(57)【要約】  少数の目的領域に対するマルチプレックスＰＣＲの試行を繰り返し、配列リード数の変動係数が閾値以上である目的領域の群と、閾値未満である目的領域の群とに分け、それぞれの群について、横軸に目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をとり、縦軸に目的領域数をとったヒストグラムを作成し、プライマー設計の際のＴｍ値範囲の下限値および上限値を算出し、得られたＴｍ値範囲を設定して、プライマーを設計することで、複数の単一細胞間での目的領域ごとの増幅バラツキを抑えた、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法が提供される。
2018061693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー設計の際のＴｍ値範囲を設定するＴｍ値範囲設定工程を含む、単一細胞からのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
ｎ個の目的領域中ｍ個の目的領域をＰＣＲ増幅して目的領域ごとの配列リード数を計数する試行をＮ回行い、目的領域ごとの配列リード数の変動係数を算出した場合であって、ｉ番目の目的領域の配列リード数の変動係数の実績値をＣＶｉとし、ｉ番目の目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をＴｍｉとするとき、
前記Ｔｍ値範囲設定工程においてプライマーのＴｍ値範囲は、
配列リード数の変動係数の目標値ＣＶ０が入力手段から入力されて、記憶手段に記憶される工程；
Ｎ回の試行における目的領域の数ｍ、ｉ番目の目的領域の配列リード数の変動係数の実績値ＣＶｉ、およびｉ番目の目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値Ｔｍｉが入力されて、記憶手段に記憶される工程；
演算手段が配列リード数の変動係数の閾値ＣＶｔを目標値ＣＶ０の関数として、ＣＶｔ＝Ｈ（ＣＶ０）により算出し、記憶手段に記憶する工程；
演算手段が、前記ｍ個の目的領域を、配列リード数の変動係数ＣＶｉが、ＣＶｉ≧ＣＶｔであるｍ１個の目的領域からなるＲ１群と、ＣＶｉ＜ＣＶｔであるｍ２個の目的領域からなるＲ２群とに分け、Ｒ１群およびＲ２群のそれぞれについて、横軸に目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をとり、縦軸に目的領域数をとったヒストグラムを作成し、記憶手段に記憶する工程；ならびに、
Ｒ１群のヒストグラムの左端の値、右端の値、および最頻値、Ｒ２群のヒストグラムの左端の値、ならびに、Ｒ１群のヒストグラムとＲ２群のヒストグラムとの交点のＴｍ値から予め指定された１つを算出し、Ｔｍ値範囲の下限値として記憶手段に記憶する工程；
Ｒ２群のヒストグラムの右端の値を算出し、Ｔｍ値範囲の上限値として記憶手段に記憶する工程；
演算手段が、記憶手段に記憶された下限値および上限値を読み出し、表示手段に表示する工程
によって決定される、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
ただし、ｎは２≦ｎを満たす整数であり、ｍは２≦ｍ≦ｎを満たす整数であり、Ｎは３≦Ｎを満たす整数であり、ｉは１≦ｉ≦ｍを満たす整数であり、ｍ１およびｍ２は、１≦ｍ１＜ｍ、１≦ｍ２＜ｍ、ｍ１＋ｍ２＝ｍを満たす整数である。
【請求項２】
ＣＶｔ＝Ｈ（ＣＶ０）＝√２×ＣＶ０である、請求項１に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
【請求項３】
ＣＶｔ＝Ｈ（ＣＶ０）＝ＣＶ０である、請求項１に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年発達してきたＤＮＡシーケンサ等により遺伝子解析が手軽に行えるようになっている。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約がある。そこで、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。【０００３】
特許文献１には、同一染色体上に座標順に配置されたｍ個の目的領域に対して、マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーの設計方法が記載されている。ここで、ｍは１以上の整数である。
まず、増幅の対象となるＤＮＡの塩基配列から１つめの目的領域Ｘ１に対応するプライマー候補を選び出す。このとき、プライマー候補は、プライマーの融解温度Ｔｍ、ＧＣ含量、塩基配列の長さ、塩基配列の特異性、ヘアピン構造およびプライマー・ダイマーの形成のしにくさをあらわすスコアから選び出されるものとする。融解温度、ＧＣ含量、および塩基配列の長さが、あらかじめ定めた範囲内に収まっている、目的領域Ｘ１に対応するｎ個のプライマー候補のうち、塩基配列の特異性、ヘアピン構造及びプライマー・ダイマーの形成のしにくさから算出した、プライマー候補の優位性を示すスコアが最も高いものをＰ１１、２番目に高い候補をＰ１２、そしてｎ番目の候補をＰ１ｎと呼ぶことにする。２つめの目的領域Ｘ２に対応するｎ’個のプライマー候補Ｐ２１，Ｐ２２，・・・，Ｐ２ｎ’も、上記と同様に選び出す。すべての目的領域について同様の操作を繰り返し、ｍ番目の目的領域Ｘｍに対応するｋ個のプライマー候補Ｐｍ１，Ｐｍ２，・・・，Ｐｍｋを選び出す。
次に、選び出されたプライマー候補の中から反応に最適なプライマーの組み合わせを選び出すために、異なる目的領域のプライマー同士が意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。異なる目的領域のプライマー同士でプライマー・ダイマーを形成する可能性が低いプライマーが、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５０７９６９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特に、単一細胞から抽出した数ｐｇから十数ｐｇの少量ゲノムＤＮＡに対して、数百ヶ所以上の領域を増幅しようとしてマルチプレックスＰＣＲを行うと、同一の領域であっても、複数の単一細胞間での増幅バラツキが大きい領域が存在することがある。【０００６】
複数の単一細胞間で領域毎の増幅バラツキが大きい領域が存在することは、ＤＮＡ増幅が不安定であることを示唆するため、複数の単一細胞間での増幅バラツキを小さくし、より安定なＤＮＡ増幅を行うことができるようにすることが求められている。【０００７】
そこで、本発明は、複数の単一細胞間での目的領域ごとの増幅バラツキを抑えることができる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、少数の目的領域に対するマルチプレックスＰＣＲの試行を繰り返し、配列リード数の変動係数が閾値以上である目的領域の群と、閾値未満である目的領域の群とに分け、それぞれの群について、横軸に目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をとり、縦軸に目的領域数をとったヒストグラムを作成し、プライマー設計の際のＴｍ値範囲の下限値および上限値を算出し、得られたＴｍ値範囲を設定して、プライマーを設計することで、複数の単一細胞間での目的領域ごとの増幅バラツキを抑えることができることを知得し、本発明を完成させた。【０００９】
［１］  プライマー設計の際のＴｍ値範囲を設定するＴｍ値範囲設定工程を含む、単一細胞からのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
ｎ個の目的領域中ｍ個の目的領域をＰＣＲ増幅して目的領域ごとの配列リード数を計数する試行をＮ回行い、目的領域ごとの配列リード数の変動係数を算出した場合であって、ｉ番目の目的領域の配列リード数の変動係数の実績値をＣＶｉとし、ｉ番目の目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をＴｍｉとするとき、
上記Ｔｍ値範囲設定工程においてプライマーのＴｍ値範囲は、
配列リード数の変動係数の目標値ＣＶ０が入力手段から入力されて、記憶手段に記憶される工程；
