(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ａ）に記載のDNA。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１乃至３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、寄託番号：FERM BP-6708で識別される細胞の増殖を支持する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｅ）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ｄ）に記載のDNA。
（ｆ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１乃至３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、寄託番号：FERM BP-6708で識別される細胞の増殖を支持する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
請求項１に記載するDNAが挿入されたベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項５】
請求項３に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項４に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項４に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該タンパク質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質と被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項７】
請求項４に記載のタンパク質の寄託番号：FERM BP-6708で識別される細胞の増殖を支持する活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で、FERM  BP-6708で特定される細胞に請求項４に記載のタンパク質を接触させる工程、
（ｂ）該細胞の増殖を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該増殖を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なサイトカインに関する。より詳しくは、変異Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖支持能を有するサイトカインに関する。
背景技術
免疫系、造血系の細胞は、サイトカインと呼ばれる一群の液性因子により、その増殖や活性が調節されていることが知られている。これまでに数多くのサイトカインが同定され、それらの解析が進んだ結果、多くのサイトカインは広範な生理活性を有しており、１つのサイトカインが多様な細胞に作用し、細胞によりさまざまな作用を示すことが明らかとなってきている。これらのサイトカインにより、造血細胞やリンパ系細胞、内皮細胞などの細胞間で情報伝達のネットワークが形成されており、これらの細胞の分化や増殖、活性化が制御されていると考えられている（小津真理子ら，１９９２，サイトカイン療法、南江堂，ｐｐ２−１４）。サイトカインは、特に医療分野における臨床応用が期待されており、癌、感染症、自己免疫疾患、血栓症を含む種々の疾患に対する治療への応用が試みられている。
発明の開示
本発明は、変異Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖支持能を有する新規なサイトカインおよびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途を提供することを課題とする。
発現クローニング法は、目的蛋白の機能が既知でアミノ酸配列が未知な場合のｃＤＮＡクローニングの方法として極めて有効である。多くのサイトカインｃＤＮＡがＣＯＳ細胞を用いた一過性の遺伝子発現（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，３３６５−３３６９，１９８７、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６６，１１６５−１１７４，１９９１、Ｗｏｎｇ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，８１０−８１５，１９８５）、あるいはレトロウィルスを用いた恒常的遺伝子発現クローニング（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８８，１３９９−１４０６，１９９６、Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２４，３２４−３２９，１９９６、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，９１４６−９１５０，１９９５、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．１５，７０４−７１０，１９９５、Ｗｏｎｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，５５２３−５５３１，１９９４）の手法により同定されている。レトロウィルスを用いた発現クローニング法では、ＣＯＳ細胞を用いた発現クローニング法の２つの主要な制限要因、即ち、標的細胞及び選別方法に於ける制約を回避することが可能である。一般に造血系細胞を標的とした場合、遺伝子導入効率は低く、それ故に複雑な組成から成るｃＤＮＡライブラリーに含まれる遺伝子を効率よく発現せしめることは困難である。一方、一過性の遺伝子発現に基づいた発現クローニング法では、発現形質による標的細胞の選別がアッセイそのものあるいは選別期間（通常２−３日）を制限してしまう。これに対して、レトロウィルスを用いた系ではより幅広い範囲の細胞を標的として利用可能であり、より長い期間を要する選別に基づいた機能的なスクリーニングを実施することが可能である。本発明者らは、このようなレトロウイルスを用いた発現クローニング法の利点に鑑み、これを利用して新規サイトカインのクローニングを試みた。
まず、本発明者らは、レトロウイルスベクター感染を利用してｃＤＮＡライブラリー発現細胞を調製した場合において、その中から新規なサイトカインを発現する細胞を選択するための指標とするために、新規なサイトカイン依存的に増殖する細胞株（即ち、新規サイトカインに対する受容体を発現する細胞株）の調製を行った。このような細胞株の調製のためには、変異源や発癌物質を用いることが知られている（Ｌｅｂｒｏｗｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．６，１８３８−１８４２，１９８６、Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２，３７−４２，１９７４、Ｆｒｅｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７４，１０３１−１０４４，１９７８、Ｇｕｐｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５，３３３７−３３４０，１９７８、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９，１２４４−１２４８，１９７２、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．３，３１１７−３１２１，１９８４）。変異源処理を行うと、細胞内でそれまで休眠状態であった遺伝子、主として受容体をコードする遺伝子がランダムに活性化する。
本発明者らは、ｐｒｅ−Ｂ細胞の性質を有し、ＩＬ−３依存性細胞株であるＢａ／Ｆ３細胞を変異原であるＥＭＳで処理して、ランダムな異所性の受容体を発現させた変異Ｂａ／Ｆ３細胞を調製した。次いで、既知のサイトカインに対する反応性を有しないクローンの選択を行なうために、調製した変異Ｂａ／Ｆ３細胞の種々の既知サイトカイン（ｍＧＭ−ＣＳＦ、ｍＩＬ５及びｍＳＣＦ）に対する反応性の検討を行った。これによりｍＧＭ−ＣＳＦ依存性の増殖を呈したクローンを除外した。さらにｍＭ−ＣＳＦ、ｍＳＣＦ及びｍＩＬ１に対する抗体を用いて上記クローンのストローマ依存性増殖に及ぼす効果を検討し、これらの中和抗体による影響を全く受けず、最も良好なストローマ依存性を示すクローンを選択した。このクローンを「Ｓ２１細胞」と命名した。この細胞は、発現する受容体に対応するリガンドの存在下においてのみ生育し、該リガンドが存在しない場合には急速なアポトーシスによる細胞死を引き起こす。従って、この細胞の増殖支持活性を指標に、該細胞が発現する受容体に対応するリガンド（サイトカイン）の効率的なスクリーニングが可能であると考えられた。
次に、本発明者らは、発現クローニングの際のレシピエントに用いるべく、Ｓ２１細胞の増殖を支持しないストローマ細胞株の検索を行った。これはレシピエントであるストローマ細胞にｃＤＮＡを導入してＳ２１細胞の増殖支持活性を指標にスクリーニングを行う際に、観察された増殖支持活性が導入されたｃＤＮＡに由来し、レシピエントのストローマ細胞が本来保有していたものではないことを確認する上で重要である。本発明者らは、繊維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３、Ｒａｔ１、マウス骨髄由来ストローマ細胞株であるＭＳ１０、ＳＴ２（陽性対照）について検討を行ったところ、ＮＩＨ３Ｔ３とＲａｔ１がそれ自体でＳ２１細胞の増殖支持能を有していることを見出した。これらの繊維芽細胞株をフィーダーとした場合にはＳ２１細胞の増殖はフィーダー細胞との接触を必要とせず、フィーダー細胞由来の可溶性因子によるものと考えられた。さらに、ＮＩＨ３Ｔ３とＲａｔ１の場合にはコンフルエントとなった培養を１週間維持するのが困難なことから長期にわたる選別を必要とする発現クローニングには不適と考えられた。これに対してＭＳ１０は、Ｓ２１細胞の増殖支持活性を欠いていること、さらには毎週の培養液交換で１ヶ月以上にわたって培養の維持が可能なことからレシピエントの候補として適したものであるとの結論に至った。以上より、本発明者らは、バイオアッセイの標的としてＳ２１細胞、発現クローニングのレシピエントとしてＭＳ１０を用いることが好適と考えた。そこで、次ぎに、これら細胞を利用して、レトロウィルスベクターを利用した新規サイトカインの発現クローニングを行った。
まず、ＳＴ２細胞由来ｃＤＮＡライブラリーをレトロウィルスベクター上に構築し、これをＭＳ１０細胞に感染させた。この細胞をＳ２１細胞と共培養し、Ｓ２１細胞の増殖支持活性を示すクローンの選択を行った。その結果、ひとつのプール（Ｎｏ．２−２１）がレシピエントのＭＳ１０細胞に対し増殖支持活性を示すことを見出した。即ち、Ｓ２１細胞は共培養によりこのプール（Ｎｏ．２−２１）を感染させたＭＳ１０細胞層の表面に接着して増殖するのに対して、同様の現象は感染を行わなかったＭＳ１０細胞あるいは他のプールを感染させたＭＳ１０細胞においては全く観察されなかったこのプール（Ｎｏ．２−２１）はさらに個々のクローンに分割してトランスフェクションと感染を繰り返すことにより、最終的に元のプール（Ｎｏ．２−２１）と同一のＳ２１細胞増殖支持能を示す二つの単一クローンを得た。この両クローンはともに１．２２ｋｂの同一塩基配列を含む事から、当該遺伝子を「Ｃ１２１」と命名した。Ｃ１２１に関連する遺伝子を探す目的で実施したデータベース検索の結果、ＩＳＦ（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｆａｃｔｏｒ）として報告されているタンパク質のアミノ酸配列の一部からなる完全なタンパク質であることが判明した。データベースに登録されているＩＳＦの塩基配列から、Ｃ１２１は全長ＩＳＦタンパク質のＣ端側１／３に相当することが明らかとなった。
本発明者らは、次いで、Ｃ１２１の組織特異性につき解析を行い、Ｃ１２１遺伝子の発現が種々のマウス組織において認められるが、そのうち腎と肝において比較的強い発現を示すことを見出した。また、Ｃ１２１タンパク質の生物活性を確認する目的で発現系の構築を行った。即ち、Ｃ１２１を哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓにサブクローニングし、ＳＲαプロモーターの制御下で発現せしめるように構築した後、該遺伝子産物が可溶性蛋白である場合を想定した場合はＣＯＳ７細胞に、共培養の実験を目的とした場合はＭＳ１０細胞にそれぞれ発現せしめた。その結果、Ｃ１２１  ｃＤＮＡを導入したＣＯＳ７細胞の培養上清は、Ｓ２１細胞の増殖を支持したが親株であるＢａ／Ｆ３細胞の増殖は支持しなかった。さらに、Ｓ２１細胞はＣ１２１を導入したＭＳ１０細胞との共培養により増殖することが可能であった。
さらに、Ｃ１２１タンパク質の発現を解析する目的でＣ端にＦＬＡＧ標識を付けた蛋白をｐＭＥ１８Ｓベクター上に構築し、ＣＯＳ７細胞にて発現せしめた。その結果、培養上清中にＦＬＡＧ標識タンパク質を検出し、Ｃ１２１タンパク質が分泌されることが判明した。塩基配列から予想される成熟Ｃ１２１タンパク質の分子量は２７ｋＤａであり、ウェスタンブロッティングで検出されたＦＬＡＧ標識蛋白の分子量とよく一致した。また、細胞抽出物についても同様な検討を行ったところ同一のバンドが確認された。以上の結果から、Ｃ１２１タンパク質には可溶型と細胞膜結合型（細胞表面タンパク質）の２つの形態が存在するものと考えられた。また、培養上清中のＦＬＡＧ標識Ｃ１２１蛋白を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて除去することが可能であるが、この処理により培養上清中の活性が完全に失われることから可溶型Ｃ１２１蛋白がＳ２１細胞に対して活性な増殖因子であることが確認された。
