(57)【要約】  目的領域のＰＣＲ増幅を均一かつ精度よく行うことができる、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法が提供される。
2018061674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
前記脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
前記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
前記ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲにより増幅するＰＣＲ増幅工程と、
前記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、前記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
を含み、前記目的領域選択工程と、前記単一細胞単離工程から前記ゲノムＤＮＡ抽出工程までの工程とは、任意の順序である、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法であって、
前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ）前記少なくとも１つの目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程と、
ｂ）前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における前記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程と、
ｃ）前記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程と、
ｄ）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程と、
ｅ）前記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程と、
ｆ）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程と、
ｇ）前記第一段階選抜工程および前記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程と、
を含み、
前記ローカルアラインメント工程および前記第一段階選抜工程の両工程と、前記グローバルアラインメント工程および前記第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時である、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【請求項２】
脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
前記脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
前記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
前記ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲにより増幅するＰＣＲ増幅工程と、
前記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、前記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
を含み、前記目的領域選択工程と、前記単一細胞単離工程から前記ゲノムＤＮＡ抽出工程までの工程とは、任意の順序である、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法であって、
前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ１）前記少なくとも１つの目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程と、
ｂ１）前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における前記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程と、
ｃ１）前記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程と、
ｄ１）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程と、
ｅ１）前記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程と、
ｆ１）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程と、
ｇ１）前記第一段階選抜第１工程および前記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程と、
ａ２）前記少なくとも１つの目的領域のうちまだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程と、
ｂ２）前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における前記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程と、
ｃ２）前記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程と、
ｄ２）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程と、
ｅ２）前記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程と、
ｆ２）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程と、
ｇ２）前記第一段階選抜第２工程および前記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程と、
を含み、
前記ローカルアラインメント第１工程および前記第一段階選抜第１工程の両工程と、前記グローバルアラインメント第１工程および前記第二段階選抜第１工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記ローカルアラインメント第２工程および前記第一段階選抜第２工程の両工程と、前記グローバルアラインメント第２工程および前記第二段階選抜第２工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、前記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、前記第３以降の対象領域について、前記対象領域選択第２工程から前記プライマー採用第２工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【請求項３】
脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
前記脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
前記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
前記ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲにより増幅するＰＣＲ増幅工程と、
前記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、前記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
を含み、前記目的領域選択工程と、前記単一細胞単離工程から前記ゲノムＤＮＡ抽出工程までの工程とは、任意の順序である、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法であって、
前記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ−０）前記少なくとも１つの目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程と、
ｂ−０）前記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、前記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における前記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程と、
ｃ−１）前記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
ｄ−１）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程と、
ｅ−１）前記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−１）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程と、
ｇ−１）前記第１の第一段階選抜工程および前記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
ｃ−２）前記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が前記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
ｄ−２）前記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程と、
ｅ−２）前記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、前記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−２）前記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程と、
ｇ−２）前記第２の第一段階選抜工程および前記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を含み、
前記第１のローカルアラインメント工程および前記第１の第一段階選抜工程の両工程と、前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記第２のローカルアラインメント工程および前記第２の第一段階選抜工程の両工程と、前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
前記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、前記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、前記プライマー候補塩基配列複数作成工程において前記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、前記第３以降の対象領域について、前記第２のローカルアラインメント工程から前記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【請求項４】
前記単一細胞が希少細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【請求項５】
前記希少細胞が胎児由来の有核赤血球である、請求項４に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【請求項６】
前記希少細胞ががん細胞である、請求項４に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【請求項７】
前記がん細胞が血中循環がん細胞である、請求項６に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【請求項８】
前記単一細胞が臓器の固形がん由来のがん細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの血液中には、正常な個体の場合には存在しないが、妊婦や、癌患者などに、希少細胞と呼ばれる、非常に低い確率で血液中に細胞が存在する。その一つとして、妊娠中の母親の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが知られている。血液中の存在確率は、数ｍＬ中に数個の割合で存在するといわれている。このような胎児細胞中のゲノムＤＮＡを再現性よく確実に分析することが可能となれば、流産の可能性のない、安全で、しかも直接胎児由来のＤＮＡを分析する遺伝子診断が実現できることとなる。【０００３】
また、別の希少細胞としては、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ）と呼ばれているがん細胞がある。このがん細胞の血液中の存在数は、血液１０ｍＬ中に数個から数十個程度といわれている。ＣＴＣは腫瘍や癌を有するヒト個体の進行した癌細胞が血液の流れに乗って循環し、離れた臓器にまで転移をおこすことが知られており、乳がんや前立腺がん、大腸がんなどの転移性のがん症例において治療効果の判定や予後予測因子として有用性が認められている。【０００４】
ＣＴＣの臨床的な有用性は、従来の診断方法に比べてはるかに早く、癌化学療法の治療効果の評価ができることである。また、ＣＴＣに発現しているバイオマーカーや、遺伝子の変異、増幅、融合などの情報から患者毎の最適な治療を選択することが可能になると期待されている。【０００５】
近年、次世代シーケンシング（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術の普及によって、塩基配列データの質および量を担保することが容易になったことから、遺伝子解析が手軽に行われるようになってきた。ＮＧＳ技術の導入によって、全ゲノム解析の技術的困難の多くは解消されつつある。しかし、ゲノムの総塩基長は、ヒトゲノムの場合で３０億塩基対以上と、一般に膨大であり、ＮＧＳ技術をもってしても、全ゲノム解析を行うにはかなりの費用および時間を要する。【０００６】
一方、遺伝子異常を検出するという目的を達成するための手段として、全ゲノム解析は最適とはいえない。遺伝子異常に関係するゲノムＤＮＡ上の領域（コーディング領域のみならず、非コーディング領域も含む）のみを解析すれば足りるからである。そのため、ゲノムＤＮＡ上の必要な特定の領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲ（マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応）と称する。【０００７】
一般に、マルチプレックスＰＣＲで同時に増幅する領域の数は、あまり多くすることができない。その要因の一つとして、プライマー同士が反応することによって、プライマー・ダイマーと呼ばれる余計な増幅産物が生成され、ゲノムＤＮＡ上の目的領域を効率的に増幅することができなくなる現象が知られている。【０００８】
プライマー・ダイマーの形成を抑制する手段として、例えば、特許文献１では、プライマーの塩基配列を定常領域と可変領域とに分割し、定常領域においては同一の塩基列を配し、可変領域においてはシトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）のうち、相互に相補的にならないような２種類の塩基のみに限定することで、膨大な数の領域に対してポリメラーゼ反応をかける手段が記載されている。【０００９】
また、特許文献２では、プライマーのすべての組合せについて、プライマー間の３’末端での相補性を示すスコア（３’末端のローカルアラインメント・スコア）を計算し、プライマー同士の相補性が低いプライマーの組合せを選び出すことによって、マルチプレックスＰＣＲで異なるターゲットのプライマー同士がプライマー・ダイマーを形成する可能性を低くすることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００４／０８１２２５号
【特許文献２】国際公開第２００８／００４６９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これらの改良技術は、多細胞から抽出した豊富なＤＮＡを増幅される場合には有用な技術ではあるが、例えば、単一細胞（シングルセル）解析といった、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）の鋳型となるゲノムＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；リボ核酸）が極めて少量である場合には、プライマー・ダイマーを抑制するには不十分である。【００１２】
そのため、脊椎動物由来の単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として目的領域のＰＣＲ増幅を均一かつ精度よく行うことができる、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法が求められている。【００１３】
そこで、本発明は、目的領域のＰＣＲ増幅を均一かつ精度よく行うことができる、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プライマー間の相補性が低下するように設計したプライマーを用いて、目的領域のＰＣＲ増幅をすると、目的領域のＰＣＲ増幅を均一かつ精度よく行うことができることを知得し、本発明を完成させた。【００１５】
すなわち、本発明は次の［１］〜［８］を提供する。
［１］  脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
上記脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
上記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
