(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロドラッグを設計する方法であって、以下の：
（１）式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎは０〜３であり、ｍは０〜３であり、そしてｍ＋ｎが３以下であり、
ＡＡP2は、疎水性アミノ酸であり、
ＡＡP1は、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択され、
ＡＡP1’は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択され、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるオリゴペプチドを準備する工程と、
（２）上記オリゴペプチドを当該オリゴペプチドの第一結合部位で、全血に存在する酵素による当該オリゴペプチドの切断を阻害する安定化基に結合させる工程であって、ここで、該安定化基は、アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合しているアスパラギン酸、及びグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合しているグルタミン酸からなる群から選択される前記工程と、
（３）上記オリゴペプチドを当該オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤に直接的又は間接的に結合させる工程であって、
工程（２）及び工程（３）を、いずれの順序で実施してもよいし、同時に実施してもよく、さらに、工程（１）〜（３）を実施することにより複合体が形成され、
（４）ＣＤ１０により前記複合体を切断できるかどうかを試験する工程と、
（５）前記複合体がＣＤ１０により切断されることができる場合には、前記複合体をプロドラッグとして選択する工程と、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記第一結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第二結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
プロドラッグを設計するのに有用なオリゴペプチドを同定するための、スクリーニング方法であって、以下の：
（１）式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎは０〜３であり、ｍは０〜３であり、そしてｍ＋ｎが３以下であり、
ＡＡP2は、疎水性アミノ酸であり、
ＡＡP1は、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択され、
ＡＡP1’は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択され、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるオリゴペプチドを準備する工程と、
（２）ＣＤ１０により上記オリゴペプチドを切断できるかどうかを試験する工程であって、ＣＤ１０による切断性が、プロドラッグを設計するための候補としての上記オリゴペプチドの目安である工程と、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロドラッグとして有用な新規な化合物に関する。このようなプロドラッグは、患者の疾患、とりわけ腫瘍を治療するのに使用できる。
【背景技術】
【０００２】
数多くの治療剤、例えば、アントラサイクリン及びビンカアルカロイドは、とりわけ癌の治療に効果的である。しかしながら、これらの分子は、生体内において、急性毒性、とりわけ骨髄毒性及び粘膜毒性だけでなく、アントラサイクリンの場合に慢性心毒性、及びビンカアルカロイドの場合には慢性神経毒性の特徴を示すことがしばしばある。同様に、メトトレキサートを、リウマチ性疾患等の炎症反応の治療に使用できるが、その毒性が大きいためにその用途が限られている。したがって、より特異的で且つより安全な抗腫瘍剤を開発することが、腫瘍細胞に対する大きな効果及びこれらの製品の副作用（毒性、非腫瘍細胞の破壊等）の数及び重症度を減少させるために、望ましい。また、より特異的な抗炎症剤の開発も、望ましい。
【０００３】
毒性の問題を最小限に抑えるためには、治療剤を、プロドラッグの形態で患者に投与することが有利である。プロドラッグは、生体内において、それらの構造のある種の化学的又は酵素的修飾により薬剤（活性治療化合物）に転換されることのできる分子である。毒性を減少させるために、この転換は、循環系又は非標的細胞ではなく、作用部位又は標的組織に限定されなければならない。しかしながら、プロドラッグは、血液及び血清において安定性が低いという特徴を示すことがしばしばある。これは、血液及び血清中に酵素が存在し、これにより、プロドラッグが患者の体内の所望の部位に到達する前に分解され、その結果、活性化されることがあるためである。
【０００４】
このような問題を克服する望ましい種類のプロドラッグが、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９６／０５８６３及び米国特許第５，９６２，２１６号に開示されている。これらの両方とも、引用することにより本明細書の内容とする。しかしながら、さらに有用なプロドラッグ化合物及びこのようなプロドラッグの製造方法が、開発されることが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
とりわけ既存の類似の構造を有するプロドラッグに対して、高度に特異的な作用、減少した毒性、及び血液中での向上した安定性を示すプロドラッグが、特に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の化合物は、プロドラッグ型治療剤である。この治療剤は、オリゴペプチドに直接的又は間接的に結合しており、次にこのオリゴペプチドが安定化基に結合している。この化合物は、ＣＤ１０により切断されることができる。本発明のプロドラッグは、高度の特異的作用、減少した毒性、血清及び血液中での改善された安定性を示し、ＣＤ１０により活性化されるまで、標的細胞には入らないか、入ったとしても最小限である。また、ＣＤ１０又は別のサーモリシン様酵素により切断されることのできる複合体も、本発明に含まれる。
【０００７】
また、本発明は、本発明による化合物と、任意の薬学的に許容される担体、補助剤、媒質等を含む、医薬組成物に関する。診断又はアッセイ用キット等の製品も、記載される。
【０００８】
さらに、治療剤を修飾することによりプロドラッグを生成することにより、プロドラッグを設計する方法及び毒性を減少させる方法が、開示される。このような修飾により、遊離の治療剤と比較して、治療指数が改善される。ＣＤ１０により切断されることのできる好適な配列のオリゴペプチドをスクリーニングする方法は、プロドラッグの設計に利用できる。
【０００９】
さらに、本発明には、本発明のプロドラッグを投与することによる、腫瘍等の病状又は疾患を治療する方法も、含まれる。病状には、ＣＤ１０関連標的細胞が関与している。
【００１０】
いくつかのプロドラッグの製造方法も、本発明に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
略語
ＡＣＮ＝アセトニトリル
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸
Ａｌｌ＝アリル
Ａｌｏｃ＝アリルオキシカルボニル
Ａｍｂ＝４−（アミノメチル）安息香酸
ＡＰＰ＝３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸
ＤＣＣ＝Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｃａｐ＝アミノカプロン酸
ＤＢＮ＝１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン
ＤＢＯ＝１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン
ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン
Ｄｏｘ−ＨＣＬ＝ドキソルビシンの塩酸塩
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＣ＝Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
Ｄｇ＝ジグリコール酸
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
Ｄｎｒ＝ダウノルビシン
Ｄｏｘ＝ドキソルビシン
Ｅｔ2Ｏ＝ジエチルエーテル
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｇｌ＝グルタル酸
ＨＡＴＵ＝Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＨＥＰＥＳ＝ヒドロキシエチルピペリジン
ＨＯＢｔ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＭｅＯＳｕｃ＝メチルヘミスクシニル／メチルヘミスクシネート
ＭＴＤ＝最大耐性量
ＮＡＡ＝３−アミノー４，４−ジフェニル酪酸
Ｎａｌ＝２−ナフチルアラニン
Ｎａｐｈ＝１，８−ナフタレンジカルボン酸
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリジン
Ｎｖａ＝ノルバリン
ＰＡＭ樹脂＝４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル
Ｐｙｇ＝ピログルタミン酸
Ｐｙｒ＝３−ピリジルアラニン
ｒＲＴＯＰ＝組み換えラットＴＯＰ
ＲＴ，ｒｔ＝室温
Ｓｕｃ＝コハク酸／スクシニル
ＴＣＥ＝トリクロロエチル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
Ｔｈｉ＝２−チエニルアラニン
Ｔｈｚ＝チアゾリジン−４−カルボン酸
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
ＴＯＰ＝チメットオリゴペプチダーゼ
【００１２】
本発明には、プロドラッグ型治療剤として説明される化合物が含まれる。この治療剤は、オリゴペプチドに直接的又は間接的に結合されており、このオリゴペプチドは、安定化基に結合されている。必要に応じて、リンカー基が、治療剤とオリゴペプチドとの間に存在していてもよい。オリゴペプチドは、長さにおいて少なくとも３種のアミノ酸であり、好ましくは長さにおいて３〜６種のアミノ酸である。この化合物は、ＣＤ１０酵素により切断されやすいという特徴がある。
【００１３】
プロドラッグ
より詳細には、本発明のプロドラッグは、修飾型治療剤であり、
（１）治療剤、
（２）オリゴペプチド、
（３）安定化基及び
（４）場合によりリンカー基
等のいくつかの部分を含む。
【００１４】
プロドラッグのこれらの各部分を、以下でより詳細に説明する。プロドラッグのこれらの部分の典型的な位置づけは、以下のとおりである：
（安定化基）−（オリゴペプチド）−（任意のリンカー基）−（治療剤）。
【００１５】
安定化基は、オリゴペプチドの第一結合部位で、オリゴペプチドに直接結合している。オリゴペプチドは、オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤に直接的又は間接的に結合している。オリゴペプチド及び治療剤が間接的に結合している場合には、リンカー基が、存在する。
【００１６】
プロドラッグの２つの部分が直接的に結合している場合、これらの２つの部分の間に、共有結合が存在することを意味している。したがって、安定化基及びオリゴペプチドは、オリゴペプチドの第一結合部位、典型的にはオリゴペプチドのＮ末端で、共有化学結合を介して、直接的に結合している。オリゴペプチド及び治療剤が直接的に結合しているときには、オリゴペプチドの第二結合部位で互いに共有結合している。オリゴペプチドの第二結合部位は、典型的にはオリゴペプチドのＣ末端であるが、オリゴペプチドの他の場所でもよい。
【００１７】
プロドラッグの２つの部分が間接的に結合している場合、２つの部分の各々が、リンカー基に共有結合していることを意味する。別の実施態様によれば、プロドラッグは、オリゴペプチドが治療剤に間接的に結合している。したがって、オリゴペプチドは、リンカー基に共有結合しており、このリンカー基が治療剤に共有結合している。
【００１８】
別の実施態様では、プロドラッグの配位を逆にして、安定化基をこれらのオリゴペプチドのＣ末端でオリゴペプチドに結合し、治療剤をオリゴペプチドのＮ末端に直接的又は間接的に結合するようにしてもよい。したがって、別の実施態様によれば、オリゴペプチドの第一結合部位はオリゴペプチドのＣ末端でよく、オリゴペプチドの第二結合部位はオリゴペプチドのＮ末端でよい。治療剤とオリゴペプチドとの間には、リンカー基が場合により存在してもよい。本発明のプロドラッグの別の実施態様は、第一の実施態様と同様に機能する。
【００１９】
本発明のプロドラッグは、典型的にはオリゴペプチド部分内で切断されることができる。プロドラッグが効果的であるためには、プロドラッグは、典型的には生体内で修飾されて、標的細胞に入ることができるプロドラッグの部分を生成する。プロドラッグのオリゴペプチド部分内の第一の切断は、プロドラッグの活性部分、すなわち、標的細胞への輸送に適したプロドラッグの部分を、切断生成物の一つとして残すことができる。別法として、プロドラッグの輸送に適した部分を生じさせるためには、一種以上のペプチダーゼによるさらなる切断が必要なことがある。プロドラッグの活性又は輸送に適した部分は、少なくとも治療剤を有し、且つ標的細胞に侵入して、治療効果を、直接又は標的細胞内でのさらなる転換により示すことができるプロドラッグの部分である。
【００２０】
したがって、化合物は活性部分を有し、この活性部分は、標的細胞と関連した酵素により切断した後の方が、このような切断をする前よりも標的細胞に、もっと侵入することができる。安定化基及びオリゴペプチドの構造は、血液又は非標的組織に存在することができる酵素によるプロドラッグの除去及び代謝作用を制限するように選択され、且つさらに、プロドラッグの細胞への輸送が制限されるように選択される。安定化基は、生体内におけるエクソペプチダーゼによるプロドラッグの切断をブロックし、さらに、プロドラッグの好ましい電荷又は他の物性を賦与するように作用することができる。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、標的細胞に関連する酵素であり、以下でより詳細に説明する、ＣＤ１０により切断されることができるように選択される。異なる長さのオリゴペプチドを有するプロドラッグを、本発明に使用することができるが、少なくとも３種のアミノ酸のオリゴペプチドが好ましく、３〜６種のアミノ酸のオリゴペプチドがとりわけ好ましい。
【００２１】
治療剤、とりわけ抗腫瘍治療剤及び/又は抗炎症治療剤を修飾して、プロドラッグ形態とすることにより、不活性とすることが望ましい。本発明によれば、標的細胞は、通常腫瘍細胞、又は炎症反応に関与、とりわけリウマチ性疾患と関連している炎症反応に関与している、マクロファージ、好中球及び単球等の細胞である。治療剤を修飾してプロドラッグの形態とすると、治療剤の副作用の一部分も減少する。
【００２２】
プロドラッグは、患者に投与され、安定な形態で血流を介して搬送され、標的細胞の付近で、標的細胞関連酵素により認識され、修飾される。酵素活性は、細胞外の正常細胞付近に存在するのは最小限でしかないので、プロドラッグは、活性化されず、その輸送に適した部分（治療剤を含む）が正常細胞に入るのはほんの最小限でしかない。しかしながら、腫瘍又は他の標的細胞付近では、局部的環境において関連酵素の存在量が増加するので、プロドラッグの切断が生じる。プロドラッグ形態から修飾され、標的細胞に侵入すると、治療剤（必要に応じて、一つ以上のアミノ酸及びおそらくリンカー基にも結合している）が作用して、標的細胞を殺したり、標的細胞の増殖をブロックする。図２は、典型的なプロドラッグが細胞外で切断され、標的細胞に侵入する例を示している。一旦標的細胞内に入ると、さらに修飾されて治療効果を得ることができる。プロドラッグの一部分が、正常細胞に接近したり、損傷させたりすることがあるが、プロドラッグの輸送に適した部分は、標的細胞の付近に主に放出される。したがって、正常細胞に対する毒性を、最小限に抑えることができる。
【００２３】
本発明の化合物は、全身循環及び正常組織において、高安定性、すなわち、活性治療剤の放出レベルが低いので、良好なプロドラッグである。本発明のプロドラッグは、血液中又は正常組織中では顕著には活性化されないけれども、腫瘍部位又は他の標的部位で活性化される。その結果、本発明のプロドラッグは、公知の化合物と比較して、改善された治療指数、改善された毒性プロファイル及び好ましい薬動力学を有している。
【００２４】
特定の理論には限定されないが、ＣＤ１０により認識されることができる特定の配列を有する化合物は、ＣＤ１０酵素又は類似のサーモリシン様酵素により、標的細胞付近で活性化される。ＣＤ１０は、標的細胞寿命サイクルの少なくとも一部分の間、存在する。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様には、ＣＤ１０によりオリゴペプチド部分が切断されることのできるが、チメットオリゴペプチダーゼ（「ＴＯＰ」）による切断には耐性を有する化合物が含まれる。ＴＯPは、ＷＯ００／３３８８８においてより詳細に記載されている種類の酵素に属するものであると思われる。さらなる実施態様によれば、化合物は、好ましくはさらに前立腺特異的抗原（PSＡ）による切断に対する耐性があるという特徴があるオリゴペプチドを含む。このような耐性は、生理学的条件下で測定される。
【００２６】
これについて、化合物は、一定の酵素の精製試料による切断速度が、意図する化合物と同じ治療剤にカルボキシル末端を介して共役しているＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの切断速度の１５％以下、好ましくは５％以下、理想的には１％以下である場合には、切断に対して耐性がある。この速度は、同じアッセイ条件下で比較しなければならない。
【００２７】
化合物と一定の酵素とを、生理学的条件、特に標的細胞の外側のモデルの実験条件下でインキュベーションしたときに、１時間当たり化合物の１０％超、好ましくは１時間当たり化合物の５０％超が切断される場合には、この化合物は、この酵素により切断されることができる。実験条件下での一定酵素の濃度は、標的組織の細胞外環境を示すものでなければならない。
【００２８】
ここで、本発明の化合物は、
（１）標的細胞に侵入できる治療剤と、
（２）式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
（式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す）
で表されるオリゴペプチドと、
（３）安定化基と、
（４）場合によりリンカー基と、
を含み、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、ＣＤ１０により切断されることができる。
【００２９】
好ましくは、ｎは０〜３であり、ｍは０〜３であり、ｍ＋ｎが３以下である。
【００３０】
この化合物は、生理学的条件下でＣＤ１０により切断されることができる。
【００３１】
本発明の化合物は、当該技術分野において具体的に開示されているものを含まない。例えば、ＷＯ００／３３８８８、米国特許第５，９６２，２１６号、ＷＯ００／６９４７２、ＷＯ９８／５２９６６、米国特許第５，５９９，６８６号及び他の刊行物が、関連がある。したがって、前記化合物のオリゴペプチドがＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕであるときには、前記安定化基がスクシニル若しくはβＡｌａではなく、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではない。同様に、前記オリゴペプチドがβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕであるときには、前記安定化基がスクシニルではなく、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではない。前記オリゴペプチドがβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕであるときには、前記安定化基がグルタリルではなく、又は前記治療剤がドキソルビシンではない。さらに、前記化合物が、Ｓｕｃｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、ｐＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｄ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、アセチル−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｄｏｘ、モルホリノカルボニル−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ、Ｎ−グルタリル−（４−ヒドロキシプロリル）−Ａｌａ−Ｓｅｒ−シクロヘキシルグリシン−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｎ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＮ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘからなる群から選択されたものではない。
【００３２】
標的細胞関連酵素
本発明のプロドラッグは、患者の体内の標的部位又はその付近での標的細胞に関連する酵素との相互作用による優先活性化を利用するように設計される。標的細胞関連酵素の全体又は標的細胞関連酵素の少なくとも活性部位が、外側細胞表面と関連しているか、結合している。別法として、標的細胞関連酵素が、標的細胞の細胞外付近において、分泌されるか、放出されるか、又はある他の方法で存在することができる。
【００３３】
従来開示されている標的細胞関連酵素の一つは、ｔｒｏｕａｓｅである。この酵素は、ＷＯ００／３３８８８により詳細に記載されている。ｔｒｏｕａｓｅは、一種の酵素と思われ、チメットオリゴペプチダーゼ（「ＴＯＰ」）が、これに属する。ｔｒｏｕａｓｅは、選択性と切断において、高度の識別性がある。ｔｒｏｕａｓｅは、オリゴペプチドの切断部位のカルボキシル側でロイシンとイソロイシンとの間で著しい差異を示すエンドペプチダーゼである。適切なアッセイ条件下で、ｔｒｏｕａｓｅは、スクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンを容易に切断するが、スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンについては活性が少なくとも２０倍小さいという明確な特徴がある。
【００３４】
本発明に特に関連しているがｔｒｏｕａｓｅ酵素とは異なる、別の標的細胞関連酵素は、ＣＤ１０である。
【００３５】
ＣＤ１０の歴史
ＣＤ１０が最初に報告されたのは、中性ｐＨでの125ヨードインスリンＢ鎖を加水分解できるラットの腎臓の刷子縁膜における活性であった（Ｗｏｎｇ−Ｌｅｕｎｇ等、「Ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ（ラットの腎臓におけるミクロソームペプチダーゼのある特性）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１０：５Ｐ（１９６８））。したがって、この酵素が、腎臓刷子縁中性プロテイナーゼと称された。この酵素は、メタロペプチダーゼであることが判明した  （Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、１０８０−１０８５（１９９８））。ＣＤ１０は、独立してエンケファリンの失活を引き起こす脳膜酵素としても見出された（Ｍａｌｆｒｏｙ等、「Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｍｏｒｐｈｉｎｅ（モルヒネの後で高親和性エンケファリン分解ペプチダーゼが増加する）」、Ｎａｔｕｒｅ、２７６：５２３−５２６（１９７８））。これにより、慣用名エンケファリナーゼが使用されるようになった。また、ＣＤ１０は、一般的に、文献では、ネプリリシン又は中性エンドペプチダーゼ２４．１１又はＥＣ３．４．２４．１１又はＮＥＰと称されている。酵素のクローニング及び配列決定（Ｄｅｖａｕｌｔ等、「Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−２４．１１（ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅ）  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ（相補ＤＮＡから推定されたウサギ腎臓中性エンドペプチダーゼ−２４．１１（エンケファリナーゼ）のアミノ酸配列）」、ＥＭＢＯＪ，６：１３１７−１３２２（１９８７））により、白血球細胞表面抗原と同一であるとの認識に至った。この抗原は、一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ又はＣＤ１０）であり、プレ−Ｂ細胞白血病群に存在する（ＬｅＴａｒｔｅ等、「Ｃｏｍｍｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｔｏ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（一般的な急性リンパ球性白血病抗原は、中性エンドペプチダーゼと同一である）」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１６８：１２４７−１２５３（１９８８））。
【００３６】
ＣＤ１０の生物学的活性
ＣＤ１０は、実質的に長さが約４０個以下であるアミノ酸のペプチドを加水分解するオリゴペプチダーゼである。但し、一般的に、加水分解効率は、ペプチドの長さの増加とともに減少する。最も効率的に加水分解される基質の一つは、ウンデカペプチド物質Ｐである（Ｍａｔｓａｓ等、「Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎｓ，  ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｂｙ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−２４．１１（神経ペプチドの代謝：エンドペプチダーゼ−２４．１１によるエンケファリン、タキキニン及びそれらの類似物を含むペプチドの加水分解）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２２３：４３３−４４０（１９８４））。生体内での主要な基質は、エンケファリン、タキキニン、例えば、物質Ｐ、及び心房性ナトリウム利尿ペプチドファミリーであると思われる。
【００３７】
文献によれば、主要な特異性要件は、Ｐ１’位置におけるバルク疎水性残基であり、この酵素は、通常エンドペプチダーゼとして機能する。Ｐ１’位置におけるＬｅｕは最高の加水分解速度を示すが、一方、Ｐｈｅは最低のＫｍ値を示す。文献における最小の確認された基質は、化学走化性ペプチドホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅである。これは、Ｍｅｔ-|-Ｌｅｕ結合で切断が生じる（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ等、「Ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２４．１１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ヒト好中における中性エンドペプチダーゼ２４．１１：化学走化性ペプチドの切断）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：７１０３−７１０７（１９８５））。
【００３８】
この酵素は、少なくとも４個のアミノ酸側鎖を収容する長い活性部位を有する。ＣＤ１０による加水分解を効率的にするコンセンサス配列は、−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ-|-Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−（Ａｌａ）−（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  １０８０−１０８５（１９９８））として提案されている。ある基質の場合、ＣＤ１０は、例えば、［Ｌｅｕ］−エンケファリン：Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ-|-Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ｋｃａｔ／Ｋｍ４３．９分−１ｍＭ−１）の加水分解において、ペプチジル−ジペプチダーゼ形質を示す。［Ｌｅｕ］−エンケファリンのＣ末端アミド化誘導体の加水分解効率は、はるかに低い（（ｋｃａｔ／Ｋｍ１．７分−１ｍＭ−１）。これは、［Ｌｅｕ］−エンケファリンにおける遊離Ｃ末端カルボキシレート基と、酵素の活性部位におけるアルギニル残基（Ａｒｇ１０２）との相互作用を反映している（Ｂａｔｅｍａｎ等、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｉｎ  ｒａｔｅ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２４．１１  （ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅ）  ａｓ  Ａｒｇ  １０２  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  １０２  ｍｕｔａｎｔ（速度による中性エンドペプチダーゼ２４．１１（エンケファリナーゼ）の活性部位アルギニン、Ａｒｇ１０２の同定及びグルタミン１０２突然変異体の分析）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４：６１５１−６１５７（１９８９））。他の生物学的に活性な基質の切断の位置の例として、物質Pについては、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ-|-Ｐｈｅ-|-Ｐｈｅ−Ｇｌｙ-|-Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2がある。この場合、加水分解のコンセンサス配列と一致するＧｌｙ-|-Ｌｅｕ結合で、加水分解速度が最も高い。ニューロテンシンでは、以下の加水分解部位がみられる：Ｐｙｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ-|-Ｔｙｒ-|-Ｉｌｅ−Ｌｅｕ。コレシストキニン−８では、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ-|-Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ-|-Ｐｈｅ−ＮＨ2である。合成基質及び天然ペプチドについてのＫｍ値は、通常１０μＭ〜１ｍＭの範囲である。
【００３９】
文献によれば、ＣＤ１０の最適ｐＨは、６．０である（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  １０８０−１０８５  （１９９８））。ＣＤ１０は亜鉛キレート化試薬により阻害され、酵素の種々の合成阻害剤が設計された。そのうちで最初のものが、チオルファン（［ＤＬ−３−メルカプト−２−ベンジルプロパノイル］−グリシン）であった。
【００４０】
ＣＤ１０の構造化学
ＣＤ１０は、原形質膜タンパク質のＩＩ型一体膜タンパク質である。これは、タンパク質の大部分とともに外酵素として存在し、活性部位を含み、細胞外空間に向いている。ＣＤ１０は、２３アミノ酸Ｎ末端細胞質領域と、２８アミノ酸膜スパニング領域と、活性部位を有する約７００アミノ酸細胞外領域とから構成されている（Ｌｉ等、「Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ：  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ネプリリシン：アッセイ法、精製及び特徴付け）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２４８：２５３−２６３（１９９５））。ＣＤ１０は、１つのサブユニット当たり１モルの亜鉛を含有している。鎖内ジスルフィド結合は、構造及び活性の維持のために重要である。ＣＤ１０のＭｒは、組織源によって、約８５０００〜１０００００の範囲である。組織源によって異なるのは、グリコシル化の差異による。ｃＤＮＡクローニングにより、ウサギ酵素、ラット酵素及びヒト酵素が、それぞれ７５０個のアミノ酸ポリペプチド、７４２個のアミノ酸ポリペプチド及び７４２個のアミノ酸ポリペプチドからなることが、明らかとなった（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  １０８０−１０８５  （１９９８））。
【００４１】
ＣＤ１０は、種に応じて、５又は６のＮ結合グリコシル化部位で高度にグリコシル化される。酵素の他のポストトランスレーショナル修飾はないように思われ、また、天然循環阻害剤も同定されなかった。染色体領域３ｑ２１−ｑ２７に位置するＣＤ１０遺伝子は、単一のコピーに存在し、スパンが８０ｋｂ超であり、２４のエクソンからなり、哺乳動物種の間に高度に保存されている（Ｂａｒｋｅｒ等、「Ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｍａｐｓ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ３（ｑ２１−ｑ２７）（染色体領域３（ｑ２１−ｑ２７）に対する一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原マップ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４２：２８３−２８７（１９８９））。
