(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲン及びトロンビンの粒子を含む懸濁液を調製する方法であって、トロンビンとアルコールとのトロンビン混合物が０℃〜８℃の温度で８０〜１００秒間ホモジナイズされる、トロンビン混合物を提供する段階、０℃〜１２℃の温度においてフィブリノーゲンとアルコールとのフィブリノーゲン混合物を提供する段階、及びＦｏｌｋ  Ｗａｒｄ平均直径が２５〜１００μｍであるフィブリノーゲンおよびトロンビンの粒子を含む懸濁液を得るためにフィブリノーゲン混合物とトロンビン混合物を混合する段階、を含み、０℃〜１２℃の温度で懸濁液が担体に適用される、該方法。
【請求項２】
トロンビンを水に溶解し、トロンビン混合物をホモジナイズする前に１７〜３５倍量の１００％エタノールをトロンビン溶液に添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｏｌｋ  Ｗａｒｄ平均直径が２５〜１００μｍである粒子を得るために、フィブリノーゲン混合物を提供する段階において、フィブリノーゲンが予め微小化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
混合物を提供する段階において、混合物がホモジナイズされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
粒子のＦｏｌｋ  Ｗａｒｄ平均直径が３５〜８０μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
懸濁液の粘度が、重力のみの影響を受ける場合、懸濁液の容積９０〜１２０ｍｌが、以下を有する容器の底の開口部の中に２５〜７５秒間存在するような粘度である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
−  内径が４０〜５０ｍｍで高さが５５〜６５ｍｍの円柱部分、および
−  高さが１７〜２３ｍｍの円錐形の底の部分であって、それによって底の開口部が直径２〜３ｍｍの環状の開口部として円錐部分の下端に提供される部分。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得られる、フィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールを含む懸濁液。
【請求項８】
以下の段階を含む、請求項７に記載の懸濁液で担体をコーティングする方法：
−  コーティング表面１ｃｍ２あたり０．０８ｍｌ〜０．１２ｍｌの懸濁液を０〜１２℃の温度で担体に適用する段階、
−  担体上で乾燥したコーティング表面を得るために、乾燥したコーティングをコーティング表面に固定するために、コーティングした担体に０℃〜１２℃の温度で１０００ｍｂａｒ未満の圧力を供する段階。
【請求項９】
担体がコラーゲン担体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
コラーゲン担体がコラーゲンスポンジである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
懸濁液のトロンビン含有量が２０〜４０Ｉ．Ｕ．／ｍｌである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
トロンビン含有量がコーティング表面に対して平均で２〜４Ｉ．Ｕ．／ｃｍ２である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
コーティングされた担体が、周囲の大気の相対湿度７５〜９９％で前記の圧力及び前記の温度に供される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、フィブリノーゲン、トロンビン、アルコール、および選択的にアプロチニンを含む懸濁液に関する。本発明はさらに、そのような懸濁液を調製する方法、およびそのような懸濁液によって担体をコーティングする方法に関する。担体は、コラーゲンスポンジのようなコラーゲン担体であってもよい。本発明はさらに、コーティングされた担体、特に、本発明に従う懸濁液によってコーティングされたコラーゲン担体を乾燥させる方法、および固化によって担体に固定された活性物質を有する得られたコーティングされたコラーゲン担体にも関する。
【０００２】
コーティングされたコラーゲン担体は、本質的に、フィブリン膠、すなわちフィブリノーゲンとトロンビンの固化固定成分によってコーティングされた担体からなる組織接着、組織密封、および止血のための即時使用可能な吸収性の組成物として用いてもよい。この固定された配合剤は、例えば、創傷表面に直接適用することができる。血液、体液または生理食塩液に接触すると、この系の作用機序が凝固カスケードの最終段階を模倣し、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換をトロンビンが触媒して、第XIII因子を活性化してXIIIaを生じる。第XIIIa因子は一度形成されると、共有的クロスリンクによってフィブリン凝血を安定化させる。
【０００３】
二成分接着剤と同様に、創傷表面と担体とを重合化によって互いに接着させる。約3〜5分間持続するこのプロセスにおいて、本発明のコーティングされたコラーゲン担体は、好ましくは創傷領域に押しつけられる。本発明の組成物の成分は、適用後約4〜6ヶ月以内に酵素的に分解される。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
凝固カスケードの最終段階を模倣する市販のフィブリン膠は、存在する外科的創傷に適用する前にトロンビン溶液と混合される高度濃縮フィブリノーゲン溶液からなる。これらの混合物は、繊維素溶解酵素であるプラスミンによってフィブリン凝血が早期に解離しないように、繊維素溶解阻害剤、例えば、アプロチニン、またはε-アミノカプロン酸を含む。これらの二成分フィブリン膠は、様々な外科的技法において貴重であるが、出血が重度の場合には止血が得られる前に流れてしまう可能性がある。二成分フィブリン膠は、融解または解離を含むいくつかの準備段階をさらに必要とする。このように、それらはむしろ、非現実的で取り扱いがやっかいであり、これらのフィブリン膠を用いて成功するためには経験が必要である。
【０００５】
過去10年間に、多数のフィブリンシーラントが外科の多くの適用において選択される方法となった。しかし、フィブリン膠を用いる大多数の臨床試験において、止血および接着特徴を改善するために、コラーゲンフリースがさらに用いられ、それらの短所および外科医による使用の制限を示している。
【０００６】
コラーゲンは60年代後半以降、止血剤として用いられている。コラーゲンは、全ての哺乳類において最も頻繁に認められる構造タンパク質である。約300 kDaの単量体タンパク質（トロポコラーゲン）は、特異的部位で共有結合している。したがって成熟タンパク質は不溶性であり、高い張力を有する特徴的な原線維を形成する。多数のコラーゲンサブクラスが記述されており、最も一般的なものは、皮膚、腱、骨、および角膜における主なコラーゲンタイプであるI型コラーゲンである。コラーゲンは、長さが約290 nmの三重らせんからなる線維様タンパク質である。これらの三重らせん（トロポコラーゲン分子）5個が交互して直径約3.6 nmの微小線維を形成する。これらの微小線維は、原線維間および原線維内相互作用のために容易に近づくことができる極性および非極性セグメントを有する。微小線維は、四面体格子に充填されて、直径約30 nmの小原線維を形成する。次に、これらの小原線維が集合して、結合組織の基本単位であるコラーゲン原線維となり、これは直径が数百nmであり、したがって光学顕微鏡では薄い線のように見える。
【０００７】
コラーゲンは、おそらくフィブリン膠を含むコーティングによって、創傷を密封する材料として用いてもよい。フィブリン膠、すなわち、フィブリノーゲン、トロンビン、およびアプロチニンの組み合わせは、組織および神経を接着するため、ならびに出血が軽度の場合に表面を密封するために、何年もの間治療的に用いられて成功している。フィブリン膠の一つの欠点は、出血が大量である場合、フィブリンの十分な重合化が起こる前に、たいていの場合膠が流れてしまうことであった。この問題に対処するために、外科医は、液体フィブリン膠をコラーゲンフリースのような吸収性の担体に手で適用し始めた。
【０００８】
