(57)【要約】  かゆみの新たな神経伝達物質及びかゆみの治療手段の提供。  コレシストキニン−２受容体拮抗剤を有効成分とする掻痒性皮膚疾患予防又は治療薬。
2018151285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレシストキニン−２受容体拮抗剤を有効成分とする掻痒性皮膚疾患予防又は治療薬。
【請求項２】
掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である請求項１記載の予防又は治療薬。
【請求項３】
コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である請求項１又は２記載の予防又は治療薬。
【請求項４】
掻痒性皮膚疾患予防薬又は治療薬製造のための、コレシストキニン−２受容体拮抗剤製造のための使用。
【請求項５】
掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である請求項４記載の使用。
【請求項６】
コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である請求項４又は５記載の使用。
【請求項７】
掻痒性皮膚疾患を予防又は治療するための、コレシストキニン−２受容体拮抗剤。
【請求項８】
掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である請求項７記載のコレシストキニン−２受容体拮抗剤。
【請求項９】
コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である請求項７又は８記載のコレシストキニン−２受容体拮抗剤。
【請求項１０】
コレシストキニン−２受容体拮抗剤の有効量を投与することを特徴とする掻痒性皮膚疾患の予防又は治療方法。
【請求項１１】
掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
被検体のコレシストキニン−２受容体に対する拮抗作用を測定することを特徴とする掻痒性皮膚疾患予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１４】
被検体のコレシストキニン−２受容体に対する拮抗作用の測定が、コレシストキニン又はその部分ペプチド類及び被検体を投与した非ヒト動物の掻破行動を測定するものである請求項１３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患の予防又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
かゆみを伴う皮膚疾患には、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬、乾皮症等の原因が判明している限局性掻痒症以外に、肝硬変、腎不全、悪性リンパ腫等の内臓疾患による全身性の皮膚掻痒症がある。このうち、アトピー性皮膚炎等においては、強いかゆみを引き起こすため、掻いてしまうことで症状を悪化させてしまうことが問題となっている。かゆみのメカニズムは明確にされていない。【０００３】
最近の研究によって、後根神経節（ＤＲＧ）−脊髄間でいくつかの神経伝達物質がかゆみの情報伝達に関与することが示された。すなわち、末梢ＤＲＧで放出された脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）やガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）が、脊髄内のＢＮＰ受容体（Ｎｐｒａ）やＧＲＰ受容体（ＧＲＰＲ）を介してかゆみの情報伝達をしていることが報告された（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mishra SK, Hoon MA. The Cells and Circuitry for Itch Responses in Mice. Science. 2013, 340(6135): 968-971.
【非特許文献２】Sun YG, Chen ZF. A gastrin-releasing peptide receptor mediates the itch sensation in the spinal cord. Nature. 2007, 448(7154): 700-703.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＢＮＰやＧＲＰだけではかゆみの神経伝達を解明したとは言えず、更なる新たな神経伝達物質の解明が望まれている。
