(57)【要約】  培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法であって、培養細胞分散液は、培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含み、培養細胞分散液中の培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、培養細胞分散液中のセルロースナノファイバーの含有量が培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞の回収方法、および培養細胞分散液が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法であって、
前記培養細胞分散液は、前記培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含み、
前記培養細胞分散液中の前記培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
前記培養細胞分散液中の前記セルロースナノファイバーの含有量が前記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
前記培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞の回収方法。
ここで、スフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔは、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた割合である。
Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ−Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ            （１）
【請求項２】
前記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、請求項１に記載の培養細胞の回収方法。
【請求項３】
前記沈降工程の前に、さらに、
種細胞として細胞を播種する播種工程と、
前記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備え、
前記播種工程において、播種された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む播種細胞分散液の細胞数分布が１．０％以上５０％以下である、請求項１または２に記載の培養細胞の回収方法。
ここで、細胞数分布Ｎｄｉｓｔ（％）は、前記播種細胞分散液から１０箇所サンプリングして測定した播種細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数の最大値Ｎｍａｘ（個）、最小値Ｎｍｉｎ（個）および算術平均値Ｎａｖｇ（個）から、下記式（２）によって求めたパーセンテージである。
Ｎｄｉｓｔ（％）＝｛（Ｎｍａｘ−Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ｝×１００（％）          （２）
【請求項４】
前記沈降工程の前に、さらに、
種細胞として細胞を播種する播種工程と、
前記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備え、
前記培養工程において、浮遊培養される細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーとを含む浮遊細胞分散液に０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養細胞の回収方法。
ここで、温度数分布Ｔｄｉｆｆ（℃）は、浮遊細胞分散液の液温の最高値Ｔｍａｘ（℃）および最低値Ｔｍｉｎ（℃）から、下記式（３）によって求めた温度差である。
Ｔｄｉｆｆ（℃）＝Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ（℃）          （３）
【請求項５】
前記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養細胞の回収方法。
【請求項６】
前記細胞が幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養細胞の回収方法。
【請求項７】
培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む培養細胞分散液であって、
前記培養細胞分散液中の前記細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
前記培養細胞分散液中の前記セルロースナノファイバーの含有量が前記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
前記細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞分散液。
ここで、前記スフェロイドの直径の分布は、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた値Ｄｄｉｓｔである。
Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ−Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ            （１）
【請求項８】
前記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、請求項７に記載の培養細胞分散液。
【請求項９】
前記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、請求項７または８に記載の培養細胞分散液。
【請求項１０】
前記細胞が幹細胞である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の培養細胞分散液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞の回収方法および培養細胞分散液に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を培養する際の足場材料として、セルロースナノファイバー等のナノファイバーを用いることが知られている。
例えば、特許文献１には、間葉系幹細胞をセルロースナノファイバー等の天然物由来の多糖類が分散されてなる細胞培養液の中に液中を漂うように分散させることにより、培養液を凍結させることなく、培養条件下で間葉系幹細胞の分化を抑制し、そして望みの一定期間、初期状態を維持し保存することができること、および、セルロースナノファイバー等のナノファイバーの形態にある多糖類といった天然物由来の多糖類を用いることにより、一般的な細胞回収方法により、培養液からの間葉系幹細胞の回収が可能であり、間葉系幹細胞の再利用が可能となることが記載されている（［００１１］）。
また、特許文献２には、ヒドロゲルまたは膜の形態の植物由来の機械的に崩壊させたセルロースナノファイバーおよび／またはその誘導体を含む細胞培養または細胞送達組成物が記載され、さらに、細胞を提供する工程、細胞をこの細胞培養または細胞送達組成物と接触させ、マトリックスを形成する工程、およびそのマトリックス内で三次元または二次元の配置で細胞を培養する工程を含む細胞を培養する方法、ならびに、細胞培養培地および細胞を含む材料を提供する工程、細胞培養材料を分解酵素と接触させる工程、細胞および細胞凝集体を沈降させるために材料を遠心する工程、およびデカンテーションによりセルロースナノファイバーを除去する工程を含む、細胞培養材料から植物ベースのセルロースナノファイバーおよび／またはその培養体を除去する方法が記載されている（特許請求の範囲）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１１１７３４号
【特許文献２】特表２０１３−５４１９５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の培養細胞の回収方法では、浮遊培養した細胞を遠沈処理にかけ、沈降させた細胞を回収していた（特許文献１、特許文献２）。
しかし、遠沈処理時に細胞にかかる遠心加速度によって細胞が潰されてダメージを受けるため、細胞増殖率および細胞沈降率を両立できないことが問題となっていた。
また、遠沈処理を行うために、培養により得られた細胞分散液を希釈する必要があるなど、煩雑な操作を要する工程が増加することによって、培養コストが上昇する等の不利益があった。【０００５】
そこで、本発明は、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞増殖率および細胞沈降率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができる培養細胞の回収方法、および、この回収方法に用いる培養細胞分散液を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、培養を終了した培養細胞分散液中のセルロースナノファイバー含有量、細胞数、およびスフェロイドの直径分布をいずれも所定の範囲にすると、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞の増殖率および回収率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができることを知得し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明は次の［１］〜［１０］を提供する。
［１］培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法であって、
上記培養細胞分散液は、上記培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含み、
上記培養細胞分散液中の上記培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
上記培養細胞分散液中の上記セルロースナノファイバーの含有量が上記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
上記培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞の回収方法。
ここで、スフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔは、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた割合である。
Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ−Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ            （１）
［２］上記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、上記［１］に記載の培養細胞の回収方法。
［３］上記沈降工程の前に、さらに、
種細胞として細胞を播種する播種工程と、
上記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備え、
上記播種工程において、播種された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む播種細胞分散液の細胞数分布が１．０％以上５０％以下である、上記［１］または［２］に記載の培養細胞の回収方法。
ここで、細胞数分布Ｎｄｉｓｔ（％）は、上記播種細胞分散液から１０箇所サンプリングして測定した播種細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数の最大値Ｎｍａｘ（個）、最小値Ｎｍｉｎ（個）および算術平均値Ｎａｖｇ（個）から、下記式（２）によって求めたパーセンテージである。
Ｎｄｉｓｔ（％）＝｛（Ｎｍａｘ−Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ｝×１００（％）          （２）
［４］上記沈降工程の前に、さらに、
種細胞として細胞を播種する播種工程と、
上記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備え、
上記培養工程において、浮遊培養される細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーとを含む浮遊細胞分散液に０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与する、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の培養細胞の回収方法。
ここで、温度数分布Ｔｄｉｆｆ（℃）は、浮遊細胞分散液の液温の最高値Ｔｍａｘ（℃）および最低値Ｔｍｉｎ（℃）から、下記式（３）によって求めた温度差である。
Ｔｄｉｆｆ（℃）＝Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ（℃）          （３）
