(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２６（ＣＤＲＬ１）、配列番号２７（ＣＤＲＬ２）および配列番号２８（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖と、配列番号２３（ＣＤＲＨ１）、配列番号２４（ＣＤＲＨ２）および配列番号２５（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖とを含む、抗ＰＤ−１抗体。
【請求項２】
配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖と、配列番号２９（ＣＤＲＨ１）、配列番号３０（ＣＤＲＨ２）および配列番号３１（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖とを含む、抗ＰＤ−１抗体。
【請求項３】
配列番号３８（ＣＤＲＬ１）、配列番号３９（ＣＤＲＬ２）および配列番号４０（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖と、配列番号３５（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６（ＣＤＲＨ２）および配列番号３７（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖とを含む、抗ＰＤ−１抗体。
【請求項４】
配列番号５３（ＣＤＲＬ１）、配列番号５４（ＣＤＲＬ２）および配列番号５５（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖と、配列番号５０（ＣＤＲＨ１）、配列番号５１（ＣＤＲＨ２）および配列番号５２（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖とを含む、抗ＰＤ−１抗体。
【請求項５】
前記抗体がＰＤ１−２８である、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項６】
前記抗体がＰＤ１−３３である、請求項２に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項７】
前記抗体がＰＤ１−３５である、請求項３に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項８】
前記抗体がＰＤ１−Ｆ２である、請求項４に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号４１および配列番号５６からなる群から選択される少なくとも一つ配列の少なくとも１００個の連続するアミノ酸のうちの任意の配列と、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、１０７Ｍ−１より大きい親和定数でＰＤ−１の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、１０ｎＭ未満のＩＣ５０で、ＰＤ−ＬのＰＤ−１への結合を阻害する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、ＩｇＧ１λまたはＩｇＧ１κである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒトフレームワーク領域を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体であって、該抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の結合を阻害することが可能である、抗体。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、以下：Ｅ．Ｃｏｌｉ細菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＮＳ０細胞から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
リンパ球と接触させるのに適した、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む、適応免疫応答を調節するための組成物。
【請求項２１】
前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または単球である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体が、支持マトリクス上で固定されるか、または架橋される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記支持マトリクスが、アガロース、デキストラン、セルロース、ＰＶＤＦ、シリカ、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン（登録商標）、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、コラーゲン、およびゼラチンから選択される一以上の物質を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗ＰＤ−１抗体が、抗原によって引き起こされた免疫細胞応答を調節する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗原が、前記抗ＰＤ−１抗体と同時に提示される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗原と抗ＰＤ−１抗体とが、固体支持体マトリクス上に固定されており、そして１００μｍまたは１００μｍより小さい間隔を空けて同時に提示される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｄＡｂからなる群より選択される抗ＰＤ−１抗体フラグメントであって、
（ａ）配列番号２６（ＣＤＲＬ１）、配列番号２７（ＣＤＲＬ２）および配列番号２８（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖；および
（ｂ）配列番号２３（ＣＤＲＨ１）、配列番号２４（ＣＤＲＨ２）および配列番号２５（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖
を含む、抗ＰＤ−１抗体フラグメント。
【請求項２８】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｄＡｂからなる群より選択される抗ＰＤ−１抗体フラグメントであって、
（ａ）配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）および配列番号３４（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖；および
（ｂ）配列番号２９（ＣＤＲＨ１）、配列番号３０（ＣＤＲＨ２）および配列番号３１（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖
を含む、抗ＰＤ−１抗体フラグメント。
【請求項２９】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｄＡｂからなる群より選択される抗ＰＤ−１抗体フラグメントであって、
（ａ）配列番号３８（ＣＤＲＬ１）、配列番号３９（ＣＤＲＬ２）および配列番号４０（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖；および
（ｂ）配列番号３５（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６（ＣＤＲＨ２）および配列番号３７（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖
を含む、抗ＰＤ−１抗体フラグメント。
【請求項３０】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｄＡｂからなる群より選択される抗ＰＤ−１抗体フラグメントであって、
（ａ）配列番号５３（ＣＤＲＬ１）、配列番号５４（ＣＤＲＬ２）および配列番号５５（ＣＤＲＬ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を含む軽鎖；および
（ｂ）配列番号５０（ＣＤＲＨ１）、配列番号５１（ＣＤＲＨ２）および配列番号５２（ＣＤＲＨ３）に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む重鎖
を含む、抗ＰＤ−１抗体フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本技術分野は、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １（ＰＤ−１）レセプターによって調節される免疫応答の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
適応免疫応答は、Ｔ細胞およびＢ細胞と呼ばれるリンパ球の二種の主要なクラスの活性化、選択、およびクローン増殖を含む。抗原と接触した後、Ｔ細胞は増殖して抗原特異的エフェクター細胞へと分化し、一方でＢ細胞は増殖して抗体分泌細胞へと分化する。
【０００３】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間のいくつかのシグナル伝達現象を必要とするマルチ工程プロセスである。Ｔ細胞活性化が起こるためには、二つのタイプのシグナルが、休止Ｔ細胞へ伝達されなければならない。第一のタイプは、抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴｃＲ）によって媒介され、免疫応答に特異性を与える。第二の、同時刺激のタイプは、この応答の程度を調節し、Ｔ細胞上の補助レセプターを介して伝達される。
【０００４】
一次同時刺激シグナルは、ＣＤ２８のリガンドのＢ７−１またはＢ７−２の結合の際に、活性化ＣＤ２８レセプターを介して伝達される。対照的に、同一のＢ７−１またはＢ７−２による阻害性ＣＴＬＡ−４レセプターの結合は、結果としてＴ細胞応答の減弱になる。従って、ＣＴＬＡ−４シグナルは、ＣＤ２８によって媒介される同時刺激に拮抗する。高い抗原濃度では、ＣＤ２８同時刺激は、ＣＴＬＡ−４阻害性効果より優位に立つ。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の時間的調節は、活性化シグナルと阻害性シグナルとの間のバランスを保ち、有効な免疫応答の発生を確実にし、一方で自己免疫の発生に対して保護する。
【０００５】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の分子ホモログ、ならびにこれらのＢ−７様リガンドが、最近、同定されている。ＩＣＯＳは、ＣＤ２８様同時刺激レセプターである。ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １）は、阻害性レセプターであり、ＣＴＬＡ−４のカウンターパートである。本開示は、ＰＤ−１によって媒介される免疫応答の調節に関する。
【０００６】
ＰＤ−１は、もともとは、活性化誘導性アポトーシスを起こすＴ細胞株において同定された、５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通型レセプターである。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージにおいて発現される。ＰＤ−１に対するリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）である。
【０００７】
ＰＤ−１は、その細胞外領域に単一のＩｇ  Ｖ様ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。このＰＤ−１細胞質ドメインは、ＩＴＩＭ（免疫レセプターチロシンベースの阻害性モチーフ）（ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）内に位置する最も膜近位のチロシン（マウスＰＤ−１ではＶＡＹＥＥＬ）である、二つのチロシンを含む。ＰＤ−１上のＩＴＩＭの存在は、この分子が、細胞質のホスファターゼの補充によって、抗原レセプターシグナル伝達を減弱するために機能することを示す。ヒトＰＤ−１タンパク質およびマウスＰＤ−１タンパク質は、４つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位およびＩｇ−Ｖドメインを規定する残基を保存しながら約６０％のアミノ酸同一性を共有する。細胞質領域のＩＴＩＭならびにカルボキシ末端のチロシン周囲のＩＴＩＭ様モチーフ（ヒトおよびマウスにおいてＴＥＹＡＴＩ）もまた、ヒトオルソログとマウスオルソログとの間で保存される。
【０００８】
ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、および活性化単球上で発現される。実験データは、中枢免疫応答および抹消免疫応答のダウンレギュレーションにおけるＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用示す。特に、ＰＤ−Ｌ１の存在下において、野生型Ｔ細胞における増殖は阻害されるが、ＰＤ−１欠損Ｔ細胞における増殖は阻害されない。さらに、ＰＤ−１欠損マウスは、自己免疫表現型を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＤ−１欠損は、結果として、慢性進行性狼瘡様の糸球体腎炎および関節炎を生じる。Ｂａｌｂ／ｃマウスでは、ＰＤ−１欠損は、心臓組織特異的な自己反応性抗体の存在によって、重度の心筋症をもたらす。
【０００９】
一般的に、例えば、自己免疫疾患、炎症性障害、アレルギー、移植拒絶、癌、免疫不全、および他の免疫系関連障害のような免疫障害のための安全かつ有効な治療方法を提供する必要性が、存在する。これらの障害に関与する免疫応答の調節は、ＰＤ−１経路の操作によって、成し遂げられ得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本開示は、ＰＤ−１のアゴニストおよび／またはアンタゴニストとして作用し得る抗体を提供して、これにより、ＰＤ−１によって調節される免疫応答を調節する。本開示は、新規抗原結合フラグメントを含む抗ＰＤ−１抗体を、さらに提供する。本発明の抗ＰＤ−１抗体は、（ａ）ＰＤ−１（ヒトＰＤ−１を含める）に特異的に結合すること；（ｂ）ＰＤ−１とその天然リガンドとの相互作用をブロックすること；または（ｃ）両方の機能を実行することが可能である。さらに、これらの抗体は、免疫調節性特性を有する（すなわち、これらの抗体は、免疫応答のＰＤ−１関連ダウンレギュレーションの調節において有効であり得る）。使用方法および所望される効果に応じて、これらの抗体は、免疫応答を増強するか、または阻害するかのいずれかのために、使用され得る。
