【手続補正書】
【提出日】平成17年11月29日(2005.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  真核細胞内におけるDNAの配列特異的組換えの方法であって、以下の工程、
ａ）第１attB、attP、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含むDNAを細胞中に導入する工程、
ｂ）第２attB、attP、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含むDNAを細胞中に導入する工程であって、前記第１DNA配列がattB配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattB、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含み、或いは前記第１DNA配列がattP配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattP、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含み、或いは前記第１DNA配列がattL配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattB、attP若しくはattL配列又はその誘導体を含み、或いは前記第１DNA配列がattR配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattB、attP若しくはattR配列又はその誘導体を含むことを特徴とする工程、及び
ｃ）バクテリオファージlambdaインテグラーゼIntによって配列特異的組換えを行う工程、
を含む方法。
【請求項２】  人工的な微小染色体又は前記真核細胞のゲノム内に請求項１記載の第１att配列又はその誘導体を組み込んだ、真核細胞内におけるDNAの配列特異的組換えの方法であって、請求項１に記載の工程ｂ）及びｃ）を含む方法。
【請求項３】  前記第１att配列又はその誘導体が、前記真核細胞のゲノム内に天然に存在するか、或いは前もって導入されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】  真核細胞内で、１種以上の所望のポリペプチド／産物をコードする関心のある少なくとも１つの遺伝子を発現させる方法であって、以下の工程、
ａ）attB、attP、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含む第１DNAを細胞中に導入する工程、
ｂ）attB、attP、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含む第２DNAと、関心のある少なくとも１つの遺伝子を細胞中に導入する工程、
ｃ）前記細胞をバクテリオファージlambdaインテグラーゼIntと接触させる工程、
ｄ）バクテリオファージlambdaインテグラーゼIntによる配列特異的組換えを行う工程であって、前記第２DNAが前記第１DNA中に組み込まれることを特徴とする工程、及び
ｅ）前記細胞を、関心のある前記遺伝子が発現される条件下で培養する工程、
を含む方法。
【請求項５】  前記第１DNA配列がattB配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattB、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含み、或いは前記第１DNA配列がattP配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattP、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含み、或いは前記第１DNA配列がattL配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattB、attP若しくはattL配列又はその誘導体を含み、或いは前記第１DNA配列がattR配列又はその誘導体を含む場合、前記第２配列がattB、attP若しくはattR配列又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】  前記第２DNAが前記細胞中に導入される前に、前記第１DNAが宿主細胞のゲノム、人工的な微小染色体又はエピソーム要素中に組み込まれていることを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】  前記第１DNAが宿主細胞ゲノム中に組み込まれていることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】  １種以上の所望のポリペプチド／産物をコードする関心のある少なくとも１つの遺伝子を、バクテリオファージlambda Int又はその機能性突然変異体によって媒介される配列特異的組換えを可能にする少なくとも１つの天然に存在する組換え配列を有する真核細胞内で発現させる方法であって、以下の工程、
ａ）attB、attP、attL若しくはattR配列又はその誘導体を含むDNAと、少なくとも１つの関心のある遺伝子を前記細胞中に導入する工程、
ｂ）前記細胞をバクテリオファージlambdaインテグラーゼIntと接触させる工程、
ｃ）前記細胞内の天然に存在する前記組換え配列と、前記細胞中に導入された前記DNAとの間で、バクテリオファージlambdaインテグラーゼIntによる配列特異的組換えを行う工程、及び
ｄ）前記細胞を、関心のある前記遺伝子が発現される条件下で培養する工程、
を含む方法。
【請求項９】  前記天然に存在する配列が、attＨであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  前記所望のポリペプチド／産物が、宿主細胞又は細胞培地から単離されることを特徴とする請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】  attP、attB、attL若しくはattRの前記誘導体が、Int用のアーム結合部位の１コピー又は１より多くのコピーを含むか、或いは前記誘導体が、コアInt結合部位の１コピー又は１より多くのコピーを含むか、或いは前記誘導体が、Int用アーム結合部位の１コピー又は１より多くのコピーと、コアInt結合部位の１コピー又は１より多くのコピーとの組合せを含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】  attP、attB、attL若しくはattRの前記誘導体が、コアInt結合部位の１コピー又は１より多くのコピーから成るか、或いは前記誘導体が、Int用アーム結合部位の１コピー又は１より多くのコピーと、コアInt結合部位の１コピー又は１より多くのコピーとの組合せから成ることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】  前記コア結合部位が、９個の相接塩基対から成り、かつ、野生型att部位内の、Ｂ-配列ではヌクレオチド配列5'-CTGCTTTTT-3'から成り、Ｂ'-配列ではヌクレオチド配列5'-CAAGTTAGT-3'（逆相補性鎖）から成り、Ｃ-配列ではヌクレオチド配列5'-CAGCTTTTT-3'（逆相補性鎖）から成り、かつＣ'-配列ではヌクレオチド配列5'-CAACTTAGT-3'（逆相補性鎖）から成るDNA配列、又は機能性ヌクレオチド置換を有する前記配列に関係することを特徴とする請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】  前記配列特異的組換えが、Intと、XIS、FIS及び／又はIHFから選択される１種以上の補助因子とによって行われることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】  前記配列特異的組換えが、修飾Intによって行われることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】  前記修飾Intが、Int-h又はInt-h/218であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】  Int、Int-h又はInt-h/218、XIS、FIS及び／又はIHFが、精製形態で細胞に添加されるか、或いは前記宿主細胞によって共−発現され、前記配列特異的組換えが行われることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】  さらに、Int遺伝子、又はInt遺伝子と、XIS遺伝子、FIS遺伝子及び／又はIHF遺伝子から選択される１種以上の補助因子とを含む第３又は第３及び第４DNA配列が、それぞれ前記細胞中に導入されることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】  配列特異的組換えが修飾Intによって行われる場合、XIS、FIS、IHFのどれも必要ないことを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】  前記修飾Intが、Int-h又はInt-h/218であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】  前記第１及び／又は第２組換え配列が、さらに、関心のあるポリペプチドの核酸コーディングを含むことを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】  前記関心のあるポリペプチドが、抗体、ホルモン又は成長因子であることを特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】  前記宿主細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】  前記哺乳類細胞がげっ歯類細胞であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】  前記げっ歯類細胞が、マウス又はハムスター細胞であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】  前記ハムスター細胞がBHK又CHO細胞であり、かつ前記マウス細胞がマウス骨髄腫細胞であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】  前記マウス骨髄腫細胞が、NSO又はSp2/0細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。