(57)【要約】  本発明は、Ｆｃタンパク質と目的物質（例、ペプチド）との融合物質を効率良く作製できる手段を提供する。具体的には、本発明は、下記式（１）：Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）〔式中、  Ｎ３は、アジド基を示し、  Ｌａは、結合又は２価の基を示し、  Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、  Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、  Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質などを提供する。
2017191817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、アジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項２】
前記ペプチドリンカーが４〜３０個のアミノ酸残基からなる、請求項１記載のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項３】
前記ペプチドリンカーが１６個のアミノ酸残基からなる、請求項２記載のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項４】
前記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質が、下記式（１−１）：
【化１】
2017191817.tif 000036
〔式中、
Ｎ３、Ｌａ、Ｌｂ及びＦｃは、前記式（１）と同じであり、
ベンゼン環は、さらに置換されていてもよい。〕で表される、請求項１〜３のいずれか一項記載のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項５】
Ｆｃタンパク質が哺乳動物抗体のＦｃ領域に由来する、請求項１〜４のいずれか一項記載のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項６】
哺乳動物抗体がヒト抗体である、請求項５記載のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項７】
Ｆｃタンパク質がＩｇＧ抗体のＦｃ領域に由来する、請求項１〜６のいずれか一項記載のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項８】
Ｆｃタンパク質が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれる、請求項１〜７のいずれか一項記載のアジド基含有Ｆｃタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び挿入からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項９】
アジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法であって、
フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、
下記式（２）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ  （２）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体を示す。〕で表される、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、
下記式（３）：
Ｌｂ−Ｆｃ  （３）
〔式中、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、
下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３及びＬａは、前記式（２）と同じであり、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂ及びＦｃは、前記式（３）と同じである。〕で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質を生成することを含む、方法。
【請求項１０】
下記式（４）：
【化２】
2017191817.tif 000037
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体。
【請求項１１】
環Ａが、７員若しくは８員環、又は７員若しくは８員環と他の環との縮合環である、請求項１０記載のＦｃタンパク質誘導体。
【請求項１２】
目的物質がポリマー系物質である、請求項１０又は１１記載のＦｃタンパク質誘導体。
【請求項１３】
目的物質が、ペプチド、サッカリド、又はヌクレオチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項記載のＦｃタンパク質誘導体。
【請求項１４】
目的物質が、システイン残基をＣ末端に有するペプチドである、請求項１０〜１３のいずれか一項記載のＦｃタンパク質誘導体。
【請求項１５】
目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法であって、
下記式（５）：
【化３】
2017191817.tif 000038
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環ａは、炭素原子間３重結合を有する環を示す。〕で表される、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を、
下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質と反応させて、
下記式（４）：
【化４】
2017191817.tif 000039
〔式中、
Ｓ及びＬは、前記式（５）と同じであり、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｂ、及びＦｃは、前記式（１）と同じである。〕で表される、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体を生成することを含む、方法。
【請求項１６】
炭素原子間３重結合を有する環が、７員若しくは８員環、又は７員若しくは８員環と他の環との縮合環である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
目的物質を、炭素原子間３重結合を有する環を含む試薬と反応させて、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を生成することをさらに含む、請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
下記（Ａ）及び（Ｂ）を含む、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法：
（Ａ）フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、
下記式（２）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ  （２）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体を示す。〕で表される、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、
下記式（３）：
Ｌｂ−Ｆｃ  （３）
〔式中、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、
下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３及びＬａは、前記式（２）と同じであり、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂ及びＦｃは、前記式（３）と同じである。〕で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質を生成すること；並びに
（Ｂ）下記式（５）：
【化５】
2017191817.tif 000040
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環ａは、炭素原子間３重結合を有する環を示す。〕で表される、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を、
前記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質と反応させて、
下記式（４）：
【化６】
2017191817.tif 000041
〔式中、
Ｓ及びＬは、前記式（５）と同じであり、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｂ、及びＦｃは、前記式（１）と同じである。〕で表される、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体を生成すること。
【請求項１９】
１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをＮ末端に有する、Ｆｃタンパク質。
【請求項２０】
ペプチドリンカーのＮ末端アミノ酸残基が、リジン残基又はアルギニン残基である、請求項１９記載のＦｃタンパク質。
【請求項２１】
Ｎ末端アミノ酸残基がリジン残基又はアルギニン残基である１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体残基をＮ末端に有する、アジド基含有Ｆｃタンパク質。
【請求項２２】
Ｎ末端アミノ酸残基がリジン残基又はアルギニン残基である１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体残基をＮ末端に有する、アジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法であって、
フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、前記ペプチドリンカーをＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、前記アジド基含有Ｆｃタンパク質を生成することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジド基含有Ｆｃタンパク質及びその製造方法、並びにアジド基含有Ｆｃタンパク質を材料として用いる、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体、及びその製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質等の目的物質は種々の生理活性を有することから、このような目的物質を用いて種々の製剤が開発されている。安定性等の特性を向上させるため、タンパク質等の目的物質とＦｃタンパク質との融合タンパク質が開発されている。【０００３】
特許文献１には、リコンビナント法による、目的タンパク質とＦｃタンパク質との融合タンパク質の調製方法が記載されている。
特許文献２には、ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ法により、目的ペプチドのチオエステル（Ｒ１−ＣＯ−ＳＲ）をＮ末端にシステイン残基を有するＦｃタンパク質（ＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ２ＳＨ）−Ｒ２）と反応させて、目的ペプチドとＦｃタンパク質との融合タンパク質（Ｒ１−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＳＨ）−Ｒ２）を調製する方法が記載されている。
特許文献３には、還元アミノ化反応により、ホルミル基を有する目的ペプチド（Ｒ１−ＣＨ２−ＣＨＯ）をアミノ基を有するＦｃタンパク質（Ｈ２Ｎ−Ｒ２）と反応させて、目的タンパク質とＦｃタンパク質との融合タンパク質（Ｒ１−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２）を調製する方法が記載されている。
特許文献４には、セルフリーのタンパク質発現系において、任意の位置にアジド基を導入したＦｃタンパク質を調製し、次いでＳｔｒａｉｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＡＡＣ）反応によって、目的ペプチドとＦｃタンパク質との融合タンパク質を調製する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，４２８，１３０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，４０４，９５６号明細書
【特許文献３】米国特許第７，７３７，２６０号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１４／００４６３９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載されるリコンビナント法については、融合タンパク質の配列によっては融合タンパク質を発現できないこともあり、また、Ｆｃタンパク質がタンパク質以外の目的物質と融合されるべき場合に利用できないことから、汎用性の面で課題がある。
特許文献２に記載されるｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ法については、目的タンパク質のチオエステルを大過剰用いてもＦｃタンパク質に対する目的タンパク質のモノ付加体とジ付加体の混合物が取得されており、反応効率と精製の煩雑さの点で課題がある。
特許文献３に記載される還元アミノ化反応は、反応効率の点で課題があり、また、本反応で用いられるｓｏｄｉｕｍ  ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅがタンパク質側鎖の化学変換という副反応を引き起こすという課題がある。
特許文献４に記載される方法については、セルフリーのタンパク質発現系の原料の入手性及びコスト面から、実用的な方法とは言い難いという課題がある。【０００６】
本発明の目的は、Ｆｃタンパク質と目的物質（例、タンパク質）との融合物質を効率良く作製できる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の酵素反応により所定のアジド基含有Ｆｃタンパク質を作製すること、及びこの作製されたアジド基含有Ｆｃタンパク質を材料として用いることにより目的タンパク質とＦｃタンパク質との融合タンパク質が効率良く作製できること等を見出した。所定のアジド基含有Ｆｃタンパク質を材料として用いる本発明者らが開発した方法論は、タンパク質以外の物質のＦｃタンパク質への付加にも応用できることから汎用性に優れ、また、セルフリーのタンパク質発現系の使用を回避できることから実用性にも優れると考えられる。以上に基づき、本発明者らは上記課題を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、アジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔２〕前記ペプチドリンカーが４〜３０個のアミノ酸残基からなる、〔１〕のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔３〕前記ペプチドリンカーが１６個のアミノ酸残基からなる、〔２〕のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔４〕前記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質が、下記式（１−１）：
【化１】
2017191817.tif 000003
〔式中、
Ｎ３、Ｌａ、Ｌｂ及びＦｃは、前記式（１）と同じであり、
ベンゼン環は、さらに置換されていてもよい。〕で表される、〔１〕〜〔３〕のいずれかのアジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔５〕Ｆｃタンパク質が哺乳動物抗体のＦｃ領域に由来する、〔１〕〜〔４〕のいずれかのアジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔６〕哺乳動物抗体がヒト抗体である、〔５〕のアジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔７〕Ｆｃタンパク質がＩｇＧ抗体のＦｃ領域に由来する、〔１〕〜〔６〕のいずれかのアジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔８〕Ｆｃタンパク質が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれる、〔１〕〜〔７〕のいずれかのアジド基含有Ｆｃタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び挿入からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
〔９〕アジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法であって、
フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、
下記式（２）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ  （２）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体を示す。〕で表される、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、
下記式（３）：
Ｌｂ−Ｆｃ  （３）
〔式中、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、
下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３及びＬａは、前記式（２）と同じであり、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂ及びＦｃは、前記式（３）と同じである。〕で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質を生成することを含む、方法。
〔１０〕下記式（４）：
【化２】
2017191817.tif 000004
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体。
〔１１〕環Ａが、７〜９員の単環、又は７〜９員の単環と他の環との縮合環である、〔１０〕のＦｃタンパク質誘導体。
〔１２〕目的物質がポリマー系物質である、〔１０〕又は〔１１〕のＦｃタンパク質誘導体。
〔１３〕目的物質が、ペプチド、サッカリド、又はヌクレオチドである、〔１０〕〜〔１２〕のいずれかのＦｃタンパク質誘導体。
〔１４〕目的物質が、システイン残基をＣ末端に有するペプチドである、〔１０〕〜〔１３〕のいずれかのＦｃタンパク質誘導体。
〔１５〕目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法であって、
下記式（５）：
【化３】
2017191817.tif 000005
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環ａは、炭素原子間３重結合を有する環を示す。〕で表される、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を、
