(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸の同定方法であり、該方法は以下の工程：
（ａ）複数の真核生物宿主細胞を含む組成物を提供する工程であって、
（ｉ）ここで各宿主細胞は異なるメンバーを含む発現系を有し、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスを含み、ここで該制御エレメントはサブゲノムプロモーターまたはウイルス内部リボソーム進入部位であり；
（ｉｉ）ここで該組換えウイルスはアルファウイルスであり；そして
（ｉｉｉ）ここで該組換えウイルスは自己複製可能である、工程；
（ｂ）該真核生物宿主細胞を、該外因性タンパク質が発現される条件下で培養する工程；および
（ｃ）目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含むメンバーを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記特性が、細胞膜に対して予め決定された細胞局在位置である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特性が、結合パートナーに対する結合親和性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルファウイルスが、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスが、さらにウイルス粒子の生成を指向する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
外因性タンパク質をコードする前記核酸が、ポリペプチドをコードする複数の異なる核酸を含有する核酸ライブラリー由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のメンバーが、前記真核生物宿主細胞の物理的な分離を用いてスクリーニングされる、請求項１に記載の方法であって、ここで該宿主細胞の各々が該複数のメンバーの１つの個別のメンバーを保有する、方法。
【請求項８】
複数の異なるメンバーを有する真核生物発現系の集団を含む核酸ライブラリーであって、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスを含み、
（ｉ）ここで該制御エレメントはサブゲノムプロモーターまたはウイルス内部リボソーム進入部位であり；
（ｉｉ）ここで該組換えウイルスはアルファウイルスであり；そして
（ｉｉｉ）ここで該組換えウイルスは自己複製可能である、核酸ライブラリー。
【請求項９】
前記アルファウイルスはシンドビスウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルファウイルスがシンドビスウイルスである、請求項８に記載の核酸ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、発現遺伝子技術および発現クローニングの分野に関する。より詳細には、本発明は、予め決定された特性（例えば、細胞局在位置、構造、酵素的機能、または他の分子に対する親和性）を有する転写されたポリペプチドをコードする核酸配列の同定、特徴づけおよび単離、ならびに対応するポリペプチドの産生に関連する。
【０００２】
【従来の技術】
（一般的背景）
タンパク質は、生物において最も重要な生体分子である；タンパク質の構造構成要素および触媒としての役割に加え、タンパク質は、調節プロセスにおける重要な役割を担う。細胞増殖および代謝機能の両方の調節は、主として多数の細胞性タンパク質および細胞外タンパク質の協同作用により、制御されそして行われる。Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，１９７５「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。例えば、重要な生理学的応答に影響を及ぼす多くの種類のシグナル伝達経路は、タンパク質の分子間相互作用によりタンパク質を介して作動する。Ｍｅｔｚｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．，１９７７「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｌｏｎｄｏｎ。さらに、遺伝子の転写およびそのような転写の調節は、多数のタンパク質因子の相互依存に依存し、そして制御される。Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．，「Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ。
【０００３】
多細胞生物の適切な機能は、細胞内の生体分子の相互作用のみに依存するわけではなく、個々の細胞はまた、適切にコミュニケートしなけらばならない。このような細胞間コミュニケーションおよび環境と細胞の相互作用は、しばしば、細胞外表面上のレセプターの作用および関連した細胞内シグナル伝達機構により実現される。Ｐｏｓｔｅ，Ｇ．，  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．，  １９７６，「Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ」，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒｅ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。情報は、細胞環境を介してコミュニケートされ、遺伝子発現または細胞内のタンパク質活性を調節する。細胞外環境における分泌タンパク質は、それにより、特定の細胞機能に対し強力な調節効果を発揮する。
【０００４】
上記の概要に照らして、細胞機能の非常に単純化されたパラダイム（細胞局在位置、構造、結合パートナーに対する親和性、または生理条件下での酵素活性を含む特定のタンパク質の特性）は、このタイプの機能を高度に示すようである。特定の細胞局在位置に関して、例えば、分泌タンパク質は、シグナルの細胞間コミュニケーターとして機能するようであるが、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有する膜結合レセプターは、細胞内に細胞外シグナルをおそらく伝達するようである。細胞質タンパク質は、細胞内シグナル伝達物質およびコーディネーターとして機能し得る。Ｊｅｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｐａｄｉｌｌａ，Ｉ．Ｌ．，Ｐａｄｉｌｌａ，Ｇ．Ｍ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ａ．Ｍ．，１９７８，「Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」，  Ｌｏｎｄｏｎ。核タンパク質は、遺伝子調節の特定の局面に関与するようである。Ｚａｗｅｌら、１９９５，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４：５３３−５６１。ゴルジ体またはＥＲで見出される成熟タンパク質は、タンパク質前駆体の翻訳後プロセシング（例えば、切断または炭水化物の添加）において調節的役割を担い得る。Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，  １９８７，  Ｃ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６３−８７。
【０００５】
（膜結合タンパク質）
多年の間、細胞機能のパラダイムは、特定の新規のレセプターおよびそれぞれの機能における膜結合タンパク質の同定に焦点をあてた、多数の薬物の発見プログラムを動機付けた。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．およびＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．，１９７０，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ」，Ｊ＆Ａ  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ。実際に多くの実例は、膜レセプターの不適切な機能は、癌のような重篤な代謝疾患および増殖疾患の発症の顕著な供給源であるとの結論を強いる。例えば、真性糖尿病の特定の形態、すなわち非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、インシュリンレセプターの変異により生じ得る。Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：７５６−７６１；  Ｔａｉｒａら、１９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：６３−６６。さらに、すべての哺乳動物の癌の３０％は、レセプターチロシンキナーゼＨＥＲ２の増幅と関連する。Ｂａｒｇｍａｎら、１９８６，  Ｃｅｌｌ  ４５：６４９−６５７；  Ｓｌａｍｏｎら、１９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２。レセプターを標的とする伝統的な薬剤発見プログラムに加え、野心的に探求された目的は、比較ゲノム学（例えば、病理学的状態における遺伝子発現の変化の決定を可能にする）を用いて、可能性のある遺伝子治療標的として膜結合レセプターを同定するようになった。Ｗｅｌｓら、１９９５，  Ｇｅｎｅ
１５９：（１）：７３−８０。
【０００６】
（分泌タンパク質）
レセプターは、主に重要な潜在的治療標的として考慮されているが、分泌タンパク質は、潜在的治療剤として、特に興味深い。分泌タンパク質は、しばしば、シグナル伝達機能またはホルモン機能を有し、それ故、高度かつ特異的な生物学的活性を有する。Ｓｃｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．，１９９４「Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ」，  Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ。例えば、分泌タンパク質は、分化および増殖、血液凝固および血栓崩壊、体細胞増殖および細胞死、ならびに免疫反応のような生理学的反応を制御する。Ｓｃｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．，１９９４，「  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  」，  Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  。
【０００７】
顕著な資金と研究の努力が、生物学的機能を制御する新規の分泌タンパク質の発見および調査のために、拡大されてきた。そのような分泌タンパク質の多くは、サイトカインおよびペプチドホルモンを含み、そして治療剤として製造され、使用される。Ｚａｖｙａｌｏｖら、１９９７，  ＡＰＭＩＳ  １０５（３）：１６１−１８６。しかし、数千の予想される分泌タンパク質のうち、ほんのいくつかのみが、現在治療化合物として使用される。ヒト生物体の現在まで発見されていない分泌タンパク質の多くは、生理学的障害を直すのに効果的であり、従って新規薬物の有望な候補であると、期待され得る。
【０００８】
過去において、新規のサイトカインおよびホルモンタンパク質は、タンパク質画分または精製タンパク質に対するその応答についての特定の細胞型をアッセイすることにより同定された。Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒら、１９９６，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５２（１）：６１−８０。他の研究者は、ＤＮＡレベルの配列類似性を用い、新規のインターフェロンおよびインターロイキンをクローン化した。Ｎａｂｏｒｉら、１９９２，  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０５（１）：４２−４６。さらに別のアプローチにおいて、ディファレンシャルディスプレイ技術は、刺激された細胞対刺激されない細胞の発現パターンを比較するために使用された。Ｎａｇａｔａら、１９８０，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８７：４０１−４０８。これら全ての方法は、特定の分泌ポリペプチドの同定および単離をもたらし得る。
【０００９】
近年、選択マーカーとしてインベルターゼ遺伝子を用いる、酵母における新規分泌型哺乳動物タンパク質をコードするためのｃＤＮＡを同定するためのスクリーニング方法が記述された。米国特許第５，５３６，６３７号（「６３７特許」）を参照のこと。開示された技術は、哺乳動物ｃＤＮＡのリーダー配列は、そのリーダー配列を欠損したインベルターゼタンパク質の搬出に効果的であるという概念に頼っている。このアプローチは、部分ｃＤＮＡをもたらし、次にこれは、全長ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。次に、目的の新規タンパク質は、標準的であるが骨の折れる技術（サブクローニング、組換え宿主の形質転換、発現、精製プロセスの開発および実行を含む）により作られ得る。さらに、６３７特許に記載されるアッセイは酵母で行われているので、単離された産物のグリコシル化パターンは、哺乳動物において生成された天然産物と有意に異なる。この差は、分泌されるタンパク質（レセプターの細胞外ドメインにもあてはまる）の非常に重要な特徴がそのグリコシル化パターンおよび炭水化物組成であるという事実に鑑みると、主要な障害である。Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら、１９８８，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７：７８５−８３８。
【００１０】
（核タンパク質）
核において、ＤＮＡの複製および遺伝子の転写の両方が、実際に行われる。多くの核タンパク質は、転写因子として、細胞周期レギュレーターとして、または両方として、これらのプロセスに直接関与する。いくつかの核タンパク質は、環境の変化に応答して、特定の代謝タンパク質の発現を起こす原因である。Ｚａｗｅｌら、１９９５，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４：５３３−５６１。他の多くは、細胞増殖の調節に直接関与する。Ｊｅｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，  Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｐａｄｉｌｌａ，Ｇ．Ｍ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ａ．Ｍ．，１９７８，「Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」，Ｌｏｎｄｏｎ。後者のクラスのタンパク質は、２つの一般的なカテゴリーに分類される：（１）癌遺伝子を含む優性形質転換遺伝子；および（２）  癌抑制遺伝子およびプログラムされた細胞死（「アポトーシス」）に関与する産物をコードする遺伝子を含む劣性細胞増殖遺伝子。
【００１１】
癌遺伝子は、一般的に、細胞増殖の促進と関連するタンパク質をコードする。細胞分裂は、正常組織の発生の重要な部分であり、そして組織の再生において重要な役割を担い続けるので、癌遺伝子活性の適切な調節は、生物体の生存にとって必須である。しかし、癌遺伝子の不適切な発現または不適当な活性制御は、制御されない細胞増殖を誘導し、そして癌のような重篤な疾患の発症を生じる。Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  １９９４，  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  ４４：１６０−１７０。
【００１２】
他方、癌抑制遺伝子は、通常、細胞増殖の「ブレーキ」として作用し、従って、癌遺伝子の活性に対抗する。従って、癌抑制遺伝子の不活性化（例えば、変異または増殖阻害効果の除去を介する）は、増殖制御の喪失を生じ得、そして癌のような細胞増殖性疾患が発症し得る。Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  １９９４，  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．  ４４：１６０−１７０。
【００１３】
癌抑制遺伝子と関連するのは、その産物が細胞の増殖の調節よりはむしろ、アポトーシスの制御に関連する遺伝子であり、これらは体における細胞の生存に影響を与える。正常細胞において、監視系は、増殖調節機構がインタクトであることを保証すると考えられている；異常が検出される場合、監視系は、アポトーシスにおいて最高に達する自殺プログラムのスイッチを入れる。
【００１４】
アポトーシスのプロセスに関与するいくつかの遺伝子が、記載されている。例えば、ＣｏｌｌｉｎｓおよびＬｏｐｅｚ  Ｒｉｖａｓ，  １９９３，  ＴＩＢＳ１８：３０７−３０８；  Ｍａｒｔｉｎら、１９９４，  ＴＩＢＳ  １９：２６−３０を参照のこと。アポトーシスに耐性の細胞は、通常細胞を超える利点を有し、そしてその通常の対応物よりも増殖して組織を占有する傾向がある。結果として、アポトーシスに関与する遺伝子の不活性化は、腫瘍の進行を生じ得、そして実際には、腫瘍形成の重要な段階である。
【００１５】
したがって、核タンパク質の同定は、目的の２つの領域を扱う。第１に、癌遺伝子は、癌の処置のための高度に特異的な薬物の開発のための役に立つ標的でありやすい。第２に、腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスを誘導するタンパク質は、癌の処置のための薬剤として有用であり得る。
【００１６】
（他の細胞局在位置）
残りの多くの細胞局在位置もまた、特定の機能と関連する。例えば、ほとんどの代謝酵素は、ミトコンドリアに局在する。Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，１９７５，  「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。従って、ミトコンドリアタンパク質は、代謝疾患の処置のための標的を明らかにし得る。ゴルジ体よびＥＲは、タンパク質の翻訳後のプロセッシングに関連する；そのようなプロセスは、タンパク質折り畳みおよびグリコシル化に関連する疾患の処置のための役立つ標的である。Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら、１９８８，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７：７８５−８３８。
【００１７】
（酵素活性）
特定の酵素活性は、タンパク質の機能の指標であり得る。例えば、キナーゼは、頻繁にシグナル伝達プロセスに関与する。
【００１８】
（構造）
タンパク質はまた、タンパク質の機能を示す。実際、類似の構造のタンパク質は、頻繁に特定の機能的特性を共有する。従って、目的の特定の機能を有する既知のタンパク質の構造と関連する構造を有するタンパク質を同定することにより、そのような機能を有するさらなるタンパク質を明らかにし得る。
【００１９】
一般的に、目的の特性（例えば、細胞における局在位置、結合パートナーへの親和性、酵素活性、構造など）により、予めタンパク質を分類することを可能にする方法が、所望される。そのような方法は、例えば、サイトカインのような分泌タンパク質、レセプターのような膜結合タンパク質、転写因子のような核タンパク質、呼吸タンパク質のようなミトコンドリアタンパク質などのライブラリーを生成することを可能にする。さらに、適切なグリコシル化パターンを達成するために、哺乳動物細胞において任意の産物のスクリーニング、単離、および産生を行うことが所望される。最後に、もっとも好ましい方法は、さらに、部分ＤＮＡ配列よりむしろ、目的のタンパク質自体の同定および単離を可能にする。
【００２０】
本発明は、この必要性を扱う。本発明は、予め決定された特性（細胞局在位置、構造、酵素的機能、または他の分子との親和性を含むがこれらに限定されない）のポリペプチドをコードする発現ライブラリーの生成のための方法および発現系を提供する。本発明の方法および発現系は、目的の新規のタンパク質をコードする核酸の同定および単離を可能にする。方法および発現系は、さらに、今までのところ解明されていないレセプター／リガンドの関係を同定するための強力な系を提供する。提供される方法は、哺乳動物系を含む広範な種々の宿主細胞系において使用され得るので、この方法は適切な炭水化物組成を有する発現産物を提供する。
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する：
１．目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸の同定方法であり、該方法は以下の工程：ａ．複数の真核生物宿主細胞を含む組成物を提供する工程であって、ここで各宿主細胞は異なるメンバーを含む発現系を有し、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含む、工程；ｂ．該真核生物宿主細胞を、該外因性タンパク質が発現するが、該真核生物宿主細胞の内因性タンパク質の発現は抑制される条件下で培養する工程；およびｃ．目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含むメンバーを同定する工程、を包含する、方法。
【００２２】
２．前記特性が、予め決定された細胞局在位置である、項１に記載の方法。
【００２３】
３．前記予め決定された細胞局在位置が、細胞外空間である、項２に記載の方法。
【００２４】
４．前記予め決定された細胞局在位置が、細胞膜である、項２に記載の方法。
【００２５】
５．前記予め決定された細胞局在位置が、核、リソソーム、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、ペルオキシソーム、エンドソーム、および細胞質からなる群から選択される、項２に記載の方法。
【００２６】
６．前記特性が、結合パートナーに対する結合親和性である、項１に記載の方法。
【００２７】
７．前記特性が、酵素活性である、項１に記載の方法。
【００２８】
８．前記特性が、構造的特性である、項１に記載の方法。
【００２９】
９．前記外因性タンパク質が標識されるが、前記内因性タンパク質の発現が抑制される、項１に記載の方法。
【００３０】
１０．前記外因性タンパク質が、放射性マーカーおよび分光学的に検出可能なマーカーからなる群より選択されるマーカーで標識される、項９に記載の方法。
【００３１】
１１．前記放射性マーカーが、放射性アミノ酸および放射性糖からなる群より選択される、項１０に記載の方法。
【００３２】
１２．前記メンバーの各々が、個別の真核生物宿主細胞において発現される、項１に記載の方法。
【００３３】
１３．前記制御エレメントが、ウイルス由来である、項９に記載の方法。
【００３４】
１４．前記ウイルスが、内因性タンパク質の発現を抑制する、項１３に記載の方法。
【００３５】
１５．前記ウイルスが、アルファウイルスである、項１３に記載の方法。
【００３６】
１６．前記アルファウイルスが、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスからなる群より選択される、項１５に記載の方法。
【００３７】
１７．前記発現系が、さらにウイルス粒子の生成を指向する、項１３に記載の方法。
【００３８】
１８．前記ウイルス粒子を前記外因性タンパク質より分離する工程をさらに包含する、項１７に記載の方法。
【００３９】
１９．前記ウイルス粒子が、前記外因性タンパク質より、濾過、クロマトグラフィー、または沈殿を介して分離される、項１８に記載の方法。
【００４０】
２０．前記制御エレメントが、前記ウイルスの増殖に必要な少なくとも１つの機能を欠損する、項１４に記載の方法。
【００４１】
２１．前記ウイルスの増殖に必要な前記機能が、ヘルパー機能を介して提供される、項２０に記載の方法。
【００４２】
２２．前記ヘルパー機能が、ウイルスパッケージング細胞株またはヘルパーウイルス粒子により提供される、項２１に記載の方法。
【００４３】
２３．前記制御エレメントが、外因性タンパク質をコードする前記核酸の発現を指向し得るが、内因性タンパク質の発現が抑制されるウイルス由来である、項１に記載の方法。
【００４４】
２４．前記内因性タンパク質の発現が、該内因性タンパク質をコードする核酸の転写または翻訳の阻害により抑制される、項２３に記載の方法。
【００４５】
２５．前記制御エレメントが、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩのインヒビター存在下で、前記外因性タンパク質をコードする前記組換え核酸の転写を促進し、ここで工程ｂにおいて、前記真核生物宿主細胞を、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩのインヒビターの有効量の存在下で培養する、項１に記載の方法。
【００４６】
２６．前記インヒビターが、アクチノマイシンＤ、アフラトキシンＢ１、およびアマトキシンからなる群より選択される、項２５に記載の方法。
【００４７】
２７．前記ウイルス粒子が、可溶化ウイルスタンパク質を産生し、ここで、該可溶化ウイルスタンパク質の産生が減少する、項１７に記載の方法。
【００４８】
２８．前記ウイルスの可溶化タンパク質の産生が、プロテアーゼインヒビターの使用により減少する、項２７に記載の方法。
【００４９】
２９．前記ウイルスの可溶化タンパク質の産生が、変異ウイルス株の使用により減少する、項２７に記載の方法。
【００５０】
３０．前記変異ウイルス株が、温度感受性シンドビス変異体ｔｓ２０、ｔｓ１０、およびｔｓ２３からなる群より選択される、項２９に記載の方法。
【００５１】
３１．前記ウイルスの可溶化タンパク質の産生が、該ウイルスのタンパク質の切断が欠損する細胞株の使用により減少する、項２７に記載の方法。
【００５２】
３２．前記細胞株が、タンパク質ＰＥ２のＥ２およびＥ３への切断を欠損する、項３１に記載の方法。
【００５３】
３３．外因性タンパク質をコードする前記核酸が、ポリペプチドをコードする複数の異なる核酸を含有する核酸ライブラリー由来である、項１に記載の方法。
【００５４】
３４．前記複数のメンバーが、前記真核生物宿主細胞の物理的な分離を用いてスクリーニングされる、項１に記載の方法であって、ここで該宿主細胞の各々が該複数のメンバーの１つの個別のメンバーを保有する、方法。
【００５５】
３５．前記物理的な分離が、半固形培地における前記真核生物宿主細胞の分離により達成される、項３４に記載の方法。
【００５６】
３６．前記物理的な分離が、真核生物宿主細胞を別々のコンパートメントに配置する工程により達成され、ここで、各コンパートメントは、前記複数の発現系と同一の発現系を保有する宿主細胞を含む、項３４に記載の方法。
【００５７】
３７．前記発現系が、自律複製可能である、項１に記載の方法。
【００５８】
３８．目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸の同定方法であり、該方法は以下の工程：ａ．複数の真核生物宿主細胞を含む組成物を提供する工程であって、ここで各宿主細胞は異なるメンバーを含む発現系を有し、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスを含む、工程；ｂ．該真核生物宿主細胞を、該外因性タンパク質が発現される条件下で培養する工程；およびｃ．目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含むメンバーを同定する工程、を包含する、方法。
【００５９】
３９．前記特性が、予め決定された細胞局在位置である、項３８に記載の方法。
【００６０】
４０．前記予め決定された細胞局在位置が、細胞外空間である、項３９に記載の方法。
【００６１】
４１．前記予め決定された細胞局在位置が、細胞膜である、項３９に記載の方法。
【００６２】
４２．前記予め決定された細胞局在位置が、核、リソソーム、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、ペルオキシソーム、エンドソーム、および細胞質からなる群から選択される、項３９に記載の方法。
【００６３】
４３．前記特性が、結合パートナーに対する結合親和性である、項３８に記載の方法。
【００６４】
４４．前記特性が、酵素活性である、項３８に記載の方法。
【００６５】
４５．前記特性が、構造的特性である、項３８に記載の方法。
【００６６】
４６．前記真核生物宿主細胞を、前記外因性タンパク質が発現されるが、前記真核生物宿主細胞の内因性タンパク質の発現が抑制される条件下で培養される、項３８に記載の方法。
【００６７】
４７．前記外因性タンパク質が標識されるが、前記内因性タンパク質の発現が抑制される、項３８に記載の方法。
【００６８】
４８．前記外因性タンパク質が、放射性マーカーおよび分光学的に検出可能なマーカーからなる群より選択されるマーカーで標識される、項４７に記載の方法。
【００６９】
４９．前記放射性マーカーが、放射性アミノ酸および放射性糖からなる群より選択される、項４８に記載の方法。
【００７０】
５０．前記メンバーの各々が、個別の真核生物宿主細胞において発現される、項３８に記載の方法。
【００７１】
５１．前記ウイルスが、内因性タンパク質の発現を抑制する、項３８に記載の方法。
【００７２】
５２．前記ウイルスが、アルファウイルスである、項３８に記載の方法。
【００７３】
５３．前記アルファウイルスが、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスからなる群より選択される、項５２に記載の方法。
【００７４】
５４．前記ウイルスが、さらにウイルス粒子の生成を指向する、項３８に記載の方法。
【００７５】
５５．前記ウイルス粒子を前記外因性タンパク質から分離する工程をさらに包含する、項５４に記載の方法。
【００７６】
５６．前記ウイルス粒子が、前記外因性タンパク質から、濾過、クロマトグラフィー、または沈殿を介して分離される、項５５に記載の方法。
【００７７】
５７．前記ウイルスが、該ウイルスの増殖に必要な少なくとも１つの機能を欠損する、項５１に記載の方法。
【００７８】
５８．前記ウイルスの増殖に必要な前記機能が、ヘルパー機能を介して提供される、項５７に記載の方法。
【００７９】
５９．前記ヘルパー機能が、ウイルスパッケージング細胞株またはヘルパーウイルス粒子により提供される、項５８に記載の方法。
【００８０】
６０．前記ウイルスが、外因性タンパク質をコードする前記核酸の発現を指向し得るが、内因性タンパク質の発現が抑制される、項３８に記載の方法。
【００８１】
６１．前記内因性タンパク質の発現が、該内因性タンパク質をコードする核酸の転写または翻訳の阻害により抑制される、項６０に記載の方法。
【００８２】
６２．前記ウイルス粒子が、可溶化ウイルスタンパク質を産生し、ここで、前記可溶化ウイルスタンパク質の産生が減少する、項５４に記載の方法。
【００８３】
６３．前記ウイルスの可溶化タンパク質の産生が、プロテアーゼインヒビターの使用により減少する、項６２に記載の方法。
【００８４】
６４．前記ウイルスの可溶化タンパク質の産生が、変異ウイルス株の使用により減少する、項６２に記載の方法。
【００８５】
６５．前記変異ウイルス株が、温度感受性シンドビス変異ｔｓ２０、ｔｓ１０、およびｔｓ２３からなる群より選択される、項６４に記載の方法。
【００８６】
６６．前記ウイルスの可溶化タンパク質の産生が、該ウイルスのタンパク質の切断が欠損する細胞株の使用により減少する、項６２に記載の方法。
【００８７】
６７．前記細胞株が、タンパク質ＰＥ２のＥ２およびＥ３への切断を欠損する、項６６に記載の方法。
【００８８】
６８．外因性タンパク質をコードする前記核酸が、ポリペプチドをコードする複数の異なる核酸を含有する核酸ライブラリー由来である、項３８に記載の方法。
【００８９】