［５］上記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の培養細胞の回収方法。
［６］上記細胞が幹細胞である、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の培養細胞の回収方法。
［７］培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む培養細胞分散液であって、
上記培養細胞分散液中の上記細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
上記培養細胞分散液中の上記セルロースナノファイバーの含有量が上記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
上記細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞分散液。
ここで、上記スフェロイドの直径の分布は、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた値Ｄｄｉｓｔである。
Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ−Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ            （１）
［８］上記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、上記［７］に記載の細胞分散液。
［９］上記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、上記［７］または［８］に記載の細胞分散液。
［１０］上記細胞が幹細胞である、上記［７］〜［９］のいずれか１つに記載の細胞分散液。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞増殖率および細胞沈降率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができる培養細胞の回収方法、および、この回収方法に用いる培養細胞分散液を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
まず、本発明の従来技術に対する有利な点および作用効果を奏するメカニズムを説明する。
従来の培養細胞の回収方法では、浮遊培養により得られた細胞分散液を遠沈処理にかけて培養した細胞を沈降させ、細胞を回収していた。そのため、遠沈処理を行う従来の培養細胞の回収方法では、遠沈処理の際に細胞にかかる遠心加速度によるダメージが大きく、遠沈処理の前後における細胞の死亡率が高かった。
これに対して、本発明の培養細胞の回収方法では、浮遊培養時に細胞に浮力を与えていたセルロースナノファイバーのネットワークを、軽い衝撃等を与えるだけで崩壊せしめ、培養された細胞（細胞塊（スフェロイド）を含む。）を沈降させることができるので、遠沈処理によらず細胞を沈降させることができ、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制するとともに、煩雑な回収操作を簡略化することができる。
【００１０】
従来の培養細胞の回収方法では、培養中の細胞分散液を撹拌することにより、培養された細胞が沈降することを防止し、浮遊培養を維持していた。
これに対して、本発明の培養細胞の回収方法では、浮遊培養時にセルロースナノファイバーのネットワークが細胞に浮力を与えるため、培養中の細胞分散液を撹拌することなく、浮遊培養を維持することができる。
【００１１】
また、スフェロイドの直径が所定の分布を持つことにより、スフェロイドの中心部まで細胞増殖に必要な酸素および栄養分が十分に届き、細胞増殖率の向上に有利な直径が小さなスフェロイドと、セルロースナノファイバーのネットワークに衝突して、これを崩壊せしめ、細胞沈降率の向上に有利な直径が大きなスフェロイドと、の両方を単一の培養容器中の形成することができ、細胞増殖率および細胞沈降率を向上させることができる。
【００１２】
以下では、セルロースナノファイバーをＣＮＦ（cellulose nanofiber）という場合がある。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、「ａ〜ｂ」（ここで、ａおよびｂはある数値（実数）を表し、かつ、ａ＜ｂであるとする。）という範囲には、ａおよびｂを含む。
【００１３】
［培養細胞の回収方法］
以下、本発明の培養細胞の回収方法を詳細に説明する。
本発明の培養細胞の回収方法は、培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法である。
また、本発明の培養細胞の回収方法においては、培養細胞分散液は、培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む。
さらに、本発明の培養細胞の回収方法においては、培養細胞分散液中の培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、培養細胞分散液中のセルロースナノファイバーの含有量が培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である。
【００１４】
〈沈降工程〉
沈降工程を詳細に説明する。
沈降工程では、培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から、培養された細胞を沈降させる。
【００１５】
《培養終了した単一培養容器》
培養終了した単一培養容器とは、細胞の培養が終了した状態の培養容器であって、培養終了時から内容物に意図的な改変が加えられていない培養容器をいう。具体的には、培養終了時から内容物が変更されていない単一の培養容器をいい、培養が終了した複数の培養容器の内容物を混合した培養容器をいうものではない。
本発明の培養細胞の回収方法では、培養終了した単一の培養容器をそのまま沈降処理に適用する。
培養終了した単一培養容器を用いることによって、培養終了時のスフェロイドの直径の分布およびセルロースナノファイバーのネットワークが壊されることがないので、簡単な沈降操作で細胞を沈降させることができ、高い細胞沈降率を達成することができる。
【００１６】
《培養細胞分散液》
培養細胞分散液は、培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む。
【００１７】
（培養された細胞）
培養細胞分散液に含まれる培養された細胞とは、上記培養容器中で培養された細胞である。
【００１８】
培養細胞分散液に含まれる培養された細胞の総数は５．０×１０７個以上であれば特に限定されないが、好ましくは５．０×１０８個以上５．０×１０１２個以下であり、より好ましくは５．０×１０９個以上５．０×１０１２個以下である。
細胞の総数が５．０×１０７個未満では、所定のスフェロイドの直径の分布を達成し難く、僅かな衝撃等によってＣＮＦのネットワークに培養した細胞が十分に沈降するだけの欠陥を生じさせることができず、良好な細胞沈降率を達成することができない。また、細胞の総数が５．０×１０１２個以下であると、細胞に十分な酸素を供給することができ、細胞増殖率がより向上する。
【００１９】
培養細胞分散液中の細胞の総数を５．０×１０７個以上とするには、浮遊培養持に細胞分散液の内部まで酸素を拡散させることが望ましい。酸素の拡散は細胞分散液中の拡散が律速のため、細胞分散液に温度勾配を形成させ、僅かな対流を起こし酸素拡散を行うことが好ましい。細胞分散液を撹拌すると、ＣＮＦのネットワークが崩れ、浮遊培養中に細胞が沈降してしまい、細胞に十分な酸素が供給されず、細胞増殖率が低下する。
このため、培養工程において、浮遊細胞分散液（培養工程において、浮遊培養している細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に温度分布を付与することが好ましい。
なお、浮遊細胞分散液に温度分布を付与することについては、培養工程の説明において詳細を記載する。
【００２０】
細胞は、特に限定されず、種々の細胞を含み得る。
細胞の由来は、特に限定されないが、好ましくは動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。
細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは幹細胞であり、より好ましくは胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」という場合がある。：ＥＳ，embryonic stem）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（以下「ｉＰＳ細胞」という場合がある。：ｉＰＳ，induced pluripotent stem）からなる群から選択される少なくとも１つである。
細胞の由来および種類は、特に限定されないが、好ましくはヒト幹細胞であり、より好ましくはヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）、ヒト体性幹細胞、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群から選択される少なくとも１つである。
幹細胞は未分化のため、スフェロイドを形成し易く、細胞増殖率と細胞沈降率とを両立しやすいからである。
【００２１】
体性幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、衛星細胞、腸管幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内皮幹細胞、嗅粘膜幹細胞、神経冠幹細胞、および精巣細胞などが挙げられ、好ましくは間葉系幹細胞である。
また、ヒト体性幹細胞としては、例えば、ヒト造血幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、ヒト衛星細胞、ヒト腸管幹細胞、ヒト毛包幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト内皮幹細胞、ヒト嗅粘膜幹細胞、ヒト神経冠幹細胞、およびヒト精巣細胞などが挙げられ、好ましくはヒト間葉系幹細胞である。
【００２２】
いろいろな型の細胞分化可能で、治療に活用され得る間葉系幹細胞は、通常、生体から採取し、選別し、そして純化したものを陥る。本発明の回収方法において使用できる間葉系幹細胞としては、患者から直接採取される臨床用の初代ヒト間葉系幹細胞ばかりでなく、試験研究用に用い得る細胞バンクより入手できる間葉系幹細胞、および不死化された間葉系幹細胞株も挙げられる。
当業者であれば既知のとおり、これらの間葉系幹細胞は、臨床上の適用の観点から捉えると、自家ソース由来、異種異系ソース由来、または異種間ソース由来のいずれの細胞であってもよい。また、採取源は、ドナー骨髄、組織生検、胚性ソース、または出生後ソースなどのいずれの採取源であってもよい。具体的には、腸骨稜の骨髄、大腿頸骨、脊椎、肋骨、もしくはその他の骨髄腔由来、または胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児または青年期の皮膚、および血液を含む組織生検由来などの採取源が挙げられる。
【００２３】
ｉＰＳ細胞としては、例えば、国際公開第２０１５／０３７５３５号、特許第５５９０６４６号公報、国際公開第２０１１／０４３４０５号、国際公開第２０１３／０７７４２３号、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００５０］〜［００６１］）に記載されたｉＰＳ細胞を使用することができる。
【００２４】
なお、沈降工程における「培養された細胞」、後述する播種工程における「播種された細胞」および種細胞としての「細胞」、ならびに後述する培養工程における「浮遊培養される細胞」および種細胞から浮遊培養する「細胞」は、いずれも、上記した細胞であってよい。
【００２５】
培養細胞分散液中の培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布は０．１０以上３．０未満である、
【００２６】
スフェロイドの直径の分布は、０．１０以上３．０未満であれば特に限定されないが、好ましくは０．２０以上２．１以下であり、より好ましくは０．３０以上１．０以下である。
スフェロイドの直径の分布が０．１０未満では僅かな衝撃等によってはＣＮＦのネットワークを破壊できず細胞沈降率が低下する。また、スフェロイドの直径の分布が３．０以上では培養中にネットワークが破壊され浮遊培養できず細胞増殖率が低下する。なお、培養終了した単一培養容器中とは、細胞の培養を終了した後に複数の培養容器からの培養細胞分散液を混合したものではなく、培養終了時の単一の培養容器内の培養細胞分散液を意味する。
【００２７】
直径が大きなスフェロイドと、直径が小さなスフェロイドとの両方が存在する（スフェロイド径分布を付与）ことで、高い細胞増殖率および高い細胞沈降率を両立できる。
直径が大きなスフェロイドが存在すると、ＣＮＦのネットワークを壊し易く、細胞沈降率が向上する。僅かな振動で直径が大きなスフェロイドが動き、ＣＮＦのネットワークを破壊するためである。
一方、直径が大きなスフェロイドは内部に酸素が浸透し難く、細胞増殖率が低下し易い上、ＣＮＦのネットワークは数か所破壊されれば連鎖的に崩壊するため、直径が大きなスフェロイドは少量あればよい。
