(57)【要約】  本発明は、下記式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物および該アミノクマリン化合物と該アミノクマリン化合物を内包する樹脂粒子とを有するアミノクマリン化合物内包樹脂粒子である。式（１）中、Ｒは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ1を表わし、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表わす。本発明のアミノクマリン化合物は、従来知られているスルホン化クマリン系化合物と比べ、励起波長がより長波長であり、４７５ｎｍ以上の波長、特に５００ｎｍ近辺の波長に対して有効に励起する蛍光色素である。本発明のアミノクマリン化合物は、この波長特性を利用して、たとえば４７５〜５１０ｎｍの波長で励起をし、５１０〜５４０ｎｍの緑色発光領域において観察することが可能な蛍光色素であり、免疫染色等において好適に活用することが期待できる。2018151072.tif 000031
2018151072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物。
【化１】
2018151072.tif 000030
（式（１）中、Ｒは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ1を表わし、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表わす。）
【請求項２】
前記式（１）中のＱがイオウ原子である請求項１に記載のアミノクマリン化合物。
【請求項３】
前記式（１）中のＱが酸素原子である請求項１に記載のアミノクマリン化合物。
【請求項４】
前記式（１）中のＱがＮ−Ｒ1である請求項１に記載のアミノクマリン化合物。
【請求項５】
請求項１に記載のアミノクマリン化合物と該アミノクマリン化合物を内包する樹脂粒子とを有するアミノクマリン化合物内包樹脂粒子。
【請求項６】
前記樹脂粒子がアミノ樹脂粒子である請求項５に記載のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子。
【請求項７】
励起スペクトル極大波長が４７５〜５１０ｎｍであり、蛍光スペクトル極大波長が５１０〜５４０ｎｍである請求項５または６に記載のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な色素であるアミノクマリン化合物およびこのアミノクマリン化合物を樹脂に内包してなるアミノクマリン化合物内包樹脂粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の医療環境においては、被験者が対象疾患に罹患しているか否かを判断するためのデータを提供するために、あるいは被験者へ投薬すべきかどうかの指標を提供するために、さまざまな臨床用検査薬や研究用検査薬が開発され、治療の大きな助けとなっている。【０００３】
被験者から血液や組織切片等の検体を採取し、多くの場合には免疫反応を利用して特定のターゲット(低分子・タンパク・遺伝子・細胞など)を検出し、同定し、定量することで、さまざまな検査が開発されてきた。例えば、前記罹患の有無によって発現量が増減する生体内の分子（抗原）に、蛍光標識した抗体を特異的に結合させることにより抗原を蛍光標識し、蛍光シグナルの量から疾患に関連する抗原の量を定量することが行われる。【０００４】
また、成人T細胞白血病 (ATL)へ投薬すべきかどうかの指標を提供するために開発された最近の臨床用検査薬の例として、抗 CCR4 抗体モガムリズマブ分子標的薬の投与前にターゲットであるCCR4の検出を行う検査が義務づけられた。CCR4の検出は、採取した血液検体に免疫反応を施すFACS法と、採取した組織検体に免疫反応を施すIHC法とが開発されており、前者は蛍光検出によりCCR4を定量(スコア化)し、後者は発色検出によりCCR4を定量(スコア化)している。【０００５】
ところで、採取した組織検体に免疫反応を施す免疫組織化学的手法の中にも、蛍光標識した抗体を抗原に結合させる技術も知られており、蛍光色素を粒子に内包させたナノ粒子に抗体を直接的または間接的に結合させ、これを抗原に結合させる技術が高感度達成に有用と考えられている。【０００６】
免疫組織化学的手法に限らず、一度に多くの情報を得たいというニーズは医療関係者に強くあり、複数の蛍光色素で同時に別のターゲットを検出する方法の開発も多く進められている。たとえば、緑色領域、赤色領域、オレンジ色領域および遠赤外線領域の各領域において蛍光発光を呈する色素を用意して、4種類のターゲットを検出することは上記の免疫反応を利用するFACS法の他にもELISA法、FISH法などで原理的には可能であり、商品化もされている。【０００７】
緑色領域で発光する色素としては、スルホン化されたクマリン系色素が知られている。このスルホン化クマリン色素としては、たとえば特許文献１に記載されたスルホン化クマリン色素が挙げられる。スルホン化クマリン色素は、水への溶解性が優れるので、さまざまな免疫反応による蛍光検出ツールに対する適応性がある。しかしその一方、以下の通り検体に由来する蛍光ノイズが、蛍光検出および定量を不正確にする大きな要因になっていた。【０００８】
