(57)【要約】  Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現を促進させたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法、並びに、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体。
2018047657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
【請求項２】
ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類において、Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖多価不飽和脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
【請求項３】
Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記Δ12-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
前記Δ6-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記藻類において、ω3-デサチュラーゼ、Δ5-デサチュラーゼ、Δ9-デサチュラーゼ及びΔ6-エロンガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子を前記藻類に導入し、導入した前記遺伝子の発現を促進させる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ω3-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）である、請求項６又は７記載の方法。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
前記Δ5-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）である、請求項６又は７記載の方法。
（Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
前記Δ9-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）である、請求項６又は７記載の方法。
（Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
前記Δ6-エロンガーゼが下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）である、請求項６又は７記載の方法。
（Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
前記脂肪酸又は前記脂質が、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現が促進されている、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の形質転換体。
【請求項１４】
前記Δ12-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）である、請求項１３記載の形質転換体。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
前記Δ6-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）である、請求項１３又は１４記載の形質転換体。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１６】
前記形質転換体において、ω3-デサチュラーゼ、Δ5-デサチュラーゼ、Δ9-デサチュラーゼ及びΔ6-エロンガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現が促進されている、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１７】
前記ω3-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）である、請求項１６記載の形質転換体。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１８】
前記Δ5-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）である、請求項１６記載の形質転換体。
（Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
前記Δ9-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）である、請求項１６記載の形質転換体。
（Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２０】
前記Δ6-エロンガーゼが下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）である、請求項１６記載の形質転換体。
（Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法に関する。また本発明は、当該方法に用いる形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数が１８以上の長鎖脂肪酸は炭素原子数や不飽和度によって化学的性質が異なり、様々な用途に用いられている。例えば、エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid、以下「EPA」ともいう）やドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid、以下、「DHA」ともいう）といった長鎖多価不飽和脂肪酸（以下、「ＰＵＦＡ」ともいう）の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。よってＰＵＦＡは栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。【０００３】
一般に、植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−アシルキャリアープロテイン（acyl carrier protein、以下「ACP」ともいう）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１８程度のアシル-ACP（脂肪酸残基であるアシル基とACPとからなる複合体。ここで炭素原子数はアシル基の炭素数を示し、以下同様に示す場合がある。）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β−ケトアシル-ACPシンターゼ（β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase、以下「KAS」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、KAS  I、KAS  II、KAS  III、KAS  IV、のそれぞれ機能が異なる４種のKASが存在することが知られている。このうち、KAS  IIは主に炭素原子数１８のステアロイル-ACPまでの伸長反応に関与する。
合成されたアシル-ACPは、アシル-ACPチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）によって遊離脂肪酸となり、小胞体に運ばれる。そして小胞体上で、遊離脂肪酸、アシル-CoA、又は脂肪酸とグリセロールとのエステル化合物を基質とし、多数のデサチュラーゼ（Desaturase）やエロンガーゼ（Elongase）が作用する多段階反応によって、ＰＵＦＡが合成される。【０００４】
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究、開発が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
この中で、とりわけ、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産能力や脂質蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成や蓄積のメカニズム、並びに藻類の脂質生産能力や脂質蓄積能力を応用した脂質生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。【０００５】
前述のように、脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物や細菌等の宿主において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。
一般的にＰＵＦＡの生産性向上には、デサチュラーゼの強化が有効であると考えられており、様々な生物からこれらの酵素群が同定されている。例えば、次世代の油脂生産源として注目を集めている微細藻類の一種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来のデサチュラーゼが、ＰＵＦＡの合成に使用できることが知られている（特許文献１、非特許文献１及び２参照）。
このように、油糧生物において所望のＰＵＦＡに富む脂質を効率的に産生させる方法に対しては、当技術分野における需要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４９４５７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Algal Research，2015，Vol．11，p．387-398
【非特許文献２】Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，Vol．29(2)，p．290-296
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
また本発明は、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現を促進し、前記藻類の細胞内で生産される全脂肪酸に占めるＰＵＦＡの割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法に関する。
さらに本発明は、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体に関する。
【０００９】
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるEPAの主要な合成経路と、EPAなどのＰＵＦＡの合成における律速段階を示す図である。
【図２】藻類や植物でのＰＵＦＡの一般的な合成経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供する。
また本発明は、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供する。
【００１２】
本発明者は上記点について、鋭意検討を行った。
ナンノクロロプシス属に属する藻類はEPAなどのＰＵＦＡの生産能に優れる。また藻類の培養後期（具体的には、窒素などの栄養源が枯渇した条件）では、全脂肪酸の生産量が有意に増加する。しかし、本発明者がナンノクロロプシス属に属する藻類のＰＵＦＡ生産能について詳細に検討した結果、培養期間が長くなり全脂肪酸の生産量が増加するに従い、全脂肪酸の生産量に対するＰＵＦＡの生産量の割合が大幅に減少することを見い出した。
そこで本発明者はまず、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路について種々検討し、それを特定することを試みた。そしてＰＵＦＡの合成における律速反応についてさらに検討を重ねた結果、デサチュラーゼの１種であるΔ12-デサチュラーゼの作用によりオレイン酸（以下、「C18:1Δ9」とも表記する）からリノール酸（以下、「C18:2Δ9,12」とも表記する）を生成し、同じくデサチュラーゼの１種であるΔ6-デサチュラーゼの作用により生成したC18:2Δ9,12からγ-リノレン酸（以下、「C18:3Δ6,9,12」とも表記する）を生成するまでの一連の工程が、ＰＵＦＡの合成反応における律速段階であることを見い出した。そしてこの律速段階の反応を触媒する酵素の発現を促進させることで、ＰＵＦＡの生産量が有意に増大することを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１３】
本発明によりＰＵＦＡ合成経路の律速段階の反応を触媒する酵素の発現が促進され、ＰＵＦＡの生産量を増大させることができる。
よって本発明の脂質の製造方法によれば、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、ＰＵＦＡ合成経路の律速段階の反応を触媒する酵素の発現が促進されており、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
【００１４】
本明細書における「脂質」は、中性脂質（モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基を脂肪酸と見做して合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
【００１５】
また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数xで二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数xの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１６】
前述のように、本発明者は、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの主な合成経路を特定した。今回特定したＰＵＦＡの主要な合成経路と、ＰＵＦＡの合成における律速段階を図１に示した。なお、参考として、藻類や植物でのＰＵＦＡの一般的な合成経路を図２に示す。
後述の実施例に示すように、野生型のナンノクロロプシス属に属する藻類では、C20:4は検出されるが、ステアリドン酸（以下、「C18:4Δ6,9,12,15」とも表記する）がほとんど検出されない。これらの結果から、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるEPAの主な合成経路は、図１に示すようなアラキドン酸（以下、「C20:4Δ5,8,11,14」とも表記する）を経由する経路であると特定した。
【００１７】
そして本発明者は、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来の各種デサチュラーゼを特定した。そしてこれらデサチュラーゼの発現をそれぞれ促進させ、EPAなどのＰＵＦＡの生成量を測定した。その結果、各種デサチュラーゼをそれぞれ単独で発現を促進させても、ＰＵＦＡ量に大きな変化が確認できなかった。
そこで、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路について、さらに検討を行った。その結果、Δ12-デサチュラーゼ（以下、「Δ12-DES」ともいう）とΔ6-デサチュラーゼ（以下、「Δ6-DES」ともいう）が触媒する一連の工程（オレイン酸からリノール酸を生成し、生成したリノール酸からγ-リノレン酸を生成する反応）が、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路の律速段階であることを見い出した。そして、この律速段階の反応を触媒する酵素の発現を促進することで、ナンノクロロプシス属に属する藻類のＰＵＦＡの生産能が向上する。さらに、藻類の培養時間の経過とともに、全脂肪酸量に対するＰＵＦＡ量の割合が、野生株と比較して有意に増加する。
なお本明細書において「律速段階」とは、化学反応などの動的過程や複雑な代謝経路がいくつかの段階によって構成されているとき、それらの段階のうち他の段階に比べて進行が緩慢であり、全過程の進行を実際上支配する段階をいう。
【００１８】
本明細書において「Δ12-DES」とは、C18:1Δ9のΔ12位に不飽和結合を導入し、ω-6脂肪酸であるC18:2Δ9,12を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ12-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ12-DES活性」ともいう）」とは、C18:1Δ9のΔ12位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
タンパク質がΔ12-DES活性を有することは、例えば、Δ12-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ12-DES合成遺伝子欠損株に導入し、リノール酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ12-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、オレイン酸、オレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いオレイン酸量の減少又はリノール酸量の増加を測定することで確認できる。
【００１９】
本発明における好ましいΔ12-DESとしては、下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）が挙げられる。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株由来のΔ12-DES（以下、「NoΔ12-DES」ともいう）である。また、配列番号４５のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）B-31株由来のΔ12-DES（以下、「NgΔ12-DES」ともいう）である。
なお、タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列の同一性は８６％である。
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）はいずれも、Δ12-DES活性を有する。
【００２０】
前記タンパク質（Ｂ）において、Δ12-DES活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１７６個以下、好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｄ）において、Δ12-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１８１個以下、好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１３個以下、より好ましくは１個以上９１個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
【００２１】
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このように所望の活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２２】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１又は４５に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ12-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
【００２３】
前記Δ12-DES（好ましくは前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ12-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ12-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ12-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
