(57)【要約】  本発明は、メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーを含むビーズであって、メルカプト基の一部または全部がジスルフィド結合を形成しているビーズを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーを含むビーズであって、メルカプト基の一部または全部がジスルフィド結合を形成しているビーズ。
【請求項２】
メルカプト基を有するウロン酸単位は、ウロン酸残基と、式（Ａ１）：
【化１】
2018151186.tif 000036
［式中、Ｌａ１は、単結合またはＣ１−３アルキレン基を示し、および
Ｌａ２は、Ｃ１−４アルキレン基を示す。］
で表される化合物、または式（Ａ２）：
【化２】
2018151186.tif 000037
で表される化合物の残基とがアミド結合を介して結合しているものである請求項１に記載のビーズ。
【請求項３】
ウロン酸が、ガラクツロン酸、マンヌロン酸およびグルロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１または２に記載のビーズ。
【請求項４】
ウロン酸が、マンヌロン酸およびグルロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、およびメルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、メルカプト基を有するアルギン酸である請求項１または２に記載のビーズ。
【請求項５】
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、メルカプト基を有するガラクツロン酸単位を含むポリマーである請求項１に記載のビーズ。
【請求項６】
メルカプト基を有するガラクツロン酸単位が、ガラクツロン酸残基とメルカプト基を有するアミノ酸残基とがアミド結合を介して結合しているものである請求項５に記載のビーズ。
【請求項７】
メルカプト基を有するアミノ酸が、システインである請求項６に記載のビーズ。
【請求項８】
ガラクツロン酸単位を含むポリマーが、ポリガラクツロン酸である請求項５〜７のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項９】
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、さらに、式（Ｂ）：
【化３】
2018151186.tif 000038
［式中、Ｒｂ１は、メルカプト基と結合し得る官能基を示し、
Ｌｂ１およびＬｂ２は、それぞれ独立に、単結合またはＣ１−６アルキレン基を示し、
Ｑｂ１は、単結合、フェニレン基、またはＣ４−８シクロアルカンジイル基を示し、
Ｌｂ３は、単結合、または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊（前記式中、＊はＱｂ１との結合位置を示し、＊＊はＱｂ２との結合位置を示し、およびｎは１〜１０の整数を示す。）を示し、
Ｑｂ２は、２価のトリアゾール環基を示し、
Ｌｂ４は、単結合、Ｃ１−６アルキレン基、またはＣ１−６アルキレン−オキシ基を示し、および
Ｑｂ３は、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい１価の５ないし６員複素環基、または置換されていてもよいＣ４−８シクロアルキル基を示す。］
で表される化合物と結合している請求項１〜８のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１０】
式（Ｂ）で表される化合物が、式（Ｂ１）：
【化４】
2018151186.tif 000039
で表される化合物、式（Ｂ２）：
【化５】
2018151186.tif 000040
で表される化合物、および式（Ｂ３）：
【化６】
2018151186.tif 000041
で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項９に記載のビーズ。
【請求項１１】
式（Ｂ）で表される化合物が、式（Ｂ１）：
【化７】
2018151186.tif 000042
で表される化合物である請求項９に記載のビーズ。
【請求項１２】
式（Ｂ）で表される化合物が、異物反応抑制作用を有する化合物である請求項９〜１１のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１３】
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーの全構成単位中のメルカプト基を有するウロン酸単位の割合が、０．１〜５０モル％である請求項１〜１２のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１４】
全メルカプト基中のジスルフィド結合を形成しているメルカプト基の割合が、１０〜１００モル％である請求項１〜１３のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１５】
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーの数平均分子量が、２５，０００〜５００，０００である請求項１〜１４のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１６】
ポリマーが、２価の金属イオンを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１７】
２価の金属イオンが、カルシウムイオン、バリウムイオンおよびストロンチウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１６に記載のビーズ。
【請求項１８】
外層として第１層および第２層をさらに有し、第１層がビーズの上に形成され、第２層が第１層の上に形成されている請求項１〜１７のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１９】
ウロン酸が、マンヌロン酸およびグルロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、メルカプト基を有するアルギン酸であり、および
メルカプト基を有するウロン酸単位が、ウロン酸残基と、式（Ａ１）：
【化８】
2018151186.tif 000043
［式中、Ｌａ１は、単結合またはＣ１−３アルキレン基を示し、および
Ｌａ２は、Ｃ１−４アルキレン基を示す。］
で表される化合物、または式（Ａ２）：
【化９】
2018151186.tif 000044
で表される化合物の残基とがアミド結合を介して結合しているものである請求項１８に記載のビーズ。
【請求項２０】
式（Ａ１）で表される化合物または式（Ａ２）で表される化合物が、システインである請求項１９に記載のビーズ。
【請求項２１】
第１層が、水溶性キトサンおよびポリオルニチンからなる群から選ばれる少なくとも一つから形成されている請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項２２】
第２層が、ポリガラクツロン酸およびメルカプト基を有するポリガラクツロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つから形成されている請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項２３】
ポリガラクツロン酸およびメルカプト基を有するポリガラクツロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つが、さらに、式（ｂ）：
【化１０】
2018151186.tif 000045
［式中、Ｌｂ２は、単結合またはＣ１−６アルキレン基を示し、
Ｑｂ１は、単結合、フェニレン基、またはＣ４−８シクロアルカンジイル基を示し、
Ｌｂ３は、単結合、または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊（前記式中、＊はＱｂ１との結合位置を示し、＊＊はＱｂ２との結合位置を示し、およびｎは１〜１０の整数を示す。）を示し、
Ｑｂ２は、２価のトリアゾール環基を示し、
Ｌｂ４は、単結合、Ｃ１−６アルキレン基、またはＣ１−６アルキレン−オキシ基を示し、および
Ｑｂ３は、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい１価の５ないし６員複素環基、または置換されていてもよいＣ４−８シクロアルキル基を示す。］
で表される化合物と結合している請求項２２に記載のビーズ。
【請求項２４】
式（ｂ）で表される化合物が、式（ｂ１）：
【化１１】
2018151186.tif 000046
で表される化合物、式（ｂ２）：
【化１２】
2018151186.tif 000047
で表される化合物、および式（ｂ３）：
【化１３】
2018151186.tif 000048
で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項２３に記載のビーズ。
【請求項２５】
式（ｂ）で表される化合物が、式（ｂ１）：
【化１４】
2018151186.tif 000049
で表される化合物である請求項２３に記載のビーズ。
【請求項２６】
式（ｂ）で表される化合物が、異物反応抑制作用を有する化合物である請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項２７】
細胞または微生物を内部に包含させるために用いられる請求項１〜２６のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項２８】
細胞または微生物を内部に包含した請求項１〜２６のいずれか一項に記載のビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞または微生物を内部に包含させるために有用なポリマービーズに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポリマービーズまたはポリマーカプセル内に封入した細胞等を体内に移植することが研究されている。そのようなカプセルとして、例えば、非特許文献１には、アルギネートからなるコアをポリ−Ｌ−オルチニンで被覆し、さらにアルギネートで被覆した構造を有するアルギネート／ポリ−Ｌ−オルチニン／アルギネートカプセルが記載されている。【０００３】
非特許文献２には、ジスルフィド架橋ポリガラクツロン酸ハイドロゲルが記載されている。なお、非特許文献２には、そのハイドロゲルから形成されたフィルムは記載されているが、そのハイドロゲルから形成されたビーズまたはカプセルは記載されていない。【０００４】
非特許文献３には、異物反応抑制作用を有するアミンと結合したアルギネートのハイドロゲルが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS I FEB 2013 VOL 101B, ISSUE 2, 258-268
【非特許文献２】J Mater Sci: Mater Med (2013) 24: 1375-1382
【非特許文献３】Nature Biotechnology, Vol 34, No. 3 (2016), 345-352
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に記載のアルギネート（第２層）／ポリ−Ｌ−オルチニン（第１層）／アルギネートカプセルは、第２層のアルギネート層が生体内で分解して、第１層のポリ−Ｌ−オルチニンが露出し、その結果、炎症反応が引き起こされるという問題がある。本発明はこのような事情に着目してなされたものであって、その目的は、耐久性に優れたポリマービーズを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、メルカプト基（−ＳＨ）を有するウロン酸単位を含むポリマーから形成されるビーズは、その内部でメルカプト基の一部または全部がジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成し、低カルシウムイオン条件下でも優れた耐久性を示すことを見出した。この知見に基づく本発明は、以下の通りである。【０００８】
［１］  メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーを含むビーズであって、メルカプト基の一部または全部がジスルフィド結合を形成しているビーズ。
［２］  メルカプト基を有するウロン酸単位は、ウロン酸残基と、式（Ａ１）：【０００９】
【化１】
2018151186.tif 000002
【００１０】
［式中、Ｌａ１は、単結合またはＣ１−３アルキレン基を示し、および
Ｌａ２は、Ｃ１−４アルキレン基を示す。］
で表される化合物、または式（Ａ２）：【００１１】
【化２】
2018151186.tif 000003
【００１２】
で表される化合物の残基とがアミド結合を介して結合しているものである前記［１］に記載のビーズ。
［３］  ウロン酸が、ガラクツロン酸、マンヌロン酸およびグルロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つである前記［１］または［２］に記載のビーズ。
［４］  ウロン酸が、マンヌロン酸およびグルロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、およびメルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、メルカプト基を有するアルギン酸である前記［１］または［２］に記載のビーズ。
［５］  メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、メルカプト基を有するガラクツロン酸単位を含むポリマーである前記［１］に記載のビーズ。
［６］  メルカプト基を有するガラクツロン酸単位が、ガラクツロン酸残基とメルカプト基を有するアミノ酸残基とがアミド結合を介して結合しているものである前記［５］に記載のビーズ。
［７］  メルカプト基を有するアミノ酸が、システインである前記［６］に記載のビーズ。
［８］  ガラクツロン酸単位を含むポリマーが、ポリガラクツロン酸である前記［５］〜［７］のいずれか一つに記載のビーズ。
［９］  メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、さらに、式（Ｂ）：【００１３】
【化３】
2018151186.tif 000004
【００１４】
［式中、Ｒｂ１は、メルカプト基と結合し得る官能基を示し、
Ｌｂ１およびＬｂ２は、それぞれ独立に、単結合またはＣ１−６アルキレン基を示し、
Ｑｂ１は、単結合、フェニレン基、またはＣ４−８シクロアルカンジイル基を示し、
Ｌｂ３は、単結合、または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊（前記式中、＊はＱｂ１との結合位置を示し、＊＊はＱｂ２との結合位置を示し、およびｎは１〜１０の整数を示す。）を示し、
Ｑｂ２は、２価のトリアゾール環基を示し、
Ｌｂ４は、単結合、Ｃ１−６アルキレン基、またはＣ１−６アルキレン−オキシ基を示し、および
Ｑｂ３は、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい１価の５ないし６員複素環基、または置換されていてもよいＣ４−８シクロアルキル基を示す。］
で表される化合物と結合している前記［１］〜［８］のいずれか一つに記載のビーズ。
［１０］  式（Ｂ）で表される化合物が、式（Ｂ１）：【００１５】
【化４】
2018151186.tif 000005
【００１６】
で表される化合物、式（Ｂ２）：【００１７】
【化５】
2018151186.tif 000006
【００１８】
で表される化合物、および式（Ｂ３）：【００１９】
【化６】
2018151186.tif 000007
【００２０】
で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つである前記［９］に記載のビーズ。
［１１］  式（Ｂ）で表される化合物が、式（Ｂ１）：【００２１】
【化７】
2018151186.tif 000008
【００２２】
で表される化合物である前記［９］に記載のビーズ。
［１２］  式（Ｂ）で表される化合物が、異物反応抑制作用を有する化合物である前記［９］〜［１１］のいずれか一つに記載のビーズ。
［１３］  メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーの全構成単位中のメルカプト基を有するウロン酸単位の割合が、０．１〜５０モル％である前記［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のビーズ。
［１４］  全メルカプト基中のジスルフィド結合を形成しているメルカプト基の割合が、１０〜１００モル％である前記［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のビーズ。
［１５］  メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーの数平均分子量が、２５，０００〜５００，０００である前記［１］〜［１４］のいずれか一つに記載のビーズ。
