(57)【要約】  トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターのそれぞれに、分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを配置するとともに、その一方に、ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを配置して、ゲノム編集用のウイルスベクターの組み合わせを構築した。これらウイルスベクターを植物細胞に導入したところ、植物細胞内で機能的なCas9タンパク質とガイドRNAとの複合体が形成され、目的の部位特異的にゲノムが編集されることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが部位特異的に編集された植物細胞の生産方法であって、
下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体により部位特異的にゲノムを編集させることを含む方法。
【請求項２】
ゲノムが部位特異的に編集された植物の生産方法であって、
下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体により部位特異的にゲノムを編集させ、当該植物細胞から植物体を再生させることを含む方法。
【請求項３】
植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ゲノム編集酵素がCas9タンパク質またはCpf1タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの5'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの3'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを含むキット。
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを挿入するための部位を含む
【請求項８】
植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの組み合わせを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
ゲノム編集酵素がCas9タンパク質またはCpf1タンパク質である、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの5'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、請求項７から９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの3'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、請求項７から１０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターを利用して、ゲノム編集された植物細胞および植物を生産する方法、および当該方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集技術は、特定の遺伝子の狙った部位に変異を導入して、そのコードするタンパク質の活性を修飾（例えば、活性型から不活性型への置換や不活性型から活性型への置換）することにより、新たな細胞や品種を作製する技術である。この技術によれば、単に内在性遺伝子に変異が導入され、外来遺伝子を保持しない品種や系統を作成することが可能であり、この点で従来の遺伝子組換え技術と異なる（非特許文献1）。【０００３】
ゲノム編集技術においては、ゲノム上の部位特異性とゲノムの改変という2つの特性を持たせるために、一般に、部位特異性が付与されたヌクレアーゼ（核酸(DNA)切断酵素）が利用される。このようなヌクレアーゼとしては、2005年以降、第一世代のZFNs（Zinc  Finger  Nucleases）に続いて、TALENs（Transcription  Activator  Like  Effector  Nucleases）やCRISPR-Cas9（Clustered  Regularly  Interspaced  Short  Palindromic  Repeats  CRISPR-Associated  Proteins  9）といった第二世代・第三世代のゲノム編集技術が、次々と開発されてきた（非特許文献2）。ヌクレアーゼに部位特異性を付与するために、ZFNsとTALENsでは、標的DNAに結合する配列認識ドメイン（ZFドメイン、TALEドメイン）が利用され、CRISPR/Cas9では、標的DNAに相補的な配列を持つRNA（ガイドRNA）が利用される。【０００４】
TALENsをはじめとするゲノム編集用の人工ヌクレアーゼを作物の育種に活用する場合、植物ではアグロバクテリウム法などの遺伝子組換え技術によって、人工ヌクレアーゼ遺伝子を導入する方法が主流となっている（非特許文献3）。しかしながら、アグロバクテリウム法では、対象植物のゲノムDNAに人工ヌクレアーゼ遺伝子が組み込まれてしまうため、植物の標的遺伝子を編集した後、不要になった人工ヌクレアーゼ遺伝子を除去することが必要になる。この場合、かけ合わせが可能な植物ではゲノム編集用タンパク質の遺伝子を除去できるが、栄養繁殖性植物や木本植物など、不要遺伝子のかけ合わせによる除去が事実上不可能な作物も多く存在する。【０００５】
そこで、植物においても、人工ヌクレアーゼをタンパク質として直接細胞内へ導入し、ゲノムへの遺伝子の組込みを経ずにゲノム編集を行う技術の開発が行われているが、プロトプラスト化が必要であることなどから適用できる植物種は限られている（非特許文献4、5）。同様に、パーティクルガン法でトウモロコシ胚にRNP（CRISPR/Cas9タンパク質RNA複合体）を直接導入して標的遺伝子の変異に成功した報告もあるが（非特許文献6）、パーティクルガン法においては、通常の遺伝子組み換えの場合ですら個体再生が可能な植物は限られていることから、ゲノム編集の場合には、それ以上に、再生された個体の獲得は困難であると考えられる。【０００６】
また、ウイルスの媒介により植物のゲノム編集を行おうとする試みもあるが（非特許文献7）、ウイルスベクターから発現可能な遺伝子の大きさには制約がある一方で、ゲノム編集のための酵素が大きいために、植物のゲノム編集を行うことはこれまで困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Voytas,  Annu.  Rev.  Plant  Biol.  64:327-350(2013)
【非特許文献２】Doyle  et  al.,  Trends  Cell  Biol  23:390-398(2013)
【非特許文献３】Endo  et  al.,  Methods  in  Molecular  Biology  Volume  1469  pp123-135(2016)
【非特許文献４】Woo  et  al.,  Nature  Biotech.  33:1162-1164(2016)
