(57)【要約】  １００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを均一に増幅することにより、その１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する方法、個人を識別する方法、および造血幹細胞の生着の程度を解析する方法が提供される。
2018061638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
前記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、
前記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、前記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
前記塩基配列情報に基づいて、前記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する由来判別工程と
を備え、
前記目的領域選択工程と、前記ＤＮＡ抽出工程とは、任意の順序である、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法であって、
前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ）前記少なくとも１つの目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程と、
ｂ）前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記ヒトゲノムＤＮＡ上における前記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程と、
ｃ）前記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程と、
ｄ）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程と、
ｅ）前記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程と、
ｆ）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程と、
ｇ）前記第一段階選抜工程および前記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程と、
を備え、
前記ローカルアラインメント工程および前記第一段階選抜工程の両工程と、前記グローバルアラインメント工程および前記第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時である、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法。
【請求項２】
ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
前記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、
前記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、前記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
前記塩基配列情報に基づいて、前記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する由来判別工程と
を備え、
前記目的領域選択工程と、前記ＤＮＡ抽出工程とは、任意の順序である、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法であって、
前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ１）前記少なくとも１つの目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程と、
ｂ１）前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記ヒトゲノムＤＮＡ上における前記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程と、
ｃ１）前記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程と、
ｄ１）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程と、
ｅ１）前記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程と、
ｆ１）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程と、
ｇ１）前記第一段階選抜第１工程および前記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程と、
ａ２）前記少なくとも１つの目的領域のうちまだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程と、
ｂ２）前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記ヒトゲノムＤＮＡ上における前記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程と、
ｃ２）前記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程と、
ｄ２）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程と、
ｅ２）前記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程と、
ｆ２）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程と、
ｇ２）前記第一段階選抜第２工程および前記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程と、
を備え、
前記ローカルアラインメント第１工程および前記第一段階選抜第１工程の両工程と、前記グローバルアラインメント第１工程および前記第二段階選抜第１工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記ローカルアラインメント第２工程および前記第一段階選抜第２工程の両工程と、前記グローバルアラインメント第２工程および前記第二段階選抜第２工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、前記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、前記第３以降の対象領域について、前記対象領域選択第２工程から前記プライマー採用第２工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法。
【請求項３】
ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
前記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、
前記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、前記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
前記塩基配列情報に基づいて、前記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する由来判別工程と
を備え、
前記目的領域選択工程と、前記ＤＮＡ抽出工程とは、任意の順序である、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法であって、
前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ−０）前記少なくとも１つの目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程と、
ｂ−０）前記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記ヒトゲノムＤＮＡ上における前記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程と、
ｃ−１）前記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
ｄ−１）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程と、
ｅ−１）前記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−１）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程と、
ｇ−１）前記第１の第一段階選抜工程および前記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
ｃ−２）前記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
ｄ−２）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程と、
ｅ−２）前記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−２）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程と、
ｇ−２）前記第２の第一段階選抜工程および前記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を含み、
前記第１のローカルアラインメント工程および前記第１の第一段階選抜工程の両工程と、前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記第２のローカルアラインメント工程および前記第２の第一段階選抜工程の両工程と、前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、前記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、前記プライマー候補塩基配列複数作成工程において前記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、前記第３以降の対象領域について、前記第２のローカルアラインメント工程から前記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法。
【請求項４】
前記目的領域が一塩基多型および／または縦列型反復配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法を用いる、個人を識別する方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法を用いる、造血幹細胞の生着の程度を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；デオキシリボ核酸）からその由来を判別する方法、個人を識別する方法、および造血幹細胞の生着の程度を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量のゲノムＤＮＡから塩基配列情報を取得するには、全ゲノム増幅により解析対象となるＤＮＡを増幅した後、所望の目的領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅する必要がある。しかし、この方法では、増幅領域の不均一化または増幅エラーなどにより、精度の高い塩基配列情報を取得することができないことがある。【０００３】
全ゲノム増幅を行わず直接目的領域をＰＣＲにより増幅すれば、上記した全ゲノム増幅の影響を排除することができる。しかし、鋳型ＤＮＡ量が極めて少ないため、過剰な増幅反応による増幅エラー、またはプライマー同士の非特異的増幅（プライマー・ダイマー）などが発生し、正確な塩基配列情報を取得できないことがある。【０００４】
プライマー・ダイマーの形成を抑制する手段として、例えば、特許文献１では、プライマーのすべての組合せについて、プライマー間の３’末端での相補性を示すスコア（３’末端のローカルアライメントスコア）を計算し、プライマー同士の相補性が低いプライマーの組合せを選び出すことによって、マルチプレックスＰＣＲで異なるターゲットのプライマー同士がプライマー・ダイマーを形成する可能性を低くすることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／００４６９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、極微量の鋳型ＤＮＡに対するマルチプレックスＰＣＲでは、プライマー端部のみでアニーリングして形成されるプライマー・ダイマーを考慮することも重要であるが、特許文献１に記載の手段は、そこまでは考慮していない。【０００７】
そのため、特許文献１に記載されたプライマーの設計方法に従って設計したプライマーでは、１００ｐｇ以下の極微量の鋳型ＤＮＡに対してマルチプレックスＰＣＲを行った場合に、複数の目的領域を均一に増幅することができなかった。【０００８】
したがって、遺留ＤＮＡまたは単一細胞から抽出したＤＮＡのような１００ｐｇ以下の微量ＤＮＡからその由来を判別すること、個人を識別すること、および造血幹細胞の生着の程度を解析することは、従来、困難であった。【０００９】