本発明者らは、次いで、上記マウスＩＳＦに対応するヒトＩＳＦの単離を試みた。まず、Ｃ１２１の一部を含むマウスＩＳＦの部分配列に相当する９４２ｂｐの断片（ＯＬ−１）の一部を増幅するように設計したプライマーを用いて、ヒト腎由来ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を実施したところ、マウスＩＳＦに対応するヒトｃＤＮＡ断片を得た。さらに、完全長ｃＤＮＡを得るべく、ヒト腎由来ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として５’及び３’ＲＡＣＥを実施した。その結果、１本の主要なバンドの増幅が観察された。これをＴＡベクターにサブクローニング後、塩基配列を決定したところ、マウスＩＳＦのヒト相同遺伝子であることを確認した。完全長ヒトＩＳＦは、アミノ酸レベルでマウスＩＳＦと９４．７％の相同性を示した。興味深いことにヒト遺伝子にはマウスＩＳＦ蛋白のＮ端部に相当する部位に８７アミノ酸の欠失が存在していた。ＤＮＡＳＩＳプログラムによるモチーフ検索の結果、ヒト及びマウスＩＳＦ蛋白には２つのロイシンジッパー様パターンと２つのチロシンキナーゼによるリン酸化を受ける部位が見出された。しかし、ヒト遺伝子には５個のＮ型糖鎖付加可能部位が存在するのに対してマウス遺伝子では３個しか存在しなかった。
また、種々のヒト組織におけるヒトＩＳＦの発現を検討した結果、ヒトＩＳＦの発現は骨格筋、大腸、小腸及び末梢白血球において他の組織に比べて低いレベルであるものの、比較的一様な幅広い発現が認められた。また、ヒトＭＴＮ  ｂｌｏｔに対して行ったノーザン解析の結果３．５、５．５及び８．０ｋｂの３つの主要な転写産物を認めた。ヒトＩＳＦタンパク質をコードする転写産物は３．５ｋｂのバンドに相当し、他の大きい転写産物は他の相同な遺伝子あるいはオルタネイティブスプライシングに由来するものと考えられた。
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものであり、変異Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖支持能を有する新規なマウスサイトカインおよびヒトサイトカイン、それらの遺伝子、並びにそれらの製造及び用途を提供する。
より具体的には、本発明は、
（１）  下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ａ）に記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ｄ）に記載のＤＮＡ。
（ｆ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２）  配列番号：２または４に記載のタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）  （１）または（２）に記載するＤＮＡが挿入されたベクター、
（４）  （１）または（２）に記載のＤＮＡまたは（３）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
（５）  （１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
（６）  （４）に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質またはペプチドを回収する工程を含む、（５）に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
（７）  （５）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（８）  配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド、
（９）  （５）に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該タンパク貿またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１０）  （９）に記載の方法により単離されうる、（５）に記載のタンパク質に結合する化合物、
（１１）  （５）に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０８で特定される細胞に（５）に記載のタンパク質を接触させる工程、
（ｂ）該細胞の増殖を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該増殖を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、および
（１２）  （１１）に記載の方法により単離されうる、（５）に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物、を提供するものである。
本発明は、変異Ｂａ／Ｆ３細胞（Ｓ２１細胞）の増殖支持能を有する新規サイトカインに関する。本発明に含まれる、単離されたマウスＣ１２１（細胞膜結合型）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
本発明者らにより単離されたＣ１２１タンパク質には、可溶型（ｓＣ１２１）および細胞膜結合型（ｓｃＣ１２１）の２つの形態が存在する。可溶型Ｃ１２１タンパク質の分泌は種々の蛋白分解酵素阻害剤により阻害される。可溶型Ｃ１２１タンパク質は、細胞膜結合型Ｃ１２１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）の２０番と２１番の間の切断により生成されると考えられる。
これらＣ１２１タンパク質は、全長ＩＳＦタンパク質のＣ端側の領域に相当する。しかしながら、発現クローニングの過程でＣ１２１タンパク質がＳ２１細胞の増殖を支持可能であることが確認されており、Ｃ１２１タンパク質自身は生物学的に活性な独立のタンパク質である。ＣＯＳ７細胞に発現させ、分泌させた可溶型のＣ１２１タンパク質のみならず、Ｃ１２１をトランスフェクトしたストローマ細胞も、Ｓ２１細胞の増殖支持活性を増強した。この事実から、細胞膜結合型タンパク質も可溶型タンパク質と同様に強力な生物学的活性を有していることを示している。また、可溶型Ｃ１２１タンパク質を含む培養上清から抗体を用いて該タンパク質を除去することによりこの増殖支持活性が失われることも、Ｃ１２１タンパク質自体がＳ２１細胞の増殖支持活性の本体であることを裏付ける。Ｓ２１細胞とＣ１２１タンパク質を発現したストローマ細胞との間に観察された相互作用はＢ細胞系細胞あるいは骨髄における他の造血細胞の増殖、分化において生理的な意義を内包しているものと考えられる。
また、本発明者らは、マウスＩＳＦ（Ｌｅｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，１１３７−１１４４，１９９０）として報告されているタンパク質に対応するヒトＩＳＦを単離した。本発明に含まれる、単離されたヒトＩＳＦのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。その一次構造の解析の結果、ヒトＩＳＦ遺伝子は、アミノ酸レベルでマウスＩＳＦと９４．７％の相同性を示した。しかしながら、興味深いことに、ヒト遺伝子にはマウスＩＳＦタンパク質のＮ端部に相当する部位に８７アミノ酸の欠失が存在していた。さらに、ＤＮＡＳＩＳプログラムによるモチーフ検索の結果、ヒト及びマウスＩＳＦ蛋白には２つのロイシンジッパー様パターンと２つのチロシンキナーゼによるリン酸化を受ける部位が見出されたが、ヒト遺伝子においては５個のＮ型糖鎖付加可能部位が存在したのに対して、マウス遺伝子では３個しか存在しなかったという点で相違していた。
本発明のＣ１２１タンパク質はＳ２１細胞の増殖支持活性を有することから、該タンパク質を発現させたストローマ細胞を利用したヒト骨髄幹細胞の増殖、あるいは可溶化該タンパク質を直接投与することによる造血能の亢進が期待できる。該タンパク質の活性の促進剤も、その投与により同様の効果が期待できる。また、該タンパク質の阻害剤は、Ｃ１２１タンパク質の増殖活性に依存性を示す癌などに対して、有効な抗癌剤となることが期待できる。また、ヒトＩＳＦは、ヒトＣ１２１との相同性からＣ１２１と同様の活性を有することが期待され、ヒトＩＳＦタンパク質、該タンパク質の促進剤、および阻害剤についても、それぞれＣ１２１タンパク質、該タンパク質の促進剤、および阻害剤と同様の効果が期待できる。
本発明は、また、マウスＣ１２１タンパク質（細胞膜結合型および可溶型）と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、マウスＣ１２１タンパク質の機能を保持した変異体やヒトを含む他の哺乳動物由来のＣ１２１タンパク質が含まれる。
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、Ｓ２１細胞の増殖支持活性を有することを指す。対象となるタンパク質がＳ２１細胞の増殖支持活性を有するか否かは、例えば、該タンパク質自体をＳ２１細胞に作用させて、Ｓ２１細胞の増殖を検出する方法や、該タンパク質をコードするＤＮＡをＭＳ１０細胞などの細胞に導入し、該細胞表面に該タンパク質を発現させて、これをＳ２１細胞に接触させ、Ｓ２１細胞の増殖を検出する方法などにより、判定することができる。具体的な方法は、後述の実施例に従って行えばよい。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、マウスＣ１２１タンパク質のアミノ酸に適宜変異を導入することによりマウスＣ１２１タンパク質と機能的に同等な変異タンパク質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
本発明においては、このようにマウスＣ１２１タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、マウスＣ１２１タンパク質と機能的に同等な変異タンパク質が含まれる。また、ヒトなどを含む他の哺乳動物由来のＣ１２１タンパク質のように、天然においてマウスＣ１２１タンパク質のアミノ酸配列と１もしくは複数のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有し、マウスＣ１２１タンパク質と機能的に同等であるタンパク質も含まれる。
また、本発明は、ヒトＩＳＦタンパク質と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ヒトＣ１２１タンパク質の機能を保持した変異体が含まれる。上記したように、ヒトＩＳＦタンパク質には、Ｃ１２１タンパク質と同様のＳ２１細胞の増殖支持活性を有することが期待されており、本発明には、Ｓ２１細胞の増殖支持活性を保持するヒトＩＳＦタンパク質の変異体が含まれる。
マウスＣ１２１タンパク質やヒトＩＳＦタンパク質のアミノ酸配列に対し、その変異体において付加、欠失、置換、および／または挿入されているアミノ酸数は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
なお、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することについては、すでに報告がある（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
本発明において細胞膜結合型のマウスＣ１２１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）の複数のアミノ酸が欠失したタンパク質には、該タンパク質からシグナルペプチドが除去された可溶型タンパク質が含まれる。
また、マウスＣ１２１タンパク質（細胞膜結合型および可溶型）やヒトＩＳＦタンパク質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質としては、例えば、これらタンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質は、これらタンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定されない。
