(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ前駆体に由来するプロテアーゼ変異体であって、該プロテアーゼ前駆体に対して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置１０３、１０４、１５９および２４５に対応する残基位置でのアミノ酸置換を含み、さらにＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置１、３、４、８、１０、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、３３、３７、３８、４２、４３、４８、５５、５７、５８、６１、６２、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８６、８７、８９、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０６、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２６、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３７、１４０、１４１、１４２、１４６、１４７、１５８、１６０、１６６、１６７、１７０、１７３、１７４、１７７、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８８、１９２、１９４、１９８、２０３、２０４、２０５、２０６、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２２、２２４、２２７、２２８、２３０、２３２、２３７、２３８、２４０、２４２、２４３、２４４、２４６、２４７、２４８、２４９、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４および２７５に対応する残基位置から選択される１以上の残基位置でのアミノ酸置換を含み；前記残基位置１０３でのアミノ酸置換がＳ１０３Ａであり、前記残基位置１０４でのアミノ酸置換がＶ１０４Ｉであり、前記残基位置１５９でのアミノ酸置換がＧ１５９Ｄであり、かつ前記残基位置２４５でのアミノ酸置換がＱ２４５Ｒ、Ｑ２４５ＬまたはＱ２４５Ｖであり、プロテアーゼ前駆体と比較して高められた洗浄能力を有することを特徴とするプロテアーゼ変異体。
【請求項２】
位置２３６に対応する残基位置でのアミノ酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換がＱ２３６Ｈであることを特徴とする請求項１記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項３】
位置１、９、１２、６１、６２、６８、７６、９７、９８、１０１、１０２、１０９、１３０、１３１、１７０、１８３、１８５、２０５、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１５、２１７、２２２、２３０、２３２、２４８、２５２、２５７、２６０、２６１、２７０および２７５のうちの１以上でのアミノ酸残基の置換を含む請求項１記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項４】
位置１、９、１２、６１、６２、６８、７６、９７、９８、１０１、１０２、１０９、１３０、１３１、１８３、１８５、２０５、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１５、２１７、２３０、２３２、２４３、２４８、２５２、２５７、２６０、２７０および２７５のうちの１以上でのアミノ酸残基の置換を含む請求項２記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  スブチリシンに由来する請求項１から４いずれか１項記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  スブチリシンに由来する請求項５記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項７】
請求項１から６いずれか１項記載のプロテアーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載のＤＮＡをコードする発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から６いずれか１項記載のプロテアーゼ変異体を含む清浄組成物。
【請求項１１】
請求項１から６いずれか１項記載のプロテアーゼ変異体を含む動物飼料。
【請求項１２】
請求項１から６いずれか１項記載のプロテアーゼ変異体を含むテキスタイルを処理するための組成物。
【請求項１３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの下記の残基位置の組より成る群から選択される残基位置の組に対応する残基位置でのアミノ酸置換を含む請求項１記載のプロテアーゼ変異体：
68/103/104/159/232/236/245/252;
68/103/104/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/232/236/245;
68/103/104/140/159/232/236/245/252;
43/68/103/104/159/232/236/245/252;
43/68/103/104/159/232/236/245;
68/103/104/159/232/236/245/257;
68/103/104/159/232/236/245/248;
68/103/104/159/232/236/237/245;
68/103/104/159/232/236/245/252;
68/103/104/159/232/236/245/257/275;
68/103/104/159/224/232/236/245/257;
61/68/103/104/159/232/236/245/248/252;
43/68/103/104/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
68/76/103/104/159/236/245;
68/76/103/104/159/236/245/261;
68/76/103/104/141/159/236/245/255;
68/76/103/104/159/236/245/247;
68/76/103/104/159/174/204/236/245;
68/76/103/104/159/204/236/245;
68/76/103/104/133/159/218/236/245;
68/76/103/104/159/232/236/245;
68/76/103/104/159/194/203/236/245;
68/76/103/104/159/213/232/236/245/260;
68/76/103/104/159/232/236/245/257;
76/103/104/159/232/236/245/257;
68/76/103/104/159/209/232/236/245;
68/76/103/104/159/211/232/236/245;
68/76/103/104/159/211/232/236/245;
12/68/76/103/104/159/214/232/236/245;
68/76/103/104/159/215/232/236/245;
12/68/76/103/104/159/232/236/245;
20/68/76/103/104/159/232/236/245/259;
68/76/87/103/104/159/232/236/245/260;
68/76/103/104/159/232/236/245/261;
68/76/103/104/159/232/236/245/261;
68/76/103/104/159/210/232/236/245;
12/48/68/76/103/104/159/232/236/245;
76/103/104/159/192/232/236/245;
76/103/104/147/159/232/236/245/248/251;
12/68/76/103/104/159/232/236/245/272;
68/76/103/104/159/183/206/232/236/245;
68/76/103/104/159/232/236/245/256;
68/76/103/104/159/206/232/236/245;
27/68/76/103/104/159/232/236/245;
68/76/103/104/116/159/170/185/232/236/245;
103/104/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/209/232/236/245/248/252;
68/103/104/109/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/209/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/185/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/210/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/185/210/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/210/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