そこで、本発明は、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを均一に増幅することにより、その１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する方法、個人を識別する方法、および造血幹細胞の生着の程度を解析する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としてマルチプレックスＰＣＲを行う際に使用するプライマーの設計方法において、プライマー・ダイマー形成性の評価を、プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下で、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求め、求めたローカルアラインメント・スコアに基づいて第１段階の選抜を行い、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求め、求めたグローバルアラインメント・スコアに基づいて第２段階の選抜を行い、第１段階および第２段階のいずれにおいても選抜されたプライマーを採用すると、プライマー・ダイマーの形成を抑え、複数の目的領域を均一に増幅することができることを知得し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［６］を提供する。
［１］  ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
上記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、
上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
上記塩基配列情報に基づいて、上記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する由来判別工程と
を備え、
上記目的領域選択工程と、上記ＤＮＡ抽出工程とは、任意の順序である、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法であって、
上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ）上記少なくとも１つの目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程と、
ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記ヒトゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程と、
ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程と、
ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程と、
ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程と、
ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程と、
ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程と、
を備え、
上記ローカルアラインメント工程および上記第一段階選抜工程の両工程と、上記グローバルアラインメント工程および上記第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時である、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法。
［２］  ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
上記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、
上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
上記塩基配列情報に基づいて、上記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する由来判別工程と
を備え、
上記目的領域選択工程と、上記ＤＮＡ抽出工程とは、任意の順序である、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法であって、
上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ１）上記少なくとも１つの目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程と、
ｂ１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記ヒトゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程と、
ｃ１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程と、
ｄ１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程と、
ｅ１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程と、
ｆ１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程と、
ｇ１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程と、
ａ２）上記少なくとも１つの目的領域のうちまだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程と、
ｂ２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記ヒトゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程と、
ｃ２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程と、
ｄ２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程と、
ｅ２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程と、
ｆ２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程と、
ｇ２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程と、
を備え、
上記ローカルアラインメント第１工程および上記第一段階選抜第１工程の両工程と、上記グローバルアラインメント第１工程および上記第二段階選抜第１工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記ローカルアラインメント第２工程および上記第一段階選抜第２工程の両工程と、上記グローバルアラインメント第２工程および上記第二段階選抜第２工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記対象領域選択第２工程から上記プライマー採用第２工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法。
［３］  ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
上記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、
上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
上記塩基配列情報に基づいて、上記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する由来判別工程と
を備え、
上記目的領域選択工程と、上記ＤＮＡ抽出工程とは、任意の順序である、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法であって、
上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ−０）上記少なくとも１つの目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程と、
ｂ−０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記ヒトゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程と、
ｃ−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
ｄ−１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程と、
ｅ−１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程と、
ｇ−１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
ｃ−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
ｄ−２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程と、
ｅ−２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程と、
ｇ−２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を含み、
上記第１のローカルアラインメント工程および上記第１の第一段階選抜工程の両工程と、上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記第２のローカルアラインメント工程および上記第２の第一段階選抜工程の両工程と、上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法。
［４］  上記目的領域が一塩基多型および／または縦列型反復配列を含む、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］  上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法を用いる、個人を識別する方法。
［６］  上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法を用いる、造血幹細胞の生着の程度を解析する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを均一に増幅することにより、その１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する方法、個人を識別する方法、および造血幹細胞の生着の程度を解析する方法を提供することができる。【００１３】
本発明によれば、１００ｐｇ以下の微量なＤＮＡ量でも、精度よくＤＮＡ解析が可能になる。さらに、５０ｐｇ以下のＤＮＡ量においても精度良いＤＮＡ解析が可能であり、ヒトゲノムＤＮＡの由来の判別、個人の識別する方法、および造血幹細胞の生着の程度の解析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法の概略を表すフロー図である。
【図２】図２は、本発明の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法において使用する目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを設計するためのポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第１の態様を説明するフロー図である。
【図３】図３は、本発明の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法において使用する目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを設計するためのポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第２の態様を説明するフロー図である。
【図４】図４は、本発明の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法において使用する目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを設計するためのポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第２の態様を説明するフロー図である。
【図５】図５は、鋳型ＤＮＡ量（横軸）とシークエンスリードのカバレッジが１９以上となった領域の割合（縦軸）との関係を表す縦棒グラフである。
【図６】図６は、作業者Ａおよび１〜１１（横軸）とＳＮＰｓ情報［ホモ一致、ヘテロ不一致、ＡＤＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｄｒｏｐ  Ｏｕｔ；アレルドロップアウト）、ＡＤＩ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｄｒｏｐ  Ｉｎ；アレルドロップイン）、およびホモ不一致の個数］との関係を表す積み上げ縦棒グラフである。
【図７】図７は、作業者Ａおよび１〜１１の相互間の距離に基づくデンドログラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法］