［１６］  ポリマーが、２価の金属イオンを含む前記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載のビーズ。
［１７］  ２価の金属イオンが、カルシウムイオン、バリウムイオンおよびストロンチウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも一つである前記［１６］に記載のビーズ。
［１８］  外層として第１層および第２層をさらに有し、第１層がビーズの上に形成され、第２層が第１層の上に形成されている前記［１］〜［１７］のいずれか一つに記載のビーズ。
［１９］  ウロン酸が、マンヌロン酸およびグルロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、メルカプト基を有するアルギン酸であり、および
メルカプト基を有するウロン酸単位が、ウロン酸残基と、式（Ａ１）：【００２３】
【化８】
2018151186.tif 000009
【００２４】
［式中、Ｌａ１は、単結合またはＣ１−３アルキレン基を示し、および
Ｌａ２は、Ｃ１−４アルキレン基を示す。］
で表される化合物、または式（Ａ２）：【００２５】
【化９】
2018151186.tif 000010
【００２６】
で表される化合物の残基とがアミド結合を介して結合しているものである前記［１８］に記載のビーズ。
［２０］  式（Ａ１）で表される化合物または式（Ａ２）で表される化合物が、システインである前記［１９］に記載のビーズ。
［２１］  第１層が、水溶性キトサンおよびポリオルニチンからなる群から選ばれる少なくとも一つから形成されている前記［１８］〜［２０］のいずれか一つに記載のビーズ。
［２２］  第２層が、ポリガラクツロン酸およびメルカプト基を有するポリガラクツロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つから形成されている前記［１８］〜［２１］のいずれか一つに記載のビーズ。
［２３］  ポリガラクツロン酸およびメルカプト基を有するポリガラクツロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つが、さらに、式（ｂ）：【００２７】
【化１０】
2018151186.tif 000011
【００２８】
［式中、Ｌｂ２は、単結合またはＣ１−６アルキレン基を示し、
Ｑｂ１は、単結合、フェニレン基、またはＣ４−８シクロアルカンジイル基を示し、
Ｌｂ３は、単結合、または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊（前記式中、＊はＱｂ１との結合位置を示し、＊＊はＱｂ２との結合位置を示し、およびｎは１〜１０の整数を示す。）を示し、
Ｑｂ２は、２価のトリアゾール環基を示し、
Ｌｂ４は、単結合、Ｃ１−６アルキレン基、またはＣ１−６アルキレン−オキシ基を示し、および
Ｑｂ３は、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい１価の５ないし６員複素環基、または置換されていてもよいＣ４−８シクロアルキル基を示す。］
で表される化合物と結合している前記［２２］に記載のビーズ。
［２４］  式（ｂ）で表される化合物が、式（ｂ１）：【００２９】
【化１１】
2018151186.tif 000012
【００３０】
で表される化合物、式（ｂ２）：【００３１】
【化１２】
2018151186.tif 000013
【００３２】
で表される化合物、および式（ｂ３）：【００３３】
【化１３】
2018151186.tif 000014
【００３４】
で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つである前記［２３］に記載のビーズ。
［２５］  式（ｂ）で表される化合物が、式（ｂ１）：【００３５】
【化１４】
2018151186.tif 000015
【００３６】
で表される化合物である前記［２３］に記載のビーズ。
［２６］  式（ｂ）で表される化合物が、異物反応抑制作用を有する化合物である前記［２３］〜［２５］のいずれか一つに記載のビーズ。
［２７］  細胞または微生物を内部に包含させるために用いられる前記［１］〜［２６］のいずれか一つに記載のビーズ。
［２８］  細胞または微生物を内部に包含した前記［１］〜［２６］のいずれか一つに記載のビーズ。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、耐久性に優れたポリマービーズを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマー（以下「メルカプト基含有ウロン酸系ポリマー」と記載することがある）を含むビーズであって、メルカプト基の一部または全部がジスルフィド結合を形成しているビーズを提供する。本発明のビーズは、細胞または微生物をその内部に包含させるために用いられることが好ましい。そのため本発明は、細胞または微生物を内部に包含したビーズも提供する。
【００３９】
「ウロン酸」とは、単糖のヒドロキシメチル基（−ＣＨ２ＯＨ）が酸化されてカルボキシ基に変換されて得られるカルボン酸を意味し、例えば、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルロン酸、アラビノン酸、フルクツロン酸、タガツロン酸、グルクロン酸、イズロン酸等が挙げられる。ウロン酸は、１種のみでもよく、２種以上でもよい。ウロン酸としては、ガラクツロン酸、マンヌロン酸およびグルロン酸が好ましく、ガラクツロン酸がより好ましい。
【００４０】
本発明において「ビーズ」とは、内部充填型の球を意味する。なお、細胞または微生物を内部に包含させるために用いられるビーズは、当該分野では「カプセル」と呼ばれることもある。
【００４１】
本発明のビーズ中に封入し得る細胞としては、例えば、移植用細胞、培養用細胞が挙げられる。移植用細胞としては、例えば、哺乳類由来細胞が挙げられる。哺乳類由来細胞としては、例えば、ヒト由来細胞、ブタ由来細胞が挙げられる。ヒト由来細胞およびブタ由来細胞としては、例えば、それらのホルモン分泌細胞が挙げられる。ホルモン分泌細胞としては、例えば、膵臓細胞、脳下垂体細胞が挙げられる。培養用細胞としては、例えば、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell）、ＥＳ細胞（embryonic stem cell）、ＭＳＣ細胞（mesenchymal stem cell）などの幹細胞が挙げられる。本発明のビーズ中に封入し得る微生物としては、好気性菌および嫌気性菌のいずれでもよい。
【００４２】
本発明のビーズは、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーとは異なる他のポリマーを含んでいてもよい。他のポリマーとしては、例えば、メルカプト基を含有しないアルギン酸またはその塩（即ち、アルギネート）、キトサン、ヒアルロン酸、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、グルコマンナン等が挙げられる。他のポリマーは、１種のみでもよく、２種以上でもよい。他のポリマーとしては、メルカプト基を含有しないアルギン酸またはその塩が好ましく、メルカプト基を含有しないアルギネートがより好ましい。本発明のビーズが他のポリマーを含む場合、その量は、ビーズ中に含まれる全ポリマーあたり、好ましくは１〜８０重量％、より好ましくは１０〜７０重量％、さらに好ましくは２０〜６０重量％である。本発明のビーズは、ビーズを構成するポリマーとして、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーのみを含むことが特に好ましい。即ち、ビーズを構成するポリマーが、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーからなることが特に好ましい。
【００４３】
ウロン酸単位を含むポリマー（即ち、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの主鎖を構成するポリマー）は、１種のみでもよく、２種以上でもよい。ウロン酸単位を含むポリマーは、好ましくはガラクツロン酸単位、マンヌロン酸単位およびグルロン酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むポリマーであり、より好ましくはガラクツロン酸単位を含むポリマー、並びにマンヌロン酸単位およびグルロン酸単位を含むポリマーからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、さらに好ましくはガラクツロン酸単位を含むポリマーである。
【００４４】
ガラクツロン酸単位を含むポリマーとしては、例えば、ポリガラクツロン酸、ペクチン（即ち、ポリガラクツロン酸のカルボキシ基の一部がメチルエステル化したポリマー）等が挙げられる。好ましいメルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーとしては、メルカプト基を有するガラクツロン酸単位を含むポリマーが挙げられる。前記ポリマーは、１種のみでもよく、２種以上でもよい。前記ポリマーは、より好ましくはメルカプト基を有するポリガラクツロン酸である。
【００４５】
好ましいマンヌロン酸単位およびグルロン酸単位を含むポリマーとしては、アルギン酸が挙げられる。即ち、好ましいメルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーとしては、メルカプト基を有するアルギン酸が挙げられる。
【００４６】
メルカプト基を有するウロン酸単位は、好ましくは、ウロン酸残基と、式（Ａ１）：
【００４７】
【化１５】
2018151186.tif 000016
【００４８】
［式中、Ｌａ１は、単結合またはＣ１−３アルキレン基を示し、および
Ｌａ２は、Ｃ１−４アルキレン基を示す。］
で表される化合物、または式（Ａ２）：
【００４９】
【化１６】
2018151186.tif 000017
【００５０】
で表される化合物の残基とがアミド結合（ペプチド結合）を介して結合しているものである。なお、以下では「式（Ａ１）で表される化合物」を「化合物（Ａ１）」と略称することがある。他の式で表される化合物も同様に略称することがある。また、化合物（Ａ１）および化合物（Ａ２）を、まとめて「化合物（Ａ）」と記載することがある。
【００５１】
メルカプト基を有するウロン酸単位は、１種のみでもよく、２種以上でもよい。従って、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーは、メルカプト基を有するウロン酸単位として、ウロン酸残基と化合物（Ａ１）の残基とから構成される単位のみを有していてもよく、ウロン酸残基と化合物（Ａ２）の残基とから構成される単位のみを有していてもよく、ウロン酸残基と化合物（Ａ１）の残基とから構成される単位およびウロン酸残基と化合物（Ａ２）の残基とから構成される単位の両方を有していてもよい。また、化合物（Ａ１）は、１種のみでもよく、２種以上でもよい。
【００５２】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーのカルボキシ基は、該ポリマーの水溶性および得られるビーズの強度の維持に寄与する。そのため、上記のようなメルカプト基およびカルボキシ基の両方を有する化合物（Ａ）を用いて、カルボキシ基の量を減らさずに、ウロン酸単位を含むポリマーにメルカプト基を導入することが好ましい。
【００５３】
前記アミド結合は、ウロン酸単位中のカルボキシ基と、化合物（Ａ）のアミノ基とから形成されていることが好ましい。即ち、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーは、好ましくは、化合物（Ａ）のアミノ基とウロン酸単位を含むポリマーのカルボキシ基とが直接結合することによって形成されるポリマーである。化合物（Ａ）が直接結合しているメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーは、化合物（Ａ）がポリエチレングリコール鎖などのリンカーを介して結合しているメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーに比べて立体障害が少ないため、ポリマーのゲル化を阻害せず、より強固なビーズを作製できる。
【００５４】
本明細書中、「Ｃｘ−ｙ」とは、炭素原子数がｘ以上ｙ以下（ｘ、ｙ：整数）であることを意味する。
【００５５】
本明細書中、アルキレン基は、直鎖状でもよく、分岐鎖状でもよい。アルキレン基は、好ましくは直鎖状である。本明細書中、「Ｃ１−６アルキレン基」としては、例えば、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＨ（Ｃ３Ｈ７）−、−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）−、−（ＣＨ（ＣＨ３））２−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−が挙げられる。本明細書中、「Ｃ１−２アルキレン基」、「Ｃ１−３アルキレン基」および「Ｃ１−４アルキレン基」のそれぞれの例としては、上述のものの中で、炭素数が１〜２、炭素数が１〜３または炭素数が１〜４であるアルキレン基が挙げられる。
【００５６】
Ｌａ１は、好ましくは単結合またはＣ１−２アルキレン基であり、より好ましくは単結合または−ＣＨ２−であり、さらに好ましくは単結合である。
Ｌａ２は、好ましくはＣ１−３アルキレン基であり、より好ましくはＣ１−２アルキレン基であり、さらに好ましくは−ＣＨ２−である。
【００５７】
化合物（Ａ１）（即ち、メルカプト基を有するアミノ酸）の具体例としては、以下のものが挙げられる。
【００５８】
【化１７】
2018151186.tif 000018
【００５９】
化合物（Ａ１）は、例えば関東化学社、FCH Group等から入手できる。また、化合物（Ａ２）は、FCH Group等から入手できる。化合物（Ａ１）および化合物（Ａ２）の中では、化合物（Ａ１）が好ましく、システインおよびホモシステインがより好ましく、システインがさらに好ましい。
【００６０】
ウロン酸単位を含むポリマーが有するカルボキシ基と、化合物（Ａ）が有するアミノ基との縮合は、当業者にとって周知の条件で行うことができる。また、前記ポリマーは、例えば、非特許文献２に記載されている方法に準じて製造することができる。
【００６１】
上述のカルボキシ基とアミノ基との縮合には、縮合剤を使用することが好ましい。縮合剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）等が挙げられる。ＥＤＣ・ＨＣｌを使用する場合、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムを併用することが好ましい。
【００６２】
上述の縮合後、反応混合物を透析等の公知の手段によって精製して、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーを得ることが好ましい。
【００６３】
メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーは、好ましくはメルカプト基を有するガラクツロン酸単位を含むポリマーであり、より好ましくはメルカプト基を有するポリガラクツロン酸である。これらの態様において、メルカプト基を有するガラクツロン酸単位は、好ましくは、ガラクツロン酸残基とメルカプト基を有するアミノ酸残基とがアミド結合（ペプチド結合）を介して結合していることがさらに好ましい。
【００６４】
前記アミド結合は、ガラクツロン酸単位中のカルボキシ基と、メルカプト基を有するアミノ酸のアミノ基とから形成されていることがさらに好ましい。即ち、メルカプト基を有するガラクツロン酸単位を含むポリマーは、さらに好ましくは、メルカプト基を有するアミノ酸のアミノ基とガラクツロン酸単位を含むポリマーのカルボキシ基とが直接結合することによって形成されるポリマーである。
【００６５】
ガラクツロン酸単位を含むポリマーが有するカルボキシ基とアミノ酸が有するアミノ基との縮合は、当業者にとって周知の条件で行うことができる。また、前記ポリマーは、例えば、非特許文献２に記載されている方法に準じて製造することができる。
【００６６】
メルカプト基を有するアミノ酸の具体例としては、上述した化合物（Ａ１）の具体例が挙げられる。メルカプト基を有するアミノ酸は、１種のみでもよく、２種以上でもよい。メルカプト基を有するアミノ酸は、好ましくはシステインおよびホモシステインからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくはシステインである。
【００６７】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーは、さらに、式（Ｂ）：
【００６８】
【化１８】
2018151186.tif 000019
【００６９】
［式中、Ｒｂ１は、メルカプト基と結合し得る官能基を示し、
Ｌｂ１およびＬｂ２は、それぞれ独立に、単結合またはＣ１−６アルキレン基を示し、
