(57)【要約】  本発明は、より簡便、高感度に試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法を提供する。本発明者は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含んだ反応液を用いることで、より簡便、高感度に試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出できることを見出した。さらに、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターすること及び標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析を高感度に同一反応液中で行うことができることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）を含む、試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法。
工程（１）少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
工程（２）前記標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅するワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行う。
工程（３）工程（２）で得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定する。
【請求項２】
工程（３）が以下の工程（３ａ）〜（３ｃ）の少なくともひとつに該当する、請求項１に記載の方法。
工程（３ａ）得られた反応液中の増幅産物に、前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。
工程（３ｂ）工程（２）の終了後に、得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
工程（３ｃ）工程（２）の終了後に、得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、標的ＲＮＡを検出する、または、前記標的ＲＮＡの塩基配列多型を分析する。
【請求項３】
前記（Ａ）が古細菌ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
古細菌ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記（Ｃ）の蛍光消光色素が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）および２−オキソ−６，８−ジフルオロ−７−ジヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）からなる群のうちいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドにおいて、蛍光消光色素で標識されている末端塩基がシトシンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
標的ＲＮＡがＲＮＡウイルスである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスＧ１型及び／又はノロウイルスＧ２型である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的ＲＮＡがヒト由来ＲＮＡである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３又は４で示される塩基配列を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（２）で増幅のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）を少なくとも含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法を実施するための試薬。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【請求項１３】
請求項１２に記載の試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるＲＮＡを検出する方法およびＲＮＡを検出するための試薬・キット等に関する。更に詳しくは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含んだ反応液を用いてワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応及び蛍光強度の測定を行うことで、標的ＲＮＡを検出する方法及びそのための試薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれるＲＮＡの検出は、生命科学研究、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等で一般的に使用されている。特に、蛍光色素で標識されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含んだ反応液を用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することで種々の定性的及び定量的なＲＮＡ検出が実施され得る。【０００３】
例えば、試料中のＲＮＡウイルスの検出、遺伝子発現解析等を実施するためにＲＴ−ＰＣＲ反応が行われるが、従来技術では、以下の（ａ）〜（ｃ）に示すような課題があった。
（ａ）試料中に含まれる核酸増幅阻害物質の影響により、標的ＲＮＡの増幅が抑制されるため、感度が低下する
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ反応の反応時間が長い
（ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターすること及び標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析を高感度に同一反応液中で行うことができない。【０００４】
上記の課題を解決するために、種々の発明が報告されてきたが、操作が煩雑、高コスト等の問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−５０９９４号公報
【特許文献２】特許第５３５４２１６号公報
【特許文献３】米国特許６７６７７２４号公報
【特許文献４】特開２０１６−０５２２６５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，Ａｐｒ１１；２０（７）：１４８７−９０
【非特許文献２】厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長、食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）、最終改正  食安監発第０５１４００４号（平成１９年５月１４日）「ノロウイルスの検出法について」別添資料
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、より簡便、高感度に試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出することである。さらには、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターすること及び標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析を高感度に同一反応液中で行うことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究の結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含んだ反応液を用いることで、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明の概要は以下の通りである。【０００９】