下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質と反応させて、
下記式（４）：
【化４】
2017191817.tif 000006
〔式中、
Ｓ及びＬは、前記式（５）と同じであり、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｂ、及びＦｃは、前記式（１）と同じである。〕で表される、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体を生成することを含む、方法。
〔１６〕炭素原子間３重結合を有する環が、７〜９員環、又は７〜９員の単環と他の環との縮合環である、〔１５〕の方法。
〔１７〕目的物質を、炭素原子間３重結合を有する環を含む試薬と反応させて、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を生成することをさらに含む、〔１５〕又は〔１６〕の方法。
〔１８〕下記（Ａ）及び（Ｂ）を含む、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法：
（Ａ）フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、
下記式（２）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ  （２）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体を示す。〕で表される、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、
下記式（３）：
Ｌｂ−Ｆｃ  （３）
〔式中、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕で表される、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、
下記式（１）：
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３及びＬａは、前記式（２）と同じであり、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂ及びＦｃは、前記式（３）と同じである。〕で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質を生成すること；並びに
（Ｂ）下記式（５）：
【化５】
2017191817.tif 000007
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環ａは、炭素原子間３重結合を有する環を示す。〕で表される、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を、
前記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質と反応させて、
下記式（４）：
【化６】
2017191817.tif 000008
〔式中、
Ｓ及びＬは、前記式（５）と同じであり、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｂ、及びＦｃは、前記式（１）と同じである。〕で表される、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体を生成すること。
〔１９〕１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをＮ末端に有する、Ｆｃタンパク質。
〔２０〕ペプチドリンカーのＮ末端アミノ酸残基が、リジン残基又はアルギニン残基である、〔１９〕のＦｃタンパク質。
〔２１〕Ｎ末端アミノ酸残基がリジン残基又はアルギニン残基である１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体残基をＮ末端に有する、アジド基含有Ｆｃタンパク質。
〔２２〕Ｎ末端アミノ酸残基がリジン残基又はアルギニン残基である１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体残基をＮ末端に有する、アジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法であって、
フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、前記ペプチドリンカーをＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、前記アジド基含有Ｆｃタンパク質を生成することを含む、方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアジド基含有Ｆｃタンパク質は、融合されるべき目的物質との反応効率に優れることから、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造に有用である。本発明はまた、このようなアジド基含有Ｆｃタンパク質を用いて製造された、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体などを提供する。
１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをＮ末端に有する本発明のＦｃタンパク質は、目的物質との反応効率に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の概要を示す図である。
【図２】図２は、Ｃｙｓ−Ｆｃ遺伝子導入ＨＥＫ２９３細胞の培養上清をプロテインＡで精製した後の溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す図である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：培養上清；レーン３：プロテインＡ透過液；レーン４；プロテインＡ溶出液。
【図３】図３は、アジド基含有Ｆｃタンパク質の合成（図１の反応Ａを参照）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアジド基含有Ｆｃタンパク質への変換率の評価を示す図である。アジド基含有Ｆｃタンパク質の合成は、フェニルアラニルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｈｅ）、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔａｎｔ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素（Ｌ／Ｆ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いた、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体（４−アジドフェニルアラニン）の下記各種Ｆｃタンパク質への付加により行われた。Ｃｏｎｖ．：変換率。Ｆｃ（４）：ＫＴＨＴ（配列番号４）−Ｆｃタンパク質（変換率７０％）；Ｆｃ（８）：ＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号５）−Ｆｃタンパク質（変換率８４％）；Ｆｃ（１２）：ＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号６）−Ｆｃタンパク質（変換率７５％）；Ｆｃ（１３）：ＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号７）−Ｆｃタンパク質（変換率７６％）；Ｆｃ（１６）：ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号８）−Ｆｃタンパク質（変換率９０％）。レーン１：分子量マーカー（図２と同じ）；レーン２：反応前の上記各種Ｆｃタンパク質（ネガティブコントロール）；レーン３：アジド基含有Ｆｃタンパク質の合成における反応混合物（上のバンド：ＰＥＧ化タンパク質；下のバンド：非ＰＥＧ化タンパク質）。
【図４】図４は、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成（図１の反応Ｂに対する比較例）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる当該Ｆｃタンパク質誘導体への変換率の評価を示す図である。目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成（比較例）は、Ｓ−Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ反応によるＦｃタンパク質と目的物質との反応により行われた。Ｃｏｎｖ．：変換率。レーン１：分子量マーカー；レーン２：反応前のＦｃタンパク質Ｆｃ（１６）（ネガティブコントロール）；レーン３：目的ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成における反応混合物（変換率４９％）。
【図５】図５は、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成（図１の反応Ｂ）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる当該Ｆｃタンパク質誘導体への変換率の評価を示す図である。目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成は、ＳＰＡＡＣ反応によるアジド基含有Ｆｃタンパク質と目的物質との反応により行われた。Ｃｏｎｖ．：変換率。レーン１：分子量マーカー；レーン２：反応前のＦｃタンパク質Ｆｃ（１６）（ネガティブコントロール）；レーン３：目的ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成における反応混合物（変換率１００％）。
【図６】図６は、形質転換細胞を用いて産生された、Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質（Ｌｙｓ−Ｆｃ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す図である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  Ｍｉｘｔｕｒｅ；レーン３：Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質（実施例７で調製されたＦｃタンパク質）。
【図７】図７は、目的物質としての非天然環状ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成（図１の反応Ｂ）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる当該Ｆｃタンパク質誘導体への変換率の評価を示す図である。目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成は、ＳＰＡＡＣ反応によるアジド基含有Ｆｃタンパク質と目的物質との反応により行われた。レーン１：分子量マーカー；レーン２：反応前のＦｃタンパク質Ｆｃ（１６）（ネガティブコントロール）；レーン３：目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成における反応混合物。
【図８】図８は、目的物質としての非天然直鎖ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成（図１の反応Ｂ）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる当該Ｆｃタンパク質誘導体への変換率の評価を示す図である。目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成は、ＳＰＡＡＣ反応によるアジド基含有Ｆｃタンパク質と目的物質との反応により行われた。レーン１：分子量マーカー；レーン２：反応前のＦｃタンパク質Ｆｃ（１６）（ネガティブコントロール）；レーン３：目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成における反応混合物。
【図９】図９は、目的物質としてのオリゴ核酸（配列番号２１）が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成（図１の反応Ｂ）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる当該Ｆｃタンパク質誘導体への変換率の評価を示す図である。目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成は、ＳＰＡＡＣ反応によるアジド基含有Ｆｃタンパク質と目的物質との反応により行われた。レーン１：分子量マーカー；レーン２：反応前のＦｃタンパク質Ｆｃ（１６）（ネガティブコントロール）；レーン３：目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成における反応混合物。
【図１０】図１０は、目的物質としてのオリゴ核酸（配列番号２２）が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成（図１の反応Ｂ）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる当該Ｆｃタンパク質誘導体への変換率の評価を示す図である。目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成は、ＳＰＡＡＣ反応によるアジド基含有Ｆｃタンパク質と目的物質との反応により行われた。レーン１：分子量マーカー；レーン２：反応前のＦｃタンパク質Ｆｃ（１６）（ネガティブコントロール）；レーン３：目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の合成における反応混合物。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１．アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びその製造方法）
本発明は、アジド基含有Ｆｃタンパク質を提供する。
【００１２】
本発明のアジド基含有Ｆｃタンパク質は、下記式（１）で表される。
【００１３】
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕
【００１４】
式（１）において、Ｐｈｅ及びＬｂ間の結合、並びにＬｂ及びＦｃ間の結合は、アミド結合である。よって、上記式（１）におけるＰｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃの部分は、その構成アミノ酸残基がアミド結合で連結されたポリペプチド構造を示す。
【００１５】
式（１）において、Ｌａにより示される２価の基は、Ｎ３及びＰｈｅを連結する直鎖又は分岐鎖の基である。Ｌａにより示される２価の基としては、例えば、置換基を有していてもよい直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲａ−（Ｒａは水素原子、又は置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲａ−（Ｒａは水素原子、又は置換基を示す）、及びこれらの組み合わせからなる基が挙げられる。
【００１６】
直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基としては、例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレンが挙げられる。
【００１７】
アルキレンとしては、炭素原子数１〜１２のアルキレンが好ましく、炭素原子数１〜６のアルキレンがより好ましく、炭素原子数１〜４のアルキレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキレンは、直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキレンが好ましい。このようなアルキレンとしては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、へキシレンが挙げられる。
【００１８】
アルケニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルケニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルケニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルケニレンは、直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルケニレンが好ましい。このようなアルケニレンとしては、例えば、エチレニレン、プロピニレン、ブテニレン、ペンテニレン、へキセニレンが挙げられる。
【００１９】
アルキニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルキニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルキニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキニレンは、直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキニレンが好ましい。このようなアルキニレンとしては、例えば、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ペンチニレン、へキシニレンが挙げられる。
【００２０】
直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基が有していてもよい置換基、及びＲａにより示される置換基は、後述するフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様であるが、なかでも炭化水素基が好ましい。直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基が有していてもよい置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【００２１】
これらの中でも、Ｌａにより示される２価の基としては、２価の炭化水素基が好ましく、アルキレンがより好ましい。
【００２２】
特に好ましくは、Ｌａは、結合である。この場合、式（１）は、Ｎ３−Ｐｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃ  （１’）と表記することもできる。
【００２３】
式（１）において、Ｐｈｅにより示されるフェニルアラニン又はその誘導体の残基は、隣接するＬｂ（リジン残基若しくはアルギニン残基、又はペプチドリンカー中のＮ末端リジン残基若しくはアルギニン残基）にアミド結合を介して結合するため、アミド結合のＣ末端側の構造（すなわち、ＣＯ−）をＣ末端に有する。フェニルアラニンの誘導体は、フェニルアラニンの側鎖部分（ベンジル基）に１〜５個、１〜３個、又は１若しくは２個の置換基を有するフェニルアラニンである。このような置換基は、例えば、以下である；
（ｉ）炭化水素基、ハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、グアニジノ、若しくはシアノ；
（ｉｉ）Ｒｂ−Ｏ−、Ｒｂ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｂ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、若しくはＲｂ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−〔（ｉｉ）におけるＲｂは、水素原子、又は炭化水素基を示す〕；又は