６９．前記複数のメンバーが、前記真核生物宿主細胞の物理的な分離を用いてスクリーニングされる、項３８に記載の方法であって、ここで該宿主細胞の各々が該複数のメンバーの１つの個別のメンバーを保有する、方法。
【００９０】
７０．前記物理的な分離が、半固形培地における前記真核生物宿主細胞の分離により達成される、項６９に記載の方法。
【００９１】
７１．前記物理的な分離が、真核生物宿主細胞を別々のコンパートメントに配置する工程により達成され、ここで、各コンパートメントは、前記複数の発現系と同一の発現系を保有する宿主細胞を含む、項６９に記載の方法。
【００９２】
７２．前記組換えウイルスが、自己複製可能である、項３８に記載の方法。
【００９３】
７３．予め決定された目的の特性を有するタンパク質をコードする遺伝子発現ライブラリーの生成方法であり、該方法は以下の工程：ａ．複数の真核生物宿主細胞を含む組成物を提供する工程であって、ここで各宿主細胞は異なるメンバーを含む発現系を有し、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含む、工程；ｂ．該真核生物宿主細胞を、該外因性タンパク質が発現するが、該真核生物宿主細胞の内因性タンパク質の発現は抑制される条件下で培養する、工程；およびｃ．目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含むメンバーを同定する工程、を包含する、方法。
【００９４】
７４．外因性タンパク質をコードする前記核酸が、異なるポリペプチドをコードする複数の核酸を含む核酸ライブラリー由来である、項７３に記載の方法。
【００９５】
７５．予め決定された細胞局在位置に局在するタンパク質をコードする複数の発現系を含む遺伝子発現ライブラリーであり、項７３に記載の方法で生成される、遺伝子発現ライブラリー。
【００９６】
７６．前記タンパク質が、分泌タンパク質である、項７５に記載の発現ライブラリー。
【００９７】
７７．前記タンパク質が、細胞膜結合レセプターである、項７５に記載の発現ライブラリー。
【００９８】
７８．前記細胞局在位置が、核、リソソーム、およびミトコンドリアからなる群から選択される、項７５に記載の発現ライブラリー。
【００９９】
７９．項７３に記載の方法を用いて生成される、外因性タンパク質のライブラリー。
【０１００】
８０．複数の異なるメンバーを有する真核生物発現系の集団を含む核酸ライブラリーであって、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含み、ここで、該制御エレメントは該外因性タンパク質の発現を指向するが、該真核生物宿主細胞の内因性タンパク質の発現は抑制される、核酸ライブラリー。
【０１０１】
８１．予め決定された目的の特性を有するタンパク質をコードする遺伝子発現ライブラリーの生成方法であり、該方法は以下の工程：ａ．複数の真核生物宿主細胞を含む組成物を提供する工程であって、ここで各宿主細胞は異なるメンバーを含む発現系を有し、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスを含む、工程；ｂ．該真核生物宿主細胞を、該外因性タンパク質が発現する条件下で培養する工程；およびｃ．目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含むメンバーを同定する工程、を包含する、方法。
【０１０２】
８２．外因性タンパク質をコードする前記核酸が、異なるポリペプチドをコードする複数の核酸を含有する核酸ライブラリー由来である、項８１に記載の方法。
【０１０３】
８３．予め決定された細胞局在位置に局在するタンパク質をコードする複数の発現系を含む遺伝子発現ライブラリーであり、項８１に記載の方法で生成される、遺伝子発現ライブラリー。
【０１０４】
８４．前記タンパク質が、分泌タンパク質である、項８３に記載の発現ライブラリー。
【０１０５】
８５．前記タンパク質が、細胞膜結合レセプターである、項８３に記載の発現ライブラリー。
【０１０６】
８６．前記細胞局在位置が、核、リソソーム、およびミトコンドリアからなる群から選択される、項８３に記載の発現ライブラリー。
【０１０７】
８７．項８１に記載の方法を用いて生成される、外因性タンパク質のライブラリー。
【０１０８】
８８．複数の異なるメンバーを有する真核生物発現系の集団を含む核酸ライブラリーであって、各メンバーは制御エレメントと作動可能に連結した外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスを含む、核酸ライブラリー。
【０１０９】
本発明は、一般に、発現遺伝子技術および発現クローニングの分野に関する。より詳細には、本発明は、所定の特性（これには、細胞局在位置、構造、酵素機能、および他の分子との親和性、ならびに対応するポリペプチドの産生を含むがこれらに限定されない）を有するポリペプチドをコードする転写された核酸配列の同定、特徴付け、および単離に関する。
【０１１０】
より詳細には、本発明は、目的の所定の特性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するための方法に関する。このような特性は、特定の細胞局在位置、構造、酵素機能、または他の分子との親和性を含み得る。本発明の１つの実施態様において、複数の真核生物宿主細胞が提供され、ここで、各宿主細胞は、各メンバーが制御エレメントと作動可能に連結した、外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含む、異なるメンバーを含む発現系を有する。第二の工程において、真核生物宿主細胞は、真核生物宿主細胞の内因性タンパク質の発現を抑制しつつ、外因性タンパク質が発現される条件下で培養される。この時間枠において、外因性タンパク質は、必要に応じて標識されるか、または処理していない外因性タンパク質からの識別を可能にする方法で処理され得る。最後に、目的の特性を有する外因性タンパク質（単数または複数）をコードする発現系のメンバー（単数または複数）が同定される。
【０１１１】
本発明の別の局面において、目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を同定するための方法は、複数の真核生物宿主細胞を提供することによって達成され、ここで、各宿主細胞は、異なるメンバーを含む発現系を有し、そして各メンバーは制御エレメントに作動可能に連結された、外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスを含む。この真核生物宿主細胞を培養して、外因性タンパク質を発現させ、そして目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を発現する発現系を同定する。必要に応じて、発現系は、真核生物宿主細胞の内因性タンパク質産生を抑制しつつ、外因性タンパク質の発現をし得る。任意の種類の組換え真核生物ウイルスが使用され得るが、特に有利なウイルスはアルファウイルスである。さらに、外因性タンパク質は、内因性タンパク質より優先的に標識され得るかまたは識別され得る。組換えウイルスは、ウイルス粒子の生成を指向することおよび複製することが可能であり得、または組換えウイルスは、増殖に必要な機能を欠失し得る。
【０１１２】
本発明にはまた、目的の所定の特性を有するタンパク質をコードする遺伝子発現ライブラリーを生成するための方法が含まれる。１つの局面において、このような方法は、複数の真核生物宿主細胞を提供する工程であって、各宿主細胞が異なるメンバーを含む発現系を有し、各メンバーが制御エレメントに作動可能に連結された、外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する、工程、上記真核生物宿主細胞の内因性タンパク質の発現を抑制しつつ上記外因性タンパク質を発現する条件下でこの真核生物宿主細胞を培養する工程、ならびに目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を発現するメンバーを同定する工程を包含する。別の局面において、この方法は、複数の真核生物宿主細胞を提供する工程であって、各宿主細胞が異なるメンバーを含む発現系を有し、各メンバーが制御エレメントに作動可能に連結された、外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスである、工程、この真核生物宿主細胞を培養してこの外因性タンパク質を発現させる工程、ならびに目的の特性を有する外因性タンパク質をコードする組換え核酸を発現するメンバーを同定する工程を包含する。本発明は、このような方法を使用して同定されたタンパク質のライブラリーをさらに包含する。さらに、本発明は、各メンバーが真核生物宿主細胞での発現のための制御エレメントに作動可能に連結された、外因性タンパク質をコードする組換え核酸を有する、複数のメンバーを含む真核生物発現系の集団を有する核酸ライブラリーを含む。１つの実施態様において、制御エレメントは、真核生物宿主細胞における内因性タンパク質の発現を抑制しつつ、外因性タンパク質の発現を指向する。さらに別の実施態様において、制御エレメントは、真核生物ウイルスに由来する。
【０１１３】
（ＩＶ．定義）
本明細書において使用される用語は、一般に、当該分野で代表的に使用されるとおりである。以下の用語は、本明細書において使用される場合、以下の一般的な意味を有することが意図される。
【０１１４】
用語「細胞局在位置」とは、細胞の状況において定義された局在化をいい、これには、細胞外空間および任意の定義された細胞内区画（これには、核、ミトコンドリア、リソゾーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ、細胞質、細胞膜、エンドサイトーシスベシクルまたはエキソサイトーシスベシクル、細胞骨格、ペルオキシゾームが含まれるがこれらに限定されない）が含まれる。細菌または植物細胞において、細胞局在位置はさらに、細胞壁および葉緑体を含み得る。
【０１１５】
用語「制御エレメント」とは、作動可能に連結したポリペプチドをコードする核酸の発現を指向し得る核酸成分をいう。一般に、「制御エレメント」は、遺伝子情報の転写および／または翻訳に必要とされる調節配列を含む。制御エレメントは、特定の条件または環境下で、内因性宿主タンパク質の発現を抑制しつつ作動可能に連結した核酸の選択的発現を促進する成分をさらに含む。必要に応じて，「制御エレメント」は、作動可能に連結した核酸のパッケージングを容易にする成分をさらに含み得る。
【０１１６】
用語「外因性タンパク質」とは、組換え核酸によってコードされるタンパク質をいう。「外因性タンパク質」が細胞において発現される場合、細胞またはその先祖に導入された組換え核酸によってコードされる。本発明の発現系において、外因性タンパク質をコードする核酸は、制御エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの環境において、外因性タンパク質は、細胞によって内因的に産生されるものと同じタンパク質であり得る。
【０１１７】
用語「ウイルス」とは、細胞中に遺伝情報を導入し得る生物体（ｅｎｔｉｔｙ）をいう。遺伝情報は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの誘導体の形態で導入され得る。細胞は、真核生物性または原核生物性であり得る。
【０１１８】
【発明の実施の形態】
（Ｖ．発明の詳細な説明）
（Ａ．本発明の一般的な概観）
本発明は、所定の特性（これには、細胞局在位置、構造、酵素機能、または他の分子との親和性を含むがこれらに限定されない）を有するポリペプチドをコードする、転写された核酸配列を迅速に同定、特徴付け、および単離することを可能にする方法および発現系に関する。本発明は、発現系の永続的な部分である内因性細胞タンパク質および組換えタンパク質を含む、系に存在する独特の外因性の目的のタンパク質とすべての他の「共通する」タンパク質との間の識別を可能にする物質および組成物を本発明者らが驚くべき発見したことに部分的に基づく。一般に、本発明の方法は、真核生物宿主細胞系を使用する。この系には、発現系が、本発明に従って、任意のさらなる特徴について導入されている。好ましくは、使用される発現系は、１真核生物細胞当たり、１回のみの発現系の導入を可能にする固有の特徴を有する。このような系は、個々の発現される配列の迅速な１工程クローニングを可能にするという利点を有する。
【０１１９】
以下により詳細に記載する系は、多数の利点を有する。第一に、本発明の系は、１工程での全長ｃＤＮＡのクローニングを指向することを可能にする発現クローニング系である。第二に、これは、目的のタンパク質の迅速な発現をサブクローニングおよび産生細胞株の樹立のようなさらなる煩わしい手間をかけることなく、容易にさせる。第三に、産物が哺乳動物細胞において発現され得るので、この系は、正確に折り畳まれ、グリコシル化され、かつ活性な物質を生じ得る。第四に、この系は、タンパク質の性質の明白な知識なしに、物質の迅速な精製を可能にする。第五に、これは、任意の状況（動物を含む）における結合の部位の迅速な同定を容易にする物質の標識を可能にする。最後に、この系は、培養された細胞、組織、または動物への遺伝子の移入に有用なベクターを直接提供する。
【０１２０】
１つの局面において、本発明は、所定の特性（例えば、細胞局在位置）を有する新規のおよび公知のタンパク質の同定および単離を可能にする方法を開示する。より詳細には、適切な宿主細胞系において発現される独特の外因性タンパク質をコードする複数の発現系内で、開示された方法は、目的の細胞区画に位置する外因性タンパク質をコードするこれらの発現系を同定し、そして単離することを可能にする。この方法は、その局面の１つにおいて、特定の時間枠の間、内因性タンパク質の合成を抑制しつつ、外因性タンパク質の高度の発現を可能にする、使用される発現系をの独特な特徴に基づく。この時間枠の間、発現された外因性タンパク質が特定の検出される方法（例えば、放射能標識）で処理される場合、それらは、選択された細胞画分内で容易に同定され得る。あるいは、内因性タンパク質の合成が抑制される時間枠の前に発現されるすべてのタンパク質は、同定され得る方法で処理され得る；この場合、内因性タンパク質の発現を阻害しつつこのような処置の後で発現される外因性タンパク質は、処理によって生じる特徴を示さないことによって同定され得る。
【０１２１】
１つの局面において、本発明の方法は、分泌タンパク質をコードする個々の発現系を同定および単離するのに使用され得る。宿主細胞系の内因性タンパク質の発現が抑制される時間枠の間、外因性タンパク質は、例えば、放射性アミノ酸とのインキュベーションにより標識される。続いて、すべての分泌タンパク質は、個々の発現系を含む宿主細胞から分離される。この分離は、分泌タンパク質画分を、それが由来する宿主細胞／発現系と相関づけることを可能にする様式で行われる。例えば、個々の発現系を含む宿主細胞は、半固体の培地（例えば、個々のクローンまたはコロニーの物理的分離を可能にする濃度での軟寒天）において増殖され得る。分泌タンパク質が、例えば、ニトロセルロースフィルターにおける垂直拡散プロセスによって細胞から分離される（これは、フィルターを半固体培地の上部におくことによって達成され得る）場合、分泌タンパク質は、この半固体培地における対応する宿主細胞の物理的分布パターンを正確に反映するパターンでフィルターに結合する。従って、外因性分泌タンパク質を含むこれらの宿主細胞／発現系は、分泌タンパク質の画分における標識の存在によって容易に同定され得る。
【０１２２】
同様に、この方法を適用して、本願の明細書においてより詳細に記載するように、膜会合タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、リソソームタンパク質、ゴルジ装置タンパク質、ＥＲタンパク質などを同定および単離し得る。手短には、上記の原理を、改変を伴って適用して、目的の任意の他の所定の細胞位置に局在化された外因性タンパク質を同定および単離し得る。さらに、本発明の方法および発現系を適用して、特定の酵素活性、結合パートナーに対する結合親和性、または目的の構造を有する外因性タンパク質をコードする核酸を同定および単離し得る。
【０１２３】
第二の一般的な局面において、本発明は、所定の結合分子および基質（リガンド）が利用可能である外因性タンパク質をコードする核酸の発現クローニングを可能にする方法を提供する。例えば、公知のレセプターに対する未知の分泌リガンドを同定するために、レセプタータンパク質を、タンパク質と飽和する（すなわち、いかなるタンパク質分子にももはや結合しない）ような様式で、フィルター（例えば、ニトロセルロース）に固定し得る。標準的な方法を用いて決定され得る、レセプターのリガンドを発現することが公知の供給源からの発現された核酸を用いて調製された、複数の発現系が提供される。発現系はまた、個々の発現系を含む宿主細胞が、例えば、半固体の培地において細胞を増殖させることによって、同定可能な方法で、物理的に分離可能である様式で適切な宿主細胞に導入され、そして発現される。同様に、分泌タンパク質を含む発現系の同定について記載されるように、外因性タンパク質は、内因性タンパク質の発現が抑制される時間枠内に標識される。続いて、分泌タンパク質は、レセプタータンパク質で飽和しているニトロセルロースフィルターへと移される。フィルター上のすべての結合位置がタンパク質で飽和されている（前出を参照のこと）ので、レセプターに結合しているリガンドのみがフィルターに接着し得る。レセプターのリガンドに対応する外因性タンパク質は、その標識に起因して同定され得、そしてそれに由来する発現系と相関付けられ得る。従って、所定のリガンドに対するレセプターがクローニングされ、そして宿主細胞へのこの標識されたリガンドの結合が検出される場合、標識されたリガンドは、複数の発現系を含む宿主細胞に供され、そして宿主細胞に対するこの標識されたリガンドの結合が検出される。リガンド結合を生じる個々の発現系は、単離され得る。
【０１２４】
本発明によって提供される発現系によって提供される１つの利点は、発現系が広範な種々の宿主細胞に導入され得、そして発現され得ることである。従って、レセプターおよびリガンドの発現クローニングは、レセプターおよびリガンドに由来するものと同じかまたは関連のある種の宿主細胞系において行われ得る。これは、種依存性であることが公知であり、そしてレセプターリガンド結合に影響を与え得るグリコシル化パターンの意義に特に照らせば、価値ある特徴である。
【０１２５】
（Ｂ．所定の特性を有するタンパク質の同定および単離のためのプロセス）
１．発現系
本発明によって提供される方法についての１つの重要な成分は、多数の特徴を有する発現ベクターである。本発明の方法を実施するために、１つ以上の独特の発現系が生成され、そして真核生物宿主細胞に導入され、これによって、概して各細胞が独特の型の発現系を含む宿主細胞の集団をもたらす。しかし、この宿主細胞の集団は、同じ発現系を有するいくつかの細胞を含み得ることが理解される。
【０１２６】
一般に、本発明によって提供される発現系は、２つの重要なエレメントを含む核酸分子である。第一に、これは、制御エレメントを含む；第二に、これは、「外因性タンパク質」と称する組換えタンパク質をコードする異種核酸（これは、制御エレメントに作動可能に連結される）を含む。
【０１２７】
（制御エレメント）
最も基本的な型において、制御エレメントは、外因性タンパク質の転写および翻訳を容易にする成分を含む。好ましくは、制御エレメントはまた、特定の環境下において宿主内の内因性タンパク質の発現を抑制しつつ、発現タンパク質の選択的発現を促進する成分であるか、またはこの成分を含む。制御エレメントは、以下に詳述するように、さらなる成分をさらに含み得る。
【０１２８】
本発明の実施に有用な制御エレメントは、多数の供給源に由来し得る。代表的には、制御エレメントは、ウイルスに由来する。真核生物細胞における発現を指向し得る種々のウイルス制御エレメントが記載されている。特に好ましい制御エレメントは、特定の環境下で内因性タンパク質の発現を阻害しつつ真核生物細胞における核酸の発現をさらに促進し得る。このようなウイルス制御エレメントはともに、すでに記載されており、そしてまだ発見されていないものは本発明の範囲内である。
【０１２９】
ＲＮＡウイルスの群のウイルスが本発明にとって好ましいベクターである。アルファウイルスの群の最も好ましいウイルスがウイルスベクターとして使用される。なぜなら、それらは、それ自身が宿主タンパク質合成をブロックする能力を有するからである。適切なアルファウイルスの例は、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、またはベネズエラウマ脳炎ウイルスである。種々のアルファウイルス由来の制御エレメントが記載されている。とりわけ、ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｅｍおよびＧａｒｏｆｆ、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３５６−３６１；Ｈａｈｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９−２６８３；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６を参照のこと。
【０１３０】
アルファウイルスは、トガウイルス科の正鎖ＲＮＡウイルスである。Ｓｔｒａｕｓｓら、１９９４、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、４９１〜５６２頁。アルファウイルスは、広範な宿主細胞（これは、哺乳動物、鳥類、両生類、爬虫類、および昆虫類）において機能し得る。アルファウイルスのゲノムは、このゲノムウイルスの核酸によってコードされるタンパク質の発現を大量に指向し得るエレメントを含む。
【０１３１】
アルファウイルスゲノムによってコードされるタンパク質の発現は、宿主細胞のゲノムによってコードされるタンパク質の発現には依存しない。細胞遺伝子の転写は、ウイルスがコードする核酸の発現に明白には影響せずに、停止され得る。さらに、アルファウイルスのウイルスゲノムの細胞における発現は、細胞メッセンジャーＲＮＡ分子の翻訳の阻害をもたらすことが見い出された。Ｆｒｏｌｏｖら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１７２１−１７２７。アルファウイルスが媒介する細胞におけるタンパク質の発現のこの特徴は、、本発明の実施に特に有用である。
【０１３２】
組換え核酸が第二のサブゲノムプロモーターまたは別の遺伝子エレメントの下流のゲノムにおける部位に挿入され得、これが外因性核酸の発現へと導き得る、例えば、アルファウイルス群の多数の二重サブゲノムベクターが提供される。Ｈａｈｎら、ＰＮＡＳ、８９：２６７９−２６８３。例えば、内部リボソーム進入部位がシンドビスウイルスバックグラウンドにおいて機能的であることは周知である。細胞質において耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）の上流にウイルス内部リボソーム進入部位を含むＲＮＡ分子は、Ｇ４１８を用いる選択を生存するのに充分である。従って、ウイルス内部リボソーム進入部位は、翻訳に充分である。また、ゲノム内の多くの部位が、外因性核酸の発現について機能的である。構造遺伝子の上流または下流に第二のサブゲノム的プロモーター／発現カセットを含むシンドビスウイルスベクターが操作されている。  Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６、ＰＮＡＳ、９３：１１３７１−１１３７７。さらに、クローニング容量の増加およびベクターの安全性の増強のために、構造タンパク質は、パッケージング細胞株またはヘルパーウイルス粒子のいずれかによって提供されるヘルパー機能によって供給され得る。Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４３３−６４４６頁。レプリコンから構造タンパク質を除去することは、使用されるベクターのクローニング容量を増加させ、これは、大きな分泌タンパク質および糖タンパク質のクローニングにとって有利である。以下を参照のこと。これらの実施例を用いて指摘されるように、遺伝子配置の多くの改変が本発明の範囲内で可能である。
【０１３３】
アルファウイルス制御エレメントが最も好ましいが、宿主細胞のタンパク質合成が停止する場合に、ウイルス制御下でタンパク質合成が生じ得る合成の規準を満たす多数の他のウイルス制御エレメントが使用され得る。本発明に従えば、種々の方法を適用して、宿主細胞タンパク質合成からウイルスタンパク質合成を分離し得る。例えば、タンパク質をコードするすべての真核生物遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。従って，転写についてＲＮＡポリメラーゼＩＩを使用しない制御エレメントが使用される場合、宿主タンパク質合成は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩインヒビターを用いて選択的に阻害され得る；転写の阻害はまた、結果的に翻訳の阻害を導く。
【０１３４】
種々の他のＲＮＡポリメラーゼＩＩ特異的インヒビターが記載され、そして本発明のこの実施態様の実施について有用である。当業者は、どのＲＮＡポリメラーゼＩＩ特異的インヒビターを使用するべきかを容易に理解する。例えば、抗生物質は、そのような阻害に有用なものとして実証されている。このような抗生物質は、例えば、アクチノマイシンＤ、アフラトキシンＢ１、アマトキシンであり、これらは、本発明のこの実施態様の実施について有用である。
【０１３５】
本発明の別の実施態様において、制御エレメントが、原核生物細胞に由来し得る。その場合、発現系はまた、細菌性ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む。次いで、宿主転写はまた、アクチノマイシンＤ、アフラトキシンＢ１、アマトキシンのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩインヒビターを用いて選択的に阻害され得る。当業者は、本発明の実施の際にどの制御エレメント用いるべきかを容易に理解する。
【０１３６】
本発明のさらに別の実施態様において、真核生物系に由来する制御エレメントが本発明の発現系において使用され得る。例えば、制御エレメントとしてＲＮＡポリメラーゼＩまたはＩＩＩに特異的なプロモーターまたはエンハンサーエレメントを使用し得る。これは、外因性タンパク質をコードする核酸の発現を、ＲＮＡポリメラーゼＩまたはＩＩＩに依存性にするが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩには依存性にはしない。真核生物宿主細胞においてタンパク質をコードする遺伝子がＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されることが実証されており、そして当該分野においてＲＮＡポリメラーゼＩＩのみがこのような転写を担うと考えられている。従って、本実施態様の実施において、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ特異的なインヒビターを添加すること、従って外因性タンパク質の発現に対するこのような効果なしに内因性タンパク質の発現を阻害することによってＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性転写を阻害し得る。
【０１３７】
（外因性タンパク質をコードする核酸）
上記に示すように、本発明の発現系は、制御エレメントに加えて、制御エレメントに作動可能に連結されている外因性タンパク質をコードする組換え核酸を含む。この組換え核酸は、任意の供給源（すなわち、任意の生物、組織または細胞型、疾患状態など）に由来し得る。本発明の１つの実施態様において、複数の異なる核酸が複数の発現系に挿入され、その結果、各々が独特の外因性タンパク質をコードする複数の発現系が生成される。あるいは、特徴付けられる１つの特定の外因性タンパク質をコードする１つの目的の公知または未知の核酸は、発現系に挿入され得る。
【０１３８】
本発明の１つの実施態様において、外因性タンパク質をコードする核酸成分は、核酸ライブラリー由来であり得る。この実施態様は、特に、目的の、予め決定された特性を有する外因性タンパク質をコードする核酸を同定および単離することを目的にする場合、特に好ましい。ライブラリーは、目的の組織または細胞型から得られ得る。このライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、ＲＮＡライブラリー、異種ＲＮＡライブラリーまたは当業者に公知である任意の種類の生物、組織、または細胞型由来の転写された核酸を含む任意の他の種類のライブラリーであり得る。好ましい実施態様において、ライブラリーは、哺乳動物供給源由来であり、最も好ましい実施態様においては、ヒト供給源を形成するが、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫、植物、真菌、細菌細胞などにも由来し得る。いくつかの例では、組み換え核酸は、サブトラクティブライブラリー由来であり、例えば、対応する健康組織との比較した場合、疾患状態において示差的に発現されるｃＤＮＡを含むライブラリーである。核酸ライブラリーは、代表的には多くの異なる核酸種を含み、それぞれの種は、ライブラリーでの他の種と比較する場合、異なる核酸配列を有する。ライブラリーの核酸種の数、つまり複雑性は、パラメーターの数に依存して広範に異なり得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーの場合、ライブラリーの複雑性は、ｃＤＮＡライブラリーを生成するために使用されるＲＮＡプールの複雑性に依存する。適切な核酸ライブラリーは、標準的な方法を使用して生成され得る、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を参照のこと。あるいは、適切なライブラリーは多くの商業的供給源から入手され得、以下を含むがこれらに限定されない、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ。
【０１３９】
必要に応じて、遺伝子ライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ、ファージ、酵母などで増殖し得る。
【０１４０】
あるいは、外因性タンパク質をコードする核酸は、目的の組織または細胞型から単離されたｍＲＮＡ由来であり得る。この場合、ｍＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写される。細胞性ｍＲＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡを用いて出発して、多くの方法がｃＤＮＡの調製について公知である。最も好ましく指向されたｃＤＮＡは、クローンがセンス方向に挿入物を有するようにウイルス性ベクターに挿入され得るｃＤＮＡが生成される。  例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅは、指向されるｃＤＮＡの生成のためのいくつかのキットを提供する（λＺＡＰ  ｃＤＮＡ  キット）。さらに、ｃＤＮＡの生成についての標準的なプロトコールが、利用可能であり、そして  特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）中で見出される。
【０１４１】
本発明の別の実施態様では、外因性タンパク質をコードする核酸は、目的の特定かつ特異的な核酸である。このように生成される発現系は、目的の特定の核酸またはタンパク質の特徴づけについて特に有用である。なぜなら、核酸分子によってコードされるタンパク質が、細胞中のどこに位置するか決定することを都合良く可能にし、それにより当業者に対してこのタンパク質の機能についての重要な情報を明らかにするからである。
【０１４２】
目的の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。核酸がＤＮＡまたはＲＮＡとして利用可能であろうとなかろうと、本発明の発現系の一部としての制御エレメントで容易に使用され得る。一旦、当業者が本発明の方法について有用である制御エレメントを選択すると、この制御エレメントを有する目的の核酸を使用する日常的な実験のみが必要とされる。
【０１４３】