【００１１】
これらの抗体の非限定的な例示的な実施形態は、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、およびＰＤ１−Ｆ２として呼ばれる。他の実施形態は、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、またはＰＤ１−Ｆ２のＦｖフラグメントのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、任意のこれらのＶＨドメインおよびＶＬドメインのうちの一以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。他の実施形態は、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、またはＰＤ１−Ｆ２のＶＨドメインのＨ３フラグメントを含む。
【００１２】
本開示はまた、ＰＤ−１抗体を含有する組成物、および免疫応答を調節する方法（ヒトまたは動物を処置する方法を含める）におけるこれらの使用を提供する。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＴｃＲ／ＣＤ２８によって媒介されるＴ細胞応答を上昇または低下させることによって、免疫障害を処置するか、または予防するために使用される。本発明の組成物を用いた処置に感受性がある障害としては、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、移植拒絶、移植片対宿主病、高増殖性免疫不全、癌、および感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
さらに、抗ＰＤ−１抗体は、生物学的サンプル中のＰＤ−１またはそのフラグメントを検出するために、診断的に使用され得る。検出されるＰＤ−１の量は、ＰＤ−１の発現レベルと相関し得、さらに、この発現レベルは、被験体内の免疫細胞の活性化状態（例えば、活性型のＴ細胞、Ｂ細胞、および単球）と相関する。
【００１４】
本開示はまた、単離された核酸を提供し、この核酸は、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、またはＰＤ１−Ｆ２のＦｖフラグメントのＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードする配列を含む。任意の本明細書で開示されるＶＨドメインおよびＶＬドメインからの一以上のＣＤＲをコードする配列を含む、単離された核酸もまた提供される。本開示はまた、このような核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１５】
本開示はさらに、新しいＶＨドメインまたはＶＬドメイン、ならびに／あるいはＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、またはＰＤ１−Ｆ２のＶＨドメインもしくはＶＬドメイン由来のこのようなドメインの全てまたは一部を含む機能的抗体を生成する方法を提供する。
【００１６】
本開示のさらなる局面は、一部分は、以下の明細書において示され、そして一部分は明細書から明らかになるか、または本発明を実施することによって理解され得る。本発明は、示され、特に、添付の特許請求の範囲において示され、そして本開示は、決して特許請求の範囲の範囲を限定することとして解釈されるべきでない。以下の詳細な説明は、本発明の種々の実施形態の例示的な説明を含むものであって、特許請求されるように、本発明を限定するものではない。添付の図面は、本明細書の一部を構成し、そしてこの明細書とともに、種々の実施形態を説明するためだけに役立ち、本発明は限定しない。参考文献の引用は、これらの参考文献が本発明の先行技術であることを承認するものではない。
【００１７】
（詳細な説明）
（定義）
用語「抗体」は、本開示において使用される場合、免疫グロブリンまたはそのフラグメント、もしくは誘導体を言い、そして、この抗体がインビトロまたはインビボで産生されるか否かにかかわらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノ特異的抗体、ポリ特異的抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、および移植抗体を含むが、これらに限定されない。本開示の目的のために、「インタクト抗体」のように、用語「インタクト」によって他に修飾されない限り、用語「抗体」はまた、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ）、ならびに抗原結合機能（すなわち、ＰＤ−１に特異的に結合する能力）を維持する他の抗体フラグメントを含む。代表的には、このようなフラグメントは、抗原結合ドメインを含む。
【００１８】
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」、および「結合性フラグメント」は、抗体と抗原との間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部分を言う。例えば、抗原が大きい場合、この抗原結合ドメインは、この抗原の一部分にだけ結合し得る。抗原結合ドメインとの特異的相互作用を担う抗原分子の部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」と呼ばれる。
【００１９】
抗原結合ドメインは、代表的に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、抗体は、必ずしも両方を含む必要はない。例えば、いわゆるＦｄ抗体フラグメントは、ＶＨドメインのみからなるが、それでもインタクトな抗体のいくつかの抗原結合機能を保持する。
【００２０】
用語「レパートリー」は、発現される免疫グロブリンをコードする配列に全体的にあるいは部分的に由来するヌクレオチドの遺伝的に多種多様な収集物を言う。この配列は、例えば、Ｈ鎖のＶセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント、ならびに例えば、Ｌ鎖のＶセグメントおよびＪセグメントのインビボでの再構成によって作製される。あるいは、この配列は、インビトロ刺激により細胞から産生され得、このインビトロ刺激に応じて再構成が生じる。あるいは、この部分的配列または全配列は、例えば、ヌクレオチド合成、ランダム変異誘発、および他の方法（例えば、米国特許番号第５，５６５，３３２号に開示される）によって、再構成されていないＶセグメントをＤセグメントおよびＪセグメントと組み合わせることにより得られ得る。
【００２１】
用語「特異的相互作用」および「特異的結合性」は、生理的条件下において、比較的安定である複合体を形成する二つの分子を言う。通常、中〜高程度の受容能力有する低親和性を有する非特異的結合と区別されて、特異的結合は、高親和性および低〜中程度の受容能力によって特徴づけられる。代表的には、結合は、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ−１より高いか、または好ましくは１０８Ｍ−１より高い場合、特異的であるとみさなれる。必要に応じて、非特異的結合は、結合状態を変えることによって実質的に特異的結合性に影響することなく、低下され得る。この適切な結合条件（例えば、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合を可能にする時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度など）は、慣用的な技術を用いて、当業者によって最適化され得る。例示的な条件は、実施例１、２、４、６、および７において示される。
【００２２】
語句「実質的に示されるような」は、本発明の関連するＣＤＲドメイン、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインが、特定の領域（例えば、ＣＤＲ）（この配列は、示される）に対して、同一であるか、または非実質的な相違のみを有するかのいずれかであることを意味する。非実質的な相違は、少数のアミノ酸変化（例えば、特定領域の配列において、任意の５つのアミノ酸から１つまたは２つの置換）を含む。
【００２３】
用語「ＰＤ−１活性」は、ＰＤ−１と関連する一以上の免疫調節性活性を言う。例えば、ＰＤ−１は、ＴｃＲ／ＣＤ２８を介した免疫応答の負の調節因子である。インビボおよびインビトロでのＰＤ−１活性を評価するための手順は、実施例８、９、および１０に記載される。
【００２４】
用語「調節する」、「免疫調節性」、およびこれらの同族語は、ＰＤ−１の抗ＰＤ−１抗体との相互作用によって、Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションに関連するＰＤ−１の活性の低下または上昇を言い、この低下または上昇は、同抗体の非存在下におけるＰＤ−１活性に比例する。活性の低下または上昇は、好ましくは、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上である。ＰＤ−１活性が低下する場合、用語「調節性」および「調節する」は、用語「阻害性」および「阻害する」と互換可能である。ＰＤ−１の活性は、実施例８および９に記載されるようなＴ細胞増殖アッセイを用いて、定量的に決定され得る。
【００２５】
用語「処置」および「治療方法」は、治療処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防の（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を言う。処置を必要とする個体は、すでに特定の医学的障害を有する個体ならびにこの障害を最終的には獲得する個体（すなわち、予防手段を必要とする個体）を含み得る。
【００２６】
用語「有効量」は、ＰＤ−１の活性を低下させ、患者の症状の回復をもたらすため、あるいは所望される生物学的結果（例えば、Ｔ細胞の細胞溶解活性の上昇、免疫寛容の誘導、Ｔ細胞を介した免疫応答の負の調節に関連するＰＤ−１活性の低下または上昇など）を達成するために十分な投薬量または量を言う。
【００２７】
用語「単離された」は、天然の環境から実質的に遊離している分子を言う。例えば、単離されたタンパク質は、このタンパク質が由来する細胞または組織供給源からの細胞性物質または他のタンパク質を実質的に含まない。用語「単離された」はまた、単離されたタンパク質が十分に純粋であって薬学的組成物として投与されるか、あるいは、少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは、９０〜９５％純粋；ならびに、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である場合の調製物を言う。
【００２８】
（抗ＰＤ−１抗体）
本開示は、新規抗原結合フラグメントを含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。
【００２９】
概して、抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを用いて行われるファージディスプレイ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）を用いて作製され得る。他の抗体作製技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（編）．Ｈａｒｌｏｗら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８もまた参照のこと。本発明は、任意の特定の供給源、任意の特定の起源の種、任意の特定の作製方法に限定されない。
【００３０】
免疫グロブリンとしても公知であるインタクトな抗体はまた、代表的には、それぞれ約２５ｋＤａの二つの軽（Ｌ）鎖およびそれぞれ約５０ｋＤａの二つの重（Ｈ）鎖からなる四量体のグリコシル化されたタンパク質である。二つタイプの軽鎖（λ鎖およびκ鎖として名付けられる）が、抗体において見出されている。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主要なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てられ得、そしてこれらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）に分類される。
【００３１】
免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は、当該分野で周知である。抗体構造の総説については、前出のＨａｒｌｏｗらを参照のこと。簡潔には、各軽鎖は、一つのＮ末端の可変ドメイン（ＶＬ）および一つの定常ドメイン（ＣＬ）からなる。各重鎖は、一つのＮ末端の可変ドメイン（ＶＨ）、三つまたは四つの定常ドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域からなる。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、ＣＨ１として名付けられる。このＶＨドメインおよびこのＶＬドメインは、フレームワーク領域と呼ばれる四つの比較的保存された配列の領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）からなり、この領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変配列の三つの領域のための骨格を形成する。このＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を担うほとんどの残基を含む。この三つのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖上のＣＤＲ構成成分（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ）は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ、従って、一方で軽鎖上のＣＤＲ構成成分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３（および特にＨ３）は、抗原結合ドメイン内の分子多様性の最も大きな原因である。例えば、Ｈ３は、二個のアミノ酸残基と同じぐらい短くてもよく、または２６個よりも大きくてもよい。
【００３２】