（ｉｉｉ）ＮＲｂ１Ｒｂ２−、ＮＲｂ１Ｒｂ２−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｂ１Ｒｂ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、若しくはＲｂ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｂ２−〔（ｉｉｉ）におけるＲｂ１及びＲｂ２は、同一若しくは異なって、水素原子、若しくは炭化水素基を示す〕。
【００２４】
（ｉ）〜（ｉｉｉ）における炭化水素基は、直鎖、分岐鎖、又は環状の１価の炭化水素基であり、好ましくは直鎖又は分岐鎖の１価の炭化水素基である。このような炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、及びアルキニルが挙げられる。
【００２５】
アルキルとしては、例えば、炭素原子数１〜１２のアルキルが好ましく、炭素原子数１〜６のアルキルがより好ましく、炭素原子数１〜４のアルキルが特に好ましい。アルキルは、直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれであってもよいが、直鎖又は分岐鎖のアルキルが好ましい。このようなアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルが挙げられる。
【００２６】
アルケニルとしては、炭素原子数２〜１２のアルケニルが好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニルがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルケニルが特に好ましい。アルケニルは、直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれであってもよいが、直鎖又は分岐鎖のアルケニルが好ましい。このようなアルケニルとしては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニルが挙げられる。
【００２７】
アルキニルとしては、炭素原子数２〜１２のアルキニルが好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニルがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルキニルが特に好ましい。アルキニルは、直鎖、分岐鎖、又は環状のいずれであってもよいが、直鎖又は分岐鎖のアルキニルが好ましい。このようなアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、へキシニルが挙げられる。
【００２８】
式（１）において、Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示す。Ｌｂがリジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有するペプチドリンカーである理由は、式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法において、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体（「Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ」の構造単位に相当し得る）をアミド結合によりＬｂに連結するためには、当該フェニルアラニン誘導体を連結可能であるアミノ酸として、アルギニン残基、又はリジン残基を用いる必要があるためである。詳細については、上記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法における、フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いる後述の反応を参照されたい。
【００２９】
好ましくは、Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示す。アミノ酸残基は、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸の残基であるが、Ｌ−アミノ酸の残基が好ましい。アミノ酸残基としてはまた、α−アミノ酸が好ましい。より具体的には、好ましいアミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、及びグリシン（Ｇ）が挙げられる。
【００３０】
より好ましくは、ペプチドリンカーは、４個以上のアミノ酸残基からなる。ペプチドリンカーは、６個以上、８個以上、１０個以上、１２個以上、又は１４個以上のアミノ酸残基からなるものであってもよい。ペプチドリンカーはまた、３０個以下、２５個以下、２０個以下、又は１８個以下のアミノ酸残基からなるものであってもよい。特に好ましくは、ペプチドリンカーは、１６個のアミノ酸残基からなる。
【００３１】
特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列に対して異種のアミノ酸配列からなるものであってもよい。ペプチドリンカーについて、Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列に対して「異種」のアミノ酸配列とは、抗体においてＦｃタンパク質が天然に連結されているアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなることを意味する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるＦｃタンパク質を含む天然抗体において、当該Ｆｃタンパク質のＮ末端アミノ酸（メチオニン）残基はグリシンのＣ末端に対して天然に連結されているが、Ｆｃタンパク質として配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質が用いられる場合、ペプチドリンカーは、そのＣ末端にグリシン残基を含まないアミノ酸配列からなる。
【００３２】
好ましい特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、以下であってもよい。
（１）ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるペプチド；又は
（２）ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号８）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び挿入からなる群より選ばれる１若しくは２個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【００３３】
式（１）において、Ｆｃにより示されるＦｃタンパク質は、任意の動物（例、ニワトリ等の鳥類、哺乳動物）の抗体のＦｃ領域に由来する。好ましくは、Ｆｃタンパク質が由来する動物種は、哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジが挙げられるが、霊長類又は齧歯類が好ましく、霊長類がより好ましく、ヒトがさらにより好ましい。
【００３４】
Ｆｃタンパク質が由来する抗体としては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＹ、並びにこれらの抗体のＦｃ部分のハイブリッドが挙げられるが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥが好ましく、ＩｇＧがより好ましい。
【００３５】
特に好ましくは、Ｆｃタンパク質は、ヒトＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）である。
【００３６】
特定の実施形態では、Ｆｃタンパク質は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び挿入からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００３７】
上記（ｂ）のタンパク質において、１又は数個のアミノ酸残基についての変異の数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
【００３８】
上記（ｃ）のタンパク質において、アミノ酸配列の相同性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。相同性としては、例えば、同一性及び類似性が挙げられるが、同一性が好ましい。
【００３９】
アミノ酸配列の相同性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。アミノ酸配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。好ましくは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム検索において上記パラメータを用いて得られた値であってもよい。
【００４０】
上記（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質の調製のため、配列番号１のアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、Ｆｃタンパク質の機能（例、循環血中での長い半減期）を維持するように、１以上のアミノ酸残基の変異を適宜導入することができる。
【００４１】
上記（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質の調製のため、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００４２】
好ましくは、上記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質は、下記式（１−１）で表される。
【００４３】
【化７】
2017191817.tif 000009
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示し、
ベンゼン環は、さらに置換されていてもよい。〕
【００４４】
式（１−１）において、Ｌａ、Ｌｂ及びＦｃの定義、例及び好ましい例は、式（１）と同じである。
【００４５】
式（１−１）において、ベンゼン環は、任意の位置にＮ３−Ｌａ−の基を有するが、好ましくは、−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ−Ｌｂ−Ｆｃの基に対してメタ位又はパラ位に有する。ベンゼン環が置換されている場合、置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【００４６】
より好ましくは、式（１−１）において、ベンゼン環は、−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ−Ｌｂ−Ｆｃの基に対してパラ位にＮ３−Ｌａ−の基を有する。
【００４７】
本発明はまた、上記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法を提供する。本方法は、フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、下記式（２）で表される、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、下記式（３）で表される、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、上記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質を生成することを含む。
【００４８】
Ｎ３−Ｌａ−Ｐｈｅ  （２）
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体を示す。〕
【００４９】
Ｌｂ−Ｆｃ  （３）
〔式中、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕
【００５０】
式（２）において、Ｌａにより示される２価の基の定義、例及び好ましい例は、式（１）と同じである。
【００５１】
式（２）において、Ｐｈｅにより示されるフェニルアラニンの誘導体は、フェニルアラニンの側鎖部分（ベンジル基）に１〜５個、１〜３個、又は１若しくは２個の置換基を有するフェニルアラニンである。置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。下記式（２）で表される、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体としては、非常に多数の誘導体が知られている。したがって、本発明では、このような誘導体を適宜合成することができ、また、市販品を利用することもできる。
【００５２】
好ましくは、上記式（２）で表される、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体は、下記式（２−１）で表される。
【００５３】
【化８】
2017191817.tif 000010
〔式中、
Ｎ３は、アジド基を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
ベンゼン環は、さらに置換されていてもよい。〕
【００５４】
式（２−１）において、Ｌａにより示される２価の基の定義、例及び好ましい例は、式（１）と同じである。
【００５５】
式（２−１）において、ベンゼン環は、任意の位置にＮ３−Ｌａ−の基を有するが、好ましくは、−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨの基に対してメタ位又はパラ位に有する。ベンゼン環が置換されている場合、置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【００５６】
より好ましくは、式（２−１）において、ベンゼン環は、−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨの基に対してパラ位にＮ３−Ｌａ−の基を有する。
【００５７】
式（３）において、Ｌｂにより示されるペプチドリンカーの定義、例及び好ましい例は、式（１）と同じである。
【００５８】
式（３）において、Ｆｃにより示されるＦｃタンパク質の定義、例及び好ましい例は、式（１）と同じである。
【００５９】
式（３）で表される、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質は、任意の方法により調製することができる。このような方法としては、例えば、（１）リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質のＮ末端リジン残基又はアルギニン残基に対して分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を培養細胞において発現させ、分泌シグナルペプチドが切断された、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質を培地から回収する方法（例、国際公開第２００２／０８１６９４号；国際公開第２００５／１０３２７８号；国際公開第２０１４／１２６２６０号を参照）、（２）リジン残基又はアルギニン残基をＦｃタンパク質のＮ末端アミノ酸残基に対して付加する方法（例、米国特許第７，４０４，９５６号明細書；Ｐｒｏｃ．Ｊａｐ．Ａｃａｄ．Ｓｅｒ．Ｂ，２０１１，６０３を参照）、（３）Ｆｃタンパク質のＮ末端アミノ酸残基に対してペプチドが付加されたタンパク質をプロテアーゼにより切断して、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質を得る方法が挙げられる。
【００６０】
フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いた反応（図１の反応Ａを参照）により、タンパク質のＮ末端に存在するリジン残基若しくはアルギニン残基に対して、フェニルアラニン又はその誘導体をアミド結合により付加することができる。このような反応は、ＮＥＸＴ−Ａ反応として知られている（例、特開２００９−１０６２６７号公報、特開２００９−１０６２６８号公報、国際公開第２０１１／０２４８８７号）。
【００６１】
フェニルアラニルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｈｅ）は、既報（例、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９，２４６０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９６，９０７）にしたがい調製することができる。あるいは、ｔＲＮＡＰｈｅは、市販のものを購入して入手してもよい。
【００６２】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、既報（例、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９，２４６０；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，５６５２；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １９９１，９９；Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，２３５−２３７）にしたがい調製することができる。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素としては、フェニルアラニン又はその誘導体に対して基質特異性を有する野生型のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ならびにフェニルアラニン又はその誘導体に対して特異性が高められたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を用いることができる。例えば、大腸菌由来フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｈｅＲＳ）変異体（例、Ａｌａ２９４→Ｇｌｙ変異体、Ａｌａ３５６→Ｔｒｐ変異体、Ｔｈｒ２５１→Ａｌａ変異体、もしくは、Ｇｌｙ３１８→Ｔｒｐ変異体のいずれか、またはこれらの多重変異体）を用いることができる。あるいは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、市販のものを購入して入手してもよい。
【００６３】
ロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素（Ｌ／Ｆ転移酵素）は、ｔＲＮＡＰｈｅに結合しているフェニルアラニン又はその誘導体を、Ｎ末端にリジン残基又はアルギニン残基を有するタンパク質に転移する能力を有する。ロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素は、既報（例、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００６，１６７６；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，２０６３１；Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，７１９−７２２）にしたがい調製することができる。
【００６４】
フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いた反応は、補酵素（ＡＴＰ）、塩類などを含む適切な緩衝液等の水系媒体中で行うことができる。緩衝液としては、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。例えば、このような反応は、ＭｇＣｌ２、Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅを含むＨＥＰＥＳ緩衝液と、ＡＴＰを含む溶液との混合液を用いて行うことができる。
【００６５】
反応で用いられる、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体、及びリジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質の量は適宜設定することができる。リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質に対して、例えば１〜５０００当量、好ましくは１〜５００当量、より好ましくは２〜５０当量の、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を用いることができる。
【００６６】
反応温度、反応ｐＨおよび反応時間などの反応条件については、タンパク質の変性を回避できる穏やかな条件を適宜設定することができる。反応温度は、例えば、約４℃〜４０℃、好ましくは約１５℃〜３７℃である。反応ｐＨは、例えば、約６〜９、好ましくは約６．５〜８．５であり、より好ましくは７〜８である。反応時間は、反応温度及び反応ｐＨの条件、並びに生成物の所望される量に応じて適宜設定することができる。
【００６７】
（２．目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体、及びその製造方法）
本発明はさらに、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体を提供する。
【００６８】
本発明のＦｃタンパク質誘導体は、下記式（４）で表される。
【００６９】
【化９】
2017191817.tif 000011
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｐｈｅは、フェニルアラニン又はその誘導体の残基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕
【００７０】
式（４）において、Ｐｈｅ及びＬｂ間の結合、並びにＬｂ及びＦｃ間の結合は、アミド結合である。よって、上記式（４）におけるＰｈｅ−Ｌｂ−Ｆｃの部分は、その構成アミノ酸残基がアミド結合で連結されたポリペプチド構造を示す。
【００７１】
式（４）において、Ｓにより示される目的物質は、２以上の構成単位が連結したポリマー系物質、又は非ポリマー系物質であり、ポリマー系物質が好ましい。ポリマー系物質は、同じ構成単位が連結したホモポリマー系物質、又は異なる構成単位が連結したヘテロポリマー系物質である。ポリマー系物質における構成単位数は、２以上である限り特に限定されないが、好ましくは５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上又は３０以上である。ポリマー系物質における構成単位数はまた、例えば、５００以下、３００以下、２００以下、１００以下又は５０以下であってもよい。ポリマー系物質としては、例えば、ペプチド、サッカリド、及びヌクレオチドが挙げられる。本発明において目的物質として用いられるペプチドとしては、例えば、オリゴペプチド（例、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド）、及びポリペプチドが挙げられる。ペプチドは、上述したような２０種のＬ−α−アミノ酸及びそれ以外の任意のアミノ酸（例、Ｄ−アミノ酸）から構成されていてもよい。ペプチドはまた、直鎖、分岐鎖、または環状であってもよい。ペプチドは、サッカリド等の分子により修飾されていてもよい。本発明において目的物質として又はペプチドの修飾に用いられるサッカリドとしては、例えば、オリゴサッカリド（例、ジサッカリド、トリサッカリド、テトラサッカリド）、及びポリサッカリドが挙げられる。サッカリドはまた、リガンド等の機能性サッカリドであってもよい。本発明において目的物質として用いられるヌクレオチドとしては、例えば、オリゴヌクレオチド（例、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド）、及びポリヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドとしては、例えば、天然ヌクレオチド（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、及び非天然ヌクレオチド（例、ペプチド核酸、ロック型核酸、架橋型核酸、ホスホロチオエート核酸）が挙げられる。ヌクレオチドはまた、アンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核酸アプタマー（例、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー）等の機能性ヌクレオチドであってもよい。目的物質はまた、医薬、又は試薬であってもよい。
【００７２】
目的物質がペプチドである場合、ペプチドとしては、生理活性ポリペプチドが好ましい。このような生理活性ポリペプチドとしては、例えば、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、酵素、抗体、増殖因子、転写調節因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質、血液因子、及びペプチド医薬が挙げられる。より具体的には、このような生理活性ポリペプチドとしては、例えば、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン様ペプチド（例、ＧＬＰ−１（前駆体、ならびに成熟体および中間体等の誘導体を含む。例、特許第４５４８３３５号公報）、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、Ｇタンパク質共役受容体、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞怪死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍怪死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖化赤血球生成因子、アンジオポイエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リレキシン、シクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体断片が挙げられる。Ｆｃタンパク質との融合タンパク質として、このような生理活性ポリペプチドを適宜用いることができる（例、特許第５０２０９３４号公報を参照）。上記グルカゴン様ペプチドの好ましい例としては、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（１−３７）が挙げられる（特許第４５４８３３５号公報）。
【００７３】
式（４）において、Ｌにより示される２価の基は、目的物質Ｓと環Ａを連結する直鎖、分岐鎖、若しくは環状の基、又はこれらの組み合わせからなる基である。Ｌにより示される２価の基は、置換基を有していてもよい。Ｌにより示される２価の基としては、例えば、２価の炭化水素基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−（Ｒは水素原子、又は置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ−（Ｒは水素原子、又は置換基を示す）、２価の複素環基、及びこれらの２以上（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）の組み合わせからなる基が挙げられる。Ｌは、環Ａにおける任意の原子、例えば環構成原子に結合するが、好ましくは、トリアゾールと共有している炭素原子とは異なる環構成原子に結合する。
【００７４】
２価の炭化水素基としては、直鎖、分岐鎖、又は環状の２価の炭化水素基であり、好ましくは直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基である。このような２価の炭化水素基としては、例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンが挙げられる。
【００７５】
Ｌにより示される２価の基の例であるアルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンの定義、例及び好ましい例は、Ｌａにより示される２価の基の例であるアルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンのものと同じである。
【００７６】
アリーレンとしては、炭素原子数６〜２４のアリーレンが好ましく、炭素原子数６〜１８のアリーレンがより好ましく、炭素原子数６〜１４のアリーレンがさらに好ましく、炭素原子数６〜１０のアリーレンがさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アリーレンとしては、例えば、フェニレン（例、フルオロベンゼン試薬を用いて式（４）で表されるＦｃタンパク質誘導体を製造した場合）、ナフチレン、アントラセニレンが挙げられる。
【００７７】
Ｌにより示される２価の基の例である−ＮＲ−及び−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ−におけるＲにより示される置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。
【００７８】
Ｌにより示される２価の基の例である２価の複素環基は、２価の芳香族複素環基、又は２価の非芳香族複素環基である。複素環を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
【００７９】
２価の芳香族複素環基としては、炭素原子数３〜２１の２価の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数３〜１５の２価の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数３〜９の２価の芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数３〜６の２価の芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の芳香族複素環基としては、例えば、ピレンジイル、ピロールジイル、フランジイル、チオフェンジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアジンジイル、ピロリンジイル、ピペリジンジイル、トリアゾールジイル、プリンジイル、アントラキノンジイル、カルバゾールジイル、フルオレンジイル、キノリンジイル、及びイソキノリンジイルが挙げられる。
【００８０】
２価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数３〜２１の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数３〜１５の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数３〜９の非芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数３〜６の非芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の非芳香族複素環基としては、例えば、２，５−ピロールジオンジイル（マレイミド試薬を用いて式（４）で表されるＦｃタンパク質誘導体を製造した場合）、３−ピロリン−２，５−ジオン−１，３−ジイル（ハロゲン化マレイミド試薬を用いてＦｃタンパク質誘導体を製造した場合）、ピロール−３−アリールチオ−２，５−ジオン−１，３−ジイル（アリールチオマレイミド試薬を用いてＦｃタンパク質誘導体を製造した場合）、オキシランジイル、アジリジンジイル、アゼチジンジイル、オキセタンジイル、チエタンジイル、ピロリジンジイル、ジヒドロフランジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキソランジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、イミダゾリジンジイル、オキサゾリジンジイル、ピペリジンジイル基、ジヒドロピランジイル、テトラヒドロピランジイル、テトラヒドロチオピランジイル、モルホリンジイル、チオモルホリンジイル、ピペラジンジイル、ジヒドロオキサジンジイル、テトラヒドロオキサジンジイル、ジヒドロピリミジンジイル、及びテトラヒドロピリミジンジイルが挙げられる。
【００８１】
好ましくは、２価の非芳香族複素環基は、２，５−ピロールジオンジイル、３−ピロリン−２，５−ジオン−１，３−ジイル、ピロール−３−アリールチオ−２，５−ジオン−１，３−ジイルである。
【００８２】
好ましくは、Ｌにより示される２価の基は、−Ｌ１−Ｌ２−（Ｌ１及びＬ２は、２価の基を示す。）である。
【００８３】
ここで、Ｌ１により示される２価の基としては、例えば、Ｌについて上述したような２価の基が挙げられるが、好ましくは、アリーレン又は２価の複素環基であり、より好ましくは、アリーレン又は２価の非芳香族複素環基であり、さらにより好ましくは、フェニルジイル、２，５−ピロールジオンジイル、３−ピロリン−２，５−ジオン−１，３−ジイル、ピロール−３−アリールチオ−２，５−ジオン−１，３−ジイルである。
【００８４】
Ｌ２により示される２価の基としては、例えば、２価の炭化水素基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−（Ｒは水素原子、又は置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ−（Ｒは水素原子、又は置換基を示す）、２価の複素環基、及びこれらの２以上（例えば２〜７、好ましくは２〜５、より好ましくは２又は３）の組み合わせからなる基が挙げられる。ここで、Ｌ２により示される２価の基の例である２価の炭化水素基、−ＮＲ−（Ｒは水素原子、又は置換基を示す）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ−（Ｒは水素原子、又は置換基を示す）、２価の複素環基の定義、例及び好ましい例は、Ｌにより示される２価の基の例であるものと同じである。
【００８５】
Ｌ、又はＬ１若しくはＬ２により示される２価の基は、置換基を有していてもよい。置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【００８６】
式（４）において、環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示す。環Ａの構成部分には、縮合しているトリアゾール環自体は含まれないが、トリアゾールと共有している炭素原子間二重結合の部分は含まれる。したがって、環Ａは、炭素原子間二重結合を有する環であるということができる。
【００８７】
環Ａは、単環、又は単環と他の環との縮合環である。環Ａは、置換基を有していてもよい。単環としては、同素環、又は酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含む複素環が好ましい。より好ましくは、単環は、同素環、又は酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含む複素環である。単環としては、５〜１２員の単環が好ましく、６〜１０員の単環がより好ましく、７〜９員の単環がさらにより好ましい。単環としては、非芳香族性の単環が好ましい。
【００８８】
環Ａが縮合環である場合、単環と縮合される他の環としては、例えば、シクロアルカン、アレーン、複素環が挙げられる。
【００８９】
シクロアルカンとしては、炭素原子数３〜２４のシクロアルカンが好ましく、炭素原子数６〜１８のシクロアルカンがより好ましく、炭素原子数３〜１４のシクロアルカンがさらに好ましく、炭素原子数３〜１０のシクロアルカンがさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。シクロアルカンとしては、例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタンが挙げられる。
【００９０】
アレーンとしては、炭素原子数６〜２４のアレーンが好ましく、炭素原子数６〜１８のアレーンがより好ましく、炭素原子数６〜１４のアレーンがさらに好ましく、炭素原子数６〜１０のアレーンがさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アレーンとしては、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセンが挙げられる。
【００９１】
複素環は、芳香族複素環、又は非芳香族複素環である。複素環を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
【００９２】
芳香族複素環としては、炭素原子数３〜２１の芳香族複素環が好ましく、炭素原子数３〜１５の芳香族複素環がより好ましく、炭素原子数３〜９の芳香族複素環がさらに好ましく、炭素原子数３〜６の芳香族複素環がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、芳香族複素環としては、例えば、ピレン、ピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、ピロリン、ピペリジン、トリアゾール、プリン、アントラキノン、カルバゾール、フルオレン、キノリン、及びイソキノリンが挙げられる。
【００９３】
非芳香族複素環としては、炭素原子数３〜２１の非芳香族複素環が好ましく、炭素原子数３〜１５の非芳香族複素環がより好ましく、炭素原子数３〜９の非芳香族複素環がさらに好ましく、炭素原子数３〜６の非芳香族複素環がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、非芳香族複素環としては、例えば、オキシラン、アジリジン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、ジオキソラン、テトラヒドロチオフェン、イミダゾリジン、オキサゾリジン、ピペリジン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ジヒドロオキサジン、テトラヒドロオキサジン、ジヒドロピリミジン、及びテトラヒドロピリミジンが挙げられる。
【００９４】
環Ａが有していてもよい置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【００９５】
好ましくは、環Ａは、７〜９員の単環、又は７〜９員の単環と他の環との縮合環である。このような環Ａの好適な例は、以下である（例、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，１１，６４３９、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１５，  ５４，  １１９０を参照）。
【００９６】
【化１０】
2017191817.tif 000012
〔式中、
Ｘ及びＹの一方は、ＣＨ２を示し、他方はＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示し、
