(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中マンノース濃度の測定値であって、空腹時におけるグルコース負荷試験前後、日常生活における食事の前後、インスリンの変動を来すような薬剤の負荷前後、運動負荷前後または就眠前後の経時変化を用いることを特徴とするインスリン作用不足の検出方法。
【請求項２】
インスリン作用不足がグルコース放出の抑制の低下に起因するインスリン作用不足である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
インスリン作用不足を検出するための血中マンノース濃度の、空腹時におけるグルコース負荷試験前後、日常生活における食事の前後、インスリンの変動を来すような薬剤の負荷前後、運動負荷前後または就眠前後の経時測定値間の差の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病や肥満に伴う動脈硬化の病態を診断する上で必要とされるインスリン作用不足の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリンは、体内でのグルコース利用を促進する唯一のホルモンであるが、このホルモンが不足したり有効に作用しなくなった場合、血中のグルコース濃度が異常に上昇して糖尿病となる。従って、尿糖値、空腹時血糖値や糖負荷試験に伴う血糖値の変動パターン等の解析から、高血糖の状態を把握し、「インスリン作用の不足」を間接的に判断して糖尿病を診断してきた。
【０００３】
このインスリン作用の不足は、膵臓からの「インスリン分泌の絶対量の低下」のみならず、「インスリン抵抗性」によるグルコース利用効率の低下とも関係している。例えば、肥満に伴う軽度の高血糖（ＩＧＴ）では、インスリンに対する感受性が低下し、結果的に、インスリンの過剰分泌が起こる。この高インスリン血症が、肥満に伴う動脈硬化の重要な要因になっているものと考えられている。
このように、インスリン作用の不足は、肥満や糖尿病と密接に関係している。
【０００４】
これまでのインスリン作用不足の検出方法は、簡便には、空腹時の血糖値、グルコース経口負荷後の血糖値やその経時変化を解析して行なわれている。また、さらに厳密には、インスリンの分泌量と、インスリンに対する感受性の低下（インスリン抵抗性）を把握するため、空腹時の血糖値と血中インスリン値の両方を測定して両者の関係（ＨＯＭＡ指数）を解析する方法等が行なわれている。もっとも厳密には、グルコースやインスリンを静注負荷し、血糖値と血中インスリン値の動的な関係を解析することで行なわれている。
【０００５】
一方、マンノース濃度測定の臨床的意義については、(1)血糖値とマンノース濃度は相関する（J. Clin. Endocrinol. Metab., 62, p984-989 (1986)、Scand. J. Clin. Lab. Invest., 59, p607-612 (1999)）、(2)マンノース／グルコース濃度比が、インスリン非依存型糖尿病（Clin. Chim. Acta, 251, p91-103 (1996)）、異脂肪血症、尿蛋白排泄の亢進やＢＭＩ（Body Mass Index：肥満度指数）上昇（Scand. J. Clin. Lab. Invest., 59, p607-612 (1999)）で増加するとの報告がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、血糖値のみを用いるインスリン作用不足の検出方法では、組織でのグルコースの消費によって血糖値が大きく変動するという問題点があった。
また、血中インスリン値と血糖値を組み合わせるインスリン作用不足の検出方法は、より厳密ではあるが、インスリン負荷による患者負担が大きいという問題点があった。たとえ、空腹時採血だけの簡便法であったとしても、免疫学的にインスリンを測定することは、生化学的測定法よりもコストが高いという問題点もあった。
また、これまでのマンノース値の一点測定では、これまでの検査法を超える臨床的な有用性を認めることができなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、インスリンに反応して血中マンノース値が低下することを見出し、その結果、インスリン作用を簡便に把握できることに基づき本発明に至ったものである。
【０００８】
即ち、本発明は、
（１）血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いることを特徴とするインスリン作用不足の検出方法
（２）インスリン作用不足がグルコース放出の抑制の低下に起因するインスリン作用不足である上記（１）記載の検出方法
（３）グルコース負荷時における血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いる上記（１）または（２）に記載の検出方法
（４）インスリン作用不足を検出するための血中マンノース濃度の経時測定値の使用
