(57)【要約】  本発明に係る筋分化促進剤は、細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む。前記オリゴＤＮＡは好ましくは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する。さらに前記オリゴＤＮＡと併せてベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む筋分化促進剤。
【請求項２】
ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩をさらに含む請求項１に記載の筋分化促進剤。
【請求項３】
前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している、請求項１又は２記載の筋分化促進剤。
【請求項４】
前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む請求項３記載の筋分化促進剤。
【請求項５】
前記オリゴＤＮＡは、塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む請求項４記載の筋分化促進剤。
【請求項６】
前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’ 又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する請求項１記載の筋分化促進剤。
【請求項７】
哺乳類又は鳥類の細胞又は個体に対して適用するための請求項１から６のいずれか１項に記載の筋分化促進剤。
【請求項８】
前記細胞はマウス筋芽細胞又はニワトリ筋芽細胞又はヒト横紋筋肉腫細胞である請求項７記載の筋分化促進剤。
【請求項９】
前記個体はマウス、ニワトリ又はヒトである請求項７記載の筋分化促進剤。
【請求項１０】
前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む請求項２記載の筋分化促進剤。
【請求項１１】
５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した請求項１０記載の筋分化促進剤。
【請求項１２】
前記オリゴＤＮＡと前記ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩のモル比は１：１０〜１０：１である、請求項９記載の筋分化促進剤。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかの１項に記載の筋分化促進剤を使用する筋分化促進方法。
【請求項１４】
５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有するた筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡ。
【請求項１５】
５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している請求項１４記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項１６】
５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む請求項１５記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項１７】
塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む請求項１６記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項１８】
細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有し、塩基長が６から２５のいずれかであるオリゴＤＮＡ。
【請求項１９】
前記塩基長が９から１８のいずれかである請求項１８記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項２０】
前記塩基長が１８である請求項１８記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項２１】
５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した請求項１８記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項２２】
５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結したことを特徴とする請求項１９記載のオリゴＤＮＡ。
【請求項２３】
オリゴＤＮＡによる筋分化促進を増強するための増強剤であって、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含む増強剤。
【請求項２４】
前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む請求項２３記載の増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年２月１６日に出願された、日本国特許出願第２０１７−０２６５４７号明細書及び２０１７年８月３日に出願された、日本国特許出願第２０１７−１５０３２０号明細書（これらの開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、筋分化促進剤、筋分化促進方法、筋分化促進の増強剤及び筋分化促進の増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢社会では、加齢性の骨格筋委縮を主徴とするサルコペニアを含むロコモティブ症候群が急増しており、寝たきりの原因として大きな問題となっている。また近年の研究から、骨格筋の委縮は心不全の予後の独立した危険因子であるなど、運動機能の増進が様々な疾患の治療及び／又は予防にも重要であることが明らかになりつつある。多くの高齢者が自立した生活を送る健康長寿社会を実現するには、生涯に渡って筋力及び／又は筋量を維持していくことが不可欠である。加齢に伴う筋委縮の予防には、食事を介して筋肉に有益な分子を摂取するといった、日常的かつ長期的な取り組みが有効であると考えられており、安全で安価な機能性分子が求められている。【０００３】
骨格筋は、衛星細胞と呼ばれる骨格筋幹細胞の増殖と分化によって再生され、組織としての恒常性が保たれている。老化が進行すると、筋組織中の衛星細胞の数が減少し、また、個々の衛星細胞の再生能力も低下する。衛星細胞の老化を抑制したり、再生能力を活性化する機能性分子を探索及び同定することは、加齢性の筋委縮に対する新しい予防戦略の提唱につながると期待されている。【０００４】
例えば、マウス骨格筋から採取した衛星細胞を初代培養して得られた筋芽細胞を用い、骨格筋分化に作用する分子をスクリーニングする系が確立されており、このスクリーニング系によって、ウコンに含まれるポリフェノールの一種であるクルクミンが筋分化を促進することが見出されている（非特許文献１）。【０００５】
しかし、自然由来のクルクミンは、栽培されたウコン等を原材料にし、有機溶媒抽出法、アルコール抽出法などによって、分離及び抽出を行い、生産することが現在でも行われており、今後の世界的な需要の増加に対し高純度なクルクミンが安定にしかも安価に生産できるかどうかが懸念される。また特許文献１の方法はＤＮＡの修復及びＤＮＡ欠損によるガン化の抑制を目的としたものである。【０００６】
