(57)【要約】本発明は、癌細胞を含む生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養して癌幹細胞を含有する生体細胞集団を得ることを含み、ゲル状物質は、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、癌幹細胞の製造方法に関する。さらに、本発明は、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導剤に関する。ここで、ゲル状物質は、例えば、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである。高価な機器を必要とせず、培養コストは比較的安く、比較的短時間に癌幹細胞を調製できる手段及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌幹細胞の製造方法であって、癌細胞を含む生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養して癌幹細胞を含有する生体細胞集団を得ることを含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、前記方法。
【請求項２】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記癌幹細胞を含有する生体細胞集団は、球状を呈する細胞を含有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記癌幹細胞を含有する生体細胞集団中の細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及び／又はＮａｎｏｇの発現量が、ゲル状物質共存下での培養前に比べて高い、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
癌細胞の癌幹細胞への転換傾向強度を試験する方法であって、癌細胞を含有する生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養すること、及び得られた培養液中の癌幹細胞の質及び／又は量を測定すること、を含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、前記方法。
【請求項６】
前記癌細胞を含有する生体細胞集団が、採取した癌を含む組織の少なくとも一部である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
被試験物質の癌幹細胞に対する影響の試験方法であって、癌細胞及び／又は癌幹細胞を含有する生体細胞集団を被試験物質及びゲル状物質の共存下で培養することを含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、前記方法。
【請求項９】
前記培養が、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
癌幹細胞を含有する生体細胞集団は、癌細胞を含む生体細胞集団を、前記ゲル状物質の共存下で培養して得られた生体細胞集団である、請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項８〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導剤。
【請求項１３】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項１２に記載の誘導剤。
【請求項１４】
前記ゲル状物質は、シート状又は粒状である請求項１２又は１３に記載の誘導剤。
【請求項１５】
下記（１）及び（２）を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導用キットであって、
（１）生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質、及び
（２）癌細胞培養用培養液。
【請求項１６】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ゲル状物質は、シート状又は粒状である請求項１５又は１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞の製造方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月２０日出願の日本特願２０１７‐２８８３３号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【背景技術】
【０００２】
癌幹細胞は自己複製能及び多分化能を併せ持つ細胞と定義されるが、近年、癌幹細胞が放射線療法や化学療法、分子標的治療に対して治療抵抗性を示し、癌の再発・転移の原因となっていることが明らかとなっている。この癌幹細胞は通常腫瘍中にごく少数しか存在しないため、その重要性にも関わらず、癌幹細胞の特性の把握や研究は困難な状況にあった。従って、癌の再発・転移、治療抵抗性のメカニズムを解明し、癌幹細胞を標的とした根治的治療法を開発するためには、癌細胞中に存在する癌幹細胞の比率を高め、分離・濃縮する方法を確立することが極めて重要である。【０００３】
近年、癌幹細胞を分離・濃縮する方法が開発されている。
（１）Spheroid 形成による分離：細胞を無血清、浮遊培養することにより球形の細胞塊（spheroid）を形成させ、癌幹細胞を濃縮する方法（非特許文献１）。
（２）Side population分画による分離：癌幹細胞は抗がん剤抵抗性であるとのデータから、DNA結合試薬を細胞内に取込ませ、その排出能力の高い細胞集団をFACSで分離・取得する方法（非特許文献２）。
（３）癌幹細胞表面マーカーによる分離：癌幹細胞膜表面に特異的に発現している分子に対する抗体を用いて、この分子の発現細胞を分離・取得する方法（非特許文献３）。例）大腸癌幹細胞の表面マーカー：LGR5、CD133、CD44、EpCAM、CD166、ALDH、CD24、CD26、CD29。
（４）低酸素下・無グルコース培地による分離：癌幹細胞を含有する癌細胞集団を、低酸素下、グルコースを実質的に含有しない培地中で培養する方法（非特許文献４）。
（５）脳腫瘍における癌幹細胞濃縮従前技術：Neurosphere assayという手法が用いられている。この手法には、各種細胞増殖因子やサイトカインのような分子に加え、通常のsphere formation assayでは除くウシ胎児血清を含む非常に高価な培養液を用いる（非特許文献５）。また、正常神経幹細胞の分離には、lamininを用いた手法が用いられている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特許文献１：日本特開２０１０‐１７４０６３号公報
特許文献２：日本特開２０１０‐１５８１８０号公報
特許文献３：日本特開２０１６‐８３２７６号公報【０００５】
非特許文献１：Ｓｃｉｅｎｃｅ, １９９２, ２５５, １７０７-１７１０
非特許文献２：Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ, １９９６, １８３, １７９７-１８０６
非特許文献３：Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ, ２０１０, １, ３８７-３９５
非特許文献４：Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ, ２０１１, １８, ８２９-８４０
非特許文献５：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ, ２０００, ９７, １５７２０-１５７２５
非特許文献６：ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ, ２００８, ９, ７１
非特許文献７：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ, ２０１５，３３，１７０５−１７１８
非特許文献８：Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ, ２０１１，２５，２５９４−２６０９
非特許文献９：Ｎａｔｕｒｅ, ２０１１，４７４，１７９−１８３
非特許文献１０：Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０１２，  １３，５９１−６００
非特許文献１１：Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４４，１６１−１６２，２０１４
非特許文献１２：Acta Biomaterialia 6 (2010) 494-501、
非特許文献１３：Biomaterials 26 (2005) 4588-4596、
非特許文献１４：Biomaterials 28 (2007) 1752-1760、
非特許文献１５： J Tissue Eng Regen Med 2015; 9: 375-388
非特許文献１６： Nature Materials, 12(10), 932-937 2013.