直径が小さなスフェロイドは、細胞沈降率を向上させ難いが、細胞増殖率を高くすることができるため、これも存在させることが必要である。スフェロイドの表面積が大きく、培養液から酸素等を取り込み易いためである。
したがって、本発明では、直径が大きなスフェロイドと、直径が小さなスフェロイドとが両方存在し、スフェロイドの直径の分布が所定範囲内となることが必要である。
【００２８】
また、スフェロイドの平均直径は、特に限定されないが、好ましくは５０μｍ以上８００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１５０μｍ以上６００μｍ以下である。
スフェロイドの平均直径がこの範囲内であると、直径の大きなスフェロイド（「大スフェロイド」という場合がある。）の中心部の細胞に十分な栄養および酸素が供給され、細胞増殖率が向上するとともに、大スフェロイドがＣＮＦのハイドロゲルネットワークを容易に破壊することができ、細胞沈降率が向上する。
また、スフェロイドの平均直径を調節する方法は、特に限定されないが、例えば、ＣＮＦのカルボキシ基含有量を調整することによって調節することができる。ＣＮＦ表面のカルボキシ基により、細胞が集合し易く、大スフェロイドを形成し易いためである。すなわち、ＣＮＦのカルボキシ基含有量が少ないとスフェロイドの平均直径は小さくなり、カルボキシ基含有量が多いとスフェロイドの平均直径は大きくなる。
【００２９】
なお、スフェロイドの直径およびその分布は、以下の方法により求めたものである。
培養液に細胞を播種した後、温度  ３７℃、湿度  ９５％ＲＨ、二酸化炭素濃度  ５体積％で５日間培養する。培養により得られた細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入する。ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で観察し、スフェロイドの直径を任意に２０点計測する。直径の計測は、２０点のスフェロイドのそれぞれについて長辺および短辺を測定し、これらの算術平均値を各スフェロイドの直径Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３・・・Ｄ２０とする。こうして測定したスフェロイドの直径から、下記式によって２０点のスフェロイドの直径の算術平均値Ｄａｖｇおよびスフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔを算出する。
Ｄａｖｇ＝（Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３＋・・・＋Ｄ２０）／２０
Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ−Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ
ただし、Ｄｍａｘはスフェロイドの直径の最大値であり、Ｄｍｉｎはスフェロイドの直径の最小値である。
【００３０】
直径の大きなスフェロイド（以下「大スフェロイド」という場合がある。）は、例えば、播種工程において、播種細胞分散液（播種工程において、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に細胞数分布を付与すること、および／または、培養工程において、浮遊細胞分散液（培養工程において、浮遊培養している細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中のＣＮＦの含有量を所定範囲内として細胞に接着性を付与することによって、形成することができる。
なお、播種細胞分散液に細胞数分布を付与することについては、播種工程に関する説明を行う際に説明する。
直径の小さなスフェロイド（以下「小スフェロイド」という場合がある。）は、例えば、浮遊培養工程において、浮遊細胞分散液に温度分布を付与して、大スフェロイドを解体することによって、形成することができる。
なお、浮遊細胞分散液に温度分布を付与することについては、培養工程に関する説明を行う際に説明する。
大スフェロイドおよび小スフェロイドの形成によって、所定のスフェロイドの直径の分布を容易に達成することができる。
【００３１】
５．０×１０７個以上といった大量の細胞を、セルロースナノファイバーを含む培養液中で培養すると、上記したスフェロイドの直径の分布が発現し易い。
大スフェロイドの解体による小スフェロイドの形成は、確率的に発生するため、母集団、すなわち、細胞総数が大きいほど発生し易い。スフェロイドどうしの衝突によるものではないため、細胞総数を増加させることが好ましい。
細胞総数を増加させ、大量培養をするには、浮遊培養時に浮遊細胞分散液に温度分布を付与することが好ましい。温度分布の付与については後述する。
【００３２】
本発明では、複数の培養容器からの、スフェロイドの平均直径が大きな培養細胞分散液とスフェロイドの平均直径が小さな培養細胞分散液とを混合することによって、単一の培養容器内の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を所定の範囲内としても、優れた細胞沈降率を得ることはできない。培養終了した単一培養基内の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を所定の範囲内とすることによってはじめて、本発明は上記効果を奏する。すなわち、スフェロイドの直径の分布が、培養終了時に上記範囲内となっていることが、本発明の作用効果を奏するために肝要である。
別々の培養容器で培養して得られた、スフェロイドの平均直径が大きな培養細胞分散液とスフェロイドの平均直径が小さな培養細胞分散液とを混合しても、優れた細胞沈降率、すなわち高い回収率、を得られない理由は次の通り説明できる。
培養初期からスフェロイドの直径の分布を上記範囲内とすると、直径の大きなスフェロイドおよび直径の小さなスフェロイドが容器内で均一に分布し、培養終了後、軽衝撃等を与えてハイドロゲルのネットワークを崩す際、均一に壊れるため、培養した細胞を沈降させ易く、細胞沈降率が向上する。
一方、培養終了後に複数の培養細胞分散液を混合すると、直径の大きなスフェロイドおよび直径の小さなスフェロイドが不均一に分散され、ネットワークが均一に壊れず、ハイドロゲルの塊が残るため、培養した細胞を沈降させ難く、細胞沈降率が低下する。
【００３３】
（基礎培地成分）
培養細胞分散液に含まれる基礎培地成分とは、細胞を培養するために必要な栄養成分を意味する。細胞の培養中に栄養成分が消費されるため、培養開始時と培養終了時とでは、基礎培地成分の含有量は、通常、相違する。
培養開始時の基礎培地成分は、細胞の種類によって適宜選択することができるが、ヒト細胞を培養するための基礎培地成分を含む培地としては、例えば、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）と称する場合がある。）および／またはその変法培地などが挙げられる。ＥＭＥＭの変法培地として、例えば、ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium））が挙げられる。また、基礎培地成分を含む培地としては、これらの最小必須培地にビタミン、アミノ酸、およびグルコース等の成分を添加したものも含まれる。
【００３４】
（セルロースナノファイバー）
培養細胞分散液に含まれるセルロースナノファイバーは、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバー（以下、ＣＮＦ（cellulose nanofiber）という場合がある。）である。
【００３５】
ＣＮＦの平均直径は、２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であれば特に限定されないが、好ましくは３．０ｎｍ〜５０ｎｍ、より好ましくは４．０〜２０ｎｍである。
ＣＮＦの平均直径が２．０ｎｍ未満では、ＣＮＦのネットワーク構造が弱くなり過ぎ、後述する培養工程において、培養中の細胞の浮遊性が低下し、細胞増殖率が低下する。
これは、細胞を浮遊培養できなくなることによって、細胞の増殖に必要な酸素および栄養が十分に供給されず、細胞の増殖が抑制されるからである。
ＣＮＦの平均直径が１００ｎｍ超では、ネットワーク構造が強くなりすぎ、沈降工程において、僅かな衝撃等によってスフェロイドを沈降させ難く、細胞沈降率が低下する。
これは、僅かな衝撃等がトリガーとなって、直径が大きなスフェロイドがＣＮＦのネットワークに衝突し、ＣＮＦのネットワークを破壊して、浮力を失わせ、細胞を沈降させるためである。
【００３６】
ＣＮＦの平均直径は、その製造条件を調整することによって、調節することができる。
例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を細くすることができる。解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を太くすることができる。
また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の後に機械解砕し、解砕機の圧力および／または処理回数を調整することによって、ＣＮＦの平均直径を調節することができる。機械解砕でＣＮＦを製造する場合と同様、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができ、解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。
【００３７】
なお、ＣＮＦの平均直径は、以下の方法（特許第５５４４０５３号明細書を参照）により求めたものである。
ＣＮＦ濃度が０．００１質量％となるように希釈したＣＮＦ水分散液を調製する。このＣＮＦ分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥させて観察用試料を作成する。観察用試料をＡＦＭ（Atomic Force Microscope；原子間力顕微鏡）を用いて観察し、観察した形状像の断面高さを１０点計測する。１０点の計測値の算術平均値をＣＮＦの平均直径とする。
【００３８】
ＣＮＦの平均繊維長は、特に限定されないが、好ましくは０．２０μｍ以上２．０μｍ以下であり、より好ましくは０．３０μｍ以上１．５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．４０μｍ以上１．０μｍ以下である。
この範囲内であると、ＣＮＦのネットワークを崩すことがさらに容易となるため、細胞沈降率細胞をさらに向上させることができる。
なお、ＣＮＦの平均繊維長は、特表２０１３−５４１９５６号公報に記載された方法に従って測定することができる。
【００３９】
ＣＮＦの平均繊維長は、その製造条件を調整することによって、調節することができる。
例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕処理時のＣＮＦ分散液の温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、ＣＮＦ分散液の温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の際の処理温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、処理温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
【００４０】
ＣＮＦの含有量は、培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、好ましくは０．０２０質量％以上０．５０質量％以下、より好ましくは０．０３０質量％以上０．１０質量％以下である。
ＣＮＦの含有量を培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下の範囲内とすることで、僅かな衝撃等でネットワークに欠陥を発生させ易く、浮力が低下し、細胞沈降率を向上することができる。液培養細胞分散液中のＣＮＦの含有量が０．１０質量％未満では、ＣＮＦが培養した細胞に十分な浮力を与えるネットワークを形成することができず、良好な細胞増殖率を達成することができない。また、培養細胞分散液中のＣＮＦの含有量が１．０質量％超では、僅かな衝撃等によってＣＮＦのネットワークに培養した細胞が十分に沈降するだけの欠陥を生じさせることができず、良好な細胞沈降率を達成することができない。
なお、本発明において「良好な細胞沈降率」または「細胞沈降率が良好である」とは、培養終了後、培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞と培養液からなる分散液をいう。）に僅かな衝撃を与えるだけで細胞（スフェロイドを含む。）が沈降することをいう。
【００４１】
ＣＮＦは、カルボキシ基を含有することが好ましい。
ＣＮＦのカルボキシ基含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、より好ましくは０．７０ｍｍｏｌ／ｇ以上１．９ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、さらに好ましくは０．９０ｍｍｏｌ以上１．８ｍｍｏｌ／ｇ以下である。
ＣＮＦのカルボキシ基含有量がこの範囲内であると、ＣＮＦの細胞への吸着力が適度なものとなることにより、細胞相互の凝集を促進するため、直径の大きなスフェロイド（「大スフェロイド」という場合がある。）の形成をし易くし、かつ、温度勾配によって大スフェロイドをバラし易くなることにより、直径の小さなスフェロイド（「小スフェロイド」という場合がある。）の形成をし易くするため、スフェロイドの直径の分布を所定範囲内とすることがより容易となる。