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、インスリン作用不足の検出において、血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いることを特徴とする方法であり、更に、グルコース負荷時の血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いる方法である。本発明で使用する血中マンノース濃度の測定方法は、臨床的に意味のある精度で測定できる方法であれば何であっても良く、特に限定されない。例えば、ガスクロマトグラフ法（Pflugers Arch., 420, p367-375 (1992)、Biol. Mass Spectrom., 23, p590-595 (1994)）や液体クロマトグラフ法（Am. J. Clin. Pathol., 53, p793-802 (1970)）や最近臨床検査の現場で用いられている汎用の生化学分析装置で測定する方法（特開平１１−２６６８９６号公報）が挙げられるが、臨床現場でのルーチン測定に適した生化学的分析法が好ましい。
本発明におけるインスリン作用とは、前記したように、インスリンによる血中グルコース濃度の低下を意味し、インスリンの分泌量（血中濃度）及びインスリンの効き具合（＝グルコースの利用効率）を反映するものである。グルコースの利用効率の低下は、インスリン抵抗性と言われるものであるが、これはさらに、筋肉や脂肪組織等の末梢組織における糖利用の低下と、肝臓や腎臓でのグルコース放出の抑制の低下の両面によって説明されるものである。後記するように、肝臓におけるグリコーゲンの分解によりグルコース放出が促進され、その際にグルコースと共にマンノースが放出される。インスリンによる肝臓でのグルコース放出の抑制作用は知られているので、血中マンノースの測定値の経時変化はインスリン抵抗性の原因が糖利用の低下か、グルコース放出の抑制の低下かの検査を可能とする。この肝臓等の臓器におけるインスリン作用不足の検査法も本願発明に含まれる。
【００１０】
本発明に使用される血液は、全血、血漿または血清であるが、血漿または血清が好ましい。
本発明における血中マンノース濃度の測定は、血中インスリン濃度の変動が予想される場面で測定するのが好ましい。例えば、空腹時におけるグルコース負荷試験前後、日常生活における食事の前後、インスリンの変動を来すような薬剤の負荷前後、運動負荷前後、就眠前後等における血中濃度及びその変化を測定し、糖尿病や肥満によるインスリン抵抗性患者の診断や、より詳細な病態の把握に都合の良い方法で解析すれば良い。
【００１１】
本発明におけるグルコース負荷とは、効率良く負荷できる方法であれば何であっても良く、特に制限されない。日常の食事による負荷試験、糖尿病の診断法として多用されているグルコースやマルトース等の経口負荷試験（ＯＧＴＴ）、静注によるグルコースの負荷試験等があるが、好ましくはＯＧＴＴであり、ＯＧＴＴによる糖尿病検査と同時に行なうことも可能である。
【００１２】
更に、グルコース負荷における血中マンノース濃度の測定は、グルコースに反応してインスリンが分泌され、この分泌されたインスリンによってマンノースが変動すると考えられるから、例えば、ＯＧＴＴの場合、血糖値がピークに達する時間の近傍から、さらに遅れた時点で測定するのが適切である。後記するように正常ラットでのグルコース負荷試験におけるマンノース濃度の最小値は２０分後であるが、ヒト（健常者）ではグルコース負荷後から徐々に低下して行き１２０分後に最小値（グルコース負荷前の値の５０〜８０％程度）に達した。マンノース値の変動を解析するための至適観測点は、動物の種差によって変化する。ヒトの場合、好ましくは負荷後１０分から３時間、さらに好ましくは負荷後３０分から２時間での測定が良い。
【００１３】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
実施例１  インスリン負荷試験
カニュレーション
正常ラットとしてWistar系ラット（♂、２４０〜２７０ｇ、日本クレア）に、無麻酔下、無拘束でストレスをかけずに、同一個体から連続採血するため、右心房にカニューレを留置する手術を施行した。具体的には、ネンブタール麻酔下に、ラットを保定台に背位に保定し、右側頚静脈上部の周辺を剃毛し、頚静脈が拍動している部分の皮膚を切開した。結合組織を、鉗子を用いて鈍性剥離し、頚静脈を露出させ、頚静脈の吻側及び尾側に縫合糸（２号）をかけ、吻側の糸を固く結んだ。尾側の糸は緩くかけたままにしておいた。
クリップで心臓側からの血流を止め、ウェッケル剪刀で血管に小さな切れ目を入れ、ヘパリン１０Ｕ／ｍＬ添加生理食塩水（ヘパリン加生食）で満たされたカニューレを挿入した。あらかじめカニューレのストッパーに掛けておいた糸で胸筋を縫い、カニューレを固定した。さらに、頚部背側の皮膚を小さく切開し、切れ目より鉗子を挿入してカニューレを引き出し、カニューレケース本体の中央の穴に通した。ケースを縫合糸（４号）により背側皮膚に固定した。カニューレ内に血液が残らないようにヘパリン加生食を適量注入し、充填液をカニューレ内部に詰めた後、先端を結んで栓をし、ケースに収納した。
【００１５】
投与及び採血
カニューレから０．２５Ｕ／ｍＬのインスリンを投与し、投与の５分前、投与直前、投与後５、１０、２０、３０、４５、６０分と合計８回にわたってカニューレから８０μＬづつ採血した。