また、老化防止という観点から、テロメア相同オリゴヌクレオチド（配列番号１７、１８）を細胞に曝露することにより、平均テロメア長を増加させる技術が開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５２２５２０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】高谷智英、転写因子ＧＡＴＡ４は骨格筋幹細胞の増殖・分化を制御する、第２回国際心血管薬物療法学会日本部会学術集会  （徳島）プログラム抄録集、ｐｐ７６、２０１６／０６／２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決すべき課題は、新たな筋分化促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、新たな知見を見出すに至った。
具体的には、本発明は、以下の項を提供する
項１．細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む筋分化促進剤。【００１１】
項２．ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩をさらに含む項１に記載の筋分化促進剤。【００１２】
項３．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している、項１又は２記載の筋分化促進剤。【００１３】
項４．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む項３記載の筋分化促進剤。【００１４】
項５．前記オリゴＤＮＡは、塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む項４記載の筋分化促進剤。【００１５】
項６．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’ 又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する項１記載の筋分化促進剤。【００１６】
項７．哺乳類又は鳥類の細胞又は個体に対して適用するための項１から６のいずれか１項に記載の筋分化促進剤。【００１７】
項８．前記細胞はマウス筋芽細胞又はニワトリ筋芽細胞又はヒト横紋筋肉腫細胞である項７記載の筋分化促進剤。【００１８】
項９．前記個体はマウス、ニワトリ又はヒトである項７記載の筋分化促進剤。【００１９】
項１０．前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む項２記載の筋分化促進剤。【００２０】
項１１．５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した項１０記載の筋分化促進剤。【００２１】
項１２．前記オリゴＤＮＡと前記ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩のモル比は１：１０〜１０：１である、項９記載の筋分化促進剤。【００２２】
項１３．項１から１２のいずれかの１項に記載の筋分化促進剤を使用する筋分化促進方法。【００２３】
項１４．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有するた筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡ。【００２４】
項１５．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している項１４記載のオリゴＤＮＡ。【００２５】
項１６．５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む項１５記載のオリゴＤＮＡ。【００２６】
項１７．塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む項１６記載のオリゴＤＮＡ。【００２７】
項１８．細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有し、塩基長が６から２５のいずれかであるオリゴＤＮＡ。【００２８】
項１９．前記塩基長が９から１８のいずれかである項１８記載のオリゴＤＮＡ。【００２９】
項２０．前記塩基長が１８である項１８記載のオリゴＤＮＡ。【００３０】
項２１．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した項１８記載のオリゴＤＮＡ。【００３１】
項２２．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結したことを特徴とする項１９記載のオリゴＤＮＡ。【００３２】
項２３．オリゴＤＮＡによる筋分化促進を増強するための増強剤であって、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含む増強剤。【００３３】
項２４．前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む項２３記載の増強剤。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、筋分化を強力に促進することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】骨格筋の再生メカニズムを示す説明図
【図２】本発明の一実施形態におけるオリゴＤＮＡの構造的特徴を示す図
【図３】本発明の実施例１におけるＭＨＣ陽性細胞出現結果を示すグラフ
【図４】本発明の実施例１におけるオリゴＤＮＡのＭＨＣ陽性細胞出現結果を示すグラフ
【図５】本発明の実施例２におけるオリゴＤＮＡ濃度とＭＨＣ陽性細胞出現の関係を示すグラフ
【図６】本発明の実施例２におけるオリゴＤＮＡの熱変性の影響を示すグラフ
【図７】本発明の実施例３におけるヒト横紋筋肉腫の増殖抑制効果を示すグラフ
【図８】本発明の実施例４におけるオリゴＤＮＡ変異型のＭＨＣ陽性細胞の出現を示すグラフ
【図９】本発明の実施例５におけるマウス筋芽細胞に対する特異的効果を示すグラフ
【図１０】本発明の実施例６におけるベルベリン又は類縁体化合物併用の効果を示すグラフ
【図１１】本発明の実施例７におけるベルベリンによるオリゴＤＮＡ変異型の筋分化促進作用の増強効果を示すグラフ
【図１２】本発明の実施例８におけるニワトリ筋芽細胞におけるベルベリン又は類縁体化合物によるオリゴＤＮＡの筋分化促進作用の増強効果を示すグラフ
【図１３】本発明の実施例９におけるヒト横紋筋肉腫細胞の種類に起因する効果の差を示すグラフ
【図１４】本発明の実施例９におけるオリゴＤＮＡとベルベリンのヒト横紋筋肉腫細胞増殖抑制効果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の一態様に係る筋分化促進剤は、細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む。本発明において、「筋分化を促進する活性を有する」とは、本発明の属する分野における技術常識を参酌して適宜解釈し得るが、一般的には、対照群と比較して、骨格筋細胞の最終分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の出現割合を増加させる性質を指す。ＭＨＣ陽性細胞の出現割合は、例えば、後述の実施例１（図３）に示す試験において、測定、評価することができる。