Ｎ回の試行における目的領域の数ｍ、ｉ番目の目的領域の配列リード数の変動係数の実績値ＣＶｉ、およびｉ番目の目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値Ｔｍｉが入力されて、記憶手段に記憶される工程；
演算手段が配列リード数の変動係数の閾値ＣＶｔを目標値ＣＶ０の関数として、ＣＶｔ＝Ｈ（ＣＶ０）により算出し、記憶手段に記憶する工程；
演算手段が、上記ｍ個の目的領域を、配列リード数の変動係数ＣＶｉが、ＣＶｉ≧ＣＶｔであるｍ１個の目的領域からなるＲ１群と、ＣＶｉ＜ＣＶｔであるｍ２個の目的領域からなるＲ２群とに分け、Ｒ１群およびＲ２群のそれぞれについて、横軸に目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をとり、縦軸に目的領域数をとったヒストグラムを作成し、記憶手段に記憶する工程；ならびに、
Ｒ１群のヒストグラムの左端の値、右端の値、および最頻値、Ｒ２群のヒストグラムの左端の値、ならびに、Ｒ１群のヒストグラムとＲ２群のヒストグラムとの交点のＴｍ値から予め指定された１つを算出し、Ｔｍ値範囲の下限値として記憶手段に記憶する工程；
Ｒ２群のヒストグラムの右端の値を算出し、Ｔｍ値範囲の上限値として記憶手段に記憶する工程；
演算手段が、記憶手段に記憶された下限値および上限値を読み出し、表示手段に表示する工程
によって決定される、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
ただし、ｎは２≦ｎを満たす整数であり、ｍは２≦ｍ≦ｎを満たす整数であり、Ｎは３≦Ｎを満たす整数であり、ｉは１≦ｉ≦ｍを満たす整数であり、ｍ１およびｍ２は、１≦ｍ１＜ｍ、１≦ｍ２＜ｍ、ｍ１＋ｍ２＝ｍを満たす整数である。
［２］  ＣＶｔ＝Ｈ（ＣＶ０）＝√２×ＣＶ０である、上記［１］に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
［３］  ＣＶｔ＝Ｈ（ＣＶ０）＝ＣＶ０である、上記［１］に記載のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、複数の単一細胞間での目的領域ごとの増幅バラツキを抑えることができる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することができる。
複数の単一細胞間での目的領域ごとの増幅バラツキを抑えることにより、複数の単一細胞間でＰＣＲ増幅結果が安定するようになり、高精度な染色体数定量およびＳＮＰコールを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明において用いるハードウェアを表す概念図である。
【図２】図２は、本発明における、プライマー設計の際のＴｍ値範囲を設定するＴｍ値範囲設定工程を説明するフロー図である。
【図３】図３は、ｎ個の目的領域中ｍ個の目的領域をＰＣＲ増幅して目的領域ごとの配列リード数を計数する試行をＮ回行った結果得られた、Ｒ１群およびＲ２群のそれぞれについて、横軸に目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をとり、縦軸に目的領域数をとったヒストグラムである。グラフ中「Ａ」〜「Ｅ」点がプライマー設計の際のＴｍ値範囲の下限値の選択肢であり、「Ｆ」はＴｍ値範囲の上限値である。
【図４】図４は、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１の態様を説明する図である。
【図５】図５は、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第２の態様を説明する図である。
【図６】図６は、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１の態様を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、「Ａ〜Ｂ」はＡおよびＢを含む範囲を表す。
【００１３】
本発明は、プライマー設計の際のＴｍ値範囲を設定するＴｍ値範囲設定工程を含む、単一細胞からのマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
【００１４】
［Ｔｍ値範囲設定装置］
本発明におけるＴｍ値範囲の設定工程を実行する装置（「ハードウェア」または「実行装置」ともいう。）について、図１を参照しながら説明する。
本発明において、優先順位の設定は、演算手段（ＣＰＵ；Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ，中央演算処理装置）１１、記憶手段（メモリ）１２、補助記憶手段（ストレージ）１３、入力手段（キーボード）１４、および表示手段（モニタ）１６を備えるハードウェア（装置）によって行われる。この装置は、さらに、補助入力手段（マウス）１５、および出力手段（プリンタ）１７等を備えていてもよい。
それぞれの手段について説明する。
入力手段（キーボード）１４は、装置に指示およびデータ等を入力する手段である。補助入力手段（マウス）１５は、入力手段（キーボード）１４に代えて、またはそれとともに、用いられる。
演算手段（ＣＰＵ）１１は、演算処理を行う手段である。
記憶手段（メモリ）１２は、演算手段（ＣＰＵ）１１の演算処理の結果を記憶したり、入力手段（キーボード）１４からの入力を記憶したりする手段である。
補助記憶手段（ストレージ）１３は、オペレーティングシステム、必要ローカス数を決定するためのプログラムなどを保存するストレージである。補助記憶手段（ストレージ）１３は、その一部を記憶手段（メモリ）１２を拡張するために用いることもできる（仮想メモリ）。
【００１５】
以下では、Ｔｍ値範囲設定工程、および目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法について説明する。
【００１６】
［Ｔｍ値範囲設定工程］
図２および図３を参照しながら説明する。
Ｔｍ値範囲設定工程では、ｎ個の目的領域中ｍ個の目的領域をＰＣＲ増幅して目的領域ごとの配列リード数を計数する試行をＮ回行い、目的領域ごとの配列リード数の変動係数を算出した場合であって、ｉ番目の目的領域の配列リード数の変動係数の実績値をＣＶｉとし、ｉ番目の目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をＴｍｉとするときを前提とする。
【００１７】
上記Ｔｍ値範囲設定工程においてプライマーのＴｍ値範囲は以下のようにして設定される。
（１）配列リード数の変動係数の目標値ＣＶ０が入力手段１４から入力されて、記憶手段１２に記憶される（図２の「変動係数目標値（ＣＶ０）入力」Ｓ１１）。
（２）Ｎ回の試行における目的領域の数ｍ、ｉ番目の目的領域の配列リード数の変動係数の実績値ＣＶｉ、およびｉ番目の目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値Ｔｍｉが入力されて、記憶手段１２に記憶される（図２の「プライマーＴｍ値（Ｔｍｉ），変動係数実績値（ＣＶｉ）入力」Ｓ１２）。
（３）演算手段１１が配列リード数の変動係数の閾値ＣＶｔを目標値ＣＶ０の関数として、ＣＶｔ＝Ｈ（ＣＶ０）により算出し、記憶手段１２に記憶する（図２の「変動係数閾値ＣＶｔ）算出」Ｓ１３）。ＣＶ０の関数Ｈ（ＣＶ０）は特に限定されないが、Ｈ（ＣＶ０）＝√２×ＣＶ０、またはＨ（ＣＶ０）＝ＣＶ０が好ましく、Ｈ（ＣＶ０）＝√２×ＣＶ０がより好ましい。
（４）演算手段１１が、上記ｍ個の目的領域を、配列リード数の変動係数ＣＶｉが、ＣＶｉ≧ＣＶｔであるｍ１個の目的領域からなるＲ１群と、ＣＶｉ＜ＣＶｔであるｍ２個の目的領域からなるＲ２群とに分け、Ｒ１群およびＲ２群のそれぞれについて、横軸に目的領域をＰＣＲ増幅するために使用された１対のプライマーの平均Ｔｍ値をとり、縦軸に目的領域数をとったヒストグラムを作成し、記憶手段１２に記憶する（図３）。
（５）演算手段１１が、Ｒ１群のヒストグラムの左端の値（図３の「Ａ」）、右端の値（図３の「Ｃ」、および最頻値（図３の「Ｂ」）、Ｒ２群のヒストグラムの左端の値（図３の「Ｅ」）、ならびに、Ｒ１群のヒストグラムとＲ２群のヒストグラムとの交点（図３の「Ｄ」）から予め選択された１つを算出し、Ｔｍ値範囲の下限値として、記憶手段１２に記憶する（図２の「「Ｔｍ値下限値算出」Ｓ１５）。