このように組み合わせて適用することが印象的な成功を収めたにもかかわらず、この方法は、いくつかの短所のために広い規模で適用されていない。調製は比較的やっかいであり、方法は経験と熟練した人を必要とし、調製時間が10〜15分の範囲であるために、緊急の場合には調製物は容易に利用できない。これらの要因によって、改善された製品の開発が刺激され、その結果欧州特許第0 059 265号に開示されるように、固体フィブリノーゲン、固体トロンビン、および固体アプロチニンのコーティングによって覆われたコラーゲン担体の固定配合剤が開発されるに至った。
【０００９】
欧州特許第0 059 265号に開示されるコラーゲン担体の機能は、主に、それが吸収する担体の機能であり、コーティングされる凝固調製物に対して機械的安定性を付与する。
【００１０】
フィブリン膠の止血特徴と担体としてのコラーゲンの長所とを組み合わせた製品が開発され、登録商標TachoCombの名称で製造されている。TachoComb（登録商標）は、フィブリン膠の以下の活性成分：ヒトフィブリノーゲン、ウシトロンビン、およびウシアプロチニンによってコーティングしたコラーゲン小片の即時利用可能な容易に適用可能な固定配合体である。
【００１１】
TachoComb（登録商標）は、Nycomed Pharma社によって1990年代初期以降販売されており、ヨーロッパにおける臨床試験において患者2500人以上に用いられている。製品はさらに、日本の臨床プログラムにおいて、肝臓および肺切除、胆管手術、脾臓、腎臓および膵臓手術、ENT手術、婦人科手術、および血管手術のような非常に多様な適応の患者700人以上に用いられている。TachoComb（登録商標）は、有効かつ安全であることが判明した。
【００１２】
TachoComb（登録商標）の適用に関連した臨床合併症は、行った臨床試験の経過において報告されていない。
【００１３】
国際公開公報第97/37694号（イムノフランス（Immuno France S.A.）社）において、参照の実施例4において、コラーゲン製品またはTachoComb（登録商標）を用いた場合に、TachoComb（登録商標）を用いた場合止血を認めず失血死に至り、国際公開公報第97/37694号に従って調製したトロンビンを含まないコラーゲン製品を用いた場合の5分以内の止血とは対照的であることが開示されている。
【００１４】
国際公開公報第96/40033号において、ウシまたは他の種のトロンビンを用いることが有害なウイルス汚染を導入しうること、ウシ海綿状脳症のようなウシ疾患を伝搬する可能性があるという点において、TachoComb（登録商標）において用いられたウシトロンビンの短所が強調された。
【００１５】
米国特許第6,177,126 B1号は、創傷を密封および治癒するための材料を製造するための装置およびプロセスを開示する。装置は、その底の部分に、互いに対して移動可能な二つの穴の開いたプレートを有する容器を含み、容器に含まれる懸濁液がその底の部分の下の容器の中を移動する担体上に滴下するようになっている。
【発明の開示】
【００１６】
発明の説明
本発明の目的は、組織接着、組織密封、および止血のために即時使用可能な吸収性の組成物を提供する目的で、例えばコラーゲン担体のコーティングとして用いるために適した改善された懸濁液を提供することである。本発明のさらなる目的は、そのような懸濁液を生成する方法を提供することである。本発明のなおさらなる目的は、フィブリノーゲンとトロンビンとを含む懸濁液によってコラーゲン担体のような担体をコーティングする改善された方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、コーティングを担体に申し分なく確実に固定する目的で、担体に適用された懸濁液の湿潤コーティングを乾燥させる方法を提供することである。本発明のなおさらなる目的は、一度コーティングされたコラーゲンスポンジが血液、体液、または生理食塩液に接触すると、凝固カスケードの最終段階を効率よく模倣するフィブリノーゲンとトロンビンとのコーティングによってコーティングされたコラーゲンスポンジを提供することである。さらに、本発明の目的は、コラーゲンスポンジに対するコーティングの十分な固定を有する、すなわち機械的衝撃を与えた場合にコーティングの剥離が申し分なく低い前記のコーティングを有するコーティングされたコラーゲンスポンジを提供することである。
【００１７】
第一の局面において、本発明は、以下を含む方法によって得られる、フィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールを含む懸濁液を提供する：
フィブリノーゲンとアルコールとのフィブリノーゲン混合物を提供する段階、
トロンビンとアルコールのトロンビン混合物を提供する段階、
前記の懸濁液を得るために、フィブリノーゲン混合物とトロンビン混合物とを混合する段階、懸濁液はフィブリノーゲンおよびトロンビンの粒子を含み、粒子のFolk Ward平均直径は、35〜80μmのような、40〜78μmのような、40〜75μmのような、45〜60μmのような、47〜55μmのような25〜100μmであるか、または60〜80μmのような、65〜75μmのような60〜100μmであり、好ましくは±4μmのような、±3.5μmのような、±2μmのような、±1.5μmのような、±1μmのような、±0.8μmのような、±0.6μmのような、±0.5μmのような±5μmである。そのような懸濁液は、コラーゲン担体のような担体上にコーティングした場合、組織接着、組織密封および止血のための即時使用可能な吸収性の組成物において有効である。懸濁液は選択的に、濃縮水溶液としてフィブリノーゲン混合物に加えられるアプロチニンを含んでもよい。懸濁液が、担体上にコーティングされて乾燥すると容易に同定されるように、リボフラビンを着色剤として加えてもよい。
【００１８】
懸濁液の物理的特性のために、特にアルコール中での粒子の沈降挙動がやや大きいために、懸濁液の標準的な液体粘性測定は行うことができない。このように、粘度測定を提供するもう一つの方法が行われている。したがって、懸濁液は、懸濁液の容積90〜120 mlが、重力のみによって影響を受ける場合、以下を有する容器の底の開口部に25〜75秒間存在するような粘度を有してもよい：
−  内径40〜50mmで内部の高さが55〜65mmの円柱部分、および
−  それによって底の開口部が、直径2〜3mmを有する環状の開口部として円錐部分の下端で提供される、高さ17〜23mmの円錐形の底部分。
【００１９】
スチール製の容器の場合、容器および開口部は以下の寸法を有する：
−  円柱部分の内径：46mm
−  円柱部分の内部の高さ：60mm
−  円錐形の底の内部の高さ：20.5mm
−  底の開口部の内径：2.6mm、
−  底の開口部に接続した通路の長さ：9mm、または
プラスチック材料製の容器の場合、容器および開口部は以下の寸法を有する：
−  円柱部分の内径：50mm
−  円柱部分の内部の高さ：41mm
−  円錐形の底の内部の高さ：24mm
−  底の開口部の内径：2.5mm、
−  底の開口部に接続した通路の長さ：5mm未満、
懸濁液の前記の出口時間は、25〜50秒のような、30〜50秒のような、32〜44秒のような、34〜38秒のような25〜60秒であってもよい。
【００２０】
本発明の第二の局面の方法に関連して下記に開示する懸濁液のパラメータおよび特徴はまた、本発明の第一の局面の懸濁液にも当てはまる。
【００２１】
第二の局面において、本発明は、粒子のFolk Ward平均直径が25〜100μmである、フィブリノーゲンおよびトロンビンの粒子を含む懸濁液を得るために、以下を含む、フィブリノーゲンとトロンビンとの懸濁液を調製する方法を提供する：
−  フィブリノーゲンとアルコールとのフィブリノーゲン混合物を提供する段階、
−  トロンビンとアルコールのトロンビン混合物を提供する段階、
−  前記の懸濁液を得るためように、フィブリノーゲン混合物とトロンビン混合物とを混合する段階。本発明の第一の局面に従う懸濁液に関連して先に開示したパラメータおよび特徴は、本発明の第二の局面の方法にも当てはまる。
【００２２】
フィブリノーゲン混合物を提供する段階で、Folk Ward平均直径が25〜100μmである粒子を得るために、フィブリノーゲンを、適した方法、例えばふるい分けによって予め微小化してもよい。微小化フィブリノーゲンは、例えば、前記のフィブリノーゲン混合物を得るためにアルコールに攪拌してもよい。混合物を提供する段階で、フィブリノーゲンはまた、アルコール中で、好ましくは温度2℃〜8℃のような0℃〜12℃の間で直接ホモジナイズしてもよい。ホモジナイゼーションの際の温度は低下させてもよい。フィブリノーゲン混合物とトロンビン混合物とを混合する段階は、懸濁液を攪拌しながら行ってもよく、それによって攪拌は、温度2℃〜8℃のような0℃〜12℃の間で行ってもよい。