たとえば緑の蛍光発光を示す色素の場合、スルホン化クマリン色素については、そのほとんどは４７０ｎｍ以下の波長領域に励起スペクトルの極大波長を有し、４７５ｎｍ以上の波長では励起光吸収が大幅に低減する。このため、従来のスルホン化クマリン色素は、多重染色を行う上で別の蛍光色素の波長領域から影響を受けてしまうなどの制約が大きい。【０００９】
また、４７５ｎｍより短波長領域では、当該蛍光色素以外の物質(夾雑物)に起因する蛍光、いわゆる自家蛍光が大きくなる傾向がある。このため、従来のスルホン化クマリン色素を用いた免疫蛍光検出においては、蛍光色素に基づく蛍光強度に対して、バックグラウンドの蛍光強度が相対的に高くなり、シグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）が低くなるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２７１５９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記のような従来技術に伴う問題を解決しようとするものであって、４７５ｎｍ以上の波長領域、たとえば４７５〜５１０ｎｍの波長領域に励起スペクトルの極大波長を有するスルホン化クマリン系色素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意研究した結果、特定構造を有するアミノクマリン化合物が上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明のアミノクマリン化合物は、下記式（１）で示される構造を有する。      【００１４】
【化１】
2018151072.tif 000003
（式（１）中、Ｒは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ1を表わし、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表わす。）
前記アミノクマリン化合物は、前記式（１）中のＱがイオウ原子であるアミノクマリン化合物、酸素原子であるアミノクマリン化合物、またはＮ−Ｒ1であるアミノクマリン化合物である。【００１５】
本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、前記アミノクマリン化合物と該アミノクマリン化合物を内包する樹脂粒子とを有する。【００１６】
前記アミノクマリン化合物内包樹脂粒子において、前記樹脂粒子がアミノ樹脂粒子であることが好ましい。【００１７】
前記アミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、励起スペクトル極大波長が４７５〜５１０ｎｍであり、蛍光スペクトル極大波長が５１０〜５４０ｎｍであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアミノクマリン化合物は、従来知られている特許文献１に記載のスルホン化クマリン系化合物等と比べ、励起波長がより長波長であり、４７５以上の波長、特に５００ｎｍ近辺の波長に対して有効に励起する蛍光色素である。本発明のアミノクマリン化合物は、この波長特性を利用して、たとえば４７５〜５１０ｎｍの波長で励起をし、５１０〜５４０ｎｍの緑色発光領域において観察することが可能な蛍光色素であり、免疫染色等において好適に活用することが期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のアミノクマリン化合物は、下記式（１）で示される構造を有する。
【００２０】
【化２】
2018151072.tif 000004
式（１）中、１２個のＲは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わす。
【００２１】
式（１）中、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ1を表わす。前記Ｒ1は水素原子またはメチル基を表わす。本発明のアミノクマリン化合物は、式（１）のＱがイオウ原子である場合、ベンゾチアゾール構造を有し、酸素原子である場合、ベンゾオキサゾール構造を有し、Ｎ−Ｒ1である場合、ベンゾイミダゾール構造を有することになる。
【００２２】
式（１）に含まれるスルホン酸基ＳＯ3Ｈは、前記ベンゾチアゾール構造、ベンゾオキサゾール構造またはベンゾイミダゾール構造に含まれるベンゼン環が有する結合可能な４つの炭素原子のうちどの炭素原子に結合していてもよい。
【００２３】
本発明のアミノクマリン化合物は、クマリン構造に結合する窒素原子が、クマリン構造に含まれるベンゼン環の４つの炭素原子とともに、２つの６員環を形成している点、すなわちアミノクマリンのアミノ基がジュロリジン構造となっている点で、特許文献１などに記載された公知のスルホン化クマリン系化合物と構造が相違する。
【００２４】