（６）演算手段１１が、Ｒ２群の右端の値（図３の「Ｆ」）を算出し、Ｔｍ値範囲の上限値として、記憶手段１２に記憶する（図２の「「Ｔｍ値上限値算出」Ｓ１６）。
（７）演算手段１１が、Ｔｍ値範囲を表示手段１６に表示する、または出力手段１７に出力する（図２の「「Ｔｍ値範囲出力」Ｓ１７）。
ただし、ｎは２≦ｎを満たす整数であり、ｍは２≦ｍ≦ｎを満たす整数であり、Ｎは３≦Ｎを満たす整数であり、ｉは１≦ｉ≦ｍを満たす整数であり、ｍ１およびｍ２は、１≦ｍ１＜ｍ、１≦ｍ２＜ｍ、ｍ１＋ｍ２＝ｍを満たす整数である。
【００１８】
［目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法］
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法における、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法は、以下の工程を含む。
【００１９】
〈目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１の態様〉
目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１の態様は、以下の（ａ）対象領域選択工程と、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程と、（ｃ）ローカルアラインメント工程と、（ｄ）第一段階選抜工程と、（ｅ）グローバルアラインメント工程と、（ｆ）第二段階選抜工程と、（ｇ）プライマー採用工程と、を含む。
【００２０】
（ａ）目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程。
（ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程。
（ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
（ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程。
（ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
（ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程。
（ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程。
【００２１】
ただし、上記（ａ）工程〜上記（ｇ）工程のうち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程の両工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行った後、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行ってもよいし、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行ってもよいし、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行ってもよい。
【００２２】
上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行う場合には、上記（ｅ）工程および上記（ｃ）工程は、それぞれ、下記（ｅ’）工程および下記（ｃ’）工程とすることが好ましい。
【００２３】
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
【００２４】
（ｃ’）上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
【００２５】
また、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ）工程は、下記（ｅ’）工程とすることが好ましい。
【００２６】
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
【００２７】
〈目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第２の態様〉
目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第２の態様は、以下の（ａ１）対象領域選択第１工程と、（ｂ１）プライマー候補塩基配列作成第１工程と、（ｃ１）ローカルアラインメント第１工程と、（ｄ１）第一段階選抜第１工程と、（ｅ１）グローバルアラインメント第１工程と、（ｆ１）第二段階選抜第１工程と、（ｇ１）プライマー採用第１工程と、（ａ２）対象領域選択第２工程と、（ｂ２）プライマー候補塩基配列作成第２工程と、（ｃ２）ローカルアラインメント第２工程と、（ｄ２）第一段階選抜第２工程と、（ｅ２）グローバルアラインメント第２工程と、（ｆ２）第二段階選抜第２工程と、（ｇ２）プライマー採用第２工程と、を含む。
【００２８】
（ａ１）目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程。
（ｂ１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程。
（ｃ１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
（ｄ１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程。
（ｅ１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
（ｆ１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程。
（ｇ１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程。
【００２９】
（ａ２）目的領域から上記第１の対象領域とは異なる第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程。
（ｂ２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程。
（ｃ２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
（ｄ２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程。
（ｅ２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｆ２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程。
（ｇ２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程。
【００３０】
ただし、上記（ａ１）工程〜上記（ｇ１）工程のうち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程の両工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行った後、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００３１】
上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行う場合には、上記（ｅ１）工程および上記（ｃ１）工程は、それぞれ、下記（ｅ１’）工程および下記（ｃ１’）工程とすることが好ましい。
【００３２】
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
【００３３】
（ｃ１’）上記第二段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
【００３４】