Ｆａｂフラグメント（フラグメント抗原結合（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ））は、上記の定常領域間のジスルフィド結合によって共有結合的に連結されたＶＨ−ＣＨ１ドメインおよびＶＬ−ＣＬドメインからなる。宿主細胞において同時に発現される場合に、非共有結合されたＶＨドメインおよびＶＬドメインが解離する傾向を克服するために、いわゆる単鎖（ｓｃ）Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）が構築され得る。ｓｃＦｖにおいては、可撓性かつ適切な長さのポリペプチドが、ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に連結させるか、またはＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結させる。最も一般に、１５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドは、リンカーとして使用されるが、他のリンカーもまた当該分野において公知である。
【００３３】
抗体多様性は、可変領域をコードする複数の生殖系列遺伝子のコンビナトリアルアセンブリおよび種々の体細胞の事象の結果である。この体細胞の事象は、完全なＶＨ領域を作製する、多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび連結（Ｊ）遺伝子セグメントを有する可変遺伝子セグメントの組換え、ならびに完全なＶＬ領域を作製する、可変遺伝子セグメントおよび連結遺伝子セグメントの組換えを含む。この組換えプロセス自体は、不明確であって、Ｖ（Ｄ）Ｊ連結部分でアミノ酸の欠失または付加をもたらす。多様性のこれらの機構は、抗原露出前の発達中のＢ細胞において起きる。抗原刺激後、Ｂ細胞において発現される抗体遺伝子は、体細胞変異を受ける。
【００３４】
生殖系列遺伝子セグメントの概算数、これらのセグメントのランダム組換え、およびランダムＶＨ−ＶＬ対形成に基づき、１．６×１０７までの種々の抗体が産生され得る（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｐａｕｌ（編），Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３）。抗体の多様性（例えば、体細胞変異）に寄与する他のプロセスを考慮に入れる場合、１×１０１０以上の種々の抗体が潜在的に作製され得ると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，第２版，Ｊｏｎｉｏら（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。抗体の多様性に関与する多くのプロセスによって、独立的に作製される抗体は、ＣＤＲにおいて同一のアミノ酸配列またはなお実質的に類似のアミノ酸配列を有する可能性は非常に低い。
【００３５】
本開示は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー由来の新規ＣＤＲを提供する。ＣＤＲを保有するための構造は、概して、抗体の重鎖または抗体の軽鎖あるいはこれらの一部であり、その構造においてＣＤＲは、天然に存在するＶＨおよびＶＬのＣＤＲに対応する位置に位置している。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、例えば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１において記載されるように、決定され得る。
【００３６】
抗ＰＤ−１抗体、これらのｓｃＦｖフラグメント、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ならびにＣＤＲのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、配列表に示され、表１に記載されるように、列挙される。これらの抗体の特定の非限定的な例示的な実施形態は、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、およびＰＤ１−Ｆ２と呼ばれる。例示的な実施形態のＶＨドメインおよびＶＬドメイン内の各ＣＤＲについての位置は、表２および表３に記載される。
【００３７】
【表１】
0004511943.tif 000002
【００３８】
【表２】
0004511943.tif 000003
【００３９】
【表３】
0004511943.tif 000004
抗ＰＤ−１抗体は、必要に応じて、抗体の定常領域またはこれらの部分を含み得る。例えば、ＶＬドメインは、ヒトのＣκ鎖またはＣλ鎖を含める抗体の軽鎖定常ドメインのこのＣ末端で付着され得る。同様に、ＶＨドメインに基づく特異的抗原結合ドメインは、任意の抗体アイソトープ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ）ならびに任意のこれらのアイソトープのサブクラス（これとしては、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４が挙げられるが、これらに限定されない）に由来する免疫グロブリン重鎖の全てまたは一部に付着され得る。例示的な実施形態、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５において、抗体は、ヒトＩｇＧ１λの重鎖および軽鎖のＣ末端フラグメントを含み、一方でＰＤ１−Ｆ２は、ヒトＩｇＧ１κの重鎖および軽鎖のＣ末端フラグメントを含む。このＣ末端フラグメントについてのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、当該分野において周知である（例えば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１を参照のこと）。非限定的で例示的な配列が、表４に示される。
【００４０】
【表４】
0004511943.tif 000005
特定の実施形態は、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、およびＰＤ１−Ｆ２由来のＦｖフラグメントのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、任意のこれらのＶＨドメインおよびＶＬドメインのうちの少なくとも一つのＣＤＲを含む。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６〜４０、配列番号４７、または配列番号４９に示されるＣＤＲ配列抗体のうちの少なくとも一つを含む抗体は、本発明の範囲内に含まれる。例えば、実施形態は、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、ＰＤ１−３５、およびＰＤ１−Ｆ２のうちの少なくとも一つから選択される抗体のＶＨドメインのＨ３フラグメントを含む。
【００４１】
特定の実施形態において、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、生殖系列化され得る（ｇｅｒｍｌｉｎｅｄ）（すなわち、これらのドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）は、従来の分子生物学技術を用いて生殖系列細胞によって産生されるＦＲに適合するように変異される）。他の実施形態において、このフレーム領域配列は、コンセンサス生殖系列配列とは異なったままである。
【００４２】
特定の実施形態において、上記の抗体は、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する。この予測される細胞外ドメインは、配列番号４１（Ｓｗｉｓｓｐｏｒｔ登録番号Ｑ１５１１６）の約アミノ酸２１〜約アミノ酸１７０の配列からなる。特定の他の実施形態において、この抗体は、１０７Ｍ−１を超える親和性で、そしてより好ましくは１０８Ｍ−１を超える親和性で、マウスＰＤ−１の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する。マウスＰＤ−１のアミノ酸配列は、配列番号５６（登録番号ＮＭ＿００８７９８）に示され、そのヒトの対応物に対して全体で約６０％の同一である。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ結合性ドメインに結合する。
【００４３】
本発明の抗体はまた、他のタンパク質（例えば、ＰＤ−１細胞外ドメインの全て、または一部を含む組換えタンパク質を含む）と結合し得ると、考えられる。
【００４４】
当業者は、本発明の抗体を用いて、ＰＤ−１といくらかことなるタンパク質を検出し、測定し、そして阻害し得ることを認識する。この抗体は、標的タンパク質が、配列番号４１に示される配列内の連続したアミノ酸のうち、少なくとも１００個、８０個、６０個、４０個、または２０個の任意の配列に対して少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上同一である配列を含む限りは、結合の特異性を保持することが、期待される。この同一性％は、標準的なアラインメントアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム、Ｍｅｙｅｒｓら（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７．のアルゴリズムなど）によって決定される。
【００４５】
配列相同性分析に加えて、エピトープマッピング（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ,Ｍｏｒｒｉｓ（編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照のこと）ならびに二次構造分析および三次構造分析を実行して、開示された抗体および抗体の抗原との複合体から推測される固有の３Ｄ構造を同定し得る。このような方法としては、Ｘ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，１１：７−１３）および本発明の開示される抗体の仮想表示のコンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋら（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
（誘導体）
本開示はまた、ＰＤ−１に特異的な抗体を得る方法を提供する。このような抗体のＣＤＲは、表１に同定されるＶＨおよびＶＬの特異的な配列に限定されず、そしてＰＤ−１に特異的に結合する能力を保持するこれらの配列の改変体を含み得る。このような改変体は、当該分野において周知の技術を用いて、当業者によって、表１に列挙される配列から誘導され得る。例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸付加は、ＦＲにおいておよび／またはＣＤＲにおいてなされ得る。ＦＲにおける変更は、通常、抗体の安定性および免疫原性を向上するように設計され、一方でＣＤＲにおける変更は、代表的に、この標的に対する抗体の親和性を上昇するように設計される。ＦＲの改変体はまた、天然に存在する免疫グロブリンアロタイプ含む。このような、親和性を上昇させる変更は、ＣＤＲを変更させること、および抗体の標的に対する抗体の親和性を試験することを包含する慣例的な技術によって、経験的に決定され得る。例えば、保存的なアミノ酸置換は、任意の一つの開示されるＣＤＲ内になされ得る。種々の変更が、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（編）Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載される方法に従って、なされ得る。これらは、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更されて、従って「サイレント」変化を生じるヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。陽性荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。陰性荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。この配列内のアミノ酸置換は、このアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（表５を参照のこと）。さらに、このポリペプチドにおける任意のネイティブ残基はまた、アラニンで置換され得る（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら（１９９８）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４を参照のこと）。
【００４７】
本発明の抗体の誘導体およびアナログは、組換え方法および合成方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，およびＢｏｄａｎｓｋｙら（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含める当該分野において周知の種々の技術によって、作製され得る。
【００４８】
【表５】
0004511943.tif 000006
一つの実施形態において、本発明のＶＨドメインのアミノ酸配列改変体であるＶＨドメインを作製するための方法は、本発明で開示されるＶＨドメインのアミノ酸配列における一以上のアミノ酸の付加する工程、欠失する工程、置換する工程、もしくは挿入する工程、必要に応じて、このようにして提供されるＶＨドメインを一以上のＶＬドメインと組み合わせる工程、およびＰＤ−１に対する特異的な結合についてＶＨドメインもしくはＶＨ／ＶＬの組み合わせを試験する工程、または必要に応じて、このような抗原結合ドメインのＰＤ−１活性を調節する能力を試験する工程を包含する。このＶＬドメインは、同一であるか、または実質的に表１に従って示されるようなアミノ酸配列を有し得る。
【００４９】
本明細書中で開示されるＶＬドメインの一以上の配列改変体が、一以上のＶＨドメインと組み合わせられる類似の方法が、採用され得る。
【００５０】
本開示のさらなる局面は、ＰＤ−１と特異的に結合する抗原結合フラグメントを調製する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）置換されるべきＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３のコード領域を欠いたかのいずれかのＶＨドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供する工程；
（ｂ）このレパートリーを、ＶＨのＣＤＲ３（すなわちＨ３）について、本明細書中に実質的に示されるようなアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせて、このドナー核酸が、このレパートリーのＣＤＲ３領域内に挿入されることによって、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供する工程；
