(57)【要約】【課題】  従来法と比べより迅速かつ簡易性を備え、誰でも圃場でカンキツグリーニング病の診断ができるカンキツグリーニング病の診断キットを提供することを課題とする。【解決手段】  サンドペーパーで葉表面を擦ることにより、罹病葉内に多量に蓄積するデンプンを抽出し、ヨウ素溶液と反応させ、染色の有無でカンキツグリーニング病の診断を行なうための診断キットであり、少なくとも、サンドペーパーと、ヨウ素溶液と、前記の抽出したデンプンを含むサンドペーパーとヨウ素溶液を反応させるための反応容器とで構成されるカンキツグリーニング病の診断キットである。【選択図】  図２
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
サンドペーパーで葉表面を擦ることにより、罹病葉内に多量に蓄積するデンプンを抽出し、ヨウ素溶液と反応させ、染色の有無でカンキツグリーニング病の診断を行なうための診断キットであり、少なくとも、サンドペーパーと、ヨウ素溶液と、前記の抽出したデンプンを含むサンドペーパーとヨウ素溶液を反応させるための反応容器とで構成されるカンキツグリーニング病の診断キット。
【請求項２】
前記の診断キットに、サンドペーパーに付着したデンプンを溶出させるための水が加えられていることを特徴とする請求項１に記載のカンキツグリーニング病の診断キット。
【請求項３】
前記のサンドペーパー目の粗さは、粒度が１００番〜１４０番であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のカンキツグリーニング病の診断キット。
【請求項４】
前記のサンドペーパーは、小片にカットしやすいように、ミシン目が設けられていることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれかの項に記載のカンキツグリーニング病の診断キット。
【請求項５】
前記のヨウ素溶液は、０．０１Ｍ〜０．５Ｍであることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれかの項に記載のカンキツグリーニング病の診断キット。
【請求項６】
前記のヨウ素溶液を反応させるための反応容器は、透明な袋体であることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれかの項に記載のカンキツグリーニング病の診断キット。
【請求項７】
前記の染色反応は、黄色または橙色では陰性、こげ茶または黒色では陽性と判断されることを特徴とする請求項１から請求項６までのいずれかの項に記載のカンキツグリーニング病の診断キット。
【請求項８】
前記の診断キットは、粒度が１２０番でサイズが１ｃｍ×２ｃｍの耐水性サンドペーパーと、０．０５Ｍのヨウ素溶液入りボトルと、水入りボトルと、ビニールパックと、判定用白紙カードと、説明書とがプラスチックケースに収納された携帯型の診断キットであることを特徴とする請求項１から請求項７までのいずれかの項に記載のカンキツグリーニング病の診断キット。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案はヨウ素・デンプン反応を利用したカンキツグリーニング病の迅速簡易な診断方法に関し、特に、誰でも簡単に、かつ短時間診断を行なうことができるカンキツグリーニング病の診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定重要病害であるカンキツグリーニング病（以下ＨＬＢ）は、現在、沖縄県および鹿児島県の一部地域で発生が確認されている。
【０００３】
沖縄県では１９８８年に西表島で初めて本病の発生が確認され、その後１９９９年までに南北大東島を除く地域に発生が拡大した。
【０００４】
ＨＬＢ病原菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）は師部局在の難培養性細菌であり、ミカンキジラミ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ  ｃｉｔｒｉ  Ｋｕｗａｙａｍａ）によって媒介される。
【０００５】
発病樹は、葉が黄化し樹勢衰弱して収量低下および果実品質の低下をもたらすことから、日本本土へと発生域の拡大が進むと、わが国のカンキツ産地に多大な被害を及ぼすことが懸念されている。
【０００６】
本病への有効な登録薬剤がない現在、防除対策は、初期発生での罹病樹の伐採除去が重要な手段である。
【０００７】
沖縄県では１９９７年から特定重要病害虫特別対策事業によりＨＬＢ発生状況の全県一斉調査、並びに防除伐採指導、啓発普及などの総合的な防除対策を行っている。
【０００８】
ＨＬＢ感染葉の病徴は、要素欠乏症や生理障害と類似し、肉眼による識別が困難であるため、発生調査では主にＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法）による遺伝子検定が行われている。