【００２３】
トロンビンは、ヒトトロンビン、ウシトロンビン、または組換え型トロンビンを含んでもよく、フィブリノーゲンは、ヒトフィブリノーゲンまたは組換え型フィブリノーゲンを含んでもよい。アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールのような有機アルコール、無水エタノール、無水プロパノール、または無水イソプロパノールのような無水有機アルコールであってもよい。ヒトフィブリノーゲンは、固体の凍結乾燥型で供給してもよい。
【００２４】
本発明の第三の局面において、本発明は、粒子のFolk Ward平均直径が25〜100μmである、フィブリノーゲンおよびトロンビンの粒子を含む懸濁液を得るために、懸濁液が以下の段階を含む方法に由来して：
−  フィブリノーゲンとアルコールとのフィブリノーゲン混合物を提供する段階、
−  トロンビンとアルコールのトロンビン混合物を提供する段階、
−  前記の懸濁液を得るために、フィブリノーゲン混合物とトロンビン混合物とを混合する段階、
コーティング方法が以下を含む：
−  担体近傍の位置でフィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールの懸濁液を提供する段階：
−  担体のコーティング表面に前記の懸濁液を適用する段階、
フィブリノーゲンとトロンビンとを含む懸濁液によって担体をコーティングする方法を提供する。
【００２５】
担体は、コラーゲンスポンジのようなコラーゲン担体であってもよい。コラーゲンスポンジは、以下の基準の少なくとも一つ、好ましくは複数を満たす：
−  ｐＨ値が５．０〜６．０の間である、
−  乳酸含有量が多くとも５％である、
−  アンモニア含有量が多くとも０．５％である、
−  アルブミン含有量として計算した可溶性タンパク質含有量が多くとも０．５％である、
−  硫酸塩の灰含有量が多くとも１．０％である、
−  重金属含有量が多くとも２０ｐｐｍである、
−  微生物純度が多くとも１０３ＣＦＵ／ｇである、
−  コラーゲン含有量が７５〜１００％である、
−  密度が１〜１０ｍｇ／ｃｍ３である、
−  弾性係数が５〜１００Ｎ／ｃｍ２の範囲である。
【００２６】
コラーゲンスポンジは、以下の段階を含む方法に由来してもよい：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有する担体の乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるか、または小室の平均対角線寸法が3mmであるスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階。
【００２７】
本発明の意味において、「小室の直径」という用語は、小室における最大直線壁間距離、すなわち小室の最大対角線直線距離として理解すべきである。小室は、八角形のような多角形であってもよい。小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるか、または小室の直径が多くとも3mmであれば、コラーゲンスポンジはフィブリノーゲンおよびトロンビンを含む懸濁液によってコーティングされるために特に有用となることが判明した。さらに、前記の方法によって調製したコーティングしたコラーゲンスポンジは、コラーゲンスポンジが創傷に適用されると、空気または液体がコラーゲンスポンジの中を浸透できないという点において空気および液体を通さないことが判明した。
【００２８】
懸濁液を担体に適用する段階は、室温1℃〜10℃のような、2℃〜8℃のような0℃〜12℃で行ってもよい。さらに、懸濁液を担体に適用する段階は、相対湿度85〜95％のような75〜99％の大気中で行ってもよい。好ましくは、コーティング表面1 cm2あたり懸濁液の容量0.08 ml〜0.12 mlを担体に適用する。最終的にコーティングされた担体のその全表面に及ぶ均一な有効性を確保するために、コーティング表面の面積単位あたりのフィブリノーゲン量の変化が、多くとも20％、多くとも15％、多くとも10％のような多くとも25％であるように、懸濁液は好ましくはコーティング表面の所定の幅に対して均一に分布させる。
【００２９】
懸濁液を担体に適用するために、少なくとも一つの噴射口を含むアプリケータを用いてもよく、それによって担体と噴射口とが互いに移動する際に懸濁液が噴射口から噴射される。アプリケータは、コンベヤベルト、ポンプもしくはポンプシステムまたは他の供給装置に接続した攪拌単位、およびコンベヤベルトに対して横切って、例えば直角に移動する噴射口または噴射口システムを含んでもよく、またはその近傍に配置してもよい。媒体の特定の特徴に応じて、噴射口または噴射口システムは、様々な形状および大きさを有してもよい。噴射口または噴射口システムは、チューブを通して供給装置に接続してもよい。供給装置は、コーティング媒体を攪拌単位から噴射口システムに送ってもよい。コーティングプロセスの間、噴射システムは担体を横切って移動してもよい。その待機位置において、噴射システムをコンベヤベルトの片面上で固定してもよい。コーティングプロセスは、コンベヤベルト上に担体が存在することを感知する光障壁によって開始してもよく、同様に、光障壁シグナルによって停止してもよい。そのようなアプリケータは、無駄な容積が比較的小さく、掃除のし易さを含む取り扱いが容易である。さらに、これは如何なる時にもコーティングプロセスを中断する可能性を与え、比較的広範囲の粘度で適用可能であり、均一なコーティングを与える。
【００３０】
またはもしくは付加的に、異なる複数の出口を有する容器を、担体に懸濁液を適用するために用いてもよく、それによって、懸濁液は出口を通して容器から担体に押し出される。その底で移動可能なプレートを有する容器の形での後者のタイプのアプリケータは、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,177,126 B1号に開示されている。米国特許第6,177,126 B1号の装置によって与えられる均一な分布により、それらの装置の一つは本発明の好ましい態様において適用される。担体およびアプリケータは好ましくは、懸濁液が担体に適用される間、輸送方向に互いに移動して、その場合、移動速度は0.03〜0.04 m/sのような0.025 m/s〜0.05 m/sであってもよい。アプリケータを通して担体に適用される懸濁液の流速は、470〜550 ml/分のような、495〜505 ml/分のような400〜600 ml/分であってもよい。
【００３１】
第四の局面において、本発明は、担体上で乾燥したコーティング表面を得るため、コーティング表面に乾燥コーティングを固定するために、コーティングされる担体に1000 mbar未満の大気を適用する段階を含む、担体のコーティング表面に湿潤コーティングとして適用されるフィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールの懸濁液を乾燥させる方法に関する。真空を適用することによって、そして乾燥プロセスにおいて真空を用いることによって、低温（2〜10℃）および高い相対湿度（80〜95％）が維持され、それによって担体、特にコラーゲンスポンジのようなコラーゲンの形の担体と共に、フィブリノーゲンおよびトロンビンの構造および物理的特性を維持してもよい。
【００３２】
懸濁液は以下によって得てもよい：
−  フィブリノーゲンとアルコールとのフィブリノーゲン混合物を提供する段階、
−  トロンビンとアルコールとのトロンビン混合物を提供する段階、
−  前記の懸濁液を得るためにフィブリノーゲン混合物とトロンビン混合物とを混合する段階、
および担体は、以下の段階を含む方法に由来するコラーゲンスポンジであってもよい：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるか、または平均対角線寸法が3mmであるスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階、
およびコーティングは以下によって、コラーゲンスポンジに適用してもよい：
−  コラーゲンスポンジの近傍の位置にフィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールの懸濁液を提供する段階、
−  コラーゲンスポンジのコーティング表面に懸濁液を適用する段階。
【００３３】
コラーゲンスポンジを調製する方法および懸濁液を調製する方法は、本発明の第二および第三の局面の方法に関連して先に考察した通りである。
【００３４】
