(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）’
【化１】
0004511470.tif 000009
ここで、Ｒ０は下記式（１）’−ａ
【化２】
0004511470.tif 000010
で表わされる基、−ＯＨまたは−ＯＮａであり、Ｒ０１は炭素数１０〜２８のアルケニル基でありそしてｎは３００〜３０，０００の数である、但しＲ０の１〜５０％が上記式（１）’−ａで表わされる基であるものとする、
で表わされる、ヒアルロン酸化合物。
【請求項２】
ｎが１，０００〜１０，０００である請求項１に記載のヒアルロン酸化合物。
【請求項３】
式（１）’−ａにおける２つの基Ｒ０１ＣＯ−がいずれもオレオイル基である請求項１に記載のヒアルロン酸化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のヒアルロン酸化合物からなるハイドロゲル。
【請求項５】
下記式（１）
【化３】
0004511470.tif 000011
ここで、Ｒは下記式（１）−ａ
【化４】
0004511470.tif 000012
で表わされる基、−ＯＨまたは−ＯＮａであり、Ｒ１は炭素数１０〜２８のアルキル基またはアルケニル基でありそしてｎは５０〜５０，０００の数である、但しＲの１〜１００％が上記式（１）−ａで表わされる基であるものとする、
で表わされる、ヒアルロン酸化合物からなる関節軟骨損傷治療用材料。
【請求項６】
軟骨修復能力を有する請求項５に記載の関節軟骨損傷治療用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンの反応生成物であるヒアルロン酸化合物、そのハイドロゲルおよび関節軟骨損傷治療用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は生体内で数少ない無血管系の組織の１つであり、元の組織に再建することは難しいとされている。外傷による軟骨欠損や離断性骨軟骨炎など限局した軟骨病変に基づく変形性関節症の発症を抑えるため、種々の治療法が試みられてきた。
自家軟骨細胞または骨髄細胞から間葉系幹細胞を採取して分化した軟骨細胞を、細胞のみ、あるいは培養基材（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）に培養して軟骨欠損部に移植する自家軟骨細胞移植（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；ＡＣＩ）が試みられている（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３参照）。
また、自家軟骨細胞を生体外で培養する際に、より生体内環境に近いとされる３次元培養が積極的に試みられており、培養基材としては、コラーゲン、アルギン酸、フィブリンなど体内で安全と認められている材料が用いられている。そのうちコラーゲンについては、アテロコラーゲンを用いた手法を越智らが開発し、臨床試験が始まっている（特許文献１参照）。
しかし、コラーゲンは生体吸収性は示すものの、抗原性を完全に除去することは困難であり、また未知のウィルス感染などの危険性を否定することが出来ないなどの課題がある。
【０００３】
これに対し、ヒアルロン酸は関節軟骨を形成する細胞外基質の構成成分であり、軟骨との親和性が高い。さらにヒアルロン酸は動物由来の原料を含まない発酵法で生成することが可能であるため、コラーゲンとは異なり未知のウィルス感染などの危険性は低い。そこで最近では、再生医療においてヒアルロン酸を利用した膝軟骨損傷治療の検討が行われている。
特許文献２、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６には、ベンジルエステル化ヒアルロン酸が開示されている。また、特許文献３には、ビスエポキシド架橋ヒアルロン酸が開示されている。さらに、特許文献４および特許文献５にはジビニルスルフォン架橋ヒアルロン酸が開示され、特許文献６にはホルムアルデヒド架橋ヒアルロン酸が開示され、特許文献６にはホルムアルデヒド架橋ヒアルロン酸が開示されている。その他ヒドラジド架橋ヒアルロン酸も知られている。
しかし、いずれの場合もヒアルロン酸の生体吸収性を改善するために架橋剤を使用しているが、これらの架橋剤が非生体吸収性物質であるため安全性が懸念されており、安全性に優れた関節軟骨治療用材料が求められている。ちなみにここで言う“架橋”とは、共有結合からなる化学架橋以外に、静電相互作用によるイオン架橋、ファンデルワールスカ、疎水性相互作用による物理架橋を指す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２９３０８１号公報
【特許文献２】米国特許第５９３９３２３号明細書
【特許文献３】特開平７−９７４０１号公報
【特許文献４】米国特許第４５８２８６５号明細書
【特許文献５】米国特許第４６０５６９１号明細書
【特許文献６】特開昭６０−１３０６０１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３３１,８８９−９５（１９９４）
【非特許文献２】Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ．７６，５７９−９２（１９９４）
【非特許文献３】Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ．２５，１７２−１７９（２００１）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４２，１７２−８１（１９９８）