Ｑｂ１は、単結合、フェニレン基、またはＣ４−８シクロアルカンジイル基を示し、
Ｌｂ３は、単結合、または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊（前記式中、＊はＱｂ１との結合位置を示し、＊＊はＱｂ２との結合位置を示し、およびｎは１〜１００の整数を示す。）を示し、
Ｑｂ２は、２価のトリアゾール環基を示し、
Ｌｂ４は、単結合、Ｃ１−６アルキレン基、またはＣ１−６アルキレン−オキシ基を示し、および
Ｑｂ３は、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい１価の５ないし６員複素環基、または置換されていてもよいＣ４−８シクロアルキル基を示す。］
で表される化合物と結合していることが好ましい。
【００７０】
本明細書中、「メルカプト基と結合し得る官能基」としては、例えば、１−マレイミジル基、クロロメチルカルボニル基、ブロモメチルカルボニル基、ビニルスルホニル基、（メタ）アクリロイル基、ジスルフィド結合、またはこれらの基のいずれかを含む有機基が挙げられる。メルカプト基と結合し得る官能基の具体例としては、以下のものが挙げられる（下記式中、＊は結合位置を示す）。
【００７１】
【化１９】
2018151186.tif 000020
【００７２】
本明細書中、「Ｃ４−８シクロアルキル基」としては、例えば、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基が挙げられる。
【００７３】
本明細書中、「Ｃ４−８シクロアルカンジイル基」としては、例えば、シクロブタン−１，３−ジイル基、シクロペンタン−１，３−ジイル基、シクロヘキサン−１，４−ジイル基、シクロヘプタン−１，４−ジイル基、シクロオクタン−１，５−ジイル基が挙げられる。
【００７４】
本明細書中、「１価の５ないし６員複素環基」としては、例えば、以下の複素環から１個の水素結合が除かれることによって形成される１価の基が挙げられる。
【００７５】
【化２０】
2018151186.tif 000021
【００７６】
本明細書中、「２価のトリアゾール環基」とは、トリアゾール環から２個の水素結合が除かれることによって形成される２価の基を意味する。
【００７７】
本明細書中、フェニル基が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、アミノ基が挙げられる。
本明細書中、１価の５ないし６員複素環基が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、オキソ基が挙げられる。
本明細書中、Ｃ４−８シクロアルキル基が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、オキソ基が挙げられる。
【００７８】
Ｒｂ１は、好ましくは１−マレイミジル基である。
Ｌｂ１は、好ましくは−（ＣＨ２）２−である。
【００７９】
Ｌｂ２は、好ましくは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり、より好ましくは−（ＣＨ２）２−である。
Ｑｂ１は、好ましくは単結合または１，４−フェニレン基であり、より好ましくは単結合である。
【００８０】
Ｌｂ３の＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊におけるｎは、好ましくは１〜６の整数、より好ましくは３である。Ｌｂ３は、好ましくは単結合または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊（前記式中、ｎは１〜６の整数を示す。）であり、より好ましくは単結合または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−＊＊であり、さらに好ましくは＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−＊＊である。
Ｑｂ２は、好ましくは１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１，４−ジイル基である。
【００８１】
Ｌｂ４は、好ましくは単結合、−ＣＨ２−または−ＣＨ２−Ｏ−であり、より好ましくは単結合または−ＣＨ２−であり、さらに好ましくは−ＣＨ２−である。
Ｑｂ３は、好ましくは１，１−ジオキソチオモルホリン−４−イル基、４−アミノフェニル基またはテトラヒドロピラン−２−イル基であり、より好ましくは１，１−ジオキソチオモルホリン−４−イル基または４−アミノフェニル基であり、さらに好ましくは１，１−ジオキソチオモルホリン−４−イル基である。
【００８２】
化合物（Ｂ）は、好ましくは、下記式で表される化合物（Ｂ１）、化合物（Ｂ２）および化合物（Ｂ３）からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくは化合物（Ｂ１）である。
【００８３】
【化２１】
2018151186.tif 000022
【００８４】
化合物（Ｂ１）は、式（Ｂ）中のＲｂ１が１−マレイミジル基であり、Ｌｂ１が−（ＣＨ２）２−であり、Ｌｂ２が−（ＣＨ２）２−であり、Ｑｂ１が単結合であり、Ｌｂ３が＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−＊＊であり、Ｑｂ２が１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１，４−ジイル基であり、Ｌｂ４が−ＣＨ２−であり、およびＱｂ３が１，１−ジオキソチオモルホリン−４−イル基である化合物である。
【００８５】
化合物（Ｂ２）は、式（Ｂ）中のＲｂ１が１−マレイミジル基であり、Ｌｂ１が−（ＣＨ２）２−であり、Ｌｂ２が−（ＣＨ２）２−であり、Ｑｂ１が単結合であり、Ｌｂ３が＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−＊＊であり、Ｑｂ２が１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１，４−ジイル基であり、Ｌｂ４が単結合であり、およびＱｂ３が４−アミノフェニル基である化合物である。
【００８６】
化合物（Ｂ３）は、式（Ｂ）中のＲｂ１が１−マレイミジル基であり、Ｌｂ１が−（ＣＨ２）２−であり、Ｌｂ２が−ＣＨ２−であり、Ｑｂ１が１，４−フェニレン基であり、Ｌｂ３が単結合であり、Ｑｂ２が１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１，４−ジイル基であり、Ｌｂ４が−ＣＨ２−Ｏ−であり、およびＱｂ３がテトラヒドロピラン−２−イル基である化合物である。
【００８７】
化合物（Ｂ）は、好ましくは異物反応抑制作用を有する化合物である。ここで「異物反応抑制作用」とは、ビーズ表面への炎症性細胞の接着を抑制する作用、およびビーズ表面に接着した炎症性細胞が死滅した後に線維層の形成を抑制する作用を意味する。異物反応抑制作用を有する化合物としては、例えば、上述の化合物（Ｂ１）〜化合物（Ｂ３）が挙げられる。
【００８８】
化合物（Ｂ１）は、後述の製造例７および８に記載するようにして製造することができる。化合物（Ｂ２）および化合物（Ｂ３）は、非特許文献３（特にその実験項）に従い、対応する異物反応抑制作用を有するアミンを調製すること以外は化合物（Ｂ１）と同様にして製造することができる。また、化合物（Ｂ）は、例えば、以下のような反応によって製造することができる（下記式中、Ｘは、脱離基（例えば、ハロゲン原子、置換または未置換のフェニルオキシ基、マレイミジルオキシ基等）を示し、他の記号は上記の通りである）。
【００８９】
【化２２】
2018151186.tif 000023
【００９０】
水または有機溶媒中におけるアジド基（−Ｎ３）を有する化合物（１）と、エチニル基（−Ｃ≡ＣＨ）を有する化合物（２）とのＣｌｉｃｋ反応によって、化合物（３）を簡便に合成できる。化合物（３）は、シリカゲルクロマトグラフィー等によって精製することができる。次いで、化合物（３）と、脱離基Ｘを有する化合物（４）とを反応させることによって、化合物（Ｂ）を合成することができる。化合物（Ｂ）は、シリカゲルクロマトグラフィー等によって精製することができる。
【００９１】
Ｒｂ１が１−マレイミジル基または１−マレイミジル基を含む有機基である化合物（Ｂ）は、メルカプト基との反応性が高いため、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーのビーズおよび水等を含む混合物に、前記化合物（Ｂ）の溶液を添加した後、得られた混合物を静置するだけで、前記化合物（Ｂ）をビーズに結合させることができる。前記溶液のための溶媒としては、例えば、水、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル等が挙げられる。前記化合物（Ｂ）の溶液濃度は、例えば１μｍＭ〜１００ｍＭである。前記化合物（Ｂ）の溶液添加後の混合物の静置時間は、例えば１０分〜５時間であり、その温度は、例えば１０〜１００℃である。
【００９２】
Ｒｂ１が１−マレイミジル基または１−マレイミジル基を含む有機基以外の基である化合物（Ｂ）とメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーとの反応は、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマービーズおよび水等を含む混合物に、化合物（Ｂ）の溶液を加えることで実施できる。前記溶液のための溶媒としては、例えば、水、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル等が挙げられる。必要に応じて、反応系に水酸化ナトリウムの希薄溶液を添加して、そのｐＨを６〜７に調整してもよい。反応時間は、１０分〜５時間であり、その温度は１０〜１００℃である。
【００９３】
本発明のビーズにおいて、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの全構成単位中のメルカプト基を有するウロン酸単位の割合は、好ましくは０．１〜５０モル％、より好ましくは０．１〜３０モル％、さらに好ましくは１〜１０モル％である。この割合は、核磁気共鳴装置でサンプルを測定した際に得られる、メルカプト基（−ＳＨ）が結合した炭素原子上のプロトンのピークの面積と、ウロン酸の炭素骨格上のプロトンのピークの面積との比によって算出することができる。
【００９４】
本発明のビーズ中で、自然酸化によってメルカプト基（−ＳＨ）からジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）が形成される。このジスルフィド結合のために、本発明のビーズは優れた耐久性を示す。本発明のビーズにおいて、全メルカプト基中のジスルフィド結合を形成しているメルカプト基の割合は、好ましくは１０〜１００モル％、より好ましくは５０〜１００モル％、さらに好ましくは７０〜１００モル％である。この割合は、ジスルフィド結合が０であると考えられるビーズ製造直後におけるメルカプト基の量と、ジスルフィド結合が形成したと考えられるビーズ製造から所定時間が経過した後のメルカプト基の量とを、Ｅｌｌｅｍａｎ法によって測定し、これらを比較することによって算出することができる。
【００９５】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーは、メルカプト基に加えて、カルボキシ基を有することが好ましい。このカルボキシ基は、遊離酸（−ＣＯＯＨ）の形態でもよく、アニオン（−ＣＯＯ−）の形態でもよい。メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーのカルボキシ基の量は、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの全構成単位１００モルに対して、好ましくは８０〜１００モル、より好ましくは９０〜１００モル、さらに好ましくは９５〜１００モルである。この量は、核磁気共鳴装置でサンプルを測定した際に得られるメルカプト基（−ＳＨ）が結合した炭素原子上のプロトンのピークの面積と、ウロン酸の炭素骨格上のプロトンのピークの面積との比によって測定することができる。
【００９６】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの数平均分子量は、好ましくは２５，０００〜５００，０００、より好ましくは２５，０００〜３００，０００、さらに好ましくは２５，０００〜１００，０００である。なお、ジスルフィド結合を形成し、架橋しているポリマーの数平均分子量は測定することができない。そのため、この数平均分子量は、ジスルフィド結合を形成していないポリマーの値である。この数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
【００９７】
本発明のビーズは、２価の金属イオンを含む水溶液中にメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーを添加することによって製造することができる。このようにして製造された本発明のビーズは、２価の金属イオンを含む。
【００９８】
２価の金属イオンとしては、例えばアルカリ土類金属イオン等が挙げられる。これらの中で、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンが好ましく、カルシウムイオンがより好ましい。２価の金属イオンは、１種のみでもよく、２種以上でもよい。本発明のビーズ中の２価の金属イオンの量は、ビーズ１Ｌあたり、好ましくは１〜３００ｍｍｏｌ、より好ましくは１０〜２００ｍｍｏｌ、さらに好ましくは２０〜１００ｍｍｏｌである。この量は、原子吸光分析法によって測定することができる。
【００９９】
２価の金属イオンを含む水溶液としては、例えば、塩化カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液、塩化ストロンチウム水溶液等が挙げられる。これらの中で、塩化カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液が好ましく、塩化カルシウム水溶液がより好ましい。２価の金属イオンを含む水溶液中の２価の金属イオンの濃度は、好ましくは１０〜２００ｍＭ、より好ましくは２０〜１００ｍＭである。
【０１００】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーがカルボキシ基を有する場合、アルカリ金属水酸化物によってこのカルボキシ基をアニオンの形態に変換させて、メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの水溶液を調製することが好ましい。前記アルカリ金属水酸化物は、好ましくは水酸化ナトリウムである。
【０１０１】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの水溶液を、上述の２価の金属イオンを含む水溶液に添加することによってビーズを形成することが好ましい。添加する水溶液中のメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの濃度は、好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上、より好ましくは１ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは２ｗ／ｖ％以上であり、好ましくは３０ｗ／ｖ％以下、より好ましくは２０ｗ／ｖ％以下、さらに好ましくは１０ｗ／ｖ％以下である。
【０１０２】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーを含む水溶液の添加には、シリンジを用いることが好ましい。シリンジの針の内径は、好ましくは０．１４〜２．２７ｍｍ、より好ましくは０．１４〜０．５２ｍｍである。
【０１０３】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの水溶液を添加する際の温度（即ち、前記水溶液の温度、および２価の金属イオンを含む水溶液の温度）は、好ましくは４〜３７℃、より好ましくは１０〜３０℃である。
【０１０４】
本発明のビーズは、さらに１価の金属イオンを含んでいてもよい。１価の金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン等が挙げられる。
【０１０５】
本発明のビーズの平均粒径は、好ましくは０．０１〜２０ｍｍ、より好ましくは０．１〜５ｍｍ、さらに好ましくは０．２〜２ｍｍである。本発明において「ビーズの平均粒径」とは、別段の記載が無い限り、ランダムに選択した５個のビーズの最大径の平均値を意味する。この平均粒径は、顕微鏡およびデジタルカメラによって測定することができる。詳しくは、顕微鏡およびデジタルカメラを用いて倍率４倍でビーズの顕微鏡写真を撮影し、５個のビーズをランダムに選択し、選択した５個のビーズの写真中における最大径をデジタルカメラに付属するソフトウェアで算出することによって、ビーズの平均粒径を計算することができる。
【０１０６】
