【手続補正書】
【提出日】平成18年2月20日(2006.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）：
【化１】
2000236875.tif 000001
［式（１）中、
Ｘは、ＮＨ又はＳであり；
Ｚは、ＮＨ又はＯであり；
ｋは０又は１であり；
ｍは０ないし２の整数であり；そして
ｎは１ないし２０の整数である］
で表される構造を有する化合物。
【請求項２】
式（１）において、ＸがＮＨであり、ＺがＯであり、ｋが０であり、ｍが２であり、そしてｎが５である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）：
【化２】
2000236875.tif 000002
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製造することを特徴とする、式（２）で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントの製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の結合体を抗原として用いることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項６】
モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項７】
モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３又はそのフラグメントである、請求項５若しくは６に記載の抗体又は抗原と結合可能なフラグメント。
【請求項８】
請求項５ないし７のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項９】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１５７で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項５ないし７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原と結合可能なフラグメントを用いることを特徴とする、式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
【請求項１１】
さらに、請求項１若しくは２に記載の化合物又は請求項３に記載の結合体を用いることを含む、請求項１０に記載の免疫学的測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｓ−１，２−ビス（エトキシカルボニル）エチル  Ｏ，Ｏ−ジメチルホスホロジチオアート（以下、本明細書中「マラチオン」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本発明はさらに、前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハーベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。マラチオンについては、食品衛生法に基づき残留基準値が、米（０．１ｐｐｍ）、穀類（２−８ｐｐｍ）、豆類、果実、野菜（０．５−８ｐｐｍ）、小麦粉（１．２ｐｐｍ）、オイルシード（０．１−８ｐｐｍ）、ナッツ類（８ｐｐｍ）、ホップ（１ｐｐｍ）等定められている（「最新農薬の残留分析法」  同上）。さらに、水質に関しても、水質汚濁に係る登録保留基準値が０．１ｍｇ／ｌと定められている（改訂３版  農薬登録保留基準ハンドブック  第８７４頁−第８７６頁  １９９８年９月２５日  化学工業日報社）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有される、マラチオンの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マラチオンに反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記マラチオンハプテンと高分子化合物との結合体を使用することを含む、マラチオンの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
ｉｉｉ）ｋ＝１かつＺ＝ＮＨの場合
先ず、式（Ｙ２）の化合物の合成と同様に、五硫化二リンに有機溶媒中、メタノールを反応させる。次いで、塩基を加え、さらに、以下の式（Ｙ１０）：
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
例えば、保護基としてベンジルオキシカルボニル基を導入する場合、水中、塩基の存在下、ベンジルオキシカルボニルクロリドを反応させて、保護基を（Ｙ１７）の化合物に導入する。塩基としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン等を用いることができる。反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは０℃から８０℃で、１時間から２０時間、好ましくは１時間から３時間行う。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
［式（Ｙ２１）中、Ｐ’、ｋおよびｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
一方、混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応において慣用されている化合物を使用することができる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
［表３］
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
１．２３−１．３５（３Ｈ，ｔ）、２．９０−３．１８（２Ｈ，ｍ）
３．７６−３．８７（６Ｈ，ｄ）、４．０６−４．２９（３Ｈ，ｍ）
（５）の合成
２．４６ｇ（８．１ｍｍｏｌ）の（４）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶解し、この溶液を塩−氷で冷却しながら０．８２ｇ（８．１ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌ、次いでクロロ蟻酸イソブチル１．１ｇ（８．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。１０分間撹拌後に、１．５ｇ（８．１ｍｍｏｌ）の６−アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。５分間氷冷下で撹拌後、４℃で２０分、更に室温で１０分撹拌した。溶媒を留去後に残渣をジクロロメタンで再溶解させて、水洗、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）で粗精製した。
（６）の合成
（５）を含む粗精製物を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ＴＦＡ１０ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１→酢酸エチル）で精製すると、透明油状物として１．９４ｇ（（４）からの通算収率５７％）の（６）を得た。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
［表７］
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
１．２０−１．３１（３Ｈ，ｔ）、２．８４−３．１１（２Ｈ，ｍ）
３．７２−３．８８（６Ｈ，ｍ）、４．０６−４．２７（３Ｈ，ｍ）
（５）の合成
１．５ｇ（５ｍｍｏｌ）の（４）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶解し、この溶液を塩−氷で冷却しながら０．６７ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＴＨＦ溶液５ｍｌ、次いで０．９ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のクロロ蟻酸イソブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。２０分間撹拌後に、１．１ｇ（５．９ｍｍｏｌ）の６−アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。３０分間氷冷下で撹拌後、更に室温で１５分撹拌した。溶媒を留去後に残渣をジクロロメタンで再溶解させて、水洗、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）で精製すると、透明油状物として３９０ｍｇ（収率１６％）の（５）を得た。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
【化３４】
2000236875.tif 000003
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
【化３５】
2000236875.tif 000004
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
（２）の合成
硫酸１０ｍｌをジエチルエーテル１００ｍｌに加えた後、撹拌しながらベンジルアルコール１００ｍｌを加えた。ジエチルエーテルを留去後に１３．４ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸を少しずつ加えた。室温で１日撹拌後に、エタノール２００ｍｌとピリジン５０ｍｌを加えて、一晩冷蔵庫に放置した。析出した結晶をろ別し、エーテルと水で洗浄した後に乾燥させると、１１ｇ（収率４９％）の（２）を得た。
（３）の合成
１１ｇ（４９ｍｍｏｌ）の（２）を６００ｍｌの水に加えて、８０℃で溶解させた。加熱を停止して６０℃まで冷却した時に、１０．５ｇ（１２５ｍｍｏｌ）の炭酸水素ナトリウムと１２ｇ（７０ｍｍｏｌ）のベンジルオキシカルボニルクロリド（Ｚ−Ｃｌ）を加えて３時間撹拌した。ジエチルエーテルで洗浄後に、氷冷しながら濃塩酸でｐＨを１にして酢酸エチルで抽出した。脱水（無水硫酸ナトリウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→１：２）で精製すると、白色結晶として４．５ｇ（収率２５％）の（３）を得た。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
各ウェルの反応性を定性的にスクリーニングした後、マラチオンとの反応性を示したウェルのハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングした。このようにして、マラチオンに反応性を有する抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を３株（ＭＬＴ２−２３、ＭＬＴ４０−４、ＭＬＴ４５−３）分離した。これらの３株はいずれもマラチオンハプテン−５／ＫＬＨを抗原として得られたハイブリドーマである。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
表２８において、ＩＣ５０は、反応を５０％阻害する化合物の濃度であり、交差反応率はマラチオンのＩＣ５０値／各化合物のＩＣ５０値×１００である。表２８より、モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３は、マラチオンの代謝物であるマラオクソンと１．６％の交差反応性を示したものの、他の化合物に対してはすべて１％以下しか交差反応をせず、マラチオンに対する高い特異性を持つことが明らかとなった。