【手続補正書】
【提出日】平成18年3月13日(2006.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  特定の塩基を有したヌクレオチド配列が３´側に存在するヌクレオチド鎖に、前記特定の塩基を有したヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端に修飾物質に対して反応性を有する官能基を形成し、このヌクレオチド鎖の３´末端に直接に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項２】  特定の塩基を有したヌクレオチド配列が、主鎖となすヌクレオチド鎖の３´側に位置し、前記特定の塩基が前記主鎖に存在しない塩基である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項３】  反応性を有する官能基がアルデヒド基である請求項１または請求項２のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項４】  特定の塩基がヒポキサンチンであり、分解酵素が３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼである請求項１〜請求項３のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項５】  特定の塩基を有したヌクレオチド配列は、テーリング法により付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項６】  特定の塩基を有したヌクレオチド配列が存在するヌクレオチド鎖として、化学合成されたヌクレオチド鎖を使用する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項７】  分解酵素を作用させるに先だって、特定の塩基と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項８】  修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項９】  修飾物質が、遺伝子解析のための基板への結合能を有した物質である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１０】  ヌクレオチド鎖の３´末端の官能基に反応する修飾物質がアミノ基を有する請求項１または請求項３のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１１】  修飾物質が、アミノ酸、オリゴペプチド、またはタンパク質である請求項１０記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１２】  修飾物質が、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物である請求項１０記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
上述したヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化の課題を解決するものとして、ヌクレオチド鎖の３´末端部を直接的に修飾物質で修飾する方法が提案されている（特許文献１０参照）。この方法は、ヌクレオチド鎖の３´側に２つ以上のウラシル塩基を付加させ、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで分解して、３´末端にアルデヒド基を形成させ、このアルデヒド基とアミノ基を有する修飾物質とを共有結合させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端を修飾する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【特許文献１０】特開２００３−２４６７９４公報
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【非特許文献２】ベック（Beck.S.）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１６巻、１４３頁、１９９２年
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
【非特許文献３】ブロンシュタイン（Bronstein.I.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１７巻、３９８頁、１９９３年
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
【非特許文献２３】ミュリス（Mullis.K.B.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、１５５巻、３３５頁、１９８７年
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
この問題を解決するものとして特許文献１０記載の方法が提案されており、ヌクレオチド鎖の鎖長に関係なく、ヌクレオチド鎖の３´側を直接的に簡便に任意の修飾物質で修飾して、安定に保持可能な方法であるが、その一方で、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより分解する原理から理解されるように、ヌクレオチド鎖中にウラシル塩基の配列が存在しない時しか実施できないという制約を有している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
反応性を有する官能基として、アルデヒド基を形成することができる。
特定の塩基がヒポキサンチンであり、分解酵素が３−メチルアデニンＤＮＡグリコラーゼであるのが好ましい。特定の塩基および分解酵素は種々の組合せが可能であるが、たとえばウラシル塩基のヌクレオチド鎖への組み込みは、遺伝子解析の様々な手法の中で汎用されているため、これを特定の塩基として利用することは望ましくない場合がある。汎用頻度の低いヒポキサンチン塩基とその分解酵素を利用することで、ヌクレオチド鎖の３´末端修飾を実施する際の利用者の利便性を大幅に向上することが可能となる。また、ヌクレオチド鎖の塩基の構成や鎖長に関わらず、ヌクレオチド鎖の３´末端側を直接的に簡便に、任意の修飾物質で、定量的、安定的に修飾することが可能となる。ヌクレオチド鎖内への不必要な塩基配列、修飾された塩基の取り込みを排除し、ヌクレオチド鎖の３´末端に限定して修飾物質で修飾できる方法である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
なお、この実施の形態１では、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド（Ａ）をテーリングさせ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させる例を示したが、これに限らず、以下の表１に例示するＤＮＡグリコシラーゼあるいはＤＮＡ修復酵素と各塩基を有するヌクレオチドのテーリングとを組み合せても、同様にしてヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【表１】
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目的とするヌクレオチド鎖が化学合成可能な数十ヌクレオチド鎖長のものであれば、予め特定の塩基の配列を有するヌクレオチド鎖を合成しておくことで、第１段階の反応を省略することも可能である。
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２を図２に基づいて説明する。図中、ｍは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
フルオレセインのほかに、アミノ基を有するテキサスレッド、ローダミン、Ｃｙ３・Ｃｙ５に代表されるシアニン系化合物、ジゴギシゲニン、ビオチン等を用いて同様に、ラベル化、標識化することが可能である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
これは、テーリングしたヒポキサンチンのヌクレオチド鎖部分にオリゴデオキシシトシンがランダムにアニールするため、部分的に２本鎖が形成されず、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型が作用しない箇所が存在してしまうためである。