68/A103V/104/159/213/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/215/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/215/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/216/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/216/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/216/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/173/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/206/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/232/236/245/248/252;
55/68/103/104/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/232/236/245/248/252/255;
68/103/104/159/232/236/245/248/252/256;
68/103/104/159/232/236/245/248/252/256;
68/103/104/159/232/236/245/248/252/260;
68/103/104/159/232/236/245/248/252/257;
68/103/104/159/232/236/245/248/252/258;
68/103/104/159/232/236/245/248/252/261;
68/103/104/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/228/232/236/245/248/252;
61/68/103/104/130/159/232/236/245/248/252;
61/103/104/133/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/232/236/245/248/252;
68/103/104/159/218/232/236/245/248/252;
20/68/103/104/159/232/236/245/248/252;
68/76/89/103/104/159/210/213/232/236/245/260;
68/76/103/104/159/232/236/245/248/252;
61/68/103/104/159/160/232/236/245/248/252;
61/68/103/104/159/167/232/236/245/248/252;
97/103/104/159/232/236/245/248/252;
98/103/104/159/232/236/245/248/252;
99/103/104/159/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/232/236/245/248/252;
102/103/104/159/232/236/245/248/252;
103/104/106/159/232/236/245/248/252;
103/104/109/159/232/236/245/248/252;
103/104/159/232/236/245/248/252/261;
103/104/109/159/232/236/245/248/252;
62/103/104/159/232/236/245/248/252;
103/104/159/184/232/236/245/248/252;
103/104/159/166/232/236/245/248/252;
103/104/159/217/232/236/245/248/252;
20/62/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
62/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
103/104/159/206/217/232/236/245/248/252;
62/103/104/159/206/232/236/245/248/252;
103/104/159/184/232/236/245/248/252;
103/104/159/232/236/244/245/248/252;
103/104/159/232/236/244/245/248/252;
27/103/104/159/232/236/245/248/252;
38/103/104/159/232/236/245/248/252;
62/103/104/159/213/232/236/245/248/252/256;
12/62/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
62/103/104/159/185/206/213/232/236/245/248/252/271;
101/103/104/159/185/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/206/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
98/102/103/104/159/232/236/245/248/252;
101/102/103/104/159/232/236/245/248/252;
102/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
12/102/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
98/102/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
101/102/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
102/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
62/103/104/109/159/213/232/236/245/248/252;
103/104/159/232/245/248/252;
103/104/159/230/245;
62/103/104/13G/159/213/232/236/245/248/252;
101/103/104/13G/159/232/236/245/248/252;
101/103/104/128/159/232/236/245/248/252;
101/103/104/128/159/232/236/245/248/252;
62/101/103/104/159/213/232/236/245/248/252;
62/103/104/128/159/213/232/236/245/248/252;
101/103/104/131/159/232/236/245/248/252;
98/101/103/104/159/232/236/245/248/252;
99/101/103/104/159/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/212/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/209/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/210/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/205/232/236/245/248/252;
101/103/104/159/230/236/245;
101/103/104/159/194/232/236/245/248/252; および
76/101/103/104/159/194/232/236/245/248/252。
【請求項１４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの下記のアミノ酸置換の組より成る群から選択されるアミノ酸置換の組に対応するアミノ酸置換を含む請求項１３記載のプロテアーゼ変異体：
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/A114V/V121I/G159D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245L;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R/N261D;
V68A/N76D/S103A/V104I/S141N/G159D/Q236H/Q245R/T255S;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R/R247H;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A174V/N204D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/N204D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/A133V/G159D/N218D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A194I/V203A/Q236H/Q245R；
S103A/V104I/G159D/A230V/Q245R;および
S101G/S103A/V104I/G159D/A230V/Q236H/Q245R。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、ここに引用して本明細書に一体化させる１９９８年１０月２３日に出願された米国特許出願第０８／９５６，３２３号、１９９８年１０月２３日に出願された米国特許出願第０８／９５６，５６４号、および１９９８年１０月２３日に出願された米国特許出願第０８／９５６，３２４号の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の背景）
