(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外科手術、治療または診断によるヒトまたは動物の身体の処置において使用されるために、宿主の細胞へ生物学的関連分子を投与するためのコクリエート組成物であって、
a)少なくとも１つの生物学的関連分子成分；
b)負に荷電した脂質成分、および
c)二価カチオン成分、
を含む、コクリエート組成物であって、
負に荷電した脂質成分が、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジン酸からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含み、
二価カチオン成分が、Ca++、Mg++、Ba++、およびZn++からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、前記コクリエート組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のコクリエート組成物であって、前記生物学的関連分子成分が、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、トキシン、殺菌剤、静菌剤、補因子、酵素、ポリペプチド、ポリペプチド集合体、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、デンプン、色素、脂肪酸、ホルモン、サイトカイン、ウイルス、細胞小器官、ステロイド、および他の多環構造体、サッカライド、金属、代謝性毒素、タンパク質ならびに薬物からなる群より選択される、コクリエート組成物。
【請求項３】
請求項２に記載のコクリエート組成物であって、前記生物学的関連分子成分が、ポリヌクレオチドである、コクリエート組成物。
【請求項４】
請求項３に記載のコクリエート組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、リボ核酸を生じるように転写されるデオキシリボ核酸である、コクリエート組成物。
【請求項５】
請求項４に記載のコクリエート組成物であって、前記リボ核酸が、ポリペプチドを生成するように翻訳される、コクリエート組成物。
【請求項６】
請求項３に記載のコクリエート組成物であって、前記ポリヌクレオチドが触媒性リボ核酸である、コクリエート組成物。
【請求項７】
請求項２に記載のコクリエート組成物であって、前記生物学的関連分子成分が、ポリヌクレオチド成分でありかつアンチセンス分子である、コクリエート組成物。
【請求項８】
請求項２に記載のコクリエート組成物であって、前記生物学的関連分子成分が、ホルモンである、コクリエート組成物。
【請求項９】
請求項２に記載のコクリエート組成物であって、前記生物学的関連分子成分が、ミネラルである、コクリエート組成物。
【請求項１０】
請求項２に記載のコクリエート組成物であって、前記生物学的関連分子成分が、親油性薬物である、コクリエート組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載のコクリエート組成物であって、前記親油性薬物がシクロスポリン、イベルメクチン、およびアンホテリシンからなる群より選択される、コクリエート組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載のコクリエート組成物であって、前記親油性薬物が、アンホテリシンである、コクリエート組成物。
【請求項１３】
外科手術、治療または診断によるヒトまたは動物の身体の処置のコクリエート組成物を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコクリエート組成物の使用。
【請求項１４】
前記コクリエート組成物がヒトまたは動物に対して局所的に投与される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記コクリエート組成物がヒトまたは動物の身体に対して粘膜面に投与されるものである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１３に記載の使用であって、前記コクリエート組成物が、ヒトまたは動物に対して経皮的、筋内、または皮内的に投与されるものである、使用。
【請求項１７】
請求項３に記載のコクリエート組成物であって、前記ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸である、コクリエート組成物。
【請求項１８】
請求項８に記載のコクリエート組成物であって、前記ホルモンがインシュリンである、コクリエート組成物。
【請求項１９】
前記コクリエート組成物が経口的に投与されるものである、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１７に記載のコクリエート組成物であって、前記デオキシリボ核酸がプラスミドである、コクリエート組成物。
【発明の詳細な説明】
本明細書に開示の発明の一部は、合衆国政府からの予算または許可により一部援助された。
これは、1995年２月22日に出願された、出願番号第08/394170号の一部継続出願であり、これは、1993年10月４日に出願された出願番号第08/130986号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、生体分子(例えば、炭水化物、ビタミン、無機質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質など)を安定化するためのコクリエートおよびその使用に関する。コクリエート(cochleate)は、その中に生体分子を組み込む安定な不溶性脂質-二価カチオン構造である。コクリエートは、生物学的に適合し得るので、コクリエートは、従来の経路によって宿主に投与され得、そして生体分子を宿主中の標的部位へ送達するために作用し得る。
発明の背景
プレーンな(plain)脂質コクリエート(図１)は、以前に記載されている。タンパク質-コクリエートまたはペプチド-コクリエートは、カルシウムキレート化剤の添加によってタンパク質-脂質ビヒクル(プロテオリポソーム)に変換され得る中間構造(図２)として本発明者らによって以前に記載され、そして特許化されている(米国特許第4,663,161号および同第4,871,488号(この開示は、本明細書中で参考として明白に援用される)を参照のこと)。センダイ糖タンパク質を含むタンパク質-コクリエートのDC法による凍結割断電子顕微鏡写真は、「凹凸のある(bumpy)」表面を有する巻き上げ(roll-up)脂質二重層構造を示す。プレーンなリン脂質コクリエートは、調製の表面型においてなめらかである。