上記ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲにより増幅するＰＣＲ増幅工程と、
上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
を含み、上記目的領域選択工程と、上記単一細胞単離工程から上記ゲノムＤＮＡ抽出工程までの工程とは、任意の順序である、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法であって、
上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ）上記少なくとも１つの目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程と、
ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程と、
ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程と、
ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程と、
ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程と、
ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程と、
ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程と、
を含み、
上記ローカルアラインメント工程および上記第一段階選抜工程の両工程と、上記グローバルアラインメント工程および上記第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時である、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
［２］  脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
上記脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
上記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
上記ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲにより増幅するＰＣＲ増幅工程と、
上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
を含み、上記目的領域選択工程と、上記単一細胞単離工程から上記ゲノムＤＮＡ抽出工程までの工程とは、任意の順序である、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法であって、
上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ１）上記少なくとも１つの目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程と、
ｂ１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程と、
ｃ１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程と、
ｄ１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程と、
ｅ１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程と、
ｆ１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程と、
ｇ１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程と、
ａ２）上記少なくとも１つの目的領域のうちまだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程と、
ｂ２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程と、
ｃ２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程と、
ｄ２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程と、
ｅ２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程と、
ｆ２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程と、
ｇ２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程と、
を含み、
上記ローカルアラインメント第１工程および上記第一段階選抜第１工程の両工程と、上記グローバルアラインメント第１工程および上記第二段階選抜第１工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記ローカルアラインメント第２工程および上記第一段階選抜第２工程の両工程と、上記グローバルアラインメント第２工程および上記第二段階選抜第２工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
［３］  脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程と、
上記脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
上記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
上記ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲにより増幅するＰＣＲ増幅工程と、
上記ＰＣＲ増幅工程において得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程と、
を含み、上記目的領域選択工程と、上記単一細胞単離工程から上記ゲノムＤＮＡ抽出工程までの工程とは、任意の順序である、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法であって、
上記少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットが、
ａ−０）上記少なくとも１つの目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程と、
ｂ−０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程と、
ｃ−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
ｄ−１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程と、
ｅ−１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程と、
ｇ−１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
ｃ−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
ｄ−２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程と、
ｅ−２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
ｆ−２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程と、
ｇ−２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を含み、
上記第１のローカルアラインメント工程および上記第１の第一段階選抜工程の両工程と、上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記第２のローカルアラインメント工程および上記第２の第一段階選抜工程の両工程と、上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第二段階選抜工程の両工程とは、任意の順序または同時であり、
上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、
脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
［４］  上記単一細胞が希少細胞である、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
［５］  上記希少細胞が胎児由来の有核赤血球である、上記［４］に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
［６］  上記希少細胞ががん細胞である、上記［４］に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
［７］  上記がん細胞が血中循環がん細胞である、上記［６］に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
［８］  上記単一細胞が臓器の固形がん由来のがん細胞である、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、目的領域のＰＣＲ増幅を均一かつ精度よく行うことができる、脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法を提供することができる。
さらに、本発明によれば、ＷＧＡ（全ゲノム増幅）工程を経ることなく、単一細胞から塩基配列情報を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法の概略を表すフロー図である。
【図２】図２は、本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法に用いる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第１の態様を説明するフロー図である。
【図３】図３は、本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法に用いる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第２の態様を説明するフロー図である。
【図４】図４は、本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法に用いる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第３の態様を説明するフロー図である。
【図５】図５は、実施例１の結果を示すグラフである。細胞３、細胞８、細胞１８、および細胞２０の４つの細胞が標品ゲノムとは異なるパターンを示し、かつ、これらの示すパターンは相互に類似していることから、胎児由来の細胞であると推定された。
【図６】図６は、実施例１の結果を示すグラフである。胎児由来の４個の細胞とも、１８番染色体が１３番染色体および２１番染色体のいずれに対しても約１．５倍の本数存在し、１８番染色体トリソミーを示した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法］
本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法は、概していえば、妊婦の末梢血中に存在する胎児由来の有核赤血球もしくは血中循環がん細胞などの希少細胞を血液中から単離した単一細胞、または、固形がん由来の腫瘍の複数の各腫瘍部分の細胞集団に属する単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、目的領域のＰＣＲ増幅を行って、目的領域の塩基配列情報を取得するものである。
本発明における特徴的な点は、ゲノムＤＮＡ上の目的領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する際に、プライマー間の相補性が低下するように設計したプライマーを用いることによって、単一細胞から抽出した少量の鋳型ＤＮＡであっても、ＰＣＲ増幅を均一かつ精度よく行うことができる点にある。
【００１９】
なお、本発明において、数値範囲を「〜」を用いて表記した場合は、その数値範囲は「〜」の両側の数値を含むものとする。例えば、「０．１〜０．５」は「０．１」および「０．５」をその範囲に含み、「０．１以上０．５以下」と同義である。また、「０．５〜０．１」についても同様である。さらに、大小関係または前後関係があるものについても同様である。
【００２０】
以下では、本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法（以下、単に「本発明の塩基配列情報取得方法」という場合がある。）について、詳細に説明する。
【００２１】
本発明の塩基配列情報取得方法は、以下の（１）〜（５）の各工程と、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計をする工程とを含む（図１）。
（１）脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する目的領域選択工程。
（２）脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程。
（３）単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程。
（４）ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、少なくとも１つの目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、少なくとも１つの目的領域をＰＣＲにより増幅するＰＣＲ増幅工程。
（５）ＰＣＲ増幅工程においてＰＣＲ増幅された少なくとも１つの目的領域のＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得するＤＮＡシークエンシング工程。
ここで、（１）目的領域選択工程と、（２）単一細胞単離工程から（３）ゲノムＤＮＡ抽出工程までの工程とは、順序を変更してもよい。
また、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計をする工程は、目的領域を選択した後、ＰＣＲ増幅を行う前に、プライマーを設計し、使用するプライマーを作製しておけばよい。
目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計をする工程におけるポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法については、別途、「ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法」において詳細に説明する。
【００２２】
〈目的領域選択工程〉
目的領域選択工程は、脊椎動物のゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得するための少なくとも１つの目的領域を選択する工程である。
脊椎動物のゲノムＤＮＡ上には、塩基配列情報を取得することができる領域が多数存在するが、合目的的に目的領域を選択すればよい。
【００２３】
《脊椎動物》
脊椎動物は脊椎をもつ動物であり、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を含む。脊椎動物としては哺乳類が好ましく、哺乳類の中でもとりわけヒトが好ましい。
【００２４】
《ゲノムＤＮＡ上の領域》
本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法において「ゲノムＤＮＡ上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患の可能性のある遺伝子領域が存在するゲノムＤＮＡ上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、１塩基以上であればよい。目的領域が選択されるゲノムＤＮＡ上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：リボ核酸）遺伝子およびトランスファーＲＮＡ遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、５’−リーダー配列および３’−トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
【００２５】
遺伝子多型は、例えば、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）、ＳＮＶ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｖａｒｉａｎｔ：一塩基変異）、ＳＴＲＰ（Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：縦列型反復配列多型）、ミューテーション、ならびに挿入および／または欠失（インデル）などである。単一遺伝子疾患は、単一の遺伝子の異常が原因となって発症する疾患である。異常としては、遺伝子そのものの欠失もしくは重複、ならびに／または、遺伝子内の塩基の置換、挿入および／もしくは欠失などが挙げられる。単一遺伝子疾患の原因となる単一遺伝子を「責任遺伝子」という。多因子疾患は、複数の遺伝子が発症に関与する疾患であり、ＳＮＰの特定の組合せ等が関係する場合がある。これらの遺伝子を病気に感受性があるという意味で「感受性遺伝子」という。がんは遺伝子が変異することによって起こる疾患である。他の疾患と同様、がんにも遺伝性（家族性）のがんが存在し、遺伝子腫瘍（家族性腫瘍）などと称される。
【００２６】
ゲノムＤＮＡ上の領域の数は特に限定されない。ゲノムＤＮＡ上の領域は、目的領域を選択する際の候補リストであり、膨大な数がリストされていたとしても、そのすべてについて解析しなければならないわけではないからである。
【００２７】
《目的領域》
