【手続補正書】
【提出日】平成18年10月27日(2006.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次に示す一般式（１）に表される化合物乃至はその塩を含む、Ｒｈｏ活性化剤。
【化１】
2006067941.tif 000001
一般式（１）
（但し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表し、且つ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４の少なくとも１つは、水酸基乃至はアルキルオキシ基であり、Ａ、Ｂの何れかは一般式（２）に表される基であって、他方は水素原子またはＯＣＨ３であり、破線の結合はあってもなくても良い。）
【化２】
2006067941.tif 000002
一般式（２）
（但し、式中ｎは０乃至１の整数を表し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルキルオキシ基又は炭素数１〜４のアルキレンジオキシ基を表し、該アルキレンジオキシ基においては、共通のアルキレン基を介して、同一芳香環に結合した他の酸素原子と結合し、脂肪族環を形成するものとする。）
【請求項２】
前記一般式（１）に表される化合物が、センタウレイジン（化合物１）、メチルオフィオポゴナノンＡ（化合物２）、オピオポゴナノンＡ（化合物３）、オピオポゴノンＡ（化合物４）、メチルオフィオポゴナノンＢ（化合物５）又はメチルオフィオポゴノンＡ（化合物６）であることを特徴とする、請求項１に記載のＲｈｏ活性化剤。
【化３】
2006067941.tif 000003
センタウレイジン（centaureidin）
【化４】
2006067941.tif 000004
メチルオフィオポゴナノンＡ（methylophiopogonanone A）
【化５】
2006067941.tif 000005
オピオポゴナノンA（opiopogonanone A）
【化６】
2006067941.tif 000006
オピオポゴノンA（opiopogonone A）
【化７】
2006067941.tif 000007
メチルオフィオポゴナノンＢ（methylophiopogonanone B）
【化８】
2006067941.tif 000008
メチルオフィオポゴノンＡ（methylophiopogonone A）
【請求項３】
Ｒｈｏ阻害剤をスクリーニングするためのものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＲｈｏ活性化剤。
【請求項４】
樹状突起を有する細胞を、請求項１〜３のいずれかに記載のＲｈｏ活性化剤の存在下培養し、これに被験物質を加え、細胞の形態の変化を観察することを特徴とする、Ｒｈｏ活性阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記樹状突起を有する細胞がアストロサイトであることを特徴とする、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のスクリーニング方法によって得られるＲｈｏ活性阻害剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】Ｒｈｏ活性化剤
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、Ｒｈｏ活性化剤に関し、更に詳細には、Ｒｈｏ阻害剤をスクリーニングするなどの生化学的試薬として有用なＲｈｏ活性化剤に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
Ｒｈｏはｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅに分類される蛋白であり、メラノサイトやアストロサイト等の、樹状突起を有する細胞に於いて、該樹状突起を収縮せしめる作用を担った、樹状突起を有する細胞を制御する酵素である（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。前記樹状突起を有する細胞の内、メラノサイトはメラニン色素の生合成や炎症に関連する細胞であり、その制御はメラニン色素の生合成、炎症系を制御する上で重要である。又、後者に於いては、神経細胞の再生などの面で重要な位置を占めている。かかる作用を有するＲｈｏに対する阻害剤は既に存在し、神経細胞の再生などにおいて有用であることが知られている（例えば、特許文献１を参照）。かかる神経細胞の再生については、高齢化社会を迎えるにあたって、その重要性はますます高まっており、その意味での多種のメカニズムのＲｈｏ阻害剤の開発が、この分野では望まれている。この様なＲｈｏ阻害剤の開発において重要なことは、対象とする細胞のステージをあわせることであり、その為には、Ｒｈｏを活性化しておく必要が存している。しかしながら、Ｒｈｏの活性剤の存在は全く知られていない。即ち、Ｒｈｏを活性化し、樹状突起を同じレベルに収縮させる技術の開発が望まれていた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
一方、センタウレイジンは、既知化合物であって、キク科セイヨウノコギリソウ等の植物の植物体中に含有され、ラジカルをスカベンジする作用やメラノサイトの樹状突起を収縮させる作用を有することが知られている（例えば、非特許文献３、非特許文献４、特許文献２を参照）。又、メチルオフィオポゴナノン類については、ユリ科バクモンドウ（麦門冬）の植物体中に含有され、鎮咳作用やメラノサイトの樹状突起の収縮作用を有することが知られている（例えば、特許文献３、特許文献４を参照）。しかしながら、センタウレイジンについても、メチルオフィオポゴナノン類についてもＲｈｏに対する作用は全く知られていない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、Ｒｈｏを活性化し、樹状突起を同じレベルに収縮させる技術を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩が、Ｒｈｏの活性化を促進する作用に優れることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下の通りである。