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４６，３３７−４６（１９９９）
【非特許文献６】Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１８，７７３−７８０（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、生体適用性に優れ且つ安全なヒアルロン酸化合物を提供することにある。
本発明の目的は、生体内において荷重のかかる部位においても使用可能な程の十分な強度を示すハイドロゲルを与えるヒアルロン酸化合物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、本発明の上記ヒアルロン酸化合物からなる関節軟骨損傷治療用材料を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、
下記式（１）’
【０００８】
【化１】
0004511470.tif 000002
【０００９】
ここで、Ｒ０は下記式（１）’−ａ
【００１０】
【化２】
0004511470.tif 000003
【００１１】
で表わされる基、−ＯＨまたは−ＯＮａであり、Ｒ０１は炭素数１０〜２８のアルケニル基でありそしてｎは３００〜３０，０００の数である、但しＲ０の１〜５０％が上記式（１）’−ａで表わされる基であるものとする、
で表わされる、ヒアルロン酸化合物によって達成される。
【００１２】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、
本発明の上記ヒアルロン酸化合物からなるハイドロゲルによって達成される。
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、
下記式（１）
【００１３】
【化３】
0004511470.tif 000004
【００１４】
ここで、Ｒは下記式（１）−ａ
【００１５】
【化４】
0004511470.tif 000005
【００１６】
で表わされる基、−ＯＨまたは−ＯＮａであり、Ｒ１は炭素数１０〜２８のアルキル基またはアルケニル基でありそしてｎは５０〜５０，０００の数である、但しＲの１〜１００％が上記式（１）−ａで表わされる基であるものとする、
で表わされる、ヒアルロン酸化合物からなる関節軟骨損傷治療用材料によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例５および比較例５における、術後８週におけるウサギ膝関節の組織学的評価の対比である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のヒアルロン酸化合物は、上記式（１）’で表わされ、また本発明の関節治療用材料で用いられるヒアルロン酸化合物は上記式（１）で表わされる。上記式（１）中、Ｒは式（１）−ａで表わされるホスファチジルエタノールアミノ基であるか、−ＯＨまたは−ＯＮａである。また、式（１）’中、Ｒ０は式（１）’−ａで表されるホスファチジルエタノールアミノ基であるか、−ＯＨまたは−ＯＮａである。但し、Ｒの１〜１００％またはＲ０の１〜５０％がホスファチジルエタノールアミノ基である必要がある。ホスファチジルエタノールアミノ基がＲまたはＲ０の１％未満であると、本発明の目的が達成されない。Ｒは炭素数１０〜２８、好ましくは炭素数１４〜２０のアルキル基またはアルケニル基であり、そしてＲ０は炭素数１０〜２８、好ましくは炭素数１４〜２０のアルケニル基である。ｎは５０〜５０，０００、好ましくは３００〜３０，０００、さらに好ましくは１，０００〜１０，０００である。
Ｒの炭素数１０〜２８のアルキル基としては、例えばデシル、ウンデシル、ラウリル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、ステアリル、エイコサニルを挙げることができる。また、ＲおよびＲ０の炭素数１０〜２８のアルケニル基としては、例示した上記アルキル基に対応する、１〜３個の炭素−炭素不飽和結合を有するアルケニル基例えばオレイル基を挙げることができる。
上記式（１）および（１）’のそれぞれで表わされる化合物として、式（１）−ａ中の２つの基Ｒ１ＣＯ−または式（１）’−ａ中の２つの基Ｒ０１ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
上記式（１）および式（１）’のそれぞれで表わされるヒアルロン酸化合物は、例えばヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンとを反応させることによって製造することができる。
【００１９】
ヒアルロン酸としては、例えば動物組織から抽出したもの、または発酵法で製造したものどちらでも使用できる。発酵法で使用される菌株としてはストレプトコッカス属のヒアルロン酸生産能を有する微生物であり、ストレプトコッカス・エクイＦＭ-１００(特開昭６３-１２３３９２号公報)、ストレプトコッカス・エクイＦＭ-３００(特開平２-２３４６８９号公報)が知られている。これらの変異株を用いて培養、精製されたものも用いることができる。またヒアルロン酸の分子量は、約１×１０５〜１×１０７が好ましい。なおここでいうヒアルロン酸には、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩も包含される。