Ｚは、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示し、
Ｖ及びＷは、同一又は異なって、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示す。〕
【００９７】
式（４）において、Ｌａ、Ｌｂ及びＦｃの定義、例及び好ましい例は、上記式（１）と同じである。
【００９８】
式（４）において、Ｐｈｅの定義、例及び好ましい例は、上記式（１）と同じである。よって、フェニルアラニン誘導体の有する置換基の例及び好ましい例もまた、上述したとおりである。置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【００９９】
好ましくは、上記式（４）で表されるＦｃタンパク質誘導体は、下記式（４−１）で表される。
【０１００】
【化１１】
2017191817.tif 000013
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環Ａは、トリアゾールと縮合している環を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕
【０１０１】
式（４−１）において、Ｓ、Ｌ、環Ａ、Ｌａ、Ｌｂ、及びＦｃの定義、例及び好ましい例は、式（４）のものと同じである。ベンゼン環は、置換基を有していてもよい。ベンゼン環が有していてもよい置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【０１０２】
より好ましくは、上記式（４）で表されるＦｃタンパク質誘導体は、下記式（４−２）で表される。
【０１０３】
【化１２】
2017191817.tif 000014
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環Ａ’は、トリアゾールと縮合している８員環を示し、
Ｘ及びＹの一方は、ＣＨ２を示し、他方はＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示し、
Ｒ１〜Ｒ４は、同一又は異なって、水素原子、又は置換基を示し、
あるいは、Ｒ１及びＲ２は一緒になって、置換基を有する環を形成していてもよく、Ｒ３及びＲ４は一緒になって、置換基を有する環を形成していてもよく、
環Ａ’における実線及び破線からなる二重線は、単結合又は二重結合を示し、
Ｌａは、結合又は２価の基を示し、
Ｌｂは、リジン残基若しくはアルギニン残基、又はリジン残基若しくはアルギニン残基をＮ末端に有する２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを示し、
Ｆｃは、Ｆｃタンパク質を示す。〕
【０１０４】
式（４−２）において、Ｓ、Ｌ、Ｌａ、Ｌｂ、及びＦｃの定義、例及び好ましい例は、式（４）のものと同じである。ベンゼン環は、置換基を有していてもよい。ベンゼン環が有していてもよい置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【０１０５】
環Ａ’において、Ｘ及びＹの一方は、ＣＨ２を示し、他方はＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示す。好ましくは、Ｘ及びＹの一方は、ＣＨ２を示し、他方はＣＨ２、又はＮＨを示す。
【０１０６】
好ましくは、Ｘ又はＹは、Ｌと連結されている。この場合、環Ａ’に結合するＳ−Ｌ−の基は、Ｘ又はＹと連結して、Ｓ−Ｌ−ＣＨ又はＳ−Ｌ−Ｎの構造を示してもよい。
【０１０７】
Ｒ１〜Ｒ４により示される置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。
【０１０８】
Ｒ１及びＲ２並びに／あるいはＲ３及びＲ４が一緒になって形成される環としては、例えば、上述したシクロアルカン、アレーン、及び複素環が挙げられる。シクロアルカン、アレーン、及び複素環の定義、例及び好ましい例は、上述したものと同じである。Ｒ１及びＲ２並びに／あるいはＲ３及びＲ４が一緒になって形成される環が有していてもよい置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【０１０９】
環Ａ’は、Ｒ１〜Ｒ４に加えて、追加置換基を有していてもよい。このような追加置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。追加置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【０１１０】
本発明はまた、上記式（４）で表されるＦｃタンパク質誘導体の製造方法を提供する。本方法は、下記式（５）で表される、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を、上記式（１）で表されるアジド基含有Ｆｃタンパク質と反応させて、上記式（４）で表されるＦｃタンパク質誘導体を生成することを含む。
【０１１１】
【化１３】
2017191817.tif 000015
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環ａは、炭素原子間３重結合を有する環を示す。〕
【０１１２】
式（５）において、Ｓ及びＬの定義、例及び好ましい例は、上記式（４）と同じである。
【０１１３】
環ａは、炭素原子間３重結合を有する環を示す。環ａは、単環、又は単環と他の環との縮合環である。環ａは、置換基を有していてもよい。単環としては、同素環、又は酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含む複素環が好ましい。より好ましくは、単環は、同素環、又は酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含む複素環である。単環としては、７〜１０員の単環が好ましく、７〜９員の単環がより好ましい。単環としては、非芳香族性の単環が好ましい。
【０１１４】
環ａが縮合環である場合、単環と縮合される他の環としては、例えば、シクロアルカン、アレーン、複素環が挙げられる。シクロアルカン、アレーン、複素環の定義、例及び好ましい例は、環Ａについての縮合環における他の環のものと同じである。
【０１１５】
環ａが有していてもよい置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【０１１６】
好ましくは、環ａは、７〜９員の単環、又は７〜９員の単環と他の環との縮合環である。このような環ａの好適な例は、以下である（例、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，１１，６４３９；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，１１９０；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１５０４６；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１１４８６；Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６，９７）。
【０１１７】
【化１４】
2017191817.tif 000016
〔式中、
Ｘ及びＹの一方は、ＣＨ２を示し、他方はＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示し、
Ｚは、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示し、
Ｖ及びＷは、同一又は異なって、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示す。〕
【０１１８】
好ましくは、上記式（５）で表される、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質は、下記式（５’）で表される、炭素原子間３重結合を有する８員環が付加されている目的物質である。
【０１１９】
【化１５】
2017191817.tif 000017
【０１２０】
〔式中、
Ｓは、目的物質を示し、
Ｌは、結合又は２価の基を示し、
環ａ’は、炭素原子間３重結合を有する８員環を示し、
Ｘ及びＹの一方は、ＣＨ２を示し、他方はＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、又はＳを示し、
Ｒ１〜Ｒ４は、同一又は異なって、水素原子、又は置換基を示し、
あるいは、Ｒ１及びＲ２は一緒になって、置換基を有する環を形成していてもよく、Ｒ３及びＲ４は一緒になって、置換基を有する環を形成していてもよく、
環Ａ’における実線及び破線からなる二重線は、単結合又は二重結合を示す。〕
【０１２１】
式（５’）において、Ｓ、Ｌ、Ｘ、Ｙ、及びＲ１〜Ｒ４の定義、例及び好ましい例は、式（４−２）のものと同じである。
【０１２２】
環ａ’は、Ｒ１〜Ｒ４に加えて、追加置換基を有していてもよい。このような追加置換基は、上述したフェニルアラニンの誘導体が有してもよい置換基と同様であり、好ましい範囲も同様である。追加置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個である。
【０１２３】
Ｆｃタンパク質誘導体の製造方法における反応は、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質、及びアジド基含有Ｆｃタンパク質と共存させることにより進行させることができる（図１の反応Ｂを参照）。これは、所定の環中の炭素原子間３重結合とアジド基が非酵素的に反応するためである。このような反応は、銅触媒の存在下又は非存在下で行うことができる。このような反応は、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応としても知られている。銅触媒は、反応効率を高めるために使用される。しかし、銅触媒の細胞毒性や生成物における残留を回避できることから、銅触媒の非存在下で反応を行うことが好ましい。環ａとして７〜９員の単環、又は７〜９員の単環と他の環との縮合環を用いる場合、銅触媒の非存在下で反応を効率的に行うことができる。このような反応は、Ｓｔｒａｉｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＡＡＣ）反応としても知られている（例、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，１１，６４３９；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，１１９０；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１５０４６；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１１４８６；Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６，９７）。本発明では、銅触媒の非存在下でも極めて高い反応効率が確認されている（例、実施例を参照）。
【０１２４】
Ｆｃタンパク質誘導体の製造方法は、目的物質を、炭素原子間３重結合を有する環を含む試薬と反応させて、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を生成することをさらに含んでいてもよい。このような試薬としては、例えば、マレイミド試薬、ハロゲン化マレイミド試薬、アルキルチオマレイミド試薬、フルオロベンゼン試薬が挙げられる。
【０１２５】
反応で用いられる、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質、及びアジド基含有Ｆｃタンパク質の量は適宜設定することができる。アジド基含有Ｆｃタンパク質に対して、例えば１〜１００当量、好ましくは１〜２０当量、より好ましくは１．５〜１０当量の、より好ましくは２〜５当量の、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を用いることができる。
【０１２６】
反応は、適切な緩衝液等の水系媒体中で行うことができる。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【０１２７】
反応温度、反応ｐＨおよび反応時間などの反応条件については、タンパク質の変性を回避できる穏やかな条件を適宜設定することができる。反応温度は、例えば、約４℃〜４０℃、好ましくは約１５℃〜３７℃である。反応ｐＨは、例えば、約６〜９、好ましくは約６．５〜８．５であり、より好ましくは７〜８である。反応時間は、反応温度及び反応ｐＨの条件、並びに生成物の所望される量に応じて適宜設定することができる。
【０１２８】
本発明はまた、以下の工程を含む、Ｆｃタンパク質誘導体の製造方法を提供する：
（Ａ）フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、アジド基含有Ｆｃタンパク質を生成すること；並びに
（Ｂ）炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質を、アジド基含有Ｆｃタンパク質と反応させて、Ｆｃタンパク質誘導体を生成すること。
【０１２９】
工程（Ａ）は、本発明に係るアジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法と同様にして行うことができる（図１の反応Ａを参照）。工程（Ａ）における、フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体、リジン残基又はアルギニン残基をＮ末端に有するＦｃタンパク質、及びアジド基含有Ｆｃタンパク質の定義、例及び好ましい例は、上述したとおりである。
【０１３０】
工程（Ｂ）は、本発明に係るＦｃタンパク質誘導体の製造方法と同様にして行うことができる（図１の反応Ｂを参照）。工程（Ｂ）における、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質、アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びＦｃタンパク質誘導体の定義、例及び好ましい例は、上述したとおりである。
【０１３１】
工程（Ａ）及び（Ｂ）は、別々に行うことができる。あるいは、工程（Ａ）及び（Ｂ）は、同時に行こともできる。工程（Ａ）及び（Ｂ）の反応は、いずれも水系媒体中で、タンパク質の変性を回避できる穏やかな条件で行うことができる点で共通するためである。したがって、工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む本発明の方法は、ワンポット反応で行われてもよい。
【０１３２】
本発明のＦｃタンパク質誘導体は、例えば、医薬又は試薬として有用である。したがって、本発明のＦｃタンパク質誘導体は、医薬組成物の形態で提供されてもよい。このような医薬組成物は、本発明のＦｃタンパク質誘導体に加えて、医薬上許容され得る担体を含んでいてもよい。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明のＦｃタンパク質誘導体は、Ｆｃタンパク質部分を有することから、ヒト等の動物の体内において高い安定性を有することができる。本発明のＦｃタンパク質誘導体はまた、Ｆｃタンパク質との融合に加えて、さらなる安定性を実現する任意の修飾（例、ＰＥＧ化）を有していてもよい。
【０１３３】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の有効成分を溶解させた液剤、有効量の有効成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は、非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与）に好適である。このような非経口的な投与に好適な医薬組成物としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
【０１３５】
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、適宜設定することができる。
【０１３６】
（３．１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを有するＦｃタンパク質）
本発明は、１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをＮ末端に有する、Ｆｃタンパク質を提供する。
【０１３７】
上記ペプチドリンカーの定義、例及び好ましい例は、１６個のアミノ酸残基からなるものである点を除き、上記（１．アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びその製造方法）で述べたものと同じである。
【０１３８】
Ｆｃタンパク質の定義、例及び好ましい例は、上記（１．アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びその製造方法）で述べたものと同じである。
【０１３９】
本発明はまた、Ｎ末端アミノ酸残基がリジン残基又はアルギニン残基である１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体残基をＮ末端に有する、アジド基含有Ｆｃタンパク質を提供する。
【０１４０】
本発明はさらに、上記アジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法を提供する。本製造方法は、フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素を用いて、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体を、前記ペプチドリンカーをＮ末端に有するＦｃタンパク質と反応させて、前記アジド基含有Ｆｃタンパク質を生成することを含む。
【０１４１】
上記アジド基含有Ｆｃタンパク質及びその製造方法における上記ペプチドリンカーの定義、例及び好ましい例は、１６個のアミノ酸残基からなるものである点を除き、上記（１．アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びその製造方法）で述べたものと同じである。
【０１４２】
上記アジド基含有Ｆｃタンパク質及びその製造方法における、Ｆｃタンパク質、アジド基を含有するフェニルアラニン誘導体、及びアジド基含有Ｆｃタンパク質の定義、例及び好ましい例は、上記（１．アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びその製造方法）で述べたものと同じである。
【０１４３】
上記アジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法で用いられる、フェニルアラニルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びロイシル／フェニルアラニルｔＲＮＡ転移酵素の定義、例及び好ましい例は、上記（１．アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びその製造方法）で述べたものと同じである。上記アジド基含有Ｆｃタンパク質の製造方法は、上記（１．アジド基含有Ｆｃタンパク質、及びその製造方法）で述べたものと同様にして行うことができる。
【実施例】
【０１４４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１４５】
実施例１：Ｎ末端にシステイン残基を有するＦｃタンパク質（Ｃｙｓ−Ｆｃ）の調製