従って、本発明の課題は、かゆみの新たな神経伝達物質を見出し、新たなかゆみの治療手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、アトピー性皮膚炎発症ＮＣ／Ｎｇａマウス（ＡＤ／ＮＣ／Ｎｇａマウス）を用いてかゆみの新たな神経伝達物質の探索を行ったところ、ＡＤ−ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、アトピー性皮膚炎未発症ＮＣ／Ｎｇａマウスに比べて、後根神経節（ＤＲＧ）でコレシストキニン遺伝子の発現が強く発現しており、コレシストキニンがかゆみの神経伝達物質である可能性を見出した。さらに、研究を続けたところ、コレシストキニン８Ｓの髄腔内投与によりマウスの掻破行動が増加し、コレシストキニン８Ｓは、アトピー性皮膚炎の特徴的な症状であるアロネーシスも誘発することを見出し、コレシストキニン８Ｓがかゆみの神経伝達物質であることを確認した。そしてさらに研究を続けたところ、コレシストキニン受容体のうち、コレシストキニン−２受容体（ＣＣＫ−２Ｒ）拮抗剤が、コレシストキニン８Ｓによる掻痒性皮膚疾患の予防又は治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。【０００８】
〔１〕コレシストキニン−２受容体拮抗剤を有効成分とする掻痒性皮膚疾患予防又は治療薬。
〔２〕掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である〔１〕記載の予防又は治療薬。
〔３〕コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である〔１〕又は〔２〕記載の予防又は治療薬。
〔４〕掻痒性皮膚疾患予防薬又は治療薬製造のための、コレシストキニン−２受容体拮抗剤製造のための使用。
〔５〕掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である〔４〕記載の使用。
〔６〕コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である〔４〕又は〔５〕記載の使用。
〔７〕掻痒性皮膚疾患を予防又は治療するための、コレシストキニン−２受容体拮抗剤。
〔８〕掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である〔７〕記載のコレシストキニン−２受容体拮抗剤。
〔９〕コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である〔７〕又は〔８〕記載のコレシストキニン−２受容体拮抗剤。
〔10〕コレシストキニン−２受容体拮抗剤の有効量を投与することを特徴とする掻痒性皮膚疾患の予防又は治療方法。
〔11〕掻痒性皮膚疾患が、アロネーシスを伴う掻痒性皮膚疾患である〔１０〕記載の方法。
〔12〕コレシストキニン−２受容体拮抗剤が、Ｌ−３６５２６０、ＹＭ０２２、ＣＩ−９８８、Ｚ−３６０、プログルミド、ＣＩ−１０１５、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ２２５９１０、ＹＦ４７６、ＬＹ−２８８５１３又はＲＰ−６９７５８である〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
〔13〕被検体のコレシストキニン−２受容体に対する拮抗作用を測定することを特徴とする掻痒性皮膚疾患予防又は治療薬のスクリーニング方法。
〔14〕被検体のコレシストキニン−２受容体に対する拮抗作用の測定が、コレシストキニン又はその部分ペプチド類及び被検体を投与した非ヒト動物の掻破行動を測定するものである〔１３〕記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、全く新しい機序による掻痒性皮膚疾患の予防又は治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】コレシストキニン８Ｓ投与後３時間の掻破行動の発作回数を示す。
【図２】コレシストキニン８Ｓ投与後３時間までの掻破行動のタイムコースを示す。
【図３】コレシストキニン８Ｓ投与後のアロネーシススコアのタイムコースを示す。
【図４】コレシストキニン８Ｓ（０．５ｎｍｏｌ）投与後のアロネーシススコアに対するＣＣＫ１Ｒアンタゴニスト及びＣＣＫ２Ｒアンタゴニストの作用を示す。
【図５】コレシストキニン８Ｓ（１．０ｎｍｏｌ）投与後のアロネーシススコアに対するＣＣＫ１Ｒアンタゴニスト及びＣＣＫ２Ｒアンタゴニストの作用を示す。
【図６】ＣＣＫ２受容体拮抗剤の自発運動量に及ぼす作用を示す。
【図７】コレシストキニン誘発性アロネーシスに対するＣＣＫ２受容体拮抗剤経口投与の作用を示す。
【図８】ドライスキンモデルマウスの皮膚における経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）及びＳＣ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎの変動を示す。
【図９】ドライスキンモデルマウスにおける自発的掻破行動を示す。
【図１０】ドライスキンモデルマウスのアロネーシスに対するＣＣＫ２受容体拮抗剤経口投与の作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、コレシストキニン８Ｓ（ＣＣＫ８Ｓ）がかゆみの神経伝達物質であるとともにアロネーシスを誘発する神経ペプチドであることを見出し、さらにＣＣＫ−２受容体（ＣＣＫ−２Ｒ）拮抗剤が掻痒性皮膚疾患の予防又は治療薬として有用であることを見出したものである。
【００１２】