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これれにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質が、本発明のマウスＣ１２１タンパク質またはヒトＩＳＦタンパク質と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のタンパク質をグルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなる部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。さらに、本発明のタンパク質の受容体に対するアンタゴニストになりうる。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、たとえば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡは、上述したような本発明のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または３）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のタンパク質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または３）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器（例えば、腎臓、肝臓、骨格筋）から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマーを用いて、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｐ４３−ｐ７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において７６位の塩基Ａから８６４位の塩基ＡからなるＤＮＡ、配列番号：３の塩基配列において１１位の塩基Ａから２３４１位の塩基ＡからなるＤＮＡを包含する。
また、本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターに関する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選択遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するために、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選択するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製機転を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のＣ１２１遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された形質転換細胞に関する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えはｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
また、本発明は、本発明のタンパク質と結合する抗体に関する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であってもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原住を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片あるいはＮ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。
本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、マウスＣ１２１タンパク質またはヒトＩＳＦタンパク質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはマウスＣ１２１タンパク質またはヒトＩＳＦタンパク質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。このようなＤＮＡには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ又はその相補鎖と特異的にハイブリダイズし得るプローブやプライマー、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。また、このようなポリヌクレオチドはＤＮＡチップの作製に利用することも考えられる。
本発明は、例えば、配列番号：１または３に示される塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１または３に示される塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
ここでいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１または３に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。
このようなポリヌクレオチドは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有する。なお、相同性を決定するためのアルゴリズムは、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。このようなＤＮＡは、後述の実施例に記載するように本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを検出若しくは単離するためのプローブとして、又は増幅するためのプライマーとして有用である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害し、従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
また、本発明は、本発明のタンパク質を利用する、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、ｃＤＮＡライブラリーを発現させた細胞などが挙げられる。被検試料を接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、可溶型タンパク質として、担体に結合させた形態として、他のタンパク質との融合タンパク質として、また、細胞表面に発現させた形態として、被検試料に接触させることができる。
本発明のタンパク質を用いて、例えば、該タンパク質に結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ  ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のタンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。
融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のタンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたタンパク質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明のタンパク質に結合したタンパク質は、クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に結合するタンパク質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のタンパク質と結合する結合タンパク質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、Ｂａ／Ｆ３細胞に由来するＳ２１細胞など）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、精製して標識した本発明のタンパク質と上記フィルターとを反応させ、本発明のタンパク質と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のタンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質に融合したペプチド又はポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２）を用いて行う方法が挙げられる。本発明のタンパク質をＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離して大腸菌に導入して発現させる（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）「ｔｗｏハイブリッドシステム」（「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「Ｈｙｂｒｉ  ＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、文献「Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２」）を利用して、本発明のタンパク質に結合するタンパク質またはその遺伝子を調製することも可能である。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
本発明のタンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のタンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製することができる。
得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは本発明のタンパク質と被検化合物との間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のタンパク質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、タンパク質に限らず、本発明のタンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
このスクリーニングにより単離され得る化合物には、例えば、本発明のタンパク質に対する受容体が含まれる。また、このスクリーニングによれば、本発明のタンパク質が関連する疾患において、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害するための薬剤や、本発明のタンパク質からのシグナル伝達を促進または阻害する薬剤の候補となる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、本発明のタンパク質に結合する活性を有する化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物に含まれる。
また、本発明は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明のタンパク質は、Ｓ２１細胞の増殖支持活性を有することから、この活性を指標に、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることが可能である。
このスクリーニング方法は、（ａ）被検試料の存在下で、Ｓ２１細胞に本発明のタンパク質を接触させる工程、（ｂ）該細胞の増殖を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該増殖を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質としては、天然由来のタンパク質であっても、組み換えタンパク質であってもよい。また、精製されたタンパク質であっても、細胞培養上清（細胞から分泌される場合）であってもよい。また、細胞膜上に発現させた形態であってもよい。
被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。また、上記の本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングで得られた化合物を被検試料として用いることも可能である。
Ｓ２１細胞の増殖の検出は、例えば、実施例に記載のように行うことができる。Ｓ２１細胞の増殖の検出の結果、増殖が促進されれば、用いた化合物は本発明のタンパク質の活性を促進する化合物の候補となり、また、増殖が抑制されれば用いた化合物は本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物の候補となる。本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物には、本発明のタンパク質とその受容体との結合を阻害する化合物が含まれる。
このスクリーニングにより単離される化合物は、本発明のタンパク質とその受容体を介したシグナル伝達を促進したりまた阻害する薬剤の候補になる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も含まれる。
本発明のタンパク質や本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物をヒトや他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
例えば、本発明のタンパク質の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１μｇから１００ｍｇであると考えられる。
本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を調節する化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
