(57)【要約】（ａ）  下記式（１）〜（３）Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ）ｎ − ＯＨ          （１）Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ）ｎ − ＯＨ          （２）Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ）ｎ − ＯＨ          （３）（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は（ｂ）  上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）Ｈ − （ Ｚ ） − ＯＨ          （４）（式（４）中、Ｚは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。） Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ          （５）Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ          （６）Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ          （７） （式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。） Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ            （８）Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ            （９）Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ          （１０） （式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることによりポリペプチドを製造する方法によれば、実用上十分な耐熱性を有するコラーゲン様ポリペプチドを安定的に製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  下記式（１）〜（３）
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ）ｎ − ＯＨ          （１）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ）ｎ − ＯＨ          （２）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ）ｎ − ＯＨ          （３）
（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ）  上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ          （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ          （５）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ          （６）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ          （７）
（式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ            （８）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ            （９）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ          （１０）
（式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、
有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを得る工程を含むポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
有機塩基が第三級アミンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水系溶媒のｐＨを４〜８に調整する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ペプチドオリゴマーを塩体として縮合反応に供する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の方法で製造される、下記式（１１）
― （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｍ ―          （１１）
（式（１１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｍは、１０〜３６００の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
【請求項６】
円二色性スペクトルにおいて、波長２１０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１８５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
変性温度が５０℃〜１５０℃である請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ―          （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
【請求項９】
下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ―          （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットと、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ―          （１２）
（式（１２）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ―        （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ―          （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットとを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項５〜９の何れかに記載のポリペプチドを架橋してなる架橋ポリペプチド。
【請求項１１】
変性温度が５０℃〜１５０℃である請求項１０に記載の架橋ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高耐熱性コラーゲン様ポリペプチドを安定的に製造することができる方法、この方法により得られる高耐熱性コラーゲン様ポリペプチド、及びこのポリペプチドを用いて製造される架橋ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
典型的なコラーゲン分子は、３アミノ酸ごとにグリシンが存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、３本のポリペプチド鎖がらせんを巻いた特徴的なコラーゲンヘリックス構造を採っている。生体内では、３本鎖はコラーゲン繊維を形成し、さらに３次元的なコラーゲンマトリクスを形成している。コラーゲンマトリクスは、そこに細胞が接着して増殖や分化を行う足場として機能している。【０００３】
コラーゲンは、その高い生体親和性から、医療・組織工学用のバイオマテリアルとして汎用されている。