本発明のビーズは、好ましくは水を含有する。本発明のビーズ中の水分量は、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、さらに好ましくは９５重量％以上であり、好ましくは９９．５重量％以下、より好ましくは９９重量％以下、さらに好ましくは９８重量％以下、特に好ましくは９７重量％以下である。この水分量は、乾燥前後のビーズ重量の比較によって算出することができる。詳しくは、５０個のビーズをランダムに選択し、表面の水分を除去し、これらの乾燥前の重量合計を測定する。次いで、これらを１００℃の恒温乾燥機で３時間乾燥させ、これらの乾燥後の重量合計を測定する。得られた乾燥前後のビーズ重量合計を比較することによって、１個あたりのビーズの水分量を算出することができる。
【０１０７】
本発明のビーズ中のメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーの量は、好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは１重量％以上、さらに好ましくは２重量％以上であり、特に好ましくは３重量％以上であり、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５重量％以下である。
【０１０８】
細胞または微生物を内部に包含する本発明のビーズは、例えば、細胞または微生物およびメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーを含む懸濁液を、２価の金属イオンを含む水溶液中に添加することによって製造することができる。２価の金属イオンの説明（イオンの種類および濃度）は、上述の通りである。
【０１０９】
メルカプト基含有ウロン酸系ポリマーがカルボキシ基を有する場合、前記ポリマーは、アルカリ金属との塩（特にアルカリ金属水酸化物との塩）であることが好ましい。前記アルカリ金属は、好ましくはナトリウムであり、前記アルカリ金属水酸化物は、好ましくは水酸化ナトリウムである。
【０１１０】
細胞または微生物およびメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーを含む懸濁液中の前記ポリマーの濃度は、好ましくは１〜３０ｗ／ｖ％、より好ましくは２〜１０ｗ／ｖ％である。前記懸濁液が細胞を含有する場合、その細胞量は、好ましくは１．０×１０〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０２〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。この細胞量は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロミド（ＭＴＴ）を使用するＭＴＴアッセイによって測定することができる。前記懸濁液が微生物を含有する場合、その微生物量は、好ましくは１．０×１０〜１．０×１０９個／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０２〜１．０×１０７個／ｍＬである。この微生物量は、平板培養法によって測定することができる。
【０１１１】
細胞または微生物およびメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーを含む懸濁液の添加には、シリンジを用いることが好ましい。シリンジの針の内径は、好ましくは０．１４〜２．２７ｍｍ、より好ましくは０．１４〜０．５２ｍｍである。
【０１１２】
細胞または微生物およびメルカプト基含有ウロン酸系ポリマーを含む懸濁液を添加する際の温度（即ち、前記懸濁液の温度、および２価の金属イオンを含む水溶液の温度）は、好ましくは４〜３７℃、より好ましくは１０〜３７℃である。
【０１１３】
本発明の細胞または微生物包含ビーズの平均粒径は、好ましくは０．０１〜２０ｍｍ、より好ましくは０．１〜５ｍｍ、さらに好ましくは０．２〜２ｍｍである。この平均粒径は、上述したように、顕微鏡およびデジタルカメラによって測定することができる。
【０１１４】
本発明の細胞包含ビーズ中の細胞量は、好ましくは１．０×１０〜１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０２〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。この細胞量は、ＭＴＴアッセイによって測定することができる。本発明の微生物包含ビーズ中の微生物量は、好ましくは１．０×１０〜１．０×１０９個／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０２〜１．０×１０７個／ｍＬである。この微生物量は、平板培養法によって測定することができる。
【０１１５】
本発明のビーズは、少なくとも一つの外層（例えば、二つの外層）をさらに有していてもよい。このようなビーズとしては、例えば、外層として第１層および第２層をさらに有し、第１層が本発明のビーズの上に形成され、第２層が第１層の上に形成されているものが挙げられる。以下、第１層および第２層を有する本発明のビーズを、本発明のコア−シェル型ビーズと記載することがある。
【０１１６】
本発明のコア−シェル型ビーズのビーズ（コア）の説明は、特段の記載がない限り、上述したものと同じである。このビーズが含むメルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーにおいて、前記ウロン酸が、マンヌロン酸およびグルロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、メルカプト基を有するウロン酸単位を含むポリマーが、メルカプト基を有するアルギン酸であることが好ましい。
【０１１７】
前記メルカプト基を有するウロン酸単位は、好ましくは、ウロン酸残基と、化合物（Ａ１）または化合物（Ａ２）の残基とがアミド結合を介して結合しているものである。本発明のコア−シェル型ビーズにおける化合物（Ａ１）および化合物（Ａ２）の説明は、特段の記載が無い限り、上述したものと同じである。これら化合物（Ａ１）および化合物（Ａ２）の中では、化合物（Ａ１）が好ましく、システインおよびホモシステインがより好ましく、システインがさらに好ましい。
【０１１８】
本発明のコア−シェル型ビーズの第１層（シェルの一つ）の厚さは、好ましくは０．１〜２００μｍ、より好ましくは１〜１００μｍである。第１層は、好ましくは水溶性キトサンおよびポリオルニチンからなる群から選ばれる少なくとも一つ、より好ましくは水溶性キトサンまたはポリオルニチン、さらに好ましくは水溶性キトサンから形成されている。水溶性キトサンは、ポリオルニチンに比べて生体内で炎症反応を引き起こしにくいという利点を有する。
【０１１９】
水溶性キトサンの数平均分子量は、好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、より好ましくは５０，０００〜５００，０００である。この数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。ポリオルニチンの数平均分子量は、好ましくは１０，０００〜３００，０００、より好ましくは１０，０００〜１００，０００である。この数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
【０１２０】
水溶性キトサンとしては、例えば、キトサンにグリコールを結合させることによって得られるグリコールキトサン、キトサンにアルドン酸を結合させることによって得られるアルドン酸修飾キトサンが挙げられる。グリコールとしては、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール等が挙げられる。アルドン酸としては、例えば、トレオン酸、キシロン酸、グルコン酸等が挙げられる。第２層は、特に好ましくはグリコールキトサンから形成されている。
【０１２１】
ポリオルニチンを構成するオルニチンは、Ｌ体およびＤ体のいずれでもよく、好ましくはＬ体である。ポリオルニチンは、無機酸との塩の形態であってもよい。ポリオルニチン塩を形成するための酸としては、有機酸および無機酸のいずれでもよく、好ましくは無機酸である。無機酸としては、例えば、臭化水素酸、塩化水素酸等が挙げられる。これらの中で臭化水素酸が好ましい。第１層を形成するためのポリオルニチンは、好ましくは、ポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩である。
【０１２２】
水溶性キトサンは、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手することができる。また、ポリオルニチンは、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手することができる。
【０１２３】
本発明のコア−シェル型ビーズの第２層（シェルの一つ）の厚さは、好ましくは０．１〜２００μｍ、より好ましくは１〜１００μｍである。第２層は、好ましくはポリガラクツロン酸およびメルカプト基を有するポリガラクツロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つ（以下「ポリガラクツロン酸等」と記載することがある）から形成されている。ポリガラクツロン酸は、その上でマクロファージ等の免疫細胞が増殖しにくく、これを第２層（最外層）に使用することによって、生体内での異物反応を抑制することができる。
【０１２４】
第２層を形成するためのポリガラクツロン酸の数平均分子量は、好ましくは２５，０００〜５００，０００、より好ましくは２５，０００〜３００，０００、さらに好ましくは２５，０００〜１００，０００である。この数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
【０１２５】
第２層を形成するためのポリガラクツロン酸等は、好ましくは２価の金属イオンを含む。なお、ポリガラクツロン酸等は、２価の金属イオンを含まなくとも、第２層を形成することができる。２価の金属イオンとしては、例えばアルカリ土類金属イオン等が挙げられる。これらの中で、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンが好ましく、カルシウムイオンがより好ましい。２価の金属イオンは、１種のみでもよく、２種以上でもよい。ポリガラクツロン酸等中の２価の金属イオンの量は、ビーズ１Ｌあたり、好ましくは１〜３００ｍｍｏｌ、より好ましくは１〜２００ｍｍｏｌ、さらに好ましくは１〜１００ｍｍｏｌである。この量は、原子吸光分析法によって測定することができる。
【０１２６】
第２層を形成するためのメルカプト基を有するポリガラクツロン酸としては、ガラクツロン酸残基とメルカプト基を有するアミノ酸残基とがアミド結合を介して結合しているポリガラクツロン酸が好ましい。メルカプト基を有するアミノ酸の具体例としては、上述した化合物（Ａ１）の具体例が挙げられる。メルカプト基を有するアミノ酸は、１種のみでもよく、２種以上でもよい。メルカプト基を有するアミノ酸は、好ましくはシステインおよびホモシステインからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくはシステインである。
【０１２７】
第２層を形成するためのメルカプト基を有するポリガラクツロン酸の全構成単位中のメルカプト基を有するガラクツロン酸単位の割合は、好ましくは０．１〜５０モル％、より好ましくは０．１〜３０モル％、さらに好ましくは１〜１０モル％である。この割合は、核磁気共鳴装置でサンプルを測定した際に得られる、メルカプト基（−ＳＨ）が結合した炭素原子上のプロトンのピークの面積と、ガラクツロン酸の炭素骨格上のプロトンのピークの面積との比によって算出することができる。
【０１２８】
第２層を形成するためのポリガラクツロン酸およびメルカプト基を有するポリガラクツロン酸は、アルカリ金属（特にアルカリ金属水酸化物との塩）との塩であることが好ましい。前記アルカリ金属は、好ましくはナトリウムであり、前記アルカリ金属水酸化物は、好ましくは水酸化ナトリウムである。
【０１２９】
第２層を形成するために、式（ｂ）：
【０１３０】
【化２３】
2018151186.tif 000024
【０１３１】
［式中、Ｌｂ２は、単結合またはＣ１−６アルキレン基を示し、
Ｑｂ１は、単結合、フェニレン基、またはＣ４−８シクロアルカンジイル基を示し、
Ｌｂ３は、単結合、または＊−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−＊＊（前記式中、＊はＱｂ１との結合位置を示し、＊＊はＱｂ２との結合位置を示し、およびｎは１〜１０の整数を示す。）を示し、
Ｑｂ２は、２価のトリアゾール環基を示し、
Ｌｂ４は、単結合、Ｃ１−６アルキレン基、またはＣ１−６アルキレン−オキシ基を示し、および
Ｑｂ３は、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい１価の５ないし６員複素環基、または置換されていてもよいＣ４−８シクロアルキル基を示す。］
で表される化合物と結合しているポリガラクツロン酸、および化合物（ｂ）と結合しているメルカプト基を有するポリガラクツロン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つを用いてもよい。
【０１３２】
化合物（ｂ）は、Ｒｂ１−Ｌｂ１−ＣＯ−がアミノ基に結合していないことを除けば、化合物（Ｂ）と同じである。化合物（ｂ）中の基の説明は、上述した化合物（Ｂ）の基の説明と同じである。
【０１３３】
化合物（ｂ）は、好ましくは、下記式で表される化合物（ｂ１）、化合物（ｂ２）および化合物（ｂ３）からなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくは化合物（ｂ１）である。
【０１３４】
【化２４】
2018151186.tif 000025
【０１３５】
化合物（ｂ）は、好ましくは異物反応抑制作用を有する化合物である。異物反応抑制作用を有する化合物としては、例えば、上述の化合物（ｂ１）〜化合物（ｂ３）が挙げられる。化合物（ｂ）は、公知の方法（例えば、非特許文献３に記載の方法）によって製造することができる。また、化合物（ｂ）と、ポリガラクツロン酸等との結合は、化合物（ｂ）が有するアミノ基と、ポリガラクツロン酸等が有するカルボキシ基とを、当業者に周知の条件で縮合させることによって行うことができる。
【０１３６】
外層を有さない本発明のビーズおよび外層を有する本発明のビーズ（特に本発明のコア−シェル型ビーズ）は、いずれも細胞または微生物を内部に包含させるために有用である。外層を有する本発明のビーズ（特に本発明のコア−シェル型ビーズ）における細胞量およびビーズ（コア）の平均粒径等の説明は、外層を有さない本発明のビーズの説明と同じである。
【０１３７】
本発明のコア−シェル型ビーズは、例えば、以下のようにして製造することができる。まず、外層を有さない本発明のビーズを上述したように製造し、次いで得られたビーズと第１層を形成するポリマーの水溶液とを混合し、前記水溶液中でビーズを静置し、ビーズを取り出して、ビーズ上に第１層を形成し、次いで得られたビーズと第２層を形成するポリマーの水溶液とを混合し、前記水溶液中でビーズを静置し、ビーズを取り出して、第１層上に第２層を形成することによって、本発明のコア−シェル型ビーズを得ることができる。
【０１３８】
第２層を形成するポリマーとして、ポリガラクツロン酸等を使用する場合、第１層を有するビーズと、ポリガラクツロン酸等の水溶液とを混合し、前記水溶液中でビーズを静置し、ビーズを取り出した後、得られたビーズと２価の金属イオンを含む水溶液とを混合して、ポリガラクツロン酸等に２価の金属イオンを含有させることが好ましい。
【実施例】
【０１３９】
以下、製造例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の製造例等によって制限を受けるものではなく、上記・下記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。なお、以下に記載の室温とは２５℃を意味する。【０１４０】
後述の製造例等では以下の試薬を使用した。
ポリガラクツロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、数平均分子量：２５，０００〜５０，０００）
アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業社製「アルギン酸ナトリウム３００〜４００」、１ｗ／ｖ％水溶液の２５℃での粘度：３００〜４００ｃｐ）
アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業社製「１９２−−０９９９５」）
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（渡辺化学工業社製「ＷＳＣＩ・ＨＣｌ」）
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（東京化成社製）
システイン塩酸塩一水和物（関東化学社製）
塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）
エタノール（関東化学社製）
クエン酸三ナトリウム（和光純薬工業社製）
ポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、数平均分子量：３０，０００〜７０，０００）