非特許文献１７： Journal of Materials Chemistry B, 1(36), 4555-4562 2013
特許文献１〜３及び非特許文献１〜１７の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記いずれの方法も、高価な機器が必要である、培養コストが高い、一週間以上時間がかかる、などという問題点があった。【０００７】
そこで本発明は、高価な機器を必要とせず、培養コストは比較的安く、比較的短時間に癌幹細胞を調製できる手段及び方法を提供することを解決すべき課題とし、そのような癌幹細胞調製手段及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、癌幹細胞調製手段及び方法を提供するための、従来とは全く異なるアプローチを試みた。即ち、本発明者らは、本発明者の一人であるグンらが開発・作製した合成高分子ゲル（特許文献１）を用いたヒト癌幹細胞を含む癌細胞の培養について検討した。その結果、一部の合成高分子ゲルを用いることで、癌細胞に含まれる癌幹細胞がその他の癌細胞に比べて優先的に培養され、癌幹細胞濃度が高まった癌細胞を得ることができることを見出して本発明を完成させた。【０００９】
本発明は以下の通りである。
［１］
癌幹細胞の製造方法であって、癌細胞を含む生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養して癌幹細胞を含有する生体細胞集団を得ることを含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、前記方法。
［２］
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、［１］に記載の製造方法。
［３］
前記癌幹細胞を含有する生体細胞集団は、球状を呈する細胞を含有する、［１］に記載の製造方法。
［４］
前記癌幹細胞を含有する生体細胞集団中の細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及び／又はＮａｎｏｇの発現量が、ゲル状物質共存下での培養前に比べて高い、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］
癌細胞の癌幹細胞への転換傾向強度を試験する方法であって、癌細胞を含有する生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養すること、及び得られた培養液中の癌幹細胞の質及び／又は量を測定すること、を含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、前記方法。
［６］
前記癌細胞を含有する生体細胞集団が、採取した癌を含む組織の少なくとも一部である、［５］に記載の製造方法。
［７］
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、［５］又は［６］に記載の製造方法。
［８］
被試験物質の癌幹細胞に対する影響の試験方法であって、癌細胞及び／又は癌幹細胞を含有する生体細胞集団を被試験物質及びゲル状物質の共存下で培養することを含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、前記方法。
［９］
前記培養が、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる［８］に記載の製造方法。
［１０］
癌幹細胞を含有する生体細胞集団は、癌細胞を含む生体細胞集団を、前記ゲル状物質の共存下で培養して得られた生体細胞集団である、［８］又は［９］に記載の製造方法。
［１１］
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、［８］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導剤。
［１３］
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、［１２］に記載の誘導剤。
［１４］
前記ゲル状物質は、シート状又は粒状である［１２］又は［１３］に記載の誘導剤。
［１５］
下記（１）及び（２）を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導用キットであって、
（１）生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質、及び
（２）癌細胞培養用培養液。
［１６］
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルである、［１５］に記載のキット。
［１７］
前記ゲル状物質は、シート状又は粒状である［１５］又は［１６］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、特定の合成高分子ゲルを足場として癌細胞を培養することで、癌幹細胞濃度が高まった癌細胞を得ることができる。発明においては、合成高分子ゲル以外に必要な試薬は通常培養液（例えば、10％ウシ胎児血清含有DMEM等）のみであり、特別なデバイスも不要である。しかも、例えば、1日ほどの短時間で幹細胞マーカー分子の発現を誘導できる。【００１１】
そのため、本発明を利用することにより、癌患者から採取した癌細胞から癌幹細胞濃度が高まった癌細胞を調製し、この癌幹細胞濃度が高まった癌細胞を用いることで、例えば、癌の初診時において、再発時の幹細胞の性質を予測することができる。さらに、これにより再発を予防するための治療薬の投与のための診断が可能となる。加えて、癌患者が分子標的治療を受ける前に再発した場合の癌幹細胞の特徴および対処可能な治療薬を推測することができる。本発明は、癌治療薬選択のための新しい検査法の開発基盤となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１（１）における膠芽腫細胞株（U138）のＤＮゲル上での１６時間後、３日後及び６日後の細胞の写真を示す。
【図２】実施例１（１）における膠芽腫細胞株（KMG4）、及びオリゴデンドロサイトの８日培養後の細胞の写真、並びに膠芽腫細胞株（U138、U343）の２１日培養後の細胞（sphereの形成）の写真を示す（ＰＳ：ポリスチレン培養皿、ＤＮ：ＤＮゲル）。
【図３】実施例１（１）における初代培養膠芽腫細胞（G137、G140、G144、G150）のＤＮゲル上での24時間培養後の細胞（sphereの形成）の写真を示す。
【図４】実施例１（１）における２４時間及び４８時間後の脳腫瘍KMG4、G137、G140、G144、G150の細胞の写真を示す。
【図５】実施例１（１）におけるKMG4、U138、U343の3日間培養後、Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAsの発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。
【図６】実施例１（１）におけるKMG4について、DNゲル上で形成されたsphereにおいて、Sox2蛋白質の発現誘導を確認した結果を示す。