目的領域は、上記ゲノムＤＮＡ上の領域から、塩基配列情報を取得する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型、疾患、またはがん等を検出することに限定されるものではなく、染色体の異数性を検出すること等であってもよい。また、選択の目的は１つに限定されず、２つ以上の目的を有していてもよい。
【００２８】
目的領域として選択するゲノムＤＮＡ上の領域の数は、塩基配列情報を取得する目的により異なり、特に限定されるものではないが、好ましくは３箇所以上、より好ましくは５箇所以上、さらに好ましくは１０箇所以上である。
【００２９】
塩基配列情報を取得する目的は、特に限定されるものではないが、例えば、胎児有核赤血球から塩基配列情報を取得する場合は、胎児の遺伝子状態の取得、胎児の染色体異数性の検査、胎児と擬父との親子（父子）鑑定、または胎児と親族との血縁鑑定などが目的として挙げられ、血中循環がん細胞から塩基配列情報を取得する場合は、現在のがんの進行状態の評価、抗がん剤の選択、または抗がん剤の効果の判定などが挙げられ、固形がんから単離した単一がん細胞から塩基配列情報を取得する場合は、遺伝子異常の検出、治療方法の選択、抗がん剤の選択、または進行状態の評価などが挙げられる。
【００３０】
例えば、胎児の遺伝子状態の判定を目的とする場合は、単一遺伝子の異常が疾患の原因となるメンデル遺伝性疾患について、検出を所望する原因遺伝子をＯＭＩＭ（Online Mendelian Inheritance in Man：オンライン・ヒトメンデル遺伝形質）データベースから選択し、検査したい変異箇所の数のプライマーを設計する。設計したプライマーセットを用いて、胎児有核赤血球から抽出したゲノムＤＮＡの標的遺伝子領域を増幅し、増幅産物の塩基配列をシークエンサーで求める。解読した塩基配列を健常なリファレンスゲノムと比較したとき、遺伝子の欠失、重複、逆位および／または転座を認めた場合、胎児が遺伝子疾患を有すると予想される。
【００３１】
〈単一細胞単離工程〉
単一細胞単離工程は、上記脊椎動物に由来する生物試料から単一細胞を単離する工程である。
【００３２】
《生物試料》
生物試料はゲノムＤＮＡを抽出可能な細胞が含まれているものであれば特に限定されないが、例えば、血液、固形組織、または培養細胞などが挙げられる。
【００３３】
《単一細胞》
単一細胞としては、例えば、血液に含まれる、血液中の他の細胞に対する存在比が極めて低く、血液数ｍＬ中に１個程度しか存在しない希少細胞が挙げられる。
【００３４】
ヒト血液に含まれる希少細胞としては、例えば、妊娠母体より採取された血液に含まれる胎児由来の有核赤血球、またはがん患者より採取された血液に含まれる血中循環腫瘍細胞等が挙げられる。
【００３５】
（胎児由来の有核赤血球）
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して母体血中に存在する赤血球前駆体であり、母体血中の細胞の約１０６個に１個の割合で存在するといわれる希少細胞である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。有核赤血球には核が存在するため、胎児由来の有核赤血球を単離することで、胎児ゲノムＤＮＡの入手が可能となる。
【００３６】
胎児由来の有核赤血球を単離する目的で妊娠母体より採取される血液としては、母体血、臍帯血など、胎児由来の有核赤血球が存在することが知られている血液であればよく、妊娠母体への侵襲性を極力抑える観点で、母体末梢血が好ましい。
【００３７】
妊娠母体の末梢血には、母親由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球、母親由来の、核のない成熟した赤血球、母親由来の有核赤血球、および胎児由来の有核赤血球などの血液細胞が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後６週程度から母体血中に存在するといわれている。したがって、胎児由来の有核赤血球の単離を目的とする場合、本発明に供する血液は、妊娠後６週程度以降の妊娠母体より採取した末梢血、または、妊娠後６週程度以降の妊娠母体より採取した末梢血から調製した血液試料であることが好ましい。
【００３８】
（胎児由来の有核赤血球の単離）
胎児由来の有核赤血球は、光学機器を用いた解析（「光学的解析」ともいう。）により、血液中に存在するその他の細胞と区別され単離され得る。光学的解析は、好ましくは、画像解析および／または分光学的解析である。光学的解析を容易にするため、光学的解析に先だって、希少細胞を濃縮することが好ましい。
【００３９】
例えば、有核赤血球は、血液を密度勾配遠心分離に供し濃縮する方法が知られている。
以下、有核赤血球の密度勾配遠心分離について詳しく説明する。
【００４０】
((有核赤血球の密度勾配遠心分離による濃縮))
有核赤血球は、密度勾配遠心分離により、血液中に存在する血漿成分やその他の血液細胞と分離され得る。有核赤血球を分離するための密度勾配遠心分離は、公知の方法を適用してよい。例えば、密度（比重）の異なる２種類の媒体を遠沈管に重層した不連続密度勾配の上に、生理食塩水で希釈した血液を重層して遠心を行うことにより、有核赤血球を分画し濃縮できる。
【００４１】
国際公開第２０１２／０２３２９８号に、胎児由来の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度であり、母親の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度であり、好酸球が１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度であり、好中球が１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度であり、好塩基球が１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度であり、リンパ球が１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度であり、単核球が１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。
【００４２】
密度１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、他の血液細胞と分離するために、積層する媒体の密度（比重）が設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の媒体を隣接して重層することで、その界面に胎児由来の有核赤血球を有する画分を集めることが可能となる。下層の媒体の密度は、１．０８ｇ／ｍＬ以上で上層の媒体の密度よりも大きくするが、好ましくは１．０８ｇ／ｍＬ〜１．１０ｇ／ｍＬとし、より好ましくは１．０８ｇ／ｍＬ〜１．０９ｇ／ｍＬとする。また、上層の媒体の密度は、１．０８ｇ／ｍＬ以下で下層の媒体の密度よりも小さくするが、好ましくは１．０６ｇ／ｍＬ〜１．０８ｇ／ｍＬであり、より好ましくは１．０６５ｇ／ｍＬ〜１．０８ｇ／ｍＬである。
一例として、下層の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬとし、上層の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬとして、血漿成分、好酸球および単核球を、回収する所望の画分から分離することが好ましい。また、このように設定することによって、赤血球、好中球、およびリンパ球の一部も分離することが可能となる。
本発明では、下層の媒体と上層の媒体とは、同じ種類の媒体を用いてもよいし、異なる種類の媒体を用いてもよいが、好ましくは同じ種類の媒体を用いる。
【００４３】
媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５ｎｍ〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるＰｅｒｃｏｌｌ（パーコール，ＧＥヘルスケア社製）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（フィコール−パック，ＧＥヘルスケア社製）、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含むＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ヒストパック，シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。本発明では、パーコールおよび／またはヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度１．１３０の製品が市販されており、水で希釈することで密度勾配を調製することが可能である。ヒストパックは、市販されている密度１．０７７の媒体および密度１．１１９の媒体と水とを用いて密度勾配を調製することが可能である。
【００４４】
２層の不連続密度勾配は、例えば以下のようにして遠沈管に形成する。
まず、凝固点以上かつ１４℃以下、好ましくは８℃以下、の温度状態にある下層の媒体を遠沈管の底部に収容するか、または、下層の媒体を遠沈管の底部に収容したのち１４℃以下、好ましくは８℃以下、の温度下で保存して冷却する。
次に、下層の媒体の上に上層の媒体を重層する。
【００４５】
((フローサイトメトリーによる単離))
本発明では、有核赤血球を密度勾配遠心分離により濃縮した後、フローサイトメトリー法により有核赤血球細胞を単離することが好ましい。
フローサイトメーターでの分取は、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の情報を取得して、取得した情報に基づいて、目的の細胞を、開口を有するウェルが配列された容器に分取し、容器に分取された細胞を撮像し、その画像に基づいて有核赤血球候補細胞を決定して、行う。
フローサイトメーターでの分取の前に染色が行われる。まず、目的の細胞を含む分析対象試料を準備する。分析対象試料に、例えば、溶血剤と、免疫染色に用いる蛍光標識された抗体と混合し、インキュベーションすることにより、細胞を免疫染色する。細胞を免疫染色することにより試料液Ｓが調製される。血液細胞に光源から、レーザー光等が照射される。レーザー光の照射により血液細胞の免疫染色による蛍光標識が励起され、血液細胞は免疫染色による蛍光標識により蛍光を発光する。この蛍光強度が検知器により検知される。検知された情報を基に、フローセルに超音波が印加された細胞がプラス、またはマイナスに荷電される。細胞が偏向電極板を通過する際、荷電された液滴を何れかの偏向電極板に引き寄せることにより、基本的には、容器の１ウェルに１細胞が分取される。
【００４６】
フローサイトメトリーによる単離のみによっては、単離した有核赤血球が胎児由来であるか、または母体（妊婦）由来であるかの確定をすることができない場合がある。しかし、本発明においては、ＳＮＰ（一塩基多型）および／またはＳＴＲ（短鎖縦列反復配列）等による多型解析、ならびにＹ染色体の存在の確認など、ジェノタイピング解析によって、単離した有核赤血球の由来を判別することができる。
【００４７】
（血中循環腫瘍細胞）
固形がん患者の血液中を循環する腫瘍細胞が知られており、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ；ＣＴＣ）と呼ばれている。ＣＴＣは、血球成分１０８〜１０９個に約１個の割合で存在するといわれる希少細胞である。
ＣＴＣは、原発巣から他の部位へ転移する能力を有する細胞を含んでいると考えられている。腫瘍細胞の塊から血管内へ浸潤するがん細胞のうち、自己免疫系をすり抜けたごく少数の細胞が、ＣＴＣとして血液内を循環し、転移巣を形成すると考えられている。この転移性がんの経過予測は非常に困難と考えられており、ＣＴＣの情報を取得して、がんの病態についての正確な情報を得ることは治療を行う上で有益である。がんの病態の経過は、画像診断か、腫瘍マーカーによる診断が行われているが、腫瘍の活動状況、即ち、休眠状態か、活発に増殖しているかを、タイムリーに判断することが難しいのが実情である。従って、末梢血中のＣＴＣ検査でがんの病態予測が可能になれば、非常に有効な手段となる。
【００４８】
腫瘍内不均一性は、腫瘍の中にゲノムの異なる複数のクローンが存在する現象であり、がんの治療抵抗性の一因となっている。腫瘍内不均一性により、治療感受性のクローンが縮小しても、治療抵抗性の少数のクローンが残存する場合、そのクローンが増殖して再発に至る場合がある。腫瘍内不均一性は、がんの進化の過程でクローンが分枝することにより生じると考えられており、腫瘍内においても薬剤耐性クローンが生じている可能性が高い。従って、がんの治療を行う際には、腫瘍内不均一性を把握したうえで、治療方法をタイムリーに検討することが非常に重要となる。
【００４９】
（血中循環腫瘍細胞の単離）
血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を取得する手段として、例えば、血液細胞との大きさおよび形態の違いを利用してフィルターを用いて血液細胞と分離し、濃縮する方法が知られている（例えば、特開２０１１−１６３８３０号公報、特開２０１３−４２６８９号公報）。
【００５０】
また、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を取得する手段として、セルサーチシステム（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステム；Ｖｅｒｉｄｅｘ社製）が市販されている。現在、このセルサーチシステムを使用した、乳がん、前立腺がん、および大腸がんの症例のＣＴＣ検査は、米国食品医薬局（ＦＤＡ；ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の承認が得られている。ＣＴＣは、このセルサーチシステムを用いることによって取得可能である。
【００５１】
セルサーチシステムを使用してＣＴＣを取得する手段としては、まず、上皮細胞接着因子である抗ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ；上皮細胞接着分子）抗体で標識した磁性粒子により、血液中からＣＴＣ細胞候補を分離、抽出する。この分離した細胞に対して、さらに、蛍光標識した抗サイトケラチンモノクローナル抗体を反応させるとともに、同時に、ＤＮＡ染色物質であるＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いて核を染色する。ここで、白血球を識別するため、蛍光標識した抗ＣＤ４５抗体と反応させる。ＣＴＣ反応液は、磁石を固定したカートリッジに移され、磁石にとらえられたＣＴＣの蛍光発色状況を解析する。ＤＡＰＩで染色された核と抗サイトケラチンモノクローナル抗体で蛍光染色された細胞の形態とＣＤ４５抗体に未反応であることを確認することにより、ＣＴＣを同定することができる。
【００５２】
また、ＣＴＣを取得する手段として、微小流路と流体力学を組み合わせた手段として、ＣｌｅａｒＣｅｌｌ  ＦＸシステム（Ｃｌｅａｒｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｓ社製）も知られている。この装置では、抗体を使わずにラベルフリーでＣＴＣを濃縮回収することが可能であり、ＥｐＣＡＭ抗原の発現量に依存しないＣＴＣも回収することが可能である。
具体的には、患者血液約７ｍＬからＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ（株）社製）で赤血球を溶解し、遠心後、ペレットをバッファーにて懸濁後、ＣｌｅａｒＣｅｌｌ  ＦＸチップ（Ｃｌｅａｒｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｓ社製）に充填しＣＴＣをチューブに回収することができる。
【００５３】
（固形がん由来のがん細胞の単離）
腫瘍内不均一性の確認のための細胞単離は、原発巣の部位を複数の部位に区切り、その部位から単一細胞を取得する。
取得する方法としては、例えば、がん細胞の塊を、トリプシンまたはトリプシン・ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）による処理などが挙げられる。
また、腫瘍切片を用いてＬＣＭ（Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ；レーザーキャプチャーマイクロダイセクション）のように、顕微鏡にレーザー照射装置が接続された機器を用いて、顕微鏡下で腫瘍切片を観察しながら、標的とする細胞をレーザーによって選択的に採取、回収する手法なども挙げられる。用いる腫瘍切片としては、ホルマリンもしくはアルコール固定後のパラフィンブロックを用いることも可能だが、望ましくは液体窒素で保存された凍結腫瘍由来の腫瘍切片が望ましい。
【００５４】
〈ゲノムＤＮＡ抽出工程〉
ゲノムＤＮＡ抽出工程は、上記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出する工程である。
単一細胞からのゲノムＤＮＡ抽出は、特に限定されず、従来公知の方法によって行うことができる。
例えば、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを使用してもよい。
また、ＤＮＡ抽出の際には、タンパク質分解処理を行うことが好ましい。細胞にはＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸の他に、タンパク質その他の物質も含んでおり、また、染色体の最も基本的な構成要素はゲノムＤＮＡとヒストンタンパク質であることから、タンパク質を分解して除去することにより、ＰＣＲ増幅工程の成功率を上げることができる。
タンパク質を分解して除去する方法は、特に限定されるものではないが、プロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を用いることが好ましい。市販のタンパク質分解酵素キットなどを利用することもできる。
【００５５】
〈ＰＣＲ増幅工程〉
ＰＣＲ増幅工程は、上記ゲノムＤＮＡ抽出工程において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上記少なくとも１つの目的領域を増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記少なくとも１つの目的領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する工程である。
