【手続補正書】
【提出日】平成17年10月28日(2005.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加し、前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させて、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端に所望の修飾物質に対して結合能を有する官能基を付与し、前記官能基を有したヌクレオチド鎖の３´末端に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項２】
修飾対象とする１本鎖ヌクレオチドに、当該ヌクレオチド鎖の３´末端領域に相補的な配列を３´末端領域に有するヌクレオチド鎖をアニールし、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項３】
少なくとも一方のヌクレオチド鎖を修飾対象とする２本鎖ヌクレオチドを、修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端領域の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断し、切断した修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項４】
２本鎖ヌクレオチドの少なくとも一方である修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に、特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を５´末端領域に有した２本鎖ヌクレオチドをＤＮＡリガーゼで接合することにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項５】
分解酵素としてＤＮＡグリコシラーゼを使用してヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を付与する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項６】
ヌクレオチド配列の付加は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチドを取り込むことにより行う請求項２または請求項３のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項７】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖の３´末端に付与される官能基と結合を形成するアミノ基を有する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項８】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質である請求項１または請求項７のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項９】
修飾物質が、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質または、生体外因性物質である請求項８記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１０】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質である請求項１または請求項７のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１１】
修飾物質が、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物である請求項１０記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
一方、ヌクレオチド鎖の修飾は、ラベル化、標識化の他に、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するために行なわれている。このための基板は当初、疎水性と正電荷の片方または両方を有するニトロセルロース、ナイロン、フッ化ポリビニリデンよりなるものが利用されていたが、固定化したヌクレオチド鎖が解離してしまうことがあった。近年では、ヌクレオチド鎖に５´末端のリン酸基を介してアミノ基を持たせる修飾処理を施す一方で、ガラス、シリコンなどの基板を用い、その表面がアルデヒド基あるいはエポキシ基になるように予め処理を施すことにより、ヌクレオチド鎖を基板に固定化する方法がとられる。このような方法で配列の異なるヌクレオチド鎖を基板単位面積当たり多数固定化することにより、遺伝子解析マイクロアレイを実現している。
【特許文献１】特許１７０６２８９号
【特許文献２】特開昭６１−１１５０９４号
【特許文献３】特公平７−３１１９４号
【特許文献４】特表２０００−５０８７０９号
【特許文献５】特許１８１４７１３号
【特許文献６】特許２０９３７３０号
【特許文献７】特許２０９３７３１号
【特許文献８】特許２６１３８７７号
【特許文献９】特表平１０−５０３８４１号
【特許文献１０】特開２００３−２４６７９４号
【特許文献１１】特許２１０３１５５号
【特許文献１２】特表２０００−５０２２５１号
【特許文献１３】特開平１１−１１３５９９号
【非特許文献１】チュ（Chu B.C.F）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１１巻、６５１３頁、１９８３年
【非特許文献２】ベック（Beck.S.）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１６巻、１４３頁、１９９２年
【非特許文献３】ブロンシュタイン（Bronstein.I.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１７巻、３９８頁、１９９３年
【非特許文献４】アルブス（Alves.A.M.）ら、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３０巻、３０８９頁、１９８９年
【非特許文献５】コクッザ（Cocuzza.A.J.）、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３０巻、６２８７頁、１９８９年
【非特許文献６】タイセン（Theisen.P.）ら、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３３巻、５０３３頁、１９９２年
【非特許文献７】ケンプ（Kempe.T.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１３巻、４５頁、１９８５年
【非特許文献８】スミス（Smith.L.M.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１３巻、２３９９頁、１９８５年
【非特許文献９】アンソージュ（Ansorge.W.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１５巻、４５９３頁、１９８７年
【非特許文献１０】クック（Cook.A.F.）、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１６巻、４０７７頁、１９８８年
【非特許文献１１】ロジェ（Roget.A）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１７巻、１９８９年
【非特許文献１２】ミシウラ（Misiura.K.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１８巻、４３４５頁、１９９０年
【非特許文献１３】ピールス（Pieles.U.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１８巻、４３５５頁、１９９０年
【非特許文献１４】ランガー（Langer.P.R.）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA」、７８巻、６６３３頁、１９８１年
【非特許文献１５】ロイコウドリー（Roychoudhury.R.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、３巻、１０１頁、１９７６年
【非特許文献１６】ビンセント（Vincent.C.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１０巻、６７８７頁、１９８２年
【非特許文献１７】ヨウサフ（Yousaf.S.I.）ら、「ジーン（Gene）」、３巻、３０９頁、１９８４年
【非特許文献１８】シュミッツ（Schmitz.G.G.）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１９２巻、２２２頁、１９９１年
