【手続補正書】
【提出日】平成18年10月31日(2006.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリー中の下記に示す性質を有する分子量約１００００未満の低分子量タンパク質を指標とすることを特徴とする、ローヤルゼリーの鮮度の評価方法。
１）トーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（7.5×30ｃｍ）をカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出する高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持時間３５〜４５分にピークを有するタンパク質であり、分子量が約１００００未満の低分子量タンパク質。
２）トリシン−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約１００００未満の低分子量タンパク質。
【請求項２】
鮮度の指標物質である分子量約１００００未満の低分子量タンパク質の、ローヤルゼリー中総タンパク質量あたりに占める割合が、４４重量％以下である場合に、生理活性が十分に発揮されると評価することを特徴とする、請求項１に記載のローヤルゼリーの鮮度の評価方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
一方、ローヤルゼリー中に、下記に示す性質を有するタンパク質：
１）トーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（7.5×30ｃｍ）をカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出する高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持時間35〜45分にピークを有するタンパク質であり、分子量が約１００００未満の低分子量タンパク質、
２）トリシン−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約１００００未満の低分子量タンパク質、
が存在することは知られておらず、又該分子量約１００００未満の低分子量タンパク質の
起源は、元々含まれているものの他、熱による分子量約１００００以上の高分子量タンパク質の分解により生成したものであり、それに伴いローヤルゼリーの種々の生理活性が低下することも知られていなかった。更に、その分子量約１００００未満の低分子量タンパク質がローヤルゼリーの鮮度の指標になることも知られていなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【課題の解決手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは鋭意研究努力を重ねた結果、ローヤルゼリー中の鮮度の指標物質が分子量約１００００未満の低分子量タンパク質であり、且つ該タンパク質が熱により分子量１００００以上の高分子量タンパク質が分解することにより生成し、このような分解によりローヤルゼリーの種々の生理活性が低下することを見出し、発明を完成させるに至った。該タンパク質について、以後、単に「分子量約１００００未満の低分子量タンパク質」或いは「分子量１００００未満低分子量タンパク質」と表現することがある。即ち、本発明は、次に示す技術に関するものである。
（１）ローヤルゼリー中の下記に示す性質を有する分子量約１００００未満の低分子量タンパク質を指標とすることを特徴とする、ローヤルゼリーの鮮度の評価方法。
１）トーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（7.5×30ｃｍ）をカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出する高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持時間３５〜４５分にピークを有するタンパク質であり、分子量が約１００００未満の低分子量タンパク質。
２）トリシン−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約１００００未満の低分子量タンパク質。
（２）鮮度の指標物質である分子量約１００００未満の低分子量タンパク質のローヤルゼリー中総タンパク質量あたりに占める割合が、４４重量％以下である場合に生理活性が十分に発揮されると評価することを特徴とする、（１）に記載のローヤルゼリーの鮮度の評価方法。
以下、本発明について、実施の形態を中心に説明を加える。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【発明の実施の形態】
（１）本発明のローヤルゼリーの成分である鮮度の指標物質
本発明の鮮度の指標物質は、ローヤルゼリーに含有されていることを特徴とする。ローヤルゼリーの化学的組成は、生産地により、多少の差異はあるが、水分６５〜７０％、タンパク質１５〜２０％、炭水化物１０〜１５％、脂肪１．７〜６％、灰分０．７〜２％を含むとされている。ローヤルゼリーの生物学的・薬理学的作用については、老化予防作用、酵素作用、抗菌作用、抗腫瘍作用、血液・循環器に対する作用などが知られている。本発明に係るローヤルゼリーは、分子量約１００００未満の低分子量タンパク質が、ローヤルゼリー中総タンパク質量あたりに占める割合が４４重量％以下であることを特徴とする
。このタンパク質は本発明者らによって、はじめてローヤルゼリー中で確認された成分であり、このタンパク質は、熱により分子量約１００００以上の高分子量タンパク質の分解により生成したものであり、分子量約１００００未満の低分子量タンパク質の含有量が増加すると、ローヤルゼリーの種々の生理活性が低下する。ローヤルゼリーの生理活性として、例えば、限界運動量増強作用、肝細胞増殖促進作用、血中アンモニア濃度抑制作用、血中乳酸蓄積抑制作用などの活性を発現することを見出している。ここで、この該タンパク質の含有量であるが、前記効果を十分に発揮する為には、分子量約１００００未満の低分子量タンパク質が、ローヤルゼリー中総タンパク質量あたりに占める割合が、多くても４４重量％以下であることが好ましい。このタンパク質はＧＰＣカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによって定量する事ができる。即ち、該指標物質の多少により、ローヤルゼリーの効果の程度がわかる。更に、ローヤルゼリーを採取直後より、経時的に保存し、この指標物質を定量した場合、この指標物質の含有量は、特に、４０℃及び５０℃の高温で単調に増加し、それに伴い、上記したローヤルゼリーの種々の生理活性も同様に減少するため、分子量約１００００未満の低分子量タンパク質は、ローヤルゼリーの鮮度の指標物質であることがわかる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
（２）高速液体クロマトグラフィーによるローヤルゼリーの鮮度の指標物質の分析
本発明のローヤルゼリー中の分子量約１００００未満の低分子量タンパク質は、高速液体クロマトグラフィーにより特定できることを特徴とする。上記の指標物質は、高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過でも識別・定量することが出来る。従って、この様な分析結果をもって、品質管理や効果の鑑別・評価に使用することもできる。かかるゲル濾過分析は、通常に知られている方法に従って行えば良く、この様な好ましい例としては、例えば、トーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷをカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出した結果、鮮度の指標タンパク質量を求めることができる。この分析条件下で、上記指標タンパク質は、保持時間35分〜45分にピークとして現れる。また、既知分子量のゲル濾過分析の結果より、上記指標物質の分子量は、約１００００未満と確定された。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（４）電気泳動によるローヤルゼリー中の分子量約１００００未満の低分子量タンパク質の定性方法
本発明のローヤルゼリー中の分子量約１００００未満の低分子量タンパク質は、トリシン−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質の構成やタンパク質の分子量を分析することができる。この電気泳動法はSchaggerら（Schagger, H. et al., Anal.