【００５６】
上記少なくとも１つの目的領域を増幅するように設計されたプライマーセットは、後述する「ポリメラーゼ連鎖反応に供するためのプライマーの設計方法」において説明する。
【００５７】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
ポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型ＤＮＡを繰り返し複製させる。増幅させるＤＮＡ塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする短いＤＮＡプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型２本鎖ＤＮＡの２本の鎖が解離し別々に複製される。
【００５８】
マルチプレックスＰＣＲは、一般的なＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが可能であるが、それぞれのプライマー対が鋳型ＤＮＡにアニーリングする温度が異なる為、反応条件の検討が必要な場合がある。そのため、マルチプレックスＰＣＲに最適化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが好ましく、本発明では、マルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ（株）社製）を用いて反応することがより好ましい。
【００５９】
プライマーおよびプライマーセットの設計方法についての詳細は後述するため、ここでは、例示として、１３番、１８番および／または２１番染色体の異数性を検出する場合の概略を述べる。
目的領域の数は、１３番、１８番および／または２１番染色体の異数性を検出する場合では、上記染色体に特異的なＤＮＡ配列領域から、検査に応じて必要とする箇所の標的領域を選択して、各標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成し、プライマー塩基配列間の相補性が低いものを選抜することによって、単一細胞のような微量のゲノムＤＮＡに対しても目的領域の増幅性が非常に改良される。
【００６０】
次世代シークエンサー技術は飛躍的に進化しているものの、シークエンス解析に用いるサンプルの調製は非常に複雑な工程が必要となる。サンプルの前処理は、最も広く応用されているゲノム解析の場合、サンプルから核酸の抽出後、（１）ＤＮＡの断片化、（２）ＤＮＡサイズセレクション、（３）ＤＮＡ末端の平滑化処理、（４）ＤＮＡ末端へのアダプター配列の付加、（５）ＤＮＡの精製、および（６）ＤＮＡの増幅というプロセスを必要とする。
【００６１】
複雑なサンプル調整工程は時間および労力を要し、工程が適切に行われていることを確認しなければならない。また、各工程においてバイアスが生じていくため、特に結果の精度および確度を高いレベルで要求される医療現場での診断ツールとしての使用に際しては、このバイアスを減らす必要がある。
【００６２】
これらを解決するために、本発明においては、後述する特定の方法を用いて設計したプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことによって、遺伝子状態を判別するために選択した目的領域のより均一な増幅が可能となる。さらに、ＰＣＲ産物を磁性ビーズにより精製することによって、より効果的な増幅産物の回収が可能となる。ＰＣＲ反応溶液中には、余剰のプライマー、ｄＮＴＰｓ（Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：デオキシヌクレオチド）、および酵素等の夾雑物が残留しているため、高精度のシークエンスデータを得る際の障害となる場合がある。しかし、ＰＣＲ増幅産物を、磁性ビーズを用いて精製することによって、ＰＣＲ増幅産物の損失を著しく抑制しながら、十分な精製を行うことができる。この場合、単一細胞の非常に少ないＤＮＡからでも、（１）ＤＮＡの増幅、および（２）ＤＮＡの精製という、シンプルなサンプル調整工程のみで、様々な遺伝子領域を均一に精度よく増幅し、確実に胎児の遺伝子異常の有無を検出する方法を用いることが好ましい。
【００６３】
増幅されたＤＮＡの量の測定は、例えば、２６０ｎｍの波長の吸収度を測定する超微量分光光度計ナノドロップ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、レーザー蛍光検出法を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー（株）社製）、または蛍光法により２本鎖ＤＮＡを定量するＱｕａｎｔｕｓフルオロメーター（プロメガ（株）社製）等を用いて行うことが可能である。
【００６４】
ＰＣＲ、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＤＮＡ合成は、細胞内でのＤＮＡ複製、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏのＤＮＡ合成とは、ＰＣＲでは、２本鎖ＤＮＡを合成するために、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドが２種類以上、必要となる。１つのＰＣＲ反応系で同時に使用されるプライマーの組合せをプライマーセットという場合がある。
ＰＣＲは、１対のプライマー（「プライマーペア」ともいう。）を用いて１つの領域を増幅する単純な系から、複数のプライマーペアからなるプライマーセットを用いて複数の領域を同時に増幅する複雑な系（マルチプレックスＰＣＲ）まで、容易に拡張することができる。
ＰＣＲの利点は、ヒトのゲノムＤＮＡ（３０億塩基対）のような非常に長大なＤＮＡ分子の中から、所望の領域だけを選択的に増幅させることができる点にある。しかも、極めて微量のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、所望の領域の増幅産物を十分量得ることができる。
また、ＰＣＲの利点としては、プログラムにもよるが、概ね、増幅に要する時間が２時間程度と短い点も挙げられる。
さらに、ＰＣＲの利点としては、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる点も挙げられる。
【００６５】
（ＰＣＲ産物の精製）
ＰＣＲ増幅産物を含む反応液には、酵素、ヌクレオチド、塩類、およびその他不純物が混在するため、それらを除去することが好ましい。核酸の精製方法としては、例えば、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法、カオトロピック塩の存在下でシリカメンブレンフィルタなどのシリカ担体に選択的に吸着させる方法、およびＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ポリエチレングリコール）存在下においてカルボキシル基で修飾された磁性ビーズに核酸が選択的に結合する現象を利用した方法などが知られている。
本発明の好ましい実施態様として、ＰＣＲ増幅産物は、磁性ビーズを利用した精製法を選択することができる。
【００６６】
ＰＣＲ増幅産物を、常磁性微小ビーズである磁性ビーズを利用した精製を行うことによって、さらに効率的に目的領域のみの解析を可能とすることができる。
ＰＣＲ増幅産物の磁性ビーズを利用した精製法について説明する。
磁性ビーズを利用したＰＣＲ増幅産物の精製方法は、磁性ビーズの粒子表面にＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡフラグメントを可逆的に結合させ、磁性ビーズをマグネットで吸着し、増幅したＤＮＡ断片と液体とを分離することによって、効率よく酵素、ｄＮＴＰｓ、ＰＣＲプライマー、プライマー・ダイマー、および塩などの夾雑物を除去することができる。磁性ビーズを利用した方法は、他の精製方法と比較して、サンプルロスが少なく、かつ、夾雑物の除去効率が高い。その結果として、ＤＮＡシーケンス工程において、効率的に目的領域のみの解析を行うことが可能となる。磁性ビーズは市販されており、例えば、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰキット（ベックマンコールター社製）、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（タカラバイオ（株）社製）、またはＥｐｉＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＨＴ Ｓｙｓｔｅｍ（エピジェンテック社製）等を用いることができる。なかでも、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰキット（ベックマンコールター社製）を用いて精製することが好ましい。
【００６７】
〈ＤＮＡシークエンシング工程〉
ＤＮＡシークエンシング工程は、上記ＰＣＲ増幅工程において増幅された上記少なくとも１つの目的領域の増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読して、上記少なくとも１つの目的領域の塩基配列情報を取得する工程である。
【００６８】
ＰＣＲ増幅産物の配列解析には、次世代シークエンサー、特に、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）を用いることが望ましい。複数のマルチプレックスＰＣＲ産物を次世代シークエンサー「ＭｉＳｅｑ」を用いてシークエンシングする場合、それぞれのマルチプレックスＰＣＲ産物に６〜８塩基で構成されるサンプル識別配列（インデックス配列）ならびにＭｉＳｅｑフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるためのＰ５配列およびＰ７配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大９６種類のマルチプレックスＰＣＲ産物を１回で測定することが可能である。
インデックス配列、Ｐ５配列およびＰ７配列をマルチプレックスＰＣＲ産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法またはＰＣＲ法などを用いることが可能である。
【００６９】
また、複数のマルチプレックスＰＣＲ産物を混合してＭｉＳｅｑで測定する場合には、それぞれのＰＣＲ産物を正確に定量することが望ましい。ＰＣＲ産物の定量方法としては、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー（株）社製）またはＱｕａｎｔｕｓフルオロメーター（プロメガ（株）社）を用いることも可能であるが、マルチプレックスＰＣＲ産物を定量ＰＣＲ法で測定する方法がさらに好ましい。本発明での定量方法としては、ＫＡＰＡライブラリー定量キット（日本ジェネティクス（株）社製）を用いて定量することが好ましい。
【００７０】
ＭｉＳｅｑで得られたシーケンスデータを解析する方法としては、ＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ；バーロウズ−ホィーラー・アライナー：Ｌｉ，  Ｈ．、外１名、「Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年、第２５巻、第１４号、ｐ．１７５４−１７６０．；Ｌｉ，  Ｈ．、外１名、「Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｌｏｎｇ−ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１０年、第２６巻、第５号、ｐ．５８９−５９５）を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Ｌｉ，Ｈｅｎｇ、外、「Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年、第２５巻、第１６号、ｐ．２０７８−２０７９；ＳＡＭは“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ”に由来する。）、および／またはＢＥＤＴｏｏｌｓ（Ｑｕｉｎｌａｎ，Ａ．Ｒ．、外１名、「ＢＥＤＴｏｏｌｓ：  ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１０年、第２６巻、第６号、ｐ．８４１−８４２）を用いることで遺伝子の変異や染色体数の定量を解析することが好ましい。
【００７１】
（配列リード数の決定）
ＤＮＡシークエンシング工程においては、さらに、配列リード数を測定することが望ましい。
例えば、胎児有核赤血球の細胞が同定され、標的領域をＰＣＲ増幅して得たＤＮＡ断片に対して、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（配列リード数）をシークエンサーで求めることができる。基準（あるいは参照）として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（配列リード数）をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量（配列リード数）と、母親由来の増幅産物の増幅量（配列リード数）とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、１：１．５（または２：３）となることが予想される。
本発明においては、あらかじめ、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母親由来のＰＣＲ増幅産物の量（配列リード数）に対する胎児由来のＰＣＲ増幅産物の量（配列リード数）の比を複数求め、その分布を求める。また、トリソミーの胎児を妊娠した場合の母親由来の増幅産物の量（配列リード数）に対する胎児由来の増幅産物の量（配列リード数）の比を複数求め、その分布を求める。この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定することもできる。この、あらかじめ決定したカットオフ値と、増幅産物の比を求めた結果とを比較して、その比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである、と検査結果を解釈することも可能である。結果が得られない場合には、単一細胞の単離からやり直してもよい。
【００７２】
この例においては、単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認を行って、胎児由来の単一細胞の遺伝子状態の判定を行ったことを確定させてもよい。妊娠母体から採取した抹消血の有核赤血球には、母親由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球が混在していることが知られており、本発明の方法は胎児の遺伝子状態を判定しながら、胎児由来の有核赤血球を同定することができる。遺伝子配列の個人差を識別する方法としては、一般的に、対立遺伝子に存在する遺伝子多型を検出する方法で行われている。一例として、父子判別には、遺伝子多型の一種にＳＴＲも使用することができる。また、個人差を識別する方法として、ゲノム塩基配列中の一塩基が変異し、１％以上の頻度で観察されるＳＮＰｓも使用することができる。本発明では、次世代シークエンサーを用いて、有核赤血球の中に、異なるＳＴＲまたはＳＮＰｓを有する細胞の有無により、胎児細胞と、母親細胞を識別することもできる。また、別に遺伝子状態の判定に補助的な情報を使って、胎児由来の有核赤血球か否かを判定するには、例えば、母親由来の白血球を取得して、同様にＳＴＲまたはＳＮＰｓを分析することによって、行うことができる。
【００７３】
また、有核赤血球を採取する前に超音波検査で胎児が男児であると確認されている場合であれば、採取した有核赤血球のＹ染色体の有無を検出することによって、有核赤血球が胎児由来であるか否かを判定することができる。一般的に、採取した細胞のＹ染色体の有無を検出する方法としては、Ｙ染色体特異的な蛍光プローブを用いるＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション）法が知られている。一例としては、ＣＥＰ  Ｘ／Ｙ  ＤＮＡプローブキット（アボット社製）が使用されている。本発明では、Ｙ染色体に特異的な塩基配列を持つプライマーを作製しＰＣＲを用い、その増幅有無を確認することで男児の胎児由来の有核赤血球であることを同定することが好ましい。
【００７４】
血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は原発巣から他の部位へ転移する能力を有する細胞を含んでいると考えられている。
また、更には抗がん剤に耐性を持つ薬剤耐性能力を有する細胞も含まれていると考えられている。例としては、非小細胞肺がん患者において、イレッサ（Ｒ）（アストラゼネカ（株）製；一般名  ゲフィチニブ）およびタルセバ（Ｒ）（中外製薬（株）社製；一般名  エルロチニブ塩酸塩）などのＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤が知られているが、多くの患者において、投薬開始後１年以内に再発することが知られている。この原因としては再発腫瘍においてＥＧＦＲタンパク質の７９０番目がスレオニンからメチオニンに置換（Ｔ７９０Ｍ）された薬剤耐性変異を獲得していることが知られている。この変異は、薬剤結合を妨げることから、投薬の開始や投薬後には薬剤耐性変異有無を検出することが重要と考えられている。
分子標的薬の開発に伴い、よく知られている事例はＥＧＦＲ遺伝子の薬剤耐性変異であるが、同様にＫＲＡＳ遺伝子変異やＢＲＡＦ遺伝子変異を患者から取得したＣＴＣから同時に検出しておくことで、有効な抗がん剤治療の選択が可能になり不必要な治療、診断を回避することが可能である。
遺伝子の変異を検出する方法としては、リアルタイムＰＣＲ法で検出する方法が知られている。一例としては、ｔｈｅｒａｓｃｒｅｅｎ  ＥＧＦＲ変異検出キットＲＧＱ（キアゲン（株）社製）が使用されている。
また、次世代シークエンサーを用いて複数個所の遺伝子変異を検出する方法としては、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｐａｎｅｌ  ｖ２（ライフテクノロジーズ（株）社製）が知られているが、単一細胞からの直接的な遺伝子変異の検出には使用されていない。更に患者の固形がんなどから次世代シークエンサーを用いて複数個所の遺伝子変異を検出する方法としては、ＴｒｕＳｉｇｈｔ  Ｃａｎｃｅｒ（イルミナ（株）社製）が知られており、マルチプレックスＰＣＲではなくオリゴＤＮＡを用いたキャプチャー法を用いているため必要なＤＮＡ量が５０ｎｇであることから単一細胞からの直接的な遺伝子変異の検出には使用されていない。