例えば、目的の核酸がＲＮＡの形態で利用可能であり、そして選択の制御エレメントがＤＮＡの形態で利用可能である場合、目的の核酸は、日常的な逆転写アッセイを使用してＤＮＡに換えられ得る。制御エレメントもまた、日常的な転写アッセイの使用によりＲＮＡに換えられ得る。いずれかの転換の後、得られた２つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子が日常的なＤＮＡリガーゼアッセイまたはＲＮＡリガーゼアッセイを使用して共に連結され得る。最後に、目的の核酸および組み合わされた制御エレメントを含む、得られた発現系は、次いで本発明において使用され得る。上記の実施例に類似して、目的の核酸がＤＮＡの形態および制御エレメントがＲＮＡの形態で利用可能である場合、いずれかの日常的な変換方法が適用され得、続いて適切な日常的なリガーゼ方法が適用され得る。当業者は、本発明を実施するために、転写、逆転写または連結のどの手順を次に行うか容易に知る。
【０１４４】
あるいは、目的の核酸は任意の種のＤＮＡであり得る。これは以下を含むがこれらに限定されない、相補的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）、ゲノムＤＮＡ、さらなる核酸分子を含むように操作されたｃＤＮＡ、または任意の他の種のＤＮＡ  。任意の種のＤＮＡは、本発明の方法において使用され得る。任意の種のＤＮＡは日常的な連結アッセイを使用することにより制御エレメント分子に連結され得る。ゲノムＤＮＡの発現は、充分に本発明の範囲内にある。なぜなら、真核生物細胞型の使用がゲノムＤＮＡの転写を通じて生成される異種ＲＮＡ分子の必要なプロセシングを容易にし、細胞性タンパク質合成について有用であるメッセンジャーＲＮＡを産生する。
【０１４５】
外因性タンパク質をコードする核酸は、ｃＤＮＡライブラリーまたはＲＮＡまたは任意の他の供給源由来である場合、標準的な手順を使用して発現系に組込まれ得る。このような組み込みは、例えば、制御エレメント分子を有するライブラリーの核酸分子を接続させるためのＤＮＡ連結またはＲＮＡ連結手順により容易にされ得る。
【０１４６】
さらに、ｃＤＮＡまたはＲＮＡとウイルス性ベクターとの組み立ての異なる方法が利用可能である。ＤＮＡとしての核酸の標準的な連結が、組み立て工程を実施するための好ましい方法である。当然、他の方法も適している（例えば、ＲＮＡ分子がＴ４  ＲＮＡリガーゼ酵素を使用して連結され得る）。多くの標準的な方法が利用可能であり、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）において記載される。
【０１４７】
（ウイルス性増殖）
本発明の実施におけるウイルス由来の制御エレメントを使用した場合、将来の実験方法について利用可能である発現系を有するためにウイルスを増殖することを必要とされ得る。ウイルスの増殖は、ウイルス粒子の組み立てを容易にする特定の分子成分の利用可能性を必要とする。タンパク質の場合において、いくつかの分子成分は、代表的には、特定のウイルスに依存して、ウイルス性ゲノムの核酸によりコードされなければならない。しかし、これは、ウイルス性ゲノムの得られる誘導体が、ウイルス粒子中にパッケージされる能力を維持しながら、無制限の数の核酸分子をウイルスのゲノムには付加し得ない。
【０１４８】
それゆえ、本発明の方法における特徴づけのためにウイルスゲノムへ組み込まれ得る目的の核酸のサイズの最大化を試みる場合、そのゲノムの野生型ウイルスゲノムゲノムに見出される核酸分子を欠失することが必要である。しかし、このような欠失は、得られる発現系が制御エレメントが由来するウイルスを増殖することを不可能にする。
【０１４９】
しかし、この問題は、ウイルス増殖について必要とされる成分を提供するヘルパー機能の使用により克服され得る。本発明の１つの実施態様において、このようなヘルパー機能は、ヘルパー核酸の使用により提供され得る。ヘルパー核酸は、例えば、アルファウイルスの増殖を容易にするために、アルファウイルスに基づく発現系について使用されるような欠損ヘルパーＲＮＡであり得る。
【０１５０】
本発明の別の実施態様において、このようなヘルパー機能は、パッケージング細胞株を通じて提供され得る。パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムにより通常コードされるウイルス増殖について必要である成分をそのゲノム中にコードするが、クローニングの有用性の目的のために欠失される。それゆえ、これらの成分は、本発明の方法において使用される細胞株中で発現され、そしてウイルスの増殖が容易にされる。
【０１５１】
このようなパッケージング細胞株の産生は、日常的な実験を使用することにより充分に当業者の知識の範囲内である。例えば、本発明の実施のために選択されるウイルスに依存して、ウイルスゲノムから欠失された正確に同じヌクレオチド配列を取得し得、選択された細胞株において核酸の高レベルの発現を容易にすることが公知である制御エレメントにそれを連結し得、そして得られた核酸を細胞株にトランスフェクトし得る。このようなベクターの例を、以下に提供する。具体的には、ベクター９８７ＢＢｎｅｏ（配列番号２）は、Ｃａ−リン酸法でＢＨＫ２１細胞にトランスフェクトされ得、そして続いて公知の方法に従って２００ｍｇ／ｌのＧ４１８が選択され得る。例えば、これは、新しい特性を有する細胞株の樹立のための標準的なスクリーニング手順（例えば、特定の毒素に対する耐性を提供するマーカーの存在についてのスクリーニングのような）の使用によりさらに容易にされ得る。このようなマーカー（例えば、細胞にネオマイシン選択に耐性を与えるネオマイシン耐性遺伝子のような）は、ウイルス増殖について必要である成分をコードする核酸分子および選択した細胞株について特異的である制御エレメントを含む発現系に含まれ得る。
【０１５２】
２．宿主細胞への発現系の導入
発現系、または代表的には外因性タンパク質をコードするライブラリー挿入物を含む複数の独自の発現系は、適切な真核生物宿主細胞中に導入される。この様式において、複数の真核生物宿主細胞が提供され得、ここで、各宿主細胞は異なるメンバーを含む発現系を有する。当然ながら、この集団において、同じメンバーを含む複数の宿主細胞が存在し得る。宿主細胞は任意の種類の生物由来であり得、これは、発現系の適合性に依存する。好ましくは、宿主細胞は、外因性タンパク質をコードする組換え核酸の細胞供給源（これは、好ましい実施態様においては哺乳動物である）に対して同一かまたは関連する。
【０１５３】
真核生物宿主細胞への発現系の導入は、多くの異なる周知の手順を使用して実施され得る。ＣａＰｏ4、ポリエチレンイミン、リポフェクション、エレクトロポレーションを用いたトランスフェクションは、核酸を動物細胞に導入するための僅かな数の利用可能な技術である。細胞質中の耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）の上流のウイルス内在性リボソーム導入部位を含むＲＮＡ分子は、Ｇ４１８での選択を生存するために十分である。それゆえ、ウイルス性内在性リボソーム導入部位は翻訳について十分である。アルファウイルスの利点は、それらの広範な宿主範囲（多種の異なる組織に由来する哺乳動物、昆虫、鳥類、両生類、および爬虫類細胞）への感染、および異なる度合いの形質転換が報告されている。外因性ウイルス性核酸を含む細胞は、上清から、または細胞溶解によって収集され得るウイルス粒子を生成するために使用され得る。あるいは、外因性核酸を含む細胞は、フィーダー培養物中でのプラーク形成を誘導するために使用され得る。
【０１５４】
３．予め決定された特性を有する外因性タンパク質の同定および単離のためのスクリーニングプロセス
個別の外因性タンパク質についてのスクリーニングを容易にするために、異なるウイルス性クローンの物理的分離を可能にし、そして目的の外因性の新規の分泌タンパク質または糖タンパク質からウイルス性粒子および／またはウイルスタンパク質の物理的分離を可能にする細胞培養物が提供される。
【０１５５】
本発明に従って、新規の放射能標識したタンパク質または糖タンパク質を分泌するクローンの検出が、様々な方法において実施され得る。ウイルス性クローンの物理的な分離は、例えば、アガロースまたはカルボキシメチルセルロースを含む正常の培養培地からなる半固形倍地中でのプラーク形成により達成され得る（ファージスクリーニングに類似する）。あるいは、単一のウイルス粒子（限定希釈により単離される）またはプラーク精製クローンが、例えば、動物細胞を含む９６ウェルプレート中に播種され得る。９６ウェルプレートのフィーダー層への単一細胞の添加は、単一クローンの細胞を感染する。ウイルス性クローンの物理的分離の他の方法が、本発明の範囲を超えることなく実行可能である。
【０１５６】
（残留宿主タンパク質合成のブロッキング）
ウイルスにコードされた外因性タンパク質の選択的標識が所望される場合、宿主細胞タンパク質合成はサイレントでなければならない。本発明に従って、いくつかの方法が細胞性タンパク質の合成を抑制するために使用され得る。ウイルスは、細胞性タンパク質合成を完全に阻止することから（前出を参照のこと）、アルファウイルス群のウイルスを使用することによって、この問題に取り組む。あるいは、使用される制御エレメントに依存して（前出を参照のこと）他のウイルスが使用される場合、宿主細胞特異的ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写および翻訳は、アクチノマイシンＤ、アフラトキシンＢ１、アマトキシンのような薬剤の添加により特異的に抑制され得る。すべての細胞がウイルス性複製に供されない場合においてもまた、細胞の残りの部分が、この物質を用いて転写／翻訳を停止され得る。Ｃｏｎｄｒｅａｙら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６２：２６２９−２６３５。
【０１５７】
（標識工程）
本発明の好ましい実施態様において、発現系により発現される外因性タンパク質は、時間枠の期間中（この期間では、内因性タンパク質の発現が抑制されているが、外因性タンパク質が発現されている）の特異的な標識による宿主細胞系の内因性タンパク質から識別可能にされ得る。例えば、適切な長さと強度の放射性標識されたアミノ酸のパルスが適用され、その結果、十分な放射性タンパク質が検出のためのクローンから回収され得る。この系は、少なくとも３次元で変化し得る（すなわち、（１）パルス長、（２）パルス強度、および（３）プラークの部位）。
【０１５８】
十分な細胞がウイルス性複製を生じ、そしてウイルスコードされたタンパク質を発現し、そしてＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写および／または翻訳の抑制が完全である、感染後の適切な時間において、放射性アミノ酸のパルスが培養物に添加される。当然ながら、パルス−チェイス時間、異なるプラークサイズ、アイソトープの選択、オートラジオグラフィーの態様（Ｘ線フィルムに対するホスホイメージャー）などの多くの異なる組み合わせが適切である。標識する時間、アイソトープ、濃度などの適切な組み合わせの例を実施例中で与える。放射性アミノ酸の適用は、続くチェイス期間を伴うパルスとして実施され得る。他のスキームは適切である（例えば、放射性アミノ酸の連続的な取込み）。タンパク質が沈殿可能で、それゆえ除去し得る特定の条件下では、単量体アミノ酸は沈殿しない。適切なアイソトープは、任意の２０個の天然アミノ酸における、35Ｓ、3Ｈ、14Ｃである。あるいは、内因性タンパク質は、新規の合成された外因性タンパク質と識別が可能であるような方法で処理され得る。本発明の処理は、１）シアリダーゼによる細胞表面からのシアル酸残基の除去。外因性の発現系から合成されつつある新しい膜タンパク質は、検出を可能にする細胞表面上にシアル酸残基を示し、２）内因性タンパク質のタンパク質分解消化（例えば、細胞表面上）である。他の方法が可能であり、そして本発明の範囲内である。
【０１５９】
（可溶性ウイルスタンパク質）
ウイルスタンパク質を含むウイルス由来の制御エレメントの発現系を使用した場合、外因性タンパク質が発現される場合に発現される可溶性ウイルスタンパク質の問題と遭遇し得る。この問題は、異なる程度であり得る。例えば、半固体の培地（例えば、軟寒天プレート）に基づくスクリーニング方法を使用する場合、このような可溶性ウイルス性タンパク質は、外因性タンパク質に結合するために設計された膜に結合し得る。
【０１６０】
本発明の１つの実施態様において、このような可溶性ウイルス性タンパク質は、このような可溶性ウイルス性タンパク質の流れを結合するかまたは止め得るフィルターを使用することにより、所望の外因性タンパク質についてのスクリーニングに干渉することから阻止される。別の実施態様では、可溶性ウイルス性タンパク質に特異的な抗体は、このような濾紙に、可溶性ウイルス性タンパク質が結合するように付着する。可溶性ウイルス性タンパク質の流れと結合または止めるのに有用である種々の濾紙が、記載されている。当業者は、どのフィルターが本発明の実施のために使用すべきか容易に知る。このようなフィルターに、可溶性ウイルス性タンパク質について特異的である抗体を付着させることもまた、充分に当業者の知識の範囲内である。本発明の別の実施態様では、抗体が半固体培地と架橋される（例えば、ＮｕＦｉｘ  Ａｇａｒｏｓｅ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ＵＳＡ、これらはスクリーンとウイルスタンパク質との干渉を阻止する）。
【０１６１】
本発明の別の実施態様では、可溶性ウイルス性タンパク質の生成は、血清含有培地の使用により減少される。任意の減少量が所望され、好ましくはウイルスタンパク質のバックグラウンドにおける目的の分泌タンパク質の検出が可能であるレベルまでである。可溶性ウイルス性タンパク質の生成を減少させるさらに別の方法は、プロテアーゼインヒビターまたはインヒビターの使用による。可溶性ウイルス性タンパク質の量を減少させるためのプロテアーゼインヒビターの使用の例は、実際の実施例として以下に例示される。任意の１つまたは複数のプロテアーゼインヒビターが使用され得、そしてこれらは当業者に周知である。
【０１６２】
本発明の別の実施態様において、可溶性ウイルス性タンパク質の生成は、変異体ウイルスに基づく制御エレメントを含む発現系の使用により減少される。本発明のこの実施態様について有用である種々の変異体ウイルス株が、記載されている。
【０１６３】
当業者は、どの変異ウイルス株を、この実施態様について使用すべきか容易に知る。例えば、アルファウイルス属の変異ウイルス株が、本発明のこの実施態様の実施について有用であることが記載されてきた。本発明のこの実施態様の実施について有用である変異シンドビスウイルス株は、例えば、ｔｓ２０、ｔｓ１０、およびｔｓ２３の遺伝子型を有する（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔら、１９８６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５１：１０−２０；Ａｒｉａｓら、１９８３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６８：８７−１０２；ＣａｒｌｅｔｏｎおよびＢｒｏｗｎ，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：９５２−９５９）。このような温度感受性ウイルス変異体は、ＰＥ２の切断における欠損（ｔｓ２０）およびＥ１の折り畳みにおいて欠損（ｔｓ１０；ｔｓ２３）である。結果として、ウイルスタンパク質は、非許容温度では細胞表面に到達しない。可溶性タンパク質の漏出は、これらの変異体の使用により減少される。
【０１６４】
本発明の別の実施態様において、可溶性ウイルス性タンパク質の生成は、本発明の方法におけるウイルス性タンパク質のタンパク質分解を欠失する細胞株を使用して減少される。ウイルス性タンパク質のタンパク質分解を欠失する種々の細胞株が記載されている。Ｗａｔｓｏｎら、１９９１、Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６５：２３３２−２３３９。
【０１６５】
当業者は、どの細胞株がウイルス性タンパク質のタンパク質分解を欠失する細胞株かどうかを容易に知る。本発明のこの実施態様における実施について有用である細胞株は、本発明の方法において使用されるウイルスのタンパク質のタンパク質分解の切断を欠失する。例えば、本発明の実施においてアルファウイルスを使用する場合、ウイルスタンパク質のＰＥ２からＥ２およびＥ３の切断を欠失する記載された細胞株が有用であり得る。
【０１６６】
本発明のより特定のスクリーニングプロセスが、以下に例証される。
【０１６７】
（コンパートメントスクリーニング）
本発明の１つの実施態様について、外因性タンパク質をコードする独自の発現系を含む宿主細胞は、それらを分離したコンパートメントに配置することによりスクリーニングされ得る。例えば、個別の細胞が物理的に拾われ、そして別個のコンパートメント、例えば、９６ウェルプレート中の１つのウェルに配置される。当然ながら、もし所望ならば、多数の細胞がコンパートメントまたはウェルに配置され得、群中の細胞のスクリーニングを容易にする。あるいは、ウイルス粒子は、１コンパートメントあたり１ｐｆｕに希釈され、モノクローンを誘導する。
【０１６８】
（半固体培地スクリーニング）
本発明の別の実施態様において、本発明の方法において使用される細胞は、軟寒天中でこれらを増殖させることにより分離され得る。例えば、細胞は発現系の核酸でトランスフェクトされ得、次いで半固体培地（すなわち、軟寒天）でのプレート上で展開される。この軟培地または半固体培地は、例えば、アガロースまたはカルボキシメチルセルロースを含む通常の増殖培地からなり得る。あるいは、細胞のコンフルエントな層をウイルス（例えば、アルファウイルス）プラークを１〜３ｍｍのサイズまでの増殖を可能にするＭＯＩで感染させる。感染後３時間で、ウイルス溶液を除去し、そして半固体培地で置換する。この半固体培地は、ウイルス粒子の拡散を阻害し、そしてプラーク形成を可能にする。当業者に公知である半固体培地において細胞を維持する他の方法もまた、本発明に範囲内にある。
【０１６９】
一旦、軟寒天または半固体培地にプレートされると、宿主細胞はスクリーニングされ得る。これは、プレート上の物質の側方拡散を減少させることを可能にし、それ故異なる外因性タンパク質を発現する発現系を含む種々の細胞またはウイルスの交差混入を減少させる。さらに、この実験設定は、細胞により分泌されるタンパク質（例えば、目的の核酸によりコードされる細胞外タンパク質）の細胞からこのようなタンパク質を結合し得るフィルターへの流入を可能にする。タンパク質の結合について有用であるフィルターは、例えば、ニトロセルロースフィルターおよびＰＶＤＦまたはナイロン膜である。
【０１７０】
一旦、外因性タンパク質がフィルターに結合すると、これらは当業者に公知の異なる方法によりスクリーニングされ得る。本発明の１つの実施態様では、外因性タンパク質を、フィルター上のこれらの位置を決定するために選択的に標識する（前出を参照のこと）。例えば、フィルムに対してフィルターを暴露することにより、フィルムは、一旦現像すると、標識された外因性タンパク質を結合したフィルターのスポットに並列されるような場所に暗い点を有する。正常な表示を使用する場合、当業者はフィルム上のそれぞれのスポットを軟寒天プレート上の領域へと相関付け得る。従って、フィルム上のスポットに生じる外因性タンパク質を発現する細胞を位置付けし得る。それゆえ、分泌され、そしてフィルム上のスポットに生じる外因性タンパク質をコードする核酸を含む特定の発現系もまた位置付けし得る。
【０１７１】
本発明の別の実施態様において、フィルターをリガンドに曝露することによって、結合した外因性のタンパク質を有するフィルターをスクリーニングし得る。例えば、選択される１つの方法は、結合した外因性のタンパク質を有するフィルターを、標識したレクチンに曝露し、それによって分泌糖タンパク質をスクリーニングすることであり得る。または、例えば、特定の翻訳後修飾（例えば、糖部分のような）に特異的な抗体を用いてフィルターをスクリーニングし得る。また、目的の特定のタンパク質に特異的な抗体を使用し得る。
【０１７２】
さらに、この系は外因性タンパク質からのウイルス粒子の容易な分離を促進する。分離は、例えば異なるろ紙の使用（すなわち、ウイルス粒子に結合または、ウイルス粒子の流れを停止させるが、しかし外因性タンパク質には結合せず、その流れの停止もしないもの）によって達成し得る。このさらなるろ紙は、外因性タンパク質を結合するフィルターの下に配置され得る。それゆえに、ウイルス粒子は外因性タンパク質を結合するろ紙には到達しない。
【０１７３】
フィルターは、例えば、可溶性ウイルスタンパク質に対する抗体を、可溶性ウイルスタンパク質を結合するが外因性タンパク質を結合しないフィルターに付着させることによって、より効果的にされ得る。
【０１７４】
（分泌タンパク質の検出および単離）
本発明の好ましい実施態様において、サンプルは分泌された放射活性タンパク質の検出および放射能対バックグラウンドの検出のために調製される。
【０１７５】
選択されたクローンの物理的な分離の方法に従って、分泌タンパク質または糖タンパク質の異なる検出の様式が適用され得る。例えば、単一のクローンがマイクロタイタープレート中に接種される場合、上清中の分泌された放射活性タンパク質または糖タンパク質の沈殿は、例えばＴＣＡ法を用いて実行され得る（Ｍａら、１９９４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８（４）：３９１−３９４）。クローンの物理的な分離が半固体の増殖培地を用いて達成された場合、次いで分泌された放射活性タンパク質または糖タンパク質を捕獲した膜は、洗浄されそしてオートラジオグラフィーのために調製される。多くの異なる市販の膜またはフィルターがトレーサー膜として有用である。膜において捕獲されたタンパク質は、放射活性タンパク質を分泌するクローンが検出され得るように結合される必要がある。いくつかの異なる洗浄手順は、沈殿性タンパク質を膜に連結し、そして取り込まれていない放射活性アミノ酸を除去するために適用され得る。増感剤を用いる、または用いないＸ線フィルムへの曝露およびりん光画像法を含むいくつかの方法が、オートラジオグラフィーのために適切である。
【０１７６】
（リガンド選択）
本発明の別の実施態様において、異なる外因性タンパク質を発現する発現系を含む細胞は、リガンド認識によって分離され得る。例えば、細胞膜のレセプター分子をコードする目的の核酸のスクリーニングの場合、このようなレセプターを認識し得るリガンドは、このようなレセプターを発現する細胞をスクリーニングするために使用され得る。このスクリーニングは、例えば、固体支持体にリガンドを付着させる工程、および固体支持体上のリガンドに目的のタンパク質を発現する細胞を曝露させる工程によって行われ得る。目的の膜レセプター分子を発現する細胞を結合することによって、このようなレセプターを発現する細胞は、このようなレセプターを発現しない細胞から分離され得る。
【０１７７】
本発明の１つの実施態様において、リガンドはタンパク質であり得る。別の実施態様において、リガンドは抗体であり得る。なお別の実施態様において、リガンドはレクチンであり得る。さらなる実施態様において、リガンドは非タンパク質であり得る。リガンドの選択は、そのために選択されるタンパク質に依存する。ペプチド骨格、翻訳後修飾、または他の基準に基づくタンパク質を結合可能な大量のリガンドが記載されてきた。当業者は、本発明の本実施態様の実行のためにどのリガンドが有用であるかを容易に知る。
【０１７８】
本発明の別の実施態様において、リガンドは固体支持体に結合される。本実施態様の実行のために有用な種々の固体支持体が記載されてきた。例えば、リガンドを、外因性タンパク質を発現する細胞を加えるプレートに結合させ得る。一旦リガンドが結合しているプレート上に置かれると、細胞がリガンドを認識する膜タンパク質を発現する場合、細胞はリガンドに結合する。リガンドに結合した細胞は、それゆえに、洗浄溶液がリガンドに結合しない細胞の除去のために加えられた場合に、プレートに残存する。このようにして、リガンドを結合する膜レセプターを発現する細胞は、発現しない細胞から除去される。結果的に、これは膜レセプターおよびそれらをコードする核酸を同定するための迅速かつ単純な方法である。膜レセプターは薬物開発の主要な標的であるので、本発明の本実施態様は、製薬研究および薬物発見のために非常に有用である。
【０１７９】
（膜タンパク質選択）
本発明の別の実施態様において、細胞外ドメインを有する膜タンパク質である外因性タンパク質に基づく外因性タンパク質を発現する細胞を選択し得る。例えば、細胞内で外因性タンパク質を発現させ得、一方内在性タンパク質の発現は阻害されるか、または発現系を使用して、その操作が内在性タンパク質の発現を阻害する（前出を参照のこと）。
【０１８０】
このセットアップを使用して、例えば、内在性タンパク質の発現の阻害が起こった後（しかし、外因性タンパク質の発現はまだ継続している）、細胞をプロテアーゼ処理し得る。細胞表面から、細胞外のタンパク質性の突出（すなわち、細胞膜レセプターなど）が取り除かれた後、外因性タンパク質の発現がこのような突出を補充し得る。しかし、このような補充は、特定の細胞中で発現している外因性タンパク質が膜レセプター分子である場合にのみ生じる。
【０１８１】
それゆえに、この工程において、膜レセプター分子をコードする発現系を含む細胞のみが、細胞外のタンパク質性の突出を有する。このような突出は、このような結合が、結合するタンパク質の構造に関して特異的であるか、または非特異的であるかに関係なく、タンパク質に結合する任意の構造に細胞を結合させるために使用され得る。次いで、このようなタンパク質結合構造に結合する細胞は、例えば、外因性タンパク質をコードする核酸の配列に関してさらに分析され得る。タンパク質を結合する種々の構造が記載されており、当業者に周知である。例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのフィルターが、タンパク質結合構造として、本実施態様において使用され得る。当業者に公知の、タンパク質に結合する他の構造もまた、本発明の範囲内である。
【０１８２】
（膜糖タンパク質スクリーニング）
本発明の１つの実施態様において、細胞膜糖タンパク質が、本発明の方法を使用して同定される。細胞膜糖タンパク質の同定を容易にするために、本発明の本実施態様の実行に有用な種々の方法が記載されてきた。例えば、細胞表面の糖残基の化学的反応性を改変し得、それによってこのような糖残基の特異的な認識および同定を容易にし得る。化学的反応性のこのような改変に有用な１つの方法は、例えば、反応性のケトン基の細胞表面オリゴサッカライドへの導入である。Ｍａｈａｌら、１９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８。この方法において、新規な化学的反応基を細胞表面の糖タンパク質に導入する。この方法が、外因性タンパク質が本発明の方法において発現されるような条件下で適用され、一方内在性タンパク質の発現が阻害される場合、外因性タンパク質は好ましく反応基を取り込み、それによって外因性タンパク質の認識を容易にする。当業者に公知の他の方法は本発明の本実施態様の実行に有用であり、そしてまた本発明の範囲内である。
【０１８３】
本発明の別の実施態様において、膜糖タンパク質はそのような膜糖タンパク質の選択的グリコシル化を介する本発明の方法を使用して、同定される。選択的に膜タンパク質をグリコシル化するための種々の方法が公知であり、そして本発明の範囲内である。例えば、まず、シアリダーゼ活性を示す酵素の使用によって、細胞表面のすべてのシアル酸残基を除去し得る。そのような除去の後、本発明の方法を使用して、細胞内で外因性タンパク質を発現させ、一方内在性タンパク質の発現は阻害される。それによって、外因性タンパク質はシアル化した（ｓｉａｌｉａｔｅｄ）形態で好ましく細胞表面に輸送され、その改善された同定を容易にする。
【０１８４】
（目的の他の細胞フラクションに局在するタンパク質のスクリーニング）
１つの実施態様において、本発明は、一般的なアプローチを提供し、それを用いて任意の目的の細胞位置に局在する外因性タンパク質をコードする核酸を含む発現系が、同定され得る。外因性タンパク質をコードする独特な核酸を含む、発現系を有する宿主細胞は、個々の発現系を含むそれぞれの宿主細胞の物理的な分離が可能である様式で提供される。好ましくは、発現系はウイルス制御エレメントを含む。最も好ましくは、宿主細胞／発現系は、発現系を含むウイルス粒子を宿主細胞から放出されることを可能にする。
【０１８５】
例えば、宿主細胞は半固体培地上でプレートされ得る。最初に、ウイルス粒子を、フィルター上に捕獲し得る条件下、および時間に、ウイルス粒子を結合可能なフィルターが半固体培地上に置かれる。当業者は、どんなフィルターが本発明の本実施態様の産生に有用であり得るかを容易に知る。例えば、フィルターはニトロセルロースフィルターであり得る。フィルターに付随するウイルス粒子を有する第１のフィルターは、発現系を含む感染性のウイルス粒子の回収を容易にするような様式で処理される。続いて、半固体培地中の宿主細胞は、発現された外因性タンパク質の標識を可能にし、内在性タンパク質の発現は阻害される、組成物に曝露される。例えば、外因性タンパク質は放射性アミノ酸を用いて標識され得、一方内在性タンパク質発現は抑制される。次の工程では、半固体培地中の宿主細胞は、目的の細胞内画分／細胞内区画の回収を可能にするものであり、そして／または目的の細胞内画分／細胞内区画の回収を可能にすることの条件を整える。当業者は、考慮のもとでいかなる条件が細胞内区画／画分に依存して適切かを知る。次の工程では、それに結合していた、例えば、目的の細胞内画分内に含まれる特定の構造に対する抗体を有する、第２のフィルターが、半固体培地上に置かれる。フィルターが飽和していること（すなわち、任意のさらなる分子がその表面に結合することを許容しない）が重要である。第２のフィルターは、所定の目的の細胞区画が接着することを許容するような条件下で、そしてそのような時間、置かれる。例えば、目的の細胞成分が核にある場合、核膜表面タンパク質に対する抗体が、フィルターに付着される。別の区画では、対応する方法が使用される。従って、第２のフィルターは、第１のフィルターの「レプリカ」を構成し、ここで第１のフィルターは回収可能な発現系をそれに付着させ、一方第２のフィルターは目的の細胞成分に由来するタンパク質を付着させる。宿主細胞のこれらの個々のクローンは、目的の細胞内画分／細胞内成分内に位置する外因性タンパク質をコードする核酸を含む発現系を含み、標識の存在を通して同定され得る。さらに、細胞成分は当該分野において周知の古典的な方法（例えば、示差的遠心分離）を使用して物理的に分離され得る。
【０１８６】
（既知のレセプターの未知のリガンドの同定）
１つの実施態様において、本発明は、目的の既知のレセプターの未知の分泌リガンドの同定を可能にする。外因性タンパク質をコードする独特な組換え核酸を含む発現系を含む宿主細胞は、それらが物理的に分離可能な様式で培養される。例えば、この目的のために、宿主細胞は半固体培地中で培養され得る。細胞は、発現された外因性タンパク質の標識化を可能にし、一方内在性タンパク質の発現は阻害される組成物とともに、インキュベートされる。目的のレセプタータンパク質を用いてコートしたフィルターは、それによってすべての結合部位は飽和され（レセプタータンパク質または他の任意の中性タンパク質のいずれかによって）、すべての分泌タンパク質がフィルターに移動できるような条件および時間で、半固体培地上に置かれる。フィルター上のすべてのタンパク質結合部位は飽和しているので、目的のレセプターに結合した分泌タンパク質のみが、フィルターに接着する。これらの外因性タンパク質は、それらの標識によって同定され得る。フィルターはレプリカ（すなわち、もともとのプレートの鏡像）を表すので、目的のレセプターのリガンドをコードする核酸を含む発現系を含むコロニーは、容易に同定され得る。
【０１８７】
（既知のリガンドの未知のレセプターの同定）
１つの実施態様において、本発明は、既知のリガンドに対する未知のレセプターの同定を可能にする。外因性タンパク質をコードする独特な組換え核酸を含む発現系を含む宿主細胞は、それらが物理的に分離可能な方法で培養される。例えば、細胞のコンフルエント層は、複数の発現系を有する感染ウイルスの低ＭＯＩで感染され得る。感染後、細胞は、３７℃付近に融点を有する半固体培地（例えば、低融点アガロース）中３４℃でインキュベートされる。十分な大きさのプラークが産生された後、フィルターは、プレートのレプリカとして働くウイルス粒子を捕獲するのに十分な時間、表面（ｔｏｐ）に配置される。続いて、プレートを３９℃まで加熱することによって、アガロースを溶解させる。アガロースの除去および洗浄の後、細胞を、選択した標識化リガンドと共にインキュベートする。細胞の洗浄後、リガンドの結合は、オートラジオグラフィーによって検出され得る。次いで、目的の発現系（および核酸）を含むウイルス粒子は、レプリカフィルターから回収され得る。