しかし、天然のコラーゲンは熱に弱く、哺乳類由来のコラーゲンでも３０℃〜４０℃で三重らせん構造がほどけてランダムコイル状に変性する。バイオマテリアルとして利用するには加熱滅菌できることが求められるため、天然のコラーゲンをバイオマテリアルとして利用することは困難である。【０００４】
そこで、合成コラーゲン様ポリペプチドの製造方法が、種々試みられている。合成コラーゲン様ポリペプチドは、天然コラーゲンと異なり、感染症の危険性がないこと、工業的合成により得られるため安定な供給が可能であることなどの優れた性質を有する。
非特許文献１は、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｙは、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表す）のユニットからなるポリペプチドが三重らせん構造を有するコラーゲン様ポリペプチドであること、このコラーゲン様ポリペプチドが、天然コラーゲンに比べて熱安定性が高いことを記載している。しかし、その耐熱性は、加熱滅菌に耐えるほどの十分なものではない。【０００５】
また、特許文献１は、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−（式中、Ｙは、Ｈｙｐを表し、ｎは１〜２０の整数を表す。）と、−（Ｚ）ｒ−（式中、Ｚは、Ｇｌｙなどのアミノ酸残基又はペプチド鎖を表し、ｒは１〜２の整数を表す。）とを、１００：０〜７０：３０のモル比で有し、分子量２万〜１００万のコラーゲン様ポリペプチドを開示している（［請求項1］）。特許文献１は、通常のペプチド合成法、特に固相合成法により、このコラーゲン様ポリペプチドを製造できることを教えている（［0044］）。【０００６】
また、特許文献２は、Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ、Ｈ−（Ｙ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ、又はＨ−（Ｇｌｙ-Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ（式中、Ｙは、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）を、リン酸イオン濃度０．０１Ｍ未満の水系溶媒中で縮合させることにより、コラーゲン様ポリペプチドを製造する方法を開示している（［請求項1］）。特許文献２は、リン酸イオン濃度が低いほど高分子量のポリペプチドが得られることを教えている（［0040］）。【０００７】
また、特許文献３は、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−（式中、Ｙは、Ｐｒｏ又はＨｙｐを表し、ｎは１以上の整数である。）と多糖類由来の糖残基とを有する重合体が、コラーゲン様ポリペプチドの生体親和性と、多糖類由来の親水性とを兼ね備え、機械的強度が高い重合体であることを教えている（［0013］）。特許文献３は、一般的な縮合反応により、この重合体を製造できることを教えている（［0033］〜［0039］）。【０００８】
しかし、これらの文献が教えるコラーゲン様ポリペプチドの製造方法では、縮合反応の進行が不十分でポリペプチド鎖が形成されなかったり、逆に、縮合反応が進行し過ぎて、過重合によりゲル状になってしまう場合がある。ゲル状になると、その後の精製が困難であり、また、構造や特性を分析できないため、バイオマテリアルに応用することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−３２１５００号公報
【特許文献２】特開２０１４−９１９４号公報
【特許文献３】特開２０１３−１１２６５３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】T. Kishimoto et al., Biopolymers,７９,１６３−１７２（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、実用上十分な耐熱性を有するコラーゲン様ポリペプチドを安定的に製造することができる方法、及びこの方法により得られる高耐熱性コラーゲン様ポリペプチドを提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、
（ａ）  下記式（１）
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｎ− ＯＨ          （１）
（式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（２）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ） ｎ− ＯＨ          （２）
（式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、及び下記式（３）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ） ｎ− ＯＨ          （３）
（式（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ）  上記式（１）で表されるペプチドオリゴマー、上記式（２）で表されるペプチドオリゴマー、及び上記式（３）で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ          （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチド、下記式（５）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ          （５）
（式（５）中、ｐは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（６）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ          （６）
（式（６）中、ｐは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（７）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ          （７）
（式（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（８）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ            （８）
（式（８）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（９）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ            （９）
（式（９）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、及び下記式（１０）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ          （１０）
（式（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部が三重らせん構造を形成する、又は形成し得る重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００の高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られることを見出した。
また、この製造方法によれば、縮合反応が過不足なく安定して進行し、高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドを効率よく製造できることを見出した。【００１３】
本発明は、この知見に基づき完成されたものであり、以下のポリペプチドの製造方法、ポリペプチド、及び架橋ポリペプチドを提供する。
項１．  （ａ）  下記式（１）〜（３）
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ）ｎ − ＯＨ          （１）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ）ｎ − ＯＨ          （２）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ）ｎ − ＯＨ          （３）