ポリペプチド-コクリエートから得られるプロテオリポソームは、免疫化の腹腔内経路および筋肉内経路によって動物に投与された場合、有効な免疫原であることが示された(G.Goodman-Snitkoffら、J.Immunol.、第147巻、410頁(1991)；M.D.Millerら、J.Exp.Med.、第176巻、1739頁(1992))。さらに、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスの糖タンパク質が、その方法で再構築される場合、プロテオリポソームは、動物および培養中の細胞に対するカプセル化タンパク質およびDNAのための有効な送達ビヒクルである(R.J.ManninoおよびS.Gould-Fogerite、Biotechniques、第６巻、No.1、682〜690頁(1988)；S.Gould-Fogeriteら、Gene、第84巻、429頁(1989)；M.D.Millerら、J.Exp.Med.、第176巻、1739頁(1992))。
室温で安定であり、乾燥可能であり、そして経口投与に適する形態で生体分子を安定化または保存する手段を提供することが有利である。例えば、ポリヌクレオチドを安定化する製剤およびポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用し得る製剤を有することが有益である。
発明の要旨
従って、長期の貯蔵寿命を有する製剤を産生するために生体分子を安定化するための手段を提供することが本発明の目的である。この製剤は、粉末形態に製造され得、そしてその後、再水和されて生物学的に活性な分子を生じ得る。
生物学的に活性な分子を宿主に投与するためのビヒクルとしての使用に適する製剤を提供することもまた、本発明の目的である。製剤は、生体分子を吸収のために消化管に、あるいは標的器官、組織、または細胞に送達するのに用いられ得る。
適切な生体分子は、ポリヌクレオチドである。
他の適切な生体分子は、ホルモンおよびサイトカインのようなポリペプチドである。
さらに他の適切な生体分子は、薬物のような生体活性成分である。
これらの目的および他の目的は、以下の成分：
a)安定化または送達されるべき生物学的関連分子成分、
b)負に荷電した脂質成分、および
c)二価カチオン成分、
を含むコクリエート製剤を提供することによって得られた。
好ましい実施態様において、コクリエート製剤は、経口投与される。
本発明は、ポリヌクレオチドを含むコクリエート製剤をさらに提供し、ここで、このポリヌクレオチド-コクリエートは、以下の成分を含む：
a)ポリヌクレオチド成分、
b)負に荷電した脂質成分、および
c)二価カチオン成分。
ポリヌクレオチドは、生物学的に活性なポリペプチドまたはポリヌクレオチドを産生するために発現されるものであり得る。従って、ポリペプチドは、免疫原として作用し得るか、または、例えば、酵素活性を有し得る。ポリヌクレオチドは、触媒活性を有し得、例えば、リボザイムであり得るか、または転写または翻訳のインヒビターとして作用し得る。従って、アンチセンス分子であり得る。発現される場合、ポリヌクレオチドは、当該分野に公知の必要な調節エレメント(例えば、プロモーター)を含む。
本発明は、ポリペプチドを含むコクリエート製剤をさらに提供し、ここで、このポリペプチド-コクリエートは、以下の成分を含む：
a)ポリペプチド成分、
b)負に荷電した脂質成分、および
c)二価カチオン成分。
特定の例は、インスリンコクリエートである。
コクリエートの利点は多数ある。コクリエートは、非水性(nonaqueous)構造を有するが、内部水性領域(internal aqueous space)を有しない。従って、コクリエートは：
a)コクリエート中の脂質は、ほとんど酸化を受けないのでリポソームよりも安定である；
b)室温で長期間保される可能性を提供する凍結乾燥状態で保存され得、これは世界中の輸送および投与前の保存に有利である；
c)リポソーム構造が凍結乾燥によって破壊されるのに対して、凍結乾燥後でさえも構造を維持する；
d)生体分子の有効な組み込み(特に、コクリエート構造の脂質二重層内に疎水性部分を有する)を示す；
e)コクリエートはゆっくり巻き戻るか、または、そうでなければ解離するので、インビボにおける生体分子の遅延放出または一定時間の放出についての可能性を有する；
f)キャリアとして作用し、および動物細胞膜および植物細胞膜中に見出される単純脂質から構成される脂質二重層マトリックスを有するので、脂質は無毒性であり、非免疫原性であり、そして非炎症性である；
g)必須の無機質であるカルシウムのような高濃度の二価カチオンを含む；
h)安全であり、そしてコクリエートは、非生物(non-living)サブユニット製剤であり、そしてその結果、コクリエートは、生ワクチンまたは形質転換配列を含むベクターの使用に関連する危険(例えば、免疫無防備状態の個体における生命を脅かす感染または健常なヒトに対して危険を有する野生型感染力への復帰)を有しない；
i)容易にそして安全に生成される；および
j)ポリペプチド、炭水化物、およびDNAのようなポリヌクレオチドを含む生物学的関連分子の予め決定された量および割合からなる規定の製剤として生成され得る。
経口投与の利点もまた多数ある。経口経路は、投与が容易であるのでWHO Children’s Vaccine Initiativeによって選択されてきた。経口ワクチンは、あまり高価ではなく、そして非経口(筋肉内または皮下)で投与されるワクチンよりも投与するのにより安全である。注射針の使用は費用を加算し、そしてまた、残念ながら、当該分野では、注射針はしばしば再使用される。
【図面の簡単な説明】
図１は、プレーンな脂質コクリエートの概略図である。
図２は、組み込まれた膜タンパク質を有するポリペプチド-脂質ビヒクルの構造を示す。
図３は、コクリエートの調製のための種々の代替手順をまとめる。
図4(A)および図4(B)は、インフルエンザポリペプチド-コクリエートの経口投与後のマウスにおける血清抗体力価を示す。
図５は、生ウイルスで抗原投与(challenge)した場合のポリペプチド-コクリエートの経口投与の結果を示すグラフである。
図６は、センダイ-コクリエートの経口投与後のマウスにおける血清抗体力価のグラフ表示である。
図７は、センダイ-コクリエートの経口投与後の抗体特異的細胞傷害性脾臓細胞の誘導を示すグラフである。
図８は、経口インスリンの投与前および投与後の血清グルコースレベルを示す一連の棒グラフを提供する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、今回、驚くべきことに、コクリエートそれ自身が生体分子の安定化および送達の手段として使用されることを見い出し、そして実証した。コクリエートは、胃内の強酸環境下で残存し、おそらくはその独特な多層性沈殿構造のため、その中に浸されている感受性の生体分子を保護する。コクリエートは、次いで小腸内の微小ひだ(microfold)細胞(Ｍ細胞)により吸収されるようである。
本発明者らは、ホスファチジルセリンおよびコレステロールを加えた、インフルエンザまたはセンダイウイルスの表面由来の糖タンパク質およびウイルス脂質を含むコクリエートの飲用による経口投与が、粘膜および循環抗体応答の両方を刺激することを実証した。さらに、強いヘルパー細胞(増殖的)およびキラー(細胞傷害性)細胞応答もまた生じる。おそらく最も印象的には、インフルエンザコクリエートの経口投与は、生ウイルスの鼻腔内での抗原投与に対して保護する。