セリンプロテアーゼ類はカルボニルヒドロラーゼの亜群である。それらは広い範囲の特異性および生物学的機能を有する多様なクラスの酵素を含む。Ｓｔｒｏｕｄ．Ｒ．  Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．，  １３１：７４−８８。その機能的多様性にも拘わらず、セリンプロテアーゼの触媒装置は、少なくとも２つの酵素の遺伝的に区別されるファミリー；１）スブチリシンおよび２）哺乳動物キモトリプシン−関連および相同細菌セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよびＳ．  ｇｒｅｓｉｕｓ  トリプシン）によってアプローチされてきた。セリンプロテアーゼのこれらの２つのファミリーは、触媒の顕著に似たメカニズムを示す。Ｋｒａｕｔ，  Ｊ．  （１９７７），  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４６：３３１−３５８。さらに、一次構造は関連しないが、これらの２つの酵素ファミリーの三次構造は、セリン、ヒスチジンおよびアスパルテートよりなるアミノ酸の保存された触媒トリアドを一緒にする。
【０００３】
スブチリシンは、かなり種々のＢａｃｉｌｌｕｓ種および他の微生物から大量に分泌されるセリンプロテアーゼ（ほぼＭＷ２７，５００）である。スブチリシンの蛋白質配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓの少なくとも９つの異なる種から決定されてきた。Ｍａｒｋｌａｎｄ，  Ｆ．Ｓ．ら  （１９８３），Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３６４：１５３７−１５４０。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢ．  ｌｅｎｔｕｓのいくつかの天然変異体からのスブチリシンの三次元結晶学構造が報告されている。これらの研究は、スブチリシンは哺乳動物セリンプロテアーゼと遺伝的には無関係であるが、それは同様の活性部位構造を有する。スブチリシンを含有する共有結合したペプチド阻害剤（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ，  Ｊ．Ｄ．ら  （１９７２），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１：２４３９−２４４９）または生産された複合体（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ，  Ｊ．  Ｄ．ら，  （１９７６），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５１：１０９７−１１０３）のＸ−線結晶構造は、スブチリシンの活性部位および推定基質結合裂け目に関する情報を提供してきた。加えて、非常に多数の速度論および化学的修飾研究がスブチリシンにつき報告されており；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，  Ｂ．  （１９７６），  Ｃａｒｉｓｂｅｒａ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ４１：２３７−２９１；  Ｍａｒｋｌａｎｄ，  Ｆ．Ｓ．、前掲）、ならびに、スブチリシンの残基２２２におけるメチオニンの側鎖が過酸化水素によってメチオニンスルホキシドに変換され（Ｓｔａｕｆｆｅｒ，  Ｄ．Ｃ．ら  （１９６５），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４４：５３３３−５３３８）、広範な部位−特異的突然変異誘発が行われた（ＷｅｌｌｓおよびＥｓｔｅｌｌ  （１９８８）  ＴＩＢＳ  １３：２９１−２９７）という少なくとも１つの報告がある。
【０００４】
（発明の概要）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置１０３に対応する残基位置においてアミノ酸を置き換え、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置１、３、４、８、１０、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、３３、３７、３８、４２、４３、４８、５５、５７、５８、６１、６２、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８６、８７、８９、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２６、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３７、１４０、１４１、１４２、１４６、１４７、１５８、１５９、１６０、１６６、１６７、１７０、１７３、１７４、１７７、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８８、１９２、１９４、１９８、２０３、２０４、２０５、２０６、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２２、２２４、２２７、２２８、２３０、２３２、２３６、２３７、２３８、２４０、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４および２７５に対応する残基位置よりなる群から選択される残基において１以上のアミノ酸を置き換えることを含み；ここに、残基位置１０３に対応する位置における置換が残基位置７６に対応する位置における置換と組み合わされる場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置２７、９９、１０１、１０４、１０７、１０９、１２３、１２８、１６６、２０４、２０６、２１０、２１６、２１７、２１８、２２２、２６０、２６５または２７４に対応する残基位置以外の１以上の残基位置における置換もあることを特徴とするプロテアーゼ変異体を提供するのがここに目的である。
【０００５】
前記リストのアミノ酸置換のいずれの組合せを用いることもできるが、本発明の好ましいプロテアーゼ変異体酵素は以下の組合せにおけるアミノ酸残基の置換を含む。残基位置の全てはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置に対応する：
（１）位置１０３におけるおよび以下の位置２３６および２４５のうちの１以上におけるアミノ酸残基の置換を含むプロテアーゼ変異体；
（２）位置１０３および２３６におけるおよび以下の位置１、９、１２、６１、６２、６８、７６、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０９、１３０、１３１、１５９、１８３、１８５、２０５、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１５、２１７、２３０、２３２、２４８、２５２、２５７、２６０、２７０および２７５のうちの１以上におけるアミノ酸残基の置換を含むプロテアーゼ変異体；
（３）位置１０３および２４５におけるおよび以下の位置１、９、１２、６１、６２、６８、７６、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０９、１３０、１３１、１５９、１７０、１８３、１８５、２０５、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１５、２１７、２２２、２３０、２３２、２４８、２５２、２５７、２６０、２６１、２７０および２７５のうちの１以上におけるアミノ酸残基の置換を含むプロテアーゼ変異体；
（４）位置１０３、２３６および２４５におけるおよび以下の位置１、９、１２、６１、６２、６８、７６、９７、９８、１０１、１０２、１０４、１０９、１３０、１３１、１５９、１８３、１８５、２０５、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１５、２１７、２３０、２３２、２４３、２４８、２５２、２５７、２６０、２７０および２７５のうちの１以上におけるアミノ酸残基の置換を含むプロテアーゼ変異体。
【０００６】
より好ましいプロテアーゼ変異体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの表１における位置に対応する残位置よりなる群から選択される置換組である：
【表１】
0004511025.tif 000002
【表２】
0004511025.tif 000003
【表３】
0004511025.tif 000004
【表４】
0004511025.tif 000005
【表５】
0004511025.tif 000006
【表６】
0004511025.tif 000007
【表７】
0004511025.tif 000008
【表８】
0004511025.tif 000009
【表９】
0004511025.tif 000010
【表１０】
0004511025.tif 000011
【表１１】
0004511025.tif 000012
【表１２】
0004511025.tif 000013
【表１３】
0004511025.tif 000014
【表１４】
0004511025.tif 000015
【表１５】
0004511025.tif 000016
【表１６】
0004511025.tif 000017
【表１７】
0004511025.tif 000018
【表１８】
0004511025.tif 000019
最も好ましいプロテアーゼ変異体は表３に示すものである。
【０００７】
かかるプロテアーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列、ならびにかかる変異体ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを提供するのがさらなる目的である。
【０００８】
かかるベクターで形質転換した宿主細胞、ならびにかかるＤＮＡを発現してプロテアーゼ変異体を細胞内または細胞外で生産できる宿主細胞を提供するのがなおさらなる本発明のもう１つの目的である。
【０００９】
さらに、本発明のプロテアーゼ変異体を含む清浄組成物が提供される。
【００１０】