（ｃ）この生成物レパートリーの核酸を発現する工程；
（ｄ）ＰＤ−１に特異的な抗原結合フラグメントを選択する工程；ならびに
（ｅ）この特異的抗原結合フラグメントまたはこの結合性フラグメントをコードする核酸を回収する工程。
【００５１】
さらに、本発明のＶＬのＣＤＲ３（すなわち、Ｌ３）が、置換されるべきＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３のコード領域を欠いたかのいずれかのＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わされる方法が、採用され得る。このドナー核酸は、配列番号１７〜４０または配列番号５０〜５５において実質的に示されるようなアミノ酸配列をコードする核酸から選択され得る。
【００５２】
本発明のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）をコードする配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：７７９−７８３）に記載される方法論を用いて、それぞれのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリー内へ導入され得る。特に、可変ドメイン領域の５’末端方向の、または５’末端に隣接するコンセンサスプライマーが、ヒトＶＨ遺伝子の第三のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに使用され、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供し得る。このレパートリーは、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わされ得る。類似の技術を用いて、このＣＤＲ３由来の配列は、ＣＤＲ３を欠くＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパートリーと混合され得、そしてこの混合された完全なＶＨドメインまたはＶＬドメインは、同族のＶＨドメインまたはＶＬドメインと組み合わされて、本発明のＰＤ−１特異的抗体が作製され得る。次いで、このレパートリーは、適切な宿主細胞系（例えば、ＷＯ９２／０１０４７に記載されるようなファージディスプレイシステム）において表示されて、これによって適切な抗原結合フラグメントが選択され得る。
【００５３】
類似の混合技術またはコンビナトリアル技術もまた、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）によって開示され、Ｓｔｅｍｍｅｒは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載するが、このアプローチが、抗体の作製に使用され得ることを認める。
【００５４】
さらなる実施形態において、一以上の選択されるＶＨ遺伝子および／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を用いて、本明細書中で開示される配列由来の一以上の配列を有する新規ＶＨ領域または新規ＶＬ領域を作製し得る。一つのこのような技術の変異性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲは、Ｇｒａｍら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６−３５８０）によって記載される。
【００５５】
使用され得る別の方法は、ＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のＣＤＲに変異誘発を仕向けることである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１−５６７）によって開示される。
【００５６】
同様に、一以上のＣＤＲ、または三つ全てのＣＤＲは、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパートリー内に挿入され、次いで、ＰＤ−１に特異的な抗原結合フラグメントについてスクリーニングされる。
【００５７】
免疫グロブリン可変ドメインの部分は、本明細書中に実質的に示されるようなＣＤＲのうちの少なくとも一つを含み、必要に応じて、本明細書中に示されるようなｓｃＦｖフラグメント由来のフレームワーク領域に介在する。この部分は、ＦＲ１およびＦＲ４のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み得、この５０％は、ＦＲ１のＣ末端の５０％、ＦＲ４のＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端にあるさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域に通常は関連しない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術による抗体の構築は、導入されるリンカーによってコードされるＮ末端残基またはＣ末端残基の導入を結果としてもたらし、クローニングまたは他の操作工程を容易にし得る。他の操作工程は、可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）の作製における）、または以下にさらに詳細に議論されるようなタンパク質性標識を含むさらなるタンパク質配列に連結するためのリンカーの導入を包含する。
【００５８】
実施例に例示される実施形態は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの「適合性（ｍａｔｃｈｉｎｇ）」対を含むが、当業者は、代替的な実施形態が、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかに由来する単一のＣＤＲのみを含む抗原結合フラグメントを含み得ることを認識する。一本鎖特異的結合性ドメインのうちのいずれか一つを使用して、例えばＰＤ−１に結合可能な二つのドメイン特異的な抗原結合フラグメントを形成し得る相補性ドメインについてスクリーニングし得る。このスクリーニングは、ＷＯ９２／０１０４７に開示されるいわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法（Ｈ鎖クローンまたはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、そして結果として生じる二本鎖の特異的結合性ドメインは、記載されるようなファージディスプレイ技術に従って選択される）によって成し遂げられ得る。
【００５９】
本明細書中で記載される抗ＰＤ−１抗体は、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質（アルブミン、別の抗体など）、毒素、放射性同位体、細胞傷害剤、または細胞増殖抑制剤）に連結され得る。例えば、この抗体は、化学的架橋法によって連結され得るか、または組換え方法によって連結され得る。この抗体はまた、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に示される様式で、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の一つに連結され得る。この抗体は、ポリマーに共有結合によって、化学的に修飾されて、例えば、その循環半減期を増加させ得る。これらを付着するための例示的なポリマーおよび方法はまた、米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、および同第４，６０９，５４６号に示される。
【００６０】
この開示される抗体はまた、ネイティブのパターンと異なるグリコシル化パターンを有するように変更され得る。例えば、一以上の炭化水素部分が、欠失され得、そして／または一以上のグリコシル化部位が、最初の抗体に付加され得る。本発明で開示される抗体へのグリコシル化部位の付加は、このアミノ酸配列を当該分野において公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含めるように変更させることによって成し遂げられ得る。抗体上の炭化水素部分の数を上昇させる別の手段は、グリコシドを抗体のアミノ酸残基に化学的にまたは酵素的にカップリングさせる工程による。このような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に、およびＡｐｌｉｎｒら（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６に記載される。抗体からの任意の炭化水素部分の除去は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２；およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１によって記載されるように、ならびにＴｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０によって記載されるように、化学的にまたは酵素的に成し遂げられ得る。この抗体はまた、検出可能な標識あるいは機能的な標識を用いてタグ化され得る。検出可能な標識は、１３１Ｉまたは９９Ｔｃのような放射性標識を含み、慣用的な化学を用いて抗体に付着され得る。検出可能な標識としてはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼあるいはアルカリホスファターゼのような酵素標識が挙げられる。検出可能な標識はさらに、ビオチンのような化学的部分を含み、これは、特定の同族の検出可能な部分（例えば、標識化アビジン）への結合を介して検出され得る。
【００６１】
ＣＤＲ配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６〜４０、配列番号４７、または配列番号４９に示されるものと、非実質的にしか異ならない抗体は、本発明の範囲内に含まれる。代表的に、アミノ酸は、同様の荷電特性、同様の疎水性特性、または同様の立体化学的特性を有する関連したアミノ酸によって置換される。このような置換は、当業者の通常技術の範囲内である。ＣＤＲの場合と異なり、ＦＲにおいて、さらなる実質的な変更が、抗体の結合特性に悪影響を及ぼすことなく、なされ得る。ＦＲにおける変更は、非ヒト由来フレームワーク残基をヒト化すること、または抗原との接触にとって重要であるか、もしくはこの結合部位の安定化にとって重要である特定のフレームワーク残基を操作すること（例えば、定常領域のクラスまたはサブクラスを変更すること、Ｆｃレセプターのようなエフェクター機能を変更し得る特定のアミノ酸残基を変更すること（例えば、米国特許第５，６２４，８２１および同第５，６４８，２６０号、ならびにＬｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４に記載されるような）、または定常領域が由来する種を変更すること）を包含するが、これらに限定されない。
【００６２】
当業者は、上記に記載される改変が、完全に網羅しているわけではなく、多くの他の改変が、本開示の教示の観点から当業者に明らかになることを理解する。
【００６３】
（核酸、クローニング、および発現系）
本開示は、開示された抗体をコードする単離された核酸をさらに提供する。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、そして全体的、もしくは部分的に合成であり得るか、または組み換えであり得る。本明細書で示すような核酸配列への言及は、指定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、指定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。そのＲＮＡ配列においては、文脈が別なように必要としない限りは、ＵはＴに置換されている。
【００６４】
本明細書で提供される核酸は、本明細書で開示されるＣＤＲ、ＶＨドメイン、および／またはＶＬドメインのためのコード配列を含む。
【００６５】
本開示はまた、本明細書で開示される少なくとも１つのＣＤＲ、ＶＨドメイン、および／またはＶＬドメインをコードする核酸を含むプラスミド、ベクター、ファージミド、転写カセットまたは発現カセットの形態の構築物をも提供する。
【００６６】
本開示はさらに、１つ以上の上記の構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００６７】
ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３）ドメイン、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのいずれかをコードする核酸、およびコードされた生成物の作製の方法もまた、提供される。この方法は、コードしている核酸からコードされた生成物を発現する工程を包含する。発現は、適切な条件下で、その核酸を含む組み換え宿主細胞を培養することにより達成され得る。発現による生成に引き続いて、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または特異的な結合メンバーは、任意の適切な手法を用いて、単離され得、および／または精製され得、次いで、必要に応じて用いられる。
【００６８】
抗原結合フラグメント、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、それらの天然の環境から実質的に純粋な形態または均質の形態で単離および／または精製され得る。または、核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の、もとの核酸もしくは遺伝子を含まずにかまたは実質的に含まずに遊離型で単離および／または精製され得る。
【００６９】
種々の異なった宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、当該分野で周知である。抗体を生成するために適切な細胞に関しては、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（編），１９９９を参照のこと。手短には、適切な宿主細胞には、細菌、植物細胞、哺乳類細胞、または酵母系またはバキュロウイルス系が挙げられる。当該分野で、異種のポリペプチドの発現のために利用可能である哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスミエローマ細胞、および多くの他の細胞が挙げられる。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。本発明と両立し得る任意のタンパク質発現系が、開示された抗体を生成するために用いられ得る。適切な発現系は、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（編），１９９９において記載されたトランスジェニック動物を含む。
