(57)【要約】  変性凝固により固体化された血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを含む担体、及び該担体に担持されたペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを含み、抗原提示細胞を強く刺激できる高い有効性を有し、かつ生体への毒性が軽減された安全性の高い免疫刺激剤として利用可能な複合体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性凝固により固体化された血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを含む担体、及び該担体に担持されたペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを含む複合体。
【請求項２】
ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクが実質的に未変性の状態又は変性した状態で担持されている請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクが血漿由来タンパク又は血清由来タンパクとともに変性凝固により固体化された状態で担持されている請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクがヘモグロビン又はミオグロビンである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
さらに１種又は２種以上の免疫刺激物質を担持させた請求項１ないし４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
免疫刺激物質が精製ツベルクリン、BCG菌抽出物、サイトカイン、トル様受容体リガンド、NOD様受容体アゴニスト、RIG様受容体アゴニスト、Cタイプレクチン受容体アゴニスト、環状GMP-AMPシンターゼに結合する外因性DNA、アラーミン、抗原、及び抗体よりなる群から選ばれる1ないし2以上の物質である請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１ないし６ののいずれか１項に記載の複合体を含む免疫刺激剤。
【請求項８】
請求項７に記載の免疫刺激剤とアルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿とを含む免疫刺激性組成物。
【請求項９】
アルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿がサイトカインを吸着させたヘパリン-アルブミンコアセルベート沈殿である請求項８に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１０】
サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン-2、及びインターフェロンガンマよりなる群から選ばれる1又は2以上の物質である請求項９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載の免疫刺激剤又は請求項８に記載の免疫刺激性組成物と、免疫反応抑制作用阻害物質との組み合わせを含む、疾病の治療及び/又は予防に用いるための医薬。
【請求項１２】
悪性腫瘍の治療及び／又は再発若しくは転移の予防に用いるための請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
免疫反応抑制作用阻害物質が免疫チェックポイント阻害剤である請求項１１又は１２に記載の医薬。
【請求項１４】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体 、抗PD-L2抗体 、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗TGF-β抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗TIM3抗体、抗CD96抗体、及び抗TIGIT抗体よりなる群から選ばれる1又は2以上の抗体である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
請求項７に記載の免疫刺激剤又は請求項８に記載の免疫刺激性組成物と、抗原との組み合わせを含む、疾病の予防のために用いるワクチン。
【請求項１６】
抗原が腫瘍抗原である請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
悪性腫瘍の治療及び／又は再発若しくは転移の予防に用いるための請求項１６に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫刺激剤に関する。より具体的には、変性凝固することにより固体化した血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを担体として含む免疫刺激剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫には、大別して自然免疫と獲得免疫の2種類があることが知られている。生体に炎症反応を引き起こす物質は主に自然免疫を刺激し、数分から数日の間に炎症反応を惹起する。以後は獲得免疫が誘導され、抗原となる物質に特異的な反応が起こる。その反応には主にB細胞による液性免疫反応(抗体産生)とT細胞による細胞性免疫反応(異常細胞の傷害除去)がある。ワクチンは、抗原を生体に投与し、免疫を刺激して感染症等の疾病を予防(場合によっては治療)するために使用される。また、免疫反応を惹起することを期待されている抗原の免疫刺激能力が弱い(抗原性が低い)場合、免疫アジュバントを免疫刺激補助のために添加して抗原に対する免疫反応を増強させることができる。【０００３】
免疫アジュバントは、抗原を吸着する・覆う・封じ込める・抗原と共有結合させる等、何等かの形で抗原と一体化していて、抗原が容易に体内で拡散・消失することのないように工夫されている。これらの工夫は、抗原が液性免疫反応又は細胞性免疫反応のどちらを惹起するとしても、抗原がいったん抗原提示細胞(樹状細胞、マクロファージ、単球、B細胞が知られている)に取り込まれ、細胞内で処理されなければならないことに対応している。処理された抗原は、主要組織適合遺伝子複合体(major-histocompatibility complex, 「MHC」と略す、以下同様)上に搭載されて抗原提示細胞表面に提示され、それがヘルパーT細胞に認識され、液性免疫反応又は細胞性免疫反応の誘導につながっていく。従って、免疫アジュバントは、抗原に対する免疫反応の誘導を期待するために、一般的には抗原とともに体外から投与されるか、又は体内の抗原のある局所に投与される。抗原を伴わずに(従って該抗原特異的免疫反応を惹起することは必ずしも期待せずに)一般的な免疫反応系の刺激作用を期待する物質群は、通常「生物反応修飾物質(biological response modifier, BRM)」として分類されており、著名なものにクレスチン、レンチナン、丸山ワクチンがある。【０００４】
抗原提示細胞に取り込まれ処理された抗原は、MHCのうちのclass II分子上に提示されたものは主にTh2型ヘルパーT細胞の活性化を経て成熟B細胞による抗原特異的な抗体産生を誘導する。抗体が液性免疫反応の主役である。また、MHCのうちのclass I分子上に提示されたものは主にTh1型ヘルパーT細胞の活性化を経て抗原特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)を増殖活性化させる。Th1型ヘルパーT細胞とCTLが細胞性免疫反応の主役である。液性免疫反応、細胞性免疫反応のいずれの場合も、ワクチン中の免疫アジュバントは一般に自然免疫を介して獲得免疫を増強すると理解されている(非特許文献1)。なお、本明細書中に引用した特許文献及び非特許文献中の記載の全てを参照により本明細書の開示として含める。【０００５】
外来生物による感染症対策としてのみならず、同一個体の体内に発生した腫瘍(がん腫を含む)をも、体内の免疫系の活性化によって治療しようという概念(Coley, 1891)が登場してからすでに100年を超えている。しかし、感染症ワクチンと同じ方式(すなわち、抗原と免疫アジュバントの組み合わせ)による腫瘍ワクチンでは、今日でも腫瘍治療において十分な成功を収めているとは言い難い。【０００６】
また、免疫反応系には、リンパ球の活性化を停止させる免疫チェックポイントがあり、この壁を乗り越えて免疫反応を強化する方法の開発が課題となっている。腫瘍の免疫療法としては、2014年7月に世界に先駆けて本邦で承認された抗PD-1抗体ニボルマブが知られている。この抗体医薬は免疫チェックポイントを阻害する作用により免疫反応を活性化する作用を有しており、メラノーマ、肺がん、腎がん等において高い有効性を発揮するとされる。しかしながら、有効ながんの種類は一部のがんに限定されており、おおよそ30％程度の症例において奏功するにとどまっている。また、例えば、脳腫瘍のうちの膠芽腫のように、従来型の手術・放射線治療・化学療法の全てを組み合わせた治療を行っても、術後再発予防でさえ非常に困難な難治性腫瘍があることから、免疫チェックポイント阻害剤のみならず、他の効果的な免疫反応の増強による腫瘍治療法の開発に期待する社会的ニーズは非常に大きい。【０００７】
免疫アジュバントの候補としては、自然免疫を惹起するpattern-recognition receptorsに結合する物質群がある。これらには、pathogen-associated molecular patternsとして知られる外因性のトル様受容体アゴニスト、NOD様受容体アゴニスト、RIG様受容体アゴニスト、内因性のアラーミンが挙げられる。他に、receptor of advanced glycation endproductに結合する物質群や、サイトカイン、ケモカイン等もあり、その種類は膨大である(非特許文献2)。【０００８】
これら免疫刺激物質群のうち、免疫アジュバントとしては、細菌由来のリポタンパク、リポペプチド、リポテイコリック酸、マイコバクテリア由来のリポグリカン、マイコプラズマ由来のリポタンパク、酵母由来のザイモザン、ポーリン、ウイルス2本鎖RNA、グラム陰性桿菌のリポポリサッカライド、リピッドA、モノフォスフォリルリピッドA、リポ多糖体、熱ショックタンパク、フラジェリン、ウイルス1本鎖RNA、イミダゾキノリン、細菌DNA、CpG DNA、ヘモゾリン、ウロパソジェニック細菌、プロフィリン、原虫のプロフィリン様タンパク等、他にサポニン、細菌トキシン等が比較的よく用いられる(非特許文献1)。作用に強弱はあるが、これらはすべて炎症誘導因子であり、サイトカインの産生に繋がる細胞内シグナルを惹起する。【０００９】
炎症誘導因子群のデリバリーシステムとしては、アルミニウム塩、油脂-水エマルジョン(乳化剤として界面活性剤を含む)、リポソーム、ヴィロゾーム、生物学的に分解可能な人造ポリマー小球、Immune stimulating complex (ISCOM)、スクアレン、アルファトコフェロール、粘膜デリバリーシステムが知られている(非特許文献1)。これらの他に、リン酸カルシウム(特許文献1)、シリカ(非特許文献3及び4)も知られている。また、サイトカインの中で免疫反応刺激能が高いものとして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が知られており(非特許文献5)、その他にもインターロイキン-12等(非特許文献6)がある。【００１０】
最も強力な免疫アジュバントとして知られているのは、フロイントの完全アジュバント(FCA)(流動パラフィン、界面活性剤、結核死菌の混合物)である(非特許文献3)。しかしながら、強烈な炎症誘導による毒性が強いため、今日では実験目的でしか使用されていない。腫瘍治療分野では、結核死菌を含まないフロイントの不完全アジュバント(IFA)(例えばMontanide ISA-51)が、がんペプチドワクチンの免疫アジュバントとして臨床的には使用が試みられているが(非特許文献7及び8)、IFAでも強い炎症反応を誘導し、皮下注射した場合に数ヶ月以上、ときとして年余に渡る長期の間、注射局所の発赤と腫脹が残ることが知られている。【００１１】
現在、感染症対策用ワクチンの組成物として最も臨床的に普及している免疫アジュバントは、アルミニウム塩又は水酸化アルミニウムである。しかしながら、液性免疫反応増強には優れているものの、細胞性免疫反応の誘導能が低いという問題がある(非特許文献4及び6)。【００１２】
腫瘍の治療や再発予防においては、自然免疫のみならず獲得免疫を刺激できたとしても、液性免疫反応誘導だけでは不十分であり、細胞性免疫反応誘導によるヘルパーT細胞(特にTh1型ヘルパーT細胞)及びCTLの活性化と、CTLによる殺腫瘍細胞作用が重要であることが広く知られている。このためにアルミニウム塩又は水酸化アルミニウムとは異なる特徴を持ち、細胞性免疫反応を特異的に活性化できる免疫アジュバントや免疫刺激剤が求められている。しかしながら、前述したFCAやIFAのように、各種の公知の免疫アジュバントのうち、細胞性免疫反応誘導能が高いものは炎症誘導による毒性も強い傾向があり、臨床的な応用が困難であるという問題がある。細胞性免疫反応増強に優れ、かつ、毒性が低く安全性の高い有用な免疫アジュバントは、十分に開発されているとは言えない。【００１３】
本発明者らは、細胞性免疫反応の誘導のためにアルブミン-ヘパリンコアセルベートの沈殿物にGM-CSF、インターロイキン-2(IL-2)、及び／又は精製ツベルクリンを結合させたものを免疫アジュバントとし、術後摘出ホルマリン固定自家肝がん組織断片を抗原とした自家がんワクチンを作製した。このワクチンは安全性が高く、肝がん患者18例に使用した場合に、National Cancer Institute - Common Toxicity Criteria v2.0, 1999に従うgrade 1〜2の自然治癒するレベルの有害事象しか示さず、grade 3〜4の重篤な有害事象を示した症例は1例もなかった。さらに、肝がんの術後再発予防効果が観察されており、有効性も確認されている(非特許文献9及び特許文献2)。【００１４】
また、術後摘出ホルマリン固定肝がん組織断片を抗原とし、免疫アジュバントとしてBCG菌抽出物(BCGext)を吸着させたもの、及びアルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿に精製ツベルクリンを含ませ架橋反応により固定したものに、さらに溶解している精製ツベルクリンを添加して自家肝がんワクチンとして用いることができるが、このワクチンにより肝がん特異的な抗原分子glypican 3に対するCTLの誘導がなされたことが肝がん症例で観察されている(非特許文献10)。【００１５】