加えて、本発明のプロテアーゼ変異体を含む動物飼料が提供される。
【００１１】
また、本発明のプロテアーゼ変異体を含むテキスタイルの処理用の組成物が提供される。
【００１２】
（図面の説明）
図１−４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにこの遺伝子の部分的制限地図を示す。
【００１３】
図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  （ＢＰＮ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ（野生型）からのスブチリシンの間での保存されたアミノ酸残基を示す。
【００１４】
図６および７は、４つのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。頂部の線はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシン（時々はスブチリシンＢＰＮともいう）からのスブチリシンのアミノ酸配列を表す。第２の線はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。第３の線はＢ．  ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓからのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。第４の線はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓからのスブチリシン（ＰＣＴ  ＷＯ８９／０６２７６ではスブチリシン３０９ともいう）のアミノ酸配列を示す。記号＊はスブチリシンＢＰＮと比較した特異的アミノ酸残基の不存在を示す。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
プロテアーゼは、一般的には、蛋白質またはペプチドのペプチド結合を切断するように作用するカルボニルヒドロラーゼである。本明細書で用いるごとく、「プロテアーゼ」は、天然に生じるプロテアーゼまたは組換えプロテアーゼを意味する。天然に生じるプロテアーゼはα−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼを含む。セリン、メタロ、チオールおよび酸性プロテアーゼ、ならびにエンドおよびエキソ−プロテアーゼが含まれる。
【００１６】
本発明は、変異体のアミノ酸配列がそれに由来する前駆体カルボニルヒドロラーゼと比較して、異なる蛋白質分解活性、安定性、基質特異性、ｐＨプロフィールおよび／または効率特徴を有する天然に生じるカルボニルヒドロラーゼ変異体（プロテアーゼ変異体）であるプロテアーゼ酵素を含む。具体的には、かかるプロテアーゼ変異体は、前駆体プロテアーゼの複数のアミノ酸残基の異なるアミノ酸での置換によって由来する、天然では見いだされないアミノ酸配列を有する。前駆体プロテアーゼは天然に生じるプロテアーゼまたは組換えプロテアーゼであり得る。
【００１７】
ここに有用なプロテアーゼ変異体は、指名されたアミノ酸残基位置における１９の天然に生じるＬ−アミノ酸のいずれかの置換を含む。かかる置換はいずれかの前駆体スブチリシン（原核生物、真核生物、哺乳動物等）でなすことができる。本出願を通じて、共通の１文字−および３文字暗号によって種々のアミノ酸を引用する。かかる暗号はＤａｌｅ，  Ｍ．Ｗ．  （１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｌｔｄ．，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｂで確認される。
【００１８】
ここに有用なプロテアーゼ変異体は、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  スブチリシンに由来する。より好ましくは、プロテアーゼ変異体はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  スブチリシンおよび／またはスブチリシン３０９に由来する。
【００１９】
スブチリシンは、一般的には、蛋白質またはペプチドのペプチド結合を切断するように作用する細菌または菌類プロテアーゼである。本明細書で用いるごとく、「スブチリシン」は天然に生じるスブチリシンまたは組換えスブチリシンを意味する。一連の天然に生じるスブチリシンは種々の微生物種によって生産され、しばしば分泌されることが知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列は全く相同というのではない。しかしながら、このシリーズのスブチリシンは、同一または類似のタイプの蛋白質分解活性を呈する。このクラスのセリンプロテアーゼは、それらをキモトリプシン関連クラスのセリンプロテアーゼから区別する触媒トリアドを規定する共通のアミノ酸配列を保有する。スブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼは、共に、アスパルテート、ヒトチジンおよびセリンを含む触媒トリアドを共に有する。スブチリシン関連プロテアーゼにおいて、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて読んだこれらのアミノ酸の相対的順序は、アスパルテート−ヒスチジン−セリンである。キモトリプシン関連プロテアーゼにおいて、しかしながら、相対的順序はヒスチジン−アスパルテート−セリンである。かくして、ここにスブチリシンは、スブチリシン関連プロテアーゼの触媒トリアドを有するセリンプロテアーゼをいう。その例は限定されるものではないが図６−７で確認されるスブチリシンを含む。一般的には、かつ本発明の目的では、プロテアーゼにおけるアミノ酸のナンバリングは、図１−４に提示された成熟Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシン配列に帰属される番号に対応する。
【００２０】
「組換えスブチリシン」または「組換えプロテアーゼ」とは、スブチリシンまたはプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が修飾されて、天然に生じるアミノ酸配列における１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入をコードする変異体（または突然変異体）ＤＮＡ配列を生じるスブチリシンまたはプロテアーゼをいう。かかる修飾を生じる、本明細書に開示されているものと組み合わせることができる適当な方法は米国特許ＲＥ３４，６０６号、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号、米国特許第５，７００，６７６号、米国特許第５，８０１，０３８号および米国特許第５，７６３，２５７号に開示されているものを含む。
【００２１】
「非ヒトスブチリシン」およびそれらをコードするＤＮＡは、多くの原核生物および真核生物から得ることができる。原核生物の適当な例は、Ｅ．  ｃｏｌｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのごときグラム陰性生物およびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓのごときグラム陽性細菌を含む。スブチリシンおよびそれらの遺伝子がそれから得ることができる真核生物の例はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのごとき酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．のごとき菌類を含む。
【００２２】
「プロテアーゼ変異体」は、「前駆体プロテアーゼ」のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。前駆体プロテアーゼは天然に生じるプロテアーゼおよび組換えプロテアーゼを含む。プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によって前駆体プロテアーゼアミノ酸配列に「由来」する。かかる修飾は、前駆体プロテアーゼ酵素それ自体の操作よりもむしろ前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列をコードする「前駆体ＤＮＡ配列」のものである。前駆体ＤＮＡ配列のかかる操作についての適当な方法は、ここに開示される方法、ならびに当業者に知られた方法を含む（例えば、ＥＰ  ０  ３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９および既に引用された米国特許および出願参照）。
【００２３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置１、３、４、８、１０、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、３３、３７、３８、４２、４３、４８、５５、５７、５８、６１、６２、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８６、８７、８９、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２６、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３７、１４０、１４１、１４２、１４６、１４７、１５８、１５９、１６０、１６６、１６７、１７０、１７３、１７４、１７７、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８８、１９２、１９４、１９８、２０３、２０４、２０５、２０６、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２２、２２４、２２７、２２８、２３０、２３２、２３６、２３７、２３８、２４０、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４および２７５に対応する１以上の置換と組み合わせた位置１０３に対応する特異的置換がここに確認される。