【０００９】
ＰＣＲ法は、精度の高い優れた検定法であるが、核酸抽出やＰＣＲ時のサーマルサイクラーの能力等により１日あたりの検定数が制限され、県全域より持ち込まれる大量のサンプルを短期間で処理することが困難となっている。
【００１０】
また、設備や試薬コストが高く、技術者の熟練が要求されるため、限られた研究機関でしか診断できない。
【００１１】
そのため、迅速な診断結果が得られず、伐採防除までに時間を要することから、罹病樹を長期間放置することもあった。
【００１２】
よって効率的に伐採を行うための迅速で簡易な診断技術の開発が急務となっている。
【００１３】
ＨＬＢ感染葉には、柵状組織内において特徴的に多量のデンプンが蓄積する。
【００１４】
その性質に着目し、ヨウ素デンプン反応を利用した簡易検定法が開発されている（実用新案登録第３１１７９０５号公報）。
【００１５】
この方法は、感染葉を細断、粉砕、煮沸して葉内のデンプンを抽出し、その後上清にヨウ素溶液を添加して発色の度合いにより罹病の有無を判定するもので、ＰＣＲ法や生物検定に比べ簡易に診断できる。
【特許文献１】実用新案登録第３１１７９０５号公報
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【００１６】
しかし、前記の実用新案登録第３１１７９０５号公報では、試料の細断とチューブ内での粉砕、１０分間の煮沸、マイクロプレートへの上清液の注入等に時間と手間を要し、１葉あたり２０分以上の検定時間がかかる。
【００１７】
また、発色（青〜藍色）の違いによる目視での判定が難しいことや器具類が多い理由で現場機関での普及には至っておらず、さらなる迅速化および簡易化が求められている。
【００１８】
本考案は、従来法と比べより迅速かつ簡易性を備え、誰でも圃場でカンキツグリーニング病の診断ができるカンキツグリーニング病の診断キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記の問題を解決するために、本考案の請求項１は、サンドペーパーで葉表面を擦ることにより、罹病葉内に多量に蓄積するデンプンを抽出し、ヨウ素溶液と反応させ、染色の有無でカンキツグリーニング病の診断を行なうための診断キットであり、少なくとも、サンドペーパーと、ヨウ素溶液と、前記の抽出したデンプンを含むサンドペーパーとヨウ素溶液を反応させるための反応容器とで構成されるカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００２０】
該サンドペーパーは、耐水製であれば良く、好ましくは、耐水性サンドペーパーが良い。
【００２１】
該ヨウ素溶液は、ヨウ素デンプン反応により、サンドペーパーに付着したデンプンが染色されるものであれば良く、市販されるヨウ素溶液が使用できる。
【００２２】
該反応容器は、サンドペーパーが収納でき、ヨウ素デンプン反応を視認できるものであればいずれでも良く、各種形状の容器や、トレー、袋、試験管などでも良い。
【００２３】
また、本考案の請求項２は、前記の診断キットに、サンドペーパーに付着したデンプンを溶出させるための水が加えられていることを特徴とするカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００２４】
該水は、水道水、蒸留水などを小型容器に入れて用いて良い。
【００２５】
また、本考案の請求項３は、前記のサンドペーパー目の粗さは、粒度が１００番〜１４０番であることを特徴とするカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００２６】
粒度の番号が大きいと、目が細かすぎて、葉の表面を擦り取れず、粒度が小さいと粗すぎて葉の表面を削れるが、サンドペーパーに付着しにくい。
【００２７】
また、本考案の請求項４は、前記のサンドペーパーは、小片にカットしやすいように、ミシン目が設けられていることを特徴とするカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００２８】
サンプルとして必要量を擦り取れればよいので、１ｃｍから２ｃｍ程度のサイズに手で簡単に千切れると良い。
【００２９】
また、本考案の請求項５は、前記のヨウ素溶液は、０．０１Ｍ〜０．５Ｍであることを特徴とするカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００３０】
ヨウ素濃度が高いと、染色が濃いので、判別が難しくなり、ヨウ素濃度が薄いと染色が薄すぎて、やはり判別が困難となる。
【００３１】
０．０５Ｍ程度が最も好ましい。
【００３２】
また、本考案の請求項６は、前記のヨウ素溶液を反応させるための反応容器は、透明な袋体であることを特徴とするカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００３３】