ＨＥＫ２９３細胞にてＣｙｓ−Ｆｃ（配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトＩｇＧ１由来ポリペプチド）の発現を行なった。ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を導入した発現ベクターでＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地中で形質転換した。配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にリーダー配列〔ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号３）〕が付加されたタンパク質をコードする。形質転換細胞から分泌されるタンパク質は、リーダー配列直後のシグナル切断部位で切断されるので、培養上清中にはＣｙｓ−Ｆｃ（配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド）が分泌される。得られた形質転換細胞を、３７℃、ＣＯ２濃度８％の条件下で５日間回転培養（１２５ｒｐｍ）した。遠心分離により培養上清を取得し、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ  （１ｍＬ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製した。その溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ、還元条件下、Ｂｉｏ−ｓａｆｅ  ＣＢＢ  Ｇ−２５０染色）で分析した結果を図２に示す。また、得られたＣｙｓ−Ｆｃを、以下の手順によりＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。得られたＣｙｓ−ＦｃをＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルに従って糖鎖切断を行なった。Ｃｙｓ−Ｆｃ（４０μｇ）の溶液にキット添付のＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ２（１０ｘ、８μＬ）を添加し、水を添加して８０μＬとした。ここに、水で１０倍希釈したＰＮＧａｓｅ  Ｆ溶液を４μＬ加え、混合した後に３７℃で２４時間インキュベートした。ここに終濃度０．２％となるようＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、これを限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００，１０ｋ  ＭＷＣＯ）を用いて２０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）へ緩衝液置換した。その溶液５μＬに２ｍＭ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）水溶液（３．５μＬ）と水（１１．５μＬ）を加えて混合し、室温にて１時間静置した後にＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。結果を以下に示す。
Ｃｙｓ−Ｆｃの分子量：
理論値：２４８３６．９
実測値：２４８３４．５【０１４６】
実施例２：ペプチドリンカーチオエステルの調製
下記に示したペプチドリンカーチオエステルは、全て同様の方法にて調製した。Ｆｍｏｃ法による２−クロロトリチル樹脂を用いたペプチド固相合成によって、Ｎ末端Ｂｏｃ保護の保護ペプチドを調製し、２０％ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）／ジクロロメタン溶液にて保護ペプチドを切り出した。これを濃縮し、ジクロロメタン溶液とした上で、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（１０モル当量）、ＤＩＰＣＩ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）（１０モル当量）、チオフェノール（３０モル当量）、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）（１０モル当量）を加え、室温にて２晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後に濃縮した。この反応混合物をＴＦＡ／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／水＝９５／２．５／２．５に溶解させ、室温にて３時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後に、ジクロロメタンと水を加えて混合し、水層を分取ＨＰＬＣにて精製し、ペプチドリンカーチオエステルを取得した。【０１４７】
ペプチドリンカーチオエステル
Ｆｃ（４）用リンカー：                          ＫＴＨＴ（配列番号４）−ＳＰｈ
Ｆｃ（８）用リンカー：                  ＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号５）−ＳＰｈ
Ｆｃ（１２）用リンカー：        ＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号６）−ＳＰｈ
Ｆｃ（１３）用リンカー：      ＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号７）−ＳＰｈ
Ｆｃ（１６）用リンカー：ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号８）−ＳＰｈ
（Ｐｈは、フェニルを示し、ＳＰｈは、フェニルチオを示す）【０１４８】
実施例３：Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質の調製
Ｆｃタンパク質は、特許文献（米国特許第７，４０４，９５６号明細書）および非特許文献（Ｐｒｏｃ．Ｊａｐ．Ａｃａｄ．Ｓｅｒ．Ｂ，２０１１，６０３）に従って調製した。１．０ｍＭ  ＴＣＥＰ−ＨＣｌと１０ｍＭ  ＭＰＡＡ（４−メルカプトフェニル酢酸）を含む５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に、０．０２ｍＭ  Ｃｙｓ−Ｆｃ（実施例１で調製したもの）と０．４ｍＭ  ペプチドリンカーチオエステル（実施例２で調製したもの）を溶解し、２５℃にて１晩混合した。反応液をＶｉｖａｓｐｉｎ  ５００（１０ｋ  ＭＷＣＯ，  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）にて２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に置換し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（１ｍＬ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製した。【０１４９】
実施例３で得られた、Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質は、以下のとおりである。
Ｆｃ（４）：ＫＴＨＴ（配列番号４）−Ｆｃタンパク質（配列番号１）
Ｆｃ（８）：ＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号５）−Ｆｃタンパク質（配列番号１）
Ｆｃ（１２）：ＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号６）−Ｆｃタンパク質（配列番号１）
Ｆｃ（１３）：ＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号７）−Ｆｃタンパク質（配列番号１）
Ｆｃ（１６）：ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号８）−Ｆｃタンパク質（配列番号１）
（ペプチドリンカーとＦｃタンパク質はアミド結合を介して結合している。ペプチドリンカーチオエステルとＦｃタンパク質のＮ末端システイン残基のアミノ基とが反応して、アミド結合を生じるためである。）【０１５０】
実施例４：酵素およびｔＲＮＡの調製
Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質とフェニルアラニン誘導体との反応に用いる二種の酵素およびｔＲＮＡを調製した。具体的には、Ｌｅｕｃｙｌ／ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｌ／Ｆ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、非特許文献（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００６，１６７６；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，２０６３１）記載の方法で調製した。Ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔａｔｅｄ  ＡＲＳは、非特許文献（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９，２４６０；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，５６５２；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １９９１，９９）に従って調製した。ｔＲＮＡＰｈｅは、非特許文献（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９，２４６０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９６，９０７）に従って調製した。【０１５１】
実施例５：Ｆｃタンパク質のＮ末端配列による反応性の違い
（５−１）炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質の調製
ＰＥＧを目的物質として、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質（ＰＥＧ−ＤＩＢＡＣ）を以下の手順で調製した。ＤＩＢＡＣ  ａｃｉｄ（５−（５，６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−１１，１２−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎ−５（６Ｈ）−ｙｌ）−５−ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）１６．１ｍｇをジクロロメタン１ｍＬに溶解し、ＥＤＣ−ＨＣｌ  １４．７ｍｇ、ＨＯＢｔ−Ｈ２Ｏ  １１．７ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  １７．５μＬを加え、メトキシポリエチレングリコールプロピルアミン（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ）１０２．２ｍｇを加え、室温にて一晩混合した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水にて洗浄した後に溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、ＰＥＧ−ＤＩＢＡＣを９４ｍｇ取得した。【０１５２】
（５−２）アジド基含有Ｆｃタンパク質の調製
反応容器に、溶液Ａ（５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン）４μＬと溶液Ｂ（２５ｍＭ  ＡＴＰ、２００ｍＭ  ＫＣｌ）４μＬを取り、ここにｔＲＮＡＰｈｅ水溶液（０．１０  Ｏ．Ｄ．／μＬ）２μＬ、ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔａｎｔ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ溶液（１７．８μＭ）４．５μＬ、Ｌ／Ｆ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（３９μＭ）２．１μＬ、４−アジドフェニルアラニン（１ｍＭ）１４．５μＬ、水３．４μＬを加え、混合した。ここに実施例３で得られた各種鎖長の上記ペプチドリンカーを有するＦｃタンパク質溶液（１．２〜２．３ｍｇ／ｍＬ）を５．５μＬ加えて混合し、３７℃にて５時間振とうした。これにより、４−アジドフェニルアラニンと上記Ｆｃタンパク質とが反応したアジド基含有Ｆｃタンパク質が得られた。【０１５３】
（５−３）目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の調製
（５−２）で得られた反応液に（５−１）で得られたＰＥＧ−ＤＩＢＡＣのＤＭＳＯ溶液（２ｍＭ）３０μＬを加え、２５℃にて一晩振とうした。これにより、アジド基含有Ｆｃタンパク質とＰＥＧ−ＤＩＢＡＣとが反応してＰＥＧ化Ｆｃタンパク質が生成した（ＤＩＢＡＣに対するアジド基の付加様式は下記式に示す２とおりが考えられる）。【０１５４】
【化１６】
2017191817.tif 000018
【０１５５】
得られた反応混合物をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ａｓｐｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ，４〜２０％，ＢＩＯ−ＲＡＤ）にて分析した結果を、図３に示す。【０１５６】
その結果、Ｎ末端にあるペプチドリンカーの長さが４〜１６アミノ酸残基長であるＦｃタンパク質はいずれもフェニルアラニン誘導体（４−アジドフェニルアラニン）との反応、その後のＰＥＧ−ＤＩＢＡＣとの反応の全体をとおして７０％以上の高い変換率を示しつつも、ペプチドリンカーの長さにより変換率が異なる傾向が認められた（図３）。Ｎ末端にあるペプチドリンカーの長さが１６アミノ酸残基長であるＦｃ（１６）は９０％という極めて高い変換率を示した（図３）。【０１５７】
比較例１：Ｓ−アルキル化反応による、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法
目的物質として、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ−Ｃｙｓ：Ｅｘｅｎａｔｉｄｅというペプチド医薬のＣ末端にシステインを付加したペプチド）を、ペプチド固相合成法により調製した。【０１５８】
反応容器に、溶液Ａ（５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン）８μＬと溶液Ｂ（２５ｍＭ  ＡＴＰ、２００ｍＭ  ＫＣｌ）８μＬを取り、ここにｔＲＮＡＰｈｅ水溶液（０．１０  Ｏ．Ｄ．／μＬ）４μＬ、ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔａｎｔ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ溶液（１７．８μＭ）  ９μＬ、Ｌ／Ｆ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （３９μＭ）  ４．１μＬ、４−（クロロアセトアミド）フェニルアラニン（１１ｍＭ）  ２９μＬ、水  ９．５μＬを加え、混合した。ここにＦｃ（１６）溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を８．３μＬ加えて混合し、３７℃にて５時間振とうした。これにより、４−（クロロアセトアミド）フェニルアラニンとＦｃ（１６）とが反応したクロロアセトアミド基含有Ｆｃタンパク質が得られた。【０１５９】
【化１７】
2017191817.tif 000019
【０１６０】
得られた反応混合物をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ａｓｐｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ  ７．５に緩衝液置換し、限外濾過にて２５μＬに濃縮した。ここにペプチド（配列番号９）の水溶液（１８ｍＭ）を５μＬ（クロロアセトアミド基含有Ｆｃタンパク質の量に対して１００当量のペプチド（配列番号９）を含有）を加えて混合し、２５℃にて４日間振とうした。これにより、クロロアセトアミド基含有Ｆｃタンパク質とペプチド（配列番号９）とが反応した、ペプチド（配列番号９）が付加されたＦｃタンパク質誘導体が得られた。【０１６１】
【化１８】
2017191817.tif 000020
【０１６２】
得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ，４〜２０％，ＢＩＯ−ＲＡＤ；還元条件下；ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙにより染色）にて分析した結果を、図４に示す。【０１６３】
その結果、Ｓ−アルキル化反応によるＦｃタンパク質の反応効率は、Ｆｃタンパク質の量に対して約１００当量のペプチドを用いた場合、４９％であった（図４）。【０１６４】
実施例６：ＳＰＡＡＣ反応による、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法
（６−１）アジド基含有Ｆｃタンパク質の調製
反応容器に、溶液Ａ（５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン）１６μＬと溶液Ｂ（２５ｍＭ  ＡＴＰ、２００ｍＭ  ＫＣｌ）１６μＬを取り、ここにｔＲＮＡＰｈｅ水溶液（０．１０  Ｏ．Ｄ．／μＬ）８μＬ、ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔａｎｔ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ溶液（１７．８μＭ）  １８μＬ、Ｌ／Ｆ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（３９μＭ）８．２μＬ、４−アジドフェニルアラニン（１１ｍＭ）５８．２μＬ、水１９μＬを加え、混合した。ここにＦｃ（１６）溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を１６．６μＬ加えて混合し、３７℃にて６時間振とうした。これにより、下記式に示す４−アジドフェニルアラニンとＦｃ（１６）とが反応したアジド基含有Ｆｃタンパク質が得られた。【０１６５】
【化１９】
2017191817.tif 000021
【０１６６】
得られた反応混合物をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ａｓｐｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に緩衝液置換し、限外濾過にて６５μＬに濃縮した。アジド基含有Ｆｃタンパク質の溶液をＡ２８０法により定量したところ、０．４９ｍｇ／ｍＬであった。【０１６７】
また、ここで用いたＦｃ（１６）、およびここで調製したアジド基含有Ｆｃタンパク質を、以下の手順によりＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。Ｆｃ（１６）およびアジド基含有Ｆｃタンパク質をそれぞれＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルに従って糖鎖切断を行なった。それぞれの化合物（４０μｇ）の溶液にキット添付のＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ２（１０ｘ、８μＬ）を添加し、水を添加して８０μＬとした。ここに、水で１０倍希釈したＰＮＧａｓｅ  Ｆ溶液を４μＬ加え、混合した後に３７℃で２４時間インキュベートした。ここに終濃度０．２％となるようＴＦＡを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、これを限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００，１０ｋ  ＭＷＣＯ）を用いて２０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）へ緩衝液置換した。その溶液５μＬに２ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（３．５μＬ）と水（１１．５μＬ）を加えて混合し、室温にて１時間静置した後にＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。結果を以下に示す。