【０１８８】
（４．目的の外因性タンパク質を含むウイルス粒子の回収）
次の工程では、サンプルまたは増加した放射能が観察された領域からのこれらのウイルス粒子は、同定され、そして回収される。ウェルまたは目的の外因性タンパク質が検出されたプラークの位置の同定は、現像したフィルムを用いてさかのぼり得、そしてウイルス粒子が回収され得る。この点において、目的のタンパク質の発現を生じる核酸配列を含む組換えウイルス粒子が、収集される。本発明により、この粒子が、例えば、以下に記載される手順の１つに適用され得る。
【０１８９】
Ｃ．所定の特性のタンパク質をコードする、同定された発現系の適用
所定の特性、例えば細胞局在位置、構造、酵素的機能、または他の分子に対する親和性を有する、上記のスクリーニング方法を用いて選択された発現系のプールは、さらなるスクリーニング手順のために使用され得る。あるいは、個々の発現系は、ランダムに拾い上げられ得、そして特徴付けおよび機能的分析に供され得る。下記を参照のこと。
【０１９０】
（夾雑を避けるためのさらなるスクリーニングラウンド）
個々のクローンは拾い上げられ得、そして工程３および４の手順は、クローンをプラーク精製するため、および夾雑を避けるために反復され得る。
【０１９１】
（ウイルス粒子の数を増すための、ウイルス粒子の継代）
単離され、必要に応じて継代により増幅されたウイルス粒子は、以下の手順の１つに適用され得る。分泌タンパク質または糖タンパク質をコードする外因性の核酸を含むウイルス粒子のための多数の有用な適用は明白であり、そのいくつかが以下に記載される。それゆえに本発明は、上記に記載の適用に限定されない。
【０１９２】
（標識化された形態、または標識化されていない形態のいずれかにおける、新規な分泌タンパク質または糖タンパク質の産生を誘導する細胞培養物の感染）
単離されたウイルス粒子を用いて、例えば、Ｔ−フラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、バイオリアクター、灌流リアクターなどの容器中で増殖させた基質細胞株に感染させることによって、大量スケールで、新規な分泌タンパク質または糖タンパク質は産生され得る。上記で選択された遺伝子構築物の性質に依存して、産生はわずかに異なる条件下で起こる。１つの方法のベクターがパッケージング細胞株でパッケージングされる場合、粒子は１回のラウンドの感染（従ってＭＯＩは１より大きいべきである）だけを誘導する。また、新規な分泌タンパク質または糖タンパク質の産生のために、広い領域の宿主細胞株が使用され得る。新規の分泌タンパク質または糖タンパク質の標識化は、上記のように放射活性アミノ酸の添加によって達成され得る。これは、生成物の形成が、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および続くオートラジオグラフィーによって容易にモニターされ得るという利点を提供する。この方法において、未知の生成物が、産生パラメーターの最適化のために容易に検出され得る。
【０１９３】
（そのように産生された上清の、その放射性標識による、タンパク質精製または単離方法、および新規な分泌タンパク質もしくは糖タンパク質の検出への適用）
新規な分泌タンパク質または糖タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用して、上記の工程の上清から容易に精製され得る。産生の間に、分泌タンパク質を標識する独特の可能性は（前出を参照のこと）、精製プロセスを顕著に単純化する。クロマトグラフィーカラムまたはそれに類するものからの溶出物は、サンプルコレクターを使用して自動的に収集され得る。新規な分泌タンパク質を含むサンプルは、放射能の検出によって容易に同定され得る。富化され、精製された物質はこの方法で入手され得る。標識されていない物質は、標識していない細胞培養上清への同一のクロマトグラフィー条件の適用によって入手され得る。
【０１９４】
Ｄ．個々の同定したタンパク質の特徴付けおよび機能的分析
当該分野において公知のいくつかの手順が、個々の同定された外因性タンパク質のさらなる特徴付けおよび機能的分析のために利用され得る。
【０１９５】
１．外因性タンパク質をコードする核酸の配列決定
１つの実施態様において、回収されたウイルス粒子における外因性核酸の同定および配列は、標準的な方法による配列決定によって研究され得る。適切なプロトコールの詳細な記載は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９８９）  に見出され得る。
【０１９６】
データベースにおける既知のポリヌクレオチド配列との配列比較は、同定され、単離された外因性タンパク質の機能に関する指標を示し得る。
【０１９７】
２．同定された外因性タンパク質の発現パターンの分析
１つの実施態様において、同定された外因性タンパク質またはそのフラグメントのｃＤＮＡが、そのｍＲＮＡの発現を検出するためのプローブとして使用される。例えば、組織サンプルの切片が、調製され得、適切な標識化プローブを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションによって試験され得る。あるいは、ｍＲＮＡ抽出物が調製され得、ノーザンブロット分析において分析され得る。あるいは、同定されたタンパク質のｃＤＮＡ配列に従って設計された合成オリゴヌクレオチドが生成され得、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。適切なプロトコールの詳細な記載は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９８９）  に見出され得る。
【０１９８】
１つの実施態様において、遺伝子発現のレベルは、その転写の検出および測定によってアッセイされる。例えば、既知の、またはその遺伝子を過剰発現もしくは過少発現すると考えられている特定の細胞型あるいは組織（例えば、ガン性組織）からのＲＮＡは、本明細書に記載されているようなハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術を利用することによって単離され、そして試験される。単離された細胞は、細胞培養、患者、または実験動物に由来し得る。このような分析は、その遺伝子発現の活性化または不活性化を含む、同定された外因性タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンの定量的および定性的な両方の局面を示し得る。
【０１９９】
ノーザンブロット、サザンブロット、およびインサイチュハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーションプローブは、32Ｐ、35Ｓ、および3Ｈ（インサイチュハイブリダイゼーションの場合）のような放射性核種、またはアビジン／ビオチンカップリング系を介してプローブにカップリングしたアルカリホスファターゼのような酵素的標識物などを含む、種々のレポーターグループによって標識され得る。標識されたハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。下記のＶ１．Ｈ．節を参照のこと。核酸ハイブリダイゼーションプローブに関するさらなる使用は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマーとしてのそれらの使用を含む。ＰＣＲは、米国特許第４，９６５，１８８号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１９５号に詳細に記載される。
【０２００】
ＤＮＡは、点突然変異、挿入、欠失、および染色体再編成を含む、遺伝子構造を含む異常を検出するための、生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用され得る。そのようなアッセイは、サザン分析、単鎖多型分析（ＳＳＣＰ）およびＰＣＲ分析を含むが、それらに限定されない。
【０２０１】
同定された外因性タンパク質をコードする遺伝子の特定の変異の検出のための診断方法は、例えば、サンプル（例えば、患者サンプル由来、または他の適切な細胞供給源に由来する）から得られた組換えＤＮＡ分子、クローニングした遺伝子またはその縮重改変体を、組換えＤＮＡ分子、クローニングした遺伝子またはその縮重改変体を含む、１つ以上の標識化された核酸試薬と、これらの試薬の、遺伝子内のそれらの相補的配列への特異的アニーリングに好ましい条件下で、接触およびインキュベートさせる工程を含み得る。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、すべてのアニーリングしなかった核酸は核酸分子ハイブリッドから除去される。次いで、ハイブリダイズした核酸の存在は、存在する場合、検出される。このような検出系を使用することによって、目的の細胞型または組織からの核酸は、例えば、膜のような固体支持体に、またはマイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビーズ上のようなプラスチック表面に固定され得る。この場合、インキュベーション後に、アニ−ルしていない、標識核酸試薬が容易に除去される。残存している、アニ−ルした、標識遺伝子の核酸試薬の検出は、当該分野で周知である、標準的な技術の使用によって行われる。核酸試薬がアニ−ルした配列は、遺伝子変異が存在するかどうかを決定するために、正常な遺伝子配列から予測されたアニーリングパターンと比較される。
【０２０２】
患者サンプル中または他の適切な細胞供給源における、その遺伝子に特異的な核酸分子の検出のための他の方法は、例えばＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号に記載される実験的な実施態様、前出を参照のこと）による遺伝子の増幅を含み得、続いて当業者に周知の技術を使用して増幅された分子の検出を行う。変異が測定されるように意図される場合、生ずる増幅配列は、遺伝子変異が存在するかどうかを決定するために、増幅された核酸がその遺伝子の正常なコピーのみを含む場合に、予想される配列と比較され得る。
【０２０３】
３．抗体を使用して同定された外因性タンパク質の検出
目的の同定された外因性タンパク質、または保存された改変体もしくはそのペプチドフラグメントに対して指向された抗体はまた、インビボでの発現パターンに関するさらなる識見を得るために使用され得る。抗体はまた、遺伝子の発現レベルにおける異常性、またはその遺伝子産物の構造および／もしくは時間的、組織、細胞性、または細胞下の位置における異常性を検出するために使用され得、そして、例えば、生検組織におけるように、インビボまたはインビトロで作用され得る。
【０２０４】
分析は、任意の組織もしくは細胞型において、または標識された抗体を用いて、なおインビボで、試験動物において、行なわれ得る。あるいは、分析されるべき組織または細胞型は、例えば、ガン組織のような、目的の同定された外因性タンパク質を異常に発現することが公知である（または、推測される）組織または細胞型を含み得る。
【０２０５】
本明細書中で使用されるタンパク質単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されるような方法であり得る。単離された細胞は、細胞培養物、実験動物、または患者由来であり得る。
【０２０６】
例えば、抗体、または本発明において有用な抗体のフラグメントは、目的の同定された外因性タンパク質、または保存された改変体もしくはそのペプチドフラグメントの存在を、定量的または定性的に検出するために使用され得る。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量的検出と組み合わされた、蛍光標識された抗体（この章の下記を参照のこと）を使用して免疫蛍光技術によって達成され得る。
【０２０７】
本発明において有用な、抗体（もしくは、そのフラグメント）、または融合もしくは結合されたタンパク質は、さらに、目的の同定された外因性タンパク質、または保存された改変体もしくはそのペプチドフラグメントのインサイチュ検出のために、あるいは触媒的サブユニット結合のために（標識された触媒サブユニット融合タンパク質の場合）、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡、または非イムノアッセイのように、組織学的に使用され得る。
【０２０８】
インサイチュ検出は、患者から組織学的検体を取り出し、それに標識された抗体または本発明の融合タンパク質を適用することによって達成され得る。抗体（もしくはフラグメント）または融合タンパク質は、標識された抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに被覆する（ｏｖｅｒｌａｙ）ことによって、好ましくは適用される。このような手順の使用により、目的の同定された外因性タンパク質、または保存された改変体もしくはペプチドフラグメントの存在だけでなく、試験された組織における分布もまた決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、任意の広範な種々の組織学的方法（例えば、染色手順）がこのようなインサイチュ検出を達成するために変更され得ることを容易に理解する。
【０２０９】
目的の同定された外因性タンパク質、または保存された改変体もしくはそのペプチドフラグメントのためのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、代表的には、サンプル（例えば、生物学的体液、組織抽出物、新鮮に採集した細胞、または細胞培養においてインキュベートされた細胞溶解物）を、目的の同定された外因性タンパク質、または保存された改変体もしくはそのペプチドフラグメントを同定し得る検出可能に標識された抗体の存在下でインキュベートする工程、および結合した抗体を当該分野に周知の多数の技術のいずれかによって検出する工程を包含する。
【０２１０】
生物学的サンプルは、固相支持体またはキャリア（例えば、ニトロセルロース、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化し得る他の固体支持体）との接触に供され、そして固定化され得る。次いで、支持体は適切な緩衝液で洗浄され、続いて検出可能に標識された抗体または融合タンパク質で処理され得る。次いで、固相支持体は、非結合抗体または融合タンパク質を除去するために、緩衝液で２回目の洗浄をされ得る。次いで、固体支持体上の結合標識の量は、従来の手段によって検出される。
【０２１１】
「固相支持体またはキャリア」によって、抗原または抗体を結合し得る任意の支持体が意図される。周知の支持体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であるかまたは不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合した分子が抗原または抗体に結合し得る限り、実質的に任意の可能性のある構造コンフィギュレーションを有し得る。従って、支持体コンフィギュレーションは、球状（例えば、ビーズにおいて）、または円筒状（例えば、試験管の内表面において）、または桿状体の外表面であり得る。あるいは、表面は、シート、試験片（ｔｅｓｔ  ｓｔｒｉｐ）などのように平らであり得る。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者は、抗体または抗原の結合のための多くの他の適切なキャリアを知っているか、または同様のものを容易に得ることが出来る。
【０２１２】
所定のロットの抗体または融合タンパク質の結合活性は、周知の方法によって決定される。当業者は、操作的および最適なアッセイ条件を容易に決定し得る。
【０２１３】
抗体に関して、抗体が検出可能に標識され得る方法の１つは、同様のものを酵素に結合し、そしてエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）において使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；Ｖｏｌｌｅｒら、１９７８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０；Ｂｕｔｌｅｒ，１９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），１９８０，Ｅｎｚｕｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，；Ｉｓｈｉｋａｗａら（編），１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合した酵素は、例えば、分光光度計、蛍光光度計によって、または視覚的な手段によって検出され得る化学部分を生成するような様式において、適切な基質（好ましくは、発色性基質）と反応する。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。検出は、酵素に対する発色性基質を使用する比色法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製した標準との比較において、基質の酵素反応の程度の視覚的な比較によって達成され得る。
【０２１４】
検出はまた、任意の種々の他のイムノアッセイを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射活性的に標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用によって、目的の同定された外因性タンパク質を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照のこと）。放射活性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【０２１５】
抗体を蛍光化合物で標識することもまた可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に暴露されると、次いでその存在は、蛍光に起因して検出され得る。最も通常使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンである。
【０２１６】
抗体はまた、152Ｅｕ、または他のランタン系列のような蛍光発光金属を使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート群を使用して抗体に結合され得る。
【０２１７】
抗体はまた、抗体を化学発光化合物に結合することによって検出可能に標識され得る。次いで化学発光タグ化抗体の存在は、化学的反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびオキザレート（ｏｘａｌａｔｅ）エステルである。
【０２１８】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効果を増加させる生物学的系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【０２１９】
（動物組織または細胞の感染）
上記の手順によって得られたウイルス粒子は、組織または動物への目的の遺伝子の送達のための遺伝子移入ベクターとして使用され得る。このアプローチは、目的のタンパク質の性質の研究に有用であるか、または、例えば、宿主でのその発現の結果として新規のタンパク質に対する抗体の生成のために使用され得る。
【０２２０】
Ｅ．予め決定された特性を有するタンパク質の使用
本発明の方法および発現系を使用して、同定、特徴付け、および単離された核酸、ならびにより重要には、それによってコードされるタンパク質は、多数の適用に有用であり得る。第１に、多くの場合、それらは研究適用および実験室使用に有用であり、例えば、新規の増殖因子、サイトカイン、またはホルモンの発見および単離は、以前には培養され得なかった培養における細胞の増殖を容易にし得る。膜レセプター、細胞質タンパク質、ならびに核タンパク質の発見および単離は、重要な細胞性シグナル伝達および制御過程におけるさらなる識見を得るために有用である。細胞小器官タンパク質の発見および単離は、代謝、同化作用、およびプロセシング機能へのさらなる識見を提供し得る。
【０２２１】
しかし、本発明によって同定および単離されたいくつかの遺伝子および遺伝子産物は、治療剤、または代替的に、治療標的として直接使用され得る。
【０２２２】
１．治療剤としての使用
本発明の発現系を用いて同定および単離されたタンパク質（特に、分泌タンパク質）は、治療剤として有用であり得る。事実、多数の既に公知の分泌タンパク質（サイトカインおよびペプチドホルモンを含む）は製造され、そして治療剤として使用されている。多くの重篤な疾患は、細胞間コミュニケーターとして、例えば、環境の変化または他の生理学的必要性に対する応答において、作用する特定の分泌タンパク質の欠如または不十分な量によって引き起こされる。周知の例には、最も頻繁には、ペプチドホルモンインスリンの産生の欠損によって引き起こされる糖尿病がある。多くの他の例が公知である。これまで全ての分泌タンパク質のうちのほんの少しの割合が、同定、単離、および特徴づけられているという事実に関して、本発明によって網羅されていない多くの新規の分泌タンパク質が、疾患（異常な細胞増殖、代謝シグナル、または細胞が適切に連絡し得ない特定の他の可能性に関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない）の処置のための治療化合物として有用であることが、期待され得る。
【０２２３】
さらに、他の細胞局在位置に由来するタンパク質は、治療剤に有用であり得る。例えば、核内で発現する多数のタンパク質には、アポトーシス誘導性タンパク質または腫瘍サプレッサーが含まれ、処置（例えば、ガン）のための薬剤として使用される傾向がある。
【０２２４】
当業者は、本発明の方法および発現系を使用して、同定したどのタンパク質が治療標的として有用であり得るかを決定し得る。例えば、阻害性抗体またはアンチセンスストラテジーを使用するインビボアッセイは、タンパク質の機能を解明するために使用され得る。さらに、タンパク質の精製形態は、治療化合物としてのそれらの価値を決定するために、動物疾患モデルにおける細胞性アッセイおよび試験のために使用され得る。
【０２２５】
２．治療標的としての使用
本発明の別の重要な局面は、治療病理学的障害のための特異的な治療標的として働くタンパク質を提供することである。分泌タンパク質の不適切な機能または分泌タンパク質の発生量に関連する多くの疾患が、それぞれのタンパク質（またはその等価物）の投与によって処置され得る場合、この状況は、しばしば、細胞内に位置するタンパク質に対して異なる。ホルモンまたはサイトカインの産生における欠損は、しばしば、生理学的応答を回復するための投与によって治療され得る。対照的に、特に細胞膜および核において、多くの他の細胞性機能は、それらの機能が不相応である場合、重篤な疾患（ガンおよび他の増殖障害、ならびに種々の代謝性疾患を含む）の原因であり得る多数のタンパク質が含まれることが公知である。例えば、乳ガンは、全発症の３０％において、細胞表面レセプター（すなわち、レセプターチロシンキナーゼＨＥＲ２）の過剰発現によって生じると考えられる。Ｓｌａｍｏｎ，１９８９、前出。この型の乳ガンは、適切な標的部位へのＨＥＲ２インヒビターの投与によって処置され得ると考えられている。代謝性疾患の例として、ＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）は、異常な発現または欠損インスリンレセプターによって引き起こされ得る。Ｔａｉｒａ．１９８９、前出。ＩＩ型糖尿病は、レセプターを抑制し、そしてインスリンレセプターのシグナル伝達経路の下流の分子を活性化する治療化合物を用いて処置され得る。あるいは、ＩＩ型糖尿病は、欠損インスリンレセプターを活性化し得る化合物で処置され得る。
【０２２６】
多くの疾患（不適切な細胞増殖に関連する疾患、および代謝性欠損に関連する疾患の両方）の場合、生物学的原因はいまだに同定されていないが、細胞性タンパク質の不相応な機能または発生量に起因すると考えられる。本発明の方法によって同定されたタンパク質は、標的化治療アプローチの開発（薬物開発および遺伝子治療を含む）、または診断薬／試薬としての開発に有用である。
【０２２７】
本発明の方法によって同定されたタンパク質が治療標的として使用される場合、タンパク質は、その活性を調節することにより、化合物の同定および単離に適切なアッセイに供され得る。
【０２２８】
Ｆ．本発明の方法によって同定されたタンパク質に対して指向された抗体の生成および使用
当該分野において公知の種々の手順は、本発明の方法を使用して同定および単離された組換え的に産生されたタンパク質のエピトープに対する抗体の産生のために使用され得る。このような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２９】
本発明の１つの実施態様において、このような抗体は、本発明の方法によって同定されたタンパク質の発現パターン、発生量、機能、および他の特徴の研究のためのツールとして使用される。例えば、細胞または組織切片は抗体に暴露され得、本発明の同定されたタンパク質の発現特異性および発生量を特徴付け得る。種々の型の抗体（モノクローナル、ポリクローナル、および単鎖抗体を含む）は、同定されたタンパク質の、細胞および組織特異的発現パターンを決定するような実験のために使用され得る。細胞または組織切片において発現されるタンパク質に結合する抗体の検出を可能にする多数の技術が、十分確立されている。
【０２３０】
さらに、標識された抗体（例えば、放射標識された抗体）は、インビボで、同定されたタンパク質の発現パターンおよび発生量を決定するために使用され得る。前出を参照のこと。例えば、標識された抗体は、試験体に注入され得、そしてその結合部位は、同定されたタンパク質が位置する細胞および／または組織型を決定するためにモニターされ得る。本来同定および単離された目的のタンパク質が、試験動物とは異なる種の産物であることは確かなので、ポリクローナル抗体の使用が好ましい。従って、例えば、抗体を生成するために使用される同定されたタンパク質がヒト由来であり、そして試験体がヒトでない場合、例外はあるが、ポリクローナル抗体が好ましい。
【０２３１】
さらに、抗体は、本発明の方法および発現系を用いて同定されたタンパク質の生理学的機能を分析するために使用され得る。例えば、阻害性抗体（すなわち、目的の同定されたタンパク質の特定の機能的エピトープに結合する抗体）は、合理的または経験的に同定され、そして試験細胞または実験動物に注入され得る。細胞、特定の組織、または生理学的機能における効果が同定され、同定されたタンパク質の生物学的な役割、および異常なまたは病理学的状態におけるその潜在的な環境を解明し得る。一旦、疾患発症における生物学的機能および役割が同定されると、標的化された処置ストラテジーの開発および設計が開始され得る。このようなストラテジーの１つは、標的タンパク質の機能を都合良く調節する化合物の同定および単離であり、これは以下により詳細に記載される。
【０２３２】
他の実施態様において、抗体は、例えば、診断剤または治療剤として有用である。治療剤として、中和抗体（すなわち、リガンド、基質、またはアダプター分子と結合について競合する抗体、または本発明のタンパク質が治療標的として使用される場合、このタンパク質を妨害する抗体）が、特に好ましい目的である。
【０２３３】
診断剤としての使用のために、同定されたタンパク質に結合するモノクローナル抗体は放射活性標識され、注入後の体内での位置および分布の検出を可能にする。放射活性タグ化された抗体は、本発明の同定されたタンパク質の発現に関連する腫瘍および転移の存在をインビボで画像化するための非侵入性診断ツールとして使用され得る。
【０２３４】
細胞障害性因子を体内の特定の部位に標的化する免疫毒素もまた設計され得る。例えば、高親和性モノクローナル抗体は、細菌または植物毒素（例えば、ジフテリア毒素、アブリン、またはリシン）に共有結合され得る。抗体／ハイブリッド分子の調製の一般的な方法は、抗体における一級アミノ基を攻撃し、そしてジスルフィド交換によって抗体に毒素を結合させる、ＳＰＤＰのようなチオール架橋試薬の使用を含み得る。ハイブリッド抗体は、本発明の方法によって同定されたタンパク質を発現する細胞を特異的に除去するために使用され得る。
【０２３５】
抗体の産生のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限定されない）は、目的の同定されたタンパク質を注入することによって免疫される。種々のアジュバント（フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリマー、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール）、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が含まれるが、これらに限定されない）が、宿主種に依存して、免疫学的応答を増強させるために使用され得る。
【０２３６】
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体は、培養における連続的な細胞株によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製され得る。これらには、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７によって本来記載されるハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、適切な抗原特異性のマウス抗体分化からの遺伝子をスプライスすることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）が使用され得る。あるいは、単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が、本発明のタンパク質に特異的な単鎖抗体を産生するために適合され得る。
【０２３７】
細胞増殖遺伝子の特異的な結合部位を含む抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）2フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、本発明のタンパク質の所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る（Ｈｕｓｅら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１）。
【０２３８】
Ｇ．アンチセンスアプローチおよびリボザイムの開発のための目的の標的タンパク質をコードする同定された核酸の使用
細胞増殖遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために機能するアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはリボザイムを含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド配列の開発および使用は、２つの目的のいずれかを満たし得る。第１に、このようなアプローチは、本発明の方法を用いて同定された新規のタンパク質の機能を研究するために使用され得る。第２に、これらのアプローチは、一旦、タンパク質の機能および病理学的状態におけるその関与が確立されると、実際の治療方法として働き得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡに結合し、次いでタンパク質の翻訳を妨げることによって、標的化された遺伝子の翻訳を直接ブロックするように作用する。
【０２３９】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒し得る酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用のメカニズムは、標的ＲＮＡの相補的配列へのリボザイム分子の部位特異的ハイブリダイゼーション、続いてエンドヌクレオチド分解的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断に関与するようである。本発明の１つの実施態様において、リボザイム分子は、本発明の方法を用いて同定された遺伝子のｍＲＮＡのエンドヌクレオチド分解的切断を特異的に触媒するように操作される。
