS (A**3): 146; 0.140; 0.200
REMARK 3 GENERAL PLANES REFINED ATOMS (A): 1099; 0.012; 0.020
REMARK 3 GENERAL PLANES OTHERS     (A): 215; 0.002; 0.020
REMARK 3
REMARK 3 ISOTROPIC THERMAL FACTOR RESTRAINTS. COUNT   RMS WEIGHT
REMARK 3 MAIN-CHAIN BOND REFINED ATOMS (A**2):491; 2.301; 2.112
REMARK 3 MAIN-CHAIN BOND OTHER ATOMS    (A**2):490; 2.301; 2.106
REMARK 3 MAIN-CHAIN ANGLE REFINED ATOMS (A**2):612; 3.672; 3.155
REMARK 3 MAIN-CHAIN ANGLE OTHER ATOMS (A**2):613; 3.670; 3.162
REMARK 3 SIDE-CHAIN BOND REFINED ATOMS  (A**2):461; 2.879; 2.336
REMARK 3 SIDE-CHAIN BOND OTHER ATOMS  (A**2):459; 2.882; 2.335
REMARK 3 SIDE-CHAIN ANGLE OTHER ATOMS (A**2):692; 4.372; 3.379
REMARK 3 LONG RANGE B REFINED ATOMS (A**2):1025; 8.931;24.362
REMARK 3 LONG RANGE B OTHER ATOMS (A**2):1026; 8.926; 24.369
REMARK 3
REMARK 3  NCS RESTRAINTS STATISTICS
REMARK 3   NUMBER OF NCS GROUPS : NULL
REMARK 3
REMARK 3  TWIN DETAILS
REMARK 3   NUMBER OF TWIN DOMAINS  : NULL
REMARK 3
REMARK 3
REMARK 3  TLS DETAILS
REMARK 3   NUMBER OF TLS GROUPS  : NULL
REMARK 3
REMARK 3
REMARK 3  BULK SOLVENT MODELLING.
REMARK 3   METHOD USED :  MASK
REMARK 3   PARAMETERS FOR MASK CALCULATION
REMARK 3   VDW PROBE RADIUS   :   1.20
REMARK 3   ION PROBE RADIUS   :   0.80
REMARK 3   SHRINKAGE RADIUS   :   0.80
REMARK 3
REMARK 3  OTHER REFINEMENT REMARKS:
REMARK 3  HYDROGENS HAVE BEEN ADDED IN THE RIDING POSITIONS
REMARK 3  U VALUES      : REFINED INDIVIDUALLY
REMARK 3
CRYST1 57.765   57.765  182.995  90.00  90.00  90.00 I 41 2 2
SCALE1 0.017312  0.000000  0.000000        0.00000             
SCALE2 -0.000000  0.017312  0.000000        0.00000            
SCALE3 0.000000 -0.000000  0.005465        0.00000             
ATOM  1  N   SER A  12  -24.590  -2.136 -14.698  1.00 35.05  A  N
ATOM  2  CA  SER A  12  -23.588  -3.207 -14.347  1.00 33.49  A  C
ATOM  3  CB  SER A  12  -22.153  -2.639 -14.241  1.00 33.09  A  C
ATOM  4  OG  SER A  12  -21.983  -1.835 -13.070  1.00 30.54  A  O
ATOM  5  C   SER A  12  -23.968  -3.950 -13.037  1.00 31.12  A  C
ATOM  6  O   SER A  12  -24.733  -3.462 -12.190  1.00 30.11  A  O
ATOM  7  N   ALA A  13  -23.428  -5.160 -12.930  1.00 29.20  A  N
ATOM  8  CA  ALA A  13  -23.551  -5.963 -11.733  1.00 30.72  A  C
ATOM  9  CB  ALA A  13  -22.807  -7.302 -11.935  1.00 31.55  A  C
ATOM  10  C   ALA A  13  -22.956  -5.216 -10.548  1.00 29.10  A  C
ATOM  11  O   ALA A  13  -23.547  -5.230  -9.455  1.00 25.75  A  O
ATOM  12  N   GLU A  14  -21.741  -4.642 -10.716  1.00 28.93  A  N
ATOM  13  CA  GLU A  14  -21.111  -3.807  -9.638  1.00 31.91  A  C
ATOM  14  CB  GLU A  14  -19.895  -2.999 -10.134  1.00 36.91  A  C
ATOM  15  CG  GLU A  14  -18.657  -3.765 -10.567  1.00 42.41  A  C
ATOM  16  CD  GLU A  14  -18.797  -4.576 -11.885  1.00 49.72  A  C
ATOM  17  OE1 GLU A  14  -19.786  -4.411 -12.652  1.00 55.11  A  O
ATOM  18  OE2 GLU A  14  -17.887  -5.403 -12.160  1.00 56.64  A  O
ATOM  19  C   GLU A  14  -22.091  -2.767  -9.064  1.00 27.77  A  C
ATOM  20  O   GLU A  14  -22.267  -2.671  -7.871  1.00 26.78  A  O
ATOM  21  N   ALA A  15  -22.671  -1.960  -9.931  1.00 26.16  A  N
ATOM  22  CA  ALA A  15  -23.635  -0.888  -9.519  1.00 25.76  A  C
ATOM  23  CB  ALA A  15  -23.947  -0.032 -10.723  1.00 26.10  A  C
ATOM  24  C   ALA A  15  -24.961  -1.468  -8.907  1.00 27.06  A  C
ATOM  25  O   ALA A  15  -25.538  -0.929  -7.960  1.00 27.82  A  O
ATOM  26  N   GLY A  16  -25.382  -2.636  -9.384  1.00 23.31  A  N
ATOM  27  CA  GLY A  16  -26.585  -3.276  -8.880  1.00 20.86  A  C
ATOM  28  C   GLY A  16  -26.470  -3.913  -7.500  1.00 19.56  A  C
ATOM  29  O   GLY A  16  -27.341  -3.754  -6.628  1.00 21.64  A  O
ATOM  30  N   ILE A  17  -25.346  -4.636  -7.290  1.00 18.86  A  N
ATOM  31  CA  ILE A  17  -25.126  -5.350  -6.023  1.00 18.29  A  C
ATOM  32  CB  ILE A  17  -24.065  -6.498  -6.276  1.00 18.33  A  C
ATOM  33  CG1 ILE A  17  -24.595  -7.482  -7.323  1.00 20.90  A  C
ATOM  34  CD1 ILE A  17  -23.510  -8.321  -7.991  1.00 22.55  A  C
ATOM  35  CG2 ILE A  17  -23.753  -7.294  -5.007  1.00 18.05  A  C
ATOM  36  C   ILE A  17  -24.686  -4.510  -4.851  1.00 17.39  A  C
ATOM  37  O   ILE A  17  -25.107  -4.711  -3.681  1.00 16.83  A  O
ATOM  38  N   THR A  18  -23.744  -3.605  -5.135  1.00 18.43  A  N
ATOM  39  CA  THR A  18  -23.161  -2.732  -4.137  1.00 19.39  A  C
ATOM  40  CB  THR A  18  -22.080  -1.821  -4.736  1.00 19.58  A  C
ATOM  41  OG1 THR A  18 -20.980  -2.599  -5.205  1.00 19.34  A  O
ATOM  42  CG2 THR A  18  -21.605  -0.829  -3.680  1.00 19.51  A  C
ATOM  43  C   THR A  18  -24.223  -1.961  -3.308  1.00 19.04  A  C
ATOM  44  O   THR A  18  -25.147  -1.258  -3.836  1.00 19.94  A  O
ATOM  45  N   GLY A  19  -24.134  -2.154  -1.986  1.00 17.89  A  N
ATOM  46  CA  GLY A  19  -25.052  -1.485  -1.045  1.00 19.62  A  C
ATOM  47  C   GLY A  19  -25.570  -2.388   0.071  1.00 19.08  A  C
ATOM  48  O   GLY A  19  -24.962  -3.456   0.397  1.00 19.84  A  O
ATOM  49  N   THR A  20  -26.737  -2.020   0.588  1.00 18.95  A  N
ATOM  50  CA  THR A  20  -27.285  -2.619   1.820  1.00 18.73  A  C
ATOM  51  CB  THR A  20  -27.709  -1.550   2.847  1.00 21.02  A  C
ATOM  52  OG1 THR A  20  -26.602  -0.714   3.145  1.00 22.51  A  O
ATOM  53  CG2 THR A  20  -28.207  -2.144   4.106  1.00 20.02  A  C
ATOM  54  C   THR A  20  -28.511  -3.466   1.420  1.00 18.52  A  C
ATOM  55  O   THR A  20  -29.399  -3.027   0.657  1.00 18.77  A  O
ATOM  56  N   TRP A  21  -28.520  -4.680   1.913  1.00 16.07  A  N
ATOM  57  CA  TRP A  21  -29.570  -5.679   1.659  1.00 16.67  A C
ATOM  58  CB  TRP A  21  -29.058  -6.726   0.779  1.00 14.71  A C
ATOM  59  CG  TRP A  21  -28.595  -6.339  -0.626  1.00 14.06  A C
ATOM  60  CD1 TRP A  21  -27.318  -5.936  -1.001  1.00 12.92  A C
ATOM  61  NE1 TRP A  21  -27.293  -5.777  -2.388  1.00 13.91  A N
ATOM  62  CE2 TRP A  21  -28.562  -6.031  -2.852  1.00 13.09  A C
ATOM  63  CD2 TRP A  21  -29.353  -6.416  -1.777  1.00 13.43  A C
ATOM  64  CE3 TRP A  21  -30.668  -6.775  -2.029  1.00 13.60  A C
ATOM  65  CZ3 TRP A  21  -31.110  -6.764  -3.338  1.00 14.71  A C
ATOM  66  CH2 TRP A  21  -30.327  -6.396  -4.348  1.00 14.45  A C
ATOM  67  CZ2 TRP A  21  -29.028  -6.043  -4.161  1.00 12.52  A C
ATOM  68  C   TRP A  21  -30.125  -6.244   2.935  1.00 16.40  A C
ATOM  69  O   TRP A  21  -29.470  -6.291   3.938  1.00 15.82  A O
ATOM  70  N   TYR A  22  -31.423  -6.573   2.892  1.00 16.68  A N
ATOM  71  CA  TYR A  22  -32.216  -6.969   4.074  1.00 18.74  A C
ATOM  72  CB  TYR A  22  -33.321  -5.965   4.398  1.00 16.19  A C
ATOM  73  CG  TYR A  22  -32.751  -4.630   4.644  1.00 16.43  A C
ATOM  74  CD1 TYR A  22  -32.623  -3.744   3.626  1.00 17.29  A C
ATOM  75  CE1 TYR A  22  -32.050  -2.510   3.829  1.00 16.46  A C
ATOM  76  CZ  TYR A  22  -31.627  -2.104   5.109  1.00 16.82  A C
ATOM  77  OH  TYR A  22  -31.085  -0.777   5.332  1.00 19.07  A O
ATOM  78  CE2 TYR A  22  -31.728  -2.997   6.123  1.00 19.14  A C
ATOM  79  CD2 TYR A  22  -32.291  -4.273   5.883  1.00 15.90  A C
ATOM  80  C   TYR A  22  -32.939  -8.263   3.761  1.00 19.33  A C
ATOM  81  O   TYR A  22  -33.442  -8.397   2.679  1.00 19.38  A O
ATOM  82  N   ASP A  23  -32.934  -9.211   4.675  1.00 24.41  A N
ATOM  83  CA  ASP A  23  -33.676 -10.460   4.431  1.00 30.45  A C
ATOM  84  CB  ASP A  23  -32.816 -11.744   4.655  1.00 32.46  A C
ATOM  85  CG  ASP A  23  -32.658 -12.130   6.139  1.00 37.26  A C
ATOM  86  OD1 ASP A  23  -33.238 -11.395   7.012  1.00 35.20  A O
ATOM  87  OD2 ASP A  23  -31.973 -13.198   6.372  1.00 36.81  A O
ATOM  88  C   ASP A  23  -35.001 -10.460   5.142  1.00 36.82  A C
ATOM  89  O   ASP A  23  -35.399  -9.453   5.700  1.00 36.77  A O
ATOM  90  N   GLN A  24  -35.692 -11.585   5.029  1.00 44.93  A N
ATOM  91  CA  GLN A  24  -36.949 -11.861   5.738  1.00 55.45  A C
ATOM  92  CB  GLN A  24  -37.653 -13.106   5.096  1.00 58.99  A C
ATOM  93  CG  GLN A  24  -36.949 -14.494   5.178  1.00 60.34  A C
ATOM  94  CD  GLN A  24  -35.621 -14.648   4.374  1.00 61.29  A C
ATOM  95  OE1 GLN A  24  -35.556 -14.365   3.177  1.00 58.08  A O
ATOM  96  NE2 GLN A  24  -34.568 -15.109   5.045  1.00 63.91  A N
ATOM  97  C   GLN A  24  -36.731 -11.989   7.280  1.00 59.95  A C
ATOM  98  O   GLN A  24  -37.360 -11.256   8.048  1.00 62.75  A O
ATOM  99  N   LEU A  25  -35.776 -12.841   7.698  1.00 61.98  A N
ATOM  100  CA  LEU A  25  -35.413 -13.068   9.142  1.00 58.71  A C