［項１］
以下の工程（１）〜（３）を含む、試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法。
工程（１）少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、
工程（２）前記標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅するワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行う。
工程（３）工程（２）で得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定する。
［項２］
工程（３）が以下の工程（３ａ）〜（３ｃ）の少なくともひとつに該当する、項１に記載の方法。
工程（３ａ）得られた反応液中の増幅産物に、前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。
工程（３ｂ）工程（２）の終了後に、得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
工程（３ｃ）工程（２）の終了後に、得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、標的ＲＮＡを検出する、または、前記標的ＲＮＡの塩基配列多型を分析する。
［項３］
前記（Ａ）が古細菌ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、項１または２に記載の方法。
［項４］
古細菌ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、項３に記載の方法。
［項５］
前記（Ｃ）の蛍光消光色素が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）および２−オキソ−６，８−ジフルオロ−７−ジヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）からなる群のうちいずれかである、項１〜４のいずれかに記載の方法。
［項６］
前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドにおいて、蛍光消光色素で標識されている末端塩基がシトシンである、項１〜５のいずれかに記載の方法。
［項７］
標的ＲＮＡがＲＮＡウイルスである、項１〜６のいずれかに記載の方法。
［項８］
ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスＧ１型及び／又はノロウイルスＧ２型である、項７に記載の方法。
［項９］
標的ＲＮＡがヒト由来ＲＮＡである、項１〜６のいずれかに記載の方法。
[項１０]
前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３又は４で示される塩基配列を有する、項１〜９のいずれかに記載の方法。
［項１１］
工程（２）で増幅のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列を有する、項１〜１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］
以下の（Ａ）〜（Ｃ）を少なくとも含む、項１〜１１のいずれかに記載の試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法を実施するための試薬。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
［項１３］
項１２に記載の試薬を含むキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出することができるようになった。さらには、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターできるだけでなく、標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析も行うことができるようになった。本発明の方法あるいはキットを使用することで、生命科学研究、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１（Ｇ１）の結果を示す図である。
【図２】実施例１（Ｇ２）の結果を示す図である。
【図３】実施例２（Ｇ１）の結果を示す図である。
【図４】実施例２（Ｇ２）の結果を示す図である。
【図５】実施例３（Ｇ１）の結果を示す図である。
【図６】実施例３（Ｇ２）の結果を示す図である。
【図７】実施例４（Ｇ１）の結果を示す図である。
【図８】実施例４（Ｇ２）の結果を示す図である。
【図９】試験例１における比較例１（Ｇ１）の結果を示す図である。
【図１０】試験例１における比較例１（Ｇ２）の結果を示す図である。
【図１１】試験例１、２における実施例１（Ｇ１）の結果を示す図である。
【図１２】試験例１、２における実施例１（Ｇ２）の結果を示す図である。
【図１３】試験例２における比較例２（Ｇ１）の結果を示す図である。
【図１４】試験例２における比較例２（Ｇ２）の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
また、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ〜Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。また本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
【００１３】
本発明の実施態様の一つは、以下の工程（１）〜（３）を含む、試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出する方法である。本発明は、逆転写から検出までを閉鎖系で実施するワンステップ法で行うことを大きな特徴とする。
工程（１）少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、工程（２）で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
工程（２）前記標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡの少なくとも一部を増幅するワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行う。
工程（３）工程（２）で得られた反応液中の増幅産物に前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定する。
【００１４】
［試料］
本発明において使用できる試料は、特に制限されないが、生体試料や食品、環境試料だけでなく、精製核酸等が挙げられる。また、試料は核酸抽出やいくつかの前処理を行ってもよい。試料の核酸抽出や前処理は、当該技術分野で一般的に行われている。前処理としては、ろ過、遠心分離、希釈処理、加熱処理、アルカリ処理、有機溶媒処理、懸濁処理、破砕処理等が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されない。
【００１５】
生体試料の例として、特に制限されないが、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。さらに挙げると、血液、血液培養液、尿、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー、カテーテル洗浄液等が挙げられる。
【００１６】
食品の例として、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられる。また、食品を測定試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できる。さらに、調理器具やドアノブを拭き取った材料あるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。
【００１７】
環境試料の例として、水、氷、土壌、空気やエアゾール等が挙げられる。ここでいう水とは、例として、水道水、海水あるいは川や滝、湖、池等から採取した水等が挙げられる。