また、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ１）工程は、下記（ｅ１’）工程とすることが好ましい。
【００３５】
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
【００３６】
ただし、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程のうち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程の両工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行った後、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行ってもよい。
【００３７】
上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行う場合には、上記（ｅ２）工程および上記（ｃ２）工程は、それぞれ、下記（ｅ２’）工程および下記（ｃ２’）工程とすることが好ましい。
【００３８】
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
【００３９】
（ｃ２’）上記第二段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
【００４０】
また、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ２）工程は、下記（ｅ２’）工程とすることが好ましい。
【００４１】
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
【００４２】
さらに、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程までの各工程を繰り返す。
【００４３】
〈目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第３の態様〉
目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第３の態様は、以下の（ａ−０）対象領域複数選択工程と、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程と、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程と、（ｄ−１）第１の第一段階選抜工程と、（ｅ−１）第１のグローバルアラインメント工程と、（ｆ−１）第１の第二段階選抜工程と、（ｇ−１）第１のプライマー採用工程と、（ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程と、（ｄ−２）第２の第一段階選抜工程と、（ｅ−２）第２のグローバルアラインメント工程と、（ｆ−２）第２の第二段階選抜工程と、（ｇ−２）第２のプライマー採用工程と、を含む。
【００４４】
（ａ−０）目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程。
（ｂ−０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程。
【００４５】
（ｃ−１）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち１つを第１の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
（ｄ−１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程。
（ｅ−１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｆ−１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程。
（ｇ−１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程。
【００４６】
（ｃ−２）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち、上記第１の対象領域を除く１つを第２の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
（ｄ−２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程。
（ｅ−２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
（ｆ−２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程。
（ｇ−２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程。
【００４７】
ただし、上記（ｃ−１）工程〜上記（ｇ−１）工程のうち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程の両工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行った後、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００４８】
上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行う場合には、上記（ｅ−１）工程および上記（ｃ−１）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−１）工程および下記（ｃ’−１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−１）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち１つを第１の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｃ’−１）上記第１の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
【００４９】
また、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−１）工程は、下記（ｅ’−１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−１）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち１つを第１の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
【００５０】
ただし、上記（ｃ−２）工程〜上記（ｇ−２）工程のうち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程の両工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行った後、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００５１】
上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行う場合には、上記（ｅ−２）工程および上記（ｃ−２）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−２）工程および下記（ｃ’−２）工程とすることが好ましい。
【００５２】
（ｅ’−２）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち、上記第１の対象領域を除く１つを第２の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
【００５３】
（ｃ’−２）上記第２の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
【００５４】