ATOM  101  CB  LEU A  25  -34.196 -14.091   9.286  1.00 48.56  A C
ATOM  102  CG  LEU A  25  -34.254 -15.540   8.633  1.00 48.98  A C
ATOM  103  CD1 LEU A  25  -32.913 -16.281   8.430  1.00 42.11  A C
ATOM  104  CD2 LEU A  25  -35.213 -16.513   9.342  1.00 46.59  A C
ATOM  105  C   LEU A  25  -35.221 -11.692   9.947  1.00 62.94  A C
ATOM  106  O   LEU A  25  -35.708 -11.573  11.089  1.00 67.22  A O
ATOM  107  N   GLY A  26  -34.631 -10.655   9.310  1.00 52.67  A N
ATOM  108  CA  GLY A  26  -34.225  -9.359   9.952  1.00 39.54  A C
ATOM  109  C   GLY A  26  -32.696  -9.088   9.899  1.00 33.50  A C
ATOM  110  O   GLY A  26  -32.171  -8.284  10.672  1.00 31.06  A O
ATOM  111  N   ALA A  27  -31.982  -9.768   8.998  1.00 25.56  A N
ATOM  112  CA  ALA A  27  -30.562  -9.598   8.788  1.00 23.69  A C
ATOM  113  CB  ALA A  27  -29.961 -10.862   8.168  1.00 27.35  A C
ATOM  114  C   ALA A  27  -30.277  -8.419   7.873  1.00 21.86  A C
ATOM  115  O   ALA A  27  -31.062  -8.099   7.038  1.00 22.74  A O
ATOM  116  N   THR A  28  -29.071  -7.875   7.968  1.00 23.35  A N
ATOM  117  CA  THR A  28  -28.613  -6.771   7.111  1.00 25.58  A C
ATOM  118  CB  THR A  28  -28.470  -5.468   7.925  1.00 28.45  A C
ATOM  119  OG1 THR A  28  -29.683  -5.191   8.605  1.00 30.56  A O
ATOM  120  CG2 THR A  28  -28.147  -4.287   7.022  1.00 30.95  A C
ATOM  121  C   THR A  28   -27.212  -7.161   6.573  1.00 21.48  A C
ATOM  122  O   THR A  28  -26.330  -7.536   7.340  1.00 24.83  A O
ATOM  123  N   PHE A  29  -27.046  -7.121   5.252  1.00 19.91  A N
ATOM  124  CA  PHE A  29  -25.823  -7.589   4.520  1.00 23.45  A C
ATOM  125  CB  PHE A  29  -26.354  -8.709   3.588  1.00 24.59  A C
ATOM  126  CG  PHE A  29  -25.577  -9.010   2.403  1.00 23.33  A C
ATOM  127  CD1 PHE A  29  -24.266  -9.484   2.485  1.00 25.55  A C
ATOM  128  CE1 PHE A  29  -23.570  -9.847   1.335  1.00 21.65  A C
ATOM  129  CZ  PHE A  29  -24.205  -9.886   0.103  1.00 21.41  A C
ATOM  130  CE2 PHE A  29  -25.548  -9.500   0.051  1.00 22.80  A C
ATOM  131  CD2 PHE A  29  -26.215  -9.098   1.164  1.00 25.38  A C
ATOM  132  C   PHE A  29  -25.404  -6.252   3.821  1.00 21.83  A C
ATOM  133  O   PHE A  29  -26.229  -5.633   3.083  1.00 22.06  A O
ATOM  134  N   ILE A  30  -24.186  -5.776   4.069  1.00 18.73  A N
ATOM  135  CA  ILE A  30  -23.683  -4.545   3.467  1.00 22.00  A C
ATOM  136  CB  ILE A  30  -23.250  -3.551   4.514  1.00 26.06  A C
ATOM  137  CG1 ILE A  30  -24.409  -3.262   5.453  1.00 26.43  A C
ATOM  138  CD1 ILE A  30  -23.967  -2.447   6.637  1.00 27.01  A C
ATOM  139  CG2 ILE A  30  -22.851  -2.235   3.851  1.00 26.77  A C
ATOM  140  C   ILE A  30  -22.512  -4.946   2.636  1.00 21.76  A C
ATOM  141  O   ILE A  30  -21.604  -5.510   3.147  1.00 20.88  A O
ATOM  142  N   VAL A  31  -22.576  -4.749   1.328  1.00 21.38  A N
ATOM  143  CA  VAL A  31  -21.585  -5.346   0.441  1.00 19.41  A C
ATOM  144  CB  VAL A  31  -22.141  -6.604  -0.235  1.00 20.60  A C
ATOM  145  CG1 VAL A  31  -23.369  -6.301  -1.150  1.00 20.12  A C
ATOM  146  CG2 VAL A  31  -21.085  -7.406  -0.970  1.00 20.28  A C
ATOM  147  C   VAL A  31  -21.103  -4.347  -0.624  1.00 19.13  A C
ATOM  148  O   VAL A  31  -21.811  -3.468  -1.073  1.00 19.64  A O
ATOM  149  N   THR A  32  -19.824  -4.425  -0.926  1.00 19.88  A N
ATOM  150  CA  THR A  32  -19.277  -3.777  -2.098  1.00 19.80  A C
ATOM  151  CB  THR A  32  -18.039  -2.930  -1.742  1.00 23.25  A C
ATOM  152  OG1 THR A  32  -18.410  -2.002  -0.742  1.00 23.99  A O
ATOM  153  CG2 THR A  32  -17.507  -2.216  -2.929  1.00 23.25  A C
ATOM  154  C   THR A  32  -18.882  -4.854  -3.095  1.00 21.65  A C
ATOM  155  O   THR A  32  -18.138  -5.805  -2.769  1.00 17.13  A O
ATOM  156  N   ALA A  33  -19.306  -4.638  -4.358  1.00 18.89  A N
ATOM  157  CA  ALA A  33  -18.936  -5.520  -5.469  1.00 20.18  A C
ATOM  158  CB  ALA A  33  -20.182  -5.833  -6.273  1.00 19.54  A C
ATOM  159  C   ALA A  33  -17.884  -4.834  -6.340  1.00 22.60  A C
ATOM  160  O   ALA A  33  -18.185  -3.777  -6.895  1.00 24.21  A O
ATOM  161  N   GLY A  34  -16.685  -5.419  -6.434  1.00 22.16  A N
ATOM  162  CA  GLY A  34  -15.539  -4.815  -7.103  1.00 28.16  A C
ATOM  163  C   GLY A  34  -15.658  -5.122  -8.567  1.00 34.23  A C
ATOM  164  O   GLY A  34  -16.350  -6.098  -8.963  1.00 35.35  A O
ATOM  165  N   ALA A  35  -15.031  -4.288  -9.421  1.00 40.74  A N
ATOM  166  CA  ALA A  35  -15.121  -4.486 -10.904  1.00 36.86  A C
ATOM  167  CB  ALA A  35  -14.540  -3.314 -11.671  1.00 38.16  A C
ATOM  168  C   ALA A  35  -14.491  -5.855 -11.345  1.00 39.96  A C
ATOM  169  O   ALA A  35  -14.820  -6.407 -12.402  1.00 42.31  A O
ATOM  170  N   ASP A  36  -13.632  -6.383 -10.475  1.00 35.03  A N
ATOM  171  CA  ASP A  36  -12.929  -7.604 -10.659  1.00 37.23  A C
ATOM  172  CB  ASP A  36  -11.757  -7.561  -9.678  1.00 40.42  A C
ATOM  173  CG  ASP A  36  -12.161  -7.043  -8.294  1.00 52.41  A C
ATOM  174  OD1 ASP A  36  -12.839  -5.983  -8.195  1.00 60.10  A O
ATOM  175  OD2 ASP A  36  -11.784  -7.683  -7.294  1.00 63.05  A O
ATOM  176  C   ASP A  36  -13.759  -8.903 -10.407  1.00 30.76  A C
ATOM  177  O   ASP A  36  -13.377  -9.952 -10.879  1.00 34.66  A O
ATOM  178  N   GLY A  37  -14.871  -8.843  -9.672  1.00 21.89  A N
ATOM  179  CA  GLY A  37  -15.551 -10.060  -9.209  1.00 20.15  A C
ATOM  180  C   GLY A  37  -15.533 -10.207  -7.695  1.00 17.31  A C
ATOM  181  O   GLY A  37  -16.056 -11.199  -7.181  1.00 16.84  A O
ATOM  182  N   ALA A  38  -14.927  -9.276  -6.992  1.00 16.44  A N
ATOM  183  CA  ALA A  38  -14.906  -9.415  -5.505  1.00 17.16  A C
ATOM  184  CB  ALA A  38  -13.640  -8.842  -4.915  1.00 19.72  A C
ATOM  185  C   ALA A  38  -16.161  -8.887  -4.773  1.00 19.43  A C
ATOM  186  O   ALA A  38  -16.685  -7.805  -5.103  1.00 20.74  A O
ATOM  187  N   LEU A  39  -16.529  -9.582  -3.687  1.00 17.46  A N
ATOM  188  CA  LEU A  39  -17.506  -9.154  -2.767  1.00 17.84  A C
ATOM  189  CB  LEU A  39  -18.679 -10.132  -2.610  1.00 18.13  A C
ATOM  190  CG  LEU A  39  -19.509 -10.393  -3.873  1.00 18.35  A C
ATOM  191  CD1 LEU A  39  -20.555 -11.424  -3.484  1.00 17.68  A C
ATOM  192  CD2 LEU A  39  -20.204  -9.202  -4.424  1.00 18.29  A C
ATOM  193  C   LEU A  39  -16.848  -9.021  -1.430  1.00 16.96  A C
ATOM  194  O   LEU A  39  -16.134  -9.883  -0.994  1.00 19.04  A O
ATOM  195  N   THR A  40  -17.032  -7.874  -0.848  1.00 16.16  A N
ATOM  196  CA  THR A  40  -16.562  -7.639   0.517  1.00 17.71  A C
ATOM  197  CB  THR A  40  -15.236  -6.848   0.478  1.00 18.35  A C
ATOM  198  OG1 THR A  40  -15.466  -5.589  -0.139  1.00 22.04  A O
ATOM  199  CG2 THR A  40  -14.269  -7.443  -0.368  1.00 18.36  A C
ATOM  200  C   THR A  40  -17.603  -6.859   1.293  1.00 19.09  A C
ATOM  201  O   THR A  40  -18.278  -5.989   0.752  1.00 20.33  A O
ATOM  202  N   GLY A  41  -17.686  -7.111   2.593  1.00 18.42  A N
ATOM  203  CA  GLY A  41  -18.555  -6.335   3.394  1.00 17.80  A C
ATOM  204  C   GLY A  41  -18.743  -6.916   4.762  1.00 16.42  A C
ATOM  205  O   GLY A  41  -17.860  -7.536   5.317  1.00 18.14  A O
ATOM  206  N   THR A  42  -19.954  -6.730   5.301  1.00 18.17  A N
ATOM  207  CA  THR A  42  -20.325  -7.236   6.622  1.00 17.52  A C
ATOM  208  CB  THR A  42  -20.249  -6.119   7.695  1.00 19.32  A C
ATOM  209  OG1 THR A  42  -21.150  -5.065   7.404  1.00 20.00  A O
ATOM  210  CG2 THR A  42  -18.829  -5.613   7.800  1.00 20.09  A C
ATOM  211  C   THR A  42  -21.716  -7.772   6.607  1.00 18.63  A C
ATOM  212  O   THR A  42  -22.513  -7.336   5.803  1.00 18.01  A O
ATOM  213  N   TYR A  43  -21.987  -8.678   7.534  1.00 18.20  A N
ATOM  214  CA  TYR A  43  -23.257  -9.326   7.657  1.00 13.58  A C
ATOM  215  CB  TYR A  43  -23.137 -10.824   7.249  1.00 15.03  A C
ATOM  216  CG  TYR A  43  -24.521 -11.468   7.036  1.00 15.25  A C
ATOM  217  CD1 TYR A  43  -25.256 -11.958   8.114  1.00 17.63  A C
ATOM  218  CE1 TYR A  43  -26.563 -12.487   7.933  1.00 16.32  A C
ATOM  219  CZ  TYR A  43  -27.079 -12.625   6.619  1.00 17.17  A C
ATOM  220  OH  TYR A  43  -28.340 -13.221   6.353  1.00 21.04  A O
ATOM  221  CE2 TYR A  43  -26.340 -12.181   5.557  1.00 16.77  A C
ATOM  222  CD2 TYR A  43  -25.024 -11.645   5.750  1.00 16.43  A C
ATOM  223  C   TYR A  43  -23.676  -9.188   9.118  1.00 15.26  A C
ATOM  224  O   TYR A  43  -22.916  -9.460   9.966  1.00 17.69  A O
ATOM  225  N   GLU A  44  -24.950  -8.848   9.386  1.00 16.42  A N