（１）次に示す一般式（１）に表される化合物乃至はその塩を含む、Ｒｈｏ活性化剤。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【化１】
2006067941.tif 000009
一般式（１）
（但し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表し、且つ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４の少なくとも１つは、水酸基乃至はアルキルオキシ基であり、Ａ、Ｂの何れかは一般式（２）に表される基であって、他方は水素原子またはＯＣＨ３であり、破線の結合はあってもなくても良い。）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【化２】
2006067941.tif 000010
一般式（２）
（但し、式中ｎは０乃至１の整数を表し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルキルオキシ基又は炭素数１〜４のアルキレンジオキシ基を表し、該アルキレンジオキシ基においては、共通のアルキレン基を介して、同一芳香環に結合した他の酸素原子と結合し、脂肪族環を形成するものとする。）
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
（２）前記一般式（１）に表される化合物が、センタウレイジン（化合物１）、メチルオフィオポゴナノンＡ（化合物２）、オピオポゴナノンＡ（化合物３）、オピオポゴノンＡ（化合物４）、メチルオフィオポゴナノンＢ（化合物５）又はメチルオフィオポゴノンＡ（化合物６）であることを特徴とする、（１）に記載のＲｈｏ活性化剤。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（３）Ｒｈｏ阻害剤をスクリーニングするためのものであることを特徴とする、（１）又は（２）に記載のＲｈｏ活性化剤。
（４）樹状突起を有する細胞を、（１）〜（３）のいずれかに記載のＲｈｏ活性化剤の存在下培養し、これに被験物質を加え、細胞の形態の変化を観察することを特徴とする、Ｒｈｏ活性阻害剤のスクリーニング方法。
（５）前記樹状突起を有する細胞がアストロサイトであることを特徴とする、（４）に記載のスクリーニング方法。
（６）（４）又は（５）に記載のスクリーニング方法によって得られるＲｈｏ活性阻害剤。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
（１）本発明のＲｈｏ活性化剤
本発明のＲｈｏ活性化剤は、上記一般式（１）に表される化合物及び／又はその塩を含む。式中、ｎは０乃至１の整数を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表し、且つ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４の少なくとも１つは、水酸基乃至はアルキルオキシ基であり、Ａ、Ｂの何れかは一般式（２）に表される基であって、他方は水素原子であり、破線の結合はあってもなくても良い。前記炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、セカンダリーブチル基、ターシャリーブチル基などが好適に例示でき、特に好ましくはメチル基である。又、アルキルオキシ基としては、炭素数１〜４のものが好ましく、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、１−メチルエチルオキシ基、ブチルオキシ基、１−メチルプロピルオキシ基、２−メチルプロピルオキシ基、１，１−ジメチルエチルオキシ基などが好適に例示できる。又、これらの置換基の一般式（１）への分配であるが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の内、少なくとも一つは水酸基乃至はアルキルオキシ基であることが好ましく、Ｒ１又はＲ３の、少なくとも１方がアルキル基乃至はアルキルオキシ基であることが好ましい。より好ましくはＲ３がアルキル基乃至はアルキルオキシ基であることである。Ｒ２、Ｒ４は少なくともどちらか一方が水酸基であることが好ましく、ともに水酸基であることがより好ましい。又、一般式（１）における破線の結合はあってもなくても良いが、存在することが好ましい。Ａ、Ｂの何れかに一般式（２）に表される基が置換基として結合するが、Ａに結合することが好ましい。一般式（２）に表される置換基が結合しない方は、水素原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキル基乃至はアルキルオキシ基であることが好ましい。一般式（２）においてＲ７、Ｒ８の少なくともどちらか一方はアルキルオキシ基乃至はアルキレンオキシ基であることが好ましい。特に、Ｒ７がアルキルオキシであることが好ましい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