【００４２】
ＣＮＦにカルボキシ基を導入する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｐｅｒｉｚｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｙｌ；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）酸化による方法（例えば、国際公開２０１０／１１６８２６号、または国際公開第２００９／０８４５６６号等を参照）、およびカルボキシメチル化する方法（例えば、国際公開第２０１４／０８８０７２号、または特許第４０５５９１４号公報等を参照）などが挙げられる。酸化処理の際の反応時間、反応温度および／もしくは酸化剤の量、ならびに／またはカルボキシメチル化処理の際の反応時間、反応温度および／もしくはカルボキシメチル化剤の量等を調整することにより、カルボキシ基導入量を調整することができる。
【００４３】
なお、ＣＮＦのカルボキシ基含有量は、以下の方法（特許第５３５１５８６号明細書を参照）により求めたものである。
ＣＮＦの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とする。このスラリーに０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定する。電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム水溶液量Ａ（ｍＬ）から、下記式により算出する。
カルボキシ基含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ａ（ｍＬ）×０．０５（ｍｏｌ／Ｌ）／ＣＮＦ質量（ｇ）
【００４４】
《沈降操作》
沈降工程は、培養容器に僅かな衝撃等を加える沈降操作を含んでもよい。
ここで、「僅かな衝撃等」は特に限定されないが、例えば、培養容器を僅かな高さ（例えば「数ｍｍの高さ」をいう。）から落とす、または、培養容器を軽く叩く、等の行為による衝撃等が挙げられる。
より具体的には、僅かな衝撃等として、以下に例示される。ただし、弱い機械的な刺激であればよく、以下に例示されるものに限定されない。
【００４５】
・衝撃
培養細胞分散液に僅かな衝撃を与えることによって、培養した細胞を沈降させることができる。培養細胞分散液が入った培養容器に衝撃を与えてもよいし（容器衝撃法）、培養細胞分散液に球等を投げ入れて衝撃を与えてもよい（投入衝撃法）。容器衝撃法は、例えば、培養細胞分散液の入った培養容器を所定の高さから落とすことによって実施される。投入衝撃法は、例えば、錘を所定の高さから培養細胞分散液に投げ入れることで実施される。衝撃の強度は「ガル（Ｇａｌ）」で表され、１．０ガル＝１．０ｃｍ／ｓ２＝１．０×１０−２ｍ／ｓ２である。本発明の培養細胞の回収方法においては、好ましくは８．０ガル以下、より好ましくは０．２０ガル以上５．０ガル以下、さらに好ましくは０．４０ガル以上３．０ガル以下、の衝撃を培養細胞分散液に与えることにより、ＣＮＦのネットワークが破壊され、培養した細胞を沈降させることができる。
培養した細胞を沈降させた後は、例えば、デカンテーション、デカントアスピレーション、またはアスピレーションなど、従来公知の手段によって、沈降上清である培養液を除去することができる。
【００４６】
・振動
培養細胞分散液に軽く振動を与えることによって、培養した細胞を沈降させることができる。これは、たとえば容器を振ることで達成できる。振動の大きさは「デシベル（ｄＢ）」で表される。本発明の培養細胞の回収方法においては、好ましくは７０ｄＢ以下、より好ましくは３０ｄＢ以上６５ｄＢ以下、さらに好ましくは４０ｄＢ以上６０ｄＢ以下、の振動を培養細胞培養液に与えることにより、ＣＮＦのネットワークが破壊され、培養した細胞を沈降させることができる。
【００４７】
・撹拌
培養細胞分散液に軽く回転を与えることによって、培養した細胞を沈降させることができる。培養細胞分散液が入った培養容器ごと回転させてもよいし、培養細胞分散液に撹拌羽および／またはマクネティックスターラーを入れて撹拌してもよい。撹拌の強度は「回毎分（ｒｐｍ；ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）で表される。本発明の培養細胞の回収方法においては、好ましくは２００ｒｐｍ以下、より好ましくは１０ｒｐｍ以上１５０ｒｐｍ以下、さらに好ましくは２０ｒｐｍ以上１００ｒｐｍ以下、の撹拌を培養細胞分散液に与えることにより、ＣＮＦのネットワークが破壊され、培養した細胞を沈降させることができる。なお、培養細胞分散液が入った培養容器ごと回転させる場合、従来の培養細胞の回収方法において行われていた遠沈処理も培養した細胞を含む培養液が入った容器を回転する点が共通するが、通常の細胞沈降には１０００ｒｐｍ（３３５×ｇ）以上と、本発明の回転数の５倍以上の回転数が必要である。そのため、細胞に高い加速度をかけることとなり、培養した細胞が死亡し易い。
【００４８】
〈培養工程〉
本発明の培養細胞の回収方法は、沈降工程を行う前に、培養工程を実施してもよい。
培養方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３２］〜［００３３］）、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６３］〜［００９５］）に記載された浮遊培養の方法を用いる事ができる。
【００４９】
（温度分布）
培養工程においては、浮遊細胞分散液（培養工程において、浮遊培養している細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に温度分布を付与してもよい。
浮遊培養時に付与する温度分布は、特に限定されないが、好ましくは０．１℃以上３．０℃以下、より好ましくは０．２℃以上２．０℃以下、さらに好ましくは０．３℃以上１．０℃以下である。
温度分布がこの範囲内であると、細胞分散液中に適度な温度勾配が規制され、浮遊培養時の細胞分散液に弱い撹拌効果を付与することとなり、大スフェロイドの解体による小スフェロイドの形成が促進され、所定のスフェロイドの直径の分布を達成することができる。
また、撹拌効果により浮遊培養持の細胞分散液中の酸素拡散がより向上するとともに、ＣＮＦのネットワーク形成に影響を与えず、細胞の浮遊培養に支障がないことから、細胞増殖率がより向上する。結果として、細胞増殖率および細胞回収率をともに向上させることができる。
このような温度分布を浮遊細胞分散液に付与する方法は、特に限定されないが、例えば、浮遊細胞分散液が入った培養容器を恒温槽にいれ、かつ培養容器の下にホットプレートを敷き、両者に温度差を設けることで達成できる。
【００５０】
ここで、温度分布は、以下の方法により求めたものである。
温度数分布Ｔｄｉｆｆ（℃）は、浮遊培養中の細胞分散液の液温の最高値Ｔｍａｘ（℃）および最低値Ｔｍｉｎ（℃）から、下記式（３）によって求めた温度差である。
Ｔｄｉｆｆ（℃）＝Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ（℃）          （３）
【００５１】
〈播種工程〉
本発明の培養細胞の回収方法は、培養工程を行う前に、播種工程を実施してもよい。
播種工程は、種細胞として細胞を播種する工程である。
【００５２】
培養液に細胞を播種する方法は、特に限定されないが、例えば、細胞を培養液に分散して調製した懸濁液を培養液に注入する方法が挙げられる。
【００５３】
（細胞数分布）
播種細胞分散液（播種工程において、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、細胞数分布を付与してもよい。
播種細胞分散液に細胞数分布を付与することによって、大スフェロイドの形成を促し、浮遊培養終了時に所定のスフェロイドの直径の分布を達成することが容易になる。
播種細胞分散液に付与する細胞数分布は、特に限定されないが、好ましくは１．０％以上５０％以下、より好ましくは２．０％以上４０％以下、さらに好ましくは３．０％以上３０％以下である。
この範囲内であると、浮遊培養時の細胞分散液中に大スフェロイドを形成することができ、所定のスフェロイドの直径の分布を達成することができる。その結果として、細胞増殖率および細胞回収率をともに向上させることができる。
【００５４】
ここで、細胞数分布は、以下の方法により求めたものである。
培養液に細胞を播種した直後に細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入する。ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で１０視野観察し、細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数を計測する。最初に選択した１０視野の細胞数の算術平均値を計算し、１番目のサンプルの平均値Ｎ１（個／ｍＬ）とする。さらにサンプリングから１０回繰り返し、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を求める。Ｎ１〜Ｎ１０から、下記式によって１０回のサンプリングによる細胞数の算術平均値Ｎａｖｇ（個／ｍＬ）および細胞数分布Ｎｄｉｓｔ（％）を求める。
Ｎａｖｇ（個／ｍＬ）＝（Ｎ１＋Ｎ２＋Ｎ３＋・・・＋Ｎ１０）／１０  （個／ｍＬ）
Ｎｄｉｓｔ（％）＝（Ｎｍａｘ−Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ×１００  （％）
ただし、ＮｍａｘはＮ１〜Ｎ１０の最大値であり、ＮｍｉｎはＮ１〜Ｎ１０の最小値である。
【００５５】
細胞数分布を付与する方法は、特に限定されないが、好ましくは培養液に細胞を播種する際に、時間間隔を変動させて培養液に注入（または、滴下）する方法が挙げられる。
注入時間間隔の変動は、特に限定されないが、好ましくは０．１０以上１０以下、より好ましくは０．２０以上８．０以下、さらに好ましくは０．３０以上〜５．０以下である。
注入時間間隔の変動がこの範囲内であると、所定のスフェロイドの直径の分布を達成しやすい。
【００５６】
ここで、入時間間隔の変動は、下記式によって求めた値である。
注入時間間隔の変動＝（注入する時間の間隔の最大値と最小値の差）／全時間間隔の平均値
細胞播種時に細胞数分布を付与することにより、培養時の細胞分散液中に細胞濃度の高いところ（播種時に時間間隔が短かったところ）と細胞濃度の低いところ（播種時に時間間隔が長かったところ）が形成される。すなわち、培養細胞分散液に細胞数分布が形成される。細胞数分布の高いところで細胞が集まり易く、大スフェロイドを形成し易い。
このとき、ＣＮＦがカルボキシ基を有することで細胞と相互作用し易く（細胞を凝集させスフェロイドの形成を促し）、上記の効果をさらに促進する。
【００５７】
〈培養液調製工程〉
本発明の培養細胞の回収方法は、播種工程を行う前に、培養液調製工程を実施してもよい。
培養液調製工程は、細胞を培養するための培養液を調製する工程である。
本発明において、培養液調製工程は、セルロースナノファイバーの調製と、培養液の調製とを含み得る。
セルロースナノファイバーとして既製品を使用する場合は、セルロースナノファイバーの調製を省略することができる。
【００５８】
《セルロースナノファイバーの調製》
（ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｐｅｒｉｚｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｙｌ；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）化ＣＮＦの調製方法）
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、特開２００９−２６３８５３号公報（［００１５］〜［００３０］）に記載された方法に従って、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｐｅｒｉｚｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｙｌ；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
【００５９】
（ＣＭ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ；カルボキシメチル）化ＣＮＦの調製方法）
ＣＭ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法に従って、アルカリ触媒存在下で、ＣＭ化剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
その他、特開２０１５−２２７５１７、特開２０１５−１３４８７３、特開２０１５−４０３２、特開２０１４−１９３５８０、特開２０１３−１８５１２２、特許３６４２１４７、特許４０５５９１４、国際公開第１３／１３７１４０、国際公開第２０１５／１０７９９５、国際公開第２０１５／５０１１７、国際公開第２０１４／１８１５６０、国際公開第２０１４／１８１２６０、国際公開第２０１４／０８８０７２、国際公開第２０１４／０８７７６７等に記載されたＣＭ化ＣＮＦの調製方法を使用できる。
【００６０】
（リン酸処理ＣＮＦ）
リン酸基をＣＮＦに導入することにより、より好ましくはリン酸エステル化することにより、調製することができる。