本実施例に用いたリコンビナントマウスＩＬ３（カタログ番号０１−３７４）とマウスＧＭ−ＣＳＦ（カタログ番号０１−１６７）はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．より購入した。リコンビナントマウスＩＬ５（カタログ番号４０５−ＭＬ）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより、リコンビナントマウスＳＣＦ（カタログ番号Ｓ−９９１５）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社よりそれぞれ購入した。抗マウスＭ−ＣＳＦ、抗マウスＳＣＦ及び抗マウスＩＬ１の抗体は全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社より購入した。抗ＦＬＡＧ  ＢｉｏＭ２抗体はＳｉｇｍａ社より購入した（カタログ番号Ｆ−９２９１）。レトロウィルスパッケージング細胞であるＢＯＳＣ２３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１５５４）は１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）にＧＰＴ選択試薬（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ，Ｌａｖｅｌｅｔｔｅ，ＮＪ）を添加して維持し、トランスフェクションの２日前にＧＰＴ選択試薬抜きのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに交換した。マウスｐｒｅ−Ｂ細胞株であるＢａ／Ｆ３は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ３を添加して培養した。また以下のマウスストローマ細胞株、ＳＴ２、ＰＡ６、ＣＦ１及びＯＰ９は１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて培養した。別のマウス骨髄由来ストローマ細胞株であるＭＳ１０（東京大学西原博士より供与）は１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ培地にて培養した。ＣＯＳ７、ＮＩＨ３Ｔ３及びＲａｔ１細胞はＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにて維持した。
また、本実施例において用いたＥＭＳはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社より購入した（カタログ番号Ｍ−０８８０）。以下の蛋白分解酵素阻害剤はＳｉｇｍａより購入して用いた：ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ｐＡＧＡ）（カタログ番号Ａ４３３６）、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ（Ｃｐ）（カタログ番号Ｃ−４０４２）、Ｂｅｓｔａｔｉｎ（ＢＳ）（カタログ番号Ｂ−８３８５）、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（Ｌｐ）（カタログ番号Ｌ−２０２３）、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ（Ｐｓ）（カタログ番号Ｐ−４２６５）及びＢａｃｉｔｒａｃｉｎ（Ｂｃ）（カタログ番号Ｂ−０１２５）。これら全ての蛋白分解酵素阻害剤は１０ｍｌＭの濃度でＤＭＳＯに溶解してストック溶液とした。
［実施例１］変異Ｂａ／Ｆ３細胞クローンＳ２１の単離
＜Ｂａ／Ｆ３変異源処理＞
新規な異所性受容体を発現する細胞株を得るため、マウスＩＬ３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３の変異源による処理を行った。変異源としては哺乳動物細胞で広く用いられているＥＭＳを用いる事とした。
１ｘ１０７個のＢａ／Ｆ３細胞を１０μＭのＥＭＳで２時間、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で処理を行った。至適なＥＭＳ濃度と処理時間は種々の濃度と処理時間でＢａ／Ｆ３細胞した後２４時間後の生存細胞の％をモニターする事により決定した。上記条件は１０〜２０％の細胞が生存する条件であり、今回の目的に適ったものと考えられた。上記条件でＥＭＳ処理を行った後、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）にて細胞を回収し、さらに細胞に付着した少量のＥＭＳを除去すべく１回洗浄を行った。得られた処理細胞はＩＬ３を含む培地に懸濁せしめさらに２４時間培養する事によりＥＭＳによるダメージからの回復を図った。再度遠心（１０００ｒｐｍ、５分）にて細胞を回収し、ストローマ細胞上に播種すべくＤＭＥＭ−Ｆ１２／１０％ＦＣＳ培地に懸濁せしめた。
＜共培養と変異Ｂａ／Ｆ３クローンの分離＞
共培養にはＰＡ６、ＳＴ２、ＣＦ１及びＯＰ９の４種のストローマ細胞株を用いた。脾臓由来ストローマ細胞株であるＣＦ１を除いて他は全てマウス骨髄由来ストローマ細胞株である。これらのストローマ細胞５ｘ１０６個を１００ｍｍのディッシュに播種して培養しコンフルエントとしたものをフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上に１ｘ１０６個の上記変異Ｂａ／Ｆ３細胞を播種した。培養液の交換は４〜５日毎に行い、ストローマへのＢａ／Ｆ３細胞の接着を乱さない様注意を払いながら培養液の半量を新鮮培地と交換した。陰性対照として変異源処理を行わないＢａ／Ｆ３細胞を同様にストローマ細胞と共培養した。
ＥＭＳ処理Ｂａ／Ｆ３細胞と各種ストローマ細胞との共培養に於いて、ストローマ層に接着して形成された明瞭なコロニーが観察されるのに５〜６週間を要した（図１）。ＥＭＳ処理を行わない対照のＢａ／Ｆ３細胞の場合には細胞は共培養６日迄に全て死滅しコロニー形成は認められなかった。形成された個々のコロニーは円筒環で他のコロニーから隔離した後トリプシン・ＥＤＴＡ処理により（一部の場合では直接ピペッティングにより）回収した。回収したコロニーからさらに９６穴プレートにて限界希釈法を行う事により個々のクローンを得た。単離した総計９６クローンの内訳は３５クローンがＰＡ６との共培養、４９クローンがＳＴ２との共培養、１２クローンがＣＦ１との共培養に由来している。このうち１４の代表的なクローン（内訳はＰＡ６との共培養より６、ＳＴ２より５、ＣＦ１より３）を選び、個々のクローンについてストローマ細胞依存性の増殖を再度確認した。これら１４のクローンは、全てがＰＡ６あるいはＳＴ２の存在下で増殖可能であったが、ＰＡ６との共培養に由来する３クローン（Ｐ２０、Ｐ１及びＰ１６）はＣＦ１上では増殖不可で異なるストローマ依存性の存在が示唆された。
＜変異Ｂａ／Ｆ３クローンの性状の検討＞
さらに総計９６個の得られたクローンのうち代表的な上記１４クローンを選んで以下のような詳細な解析を行った。
ｉ）ＩＬ３及び類縁サイトカイン存在下液体培養での増殖
個々のクローンについて共通β鎖を介してシグナル伝達が行われる事が知られているサイトカイン（ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ５）およびＳＣＦの増殖刺激活性を検討した。約１ｘ１０４個の個々のクローンに由来する細胞を、ｍＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ｍＩＬ５（１ｎｇ／ｍｌ）、ｍＳＣＦ（５ｎｇ／ｍｌ）及びｍＩＬ３（５ｎｇ／ｍｌ）を含む９６穴プレートに播種して７２時間培養後、トリパン青排除試験により生細胞数を測定した。その結果、半数のクローン（Ｓ１６、Ｓ２５、Ｐ１１、Ｐ２０、Ｃ３、Ｃ７及びＣ１０）がｍＧＭ−ＣＳＦに反応して増殖可能であったのに対して、いずれのクローンもｍＩＬ５あるいはｍＳＣＦに対しては反応性を示さなかった（表１）。ｍＩＬ３は、いずれのクローンも反応性を有していた。
0004541613.tif 000002
ｉｉ）各種中和抗体のストローマ（ＳＴ２）依存性増殖に及ぼす効果
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社より購入した坑ｍＭ−ＣＳＦ抗体（５ｍｇ／ｍｌ）、抗ｍＳＣＦ抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）、抗ｍＩＬ１抗体（１ｍｇ／ｍｌ）について検討を行った。Ｓ１６、Ｓ２５、Ｐ２０、Ｃ３及びＣ１０の５クローンは前項の検討でｍＧＭ−ＣＳＦに対する反応性が認められ、観察されたＳＴ２依存性増殖がｍＧＭ−ＣＳＦを介したものと考えられた事から除外した。ＳＴ２細胞を２４穴プレートに播種して１週間培養後、上記抗体を添加しさらに２時間後に１ｘ１０４個の被検変異Ｂａ／Ｆ３細胞を重層した。さらに５日間培養を行った後、細胞を回収後、細胞数を計数し、抗体非添加の場合を対照として抗体の効果を検討した。
ｍＭ−ＣＳＦ、ｍＳＣＦ及びｍＩＬ１に対する中和抗体が各種変異Ｂａ／Ｆ３細胞のストローマ依存性増殖に及ぼす効果を表２に示した。７個のクローン（Ｓ１６、Ｓ２５、Ｐ１１、Ｐ２０、Ｃ３、Ｃ７及びＣ１０）は上記試験でｍＧＭ−ＣＳＦに対する反応性を示した事から除外した。５クローン（Ｓ６、Ｓ９、Ｓ２１、Ｐ１１及びＰ１６：ＳはＳＴ２との共培養由来、ＰはＰＡ６との共培養由来）はいずれの抗体によっても影響を受けなかったが残りのクローンは５日間の抗体処理により抗体非添加対照と比較して細胞数の減少を示した。これら５クローンのうち、クローンＳ２１が最も良好なストローマ依存性増殖を呈した事から、Ｓ２１を以後の発現クローニングの実験に供した。Ｓ２１細胞は、下記の寄託機関に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）
（ロ）寄託日（原寄託日）  平成１１年４月２７日
（ハ）寄託番号  生命研条寄第６７０８号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０８）
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［実施例２］  変異Ｂａ／Ｆ３クローン（Ｓ２１）の増殖支持能を欠いたフィーダー細胞株の検索
発現クローニングの際のレシピエントとして使用すべく、変異Ｂａ／Ｆ３クローン（Ｓ２１）の増殖支持能を欠いたフィーダー細胞株の検索を行った。これはレシピエントのストローマ細胞にｃＤＮＡを導入してＳ２１細胞の支持能を指標にスクリーニングを行う際に、観察された増殖支持活性が導入されたｃＤＮＡに由来して、レシピエントのストローマ細胞が本来保有していたものではない事を確認するうえで重要である。
ＮＩＨ３Ｔ３およびＲａｔ１の２種の繊維芽細胞株、ならびに、マウス骨髄由来ストローマ細胞株であるＭＳ１０及びＳＴ２（陽性対照）について検討を行った。すなわち、１ｘ１０５個の細胞を１２穴プレートに播種し細胞がコンフルエントに達した後さらに２日間コンディショニングを行い、１ｘ１０４個のＳ２１細胞を重層後３日目に判定を行った。
その結果、ＮＩＨ３Ｔ３及びＲａｔ１は表３に示すように、全ての変異Ｂａ／Ｆ３クローン及び親株の増殖を支持可能であった。ＳＴ２による変異Ｂａ／Ｆ３クローンの増殖支持が細胞接触を必要とするのに対して、これらの繊維芽細胞株によるＳ２１細胞の増殖支持は細胞接触を必要とせず、フィーダー細胞由来の可溶性増殖因子の関与が示唆された。それに加えて上記ＮＩＨ３Ｔ３とＲａｔ１の２種の繊維芽細胞株は、１週間以上の培養維持が困難であり、長期の選別期間を要する発現クローニングのレシピエントとしては不適と考えられた。これに対してマウス骨髄ストローマ由来細胞株であるＭＳ１０は、検討した何れの変異Ｂａ／Ｆ３クローンの増殖支持能を欠き、かつ、週毎の培養液交換により１ケ月以上にわたって培養維持が可能であることから、レシピエントとして最も適当と考えられた。以上の結果から、ＭＳ１０を発現クローニングのレシピエントとして使用した。
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［実施例３］  Ｃ１２１の発現クローニング
上記の結果を踏まえ、バイオアッセイの標的としてＳ２１細胞を、発現クローニングのレシピエントとしてＭＳ１０細胞を用いる事により、レトロウィルスを介した新規造血因子の発現クローニングの実施に移行した。
＜ｃＤＮＡライブラリーの構築＞
Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＦＡＳＴＴＲＡＣＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、マウス骨髄ストローマ細胞株ＳＴ２より調製した。ｃＤＮＡライブラリーはｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ社）を用い、製造元の指示に若干の改変を加えて構築した。すなわち、オリゴｄＴプライマーを用いた２方向性クローニングによりｃＤＮＡを合成後、ＢｓｔＸ１アダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を付加した後アガロースゲル電気泳動により分画を行い、１．０ｋｂより大きなｃＤＮＡ断片をレトロウィルスベクターｐＭＸ（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２４，３２４−３２９，１９９６）のＢｓｔＸ１部位に挿入した。ライゲーションにより環状プラスミドとした後、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いたエレクトロポーレーション法により大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を形質転換せしめた。得られたｃＤＮＡライブラリーは４．１ｘ１０７個の独立したクローンを含んでいた。
＜レトロウイルスストックの調製と感染＞
