【手続補正書】
【提出日】平成18年7月14日(2006.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を固相調製した後、前記固相に酵素標識抗原、および内分泌撹乱化学物質を添加して免疫反応を行わせ、
免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、標識酵素量に比例して発生する発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項２】
前記内分泌撹乱化学物質が１７β−エストラジオールであることを特徴とする請求項１に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項３】
前記抗体は１７β−エストラジオールに牛血清アルブミンを結合し、ウサギに免疫して調製したものであることを特徴とする請求項２に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項４】
前記抗体の濃度が０．７５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項３に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項５】
前記抗体１ｍＬに対して添加する前記酵素標識抗原および１７β−エストラジオールの混合溶液の体積が１００μＬであることを特徴とする請求項４に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項６】
前記混合溶液中の酵素標識抗原の濃度が０．１２５〜０．２５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項４に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項７】
前記免疫反応を２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする請求項５または６に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項８】
前記免疫反応を１時間以上行うことを特徴とする請求項５から７のいずれか１項に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項９】
第1抗体を固相調製した後、固相に酵素標識抗原、内分泌撹乱化学物質、および第2抗体を添加して免疫反応を行わせ、
免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、標識酵素量に比例して発生する発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１０】
前記内分泌撹乱化学物質が１７β−エストラジオールであることを特徴とする請求項９に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１１】
前記第１抗体が抗ウサギＩｇＧヤギ抗体であり、前記第２抗体が抗１７β−エストラジオールウサギ抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１２】
前記抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の濃度が１．０μｇ／ｍＬであり、前記抗１７β−エストラジオールウサギ抗体の濃度が０．７５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１１に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１３】
免疫反応を２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする請求項１１または１２に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
例えば、環境ホルモンを抗原とし、その抗原と酵素で標識した標識抗原とを競合させる方法、または二抗体法と呼ばれる非競合法による免疫反応を行い、反応終了後に反応試薬を添加して、標識酵素量に比例して発生する発光量から環境ホルモンを測定する酵素免疫測定法が行われている(例えば、特許文献１参照。)。
【特許文献１】特開２００１−６６３１１号公報
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
前記課題を解決するために、請求項１に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、抗体を固相調製した後、前記固相に酵素標識抗原、および内分泌撹乱化学物質を添加して免疫反応を行わせ、免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、標識酵素量に比例して発生する発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
請求項８に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項５から７のいずれかにおいて、前記免疫反応を１時間以上行うことを特徴とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
請求項９に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、第1抗体を固相調製した後、固相に酵素標識抗原、内分泌撹乱化学物質、および第2抗体を添加して免疫反応を行わせ、免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、標識酵素量に比例して発生する発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
請求項１乃至８に記載の発明は、試料中の内分泌撹乱化学物質と、酵素標識抗原とを固相調製した抗体に競合させて免疫反応させ、発光試薬を加えることにより標識酵素量に比例して発生する発光量を求め、検量線を用いて間接的に試料中の内分泌撹乱化学物質の測定を行うことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
また、請求項９乃至１３に記載の発明は、試料中の内分泌撹乱化学物質と、酵素標識抗原と、を固相調製した第１抗体に反応されうる第２抗体に競合させて免疫反応させ、第2抗体と、第1抗体と、により固相に結合した酵素標識抗原を発光試薬を加えることにより標識酵素量に比例して発生する発光量を測定することにより、試料中の内分泌撹乱化学物質の測定を行うことができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
１７β−エストラジオールの測定に用いる抗体の濃度、酵素標識抗原の濃度、振とう効果、および反応時間を最適化することにより、正確な測定が可能である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
（実施例１２）  免疫反応時間の検討２
実施例１１では、１７β−エストラジオールの希釈緩衝液で最適反応時間について検討したが、濃度によって１７β−エストラジオールの反応性が異なることも考えられるので、１７β−エストラジオールの濃度を６．４０×１０-9〜１．０×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲に５倍ずつ希釈調製して最適反応時間について検討した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、６．４０×１０-9〜１．０×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲に５倍ずつ希釈調製した１７β−エストラジオールを１００μＬずつ添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、６．４０×１０-9〜１．０×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲に５倍ずつ希釈調製した１７β−エストラジオールを１００μＬずつ添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、５．０×１０-8〜５．０×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲に希釈調製した１７β−エストラジオールと下水処理水（Ｓ浄水場の曝気槽入口水と放流水）に１７β−エストラジオール濃度が５．０×１０-7ｇ／Ｌ、５．０×１０-5ｇ／Ｌになるように調製した処理水を添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、５．０×１０-8〜５．０×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲に希釈調製した１７β−エストラジオールと下水処理水（Ｃ処理場の一沈流出水と放流水）に１７β−エストラジオール濃度が５．０×１０-7ｇ／Ｌ、５．０×１０-5ｇ／Ｌになるように調製した処理水を添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、５．０×１０-8〜５．０×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲に希釈調製した１７β−エストラジオールと河川水（Ｍ川）に１７β−エストラジオール濃度が５．０×１０-7ｇ／Ｌ、５．０×１０-5ｇ／Ｌになるように調製した処理水を添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。