【００２４】
好ましい変異体は、表１中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置に対応する残基位置における置換の組合せを有するものである。
【００２５】
より好ましい変異体は、表３中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置に対応する残基位置における置換の組合せを有するものである。
【００２６】
より好ましい変異体は、表２中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの位置に対応する残基位置における置換の組合せを有するものである。
【００２７】
【表１９】
0004511025.tif 000020
【表２０】
0004511025.tif 000021
【表２１】
0004511025.tif 000022
これらのアミノ酸位置番号は、図１−４に呈された成熟Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシン配列に帰属されるものをいう。しかしながら、本発明は、この特定のスブチリシンの突然変異に限定されず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンにおける特定の同定される残基と「同等である」位置におけるアミノ酸残基を含有する前駆体プロテアーゼまでに拡大される。本発明の好ましい具体例において、前駆体プロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓスブチリシンであり、前記リストのものに対応するＢ．  Ｌｅｎｔｕｓにおける同等のアミノ酸残基位置で置換がなされる。
【００２８】
前駆体プロテアーゼの残基（アミノ酸）位置は、もし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンにおける特別の残基またはその残基の一部と相同（すなわち、一次または三次いずれかの構造における位置に対応する）または類似する（すなわち、化学的に組み合わせる、反応するまたは相互作用する同一または同様の機能的能力を有する）ならば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの残基と同等である。
【００２９】
一次構造に対する相同性を確立するには、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列をＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシン一次配列、特に配列が知られているスブチリシンにおいて不変であることが知られている残基の組と直接的に比較する。例えば、ここに図５は、Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンおよびＢ．  ｌｅｎｔｕｓスブチリシンの間で保存された残基を示す。保存された残基を整列させ、整列を維持するのに必要な挿入および欠失を可能とした後（すなわち、任意の欠失および挿入を通じて保存された残基の排除を回避し）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの一次配列における特定のアミノ酸と同等の残基が規定される。保存された残基の整列は、好ましくは、かかる残基の１００％を保存すべきである。しかしながら、保存された残基の７５％より大または５０％と少ない整列もまた同等の残基を規定するのに適当である。触媒トリアド、Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は維持されるべきである。Ｓｉｅｚｅｎら（１９９１）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ４（７）：７１９−７３７は、非常に多数のセリンプロテアーゼの整列を示す。Ｓｉｅｚｅｎらはスブチラーゼまたはスブチラーゼ−様セリンプロテアーゼとしてのグループ分けに言及する。
【００３０】
例えば、図６−７において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  （ｃａｒｉｓｂｅｒｇｅｎｉｓ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓからのスブチリシンのアミノ酸配列を整列させて、アミノ酸配列の間の相同性の最大量を提供する。これらの配列の比較は、各配列に含有される保存された多数の残基があることを示す。これらの保存された残基（ＢＰＮ’およびＢ．  ｌｅｎｔｕｓの間）は図５に確認される。
【００３１】
これらの保存された配列は、かくして、好ましいＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓスブチリシンと高度に相同である、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓからのスブチリシンのごとき他のスブチリシンにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシン  （１９８９年７月１３日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０６２７９）、ここに好ましいプロテアーゼ前駆体酵素、またはＰＢ９２というスブチリシン（ＥＰ  ０  ３２８  ２９９）の対応する同等のアミノ酸残基を規定するのに用いることができる。これらのスブチリシンのあるもののアミノ酸配列は、保存された残基の最大相同性を生じるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの配列と共に図６および７で整列される。分かるように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンと比較してＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓの配列には多数の欠失がある。かくして、例えば、他のスブチリシンにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンでのＶａｌ１６５についての同等のアミノ酸はＢ．  ｌｅｎｔｕｓおよびＢ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓについてのイソロイシンである。
【００３２】
「同等の残基」は、その三次構造がＸ−線結晶解析によって決定されている前駆体プロテアーゼについての三次構造のレベルでの相同性を決定することによっても定義することができる。同等の残渣は、前駆体プロテアーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの特定のアミノ酸残基の主要鎖原子の２以上の原子座標（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣおよびＯ上のＯ）が０．１３ｎｍ以内にあり、好ましくは、整列後に０．１ｎｍであるものと定義される。整列は、最良のモデルが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンに対して問題のプロテアーゼの非水素蛋白質原子の原子座標の最大重複を与えるように配位させ位置付けされた後に達成される。最良のモデルは、最高の利用可能な分解における実験的解析データについての最低のＲ因子を与える結晶モデルである。
【００３３】
Ｒ因子＝Σｈ｜Ｆｏ（ｈ）｜−｜Ｆｃ（ｈ）｜
Σｈ｜Ｆｏ（ｈ）｜
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの特異的残基に類似して機能的な同等の残基は、それらが、定義されたおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの特異的残基に帰属される方法で、蛋白質構造、基質結合または触媒作用を改変し、修飾しまたはそれに寄与するような立体配座を採り得る前駆体プロテアーゼのアミノ酸と定義される。さらに、それらは、所与の残基の主要鎖原子は相同位置を占めることを基礎とした同等の基準を満足できないが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子座標はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍ以内にある程度まで類似の位置を占める（それにつき三次構造がＸ−線結晶解析によって得られている）前駆体プロテアーゼの残基である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの三次元構造の座標はＥＰＯ公開番号０  ２５１  ４４６（米国特許第５，１８２，２０４号と同様、引用によりその開示を本明細書に一体化させる）に記載されており、前記で概説したように使用して、三次構造のレベルにつき同等の残基を決定することができる。
【００３４】
置換につき同定される残基のいくつかは保存された残基であり、他方、他のものはそうではない。保存されていない残基の場合は、１以上のアミノ酸の置換は、天然で見いだされるものに対応しないアミノ酸配列を有する変異体を生じる置換に限定される。保存された残基の場合には、かかる置換の結果、天然に生じる配列はもたらされないはずである。本発明のプロテアーゼ変異体は、プロテアーゼ変異体の成熟形ならびにかかるプロテアーゼ変異体のプロ−およびプレプロ−形態を含む。プレプロ−形態は好ましい構築である。というのは、これは、プロテアーゼ変異体の発現、分泌および成熟を容易とするからである。
【００３５】
「プロ配列」とは、除去される結果、プロテアーゼの「成熟」形態が出現するプロテアーゼの成熟形態のＮ−末端部分に結合したアミノ酸の配列をいう。多くの蛋白質分解酵素は、翻訳プレ酵素産物として天然で見いだされ、翻訳後プロセッシングの不存在下では、このようにして発現される。プロテアーゼ変異体を生産するための好ましいプロ配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの推定プロ配列であるが、他のプロテアーゼプロ配列も使用することができる。