【００１８】
試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。
【００１９】
［標的ＲＮＡ］
本発明の検出対象となる標的ＲＮＡは特に限定されないが、例えば、ＲＮＡウイルスやヒト由来ＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡウイルスとしては、例えば、ノロウイルス（Ｇ１型、Ｇ２型）、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス等を挙げることができる。好ましくは、本発明は、ノロウイルスＧ１型及び／又はノロウイルスＧ２型を検出するために使用される。
【００２０】
本発明の標的ＲＮＡ検出方法においては、少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｃ）を含む試薬溶液に試料を提供する工程を含む。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【００２１】
［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。
【００２２】
［古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ］
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。
【００２３】
なかでも、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい（特許文献１）。
【００２４】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、クルードサンプル耐性に優れている。
［逆転写酵素］
本発明で用いる逆転写酵素としては、特に制限されないが、レトロウイルスあるいは細菌由来の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）２−ＲＴ、ＥＩＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｎｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼなど）やその変異体が使用される。さらには、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼも使用され得る。
【００２５】
［蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチド］
本発明では、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを使用する。これらは、工程（３）においてハイブリダイゼーションプローブとしての働きを有する限り、特に制限されない。
【００２６】
オリゴヌクレオチドプローブを使用した核酸検査法は、従来から実施されており、既に当該技術分野において確立されている（例えば、特許文献２、特許文献４）。このような核酸検査法に用いるオリゴヌクレオチドプローブとしては、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ、モレキュラービーコン、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、ＱＰｒｏｂｅなどがあるが、本発明ではＱＰｒｏｂｅを使用することが好ましい。
【００２７】
ＴａｑＭａｎ加水分解プローブやＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブが増幅された標的核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）を検出するために一般的に用いられている。これらのプローブはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）等の核酸増幅法において、高感度に標的核酸を検出できるとされている。しかしながら、これらのプローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の両方に、蛍光色素あるいはクエンチャーを標識しなければならないため、合成に手間やコストがかかるという問題がある。
【００２８】
ＱＰｒｏｂｅは、ＫＵＲＡＴＡらにより開発された蛍光プローブ（蛍光消光プローブ）である（特許文献２）。このプローブは、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されているハイブリダイゼーションプローブである。
【００２９】
蛍光消光色素としては特に限定されないが、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）および２−オキソ−６，８−ジフルオロ−７−ジヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）からなる群のうちのいずれかが好ましい。
【００３０】
さらに、蛍光消光色素で標識されている末端塩基（両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンであるオリゴヌクレオチドプローブがより好ましい。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物にハイブリダイズした際に、増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。
【００３１】
なお、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基と増幅産物中のグアニン塩基が塩基対を形成しなくとも、それらの塩基同士の距離が近ければ蛍光は消光できる。例えば、詳細は特許文献２に記載があり、本発明も該技術を参照できる。
【００３２】
また、蛍光消光色素で標識されている末端塩基（両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンでないオリゴヌクレオチドプローブであっても、反応液の蛍光強度の変化を測定できる。例えば、詳細は特許文献２に記載があり、本発明も該技術を参照できる。
【００３３】
ハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチドは、目的とする増幅産物とハイブリダイズし得る限り、任意の塩基配列のものを使用することができる。例えば、ノロウイルスＧ１型を検出する場合には、配列番号３で示される塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとすることが好ましく、ノロウイルスＧ２型を検出する場合には、配列番号４で示される塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブであることが好ましい。
【００３４】
［ワンステップＲＴ−ＰＣＲ］
本発明の標的ＲＮＡ検出方法においては、ワンステップＲＴ−ＰＣＲを行う工程を含む。
【００３５】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲとは、反応系を開放することなく以下の２工程を行う反応である。
（１）標的ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
（２）ｃＤＮＡを鋳型に核酸増幅を行うＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
すなわち、ワンステップＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写反応とＰＣＲ反応を同じチューブ内で連続して行うため、操作が簡便でコンタミネーションリスクも低減できる。しかしながら、逆転写反応とＰＣＲ反応を独立した工程で行うツーステップＲＴ−ＰＣＲと比較して、従来のワンステップＲＴ−ＰＣＲは感度が低いことが知られている。
【００３６】