ホルマリン固定自家膠芽腫組織断片を抗原とし、免疫アジュバントとしてBCGextを含有させたもの(特許文献3)、及びアルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿に精製ツベルクリンを架橋反応により固定したものに(特許文献4)、さらに溶解している精製ツベルクリンも添加混合して自家脳腫瘍ワクチンとして用いることができる。このワクチンにより、膠芽腫患者においては文献上の過去データから抽出した歴史対照群に比して術後全生存期間の延長が観察されている(非特許文献11、12、13)。これらの臨床試験でも、高い安全性が示されており、grade 3〜4の重篤な有害事象を示した症例はやはり1例もない。【００１６】
上述の自家脳腫瘍ワクチンでは、ホルマリン固定自家脳腫瘍組織が免疫刺激物質の担体として利用されていたが、腫瘍患者によっては、十分量の摘出腫瘍組織が利用できない場合も多い。そこで、ホルマリン固定腫瘍組織の代用となるものが必要とされ、鋭意探索されてきた。その開発過程において、アルブミンを無機固形物であるリン酸カルシウム沈殿に担持させたものや(特許文献1)、アルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿の形態にしたもの(特許文献4、5)など、基盤となる不溶性物質に担持させた形で溶解性の血清タンパクを固定化した形態が提案されている。これらの形態では、アルブミン分子自体は変性しておらず本来の分子形態を保っている状態となっている。前者ではリン酸カルシウム沈殿中にアルブミン分子が巻き込まれており、後者ではコアセルベート状態のままでタンパク分子間架橋剤により架橋されている。しかしながら、アルブミン分子自体をあらかじめ変性凝固した上でタンパク分子間架橋剤により架橋され固体化されたものが、抗原や免疫刺激物質の効果的な担体として作用することは従来知られていない。【００１７】
また、ヒトを含む動物の組織、細胞、及びこれらの成分からなる群から選ばれる固体化された材料から調製された不溶性微粒子を利用することができるが(特許文献6)、組織細胞外に分泌され血漿中に溶解しているタンパクを組織、細胞、及びこれらの成分として利用できることについては上記特許文献6に開示されておらず、そのような技術的な思想についても示唆ないし教示がない。血漿(又は血清)中に溶解しているタンパクそのものをあらかじめ分子レベルで変性凝固させ、タンパク架橋剤処理により不溶性固体としたものが免疫刺激物質の主要な担体あるいは組成物として(炎症誘導因子群のデリバリーシステムとして)用いることを示唆ないし教示する刊行物は見あたらない。【００１８】
周知のように、動物の組織、細胞、及びこれらの成分からなる材料を、異種動物に投与した場合、拒絶反応が生じる。該材料が加工され固体化された場合でも拒絶反応は発生すると推定されてきたため、該材料が容易に入手可能であっても、抗原性の極めて低いコラーゲン等の一部の材料を除き、ヒト臨床で広く応用されることはなかった。ヒト由来で、もともと溶解している血漿由来タンパクは比較的大量に入手可能であるが、それらタンパク分子を変性させ加工した場合、同種であるヒトに投与したとき拒絶反応を惹起するか否かについては、いままで詳細に検討されていない。そのような背景から、血漿由来タンパクを不溶性となるように加工して抗原や免疫刺激物質の担体として利用しようという技術的な思想について示唆ないし教示した文献はなく、そのようにして調製された担体がヒトに投与しても拒絶反応をほとんど惹起することなく抗原に対する獲得免疫の増強のために貢献できるとの示唆ないし教示をした文献も全く存在しない。さらには、抗原を同時に同所に投与せずに、分子レベルで変性凝固させ不溶性の固体とした血漿(又は血清)由来タンパクを主要な担体として免疫刺激物質を担持する免疫刺激剤のみで、すなわちBRMとして、生体を刺激し、一般的な免疫反応を強化しようとする試みも従来なされていない。【００１９】
一方、IV型アレルギー反応(遅延型アレルギー、細胞性免疫、ツベルクリン型とも呼ばれている)を誘導する代表的物質であるツベルクリンは、ヒトに繰り返し投与しても極めて安全であることが知られている(非特許文献14)。IV型アレルギー反応では、細胞性免疫反応が誘導されており、しかも液性免疫反応の主役である抗体や補体は関与しない(非特許文献15)。ただし、精製したツベルクリンは水溶性であり、そのまま体内に投与しても速やかに拡散消失してしまうという問題がある。また、精製ツベルクリンは腫瘍抗原ではないため、それを単独で使用しただけでは腫瘍の再発予防・治療効果は期待できないと考えらている。【００２０】
精製ツベルクリンはガラス容器に吸着しやすいが、その吸着は血清アルブミンで防ぐことができるため、精製ツベルクリンは血清アルブミンに強く吸着すると理解されている(非特許文献16及び17)。しかしながら、分子レベルで血清アルブミンを変性凝固させタンパク架橋剤処理することによりアルブミンを不溶性固体とした場合にも、精製ツベルクリンに対して十分な吸着能を有するか否かは従来知られていない。また、このようなアルブミンの不溶性固体に吸着させた精製ツベルクリンによる抗原提示細胞の刺激性の変化についても従来全く検討されておらず、同様に、アルブミン等の血漿(又は血清)由来タンパクを不溶性固体とし、それに精製ツベルクリン以外の免疫刺激性物質を担持させた場合についても、免疫担当細胞の刺激性に変化をもたらすか否かは従来検討されていない。【００２１】
さらに、ヘモグロビンは、通常は血漿中に溶解しておらず、溶血反応を起こした場合に赤血球外に出て血漿中に表れるが、このヘモグロビンにペルオキシダーゼ様活性があることが広く知られている。しかしながら、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性を利用した免疫刺激剤は従来知られていない。ヘモグロビン類似のヘムタンパクであるミオグロビン、チトクローム、及びカタラーゼもペルオキシダーゼ様活性を有するが、これらのヘムタンパクのペルオキシダーゼ様活性を利用した免疫刺激剤も従来は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】特許第4569946号
【特許文献２】特許第4688254号
【特許文献３】特許第5579586号
【特許文献４】特許第3492671号
【特許文献５】特許第4238279号
【特許文献６】特許第4176021号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】堺春美、臨床とウイルス, 41(5):1-9, 2013.
【非特許文献２】ブログ：EARLの医学ノート、http://drmagician.exblog.jp/16073684
【非特許文献３】Stills HF, Jr. Adjuvants and antibody production: Dispelling the myths associated with Freund’s complete and other adjuvants. ILAR Journal, 46:280-293, 2005.
【非特許文献４】Kuroda E, Coban C, Ishii KJ. Particulate adjuvant and innate immunity: Past achievements, present findings, and future prospects. Intern. Rev. Immunol., 32:209-220, 2013.
【非特許文献５】Disis ML, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines. Blood, 88:202-210, 1996.
【非特許文献６】石井健、アジュバント開発研究の新展開、第9回厚生科学審議会予防接種・ワクチン分科会研究開発及び生産・流通部会  資料1、平成27年1月30日.
【非特許文献７】Yutani S, et al. Phase II study of personalized peptide vaccination with both a hepatitis C virus-derived peptide and peptides from tumor-associated antigens for the treatment of HCV-positive advanced hepatocellular carcinoma patients. J. Immunol. Res., Article ID 473909, 2015. http://www.hindawi.com/journals/jir/2015/473909/
【非特許文献８】Hashimoto N, et al. Wilms tumor 1 peptide vaccination combined with temozolomide against newly diagnosed glioblastoma: safety and impact on immunological response. Cancer Immunol. Immunother., 64:707-16, 2015.
【非特許文献９】Kuang M, et al. Phase II randomized trial of autologous formalin-fixed tumor Vaccine for Postsurgical recurrence of Hepatocellular Carcinoma. Clin. Cancer Res., 10:1574-1579, 2004.
【非特許文献１０】Kawashima I, et al. Suppression of postsurgical recurrence of hepatocellular carcinoma treated with autologous formalin-fixed tumor vaccine, with special reference to glypican-3. Clinical Case Reports, 3: 444-447, 2015.
【非特許文献１１】Ishikawa E, et al. A clinical trial of autologous formalin-fixed tumor vaccine for glioblastoma multiforme patients. Cancer Sci., 98:1226-1233, 2007.
【非特許文献１２】Muragaki Y, et al. Phase I / IIa Trial of Autologous Formalin-fixed Tumor Vaccine Concomitant with Fractionated Radiotherapy for Initially-Diagnosed Glioblastoma. J. Neurosurg., 115:248-255, 2011.
【非特許文献１３】Ishikawa E, et al. Phase I/IIa trial of fractionated radiotherapy, temozolomide, and autologous formalin-fixed tumor vaccine for newly diagnosed glioblastoma. J. Neurosurg., 121:543-553, 2014.
【非特許文献１４】Kunins HV, et al. Validity of a self-reported history of a positive tuberculin skin test - A prospective study of drug users. J. Gen. Intern. Med., 19:1039-1044, 2004.
【非特許文献１５】厚生労働省ホームページ、アレルギー総論第1章. http://www.mhlw.go.jp/new-info/kobetu/kenkou/ryumachi/dl/jouhou01-17.pdf
【非特許文献１６】Guld J. Standardization and stability of purified tuberculin, American Review of Respiratory Disease, 80(2), pp. 255-256, 1959.
【非特許文献１７】Landi S, Held HR, Tseng MC. Evaluation of various substances to prevent adsorption of tuberculin purified protein derivative (PPD) to glass surfaces. Bull. Org. mond. Sant. ull. Wld. Hlth. Org., 43:91-106, 1970.
【非特許文献１８】Kurosaka K, Watanabe N, Kobayashi Y. Production of proinflammatory cytokines by phorbol myristate acetate-treated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages after phagocytosis of apoptotic CTLL-2 cells. J. Immunol., 161:6245-6249, 1998.
【非特許文献１９】Hu PQ, et al. Escherichia coli expressing recombinant antigen and listeriolysin O stimulate class I-restricted CD8+ T cells following uptake by human APC. J. Immunol., 172:1595-1601, 2004.
【非特許文献２０】Brett SJ, Rhodes J, Liew FY, Tite JP. Comparison of antigen presentation of influenza A nucleoprotein expressed in attenuated AroA- Salmonella typhimurium with that of live virus. J. Immunol., 150:2869-2884, 1993.
【非特許文献２１】Oliveira MM, Charlab R, Pessolani MC. Mycobacterium bovis BCG but not Mycobacterium leprae induces TNF-alpha secretion in human monocytic THP-1 cells. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz., 96(7):973-978, 2001.
【非特許文献２２】Gordon S. The macrophage: past, present and future. Eur. J. Immunol., 37: Suppl 1:S9-17, 2007.