（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ）  上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ          （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ          （５）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ          （６）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ          （７）
（式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ            （８）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ            （９）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ          （１０）
（式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、
有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを得る工程を含むポリペプチドの製造方法。
項２．  有機塩基が第三級アミンである項１に記載の方法。
項３．  水系溶媒のｐＨを４〜８に調整する項１又は２に記載の方法。
項４．  ペプチドオリゴマーを塩体として縮合反応に供する項１〜３の何れかに記載の方法。
項５．  項１〜４の何れかに記載の方法で製造される、下記式（１１）
― （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｍ ―          （１１）
（式（１１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｍは、１０〜３６００の整数である。）
で表される少なくとも1種のユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
項６．  円二色性スペクトルにおいて、波長２１０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１８５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す項５に記載のポリペプチド。
項７．  変性温度が５０℃〜１５０℃である項５又は６に記載のポリペプチド。
項８．  下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ―          （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
項９．  下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ―          （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットと、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ―          （１２）
（式（１２）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ―        （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ―          （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットとを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
項１０．  項５〜９の何れかに記載のポリペプチドを架橋してなる架橋ポリペプチド。
項１１．  変性温度が５０℃〜１５０℃である項１０に記載の架橋ポリペプチド。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のポリペプチドの製造方法によれば、縮合反応が過不足なく進行し、高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドを効率よく製造することができる。
即ち、従来の製造方法では、条件によっては、縮合反応が十分に進行せず、所望の分子量のポリペプチドが得られなかったり、未反応原料が残る場合がある。また、縮合反応が進み過ぎて、ポリペプチドがゲル状になる場合もある。ゲル状になると、その後の精製が困難であり、また、構造や特性を分析できないため、バイオマテリアルに応用することができない。
この点、本発明方法によれば、縮合反応が十分に進行しなかったり、未反応物が生成したり、過重合するといった事態が抑制されて、広範囲の条件下で、安定してコラーゲン様ポリペプチドを得ることができる。また、得られるポリペプチドは、精製、分析が可能であるため、ポリペプチドの構造や特性に応じたバイオマテリアルに応用することができる。また、本発明方法によれば、ポリペプチドの分子量を容易に制御できるため、目的とするバイオマテリアルに応じた分子量のポリペプチドを効率よく製造することができる。【００１５】
また、本発明方法によれば、変性温度が通常５０℃以上の高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られる。製造条件によっては、変性温度が１２０℃以上の超高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られる場合もあり、この場合は、バイオマテリアルの汎用の滅菌方法であるオートクレーブ滅菌にも耐えるものとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ポリペプチドの製造方法
本発明の製造方法は、
（ａ）  下記式（１）〜（３）
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｎ− ＯＨ          （１）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ） ｎ− ＯＨ          （２）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ） ｎ− ＯＨ          （３）
（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ）  上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ          （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ          （５）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ          （６）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ          （７）
（式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ            （８）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ            （９）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ          （１０）
（式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、
有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部分が三重らせん構造を形成する、又は形成し得る重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを得る工程を含むポリペプチドの製造方法である。