また、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２つを加えて行う二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼが干渉し、効率を低下させることが報告されている（非特許文献１）。この干渉を抑えるため、鋳型ＲＮＡの増加、逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼ比率の増加、あるいは非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、硫黄又は酢酸塩含有分子（特許文献３）などの使用が行われてきた。
【００３７】
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。
【００３８】
本発明における大きな特徴として、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、核酸増幅効率の低下を防いだ点が挙げられる。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、増幅効率等の観点から二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲでの使用に適しており、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲを行っても従来報告されてきたような増幅効率の低下は見られなかった。
従来、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）等には、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼやＴｔｈポリメラーゼが使用されてきた。これは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しており、ＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブが使用できることから、ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターしながら標的核酸の検出ができるためである。一方で、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないため、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブを使用できない。そのため、ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターするためには、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎなどのインターカレーター蛍光色素を使用しなければならなかった。しかしながら、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ等は、標的核酸以外の増幅核酸（例えば、非特異増幅されたＤＮＡやプライマーダイマー等）も検出するという欠点がある。さらに、ハイブリダイゼーションプローブと異なり、同時に複数の蛍光色素を使用できないため、マルチプレックス解析を行うことができない。
【００３９】
本発明の標的ＲＮＡ検出方法においては、前記ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応で得られた反応液中の増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを前記増幅産物にハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定する工程を含む。
【００４０】
［ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニター］
前記ワンステップＲＴ−ＰＣＲ工程において、反応液中の増幅産物に、増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることができる。
【００４１】
ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、増幅率に基づいて試料中に含まれる標的核酸の定量も可能である。
【００４２】
本発明者らは鋭意研究の結果、蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用することで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターできることを見出した（実施例１）。蛍光消光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブとしてＱＰｒｏｂｅ、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、高い増幅効率でのワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応が可能となり、さらに反応の進行をリアルタイムでモニターできた。また、本発明の驚くべき特徴として、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応に続いて後述する融解曲線分析も可能であった。
【００４３】
本発明では、増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドとして、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用い、反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。例えば、核酸増幅反応の任意の時点で、反応液の蛍光強度を測定し、試料中に標的核酸が含まれている場合、増幅した核酸量に依存してオリゴヌクレオチドプローブが増幅核酸にハイブリダイズして蛍光強度が増加（あるいは減少）する。取得した蛍光強度を時間（ＰＣＲ反応ではサイクル数）に対してプロットすることで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできる（例えば、実施例１）。
【００４４】
［ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をエンドポイントでモニター］
前記ワンステップＲＴ−ＰＣＲ工程の終了後に、得られた反応液中の増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを増幅産物にハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることができる。
【００４５】
核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、エンドポイントでの蛍光強度等を比較することで標的核酸の定量も可能である。
本発明では、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする（例えば、実施例２）。例えば、核酸増幅反応終了後に、反応液の蛍光強度を測定し、反応後の反応液の蛍光強度を反応前の反応液の蛍光強度と比較することで、標的核酸の増幅の有無を確認できる。あるいは、反応後の反応液の反応強度をコントロール反応液の反応強度と比較することでも試料中に含まれる標的核酸の有無を確認することができる。コントロール反応液とは、測定したい試料の代わりに陰性と判明している試料あるいは陽性と判明している試料を加えた反応液である。
核酸増幅反応の進行は、一般的にリアルタイムでモニターすることが好ましいが、検出工程をより簡便にする等の目的では、エンドポイントでモニターすることが好ましい。
【００４６】
［蛍光強度の温度依存性を測定］
前記ワンステップＲＴ−ＰＣＲ工程の終了後に、得られた反応液中の増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを増幅産物にハイブリダイズさせ、前記反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、標的核酸を検出することができるし、前記標的ＲＮＡの塩基配列多型を分析することもできる。
【００４７】