【図７】実施例１（１）における脳腫瘍G137、G140、G144、G150、G145についてSox2、Nanog、Oct3/4 mRNAsの発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。
【図８Ａ】実施例１（１）における、肺癌細胞株（H209）培養後の細胞の写真及び幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。
【図８Ｂ】実施例１（１）における、肺癌細胞株（SBC3）培養後の細胞の写真及び幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。
【図９Ａ】実施例１（１）における、卵巣癌細胞株（KF28）培養後の細胞の写真及び幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果（左からPS3〜PS7、NC3〜NC7、DN3〜DN7）を示す。
【図９Ｂ】実施例１（１）における、卵巣癌細胞株（Tu-OM-1）培養後の細胞の写真及び幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果（左からPS3〜PS7、NC3〜NC7、DN3〜DN7）を示す。
【図１０】実施例１（２）におけるマイクロアレイ解析(6、24、48時間培養したKMG4細胞からtotal RNAを抽出、cDNAに変換後)結果を示す。
【図１１】実施例１（２）におけるマイクロアレイ解析(6、24、48時間培養したKMG4細胞からtotal RNAを抽出、cDNAに変換後)結果を示す。
【図１２】癌細胞からの癌幹細胞性の誘発のメカニズムの説明図。
【図１３】実施例１（３）におけるマウスin vivoでの腫瘍形成能力の解析結果を示す。
【図１４】実施例１（３）におけるマウスin vivoでの腫瘍形成能力の解析結果を示す。
【図１５】実施例２（１）におけるDNゲル、PCDME、PNaSS上での脳腫瘍KMG4細胞の写真を示す。
【図１６】実施例２（１）における幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。
【図１７】実施例２（２）における合成高分子ゲル誘導脳腫瘍幹細胞によるマウスin vivoでの腫瘍形成能力の解析結果を示す。
【図１８】実施例３における、高分子ゲルによる癌患者由来初代培養細胞の幹細胞化の試験結果を示す。PS dishおよびDNゲル上で培養したG144細胞におけるEGFRとPDGFRの発現量を示す。
【図１９】実施例２（１）におけるオステオポンチン（OPN） mRNAの発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。
【図２０】実施例４における、４種類の高分子ゲル（PA、PAMPS、PDMA、及びPAAcゲル）上で培養したKMG4細胞でのオステオポンチン（OPN） mRNAの発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を、DN、PCDME、PNaSSゲル上で培養した細胞での結果と併せて示す。
【図２１】実施例４における、４種類の高分子ゲル（PA、PAMPS、PDMA、及びPAAcゲル）上で培養したKMG4細胞での幹細胞マーカー分子（Oct3/4、Nanog mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を、DN、PCDME、PNaSSゲル状で培養した細胞での結果と併せて示す。
【図２２】実施例４における、４種類の高分子ゲル（PA、PAMPS、PDMA、及びPAAcゲル）上での脳腫瘍KMG4細胞の写真を、DN、PCDME、PNaSSゲル上で培養した細胞の写真と併せて示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜癌幹細胞の製造方法＞
本発明の第１の態様は、癌幹細胞の製造方法に関する。
この製造方法は、癌細胞を含む生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養して癌幹細胞を含有する生体細胞集団を得ることを含む。さらに、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である。
【００１４】
本発明の癌幹細胞の製造方法においては、出発原料として癌細胞を含む生体細胞集団を用い、この細胞集団をゲル状物質の共存下で培養し、得られる培養物として癌幹細胞を含有する生体細胞集団を得る。
【００１５】
出発原料として用いられる癌細胞を含む生体細胞集団は、例えば、癌患者から採取した癌細胞を含む生体からの検体（組織切片）及び初代培養癌細胞であることができる。
【００１６】
培養液及び培養条件は、ゲル状物質の共存下で行うことを除き、従来使用されている癌細胞の培養と同様であることができる。例えば、培養液としては、通常培養液（10%ウシ胎児血清含有DMEM等）を用いることができ、例えば、1 x 105/mlの細胞密度で細胞を播種し、24時間、37℃、5%CO2環境下で培養することで実施できる。培養は、例えば、細胞がゲル状物質の表面と接触し得る状態で行うことができ、具体的には、シート状のゲル状物質の上で実施できる。但し、シート状のゲル状物質の上での培養に限られず、細胞がゲル状物質の表面と接触し得る状態で行うことができる方法であればよい。例えば、粒子状のゲル状物質を用い、粒子状のゲル状物質を分散した培養液を静置または攪拌しつつおこなうこともできる。
【００１７】
本発明においては、前記ゲル状物質は、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料から選ばれる。そのようなゲル状物質は、例えば、ダブルネットワークゲル(DNゲル)、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルであることができる。但し、これらに限定される意図ではなく、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料であればよい。
【００１８】
実施例１（２）に詳述するように、本発明において合成高分子ゲル上において培養した癌細胞を含有する生体細胞集団を培養して得られた細胞における、脳腫瘍幹細胞マーカー発現誘導は、合成高分子ゲル上で培養された細胞中でオステオポンチンの発現が誘導されることに基因することが解明された。癌細胞は、表面にCD44やインテグリン（ITG）などのオステオポンチンのレセプターを有し、Osteopontin/CD44シグナル経路からはHippo pathwayが、Osteopontin/ITGからはFAKを含む細胞接着分子やSrc、Akt、ERK、p38MAPKを含む各種キナーゼ群が活性化されることが明らかにされている（非特許文献７）。図１２に示すように、発現誘導されたオステオポンチン（第一ステップ）は、癌細胞表面のオステオポンチンのレセプターを介して、Hippo pathwayや各種キナーゼ群を活性化し、Oct3/4、Sox2、Nanogの発現が亢進することが示され、脳腫瘍細胞においてHippo pathwayの下流で幹細胞マーカー分子の発現が制御されていることが明らかとなった。
【００１９】