【００３６】
「シグナル配列」または「プレ配列」は、プロテアーゼのＮ−末端部分にまたはプロテアーゼの成熟またはプロ形態の分泌に参画できるプロプロテアーゼのＮ−末端部分に結合したアミノ酸のいずれの配列もいう。シグナル配列のこの定義は機能的なものであり、天然条件下でプロテアーゼの分泌の実行に参画するプロテアーゼ遺伝子のＮ−末端部分によってコードされた全てのアミノ酸配列を含むことを意味する。本発明は、ここに定義されたプロテアーゼ変異体の分泌を実行するためにかかる配列を利用する。１つの可能なシグナル配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  （ＡＴＣＣ  ２１５３６）からのスブチリシンのシグナル配列の残りに融合したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓスブチリシンからのシグナル配列の最初の７つのアミノ酸残基を含む。
【００３７】
プロテアーゼ変異体の「プレプロ」形態は、プロテアーゼのアミノ末端に作動可能に連結されたプロ配列およびプロ配列のアミノ末端に作動可能に連結された「プレ」または「シグナル」配列を有するプロテアーゼの成熟形態よりなる。
【００３８】
「発現ベクター」とは、適当な宿主中の当該ＤＮＡの発現が可能な適当な制御配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体をいう。かかる制御配列は、転写を行うためのプロモーター、かかる転写を制御するための所望のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の終止を制御する配列を含む。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または単純に可能なゲノムインサートでよい。一旦適当な宿主に形質転換されたならば、ベクターは宿主ゲノムとは独立して複製、機能でき、あるいはある場合には、ゲノム自体に組み込まれ得る。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、時々、相互交換可能に使用される。というのは、プラスミドは現在ではベクターの最も通常に使用される形態だからである。しかしながら、本発明は、同等の機能を供し、当該分野で知られているまたは知られるようになった発現ベクターのかかる他の形態を含むことを意図する。
【００３９】
本発明で使用される「宿主細胞」は、一般に、好ましくは米国特許ＲＥ３４，６０６号に開示されている方法によって操作されて、それらを酵素的に活性なエンドペプチダーゼを分泌できないようにしている原核生物または真核生物宿主である。プロテアーゼを発現するための好ましい宿主細胞は、酵素的に活性な中性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ（スブチリシン）において欠乏しているＢａｃｉｌｌｕｓ  株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の構築は米国特許第５，２６４，３５６号に詳細に記載されている。プロテアーゼを発現するための他の宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １１６８（引用して、その開示を本明細書に一体化させる米国特許ＲＥ３４，６０６号および米国特許第５，２６４，３６６号にも開示されている）ならびにＢ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，  Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ等のごときいずれかの適当なＢａｃｉｌｌｕｓ  株を含む。
【００４０】
宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。かかる形質転換宿主細胞は、プロテアーゼ変異体をコードするまたは所望のプロテアーゼ変異体を発現するベクターを複製できる。プロテアーゼ変異体のプレ−またはプレプロ−形態をコードするベクターの場合、かかる変異体は、発現されると、典型的には、宿主細胞から宿主細胞培地に分泌される。
【００４１】
２つのＤＮＡ領域の間の関係を記載する場合に「作動可能に連結した」とは、単に、相互に機能的に関連することを意味する。例えば、プレ配列は、もし当該シグナル配列の切断に最も恐らくは関与する蛋白質の成熟形態の分泌に関与するシグナル配列としてそれが機能すれば、ペプチドに作動可能に連結している。プロモーターは、もしそれが配列の転写を制御すれば、コーディング配列に作動可能に連結している；リボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を可能とするように位置していれば、コーディング配列に作動可能に連結している。
【００４２】
天然に生じる前駆体プロテアーゼをコードする遺伝子は、当業者に知られている一般的方法に従って得ることができる。該方法は、一般的には、注目するプロテアーゼの領域をコードする推定配列を有する標的プローブを合成し、該プロテアーゼを発現する生物からゲノムライブラリーを調製し、次いで、プローブにハイブリダイズさせることによって、注目する遺伝子につきライブラリーをスクリーニングすることを含む。次いで、陽性的にハイブリダイズするクローンをマップし、配列決定する。
【００４３】
次いで、クローン化プロテアーゼを用いて、宿主細胞を形質転換してプロテアーゼを発現させる。次いで、プロテアーゼ遺伝子を高コピー数プラスミドに連結する。このプラスミドは、それがプラスミド複製に必要なよく知られたエレメント：（もしそれが宿主によって認識されれば、すなわち転写されれば、遺伝子自身の相同プロモーターとして供給することができる）問題の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、転写終止および外因性であって、プロモーター遺伝子、望ましくは、抗生物質含有培地での増殖によってプラスミド−感染宿主細胞の連続的培養維持を可能とする抗生物質耐性遺伝子のごとき選択遺伝子の内因性ターミネーター領域によって供給される（ある種の真核生物宿主細胞におけるプロテアーゼ遺伝子からの宿主によって転写されるｍＲＮＡの安定性に必要な）ポリアデニル化シグナルを含有する意味で宿主中で複製する。また、高コピー数プラスミドは、宿主用の複製起点を含有し、それにより、染色体制限なくして非常に多数のプラスミドが細胞質中で生成することを可能とする。しかしながら、複数コピーのプロテアーゼ遺伝子を宿主ゲノムに取り込むのは本明細書の範囲内のものである。これは、相同組換えに特に感受性の原核生物および真核生物生物によって容易とされる。
【００４４】
該遺伝子は天然Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ遺伝子であり得る。別法として、天然に生じるまたは突然変異体前駆体プロテアーゼをードする合成遺伝子を生産することができる。かかるアプローチにおいて、前駆体プロテアーゼのＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列が決定される。複数の重複する合成一本鎖ＤＮＡ断片がしかる後に合成され、ハイブリダイゼーションおよび連結に際して、それは前駆体プロテアーゼをコードする合成ＤＮＡを生じる。合成遺伝子構築の例は、出典明示して本明細書に一体化させる米国特許第５，２０４，０１５号の実施例３に記載されている。
【００４５】
一旦、天然に生じるまたは合成前駆体プロテアーゼ遺伝子がクローン化されれば、多数の修飾を行って、天然に生じる前駆体プロテアーゼの合成を超えて遺伝子の使用を増強させる。かかる修飾は、米国特許ＲＥ３４，６０６号およびＥＰＯ公開番号第０  ２５１  ４４６号に開示されている組換えプロテアーゼの生産およびここに記載されたプロテアーゼ変異体の生産を含む。
【００４６】
以下のカセット突然変異誘発方法を用いて、本発明のプロテアーゼ変異体の構築を容易とすることができるが、他の方法を用いることもできる。まず、該プロテアーゼをコードする天然に生じる遺伝子が得られ、全部または一部が配列決定される。次いで、該配列を、コードされた酵素における１以上のアミノ酸の突然変異（欠失、挿入または置換）を作成するのが望ましい点につきスキャンする。この点にフランキングする配列を、遺伝子の短いセグメントを、発現された場合に種々の突然変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールで置き換えるための制限部位の存在につき評価する。かかる制限部位は、好ましくは、遺伝子セグメントの置き換えを容易とするようにプロテアーゼ遺伝子内のユニークな部位である。しかしながら、プロテアーゼ遺伝子において総じて豊富ではないいずれの便宜な制限部位も用いることができる。但し、制限消化によって生じた遺伝子断片は適当な配列において再度組み立てることができるものとする。もし制限部位が選択された点（１０ないし１５ヌクレオチド）から便宜な距離内の位置に存在しないならば、かかる部位は、リーディングフレームまたはコードされたアミノ酸も最終構築中で変化しないように、遺伝子中のヌクレオチドを置換することによって生成させる。所望の配列に適合させるようにその配列を変化させるための遺伝子の突然変異は、一般的に知られている方法によりＭ１３プライマー伸長によって達成される。適当なフランキング領域を位置決定し、２つの便宜な制限部位配列に到達するのに必要な変化を評価する仕事は、遺伝暗号の縮重、遺伝子の制限酵素地図および非常に多数の異なる制限酵素によってルーチン的になされる。もし便宜なフランキング制限部位が利用できるならば、前記方法は、部位を含有しないフランキング配列に関してのみ使用する必要があることに注意されたし。
【００４７】
一旦天然に生じるＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローン化されたならば、突然変異させるべき位置にフランキングする制限部位を、同族制限酵素で消化し、複数の末端相補性オリゴヌクレオチドカセットを遺伝子に連結する。突然変異誘発はこの方法によって単純化される。何故ならば、オリゴヌクレオチドの全ては同一制限部位を有するように合成でき、制限部位を生じさせるために合成リンカーは必要ではないからである。