配列番号４６の塩基配列は、配列番号４５のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ12-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ12-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
【００２４】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、Δ12-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５２７個以下、好ましくは１個以上４６１個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３３０個以下、より好ましくは１個以上２６４個以下、より好ましくは１個以上１９８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００２５】
前記ＤＮＡ（ｄ）において、Δ12-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５４４個以下、好ましくは１個以上４７６個以下、より好ましくは１個以上４０８個以下、より好ましくは１個以上３４０個以下、より好ましくは１個以上２７２個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００２６】
本明細書において「Δ6-DES」とは、C18:2Δ9,12のΔ6位に不飽和結合を導入し、C18:3Δ6,9,12を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ6-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ6-DES活性」ともいう）」とは、C18:2Δ9,12のΔ6位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
タンパク質がΔ6-DES活性を有することは、例えば、Δ6-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-DES合成遺伝子欠損株に導入し、γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、リノール酸、リノレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いリノール酸量の減少又はγ-リノレン酸量の増加を測定することで確認できる。
【００２７】
本発明における好ましいΔ6-DESとしては、下記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）が挙げられる。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｇ）配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ6-DES（以下、「NoΔ6-DES」ともいう）である。また、配列番号４７のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナB-31株由来のΔ6-DES（以下、「NgΔ6-DES」ともいう）である。
なお、タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列の同一性は８９％である。
前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）はいずれも、Δ6-DES活性を有する。
【００２８】
前記タンパク質（Ｆ）において、Δ6-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｆ）として、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｈ）において、Δ6-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｈ）として、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
【００２９】
前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号３又は４７に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ6-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
【００３０】
前記Δ6-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ6-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｅ）〜（ｈ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ｅ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号４の塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ6-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ6-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
配列番号４８の塩基配列は、配列番号４７のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ6-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ6-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
【００３１】
前記ＤＮＡ（ｆ）において、Δ6-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｆ）として、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７０個以下、好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｆ）として、前記ＤＮＡ（ｅ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００３２】
前記ＤＮＡ（ｈ）において、Δ6-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｈ）として、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７２個以下、好ましくは１個以上５００個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｈ）として、前記ＤＮＡ（ｇ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００３３】
本発明において、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、ω3-デサチュラーゼ（以下、「ω3-DES」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
本明細書において「ω3-DES」とは、図１に示すように、C20:4Δ5,8,11,14のω3位に不飽和結合を導入し、ω-3脂肪酸であるEPA（以下、「C20:5Δ5,8,11,14,17」とも表記する）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「ω3-デサチュラーゼ活性（以下、「ω3-DES活性」ともいう」」とは、C20:4Δ5,8,11,14のω3位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
後述の実施例で示すように、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類において、ω3-DESの発現も促進することで、C20:4Δ5,8,11,14のω3位への不飽和結合の導入が亢進し、C20:5Δ5,8,11,14,17の生産量がさらに増加する。
タンパク質がω3-DES活性を有することは、例えば、ω3-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをω3-DES合成遺伝子欠損株に導入し、EPAの生成を検討することで確認できる。あるいは、ω3-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、アラキドン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いアラキドン酸量の減少又はEPA量の増加を測定することで確認できる。
【００３４】
本発明における好ましいω3-DESとしては、下記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）が挙げられる。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のω3-DES（以下、「Noω3-DES」ともいう）である。また、配列番号４９のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のω3-DES（以下、「Ngω3-DES」ともいう）である。
なお、タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列の同一性は８２％である。
前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）はいずれも、ω3-DES活性を有する。
【００３５】
前記タンパク質（Ｊ）において、ω3-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｊ）として、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６４個以下、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｌ）において、ω3-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｌ）として、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６３個以下、好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
【００３６】
前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号５又は４９に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、ω3-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
【００３７】
前記ω3-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「ω3-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｉ）〜（ｌ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号６の塩基配列は、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質（Noω3-DES）をコードする遺伝子（以下、「Noω3-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
配列番号５０の塩基配列は、配列番号４９のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ngω3-DES）をコードする遺伝子ｃの塩基配列である。
【００３８】
前記ＤＮＡ（ｊ）において、ω3-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｊ）として、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４９４個以下、好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７０個以下、より好ましくは１個以上３０９個以下、より好ましくは１個以上２４７個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｊ）として、前記ＤＮＡ（ｉ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００３９】
前記ＤＮＡ（ｌ）において、ω3-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｌ）として、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４９０個以下、好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３６８個以下、より好ましくは１個以上３０６個以下、より好ましくは１個以上２４５個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上９８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｌ）として、前記ＤＮＡ（ｋ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００４０】
本発明において、ω3-DESと同様、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、Δ5-デサチュラーゼ（以下、「Δ5-DES」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
本明細書において「Δ5-DES」とは、図１に示すように、ジホモ-γ-リノレン酸（以下、「C20:3Δ8,11,14」とも表記する）のΔ5位に不飽和結合を導入し、C20:4Δ5,8,11,14を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ5-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ5-DES活性」ともいう」」とは、C20:3Δ8,11,14のΔ5位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類では、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続反応によって、C18:3Δ6,9,12と、C18:3Δ6,9,12に炭素鎖を２個分伸長させて合成されるC20:3Δ8,11,14の生成量が増加する。よって、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ5-DESの発現も促進することで、C20:3Δ8,11,14のΔ5位への不飽和結合の導入が亢進し、C20:5Δ5,8,11,14,17合成の基質となるC20:4Δ5,8,11,14の生産量がさらに増加する。
タンパク質がΔ5-DES活性を有することは、例えば、Δ5-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ5-DES合成遺伝子欠損株に導入し、アラキドン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ5-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ジホモ-γ-リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いジホモ-γ-リノレン酸量の減少又はアラキドン酸量の増加を測定することで確認できる。
【００４１】
本発明における好ましいΔ5-DESとしては、下記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）が挙げられる。
（Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｏ）配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ5-DES（以下、「NoΔ5-DES」ともいう）である。また、配列番号５１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナB-31株由来のΔ5-DES（以下、「NgΔ5-DES」ともいう）である。
なお、タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列の同一性は81％である。
前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）はいずれも、Δ5-DES活性を有する。
【００４２】
前記タンパク質（Ｎ）において、Δ5-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｎ）として、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２１１個以下、好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７９個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｐ）において、Δ5-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｐ）として、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２０６個以下、好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２９個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
【００４３】
前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号７又は５１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ5-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
【００４４】
前記Δ5-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ5-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｍ）〜（ｐ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ｍ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｎ）前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号８の塩基配列は、配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ5-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ5-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
配列番号５２の塩基配列は、配列番号５１のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ5-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ5-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
【００４５】
前記ＤＮＡ（ｎ）において、Δ5-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｎ）として、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上６３３個以下、好ましくは１個以上５５４個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３１７個以下、より好ましくは１個以上２３８個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｎ）として、前記ＤＮＡ（ｍ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００４６】