【００１７】
原料
本発明方法では、上記式（１）で表されるペプチドオリゴマー、上記式（２）で表されるペプチドオリゴマー、及び／又は上記式（３）で表されるペプチドオリゴマーが必須の原料である。式（１）、（２）、及び（３）中のＸとＹの組み合わせとしては、一方がＨｙｐで他方がＰｒｏである組み合わせ、双方がＨｙｐである組み合わせ、双方がＰｒｏである組み合わせがある。少なくとも一方がＨｙｐであれば、得られるペプチドの親水性が向上し、例えば、保水性が求められるバイオマテリアル、例えば、化粧品原料などに好適に応用できる。双方がＨｙｐであってもよい。
【００１８】
式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーは、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。２種以上のペプチドオリゴマーを用いるときは、得られるポリペプチドが３重らせん構造をとり易くなるように、又は得られるポリペプチド中の３重らせん構造の部分を長くするために、式（１）〜（３）のペプチドオリゴマーの合計量に対して、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーを３５〜１００モル％、中でも５０〜１００モル％、中でも７０〜１００モル％、中でも８０〜１００モル％、中でも９０〜１００モル％用いることが好ましい。例えば、式（１）に包含されるペプチドオリゴマーはＧｌｙが３番目に存在する点で、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーである。式（２）に包含されるペプチドオリゴマー、及び式（３）に包含されるペプチドオリゴマーも同様である。式（１）に包含されるペプチドオリゴマー、式（２）に包含されるペプチドオリゴマー、又は式（３）に包含されるペプチドオリゴマーだけを用いることが最も好ましい。
式（１）、（２）、及び（３）において、ｎは、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。また、ｎは、１、又は２であってもよい。
【００１９】
また、本発明方法では、式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーに加えて、他のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いてもよい。他のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとしては、例えば、上記式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドが挙げられる。式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドは、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドのうち、ポリペプチドを架橋して架橋ポリペプチドとする場合に反応点となり易い点で、極性アミノ酸が好ましく、酸性の極性アミノ酸又は塩基性の極性アミノ酸がより好ましく、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓがさらにより好ましい。
また、架橋ポリペプチドとする場合に反応点となりやすい点では、式（５）〜（７）のペプチドオリゴマー、又は式（８）〜（１０）においてＺ２がＧｌｕであるペプチドオリゴマーが好ましく、ポリペプチドの疎水性を調整できる点では式（８）〜（１０）においてＺ２がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであるペプチドオリゴマーが好ましい。
また、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐは細胞接着活性配列であるＲＧＤモチーフであるため、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを用いることにより、得られるポリペプチドに細胞の接着生存促進作用などを付与できることが期待される。
式（４）中のε-ポリリジンは、特に限定されないが、例えば、約２５〜３０個のＬ−Ｌｙｓからなり、食品防腐剤などとして市販されているε-ポリリジンを用いることができる。
【００２０】
また、式（４）中のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び式（５）〜（１０）で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれるペプチドオリゴマーを２種以上用いるときは、得られるポリペプチドが３重らせん構造をとり易くなるように、又は得られるポリペプチド中の３重らせん構造の部分を長くするために、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び式（５）〜（１０）のペプチドオリゴマーの合計量に対して、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーを３５〜１００モル％、中でも５０〜１００モル％、中でも７０〜１００モル％、中でも８０〜１００モル％、中でも９０〜１００モル％、中でも１００モル％用いることが好ましい。例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐと、式（７）のペプチドオリゴマーと、式（１０）のペプチドオリゴマーとは、Ｇｌｙの位置が同じであるため、これらから選択されるペプチドオリゴマーの比率を上記範囲にすることが好ましい。また、式（５）のペプチドオリゴマーと、式（８）のペプチドオリゴマーはＧｌｙの位置が同じであり、式（６）のペプチドオリゴマーと、式（９）のペプチドオリゴマーはＧｌｙの位置が同じである。
【００２１】
式（４）中のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び式（５）〜（１０）で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドオリゴマーを用いるときは、さらに、式（１）、式（２）、及び／又は式（３）のペプチドオリゴマーも含む全ペプチドオリゴマーについて、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーを多くすることが好ましい。全ペプチドオリゴマー量に対する、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーの使用量は、３５〜１００モル％、中でも５０〜１００モル％、中でも７０〜１００モル％、中でも８０〜１００モル％、中でも９０〜１００モル％、中でも１００モル％が好ましい。例えば、式（１）で表されるペプチドオリゴマーと、式（５）で表されるペプチドオリゴマー、及び／又は式（８）で表されるペプチドオリゴマーとを組み合わせることが好ましい。
【００２２】
式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いる場合のその合計使用量は、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの合計量の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．０５ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、用途に応じて得られるポリペプチドの反応性を調整する等の分子設計を行うことができる。
また、５ｍｏｌ以下、３ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、得られるペプチドが三重らせんを形成し易くなる。
【００２３】
式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマー、及び式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドは、塩の形態で縮合反応に供することができ、これにより、反応が一層円滑に進行する。
