(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌルデモドキ（Peronema canescens Jack）の茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導、増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させる、ことを特徴とするヌルデモドキの組織培養による大量増殖法であって、前記発根培地として、BAPのみを含有する、MS培地、又はその改変培地（全培地成分を半分量にしたMS培地）を用いる大量増殖法。
【請求項２】
BAPのみを含有する、MS培地、又はその改変培地（全培地成分を半分量にしたMS培地）が、BAPを０．０１〜４．０ｍｇ／l含む、請求項１に記載の大量増殖法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌルデモドキ（Peronema  canescens  Jack）の組織培養による大量増殖法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヌルデモドキは、世界の熱帯地域における造林木であり、材は内装材、突板、集成材として利用され、樹皮は薬用として用いられている。増殖は一般に挿し木法が用いられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、組織培養技術の発達により、精英樹の選抜、増殖、また薬用物質の大量生産、それに係わる遺伝子の単離が行われており、ヌルデモドキにおいてもそのような技術の開発が期待されている。しかしながら、このような技術開発を行う場合、優良苗を無菌増殖する必要があるが、ヌルデモドキの組織培養による大量増殖法は、未だ開発されておらず、効率的な培養方法の開発が望まれている。
従って、本発明の目的は、ヌルデモドキの大量生産を可能にする大量増殖法を提供することにある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヌルデモドキの茎頂からシュートを大量生産し、植物体を再生することができることを特徴とするヌルデモドキの大量増殖法である。
即ち、ヌルデモドキの苗木、あるいは成木を用いて、大量生産を可能にする大量増殖法を開発することを目的として鋭意研究した結果、ヌルデモドキの茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を効率よく誘導させ、更には誘導された多芽体を増殖させ、次いで多芽体からシュートを伸長させることを見出した。増殖したシュートを、発根培地で培養することにより、更なるシュート伸長及び発根が可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００５】
従って本発明は、ヌルデモドキ（Peronema  canescens  Jack）の茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導、増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュート伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養して発根させる、ことを特徴とするヌルデモドキの組織培養による大量増殖法に関する。
本発明では、ヌルデモドキの茎頂、頂芽あるいは腋芽をBAPを含有するMS培地またはその改変培地で培養して多芽体を誘導し、次いでBAPを含有するMS培地またはその改変培地で培養して多芽体を増殖し、増殖した多芽体をBAPを含有するMS培地またはその改変培地で培養してシュートを伸長させるのが好ましい。
また、本発明では、伸長したシュートをBAPを含有するMS培地またはその改変培地で培養して発根させるのが好ましい。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、ヌルデモドキの苗及び成木の茎頂を含む植物組織から多芽体を誘導、増殖させ、次いで得られた多芽体からシュートを伸長させ、これを発根させることにより、大量の幼植物体を効率よく生産することができる。ここで茎頂を含む植物組織とは、茎頂を含む植物組織であればいずれでも良く、具体的には、茎頂、頂芽、腋芽等を指す。茎頂を用いる場合には、葉原基対を１〜３対付けた状態の茎頂を用いるのが好ましい。多芽体とは、定芽及び／又は不定芽を含む多芽体を指す。
本発明で用いる培養材料としては、苗木及び成木から採取した茎頂を含む植物組織、具体的には、茎頂、頂芽、腋芽等が用いられる。採取した材料は、通常の方法に従って、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸化水素水あるいは塩化水銀（昇汞水）で表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後、培地中で培養する。
培養に用いる基本培地としては、無機成分及び炭素源を必須成分とし、その他植物成長調節物質、ビタミン、アミノ酸を含有する培地が用いられる。無機成分としては、窒素、燐、カリウム、ナトリウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、沃素、硼素、モリブデン、塩素、コバルト等の元素を含む無機化合物が用いられる。炭素源としては、炭水化物、例えばしょ糖又はグルコースが用いられる。植物成長調節物質としては、例えばオーキシン、サイトカイニンを用いられる。オーキシンとしては、例えば３−インドール酢酸（IAA）、３−インドール酪酸（IBA）、ナフタレン酢酸（NAA）、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、4−クロロ−2−メチルフェノキシ酢酸、p−クロロフェノキシ酢酸、2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸等が挙げられ、サイトカイニンとしては、例えばベンジルアミノプリン（BAP）、カイネチン、ゼアチン、6−（γ，γ−ジメチルアラミノ）プリン（2iP）、N−（2−クロロ−4−ピリド）−N’−フェニルウレア（CPPU）、1−フェニル−3−（1,2,3−ティアディアゾール−5−YL）ウレア（チディアズロン）等が挙げられる。ビタミンとしては、例えばチアミン、ピリドキシン、ニコチン酸等が挙げられる。アミノ酸としては、例えばグリシン、グルタミン酸、リジン等が挙げられる。