このような構造を有する本発明のアミノクマリン化合物は、公知のスルホン化クマリン系化合物よりも、励起波長が長波長であり、励起スペクトル極大波長が４７５ｎｍ以上であり、たとえば４７５〜５１０ｎｍである。また、本発明のアミノクマリン化合物は、発光波長も公知のスルホン化クマリン系化合物より長波長であり、蛍光スペクトル極大波長が５１０ｎｍ以上であり、たとえば５１０〜５４０ｎｍである。ここで、「励起スペクトル極大波長」とは、励起スペクトルにおいて極大を示す波長を意味する。「蛍光スペクトル極大波長」とは、蛍光スペクトルにおいて極大を示す波長を意味する。
【００２５】
式（１）で表わされる本発明のアミノクマリン化合物は、該アミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物に比較して、発光強度が強いという特徴を有する。
【００２６】
本発明のアミノクマリン化合物は、たとえば、下記式（２）で示される構造を有するクマリン化合物をスルホン化する方法により製造することができる。具体的には、式（２）で示されるクマリン化合物０．１ｇに対して発煙硫酸を１ｍｌ加えて、０〜１４０℃で、１〜８時間反応させることにより本発明のアミノクマリン化合物を製造することができる。
【００２７】
【化３】
2018151072.tif 000005
（式（２）中のＲおよびＱは、それぞれ式（１）中のＲおよびＱと同義である。）
本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、前記アミノクマリン化合物と該アミノクマリン化合物を内包する樹脂粒子とを有する。本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、免疫染色等に好適に使用することができる。
【００２８】
樹脂粒子に内包されるアミノクマリン化合物については前述のとおりである。
【００２９】
アミノクマリン化合物を内包する樹脂粒子は、アミノクマリン化合物を内包できる限り特に制限はないが、 熱硬化性樹脂であることが好ましい。 熱硬化性樹脂は三次元的な網目構造を有するので、これに包み込まれた色素は樹脂粒子から離脱しにくく、免疫染色等において好適である。熱硬化性樹脂としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂およびフラン樹脂等を挙げることができる。これらの中でも、メラミン樹脂、尿素樹脂等のアミノ樹脂は、色素の樹脂粒子からの離脱をより効果的に抑止できる点で、特に好ましい。
【００３０】
樹脂粒子に内包されるアミノクマリン化合物の量は、特に制限はなく、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を免疫染色に用いる場合には、検出可能な輝度を確保できる量であればよい。
【００３１】
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子の平均粒径は、特に制限はないが、免疫染色に用いる場合には、通常４０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである。アミノクマリン化合物内包樹脂粒子の平均粒径が５００ｎｍを超えると染色性に問題が生じる場合があり、４０ｎｍ未満であると、視認性に問題が生じる場合がある。
【００３２】
上記平均粒径は、ＳＥＭ観察でアミノクマリン化合物内包粒子の１０００個について粒径を測定し、その平均値として算出される。
【００３３】
本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、公知の色素内包樹脂粒子の製造方法に準じて製造することができる。
【００３４】
たとえば、本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、樹脂合成用のモノマー原料をアミノクマリン化合物の存在下で重合させることにより製造することができる。具体的には、アミノクマリン化合物および界面活性剤を含有する水溶液に樹脂合成用のモノマー原料を添加し、通常５５〜７５℃、好ましくは６８〜７２℃で、１０分間程度、好ましくは１０〜１５分間激しく撹拌する。その後、重合開始剤を添加して、５５〜７５℃、好ましくは６８〜７２℃で、４〜２４時間、好ましくは４〜５時間激しく撹拌して、乳化重合させる。さらに、液温を８０〜９０℃、好ましくは８０〜８２℃に上げ、３０〜６０分間、好ましくは３０〜４０分間激しく攪拌する。反応液は、通常、凝集塊と上清である粒子分散液とに分かれる。反応液から粒子分散液を回収する。この粒子分散液を遠心分離し、上清である分散媒を除いた後、沈殿に超純水を加え、超音波分散する。遠心分離、沈殿への超純水添加および超音波分散の工程をさらに数回繰り返す。これにより、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子の水分散液が得られる。
【００３５】
前記樹脂合成用のモノマー原料とは、重合することにより、前記樹脂粒子を形成し得る原料である。
【００３６】
アミノクマリン化合物の添加量は、樹脂合成用のモノマー原料１ｇに対し、通常１〜５０ｍｇである。
【００３７】
前記界面活性剤には特に制限はなく、通常の乳化重合反応に使用される界面活性剤を用いることができる。前記界面活性剤としては、アニオン系、ノニオン系およびカチオン系の全ての界面活性剤を用いることができる。アニオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド等が挙げられる。界面活性剤は、１種類単独で使用しても、２種類以上を併用してもよい。
