【手続補正書】
【提出日】平成18年11月8日(2006.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成ペプチドＨＣＶ抗原および遺伝子組換えＨＣＶ抗原を用いて、抗ＨＣＶ抗体を検出する抗ＨＣＶ抗体検出方法であって、
抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した合成ペプチドＨＣＶ抗原と、キャリアータンパク質とからなる第１の複合体を固相に担持し、且つ、
抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した遺伝子組換えＨＣＶ抗原とからなる第２の複合体を固相に担持した状態で抗ＨＣＶ抗体の検出を行うことを特徴とする抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項２】
前記遺伝子組換えＨＣＶ抗原がＨＣＶの非構造領域タンパク質であり、前記合成ペプチドＨＣＶ抗原がＨＣＶの構造領域タンパク質である請求項１記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項３】
抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した、第２の合成ペプチドＨＣＶ抗原と、キャリアータンパク質とからなる第３の複合体を固相に担持した状態で抗ＨＣＶ抗体の検出を行い、前記第２合成ペプチドＨＣＶ抗原がＨＣＶの非構造領域タンパク質である請求項２記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項４】
抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した、第３の合成ペプチドＨＣＶ抗原と、キャリアータンパク質とからなる第４の複合体を固相に担持した状態で抗ＨＣＶ抗体の検出を行い、前記第３合成ペプチドＨＣＶ抗原が前記第２合成ペプチドＨＣＶ抗原とは異なるＨＣＶの非構造領域タンパク質である請求項３記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項５】
前記合成ペプチドＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ４抗原またはＮＳ５抗原であり、前記遺伝子組換えＨＣＶ抗原がＮＳ３抗原である請求項１記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項６】
前記合成ペプチドＨＣＶ抗原の分子量が１０００〜５０００である請求項１記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項７】
前記第２複合体がさらにキャリアータンパク質を含む請求項１〜６のいずれかに記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項８】
キャリアータンパク質がＢＳＡ、卵白アルブミンまたはヘモシアニンから選択される請求項１〜７のいずれかに記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【請求項９】
固相が担体粒子である請求項１〜８のいずれかに記載の抗ＨＣＶ抗体検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】抗ＨＣＶ抗体検出方法
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を検出するために、検体試料中の抗ＨＣＶ抗体を検出する抗ＨＣＶ抗体検出方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
したがって、より高感度で迅速にＣ型肝炎ウイルス感染症を検出することができる抗ＨＣＶ抗体検出方法が求められている。
［課題を解決するための手段］
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は、合成ペプチドＨＣＶ抗原および遺伝子組換えＨＣＶ抗原を用いて、抗ＨＣＶ抗体を検出する抗ＨＣＶ抗体検出方法であって、抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した合成ペプチドＨＣＶ抗原と、キャリアータンパク質とからなる第１の複合体を固相に担持し、且つ、抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した遺伝子組換えＨＣＶ抗原とからなる第２の複合体を固相に担持した状態で抗ＨＣＶ抗体の検出を行うことを特徴とする抗ＨＣＶ抗体検出方法を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の検出方法で使用するＨＣＶ抗原タンパク質は、公知のＨＣＶの構造領域タンパク質や非構造タンパク質である。構造領域タンパク質としては、コアタンパク、非構造領域タンパク質としてはＮＳ３タンパク、ＮＳ４タンパク、およびＮＳ５タンパクを使用できる。なお、これらの抗原タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列については文献（特表平５−５０８２１９号）に記載されている。抗原タンパク質の由来についてはＨＣＶ抗原活性を有するものであれば特に制限されず、天然から単離したもの、化学合成によるもの、および遺伝子組換え法により製造したものを使用できる。抗原タンパク質としてはこれらの領域のタンパク質のうちの種々の長さのペプチドを用いることができ、好ましくは、少なくとも１つのエピトープを含む８個以上のアミノ酸からなるペプチドを用いる。より好ましくは、分子量１，０００〜５，０００の合成ペプチドを用いる。ペプチドは当業界で公知の方法、例えば固相合成法、フラグメント縮合法、または古典的溶液合成法を用いて合成することができる。好ましくは文献（Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963）に記載の固相ペプチド合成法により製造できる。