【０２４０】
リボザイム活性の適切な標的部位は、第一に標的分子を潜在的なリボザイム切断モチーフについてスキャニングし、第二に同定された切断認識部位を含有する標的分子の領域に対応する約１５〜２５アミノ酸の構造的特徴を評価することによって同定される。さらに、候補標的の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近可能性を試験することによって評価され得る。Ｂｏｒｄｏｎａｒｏら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：４２８−４３０。
【０２４１】
本発明の標識されたハイブリダイゼーションプローブアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成のための当該分野で任意の公知の方法によって調製される。例えば、オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって販売されている装置のような市販のＤＮＡまたはＲＮＡ合成機を使用して化学的に合成され得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボでの転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む広範な種々のベクター中に組み込まれ得る。あるいは、アンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、構成的にまたは誘導的に、細胞株中に安定に導入され得る。
【０２４２】
ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に対する種々の改変が、細胞内安定性および半減期を増大する手段として導入され得る。例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列は、分子の５’および／または３’末端に付加され得るか、あるいはホスホジエステル連結よりもむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルが、オリゴヌクレオチド骨格内で使用され得る。Ｘｕら、１９９６，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２４：１６０２−１６０７。
【０２４３】
Ｈ．  同定され、単離され、そして特徴付けられたタンパク質を標的化する化合物の生成
１．化合物の同定
本発明の、同定され、そして特徴付けられたタンパク質の機能を改変し、阻害し、または増強する化合物の同定および単離のために、同定されたタンパク質を発現する適切な細胞系が利用され得る。あるいは、本発明のプロセスによって同定されたタンパク質は、それらの活性を特異的に妨害する化合物の同定および単離についてのインビトロまたはインビボアッセイのために単離および使用され得る。一般に、利用されるアッセイのタイプは、標的として使用された同定されたタンパク質（以下、「標的タンパク質」と呼ぶ）の性質および機能的特徴に大きく依存する。例えば、標的タンパク質が増殖因子レセプターである場合、増殖に対する化合物の影響が測定される細胞アッセイが利用され得る。標的タンパク質が、分泌されたタンパク質である場合、適切な系（例えば、分泌されたタンパク質の機能を測定することを可能にさせるレセプター系）に対する単離された分泌されたタンパク質の効果を包含するアッセイが利用され得る。標的タンパク質が転写因子である場合、転写因子によって制御される遺伝子の発現に対する化合物の影響をアッセイすることを可能にする細胞系が利用され得る。標的タンパク質がアポトーシス調節因子である場合、細胞死（または生存）が応答性標的タンパク質によって駆動される細胞系が利用され得、そして化合物の影響がアッセイされ得る。
【０２４４】
より詳細には、標的タンパク質を発現する適切なアッセイ系における細胞は、化学的化合物または化合物ライブラリーに曝露され、所望の調節効果を有する化合物を同定し得る。あるいは、標的タンパク質が、任意の供給源からの化合物の高処理量試験を可能にするように設計された適切な発現系において発現され得、標的タンパク質に対して結合するか、または測定可能な阻害効果を有する分子を同定するために必要に応じて単離される。
【０２４５】
本発明の方法を使用して同定および単離された標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術の周知の方法を使用して、対応する精製されたタンパク質を生成するために使用され得る。単離された後の遺伝子の発現についての方法を教示する多くの刊行物には、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．：１８５、Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （１９９０）がある。
【０２４６】
標的タンパク質として選択された本発明のタンパク質は、種々の宿主細胞（原核生物かまたは真核生物のいずれか）において発現され得る。多くの場合、宿主は、真核生物であり、より好ましくは宿主は、哺乳動物である。宿主細胞は、本発明の方法を用いて同定されたタンパク質をコードする核酸配列が天然に存在する（すなわち、内因性の）種と同一の種か、または異なる種のいずれかに由来し得る。それらの細胞の位置に従ったタンパク質の元々の同定および単離について初めに使用された発現系（前出を参照のこと）以外の細胞発現系において、組換えＤＮＡ技術によって選択された標的タンパク質を産生する利点には、調節化合物の同定についての最適化されたアッセイ系の開発が含まれる。一般に、本発明の発現系は、それらが大量の組換えタンパク質の産生のための系を容易に提供するという利点を有する。しかし、当業者が理解する特定の状況下で、代替の発現系は、いくつかの場合には、精製のためのタンパク質の高度に富化された供給源、および単純化された精製手順の利用可能性を得るのに有利であることが証明され得る。タンパク質の組換え産生のための方法は、一般に、当該分野で非常に良く確立されており、そしてとりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）において見出され得る。
【０２４７】
本発明の実施態様において、本発明の同定されたタンパク質をコードする発現ベクターで形質転換された細胞は、その遺伝子配列の発現および組換え産生されたタンパク質の細胞培養からの回収に有利な条件下で培養される。組換え体細胞によって産生された目的の標的タンパク質は、遺伝子の性質および使用された特定の遺伝子構築物に依存して、分泌され得るか、または細胞内に含まれ得る。一般に、分泌された形態での組換えタンパク質を調製することがより都合が良い。精製工程は、産生および産生された特定のタンパク質の性質に依存する。精製の方法論は、当該分野で周知である；当業者は、精製条件をどのように最適化するかを理解する。特定のタンパク質についての精製条件を最適化する方法の一般的なプロトコルは、とりわけ、Ｓｃｏｐｅｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  １９８２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｂｅｒｌｉｎにおいて見出され得る。
【０２４８】
組換え産生に加えて、ペプチドフラグメントは、固相技術を使用して、直接的ペプチド合成によって産生され得る。Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （１９６９），  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  １９６３，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１５４を参照のこと。
【０２４９】
インビトロポリぺプチド合成は、手動の技術を使用して、または自動化によって行い得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、製造業者によって供給される取扱説明書に提供される説明に従って、達成され得る。
【０２５０】
本発明の１つの実施態様において、標的タンパク質を発現する標的タンパク質および／または標的タンパク質を発現する細胞株を使用して、細胞増殖遺伝子活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体、ペプチド、有機分子、または他のリガンドをスクリーニングする。例えば、活性（例えば、標的タンパク質の酵素活性）、またはリガンド、アダプター分子、もしくは基質とのその相互作用を妨害し得る抗体は、標的タンパク質の機能を阻害するために使用される。標的タンパク質の機能の増幅が所望される場合、例えば、対応するシグナル伝達経路のリガンド、アダプター分子、または基質を模倣する抗体が、開発され得る。明らかに、所望の場合には、標的タンパク質の活性、機能、または特異性を改変する抗体が精製され得る。
【０２５１】
あるいは、ペプチドライブラリーまたは有機化合物の、組換え的に発現された標的タンパク質または標的タンパク質を発現する細胞株でのスクリーニングは、その生物学的活性を阻害、増幅、または改変することによって機能する治療用分子の同定に有用であり得る。
【０２５２】
合成化合物、天然の産物、および潜在的に生物学的に活性な物質の他の供給源は、多くの方法によってスクリーニングされ得る。試験化合物の標的タンパク質の機能を阻害、増強、または調節する能力は、標的タンパク質の機能を測定する適切なアッセイを用いて決定され得る。例えば、応答（例えば、酵素活性のような活性、またはリガンド、アダプター分子、または基質に結合する標的タンパク質の能力）は、インビトロアッセイにおいて決定され得る。細胞アッセイは、セカンドメッセンジャーの生成の調節、細胞内代謝の変化、または細胞増殖に対する効果をモニターするために開発され得る。これらのアッセイは、これらの目的のために開発された従来の技術を使用して行われ得る。最後に、試験化合物の、標的タンパク質の機能を阻害、増強、または調節する能力は、適切な動物モデルにおいてインビボで測定される。例えば、マウスモデルは、固形腫瘍の発達を阻害する化合物の能力、または固形腫瘍のサイズを減少させる効果をモニターするために使用される。
【０２５３】
本発明の１つの実施態様において、固相支持体に結合したアミノ酸のすべての可能な組み合わせからなるランダムペプチドライブラリーは、標的タンパク質の機能を妨害し得るペプチドを同定するために使用される。例えば、ペプチドは、所定の標的タンパク質の、リガンド結合部位、アダプター分子結合部位、もしくは基質結合部位、または標的タンパク質の他の機能的ドメイン（例えば、酵素ドメイン）への結合について同定され得る。従って、ペプチドライブラリーのスクリーニングは、その活性を妨害するので治療的価値を有する化合物を生じ得る。
【０２５４】
標的タンパク質に結合し得る分子の同定は、ペプチドライブラリーを組換え可溶性標的タンパク質でスクリーニングすることによって達成され得る。選択された標的タンパク質の発現および精製のための方法は、目的の機能的ドメインに依存して、組換え全長タンパク質またはそのフラグメントを発現するために使用され得る。
【０２５５】
標的タンパク質と相互作用し複合体を形成するペプチド／固相支持体を同定および単離するために、標的タンパク質分子またはそのフラグメントを標識または「タグ化」することが必要である。例えば、標的タンパク質は、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素に、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリチン（ＰＥ）、またはローダミンを含み得る蛍光標識のような他の試薬に結合体化し得る。任意の所与の標識の標的タンパク質への結合は、当該分野で日常的な技術を使用することによって行われ得る。
【０２５６】
可溶性のタンパク質分子またはそのフラグメントを使用することに加えて、別の実施態様において、標的タンパク質に結合するペプチドが、インタクトな細胞使用して同定され得る。インタクトな細胞の使用は、細胞膜の脂質ドメインが機能的であることを必要とする細胞表面レセプターを含む標的タンパク質である場合に好ましい。本発明の方法および発現系を用いて同定される標的タンパク質を発現する細胞株を生成するための方法。この技術において使用される細胞は、生細胞または固定化細胞のいずれかであり得る。細胞は、ランダムペプチドライブラリーとともにインキュベートされ、そしてライブラリー中の特定のペプチドに結合する。標的細胞と関連する固相支持体／ペプチドとの間のこのように形成された複合体は、当該分野で公知の標準的な方法（示差的遠心分離を含む）によって単離され得る。
【０２５７】
標的タンパク質が、膜結合レセプター、または細胞膜の脂質ドメインが機能的であることを要求するレセプターである場合、全細胞アッセイに代わるものは、レセプター分子を標識または「タグ」が結合し得るリポソームへと再構築することである。
【０２５８】
別の実施態様において、選択された標的タンパク質、または単離された標的タンパク質またはそのフラグメントを発現する細胞株は、標的タンパク質の活性（適用可能な場合には、シグナル伝達）を阻害、増強、または調節する分子をスクリーニングするために使用される。このような分子には、低有機または無機化合物、あるいは標的タンパク質の活性に影響を与えるか、またはそのリガンド、アダプター分子、または基質との複合体形成を促進または防止する他の分子が含まれ得る。合成化合物、天然の産物、および潜在的に生物学的に活性な物質の他の供給源は、当業者に一般に知られる多くの方法によってスクリーニングされ得る。
【０２５９】
例えば、試験分子の選択された標的タンパク質の機能を妨害する能力は、標準的な生化学的技術を使用して測定され得る。あるいは、他のタンパク質の触媒活性の活性化もしくは抑制、リン酸化、脱リン酸化、または他の改変、セカンドメッセンジャー産生の活性化もしくは調節、細胞内のイオンレベルの変化、シグナリング分子の結合、解離、もしくは転移、または特定の遺伝子の転写または翻訳のような細胞応答もまた、モニターされ得る。これらのアッセイは、スクリーニングの経過において、これらの目的のために開発された従来の技術を使用することによって行われ得る。
【０２６０】
さらに、標的タンパク質の機能に対する効果は、シグナル伝達経路を介して、種々の細胞性プロセスに影響を与え得る。そのシグナリング経路の制御下での細胞プロセスには、正常な細胞機能、増殖、分化、細胞の形状の維持、接着、さらには、正常なまたは潜在的に有害なプロセス（例えば、調節されていない細胞増殖、接触阻害の欠損、および分化または細胞死のブロッキング）が含まれるが、これらに限定されない。当該分野で公知の技術による任意の記載された細胞プロセスの定性的または定量的な観察および測定は、スクリーニングの過程において、シグナル伝達のためのスコアリングの手段として有利に使用され得る。
【０２６１】
本発明の選択された標的タンパク質と相互作用する化合物のスクリーニング、同定、および評価のための種々の技術が利用され得る。その化合物は、上記標的タンパク質の制御下で、種々の細胞プロセスに影響を与え得る。
【０２６２】
例えば、標的タンパク質またはその機能的誘導体は、純粋なまたは半純粋な形態において、膜の調製物中で、または全ての生細胞もしくは固定化細胞において、化合物とインキュベートされる。続いて、適切な条件下で、標的タンパク質機能に対する化合物の効果が、例えば、その活性またはそのシグナル伝達を測定し、そしてその化合物なしで同じ条件下でインキュベートされた標的タンパク質の活性と比較することによって、綿密に検査され、それにより、その化合物が標的タンパク質の活性を刺激または阻害するか否かが決定される。
【０２６３】
化合物のスクリーニングのための選択された標的タンパク質を発現する全細胞の使用に加えて、本発明は、可溶性のまたは固定化した標的タンパク質を使用する方法もまた含む。例えば、標的タンパク質に結合し得る分子は、生物学的または化学的調製物内にて同定され得る。例えば、標的タンパク質またはその機能的なフラグメント（例えば、目的の特定のドメインを含むフラグメント）は、固相マトリックスに固定化され、続いて化学的または生物学的調製物が、固定化標的タンパク質と化合物が結合するのに十分な時間接触される。次いで、任意の未結合の物質が、固相マトリックスから洗浄除去され、そして固相に結合した化合物の存在が検出され、これにより、化合物が同定される。次いで、適切な手段が、結合化合物を溶出するために使用される。
【０２６４】
２．候補試験化合物の供給源
標的タンパク質の活性の調節因子を同定するためのアッセイのために使用される試験化合物は、任意の商業的供給源（Ａｌｄｒｉｃｈ（１００１  Ｗｅｓｔ  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ  Ａｖｅ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ  ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  （Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １４５０８、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ６３１７８）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓｔｒａｓｓｅ２５、ＣＨ−９４７１  Ｂｕｃｈｓ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  （Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．９８０  Ｓｏｕｔｈ  ２ｎｄ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ＮＹ  １１７７９））、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｐ．Ｏ  Ｂｏｘ  ４３１、Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ，ＴＮ  ３７６６２）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ（Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ  Ｓｔｒａｓｓｅ１１６、Ｄ−６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔａｋａｓａｇｏ（４Ｖｏｌｖｏ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ、ＮＪ  ０７６４７）、ＳＳＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（６３５  Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ  ０７０１２）、Ｆｅｒｒｏ（１１１  Ｗｅｓｔ  Ｉｒｅｎｅ  Ｒｏａｄ、Ｚａｃｈａｒｙ、ＬＡ  ７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎＡｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  Ｄ−３０９１８、Ｓｅｅｌｚｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｎｅ  ＰＰＧ  Ｐｌａｃｅ、３４ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ  １５２７２）から得られ；さらに、微生物、真菌、または植物の抽出物を含む任意の種類の天然の産物が、本発明のアッセイカスケードを使用してスクリーニングされ得る。
【０２６５】
３．そのあらかじめ決定された特性に従う本発明の標的タンパク質の活性を調節するための化合物の使用のための表示
標的タンパク質の性質および機能に従って、上記の例示されたアッセイおよび方法によって同定される化合物は、細胞増殖の調節因子または特定の代謝機能の調節因子であり得る。このように、本発明のプロセスおよびアッセイによって産生される化合物は、異常な、制御されていない、または不適切な細胞増殖（過剰なまたは減少した増殖を含む）に関連する疾患の処置に有用である。あるいは、化合物は、異常な代謝機能に関連する疾患の処置のために有用であり得る。
【０２６６】
多くの疾患状態は、過剰のまたは減少した細胞増殖を含む。一般に、これらの疾患の多くは、ＤＮＡ配列または細胞増殖に影響を与える低分子で処理され得る。いくつかの場合には、目的は、増殖を刺激することであり；他の場合には、細胞の増殖を予防または阻害することである。細胞増殖を直接含む疾患のリストには、ガン、乾癬、炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）、再狭窄、免疫学的活性化もしくは抑制（組織注射）、神経変性、または神経細胞の拡張、およびウイルス感染が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６７】
多くの疾患は、異常な代謝機能（真性糖尿病、線維症、嚢胞性線維症が含まれるが、これらに限定されない）を含む。さらに、病理学的状態は、異常な細胞増殖および代謝欠損の両方に関連する。
【０２６８】
従って、上記の方法によって同定される治療的有効量の化合物を含む薬学的組成物は、制御されていないかまたは不適切な細胞増殖によって駆動される疾患（神経膠腫、黒色腫、カポジ肉腫、乾癬、血管腫のようなガン、および卵巣ガン、乳ガン、肺ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、結腸ガン、および類表皮ガン、慢性関節リウマチ、再狭窄、免疫学的活性化または抑制（組織拒絶を含む）、神経細胞の神経変性または拡張を含む）；ならびに代謝不全に関連する疾患（真性糖尿病、線維症、嚢胞性線維症を含むが、これらに限定されない）の処置のために有用である。
【０２６９】
Ｉ．投与の処方物／経路
本発明は、治療用組成物の２つの形態を提供する。第一に、本発明は、天然に存在する機能的ポリぺプチドもしくはペプチド、またはこれらの機能的フラグメントもしくは誘導体に類似している医薬を提供する。このような医薬は、例えば、その天然の形態において分泌されるタンパク質である；このようなタンパク質は、本発明の発現系を用いて直接同定され得る。このタイプの医薬には、サイトカイン、ホルモン、成長因子などが含まれるが、これらに限定されない。第二に、本発明は、本発明の方法および発現系を使用して同定される標的タンパク質の機能を調節する治療化合物を提供する。代表的には、これらのタイプの化合物は、低有機分子であるが、これらはまた、ペプチド化合物および抗体を含む。当業者は、以下の投与方法、処方、および処置方法が、選択される化合物および処置されるべき疾患のタイプに依存して調整される必要があることを理解する。
【０２７０】
同定された治療化合物は、ヒト患者に、単独でまたは薬学的組成物中において投与され得る。組成物中で、それらは適切なキャリアまたは賦形剤と、種々の障害を処置または低減するための治療的有効用量で混合されている。治療的有効用量とは、例えば、細胞増殖の減少もしくは増大、または代謝機能の再構築において決定された兆候の軽減を生じるのに十分な化合物の量をいう。本出願の化合物の処方および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  最新版において見出され得る。
【０２７１】
１．投与の経路
適切な投与の経路には、例えば、経口、経直腸、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、およびくも膜下内、直接脳室内、血管内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達が含まれる。
【０２７２】
あるいは、本発明の化合物を、全身的な様式ではなく、局所的に、例えば、化合物を固形腫瘍に、しばしばデポット（ｄｅｐｏｔ）中において、または徐放処方物中において、直接注入することにより投与し得る。
【０２７３】
さらに、例えば、腫瘍特異的抗体でコートされたリポソームにおいて、標的化薬物送達系を介して薬物を投与し得る。リポソームは、腫瘍に標的化され、そして腫瘍により選択的に取り込まれる。
【０２７４】
２．組成物／処方物
本発明の薬学的組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化（ｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ）、糖衣錠形成（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、微粒子化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、包括化（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）、または凍結乾燥化プロセスの手段によって製造され得る。
【０２７５】
従って、本発明による使用のための薬学的組成物は、賦形剤および補助剤（これらは、薬学的に使用され得る調製物への活性な治療用化合物の加工を容易にする）を含む１つ以上の生理的に受容可能なキャリアを使用する従来の様式で処方され得る。適切な処方物は、選択される投与の経路に依存する。
【０２７６】
注入のためには、本発明の薬剤は、水溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー液、または生理学的な生理食塩緩衝液のような生理学的に適合した緩衝液中に処方され得る。経粘膜投与のためには、浸透されるべき関門に適切な浸透剤が処方物に使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知である。
【０２７７】
経口投与のためには、治療用化合物は、活性な治療用化合物を、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせることによって、容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の治療用化合物を、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などのように、処置される患者による経口摂取のために処方されることが可能である。経口使用のための薬学的調製物は、固型賦形剤として、所望であれば、錠剤または糖衣錠コアを得るために適切な補助剤の添加後、必要に応じて得られる混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物を加工して得られ得る。適切な賦形剤としては、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む）のような充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ポテトデンプン、ゼラチン、ガムトラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物が挙げられる。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤が添加され得る。
【０２７８】
糖衣錠コアは、適切なコーティングとともに提供される。この目的のためには、濃縮した糖溶液が使用され得、これは、必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ  ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料または色素は、活性な治療用化合物用量の異なる組み合わせを同定または特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０２７９】
経口的に使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作製されるプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤から作製される軟封入カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ならびに必要に応じて安定剤と混合した活性成分を含み得る。軟カプセルにおいて、活性な治療用化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量であるべきである。
【０２８０】
口腔内投与のためには、組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはトローチの形態をとり得る。
【０２８１】
吸入による投与のためには、本発明による使用のための治療用化合物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）の使用とともに、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合において、投薬量単位は、測定された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器における使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが処方され得、これは、治療用化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤を含む。
【０２８２】
治療用化合物は、注射によって、例えば、大量注射または連続注入によって、非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、単位投薬量形態において、例えば、アンプルまたは複数用量の容器において、さらなる保存剤とともに存在し得る。組成物は、懸濁物、溶液、または油および水性ビヒクル中エマルジョンのような形態をとり得、そして懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような処方剤を含み得る。
【０２８３】
非経口投与のための薬学的処方物は、水溶性形態中の活性化な治療用化合物の水溶液を含む。さらに、活性な化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油のような脂肪油、エチルオレートもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加する物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、治療用化合物の溶解度を増加する適切な安定剤または薬剤を含み、高度に濃縮された溶液の調製を可能にし得る。
【０２８４】
あるいは、活性成分は、使用の前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌無発熱物質水）で構成されるために粉末形態であり得る。
【０２８５】
治療用化合物はまた、座薬または保持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸（例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような従来の座薬基剤を含む）のような直腸組成物に処方され得る。
【０２８６】
以前に記載される処方物に加えて、治療用化合物はまた、蓄積調製物（ｄｅｐｏｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）として処方され得る。このような長時間作用性処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、治療用化合物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは節約型（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ）可溶性誘導体（例えば、節約型可溶性塩）として処方され得る。
【０２８７】
本発明の疎水性治療用化合物のための薬学的キャリアは、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水相を含む共溶媒系である。