【０００７】
実際に培養する際に用いられる培地としては、植物組織培養に用いられる培地、例えばMS培地(Murashige, T.(1962), Physiol. Plant. 15: 473 - 497)、B5培地(Gamborg, O.L. (1968), Exp. Cell. Res. 50: 151 - 158)、WP培地(Lloyd, G. (1981), Int. Plant Prop. Soc. 30: 421 - 427)、BTM培地(Chalupa, V. (1984) Biologia Plnt. (praha) 26: 374 - 377)等が挙げられる。
本発明では、茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導、増殖させる培地、増殖した多芽体を培養してシュートを伸長させるためのシュート伸長培地、及び伸長したシュートを培養して発根させるための発根培地は、いずれも、特に、MS培地及びその改変培地が好ましい。より具体的には、例えば茎頂を培養して、定芽、不定芽を多数有する多芽体の誘導及び成長を促進するためには、BAPを0.01〜4.0mg/l、好ましくは0.1〜2.0mg/l含有するMS培地またはその改変培地を用いることが好ましい。腋芽あるいは頂芽を培養して、定芽、不定芽を多数有する多芽体の誘導及び増殖を促進するためには、BAPを0.001〜1.0mg/l、好ましくは0.01〜0.8mg/l含有するMS培地またはその改変培地を用いることが好ましい。
【０００８】
次いで、得られた多芽体をそのまま培養を継続することにより、あるいは増殖培地に移植して培養することにより、効率よく多芽体を増殖させることができる。
多芽体を増殖するための培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、BAPを0.01〜4.0mg/l、好ましくは0.02〜2.0mg/l含有するMS培地またはその改変培地が好ましい。
【０００９】
次いで、増殖した多芽体をシュート伸長培地に移植することにより、多芽体から効率よくシュートを伸長させることができる。
シュート伸長培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、BAPを0.01〜4.0mg/l、好ましくは0.02〜2.0mg/l含有するMS培地またはその改変培地が好ましい。
【００１０】
次いで、伸長したシュートを分割、あるいは分割せずに発根培地に移植することにより、シュートを更に伸長させ、かつ発根させることができる。
発根培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミノ酸等を含有し、BAPを0.01〜4.0mg/l、好ましくは0.02〜2.0mg/l含有するMS培地またはその改変培地が好ましい。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１２】
インドネシアから入手したヌルデモドキの苗木(高さ0.2〜0.5ｍ)を温室で成育させ、高さ1.0〜6.0ｍに成長させた後、材料を採取した。茎頂は、殺菌した頂芽から無菌条件下で摘出した。摘出した茎頂は、葉原基対を３対付けた状態で摘出した。
【００１３】
ヌルデモドキの成木から頂芽及び腋芽を採取し、70％エタノール中で30秒、２％次亜塩素酸ナトリウム中で７分間表面殺菌を行い、滅菌水で数回洗浄後、滅菌濾紙上で風乾した。風乾後、寒天培地で培養した。
【００１４】
(1)多芽体の形成
培地としては、改変MS培地（全培地成分を半分量にしたMS培地）にショ糖30g/l及び植物成長調節物質として、茎頂を用いた場合にはBAPを0〜2.3mg/l、腋芽を用いた場合にはBAPを0〜0.44mg/l、あるいはゼアチンを0〜2.2mg/l添加し、pHを5.7に調整後、殺菌して用いた。培養は26±２℃、16時間日長（3,000lux）で行った。茎頂及び腋芽の培養3ヶ月後の多芽体形成率の結果をそれぞれ表１及び表２に示した。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】
ゼアチンを添加した処理区では、シュートへの伸長は観察されるものの、多芽体の形成は観察されなかった。これに対して、BAP添加処理区では、表１の結果から明らかなように、培養2〜3ヶ月後には、伸長した茎頂の基部より新しい芽の形成が始まり、茎頂は多芽体へと成長した。特に、BAP1.1mg/lを添加することが効果的であった。
腋芽を培養した場合には、表２の結果から明らかなように、培養2〜3ヵ月後には、腋芽から数本のシュートが伸長し多芽体へと成長した、特にBAP0.44mg/lを添加することが効果的であった。
(2) シュート伸長
(1)で形成した多芽体をそのままシュート伸長培地に移植した。培地には、BAPを0〜2.3mg/l添加した改変MS培地（前記(1)と同じ）をpH5.7に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(1)と同じ条件である。２〜３ヶ月後の多芽体増殖の結果を表３に示した。
【００１８】
【表３】
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表３の結果からも明らかなように、培養２ヶ月後には、多芽体からのシュート伸長が認められた。特にBAP1.1mg/lを添加することが効果的であった。
(3)発根
(2)で得られたシュートを一本ずつに切り分け、発根培地に移植した。培地には、BAPを0〜1.1mg/l、あるいは0〜1.0mg/lのNAAと0〜1.0mg/lのIBAを組み合せて添加した改変MS培地（前記(1)と同じ）をpH5.7に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(1)と同じ条件である。１ヶ月後の結果を表４に示した。
【００１９】
【表４】
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【００２０】
表４の結果からも明らかなように、培養１ヶ月後には、65％の個体で発根が観察され、特にBAP1.1mg/lを添加することが効果的であった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、ヌルデモドキの組織培養に供する無菌幼植物体、挿し木用に供する苗及び挿し穂を、試験管内で短期間に大量に生産することができ、ヌルデモドキの大量生産、遺伝子研究等の可能性が高くなる。