【手続補正書】
【提出日】平成18年3月29日(2006.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）下記一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩と、２）アスコルビン酸の配糖体及びその塩、ハイドロキノンの配糖体及びその塩、４−メチルサリチル酸及びその塩、並びにトラネキサム酸及びその塩から選択される１種乃至は２種以上とを含有し、前記一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩の含有量が０．１ｍＭ以上であることを特徴とする、皮膚外用剤。
【化１】
2005075771.tif 000001
一般式（１）
（但し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子、水酸基又は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表す。）
【請求項２】
一般式（１）に表される化合物がセンタウレイジン（Centaureidin）であることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚外用剤。
【化２】
2005075771.tif 000002
センタウレイジン
【請求項３】
一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩の基源が、アゲラタム（Achillea. ageratum）、カーティラギネア（Achillea cartilaginea）、クラヴェナエ（Achillea clavenae）、キバナノコゴリソウ（Achillea. filipendula）、ミレフォリウム（Achillea millefolium）、ナナ（Achillea nana）、プターミカ（Achillea ptarmica）及びヒメノコギリソウ（Achillea tomentosa）から選択されるキク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物のエキスであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
エキスが、植物体の地上部及び／又はその加工物を含水エタノールで抽出し、イオン交換樹脂に吸着させた後、非吸着部分を洗浄、除去し、しかる後エタノール溶出分を集め、溶剤除去して得たものであることを特徴とする、請求項３に記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
ブライトニング化粧料であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の皮膚外用剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
肌の色が白いことは、日本においては古くから大きなメリットであり、「肌の白いは、百難隠す」ということわざが存するほど、この観念は一般化されている。この目的から種々の美白素材が開発され、商品に応用されている。この様な美白素材としては、例えば、アスコルビン酸誘導体、アルブチン、エラグ酸、４−メトキシサリチル酸、トラネキサム酸等が存する（例えば、非特許文献１を参照）。この様な美白素材に於いて課題となることは、過剰なメラニン産生抑制であり、メラニン産生を抑制しすぎて、肌の色が、不自然な白さになってしまうことを如何に制御するかと言うことである。前記美白成分の主たる副作用の一つに「白斑」が存することからも、このことは裏付けられる。この様な背景をもとに、「ブリーチング」と「ブライトニング」という概念が化粧料に導入されようになってきている（例えば、特許文献１を参照）。しかしながら、これまでブライトニング効果を有する化粧料素材は見つかっていないのが現状である。言い換えれば、これまでブリーチング化粧料素材或いはブリーチング化粧料は開発されてきたが、ブライトニング化粧料素材或いはブライトニング化粧料は開発されておらず、その開発が望まれていた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
一方、後記一般式（１）に表される化合物の一つである、センタウレイジンはセイヨウノコギリソウなどの、キク科ノコギリソウ属の植物に極少量含有されることが知られている（例えば、非特許文献２を参照）。又、セイヨウノコギリソウなどの、キク科ノコギリソウ属の植物が美白作用を有することは既に知られている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４を参照）。又、メラノサイトのデンドライトの伸長を抑制することにより、美白が達成されることも既に知られている（例えば、特許文献５、特許文献６を参照）。しかしながら、従来の美白剤とセンタウレイジン等の一般式（１）に表される化合物を組み合わせることは知られていないし、この様な組合せにより、過剰なメラニン産生を抑制し、自然な感じを維持しながら、美白作用を発揮する「ブライトニング」が具現化出来ることも全く知られていない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
この様な状況に鑑みて、本発明者らはブライトニング化粧料素材或いはブライトニング化粧料を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、従来の美白剤とセンタウレイジン等の一般式（１）に表される化合物を組み合わせることにより、この様な技術が具現化できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す技術に関するものである。
（１）１）下記一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩と、２）アスコルビン酸の配糖体及びその塩、ハイドロキノンの配糖体及びその塩、４−メチルサリチル酸及びその塩、並びにトラネキサム酸及びその塩から選択される１種乃至は２種以上とを含有し、前記一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩の含有量が０．１ｍＭ以上であることを特徴とする、皮膚外用剤。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（３）一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩の基源が、アゲラタム（Achillea. ageratum）、カーティラギネア（Achillea cartilaginea）、クラヴェナエ（Achillea clavenae）、キバナノコゴリソウ（Achillea. filipendula）、ミレフォリウム（Achillea millefolium）、ナナ（Achillea nana）、プターミカ（Achillea ptarmica）及びヒメノコギリソウ（Achillea tomentosa）から選択されるキク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物のエキスであることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の皮膚外用剤。