【００４８】
本明細書中で用いるごとく、蛋白質分解活性は、活性な酵素１ミリグラム当たりのペプチド結合の加水分解の速度と定義される。蛋白質分解活性を測定するための多くのよく知られた手法が存在する（Ｋ．  Ｍ．  Ｋａｌｉｓｚ，  「Ｍｉｃｒｏｂｉｂａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ａ．  Ｆｉｅｃｈｔｅｒら，  １９８８）。修飾された蛋白質分解活性に加えて、またはその代替法として、本発明の変異体酵素はＫｍ、Ｋｃａｔ、Ｋｃａｔ／Ｋｍ比のごとき他の修飾された特性および／または修飾された基質特異性および／または修飾されたｐＨ活性プロティールを有し得る。これらの酵素は、例えば、ペプチドの合成において、またはランドリー用途のごとき加水分解プロセスのために存在することが予測される特別の基質のために仕立てることができる。
【００４９】
本発明の１つの態様において、当該目的は、少なくとも１つの洗剤処方において、および／または少なくとも１つの洗浄条件の組下で、前駆体プロテアーゼと比較して、改変された、好ましくは改良された洗浄性能を有する変異体プロテアーゼを確保することである。
【００５０】
プロテアーゼ変異体が暴露されるであろう種々の洗剤処方、洗浄水容量、洗浄水温度および洗浄時間の長さを含めた種々の洗浄条件がある。例えば、異なる領域で使用される洗剤処方は、洗浄水中に存在するその関連成分の異なる濃度を有する。例えば、欧州洗剤は、典型的には、洗浄水中に約４５００−５０００ｐｐｍの洗剤成分を有するが、日本の洗剤は、典型的には、洗浄水中にほぼ６６７ｐｐｍの洗剤成分を有する。北米では、特に米国では、洗剤は典型的には洗浄水中に存在する約９７５ｐｐｍの洗剤成分を有する。
【００５１】
低い洗剤濃度系は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤を含む。日本の洗剤は、典型的には、低い洗剤濃度系であると考えられる。というのは、それらは洗浄水中の存在するほぼ６６７ｐｐｍの洗剤成分を有するからである。
【００５２】
中程度の洗剤濃度は、約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤を含む。北米洗剤は、一般に、中程度の洗剤濃度であると考えられる。というのは、それらは、洗浄水中に存在するほぼ９７５ｐｐｍの洗剤成分を有するからである。ブラジルは、典型的には、洗浄水に存在するほぼ１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。
【００５３】
高い洗剤濃度系は、約２０００ｐｐｍより大の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤を含む。欧州の洗剤は、一般に、高い洗剤濃度系であると考えられる。というのは、それらは、洗浄水中にほぼ４５００−５０００ｐｐｍの洗剤成分を有するからである。
【００５４】
ラテンアメリカの洗剤は、一般に、高いセッケン泡のホスフェートビルダー洗剤であり、ラテンアメリカで使用される洗剤の範囲は、中程度および高い洗剤濃度双方に入る得る。というのは、それらは、洗浄水中に１５００ｐｐｍないし６０００ｐｐｍの洗剤成分の範囲だからである。前記したごとく、ブラジルは、典型的には、洗浄水中に存在するほぼ１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。しかしながら、他のラテンアメリカ国に限定されず、他の高いセッケン泡ホスフェートビルダー洗剤地理は、洗浄水中に存在する約６０００ｐｐｍまでの洗剤成分の高い洗剤濃度系を有し得る。
【００５５】
前記に徴すれば、世界中の典型的な洗浄溶液中の洗剤の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低い洗剤濃度の地理」）、例えば、日本における約６６７ｐｐｍから、約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間（「中程度の洗剤濃度地理」）、例えば、米国における約９７５ｐｐｍおよびブラジルにおける約１５００ｐｐｍまで、約２０００ｐｐｍより大（「高い洗剤濃度地理」）、例えば、欧州における約４５００ないし約５０００ｐｐｍおよび高いセッケン泡ホスフェートビルダー地理における約６０００ｐｐｍの範囲であることは明らかである。
【００５６】
典型的な洗浄溶液の濃度は経験的に決定される。例えば、米国においては、典型的な洗浄マシーンは、約６４．４Ｌ容量の洗浄溶液を保持する。従って、洗浄溶液内で約９７５ｐｐｍの洗剤の濃度を得るためには、約６２．７９ｇの洗剤組成物が６４．４Ｌの洗浄溶液に添加されなければならない。この量は、洗浄を入れた測定カップを用いて消費者によって洗浄水に測定される典型的量である。
【００５７】
さらなる例として、異なる地理は異なる洗浄温度を用いる。日本における洗浄水の温度は、典型的には、欧州で用いられるものよりも低い。
【００５８】
従って、本発明の１つの態様は、少なくとも１組の洗浄条件において改良された洗浄性能を示すプロテアーゼ変異体を含む。
【００５９】
本発明のもう１つの態様において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンの対応する１、３、４、８、１０、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、３３、３７、３８、４２、４３、４８、５５、５７、５８、６１、６２、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８６、８７、８９、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２６、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３７、１４０、１４１、１４２、１４６、１４７、１５８、１５９、１６０、１６６、１６７、１７０、１７３、１７４、１７７、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８８、１９２、１９４、１９８、２０３、２０４、２０５、２０６、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２２、２２４、２２７、２２８、２３０、２３２、２３６、２３７、２３８、２４０、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４および２７５の位置よりなる群から選択される１以上の置換と組み合わせた１０３に対応する位置における置換が酵素の洗浄性能を改良するのに重要であると判断された。
【００６０】
これらの置換は、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  （組換えまたは天然タイプ）でなされるが、置換はＢａｃｉｌｌｕｓ  プロテアーゼでなすこともできる。
【００６１】
変異体プロテアーゼで得られたスクリーニング結果に基づき、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンにおける注目される突然変異は、これらの酵素の蛋白質分解活性、性能および／または安定性ならびにかかる変異体酵素の清浄または洗浄性能で重要である。
【００６２】
本発明のプロテアーゼ変異体の多くは種々の洗剤組成物またはシャンプーもしくはローションのごとき個人のケア処方を処方するのに有用である。多数の公知化合物が、本発明のプロテアーゼ突然変異体を含む組成物で有用な適当な界面活性剤である。これらは、Ｂａｒｒｙ  Ｊ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎに対する米国特許第４，４０４，１２８号およびＪｉｒｉ  Ｆｌｏｒａらに対する米国特許第４，２６１，８６８号に開示されているごときノニオン、アニオン、カチオンまたは両性洗剤を含む。適当な洗剤処方は、（先に出典明示して本明細書に一体化させる）米国特許第５，２０４，０１５号の実施例７に記載されているものである。該技術は、清浄組成物として使用することができる異なる処方に馴染み深い。典型的な清浄組成物に加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は天然または野生型プロテアーゼが使用されるいずれかの目的で使用することができるのは容易に理解される。かくして、これらの変異体は、例えば、棒もしくは液体セッケン適用、ディッシュケア処方、コンタクトレンズ清浄溶液もしくは製品、ペプチド加水分解、廃物処理、テキスタイル適用において、蛋白質生産における融合−切断酵素として使用することができる。本発明の変異体は、（前駆体と比較して）洗剤組成物における増強された性能を含むことができる。本明細書で用いるごとく、洗剤における増強された性能は、標準的な洗浄サイクル後に通常の評価によって測定して、ガラスまたは血液のごときある種の酵素感受性汚染の清浄の増大と定義される。
【００６３】
本発明のプロテアーゼは、約０．０１ないし５重量％（好ましくは０．１％ないし０．５重量）のレベルで６．５および１２．０の間のｐＨを有する公知の粉末化よび液体洗剤に処方することができる。これらの洗剤清浄組成物は、公知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼのごとき他の酵素、ならびにビルダーおよび安定化剤を含むこともできる。
【００６４】
本発明のプロテアーゼの通常の清浄組成物への添加は、いずれの特別な使用制限も生じない。換言すれば、洗剤に適したいずれの温度およびｐＨも、該ｐＨが前記範囲内であって、該温度が記載されたプロテアーゼの変性温度未満である限り本発明の組成物で適当である。加えて、本発明のプロテアーゼは、再度、単独またはビルダーおよび安定化剤と組み合わせて、洗剤なくして清浄組成物で使用することができる。
【００６５】