これら原料のアミノ基部分の塩としては、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フタル酸塩、クエン酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、グルタル酸塩、リンゴ酸塩、安息香酸塩、フタル酸塩、アスコルビン酸塩のような有機酸塩；炭酸塩、炭酸水素塩、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩のような無機酸塩などが挙げられる。
また、カルボキシル基部分の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；亜鉛塩；鉄塩；アンモニウム塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ｔ−ブチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジメチルアンモニウム塩、ベンジルアミン塩、ピリジン塩、メチルピリジン（ピコリン）塩、キノリン塩、イソキノリン塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩のようなアミン塩などが挙げられる。
中でも、アミノ基部分の塩が好ましく、有機酸塩がより好ましく、塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩がさらにより好ましく、トリフルオロ酢酸塩がさらにより好ましい。
【００２４】
水系溶媒
水系溶媒としては、好ましくは、水を用いる。また、有機溶媒を含む水であってもよい。この場合、有機溶媒の含有量は、水系溶媒の全量に対して、５０容量％以下が好ましく、２５容量％以下がより好ましく、１０容量％以下がさらにより好ましく、５容量％以下がさらにより好ましい。
有機溶媒の種類は、水と混和するものであればよく、例えば、ジメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチルウレア、ヘキサメチルホスホロアミドのようなアミド系溶媒；エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンのような多価アルコール系溶媒；ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド系溶媒；Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンのような窒素含有環状化合物系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルのようなニトリル系溶媒；ジオキサン、テトラヒドロフランのようなエーテル系溶媒；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコールのようなアルコール系溶媒；ギ酸、酢酸のようなカルボン酸系溶媒などが挙げられる。
有機溶媒は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
なお、水系溶媒は、縮合反応に関与しない成分や縮合反応を阻害しない成分であれば含んでいてもよいが、リン酸イオンを含まない水系溶媒とすることができる。
【００２５】
縮合剤・縮合助剤
本発明において、脱水縮合反応によるペプチドの合成は、液相合成、固相合成の何れでも行える。低コストで大量合成を行える点では、液相合成が好ましい。
何れの場合も、脱水縮合反応は、通常、縮合剤の存在下、又は縮合剤と縮合助剤の存在下で行えばよい。縮合助剤を使用することにより、縮合反応が促進され、かつ、ラセミ化が抑制される。
【００２６】
縮合剤は、水系溶媒中で脱水縮合を行えるものであればよく、例えば、１-［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣＤ（ＥＤＣ））、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＭＥ-カルボジイミド）のようなカルボジイミド系縮合剤；Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールのようなイミダゾール系縮合剤；４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホニウム・クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）、トリフルオロメタンスルホン酸（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）-(２−オクトキシ−２−オキソエチル）ジメチルアンモニウム（ＤＭＴ-ＭＭ）のようなトリアジン系縮合剤；{{[（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデン）アミノ]オキシ}−４−モルホリノメチレン}ジメチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌｏＰ）のようなフルオロホスフェート系縮合剤；Ｏ−（７−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＳＴＵ）、Ｏ−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＤＢＴＵ）のようなフルオロホウ酸塩系縮合剤；ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）などが挙げられる。
中でも、カルボジイミド系縮合剤が好ましく、ＷＳＣＤ、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ、ＤＣＣ、ＤＩＣがより好ましい。
縮合剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００２７】
縮合剤の使用量は、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの合計の１ｍｏｌに対して、０．１ｍｏｌ以上、０．２ｍｏｌ以上、０．３ｍｏｌ以上、０．５ｍｏｌ以上、又は１ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行する。また、２０ｍｏｌ以下、１５ｍｏｌ以下、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、又は６ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、過重合を回避できる。
【００２８】
また、原料として、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーに加えて、式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いる場合は、縮合剤の使用量は、これら原料化合物の合計の１ｍｏｌに対して、０．１ｍｏｌ以上、０．２ｍｏｌ以上、０．３ｍｏｌ以上、０．５ｍｏｌ以上、又は１ｍｏｌ以上とすることができ、また、２０ｍｏｌ以下、１５ｍｏｌ以下、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、又は６ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行すると共に、過重合を回避できる。
【００２９】
縮合助剤は、縮合反応を促進するものであればよく、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）のようなＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド（Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類）系縮合助剤；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）のようなＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール系縮合助剤；３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）のようなトリアジン系縮合助剤；２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなどが挙げられる。