【非特許文献５】Subburaj  et  al.,  Plant  Cell  Rep.  35:1535-1544(2016)
【非特許文献６】Svitashev  et  al.,  Nature  Communication  7:13274(2016)
【非特許文献７】Ali  et  al.,  Molecular  Plant  8:1288-1291(2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物ウイルスベクターを用いて、ゲノム編集酵素遺伝子のゲノムへの組込みを経ずに、植物のゲノム編集を行うことが可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、まず、植物ウイルスベクターから発現可能な遺伝子の大きさに制約があることに鑑みて、ゲノム編集酵素を分割して複数の植物ウイルスベクターに搭載し、植物細胞内での発現後に、会合により機能的なゲノム編集酵素を形成させることを構想した。ここで各断片の発現に同属の植物ウイルスベクターを利用した場合、植物細胞において排他的に作用する可能性があることを考慮し、異なる植物ウイルスベクターを採用することとした。また、搭載した遺伝子が植物ゲノムに組み込まれるのを回避するために、植物ウイルスベクターとして、植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターを採用することとした。【００１０】
かかる構想に基づき、本発明者は、植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせの一例として、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターを用い、各ウイルスベクターに、分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを配置するとともに、ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを配置して、ゲノム編集用のウイルスベクターの組み合わせを調製した。そして、これらウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入したところ、植物細胞内で機能的なCas9タンパク質とガイドRNAとの複合体が形成され、目的の部位特異的にゲノムが編集されることを見出した。さらに、ガイドRNAの5'末端に自己切断型リボザイムを配置して、植物細胞内でガイドRNAの5'側を当該リボザイムにより適度に切断させたところ、ゲノムの編集効率が顕著に高まることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
本発明は、複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターを利用して、ゲノム編集された植物細胞および植物を生産する方法、および当該方法に用いられるキットに関し、より詳しくは、以下を提供するものである。【００１２】
（１）ゲノムが部位特異的に編集された植物細胞の生産方法であって、
下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体により部位特異的にゲノムを編集させることを含む方法。【００１３】
（２）ゲノムが部位特異的に編集された植物の生産方法であって、
下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体により部位特異的にゲノムを編集させ、当該植物細胞から植物体を再生させることを含む方法。【００１４】
（３）植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの組み合わせを含む、（１）または（２）に記載の方法。【００１５】
（４）ゲノム編集酵素がCas9タンパク質またはCpf1タンパク質である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。【００１６】
（５）ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの5'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。【００１７】
（６）ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの3'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。【００１８】
（７）（１）から（６）のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを含むキット。【００１９】
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを挿入するための部位を含む
（８）植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの組み合わせを含む、（７）に記載のキット。【００２０】
（９）ゲノム編集酵素がCas9タンパク質またはCpf1タンパク質である、（７）または（８）に記載のキット。【００２１】
（１０）ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの5'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、（７）から（９）のいずれかに記載のキット。【００２２】
（１１）ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの3'末端に自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されている、（７）から（１０）のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明において、複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせに、分割されたゲノム編集酵素とガイドRNAを搭載して用いることにより、植物ゲノムへのゲノム編集酵素遺伝子の組込みを経ずに、植物のゲノム編集を行うことが可能となった。また、ガイドRNAの5'側に自己切断型リボザイムを配置することにより、ゲノム編集効率を顕著に高めることができた。本発明は、自律的に複製するウイルスベクターのみを用いて植物のゲノム編集に成功した世界で初めての例となる。【００２４】