本発明の１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法（以下単に「本発明の由来を判別する方法」という場合がある。）は、ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つ の目的領域を選択する目的領域選択工程と、ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、上記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、上記塩基配列情報に基づいて、上記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する由来判別工程とを備える。
【００１６】
上記目的領域選択工程と、上記ＤＮＡ抽出工程とは、任意の順序である。
【００１７】
上記ＰＣＲ増幅工程において上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するために用いられるプライマーセットは、後述する「［ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法］」において説明するプライマーセットの設計方法によって設計される。
【００１８】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００１９】
〈目的領域選択工程〉
目的領域選択工程では、ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から、マルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡである、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡの由来を判別するための塩基配列情報を取得する目的領域を選択する。
【００２０】
（１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡ）
本発明の由来を判別する方法において、マルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとするヒトゲノムＤＮＡは、１００ｐｇ以下であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１ｐｇ以上１００ｐｇ以下であり、より好ましくは５ｐｇ以上１００ｐｇ以下であり、さらに好ましくは１０ｐｇ以上５０ｐｇ以下である。
【００２１】
下限値について説明する。ヒトゲノムＤＮＡは約３０億塩基対であり、これは約５ｐｇに相当する。本発明で実施するマルチプレックスＰＣＲでは、ヒトゲノムＤＮＡ上の約６５０箇所を１５０〜２００塩基対の各アンプリコンで同時増幅することによって、約１１万塩基対を解析できる。これはヒトゲノムＤＮＡの０．００４％に相当し、質量に換算すると２０ｆｇが理論上の検出下限値となる。しかし実際には、ＤＮＡポリメラーゼやプライマー安定性、解析対象となるヒトゲノムＤＮＡの状態を考慮すると、好ましくは１ｐｇ以上であり、より好ましくは５ｐｇ以上であり、さらに好ましくは１０ｐｇ以上である。
【００２２】
（ヒトゲノムＤＮＡ上の領域）
本発明の由来を判別する方法において、「ヒトゲノムＤＮＡ上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患の可能性のある遺伝子領域が存在するゲノムＤＮＡ上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、１塩基以上であればよい。目的領域が選択されるヒトゲノム上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、遺伝子多型の領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
【００２３】
遺伝子多型は、例えば、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）、ＳＮＶ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｖａｒｉａｎｔ：一塩基変異）、ＳＴＲＰ（Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：縦列型反復配列多型）、ミューテーション、ならびに挿入および／または欠失（インデル）などである。
【００２４】
ヒトゲノムＤＮＡ上の領域の数は特に限定されない。ヒトゲノムＤＮＡ上の領域は、目的領域を選択する際の候補リストであり、膨大な数がリストされていたとしても、そのすべてについて解析しなければならないわけではないからである。
【００２５】
（目的領域）
目的領域は、上記ヒトゲノムＤＮＡ上の領域から塩基配列情報を取得する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型を検出することに限定されるものではない。また、選択の目的は１つに限定されず、２つ以上の目的を有していてもよい。
【００２６】
目的領域として選択するヒトゲノムＤＮＡ上の領域の数は、少なくとも１個であり、特に限定されないが、好ましくは３箇所以上、より好ましくは５箇所以上、さらに好ましくは１０箇所以上である。
【００２７】
〈ＤＮＡ抽出工程〉
ＤＮＡ抽出工程では、ヒト由来試料からヒトゲノムＤＮＡを抽出する。
ヒト由来試料は、ヒトゲノムＤＮＡが含まれているものであれば特に限定されるものではないが、例えば、細胞、毛髪、血液、および血痕などが挙げられる。ヒトゲノムＤＮＡは細胞内に存在するものに限定されず、細胞が破壊されるなどして細胞外に逸出したものでもかまわない。
【００２８】
（細胞からのＤＮＡ抽出）
細胞からのＤＮＡ抽出方法は、タンパク質分解酵素および界面活性剤の存在下で加熱することにより行う。この処理により、細胞膜上のタンパク質および脂質成分が溶解され、細胞内のゲノムＤＮＡを細胞外に抽出することができる。
ＤＮＡ抽出を行う細胞は単離したものであることが好ましい。細胞を単離する場合には、免疫染色、フローサイトメトリー、画像判別など、従来公知の細胞単離方法を用いることができる。
【００２９】
〈ＰＣＲ増幅工程〉
ＰＣＲ増幅工程では、上記ＤＮＡ抽出工程において得られたヒトゲノムＤＮＡから、１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法については、別途、「［ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法］」において詳細に説明する。
【００３０】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
ポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型ＤＮＡを繰り返し複製させる。増幅させるＤＮＡ塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする短いＤＮＡプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型二本鎖ＤＮＡの２本の鎖が解離し別々に複製される。
【００３１】
マルチプレックスＰＣＲは、一般的なＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが可能であるが、夫々のプライマー対が鋳型ＤＮＡにアニーリングする温度が異なる為、反応条件の検討が必要な場合がある。そのため、マルチプレックスＰＣＲに最適化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが好ましく、本発明では、マルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ（株）社製）を用いて反応することがより好ましい。
【００３２】
プライマーセットの設計方法についての詳細は後述するため、ここでは、概略を述べる。
目的領域の数は、目的とする染色体に特異的なＤＮＡ配列領域から、検査に応じて必要とする箇所の対象領域を選択して、各対象領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成し、プライマー塩基配列間の相補性が低いものを選抜することによって、１００ｐｇ以下のような微量のゲノムＤＮＡに対しても目的領域の増幅性が非常に改良される。
【００３３】
次世代シークエンサー技術は飛躍的に進化しているものの、シークエンス解析に用いるサンプルの調製は非常に複雑な工程が必要となる。サンプルの前処理は、最も広く応用されているゲノム解析の場合、サンプルから核酸の抽出後、（１）ＤＮＡの断片化、（２）ＤＮＡサイズセレクション、（３）ＤＮＡ末端の平滑化処理、（４）ＤＮＡ末端へのアダプター配列の付加、（５）ＤＮＡの精製、および（６）ＤＮＡの増幅というプロセスを必要とする。
【００３４】
複雑なサンプル調整工程は時間および労力を要し、工程が適切に行われていることを確認しなければならない。また、各工程においてバイアスが生じていくため、特に結果の精度および確度を高いレベルで要求される医療現場での診断ツールとしての使用に際しては、このバイアスを減らす必要がある。
【００３５】
これらを解決するために、本発明においては、後述する特定の方法を用いて設計したプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことによって、選択した目的領域のより均一な増幅が可能となる。さらに、ＰＣＲ産物を磁性ビーズにより精製することによって、より効果的な増幅産物の回収が可能となる。ＰＣＲ反応溶液中には、余剰のプライマー、ｄＮＴＰｓ（Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；デオキシヌクレオチド）、および酵素等の夾雑物が残留しているため、高精度のシークエンスデータを得る際の障害となる場合がある。しかし、ＰＣＲ増幅産物を、磁性ビーズを用いて精製することによって、ＰＣＲ増幅産物の損失を著しく抑制しながら、十分な精製を行うことができる。この場合、１００ｇ以下の非常に少ないＤＮＡからでも、（１）ＤＮＡの増幅、および（２）ＤＮＡの精製という、シンプルなサンプル調整工程のみで、様々な遺伝子領域を均一に精度よく増幅し、確実に細胞由来の情報を検出する方法を用いることが好ましい。
【００３６】
増幅されたＤＮＡの定量は、例えば、２６０ｎｍの波長の吸収度を測定する超微量分光光度計ナノドロップ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、レーザー蛍光検出法を用いたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（アジレント社製）、または蛍光法により二本鎖ＤＮＡを定量するＱｕａｎｔｕｓフルオロメーター（プロメガ社製）等を用いて行うことが可能である。
【００３７】
《ＰＣＲ増幅産物の精製工程》
ＰＣＲ増幅産物を含む反応液には、酵素、ヌクレオチド、塩類、およびその他不純物が混在するため、それらを除去することが好ましい。核酸の精製方法としては、例えば、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法、カオトロピック塩の存在下でシリカメンブレンフィルタなどのシリカ担体に選択的に吸着させる方法、およびＰＥＧ（Polyethylene glycol：ポリエチレングリコール）存在下においてカルボキシル基で修飾された磁性ビーズに核酸が選択的に結合する現象を利用した方法などが知られている。
本発明の好ましい実施態様として、マルチプレックスＰＣＲ増幅産物は、磁性ビーズを利用した精製方法を選択することができる。
【００３８】
（磁性ビーズ精製工程）
ＰＣＲ増幅産物を、常磁性微小ビーズである磁性ビーズを利用した精製を行うことによって、さらに効率的に目的領域のみの解析を可能とすることができる。磁性ビーズを利用した精製方法は、磁性ビーズの粒子表面に核酸を可逆的に結合させ、磁性ビーズをマグネットで吸着し、増幅したＤＮＡ断片と液体とを分離することによって、効率よく酵素、ｄＮＴＰｓ、ＰＣＲプライマー、プライマー・ダイマー、および塩などの夾雑物を除去することができる。磁性ビーズを利用した方法は、他の精製方法と比較して、サンプルロスが少なく、かつ、夾雑物の除去効率が高い。その結果として、ＤＮＡシーケンス工程において、効率的に目的領域のみの解析を行うことが可能となる。磁性ビーズは市販されており、例えば、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰキット（ベックマン・コールター社製）、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（タカラバイオ（株）社製）、またはＥｐｉＮｅｘｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＨＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（エピジェンテック社製）等を用いることができる。なかでも、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター社製）を用いて精製することが好ましい。
【００３９】
〈ＤＮＡシークエンシング工程〉
上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して上記目的領域の塩基配列情報を取得する。
【００４０】
ＰＣＲ増幅産物の配列解析には、次世代シークエンサー、特に、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）を用いることが望ましい。複数のマルチプレックスＰＣＲ産物を次世代シークエンサー「ＭｉＳｅｑ」を用いてシークエンシングする場合、それぞれのマルチプレックスＰＣＲ産物に６〜８塩基で構成されるサンプル識別配列（インデックス配列）ならびにＭｉＳｅｑフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるためのＰ５配列およびＰ７配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大９６種類のマルチプレックスＰＣＲ産物を１回で測定することが可能である。インデックス配列、Ｐ５配列およびＰ７配列をマルチプレックスＰＣＲ産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法またはＰＣＲ法などを用いることが可能である。