【００３７】
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含んでいてもよい。本発明において、「５’ＸＸＸＸＸＸ３’又は５’ＹＹＹＹＹＹ３’を含む」には、５’ＸＸＸＸＸＸ３’及び５’ＹＹＹＹＹＹ３’の一方のみを含む場合と、これらの両方を含む場合とを包含する。本発明にかかるオリゴＤＮＡがコア塩基配列を含む実施形態においては、当該オリゴＤＮＡは、５’末端側に、塩基配列ＧＡＡ、塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；好ましくは塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；より好ましくは塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有してもよい。かかる実施形態において、「５’末端側に塩基配列ＸＸＸを有する」とは、コア塩基配列よりも５’末端側に塩基配列ＸＸＸを有することを意味し、オリゴＤＮＡの５’末端に塩基配列ＸＸＸを有する場合だけでなく、塩基配列ＸＸＸのさらに５’末端に塩基配列（例えば、Ａ及びＧからなる群より選択される少なくとも１個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個）からなる塩基配列）を有する場合も包含される。また、当該実施形態において、上記塩基配列（塩基配列ＧＡＡ、塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；好ましくは塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；より好ましくは塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧ）は、コア配列に連結していることが好ましいが、上記塩基配列とコア配列との間に別の塩基配列（例えば、Ａ及びＧからなる群より選択される少なくとも１個（例えば、好ましくは１〜３個）からなる塩基配列）を介していてもよい。
【００３８】
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上（好ましくは２〜３、より好ましくは２）連結して含んでもよい。すなわち、前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’（配列番号２８）；５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号２９）；５’ＴＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’（配列番号３０）；又は５’ＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号３１）を含んでもよい。これらのコア塩基配列のうち、５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’、５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’等が好ましい。
【００３９】
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含んでもよい。
【００４０】
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含んでもよい。
【００４１】
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは哺乳類又は鳥類の細胞又は個体に対して適用してもよい。
【００４２】
前記筋分化促進剤において前記細胞はマウス筋芽細胞又はニワトリ筋芽細胞又はヒト横紋筋肉腫細胞であってもよい。
【００４３】
前記筋分化促進剤において前記個体はマウス又はニワトリ又はヒトであってもよい。
【００４４】
本発明の一態様に係る筋分化促進方法は、前記筋分化促進剤を使用する。
【００４５】
本発明の一態様に係る筋分化促進オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する。
【００４６】
前記筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結してもよい。
【００４７】
前記筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含んでもよい。
【００４８】
前記筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含んでもよい。
【００４９】
本発明の一態様に係る筋分化促進剤は細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物とを含む。
【００５０】
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む。
【００５１】
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡ５’は末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有してもよい。
【００５２】
前記オリゴＤＮＡと前記ベルベリン又はその類縁体化合物のモル比は等しくあってもよい。
【００５３】
本発明の一態様に係る筋分化促進方法は５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含むオリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物とを含む筋分化促進剤を使用する。
【００５４】
本発明の一態様に係る増強剤は、オリゴＤＮＡと併用され、細胞又は、個体に対して適用することにより筋分化を促進する増強剤であって、ベルベリン又はその類縁化合物を含む。
【００５５】
前記増強剤において、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含むオリゴＤＮＡと併用されてもよい。
【００５６】
本発明の一態様に係るオリゴＤＮＡは細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有し、塩基長が６から２５のいずれかである。
【００５７】
前記オリゴＤＮＡにおいて前記塩基長が９から１８のいずれかであってもよい。
【００５８】
前記オリゴＤＮＡにおいて前記塩基長が１３から２３のいずれか、好ましくは１５から２１のいずれか、より好ましくは１７から１９のいずれか、さらに好ましくは１８であってもよい。
【００５９】
前記オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有しているのが好ましい。
【００６０】
前記オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結しているのが好ましい。