【０２８８】
共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であり得る。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の溶液であり、無水エタノールで総容量にした。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、水溶液中５％デキストロースで１：１に希釈したＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性治療用化合物を十分溶解し、そしてそれ自体、全身性投与時に低い毒性を生じる。自然に、共溶媒系の割合は、その溶解度および毒性特徴を破壊せずに、かなり変化し得る。さらに、共溶媒成分の同一性は変化し得る：例えば、他の低毒性非極性界面活性剤は、ポリソルベート８０の代わりに使用され得る；ポリエチレングリコールの画分サイズは、変化し得る；他の生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（例えば、ポリビニルピロリドン）と置き換え得る；ならびに他の糖または多糖類は、デキストロースと置換され得る。
【０２８９】
あるいは、疎水性薬学的治療用化合物のための他の送達系が使用され得る。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物のための送達ビヒクルまたはキャリアの例として周知である。通常はかなりの毒性を有するが、ジメチルスルフォキシドのような特定の有機溶媒もまた使用され得る。
【０２９０】
さらに、治療用化合物は、治療用薬剤を含む固型疎水性ポリマーの半透性マトリクスのような持続性放出系を用いて送達され得る。種々の持続性放出材料は確立されており、そして当業者に周知である。持続性放出カプセルは、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日までにわたって、治療用化合物を放出し得る。
【０２９１】
治療剤の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定性のためのさらなるストラテジーが使用され得る。
【０２９２】
薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相キャリアまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン−セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９３】
本発明の多くの治療用化合物は、薬学的に適合性の対イオンとの塩として提供され得る。薬学的に適合な塩は、多くの酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがこれらに限定されない）とともに形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態である水性溶媒間または他のプロトン性溶媒において、より可溶性である傾向がある。
【０２９４】
３．有効な投薬量
本発明の使用に適切な薬学的組成物は、活性成分がその意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。より詳細には、治療的に有効な量は、処置される被検体の発症を予防するかまたは存在する症状を緩和するのに有効な量を意味する。有効な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内で十分である。
【０２９５】
本発明の方法において使用される任意の治療用化合物については、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。例えば、用量は、動物モデルに処方されて、細胞培養で決定されるようなＩＣ50を含む循環濃度範囲（すなわち、細胞増殖活性の半最大（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）の阻害または活性化、あるいは代謝機能の回復を達成する試験治療用化合物の濃度）を達成し得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０２９６】
治療的に有効な用量とは、患者において症状の寛解または生存の延長を生じる治療用化合物の量をいう。このような治療用化合物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ50（集団の５０％までの致死用量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療的に効果的な用量）を決定するための標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果と間の用量比は治療指数であり、そしてＬＤ50とＥＤ50との間の比として示され得る。高い治療指数を示す治療用化合物が好ましい。
【０２９７】
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方するのに使用され得る。このような治療用化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有さないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変化し得る。正確な処方、投与の経路、および投薬量は、患者の状態を参照して、個々の医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５，  「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、第１ページ）。
【０２９８】
投薬量および間隔は、キナーゼ調節効果を維持するのに十分な活性部分の血漿レベル、または最小効果濃度（ＭＥＣ）を提供するように、個々に調整され得る。ＭＥＣは、各治療用化合物について変化するが、インビトロでのデータから推定され得る；例えば、本明細書中に記載のアッセイを用いて、キナーゼの５０〜９０％阻害を達成するのに必要な濃度。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個体の特長および投与の経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使用して、血漿濃度を決定し得る。
【０２９９】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を用いて決定され得る。治療用化合物は、その時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、そして最も好ましくは５０〜９０％の間、ＭＥＣを超える血漿レベルを維持するレジメを用いて投与されるべきである。局所投与および選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度に関与し得ない。
【０３００】
投与される組成物の量は、もちろん、処置される被検体、被検体の体重、苦痛の重症度、投与の様式、および薬を処方する医師の判断に依存する。
【０３０１】
４．パッケージング
組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つ以上の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在し得る。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル（例えば、ブリスターパック）を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を添付し得る。適合する薬学的キャリア中に処方される本発明の治療用化合物を含む組成物が調製され、適切な容器中に配置され、そして指示された条件の処置についてラベルされ得る。ラベルに示される適切な条件としては、細胞増殖の阻害または活性化、代謝機能の回復、腫瘍の処置、関節炎の処置などが挙げられ得る。
【０３０２】
本発明の選択系の生成および使用についての以下の実施例は、当業者には、本発明のより明確な理解および実施を可能にする。しかし、本発明は、本発明の単一の局面の例示としてのみ意図される例示的な実施態様による範囲に制限されず、そして機能的に等価である方法は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明および添付の図面から、当業者には明らかになる。このような改変は、上記の請求の範囲内であることが意図される。
【０３０３】
ＶＩ．実施例
Ａ．材料および方法
以下は、以下に示される実施例に使用される実験手順および材料である。
【０３０４】
（ｃＤＮＡライブラリーのＳｉｎＲｅｐ５ベクターへの構築）
任意の組織または細胞株の全ｍＲＮＡを、供給者の推奨に従ってＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，  Ｄｕｅｂｅｎｄｏｒｆ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して単離する。供給者の説明書に従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ  ＡＧ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ＺＡＰ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて、第１鎖合成を５−メチル−シトシンの存在下で行い、内部ＳｔｕＩ制限部位を保護する。ＲＮａｓｅＨでの簡潔な消化の後、第２鎖をＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成して、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（３’エキソヌクレアーゼ活性）によって陥凹され得る３’オーバーハングを産生する。二本鎖ＤＮＡを、最後に、ｐＳｉｎＲｅｐ５ベクターに連結する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＮＶ  Ｌｅｅｋ，  Ｎｅｔｈｅｒｌ；図５およびＢｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  １１：６４３９−６４４６を参照のこと）。続いて得られたＤＮＡをＳｔｕＩで消化し、インビトロ転写のためにプラスミドを線状化する。
【０３０５】
ＴＥベクター（図６およびＦｒｏｌｏｖら、１９９６，  ＰＮＡＳ  ９３：１１３７１−１１３７７を参照のこと；ｐＴＥ５’２Ｊの完全な配列は、配列番号１に与えられる）におけるｃＤＮＡライブラリーの構築を、本質的にｐＳｉｎＲｅｐ５について記載されたように行う。唯一の例外は、第２鎖合成の間に５−メチル−アデノシンを使用して、内部ＸｂａＩ制限部位を保護して、得られるＤＮＡフラグメントをｐＴＥプラスミドｐＴＥ  ＳＥＡＰに、ＸｂａＩ／ＳｔｕＩまたはＡｐａＩを介してクローン化することである。
【０３０６】
本研究で使用したプラスミドを、表１に詳細に記載する。
【０３０７】
表Ｉ
ＤＮＡ構築物の説明：
ｐＳｉｎＲｅｐ５構築物：
ｐＳｉｎＲｅｐ５：            Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｎｄｂｉｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍよりＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＮＶ  Ｌｅｅｋ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ
Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３年１１月、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６４３９−６４４６。
【０３０８】
ＳＰ６プロモーター：          ９９３３〜９９５１
非構造遺伝子：                ６０〜７５９８
サブゲノムプロモーター：      ７５８０〜７６０３
転写開始：                    ７５９８
多重クローニング部位：        ７６４７〜７６８９
ポリＡテイル：                ７９９７〜８０３３
Ａｍｐ耐性遺伝子：            ８２２７〜９０８５
ＣｏｌＥ１起点：              ９２３２〜９８６１。
【０３０９】
ｐＳｉｎＲｅｐ５  ＥＰＯ：    ＸｂａＩ／ＳｐｈＩで消化したｐＳｉｎＲｅｐ５をＥＰＯの合成ＥＰＯ配列（ＸｂａＩ／ＳｐｈＩ）と連結した。ＥＰＯの配列は添付：配列１を参照のこと。
【０３１０】
ｐＳｉｎＲｅｐ５  ＳＥＡＰ：  ＸｂａＩ／ＳｔｕＩで消化し、そしてｐＳＥＡＰ２ＢａｓｉｃのＮｈｅＩ／ＣｌａＩフラグメントと連結したｐＳｉｎＲｅｐ５、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＵＳＡ。ｐＳｉｎＲｅｐ５  ｌａｃＺ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに由来。
【０３１１】
ｐＴＥ構築物：
ｐＴＥ５’２Ｊ：              関連ベクターｐＴＥ３’２Ｊの一般的な説明は以下に記載される：Ｈａｈｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９−２６８３。Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１１３７１−１１３７７。ＴＥ５’２Ｊの詳細な配列は配列番号１に示される。
【０３１２】
ｐＴＥ５’２Ｊ  ＥＰＯ：    ｐＴＥをＸｂａＩ／ＡｐａＩで消化し、ｐＳｉｎＲｅｐ５に由来するＸｂａＩ／ＡｐａＩＥＰＯフラグメントと連結した。
【０３１３】
ｐＴＥ５’２Ｊ  ＳＥＡＰ：  ｐＴＥをＡｐａＩで消化し、末端を、ＸｂａＩでの消化の前にクレノウ酵素で処理した。ベクターをｐＳＥＡＰ  ２Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＵＳＡ）由来のＮｈｅＩ／ＣｌａＩフラグメントと連結した。
【０３１４】
ｐＴＥ５’２Ｊ  ＣＡＴ：    ｐＴＥ５’２ＪをＸｂａＩで消化し、末端を、標準的な手順に従ってクレノウ酵素で満たした。添付の配列３に示されるＣＡＴ  ＰＣＲフラグメントを、平滑末端化してベクターＴＥ５’２Ｊに連結した。
【０３１５】
ヘルパー構築物：
ＤＨＥＢ：                    Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６４３９−６４４６。
【０３１６】
９８７ＢＢｎｅｏ：            （配列番号２）。
【０３１７】
（シンドビスｃＤＮＡライブラリーのインビトロ転写）
線状化ベクターＤＮＡ（  ＮｏｔＩ消化によって線状化したｐＳｉｎＲｅｐ５またはｐＴＥ；ＥｃｏＲＩ消化によって線状化したヘルパーＤＮＡ  ＤＨ−ＥＢ（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３，  Ｊ.Ｖｉｒｏｌ．  １１：６４３９−６４４６））を、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を通して精製することによってＲＮａｓｅを含まないようにし、そしてＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏで溶出した。続くインビトロでの転写を、ＳＰ６インビトロ転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐｔ  ＣＡＰ  Ｋｉｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，  ＮＶ  Ｌｅｅｋ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造業者の推奨に従って行った。得られた５’キャップ化ｍＲＮＡを、還元および非還元アガロースゲルで分析した。
【０３１８】
（シンドビスウイルス粒子の生成）
２〜５μｇのインビトロ転写したｍＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアルに従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐｔ  ＣＡＰ  Ｋｉｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，  ＮＶ  Ｌｅｅｋ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１０）にエレクトロポレートしたか（ＴＥ構築物について）、または同時エレクトロポレートした（ＰＳｉｎＲｅｐ５およびヘルパーＤＨ−ＥＢについて）。ｐＳｉｎＲｅｐ５の５’キャップ化ｍＲＮＡは、ウイルスの非構造タンパク質をコードし、これはウイルス複製工程を誘導する。同時エレクトロポレートしたヘルパーｍＲＮＡ（ＤＨ−ＥＢ）は、ウイルス構造タンパク質を送達した。１％ＦＣＳを含むＴｕｒｂｏｄｏｍａＨＰ−１培地中で、５％ＣＯ2、３７℃にて１８時間のインキュベーションの後、細胞上清を採取し、そして放出された感染性ウイルス粒子の量を、プラークアッセイによって決定した。
【０３１９】
（プラークアッセイ）
採取したウイルス粒子（前出を参照のこと）の希釈系列を、６ウェルプレートにおける９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞において、１ｍｌのＴｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１（１：１０4、１：５×１０4、１：１０5、１：５×１０5、１：１０6、１：５×１０6）で行った。３７℃にて２時間のインキュベーションの後、相補性群Ｃ、Ｄ，およびＥからの温度感受性変異体の場合において、プレートを、３０℃の許容温度でインキュベートした（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔら、１９８６，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５１：１０−２０；  Ａｒｉａｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １６８：８７−１０２；ＣａｒｌｅｔｏｎおよびＢｒｏｗｎ，  １９９６，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ７０：９５２−９５９）。培地を、Ｔｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１培地（Ｆ．Ｍｅｓｓｉ博士、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｚｕｒｉｃｈ，  ＣＨ）中２ｍｌの４１℃の暖かい０．８％アガロース（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で置き換えた。許容温度での２日間のインキュベーション後、１〜４ｍｍ直径のプラークが形成された。プラークを計数し、そして１ｍｌあたりに対応するプラーク形成単位（「ｐｆｕ」）数を計算した。
【０３２０】
（アガロースブロットアッセイ（ＡＢＡ））
６０ｍｍディッシュにおいて９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞層を、許容温度にて、２時間、約８００〜１０００プラーク形成単位を含むＨＰ−１培地とともにインキュベートした。上清を１×ＨＰ−１中の４１℃の暖かい０．８％アガロースの１．５ｍｍの層で細胞を重層することによって置き換え、そして細胞を、許容温度にて２時間インキュベートした。分泌されたタンパク質を、感染された細胞の35Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓ標識によって検出した。この目的のために、培地を、２０μＣｉ  35Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓ（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  ＧｍｂＨ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加する前に、２ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ欠損培地）で３０分間置き換えた。
【０３２１】
ウイルスタンパク質の放出を、プロテアーゼインヒビターのカクテルおよび／または実施例に記載のシンドビスウイルス糖タンパク質に対する架橋抗体を添加することによって阻害した。温度感受性シンドビス変異体を、標識前に２時間４０℃に変えて、ウイルス粒子放出を阻害した。細胞およびアガロース層を１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ欠損培地）で２回洗浄する前に、２０μＣｉ  35Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓを、３７℃にて２時間適用した。後に、予め湿らせたニトロセルロース膜を、アガロースの頂部に４〜２０時間置いた。膜を取り出し、そして実施例に記載の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ）を含む緩衝液で洗浄し、そして乾燥後にＸ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ｂｍａｘ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｓｗｅｄｅｎ）に暴露した。発色したＸ線フィルム上の黒いスポットは、分泌タンパク質についてのｃＤＮＡを含むシンドビスウイルス粒子を示した。
【０３２２】
（選択されたウイルス粒子の増幅）
ポジティブプラークを、アガロースの重層を有するＸ線フィルムの重層により同定した。対応するプラークを、１０μｌのチップで採取し、そして２００μｌのＰＢＳ中で４℃にて一晩溶出させた。アガロースをペレット化した後、１２ウェルプレート中の６０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞を、０．５ｍｌのＴｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１中で、溶出されたウイルスを用いて許容温度にて２時間感染させ、次いで、培地を１ｍｌのＴｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１培地で置換させた。許容温度にて２０時間のインキュベートの後、細胞上清を収集し、そして２ｍｌのＴｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１中の１：２０希釈物を、６０％コンフルエントのＢＨＫ  ２１細胞を含むＴ２５フラスコ中で２時間インキュベートし、次いでその培地を１０ｍｌのＨＰ−１培地で置換した。２０時間のインキュベート後、得られた上清は約１０4〜１０6ｐｆｕ／ｍｌ（Ｔ２５上清あたり総計約１０5〜１０7ｐｆｕに相当する）を含んだ。
【０３２３】
（選択されたシンドビスウイルス粒子の配列決定）
ウイルスＲＮＡを、ウイルスＲＮＡ単離キット（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲを、製造業者の推奨に従って、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔの１工程ＲＴ−ＰＣＲを用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲのための３’プライマーは、オリゴＧＣＧＣＧＧＧＣＣＣＴ20（ポリＡテイル（ｔａｉｌ）に特異的）またはオリゴＧＣＧＣＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣ（シンドビスウイルスの３’ＣＩＳ配列に特異的）のいずれかであり；５’プライマーは、オリゴＧＣＧＣＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣであった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、制限酵素Ｂｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、ゲル精製し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いて消化した）に連結し、そして最後に、多重クローニング部位のオリゴ「約４０の正方向および逆方向のプライマー」を用いて配列決定した。
【０３２４】
（シンドビスウイルス感染細胞の免疫蛍光顕微鏡法）
６ウェルプレート中の６０％コンフルエントのＢＨＫ  ２１細胞を、膜タンパク質（レセプター）をコードする異種ｃＤＮＡを含むシンドビスウイルス粒子を含む１ｍｌのＨＰ−１培地中、０．１ｍｏｉで、許容温度にて２時間感染させた。感染の２０時間後、細胞を、細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解離し、そして１％ＢＳＡのＨＢＳＳ中で、４℃にて２回洗浄させた。次いで、再懸濁された細胞を、１００ｎｇ／ｍｌと１μｇ／ｍｌとの間の濃度のリガンド−フラッグ（ｌｉｇａｎｄ−ｆｌａｇ）融合タンパク質、および５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ｍ２とともに氷上で１５分間インキュベートした。細胞を、２回洗浄し、次いで１％ＢＳＡのＨＢＳＳ中で１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合二次抗体とともに４℃にて３０分間インキュベートした。１％ＢＳＡのＨＢＳＳを用いた２回の洗浄工程の後、細胞を、免疫蛍光顕微鏡法を用いて分析したか（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＬ，Ｌｅｉｃａ，Ｈｅｅｒｂｕｒｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、または細胞を、ＦＡＣＳソーターを用いて分析および分類した。
【０３２５】
（ｔｓ２、ｔｓ２０のクローニングおよびＤＨ−ＥＢにおける二重変異ｔｓ２、２０）
変異ｔｓ２、ｔｓ２０、およびこれらの２つの変異の組み合わせを、以下のオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによりＤＨ−ＥＢに挿入した（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６４３９〜６４４６頁）：
プライマー：
オリゴ  ＡａｔＩＩ        ＧＣＡＣＴＴＡＡＧＴＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＣ
オリゴ  ＢｓｓＨＩＩ      ＧＧＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣＧＣＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣ
オリゴ  ＨｐａＩ．１      ＧＣＡＡＴＧＴｔＡＡｃａＧＧＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＡＴＴＧＧ
オリゴ  ＨｐａＩ．２      ＣＡＧＡＣＣｔｇＴＴａＡＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧ
オリゴ  ＰｖｕＩ．１      ＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧａｔＣＧＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＣ
オリゴ  ＰｖｕＩ．２      ＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＴＧＡＴＣＧａｔＣＧＡＣＣＧＣＴＧＴＣ。
【０３２６】
分析のために使用した制限部位に下線を付し、変異されたヌクレオチドは、小文字かつ太字で示されている。ＰＣＲ反応を、以下の組み合わせで行った。
【０３２７】
ＰＣＲ１：オリゴ  ＡａｔＩＩ−オリゴ  ＨｐａＩ．１（ｔｓ２０について）
ＰＣＲ２：オリゴ  ＢｓｓＨＩＩ−オリゴ  ＨｐａＩ．２（ｔｓ２０について）
ＰＣＲ３：オリゴ  ＡａｔＩＩ−オリゴ  ＰｖｕＩ．１（ｔｓ２について）
ＰＣＲ４：オリゴ  ＢｓｓＨＩＩ−オリゴ  Ｐｖｕ．Ｉ．２（ｔｓ２について）。
【０３２８】
１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５ｎｇの鋳型ＤＮＡを、４単位のＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１μＭのｄＮＴＰおよび１．５ｍＭのＭｇＳＯ4を含む１００μｌの反応混液において使用した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する前に（開始点は９５℃）直接添加した。温度サイクルは、以下の通りである：９５℃、１．５分間、続いて９５℃（３０秒）、５４℃（３０秒）、７２℃（１２０秒）を５サイクル、そして続いて９５℃（３０秒）、６４℃（３０秒）、７２℃（１２０秒）を２５サイクル。
【０３２９】
４つのＰＣＲ（ＰＣＲ１〜４）フラグメントを、Ｑｉａ  ｓｐｉｎ  ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ  ９１３１１，ＵＳＡ）を用いて精製し、そして最後に適切な緩衝液中で１０単位のＤｒａＩＩＩおよびＨｐａＩ、ＨｐａＩおよびＢｓｓＨＩＩ、ＤｒａＩＩＩおよびＰｖｕＩ、またはＢｓｓＨＩＩおよびＰｖｕＩをそれぞれに用いて消化された。この消化を、３７℃にて６時間行い、次いでＤＮＡフラグメントをゲル精製（ｇｅｎｅ−ｃｌｅａｎ；Ｂｉｏ  １０１  Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，  ＣＡ  ９２０８３，ＵＳＡ）した。精製されたＰＣＲフラグメント１および２、ならびにフラグメント３および４を、最終的に、ＤｒａＩＩＩ／ＢｓｓＨＩＩ消化され、そしてゲル精製されたｐＤＨ−ＥＢに連結した（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９３年１１月，６４３９〜６４４６頁）。得られたベクターの正確な配列を、制限酵素消化によりチェックし、そして以下のプライマーを用いるＤＮＡ配列決定により確認した：
オリゴ配列  ｔｓ２  ：ＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＧ
オリゴ配列  ｔｓ２０：ＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＡＣＣＧ。
【０３３０】
正確なベクターＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２およびＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２０を、適切な緩衝液中で１０単位のＢｓｐ６８ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、３７℃にて４時間消化した。ｐＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２の４．５ｋｂのＤＮＡフラグメントおよびｐＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２０の３．４ｋｂのフラグメントを、ゲル精製し（上記のように）、そしてＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２、２０を作製するために連結した。得られたベクターの正確な配列を、制限酵素消化により確認し、そしてプライマーオリゴ配列ｔｓ２およびオリゴ配列ｔｓ２０（上記）を用いたＤＮＡ配列決定により確認した。