蛍光強度の温度依存性を測定するとは、具体的には、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度を測定することである（例えば、実施例３）。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用するオリゴヌクレオチドプローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。また、蛍光強度は目的に合わせて蛍光消光率等に変換してもよい。
Ｔｍ値を用いた標的核酸の検出、分析等を融解曲線分析という。一般的に、Ｔｍ値は、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖である割合が等しいときの温度をいう。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は標的核酸の塩基配列多型を分析する手法として使用できる。ここでいう塩基配列多型とは、一塩基多型、塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等を含む。
【００４８】
一例として、融解曲線分析はＳＮＰ解析などにも応用されている。
オリゴヌクレオチドプローブに対して標的核酸の塩基配列に変異がある場合、プローブがハイブリダイズした際に塩基がミスマッチしているため、一般的にＴｍ値は低くなる。したがって、Ｔｍ値の大きさを比較することで一塩基多型の解析（ＳＮＰ解析）を行うことができる（例えば、実施例４）。
【００４９】
［試料中に含まれるＲＮＡを検出するための試薬］
本発明の別の実施態様は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）を少なくとも含む、前記のいずれかの標的ＲＮＡを検出する方法を実施するための試薬である。
（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素
（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
【００５０】
試薬には、上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、増幅工程で得られる増幅産物とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに加えて、核酸増幅に必要な成分が少なくとも含まれる。
【００５１】
本発明の試薬に必要な他の成分は、実施する方法の目的等によって異なり、それぞれ公知の成分を用いることができる。例えばワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて試料中に含まれるＲＮＡを検出する場合、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩またはマンガン塩が少なくとも含まれる。
【００５２】
本発明の試薬には、さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、当該技術分野で知られる添加物等を加えてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物として、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体やリン酸等が挙げられる（特許文献４）。反応促進を目的とする添加物として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０などが挙げられる。本発明では、これらの添加物を１種類以上組み合わせて使用してもよいが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の試薬に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸増幅反応において核酸増幅の起点として使用されるオリゴヌクレオチドであり、当該技術分野において一般的に使用されている知見（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献４）にもとづいて適宜設計することができる。また、実施する核酸増幅反応によっては、複数種類のオリゴヌクレオチドプライマーを使用できる。特異性の高いオリゴヌクレオチドプライマーは、３’末端がターゲット配列に対して相補的であることが重要であり、言い換えれば、３’末端が相補的であれば５’末端が相補的でなくとも有効なプライマーとしてはたらくとされている。このことから、本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーも３’末端がゲノム配列に対して相補的な配列を有するように設計することが好ましい。さらに、標的核酸がノロウイルスＲＮＡのように塩基配列多型である場合、縮重プライマーを使用してもよい。例えば、ノロウイルスＲＮＡの検出に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列を有するものが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーとして配列番号５及びリバースプライマーとして配列番号６で示される塩基配列を有するものの組合せ、又は、フォワードプライマーとして配列番号７及びリバースプライマーとして配列番号８で示される塩基配列を有するものの組合せを用いることでより高感度にノロウイルスＲＮＡを検出することが可能であり得る。
【００５４】
［試料中に含まれるＲＮＡを検出するためのキット］
さらに、本発明の別の実施態様として、前記の標的ＲＮＡ検出試薬を含むキットが挙げられる。
【００５５】
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて又は変更若しくは置き換えて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００５７】
実施例１：リアルタイムでモニターできるノロウイルスＲＮＡの検出
（１−１）方法
配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片及びノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ノロウイルスＧ１型ＲＮＡを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号３に示される塩基配列を使用し、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識した。また、ノロウイルスＧ２型ＲＮＡを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号４に示される塩基配列を使用し、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識した。なお、オリゴヌクレオチドプライマーは非特許文献２に記載のプライマーを使用した。
（１−２）反応液
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含むジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。逆転写酵素は市販のＲｅｖｅｒｔｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社）を使用した。
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
１．５μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー（配列番号５）
０．５μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
０．３μＭ  ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号３）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｒｅｖｅｒｔｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号７）