グリコールキトサン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、数平均分子量が１０，０００〜３００，０００のキトサンに、エチレングリコールを結合させることによって得られたポリマー）【０１４１】
後述の実施例１、２および６〜９、並びに比較例１、２および５におけるビーズの製造のために、武蔵エンジニアリング社製の金属ニードル「ＳＮＡ−３０Ｇ−Ｂ」（内径：０．１４ｍｍ、以下「３０Ｇ針」と記載する）を使用した。
後述の実施例３〜５並びに比較例３および４におけるビーズの製造のために、武蔵エンジニアリング社製の金属ニードル「ＳＮＡ−２８Ｇ−Ｂ」（内径：０．１８ｍｍ、以下「２８Ｇ針」と記載する）を使用した。
後述の実施例１０におけるビーズの製造のために、テルモ社製の注射針２７Ｇ「ＮＮ２７２５Ｒ．Ｂ」（内径：０．４０ｍｍ、以下「２７Ｇ針」と記載する）を使用した。【０１４２】
製造例１：ポリガラクツロン酸ナトリウムの製造
ポリガラクツロン酸（５ｇ）をミリポア社製の純水製造装置で調製した純水（以下「純水」と記載する）（２４ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁水を撹拌しながら、室温で１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（２４ｍＬ）をゆっくりと加えた。ポリガラクツロン酸が完全に溶けるのを確認してから、得られた水溶液を凍結乾燥して、ポリガラクツロン酸ナトリウムを白色パウダー（５．６ｇ）として得た。【０１４３】
製造例２：システイン残基を有するポリガラクツロン酸の製造
非特許文献２に記載の方法を参考にして、システイン残基を有するポリガラクツロン酸（以下「システイン−ポリガラクツロン酸」と略称することがある）を製造した。具体的には、製造例１で得られたポリガラクツロン酸ナトリウム（２５０ｍｇ）を、室温で純水（１２．５ｍＬ）に溶かした。この水溶液を撹拌しながら、室温で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１２０ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（５４ｍｇ）を加えた。次いで、得られた混合物に、室温で１Ｎの塩酸（２００μＬ）を加えて、そのｐＨを５に調整し、室温でさらに混合物を撹拌した。撹拌を１時間続けた後、混合物に、室温でシステイン塩酸塩一水和物（１２５ｍｇ）を加えた、次いで１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（５２０μＬ）を加えて、そのｐＨを４に調整し、室温でさらに混合物を撹拌した。撹拌を２時間続けた後、混合物に１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（２００μＬ）を加えて、そのｐＨを６に調整し、室温でさらに混合物を撹拌した。撹拌を１時間続けた後、混合物に、室温でエタノール（５０ｍＬ）をピペットでゆっくり加えて、沈殿を析出させた。沈殿が析出した懸濁液に、１Ｎの塩酸（４００μＬ）を加えて、そのｐＨを４に調整した。【０１４４】
沈殿を含む懸濁液を、遠心チューブ２本に分注し、遠心分離して（２５００ｒｐｍ、３分）、完全に沈殿を析出させた。ピペットを用いて、遠心チューブ内の上澄み液を捨て、遠心チューブ内に新たに水（１０ｍＬ）を加えて、室温で沈殿を溶かした。得られた水溶液に室温でエタノール（２０ｍＬ）を加えて、沈殿を析出させた。沈殿を含む懸濁液を、遠心分離して（２５００ｒｐｍ、３分）、完全に沈殿を析出させた。この遠心分離の操作を合計で３回行った。【０１４５】
２本の遠心チューブ内の沈殿を水で溶かして、得られた水溶液を透析チューブ（Biotech CE Tubing MWCO: 8-10kD）に充填し、以下の透析液を用いて、室温で透析を行った。１回目の透析は、０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液を用いて９時間行った。２回目の透析は、０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液を用いて１６時間行った。３回目の透析は、１ｍＭの塩酸を用いて６時間行った。これらの透析後に、透析チューブ内の水溶液を凍結乾燥して、システイン−ポリガラクツロン酸を白色パウダー（９５ｍｇ）として得た。後述の方法で測定した１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）の結果を以下に記載する。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ２Ｏ）  δ（ｐｐｍ）：２．７５−３．０（ｍ）、３．５０−３．７５（ｍ）、３．７５−４．０（ｍ）、４．２０−４．４０（ｍ）、４．８０−５．２５（ｍ）【０１４６】
製造例３：ポリガラクツロン酸の白色パウダーの製造（コントロール合成）
製造例２における精製の効果を確認するため、縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を使用せず、縮合反応が起こらないようにしたこと以外は、製造例２と同じ原料を用いて、同じ縮合および精製操作を行い、ポリガラクツロン酸の白色パウダー（１０６ｍｇ）を得た。後述の方法で測定した１Ｈ−ＮＭＲの結果を以下に記載する。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ２Ｏ）  δ（ｐｐｍ）：３．５０−３．７５（ｍ）、３．７５−４．０（ｍ）、４．２０−４．４０（ｍ）、４．８０−５．２５（ｍ）【０１４７】
製造例４：システイン残基を有するアルギン酸の製造
ポリガラクツロン酸ナトリウムの代わりに、アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業社製「アルギン酸ナトリウム３００〜４００」）を使用したこと以外は製造例２と同様にして、システイン残基を有するアルギン酸（以下「システイン−アルギン酸」と略称することがある）を白色パウダー（１００ｍｇ）として得た。後述の方法で測定した１Ｈ−ＮＭＲの結果を以下に記載する。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ２Ｏ）  δ（ｐｐｍ）：２．７５−２．９０（ｍ）、３．２５−４．３０（ｍ）、４．３０−５．８０（ｍ）【０１４８】
製造例５：アルギン酸の白色パウダーの製造（コントロール合成）
製造例４における精製の効果を確認するため、縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を使用せず、縮合反応が起こらないようにしたこと以外は、製造例４と同じ原料を用いて、同じ縮合および精製操作を行い、アルギン酸の白色パウダー（７６ｍｇ）を得た。後述の方法で測定した１Ｈ−ＮＭＲの結果を以下に記載する。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ２Ｏ）  δ（ｐｐｍ）：３．２５−４．３０（ｍ）、４．３０−５．８０（ｍ）【０１４９】
製造例６：システイン残基を有するアルギン酸の製造
アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業社製「１９２−−０９９９５」）（５００ｍｇ）を、室温で純水（２５ｍＬ）に溶かした。この水溶液を撹拌しながら、室温で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２４０ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（１０８ｍｇ）を加えた。次いで、得られた混合物に、室温で１Ｎの塩酸（４００μＬ）を加えて、そのｐＨを５に調整し、室温でさらに混合物を撹拌した。撹拌を１時間続けた後、混合物に、室温でシステイン塩酸塩一水和物（１０００ｍｇ）を加えた、次いで１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（４．５ｍＬ）を加えて、そのｐＨを４に調整し、室温でさらに混合物を撹拌した。撹拌を２時間続けた後、混合物に１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１２００μＬ）を加えて、そのｐＨを６に調整し、室温でさらに混合物を撹拌した。撹拌を１時間続けた後、混合物に１Ｎの塩酸（６００μＬ）を加えて、そのｐＨを４に調整した。混合物に、室温でエタノール（１００ｍＬ）をピペットでゆっくり加えて、沈殿を析出させた。【０１５０】
沈殿を含む懸濁液を、遠心チューブ４本に分注し、遠心分離して（２５００ｒｐｍ、３分）、完全に沈殿を析出させた。遠心チューブ内の上澄み液を捨て、遠心チューブ内に新たに水（１０ｍＬ）を加えて、よく降って沈殿を溶かした。得られた水溶液に室温でエタノール（２０ｍＬ）を加えて、沈殿を析出させた。沈殿を含む懸濁液を、遠心分離して（２５００ｒｐｍ、３分）、完全に沈殿を析出させた。この遠心分離の操作を合計で３回行った。【０１５１】
４本の遠心チューブ内の沈殿を水で溶かして、得られた水溶液を透析チューブ（Biotech CE Tubing MWCO: 8-10kD）、２本に充填し、以下の透析液を用いて、室温で透析を行った。１回目の透析は、０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液と１ｍＭ塩酸を用いて８時間行った。２回目の透析は、０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液と１ｍＭ塩酸を用いて１７時間行った。３回目の透析は、１ｍＭの塩酸を用いて６時間行った。これらの透析後に、透析チューブ内の水溶液を凍結乾燥して、システイン−アルギン酸を白色パウダー（３０４ｍｇ）として得た。後述の方法で測定した１Ｈ−ＮＭＲの結果を以下に記載する。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ２Ｏ）  δ（ｐｐｍ）：２．７５−２．９０（ｍ）、３．２５−４．３０（ｍ）、４．３０−５．８０（ｍ）【０１５２】
製造例７：化合物（ｂ１）の製造【０１５３】
【化２５】
2018151186.tif 000026
【０１５４】
化合物（ｂ１）（即ち、２−［２−［２−［２−［４−［（１，１−ジオキソ−１，４−チアジナン−４−イル）メチル］トリアゾール−１−イル］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エタンアミン）は、非特許文献３（Nature Biotechnology, Vol 34, No. 3 (2016), 345-352）の実験項に記載のとおりに製造した。【０１５５】
製造例８：化合物（Ｂ１）の製造【０１５６】
【化２６】
2018151186.tif 000027
【０１５７】
化合物（ｂ１）（０．９６５ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６３７ｍＬ、３．７０ｍｍｏｌ）および化合物（ｂ２）（即ち、３−マレイミドプロピオン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド  エステル）（０．６５５ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）を加えて、室温で一晩撹拌した。反応混合物に０．１Ｎ塩酸（２０ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。溶媒を留去することにより得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー（水−アセトニトリル、それぞれ０．１体積％トリフルオロ酢酸を含有）にて精製して、化合物（Ｂ１）（即ち、２−［３−［２−［２−［２−［２−［４−［（１，１−ジオキソ−１，４−チアジナン−４−イル）メチル］トリアゾール−１−イル］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］ブタ−３−エニル］シクロペンタ−４−エン−１，３−ジオン）（０．３９８ｇ、０．７３３ｍｍｏｌ、収率３０％）を得た。後述の方法で測定したＭＳ（マススペクトル）および１Ｈ−ＮＭＲの結果を以下に記載する。
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ５４３（Ｍ＋Ｈ）＋
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．００（ｓ, １Ｈ）、７．００（ｓ, １Ｈ）、４．５１（ｔ, Ｊ＝５．３Ｈｚ, １Ｈ）、３．８２（ｔ, Ｊ＝５．３Ｈｚ, １Ｈ）、３．７７（ｓ, １Ｈ）、３．６０（ｄｄ, Ｊ＝７．９, ６．６Ｈｚ, １Ｈ）、３．５４−３．５０（ｍ, １Ｈ）、３．５０−３．４６（ｍ, ３Ｈ）、３．４１−３．３０（ｍ, ４Ｈ）、３．２０−３．０７（ｍ, ３Ｈ）、２．９６−２．８７（ｍ, ２Ｈ）、２．７２（ｓ, １Ｈ）、２．６７−２．４３（ｍ, １２Ｈ）、２．３７（ｓ, １Ｈ）、２．３３（ｍ, １Ｈ）．【０１５８】
製造例９：化合物（ｂ１）が結合したアルギン酸の製造
非特許文献３（Nature Biotechnology, Vol 34, No. 3 (2016), 345-352）の実験項に記載の条件で化合物（ｂ１）が結合したアルギン酸を製造した。前記アルギン酸を、製造例２に記載の操作によって精製した。後述の方法で測定した１Ｈ−ＮＭＲの結果を以下に記載する。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ２Ｏ）  δ（ｐｐｍ）：８．０６−７．９２（ｍ）、５．２９−４．３１（ｍ）、４．２２−３．２７（ｍ）、３．２６−３．１３（ｍ）、３．０７−２．９１（ｍ）【０１５９】
製造例１０：化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸の製造
ポリガラクツロン酸ナトリウム（２５０ｍｇ）を、室温で０．１ＭのＭＥＳバッファー（５０ｍＬ、ｐＨ：６．０）に溶かした。得られた水溶液を室温で撹拌しながら、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２４１ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（１３７ｍｇ）を加えて、さらに１時間撹拌して、溶液１を調製した。【０１６０】
次に、化合物（ｂ１）（１２５ｍｇ）を純水（１．５ｍＬ）とアセトニトリル（１．５ｍＬ）の混合溶媒に溶かして、溶液２を調製した。上述の溶液１に、溶液２を添加し、得られた混合物を室温で２０時間撹拌した。撹拌後、混合物に、室温でエタノール（８０ｍＬ）をピペットでゆっくり加えて、沈殿物を析出させて、懸濁液を得た。【０１６１】
得られた懸濁液を、遠心チューブ２本に分注し、遠心分離して（２５００ｒｐｍ、３分）、完全に沈殿物を析出させた。ピペットを用いて、遠心チューブ内の上澄み液を捨て、遠心チューブ内に新たに水（１０ｍＬ）を加えて、室温で沈殿を溶かした。得られた水溶液を透析チューブ（Biotech CE Tubing MWCO: 8-10kD）に充填し、０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液と１ｍＭ塩酸を混合した透析液を用いて、室温で透析を３回行った。各々の透析時間は４時間、１８時間および６時間であった。次に透析液として１ｍＭ塩酸を用いて、７時間の透析を行った。これらの透析後に、透析チューブ内の水溶液を凍結乾燥して、化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸を白色パウダー（２６０ｍｇ）として得た。
後述の方法で測定した１Ｈ−ＮＭＲの結果を以下に記載する。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ２Ｏ）  δ（ｐｐｍ）：８．１０−７．９０（ｍ）、５．１０−４．９０（ｍ）、４．９０−４．４０（ｍ）、４．４０−４．１０（ｍ）、４．１０−３．８０（ｍ）、３．８０−３．６５（ｍ）、３．６５−３．４５（ｍ）、３．２６−３．２０（ｍ）、３．０５−２．９０（ｍ）【０１６２】
１Ｈ−ＮＭＲ測定
製造例２〜６で得られた各白色パウダー（２０ｍｇ）、製造例８で得られた化合物（Ｂ１）（２０ｍｇ）、製造例９で得られた化合物（ｂ１）が結合したアルギン酸（２０ｍｇ）、または製造例１０で得られた化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸をＤ２Ｏ（１ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１ＮのＮａＯＤ溶液（溶媒：Ｄ２Ｏ）（４０μＬ）を加えて、白色パウダーを溶かした。得られた溶液の１Ｈ−ＮＭＲを、ブルカー社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴分析装置を使用して測定した。【０１６３】
製造例３および５で得られたポリガラクツロン酸およびアルギン酸の白色パウダーの１Ｈ−ＮＭＲでは、システインのピークは全く観測されなかった。このことから、製造例２および４で行った精製操作によって、システイン−ポリガラクツロン酸またはシステイン−アルギン酸の製造に使用した原料（遊離システイン）を、完全に除去できることが確認された。【０１６４】