これらの結果は、多くの理由のために予期されない。
コクリエートが胃内で残存し、そしてそれらと結合しているポリペプチドを酸環境および分解酵素から保護することは知られておらず、そして予期されなかった。少なくとも３mMのカルシウムの存在がなければ、コクリエートは巻き戻し始めそしてリポソームの形成を開始することが知られている。コクリエートは口腔から食道を下りそして胃まで送達される間、完全なままではないと考えられた(事実、そのようであった)。コクリエートがばらばらになれば、食物として消化され得る。
また、胃内で残存しながら、コクリエートが効果的に粘膜および循環免疫系と相互作用することも知られておらず、そして予期されなかった。ヒトは、日々多くの量のタンパク質、脂質、および糖を摂取し、それらは、いかなる種の粘膜または循環免疫応答も刺激することなく、容易に消化されそしてエネルギー源として利用される。従って、コクリエートは、宿主内の送達部位において生物学的活性を保ち続ける分子を送達する。
本明細書で使用されるように、用語「免疫応答」は、抗体、細胞の増殖性または細胞傷害性の活性、またはサイトカインの分泌のいずれかを意味する。
また、本明細書で使用されるように、用語「抗原」は、免疫応答が指向されるポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする発現性ポリヌクレオチドを示すことが意図される。
「ポリヌクレオチド」は、DNAまたはRNAを含み、ならびにアンチセンスおよび酵素的に活性な分子を含む。従って、生物学的関連分子はポリヌクレオチドそれ自身、それらの転写物、またはそれらにコードされた転写ポリペプチドであり得る。
「ポリペプチド」はアミノ酸の任意のオリゴマーまたはポリマーである。このアミノ酸は、L-アミノ酸またはD-アミノ酸であり得る。
「生物学的関連分子」は、生きている生物の寿命過程において役割を有するものである。この分子は、有機物または無機物であり得、モノマーまたはポリマーであり得、宿主生物に内生的であるかまたはそうでなく、天然に存在するかまたはインビトロで合成され得る、などである。したがって、例として、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、トキシン、殺菌剤、静菌剤、補因子、酵素、ポリペプチド、ポリペプチド集合体、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、デンプン、色素、脂肪酸、ホルモン、サイトカイン、ウイルス、細胞小器官、ステロイド、および他のマルチリング(multi-ring)構造体、サッカライド、金属、代謝性毒素、薬物などが挙げられる。
本発明はまた、ウイルスおよびウイロイドのような全細胞や他の細胞下複製物(replicative entity)用いて実施され得る。このように、細菌、酵母、細胞株、ウイルスなどを関連の脂質溶液と混合し得、その結果、沈殿物を生じさせて、細胞などがコクリエート構造内に固定される構造体を生成する。
ポリペプチドは、コクリエートに組み込まれるのに適した分子である。コクリエートの調製手順は、本明細書で後により詳細に記載する。ポリペプチドを適切な水溶性緩衝液中に懸濁する。脂質を乾燥させて、薄膜を形成させる。次いで、水溶性緩衝液を脂質膜に添加する。容器をボルテックスにかけ、次いでサンプルをカチオン含有緩衝液に対して透析する。
このようにして、例えば、インシュリンを送達するコクリエートが得られる。インシュリンコクリエートは１mg/mlのインシュリン溶液を用いて作製されるが、種々の他のインシュリン開始濃度が、種々となるインシュリン濃度で充填されるコクリエートを得るために用いられ得る。
最近の研究は、DNAプラスミドの直接注入により、それらのプラスミドによりコードされるタンパク質の発現が誘導され得、その結果、体液性および細胞性免疫応答が生じることを示す。例えば、Wangら、Proc.Natl.Acad.Sci.90:4156-4160(1993)；Zhuら、Science 261:209-211(1993)を参照のこと。これらの研究は、DNAワクチンが、ヒトのワクチン接種について安全かつ効果的な代替物を提供することを示す。これらの研究はまた、DNAワクチンが、簡単でより効率的な送達系の恩恵を受け得ることを示唆した。
動物細胞におけるDNAの送達、侵入、および発現を容易にする脂質の使用は十分に証明されている。例えば、Philipら、Mol.Cell Biol.14:2411-2418(1994)を参照のこと。実際、近年では、DNA-脂質複合体は、多くのヒト遺伝子療法のプロトコルのための基礎を形成している。
コクリエートは種々の生理的条件下に耐え得る安定な構造体であるため、コクリエートはポリペプチドまたはポリヌクレオチドのような生体分子を宿主内の選択される部位に送達するのに適した手段である。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、コクリエート構造体に組み込まれ、そしてコクリエート構造体に不可欠である。従って、発現されることが必要であり得るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、分解プロテアーゼおよびヌクレアーゼから保護される。
本発明で使用されるコクリエートは、下記に記載のような公知の方法で調製され得る。米国特許第4,663,161号(1985年４月22日出願)、米国特許第4,871,488号(1987年４月13日出願)、S.Gould-Fogeriteら、Analytical Biochemistry,148巻、15〜25頁(1985)；S.Gould-Fogeriteら、Advances in Membrane Biochemistry and Bioenergetics,Kim,C.H.,Tedeschi,T.,Diwan,J.J.,およびSalerno,J.C.編、Plenum Press,New York,569〜586頁(1988)；S.Gould-Fogeriteら、Gene,84巻、429〜438頁(1989)；Liposome Technology,第２版、Ｉ巻、Liposome Preparation and Related Techniques,II巻、Entrapment of Drugs and Other Materials,およびIII巻、Interactions of Liposomes with the Biological Milieu,Gregory Gregoriadis全編(CRC Press,Boca Raton,Ann Arbor,London,Tokyo)、第4章,69〜80頁、第10章,167〜184頁、第17章,261〜276頁(1993);およびR.J.ManninoおよびS.Gould-Fogerite,Liposome Mediated Gene Transfer,Biotechniques,６巻、１号(1988)、682〜690頁。