従来、植物のゲノム編集を行う際に、ゲノム編集酵素遺伝子の植物への導入にアグロバクテリウム法を利用した場合、当該遺伝子が植物ゲノムに組み込まれてしまうため、ゲノム編集後、不要になった人工ヌクレアーゼ遺伝子を除去することが必要であった。この場合、かけ合わせが可能な植物ではゲノム編集用タンパク質の遺伝子を除去できるが、栄養繁殖性植物や木本植物など、不要遺伝子のかけ合わせによる除去が事実上不可能な作物も多く存在していた。本発明は、このような植物においても、植物ゲノムへの外来遺伝子の組込みを経ずに、ゲノム編集を行うことを可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ToMVベクターによるCRISPR-gRNAの発現を示す図である。図中、(a)は、ToMVベクターの構造を示し、(b)は、試験管内転写産物の電気泳動写真を示し、(c)は、SpCas9および標的配列（切断・修復によりLUCが発現する）を一過的に導入したベンサミアナタバコの葉に、各種リボザイムとgRNAをもつToMVベクターを接種してLUC活性を検出した結果を示す写真である。なお、図１中の塩基配列は、上から順に、配列表の配列番号：７〜１１に示した。
【図２】ToMVベクターによるCRISPR-gRNAの発現とゲノム編集を示す図である。図中、(a)は、ToMVベクターの構造を示し、(b)は、試験管内転写産物の電気泳動写真を示し、(c)は、SaCas9を一過的に導入したベンサミアナタバコの葉に、各種リボザイムと内在性のPDS遺伝子に対するgRNAをもつToMVベクターを接種して、ゲノムDNAの標的部位におけるゲノム編集の有無をCAPS法により解析した結果を示す電気泳動写真である。なお、図２中の塩基配列は、上から順に、配列表の配列番号：１２〜１８に示した。
【図３】ToMVベクターとPVXベクターの共感染によるゲノム編集を示す図である。図中、上は、分割されたSaCas9タンパク質を搭載したToMVベクターとPVXベクターの構造を示す。ToMVベクターには、さらにリボザイムを挟んでPDS遺伝子に対するgRNAを搭載した。下は、上記2種のベクターの転写産物をベンサミアナタバコの葉に接種して、ゲノムDNAの標的部位におけるゲノム編集の有無をCAPS法により解析した結果を示す電気泳動写真である。
【図４】ToMVベクターとPVXベクターを共感染させてPDS遺伝子を破壊したタバコの再分化シュートの写真である。
【図５】ToMVベクターによるCRISPR-gRNAの発現とゲノム編集を示す図である。図中、(a)は、ToMVベクターに挿入されたgRNAとリボザイム（gRNAの5'側に配置したリボザイムと3'側に配置したリボザイム）の構造を示す。（b）は、SaCas9を一過的に導入したベンサミアナタバコの葉に、各種リボザイムと内在性のTOM1遺伝子に対するgRNAをもつToMVベクターを接種して、ゲノムDNAの標的部位におけるゲノム編集の有無をCAPS法により解析した結果を示す電気泳動写真である。なお、図５（ａ）中の塩基配列は、上から順に、配列表の配列番号：１９〜２９に示した。
【図６】分割したSpCas9を発現するToMVベクターとPVXベクターをベンサミアナタバコの葉に接種して、ゲノムDNAの標的部位におけるゲノム編集の有無をCAPS法により解析した結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ゲノムが部位特異的に編集された植物細胞の生産方法を提供する。
【００２７】
本発明の方法においては、複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターを植物細胞に導入する。
【００２８】
ここで「植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクター」とは、植物ウイルスに由来するベクターであって、当該植物ウイルスが一本鎖プラス鎖RNAをゲノムとするウイルスであるベクターを意味する。プラス鎖RNAは、それ自体がmRNAとして機能する点で、マイナス鎖RNAと異なる。本発明における「植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクター」は、ウイルスゲノム由来の遺伝子と外来遺伝子とを発現可能な形で含むポリヌクレオチドであり、RNAの形態（例えば、ウイルスゲノムRNAに対するcDNAに外来遺伝子を挿入した発現構築物の転写産物）でも、DNAの形態（例えば、ウイルスゲノムRNAに対するcDNAに外来遺伝子を挿入した発現構築物）でもあり得る。
【００２９】
本発明において用いる「植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせ」は、宿主範囲が重複しており、病原性が低く、かつ、分割されたゲノム編集酵素を安定的に発現可能であることが好ましい。また、互いの干渉を排除するため、異なる属に属する植物ウイルスに由来するウイルスベクターの組み合わせであることが好ましい。異なる属に属する植物ウイルスに由来するウイルスベクターとしては、例えば、トバモウイルス属ウイルスベクター、ポテックスウイルス属ウイルスベクター、ポティウイルス属ウイルスベクター、トブラウイルス属ウイルスベクター、トンブスウイルス属ウイルスベクター、ククモウイルス属ウイルスベクター、ブロモウイルス属ウイルスベクター、カルモウイルス属ウイルスベクター、アルファモウイルス属ウイルスベクターからなる群より選択される複数種のウイルスベクターが挙げられる。ここで「複数種」とは、2種以上（例えば、2種、3種、4種など）を意味する。好ましくは、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの2種の組み合わせである。
【００３０】
トバモウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、トマトモザイクウイルス（ToMV）ベクター、タバコモザイクウイルス（TMV）ベクター、タバコ微斑モザイクウイルス（TMGMV）ベクター、トウガラシ微斑ウイルス（PMMoV）ベクター、パプリカ微斑ウイルス（PaMMV）ベクター、スイカ緑斑モザイクウイルス（CGMMV）ベクター、キュウリ緑斑モザイクウイルス（KGMMV）ベクター、ハイビスカス潜在フォートピアスウイルス（HLFPV）ベクター、オドントグロッサム輪点ウイルス（ORSV）ベクター、ジオウモザイクウイルス（ReMV）ベクター、ウチワサボテンサモンズウイルス（SOV）ベクター、ワサビ斑紋ウイルス（WMoV）ベクター、アブラナモザイクウイルス（YoMV）ベクター、サンヘンプモザイクウイルス（SHMV）ベクターなどが挙げられ、ポテックスウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、ジャガイモXウイルス（PVX）ベクター、ジャガイモ黄斑モザイクウイルス（PAMV）ベクター、アルストロメリアXウイルス（AlsVX）ベクター、サボテンXウイルス（CVX）ベクター、シンビジウムモザイクウイルス（CymMV）ベクター、ギボウシXウイルス（HVX）ベクター、ユリXウイルス（LVX）ベクター、スイセンモザイクウイルス（NMV）ベクター、ネリネXウイルス（NVX）ベクター、オオバコモザイクウイルス（PlAMV）ベクター、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（SMYEV）ベクター、チューリップXウイルス（TVX）ベクター、シロクローバモザイクウイルス（WClMV）ベクター、バンブーモザイクウイルス（BaMV）ベクターなどが挙げられ、ポティウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、ジャガイモYウイルス（PVY）ベクター、インゲンマメモザイクウイルス（BCMV）ベクター、クローバ葉脈黄化ウイルス（ClYVV）ベクター、トケイソウ東アジアウイルス（EAPV）ベクター、フリージアモザイクウイルス（FreMV）ベクター、ヤマノイモモザイクウイルス（JYMV）ベクター、レタスモザイクウイルス（LMV）ベクター、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（MDMV）ベクター、タマネギ萎縮ウイルス（OYDV）ベクター、パパイヤ輪点ウイルス（PRSV）ベクター、トウガラシ斑紋ウイルス（PepMoV）ベクター、シソ斑紋ウイルス（PerMoV）ベクター、ウメ輪紋ウイルス（PPV）ベクター、ジャガイモAウイルス（PVA）ベクター、ソルガムモザイクウイルス（SrMV）ベクター、ダイズモザイクウイルス（SMV）ベクター、サトウキビモザイクウイルス（SCMV）ベクター、チューリップモザイクウイルス（TulMV）ベクター、カブモザイクウイルス（TuMV）ベクター、スイカモザイクウイルス（WMV）ベクター、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ZYMV）ベクター、タバコエッチウイルス（TEV）ベクターなどが挙げられ、トブラウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、タバコ茎えそウイルス（TRV）ベクターなどが挙げられ、トンブスウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、トマトブッシースタントウイルス（TBSV）ベクター、ナス斑紋クリンクルウイルス（EMCV）ベクター、ブドウアルジェリア潜在ウイルス（GALV）ベクターなどが挙げられ、ククモウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、キュウリモザイクウイルス（CMV）ベクター、ラッカセイ矮化ウイルス（PSV）ベクター、トマトアスパーミィウイルス（TAV）ベクターなどが挙げられ、ブロモウイルス属ウイルスベクター��しては、例えば、ブロムモザイクウイルス（BMV）ベクター、ササゲクロロティックモットルウイルス（CCMV）ベクターなどが挙げられ、カルモウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、カーネーション斑紋ウイルス（CarMV）ベクター、メロンえそ斑点ウイルス（MNSV）ベクター、エンドウ茎えそウイルス（PSNV）ベクター、カブクリンクルウイルス（TCV）ベクターなどが挙げられ、アルファモウイルス属ウイルスベクターとしては、例えば、アルファルファモザイクウイルス（AMV）ベクターなどが挙げられる。
【００３１】
本発明における「複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせ」は、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する。
【００３２】
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
本発明における「ゲノム編集酵素」としては、ガイドRNAと複合体を形成し、部位特異的にゲノムを編集することが可能な酵素であれば特に制限はないが、代表的には、ヌクレアーゼ（典型的には、エンドヌクレアーゼ）である。エンドヌクレアーゼとしては、例えば、Cas9タンパク質やCpf1タンパク質が挙げられるが、これらに制限されない。その他、例えば、ヌクレアーゼ活性を一部または全部消失させたCas9タンパク質とデアミナーゼの融合タンパク質を利用することも考えられる。従って、本発明におけるゲノムの「編集」には、切断のみならず、脱アミノ化などのその他のゲノムの修飾、およびそれら修飾を介したゲノムの改変（例えば、変異導入）も含まれる。
【００３３】
Cas9タンパク質としては、種々の由来のものが公知であり（例えば、米国特許8697359号、米国特許8865406号、国際公開2013/176772号など）、それらを利用することができる。ウイルスベクターから発現可能な遺伝子の鎖長の制限の観点からは、分子量が比較的小さいCas9タンパク質が好ましい。このようなCas9タンパク質としては、Staphylococcus  aureus由来のCas9タンパク質（SaCas9）が挙げられる。Cas9タンパク質のアミノ酸配列および塩基配列は公開されたデータベース、例えば、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）に登録されている（例えば、アクセッション番号：J7RUA5、WP_010922251など、配列番号：１、５）。
【００３４】
好ましくは本発明においてCas9タンパク質は、配列番号：２または６で表されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるタンパク質を利用することができる。また、本発明においてCas9タンパク質には、天然型のアミノ酸配列に対して、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含む変異体を用いることもできる。ここで「複数個」とは1〜50個、好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜10個である。さらに、本発明においてCas9タンパク質には、元のタンパク質の活性を保持する限り、配列番号：２または６で表されるアミノ酸配列と80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、BLAST（Basic  Local  Alignment  Search  Tool  at  the  National  Center  for  Biological  Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））などを、例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。
【００３５】
Cpf1タンパク質についても種々のものが公知であり、文献（Zetsche，B.  et  al.  Cell  163（3），759-71(2015)、Endo  et  al.  Sci.  Rep.  6，38169(2016)）に記載されたものを利用することができる。好ましくは、Lachnospiraceae  bacterium、Acidaminococcus  sp.、あるいはFrancisella  novicida由来のCpf1タンパク質（LbCpf1、AsCpf1、FnCpf1）を利用する。それらのアミノ酸配列は公開されたデータベース、例えば、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）に登録されている（例えば、アクセッション番号：WP_021736722、WP_035635841など）。また、天然型のアミノ酸配列に対して、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含む変異体を用いることができる点は、Cas9タンパク質の場合と同様である。Cas9タンパク質は、標的二本鎖DNAを切断した結果、平滑末端を生じさせるのに対し、Cpf1タンパク質は、突出末端を生じさせる。