尚、Glioblastoma（膠芽腫）においては、Hippo pathwayのtransducerであるTAZ(転写活性化補助因子)が癌幹細胞性の獲得に重要であることが知られ(非特許文献8)、YAP/TAZは機械的刺激(mechanotransduction)のセンサーとして重要であることの報告もある(非特許文献9及び10)。これらのことから、特定の合成高分子ゲルと接触可能な状態で癌細胞を含有する生体細胞集団を培養することで、癌細胞が合成高分子ゲルから刺激を受けて、癌幹細胞性を獲得し、生体細胞集団中の癌幹細胞の濃度が高まるものと推察される。
【００２０】
本発明では、前記ゲル状物質は、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料から選ばれる。このような性質を示すゲル状物質としては、例えば、ダブルネットワークゲル(DNゲル)、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、及びPAAcゲルからなる合成高分子ゲルを挙げることができる。これらの合成ゲルは、実施例２（１）及び実施例４に結果を示すように、これらの合成ゲル上で培養したKMG4細胞でのオステオポンチン（OPN） mRNAの発現誘導をqRT-PCRで確認できた。本発明において、ゲル状物質が、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料であるか否かは、前記生体細胞集団に含まれる任意の１種の細胞でのオステオポンチン（OPN） mRNAの発現誘導をqRT-PCRで確認することで行うことができる。
【００２１】
ダブルネットワークゲル（DNゲル）は、例えば、２種類のゲルが挙げられる。
（ｉ）第一の網目構造（Ａ）と、該第一の網目構造（Ａ）中に形成された第二の網目構造（Ｂ）とからなる相互侵入網目構造を有するゲル。
（ｉｉ）第一の網目構造（Ａ）と、該第一の網目構造（Ａ）中に形成されたポリマー（Ｂ’）とからなるセミ相互侵入網目構造を有するゲル。
ダブルネットワークゲルは、例えば、特許文献１に記載のゲルを例示することができ、具体例としては、第一の網目構造（Ａ）としてＰＡＭＰＳ（ｐｏlｙ（ＡＭＰＳ））、該第一の網目構造（Ａ）中に形成された第二の網目構造（Ｂ）として、ＰＤＭＡからなる相互侵入網目構造を有するゲルを挙げることができる。ｐｏlｙ（ＡＭＰＳ）及びＰＡＭＰＳは、poly(2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid)の略称であり、ＰＤＭＡは、poly N,N-dimethyl acrylamideの略称である。ダブルネットワークゲルについては非特許文献11を参照することもできる。
【００２２】
PNaSSゲルは、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＮａＳＳ）からなるゲルであり、例えば、特許文献２、非特許文献１３、１４に記載されている。具体的には、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウムを架橋剤とともに重合することで調製できる。架橋剤としては、メチレンビスアクリルアミドなど、後述のPCDMEゲルで使用できる架橋剤と同様の化合物を挙げることができる。
【００２３】
PCDMEゲルは、ポリ−Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（メタクリロイロキシ）エタンアミニウム（ＰＣＤＭＥ）を含むゲルであり、例えば、特許文献３に記載されている。具体的には、ＰＣＤＭＥを主鎖として含み、さらにこの主鎖を架橋剤で架橋した構造を有するゲル組成物である。ＰＣＤＭＥのモノマー成分であるカルボキシメチルベタインモノマーと架橋剤とを重合することで調製できる。架橋剤は、例えば、メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミド、ブタンジオールジアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、アリル（メタ）アクリレート、トリアリルシアヌレート、ジアリルマレアート、ポリアリルエステル、テトラアリルオキシエタン、トリアリルアミン、テトラアリルエチレンジアミン、ペンタエリスリトールトリアリルエステル及びエチレンビスアクリルアミドからなる群より少なくとも１つ選択される。
【００２４】
PAゲルは、Poly Ampholyte（ポリ両性電解質）ゲルの略称であり、酸性基及び塩基性基の両方の官能基を有するポリマーである。酸性基としてはスルホン酸を挙げることができ、塩基性基としてアンモニウム基（アミニウム基）を挙げることができる。このポリマーは、スルホン酸又はその塩を有するモノマー（例えば、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、2-アクリルアミド-2-メチル-プロパンスルホン酸、エチレンスルホン酸、2-メタクリルオキシエタン-1-スルホン酸、3-メタクリルオキシエタン-1-スルホン酸、3-(ビニルオキシ)プロパン-1-スルホン酸及びこれらの誘導体など）とアンモニウム基（アミニウム基）を有するモノマー（例えば、ジアリルジメチルアンモニウム、2-ブチル-メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、4-ビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ブチルアクリレートメタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム及びこれらの誘導体など）を用い、これらを共重合することにより合成することができる。例えば、非特許文献１６および１７に記載されている。
【００２５】
実施例では、p-スチレンスルホン酸ナトリウムと[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアミニウム・クロリドをモノマーとして用い、オキソグルタル酸を重合開始剤として共重合体ゲルを合成した。実施例においては、このゲルをPAゲルと呼ぶ。
【００２６】
PAMPSゲルは、poly（2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid）からなるゲルである。上記ダブルネットワークゲルの構成ポリマーとしても例示されている。アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸ナトリウムとメチレンビスアクリルアミドをモノマーとして、オキソグルタル酸を重合開始剤として用いて合成した共重合体ゲルである。例えば、非特許文献１２〜１５などに記載されている。
【００２７】
PDMAゲルは、poly(N,N’-Dimethylacrylamide) からなるゲルである。実施例においては、ジメチルアクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドをモノマーとして、オキソグルタル酸を重合開始剤として用いて合成した共重合体ゲルである。例えば、非特許文献１５に記載されている。
【００２８】
PAAcゲルは、poly(Acrylic acid) からなるゲルである。実施例においては、モノマーとしてアクリル酸とメチレンビスアクリルアミドをモノマーとして、オキソグルタル酸を重合開始剤として用いて合成した共重合体ゲルである。例えば、非特許文献１２、１３に記載されている。
【００２９】
本発明の方法では、ゲル状物質の共存下で培養すること以外、特別な手段を用いることなく、培養物として癌幹細胞を含有する生体細胞集団を得ることができる。生体細胞集団に含まれる細胞は、例えば、形状やＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及び／又はＮａｎｏｇの発現量により癌幹細胞であるか否かを判定することができる。形状に関しては、例えば、癌幹細胞は、球状を呈する細胞であることができる。但し、球状を呈しない細胞であっても、癌幹細胞である場合もある（実施例２参照）。また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及び／又はＮａｎｏｇのいずれか１つ又は２つ以上の発現量が亢進している細胞を癌幹細胞として選択することもできる。
【００３０】
培養物として癌幹細胞を含有する生体細胞集団には、癌幹細胞に加えて癌細胞も含まれることがある。
【００３１】
＜癌細胞の癌幹細胞への転換傾向強度を試験する方法＞
本発明の第２の態様は、癌細胞の癌幹細胞への転換傾向強度を試験する方法である。この方法は、癌細胞を含有する生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養すること、及び得られた培養液中の癌幹細胞の質及び／又は量を測定すること、を含む。ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料であり、前記第一の態様で説明した材料と同様の材料である。
【００３２】
本発明の第２の態様（方法）においては、癌細胞を含有する生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養する。癌細胞を含有する生体細胞集団は、採取した癌を含む組織の少なくとも一部であることかできる。
【００３３】
ゲル状物質は、第一の態様で説明したように、シート状であっても、粒状であってもよい。ゲル状物質の共存下での培養の方法及び条件も、基本的には、第一の態様での説明と同様である。
【００３４】
得られた培養液中の癌幹細胞の質及び／又は量を測定する。癌幹細胞の質及び／又は量の測定は、例えば、培養液中の癌幹細胞の外観を観察すること（球状細胞の存在や球状細胞の数を計測する）、あるいは、培養液中の癌幹細胞におけるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及び／又はＮａｎｏｇのいずれか１つ又は２つ以上の発現量を計測することで実施することができる。
【００３５】
得られた結果から、癌細胞の癌幹細胞への転換傾向強度が分かる。この結果に基づいて、医療専門家による、採取した癌を含む組織の再発の可能性の診断が可能になる。
【００３６】
＜被試験物質の癌幹細胞に対する影響の試験方法＞
本発明の第三の態様は、被試験物質の癌幹細胞に対する影響の試験方法に関する。この方法は、癌細胞及び／又は癌幹細胞を含有する生体細胞集団を被試験物質及びゲル状物質の共存下で培養することを含む。ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料であり、前記第一の態様で説明した材料と同様の材料である。
【００３７】
本発明の第三の態様（方法）は、例えば、被試験物質による癌幹細胞の増殖の抑制又は増進などの癌幹細胞に対する影響を評価することができ、それにより、癌幹細胞の増殖を抑制することができる薬剤をスクリーニングすることができる。
【００３８】
ゲル状物質は、第一の態様で説明したように、シート状であっても、粒状であってもよい。ゲル状物質の共存下での培養の方法及び条件も、被試験物質の共存の有無以外、基本的には、第一の態様での説明と同様である。また、培養は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことで、癌幹細胞の増殖に影響がある被試験物質を簡易にスクリーニングすることができる。また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験により、生体内での被試験物質の癌幹細胞に対する影響をより直接的に把握することができる。
【００３９】
本発明の第三の態様（方法）に用いる癌幹細胞を含有する生体細胞集団は、癌細胞を含む生体細胞集団を、例えば、第一の態様の方法において、ゲル状物質の共存下で培養して得られた生体細胞集団であることができる。
【００４０】
＜癌細胞の癌幹細胞への転換誘導剤＞
本発明の第四の態様は、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導剤に関する。
【００４１】
前述のように、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質は、結果として、癌細胞の癌幹細胞への転換を誘導し得る。そこで、本発明は、このゲル状物質を含む剤であって、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導に用いることができる剤を提供する。
【００４２】
ゲル状物質は、例えば、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルであることができる。癌細胞の癌幹細胞への転換誘導剤として用いるゲル状物質は、例えば、シート状又は粒状であることができるが、これらに限定される意図ではない。癌細胞の癌幹細胞への転換誘導に適した形状であればどのような形状であってもよい。
【００４３】
＜癌細胞の癌幹細胞への転換誘導用キット＞
本発明の第五の態様は、下記（１）及び（２）を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導用キットに関する。
（１）生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質、及び
（２）癌細胞培養用培養液。
【００４４】
（１）のゲル状物質は、生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料であり、第一及び第四の態様で説明したものと同様である。ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、PNaSSゲル、PCDMEゲル、PAゲル、PAMPSゲル、PDMAゲル、又はPAAcゲルからなる合成高分子ゲルであることができる。
【００４５】
（２）癌細胞培養用培養液は、培養対象である癌細胞を含む生体細胞集団の培養に一般に用いられている培養液、あるいは、癌細胞を含む生体細胞集団の培養に適した培養液であることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
本実施例で用いた合成高分子ダブルネットワーク（DN）ゲル、PCDME、PNaSS、PA、PAMPS、PDMA、及びPAAcの合成方法及び初期弾性率と膨潤度を以下に示す。【００４７】