【００１６】
血糖測定
採血した全血２０μＬを用い、アントセンスII（バイエル・三共）により血糖値を測定した。
【００１７】
マンノースの測定
採血した全血５０μＬにヘパリン加生食５０μＬを加え、７，５００×ｇで１５分間遠心分離し、その上清液７０μＬに、１．５Ｍ過塩素酸１０μＬを加えて、氷冷下で１０分間放置後、７，５００×ｇで１５分間遠心分離して除蛋白した。この上清液中のマンノース濃度を、糖分析用のカラムをセットした液体クロマトグラフィー分析装置（ＨＰＬＣ）を用い、下記の条件で定量した。
【００１８】
ＨＰＬＣの条件
カラム：Finepak gel SA-121
カラム温度：８０℃
カラム流速：０．５ｍＬ／分
移動相：緩衝液Ａ（０．２５Ｍホウ酸溶液）、緩衝液Ｂ（０．６０Ｍホウ酸溶液）
移動相組成：Ａ／Ｂ＝８／２（０分）→６／４（１７分）直線勾配
反応試薬：１００ｍＭホウ酸、５０ｍＭグアニジン塩酸塩及び０．５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを含む２０％アセトニトリル水溶液
反応温度：１６０℃
試薬流速：０．５ｍＬ／分
蛍光検出：励起波長３１０ｎｍ、検出波長４１５ｎｍ
【００１９】
実験結果
これらの結果を、図１と表１に示した。これより、インスリンに応答し、血中マンノースが低下していると考えられた。
【００２０】
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【００２１】
実施例２  グルコース負荷試験
実施例１のインスリンに代えて、５０％グルコース溶液１ｍＬを正常のWistar系ラット及び２型糖尿病モデルであるＧＫラット（♂、１８０〜２００ｇ、日本クレア）に負荷し、同様の試験を行った。これらの結果を、図２（正常Wistar系ラット）と図３（糖尿病ＧＫラット）に示した。両者とも、血糖値は５分後にピークとなったが、マンノース値はこれより約２０分遅れて、２０〜３０分後に最低値に達した。正常ラットのインスリンの分泌は、通常、グルコースとほぼパラレルになることから、インスリン分泌に要する時間分だけ、５〜１０分程インスリン負荷時よりも遅れる傾向を示した。さらに、正常ラットと糖尿病ラットの血中マンノース濃度の変化を比較するため、マンノース濃度がほぼ最小に達した時点の、グルコース負荷後２０分におけるマンノース値の低下量及び負荷前値に対する低下量の割合（％）を求め表２に示した。糖尿病ラットのマンノース値の低下量及び負荷前値に対する低下量の割合（％）は、それぞれ正常ラットの約１/３及び１／４と、著しく低下していた。このことは、糖尿病ラットにおけるインスリン作用の不足を反映していると考えられる。
【００２２】
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【００２３】
実施例３  グルコース負荷試験２
カニュレーション
正常ラットとしてWistar系ラット（♂、７週齢、日本クレア）、及び、２型糖尿病モデルのＧＫラット（♂、9週齢、日本クレア）に、実施例１と同様にしてカニュレーションを行なった。
【００２４】
投与及び採血
カニューレから５０％グルコース溶液１ｍＬ（２ｇ／kg）を投与し、投与直前（０分）、投与後２、５、７、１０、１５、３０分と、合計７回にわたって１５０μＬづつカニューレから採血した。
【００２５】
血糖測定
実施例１と同様にして測定した。
マンノース測定
採血した全血９０μＬにヘパリン１０Ｕ／ｍＬ加生食９０μＬを加え、７，５００×ｇで１５分間遠心分離した。この上清液１２０μＬに１．５Ｍ過塩素酸１８．５μＬを加え、氷冷下で１０分間放置後、７，５００×ｇで１５分間遠心分離して除蛋白した。この上清液中のマンノース濃度は、液体クロマトグラフィー分析装置（ＨＰＬＣ）を用い、実施例１と同様の条件下で測定した。
【００２６】
インスリン測定
全血を、７，５００×ｇで１０分間遠心分離後、その上清液５μＬを用い、ＥＬＩＳＡ法によるインスリン測定キット（森永生化学研究所）で、インスリン濃度を測定した。
【００２７】
これらの結果を、図４（正常Wistar系ラット）と図５（糖尿病ＧＫラット）に示した。血糖値は、両者とも２分後にはピークとなった。正常ラットでは、血糖に反応して大量のインスリンが放出されたが、ＧＫラットでは、インスリンは存在するが、極めてわずかしか変化しなかった。これを反映し、正常ラットのマンノース値は徐々に低下し、３０分後には３４μＭ低下した。一方、ＧＫラットでは、僅かに１．７μＭ低下しただけであった。インスリンとマンノースの関係をさらに明確にするため、これらの数値を表３に纏めた。これらの結果から、マンノース値は、血糖ではなく、インスリンによって変動していることが明らかになった。
【００２８】
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【００２９】
実施例４  ヒトでのグルコース負荷試験