【００４２】
ＣＤ１０のＣ末端領域は、数多くの亜鉛ペプチダーゼに典型的であるＨＥＸＸＨ亜鉛結合モチーフを含んでいる。このモチーフにおけるヒスチジン（ウサギ配列におけるＨｉｓ５８３及び５８７）は、第三の亜鉛リガンドとしての役割を果たす位置６４６でのグルタメートとともに、亜鉛リガンドのうちの２つを構成している。Ｇｌｕ５８４は、触媒作用にとって欠くことができない。
【００４３】
ＣＤ１０の生態
ＣＤ１０は、広い組織分布を示すが、酵素活性は異なる組織間で全く異なる。腎臓は最高のＣＤ１０濃度を有することが分かった。この酵素は、主に腎臓尿細管の刷子縁膜上に位置する（Ａ．Ｊ．Ｋｅｎｎｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１，４０（１９８６））。
【００４４】
相対的に高い濃度のＣＤ１０が、腸、リンパ節及び胎盤の刷子縁上皮細胞の膜において見出される。一方、顕著なレベルの酵素が、胃、小腸及び結腸における筋細胞に局在化している(Ａ．Ｊ．Ｋｅｎｎｙ，Ｓ．Ｌ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ及びＡ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒによる「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｃｔｏｅｎｚｙｍｅｓ（哺乳動物の外酵素）」（Ａ．Ｊ．Ｋｅｎｎｙ及びＡ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ編）、ｐ１６９、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８７）)。ＣＤ１０は、副腎、睾丸、前立腺、線維芽細胞、好中球及び肺において、より低濃度で見出される（Ａ．Ｊ．Ｋｅｎｎｙ，Ｓ．Ｌ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ及びＡ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒによる「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｃｔｏｅｎｚｙｍｅｓ（哺乳動物の外酵素）」（Ａ．Ｊ．Ｋｅｎｎｙ及びＡ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ編）、ｐ１６９、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８７）；Ｎ．Ｓａｌｅｓ，Ｉ．Ｄｕｔｒｉｅｚ，Ｂ．Ｍａｚｉｅｒｅ，Ｍ．Ｏｔｔａｖｉａｎｉ及びＢ．Ｐ．Ｒｏｑｕｅｓ，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．３３，２０９（１９９１））。上気道において、酵素は、上皮細胞、粘膜下腺の漿液細胞及び血管壁において生じると考えられる（Ｊ．Ｎ．Ｂａｒａｎｉｕｋ，Ｋ．Ｏｈｋｕｂｏ，Ｏ．Ｊ．Ｋｗｏｎ，Ｊ．Ｍａｋ，Ｊ．Ｒｏｈｄｅ，Ｍ．Ａ．Ｋａｌｉｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｄｕｒｈａｍ及びＰ．Ｊ．Ｂａｒｎｅｓ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４，２７２（１９９３））。ヒト子宮内膜にＣＤ１０がみられる（間質細胞に限られる）ことは、排卵周期を調節する役割を果たしている可能性のあることを示唆している（Ｍ．Ｌ．Ｃａｓｅｙ，Ｊ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｎａｇａｉ，Ｌ．Ｂ．Ｈｅｒｓｈ及びＰ．Ｃ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３０４１（１９９１）；Ｊ．Ｒ．Ｈｅａｄ，Ｐ．Ｃ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ及びＭ．Ｌ．Ｃａｓｅｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７６，７６９（１９９３））。
【００４５】
哺乳動物の脳において、ＣＤ１０は、脈絡叢、黒質、尾状核、淡蒼球、嗅結節、側坐核及び脊髄の膠様質において、比較的高濃度でみられた。また、酵素が、ラット及びヒト脊髄の髄膜においても検出された（Ｇ．Ｗａｋｓｍａｎ，Ｒ．Ｂｏｕｂｏｕｔｏｕ，Ｊ．Ｄｅｖｉｎ，Ｒ．Ｂｅｓｓｅｌｉｅｖｒｅ，Ｍ．Ｃ．Ｆｏｕｒｎｉｅ−Ｚａｌｕｓｋｉ及びＢ．Ｐ．Ｒｏｑｕｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３１，２６２（１９８５）；Ｊ．Ｍ．Ｚａｊａｃ，Ｙ．Ｃｈａｒｎａｙ，Ｊ．Ｍ．Ｓｏｌｅｉｌｈａｃ，Ｎ．Ｓａｌｅｓ及びＢ．Ｐ．Ｒｏｑｕｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１６，１１８（１９８７））。
【００４６】
ＣＤ１０の精製
ＣＤ１０は、膜からの酵素を界面活性剤処理により可溶化した後に、モノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーを適用することにより、精製できる。通常のクロマトグラフィー法も、ＣＤ１０の精製に適用された。組み換えネプリリシン、すなわち、ＣＤ１０の大規模発現及び精製が、バキュロウイルス感染昆虫細胞系から得られた。精製方法は、さらにＬｉ等、「Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ：Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ネプリリシン：アッセイ方法、精製及び特徴付け）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２４８：２５３−２６３（１９９５）に記載されている。
【００４７】
ＣＤ１０のアッセイ
マイクロタイタープレートアッセイに適用できるＣＤ１０用の特に都合がよく且つ感度のよい２段階アッセイでは、カップリング酵素としてのＳ．ｇｒｉｓｅｕｓアミノペプチダーゼの存在下で基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ-|-Ｌｅｕ−ＮＨＰｈＮｏ2を使用する（Ｉｎｄｉｇ等、「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  （ＥＣ  ３．４．２４．１１）  ａｎｄ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  （ＥＣ  ３．４．２４．４）  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（新規な２段階反応を用いた中性エンドペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．１１）及び中性プロテイナーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．４）の調査）」、ＦＥＢＳ，２５５：２３７−２４０（１９８９））。ＣＤ１０によるＬｅｕ−ＮＨＰｈＮｏ2の放出の後に、４−ニトロアニリン脱離基のアミノペプチダーゼ放出が生じる（これは、４０５ｎｍで観察できる）。
【００４８】
ＣＤ１０活性を理解するのに使用される、多数の他のアッセイ方法がある。これらには、トリチウム化したエンケファリン誘導体の加水分解を測定する放射アッセイ、蛍光体を含有する合成ペプチドの加水分解に続いての蛍光アッセイ、及び内部クエンチ基質の切断に続いてのアッセイなどがある（Ｌｉ等、「Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ：Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ネプリリシン：アッセイ法、精製及び特徴付け）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２４８：２５３−２６３（１９９５））。
【００４９】
標的細胞におけるＣＤ１０
ＣＤ１０は、リンパ前駆体細胞、胚中心Ｂリンパ球及びある種の骨髄球により発現され、したがって、急性白血病の分類及び悪性リンパ腫の下位分類のために、細胞表面マーカーとして広く使用されている。ＣＤ１０は、胃腸管及び尿生殖路の癌腫並びにある種の肉腫において広く発現され、これらの腫瘍の鑑別診断のためのマーカーとして有用なことがある（Ｃｈｕ等、「Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１０  ｉｎ  ５０５  Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓａｒｃｏｍａ（５０５非造血新生物におけるＣＤ１０のパラフィン切片検出：腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現）」、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１１３：３７４−３８２（２０００））。
【００５０】
ＣＤ１０抗原が、前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病と広く関連していることが分かった（Ｇｒｅａｖｅｓ等、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  （ｇｐ１００）  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｉｅｒ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ（未成熟リンパ細胞及びそれらの悪性対応物についての一般的な急性リンパ芽球性白血病（ｇｐ１００）抗原の選択的発現）」、Ｂｌｏｏｄ，６１：６２８−６３９（１９８３））。また、ＣＤ１０は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病とも関連している（Ｗｅｉｓｓ等、「Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ２６  ｃａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（リンパ芽球性リンパ腫：Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病と比較した、２６症例の免疫表現型の研究））」、Ｂｌｏｏｄ，６７：４７４−４７８（１９８６））。
【００５１】
ＣＤ１０は、泌尿生殖路の新生物、例えば、腎細胞癌、移行上皮癌及び前立腺癌（Ｃｈｕ等、「Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１０  ｉｎ  ５０５  Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓａｒｃｏｍａ（５０５非造血新生物におけるＣＤ１０のパラフィン切片検出：腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現）」、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１１３：３７４−３８２（２０００））において広く発現する。また、子宮内膜間質部肉腫、横紋筋肉腫、膵臓腺癌、神経鞘腫及び悪性黒色腫は、ＣＤ１０について陽性である（Ｃｈｕ等、「Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１０  ｉｎ  ５０５  Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓａｒｃｏｍａ（５０５非造血新生物におけるＣＤ１０のパラフィン切片検出：腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現）」、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１１３：３７４−３８２（２０００））。ＣＤ１０は、高分化型結腸腺癌、膵臓腺癌及び前立腺癌の悪性腺細胞の先端面に明確に限定されたが、一方、低高分化型腺癌及び他の腫瘍、例えば、黒色腫、移行上皮癌、腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫においては、ＣＤ１０は、明確にびまん性細胞形質又は膜質／Ｇｏｌｇｉパターンを示した（Ｃｈｕ等、「Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１０  ｉｎ  ５０５  Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓａｒｃｏｍａ（５０５非造血新生物におけるＣＤ１０のパラフィン切片検出：腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現）」、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１１３：３７４−３８２（２０００））。
【００５２】
基質特異性
文献には、ＣＤ１０についての好ましい基質に関するいくつかの手がかりが含まれている。２つの研究（Ｐｏｚｓｇａｙ等、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｆｒｏｍ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ（腎膜画分からのサーモリシン様中性メタロエンドペプチダーゼの基質及び阻害剤の研究。バクテリアサーモリシンとの比較）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：１２９２−１２９９（１９８６）及びＨｅｒｓｈ等、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｂｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２４．１１  （Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅ）  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ（哺乳動物中性エンドペプチダーゼ２４．１１（エンケファリナーゼ）のサブサイト位特異性のバクテリア中性エンドペプチダーゼサーモリシンとの比較）」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６１：６４３３−６４３７（１９８６））は、ＣＤ１０の基質特異性を詳細に記載している。これらの刊行物の両方とも、本明細書中に援用する。これらの２つの刊行物において得られている基質特異性の結果を、以下に簡単にまとめて示す。
【００５３】
ＣＤ１０に最適な基質は、
式ＡＡP3−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−ＡＡP2’−ＡＡP3’
｛式中、
ＡＡP3は、Ｐｈｅ又はＡｌａであり、
ＡＡP2は、Ｐｈｅであり、
ＡＡP1は、Ｇｌｙ又はＡｌａであり、
ＡＡP1’は、Ｐｈｅ又はＬｅｕであり、
ＡＡP2’は、Ｌｅｕであり、そして
ＡＡP3’は、Ａｌａである。｝
で表される、オリゴペプチドであろう。文献によれば、これらの残基のうち、P３’位は、最も重要性が小さい。
【００５４】
この膜結合メタロエンドペプチダーゼの主要な特異性は、疎水性アミノ酸残基のアミノ側のペプチド結合にある。他のプロテアーゼと同様に、この酵素は、少なくとも４個のアミノ酸残基を収容する長い基質結合部位を有している。酵素の活性部位は、明らかにＳ１’サブサイトに、疎水性アミノ酸残基の側鎖と相互作用する疎水性ポケットを有している。
【００５５】
回転率定数（ｋｃａｔ）及び特異性定数（ｋｃａｔ／ｋｍ）は、Ｐ１’におけるＧｌｙ残基を、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えると、大きく増加する。したがって、Ｇｌｙ残基をＬｅｕにより置き換えると、回転率定数が１４０倍増加し、特異性定数が３７０倍増加する。しかしながら、文献で報告されている実験によれば、Ｌｅｕ残基をＰｈｅ残基に置き換えたり、さらにＴｙｒ残基により置き換えると、これらのパラメータが減少する。
【００５６】
酵素のS１’サブサイトでの疎水性ポケットに結合している残基を変更した基質を用いた得られた運動パラメータから、Ｐ１’にＬｅｕ残基が存在すると最高のｋｃａｔが得られ、一方、Ｐｈｅ残基では、Ｋｍが最低となることが、あきらかとなった。ＴｙｒによるＰｈｅ残基の置換により、Ｋｍが著しく増加するとともに、回転率定数が減少した。
【００５７】
Ｐ１’位にＰｈｅ残基が存在すると、Ｐ２’位に存在する残基の種類とは無関係に、回転率定数が顕著に減少した。このことは、Ｓ１’サブサイトに結合する残基には、サイズについて明確な制限があることを示唆している。確かに、この位置にＡｌａ残基を有する基質で、最高の反応速度が得られた。P１’位にＰｈｅ残基を有する場合、Ｋｍ値が最低であった。このことは、この残基により、最高の結合親和力が得られることを示唆している。
【００５８】
P１’サブサイトでは、アミノ酸置換の効果が、主にｋｃａｔ、ひいてはｋｃａｔ／Ｋｍに反映される。この位置にＡｌａ残基が存在すると、Ｇｌｙ又はＰｈｅに対してｋｃａｔ値が８倍及び３．５倍高くなる。この位置におけるＤ−アミノ酸の置換により、未反応基質が生じる。酵素とのＰ１’相互作用には、強い疎水性相互作用はない。
【００５９】
P２’位置がＰｈｅ残基である場合には、酵素についてのＫｍ値は低かった。また、この残基を有する基質では、P1'位置をＡｌａ残基又はＧｌｙ残基で置き換えたときに、高反応速度と低Ｋｍ値の両方が得られた。
【００６０】
酵素のP２’サブサイトにおけるアミノ酸置換の主要な効果は、Ｋｍに反映され、Ａｌａよりも、Ｌｅｕの結合が３倍強く、Ｇｌｙの結合が３倍弱い。P２’での酵素の疎水性相互作用は、P1’相互作用に影響をおよぼさず、したがって、Ｋｍに直接に反映される。P２’位での結合相互作用は、Ｐｈｅ及びＡｌａがＧｌｙに対してＫｍ値が４倍低いことから分かるように、疎水性相互作用を伴うと思われる。酵素におけるP２’位におけるＤ−Ａｌａ残基は、触媒作用に大きくは影響しない。Ｄ−Ａｌａ残基は、この位置に受容されることができ、その結果ｋｃａｔ値が最大となる。
【００６１】
蛍光発生基質ダンシル−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−（ｐＮＯ2）Ｐｈｅ−Ｇｌｙは、この酵素により、かなりの速度で加水分解される。酵素は、遊離酸において、そのアミドに対するよりも結合が、８〜９倍増加する。この知見は、酵素に対する基質の結合は、部分的には、疎水性サブサイト相互作用だけでなく、比較的強力な遊離ＣＯＯＨ末端カルボキシル基との静電的相互作用にも依存していることを示唆している。このイオン性相互作用は、ＣＯＯＨ末端に対してよりも、基質の切断を優先するものでなければならない。
【００６２】
本発明のプロドラッグの活性化に関与している酵素は、標的細胞の外膜と関連していると思われるが、循環において極めて低レベルでしかみられない。酵素が、標的細胞自体により生成されるか、又は標的細胞と関連する正常細胞、例えば、白血球、間質細胞、Ｂ細胞、好中球又はマクロファージにより生成されている可能性が、最も高い。ここで、用語「白血球」は、リンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞等を含む。したがって、例えば、標的細胞関連酵素は、標的細胞の細胞外付近に何らかの他の方法で存在すると思われる。多くの場合、本発明のプロドラッグは、癌の治療用の治療剤を含み、標的細胞は腫瘍細胞である。したがって、酵素は、細胞膜の外の腫瘍細胞に結合してもよいし、酵素は、酵素を発現する腫瘍関連細胞のため、細胞外に存在していてもよい。
【００６３】
本発明の酵素により優先的に切断され且つ他のエンドペプチダーゼによる体内のいずれかの場所での切断には耐性を有する化合物が、とりわけ有用である。なんらかの検出可能な割合で小さなペプチドを切断することが知られており、且つ本発明のプロドラッグの過剰又は不適切な活性化を生じることのある他の酵素には、ＴＯＰ、ＰＳＡ及びマトリックスメタロプロテイナーゼなどがある。ＣＤ１０により切断されることができるが、ＴＯＰ酵素による切断に対しては耐性がある化合物が、とりわけ有用である。ＣＤ１０により切断されることができるが、ＴＯPによる切断には耐性のある化合物としては、例えば、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘがある。
【００６４】
また、ＣＤ１０により切断されることができるが、前立腺特異的抗原（PSＡ）による切断には耐性がある化合物も、有用である。これらの種類の化合物の例として、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘも挙げられる。
【００６５】
安定化基
プロドラッグの重要な部分は、安定化基である。安定化基は、プロドラッグ化合物を患者に投与したときに、プロドラッグ化合物が循環血液中で切断されないように保護する役割を果たす。したがって、プロドラッグは、比較的無傷で標的細胞の付近に到達できる。安定化基は、血液、血清及び正常組織に存在するプロテイナーゼ及びペプチダーゼによってプロドラッグが切断されないように保護する。安定化基は、典型的にはオリゴペプチドのＮ末端をキャッピングしており、したがって、Ｎキャップ又はＮブロックと称されることがある。したがって、安定化基は、安定化基がないとプロドラッグが感受性を有することがあるペプチダーゼを避ける役割を果たす。
【００６６】
理想的には、安定化基が、一定のアッセイ条件下で、ヒト血液にプロドラッグ化合物を３７℃で２時間保存することにより試験したときに、プロドラッグが分解、すなわち、切断されないように保護する役割を果たし、ヒト血液に存在する酵素によるプロドラッグの切断率が２０％未満、好ましくは２％未満であるときに、安定化基は、本発明のプロドラッグにおいて有用である。
【００６７】
より詳細には、安定化基は、
（１）アミノ酸以外であるか、
（２）（ｉ）非遺伝的にコードされたアミノ酸又は（ｉｉ）アスパラギン酸のβ−カルボキシル基又はグルタミン酸のγ−カルボキシル基でオリゴペプチドのＮ末端に結合したアスパラギン酸又はグルタミン酸であるアミノ酸、
である。
【００６８】
例えば、ジカルボン酸（若しくは高次カルボン酸）又はその薬学的に許容される塩を、安定化基として使用できる。２個を超えるカルボン酸を有する化学ラジカルも、プロドラッグの一部として可能であるので、ジカルボン酸（若しくは高次のカルボン酸）を有する末端基は、典型的なＮキャップである。したがって、Ｎキャップは、アミドがペプチドのアミノ末端に結合し、残りのカルボン酸が遊離しており、未結合である、２つ以上のカルボン酸を含む化学ラジカルのモノアミド誘導体であることができる。この目的には、Ｎキャップは、好ましくはコハク酸、アジピン酸、グルタル酸又はフタル酸であり、コハク酸及びアジピン酸が最も好ましい。本発明のプロドラッグ化合物において有用なＮキャップの他の例には、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピログルタミン酸、酢酸、１−ナフチルカルボン酸、２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシケイ皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、（PＥＧ）n類似物、例えば、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸、マレイン酸、ニペコチン酸及びイソニペコチン酸などがある。
【００６９】
さらに、以下に列挙するもののうちの一つ等の非遺伝的にコードされたアミノ酸も、安定化基として使用できる：β−アラニン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２−チエニルアラニン、２−ナフチルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−アミノメチル安息香酸及びアミノイソ酪酸。
【００７０】
さらに、ある実験では、凝集している正に帯電したプロドラッグをマウスに血管内投与すると、急性毒性が生じた。しかしながら、このプロドラッグ上の電荷を、負に帯電した安定化基での誘導化により逆にしたときには、このような毒性は観察されなかった。
【００７１】
数多くの細胞障害化合物は、固有的に溶解度が低い。例えば、正に帯電したアントラサイクリンは、高濃度で凝集物を形成することがあり、これらの凝集物が、静脈内投与されたときに、静脈内凝固が生じることがある。数多くのオリゴペプチドを生理的ｐＨで露出した正帯電アミノ末端を有するので、これらの凝集物は、生体内で多正帯電表面を形成することがあり、投与から数分内で凝固カスケードを生じる。このため、凝集物を形成する正に帯電したプロドラッグが、治療用途に不適当となる可能性がある。
【００７２】
ＷＯ００／３３８８８においてより詳細に記載されているように、このような危険な可能性のある障害に対処する一つの方法に、負に帯電しているか、又は中性の官能性のペプチド鎖Ｎ末端に安定化基を利用することがある。例えば、プロドラッグの安定化基としてスクシニルを使用すると、プロドラッグの急性毒性を軽減することができる。これにより、ヒトにおける静脈内投与のための実用的な治療としてペプチドプロドラッグを使用する際の重要な問題を解決できる。
【００７３】
オリゴペプチド
オリゴペプチドは、一般的に短鎖長、典型的にアミノ酸２０個以下のポリペプチドとして定義される。本発明のプロドラッグに有用なオリゴペプチドは、長さが少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは長さが３〜６個のアミノ酸である。しかしながら、上記範囲を超える長さのオリゴペプチドも、有用である。
【００７４】
ナンバリングスキーム
本発明によれば、プロドラッグのオリゴペプチド部分は、式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）mで表される。この式において、ｎ及びｍは、整数である。ここで、整数は、いずれかの正の自然数又はゼロである。オリゴペプチドは、長さが３個以上のアミノ酸である。好ましい実施態様によれば、ｎは０〜３の整数であり、ｍは０〜３であり、ｍ＋ｎが３以下である。したがって、好ましいオリゴペプチドは、長さが３〜６個のアミノ酸である。上記式における各ＡＡは、独立してアミノ酸を表す。一定のアミノ酸には、上付き文字を付して表し、ＣＤ１０による切断部位に対する位置を示す。特に、ＣＤ１０は、アミノ酸のＰ１位、すなわち、ＡＡP1と、アミノ酸のＰ１’位、すなわち、ＡＡP1’との間で切断する。
【００７５】
オリゴペプチドは、右をカルボキシル末端（すなわち、Ｃ末端）、左をアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）とする従来の方法で記載する。
【００７６】
本発明のオリゴペプチドでは、ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表す。ＡＡP1も、いずれかのアミノ酸を表し、ＡＡP1’についても、同様である。オリゴペプチドのコアＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’部に結合して、追加のアミノ酸が存在していてもよい。一般的に、ＡＡP2又はＡＡP1’に０〜３個の追加のアミノ酸が結合しているが、３個を超えるアミノ酸が結合することも、可能である。これらの追加のアミノ酸は、上記式において、（ＡＡ）n又は（ＡＡ）mとして表される。（ＡＡ）n又は（ＡＡ）mにより表されるものにおける各ＡＡも、独立してアミノ酸を表す。したがって、ｍ＝１であるとき、（ＡＡ）mは、ＡＡm=1を表し、ＡＡm=1は、ＡＡP1’に結合している。そのとき、ＡＡm=1は、P２’位にあり、ＡＡP2’により表すことができる。ｍ＝２であるとき、（ＡＡ）mは、ＡＡm=1−ＡＡm=2を表し、ＡＡm=1は、P２’位にあり、ＡＡm=2はP３’位にあり、ＡＡm=1は、ＡＡP1’に結合している。ｍ＝３であるとき、（ＡＡ）mは、ＡＡm=1−ＡＡm=2−ＡＡm=3を表し（すなわち、ＡＡP2’  ＡＡP3’  ＡＡP4’）、ＡＡm=1は、ＡＡP1’に結合している。同様に、ＡＡn=1又はＡＡn=2−ＡＡn=1又はＡＡn=3−ＡＡn=2−ＡＡn=1が存在していもよく、この場合、ＡＡn=1は、ＡＡP2に結合しており、ＡＡP3を表す。したがって、ＡＡn=2は、P4位にあり、ＡＡn=3は、P5位にある、等である。
【００７７】
好ましいアミノ酸
特記のない限りは、全てのアミノ酸が、Ｌ配置にある。いずれのアミノ酸がプロドラッグのオリゴペプチド部分に存在してもよいが、一定のアミノ酸が好ましい。
【００７８】
特に、ＡＡP1は、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択されたものが好ましい。
【００７９】
同様に、ＡＡP1’は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択されたものが好ましい。ＡＡP1’は、好ましくは疎水性アミノ酸である。
【００８０】
本発明のある実施態様によれば、特定のＡＡP1−ＡＡP1’対が好ましい。具体的には、ＡＡP1−ＡＡP1’の組み合わせは、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｉｌｅ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｔｙｒ、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ及びＳｅｒ−Ｌｅｕからなる群から選択されるものが好ましい。
【００８１】
疎水性アミノ酸は、好ましくはＡＡP2として存在する。したがって、イソロイシンが、P２位におけるアミノ酸として特に有用である。ｍが１〜３の場合、ＡＡm=1は、好ましくは疎水性アミノ酸でもよい。
【００８２】
例えば、以下のアミノ酸配列が、ＣＤ１０切断可能配列の少なくとも一部分としてオリゴペプチドに存在してもよい：βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ。
【００８３】
治療剤
修飾してプロドラッグ形態とするのに特に有利である治療剤は、治療濃度域が狭いものである。治療濃度域が狭い薬剤又は治療剤は、一般的な医療水準により毒性が明らかである投与量が、効力が明らかである投与量に極めて近いものである。
【００８４】
安定化基及びオリゴペプチド並びに場合によりリンカー基に結合して本発明のプロドラッグを形成する治療剤は、癌、炎症性疾患又はある種の他の病状の治療に有用である。好ましくは、治療剤は、以下の種類の化合物から選択されたものである：アルキル化剤、増殖防止剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド類、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン薬剤群、タキサン類、アントラサイクリン類、ドラスタチン、トポイソメラーゼ阻害剤、白金配位錯体化学療法剤及びメイタンシノイド。
【００８５】
特に、治療剤は、以下の化合物又はそれらの誘導体若しくは類似物から選択したものが有利である：ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、カリーチアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、硫酸エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ＫＷ−２１８９、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、メトプテリン（Ｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、アミノプテリン（Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、ジクロロメトトレキサート（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エピチオロン（Ｅｐｉｔｈｉｏｌｏｎｅ）、コンブレタスタチン（Ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、コンブレタスタチンＡ4リン酸塩（ＣｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎＡ4Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ドラスタチン１０（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １０）、ドラスタチン１１（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １１）、ドラスタチン１５（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １５）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、ポルフィロマイシン（Ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６−メルカプトプリン（６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、アデノシンアラビノシド（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ハリコンドリンＢ（Ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉｎ  Ｂ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ）及びメイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）。ここで、誘導体とは、記載の化合物と、別の化学的部分とを反応させることにより得られる化合物であり、記載の化合物の薬学的に許容される塩、酸、塩基又はエステルなどがある。類似物とは、記載の化合物と類似の構造的及び機能的性質、例えば、生物活性を有する化合物のことである。