本発明の掻痒性皮膚疾患の予防又は治療薬の有効成分は、コレシストキニン−２受容体拮抗剤（ＣＣＫ−２Ｒアンタゴニスト）である。
【００１３】
コレシストキニンは、ガストリンファミリーに属するペプチドであり、ＣＣＫ−２受容体拮抗剤は、従来、胃運動亢進作用を有すること、及び痛覚消失作用又は痛覚消失増強作用を有することは知られているが、かゆみに対する作用は全く知られていない。ＣＣＫ−２Ｒ拮抗剤としては、例えば次の既知化合物が挙げられる。
【００１４】
【化１】
2018151285.tif 000003
【００１５】
【化２】
2018151285.tif 000004
【００１６】
【化３】
2018151285.tif 000005
【００１７】
【化４】
2018151285.tif 000006
【００１８】
（Ｒ）−（−）−３−［３−（１−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルメチル−２−オキソ−５−シクロヘキシル−１，３，４，５−テトラヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジアゼピン−３−イル）ウレイド］安息香酸またはその薬学的に許容される塩（Ｚ−３６０）
【００１９】
ＣＣＫ−２受容体拮抗剤は、後記実施例に示すように、コレシストキニンの部分ペプチドであるコレシストキニン８Ｓにより生じるアロネーシスを抑制し、ヒトを含む哺乳動物における掻痒性皮膚疾患の予防又は治療薬として有用である。アロネーシスとは、本来かゆみをもたらさない刺激によりかゆみを生じることをいう。掻痒性皮膚疾患としては、掻痒を伴なうアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎などのアレルギー性皮膚炎、乾癬、乾皮症、ドライスキン等が挙げられる。
また、これらのＣＣＫ−２受容体拮抗剤は、中枢作用を示さない投与量において、コレシストキニン８Ｓにより生じるアロネーシスを抑制することから、安全性も高い。
【００２０】
本発明の医薬は、ＣＣＫ−２受容体拮抗剤を有効成分として含有する各種の剤形の医薬組成物とすることができる。当該剤形としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤、カプセル剤、液剤等の経口投与用製剤、静脈投与用製剤等の注射剤、経皮投与用製剤、経直腸投与用製剤等が挙げられるが、経口投与用製剤が特に好ましい。
【００２１】
これらの医薬組成物の形態とするには、薬学的に許容される担体とともに製剤化することができる。そのような担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、グリシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン又はその塩と混合して使用される。
【００２２】
さらに、本発明の医薬組成物中における本発明の有効成分の含有量は、製剤の形によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して０．０１〜１００質量％、好ましくは１〜１００質量％である。
【００２３】
本発明の医薬の投与量は、投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、ＣＣＫ−２受容体拮抗剤として、成人に対して１日あたり１０〜２０００ｍｇであるのが好ましい。またこの投与量は１日に１〜４回に分けて投与することもできる。
【００２４】
本発明の掻痒性皮膚疾患予防又は治療薬のスクリーニング方法は、被検体のＣＣＫ−２受容体に対する拮抗作用を測定することにより実施できる。ＣＣＫ−２受容体拮抗作用は、ＣＣＫ−２受容体を有する細胞又は組織を用いて、ＣＣＫ又はその部分ペプチド類と被検体との拮抗作用を測定することにより検討することができる。また、掻痒作用を直接評価するには、コレシストキニン又はその部分ペプチド類及び被検体を投与した非ヒト動物の掻破行動を測定することによって行うこともできる。また、ドライスキンモデル動物の掻破行動を測定することによっても行うことができる。
【００２５】
より具体的には、マウスやラット等の非ヒト動物にコレシストキニン又はその部分ペプチド類を投与して誘発されるアロネーシスを、被検体を投与した場合に抑制するか否かを検討すればよい。コレシストキニンの部分ペプチド類としては、コレシストキニン８、コレシストキニン８Ｓ（コレシストキニン８の硫酸付加物）等が挙げられる。コレシストキニンや被検体の投与は、髄腔内投与が好ましい。また、掻破行動の観察は、以前報告された方法に従い、マウスをケージに置き、観察室に実験者がいない状態で１８０分間ビデオに掻破行動を記録、各ビデオを再生することによって掻破行動の発作の数を計測することにより行うのが好ましい（Kuraishi Y, Nagasawa T, Hayashi K, Satoh M. Scratching behavior induced by pruritogenic but not algesiogenic agents in mice. 1995, 275(3):229-33）。計測の際に、後脚を上げ、掻破し、下す一連の行動を１回の掻破行動の発作として定義する。