該袋体は、染色反応が容易に確認できる透明な袋であればいずれでも良く、ビニールパックなどが好ましい。
【００３４】
また、本考案の請求項７は、前記の染色反応は、黄色または橙色では陰性、こげ茶または黒色では陽性と判断されることを特徴とするカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００３５】
健康葉と罹病葉でのデンプン量は５〜６倍の違いがあり、十分に識別が可能であり、染色見本をつけることが好ましい。
【００３６】
また、本考案の請求項８は、前記の診断キットは、粒度が１２０番でサイズが１ｃｍ×２ｃｍの耐水性サンドペーパーと、０．０５Ｍのヨウ素溶液入りボトルと、水入りボトルと、ビニールパックと、判定用白紙カードと、説明書とがプラスチックケースに収納された携帯型の診断キットであることを特徴とするカンキツグリーニング病の診断キットである。
【００３７】
該ヨウ素溶液と水を入れるボトルは、滴下しやすい、点滴容器などが好ましい。
【００３８】
該判定用白紙カードは、染色を確認しやすくするためにバックグラウンドを白色にできるものであればいずれでも良く、紙製やプラスチック製などでも良い。
【００３９】
該説明書は、本カンキツグリーニング病の診断方法をわかりやすく記載し、染色見本などを示して罹病を判定しやすくするものであり、図解などが好ましい。
【００４０】
該収納ケースは、取り扱いがしやすく、持ち運びに便利なように、開閉蓋が設けられ、すべてが収納できるものであれば良く、市販の箱型プラスチックケースなどでも良く、取手が設けられたものでも良い。
【考案の効果】
【００４１】
本考案は以下の効果がある。
【００４２】
１）サンドペーパーで葉の表面から擦ることで、葉の切断や煮沸などを必要とせずに、簡単に、かつ容易に葉の表面のデンプンを採取できる。
【００４３】
２）染色反応をビニールパック内で行なうことができ、簡単で容易に視認しやすい。
【００４４】
３）反応の判別は、黄色または橙色では陰性、こげ茶または黒色では陽性と判断されるため、識別が容易で誰でも診断できる。
【００４５】
４）本考案により、カンキツ産地における圃場でのカンキツグリーニング病の罹病診断が１検体あたり約２分でできるようになる。
【００４６】
５）本診断法の１検体にかかる費用はＰＣＲの１／２０であり、従来法の１／２であり、より低コストとなる。
【００４７】
６）１日の処理量は、ＰＣＲの約２０倍、従来法の約５倍と短時間で大量の診断が可能となる。
【００４８】
７）該診断キットの活用により、誰でも簡単に圃場で診断ができるため、迅速な判定結果が得られ、伝染源となる罹病樹を長期間を放置することなく、迅速に伐採防除が実施できる。
【００４９】
８）罹病樹の早期発見と除去によって、病気の蔓延と被害を最小限に抑え、収量・収益が安定することにより、カンキツの産地形成と維持に大きく貢献できる。
【考案を実施するための最良の形態】
【００５０】
従来、ヨウ素デンプン反応による診断精度を裏付けるための健全葉と罹病葉における葉内デンプンの定量比較については、これまでほとんど検討がなされていなかった。
【００５１】
そこで、本発明者らは、はじめにＨＬＢ感染葉と健全葉との詳細な葉内デンプン含量の定量比較を行い、その結果を基に新たなカンキツグリーニング病（ＨＬＢ）の迅速簡易診断法（スクラッチ法）を考案し、その診断キットを完成するに至ったものである。
【００５２】
本考案の実施の形態について図面を用いて説明する。
【００５３】
図１は、代表的なカンキツ類における健全葉とカンキツグリーニング病の感染葉におけるデンプン含量の比較を示す図である。
【００５４】
この図からわかるように、感染葉のデンプン含量は、シークァーサーにおいては、健全葉の５倍、ポンカンにおいては、健全葉の３倍、オートーにおいては、２５倍であり、トータルでは、５倍となっており、カンキツグリーニング病の罹病葉は、葉の組織に健全葉の５倍ものデンプンが異常に蓄積されることがわかる。
【００５５】
図２は、本考案によるカンキツグリーニング病の診断キットの実施例を示す図である。
【００５６】
（１）は、キットの内容を示す図であり、（２）はケースに収納した状態を示す図である。
【００５７】
本診断キットは、罹病葉の表面からデンプンを擦り取るための耐水性サンドペーパー４と、該サンドペーパー４に付着したデンプンを溶出させるための容器入りの水６と、容器入りのヨウ素溶液５と、染色反応させるためのビニールパック７と、染色状態を視認しやすくするための判定用白紙カード３と、本診断キットの使用方法が記載された説明書２で構成され、（２）に示すように、収納容器１内に収納されて提供される。
【００５８】
該耐水性サンドペーパー４は、１ｃｍ×２ｃｍのサイズにちぎって使用できるように、ミシン目処理が施されている。
【００５９】
粒度は、１２０番であり、１枚で２１枚切りである。
【００６０】