２ｘ１０６個のＰＬＡＴ−Ｅ細胞を６−ｃｍのディッシュに播種した翌日に、高力価レトロウィルスストックを得るべく、前項で調製したｃＤＮＡライブラリーをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）法にてトランスフェクトした。さらに２日間培養後培養上清を回収し感染に用いた。ＭＳ１０細胞への感染は、感染前日に１ｘ１０４個の細胞を２４穴プレートに播種したものを用い、１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で０．５ｍｌのウィルスストックと４時間孵置する事により行った。次いで０．５ｍｌの新鮮ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地を加えさらに培養を継続し、２４時間後にレトロウィルスを含んだ培地は新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地と交換した。さらに４８時間培養後１ｘ１０４個のＳ２１細胞を重層する事により共培養を開始し、以後経時的に観察を行った。レトロウィルスの力価はｐＭＸベクターにＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）ｃＤＮＡを挿入したものをＰＬＡＴ−Ｅ細胞に導入し、上記と同様に得られたウイルスを含む培養上清をＭＳ１０細胞に感染させ、ＦＡＣＳによりＧＦＰ発現細胞数を算定することにより測定した。
＜発現クローニング系＞
発現クローニングは北村等の方法（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，９１４６−９１５０，１９９５）に若干の改変を加えて実施した。それぞれ６ｘ１０３個の独立したクローンから成る２回のスクリーニングを行った。スクリーニングにはシブリング（ｓｉｂｌｉｎｇ）法を用いた。個々のスクリーニングに於いて、ライブラリーは小さなプール（１プール当たり６０クローンを含む）に分割した後２つのプールを併せて１プールとした。このプールからミニプレップＤＮＡを調製した後、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞に導入してウィルスを含む培養上清を得た。このウィルスを含む培養上清を上記の如くＭＳ１０細胞に感染せしめ、さらにその２日後にＳ２１細胞を重層した。ＭＳ１０細胞へのレトロウィルスの感染効率は８０〜９５％であった。
２回目のスクリーニングに於いて、ひとつのプール（プール番号２−２１）がレシピエントのＭＳ１０細胞にＳＴ２細胞の場合と同様なＳ２１支持能を賦与する事を見出した。すなわち、共培養開始３〜４週間後、Ｓ２１細胞はプールＮｏ．２−２１を感染させたＭＳ１０細胞層の表面に接着して増殖するのに対して、同様の現象は感染を行わなかったＭＳ１０細胞あるいは他のプールを感染させたＭＳ１０細胞に於いては全く観察されなかった。このプールは１２０個の独立したクローンを含んでいる事から、さらに１４８個の単一クローンを該陽性プールから拾い、ミニプレップＤＮＡを調製しトランスフェクションと感染を繰り返す事によりスクリーニングを行った。
その結果、２つの単一クローン（２−２１−Ｃ１２１と２−２１−Ｃ１２６）がもとのプール２−２１と同等なＳ２１増殖支持能を付与する事を見出した。Ｓ２１細胞はクローン２−２１−Ｃ１２１を感染させたＭＳ１０細胞の表面で増殖するが（図２ａ）、未感染のＭＳ１０細胞（図２ｄ）あるいは他のプールを感染させたＭＳ１０細胞（図２ｃ）に於いては同様な現象は全く認められなかった。同様に親株であるＢａ／Ｆ３細胞はクローン２−２１−Ｃ１２１を感染させたＭＳ１０細胞（図２ｂ）あるいは未感染のＭＳ１０細胞（図２ｅ）との共培養に於いて増殖を示さなかった。上記２個の陽性クローンは同一の塩基配列からなる事が判明し、この遺伝子をＣ１２１と命名した。
［実施例４］  Ｃ１２１の一次構造
塩基配列解析はｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の試薬とＰｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。
Ｃ１２１（配列番号：１）は全長１．２２ｋｂで２６３アミノ酸（配列番号：２）からなるポリペプチドをコードするＯＲＦを含む（図３および４）。Ｎ端の１４アミノ酸は疎水性アミノ酸からなり、アミノ酸番号２０番と２１番の間（図中矢印で示す）で切断されると予測される典型的なシグナルペプチドと推測された（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅの方法、ＰＳＯＲＴ  ＩＩによる予測）。開始コドンは５’端から７５ｂｐの位置にあり、典型的な翻訳開始シグナルの配列は５’非翻訳領域には見当たらない。アミノ酸配列の疎水性解析の結果１９アミノ酸と２６アミノ酸からなる２つ膜貫通領域がそれぞれアミノ酸番号５４−７２と１９０−２１５の領域（図中下線）に見出された。
［実施例５］  Ｃ１２１  ｍＲＮＡの分布
Ｃ１２１の発現の分布を検討する目的で、Ｃ１２１  ｃＤＮＡをプローブとしたノーザン解析を実施した。ノーザン解析は常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に従った。Ｃ１２１  ｃＤＮＡ（１．２２ｋｂ）はｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にて標識後プローブとして用いた。マウスｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カタログ番号７７６２−１）及び種々の細胞株から調製した１μｇのｍＲＮＡを用いて解析を行い、βアクチン（ＭＴＮｂｌｏｔ）あるいはＧ３ＰＤＨ（細胞株）由来ｃＤＮＡで再度ハイブリダイゼーションすることによりローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）量の確認を行った。
３．０、４．０及び６．０ｋｂの３種の異なるサイズの転写産物が全ての検討したマウス組織に於いて検出された（図５）。このうち、腎と肝に於いて比較的高い発現が見られたのに対して、脾、睾丸、骨格筋に於いては低いレベルであった（パネルＡ）。また共にマウス骨髄由来ストローマ細胞株であるＳＴ２及びＳＴ０では高い発現が認められたのに対して、幾つかのマウス細胞株では全く発現を認めなかった（パネルＢ）。
［実施例６］  Ｃ１２１蛋白の発現
Ｃ１２１蛋白の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏで解析する目的で、ＮｏｔＩ部位を利用してＣ１２１の終止コドンの直前にＦＬＡＧエピトープ（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＩ）を挿入する事によりＣ端にＦＬＡＧ標識を付加したＣ１２１蛋白をコードするｃＤＮＡを構築した。得られたｃＤＮＡは哺乳動物発現ベクターであるｐＭＥ１８ＳのＳＲαプロモータ制御下に挿入した（ｐＭＥ−Ｃ１２１と称する）。
２ｘ１０５個のＣＯＳ７細胞を６穴プレートに播種し、翌日ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法によりＣ端にＦＬＡＧ標識を付加した上記ｐＭＥ−Ｃ１２１をトランスフェクトした。４８時間培養後、可溶型Ｃ１２１（ｓＣ１２１）分子の存在を確認するため培養上清を回収し、抗ＦＬＡＧ  ＢｉｏＭ２アフィニティゲル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社，カタログ番号ＩＢ１３０２３）を用いて４℃一晩免疫沈降を実施した。また、細胞膜結合型Ｃ１２１（ｓｃＣ１２１）の検出は細胞を免疫沈降バッファーにて溶解せしめ、遠心にて細胞破片等を除去した後、抗ＦＬＡＧアフィニティゲルにて免疫沈降を行った。
それぞれの免疫沈降物は５０００ｒｐｍ、５分の遠心で回収した後、免疫沈降バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  ＮａＶＯ４、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ及び０．５％ＮＰ４０から成る）にて３回洗浄を行った。結合した蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルバッファーにて溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。転写されたＰＶＤＦ膜は抗ＦＬＡＧ  ＢｉｏＭ２抗体と反応後、ＨＲＰ標識２次抗体と反応せしめ、ＥＣＬウェスタンブロティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｊａｐａｎ社）で発色せしめＥＣＬハイパーフィルムを感光せしめた。
その結果、培養上清中にＦＬＡＧ標識蛋白が検出され（図６）、Ｃ１２１蛋白が培地中に分泌されている事が示された。Ｃ１２１蛋白の開始コドンから２０番目と２１番目のアミノ酸の間でシグナルペプチドの切断が起こると予測（表１）した場合の予想される２４３アミノ酸からなる成熟蛋白の分子量２７ｋＤａは、ウェスタンブロットにて培養上清及び細胞抽出液に検出されたＦＬＡＧ標識タンパク質のバンドのサイズと良く一致した（図６のパネルＡ及びＢ）。以上の結果からＣ１２１タンパク質は可溶型（ｓＣ１２１）と細胞膜結合型（細胞表面タンパク質；ｓｃＣ１２１）の２種の様態で存在するものと結論された。
［実施例７］  蛋白質分解阻害剤を用いた検討
ｓＣ１２１蛋白の培地中への分泌は蛋白分解酵素／シグナルペプチド切断酵素の活性に依存すると考えられた事から、Ｃ１２１蛋白の分泌に及ぼす蛋白分解酵素阻害剤の効果を検討した。前述の如く２ｘ１０５個のＣＯＳ７細胞を６穴プレートに播種後翌日、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法にて１μｇのＦＬＡＧ標識Ｃ１２１  ＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション（４時間）終了後、新鮮ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地に交換して２４時間培養した後、１００μｇの阻害剤を含む新鮮培地に交換しさらに４８時間培養後、培養上清と細胞抽出液を回収した。培養上清と細胞抽出液はそれぞれ抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜への転写を行った後、前述の如くＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出試薬にてＦＬＡＧ標識蛋白の検出を行った。その結果、ｓＣ１２１蛋白の培地中への遊離は完全に阻害されたが（図７，パネルＡ）、細胞膜結合型分子の生成は影響を受けなかった（パネルＢ）。
このように、可溶型Ｃ１２１の生成に関与すると考えられる蛋白分解と分泌は、種々の蛋白分解酵素阻害剤によってブロックされるのに対して、細胞膜結合型分子は上記阻害剤の影響を受けないと考えられる。この現象は当該分子が、如何に増殖シグナルを伝搬するかと云う点に何らかの示唆を与えるものと考えられる。
［実施例８］  Ｃ１２１タンパク質のＳ２１細胞に対する生物活性
可溶型Ｃ１２１蛋白の活性を検討する目的で、可溶型Ｃ１２１タンパク質を含む培養上清の、Ｓ２１あるいはＢａ／Ｆ３細胞の増殖支持能を９６穴マイクロプレート（１００μｌ）にて検討した。陰性対照としては、トランスフェクションしていないＣＯＳ７細胞あるいは空のｐＭＥ１８ＳベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞の培養上清を用いた。１ｘ１０４個の細胞を４８時間培養後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて細胞増殖を判定した。
可溶型Ｃ１２１タンパク質の活性をさらに確認する目的で、上記ＣＯＳ７細胞培養上清から抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＣ１２１タンパク質を除去し、残った培養上清のＳ２１増殖支持能を検討した。０．１、１．０、５．０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＦＬＡＧ抗体を用いて４℃、２時間培養上清を処理した後、１４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により免疫複合体を回収し、残った培養上清を１００μｌずつ９６穴プレートに分注した。トランスフェクションしていないＣＯＳ７細胞あるいは空のｐＭＥ１８ＳベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞の培養上清についても同様に処理し陰性対照とした。親株のＢａ／Ｆ３細胞とＳ２１細胞を上記９６穴プレートに播種して４８時間培養した後前述の方法により細胞増殖を判定した。
その結果、Ｃ１２１を含むＣＯＳ７細胞培養上清は、Ｓ２１細胞の増殖は支持するが、親株のＢａ／Ｆ３細胞の増殖は支持しないことが判明した（図８Ａ）。さらに抗ＦＬＡＧ抗体アフィニティゲルを用いて培養上清中のｓＣ１２１蛋白を除去する事によりこの活性が完全に失われた事から、可溶型Ｃ１２１タンパク質はＳ２１細胞に対して活性な増殖因子であり、Ｓ２１細胞の増殖がｓＣ１２１タンパク質に依存している事が確認された（図８Ｂ）。
また、同じ発現ベクターをＭＳ１０細胞に導入し、共培養の実験を行ったところ、Ｓ２１細胞はＣ１２１を導入したＭＳ１０細胞と共培養する事により増殖可能であった。
［実施例９］  Ｃ１２１のヒト相同遺伝子の検出
Ｃ１２１のヒト相同遺伝子をクローニングする為、まず、ＥｃｏＲＩ消化ヒト染色体ＤＮＡに対してサザンブロットを行い、Ｃ１２１をプローブとした交差ハイブリダィゼーションを試みた。