（４）エキスが、植物体の地上部及び／又はその加工物を含水エタノールで抽出し、イオン交換樹脂に吸着させた後、非吸着部分を洗浄、除去し、しかる後エタノール溶出分を集め、溶剤除去して得たものであることを特徴とする、（３）に記載の皮膚外用剤。
（５）ブライトニング化粧料であることを特徴とする、（１）〜（４）の何れか一に記載の皮膚外用剤。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（１）本発明の皮膚外用剤の必須成分である一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩
本発明の皮膚外用剤は、前記一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩を含有することを特徴とする。一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、１−メチルエチル基、ｎ−ブチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、１，１−ジメチルエチル基などが好適に例示できる。特に好ましいものは、メチル基又は水素原子である。又、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子、水酸基又は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表し、前記アルキルオキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、１−メチルエチルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、１−メチルプロピルオキシ基、２−メチルプロピルオキシ基、１，１−ジメチルエチルオキシ基などが好適に例示できる。特に好ましいものは、水素原子、水酸基又はメトキシ基である。この様な一般式（１）に表される化合物の具体例としては、例えば、センタウレイジン（化合物１）、５，７−ジヒドロキシ−３，６，８−トリメトキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（化合物２）、３，３’，５−トリエトキシ−４’，６，７−トリメトキシフラバノン（化合物３）、或いは、５，６−ジヒドロキシ−２−（５−ヒドロキシ−２，４−ジメトキシフェニル）−３，７−ジメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（化合物４）等が好適に例示できる。この様な化合物で特に好ましいものは、センタウレイジンである。また塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリエチルアミン塩等の有機アミン塩類、リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩等が好ましく例示できる。かかる成分は、メラノサイトのデンドライトの伸長を抑制する作用を有し、かかる作用と通常のメラニン産生抑制作用の組合せにより、過剰にメラニンの産生を抑制することなく、美白効果を発揮するので自然な感じを喪失せずに、美白を具現化できる。この様な一般式（１）に表されるような化合物及び／又はその塩を皮膚外用剤に含有させるには、植物体を処理して、溶媒抽出し、それを精製することにより、好適な濃度の一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩を含有するエキスを得ることが出来、かかるエキスを皮膚外用剤に含有させればよい。センタウレイジンであれば、キク科ノコギリソウ属の植物の地上部の抽出物を精製分画することにより得ることが出来る。セイヨウノコギリソウの抽出物としては、極性の高い溶剤によって抽出された抽出物が特に好ましく例示できる。極性の高い溶剤としては、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、蟻酸メチルなどのエステル類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、１，３−ブタンジオール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、水などが好ましく例示できる。これらの内では、アルコールが特に好ましい。抽出は、植物体に対して１〜１０質量倍の溶剤を加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬すればよい。抽出後は、必要に応じて、減圧濃縮などして溶剤を除去することが好ましい。溶剤除去した抽出物は、酢酸エチルと水で液液抽出したり、クロロホルムーメタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー等で精製したり、アルコール抽出物より溶媒を溜去した後、残査を水に分散させ、ＨＰ−２０（三菱化成株式会社製）等のイオン交換樹脂を充填したカラムにチャージし、水洗した後、アルコールなどで溶出させ、溶剤溜去することにより、前記センタウレイジンを１〜２０質量％含有するエキスを製造することが出来る。前記キク科ノコギリソウ属の植物としては、アゲラタム（Achillea. ageratum）、カーティラギネア（Achillea cartilaginea）、クラヴェナエ（Achillea clavenae）、キバナノコゴリソウ（Achillea. filipendula）、ミレフォリウム（Achillea millefolium）、
ナナ（Achillea nana）、プターミカ（Achillea ptarmica）、ヒメノコギリソウ（Achillea tomentosa）等が存するが、これらの何れもがセンタウレイジンを極少量含有しているので、前記の如くの処理を行えば、同様にセンタウレイジンを１〜２０質量％含有するエキスを製造することが出来る。５，７−ジヒドロキシ−３，６，８−トリメトキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（化合物２）、３，３’，５−トリエトキシ−４’，６，７−トリメトキシフラバノン（化合物３）、或いは、５，６−ジヒドロキシ−２−（５−ヒドロキシ−２，４−ジメトキシフェニル）−３，７−ジメトキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（化合物４）については、基源植物を、キク科ノコギリソウ属の植物をキク科ヤグルマギク属の植物に代えることにより、同様に１〜１０質量％含有するエキスを得ることが出来る。かかるエキスは、一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩の含有量が、製剤において、０．１ｍＭ以上になるような形態で含有することが好ましく、更に好ましくは０．５ｍＭ以上である。加えて、上限値としては、エキスとして１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。これは一般式（１）に表される化合物及びその塩の含有量が少なすぎると効果を奏さない場合が存し、エキスが多すぎると、一般式（１）系の安定性を損なう場合が存するからである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