ポリヌクレオチドは、ポリペプチド(すなわち、病原体膜ポリペプチド、異所性(aberrant)または異型性(atypical)細胞ポリペプチド、ウイルスポリペプチドなど)を発現するポリヌクレオチドであり得、それらに対する免疫の発達における宿主免疫系認識について公知であるか、または適切な標的である。
ポリヌクレオチドは、酵素または構造的もしくはハウスキーピングタンパク質のような、生物学的に活性なポリペプチドを発現し得る。
また、ポリヌクレオチドは、必ずしもポリペプチドとして発現されないが、にもかかわらず生物学的効果を及ぼすポリヌクレオチドであり得る。例は、アンチセンス分子および触媒活性を有するRNAである。従って、発現される配列は転写の際、活性化されない場合、所望でない表現型を無効にするメッセージと相補的なRNAを生成し得るか、または、特異的核酸配列を認識し、そしてその同じかまたはほぼ同じ部位で切断するRNAを生成し得る。さらにまた、所望でない表現型を無効にするRNAの非発現を生じる。
ポリヌクレオチドは発現される必要はないが、発現されるかのように使用され得る。従って、ポリヌクレオチドはアンチセンス分子またはリボザイムであり得る。また、ポリヌクレオチドは免疫原であり得る。
従って、ポリヌクレオチドについて、関連コード配列は、適切なプロモーターから下流にサブクローン化され、他の調節配列は、必要であれば、当該分野で公知でそして利用可能な方法を実施し、そして材料を使用して、適切な宿主で拡大されるベクターに組み込まれ得る。
例えば、２つのプラスミド、pDOLHIVenv(AIDS Research and Reference Reagent Program,1991年１月カタログ113頁；Freedら、J.Virol.63:4670(1989))およびpCMVHIVLenv(Dr.Eric Freed,Laboratory of Molecular Immunology,NJAID,NIH)は、ポリヌクレオチド-コクリエートにおける使用に関して適切な発現プラスミドである。
プラスミドは、HIV-1(LAV鎖)のenv、tat、およびrevコード領域のオープンリーディングフレームを含む。
pDOLHIVenvは、完全長の感染分子クローンpNL4-3由来のSalI-XhoIフラグメントをレトロウイルスベクターpDOLのSalI部位に導入して構築した(Kormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.84:2150(1987))。発現は、MoloneyマウスウイルスLTRからである。
pCMVHIVLenvは、同じSalI-XhoIフラグメントをサイトメガロウイルス(CMV)に基づく発現ベクターp763のXhoI部位にクローニングすることで構築した。
ポリヌクレオチドは、複数のエピトープ、または、特にエピトープがほんの少数のアミノ酸の大きさでしかない場合、免疫系認識を増強させるために公知の免疫原ペプチドと結合したエピトープをコードするように配置され得る。
コクリエート沈殿を形成するためには、存在する脂質の大部分が負に荷電されなければならない。１つのタイプの脂質が使用され得るか、または脂質の混合物が使用され得る。ホスファチジルセリンまたはホスファチジルグリセロールが一般に使用されてきた。ホスファチジルイノシトールもまた、EDTAとの接触の際にリポソームに転化する沈殿物を形成する。しかし、脂質の大部分は、中性または正に荷電し得る。本発明者らは、存在する全脂質に基づいて40mol％までのコレステロールを含み、そして10mol％のコレステロールおよび20％のウイルス膜脂質を含むポリペプチド-脂質またはポリヌクレオチド-脂質のコクリエートを定型的に作製した。ホスファチジルエタノールアミンもまた、プレーンなまたはポリペプチドと架橋して、コクリエートに組み込まれ得る。
負に荷電した脂質が使用され得る一方で、負に荷電したリン脂質は好ましく、そしてそれらのホスファチジルセリン、ホスファチジルノスチオール、ホスファチジル酸、およびホスファチジルグリセロールが最も好ましい。
当業者は、脂質がどの程度に荷電していなければならないかを、既知濃度の負に荷電したまたは負に荷電していない脂質を有する混合物を調製することにより、そして、沈殿物が形成するかどうかを決定する、本明細書中に記載の任意の手順によって、容易に決定し得る。
本発明のコクリエートを作製する公知の手順はいくつかあり、そしてそれらを図３に図式化する。
コクリエートを作製する適切な手順は、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル酸、またはホスファチジルグリセロールのような負に荷電した脂質が、コレステロールの非存在下または存在下(3:1まで、好ましくは9:1w/w)で、生物学的関連分子(ポリペプチド、ポリサッカライド、またはDNAのようなポリヌクレオチド)を含むまたはこれに囲まれる多重層脂質小胞(これらは、窒素下で超音波処理によって、小さな単層タンパク質脂質小胞に転化される)の懸濁液を作製するのに利用される手順である。あるいは、損傷をさけるために、生物学的関連分子は、超音波処理の後、溶液に添加され得る。小胞を、室温で緩衝化二価カチオン(例えば塩化カルシウム)に対して透析し、その結果、コクリエートシリンダーと称される形態で提供され得る不溶性沈殿物を形成する。遠心分離の後、得られたペレットを緩衝液中に溶解し、本発明で利用されるコクリエート溶液を得る。
別のおよび好ましい実施態様において、ある量の負に荷電した脂質、例えば、ホスファチジルセリンおよびコレステロール(上記と同じ割合)、および約１〜10倍重量に等しい、好ましくは４倍重量のウイルスまたは他の追加の脂質を、コクリエートの調製に利用する。ポリペプチド、ミネラル、ビタミン、炭水化物、またはDNAのようなポリヌクレオチドのいずれかを溶液に添加する。その後溶液を緩衝化二価カチオン(例えば塩化カルシウム)に対して透析してのいずれかにより、DC(直接カルシウム透析について)コクリエートと呼ばれ得る沈殿物を生成した。
コクリエートの再構成に関するさらなる関連した方法が開発され、そしてLC法(コクリエートより前のリポソーム)と呼ばれている。抽出したポリペプチド、ポリサッカライド、DNAのようなポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを乾燥した負に荷電した脂質およびコレステロールに添加することを含む最初の工程は、DC法と同様である。しかし、溶液を次に緩衝液(例えば２mMのTES、２mMのL-ヒスチジン、100mMのNaCl、pH7.4)に対して透析し、ポリペプチド、DNAのようなポリヌクレオチド、および／またはポリサッカライドを含む小さなリポソームを形成させる。次いで、二価カチオン(例えばカルシウム)を直接にまたは透析して添加し、コクリエートから成り得る沈殿物を形成させる。