ATOM  226  CA  GLU A  44  -25.432  -8.847  10.793  1.00 19.27  A C
ATOM  227  CB  GLU A  44  -25.684  -7.414  11.215  1.00 22.51  A C
ATOM  228  CG  GLU A  44  -26.222  -7.320  12.629  1.00 27.05  A C
ATOM  229  CD  GLU A  44  -26.109  -5.918  13.200  1.00 32.58  A C
ATOM  230  OE1 GLU A  44  -26.066  -4.943  12.437  1.00 28.73  A O
ATOM  231  OE2 GLU A  44  -26.058  -5.770  14.446  1.00 32.12  A O
ATOM  232  C   GLU A  44  -26.745  -9.708  10.791  1.00 20.57  A C
ATOM  233  O   GLU A  44  -27.705  -9.375  10.090  1.00 21.96  A O
ATOM  234  N   ALA A  45  -26.736 -10.823  11.542  1.00 22.25  A N
ATOM  235  CA  ALA A  45  -27.834 -11.751  11.624  1.00 21.97  A C
ATOM  236  CB  ALA A  45  -27.349 -13.199  11.791  1.00 23.41  A C
ATOM  237  C   ALA A  45  -28.627 -11.403  12.812  1.00 25.14  A C
ATOM  238  O   ALA A  45  -28.053 -11.009  13.822  1.00 32.36  A O
ATOM  239  N   ALA A  46  -29.927 -11.637  12.702  1.00 24.46  A N
ATOM  240  CA  ALA A  46  -30.873 -11.444  13.786  1.00 28.03  A C
ATOM  241  CB  ALA A  46  -32.047 -10.622  13.312  1.00 31.09  A C
ATOM  242  C   ALA A  46  -31.348 -12.760  14.402  1.00 28.43  A C
ATOM  243  O   ALA A  46  -32.006 -12.748  15.426  1.00 29.54  A O
ATOM  244  N   VAL A  47  -31.019 -13.883  13.796  1.00 23.52  A N
ATOM  245  CA  VAL A  47  -31.224 -15.202  14.439  1.00 22.19  A C
ATOM  246  CB  VAL A  47  -32.282 -16.071  13.730  1.00 23.12  A C
ATOM  247  CG1 VAL A  47  -33.557 -15.259  13.621  1.00 22.67  A C
ATOM  248  CG2 VAL A  47  -31.837 -16.487  12.334  1.00 22.80  A C
ATOM  249  C   VAL A  47  -29.892 -15.903  14.555  1.00 24.69  A C
ATOM  250  O   VAL A  47  -28.965 -15.567  13.819  1.00 27.40  A O
ATOM  251  N   GLY A  48  -29.814 -16.875  15.451  1.00 22.30  A N
ATOM  252  CA  GLY A  48  -28.646 -17.733  15.555  1.00 24.01  A C
ATOM  253  C   GLY A  48  -27.682 -17.267  16.611  1.00 23.81  A C
ATOM  254  O   GLY A  48  -27.931 -16.296  17.325  1.00 25.68  A O
ATOM  255  N   ASN A  49  -26.557 -17.963  16.693  1.00 23.09  A N
ATOM  256  CA  ASN A  49  -25.539 -17.682  17.711  1.00 22.53  A C
ATOM  257  CB  ASN A  49  -24.810 -18.960  18.065  1.00 24.14  A C
ATOM  258  CG  ASN A  49  -23.906 -18.802  19.264  1.00 24.89  A C
ATOM  259  OD1 ASN A  49  -23.816 -17.735  19.937  1.00 25.32  A O
ATOM  260  ND2 ASN A  49  -23.187 -19.868  19.512  1.00 26.43  A N
ATOM  261  C   ASN A  49  -24.580 -16.623  17.154  1.00 22.24  A C
ATOM  262  O   ASN A  49  -23.444 -16.935  16.701  1.00 21.06  A O
ATOM  263  N   ALA A  50  -25.072 -15.398  17.188  1.00 21.77  A N
ATOM  264  CA  ALA A  50  -24.443 -14.280  16.504  1.00 22.01  A C
ATOM  265  CB  ALA A  50  -24.824 -14.258  15.014  1.00 23.55  A C
ATOM  266  C   ALA A  50  -24.843 -13.014  17.138  1.00 23.23  A C
ATOM  267  O   ALA A  50  -25.967 -12.875  17.637  1.00 21.90  A O
ATOM  268  N   GLU A  51  -23.915 -12.085  17.172  1.00 22.60  A N
ATOM  269  CA  GLU A  51  -24.303 -10.732  17.448  1.00 23.25  A C
ATOM  270  CB  GLU A  51  -24.362 -10.516  18.979  1.00 28.34  A C
ATOM  271  CG  GLU A  51  -23.134  -9.906  19.594  1.00 29.94  A C
ATOM  272  CD  GLU A  51  -23.241  -9.756  21.110  1.00 35.05  A C
ATOM  273  OE1 GLU A  51  -23.233  -8.595  21.556  1.00 41.25  A O
ATOM  274  OE2 GLU A  51  -23.383 -10.786  21.825  1.00 38.53  A O
ATOM  275  C   GLU A  51  -23.320  -9.745  16.771  1.00 21.42  A C
ATOM  276  O   GLU A  51  -22.138 -10.041  16.573  1.00 22.31  A O
ATOM  277  N   SER A  52  -23.865  -8.604  16.426  1.00 22.32  A N
ATOM  278  CA  SER A  52  -23.186  -7.511  15.803  1.00 23.10  A C
ATOM  279  CB  SER A  52  -21.982  -7.027  16.658  1.00 26.33  A C
ATOM  280  OG  SER A  52  -21.397  -5.843  16.111  1.00 27.68  A O
ATOM  281  C   SER A  52  -22.801  -7.947  14.355  1.00 22.62  A C
ATOM  282  O   SER A  52  -23.340  -8.947  13.780  1.00 20.26  A O
ATOM  283  N   ARG A  53  -21.800  -7.244  13.823  1.00 21.63  A N
ATOM  284  CA  ARG A  53  -21.360  -7.444  12.410  1.00 21.71  A C
ATOM  285  CB  ARG A  53  -20.913  -6.120  11.777  1.00 26.94  A C
ATOM  286  CG  ARG A  53  -22.033  -5.113  11.591  1.00 32.15  A C
ATOM  287  CD  ARG A  53  -21.732  -3.956  10.667  1.00 41.47  A C
ATOM  288  NE  ARG A  53  -21.065  -2.835  11.352  1.00 54.96  A N
ATOM  289  CZ  ARG A  53  -20.755  -1.651  10.788  1.00 56.22  A C
ATOM  290  NH1 ARG A  53  -21.050  -1.378   9.511  1.00 51.50  A N
ATOM  291  NH2 ARG A  53  -20.141  -0.726  11.524  1.00 60.44  A N
ATOM  292  C   ARG A  53  -20.217  -8.478  12.308  1.00 20.08  A C
ATOM  293  O   ARG A  53  -19.367  -8.593  13.188  1.00 18.17  A O
ATOM  294  N   TYR A  54  -20.265  -9.281  11.241  1.00 18.46  A N
ATOM  295  CA  TYR A  54  -19.254 -10.267  10.882  1.00 16.08  A C
ATOM  296  CB  TYR A  54  -19.825 -11.729  10.879  1.00 15.32  A C
ATOM  297  CG  TYR A  54  -20.284 -12.144  12.255  1.00 16.94  A C
ATOM  298  CD1 TYR A  54  -21.542 -11.766  12.705  1.00 14.12  A C
ATOM  299  CE1 TYR A  54  -21.920 -12.072  14.023  1.00 15.58  A C
ATOM  300  CZ  TYR A  54  -21.134 -12.808  14.789  1.00 18.44  A C
ATOM  301  OH  TYR A  54  -21.509 -13.120  16.060  1.00 18.97  A O
ATOM  302  CE2 TYR A  54  -19.919 -13.234  14.353  1.00 18.64  A C
ATOM  303  CD2 TYR A  54  -19.506 -12.914  13.074  1.00 16.26  A C
ATOM  304  C   TYR A  54  -18.713  -9.978   9.463  1.00 15.04  A C
ATOM  305  O   TYR A  54  -19.423  -9.541   8.584  1.00 16.36  A O
ATOM  306  N   VAL A  55  -17.405 -10.205   9.282  1.00 14.03  A N
ATOM  307  CA  VAL A  55  -16.832 -10.038   7.957  1.00 15.87  A C
ATOM  308  CB  VAL A  55  -15.281 -10.209   8.003  1.00 17.23  A C
ATOM  309  CG1 VAL A  55  -14.677 -10.261   6.588  1.00 17.72  A C
ATOM  310  CG2 VAL A  55  -14.699  -9.057   8.757  1.00 19.72  A C
ATOM  311  C   VAL A  55  -17.383 -10.996   6.954  1.00 16.79  A C
ATOM  312  O   VAL A  55  -17.656 -12.191   7.247  1.00 17.29  A O
ATOM  313  N   LEU A  56  -17.505 -10.525   5.720  1.00 19.39  A N
ATOM  314  CA  LEU A  56  -17.899 -11.500   4.691  1.00 22.53  A C
ATOM  315  CB  LEU A  56  -19.358 -11.358   4.279  1.00 22.49  A C
ATOM  316  CG  LEU A  56  -19.806 -10.155   3.459  1.00 19.77  A C
ATOM  317  CD1 LEU A  56  -19.782 -10.273   1.881  1.00 18.92  A C
ATOM  318  CD2 LEU A  56  -21.211  -9.844   3.832  1.00 24.33  A C
ATOM  319  C   LEU A  56  -17.107 -11.241   3.488  1.00 21.24  A C
ATOM  320  O   LEU A  56  -16.717 -10.106   3.250  1.00 19.27  A O
ATOM  321  N   THR A  57  -16.904 -12.303   2.730  1.00 16.28  A N
ATOM  322  CA  THR A  57  -16.209 -12.164   1.501  1.00 16.59  A C
ATOM  323  CB  THR A  57  -14.685 -12.409   1.732  1.00 16.53  A C
ATOM  324  OG1 THR A  57  -14.036 -12.117   0.532  1.00 23.86  A O
ATOM  325  CG2 THR A  57  -14.344 -13.872   1.998  1.00 16.65  A C
ATOM  326  C   THR A  57  -16.810 -13.083   0.489  1.00 16.06  A C
ATOM  327  O   THR A  57  -17.233 -14.168   0.830  1.00 15.61  A O
ATOM  328  N   GLY A  58  -16.704 -12.771  -0.806  1.00 15.90  A N
ATOM  329  CA  GLY A  58  -17.231 -13.649  -1.793  1.00 13.46  A C
ATOM  330  C   GLY A  58  -16.854 -13.187  -3.152  1.00 14.30  A C
ATOM  331  O   GLY A  58  -15.916 -12.393  -3.294  1.00 14.85  A O
ATOM  332  N   ARG A  59  -17.563 -13.701  -4.124  1.00 13.42  A N
ATOM  333  CA  ARG A  59  -17.294 -13.505  -5.559  1.00 13.58  A C
ATOM  334  CB  ARG A  59  -16.514 -14.705  -6.134  1.00 15.75  A C
ATOM  335  CG  ARG A  59  -15.134 -14.937  -5.565  1.00 16.64  A C
ATOM  336  CD  ARG A  59  -14.020 -13.925  -5.773  1.00 13.78  A C
ATOM  337  NE  ARG A  59  -13.722 -13.854  -7.223  1.00 14.26  A N
ATOM  338  CZ  ARG A  59  -13.023 -12.887  -7.794  1.00 19.57  A C
ATOM  339  NH1 ARG A  59  -12.592 -11.861  -7.108  1.00 20.45  A N
ATOM  340  NH2 ARG A  59  -12.838 -12.886  -9.107  1.00 20.51  A N
ATOM  341  C   ARG A  59  -18.658 -13.352  -6.294  1.00 15.96  A C
ATOM  342  O   ARG A  59  -19.696 -13.972  -5.915  1.00 17.20  A O
ATOM  343  N   TYR A  60  -18.661 -12.660  -7.465  1.00 16.16  A N
ATOM  344  CA  TYR A  60  -19.863 -12.589  -8.308  1.00 15.24  A C
ATOM  345  CB  TYR A  60  -20.623 -11.288  -7.993  1.00 18.01  A C
ATOM  346  CG  TYR A  60  -20.007 -10.033  -8.448  1.00 19.37  A C
ATOM  347  CD1 TYR A  60  -18.931  -9.480  -7.768  1.00 20.00  A C
ATOM  348  CE1 TYR A  60  -18.344  -8.307  -8.209  1.00 23.72  A C
ATOM  349  CZ  TYR A  60  -18.801  -7.751  -9.397  1.00 24.97  A C