【００４１】
また、複数のマルチプレックスＰＣＲ産物を混合してＭｉＳｅｑで測定する場合には、それぞれのＰＣＲ産物を正確に定量することが望ましい。ＰＣＲ産物の定量方法としては、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ（アジレント社製）またはＱｕａｎｔｕｓフルオロメーター（プロメガ社）を用いることも可能であるが、マルチプレックスＰＣＲ産物を定量ＰＣＲ法で測定する方法がさらに好ましい。本発明での定量方法としては、ＫＡＰＡライブラリー定量キット（日本ジェネティクス社製）を用いて定量することが好ましい。
【００４２】
ＭｉＳｅｑで得られたシーケンスデータを解析する方法としては、ＢＷＡ（Burrows-Wheeler Aligner；バーロウズ−ホィーラー・アライナー：Li, H.、外1名、「Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第14号、ｐ．1754-1760.；Li, H.、外1名、「Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第5号、ｐ．589-595）を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Li, Heng、外、「The Sequence Alignment/Map format and SAMtools」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第16号、ｐ．2078-2079；ＳＡＭは“Sequence Alignment/Map”に由来する。）、および／またはＢＥＤｔｏｏｌｓ（Quinlan, A. R.、外1名、「BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第6号、ｐ．841-842）を用いることで遺伝子の変異や染色体数の定量を解析することが好ましい。
【００４３】
（配列リード数の決定）
ＤＮＡシークエンシング工程においては、さらに、配列リード数を測定することが望ましい。
例えば、対象領域をＰＣＲ増幅して得たＤＮＡ断片に対して、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（配列リード数）をシークエンサーで求めることができる。基準（あるいは参照）として、犯罪捜査などで容疑者となる個人の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（配列リード数）をシークエンサーで求める。
【００４４】
〈由来判別工程〉
上記塩基配列情報に基づいて、上記ヒトゲノムＤＮＡの由来を判別する。
ＤＮＡの由来は、例えば、得られた塩基配列情報の類似の程度によって判別することができる。原理的には、同一人に由来するＤＮＡからは同一の塩基配列情報が得られる。しかし、実際には、ＡＤＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｄｒｏｐ  Ｏｕｔ；アレルドロップアウト）、ＤＮＡの部分的欠損、または実験誤差などによって、完全に同一の塩基配列情報が得られない場合がある。
【００４５】
遺伝子配列の個人差を識別する方法としては、一般的に、対立遺伝子に存在する遺伝子多型を検出する方法で行われている。一例として、父子判別には、遺伝子多型の一種にＳＴＲも使用することができる。また、個人差を識別する方法として、ゲノム塩基配列中の一塩基が変異し、１％以上の頻度で観察されるＳＮＰｓも使用することができる。本発明では、次世代シークエンサーを用いて、遺留品から単離した細胞が、容疑者と同じＳＴＲまたはＳＮＰｓを有するかどうかＤＮＡ配列状態の判定を行って確定させる。
【００４６】
［ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法］
本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法において実施するポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法について説明する。
【００４７】
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第１の態様〉
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第１の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図２を参照する。
（ａ）少なくとも１つの目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程（図２のＳ１０１）。
（ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程（図２のＳ１０２）。
（ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程（図２のＳ１０３）。
（ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程（図２のＳ１０４）。
（ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程（図２のＳ１０５）。
（ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程（図２のＳ１０６）。
（ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程（図２のＳ１０７）。
【００４８】
ただし、上記（ａ）工程〜上記（ｇ）工程のうち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程の両工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行った後、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行ってもよいし、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行ってもよいし、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行ってもよい。
【００４９】
上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行う場合には、上記（ｅ）工程および上記（ｃ）工程は、それぞれ、下記（ｅ’）工程および下記（ｃ’）工程とすることが好ましい。
【００５０】
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
【００５１】
（ｃ’）上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
【００５２】
また、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ）工程は、下記（ｅ’）工程とすることが好ましい。
【００５３】
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
【００５４】
さらにプライマーを設計する場合は、プライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ｃ）ローカルアラインメント工程（図２のＳ１０３）から、作成されていなければ、ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程（図２のＳ１０２）またはａ）対象領域選択工程（図２のＳ１０１）から、プライマーを設計する（図２のＳ１０８、Ｓ１０９、およびＳ１１０）。
【００５５】
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第２の態様〉
本発明において、少なくとも１つの目的領域が２つ以上の目的領域を含む場合のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の派生態様の一つである第２の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図３を参照する。
【００５６】
（ａ１）少なくとも１つの目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程（図３のＳ２０１）。
（ｂ１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程（図２のＳ２０２）。
（ｃ１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程（図３のＳ２０３）。
（ｄ１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程（図３のＳ２０４）。
（ｅ１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程（図３のＳ２０５）。
（ｆ１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程（図３のＳ２０６）。
（ｇ１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程（図３のＳ２０７）。
【００５７】
ただし、上記（ａ１）工程〜上記（ｇ１）工程のうち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程の両工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行った後、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００５８】
上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行う場合には、上記（ｅ１）工程および上記（ｃ１）工程は、それぞれ、下記（ｅ１’）工程および下記（ｃ１’）工程とすることが好ましい。
【００５９】
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
【００６０】
（ｃ１’）上記第二段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
【００６１】
また、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ１）工程は、下記（ｅ１’）工程とすることが好ましい。
【００６２】
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
【００６３】
（ａ２）上記少なくとも１つの目的領域のうちまだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程（図３のＳ２１１）。
（ｂ２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程（図３のＳ２１２）。
（ｃ２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程（図３のＳ２１３）。
（ｄ２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程（図３のＳ２１４）。
（ｅ２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程（図３のＳ２１５）。
（ｆ２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程（図３のＳ２１６）。
（ｇ２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程（図３のＳ２１７）。
【００６４】
ただし、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程のうち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程の両工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行った後、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００６５】
上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行う場合には、上記（ｅ２）工程および上記（ｃ２）工程は、それぞれ、下記（ｅ２’）工程および下記（ｃ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｃ２’）上記第二段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
【００６６】
また、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ２）工程は、下記（ｅ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
【００６７】
さらにプライマーを設計する場合は、ａ２）対象領域選択第２工程（図３のＳ２１１）からｇ２）プライマー採用第２工程（図３のＳ２１７）までを繰り返す（図３のＳ２０８）。すなわち、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程までの各工程を繰り返す。
【００６８】
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第３の態様〉
