(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性溶媒中において、三ハロゲン化リンをジアルキルアミンと反応させて中間体化合物を形成させ、ここで前記極性溶媒がニトリル化合物であり、次いで該中間体化合物を、非極性共溶媒の存在下に、ヒドロキシアルキル化合物もしくはヒドロキシプロピオニトリル、および、ジアルキルアミンと反応させるステップを含む、ホスホロジアミダイト生産方法。
【請求項２】
前記三ハロゲン化リンが三塩化リンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記三ハロゲン化リンが三臭化リンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ジアルキルアミンがジイソプロピルアミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ジアルキルアミンが、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、ジイソブチルアミン、またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルアミンからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ニトリル化合物がアセトニトリルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記極性溶媒がプロピオニトリルまたはベンゾニトリルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒドロキシアルキル化合物がメタノールまたはｔｅｒｔ−ブチルアルコールである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記非極性共溶媒がアルカンでありＣ５〜Ｃ９脂肪族炭化水素である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非極性共溶媒がアルカンであり脂環式炭化水素である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記極性溶媒の前記非極性共溶媒に対する比が１：１である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホロジアミダイト生産のための改良方法、このような方法により生産されたホスホロジアミダイト、およびこのようなホスホロジアミダイトの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホロジアミダイト生産は、バイオテクノロジー産業において、益々重要になってきている。ホスホロジアミダイトは、新規抗新生物剤製造において、中間体として使用される。
【０００３】
このような産業における使用に適したものであるためには、ホスホロジアミダイトは、高純度でなければならない。このようなホスホロジアミダイトはまた、低濃度のビス（２−シアノエチル）ホスホロジアミダイト（いわゆる「ジエステル」）しか含有してはならない。
【０００４】
この不純物は、オリゴヌクレオチド合成における商業的に重要な中間体である２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト合成における重大な副生成物であることが知られている。
【０００５】
ホスホロジアミダイトは非常に空気に敏感であり、熱に不安定であり、その精製は今のところ、複雑かつ高コストである。今まで、ホスホロジアミダイトの抽出および精製プロセスはしばしば多段階な合成手順を要し、これは、中間体材料の化学的な単離を要し、高純度ホスホロジアミダイト生成物の単離前に、更なる精製手順を要する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ホスホロジアミダイト生産の前記した短所を改良することを狙いとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、ホスホロジアミダイト生産方法を提供し、本方法は、極性溶媒中において、三ハロゲン化リンをジアルキルアミンと反応させ、中間体化合物を形成させ、次いで、非極性共溶媒の存在下に、ヒドロキシアルキル化合物およびジアルキルアミンと、該中間体化合物を反応させるステップを含む。
【０００８】
次いで濾過し、固体の前記副生成物を除去すると、これら２種の溶媒は分離した層を形成する。これは、その上層である非極性溶媒層が高純度ホスホロジアミダイト生成物を含有するので、有利である。その下層である極性溶媒層は、「ジエステル」および他の欲されない副生成物が混入した純粋でない生成物を含有する。該上層は次いで真空に付され、該溶媒を除去し、９６％より高い純度を有する所望の生成物が残り、１％未満の「ジエステル」不純物しか含有しない。該生成物の収率は、更なる量の非極性溶媒を用いて該極性溶媒層を再度任意に洗浄することにより、更に上昇され得、純粋な生成物を含有する非極性溶媒溶液を与え、これからは次いで、高純度ホスホロジアミダイトが単離され得る。
【０００９】
有利なことには、他に条件がなければ商業的使用には不適であろう「ジエステル」および他の不純物が混入した純粋でない生成物は、前記した溶媒による精製手順により、抽出および精製され得る。ホスホロジアミダイト生成物は好ましくは該非極性共溶媒に可溶である一方、「ジエステル」および他の欲されない極性副生成物は不溶であり、該極性溶媒層中に留まる。
【００１０】