【００７０】
適切なベクターは、適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む）を含むように選択され得るか、または構築され得る。ベクターは、プラスミドまたはウイルス（例えば、必要に応じて、ファージ、またはファージミド）であり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの公知の手法およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，（編）Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９９２において詳細に記載されている。
【００７１】
本開示のさらなる局面は、本明細書に記載された核酸を含む宿主細胞を提供する。なおさらなる局面は、そのような核酸を宿主細胞へ導入する工程を包含する方法を提供する。この導入は、任意の利用可能な手法を適用し得る。真核細胞について、適切な手法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、エレクトロポーレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス（例えば、ワクシニア、昆虫細胞についてのバキュロウイルス）を用いた形質導入が挙げられ得る。細菌細胞について、適切な手法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポーレーション、およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションが挙げられる。核酸の細胞への導入は、その後に核酸からの発現を引き起こすか、または核酸からの発現を可能にすること、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することが続き得る。
【００７２】
（使用方法）
開示された抗ＰＤ−１抗体は、免疫応答のＰＤ−１関連ダウンレギュレーションを調節することが可能である。特定の実施形態において、免疫応答は、ＴｃＲ／ＣＤ２８に媒介される。この開示された抗体は、これらの使用の方法に依存して、ＰＤ−１のアゴニストまたはアンタゴニストのどちらかとして作用し得る。この抗体は、哺乳動物、特にヒトにおいて医学的障害を阻害、診断、または処置するために用いられ得る。本発明の抗体はまた、ＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞を単離するためにも、用いられ得る。さらに、この抗体は、異常ＰＤ−１発現または機能に関連した障害の危険性を有するか、もしくは疑いのある被験体、または異常ＰＤ−１発現または機能に関連した障害を有する被験体を処置するために用いられ得る。
【００７３】
本発明の抗体は、特定の抗原（例えば、治療のタンパク質）に対する耐性を導入するための方法において用いられ得る。１つの実施形態において、耐性は、特異的な抗原に対して、抗原および本発明の抗ＰＤ−１抗体の共投与によって導入される。例えば、第ＶＩＩＩ因子を受けた患者は、このタンパク質に対する抗体をしばしば産生する；組み換え第ＶＩＩＩ因子と組み合わせた本発明の抗ＰＤ−１抗体の共投与は、この凝固因子に対する免疫応答のダウンレギュレーションをもたらすことが予想される。
【００７４】
本発明の抗体は、免疫応答のレベルの減少が所望され得る状況において用いられ得る。それは、例えば、特定の型のアレルギーまたはアレルギー反応（例えば、ＩｇＥ生成の阻害による）、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、および全身性エリテマトーデス）、組織、皮膚および器官移植拒絶反応、および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）である。
【００７５】
減少した免疫応答が所望される場合、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、免疫応答のＰＤ−１関連減衰作用を増強するために、ＰＤ−１に対するアゴニストとして用いられ得る。これらの実施形態において、正のシグナル（すなわち、例えば、ＴｃＲまたはＢｃＲのような抗原レセプターにより媒介される）および負のシグナル（すなわち、ＰＤ−１）の共提示と両者の間の物理的近接とが必要とされる。好ましい距離は、天然に存在する抗原提示細胞のサイズより小さいか、またはそれと比較できる距離である。すなわち、約１００μｍより小さく；より好ましくは、約５０μｍより小さく；および最も好ましくは、約２０μｍより小さい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、正のシグナル（活性化）および負のシグナル（阻害）は、固体支持マトリックスもしくはキャリアに固定化されたリガンドまたは抗体により提供される。種々の実施形態において、固体支持マトリックスは、例えば、活性型アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）のようなポリマーからなり得る。あるいは、その固体支持マトリックスは、シリカまたはプラスチックポリマーに基づき得る（例えば、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリビニル、テフロン（登録商標）、など）。
【００７７】
そのマトリックスは、患者の脾臓に移植され得る。あるいは、そのマトリックスは、患者から得られたＴ細胞のエキソビボインキュベーションのために用いられ得、それは、次いで分離され、患者に戻して移植される。そのマトリックスはまた、生分解性材料（例えば、ポリグリコール酸、ポリヒドロオキシアルカノエート、コラーゲン、またはゼラチン）から作製され得、それは、患者の腹膜腔に注射され得、注射に続いてしばらく後に分解する。このキャリアは、細胞を模倣して形成され得る（例えば、ビーズまたはミクロスフェア）。
【００７８】
いくつかの実施形態において、正のシグナルは、ＴｃＲを結合するＴ細胞活性化抗ＣＤ３抗体により送達される。抗ＣＤ３抗体の活性化は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，４０５，６９６号および同第５，３１６，７６３号を参照のこと）。活性化ＴｃＲシグナルおよび負のＰＤ−１シグナルの間の割合は、当該分野で公知の従来の手順を用いて、または実施例８、９、および１０において記載されるとおりに実験的に決定される。
【００７９】
特定の状況下において、免疫障害もしくは癌を処置するために、患者の免疫応答を誘発するか、または増強することは所望され得る。開示された方法によって処置されるか、または阻害される障害としては、微生物（例えば、細菌）、ウイルス（例えば、インフルエンザのような全身性ウイルス感染、ヘルペスまたは帯状ヘルペスのようなウイルス性皮膚疾患）、または寄生虫による感染；および癌（例えば、メラノーマおよび前立腺癌）が挙げられるが、これに限定されない。
【００８０】
抗ＰＤ−１抗体を用いたＴ細胞活性化の刺激は、Ｔ−Ｔ細胞反応を増強する。このような場合、抗体は、ＰＤ−１のアンタゴニストとして作用する。従って、いくつかの実施形態において、この抗体は、ＰＤ−１に関連するダウンレギュレーション活性を阻害するか、または減少するために用いられ得る。すなわち、その活性は、ＴｃＲ／ＣＤ２８媒介免疫応答のダウンレギュレーションに関連する活性である。これらの実施形態において、この抗体は、ＴｃＲ媒介刺激のような正のシグナルと結合していない（例えば、その抗体は可溶化した、支持体に結合していない形態である）。実施例において実証されるように、抗ＰＤ−１抗体をアンタゴナイズすることでのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ相互作用の遮断は、増強されたＴ細胞増殖反応をもたらし、これは、Ｔ−Ｔ相互作用におけるＰＤ−１経路についてのダウンレギュレーションの役割と一致している。種々の実施形態において、その抗体は、ＰＤ−ＬのＰＤ−１への結合を、１０ｎＭより少ないＩＣ５０で阻害する。より好ましくは、５ｎＭより少なく、最も好ましくは１ｎＭより少ない。ＰＤ−Ｌ結合の阻害は、実施例６において記載のとおりに、または当該分野で公知の手法を用いて、測定され得る。
【００８１】
本発明の抗体または抗体組成物は、治療有効量で投与される。概して、治療有効量は、被験体の年齢、状態、および性別、ならびに被験体の医学的状態の重症度により異なり得る。抗体の治療有効量は、約０．００１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、好ましくは、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。この用量は、必要なときに、観察される処置の効果を適応させるために、調節され得る。この適切な量は、臨床的指標に基づいて、処置をする医師によって選択される。
【００８２】
抗体は、大量瞬時用量として与えられ、投与後の最も長期間の間、抗体の循環レベルを最大化し得る。持続的な注入もまた、大量瞬時用量の後に、用いられ得る。
【００８３】
免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、または単球）はまた、患者から単離され得、そして本発明の抗体と一緒に、エキソビボでインキュベートされる。いくつかの実施形態において、免疫応答は、被験体から免疫細胞を除き、インビトロで免疫細胞を本発明の抗ＰＤ−１抗体と接触させることにより阻害され得、これは同時に、免疫細胞の活性化（例えば、ＴｃＲおよび／またはＢｃＲ抗原レセプターに対する抗体による）を伴う。このような実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、多価形態として用いられるべきであり、免疫細胞の表面上のＰＤ−１分子は、そのような抗体に対する結合の際に、「架橋される」。例えば、抗ＰＤ−１抗体は、ビーズのような固体支持体に対して結合し得るか、または二次抗体を介して架橋され得る。次いで、この免疫細胞は、当該分野で公知の方法を用いて単離され得、患者に再移植され得る。
【００８４】
別の局面において、本発明の抗体は、別の治療の送達のための標的剤として、またはＰＤ−１を発現する細胞に対する細胞毒性剤（例えば、トキシン）として用いられ得る。この方法は、治療剤もしくは細胞毒性剤と結合している抗ＰＤ−１抗体の投与、または抗体のＰＤ−１に対する結合を可能にする条件を含む。
【００８５】
本発明の抗体はまた、生物学的サンプルにおけるＰＤ−１の存在を検出するためにも用いられ得る。検出されるＰＤ−１の量は、ＰＤ−１の発現レベルと相関し得、それは、次には、被験体における免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球）の活性状態に相関する。
【００８６】
抗体を適用する検出方法は、当該分野で周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット法、ウェスタンブロット、蛍光抗体法、免疫沈降が挙げられる。この抗体は、ＰＤ−１を検出するためのこれらの手法の１つ以上を組み入れる診断キットにおいて提供され得る。そのようなキットは、他の成分、パッケージ、指示、またはそのタンパク質の検出を助けるための他の材料を含み得る。
【００８７】
この抗体が、診断目的を対象とする場合、例えばリガンド基（例えば、ビオチン）または検出マーカー基（例えば、蛍光基、放射性同位体元素もしくは酵素）を用いて、それらを改変することが所望され得る。所望される場合、本発明の抗体は、従来の手法を用いて標識され得る。適切な検出可能ラベルには、例えば、発蛍光団、発色団、放射性原子、高電子密度試薬、酵素、および特異的な結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、代表的に、それらの活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青色色素に変換する能力により検出され得、分光光度計を用いて定量化され得る。検出のための、適切な結合パートナーには、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野で公知の多数のレセプター−リガンド結合が挙げられるが、これらに限定されない。他の順列および可能性は、当業者に対して容易に明らかになり、本発明の範囲内で均等物として考えられる。
【００８８】
本発明の抗体は、治療剤として効果的なＰＤ−１経路のインヒビターを同定するためのスクリーニング方法において用いられ得る。そのようなスクリーニングアッセイにおいて、第一の結合混合液は、ＰＤ−１および本発明の抗体の組み合わせによって形成され；そして第一の結合混合液における結合の量（Ｍ０）が、測定される。第二の結合混合液もまた、ＰＤ−１、抗体、およびスクリーニングされる化合物または薬剤を組み合わせることによって形成され、そして第二の結合混合液（Ｍ１）における結合の量が、測定される。試験されるための化合物は、実施例において示されるような別のＰＤ−１抗体であり得る。第一および第二の結合混合液における結合の量は、次いで、例えば、Ｍ１／Ｍ０比率を計算することにより比較される。その化合物または薬剤は、免疫応答のＰＤ−１関連ダウンレギュレーションを調節することが可能であると考えられ、それは、第一の結合混合液と比べた第二の結合混合液における結合の減少が、観察される場合である。結合混合液の処方および最適化は、当業者のレベルの範囲内であり、そのような結合混合液はまた、結合を増強するか、または最適化するために必要とされる緩衝剤および塩を含み得、さらなるコントロールアッセイは、本発明のスクリーニングアッセイにおいて含まれ得る。従って、ＰＤ−１抗体結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）まで（好ましくは、約３０％を超えるまで）減少させることが見出された化合物は同定され、次いで、所望される場合、下に記載の通りの他のアッセイまたは動物モデルにおいて障害を改善する能力について二次的にスクリーニングされる。ＰＤ−１と抗体との間の結合の強さは、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、表面プラスモン共鳴に基づく技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて測定され得、これらのすべては、当該分野で周知の手法である。
【００８９】