本発明において、少なくとも１つの目的領域が２つ以上の目的領域を含む場合のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の派生態様の一つである第３の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図４を参照する。
【００６９】
（ａ−０）上記少なくとも１つの目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程（図４のＳ３０１）。
（ｂ−０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程（図４のＳ３０２）。
【００７０】
（ｃ−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程（図４のＳ３０３）。
（ｄ−１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程（図４のＳ３０４）。
（ｅ−１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程（図４のＳ３０５）。
（ｆ−１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程（図４のＳ３０６）。
（ｇ−１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程（図４のＳ３０７）。
【００７１】
ただし、上記（ｃ−１）工程〜上記（ｇ−１）工程のうち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程の両工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行った後、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００７２】
上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行う場合には、上記（ｅ−１）工程および上記（ｃ−１）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−１）工程および下記（ｃ’−１）工程とすることが好ましい。
【００７３】
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
【００７４】
（ｃ’−１）上記第１の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
【００７５】
また、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−１）工程は、下記（ｅ’−１）工程とすることが好ましい。
【００７６】
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
【００７７】
（ｃ−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程（図４のＳ３１３）。
【００７８】
（ｄ−２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程（図４のＳ３１４）。
【００７９】
（ｅ−２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程（図４のＳ３１５）。
【００８０】
（ｆ−２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程（図４のＳ３１６）。
【００８１】
（ｇ−２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程（図４のＳ３１７）。
【００８２】
ただし、上記（ｃ−２）工程〜上記（ｇ−２）工程のうち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程の両工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行った後、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００８３】
上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行う場合には、上記（ｅ−２）工程および上記（ｃ−２）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−２）工程および下記（ｃ’−２）工程とすることが好ましい。
【００８４】
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
【００８５】
（ｃ’−２）上記第２の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
【００８６】
また、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−２）工程は、下記（ｅ’−２）工程とすることが好ましい。
【００８７】
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
【００８８】
さらにプライマーを設計する場合は、ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程（図４のＳ３１３）からｇ−２）第２のプライマー採用工程（図４のＳ３１７）までを繰り返す（図３のＳ３０８）。すなわち、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す。
【００８９】
〈各工程の説明〉
以下では、本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法において実施するポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法に含まれる各工程について、詳細に説明する。
【００９０】
《対象領域選択工程》
本明細書において、対象領域選択工程Ｓ１０１（図２）、対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１（図３）、ならびに対象領域複数選択工程Ｓ３０１（図４）を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。
【００９１】
（第１の態様：  対象領域選択工程Ｓ１０１）
図２において「対象領域選択」（Ｓ１０１）として示す。
第１の態様において、（ａ）対象領域選択工程は、目的領域から対象領域を選択する工程である。
【００９２】
（第２の態様：  対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１）
図３において、「対象領域選択第１」（Ｓ２０１）および「対象領域選択第２」（Ｓ２１１）として示す。
第２の態様において、（ａ１）対象領域選択第１工程は、目的領域から第１の対象領域を選択する工程であり、（ａ２）対象領域選択第２工程は、まだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する工程である。
第２の態様では、目的領域を１つずつ選択する。
【００９３】
（第３の態様：  対象領域複数選択工程Ｓ３０１）
図４において、「対象領域複数選択」（Ｓ３０１）として示す。
第３の態様において、（ａ−０）対象領域複数選択工程は、目的領域から複数の対象領域を選択する工程である。
第３の態様では、目的領域を複数個選択する。好ましくは、全ての目的領域を対象領域として選択する。
【００９４】
《プライマー候補塩基配列作成工程》
本明細書において、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２（図２）、プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２（図３）、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２（図４）を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成工程」という場合がある。
【００９５】
（第１の態様：  プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２）
図２において「プライマー候補塩基配列作成」（Ｓ１０２）として示す。
第１の態様において、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
【００９６】
（第２の態様：  プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２）
図３において「プライマー候補塩基配列作成第１」（Ｓ２０２）および「プライマー候補塩基配列作成第２」（Ｓ２１２）として示す。
第２の態様において、（ｂ１）プライマー候補塩基配列作成第１工程は、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程であり、（ｂ２）プライマー候補塩基配列作成第２工程は、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
第２の態様では１つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の１つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。
【００９７】
（第３の態様：  プライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２）
図４において「プライマー候補塩基配列複数作成」（Ｓ３０２）として示す。
第３の態様において、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する。
第３の態様では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。
【００９８】
（近傍領域）
対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の５’端から外側の領域、および対象領域の３’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
【００９９】
（プライマーの設計パラメータ）
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、融解温度（二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度をいう。また、Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅに由来し、「Ｔｍ値」という場合もある。単位は「℃」である。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
【０１００】
・プライマーの長さ
プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。なお、「ｍｅｒ」はポリヌクレオチドの長さをヌクレオチドの個数で表す場合の単位であり、１ｍｅｒは１個のヌクレオチドを表す。したがって、例えば、１５ｍｅｒは１５個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを表す。
【０１０１】
・プライマーのＧＣ含量
プライマーのＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
【０１０２】
・プライマーのＴｍ値
プライマーのＴｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
プライマーのＴｍ値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下とする。
Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
【０１０３】
・プライマーの塩基の偏り
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
【０１０４】
・プライマーの３’末端
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
【０１０５】
《特異性チェック工程》
「プライマー候補塩基配列作成工程」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体ＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、染色体ＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体ＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが一本鎖ＤＮＡであるのに対して、染色体ＤＮＡは二本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。
【０１０６】
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
【０１０７】
スコア、およびローカルアラインメント・スコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアとして、マッチ（相補塩基）＝＋１、ミスマッチ（非相補塩基）＝−１、インデル（挿入および／または欠失）＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定すること等が考えられる。
【０１０８】
プライマー候補の塩基配列が染色体ＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、対象領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
【０１０９】