ATOM  350  OH  TYR A  60  -18.233  -6.623  -9.806  1.00 30.56  A O
ATOM  351  CE2 TYR A  60  -19.870  -8.231 -10.054  1.00 25.42  A C
ATOM  352  CD2 TYR A  60  -20.464  -9.394  -9.615  1.00 22.87  A C
ATOM  353  C   TYR A  60  -19.325 -12.599  -9.753  1.00 13.87  A C
ATOM  354  O   TYR A  60  -18.110 -12.255  -9.972  1.00 15.00  A O
ATOM  355  N   ASP A  61  -20.194 -12.860 -10.705  1.00 14.02  A N
ATOM  356  CA  ASP A  61  -19.944 -12.789 -12.125  1.00 14.36  A C
ATOM  357  CB  ASP A  61  -20.998 -13.619 -12.840  1.00 15.26  A C
ATOM  358  CG  ASP A  61  -20.851 -13.603 -14.378  1.00 16.51  A C
ATOM  359  OD1 ASP A  61  -19.945 -12.917 -14.829  1.00 19.73  A O
ATOM  360  OD2 ASP A  61  -21.722 -14.173 -14.987  1.00 17.72  A O
ATOM  361  C   ASP A  61  -20.003 -11.288 -12.518  1.00 17.15  A C
ATOM  362  O   ASP A  61  -21.056 -10.705 -12.508  1.00 19.35  A O
ATOM  363  N   SER A  62  -18.842 -10.745 -12.807  1.00 19.28  A N
ATOM  364  CA  SER A  62  -18.697  -9.337 -13.203  1.00 20.58  A C
ATOM  365  CB  SER A  62  -17.294  -8.844 -12.865  1.00 22.24  A C
ATOM  366  OG  SER A  62  -16.296  -9.650 -13.371  1.00 24.82  A O
ATOM  367  C   SER A  62  -18.979  -9.128 -14.684  1.00 22.52  A C
ATOM  368  O   SER A  62  -18.953  -8.022 -15.107  1.00 24.22  A O
ATOM  369  N   ALA A  63  -19.244 -10.166 -15.441  1.00 23.33  A N
ATOM  370  CA  ALA A  63  -19.693  -9.993 -16.854  1.00 23.68  A C
ATOM  371  CB  ALA A  63  -18.596 -10.298 -17.824  1.00 23.75  A C
ATOM  372  C   ALA A  63  -20.885 -10.897 -17.123  1.00 22.86  A C
ATOM  373  O   ALA A  63  -20.750 -11.912 -17.840  1.00 22.66  A O
ATOM  374  N   PRO A  64  -22.020 -10.622 -16.474  1.00 22.56  A N
ATOM  375  CA  PRO A  64  -23.161 -11.523 -16.577  1.00 21.49  A C
ATOM  376  CB  PRO A  64  -24.074 -11.079 -15.430  1.00 21.77  A C
ATOM  377  CG  PRO A  64  -23.775  -9.605 -15.323  1.00 21.35  A C
ATOM  378  CD  PRO A  64  -22.309  -9.472 -15.587  1.00 24.56  A C
ATOM  379  C   PRO A  64  -23.805 -11.460 -17.974  1.00 23.78  A C
ATOM  380  O   PRO A  64  -23.546 -10.540 -18.718  1.00 24.16  A O
ATOM  381  N   ALA A  65  -24.555 -12.499 -18.307  1.00 22.56  A N
ATOM  382  CA  ALA A  65  -25.262 -12.592 -19.579  1.00 27.60  A C
ATOM  383  CB  ALA A  65  -25.974 -13.919 -19.690  1.00 26.99  A C
ATOM  384  C   ALA A  65  -26.233 -11.428 -19.657  1.00 30.08  A C
ATOM  385  O   ALA A  65  -26.701 -10.907 -18.646  1.00 31.03  A O
ATOM  386  N   THR A  66  -26.490 -10.964 -20.871  1.00 33.71  A N
ATOM  387  CA  THR A  66  -27.342  -9.791 -21.038  1.00 36.18  A C
ATOM  388  CB  THR A  66  -26.654  -8.768 -21.957  1.00 34.93  A C
ATOM  389  OG1 THR A  66  -26.540  -9.331 -23.242  1.00 33.52  A O
ATOM  390  CG2 THR A  66  -25.245  -8.437 -21.517  1.00 37.15  A C
ATOM  391  C   THR A  66  -28.710 -10.218 -21.595  1.00 37.97  A C
ATOM  392  O   THR A  66  -29.387  -9.417 -22.223  1.00 40.69  A O
ATOM  393  N   ASP A  67  -29.130 -11.456 -21.319  1.00 33.68  A N
ATOM  394  CA  ASP A  67  -30.317 -12.113 -21.917  1.00 32.13  A C
ATOM  395  CB  ASP A  67  -29.937 -13.522 -22.412  1.00 32.24  A C
ATOM  396  CG  ASP A  67  -29.592 -14.483 -21.282  1.00 33.84  A C
ATOM  397  OD1 ASP A  67  -29.545 -14.060 -20.103  1.00 32.63  A O
ATOM  398  OD2 ASP A  67  -29.376 -15.670 -21.577  1.00 36.09  A O
ATOM  399  C   ASP A  67  -31.548 -12.193 -20.986  1.00 32.11  A C
ATOM  400  O   ASP A  67  -32.459 -12.967 -21.223  1.00 33.62  A O
ATOM  401  N   GLY A  68  -31.539 -11.416 -19.907  1.00 30.44  A N
ATOM  402  CA  GLY A  68  -32.501 -11.549 -18.834  1.00 31.92  A C
ATOM  403  C   GLY A  68  -32.133 -12.473 -17.679  1.00 28.89  A C
ATOM  404  O   GLY A  68  -32.903 -12.596 -16.739  1.00 31.13  A O
ATOM  405  N   SER A  69  -30.971 -13.101 -17.733  1.00 25.39  A N
ATOM  406  CA  SER A  69  -30.542 -13.967 -16.650  1.00 22.55  A C
ATOM  407  CB  SER A  69  -29.503 -14.934 -17.123  1.00 25.44  A C
ATOM  408  OG  SER A  69  -30.104 -15.772 -18.120  1.00 27.24  A O
ATOM  409  C   SER A  69  -30.050 -13.203 -15.513  1.00 19.12  A C
ATOM  410  O   SER A  69  -29.577 -12.041 -15.669  1.00 19.68  A O
ATOM  411  N   GLY A  70  -30.132 -13.821 -14.338  1.00 17.46  A N
ATOM  412  CA  GLY A  70  -29.626 -13.212 -13.124  1.00 17.75  A C
ATOM  413  C   GLY A  70  -28.086 -13.203 -13.131  1.00 18.15  A C
ATOM  414  O   GLY A  70  -27.433 -13.834 -13.998  1.00 19.62  A O
ATOM  415  N   THR A  71  -27.533 -12.628 -12.074  1.00 16.48  A N
ATOM  416  CA  THR A  71  -26.083 -12.590 -11.947  1.00 16.65  A C
ATOM  417  CB  THR A  71  -25.610 -11.164 -11.618  1.00 17.07  A C
ATOM  418  OG1 THR A  71  -25.967 -10.234 -12.705  1.00 18.85  A O
ATOM  419  CG2 THR A  71  -24.130 -11.132 -11.344  1.00 17.20  A C
ATOM  420  C   THR A  71  -25.663 -13.555 -10.839  1.00 14.35  A C
ATOM  421  O   THR A  71  -25.952 -13.289  -9.654  1.00 15.70  A O
ATOM  422  N   ALA A  72  -24.848 -14.550 -11.128  1.00 18.08  A N
ATOM  423  CA  ALA A  72  -24.476 -15.522 -10.105  1.00 16.77  A C
ATOM  424  CB  ALA A  72  -23.888 -16.757 -10.771  1.00 17.75  A C
ATOM  425  C   ALA A  72  -23.494 -14.948  -9.113  1.00 16.31  A C
ATOM  426  O   ALA A  72  -22.580 -14.177  -9.449  1.00 16.01  A O
ATOM  427  N   LEU A  73  -23.693 -15.287  -7.841  1.00 16.00  A N
ATOM  428  CA  LEU A  73  -22.808 -14.821  -6.796  1.00 18.83  A C
ATOM  429  CB  LEU A  73  -23.145 -13.325  -6.407  1.00 18.62  A C
ATOM  430  CG  LEU A  73  -24.344 -13.052  -5.538  1.00 22.18  A C
ATOM  431  CD1 LEU A  73  -24.634 -11.547  -5.450  1.00 23.44  A C
ATOM  432  CD2 LEU A  73  -25.560 -13.696  -6.010  1.00 21.87  A C
ATOM  433  C   LEU A  73  -22.811 -15.777  -5.592  1.00 17.40  A C
ATOM  434  O   LEU A  73  -23.638 -16.748  -5.518  1.00 17.94  A O
ATOM  435  N   GLY A  74  -21.766 -15.645  -4.775  1.00 15.31  A N
ATOM  436  CA  GLY A  74  -21.767 -16.236  -3.442  1.00 15.54  A C
ATOM  437  C   GLY A  74  -20.853 -15.640  -2.457  1.00 13.62  A C
ATOM  438  O   GLY A  74  -20.028 -14.852  -2.800  1.00 16.00  A O
ATOM  439  N   TRP A  75  -21.077 -15.887  -1.167  1.00 14.11  A N
ATOM  440  CA  TRP A  75  -20.254 -15.326  -0.184  1.00 12.96  A C
ATOM  441  CB  TRP A  75  -20.643 -13.831   0.171  1.00 14.00  A C
ATOM  442  CG  TRP A  75  -21.888 -13.678   0.861  1.00 12.48  A C
ATOM  443  CD1 TRP A  75  -22.093 -13.659   2.224  1.00 13.45  A C
ATOM  444  NE1 TRP A  75  -23.433 -13.496   2.477  1.00 12.74  A N
ATOM  445  CE2 TRP A  75  -24.090 -13.413   1.288  1.00 13.13  A C
ATOM  446  CD2 TRP A  75  -23.161 -13.474   0.280  1.00 10.73  A C
ATOM  447  CE3 TRP A  75  -23.605 -13.392  -1.063  1.00 10.66  A C
ATOM  448  CZ3 TRP A  75  -25.058 -13.244  -1.275  1.00 13.04  A C
ATOM  449  CH2 TRP A  75  -25.893 -13.170  -0.237  1.00 13.87  A C
ATOM  450  CZ2 TRP A  75  -25.462 -13.207   1.044  1.00 13.00  A C
ATOM  451  C   TRP A  75  -20.310 -16.147   1.071  1.00 14.17  A C
ATOM  452  O   TRP A  75  -21.141 -17.038   1.211  1.00 13.15  A O
ATOM  453  N   THR A  76  -19.320 -15.941   1.939  1.00 13.58  A N
ATOM  454  CA  THR A  76  -19.153 -16.640   3.194  1.00 13.35  A C
ATOM  455  CB  THR A  76  -17.822 -17.502   3.176  1.00 13.60  A C
ATOM  456  OG1 THR A  76  -17.818 -18.322   2.037  1.00 14.67  A O
ATOM  457  CG2 THR A  76  -17.651 -18.293   4.382  1.00 13.14  A C
ATOM  458  C   THR A  76  -19.061 -15.691   4.332  1.00 13.74  A C
ATOM  459  O   THR A  76  -18.381 -14.644   4.258  1.00 13.39  A O
ATOM  460  N   VAL A  77  -19.554 -16.146   5.452  1.00 14.79  A N
ATOM  461  CA  VAL A  77  -19.354 -15.556   6.762  1.00 16.07  A C
ATOM  462  CB  VAL A  77  -20.627 -14.915   7.318  1.00 15.64  A C
ATOM  463  CG1 VAL A  77  -20.469 -14.678   8.863  1.00 15.86  A C
ATOM  464  CG2 VAL A  77  -20.953 -13.599   6.619  1.00 17.81  A C
ATOM  465  C   VAL A  77  -18.914 -16.661   7.698  1.00 16.25  A C
ATOM  466  O   VAL A  77  -19.582 -17.691   7.840  1.00 14.79  A O
ATOM  467  N   ALA A  78  -17.760 -16.493   8.354  1.00 17.31  A N
ATOM  468  CA  ALA A  78  -17.360 -17.328   9.505  1.00 16.85  A C
ATOM  469  CB  ALA A  78  -15.847 -17.445   9.605  1.00 16.28  A C
ATOM  470  C   ALA A  78  -17.848 -16.590  10.737  1.00 15.93  A C
ATOM  471  O   ALA A  78  -17.496 -15.428  10.925  1.00 15.72  A O
ATOM  472  N   TRP A  79  -18.532 -17.278  11.613  1.00 15.43  A N
ATOM  473  CA  TRP A  79  -19.276 -16.691  12.733  1.00 15.50  A C
ATOM  474  CB  TRP A  79  -20.562 -17.493  13.012  1.00 14.81  A C