【００７５】
［ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法］
本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法において実施するポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法について説明する。
【００７６】
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第１の態様〉
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第１の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図２を参照する。
（ａ）少なくとも１つの目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程（図２のＳ１０１）。
（ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程（図２のＳ１０２）。
（ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程（図２のＳ１０３）。
（ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程（図２のＳ１０４）。
（ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程（図２のＳ１０５）。
（ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程（図２のＳ１０６）。
（ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程（図２のＳ１０７）。
【００７７】
ただし、上記（ａ）工程〜上記（ｇ）工程のうち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程の両工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行った後、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行ってもよいし、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行ってもよいし、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行ってもよい。
【００７８】
上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行う場合には、上記（ｅ）工程および上記（ｃ）工程は、それぞれ、下記（ｅ’）工程および下記（ｃ’）工程とすることが好ましい。
【００７９】
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
【００８０】
（ｃ’）上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
【００８１】
また、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ）工程は、下記（ｅ’）工程とすることが好ましい。
【００８２】
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
【００８３】
さらにプライマーを設計する場合は、プライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ｃ）ローカルアラインメント工程（図２のＳ１０３）から、作成されていなければ、ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程（図２のＳ１０２）またはａ）対象領域選択工程（図２のＳ１０１）から、プライマーを設計する（図２のＳ１０８、Ｓ１０９、およびＳ１１０）。
【００８４】
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第２の態様〉
本発明において、少なくとも１つの目的領域が２つ以上の目的領域を含む場合のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の派生態様の一つである第２の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図３を参照する。
【００８５】
（ａ１）少なくとも１つの目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程（図３のＳ２０１）。
（ｂ１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程（図２のＳ２０２）。
（ｃ１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程（図３のＳ２０３）。
（ｄ１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程（図３のＳ２０４）。
（ｅ１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程（図３のＳ２０５）。
（ｆ１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程（図３のＳ２０６）。
（ｇ１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程（図３のＳ２０７）。
【００８６】
ただし、上記（ａ１）工程〜上記（ｇ１）工程のうち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程の両工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行った後、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行ってもよい。
【００８７】
上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行う場合には、上記（ｅ１）工程および上記（ｃ１）工程は、それぞれ、下記（ｅ１’）工程および下記（ｃ１’）工程とすることが好ましい。
【００８８】
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
【００８９】
（ｃ１’）上記第二段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
【００９０】
また、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ１）工程は、下記（ｅ１’）工程とすることが好ましい。
【００９１】
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
【００９２】
（ａ２）上記少なくとも１つの目的領域のうちまだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程（図３のＳ２１１）。
（ｂ２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程（図３のＳ２１２）。
（ｃ２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程（図３のＳ２１３）。
（ｄ２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程（図３のＳ２１４）。
（ｅ２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程（図３のＳ２１５）。
（ｆ２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程（図３のＳ２１６）。
（ｇ２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程（図３のＳ２１７）。
【００９３】
ただし、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程のうち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程の両工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行った後、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行ってもよい。
【００９４】
上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行う場合には、上記（ｅ２）工程および上記（ｃ２）工程は、それぞれ、下記（ｅ２’）工程および下記（ｃ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｃ２’）上記第二段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
【００９５】
また、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ２）工程は、下記（ｅ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
【００９６】
さらにプライマーを設計する場合は、ａ２）対象領域選択第２工程（図３のＳ２１１）からｇ２）プライマー採用第２工程（図３のＳ２１７）までを繰り返す（図３のＳ２０８）。すなわち、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記（ａ２）工程〜上記（ｇ２）工程までの各工程を繰り返す。
【００９７】
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の第３の態様〉
本発明において、少なくとも１つの目的領域が２つ以上の目的領域を含む場合のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法の派生態様の一つである第３の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図４を参照する。
【００９８】
（ａ−０）上記少なくとも１つの目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程（図４のＳ３０１）。
（ｂ−０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、上記脊椎動物のゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程（図４のＳ３０２）。
【００９９】
（ｃ−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程（図４のＳ３０３）。
（ｄ−１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程（図４のＳ３０４）。
（ｅ−１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程（図４のＳ３０５）。
（ｆ−１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程（図４のＳ３０６）。
（ｇ−１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程（図４のＳ３０７）。
【０１００】
ただし、上記（ｃ−１）工程〜上記（ｇ−１）工程のうち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程の両工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行った後、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【０１０１】
上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行う場合には、上記（ｅ−１）工程および上記（ｃ−１）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−１）工程および下記（ｃ’−１）工程とすることが好ましい。
【０１０２】
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
【０１０３】
（ｃ’−１）上記第１の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
【０１０４】
また、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−１）工程は、下記（ｅ’−１）工程とすることが好ましい。
【０１０５】
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
【０１０６】
（ｃ−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程（図４のＳ３１３）。
【０１０７】
（ｄ−２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程（図４のＳ３１４）。
【０１０８】
（ｅ−２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程（図４のＳ３１５）。
【０１０９】
（ｆ−２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程（図４のＳ３１６）。
【０１１０】
（ｇ−２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程（図４のＳ３１７）。
【０１１１】
ただし、上記（ｃ−２）工程〜上記（ｇ−２）工程のうち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程の両工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行った後、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。
【０１１２】
上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行う場合には、上記（ｅ−２）工程および上記（ｃ−２）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−２）工程および下記（ｃ’−２）工程とすることが好ましい。
【０１１３】
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
【０１１４】
（ｃ’−２）上記第２の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
【０１１５】
また、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−２）工程は、下記（ｅ’−２）工程とすることが好ましい。
【０１１６】
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
【０１１７】
さらにプライマーを設計する場合は、ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程（図４のＳ３１３）からｇ−２）第２のプライマー採用工程（図４のＳ３１７）までを繰り返す（図３のＳ３０８）。すなわち、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す。
【０１１８】
〈各工程の説明〉
以下では、本発明の脊椎動物由来の単一細胞の塩基配列情報を取得する方法において実施するポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法に含まれる各工程について、詳細に説明する。
【０１１９】
《対象領域選択工程》
本明細書において、対象領域選択工程Ｓ１０１（図２）、対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１（図３）、ならびに複数対象領域選択工程Ｓ３０１（図４）を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。
【０１２０】
（第１の態様：  対象領域選択工程Ｓ１０１）
図２において「対象領域選択」（Ｓ１０１）として示す。
第１の態様において、（ａ）対象領域選択工程は、目的領域から対象領域を選択する工程である。
【０１２１】
（第２の態様：  対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１）
図３において、「対象領域選択第１」（Ｓ２０１）および「対象領域選択第２」（Ｓ２１１）として示す。
第２の態様において、（ａ１）対象領域選択第１工程は、目的領域から第１の対象領域を選択する工程であり、（ａ２）対象領域選択第２工程は、まだ選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する工程である。
第２の態様では、目的領域を１つずつ選択する。
【０１２２】
（第３の態様：  対象領域複数選択工程Ｓ３０１）
図４において、「対象領域複数選択」（Ｓ３０１）として示す。
第３の態様において、（ａ−０）対象領域複数選択工程は、目的領域から複数の対象領域を選択する工程である。
第３の態様では、目的領域を複数個選択する。好ましくは、全ての目的領域を対象領域として選択する。
【０１２３】
《プライマー候補塩基配列作成工程》
本明細書において、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２（図２）、プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２（図３）、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２（図４）を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成工程」という場合がある。