Ｆｃ（１６）の分子量：
理論値：２６６４５．９
実測値：２６６４３．８
アジド基含有Ｆｃタンパク質の分子量：
理論値：２６８３４．１
（アジド基還元体の理論値：２６８０８．１）
実測値：２６８０５．７【０１６８】
（６−２）炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質の調製
配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチドを目的物質として、炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質（ペプチド−ＤＢＣＯ付加体）を以下の手順で調製した。配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド７．６ｍｇに、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）８１８μＬを加え、ここにＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）−マレイミド（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，４０ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）８８μＬを加えて混合し、２５℃にて４時間振とうした。これを限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，  ３ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮と水希釈を４回繰り返し、得られた水溶液を凍結乾燥してペプチド−ＤＢＣＯ付加体を７．１ｍｇ取得した。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）  ｍ／ｚ；１５７２．５、１１７９．９、９４４．０、７８６．９【０１６９】
（６−３）目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の調製
（６−１）で取得したアジド基含有Ｆｃタンパク質の溶液４μＬに、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）７．６μＬと、（６−２）で取得した０．１０ｍＭペプチド（配列番号９）−ＤＢＣＯ付加体溶液１．５μＬ（アジド基含有Ｆｃタンパク質の量に対して２当量のペプチド（配列番号９）−ＤＢＣＯ付加体を含有）を加え、２５℃にて一晩振とうした。これにより、アジド基含有Ｆｃタンパク質とペプチド（配列番号９）−ＤＢＣＯ付加体とが反応した、ペプチド（配列番号９）が付加されたＦｃタンパク質誘導体が得られた（ＤＢＣＯに対するアジド基の付加様式は下記式に示す２とおりが考えられる）。【０１７０】
【化２０】
2017191817.tif 000022
【０１７１】
得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ，４〜２０％，ＢＩＯ−ＲＡＤ；還元条件下；ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙにより染色）にて分析した結果を、図５に示す。また、得られたペプチド（配列番号９）が付加されたＦｃタンパク質誘導体を、以下の手順によりＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。得られたペプチド（配列番号９）が付加されたＦｃタンパク質誘導体をＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルに従って糖鎖切断を行なった。ペプチド（配列番号９）が付加されたＦｃタンパク質誘導体（４０μｇ）の溶液にキット添付のＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ２（１０ｘ、８μＬ）を添加し、水を添加して８０μＬとした。ここに、水で１０倍希釈したＰＮＧａｓｅ  Ｆ溶液を４μＬ加え、混合した後に３７℃で２４時間インキュベートした。ここに終濃度０．２％となるようＴＦＡを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、これを限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００，  １０ｋ  ＭＷＣＯ）を用いて２０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐＨ  ６．５）へ緩衝液置換した。その溶液５μＬに２ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（３．５μＬ）と水（１１．５μＬ）を加えて混合し、室温にて１時間静置した後にＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。結果を以下に示す。
ペプチド（配列番号９）が付加されたＦｃタンパク質誘導体の分子量：
理論値：３１５５１．３
（加水分解体の理論値：３１５６９．３）
実測値：３１５６７．３【０１７２】
その結果、ＳＰＡＡＣ反応によるアジド基含有Ｆｃタンパク質の反応効率は、アジド基含有Ｆｃタンパク質の量に対して２当量という少量のペプチドを用いた場合であっても、１００％という極めて高い値を示した（図５）。【０１７３】
実施例７：培養細胞を用いた、Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質（Ｌｙｓ−Ｆｃ）の調製
（７−１）ＹＤＫ０１０７株の構築
国際公開第２０１４／１２６２６０号に記載の、生理活性ペプチドであるＴｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅの分泌発現プラスミドｐＰＫＫ５０ＴＥＶ−Ｔｅｒｉを用いて、国際公開第２００２／０８１６９４号に記載のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０株を形質転換した。なお、ｐＰＫＫ５０ＴＥＶ−Ｔｅｒｉは生理活性ペプチドであるＴｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅの分泌発現用ベクターであって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９株のｃｓｐＢ遺伝子のプロモーター領域、同プロモーターの下流に発現可能に連結された同株のＣｓｐＢシグナルペプチド、同株の成熟ＣｓｐＢのＮ末端５０アミノ酸残基、ＰｒｏＴＥＶプロテアーゼの認識配列ＥＮＬＹＦＱ（配列番号１０）、およびＴｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅの融合タンパク質（以下、ＣｓｐＢ５０ＴＥＶ−Ｔｅｒｉと表記する）をコードする塩基配列を有するプラスミドである（国際公開第２０１４／１２６２６０号）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０株は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４）の細胞表層タンパク質ＣｓｐＢの欠損株である（国際公開第２００２／０８１６９４号）。得られた形質転換体を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＣＭＤｅｘ寒天培地（グルコース  ５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．４ｇ、硫酸鉄七水和物  ０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物  ０．０１ｇ、リン酸二水素カリウム  １ｇ、ビオチン  １０μｇ、ＤｉｆｃｏＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）  １０ｇ、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）  １０ｇ、尿素  ３ｇ、大豆塩酸加水分解液（全窒素量  １．２ｇ）、寒天抹  ２０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ６．５に調整）上で３０℃で培養してコロニーを形成させた。【０１７４】
培養後、ｐｈｏＳ遺伝子に変異が導入された自然変異株を選択し、ＹＤＫ０１０７株と命名した。【０１７５】
（７−２）ｐＰＫ６ベクターの構築
（ａ）ｐＰＫ４ベクター中のＮａｅＩ認識サイトを改変したベクター（ｐＰＫ５）の構築
特開平９−３２２７７４号公報に記載のｐＰＫ４の中には、制限酵素ＮａｅＩの認識配列が一ヵ所存在する。この配列を改変するため、ＮａｅＩ認識配列ｇｃｃｇｇｃをｇｃａｇｇｃに改変した配列とｐＰＫ４におけるその周辺配列を含む配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマーを合成した。次に、ｐＰＫ４を鋳型として、配列番号１１と配列番号１２に記載のプライマーを用いて、約５．６ｋｂｐのプラスミド全長をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用い、反応条件は９５℃  ５分、（９５℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １２分）ｘ１２ｃｙｃｌｅで行った。【０１７６】
次に、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、メチル化されている鋳型ＤＮＡを消化した。Ｄｐｎ  Ｉ消化後に得られた非メチル化プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。塩基配列決定の結果、予想通りＮａｅＩ認識サイトが改変されたプラスミドが構築されていることを確認した。塩基配列の決定はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。こうして得られた、ｐＰＫ４ベクター中のＮａｅＩ認識サイトを改変したベクターをｐＰＫ５と名付けた。【０１７７】
（ｂ）ｐＰＫ５ベクターにｔａｔＡＢＣ遺伝子を搭載したベクター（ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣ）の構築
次に、国際公開第２００５／１０３２７８号に記載のＴａｔ系分泌装置の増幅プラスミドであるｐＶｔａｔＡＢＣを鋳型にして、配列番号１３および配列番号１４に記載のプライマーを用いて、ｔａｔＡＢＣ遺伝子をコードする配列を含む約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅した。配列番号１４に記載のプライマーには制限酵素ＫｐｎＩとＡｐａＩの認識配列がデザインしてある。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このＤＮＡ断片の末端をＢＫＬ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いてリン酸化し、別途ＫｐｎＩ処理し、さらにＢＫＬ  Ｋｉｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）を用いて平滑末端化し、さらにＣＩＡＰ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いて末端を脱リン酸化処理したｐＰＫ５ベクターに挿入することによって、ｔａｔＡＢＣ遺伝子搭載ベクターであるｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣを構築した。ライゲーション反応にはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。【０１７８】
（ｃ）ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣベクター中のｔａｔＡＢＣ遺伝子内ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ認識サイトを改変したベクター（ｐＰＫ６）の構築
前項で構築したｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣプラスミド中のｔａｔＡＢＣ遺伝子領域の中には、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩの認識配列が１ヵ所ずつ存在する。これらの配列を改変するため、ＫｐｎＩ認識配列ｇｇｔａｃｃをｇｇａａｃｃに改変した配列とｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣにおけるその周辺配列を含む配列番号１５および配列番号１６に記載のプライマーと、ＸｂａＩ認識配列ｔｃｔａｇａをｔｇｔａｇａに改変した配列とｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣにおけるその周辺配列を含む配列番号１７および配列番号１８に記載のプライマーを合成した。【０１７９】
まず、ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣを鋳型として、配列番号１５および配列番号１６に記載のプライマーを用いて、ｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内のＫｐｎＩ認識サイトを改変するよう約９．４ｋｂｐのプラスミド全長をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用い、反応条件は９５℃  ５分、（９５℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １２分）ｘ１２ｃｙｃｌｅで行った。【０１８０】
次に、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、メチル化されている鋳型ＤＮＡを消化した。ＤｐｎＩ消化後に得られた非メチル化プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。こうしてｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内のＫｐｎＩ認識サイトを改変したベクターであるｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣΔＫｐｎＩを構築した。【０１８１】
次に、ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣΔＫｐｎＩを鋳型として、配列番号１７および配列番号１８に記載のプライマーを用いて、ｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内のＸｂａＩ認識サイトを改変するよう約９．４ｋｂｐのプラスミド全長をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用い、反応条件は９５℃  ５分、（９５℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １２分）ｘ１２ｃｙｃｌｅで行った。【０１８２】
次に、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、メチル化されている鋳型ＤＮＡを消化した。ＤｐｎＩ消化後に得られた非メチル化プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。こうしてｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内のＸｂａＩ認識配列を改変したベクターであるｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣΔＫｐｎＩΔＸｂａＩを取得した。塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。塩基配列の決定はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。【０１８３】
こうして得られた、ｐＰＫ４ベクターを基にしたｔａｔＡＢＣ遺伝子搭載ベクターをｐＰＫ６と名付けた。【０１８４】
（７−３）Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質（Ｌｙｓ−Ｆｃ）の調製
（７−２）に記されているｐＰＫ６にＬｙｓ−Ｆｃの遺伝子（配列番号１９および配列番号２０）を導入した発現ベクターを作製し、これを用いて（７−１）で得られたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０７株を形質転換した。得られた各形質転換体を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース  １２０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ３ｇ、硫酸アンモニウム  ３０ｇ、リン酸二水素カリウム  １．５ｇ、硫酸鉄七水和物  ０．０３ｇ、硫酸マンガン五水和物  ０．０３ｇ、チアミン塩酸塩  ０．４５ｍｇ、ビオチン  ０．４５ｍｇ、ＤＬ−メチオニン  ０．１５ｇ、大豆塩酸加水分解液（全窒素量  ０．２ｇ）、炭酸カルシウム  ５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．０に調整）で３０℃、７２時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して培養上清を取得した。【０１８５】
このＦｃタンパク質を含む培養上清（９ｍＬ弱）をＭＩＬＬＥＸ−ＧＶフィルター（０．２２μｍ，φ１３ｍｍ）にて濾過し、これを限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，１０ｋ  ＭＷＣＯ）で遠心濃縮しつつＰＢＳの差し液により緩衝液置換した。その濃縮液１６０μＬのうち、１００μＬをもちいてｒｅｆｏｌｄｉｎｇを行なった。濃縮液に８Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ  ｉｎ  ２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ８．０（３００μＬ）を加えて混合し、３７℃にて１．５ｈ撹拌した。ここに２００ｍＭ  ＤＴＴ  ｉｎ  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４（６μＬ）を加えて混合し、３７℃にて更に１．５ｈ撹拌した。この混合液を５℃に冷却し、冷却したｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｅｍｉｘ（表１）全量を加えて混合し、冷蔵室内にて一晩静置した。Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ液を透析膜（ＳｐｅｃｔｒｏＰｏｒ社，Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２  ５ｍＬ，３．５−５ｋ  ＭＷＣＯ）にてＰＢＳへと透析し、更に限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，１０ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮し、ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ混合物３００μＬを取得した。この取得物をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ａｓｐｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液を限外濾過膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００，１０ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮およびＰＢＳ置換して、Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質（Ｌｙｓ−Ｆｃ）を１００μＬ取得した。Ａ２８０法による定量の結果、取得された溶液中のＦｃタンパク質を０．６９ｍｇ／ｍＬと算出した。そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ；非還元条件下；Ｂｉｏ−ｓａｆｅ  ＣＢＢ  Ｇ−２５０染色）の結果を図６に示した。【０１８６】