製造例２で得られた白色パウダーの１Ｈ−ＮＭＲでは、システインのピークがδ  ２．７５〜３．００に観測された。製造例３（コントロール合成）の１Ｈ−ＮＭＲの結果から、精製によって遊離システインは完全に除去できていることを確認しているので、前記ピークは、ガラクツロン酸に共有結合したシステイン残基に由来する。これらの結果から、製造例２で得られた白色パウダーは、システイン残基を有するポリガラクツロン酸であることが確認された。【０１６５】
また、１Ｈ−ＮＭＲの結果から、システイン−ポリガラクツロン酸の全構成単位中のメルカプト基を有するガラクツロン酸単位の割合は、４モル％と算出された。また、この割合および原料であるポリガラクツロン酸の数平均分子量から、システイン−ポリガラクツロン酸の数平均分子量は２５，６００〜５１，３００と算出された。【０１６６】
製造例４で得られた白色パウダーの１Ｈ−ＮＭＲでは、システインのピークがδ  ２．７０〜２．９０に観測された。製造例５（コントロール合成）の１Ｈ−ＮＭＲの結果から、精製によって遊離システインは完全に除去できていることを確認しているので、前記ピークは、アルギン酸に共有結合したシステイン残基に由来する。これらの結果から、製造例４で得られた白色パウダーは、システイン残基を有するアルギン酸であることが確認された。【０１６７】
ＭＳ測定
製造例８で得られた化合物（Ｂ１）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（濃度：１００μＭ）を調製した。得られた溶液（１０μＬ）に、アセトニトリル（３３０μＬ）を加えて、希釈液を調製した。得られた希釈液およびＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ／ＳＱＤシステム（ＷＡＴＥＲＳ社製）を使用して、化合物（Ｂ１）のＭＳを測定した。【０１６８】
比較例１：アルギネートビーズの製造
アルギン酸ナトリウムを純水に溶かして、２ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。得られた２ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液を５ｍＬのシリンジに入れた。シリンジには３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でアルギン酸ナトリウム水溶液の液滴を滴下することで、アルギネートビーズを製造した。【０１６９】
比較例２：ポリガラクツロン酸塩ビーズの製造
ポリガラクツロン酸（１．０ｇ）に、室温で純水（２０ｍＬ）を加えて、懸濁液を調製した。得られた懸濁液を撹拌しながら、室温での１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（４．７ｍＬ）をゆっくり加えて、透明なポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を調製した。得られた水溶液を、５ｍＬのシリンジに入れた。シリンジには３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（２５ｍＬ）に、室温でポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液の液滴をゆっくり滴下することで、ポリガラクツロン酸塩ビーズを製造した。【０１７０】
実施例１：システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズの製造
システイン−ポリガラクツロン酸（４０ｍｇ）を、室温で純水（１ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１５０μＬ）を加えて、透明な水溶液が得られるまで室温で撹拌して、システイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を調製した。１ｍＬのシリンジに３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液の液滴をゆっくり滴下することで、システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズを製造した。【０１７１】
得られたシステイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズの平均粒径は１．６ｍｍであった。この平均粒径は後述する顕微鏡およびデジタルカメラによって測定した。詳しくは、顕微鏡およびデジタルカメラを用いて倍率４倍でビーズの顕微鏡写真を撮影し、５個のビーズをランダムに選択し、選択した５個のビーズの写真中における最大径をデジタルカメラに付属するソフトウェアで算出し、ビーズの平均粒径（５個のビーズの最大径の平均値）を計算した。【０１７２】
実施例２：システイン−アルギネートビーズの製造
システイン−アルギン酸（２０ｍｇ）を、室温で純水（１ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１５０μＬ）を加えて、透明な水溶液が得られるまで室温で撹拌して、システイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。１ｍＬのシリンジに３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の液滴をゆっくり滴下することで、システイン−アルギネートビーズを製造した。実施例１と同様にして測定したシステイン−アルギネートビーズの平均粒径は１．７ｍｍであった。【０１７３】
試験例１：Ｅｌｌｅｍａｎ法によるメルカプト基（−ＳＨ）濃度の測定
１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液を９６穴プレートに１６０μＬずつ添加した。各ウェルに４ｗ／ｖ％のシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液、または４ｗ／ｖ％のポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を２０μＬずつ添加して、各ウェルにビーズを１個製造した。室温でのビーズ製造直後（静置０時間）およびビーズ製造から静置２４時間後に、ＳＨ基測定用ＰＢＳ溶液［ダルベッコ  リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ（−））（１５ｍＬ）と純水（２５ｍＬ）、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（５０μＬ）を混合した溶液］（１６０μＬ）と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（３９．６ｍｇ）をダルベッコ  リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ（−））（１０ｍＬ）に溶解させて得られた溶液（２０μＬ）を各ウェルに添加し、暗所でさらに１時間静置した。その後、各ウェルの上清を５０μＬ回収し、純水（１５０μＬ）で希釈し、マイクロプレートリーダーＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、吸光度測定（λｍａｘ＝４１２ｎｍ）を行った。メルカプト基濃度は、各種濃度のシステインを同様の手法にて測定することで得られた検量線を用いて算出した。本試験例では、８個のウェルのメルカプト基濃度を測定し、その平均値を求めた。【０１７４】
４ｗ／ｖ％のポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液および塩化カルシウム水溶液からビーズを製造したウェルでは、静置０および２４時間後の両方で、メルカプト基は全く検出されなかった。【０１７５】
４ｗ／ｖ％のシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液および塩化カルシウム水溶液からビーズを製造したウェルでは、静置０時間では、メルカプト基濃度は０．５８μＭであった。一方、静置２４時間後では、メルカプト基濃度は０．１７μＭに低下していた。このことから、システイン−ポリガラクツロン酸では、メルカプト基（−ＳＨ）が、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）に変化して、ポリマー鎖が架橋していることが明らかになった。また、静置０時間ではジスルフィド結合は形成されていないと考えられるため、静置２４時間後のシステイン−ポリガラクツロン酸のビーズにおいて、全メルカプト基中のジスルフィド結合を形成しているメルカプト基の割合は、１００×（０．５８−０．１７）／０．５８＝７０．６モル％であると計算される。【０１７６】
試験例２：低カルシウムイオン（Ｃａ２＋）条件下での耐久性評価
アルギネートビーズ等の製造のために、しばしば、２価の金属イオン、特にＣａ２が用いられる。一方で、生体内でのＣａ２＋濃度は最大でも２ｍＭ程度である。そのため、Ｃａ２＋を含むアルギネートビーズ等を生体に移植した場合、平衡反応によって、ビーズ中のＣａ２＋濃度は２ｍＭにまで低下すると考えられる。その結果、生体内において、ビーズの強度が低下する可能性がある。そこで我々は、比較例１および２並びに実施例１および２のビーズの低Ｃａ２＋条件下での耐久性を評価した。【０１７７】
クエン酸ナトリウムには２価の金属イオンに対する結合能があるため、クエン酸ナトリウムを使用することによって、ビーズ中のＣａ２＋を除去することができる。そこで、得られたビーズを５５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液中に沈めて、ビーズの形状観察を行った。具体的には、比較例１および２並びに実施例１および２のビーズを、それぞれ５個ずつ、２４穴プレートのウェルに入れ、各ウェルに５５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を添加し、ビーズ全体がクエン酸ナトリウム水溶液に浸かるようにした。ロータリーシェーカーで、２４穴プレート３０時間まで振とうさせて、ビーズの形状を観察した。【０１７８】
ビーズの観察には、以下の顕微鏡（倍率：４倍）およびデジタルカメラを使用した。なお、デジタルカメラで撮影した顕微鏡写真中のビーズ面積（以下「ビーズ面積」と記載する）は、デジタルカメラに付属のソフトウェアで計測した。比較例１および２並びに実施例１および２で得られたビーズについて、それぞれ５個のビーズ面積を計測し、その平均値を算出した。これらの結果を表１に示す。
ＯＬＹＭＰＵＳ社製培養顕微鏡「ＣＫＸ４１」
ＯＬＹＭＰＵＳ社製顕微鏡用デジタルカメラ「ＤＰ２２」【０１７９】
【表１】
2018151186.tif 000028
【０１８０】
比較例１のアルギネートビーズは、５５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液中での振とう３０分後には溶けて完全に消失した。【０１８１】
比較例２のポリガラクツロン酸塩ビーズは、５５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液中における振とう前で、そのビーズ面積は３．５２ｍｍ２であった。振とう３０分後には、そのビーズ面積が４．３７ｍｍ２にまで増大し、振とう１８時間後では、そのビーズ面積が６．８２ｍｍ２にまで増大した。振とう２４時間後では、該ビーズはさらに膨張して変形し、そのビーズ面積を測定できなかった。【０１８２】
実施例１のシステイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズは、クエン酸ナトリウム水溶液中における振とう前で、そのビーズ面積は２．４９ｍｍ２であった。振とう３０分、３時間、１８時間、２４時間および３０時間後でも、そのビーズ面積は２．５ｍｍ２以下であり、全く増大せず、ビーズ形状にも変化は見られなかった。これらの結果から分かるように、システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズは、低Ｃａ２＋条件下で全く膨張しなかった。【０１８３】
実施例２のシステイン−アルギネートビーズは、５５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液中における振とう前で、そのビーズ面積は２．４９ｍｍ２であった。振とう３０時間後では、そのビーズ面積が５．７６ｍｍ２と増大したが、ビーズ形状を維持していた。一方、比較例１のアルギネートビーズは振とう３０分後には溶けて消失し、比較例２のポリガラクツロン酸塩ビーズは、振とう２４時間後で膨張および変形した。これらの結果から分かるように、アルギネートビーズにシステイン残基を導入することによって、その膨張を抑制することができる。【０１８４】
また、実施例１および実施例２の対比から分かるように、ウロン酸単位を含むポリマーとして、ガラクツロン酸単位を含むポリマー（特に、ポリガラクツロン酸）を使用することによって、より一層優れた耐久性を示すビーズを得ることができる。【０１８５】
実施例３：細胞を内部に包含するシステイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズの製造および細胞培養
１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清（ニチレイ社製）および１ｖ／ｖ％のペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（ナカライテスク社製）を用いて維持したＰＥＡＫＲＡＰＩＤ由来Ｇα１５−ｔａｒａｎｓ４８ＬＤ安定発現細胞（ＰＲＧ４８）を、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）で洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液［０．２５ｇ／Ｌのトリプシン−１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）の水溶液をＤ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）に２０ｖ／ｖ％になるように加えた溶液］を用いて、細胞を１５０ｍｍ  ＴＣ−処理培養皿（150mm TC-treated Culture Dish）（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）から回収した。細胞懸濁液の遠心分離（１，２００ｒｐｍ、３分）を行って、上清を除去し、遠心分離で得られた細胞にＤ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）を加え、懸濁させた。得られた懸濁液の遠心分離（１，２００ｒｐｍ、３分）を行って、上清を除去し、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩水（１１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤ−グルコース、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、細胞を懸濁させた。得られた細胞の懸濁液（２００μＬ）を、４ｗ／ｖ％のシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液（１．８ｍＬ）に室温で添加して、懸濁液を得た（ポリマー濃度：３．６ｗ／ｖ％、細胞量：１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。得られた懸濁液を、２８Ｇ針を付けた１ｍＬシリンジ（テルモ）に入れ、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液２５ｍＬに室温で滴下して、細胞を内部に包含したビーズを得た（ビーズ中の細胞量：１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。【０１８６】
得られた細胞を内部に包含したビーズの平均粒径は１．８ｍｍであった。これは、実施例１と同様にして測定した。【０１８７】
得られたビーズを、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（ナカライテスク社製）で３回洗浄した後、細胞を内部に包含したビーズをＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ナカライテスク社製）に入れ、細胞を１４日培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。【０１８８】
比較例３：細胞を内部に包含するアルギネートビーズの製造および細胞培養
４ｗ／ｖ％のシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液に替えて４ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液を使用したこと以外は実施例３と同様にして、細胞を内部に包含したビーズを得た。また、実施例３と同様にして、細胞を１４日培養した。【０１８９】
試験例３：細胞核染色法による細胞の生存割合の評価