５μｇのマウス染色体ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カタログ番号６６５０−１）はＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩあるいはＡｃｃＩの制限酵素にて、５μｇのヒト染色体ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カタログ番号６５５０−１）はＥｃｏＲＩにて一晩３７℃で消化した後、１％アガロースによる電気泳動にて分離した。ＤＮＡの膜への転写及びサザン解析は標準的な手法に依った（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）。プローブには、全長Ｃ１２１  ｃＤＮＡ（図１０）を用いた。プローブは塩基配列を確認した後、ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）により標識を行い実験に供した。交差ハイブリダイゼーションの為の低ストリンジェンシー条件としてブロットを５０℃、３０分間洗浄した後検出を行った。
しかし、図９ａに示したように明瞭なバンドを認めなかったことから、次にＩＳＦの利用可能な配列として、報告されたＩＳＦ配列のＮ端側部分でＣ１２１の上流１９３ｂｐ迄を含む１２５０ｂｐの断片（ＯＳ−１）をＰＣＲにより増幅してプローブとして、上記と同様にサザンブロット解析を行った。ＯＳ−１プローブは、ＩＳＦ配列に由来するＳ３Ｒ（５’−ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＴ  ＧＴＣ−３’／配列番号：５）及びＡＳ２Ｒ（５’−ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＧ−３’／配列番号：６）のプライマーを用いて増幅した（図１０Ａ）。プローブは塩基配列を確認した後、ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）により標識を行い実験に供した。ハイブリダイゼーションの条件は上記と同様に行った。しかし、やはり辛うじて視認可能な程度のシグナルしか得られなかった（図９ｂ）。
そこで、Ｃ１２１とＯＳ−１の両者と重複する部分に相当する９４２ｂｐの断片（ＯＬ−１）を増幅してプローブとして用い、同様にサザンブロット解析を行った。ＯＬ−１プローブは、Ｓ５Ｒ（５’−ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ−３’／配列番号：７）及びＧＳＰ−１（５’−ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＣＴ−３’／配列番号：８）のプライマーを用いて増幅した９４２ｂｐ断片を用いた（図１０Ｂ）。Ｃ１２１とＯＳ−１の間には１８０ｂｐの重複がある。プローブは塩基配列を確認した後、ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）により標識を行い実験に供した。ハイブリダイゼーションの条件は上記と同様に行った。
その結果、ＯＬ−１プローブを用いたハイブリダイゼーションにより明瞭なバンドが観察された（図９ｃ）事から、Ｃ１２１あるいはＯＳ−１に相当する部分はヒト相同遺伝子の対応する部位と弱いハイブリダイゼーションしか得られないのに対してＯＬ−１に相当する部位はより良く保存されているものと考えられた。
［実施例１０］  ＰＣＲによるＣ１２１のヒト相同遺伝子の検出
上記染色体ＤＮＡを用いたサザン解析の結果を確認する目的で、ＯＬ−１領域に位置するプライマー（図１０Ｂ参照）、Ｓ３Ｒ、Ｓ４Ｒ、Ｓ５Ｒ（何れもセンス鎖）及びＧＳＰ−１（アンチセンス鎖）を用い、ヒト腎Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７４０５−１）を鋳型として下記の条件にてＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマー配列を以下に示す。
Ｓ３Ｒ；      ５’−ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＴ  ＧＴＣ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：９）
Ｓ４Ｒ；      ５’−ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＴＡＴ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：１０）
Ｓ５Ｒ；      ５’−ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：１１）
ＧＳＰ−１；  ５’−ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＣＴ−３’（２３ｍｅｒ）（配列番号：１２）
ＰＣＲ反応は、９４℃  ５分、の後、「９４℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １分」を３５サイクル行い、７２℃  ２分の後、４℃で反応を停止させた。
その結果を図１１に示す。ＰＣＲ産物は電気泳動上予想されたサイズの単一バンドを呈し、塩基配列解析の結果、ＯＬ−１断片に一致する事を確認した。腎由来ライブラリーはマウスに於いてＩＳＦの発現が高い事から選択した。
［実施例１１］  Ｃ１２１のヒト相同遺伝子の完全長ｃＤＮＡの単離
次に完全長ｃＤＮＡを得るべくヒト腎由来ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として５’及び３’ＲＡＣＥを実施した。２セットの遺伝子特異的プライマー；５’ＲＡＣＥにはＧＳＰ−１とｈＧＳＰ２−５、３’ＲＡＣＥにはＳ６ＲとｈＧＳＰ１−３、をそれぞれ用いた（図１０）。これらのプライマーは何れもＯＬ−１部位に位置してＧＳＰ−１とＳ６Ｒはそれぞれ１８０ｂｐ重複する断片を増幅する。プライマーを以下に示す。
５’−ＲＡＣＥプライマー：
ＧＳＰ−１；      ５’−ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＣＴ−３’（２３ｍｅｒ）（配列番号：１３）
ｈＧＳＰ２−５；  ５’−ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＴＧＴ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号：１４）
３’−ＲＡＣＥプライマー：
Ｓ６Ｒ；          ５’−ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＴＧＣ−３’（２１ｍｅｒ）（配列番号：１５）
ｈＧＳＰ１−３；  ５’−ＧＴＡ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号：１６）
ＲＡＣＥ反応は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社が推奨するプロトコルに従い、サーマルサイクラー条件は以下のようにして実施した。
第１回目のＰＣＲ反応を、９６℃  ４分、「９６℃  ３０秒、６８℃  ４分、７２℃  ２分」を３５サイクル、７２℃  ２分の後、４℃で反応を停止する条件で行った。
第２回目のＰＣＲ反応は、９４℃  ４分、「９４℃  ２０秒、７０℃  ３分３０秒」を５サイクル、「９４℃  ２０秒、６８℃  ３分３０秒」を２５サイクル、７２℃  ４分の後、４℃で反応を停止する条件で行った。
その結果、５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥの何れに於いてもネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲの第２ラウンドで図１２に見られるように１本の主要なバンドの増幅が観察された。
２μｌのＲＡＣＥ産物はキット（ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に付随したワンショットコンピテントセル（ｏｎｅ−ｓｈｏｔ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を用いてＴＡベクターにサブクローニングした。５’ＲＡＣＥ反応由来の４０クローン及び３’ＲＡＣＥ由来の３０クローンについてインサートの確認をＴＡベクター由来配列をプライマーとしてＰｒｅｍｉｘ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（東洋紡社）を用いて行った。このうち、約１．５ｋｂのインサートを含むクローンとして５’ＲＡＣＥ反応について５クローン、３’ＲＡＣＥ反応について６クローンを選択して塩基配列を決定した。なお１．５ｋｂのインサートサイズは両ＲＡＣＥ反応で増幅された主要なバンドのサイズである。
塩基配列解析はｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて行った。部分的な配列解析の結果、５’ＲＡＣＥに由来する４クローン（ＴＡ／３−２６、ＴＡ／３−２９、ＴＡ／３−３５及びＴＡ／３−３８）は全長ｈＩＳＦ  ｃＤＮＡの５’端に相当し、３’ＲＡＣＥに由来する２クローン（ＴＡ／２−１６及びＴＡ／２−２０）は３’端に相当する事が明らかとなった（図１３）。これらのクローンの全長を解析した結果、５’ＲＡＣＥ由来の４クローンは全て同一でリーダー（ｌｅａｄｅｒ）配列を含んでいた。３’ＲＡＣＥ由来の２クローンも同一のテール（ｔａｉｌ）配列を含む配列であった。全長の塩基配列解析はプライマーウォーキングの手法に依った。
完全長ｃＤＮＡはＴＡ／３−２６（ｌｅａｄｅｒ配列を含む）及びＴＡ／２−１６（ｔａｉｌ配列を含む）を用いて調製した（図１４）。すなわち、先に述べた様に５’及び３’ＲＡＣＥ産物は１８０ｂｐの重複を含み、この部分にユニークなＢａｌＩ制限酵素認識部位（図１５）が存在する事から、ＴＡ／３−２６のインサートをＥｃｏＲＩとＢａｌＩで消化し、ＴＡ／２−１６のインサートをＢａｌＩとＸｂａＩで消化した後、２段階のライゲーション反応を経て連結したＴＡ／３−２６−ＴＡ／２−１６断片をｐＭＥ１８Ｓベクターに挿入する事により完全長ｈＩＳＦ  ｃＤＮＡを得た（図１６）。
塩基配列の解析により、得られた遺伝子は、マウスＩＳＦのヒト相同遺伝子である事が確認された。完全長ヒトＩＳＦは２６２０ｂｐ（配列番号：３）で、７７７アミノ酸（配列番号：４）をコードする２３３１ｂｐのＯＲＦを含む（図１７〜２０）。アミノ酸レベルでヒト、マウスＩＳＦは９４．７％の相同性を示す。ＯＲＦのＮ端にはシグナルペプチドと考えられる疎水性アミノ酸に富む部位が存在し、図中矢印で示したアミノ酸番号５８番と５９番の間で切断が起こる事が予測（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｅの方法、ＰＳＯＲＴ  ＩＩによる予測）される。開始コドンはインサートの５’端から１１塩基下流に存在し、５’非翻訳領域には翻訳開始の為の典型的なＫＯＺＡＫ配列（ＧＣＣＡＧＴＧＴＧ）が認められる。報告されているマウスＩＳＦ  ｃＤＮＡは８５５アミノ酸をコードする全長２９３７ｂｐから成り、興味深い事にこれはヒト相同遺伝子の場合にはマウス遺伝子のＮ端部分に相当する部位に８７アミノ酸の欠失がある事に起因している。ＤＮＡＳＩＳプログラムを用いたモチーフ検索の結果、２つのロイシンジッパー様パターンと２つのチロシンキナーゼによるリン酸化部位がヒト、マウス何れの分子に於いても見出された（図２１）。しかし、ヒトタンパク質の場合には５個のＮ型糖鎖付加可能部位が存在するのに対して、マウスタンパク質の場合は３個のみであった。
［実施例１２］  ｈＩＳＦの発現分布
種々のヒト組織に於けるｈＩＳＦの発現分布をノーザン解析及びＲＴ−ＰＣＲにより検討した。ノーザン解析は標準的な手法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に従い、ＴＡ／３−２６（Ｎ端側断片）ＤＮＡ（１．５ｋｂ）をｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて標識してプローブとし、ヒトｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カタログ番号７７６１−１）に対して実施した。さらに、種々のヒト組織に於けるｈＩＳＦの発現レベルを検討する目的で、ＲＴ−ＰＣＲによる解析を行った。完全長ｈＩＳＦの塩基番号１４１０番から２０１０番に相当する部分に由来する配列をプライマーとして、約３ｎｇの各組織に由来するｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  ｐａｎｅｌ）を鋳型として下記のサーマルサイクラー条件にて実施した。
９４℃  ４分、「９４℃  ２０秒、７２℃  ９０秒」を５サイクル、「９４℃  ２０秒、７０℃  ９０秒」を５サイクル、「９４℃  ２０秒、６８℃  ９０秒］を２４サイクル、７２℃  ３分の後、４℃で反応を停止した。
ヒトＭＴＮ  ｂｌｏｔに対して行ったノーザン解析の結果、３．５、５．５及び８．０ｋｂの３つの主要な転写産物を認めた（図２２）。単離した完全長ヒトＩＳＦ  ｃＤＮＡに相当するヒトＩＳＦ蛋白をコードする転写産物は３．５ｋｂのバンドに相当し、他の大きい転写産物は他の相同な遺伝子あるいはオルタネイティブスプライシングに由来するものと考えられた。
また、ＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果、ｈＩＳＦの発現は骨格筋、大腸、小腸及び末梢白血球に於いて他の組織に比べて低いレベルであるものの、比較的一様な幅広い発現が認められた（図２３）。