（２）本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、前記本発明のＲｈｏ活性化剤のＲｈｏ活性化促進作用を利用したものであり、予め、本発明のＲｈｏ活性化剤を添加して、樹状突起を有する細胞を培養し、該細胞の樹状突起を収縮せしめておき、これに検体を添加し、樹状突起の収縮がどの程度回復するかを指標に、検体のＲｈｏ活性阻害作用を評価するものである。この様な評価対象とすべき、樹状突起を有する細胞としては、樹状突起を有していれば特段の限定無く適用することが出来、例えば、メラノサイトやモノサイトやアストロサイトが好ましく例示でき、アストロサイトが特に好ましい。これはアストロサイトのＲｈｏに対する活性化阻害剤は、神経細胞の再生に有用であると考えられ、この様な再生により、老化により失われた記憶能力などを取り戻すことが出来ると考えられるからである。かかる細胞の培養条件は、通常知られている培養条件に従えば良く、例えば、１５４Ｓ培地やＤＭＥ培地などにＦＢＳ、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ｂＦＧＦの成長因子、牛胎児血清、インスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェリン、ヘパリン、ＰＭＡ、牛脳下垂体抽出液等を適宜加えて使用することが出来る。又、培養条件は通常のように５％炭酸ガス混合で、３７℃の条件で培養できる。しかる後に、ホルマリンなどで固定した上、染色し、顕微鏡下観察すれば樹状突起の状態を知ることが出来る。これにより、本発明のＲｈｏ活性化剤の効果がどの程度解除できたかを知ることが出来、これにより、被験物質のＲｈｏ阻害作用の強さを鑑別できる。この様な、スクリーニング方法で、５０％阻害濃度が１０ｍＭ以下のものについては、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、Ｒｈｏ活性阻害効果が期待でき、かかる物質をＲｈｏ活性阻害剤として用いることは、本発明の技術的範囲に属する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
＜結果＞
結果を図１に示す。Ｒｈｏ関連蛋白の阻害は正常ヒトメラノサイトにおいても著しいデンドライトの伸長と分岐を促進したが、ここに化合物１を添加することにより、このＲｈｏの抑制は完全に解除され、デンドライトは完全に縮んだ状態となることがわかる。尚、図中centaureidineはセンタウレイジン（化合物１）を表し、ＭＯＰＢはメチルオフィオポゴナノンＢ（化合物５）を表す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
＜方法＞
１）白人由来正常ヒトメラノサイトを１×１０６ｃｅｌｌｓ／１０φｄｉｓｈで播種した。２４ｈｒ、３７℃でインキュベートする。
２）ここに５００ｎＭの化合物１、１μＭの化合物２もしくはコントロール群には等量のＤＭＳＯを添加し、  各０，１５，３０，６０，２４０ｍｉｎに細胞を回収した。
３）その後、タンパクを抽出した。（抽出溶液： ０．１％ ＮＰ−４０、４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８)、 １．５ｍＭ ＮａＣｌ、 １％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、 ５ｍＭ ＰＭＳＦ、 １ｍｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０ｍｍ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）
４）遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）でメラニン等を除去した細胞溶解液を調製し、最終のボリュームを２００μｌとした。この１／１０を分取し、ｔｏｔａｌ  ｌｙｓａｔｅとしてｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
５）残りの細胞溶解液にｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％  ＮＰ４０、１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を８００μｌ加え、そこへＧＳＴ−ａｇａｒｏｓｅ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）  を１μｇ加え、４℃  ３０ｍｉｎ  ローテーター上で混合した。
６）２０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎの遠心でＧＳＴを除いた上清に、Ｒｈｏであれば、１５μｇのＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｉｎ  Ｒｈｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ（ＲＢＤ）、ＲａｃであればＧＳＴ−ｐ２１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎを加え４℃  ６０ｍｉｎ  ローテーター上で混合した。
７）その後、沈殿をＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％  ＮＰ４０、１ｍＭ  ＮａＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）  で３回洗浄後、さらにＮＰ４０を除いたＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した
８）沈殿に２×Ｌａｅｍｍｅｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃で変性しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。
９）この一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色後、ゲルのバンドを読み込みＳｃｉ  Ｉｍａｇｅによりバンドから各サンプルの蛋白量を均一化した。これに従って各サンプルを調整した。
１０）その後は通常のｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔと同じ方法にてＲｈｏの検出を行った。