実施例３および比較例３の１日および１４日の細胞培養を行った細胞包含ビーズ５個を、４８穴プレートの各ウェルに入れ、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）（３００μＬ）で２回洗浄した。その後、各ウェルにＤ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）（１５０μＬ）、フルオレセイン  ジアセテート（ＦＤＡ）溶液（Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）（５ｍＬ）に０．５ｍｇ／ｍＬのＦＤＡ溶液（溶媒：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））（１０μＬ）を添加して得られた溶液）（１５０μＬ）、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）（５ｍＬ）に１．０ｍｇ／ｍＬのＰＩ水溶液（１０μＬ）を添加して得られた溶液）（１５０μＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下３０分間静置した。生細胞は緑色に、死細胞は赤色に染色された。静置後、各ウェルをＤ−ＰＢＳ（−）にて洗浄し、蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７００（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で観察した。【０１９０】
実施例３で得られた細胞包含システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズ内の細胞の、培養１日後の生細胞に対する培養１４日後の生細胞の割合は９５％であった。一方、比較例４で得られた細胞包含アルギネートビーズ内の細胞の該割合は６０％であった。これらの結果から、細胞包含システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズ内の細胞は、細胞包含アルギネートビーズ内の細胞と培養１４日まで同等以上に生存することが確認できた。【０１９１】
実施例４：システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズおよび化合物（Ｂ１）が結合したシステイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズの製造
製造例２と同様にして得られたシステイン−ポリガラクツロン酸（４５ｍｇ）を、室温で純水（２．８４ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１６０μＬ）を加えて、透明な水溶液が得られるまで室温で撹拌して、１．５ｗ／ｖ％のシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を調製した。２８Ｇ針を装着した１ｍＬのシリンジを用いて、得られた１．５ｗ／ｖ％のシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を２０μＬずつ、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液２０ｍＬに添加して、システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズを製造した。【０１９２】
上述のように製造してから、ビーズおよび水等の混合物を室温で２４時間静置した後に、この混合物に１００ｍＭの化合物（Ｂ１）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を２０μＬ添加した後、得られた混合物を室温で２４時間静置して、化合物（Ｂ１）が結合したシステイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズを製造した。【０１９３】
実施例５：システイン−アルギネートビーズおよび化合物（Ｂ１）が結合したシステイン−アルギネートビーズの製造
システイン−ポリガラクツロン酸の代わりに製造例６と同様にして得られたシステイン−アルギン酸を用いて、１．５ｗ／ｖ％のシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を調製したこと以外は実施例４と同様にして、システイン−アルギネートビーズおよび化合物（Ｂ１）が結合したシステイン−アルギネートビーズを製造した。【０１９４】
試験例４：Ｅｌｌｅｍａｎ法によるメルカプト基（−ＳＨ）濃度の測定
室温で、ビーズ製造直後（静置０時間）およびビーズ製造から２４時間後（静置２４時間）、並びに化合物（Ｂ１）を添加してから室温での静置２４時間後（化合物（Ｂ１）の添加２４時間）の１個のビーズを、９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、ＳＨ基測定用ＰＢＳ溶液［ダルベッコ  リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ（−））（１５ｍＬ）と純水（２５ｍＬ）、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（５０μＬ）を混合した溶液］（１６０μＬ）と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（３９．６ｍｇ）をダルベッコ  リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ（−））（１０ｍＬ）に溶解させて得られた溶液（２０μＬ）を各ウェルに添加し、暗所でさらに１時間静置した。その後、各ウェルの上清を５０μＬ回収し、純水（１５０μＬ）で希釈し、マイクロプレートリーダーＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、吸光度測定（λｍａｘ＝４１２ｎｍ）を行った。メルカプト基濃度は、各種濃度のシステインを同様の手法にて測定することで得られた検量線を用いて算出した。本試験例では、４個のウェルのメルカプト基濃度を測定し、その平均値を求めた。結果を表２および３に示す。【０１９５】
【表２】
2018151186.tif 000029
【０１９６】
【表３】
2018151186.tif 000030
【０１９７】
システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズおよびシステイン−アルギネートビーズのいずれも、ビーズを製造してから２４時間後にメルカプト基濃度が減少した。この減少は、ビーズ中のメルカプト基（−ＳＨ）が、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）に変化したことを示している。【０１９８】
また、システイン−ポリガラクツロン酸塩ビーズまたはシステイン−アルギネートビーズを含む混合物に化合物（Ｂ１）を添加してから２４時間後のビーズでは、さらにメルカプト基濃度が減少した。この減少は、化合物（Ｂ１）中のメルカプト基と結合し得る官能基（即ち、１−マレイミジル基）とビーズ中のメルカプト基とが反応して、化合物（Ｂ１）が結合したビーズが得られたことを示している。【０１９９】
比較例４：化合物（ｂ１）が結合したアルギネートビーズの製造
化合物（ｂ１）が結合したアルギン酸（１５ｍｇ）を、室温で純水（１ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（８０μＬ）を加えて、透明な水溶液が得られるまで室温で撹拌して、化合物（ｂ１）が結合したアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。１ｍＬのシリンジに２８Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温で化合物（ｂ１）が結合したアルギン酸ナトリウム水溶液の液滴をゆっくり滴下することで、化合物（ｂ１）が結合したアルギネートビーズを製造した。【０２００】
試験例５：生理食塩水中での耐久性評価
１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製したこと以外は比較例１と同様にして製造したアルギネートビーズ、比較例４で製造した化合物（ｂ１）が結合したアルギネートビーズ、および実施例５で製造した化合物（Ｂ１）が結合したシステイン−アルギネートビーズを、生理食塩液（大塚製薬社製）中４℃で一晩静置した。３個のビーズ面積を測定したこと以外は試験例２と同様にして、静置０時間および静置２０時間後のビーズ面積の平均値を求めた。その結果を表４に示す。【０２０１】
【表４】
2018151186.tif 000031
【０２０２】
表４に示すように、アルギネートビーズおよび化合物（ｂ１）が結合したアルギネートビーズに比べて、化合物（Ｂ１）が結合したシステイン−アルギネートビーズは、静置２０時間後のビーズ面積が小さく、耐久性に優れている。【０２０３】
比較例５：アルギネート（第２層）／ポリオルニチン塩（第１層）／アルギネートビーズの製造
アルギン酸ナトリウムを純水に溶かして、１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。得られた１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液を１ｍＬのシリンジに入れた。シリンジには３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でアルギン酸ナトリウム水溶液の液滴を滴下することで、アルギネートビーズを製造した。【０２０４】
アルギン酸ナトリウム水溶液の滴下から１０分後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨て、得られたビーズを純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。次いで、洗浄したビーズに０．１ｗ／ｖ％のポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩の水溶液（５ｍＬ）を加えた。添加してから１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたポリオルニチン塩（第１層）／アルギネートビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。【０２０５】
続いて、洗浄したビーズに、０．２５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を加えた。添加してから１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。得られたビーズに、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（５ｍＬ）を加えて、アルギネート（第２層）／ポリオルニチン塩（第１層）／アルギネートビーズを得た。【０２０６】
実施例６：ポリガラクツロン酸塩（第２層）／ポリオルニチン塩（第１層）／システイン−アルギネートビーズの製造
システイン−アルギン酸（９０ｍｇ）を、室温で純水（６ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１４０μＬ）を加えて、ｐＨが６である１．５ｗ／ｖ％のシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。得られた水溶液を１ｍＬのシリンジに入れた。シリンジには３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の液滴を滴下することで、システイン−アルギネートビーズを製造した。【０２０７】
システイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の滴下から１０分後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたビーズを純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。次いで、洗浄したビーズに０．１ｗ／ｖ％のポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩の水溶液（５ｍＬ）を加えた。添加してから１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたポリオルニチン塩（第１層）／システイン−アルギネートビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。【０２０８】
続いて、洗浄したビーズに０．１ｗ／ｖ％のポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を加えた。なお、このポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液は、ポリガラクツロン酸（１０ｍｇ）を純水（１０ｍＬ）に懸濁させ、得られた懸濁液に１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（２５μＬ）を加えることによって調製した。【０２０９】
ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液の添加から１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨て、得られたビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。得られたビーズに、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（５ｍＬ）を加えて、ポリガラクツロン酸塩（第２層）／ポリオルニチン塩（第１層）／システイン−アルギネートビーズを得た。【０２１０】
実施例７：ポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズの製造
システイン−アルギン酸（９０ｍｇ）を、室温で純水（６ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１４０μＬ）を加えて、ｐＨが６である１．５ｗ／ｖ％のシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。得られた水溶液を１ｍＬのシリンジに入れた。シリンジには３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の液滴を滴下することで、システイン−アルギネートビーズを製造した。【０２１１】
システイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の滴下から１０分後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたビーズを純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。次いで、得られたビーズに０．１ｗ／ｖ％のグリコールキトサン水溶液（５ｍＬ）を加えた。添加してから１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたグリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。【０２１２】
続いて、洗浄したビーズに０．１ｗ／ｖ％のポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を加えた。なお、このポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液は、ポリガラクツロン酸（１０ｍｇ）を純水（１０ｍＬ）に懸濁させ、得られた懸濁液に１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（２５μＬ）を加えることによって調製した。【０２１３】
ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液の添加から１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨て、得られたビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。得られたビーズに、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（５ｍＬの）を加えて、ポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズを得た。【０２１４】
実施例８：システイン−ポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズの製造