【０３３１】
（分泌タンパク質のｍｇ量の産生）
ＢＨＫ  ２１細胞のバッチを、目的のタンパク質を含むウイルスの上清を用いて感染させた。後の精製は、数ミリグラムの純粋なタンパク質を生じた。
【０３３２】
（Ｂ．実施例１：予め決定された局在性を用いた核酸コードタンパク質のコンパートメントスクリーニング（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）および同定）
ＢＨＫ細胞のコンフルエントな培養物を、２つの異なる核酸（ｐＳｉｎＲｅｐ５  ＥＰＯおよびｐＳｉｎＲｅｐ５  ｌａｃＺ（両方ともヘルパー構築物ＤＨＢＢでパッケージングされている））を有する２つの発現系を含むウイルス粒子を用いて感染させた。１つの培養物は、ネガティブコントロールとして感染させなかった（Ｖｉａｌ  １、図１Ａにおけるレーン１）。感染の２４時間後、細胞をメチオニンおよびシステインを欠く飢餓培地中で３０分間飢餓させた。１０μＣｉ  ３５Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓのパルス刺激を加え、そして３０分後に新しい培地により置換した。インキュベートの２時間後、細胞および細胞上清を収集した。細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で再懸濁し、そして１０分間煮沸した。５００μｌの上清を６００μｌのメタノールおよび２００μｌのクロロホルムに添加した。上層を捨て、そして沈澱したタンパク質を８００μｌのメタノールの添加によりペレット化した。沈澱した上清タンパク質および細胞ペレットの両方を、２５μｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中に再懸濁し、そしてそのタンパク質を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。乾燥後、ゲルをＸ線フィルムに一晩曝露した。上清中に見出される標識されたタンパク質を、図１Ａに示されるゲル上で電気泳動した；図１Ｂは、図１Ａのレーン１および２における上清に対応する細胞ペレット中に見出される標識されたタンパク質を示す。
【０３３３】
分泌されたタンパク質をコードする核酸の同定は、Ｘ線フィルム上でのバンドの検出により可能であり（図１Ａ）、これは、外因性の発現系によりコードされる、上清中の標識されたタンパク質に独特の結果である。図１Ａのレーン１は、感染されてない細胞（外因性の発現系を含まない）が、いくつかの未同定タンパク質を分泌することを示す。対応する細胞ペレットは、図１Ｂに示され、ここで多くのタンパク質が標識され、そして多数のバンドが可視化される。図１Ａにおける空のレーン２は、バイアル２中の細胞内タンパク質をコードする核酸を含む発現系の存在を示す。従って、図１Ｂ中のレーン２は、細胞ペレット由来の単一の標識されたタンパク質から生じた独特のバンドの存在により、この知見を確証する。他の内因性タンパク質の全ての発現を（レーン１と比較して）抑制し、独特な標識化、そしてバイアル２の核酸を細胞内タンパク質（このタンパク質は、ｌａｃＺが実際に細胞内タンパク質であるという公表された知見を確証する）をコードする核酸として明瞭に同定することを可能にした。図１Ａのレーン６における、上清中の単一の放射性タンパク質から生じた強いバンドは、分泌タンパク質をコードする核酸を含む発現系の存在を示す。バイアル６（図１Ａおよび図１Ｂにおけるレーン６）は、ｐＳｉｎＲｅｐ５  ＥＰＯ構築物で感染された。この知見は、ＥＰＯが分泌タンパク質であることを確証する。内因性タンパク質の発現を再び抑制し、独特な標識化、そしてバイアル６の核酸を分泌タンパク質をコードする核酸として明瞭に同定することを可能にした。レーン３〜５は、２つの発現系の混合物由来の標識された分泌タンパク質を示す。１０％、５０％、そして９０％で、ＥＰＯ発現系の比率を増加させることは、上清中にさらに独特な標識されたタンパク質を生じる。これらの結果は、コンパートメントスクリーニングが、予め決定された細胞局在位置のタンパク質をコードする核酸を同定し得ることを示す。
【０３３４】
（Ｃ．実施例２：半固形培地スクリーニングのための分泌タンパク質からの標識されたウイルス粒子の分離）
半固形培地において、分泌タンパク質をコードする発現系の同定の最適化のために、以下のことが好ましい：ａ）内因性タンパク質合成を抑制する；ならびにｂ）標識されたウイルス粒子および他の標識された可溶性ウイルスタンパク質をスクリーニングの干渉から防ぐ。３５ｍｍディッシュ中のコンフルエントなＢＨＫ２１細胞の層を、二重サブゲノム性（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）感染性のウイルス粒子であるｐＴＥＣ５’２ＪＣＡＴまたはｐＴＥ５’２ＪＥＰＯを５ＭＯＩで用いて感染させた。ネガティブコントロールとして、感染してないＢＨＫ  ２１細胞を使用した。感染の１４時間後、培地を除去し、そして細胞を１ディッシュあたり１０μＣｉ35ＳＭｅｔ／Ｃｙｓを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、４ｍｍの０．８％アガロースで重層した。ゲル化の後、培養物を１ｍｌのＣｙｓ／Ｍｅｔを含まないＲＰＭＩで重層し、そしてその培地を、２時間、４時間および８時間後に収集した。タンパク質を沈澱させ、そして１５％ＳＤＳゲル上で分離した。ゲルをＸ線フィルムに一晩曝露した。内因性タンパク質の合成は、再度阻害され、そして標識化は特異的であった（図２：レーン１〜３とレーン４〜９との比較）ことを示し得た。さらに、ウイルス粒子の拡散もまた阻害された。なぜなら、３つの構造ウイルスタンパク質（キャプシド、Ｅ１、およびＥ２）の特徴的パターンを検出し得なかった（レーン４〜９）からである。
【０３３５】
ウイルス性に感染させた培養物の両方の上清において、約６０ｋＤサイズの標識されたタンパク質が存在していた（レーン４〜９）。このタンパク質は、ウイルスタンパク質であり、シンドビスウイルスの糖タンパク質の１つのタンパク質分解性の切断により生じ得ることが推測された。ｐＴＥ５’２ＪＥＰＯの場合、８時間後に、ＥＰＯのサイズを有するさらなるタンパク質が検出され（レーン９）、これは半固形培地スクリーニングの主な実現可能性を示す。この実験は、標識されたウイルス粒子を、０．８％アガロース中での制限された拡散により、分泌タンパク質から分離できることを示す。しかし、さらに処置することなく、可溶性ウイルスタンパク質の放出が生じる。このような放出は、好ましくない。なぜなら、その放出は表現型スクリーニングに干渉し得るからである。実施例３は、所望されないウイルスタンパク質の放出を阻害する方法を記載している。
【０３３６】
（Ｄ．  実施例３：ウイルス性可溶性タンパク質の放出の阻害）
コンフルエントなＢＨＫ細胞の層を、二重サブゲノム性ｐＴＥ５’２ＪＣＡＴウイルス粒子を５ＭＯＩで用いて感染させた。感染の１４時間後、培地を除去し、そして細胞を１ディシュあたり１０μＣｉ35ＳＭｅｔ／Ｃｙｓおよび種々の量のＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  プロテアーゼインヒビターのカクテル溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの説明書に記載されるように７回濃縮した）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、４ｍｍの０．８％アガロースで重層した。１００μｌ、２０μｌ、１０μｌ、５μｌ、および１μｌを用いた（図３中のレーン１〜５）。ゲル化の後、培養物を１ｍｌのＣｙｓ／Ｍｅｔを含まないＲＰＭＩで重層し、培地を４時間後に収集した。タンパク質を沈澱させ、そして１５％ＳＤＳゲル上で分離した。ゲルをＸ線フィルムに一晩曝露した。結果（図３に示される）は、ウイルスタンパク質の放出が、プロテアーゼインヒビターの添加により阻害されることを示した。２０μｌ／ｍｌ（レーン１および２）を超える濃度で、可溶型タンパク質の放出を阻害し、これはウイルス粒子およびウイルスタンパク質のどちらもアガロース層を通って拡散しないこと、および内因性タンパク質またはウイルスタンパク質は、スクリーニングを干渉しないことを示した。
【０３３７】
（Ｅ．  実施例４：半固形培地スクリーニングにおける核酸の混合物中での予め決定された酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸の同定）
ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む発現系を、２つの発現系の混合物において同定した。ｐＳｉｎＲｅｐ５  ｌａｃＺおよびｐＳｉｎＲｅｐ５  ＳＥＡＰを、ヘルパーＤＨＥＢを用いて個々にパッケージングし、感染性の粒子を産生した。２つの発現系を１０：１の比（ｐＳｉｎＲｅｐ５  ｌａｃＺ：ｐＳｉｎＲｅｐ５  ＳＥＡＰ）で混合した。３５ｍｍディッシュ中のコンフルエントなＢＨＫ  ２１細胞の層をこの発現系の混合物で、またはｐＳｉｎＲｅｐ５  ｌａｃＺ発現系のみで感染させた。感染の２時間後、培地を除去し、細胞を１．５ｍｌの０．８％アガロースの１×ＨＰ−１培地で重層した。
【０３３８】
２日後に、ニトロセルロースフィルターをアガロースの頂部に４時間置いた。フィルターを取り出し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３７０ｍｇ／ニトロブルーテトラゾリウム、および２５０ｍｇ／ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（全てＳｉｇｍａ）の溶液中に置き、アルカリホスファターゼ活性を検出した。
【０３３９】
１０％のｐＳｉｎＲｅｐ５  ＳＥＡＰ発現系を含むサンプルにおいて、アルカリホスファターゼ活性を有する２つの空間的に異なる領域を検出し得た（図５）。スクリーニングにおいて、基質の酵素変換を生じる２つの対応プラークおよびネガティブに染色する領域からのネガティブコントロールを単離した。次いで、細胞培養物を、０．５％グルタルアルデヒドのＰＢＳ中で固定し、そしてｌａｃＺ活性を使用説明書「シンドビス発現系」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）に記載されるようにＸ−Ｇａｌ染色により細胞を検出した（示さず）。この細胞培養物において青色に染色された約２０〜３０のプラークは、オリジナルの発現系の分布を示す。
【０３４０】
ポジティブなアルカリホスファターゼのプラークおよびネガティブコントロール由来のウイルスを、ＰＢＳ中で一晩、４℃にて振とうすることにより溶出させた。ＰＢＳを、３５ｍｍディッシュ中の新しいコンフルエントなＢＨＫ細胞の培養物に添加し、そしてＳＥＡＰ活性を以下のアッセイにより感染の２日後に確認した。５００μｌの２×ＳＥＡＰ緩衝液（２ｍＭ  Ｌ−ホモアルギニン、０．２Ｍ  ジエタノールアミン、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2の水溶液）＋１００μｌの基質溶液（１２０ｍＭ  ニトロフェニルホスフェートの水溶液）を熱非働化した（１０分、６０℃）４００μｌの細胞培養物の上清と混合した。ＳＥＡＰ活性は、培養物のポジティブ領域からのサンプルにおける紫色から黄色への色の変化により表され、これに対しネガティブコントロールは色の変化を生じなかった。この実施例は、予め決定された酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む発現系を、半固形培地スクリーニグにおける発現系の混合物から単離し得ることを示す。
【０３４１】
（Ｆ．実施例５：発現系の安定な増幅）
実施例４からのポジティブなウイルス粒子（ＳＥＡＰをコードする核酸を含む）を３継代にわたって増幅した。実施例４の３５ｍｍディッシュからの上清の１％を、ＢＨＫ  ２１を含む８０％コンフルエントなＴ２５（２５ｃｍ2）細胞培養物フラッシュ（ｆｌａｓｈ）を感染させるために使用した。感染の２４時間後、上清を除去し、そしてＳＥＡＰ活性についてアッセイした。この上清におけるＳＥＡＰ活性を、このサンプル中の素早い色の変化により証明した。粒子をこのようにして総計４回継代し、これにより、１０8のファクターにより５日以内で発現系を増幅した。この結果は、この発現系が、迅速かつ効率的に増幅され、大量の目的のタンパク質を産生することを示す。さらに、この過程は、タンパク質の機能のさらなる研究について利益となる発現系の実質的量および任意の他の哺乳動物系における有用性を与える。
【０３４２】
（Ｇ：実施例６：半固形培地スクリーニングにおける核酸の混合物中の分泌タンパク質をコードする核酸の同定）
ホスファターゼ活性を有する分泌タンパク質をコードする核酸を含む発現系を、２つの発現系の混合物において同定した。ｐＳｉｎＲｅｐ５’ＬａｃＺおよびｐＳｉｎＲｅｐ５’  ＳＥＡＰをヘルパーＤＨＥＢを用いて個々にパッケージングし、感染性の粒子を生じた。６０ｍｍディッシュ中の９０％コンフルエントなＢＨＫ  ２１細胞層（Ｅａｓｙ  Ｇｒｉｐ，Ｆａｌｃｏｎ  ３００４，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を約７８０プラーク形成単位（「ｐｆｕ」）のｐＳｉｎＲｅｐ５  ＬａｃＺ  および２０ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ５  ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）を含む１ｍｌの１×ＨＰ−１培地とともに３７℃にて２時間インキュベートした。培地を除去した後、細胞を４１℃温０．８％アガロース（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＨＰ−１培地３ｍｌで重層し、次いで、５％ＣＯ2中、３７℃にて２日間インキュベートした。
【０３４３】
アガロースを、１ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔー／Ｃｙｓーで１０分間重層し、次いで１ｍｌの新しい１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔー／Ｃｙｓーにより置換した。３０分間の飢餓の後、培地を０．８ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔー／Ｃｙｓー＋２０μＣｉの35Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓで置換した。４時間の標識化の後、アガロースの重層を、１ｍｌの１×ＨＰ−１で１０分間、３回洗浄し、次いで５４ｍｍの予め湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μｍメンブレン，ＢＡ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１６〜１８時間適用した。
【０３４４】
拡散ブロッティングを１８時間進行させ、次いでＳＥＡＰ活性を、紫色のスポットを生じるＡＰ染色（１０ｍｌ  １００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，３７０ｍｇ  ニトロブルーテトラゾリウムおよび２５０ｍｇ／ｌの５−ブロモ−４クロロ−３インドリルホスフェート（全てＳｉｇｍａ））により検出した（図７）。ＡＰの発色をＡＰ染色溶液の除去、および続く洗浄工程（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＢＳを用いて３回）により停止させた。次いで、ニトロセルロースを乾燥させ、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  βｍａｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）に少なくとも２４時間曝露し、次いでＡＧＦＡ  Ｃｕｒｉｘ  ６０（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｗｉｎｔｅｒｔｈｕｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ｍａｃｈｉｎｅを用いて発色させた（図７）。
【０３４５】
放射性スポットの座標を決定し、そしてそれと等価な領域をアガロース層から１０μｌチップを用いて採取した。溶出したウイルス（上記のような）を、６０％コンフルエントなＢＨＫ  ２１の１２ウェルプレートで継代した。溶出したウイルスの挿入物における、ＳＥＡＰコード遺伝子の存在を、ニトロセルロースメンブレン上に４μｌの上清をスポットし、そして上記のようなＡＰ染色により決定した。
【０３４６】
分泌アルカリホスファターゼ染色されたフィルター上のスポットとＸ線フィルム上のスポットとの一致は、明らかに、分泌タンパク質をコードする核酸を、半固形培地スクリーニングを使用して、核酸の混合物中に同定し得ることを示す。
【０３４７】
（Ｈ．実施例７：半固形培地スクリーニングにおいてｃＤＮＡライブラリーを表すシンドビスウイルスライブラリーにおける分泌タンパク質をコードする核酸の同定）
３’末端および５’平滑末端でＮｏｔ  Ｉ部位を含むＥＣＶ  ３０４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９８，ヒト内皮細胞株）由来の方向付けされた（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーをＳｔｕＩ、Ｂｓｐ  １２０Ｌ消化されたｐＳｉｎＲｅｐ５ベクターに連結し、そして１０7の初代クローンをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０ｂの形質転換後に得た。プラスミドＤＮＡの調製およびＮｏｔ  Ｉを用いた線状化の後、ライブラリーを、前記のようにインビトロで転写し、そしてヘルパーＤＨＥＢを用いてパッケージングし、感染性粒子を産生した。６０ｍｍディッシュ（Ｅａｓｙ  Ｇｒｉｐ，Ｆａｌｃｏｎ  ３００４，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中の９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞層を、約８００ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ５  ＥＣＶ  ３０４ライブラリーを含む１ｍｌの１×ＨＰ−１培地とともに３７℃にて２時間インキュベートした。培地を除去した後、細胞を、３ｍｌの４１℃温０．８％アガロース（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＨＰ−１培地で重層し、次いで５％ＣＯ2中、３７℃にて２日間インキュベートした。
【０３４８】
アガロースを、１ｍｌの新しい１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔー／Ｃｙｓーにより置換された１ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔー／Ｃｙｓーで１０分間重層した。３０分間の飢餓の後、その培地を２０μＣｉの35Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓを含む０．８ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔー／Ｃｙｓーで置換した。４時間の標識化の後、そのアガロースの重層を、１ｍｌの１×ＨＰ−１とともに１０分間、３回洗浄し、次いで５４ｍｍの予め湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μｍメンブレン，ＢＡ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。
【０３４９】
拡散ブロッティングを３７℃にて１８時間進行させ、次いで、ニトロセルロースを、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＢＳを用いて１０分間、３回洗浄し、次いでメンブレンを乾燥させ、そしてＸ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  βｍａｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）に少なくとも２４時間曝露し、続いてＡＧＦＡ  Ｃｕｒｉｘ  ６０（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｗｉｎｔｅｒｔｈｕｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ｍａｃｈｉｎｅで発色させた。
【０３５０】
放射活性スポットの座標を決定し、そして等しい領域を、１０μｌチップを用いてアガロース層から拾った。ウイルスを、先に記載の通りに溶出させ、そして１２ウェルプレート中の６０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞に継代した。６ウェルプレートにおける６０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞におけるウイルス粒子の再増幅の後、「高純度ウイルスＲＮＡキット」（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてウイルスＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、製造業者（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  一工程ＲＴ−ＰＣＲキットおよび先に記載したプライマーを用いて実施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、制限酵素Ｂｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐ１２０Ｉで消化した）中に連結し、そしてマルチクローニング部位のオリゴ「−４０正方向および逆方向プライマー」を用いて最終的に配列決定した。
【０３５１】
Ｉ．実施例８：シンドビスｔｓ変異体を用いる半固体培地スクリーニングにおける、核酸混合物中の分泌タンパク質をコードする核酸の同定
（組換えＳＥＡＰシンドビスウイルスストック）
ＥｃｏＲＩ線状化ＤＨ−ＥＢヘルパー構築物（ＤＨ−ＥＢ、ＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２、ＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２０、ＤＨ−ＥＢ  ｔｓ２，２０）およびＮｏｔＩ線状化ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＳＥＡＰならびにｐＳｉｎＲｅｐ５  ＬａｃＺ  ＤＮＡを、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）での精製およびＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏを用いる溶出によりＲＮａｓｅを含まないように作成した。ＳＰ６インビトロ転写を、製造業者Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐｔ  ＣＡＰ  Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，ＮＶ  Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って実施した。５μｇのＳｉｎＲｅｐ  ５’ＳＥＡＰおよび５μｇのヘルパー転写物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐｔ  ＣＡＰ  Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，ＮＶ  Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従ってＢＨＫ２１細胞に同時にエレクトロポレーションした。上清を、エレクトロポレーションの３０時間後（３０℃、５％  ＣＯ2にてインキュベートした）に収集し、そしてＳＥＡＰ活性についてアッセイした。４μｌの上清を、ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）にスポットし、そしてＳＥＡＰ活性を、上記のようにＡＰ染色法により検出した（図８）。
【０３５２】
（ｔｓ変異体の最初の継代）
組換え体ウイルスストックを、ＢＨＫ２１細胞を有する６０％コンフルエントな６ウェルプレートに継代した。１００μｌの各ストック＋９００μｌのＨＰ−１を、３０℃にて２時間、ＢＨＫ細胞に添加し、次いでウイルス上清を２ｍｌ  ＨＰ−１で置換した。細胞を、３０℃の許容温度にてまたは３７℃の非許容温度のいずれかで２４時間インキュベートし、その後上清をＳＥＡＰ活性について（先に記載したように）アッセイした（図８）。
【０３５３】
（ｔｓ変異体についてのプラークアッセイ）
収集したウイルス粒子の希釈シリーズ（前出を参照のこと）を、６０ｍｍ組織培養ディッシュ（Ｅａｓｙ  Ｇｒｉｐ，Ｆａｌｃｏｎ  ３００４，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中の９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞において１ｍｌ  Ｔｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１において実施した（１：１０4、１：５×１０4、１：１０5、１：５×１０5、１：１０6、１：５×１０6）。細胞を、収集したウイルス粒子の希釈シリーズ（前出を参照のこと）にて希釈したウイルスで３０℃にて２時間感染させた。次いで、上清を、ＨＰ−１中の０．８％アガロースに置換し、そして３７℃または３０℃にて２日間、５％ＣＯ2中でインキュベートした。次いでプラークを計数した。
【０３５４】
（ｐＳｉｎＲｅｐ  ＳＥＡＰおよびｐＳｉｎＲｅｐ  ＬａｃＺの混合物を用いるアガロースブロットアッセイ）
分泌タンパク質をコードする核酸を含有する発現系を、２つの発現系の混合物において同定した。ｐＳｉｎＲｅｐ５’ＬａｃＺおよびｐＳｉｎＲｅｐ５’ＳＥＡＰを、ｔｓ変異体ヘルパーＤＨＥＢ（表１を参照のこと）を用いて個々にパッケージングし、感染性粒子を得た。６０ｍｍディッシュ（Ｅａｓｙ  Ｇｒｉｐ，Ｆａｌｃｏｎ  ３００４，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中の９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞層を、ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＬａｃＺ／ＤＨＥＢ  ｔｓの約７８０プラーク形成単位（「ｐｆｕ」）および２０  ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）／ＤＨＥＢ  ｔｓを含有する１×ＨＰ−１培地１ｍｌを用いて３０℃にて２時間インキュベートした。培地の除去後、細胞に、ＨＰ−１培地中の４１℃の０．８％アガロース（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）３ｍｌを重層し、次いで５％  ＣＯ2中で３０℃にて２日間インキュベートした。
【０３５５】
２時間の予備飢餓の後、細胞を、５％ＣＯ2中で４０℃までシフトさせた。アガロースに、１ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔ-／Ｃｙｓ-を１０分間重層し、その後１ｍｌのＲＰＭＩ培地を１ｍｌの新鮮な１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔ-／Ｃｙｓ-培地で置換した。４０℃にて３０分間の飢餓の後、培地を、２０μＣｉの35Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓを含有する、０．８ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔ-／Ｃｙｓ-で置換した。４０℃にて４時間の標識後、アガロース上層を、１ｍｌの１×ＨＰ−１を用いて１０分間、３回洗浄し、その後５４ｍｍの予め湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μｍメンブレン、ＢＡ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。
【０３５６】
拡散ブロッティングを、１８時間の間、４０℃にて進行させ、その後ＳＥＡＰ活性をＡＰ染色（１０ｍｌ  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３７０ｍｇニトロブルー−テトラゾリウム、および２５０ｍｇ／ｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３インドリルホスフェート（全てＳｉｇｍａ））により検出し、紫色のスポットを得た（図８）。ＡＰ染色を、ＡＰ溶液の除去およびその後の洗浄工程（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含有するＴＢＳで３回）により停止させた。ニトロセルロースを乾燥し、そしてＸ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ｂｍａｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）に少なくとも２４時間曝露し、その後ＡＧＦＡ  Ｃｕｒｉｘ  ６０（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｗｉｎｔｅｒｔｈｕｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）装置で現像した。
【０３５７】
放射活性スポットの座標を決定し、そして等しい領域を、１０μｌピペットチップを用いてアガロース層から拾った。
【０３５８】
（Ｊ．実施例９：ｔｓ変異体を用いる半固体培地ライブラリースクリーニングにおける、核酸混合物中の分泌タンパク質をコードする核酸の同定）
ｐＳｉｎＲｅｐ５’  ｃＤＮＡライブラリーＥＣＶ  ３０４を、変異体ヘルパーＤＨＥＢを用いてパッケージングし、感染性粒子を得た。６０ｍｍディッシュ中（Ｅａｓｙ  Ｇｒｉｐ，Ｆａｌｃｏｎ  ３００４，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）の９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞層を、約８００  ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｃＤＮＡライブラリーＥＣＶ  ３０４を含有する１×ＨＰ−１培地１ｍｌを用いて３０℃にて２時間インキュベートした。培地の除去後、細胞に、ＨＰ−１培地中の０．８％アガロース（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）３ｍｌを重層し、次いで５％  ＣＯ2中で３０℃にて２日間インキュベートした。
【０３５９】
２時間の予備飢餓の後、細胞を、５％ＣＯ2中で４０℃までシフトさせた。アガロースに、１ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔ-／Ｃｙｓ-を１０分間重層し、その後１ｍｌの新鮮な１×ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｔ-／Ｃｙｓ-培地で置換した。３０分間の飢餓の後、培地を、０．８ｍｌの１×ＲＰＭＩ  １６４０Ｍｅｔ-／Ｃｙｓ-＋２０μＣｉの35Ｓ  Ｍｅｔ／Ｃｙｓで置換した。４時間の標識後、アガロース上層を、１ｍｌの１×ＨＰ−１を用いて１０分間、３回洗浄し、その後５４ｍｍの予め湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μｍメンブレン、ＢＡ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１６〜１８時間適用した。
【０３６０】