【００８６】
リンカー基
オリゴペプチドと治療剤との間にリンカー基が存在すると、以下の理由で有利なことがある：
１．治療剤に結合したアミノ酸の酵素的放出又は他の酵素的活性工程を容易にするための、立体的な面からのスペーサーとして。
２．治療剤とオリゴペプチドとの間の適切な結合化学反応を可能とする。
３．プロドラッグ複合体を製造する際の合成プロセスを改善する（例えば、結合前にリンカー基を用いて、治療剤又はオリゴペプチドを予備誘導して収率又は特異性を高めることにより）。
４．プロドラッグの物性を改善する。
５．薬剤の細胞内放出のさらなる機構を提供する。
【００８７】
リンカーの構造は、必要とする官能性により決まる。可能なリンカー化学物質として、例えば、ヒドラジド、エステル、エーテル及びスルフィドリルが挙げられる。アミノカプロン酸は、二官能リンカー基の一例として挙げられる。アミノカプロン酸をリンカー基の一部として使用するとき、オリゴペプチドの番号付けでは、アミノ酸としてカウントしない。
【００８８】
プロドラッグの設計
プロドラッグの設計方法は、本発明の別の態様を構成し、最初に上記した本発明のオリゴペプチドを同定することを必要とする。次に、オリゴペプチドを、オリゴペプチドの第一結合部位で、安定化基に結合させる。安定化基は、全血に存在する酵素によるオリゴペプチドの切断を阻害する役割を果たす。オリゴペプチドは、オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤と直接的又は間接的に結合する。第一結合部位は、通常オリゴペプチドのＮ末端であるが、オリゴペプチドのＣ末端又はオリゴペプチドの別の部分であってもよい。第二結合部位は、通常オリゴペプチドのＣ末端であるが、オリゴペプチドのＮ末端又はオリゴペプチドの別の部分でもよい。治療剤及び安定化基へのオリゴペプチドの結合は、いずれかの順序でおこなってもよいし、同時におこなってもよい。
【００８９】
得られた複合体を、当業者には公知の方法を用いて、ＣＤ１０による切断性について試験してもよい。例えば、複合体を、細胞源から精製したＣＤ１０とともにインキュベーションし、得られた生成物を、実施例２で説明する蛍光検出を用いたＨＰＬＣにより分析することにより、複合体を、ＣＤ１０による切断性について試験してもよい。複合体が、ＣＤ１０により切断されることができる場合には、これをプロドラッグとして選択することができる。
【００９０】
まだ安定化基又は治療剤基に結合していないオリゴペプチドも、複合体の切断性を試験するのに用いられる方法により、ＣＤ１０による切断性について試験してもよい。ＣＤ１０による切断性は、そのオリゴペプチドがプロドラッグを設計するのに使用できるかどうかの候補としての目安となる。
【００９１】
本発明の別の態様によれば、プロドラッグを設計するのに有用なオリゴペプチドを同定するための、スクリーニング方法が提供される。３個以上のアミノ酸からなるオリゴペプチドが、準備され、ＣＤ１０による切断性について試験される。上記したように、ＣＤ１０による切断性は、プロドラッグを設計する際に、そのオリゴペプチドが候補として使用できるかどうかの目安となる。
【００９２】
さらに、ＣＤ１０により切断されることができるが、ＴＯPによる切断に対して耐性があるかどうかの試験をおこなうことが、好ましい。さらには、ＣＤ１０により切断されることができるが、前立腺特異的抗原（PSＡ）の切断に対して耐性があるかどうかの試験をおこなうことが、好ましい。また、得られた複合体を、全血における安定性について試験することもできる。全血において安定な試験化合物が、選択される。また、ＣＤ１０により切断されることができ且つ好ましくは他の酵素による切断に対して耐性を有する化合物を、選択する。このような方法により設計されたプロドラッグも、本発明の一部を構成する。
【００９３】
さらに、本発明によれば、患者に投与しようとしている治療剤の毒性を減少させる方法も提供される。すなわち、治療剤を、ＣＤ１０により切断されることができ且つ好ましくはＴＯP及びPSＡによる切断には耐性があるオリゴペプチドに直接的又は間接的に結合することにより、修飾プロドラッグ型治療剤が形成される。このオリゴペプチドは、安定化基にも結合される。好ましくは、オリゴペプチドは、式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表される。
【００９４】
より好ましくは、ｎは、０〜３であり、ｍは、０〜３であり、ｍ＋ｎは３以下である。
【００９５】
このように形成されたプロドラッグは、患者に投与したときの治療剤の毒性を減少させる。また、この方法により治療剤を修飾することにより、治療剤を、患者に、未結合形態で投与するよりも、治療剤の投与量を増加することもできる。
【００９６】
医薬組成物
また、本発明によれば、本発明による化合物、特にプロドラッグ化合物と、必要に応じて薬学的に許容される担体、例えば、補助剤又は媒質等を含む、医薬組成物も提供される。
【００９７】
より詳細には、本発明によれば、
（１）（ａ）標的細胞に侵入できる治療剤と、
（ｂ）式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるオリゴペプチドと、
（ｃ）安定化基と、
（ｄ）場合によりＣＤ１０により切断されることのないリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、ＣＤ１０により切断されることができる、化合物と、
（２）薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物が、提供される。
【００９８】
好ましくは、化合物の式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）mで表される前記オリゴペプチドにおいて、ｎは０〜３であり、ｍは０〜３であり、ｍ＋ｎが３以下である。
【００９９】
また、本発明は、病状の治療に使用しようとする医薬品を調製するための、医薬組成物の使用に関する。
【０１００】
医薬組成物は、例えば、患者に対して、非経口投与、とりわけ静脈内投与、筋肉内投与又は腹腔内投与により投与できる。非経口投与に用いられる本発明の医薬組成物は、無菌、水性若しくは非水性溶液、懸濁液、乳濁液を含む。薬学的に許容される担体、溶媒又は媒質として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、注射可能な有機エステル、例えば、エチルオレエート又はシクロデキストリンを、用いることができる。等張食塩水も、医薬組成物の一部分を構成してもよい。これらの組成物は、湿潤剤、乳化剤及び/又は分散剤も含有できる。
【０１０１】
殺菌を、いくつかの方法、例えば、細菌フィルターを使用したり、組成物に殺菌剤を含有させたり、照射により、実施できる。また、組成物は、使用時に、滅菌水又は他の滅菌注射可能媒体に溶解することができる、滅菌固体組成物の形態で調製することもできる。
【０１０２】
医薬組成物は、当該技術分野において周知であり（例えば、ビタミンＣ、リンゴ酸、酸化防止剤等）且つ本発明の化合物と組み合わせて使用して、投与目的である病状の治療を改善及び延命できる補助剤を含むこともできる。
【０１０３】
患者に対する本発明による化合物の投与量は、Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ及びＪｅｒｒｙ  Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ編、ＩＳＢＮ０−３９７−５０９００−６（１９９０）に記載されている、この分野で公知の治療剤の、少なくとも通常の投与量でよいし、又は治療する医師の判断で、プロドラッグ剤の優れた有効性の提供又は治療される患者の具体的な状況に応じて調整してもよい。したがって、投与量は、本発明の化合物の調製に使用される治療剤により異なる。
【０１０４】
プロドラッグ化合物による治療
患者に、治療に有効な量の医薬組成物を、好ましくは非経口及びより好ましくは静脈内投与することを含む、病状の治療方法も、本発明の範囲内である。
【０１０５】
したがって、患者の治療方法は、治療に有効な量の本発明の化合物を、患者に投与することを含む。
【０１０６】
プロドラッグ化合物は、一般的に癌、腫瘍性疾患、腫瘍、炎症性疾患及び感染症を含む数多くの病状を治療するのに、有用である。治療するのに好ましい疾患としては、例えば、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌及び膵癌である。より詳細には、いくつかの特定の腫瘍がＣＤ１０に対して陽性であることが確認されたので、ここで教示される化合物を用いてこれらの腫瘍の治療することは、とりわけ有利である。具体的には、以下の腫瘍のうちの一つの治療を、おこなうことができる：Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、メラノーマ、眼メラノーマ、皮膚メラノーマ、直腸腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、移行上皮癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌及び結腸癌。
【０１０７】
薬学的に許容される媒質（例えば、等張食塩水）に配合したプロドラッグ化合物を、動物又はヒトに、１日１回あたり０．０５ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇの範囲で、静脈内投与できる。また、点滴又は他の低速導入法により投与してもよい。
【０１０８】
ヒト患者は、本発明のプロドラッグの通常のレシピエントであるが、動物への使用も可能である。
【０１０９】
本発明によれば、ＣＤ１０関連標的細胞を含む疾患の治療方法であって、
（１）標的細胞に侵入できる治療剤と、
（２）式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるオリゴペプチドと、
（３）安定化基と、
（４）場合によりＣＤ１０により切断されないリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接的に結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、ＣＤ１０により切断されることができる、
化合物の治療に効果的な量を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【０１１０】
好ましくは、ｎは０〜３であり、ｍは０〜３であり、ｍ＋ｎが３以下である。この化合物は、生理条件下、ＣＤ１０により切断されることができる。
【０１１１】
また、本発明によれば、以下で詳細に説明するように、患者における腫瘍等の疾患を治療する方法が提供される。この方法は、標的細胞におけるＣＤ１０を検出する工程と、ＣＤ１０が標的細胞と関連している場合には、ＣＤ１０により切断されることのできるプロドラッグを患者に投与する工程とを含む。検出工程は、さらに患者から組織の試料を得る工程と、この試料をＣＤ１０抗体と混ぜる工程と、ＣＤ１０抗体の試料への結合が生じた場合には測定をおこなう工程とを含む。
【０１１２】
ＣＤ１０で切断されることのできるプロドラッグを腫瘍又は他の標的細胞に投与することを含む、ＣＤ１０陽性腫瘍又は他のＣＤ１０陽性標的細胞を治療する方法も、明確に本発明の範囲内である。ＣＤ１０で切断されることのできるプロドラッグは、上記したように特徴付けられる。また、特に、患者における前立腺癌の治療方法であって、ＣＤ１０により切断されることのできるプロドラッグを患者に投与することを含む方法も、含まれる。このプロドラッグは、一般的に前立腺癌の治療に有用な治療剤を含む。本発明の別の態様によれば、薬剤の製造用として記載されている化合物の、ＣＤ１０関連標的細胞を有する疾患を患っている患者の治療のための使用が提供される。
【０１１３】
上記したように、標的細胞は、ＣＤ１０が、標的細胞によるか、標的細胞と関連する正常細胞、例えば、白血球、間質細胞、Ｂ細胞、好中球又はマクロファージにより生成される場合に、関連するＣＤ１０でよい。したがって、ＣＤ１０は、標的細胞の細胞外膜に結合していてもよいし、又は標的細胞関連細胞がこの酵素を発現するので細胞外に存在していてもよい。
【０１１４】
ヒト腫瘍組織上のＣＤ１０の免疫反応性の、ＣＤ１０陽性腫瘍の診断及び治療における使用
本発明のプロドラッグは、腫瘍における細胞の一部又は全ての上で表面マーカーとしてＣＤ１０を発現する腫瘍の場合に、特に新規な用途に用いられる。ＣＤ１０についての免疫組織化学的染色試薬を、ＣＤ１０で切断されることのできるプロドラッグに対して特定の感受性を有する腫瘍のための診断マーカーとして使用して、治療患者を、事前に選別できる。例えば、腫瘍細胞上でＣＤ１０により、ＣＤ１０で切断されることのできるプロドラッグから放出されるドキソルビシンが局部的に産生されることにより、全ての細胞に無差別に作用すると思われる遊離ドキソルビシンによる治療と比較して、プロドラッグの安全性が相対的に増加すると思われる。
【０１１５】
固形癌又は組織に腫瘍細胞が存在する疑いのある患者は、通常の医療方法により腫瘍の存在を確認した後に、腫瘍組織の生検により、スクリーニングすることができる。標準的な診断モノクローナル抗体を、組織病理学者が通常の方法で使用して、ＣＤ１０の免疫反応性に基づいて、腫瘍を同定及び分類することができる。特に、ヒトＣＤ１０に対するマウスモノクローナル抗体であるクローン５６Ｃ６（英国ニューキャッスルにあるＮｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）は、この目的に広く使用される（Ｓｕｚｕｋｉ等、「Ｉｍｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２４．１１  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ヒト子宮内膜癌における中性エンドペプチダーゼ２４．１１とエンドセリン−１発現とのアンバランス）」、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６０：２５８−２６７（２００１）；及びＣｈｕ及びＡｒｂｅｒ、「Ｐａｒａｆｆｉｎ−ｓｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１０  ｉｎ  ５０５  ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓａｒｃｏｍａ（５０５非造血新生物におけるＣＤ１０のパラフィン切片検出：腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現）」、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１３：３７４−３８２（２０００））。
【０１１６】
腫瘍の小バイオプシーを、免疫組織化学的に以下のように処理できる。バイオプシーを、中性緩衝ホルマリンに固定した後、パラフィンに埋封し、切片（６〜１０ミクロン）を調製することができる。この切片を、脱パラフィン化し、再水和化することができる。熱によるエピトープ検索のために、脱パラフィン化切片を０．０１Ｍクエン酸緩衝液に添加し、電子レンジで処理できる。免疫組織化学的染色は、アビジン−ビオチンイムノペルオキシダーゼ法を用いて実施できる。ヒトＣＤ１０に対するマウスモノクローナル抗体であるクローン５６Ｃ６は、１：２０希釈液として使用できる。マウスＩｇＧ１  ＭＯＰＣ−３１Ｃ抗体は、陰性アイソタイプ適合対照として使用できる。次に、切片を、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色する。ＣＤ１０の免疫反応性は、アイソタイプ対照ではないヒト抗ＣＤ１０対照で処理された組織上のとりわけ陽性細胞の周縁の褐色染色により示される。これらの腫瘍は、ＣＤ１０により切断されやすいプロドラッグでの処理についての標的である。
【０１１７】
同様に、ＣＤ１０について陽性のことがある他の非固形ヒト腫瘍、例えば、バイオプシーされることのできないことがある血液系腫瘍は、免疫化学法によりＣＤ１０の存在によりスクリーニングし、標準的な臨床的フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）法により分析できる。陽性としてスクリーニングされるこのような腫瘍も、ＣＤ１０により切断されることのできるプロドラッグについての標的であろう。Ｒａｍｏｓ（ヒトＢ細胞リンパ腫）細胞系を用いた生体外アッセイから、ＣＤ１０は、この方法により、細胞上で容易に検出されることができることが明らかである。
【０１１８】
診断又はアッセイ
診断又はアッセイ用のキット等の製品も、本発明の範囲内である。このような製品では、好ましくはクマリン等のマーカーを、オリゴペプチド及び安定化基（治療剤の代わり）に結合している以外は、上記した化合物を利用する。使用されるマーカーは、オリゴペプチドに結合されることのできるいずれかの成分として定義され、当該技術分野において公知の方法により容易に検出できる。マーカーの検出に有用である少なくとも一種の試薬が、典型的にキットの一部分として含まれる。すなわち、製品は、以下の構成要素を含む：
（１）（ａ）マーカーと、
（ｂ）式（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるオリゴペプチドと、
（ｃ）安定化基と、
（ｄ）場合によりリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記マーカーに直接的に結合しているか、前記マーカーに前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、ＣＤ１０により切断されることができる、
化合物と、
（２）前記マーカーの検出に有用な少なくとも一種の試薬と、
を含む。
【０１１９】
好ましくは、ｎは、０〜３であり、ｍは、０〜３であり、ｍ＋ｎは３以下である。
【０１２０】
製品は、例えば、患者の試験試料とともに使用して、腫瘍を診断するか、又はプロドラッグ療法による治療が可能な患者を同定することができる。
【０１２１】
プロセス化学の基本手順
オリゴペプチド：ペプチド合成の一般法
本発明のプロドラッグ複合体におけるペプチド（オリゴペプチド）の配列は、固相ペプチド合成（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学反応を用いる）法によるか、又は液相合成により合成できる。一般的なＢｏｃ法びＦｍｏｃ法は、広く使用され、以下の文献に記載されている：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８：２１４９（１９６３）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ペプチド合成の実際）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，７−１６１（１９９４）；並びにＳｔｅｗａｒｔ，「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（固相ペプチド合成）」、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ（１９８４）。
【０１２２】
一般的なＦｍｏｃ固相法
好ましい固相合成法（自動又は手動）を用いて、所望の長さ及び配列のペプチドを、アミノ酸を、固体樹脂に結合している増殖している鎖に段階的に付加することにより合成する。有用なＦｍｏｃ適合樹脂としては、例えば、Ｗａｎｇ樹脂、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂又はヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂などがあるが、これらには限定されない。ペプチド鎖のＣ末端を、高分子樹脂に共有結合し、保護されたα−アミノ酸を、カップリング試薬を用いた段階的方法により付加する。好ましいα−アミノ保護基は、カップリング条件で安定であり且つ穏やかなアルカリ性条件下で容易に除去できるＦｍｏｃ基である。反応溶媒は、好ましくはＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＥｔＯＨであるが、これらには限定されない。カップリング剤としては、例えば、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵがある。Ｎ末端保護基の切断は、ＤＭＦにピペリジンを１０〜１００％添加した溶液中、０〜４０℃でおこなわれる。温度は、周囲温度が好ましい。合成の終わりに、最終的なＦｍｏｃ保護基を、上記のＮ末端切断法を用いて除去する。樹脂上に残存するペプチドを、酸性条件下で樹脂を処理することにより、酸に感受性のある側鎖保護基とともに、樹脂から切断される。例えば、酸性切断条件として、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をジクロロメタンに混合が挙げられる。ヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂を使用する場合には、切断を生じさせるのに好適な波長は、λ３６５ｎｍの紫外線である。このプロセスを図示したものを、図３に示す。
【０１２３】
固相合成による一般的なＮキャップ法
Ｎ末端誘導ペプチドの調製は、通常固相でおこなわれる。ペプチド合成が完了したら、末端のＦｍｏｃを除去する。このとき、ペプチドは、まだ固体の支持体上にある。最適なＮキャップを、次にペプチドのＮ末端上に、標準的ペプチドカップリング条件を用いてカップリングする。Ｆｍｏｃ合成法を使用する場合には、Ｎキャップのカップリング終了後、ペプチドを、上記した方法を用いて樹脂から切断する。
【０１２４】
一般的なＢｏｃ固相法
Ｂｏｃ化学反応を用いた固相方法では、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂又はＰＡＭ樹脂が、有用である。カップリング剤活性化Ｂｏｃ保護アミノ酸を順次付加することにより、アミノ酸を、固相上に増殖している鎖にカップリングする。カップリング剤としては、例えば、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ及びＨＢＴＵがある。反応溶媒は、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ又はＮＭＰでよい。Ｂｏｃ保護基の切断は、ＤＣＭにＴＦＡを１０〜１００％添加した溶液中、０〜４０℃でおこなう。温度は、周囲温度が好ましい。ペプチド鎖アセンブリが完了したら、Ｎ末端保護基（通常Ｂｏｃ）を、上記したようにして除去する。ペプチドを、ジクロロメタン中、液状ＨＦ又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂から除去する。
【０１２５】
液相合成によるＦｍｏｃオリゴペプチドの調製のための基本的手順
別法として、プロドラッグペプチド中間体を、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学反応を利用して、液相合成により製造できる。この方法を示した図（図４）では、Ｃ末端Ｌｅｕテトラペプチドを、一般的に一例として使用されるが、他のどのような長さのＣ末端ペプチドを用いて同様の反応をおこなってもよいことは、理解されるところであろう。ペプチドは、固相法に類似の方法（Ｎ末端方向又はＣ末端方向）によるか、又は例えば、２種の好適な保護ジペプチド又は単一のアミノ酸のトリペプチドのカップリングによる段階的アセンブリにより構築できる。
【０１２６】
液相合成の一つの方法は、図４に示すＦｍｏｃ化学反応を用いたプロドラッグペプチド中間体の段階的構築である。Ｃ末端は、副生成物の形成を減少させるために保護する必要がある。図４におけるＣ末端Ｒ基は、Ｍｅ、ｔＢｕ、ベンジル又はＴＣＥである（ここで、Ｎキャップがメチルスクシニルであるときには、Ｃ末端Ｒ基は、メチルであることはできない）。ＤＭＦを溶媒として用いるが、ＤＭＦの代わりに、他の溶媒、例えば、ＤＭＳＯ、ＣＨ3ＣＮ又はＮＭＰ（又はそれらの混合物）を使用してもよい。増殖ペプチド鎖保護アミノ末端を脱保護する際に、ピペリジンの代わりに、ピリジン、Ｅｔ3Ｎ又は他の塩基を用いてもよい。同様に、ＨＢＴＵを活性化剤として上記図に示してあるが、他の活性化剤、例えば、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢｔ、ＯＳｕ、活性化エステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジドを使用してもよい。さらに、保護されたペプチド酸クロリド又は酸ブロミドを使用して、アミノ酸又はペプチド断片に直接カップリングすることができる。オリゴペプチドアセンブリが完了したら、Ｎ末端を脱保護し、Ｃ末端保護ペプチドは、所望のＮキャップを受容できる状態となる。
【０１２７】
液相合成によるＮキャップドオリゴペプチドの調製のための基本手順
液相合成によりＮキャップドオリゴペプチドを構築するとき、Ｎキャップを、わずかに修正した方法により合成する必要がある（図４）。まず、ＦｍｏｃオリゴペプチドのＣ末端は、Ｎキャップ上のＣ末端の選択的脱保護と適合する酸不安定又は水素添加感受性保護基で保護する必要がある。次に、Ｆｍｏｃ保護基を、オリゴペプチドから除去してＮ末端を露出させる必要がある。Ｎ末端が脱保護され且つＣ末端が保護された状態で、オリゴペプチドを、所望のＮキャップの活性化半エステルと反応させる。Ｎキャップは、塩基及び好適な溶媒中で、ＤＣＣ又はＨＡＴＵ等のアミノ酸を活性化するための方法を用いて、活性化できる。別法として、メチルヘミスクシネートを使用する場合、カップリングは、有機又は無機塩基、例えば、ＤＩＥＡ、トリエチルアミン又はＣｓ2ＣＯ3の存在下、不活性溶媒を用いて、メチルヘミスクシニルクロリド（又は他の酸ハライド）（図４）を介して実施することができる。このような合成の一例として、メチル−ヘミスクシネートとβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステルとの反応が挙げられる。カップリング法は、当該技術分野において一般的に使用されている方法のいずれかであることができる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ペプチド合成の実際），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１８５（１９８４）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ペプチド合成の原理），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１５９（１９８４）参照）。次に、ベンジル基を、接触水素添加により除去して所望のＮキャップメチル−スクシニル型オリゴペプチドを得ることができる。好適な選択的に除去可能なＣ末端保護基の他の例として、ｔＢu、アルコキシ−メチル及びＴＣＥであることができるが、これらには限定されない。この工程をおこなうための他の方法が、文献に記載されている。
【０１２８】
ジ−又はトリペプチドの「フラグメント縮合」等の上記した方法の組み合わせも、考慮できる。反応条件は、当該技術分野において周知であり、引用文献に詳細に記載されている。上記した方法の利点は、液相合成により製造される生成物の精製が容易なことである。
【０１２９】
プロドラッグ複合体
複合及び脱保護工程の一般的な方法
本発明に記載のＮキャップ型オリゴペプチド−治療剤は、オリゴペプチドのＦｍｏｃ形態（ＦｍｏｃがオリゴペプチドのＮ末端に結合していることを意味する）を、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はいずれかの好適な治療剤と、ペプチド合成に使用される標準的な活性化試薬のいずれかを用いてカップリングすることにより、合成できる（図５）。溶媒は、トルエン、酢酸エチル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ3ＣＮ、ＮＭＰ、ＴＨＦ、ＤＣＭ又は当該技術分野において公知の他の好適な不活性溶媒でよく、試薬がそこに可溶なものである。好ましい溶媒は、ＤＭＦ及びＮＭPである。好適な温度は、−２５〜＋２５℃の範囲であり、周囲温度が好ましい。活性化剤は、以下のものから一つを選択できる：ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＥＤＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢＴ、ＯＳｕ活性化エステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジド。ＨＢＴＵ又はＨＡＴＵは、好ましい活性化剤である。別法として、このカップリング反応に、保護されたペプチドの酸クロリド又は酸ブロミドを使用してもよい。２〜４当量、有利には２〜２．５当量の塩基が、カップリング反応に必要とされる。塩基は、無機塩基、例えば、ＣｓＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3若しくはＫ2ＣＯ3又は有機塩基、例えば、ＴＥＡ、ＤＩＥＡ、ＤＢＵ、ＤＢＮ、ＤＢＯ、ピリジン、置換ピリジン、Ｎ−メチル−モルホリン等から選択されることができ、好ましくはＴＥＡ又はＤＩＥＡである。反応は、−１５℃〜５０℃の温度、有利には−１０℃〜１０℃の温度で実施できる。反応時間は、５〜９０分間であり、２０〜４０分間が有利である。生成物は、反応混合物を水に注ぎ、形成した沈殿物を濾過することにより単離される。粗生成物は、さらにＤＣＭ、ＴＨＦ、酢酸エチル又はアセトニトリルから、好ましくはジクロロメタン又はアセトニトリルから再結晶することにより精製できる。次に、単離されたＦｍｏｃ型オリゴペプチド治療剤複合体を、１０倍〜１００倍過剰の塩基を用いて、−１０℃〜５０℃の温度で、２〜９０分間、好ましくは３〜８分間かけて脱保護する。理想的には、５〜６０当量の塩基が、好ましい。ピペリジンは、Ｆｍｏｃ基を脱保護するのに好ましい塩基である。オリゴペプチド−治療剤複合体の脱保護されたアミノ末端を、二酸無水物又は半保護活性化二酸（すなわち、続いて脱保護されるモノエステル）によりアシル化して最終的なＮキャップ型オリゴペプチド−治療剤を得る。
【０１３０】
別法として、最終的なプロドラッグを、メチル半エステル型スクシニル−Ｎ−ｃａｐオリゴペプチド等の保護されたＮキャップ形態のオリゴペプチドから同様にして調製し、治療剤に結合できる。この方法は、図６に示す。
【０１３１】
ここで、保護されたＮ−Ｃａｐ−オリゴペプチド治療剤を、治療剤の安定性と適合する方法により脱保護される。例えば、ジカルボキシル−ペプチジル−アントラサイクリンを、メチル基で保護し、エステラーゼで脱保護できる。他の治療剤については、脱保護に、ベンジル保護基及び接触水素添加を選択することができる。
【０１３２】
塩の形態の負に帯電したＮキャップオリゴペプチド−治療剤を、以下の基から選択される溶媒を用いて調製できる:アルコール（例えば、メタノール、エタノール又はイソプロパノール）、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジグライム又は他の極性溶媒。ナトリウム源は、１モル当量のＮａＨＣＯ3、ＮａＯＨ、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＯＡｃ、ＮａＯＣＨ3（一般的に、ソジウムアルコキシド）又はＮａＨである。Ｎａ+をチャージしたイオン交換カラム（例えば、強又は弱イオン交換体）も、適切な場合、塩形態のＮキャップオリゴペプチド治療剤を製造するこの最後の工程に有用である。ナトリウムは、単に一例として挙げたにすぎない。
【０１３３】
一般的に、プロドラッグを、薬学的に許容される塩の形態に転換してプロドラッグの溶解度を改善してもよい。Ｎキャップ−オリゴペプチド治療剤を、薬学的に許容される塩、例えば、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＯＨ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＫＨＣＯ3、Ｋ2ＣＯ3、ＣａＣＯ3、ＮＨ4ＯＨ、ＣＨ3ＮＨ2、（ＣＨ3）2ＮＨ、（ＣＨ3）3Ｎ、アセチルトリエチルアンモニウムで、中和する。好ましい塩の形態のプロドラッグは、ナトリウムであり、好ましい中和塩は、ＮａＨＣＯ3である。
【０１３４】
ドキソルビシン及びダウノルビシンを含むアントラサイクリン型分子が、極めて低濃度で有機溶媒中でゲルを形成することは、十分に立証されている（Ｍａｔｚａｎｋｅ，Ｂ．Ｆ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０７：７４７−５５（１９９２）；Ｃｈａｉｒｅｓ，Ｊ．Ｂ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：３９２７−３２（１９８２）；Ｈａｙａｋａｗａ，Ｅ．等、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３９：１２８２−６（１９９１）。このことは、ペプチドアントラサイクリン複合体を製造するときに、清浄な生成物を高収率で得るのにかなりの障害となる可能性がある。ゲルの形成は、望ましくない副反応の発生の原因となる。この問題を最小限とする一つの方法に、カップリング反応に、極めて希薄な溶液（１〜２％）を使用することがある。しかしながら、この方法は、プロセス環境においては、実用的ではない（多量の廃棄物、複雑な単離）。この問題を克服するために、尿素又は他のカオトロピック剤を使用して、ゲルを形成する強力な疎水性及び水素結合力を破壊することができる。したがって、カップリング反応を、尿素含有溶媒、有利にはＤＭＦ又はＮＭPに尿素を添加して２０％〜飽和溶液としたものを用いて実施すると、たとえ反応剤の濃度が１０％を超えても、副反応を２％未満に維持することができる。これにより、結合工程を高濃度で実施できるようになり、収量が良好となる。
【０１３５】
一般的な酵素法