システイン−アルギン酸（９０ｍｇ）を、室温で純水（６ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１４０μＬ）を加えて、ｐＨが６である１．５ｗ／ｖ％のシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。得られた１．５ｗ／ｖ％のシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を１ｍＬのシリンジに入れた。シリンジには３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の液滴を滴下することで、システイン−アルギネートビーズを製造した。【０２１５】
システイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の滴下から１０分後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたビーズを純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。次いで、得られたビーズに５ｍＬの０．１ｗ／ｖ％のグリコールキトサン水溶液を加えた。添加してから１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたグリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。【０２１６】
続いて、洗浄したビーズに５ｍＬの０．１ｗ／ｖ％のシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を加えた。なお、このシステイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液は、システイン−ポリガラクツロン酸（１０ｍｇ）を純水（１０ｍＬ）に懸濁させ、得られた懸濁液に１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（２５μＬ）を加えることによって調製した。【０２１７】
システイン−ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液の添加から１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨て、得られたビーズを純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。得られたビーズに、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（５ｍＬ）を加えてシステイン−ポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズを得た。【０２１８】
実施例９：化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズの製造
システイン−アルギン酸（９０ｍｇ）を、室温で（６ｍＬ）の純水に懸濁させた。得られた懸濁液に、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１４０μＬ）を加えて、ｐＨが６である１．５ｗ／ｖ％のシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。得られた１．５ｗ／ｖ％のシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液を１ｍＬのシリンジに入れた。シリンジには３０Ｇ針を装着して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に、室温でシステイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の液滴を滴下することで、システイン−アルギネートビーズを製造した。【０２１９】
システイン−アルギン酸ナトリウム水溶液の滴下から１０分後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたビーズを純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。次いで、得られたビーズに０．１ｗ／ｖ％のグリコールキトサン水溶液（５ｍＬ）を加えた。添加してから１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨てて、得られたグリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズを、純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。【０２２０】
続いて、洗浄したビーズに５ｍＬの０．１ｗ／ｖ％の化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を加えた。なお、この化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液は、化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸（１０ｍｇ）を純水（１０ｍＬ）に懸濁させ、得られた懸濁液に１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（５０μＬ）を加えることによって調製した。【０２２１】
化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液の添加から１０分間静置した後に、ビーズを含む懸濁液の上澄み液を捨て、得られたビーズを純水（５ｍＬ）で３回洗浄した。得られたビーズに、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（５ｍＬ）を加えて、化合物（ｂ１）が結合したポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズを得た。【０２２２】
試験例６：耐久性評価
比較例５および実施例６〜９で得られた各ビーズを、５５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液、１０ｍＭのＥＤＴＡ水溶液または生理食塩液（大塚製薬社製）中に沈めて、ビーズの形状観察を行った。具体的には、ビーズをそれぞれ３個ずつ、４８穴プレートに入れ、各ウェルに５５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液、１０ｍＭのＥＤＴＡ水溶液または生理食塩液（いずれも４００μＬ）を添加し、ビーズ全体が溶液に浸るようにした。ロータリーシェーカーで、４８穴プレートを１８０分まで振とうさせて、ビーズの形状を観察した。【０２２３】
ビーズの観察には、以下の顕微鏡（倍率：４倍）およびデジタルカメラを使用した。なお、デジタルカメラで撮影した顕微鏡写真中のビーズ面積（以下「ビーズ面積」と記載する）は、デジタルカメラに付属のソフトウェアで計測した。それぞれ３個のビーズ面積を計測し、その平均値を算出した。
ＯＬＹＭＰＵＳ社製培養顕微鏡「ＣＫＸ４１」
ＯＬＹＭＰＵＳ社製顕微鏡用デジタルカメラ「ＤＰ２２」【０２２４】
振とう前のビーズ面積の平均値および振とう後のビーズ面積の平均値から、下記式：
振とう後の膨張率（％）
＝１００×振とう後のビーズ面積の平均値／振とう前のビーズ面積の平均値
によって振とう後の膨張率を算出した。各時間での振とう後の膨張率の結果を表５〜７に示す。【０２２５】
【表５】
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【０２２６】
【表６】
2018151186.tif 000033
【０２２７】
【表７】
2018151186.tif 000034
【０２２８】
実施例１０：細胞を内部に包含するポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズの製造および細胞培養
１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清（ニチレイ社製）および１ｖ／ｖ％のペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＤＭＥＭ培地（Sigma Chemical Company社製）を用いて維持したヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（ロンザジャパン社製）を、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、細胞を１７５ｍｍ２  フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）から回収し、等量以上の培養培地を加えた。細胞懸濁液の遠心分離（１，０００ｒｐｍ、３分）を行って、上清を除去し、遠心分離で得られた細胞にＤ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）を加え、懸濁させた。得られた懸濁液の遠心分離（１，０００ｒｐｍ、３分）を行って、上清を除去し、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩水（１１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤ−グルコース、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、細胞を懸濁させた。得られた細胞の懸濁液（２００μＬ）を、１．５ｗ／ｖ％システイン−アルギン酸ナトリウム水溶液（１．８ｍＬ）に室温で添加して、懸濁液を得た（細胞量：１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。得られた懸濁液を、２７Ｇ針を付けた１ｍＬシリンジ（テルモ）に入れ、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液２５ｍＬに室温で滴下して、細胞を内部に包含したビーズを得た（ビーズ中の細胞量：１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。【０２２９】
得られたビーズを４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩水（５ｍＬ）で２回洗浄した後、洗浄したビーズに０．１ｗ／ｖ％のグリコールキトサン溶液を添加し、１０分間静置した。０．１ｗ／ｖ％のグリコールキトサン水溶液を除去し、得られたビーズを４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩水（５ｍＬ）で２回洗浄した。なお、０．１ｗ／ｖ％のグリコールキトサン溶液は、グリコールキトサン（３ｍｇ）を３ｍＬの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩水（１１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤ−グルコース、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解させて調製した。【０２３０】
洗浄したビーズに、０．１５ｗ／ｖ％のポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を添加し、５分間静置した。０．１５ｗ／ｖ％のポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液を除去し、得られたビーズをＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（ナカライテスク社製）で３回洗浄して、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を内部に包含したポリガラクツロン酸塩（第２層）／グリコールキトサン（第１層）／システイン−アルギネートビーズを得た。【０２３１】
上記のようにして得られた細胞を内部に包含したビーズを１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清（ニチレイ社製）および１ｖ／ｖ％のペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＤＭＥＭ培地（Sigma Chemical Company社製）に入れ、細胞を１４日培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。【０２３２】
得られたビーズ内の細胞の、培養１日後の生細胞に対する培養１４日後の生細胞の割合は９５％以上であった。【０２３３】
試験例７（参考試験）：ＲＡＷ２６４．７細胞の増殖率
１ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム水溶液（５０μＬ）または１．５ｗ／ｖ％ポリガラクツロン酸ナトリウム水溶液（５０μＬ）を９６穴ポリ−Ｌ−リジンコートプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に加え、１時間静置した（３７℃、５％ＣＯ２）。プレートの各ウェルに１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（１５０μＬ）を添加し、１０分間室温で静置した。各ウェルの塩化カルシウム水溶液を除去し、１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清（ニチレイ社製）および１ｖ／ｖ％のペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（ナカライテスク社製）（２００μＬ）で２回洗浄した。【０２３４】
１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清（ニチレイ社製）および１ｖ／ｖ％のペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（ナカライテスク社製）を用いて維持したＲＡＷ２６４．７細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）で洗浄後、０．２５ｇ／Ｌのトリプシン−１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）を用いて、細胞を１００ｍｍ  ＴＣ−処理培養皿（ＩＷＡＫＩ社製）から回収し、等量以上の培地を加えた。細胞懸濁液の遠心分離（１，２００ｒｐｍ、３分）を行って、上清を除去し、遠心分離で得られた細胞に培養培地（ナカライテスク社製）を加え、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、細胞を懸濁させた。この懸濁液を作製した９６穴プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、細胞を４日培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。【０２３５】
その後、各ウェルに生細胞数測定試薬混合液（ナカライテスク社製「生細胞数測定試薬ＳＦ」（２０μＬ）および培養培地（８０μＬ）の混合物）（１００μＬ）を添加し、３．５時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。その後、各ウェルに０．１Ｎの塩酸を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、各ウェルの上清を１００μＬずつ回収し、マイクロプレートリーダーＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、吸光度測定（λｍａｘ＝４５０ｎｍ）を行った。【０２３６】
生細胞数は、各種濃度の細胞懸濁液を同様の手法にて測定することで得られた検量線を用いて算出した。本試験例では、４個のウェルの生細胞数を測定し、その平均値を求めた。アルギン酸ナトリウムまたはポリガラクツロン酸ナトリウムを使用した場合の生細胞数（平均値）と、アルギン酸ナトリウムおよびポリガラクツロン酸ナトリウムのいずれも使用していないコントロールの生細胞数（平均値）とから、下記式
増殖率（％）＝１００×アルギン酸ナトリウムまたはポリガラクツロン酸ナトリウムを使用した場合の生細胞数（平均値）／コントロールの生細胞数（平均値）
から、増殖率を算出した。結果を表８に示す。【０２３７】
【表８】
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【０２３８】
ポリガラクツロン酸ナトリウムを使用した場合のＲＡＷ２６４．７細胞の増殖率は、アルギン酸ナトリウムを使用した場合の増殖率に比べて低い。この結果から、ポリガラクツロン酸ナトリウムを第２層（最外層）を使用すれば、細胞がその上で増殖しにくいコア−シェル型ビーズを製造し得ることが推定される。
【産業上の利用可能性】
【０２３９】
本発明のビーズは、細胞または微生物をその内部に包含させるために用いることができる。そのため、本発明のビーズは、細胞または微生物の保護および培養に有用である。【０２４０】
本願は、日本で出願された特願２０１７−０２７２４６号および特願２０１７−２２５９０３号を基礎としており、それらの内容は本願明細書に全て包含される。
【国際調査報告】
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