乾燥の際に、コーティングした担体に、温度1℃〜10℃のような、2℃〜8℃のような0℃〜12℃で、および／または大気中の相対湿度85〜95％のような75〜99％で前記の圧力を適用してもよい。コーティングした担体から蒸気を運び去るために、乾燥時にコーティングした担体に空気流を通過させてもよい。
【００３５】
乾燥を完全にするために、コーティングした担体は、好ましくは、少なくとも2時間のような、少なくとも4時間のような、少なくとも1時間の間、前記の条件で維持する。
【００３６】
収縮のために、乾燥したコーティングの表面積は、湿潤コーティング表面積の大きさより小さい。本発明に従う方法において、乾燥コーティング表面積は、湿潤コーティング表面積の大きさの80％のような少なくとも75％である。
【００３７】
コーティングした担体を保存した場合に活性成分を安定に維持するため、担体と乾燥コーティング表面は共に好ましくは水分含有量が、重量で8％を超えないような、重量で12％を超えない。
【００３８】
本発明の他の局面に関連して考察した製造方法を含む懸濁液およびコラーゲンスポンジの全てのパラメータおよび特徴はまた、本発明の第四の局面の方法にも当てはまる。
【００３９】
第五の局面において、本発明は、コーティングしたコラーゲンスポンジが以下の段階を含む方法によって得られる、フィブリノーゲンおよびトロンビンのコーティングによってコーティングされたコラーゲンスポンジに関する：
−  以下を含む方法によってコラーゲンスポンジを提供する段階：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるか、小室の平均対角線寸法が3mmであるスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階、
−  フィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールの懸濁液をコラーゲンスポンジのコーティング表面に適用する段階、および
−  コーティングしたコラーゲンスポンジが以下の特性の少なくとも一つを有する、担体上に乾燥コーティング表面を得るために、コーティング表面に乾燥コーティングを固定するために、コーティングした担体に1000 mbar未満の圧力を適用する段階、
−  懸濁液は、コーティング表面の単位面積あたりのフィブリノーゲン量の変化が多くとも25％であるように、コーティング表面の所定の幅に対して均一に分布する、
−  コーティング材料の試料をVibrofixシェーカーにおいて800〜1200 rpmの回転数で2分間振とうした場合のコーティングの剥離が2.0 mg/cm2未満である。
【００４０】
コーティング表面に対して懸濁液が均一に分布することによって、例えば、組織接着、組織密封、または止血のために適用した場合に、コーティング表面の有効性が改善される。コーティングの剥離が低いことから、コーティングしたコラーゲンスポンジを輸送してもよく、外科医の手および／または手術機器でつかんでもよく、およびそうでなければ乾燥した懸濁液、すなわちコーティングを失うことなく取り扱ってもよいことが確保される。フィブリノーゲン製剤は、コーティングしたコラーゲンスポンジの総重量の約60〜90％を占めてもよい。製剤は通常、以下の物質を重量で約50〜60％含む：塩、アミノ酸、およびアルブミン。フィブリノーゲン単独は通常、製剤の40〜50％を占める。
【００４１】
懸濁液の水分含有量は、好ましくは24〜32 mg/mlのような20〜80 mg/mlである。懸濁液のトロンビン含有量は、24〜33 I.U./mlのような20〜40 I.U./mlであってもよい。平均すると、コーティング後のトロンビン含有量は、コーティング表面に対して2.3〜3.3 I.U./cm2のような、2〜4 I.U./cm2であってもよい。トロンビン含有量はコーティング表面の如何なる位置でも5 I.U./cm2を超えないか、またはコーティング表面の如何なる位置でも3.8 I.U./cm2を超えないことが望ましいと考えられる。
【００４２】
コーティングした担体の微生物純度は好ましくは、多くとも2.25 CFU/cm2のような多くとも4 CFU/cm2である。
【００４３】
さらに独立した局面において、本発明は、組織接着、組織密封、および止血のために前記のコーティングしたコラーゲンスポンジを用いることに関する。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明の方法および産物の好ましい態様を、図8も参照して以下に説明する。
【００４５】
フィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールを含む懸濁液は、以下のように、本発明に従う懸濁液を作製する方法によって作製してもよい：
フィブリノーゲンを100％エタノール中で2〜8℃でホモジナイズして、最終懸濁液容積の約80％を占めるフィブリノーゲンとアルコールとの混合液を得る。次に、リボフラビンを加える。その後、混合物をその次の処理まで密閉容器において攪拌する。
ヒトまたはウシトロンビンを注射用水に溶解する。溶液を0〜8℃の100％エタノールの35倍量に加える。それによって得られたトロンビン懸濁液を0〜8℃で80〜100秒間ホモジナイズする。
フィブリノーゲンとトロンビン混合物を混合する前に、アプロチニン溶液と注射用水をフィブリノーゲン混合物に加える。次に、トロンビン混合物をフィブリノーゲン混合物に加える。懸濁液の最終容積は、2〜8℃の100％エタノールを加えることによって調製する。
【００４６】
上記の段階を含む方法を、以降、「I群の方法」と呼ぶ。
【００４７】
その代わりとして、フィブリノーゲン、トロンビン、およびアルコールを含む本発明に従う懸濁液を作製する方法は以下の段階を含む：
フィブリノーゲン混合物は、粒子のFolk Ward平均直径が35〜80μmである予め微小化したフィブリノーゲンとリボフラビンとを、攪拌しながら2〜8℃の94〜97％エタノールに加えることによって得られる。それによって得られたリボフラビンとエタノール混合物は、最終懸濁液容積の約70〜80％を占める。フィブリノーゲン混合物はさらに、その次の処理まで密閉容器において攪拌する。
トロンビン混合物は、−30℃の94〜97％エタノールにトロンビンを加えることによって得られる。それによって得られたトロンビン混合物を80〜100秒間ホモジナイズする。または、トロンビン混合物は、トロンビンを注射用水に溶解することによって得られ、それによって得られたトロンビン溶液を−30℃の100％エタノールの17〜35倍量に徐々に加える。懸濁液を80〜100秒間ホモジナイズする。
IKAによるUltraTurrax装置をホモジナイズ装置として用いてもよい。
トロンビン混合物を、フィブリノーゲンとリボフラビンとを含む混合物に加える。2〜8℃の94〜97％エタノールを加える。
【００４８】
上記の段階を含む方法を以降、「II群の方法」と呼ぶ。
【００４９】
上記のI群およびII群の方法によって、好ましくは以下の特徴を有する本発明に従う懸濁液を得てもよい：
−  エタノール濃度：94〜97％
−  図9の左に示す装置によって測定した出口時間：31.5〜48秒
−  沈降挙動：総容積の百分率における固体粒子の容積：
試験開始5分後：85％以上、
試験開始24時間：50〜80％
−  粒子径：Folk Ward平均直径35〜80μm
【００５０】
本発明に従う乾燥方法の一つの態様において、コラーゲンスポンジ片を相対湿度80〜91％で2〜8℃で2〜30時間インキュベートしてから、コラーゲンスポンジの形の担体をコーティングした。懸濁液をコラーゲンスポンジに適用するためのアプリケータは、先に記述したとおりである。コーティングした後、コラーゲンスポンジ片は、2〜8℃、相対湿度80〜90％で8〜60分間インキュベートする。コーティングしたコラーゲンスポンジ片は、室温2〜8℃で、相対湿度80〜90％の真空乾燥器において乾燥する。空気流を、吸引弁を通してコラーゲン片に流速1.2〜40 m3/時間で通過させる。大気圧に応じて真空30〜60 mbar、すなわち絶対圧約970 mbarを適用して、コーティングしたコラーゲン片を2〜5時間乾燥させる。
【００５１】
懸濁液の粘度測定は、図9に示し、先に記述した装置の一つを用いることによって得られる。図9の左に示す装置は、スチール製であり、容器および底の開口部は以下の寸法を有する：
−  円柱部分の内径：46mm、
−  円柱部分の内部の高さ：60mm、
−  円錐形の底の内部の高さ：20.5mm、
−  底の開口部の内径：2.6mm、
−  底の開口部に接続した通路の長さ：9mm。
【００５２】