さらに、ホスファチジルエタノールアミンとしては動物組織から抽出したもの、または合成して製造したものどちらでも使用できる。ホスファチジルエタノールアミンとしては、例えばジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン、ジベヘノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリグノセロイルホスファチジルエタノールアミン、ジセロチオイルホスファチジルエタノールアミン、ジモンタノイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストオレオイルホスファチジルエタノールアミン、シパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジネルボノイルホスファチジルエタノールアミン、ジキメノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジヒラゴノイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。その中でも、溶解性の面からジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
ホスファチジルエタノールアミンは、生体に安全な物質であり、本発明のヒアルロン酸化合物としてヒアルロン酸を水素結合あるいは疎水性相互作用を利用した物理架橋等により架橋を促進する。そのため、本発明のヒアルロン酸化合物は、これらの架橋により後述するハイドロゲルや不溶性成型体に形成することができる。
【００２０】
ホスファチジルエタノールアミンの使用量は、ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し、１〜１００当量であることが好ましい。１当量より少ないと生成するヒアルロン酸化合物がハイドロゲルを形成しない。また、５０当量より多いと、生成するヒアルロン酸化合物の疎水性が高くなり不溶物が発生し、ハイドロゲルを形成し難くなり、特に５１当量以上の使用量では水性媒体に対し十分な不溶性を示すようになる。ここで水性媒体とは、水、生理食塩水、緩衝液およびアルコールなど有機溶媒を含有する水溶液を意味し、また不溶性とは、ある一定期間ヒアルロン酸化合物が生体内に滞留し、その後は徐々に分解が進み、最終的には生体内に吸収されることを意味すると理解されるべきである。
動物例えば人間の膝関節の如き荷重のかかる生体膝関節部位に化合物を注入した際２００Ｐａ以下では形状を維持することが困難であるのに対し、本発明のヒアルロン酸化合物からなるハイドロゲルは２００Ｐａ以上の高弾性率を有するので、膝軟骨損傷治療用の材料として有用である。
【００２１】
本発明のヒアルロン酸化合物が水性媒体に、十分な不溶性を示すときには、これを成型体例えばスポンジの如き多孔体、不織布、フィルム等の形状に成形することができる。また、本発明のヒアルロン酸化合物が水性媒体に不溶性であっても体内に成形体を埋入した際に例えば２〜３週間後、体液により膨潤してゲルに変換することも可能である。
成型体を製造する方法としては、例えば凍結乾燥法、乾式製膜、湿式製膜、凝固紡糸、スパンボンド法、メルトブロー法、フラッシュ紡糸法などが挙げられる。
これらの成型体は、例えば一定の形状を持つ成型体として用いて軟骨を修復することを必要とする用途、とくに高い滞留性が求められる用途、例えば関節治療、術後組織の癒着防止剤あるいは皮膚の保湿剤等に使用することができる。
本発明のヒアルロン酸化合物は、上記の如く軟骨修復能力を有する関節治療用材料として有利に使用することができる。
【実施例】
【００２２】
以下の実施例により本発明の詳細をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下の実施例１〜４に使用したヒアルロン酸ナトリウムはストレプトコッカス属由来の平均分子量が１，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムであり、これはｎ＝３，５００に相当する。その他の試薬については、テトラヒドロフラン、０．１Ｍ  ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉ−ｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）、１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）、Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅは、和光純薬工業（株）、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−８１８１）は日本油脂（株）、３％アテロコラーゲンは高研（株）のものを使用した。
【００２３】
実施例１
Ｌ−α−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン１１０ｍｇ（０．００００３３ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し１０当量）を、テトラヒドロフラン／水＝１／１（ｖ／ｖ）２００ｍｌに溶解した。この溶液に、ヒアルロン酸ナトリウム５００ｍｇを加え、０．１Ｍ  ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、ｐＨ  ６．８に調整した。１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）  ３０ｍｇ（０．００００３３ｍｏｌ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  （ＨＯＢｔ）２５ｍｇ（０．００００３３ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水＝１／１の水溶液１０ｍｌに溶解し反応系に添加し、終夜攪拌を行った。