また、本発明において、オリゴＤＮＡは、後述する配列番号１〜７、１６のいずれかで示される塩基配列からなるもの；配列番号１〜７、１６のいずれかにおいて１個又は数個（好ましくは１〜３個、より好ましく１個）の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなるもの等が好ましい。また、本発明において、オリゴＤＮＡとしては、５’ＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号３２）又は５’ＡＡＡＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号３３）で示される塩基配列からなるもの、当該配列番号３２又は３３で示される塩基配列のうち連続する１５〜２１個（好ましくは１７〜１９固、さらに好ましくは１８個）の塩基で示される塩基配列からなるもの、これらの塩基配列いずれかにおいて１個又は数個（好ましくは１〜３個、より好ましく１個）の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなるもの等が好ましい。  また、本発明において、オリゴＤＮＡとしては、
５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７ＡＧＧＧＴＸ８ＡＧＧＧＴＸ９Ａ３’（配列番号３４）
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、それぞれ独立して、Ａ又はＧを示す。Ｘ７及びＸ８、Ｘ９は、それぞれ独立して、Ｔ又はＧを示す。］
で示される塩基配列のうち連続する１５〜２１個（好ましくは１７〜１９固、さらに好ましくは１８個）の塩基で示される塩基配列からなるもの等が好ましい。上記実施形態において、オリゴＤＮＡは、Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７ＡＧＧＧＴＸ８ＡＧＧＧを含むものが好ましい。また、配列番号３２においてＸ７としてはＴが好ましい。配列番号３２においてＸ８としてはＧが好ましい。配列番号３２においてＸ９としてはＧが好ましい。
【００６１】
本発明において、上記オリゴＤＮＡは、筋分化を促進することができる。具体的には、後述するように、筋分化を強力に促進する一連のオリゴＤＮＡ群を曝露した筋芽細胞では、細胞増殖が抑制され、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の筋管形成が促進されることが確認された。しかも、上記オリゴＤＮＡ群は化学合成が可能で安定構造を有すため、将来的に大量に供給及び保存ができ、また乳酸菌のゲノム配列に由来するため、安全性も高いことが期待される。
そのため、本発明の筋分化促進剤は、筋肉減弱症の予防及び／又は治療、横紋筋肉腫の増殖及び／又は転移の抑制、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又は体性幹細胞の筋分化誘導、筋疾患の再生医療、創薬のスクリーニングに供する骨格筋幹細胞（衛星細胞）、骨格筋前駆細胞（筋芽細胞）及び骨格筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種の作成、食肉用家畜及び／又は家禽の飼料の添加物、食肉用家畜及び／又は家禽の骨格筋の形成及び／又は生育の促進に利用可能である。
【００６２】
本発明においては、本発明の有効成分である上記オリゴＤＮＡそのものを筋分化促進剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、例えば等張化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、防腐剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。
また、上記医薬組成物は、オリゴＤＮＡ以外に、筋分化促進作用を有することが知られている化合物をさらに含んでいてもよい。
医薬組成物の実施形態において、組成物中のオリゴＤＮＡの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
製剤中の本発明のオリゴＤＮＡの含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、オリゴＤＮＡの１日投与量が通常１０〜５０００ｍｇ程度、より好ましくは１００〜１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、１製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの３分の１量が含まれていればよい。
【００６３】
（本発明の実施形態）
以下、本発明の一態様に係る実施の形態（以下、本実施形態）について図面を参照して詳細に説明する。
【００６４】
まず骨格筋の再生メカニズムについて図１を参照しながら説明する。
【００６５】
図１において、筋肉組織の一部に損傷又は劣化が生じた場合、まず衛星細胞と呼ばれる幹細胞が活性化し、筋芽細胞と呼ばれる前駆細胞となる。筋芽細胞は増殖を繰り返した後、筋細胞へと分化する。筋細胞は細胞融合により多核の筋管となる。筋管はさらに構造的成熟を遂げ、最終的に筋線維となり、骨格筋組織を再生する。
【００６６】
本発明者らは、乳酸菌Lactobacillus rhamnosus GGのゲノム配列に由来するオリゴＤＮＡライブラリを用いて筋分化促進作用の検証実験を行った。本実施形態において、オリゴＤＮＡとは６から２５の塩基からなる短いＤＮＡを意味する。好ましくは９から１８の塩基からなる。さらに好ましくは１８の塩基からなる。これらのオリゴＤＮＡは免疫調節作用を有する核酸素材として、医療及び食品の分野で研究が進んでおり、これまでに免疫系を制御する分子機構が明らかにされてきている。しかし免疫系以外の組織及び／又は細胞を標的とするオリゴＤＮＡの研究は行われていなかった。そこで本発明者らはマウス筋芽細胞への作用をスクリーニングし、その結果、筋分化を強力に促進する一連の新規のオリゴＤＮＡ群を同定した。これらを曝露した筋芽細胞では、細胞増殖が抑制され、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の筋管形成が促進される。
【００６７】
＜ｍｙｏＤＮ＞
本実施形態における筋分化促進剤は、例えば次に示す配列番号のオリゴＤＮＡを含む：
ｉＳＮ０１：５’ＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号１）
ｉＳＮ０２：５’ＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴ３’（配列番号２）
ｉＳＮ０３：５’ＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧ３’（配列番号３）
ｉＳＮ０４：５’ＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号４）
ｉＳＮ０５：５’ＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号５）
ｉＳＮ０６：５’ＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴ３’（配列番号６）
ｉＳＮ０７：５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴ３’（配列番号７）
ｉＳＮ０４’：５’ＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号１６）
【００６８】