また、ヨウ素溶液の入った容器５は、光をさえぎるために褐色容器が用いられており、２０ｍｌ入りである。
【００６１】
水６は３０ｍｌとした。
【００６２】
また、ビニールパック７は、４ｃｍ×６ｃｍサイズで密封できるジッパー付きを用い、２０枚入りである。
【００６３】
判定用白紙カード３は、５ｃｍ×１０ｃｍの白色の厚紙を用いた。
【００６４】
説明書４は、Ａ４サイズの１／４を四つ折りしたものである。
【００６５】
収納ケース１は、上部に開閉蓋が設けられた箱型のプラスチックケースであり、（２）の１ｂに示すように、裏面には、カンキツグリーニング病の罹病葉の説明が記載されている。
【００６６】
このように構成されたカンキツグリーニング病の診断キットは以下のように診断を行なう。
【００６７】
図３に示す。
【００６８】
Ｓ−１）罹病葉の表皮組織採取
はじめに、１×２ｃｍにカットしたサンドペーパーで、罹病葉の表面を２０〜３０回程度擦る。
【００６９】
葉が破れない程度の強さで表面を削るように擦る。
【００７０】
サンドペーパーの１／３に表皮組織をしっかり付着させる。
【００７１】
Ｓ−２）デンプン溶出
表皮組織が付着したサンドペーパーをビニールパックに入れ、水を６滴（約１ｍｌ）入れる。
【００７２】
サンドペーパーに付着した表皮組織を水に馴染ますように数回揉む。
【００７３】
Ｓ−３）ヨウ素溶液添加
ビニールパック内の表皮組織中のデンプンが溶けた溶液に、ヨウ素溶液を１滴添加する。
【００７４】
Ｓ−４）判  定
判定は判定用白紙の上で水溶液の染色の有無を確認する。
【００７５】
図４に示すように、陰性では黄色またはオレンジ色となり、陽性ではこげ茶または黒色に水溶液が染色される。
【００７６】
本実施例によるスクラッチ法によるＨＬＢ診断では、１葉あたり約２分で診断が可能であった。
【００７７】
図５は、本考案によるスクラッチ法によるＨＬＢ診断と、従来のＰＣＲ法によるＨＬＢ診断との比較表を示す図である。
【００７８】
（１）は、圃場内でのシークァーサーにおける罹病葉が３８葉と、健全葉が４０葉に対して、スクラッチ法とＰＣＲ法の比較を行なった結果を示す。
【００７９】
本考案によるスクラッチ法とＰＣＲ法との一致率は、罹病葉で９４．７％、健全葉では、１００％であった。
【００８０】
（２）は、タンカン農園における現地での診断結果を示すものであり、うるま市のタンカン農園における樹木が２４本で葉が７８葉の場合と、石垣市のタンカン農園における樹木が７本で葉が２０葉に対して、スクラッチ法とＰＣＲ法の比較を行なった結果を示す。
【００８１】
本考案によるスクラッチ法とＰＣＲ法との一致率は、うるま市のタンカン農園の場合は、樹木では９１．７％、葉では９６．２％であり、石垣市のタンカン農園の場合は、樹木では１００％、葉で９０．０％であった。
【００８２】
このように、本考案によるカンキツグリーニング病の診断キットを用いたＨＬＢ診断では、従来のＰＣＲ法との一致率がいずれも９０％以上であり、症状のある葉においては、検出率が高く、従来法と比べて同等の精度を有するものと思われ、かつ、１葉につき、僅かに２分程度で診断を行なうことができるものである。
【００８３】
図６は、本考案によるスクラッチ法によるＨＬＢ診断と、従来法（実用新案登録第３１１７９０５号公報による（田場ら、２００３））のＨＬＢ診断と、ＰＣＲ法による診断との診断費用、診断時間、診断量についての比較表を示す図である。
【００８４】
この表からも明らかなように、本考案によるスクラッチ法によるＨＬＢ診断は、１検体コストにおいては、ＰＣＲ法の約１／２０であり、従来法の１／２となる。
【００８５】
また、１日の処理量においては、ＰＣＲ法の約２０倍、従来法の約５倍の処理が可能であることがわかる。
【００８６】
また、１葉の診断に要する時間においては、ＰＣＲの１／１９５であり、従来法の１／２となる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】健全葉とカンキツグリーニング病の感染葉におけるデンプン含量の比較を示す図である。
【図２】本考案によるカンキツグリーニング病の診断キットの実施例を示す図である。
【図３】本考案によるカンキツグリーニング病の診断キットの診断手順を示す図である。
【図４】本考案の診断キットによる判定状況を示す図である。
【図５】本考案によるスクラッチ法によるＨＬＢ診断と、従来のＰＣＲ法によるＨＬＢ診断との比較表を示す図である。
【図６】スクラッチ法と、従来法と、ＰＣＲ法とにおける診断費用、診断時間、診断量の比較表を示す図である。
【符号の説明】
【００８８】
１  収納ケース
２  説明書
３  判定用白紙カード
４  耐水性サンドペーパー
５  容器入りヨウ素溶液
６  容器入り水
７  ビニールパック
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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