酸又は塩基により触媒された完全Ｎキャップ化合物への保護されたＮキャップ−オリゴペプチド治療剤の加水分解により、適度に酸性又は塩基性の条件下であっても、数多くの治療剤が不安定であるため複雑な反応混合物となる。酵素は、基質又は生成物を破壊することなく、加水分解を促進することができる。エステラーゼ又はリパーゼが、この反応に好適な酵素のことがあり、それらの天然又は水溶性の形態であってもよいし、又は市販の固体支持体材料に交差カップリング又は結合により固定化してもよい。評価した可溶性酵素のうち、Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ「Ｂ」リパーゼ（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）は、とりわけ有用である。交差カップリングにより固定化された酵素の一例として、ＣｈｉｒｏＣＬＥＣ−ＰＣ（商標）（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）が挙げられる。Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ「Ｂ」リパーゼ（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）は、ＮＨS活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）との反応により固定化できる。加水分解中の反応混合物のｐＨを、慎重に制御し、ｐＨシュタットにより、ＮａＨＣＯ3溶液の添加を制御して、５．５〜７．５、有利には５．７〜６．５に維持する。反応が完了したら、生成物を、濾過した反応混合物を凍結乾燥することにより単離する。固定化酵素は、フィルターケーキに残存しており、必要に応じて再使用できる。
【０１３６】
一般的なアリル又はアルキルエステル法
プロドラッグは、アリル半エステル又はアルキル半エステル形態のＮキャップオリゴペプチドを治療剤とカップリングした後、複合体から遊離酸を放出することにより、調製することもできる。図８は、スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕとドキソルビシンを用いたこのプロセスを示す。
【０１３７】
アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕとドキソルビシンとのカップリングは、オリゴペプチド結合方法のいずれか一つにより実施できる。
【０１３８】
また、アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンは、公知の方法（Ｃａｓｉｍｉｒ，Ｊ．Ｒ．等、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．３６／１９  ３４０９（１９９５））で調製したアリルヘミスクシネートを、βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンと、図５に示すように、以前の方法で説明されている保護されたテトラペプチド前駆体のドキソルビシンとのカップリングのようにして、反応させることによっても合成できる。好適な不活性溶媒は、ＴＨＦ、ジクロロメタン、酢酸エチル、トルエンであり、好ましくはＴＨＦである。この溶媒から、反応が進行するにつれて、酸の形態の生成物が沈殿する。単離された酸を、上記した方法でそのナトリウム塩に転換する。反応時間は、１０〜１８０分間、有利には１０〜６０分間、温度は、０〜６０℃、好ましくは１５〜３０℃である。
【０１３９】
アリル基又はアルキル基の除去は、当該技術分野において周知であり且つ科学文献（Ｇｅｎｅｔ，Ｊ−Ｐ等、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，５０，４９７，１９９４；Ｂｒｉｃｏｕｔ，Ｈ．，等、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，５４：１０７３（１９９８），Ｇｅｎｅｔ，Ｊ−Ｐ等Ｓｙｎｌｅｔｔ，６８０（１９９３）；Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：７４９（１９９８）；Ｓｈａｐｈｉｒｏ，Ｇ．，Ｂｕｅｃｈｌｅｒ，Ｄ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ，３５：５４２１（１９９４））で裏付けられている、アリル基又はアルキル基のアクセプター分子へのＰｄ（０）又はＮｉ（０）、有利にはＰｄ（０）促進移動によりおこなうことができる。触媒の量は、基質に対して、０．５〜２５モル％であることができる。
【０１４０】
一般的なトリチル又は置換トリチル法
また、プロドラッグは、図７に示す方法で合成してもよい。この方法では、Ｒ’−オリゴペプチド（ここで、Ｒ’は、トリチル又は置換トリチルである）を利用する。Ｒ’−オリゴペプチドと治療剤とのカップリングは、保護されたオリゴペプチドと治療剤とを０〜２０℃で３０〜１２０分間で結合させることについて、上記で説明した方法のいずれか一つにより、実施できる。
【０１４１】
トリチル基又は置換トリチル基の除去は、酸性条件下でおこなって正に帯電したプロドラッグを得ることができる。この正に帯電したプロドラッグは、図４に示したようなＮキャップ型であり、上記したようなものである。トリチル脱保護は、酢酸、ギ酸及び希薄塩酸を用いておこなうことができる。
【０１４２】
プロドラッグは、無水コハク酸又は無水グルタル酸と反応させることにより、（スクシニル又はグルタリル）−オリゴペプチド−治療剤に転換でき、さらにいずれかの薬学的に許容される塩に転換できる。カップリング工程の溶媒は、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ3ＣＮ、ＮＭＰ又は当該技術分野において公知の他の好適な溶媒でよい。
【０１４３】
一般的な逆方向固相結合法
本発明のプロドラッグ化合物は、「段階的」逆（Ｎ末端からＣ末端）方向法を用いた固相化学反応を用いることにより、合成できる。
【０１４４】
一つの方法として、スクシニル半エステル、例えば、スクシニル−モノ−ベンジルエステル又は−アリルエステルを固定化するのに樹脂を用いることが挙げられる。選択できる樹脂として、例えば、「Ｗａｎｇ    Ｒｅｓｉｎｓ（Ｗａｎｇ樹脂）」（Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．，９５：１３２８（１９７３）；Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ｍｊａｉｌｉ，Ａ．Ｍ．Ｍ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，３７：５４５７（１９９６））、「Ｒｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎｓ（Ｒｉｎｋ樹脂）」（Ｒｉｎｋ，Ｈ．Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：３７８７（１９８７））、「Ｔｒｉｔｙｌ−，  ｏｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ−ｔｒｉｔｙｌ  Ｒｅｓｉｎｓ（トリチル樹脂又は置換トリチル樹脂）」（Ｃｈｅｎ，Ｃ．等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２６６１（１９９４）；Ｂａｒｔｏｓ，Ｋ．等、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．２２ｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（１９９２）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｈ．；Ｅｂｅｒｌｅ，Ａ．Ｎ．（Ｅｄｓ．），ＥＳＣＯＭ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｐｐ．２８１（１９９３））がある。次に、固定化したエステルを、脱保護し、例えば、同様にＣ末端保護β−アラニンと反応させる。次に、これらの工程を、イソロイシン、アラニン及び最後にロイシンエステルを用いて反復した後、固定化スクシニル−テトラペプチドにドキソルビシンをカップリングする。次に、この分子を、穏やかな酸性条件を用いることにより樹脂から遊離させて遊離プロドラッグ、例えば、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを形成する。この方法は、図９のスキームにより表される。別の種類の相合成では、固定化スクシニルオリゴペプチドエステルを利用する。これを、次にＣ末端脱保護した後、ドキソルビシン又は他の治療剤へのカップリング工程をおこない、最後に図９のスキームにより表すように樹脂から遊離させる。次に、酸型のプロドラッグ分子を、最後に上記したようにしてそのナトリウム塩に転換できる。
【０１４５】
一般的な大規模化合物合成
プロドラッグ化合物は、本発明の簡単で効率的な３工程プロセスを用いて合成できる：（１）アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチドと治療剤とを、活性化剤の存在下でカップリングしてアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を調製する工程、（２）カップリング工程後に残存する未カップリング治療剤を除去する工程、及び（３）アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護して安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を調製する工程。
【０１４６】
第一の工程では、治療剤に、アルキルエステル保護オリゴペプチドフラグメントをカップリングする。この第一工程の好ましい態様では、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド、例えば、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨを、治療剤、例えば、ドキソルビシン（図２７）と、活性化剤、例えば、ＨＡＴＵを用いて、カップリングして、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド治療剤複合体、例えば、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得る。この工程の着目点は、加水分解工程は純度には影響しないことが判明したので、純度とメチルエステルの収率にある。好ましくは、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドの治療剤に対するモル比は、２：１〜１：１である。より好ましくは、モル比は、１．７５：１〜１．５：１である。最も好ましくは、モル比は、１．６６：１である。
【０１４７】
アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドと治療剤とのカップリングは、好ましくは（ａ）アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドと治療剤とを、ＤＭＦ中で混ぜること、（ｂ）ＤＩＥＡを添加すること、（ｃ）アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドと治療剤とを、活性化剤の存在下で反応させて複合体を形成すること、及び（ｄ）食塩溶液を添加することにより複合体を沈殿させて沈殿物を得ることにより、実施される。好ましくは、ＤＩＥＡとアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチドとのモル比は、３：１〜１．５：１である。より好ましくは、モル比は、２．５：１〜２：１である。最も好ましくは、モル比は、２．１８：１である。反応工程は、好ましくは０℃で３０分間実施する。好ましくは、活性化剤とアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチドのモル比は、１．５：１〜１：１である。より好ましくは、モル比は、１．１：１である。食塩溶液は、好ましくはＮａＣｌを水に２０％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）添加したものである。より好ましくは、食塩水溶液は、ＮａＣｌを水に２５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）添加したものである。最も好ましくは、食塩水溶液は、ＮａＣｌを水に３０％（ｗ／ｖ）添加したものである。複合体を、好ましくは食塩水で沈殿させる。この際のｐＨは、５．０〜７．０（５．０と７．０を含む）である。最も好ましくは、複合体を、ｐＨ５．８〜６．０で沈殿させる。
【０１４８】
数多くの治療剤は毒性物質であるので、カップリング生成物から遊離の治療剤を除去することが、好ましい。この除去工程は、（ａ）複合体をＤＭＦに溶解すること、（ｂ）スカベンジャー樹脂を無水ＤＭＦに溶解すること、（ｃ）カップリング工程で形成されたアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド治療剤複合体を、スカベンジャー樹脂に添加して複合体−樹脂混合物を形成すること、（ｄ）得られた混合物を、０℃〜３０℃で２〜２４時間維持して未カップリング治療剤を樹脂と反応させること、（ｅ）樹脂を混合物から除去すること、及び（ｆ）食塩溶液を添加することにより残部を沈殿させてアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド治療剤複合体の沈殿物を形成することにより、実施するのが好ましい。好ましくは、スカベンジャー樹脂は、ポリスチレン−イソシアネート（ＰＳ−イソシアネート）、ＰＳ−メチルイソシアネート、ＰＳ−チオイソシアネート、ＰＳ−メチルチオイソシアネート、ＰＳ−スルホニルクロリド、ＰＳ−メチルスルホニルクロリド又はＰＳ−ベンズアルデヒドである。最も好ましくは、スカベンジャー樹脂は、ＰＳ−イソシアネートである。好ましくは、除去工程を実施して遊離治療剤（アントラサイクリン）を除去する。
【０１４９】
第三工程は、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を、好ましくは酵素による加水分解か、より好ましくはエステラーゼによる加水分解により脱保護して、良好な収率で少なくとも９０％の最終純度のプロドラッグ化合物が直接得られる。例えば、第三工程では、酵素、例えば、ＣＬＥＣ  ＣＡＢ（架橋Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｂリパーゼ）により、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにおけるメチルエステル基の加水分解をおこない、定量的収率で高純度のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのナトリウム塩を直接得ることができる。
【０１５０】
酵素は、好ましくは固体支持体上に架橋又は固定化される。エステラーゼは、ブタ肝臓エステラーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ  ＡｎｔａｒｃｔｉｃａＢリパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼ、セファロースに固定化したブタ肝臓エステラーゼ、セファロースに固定化したＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａＢリパーゼ、ＣＬＥＣ−ＰＣ（商標）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼ）、ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  ＡｎｔａｒｃｔｉｃａＢリパーゼ）又はＣＬＥＣ−ＣＲ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ）であることができる。酵素による加水分解を用いた脱保護は、好ましくは（ａ）酵素を洗浄して遊離酵素を除去し、（ｂ）洗浄された酵素をアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体に添加し、（ｃ）この酵素を複合体と、１５〜４０℃（１５℃と４０℃を含む）、ｐＨ５．０〜８．０（５．０と８．０を含む）、少なくとも１８時間の条件で反応させて、安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を得、（ｄ）酵素をプロドラッグ化合物から分離することにより、実施される。最も好ましくは、追加の洗浄した架橋又は固定化酵素を、酵素と複合体とを反応させる工程の後で添加してから、プロドラッグ化合物から酵素を分離する。
【０１５１】
遊離治療剤の除去
未結合治療剤は、プロドラッグの製造プロセスの後の段階で存在することがある。例えば、（安定化基）−（オリゴペプチド）複合体を治療剤としてのドキソルビシンとカップリング中、ある場合には、反応が完全には進行しないことが判明した。このカップリング生成物には、約２〜４％の残留ドキソルビシンがあった。最初に酸性洗浄により生成物からドキソルビシンを完全に除去することを試みたときには、完全には除去されなかった。遊離治療剤の完全除去は、スカベンジャー樹脂又はビーズを利用する、実施例４７及び図１１に概略示したプロセスによりおこなった。
【０１５２】
中間体と残留ドキソルビシンを含有する粗生成物を、ＤＭＦに溶解し、ポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロリド樹脂又はビーズを添加した。反応液を、６０分間攪拌した。ドキソルビシンの遊離アミノ基は、ビーズ上のイソシアネート基又は塩化スルホニル基と反応して尿素又はスルホンアミド誘導体を形成する。次に、ドキソルビシンを結合した固体ビーズを、濾過により所望の生成物から分離した。所望の生成物は、ＤＭＦ溶液に残存している。この方法は、生成物から残留治療剤を除去するための、極めて穏やかで且つ効果的な方法であると思われる。
【０１５３】
したがって、本発明によれば、化合物の製造方法であって、
（１）式
Ｆｍｏｃ−（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるＦｍｏｃ保護オリゴペプチドを選択する工程と、
（２）Ｆｍｏｃ保護オリゴペプチドを、治療剤の存在下で活性化剤で活性化することにより、Ｆｍｏｃ保護オリゴペプチドを治療剤にカップリングしてＦｍｏｃ保護オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
（３）前記Ｆｍｏｃ保護オリゴペプチド−治療剤複合体を塩基と接触させることにより、Ｆｍｏｃ保護オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護してオリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
（４）前記オリゴペプチド−治療剤複合体を安定化基にカップリングして前記化合物を形成する工程と、
を含む方法が提供される。
【０１５４】
好ましくは、ｎは、０〜３であり、ｍは、０〜３であり、ｍ＋ｎは３以下である。
【０１５５】
別法として、化合物の製造方法であって、
（１）式
（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるオリゴペプチドを選択する工程と、
（２）前記オリゴペプチドを、アルキルエステル保護安定化基にカップリングしてアルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を形成する工程と、
（３）前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を、治療剤の存在下で活性化剤により活性化することにより、前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を治療剤にカップリングしてアルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
（４）前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド治療剤複合体を脱保護して前記化合物を形成する工程と、
を含む方法が提供される。
【０１５６】
好ましくは、ｎは、０〜３であり、ｍは、０〜３であり、ｍ＋ｎは３以下である。
【０１５７】
本発明の化合物は、以下の工程によって製造することもできる：
（１）式
（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるオリゴペプチドを選択する工程と、
（２）前記オリゴペプチドを、アリルエステル保護安定化基にカップリングしてアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を形成する工程と、
（３）前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を、治療剤の存在下で活性化剤により活性化することにより、前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を治療剤にカップリングしてアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
（４）前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド治療剤複合体を脱保護して前記化合物を形成する工程。
【０１５８】
好ましくは、ｎは、０〜３であり、ｍは、０〜３であり、ｍ＋ｎは３以下である。
【０１５９】
本発明の化合物を製造するためのさらに別の方法は、以下の工程を含む：
（１）式
トリチル−（ＡＡ）n−ＡＡP2−ＡＡP1−ＡＡP1’−（ＡＡ）m
｛式中、
ｎとｍは整数であり、
ＡＡP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
ＡＡP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各ＡＡは独立してアミノ酸を表す。｝
で表されるトリチル保護オリゴペプチドを選択する工程と、
（２）トリチル保護オリゴペプチドを、治療剤の存在下で活性化剤で活性化することにより、トリチル保護オリゴペプチドを治療剤にカップリングしてトリチル保護オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
（３）酸性条件下でトリチル保護オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護してオリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
（４）前記オリゴペプチド−治療剤複合体を安定化基にカップリングして前記化合物を形成する工程。
【０１６０】
好ましくは、ｎは、０〜３であり、ｍは、０〜３であり、ｍ＋ｎは３以下である。
【０１６１】
これらの方法のいずれかとの関連における別の可能な工程として、スカベンジャー樹脂又はビーズを使用することにより、未カップリング治療剤を除去する工程が挙げられる。さらに、化合物を、必要に応じて、薬学的に許容される塩で中和してもよい。
【０１６２】
具体的化合物
本発明の化合物の具体例を、以下に示す：
【０１６３】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ。
【０１６４】
ＣＤ１０により切断されることができるが、ＴＯＰによる切断には耐性を有する化合物の例として、以下のものが挙げられる：Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ。
【実施例】
【０１６５】
実施例１：
細胞ホモジェネートのタンパク質特異的活性
種々の培養ヒト細胞ペレットを、ｐＨ７．２の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に添加して均一化し、得られたホモジェネートを、１２．５μｇ／ｍＬのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとともに、３７℃で１時間インキュベーションした。さらに、ＣＤ１０阻害剤としての１μＭホスホラミドンを、ＬＮＣａＰ細胞ホモジェネートとともにインキュベーションに含ませた。特異的活性を推定するために、ホモジェネートの可溶性部分におけるタンパク質含量を推定した。タンパク質特異的活性として表した結果（図１２）から、ＣＤ１０を含有することが知られているＬＮＣａＰ細胞が、最大のＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ加水分解活性を示すことが明らかである。この活性は、ホスホラミドンにより阻害される。ＣＤ１０を発現しないＰＣ−３細胞は、他の３種の基質を加水分解するが、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを加水分解しない。
【０１６６】
種々のソースからのマウス腫瘍異種移植片を、外科的に取り出し、ｐＨ７．２の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に添加して均一化し、得られたホモジェネートを、１２．５μｇ／ｍＬのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとともに、３７℃で１時間インキュベーションした。可溶性タンパク質を測定し、結果を、タンパク質特異的活性として報告する。結果を、図１３に示す。結果から、ＬＮＣａＰ細胞が、最高のＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ加水分解活性を示し、一方、ＨＬ−６０細胞がＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ加水分解活性を示さないことが明らかである。
【０１６７】
実施例２：
精製ＣＤ１０による加水分解
ブタ腎臓ＣＤ１０（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）の精製品の等量を、種々のペプチジルドキソルビシン化合物１２．５μｇ／ｍＬとともに、ｐＨ７．４の５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中、３７℃、１０時間の条件で、インキュベーションした。反応生成物を、蛍光検出を用いたＨＰＬＣにより分析した。速度は、インキュベーション中、実質的に直線状であった。得られた生成物は、Ｌｅｕ−ドキソルビシンであった。表１に、１０時間で加水分解された各試験化合物のパーセントを示す。さらに、これらの結果を、標準試験化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに対して表す。
【０１６８】
【表１】
0004541693.tif 000002
【０１６９】
実施例３：
ペプチドに結合した薬剤が、ＣＤ１０による切断に及ぼす影響
プロドラッグの「トキシン」位置での構造のＣＤ１０触媒速度効果を試験するために、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの加水分解速度を、ドキソルビシンをパラニトロアニリド（ｐＮＡ）に置換した類似物、すなわち、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ｐＮＡの加水分解速度と比較した。ブタ腎臓ＣＤ１０（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を、２種の基質とともに、同一条件（３７℃、ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）下でインキュベーションし、Ｌｅｕ−Ｄｏｘの放出速度を、Ｌｅｕ−ｐＮＡの放出速度と比較した。得られた結果から、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ｐＮＡは、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘよりも、５９０倍速く切断されることが分かる。このことは、これらの腫瘍活性化プロドラッグ化合物におけるトキシンの構造（又は結合部位）が、切断速度に影響することがあることを示している。  
【０１７０】
実施例４：
潜在的プロドラッグのスクリーニング
ｔｒｏｕａｓｅ又はチメットオリゴペプチダーゼによっては切断されないが、ＣＤ１０によって切断されるプロドラッグ化合物が、本発明にとって好ましい。すなわち、ｔｒｏｕａｓｅによる切断性の欠如について化合物をスクリーニングすることが、好ましい。癌細胞ｔｒｏｕａｓｅの３種の異なる試料を使用して、種々の試験化合物をスクリーニングした。これらの３種の試料は、以下に示すものであった：
（ａ）ＭＣＦ７／６（乳癌）細胞ホモジェネート、
（ｂ）ＭＣＦ７／６（乳癌）ならし培地、
（ｃ）ＨｅＬａ（子宮頸癌）細胞抽出物アニオン交換画分プール。
【０１７１】
ａ．ＭＣＦ７／６細胞ホモジェネートの調製
ＭＣＦ７／６細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）、５０ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、ＩＴＳ−Ｘ(１０ｍｇ／Ｌインスリン、５．５ｍｇ／Ｌトランスフェリン、６．７μｇ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／Ｌエタノールアミン)を含有する、無血清培地で、密集状態となるまで増殖させ、４℃、１０，０００ｘｇ、２０分間の条件で遠心分離し、デカントすることにより、細胞の脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ＃２１９００−０３０）１００ｍＬを採取した。得られたペレットを、リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ社）２ｍＬに再懸濁し、１８，０００ｘｇ、１０分間の条件で遠心分離した。デカントした後、細胞（湿潤物約３００μＬ）を、１．７ｍＬの１０ｍＭ  ｐＨ７．２  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ナトリウム塩）中で、粉砕することにより均一化した。得られたホモジェネートを、１８，０００ｘｇ、４℃、５分間の条件で遠心分離し、上清を、等分し、つづいての化合物のスクリーニングに使用するために、−２０℃以下の温度で保存した。
【０１７２】
ｂ．ＭＣＦ７／６ならし培地の調製
ＭＣＦ７／６細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｌ−グルタミン、２５０ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地で、密集状態となるまで増殖させた。次に、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、０．０２％ＢＳＡ、ＩＴＳ−Ｘ(１０ｍｇ／Ｌインスリン、５．５ｍｇ／Ｌトランスフェリン、６．７μｇ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／Ｌエタノールアミン)中、５％ＣＯ2、３７℃、２４時間の条件でインキュベーションした。次に、ならし培地を、デカントし、ＹＭ１０（分画ＭＷ１０，０００）限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を備えた攪拌型セル装置を用いて、ｐＨ７．２の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液と一旦交換した後２０倍に濃縮した。この溶液を、化合物のスクリーニングに使用するために、等分して、−２０℃の温度で保存した。
【０１７３】
ｃ．ＨｅＬａ細胞アニオン交換画分プールの調製
３００億個の工業生産したＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌、ベルギー国のＳｅｎｅｆｆｅに所在するＣｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒより入手）を、溶菌水溶液１０８ｍＬに添加し、超音波処理器及びダウンスホモジェナイザーを用いて、均一化した。溶菌液は、０．０２％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０４％ｗ／ｖアジ化ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤混合物（２タブレット／５０ｍＬ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、無ＥＤＴＡタブレット、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を含有していた。細胞ホモジェネートを、４℃、５０００ｘｇ、３０分の条件で遠心分離し、得られたペレットを、溶菌液１０８ｍＬ（２回目）に添加し、ダウンスホモジェナイザーを用いて均一化し、上記と同様にして遠心分離した。得られた上清を、混合し、１４５，０００ｘｇ、４℃、９０分間の条件で遠心分離した。
【０１７４】
超遠心分離上清の一部分を、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムとを含有する２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ  ｐＨ７．２緩衝液（平衡緩衝液）により、２倍希釈した。得られた溶液の３０ｍＬ（タンパク質約１８０ｍｇに相当）を、２．６×９．４ｃｍ  Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）低圧アニオン交換クロマトグラフィーカラム（１ｍｌ／分）に４℃で供給した。次に、このカラムを、平衡緩衝液２５０ｍｌを流量１ｍＬ／分で流して洗浄した。タンパク質を、ＮａＣｌ線状濃度勾配（ＮａＣｌを平衡緩衝液に添加して０〜０．５Ｍとしたもの、勾配の総容積は１０００ｍｌ）で、流量３ｍｌ／分で溶離した。２分間の画分を集め、基質としてβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを使用した酵素活性測定に使用した。そのＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘへの転換を、アントラサイクリン部分の蛍光検出を利用した逆相高速液体クロマトグラフィーにより定量した。最高活性レベルの画分をプールし（画分＃４３〜４６；ほぼ０．１３Ｍ  ＮａＣｌ）、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、無ＥＤＴＡタブレット、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を補充し、アリコットとして−８０℃で保存した。