《ローカルアラインメント工程》
本明細書において、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３（図２）、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３（図３）、ならびに第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３（図４）を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。
【０１１０】
（第１の態様：  ローカルアラインメント工程Ｓ１０３）
図２において「ローカルアラインメント」（Ｓ１０３）として示す。
第１の態様において、（ｃ）ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１１１】
（第２の態様：  ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３）
図３において「ローカルアラインメント第１」（Ｓ２０３）および「ローカルアラインメント第２」（Ｓ２１３）として示す。
第２の態様において、（ｃ１）ローカルアラインメント第１工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ２）ローカルアラインメント第２工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１１２】
（第３の態様：  第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３）
図４において「第１のローカルアラインメント」（Ｓ３０３）および「第２のローカルアラインメント」（Ｓ３１３）として示す。
第３の態様において、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から選ばれた第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から選ばれた第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１１３】
（ローカルアラインメントの方法）
ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をｐ個として、重複を許して選択した場合は、「ｐＨ２＝ｐ＋１Ｃ２＝（ｐ＋１）！／２（ｐ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｐＣ２＝ｐ（ｐ−１）／２」通りである。
【０１１４】
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。
さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１１５】
【表１】
2018061638.tif 000003
【０１１６】
例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
【０１１７】
【表２】
2018061638.tif 000004
【０１１８】
配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
【０１１９】
【表３】
2018061638.tif 000005
【０１２０】
表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。なお、表４中、マッチを「｜」で示す。
【０１２１】
【表４】
2018061638.tif 000006
【０１２２】
この（ペアワイズ）アラインメントには、マッチが５か所あり、ミスマッチが４か所あり、インデル（ギャップ）が１か所ある。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、（＋１）×５＋（−１）×４＋（−１）×１＝±０となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１２３】
《第一段階選抜工程》
本明細書において、第一段階選抜工程Ｓ１０４（図２）、第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４、ならびに第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。
【０１２４】
（第１の態様：  第一段階選抜工程Ｓ１０４）
図２において「第一段階選抜」（Ｓ１０４）として示す。
第１の態様において、（ｄ）第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１２５】
（第２の態様：  第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４）
図３において、「第一段階選抜第１」（Ｓ２０４）および「第一段階選抜第２」（Ｓ２１４）として示す。
第２の態様において、（ｄ１）第一段階選抜第１工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ２）第一段階選抜第２工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１２６】
（第３の態様：  第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４）
図４において、「第１の第一段階選抜」（Ｓ３０４）および「第２の第一段階選抜」（Ｓ３１４）として示す。
第３の態様において、（ｄ−１）第１の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ−２）第２の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１２７】
（第１段階選抜の方法）
ローカルアラインメント・スコアの閾値（第１の閾値）を予め設定しておく。
ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
【０１２８】
ここで、上記「ローカルアラインメント工程」に示した例において、第１の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「±０」であり、第１の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１２９】
なお、本工程は、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３、ローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３、第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３、または第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３においてローカルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【０１３０】
《グローバルアラインメント工程》
本明細書において、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５（図２）、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５（図３）、ならびに第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５（図４）を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。
【０１３１】
（第１の態様：  グローバルアラインメント工程Ｓ１０５）
図２において「グローバルアラインメント」（Ｓ１０５）として示す。
第１の態様において、（ｅ）グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１３２】
（第２の態様：  グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５）
図３において「グローバルアラインメント第１」（Ｓ２０５）および「グローバルアラインメント第２」（Ｓ２１５）として示す。
第２の態様において、（ｅ１）グローバルアラインメント第１工程は、上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ２）グローバルアラインメント第２工程は、上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１３３】
（第３の態様：  第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５）
図４において「第１のグローバルアラインメント」（Ｓ３０５）および「第２のグローバルアラインメント」（Ｓ３１５）として示す。
第３の態様において、（ｅ−１）第１のグローバルアラインメント工程は、上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ−２）第２のグローバルアラインメント工程は、上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１３４】
（グローバルアラインメントの方法）
グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成工程」で作成したプライマー候補の全部（「ローカルアラインメント工程」および「第一段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。）および既に採用したプライマーの全部（既に採用したプライマーが存在する場合に限る。）からなる群から２つのプライマーを取り出して、３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。
【０１３５】
グローバルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「ｘＨ２＝ｘ＋１Ｃ２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｘＣ２＝ｘ（ｘ−１）／２」通りである。
【０１３６】
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１３７】
例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字部分。「３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列」に該当する。）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアリング・システムは表１に示すとおりとする。
【０１３８】
【表５】
2018061638.tif 000007
【０１３９】
スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。
【０１４０】
【表６】
2018061638.tif 000008
【０１４１】
この（ペアワイズ）アラインメントには、ミスマッチが３か所あり、マッチおよびインデル（ギャップ）はいずれもない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、（＋１）×０＋（−１）×３＋（−１）×０＝−３となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１４２】
《第二段階選抜工程》
本明細書において、第二段階選抜工程Ｓ１０６（図２）、第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６（図３）、ならびに第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６（図４）を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。
【０１４３】
（第１の態様：  第二段階選抜工程Ｓ１０６）
図２において「第二段階選抜」（Ｓ１０６）として示す。
第１の態様において、（ｆ）第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１４４】
（第２の態様：  第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６）
図３において「第二段階選抜第１」（Ｓ２０６）および「第二段階選抜第２」（Ｓ２１６）として示す。
第２の態様において、（ｆ１）第二段階選抜第１工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ２）第二段階選抜第２工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１４５】
（第３の態様：  第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６）
図４において「第１の第二段階選抜」（Ｓ３０６）および「第２の第二段階選抜」（Ｓ３１６）として示す。
第３の態様において、（ｆ−１）第１の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ−２）第２の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１４６】
（第二段階選抜の方法）
グローバルアラインメント・スコアの閾値（「第２の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
【０１４７】
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアを第２の閾値未満とすることができる。
【０１４８】