前記ＤＮＡ（ｐ）において、Δ5-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｐ）として、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上６２０個以下、好ましくは１個以上５４２個以下、より好ましくは１個以上４６５個以下、より好ましくは１個以上３８７個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２３３個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｐ）として、前記ＤＮＡ（ｏ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００４７】
本発明において、ω3-DES及びΔ5-DESと同様、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、Δ9-デサチュラーゼ（以下、「Δ9-DES」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
本明細書において「Δ9-DES」とは、図１に示すように、ステアリン酸（以下、「C18:0」とも表記する）のΔ9位に不飽和結合を導入し、C18:1Δ9を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ9-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ9-DES活性」ともいう」」とは、C18:0のΔ9位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
Δ9-DESの発現を促進することで、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続反応の出発物質であるC18:1Δ9の生成量を増加させ、ＰＵＦＡの生産性をさらに向上させることができる。
タンパク質がΔ9-DES活性を有することは、例えば、Δ9-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ9-DES合成遺伝子欠損株に導入し、オレイン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ9-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ステアリン酸、ステアロイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いステアリン酸量の減少又はオレイン量の増加を測定することで確認できる。
【００４８】
本発明における好ましいΔ9-DESとしては、下記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）が挙げられる。
（Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｓ）配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ9-DES（以下、「NoΔ9-DES」ともいう）である。また、配列番号５３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナB-31株由来のΔ9-DES（以下、「NgΔ9-DES」ともいう）である。
なお、タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列の同一性は９３％である。
前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）はいずれも、Δ9-DES活性を有する。
【００４９】
前記タンパク質（Ｒ）において、Δ9-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｒ）として、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４４個以下、好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｔ）において、Δ9-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｔ）として、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１３６個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
【００５０】
前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号９又は５３に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ9-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
【００５１】
前記Δ9-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ9-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｑ）〜（ｔ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ｑ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｒ）前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｓ）配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｔ）前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号１０の塩基配列は、配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ9-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ9-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
配列番号５４の塩基配列は、配列番号５３のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ9-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ9-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
【００５２】
前記ＤＮＡ（ｒ）において、Δ9-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｒ）として、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４３２個以下、好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｒ）として、前記ＤＮＡ（ｑ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００５３】
前記ＤＮＡ（ｔ）において、Δ9-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｔ）として、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４１０個以下、好ましくは１個以上３５９個以下、より好ましくは１個以上３０７個以下、より好ましくは１個以上２５６個以下、より好ましくは１個以上２０５個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｔ）として、前記ＤＮＡ（ｓ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００５４】
本発明において、ω3-DES、Δ5-DES及びΔ9-DESと同様、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、Δ9-エロンガーゼ（以下、「Δ6-ELO」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
本明細書において「Δ6-ELO」とは、図１に示すように、γ-リノレン酸（C18:3Δ6,9,12）に炭素鎖を２個分伸長させて、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3Δ8,11,14）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ6-エロンガーゼ活性（以下、「Δ6-ELO活性」ともいう」」とは、C18:3Δ6,9,12の炭素鎖を２個分伸長させる活性を意味する。
Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類では、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続反応によって、C18:3Δ6,9,12の生成量が増加する。よって、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ6-ELOの発現も促進することで、C18:3Δ6,9,12への炭素鎖２個分の導入（伸長）が亢進し、C20:3Δ8,11,14、C20:4Δ5,8,11,14及びC20:5Δ5,8,11,14,17の生産量がさらに増加する。
タンパク質がΔ6-ELO活性を有することは、例えば、Δ6-ELO合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-ELO合成遺伝子欠損株に導入し、ジホモ-γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-ELO又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、γ-リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いγ-リノレン酸の減少又はジホモ-γ-リノレン酸の増加を測定することで確認できる。
【００５５】
本発明における好ましいΔ6-ELOとしては、下記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）が挙げられる。
（Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質。
配列番号７４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ6-ELO（以下、「NoΔ6-ELO」ともいう）である。
前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）はいずれも、Δ6-ELO活性を有する。
【００５６】
前記タンパク質（Ｖ）において、Δ6-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｖ）として、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１１１個以下、好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上８３個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
【００５７】
前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号７４に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ6-ELOをコードする遺伝子を用いることができる。
【００５８】
前記Δ6-ELO（好ましくは前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ6-ELO遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｕ）及び（ｖ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ｕ）配列番号７３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｖ）前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号７３の塩基配列は、配列番号７４のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ6-ELO）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ6-ELO遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
【００５９】
前記ＤＮＡ（ｖ）において、Δ6-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｖ）として、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上３３３個以下、好ましくは１個以上２９１個以下、より好ましくは１個以上２５０個以下、より好ましくは１個以上２０８個以下、より好ましくは１個以上１６７個以下、より好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｖ）として、前記ＤＮＡ（ｕ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００６０】
前述のように、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路では、オレイン酸からリノール酸を生成し、生成したリノール酸からγ-リノレン酸を生成する反応が律速段階である。よって、本発明において、この律速段階の反応を触媒するΔ12-DES及びΔ6-DESのみの発現を促進させてもよい。
あるいは、ＰＵＦＡの生産性を一層向上させる観点から、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素の発現が促進されていることが好ましく、ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる２種以上の酵素の発現が促進されていることがより好ましい。
【００６１】
前記各種酵素の発現を促進する方法としては、常法より適宜選択することができ、各種酵素をコードする遺伝子の発現を促進する方法が好ましい。具体的な方法としては、前記各種遺伝子を宿主に導入し、当該遺伝子の発現を促進する方法、前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変し、当該遺伝子の発現を促進する方法、などが挙げられる。なかでも、前記各種遺伝子を宿主に導入し、各種遺伝子の発現を促進する方法が好ましい。
以下本明細書において、各種酵素などの目的のタンパク質の発現を促進したものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、ＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の生産性（ＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占めるＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の割合）が増加傾向にある。そしてその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂肪酸又は脂質、特にＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはC20:3、C20:4若しくはC20:5又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００６２】
前記各種遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
前記各種遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１、３、５、７、９、４５、４７、４９、５１、５３若しくは７４に示すアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０、４６、４８、５０、５２、５４若しくは７３に示す塩基配列に基づいて、各種遺伝子を人工的に合成できる。各種遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナなどのナンノクロロプシス属に属する藻類からクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
【００６３】
本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、前記各種遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得られる。具体的には、前記各種遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００６４】
本発明で用いる藻類は、ナンノクロロプシス属に属する藻類である。ナンノクロロプシス属の藻類は、球形又は楕円形の形状を有する、２〜５μｍ程度の小さな藻類（微細藻）である。
本発明で用いるナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp.）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
【００６５】
遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現用カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現ベクターとしては、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ法により増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。
【００６６】
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、c-phycocyanin βサブユニット（cpcB）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP(lipid droplet surface protein)遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012;8(11):e1003064. doi: 10.1371）が挙げられる。本発明において、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターや、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。
【００６７】
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
【００６８】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。本発明では、Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００６９】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
【００７０】
前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記各種遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記各種遺伝子の発現を促進させることで、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