攪拌後、透析精製を行い、凍結乾燥し目的物を得た。確認は１ＨＮＭＲ（日本電子  ＪＮＭ−ａｌｐｈａ４００）により行い、目的物の生成を確認した。
この凍結乾燥品３０ｍｇをイオン交換水９７０ｍｇに溶解し、濃度３ｗｔ％のハイドロゲルを調整した。このハイドロゲルの複素弾性率及びズリ降伏応力を調べるために、Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ  ＲＦＩＩＩ、ＳＲＶ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用し、３７℃で測定を行った。その結果を表１に示す。ここでいう、複素弾性率とは弾性体の応力とひずみの比を表す定数であり、ズリ降伏応力とはズリ応力を懸けた際、ゲルの構造が維持される最大応力を示す。
【００２４】
実施例２
Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４４０ｍｇ（０．０００１２ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し４０当量）、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）１２０ｍｇ（０．０００１３２ｍｏｌ）  １−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏ−ｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）１００ｍｇ（０．０００１３２ｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００２５】
比較例１
ヒアルロン酸ナトリウム５０ｍｇにイオン交換水５ｍｌを加え攪拌を行い、ハイドロゲルを得た。物性評価については、実施例１と同様。結果を表１に示す。
【００２６】
比較例２
米国特許第４，９３７，２７０号明細書を参考に追試実験を行った。詳細は以下の通りである。
ヒアルロン酸ナトリウム４００ｍｇを水４０ｍｌに溶解し、０．１Ｍ  ＨＣｌによりｐＨを４．７５に調整した。
１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）  １５３ｍｇ（０．８０ｍｍｏｌ）、Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  １８２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）を添加し、５時間攪拌を行った。攪拌後、透析精製を行い、凍結乾燥し目的物を得た。物性評価については、実施例１と同様。結果を表１に示す。
【００２７】
比較例３
アテロコラーゲンを使用した以外は、実施例１と同様の条件でアテロコラーゲンを測定した。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
0004511470.tif 000006
【００２９】
表１より、ヒアルロン酸−Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンは、ヒアルロン酸ナトリウム、アテロコラーゲンと比較し複素弾性率、降伏ズリ応力いずれも優れていることが明らかである。また、架橋ヒアルロン酸と比較した場合においても、同等またはそれ以上の機械特性を示すことが分かる。
【００３０】
実施例３
ヒアルロン酸ナトリウム１００ｍｇをテトラヒドロフラン／水＝１／１（ｖ／ｖ）の水溶液４０ｍｌに溶解した。この溶液に、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン１５４ｍｇ（０．０００２１ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し７０当量）を加え、０．１Ｍ  ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、ｐＨ  ６．８に調整した。１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）４２ｍｇ（０．０００２３１ｍｏｌ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  （ＨＯＢｔ）３５ｍｇ（０．０００２３１ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水＝１／１（ｖ／ｖ）１０ｍｌに溶解し反応系に添加した。その際０．１ＭＮａＯＨを加え反応系をｐＨ  ６．８に保持した。その後終夜攪拌を行い、攪拌後透析を３日間行い凍結乾燥し目的物（スポンジ）を得た。確認は１ＨＮＭＲ（日本電子  ＪＮＭ−ａｌｐｈａ４００）により行い、目的物の生成を確認した。
以下の方法により溶解性テストを行った。得られた目的物２０ｍｇをリン酸緩衝生理食塩水５ｍｌ中に浸漬し、室温静置状態での溶解性について４週間テストを行い、目視で確認を行った。溶解性テストの結果を表２に示す。
【００３１】
実施例４
Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン２２３ｍｇ（０．０００３ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し１００当量）、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）６０ｍｇ（０．０００３３ｍｏｌ）  １−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏ−ｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）５０ｍｇ（０．０００３３ｍｏｌ）とした以外は、実施例１と同様に目的物（スポンジ）を得た。溶解性テストの結果を表２に示す。