Biochem., 166, 368-379 (1987)）の方法によって行うことができる。特に限定されないが、好ましい方法としては、水溶性ローヤルゼリータンパク質（3％ローヤルゼリー水溶液（Ｗ／Ｖ））をポリアクリルアミドゲル（１０％均一）にて、トリシンを含む電極液にて電流２０ｍＡで電気泳動し、クマシーブリリアントブルーにより染色して、タンパク質を特定する方法である。この様な電気泳動に於ける本発明のタンパク質の分子量は、分子
量マーカーとしてペプチドマーカーキット（ファルマシアバイオテク社）を用いた場合、約１００００未満と決定された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
＜実施例１＞
各種保存温度条件下に於けるローヤルゼリーの鮮度の指標である分子量約１００００未満の低分子量タンパク質をトーソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷをカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定したＧＰＣにより含有率を測定した。即ち、ローヤルゼリーを４℃、２０℃、４０℃及び５０℃に保存し、０日（スタート時の新鮮なローヤルゼリー中の分子量約１００００未満の低分子量タンパク質の含有量／ローヤルゼリー中の総タンパク質量（％）），１日後，３日後，５日後，７日後のローヤルゼリー中の分子量約１００００未満の低分子量タンパク質の含有量を測定した。表１に示すように、４℃における保存では、分子量約１００００以上のタンパク質が分解をされず、７日後まで分子量約１００００未満の低分子量タンパク質は増加しなかった。また、２０℃保存の条件では、５，７日後に、分子量約１００００未満の低分子量タンパク質は多少増加し４５．２％となった。一方、高温の４０℃及び５０℃保存の条件では、１〜７日後まで、分子量約１００００未満の低分子量タンパク質は経時的に増加し７日後でそれぞれ、６３．８％及び７４．１％に増加した。即ち、この分子量約１００００未満の低分子量タンパク質はローヤルゼリーの鮮度の指標物質となりうることがわかる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
＜実施例２＞
マウス抗疲労試験を指標として、実施例１の５０℃で経時的に保存したローヤルゼリーの生理活性試験を行った。即ち、実験動物としてｄｄＹマウス、５週齢、雄、１群１０匹を用いた。ローヤルゼリーの投与方法として、ローヤルゼリーの凍結乾燥物を生換算で５％になるように粉餌（ＣＥー２）に混ぜて２週間自由摂取させた。（計算上の摂取量は５ｇ/Ｋｇ）抗疲労試験として、京大松元式マウス運動量測定流水層を用いた。水層の水流量は８Ｌ/分で流し、マウスを遊泳させ、７秒間以上息継ぎが出来なくなった時点を遊泳時間とした。群分けとして、１群はコントロール（通常食）、２群は、新鮮なローヤルゼリー投与群、３群は、５０℃で１日保存したローヤルゼリー投与群、４群は、５０℃で３日保存したローヤルゼリー投与群、５群は５０℃で５日保存したローヤルゼリー投与群、６群は５０℃で７日保存したローヤルゼリー投与群とした。マウスは泳ぎの上手いものと下手なものがおり、下手なものは遊泳を重ねても遊泳時間がほとんど伸びなかった。従って、マウスの選定として、投与前遊泳時間において４０分以上泳いだものだけを選出し実験に供した。実験のスケジュールとして、まず、マウスを週１回遊泳させた。１週目に予備遊泳させ、２週目に投与前遊泳時間を測定した。４週目に投与開始後２週目の遊泳時間を測定した。結果を平均遊泳時間比（投与前の遊泳時間を１とした場合の投与後の遊泳時間の比を平均したもの。）として表２に示す。これより、ローヤルゼリーの鮮度の指標物
質である分子量約１００００未満の低分子量タンパク質の含有量が少ないものほど遊泳時間がのびていることがわかる。従って、該タンパク質含量がローヤルゼリーの薬理活性の１つである抗疲労活性に対して極めて良好な相関があることが確かめられた。