【００７１】
発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記各種デサチュラーゼ遺伝子又はエロンガーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「デサチュラーゼプロモーター」、「エロンガーゼプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記各種遺伝子の発現を促進させることができる。
例えば、ゲノム上に前記各種デサチュラーゼ遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号５５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ12-DES遺伝子が存在しており、配列番号５５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ12-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
また、配列番号５６に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ6-DES遺伝子が存在しており、配列番号５６に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ6-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
また、配列番号５７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoω3-DES遺伝子が存在しており、配列番号５７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoω3-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
また、配列番号５８に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ5-DES遺伝子が存在しており、配列番号５８に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ5-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
また、配列番号５９に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ9-DES遺伝子が存在しており、配列番号５９に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ9-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
さらに、配列番号７５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ6-ELO遺伝子が存在しており、配列番号７５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ6-ELO遺伝子のプロモーター領域が存在している。
よって、配列番号５５〜５９並びに７５のいずれか１つに示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記各種遺伝子それぞれの発現を促進させることができる。
【００７２】
デサチュラーゼプロモーター又はエロンガーゼプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、デサチュラーゼプロモーター又はエロンガーゼプロモーターよりも転写活性が高く、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP遺伝子のプロモーターが挙げられる。ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター又はLDSP遺伝子のプロモーターがより好ましい。
【００７３】
前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p. 291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
【００７４】
さらに本発明の形質転換体は、KASの発現が促進されていることが好ましく、KASをコードする遺伝子（以下単に、「KAS遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
KASは、アシル-ACPとマロニルACPとの縮合反応を触媒し、アシル−ACPの合成に関与する脂肪酸合成酵素の１種である。葉緑体では、アセチル-ACP（又はアセチル-CoA）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル-ACPが合成される。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル-ACP（又はアセチル-CoA）とマロニルACPとの縮合反応により、アセトアセチルACPが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β-ケトアシル-ACPレダクターゼによりアセトアセチルACPのケト基が還元されてヒドロキシブチリルACPが生成する。続いて、β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルACPが脱水され、クロトニルACPが生成する。最後に、エノイル-ACPレダクターゼによりクロトニルACPが還元されて、ブチリルACPが生成する。これら一連の反応により、アセチル-ACPからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルACPが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル-ACPの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル-ACPが合成される。
そのため、KASの発現を促進することで、好ましくはKAS遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる藻類の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００７５】
本発明で好ましく用いることができるKASは、β-ケトアシル-ACPシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「KAS活性」とは、アセチル-ACPやアシル-ACPとマロニルACPとの縮合反応を触媒する活性をいう。
タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル-ACPを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
【００７６】
KASはその基質特異性によって、KAS I、KAS II、KAS III、又はKAS IVに分類される。例えば、KAS IIIは、炭素原子数２のアセチル-ACP（又はアセチル-CoA）を基質とし、炭素原子数２から４の伸長反応を触媒する。KAS  Iは、主に炭素原子数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素原子数１６のパルミトイル-ACPを合成する。KAS IIは、主に炭素原子数１８以上の長鎖アシル基への伸長反応を触媒し、長鎖アシル-ACPを合成する。KAS IVは主に炭素原子数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル-ACPを合成する。
そのため、KAS IIの発現を促進することで、好ましくはKAS IIをコードする遺伝子の発現を促進することで、長鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００７７】
本発明で好ましく用いることができるKASは、通常のKASや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKAS II（以下、「NoKASII」ともいう）（配列番号６０）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記NoKASIIのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質も用いることができる。前記NoKASIIをコードする遺伝子としては、配列番号６１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６１で表される塩基配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また、KASの発現を促進させた形質転換体（例えば、KAS遺伝子の発現を促進させた形質転換体）は、常法により作製できる。例えば、前述の各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法と同様、KASをコードする遺伝子を宿主に導入する方法、KASをコードする遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
【００７８】
さらに本発明の形質転換体は、ACPの発現が促進されていることが好ましく、ACPをコードする遺伝子（以下単に、「ACP遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
ACPは脂肪酸の生合成反応（脂肪酸の伸長反応）の足場（担体）として機能する。脂肪酸のアシル基は、ACPのセリン残基に結合したホスホパンテテイン基とチオエステル結合を形成する。この状態で脂肪酸が伸長される。
そのため、ACPの発現を促進することで、好ましくはACP遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる藻類の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００７９】
本発明で好ましく用いることができるACPは、アシルキャリアープロテイン活性（以下、「ACP活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「ACP活性」とは、脂肪酸のアシル基とチオエステル結合を形成することで脂肪酸の伸長反応の足場として機能する活性を意味する。
タンパク質がACP活性を有することは、例えば、ACP遺伝子欠損株に、宿主内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを導入し、脂肪酸合成能を相補させることで確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸の生産量や組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、前記タンパク質を、Biochemistry, 2011, vol. 50(25), p. 5704-5717等の文献を参考にして、補酵素A（CoA）と適当なACPシンターゼ（ACP synthase）（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（phosphopantetheinyl transferase））と反応させ、ホスホパンテテイン基が結合したholo-ACPを形成させることで確認することができる。あるいは、The Journal of Biological Chemistry, 1979, vol. 254(15), p. 7123-7128等の文献を参考にして、前記holo-ACPを脂肪酸及び適当なアシル-ACPシンセターゼ（acyl-ACP synthetase）と反応させ、アシル基が結合したacyl-ACPを形成させることで確認することができる。
【００８０】
本発明で好ましく用いることができるACPは、通常のACPや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のACP（以下、「NoACP」ともいう）（配列番号６２）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記NoACPのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質も用いることができる。前記NoACPをコードする遺伝子としては、配列番号６３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６３で表される塩基配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また、ACPの発現を促進させた形質転換体（例えば、ACP遺伝子の発現を促進させた形質転換体）は、常法により作製できる。例えば、前述の各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法と同様、ACPをコードする遺伝子を宿主に導入する方法、ACPをコードする遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
さらに、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、ACPは葉緑体に局在することが好ましい。例えば、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のACP遺伝子の塩基配列に、ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルをコードする塩基配列を付加した遺伝子の発現を促進することがより好ましい。あるいは、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のACPをコードする遺伝子を葉緑体ゲノム中に導入し、導入した遺伝子の発現を促進することがより好ましい。
【００８１】
さらに本発明の形質転換体は、TEの発現が促進されていることが好ましく、TEをコードする遺伝子（以下単に、「TE遺伝子」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
前述したように、TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル-ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はＰＵＦＡの合成やトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、TEの発現を促進することで、好ましくはTE遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるTEは、アシル-ACPチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
【００８２】
TEは、基質であるアシル-ACPを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子、好ましくは長鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子の導入が効果的である。このような遺伝子を導入することで、ＰＵＦＡの生産性を一層向上させることができる。
【００８３】
本発明で用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来TE（配列番号６４）、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来TE（配列番号６５又は６７）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来TE（配列番号６６）などを用いることができる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記TEのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。
また、TE遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述の各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法と同様、TE遺伝子を宿主に導入する方法、TE遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
【００８４】
本発明の形質転換体は、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼそれぞれの発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物からＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
【００８５】
本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
【００８６】
本発明で用いる培地は、天然海水又は人工海水をベースにした培地でもよいし、市販の培養培地でもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から、培地当たり１％（vol/vol）以上が好ましい。また、その上限値は５０％（vol/vol）以下が好ましく、１０％（vol/vol）以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、１０℃以上が好ましく、１５℃以上がより好ましい。またその上限値は３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、１００ルクス以上が好ましく、３００ルクス以上がより好ましく、１０００ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、５００００ルクス以下が好ましく、１００００ルクス以下がより好ましく、６０００ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期は８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。またその上限値は、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３％（大気条件と同程度）以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．３％以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましく、１％以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、０．０３〜１０％が好ましく、０．０５〜５％がより好ましく、０．１〜３％がさらに好ましく、０．３〜１％がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。またその上限値は、５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、０．０１〜５質量％が好ましく、０．０５〜２質量％がより好ましく、０．１〜１質量％がさらに好ましい。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。３日以上が好ましく、７日以上がより好ましい。またその上限値は、９０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養が好ましい。
【００８７】
培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００８８】
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。前記脂肪酸エステル化合物は、ＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、ＴＡＧがより好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物が好ましく、炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、C20:3、C20:4若しくはC20:5、又はそのエステル化合物がより好ましく、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物がより好ましく、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物がより好ましく、エイコサペンタエン酸又はそのエステル化合物がさらに好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