【００３２】
比較例４
ヒアルロン酸ナトリウム２０ｍｇをリン酸緩衝生理食塩水５ｍｌ中に浸漬し、室温静置状態での溶解性について４週間テストを行い、目視で確認を行った。結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
0004511470.tif 000007
【００３４】
表２より、ヒアルロン酸−Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（含有量：７０、１００当量）は、ヒアルロン酸ナトリウムと比較し、水性液体に対するヒアルロン酸の不溶化が進んでいることが明らかである。
次の実施例５に使用した消毒用エタノール、１０％中性緩衝ホルマリン溶液、サフラニンＯ溶液は、和光純薬工業（株）の市販品、Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＣＦは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ（社）の市販品、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ（以下ＥＤＴＡ）は同仁化学研究所（株）の市販品、ペントバルビタール（以下ネンブタール）は大日本製薬（株）の市販品、１％キシロカインはアストラゼネカ（株）の市販品、結晶ペニシリン  Ｇ  カリウム（以下ペニシリン）は萬有製薬（株）の市販品、ヨードチンキは吉田製薬（株）の市販品である。また、実施例５に使用したニュージーランド白色家兎（以下ＮＺＷウサギ）は雄性であり、日本ＳＬＣ（株）より購入して体重３．０〜３．５ｋｇになるまでゲージにて通常飼育を行った。手術後の週齢は２４〜２８週齢であった。
【００３５】
実施例５
実施例１で調整した濃度３ｗｔ％のヒアルロン酸ハイドロゲルの生物学的評価を以下の方法により行った。通常飼育したＮＺＷウサギの耳介静脈にペントバルビタールを投与し、全身麻酔下で以下の手術を施した。両側の後肢膝関節周辺部を剃毛し、エタノール消毒をした後、キシロカインを局所に数回分けて筋肉内投与した。膝関節内側を切開し、膝蓋骨を脱臼させることにより大腿骨膝蓋溝を露出させた。内側側副靭帯から５ｍｍほど上部の滑車溝部分に、手術用ドリルで内径５ｍｍ、深さ５ｍｍの円筒形の欠損部を作製することによって、膝関節軟骨全層を欠損させた。そこに欠損部に上記で得られたハイドロゲルを埋入したのち、膝蓋骨を元の位置に戻して筋肉を手術用縫合した。感染防止のためにペニシリンを患部に滴下したのち、皮膚を縫合した。最後にヨードチンキで消毒し、ゲージに戻して通常の飼育を行った。術後８週間目に屠殺して欠損部分を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬、固定させ、組織学的評価に供した。固定した組織を、脱脂、ＥＤＴＡ脱灰した後、パラフィンに包埋し、欠損部の中心部近傍を矢状面に薄切して、標本を作製した。作製した標本にサフラニンＯ染色を施し、以下の項目についてスコア化することにより組織学的な評価を行った。
組織学的評価に用いたスコアグレードは、Ｗａｋｉｔａｎｉ  Ｓ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ．７６，５７９−９２（１９９４）の変法である  Ｍａｋｉｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｏｂｅ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．４８：９７−１０４（２００２）に従って実施した。表３に組織学的評価をする際に用いた項目と得点を示す。
全体の合計は１４点であり、項目によって３〜５段階で評価する。組織の修復度が高いほど、すなわち、正常組織に近い修復を示すほど、１４点に近づくことになる。すなわち、項目は、修復された組織の形態（０点から４点）、基質の染色性（０点から３点）、表面の状態（０点から３点）、軟骨組織の厚さ（０点から２点）、非欠損部との結合度（０点から２点）、についてであり、本法では正常組織に近いほど得点が高くなる。
術後８週目に欠損部位を摘出して組織学的評価を行った結果を図１に示す。術後８週間目において修復された軟骨組織は、ほとんどが硝子軟骨様を呈しており、基質が良好に産生をしている様子が観察された。また、正常部との結合も良好であり、組織の連続性を認めた。
【００３６】
比較例５
実施例５と同様に、大腿骨滑車溝に欠損部分を作製したのち、アテロコラーゲンゲル（登録商標）（Ｉ型、（株）高研）を埋入して整復し、術後８週目に欠損部分を摘出して組織学的評価を行った結果を図１に示す。
実施例５と比較すると、基質の染色性は他の条件との差が認められないものの、表面は平滑になっておらず、軟骨下骨が全く再建されていなかった。
【００３７】
【表３】
0004511470.tif 000008
【００３８】
以上の結果より、実施例５は、基質の染色性と修復した軟骨組織の厚さにおいては比較例５と同等であるが、表面の状態と正常組織との組織学的な連続性については正常組織により近い修復であり、全体として良好な修復能を示すことが確認できた。
これより本発明のヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンジオレオイルからなるヒアルロン酸化合物は比較例（アテロコラ−ゲン）よりも軟骨治療用材料として優れていることが分かった。
【図１】
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