この化合物は、次いで、実施例に記載のとおりインビトロでまたは動物モデルにおいて（概しては、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｅｒｓｈｗｉｎら（編），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１を参照のこと）、試験され得、例えば、以下のようなものである：ＳＷＲ  Ｘ  ＮＺＢ（ＳＮＦ１）トランスジェニックマウスモデル（Ｕｎｅｒら（１９９８）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ．１１（３）：２３３−２４０）、ＫＲＮトランスジェニックマウス（Ｋ／ＢｘＮ）モデル（Ｊｉら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６９：１３９）；ＮＺＢ  Ｘ  ＮＺＷ（Ｂ／Ｗ）マウス（ＳＬＥモデル）（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４４（１０）：２４３５−２４４５）；マウスにおける実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（多発性硬化症モデル）（Ｔｕｏｈｙら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１１２６−１１３０，Ｓｏｂｅｌら（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２３９３−２４０１，およびＴｒａｕｇｏｔｔ，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１１９：１１４−１２９）；糖尿病のＮＯＤマウスモデル（Ｂａｘｔｅｒら（１９９１）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，９（１）：６１−６７）など。
【００９０】
例えば、動物試験に従って決定された予備的な量、およびヒト投与のための容量のスケーリングは、当該分野で認められた方法に従って、実行された。毒性効力および治療効力は、細胞培養物または実験動物において標準の薬学的手順により決定され得る。細胞培養アッセイまたは動物研究から得られたデータは、ヒトに用いる投薬量の範囲の処方において用いられ得る。１つの動物モデルにおいて達成される治療的有効量は、別の動物（ヒトを含む）に用いる際に、当該分野で公知の変換因子を用いて変換され得る（例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５０（４）：２１９−２４４を参照のこと）。
【００９１】
（薬学的組成物および投与の方法）
本開示は、抗ＰＤ−１抗体を含有する組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的使用および患者への投与のために適し得る。代表的には、この組成物は、１つ以上の本発明の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。語句「薬学的に受容可能な賦形剤」には、薬学的投与と両立するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。その組成物はまた、補足された治療機能、追加された治療機能、または増強された治療機能を提供する他の活性な化合物をも含み得る。その薬学的な組成物はまた、コンテナ（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、パック、またはディスペンサー（ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）中に投与のための指示書と一緒に含まれ得る。
【００９２】
本発明の薬学的組成物は、それの意図された経路の投与と両立するために処方される。投与を達成するための方法は、当業者に公知である。その投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、皮下または経皮であり得る。局所的にか、または経口的に投与され得る組成物、または粘膜を経た伝達が可能であり得る組成物を得ることはまた、可能であり得る。
【００９３】
皮内または皮下の適用のために用いられる溶液または懸濁液は、代表的に、１つ以上の以下の成分を含む：注射用水のような無菌の希釈液、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩のような緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような張度の調節のための薬剤。そのｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調節され得る。このような調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されたアンプル、使い捨てのシリンジまたは複数用量バイヤルの中に入れられ得る。
【００９４】
注射に適した薬学的組成物には、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液および分散物の即座の調製のための無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与のための適切なキャリアには、生理的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、その組成物は、無菌でなければならず、容易なシリンガビリティー（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に備えて保存されなければならない。微生物の作用の阻害は、種々の抗菌剤および抗真菌剤によって達成され得、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどである。多くの場合において、組成物中に等張剤を含むことが好ましく、それは、例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、および塩化ナトリウムである。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒、ならびにそれらの適切な混合液であり得る。適切な流動率は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合において必要とされる粒子サイズを維持することによりおよび／または界面活性剤の使用により、維持され得る。注射用組成物の延長された吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことによって引き起こされ得る。
【００９５】
経口の組成物は、概して、不活性希釈液または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルの中に入れられ得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口投与のために、この抗体は、賦形剤とともに組み合わせられ得、錠剤、トローチ、またはカプセルの形で用いられ得る。薬学的に両立する結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似する性質の化合物のいずれかを含み得る；結合剤（例えば、微結晶性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）；流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカロース）；または矯味矯臭剤（例えば、ペッパーミント、メチルサリチレート、またはオレンジ香料）。
【００９６】
全身的投与はまた、経粘膜方法または経皮方法によってされ得る。経粘膜投与または経皮投与のために、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、この処方において用いられる。このような浸透剤は、概して当該分野で公知であり、例えば、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、例えば、口内剤、鼻スプレー、吸入器、または坐剤の使用を通じて達成され得る。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体の場合は、組成物は、腸、口、または肺において粘膜を経た伝達が可能であり得る（例えば、米国特許第６，０３０，６１３号に記載のような、ＦｃＲｎレセプター媒介経路を介するもの）。経皮の投与のために、概して当該分野で公知のように、活性な化合物は、軟剤、軟膏剤、ゲル、またはクリーム中に処方され得る。吸入による投与のために、抗体は、圧をかけられたコンテナまたは容器（それは、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む）、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形で送達され得る。
【００９７】
特定の実施形態において、現在開示される抗体は、キャリアを用いて調製される。そのキャリアは、化合物が身体から素早く放出されることから守り、例えば、制御された放出処方物であり、移植片およびマイクロカプセルに入った送達系を含む。生分解性ポリマー、生物適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、用いられ得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかである。現在、開示される抗体を含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、当業者に公知の方法に従って調製され得、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されている。
【００９８】
経口または非経口組成物を１つの用量単位形態に処方することは、投与を簡略化するためおよび用量の均一性のために、有利であり得る。本明細書で用いられるとき、用語「用量単位形態」は、処置される被験体のための単位用量として適している、物質的に分離した単位をいう；各単位は、所定の量の活性化合物を含み、その量は、必要とされる薬学的キャリアに関連した所望される治療効果を生成するために計算されている。
【００９９】
本発明の組成物の毒性効力および治療効力は、細胞培養物および実験動物において標準的な薬学的手順により決定され得る。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療有効量）の決定のためである。毒性と治療的効果との間の用量比率は、治療指標であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比率として表され得る。大きな治療指数を示す組成物が、好ましい。
【０１００】
本発明で用いられるいずれの組成物についても、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に評価され得る。適切なバイオアッセイの例には、ＤＮＡ複製アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるグルコースの取り込みに基づくアッセイ、免疫アッセイ、例えば、実施例において記載された通りの他のアッセイが挙げられる。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで用いる投薬量の範囲を処方する際に用いられ得る。用量は、動物モデルにおいて処方され得、ＩＣ５０（すなわち、症候の半最大阻害を達成する抗体濃度）を含む循環する血漿濃度範囲を達成する。血漿における循環レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイによりモニターされ得る。その投薬量は、好ましくは、ほとんど毒性がないか、または毒性のない循環する濃度の範囲内である。その投薬量は、適用した投薬形態および利用された投与の経路に依存して異なり得る。
【０１０１】
以下の実施例は、決して本発明の範囲を制限するものではない。当業者は、本発明の精神または範囲を変更させることなく実行され得る多数の改変および変化を認識する。そのような改変および変化もまた本発明の範囲内に包含される。本出願全体にわたって引用されるすべての参考文献、特許、および刊行された特許出願の全内容は、本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１：ＰＤ−１結合ＳｃＦｖの選択）
ｓｃＦｖファージミドライブラリー（Ｖａｕｇｈａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）１４：３０９−３１４）により記載された１．３８×１０１０ライブラリーの拡張版）を、ヒトＰＤ−１に特異的な抗体を選択するために用いた。可溶ＰＤ−１融合タンパク質（２０μｇ／ｍｌ（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中））またはコントロール融合タンパク質（５０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中））を、一晩４℃においてマイクロタイタープレートのウェルにコートした。ウェルをＰＢＳ中で洗浄し、ＭＰＢＳ（３％粉乳（ＰＢＳ中））において１時間３７℃でブロックした。精製ファージ（１０１２形質転換単位（ｔｕ））を、最終容量の１００μｌの３％ＭＰＢＳにおいて１時間ブロックした。ブロックされたファージを、ブロックされたコントロール融合タンパク質のウェルに加え、１時間インキュベートした。次いで、ブロックされたファージおよび除外されたファージを、ＰＤ−１融合タンパク質でコートされたブロックされたウェルに移し、さらに１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳコーティング  ０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、次いでＰＢＳで５回洗浄した。結合されたファージ粒子を溶出し、１０ｍｌの指数関数的に増殖するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させるために用いた。感染細胞を、２ＴＹブロス中で１時間３７℃において増殖させ、次いで、２ＴＹＡＧプレートに薄く塗り、一晩３０℃においてインキュベートした。コロニーをプレートからはがして１０ｍｌの２ＴＹブロスに移し、そして−７０℃における貯蔵のための１５％グリセロールを添加した。
【０１０３】