例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５、特開２０１６−３７０３１、国際公開第２０１６／００２６８９、国際公開第２０１６／００２６８８号に記載された方法を使用することができる。
【００６１】
（機械解砕ＣＮＦの調製方法）
機械解砕ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法に従って、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕ＣＮＦを調製することができる。
【００６２】
ＣＮＦの由来は特に限定されず、パルプ由来のＣＮＦ、バクテリアセルロース（ＢＣ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）由来のＣＮＦ、およびエレクトロスピニングによるナノファイバーのいずれも使用することができるが、特に好ましくはパルプ由来のＣＮＦである。これは、繊維強度が強く、継代でスフェロイドが細分化し難いからである。
【００６３】
《培養液の調製》
（ＣＮＦ無添加培養液の調製）
使用する細胞に適した基礎培地を、従来公知の方法によって、調製することができる。
例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００２９］〜［００３１］）に記載された培地、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６２］）に記載された培地を使用してもよい。
【００６４】
（ＣＮＦの添加）
基礎培地にＣＮＦを添加することにより、培養液を調製する。
ＣＮＦを基礎培地に添加する際、急激な撹拌を行うことで、ハイドロゲルのネットワークを乱し（欠陥を形成させ）崩し易くし、沈降工程における細胞沈降を促すことができる。
具体的には、ＣＮＦを基礎培地に添加する際、マグネティックスターラー等で撹拌することが好ましく、さらには、添加後、高回転のホモジナイザーで撹拌することが好ましい。
回転数は、特に限定されないが、好ましくは１０００ｒｐｍ〜１０万ｒｐｍであり、より好ましくは３０００ｒｐｍ〜５万ｒｐｍであり、さらに好ましくは６０００ｒｐｍ〜２万ｒｐｍである。
撹拌時間は、特に限定されないが、好ましくは１０秒以上３０分以下であり、より好ましくは２０秒以上１５分以下であり、さらに好ましくは３０秒以上１０分以下である。
回転数および時間がともにこの範囲内であると、細胞増殖率および細胞沈降率がともに向上しやすい。
【００６５】
培養液の量は、特に限定されないが、好ましくは２００ｍＬ以上であり、より好ましくは５００ｍＬ以上１０００Ｌ以下であり、さらに好ましくは１０００ｍＬ以上５００Ｌ以下である。培養液の体積がこの範囲内であると、浮遊培養工程において、浮遊細胞分散液中に酸素を十分に供給することができるため、大量の細胞を培養でき、その結果、効率的に培養細胞の回収をすることが容易となる。
【００６６】
［培養細胞分散液］
本発明は、また、上記した本発明の培養細胞の回収方法に用いる培養細胞分散液を提供する。
この培養細胞分散液は、既に述べたとおりである。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。【００６８】
［実施例１〜４、比較例１および２］【００６９】
以下に説明する比較例１、実施例１〜４、および比較例２は、播種時の播種細胞濃度がスフェロイドの直径の分布に与える影響を比較した例である。
なお、実施例１〜４および比較例２は、播種時の播種細胞濃度を比較例１から変更した上、さらに、播種工程において細胞を播種する際に注入時間変動を付与し、かつ、培養工程において浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に温度分布を付与した例である。【００７０】
〈比較例１〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
特開２００９−２６３８５３号公報（［００１５］〜［００３０］）に記載された方法に従って、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１」という場合がある。）を調製した。
調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１の平均直径およびカルボキシ基導入量を以下の方法に従って測定したところ、平均直径は５．０ｎｍであり、カルボキシ基導入量は１．９ｍｍｏｌ／ｇであった。【００７１】
・平均直径の測定方法
セルロースナノファイバーの濃度が０．００１質量％となるように希釈したセルロースナノファイバー水分散液（以下「ＣＮＦ水分散液」という場合がある。）を調製した。このＣＮＦ水分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥して観察用試料を作成し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：atomic force microscope）を用いて観察した形状像の断面高さを１０点計測し、平均直径を算出した。【００７２】
・カルボキシ基導入量の測定方法
セルロースナノファイバーの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とした後、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定し、電気伝導度の変化が穏やかな弱酸の中和段階において消費された０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の量（ａ）から、下記式を用いて算出した。
カルボキシ基導入量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝ａ（ｍＬ）×０．０５／セルロースナノファイバー質量（ｇ）【００７３】
（培養液の調製）
調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１を純水と混合して０．３質量％水分散液（以下「ＣＮＦ分散液」という場合がある。）を得た。このＣＮＦ分散液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
粉末培地（ダルベッコ変法イーグル培地２，日水製薬（株）製）に加水し、３０分程マグネティックスターラーで撹拌してダルベッコ変法イーグル培地２溶液（以下「ＤＭＥＭ２溶液」という場合がある。）を調製した。ＤＭＥＭ２溶液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
オートクレーブ滅菌後、室温まで冷却したＤＭＥＭ２溶液に、滅菌したＣＮＦ分散液を、表１記載の濃度になるように無菌条件下で滴下した。滴下後、ＣＮＦ分散液を添加したＤＭＥＭ２溶液を、ホモミキサーを用いて、１００００ｒｐｍで５分間撹拌処理し、ＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。
このＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を室温まで冷却した後に、ろ過滅菌したＬ−グルタミン溶液（Ｌ−グルタミン溶液（×１００），和光純薬工業（株）製；２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を終濃度２ｍＭとなるように添加し、さらに滅菌した１０質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍＬ加え、アミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。このアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液の少量を採取し、ｐＨ試験紙を使用して溶液のｐＨがｐＨ７．０〜８．０の範囲内であることを確認した。少量を採取して残ったアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液に、使用前に１０体積％となるようにＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）を加え、細胞の培養に使用する培養液を得た。
培養容器として、親水化処理したポリスチレン製培養容器（浮遊細胞培養用フラスコ  ＭＳ−２１８００，住友ベークライト社製；培養面積２２５ｃｍ２；容量８００ｍＬ）を準備した。なお、培養容器は、培養液を注入した際の培養液の高さが４．０〜５．０ｃｍとなる培養面積（底面積）を有するものを選定した。
準備した培養容器に、調製した培養液を表１に示す量、無菌的に注入した。【００７４】
《播種工程》
培養液を注入した培養容器に、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ（human mesenchymal stem cells），Ｌｏｎｚａ社製；カタログ番号  ＰＴ−２５０１）（以下「ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１」という場合がある。）を種細胞として播種した（培養容器内の培養液に種細胞を播種したものを、以下「播種細胞分散液」という場合がある。）。具体的には、ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１を培養液に分散して調製した懸濁液（以下「ＰＴ−２５０１懸濁液」という。）を培養液に注入した。
この結果、下記細胞数分布の算出方法従って算出した細胞数分布は表１に示すとおりであった。【００７５】
・細胞数分布の算出方法
細胞を播種した直後に２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入し、光学顕微鏡を用いて倍率２００倍で１０視野観察し、細胞数を計測して、このサンプリングにおける細胞数の平均値（算術平均値）を算出した。サンプリングから平均値の算出までを１０回繰返し、サンプリングごとの細胞数の平均値Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を算出した。これらの細胞数の平均値から、下記式によって細胞数分布を算出した。
細胞数分布（％）＝｛（Ｎｍａｘ−Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ｝×１００（％）
ただし、ＮｍａｘおよびＮｍｉｎは、それぞれ、Ｎ１からＮ１０までの最大値および最小値を表し、ＮａｖｇはＮ１からＮ１０までの算術平均値を表す。【００７６】
《培養工程》
細胞を播種した培養容器を、温度３７℃に設定したインキュベーター（Ｈｅｒａｃａｌｌ  ＶＩＯＳ  ＣＯ２インキュベーター，サーモフィッシャー株式会社製）の中に入れ、細胞の培養を開始した（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液を「浮遊細胞分散液」という。）。
培養条件は、二酸化炭素濃度５．０体積％、および湿度９５％ＲＨとした。
培養開始から１日後、培養容器に接着した細胞を取り除くため、培養容器中の浮遊細胞分散液を新しいアズノール滅菌容器（アズノール滅菌シャーレ  ＧＤ９０−１５，アズワン社製）に移し、さらに４日間、培養を継続して、スフェロイドを形成した。【００７７】
《沈降工程》
培養細胞分散液（沈降工程における、培養終了した培養容器中の培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の総細胞数、スフェロイドの平均直径および直径の分布、細胞増殖率、細胞沈降率、ならびに細胞死亡率を以下に記載する方法に従って求めた。【００７８】
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率４．５倍であり、細胞沈降率６５％であり、細胞死亡率３．０％であった。【００７９】
・細胞総数の算出方法
培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、トリプシン処理によってスフェロイドを形成している細胞をばらばらにした後、光学顕微鏡を用いて、培養細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数を計測し、これに培養細胞分散液量をかけて培養細胞分散液中の細胞総数を算出した。【００８０】
・スフェロイドの平均直径および直径の分布の算出方法
培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入した。培養ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で観察し、スフェロイドの直径を任意に２０点計測した。直径の計測は、２０点のスフェロイドのそれぞれについて長辺および短辺を測定し、これらの算術平均値を各スフェロイドの直径Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３・・・Ｄ２０とした。こうして測定したスフェロイドの直径から、下記式によって２０点のスフェロイドの直径の算術平均値Ｄａｖｇおよびスフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔを算出した。
Ｄａｖｇ＝（Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３＋・・・＋Ｄ２０）／２０
Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ−Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ
ただし、ＤｍａｘおよびＤｍｉｎは、それぞれ、スフェロイドの直径の最大値および最小値である。【００８１】
・細胞増殖率の算出方法
培養細胞分散液中の細胞総数をＮ個、播種した細胞数をＮｆ個として、細胞増殖率を下記式により算出した。
細胞増殖率＝Ｎ／Ｎｆ  （倍）
細胞増殖率は高いほどよく、特に７．３倍以上であることが望ましい。【００８２】
・細胞沈降率の算出方法
１）沈降操作前の全スフェロイド数（Ｎ）の計測：
培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを３７℃に保った直径２０ｍｍのポリスチレン製培養ウェルに注入した。培養ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で１０視野観察し、各視野についてスフェロイド数を測定した。この平均値をＮ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰返し実施し、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を求めた。Ｎ１〜Ｎ１０の平均値から培養細胞分散液１ｍＬあたりのスフェロイド数Ｎ（個／ｍＬ）を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
２）沈降操作後の浮遊（非沈降性）スフェロイド数（ｎ）の計測：
上記培養ウェルに沈降処理を行った後、ウェル中の培養液の上澄みを静かに採取した。採取した上澄みを、同様に顕微鏡を用いて倍率２００倍で１０視野観察し、各視野について浮遊しているスフェロイド数を測定した。この平均値をｎ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰り返し測定し、ｎ２、ｎ３、・・・、ｎ１０を求めた。ｎ１〜ｎ１０の平均値から上澄み１ｍＬあたりの浮遊スフェロイド数ｎ（個／ｍＬ）を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
３）細胞沈降率の算出：
下記式により細胞沈降率（％）を算出した。
細胞沈降率（％）＝｛（Ｎ−ｎ）／Ｎ｝×１００  （％）
細胞沈降率は高いほどよく、特に７０％以上であることが望ましい。【００８３】
・細胞死亡率の算出方法
沈降操作前の細胞について、特表２０１３−５４１９５６号公報（［００８２］）に記載の方法に従って、生細胞と死細胞とを染め分け、沈降操作前の細胞生存率Ｘａ（％）を算出した。
次に、沈降操作後の細胞について、同様にして、沈降操作後の細胞生存率Ｘｂ（％）を算出した。
沈降操作による細胞死亡率を下記式により算出した。
細胞死亡率（％）＝Ｘａ（％）−Ｘｂ（％）
細胞死亡率は低いほどよく、特に５．０％以下であることが望ましい。【００８４】
〈実施例１〉
《培養液調製工程》
比較例１と同様にして培養液を調製した。【００８５】
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１を培養液に分散して調製した懸濁液（以下「ＰＴ−２５０１懸濁液」という。）を、播種細胞分散液中の細胞濃度（播種時細胞濃度）が表１に示す値となるように培養液に注入した点、および、この際、ＰＴ−２５０１懸濁液の培養液への注入は、３０回に分けて行い、注入時間間隔を変更しながら、注入時間変動が表１に示す値となるように、かつ、平均注入時間間隔が５．０秒となるように行った点を除いて、比較例１と同様にして細胞を播種した。
なお、注入時間変動は、下記式によって算出した。
注入時間変動＝（注入時間間隔の最大値（秒）−注入時間間隔の最小値（秒））／平均注入時間間隔（秒）【００８６】
《培養工程》
細胞を播種した培養容器をプレートヒーター（プレートヒーターＭＰＨＫ型，株式会社ミスミ製；サイズ１５０×１５０ｍｍ）上に設置し、プレートヒーターごと、温度３７℃に設定したインキュベーター（Ｈｅｒａｃａｌｌ  ＶＩＯＳ  ＣＯ２インキュベーター，サーモフィッシャー株式会社製）の中に入れ、細胞の培養を開始した（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液を「浮遊細胞分散液」という。）点、プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液の上面および底部との間に表１の「温度分布（℃）」の欄に記載した温度差（浮遊細胞分散液の上面および底部に設置した熱電対で測定した温度の差をいう。）を設けた点、および、培養容器中の浮遊細胞分散液を新しいアズノール滅菌容器（アズノール滅菌シャーレ  ＧＤ９０−１５，アズワン株式会社製）に移した後、さらに４日間培養を継続した際に、表１の「温度分布（℃）」の欄に記載した温度差を設けた点を除いて、比較例１と同様にして、細胞の培養を行ってスフェロイドを形成した。【００８７】
《沈降工程》
比較例１と同様にして沈降操作を行った。【００８８】
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率７５％であり、細胞死亡率４．０％であった。【００８９】
〈実施例２〉
播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【００９０】
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．３倍であり、細胞沈降率８０％であり、細胞死亡率３．０％であった。【００９１】
〈実施例３〉
播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【００９２】
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９６％であり、細胞死亡率２．０％であった。【００９３】
〈実施例４〉
播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【００９４】
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率８．６倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率３．０％であった。【００９５】
〈比較例２〉
播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【００９６】
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率７．２倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率４．０％であった。【００９７】
〈比較例１、実施例１〜４、および比較例２の結果の解説〉
実施例１〜４では、播種工程において播種時細胞濃度を変えることにより、培養終了した培養容器中の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を変化させ、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
実施例１〜４のスフェロイドの直径の分布は０．１０以上３．０未満の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．６倍以上）、および、高い細胞沈降率（７５％以上）を示した。
また、実施例２〜４のスフェロイドの直径の分布は０．２０以上２．１以下の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．６倍以上）、および、より高い細胞沈降率（８０％以上）を示した。
さらに、実施例３のスフェロイドの直径の分布は０．３０以上１．０以下の範囲内であり、より高い細胞増殖率（９．５倍）、および、さらに高い細胞沈降率（９６％）を示した。
比較例１は、スフェロイドの直径の分布が本発明の規定する範囲を下回った例である。
スフェロイドの平均直径が７５０μｍであり、直径の分布が０であったことから、直径がより大きなスフェロイドが形成されておらず、僅かな衝撃によってセルロースナノファイバーのネットワークを大規模に破壊することができず、細胞沈降率が低い結果となったと考えられる。
また、比較例１は、スフェロイドの中心部まで細胞増殖に必要な酸素および栄養が十分に届く、直径がより小さなスフェロイドが形成されておらず、細胞増殖率が低い結果となった。
比較例２は、スフェロイドの直径の分布が本発明の規定する範囲を超えた例である。
スフェロイドの平均直径が７７０μｍであり、直径の分布が３．０であったことから、直径が大きなスフェロイドが形成された割合が大きく、培養中にセルロースナノファイバーのネットワークが破壊されてしまって浮遊培養できず、細胞増殖率が低い結果となった。【００９８】
【表１】
2017199737.tif 000002
【００９９】
［実施例５〜９］
実施例５〜９について、以下に説明する。
実施例５〜９は、セルロースナノファイバーの添加量が細胞増殖率および細胞沈降率に与える影響を比較する例である。【０１００】
〈実施例５〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表２に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２」という場合がある。）を調製した。【０１０１】
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２を表２に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。【０１０２】
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用して、表２に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表２に示す細胞数分布を付与した。【０１０３】
《培養工程》
プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表２に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。【０１０４】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表２に示すとおりであった。【０１０５】
（沈降操作）
培養細胞分散液の入った培養容器を左右に振ることで、培養容器中の培養細胞分散液に表２に示す強度の振動を与えた。【０１０６】
(結果）
表２に示すとおり、細胞増殖率８．１倍であり、細胞沈降率９１％であり、細胞死亡率３．０％であった。【０１０７】
〈実施例６〉
培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１０８】
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率８．８倍であり、細胞沈降率９２％であり、細胞死亡率４．０％であった。【０１０９】
〈実施例７〉
培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１１０】
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率２．０％であった。【０１１１】
〈実施例８〉
培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１１２】
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．４倍であり、細胞沈降率８５％であり、細胞死亡率３．０％であった。【０１１３】
〈実施例９〉
培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１１４】
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率７４％であり、細胞死亡率４．０％であった。【０１１５】
〈実施例５〜９の結果の解説〉
実施例５〜９では、培養液中のセルロースナノファイバーの含有量を変えることにより、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
また、実施例５〜９のセルロースナノファイバーの含有量は培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．１倍以上）、および、高い細胞沈降率（７４％以上）を示した。
さらに、実施例６〜８のセルロースナノファイバーの含有量は培養細胞分散液の０．０２０質量％以上０．５０質量％以下の範囲内であり、より高い細胞増殖率（８．８倍以上）、および、より高い細胞沈降率（８５％以上）を示した。
実施例７のセルロースナノファイバーの含有量は培養細胞分散液の０．０３質量％以上０．１０質量％以下の範囲内であり、さらに高い細胞増殖率（９．５倍）、および、さらに高い細胞沈降率（９５％）を示した。
セルロースナノファイバーの含有量が、培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下の範囲内であると、高い細胞増殖率、および、高い細胞沈降率を得ることができ、培養細胞分散液の０．０２０質量％以上０．５０質量％以下の範囲内であると、より高い細胞増殖率、および、より高い細胞沈降率を得ることができ、培養細胞分散液の０．０３質量％以上０．１０質量％以下の範囲内であると、さらに高い細胞増殖率、および、さらに高い細胞沈降率を得ることができる。【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