また、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−２）工程は、下記（ｅ’−２）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−２）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち、上記第１の対象領域を除く１つを第２の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
【００５５】
さらに、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち、上記第１および第２の対象領域を除く１つを第３の対象領域とし、上記第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す。
【００５６】
〈各工程の説明〉
目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１〜第３の態様について、適宜、図４〜図６を参照しながら、各工程を説明する。
【００５７】
《対象領域選択工程》
本明細書において、対象領域選択工程Ｓ１０１（図４）、対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１（図５）、ならびに複数対象領域選択工程Ｓ３０１（図６）を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。
【００５８】
（第１の態様：  対象領域選択工程Ｓ１０１）
図４において「対象領域選択」として示す。
第１の態様において、（ａ）対象領域選択工程は、目的領域から対象領域を選択する工程である。選択の方法は特に限定されないが、例えば、目的領域にプライマー設計の優先順位が付けられている場合は、その優先順位が示す順序に従って、目的領域からプライマーを設計する対象領域を選択する。
【００５９】
（第２の態様：  対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１）
図５において、「対象領域選択第１」および「対象領域選択第２」として示す。
第２の態様において、（ａ１）対象領域選択第１工程は、目的領域から第１の対象領域を選択する工程であり、（ａ２）対象領域選択第２工程は、まだ対象領域として選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する工程である。選択の方法は特に限定されないが、例えば、目的領域にプライマー設計の優先順位が付けられている場合は、その優先順位が示す順序に従って、目的領域からプライマーを設計する対象領域を選択する。
【００６０】
（第３の態様：  対象領域複数選択工程Ｓ３０１）
図６において、「対象領域複数選択」として示す。
第３の態様において、（ａ−０）対象領域複数選択工程は、目的領域から複数の対象領域を選択する工程である。選択の方法は特に限定されないが、例えば、目的領域にプライマー設計の優先順位が付けられている場合は、その優先順位が示す順序に従って、目的領域からプライマーを設計する対象領域を複数選択する。
【００６１】
《プライマー候補塩基配列作成工程》
本明細書において、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２（図４）、プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２（図５）、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２（図６）を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成工程」という場合がある。
【００６２】
（第１の態様：  プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２）
図４において「プライマー候補塩基配列作成」として示す。
第１の態様において、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
【００６３】
（第２の態様：  プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２）
図５において「プライマー候補塩基配列作成第１」および「プライマー候補塩基配列作成第２」として示す。
第２の態様において、（ｂ１）プライマー候補塩基配列作成第１工程は、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程であり、（ｂ２）プライマー候補塩基配列作成第２工程は、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
第２の態様では１つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の１つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。
【００６４】
（第３の態様：  プライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２）
図６において「プライマー候補塩基配列複数作成」として示す。
第３の態様において、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する。
第３の態様では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。
【００６５】
（近傍領域）
対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の５’端から外側の領域、および対象領域の３’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
【００６６】
（プライマーの設計パラメータ）
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、融解温度（２本鎖ＤＮＡの５０％が解離して１本鎖ＤＮＡになる温度をいう。また、Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅに由来し、「Ｔｍ値」という場合もある。単位は「℃」である。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
【００６７】
・プライマーの長さ
プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
【００６８】
・プライマーのＧＣ含量
プライマーのＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
【００６９】
・プライマーのＴｍ値
プライマーのＴｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
プライマーのＴｍ値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下とする。
Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
【００７０】
ただし、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法においては、上記した「プライマー設計の際のＴｍ値範囲を設定するＴｍ値範囲設定工程」においてＴｍ値の範囲を決定した後は、そのＴｍ値の範囲を用いる。
【００７１】
・プライマーの塩基の偏り
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
【００７２】
・プライマーの３’末端
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
【００７３】
《特異性チェック工程》
「プライマー候補塩基配列作成工程」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体ＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