【０１２４】
（第１の態様：  プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２）
図２において「プライマー候補塩基配列作成」（Ｓ１０２）として示す。
第１の態様において、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
【０１２５】
（第２の態様：  プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２）
図３において「プライマー候補塩基配列作成第１」（Ｓ２０２）および「プライマー候補塩基配列作成第２」（Ｓ２１２）として示す。
第２の態様において、（ｂ１）プライマー候補塩基配列作成第１工程は、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程であり、（ｂ２）プライマー候補塩基配列作成第２工程は、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
第２の態様では１つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の１つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。
【０１２６】
（第３の態様：  プライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２）
図４において「プライマー候補塩基配列複数作成」（Ｓ３０２）として示す。
第３の態様において、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する。
第３の態様では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。
【０１２７】
（近傍領域）
対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の５’端から外側の領域、および対象領域の３’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
【０１２８】
（プライマーの設計パラメータ）
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、融解温度（２本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度をいう。また、Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅに由来し、「Ｔｍ値」という場合もある。単位は「℃」である。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
【０１２９】
・プライマーの長さ
プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。なお、「ｍｅｒ」はポリヌクレオチドの長さをヌクレオチドの個数で表す場合の単位であり、１ｍｅｒは１個のヌクレオチドを表す。したがって、例えば、１５ｍｅｒは１５個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを表す。
【０１３０】
・プライマーのＧＣ含量
プライマーのＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
【０１３１】
・プライマーのＴｍ値
プライマーのＴｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
プライマーのＴｍ値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下とする。
Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
【０１３２】
・プライマーの塩基の偏り
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
【０１３３】
・プライマーの３’末端
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
【０１３４】
《特異性チェック工程》
「プライマー候補塩基配列作成工程」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体ＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、染色体ＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体ＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、染色体ＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。
【０１３５】
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
【０１３６】
スコア、およびローカルアラインメント・スコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアとして、マッチ（相補塩基）＝＋１、ミスマッチ（非相補塩基）＝−１、インデル（挿入および／または欠失）＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定すること等が考えられる。
【０１３７】
プライマー候補の塩基配列が染色体ＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、対象領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
【０１３８】
《ローカルアラインメント工程》
本明細書において、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３（図２）、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３（図３）、ならびに第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３（図４）を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。
【０１３９】
（第１の態様：  ローカルアラインメント工程Ｓ１０３）
図２において「ローカルアラインメント」（Ｓ１０３）として示す。
第１の態様において、（ｃ）ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１４０】
（第２の態様：  ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３）
図３において「ローカルアラインメント第１」（Ｓ２０３）および「ローカルアラインメント第２」（Ｓ２１３）として示す。
第２の態様において、（ｃ１）ローカルアラインメント第１工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ２）ローカルアラインメント第２工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１４１】
（第３の態様：  第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３）
図４において「第１のローカルアラインメント」（Ｓ３０３）および「第２のローカルアラインメント」（Ｓ３１３）として示す。
第３の態様において、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から選ばれた第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から選ばれた第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１４２】
（ローカルアラインメントの方法）
ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をｐ個として、重複を許して選択した場合は、「ｐＨ２＝ｐ＋１Ｃ２＝（ｐ＋１）！／２（ｐ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｐＣ２＝ｐ（ｐ−１）／２」通りである。
【０１４３】
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。
さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１４４】
【表１】
2018061674.tif 000003
【０１４５】
例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
【０１４６】
【表２】
2018061674.tif 000004
【０１４７】
配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
【０１４８】
【表３】
2018061674.tif 000005
【０１４９】
表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。なお、表４中、マッチを「｜」で、ミスマッチを「：」で、それぞれ示す。
【０１５０】
【表４】
2018061674.tif 000006
【０１５１】
この（ペアワイズ）アラインメントには、マッチが９か所あり、ミスマッチが８か所あり、インデル（ギャップ）はない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、（＋１）×９＋（−１）×８＋（−１）×０＝＋１となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１５２】
《第一段階選抜工程》
本明細書において、第一段階選抜工程Ｓ１０４（図２）、第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４（図３）、ならびに第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４（図４）を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。
【０１５３】
（第１の態様：  第一段階選抜工程Ｓ１０４）
図２において「第一段階選抜」（Ｓ１０４）として示す。
第１の態様において、（ｄ）第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１５４】
（第２の態様：  第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４）
図３において、「第一段階選抜第１」（Ｓ２０４）および「第一段階選抜第２」（Ｓ２１４）として示す。
第２の態様において、（ｄ１）第一段階選抜第１工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ２）第一段階選抜第２工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１５５】
（第３の態様：  第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４）
図４において、「第１の第一段階選抜」（Ｓ３０４）および「第２の第一段階選抜」（Ｓ３１４）として示す。
第３の態様において、（ｄ−１）第１の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ−２）第２の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
【０１５６】
（第１段階選抜の方法）
ローカルアラインメント・スコアの閾値（「第１の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
【０１５７】
ここで、上記「ローカルアラインメント工程」に示した例において、第１の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であり、第１の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１５８】
なお、本工程は、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３、ローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３、第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３、または第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３においてローカルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【０１５９】
《グローバルアラインメント工程》
本明細書において、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５（図２）、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５（図３）、ならびに第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５（図４）を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。
【０１６０】
（第１の態様：  グローバルアラインメント工程Ｓ１０５）
図２において「グローバルアラインメント」（Ｓ１０５）として示す。
第１の態様において、（ｅ）グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１６１】
（第２の態様：  グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５）
図３において「グローバルアラインメント第１」（Ｓ２０５）および「グローバルアラインメント第２」（Ｓ２１５）として示す。
第２の態様において、（ｅ１）グローバルアラインメント第１工程は、上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ２）グローバルアラインメント第２工程は、上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１６２】
（第３の態様：  第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５）
図４において「第１のグローバルアラインメント」（Ｓ３０５）および「第２のグローバルアラインメント」（Ｓ３１５）として示す。
第３の態様において、（ｅ−１）第１のグローバルアラインメント工程は、上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ−２）第２のグローバルアラインメント工程は、上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
【０１６３】
（グローバルアラインメントの方法）
グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成工程」で作成したプライマー候補の全部（「ローカルアラインメント工程」および「第一段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。）および既に採用したプライマーの全部（既に採用したプライマーが存在する場合に限る。）からなる群から２つのプライマーを取り出して、３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。
【０１６４】
グローバルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「ｘＨ２＝ｘ＋１Ｃ２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｘＣ２＝ｘ（ｘ−１）／２」通りである。
【０１６５】
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１６６】
例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字部分。）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
【０１６７】
【表５】
2018061674.tif 000007
【０１６８】
スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。なお、表６中、ミスマッチを「：」で示す。
【０１６９】
【表６】
2018061674.tif 000008
【０１７０】
この（ペアワイズ）アラインメントには、ミスマッチが３か所あり、マッチおよびインデル（ギャップ）はいずれもない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、（＋１）×０＋（−１）×３＋（−１）×０＝−３となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１７１】
《第二段階選抜工程》
本明細書において、第二段階選抜工程Ｓ１０６（図２）、第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６（図３）、ならびに第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。
【０１７２】
（第１の態様：  第二段階選抜工程Ｓ１０６）
図２において「第二段階選抜」（Ｓ１０６）として示す。
第１の態様において、（ｆ）第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１７３】
（第２の態様：  第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６）
図３において「第二段階選抜第１」（Ｓ２０６）および「第二段階選抜第２」（Ｓ２１６）として示す。