（１）DNゲル：1stネットワークPAMPS（poly (AMPS)：poly（2-acrylamido-2-methyl-1- propanesulfonic acid））に、2ndネットワーク：PDMA（poly N,N-dimethyl acrylamide）を重合させたゲル。アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸ナトリウム2.1g、メチレンビスアクリルアミド0.062ｇ、オキソグルタル酸  0.015gを純水で溶解し10mLメスフラスコを用いて、10ml水溶液とした。これを8cm X 8cm X 0.5mmのガラス製の型に注入しアルゴン雰囲気下で紫外光を8時間照射し、第一のネットワークを持つゲルを合成した。このゲルを4分割し、N,N’-ジメチルアクリルアミド99g、メチレンビスアクリルアミド0.15g、オキソグルタル酸0.15gを含む500mlの水溶液に投入したところ、本水溶液を吸収し、ゲルは体積10倍程度に膨潤した。この膨潤したゲルをガラス板で挟み、アルゴン雰囲気下で紫外光を8時間照射し、第２のネットワークを合成した。合成した２種類のネットワークを持つゲルを純水に投入、3回純水交換を行って未反応の原料等を取り除き、DNゲルを得た。DNゲルの初期弾性率は0.435MPa、膨潤度は7.3 g/gであった。【００４８】
（２）PCDME：poly N-(carboxymethyl)-N, N-dimethyl-2-(methacryloyloxy) ethanaminium。カルボキシメチルベタインモノマー6.5g、メチレンビスアクリルアミド0.19ｇ、オキソグルタル酸0.0044gを純水で溶解し30mLメスフラスコを用いて、30ml水溶液とした。これを8cm X 8cm X 1mmのガラス製の型に注入しアルゴン雰囲気下で紫外光を8時間照射し、ゲルを合成した。合成したゲルを純水に投入、3回純水交換を行って未反応の原料等を取り除き、PCDMEゲルを得た。PCDMEゲルの初期弾性率は0.0507MPa、膨潤度は8.6 g/gであった。【００４９】
（３）PNaSS：poly(sodium p-styrene sulfonate)。p-スチレンスルホン酸ナトリウム2.1g、メチレンビスアクリルアミド0.062ｇ、オキソグルタル酸0.0015gを純水で溶解し10mLメスフラスコを用いて、10ml水溶液とした。これを8cm X 8cm X 0.5mmのガラス製の型に注入しアルゴン雰囲気下で紫外光を8時間照射し、ゲルを合成した。ゲルを純水に投入、3回純水交換を行って未反応の原料等を取り除き、PNaSSゲルを得た。PNaSSゲルの初期弾性率は0.0026MPa、膨潤度は306.8 g/gであった。【００５０】
（４）PA：Poly Ampholyte(ポリ両性電解質)。p-スチレンスルホン酸ナトリウム6.2g、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアミニウム・クロリド6.0ｇ、オキソグルタル酸0.0083gを純水で溶解し30mLメスフラスコを用いて、10ml水溶液とした。これを8cm X 8cm X 1mmのガラス製の型に注入しアルゴン雰囲気下で紫外光を10時間照射し、ゲルを合成した。ゲルを純水に投入、3回純水交換を行って未反応の原料等を取り除き、PAゲルを得た。【００５１】
（５）PAMPS：poly（2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid）。アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸ナトリウム2.1g、メチレンビスアクリルアミド0.062ｇ、オキソグルタル酸  0.015gを純水で溶解し10mLメスフラスコを用いて、10ml水溶液とした。これを8cm X 8cm X 0.5mmのガラス製の型に注入しアルゴン雰囲気下で紫外光を8時間照射し、ゲルを合成した。合成したゲルを純水に投入、3回純水交換を行って未反応の原料等を取り除き、PAMPSゲルを得た。【００５２】
（６）PDMA：poly(N,N’-Dimethylacrylamide)。ジメチルアクリルアミド3.3g、メチレンビスアクリルアミド0.19ｇ、オキソグルタル酸  0.044gを純水で溶解し30mLメスフラスコを用いて、30ml水溶液とした。これを8cm X 8cm X １mmのガラス製の型に注入しアルゴン雰囲気下で紫外光を8時間照射し、ゲルを合成した。合成したゲルを純水に投入、3回純水交換を行って未反応の原料等を取り除き、PDMAゲルを得た。【００５３】
（７）PAAc：poly(Acrylic acid)。アクリル酸2.2g、メチレンビスアクリルアミド0.19ｇ、オキソグルタル酸  0.044gを純水で溶解し30mLメスフラスコを用いて、30ml水溶液とした。これを8cm X 8cm X １mmのガラス製の型に注入しアルゴン雰囲気下で紫外光を8時間照射し、ゲルを合成した。合成したゲルを純水に投入、3回純水交換を行って未反応の原料等を取り除き、PAAcゲルを得た。【００５４】
実施例１（１）
合成高分子DNゲルによる脳腫瘍幹細胞マーカー分子の発現誘導解析
合成高分子DNゲル上にヒト膠芽腫細胞株（KMG4、U138、U343）、ヒト初代膠芽腫細胞（G137、G140、G144、G150）、肺癌細胞株（H209、SBC3）、卵巣癌細胞株（KF28、Tu-OM-1）を1 x 105/mlで播種し、培養した。【００５５】
U138についての１６時間後、３日後及び６日後の細胞の写真を図１に示す。さらに、KMG4及びオリゴデンドロサイトの８日培養後の細胞の写真、U138、U343の２１日培養後の細胞の写真、並びにG137、G140、G144、G150の２４時間培養後の細胞の写真をそれぞれ図２及び３に示す。さらに、２４時間及び４８時間後のKMG4、G137、G140、G144、G150の細胞の写真を図４に示す。【００５６】
KMG4、U138、U343を3日間培養後、代表的な幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した。陰性コントロールとして、通常のポリスチレン培養皿（PS dish）で培養した細胞を用いた。結果を図５に示す。いずれの細胞もPS dish上の細胞に比較して、DNゲル上では幹細胞マーカー分子の著明な発現誘導が確認された。また、KMG4について、DNゲル上で形成されたsphereにおいて、Sox2蛋白質の発現誘導を確認した（図６）。G137、G140、G144、G150、G145についても代表的な幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を図７に示す。【００５７】
図８Ａ及びＢには、肺癌細胞株（H209、SBC3）培養後の細胞の写真及び幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。図９Ａ及びＢには、卵巣癌細胞株（KF28、Tu-OM-1）培養後の細胞の写真及び幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を示す。【００５８】
実施例１（２）
合成高分子DNゲル上における脳腫瘍幹細胞マーカー発現誘導メカニズムの解明
DNゲル上に播種した膠芽腫細胞株KMG4において、幹細胞マーカーが発現誘導されるメカニズムを解明するために、マイクロアレイ解析を施行した（SurePrint G3 Human GE 8x60K v2, Agilent Technology）。DNゲル上で6、24、48時間培養したKMG4細胞からtotal RNAを抽出、cDNAに変換後マイクロアレイ解析に供与した。陰性コントロールとしてPS dish上で6、24、48時間培養した細胞を使用した。結果を図１０及び１１に示す。【００５９】