ここで、上記「グローバルアラインメント工程」に示した例において、第２の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であり、第２の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１４９】
なお、本工程は、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５、グローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５、第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５、または第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５においてグローバルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【０１５０】
また、計算量を低減させるため、「グローバルアラインメント工程」および「第２段階選抜工程」の両工程を先に実施して、「第２段階選抜工程」を通過したプライマーの塩基配列の組合せに対して、「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」の両工程を実施することが好ましい。特に、対象領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【０１５１】
これは、「グローバルアラインメント工程」では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメント・スコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
【０１５２】
《増幅配列長チェック工程》
「第一段階選抜工程」および「第二段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
【０１５３】
《プライマー採用工程》
本明細書において、プライマー採用工程Ｓ１０７（図２）、プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７（図３）、ならびに第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７（図４）を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。
【０１５４】
（第１の態様：  プライマー採用工程Ｓ１０７）
図２において「プライマー採用」（Ｓ１０７）として示す。
第１の態様において、（ｇ）プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１５５】
（第２の態様：  プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７）
図３において「プライマー採用第１」（Ｓ２０７）および「プライマー採用第２」（Ｓ２１７）として示す。
第２の態様において、（ｇ１）プライマー採用第１工程は、上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ２）プライマー採用第２工程は、上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１５６】
（第３の態様：  第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７）
図４において「第１のプライマー採用」（Ｓ３０７）および「第２のプライマー採用」（Ｓ３１７）として示す。
第３の態様において、（ｇ−１）第１のプライマー採用工程は、上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ−２）第２のプライマー採用工程は、上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１５７】
（プライマー採用の方法）
プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
【０１５８】
例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
【０１５９】
【表７】
2018061638.tif 000009
【０１６０】
既に記載したように、ローカルアラインメント・スコアは「±０」であるから、第１の閾値である「＋３」未満であり、また、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であるから、第２の閾値である「＋３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
【０１６１】
《他の目的領域のプライマー設計》
１つの目的領域に対してプライマーを採用した後、さらに他の目的領域に対してプライマーを設計してもよい。
第１の態様においては、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、プライマーを設計しようとする目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３から行う。次の目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の目的領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の目的領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、その目的領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３以降を行う。
第２の態様においては、対象領域選択第２工程Ｓ２１１から繰り返す。
第３の態様において、既に対象領域複数選択工程Ｓ３０１において選択した目的領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２において作成されているため、第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３から繰り返す。
【０１６２】
《プライマー等の設計における特徴点》
目的領域を選択した後のプライマー等の設計における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。
【０１６３】
［個人を識別する方法］
本発明の個人を識別する方法は、上記した１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法を用いる。
【０１６４】
ヒトの遺伝子の中には、個人によって異なる領域として、短い繰返し単位の繰り返し回数のＳＴＲ（Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔ；縦列型反復配列）遺伝子座の長さや、１つの塩基が別の塩基に置き換わった情報を持つ遺伝子座であるＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）が知られており、複数のＳＴＲ遺伝子座の長さや、ＳＮＰ遺伝子座の配列を調べることで、個人を識別することができる。
【０１６５】
例えば、災害時の遺体の同定や、犯罪捜査などでＤＮＡ鑑定を行いたい対象の毛髪や血痕などに含まれる極微量のＤＮＡからでも塩基配列情報を精度高く取得することができる。個人識別を行いたい対象の個人の遺留品などは、通常取得される体細胞を含むものは非常に少ない場合が多く、細胞数として１０固程度回収される場合もある。そのような場合、従来のＤＮＡ増幅技術では、１０個程度以下の各細胞から抽出混合した量のＤＮＡに対して全ゲノム増幅法により解析対象となるＤＮＡを増幅し、その増幅産物の塩基配列を間接的に決定する手法が一般的に使用されているが、この方法では増幅される領域の不均一化により増幅されない領域が生じてしまうことやＤＮＡ合成酵素の増幅エラーにより正しい塩基配列情報を反映しない増幅産物が得られてしまうことにより、必ずしも精度の高い配列情報を取得できないことが問題として指摘されている。加えて、全ゲノム増幅を行わず直接的に極微量ＤＮＡからＰＣＲを行った場合でも、鋳型ＤＮＡ量が極めて少ないことに起因する過剰な増幅反応による不均一化や塩基配列情報を取得するために使用するプライマー同士の非特異的増幅(プライマー・ダイマー)が発生し、正確な塩基配列情報を取得できないことが課題として存在している。
【０１６６】
災害時や犯罪捜査での解析対象となるＤＮＡは、必ずしも完全な形のゲノムＤＮＡではなく、細胞核から露出され、物理的作用や紫外線に代表される化学的作用により断片化されていることも少なくない。このような極微量の断片化されたＤＮＡにおいても遺伝子配列情報を取得することができる。
【０１６７】
本発明の個人を識別する方法では、災害時の遺体の同定や、犯罪捜査などでＤＮＡ鑑定を行いたい対象の毛髪や血痕などに含まれる極微量のＤＮＡからでも塩基配列情報を精度高く取得することができる。個人識別を行いたい対象の個人の遺留品などは、通常取得される体細胞を含むものは非常に少ない場合が多く、細胞数として１０固程度回収される場合もある。そのような場合でも、本発明により、より精度よく個人識別を行うことが可能となる。
【０１６８】
［造血幹細胞の生着の程度を解析する方法］
本発明の造血幹細胞の生着の程度を解析する方法は、上記した１００ｐｇ以下のヒトゲノムＤＮＡからその由来を判別する方法を用いる。
【０１６９】
キメリズム検査と称する検査では、正常な血液細胞を作ることが困難な疾患の患者の体にどの程度移植した造血幹細胞が生着したかの確認の指標として用いられる検査であり、このような検査にも少ないＤＮＡ量から精度よく塩基配列情報を取得することが可能となる。
【０１７０】
骨髄移植は、造血器の腫瘍や、再生不良性貧血などの疾病の根治的な治療方法として行われている。その場合に、移植後に、健常提供者（ドナー）の骨髄細胞の生着と、患者（レシピエント）の細胞が根絶していることを確認することが、移植の成否判定、予後の判定にきわめて重要である。移植後に、患者の体の中には患者由来の細胞と健常提供者由来の細胞が混在する期間があり、混合キメラ状態という。この状態を数値定量化する検査法がキメリズム検査である。
キメリズム検査は、Ｔリンパ球と、Ｔリンパ球以外の細胞に分けてそれぞれ解析が行われる。
【０１７１】
現在、主に用いられているキメリズム検査法には、ＳＴＲ法があり、細胞のＳＴＲが調べられている。あらかじめ、造血幹細胞を提供するドナーのＳＴＲと、造血幹細胞の移植を受ける患者のＳＴＲを調べ、互いに長さの異なるＳＴＲ遺伝子座を確定しておく。肝細胞移植後、血液中の複数の核を有する細胞を取得し、抽出したＤＮＡを混合して観察していくと、ドナーの移植細胞由来のＳＴＲの長さを有する情報が、最終的１００％になった時点でしっかりと造血幹細胞が生着した状態が確認できる。
【０１７２】
ＳＮＰを調べる場合には、該当するＳＮＰ遺伝子座のＳＮＰ配列の存在する数を次世代シークエンサーで解読し、ドナーのＳＮＰの情報が１００％になった時点で、しっかりと造血幹細胞が生着した状態が確認できる。
【０１７３】
ＳＮＰの情報を利用して、識別する場合は、比較するＳＮＰ遺伝子座の数が多いほど識別の正確性が高まる。個人間で同じＳＮＰ配列を有する確率（Ｐ）を試算したところ、ＳＮＰ配列が１箇所ではＰ＝５．２×１０−１となり、５箇所ではＰ＝３．８×１０−２となり、１０箇所ではＰ＝１．４５×１０−３となり、１５箇所ではＰ＝５．５×１０−５となり、２０箇所ではＰ＝２．０９×１０−６となる。すなわち２０箇所程度のＳＮＰ配列を比較できれば高い精度で造血幹細胞の生着の程度が識別可能となる。
【０１７４】
Ｔリンパ球の検出方法は、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の情報を取得して、取得した情報に基づいて、目的の細胞を、開口を有するウェルが配列された容器に分取する工程と、容器に分取された細胞を撮像し、その画像に基づいて、Ｔリンパ球候補細胞を決定する。フローサイトメータでの分取の前に染色が行われる。まず、目的の細胞を含む分析対象試料を準備する。分析対象試料に、例えば、溶血剤と、免疫染色に用いる蛍光標識された抗体と混合し、インキュベーションすることにより、細胞を免疫染色する。細胞を免疫染色することにより試料液Ｓが調製される。血液細胞に光源から、レーザー光等が照射される。レーザー光の照射により血液細胞の免疫染色による蛍光標識が励起され、血液細胞は免疫染色による蛍光標識により蛍光を発光する。この蛍光強度が検知器により検知される。検知された情報を基に、フローセルに超音波が印加された細胞がプラス、又はマイナスに荷電される。細胞が偏向電極板を通過する際、荷電された液滴を何れかの偏向電極板に引き寄せることにより、基本的には、容器の１ウェルに１細胞が分取される。
【０１７５】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１７６】
［実施例１］
１．解析ＤＮＡの調製
（１）ゲノムＤＮＡ
ヒト培養細胞から抽出混合したゲノムＤＮＡをＤＮａｓｅ（ＤＮＡ分解酵素）フリー超純水で希釈して、ゲノムＤＮＡ濃度が２．５ｎｇ／μＬ、２５０ｐｇ／μＬ、１２５ｐｇ／μＬ、２５ｐｇ／μＬ、１２．５ｐｇ／μＬ、および２．５ｐｇ／μＬのゲノムＤＮＡ水溶液を調製した。
各濃度のゲノムＤＮＡ水溶液を、それぞれ、０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに４μＬずつ添加した。各ＰＣＲチューブに含まれるゲノムＤＮＡ量は、それぞれ、１０ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、および１０ｐｇであった。
（２）毛髪ＤＮＡ
男性ボランティア（作業者Ａ）から毛髪を１本採取した。
採取した毛髪を毛根部と毛幹とに切り分け、その毛根部を、０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに加えた。
毛根部を入れたＰＣＲチューブに含まれるゲノムＤＮＡ量は約５０ｐｇであった。【０１７７】
２．タンパク質溶解処理