前記配列番号１〜７、及び１６のオリゴＤＮＡはいずれもコア配列ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ（配列番号２９）を含む。前記配列番号２８で示されるコア配列の５’末端側から２番目と８番目の塩基はＴでもＧでもよい。また前記コア配列の４〜６番目と９〜１１番目に配列ＧＧＧを有するが、筋分化を活性させるに後者の配列がより重要である。なお、配列ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎはテロメアと呼ばれ、真核生物の染色体の末端部に存在する。テロメアは細胞分裂に先立つＤＮＡ複製とともに短くなり、細胞の老化が進むとされる（特許文献１）。
【００６９】
本実施形態における筋分化促進剤は、より好ましくは、配列番号４及び／又は５１のオリゴＤＮＡ（以下、ｉＳＮ０４、ｉＳＮ０４’）を含む。これらのオリゴＤＮＡは前記コア配列の５’側に配列ＡＧＡ又はＡＡＧを含む。以下、ｉＳＮ０４、ｉＳＮ０４’を併せて、「ｍｙｏＤＮ」と称する。
【００７０】
本実施形態における前記オリゴＤＮＡは一本鎖であってもよい。また、核酸分解酵素に対して耐性を高めるためにホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドのリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したもの（例えばホスホロチオエート結合）であってもよいが、これらに限定されない。また、前記オリゴＤＮＡは乳酸菌、大腸菌などの生物からＤＮＡを抽出し断片化したもの、あるいは、化学合成、遺伝子組替え技術によって作成したものであってもよいが、これらに限定されない。
【００７１】
＜ｍｙｏＤＮの構造的特徴＞
図２の左上及び左下にｉＳＮ０４（配列番号４）の立体構造をシミュレートした結果を示す。当シミュレーションにおいてはｉＳＮ０４はホスホロチオエート骨格を有する一本鎖ＤＮＡであることを前提としていない。左上の図はｉＳＮ０４の分子構造図であり、左下の図は各塩基間の距離を濃淡描画したマップである。縦軸、横軸の数字はそれぞれ５’末端側から何番目の塩基であるかを示し、縦軸の番号の塩基と横軸の番号の塩基との距離が近いほど濃く表示される。左下図において、１３〜１５番目の塩基配列ＧＧＧの周辺が濃く表示されているが、これはｉＳＮ０４においてこれらのグアニン塩基群が他の塩基と比較して互いに近接していることを示している。
【００７２】
＜筋分化促進剤の適用対象＞
本実施の形態における筋分化促進剤は、個体を構成する細胞に対しても培地上で培養された細胞に対しても適用可能である。また、前記筋分化促進剤はマウス、ヒトを含む哺乳類又はニワトリを含む鳥類を対象とすることができるが、これらに限定されない。
【００７３】
＜筋分化促進剤の利用形態＞
本実施の形態における筋分化促進剤は、通常使用されている各種の担体、賦形剤の成分を配合し、公知の方法に従って、注射薬、塗布薬、錠剤、カプセル剤、シロップ、座薬等に製剤化できるが、これらに限定されない。また、前記筋分化促進剤は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、経腸、局所、舌下又は直腸手段によって投与することができるが、これらに限定されない。
【００７４】
（本発明の第２の実施形態）
以下、本発明の第２の実施形態について説明する。第２の実施形態の筋分化促進剤はオリゴＤＮＡにベルベリンもしくはその類縁体化合物（例えば、パルマチン、ヤテオリジン、コランバミン等）又はその塩を併用したものである。好ましくは、オリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物のモル比を、１：１０〜１０：１、より好ましくは１：５〜５：１、さらに好ましくは１：２〜２：１、なおさらに好ましくは１：１で用いる。オリゴＤＮＡとしては、前述のものが挙げられる。当該実施形態において、筋分化促進剤中のオリゴＤＮＡの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のオリゴＤＮＡの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。当該実施形態において、筋分化促進剤中のベルベリンの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のベルベリンの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。
【００７５】
当該実施形態においては、安価で安全なベルベリン又はその類縁体化合物をオリゴＤＮＡに併用することによりオリゴＤＮＡの筋分化促進作用を増強することが可能となる。ベルベリンの類縁体化合物としては、特に限定されず、天然の誘導体、人工の誘導体のいずれも使用し得る。
【００７６】
＜ベルベリンと組み合わせたｍｙｏＤＮの構造的特徴＞
図２の右上及び右下にベルベリンと組み合わせたｉＳＮ０４（配列番号４）の立体構造をシミュレートした結果を示す。当シミュレーションにおいてはｉＳＮ０４はホスホロチオエート骨格を有する一本鎖ＤＮＡであることを前提としていない。図２の右上はベルベリンと組み合わせた状態（ベルベリン存在下）におけるｉＳＮ０４の複合体構造図（ベルベリン分子は空間充填モデルで表示）であり、右下の図はベルベリンと組み合わせた状態での各塩基間およびベルベリン（残基番号０）の距離を濃淡描画したマップである。図２の右下においては、１３〜１５番目の塩基配列ＧＧＧの周辺だけでなく、７〜９番目の塩基配列ＧＧＧの周辺も濃く表示されている。これはベルベリンと組み合わせた状態のｉＳＮ０４においてこれらのグアニン塩基群が他の塩基と比較して互いに近接していることを示している。
【００７７】
＜ベルベリン＞
ベルベリン（式１）はオウバク(黄檗)から抽出される生薬の成分で、アルカロイドの一種であり、窒素を含む塩基性の天然有機化合物として知られている。主に、抗菌、抗炎症、中枢抑制又は血圧降下剤として、下痢の止瀉薬、目薬として利用されており、人体に対して安全である。
【００７８】
【化１】
2018151225.tif 000002
【００７９】
ベルベリンは単体では筋分化促進効果は無く、後述の実施例で示されるように、むしろ弱い筋分化抑制効果を有する。しかし、ベルベリンをｉＳＮ０４又は所定の変異体とともに筋芽細胞に作用させたとき、筋分化促進効果が劇的に亢進する。変異体はｉＳＮ０４’でもよく、あるいはｉＳＮ０４の５’末端側より１１番目のＧをＴに置換したオリゴＤＮＡ（配列番号２６）であってもよい。ただし、後述の実施例で示されるように、ｉＳＮ０４の５番目のＴをＧに置換させるとベルベリンによる顕著な増強効果は見られなくなる。
【００８０】
＜パルマチン＞
ベルベリンに代えて、パルマチンをオリゴＤＮＡと併用してもよい。パルマチンはベルベリンと同じくオウバク(黄檗)から抽出される生薬成分であり、式２で示されるように、ベルベリンのメチレンジオキシ基の代わりにジメトキシ基を有す類縁体化合物である。当該実施形態において、筋分化促進剤中のパルマチンの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のパルマチンの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。
【００８１】
【化２】
2018151225.tif 000003
【００８２】
ベルベリンもパルマチンも（Ｓ）−レチクリン（Ｃ１９Ｈ２３ＮＯ４）を前駆体としコランバミン（Ｃ２０Ｈ２０ＮＯ４）を経て生合成される。ベルベリンシターゼという酵素がコランバミンをメチレンジオキシ基を有するベルベリンに変換する。また他の酵素がコランバミンをメチル化してパルマチンを生成する。