【００８９】
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００９０】
本発明は、Δ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体の作製用キットも提供する。本発明のキットは、ＰＵＦＡ合成経路の律速段階の反応を触媒する酵素の発現が促進され、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れた形質転換体の作製に使用することができる。本発明のキットは、ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる少なくとも１種の組換えベクター、好ましくは、ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる２種以上の組換えベクター、も含んでもよい。
なお本発明のキットは、前記組換えベクターの他、宿主、前記ベクターで宿主を形質転換するために通常用いられる試薬、形質転換用緩衝液、形質転換体を選抜するための指標となる試薬等、形質転換体の作製の検出に必要な他の要素を含んでいてもよい。
【００９１】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、生産される脂肪酸組成を改変する方法、形質転換体、形質転換体の作製方法、及び形質転換体の作製用キットを開示する。
【００９２】
＜１＞Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜２＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産されるＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜３＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産される全脂肪酸に占めるＰＵＦＡの割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
＜４＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産される脂肪酸エステル化合物、好ましくはＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種、より好ましくはＴＡＧ、の全脂肪酸残基に占めるＰＵＦＡ残基の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
【００９３】
＜５＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進する、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
【００９４】
＜７＞前記Δ12-DESが下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）、である、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質。
＜８＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１７６個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜７＞項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１３個以下、より好ましくは１個以上９１個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜７＞項記載の方法。
＜１０＞前記Δ12-DES、好ましくは前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子、である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１１＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５２７個以下、より好ましくは１個以上４６１個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３３０個以下、より好ましくは１個以上２６４個以下、より好ましくは１個以上１９８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１０＞項記載の方法。
＜１２＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５４４個以下、より好ましくは１個以上４７６個以下、より好ましくは１個以上４０８個以下、より好ましくは１個以上３４０個以下、より好ましくは１個以上２７２個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１０＞項記載の方法。
【００９５】
＜１３＞前記Δ6-DESが下記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）、である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質。
（Ｇ）配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質。
＜１４＞前記タンパク質（Ｆ）が、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１５＞前記タンパク質（Ｈ）が、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１６＞前記Δ6-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｅ）〜（ｈ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｅ）又は（ｆ）からなる遺伝子、である、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
（ｅ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１７＞前記ＤＮＡ（ｆ）が、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５７０個以下、より好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｅ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１６＞項記載の方法。
＜１８＞前記ＤＮＡ（ｈ）が、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５７２個以下、より好ましくは１個以上５００個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｇ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１６＞項記載の方法。
【００９６】
＜１９＞前記藻類において、ω3-DESの発現、又はω3-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の方法。
＜２０＞ω3-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、ω3-DESの発現を促進する、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２１＞ω3-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したω3-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜１９＞又は＜２０＞項記載の方法。
＜２２＞前記ω3-DESが下記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）、である、前記＜１９＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質。
＜２３＞前記タンパク質（Ｊ）が、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１６４個以下、より好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜２２＞項記載の方法。
＜２４＞前記タンパク質（Ｌ）が、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１６３個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜２２＞項記載の方法。
＜２５＞前記ω3-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｉ）〜（ｌ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｉ）又は（ｊ）からなる遺伝子、である、前記＜１９＞〜＜２４＞のいずれか１項記載の方法。
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜２６＞前記ＤＮＡ（ｊ）が、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４９４個以下、より好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７０個以下、より好ましくは１個以上３０９個以下、より好ましくは１個以上２４７個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｉ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜２５＞項記載の方法。
＜２７＞前記ＤＮＡ（ｌ）が、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４９０個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３６８個以下、より好ましくは１個以上３０６個以下、より好ましくは１個以上２４５個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上９８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｋ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜２５＞項記載の方法。
【００９７】
＜２８＞前記藻類において、Δ5-DESの発現、又はΔ5-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜２７＞のいずれか１項記載の方法。
＜２９＞Δ5-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ5-DESの発現を促進する、前記＜２８＞項記載の方法。
＜３０＞Δ5-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ5-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜２８＞又は＜２９＞項記載の方法。
＜３１＞前記Δ5-DESが下記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）、である、前記＜２８＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質。
（Ｏ）配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質。
＜３２＞前記タンパク質（Ｎ）が、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上２１１個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７９個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜３１＞項記載の方法。
＜３３＞前記タンパク質（Ｐ）が、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上２０６個以下、より好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２９個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜３１＞項記載の方法。
＜３４＞前記Δ5-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｍ）〜（ｐ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｍ）又は（ｎ）からなる遺伝子、である、前記＜２８＞〜＜３３＞のいずれか１項記載の方法。
（ｍ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｎ）前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜３５＞前記ＤＮＡ（ｎ）が、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上６３３個以下、より好ましくは１個以上５５４個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３１７個以下、より好ましくは１個以上２３８個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｍ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜３４＞項記載の方法。
＜３６＞前記ＤＮＡ（ｐ）が、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上６２０個以下、より好ましくは１個以上５４２個以下、より好ましくは１個以上４６５個以下、より好ましくは１個以上３８７個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２３３個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｏ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜３４＞項記載の方法。
【００９８】
＜３７＞前記藻類において、Δ9-DESの発現、又はΔ9-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の方法。
＜３８＞Δ9-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ9-DESの発現を促進する、前記＜３７＞項記載の方法。
＜３９＞Δ9-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ9-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜３７＞又は＜３８＞項記載の方法。
＜４０＞前記Δ9-DESが下記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）、である、前記＜３７＞〜＜３９＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質。
（Ｓ）配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質。
＜４１＞前記タンパク質（Ｒ）が、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜４０＞項記載の方法。
＜４２＞前記タンパク質（Ｔ）が、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜４０＞項記載の方法。
＜４３＞前記Δ9-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｑ）〜（ｔ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｑ）又は（ｒ）からなる遺伝子、である、前記＜３７＞〜＜４２＞のいずれか１項記載の方法。
（ｑ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｒ）前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｓ）配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｔ）前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜４４＞前記ＤＮＡ（ｒ）が、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｑ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜４３＞項記載の方法。
＜４５＞前記ＤＮＡ（ｔ）が、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４１０個以下、より好ましくは１個以上３５９個以下、より好ましくは１個以上３０７個以下、より好ましくは１個以上２５６個以下、より好ましくは１個以上２０５個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｓ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜４３＞項記載の方法。
【００９９】
＜４６＞前記藻類において、Δ6-ELOの発現、又はΔ6-ELO遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜４５＞のいずれか１項記載の方法。
＜４７＞Δ6-ELO遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ6-ELOの発現を促進する、前記＜４６＞項記載の方法。
＜４８＞Δ6-ELO遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ6-ELO遺伝子の発現を促進させる、前記＜４６＞又は＜４７＞項記載の方法。
＜４９＞前記Δ6-ELOが下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）である、前記＜４６＞〜＜４８＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質。
＜５０＞前記タンパク質（Ｖ）が、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上８３個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜４９＞項記載の方法。
＜５１＞前記Δ6-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｕ）及び（ｖ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜４６＞〜＜５０＞のいずれか１項記載の方法。
（ｕ）配列番号７３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｖ）前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜５２＞前記ＤＮＡ（ｖ）が、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３３３個以下、より好ましくは１個以上２９１個以下、より好ましくは１個以上２５０個以下、より好ましくは１個以上２０８個以下、より好ましくは１個以上１６７個以下、より好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｕ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜５１＞項記載の方法。