ATOM  475  CG  TRP A  79  -21.497 -17.495  11.858  1.00 16.50  A C
ATOM  476  CD1 TRP A  79  -21.711 -18.501  11.002  1.00 17.06  A C
ATOM  477  NE1 TRP A  79  -22.608 -18.129  10.052  1.00 17.03  A N
ATOM  478  CE2 TRP A  79  -23.001 -16.834  10.275  1.00 16.87  A C
ATOM  479  CD2 TRP A  79  -22.345 -16.421  11.472  1.00 15.24  A C
ATOM  480  CE3 TRP A  79  -22.515 -15.107  11.908  1.00 15.07  A C
ATOM  481  CZ3 TRP A  79  -23.480 -14.307  11.261  1.00 17.46  A C
ATOM  482  CH2 TRP A  79  -24.144 -14.775  10.100  1.00 17.01  A C
ATOM  483  CZ2 TRP A  79  -23.960 -16.046   9.632  1.00 15.22  A C
ATOM  484  C   TRP A  79  -18.419 -16.493  13.974  1.00 16.09  A C
ATOM  485  O   TRP A  79  -18.774 -16.885  15.101  1.00 15.87  A O
ATOM  486  N   LYS A  80  -17.332 -15.747  13.731  1.00 16.59  A N
ATOM  487  CA  LYS A  80  -16.359 -15.317  14.729  1.00 17.83  A C
ATOM  488  CB  LYS A  80  -14.980 -16.044  14.616  1.00 18.82  A C
ATOM  489  CG  LYS A  80  -13.922 -15.486  15.531  1.00 21.76  A C
ATOM  490  CD  LYS A  80  -12.625 -16.237  15.397  1.00 21.35  A C
ATOM  491  CE  LYS A  80  -11.570 -15.750  16.376  1.00 27.27  A C
ATOM  492  NZ  LYS A  80  -11.240 -14.331  16.151  1.00 28.66  A N
ATOM  493  C   LYS A  80  -16.223 -13.813  14.524  1.00 16.06  A C
ATOM  494  O   LYS A  80  -15.965 -13.357  13.402  1.00 17.08  A O
ATOM  495  N   ASN A  81  -16.368 -13.082  15.611  1.00 14.95  A N
ATOM  496  CA  ASN A  81  -16.057 -11.634  15.583  1.00 16.12  A C
ATOM  497  CB  ASN A  81  -17.286 -10.777  15.127  1.00 17.96  A C
ATOM  498  CG  ASN A  81  -18.388 -10.753  16.104  1.00 18.61  A C
ATOM  499  OD1 ASN A  81  -18.223 -11.244  17.223  1.00 19.62  A O
ATOM  500  ND2 ASN A  81  -19.544 -10.151  15.703  1.00 17.57  A N
ATOM  501  C   ASN A  81  -15.515 -11.315  16.969  1.00 17.19  A C
ATOM  502  O   ASN A  81  -15.120 -12.214  17.680  1.00 20.06  A O
ATOM  503  N   ASN A  82  -15.439 -10.051  17.330  1.00 17.87  A N
ATOM  504  CA  ASN A  82  -14.879  -9.763  18.683  1.00 22.34  A C
ATOM  505  CB  ASN A  82  -14.355  -8.318  18.741  1.00 24.12  A C
ATOM  506  CG  ASN A  82  -13.101  -8.138  17.892  1.00 28.20  A C
ATOM  507  OD1 ASN A  82  -12.962  -7.133  17.246  1.00 38.07  A O
ATOM  508  ND2 ASN A  82  -12.189  -9.122  17.894  1.00 31.84  A N
ATOM  509  C   ASN A  82  -15.727 -10.125  19.856  1.00 21.87  A C
ATOM  510  O   ASN A  82  -15.200 -10.118  21.004  1.00 24.02  A O
ATOM  511  N   TYR A  83  -17.002 -10.487  19.632  1.00 21.94  A N
ATOM  512  CA  TYR A  83  -17.992 -10.735  20.673  1.00 22.27  A C
ATOM  513  CB  TYR A  83  -19.325 -10.081  20.280  1.00 25.09  A C
ATOM  514  CG  TYR A  83  -19.220  -8.594  20.114  1.00 26.11  A C
ATOM  515  CD1 TYR A  83  -19.179  -7.766  21.219  1.00 33.29  A C
ATOM  516  CE1 TYR A  83  -19.059  -6.381  21.089  1.00 35.35  A C
ATOM  517  CZ  TYR A  83  -18.941  -5.833  19.835  1.00 37.95  A C
ATOM  518  OH  TYR A  83  -18.801  -4.470  19.710  1.00 33.88  A O
ATOM  519  CE2 TYR A  83  -18.970  -6.646  18.701  1.00 33.39  A C
ATOM  520  CD2 TYR A  83  -19.101  -8.026  18.852  1.00 30.39  A C
ATOM  521  C   TYR A  83  -18.267 -12.203  20.883  1.00 21.14  A C
ATOM  522  O   TYR A  83  -18.446 -12.661  22.014  1.00 19.32  A O
ATOM  523  N   ARG A  84  -18.304 -12.942  19.803  1.00 18.05  A N
ATOM  524  CA  ARG A  84  -18.693 -14.340  19.841  1.00 21.22  A C
ATOM  525  CB  ARG A  84  -20.139 -14.450  19.468  1.00 25.01  A C
ATOM  526  CG  ARG A  84  -21.096 -13.638  20.291  1.00 29.95  A C
ATOM  527  CD  ARG A  84  -22.364 -14.447  20.386  1.00 34.03  A C
ATOM  528  NE  ARG A  84  -23.415 -13.701  21.042  1.00 34.10  A N
ATOM  529  CZ  ARG A  84  -24.663 -14.090  21.117  1.00 31.11  A C
ATOM  530  NH1 ARG A  84  -25.531 -13.331  21.751  1.00 39.24  A N
ATOM  531  NH2 ARG A  84  -25.056 -15.221  20.582  1.00 33.47  A N
ATOM  532  C   ARG A  84  -17.928 -15.204  18.857  1.00 20.17  A C
ATOM  533  O   ARG A  84  -17.398 -14.725  17.852  1.00 20.60  A O
ATOM  534  N   ASN A  85  -17.984 -16.486  19.088  1.00 19.41  A N
ATOM  535  CA  ASN A  85  -17.507 -17.460  18.123  1.00 18.43  A C
ATOM  536  CB  ASN A  85  -16.015 -17.812  18.344  1.00 18.24  A C
ATOM  537  CG  ASN A  85  -15.423 -18.651  17.242  1.00 20.74  A C
ATOM  538  OD1 ASN A  85  -16.094 -19.114  16.349  1.00 18.84  A O
ATOM  539  ND2 ASN A  85  -14.093 -18.767  17.262  1.00 18.92  A N
ATOM  540  C   ASN A  85  -18.356 -18.704  18.173  1.00 18.92  A C
ATOM  541  O   ASN A  85  -18.242 -19.467  19.113  1.00 19.47  A O
ATOM  542  N   ALA A  86  -19.239 -18.884  17.175  1.00 17.92  A N
ATOM  543  CA  ALA A  86  -20.095 -20.020  17.081  1.00 17.69  A C
ATOM  544  CB  ALA A  86  -21.390 -19.654  16.331  1.00 17.69  A C
ATOM  545  C   ALA A  86  -19.450 -21.253  16.488  1.00 17.54  A C
ATOM  546  O   ALA A  86  -20.107 -22.248  16.418  1.00 17.38  A O
ATOM  547  N   HIS A  87  -18.184 -21.154  16.046  1.00 16.01  A N
ATOM  548  CA  HIS A  87  -17.432 -22.252  15.479  1.00 19.04  A C
ATOM  549  CB  HIS A  87  -17.100 -23.300  16.498  1.00 20.58  A C
ATOM  550  CG  HIS A  87  -16.312 -22.775  17.657  1.00 19.99  A C
ATOM  551  ND1 HIS A  87  -15.116 -22.096  17.528  1.00 21.42  A N
ATOM  552  CE1 HIS A  87  -14.644 -21.807  18.733  1.00 23.43  A C
ATOM  553  NE2 HIS A  87  -15.516 -22.240  19.630  1.00 21.31  A N
ATOM  554  CD2 HIS A  87  -16.552 -22.869  18.986  1.00 21.83  A C
ATOM  555  C   HIS A  87  -18.216 -22.804  14.322  1.00 17.42  A C
ATOM  556  O   HIS A  87  -18.611 -24.025  14.257  1.00 17.49  A O
ATOM  557  N   SER A  88  -18.495 -21.884  13.406  1.00 17.30  A N
ATOM  558  CA  SER A  88  -19.449 -22.198  12.309  1.00 17.06  A C
ATOM  559  CB  SER A  88  -20.933 -22.153  12.740  1.00 18.01  A C
ATOM  560  OG  SER A  88  -21.349 -20.813  13.082  1.00 17.58  A O
ATOM  561  C   SER A  88  -19.214 -21.209  11.198  1.00 15.34  A C
ATOM  562  O   SER A  88  -18.656 -20.132  11.410  1.00 16.11  A O
ATOM  563  N   ALA A  89  -19.639 -21.599  10.017  1.00 15.46  A N
ATOM  564  CA  ALA A  89  -19.554 -20.778   8.842  1.00 15.99  A C
ATOM  565  CB  ALA A  89  -18.241 -21.029   8.075  1.00 16.91  A C
ATOM  566  C   ALA A  89  -20.783 -21.036   7.924  1.00 14.84  A C
ATOM  567  O   ALA A  89  -21.207 -22.161   7.761  1.00 15.00  A O
ATOM  568  N   THR A  90  -21.324 -19.977   7.365  1.00 13.80  A N
ATOM  569  CA  THR A  90  -22.291 -20.101   6.317  1.00 13.02  A C
ATOM  570  CB  THR A  90  -23.537 -19.252   6.701  1.00 14.30  A C
ATOM  571  OG1 THR A  90  -24.025 -19.635   7.979  1.00 14.70  A O
ATOM  572  CG2 THR A  90  -24.629 -19.357   5.694  1.00 14.26  A C
ATOM  573  C   THR A  90  -21.820 -19.633   4.984  1.00 13.14  A C
ATOM  574  O   THR A  90  -21.181 -18.553   4.866  1.00 12.97  A O
ATOM  575  N   THR A  91  -22.204 -20.310   3.954  1.00 12.67  A N
ATOM  576  CA  THR A  91  -22.071 -19.858   2.612  1.00 12.42  A C
ATOM  577  CB  THR A  91  -21.202 -20.742   1.745  1.00 15.77  A C
ATOM  578  OG1 THR A  91  -21.809 -22.026   1.542  1.00 16.02  A O
ATOM  579  CG2 THR A  91  -19.780 -20.911   2.340  1.00 15.45  A C
ATOM  580  C   THR A  91  -23.439 -19.667   1.973  1.00 14.07  A C
ATOM  581  O   THR A  91  -24.299 -20.504   2.114  1.00 12.71  A O
ATOM  582  N   TRP A  92  -23.602 -18.551   1.251  1.00 13.47  A N
ATOM  583  CA  TRP A  92  -24.826 -18.367   0.473  1.00 12.27  A C
ATOM  584  CB  TRP A  92  -25.378 -16.896   0.702  1.00 11.42  A C
ATOM  585  CG  TRP A  92  -25.935 -16.642   2.095  1.00 10.76  A C
ATOM  586  CD1 TRP A  92  -27.297 -16.521   2.390  1.00 10.99  A C
ATOM  587  NE1 TRP A  92  -27.448 -16.294   3.722  1.00 12.14  A N
ATOM  588  CE2 TRP A  92  -26.199 -16.150   4.272  1.00 11.60  A C
ATOM  589  CD2 TRP A  92  -25.245 -16.346   3.298  1.00 13.63  A C
ATOM  590  CE3 TRP A  92  -23.874 -16.243   3.642  1.00 13.21  A C
ATOM  591  CZ3 TRP A  92  -23.541 -15.954   4.979  1.00 13.11  A C
ATOM  592  CH2 TRP A  92  -24.515 -15.689   5.900  1.00 13.75  A C
ATOM  593  CZ2 TRP A  92  -25.862 -15.841   5.616  1.00 11.60  A C
ATOM  594  C   TRP A  92  -24.390 -18.440  -1.001  1.00 12.69  A C
ATOM  595  O   TRP A  92  -23.439 -17.765  -1.428  1.00 14.32  A O
ATOM  596  N   SER A  93  -25.189 -19.085  -1.785  1.00 11.07  A N
ATOM  597  CA  SER A  93  -25.019 -19.227  -3.260  1.00 11.20  A C
ATOM  598  CB  SER A  93  -24.634 -20.716  -3.527  1.00  9.73  A C
ATOM  599  OG  SER A  93  -24.489 -20.870  -4.986  1.00 12.21  A O