【００３６】
本発明における「分割されたゲノム編集酵素」としては、上記ウイルスベクターで発現可能であり、かつ、細胞内で会合することによりゲノム編集酵素としての機能を再現しうるものであれば、特に制限はない。ゲノム編集酵素は、通常、2分割されるが、3分割以上であってもよい。SaCas9タンパク質においては、公知の方法、例えば、文献（Nishimasu  et  al.  Cell,  162:1113-1126(2015)）に記載の方法により、N末端側(739アミノ酸残基)とC末端側(314アミノ酸残基)に2分割することができる。また、Streptococcus  pyogenesに由来するCas9タンパク質（SpCas9）は、例えば、N末端側（714アミノ酸残基）とC末端側（654アミノ酸残基）に2分割する方法（Zetsche  et  al.  Nat  Biotechnol,  33:139-142(2015)）の他、N末端とC末端を含むヌクレアーゼローブ（1〜57位＋GSS＋729〜1368位）とその間に挟まれたDNA認識ローブ（56〜714位）に2分割する方法（Wright  et  al.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  112,  2984-2989  (2015)）が報告されている。分割されたゲノム編集酵素には、例えば、核移行シグナルやタグが付加されていてもよい。
【００３７】
本発明における「ガイドRNA」は、標的DNA領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列および上記ゲノム編集酵素と相互作用する塩基配列を含む。本発明において「標的DNA領域」とは、生物のゲノムDNA上、目的とする遺伝子改変を生じる部位を含む領域を意味し、通常、17〜30塩基、好ましくは17〜20塩基からなる領域である。
【００３８】
ゲノム編集酵素が、Cas9タンパク質やCpf1タンパク質である場合には、当該領域はPAM（proto-spacer  adjacent  motif）配列と隣接する領域より選択されることが好ましい。典型的には、標的DNAの部位特異的切断は、ガイドRNAと標的DNAの間の塩基対形成の相補性と、隣接するPAMの両方によって決定される位置で生じる。PAMは、ヌクレアーゼの種類や由来により異なるが、SaCas9タンパク質では、典型的には、「5'-NNGRRT（Nは任意の塩基）-3'」または「5'-NNGRR（Nは任意の塩基）-3'」であり、SpCas9タンパク質では、典型的には、「5'-NGG（Nは任意の塩基）-3'」であり、Cpf1タンパク質では、典型的には、「5'-TTN（Nは任意の塩基）−3'」または「5'-TTTN（Nは任意の塩基）-3'」である。なお、タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、PAM認識を改変することも可能である（Benjamin，P.ら、Nature  523,481-485（2015）、Hirano，S．ら、Molecular  Cell  61，  886-894（2016））。これにより標的DNAの選択肢を拡大することができる。
【００３９】
ガイドRNAは、ゲノム編集酵素と相互作用する塩基配列（タンパク質結合セグメント）を含むことによって、ゲノム編集酵素と複合体を形成する（すなわち、非共有結合性相互作用によって結合する）。また、ガイドRNAは、標的DNA領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列（DNA標的化セグメント）を含むことによって、標的特異性を複合体に与える。このように、ゲノム編集酵素は、それ自体がガイドRNAのタンパク質結合セグメントと結合することによって標的DNA領域に誘導され、そして、その活性によって標的DNAを編集（例えば、ゲノム編集酵素がヌクレアーゼの場合は、切断）する。
【００４０】
ガイドRNAは、CRISPR／Cas9システムの場合には、crRNA断片とtracrRNA断片の組み合わせである。crRNA断片は少なくとも、標的DNA領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列とtracrRNA断片と相互作用可能な塩基配列を、5'側よりこの順で含んでなる。tracrRNA断片は、5'側にcrRNA断片の一部の塩基配列と結合（ハイブリダイズ）可能な塩基配列を有する。crRNA断片は、そのtracrRNA断片と相互作用可能な塩基配列において、tracrRNA断片と二重鎖RNAを形成し、形成された二重鎖RNAは、Cas9タンパク質と相互作用する。これによりCas9タンパク質が標的DNA領域にガイドされる。crRNA断片とtracrRNA断片は、融合させて単一の分子として発現させることができる。一方、ガイドRNAは、CRISPR／Cpf1システムの場合には、crRNA断片を意味し、tracrRNA断片は不要である。crRNA断片がCpf1タンパク質と相互作用することにより、Cpf1タンパク質が標的DNA領域にガイドされる。
【００４１】
複数のDNA領域を標的とするために、また、同一DNA領域において複数箇所を標的とするために、複数種のガイドRNAを用いることができる。nCas9タンパク質を利用する場合には、例えば、標的DNA領域の二本鎖における各鎖に対して、それぞれ一箇所（合計2箇所）を標的とした、複数種のガイドRNAを用いることができる。
【００４２】
植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターは、基本的に、ウイルスの増殖に必要な複製酵素、感染植物体内で細胞から細胞への移行に必要な移行タンパク質、およびウイルス遺伝子を周囲の攻撃から守る外被タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有する。本発明で用いる植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターにおいては、分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスゲノムの複製および細胞間移行が阻害されない限り、様々な位置に挿入することが可能であり、例えば、移行タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。ウイルス自身のタンパク質（例えば、外被タンパク質）をコードするポリヌクレオチドと置換して挿入してもよい。
【００４３】
本発明で用いる植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせにおいて、ガイドRNAは、少なくとも1つのウイルスベクターにおいて配置される。複数のウイルスベクターに配置してもよく、全てのウイルスベクターに配置してもよい。