中でも、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール系縮合助剤が好ましく、ＨＯＢｔがより好ましい。
縮合助剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３０】
縮合助剤の使用量は、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの合計の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．１ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行し、ポリペプチドのラセミ化を抑制することができる。また、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、５ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、水系溶媒に均一に溶解させて、助剤として機能させることができる。
【００３１】
また、原料として、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーに加えて、式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いる場合は、縮合助剤の使用量は、これら原料化合物の合計の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．１ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行し、ポリペプチドのラセミ化を抑制することができる。また、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、５ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、水系溶媒に均一に溶解させて、助剤として機能させることができる。
【００３２】
ｐＨ調整
縮合反応を行う水系溶媒のｐＨは、約３〜１０に調整する。水系溶媒のｐＨは、約４以上、約５以上、又は約６以上とすることもできる。また、約９以下、約８以下、又は約７以下とすることもできる。
このｐＨは、ペプチドオリゴマー、又はさらにアミノ酸、ペプチドを含む原料に有機塩基を加えた後、縮合剤又はさらに縮合助剤を添加する前の反応液のｐＨを指す。即ち、有機塩基で中和した時の反応液のｐＨを指す。
【００３３】
本発明方法では、有機塩基を用いてｐＨを調整する。これにより、縮合反応を過不足なく安定して進行させることができ、構造を解析できるコラーゲン様ポリペプチドを効率良く得ることができる。
有機塩基は、縮合反応に関与しないもの、即ち、得られるペプチドに取り込まれないものであればよく、例えば、脂肪族アミン類（メチルアミン、エチルアミンのような第一級アミン；ジメチルアミン、ジエチルアミンのような第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような第三級アミン）；芳香族アミン類（アニリン、トルイジンのような第一級アミンなど）；複素環式アミン類（ピロリジン、ピペリジン、モルホリンのような第二級アミン；ピペラジンのような第二級ジアミン；ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン（コリジン）、２，６−ルチジン、キノリン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリンのような第三級アミンなど）；アルカノールアミン（モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール、トリス(ヒドロキシメチルアミノ)メタンのような第一級アミン；ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミンのような第二級アミン；トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、Ｎ−ジメチルアミノエタノールのような第三級アミン）などが挙げられる。
中でも、第三級アミンが好ましく、脂肪族第三級アミン、複素環式第三級アミンがより好ましく、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンがさらにより好ましい。
有機塩基は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３４】
その他の反応条件
縮合反応において、原料濃度、即ち、水系溶媒中の式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの濃度、又は式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーと式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとの合計の濃度は、水系溶媒の全量に対して、１重量％以上、３重量％以上、５重量％、又は１０重量％以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行する。また、７０重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量以下、又は２０重量以下とすることができる。この範囲であれば、過重合を回避できる。
【００３５】
反応温度は、−１０℃以上、−５℃以上、０℃以上、又は１０℃以上とすることができる。また、８０℃以下、７０℃以下、６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下、又は３０℃以下とすることができる。この範囲であれば、縮合反応が効率よく進行する。
また、反応時間は、原料、縮合剤、縮合助剤、及び水系溶媒の種類や使用量、水系溶媒のｐＨなどによって異なるが、例えば、１時間以上、２時間以上、又は５時間以上とすることができ、また、１００時間以下、９０時間以下、８０時間以下、７０時間以下、６０時間以下、５０時間以下、４０時間以下、３０時間以下、又は２０時間以下とすることができる。
【００３６】
精製
縮合反応による生成物には、通常、目的とするポリペプチドの他に、反応に用いた試薬や微量の未反応原料が残存している。従って、透析、限外ろ過、カラムクロマトグラフィーなどにより、目的ポリペプチドを精製することが望ましい。
また、ポリペプチドは、凍結乾燥などにより粉体とすれば、保存時の取り扱いが容易になり、また、その後の加工に使用し易くなる。
或いは、ポリペプチドを保存溶媒中で保存することもでき、これによりポリペプチドの構造が安定に保たれる。保存溶媒としては、水、生理食塩水、ｐＨ５〜８程度の緩衝液などが挙げられる。
【００３７】
（ＩＩ）ペプチド
本発明のポリペプチドは、少なくとも一部が三重らせん構造を形成可能であり、重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドである。
下記式（１１）
― （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｍ ―          （１１）
（式（１１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｍは、１０〜３６００の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットを有する場合、本発明のポリペプチドは少なくとも一部分が三重らせん構造を形成することができる。
式（１１）中、ｍは、１５以上、３０以上、１００以上、又は５００以上とすることができる。また、３５００以下、３０００以下、２０００以下、又は１０００以下とすることができる。
【００３８】
また、上記式（１１）で表される少なくとも１種のユニットに加えて、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ―          （１２）
（式（１２）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ―        （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ―          （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニット（以下、「任意ユニット」と称することもある。）を有する場合もある。