図9の右に示す装置は、プラスチック材料製であり、容器および底の開口部は以下の寸法を有する：
−  円柱部分の内径：50mm、
−  円柱部分の内部の高さ：41mm、
−  円錐形の底の内部の高さ：24mm、
−  底の開口部の内径：2.5mm、
−  底の開口部に接続した通路の長さ：5mm未満。
【００５３】
フィブリノーゲン原料
0004535678.tif 000002
【００５４】
トロンビン原料
0004535678.tif 000003
【００５５】
下記の実施例I〜IVは、本発明に従うフィブリノーゲンおよびトロンビンのコーティングによってコーティングしたコラーゲンスポンジを調製するための様々な技法を説明する。技法には、本発明に従う懸濁液を調製する方法が含まれ、下記の態様において、本発明に従う懸濁液が得られる。さらに、本発明に従うコーティング法および本発明に従う乾燥法を適用する。
【００５６】
実施例I
本実施例において、懸濁液は、ヒトフィブリノーゲン処方Bおよびヒトトロンビン処方Bを含む。
【００５７】
最終懸濁液容積3500 mlは、以下の量およびパラメータを適用することによってII群の方法によって得た：
フィブリノーゲン混合物：
−  エタノール2800 ml（2℃〜8℃で94％）
−  湿潤ヒトフィブリノーゲン処方B 492.5 g
−  リボフラビン493.5 mg
フィブリノーゲン混合物は、攪拌しながら2〜8℃で20時間保存した。
トロンビン混合物：
−  エタノール100 ml（−30℃で100％）
−  ヒトトロンビン処方B 12.27 g
トロンビン混合物は−30℃で18時間保存した。
懸濁液：
−  トロンビン混合物157 mlをフィブリノーゲン混合物に加える。
−  2〜8℃の94％エタノールを最終懸濁液容積3500 mlとなるように加えた。
【００５８】
懸濁液の特徴：
1．エタノール濃度：94.3％
2．図9の左に示すスチール装置によって測定した出口時間：36.5秒
3．沈降挙動：
a）開始5分後の沈降容積：試験容積の98％、
b）開始24時間後の沈降容積：試験容積の64％。
4．粒子径（Folk Ward平均直径）：56.4±1.3μm
【００５９】
コラーゲン片の形の担体を懸濁液によってコーティングした。最初に、コラーゲンスポンジ片48個を以下の条件で低温室において予めインキュベートした：
−  温度：5.2℃
−  絶対湿度4.8 g/kg大気
−  インキュベーション時間：18.5時間
【００６０】
コラーゲンスポンジ片を懸濁液によってコーティングするために米国特許第6,177,126 B1号に開示のアプリケータを用いた。
【００６１】
コーティングしたコラーゲンスポンジ片を以下のように乾燥させた：
コーティング片を、温度5.2℃、絶対湿度4.8 g/kg大気で15分間インキュベートした。
コーティング片を以下の乾燥条件で真空乾燥器において乾燥した：
−  大気条件：温度5.2℃、絶対湿度4.8 g水/kg大気
−  吸引弁を通過する空気流速：23 m3/時間
−  真空：59 mbar
−  乾燥時間：4時間
【００６２】
コラーゲンスポンジ片上で得られたコーティングの剥離は、試料1×5 cm2を試験管に入れてVibrofixシェーカーにおいて800〜1200 rpmの回転数で2分間振とうさせた場合に約0.2 mg/cm2であった。
【００６３】
実施例II
本実施例において、懸濁液は、ヒトフィブリノーゲン処方Cおよびヒトトロンビン処方Cを含む。
【００６４】
懸濁液の最終容積3500 mlは、以下の量およびパラメータを適用することによってII群の方法によって得た：
フィブリノーゲン混合物：
−  エタノール（2℃〜8℃で94％）2252 ml
−  微小化ヒトフィブリノーゲン処方C 370.7 g
−  リボフラビン493.5 mg
フィブリノーゲン混合物を攪拌しながら2〜8℃で20時間保存した。
トロンビン混合物：
−  エタノール（−30℃で100％）
−  ヒトトロンビン処方C 12バイアル／注射用水12 ml
トロンビン混合物を−30℃で18時間保存した。
懸濁液：
−  トロンビン混合物164.5 mlをフィブリノーゲン混合物に加えた。
−  2〜8℃の94％エタノールを懸濁液の最終容積が3500 mlとなるように加えた。
【００６５】
懸濁液の特徴：
1．エタノール濃度：94.1％
2．図に示すスチール装置によって測定した出口時間：32.8秒
3．沈降挙動：
a）開始5分後の沈降容積：試験容積の94％、
b）開始24時間後の沈降容積：試験容積の71％。
4．粒子径（Folk Ward平均直径）：49.2±0.93μm
【００６６】
コラーゲン片の形の担体を懸濁液によってコーティングした。最初に、コラーゲンスポンジ片48個を以下の条件で低温室において予めインキュベートした：
−  温度：4.8℃
−  相対湿度90.3％
−  インキュベーション時間：22.25時間
【００６７】
コラーゲンスポンジ片を懸濁液によってコーティングするために米国特許第6,177,126 B1号に開示のアプリケータを用いた。
【００６８】
コーティングしたコラーゲンスポンジ片を以下のように乾燥させた：
コーティング片を、温度4.9℃、絶対湿度4.8 g水/kg大気で13分間インキュベートした。
コーティング片を以下の乾燥条件で真空乾燥器において乾燥させた：
−  大気条件：温度5.2℃、絶対湿度4.9 g水/kg大気
−  吸引弁を通過する空気流速：25 m3/時間
−  真空：60 mbar
−  乾燥時間：4時間
【００６９】
コラーゲンスポンジ片上で得られたコーティングの剥離は、1×5 cm2試料を試験管に入れてVibrofixシェーカーにおいて800〜1200 rpmの回転数で2分間振とうさせた場合に約0.2 mg/cm2であった。
【００７０】
実施例III
本実施例において、懸濁液は、ヒトフィブリノーゲン処方B、ヒトトロンビン処方B、およびアプロチニンを含む。
【００７１】
懸濁液の最終容積1000 mlは、以下の量およびパラメータを適用することによってII群の方法によって得た：
フィブリノーゲン混合物：
−  エタノール（2℃〜8℃で100％）820 ml、注射用水39.4 ml、およびアプロチニン10.6 ml
−  微小化ヒトフィブリノーゲン処方B 90.67 g
−  リボフラビン141 mg
フィブリノーゲン混合物を攪拌しながら2〜8℃で20時間保存した。
トロンビン混合物：
−  エタノール（−30℃で100％）50 ml
−  ヒトトロンビン処方B 3.75 g
トロンビン混合物を−30℃で16時間保存した。
懸濁液：
トロンビン混合物の全容積をフィブリノーゲン混合物に加えた。
2〜8℃の100％エタノールを懸濁液の最終容積が1000 mlとなるように加えた。
【００７２】
懸濁液の特徴：
1．エタノール濃度：95％
2．図9の右に示すプラスチック装置によって測定した出口時間：35秒
3．沈降挙動：
a）開始5分後の沈降容積：試験容積の89％、
b）開始24時間後の沈降容積：試験容積の76％。
4．粒子径（Folk Ward平均直径）：74.4±3.5μm
【００７３】
コラーゲン片の形の担体を懸濁液によってコーティングした。最初に、コラーゲンスポンジ片16個を以下の条件で低温室において予めインキュベートした：
−  温度：5.0℃
−  相対湿度85％
−  インキュベーション時間：17時間
【００７４】
コラーゲンスポンジ片を懸濁液によってコーティングするために米国特許第6,177,126 B1号に開示のアプリケータを用いた。
【００７５】
コーティングしたコラーゲンスポンジ片を以下のように乾燥させた：
コーティング片を、温度5℃、相対湿度85％で35分間インキュベートした。
コーティング片を以下の乾燥条件で真空乾燥器において乾燥した：
−  大気条件：温度5℃、相対湿度85％
−  吸引弁を通過する空気流速：1.2 m3/時間
−  真空：35 mbar
−  乾燥時間：4時間
【００７６】
コラーゲンスポンジ片上で得られたコーティングの剥離は、1×5 cm2試料を試験管に入れてVibrofixシェーカーにおいて800〜1200 rpmの回転数で2分間振とうさせた場合に約0.2 mg/cm2であった。
【００７７】
実施例IV
本実施例において、懸濁液は、ヒトフィブリノーゲン処方Cおよびヒトトロンビン処方Cを含む。
【００７８】
懸濁液の最終容積780 mlは、以下の量およびパラメータを適用することによってII群の方法によって得た：
フィブリノーゲン混合物：
−  エタノール（2℃〜8℃で94％）700 ml
−  微小化ヒトフィブリノーゲン処方C 84.42 g
−  リボフラビン110 mg