健常者を対象にして７５ｇ経口グルコース負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）を行ない、血漿中のグルコース濃度とマンノース濃度の変化を追跡し、その結果を図６に示した。この図からも明らかなように、ヒトでのマンノース値は、糖負荷後から徐々に低下して行き１２０分後には最小値に達した。上記のようにラットでの最小値は２０分後であることから、マンノース値の変動を解析するための至適観測点は、動物の種差によって変化することが分かる。
【００３０】
実施例５  ラット肝での灌流実験（肝からのマンノース放出）
ラット灌流肝の調製（Ｍｉｌｌｅｒ  ｔｙｐｅ）
Wistar系ラット（♂、３１０〜４００ｇ、日本クレア）を、ペントバルビタール麻酔下（０．1ｍＬ／１００ｇ体重）で開腹し、灌流肝分離の手術を行なった。即ち、門脈に、糸を２本（１本は肝動脈と一緒に、他の１本は小腸側で、門脈のみ）緩くかけ、カニューレ（直径１．１ｍｍ）を挿入後、小腸側の糸できつく固定し、３３３Ｕ／ｍＬに希釈したヘパリン０．６ｍＬを注射筒で注入した。灌流装置からの灌流液、ポンプ流速３０ｍＬ／分で、カニューレから肝に流入させ、直ちに腹腔大静脈を右腎臓の下の位置で切断した。カニューレを肝臓側の糸で縛り、固定すると同時に肝動脈を結紮した。この段階で、肝臓内の血液はほとんど抜け、肝臓は淡黄色となった。胸部を切開し、下行大静脈を切断した。右腎臓のすぐ上の位置で、腹腔大静脈を糸で結紮し、灌流液を門脈側より流入させ、肝臓内を通過し下行大静脈から流出するようにした。最後に、肝臓を傷つけないように、他の臓器から分離した。
【００３１】
肝灌流及び薬物投与
あらかじめ、酸素９５％、炭酸ガス５％の混合ガスでバブリングした灌流液を、ペリスタポンプを用いて吸入し、エアートラップで小気泡を除去した後、温水循環ヒーターで瞬時に３７℃に加温しながら、門脈のカニューレから肝臓内に送り込んだ。肝臓は、メッシュの上に置き、湿度と温度を保つためにプラスチックのケースで覆った。また、肝臓上部より、ライト（１００Ｗ）を照射し、３７℃の恒温となるようにした。分離した肝臓に、流速３０ｍＬ／分で灌流液を送りながら、メッシュの上に１５分程静置した後、１分毎に６回、６分間、灌流液の採取を行なった。この採取の始めから２分を取り終えたところで灌流ラインのバルブを切り換え、０．２μｇ／ｍＬ濃度のエピネフリンを加えて灌流液を流した。
【００３２】
なお、灌流液は、５ｍＭグルコース、１１８ｍＭ塩化ナトリウム、４．７ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸２水素１カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウム、２４．２ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．４）からなるグルコース添加Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液を用いた。
【００３３】
グルコース放出とマンノース放出の関係
採取した灌流液中のグルコースとマンノース濃度を測定し、肝グルコース放出に伴う両者の動態を比較した結果を図７に示した。エピネフリンは、肝でのグリコーゲン分解を促進しグルコース放出を促進する薬物であるが、エピネフリンを還流すると、グルコースの放出量とほぼ平行してマンノースの放出量も促進された。このことから血中のマンノース値の変動は、肝臓等の臓器からのグルコース放出の状況を反映し、従ってインスリンによるマンノース値の低下は、肝臓等の臓器からのグルコース放出の低下を反映しているものと考えられる。
【発明の効果】
血中マンノース値を測定してその経時的な変動を解析することにより簡便にインスリン作用の不足の程度を把握することができ、特にインスリンによる肝臓等の臓器からのグルコース放出の抑制状況を把握でき、例えば血糖関連マーカー等の他のマーカーと併用することにより糖尿病や肥満に伴う疾患の病態、例えば糖尿病におけるインスリン作用の不足がグルコース放出の抑制能の低下、あるいは糖利用能の低下のいずれによるか等のより詳細な判別が可能となること、及びインスリンによる肝グルコース放出抑制の効果を知るためのマーカーとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】正常ラットに対するインスリン負荷試験の結果を示す。
【図２】正常ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図３】糖尿病ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図４】インスリンの測定値を加えた正常ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図５】インスリンの測定値を加えた糖尿病ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図６】健常者（ヒト）のグルコース負荷試験でのグルコースとマンノースの動態
【図７】ラット灌流肝でのグルコースとマンノースの動態
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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