解析ＤＮＡ  ４μＬを入れた０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに、細胞溶解緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸  ｐＨ７．５，０．５ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸，２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム，０．００７％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム，１３．３μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）５μＬを添加した。
各ＰＣＲチューブを５０℃で６０分間加熱し、プロテイナーゼＫによりタンパク質を溶解した。次いで、９５℃で５分間加熱し、プロテイナーゼＫを失活させた。
タンパク質溶解処理を行った解析ＤＮＡ（以下「タンパク質溶解物」という場合がある。）は次に使用するまで１２℃で保存した。【０１７８】
３．解析ＤＮＡのＰＣＲ増幅
（１）プライマーの作製
マルチプレックスＰＣＲに用いるプライマーは、ヒトＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；一塩基多型）を含む６４７箇所の染色体位置または遺伝子の塩基配列情報に基づいて作製した。【０１７９】
プライマー２００１−Ｆ（配列番号１）およびプライマー２００１−Ｒ（配列番号２）について、以下の表８にローカルアラインメントを、表９にグローバルアラインメントを示す。
スコアリングは、マッチ＝＋１、ミスマッチ＝−１、およびギャップ（インデル）＝−１とし、各ポジションのスコアの総和をアラインメント・スコアとした。
ローカルアラインメント・スコアの閾値は「＋３」とし、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマー同士のローカルアラインメント・スコアはこの閾値未満であることを要する。
また、グローバルアラインメント・スコアの閾値は「±０」とし、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマー同士のグローバルアラインメント・スコアはこの閾値未満であることを要する。【０１８０】
【表８】
2018061638.tif 000010
【０１８１】
ローカルアラインメント・スコアは、マッチ（＋１）×５＋ミスマッチ（−１）×４＋インデル（−１）×１＝±０である。
したがって、ローカルアラインメント・スコアは閾値未満である【０１８２】
【表９】
2018061638.tif 000011
【０１８３】
グローバルアラインメント・スコアは、マッチ（＋１）×０＋ミスマッチ（−１）×３＋インデル（−１）×０＝−３である。
したがって、グローバルアラインメント・スコアは閾値未満である。【０１８４】
作製したプライマーの一部について、各プライマーペアのプライマーの名称、塩基配列および配列長を表１０に、各プライマーペアの増幅部位および増幅産物サイズを表１１に、それぞれ示す。【０１８５】
【表１０】
2018061638.tif 000012
【０１８６】
【表１１】
2018061638.tif 000013
【０１８７】
（２）シングルプレックスＰＣＲによる増幅確認
作製したプライマーを用いて所望の増幅部位を特異的に増幅することができるか否かを確認するため、各プライマーペアについてシングルプレックスＰＣＲを行った。
ａ）反応液の調製
以下の反応液を調製した。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ）                        ２μＬ
プライマー                                            各２μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１            ０．１２５μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２              １２．５μＬ
滅菌蒸留水                                ｕｐ  ｔｏ  ２５μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
なお、ゲノムＤＮＡはヒト培養細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１およびＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２は、ＴａＫａＲａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）に含まれる試薬である。
ｂ）シングルプレックスＰＣＲの反応条件
シングルプレックスＰＣＲの反応条件は、初期熱変性（９４℃，６０秒）の後、［熱変性（９４℃，３０秒）−アニーリング（６０℃，９０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×３０サイクルとした。
ｃ）ＰＣＲ増幅産物の確認
反応終了後の反応液の一部をアガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無およびサイズを確認した。
６４７対のプライマーペアについて、シングルプレックスＰＣＲによる特異的な増幅を確認することができた。【０１８８】
（３）マルチプレックスＰＣＲによる増幅
ａ）反応液の調製
以下の反応液を調製した。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
テンプレートＤＮＡ                                      ９μＬ
プライマー・ミックス                                    ４μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１            ０．１２５μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２              １２．５μＬ
滅菌蒸留水                                ｕｐ  ｔｏ  ２６μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
なお、テンプレートＤＮＡは上記「２．タンパク質溶解処理」において保存した「タンパク質溶解物」であり、プライマー・ミックスは６４７対のプライマーペアを各プライマーの終濃度が５０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように混合したものであり、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１およびＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２は、ＴａＫａＲａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）に含まれる試薬である。
ｂ）マルチプレックスＰＣＲの反応条件
マルチプレックスＰＣＲの反応条件は、初期熱変性（９４℃，６０秒）の後、［熱変性（９４℃，３０秒）−アニーリング（５６．７℃，６００秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×３２サイクルとした。
ｃ）ＰＣＲ反応産物の精製
マルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ反応産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付マニュアル（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｕｓｅ）に従って精製した。
具体的には、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬４５μＬをＰＣＲ反応液２５μＬに加え、十分混和し、室温で５分間静置して、磁性ビーズにＰＣＲ反応産物を結合させた。
次に、ＰＣＲ反応産物が結合した磁性ビーズをマグネットスタンド（ＭａｇｎａＳｔａｎｄ，日本ジェネティクス（株）社製）の磁力で分離し、夾雑物を除いた。
ＰＣＲ反応産物が結合した磁性ビーズを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで２回洗浄後、磁性ビーズに結合したＤＮＡを４０μＬのトリス−塩酸緩衝液で溶出した。【０１８９】
４．ＤＮＡシークエンシング
（１）シークエンスライブラリーミックスの調製
次世代シークエンサー（Ｍｉｓｅｑ，イルミナ社製）を用いてデュアルインデックス・シーケンシングを行うため、マルチプレックスＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片の両端に、それぞれ、フローセル結合用配列（Ｐ５配列またはＰ７配列）、サンプル識別用のインデックス配列、およびシークエンスプライマー結合用配列を含む２種類のアダプターを付加した。
具体的には、表１２に示すプライマーＤ５０１〜Ｄ５０８およびＤ７０１〜Ｄ７１２を各１．２５μＭで使用し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いてＰＣＲを行うことで両末端への配列付加を行った。ＰＣＲ条件は、初期熱変性（９４℃，３分）の後、［熱変性（９４℃，４５秒）−アニーリング（５０℃，６０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×５サイクル、続いて、［熱変性（９４℃，４５秒）−アニーリング（５５℃，６０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×１１サイクルとした。【０１９０】
【表１２】
2018061638.tif 000014
【０１９１】
得られたＰＣＲ産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター社製）を用いて精製した後、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（日本ジェネティクス（株）社製）を用いてＤＮＡを定量した。
インデックス配列の異なった各サンプルのＤＮＡ濃度が各々１．５ｐＭとなるように混合し、シークエンスライブラリーミックスとした。【０１９２】
（２）増幅産物の配列解析
調製したシークエンスライブラリーミックスを、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ２  ３００  Ｃｙｃｌｅ（イルミナ社製）を用いてシークエンスを行い、ＦａｓｔＱファイルを取得した。
得られたＦａｓｔＱデータからＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてヒトゲノム配列（ｈｇ１９）へマッピング後、ＳＡＭｔｏｏｌｓにより遺伝子多型情報を抽出し、ＢＥＤｔｏｏｌｓにより各検出領域のシークエンスリード数を算出した。
シークエンスリードのカバレッジが、塩基配列決定の目安となる１９以上となった割合を図２に示す。
ゲノムＤＮＡの５０ｐｇ〜１０ｎｇのサンプルでは、２回中２回ともカバレッジが１９以上の割合が０．９５以上であり、安定して塩基配列決定に必要なシークエンスリードを取得できる０．８を超えた。
ゲノムＤＮＡの１０ｐｇのサンプルでも、２回中１回はカバレッジが１９以上の割合が０．９以上であり、安定して塩基配列決定に必要なシークエンスリードを取得できる０．８を超えた。
また、毛髪ＤＮＡの毛根サンプルでも、２回中２回ともカバレッジが１９以上の割合が０．９５以上であり、安定して塩基配列決定に必要なシークエンスリードが取得できる０．８を超えた。したがって、毛母細胞由来ＤＮＡが集中する毛根部で塩基配列決定に必要なシークエンスリードを取得でき、毛髪１本からでも塩基配列を決定できる検出感度を有していることを確認した。
しかし、毛髪ＤＮＡの毛幹サンプルでは、２回中２回ともカバレッジが１９以上の割合が約０．２であり、安定して塩基配列決定に必要なシークエンスリードが取得できる０．８を超えなかった。これは、毛幹には核ＤＮＡが実質的に含まれていないことによるものである。【０１９３】
５．毛髪の毛根部に含まれるゲノムＤＮＡの由来判別
毛髪を提供した作業者Ａは作業者１〜１１のうちのいずれか１人であることが判明しているため、毛根に含まれるゲノムＤＮＡ（５０ｐｇ）から得られたＳＮＰｓ情報と、作業者１〜１１のＳＮＰｓ情報とを比較して、毛根に含まれるゲノムＤＮＡが作業者１〜１１のうち誰に由来するものであるかを判別する。
作業者ＡのＳＮＰ情報は、毛髪の毛根部から決定した塩基配列情報から取得した。
作業者１〜１１の計１１人のＳＮＰｓ情報は、予め構築してあった作業者ＳＮＰｓデータベースから取得した。
作業者Ａおよび作業者１〜１１のＳＮＰｓ情報［ホモ一致、ヘテロ不一致、ＡＤＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｄｒｏｐ  Ｏｕｔ；アレルドロップアウト）、ＡＤＩ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｄｒｏｐ  Ｉｎ；アレルドロップイン）、およびホモ不一致の個数］を、作業者９のＳＮＰｓパターンをリファレンスとして視覚化した。その結果を図３の積み上げ縦棒グラフに示す。
また、同一人らしさの尤度（確率）と別人らしさの尤度（確率）の比を距離（尤度比）としてクラスタ分析した。その結果を図４のデンドログラムに示す。
以上より、作業者ＡのＳＮＰｓパターンは作業者９のＳＮＰｓパターンと一致することが分かり、は作業者９であることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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