拡散ブロッティングを、１８時間の間進行させ、その後ニトロセルロースを乾燥させ、そしてＸ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  βｍａｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）に少なくとも２４時間曝露し、その後ＡＧＦＡ  Ｃｕｒｉｘ６０（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｗｉｎｔｅｒｔｈｕｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）装置で現像した。放射活性スポットの座標を決定し、そして等しい領域を、１０μｌピペットチップを用いてアガロース層から拾った。
【０３６１】
Ｋ．実施例１０：シンドビスウイルスを用いる発現クローニング：ＦＡＣＳ単細胞選別による公知のリガンドに対するレセプターのクローニング
Ｔ１５０フラスコ中の６０％コンフルエントなＢＨＫ２１培養物を、３７℃にて２時間、０．１のｍｏｉで１×ＨＰ−１培地中で感染させた。ｐＳｉｎＲｅｐ５  ｈＩＬ  １３  Ｒａ（ヒトインターロイキン１３レセプター、サブユニットα；ｐＤＲ２−ｈＩＬ１３ＲａからＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩを用いて消化したｈＩＬ１３  Ｒａ．ＸｂａＩおよびＳｔｕＩで消化したｐＳｉｎＲｅｐ５中にクローニング）／ＤＨＥＢと、ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＬａｃＺ／ＤＨＥＢの異なる希釈（１：０／１：１００／１：１００，０００）を、０．１の総ｍｏｉで用いた。次いで培地を、新鮮な１×ＨＰ−１培地で置換し、そして細胞を５％  ＣＯ2中で３７℃にて２０時間インキュベートした。
【０３６２】
次いで、細胞を、５ｍｌの細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁し、次いで１％  ＢＳＡを含有するＨＢＳＳにおいて２つのさらなる洗浄工程を行った。ＨＢＳＳ中の１ｍｌ  １％ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌ  ＩＬ１３ｆｌａｇ（ＩＢＲ  ＧｍｂＨ，Ｗａｅｎｇｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによる）および５μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ  Ｍ２（ＩＢＲ  ＧｍｂＨ，Ｗａｅｎｇｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによる）を、４℃にて１５分間、細胞とともにインキュベートした。細胞を、１．５ｍｌ  １％ＢＳＡ／ＨＢＳＳを用いて２回洗浄し、そして１ｍｌ  １％  ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ結合体化二次抗体とともに４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を、４℃にてＨＢＳＳ中の１％  ＢＳＡを用いて２回洗浄し、そしてＨＢＳＳ中に３×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁した。９６ウェルプレートへの単一細胞の選別を、バックグラウンドより上のＦＩＴＣ蛍光強度を有する細胞について行った（図９を参照のこと）。
【０３６３】
図９は、インターロイキン１３レセプターαが、一過性に発現されること、および選択したリガンドについて適切なレセプターを発現する単一細胞がＦＡＣＳ分析により選別され得ることを示す。
【０３６４】
（Ｌ．実施例１１：シンドビスウイルスを用いる発現クローニング：既知のレセプターに対するリガンドのクローニング）
感染性シンドビスウイルスライブラリーを、二重サブゲノムシンドビスウイルスベクター（ｐＴＥ）において、またはＤＨ−ＥＢヘルパーを同時パッケージングしたｐＳｉｎＲｅｐ５において、前出に記載の通りに生成する。１５０ｍｍディッシュ中のコンフルエントなＢＨＫ２１細胞を、約５，０００  ｐｆｕの感染性シンドビスウイルスライブラリーを含有するＨＰ−１培地を用いて２時間インキュベートする。培地の除去後、細胞に、１×ＨＰ−１培地中の０．８％アガロースを２ｍｍ重層し、そして３７℃にて３日間インキュベートする。ニトロセルロースフィルターを、アガロースの上端に置き、そして少なくとも３時間インキュベートする。メンブレンを取出し、続いてＴＢＳを用いて洗浄する。フィルターをＴＢＳ中にて１５分間撹拌した後、フィルターを、１％脱脂乳中で１時間インキュベートすることによりブロッキングする。ＴＢＳ中にて３回の洗浄工程の後、フィルターを、放射標識可溶化レセプターを含有するＴＢＳ中で少なくとも１時間インキュベートする。ＴＢＳ中での数回の洗浄工程後、フィルターを乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝露する。暗い点は、目的の選択されたレセプターの結合パートナーを発現するコロニーを示す。
【０３６５】
（Ｍ．実施例１２：リガンドが既知の細胞結合タンパク質のクローニング）
感染性シンドビスウイルスライブラリーを、二重サブゲノムシンドビスウイルスベクター（ｐＴＥ）において、またはＤＨ−ＥＢヘルパーを同時パッケージングしたｐＳｉｎＲｅｐ５において、材料および方法の節（前出）に記載の通りに生成する。ＢＨＫ２１細胞を、１５０ｍｍディッシュ中のニトロセルロースフィルター上でコンフルエントになるまで増殖させる。細胞を、約５，０００  ｐｆｕを含有するＨＰ−１培地を用いて２時間インキュベートする。培地の除去後、細胞に、１×ＨＰ−１培地中の０．８％低融点アガロースを２ｍｍ重層し、そして３７℃にて２日間インキュベートする。このインキュベーションの後、ニトロセルロースフィルターを、アガロースの上端に置き、ウイルス粒子を捕捉する。２４時間のインキュベーションの後、ニトロセルロースフィルターを取出し、そして新たな１５０ｍｍディッシュ中に置き、ここでＢＨＫ細胞の新たな培養物を１ｃｍ2あたり４００，０００細胞の細胞密度で、１０％  ＦＣＳを含有する培地中に添加する。細胞の接着後、この培養物に、２ｍｍアガロースを再度重層し、そして３７℃にてインキュベートする。この培養物を、後の単離のためのウイルス粒子のストックとして供する。最初のプレートを、４０℃に加熱してアガロースを融解させる。融解したアガロースの除去後、細胞を、予想される局在位置（核、細胞質膜など）およびクローニングされるタンパク質の性質に従って公知の方法（ＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒド、３％パラホルムアルデヒド、−２０℃メタノールなど）によりメンブレンに固定する。ＴＢＳ中での数回の洗浄工程の後、フィルターを、放射活性標識リガンドを含有するＴＢＳ中でインキュベートする。数回の洗浄工程の後、フィルターを乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝露する。暗い点は、選択されたリガンドの結合パートナーを発現するコロニーを示す。
【０３６６】
（Ｎ．実施例１３：新規な膜タンパク質の発見および発現）
実施例６に記載した通りのｐＳｉｎＲｅｐ５中のシンドビスウイルスライブラリーを、ＤＨＢＢヘルパーとともに同時エレクトロポレーションして前出に記載の１方向ビリオンを生成する。ウイルス力価の決定の後、９８７  ＢＢ  ｎｅｏ細胞のコンフルエントな培養物（ＢＨＫ２１細胞をトランスフェクトして、２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中での選択後に９８７ＢＢｎｅｏ細胞株を得るベクターの記載については表Ｉおよび配列番号２を参照のこと）。培地の除去後、細胞に、２ｍｍのアガロースを重層してプラーク形成を可能にさせる。３日後、Ｍｏｔｏｂｕら（Ｅ．Ｃ．Ｂｅｕｖｅｒｙら（編）「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ２１ｔｈ  ｃｅｎｔｕｒｙ」、８１１〜８１５頁（１９９５）Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載される通りのコーティングしたポリエステルマットをアガロースの上端に置き、そしてＢＨＫ２１細胞を上端に４００，０００細胞／ｃｍ2の細胞密度で、１，０００，０００細胞／ｍｌ培地の濃度で添加する。細胞の接着後、同量の新鮮な培地を添加し、そして培養物をさらに１２時間インキュベートする。液体培地を除去し、そして標識培地（１０μＣｉの35Ｓメチオニン／システイン）で置換する。１２時間の取込み後、標識培地を除去し、そして培養物を１０ｍｌの通常培地の添加により洗浄する。この培地を１０分毎に、計２時間置換する。全ての液体培地の除去後、細胞に、０．８％アガロースおよび０．１％トリプシンを含有する、２ｍｍの層の培地を重層する。アガロースのゲル化後、ニトロセルロースメンブレンを、アガロースの上端に置き、そして培養物をさらに１〜６に時間インキュベートする。タンパク質分解により放出された、膜タンパク質のフラグメントは、メンブレンに拡散し、そしてニトロセルロースフィルター上に捕捉される。フィルターのオートラジオグラフィーを行うことにより、膜タンパク質をコードするクローンが示される。
【０３６７】
（Ｏ．実施例１４：新規な細胞小器官特異的タンパク質の発見および発現）
感染性シンドビスウイルスライブラリーを、二重サブゲノムシンドビスウイルスベクター（ｐＴＥ）において、またはＤＨ−ＥＢヘルパーを同時パッケージングしたｐＳｉｎＲｅｐ５において、材料および方法に記載の通りに生成する。ＢＨＫ２１細胞を、１５０ｍｍディッシュ中でコンフルエントになるまで増殖させる。細胞を、約５，０００  ｐｆｕを含有するＨＰ−１培地を用いて２時間インキュベートする。培地の除去後、細胞に、１×ＨＰ−１培地中の０．８％低融点アガロースを２ｍｍ重層し、そして３７℃にて１〜２日間インキュベートする。このインキュベーションの後、ニトロセルロースフィルターを、アガロースの上端に置き、ウイルス粒子を捕捉する。少なくとも１２時間のインキュベーションの後、ニトロセルロースフィルターを取出し、そして新たな１５０ｍｍディッシュ中に置き、ここでＢＨＫ細胞の新たな培養物を１ｃｍ2あたり４００，０００細胞の細胞密度で、１０％  ＦＣＳを含有する培地中に添加する。細胞の接着後、この培養物に、２ｍｍのアガロースを再度重層し、そして３７℃にてインキュベートする。この培養物を、後の単離のためのウイルス粒子のストックとして供する。
【０３６８】
最初のプレートに、４０μＣｉのメチオニンおよびシステインの35Ｓ標識混合物を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中の０．８％アガロースの第２層を重層する。２時間の標識後、プレートを４０℃に加熱してアガロースを融解させる。融解したアガロースの除去後、細胞を、公知の方法により溶解させてインタクトな細胞小器官を得る。捕捉されるべき細胞小器官の表面タンパク質に対する固定化抗体でブロッキングされたニトロセルロースフィルターを、ホモジネートの上端に置く。数回の洗浄工程の後、フィルターを乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝露する。フィルターのオートラジオグラフィーを行うことにより、所望の細胞小器官において局在するタンパク質をコードするクローンが示される。
【０３６９】
（Ｐ．実施例１５：シンドビスウイルスを用いる発現クローニング：ＦＡＣＳ単一細胞選別による既知のリガンドについての新たなレセプターのクローニング）
Ｔ１５０フラスコ中の６０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞を、２時間、０．１のｍｏｉでｐＳｉｎＲｅｐ  ＥＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーで２０ｍｌのＴｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１培地中で感染させた。次いで培地を、４０ｍｌの新鮮な１×ＨＰ−１培地で置換し、そして細胞を５％  ＣＯ2中で３７℃にて２０時間インキュベートする。
【０３７０】
次いで、細胞を、５ｍｌの細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁し、そして１％  ＢＳＡを含有するＨＢＳＳにおいて２回洗浄する。細胞を、１％ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌ  リガンド−ｆｌａｇ融合タンパク質、および５μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ  Ｍ２の存在下で１ｍｌのＨＢＳＳ中で、４℃にて１５分間、インキュベートし、そして１．５ｍｌ  １％ＢＳＡ／ＨＢＳＳを用いて２回洗浄し、続いて１ｍｌ  １％  ＢＳＡおよび１０μｌ／ｍｌ抗Ｍ２  ＦＩＴＣを用いて４℃にて３０分間インキュベーションする。細胞を、ＨＢＳＳ中の１％  ＢＳＡを用いて２回洗浄し、続いてＨＢＳＳ中に３×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁する。９６ウェルプレートへの単一細胞選別を、バックグラウンドより上のＦＩＴＣ活性を有する細胞について行う。
【０３７１】
９６ウェルプレートの上清を、９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞を有する６ウェルプレート中のプラークアッセイに用いる。プラークを、１０μｌピペットチップを用いて拾い、そして先に記載の通りに溶出させる。溶出したウイルスを、許容温度にて１ｍｌ  Ｔｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１中の６０％コンフルエントなＢＨＫ２１  １２ウェルプレートに継代する。溶出するウイルスの挿入物を、６０％ＢＨＫ２１細胞層を含有する６ウェルプレートにおける２ｍｌ  Ｔｕｒｂｏｄｏｍａ  ＨＰ−１培地中でのウイルス粒子の再増幅により決定する。ウイルスＲＮＡを、「高純度ウイルスＲＮＡキット」（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲを、製造業者（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  一工程ＲＴ−ＰＣＲキットおよび先に記載したプライマーを用いて実施する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へのＲＴ−ＰＣＲ産物の連結および配列決定を、上記の通りに行う。
【０３７２】
（Ｑ：実施例１６：既知の結合パートナーについてのリガンドの発現クローニング）
ｐＳｉｎＲｅｐ５’  ＥＰＯおよびｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＬａｃＺを、ヘルパーＤＨＥＢとともにパッケージングして感染性粒子を得た。６０ｍｍディッシュ（Ｅａｓｙ  Ｇｒｉｐ，Ｆａｌｃｏｎ  ３００４，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中の９０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞層を、約２５〜３０  ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ  ＥＰＯ／ＤＨ−ＥＢおよび約１８０〜２００  ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＬａｃＺ／ＤＨ−ＥＢを含有する１×ＨＰ−１培地１ｍｌとともに３７℃にて２時間インキュベートした。培地の除去後、細胞に３ｍｌの４１℃に温めた、ＨＰ−１培地中の０．８％アガロース（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を重層し、そしてプレートを５％ＣＯ2中で３７℃にて２日間インキュベートした。
【０３７３】
５４ｍｍの予め湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μｍメンブレン、ＢＡ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１６時間適用し、続いてニトロセルロースを、ＴＢＳ中の１％  ＢＳＡを用いて２時間ブロッキングした。スクリーニングした分泌タンパク質に特異的な一次抗体（抗ＥＰＯ、ポリクローナル、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、（製造業者に従って）ＴＢＳ中で１：３０００の希釈で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンをＴＢＳ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、続いて二次抗体（ＡＰ結合体化抗ウサギＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、ＴＢＳ  １％  ＢＳＡ中１：４０００の希釈でフィルターとインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ＡＰ染色を上記の通りに実施した。
【０３７４】
ＡＰ陽性スポット（図１０を参照のこと）に対応するプラークを、１０μｌピペットチップを用いてアガロース層から拾った。ウイルスの溶出を記載の通りに実施した。ウイルスを、６０％コンフルエントなＢＨＫ２１  １２ウェルプレート中に継代した。溶出したウイルスの挿入物を、６０％  ＢＨＫ２１  ６ウェルプレート中でのウイルス粒子の再増幅により決定し、続いてＥＰＯに対するドットブロットを上記の通りに行った。
【０３７５】
図１０は、既知の結合パートナー（レセプター、抗体）に対する分泌される特異的リガンドが、好結果にクローニングされ得ること、およびこの系がｃＤＮＡライブラリーを表すウイルスをスクリーニングするために効率的に用いられ得ることを示す。
【０３７６】
本明細書の本文に引用した全ての参考文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】核酸の混合物由来の分泌タンパク質をコードする核酸または細胞内タンパク質をコードする核酸のいずれかを含む発現系が、コンパートメントスクリーニングを使用して同定された実験を示す図である。実施例１でより詳細に記載されるような、スクリーニングした細胞培養物の上清から沈殿させた標識タンパク質のオートラジオグラムである。レーンは以下のようである：レーン１−非感染ＢＨＫ２１細胞；レーン２−細胞内タンパク質をコードする発現系ｐＳｉｎＲｅｐ５  ＬａｃＺでトランスフェクトした細胞；レーン６−分泌タンパク質（ＥＰＯ）をコードする発現系ｐＳｉｎＲＥｐ５  ＥＰＯでトランスフェクトした細胞；レーン３〜５は、ＥＰＯの増加量を示している、９０：１０、５０：５０、１０：９０の比率（ｓｉｎＲｅｐ５  ｌａｃＺ：ＳｉｎＲｅｐ５  ＥＰＯ）の２つの発現系の混合物を含む。タンパク質質量標準は左側に示される；ＥＰＯのタンパク質分子量は矢印で示される。
【図１Ｂ】図１Ａのレーン１および２の細胞ペレットに対応する標識タンパク質のオートラジオグラムであり、細胞ペレット中のｌａｃＺタンパク質の蓄積およびｐＳｉｎＲｅｐ５  ＬａｃＺで感染させた細胞における内因性タンパク質産生のシャットダウン（ｓｈｕｔｄｏｗｎ）を示す図である。
【図２】実施例２でより詳細に記載されるような分泌タンパク質由来の標識ウイルス粒子の分離を示す図である。内因性タンパク質合成のシャットダウンは、レーン１から３（非感染ＢＨＫ２１細胞）と比較して、レーン４〜６（ＴＥ５’２ＪＣＡＴで感染）およびレーン７〜９（ＴＥ５’２ＪＥＰＯで感染）で明らかである。ウイルス粒子の除去は、シンドビス構造タンパク質（カプシドＥ１およびＥ２）の特徴的なパターンの非存在によって証明される。レーン９は、アガロースによるＥＰＯのサイズのタンパク質の拡散を示す。レーン４から９において、ウイルス起源の可溶性タンパク質が見られ得る。このタンパク質はタンパク質分解性切断によって放出されると仮定される。標識タンパク質を異なる時点で回収した：２時間（レーン１，４，７）、４時間（レーン２，５，８）および８時間（レーン３，６，９）。タンパク質質量標準は左側に示され、シンドビスウイルス糖タンパク質のサイズは、上方の矢印によって示され、ＥＰＯの分子量は下方の矢印によって示される。
【図３】ウイルス可溶性タンパク質の放出がプロテアーゼインヒビターによって減少されることを証明する図である。実施例３で示されるように、３５ｍｍディッシュ中の１０6個のＢＨＫ２１細胞をＴＥ５’２ＪＣＡＴで感染させた。種々の濃度のプロテアーゼインヒビター反応混液（レーン１〜５、１ｍｌあたり１００、２０、１０、５、１μｌ）を４ｍｍのアガロースオーバーレイへ適用した。分子質量標準を左側に示す；矢印は予測されるシンドビス糖タンパク質Ｅ１の質量を示す。
【図４】半固形培地スクリーニングの予め決定された酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む発現系の同定を示す図である。ＢＨＫ２１細胞のコンフルエント３５ｍｍディッシュを、２００ｐｆｓ  ＳｉｎＲｅｐｌａｃＺ（左側のブロット１）または２００ｐｆｓ  ＳｉｎＲｅｐ  ｌａｃＺ／２０ｐｆｕのＳｉｎＲｅｐ  ５  ＳＥＡＰの混合物（右側のブロット２）で感染させた。酵素活性をＡＰ染色したフィルター上で検出した。ブロット１は（ｌａｃＺ発現系のみを含む）はＳＥＡＰ活性においてネガティブであるが、ブロット２はＳＥＡＰ活性を有する明らかな２つの領域を示す（矢印によって示される）。
【図５Ａ】本発明を例示するために使用されたｐＳＩＮベクターの模式図である。これらのベクターの供給源および構築物は表１に記載される。
【図５Ｂ】本発明を例示するために使用されたｐＳＩＮベクターの模式図である。これらのベクターの供給源および構築物は表１に記載される。
【図５Ｃ】本発明を例示するために使用されたｐＳＩＮベクターの模式図である。これらのベクターの供給源および構築物は表１に記載される。
【図５Ｄ】本発明を例示するために使用されたｐＳＩＮベクターの模式図である。これらのベクターの供給源および構築物は表１に記載される。
【図６Ａ】本発明を例示するために使用されるｐＴＥベクターの模式図である。示されるベクターは、ｐＴＥ５’２Ｊである。このベクターの供給源および構築物を表１に示す。
【図６Ｂ】本発明を例示するために使用されるｐＴＥベクターの模式図である。示されるベクターは、ｐＴＥ５’２ＪＣＡＴである。このベクターの供給源および構築物を表１に示す。
【図６Ｃ】本発明を例示するために使用されるｐＴＥベクターの模式図である。示されるベクターは、ｐＴＥ５’２ＪＳＥＡＰである。このベクターの供給源および構築物を表１に示す。
【図６Ｄ】本発明を例示するために使用されるｐＴＥベクターの模式図である。示されるベクターは、ｐＴＥ５’２ＪＥＰＯである。これらのベクターの供給源および構築物を表１に示す。
【図７】パネル７Ａおよびパネル７Ｂは、約２０ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＳＥＡＰおよび７８０ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＬａｃＺを、１ｍｌのＴｕｒｂｏｄｏｍａＨＰ−１において混合し、そしてＢＨＫ２１細胞を有する６０ｍｍディッシュを、２時間感染させたことを示す写真である。アガロースブロットアッセイを実施例１０に記載されるように実施した。パネル７Ａは、ブロットしたＳＥＡＰタンパク質が現像したＸ線フィルム（パネル７Ｂ：Ｘ線フィルムに曝露させたＡＰ染色膜）の紫色スポット（黒色スポットは標識された分泌タンパク質を示す）によって表されるＡＰ染色したニトロセルロース膜を示す。ＳＥＡＰ活性を有するスポットの座標（ＡＰ染色された膜において矢印ｘ１、ｘ２、ｘ３によって示され、そして現像したＸ線フィルムにおいて矢印ｙ１、ｙ２、ｙ３に対応する）は、標識された分泌タンパク質のスポット（ｙ１と×１、ｙ２と×２、ｙ３と×３を比較）と重ね合わされ得る。
【図８】パネル８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＳＥＡＰ  ｍＲＮＡおよびｐＤＨＥＢｔｓ変異ｍＲＮＡを、ＢＨＫ２１細胞中に同時エレクトロポレーションしたことを示す図である。エレクトロポレーションした細胞の細胞上清を、エレクトロポレーションの２０時間後にニトロセルロース片上へ４μｌの上清をスポットすることによって分析し、そしてＡＰ染色を、以前に記載したように実施した。全てのエレクトロポレーションは、パネル８Ａに示されるように、ＳＥＡＰ分泌に関してポジティブであった（ニトロセルロースフィルター上の紫色スポット）。ｔｓ変異ウイルスの第１の継代物を、３７℃および３０℃で、感染性について試験した。感染細胞の上清を、分泌産物ＳＥＡＰについてＡＰ染色によって試験した。パネル８Ｂの上列は３７℃でインキュベートした細胞の上清を示し、パネル８Ｂの下列は３０℃でインキュベートした細胞の上清を示す。二重変異ｐＳｉｎＲｅｐ５  ＳＥＡＰ／ｐＤＨＥＢｔｓ２，２０は、感染後２０時間で、少量のＳＥＡＰを産生した（パネルＢを参照のこと）が、ウイルス粒子が増幅され、そしてパネル８Ｃに示されるように、多量の産物が感染後４８時間で検出された。
【図９Ａ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒα感染ＢＨＫ２１細胞（約０．１のｍｏｉで）が、免疫蛍光によって分析されたことを示す図である。発現したｈＩＬ１３Ｒαを、ＩＬ１３−ｆｌａｇ、Ｍ２抗体および抗マウス−ＦＩＴＣで検出した。ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３αによって０．１のｍｏｉで感染させ、ＦＡＣＳで分析し、そして分類したＢＨＫ２１である。
【図９Ｂ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒα感染ＢＨＫ２１細胞（約０．１のｍｏｉで）が、免疫蛍光によって分析されたことを示す図である。発現したｈＩＬ１３Ｒαを、ＩＬ１３−ｆｌａｇ、Ｍ２抗体および抗マウス−ＦＩＴＣで検出した。免疫蛍光顕微鏡によるパネルＡと同じ細胞である。
【図９Ｃ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒα感染ＢＨＫ２１細胞（約０．１のｍｏｉで）が、免疫蛍光によって分析されたことを示す図である。発現したｈＩＬ１３Ｒαを、ＩＬ１３−ｆｌａｇ、Ｍ２抗体および抗マウス−ＦＩＴＣで検出した。ネガティブコントロールとしてのｐＳｉｎＲｅｐ５  ＬａｃＺ感染細胞である。
【図９Ｄ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒα感染ＢＨＫ２１細胞（約０．１のｍｏｉで）が、免疫蛍光によって分析されたことを示す図である。発現したｈＩＬ１３Ｒαを、ＩＬ１３−ｆｌａｇ、Ｍ２抗体および抗マウス−ＦＩＴＣで検出した。ＦＡＣＳで分析し、そして分類したｐＳｉｎＲｅｐ５  ＬａｃＺウイルス中で１：１００希釈されたｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩｌ１３Ｒαウイルスである。
【図１０】約２０ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ５  Ｅｐｏ／ＤＨＥＢを２００ｐｆｕのｐＳｉｎＲｅｐ５  ＬａｃＺと混合したことを示す図である。ウイルス上清を１×ＨＰ−１培地中で３ｍｌの０．８％、４１℃の保温アガロースと置き換える前に、ウイルス上清を６０ｍｍデッシュ中で９０％コンフルエントのＢＨＫ２１細胞上で２時間インキュベートした。２日後、ニトロセルロース膜をアガロース上に適用し、そして拡散ブロットを１４時間進行させた。ブロットしたＥＰＯを抗ＥＰＯ抗体（ウサギ）およびＡＰ結合抗ウサギ抗体を使用して免疫検出法によって検出した。紫色スポットｄ１、ｄ２、ｄ３（および他の黒色スポット）は、ｐＳｉｎＲｅｐ５
ＥＰＯウイルスを表す下層にあるウイルスプラーク由来のブロットしたＥＰＯを表す。
【図１１Ａ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５のポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｂ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５のポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｃ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５のポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｄ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＥＰＯのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｅ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＥＰＯのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｆ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ＥＰＯのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｇ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒαのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｈ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒαのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｉ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒαのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｊ】ｐＳｉｎＲｅｐ  ５  ｈＩＬ１３Ｒαのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｋ】ｐＤＨ−ＥＢのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｌ】ｐＤＨ−ＥＢのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１Ｍ】ｐＤＨ−ＥＢのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１２Ａ】ｐＴＥ５’２Ｊのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１２Ｂ】ｐＴＥ５’２Ｊのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１２Ｃ】ｐＴＥ５’２Ｊのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１２Ｄ】ｐＴＥ５’２Ｊのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１３Ａ  】９８７  ＢＢ  ｎｅｏのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１３Ｂ  】９８７  ＢＢ  ｎｅｏのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１３Ｃ  】９８７  ＢＢ  ｎｅｏのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１４】ＣＡＴのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１５】合成エリスロポイエチンのＸｂａＩ／ＡｐａＩフラグメントののポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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