【００３８】
市販の界面活性剤としては、例えば、「エマルゲン」（登録商標、花王（株）製）や「ネオペレックス」（登録商標、花王（株）製）を好適に用いることができる。エマルゲンの有効成分はポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、ネオペレックスの有効成分はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。
【００３９】
界面活性剤の添加量は、樹脂合成用のモノマー原料１ｇに対し、通常１〜３ｍｇである。
【００４０】
前記重合開始剤としては、熱によりラジカルを発生するアゾ化合物および過酸化物などの熱重合開始剤が挙げられ、アゾ化合物として好ましくはＶ−５０（２，２'−Ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が挙げられ、過酸化物として好ましくは過硫酸アンモニウムが挙げられる。重合開始剤はレドックス重合開始剤であってもよい。
【００４１】
重合開始剤の添加量は、樹脂合成用のモノマー原料１ｇに対し、通常０．１〜１．５ｍｇ、好ましくは０．３〜０．４５ｍｇである。
【００４２】
前記アミノクマリン化合物内包樹脂粒子において、前記樹脂粒子がアミノ樹脂粒子であることが好ましい。
【００４３】
前記アミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、励起スペクトル極大波長が４７５〜５１０ｎｍであり、蛍光スペクトル極大波長が５１０〜５４０ｎｍであることが好ましい。
【００４４】
式（１）で表わされるアミノクマリン化合物を樹脂に内包させて製造された本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、そのアミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物を樹脂に内包させて製造されたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子に比較して、発光強度が強い傾向がある。これは、式（１）で表わされるアミノクマリン化合物は、該アミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物よりも、樹脂に内包されやすい性質があり、樹脂により多く取り込まれるからであると推測される。
【００４５】
本発明のアミノクマリン化合物およびアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、上記の特性を有することから、免疫染色等において好適に活用することができる。
【００４６】
具体的には、本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子を用いた蛍光標識法により蛍光標識を行うと、緑色の輝点が明瞭であり、多重標識の場合、他の色領域、たとえば赤色領域への漏れ込みが小さく、緑色の輝点と赤色の輝点との良好なバランスが得られる。
【００４７】
以下、前記アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を用いた蛍光標識法を説明する。
【００４８】
前記蛍光標識法としては、免疫染色法およびＦＩＳＨ等を挙げることができる。免疫染色法およびＦＩＳＨの具体的な操作方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。色素粒子にて標識を行う従来の免疫染色法またはＦＩＳＨにおいて、前記色素粒子として前記アミノクマリン化合物内包粒子を使用すればよい。
【００４９】
免疫染色法の場合、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて、ＨＥＲ２およびＫｉ６７の他、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８およびＣＤ５９などの染色対象タンパク質に対しても染色することができる。
【００５０】
前記蛍光標識法は、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いた標識を含む多重標識であってもよい。すなわち、２つ以上の標識対象に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重標識を行い、その染色対象の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識することができる。たとえば、複数の標識対象について、そのうちの一部の標識対象に対して前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行い、他の標識対象に対して緑色以外の発光を示す色素を含む粒子を用いて標識を行って、複数の標識対象を緑色と緑色以外の色とで別々に標識化することができる。
【００５１】
