【手続補正書】
【提出日】平成18年3月17日(2006.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）：
【化１】
2000302750.tif 000001
［式（１）中、
Ｘは、無置換であるか、又は、ハロゲン原子であり；
Ｒ１は、枝分かれしていてもよい炭素数１ないし５のアルキル基であり；そして、
ｎは、１ないし１０の整数である］
で表される構造を有する化合物。
【請求項２】
Ｘが４−クロロであり、Ｒ１がエチル基であり、そして、ｎが３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体。
【請求項４】
以下のｉ）及びｉｉ）
ｉ）以下の式（２）：
【化２】
2000302750.tif 000002
[式（２）中、Ｘ、Ｒ１及びｎは、式（１）について先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物と高分子化合物との結合体を抗原として用いることにより製造された、以下の式（３）：
【化３】
2000302750.tif 000003
［式（３）中、
Ｒ２は、枝分かれしていてもよい炭素数１ないし５のアルキル基であって、Ｒ１と同一であっても異なっていてもよく；
Ｘ及びＲ１は式（１）について先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント；
ｉｉ）請求項３に記載の結合体
を用いること特徴とする、式（３）の化合物の免疫学的測定方法。
【請求項５】
さらに、式（２）に記載の化合物を用いることを含む、請求項４に記載の免疫学的測定方法。
【請求項６】
ｉ）式（２）及び式（３）の化合物において、ＸがＣｌであり、Ｒ１及びＲ２がともにエチル基であり、かつ、ｎが３であり；そして
ｉｉ）請求項３に記載の結合体を構成する式（１）の化合物において、ＸがＣｌであり、Ｒ１がエチル基であり、かつ、ｎが３である
請求項４又は５に記載の免疫学的測定方法。
【請求項７】
ｉ）式（２）の化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体を抗原として用いることにより製造された、式（３）の化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント；及び
ｉｉ）式（２）の化合物に含まれるが、ｉ）の抗体作製に使用した化合物とは異なる化合物と、高分子化合物又は標識物質との結合体
を用いること特徴とする、式（３）の化合物の免疫学的測定方法。
【請求項８】
ｉ）の抗体作製に用いる化合物は、式（２）においてＸがＣｌであり；そして
ｉｉ）の結合体を構成する化合物は、式（２）において、Ｘが無置換である
請求項７に記載の免疫学的測定方法。
【請求項９】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９０５で寄託されているハイブリドーマから産生される、式（３）の化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントを用いることを特徴とする、請求項４ないし８のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体ＴＢＣ７−２を用いることを特徴とする、請求項９に記載の免疫学的測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，  ４１９−４３９  （１９８０））等の免疫学的測定方法において、抗体作製に用いた免疫用ハプテンと、固相化用抗原又は標識用抗原に用いるハプテン化合物とが異なる測定系をヘテロロガスな系という。ヘテロロガスな系では測定感度が上昇する可能性があることが示唆されている。しかしながら、一般論として知られているだけで、個別の対象化合物について、固相化用抗原又は標識用抗原としてどのような構造のハプテンを用いれば有効に測定感度が上昇するか、個別具体的な研究を必要とする。また、ヘテロロガスな系は選択性を低下させる可能性があるとの指摘もされている。チオカルバマート系化合物については、ヘテロロガスな測定系は知られていなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
［式（Ｚ２）中、
Ｍはアルカリ金属を表し；そして
Ｒ１及びｎは式（１）で先に定義した通りである］
で表されるジチオカルバミン酸塩を合成する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
更にこのジチオカルバミン酸塩を単離することなしに式（Ｚ３）：
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
チオカルバマート系化合物のハプテン化合物と高分子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４２，  ３０１−３０９（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，  １０９０‐１０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
固相化用抗原を担体に固相化させるには、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（チオカルバマート系化合物のハプテン化合物と高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、チオカルバマート系化合物のハプテン化合物部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング剤を含む緩衝液（例えば、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（リン酸緩衝液））を適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液を用いることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
好ましくは、式（１）及び（２）の化合物において、ＸがＣｌであり、Ｒ１がエチル基であり、かつ、ｎが３である。
また、固相化用抗原として、 式（２）の化合物に含まれるが、ｉ）の抗体作製に使用した化合物とは異なる化合物と、高分子化合物又は標識物質との結合体を用いることもできる。例えば、免疫用ハプテンでは、式（２）においてＸがＣｌであるが、固相化用ハプテンではＸが無置換のものを用いることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
具体的には、免疫用ハプテンとして式（２）の化合物を用い、標識用抗原として式（１）の化合物を用いる。
好ましくは、式（１）及び（２）の化合物において、ＸがＣｌであり、Ｒ１がエチル基であり、かつ、ｎが３である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
例えば、上述したチオカルバマート系化合物に対するモノクローナル抗体ＴＢＣ７−２は、図１に示されており、かつ式（２）の範囲に含まれる化合物を免疫用ハプテンとして得られた抗体である。標識用抗原として免疫用ハプテン／ＨＲＰを用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法では、チオベンカルブの測定範囲が約０．５ｎｇ／ｍｌないし約７０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＣ５０が約３．７ｎｇ／ｍｌであった。これに対し、標識用抗原として図１の標識用ハプテン−１／ＨＲＰ及び標識用ハプテン−２／ＨＲＰを用いた場合には、測定範囲が共に約０．１ｎｇ／ｍｌないし約７０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＣ５０が各々約１．７ｎｇ／ｍｌ及び約２．１ｎｇ／ｍｌである（実施例４、図２）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
例えば、チオカルバマート系化合物に対するモノクローナル抗体ＴＢＣ７−２について、直接競合ＥＬＩＳＡ法において本発明のヘテロロガスな系を採用する場合の交差反応性について調べた。その結果、ＴＢＣ７−２はチオベンカルブの代謝分解物−６が６５％、代謝分解物−３が３３％、代謝分解物−２が５．２％、そして代謝分解物−１が４．４％の交差反応性を示したものの、他の代謝物や類縁化合物とは１％以下の交差反応性しか示さなかった（実施例５、表３）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
４−エチルアミノブタン酸の塩酸塩１．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム１．２ｇ（３０ｍｍｏｌ）を水１５ｍｌに溶解した。この溶液に氷水冷却下５℃ないし１０℃で、５０％硫酸１０ｍｌに室温下でチオシアン酸アンモニウム１．２ｇ（１５ｍｍｏｌ）の飽和水溶液を徐々に滴下することにより得られたＣＯＳガスを３０分かけて吹き込んだ。次に、この溶液にベンジルクロリド１．３ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１０ｍｌアセトン溶液を室温下に加え、５０℃で１時間撹拌した。反応混合物からアセトンを減圧下に留去し、１Ｎの塩酸で酸性にした後、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出した。酢酸エチル層を水洗い後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製し、０．４０ｇ（収率１４％）の４−（Ｎ−ベンジルチオカルボニル−Ｎ−エチルアミノ）ブタン酸（１）を無色透明の液体として得た。