好ましくは、前記三ハロゲン化リンは三塩化リンである。あるいは、該三ハロゲン化リンは三臭化リンである。
【００１１】
前記ジアルキルアミンは、好ましくはジイソプロピルアミンである。あるいは、該ジアルキルアミンは、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、ジイソブチルアミン、またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルアミンであってもよい。
【００１２】
前記極性溶媒は、好ましくはニトリル化合物であり、特にアセトニトリルである。あるいは、該極性溶媒は、プロピオニトリルまたはベンゾニトリルであってもよい。
【００１３】
前記ヒドロキシアルキル化合物は、好ましくはヒドロキシプロピオニトリルである。あるいは、該ヒドロキシアルキル化合物は、メタノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、またはホスホロジアミダイト製造に適切であることが知られる他の適切なヒドロキシアルキル化合物であってもよい。
【００１４】
アルカンである前記共溶媒は、好ましくはヘプタンまたはヘキサンである。他の適切なＣ５〜Ｃ９脂肪族炭化水素には、ペンタンが包含される。適切な脂環式炭化水素には、例えばシクロヘキサンが包含される。
【００１５】
極性溶媒の非極性溶媒に対する比は、適切には約１：１である。本発明による方法は、式Ｉ：
（Ｒ２Ｎ）２−Ｐ−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＣＮ    （Ｉ）
のホスホロジアミダイト化合物を提供し、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ヒドロキシアルキル、またはオキシアルキル基；ｎは、１〜４の整数である。
【００１６】
式Ｉの化合物は、好ましくは２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトであり、式中、Ｒはイソプロピル、ｎ＝２である。
【００１７】
本発明はまた、オリゴヌクレオチド合成における、式Ｉの化合物の使用をも提供する。
【００１８】
本発明は今から、以下のように、例示のためのみ記述される。
【実施例】
【００１９】
［実施例１］
［共溶媒としてヘキサンを使用した、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトの製造］
常温において、三塩化リン２７．５ｇを、アセトニトリル（２００ｇ）およびジイソプロピルアミン（１２１ｇ）の攪拌されている混合物へ、１時間に亘って加えた。ヘキサン２００ｇが次いで加えられ、ヒドロキシプロピオニトリル１４ｇが次いで常温において、３０分に亘って加えられた。得られた反応混合物が次いで１時間攪拌され、次いで濾過され、生じた固体の副生成物を除去した。濾過された該反応混合物の上層であるヘキサン層が分離され、真空に付され、該ヘキサン溶媒を除去した。これにより、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト２０ｇが残り、これは、３１Ｐ−ＮＭＲにより測定されると、純度９６．９％を持つものである。下層であるアセトニトリル層が２時間、更なるヘキサン２００ｇと共に、攪拌された。この再抽出からの上層であるヘキサン層は、３１Ｐ−ＮＭＲにより測定されると、純度９８％の生成物を含有する。真空に付した後、更に１１ｇの高純度２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトが単離された。
【００２０】
［実施例２］
［共溶媒としてヘプタンを使用した、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトの製造］
常温において、三塩化リン２７．５ｇを、アセトニトリル２００ｇおよびジイソプロピルアミン１２１ｇの攪拌されている混合物へ加えた。次いで、ヘプタン２００ｇがこの混合物へ加えられ、次いで、ヒドロキシプロピオニトリル１４．３ｇが常温において、３０分に亘って加えられた。得られた反応混合物は次いで１時間攪拌され、次いで濾過され、生じた固体の副生成物を除去した。上層であるヘプタン層が次いで分離され、真空に付され、該ヘプタン溶媒を除去し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト２２ｇが残り、これは、３１Ｐ−ＮＭＲにより測定されると、純度９６．７％を持つものである。
【００２１】
［実施例３］
［低純度２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトの精製］
低純度２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト６０ｇ（３１Ｐ−ＮＭＲにより測定されると、「ジエステル」１．３％を含有し、純度９２％）を、アセトニトリル２００ｇおよびヘプタン２００ｇの混合物へ加え、１０分間攪拌後、上層であるヘプタン層を分離し、下層であるアセトニトリル層を、更なるヘプタン２００ｇと共に、更に１０分間攪拌した。この第２のヘプタン分画を次いで分離し、これら２つのヘプタン分画を次いで一緒にして、真空に付し、ヘプタン溶媒を除去した。２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト３０ｇが、３１Ｐ−ＮＭＲにより測定したところ純度９８．３％にて得られた。この抽出されたホスホロジアミダイト化合物は、０．１％未満の「ジエステル」不純物を含有するものであった。