また、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を含有する清浄組成物に関する。該清浄組成物は、さらに、清浄組成物で通常使用される添加剤を含有することができる。これらは、限定されるものではないが、ブリーチ、界面活性剤、ビルダー、酵素およびブリーチ触媒から選択することができる。いずれの添加剤が組成物に含有されるのに適するかは当業者に容易に明らかであろう。本明細書で供するリストは、断じて、それに尽きるものではなく、適当な添加剤の例としてのみ採用すべきである。また、組成物中の酵素および他の成分、例えば、界面活性剤に適合する添加剤のみを使用することは当業者に容易に明らかであろう。
【００６６】
存在する場合、清浄組成物に存在する添加剤の量は約０．０１ないし９９．９％、好ましくは約１％ないし約９５％、より好ましくは約１％ないし約８０％である。
【００６７】
本発明の変異体プロテアーゼは、例えば、米国特許第５，６１２，０５５号；米国特許第５，３１４，６９２号および第５，１４７，６４２号に記載された動物飼料添加物の一部のごとき動物飼料に含めることができる。
【００６８】
本発明の１つの態様は、本発明の変異体プロテアーゼを含むテキスタイルの処理用の組成物である。該組成物は、例えば、ＲＤ２１６，０３４号；ＥＰ  １３４，２８７；ＵＳ４，５３３，３５９；およびＥＰ３４４，２５９のごとき刊行物に記載されている絹または羊毛を処理するのに使用することができる。
【００６９】
以下のものは例として提示され、請求の範囲の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【００７０】
本明細書で引用した全ての刊行物および特許はここに引用してその全体を本明細書に一体化させる。
【００７１】
【実施例】
（実施例１）
当該分野でよく知られた方法を用い、非常に多数のプロテアーゼ変異体を生産し、精製した。全ての突然変異はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＧＧ３６スブチリシンでなした。変異体は表３に示す。
【００７２】
【表２２】
0004511025.tif 000023
【表２３】
0004511025.tif 000024
【表２４】
0004511025.tif 000025
【表２５】
0004511025.tif 000026
【表２６】
0004511025.tif 000027
【表２７】
0004511025.tif 000028
【表２８】
0004511025.tif 000029
【表２９】
0004511025.tif 000030
【表３０】
0004511025.tif 000031
【表３１】
0004511025.tif 000032
【表３２】
0004511025.tif 000033
【表３３】
0004511025.tif 000034
【表３４】
0004511025.tif 000035
【表３５】
0004511025.tif 000036
【表３６】
0004511025.tif 000037
【表３７】
0004511025.tif 000038
【表３８】
0004511025.tif 000039
【表３９】
0004511025.tif 000040
【表４０】
0004511025.tif 000041
【表４１】
0004511025.tif 000042
【表４２】
0004511025.tif 000043
（実施例２）
実施例１で製造した非常に多数のプロテアーゼ変異体を、「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｓｓａｙｉｇ  ｆｏｒ  ａ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ／ｏｒ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」、米国Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．６０／０６８，７９６に記載されたミクロスウォッチアッセイを用いて、２つのタイプの洗剤および洗浄条件で性能につきテストした。
【００７３】
表４はアッセイした変異体プロテアーゼおよび２つの異なる洗剤でテストした結果をリストする。Ａ欄では、洗剤はガロン当たり３グレインの混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含有する溶液中の０．６７ｇ／ｌの濾過されたＡｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ  （Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，  Ｃｉｎｃｉｃａｔｉ，  オハイオ州，  米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を２０℃の各ウェルで用いた。Ｂ欄では、洗剤はガロン当たり１５グレインの混合されたＣａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含有する溶液中の３．３８ｇ／ｌの濾過されたＡｒｉｅｌ  Ｆｕｔｕｒ  （Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，  Ｃｉｎｃｉｃａｔｉ，  オハイオ州，  米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を４０℃で各ウェルで用いた。
【００７４】
【表４３】
0004511025.tif 000044
【表４４】
0004511025.tif 000045
【表４５】
0004511025.tif 000046
【表４６】
0004511025.tif 000047
【表４７】
0004511025.tif 000048
【表４８】
0004511025.tif 000049
【表４９】
0004511025.tif 000050
【表５０】
0004511025.tif 000051
【表５１】
0004511025.tif 000052
（実施例３）
表５は実施例１でアッセイした変異体プロテアーゼおよび４つの異なる洗剤でテストした結果をリストする。実施例２におけるのと同一の性能テストを以下の洗剤で記載した変異体プロテアーゼに対してなした。Ａ欄では、洗剤はガロン当たり３グレインの混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含有する溶液中の０．６７ｇ／ｌの濾過されたＡｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ  （Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  オハイオ州，  米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を２０℃の各ウェルで用いた。Ｂ欄では、洗剤はガロン当たり１５グレインの混合されたＣａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含有する溶液中の３．３８ｇ／ｌの濾過されたＡｒｉｅｌ  Ｆｕｔｕｒ  （Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  オハイオ州，  米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を４０℃で各ウェルで用いた。Ｃ欄では、ガロン当たり８グレインの混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含有する溶液中の３．５ｇ／ｌのＨＳＰ１洗剤  （Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  オハイオ州，  米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を２０℃の各ウェルで用いた。Ｄ欄では、ガロン当たり３グレインの混合されたＣａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含有する溶液中の１．５ｍｌ／ｌ  Ｔｉｄｅ  ＫＴ洗剤（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  オハイオ州，  米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を２０℃で各ウェルで用いた。
【００７５】
【表５２】
0004511025.tif 000053
【表５３】
0004511025.tif 000054
【表５４】
0004511025.tif 000055
【表５５】
0004511025.tif 000056
【表５６】
0004511025.tif 000057
【表５７】
0004511025.tif 000058
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにこの遺伝子の部分的制限地図を示す。
【図２】  図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  スブチリシンについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにこの遺伝子の部分的制限地図を示す。
【図３】  図３は図２の続きである。
【図４】  図４は図３の続きである。
【図５】  図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  （ＢＰＮ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ（野生型）からのスブチリシンの間での保存されたアミノ酸残基を示す。
【図６】  図６は、４つのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。
【図７】  図７は、図６の続きである。
【図１】
0004511025.tif 000059
【図２】
0004511025.tif 000060
【図３】
0004511025.tif 000061
【図４】
0004511025.tif 000062
【図５】
0004511025.tif 000063
【図６】
0004511025.tif 000064
【図７】
0004511025.tif 000065