第１回目のパニング選択からのグリセロールストック培養物を、ヘルパーファージで重感染させ、第２回目のパニングのためのｓｃＦｖ抗体発現ファージ粒子を与えるためにレスキューした。合計２回のパニングを、ＰＤ１−１７の単離のためにこの方法で実行した。ただし、第２回目のパニングにおいて、２０μｇ／ｍｌのコントロールタンパク質を、除外のために用いた。クローンＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３およびＰＤ１−３５を、続く第３回目の選択で選択した。２回目および第３回目の除外を、１０μｇ／ｍｇのコントロール融合タンパク質を用いて実行した。
【０１０４】
マウスＰＤ−１に対する抗体を、ビオチン標識したマウスＰＤ−１融合タンパク質を用いて、最終濃度１００ｎＭにおいて可溶選択により、選択した。上に記載の通りのｓｃＦｖファージミドライブラリーを用いた。１ｍｌの３％ＭＰＢＳ中の精製ｓｃＦｖファージ（１０１２ｔｕ）を３０分間ブロックし、次いで、ビオチン標識された抗原を加え、室温において１時間インキュベートした。ファージ／抗原を、１ｍｌの３％ＭＰＢＳ中で１時間３７℃においてブッロクされた２５０μｌのＤｙｎａｌ  Ｍ２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ磁気ビーズに加え、さらに１５分間室温においてインキュベートした。磁気ラックを用いてビーズを捕捉し、それを、１ｍｌの３％ＭＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０中で４回洗浄し、続いてＰＢＳ中で３回洗浄した。最後のＰＢＳ洗浄の後、ビーズを１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、５ｍｌの指数関数的に増殖するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞に感染させるため用いた。感染細胞を、１時間３７℃においてインキュベートし（３０分静止、３０分２５０ｒｐｍにおいて振盪）、次いで２ＴＹＡＧプレートに薄くまき、一晩３０℃においてインキュベートした。産出したコロニーをプレートからはがし、ファージを上記に記載の通りレスキューした。第２回目の可溶選択を上に記載の通りに実行した。
【０１０５】
（実施例２：ファージＥＬＩＳＡによる、ＰＤ−１についての抗体の特異性）
ＰＤ−１についての抗体の特異性を決定するために、ＰＤ−１融合タンパク質およびコントロールタンパク質に対するファージＥＬＩＳＡを行った。選択産出からの個々のＥ．ｃｏｌｉコロニーを、１ウェルあたり１００μｌの２ＴＹＡＧ培地を含む９６ウェルプレートに移した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを、１０の感染多重度（ｍｏｉ）で指数関数的に増殖する培養物に加え、そのプレートをさらに１時間３７℃においてインキュベートした。プレートをベンチトップ（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）遠心分離器において、２０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離した。その上清を除き、細胞ペレットを１００μｌの２ＴＹＡＫ中に再懸濁し、３０℃において一晩、振盪しながらインキュベートした。次の日、プレートを２０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離し、各ウェルからのファージ含有上清を新しい９６ウェルプレートに移した。ファージサンプルを、ＥＬＩＳＡの前に、３％ＭＰＢＳの最終濃度においてブロックした。
【０１０６】
ヒトＰＤ−１融合タンパク質またはマウスＰＤ−１融合タンパク質およびコントロール融合タンパク質および非融合タンパク質を、一晩４℃において、９６ウェルマイクロタイタープレートに０．５〜２．５μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）においてコートした。コートの後、その溶液をウェルから除き、プレートを１時間３％ＭＰＢＳにおいてブロックした。プレートを、ＰＢＳでリンスし、次いで、５０μｌのブロックされる前のファージを各ウェルに加えた。このプレートを１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに対して、５０μｌの１：５０００希釈の抗Ｍ１３−ＨＲＰ結合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）を加え、そのプレートを４０〜６０分間インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、そのサンプルを着色するまでインキュベートした。この反応を、２５μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止した。生成されたシグナルを、マイクロタイタープレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取ることにより、測定した。次いで、ＰＤ−１融合タンパク質に対して特異的な結合を示すが、コントロール融合タンパク質に対しては示さないクローンを、同定し、確認した。
【０１０７】
ＰＤ１−１７  ｓｃＦｖについての特異性データを、図１Ａにおいて示す。ヒトＰＤ−１とのＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５ｓｃＦｖの反応性を、図１Ｂにおいて示す（ＩｇＧ１コントロールはＰＤ−１を結合しなかった）。
【０１０８】
（実施例３：抗体クローンの同定）
ＰＤ−１結合ｓｃＦｖ  Ｅ．ｃｏｌｉクローンを、２ＴＹＡＧプレートに線引きし、一晩３０℃にてインキュベートした。これらのプレートからのコロニーを、ｓｃＦｖクローン由来のＶＨ領域およびＶＬ領域を増幅するためｐＣＡＮＴＡＢ６ベクター配列オリゴを用いて配列決定した。独特のＰＤ−１結合クローンを、実施例４において記載の通りＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１結合の中和について、アッセイした。ｓｃＦｖとＩｇＧフォーマットとの間の配列の差は、ｓｃＦｖからＩｇＧへの変換の間にＰＣＲプライマーにより導入された変化に起因する。
【０１０９】
（実施例４：生化学的結合阻害アッセイおよびスクリーニング）
ｓｃＦｖ生成を、指数関数的に増殖する培養物に対して１ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、一晩３０℃にてインキュベーションすることによって誘導した。粗製のｓｃＦｖ含有の周辺質抽出物を、一晩の誘導からの細菌のペレットに浸透圧性ショックを受けさせることにより得た。ペレットを、２０％（ｗ／ｖ）スクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、氷上で３０分間冷やした。細胞の組織細片を、遠心分離によって除き、ｓｃＦｖをクロマトグラフィーおよびＰＢＳへの緩衝液交換によって精製した。精製ｓｃＦｖ（ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５）を、９６ウェルマイクロタイタープレートアッセイにおいて、ビオチン標識されたヒトＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のプラスチック上に固定されたヒトＰＤ−１融合タンパク質に対する結合を阻害する能力について試験した。ビオチン標識されたＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の結合を、ＡＭＤＥＸ−アルカリホスファターゼを用いて検出し、生成されたシグナルを、マイクロタイタープレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を読み取ることにより、測定した。データは、全結合のパーセンテージとして表され、ｓｃＦｖ濃度の力価を試験し、計算されたＩＣ５０値としてクローン潜在能（ｐｏｔｅｎｃｙ）を確立した。ｓｃＦｖおよびＩｇＧ抗体についてのクローン潜在能のデータを、表５に示す。
【０１１０】
ＰＤ１−Ｆ２  ｓｃＦｖを、上に記載の通りに生成し、精製した。マウスＰＤ−１発現細胞を、１０５細胞／ウェル（最終容量１００μｌ）においてポリ−Ｄ−リジンコートの９６ウェルマイクロタイタープレートに加えた。細胞を遠心分離し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。次いで、３００μｌの１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で１時間室温においてブロックした。ブロックされた細胞を、２５μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液（０．０５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ダルベッコＰＢＳ中））またはサンプルを加える前に、ＰＢＳＴ中で３回洗浄し、続いて２５μｌのビオチン標識されたマウスＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を３００ｎｇ／ｍｌにおいて加えた。ビオチン標識されたＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の結合を、Ａｍｄｅｘアルカリホスファターゼを用いて検出し、シグナルを上に記載の通り解読した。ＰＤ１−Ｆ２  ｓｃＦｖおよびＩｇＧの潜在能を、表６に示す。
【０１１１】
【表６】
0004511943.tif 000007
（実施例５：ｓｃＦｖのＩｇＧへの変換）
ｓｃＦｖクローン由来の重鎖および軽鎖Ｖ領域を、クローン特異的プライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、適切な制限酵素を用いて消化し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９，６７１）を含有するベクター、またはヒトλまたはκ軽鎖定常領域（Ｈｉｅｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４，５３６）を含有するベクターにサブクローニングした。ＶＨおよびＶＬセグメントの生殖系列に基づいて、κまたはλ軽鎖定常領域が変換のために用いられたかどうかを決定した（表７）。
【０１１２】
【表７】
0004511943.tif 000008
Ｖ領域ドメインのプラスミドへの挿入を、個々のＥ．ｃｏｌｉコロニー由来のプラスミドＤＮＡの配列決定によって検証した。プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物から標準的手法によって調製し、重鎖および軽鎖構築物を、真核細胞中に標準的手法を用いて共トランスフェクトした。分泌されたＩｇＧをプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＰＢＳへの緩衝液交換を用いて精製した。
【０１１３】
抗マウスＰＤ１抗体ＰＤ１−Ｆ２の結合親和性を、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｌＡｃｏｒｅ  ３０００）（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でＣＭ５センサーチップに固定されたマウスＰＤ−１融合体を用いて決定した。フローセル中のＰＤ１−Ｆ２の濃度は、７．８１ｎＭ〜１２５ｎＭの範囲であり、一方、抗マウスＰＤ１抗体Ｊ４３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の濃度は、２５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲であった。ＰＤ１−Ｆ２についての平衡定数ＫＤは、６．７×１０−９Ｍ（ＫＡ＝１．５×１０８Ｍ−１）であるのに対し、Ｊ４３についてのＫＤは、３．８×１０−７Ｍ（ＫＡ＝２．６×１０６Ｍ−１）である。
【０１１４】
抗ＰＤ−１  ＩｇＧのヒトＰＤ−１またはマウスＰＤ−１を結合する能力を、以下のように決定した。ＥＬＩＳＡプレートを、２．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ−１／ＩｇＧキメラと共に一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、試験抗体の段階希釈液と共に２時間室温（ＲＴ）においてインキュベートした。洗浄の後、飽和濃度のＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト抗体またはＨＲＰ結合ウサギ抗マウス抗体を加え、そのサンプルを１時間ＲＴにおいてインキュベートした。結合していないヤギ抗体およびウサギ抗体を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄した。このアッセイを、ＴＢＭを用いて現像した。結果を、ＯＤ４０５吸光度値として表し、図２Ａ−２Ｃにおいて提示する。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体Ｊ１１０は、市販されており（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、比較のために含めた。
【０１１５】
（実施例６：選択されたＰＤ−１抗体は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１に対する結合を阻害する）
阻害アッセイを実行し、抗体のＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１に対する結合を遮断する能力を評価した。ＥＬＩＳＡを、実施例２において記載された通りに、改変を含めて実行した。一次抗ＰＤ−１抗体と２時間室温においてインキュベーションした後、一定濃度（１μｇ／ｍｌ）のビオチン結合ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇを加え、そのサンプルをさらに１時間ＲＴにおいてインキュベートした。洗浄の後、飽和濃度のアビジンＨＲＰを加え、１時間ＲＴにおいてインキュベートした。結合していないアビジンＨＲＰを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄した。このアッセイを、ＴＢＭを用いて現像した。
【０１１６】
結果を、図３に示すようにＪ１１０を用いて得られた結果と比較した。抗ヒトＰＤ−１抗体Ｊ１１０およびＰＤ１−３０は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１に対する結合を阻害しなかった。抗ヒト抗体ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５ならびに抗マウス抗体ＰＤ１−Ｆ２は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する。
【０１１７】