【００４４】
ガイドRNAは、例えば、分割したゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドの下流に配置することができる。好ましくは、ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの5'末端には、自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されており、その転写産物では、当該リボザイムの作用により、ガイドRNAの5'側で切断が生じる。自己切断型リボザイムとしては、好ましくはハンマーヘッド型リボザイム（Hamman  et  al.  RNA  18:871−885（2011））である。ハンマーヘッド型リボザイムにおいては、当該リボザイムをコードするポリヌクレオチドの5'末端にガイドRNAの5'末端領域と相補的なRNAをコードするポリヌクレオチドが結合されている。この構造を採用することにより、転写産物において、自己切断型リボザイムの5'側に付加されたRNAとガイドRNAの5'末端とがハイブリダイズし、リボザイムの作用により、ガイドRNAの5'側で切断が生じる。また、好ましくは、ガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの3'末端には、自己切断型リボザイムをコードするポリヌクレオチドが結合されており、その転写産物では、当該リボザイムの作用により、ガイドRNAの3'側で切断が生じる。自己切断型リボザイムとしては、好ましくはハンマーヘッド型リボザイムまたはデルタ肝炎ウイルスリボザイム（Webb  and  Luptak  RNA  biology  8:5,  719-727）である。ハンマーヘッド型リボザイムにおいては、当該リボザイムをコードするポリヌクレオチドの3'末端にガイドRNAの3'末端領域と相補的なRNAをコードするポリヌクレオチドが結合されている。この構造を採用することにより、転写産物において、自己切断型リボザイムの3'側に付加されたRNAとガイドRNAの3'末端とがハイブリダイズし、リボザイムの作用により、ガイドRNAの3'側で切断が生じる。デルタ肝炎ウイルスリボザイムを採用する場合は、ガイドRNAの3'末端領域と相補的なRNAは不要であり、当該リボザイムの5'末端で切断が生じる。これらリボザイムの作用の結果、ガイドRNAの5'側および／または3'側から余計な配列が排除されることから、ガイドRNAは効率的に機能することができる。
【００４５】
本発明においてハンマーヘッド型リボザイムを用いた場合、切断箇所に配置する「ガイドRNAの5'末端領域と相補的なRNA」あるいは「ガイドRNAの3'末端領域と相補的なRNA」は、それぞれ、自己切断型リボザイムが転写産物においてガイドRNAの5'側および3'側で切断が生じるのに十分な鎖長および配列を有する。しかしながら、切断が生じた転写産物は、ウイルスのゲノムRNAとして複製されることが不可能となることから、全ての転写産物が切断されることは好ましくなく、切断されていない転写産物がある程度生じるようにすることが好ましい。すなわち、「ガイドRNAの5'末端領域と相補的なRNA」および「ガイドRNAの3'末端領域と相補的なRNA」の鎖長および配列は、自己切断型リボザイムにより切断された転写産物と切断されていない転写産物の双方が生じるように選択されることが好ましい。ガイドRNAの5'側および／または3'側が切断された転写産物の総転写産物における割合は、1〜70%であることが好ましく、5〜30%であることがより好ましい。鎖長は、通常、3〜10塩基であるが、これに制限されない。必要に応じて、相補的でない塩基を導入することにより、当業者であれば、切断された転写産物と切断されていない転写産物の割合を調整することが可能である。デルタ型肝炎ウイルスリボザイムを用いた場合でも、切断された転写産物の総転写産物における割合が上記の割合となるように、適切な配列を持つデルタ型肝炎ウイルスリボザイムを採用することが好ましい。
【００４６】
植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターがRNAの形態である場合には、例えば、ウイルスゲノムRNAに対するcDNAに上記外来遺伝子を挿入した発現構築物を調製し、試験管内転写を行って得られたRNA産物を用いることができる。DNAの形態の場合には、例えば、ウイルスゲノムRNAに対するcDNAに外来遺伝子を挿入した発現構築物を用いることができる。
【００４７】
植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターを、DNAベクター（発現構築物）として用いる場合には、通常、ウイルス遺伝子および外来遺伝子を、植物で発現可能な適当なプロモーターの下流に結合させる。プロモーターとしては、例えば、CaMV  35Sプロモーター、イネアクチンプロモーター、ユビキチンプロモーターなどの公知のプロモーターを使用することができる。また、これら遺伝子の下流には、通常、ターミネーターが結合される。外来遺伝子がコードするタンパク質は、例えば、配列特異的プロテアーゼの認識配列を介在して、ウイルス遺伝子がコードするタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。この場合、プロテアーゼの作用により、融合タンパク質が切断され、外来遺伝子がコードするタンパク質が生成する。
【００４８】
本発明においては、こうして調製した植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターを植物細胞に導入する。植物細胞は、当該ウイルスベクターが感染する宿主植物細胞から選択すればよく、野菜、果実、園芸作物など様々な植物の細胞が含まれる。「植物」としては、ナス科植物（例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、ピーマン、トマト、トウガラシ、ペチュニア）、イネ科植物（イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ）、アブラナ科植物（例えば、ダイコン、アブラナ、キャベツ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナ）、バラ科植物（例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラ）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシ）、ウリ科植物（例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、スイカ、メロン、ズッキーニ）、シソ科（例えば、ラベンダー、ハッカ、シソ）、ユリ科植物（例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップ）、アカザ科植物（例えば、ホウレンソウ）、セリ科植物（例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリ）、キク科植物（例えば、キク、レタス、アーティチョーク）、ラン科植物（例えば、コチョウラン、カトレア）、ヒルガオ科植物（例えば、サツマイモ）、サトイモ科植物（例えば、サトイモ、タロイモ、コンニャク）などが挙げられるが、これらに制限されない。また、「植物細胞」には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉などが含まれる。
【００４９】
植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターを植物細胞へ導入する方法としては、例えば、摩擦接種法、パーティクルガン法などの公知の方法を利用することができる。
【００５０】
植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが導入された植物細胞内で、分割されたゲノム編集酵素が発現し、それらが会合して機能的なゲノム編集酵素が形成される。この機能的なゲノム編集酵素とガイドRNAとが複合体を形成し、当該複合体により部位特異的にゲノムが編集（例えば、ゲノム編集酵素がヌクレアーゼの場合は、切断）される。
【００５１】
本発明においては、植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが導入された植物細胞から植物体を再生させることにより、ゲノムが部位特異的に編集された植物を生産することができる。組織培養により植物の組織を再分化させて個体を得る方法としては、本技術分野において確立された方法を利用することができる（形質転換プロトコール［植物編］  田部井豊・編  化学同人  pp.340-347（2012））。こうして一旦、植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明の方法により得られた植物体、該植物体の子孫およびクローン、ならびに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００５２】
本発明は、また、上記本発明の方法に用いるためのキットを提供する。
【００５３】
当該キットは、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを含む。
【００５４】
（ａ）各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
（ｂ）ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを挿入するための部位を含む
キットには、一つまたは複数の追加の要素をさらに含んでもよい。追加の要素としては、例えば、細胞へのベクターの導入試薬、希釈緩衝液、洗浄緩衝液、培地、対照試薬（例えば、対照ベクター）などが挙げられるが、これらに制限されない。キットには、一般に、使用説明書が含まれる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５６】
なお、本実施例において用いた材料は、以下の通りである。【００５７】
・ウイルスRNAの試験管内合成：pTLW3(Kubota  et  al.  J  Virol.  77:11016-11026  (2013),  ToMV,  プラスミドDNA)、pP2C2S(Chanpman  et  al.,  Plant  J.  2:549-557  (1992),  PVX,  プラスミドDNA)、Mlu1(タカラバイオ)、Spe1(NEB)、BstNI(NEB)、AmpliCap-MaxTM  T7  High  Yield  Message  Maker  Kit(CELLSCRIPT)、DNAiso(タカラバイオ)
・供試植物：Nicotiana  benthamiana、Nicotiana  tabacum
・その他：カーボランダム(ナカライテスク)、KOD  plus  neo(TOYOBO)、DNA  Ligation  Kit＜Mighty  Mix＞(タカラバイオ)
［実施例１］
自己切断型リボザイムの作用によりガイドRNA（gRNA）の5'側が切断されるように、自己切断型リボザイムの3'側にgRNAが結合されているToMVベクターを構築した（図１ａ）。自己切断型リボザイムとしては、HamRz(CTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCGTAAGGAGTC／配列番号：３)を用い、その5'側には、gRNAの5'側と相補的な様々な鎖長の配列を配置した。構築したToMVベクターに対して試験管内転写（37℃で2.5時間）を行い、得られた転写産物であるウイルスRNAをアガロース電気泳動により展開した。その結果、リボザイムの5'側に配置した配列の違いにより、gRNAの5'側の切断効率が変化することが判明した（図１ｂ）。【００５８】
アグロインフィルトレーション法により、SpCas9を発現するpDe-CAS9(Fauser  et  al.  Plant  J.  79(2):348-359  (2014))および標的配列（配列番号：４）を一過的に導入したベンサミアナタバコの葉に、上記ToMVベクターを接種した。SpCas9とgRNAとの複合体により、当該標的配列が切断・修復されるとLUC遺伝子が発現することになる。6日後のLUC活性を検出したところ、Rz3を用いた場合に強いLUC活性が検出された（図１ｃ）。なお、「TLYFP」はgRNAを持たないネガティブコントロール、「U6-gRNA」は、アグロインフィルトレーションでU6プロモーターからgRNAを発現するポジティブコントロールである。【００５９】
［実施例２］
タバコのPDS遺伝子を標的としたgRNAをToMVベクターに挿入した。自己切断型リボザイムHamRzの5'側には、gRNAの5'側と相補的な様々な鎖長の配列を配置した（図２ａ；一部の配列には、gRNAの3'側と相補的でない塩基も導入した）。構築したToMVベクターに対して試験管内転写（37℃で2.5時間）を行い、得られた転写産物であるウイルスRNAをアガロース電気泳動により展開した。その結果、リボザイムの5'側に配置した配列の違いにより、gRNAの5'側の切断効率が変化することが判明した（図２ｂ）。【００６０】
アグロインフィルトレーション法によりSaCas9を発現するpRI201-ANを基にしたプラスミド（Kaya  et  al.  Sci  Rep  6：26871（2016））を一過的に導入したベンサミアナタバコの葉に、上記ToMVベクターを接種した。7日後にゲノムDNAを抽出して編集の有無をCAPS法により調べたところ、適度な切断効率をもつRz5aおよびRz5bにおいて効率的にゲノム編集が起きていた（図２ｃ）。なお、「NoRz」は、HamRzをもたないネガティブコントロール、「AtU6:gRNA」は、アグロインフィルトレーションでU6プロモーターからgRNAを発現するポジティブコントロールである。【００６１】
［実施例３］
以上の実施例１と２から、HamRzの5'側に配置したgRNAと相補的な配列における配列の長さや種類を調節し、gRNAとの塩基対形成効率を適度に保つことにより、ゲノム編集効率が格段に向上することが判明した（図１、２）。そこで、次に、分割されたCas9遺伝子が挿入されたベクターの構築を行った。【００６２】