［実施例１３］  ＰＬＡＴ−Ｅ細胞の作製
（１）  ＦＡＣＳ−ＧＡＬ解析
２９３細胞、２９３Ｔ細胞においてプロモーター活性を比較し、最も高い活性を示すプロモーターを用いるため、ＦＡＣＳ−ＧＡＬ解析（Ｓｔｅｖｅｎ  Ｎ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１２，２９１−３０１，１９９１）を行った。これはそれぞれのプロモーターの下流にｌａｃＺ遺伝子をつなぎ、細胞内にトランスフェクションしてその細胞内でｌａｃＺの発現分布を調べるものである。
トランスフェクションする１６〜２４時間前に２９３細胞、２９３Ｔ細胞を６ｃｍ組織／培養皿に２×１０６まいた。それぞれのプロモーターの下流にｌａｃＺをつないだプラスミド３μｇ、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）９μｌを２００μｌの胎児ウシ血清を含まないＤＭＥＭ培地に混合し、５〜１０分おいた。その後、２９３細胞、２９３Ｔ細胞を播いた６ｃｍ皿にゆっくり加えた。２４時間後細胞をはがし、５０μｌのＰＢＳに懸濁した後、３７℃で５分間置いた。ＦＤＧ（フルオレセイン  ジ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド，モレキュラープローブ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，カタログ番号Ｆ１１７９：２１ｍＭ  ｉｎ  ９８％蒸留水）をあらかじめ３７℃で温めておき、５０μｌを加えた。３７℃で１分間インキュベートしたあと、ＰＢＳを１ｍｌ加え、氷上で２時間おく。２時間後反応を止めるためＰＥＴＧ（フェニルエチル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド，Ｓｉｇｍａ社，カタログ番号Ｐ４９０２）を２０μｌ加え、ＦＡＣＳにて細胞内のｌａｃＺの発現分布を調べた。その結果、２９３Ｔ細胞内において、ＥＦ１αのプロモーター活性が一番高かった。レトロウイルスのプロモーターであるＬＴＲと比較した場合、ＥＦ１αのプロモーター活性は約１００倍高く、その他のプロモーターに対しても数十倍高い活性を示した。
（２）  選択マーカー遺伝子の増幅
選択マーカーとしてブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を用いるため、それぞれの抵抗性遺伝子（ｂｓｒ：Ｋａｍａｋｕｒａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３１６５−３１６８，１９８７．ｐｕｒｏｒ：Ｂｕｃｈｈｏｌｚ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，３１１８−３１１９，１９９６）を鋳型として、以下のＰＣＲの条件で、反応を行った。
反応組成は鋳型ＤＮＡ  １０ｎｇ、１０×ＫＯＤバッファー５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、１０μＭプライマーそれぞれ２．５μｌ（プライマーの塩基配列は以下に示す）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２２μｌ、２．５Ｕ／ｍｌ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）１μｌである。
プライマーは、ブラスチシジン抵抗性遺伝子（ｂｓｒ）については５’−ＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：２１）および５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＴＣＧＧＧＴＡＴＡＴＴＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号：２２）を、また、ピューロマイシン抵抗性遺伝子（ｐｕｒｏｒ）については５’−ＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧ−３’（配列番号：２３）および５’−ＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号：２４）を用いた。温度条件は９４℃  ３０秒、９４℃  ３０秒・５４℃  ３０秒・７２℃  ２分を２５サイクル、７２℃  １０分である。ブラスチシジン抵抗性遺伝子（ｂｓｒ）はＳａｌＩで、ピューロマイシン抵抗性遺伝子（ｐｕｒｏｒ）はＢｇｌＩＩで制限酵素処理した後、電気泳動し、ゲルからの抽出を行った。抽出にはＱｉａｅｘＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。
（３）  ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの調製
ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ：内部リボソーム侵入部位）配列とは、ウイルスのｍＲＮＡの５’非翻訳領域に存在する配列であり、特徴的な二次構造をとると考えられている。本配列をリボソームが認識して翻訳が開始し、宿主の蛋白翻訳が抑えられ、ウイルス蛋白の翻訳を優位にすることができることになる。そのＩＲＥＳの後ろに選択マーカー抵抗性遺伝子をつなげるため、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｓｔａａｌ．Ｆ．Ｊ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，３，３４５−３５１，１９９６）をＮｃｏＩで制限酵素処理した。その後エタノール沈殿を行い、クレノウ反応により平滑末端化した。フェノール／クロロホルム処理のあと、エタノール沈殿を行い、ｂｓｒを入れる場合にはＳａｌＩ、ｐｕｒｏｒを入れる場合にはＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、それぞれライゲーションした。このようにしてＩＲＥＳの後ろに選択マーカー抵抗性遺伝子が位置することになる。ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒはＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）とＳａｌＩで、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒはＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、ＩＲＥＳ−ｂｓｒ、ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒの断片を切り出した。
（４）  ｇａｇ−ｐｏｌ、エコトロピックｅｎｖの増幅
ｇａｇ−ｐｏｌ、エコトロピックｅｎｖのＰＣＲを以下の条件で行った。
反応組成は鋳型ＤＮＡ（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ．，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２９３，５４３，１９８１）１０ｎｇ、１０×ＬＡ  Ｔａｑバッファー５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ８μｌ、１０μＭプライマーそれぞれ１μｌ（塩基配列は以下に示す）、５Ｕ／ｍｌ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社）０．５μｌである。
プライマーは、ｇａｇ−ｐｏｌの増幅は５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＴＡＡ−３’（配列番号：２５）および５’−ＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号：２６）、また、エコトロピックｅｎｖ増幅は５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号：２７）および５’−ＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴ−３’（配列番号：２８）を用いた。
温度条件はｇａｇ−ｐｏｌの場合、９８℃  ２分、９８℃  ２０秒・６８℃  ３分を２０サイクル、６８℃  ８分である。エコトロピックｅｎｖの場合、９８℃  ２分、９８℃  ２０秒・６８℃  ２分を３０サイクル、６８℃  ７分である。
ＰＣＲ産物を電気泳動で流したのち、ＱｉａｅｘＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりゲルからＤＮＡ抽出を行った。これをＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりＴＡベクターにサブクローニングし、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）処理した。
（５）  ｇａｇ−ｐｏｌ、エコトロピックｅｎｖ発現ベクターの構築
ＥＦ１αのコントロール下でｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ、ｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒを発現させるために、以下のようにｐＣＨＯ（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，３５６，２４４−２４８（１９９４）；Ｏｋａｙａｍａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８３８−４５（１９９６）；ｐＣＨＯはｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ．Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３３２，１９９０）に由来する）に挿入した。
［ｐＣＨＯ（ｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ）］
ｐＣＨＯをＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）により制限酵素処理した後、クレノウ反応により平滑末端化した。そこへＳａｌＩリンカーｄ（ＣＧＧＴＣＧＡＣＣＧ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）（配列番号：２９）をつけた後、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で制限酵素処理した。ここへ（２），（３）で作製したｇａｇ−ｐｏｌ、ＩＲＥＳ−ｂｓｒ断片をいれ、ｐＣＨＯ（ｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ）を作製した。
［ｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）］
ｐＣＨＯをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）で制限酵素処理し、ここへ（２），（３）で作製したエコトロピックｅｎｖ、ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒを挿入し、ｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）を作製した。
（６）  アンフォトロピックｅｎｖ発現ベクターの構築
エコトロピックｅｎｖは同種由来の細胞にのみ感染可能であるのに対し、アンフォトロピックｅｎｖは幅広い細胞に感染可能である。このアンフォトロピックｅｎｖを用いて、（４）および（５）と同様にｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｒの発現ベクターの構築を行った。反応組成はアンフォトロピックｅｎｖ遺伝子（４０７０Ａ）（Ｏｔｔ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４．７５７−７６６．，１９９０）の挿入されているプラスミド１０ｎｇ、１０×ＫＯＤバッファー５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、１０μＭプライマー（塩基配列は以下に示す）それぞれ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２２μｌ、２．５Ｕ／ｍｌ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）１μｌである。プライマーは、５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡ−３’（配列番号：３０）および５’−ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴ−３’（配列番号：３１）を用いた。温度条件は９８℃  ３分、９８℃  １５秒・６５℃  ２秒・７２℃  ３０秒を２５サイクル、７２℃  １０分である。
（５）で作製したｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで制限酵素処理し、クレノウ処理によって、平滑末端化した。ここへ上記アンフォトロピックｅｎｖをライゲーションし、ｐＣＨＯ（ａｍｐｈｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）を作製した。