グルーミング（毛づくろい）、舐める、噛むなどの動きは掻破行動とはみなさい。アロネーシスの観察は、以前報告された方法に従い、無作為に選んだ５つの部位にｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（０．１６ｇ）を用いて１０秒ごとに５回の機械刺激を与え、次の刺激をマウスに与える前に、各刺激について掻破行動の有無を観察することにより行うのが好ましい（Akiyama T, Carstens MI, Ikoma A, Cevikbas F, Steinhoff M, E. Carstens. Mouse model of touch-evoked itch (alloknesis). J Invest Dermatol.2012, 132(7): 1886-1891、Bourane S, Duan B, Koch SC, Dalet A, Britz O, Garcia-Campmany L, Kim E, Cheng L, Ghosh A, Ma Q, Goulding M. Gate control of mechanicalitch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 2015 Oct 30;350(6260):550-4）。１回の機械刺激によって掻破行動が認められたら場合、アロネーシススコアを１点とし、５回分の機械刺激による掻破行動の有無を合計した点数で評価する。抑制作用の評価は、コレシストキニン等のみを投与した場合に比べて、コレシストキニン等と被検体を投与した場合に掻破行動及びアロネーシススコアが低下しているか否かを評価すればよい。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。【００２７】
実施例１
アトピー性皮膚炎未発症のＮＣ／Ｎｇａマウスとアトピー性皮膚炎発症のＮＣ／Ｎｇａマウスの後根神経節（ＤＲＧ）を用いて、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。すなわち、ＤＲＧからのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行い、抽出後、ＲＮＡの吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００を用いて測定した。抽出したＲＮＡの品質はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩを使用して確認した。次に、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ｃＤＮＡ合成、ｃＲＮＡのラベルと増幅を行った。ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用しラベル化ｃＲＮＡを精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩを使用してラベル化ｃＲＮＡの品質を確認した。次に、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてハイブリダイゼーションを行い、スライドガラスをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄した。その後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスライドガラスをスキャンした。次に、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  １２．０．３．１ソフトを用いて各スポットの数値化、ノーマライズを行い、ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅの解析を行った。
アトピー性皮膚炎発症ＮＣ／ＮｇａのＤＲＧにおいて、アトピー性未発症ＮＣ／ＮｇａのＤＲＧに比べて２倍以上発現が上昇していた遺伝子（ｍＲＮＡ）を表１に示す。【００２８】
【表１】
2018151285.tif 000007
【００２９】
表１から、コレシストキニン遺伝子（ｍＲＮＡ）は、アトピー性皮膚炎発症ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて有意に増加していた。【００３０】
実施例２
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの髄腔内にコレシストキニン８Ｓ（ＣＣＫ８硫酸付加物）０．５ｎｍｏｌを注射し、掻破行動を観察した。掻破行動は、以前報告された方法に従い、下記のように観察・測定した（Kuraishi Y, Nagasawa T, Hayashi K, Satoh M. Scratching behavior induced by pruritogenic but not algesiogenic agents in mice. 1995, 275(3):229-33）。各マウスの吻側背部の毛を電気シェーバーで剃毛した。マウスを個々に４つの部屋（１３×９×３５ｃｍ）からなるアクリル製ケージに入れた。ケージの上部に三脚を用いてビデオカメラ（ＨＣ−Ｗ８５０Ｍ；Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を配置し、掻破行動を録画した。マウスは撮影前に、少なくとも１時間、馴化させ、その後セボフルラン（Ｍａｒｕｉｓｈｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，大阪、日本）麻酔下で、生理食塩水（溶媒）、０．５ｎｍｏｌ  ＣＣＫ８Ｓを髄腔内投与した。髄腔内注射の直後に、マウスをケージに置き、観察室に実験者がいない状態で３時間ビデオカメラにて掻破行動を記録した。各ビデオを再生することによって掻破行動の発作の数を計測した。