【００８３】
＜その他の類縁体＞
ベルベリンの類縁体としては、パルマチン以外に、ヤテオリジン、コランバミン等が挙げられる：
【００８４】
【化３】
2018151225.tif 000004
【００８５】
当該実施形態において、筋分化促進剤中の、ヤテオリジン、コランバミン等のベルベリンの類縁体の含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のヤテオリジン、コランバミン等のベルベリンの類縁体の含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。
【００８６】
ベルベリン及びパルマチン等の類縁体を生合成する植物からこれらを抽出及び精製する方法は既に確立されており、安価で利用することが可能である。さらにオリゴＤＮＡよりも安価なベルベリン又はパルマチン等の類縁体を併用することで、効果を高めつつオリゴＤＮＡの利用コストをさらに下げることが可能である。
【００８７】
本発明においてベルベリン又はその誘導体は、塩の状態で用いてもよい。また、ベルベリン又はその誘導体の塩としては、ハロゲン化物（塩化物等）等が挙げられる。また、ベルベリン又はその誘導体の塩としては、酸付加塩及び塩基との塩も挙げられる。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。
【００８８】
本発明において、ベルベリンもしくはその誘導体又はこれらの塩は、前述したオリゴＤＮＡによる筋分化促進作用を増強することができる。従って、本発明は、オリゴＤＮＡによる筋分化促進を増強するための増強剤であって、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含む増強剤を提供する。当該実施形態において、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩の種類、配合量、オリゴＤＮＡの種類、使用量、その他成分等については、筋分化促進剤について前述したのと同様の条件を適宜適用し得る。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明の実施例について説明する。
（実施例１）
本発明者らは、マウス骨格筋から採取した衛星細胞を初代培養して得られた筋芽細胞を用い、骨格筋分化に作用する分子をスクリーニングする系を確立した。コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートで培養した筋芽細胞に、オリゴＤＮＡなどの分子を添加する。所定時間経過後に、免疫染色によって骨格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現を定量化する。このときＤＡＰＩ染色によって細胞核を可視化する。さらにイメージアナライザーを用いて、画像の撮影と解析を自動的に行い、筋分化効率と細胞数をハイスループットで定量する。このようにして、筋芽細胞に対する多種多様な分子の作用を効率的に検討することができる。【００９０】
配列番号１〜３、及び５〜５１の５０種類のオリゴＤＮＡ群（表１）を用いたスクリーニング結果を図３に示す。マウス筋芽細胞（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にそれぞれ１０μＭの濃度のオリゴＤＮＡを曝露し、４８時間後にＭＨＣ陽性細胞の出現割合を測定した。なお、以下の実施例におけるオリゴＤＮＡは一本鎖で構成され、しかも核酸分解酵素に対して耐性を高めるためにホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換する処理（Ｓ化）を予め行っている。【００９１】
＜表１＞
iSN01  :  5’AAAAGATTAGGGTGAGGG3’(配列番号1)
iSN02  :  5’AAAGATTAGGGTGAGGGT3’(配列番号2)
iSN03  :  5’AAGATTAGGGTGAGGGTG3’(配列番号3)
iSN04’: 5’AAGTTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号16)
iSN05  :  5’GATTAGGGTGAGGGTGAG3’(配列番号5)
iSN06  :  5’ATTAGGGTGAGGGTGAGT3’(配列番号6)
iSN07  :  5’TTAGGGTGAGGGTGAGTT3’(配列番号7)
iSN08  :  5’AGTTCAACATTAGGGTGA3’(配列番号8)
iSN09  :  5’GTTCAACATTAGGGTGAA3’(配列番号9)
iSN10  :  5’TTCAACATTAGGGTGAAA3’(配列番号10)
iSN11  :  5’TCAACATTAGGGTGAAAA3’(配列番号11)
iSN12  :  5’CAACATTAGGGTGAAAAT3’(配列番号12)
iSN13  :  5’AACATTAGGGTGAAAATG3’(配列番号13)
iSN14  :  5’ACATTAGGGTGAAAATGA3’(配列番号14)
iSN15  :  5’CATTAGGGTGAAAATGAA3’(配列番号15)【００９２】
図３において、右側のグラフはミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の割合を、左側のグラフは細胞数を示したものである。いずれも最上段の白色のバー（Ｃｔｒｌ）はオリゴＤＮＡを全く投与しなかった対照群（コントロール）である。なお、左側のグラフにおいては対照群の細胞数は１と正規化している。明らかにＭＨＣ陽性細胞の割合と細胞数とは相補的な関係にある。これは筋芽細胞の分化が促進されれば増殖が抑制されることを意味する。対照群におけるＭＨＣ陽性細胞の比率は高々３％程度である。【００９３】
一方、オリゴＤＮＡを投与した筋芽細胞のうち、ｉＳＮ０１、０２、０３、０４’、０５、０６及び０７のグループに属するオリゴＤＮＡが投与された筋芽細胞においては６％以上の割合でＭＨＣ陽性細胞が出現した。特にｉＳＮ０４’（配列番号１６）のオリゴＤＮＡが投与された筋芽細胞におけるＭＨＣ陽性細胞の割合は４０％超と非常に高い。【００９４】
さらに、このｉＳＮ０４’と配列が２塩基異なるｉＳＮ０４（表２、配列番号４）のオリゴＤＮＡとで、同様の条件で比較実験を行った。結果を図４に示す。【００９５】
＜表２＞
iSN04:  5’AGATTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号4)【００９６】
図４より明らかなように、配列番号４のオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４）は配列番号１６のオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４’）と同程度かそれ以上の筋分化促進作用を示す。【００９７】
ここで注目すべきことは、前記ｉＳＮ０１〜０７及び前記ｉＳＮ０４’のグループに属するオリゴＤＮＡは、共通して５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号２９）という塩基配列を有している。【００９８】
（実施例２）
