【手続補正書】
【提出日】平成18年4月11日(2006.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
該回収ＤＮＡ断片を、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法に従ってクローニングベクターに連結し、大腸菌、例えばE. coli DH5α株（東洋紡より購入可能）を形質転換する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
該微生物の具体例として、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichiacoli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Pseudomonas sp. D-0110、Agrobacterium radiobacter、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubi、Anabaena cylindrica、Anabaena doliolum、Anabaena flos-aquae、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globformis、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter mysorens、Arthrobacter nicotianae、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter protophormiae、Arthrobacter roseoparaffinus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter ureafaciens、Chromatium buderi、Chromatium tepidum、Chromatium vinosum、Chromatium warmingii、Chromatium fluviatile、Erwinia uredovora、Erwinia carotovora、Erwinia ananas、Erwinia herbicola、Erwinia punctata、Erwinia terreus、Methylobacterium rhodesianum、Methylobacterium extorquens、Phormidium sp. ATCC29409、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodopseudomonas blastica、Rhodopseudomonas marina、Rhodopseudomonas palustris、Rhodospirillum rubrum、Rhodospirillum salexigens、Rhodospirillum salinarum、Streptomyces ambofaciens、Streptomyces aureofaciens、Streptomyces aureus、Streptomyces fungicidicus、Streptomyces griseochromogenes、Streptomyces griseus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivogriseus、Streptomyces rameus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces vinaceus、Zymomonas mobilis等をあげることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
上記方法で取得したＤＩＧ標識ＤＮＡ断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法によるスクリーニングをしたところ、２種類のＤＮＡ断片が検出された。各々をシークエンスしたところ、それぞれのＤＮＡ断片から他生物種の既知ＤＸＳ遺伝子と相同性の高いＯＲＦが見出された。配列番号２６に示すアミノ酸配列をＤＸＳ１、配列番号２８に示すアミノ酸配列をＤＸＳ２と命名した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
（２） ｙａｅＭ遺伝子産物の活性測定
(i)ｙａｅＭ遺伝子産物の精製
（１）で作成したpQEDXRを常法によりpREP4を有するE. coli M15株(QIAGEN社製)に導入し、アンピシリン200μg/ml、カナマイシン25μg/mlに耐性を示すM15/pREP4+pQEDXR株を得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
(ii) 基質１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸の調製
反応基質である１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸は以下のようにして調製した。１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸の検出は、ＨＰＬＣ〔カラム：Senshu pak NH2-1251-N(4.6 x 250mm、Senshu社製)、移動層：１００ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ３．５）〕によって１９５ｎｍの吸光度を測定する方法で行った。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
大腸菌のｄｘｓ遺伝子を高発現するプラスミドpQDXS-1を上記と同様にE.coli M15/pREP4株に導入し、M15/pREP4+pQDXS-1株を得た。該株を実施例８（２）(i)と同様に培養し、Ni-NTAレジンカラムを用いてｄｘｓ酵素蛋白質を精製した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
(iii) yaeM遺伝子産物の酵素活性測定
１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨと実施例８（２）(i)で得たｙａｅＭ遺伝子産物を含む反応液１ｍｌに、上記のように合成した１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸０．３ｍＭ（終濃度）を加え、３７℃でインキュベートした。インキュベート中のＮＡＤＰＨの増減を３４０ｎｍの吸光を分光光度計(UV-160、島津社製)で測定する方法で追跡したところ、経時的にＮＡＤＰＨが減少することが分かった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
(iv) １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼの性質
実施例８（２）(iii)に記した１ｍｌ反応系を用いて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼの酵素学的性質を調べた。なお１ｕとは１分間に１ｍｍｏｌのＮＡＤＰＨを酸化する活性と定義する。ＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに置換した場合、活性は１／１００以下に低下した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
実施例８（２）(iii)に示した反応系を０．２ｍｌにスケールダウンした系（各濃度は同じ）に各種濃度のフォスミドマイシンを添加し、３７℃でインキュベートし、ＮＡＤＰＨの増減をベンチマークマイクロプレートリーダー（バイオラド社製）を用いて測定した。