陰性コントロールと比較して、DNゲル上で有意に発現が変動したパスウェイの中から、6、24、48時間のいずれかの時点においてPS dish上と較べてDN gel上で発現量が3倍以上に発現亢進した遺伝子11種類を同定した（Osteoprotegerin、IL6、TNF、COL3A1、ITGB8、TNXB、VEGFA、Osteopontin (SPP1)、CDKN1C、TIMP3）。この内、qRT-PCRで発現上昇が再確認された分子は、OsteopontinとCDKN1Cであり、その中で最も発現誘導率が高かった遺伝子はOsteopontin（SPP1）であった。確認実験として、Osteopontin（SPP1）をsiRNAでknock-downした細胞、およびOsteopontinの中和抗体で処理した細胞では、幹細胞マーカー分子の発現が低下した。【００６０】
OsteopontinのレセプターとしてCD44やITGが存在し、Osteopontin/CD44シグナル経路からはHippo pathwayが、Osteopontin/ITGからはFAKを含む細胞接着分子やSrc、Akt、ERK、p38MAPKを含む各種キナーゼ群が活性化されることが明らかとなっている（例えば、非特許文献７）。本実施例の結果においても、DNゲル上にKMG4細胞を播種すると、分子の活性化パターンが3つに大別されることが明らかとなった（図１２参照）。(i) DNゲルへの接着時間と比例して活性化が亢進（pFAK）、(ii) DNゲル上に播種後早期に活性化が入り、そのまま持続（pAKT、p-p38 MAPK）、(iii) DNゲル上に細胞を播種後、6時間と48時間をピークに二峰性に活性化（p-c-Met、pEGFR、pSrc、pERK）。Hippo pathwayの主要因子Yap1をsiRNA手法によりknock-downすると（knock-down効率80%）、Oct3/4、Sox2、Nanogのいずれも発現が亢進することが明らかとなり、脳腫瘍細胞においてHippo pathwayの下流で幹細胞マーカー分子の発現が制御されていることが明らかとなった。【００６１】
実施例１（３）
DNゲル誘導脳腫瘍幹細胞によるマウスin vivoでの腫瘍形成能力の解析
DNゲル上で誘導された癌幹細胞のマウスin vivoでの腫瘍形成能力を解析するために、以下の実験を行った。実験方法は以下の通りである。
1.KMG4細胞にtdTomato-Luc2を安定遺伝子導入
2.tdTomato-Luc2導入KMG4細胞をDNゲル上で3日間培養(下記1)の場合
3.免疫不全マウス (NOD/Shijic-scid Jcl) の脳内に500個移植【００６２】
マウスは下記4群に分けた。1) DN gel上で3日間培養したKMG4細胞を粉砕DNゲル（直径100 μm以下）と混合接種、2) DN gel上で3日間培養後の細胞を接種、3) PS dish上で3日間培養後の細胞を接種、4) 粉砕DNゲルのみを接種。細胞数はいずれも500個を接種した。結果を図１３及び図１４に示す。1) DN gel上で播種した細胞と粉砕DNゲルを混合接種した系で著明な腫瘍形成が認められた。このことは、幹細胞性の誘導にはDNゲルからの持続的な刺激が必要であることを示唆する。【００６３】
実施例２（１）
DNゲル以外の合成高分子ゲル上での脳腫瘍幹細胞マーカー分子の発現誘導解析
3種類の合成高分子ゲル（DN、PCDME、PNaSS）上にヒト脳腫瘍細胞株（KMG4）を1 x 105/mlで播種し、3日間培養後の細胞の写真を図１５に示す。さらに、幹細胞マーカー分子（Sox2、Nanog、Oct3/4 mRNAs）の発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を図１６に示す。加えて、オステオポンチン（OPN） mRNAの発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を図１９に示す。陰性コントロールとして、通常のポリスチレン培養皿（PS dish）で培養した細胞を用いた。PCDMEおよびPNaSSPゲル上で培養したKMG4細胞において、幹細胞マーカー分子（Oct3/4, Sox2, Nanog mRNA）およびオステオポンチン（OPN mRNA）の発現誘導が確認された。図１５に示すようにDNゲル上に播種した細胞はsphereを形成し、PCDMEおよびPNaSSゲルには細胞は接着し、伸展した。【００６４】
実施例２（２）
合成高分子ゲル誘導脳腫瘍幹細胞によるマウスin vivoでの腫瘍形成能力の解析
PCDMEおよびPNaSSゲル上で誘導された癌幹細胞が、マウスin vivoにおいて腫瘍形成能力を有しているかを解析した（図１７）。PCDMEおよびPNaSSゲル上で3日間培養したKMG4-luc細胞をNOD/ShinJic-scidマウスの脳内に500個接種し、腫瘍の形成および増殖をIVIS systemによって経時的に観察した。PNaSSゲル上で培養したKMG4細胞を接種した全てのマウスにおいて接種後3週間で腫瘍形成が認められ、接種後7週間で全てのマウスが癌死した。PCDMEゲル上で培養したKMG4細胞も1週間ほど遅れて著明な腫瘍を形成した。両ゲルによる腫瘍形成能力は、DNゲルによるそれよりも著しく亢進した。これらの結果より、DNゲルによる癌幹細胞の誘導にはDNゲルからの持続的な刺激が必要であったが（上記3）、PNaSSとPCDMEゲルは単独且つ短期間で癌細胞を不可逆的に癌幹細胞に誘導できる可能性が示唆された。【００６５】
実施例３
高分子ゲルによる癌患者由来初代培養細胞の幹細胞化
高分子ゲルが実際の患者由来細胞の幹細胞化を誘導し治療標的を示唆するか否かを検討した。悪性脳腫瘍患者由来細胞G144細胞は通常培養条件ではEGF受容体は発現しているが、PDGF受容体は数個の細胞にのみ発現が見られる程度であった。高分子ゲルによってsphere形成が誘導されたG144細胞ではPDGF受容体の発現誘導が認められた（図１８)。治療実験では高分子ゲル誘導幹細胞は抗PDGFR抗体によって増殖が抑制された。以上の結果は、高分子ゲルは、癌患者の治療前サンプルに対して、再発後の幹細胞プロファイルを診断する可能性を有することが示された。【００６６】
実施例４
４種類の合成高分子ゲルPA、PAMPS、PDMA、及びPAAc上での培養
さらに４種類の合成高分子ゲル（PA、PAMPS、PDMA、PAAc）を使用して解析した。合成高分子ゲルPA、PAMPS、PDMA、及びPAAcゲル上にヒト脳腫瘍細胞株（KMG4）を1 x 105細胞/mlで播種し、3日間培養し、オステオポンチン（OPN） mRNAの発現誘導をqRT-PCRで確認した結果を図２０に、幹細胞マーカー分子（Oct3/4, Nanog mRNA）をqRT-PCRで確認した結果を図２１に示す。陰性コントロールとして、通常のポリスチレン培養皿（PS dish）で培養した細胞を用いた。比較のため、図２０及び２１は、それぞれDN、PCDME、PNaSSゲルの発現解析結果と合わせて示す。DN、PCDME、PNaSSゲルのほかに、PA、PAMPS、PDMA、及びPAAcゲル上で培養したKMG4細胞において、幹細胞マーカー分子（Oct3/4, Nanog mRNA）およびオステオポンチン（OPN） mRNAの発現誘導が確認された。図２２に示すようにPA,PAMPS,PDMAゲル上に播種し、3日間培養したKMG4細胞はsphereを形成した。PAAcゲルで同様に播種・培養したKMG4細胞はゲルにゆるく接着しているが、伸展はしていないことが観察された（接着非伸展）。図２２は、比較のため、DN、PCDMEおよびPNaSSゲル上に播種し、3日間培養したKMG4細胞（DN: sphere形成、PCDMEおよびPNaSS：接着伸展）の写真も併せて示す。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、幹細胞が関与する腫瘍関連分野に有用である。