３時間の掻破行動の発作回数を図１に、掻破行動のタイムコースを図２に示す。
図１及び図２より、ＣＣＫ８Ｓの髄腔内投与により、マウスの掻破行動が有意に増加し、コレシストキニンが掻痒の神経伝達物質である可能性が示唆された。【００３１】
実施例３
アロネーシスアッセイは以前の報告された文献に基づき行った（Akiyama T, Carstens MI, Ikoma A, Cevikbas F, Steinhoff M, E. Carstens. Mouse model of touch-evoked itch (alloknesis). J Invest Dermatol. 2012, 132(7): 1886-1891、Bourane S, Duan B,Koch SC, Dalet A, Britz O, Garcia-Campmany L, Kim E, Cheng L, Ghosh A, Ma Q, Goulding M. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.  Science. 2015 Oct 30;350(6260):550-4.）。すなわち、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  フィラメントを用いて軽微な機械的刺激をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚に与え、刺激直後に掻破行動が生じるか否かを解析するアローネシスアッセイを行った。アロネーシスアッセイを実施する３日前にマウスの吻側背部を剃毛した。各マウスの髄腔内に生理食塩水５μＬを溶媒とした０．５または１．０ｎｍｏｌのＣＣＫ８Ｓを溶解した溶液を投与し、髄腔内投与５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分後にアロネーシスアッセイを行った。無作為に選んだ５つの部位でｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（０．１６ｇ）を用いてマウスに１０秒間隔で５回のＶｏｎ  Ｆｒｅｙ刺激を与え、そのうちマウスが刺激した場所を掻破した回数をスコア化し、評価した。０．５ｎｍｏｌ又は１．０ｎｍｏｌＣＣＫ８Ｓはを髄腔内投与し、アロネーシスアッセイを行った結果を図３に示す。
図３より、ＣＣＫ８Ｓの髄腔内投与により、投与後の時間経過及び投与量依存的にアロネーシスを誘発した。【００３２】
実施例４
実施例３のアロネーシスアッセイにおいて、ＣＣＫ８Ｓとともに、ＣＣＫ−１Ｒ拮抗剤であるＳＲ２７８９７（１ｎｍｏｌ）又はＣＣＫ−２Ｒ拮抗剤であるＬ−３６５２６０（１ｎｍｏｌ）を髄腔内投与し、マウスの掻破行動を測定した。
その結果、図４及び図５に示すように、ＣＣＫ−１Ｒ拮抗剤ではＣＣＫ８Ｓ誘発性アロネーシスが抑制されなかったが、ＣＣＫ−２Ｒ拮抗剤投与によりＣＣＫ８Ｓ誘発性アロネーシスが有意に抑制された。【００３３】
実施例５
ＣＣＫ−２受容体拮抗剤として知られているＬ−３６５２６０、ＰＤ１３５１５８及びＬＹ−２８８５１３を使用してアロネーシス抑制作用を検討した。
（１）投与量の決定
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、６−８週齢）を１時間撮影ケージで馴化した。中枢移行性があることが知られているＣＣＫ−２受容体拮抗剤（Ｌ−３６５２６０、ＰＤ１３５１５８、ＬＹ−２８８５１３）を経口投与した。ＳＣＬＡＢＡ−Ｒｅａｌシステムを用いて、２．５時間、自発運動量を測定した。【００３４】
群構成は、以下の通りとした。
群構成（１）
１．溶媒(0.5% メチルセルロース)                    投与群(N=9)
２．10mg/kg p.o. L-365260(ベンゾジアゼピン誘導体)  投与群(N=5)
３．10mg/kg p.o. PD135158(ペプチド誘導体)          投与群(N=6)
４．10mg/kg p.o. LY-288513(ピラゾリジン誘導体)     投与群(N=9)
群構成（２）
１．溶媒(0.5%メチルセルロース)                       投与群(N=9)
２．20mg/kg p.o. L-365260(ベンゾジアゼピン誘導体)    投与群(N=4)
３．20mg/kg p.o. PD135158(ペプチド誘導体)            投与群(N=4)
４．20mg/kg p.o. LY-288513(ピラゾリジン誘導体)       投与群(N=8)【００３５】