【０１７５】
ｄ．切断アッセイ
試験化合物を、１２．５μｇ／ｍＬの濃度で、癌細胞酵素の３種の異なる試料の各々とともに、３７℃、２時間の条件でインキュベーションした。インキュベーション後、３容のアセトニトリルを添加して、反応を停止し、タンパク質を混合物から取り出した。試料を、１８，０００ｇ、５分間の条件で遠心分離し、上清１００μＬを、水３００μＬと混合してから、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ分析については、試料５０μＬを、４．６×５０ｍｍ  ２μ  ＴＳＫ  Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳクロマトグラフィーカラムに４０℃で注入し、３分間線状勾配で溶離をおこなった（アセトニトリルを、水性２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．５緩衝液に添加して２６〜６８％の勾配としたもの；流量２ｍＬ／分）。検出は、励起波長２３５ｎｍ、発光波長５６０ｎｍでの蛍光によりおこなった。
【０１７６】
一定の条件下で酵素試料により切断されなかった（切断率＜５％、２時間）試験化合物を、以下の表２に示す。いくつかの例外はあるが、癌細胞酵素切断についての結果は、ＨｅＬａ細胞、ＭＦＣ７／６細胞ホモジェネート、ＭＣＦ７／６ならし培地からの部分精製画分について、同一であった。
【０１７７】
【表２】
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【０１７８】
実施例５：
細胞系でのＣＤ１０発現
ＣＤ１０（ＣＤ１０）は、高い割合（６１％）の前立腺腫瘍を含む、多数の腫瘍の種類（Ｃｈｕ及びＡｒｂｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１１３：３７４−３８２（２０００））において、広く発現される。また、ＣＤ１０は、生体外で培養したある種のヒト前立腺腫瘍由来細胞系で発現することも、分かった。したがって、本発明のペプチドプロドラッグが、前立腺だけでなく、表面でＣＤ１０を発現する他の腫瘍の種類から得た腫瘍系に対して細胞障害性であるかどうかを測定することは、重要である。前立腺腫瘍系であるＬＮＣａＰは、高レベルのＣＤ１０を発現する（Ｋｒｏｎｇｒａｄ等、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：１１３−１１６（１９９７）；Ｌｉｕ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３４２９−３４３４（２０００））。また、培養におけるいくつかの前立腺腫瘍系は、別の十分に特徴付けされた細胞表面関連エンドプロテアーゼである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を、発現する。表３に示す前立腺腫瘍系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られ、ＣＤ１０特異的モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより、ＣＤ１０発現についてスクリーニングした（Ｃａｌｔａｇクローン５−１  Ｂ４）。
【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１０の発現を測定するための細胞系のパネルを用いておこなった。図１４は、ＣＤ１０は、ＰＳＡを発現しないある種のＢ細胞リンパ腫系でも高レベルで発現するということを示す。このようなＢ細胞系には、Ｒａｍｏｓ及びＮａｍａｌｗａ細胞などがある。ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞も、高レベルのＣＤ１０を発現することが判明した。一方、ＨＴ２９細胞、ＰＣ−３細胞及びＢＡＬＬ−１細胞は、この抗原を検出可能なレベルでは発現せず、負の対照として続いての検討に用いた。結腸癌ＬＳ１７４Ｔ及び乳癌ＭＣＦ−７で、低レベルのＣＤ１０の発現が見られた。
【０１８１】
実施例６：
ＬＮＣａＰ細胞、ＨＴ−２９細胞及びＰＣ−３細胞での腫瘍活性化プロドラッグ活性
粘着細胞であるＬＮＣａＰ（前立腺癌）、ＨＴ−２９（結腸癌）及びＰＣ−３（前立腺癌）を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地で培養した。検討する日に、細胞をトリプシン溶液でプレートから分離した。集めた細胞を洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに細胞０．２５×１０6／ｍｌになるように再懸濁した。細胞懸濁液１００μＬを、９６ウエルプレートに添加し、３時間インキュベーションして細胞を接着させた。このインキュベーションの後、ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈（３倍づつ）し、ウエル一つあたり、化合物１００μＬを添加した。次に、プレートを、２４時間インキュベーションし、１００μＣｉ／ｍｌ  3Ｈ−チミジン１０μＬでパルシングし、さらに２４時間（総インキュベーション時間：４８時間）インキュベーションした。プレートを、９６ウエルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃｏｕｎｔｅｒにより、カウントした。４つのパラメータロジスティック曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて3Ｈ−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、ＩＣ50値を求めた。
【０１８２】
陽性対照（ドキソルビシン）ＩＣ50は、使用した細胞系において０．０２〜０．０８μＭであった。ＬＮＣａＰ細胞に対して最高の選択性を示した化合物は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−ＮＭｅＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘであった（表４）。これらの３種のプロドラッグの共通の特徴は、これらがアミノ酸の３位にイソロイシンを含むことである。アミノ酸の３位にロイシンを含むＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−ＮＭｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ等の化合物も、選択性を示す。但し、この場合、選択性の程度は、イソロイシン類似物よりも小さい。
【０１８３】
【表４】
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【０１８４】
実施例７：
Ｂａｌｌ−１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞及びＮａｍａｌｗａ細胞での腫瘍活性化プロドラッグ活性
ＬＮＣａＰの他に、Ｒａｍｏｓ細胞やＮａｍａｌｗａ細胞等の多数のＢ細胞系がＣＤ１０（ＣＤ１０pos細胞）を発現する。しかしながら、別のＢ細胞系であるＢＡＬＬ−１細胞は、ＣＤ１０を発現せず、ＣＤ１０陰性Ｂ細胞系（ＣＤ１０neg細胞）としての役割を果たす。
【０１８５】
浮遊細胞であるＢＡＬＬ−１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞及びＮａｍａｌｗａ細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。検討する日に、細胞を集め、洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩに細胞０．５×１０6／ｍｌになるように再懸濁した。細胞懸濁液１００μＬを、９６ウエルプレートに添加した。ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈（３倍づつ）し、ウエル一つあたり、化合物１００μＬを添加した。最後に、ウエル一つあたり１０μＬの１００μＣｉ／ｍｌ  3Ｈ−チミジンを添加し、プレートを、２４時間インキュベーションした。プレートを、９６ウエルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃｏｕｎｔｅｒにより、カウントした。４つのパラメータロジスティック曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて3Ｈ−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、ＩＣ50値を求めた。
【０１８６】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが、最大の選択性を示した。この選択性は、ＣＤ１０negＢＡＬＬ−１細胞と比較して、Ｒａｍｏｓ細胞とＮａｍａｌｗａ細胞についてそれぞれ１２０〜１７２倍であった（表５）。２番目に選択性が高かった類似物は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘであった。この場合、ＣＤ１０pos細胞とＣＤ１０neg細胞との間の差はほぼ３０〜３５倍であった。
【０１８７】
【表５】
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【０１８８】
実施例８：
粘着細胞であるＬＮＣａＰ（前立腺癌）、ＰＣ−３（前立腺癌）及び２２ＲＶＩ（前立腺癌）を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地で培養した。検討する日に、細胞をトリプシン溶液でプレートから分離した。集めた細胞を洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに細胞０．２５×１０6／ｍｌになるように再懸濁した。細胞懸濁液１００μＬを、９６ウエルプレートに添加し、３時間インキュベーションして細胞を接着させた。このインキュベーションの後、ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈（３倍づつ）し、ウエル一つあたり、化合物１００μＬを添加した。次に、プレートを、２４時間インキュベーションし、１００μＣｉ／ｍｌ  3Ｈ−チミジン１０μＬでパルシングし、さらに２４時間（総インキュベーション時間：４８時間）インキュベーションした。プレートを、９６ウエルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃｏｕｎｔｅｒにより、カウントした。４つのパラメータロジスティック曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて3Ｈ−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、ＩＣ50値を求めた。
【０１８９】
【表６】
0004541693.tif 000007
【０１９０】
表６は、２２ＲＶ１等のＰＳＡ陽性でありＣＤ１０陰性である細胞が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又はＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを容易に切断しないということを示している。これらのデータは、ＣＤ１０が、これらの化合物の切断に関与しているが、PSＡでは切断されないことを、示唆している。
【０１９１】
実施例９：
ＣＤ１０の阻害により、Ｒａｍｏｓ細胞及びＬＮＣａＰ細胞（ＢＡＬＬ−１細胞ではない）についてのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの効力が減少する。
ＣＤ１０の２つの公知の阻害剤の、Ｒａｍｏｓ細胞、ＬＮＣａＰ細胞及びＢａｌｌ−１細胞におけるプロドラッグ活性に及ぼす影響を評価した。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＩＣ50は、ＣＤ１０阻害剤であるホスホラミドンとチオルファンの濃度を増加させて測定した。ホスホラミドンの濃度を増加させると、Ｒａｍｏｓ細胞とＬＮＣａＰ細胞でのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの効力の損失が生じたが、一方、ＢＡＬＬ−１細胞は、影響されなかった（表７）。同様に、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＩＣ50は、１００ｎＭホスホラミドンで処理したＬＮＣａＰ細胞では、７倍変化した（データは図示せず）。図１５は、３００ｎＭホスホラミドンの不存在下又は存在下でＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを用いた場合の、ある種の滴定曲線の一例である。
【０１９２】
【表７】
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【０１９３】
第２のＣＤ１０阻害剤であるチオルファンも、ＣＤ１０＋細胞でＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＩＣ50をシフトする（表８）。しかしながら、チオルファンは、Ｒａｍｏｓ細胞と比較して、ＬＮＣａＰでの阻害活性がもっと大きかった。
【０１９４】
【表８】
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【０１９５】
実施例１０：
標的細胞に関連したＣＤ１０の検出
ヌードマウスで増殖させた後ホルマリンで固定した異種移植片から採取した、ＬＮＣａＰ及びＰＣ３組織の試料について、免疫組織化学分析を実施した。組織切片を、調製し、ＣＤ１０又はイソタイプマッチド陰性対照に特異的な抗体で免疫染色した後、ヘモトキシリンで対比染色した。ＬＮＣａＰ試料は、全てのＬＮＣａＰ細胞の腫瘍組織試料における全ての細胞の周囲に比較的均一に分布した、ＣＤ１０特異的抗体による染色の強い細胞表面膜関連パターンを示した。これに対して、PＣ３組織については、免疫反応性は、観察されなかった。ＣＤ１０により切断されることができるが、ＴＯPによっては切断されることができない化合物、例えば、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおけるＬＮＣａＰ腫瘍の増殖を阻害するのに効果的であったが、これらは、ＰＣ３細胞に対しては活性ではなかった（実施例６参照）。したがって、ＣＤ１０免疫組織化学的性質は、ＣＤ１０切断可能なプロドラッグに反応する腫瘍を選択するのに有用である。
【０１９６】
実施例１１：
Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、健康なマウスにおいて良好な耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて、十分許容される。単回投与最大耐性量（ＭＴＤ）試験において、５つの正常マウス群に、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、２８日間、毎日観察し、体重を、１週間に２回測定した。試験投与量レベルは、０ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、９３ｍｇ／ｋｇ及び１１７ｍｇ／ｋｇであった（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、１４ｍｇ、２８ｍｇ、４２ｍｇ、５６ｍｇ及び７０ｍｇに相当する）。急性毒性がなく、観察された唯一の毒性の兆候は、最高投与量群についての群平均体重（試験全体を通じて媒質対照群よりも低かった）が減少したことであった。しかしながら、死亡がなく、どの動物も、病的状態を示さなかった。２８日のＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの単回投与最大耐性量（ＭＴＤ）は、この実験では得られず、したがって、試験した最高投与量（１１７ｍｇ／ｋｇ）よりも大きい。このＭＴＤ（ドキソルビシン６６ｍｇ／ｋｇに等しい）は、ドキソルビシン単独の場合（４ｍｇ／ｋｇよりも大きな投与量で、死亡が生じる）よりも少なくとも１６倍大きい。
【０１９７】
実施例１２：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、健康マウスにおいて良好な耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて、十分許容される。単回投与最大耐性量（ＭＴＤ）試験において、５つの正常マウス群に、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、２８日間、毎日観察し、体重を、１週間に２回測定した。試験投与量レベルは、０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ及び１２５ｍｇ／ｋｇであった（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、１４ｍｇ、２８ｍｇ、４２ｍｇ、５６ｍｇ及び７０ｍｇに相当する）。投与後、何ら急性毒性は観察されなかった。麻痺及び顕著な体重損失（＞初期重量の２０％）を含む毒性が、２つの最高投与量群に観察された。１４日目に、１２５ｍｇ／ｋｇ投与量群における４匹の動物を、処置に関連した毒性のため、安楽死させた。２１日目に、次に大きな投与量（１００ｍｇ／ｋｇ）群における２匹の動物を、同様に安楽死させた。次の投与量群（７５ｍｇ／ｋｇ）では、病的状態は観察されず、且つ群平均体重は、試験中に増加した。
【０１９８】
２８日目の生存動物に基づいて、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘについての、単回投与ＭＴＤ値を推定したところ、７５ｍｇ／ｋｇ（投与量ドキソルビシン４０ｍｇ／ｋｇに等しい）であった。したがって、ＭＴＤは、ドキソルビシン単独のＭＴＤ（標準安全有効投与量（４〜８ｍｇ／ｋｇ）に基づいて４ｍｇ／ｋｇと推定）よりも、約１０倍高かった。
【０１９９】
実施例１３：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量（SＤ−ＭＴＤ）試験において、５つの正常ＩＣＲマウス群に、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、４９日間、毎日観察し、体重を、１週間に２回測定した。試験投与量レベルは、０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇであった（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、２８ｍｇ、４２ｍｇ又は５６ｍｇに相当する）。いずれの投与量レベルでも、２４時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失（＞初期重量の２０％）を含む毒性が、７５ｍｇ／ｋｇ投与量群及び１００ｍｇ／ｋｇ投与量群において観察された。３５日までに、７５ｍｇ／ｋｇ投与量群の４０％に死亡が観察された。４９日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのSＤ−ＭＴＤを求めたところ、５０ｍｇ／ｋｇ（ドキソルビシン２８ｍｇ／ｋｇに等しい）であった。この投与量は、極めてよく許容され、悪影響は観察されなかった。したがって、SＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシン単独（１６ｍｇ／ｋｇ）についてのSＤ−ＭＴＤよりも、モル基準で、約１．８倍高かった（表９参照）。これは、試験範囲にわたる１４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SＤ−ＭＴＤ測定である。
【０２００】
【表９】
0004541693.tif 000010
【０２０１】
実施例１４：
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量（SＤ−ＭＴＤ）試験において、５つの正常ＩＣＲマウス群に、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、４９日間、毎日観察し、体重を、１週間に２回測定した。試験投与量レベルは、０ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、７１ｍｇ／ｋｇ、９４ｍｇ／ｋｇ、１１７ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、又は１６４ｍｇ／ｋｇ（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、２８ｍｇ、３５ｍｇ、４２ｍｇ、５６ｍｇ、７０ｍｇ、８４ｍｇ又は９８ｍｇに相当する）。いずれの投与量レベルでも、２４時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失（＞初期重量の２０％）を含む毒性が、９４ｍｇ／ｋｇ投与量群及びそれより多い投与量群において観察された。４９日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてSＤ−ＭＴＤを求めたところ、７１ｍｇ／ｋｇ（ドキソルビシン４２ｍｇ／ｋｇに等しい）であった。したがって、SＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシン単独（１６ｍｇ／ｋｇ）についてのSＤ−ＭＴＤよりも、モル基準で、約２．６倍高かった（表１０参照）。これは、試験範囲にわたる７又は１４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SＤ−ＭＴＤ測定である。
【０２０２】
【表１０】
0004541693.tif 000011
【０２０３】
実施例１５：
Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量（SＤ−ＭＴＤ）試験において、５つの正常ＩＣＲマウス群に、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、４９日間、毎日観察し、体重を、１週間に２回測定した。試験投与量レベルは、０ｍｇ／ｋｇ、９４ｍｇ／ｋｇ、１１７ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ又は１６４ｍｇ／ｋｇであった（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、５６ｍｇ、７０ｍｇ、８４ｍｇ又は９８ｍｇに相当する）。いずれの投与量レベルでも、２４時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失（＞初期重量の２０％）を含む毒性が、最高投与量群において観察された。毒性の兆候は、１４日目までに１６４ｍｇ／ｋｇで部分的な尻の麻痺、１匹の動物において１４日目までに１４０ｍｇ／ｋｇ及びここでも１匹の動物において２１日目までに１１７ｍｇ／ｋｇで重量損失であった。４９日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてSＤ−ＭＴＤを求めたところ、９４ｍｇ／ｋｇ（ドキソルビシン５６ｍｇ／ｋｇに等しい）であった。このSＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシン単独（１６ｍｇ／ｋｇ）についてのSＤ−ＭＴＤよりも、モル基準で、３．５倍高かった（表１１参照）。これは、試験範囲にわたる１４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SＤ−ＭＴＤ測定である。
【０２０４】
【表１１】
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【０２０５】
実施例１６：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量（SＤ−ＭＴＤ）試験において、５つの正常ＩＣＲマウス群に、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、４９日間、毎日観察し、体重を、１週間に２回測定した。試験投与量レベルは、０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇであった（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、２８ｍｇ、４２ｍｇ又は５６ｍｇに相当する）。いずれの投与量レベルでも、２４時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失（＞初期重量の２０％）を含む毒性が、最高投与量群において観察された。２１日までに、１００ｍｇ／ｋｇ投与量における３匹の動物が、重量損失又は麻痺のため、安楽死させた。７５ｍｇ／ｋｇ投与量群には、病的状態も死亡も、観察されなかった。４９日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのSＤ−ＭＴＤを求めたところ、７５ｍｇ／ｋｇ（ドキソルビシン４２ｍｇ／ｋｇに等しい）であった。このSＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシン単独（１６ｍｇ／ｋｇ）についてのSＤ−ＭＴＤよりも、モル基準で、２．６倍高かった（表１２参照）。これは、試験範囲にわたる１４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SＤ−ＭＴＤ測定である。
【０２０６】
【表１２】
0004541693.tif 000013
【０２０７】
実施例１７：
Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝
Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝及びクリアランスを、正常マウスで試験した。マウスに、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、単回静脈内ボーラス投与（１１７ｍｇ／ｋｇ）した。１時間目及び４時間目に、血漿試料を採取した。血漿試料１００μｌを、ミクロ遠心分離管（１．５ｍＬ）に移し、ダウノルビシン（０．５ｍｇ／ｍｌを２０μＬ）の内部標準を、アセトニトリル（４００μｌ）と一緒に添加した。ミクロ遠心分離管にキャップをつけて、短く回転させた後、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。各管から４２０μｌを取り出し、真空乾燥した。各試料を、アセトニトリル（２０％）を含有する２０ｍＭ水性ギ酸アンモニウムｐＨ４．５緩衝液（ＡＦ）の６５μｌで戻してから、逆相液体クロマトグラフィーとタンデム質量分光分析（ＬＣＭＳ／ＭＳ）とを組み合わせて分析した。
【０２０８】
尿を、代謝ケージに入れた各対のマウスから、投与から２時間目及び２４時間目に採取した。尿試料を、アセトニトリル（２０％）含有ＡＦで希釈して、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳアッセイの実用範囲内の標的検体濃度とした。各希釈試料３０μｌを、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）に入れ、ダウノルビシン（０．５ｍｇ／ｍｌで２０μＬ）の内部標準を、アセトニトリル（２０％）含有ＡＦ５０μＬと一緒に、添加した。次に、各試料を、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０２０９】
ＤＡＤ検出器及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００ＨＰＬＣを、エレクトロスプレーイオンソースを備えたＰＥ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ３６５質量分光分析器に連結した。ＨＰＬＣを、ＨＡＩＧＵＡＲＤ  Ｃ１８ガードディスク（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）とステンレススチールフリット（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とを備えたＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＯＤＳ、２ｍｍ、４．６×５０ｍｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ社）逆相カラムにより実施した。クロマトグラフィーを室温で実施した。流量は、０．５ｍｌ／分であった。注入容積は、５０μＬであった。２０ｍＭ水性ＡＦｐＨ４．５緩衝液からなる移動相（アセトニトリルの量を増加していく）を用いて、勾配溶離を実施した。ＡＰＩ３６５を、特定の検体親−娘イオン対を観察するようにセットされた、マルチプル反応観察モードにおいて、３６５℃で操作し、クロマトグラムの積分を、ＭａｃＱｕａｎｔソフトウェア（ＰＥ  Ｓｃｉｅｘ社）により実施し、予め得られた校正曲線と比較することにより、各検体を計量した。ダウノルビシンを、全ての場合において、内部標準として使用した。
【０２１０】
表１３及び図１６から明らかなように、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが、循環から極めて迅速に除去され、投与量の約１．１％が１時間で検出され、４時間までにほとんど検出できなくなった。投与量％の算出のために、血漿容積は、血液容積の４０％であると推定した。これは、動物の体重の７％にあたる。２時間及び２４時間で、親化合物が、投与量の３．９％及び１５．０％が尿に検出された。このことは、腎臓が、プロドラッグが排出される主要な臓器であることを示している（図１７）。
【０２１１】
【表１３】
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【０２１２】
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、血漿又は尿中に検出されなかった。主要なペプチド代謝産物は、Ｌｅｕ−Ｄｏｘであった。ドキソルビシンは、血漿中にはほとんど検出されなかったが、尿中、２時間及び２４時間で低レベルで見出された。親と代謝産物の両方のレベルは、２時間時点よりも、２４時間で、尿におけるレベルが高かった。このことは、初期の尿の採取時間（２時間）に対して、マウスのあとでの排尿から生じた可能性が最も高い。尿値は、０〜２時間の蓄積と、２〜２４時間の蓄積を表すので、あとの排尿（２時間後）は、２〜２４時間試料に蓄積される。
【０２１３】
Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘプロドラッグの低レベルの切断及び活性化が、正常マウスの血液において生じた。高投与量試験レベルのＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘで最小毒性が観察された（実施例１１）。このことは、全身に存在すると正常組織に毒性がある、活性代謝産物ドキソルビシンの全身産生がほとんどないことを示している。
【０２１４】
実施例１８：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝及びクリアランスを、正常マウスに、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、単回静脈内ボーラス投与（１１７ｍｇ／ｋｇ）して試験した。別々のマウスから、１時間目及び４時間目に、血漿試料を採取した。尿を、代謝ケージに入れた各対のマウスから、投与から２時間目及び２４時間目に採取した。血漿試料及び尿試料を、調製し、実施例１７に記載のようにして分析した。
【０２１５】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、循環から極めて迅速に除去され、１時間目で、投与量の約１．０％が血漿中に検出されることができたが、４時間目ではほとんど検出できなかった（表１４及び図１８）。２時間目及び２４時間目では、尿は、投与量の１２．７％及び４．８１％を含有していた。このことは、腎臓が、プロドラッグが排出される主要な臓器であることを示している（図１９）。
【０２１６】
【表１４】
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【０２１７】
代謝産物Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、血漿中にほとんど検出されず、２時間目で、尿中に極めて低レベルでみられた。主要なペプチド代謝産物は、Ｌｅｕ−Ｄｏｘであり、これは、１時間目で血漿中に低レベルで検出でき、さらには、２時間目及び２４時間目で尿中に検出された。血漿には、遊離ドキソルビシンがほとんど存在しなかったが、尿中には比較的高レベルで検出された。このことは、多少の完全代謝が生じていることを示している。
【０２１８】
これらの試料において、尿中の親と代謝産物の両方のレベルが、２時間目で、２４時間目でよりも高かった。０〜２時間及び２〜２４時間で採取したＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘと代謝産物の合計量は、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（実施例１７参照）と同様であった。このように、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのクリアランスとＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのクリアランスとの間には、顕著な生理学的差異がない。