本発明のコクリエートを作製する上記の手順において、二価カチオンは、コクリエートまたは他の不溶性脂質-抗原構造体の形成を誘導し得る任意の二価カチオンであり得る。適切な二価カチオンの例は、Ca2+、Mg2+、Ba2+、およびZn2+または、二価のイオンを形成し得る他の要素(element)、もしくは負に荷電した脂質をキレート化および架橋し得る多数の正電荷を有する他の構造体を含む。
異なるカチオンを用いて作製されるコクリエートは異なる構造を有し、そして異なる比率でリポソームに転化する。それらの構造の違いのために、それらと共に含有される生物学的関連分子を放出する比率は、変化する。従って、異なるカチオンを用いて作製されるコクリエートの結合によって、長期の期間にわたって生物学的関連分子を放出する製剤が入手可能である。
コクリエートに取り込まれる生物学的関連分子の量は、変化し得る。一般にコクリエートの有利な特性のため、公知の送達手段を用いることと比較して、同様の結果を得るためには生物学的関連分子はより少ない量で使用され得る。
当業者は、過度の実験をすることなく、標的の目的について至適な脂質：生物学的関連分子の比を決定し得る。種々の比が形作られ、そして各サンプルの沈殿の進行が位相差顕微鏡で視覚的にモニターされる。例えば、コクリエートを形成する沈殿は容易にモニターされる。次いで、沈殿物は標的の宿主に投与され得、投与されたコクリエートの生物学的応答の性質および傾向を確認する。
任意の使用に対する至適な比は、例えば、希少な生物学的関連分子の使用を最少にするための高い割合から、コクリエート中の生物学的関連分子の最大量を得るための低い割合までの範囲であり得ることが明らかであるべきである。
コクリエートは凍結乾燥され得、そして室温で無期限に保存され得るか、または二価カチオン含有緩衝液中で４℃で少なくとも６ヶ月保存され得る。
コクリエート製剤はまた、センダイウイルスエンベロープポリペプチドのような融合誘導(fusogenic)分子とともにおよびそれなしの両方で調製され得る。プロテオリポソームに関する以前の研究は、リポソーム内容物の細胞質送達には融合誘導リポソーム二重層構造体が要求されることを実証した。ポリペプチド-コクリエートに対する免疫応答を容易にすることにおけるセンダイウイルスエンベロプポリペプチドの正確な役割は未だ明らかでない。
より単純な構造のため、融合誘導分子コクリエートよりも融合誘導分子を有さないコクリエートを用いる方が、より好ましく、そして調製の容易性はヒトでの最終的な使用に有利である。
ポリヌクレオチドは親水性分子であり、そしてコクリエートは内部水性領域を含まない疎水性分子であるため、ポリヌクレオチドがコクリエートに組み込まれ得ることは驚きである。ポリヌクレオチドはヌクレアーゼに耐性であるため、ポリヌクレオチドはコクリエートの表面に曝されない。
ポリヌクレオチドコクリエートの場合、用量に関する考察は、当該分野で公知であるようなワクチンに関する標準的な方法論に並行する。また、リポソームおよび「裸のDNA」においてポリヌクレオチドを使用する方法は、公知の方法を実施して、適切な投与用法を経験的に決定するためのベースラインとして供されるのに利用可能である。
例えば、用量の決定に関する適切なスキームは以下の通りである。
２μg程度のテストされたプラスミドが効果的であることは公知であるが、動物への注射により投与されるコクリエート中のポリヌクレオチドの初発用量は、約50μgであるように選択される。その用量は、コクリエートの単回投与の後の陽性応答を観察できる確率を最大にするために提案される。その用量で応答を惹起しないいかなる製剤も効果がないと考えられるが、さらなる研究のために保持しておくべきである。
容易にそして非侵襲的に投与され得る製剤の開発が望ましい。従って、コクリエートの経口投与(PO administration)は目標とされ、そしてより高い用量が最初に試される(100μg/動物および200μg/動物)。しかし、非経口経路のためにはより低い用量が要求される。
次いで、各製剤に対する用量応答曲線を確立するために、段階的な用量が用いられる。従って、50μg、10μg、２μg、0.4μg、および０μgのポリヌクレオチド／動物を含むコクリエートが１群あたり少なくとも10匹の動物に接種される。
免疫応答または酵素活性は、ポリヌクレオチドの発現が要求される場合に容易にモニターされる応答である。表現型の変化は、アンチセンスまたはリボザイム型分子の効力を追跡するための別の応答である。免疫系モニタリングの場合、特定の生体部位でのＴ細胞増殖、CTLおよび抗体の存在が、公知の方法を用いて、特異的免疫応答の状態を査定するために評価され得る。
コクリエート製剤の活性の持続期間を決定するために、単回の免疫化に応答した群を、１年またはそれ以上の間定期的にモニターし、投与の際のコクリエートの有効寿命を決定する。
最初の暴露で検出可能な応答を見せなかった動物は、再接種(ブースター投与)され得、後期刺激に対して免疫系を感作するための低用量製剤の能力に対する洞察を提供する。
薬学的製剤は錠剤、カプセル剤、丸剤、バルクまたは単位用量粉末および顆粒を含む固形剤形、または溶液、流動性乳剤、流動性懸濁剤、半固形などを含む液剤形であり得る。活性成分に加え、製剤は適切な当該分野で認識されている希釈液、担体、充填剤、結合剤、乳化剤、界面活性剤、水溶性賦形剤、緩衝剤、溶解補助剤、および防腐剤を含む。
コクリエートの利点は組成物が安定なことである。従って、コクリエートは、経口、局所、または点滴により心配なく投与され得、そして皮下、皮内、筋肉内などのようなより伝統的な経路により投与され得る。粘膜表面への直接的な適用はコクリエートで可能にされる魅力的な送達手段である。
当業者は、本発明を実施する処理の実行に関して、最も有効なそして治療効果のある手段を決定し得る。参考はまた、多くの先例および例えば以下を含む参考文献のいずれかもまた参照され得る。「Goodman & Gilman’s,The Pharmaceutical Basis for Therapeutics」、(第６版、Goodmanら編、MacMillan Publ.Co.,New York,1980)。
本発明のコクリエートは、リポソームのような現在公知の送達手段を使用するよりも大きな効力で細胞をトランスフェクトする手段として使用され得る。このように、本発明のポリヌクレオチドコクリエートは、遺伝子療法の種々の達成手段に関する、より優れた送達手段を提供する(Mulligan,Science 260:926-931(1993))。Mulliganが記したように、遺伝子に基づく方法による疾患を処置する多くの可能性は、遺伝子送達の改善法により増強される。
本発明のコクリエートはまた、宿主に他の生物学的関連分子を送達する優れた手段として供せられる。このような生物学的関連分子は、栄養素、ビタミン、補因子、酵素などを含む。生物学的関連分子は、水のない環境下でコクリエート内に含まれるため、生物学的関連分子は本質的に安定化されそして保存される。本明細書で上記に記載したように、生物学的関連分子を、脂質溶液に添加し、そして脂質および生物学的関連分子を含む沈殿構造体を形成するように処理する。本明細書中で示したように、親水性分子は、困難なく「コクリエート化」され得る、すなわちコクリエート構造の一部を構成し得る。
