【手続補正書】
【提出日】平成18年9月21日(2006.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
DNAのメチル化は、DNAの複製や発現の調節において重要な役割を果たしている。真核細胞のDNAのメチル化は、Ｇ（グアニン）の５'側に位置するＣ（シトシン）（以下、「CpGジヌクレオチド」という）の５位で生じることが多い。特に、多くの遺伝子のプロモーター領域には多くのCpGジヌクレオチドが見られ、CpGアイランドと呼ばれている（非特許文献１）。一般に、常染色体のこれらCpGアイランドの大部分はメチル化されているが、プロモーター領域に密集して存在するCpGアイランドはメチル化されていない(非特許文献２）。また、白血病や骨髄腫において、ガン抑制遺伝子であるP16やP15のプロモーター領域のCpGアイランドがメチル化され、その結果これらの遺伝子が不活化されるか発現量の変化によってガン化することが知られている（非特許文献３、４）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
また、Ｇ以外のヌクレオチドの５'側に位置するＣも、メチル化を受けることが報告されている（非特許文献５）。
さらに、メチル化はエピジェネティックな変化を司るDNAの修飾方法であり、ゲノムインプリンティングでは、発現抑制のために対立する遺伝子のどちらかがメチル化されることで発現が抑制され、どちらかの親由来の遺伝子が発現する機構がある。したがって、メチル化状態が変化すると、胎生致死や遺伝病などを発症することもある（非特許文献６、７、８）
以上のようなことから、シトシンのメチル化は、遺伝子の発現制御で大きな役割を担っていると考えられている。したがって、メチル化の有無の検出は、疾病の治療および予後を推し量る上で重要な情報である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の領域中のCpG
アイランドにおけるシトシンのメチル化は、個々のCpGジヌクレオチド毎に異なっているものではなく、ほとんどのCpGジヌクレオチドでメチル化されているか、されていないかに二分されていることを見い出した（ HYPERLINK "http://www6.ipdl.ncipi.go.jp/Tokujitu/tjitemdrw.ipdl?N0000=231&N0500=4E#N/;%3e9%3e;%3e%3e9?///&N0001=27&N0552=9&N0553=000005" \t "tjitemdrw" 図１Ｂ、Ｃ）。さらに、すべてのCpGジヌクレオチドにおいてメチル化された配列を検出し得るオリゴヌクレオチドと、全くメチル化されていない配列を検出し得るオリゴヌクレオチドを用いることにより、メチル化の有無を検出できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
各々のオリゴヌクレオチドは、好ましくは５'末端部分又は３'末端部分で基材に固定化される。本発明で用いる基材は、物理的吸着又は化学結合によってオリゴヌクレオチドを固定化することができ、通常のハイブリダイゼーションの条件に耐えうるものであれば特に制限されない。具体的には、オリゴヌクレオチドの固定及びハイブリダイゼーション等に用いる溶剤に不溶であり、かつ常温若しくはその付近の温度範囲内（例えば０℃〜１００℃）で固体又はゲル状であるものが挙げられる。尚、基材が溶剤に不溶性であるとは、基材に、後述のようにしてカルボジイミド基等のオリゴヌクレオチドに結合性を有する基材が担持され、ついでオリゴヌクレオチドが固定化され、その後、例えば、ＤＮＡチップ等として使用される際の各過程で用いられる水性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であることをいう。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
上記基材の形状としては、例えば、フィルム、平板、粒子、成形品（ビーズ、ストリップ、マルチウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、メッシュ、連続発泡フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、スライド及び細胞培養容器等）、ラテックス等を挙げることができる。また、それらの大きさについては、特に制限は無い。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明に用いられる担体は、上記基材上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、基材上の全面において担持されても、また、その一部において担持されてもよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基が存在する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に種々の官能基を導入することは、従来より一般的に行われていることであり、その方法も公知であるので、このような公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を行うことができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
また、オリゴヌクレオチドと基材の接触後にUV等の電磁波を照射することによって固定することもできる。さらに、オリゴヌクレオチドとカルボジイミド樹脂、窒素イペリット、ポリアミノ酸、ニトロセルロース等の公知の化合物を化学的に結合又は物理的に結合した状態で、これら混合物と基材を接触させ固定させても良く、また、このときUV等の電磁波を照射して固定しても良い。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明は、上記キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板を用い、キャプチャーオリゴヌクレオチドと試料ＤＮＡ、又はその増幅産物との間でのハイブリダイゼーションを行う。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ハイブリダイゼーションの検出の方法は特に制限されないが、例えば、試料核酸を予め標識物質で標識しておき、ハイブリダイゼーションに続いて基板を洗浄した後に、標識を検出することによって行うことができる。標識物質としては、特に制限されないが、通常ハイブリダイゼーションの検出に用いられている物質、例えば放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、又は抗原等が挙げられる。例えば、標識物質としてビオチンを用いた場合、ハイブリダイゼーション操作後に、ビオチンに特異的に結合する蛋白質（アビジン又はストレプトアビジン）とこれに化学的に結合された酵素の複合体を結合させ、更に同酵素によって分解されると沈着性の色素を形成する化合物を加えて反応を行うと、ハイブリダイゼーションの有無及び位置を容易に検出することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
＜２＞キャプチャーオリゴヌクレオチドの基板への固定化
特開平８−３３４５０９号公報に記載の方法にしたがって作製したポリカルボジイミド樹脂コートスライドガラスの所定の位置に、上記配列番号６〜１３のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、３箇所ずつスポットした。スポットの量は0.5μlずつであり、スポット
の大きさは直径約１mmであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にUvstratalinker 2400（STRATAGENE社製）を用い、波長280nmを含む紫外線を600mJ/cm2照射した。その後、前記スライドガラスを水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。