【非特許文献２３】Chang ZL. Recent development of the mononuclear phagocyte system: in memory of Metchnikoff and Ehrlich on the 100th Anniversary of the 1908 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biol. Cell., 101(12):709-721, 2009.
【非特許文献２４】Cho YS, et al. Deciphering the proteome of the in vivo diagnostic reagent “purified protein derivative” from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics, 12(7): 979-991, 2012. doi:10.1002/pmic.201100544.
【非特許文献２５】Najjam S, et al. Further characterization of the binding of human recombinant interleukin 2 to heparin and identification of putative binding sites. Glycobiology, 8:509-516, 1998.
【非特許文献２６】DAKO Educational IHC Guidebook, Immunohistochemical Staining Methods, Sixth Edition, Chapter 15, ed. Tayor CR and Rudbeck L, 2013. http://www.dako.com
【発明の概要】
【本発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の課題は、抗原提示細胞を強く刺激できる高い有効性を有し、かつ生体への毒性が軽減された安全性の高い免疫刺激剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、アルブミン等の血漿由来タンパクなどを変性凝固させて固体化した材料を生体に投与しても拒絶反応を惹起しないことを確認したが、一方で、そのように変性凝固により固体化されたアルブミン等を含む担体にヘモグロビンなどのペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを担持させた複合体が、高い免疫刺激能を有することを見いだした。さらに、上記担体が精製ツベルクリン等の免疫刺激物質に対する高い吸着性を維持していることも見いだし、上記の複合体に精製ツベルクリン等の免疫刺激物質を担持させることにより、さらに強力な免疫刺激能を達成できることを見いだした。本発明はこのような知見を基にして完成されたものである。【００２６】
すなわち、本発明者により、以下の発明が提供される。
[1]  変性凝固により固体化された血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを含む担体、及び該担体に担持されたペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを含む複合体。
[2]  ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクが実質的に未変性の状態又は変性した状態で担持されている上記[1]に記載の複合体。
[3]  ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクが血漿由来タンパク又は血清由来タンパクとともに変性凝固により固体化された状態で担持されている上記[1]に記載の複合体。
[4]   ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクがヘモグロビン又はミオグロビンである上記[1]ないし[3]のいずれか1項に記載の複合体。
[5]  さらに1種又は2種以上の免疫刺激物質を担持させた上記[1]ないし[4]のいずれか1項に記載の複合体。
[6]  免疫刺激物質が精製ツベルクリン、BCG菌抽出物、サイトカイン、トル様受容体リガンド、NOD様受容体アゴニスト、RIG様受容体アゴニスト、Cタイプレクチン受容体アゴニスト、環状GMP-AMPシンターゼに結合する外因性DNA、アラーミン、抗原、及び抗体よりなる群から選ばれる1ないし2以上の物質である上記[5]に記載の複合体。【００２７】
[7]  上記[1]ないし[6]のいずれか1項に記載の複合体を含む免疫刺激剤。
[8]  上記[7]に記載の免疫刺激剤とアルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿とを含む免疫刺激性組成物。
[9]  アルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿がサイトカインを吸着させたヘパリン-アルブミンコアセルベート沈殿である上記[8]に記載の免疫刺激性組成物。
[10]  サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン-2、及びインターフェロンガンマよりなる群から選ばれる1又は2以上の物質である上記[9]に記載の免疫刺激性組成物。【００２８】
[11]  上記[7]に記載の免疫刺激剤又は上記[8]に記載の免疫刺激性組成物と、免疫反応抑制作用阻害物質との組み合わせを含む、疾病の治療及び/又は予防に用いるための医薬。
[12]  悪性腫瘍の治療及び/又は再発若しくは転移の予防に用いるための上記[11]に記載の医薬。
[13]  免疫反応抑制作用阻害物質が免疫チェックポイント阻害剤である上記[11]又は[12]に記載の医薬。
[14]  免疫チェックポイント阻害剤が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体 、抗PD-L2抗体 、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗TGF-β抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗TIM3抗体、抗CD96抗体、及び抗TIGIT抗体よりなる群から選ばれる1又は2以上の抗体である、上記[13]に記載の医薬。【００２９】
[15]  上記[7]に記載の免疫刺激剤又は上記[8]に記載の免疫刺激性組成物と、抗原との組み合わせを含む、疾病の予防のために用いるワクチン。
[16]  抗原が腫瘍抗原である上記[15]に記載のワクチン。
[17]  悪性腫瘍の再発若しくは転移の予防に用いるための上記[16]に記載のワクチン。
[18]  ヒトを含む哺乳類動物において免疫を活性化する方法であって、上記[7]に記載の免疫刺激剤又は上記[8]に記載の免疫刺激性組成物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法。
[19]   ヒトを含む哺乳類動物において疾病、好ましくは悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法であって、上記[7]に記載の免疫刺激剤又は上記[8]に記載の免疫刺激性組成物と、免疫反応抑制作用阻害物質との組み合わせの有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法。
[20]  ヒトを含む哺乳類動物において悪性腫瘍の再発若しくは転移を予防する方法であって、上記[7]に記載の免疫刺激剤又は上記[8]に記載の免疫刺激性組成物と抗原との組み合わせの有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法。
【発明の効果】
【００３０】
変性凝固により固体化された血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを含む担体、及び該担体に担持されたペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを含む本発明の複合体、好ましくはペルオキシダーゼ様活性を有するヘモグロビンなどのタンパクがアルブミンなどの血漿由来タンパク又は血清由来タンパクとともに変性凝固により固体化された状態で担持されている上記の複合体は免疫刺激作用を有しており、抗原提示細胞を効果的に刺激できることから、腫瘍などの疾病に対する治療のほか、悪性腫瘍の術後再発や転移の予防のための免疫刺激剤として有用である。さらに好ましい態様では、精製ツベルクリンなどの免疫刺激物質を担持させることによって強力な免疫刺激剤として利用できる。【００３１】
本発明により提供される免疫刺激剤は安全であり、ヒト臨床で使用されるCommon Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) version 4.0(日本臨床腫瘍研究グループより日本語訳JCOG版が発表されている)でいうgrade 3以上の問題となる有害事象を惹起せず、臨床的に安全に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】例1のサンプル2(変性凝固固体化血漿担体)、サンプル3(変性凝固固体化血漿担体に未変性ヘモグロビンを吸着させたもの) 、サンプル4(変性凝固固体化血漿担体に未変性ミオグロビンを吸着させたもの)に抗原提示細胞刺激作用があることを示した図である。
【図２】例2のサンプル2〜5(アルブミンとヘモグロビンを混合して変性凝固固体化した担体：変性凝固固体化ヘモグロビン/アルブミン微粒子(HAMP))の抗原提示細胞の刺激活性を示した図である。
【図３】例3において、HAMPのヘモグロビンに由来するペルオキシダーゼ様活性が抗原提示細胞にする刺激作用に関与していることを示した図である。
【図４】HAMPの精製ツベルクリン(PPD)に対する吸着能を示した図である。
【図５】PPD又はhGM-CSFなどの免疫刺激物質を吸着させたHAMPによる抗原提示細胞の刺激作用を示した図である。
【図６】BCG菌抽出物(BCGext)を吸着させたHAMPによる抗原提示細胞の刺激効果を示した図である。
【図７】BCG菌抽出物(BCGext)を吸着させたHAMPで刺激した抗原提示細胞からTNFα(図中ではTNFと表示)とともにGM-CSFが同時に産生されていることを示した図である。
【図８】HAMPの抗体に対する吸着能を示した図である。
【図９】HAMPの抗体に対する吸着能を示した図である。
【図１０】PPDを担持させたHAMPの安全性(マウス体重変化)を示した図である。
【図１１】PPDを担持させたHAMPの安全性(臓器重量変化)を示した図である。NS(not significant)は有意差が認められなかったことを示す。
【図１２】がん抗原と免疫刺激剤とを混合したがんワクチンによる抗腫瘍効果を示した図である。
【図１３】がん抗原と免疫刺激剤とを混合したがんワクチンによる抗腫瘍効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の免疫刺激剤は、血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを変性凝固して固体化した担体、望ましくは架橋剤処理によってより安定な固体状態とした固体化した担体に対して、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを担持させた複合体の形態を有しており、さらに、免疫刺激物質を担持させた形態でも使用することができる。本発明の免疫刺激剤は、そのままで体内に投与するBRMとして使用することができるが、抗原とともに生体に投与するための免疫アジュバントとして使用することもできる。
【００３４】
本明細書において、「免疫刺激剤」及びその類義語(例えば「免疫刺激作用」など)は、特定の抗原に対する特異的な免疫反応の直接的な刺激作用を有するもののほか、抗原の有無にかかわらず、抗原非特異的な免疫反応に対しても間接的な刺激作用を示すものを含めて、最も広義に解釈しなければならない。
【００３５】
「免疫刺激剤」には、(a)抗原とともに用いられ該抗原に対する特異的免疫反応の強化を期待する「免疫アジュバント」、及び(b)抗原を伴わずに用いられ、免疫能の一般的な賦活のために用いられるBRMなどが包含される。また、(b)には、(b-1)免疫反応経路を一部でも直接的に刺激する「免疫反応促進剤」、及び(b-2)免疫反応経路の阻害による免疫反応抑制作用を逆に阻害する作用によって間接的に免疫刺激をする「免疫反応抑制作用阻害剤」が含まれる。本発明の免疫刺激剤は、(a)及び(b-1)として使用できるほか、「免疫反応抑制作用阻害剤」を担持させた形態では(b-2)として使用することができる。