図５にｉＳＮ０１〜０３（配列番号１〜３）、ｉＳＮ０５〜０７（配列番号５〜７）、ｉＳＮ０４’（配列番号１６）のオリゴＤＮＡを３μＭ及び１０μＭの濃度で筋芽細胞に曝露したときの、４８時間後におけるミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の割合を測定した結果を示す。同図によれば、オリゴＤＮＡの濃度が３μＭに比べて１０μＭで極端にＭＨＣ陽性細胞割合が増えることから、筋分化の促進には一定量以上の濃度のオリゴＤＮＡが必要であることが判る。【００９９】
さらに、ｉＳＮ０２（配列番号２）を加熱により変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させた１０μＭのオリゴＤＮＡ（ｄｅ−ｉＳＮ０２）を４８時間、マウス筋芽細胞（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に曝露したときのＭＨＣ陽性細胞割合を図６に示す。熱変性処理はオリゴＤＮＡを９５℃で５分間加熱して行った。熱変性によって、ｉＳＮ０２の筋分化促進作用が明らかに失われていることがわかる。この結果は、オリゴＤＮＡの活性が立体構造に依存していることを示唆する。【０１００】
（実施例３）
図７は、ｍｙｏＤＮすなわちｉＳＮ０４又はｉＳＮ０４’（配列番号４、５１のオリゴＤＮＡ）によるヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１の増殖の抑制効果を示したものである。図３で説明したとおり筋芽細胞の分化と増殖は相補的な関係にある。言い換えればオリゴＤＮＡにより筋芽細胞の分化が促進されれば、その一方で増殖は抑制される。この性質を利用すれば、オリゴＤＮＡによる癌などの悪性腫瘍の増殖及び転移を抑制する効果が期待できる。【０１０１】
図７において（ａ）はヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４’）を曝露したときの骨格筋分化マーカー遺伝子（ＭＹＨ２）の発現量を、（ｂ）は細胞増殖マーカー遺伝子（ＭＫＩ６７）の発現量を、それぞれコントロール（Ｃｔｒｌ）を１．０として定量したものである。両図より明らかなように、筋分化の促進と細胞増殖の抑制は互いに逆の関係にある。【０１０２】
図７（ｃ）は時間経過に伴う横紋筋肉腫の細胞数を計測した結果である。コントロール（Ｃｔｒｌ）と比較すると、ｉＳＮ０４（配列番号４のオリゴＤＮＡ）を曝露したときは明らかにヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１の増殖が抑制されている。【０１０３】
（実施例４）
表３に示すｉＳＮ０４（配列番号４）の一部の塩基を置換又は削除して作成したオリゴＤＮＡの変異型（配列５４〜６２）をマウス筋芽細胞に対しそれぞれ１０μＭの濃度で曝露し、４８時間後にＭＨＣ陽性細胞の出現割合を測定した。表３において「-」は塩基配列が削除されその両端の塩基が直に結合していることを表す。例えばｉＳＮ０４（ｄｅｌ１３−１５）において、５’末端側から１２番目の塩基Ａと、３’末端側から４番目の塩基Ｔは直に結合している。【０１０４】
＜表３＞
iSN04                  :5’AGATTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号4)
iSN04(4-18)            :5’---TTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号19)
iSN04(7-18)            :5’------GGGTGAGGGTGA3’(配列番号20)
iSN04(10-18)           :5’---------TGAGGGTGA3’(配列番号21)
iSN04(dell5)           :5’AGATTAGGGTGAGG-TGA3’(配列番号22)
iSN04(del14-15)        :5’AGATTAGGGTGAG--TGA3’(配列番号23)
iSN04(del13-15)        :5’AGATTAGGGTGA---TGA3’(配列番号24)
iSN04(T5G)             :5’AGATGAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号25)
iSN04(G11T)            :5’AGATTAGGGTTAGGGTGA3’(配列番号26)
iSN04(T5G,G11T)        :5’AGATGAGGGTTAGGGTGA3’(配列番号27)【０１０５】
結果を図８に示す。同図より明らかなように、ｉＳＮ０４の５’末端側から５番目、１１番目の塩基をＴ、Ｇのいずれに変えても、ＭＨＣ陽性細胞の出現割合は殆ど変わらない。その一方で、５’末端側の３塩基を削除したｉＳＮ０４（４−１８）（配列番号１９）を曝露したときのＭＨＣ陽性細胞の出現割合はＭＱ（コントロール）と同程度であり、当変異型適用による筋分化促進効果は全く認められない。６塩基削除したｉＳＮ０４（７−１８）（配列番号２０）、９塩基削除したｉＳＮ０４（１０−１８）（配列番号２１）を適用した場合においても結果はほぼ同じである。以上の結果は、ｍｙｏＤＮの筋分化促進作用には５’末端側の３塩基（ＡＧＡ又はＡＡＧ）の存在が重要であることを示している。【０１０６】
さらにｉＳＮ０４の５’側から１３〜１５番目のＧをそれぞれ１個、２個、すべて除去したオリゴＤＮＡ（配列番号２２、２３、２４）でも筋分化活性の低下がみられることから、特に当位置における塩基ＧＧＧの役割が大きいことが示唆される。図２で示されたように、当位置におけるグアニン塩基群は他の塩基と比較してより互いに近接しており、この構造的な特徴がｍｙｏＤＮの筋分化促進効果に寄与している可能性がある。【０１０７】
（実施例５）
ｍｙｏＤＮが筋分化を特異的に促進することを検証するため、ｉＳＮ０４（配列番号４）を用いた実験を行った。それぞれ５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞又はマウス胎児線維芽細胞にｉＳＮ０４（配列番号４）を１μＭ又は３μＭ、７２時間曝露し、細胞に対する増加抑制効果を観察した。実験はそれぞれ３回行いその平均をプロットした。【０１０８】
図９上のグラフはマウス筋芽細胞に対する増加抑制効果を示したもので、コントロール（Ｃｔｒｌ）の細胞（ｉＳＮ０４を加えていない細胞）が７２時間後に約２倍に増殖したのに対し、ｉＳＮ０４を３μＭ曝露したものは０．０５未満のｐ値で約２割程度の増加に抑えられた。【０１０９】
しかし、同図下のグラフに示されるように、マウス胎児線維芽細胞に対しては、ｉＳＮ０４の３μＭ程度の曝露では、細胞の増殖を抑え込むことができなかった。すなわち、ｍｙｏＤＮは筋分化を特異的に促進する結果として細胞増殖を抑制するのであり、全ての細胞の増殖を抑制するわけではない。【０１１０】
（実施例６）
ベルベリン又はパルマチンによるｍｙｏＤＮの筋分化促進作用の増強効果を検証する実験を行った。それぞれ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞にベルベリンのみ又はパルマチンのみをそれぞれ１μＭ、３μＭ又は１０μＭ曝露したものと、併せてｉＳＮ０４を０又は３μＭの濃度で曝露したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。【０１１１】