【０１００】
＜５３＞前記藻類において、ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、好ましくはω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる２種以上の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現が促進されている、前記＜１＞〜＜５２＞のいずれか１項記載の方法。
【０１０１】
＜５４＞前記藻類において、KAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の発現を促進させた、好ましくはKAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜５３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５５＞KAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子を前記藻類に導入し、導入した遺伝子の発現を促進させる、前記＜５４＞項記載の方法。
＜５６＞前記KAS IIが、配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号６０で表されるアミノ酸配列と同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記＜５４＞又は＜５５＞項記載の方法。
＜５７＞KAS IIをコードする遺伝子が、配列番号６１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６１で表される塩基配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜５４＞〜＜５６＞のいずれか１項記載の方法。
＜５８＞前記ACPが、配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号６２で表されるアミノ酸配列と同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質である、前記＜５４＞又は＜５５＞項記載の方法。
＜５９＞ACPをコードする遺伝子が、配列番号６３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６３で表される塩基配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜５４＞、＜５５＞及び＜５８＞のいずれか１項記載の方法。
＜６０＞ACPをコードする遺伝子が、前記藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列が付加された遺伝子である、前記＜５４＞、＜５５＞、＜５８＞及び＜５９＞のいずれか１項記載の方法。
＜６１＞ACPをコードする遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され、導入した遺伝子の発現を促進させる、前記＜５４＞、＜５５＞、＜５８＞及び＜５９＞のいずれか１項記載の方法。
＜６２＞前記TEが、配列番号６４〜６７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はそれらと機能的に均等なタンパク質である、前記＜５４＞又は＜５５＞項記載の方法。
＜６３＞前記TEが、配列番号６４〜６７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号６４〜６７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質である、前記＜５４＞、＜５５＞及び＜６２＞のいずれか１項記載の方法。
【０１０２】
＜６４＞前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、又はナンノクロロプシス・エスピー、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜１＞〜＜６３＞のいずれか１項記載の方法。
＜６５＞前記脂肪酸又は前記脂質が、炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはC20:3、C20:4若しくはC20:5、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物、より好ましくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜６４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６６＞ｆ／２培地を用いて前記藻類を培養する、前記＜１＞〜＜６５＞のいずれか１項記載の方法。
【０１０３】
＜６７＞Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体。
＜６８＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現が促進されている、前記＜６７＞項記載の形質転換体。
＜６９＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子、又はΔ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜６８＞項記載の形質転換体。
＜７０＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子、又はΔ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入する、形質転換体の作製方法。
＜７１＞Δ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体の作製用キット。
＜７２＞前記Δ12-DESが前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）、である、前記＜６７＞〜＜７１＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７３＞前記タンパク質（Ｂ）又は（Ｄ）が、前記＜７＞〜＜９＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜７２＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７４＞前記Δ12-DES、好ましくは前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜６７＞〜＜７３＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７５＞前記Δ6-DESが前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）、である、前記＜６７＞〜＜７４＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７６＞前記タンパク質（Ｆ）又は（Ｈ）が、前記＜１３＞〜＜１５＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜７５＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７７＞前記Δ6-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜１６＞〜＜１８＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜６７＞〜＜７６＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
【０１０４】
＜７８＞前記形質転換体において、ω3-DESの発現、又はω3-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞〜＜６９＞、及び＜７２＞〜＜７７＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜７９＞ω3-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、ω3-DESの発現が促進されている、前記＜７８＞項記載の形質転換体。
＜８０＞ω3-DES遺伝子、又はω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜７９＞項記載の形質転換体。
＜８１＞ω3-DES遺伝子、又はω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、及び＜７２＞〜＜７７＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜８２＞ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞〜＜７７＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜８３＞前記ω3-DESが前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）、である、前記＜７８＞〜＜８２＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８４＞前記タンパク質（Ｊ）又は（Ｌ）が、前記＜２２＞〜＜２４＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜８３＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８５＞前記ω3-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜２５＞〜＜２７＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜７８＞〜＜８４＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
【０１０５】
＜８６＞前記形質転換体において、Δ5-DESの発現、又はΔ5-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞〜＜６９＞、＜７２＞〜＜８０＞、及び＜８３＞〜＜８５＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜８７＞Δ5-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ5-DESの発現が促進されている、前記＜８６＞項記載の形質転換体。
＜８８＞Δ5-DES遺伝子、又はΔ5-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜８７＞項記載の形質転換体。
＜８９＞Δ5-DES遺伝子、又はΔ5-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、＜７２＞〜＜７７＞、＜８１＞、及び＜８３＞〜＜８５＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜９０＞Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞〜＜７７＞、及び＜８２＞〜＜８５＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜９１＞前記Δ5-DESが前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）、である、前記＜８６＞〜＜９０＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９２＞前記タンパク質（Ｎ）又は（Ｐ）が、前記＜３１＞〜＜３３＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜９１＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９３＞前記Δ5-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｍ）〜（Ｐ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜８６＞〜＜９２＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
【０１０６】
＜９４＞前記形質転換体において、Δ9-DESの発現、又はΔ9-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞〜＜６９＞、＜７２＞〜＜８０＞、＜８３＞〜＜８８＞、及び＜９１＞〜＜９３＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜９５＞Δ9-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ9-DESの発現が促進されている、前記＜９４＞項記載の形質転換体。
＜９６＞Δ9-DES遺伝子、又はΔ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜９５＞項記載の形質転換体。
＜９７＞Δ9-DES遺伝子、又はΔ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、＜７２＞〜＜７７＞、＜８１＞、＜８３＞〜＜８５＞、＜８９＞、及び＜９１＞〜＜９３＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜９８＞Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞〜＜７７＞、＜８２＞〜＜８５＞、及び＜９０＞〜＜９３＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜９９＞前記Δ9-DESが前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）、である、前記＜９４＞〜＜９８＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１００＞前記タンパク質（Ｒ）又は（Ｔ）が、前記＜４０＞〜＜４２＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜９９＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０１＞前記Δ9-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜４３＞〜＜４５＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜９４＞〜＜１００＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
【０１０７】
＜１０２＞前記形質転換体において、Δ6-ELOの発現、又はΔ6-ELO遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞〜＜６９＞、＜７２＞〜＜８０＞、＜８３＞〜＜８８＞、＜９１＞〜＜９６＞、及び＜９９＞〜＜１０１＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１０３＞Δ6-ELO遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ6-ELOの発現が促進されている、前記＜１０２＞項記載の形質転換体。
＜１０４＞Δ6-ELO遺伝子、又はΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜１０３＞項記載の形質転換体。
＜１０５＞Δ6-ELO遺伝子、又はΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、＜７２＞〜＜７７＞、＜８１＞、＜８３＞〜＜８５＞、＜８９＞、＜９１＞〜＜９３＞、＜９７＞、及び＜９９＞〜＜１０１＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１０６＞Δ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞〜＜７７＞、＜８２＞〜＜８５＞、＜９０＞〜＜９３＞、及び＜９８＞〜＜１０１＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１０７＞前記Δ6-ELOが前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つである、前記＜１０２＞〜＜１０６＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０８＞前記タンパク質（Ｖ）が、前記＜４９＞又は＜５０＞項で規定するタンパク質である、前記＜１０７＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０９＞前記Δ6-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜５１＞又は＜５２＞項で規定する遺伝子である、前記＜１０２＞〜＜１０８＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
【０１０８】
＜１１０＞ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、好ましくはω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる２種以上の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞〜＜６９＞、＜７２＞〜＜８０＞、＜８３＞〜＜８８＞、＜９１＞〜＜９６＞、＜９９＞〜＜１０４＞、及び＜１０７＞〜＜１０９＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１１１＞ω3-DES遺伝子、Δ5-DES遺伝子、Δ9-DES遺伝子及びΔ6-ELO遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、好ましくはω3-DES遺伝子、Δ5-DES遺伝子、Δ9-DES遺伝子及びΔ6-ELO遺伝子からなる群より選ばれる２種以上の遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを導入する、前記＜７０＞、＜７２＞〜＜７７＞、＜８１＞、＜８３＞〜＜８５＞、＜８９＞、＜９１＞〜＜９３＞、＜９７＞、＜９９＞〜＜１０１＞、＜１０５＞、及び＜１０７＞〜＜１０９＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１１２＞ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる少なくとも１種の組換えベクター、好ましくはω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる２種以上の組換えベクター、を含む、前記＜７１＞〜＜７７＞、＜８２＞〜＜８５＞、＜９０＞〜＜９３＞、＜９８＞〜＜１０１＞、及び＜１０６＞〜＜１０９＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
【０１０９】