フィブリノーゲン混合物を攪拌しながら2〜8℃で20時間保存した。
トロンビン混合物：
−  エタノール（−30℃で100％）35 ml
−  ヒトトロンビン処方C 0.54 g
トロンビン混合物を−30℃で16時間保存した。
懸濁液：
−  トロンビン混合物23.0 mlをフィブリノーゲン混合物に加えた。
−  2〜8℃の100％エタノールを懸濁液の最終容積が780 mlとなるように加えた。
【００７９】
懸濁液の特徴：
1．エタノール濃度：94％
2．図9の右に示すプラスチック装置によって測定した出口時間：33.5秒
3．沈降挙動：
a）開始5分後の沈降容積：試験容積の92％、
b）開始24時間後の沈降容積：試験容積の72％。
4．粒子径（Folk Ward平均直径）：60.5±0.5μm
【００８０】
コラーゲン片の形の担体を懸濁液によってコーティングした。最初に、コラーゲンスポンジ片8個を以下の条件で低温室において予めインキュベートした：
−  温度：6.0℃
−  相対湿度85％
−  インキュベーション時間：18.5時間
【００８１】
コラーゲンスポンジ片を懸濁液によってコーティングするために米国特許第6,177,126 B1号に開示のアプリケータを用いた。
【００８２】
コーティングしたコラーゲンスポンジ片を以下のように乾燥させた：
コーティング片を、温度5℃、相対湿度85％で45分間インキュベートした。
コーティング片を以下の乾燥条件で真空乾燥器において乾燥させた：
−  大気条件：温度5℃、相対湿度85％
−  吸引弁を通過する空気流速：1.2 m3/時間
−  真空：35 mbar
−  乾燥時間：4時間
【００８３】
コラーゲンスポンジ片上で得られたコーティングの剥離は、試料1×5 cm2を試験管に入れてVibrofixシェーカーにおいて800〜1200 rpmの回転数で2分間振とうさせた場合に約0.2 mg/cm2であった。
【００８４】
実施例V
本実施例において、懸濁液は、ヒトフィブリノーゲン処方Aおよびヒトトロンビン処方Aを含む。
【００８５】
懸濁液の最終容積3120 mlは、以下の量およびパラメータを適用することによってI群の方法によって得た：
フィブリノーゲン混合物：
−  エタノール（2℃〜8℃で100％）2540 ml
−  ヒトフィブリノーゲン処方A 311.6 g
−  リボフラビン440 mg
フィブリノーゲン混合物を攪拌しながら2〜8℃で20時間保存した。
トロンビン混合物：
−  エタノール（−30℃で100％）210 ml
−  ヒトトロンビン処方A 229 g
懸濁液：
−  注射用水87.3 mlをフィブリノーゲン混合物に加えた。
トロンビン混合物をフィブリノーゲン混合物に加えた。
2〜8℃の100％エタノールを懸濁液の最終容積となるように加えた。
【００８６】
懸濁液の特徴：
1．エタノール濃度：97％
2．図9の左に示すスチール装置によって測定した出口時間：40.8秒
3．沈降挙動：
a）開始5分後の沈降容積：試験容積の95.6％、
b）開始24時間後の沈降容積：試験容積の63.5％。
4．粒子径（Folk Ward平均直径）：51.8±0.8μm
【００８７】
コラーゲン片の形の担体を懸濁液によってコーティングした。最初に、コラーゲンスポンジ片48個を以下の条件で低温室において予めインキュベートした：
−  温度：6.5℃
−  相対湿度90％
−  インキュベーション時間：22.5時間
【００８８】
コラーゲンスポンジ片を懸濁液によってコーティングするために米国特許第6,177,126 B1号に開示のアプリケータを用いた。
【００８９】
コーティングしたコラーゲンスポンジ片を以下のように乾燥させた：
コーティング片を、温度6.5℃、相対湿度90％で10分間インキュベートした。
コーティング片を以下の乾燥条件で真空乾燥器において乾燥させた：
−  大気条件：温度6.5℃、相対湿度90％
−  吸引弁を通過する空気流速：1.2 m3/時間
−  真空：58 mbar
−  乾燥時間：4時間
【００９０】
コラーゲンスポンジ片上で得られたコーティングの剥離は、試料1×5 cm2を試験管に入れてVibrofixシェーカーにおいて800〜1200 rpmの回転数で2分間振とうさせた場合に約0.2 mg/cm2であった。
【００９１】
実施例VI
本実施例において、懸濁液は、ヒトフィブリノーゲン処方A、ウシトロンビン処方、およびアプロチニンを含む。
【００９２】
懸濁液の最終容積16720 mlは、以下の量およびパラメータを適用することによってI群の方法によって得た：
フィブリノーゲン混合物：
−  エタノール（2℃〜8℃で94％）13600 ml
−  ヒトフィブリノーゲン処方A 1750.5 g
−  リボフラビン2361 mg
フィブリノーゲン混合物を攪拌しながら2〜8℃で21時間保存した。
トロンビン混合物：
−  エタノール（−30℃で100％）420 ml
−  ウシトロンビン処方1229 g
懸濁液：
−  アプロチニン溶液162.3 mlをフィブリノーゲン混合物に加えた。
−  注射用水304.7 mlをフィブリノーゲン混合物に加えた。
トロンビン混合物をフィブリノーゲン混合物に加えた。
−  2〜8℃の100％エタノールを懸濁液の最終容積となるように加えた。
【００９３】
懸濁液の特徴：
1．エタノール濃度：97％
2．図9の左に示すスチール装置によって測定した出口時間：36.8秒
3．粒子径（Folk Ward平均直径）：58.6±0.6μm
【００９４】
コラーゲン片の形の担体を懸濁液によってコーティングした。最初に、コラーゲンスポンジ片288個を以下の条件で低温室において予めインキュベートした：
−  温度：6.5℃
−  相対湿度89％
−  インキュベーション時間：25時間
【００９５】
コラーゲンスポンジ片を懸濁液によってコーティングするために米国特許第6,177,126 B1号に開示のアプリケータを用いた。
【００９６】
コーティングしたコラーゲンスポンジ片を以下のように乾燥させた：
コーティング片を、温度6.5℃、相対湿度89％で10分間インキュベートした。
コーティング片を以下の乾燥条件で真空乾燥器において乾燥した：
−  大気条件：温度6.5℃、相対湿度89％
−  吸引弁を通過する空気流速：22.5 m3/時間
−  真空：59 mbar
−  乾燥時間：4時間
【００９７】
コラーゲンスポンジ片上で得られたコーティングの剥離は、試料1×5 cm2を試験管に入れてVibrofixシェーカーにおいて800〜1200 rpmの回転数で2分間振とうさせた場合に約0.2 mg/cm2であった。
【００９８】
実施例VII
ヒトフィブリノーゲン、ウシトロンビン、およびアプロチニンを含むコーティングしたコラーゲンスポンジにおいて、製造室の環境条件、例えば2〜8℃での7時間のコーティングプロセスの間のコーティング懸濁液の安定性を調べた。
【００９９】
それぞれの活性成分を異なるサンプリング時間でアッセイした。結果を以下の表1に示す。
【０１００】
【表１】
0004535678.tif 000004
【０１０１】
結果は、三つ全ての成分に関して申し分のない安全性を示している。
【０１０２】
実施例VIII
様々な図が以下を示す、図1〜7を参照する：
0004535678.tif 000005
【０１０３】
コーティングしたNycomedスポンジ（TachoComb S）とTachoComb Sと同一にコーティングした他の担体製品との比較。
【０１０４】
層の接着
技法
1．異なる担体のコーティング
【０１０５】
0004535678.tif 000006
【０１０６】
各担体2×4.5 cm2の領域をTachoComb Sコーティング懸濁液によってコーティングした。コーティング懸濁液の量は、TachoCombの仕様書（5.5 mgフィブリノーゲン／cm2）に対応した。試料を乾燥させた。
【０１０７】
2．各コーティング担体に関して試料1×4 cm2を調製した。
【０１０８】
3．層の剥離を以下のように試験した。
【０１０９】
方法の説明
装置
分析用天秤（測定精度±0.5 mg）
固定装置を備えたVibrofixシェーカー
ミリメートル目盛りの定規
ストップウォッチ、メス、ストッパー付の内径2 cmの試験管
【０１１０】
技法
剥離を決定する技法および計算は先に記述した通りである。
【０１１１】
結果
【０１１２】
0004535678.tif 000007
【０１１３】
注釈
Nycomedコラーゲンスポンジを除く全ての担体は、コーティング後柔軟ではない。試料は非常に注意深く切断しなければならない。鋏を用いて切断すれば、層そのものが堅固であるために多くのコーティング材料が剥がれ落ちるであろう。Ethisorb（登録商標）パッチは、コーティング材料に対してほぼ全く関連を示さなかった。少し振とうさせると、コーティングは全て「カーペット」のように剥がれる。