また、薬物および他の治療化合物のような、適切な親油性の生物学的関連分子は、コクリエート化を受け易い。例えば、シクロスポリン、イベルメクチン、およびアンホテリシンのような親油性薬物は容易にコクリエート化される。
本発明は今回、本発明を限定することを意図しない特定の実施例により記載される。
実施例１
クロロホルム中のウシ脳ホスファチジルセリンを、Avanti Polar Lipids,Birmingham,Alabamaからガラスアンプルで購入しそして-20℃に窒素下で保管した。コレステロール(ブタ肝臓)(グレードI)、β-D-オクチル-グルコピラノシド(OCG)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン(平均分子量67,000)、メトリズアミド(グレードI)、ならびに緩衝液用の化学薬品、タンパク質およびリン酸測定用の化学薬品を、Sigma Chemical Company,St.Louis,Missouriから購入した。有機溶媒は、Fisher Scientific Co.,Fairlawn,New Jerseyから購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試薬を、BioRad Laboratories,Richmond,Californiaからのものであった。S1000 Sephacryl Superfineを、Pharmacia,Piscataway,New Jerseyから入手した。Beckman Instruments,Palo Alto,California製の、厚壁のポリカーボネート遠心分離管(10ml容)を小胞調製、洗浄、および勾配用に使用した。Laboratory Supplies Company,Hicksville,New Yorkの浴型のソニケーターモデルG112SP1Gを超音波処理のために使用した。
ウイルスを、M.C.Hsuら,Virology,第95巻,476頁(1979)の記載に本質的に従って、増殖および精製した。センダイウイルス(パラインフルエンザI型)およびインフルエンザウイルス(A/PR8/34)を、10または11日齢の孵化鶏卵の尿膜包中で増殖させた。卵に、0.1mlのリン酸緩衝化生理食塩水(0.2gm/L KCl,0.2gm/L KH2PO4,8.0gm/L NaCl,1.14gm/L Na2H-PO4,0.1gm/L CaCl2,0.1gm/L MgCl26H2O(pH7.2))中、1-100egg infectious dose(HA力価により測定された103〜105ウイルス粒子)を接種した。卵を37℃で48〜72時間インキュベートし、次いで４℃で24〜48時間インキュベートした。尿膜液を回収し、そしてDamon IEC/PR-J遠心分離機において、2,000rpm、20分間、５℃で清澄化した。次いで上清を13,000rpmで、60分間遠心分離した。この遠心分離およびその後の全ての遠心分離は、GGローターを用い、５℃でSorvall RC2-B遠心分離機において実施した。そのペレットを、ボルテックスおよび超音波処理することにより、リン酸緩衝化生理食塩水(pH7.2)に再懸濁し、次いで5,000rpm,20分間の遠心分離を行った。そのペレットを、ボルテックスおよび超音波処理することにより再懸濁し、希釈ならびに5,000rpm、20分間の再度の遠心分離分離を行った。その5,000rpmの２つの上清を一緒にし、そして13,000rpmで60分間遠心分離分離した。得られたペレットをボルテックスおよび超音波処理することにより、リン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁し、アリコートし、-70℃で保管した。滅菌技術および滅菌材料を、ウイルス接種、単離、および精製の間使用した。
-70℃で保管したウイルスを解凍し、滅菌厚壁ポリカーボネート管に移し、そして緩衝液Ａ(2mM TES,2mM Ｌ-ヒスチジン、100mM NaCl(pH7.4))で希釈した。ウイルスをBeckman TY65ローターにおいて、５℃で１時間、30,000rpmでペレット化した。上清を除去し、そしてそのペレットを、ボルテックスおよび超音波処理することにより、抽出緩衝液(EB)(2M NaCl,0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)の１ml当たり２mgのウイルスタンパク質の濃度に再懸濁した。次いで、非イオン性界面活性剤β-D-オクチル-グルコピラノシドを２％(w/v)の濃度に添加した。懸濁液を混合し、５秒間超音波処理し、そして37℃の水浴中に45分間放置した。15、30、45分のインキュベーション時間で、懸濁液を混合および超音波処理のために短時間取り出した。ヌクレオカプシドを、TY65ローターにおいて、30,000rpmで45分間の遠心分離分離によりペレット化した。得られた清澄な上清を取り出し、そしてウイルスの糖タンパク質を含有するコクリエートの形成に用いた。上記手順のいくらかの改変が、他の膜タンパク質で使用され得るにちがいない。そのような改変は当業者には周知である。
実施例２
Ａ．DCコクリエート．
先の記載のように、抽出緩衝液中のホスファチジルセリンおよびコレステロール(9:1重量比)ならびに非イオン性界面活性剤のある量を、予め選択した濃度のポリヌクレオチドと混合し、そしてその溶液を５分間ボルテックスした。得られた透明で無色の溶液を、3mM CaCl2を含む緩衝液Ａ(2mM TES N-トリス[ヒドロキシメチル]-メチル-2-アミノエタンスルホン酸、2mM L-ヒスチジン、100mM NaCl、pH7.4、これはまたTES緩衝液と同一)の３回の交換(１回の交換当たり最低４時間)に対して室温で透析した。3mM Ca2+で十分であり、そして他の濃度もコクリエート形成に適合し得るけれども、日常的に用いた最終透析は、６mM Ca2+である。それぞれの交換のための緩衝液に対する透析物の比は、最低1:100であった。得られた白色のカルシウム-リン脂質沈殿物をDCコクリエートと称した。光学顕微鏡(×1000、位相差、油)により調べたところ、その懸濁液は、直径数ミクロンまでの多数の微粒子構造物、ならびに針様の構造物を含む。
Ｂ．LCコクリエート．
先の記載のように、抽出緩衝液中のホスファチジルセリンおよびコレステロール(9:1重量比)ならびに非イオン性界面活性剤のある量を、予め選択した濃度のポリヌクレオチドと混合し、そしてその溶液を５分間ボルテックスした。最初にその溶液を、最大比率1:200(v/v)の透析物対緩衝液Ａ(二価カチオンを含まない)を用いて一晩透析し、引き続いて緩衝液をさらに３回交換し、小型のタンパク質脂質小胞の形成へと導く。その小胞を、Ca2+イオンの直接添加、または３mM Ca2+イオンを含む緩衝液Ａに対する２回交換の透析、それに続く６mM Ca2+を有する緩衝液Ａを含む透析のいずれかにより、コクリエート沈殿物に転換した。