式（１２）、（１３）及び（１４）中、ｌ、ｑ及びｓは、３以上、５以上、１０以上、又は２０以上とすることができる。また、３００以下、２５０以下、２００以下、又は１５０以下とすることができる。
【００３９】
任意ユニットを有する場合のその合計含有比率は、式（１１）で表されるユニットの合計の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．０５ｍｏｌ以上とすることができ、また、５ｍｏｌ以下、３ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。本発明のポリペプチドがこの任意ユニットを有する場合、上記式（１１）で表されるユニットと任意ユニットを交互に有することもできる。
【００４０】
本発明は、
下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを包含する。
式（１５）中、ｍは、１５以上、３０以上、１００以上、又は５００以上とすることができる。また、３５００以下、３０００以下、２０００以下、又は１０００以下とすることができる。
【００４１】
また、本発明は、上記式（１５）で表されるユニットと、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ―          （１２）
（式（１２）中、Ｚ１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ―        （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ―          （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種の任意ユニットとを有するポリペプチドであって、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを包含する。
式（１２）、（１３）、及び（１４）中、ｌ、ｑ、及びｓは、３以上、５以上、１０以上、又は２０以上とすることができる。また、３００以下、２５０以下、２００以下、又は１５０以下とすることができる。
【００４２】
任意ユニットを有する場合のその合計含有比率は、式（１５）で表されるユニットの１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．０５ｍｏｌ以上とすることができ、また、５ｍｏｌ以下、３ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。本発明のポリペプチドがこの任意ユニットを有する場合、上記式（１５）で表されるユニットと任意ユニットを交互に有することもできる。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、例えば、上記説明した本発明方法により製造することができる。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、天然のコラーゲン分子と同様に、三重らせん構造を採る、又は採り得る。三重らせん構造を採ることは、円二色性スペクトルにおいて、２１０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、かつ１８５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示すことにより確認できる。
ポリペプチドは、少なくともその一部分が三重らせん構造を採っていればよく、又は採り得ればよい。
また、本発明のポリペプチドは、直鎖状、又は分岐鎖であり得る。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、非常に耐熱性が高く、高温下でも変性せず、三重らせん構造を維持することができる。その変性温度は、通常、５０℃以上であり得る。また、ポリペプチドを構成するユニットの種類や長さによっては、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、９５℃以上、１００℃以上、１０５℃以上、１１０℃以上、１１５℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上、又は１４０℃以上であり得る。変性温度の上限は、通常、１５０℃程度である。変性温度は、原料の選択やポリペプチド鎖長の調整などにより、当業者が適宜制御することができる。
変性温度は、三重らせん構造を維持できる温度であり、円二色性スペクトルの正のピーク波長での吸光度を、温度を上昇させながら測定し、吸光度が急速に低下する変曲点の温度を指す。変性温度は、円二色性スペクトルの測定装置や測定条件によりほとんど変化しない値である。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、多様な長さのものとすることができる。ポリペプチド鎖の長さは、原料の種類や使用量、反応条件など、特に、縮合剤、縮合助剤の使用量を調整することにより制御できる。ペプチド鎖の長さ又は分子量は、当業者が、通常の知識により制御することができる。
上記説明した本発明方法により本発明のポリペプチドを製造する場合は、分子量の制御が非常に容易である。また、高分子量のポリペプチドも容易に製造できる。
【００４７】
本発明のポリペプチドの重量平均分子量は、１万以上である。また、例えば、２万以上、３万以上、５万以上、又は１０万以上であり得る。また、本発明のポリペプチドの重量平均分子量は、１５０万以下である。また、例えば、１３０万以下、１２０万以下、１１０万以下、又は１００万以下であり得る。
本発明において、重量平均分子量は実施例に記載の方法で測定した値である。
【００４８】
用途
本発明のポリペプチドは、コラーゲン様ポリペプチドであるため、生体親和性ないしは生体適合性が高い。しかも、コラーゲンと異なり原料に由来する感染の危険性がない。さらに、耐熱性が高いため加熱滅菌にも耐える。従って、バイオマテリアルとして好適に利用できる。発明のポリペプチドは、例えば、人工皮膚、人工血管、細胞増殖の足場、組織接着材、医療器材（手術用縫合糸、コンタクトレンズ、カニューレ、ステントなど）、これらの医療器材の被覆材、医薬品や化粧品の原料、食品添加剤などとして利用できる。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの形態で使用できるが、バイオマテリアルとして利用する場合は、架橋させた架橋ポリペプチドの形態で使用することが多い。
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの架橋に用いられる一般的な架橋剤を用いて架橋することができる。このような架橋剤として、例えば、１-［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣＤ（ＥＤＣ））、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）、グルタルアルデヒド、１，４−ジブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＧＥ）、エチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性架橋剤が挙げられる。
架橋ポリペプチドの変性温度は、通常、５０℃以上であり得る。また、ポリペプチドを構成するユニットの種類や長さによっては、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、９５℃以上、１００℃以上、１０５℃以上、１１０℃以上、１１５℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上、又は１４０℃以上であり得る。変性温度の上限は、通常、１５０℃程度である。
本発明のポリペプチドを架橋すると、ゲル状になり得る。架橋ポリペプチドゲルはそのまま、又は乾燥物などとして利用できる。
【００５０】
本明細書において、アミノ酸残基は以下の略称で表記している。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
ポリペプチドの物性評価は、以下の方法で行った。