（実施例７：ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１の識別可能な部位を認識する）
阻害アッセイを実行し、種々のヒト抗ヒトＰＤ−１抗体によって認識される部位を位置づけた。ＥＬＩＳＡを、実施例６に記載の通り、小さな改変を含めて実行した。一次抗体と２時間ＲＴにおいてインキュベートした後、固定された濃度（０．２５μｇ／ｍｌ）のビオチン結合ＰＤ−１抗体Ｊ１１０を加え、そのサンプルをさらに１時間ＲＴにおいてインキュベートした。洗浄の後、飽和濃度のアビジンＨＲＰを加え、１時間ＲＴにおいてインキュベートした。結合していないアビジンＨＲＰを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄した。このアッセイを、ＴＢＭを用いて現像した。
【０１１８】
図４に示されるように、抗ヒトＰＤ−１抗体の結合（Ｊ１１０、Ｊ１１６、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５）は、少なくとも２つのＰＤ−１上の識別可能な部位を限定した。交差ブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）の結果はＪ１１０およびＪ１１６は、同一の部位または重複する部位に対して結合し、一方、ＰＤ１−１７、２８、３３、および３５は、別の識別可能な部位に対して結合することを示した。Ｊ１１６またはＪ１１０のＰＤ−１に対する結合は、Ｊ１１０の結合を遮断する。対照的に、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５の結合は、Ｊ１１０の結合を遮断しない。このことは、試験された抗ＰＤ−１抗体は、少なくとも２つの識別可能なエピトープに対して結合することを示唆する；１つは、Ｊ１１０およびＪ１１６によって認識され、もう１つは、ＰＤ１−１７、ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５によって認識される。
【０１１９】
（実施例８：減少したＴ細胞反応におけるＰＤ−１結合結果）
ＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０４細胞／ウェル）を、抗ｈＣＤ３＋／−ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃまたは抗ＰＤ−１（ＰＤ１−１７もしくはＪ１１０）でコートされたトシルビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ，ＮＹ）を用いて刺激した。融合タンパク質の濃度または抗体力価を、図５のＸ軸に示した。７２時間後、増殖を３Ｈチミジンの取り込みによって決定した。取り込まれた放射能を、ＬＫＢ  １２０５プレートリーダーを用いて決定した。
【０１２０】
図５において示されるように、抗ＰＤ−１抗体ＰＤ１−１７またはＰＤ−Ｌ１．ＦｃによるＰＤ−１結合は、Ｔ細胞の増殖における減少の原因になった。従って、ＰＤ１−１７は、ＰＤ−１リガンドを模倣し得、阻害シグナルを送達した。下で議論される通り（実施例９）、この阻害シグナルは、減少したＴ細胞増殖およびＩＬ−２生成という結果になる。抗体ＰＤ１−２８、ＰＤ１−３３、およびＰＤ１−３５は、ＰＤ１−１７と同様の効果を有する。この効果は、量依存的であり、増大する濃度のＰＤ１−１７またはＰＤ−Ｌ１．Ｆｃの存在下における細胞の活性化のように、減少したＴ細胞増殖という結果になる。コントロール抗ＰＤ−１抗体であるＪ１１０（図５）またはＪ１１６（データは示さず）は、Ｔ細胞反応を阻害せず、Ｊ１１０の濃度を増大させることは、Ｔ細胞増殖に関して最小限の効果を有する。比較のために、値を、抗ＣＤ−３反応のパーセンテージとして表す。「１００％」は、抗ＣＤ３／マウスＩｇＧコートのミクロスフィア用いて、細胞を活性化した場合に得られたＣＰＭを表す。これらの結果全部が、ＰＤ−１を認識する抗体のいくらか（しかし、すべてではない）は、ＰＤ−１経路のアンタゴニストとして作用し得ることを示す。
【０１２１】
さらに実験を行い、必要とされるＴ細胞反応のＰＤ−１ダウンレギュレーションが、単一細胞表面（ＣＩＳ）または別々の細胞表面（ＴＲＡＮＳ）上でのＴｃＲ／ＰＤ−１結合と協調するかどうかを扱った。２組のミクロスフィアを調製した：１組は、抗ＣＤ３およびＰＤ−Ｌ１．Ｆｃを含み（ＣＩＳ）、他の組は、抗ＣＤ３またはＰＤ−Ｌ１．Ｆｃを含んだ（ＴＲＡＮＳ）。ＰＤ−１を介した阻害は、ＰＤ−１およびＴｃＲの両方が、同じ表面上にリガンドにより結合された条件下でのみ観察された（ＣＩＳ）。試験したすべてのビーズ：細胞の比において、ＴＣＲおよびＰＤ−１シグナルが別々の表面上に送達された条件において（ＴＲＡＮＳ）、阻害は観察されなかった。
【０１２２】
ＴＲＡＮＳ実験における立体障害を除外するために、類似のアッセイを、抗ＣＤ３抗体およびＢ７．２．Ｆｃを用いて調製した。これらのアッセイにおいて、Ｔ細胞反応のＢ７同時刺激を、ＣＩＳおよびＴＲＡＮＳ条件の両方において観察した。これらの知見全部で、ＴＣＲに近いＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化に関するレセプター調節機能に必要とされることを示す。従って、Ｔ細胞反応を調節するために、活性化シグナルおよび阻害シグナルの両方が、表面が細胞の表面であろうとビーズの表面であろうと、同じ表面から生じなければならない。
【０１２３】
（実施例９：抗体によるＰＤ−１結合の遮断は、増強された増殖をもたらす）
増殖に関する可溶抗ＰＤ−１抗体の効果を評価するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートのビーズを用いて、４８時間プレ活性化し、収集し、そしてＰＤ１−１７、Ｊ１１０またはコントロールＩｇＧの存在下において、指示された濃度のＰＨＡプラス１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を用いて再刺激した。抗体の各々を、種々の濃度において培養の開始時に加えた。増殖を、７２時間において測定した。
【０１２４】
この結果は、ＰＤ１−１７（図６）およびＰＤ１−３５（データは示さず）は、初代Ｔ細胞の増殖を増強したことを示す。コントロール抗体Ｊ１１０は、インビトロにおいてＴ細胞反応を増強しなかった。ＰＤ１−１７およびＰＤ−３５により例示されるような、選択された抗ＰＤ１抗体は、ＰＤ−１とその天然のリガンドとの相互作用を阻害し、それによって負のシグナルの送達を遮断する。この負のシグナルの遮断はまた、増強された増殖およびＩＬ−２生成という結果になる。
【０１２５】
（実施例１０：障害の処置）
ＰＤ−１により制御される免疫応答の調節は、免疫抑制効果または免疫応答の増強が所望される事例において有用である。この実施例は、ＰＤ−１アゴニストまたはＰＤ−１アンタゴニストとしてのＰＤ−１抗体の使用を記載し、それぞれ、疾患発症における被験体または確立された免疫障害もしくは癌を有する被験体を処置する。
【０１２６】
癌の危険がある被験体または癌で苦しむ被験体は、免疫応答増強を必要とし得、ＰＤ−１アンタゴニスト（例えば、可溶形態の本発明の抗ＰＤ−１抗体）を用いた処置から利益を得る。最も一般的には、抗体は、外来環境において、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ量における週ごとの投与をゆっくりとした静脈内（ＩＶ）注射によって投与される。アンタゴニストの適切な治療有効用量は、処置をする臨床医によって選択され、およそ１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、およそ１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、およそ１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、およそ１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、およそ１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、およそ１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、およびおよそ５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１２７】
この抗体はまた、異常な免疫応答もしくは所望されない免疫応答（例えば、下に例示される自己免疫障害において）に関連する疾患または状態の重症度および／または症候を、防ぐためおよび／または減少するためにも用いられる。
【０１２８】
多発性硬化症（ＭＳ）は、炎症およびミエリン鞘の減少により特徴付けられる中枢神経系疾患である。多発性硬化症についての実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）マウスモデル（Ｔｕｏｈｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：１１２６−１１３０）、Ｓｏｂｅｌら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）１３２：２３９３−２４０１）、およびＴｒａｕｇｏｔｔ（Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１１９：１１４−１２９）において、ＥＡＥ誘導の前の（および持続的に）ＰＤ−１アゴニストを用いたマウスの処置は、ＭＳの発症を防ぐか、または遅らせることが予想される。
【０１２９】
関節炎は、関節における炎症によって特徴付けられる疾患である。慢性関節リウマチについてのコラーゲン誘導（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ）関節炎（ＣＩＡ）マウスモデル（Ｃｏｕｒｔｅｎａｙら（Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８３：６６６−６２８）およびＷｉｌｌｉａｍｓら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）８４：４３３−４３９））において、ＰＤ−１アゴニストを用いた処置は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）または他の関節炎疾患を防ぐか、または処置することが予想される。
【０１３０】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己抗体の存在によって特徴付けられる自己免疫疾患である。本発明の抗体および組成物は、ＰＤ−１アゴニストとして用いられ得、自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞の活性を阻害し、ＮＺＢ  Ｘ  ＮＺＷマウス（ＳＬＥについてのマウスモデル）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｅｒｓｈｗｉｎら（編），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）、もしくはヒトにおけるＳＬＥまたは関連疾患を防ぐか、または処置する。
【０１３１】
本発明のＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１アゴニストとしてエキソビボ治療において、月に一度またはそれ未満の頻度において投与されることが予想される。処置期間は、一ヶ月から数年の間の範囲である。
【０１３２】
ヒトにおける抗体の臨床的効力を試験するために、メラノーマ、前立腺癌、ＲＡ、ＳＬＥ、ＭＳ、Ｉ型糖尿病を有する個体を同定し、処置群に無作為化する。処置群は、偽薬群およびＰＤ−１アゴニストで処置される１〜３群（異なる用量）を含む。個体は、将来の１〜３年間追跡される。処置を受けた個体は、改善を示すことが予想される。
【０１３３】
本明細書は、本明細書内に引用される参照の教示を踏まえて、全面的に理解され、それらすべては、全体における参照として、本明細書で援用される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の説明を提供し、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が、特許請求された範囲によって包含されることを認識し、そして本明細書および実施例は、単なる模範として考えられ、本発明の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって示されることが意図されることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１Ａ】図１Ａは、ファージＥＬＩＳＡによって決定された、それぞれのｓｃＦｖ抗体のヒトＰＤ−１との反応性を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ファージＥＬＩＳＡによって決定された、それぞれのｓｃＦｖ抗体のヒトＰＤ−１との反応性を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定された、ＩｇＧ変換型抗体の、ヒトＰＤ−１またはマウスＰＤ−１との反応性を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＥＬＩＳＡによって決定された、ＩｇＧ変換型抗体の、ヒトＰＤ−１またはマウスＰＤ−１との反応性を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＥＬＩＳＡによって決定された、ＩｇＧ変換型抗体の、ヒトＰＤ−１またはマウスＰＤ−１との反応性を示す。
【図３】図３は、選択されたＰＤ−１抗体が、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害することを実証するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４】図４は、免疫調節性ＰＤ−１抗体が、交差ブロッキングＥＬＩＳＡアッセイによって決定された、ＰＤ−１上の異なる部位に結合することを実証するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図５】図５は、ＴｃＲと、抗ＰＤ−１抗体ＰＤ−１７またはＰＤ−Ｌ１．Ｆｃとによる同時結合が、増殖を減少させることを実証するＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。ＴｃＲと抗ＰＤ−１  Ｊ１１０とによる同時結合は、増殖に対して効果を有さない。
【図６】図６は、可溶性形態のＰＤ１−１７によって、一次Ｔ細胞の増殖の増強を実証する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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