【非特許文献１９】ジャクソン（Jackson.D.A.）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA」、６９巻、２９０５頁、１９７２年
【非特許文献２０】ファインバーグ（Feinberg.A.P）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１３２巻、６頁、１９８３年
【非特許文献２１】ファインバーグ（Feinberg.A.P）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１３７巻、２６６頁、１９８４年
【非特許文献２２】リグビー（Rigby.P.W.J）ら、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）」、１１３巻、２３７頁、１９７７年
【非特許文献２３】ミュリス（Mullis.K.B.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、１５５巻、３３５頁、１９８７年
【非特許文献２４】サイキ（Saiki.R.）、「サイエンス（Science）」、２３９巻、４８７頁、１９８８年
【非特許文献２５】シーバート（Siebert.P.D.）ら、「ネイチャー（Nature）」、３５９巻、５５７頁、１９９１年
【非特許文献２６】デイ（Day.P.J.R.）ら、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）」、２６７巻、１１９頁、１９９０年
【非特許文献２７】シェナ（Schena.M.）ら、「サイエンス（Science）」、２７０巻、４６７頁、１９９５年
【非特許文献２８】シャロン（Schalon.D.）ら、「ゲノム・リサーチ（Genome Res.）」、６巻、６３９頁、１９９６年
【非特許文献２９】核酸マイクロアレイ特集  「ネーチャージェネティックス（Nature Genet.）」、２１巻 Supplement、１月、１９９９年
【非特許文献３０】アマーシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences）社ウェブサイト（http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/microarrays_labelling%5Cmicroarrays_labelling_cyscribe_postlabelling?OpenDocument&hometitle=microarrays）、2003年4月14日アクセス
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
分解酵素としてＤＮＡグリコシラーゼを使用してヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を付与することができる。
ヌクレオチド配列の付加は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチドを取り込むことにより行うことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
形成された完全２本鎖ヌクレオチドに対して、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させ、アルカリ熱処理することにより、ヒポキサンチンＨｘを含んだヌクレオチド（デオキシリボース）の１´位の炭素と酸素の間のグリコシド結合を特異的に分解し、これにより形成されるヌクレオチド鎖（２−４）の３´末端にアルデヒド基を付与する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
修飾終了後に、不要なヌクレオチド鎖（２−２）を分離除去する。このヌクレオチド鎖（２−２）の除去は、修飾物質が結合した２本鎖ヌクレオチドを熱処理するか、あるいはヌクレオチド鎖（２−２）の５´末端にリン酸基を存在させて、これを特異的に分解するラムダエキソヌクレアーゼを作用させることで、容易に行える。予めヌクレオチド鎖（２−２）の塩基Ｎ１、Ｎ２のグアニンの一部をヒポキサンチンに代えたものとしておくことにより、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型によって小断片化することもできる。
（実施形態２）
図３は、本発明の実施形態２におけるヌクレオチド鎖修飾方法であって、２本鎖ヌクレオチドの内、修飾対象とする一方のヌクレオチド鎖に、上述した３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型に対する基質となるヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加する方法を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
上記した各実施形態では、ヒポキサンチンＨｘを含んだヌクレオチド配列を付加すること、またヒポキサンチンＨｘを含んだヌクレオチドを基質とする３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させることを例示したが、これに限定されない。たとえば、以下の表１に掲載した塩基を３´末端領域に含んだヌクレオチドとＤＮＡグリコシラーゼとの組み合わせでも、同様にしてヌクレオチド鎖の３´末端を所望の修飾物質で修飾可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【表１】
2006006179.tif 000001
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
【表２】
2006006179.tif 000002
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
被修飾ヌクレオチド鎖
ＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡ（配列１）
相補的ヌクレオチド鎖
ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡ（配列２）
（ステップ１）
被修飾ヌクレオチド鎖（以下、ＭＹＨ１と記す）と相補的ヌクレオチド鎖（以下、ＭＹＨ１-ＢａｍＨＩと記す）とを、最終濃度がそれぞれ１０μＭ、２０μＭになるように、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）の緩衝液に懸濁し（総量１００μｌ）、６５℃で１０分加温した後、３０分以上かけて室温まで冷却することにより、ｃＭＹＨ１-ＢａｍＨＩの５´領域（ＣＴＴＴＣＡＧＣＡ）が突出した２本鎖を形成した。
（ステップ２）
形成された２本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、１０ｍＭ  ｄＩＴＰ、１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ、１０ｍＭ  ｄＣＴＰ、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム、４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）の溶液に入れ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ改変酵素シーケネースｖｅｒ．２．０（ＵＳＢ社）を最終濃度０．５ｕ／μｌになるよう添加し（総量１００μｌ）、３７℃で４時間反応させることにより、ＭＹＨ１の３´末端に、ＭＹＨ１-ＢａｍＨＩに相補的なヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加して、完全な２９塩基対の２本鎖ヌクレオチドを形成した。この際に形成されるＭＹＨ１は（配列１）−ＨｘＨｘＡＴＣＣＨｘＡＴで表わされる。
（ステップ３）
形成された２本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化カリウム（ｐＨ７．４）の溶液に入れ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型（Trevigen社）を最終濃度０．２ｕ／μｌになるように添加し（総量１００μｌ）、３７℃で一昼夜反応させることにより、ヒポキサンチンを持ったデオキシリボースのグリコシド結合部分を加水分解して、ＭＹＨ１の３´末端にアルデヒド基を付与した。このＭＹＨ１は（配列１）−ＣＨＯで表わされる。
（ステップ４）
ＭＹＨ１の末端にアルデヒド基を持った２本鎖ヌクレオチドを、５０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）の溶液に入れ、修飾物質としてのアミノオキシメチルカルボニルヒドラゾン−Ｃｙ５を最終濃度２４０μＭになるよう添加し（総量１００μｌ）、室温で一昼夜反応させることにより、ＭＹＨ１の３´末端のアルデヒド基とＣｙ５のアミンとの間でシッフ塩基を形成させた。このＭＹＨ１は（配列１）−ＣＨＨＮＯＣＨＮＨＮＨ−Ｃｙ５で表わされる。