【０２１９】
実施例１９：
未共役治療剤に対するプロドラッグの利点
本発明のプロドラッグには、未共役形態の治療剤に対して治療上の利点がある。
【０２２０】
単回最大耐性量（ＭＴＤ）試験において、正常マウス群に、プロドラッグを、静脈内ボーラス投与した。マウスを、２８日間、毎日観察し、体重を１週間に２回測定した。ＭＴＤは、２８日後にマウスの死亡がなかった最高投与量に等しいと、推定した。表１５に示すように、プロドラッグを含有するイソロイシンの単回投与ＳＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシン単独よりも、１．６倍〜２．５倍高い範囲である。
【０２２１】
腫瘍を有するマウスにおける反復投与試験において、１０匹マウス群に、種々の量のプロドラッグを、５日間隔又は１週間間隔で、合計５回投与した。６０日間、頻繁に観察した後、許容毒性限界内であることが分かった投与量を、最大耐性反復量として確認した。表１５から明らかなように、プロドラッグのＲＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシン単独よりも、約６．５倍高い。ＲＤ−ＭＴＤ又はそれよりも低い投与量でプロドラッグを反復投与すると、ＬＳ１７４ｔ腫瘍を有するマウスの生存率が顕著に増加するが、一方、ドキソルビシンは、生存日数には全く効果がない。このように、プロドラッグでは、はるかに多量の治療剤を全体として体及び標的細胞付近に排出できることと同様であると言える。
【０２２２】
【表１５】
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【０２２３】
実施例２０：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、腫瘍を有するマウスにおいて良好な耐容性を有する。
プロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤は、反復投与条件下、ドキソルビシンよりも耐性が顕著によい。予想されるように、単回ＭＴＤ（７５ｍｇ／ｋｇ）（実施例１６参照）と同様の投与量を反復投与したとき、耐性が低下した。腫瘍を有するマウスにおける反復投与試験では、各群がマウス１０匹からなる３つの群に、０ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ又は６８ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、３０ｍｇ及び３８ｍｇに相当）を、合計５回の同一の投与量（Ｑ５ＤＸ５）で投与し、６０日間、頻繁に観察した。全ての処置した動物は、試験全体を通して徐々に重量が減少したが、一方、媒質対照群の重量は、平均初期体重よりも１２％まで増加した（図２０）。高投与量群における２匹の処置動物が、体重がそれらの初期重量の２０％超の重量損失が生じた毒性の兆候が生じたため、試験を終了した。毒性の兆候は、単回高投与（実施例１６参照）した後に観察されたものと同様であり、げっし動物におけるドキソルビシンの公知の毒性プロファイルと一致した。このように、蓄積毒性が、比較的高投与レベルでの反復投与から生じた。しかしながら、５回投与後の２つの投与群における動物のドキソルビシンへの最大総暴露量は、それぞれ１５０ｍｇ／ｋｇ及び１９０ｍｇ／ｋｇであった。これらの値は、ドキソルビシンの耐性反復投与レベル（５回投与後の総暴露量：４ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇ）よりも、顕著に高い（８〜１０倍）。しかしながら、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＲＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシンの耐容要求投与レベル（４ｍｇ／ｋｇを５回投与した後の総暴露量２０ｍｇ／ｋｇから成る標準安全ＲＤ有効投与量）よりも、少なくとも６〜５倍高い、約１５０ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量であった。
【０２２４】
実施例２１：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ドキソルビシンよりも生体内での耐容性がよい。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量（SＤ−ＭＴＤ）試験において、５つの正常ＩＣＲマウス群に、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、４９日間、毎日観察し、体重を、１週間に２回測定した。試験投与量レベルは、０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇであった（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、２８ｍｇ、４２ｍｇ又は５６ｍｇに相当する）。いずれの投与量レベルでも、２４時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失（＞初期重量の２０％）を含む毒性が、７５ｍｇ／ｋｇ投与量群及び１００ｍｇ／ｋｇ投与量群において観察された。３５日までに、７５ｍｇ／ｋｇ投与量群の４０％に死亡が観察された。４９日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのSＤ−ＭＴＤを求めたところ、５０ｍｇ／ｋｇ（ドキソルビシン２８ｍｇ／ｋｇに等しい）であった。この投与量は、極めてよく許容され、悪影響は観察されなかった。したがって、SＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシン単独（１６ｍｇ／ｋｇ）についてのSＤ−ＭＴＤよりも、モル基準で、約１．８倍高かった（表１６参照）。これは、試験範囲にわたる１４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SＤ−ＭＴＤ測定である。
【０２２５】
【表１６】
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【０２２６】
実施例２２：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、腫瘍を有するマウスに効果的である。
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤は、ドキソルビシン耐性結腸直腸癌ＬＳ１７４ｔを用いたマウス異種移植片モデルにおける、マウスの寿命を延ばし、ヒト腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることが分かった。例えば、ヌードマウス１０匹からなる群に、約５０ｍｇまで増殖させたＬＳ１７４ｔ塊を皮下移植し、０ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ又は６８ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１ｋｇ当たりドキソルビシン０ｍｇ、３０ｍｇ及び３８ｍｇに相当）を、５日間隔で、合計５回の同一の投与量（Ｑ５ＤＸ５）で静脈内投与した。腫瘍と体重を、６０日間、１週間に２回測定した。図２１から明らかなように、両方の投与量とも、媒質対照動物と比較して、腫瘍の増殖を減少するのに有効であった。長期生存マウスが、媒質対照群では０匹であったのに対して、低投与量群及び高投与量群では、それぞれ４匹及び２匹であった。腫瘍が、６０日前に１．５ｇに達した動物の平均生存日数（ＭＤS）は、媒質対照群（１８．２日）よりも、低投与量群（２９．７日）及び高投与量群（２３．４日）が、顕著によかった。このように、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、この投与処方下でのドキソルビシン単独での許容投与量（耐性投与量）（３ｍｇ／ｋｇ）ではこれまで効果がない、この積極的ヒト腫瘍モデルにおいて有効であった。
【０２２７】
実施例２３：
ヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ腫瘍に対するＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの効力
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤は、前立腺癌ＬＮＣａＰを用いたマウス異種移植片モデルにおける、ヒト腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることが分かった。ヌードマウス６匹又は７匹からなる群に、４００００００個のＬＮＣａＰ細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン５ｍｇ／ｋｇ又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ５９ｍｇ／ｋｇ（１ｋｇ当たりドキソルビシン３３ｍｇに相当）を、７日間隔で、合計５回の同一の投与量（Ｑ７ＤＸ５）で静脈内投与した。マウスの重量と腫瘍の測定（キャリパにより）を、投与開始前（０日目）に１週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は１週間に２度おこなった。投与開始直前（試験日：−２日目〜０日目）に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、０日目で約２５０ｍｇであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である１．５ｇ（癌エンドポイント）に到達したときか、又はマウスの重量損失が２５％超（毒性エンドポイント）となったときに、マウスを安楽死させた。６０日目で、試験を終了した。ドキソルビシンを投与した１匹のマウスは、腫瘍が潰瘍化したので、評価から除いた。
【０２２８】
ヌードマウスにおいて、媒質対照群腫瘍は、比較的ゆっくりと増殖し（図２２）、腫瘍は、不均一な増殖特性を示した。２９日目〜６０日目の腫瘍重量エンドポイント範囲（データは図示せず）で試験を終了した。対照マウスでは、体重の損失が徐々に生じ、試験中に平均重量が１５％減少した（図２３）。このような悪液質重量損失は、ＬＮＣａＰ異種移植片によるものと思われる。これについては、他にも報告されている（ＤｅＦｅｏ−Ｊｏｎｅｓ等、「Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ‘ｐｒｏｄｒｕｇ’  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｋｉｌｌｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ（前立腺特異的抗原により活性化したペプチド−ドキソルビシン「プロドラッグ」は、生体内における前立腺特異的抗原について陽性の前立腺腫瘍細胞を選択的に殺生する）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（１１）：１２４８−１２５２（２０００））。同じ発送品からの非腫瘍マウスは、重量を維持し、前哨マウスは、コロニー健康調査では正常であった。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンを投与したマウスは、平均重量損失が２０％超であった（図２３）。腫瘍による腫瘍を有するマウスにおけるベースライン重量損失と試験化合物による重量損失の複合効果により、許容重量損失を超える重量損失が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとドキソルビシンの両方において生じ、試験した比較的高投与量処方で許容のできないほどの毒性であり、それぞれマウス７匹中７匹及び５匹中４匹について、これらの処置群における過剰の重量損失のため、試験を終了した（表１７）。
【０２２９】
【表１７】
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【０２３０】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ＬＮＣａＰ腫瘍の増殖を、完全に阻害した（図２２、表１７）。この試験では、腫瘍の増殖特性がゆっくりであり、対照群における動物が、指定の試験の最終日（６０日目）まで生存し続けたため、生存エンドポイントは測定しなかった。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ群において試験を終了した全てのマウスの平均腫瘍重量は、ドキソルビシンを単独で投与した群よりも顕著に小さかった（それぞれ２３２ｍｇ及び９６７ｍｇ；計算値、図示せず）。全体として、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ドキソルビシンより、腫瘍増殖阻害の面で優れていた。
【０２３１】
実施例２４：
ＳＣＩＤマウスにおけるＬＮＣａＰ腫瘍に対する効力
次に、ＬＮＣａＰ異種移植片の試験を、次のように変更して実施した：ＳＣＩＤマウスを使用し、ドキソルビシンとＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの両方についてより低い投与量を試験して、良好な耐容の投与量反応を得るとともに、投与回数を２回に制限し、これを６日間間隔をあけて実施して、化合物のベースライン腫瘍関連重量損失に対する相加的影響を最小限に抑制した。したがって、１０匹のＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスからなる群に、２５０００００個のＬＮＣａＰ細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン３若しくは４ｍｇ／ｋｇ又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ４０、５０若しくは６２ｍｇ／ｋｇ（それぞれ１ｋｇ当たりドキソルビシン２２、２８及び３５ｍｇに相当）を、６日間隔で、合計２回の同一の投与量（Ｑ６ＤＸ２）で静脈内投与した。マウスの重量と腫瘍の測定（キャリパにより）を、投与開始前（０日目）に１週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は１週間に２度おこなった。投与開始直前（試験日：−２日目〜０日目）に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、０日目で約２００ｍｇであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である１．５ｇ（癌エンドポイント）に到達したときか、又はマウスの重量損失が２５％超（毒性エンドポイント）となったときに、マウスを安楽死させた。６０日目で、試験を終了した。
【０２３２】
ＬＮＣａＰ腫瘍を移植した媒質対照群マウスは、ここでも移植時から徐々に重量を減少し、２２日までに、平均重量損失が約１９％となった（図２４）。約１２日目で、試験における全てのマウスの体重損失が平坦となった。これは、観察される腫瘍関連悪液質を制御するためにおこなった、標準げっし動物の食事から高脂肪げっし動物の食事に食事を変更した場合と一致した。
【０２３３】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、３つの全ての投与レベルで、１２日目で腫瘍の増殖を顕著に阻害し、測定の最後の日に、全てのマウスが生存していた。投与量の増加とともに効力が増加する傾向がみられた。但し、効力は、５０ｍｇ／ｋｇで最高であった。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４０ｍｇ／ｋｇ）は、ドキソルビシン（３又は４ｍｇ／ｋｇ）（これらの両方とも、統計的有意性が得られなかった）よりも、腫瘍増殖阻害の程度がよかった（図２５及び表１８）。
【０２３４】
４０ｍｇ／ｋｇＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを投与したマウスは、対照投与の開始からの平均重量損失％とほぼ同じであり、両方のドキソルビシン群よりも小さかった(図24)。      ５０ｍｇ／ｋｇＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及び６２ｍｇ／ｋｇＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを投与したいくつかのマウスは、重量損失が２２日目で２０％超であり、許容できないレベルであった（図２４及び表１８）。
【０２３５】
【表１８】
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【０２３６】
全般的に、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、効果的であり、１週間に２回の処置後のＬＮＣａＰ腫瘍増殖の阻害において、ドキソルビシンよりも優れていた。
【０２３７】
実施例２５：
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＬＮＣａＰ異種移植片に対する効力
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞は、表面上で高レベルのＣＤ１０を発現する。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを、単回投与レベルＱ７Ｄｘ５で試験した。８匹の雄ＮＣｒヌードマウスからなる群に、４００００００個のＬＮＣａＰ細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン５ｍｇ／ｋｇ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ５９ｍｇ／ｋｇ（１ｋｇ当たりドキソルビシン３３ｍｇに相当）又はＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ７３ｍｇ／ｋｇ（１ｋｇ当たりドキソルビシン４７ｍｇに相当；又は１ｋｇ当たりＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ８１ｍｇに相当）を、７日間隔で、合計５回の同一の投与量（Ｑ７ＤＸ５）で静脈内投与した（表１９）。マウスの重量と腫瘍の測定（キャリパにより）を、投与開始前（０日目）に１週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は１週間に２度おこなった。投与開始直前（試験日：−２日目〜０日目）に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、０日目で約２５０ｍｇであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である１．５ｇ（癌エンドポイント）に到達したときか、又はマウスの重量損失が２５％超（毒性エンドポイント）となったときに、マウスを安楽死させた。６０日目で、試験を終了した。ドキソルビシンを投与した１匹のマウスは、腫瘍が潰瘍化したので、評価から除いた。
【０２３８】
【表１９】
0004541693.tif 000020
【０２３９】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ＬＮＣａＰ腫瘍の増殖を完全に停止させ、全ての処理したマウスの腫瘍の緩解を誘起し、ドキソルビシンよりも効果的であった（表１９）。興味深いことに、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘよりも３７％高いモル濃度で投与した      Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、全く効果的でなかった。この試験では、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、他の腫瘍モデル（ＬＳ１７４Ｔ及びＭＸ−１）におけるほぼそのＲＤ−ＭＴＤで投与した。しかしながら、この投与量は、ＬＮＣａＰ腫瘍を有する媒質対照マウスでさえ、平均体重損失が約１５％であり、ＬＮＣａＰ腫瘍を有するマウスに大き過ぎることが分かった。このような悪液質（通常慢性疾患と関連している一般的な身体的消耗及び栄養失調）重量損失は、ＬＮＣａＰ異種移植片によるものと思われる。これについては、他にも報告されている（ＤｅＦｅｏ−Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（１１）：１２４８−１２５２（２０００））。驚くべきことに、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを、ＨＴ−２９モデル（実施例２６）において試験した効力のある投与量よりも１０％多く投与したとき、ＬＮＣａＰモデルでは有効ではなかったが、まだ耐容性があった。それにもかかわらず、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙが効力を相対的に欠いていることと、比較的高投与量で毒性があることは、ＣＤ１０が、腫瘍活性化プロドラッグの生体内切断に重要な役割を果たしているということと一致する。
【０２４０】
実施例２６：
ＣＤ１０neg細胞系であるＨＴ−２９に対するＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘの効力
マウスの異種移植片試験では、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘがヒト結腸癌（ＨＴ−２９）の増殖に対して効力があることと、長期生存の効果があることが明らかとなった。健康な若い雄ヌードマウスに、５００００００個のＨＴ−２９細胞を皮下注射した。腫瘍の重量が約１００ｍｇに達したとき、８匹のマウスからなる群、１０匹のマウスからなる群又は１２匹のマウスからなる群に対して、７日ごとに５回、媒質、ドキソルビシン４ｍｇ／ｋｇ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ４０若しくは６７ｍｇ／ｋｇ投与することを、開始した。腫瘍のサイズと体重を、１週間に２回、６０日間、測定した。
【０２４１】
マウスの生存日数が投与量を増加とともに増加することが、観察された。  Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを４０ｍｇ／ｋｇ及び６７ｍｇ／ｋｇ（４２ｍｇ／ｋｇ及び７０ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量濃度）で投与したとき、耐容性が極めてよく、腫瘍を有するマウスの生存率が大きく延びた。ドキソルビシンで処置したマウスのＭＤSは、３０日であった。平均生存日数が、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘで処置した群で、３９日及び４１日に増加し、これに対して、媒質対照群では２６日であった（表２０）。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを高投与量で投与した場合、媒質対照群に対して、腫瘍増殖速度が顕著に減少した（表２０）。化合物の耐容性が極めてよかった。このことは、投薬量が、両方とも反復投与ＭＴＤ未満であったことを示唆している。
【０２４２】
したがって、本発明者等は、ＨＴ−２９モデルにおけるＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘについての用量反応及び大きな治療濃度域を確定した。ＨＴ−２９細胞は、生体外でＣＤ１０を発現せず、他の酵素、例えば、チメットオリゴペプチダーゼは、ＨＴ−２９異種移植片におけるＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ切断に関与していると思われる。
【０２４３】
【表２０】
0004541693.tif 000021
【０２４４】
実施例２７：
チメットオリゴペプチダーゼ及びＣＤ１０による切断性と、効力との比較
腫瘍活性化プロドラッグ化合物の切断におけるＣＤ１０の生体内での役割をさらに評価するために、チメットオリゴペプチダーゼ及びＣＤ１０についての明確な切断プロファイルを有するドキソルビシン含有プロドラッグ化合物を、Ｃ．Ｂ−１７．ＳＣＩＤマウスにおいて増殖するＬＮＣａＰ異種移植片で試験した。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを、評価した。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（３レベル）を除く全ての化合物は、２つのレベルで投与して、全ての化合物についての用量反応を得る試験をおこなった。試験化合物の各々についての切断プロファイルを、表２１に示す。
【０２４５】
【表２１】
0004541693.tif 000022
【０２４６】
ＬＮＣａＰ腫瘍を有するヌードマウスが重量損失を生じることが分かったので、本発明者等は、各化合物について、以前の研究及びＳＤ−ＭＴＤの結果に基づいて、良好な耐容等毒性投薬量であると推定される極めて控えめの投薬量レベルを選択した。反復投与についての高投与レベルは、通常それらのＳＤ−ＭＴＤの８０％であり、低投与量レベルは、高投与量レベルの８０％である。したがって、１０匹の雄ＣＤ１７．ＳＣＩＤマウスからなる群に、２５０００００個のＬＮＣａＰ細胞を皮下注射し、化合物を表２２で示すレベルで、６日間隔で、合計２回の同一投与量（Ｑ６ＤＸ２）で静脈内投与した。
【０２４７】
【表２２】
0004541693.tif 000023
【０２４８】
ＬＮＣａＰ腫瘍は、ＳＣＩＤマウスにおいて十分に増殖したが、ＬＮＣａＰ腫瘍異種移植片を有するＳＣＩＤマウスは、試験終了時点での対照マウスの８０％の重量損失が２５％超であり、重量損失が大きかった。それにもかかわらず、ほぼ等毒性レベルでの異なる処置の効力を、マウスの５０％が毒性重量損失に到達するのに要する時間と、試験の終了時点で毒性重量損失を示したマウスの合計数に基づいて、比較した。この比較の結果を、表２３に示す。
【０２４９】
【表２３】
0004541693.tif 000024
【０２５０】
これらの化合物を、最も効果的なものから最も効果のないものまでを順に示すと、以下の通りである：Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、ドキソルビシンよりも効果的であり、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘよりも効果が小さい。ＣＤ１０がＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを切断することができないこと（実施例２参照）及び生体内での効力がないこと（実施例２５参照）から予測されるように、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＤｏｘはＬＮＣａＰ腫瘍に対してそれほど活性がなかった。
【０２５１】
実施例２８：
薬物動態学的／代謝試験
ＩＣＲ正常雌マウスの６つ群に、単回ＩＶボーラス投与により、約１００μモル／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ又は１０μモル／ｋｇのドキソルビシン（Ｄｏｘ）を投与した。血漿を、５分、１時間、２時間、４時間又は６時間の時点で、各群において３匹の個々の動物から得た。親濃度、ジペプチジル−ドキソルビシン（Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ）濃度、α−アミノアシル−ドキソルビシン（Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又はＧｌｙ−Ｄｏｘ）濃度及びドキソルビシン濃度を、蛍光検出（λex＝４８０ｎｍ、λem＝５６０）を利用した逆相勾配ＨＰＬＣ法を用いて、血漿試料の抽出物について分析した。標準を入手できなかったため、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘのピーク保持時間は、確認しなかった。マウス血漿中における１０〜２０００ｎｇ／ｍＬドキソルビシン溶液の測定に適合させた直線状標準曲線を用いて、量を求めた。
【０２５２】
濃度の経時的変化（図２６）から明らかなように、ＣＤ１０により切断されないＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを除くすべての化合物について、代謝パターンが同様であった。特に、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを除いて、Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、最初の２時間にわたって主要な代謝産物であり、一方、ジペプチジル複合体Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、Ｌｅｕ−Ｄｏｘとほぼ同時に形成したより少量の生成物であった。このことは、ＣＤ１０についての切断パターンと一致している。ドキソルビシンが後で現れ、血漿濃度が、現在及び以前測定されたドキソルビシン薬物動態学（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｉｊｇｈ、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ４‘−ｅｐｉｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ，ｈｅａｔ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ（血漿、心臓及び腫瘍を有するマウスにおけるドキソルビシン及び４’−エピドキソルビシンの比較代謝及び薬物動態学）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２６（１）  ９−１２  （１９９０）；及びＴａｂｒｉｚｉ−Ｆｒａｄ等、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  ｉｎ  Ｆｅｍａｌｅ  ＩＣＲ（ＣＤ１（登録商標））  Ｍｉｃｅ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（静脈内投与後の雌ＩＣＲ（ＣＤ１（登録商標））マウスにおけるドキソルビシンプロドラッグの薬物動態学的特性の評価）」、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：３２４（２００１））から、及びドキソルビシン対照基により予想される他の代謝産物よりも、経時的にもっとゆっくりと減少した。血漿濃度時間曲線(表２４)の下の領域は、ＣＤ１０により切断されることが予想されない唯一のペプチジル複合体であり、４種のＣＤ１０切断可能なペプチジル−ドキソルビシン化合物よりもかなりＤｏｘ暴露が少ない、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘの投与を示している。ＣＤ１０切断性化合物のうち、チメットオリゴペプチダーゼ（Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）によっても切断されることができるものは、P１位のロイシンをイソロイシンに置換した対応の非化合物（それぞれＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）よりも、ドキソルビシン暴露（ＡＵＣ）が約２倍大きかった。これらのイソロイシン置換化合物は、ＴＯPによる切断が小さいか、生じなかった。また、トリペプチドが、それらの対応のテトラペプチド物と比較して、Ｄｏｘに対するＡＵＣ暴露が、２倍減少した（Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ対Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ対Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）。これらの化合物を投与した後の相対ドキソルビシン暴露は、マウスの安全性試験における最大耐量として表される相対的安全���ににている。このように、ドキソルビシンへの暴露についてよりよいプロファイルが得られる。
【０２５３】
【表２４】
0004541693.tif 000025
【０２５４】
これらの結果は、身体で通常生じているＴＯPが、ＣＤ１０基質でもある特定の化合物についての非腫瘍活性機構であるという仮説と一致している。腫瘍関連ＣＤ１０により活性化されるべき化合物について、データから、化合物がＴＯP基質でないときには、Ｄｏｘ暴露が約２倍少ないことから、オリゴペプチドを、ＴＯPによる消化を制限するように設計するのが好ましいと思われる。このような化合物として、例えば、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが挙げられる。
【０２５５】
実施例２９：
ＣＤ１０をトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系の分析
ＣＤ１０が、ペプチド前駆体薬剤を切断できること示す直接の確証を得るために、ＣＤ１０トランスフェクション体細胞系を、分析した。
【０２５６】
ＣＤ１０ｃＤＮＡを、３組の重複プライマーを用いて、ＰＣＲにより、ヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした：
ａ５ＨｉｎｄＣＤ１０    ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧ
ａ３ＸｂａＣＤ１０      ＴＣＴＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＧＧＴＣ
ｂ５ＸｂａＣＤ１０      ＴＣＴＡＧＡＧＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＴＣ
ｂ３ＸｈｏＣＤ１０      ＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＡＴＣ
ｃ５ＸｈｏＣＤ１０      ＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＴＡＣ
ｃ３ＰａｃＣＤ１０      ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＴＴＣ
【０２５７】
完全組み立てコード領域を、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモータの下流の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。ＤＮＡ配列解析により、ヒトＣＤ１０（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｙ００８１１）のコード配列との配列の同一性を確認した。発現プラスミドを、線状化し、ＣＨＯ−Ｓ細胞に安定的にトランスフェクションした。ＣＤ１０発現トランスフェクション体クローンを、５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン下で選択し、市販の抗ＣＤ１０−ＦＩＴＣ抗体を用いて、細胞表面ＣＤ１０発現についてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。図２９は、トランスフェクション体ＣＨＯ細胞クローンの幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）を示す。
【０２５８】
続いて、クローンを、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの存在下で、3Ｈチミジン増殖アッセイで試験した。ＣＨＯ細胞は、Ｄｏｘについての平均ＩＣ50値が、ＬｎＣＡＰ細胞とＲａｍｏｓ細胞がそれぞれ１３０ｎＭ及び１０ｎＭであるのに対して、５７０ｎＭであったので、ドキソルビシンに対する感度がより小さいと思われる（表２５）。表２６では、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの活性をＤｏｘと比較している。ＬｎＣａＰ（ＣＤ１０陽性）でのＤｏｘとＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのＩＣ50が、３倍異なるので、親ＣＨＯ細胞で、４９の差があった。この数であると、ＣＤ１０をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞では、ほぼ１６倍となる。
【０２５９】
【表２５】
0004541693.tif 000026
【表２６】
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【０２６０】
ＣＤ１０発現細胞がプロドラッグを切断できるかどうかを直接確認するために、化合物で処理したＣＤ１０トランスフェクション又は親ＣＨＯ細胞からの上清を、集めた。親ＣＨＯ及びＣＤ１０トランスフェクション体（クローン８）を、１０μＭ  Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（ＣＤ１０の基質）又はＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ（ＣＤ１０の基質ではない）とともに、３７℃でインキュベーションした。１時間、４時間及び２４時間のインキュベーションの後、各上清のアリコットを、９６ウエルプレートに移し、−２０℃で凍結した。続いて、試料を、解凍し、３容のアセトニトリルで希釈し、遠心分離で沈殿物を除去し、さらに３容の水で希釈した後、蛍光検出を用いた逆相ＨＰＬＣ（４．６×５０ｍｍ  ２μ  ＴＳＫ  Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳカラム）により分析した。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとともにインキュベーションしたとき、親細胞系で観察されるＬｅｕ−Ｄｏｘへの検出可能な代謝がなく、一方、クローン８（ＣＤ１０トランスフェクションした）は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（表２７）から、顕著なレベルのＬｅｕ−Ｄｏｘを生成した。ＣＤ１０をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞は、非トランスフェクションＣＨＯ細胞と比較して、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘの切断速度を顕著には増加しなかった。このことは、このペプチド前駆体薬剤は、ＣＤ１０の基質としてはよくないという示唆と一致している。
【０２６１】
【表２７】
0004541693.tif 000028
【０２６２】
ＣＤ１０発現ＣＨＯ細胞が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを切断できることを確認するために、以下の化合物の各々に暴露してから２４時間後に、上清を集めた：Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ。これらの上清を、Ｄｏｘ感受性ＨＬ６０細胞（ＣＤ１０陰性）に移し、２４時間後に、細胞増殖を測定した。3Ｈチミジン増殖データから、親ＣＨＯ又はＣＤ１０陰性ＣＨＯ細胞からの上清は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの存在下で増殖を阻害しないのに対して、２つの代表的なＣＤ１０陽性ＣＨＯ細胞は、増殖を阻害することが、明らかである（表２８）。追加の対照として、新鮮なＤｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを、ＨＬ６０に添加し、２４時間後に、ＩＣ50測定をおこなった。化合物を、新たにＨＬ６０細胞（ＣＤ１０陰性）に添加しても、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの切断が生じない。ここでも、切断にはＣＤ１０が必要であることを示している。データの確認から、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘをＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘと比較したところ、得られた結果が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＬｅｕがＣＤ１０がトランスフェクションされた細胞により切断され且つ親細胞系によっては切断されないことと一致することが、明らかである。
【０２６３】
【表２８】
0004541693.tif 000029
【０２６４】
ようするに、データから、ＣＤ１０は、プロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを切断してＬｅｕ−Ｄｏｘを放出できることが、明らかである。
【０２６５】
実施例３０：
ドキソルビシン感受性ＬＮＣａＰ前立腺癌モデルにおける、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンによる腫瘍増殖阻害の比較
ＣＤ１０陽性腫瘍細胞系（ＬＮＣａＰ）におけるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ対ドキソルビシンの腫瘍阻害の相対的効力の比較を実施して、匹敵する用量反応及び治療指数を確定した。
【０２６６】
このモデルでは、リン酸緩衝生理食塩水０．１ｍｌ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）０．１ｍｌに再懸濁した７５０００００個のＬＮＣａＰ細胞を、高脂肪食で飼育した雄のヌードマウスの側部に注射投与した。平均腫瘍重量が約２００ｍｇに達したときに、投与を開始した。その投与処方を、表２９に示す。
【０２６７】
効力
３つの全ての投与量レベル（モル当量：１８、２２、２８ｍｇドキソルビシン／ｋｇ）でＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、２２日目で腫瘍の増殖を顕著に阻害し、測定の最終日時点で、全てのマウスが生存していた（図３０及び表２９）。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの効力においては、投与量に関連した増加傾向はみられず、最大効力は、１８ｍｇ／ｋｇＤｏｘ当量で得られた（図３０）。さらに、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの３つの全ての投与量では、腫瘍増殖阻害が顕著であり、４ｍｇ／ｋｇで投与したドキソルビシンよりも大きかった。この投与量でのドキソルビシンでは、対照からの統計的有意性は得られなかった（表２９）。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの３つの全ての投与群では、腫瘍は、所定の癌エンドポイント（＞１ｇ）に達しなかった（図３１）。したがって、ドキソルビシンではなく、            Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘでは、対照群に対して、腫瘍を有するマウスの生存日数が、顕著に増加した（表２９）。
【０２６８】
毒性
さらに、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、３つの全ての投与量で、極めて良好な耐容性があり、試験を３６日目で終了したときには毒性エンドポイントに達するものがなく、群平均補正体重（腫瘍重量を引いた値）の最大損失は、３％であった（図３２）。ドキソルビシン４ｍｇ／ｋｇを投与したマウスは、２２日目で一匹が毒性エンドポイント（重量損失＞２０％）となり、２２日目での群平均補正体重損失は、約７％であった。また、対照群マウスでも、わずかに重量損失が生じ（群平均補正体重損失：最大５％）、腫瘍増殖によると思われる２匹が毒性エンドポイントに達した（表２９）。
【０２６９】
【表２９】
0004541693.tif 000030
【０２７０】
ようするに、この増殖の遅いドキソルビシン感受性ＬＮＣａＰモデルでは、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、３つの全ての投与量で、腫瘍の増殖を顕著に阻害し、マウスの生存日数を延長し、且つ耐容性が極めて良好であった（図３０〜３２）。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、増殖が遅い比較的ドキソルビシンに感受性のある前立腺腫瘍の増殖阻害の面で、ドキソルビシンのほぼ等毒性の投与量よりも、顕著によい。ドキソルビシンをその最大耐量（２２日目で、８匹のうちの１匹のマウスに重量損失があり、毒性エンドポイントに達した）付近の投与量で投与したとき、腫瘍については効果的であったが、腫瘍増殖阻害又は生存日数の延長の面で、対照からの統計的有意性は得られなかった。その結果、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが、３つの全てのレベルで、ドキソルビシンよりも良好に顕著にＬＮＣａＰ腫瘍増殖を阻害し、且つＬＮＣａＰヒト前立腺腫瘍モデルにおけるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘについての治療濃度域が、比較的広いことが確認された。さらに、そのドキソルビシンに対する感受性のため、この例に記載のモデルは、プロドラッグ分子の残部からのドキソルビシンの放出の良好な指標として役立つ。
【０２７１】
実施例３１：
ドキソルビシン感受性ＬＮＣａＰ前立腺癌モデルにおけるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びトリペプチドであるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘとＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘによる腫瘍増殖阻害の比較
腫瘍活性化プロドラッグ化合物の切断における細胞外ＣＤ１０対ＴＯＰ（チメットオリゴペプチダーゼ）の生体内の役割をさらに評価するために、ＣＤ１０に対して明瞭な切断プロファイルを有するドキソルビシン含有プロドラッグ化合物を、ヌードマウス中で増殖させたＣＤ１０positiveＬＮＣａＰ異種移植片で試験した。
【０２７２】
ＴＯPとＣＤ１０の両方の基質であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、及びＣＤ１０の基質であるが、ＴＯPについてはより弱い基質であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、等モル量、２２ｍｇ／ｋｇＤｏｘ当量Ｑ７Ｄｘ３で投与した。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘよりも比較的弱い基質であるけれども、ＴＯPの基質であるＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを、単独で、７０ｍｇ／ｋｇＤｏｘ当量Ｑ７Ｄｘ３で投与した（Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのモル濃度投与量よりも３倍多いレベル）。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、腫瘍増殖を大きく阻害し（図３３）、対照群に対して２２日目で７０％超のＴＧＩ（腫瘍増殖阻害率）が得られ（表３０）、阻害率が統計的に有意に増加した。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの３倍のモル濃度で投与したＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、腫瘍増殖阻害が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（ＴＧＩ  Ｄ２２：３９．７±２９．５％対７７．５±２７．５％）よりも小さく、対照からの統計的有意性は得られなかった（表３０）。さらに、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ群とＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ群の両方において、いずれの腫瘍も、所定の癌エンドポイント（＞１ｇ）には達しなかった（図３４）。３つの全ての化合物は、耐容性が極めて良好で、３６日で試験を終了した時点で毒性エンドポイントには達しなかった（図３５）。
【０２７３】
【表３０】
0004541693.tif 000031
【０２７４】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ対Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘの投与効力反応の差異は、ＣＤ１０が、ＣＤ１０+ＬＮＣａＰ腫瘍における腫瘍活性化プロドラッグ化合物切断において生体内で極めて重要な役割を果すことを強く裏付けている。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘとＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが、ＬＮＣａＰ異種移植片に対して同様な効力を有することは、ＣＤ１０が、ＣＤ１０+ＬＮＣａＰ腫瘍において、腫瘍活性化プロドラッグ化合物切断において、ＴＯPよりも支配的な役割を果たすことを示唆している。
【０２７５】
残りの例についての分析方法
固相法又は液相法を用いて合成したペプチド配列を、ＨＰＬＣ（Ａ法、Ｂ法及びＤ法）分析の結果、粗生成物の純度が８０％超である場合には、さらに精製することなく使用した。粗生成物の純度が８０％以下の場合には、生成物を、さらに分取ＨＰＬＣのＣ法を用いて精製した。
【０２７６】
ＨＰＬＣのＡ法
ＨＰＬＣ分析を、Ｃ−１８カラム（４μｍ、３．９×１５０ｍｍ  ＩＤ、流量１ｍＬ／分）を用いたＷａｔｅｒｓ２６９０によりおこなった（溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ）の勾配で溶離）。得られたデータを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いて、λ２５４ｎｍで処理した。ＨＰＬＣ分析での勾配は、溶媒Ａ９０％から開始し、１４分かけて最後に溶媒Ｂ１００％とした（直線的に）。この方法及び以下の方法についての化合物の純度を、ピーク曲線下の相対面積％で評価した。
【０２７７】
ＨＰＬＣのＢ法
ＨＰＬＣ分析を、Ｃ−８カラム（３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ  ＩＤ、流量１ｍＬ／分）を用いたＷａｔｅｒｓ２６９０によりおこなった（溶媒Ａ（８０％  ２０ｍＭギ酸アンモニウム及び２０％アセトニトリル）及び溶媒Ｂ（２０％  ２０ｍＭギ酸アンモニウム及び８０％アセトニトリル）の勾配を用いて溶離）。得られたデータを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いて、λ２５４ｎｍで処理した。ＨＰＬＣ分析での勾配は、溶媒Ａ１００％から開始し、３０分かけて溶媒Ｂ１００％とした（直線的に）。
【０２７８】
ＨＰＬＣのＣ法
粗生成物の分取精製を、Ｃ−４カラム（１５μｍ、４０×１００ｍｍ  ＩＤ、流量３０ｍＬ／分）を用いたＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ４０００システムにより実施した。溶離は、溶媒Ａ（Ｈ2Ｏ）及び溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）の勾配によりおこなった。分取ＨＰＬＣの勾配は、溶媒Ａ８０％から開始し、７０分かけて溶媒Ｂ１００％とした（直線的に）。ＵＶ検出は、λ２５４ｎｍでおこなった。
【０２７９】
ＨＰＬＣのＤ法
ＨＰＬＣ分析を、ＴＳＫ  ｓｕｐｅｒＯＤＳカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ社）を用いたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ装置によりおこなった：溶媒Ａ（ＴＦＡ０．１％水溶液）；溶媒Ｂ（ＴＦＡ０．１％アセトニトリル溶液）；勾配：２分間でＢ３０％→３６％、１０分間でＢ３６％→４１％、３分間でＢ４１％→９０％、Ｂ９０％で５分間、検出波長λ２５４ｎｍ。
【０２８０】
ＮＭＲ及びＭＳ
さらなる構造測定をＮＭＲ法及びＭＳ法でおこない、得られた結果は、請求の範囲に記載の化合物を裏付けるものであった。
【０２８１】
ＴＬＣ法
ＴＬＣ分析を、シリカゲル６０Ｆ−２５４ｎｍ−０．２５ｍｍプレート（Ｍｅｒｃｋ社）を用い、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／ギ酸８８％  ８５／１５／１／２の条件で溶離して、実施した。
【０２８２】
ニンヒドリン試験
数ミリグラムの生成物を試験管に入れ、２滴の溶液Ａ（ニンヒドリンの５０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液）、２滴の溶液Ｂ（フェノールの４ｍｇ／ｍＬエタノール溶液）、そして２滴の溶液Ｃ（２ｍＬ  ０．０１Ｍ  ＫＳＣＮ、ピリジン１００ｍＬ、水性液）を添加した。得られた混合物を沸騰水浴に５分間入れた。遊離アミンの存在下では溶液は紫色になる。
【０２８３】
オリゴペプチドの具体的合成例
市販試薬のソース
ドキソルビシン及びダウノルビシンは明治製菓株式会社（日本）製、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4はＳｔｒｅｍ  ｃｈｅｍ社（マサチューセッツ州Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ）製、ＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ社（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）製、溶媒、ＨＡＴＵはＡｌｄｒｉｃｈ社（ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）製、全ての樹脂及びアミノ酸はＡＢＩ社（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）製、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）製、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ社（ケンタッキー州Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ）製、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（ケンタッキー州Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ）製又はＳｙｎＰｅｐ社（カリフォルニア州Ｄｕｂｌｉｎ）製であった。
【０２８４】
実施例３２：
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
トリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ）を、標準的Ｆｍｏｃ化学的性質を用いた固相法により合成した。合成は、典型的にはＷａｎｇアルコキシ樹脂（添加量０．６０ミリモル／ｇ）を使用した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、固相ペプチド合成に使用した。
【０２８５】
樹脂に１ｍＭペプチドとなるように、３当量のアミノ酸を、活性剤としてのＨＢＴＵで５分間予備活性化した後、２当量のＤＩＥＡとともに、樹脂に添加した。カップリング反応を２時間実施した後、ＤＭＦ（２５ｍＬ×３）及びＤＣＭ（２５ｍＬ×３）で洗浄した。このカップリング反応を、同様の条件下で、２当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験で観察し、ニンヒドリン試験での確認で、２時間後で反応が不完全である場合には、３回目のカップリング工程を、反復した。脱保護は、ピペリジンをＤＭＦに２０％添加して調製した溶液を用いて、１５〜２０分間おこなった。カップリング工程を、次のアミノ酸を用いて、所望のペプチドが樹脂上にアセンブリされるまで反復した。ペプチドの樹脂からの最終的な切断は、樹脂を９５％ＴＦＡと５％水からなる溶液で処理することによりおこなった。反応混合物を、室温（ｒｔ）で２時間攪拌した後、樹脂を、減圧濾過し、ＴＦＡで２回洗浄した。濾液を混合し、冷エーテル４００ｍＬを添加することにより、ペプチドを沈殿させた。ペプチドを、減圧濾過し、乾燥してＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ａ法で求めたＨＰＬＣ純度：９２％）を得た。粗ペプチドを、ＬＣ／ＭＳにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【０２８６】
実施例３３：
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
テトラペプチド（Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ）を、標準的Ｆｍｏｃ化学的性質を用いた固相法により合成した。合成は、典型的にはＷａｎｇアルコキシ樹脂（添加量０．６０ミリモル／ｇ）を使用した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、固相ペプチド合成に使用した。樹脂に１ｍＭペプチドとなるように、３当量のアミノ酸を、活性化剤としてのＨＢＴＵで５分間予備活性化した後、２当量のＤＩＥＡとともに、樹脂に添加した。カップリング反応を２時間実施した後、ＤＭＦ（２５ｍＬ×３）及びＤＣＭ（２５ｍＬ×３）で洗浄した。このカップリング反応を、同様の条件下で、２当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験で観察し、ニンヒドリン試験での確認で、２時間後で反応が不完全である場合には、３回目のカップリング工程を、反復した。脱保護は、ピペリジンをＤＭＦに２０％添加して調製した溶液を用いて、１５〜２０分間おこなった。カップリング工程を、次のアミノ酸を用いて、所望のペプチドが樹脂上にアセンブリされるまで反復した。ペプチドの樹脂からの最終的な切断は、樹脂を９５％ＴＦＡと５％水からなる溶液で処理することによりおこなった。反応混合物を、室温（ｒｔ）で２時間攪拌した後、樹脂を、減圧濾過し、ＴＦＡで２回洗浄した。濾液を混合し、冷エーテル４００ｍＬを添加することにより、ペプチドを沈殿させた。ペプチドを、減圧濾過し、乾燥してＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ａ法で求めたＨＰＬＣ純度：９２％）を得た。粗ペプチドを、ＭＳにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【０２８７】
実施例３４：
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
ドキソルビシン・ＨＣｌ（２．３４ｇ、４．０３ミリモル）及びＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２．４ｇ、４．４８ミリモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、高速攪拌し、これにＤＩＥＡ（１．５６ｍＬ、８．９６ミリモル）を一度に加え、反応混合物を室温で１５分間攪拌した。反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、ＨＡＴＵ１．８７ｇ（４．９２ミリモル）を、１０分かけてゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温でさらに６０分間攪拌した。氷冷水（２００ｍＬ）を、反応混合物に添加したところ、赤色沈澱が生じた。沈殿物を、粗フリット上に集め、水３×５０ｍＬ及びジエチルエーテル３×５０で洗浄し、減圧乾燥してＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（収率８９％、Ａ法で求めたＨＰＬＣ純度：９４％）を得た。この生成物を、ＭＳにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【０２８８】
実施例３５：
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
ドキソルビシン・ＨＣｌ（１．４３ｇ、２．５ミリモル）及びＦｍｏｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１．６ｇ、２．６ミリモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、高速攪拌し、これにＤＩＥＡ（１ｍＬ、５．７ミリモル）を一度に加え、反応混合物を室温で１５分間攪拌した。反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、ＨＡＴＵ１．０７ｇ（２．８ミリモル）を、１０分かけてゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温でさらに６０分間攪拌した。氷冷水（２００ｍＬ）を、反応混合物に添加したところ、赤色沈澱が生じた。沈殿物を、粗フリット上に集め、水３×５０ｍＬ及びジエチルエーテル３×５０で洗浄し、減圧乾燥してＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（収率８８％、Ａ法で求めたＨＰＬＣ純度：９２％）を得た。この生成物を、ＭＳにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【０２８９】
実施例３６：
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘからのＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
乾燥ＤＭＦ２０ｍＬにＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４．４ｇ、４．１３ミリモル）を添加して調製した溶液に、ピペリジン（２０．４ｍＬ、２０６ミリモル）を一度に添加したところ、色が赤色から紫色に変化した。反応混合物を、室温で５分間攪拌した後、乾燥氷／アセトン浴を用いて−２０℃に冷却した。次に、無水コハク酸２１．２ｇ（２１０ミリモル）を、冷却した反応混合物に一度に添加した。反応液を、−５℃で５分間高速攪拌した後、室温でさらに９０分間攪拌した。無水ジエチルエーテル７５０ｍＬを、反応混合物に添加したところ、赤色沈殿が生じた。この沈殿を、中ガラスフリット上に単離し、ジエチルエーテル２×５０ｍＬで洗浄し、減圧乾燥してＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（収率８０％、Ｂ法によるＨＰＬＣ純度８８％）。最終生成物を、分取ＨＰＬＣのＣ法を用いて精製し、ＬＣ／ＭSにより特徴付けした。その結果、分子量が、９３９（予想分子量９４０）であった。
【０２９０】
実施例３７：
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘからのＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４ｇ、３．５３ミリモル）を、乾燥ＤＭＦ４０ｍＬ添加して調製した溶液に、ピペリジン（１７．４ｍＬ、１７６ミリモル）を一度に添加したところ、色が赤色から紫色に変化した。反応混合物を、室温で５分間攪拌した後、乾燥氷／アセトン浴を用いて−２０℃に冷却した。次に、無水コハク酸１８ｇ（１８０ミリモル）を、冷却した反応混合物に一度に添加した。反応液を、−５℃で５分間高速攪拌した後、室温でさらに９０分間攪拌した。無水ジエチルエーテル７５０ｍＬを、反応混合物に添加したところ、赤色沈殿が生じた。この沈殿を、中ガラスフリット上に単離し、ジエチルエーテル２×５０ｍＬで洗浄し、減圧乾燥してＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（収率７８％、Ｂ法によるＨＰＬＣ純度８６％）。最終生成物を、分取ＨＰＬＣのＣ法を用いて精製し、ＬＣ／ＭSにより特徴付けした。その結果、分子量が、１０１１（予想分子量１０１２）であった。
【０２９１】
実施例３８：
Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（２４．３４ｇ、０．０４モル）を、ＤＭＦ（３５０ｍＬ）とマグネチックスターラを入れた丸底フラスコに添加する。テトラペプチドを溶解後、溶液に、攪拌しながら臭化ベンジル（４．７６ｍＬ、０．０４ミリモル）を添加し、その後炭酸セシウム（１３．０４ｇ、０．０４モル）を添加する。得られた反応混合物を室温で１．５時間攪拌する。次に、反応混合物を、氷水４５０ｍＬを入れたフラスコにゆっくりと注ぐ。その結果、多量の白色固体が沈殿し、それを吸引濾過により集める。この生成物を、水（２×２００ｍＬ）で洗浄し、減圧デシケーターに入れる。
【０２９２】
実施例３９：
β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
丸底フラスコ（２５ｍＬ）において、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ（０．７ｇ、１．０ミリモル）を、無水ＤＭＦを５ｍＬに溶解する。ピペリジン（１．２ｍＬ、１２．１ミリモル）を溶液に添加し、得られた混合物を室温で２５分間攪拌する。反応を、水（６ｍＬ）で停止し、酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出する。混合した有機層を、さらに水（２×５ｍＬ）、食塩水（５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。溶媒を除去すると、白色固体（０．８ｇ）が得られる。
【０２９３】
実施例４０：
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
丸底フラスコ（２５０ｍＬ）で、メチルヘミスクシネート（３．１９ｇ、２４．２ミリモル）を、無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解する。ＤＩＥＡ（４．２２ｍＬ、２４．２ミリモル）、続いてＨＢＴＵ（９．１７ｇ、２４．２ミリモル）を、溶液に添加する。得られた混合物を、室温で４５分間攪拌する。この混合物に、無水ＤＭＦ（１５０ｍＬ）にβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ（粗生成物、１０．１４ｇ含有、２１．３ミリモル）を添加して調製した溶液を、添加する。混合物を、室温で２．５時間連続して攪拌する。次に、反応混合物を、氷水２００ｍＬを入れたフラスコに、攪拌しながらゆっくりと注ぐ。その結果、多量の白色固体が沈殿し、それを酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出する。有機層を混合し、混合した有機層を、水（２×２００ｍＬ）、食塩水（２００ｍＬ）でさらに洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。
【０２９４】
実施例４１：
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ（１．０ｇ、１．４６ミリモル）を、メタノール１００ｍＬを入れたエルレンマイヤーフラスコに添加する。５０ｍＬのメタノールを加える。この溶液を水素添加反応容器に移す。この容器に、Pｄ−Ｃ（９０ｍｇ、１０％湿潤、５０％水；０．０４２ミリモル）を添加する。室温で２時間水素添加した後、反応を停止、触媒を濾過する。
【０２９５】
実施例４２：
「尿素法」を用いた、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンのカップリング
乾燥窒素雰囲気下、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ２６．０４ｇ（５２．０ミリモル）及びドキソルビシン塩酸塩２３．２６ｇ（４０．２ミリモル）とを、乾燥尿素飽和（ほぼ３０％ｗ／ｖ）ＤＭＦ８００ｍＬ及びＤＩＥＡ１９．９４８ｍＬに懸濁／溶解する。この混合物を、ほぼ２５分間かけて０〜３℃に冷却する。この時点で、ＨＡＴＵ２１．２ｇ（５６．０ミリモル）を、１０分間かけて、ほぼ１００ｍＬの尿素飽和ＤＭＦに添加した溶液として添加する（この溶液の容積は、最小限に保たなければならない）。反応混合物を、−２〜２℃で１０分間攪拌し、２％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する氷冷食塩水４０００ｍＬに、激しく攪拌しながら、約５分間かけて注ぐ。生成物を、中多孔度フリットガラスフィルター上に濾取し、水で十分に洗浄し、減圧乾燥する。
【０２９６】
実施例４３：
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の合成
丸底フラスコ（５０ｍＬ）で、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（０．２５ｇ、０．５ミリモル）及びドキソルビシン（０．２９ｇ、０．５ミリモル）を、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解する。得られた混合物を、５分間攪拌後、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１．０ミリモル）、続いてＨＢＴＵ（０．１９ｇ、０．５ミリモル）を、溶液に添加する。得られた混合物を、室温で４時間攪拌する。ＤＭＦを、ロータリーエバポレーターにより除去し、残留物を、１：１塩化メチレン：メタノール４．０ｍＬに溶解する。この溶液に、エーテル４０ｍＬを、攪拌しながら、ゆっくりと添加する。沈殿物が形成し、これを吸引濾過により集める。得られた固体を、エーテル（２×１０ｍＬ）で洗浄し、真空デシケータに入れて乾燥する。
【０２９７】
実施例４４：
ＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘからの遊離ドキソルビシンの除去
ＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（２００ｍｇ、０．１９４ミリモル）、ＤＩＥＡ（０．０６８ｍＬ、０．３８８ミリモル）及び無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）を、磁気攪拌棒を備えた５０ｍＬフラスコに入れる。ＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが完全に溶解したら、イソシアネート樹脂（３９０ｍｇ（０．５８２）をジクロロメタン５ｍＬに５分間予備膨潤したもの）を、添加し、得られた溶液を、定期的にＨＰＬＣで観察しながら、室温で２時間攪拌する。次に、Ｄｏｘが完全に除去されたことをＨＰＬＣにより確認したら、反応混合物をフリットにより濾過して樹脂を除去する。この樹脂を、ＤＭＦ１０ｍｌで洗浄し、ＤＭＦ洗浄液を、濾過した反応混合物と混ぜる。次に、濾過反応混合物洗浄液を、高真空ポンプと３０℃の水浴とを備えたロータリーエバポレーターにより濃縮する。残留物を、ＤＭＦ５ｍＬに懸濁し、次に、溶液を、高速攪拌した無水ジエチルエーテル溶液にゆっくりと添加する。次に、生成物を、フリット上に濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥してＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得る。
【０２９８】
実施例４５：
架橋酵素を用いた、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の加水分解
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤（１．０ｇ、０．９７５ミリモル）及びＤＭＦ１００ｍＬを、５００ｍＬフラスコに入れる。得られた懸濁液を、マグネチックスターラーで激しく攪拌する。ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤が完全に溶解したら、脱イオン水４００ｍＬを添加し、得られた溶液を、３５℃で攪拌する。洗浄したＣＬＥＣ−ＰＣ（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）固定化酵素の１ｇのスラリーを３アリコットの脱イオン水中ですすいだ後、２０％ＤＭＦ水溶液１０ｍＬに再懸濁してから、使用する。得られた懸濁液を、定期的にＨＰＬＣで観察しながら３５℃で攪拌する。ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の全てが消費されたら、反応混合物を、０．４５μＭナイロンメンブレンフィルターで濾過してＣＬＥＣ−ＰＣ酵素を除去する。ＣＬＥＣ−ＰＣケーキを、メタノール３×１０ｍＬで洗浄し、メタノール洗浄液を濾過した反応混合物と混ぜる。次に、濾過した反応混合物＋メタノール洗浄液を、高真空ポンプと３０℃水浴を備えたロータリーエバポレーターにより濃縮して赤色ガム状物を得る。次に、この赤色ガム状物を、室温で、脱イオン水５０ｍＬに懸濁し、メカニカルスターラーで高速攪拌する。この懸濁液に、脱イオン水１００ｍＬに重炭酸ナトリウム７７．８ｍｇ（０．９２６ミリモル、０．９５当量）に添加して調製した溶液を、２分間かけて添加する。得られた懸濁液を、室温で２０分間攪拌する。反応混合物を、０．４５μＭナイロンメンブレンフィルターにより濾取し、凍結乾燥する。
【０２９９】
実施例４６：
可溶性酵素を用いた、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の加水分解
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤１１．０ｇ（１０．７２ミリモル）を、ＨＰＬＣグレード水８００ｍＬに懸濁し、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ  Ｔ８ホモジナイザーにより、６０分間均一化して微細懸濁液を得る。この懸濁液を、３５℃で攪拌（５００ｒｐｍ）し、７６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3水溶液を添加してｐＨ６．０５に調整する。次に、１．０ｇ  Ｃ．Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ「Ｂ」リパーゼ（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を添加し、反応混合物を、３５℃で４８時間攪拌する。この４８時間の反応時間の間、７６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3を定期的に添加することにより、ｐＨを５．３〜６．２に維持し、反応を定期的にＨＰＬＣで観察する。反応がほぼ完了したら、次に反応混合物に、７６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3水溶液を添加してｐＨ７に調整し、Ｃｅｌｉｔｅ５２１パッドにより濾過する。次に、清澄反応混合物に、氷酢酸５ｍＬを添加して酸性化（ｐＨ約３）する。生じた沈殿物を、Ｃｅｌｉｔｅ５２１で濾過して単離した後、Ｃｅｌｉｔｅパッドをメタノールですすぐ。メタノール溶液を、１０〜２０μＭフリットガラスフィルターで濾過し、ロータリーエバポレーターにて乾燥する。得られた生成物を、７６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3（０．９５当量）７０ｍＬに溶解することにより、ナトリウム塩に転換し、凍結乾燥する。この生成物は、実施例４５の生成物と同一である。
【０３００】
実施例４７：
固定化Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ「Ｂ」リパーゼによる、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の加水分解
Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ「Ｂ」リパーゼ（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）３０．０ｇを、水３００ｍＬに溶解し、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3水溶液（ｐＨ＝６．４）３×４リットルに対して透析する。ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＮＨＳ−活性化セファロース４ファーストフロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）３６０ｍＬを、粗ガラスフリット漏斗に入れ、それを氷冷１ｍＭ  ＨＣｌ水溶液５×４５０ｍＬですすぐ。次に、すすいだＮＨＳ−活性化セファロースを、透析した酵素溶液と混ぜる。得られた懸濁液を、周囲温度（約２２℃）で２．０時間攪拌する。次に、セファロース／酵素複合体を、粗フリットガラスフィルター上に単離した後、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ水溶液（ｐＨ＝７．４５）１０００ｍＬに添加して、１５分間攪拌する。この懸濁液を、濾過し、別の１００ｍＭ水性ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４５）１０００ｍＬとともに、４℃で一晩インキュベーションする。朝に、固定化酵素を、濾取し、水洗後、２０００ｍＬの３つ口丸底フラスコに入れる。ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤４３ｇを添加し、固体を、脱イオン水８００ｍＬに懸濁する。フラスコに、オーバーヘッドスターラーを取り付け、シリンジポンプを制御することにより、反応混合物のｐＨが５．９〜６．２に保たれるようにｐＨシュタット設定する。シリンジポンプに、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3をチャージする。反応の進行を、ＨＰＬＣにて追跡する。反応がほぼ完了したら、固定化酵素を濾去し、液相を凍結乾燥する。次に、乾燥固体を、乾燥ＴＨＦ約１１ｍＬに懸濁し、濾過する。
【０３０１】
実施例４８：
メチルスクシニル−Ｎ−Ｃａｐ型βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の大規模合成
ドキソルビシン・ＨＣｌ６９．６ｇ（１２０ミリモル）とＭｅＯＳｕｃ−ｂＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ１００ｇ（１９９ミリモル）とを、窒素下、無水ＤＭＦ（１０Ｌ）に溶解した。ＤＩＥＡ７６ｍＬ（４３４ミリモル）を、反応混合物に添加し、この反応混合物を、窒素下、室温で１０分間攪拌した。次に、反応混合物を、１０分間かけて、０℃に冷却した。別個のフラスコに、ＨＡＴＵ８６４ｇ（２２０ミリモル）をＤＭＦ（５００ｍＬ）に添加して、溶液を調製した。このＨＡＴＵ溶液を、反応混合物に、反応混合物を０℃に維持しながら、２０分間かけてゆっくりと添加した。反応混合物を、０℃で３０分間攪拌した。
【０３０２】
水（２５Ｌ）にＮａＣｌ（７．５ｋｇ、少なくとも３０％ｗ／ｖ）を添加して、溶液を調製し、その溶液を、０℃に冷却した。次に、この反応混合物を、激しく攪拌しながら、冷却した食塩溶液に、１２０分間かけてゆっくりと添加した。溶液の色は、赤色のままであった。溶液の色が青色の場合、酢酸を直ちに添加することにより、ｐＨを５．８〜６．０に調整する必要がある。温度を、約５℃に維持した。赤色沈殿物を、中多孔度フリットガラスフィルター上に濾取し、水洗し、減圧下Ｐ2Ｏ5により乾燥してＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ１１５ｇを得た。
【０３０３】
実施例４９：
微量のドキソルビシンを除去するための、Ｐｓ−イソシアネートビーズを用いたＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの処理
ＰＳ−イソシアネートビーズ１４６．４ｇ（２４０ミリモル、カリフォルニア州Ｓａｎ  ＣａｒｌｏｓにあるＡｒｇｏｎａｕｔ  Ｌａｂ社製）を、無水ＤＭＦ１．５Ｌに溶解し、得られた溶液を、室温で５〜１０分間膨潤させた。膨潤ビーズを、ガラスフリット漏斗により濾過し、追加の無水ＤＭＦ５００ｍＬで洗浄した。ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ１１５ｇ（１１２ミリモル）を、無水ＤＭＦ１０００ｍＬに溶解し、ＤＩＥＡ２．１ｍＬ（１２ミリモル）を添加後、膨潤PS−イソシアネートビーズを添加した。反応混合物を、室温で攪拌し、ドキソルビシンピークの量が０．１％未満となるまで、ＨＰＬＣを用いて観察した。これには、バッチのサイズによって、２〜１２時間かかる。ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｔｅｒ２６９０カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ8３．５μＭ  ４．６×１５０ｍｍ（カタログ番号ＷＡＴ０９４２６９）、溶媒Ａ：２０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝４．５）８０％、アセトニトリル２０％、溶媒Ｂ：２０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝４．５）２０％、アセトニトリル８０％によりおこなった。カラム温度：制御室温、試料温度：４℃、試験時間：３７．５分、検出：２５４ｎｍ、流量：１．０ｍＬ／分、注入量：１０μｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ×０．０２ｍＬ）、移動相Ａ及びＢ。勾配：７．５分間平衡遅延による、移動相Ａ１００％から移動相Ｂ１００％までの、３７．５分間直線状勾配。
【０３０４】
６時間の時点で、ドキソルビシンピークの量は、０．１％未満であった。反応混合物を、粗焼結ガラス漏斗により濾過して、ビーズを除去した。水３．５ＬにＮａＣｌ  １．１ｋｇを添加して食塩水（少なくとも３０％（ｗ／ｖ））を調製し、０℃に冷却した。次に、濾過した反応混合物を、４５分間かけて、冷却した食塩溶液に、激しく攪拌しながらゆっくりと添加した。溶液の色は、赤色のままであった。溶液の色が青色の場合、酢酸を直ちに添加することにより、ｐＨを５．８〜６．０に調整する必要がある。赤色沈殿物を、中焼結ガラス漏斗により濾取し、水洗し、減圧下Ｐ2Ｏ5により乾燥して、残留ドキソルビシンのないＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０３０５】
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘをＭｅＯＨ  １Ｌに溶解し、次に、得られたメタノール溶液を、激しく攪拌しながら、冷却したエチルエーテル１４Ｌに、６０分間かけてゆっくりと添加した。赤色沈殿物を、中焼結ガラス漏斗により濾過し、エーテル（１Ｌ）で洗浄し、真空乾燥してＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ１１０ｇを得た。純度を、実施例３７と同様にＨＰＬＣにより測定したところ、９６．５％であった。ＭＳ  ｍ／ｚ：（Ｃ50Ｈ67Ｎ5Ｏ18）理論値１０２５、実測値１０４８（Ｍ+＋Ｎａ）。
【０３０６】
実施例５０：
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得るための、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの酵素加水分解
ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ「Ｂ」リパーゼ）酵素を、溶液の形態で購入した（マサチューセッツ州ボストンにあるＡｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）。ここで、酵素濃度は、溶液１ミリリットル当たりの乾燥酵素の重量として定義される。粗酵素懸濁液を、数分間震盪して均一溶液を得た。この均一溶液の５０４ｍＬ（３２８ミリモル）アリコットを、フラスコに入れた。脱イオン水２．５Ｌを添加し、得られたスラリーを、マグネチックスターラーを用いて、１０分間攪拌した。酵素溶液を、酵素を乾燥させずに、粗ガラスフリット漏斗を用いて濾過した。この酵素を、フラスコに戻した。酵素を、水に懸濁し、３回以上濾過した。
【０３０７】
酵素ケーキを、脱イオン水５５０ｍＬに再懸濁し、ＲＢフラスコに移した。この懸濁液に、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ１０９ｇ（１０６ミリモル）を添加し、反応混合物を、室温（２５℃）で攪拌した。１Ｎ  ＮａＨＣＯ3溶液をチャージしたシリンジポンプを備えたｐＨシュタットにより、反応混合物のｐＨを、５．８〜６．１に維持した。反応の進行を、実施例４９に記載したようにして、定期的にＨＰＬＣモニタリングで追跡した。２４時間後、ＨＰＬＣで測定したところ、反応が９４％完了したように思われる。
【０３０８】
反応を加速するために、２４時間後には、追加のＣＬＥＣ酵素が必要であった。ＣＬＥＣ酵素（均一溶液）１６８ｍＬを、上記したような構成のカラムで洗浄した。酵素ケーキを、脱イオン水１．１Ｌに再懸濁し、反応混合物に添加した。反応混合物を、定期的にＨＰＬＣで観察しながら、室温で攪拌し、ｐＨを、５．８〜６．１に維持した。６０時間後、ＨＰＬＣで確認したところ、反応が９９．９％完了した。
【０３０９】
０．２μＭフィルターによる濾過により、ＣＬＥＣ酵素を、反応混合物から除去し、脱イオン水５００ｍＬですすいだ。次に、濾液を、凍結乾燥してＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ・Ｎａを得た（９５．２ｇ、物理収率８７％、ＭＳ  ｍ／ｚ：（Ｃ49Ｈ65Ｎ5Ｏ18）理論値１０１１、実測値１０３４（Ｍ+＋Ｎａ））。
【０３１０】
プロドラッグ化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、質量スペクトル分析ＦＴＩＲ、ＮＭＲによって十分に特徴付けした。
【０３１１】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの質量スペクトル分析から、１０３３でのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（Ｃ49Ｈ65Ｎ5Ｏ18Ｎａ）の理論値ｍ／ｚと一致する１０３４（Ｍ+＋Ｎａ）に分子イオンピーク（ｍ／ｚ）があることが明らかである。
【０３１２】
また、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの試料も、ＦＴＩＲにより分析した。得られたスペクトルは、上記した材料の基準のスペクトルと一致した。主要吸収の帰属を、以下に示す：
ヒドロキシル      ３３７９ｃｍ-1
Ｃ−Ｈ              ３０００〜２７００
カルボニル        １６５０〜１７２５
【０３１３】
最後に、試料を、ＮＭＲ分析した。化学シフトと帰属を、表３１と図２８に示す。ケトン領域には、２１５．２ｐｐｍ、１８７．７ｐｐｍ、１８７．４ｐｐｍに３個の炭素があり、この構造は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘと一致する。後者の２つは、同様の化学シフトを有し、したがって、１８７．７ｐｐｍ及び１８７．４ｐｐｍで（２）及び（３）に帰属する。したがって、残りのケトンは、（１）である。これらの帰属のさらなる確証が、ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルから得られ、これらの３つのいずれも、ＨＭＱＣピークを示さず、したがって、非プロトン化状態であり、（１）のみが、４．７７ｐｐｍでプロトンに対して長範囲Ｃ−Ｈカップリング（ＨＭＢＣ）を有し、これは、２プロトンシングレットであり、したがって、（４）である。ＨＭＱＣスペクトルから明らかなように、６５．７ｐｐｍの炭素は、これらのプロトンに結合している。
【０３１４】
３．９６ｐｐｍでの1Ｈ  ＮＭＲシグナルは、化学シフトを示し、メトキシ基の領域を有する。これらのプロトンは、５７．２ｐｐｍの炭素にカップリングしており、構造（５）におけるメトキシのみに帰属している。13Ｃ化学シフトも、メトキシと一致する。プロトンの長範囲Ｃ−Ｈカップリングは、１６２．３ｐｐｍの炭素に対してであり、（６）と思われる。
【０３１５】
ＨＭＱＣスペクトルから、１２０．５ｐｐｍ、１２０．３ｐｐｍ及び１３７．２ｐｐｍに３つのプロトン化芳香族炭素があることが明らかであり、芳香族プロトンは、長範囲Ｃ−Ｈカップリングも、隣接プロトン間のカップリングも示さなかった。芳香族プロトンシグナルは、極めてブロードであり、Ｔ2緩和時間が短いことが分かる。このことは、カップリングがないことを示している。カップリングがないとすると、これらの３つの部位を一義的に帰属させることはできず、まとめて（７）、（８）及び（９）に帰属する。
【０３１６】
１５７．２ｐｐｍと１５６．１ｐｐｍでの２つの非プロトン化芳香族炭素は、（１０）と（１１）、すなわち、酸素に結合する芳香族炭素と一致する化学シフトを有する。長範囲カップリングは、観察されない。
【０３１７】
１１２．３ｐｐｍ及び１１２．０ｐｐｍでの１３ＣＮＭＲシグナルは、酸素置換に対してオルト位の芳香族炭素と一致し、（１２）及び（１３）に帰属する。また、１２1.３での１３Ｃ  ＮＭＲシグナルからも、この効果が明らかであり、（１４）に帰属する。残りの３つの非プロトン化芳香族炭素は、この領域における最後の３つの炭素、（１５）、（１６）及び（１７）に帰属する。
【０３１８】
芳香族炭素に対する長範囲Ｃ−Ｈカップリングがないことは、予想されないことであり、短Ｔ2緩和時間又はプラナー構成のために、カップリングが、極めて小さいか、又は存在しないことを示している。
【０３１９】
１８１〜１７４ｐｐｍに６つのカルボニル炭素がある。これらのうち、１８０．６ｐｐｍの炭素は、ナトリウム塩と一致する化学シフトを有する唯一のものであり、したがって、（１８）に帰属する。このピークは、２．４ｐｐｍでのプロトン（未分割）に長範囲Ｃ−Ｈカップリングしていることを示している。残りの５つのカルボニル炭素は、全て一つのｐｐｍ化学シフト範囲内であり、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）の可能性はない。
【０３２０】
１０２．３ｐｐｍでの炭素は、２つの別個の酸素に結合した炭素と一致する化学シフトを有するので、（２４）と思われる。これは、１．７４ｐｐｍでのプロトンに長範囲Ｃ−Ｈカップリングしており、（２５）に帰属される。このプロトンは、３０．６ｐｐｍの３炭素にカップリングしている。Ｃ−Ｏ領域（８０〜６０ｐｐｍ）における炭素のうち、一つのみが、７７．４ｐｐｍでプロトン化され、（２６）であると思われる。これは、プロトン又は炭素に対して長範囲Ｃ−Ｈカップリングしていない。
【０３２１】
８０〜６０ｐｐｍ領域においてまだ帰属していない３つの炭素がある。これらは、全て、酸素に結合したメチンである。これらは、全て、同様の化学シフト（７１．２ｐｐｍ、６９．９ｐｐｍ及び６８．８ｐｐｍ）を有するが、６８．８ｐｐｍでの炭素が（２８）でのメチルに長範囲カップリングしていることが明らかであると思われる。また、６９．９での炭素も、（２８）でのメチルに長範囲カップリングしている。したがって、（２７）に隣接していると思われ、（２９）に帰属する。したがって、残りのメチンは、（３０）である。
【０３２２】
３．６ｐｐｍ（２９）のプロトンは、４７．３ｐｐｍで一つの炭素のみに対して長範囲Ｃ−Ｈカップリングしている。唯一の隣接未帰属炭素は、（３１）と思われる。（３１）のプロトンは、他のプロトンとオーバーラップし、長範囲の相関は、可能ではない。
【０３２３】
残りの４つのメチルは、イソプロピル領域にあり、そのうちの一つが、１．２５／１．３４ｐｐｍにあり、最後の残りのメチル（３２）に相当すると思われる。このメチルのプロトンは、５１．３ｐｐｍで、一つの炭素のみに対して長範囲カップリングしており、（３３）であると思われる。（３３）のプロトンは、他のプロトンと大きくオーバーラップし、いずれの長範囲相関にも、使用できない。
【０３２４】
残りの４つのメチルは、全て、まとめた（３４）とした、イソプロピルのメチルからのものと思われる。（３４）のプロトンは、メチル対間で、２５．９／２５．８ｐｐｍ及び４１．６／４１．７ｐｐｍの炭素に長範囲カップリングしている。これらのメチンは、（３５）／（３６）に帰属され、メチレンは、（３７）／（３８）に帰属する。これらのプロトンの全ては、１．５〜１．８ｐｐｍでオーバーラップしているが、５４．７／５３．５ｐｐｍでのメチンに長範囲カップリングしており、アミドに隣接するものと思われ、（３９）／（４０）に帰属する。
【０３２５】
残りの５つの炭素（全てメチレン）は、カルボニルに長範囲カップリングしており、そのようなものに隣接していると思われ、（４１）、（４２）及び（４３）に帰属する。1Ｈ  ＮＭＲの化学シフト、全て、２．４ｐｐｍでオーバーラップし、３７．２ｐｐｍ、３４．４ｐｐｍ及び３３．８ｐｐｍの炭素に相当する。３７．２での炭素は、最も異なるので、ナトリウム塩カルボニル（４１）に帰属し、他の２つは、アミドカルボニル（４２）、（４３）に帰属する。残りの２つのメチレンは、類似しすぎて、具体的な帰属（４４）、（４５）ができない。
【０３２６】
帰属されていない一つの部位がある。５．５〜１．５ｐｐｍの領域には、３０のプロトンがあり、
この帰属部位を含む構造と一致する。したがって、炭素シグナルが、約５０ｐｐｍでの溶媒シグナルの下に隠れており、窒素に隣接するメチレンに場合と一致すると思われる。
【０３２７】
【表３１】
0004541693.tif 000032
【０３２８】
本明細書で述べた全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が、具体的且つ個々に記載された場合と同程度にまで、引用することにより本明細書の内容とする。
【０３２９】
本発明を、詳細に説明したが、当業者には、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、数多くの変更及び修正ができることは、明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３３０】
【図１Ａ】略語、名前及び構造を示した表である。
【図１Ｂ】略語、名前及び構造を示した表である。
【図１Ｃ】略語、名前及び構造を示した表である。
【図１Ｄ】略語、名前及び構造を示した表である。
【図２】標的細胞の細胞外付近及び標的細胞内における本発明のプロドラッグの典型的な切断スキームである。
【図３】本発明の典型的な中間体である、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成を示す。
【図４】本発明の典型的な中間体である、メチル−スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕの「Ｆｍｏｃルート」合成を示す。
【図５】本発明の典型的な化合物である、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの塩の「Ｆｍｏｃルート」合成を示す。
【図６】本発明の典型的な化合物である、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの塩の「エステルルート」合成を示す。
【図７】本発明の典型的な中間体である、アミノで保護されたβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの合成を示す。
【図８】本発明の典型的な化合物である、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの塩の「アリルエステルルート」合成を示す。
【図９】本発明の典型的な化合物である、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの「樹脂ルート」合成を示す。
【図１０】本発明のプロドラッグに有用であるオリゴペプチドについての表である。
【図１１】スキャベンジャー樹脂又はビーズを使用することによる、遊離治療剤の除去を示す。
【図１２】種々の培養ヒト細胞系のホモジネートによる、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの特定の加水分解速度についての表である。
【図１３】種々の異種移植片組織のホモジネートによる、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの特定の加水分解速度についての表である。
【図１４】細胞系のパネルについてのフローサイトメトリー分析により測定したＣＤ１０の発現を示す。
【図１５】３００ｎＭホスホラミドンの不存在下又は存在下におけるＣＤ１０によるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの切断の一部の滴定曲線を示すグラフである。
【図１６】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の１時間後及び４時間後における、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとその代謝産物の血漿レベルを示すグラフである。
【図１７】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の０〜２時間後及び２〜２４時間後に採取した尿に存在する、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとその代謝産物の量を示すグラフである。
【図１８】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の１時間後及び４時間後における、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとその代謝産物の血漿レベルを示すグラフである。
【図１９】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の０〜２時間後及び２〜２４時間後に採取した尿に存在する、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとその代謝産物の量を示すグラフである。
【図２０】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又は媒質対照を投与した、マウスの体重変化率を示すグラフである。
【図２１】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又は媒質対照を投与した、ＬＳ１７４Ｔ異種移植片マウスの腫瘍増殖率を示すグラフである。
【図２２】媒質、ドキソルビシン又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより処理した、ヌードマウスのＬＮＣａＰの増殖を示すグラフである。
【図２３】異種移植片ＬＮＣａＰ腫瘍を有するヌードマウスの体重を示すグラフである。
【図２４】異種移植片ＬＮＣａＰ腫瘍を有するヌードマウスの体重を示すグラフである。
【図２５】媒質、ドキソルビシン又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより処理したヌードマウスのＬＮＣａＰ腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図２６】血漿中の、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンにおける、代謝産物の濃度を経時的に示すグラフである。
【図２７】本発明の典型的な中間体であるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの大規模な合成を示す。
【図２８】本発明の典型的な化合物であるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＮＭＲ帰属を示す。
【図２９】トランスフェクションしたＣＨＯ細胞についてのＣＤ１０の発現を示す。
【図３０】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、ドキソルビシン又は媒質により処理したヌードマウスのＬＮＣａＰ腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図３１】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、ドキソルビシン又は媒質により処理した異種移植ＬＮＣａＰ腫瘍を有するヌードマウスの生存率を示すグラフである。
【図３２】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、ドキソルビシン又は媒質により処理した異種移植ＬＮＣａＰ腫瘍を有するヌードマウスの群平均補正体重を示すグラフである。
【図３３】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ又は媒質により処理したヌードマウスのＬＮＣａＰ腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図３４】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ又は媒質により処理した異種移植ＬＮＣａＰ腫瘍を有するヌードマウスの生存率を示すグラフである。
【図３５】Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ又は媒質により処理した異種移植ＬＮＣａＰ腫瘍を有するヌードマウスの群平均補正体重を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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