Nycomedコラーゲンスポンジと他の担体材料との差を全く明らかに示す。
【０１１４】
湿潤コーティング担体の弾性
技法
1．異なる担体のコーティング
各担体2×4.5 cm2の領域をTachoComb Sコーティング懸濁液によってコーティングした。コーティング懸濁液の量は、TachoComb仕様書（5.5 mgフィブリノーゲン／cm2）に対応した。試料を乾燥させた。
【０１１５】
2．試料約5〜7 cm2を各コーティング担体のために調製した。乾燥試料の正確な開始領域を決定した。
【０１１６】
3．試料を湿らせて、見出しの「技法」に詳細に記述したように、特殊な装置に固定した弾性のラテックスシートに載せた。次に、ラテックスシートに圧をかけ伸展させた。伸展と弛緩とを2回行った後、シートに3回目の伸展を行う。担体領域は、最高伸展点で測定した。
【０１１７】
方法の説明
装置／化学物質
蠕動ポンプ（IKA PA-SF）
圧緩衝ボトル（出口3個）
VDO圧力計（0〜250 mbar）
ガラス漏斗（開口部1：30mm、開口部2：15mm）
シリコンチューブおよびクランプ、ラテックス手袋（Semper med）、メス、ミリメートル目盛りの定規、鋏
生理食塩液
【０１１８】
技法
以下の装置をシリコンチューブを通して圧緩衝ボトルの三つの出口に気密的に接続する：
a）蠕動ポンプ
b）圧力計
c）ガラス漏斗／開口部2
【０１１９】
約8×8 cm2の二重のシートをラテックス手袋から切断する。このシートをガラス漏斗／開口部1に気密的に固定する。
【０１２０】
メスを用いて、コーティング領域約5〜7 cm2をコーティングした担体から切断する。
【０１２１】
試料領域を測定する（開始領域）。試料のコーティングを生理食塩液によって湿らせて、ラテックスシート上に置く。次に、これをラテックスシートに手で約1分間押しつける。
【０１２２】
蠕動ポンプを用いて、約70 mbarの圧をかけてラテックスシートを伸展させる。これを2回繰り返した後、ラテックスシートを弛緩させる。3回目の伸展時に、ラテックスシート伸展の最高点でコーティングした担体の領域（長さおよび幅）を測定する。
【０１２３】
計算：
0004535678.tif 000008
【０１２４】
結果
0004535678.tif 000009
【０１２５】
注釈
湿らせたコラーゲンスポンジNycomed（TachoComb）の弾性係数は、製品の重要な特徴の一つである。弾性は、胸部および腹部手術において本質的である。接着後、担体は、例えば肺または腸の膨張および弛緩運動に従うことができなければならない。特に、Ethisorb（登録商標）は全く弾性を示さなかった。これは、コーティングから直ちに剥離した。コーティングしたWillospon（登録商標）スペシャルおよびOpraskin（登録商標）は、試験の間構造的欠陥を示さなかった。
【０１２６】
内視鏡手術におけるコーティングした担体の使用
技法：
1．異なる担体のコーティング
各担体の2×4 cm2領域をTachoComb Sコーティング懸濁液によってコーティングした。コーティング懸濁液の量は、TachoComb仕様書（5.5 mgフィブリノーゲン／cm2）に対応した。試料を乾燥させた。
【０１２７】
2．内視鏡手術において用いられるコーティングした担体試料の取り扱いおよびこの取り扱いによるコーティングの喪失は、デジタル写真装置によって報告する。
【０１２８】
方法の説明
装置
Endodock：内視鏡手術においてTachoComb（登録商標）を用いるためにデザインされた内視鏡ツール（図7を参照のこと）。デジタル写真装置。
【０１２９】
調べた担体の一覧
0004535678.tif 000010
【０１３０】
技法
各担体について撮影した写真のシリーズ：
1．非コーティングおよびコーティング担体試料の報告。
2．コーティング試料を内視鏡装置（Endodock）に挿入する。試料をガイド「ピン」の周囲に巻くことができるように、手で平坦にしなければならない。次に、試料を直径10mmのスチール管に注意深く挿入する。
Endodock管に部分的に挿入した試料の報告。
3．試料を注意深く押し出す。その後、試料を展開しなければならない。この取り扱いのために担体から剥がれたコーティングを担体のそばに集める。内視鏡装置に挿入後展開した試料およびこの取り扱いによるコーティングの喪失を報告する。
【０１３１】
注釈
内視鏡手術にTachoComb（コーティングしたウマコラーゲンスポンジ／Nycomed）を用いることは、製品の最も要求のきびしい応用である。TachoCombを内視鏡装置に挿入する。この装置のチューブは一般的に直径が10〜13mmである。チューブに挿入されるためには、TachoCombを平坦にして、後にガイド「ピン」の周囲を包み、その後チューブに注意深く挿入する。したがって、担体に対するおよびそれ自身内でのコーティングの結合は強くなければならないが、産物は、曲がって巻き上げられるために乾燥条件においても十分に柔軟なままでなければならない。手術部位に近づけてから、TachoCombを注意深くチューブから引き出す。次に、これを開いて創傷表面に載せなければならない。これはしばしば何らかの調節を必要とする。したがって、担体に対する層の接着は、この取り扱いに耐えるために十分に強くなければならない。
【０１３２】
結果
結果を添付の図1〜6に示す。コーティング材料の投入の推定値は以下の通りである：
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【０１３３】
Ethisorb（登録商標）は、非常に堅固な担体であるため、コーティングの接着は非常に悪い。したがって、コーティングしたEthisorb（登録商標）は、本研究においてほぼ全てのコーティングを失った。Nycomedのコーティングしたコラーゲンスポンジと比較すると、調べた他の全ての担体は、コーティングされる平坦な表面を有する。したがって、コーティングは、担体上に「平坦なカーペット」のように存在する。このために、乾燥したコーティング担体がかなり柔軟でない構造となる。曲げるまたは巻き上げると、しばしば、コーティングそのものが砕ける。
【０１３４】
コーティングした担体を内視鏡装置のチューブに挿入して、試料を展開した後、Nycomedのコラーゲンスポンジを除く全ての担体が、多くのコーティング材料を失い、そのため大きい面積がコーティング材料なしのままとなる。
【０１３５】
Nycomedコラーゲンスポンジの構造およびきめは、乾燥または湿潤条件でTachoCombの高い柔軟性に基づいている。Nycomedのコラーゲンスポンジは、泡状であり、内部に多角形の小室を有する。表面上でこれらの小室は、切断されて空洞を形成する。これらの空洞はコーティング表面を拡大させる。コーティングの間、コーティング懸濁液は、構造表面上に均一に分布する。乾燥の間、フィブリノーゲンとトロンビンとを含む溶液は、空洞に固体として固定される。したがって、TachoCombは、所望の大きさに切断することができ、コーティング材料がごく少量失われるか、または全く失われずに内視鏡装置に挿入することができる。
【０１３６】
乾燥TachoCombの高い柔軟性は、調べた他の全てのコーティング担体と比較して大きい長所を有する。
【０１３７】
コラーゲンスポンジの製造
本文において言及したコラーゲンスポンジは、図10および11に一般的に示し、および下記に示す方法によって製造してもよい。
【０１３８】
フィブリン膠調製物によるコラーゲンスポンジのコーティングの成功は、コラーゲンスポンジのきめに依存することが判明した。このように、特にフィブリン膠調製物によるコーティングのために適したコラーゲンスポンジを作製する目的で、創傷を治癒および密封する材料を得るために、特定のきめを有するコラーゲンスポンジを作成する方法を提供することが望ましい。さらに、先行技術のスポンジに関連して、改善された湿度、弾性、密度、および弾性係数という意味で改善された物理的特徴を有するコラーゲンスポンジを作製する方法を提供することが望ましい。コラーゲンスポンジを創傷に適用した後に、コラーゲンスポンジの中を空気または液体が浸透しないという意味で、空気および液体を通さないコラーゲンスポンジを調製する方法を提供することがさらに望ましい。
【０１３９】
このように、コラーゲンスポンジを調製する方法は、以下の段階を含んでもよい：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるか、または小室の平均直径が多くとも3mmであるスポンジの一部を、コラーゲンスポンジのブロックから単離する段階。