【００３６】
本発明者らは、血漿又は血清中に溶解しているアルブミンなどのタンパク(血漿由来タンパク又は血清由来タンパク変性)を分子レベルで変性凝固させ、固体化して不溶性の担体を調製し、この担体にペルオキシダーゼ様活性を有するヘモグロビンやミオグロビンなどのタンパクを担持させることにより得られる複合体が免疫刺激剤として有用であること、及びさらにこの複合体に精製ツベルクリン等の免疫刺激性物質を担持させることにより、免疫反応の起点となる抗原提示細胞によるサイトカイン(tumor necrosis factor alpha：TNFα)などの産生をより強く促進するという効果を有することを見出した。
【００３７】
本発明により提供される変性凝固により固体化された血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを含む担体は、アルブミンなどの血漿由来又は血清由来タンパクを変性凝固させて固体化することにより得られ、一般的には70μm以下の粒径を有する水不溶性の微粒子の形態で提供される。
【００３８】
本来水溶解性である血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを分子的に変性凝固させて固体化し、好ましくは微粒子状の形態の担体とする方法は特に限定されず、当業者に知られている方法であればいかなる方法を用いてもよい。変性凝固のための手段としては、例えば、熱変性、酸処理、有機溶媒処理、又は界面活性剤処理等が当業者には周知されており、これらの処理を単独で、又は2種以上の処理を組み合わせて用いることができる。例えば、加熱によりタンパク分子を変性させて凝固させる方法を採用する場合には、例えば、100℃以上での加熱処理を採用することができるが、この温度範囲に限定されるものではない。また、微粒子の形態の担体を調製する方法も特に限定されず、当業者が利用可能な方法であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、変性凝固により得られた固体を機械的に摩砕し、適切な孔径を持つメッシュやフィルターなどをを通過させて、所望の粒子径を有する微粒子状の担体を調製することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３９】
この微粒子形態の固体を免疫刺激剤の担体として使用する形態では、一般的には、固体化された微粒子形態の担体が水性溶媒中で可溶化することは望ましくないので、得られた微粒子状の固体から可溶性部分を除去して、不溶性の固体として残留するものを担体として使用することができる。このような目的で、必要に応じて固体化された担体を水のほかエタノールやアセトンなどの親水性溶媒で洗浄してもよい。
【００４０】
別の態様では、固体化された担体をタンパク分子間架橋剤で処理し、より安定化した不溶性の固体として担体を調製することもできる。タンパク分子間架橋剤の種類は特に限定されず、当業者に周知のものを周知の方法で用いることができる。例えば、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、又は1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)などを使用することができる。例えば10％中性ホルマリン液に室温にて3日間以上にわたり浸漬させる方法などが好ましい。また、例えばEDCを水溶液とし、終濃度 0.8〜1.5 mg/ml になるようにボルテックスミキサーで混ぜながら加え、その後、室温で15分間静置することにより、固体化された担体中のタンパク分子間に十分安定な架橋が形成される。もっとも、架橋形成の手段は、上記の特定の条件又は特定のタンパク分子間架橋剤に限定されるものではない。上記のようにして得られる免疫刺激剤、好ましくは十分に架橋処理された免疫刺激剤は、水で洗浄しても溶解することはなく、本発明の免疫刺激剤における担体として好適に用いることができる。
【００４１】
本発明により提供される変性凝固により固体化された血漿由来タンパク又は血清由来タンパクを含む担体には、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを担持させることができる。このタンパクは、実質的に未変性の状態で担体に担持されていてもよいが、変性した状態で担体に担持されていてもよい。ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクとしては、例えばヘムタンパクを用いることができ、より具体的には、ヘモグロビンのほか、ミオグロビン、チトクローム、カタラーゼ等を用いることができる。
【００４２】
該担体にペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを担持させる方法は特に限定されず、該担体に対してペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクが十分な強度で担持され、両者が一体化した状態を達成できるものであれば、任意の方法を採用することができる。例えば、担持させるための手段として吸着反応を用いてもよい。吸着の用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈しなければならない。上記の担体に対して、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを吸着させることにより、該タンパクを実質的に未変性の状態で担体に担持させた状態の複合体を調製することができる。また、担持させるための別の手段として、架橋剤などの化学的手段を用いた処理により、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクが実質的に変性しない状態で維持しつつ、該担体に対して共有結合により固定化することもできる。
【００４３】
また、変性した状態でもヘモグロビン等のヘムタンパクはペルオキダーゼ様活性を有する場合があることから、上記担体には、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクを変性した状態で担持させてもよい。例えば、アルブミン等の血漿由来又は血清由来タンパクを変性凝固により固体化するにあたり、該タンパクとペルオキシダーゼ様活性を有するヘモグロビンなどのタンパクを混合などの手段により共存させておき、共に変性した状態の血漿由来又は血清由来タンパクとペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクとを含む固体を調製することもできる。本明細書において「担持」の用語は、上記のようにペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクが、担体を形成するアルブミン等のタンパクとともに変性して、両者が一体化して固体化している状態を包含しており、いかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈しなければならない。
【００４４】
血漿由来又は血清由来タンパクとしてアルブミンを用い、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクとしてヘモグロビンを用いて、これらのタンパクを混合した状態で変性させることにより得られる固体状の複合体は本発明の好ましい態様であり、ヘモグロビンを血清アルブミンに混和し、熱変性凝固させホルマリン固定処理をした上で微粒子化したもの(HAMP: hemoglobin-albumin-microparticle)は本発明の特に好ましい態様である。この微粒子の粒径は特に限定されないが、例えば、200〜0.01μmの範囲である。好ましくは、通常70μmの孔径のメッシュ又はフィルターを通過できる粒子径が好ましいが、特定のサイズに限定されるものではない。なお、タンパク分子間架橋剤が十分量存在する水性溶媒中では、いかなる生物も生存できないことが当業者には広く知られており、仮に、未知の有害な生物が原料の血漿由来又は血清由来タンパク中に含まれていたとしても、タンパク分子間架橋剤処理(代表例としては、10％中性ホルマリン液に漬けるだけの処理)によって無生物化が可能であることから、上記の処理により本発明の免疫刺激剤の安全性を高めることができる。
【００４５】
上記の複合体は、それ自体で免疫刺激作用を有することから免疫刺激剤として使用することが可能であるが、例えば、精製ツベルクリンなどの免疫刺激物質の1種又は2種以上をさらに担持させた状態で免疫刺激剤として使用することもできる。例えば、精製ツベルクリンとしては、例えば精製ツベルクリンの全タンパクを用いることができるほか、当業者に周知の方法でツベルクリンから調製した可溶性タンパクの全部又はその一部を用いることができる。上記の複合体に対して担持させる免疫刺激物質の比率は特に限定されず、例えば、上記複合体に対して吸着させることができる範囲内の量で、適宜の比率を選択することが可能である。免疫刺激物質としては、精製ツベルクリンのほか、例えば、BCG菌抽出物、サイトカイン、トル様受容体リガンド、NOD様受容体アゴニスト、RIG様受容体アゴニスト、Cタイプレクチン受容体アゴニスト、環状GMP-AMPシンターゼに結合する外因性DNA、アラーミン、抗原、及び抗体などを用いることもできる。
【００４６】
吸着以外の担持方法として、例えばアルブミン等の血漿由来又は血清由来タンパクと、ペルオキシダーゼ様活性を有するヘモグロビンなどのタンパクと、さらに免疫アジュバント活性のある免疫刺激物質として例えば精製ツベルクリンなどの可溶性タンパクとをあらかじめ混合しておき、この混合物から上記と同様に変性凝固して固体化された複合体を得ることにより、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクとアジュバント活性のある精製ツベルクリン可溶性タンパクなどの免疫刺激物質とが血漿由来又は血清由来タンパクに担持された免疫刺激剤を製造することができる。
【００４７】
また、ペルオキシダーゼ様活性を有するタンパクとアジュバント活性のある精製ツベルクリン可溶性タンパクなどの免疫刺激物質とを含む上記の免疫刺激剤に対して、不溶性のタンパクをさらに担持させた免疫刺激剤としてもよい。不溶性タンパクとしては、例えば生分解性の不溶性タンパクを用いることができ、より具体的にはコラーゲンなどを用いることができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。この態様においては、生体内で分解される不溶性タンパクであれば、いかなるものも用いることができる。
【００４８】
本発明の免疫刺激剤は、アルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿と組み合わせた免疫刺激性組成物として用いることもできる。アルブミン-ヘパリンコアセルベート沈殿としては、例えば、サイトカインを吸着させたヘパリン-アルブミンコアセルベート沈殿を用いることができ、サイトカインとしては、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-2(IL-2)、及びインターフェロンガンマ(IFNγ、本明細書中で「IFNg」と表示する場合がある)よりなる群から選ばれる1又は2以上の物質を用いることができるが、これらに限定されることはない。
【００４９】
本発明の免疫刺激剤を疾病の治療及び/又は予防のために使用する場合には、薬理学的に許容可能な担体、賦形剤、添加物などと混合して製剤化し、医薬組成物としてヒトを含む哺乳類動物に投与することができる。本発明の免疫刺激剤が精製ツベルクリンなどの免疫刺激物質を担持していない場合には、別に製剤化された精製ツベルクリンなどの免疫刺激物質を使用時に混合して同時に投与することができる。あるいは、両者を別々に同一ヶ所に投与し生体内の同一局所において共存するように処置を行ってもよい。また、本発明の免疫刺激剤が1種又は2種以上の免疫刺激物質を担持する場合には、担持されている免疫刺激物質とは異なる種類の免疫刺激物質を使用時に混合して同時に投与することができる。あるいは、両者を別々に同一ヶ所に投与し生体内で共存するように処置を行ってもよい。
【００５０】