特異性のチェックは、染色体ＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体ＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、染色体ＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。
【００７４】
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
【００７５】
スコア、およびローカルアラインメント・スコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアとして、マッチ（相補塩基）＝＋１、ミスマッチ（非相補塩基）＝−１、インデル（挿入および／または欠失）＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定すること等が考えられる。
【００７６】
プライマー候補の塩基配列が染色体ＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、対象領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
【００７７】
《ローカルアラインメント工程》
本明細書において、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３（図４）、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３（図５）、ならびに第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３（図６）を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。
【００７８】
（第１の態様：  ローカルアラインメント工程Ｓ１０３）
図４において「ローカルアラインメント」として示す。
第１の態様において、（ｃ）ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【００７９】
（第２の態様：  ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３）
図５において「ローカルアラインメント第１」および「ローカルアラインメント第２」として示す。
第２の態様において、（ｃ１）ローカルアラインメント第１工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ２）ローカルアラインメント第２工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【００８０】
（第３の態様：  第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３）
図６において「第１のローカルアラインメント」および「第２のローカルアラインメント」として示す。
第３の態様において、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【００８１】
（ローカルアラインメントの方法）
ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をｐ個として、重複を許して選択した場合は、「ｐＨ２＝ｐ＋１Ｃ２＝（ｐ＋１）！／２（ｐ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｐＣ２＝ｐ（ｐ−１）／２」通りである。
【００８２】
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。
さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【００８３】
【表１】
2018061693.tif 000003
【００８４】
例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
【００８５】
【表２】
2018061693.tif 000004
【００８６】
配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
【００８７】
【表３】
2018061693.tif 000005
【００８８】
表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。なお、表４中、マッチを「｜」で、ミスマッチを「：」で、それぞれ示す。
【００８９】
【表４】
2018061693.tif 000006
【００９０】
この（ペアワイズ）アラインメントには、マッチが２か所あり、ミスマッチが４か所あり、インデル（ギャップ）はない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、（＋１）×２＋（−１）×４＋（−１）×０＝−２となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【００９１】
《第一段階選抜工程》
本明細書において、第一段階選抜工程Ｓ１０４（図４）、第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４（図５）、ならびに第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４（図６）を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。
【００９２】
（第１の態様：  第一段階選抜工程Ｓ１０４）
図４において「第一段階選抜」として示す。
第１の態様において、（ｄ）第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【００９３】
（第２の態様：  第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４）
図５において「第一段階選抜第１」および「第一段階選抜第２」として示す。
第２の態様において、（ｄ１）第一段階選抜第１工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ２）第一段階選抜第２工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【００９４】
（第３の態様：  第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４）
図６において「第１の第一段階選抜」および「第２の第一段階選抜」として示す。
第３の態様において、（ｄ−１）第１の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ−２）第２の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【００９５】
（第１段階選抜の方法）
ローカルアラインメント・スコアの閾値（「第１の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
【００９６】
ここで、上記「ローカルアラインメント」に示した例において、第１の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「−２」であり、第１の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
【００９７】
なお、本工程は、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３、ローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３、第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３、または第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３においてローカルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【００９８】