実施例３
経口的に送達したタンパク質-コクリエートワクチンに対する免疫応答
ワクチンを作製するために、インフルエンザウイルスを増殖させ、精製し、そしてその糖タンパク質および脂質を実施例１に記載のように抽出および単離した。タンパク質-コクリエートを、上記の「LC-コクリエート」手順に従い作製した。
インフルエンザウイルスのエンベロープ由来の糖タンパク質および脂質ならびにホスファチジルセリンおよびコレステロールを含むコクリエートワクチンを、口腔に0.1mlの液体を徐々に分与し、そしてそれが不快感を与えずに飲み込ませることによりマウスに与えた。図４(Ａ)(実験Ａから)および４(Ｂ)(実験Ｂから)は、ELIZAにより測定されるように、インフルエンザ糖タンパク質に特異的な全ての循環性の抗体レベルを生じることを示す。抗体力価を、ネガティブコントロールの光学密度をさらに与える最高希釈として定義する。
図４(Ａ)に示したデータを生じた実験Ａにおいては、初発ワクチン用量の、50、25、12.5、または6.25μgの糖タンパク質(それぞれグループ１からグループ４)を、０週および３週で投与した。３回目および４回目の免疫(６および19週)は、最初の２回の免疫に使用した用量の４分の１であった。ブリード１−ブリード６は、０、３、６、９、19、および21週で生じた。このデータは、高い循環する抗体力価がウイルス糖タンパク質を含むコクリエートワクチンを単に飲用することにより達し得ることを示す。この応答は、ブースト可能であり(繰り返し投与で増大する)、そしてそのワクチン中の糖タンパク質の量に直接的に関係する。
それらの観察を確認し、そして図４(Ｂ)に示したデータを生じる実験Ｂに拡大した。用量範囲を100μgおよび3.1μgの初発用量を含むように拡大した。ワクチンは、０、３、および15週で与え、３回目の免疫は最初の２回の用量の４分の１であった。ブリード１からブリード６は０、３、６、15、および16週に生じた。循環するインフルエンザの糖タンパク質特異的応答は、トップの５つの用量に対する単回投与後、および２回の摂取後の全てのグループに対して検出可能であった。示したデータは、各グループ由来のプールした血清に対するものであるが、４つの最も高い用量を与えた全てのマウス、およびグループ５および６の５匹のうちのマウスの４匹が100から102,400の範囲の循環する抗体力価を有するワクチンに対して応答した。ワクチンを受けなかったグループ７は、全ての時点で、全てのマウスに関して、50未満の力価であった。
抗体応答は、長く続いた。３回目の免疫後13週の力価(図４(A)、ブリード５)、および２回目の免疫後12週の力価(図４(B)、ブリード４)は、同じままか、あるいは以前の追加免疫後３週に見られたものより１希釈より高いかもしくは低いものであった。
実施例２に記載のサブニットワクチンの経口投与が、気道における防御免疫を導き得るかどうかを決定するために、実施例２の実験Ｂに記載のマウスを、０、３、および15週でコクリエートを用いて免疫した。免疫したマウスを、16週で2.5×109粒子のインフルエンザウイルスの鼻腔内適用により抗原投与した。ウイルス投与後３日目に、マウスを屠殺し、そして肺および気管を得た。全肺または気管を破砕および超音波処理し、そして存在するあらゆるウイルスを増幅させるために、孵化鶏卵に注射した。37℃において３日後、尿膜液を個々の卵から得、そして赤血球凝集(HA)力価を測定した。
マウスをまた実施例２の実験Ａにおける経口コクリエート投与後、鼻腔内に生インフルエンザを抗原投与した。肺を３日後に得て、ウイルスの存在を検出するために培養した。
２つの実験についての合わせたデータを表１に示す。さらに結果を図５に図示する。
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表１のデータは、５匹の非ワクチン化マウス全てが、孵化鶏卵に感染するのに十分なウイルスを気管内に有していたことを示す(気管当たり103粒子より多いかまたは懸濁液0.1ml当たり少なくとも１卵感染用量(EID))。対照的に、経口ワクチンは、気管内でのウイルス複製からの高い程度の防御を提供した。実験Ｂのグループ１、３、および５におけるマウス全てが、ウイルスに対して陰性であった。実験Ｂのグループ２中２匹のマウス、グループ４中１匹のマウス、およびグループ６(最も低いワクチン用量)中４匹のマウスが、ウイルスの存在を検出するために用いられるこの非常に感度の高いアッセイにおいて陽性を試験するために十分なウイルスを有した。
経口タンパク質コクリエートワクチンはまた、肺におけるウイルス複製に対する防御を提供した。４回の最高用量のワクチンを受けた20匹のマウス全てが、肺懸濁液を孵化鶏卵内で培養したとき、ウイルスに対し陰性であった(表１)。6.25μgおよび3.1μgの糖タンパク質で免疫したグループのマウス全て、ならびに非ワクチン化コントロールの全てのマウスが、ウイルス陽性であった。
最も低い２つのワクチン用量においてさえ、ウイルス複製のいくらかの阻害があった。肺懸濁液を1/10に希釈しそして卵に摂取した場合、3.12μgで免疫したグループでの３匹、そしてワクチン摂取しなかったコントロールにおける３匹に比較して、6.25μgで免疫したグループでは１匹の動物しか陽性ではなかった。1/100希釈培養は、6.25μgおよび3.12μgで免疫した各グループにおいて、１匹の陽性動物を生じたが、ワクチン摂取しなかったグループでは、５匹のうち３匹が陽性のままであった。さらに、3.12μgで免疫したグループの２匹の動物については、1/100で陰性であったが、卵の50％のみが1/10で感染され、そして低いHA力価を有した。対照的に、ワクチン摂取しなかったグループについては、全ての卵は感染され、そして、1/10および1/100希釈において最大量のウイルスを産生した。
C57BL/6マウスに、センダイウイルスの糖タンパク質を含むコクリエートを０および３週に経口的に与えた。それを、０週(採血１)、３週(採血２)、および６週(採血３)で採血した。グループ１は約50μgのタンパク質、グループ２は約25μg、グループ３は約12.5μg、グループ４は約6.25μg、およびグループ５(ネガティブコントロール)は０μgタンパク質を受けた。各用量グループにおける５匹のマウスからプールした血清中のセンダイ特異的抗体のレベルをELISAにより測定した。その結果を図６に示す。応答の大きさが直接免疫用量に関連した強力な抗体応答が生じたこと、そして応答の大きさが２回目の免疫後に増加する(追加免疫された)ことが見られ得る。
この応答は、非常に長く続いた。この応答は主に、Ｔ細胞ヘルプの関与および二次免疫応答に関連した長期記憶細胞の確立の指標であるIgGである。驚いたことに、最初に最も低い応答を有した最も低い用量は、その時最も高い循環する抗体レベルを有した。これはもともと非常に高い応答であるが、低い応答の緩慢な上昇を可能にする免疫系のダウンレギュレーションのためであり得る。これはまた、抗原の持続性および緩慢な放出を示し得る。顕著なIgA力価が生じそして維持されることはまた興味深く、そして免疫の経口経路の使用と一致する。