［実施例１０〜１４］
実施例１０〜１４について、以下に説明する。
実施例１０〜１４は、培養液に細胞を播種する際の注入（滴下）間隔に変動を付与し、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に付与する細胞数分布がスフェロイドの直径の分布に与える影響を比較する例である。【０１１８】
〈実施例１０〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法に従って、アルカリ触媒存在下で、ＣＭ化剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ化ＣＮＦ１」という場合がある。）を調製した。調製したＣＭ化ＣＮＦ１の平均直径およびカルボキシ基導入量は、表３に示すとおりであった。【０１１９】
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＣＭ化ＣＮＦ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。【０１２０】
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１に代えて、ヒトｉＰＳ細胞ＩＭＲ９０−１（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）、を使用して、表３に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表３に示す細胞数分布を付与した。【０１２１】
《培養工程》
プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表３に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。【０１２２】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表３に示すとおりであった。【０１２３】
（沈降操作）
培養細胞分散液に撹拌子を入れ、マグネティックスターラーを用いて撹拌子を表３記載の回転数で５分間撹拌した。【０１２４】
(結果）
表３に示すとおり、細胞増殖率９．０倍であり、細胞沈降率７３％であり、細胞死亡率４．０％であった。【０１２５】
〈実施例１１〉
播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１２６】
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率８３％であり、細胞死亡率５．０％であった。【０１２７】
〈実施例１２〉
播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１２８】
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率２．０％であった。【０１２９】
〈実施例１３〉
播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１３０】
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率８．６倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率３．０％であった。【０１３１】
〈実施例１４〉
播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１３２】
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率８．１倍であり、細胞沈降率９４％であり、細胞死亡率４．０％であった。【０１３３】
〈実施例１０〜１４の結果の解説〉
実施例１０〜１４では、播種工程において注入時時間変動を付与することにより、培養終了した培養容器中の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を変化させ、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
０．１０〜１０の注入時間変動を付与した実施例１０〜１４は、細胞総数が８．１×１０９個〜９．０×１０９個で、スフェロイドの直径の分布は０．１０〜２．９であり、高い細胞増殖率（８．６倍以上）、および、高い細胞沈降率（７３％以上）を示した。
０．２０〜８．０の注入時間変動を付与した実施例１１および１２は、細胞総数が８．６×１０９個〜９．２×１０９個で、スフェロイドの直径の分布は０．２０〜２．１であり、より高い細胞増殖率（９．２倍）、および、より高い細胞沈降率（８３％以上）を示した。
１．０の注入時間変動を付与した実施例１２は、細胞総数が９．２×１０９個で、スフェロイドの直径の分布は０．８０であり、高い細胞増殖率（９．２倍）、および、より高い細胞沈降率（９３％）を示した。
以上より、注入時間変動が小さいほどスフェロイドの直径の分布が小さくなり、注入時間変動が大きいほどスフェロイドの直径の径分布が大きくなることがわかる。【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
［実施例１５〜１９］
実施例１５〜１９について、以下に説明する。
実施例１５〜１９は、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に付与する温度分布が細胞増殖率に与える影響を比較する例である。【０１３６】
〈実施例１５〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ３」という場合がある。）を調製した。【０１３７】
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ３を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。【０１３８】
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）を使用して、表４に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表４に示す細胞数分布を付与した。【０１３９】
《培養工程》
プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。【０１４０】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表４に示すとおりであった。【０１４１】
（沈降操作）
培養細胞分散液の入った培養容器を持ち上げ、これを机上に落とすことで、培養容器中の培養細胞分散液に表４に示す強度の衝撃を与えた。【０１４２】
(結果）
表４に示すとおり、細胞増殖率８．１倍であり、細胞沈降率９１％であり、細胞死亡率３．０％であった。【０１４３】
〈実施例１６〉
培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１４４】
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．０倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率４．０％であった。【０１４５】
〈実施例１７〉
培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１４６】
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率２．０％であった。【０１４７】
〈実施例１８〉
培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１４８】
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．１倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率３．０％であった。【０１４９】
〈実施例１９〉
培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１５０】
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率８．０倍であり、細胞沈降率９０％であり、細胞死亡率４．０％であった。【０１５１】
〈実施例１５〜１９の結果の解説〉
実施例１５〜１９では、培養工程において浮遊細胞培養液に付与する温度分布を変えることにより、培養終了した培養容器中の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を変化させ、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与した実施例１５〜１９は、細胞総数が８．１×１０１１個〜９．２×１０１１個であり、スフェロイドの直径の分布は０．１０以上２．９以下の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．０倍以上）、および、高い細胞沈降率（９０％以上）を示した。
０．２℃以上２℃以下の温度分布を付与した実施例１６〜１８は、細胞総数が８．６×１０１１個〜９．２×１０１１個であり、スフェロイドの直径の分布は０．２０以上１．８以下の範囲内であり、より高い細胞増殖率（９．０倍以上）、および、より高い細胞沈降率（９３％以上）を示した。
０．３．０℃以上１℃以下の温度分布を付与した実施例１７は、細胞総数が９．２×１０１１個であり、スフェロイドの直径の分布が０．５０であり、さらに高い細胞増殖率（９．５倍以上）、および、さらに高い細胞沈降率（９５％以上）を示した。
以上より、浮遊細胞分散液に０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与することにより、細胞総数が多い状況でも高い増殖率を確保することができることがわかった。【０１５２】
【表４】
2017199737.tif 000005
【０１５３】
［実施例２０〜２２］
実施例２０〜２２について、以下に説明する。
実施例２０〜２２は、セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量の相違および化学修飾方法の相違がスフェロイドの平均直径およびスフェロイドの直径の分布に与える効果を比較する例である。【０１５４】
〈実施例２０〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４」という場合がある。）を調製した。【０１５５】
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。【０１５６】
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用して、表５に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表５に示す細胞数分布を付与した。【０１５７】
《培養工程》
プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表５に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。【０１５８】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表５に示すとおりであった。【０１５９】
（沈降操作）
培養細胞分散液の入った培養容器を持ち上げ、これを机上に落とすことで、培養容器中の培養細胞分散液に表５に示す強度の衝撃を与えた。【０１６０】
(結果）
表５に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率９８％であり、細胞死亡率１．０％であった。【０１６１】
〈実施例２１〉
表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるようにＣＭ化剤の使用量および高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１０と同様にしてＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ化ＣＮＦ２」という場合がある。）を調製した。
培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４に代えて、調製したＣＭ化ＣＮＦ２を表５に示す添加量で使用して培養液を調製した点を除いて、実施例２０と同様にして、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１６２】
その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率３．０％であった。【０１６３】
〈実施例２２〉
国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法に従って、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕セルロースナノファイバー（以下「機械解砕ＣＮＦ１」という場合がある。）を調製した。調製した機械解砕ＣＮＦ１の平均直径およびカルボキシ基導入量は、表５に示すとおりであった。機械解砕ＣＮＦ１は酸化処理等のカルボキシ基導入処理を行っていないことから、カルボキシ基導入量は０ｍｍｏｌ／ｇである。