【表１】
2017191817.tif 000023
【０１８７】
以上より、培養細胞を用いて、Ｎ末端にリジン残基を有するＦｃタンパク質を調製できることが確認された。【０１８８】
実施例８：ＳＰＡＡＣ反応による、非天然環状ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法
（８−１）炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質（非天然環状ペプチド−ＤＢＣＯ付加体）の調製【０１８９】
【化２１】
2017191817.tif 000024
【０１９０】
目的物質としての上記式の非天然環状ペプチド１８．３ｍｇを水９１３μＬに溶解し、この溶液６６３μＬに対してＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）−マレイミド（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，４０ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）７０．４μＬおよびＤＭＳＯ１５０．６μＬを加えて混合し、室温にて２０時間振とうした。この反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３，φ２０×２５０ｍｍ，溶離液Ａ；１００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液，溶離液Ｂ；アセトニトリル，３３％Ｂ〜５３％Ｂの直線的グラジエント勾配）にて精製し、得られたフラクションを凍結乾燥して下記式の非天然環状ペプチド−ＤＢＣＯ付加体を９．８ｍｇ取得した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）  ｍ／ｚ；１１３４．５【０１９１】
【化２２】
2017191817.tif 000025
【０１９２】
（８−２）目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の調製
アジド基含有Ｆｃタンパク質の溶液６．６μＬ（アジド基含有Ｆｃタンパク質５０μｇ含有）に、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２４．４μＬと、２．５ｍＭの（８−１）で得られた非天然環状ペプチド−ＤＢＣＯ付加体の水溶液７．４μＬを加え、２５℃にて一晩振とうした。これにより、アジド基含有Ｆｃタンパク質と非天然環状ペプチド−ＤＢＣＯ付加体とが反応し、非天然環状ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体が得られた（ＤＢＣＯに対するアジド基の付加様式は下記式に示す２とおりが考えられる）。【０１９３】
【化２３】
2017191817.tif 000026
【０１９４】
得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ，４〜２０％，ＢＩＯ−ＲＡＤ；還元条件下；Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０  Ｓｔａｉｎにより染色）にて分析した結果を、図７に示す。この結果から、本ペプチドとアジド基含有Ｆｃタンパク質のＳＰＡＡＣ反応が、極めて高い反応効率にて進行することが分かった。【０１９５】
この反応混合物を限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００，  １０ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮と２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ  ６．５）希釈を５回繰り返し、緩衝液置換した。この溶液１４μＬに７ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（４μＬ）とアセトニトリル（１４μＬ）を加えて混合し、室温にて３０分間静置した後にＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。結果を以下に示す。
非天然環状ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体（Ｇ０糖鎖付き）の分子量：
理論計算値            ：２９４１３．７
ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ測定値：２９４１２．５【０１９６】
実施例９：ＳＰＡＡＣ反応による、非天然直鎖ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法
（９−１）炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質（非天然直鎖ペプチド−ＤＢＣＯ付加体）の調製【０１９７】
【化２４】
2017191817.tif 000027
【０１９８】
目的物質としての上記式の非天然直鎖ペプチド１６．５ｍｇを水８２６μＬに溶解し、この溶液５７６μＬに対してＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）−マレイミド（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，４０ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）２６．４μＬおよびＤＭＳＯ１６５．６μＬを加えて混合し、室温にて２０時間振とうした。ここに更にＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）−マレイミド（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，４０ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）８．８μＬおよびＤＭＳＯ１００μＬを加えて混合し、室温にて３．５時間振とうした。この反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３，φ２０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：１００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂ：アセトニトリル、４５％Ｂ〜６５％Ｂの直線的グラジエント勾配）にて精製し、得られたフラクションを凍結乾燥して下記式の非天然直鎖ペプチド−ＤＢＣＯ付加体を４．５ｍｇ取得した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）  ｍ／ｚ；２０６０．９【０１９９】
【化２５】
2017191817.tif 000028
【０２００】
（９−２）目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の調製
アジド基含有Ｆｃタンパク質の溶液６．６μＬ（アジド基含有Ｆｃタンパク質５０μｇ含有）に、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４．８μＬおよび水２０μＬと、２．５ｍＭの（９−１）で得られた非天然直鎖ペプチド−ＤＢＣＯ付加体の溶液７．４μＬを加え、２５℃にて１９時間振とうした。その後更に水２０μＬとＤＭＳＯ６μＬを加えて２５℃にて４時間振とうした。これにより、アジド基含有Ｆｃタンパク質と非天然直鎖ペプチド−ＤＢＣＯ付加体とが反応し、非天然直鎖ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体が得られた（ＤＢＣＯに対するアジド基の付加様式は下記式に示す２とおりが考えられる）。【０２０１】
【化２６】
2017191817.tif 000029
【０２０２】
得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ，４〜２０％，ＢＩＯ−ＲＡＤ；還元条件下；Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０  Ｓｔａｉｎにより染色）にて分析した結果を、図８に示す。この結果から、本ペプチドとアジド基含有Ｆｃタンパク質のＳＰＡＡＣ反応が、極めて高い反応効率にて進行することが分かった。この反応混合物を限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００，  １０ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮と２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ  ６．５）希釈を５回繰り返し、緩衝液置換した。この溶液１４μＬに７ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（４μＬ）とアセトニトリル（１４μＬ）を加えて混合し、室温にて３０分間静置した後にＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析した。結果を以下に示す。
非天然直鎖ペプチドが付加されたＦｃタンパク質誘導体（Ｇ０糖鎖付き）の分子量：
理論計算値              ：３０３４０．２
ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ測定値：３０３３９．５【０２０３】
実施例１０：ＳＰＡＡＣ反応による、オリゴ核酸が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法
（１０−１）炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質（オリゴ核酸−ＤＢＣＯ付加体）の調製【０２０４】
【化２７】
2017191817.tif 000030
【０２０５】
Ｏｒａｖａらの報告（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２０１３，  ８，  １７０）に基づき設計した、目的物質としての上記式のオリゴ核酸（ＤＮＡ、配列番号２１）３３．８ｍｇを水６．７７ｍＬに溶解し、この溶液５．７７ｍＬに対して１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を２３．１ｍＬおよび、０．１２Ｍ  ＤＴＴ水溶液と０．５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）の２：１混合溶液２８．８ｍＬを加え、室温にて一晩振とうした。この反応混合物を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮と水希釈を４回繰り返し、溶媒置換した。ここにＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）−マレイミド（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，４０ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）  ８８．８μＬおよびＤＭＳＯ  ６００μＬを加えて混合し、室温にて一晩振とうした。この反応混合物を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮と水希釈を４回繰り返して溶媒置換し、得られた溶液を凍結乾燥して下記式のオリゴ核酸−ＤＢＣＯ付加体を２１．１ｍｇ取得した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ８４１１．７，ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｍ／ｚ；１６８１．３，２１０１．９【０２０６】
【化２８】
2017191817.tif 000031
【０２０７】
（１０−２）目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の調製
アジド基含有Ｆｃタンパク質の溶液６．６μＬ（アジド基含有Ｆｃタンパク質５０μｇ含有）に、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２４．４μＬと２．５ｍＭの（１０−１）で得られた付加体の溶液７．４μＬを加え、２５℃にて一晩振とうした。これにより、アジド基含有Ｆｃタンパク質とオリゴ核酸−ＤＢＣＯ付加体とが反応し、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体が得られた（ＤＢＣＯに対するアジド基の付加様式は下記式に示す２とおりが考えられる）。【０２０８】
【化２９】
2017191817.tif 000032
【０２０９】
得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ，４〜２０％，ＢＩＯ−ＲＡＤ；還元条件下；Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０  Ｓｔａｉｎにより染色）にて分析した結果を、図９に示す。この結果から、本オリゴ核酸とアジド基含有Ｆｃタンパク質のＳＰＡＡＣ反応が、極めて高い反応効率にて進行することが分かった。【０２１０】
実施例１１：ＳＰＡＡＣ反応による、オリゴ核酸が付加されたＦｃタンパク質誘導体の製造方法
（１１−１）炭素原子間３重結合を有する環が付加されている目的物質（オリゴ核酸−ＤＢＣＯ付加体）の調製【０２１１】
【化３０】
2017191817.tif 000033
【０２１２】
Ｐｏｔｔｙらの報告（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２００９，  ９１（２），  １４５）に基づき設計した、目的物質としての上記式のオリゴ核酸（ＤＮＡ、配列番号２２）２７．８ｍｇを水５．５５ｍＬに溶解し、この溶液４．５５ｍＬに対して１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を１８．２ｍＬおよび、０．１２Ｍ  ＤＴＴ水溶液と０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）の２：１混合溶液２２．８ｍＬを加え、室温にて一晩振とうした。この反応混合物を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮と水希釈を４回繰り返し、溶媒置換した。ここにＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）−マレイミド（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，４０ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）  ６８．４μＬおよびＤＭＳＯ  ６００μＬを加えて混合し、室温にて一晩振とうした。この反応混合物を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３ｋ  ＭＷＣＯ）にて濃縮と水希釈を４回繰り返して溶媒置換し、得られた溶液を凍結乾燥して下記式のオリゴ核酸−ＤＢＣＯ付加体を２４．７ｍｇ取得した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ８６０４．８，ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｍ／ｚ；１７１９．９，２１５０．１【０２１３】
【化３１】
2017191817.tif 000034
【０２１４】
（１１−２）目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体の調製
アジド基含有Ｆｃタンパク質の溶液６．６μＬ（アジド基含有Ｆｃタンパク質５０μｇ含有）に、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２４．４μＬと２．５ｍＭの（１１−１）で得られた付加体の溶液７．４μＬを加え、２５℃にて一晩振とうした。これにより、アジド基含有Ｆｃタンパク質とオリゴ核酸−ＤＢＣＯ付加体とが反応し、目的物質が付加されたＦｃタンパク質誘導体が得られた（ＤＢＣＯに対するアジド基の付加様式は下記式に示す２とおりが考えられる）。【０２１５】
【化３２】
2017191817.tif 000035
【０２１６】
得られた反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  ｇｅｌ，４〜２０％，ＢＩＯ−ＲＡＤ；還元条件下；Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０  Ｓｔａｉｎにより染色）にて分析した結果を、図１０に示す。この結果から、本オリゴ核酸とアジド基含有Ｆｃタンパク質のＳＰＡＡＣ反応が、極めて高い反応効率にて進行することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２１７】
本発明のＦｃタンパク質誘導体は、例えば、医薬又は試薬として有用である。
本発明のアジド基含有Ｆｃタンパク質は、例えば、本発明のＦｃタンパク質誘導体の製造における中間体として有用である。
１６個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをＮ末端に有する本発明のＦｃタンパク質は、例えば、本発明のＦｃタンパク質誘導体の製造における中間体として有用である。
【図１】
2017191817.tif 000042
【図２】
2017191817.tif 000043
【図３】
2017191817.tif 000044
【図４】
2017191817.tif 000045
【図５】
2017191817.tif 000046
【図６】
2017191817.tif 000047
【図７】
2017191817.tif 000048
【図８】
2017191817.tif 000049
【図９】
2017191817.tif 000050
【図１０】
2017191817.tif 000051
【配列表】
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【国際調査報告】
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