本発明の免疫刺激剤は、一般的な免疫アジュバントとして使用できる。単純に抗原と混合して、ヒトを含む哺乳類動物の体内に投与することにより該抗原に対する全身性免疫反応を誘導することができる。その抗原が腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、及び／又は腫瘍抗原ペプチドである場合は、腫瘍ワクチンとして利用できる。例えば、患者から分離したがん細胞溶解物(ライセート)と本発明の免疫刺激剤とを混合して患者に注射すれば、患者の体内においてその特定のがん細胞に対する抗腫瘍免疫反応を誘導できる。また同様に、その抗原が感染症を惹起する微生物由来である場合は、通常の感染症予防ワクチンとして使用できる。もっとも、本発明の免疫刺激剤の使用方法は上記のものに限定されることはなく、免疫アジュバントを用いる通常の形態のいずれの方法を用いてもよい。
【００５１】
さらに、患者の生体内において腫瘍組織を物理的手段によって変性させた後、その変性組織内に本発明の免疫刺激剤を投与することにより、変性腫瘍組織内にある腫瘍抗原と本発明の免疫刺激剤がその局所で共存する状態となり、患者の生体内に生残している腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫反応を誘導するin situ vaccinationが可能となる。腫瘍組織変性のための物理的手段は特に限定されないが、例えば、マイクロウエーブ照射、ラジオフリークエンシー凝固法、凍結凝固法、電気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、レーザー光照射、又は超音波破壊等の手段を単独で、又は2種以上を適宜組み合わせて採用することができる。もっとも、これらに限定されるものではなく、腫瘍組織内にある腫瘍細胞の細胞死を誘導することができる手段であればいかなるものを用いてもよい。
【００５２】
例えば、腫瘍組織をマイクロウエーブ照射により加熱凝固し、その凝固組織内に本発明の免疫刺激剤を投与すると、当該腫瘍組織内部やその周辺に生残している腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫反応を誘導できる。本発明の免疫刺激剤を投与するに際して、さらに精製ツベルクリン溶液や、免疫反応を刺激するサイトカイン、あるいはサイトカイン徐放製剤を同時に投与することも好ましい。もっとも、本発明の免疫刺激剤の投与方法は上記の態様に限定されるものではなく、当該変性腫瘍組織に集まってくる抗原提示細胞に本発明の免疫刺激剤が変性腫瘍組織に含まれる腫瘍抗原とともに取り込まれるか、又は本発明の免疫刺激剤が抗原提示細胞を直接刺激できる環境を与えるものであれば、いかなる方法を採用してもよい。
【００５３】
また、あらかじめ本発明の免疫刺激剤と免疫担当細胞とを体外で混合してから患者の体内に投与し、生体内における免疫反応を刺激することもできる。免疫担当細胞としては例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、Bリンパ球、Tリンパ球、又はナチュラルキラー細胞などを好ましく用いることができるが、これらに限定されるものではない。上記の手法において2種以上の免疫担当細胞を組み合わせて用いてもよい。
【００５４】
別の観点からは、本発明の免疫刺激剤を免疫アジュバントとして含むワクチンが提供される。ワクチンは疾病要因物質である抗原、好ましくは病原微生物など外来生物由来の抗原やウイルス抗原、あるいは腫瘍抗原とともに投与することができるが、さらに免疫担当細胞を同時に混合してもよい。抗原としては、患者本人由来のものが好ましいが、他家由来の同一種類の抗原を用いることもできる。例えば、他の患者から採取した腫瘍組織及び/又は腫瘍細胞を混合して用いることも可能であり、このようにして得たワクチンを腫瘍患者に投与することにより悪性腫瘍などの腫瘍を治療することができる。また、上記ワクチンにより、腫瘍の治療において必要とされる細胞性免疫反応を効果的に刺激できるため、例えば悪性腫瘍の転移や術後再発を予防することが可能になる。
【００５５】
好ましい態様では、本発明の免疫刺激剤に免疫チェックポイント阻害抗体などの免疫反応抑制作用物質を担持させることもでき、このような態様においては、さらに効果的に悪性腫瘍の治療のほか、悪性腫瘍の予防や転移予防などを目的として免疫刺激剤又は腫瘍ワクチンとして使用することができる。免疫チェックポイント阻害抗体としては、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体 、抗PD-L2抗体 、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗TGF-β抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗TIM3抗体、抗CD96抗体、及び抗TIGIT抗体よりなる群から選ばれる1又は2以上の抗体を用いることができるが、これらに限定されることはない。
【００５６】
一般に、生体内に自然発生する腫瘍細胞に含まれる腫瘍抗原は抗原性が低く、生体内で抗腫瘍免疫反応を惹起できないことが多く、それゆえに腫瘍が増殖することが当業者には広く知られている。本発明の免疫刺激剤を免疫アジュバントとして利用することにより、上記のように抗原性が低い腫瘍抗原に対して有効な抗腫瘍免疫反応を誘導できる。同様に、生体由来で抗原性が低い他の疾病要因物質であっても、本発明の免疫刺激剤を免疫アジュバントとして利用することにより、そのような抗原性が低い疾病要因物質に対しても免疫反応を誘導できる。
【００５７】
さらに、本発明の免疫刺激剤を用いると、抗原提示細胞を刺激し、抗原提示細胞の生存維持・増殖に必要とされるGM-CSFを抗原提示細胞自身から放出させることができる。従って、GM-CSFがオートクライン細胞成長因子として作用する該抗原提示細胞自身、及びパラクライン細胞成長因子として作用する近隣の抗原提示細胞群の活性化とその活性化状態の維持が可能である。これは、生体の免疫能力を底上げするBRMの性質の一つであることから、本発明の免疫刺激剤はBRMとして有用である。
【００５８】
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
本発明における用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を用いて行っている。【００６０】
【表１】
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【００６１】
例1：変性凝固固体化血漿を含む担体の調製、及び未変性ヘモグロビン吸着複合体又は未変性ミオグロビン吸着複合体による抗原提示細胞の刺激効果
ヒトマクロファージ様細胞株THP-1は、培養下でPhorbol 12-Myristate 13-Acetate(PMA)を作用させて分化誘導すると、貪食能を示すのみならず(非特許文献18)、抗原提示能も獲得し、抗原提示細胞となることが知られている(非特許文献19)。また、この細胞をサイトカインであるヒトインターフェロンガンマ(IFNg)で前処理すると、T細胞への抗原提示能が増強される(非特許文献20)。分化し貪食をしたTHP-1細胞はTNFαを産生する(非特許文献21)。TNFαの産生はマクロファージ(ないし、抗原提示細胞)が活性化したことを示しており、体内におけるマクロファージ(ないし、抗原提示細胞)の活性化は、それに続く炎症反応及び免疫反応の起点になっていることが知られている(非特許文献22、23)。【００６２】
従って、THP-1細胞を抗原提示細胞に分化誘導した後に、何等かの固形物を貪食させ、産生されるTNFα量を測定すれば、該固形物の体内における炎症反応及び免疫反応の刺激作用を体外における細胞培養系において測定できる。【００６３】
(1)バイオアッセイ用サンプルの調製方法
成人のボランティアより常法によりヘパリン添加血液として採血し、常法の遠心法によって血漿を得た。この2.25mLを110℃、5分間熱処理し凝固させた後、スパーテルで大まかに破砕した。ここに市販の10％中性緩衝ホルマリン液を20mL加え、3日間室温で放置しホルマリン固定した。固定破砕物を生理食塩液で洗浄後、マイクロチューブをセットできる汎用の組織破砕機(Tissue Lyser II, Qiagen社製)にて10分間破砕処理した。微粒子化した断片を70μmの孔径のメッシュを通過させ、十分量の生理食塩液で遠心洗浄し、さらにエタノールに漬けて殺菌、再び十分量の生理食塩液で遠心洗浄した。卓上遠心機で3000rpm(最大加速度1580G)で15分間遠心沈殿させた断片の容量割合が25v/v％になるように、生理食塩液を適量加えて懸濁し、バイオアッセイ用サンプル2「変性凝固固体化血漿担体懸濁液」とした。【００６４】
また、ヒトヘモグロビン(SIGMA社製、H7379-5G)又はウマミオグロビン(SIGMA社製、M0630)を精製水で4w/v％となるように懸濁、室温で2時間撹拌して溶解、3000rpmで15分間遠心して不溶成分を除去し、さらに上清を0.22μの孔径のメンブレンフィルターでろ過滅菌した。この溶液36μLと変性凝固固体化血漿担体懸濁液264μLを混合し、室温で2時間撹拌後、冷却微量高速遠心機で、4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分間遠心、沈殿を得た。これを十分量の生理食塩液で遠心洗浄後、沈殿に対して198μLの生理食塩液を添加して懸濁し、バイオアッセイ用サンプル3 「未変性ヘモグロビン吸着変性凝固固体化血漿担体懸濁液」又はバイオアッセイ用サンプル4 「未変性ミオグロビン吸着変性凝固固体化血漿担体懸濁液」とした。【００６５】
(2)抗原提示細胞によるバイオアッセイ方法
常法に従って維持培養しているヒトマクロファージ様細胞株THP-1を、培養液にて50万個/mLに調整した。培養液は、常法による加熱処理済みウシ胎児血清を3%含むRPMI1640培養液である(以下、「3%medium」という)。これにphorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)溶液 (SIGMA社製PMAをdimethylsulfoxideに1.62mMとなるように溶解したもの)を終濃度0.16μMになるように添加し、24穴プレートに1穴あたり0.5mL播種して４日間培養、THP-1細胞を抗原提示細胞に分化誘導した。以後の実施例でも、抗原提示細胞と記載しているのは、この方法により分化誘導した細胞である。【００６６】
分化誘導培養後、アッセイ用培養液(PMA 0.016μM、及びヒトインターフェロンガンマ(hIFNg)0.5ng/mLを含む3%medium)に交換し一夜培養した。その後、新しいアッセイ用培養液に交換し、1ウエルあたり0.5mLのアッセイ用培養液に以下のバイオアッセイ用サンプル液を添加し、22時間培養(以下、「アッセイ培養」という)した。
サンプル 1. 生理食塩液、32μL(このサンプルのTNFα産生量をブランク値とした)
サンプル 2. 変性凝固固体化血漿担体懸濁液、32μL
サンプル 3. 未変性ヘモグロビン吸着変性凝固固体化血漿担体懸濁液、32μL
サンプル 4. 未変性ミオグロビン吸着変性凝固固体化血漿担体懸濁液、32μL
アッセイ培養後の培養液を冷却微量高速遠心機で、4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分間遠心、上清を回収し、その中のTumor necrosis factor alpha (TNFα)濃度を測定した。１つのサンプルについて2又は3ウエルを用い、平均値をデータとした。【００６７】
(3)TNFαの測定方法
市販のELISA法によるTNFα測定用キット(BD Biosciences社製OptEIA Set Human TNF, Cat. No. 555212)を使用した。ELISAの詳細方法はこのキット添付の取り扱い説明書に従った。この操作過程では、界面活性剤Tween 20を含む大過剰の洗浄液をELISA用の各ウエルに添加して洗浄する工程が繰り返されるが、本ELISAでは、捕捉用１次抗体でコーティングしてあるELISA用ウエルに回収培養液遠心上清を添加後では5回、検出用2次抗体に追加添加するstreptavidin-horseradish peroxidase (このキットに含まれている、SAv-HRPと略す)又はstreptavidin-alkalinephosphatase (Promega社製、Cat. No. V5591、SAv-ALPと略す)添加後では7回、計12回の洗浄工程を繰り返した。そのため、回収培養液遠心上清中に、仮に変性凝固固体化血漿担体の微粒子が混入していたとしても、十分に洗浄除去される。実際、回収培養液遠心上清中のTNFα測定の際、SAv-HRPをあえて添加せずに本TNFα測定用キットによるELISAを実行すると、TNFα測定値がブランクレベルになってしまうことから、回収培養液遠心上清は十分に洗浄除去されていることを確認した。【００６８】