１．５μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）
０．３μＭ  ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号４）
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｒｅｖｅｒｔｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社）
（１−３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
４２℃  １８０秒（逆転写反応）、
９４℃  ３０秒、
９８℃  １秒−６０℃  １０秒−６３℃  １０秒（サイクル数６０回）
（１−４）結果
図１および図２は、測定で得られた蛍光強度（消光率に変換）をサイクル数にプロットした図である。図１がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図２がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図１、図２より、試料中に標的ＲＮＡが存在するとき、オリゴヌクレオチドプローブが増幅核酸にハイブリダイズし、蛍光強度が変化していくことが明らかとなった。また、標的ＲＮＡ量にしたがって、蛍光強度が変化するため、標的ＲＮＡの定量も可能であった。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用して核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできることが示された。【００５８】
実施例２：エンドポイントでモニターできるノロウイルスＲＮＡの検出
（２−１）方法
実施例１と同様の反応液、反応条件を用いて、配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片及びノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（５０コピー／テスト、２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、各試料の核酸増幅前及び増幅後の蛍光強度を測定した。
（１−２）結果
図３および図４にそれぞれの蛍光強度及び蛍光変化率を示す。蛍光変化率（本実施例では消光率を表す）は、（増幅前蛍光強度−増幅後蛍光強度）／（増幅前蛍光強度）の式より求めた。図３がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図４がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図３、図４より、試料中に含まれる標的ＲＮＡ量にしたがって、蛍光強度が変化することが明らかになり、標的ＲＮＡの定量も可能であった。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用して核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターできることが示された。【００５９】
実施例３：融解曲線分析によるノロウイルスＲＮＡの検出
（３−１）方法
実施例２と同様の反応液、反応条件を用いて、配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片及びノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（５０コピー／テスト、２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。核酸増幅反応後に以下の条件による融解曲線分析を行った。
９４℃  ３０秒、
３９℃  ３０秒、
４０−７５℃  ０．０９℃／秒
（３−２）結果
図５および図６にそれぞれの融解曲線分析の結果を示す。図５がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図６がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図５、図６より、融解曲線分析によって試料中に含まれる標的ＲＮＡを検出できることが明らかになった。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用して融解曲線分析を実施できることが示された。【００６０】
実施例４：糞便試料に含まれるノロウイルスＲＮＡの検出
（４−１）方法
ノロウイルスＧ１型を含む糞便試料、ノロウイルスＧ２型を含む糞便試料、ノロウイルスを含まない陰性糞便試料を試料として、実施例３と同様に核酸増幅及び融解曲線分析を行った。糞便試料は、ヒト糞便を水で懸濁した試料である。
（４−２）結果
図７および図８に融解曲線分析の結果を示す。図７がノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果、図８がノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系で測定して得られた結果である。図７（ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系）より、ノロウイルスＧ１型が含まれる糞便試料では融解曲線分析で蛍光ピークが確認されたが、ほかの試料ではピークが確認されなかった。一方で、図８（ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系）より、ノロウイルスＧ２型が含まれる糞便試料では融解曲線分析で蛍光ピークが確認されたが、ほかの試料ではピークが確認されなかった。また、驚くべきことに、それぞれの陽性糞便試料について、融解曲線分析で得られたＴｍ値が試料によって異なった。この実験結果は、Ｇ１糞便１とＧ１糞便２との間でノロウイルスの遺伝子型が異なること、および、Ｇ２糞便１とＧ２糞便２との間でノロウイルスの遺伝子型が異なることをそれぞれ示唆していると考えられる。したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用してＳＮＰ解析によるノロウイルス遺伝子型を区別できることが示された。【００６１】
試験例１：従来法（ツーステップＲＴ−ＰＣＲ）との比較
従来法との対比を行うために、従来のツーステップＲＴ−ＰＣＲ法を行った場合（比較例１）と、本発明のワンステップＲＴ−ＰＣＴ法を行った場合との比較を行った。【００６２】
（１−１）方法
逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）で標的ＲＮＡから変換したｃＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ反応を行う従来の標的ＲＮＡ検出法との比較を行った。具体的には、配列番号１、２を鋳型として人工合成したノロウイルスＧ１型ＲＮＡ断片およびノロウイルスＧ２型ＲＮＡ断片（ＰＣＲ反応での終濃度が２５０コピー／テスト、１２５０コピー／テスト）を試料としてツーステップＲＴ−ＰＣＲを行った。【００６３】
（１−２）逆転写反応
まず、市販の逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡社））を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製、反応条件等はＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔの取扱説明書に従った。
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）【００６４】
（１−３）ＰＣＲ反応
上記の反応で合成したｃＤＮＡについて、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼおよびＴａｑＭａｎ加水分解プローブを使用してＰＣＲ反応を行うとともに各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製、反応条件等はＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘの取扱説明書に従うとともに、ＰＣＲ装置はＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑを使用した。