ATOM  600  C   SER A  93  -26.361 -18.793  -3.889  1.00 12.66  A C
ATOM  601  O   SER A  93  -27.443 -19.192  -3.527  1.00 14.66  A O
ATOM  602  N   GLY A  94  -26.265 -17.930  -4.889  1.00 16.74  A N
ATOM  603  CA  GLY A  94  -27.508 -17.364  -5.420  1.00 15.90  A C
ATOM  604  C   GLY A  94  -27.321 -16.543  -6.651  1.00 15.93  A C
ATOM  605  O   GLY A  94  -26.289 -16.593  -7.275  1.00 17.33  A O
ATOM  606  N   GLN A  95  -28.279 -15.657  -6.877  1.00 15.61  A N
ATOM  607  CA  GLN A  95  -28.136 -14.766  -8.014  1.00 14.49  A C
ATOM  608  CB  GLN A  95  -28.625 -15.351  -9.303  1.00 16.88  A C
ATOM  609  CG  GLN A  95  -30.096 -15.793  -9.363  1.00 14.86  A C
ATOM  610  CD  GLN A  95  -30.462 -16.468 -10.663  1.00 17.65  A C
ATOM  611  OE1 GLN A  95  -30.160 -15.981 -11.729  1.00 16.49  A O
ATOM  612  NE2 GLN A  95  -31.183 -17.605 -10.586  1.00 21.66  A N
ATOM  613  C   GLN A  95  -28.801 -13.445  -7.692  1.00 16.08  A C
ATOM  614  O   GLN A  95  -29.848 -13.420  -6.988  1.00 14.65  A O
ATOM  615  N   TYR A  96  -28.194 -12.420  -8.254  1.00 15.51  A N
ATOM  616  CA  TYR A  96  -28.782 -11.055  -8.177  1.00 15.30  A C
ATOM  617  CB  TYR A  96  -27.604 -10.051  -8.157  1.00 16.94  A C
ATOM  618  CG  TYR A  96  -27.985  -8.670  -8.535  1.00 18.16  A C
ATOM  619  CD1 TYR A  96  -28.543  -7.802  -7.615  1.00 19.11  A C
ATOM  620  CE1 TYR A  96  -28.936  -6.501  -7.953  1.00 18.74  A C
ATOM  621  CZ  TYR A  96  -28.794  -6.092  -9.242  1.00 20.04  A C
ATOM  622  OH  TYR A  96  -29.173  -4.798  -9.613  1.00 23.69  A O
ATOM  623  CE2 TYR A  96  -28.253  -6.917 -10.167  1.00 23.25  A C
ATOM  624  CD2 TYR A  96  -27.849  -8.229  -9.824  1.00 20.21  A C
ATOM  625  C   TYR A  96  -29.679 -10.862  -9.347  1.00 16.62  A C
ATOM  626  O   TYR A  96  -29.252 -11.103 -10.482  1.00 17.40  A O
ATOM  627  N   VAL A  97  -30.900 -10.344  -9.110  1.00 18.07  A N
ATOM  628  CA  VAL A  97  -31.849  -9.998 -10.156  1.00 20.76  A C
ATOM  629  CB  VAL A  97  -33.137 -10.764  -9.910  1.00 23.01  A C
ATOM  630  CG1 VAL A  97  -34.251 -10.387 -10.888  1.00 25.43  A C
ATOM  631  CG2 VAL A  97  -32.855 -12.287  -9.920  1.00 23.41  A C
ATOM  632  C   VAL A  97  -32.140  -8.494 -10.034  1.00 20.45  A C
ATOM  633  O   VAL A  97  -32.552  -8.055  -8.954  1.00 22.10  A O
ATOM  634  N   GLY A  98  -31.901  -7.732 -11.087  1.00 23.07  A N
ATOM  635  CA  GLY A  98  -31.956  -6.238 -10.974  1.00 24.31  A C
ATOM  636  C   GLY A  98  -33.345  -5.673 -11.231  1.00 25.89  A C
ATOM  637  O   GLY A  98  -34.301  -6.416 -11.318  1.00 27.64  A O
ATOM  638  N   GLY A  99  -33.468  -4.345 -11.294  1.00 28.00  A N
ATOM  639  CA  GLY A  99  -34.746  -3.689 -11.603  1.00 27.00  A C
ATOM  640  C   GLY A  99  -35.406  -3.099 -10.371  1.00 26.18  A C
ATOM  641  O   GLY A  99  -34.851  -3.116  -9.264  1.00 26.21  A O
ATOM  642  N   ALA A 100  -36.634  -2.585 -10.543  1.00 28.67  A N
ATOM  643  CA  ALA A 100  -37.236  -1.743  -9.528  1.00 27.31  A C
ATOM  644  CB  ALA A 100  -38.537  -1.148 -10.051  1.00 29.27  A C
ATOM  645  C   ALA A 100  -37.446  -2.466  -8.222  1.00 30.01  A C
ATOM  646  O   ALA A 100  -37.389  -1.840  -7.145  1.00 29.14  A O
ATOM  647  N   GLU A 101  -37.641  -3.794  -8.305  1.00 30.89  A N
ATOM  648  CA  GLU A 101  -37.816  -4.670  -7.151  1.00 34.24  A C
ATOM  649  CB  GLU A 101  -39.238  -5.263  -7.176  1.00 38.59  A C
ATOM  650  CG  GLU A 101  -40.279  -4.110  -7.185  1.00 46.83  A C
ATOM  651  CD  GLU A 101  -41.762  -4.510  -7.320  1.00 50.44  A C
ATOM  652  OE1 GLU A 101  -42.423  -4.769  -6.284  1.00 52.52  A O
ATOM  653  OE2 GLU A 101  -42.293  -4.488  -8.459  1.00 56.15  A O
ATOM  654  C   GLU A 101  -36.652  -5.711  -7.132  1.00 28.59  A C
ATOM  655  O   GLU A 101  -36.822  -6.936  -7.207  1.00 28.05  A O
ATOM  656  N   ALA A 102  -35.445  -5.173  -7.000  1.00 24.10  A N
ATOM  657  CA  ALA A 102  -34.257  -5.972  -7.121  1.00 22.09  A C
ATOM  658  CB  ALA A 102  -32.979  -5.095  -7.198  1.00 22.18  A C
ATOM  659  C   ALA A 102  -34.178  -6.956  -5.936  1.00 21.29  A C
ATOM  660  O   ALA A 102  -34.649  -6.670  -4.827  1.00 20.75  A O
ATOM  661  N   ARG A 103  -33.494  -8.078  -6.169  1.00 20.06  A N
ATOM  662  CA  ARG A 103  -33.503  -9.243  -5.277  1.00 21.78  A C
ATOM  663  CB  ARG A 103  -34.497 -10.227  -5.836  1.00 29.62  A C
ATOM  664  CG  ARG A 103  -35.316 -10.993  -4.849  1.00 41.78  A C
ATOM  665  CD  ARG A 103  -36.730 -11.119  -5.390  1.00 47.80  A C
ATOM  666  NE  ARG A 103  -37.381  -9.807  -5.264  1.00 53.91  A N
ATOM  667  CZ  ARG A 103  -38.175  -9.395  -4.262  1.00 47.22  A C
ATOM  668  NH1 ARG A 103  -38.500 -10.192  -3.249  1.00 43.98  A N
ATOM  669  NH2 ARG A 103  -38.659  -8.145  -4.296  1.00 44.61  A N
ATOM  670  C   ARG A 103  -32.140  -9.889  -5.340  1.00 19.29  A C
ATOM  671  O   ARG A 103  -31.542  -9.974  -6.419  1.00 18.81  A O
ATOM  672  N   ILE A 104  -31.656 -10.375  -4.217  1.00 17.81  A N
ATOM  673  CA  ILE A 104  -30.676 -11.489  -4.237  1.00 18.58  A C
ATOM  674  CB  ILE A 104  -29.422 -11.139  -3.444  1.00 20.17  A C
ATOM  675  CG1 ILE A 104  -28.714  -9.929  -4.036  1.00 19.35  A C
ATOM  676  CD1 ILE A 104  -27.588  -9.417  -3.164  1.00 22.31  A C
ATOM  677  CG2 ILE A 104  -28.432 -12.304  -3.431  1.00 21.36  A C
ATOM  678  C   ILE A 104  -31.391 -12.718  -3.679  1.00 15.96  A C
ATOM  679  O   ILE A 104  -31.748 -12.782  -2.494  1.00 15.71  A O
ATOM  680  N   ASN A 105  -31.581 -13.714  -4.518  1.00 16.03  A N
ATOM  681  CA  ASN A 105  -32.177 -15.004  -4.136  1.00 15.47  A C
ATOM  682  CB  ASN A 105  -33.018 -15.486  -5.273  1.00 18.76  A C
ATOM  683  CG  ASN A 105  -34.249 -14.630  -5.481  1.00 19.99  A C
ATOM  684  OD1 ASN A 105  -34.895 -14.242  -4.514  1.00 24.04  A O
ATOM  685  ND2 ASN A 105  -34.533 -14.319  -6.742  1.00 19.00  A N
ATOM  686  C   ASN A 105  -31.055 -16.047  -3.885  1.00 16.56  A C
ATOM  687  O   ASN A 105  -30.288 -16.308  -4.767  1.00 16.66  A O
ATOM  688  N   THR A 106  -31.009 -16.568  -2.677  1.00 13.86  A N
ATOM  689  CA  THR A 106  -29.981 -17.494  -2.206  1.00 14.08  A C
ATOM  690  CB  THR A 106  -29.104 -16.888  -1.141  1.00 15.41  A C
ATOM  691  OG1 THR A 106  -29.739 -16.895   0.146  1.00 16.37  A O
ATOM  692  CG2 THR A 106  -28.592 -15.491  -1.592  1.00 15.99  A C
ATOM  693  C   THR A 106  -30.512 -18.791  -1.590  1.00 13.69  A C
ATOM  694  O   THR A 106  -31.666 -18.894  -1.116  1.00 12.85  A O
ATOM  695  N   GLN A 107  -29.609 -19.762  -1.632  1.00 14.47  A N
ATOM  696  CA  GLN A 107  -29.631 -20.948  -0.783  1.00 15.52  A C
ATOM  697  CB  GLN A 107  -29.852 -22.224  -1.591  1.00 16.42  A C
ATOM  698  CG  GLN A 107  -31.333 -22.243  -2.032  1.00 19.73  A C
ATOM  699  CD  GLN A 107  -31.740 -23.384  -2.868  1.00 21.18  A C
ATOM  700  OE1 GLN A 107  -31.560 -23.368  -4.126  1.00 25.61  A O
ATOM  701  NE2 GLN A 107  -32.319 -24.378  -2.237  1.00 24.54  A N
ATOM  702  C   GLN A 107  -28.359 -20.974  -0.005  1.00 14.36  A C
ATOM  703  O   GLN A 107  -27.365 -20.464  -0.422  1.00 15.33  A O
ATOM  704  N   TRP A 108  -28.449 -21.425   1.246  1.00 14.84  A N
ATOM  705  CA  TRP A 108  -27.307 -21.358   2.119  1.00 14.28  A C
ATOM  706  CB  TRP A 108  -27.352 -20.258   3.171  1.00 13.46  A C
ATOM  707  CG  TRP A 108  -28.624 -20.187   3.968  1.00 14.36  A C
ATOM  708  CD1 TRP A 108  -29.636 -19.304   3.815  1.00 16.85  A C
ATOM  709  NE1 TRP A 108  -30.589 -19.513   4.771  1.00 15.52  A N
ATOM  710  CE2 TRP A 108  -30.189 -20.536   5.583  1.00 17.21  A C
ATOM  711  CD2 TRP A 108  -28.891 -20.905   5.156  1.00 15.08  A C
ATOM  712  CE3 TRP A 108  -28.254 -21.970   5.786  1.00 14.60  A C
ATOM  713  CZ3 TRP A 108  -28.805 -22.492   6.933  1.00 14.45  A C
ATOM  714  CH2 TRP A 108  -30.119 -22.103   7.355  1.00 15.96  A C
ATOM  715  CZ2 TRP A 108  -30.744 -21.027   6.772  1.00 14.96  A C
ATOM  716  C   TRP A 108  -27.009 -22.706   2.767  1.00 13.11  A C
ATOM  717  O   TRP A 108  -27.874 -23.561   2.887  1.00 13.13  A O
ATOM  718  N   LEU A 109  -25.726 -22.872   3.131  1.00 13.09  A N
ATOM  719  CA  LEU A 109  -25.259 -24.004   3.924  1.00 14.34  A C
ATOM  720  CB  LEU A 109  -24.288 -24.944   3.181  1.00 17.02  A C
ATOM  721  CG  LEU A 109  -24.738 -25.544   1.878  1.00 16.95  A C
ATOM  722  CD1 LEU A 109  -23.621 -26.114   1.087  1.00 18.74  A C
ATOM  723  CD2 LEU A 109  -25.835 -26.513   2.191  1.00 17.06  A C