重量平均分子量測定
ポリペプチドの重量平均分子量を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定した。測定条件は、以下の通りである。
装置：（株）島津製作所製LC-20Aシステム
カラム：TSKgel GMPWxl
温度：40℃
流速：1.0 mL/min
溶離液：0.2N  硝酸ナトリウム水溶液
分子量標準：Showdex製STD Pシリーズ【００５２】
三重らせん構造の確認
ポリペプチドの円二色性スペクトルを、円二色性分散計により決定した。測定条件は、以下のとおりである。
装置：（株）日本分光社製JASCO J720
波長範囲：185nm〜260nm
210〜230nmに正のコットン効果、185〜205nmに負のコットン効果が観測されることをもって、三重らせん構造を形成していることを確認した。【００５３】
耐熱性評価
ポリペプチドについて、波長225nmの吸光度を、30℃から150℃まで1℃/minの温度勾配で測定し、吸光度が急速に低下する変曲点を確認し、変曲点の温度をポリペプチドの変性温度(温度変性点)とした。【００５４】
実施例１
ペプチドオリゴマーとして、L-（4-ヒドロキシプロリル）-L-（4-ヒドロキシプロリル）-グリシン  トリフルオロ酢酸塩 500mg（1.20 mmol）を4mlの蒸留水に溶解し、トリエチルアミンでpHを5に調整したのち、4℃に冷却した。その後、32.5mg（ 0.240 mmol）の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、230 mg（1.2mmol）の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド塩酸塩（WSCD・HCl）を添加して1時間攪拌した後、20℃に昇温し終夜攪拌した。得られた反応溶液を限外ろ過し、凍結乾燥することによってポリペプチド1を得た。得られたポリペプチド１の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。【００５５】
実施例２〜９
ペプチドオリゴマーの種類及び添加量、pH、WSCD・HClの添加量を表１に示すように変更し、また、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールとペプチドオリゴマーとのモル比が実施例１と同じになるように1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの使用量を調整したことを除き、実施例1と同様の方法でポリペプチド２〜９を得た。得られたポリペプチド２〜９の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。【００５６】
実施例１〜９の反応条件、及び得られたポリペプチドの物性を、下記表１に示す。変性温度の「−」は測定していないことを示す。
【表１】
2018047785.tif 000002
【００５７】
実施例１０
原料として、ペプチドオリゴマーのL-（4-ヒドロキシプロリル）-L-（4-ヒドロキシプロリル）-グリシン  トリフルオロ酢酸塩 500mg（1.20 mmol）とアラニン10.7mg（0.12mmol）とを4mlの蒸留水に溶解し、トリエチルアミンでpHを7に調整したのち、4℃に冷却した。その後、35.7mg（ 0.264 mmol） の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、430mg（2.24mmol） の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（WSCD・HCl）を添加して1時間攪拌した後、20℃に昇温し終夜攪拌した。得られた反応溶液を限外ろ過し、凍結乾燥することによってポリペプチド1０を得た。得られたポリペプチド１０の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。【００５８】
実施例１１〜２２
ペプチドオリゴマーの種類及び添加量、アミノ酸又はペプチドオリゴマーの種類及び添加量、pH、WSCD・HClの添加量を表２に示すように変更し、また、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールとペプチドオリゴマーとのモル比が実施例１０と同じになるように1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの使用量を調整したことを除き、実施例１０と同様の方法でポリペプチド１１〜２２を得た。得られたポリペプチド１１〜２２の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。
実施例１０〜２２の反応条件、及び得られたポリペプチドの物性を、下記表２に示す。変性温度の「−」は測定していないことを示す。【００５９】
【表２】
2018047785.tif 000003
【００６０】
実施例２３、２４
実施例６において、トリエチルアミンに代えて、それぞれ、N-メチルモルホリン、及びジイソプロピルエチルアミンを用いてｐＨを調整したことを除き、実施例６と同様の方法で、ポリペプチド２３、及び２４を得た。得られたポリペプチド２３及び２４の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。【００６１】
比較例１、２
実施例６において、トリエチルアミンに代えて、それぞれ、水酸化ナトリウム、及び炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを調整したことを除き、実施例６と同様の方法で、比較ポリペプチド１、及び２を得た。
実施例２３、２４、比較例１、２の反応条件、及び得られたポリペプチドの物性を、下記表３に示す。変性温度は測定していない。
【表３】
2018047785.tif 000004
比較例１は、ポリペプチドがゲル状になり、分子量を測定することができなかった。縮合反応を制御できず、反応が進行し過ぎたためと考えられる。また、比較例２は、縮合反応が不十分であり、未反応原料が多く回収された。【００６２】
実施例２５（架橋ポリペプチドの製造）
実施例１で得られたポリペプチド１の20 mg を１ m lの蒸留水に溶解し、ここに、架橋剤のカルボキシメチルセルロース10 mg を1 ml の蒸留水に溶解した水溶液を加え、室温で24時間攪拌することによって、架橋ポリペプチドゲル１を得た。【００６３】
実施例２６〜３０（架橋ポリペプチドの製造）
ポリペプチドの種類、又は架橋剤の種類を表４に示すように変更したことを除き、実施例２５と同様の方法で架橋ポリペプチドゲル２〜６を得た。
各架橋ポリペプチドゲルの変性温度をポリペプチドと同じ方法により測定した。結果を表４に示す【００６４】
【表４】
2018047785.tif 000005
本発明のポリペプチドを架橋することにより、変性温度が一層高くなった。【００６５】
表１〜４の結果から明らかなように、本発明の各実施例の方法により、変性温度８７℃〜１２０℃という超高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られた。また、ペプチドの重量平均分子量を１万〜９１万という広範囲に制御することができた。
また、無機酸塩を用いてｐＨ調整した比較例１、２では、縮合反応を制御することができなかったが、本発明の各実施例では、縮合反応を制御することができ、目的とする長さのコラーゲン様ポリペプチドを安定的に合成することができた。
また、本発明のポリペプチドを架橋することにより、変性温度が一層高い架橋ポリペプチドゲルを得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、バイオマテリアルとして利用できる高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドを効率よく製造することができる。得られるコラーゲン様ポリペプチドは、人工皮膚、人工血管、細胞増殖の足場、組織接着材、医療器材（手術用縫合糸、コンタクトレンズ、カニューレ、ステントなど）、これらの医療器材の被覆材、医薬品や化粧品の原料、食品添加剤などとして利用できる。
【国際調査報告】
2018047785.tif 000006
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