第２の態様において、（ｆ１）第二段階選抜第１工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ２）第二段階選抜第２工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１７４】
（第３の態様：  第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６）
図４において「第１の第二段階選抜」（Ｓ３０６）および「第２の第二段階選抜」（Ｓ３１６）として示す。
第３の態様において、（ｆ−１）第１の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ−２）第２の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
【０１７５】
（第二段階選抜の方法）
グローバルアラインメント・スコアの閾値（「第２の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
【０１７６】
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアを第２の閾値未満とすることができる。
【０１７７】
ここで、上記「グローバルアラインメント工程」に示した例において、第２の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であり、第２の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１７８】
なお、本工程は、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５、グローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５、第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５、または第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５においてグローバルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
【０１７９】
また、計算量を低減させるため、「グローバルアラインメント工程」および「第２段階選抜工程」の両工程を先に実施して、「第２段階選抜工程」を通過したプライマーの塩基配列の組合せに対して、「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」の両工程を実施することが好ましい。特に、対象領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【０１８０】
これは、「グローバルアラインメント工程」では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメント・スコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
【０１８１】
《増幅配列長チェック工程》
「第一段階選抜工程」および「第二段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
【０１８２】
《プライマー採用工程》
本明細書において、プライマー採用工程Ｓ１０７（図２）、プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７（図３）、ならびに第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７（図４）を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。
【０１８３】
（第１の態様：  プライマー採用工程Ｓ１０７）
図２において「プライマー採用」（Ｓ１０７）として示す。
第１の態様において、（ｇ）プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１８４】
（第２の態様：  プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７）
図３において「プライマー採用第１」（Ｓ２０７）および「プライマー採用第２」（Ｓ２１７）として示す。
第２の態様において、（ｇ１）プライマー採用第１工程は、上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ２）プライマー採用第２工程は、上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１８５】
（第３の態様：  第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７）
図４において「第１のプライマー採用」（Ｓ３０７）および「第２のプライマー採用」（Ｓ３１７）として示す。
第３の態様において、（ｇ−１）第１のプライマー採用工程は、上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ−２）第２のプライマー採用工程は、上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
【０１８６】
（プライマー採用の方法）
プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
【０１８７】
例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
【０１８８】
【表７】
2018061674.tif 000009
【０１８９】
既に記載したように、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であるから、第１の閾値である「＋３」未満であり、また、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であるから、第２の閾値である「＋３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
【０１９０】
《他の目的領域のプライマー設計》
１つの目的領域に対してプライマーを採用した後、さらに他の目的領域に対してプライマーを設計してもよい。
第１の態様においては、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、プライマーを設計しようとする目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３から行う。次の目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の目的領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の目的領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、その目的領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３以降を行う。
第２の態様においては、対象領域選択第２工程Ｓ２１１から繰り返す。
第３の態様において、既に対象領域複数選択工程Ｓ３０１において選択した目的領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２において作成されているため、第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３から繰り返す。
【０１９１】
《プライマー等の設計における特徴点》
目的領域を選択した後のプライマー等の設計における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。
【０１９２】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１９３】
［実施例１］
〈胎児由来の有核赤血球の単一細胞（シングルセル）の塩基配列情報の取得〉
《目的領域の選択》
表８に示す、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、およびＸ染色体のＳＮＰ、ならびに、Ｙ染色体上の特異的な領域をＰＣＲで増幅する目的領域として選択した。【０１９４】
【表８】
2018061674.tif 000010
【０１９５】
《単一細胞の単離》
（末梢血液試料の取得）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。【０１９６】
（有核赤血球の濃縮）
パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）液（登録商標；シグマアルドリッチ社製）を使用して、密度１．０７０と、密度１．０９５の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５の液２ｍＬを添加し、冷蔵庫で４℃に３０分冷却した。その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度１．０９５の液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０の液２ｍＬを重層した。その後、密度１．０７０の媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。遠沈管を取り出し、密度１．０７０と、密度１．０９５の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を、洗浄液（２ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．１％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水））にて２回洗浄後、有核赤血球画分を得た。【０１９７】
（有核赤血球の検出および単離）
有核赤血球画分の細胞数をセルカウンターで算出し、細胞濃度が１×１０７個／ｍＬになるようにＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）緩衝液（０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水））で調整した。その後、有核赤血球を染め分けるために白血球マーカーとしてＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）を１０μＬ、赤血球の幼若性マーカーとしてＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート））標識抗ＣＤ７１抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）を１５μＬ、核染色としてＤＲＡＱ５（セルシグナリングテクノロジー社製）を１μＬ添加し、４℃にて３０分以上インキュベートした。【０１９８】
染色後の細胞懸濁液はフローサイトメーター（ＳＯＮＹ（株）社製ＳＨ８００ＺＰ）に供し、ＣＤ４５陰性、ＣＤ７１陽性、ＤＲＡＱ５陽性画分を有核赤血球画分としてゲート設定し、イールドモードにてシングルセルソートを実施した。ソートされた細胞種と数を確認するために、画像撮影と細胞ピックアップが可能な９６ウェルプレート（Ｇｒａｖｉｔｙ  Ｔｒａｐ社製）に有核赤血球画分を１細胞ずつソートし、撮像後画像にて有核赤血球が１個含まれるウェルのみをＰＣＲチューブに単離した。【０１９９】
《ゲノムＤＮＡの抽出》
（細胞溶解）
単離した単一細胞に対して、ＰＣＲチューブ内で細胞溶解を行った。反応条件としては、各細胞に細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（トリス）−Ｈｃｌ  ｐＨ７．５，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０ｍＭ  ＫＣｌ，０．００７％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム），１３．３μｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ）を５μＬ添加した。
各ＰＣＲチューブを５０℃で６０分間加熱し、プロテイナーゼＫによりタンパク質を溶解した。次いで、９５℃で５分間加熱し、プロテイナーゼＫを失活させた。
これにより、ゲノムＤＮＡを調製した。【０２００】
《プライマーの作製》
胎児細胞の分析、染色体の数的異常を分析する目的で、表８に示す増幅対象領域の近傍の塩基配列から、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを作製した。
プライマーは、Ｔｍ値が５６〜６４℃、かつＰＣＲ増幅塩基長としては、１４０〜１８０塩基対となるように、各プライマー間の３’末端固定のローカルアラインメント・スコアが「＋３」未満、かつ各プライマーの３’末端３塩基のグローバルアラインメント・スコアが「０」未満となるプライマーを選び、２７対のプライマーペアを作製した。【０２０１】
（シングルプレックスＰＣＲによる増幅確認）
作製したプライマーペアが増幅対象領域を増幅することを確認するため、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）を用いて反応を行った。
ａ）反応液の調製
以下の反応液を調製した。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ）                        ２μＬ
プライマー                                            各２μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１            ０．１２５μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２              １２．５μＬ
滅菌蒸留水                                ｕｐ  ｔｏ  ２５μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
なお、ゲノムＤＮＡはヒト培養細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１およびＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２は、ＴａＫａＲａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）に含まれる試薬である。
ｂ）シングルプレックスＰＣＲの反応条件
シングルプレックスＰＣＲの反応条件は、初期熱変性（９４℃，６０秒）の後、［熱変性（９４℃，３０秒）−アニーリング（６０℃，９０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×３０サイクルとした。
ｃ）ＰＣＲ増幅産物の確認
反応終了後の反応液の一部をアガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無およびサイズを確認した。
表９に示す２５対のプライマーペアについて、シングルプレックスＰＣＲによる特異的な増幅を確認することができた。【０２０２】
【表９】
2018061674.tif 000011
【０２０３】
《目的領域の増幅》
（マルチプレックスＰＣＲによる増幅）
ａ）反応液の調製
以下の反応液を調製した。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
テンプレートＤＮＡ                                      ９μＬ
プライマー・ミックス                                    ４μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１            ０．１２５μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２              １２．５μＬ
滅菌蒸留水                                ｕｐ  ｔｏ  ２６μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
なお、テンプレートＤＮＡは単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり、プライマー・ミックスはシングルプレックスでの増幅が確認できた２５対のプライマーペアを、各プライマーの終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１およびＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２は、ＴａＫａＲａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）に含まれる試薬である。
ｂ）マルチプレックスＰＣＲの反応条件
マルチプレックスＰＣＲの反応条件は、初期熱変性（９４℃，６０秒）の後、［熱変性（９４℃，３０秒）−アニーリング（５６．７℃，６００秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×３２サイクルとした。
ｃ）ＰＣＲ反応産物の精製
マルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ反応産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付マニュアル（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｕｓｅ）に従って精製した。
具体的には、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬４５μＬをＰＣＲ反応液２５μＬに加え、十分混和し、室温で５分間静置して、磁性ビーズにＰＣＲ反応産物を結合させた。
次に、ＰＣＲ反応産物が結合した磁性ビーズをマグネットスタンド（ＭａｇｎａＳｔａｎｄ，日本ジェネティクス（株）社製）の磁力で分離し、夾雑物を除いた。
ＰＣＲ反応産物が結合した磁性ビーズを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで２回洗浄後、磁性ビーズに結合したＤＮＡを４０μＬのＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）緩衝液で溶出した。【０２０４】