その結果、図６に示すように、Ｌ−３６５２６０は１０ｍｇ／ｋｇ投与で、ＰＤ１３５１５８は１０ｍｇ／ｋｇ投与で、またＬＹ−２８８５１３は２０ｍｇ／ｋｇ投与で、自発運動量に影響しないことが判明した。【００３６】
（２）ＣＣＫ２受容体拮抗剤のコレシストキニン８Ｓ誘発性アロネーシスに対する作用
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、６−８週齢）を１時間アッセイ用のケージで馴化した。前記のＣＣＫ２受容体拮抗剤を経口投与した。
ＣＣＫ２Ｒ受容体拮抗剤の経口投与３０分後に、髄腔内にＣＣＫ８Ｓ（１ｎｍｏＬ／５μＬ）を投与した。ＣＣＫ８Ｓ投与後５，３０，６０，９０，１２０分で、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（０．１６ｇ）を用いてアロネーシスアッセイを行った。【００３７】
群構成を以下に示す。
１．Veh(p.o. 0.5% メチルセルロース)→ i.t. saline          (N=9)
２．Veh(p.o. 0.5% メチルセルロース)→ i.t. CCK8S (1 nmoL)  (N=9)
３．10mg/kg p.o. L-365260→i.t. CCK8S (1 nmoL)             (N=9)
４．10mg/kg p.o. PD135158→i.t. CCK8S(1 nmoL)              (N=8)
５．20mg/kg p.o. LY-288513→i.t. CCK8S(1 nmoL)             (N=7)【００３８】
その結果、図７に示すように、Ｌ−３６５２６０、ＰＤ１３５１５８及びＣＹ−２８８５１３は、いずれも自発運動量に影響を及ぼさない投与量でコレシストキニン８Ｓ誘発性アロネーシスを抑制した。【００３９】
実施例６
（方法）
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（１０週齢、雄）の背部を剃毛し（少なくとも実験開始３日前）、ＡＥＷ処置（７日間、朝・夕・２回）を行い、ドライスキンモデルマウスを作製した。
ＡＥＷ処置は、アセトン（Ａ）とジエチルエーテル（Ｅ）を１：１で混ぜたＡＥ溶液をコットンに染み込ませ、剃毛部に１５秒間塗布した。次に滅菌水をコットンに染み込ませ、３０秒間塗布した（ＡＥＷ群）。コントロール群には、滅菌水で４５秒間塗布した（Ｗ群）。
最後のＡＥＷ処理から１６〜２０時間後にスクラバを用いて２時間（内、１時間は馴化のため）、掻破行動を録画した。スクラバ解析後、下記の行動試験を開始した。
１時間ケージで馴化中に、ＡＥＷドライスキンモデルマウスにＣＣＫ２Ｒ拮抗薬（Ｌ−３６５２６０）をアロネーシスアッセイ開始３０分前に経口投与した。
アロネーシスアッセイは、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ０．１６ｇを用いて行った。計６回、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔで刺激した。
アロネーシスアッセイ後、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）及びＳＣ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎの測定し、試験を終了した。
群構成
１．Ｗ処理マウス  ＋  溶媒（０．５％メチルセルロース）（ｎ＝８）
２．ＡＥＷ処理マウス  ＋  溶媒（０．５％メチルセルロース）（ｎ＝８）
３．ＡＥＷ処理マウス  ＋  １ｍｇ／ｋｇ  Ｌ−３６５２６０（ｎ＝８）
４．ＡＥＷ処理マウス  ＋  １０ｍｇ／ｋｇ  Ｌ−３６５２６０（ｎ＝８）【００４０】
（結果）
図８に、ＡＥＷドライスキンモデルマウスの皮膚におけるＴＥＷＬ及びＳＣ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎの変動を示す。Ｗ処理コントロールマウスと比較して、ＡＥＷ処理マウスにおいて経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ値）の増加と角層水分保持量（ＳＣ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）の低下が認められた。このことから、本実験で用いたＡＥＷマウスにおけるドライスキンが誘発されたことを確認した。
図９に、ＡＥＷドライスキンモデルマウスにおける自発的掻破行動を示す。ＡＥＷ反復処理により、ドライスキンに伴う自発的掻破行動が観察された。
図１０に、ＡＥＷドライスキンモデルマウスのアロネーシスに対するＣＣＫ２受容体拮抗薬の作用を示す。図１０から、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ  Ｌ−３６５２６０の経口投与は、ＡＥＷドライスキンマウスのアロネーシスを有意に抑制した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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