《グローバルアラインメント工程》
本明細書において、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５（図４）、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５（図５）、ならびに第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５（図６）を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。
【００９９】
（第１の態様：  グローバルアラインメント工程Ｓ１０５）
図４において「グローバルアラインメント」として示す。
第１の態様において、（ｅ）グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１００】
（第２の態様：  グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５）
図５において「グローバルアラインメント第１」および「グローバルアラインメント第２」として示す。
第２の態様において、（ｅ１）グローバルアラインメント第１工程は、上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ２）グローバルアラインメント第２工程は、上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１０１】
（第３の態様：  第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５）
図６において「第１のグローバルアラインメント」および「第２のグローバルアラインメント」として示す。
第３の態様において、（ｅ−１）第１のグローバルアラインメント工程は、上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ−２）第２のグローバルアラインメント工程は、上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１０２】
（グローバルアラインメントの方法）
グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成工程」で作成したプライマー候補の全部（「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。）および既に採用したプライマーの全部（既に採用したプライマーが存在する場合に限る。）からなる群から２つのプライマーを取り出して、３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。
【０１０３】
グローバルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「ｘＨ２＝ｘ＋１Ｃ２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｘＣ２＝ｘ（ｘ−１）／２」通りである。
【０１０４】
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１０５】
例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字箇所）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
【０１０６】
【表５】
2018061693.tif 000007
【０１０７】
スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。なお、表６中、ミスマッチを「：」で示す。
【０１０８】
【表６】
2018061693.tif 000008
【０１０９】
この（ペアワイズ）アラインメントには、ミスマッチが３か所あり、マッチおよびインデル（ギャップ）はいずれもない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、（＋１）×０＋（−１）×３＋（−１）×０＝−３となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１１０】
《第二段階選抜工程》
本明細書において、第二段階選抜工程Ｓ１０６（図４）、第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６（図５）、ならびに第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６（図６）を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。
【０１１１】
（第１の態様：  第二段階選抜工程Ｓ１０６）
図４において「第二段階選抜」として示す。
第１の態様において、（ｆ）第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１１２】
（第２の態様：  第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６）
図５において「第二段階選抜第１」および「第二段階選抜第２」として示す。
第２の態様において、（ｆ１）第二段階選抜第１工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ２）第二段階選抜第２工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１１３】
（第３の態様：  第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６）
図６において「第１の第二段階選抜」および「第２の第二段階選抜」として示す。
第３の態様において、（ｆ−１）第１の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ−２）第２の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１１４】
（第二段階選抜の方法）
グローバルアラインメント・スコアの閾値（「第２の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
【０１１５】
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアを第２の閾値未満とすることができる。
【０１１６】
ここで、上記「グローバルアラインメント工程」に示した例において、第２の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であり、第２の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１１７】
なお、本工程は、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５、グローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５、第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５、または第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５においてグローバルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【０１１８】
また、計算量を低減させるため、「グローバルアラインメント工程」および「第２段階選抜工程」の両工程を先に実施して、「第２段階選抜工程」を通過したプライマーの塩基配列の組合せに対して、「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」の両工程を実施することが好ましい。特に、対象領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【０１１９】