＜１１３＞前記形質転換体において、KAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の発現が促進されている、好ましくはKAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞〜＜７０＞、＜７２＞〜＜８１＞、＜８３＞〜＜８９＞、＜９１＞〜＜９７＞、＜９９＞〜＜１０５＞、及び＜１０７＞〜＜１１２＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜１１４＞前記遺伝子を前記藻類に導入し、導入した遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進されている、前記＜１１３＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜１１５＞KAS IIをコードする遺伝子を含有する組換えベクター、ACPをコードする遺伝子を含有する組換えベクター、及びTEをコードする遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる少なくとも１つの組換えベクターを含む、前記＜７１＞〜＜７７＞、＜８２＞〜＜８５＞、＜９０＞〜＜９３＞、＜９８＞〜＜１０１＞、＜１０６＞〜＜１０９＞、及び＜１１２＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１１６＞前記KAS IIが前記＜５６＞項で規定したタンパク質である、前記＜１１３＞〜＜１１５＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１７＞前記KAS IIをコードする遺伝子が前記＜５７＞項で規定した遺伝子である、前記＜１１３＞〜＜１１６＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１８＞前記ACPが前記＜５８＞項で規定したタンパク質である、前記＜１１３＞〜＜１１７＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１９＞前記ACPをコードする遺伝子が前記＜５９＞項で規定した遺伝子である、前記＜１１３＞〜＜１１８＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２０＞ACPをコードする遺伝子が、前記藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列が付加された遺伝子である、前記＜１１３＞〜＜１１９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２１＞ACPをコードする遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され、導入した遺伝子の発現が促進されている、前記＜１１３＞〜＜１１９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２２＞前記TEが前記＜６２＞又は＜６３＞項で規定したタンパク質である、前記＜１１３＞〜＜１２１＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２３＞前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、又はナンノクロロプシス・エスピー、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜６７＞〜＜１２２＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
【０１１０】
＜１２４＞脂質を製造するための、前記＜６７＞〜＜１２３＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法により作製された形質転換体、又は形質転換体の作製用キットの使用。
＜１２５＞前記脂質が、炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはC20:3、C20:4若しくはC20:5、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物、より好ましくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１２４＞項記載の使用。
【０１１１】
＜１２６＞前記脂肪酸エステル化合物がＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種、好ましくはＴＡＧ、である、前記＜６５＞項記載の方法、又は前記＜１２５＞項記載の使用。
【実施例】
【０１１２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。【０１１３】
【表１】
2018047657.tif 000003
【０１１４】
【表２】
2018047657.tif 000004
【０１１５】
実施例１  ナンノクロロプシス・オキュラータ由来デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドの作製、ナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号１１）、及び文献（Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号１２）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号１３及びプライマー番号１４のプライマー対、並びに表１に示すプライマー番号１５及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１７及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号１９）を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。【０１１６】
これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１１７】
（２）デサチュラーゼ遺伝子の取得、及びデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。
このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号２３のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号１０の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ9-DES遺伝子）断片を取得した。
同様に、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２４及びプライマー番号２５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ12-DES遺伝子）断片を取得した。
同様に、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２６及びプライマー番号２７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号４の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ6-DES遺伝子）断片を取得した。
同様に、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２８及びプライマー番号２９のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号８の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ5-DES遺伝子）断片を取得した。
さらに、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号３０及びプライマー番号３１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号６の塩基配列からなる遺伝子（Noω3-DES遺伝子）断片を取得した。【０１１８】
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号３３のプライマー対、並びにプライマー番号３４及びプライマー番号３５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＬＤＳＰプロモーター断片（配列番号３６）及びＶＣＰ１ターミネーター断片（配列番号３７）を取得した。
さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号３８及びプライマー番号２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。【０１１９】
各種デサチュラーゼ遺伝子断片と、ＬＤＳＰプロモーター断片、ＶＣＰ１ターミネーター断片、並びにゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片を前述と同様の方法にて融合し、NoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ6-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド、をそれぞれ構築した。
なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１２０】
（３）デサチュラーゼ遺伝子発現カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入、及び形質転換体の培養
作製した各種デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）をそれぞれ増幅した。
増幅した各ＤＮＡ断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。【０１２１】
約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅した各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセット約500ngをそれぞれ宿主細胞に混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
ｆ／２液体培地（（NaNO3  75mg、NaH2PO4・2H2O  6mg、ビタミンB12  0.5μg、ビオチン  0.5μg、チアミン  100μg、Na2SiO3・9H2O  10mg、Na2EDTA・2H2O  4.4mg、FeCl3・6H2O  3.16mg、FeCl3・6H2O  12μg、ZnSO4・7H2O  21μg、MnCl2・4H2O  180μg、CuSO4・5H2O  7μg、Na2MoO4・2H2O  7μg／人工海水1L）にて２４時間回復培養を行った。その後に、2μg/mLゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（NoΔ9-DES遺伝子導入株（(delta9 DES)株）、NoΔ12-DES遺伝子導入株（(delta12 DES)株）、NoΔ6-DES遺伝子導入株（(delta6 DES)株）、NoΔ5-DES遺伝子導入株（(delta5 DES)株）、及びNoω3-DES遺伝子導入株（(omega3 DES)株））をＰＣＲ法によりそれぞれ選抜した（それぞれの株について独立した３ラインを取得）。選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLを、ｆ／２培地の窒素濃度を５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ５Ｐ５培地」という）18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（WT株）についても同様に実験を行った。【０１２２】
（４）培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
培養液1mLに、内部標準として1mg/mLのトリヘプタデカン酸グリセリル（Glyceryl triheptadecanoate、シグマアルドリッチ社製）クロロホルム溶液50μLを添加し、クロロホルム0.5mL及びメタノール1mLをさらに添加して激しく攪拌し、１０分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%ＫＣｌ 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）１ｍＬを添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン０．５ｍＬ、飽和食塩水１ｍＬを添加し激しく撹拌し、室温にて１０分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。【０１２３】
下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent technology社製）
キャピラリーカラム：DB-WAX（10m×100μm×0.10μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：100℃ 保持0.5分→100〜250℃（20℃/min昇温）→250℃保持3分（ポストラン：1分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：50：1）
注入量：5μL
洗浄バイアル：メタノール
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：350℃【０１２４】
脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準由来の炭素原子数１７の脂肪酸メチルエステルのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１Ｌあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の重量割合を算出した。その結果を表３に示す。
なお、以下の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を示し、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を示す。また、「ｎ」は３〜５の整数であり、「C20:n（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する、C20:3脂肪酸、C20:4脂肪酸、及びC20:5脂肪酸の重量の割合の総和を示す。【０１２５】
【表３】
2018047657.tif 000005
【０１２６】
表３から明らかなように、NoΔ9-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta9 DES）株）では、野生株（WT株）と比べ、C18:1Δ9量の割合が有意に増加した。しかし、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合が減少した。この結果は、Δ9-DESが触媒する反応は、ＰＵＦＡ合成の律速段階とはなりにくいことを示唆している。
また、NoΔ12-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES）株）では、野生株と比べ、C18:1Δ9量の割合が減少し、C18:2Δ9,12量の割合が有意に増加した。
NoΔ6-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta6 DES）株）では、野生株と比べ、C18:2Δ9,12量の割合がわずかに減少し、C18:2Δ6,9量の割合がわずかに増加した。
また、NoΔ5-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta5 DES）株）では、脂肪酸組成の大きな変化は見られなかった。
さらに、Noω3-DES遺伝子を導入した形質転換体（（omega3 DES）株）では、野生株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量の割合が減少し、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合がわずかに増加した。この結果から、ナンノクロロプシスのＰＵＦＡの合成においては、C20:4Δ8,11,14,17を経由するものではなく、C20:4Δ5,8,11,14を経由することが示唆された。【０１２７】
このように、各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進することで脂肪酸組成が変化することが明らかになった。そして、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるEPAの主な合成経路は、図１に示すような、C20:4Δ5,8,11,14を経由する経路であることを特定した。
しかし、１種類のデサチュラーゼ遺伝子のみの発現を促進しただけでは、C20:3、C20:4、C20:5などのＰＵＦＡ量を大きく増加させることはできなかった。【０１２８】
実施例２  ２種類のナンノクロロプシス・オキュラータ由来デサチュラーゼ遺伝子を用いたナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）の構築
実施例１で構築したNoΔ6-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド、をそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、各種デサチュラーゼ遺伝子断片（ベクター配列等を含む）をそれぞれ増幅した。
また、人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子（配列番号３９）を鋳型として、表２に示すプライマー番号４０及びプライマー番号４１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、パロモマイシン耐性遺伝子を増幅した。【０１２９】
各種デサチュラーゼ遺伝子増幅断片（ベクター配列等を含む）とパロモマイシン耐性遺伝子断片をそれぞれ実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ6-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、をそれぞれ構築した。
なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１３０】
作製した各種デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、実施例１で作製したNoΔ12-DES遺伝子導入株に、精製した断片をエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、2μg/mLゼオシン及び100μg/mLパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + delta6 DES)株）、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ5-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + delta5 DES)株）、並びにNoΔ12-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + omega3 DES)株））をＰＣＲにより選抜した。【０１３１】
（２）形質転換体の培養、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
選抜した株（それぞれの株について独立した３ラインを取得）を、Ｎ１５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株及びNoΔ12-DES遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表４に示す。【０１３２】
【表４】
2018047657.tif 000006
【０１３３】
実施例１に示したように、NoΔ6-DES遺伝子やNoΔ12-DES遺伝子をそれぞれ単独でこれらの転写量を促進させても、ＰＵＦＡ量の増加は確認できなかった。
これに対して、表４から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + delta6 DES）株）では、野生株や（delta12 DES）株と比べ、C18:1Δ9量の割合が大きく減少し、C20:n量の割合が大幅に増加した。特にC20:4Δ5,8,11,14（アラキドン酸）量の割合が大きく増加した。