（２）本発明の皮膚外用剤の必須成分であるアスコルビン酸の配糖体及びその塩、ハイドロキノンの配糖体及びその塩、４−メチルサリチル酸及びその塩、並びにトラネキサム酸及びその塩
本発明の皮膚外用剤は、アスコルビン酸の配糖体及びその塩、ハイドロキノンの配糖体及びその塩、４−メチルサリチル酸及びその塩、並びにトラネキサム酸及びその塩から選択される１種乃至は２種以上を含有することを特徴とする。これらの成分は何れもメラニン産生抑制作用を有する物質である。アスコルビン酸の配糖体としては、例えば、グルコシドなどが例示できる。アスコルビン酸の配糖体の中で、特に好ましいものは、アスコルビン酸−２−グルコシドである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の皮膚外用剤においては、かかるアスコルビン酸の配糖体及びその塩、ハイドロキノンの配糖体及びその塩、４−メチルサリチル酸及びその塩、並びにトラネキサム酸及びその塩は、唯一種を含有することも出来るし、二種以上を組み合わせて含有することも出来る。本発明の皮膚外用剤に於ける、かかる成分の好ましい含有量は、総量で、皮膚外用剤全量に対して０．０５〜１０質量％であり、更に好ましくは、０．１〜５質量％である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
（３）本発明の皮膚外用剤
本発明の皮膚外用剤は、一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩と、２）アスコルビン酸の配糖体及びその塩、ハイドロキノンの配糖体及びその塩、４−メチルサリチル酸及びその塩、並びにトラネキサム酸及びその塩から選択される１種乃至は２種以上とを含有することを特徴とする。本発明の皮膚外用剤においては、かかる成分以外に、通常皮膚外用剤で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、１，２−ヘキシレングリコール、１，２−オクタンジオール等の多価アルコール類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、ア
ラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸，ローカストビーンガム，サクシノグルカン，カロニン酸，キチン，キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等の増粘剤、表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤（但し、４−メトキシサリチル酸は含まない）、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ6塩酸塩，ビタミンＢ6トリパルミテート，ビタミンＢ6ジオクタノエート，ビタミンＢ2又はその誘導体，ビタミンＢ12，ビタミンＢ15又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール，β−トコフェロール，γ−トコフェロール，ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミンＣ以外のビタミン類などが好ましく例示できる。本発明の皮膚外用剤は、かかる必須成分と任意成分とを常法に従って処理することにより製造することが出来る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
＜試験例１＞デンドライトの伸長抑制作用
以下に示す方法に従って、ヒトメラノサイトを用いて、伸長抑制作用を調べた。
（試薬類）
細胞・培地・増殖添加剤はクラボウより購入した
（細胞）正常ヒトメラノサイト
（培地）基礎培地：Medium 154S
（試薬）増殖添加剤：ウシ脳下垂体抽出液（BPE）（培地中の最終濃度 0.4% v/v）、ウシ胎児血清（FBS）（培地中の最終濃度 0.5% v/v）、ヒト組換え型塩基性繊維芽細胞増殖因子（rFGF-B）（培地中の最終濃度 3 ng/ml）、ハイドロコーチゾン（培地中の最終濃度 0.18 mg/ml）、インスリン（培地中の最終濃度 5 mg/ml）、トランスフェリン（培地中の最終濃度 5 mg/ml）、PMA（培地中の最終濃度 10 ng/ml）、ヘパリン（培地中の最終濃度
3 mg/ml）、PSA溶液（ペニシリン濃度50,000 Unit/ml、ストレプトマイシン濃度50 mg/ml、アンフォテリシンB濃度12.5 mg/mlの混合溶液。培地500 mlに対して1 ml添加。）
培地は、試薬を基礎培地に添加した増殖用培地を使用した。
（方法）
・正常ヒトメラノサイトを４８穴マイクロプレートに播種した。（３０００cells/well,198μl）
・２４時間後に０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭとなるように製造例６で製造したセンタウレイジンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、サンプル溶液とし、これを１μｌに培地９μｌを添加し、この２μｌをマイクロプレートに添加した。
・サンプル添加２４時間後にデンドライト伸長抑制を観察した。
（結果）
結果を、デンドライトの長さとして、表２に示す。コントロールでは増殖因子の添加効果によってデンドライト伸長しているが、センタウレイジン添加群では伸長が抑制されていることがわかる。この傾向は０．５ｍＭを境に特に顕著であり、至適センタウレイジン濃度は、０．５ｍＭ以上であることが判る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
＜試験例４＞
一般式（１）に表される化合物と、メラニン産生抑制剤の併用の効果を、メラノーマＢ−１６細胞を用いて検討した。即ち、Ｂ−１６細胞は１５％ＦＢＳ加ＭＥＭで５％炭酸ガス条件で４８時間前培養し用いた。ウェルに５×１０５個／ｍｌのドーズで細胞を播き、センタウレイジンと各種濃度のアルブチンを加え、４８時間培養し、遠心分離で細胞を集め、培地で２回洗浄した後、細胞の色と数をスコアを用いて判定した。判定の対象としては、センタウレイジンもアルブチンも加えずに培養したものを対照に用い、色は、スコア０：対照と同じ、スコア１：対照よりやや薄い、スコア２：対照より明らかに薄い、スコア３：細胞が殆ど白い、スコア４：細胞が白い、の基準で、細胞数は、スコア０：細胞が殆ど死滅、スコア１：細胞が９割方死滅、スコア２：細胞が半分程度死滅、スコア３：細胞が少し死滅、スコア４：細胞数が対照と変わらない、の基準で判定を行った。結果を表５に示す。これより、センタウレイジンが存在することにより、細胞死が抑制され、この細胞死の原因である、過度のメラニン産生抑制も抑えられることがわかる。この様な作用はセンタウレイジンのメラノサイトのデンドライト抑制作用と良く一致している。