これは、「グローバルアラインメント工程」では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメント・スコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
【０１２０】
《増幅配列長チェック工程》
「第１段階選抜工程」および「第２段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
【０１２１】
《プライマー採用工程》
本明細書において、プライマー採用工程Ｓ１０７（図４）、プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７（図５）、ならびに第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７（図６）を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。
【０１２２】
（第１の態様：  プライマー採用工程Ｓ１０７）
図４において「プライマー採用」として示す。
第１の態様において、（ｇ）プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１２３】
（第２の態様：  プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７）
図５において「プライマー採用第１」および「プライマー採用第２」として示す。
第２の態様において、（ｇ１）プライマー採用第１工程は、上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ２）プライマー採用第２工程は、上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１２４】
（第３の態様：  第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７）
図６において「第１のプライマー採用」および「第２のプライマー採用」として示す。
第３の態様において、（ｇ−１）第１のプライマー採用工程は、上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ−２）第２のプライマー採用工程は、上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１２５】
（プライマー採用の方法）
プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
【０１２６】
例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
【０１２７】
【表７】
2018061693.tif 000009
【０１２８】
既に記載したように、配列番号１と配列番号２の組合せにおいて、ローカルアラインメント・スコアは「−２」であるから、第１の閾値である「＋３」未満であり、また、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であるから、第２の閾値である「＋３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
【０１２９】
《他の目的領域のプライマー設計》
１つの目的領域に対してプライマーを採用した後、さらに他の目的領域に対してプライマーを設計してもよい。
第１の態様においては、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、他の目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３から行う。他の目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程Ｓ１０１において目的領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程Ｓ１０１において他の目的領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、その目的領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３以降を行う。
第２の態様においては、対象領域選択第２工程Ｓ２１１において第１の目的領域以外の目的領域を選択するところからから繰り返す。
第３の態様においては、既に対象領域複数選択工程Ｓ３０１において選択した目的領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２において作成されているため、第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３から繰り返す。
【０１３０】
《プライマー等の設計における特徴点》
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法における、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。
さらに、プライマー候補の塩基配列を作成する際のＴｍ値として、目標値および実績値から算出したＴｍ値範囲を用いることによって、より安定した目的領域のＰＣＲ増幅が可能となる。
【０１３１】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３２】
［実施例１］
１．一般的なＴｍ値範囲でのプライマー設計
Ｔｍ値を一般的な６０℃〜８０℃の範囲（「第１のＴｍ値範囲」という。）に設定して、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、目的領域Ｖ１〜Ｖ２０をＰＣＲ増幅するためのプライマーを表８に示す。【０１３３】
【表８】
2018061693.tif 000010
【０１３４】
２．一般的なＴｍ値範囲でプライマー設計をした場合の実験結果
表９に、細胞Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５の目的領域Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１２の配列リード数と、目的領域ごとの変動係数を示す。
第１のＴｍ値範囲でプライマー設計をした場合は、目的領域ごとの変動係数が１．０を超える目的領域が存在し、ＰＣＲ増幅のばらつきが大きかった。【０１３５】
【表９】
2018061693.tif 000011
【０１３６】
３．Ｔｍ値範囲の算出
配列リード数の変動係数の目標値を１．０に設定し、閾値を目標値の√２倍に設定し、各目的領域をＰＣＲ増幅したプライマーのＴｍ値および目的領域ごとの変動係数から、新しいＴｍ値範囲（「第２のＴｍ値範囲」という。）を算出した。【０１３７】
４．新しいＴｍ値範囲でのプライマー設計
Ｔｍ値を第２のＴｍ値範囲に設定して、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、目的領域Ｖ１、およびＶ２１〜Ｖ３９をＰＣＲ増幅するためのプライマーを表１０に示す。【０１３８】
【表１０】
2018061693.tif 000012
【０１３９】
５．新しいＴｍ値範囲でプライマー設計をした場合の実験結果
表１１に、細胞Ｎｏ．６〜Ｎｏ．１０の目的領域Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１２の配列リード数と、目的領域ごとの変動係数を示す。
第２のＴｍ値範囲でプライマー設計をした場合は、目的領域ごとの変動係数が１．０を超える標的領域が存在せず、ＰＣＲ増幅のばらつきが小さかった。【０１４０】
【表１１】
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【符号の説明】
【０１４１】
１１  演算手段（ＣＰＵ）
１２  記憶手段（メモリ）
１３  補助記憶手段（ストレージ）
１４  入力手段（キーボード）
１５  補助入力手段（マウス）
１６  表示手段（モニタ）
１７  出力手段（プリンタ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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