（１）Cas9のクローニング
Staphylococcus  aureusから単離されたSaCas9遺伝子(3159bp)をN末端側(2217bp,「N739」と称する)とC末端側(942bp,「C740」と称する)に分割した。それぞれをKOD  plus  neoを用いてクローニングし、それぞれpTLW3およびpP2C2Sのサブゲノミックプロモーター下流へ導入することでpTL-739N、pTL-740C、pPVX-739N、pPVX-740Cを作成した。さらにpTL-739N、pTL-740Cの分割Cas9下流には、上記のタバコPDS遺伝子をターゲットとしたgRNA配列を自己切断型リボザイムであるHamRzを介して結合した（pTL-739N-Rz5a、pTL-740C-Rz5a）。【００６３】
（２）ウイルス感染
制限酵素(ToMVはMluI、PVXはSpeI)で開環したプラスミドDNAをテンプレートにAmpliCap-MaxTM  T7  High  Yield  Message  Maker  Kitを用いてウイルスRNAを合成した。合成したRNAを[TL-739N-Rz5a、PVX-740C]と[TL-740C-Rz5a、PVX-739N]の2通りの組み合わせで混合し、タバコ（Nicotiana  benthamianあるいはNicotiana  tabacum）葉（約4週齢、第5葉）にカーボランダムと共に擦り込むことで感染させた。【００６４】
（３）タバコのゲノム抽出、CAPS解析
接種後12日目のNicotiana  benthamiana葉をサンプルとして回収し、液体窒素にて凍結破砕後、500μLのDNAisoを用いてゲノムを抽出した。このゲノムを鋳型にして、gRNAの標的部位を含む約250bpの断片をPCRにて増幅した。次いでPCR反応液2μLを制限酵素BstNIにて消化し、CAPS解析を行った結果、いずれのウイルスの組み合わせでも標的部位のゲノム編集を確認することができた（図３）。【００６５】
また、Nicotiana  tabacumの感染葉を、既報の方法(Ohshima  et  al.  Plant  Cell  2:95-106  (1990))に従って脱分化(カルス化)させ、次いで、シュート再生を試みた結果、PDS遺伝子がノックアウトされたことを示す白色シュートを確認することができた（図４）。【００６６】
［実施例４］
実施例３において、ウイルスベクターから分割されたSaCas9を発現させてゲノム編集を行う際、ウイルスゲノム中に挿入したリボザイムがgRNAの5′側を切断することにより、gRNAが供給されている。しかしながら、この場合でも、供給されるgRNAの3′側にはウイルス由来の配列が付加されている。そこで、本実施例では、gRNAの3′側で低効率で切断を生じさせるリボザイムをさらに配置することにより、ゲノム編集効率が変化するか否かを検討した。【００６７】
具体的には、タバコTOM1遺伝子を標的としたgRNAをToMVベクターに挿入した。gRNAの両側にリボザイムを配置した。その際、gRNAの5′側を切断するリボザイムは固定して（5′Rz）、様々な切断効率のリボザイムを3′側に配置した（図５ａ）。アグロインフィルトレーション法によりSaCas9を発現するpRI201-ANを基にしたプラスミド（Kaya  et  al.  Sci  Rep  6：26871（2016））を一過的に導入したベンサミアナタバコの葉に、上記ToMVベクターを接種し、実施例２と同様に、ゲノム編集の可否をCAPS法により調べた。【００６８】
その結果、適切なリボザイムを3′側にも配置することによってゲノム編集効率が著しく向上した（図５ｂ）。付加するリボザイムによってゲノム編集効率は大きく変わり、Rz8が最もゲノム編集効率が高かった。【００６９】
［実施例５］
実施例３では、ウイルスベクターから発現するゲノム編集酵素として、分割されたSaCas9を用いた。本実施例では、本技術の汎用性を裏付けるため、分割されたSpCas9を用いて同様に検証した。【００７０】
具体的には、Streptococcus  pyogenesから単離されたSpCas9を、動物細胞での実施例(Zetsche  et  al.  Nat  Biotechnol,  33:139-142(2015))を参考に、N末端側(「1〜714位」;2280bp;Sp_N714)とC末端側(「715〜1368位」;1998bp;Sp_C715)に分割した。また、核酸認識ドメイン(「56〜714位」;1977bp;Sp_α-Helical)と核酸分解ドメイン(「1〜57位＋GSS＋730〜1368位」;2100bp;Sp_Nuclease)とに分割する方法(「Wright  et  al.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  112,  2984-2989  (2015)」を一部改変)についても検証した。Sp_N714とSp_α-Helicalには5’側に、Sp_C715とSp_Nucleaseには3’側にそれぞれ核移行シグナルコード配列を付加した。いずれのSpCas9もKOD  plus  neoを用いたPCRにより増幅した。Sp_N714とSp_α-Helicalについては、pTLW3(ToMV)の外被タンパク質遺伝子と置換し、Sp_C715とSp_Nucleaseについては、pP2C2S(PVX)のSalIおよびEcoRV切断部位へ導入した。さらに、Sp_C715とSp_Nucleaseの下流にはタバコRTS3遺伝子をターゲットとしたガイドRNA配列を自己切断型リボザイムであるHamRz(CTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCGTAAGGAGTC／配列番号：３)を介して連結した。【００７１】
両ウイルスベクターをベンサミアナタバコに共接種してゲノム編集の可否をCAPS法により調べた。その結果、いずれのウイルスの組み合わせでも標的部位のゲノム編集を確認することができた（図６）。したがって、本発明では、分割化SpCas9も利用可能であることが裏付けられた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
以上説明したように、本発明によれば、植物ゲノムへのゲノム編集酵素遺伝子の組込みを経ずに、植物ウイルスベクターを用いて植物のゲノム編集を行うことが可能となる。本発明によれば、例えば、有用な形質を有する農作物を効率的に作出することができることから、農業分野を中心に産業利用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
配列番号：３
・人工的に合成したリボザイム配列(HamRz)
配列番号：４
・Cas9標的配列が挿入されているLuc遺伝子
・挿入した配列
・Cas9標的配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018151155.tif 000009
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