なお、ノロウイルスＧ１型ＲＮＡを検出するためのＴａｑＭａｎ加水分解プローブとして、配列番号３に示される塩基配列を使用し、５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ２で標識した。また、ノロウイルスＧ２型ＲＮＡを検出するためのＴａｑＭａｎ加水分解プローブとして、配列番号４に示される塩基配列を使用し、５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ２で標識した。
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー（配列番号５）
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
０．２μＭ  ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号３）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号７）
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）
０．２μＭ  ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号４）【００６５】
別途、上記実施例１と同様の反応液（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識したハイブリダイゼーションプローブを含む）、反応条件を用いてワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、その結果を比較した。【００６６】
（１−４）結果
図９が従来法（ツーステップＲＴ−ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１０が従来法（ツーステップＲＴ−ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。また、図１１が本発明によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１２が本発明によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。
図９では低濃度のノロウイルスＧ１型ＲＮＡが検出できなかった一方で、図１１では小さいながらもピークを確認することができた。同様に、図１０では低濃度のノロウイルスＧ２型ＲＮＡの増幅曲線が小さい一方で、図１２では低濃度のノロウイルスＧ２型ＲＮＡでも増幅曲線が大きく出ることを確認できた。
したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用した本発明が、従来のツーステップＲＴ−ＰＣＲ（ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ）よりも簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出できることが示された。【００６７】
試験例２：従来法（二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲ）との比較
従来ツーステップ法で用いられていた試薬をワンステップ法に使用できるように改変された従来の二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲ試薬を用いた場合（比較例２）と、本発明のワンステップＲＴ−ＰＣＴ法で検出する場合との比較を行った。【００６８】
（２−１）方法
ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈポリメラーゼ、逆転写酵素、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブを含む従来の標的ＲＮＡ検出法との比較を行った。
従来法として、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔの取扱説明書に従うとともに、ＰＣＲ装置はＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑを使用した。
なお、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブは比較例１と同じものを使用した。【００６９】
ノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー（配列番号５）
０．５μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー（配列番号６）
０．２μＭ  ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号３）
ノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系
０．５μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー（配列番号７）
０．５μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー（配列番号８）
０．２μＭ  ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（配列番号４）【００７０】
別途、上記実施例１と同様の反応液（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識したハイブリダイゼーションプローブを含む）、反応条件を用いてワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、その結果を比較した。【００７１】
（２−２）結果
図１３が従来法（二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１４が従来法（二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲ）によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。また、図１１が本発明によるノロウイルスＧ１型ＲＮＡ検出系の結果、図１２が本発明によるノロウイルスＧ２型ＲＮＡ検出系の結果である。
図１３ではノロウイルスＧ１型ＲＮＡを検出できなかった一方で、図１１では検出することができた。同様に、図１４ではノロウイルスＧ２型ＲＮＡを検出できなかったが、図１２では検出することができた。
したがって、（Ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）逆転写酵素、（Ｃ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されており、標的核酸とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、を使用した本発明が、従来の二酵素系ワンステップＲＴ−ＰＣＲ（ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ）よりも簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、簡便、高感度に標的ＲＮＡを検出することができるようになった。さらには、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応の進行をリアルタイムでモニターできるだけでなく、標的ＲＮＡの塩基配列多型の分析も行うことができるようになった。本発明の方法およびキットを使用することで、生命科学研究、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野に大きく貢献できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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