ATOM  724  C   LEU A 109  -24.532 -23.427   5.144  1.00 14.59  A C
ATOM  725  O   LEU A 109  -23.503 -22.744   4.993  1.00 15.41  A O
ATOM  726  N   LEU A 110  -24.949 -23.834   6.335  1.00 15.54  A N
ATOM  727  CA  LEU A 110  -24.330 -23.479   7.600  1.00 16.92  A C
ATOM  728  CB  LEU A 110  -25.356 -22.940   8.515  1.00 17.99  A C
ATOM  729  CG  LEU A 110  -25.057 -22.779  10.005  1.00 19.52  A C
ATOM  730  CD1 LEU A 110  -23.722 -22.122  10.280  1.00 20.33  A C
ATOM  731  CD2 LEU A 110  -26.217 -22.002  10.597  1.00 21.65  A C
ATOM  732  C   LEU A 110  -23.658 -24.748   8.233  1.00 14.53  A C
ATOM  733  O   LEU A 110  -24.331 -25.622   8.686  1.00 17.43  A O
ATOM  734  N   THR A 111  -22.339 -24.812   8.187  1.00 15.77  A N
ATOM  735  CA  THR A 111  -21.565 -25.995   8.731  1.00 15.93  A C
ATOM  736  CB  THR A 111  -20.422 -26.415   7.842  1.00 16.12  A C
ATOM  737  OG1 THR A 111  -20.911 -26.710   6.526  1.00 15.27  A O
ATOM  738  CG2 THR A 111  -19.619 -27.656   8.376  1.00 15.86  A C
ATOM  739  C   THR A 111  -20.959 -25.592  10.070  1.00 16.43  A C
ATOM  740  O   THR A 111  -20.358 -24.494  10.182  1.00 14.55  A O
ATOM  741  N   SER A 112  -21.153 -26.443  11.056  1.00 14.09  A N
ATOM  742  CA  SER A 112  -20.563 -26.210  12.366  1.00 15.81  A C
ATOM  743  CB  SER A 112  -21.510 -26.517  13.445  1.00 17.22  A C
ATOM  744  OG  SER A 112  -22.603 -25.605  13.420  1.00 18.98  A O
ATOM  745  C   SER A 112  -19.353 -27.086  12.493  1.00 18.10  A C
ATOM  746  O   SER A 112  -19.366 -28.228  12.031  1.00 17.67  A O
ATOM  747  N   GLY A 113  -18.315 -26.589  13.169  1.00 17.50  A N
ATOM  748  CA  GLY A 113  -17.254 -27.539  13.602  1.00 19.63  A C
ATOM  749  C   GLY A 113  -17.820 -28.640  14.535  1.00 20.31  A C
ATOM  750  O   GLY A 113  -18.546 -28.324  15.510  1.00 21.97  A O
ATOM  751  N   THR A 114  -17.533 -29.901  14.218  1.00 20.34  A N
ATOM  752  CA  THR A 114  -17.992 -31.027  14.999  1.00 20.32  A C
ATOM  753  CB  THR A 114  -19.175 -31.785  14.362  1.00 20.70  A C
ATOM  754  OG1 THR A 114  -18.814 -32.402  13.117  1.00 20.53  A O
ATOM  755  CG2 THR A 114  -20.395 -30.849  14.106  1.00 23.49  A C
ATOM  756  C   THR A 114  -16.886 -32.010  15.178  1.00 21.36  A C
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ATOM  758  N   THR A 115  -17.080 -32.917  16.107  1.00 20.65  A N
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ATOM  762  CG2 THR A 115  -16.143 -34.091  18.559  1.00 24.62  A C
ATOM  763  C   THR A 115  -16.598 -35.024  14.870  1.00 25.14  A C
ATOM  764  O   THR A 115  -17.652 -34.876  14.242  1.00 22.79  A O
ATOM  765  N   GLU A 116  -15.742 -35.966  14.520  1.00 27.47  A N
ATOM  766  CA  GLU A 116  -16.034 -36.879  13.380  1.00 32.64  A C
ATOM  767  CB  GLU A 116  -14.839 -37.801  13.061  1.00 38.08  A C
ATOM  768  CG  GLU A 116  -13.627 -37.022  12.537  1.00 44.94  A C
ATOM  769  CD  GLU A 116  -12.452 -37.905  12.110  1.00 54.90  A C
ATOM  770  OE1 GLU A 116  -12.669 -39.069  11.680  1.00 58.99  A O
ATOM  771  OE2 GLU A 116  -11.297 -37.417  12.187  1.00 54.36  A O
ATOM  772  C   GLU A 116  -17.324 -37.687  13.619  1.00 28.77  A C
ATOM  773  O   GLU A 116  -18.077 -37.894  12.725  1.00 27.68  A O
ATOM  774  N   ALA A 117  -17.531 -38.112  14.860  1.00 27.12  A N
ATOM  775  CA  ALA A 117  -18.723 -38.795  15.302  1.00 26.78  A C
ATOM  776  CB  ALA A 117  -18.684 -38.939  16.826  1.00 28.01  A C
ATOM  777  C   ALA A 117  -19.980 -38.040  14.908  1.00 28.23  A C
ATOM  778  O   ALA A 117  -20.933 -38.664  14.443  1.00 27.53  A O
ATOM  779  N   ASN A 118  -19.932 -36.705  15.051  1.00 22.78  A N
ATOM  780  CA  ASN A 118  -21.099 -35.776  14.837  1.00 23.58  A C
ATOM  781  CB  ASN A 118  -21.103 -34.743  15.948  1.00 22.16  A C
ATOM  782  CG  ASN A 118  -21.402 -35.362  17.291  1.00 25.14  A C
ATOM  783  OD1 ASN A 118  -22.066 -36.418  17.360  1.00 24.57  A O
ATOM  784  ND2 ASN A 118  -20.897 -34.752  18.354  1.00 26.59  A N
ATOM  785  C   ASN A 118  -21.118 -35.054  13.479  1.00 20.46  A C
ATOM  786  O   ASN A 118  -21.957 -34.156  13.261  1.00 19.35  A O
ATOM  787  N   ALA A 119  -20.212 -35.432  12.585  1.00 21.42  A N
ATOM  788  CA  ALA A 119  -20.081 -34.770  11.307  1.00 22.38  A C
ATOM  789  CB  ALA A 119  -18.781 -35.204  10.576  1.00 24.20  A C
ATOM  790  C   ALA A 119  -21.351 -34.920  10.437  1.00 20.78  A C
ATOM  791  O   ALA A 119  -21.721 -33.992   9.705  1.00 17.06  A O
ATOM  792  N   TRP A 120  -22.027 -36.068  10.543  1.00 18.34  A N
ATOM  793  CA  TRP A 120  -23.251 -36.327   9.745  1.00 18.13  A C
ATOM  794  CB  TRP A 120  -23.881 -37.742   9.994  1.00 17.84  A C
ATOM  795  CG  TRP A 120  -24.425 -37.834  11.374  1.00 16.96  A C
ATOM  796  CD1 TRP A 120  -23.730 -38.106  12.477  1.00 18.89  A C
ATOM  797  NE1 TRP A 120  -24.487 -38.029  13.578  1.00 19.07  A N
ATOM  798  CE2 TRP A 120  -25.761 -37.694  13.223  1.00 18.30  A C
ATOM  799  CD2 TRP A 120  -25.763 -37.559  11.808  1.00 18.25  A C
ATOM  800  CE3 TRP A 120  -26.962 -37.233  11.157  1.00 20.65  A C
ATOM  801  CZ3 TRP A 120  -28.061 -37.046  11.911  1.00 20.59  A C
ATOM  802  CH2 TRP A 120  -28.035 -37.215  13.309  1.00 19.14  A C
ATOM  803  CZ2 TRP A 120  -26.886 -37.555  13.973  1.00 19.60  A C
ATOM  804  C   TRP A 120  -24.289 -35.230   9.992  1.00 19.12  A C
ATOM  805  O   TRP A 120  -25.021 -34.905   9.059  1.00 21.69  A O
ATOM  806  N   LYS A 121  -24.367 -34.687  11.210  1.00 18.67  A N
ATOM  807  CA  LYS A 121  -25.297 -33.568  11.553  1.00 19.57  A C
ATOM  808  CB  LYS A 121  -26.080 -33.860  12.818  1.00 21.73  A C
ATOM  809  CG  LYS A 121  -25.275 -34.143  14.032  1.00 22.88  A C
ATOM  810  CD  LYS A 121  -26.137 -34.197  15.266  1.00 25.20  A C
ATOM  811  CE  LYS A 121  -25.270 -34.826  16.321  1.00 25.79  A C
ATOM  812  NZ  LYS A 121  -26.063 -35.080  17.507  1.00 28.98  A N
ATOM  813  C   LYS A 121  -24.638 -32.163  11.607  1.00 19.75  A C
ATOM  814  O   LYS A 121  -25.098 -31.318  12.366  1.00 17.68  A O
ATOM  815  N   SER A 122  -23.539 -31.945  10.851  1.00 16.26  A N
ATOM  816  CA  SER A 122  -22.831 -30.678  10.872  1.00 16.42  A C
ATOM  817  CB  SER A 122  -21.349 -30.917  10.441  1.00 16.04  A C
ATOM  818  OG  SER A 122  -21.254 -31.226   9.035  1.00 18.48  A O
ATOM  819  C   SER A 122  -23.433 -29.536  10.069  1.00 15.34  A C
ATOM  820  O   SER A 122  -23.125 -28.367  10.309  1.00 15.66  A O
ATOM  821  N   THR A 123  -24.221 -29.846   9.026  1.00 14.71  A N
ATOM  822  CA  THR A 123  -24.557 -28.839   8.065  1.00 14.13  A C
ATOM  823  CB  THR A 123  -24.003 -29.274   6.711  1.00 14.70  A C
ATOM  824  OG1 THR A 123  -22.557 -29.479   6.880  1.00 16.48  A O
ATOM  825  CG2 THR A 123  -24.219 -28.237   5.667  1.00 14.95  A C
ATOM  826  C   THR A 123  -26.113 -28.680   7.943  1.00 13.40  A C
ATOM  827  O   THR A 123  -26.781 -29.587   7.542  1.00 12.91  A O
ATOM  828  N   LEU A 124  -26.539 -27.471   8.216  1.00 14.07  A N
ATOM  829  CA  LEU A 124  -27.878 -26.960   8.029  1.00 15.15  A C
ATOM  830  CB  LEU A 124  -28.215 -25.898   9.055  1.00 17.87  A C
ATOM  831  CG  LEU A 124  -28.425 -26.359  10.506  1.00 17.97  A C
ATOM  832  CD1 LEU A 124  -28.593 -25.115  11.347  1.00 20.25  A C
ATOM  833  CD2 LEU A 124  -29.689 -27.221  10.628  1.00 17.31  A C
ATOM  834  C   LEU A 124  -28.020 -26.382   6.603  1.00 13.30  A C
ATOM  835  O   LEU A 124  -27.063 -25.781   6.086  1.00 15.49  A O
ATOM  836  N   VAL A 125  -29.258 -26.468   6.040  1.00 13.21  A N
ATOM  837  CA  VAL A 125  -29.479 -25.932   4.687  1.00 13.43  A C
ATOM  838  CB  VAL A 125  -29.634 -26.995   3.647  1.00 12.41  A C
ATOM  839  CG1 VAL A 125  -30.868 -27.900   3.851  1.00 13.73  A C
ATOM  840  CG2 VAL A 125  -29.673 -26.444   2.218  1.00 13.59  A C
ATOM  841  C   VAL A 125  -30.759 -25.057   4.798  1.00 13.06  A C
ATOM  842  O   VAL A 125  -31.659 -25.380   5.543  1.00 14.17  A O
ATOM  843  N   GLY A 126  -30.746 -23.920   4.097  1.00 13.02  A N
ATOM  844  CA  GLY A 126  -31.936 -23.128   3.984  1.00 14.12  A C
ATOM  845  C   GLY A 126  -31.880 -22.193   2.821  1.00 15.80  A C
ATOM  846  O   GLY A 126  -31.083 -22.371   1.900  1.00 15.54  A O
ATOM  847  N   HIS A 127  -32.749 -21.173   2.877  1.00 18.26  A N
ATOM  848  CA  HIS A 127  -32.830 -20.204   1.772  1.00 18.62  A C
ATOM  849  CB  HIS A 127  -33.848 -20.669   0.726  1.00 20.41  A C
ATOM  850  CG  HIS A 127  -35.171 -21.041   1.309  1.00 22.15  A C