このキット添付の標準TNFの濃度と最終的な発色反応との直線性は非常に良いため、プレートリーダー(Biotrak II、Amersham Biosciences社)により得られた最終データは、サンプル1.のブランク値を差し引いた吸光度のまま図に示した。SAv-HRPを用いた場合（サンプル1、2、3に適用）は汎用されている市販のTMB基質液及び2N H2SO4反応停止液を用いたときのA450値として現した。A450＝1.0は、このキット添付の標準TNF 60pg/mLに相当する。また、SAv-ALPを用いた場合（別試験としてサンプル1、2、4に適用）はアルカリフォスファターゼの活性測定用に市販されているp-nitrophenyl phosphateを2mg/mLに溶解した基質液及び0.5N NaOH反応停止液を用いたときのA405値として現した。この方法も当業者にとっては常法の一つとなっている。この際の測定では、このキット添付の標準TNFで 240pg/mLがA405＝0.3になるように条件を設定した。TNFα産生量の結果を図1に示す。ブランク値(サンプル1)は差し引いてある。図1の左側2本のカラムはサンプル2とサンプル3に対してSAv-HRPを用いた場合を、右側2本のカラムは別試験でサンプル2とサンプル4に対してSAv-ALPを用いた場合の結果を示している。【００６９】
この結果から、サンプル2の変性凝固固体化血漿担体には抗原提示細胞刺激作用があること、また、これに未変性ヘモグロビンを吸着させたサンプル3にはより強い抗原提示細胞刺激作用があることが分かる。また未変性ミオグロビンを吸着させたサンプル4にも強い抗原提示細胞刺激作用があることが分かる。【００７０】
例2：変性凝固固体化アルブミン/ヘモグロビン複合体による抗原提示細胞の刺激効果
例1では、未変性ヘモグロビンを変性凝固固体化血漿担体に吸着させたものに抗原提示細胞の刺激効果があることを示したが、血清タンパクの代表例であるアルブミンと、赤血球由来のヘモグロビンをあらかじめ混合し、その混合物を変性凝固固体化した場合の抗原提示細胞の刺激活性を調べた。
(1)バイオアッセイ用サンプルの調製方法
市販の生物学的製剤基準  人血清アルブミン(化学及血清療法研究所製、献血アルブミン25“化血研”、以後「25%HSA」という)に対し、以下に示す割合でヒトヘモグロビン(SIGMA社製、H7379-5G、生理食塩液に溶解・懸濁)を混合した液を作製し、110℃、5分間熱処理し凝固させた後、スパーテルで大まかに破砕した。ここに10％中性緩衝ホルマリン液を20mL加え、3日間室温で放置しホルマリン固定した。固定破砕物を生理食塩液で洗浄後、マイクロチューブをセットできる汎用の組織破砕機(Tissue Lyser II, Qiagen社製)にて10分間破砕処理した。破砕断片を70μmの孔径のメッシュを通過させ、十分量の生理食塩液で遠心洗浄し、さらにエタノールに漬けて殺菌し、再び十分量の生理食塩液で遠心洗浄した。卓上遠心機で3000rpm、15分間遠心沈殿させた断片の容量割合が25v/v％になるように、生理食塩液を適量加えて懸濁し、バイオアッセイ用サンプル「変性凝固固体化ヘモグロビン・アルブミン微粒子懸濁液」とした。このサンプルには、ヘモグロビンの割合を変えた以下の種類がある。【００７１】
サンプル 1. 25%HSA 3.0mL
サンプル 2. 25%HSA 2.4mL + 100mg/mL Hemoglobin 0.6mL
サンプル 3. 25%HSA 1.84mL + 220mg/mL Hemoglobin 0.909mL + 生理食塩液0.251mL
サンプル 4. 25%HSA 1.04mL + 220mg/mL Hemoglobin 1.818mL + 生理食塩液0.141mL
サンプル 5. 220mg/mL Hemoglobin 3.0mL
サンプル 6. 生理食塩液 3.0mL(このサンプルのTNFα産生量をブランク値とした)
これらのサンプルは、アッセイ培養時には、0.5mLの3%mediumを含むウエルに、いずれも1ウエルあたり32μL添加した。1サンプルについて3ウエルを用い、平均値をデータとした。【００７２】
(2)抗原提示細胞によるバイオアッセイ方法、及びTNFαの測定方法は、例1のSAv-HRPを用いた場合と同様にして行った。TNFα産生量の結果を図2に示す。ブランク値(サンプル6)は差し引いてある。この結果は、変性凝固固体化アルブミン微粒子のみ(サンプル1)では、本来のブランク値よりもTNFαの産生量が抑制されること、アルブミンとともにヘモグロビンを変性凝固させて固体化した微粒子サンプル2〜5では、ヘモグロビンの含有割合が増加するに従って、抗原提示細胞の刺激効果が強まることを示している。【００７３】
(3)サンプル中のエンドトキシン含有量の測定と結果
前述の例1、及び上記のバイアッセイ用サンプルにエンドトキシンが混入していると、結果に影響する可能性がある。そこで、エンドトキシン含有量を測定した。測定には、Kinect-QCL 192 Test Kit(Lonza社製)、及び、標準エンドトキシンとしてE. coli O55:B5を用い、測定方法はこのキットの使用説明書に従った。その結果、前述の例1のバイアッセイ用サンプル、今回のバイアッセイ用サンプルでは、すべてについてエンドトキシン含量は検出限界以下(<0.500EU/mL)であった。この結果から、図1及び図2におけるエンドトキシンの影響はないと判断した。【００７４】
なお、以後の実施例では、変性凝固固体化ヘモグロビン・アルブミン微粒子(HAMPと略す)のうち、上述の「サンプル 2」に相当するHSAとHemoglobinの割合を含むものをHAMPの代表例とし、卓上遠心機で3000rpm(最大加速度1580G)、15分間室温で遠心、沈殿させることによって濃縮し、濃度を調整して用いている。濃縮後のHAMP濃度は沈殿重量割合でw/v%、又は、沈殿容量割合でv/v%で表している。【００７５】
例3：変性凝固固体化タンパク微粒子中のペルオキシダーゼ様活性の役割
ヘモグロビンやミオグロビンのようなタンパクにはペルオキシダーゼ様の強い活性があることは広く知られている。この活性は、ホルマリン固定しパラフィン包埋処理してから作製した病理組織切片でも発揮されるため、病理組織切片中に例えば大量のヘモグロビンが含有されていると、ペルオキシダーゼ標識抗体による免疫染色では望ましからぬ染色像が出ることがある。この活性を消去できるのが過酸化水素水処理である(非特許文献26)。上記HAMPのペルオキシダーゼ様活性も非常に強いと考えられる。【００７６】
(1)サンプル2のペルオキシダーゼ活性：定性的試験
例2(1)のバイオアッセイ用サンプル中で、ヘモグロビンの割合が最も少ないサンプル2をHAMPの代表例とした。これを遠心し、沈殿の重量を測定してから、沈殿含量を生理食塩液で40w/v%に合わせた懸濁液とした。この20μLを、ペルオキシダーゼによる発色反応に汎用されている市販のTMB基質液200μLに添加したところ、無色のTMB基質液が数秒で濃い青に変化した。これにより、HAMPのペルオキシダーゼ様活性も非常に強いことを確認した。【００７７】
サンプル2のヘモグロビンの代わりにウマミオグロビンを用い、サンプル2と全く同様にして調製したmyoglobin-albumin microparticleの懸濁液20μLをTMB基質液200μLに添加したところ、無色のTMB基質液が1分以内に濃い青に変化した。従って、変性凝固固体化後でもペルオキシダーゼ様活性があるタンパクであれば、HAMPと同様に扱うことができる。【００７８】
(2)サンプル5の過酸化水素水によるペルオキシダーゼ様活性失活処理後の抗原提示細胞刺激効果：定量的試験
ホルマリン固定・パラフィン包埋後に作製された病理組織切片中のペルオキシダーゼ様活性は、過酸化水素水処理により消失することが広く知られている。例2におけるバイオアッセイ用サンプル2に過剰の過酸化水素水を添加して一夜放置後、生理食塩液で繰り返し遠心洗浄すると、サンプル2による市販のTMB基質液の着色反応は観察されなかった。一方、例2(1)のバイオアッセイ用サンプル中で、ヘモグロビンの割合が最も多いサンプル5のペルオキシダーゼ様活性は最も強いことから、サンプル5の150μLに対し、1)精製水、又は、2)3%過酸化水素水を900μL加え、一夜室温で撹拌した。冷却微量高速遠心機で4℃、12000rpm(最大加速度11000G)の条件下に5分間遠心して沈殿を得て、これを十分量の生理食塩液で遠心洗浄後、沈殿に対して112.5μＬの生理食塩液を添加して懸濁し、バイオアッセイ用サンプルをそれぞれ1. Hemoglobin-MP、2. H2O2-Hemoglobin-MPとした。抗原提示細胞によるバイオアッセイ方法、及び、TNFαの測定方法は例1と同じである。【００７９】
TNFα産生量の結果を図3に示す。ブランク値(生理食塩液をバイオアッセイ用サンプルとしている)は差し引いてある。この結果は、過酸化水素水処理によりペルオキシダーゼ様活性を消失させると、明らかにTNFα産生が抑制されること、すなわち、変性凝固固体化ヘモグロビン断片中のペルオキシダーゼ様活性が、抗原提示細胞に対する刺激効果に貢献していることを示している。【００８０】
例4：HAMPへの精製ツベルクリンの吸着
精製ツベルクリンは、IV型アレルギー反応(すなわち細胞性免疫反応)を誘導する代表的な免疫刺激物質である。精製ツベルクリン本体そのものは安定な物質であるが、溶解後はガラス瓶内壁に吸着し見かけ上の失活を起こしやすいこと、及び、その吸着はヒト血清アルブミンで防止可能であることが知られている(非特許文献16)。そこで、HAMPが精製ツベルクリンを吸着するか否かを検討した。【００８１】
(1)精製ツベルクリンの定量法
一般診断用精製ツベルクリン(PPD)(1μg／バイアル、日本ビーシージー製造株式会社)に含まれているMycobacterium tuberculosis由来のタンパクの一つ、DnaK(非特許文献24)に対するHuCAL-Fab抗体(ジーンフロンティア株式会社、千葉県柏市)を得た。これを1次抗体とし、Jackson Immuno Research 社の抗体#109-035-097を2次抗体として、精製ツベルクリンのELISA定量法を策定した。抗原としての精製ツベルクリン(PPD)、1次抗体、2次抗体以外は当業者に周知されている通常のELISA定量法である。最終的な発色反応には例1(3)に示したhorseradish peroxidaseに対する汎用のTMB基質液と反応停止液を用い、結果はA450値として出した。本法では、生理食塩液をブランクとした。ブランク値を差し引いたとき、上記PPDの濃度が1.25μg/mL(ELISA反応時の液量はELISA用96ウエルマイクロプレートの1ウエル当たり200μL)のときのA450値は0.063であり、定量可能な範囲であった。【００８２】
(2)HAMPへの吸着反応
プラスチック製マイクロチューブにHAMP(卓上遠心機で3000rpm(最大加速度1580G)で15分間遠心沈殿させた微粒子の容量割合が40v/v％になるように生理食塩液を適量加えて懸濁した)を終濃度20v/v%となるように、上記PPDの濃度が1.25μg/mLとなるように加え、室温で撹拌した。撹拌時間は30分〜6時間である。撹拌後、微量高速遠心機で、4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分間遠心、上清を得た。この上清150μLを用い、上記のELISA定量法により(生理食塩液をブランクとして)、上清中のPPD量を測定した。
(3)結果
上清中に残存するPPD量を、ブランク値を差し引いたA450値として図4に示した。この結果は、室温にて30分の撹拌で92％のPPDがHAMPに吸着することを示している。2時間以上の撹拌では(最小のA450値が-0.004という若干の測定誤差があるが)ほぼ全量がHAMPに吸着していると考えられる。また、この結果は、抗原となり得る異種由来タンパクもHAMPに吸着し得ることを示している。【００８３】
例5：HAMPへの吸着PPD、吸着サイトカインによる抗原提示細胞の刺激効果
例4に示したように、HAMPにはPPDに対する強い吸着力がある。そこで、吸着したPPDの抗原提示細胞の刺激活性はどうか、及び生体内で重要な作用をするサイトカインを吸着させた場合にサイトカイン吸着HAMPが抗原提示細胞の刺激活性を示すか、について検討した。
(1)吸着操作
50-mL遠心チューブに生理食塩液に懸濁したHAMP沈殿とPPDの濃度がそれぞれ25v/v%、286ng/mLとなるように加え、室温で2時間攪拌した。これをPPD-HAMP懸濁液とした。
ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(hGM-CSF, Leukine(sargamostim)、sanofi-aventis U.S. LLC社製)を水で溶解、100μg/mLとした。この100μLとHAMP (25w/v%、変性凝固固体化ヘモグロビン・アルブミン微粒子沈殿の重量をもとに調製した)200μLと合わせ、室温で2時間攪拌した。攪拌後、微量高速遠心機で、4℃で12000rpm(最大加速度11000G)の条件下に5分間遠心して沈殿を得た。この沈殿を750μLの生理食塩液にて懸濁、同様に遠心して沈殿を得る遠心洗浄を計3回繰り返し、最終的な沈殿に150μLの生理食塩液を加えて、hGM-CSF-HAMP懸濁液とした。【００８４】
ヒトインターロイキン2(hIL-2)の場合は、イムネース注35(1バイアル瓶にテセロイキン(遺伝子組換え、実質的にhIL-2である)35万単位含有、シオノギ製薬)のバイアル瓶に625μLの生理食塩液を注入して溶解し、その溶液から50μLをとってHAMP 200 μLと混合し、室温で2時間攪拌した。以下は上述のhGM-CSFの場合と同じ操作を加え、hIL-2-HAMP懸濁液とした。ヒトインターフェロンガンマ（hIFNg、和光純薬工業)の場合は、生理食塩液中に50ng/mLとした溶液を調製し、HAMP 200 μLと混合し、室温で2時間攪拌した。以下は上述のhGM-CSFの場合と同じ操作を加え、hIFNg-HAMP懸濁液とした。【００８５】
(2)抗原提示細胞によるバイオアッセイ方法、及びTNFαの測定方法は例1と同じである。TNFαの測定では、SAv-HRPを用いている。ここでは、バイアッセイ用サンプルとして、1ウエルあたり、以下の溶液又は懸濁液を添加した。
サンプル 1. 生理食塩液、32μL(このサンプルのTNFα産生量をブランク値とした)
サンプル 2. 一般診断用精製ツベルクリン(PPD)1人用(0.25μg／バイアル、日本ビーシージー株式会社)を1.2mLの生理食塩液で溶解したPPD溶液、32μL
サンプル 3. HAMP懸濁液、32μL
サンプル 4. PPD-HAMP(HAMPにPPDを吸着させたもの)懸濁液、32μL
サンプル 5. hGM-CSF-HAMP(HAMPにhGM-CSFを吸着させたもの)懸濁液、32μL
サンプル 6. hIL-2-HAMP(HAMPにhIL-2を吸着させたもの)懸濁液、32μL
サンプル 7. hIFNg-HAMP(HAMPにhIFNgを吸着させたもの)懸濁液、32μL
1サンプルについて3ウエルを用いた。22時間のアッセイ培養後に回収した培養液は、新鮮な3%mediumで1/2に希釈し、TNFαのELISAによる測定に供した。【００８６】
(3)結果
ブランク値を差し引いたA450値について3ウエルの平均値を図5に示した。ただし、サンプル4では、サンプル2に比べ2倍量のPPDが添加した32μL中に含まれているため、実測A450値は0.374だが、図では測定値の半分0.187にしてある。
この結果では、溶液状態のPPD(サンプル2)はブランクとした生理食塩液(サンプル1)の場合と同レベルで(A450値は0.004、例3の場合と同様に測定誤差の範囲である)、抗原提示細胞の刺激効果は認められなかった。また、HAMPのみ(サンプル3)では、例2の場合と同様に、本来のブランク値よりTNFαの産生量が抑制されていたが、HAMPにPPDを吸着させたPPD-HAMP(サンプル4)では、刺激効果が観察された。従って、溶解性のPPDを固体化した断片であるHAMPに吸着固定した方が抗原提示細胞をより強く活性化できることが判明した。【００８７】
サイトカインを吸着させたhGM-CSF-HAMP(サンプル5、A450値は0.019)及びhIFNg-HAMP(サンプル7、A450値は0.025)では、低いながらも明瞭なTNFαの産生が観察された。しかし、hIL-2-HAMP(サンプル6)では、ブランクとした生理食塩液(サンプル1)の場合を越えた効果が見られなかった。
前述の例1(2)項に記載したように、THP-1細胞を抗原提示細胞に分化誘導した場合、TNFα産生には、トリガーとして微量のIFNgを培養液に添加しておく必要があるが、HAMPのみではこの培養液中の微量IFNgを吸着してしまうために、例2のサンプル1、2、及び本実施例のサンプル3、6では、A450値がマイナスになったものと考えられる。【００８８】
例6：BCG菌抽出物を吸着させたHAMPによる抗原提示細胞の刺激効果
例5の結果から、HAMPに溶解性のPPDを吸着させた方が抗原提示細胞をより強く活性化できることが判明したが、他の免疫刺激物質でもこのような効果が期待できるか検討した。ここでは、多様な低分子が入り混じっているBCG菌抽出物(BCGext)を用いた。
(1)BCGextの作製方法
乾燥BCGワクチンアンプル1本(日本ビーシージー製造株式会社、12 mg入り)を110℃で5分間、オートクレーブにかけ、エタノール1 mlを加え、6時間以上攪拌した後、その懸濁液を採取して別の乾燥BCG製剤1本に加え、再び十分に攪拌し、その後、微量高速遠心器にて12000 rpm(最大加速度11000G)で5分間遠心し、この上清を回収してBCGextとした。【００８９】
(2)HAMPへのBCGextの吸着
HAMP(40w/v%)に、エタノールにて1/5に希釈したBCGextを等量加え、室温にて一夜撹拌した。これを十分量の生理食塩液で遠心洗浄し、もとのHAMP(40w/v%)となるように懸濁した。3%mediumにて5.65倍に希釈し、サンプルHAMP-BCGextとした。
(3)抗原提示細胞によるバイオアッセイ方法、及びTNFαの測定方法は、例1と同じで、TNFαの測定ではSAv-HRPを用いている。
ここでは、バイアッセイ用サンプルとして、1ウエルあたり、以下のものを添加した。
サンプル 1. 生理食塩液、30μL(このサンプルのTNFα産生量をブランク値とした)
サンプル 2. HAMP(40w/v%)を生理食塩液にて5.65倍に希釈したもの、30μL(アッセイ培養時の終濃度0.4w/v%)
サンプル 3. BCGextを3%mediumにて28.3倍に希釈したもの、30μL(アッセイ培養時の終濃度0.2v/v%)
サンプル 4. HAMP-BCGext、30μL(アッセイ培養時のHAMP終濃度0.4w/v%, 元のBCGextが全部HAMPに吸着したと仮定すれば終濃度0.18v/v%となるはずのもの)【００９０】
(4)結果
結果を図6に示す。この結果はBCGextをそのまま添加するよりも、HAMPにBCGextを吸着させた方がより強力に抗原提示細胞を刺激できることを示している。すなわち、PPDに限らず、溶解性の免疫刺激物質をHAMPに吸着させることができれば、より強力な免疫刺激剤となることから、HAMPは免疫刺激物質の効果的な担体であることがわかる。【００９１】
(5)前項と同様にしてHAMP-BCGextを作製し(ただし、3%mediumにて5.65倍に希釈せず、もとのHAMP(40w/v%)となるように3%mediumに懸濁したものを1/1濃度とした)、アッセイ用培養液にて1/50〜1/800に希釈した懸濁液を作製し、抗原提示細胞によるバイオアッセイに供した。回収した上清中の産生TNFα量の定量にあたっては、ELISA法による測定用キット(BD Biosciences社製OptEIA Set Human TNF, Cat. No. 555212)に添付されている標準TNFを用い、TNF量に換算した。また、回収した上清中の産生GM-CSF(THP-1細胞がヒト由来であるためhGM-CSFである)量の定量にあたっては、ELISA法による測定用キット(Thermo Scientific社製GM-CSF ELISA kits, Cat. No. EHGMCSF)に添付されている標準GM-CSFを用い、GM-CSF量に換算した。【００９２】
(6)結果
結果を図7に示す。この結果から、TNFαに比べ、1/40量程度のhGM-CSFが同時に産生されていることが判明した。
例5のサンプル5で見られたように、hGM-CSFは直接HAMPに吸着し、吸着hGM-CSFは抗原提示細胞を刺激し活性化できる。従って、BCGextを担持させたHAMPによる刺激をきっかけに、抗原提示細胞からhGM-CSFが産生され、それが抗原提示細胞自身にも作用して活性化するというオートクライン機構が作動することが判明した。産生されたhGM-CSFは、産生した抗原提示細胞自身に作用するだけではなく、別種の抗原分子について提示を行う抗原提示細胞であっても、近隣にいるならばhGM-CSFはそれにも作用し活性化できるというパラクライン作用もあることは、当業者にとっては周知である。従って、本発明の免疫刺激剤では、刺激を受けた抗原提示細胞から分泌されるhGM-CSFが、近隣の抗原提示細胞に対する作用を通じて一般的な免疫反応を強化できるので、同時に他の特定の抗原を投与せずともBRMとしても使用できる。【００９３】
例7：HAMPへの抗体の吸着-1
抗体は、その種類によっては免疫刺激作用があることが知られている。前項の実施例までに、HAMPは各種の分子を吸着する能力があると推定された。そこで抗体も吸着するか、検討した。
(1)吸着操作
市販のヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体(horseradish peroxidase標識)(Cat. No. W4021、Promega社製)をDulbeccoのCa+Mg+不含リン酸緩衝液(PBS(-))で1/25000に希釈し、この20μLをとり、HAMP 60μL及び生理食塩液920μLを含む懸濁液に加え、0〜60分間室温で撹拌した。撹拌後、直ちに冷却微量高速遠心機で、4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分間遠心、その上清100μL中に残存する抗体のペルオキシダーゼ活性を測定した。ペルオキシダーゼ活性は、例1(3)TNFαの測定方法のTNFα測定用キットに付随しているTMB基質液による発色反応を利用してA450値で表した。
(2)結果
図8に示すように、上清中のペルオキシダーゼ活性は撹拌時間とともに減少した。ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体にHAMP を添加していない場合、抗体の希釈液は1時間程度の間では活性に変化がないことが知られているため、この減少は抗体がHAMP沈殿に経時的に吸着していくことを示している。また、この結果は、もしヤギ抗体を抗原タンパクとして利用したい場合、抗体溶液としてではなく、抗体をHAMPに吸着させた固体化抗原として利用できることを示している。【００９４】
例8：HAMPへの抗体の吸着-2
抗体吸着が別種の抗体でも同様に起こるかを検討した。
(1)吸着操作
市販のウサギ抗ヤギIgG(全分子)抗体(alkaline phosphatase標識)(A4187、Sigma-Aldrich社製)をPBS(-)で1000倍に希釈し、1次抗体とした。この100μLをとり、HAMP 60μL及び生理食塩液840μLを含む懸濁液に加え、0min〜60min室温で撹拌した。撹拌後、直ちに冷却微量高速遠心機で、4℃で12000rpm(最大加速度11000G)の条件下に5分間遠心し、得られた沈殿を十分量の生理食塩液で遠心洗浄した。この洗浄後の沈殿を100μLの生理食塩液に懸濁し、その半量に、アルカリ性ホスファターゼ用緩衝液(TRACP & ALP Assay Kit、Code No. MK301、タカラバイオ社製)とこのキットの反応基質液を説明書に従って190μL加えた。室温で10分間撹拌し、反応停止液(0.5N NaOH)30μLを加えた後、冷却微量高速遠心機で、4℃で12000rpm(最大加速度11000G)の条件下に5分間遠心し、上清200μLをとって405nmの吸光度を測定した。【００９５】
(2)結果
図9に示すように、沈殿中のアルカリ性ホスファターゼ活性は、1次抗体との撹拌時間の長さに従って増加した。すなわち、ウサギ抗ヤギIgG(全分子)抗体もHAMPに吸着することを示している。従って、抗体を吸着させたHAMPも、効果的な免疫刺激剤の組成物となり得ることが例7及び8の結果から分かる。また、抗体を吸着させたHAMPを免疫刺激剤として使用する場合、抗体が投与局所ですぐに溶解拡散してしまうことはないため、投与局所に限局した効果的な抗体適用法にすることができることがこの結果から明らかである。【００９６】
例9：PPD-HAMPの安全性