なお、本発明では、コア、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５のそれぞれの抗原タンパク質として、少なくとも１つ以上の異なるエピトープを含む１種類以上の抗原を組み合わせて、これらを直接あるいはキャリアータンパク質との複合抗原として担体粒子に感作することができる。後述する実施例ではコア抗原として特表平５−５０８２１９号記載のコア領域のうちのアミノ酸４９〜６８を含むペプチドを使用し、ＮＳ４ペプチドとして特表平５−５０８２１９号記載のＮＳ４領域のうちのアミノ酸１７０６〜１７２５、１７１８〜１７３７および１７２４〜１７４３を含むペプチドを使用し、またＮＳ５ペプチドとして特表平５−５０８２１９号記載のＮＳ５領域のうちのアミノ酸２２８７〜２３０６、２２９９〜２３１８および２３１１〜２３３０を含むペプチドを使用し、またＮＳ３抗原としては特表平５−５０８２１９号記載のＮＳ３領域のうちのアミノ酸１１９２〜１４５７のペプチドを使用したが、これに限定されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の抗ＨＣＶ抗体検出方法によれば、Ｃ型肝炎ウイルスへの感染を感度よく、かつ市販の診断薬よりも早期に診断することが可能である。すなわち、ＨＣＶ抗体が陽性化していく過程で同一人から経時的に採血した数検体から構成されるパネル血清（例えば、ＨＣＶセロコンバージョンパネル、輸入販売元：協和メディックス、製造元：ＢＯＳＴＯＮ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡ，ＩＮＣ）を用いて試験したところ、本発明の検出方法は、従来のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬を用いる検出方法（赤血球を用いる受動血球凝集法（ＰＨＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、および酵素免疫ソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））に比べてより早期に、すなわち感染初期にＨＣＶへの感染を検出できることが明らかとなった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
また、本発明の検出方法、すなわち、合成ペプチドＨＣＶ抗原および遺伝子組換えＨＣＶ抗原を用いて、抗ＨＣＶ抗体を検出する抗ＨＣＶ抗体検出方法であって、抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した合成ペプチドＨＣＶ抗原と、キャリアータンパク質とからなる第１の複合体を固相に担持し、且つ、抗ＨＣＶ抗体と、この抗ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応により結合した遺伝子組換えＨＣＶ抗原とからなる第２の複合体を固相に担持した状態で抗ＨＣＶ抗体の検出を行う抗ＨＣＶ抗体検出方法に用いられた合成ペプチドＨＣＶ抗原と、同じ抗原を用いるがキャリアータンパク質と複合体を形成することなく直接固相に担持して抗ＨＣＶ抗体の検出を行う抗ＨＣＶ抗体検出方法とを比較したところ、本発明の検出方法の方が、検出感度が優れていることが判明した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
さらに、本発明の検出方法に用いる診断薬は、長期保存をした後にも検出感度が落ちず、安定な診断薬であるといえる。
本発明の検出方法に用いる診断薬を製造する際に、固相として担体粒子を用いて製造したＨＣＶ感染症診断薬の場合には、ＥＬＩＳＡなどの従来法と比較して、繁雑な洗浄工程を伴わず、ＨＣＶ感染症診断薬（好ましくは担体粒子がラテックス粒子）を、検体試料（好ましくは被験者血液）と混合するだけの操作によって実施することが可能である。また、本発明の検出方法に用いる上記ＨＣＶ感染症診断薬を用いると、上記混合操作および測定操作のいずれをも全自動で行う測定機による測定が可能であり、多数の検体を測定するのに好適である。
［実施例］
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５抗原についても同様の操作を行い、１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ６〜８の緩衝液を用い、１容量の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液に対し、１〜８容量の０．１％（ｗ／ｖ）ＨＣＶ抗原溶液を反応させてＨＣＶ複合抗原を調製した。
実施例２：ＨＣＶ抗原感作ラテックスの製造
粒径０．７８μｍのポリスチレンラテックス粒子（積水化学工業株式会社製）を１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ４．０中に５％（ｗ／ｖ）の濃度に調製し、この中に実施例１で調製したコア抗原、ＮＳ３複合抗原、ＮＳ４複合抗原、ＮＳ５複合抗原をラテックス分散液１ｍｌ当たり５０μｇ添加し、４℃で２４時間反応させた。その後遠心（１２０００ｒｐｍ、１０分）を行い、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．１Ｍ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０を最初と同量添加し粒子を分散させた。再度遠心処理を行い、同じ緩衝液中に分散させてＨＣＶ抗原感作ラテックスとした。
実施例３：凝集反応
検体試料（被験者血液）１０μｌに実施例２で調製したＨＣＶ抗原感作ラテックス（５％）１０μｌを添加し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液８０μｌを加え、４５℃で１５分間反応させた後、ラテックス粒子の凝集度を測定した。この反応および測定は全自動免疫測定装置ＰＡＭＩＡ−３０（東亜医用電子株式会社製）を用い、前方散乱光を測定した。