図１０にその結果を示す。同図より明らかなように、ベルベリン（Ｂｅｒ）単体ではコントロール（白棒のＭＱ）よりもＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合が却って低下する。これはベルベリンは本来筋分化を抑制する作用を有する可能性があることを意味する。ところがｉＳＮ０４を３μＭ併せて曝露した場合、ｉＳＮ０４単体を投与したもの（黒棒のＭＱ）に対しＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合が１．５〜２倍程度増加する。これはベルベリンはｍｙｏＤＮの効果を増強する機能を有していることを意味する。【０１１２】
パルマチン（Ｐａｌ）についても、ベルべリンよりも効果は穏やかであるが、ｍｙｏＤＮの効果を増強する性質を有している。一方で、ベルベリン単体投与で観察された弱い筋分化抑制効果は、パルマチン単体投与では認められなかった。【０１１３】
なお、ベルベリン又はパルマチンによるｉＳＮ０４の増強作用は、いずれの場合も、ｉＳＮ０４とベルベリン又はパルマチンのモル比が１：１のときに最も効果的であった。例えば図１０においてｍｙｏＤＮ（ｉＳＮ０４）３μＭに対してベルベリンを１０μＭ投与したとき（Ｂｅｒ１０）のＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合はベルベリンを３μＭ投与したとき（Ｂｅｒ３）の割合よりも若干低い。【０１１４】
（実施例７）
＜表３＞で示されたベルベリンによるｉＳＮ０４変異体（配列番号１９〜２７）の筋分化促進作用の増強効果を明らかにする実験を行った。それぞれ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞にｉＳＮ０４又はその変異体のみを３μＭの濃度で曝露したサンプルと、併せてベルベリン３μＭを投与したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。【０１１５】
結果を図１１に示す。ベルベリン（Ｂｅｒ）を加えない場合（白棒）、この条件下ではｉＳＮ０４又は変異型を曝露したときのＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合は２０％前後であるが、ベルベリンを加えた場合（黒棒）、変異型によって顕著な差が発生する。ｉＳＮ０４及び５’末端側から１１番目のＧをＴに置換したＧ１１Ｔ（配列番号２６）にのみベルベリンによる顕著なｍｙｏＤＮ活性増強効果が確認された。他の変異型については殆ど効果に変化が無いか（配列番号２２のｄｅｌ１５等）、却って効果が抑制される（配列番号１９の４−１８等）。【０１１６】
図８（実施例４）では、５番目と１１番目の塩基がＴかＧかはｍｙｏＤＮの筋分化促進効果には関係ないことが示されたが、ベルベリンによる増強作用の点からすれば、５番目の塩基として、Ｔがより好適であることが示される。【０１１７】
（実施例８）
なお、上記実施例においては筋分化の検証にマウス筋芽細胞が用いられたが、本発明はこれに制限されるものではない。他の動物、例えば、鳥類であるニワトリの筋芽細胞を用いた実験でも、オリゴＤＮＡによる筋分化促進作用が認められた。【０１１８】
本実施例ではそれぞれ直径３ｃｍのディッシュあたり１０５ｃｅｌｌｓの密度で培養したニワトリ筋芽細胞にｉＳＮ０４’を０μＭ、３μＭ又は１０μＭ曝露したものと、ベルベリン１０μＭを併用したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。【０１１９】
結果を図１２（ａ）に示す。コントロール（図中横軸０μＭの白棒）と比べ、ｉＳＮ０４’を３μＭ又は１０μＭ投与したサンプルではＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合は倍増している。ベルベリン（Ｂｅｒ）を併用した場合、ＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合はさらに倍増している。本実験でも、ｉＳＮ０４’とベルベリンのモル比が１：１のとき（ともに１０μＭ）に、最も高い筋分化促進作用が認められた。【０１２０】
さらに図１０（実施例６）と同様の実験をニワトリ筋芽細胞に対しても行った。結果を図１２（ｂ）に示す。ニワトリ筋芽細胞に対しても、ベルベリン（Ｂｅｒ）単体では筋分化を抑制するように作用し、ｉＳＮ０４と組み合わせると顕著な筋分化促進作用が確認された。また、パルマチン（Ｐａｌ）についても、ベルべリンよりも効果は穏やかであるが、ｉＳＮ０４の効果を増強することが確認された。【０１２１】
（実施例９）
ｍｙｏＤＮのヒト横紋筋肉腫細胞の増殖の抑制効果について併せてベルベリンの効果について実験を行った。ヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１、ＲＤ、ＥＲＭＳ１の５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのサンプルそれぞれに対し、１０μＭのｉＳＮ０４を曝露し、２４〜９６時間経過後の細胞数を測定した。結果を図１３に示す。腫瘍株によってｉＳＮ０４の抑制効果が異なることが示されている。【０１２２】
図１３において（ａ）のグラフはヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１にｉＳＮ０４を曝露した結果を示すものであり、図７（ｃ）で示されたグラフとほぼ同じ条件で追試されたものである。コントロール（Ｃｔｒｌ）と比べて筋肉腫細胞の増殖が半分以下（７２時間後）に抑えられていることが本実施例においても再現されている。一方で、ＲＤ株については９６時間後に０．０５未満のｐ値で２５％程度の抑制が認められた（図１３（ｂ））。ＥＲＭＳ１株では抑制効果が１０％程度であった（同図（ｃ））。【０１２３】
ＲＤ株についてはｉＳＮ０４と併せてベルベリンを投与すると増殖抑制効果が劇的に改善することが判った。図１４にコントロール（Ｃｔｒｌ）、ｉＳＮ０４のみ（１０μＭ）、ｉＳＮ０４と等モルのベルベリン（Ｂｅｒ）（１０μＭ）を併用したときの９６時間後の細胞数の測定結果を示す。ｉＳＮ０４とベルベリンを併用した場合、ｉＳＮ０４のみの場合と比べて約２５％、コントロールと比べて約５０％の増殖抑制効果が示された。【０１２４】
以上、本発明によれば、オリゴＤＮＡにより筋分化を強力に促進することが可能となる。しかも、上記オリゴＤＮＡは化学合成が可能で安定構造を有すため、将来的に大量に供給及び保存ができ、また乳酸菌のゲノム配列由来であるため、安全性も高いと期待される。さらに、安価でしかも安全なベルベリン又はその類縁体化合物を併用することによりオリゴＤＮＡの筋分化促進作用を増強することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、筋肉減弱症状（サルコペニア）を含むロコモティブ症候群の予防及び／又は治療、横紋筋肉腫の増殖及び／又は転移の抑制、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又は体性幹細胞の筋分化誘導、筋疾患の再生医療、創薬のスクリーニングに供する骨格筋幹細胞（衛星細胞）、骨格筋前駆細胞（筋芽細胞）及び骨格筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種の作成、食肉用家畜及び/又は家禽の飼料の添加物、食肉用家畜及び/又は家禽の骨格筋の形成及び／又は生育の促進に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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