また、表４に示すように、（delta12 DES + delta6 DES）株では、C18:3Δ6,9,12の蓄積をほとんど検知できなかった。これは、ナンノクロロプシスに属する藻類において、ＰＵＦＡ、特にC20:4Δ5,8,11,14及びC20:5Δ5,8,11,14,17、の合成経路では、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続する一連の工程（C18:1Δ9からC18:2Δ9,12が生成し、生成したC18:2Δ9,12からC18:3Δ6,9,12が生成する反応）が律速段階になっていることを示している。【０１３４】
また、NoΔ12-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + omega3 DES）株）では、（delta12 DES）株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量の割合が減少し、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合が増加した。しかし、C20:n量の割合はほとんど変化しなかった。さらに、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ5-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + delta5 DES）株）では、（delta12 DES）株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量、C20:5Δ5,8,11,14,17量、C20:n量の割合はほとんど変化しなかった。
これらの結果からも、ナンノクロロプシスにおいてＰＵＦＡの生産性を向上させるためには、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進し、これらによって触媒される連続反応を強化することが重要であることがわかる。【０１３５】
実施例３  ３種類のナンノクロロプシス・オキュラータ由来デサチュラーゼ遺伝子を用いたナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）の構築
実施例１で構築したNoω3-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、Noω3-DES遺伝子断片（ベクター配列等を含む）を増幅した。
また、人工合成したハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号４２）を鋳型として、表２に示すプライマー番号４３及びプライマー番号４４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ハイグロマイシン耐性遺伝子を増幅した。【０１３６】
これら２つの断片を実施例１と同様の方法にて融合し、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を構築した。
なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、Noω3-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１３７】
作製したNoω3-DES遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、Noω3-DES遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、Noω3-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ハイグロイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、実施例２で作製したdelta12遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子導入株に、精製した断片をエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、500μg/mLのハイグロマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、Noω3-DES遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株））をＰＣＲにより選抜した。【０１３８】
（２）形質転換体の培養、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株、NoΔ12-DES遺伝子導入株、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子導入株、並びにNoΔ12-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。３週目の総脂肪酸の生産量及び脂肪酸組成の結果を表５に示す。培養１週目、２週目、及び３週目の総脂肪酸量、C20:5脂肪酸の生産量、C20:n脂肪酸の生産量を表６に示す。そして、培養１週目、２週目、及び３週目のC20:5脂肪酸量の割合、C20:n脂肪酸量の割合を表７に示す。【０１３９】
【表５】
2018047657.tif 000007
【０１４０】
【表６】
2018047657.tif 000008
【０１４１】
【表７】
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【０１４２】
表５から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株）では、（delta12 DES + delta6 DES）株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量の割合が大きく減少し、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合が大幅に増加した。さらに、C20:n量の割合も増加した。これらの結果から、Δ12-DES及びΔ6-DESに加え、ω3-DESの発現を促進することで、ＰＵＦＡ、特にC20:5Δ5,8,11,14,17の生産性が一層向上することが分かった。【０１４３】
さらに、表６及び７から明らかなように、野生株（WT株）では、培養期間が長くなるにつれて、C20:n量やC20:5量の割合は減少する。
これに対して、（delta12 DES + delta6 DES）株では、野生株（WT株）及び（delta12 DES）株と比べ、C20:nの生産量と、全脂肪酸量に占めるC20:n量の割合が、いずれの培養期間においても増加していた。
さらに、（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株では、（delta12 DES + delta6 DES）株と比較して、C20:n（特にC20:5Δ5,8,11,14,17）の生産量と、全脂肪酸量に占めるC20:n（特にC20:5Δ5,8,11,14,17）量の割合が一層増加した。
さらに、（delta12 DES + delta6 DES）株や（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株では、培養期間の長期化に伴う、C20:n量の割合の減少率が、野生株（WT株）などと比較して抑制されている。【０１４４】
実施例４  Δ9-DES遺伝子、Δ5-DES遺伝子又はΔ6-ELO遺伝子を用いた(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株の形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）デサチュラーゼ遺伝子又はエロンガーゼ遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）の構築
実施例１で構築したNoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド又はNoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、NoΔ9-DES遺伝子断片及びNoΔ5-DES遺伝子断片（pUC19ベクター自体のベクター配列等を含む）をそれぞれ増幅した。
また、ビアラフォス耐性遺伝子（配列番号６８）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号６９及びプライマー番号７０のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ビアラフォス耐性遺伝子を増幅した。【０１４５】
NoΔ9-DES遺伝子断片及びNoΔ5-DES遺伝子断片それぞれと、ビアラフォス耐性遺伝子断片とを実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）及びNoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）をそれぞれ構築した。
なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、NoΔ9-DES遺伝子又はNoΔ5-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１４６】
実施例１で調製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示すプライマー番号７１及びプライマー番号７２のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号７３の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ6-ELO遺伝子）断片を取得した。
この増幅断片と、ＬＤＳＰプロモーター断片、ＶＣＰ１ターミネーター断片、並びにゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片を実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ6-ELO遺伝子発現用プラスミドを構築した。【０１４７】
このNoΔ6-ELO遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、NoΔ6-ELO遺伝子断片（pUC19ベクター自体のベクター配列等を含む）を増幅した。この増幅断片と、前述のビアラフォス耐性遺伝子断片とを実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ6-ELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を構築した。
なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、NoΔ6-ELO遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１４８】
作製したNoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）又はNoΔ6-ELO発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、NoΔ9-DES遺伝子発現カセット、NoΔ5-DES遺伝子発現カセット又はNoΔ6-ELO遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、デサチュラーゼ遺伝子又はエロンガーゼ遺伝子（NoΔ9-DES遺伝子、NoΔ5-DES遺伝子又はNoΔ6-ELo遺伝子）、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、実施例３で作製したNoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株に、精製した断片をそれぞれエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、750μg/mLのビアラフォス含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoΔ9-DES遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta9 DES)株）、NoΔ5-DES遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta5 DES)株）、及びNoΔ6-ELO遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株）をＰＣＲによりそれぞれ選抜した。【０１４９】
（２）形質転換体の培養、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地4mL（組織培養用マイクロプレート、IWAKI社製）に播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液0.4mLをＮ５Ｐ５培地4mL（組織培養用マイクロプレート、IWAKI社製）に植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株、並びにNoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。３週目の総脂肪酸の生産量及び脂肪酸組成の結果を表８に示す。【０１５０】
【表８】
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【０１５１】
表８から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ9-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta9 DES)株）は delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株と比較して、C16:0の割合が減少し、C18:1Δ9及びC20:nの割合が増加した。
また、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ5-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta5 DES)株）は（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株と比較して、C20:3Δ8,11,14の割合が減少し、C20:4Δ5,8,11,14及びC20:5Δ5,8,11,14,17の割合が増加した。
さらに、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ6-ELO遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株）は（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株と比較して、C18:3Δ6,9,12の割合が減少し、C20:3Δ8,11,14の割合及びC20:nの割合が向上した。
これらの結果から、Δ12-DES、Δ6-DES及びω3-DESに加え、Δ9-DES、Δ5-DESやΔ6-ELOの発現を促進することで、ＰＵＦＡ、特にC20:5Δ5,8,11,14,17の生産性が一層向上することが分かった。【０１５２】
実施例５  (delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株、及び(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株のTAG中の脂肪酸組成の分析
（１）野生株及び形質転換体の培養
実施例３及び４で取得した(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株、(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株、及び陰性対照である野生株を、Ｎ５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて５日間振盪培養し、前培養液１とした。前培養液１  2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、同条件にて５日間振盪培養し、前培養液２とした。前培養液２  2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、同条件にて３週間振盪培養を行った。【０１５３】
（２）脂質の抽出、TAGの分画、TAG中の脂肪酸組成の分析
前述の培養液0.25mLに、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%ＫＣｌ  0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、クロロホルム20μLに溶解した。
このようにして得られた脂質抽出液全量、及び標準溶液｛10mg/mLトリミリスチン（和光純薬工業社製）、クロロホルム溶液｝3μLをそれぞれTLCプレートシリカゲル60F254（メルク社製）上にスポットした。TLC展開槽DT-150（三菱化学メディエンス社製）を用い、展開溶媒（ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝42：28：0.3（体積比））で約15分展開した。展開後プレートを乾燥させ、メタノールに溶解させた0.1%プリムリン（和光純薬工業社製）を噴霧して乾燥させた後、ハンデイ型UVランプUVL-21（相互理化学硝子製作所社製）でＴＡＧ画分を検出した。【０１５４】
爪楊枝を用いてＴＡＧ画分を掻き取り、クロロホルム0.1mL、14%三フッ化ホウ素−メタノール溶液（SIGMA社製）0.5mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
得られた脂肪酸メチルエステルに対して実施例１と同様の方法にてガスクロマトグラフィー解析に供し、構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表９に示す。なお、表９において、「TAG-FA」はＴＡＧを構成する脂肪酸残基の総重量を示し、「脂肪酸組成(%TAG-FA)」はＴＡＧを構成する脂肪酸残基の総重量に占める各脂肪酸残基の重量割合（ＴＡＧを構成する脂肪酸残基の組成比）を示す。【０１５５】
【表９】
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【０１５６】
表９から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株）は野生株と比較して、TAG中のC20:n（特にC20:5Δ5,8,11,14,17）の割合が向上していた。
さらに、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ6-ELO遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株）は、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株）と比較して、C20:n（特にC20:3Δ8,11,14）の割合がより一層増加していた。
これらの結果から、Δ12-DES、Δ6-DES及びω3-DESに加え、Δ6-ELOの発現を促進することで、ＰＵＦＡの生産性が一層向上することが分かった。【０１５７】
以上のように、ナンノクロロプシス属に属する藻類のＰＵＦＡの合成経路において、Δ12-DES及びΔ6-DESが、律速段階の反応を触媒する酵素である。そしてこれらの発現を促進することで、ＰＵＦＡの生産量を有意に増大させることができる。そして、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体を培養することで、ＰＵＦＡの生産性を向上させることができる。【０１５８】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【０１５９】
本願は、2016年9月7日に日本国で特許出願された特願2016-174752に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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