培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４に代えて、調製した機械解砕ＣＮＦ１を表５に示す添加量で使用して培養液を調製した点を除いて、実施例２０と同様にして、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１６４】
その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率８．４倍であり、細胞沈降率８４％であり、細胞死亡率５．０％であった。【０１６５】
〈実施例２０〜２２の結果の解説〉
セルロースナノファイバーがカルボキシ基を含有する実施例２０および２１と、セルロースナノファイバーがカルボキシ基を含有しない実施例２２とを対比すると、実施例２０および実施例２１の方が、実施例２２よりも、細胞増殖率および細胞沈降率が高く、細胞死亡率が低かった。すなわち、実施例２０および実施例２１の方が、実施例２３よりも優れた効果を示した。
ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを使用した実施例２０とＣＭ化セルロースナノファイバーを使用した実施例２１とを対比すると、実施例２０の方が、実施例２１よりも、細胞増殖率および細胞沈降率が高く、細胞死亡率が低かった。すなわち、実施例２０方が、実施例２１よりも優れた効果を示した。
また、スフェロイドの平均直径は、実施例２０および２１では３５０μｍであったのに対し、実施例２２では５０μｍであった。
これは、セルロースナノファイバーがカルボキシ基を含有することにより、セルロースナノファイバーと細胞とが相互作用しやすくなり、細胞を凝集させて直径の大きなスフェロイドの形成を促進したことによると考えられる。
また、スフェロイドの直径の分布は、実施例２０では０．７０であったが、実施例２１では０．５０であった。セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が同じであっても、スフェロイドの直径の分布に相違が認められた。
さらに、細胞増殖率、細胞沈降率および細胞死亡率をみると、スフェロイドの直径の分布が大きい順に、優れた結果を示している。
以上より、セルロースナノファイバーとしては、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦが最も優れ、ＣＭ化ＣＮＦがその次に優れ、機械解砕ＣＮＦがさらにその次に優れると考えられる。【０１６６】
【表５】
2017199737.tif 000006
【０１６７】
［実施例２３、比較例３および４］
実施例２３、比較例３および４について、以下に説明する。
実施例２３、比較例３および４は、セルロースナノファイバーとゲランガムとの効果を比較した例である。【０１６８】
〈実施例２３〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表６に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ５」という場合がある。）を調製した。
また、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ５の平均繊維長を特表２０１３−５４１９５６号公報に記載された方法に従って測定したところ、０．５０μｍであった。
なお、セルロースナノファイバーの平均繊維長の測定は、具体的には、以下に記載する方法によって行った。
セルロースナノファイバーの分散液を、セルロースナノファイバー濃度が０．００１質量％となるようにＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ジメチルスルホキシド）により希釈し、セルロースナノファイバーを分散させた。これを予め濃硫酸を用いて表面を親水化処理したシリコンウェハー上へキャストし、１１０℃にて１時間乾燥させて試料とした。得られた試料を、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−７４００Ｆ，日本電子株式会社製）を用いて倍率２，０００倍で観察し、標本数１５０〜２００本のセルロースナノファイバーについて、各々の繊維長を測定し、その算術平均値を平均繊維長とした。【０１６９】
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ５を表６に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表６に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。【０１７０】
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用して、表６に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す細胞数分布を付与した。【０１７１】
《培養工程》
プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。【０１７２】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表６に示すとおりであった。【０１７３】
（沈降操作）
培養細胞分散液の入った培養容器を持ち上げ、これを机上に落とすことで、培養容器中の培養細胞分散液に表６に示す強度の衝撃を与えた。【０１７４】
（結果）
表６に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９０％であり、細胞死亡率４．０％であった。【０１７５】
〈比較例３〉
《培養液調製工程》
セルロースナノファイバーに代えてゲランガム（脱アシル化ジェランガム  ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ，三晶株式会社製）を表６に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２３と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表６に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
また、実施例２３と同様に、ゲランガムの平均繊維長を特表２０１３−５４１９５６号公報に記載された方法に従って測定したところ、５．０μｍであった。【０１７６】
《播種工程》
実施例２３と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す細胞数分布を付与した。【０１７７】
《培養工程》
実施例２３と同様にして細胞を浮遊培養した。【０１７８】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表６に示すとおりであった。【０１７９】
（沈降操作）
実施例２３と同様にして、培養容器中の培養細胞分散液に表６に示す強度の衝撃を与えた。【０１８０】
（結果）
表６に示すとおり、細胞増殖率８．９倍であり、細胞沈降率３５％であり、細胞死亡率１１％であった。【０１８１】
〈比較例４〉
《培養液調製工程》
ゲランガム（脱アシル化ジェランガム  ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ，三晶株式会社製）を、水中衝突型超高圧ホモジナイザー（スターバースト，スギノマシン株式会社製）を用いて、圧力１２ＭＰａで５回処理することにより、平均繊維長０．５μｍのゲランガムを調製した。
調製したゲランガムを表６に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２３と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表６に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。【０１８２】
《播種工程》
実施例２３と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す細胞数分布を付与した。【０１８３】
《培養工程》
実施例２３と同様にして細胞を浮遊培養した。【０１８４】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表６に示すとおりであった。【０１８５】
（沈降操作）
実施例２３と同様にして、培養容器中の培養細胞分散液に表６に示す強度の軽衝撃を与えた。【０１８６】
（結果）
表６に示すとおり、細胞増殖率８．９倍であり、細胞沈降率３５％であり、細胞死亡率１１％であった。【０１８７】
〈実施例２３、比較例３および４の結果の解説〉
ＣＮＦを用いた実施例２３が９．５倍という高い細胞沈降率および９０％という高い細胞沈降率を達成することができたのに対し、ＣＮＦの代わりにゲランガムを用いた比較例３および４は、いずれも、８．９倍という高い細胞増殖率を達成したものの、３５％という低い細胞沈降率しか達成できなかった。
この原因のひとつとしては、ゲランガムは架橋構造を形成するため、繊維の絡み合いが強く、ハイドロゲルが崩れ難いということが考えられる。
なお、ゲランガムの繊維長は比較例３と比較例４との間で異なるが、細胞沈降率に差異はなかった。【０１８８】
【表６】
2017199737.tif 000007
【０１８９】
［実施例２４、比較例５および６］
実施例２４、比較例５および６は、沈降操作の違いによる細胞死亡率を比較した例である。【０１９０】
〈実施例２４〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ６」という場合がある。）を調製した。【０１９１】
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ６を表７に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表７に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。【０１９２】
《播種工程》
表７に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表７に示す細胞数分布を付与した。【０１９３】
《培養工程》
浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、実施例１と同様、表７に示す温度分布を付与して、細胞を浮遊培養した。【０１９４】
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表７に示すとおりであった。【０１９５】
（沈降操作）
培養細胞分散液に撹拌子を入れ、マグネティックスターラーを用いて撹拌子を表７記載の回転数で５分間撹拌した。【０１９６】
(結果）
表７に示すとおり、細胞増殖率９．３倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率３．０％であった。【０１９７】
〈比較例５〉
培養液調製工程において、培養容器に注入した培養液量を表７に示す量とした点、播種工程において、播種時細胞濃度を表７に示す濃度とした点、および、沈降工程において、沈降操作を表７に示す強度の遠沈処理により行った点を除いて、実施例２４と同様にして培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。【０１９８】
その結果、表７に示すとおり、細胞増殖率４．７倍であり、細胞沈降率６８％であり、細胞死亡率２５％であった。【０１９９】
〈比較例６〉
培養液調製工程において、培養容器に注入した培養液量を表７に示す量とした点、および、播種工程において、播種時細胞濃度を表７に示す濃度とした点を除いて、実施例２４と同様にして培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
なお、比較例５とは、沈降操作を実施例２４と同様の軽撹拌により行った点のみが異なる。【０２００】
その結果、表７に示すとおり、細胞増殖率４．７倍であり、細胞沈降率６８％であり、細胞死亡率１２％であった。【０２０１】
〈実施例２４、比較例５および６の解説〉
実施例２４は軽衝撃で細胞を沈降させた例であり、比較例５および比較例６は遠沈処理により沈降させた例である。
実施例２４は３．０％という低い細胞死亡率を達成していた。
一方、比較例５および比較例６は、それぞれ、２５％および１２％という高い細胞死亡率を示したが、遠沈操作を実施例２４と同様の軽撹拌（６０ｒｐｍ）により行った比較例６は、沈降操作を遠沈（３３５×ｇ）により行った比較例５と比べて、１／２以下の細胞死亡率を示した。
比較例５と比較例６との間の細胞死亡率の相違は、沈降操作の相違によるものであり、軽撹拌により細胞を沈降させると、遠沈により細胞を沈降させる場合に比べて、細胞に与えるダメージが小さく、細胞死亡率が大幅に改善することを示唆する。【０２０２】
【表７】
2017199737.tif 000008
【国際調査報告】
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2017199737.tif 000010
2017199737.tif 000011
2017199737.tif 000012
2017199737.tif 000013
2017199737.tif 000014