ATOM  851  ND1 HIS A 127  -36.208 -20.134   1.414  1.00 25.17  A N
ATOM  852  CE1 HIS A 127  -37.232 -20.739   1.999  1.00 27.19  A C
ATOM  853  NE2 HIS A 127  -36.894 -21.993   2.273  1.00 26.82  A N
ATOM  854  CD2 HIS A 127  -35.603 -22.202   1.863  1.00 27.56  A C
ATOM  855  C   HIS A 127  -33.123 -18.804   2.310  1.00 20.81  A C
ATOM  856  O   HIS A 127  -33.778 -18.690   3.319  1.00 22.23  A O
ATOM  857  N   ASP A 128  -32.605 -17.769   1.678  1.00 22.34  A N
ATOM  858  CA  ASP A 128  -32.721 -16.333   2.136  1.00 21.50  A C
ATOM  859  CB  ASP A 128  -31.458 -15.752   2.815  1.00 25.45  A C
ATOM  860  CG  ASP A 128  -31.237 -16.133   4.372  1.00 29.55  A C
ATOM  861  OD1 ASP A 128  -32.209 -16.549   5.075  1.00 30.31  A O
ATOM  862  OD2 ASP A 128  -30.013 -16.030   4.876  1.00 25.11  A O
ATOM  863  C   ASP A 128  -32.997 -15.560   0.846  1.00 18.17  A C
ATOM  864  O   ASP A 128  -32.337 -15.746  -0.126  1.00 17.75  A O
ATOM  865  N   THR A 129  -34.003 -14.695   0.870  1.00 18.53  A N
ATOM  866  CA  THR A 129  -34.213 -13.671  -0.151  1.00 19.69  A C
ATOM  867  CB  THR A 129  -35.617 -13.728  -0.763  1.00 23.10  A C
ATOM  868  OG1 THR A 129  -35.773 -15.011  -1.338  1.00 29.35  A O
ATOM  869  CG2 THR A 129  -35.739 -12.663  -1.928  1.00 22.92  A C
ATOM  870  C   THR A 129  -33.992 -12.287   0.426  1.00 17.24  A C
ATOM  871  O   THR A 129  -34.547 -11.970   1.472  1.00 17.62  A O
ATOM  872  N   PHE A 130  -33.021 -11.583  -0.175  1.00 16.12  A N
ATOM  873  CA  PHE A 130  -32.684 -10.209   0.157  1.00 16.86  A C
ATOM  874  CB  PHE A 130  -31.161 -10.058   0.174  1.00 17.52  A C
ATOM  875  CG  PHE A 130  -30.461 -10.992   1.108  1.00 18.59  A C
ATOM  876  CD1 PHE A 130  -30.000 -12.249   0.660  1.00 19.91  A C
ATOM  877  CE1 PHE A 130  -29.300 -13.114   1.524  1.00 20.36  A C
ATOM  878  CZ  PHE A 130  -29.083 -12.741   2.845  1.00 19.23  A C
ATOM  879  CE2 PHE A 130  -29.504 -11.489   3.280  1.00 18.63  A C
ATOM  880  CD2 PHE A 130  -30.211 -10.632   2.408  1.00 19.70  A C
ATOM  881  C   PHE A 130  -33.252  -9.197  -0.819  1.00 15.55  A C
ATOM  882  O   PHE A 130  -33.250  -9.406  -2.063  1.00 16.92  A O
ATOM  883  N   THR A 131  -33.716  -8.053  -0.254  1.00 17.19  A N
ATOM  884  CA  THR A 131  -34.213  -6.902  -1.005  1.00 18.16  A C
ATOM  885  CB  THR A 131  -35.736  -6.742  -0.850  1.00 20.34  A C
ATOM  886  OG1 THR A 131  -36.030  -6.515   0.543  1.00 23.94  A O
ATOM  887  CG2 THR A 131  -36.360  -8.065  -1.253  1.00 19.94  A C
ATOM  888  C   THR A 131  -33.507  -5.656  -0.513  1.00 19.30  A C
ATOM  889  O   THR A 131  -32.930  -5.635   0.578  1.00 19.07  A O
ATOM  890  N   LYS A 132  -33.641  -4.603  -1.299  1.00 20.04  A N
ATOM  891  CA  LYS A 132  -33.107  -3.309  -0.974  1.00 20.15  A C
ATOM  892  CB  LYS A 132  -33.052  -2.493  -2.272  1.00 22.47  A C
ATOM  893  CG  LYS A 132  -32.100  -3.060  -3.281  1.00 27.50  A C
ATOM  894  CD  LYS A 132  -30.649  -2.758  -3.000  1.00 30.10  A C
ATOM  895  CE  LYS A 132  -29.899  -2.695  -4.342  1.00 37.90  A C
ATOM  896  NZ  LYS A 132  -28.388  -2.573  -4.217  1.00 41.27  A N
ATOM  897  C   LYS A 132  -33.914  -2.539   0.075  1.00 21.30  A C
ATOM  898  O   LYS A 132  -33.438  -1.582   0.617  1.00 19.98  A O
ATOM  899  N   VAL A 133  -35.181  -2.913   0.305  1.00 24.58  A N
ATOM  900  CA  VAL A 133  -35.979  -2.250   1.308  1.00 28.80  A C
ATOM  901  CB  VAL A 133  -37.363  -1.933   0.732  1.00 30.13  A C
ATOM  902  CG1 VAL A 133  -38.020  -0.880   1.609  1.00 32.94  A C
ATOM  903  CG2 VAL A 133  -37.277  -1.538  -0.754  1.00 30.74  A C
ATOM  904  C   VAL A 133  -36.183  -3.018   2.627  1.00 33.51  A C
ATOM  905  O   VAL A 133  -36.589  -4.169   2.626  1.00 34.41  A  O
ATOM  906  N   LYS A 134  -35.990  -2.315   3.747  1.00 42.93  A N
ATOM  907  CA  LYS A 134  -36.196  -2.854   5.105  1.00 47.50  A C
ATOM  908  CB  LYS A 134  -35.860  -1.760   6.136  1.00 49.06  A C
ATOM  909  CG  LYS A 134  -35.180  -2.244   7.404  1.00 46.76  A C
ATOM  910  CD  LYS A 134  -34.388  -1.118   8.042  1.00 49.49  A C
ATOM  911  CE  LYS A 134  -33.641  -1.577   9.285  1.00 52.80  A C
ATOM  912  NZ  LYS A 134  -34.516  -1.570  10.482  1.00 55.60  A N
ATOM  913  C   LYS A 134  -37.612  -3.397   5.359  1.00 48.89  A C
ATOM  914  O   LYS A 134  -37.814  -4.600   5.440  1.00 51.03  A O
TER   915      LYS A 134
HETATM 956  O3  BTN B   1  -29.368 -14.209   8.519  1.00 22.29   O
HETATM 957  C3  BTN B   1  -29.310 -15.495   8.628  1.00 21.59   C
HETATM 958  N1  BTN B   1  -29.346 -16.433   7.643  1.00 18.94   N
HETATM 959  N2  BTN B   1  -29.217 -16.144   9.783  1.00 19.86   N
HETATM 960  C4  BTN B   1  -29.185 -17.573   9.670  1.00 19.14   C
HETATM 961  C5  BTN B   1  -29.340 -17.756   8.148  1.00 19.62   C
HETATM 962  C6  BTN B   1  -28.175 -18.542   7.651  1.00 19.93   C
HETATM 963  S1  BTN B   1  -26.812 -18.019   8.637  1.00 21.47   S
HETATM 964  C2  BTN B   1  -27.875 -18.232  10.050  1.00 20.92   C
HETATM 965  C7  BTN B   1  -27.277 -17.647  11.305  1.00 22.18   C
HETATM 966  C8  BTN B   1  -25.917 -18.135  11.659  1.00 25.46   C
HETATM 967  C9  BTN B   1  -25.722 -18.054  13.163  1.00 29.25   C
HETATM 968  C10 BTN B   1  -24.338 -18.579  13.619  1.00 25.31   C
HETATM 969  C11 BTN B   1  -24.662 -19.889  14.260  1.00 24.71   C
HETATM 970  O11 BTN B   1  -25.732 -19.984  14.911  1.00 26.64   O
HETATM 971  O12 BTN B   1  -23.906 -20.875  14.130  1.00 22.85   O
END【０２３８】
上記のＸ線結晶構造解析データから、目的とする変異体が得られたことを確認した。また、得られた変異体が、配列番号２の天然型アミノ酸配列からなる野生型ストレプトアビジンよりもビオチンに対する親和性が弱められていることを、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 79:4, 640-642 (2015）に記載の方法により確認した。【０２３９】
また、Ｎ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ変異体への更なる変異導入に用いたオリゴDNAはQuikChange Site-Directed Mutagenesis kit（アジレントテクノロジーズ）の説明書に従い設計した。ポリメラーゼ連鎖反応にはKOD plus neo（東洋紡）を用いた。下記のプライマーから目的とする変異を導入するためのプライマーを選択して使用し、上述のＮ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ａ変異体をコードするＤＮＡが挿入されたベクターを鋳型とし、Site-Directed Mutagenesis法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。その後、制限酵素DpnIにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。このようにして、変異がＮ１１Ｄ／Ｓ１５Ａ／Ｓ３３Ｎからなる変異体を含む種々の変異体を作製した。目的とする変異体が生産されたことを上記と同様にしてＸ線結晶構造解析で確認した。更に、配列番号２の天然型アミノ酸配列からなる野生型ストレプトアビジンよりもビオチンに対する親和性が弱められていることを、上記と同様にして確認した。
・Ｓ３３Ｎ変異導入用プライマーセット：
FW: TGACCGGCACCTATGAAAACGCCGTGGGTAATGCGGAAAGCCG（配列番号：９）
RV: TCCGCATTACCCACGGCGTTTTCATAGGTGCCGGTCAGCGCACC（配列番号：１０）
・Ｎ３７Ｇ変異導入用プライマーセット：
FW: ATGAAGCGGCCGTGGGTGGCGCGGAAAGCCGTTATGTTCTGACCG（配列番号：１１）
RV: ACATAACGGCTTTCCGCGCCACCCACGGCCGCTTCATAGGTGCCG（配列番号：１２）
・Ｓ７６Ｇ変異導入用プライマーセット：
FW: CAATTATCGTAACGCCCATGGCGCGACCACCTGGAGCGGCCAG（配列番号：１３）
RV: GCTCCAGGTGGTCGCGCCATGGGCGTTACGATAATTGTTTTTC（配列番号：１４）
・Ｓ７６Ｒ変異導入用プライマーセット：
FW: CAATTATCGTAACGCCCATCGTGCGACCACCTGGAGCGGCCAG（配列番号：１５）
RV: GCTCCAGGTGGTCGCACGATGGGCGTTACGATAATTGTTTTTC（配列番号：１６）
・Ｓ１００Ｌ変異導入用プライマーセット：
FW: CCCAGTGGCTGCTGACCCTGGGCACCACCGAAGCCAATGCGTG（配列番号：１７）
RV: GGCTTCGGTGGTGCCCAGGGTCAGCAGCCACTGGGTGTTAATG（配列番号：１８）
・Ｓ１００Ｉ変異導入用プライマーセット：
FW: CCCAGTGGCTGCTGACCATTGGCACCACCAATGCCAATGCGTG（配列番号：１９）
RV: GGCATTGGTGGTGCCAATGGTCAGCAGCCACTGGGTGTTAATG（配列番号：２０）
・Ｓ１００Ｖ変異導入用プライマーセット：
FW: CCCAGTGGCTGCTGACCGTGGGCACCACCAATGCCAATGCGTG（配列番号：２１）
RV: GGCATTGGTGGTGCCCACGGTCAGCAGCCACTGGGTGTTAATG（配列番号：２２）
・Ｓ１００Ｍ変異導入用プライマーセット：
FW: CCCAGTGGCTGCTGACCATGGGCACCACCAATGCCAATGCGTG（配列番号：２３）
RV: GGCATTCGGTGGTGCCCATGGTCAGCAGCCACTGGGTGTTAATG（配列番号：２４）
・Ｓ１００Ｒ変異導入用プライマーセット：
FW: CCCAGTGGCTGCTGACCCGTGGCACCACCGAAGCCAATGCGTG（配列番号：２５）
RV: GGCTTCGGTGGTGCCACGGGTCAGCAGCCACTGGGTGTTAATG（配列番号：２６）
・Ｋ１０９Ｍ変異導入用プライマーセット：
FW: CCGAAGCCAATGCGTGGATGAGCACCCTGGTGGGTCATGATAC（配列番号：２７）
RV: TGACCCACCAGGGTGCTCATCCACGCATTGGCTTCGGTGGTGC（配列番号：２８）
・Ｋ１０９Ｒ変異導入用プライマーセット：
FW: CCGAAGCCAATGCGTGGCGTAGCACCCTGGTGGGTCATGATAC（配列番号：２９）
RV: TGACCCACCAGGGTGCTACGCCACGCATTGGCTTCGGTGGTGC（配列番号：３０）
・Ｋ１０９Ｅ変異導入用プライマーセット：
FW: CCGAAGCCAATGCGTGGGAAAGCACCCTGGTGGGTCATGATAC（配列番号：３１）
RV: TGACCCACCAGGGTGCTTTCCCACGCATTGGCTTCGGTGGTGC（配列番号：３２）
・Ｌ１１２Ｎ変異導入用プライマーセット：
FW: CAATGCGTGGAAAAGCACCAACGTGGGTCATGATACCTTTACC（配列番号：３３）
RV: AGGTATCATGACCCACGTTGGTGCTTTTCCACGCATTGGCTTC（配列番号：３４）
・Ｌ１１２Ｑ変異導入用プライマーセット：
FW: CAATGCGTGGAAAAGCACCCAGGTGGGTCATGATACCTTTACC（配列番号：３５）
RV: AGGTATCATGACCCACCTGGGTGCTTTTCCACGCATTGGCTTC（配列番号：３６）
【配列表】
2018151301000001.app
【国際調査報告】
2018151301.tif 000141
2018151301.tif 000142
2018151301.tif 000143
2018151301.tif 000144
2018151301.tif 000145
2018151301.tif 000146
2018151301.tif 000147
2018151301.tif 000148
2018151301.tif 000149
2018151301.tif 000150