《ＤＮＡのシークエンシング》
（シークエンスライブラリーミックスの調製）
次世代シークエンサー（Ｍｉｓｅｑ，イルミナ社製）を用いてデュアルインデックス・シーケンシングを行うため、マルチプレックスＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片の両端に、それぞれ、フローセル結合用配列（Ｐ５配列またはＰ７配列）、サンプル識別用のインデックス配列、およびシークエンスプライマー結合用配列を含む２種類のアダプターを付加した。【０２０５】
具体的には、プライマーＤ５０１−ＦおよびＤ７０１−Ｒ〜Ｄ７０６−Ｒ（表１０に示す）を各１．２５μＭで使用し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いてＰＣＲを行うことで両末端への配列付加を行った。ＰＣＲ条件は、初期熱変性（９４℃，３分）の後、［熱変性（９４℃，４５秒）−アニーリング（５０℃，６０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×５サイクル、続いて、［熱変性（９４℃，４５秒）−アニーリング（５５℃，６０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×１１サイクルとした。【０２０６】
【表１０】
2018061674.tif 000012
【０２０７】
得られたＰＣＲ産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター社製）を用いて精製した後、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（日本ジェネティクス（株）社製）を用いてＤＮＡを定量した。
インデックス配列の異なった各サンプルのＤＮＡ濃度が各々１．５ｐＭとなるように混合し、シークエンスライブラリーミックスとした。【０２０８】
（増幅産物の配列解析）
調製したシークエンスライブラリーミックスを、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ２  ３００  Ｃｙｃｌｅ（イルミナ社製）を用いてシークエンスを行い、ＦａｓｔＱファイルを取得した。
得られたＦａｓｔＱデータからＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてヒトゲノム配列（ｈｇ１９）へマッピング後、ＳＡＭｔｏｏｌｓにより遺伝子多型情報を抽出し、ＢＥＤｔｏｏｌｓにより各検出領域のシークエンスリード数を算出した。【０２０９】
（細胞情報の確定）
各細胞から増幅したＰＣＲ増幅産物の、１３番染色体、１８番染色体、および２１番染色体のＳＮＰを比較することで、２４個の細胞のうち、４個の細胞が他と異なるＳＮＰ情報を有することが確認出来た。
別途、母親のＳＮＰ情報を取得するために、パーコール濃縮後の有核細胞画分からゲノムＤＮＡをＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン社製）で抽出した。１０ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として同様にしてＤＮＡを増幅し、ＳＮＰを調べたところ、２０個の細胞のＳＮＰと一致することが確認された。以上より、４個の細胞が胎児由来の有核赤血球細胞と確定し、２０個の細胞が、母親由来の有核細胞であることが確認された。
図５に結果を示す。細胞３、細胞８、細胞１８、および細胞２０以外の２０個の細胞が、標品ゲノム（母親由来の有核細胞から抽出したゲノム）と同一のＳＮＰパターンを示し、これら２０個の細胞は母親由来であることが示唆された。細胞３、細胞８、細胞１８、および細胞２０は胎児由来と推定された。【０２１０】
（増幅産物の量の検出）
ＰＣＲ増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の１８番染色体の検出領域の増幅産物の量を次世代シークエンサーＭｉｓｅｑ（登録商標；イルミナ社製）を用いて増幅産物のシークエンシングを行って、確定させた。
別途、母親由来と同定された有核細胞の１８番染色体の検出領域の増幅産物の量（配列リード数）を、Ｍｉｓｅｑを用いて増幅産物のシークエンシングを行って、確定させた。
これらの増幅産物の量を比較したところ、細胞間でのばらつきは小さく、かつこの２つの量比を計算したところ、１：１．５に近い値となり、胎児はトリソミーであることが推定された。
１３番染色体および２１番染色体についても同様に母親細胞と同定された有核細胞との増幅産物の量比を計算したところ、１３番染色体および２１番染色体のいずれについても１：１に近い値となった。
図６にこれらの結果を示す。細胞３、細胞８、細胞１８、および細胞２０の１８番染色体の本数は１３番染色体および２１番染色体のそれぞれの本数の約１．５倍であり、胎児の１８番染色体トリソミーが推定された。【０２１１】
［比較例１］
マルチプレックスＰＣＲ増幅工程では、実施例１で使用した、プライマー間の相補性が低くなるよう設計したプライマー対に代えて、相補性を計算した効果を確認するための比較として、プライマー間の相補性を考慮しないプライマー対を設計した。プライマーの設計は実施例１と同じ染色体位置ないしは遺伝子に対し、Ｐｒｉｍｅｒ３を使用して、Ｔｍ値が５６−６４、かつＰＣＲ増幅塩基長としては、１４０〜１８０塩基対となる２０ｂｐのプライマーを各々作製した。
これらのプライマー対を使用してマルチプレックスＰＣＲを行ったことを除き、他は実施例１と同様にして、増幅産物の配列決定を行った。その結果、マッピング率が著しく低下し、かつ細胞間の増幅産物量の分散が大きく、数的異常を明確に判断できないほど、ばらつきが大きかった。【０２１２】
［実施例２］
〈がん細胞の単一細胞（シングルセル）の塩基配列情報の取得〉
《目的領域の選択》
がん関連遺伝子の変異部位を選択した。【０２１３】
《単一細胞の単離》
非小細胞肺がん由来の細胞株Ｈ１５８１を用いて、細胞数をセルカウンターで算出し、細胞濃度が１×１０６個／ｍＬになるようにＰＢＳ（−）（マグネシウムおよびカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）溶液で調整した。その後、死細胞等の不純物を見分ける為、細胞膜透過性近赤外蛍光ＤＮＡ染色試薬ＤＲＡＱ５（アブカム（株）社製）を添加して核を染色した。【０２１４】
核染色後の細胞懸濁液はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ＿Ａｒｉａ  ＩＩＩ，ベクトンデッキンソン社製）に供し、ＤＲＡＱ５陽性画分をがん細胞画分としてゲート設定しシングルセルソートを実施、ＰＣＲチューブへ回収した。【０２１５】
《ゲノムＤＮＡの抽出》
（細胞溶解）
単離した単一細胞に対して、ＰＣＲチューブ内で細胞溶解を行った。また、同様にフローサイトメーターにより１０細胞、１００細胞で回収したサンプルにおいても、ＰＣＲチューブ内で細胞溶解を行った。反応条件としては、各細胞に細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（トリス）−Ｈｃｌ  ｐＨ７．５，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０ｍＭ  ＫＣｌ，０．００７％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム），１３．３μｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ）を５μＬ添加した。
各ＰＣＲチューブを５０℃で６０分間加熱し、プロテイナーゼＫによりタンパク質を溶解した。次いで、９５℃で５分間加熱し、プロテイナーゼＫを失活させた。
これにより、ゲノムＤＮＡを調製した。【０２１６】
《プライマーの作製》
がん細胞におけるがん関連遺伝子変異を分析する目的で、２７箇所のがん関連遺伝子領域からマルチプレックスＰＣＲに用いるプライマーを作製した。
プライマーは、Ｔｍ値が５６〜６４℃、かつＰＣＲ増幅塩基長としては、１３８〜３００塩基対となるように、各プライマー間の３’末端固定のローカルアラインメント・スコアが「＋３」未満、かつ各プライマーの３’末端３塩基のグローバルアラインメント・スコアが「０未満」となるプライマーを選び、２０対のプライマーペアを作成した。【０２１７】
（シングルプレックスＰＣＲによる増幅確認）
作製したプライマーペアが増幅対象領域を増幅することを確認するため、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）を用いて反応を行った。
ａ）反応液の調製
以下の反応液を調製した。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ）                        ２μＬ
プライマー                                            各２μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１            ０．１２５μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２              １２．５μＬ
滅菌蒸留水                                ｕｐ  ｔｏ  ２５μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
なお、ゲノムＤＮＡはヒト培養細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１およびＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２は、ＴａＫａＲａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）に含まれる試薬である。
ｂ）シングルプレックスＰＣＲの反応条件
シングルプレックスＰＣＲの反応条件は、初期熱変性（９４℃，６０秒）の後、［熱変性（９４℃，３０秒）−アニーリング（６０℃，９０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×３０サイクルとした。
ｃ）ＰＣＲ増幅産物の確認
反応終了後の反応液の一部をアガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無およびサイズを確認した。
表１１に示す２０対のプライマーペアについて、シングルプレックスＰＣＲによる特異的な増幅を確認することができた。【０２１８】
【表１１】
2018061674.tif 000013
【０２１９】
《目的領域の増幅》
（マルチプレックスＰＣＲによる増幅）
ａ）反応液の調製
以下の反応液を調製した。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
テンプレートＤＮＡ                                      ９μＬ
プライマー・ミックス                                    ４μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１            ０．１２５μＬ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２              １２．５μＬ
滅菌蒸留水                                ｕｐ  ｔｏ  ２６μＬ
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なお、テンプレートＤＮＡはがん細胞から単離した単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり、プライマー・ミックスはシングルプレックスでの増幅が確認できた２０対のプライマーペアを、各プライマーの終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１およびＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ２は、ＴａＫａＲａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）に含まれる試薬である。
ｂ）マルチプレックスＰＣＲの反応条件
マルチプレックスＰＣＲの反応条件は、初期熱変性（９４℃，６０秒）の後、［熱変性（９４℃，３０秒）−アニーリング（５６．７℃，６００秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×３２サイクルとした。
ｃ）ＰＣＲ反応産物の精製
マルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ反応産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付マニュアル（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｕｓｅ）に従って精製した。
具体的には、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬４５μＬをＰＣＲ反応液２５μＬに加え、十分混和し、室温で５分間静置して、磁性ビーズにＰＣＲ反応産物を結合させた。
次に、ＰＣＲ反応産物が結合した磁性ビーズをマグネットスタンド（ＭａｇｎａＳｔａｎｄ，日本ジェネティクス（株）社製）の磁力で分離し、夾雑物を除いた。
ＰＣＲ反応産物が結合した磁性ビーズを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで２回洗浄後、磁性ビーズに結合したＤＮＡを４０μＬのＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）緩衝液で溶出した。【０２２０】
《ＤＮＡのシークエンシング》
（１）シークエンスライブラリーミックスの調製
次世代シークエンサー（Ｍｉｓｅｑ，イルミナ社製）を用いてデュアルインデックス・シーケンシングを行うため、マルチプレックスＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片の両端に、それぞれ、フローセル結合用配列（Ｐ５配列またはＰ７配列）、サンプル識別用のインデックス配列、およびシークエンスプライマー結合用配列を含む２種類のアダプターを付加した。【０２２１】
具体的には、プライマーＤ５０１−ＦおよびＤ７０１−Ｒ〜Ｄ７０６−Ｒ（表１２に示す）を各１．２５μＭで使用し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いてＰＣＲを行うことで両末端への配列付加を行った。ＰＣＲ条件は、初期熱変性（９４℃，３分）の後、［熱変性（９４℃，４５秒）−アニーリング（５０℃，６０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×５サイクル、続いて、［熱変性（９４℃，４５秒）−アニーリング（５５℃，６０秒）−エクステンション（７２℃，３０秒）］のサーマルサイクル×１１サイクルとした。【０２２２】
【表１２】
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【０２２３】
得られたＰＣＲ産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター社製）を用いて精製した後、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（日本ジェネティクス（株）社製）を用いてＤＮＡを定量した。【０２２４】
（増幅産物の配列解析）
調製したシークエンスライブラリーミックスを、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ２  ３００  Ｃｙｃｌｅ（イルミナ社製）を用いてシークエンスを行い、ＦａｓｔＱファイルを取得した。
得られたＦａｓｔＱデータからＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてヒトゲノム配列（ｈｇ１９）へマッピング後、ＳＡＭｔｏｏｌｓにより遺伝子多型情報を抽出し、ＢＥＤｔｏｏｌｓにより各検出領域のシークエンスリード数を算出した。【０２２５】
（細胞情報の確定）
シークエンス解析の結果を表１３に示す。【０２２６】
【表１３】
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【０２２７】
単一細胞において、２０箇所の遺伝子領域の全てでリード数を検出することができた。このため本手法により、単一細胞から正確に２０個所の遺伝子領域の増幅が可能になることが明らかになった。
また、併せて１０細胞、１００細胞においても２０箇所の遺伝子領域の全てでリード数を検出することができた。
また、表１４に変異番号における検出された塩基情報を示す。【０２２８】
【表１４】
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【０２２９】
単一細胞から検出された塩基は、１０細胞、１００細胞から検出された塩基と全ての変異箇所で同等であることを確認した。
この結果から、単一細胞から複数個所の遺伝子領域に存在する変異部位を正確に検出可能であることが明らかになった。【０２３０】
［比較例２］
実施例２で使用した、プライマー間の相補性が低くなるよう設計したプライマー対において相補性を計算した効果を確認するための比較として、プライマー間の相補性を考慮しないプライマー対を設計した。プライマーの設計は実施例２と同じ変異ないしは遺伝子領域が検出可能なように、Ｐｒｉｍｅｒ３を使用して、Ｔｍ値が５６℃〜６４℃、かつＰＣＲ増幅塩基長としては、１４０〜１８０塩基対となる２０ｂｐのプライマーを各々作製した。
これらのプライマー対を使用してマルチプレックスＰＣＲを行ったことを除き、他は実施例２と同様にして、増幅産物の配列決定を行った。その結果、次世代シークエンスデータの各遺伝子領域のリード数が検出されない領域が増加し、各遺伝子領域の全てを増幅することはできないことを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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