50μgタンパク質用量のセンダイ糖タンパク質含有コクリエートを経口的に与えた。２週間後、その動物(BALB/cマウス)を屠殺し、そして脾臓細胞を得た。その脾臓細胞の細胞溶解活性をセンダイ抗原を提示する標的細胞からのクロム-51の放出を生じさせるそれらの能力により測定した。非免疫マウスは、培養中に再刺激されたセンダイウイルス(SV)でパルスされた細胞(N/SV/SV)または非センダイ提示細胞(N/N/N)を死滅させなかった。(図７)対照的に、センダイコクリエート免疫マウスは、SVパルスされた標的を非常に高い程度死滅させ、そしてパルスされていない標的をより低い程度死滅させた。細胞溶解活性は、ウイルスまたは細胞内寄生物に感染された細胞のクリアランス、あるいはガン細胞に対し重要である。それは、誘導されるワクチンに対する高い所望の活性であるが、古典的にはほとんどの非生ワクチンではみられなかった。これはタンパク質-コクリエートワクチンの重要な特徴である。
実施例４
８週齢のBALB/c雌マウスを種々のポリヌクレオチド-コクリエート製剤、ポリヌクレオチドのみ、およびコントロールで２回IMで免疫し、そして次に、そのマウス由来の脾細胞をそのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に応答して増殖する能力に関して試験した。
融合誘導センダイウイルスを有するおよび無しのコクリエートを、上記のように調製した。用いたポリヌクレオチドは、pCMVHIVLenvプラスミドであった。脂質および上記の抽出したセンダイウイルスエンベロープタンパク質を含む溶液を、10:1(w/w)の比および50:1(w/w)の比で混合した。そのプロトコルは、４つのグループ、コクリエート/DNA、10:1；コクリエート/DNA、50:1；SV-コクリエート/DNA、10:1；SV-コクリエート/DNA、50:1を生じた。裸のDNAは、10μg/マウスおよび50μg/マウスの割合で用いた。コントロールは緩衝液のみであった。マウスを50μg/マウスで15日おきに２回免疫した。
脾細胞を得、そして当業者に公知のようにトリチウムチミジンを用いてＴ細胞増殖アッセイで試験した。コントロール培養は、抗原もconAも含まないものであった。用いた抗原は、１μM、３μM、および６μMのp18ペプチドであった。脾細胞培養の調製に引き続いて２、４、および６日に細胞を回収した。
裸のDNAは、バックグラウンドを上回る限界応答を示した。４つのコクリエート調製物の全てが、経時的に増大するp18特異的な応答を生じた。６日目には、その応答はバックグラウンドを上回って約４倍であった。
10:1の比におけるDNA濃度範囲は、約120〜170μg/mlであった。50:1(w/w)の比においては、そのDNA濃度は約25〜35μg/mlであった。
ポリヌクレオチド-コクリエートをミクロコッカスのヌクレアーゼに曝露したが核酸の分解は殆どまたは全く観察されなかった。
ポリヌクレオチドのカプセル化効率は、沈降反応後の上清中に存在する、脂質由来の遊離のDNAの定量に基づいて約50％であることが見出された。沈殿物の洗浄およびカチオン除去によるその構造物の開放後に、約35％のDNAが回収された。
実施例５
同じ様式で、実施例４に記載の免疫化した動物由来の脾細胞を、HIVタンパク質(例えばgp160)を発現することが知られる、標識したH-2適合標的細胞を用いるクロム放出アッセイを用いて、抗原特異的細胞傷害活性について試験した。反応細胞は、精製したHIVペプチドへの短時間の曝露により刺激し得る。
前刺激において、ポリヌクレオチドコクリエートに曝露した動物は、gp160を指向する特異的細胞傷害性脾細胞を示し、ほとんど100％の細胞傷害性が100のエフェクター：標的比で観察された。
実施例６
15mgのインスリンを、50mlプラスチックチューブ中の15mlの抽出緩衝液(EB)に添加した。次いで、300mgのOCGをこの混合物に添加した。得られた懸濁物はコロイド性で、pH 7.4で透明ではなかった。この溶液を1N NaOHで滴定してpH 8.5にし、透明な溶液を得た。
別の容器中で、6.8mlの10mg/mlのホスファチジルセリン溶液および1.5mlの５mg/mlのコレステロール溶液を混合し、そして次に乾燥して薄膜を得た。インスリン溶液を容器に添加し、コロイド性懸濁液を得た。この懸濁液を７分間ボルテックスし、そして次に氷上に１時間置いた。この溶液のpHを1N NaOHで9〜9.5に調整し、このサンプルを濾過滅菌し、そしてバッグ当たり約２mlで透析チューブ中に置いた。
２つの異なる透析スケジュールを使用した。
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透析後、得られた沈殿物が多くのコクリエートを含んでいることを見出した。
実施例７
マウスにインスリンコクリエートサンプルを経口的に与えた。血清のグルコースレベルを、標準的な方法を用いて、０時、(コクリエート投与前)、投与後30分、および60分に測定した。実施例６のコクリエート製剤は、１mgインスリン/ml溶液の出発濃度で用いた。各マウスに、示したように100μlまたは200μlの指定の調製物を投与した。比較のために、１匹のマウスに標準的な市販のヒトインスリン(Humulin R)を、腹腔内投与により与えた。
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インスリンの経口投与は、血清グルコースレベルに影響した。
実施例８
実施例６で作製したインスリンコクリエートを、公知の方法を実施してストレプトゾトシンの腹腔内注射により、糖尿病にした３ヶ月齢の雌BALB/cマウスに経口的に与えた。ストレプトゾトシンへの曝露２日後に、マウスを５つのグループに分け、そしてマウス当たり200ρlのインスリンコクリエートを経口投与した。他のマウスには２IUのHumulin Rを注射した。
血清サンプルを、０時(インスリン投与前)、およびインスリン投与後２時間に採取した。グルコースレベルをSigma(St.Louis)のキットを用いて測定した。コントロール動物は未処置、すなわち、ストレプトゾトシンまたはインスリンを受けなかった。代表的な結果を図８に示す。経口的に投与したインスリン(単に飲ませることによる)は、血中のグルコースレベルの減少に有効であった。血中グルコースの減少は、コントロール動物では見られなかった。
本明細書中に引用した参考文献の全てを全体で参考として援用する。
本発明が詳細にそしてその特定の実施態様に対する参考を用いて記載した一方、様々な変化および改変が、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが当業者には明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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