【図１】
2018151309.tif 000002
【図２】
2018151309.tif 000003
【図３】
2018151309.tif 000004
【図４】
2018151309.tif 000005
【図５】
2018151309.tif 000006
【図６】
2018151309.tif 000007
【図７】
2018151309.tif 000008
【図８Ａ】
2018151309.tif 000009
【図８Ｂ】
2018151309.tif 000010
【図９Ａ】
2018151309.tif 000011
【図９Ｂ】
2018151309.tif 000012
【図１０】
2018151309.tif 000013
【図１１】
2018151309.tif 000014
【図１２】
2018151309.tif 000015
【図１３】
2018151309.tif 000016
【図１４】
2018151309.tif 000017
【図１５】
2018151309.tif 000018
【図１６】
2018151309.tif 000019
【図１７】
2018151309.tif 000020
【図１８】
2018151309.tif 000021
【図１９】
2018151309.tif 000022
【図２０】
2018151309.tif 000023
【図２１】
2018151309.tif 000024
【図２２】
2018151309.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月20日(2018.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌幹細胞の製造方法であって、癌細胞を含む生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養して癌幹細胞を含有する生体細胞集団を得ることを含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料であり、前記ゲル状物質の共存下での培養により、癌細胞を含む生体細胞集団中の少なくとも一部の癌細胞が、癌幹細胞に転換される、前記方法。
【請求項２】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、ＰＮａＳＳゲル、ＰＣＤＭＥゲル、ＰＡゲル、ＰＡＭＰＳゲル、ＰＤＭＡゲル、又はＰＡＡｃゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記癌幹細胞を含有する生体細胞集団は、球状を呈する細胞を含有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記癌幹細胞を含有する生体細胞集団中の細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及び／又はＮａｎｏｇの発現量が、ゲル状物質共存下での培養前に比べて高い、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
癌細胞の癌幹細胞への転換傾向強度を試験する方法であって、癌細胞を含有する生体細胞集団をゲル状物質の共存下で培養すること、及び得られた培養液中の癌幹細胞の質及び／又は量を測定すること、を含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料である、前記方法。
【請求項６】
前記癌細胞を含有する生体細胞集団が、採取した癌を含む組織の少なくとも一部である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、ＰＮａＳＳゲル、ＰＣＤＭＥゲル、ＰＡゲル、ＰＡＭＰＳゲル、ＰＤＭＡゲル、又はＰＡＡｃゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
被試験物質の癌幹細胞に対する影響の試験方法であって、癌細胞及び／又は癌幹細胞を含有する生体細胞集団を被試験物質及びゲル状物質の共存下で培養することを含み、前記ゲル状物質は、前記生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起する材料であり、前記ゲル状物質の共存下での培養により、癌細胞を含む生体細胞集団中の少なくとも一部の癌細胞が、癌幹細胞に転換される、前記方法。
【請求項９】
前記培養が、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
癌幹細胞を含有する生体細胞集団は、癌細胞を含む生体細胞集団を、前記ゲル状物質の共存下で培養して得られた生体細胞集団である、請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、ＰＮａＳＳゲル、ＰＣＤＭＥゲル、ＰＡゲル、ＰＡＭＰＳゲル、ＰＤＭＡゲル、又はＰＡＡｃゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項８〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導剤。
【請求項１３】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、ＰＮａＳＳゲル、ＰＣＤＭＥゲル、ＰＡゲル、ＰＡＭＰＳゲル、ＰＤＭＡゲル、又はＰＡＡｃゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項１２に記載の誘導剤。
【請求項１４】
前記ゲル状物質は、シート状又は粒状である請求項１２又は１３に記載の誘導剤。
【請求項１５】
下記（１）及び（２）を含む、癌細胞の癌幹細胞への転換誘導用キットであって、
（１）生体細胞集団に含まれる少なくとも一部の細胞におけるオステオポンチンの発現を誘起するゲル状物質、及び
（２）癌細胞培養用培養液。
【請求項１６】
前記ゲル状物質は、ダブルネットワークゲル、ＰＮａＳＳゲル、ＰＣＤＭＥゲル、ＰＡゲル、ＰＡＭＰＳゲル、ＰＤＭＡゲル、又はＰＡＡｃゲルからなる合成高分子ゲルである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ゲル状物質は、シート状又は粒状である請求項１５又は１６に記載のキット。
【国際調査報告】
2018151309.tif 000026
2018151309.tif 000027
2018151309.tif 000028
2018151309.tif 000029