例5では、HAMPに吸着したサイトカインによる抗原提示細胞の刺激効果が、hGM-CSF及びhIFNgでは認められたが、hIL-2では認められなかった。これらサイトカインは、いずれもヘパリンに結合しやすく、特にhIL-2はヘパリンに結合した状態で活性を示すことが知られている(非特許文献25)。そこで、HAMPとは別種の固体化担体であるヘパリン-アルブミンコアセルベート沈殿(微粒子状になっている)(特許文献4、ただし、この文献ではPPDを含むヘパリン-アルブミンコアセルベート沈殿について記載されているが、本実施例では、PPDを含まないヘパリン-アルブミンコアセルベート沈殿(nega-TuMPと命名)を用いた)にhIL-2を吸着させた微粒子(hIL-2-MP)とし、抗原提示細胞の刺激効果があるか否かを検討した。【００９７】
特許文献4中の例1、A．材料及び方法、1．免疫アジュバントの作製の項に記載の微粒子化ツベルクリン(PPD含有のnega-TuMPに相当する)の作製法において、単にPPDを添加せずに作製したものをnega-TuMPとしている。微粒子状となっているnega-TuMP の懸濁液1mL中には、ヘパリンが625単位、ヒト血清アルブミンが12.5mg含まれている。また、イムネース注35(シオノギ製薬)を注射用水625μLに溶解し、この50μL(hIL-2としては28000単位)をとってnega-TuMP懸濁液100μLと混合して一夜室温で撹拌すれば、hIL-2は微粒子状のnega-TuMPに吸着する。これを例1に従って抗原提示細胞によるバイオアッセイ用サンプルhIL-2-MPとした。このときの比較対照は同量のnega-TuMPのみである。また、このときの抗原提示細胞によるバイオアッセイ方法、及び、TNFαの測定方法は、例1でSAv-HRPを用いた場合と同じである。その結果、最終的に回収した抗原提示細胞培養液中のTNFα量に比例するA450値は、nega-TuMPのみの場合は-0.016、hIL-2-MPの場合は-0.006となった。【００９８】
すなわち、これらのサンプルは、両者とも抗原提示細胞の刺激性はなく、むしろTNFα産生をわずかに減少させた。nega-TuMPはIFNgを吸着する性質があるため、hIL-2-MPの場合も含めて、培養液中に添加されているトリガー用の微量IFNgの濃度低下をもたらした結果と考えられるが、少なくとも、nega-TuMP自体は抗原提示細胞を直接活性化するものではない。【００９９】
以上の結果を踏まえた上で、PPD-HAMPにnega-TuMPを混合したものをサンプルとして、毒性試験の基本となっている成長期のマウスに投与した場合の体重変化・臓器重量変化を指標に、安全性を検討した。【０１００】
(1)方法
5週令のC3H/HeN(オス)マウス14匹を2群にわけ、対照群には1匹あたり50μLの生理食塩液を、処置群には1匹あたり、PPD-HAMP(3000rpm(最大加速度1580G)で15分間遠心した時の沈殿量として19.1v/v%)とnega-TuMP懸濁液(容量割合で8.7 %)を含む懸濁液50μLを、それぞれ毎週1回、計3回、尾根部皮内に注射した。また、翌週よりそれぞれ毎週1回、計6回、大腿部皮下に注射し、体重を測定した。また、最終注射の7日後にマウスの脾臓、腎臓、肝臓の重量を測定した。
(2)結果
図10にマウスの体重変化を、図11に臓器重量を示す。これらの結果は、PPD-HAMPにnega-TuMPを混合した懸濁液には、成長期のマウスに体重減少をもたらすような強い毒性はなく、フロイントの完全アジュバント(FCA)を投与した場合に見られるような当業者に周知されている安全性に関する大きな問題がないことを示している。【０１０１】
例10：がん抗原と免疫刺激剤を混合したがんワクチンによる抗腫瘍効果-1
例4に示したように、HAMPはPPDを速やかに吸着し、溶解性のPPDを不溶性にでき、また例5に示したように抗原提示細胞を刺激できる。そのため、PPD-HAMPは効果的な免疫アジュバントとなると推定される。また、HAMPは例5に示したようにサイトカインを吸着できる。一方で、サイトカインはヘパリンに良く吸着することが当業者には周知されており、ヘパリンとアルブミンのコアセルベーションにより生じたnega-TuMPにもサイトカインは良く吸着する。そこで、nega-TuMPにサイトカインを混合し吸着させ、PPD-HAMPに添加したときの免疫アジュバントとしての効果を検討した。【０１０２】
(1)方法
(1-1)サイトカイン吸着nega-TuMPの作製
マウスGM-CSF(Miltenyi Biotec社製, premium grade)100μgを1mLの精製水に溶解した。この50μLを100μLのnega-TuMP懸濁液と混合、一夜、室温で撹拌して吸着させ、これをmGM-CSF-MPとした。また、イムネース注35(シオノギ製薬)を注射用水625μLに溶解、この50μLをとって100μLのnega-TuMP懸濁液と混合、一夜、室温で撹拌し、これをhIL-2-MPとした。【０１０３】
(1-2)抗原と免疫アジュバントの組成液
卵白アルブミン(Calbiochem社製, カタログ番号32467、OVAと略す)1.12mgを1mLの生理食塩液に溶解した。これを抗原原液とし、下表のような液量の割合で、マウスのG1〜G4群に合わせて、サイトカイン吸着(又は非吸着)nega-TuMPを免疫アジュバントとして添加した組成液を作製した。【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
(1-3)マウスへの投与スケジュール
6週齢のC57BL/6マウス(メス、日本クレア社より購入)に、上表の組成液を1匹あたり50μL、皮内注射した。一つのマウスの群は10匹である。注射開始日をday 0とした。このday 0のときの50μL中にはOVA原液を含んでいる。以後、OVAを含まない上表の組成液を、それぞれの群に1匹あたり50μL、day 4, 11, 18, 25, 32(計5回)に追加皮内注射した。【０１０６】
(1-4)マウスへのE.G7-OVA腫瘍細胞のチャレンジ
OVAタンパク断片を腫瘍抗原として発現しているマウスリンパ腫細胞株E.G7-OVAをアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手、常法に従って培養した。この細胞を無血清のMEM培養液で洗浄、さらに無血清MEM培養液で2時間培養後に、もう一度無血清のMEM培養液で洗浄した。この細胞50万個を0.1mLの生理食塩液に懸濁し、(1-3)項で述べたマウスの右下肢皮下にday 15に注射、腫瘍細胞チャレンジとし、以後、増殖してくる腫瘍の容積を常法に従って測定した。腫瘍容積が5000 mm3に達してもなお生存しているマウスは測定打ち切りとし安楽死させた。【０１０７】
(2)結果
結果を図12に示す。マウスの生存期間中央値は、E.G7-OVA腫瘍細胞チャレンジ後、G1(対照)群で21日(組成液注射開始日からはday 36となる)、G2(PPD-HAMP-nega-TuMP)群で24日、G3(PPD-HAMP-mGM-CSF-MP)群で26日、G4(PPD-HAMP-mGM-CSF-MP-hIL-2-MP)群では31日以上となった。チャレンジ後31日目終了時点で生存しているマウスの割合は、G1群で1/10、G4群で5/10であり、この2群間の母比率の差の検定(カイ二乗検定)を実施したところ、両側p=0.051となり、G4群で延命効果がある強い傾向が観察された。他のG2群、G3群では、G1群に対する統計学的有意差はないが、それぞれ生存期間中央値がG1群よりも延びていることから、それぞれで延命効果がある傾向が認められた。【０１０８】
例11：がん抗原と免疫刺激剤を混合したがんワクチンによる抗腫瘍効果-2
例10で用いた抗原は卵白アルブミンであり、免疫学においては典型的モデル抗原として汎用されているが、自然発生した腫瘍細胞に含まれる腫瘍抗原ではない。そこで、ここではマウス肺がん細胞のライセートを腫瘍抗原とし、生きている同じ肺がん細胞をチャレンジしたとき、添加剤としてサイトカイン吸着nega-TuMPを加えたPPD-HAMP懸濁液の免疫アジュバント効果を検討した。【０１０９】
(1)方法
(1-1)抗原と免疫アジュバントの組成液
サイトカイン吸着nega-TuMP懸濁液の作製法は例10の(1-1)項と同じである。マウス肺がんであるLLC細胞(理化学研究所・理研バイオリソースセンターより入手、細胞番号RCB0558)を、常法に従って増殖培養後、2時間無血清培養し、PBS(-)で十分洗浄後、常法のEDTA処理により細胞をはがしてからPBS(-)中で懸濁液とした。細胞数を2x107/mLに合わせてから、凍結融解を繰り返し、ライセートとした。ライセートは、3％トリパンブルー液で染色し、生残しているLLC細胞がいないことを確認した。これを腫瘍抗原とし、下表のような液量の割合で、マウスの各群に合わせて、サイトカイン吸着nega-TuMP(mGM-CSF-MP及びhIL-2-MP)を免疫アジュバントとして添加した組成液を作製した。ここではPPD-HAMP懸濁液にはnega-TuMPそのものは加えていない。【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
(1-2)マウスへの投与スケジュール
6週齢のC57BL/6マウス(メス、日本クレア社より購入)に、上表の組成液を1匹あたり0.1mL、背部皮下に注射した。一つのマウスの群は10匹であるが、mGM-CSF-hIL-2-PPD-HAMP群では8匹である。注射開始日をday 0とした。このときの投与0.1mL中にはLLC細胞ライセートを含んでいる。以後、LLC細胞ライセートを含まない上表の組成液を、それぞれの群に1匹あたり0.1mL、day 4, 10, 18, 25, 32, 39, 46に追加皮下注射した。【０１１２】
(1-3)マウスへのLLC細胞のチャレンジ
上述のライセートを作製した細胞の元株である生きているLLC細胞を、無血清のMEM培養液0.1mL中に懸濁し、1x104個をday 15に大腿部皮下に注射、腫瘍細胞チャレンジとし、以後、触診により初めて腫瘍塊が発生した日を記録した。チャレンジ後、この日までがtumor-freeの期間である。【０１１３】
(2)結果
LLC細胞のチャレンジ後、53日目まで観察をした結果、両群でtumor-freeのまま残ったマウスは図13に示すとおりであった。対照(saline)群では腫瘍細胞チャレンジ後17日目から腫瘍塊の発生が観察されたのに対し、PPD-HAMP群では腫瘍塊の発生が24日目からと遅れており腫瘍塊の発生に抑制効果が認められたが、両群ともチャレンジ後50日以降でtumor-freeのままで残るマウスは6/10(60％)で同じであった。しかし、mGM-CSF-hIL-2-PPD-HAMP投与群では全く腫瘍塊の発生は観察されず(8/8、100％)、対照群との間で2群間の母比率の差の検定(カイ二乗検定)を実施したところ、両側p＝0.0425となり、統計学的に有意な差があった。【０１１４】
この結果、及び例10の図12の結果を合わせて考えれば、PPD-HAMPには(nega-TuMPを添加するしないにかかわらず)腫瘍の増悪を抑制できる免疫アジュバント活性があり、それにnega-TuMPに吸着させたサイトカインmGM-CSF及びhIL-2を追加した場合は、より強く効果的な免疫アジュバント活性が発揮されるものと認められる。【０１１５】
また、体内に自然発生する腫瘍細胞では、それに含まれる腫瘍抗原の抗原性は一般に低いものであって、簡単には体内の抗腫瘍免疫反応を惹起できるものではないことが当業者には広く知られている(だからこそ腫瘍が発生してくるのである)。従って、ここで用いた腫瘍抗原(LLC細胞ライセート)の代わりに、抗原性の高い物質(例えばウイルス等の外来生物由来抗原)を用いれば該ウイルス感染症に対抗できるワクチンとなることは、免疫反応のメカニズムが抗原によらず基本的に同じであることから、当業者にとっては自明である。さらに、PPD-HAMPにmGM-CSF-MPやIL-2-MPを追加した免疫刺激剤を免疫アジュバントとすれば、上記のように抗原性が低い腫瘍抗原にさえ有効な抗腫瘍免疫反応を誘導できることから、体内由来で抗原性が低い他の疾病要因物質であっても、その物質を抗原とした当該疾病の治療用ワクチンとなる組成物を作り上げることが可能であることは、やはり当業者にとっては自明である。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の複合体は免疫刺激作用を有しており、抗原提示細胞を効果的に刺激できることから、腫瘍などの疾病に対する治療のほか、悪性腫瘍の術後再発や転移の予防のための免疫刺激剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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