（７）  パッケージング細胞の樹立
ヒト中腎由来細胞２９３Ｔ細胞（ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，３７９−３８７．１９８７）に、作製したコンストラクトをトランスフェクションした。トランスフェクションする１６〜２４時間前に２９３Ｔ細胞を６ｃｍ組職／培養皿に２×１０６まいた。ｐＣＨＯ（ｇａｇ−ｐｏｌ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒ）３μｇ、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）９μｌを２００μｌのウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地に混合し、５〜１０分静置した。その後、２９３Ｔ細胞をまいた６ｃｍ  ｄｉｓｈにゆっくり加えた。４８時間後細胞をはがし、１０ｃｍ皿にまき、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ブラスチシジン８μｇ／ｍｌ）を加えた。
約１０日後、ｐＣＨＯ（ｅｃｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）、またはｐＣＨＯ（ａｍｐｈｏｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）それぞれを同様にトランスフェクションし、ピューロマイシン（０．８μｇ／ｍｌおよびブラスチシジン（８μｇ／ｍｌ）の両方が入った培地で培養した。細胞が増殖してきたところで限界希釈し、単一のクローンにすることで目的とするパッケージング細胞を樹立した。当該パッケージング細胞を「Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ細胞（ＰＬＡＴ−Ｅ細胞）」と名付けた。
ｅｃｏｅｎｖ発現ベクターを導入したＰＬＡＴ−Ｅ細胞は、下記の寄託機関に寄託した。ｅｃｏｅｎｖ導入ＰＬＡＴ−Ｅ細胞（Ｐｔ−Ｅ）
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）
（ロ）寄託日（原寄託日）  平成１１年５月３１日
（ハ）寄託番号  生命研条寄第６７３７号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７３７）
（８）  レトロウイルスの産生
パッケージング細胞により得られたウイルス液の感染効率を調べるため、以下の方法で感染実験を行った。トランスフェクションする１６〜２４時間前に、パッケージング細胞（ｅｃｏｅｎｖ導入ＰＬＡＴ−Ｅ細胞）を６ｃｍ組織／培養皿に２×１０６まいた。ＭｏＬｕＬＶを基本骨格としたレトロウイルスベクターで、ＧＦＰが組み込まれているベクターＤＮＡ（ｐＭＸ−ＧＦＰ：Ｏｎｉｓｈｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４，３２４−３２９，１９９６）３μｇ、Ｆｕｇｅｎｅ  ９μｌを２００μｌの血清を含まないＤＭＥＭ培地に混合し、５〜１０分おいた。その後、これをパッケージング細胞をまいた６ｃｍ皿にゆっくり加えた。
４８時間後に上清（ウイルス液）を回収し、３０００ｒｐｍで５分間遠心した。このうち、５００μｌに１ｍｇ／ｍｌポリブレン（ｓｉｇｍａ社）を５μｌ、×１０００ＩＬ３（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ）を１μｌ加え、１×１０５のＢａＦ／３細胞に５時間感染させた。５時間後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＩＬ３含有）を５００μｌ加えた。感染した細胞内においてＧＦＰが発現され、３９５ｎｍ波長の光で励起し、５０９ｎｍの波長の光を放出することを利用し、ＦＡＣＳｃａｎ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて発光する（感染発現している）細胞の割合を感染効率として、２４時間後に測定した。ＢａＦ／３細胞に対する感染効率はウイルス液を濃縮することなく用いても９５％に達した。
液体窒素から同時期に起こしたＰＬＡＴ−Ｅ（ｅｃｏｅｎｖ導入ＰＬＡＴ−Ｅ細胞）とＢＯＳＣ２３の感染効率をＢａＦ／３細胞を用いて測定したところ、継代を開始して７日目では、いずれのパッケージング細胞でも９０％以上の感染効率が確認されたが、継代２ヶ月後には、ＢＯＳＣ２３の感染効率が２３％にまで低下したのに対し、ＰＬＡＴ−Ｅでは、７日目の感染効率と同程度の感染効率が、継代２ヶ月後および４ヶ月後においても保持されていることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明のＣ１２１タンパク質はＳ２１細胞の増殖支持活性を有することから、該タンパク質を発現させたストローマ細胞を利用したヒト骨髄幹細胞の増殖、あるいは可溶化該タンパク質を直接投与することによる造血能の亢進が期待できる。また、該タンパク質は、その活性の阻害剤や促進剤のスクリーニングに利用することが可能である。このような促進剤は、その投与によりＣ１２１タンパク質と同様の効果が期待できる。また、阻害剤は、Ｃ１２１タンパク質の増殖活性に依存性を示す癌などに対して、有効な抗癌剤となることが期待できる。
本発明のヒトＩＳＦは、ヒトＣ１２１との相同性からＣ１２１と同様の活性を有することが期待される。このためヒトＩＳＦタンパク質、該タンパク質の促進剤および阻害剤についても、それぞれＣ１２１タンパク質の場合と同様の効果が期待できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、３種のストローマ細胞株、ＰＡ６（ａ）、ＳＴ２（ｂ）、ＣＦ−１（ｃ）と共培養を行った変異Ｂａ／Ｆ３細胞のコロニー形成を示した写真である。
図２は、クローン２−２１−Ｃ１２１を感染させたストローマ細胞ＭＳ１０表面のＳ２１細胞の増殖を示した写真である。（ａ）クローン２−２１−Ｃ１２１を感染させたＭＳ１０細胞表面のＳ２１細胞。（ｂ）クローン２−２１−Ｃ１２１を感染させたＭＳ１０細胞表面のＢａ／Ｆ３細胞。（ｃ）他のプールを感染させたＭＳ１０細胞表面のＳ２１細胞。（ｄ）非感染のＭＳ１０細胞表面のＳ２１細胞。（ｅ）非感染のＭＳ１０細胞表面のＢａ／Ｆ３細胞。
図３は、Ｃ１２１の塩基配列および導出されるアミノ酸配列を示す図である。右の数字は塩基番号を示す。矢印は成熟タンパク質の予想される切断部位を表す。下線の配列は予想される膜貫通ドメインを表す。
図４は、図３の続きである。
図５は、さまざまなマウス組織（Ａ）および細胞株（Ｂ）における、Ｃ１２１遺伝子の発現をノーザンブロットにより解析した結果を示す写真である。
図６は、トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞における、ＦＬＡＧタグが付加されたＣ１２１タンパク質の発現を示した写真である。パネルＡは上清、パネルＢは細胞溶解物を示す。両パネルとも、レーン１はトランスフェクトしていない細胞、レーン２は空のベクターをトランスフェクトした細胞、レーン３はＣ１２１−ＦＬＡＧ構築物をトランスフェクトした細胞を示す。
図７は、可溶型Ｃ１２１および細胞膜結合型Ｃ１２１の発現に及ぼす、蛋白質分解阻害剤の効果を示した写真である。ＣＯＳ７細胞にｐＭＥ−Ｃ１２１をトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後に蛋白質分解阻害剤を最終濃度１００μＭになるように添加した。上清（パネルＡ）および細胞抽出物（パネルＢ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＦＬＡＧタグを持つタンパク質の検出を行った。レーン１はトランスフェクトしていない細胞、レーン２は空のベクターをトランスフェクトした細胞、レーン３はｐＭＥ−Ｃ１２１をトランスフェクトした細胞で、蛋白質分解阻害剤を加えていないもの、レーン４〜９は、ｐＭＥ−Ｃ１２１をトランスフェクトした細胞で、それぞれ蛋白質分解阻害剤、ｐＡＧＡ（レーン４）、Ｃｐ（レーン５）、Ｐｓ（レーン６）、Ｂｓ（レーン７）、Ｌｐ（レーン８）、Ｂｃ（レーン９）を添加した細胞を示す。
図８は、（Ａ）はＣＯＳ７細胞から得た培養上清を用いたＳ２１細胞の増殖アッセイの結果を示す図である。「ｕｔ」はトランスフェクトしていない細胞、「ｖｔ」は空のベクターをトランスフェクトした細胞、「Ｃ１２１」はＣ１２１発現構築物をトランスフェクトした細胞を示す。（Ｂ）は抗ＦＬＡＧ抗体アフィニティゲルを用いて培養上清中のｓＣ１２１タンパク質を除去し、Ｓ２１細胞の増殖アッセイを行った結果を示す。
図９は、マウスおよびヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を示す写真である。Ｃ１２１（パネルＡ）、ＯＳ−１（パネルＢ）、ＯＬ−１（パネルＣ）をプローブとして用いた。マウスゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩ（レーン１）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン２）、およびＡｃｃＩ（レーン３）で、ヒトゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩ（レーン４）で切断した。
図１０は、（Ａ）は、ｍＩＳＦ、Ｃ１２１、ハイブリダイゼーションのプローブに用いた種々の断片の位置を示す模式図である。（Ｂ）は、ＰＣＲおよびＲＡＣＥ反応で用いたプライマーの位置を示す。
図１１は、ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを用いたヒト遺伝子のＯＬ−１領域の増幅結果を示す写真である。レーン１、３、および５は鋳型ＤＮＡなしのブランク対照、レーン２、４、および６は、それぞれ、Ｓ３Ｒ／ＧＳＰ−１（レーン２）、Ｓ４Ｒ／ＧＳＰ−１（レーン４）、Ｓ５Ｒ／ＧＳＰ−１（レーン６）のプライマー対を用いた結果である。
図１２は、ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡライブラリーの５’−および３’−ＲＡＣＥ産物を示す写真である。レーン１および２は、それぞれプライマーｈＧＳＰ１−３およびＳ６Ｒを用いた３’−ＲＡＣＥ産物を示す。レーン３および４は、それぞれプライマーＧＳＰ−１およびｈＧＳＰ１−５を用いた５’−ＲＡＣＥ産物を示す。
図１３は、３’−ＲＡＣＥ（ＴＡ／２−１６およびＴＡ／２−２０）および５’−ＲＡＣＥ（ＴＡ／３−２６、ＴＡ／３−２９、ＴＡ／３−３５、およびＴＡ／３−３８）産物に由来する陽性クローンを示す写真である。
図１４は、ＲＡＣＥに由来するクローンの５’および３’末端の部分配列を示す図である。ＴＡ／３−２６のリーダー配列（配列番号：１７）およびＴＡ／２−１６のテール配列（配列番号：１８）を示す。アダプター配列（影を付けた部分）およびインサートＤＮＡ（矢印）が示されている。３’末端のｐｏｌｙＡ領域も示されている。
図１５は、クローンＴＡ／３−２６とＴＡ／２−１６の重複配列の位置（影を付けた部分）を示す図である。ＴＡ／３−２６（配列番号：１９）を上段に、ＴＡ／２−１６（配列番号：２０）を下段に示す。下線を付けた配列はユニークな（唯一の）ＢａｌＩ部位を示す。
図１６は、全長のヒトＩＳＦホモログのクローニングを示す写真である。（ａ）はＢａｌＩおよびＸｂａＩで切断したＴＡ／３−２６、（ｂ）はＢａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断したＴＡ／２−１６、（ｃ）はＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断したｐＭＥ１８Ｓベクター中の全長遺伝子である。Ｍ１およびＭ２は、それぞれλＨｉｎｄＩＩＩマーカーおよびφＸ１７４ＨａｅＩＩＩ切断マーカーを示す。
図１７は、ヒトＩＳＦの塩基配列および導出されるアミノ酸配列を示す図である。右の数字は塩基番号を示す。矢印は成熟タンパク質の予想される切断部位を表す。下線の配列は予想される膜貫通ドメインを示す。影をつけた部分は潜在的なグリコシレーション部位を示す。
図１８は、図１７の続きである。
図１９は、図１８の続きである。
図２０は、図１９の続きである。
図２１は、マウスおよびヒトＩＳＦのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。グリコシレーション部位（下線）、チロシンキナーゼリン酸化部位（アスタリスク）、ロイシンジッパーパターン（囲み文字）を図に示す。
図２２は、さまざまなヒト組織中のヒトＩＳＦ遺伝子の発現をノーザンブロットで解析した結果を示す写真である。
図２３は、さまざまなヒト組織中のＩＳＦ遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＴで解析した結果を示す写真である。各パネルの下段のレーンは、内部対照（Ｇ２ＰＤＨ）を増幅したものである。パネルＡはＨｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＃Ｋ１４２５−１）、パネルＢはＨｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＃Ｋ１４２０−１）、パネルＣはＨｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＃Ｋ１４２１−１）を用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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