【０１４０】
本発明の意味において、「小室の直径」という用語には、小室の最大の直線の壁から壁までの距離、すなわち小室の最大の対角線直線距離として理解すべきである。小室は、八角形のような多角形形状であってもよい。
【０１４１】
小室の直径が０．７５ｍｍより大きく４ｍｍ未満であるか、または小室の平均直径が多くとも３ｍｍであれば、コラーゲンスポンジはフィブリン膠調製物によってコーティングされるために特に有用となることが判明している。好ましくは、コラーゲンゲルは、ゲル１ｇあたり乾燥重量が４〜１８ｍｇのような、５〜１３ｍｇのような、６〜１１ｍｇのような２〜２０ｍｇの範囲である。コラーゲンゲルの動的粘度は、好ましくは４〜１０Ｎｃｍのような、６〜８Ｎｃｍのような２〜２０Ｎｃｍである。コラーゲンスポンジは好ましくは、水分含有量が１０〜１５％のような、約１８％のような２０％に過ぎない。コラーゲンスポンジの弾性係数は、好ましくは１０〜５０Ｎ／ｃｍ２のような５〜１００Ｎ／ｃｍ２の範囲内であり、スポンジの密度は好ましくは２〜７ｍｇ／ｃｍ３のような１〜１０ｍｇ／ｃｍ３である。
【０１４２】
前記の方法によって調製したコラーゲンスポンジは、コラーゲンスポンジを創傷に適用すると、空気または液体がコラーゲンスポンジを通過できないという意味において空気および液体を通さない。液体はスポンジに吸収される。この作用は主に、コラーゲンゲルに空気を混合する段階が、線維構造を有する既知のコラーゲンスポンジとは異なり、コラーゲン材料の壁によって分離され実質的に完全に封入されている小室を積み重ねた三次元構造を有するコラーゲンスポンジを提供するという事実によって行われる。
【０１４３】
コラーゲンゲルは、哺乳類、トランスジェニック、または組換え型起源のI型、II型、またはIII型のような異なるタイプの材料を含んでもよいが、他の全てのタイプのコラーゲンを用いることができる。コラーゲンは、ウマ腱、ヒト腱、およびウシ腱からなる群より選択される腱からの材料を含んでもよい。コラーゲンゲルは、さらにもしくはまたは組換え型コラーゲン材料を含んでもよい。
【０１４４】
スポンジの単離部分のコラーゲン含有量は好ましくは、スポンジの乾燥重量に対して75％〜100％のような、80％〜100％のような、85％〜100％のような、90％〜100％のような、92％〜100％のような、92％〜98％のような、93％〜97％のような、94％〜96％のような50％〜100％である。
【０１４５】
コラーゲンゲルを調製する段階は、好ましくは以下の段階を含む：
−  腱を−10℃〜−30℃の温度で保存して、腱を剥離する、
−  腱から異物タンパク質を除去する、
−  腱における生殖細胞の含有量を減少させる、
−  腱を膨張させる、
−  膨張した腱をホモジナイズする。
【０１４６】
保存、剥離、タンパク質の除去、生殖細胞含有量の減少、および膨張段階は、原料を精製することを目的としており、ホモジナイズする段階は、ゲルの形でコラーゲンを得ることを目的としている。
【０１４７】
生殖細胞含有量を減少させる段階は好ましくは、乳酸のような有機酸のような酸を腱に加えることを含む。さらに、エタノールのようなアルコールのような有機溶媒を好ましくは腱に加える。さらに、腱を膨張させる段階は、好ましくは腱に乳酸を加える段階を含む。用いる乳酸は、0.45％乳酸のような0.40〜0.50％乳酸であってもよい。
【０１４８】
腱を膨張させる段階は、温度10℃〜20℃のような4℃〜25℃で、100〜200時間のような48〜200時間の間腱を保存することを含んでもよい。
【０１４９】
膨張した腱をホモジナイズする段階は、好ましくは、粒子サイズのコラーゲンゲル断片、すなわち直径約1 cmのような0.8〜1.2 cmの繊維球が得られるように行われる。さらに、コラーゲンゲルの物理的特徴は好ましくは先に記述したとおりである。例えば、鋸歯のある円板ミルまたは適当なホモジナイゼーション装置によって膨張した腱をホモジナイズする段階を行うことによって、適当な特徴を得てもよい。
【０１５０】
コラーゲンゲルに空気を混合する段階は、好ましくは以下の段階を含む：
−  コラーゲンフォームを作製するためにミキサーを用いて周囲の空気をゲルに混合する段階、
−  混合したゲルフォームを分画チャンネルに送る段階、
−  分画チャンネルに含まれるコラーゲンゲルとコラーゲンフォームとを分離する段階。
【０１５１】
分画チャンネルにおいてコラーゲンフォームから分離したコラーゲンゲルの少なくとも一部は、ミキサーに戻してもよい。その場合、分画チャンネルからミキサーに戻すコラーゲンゲルの量と、ミキサーに加える新鮮なコラーゲンゲルの量との比率は好ましくは0.1〜0.5である。コラーゲンゲルとコラーゲンフォームとを分離する段階は、以下の段階を含む：
−  分画チャンネルに含まれるコラーゲンフォームの選択した部分を分離する段階、
−  コラーゲンフォームの選択した部分を乾燥させるために分画チャンネルから送る。
【０１５２】
方法の好ましい態様において、分画チャンネルにおいて、温度20℃〜25℃のような15℃〜40℃を維持する。
【０１５３】
コラーゲンゲルに空気を混合した後、コラーゲンフォームを2〜4分間ホモジナイズしてもよい。
【０１５４】
コラーゲンフォームを乾燥させる段階およびその後に空気をコラーゲンゲルに混合する段階の前に、中和剤をコラーゲンフォームに加えてもよく、コラーゲンフォームを好ましくは、pH値が通常、2.5〜3.5からコラーゲンフォームにおけるpH値6.5〜8.5に達するように中和する。アンモニア溶液を含む中和剤を用いてもよく、コラーゲンフォームは好ましくは、10〜20時間、約24時間のような5〜30時間中和する。
【０１５５】
コラーゲンフォームを乾燥させる段階の前に、コラーゲンフォームは、好ましくは、充填の際にフォームの中に実質的に空気が入らないように乾燥容器に入れる。
【０１５６】
乾燥段階は好ましくは、乾燥コラーゲンスポンジを得るために、温度20℃〜40℃のような15℃〜60℃で、100〜150時間のような50〜200時間の間の乾燥を含む。乾燥段階は、700〜900 mbarのような、約800 mbarのような大気圧よりわずかに低い圧力で行ってもよい。
【０１５７】
前記の方法によって作製されたコラーゲンスポンジは、好ましくは以下の基準の少なくとも一つを満たす：
−  ｐＨ値が５．０〜６．０、
−  乳酸含有量が多くとも５％
−  アンモニア含有量が多くとも０．５％
−  アルブミン含有量として計算した可溶性タンパク質含有量が多くとも０．５％
−  硫酸塩の灰含有量が多くとも１．０％
−  重金属含有量が多くとも２０ｐｐｍ
−  微生物純度は多くとも１０３ＣＦＵ／ｇ−  コラーゲン含有量は７５％〜１００％
−  密度が２〜７ｍｇ／ｃｍ３のような１〜１０ｍｇ／ｍ３、
−  弾性係数は１０〜５０Ｎ／ｃｍ２のような５〜１００Ｎ／ｃｍ２。
【０１５８】
コラーゲンスポンジの一部を単離する段階は、切断によって多数の部分にコラーゲンスポンジを分ける段階を含んでもよい。得られた部分は、円錐形、断面が環状の円柱を含む円柱形、直角形、多角形、立方体、および平坦なシートのような如何なる所望の形状に成形してもよく、または適当な造粒法によって顆粒に成型してもよい。
【０１５９】
前記から明らかであるように、コラーゲンスポンジは、以下の段階を含む方法によって作製してもよい：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥する段階、
−  以下の特性を有するスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階、
−  弾性係数が５〜１００Ｎ／ｃｍ２の範囲である、
−  密度が１〜１０ｍｇ／ｃｍ３の範囲である、
小室の直径は０．７５ｍｍより大きく４ｍｍ未満であるか、または小室の平均直径は多くとも３ｍｍである。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
（図１〜図７）実施例VIIIにおいて考察するように、様々なコーティングされた担体
と、それを適用するための機器を開示する。
（図８）懸濁液の作製からコーティングされたコラーゲンスポンジの充填までの一連
のサブプロセスを説明する流れ図である。
（図９）懸濁液の粘度測定を得るために用いられる装置の図である。
（図１０および図１１）コラーゲンスポンジを得るためのプロセスを説明する流れ図
である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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