たとえば、免疫染色法においては、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８およびＣＤ５９から選択される少なくとも２つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色することができる。そうすれば、たとえば、ＰＤＬ１をアミノクマリン化合物内包粒子によって緑色に染色し、ＣＴＬＡ４を赤色で染色して、ＰＤＬ１とＣＴＬＡ４とを異なる色で標識化するということが可能になる。
【００５２】
この多重染色においては、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８、ＣＤ５９、ＩＤＯ、 ＴＤＯ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＨＤＡＣ、ＣＸＣＲ４、ＦＬＴ−３、ＴＩＧＩＴ、ＩＮＦ-α、INF-β、INF-ω、INF-ε、INF-κ、INF-γ、INF-λ ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ５７、ＯＸ４０（別名ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（別名ＣＤ２５２）、ＩＣＯＳ（別名ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（別名ＣＤ２７５）、ＣＤ１５５、ＣＤ２２６、ＣＤ１１２、ＣＤ２７、ＣＤ７０、４−１ＢＢ（別名ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（別名ＣＤ１３７Ｌ）、ＧＩＴＲ（別名ＣＤ３５７）、ＧＩＴＲＬ、ＢＴＬＡ（別名ＣＤ２７２）、ＨＶＥＭ（別名ＣＤ２７０）、ＴＩＭ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９、ＬＡＧ−３（別名ＣＤ２２３）、Ｂ７−Ｈ３（別名ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４（別名ＣＤ２４４）、ＫＬＲＧ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｒ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３およびＣＳＦ１−Ｒ から選択される少なくとも２つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色することができる。
【００５３】
前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行うと、明瞭な緑色の輝点が確認でき、赤色領域などの他の色領域への漏れ込みが小さい。このため、特定の標識対象に対して前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて緑色の標識を行い、他の染色対象に対して赤色色素を含む色素粒子を用いて赤色の標識を行うと、得られる緑色の輝点は赤色領域への漏れ込みが小さく、緑色の輝点と赤色の輝点との良好なバランスが得られる。
【００５４】
前記アミノクマリン化合物は、前記アミノクマリン化合物以外のクマリン化合物に比較して、赤色領域に近い発光領域を有するが、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行うと、前記アミノクマリン化合物以外のクマリン化合物を含む色素粒子よりも、赤色領域への漏れ込みがむしろ小さいという効果が得られる。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
２０ｍＬバイアル管瓶に下記式（３）で表わされる化合物 （３）６００ｍｇを入れ、発煙硫酸６ｍＬを加えて、２５℃にて４時間撹拌し、反応を行った。反応の進行はＴＬＣにて確認した。具体的には、反応液の一部をＮａＯＨ水溶液にて中和した後、反応液にエタノールを加え、ＣＨＣｌ3  を２、ＭｅＯＨを３の割合で混合した溶液を用いてＴＬＣを行った。原料のＲｆ値０．８８に対し、目的物のＲｆ値０．７３であり、このＴＬＣのデータより、反応の収束および目的物の生成を確認した。【００５６】
５０ｍＬバイアル管瓶に氷を８分目（３０ｍＬ）まで入れ、この中に反応液を少しずつ加えた。生成した色素が懸濁した懸濁液が得られた。この懸濁液を遠心分離し、上澄み液を除去して色素を沈殿として回収した。沈殿を純水１０ｍＬで分散し、この分散液を遠心分離して、上澄み液を除去して、沈殿を回収し、再度、純水１０ｍＬで分散し、この分散液を遠心分離して上澄み液を除去して、沈殿を回収した。回収した沈殿をエタノールで分散し、この分散液を遠心分離し、上澄み液を除去して、沈殿として下記式（Ｉ）で表わされるアミノクマリン化合物Ｉを得た。アミノクマリン化合物Ｉの収率は８０％であった。【００５７】
得られた沈殿物を乾燥後、得られた粉末を純水に加えた後、ＮａＯＨ水溶液で中和し、沈殿を溶解し、溶液のｐＨを７〜８とした。この溶液を凍結乾燥機にて乾燥する事により、アミノクマリン化合物ＩのＮａ塩を得た。アミノクマリン化合物Ｉは、スルホン酸体では水への溶解性が悪いのに対し、Ｎａ塩とする事で、水に速やかに溶解することを確認した。【００５８】
アミノクマリン化合物Ｉを、再蒸留水（ＤＤＷ）を１０、エタノールを１の割合で混合して得られた溶媒に溶解して、１０ｎＭ溶液を作製した。この溶液に対して、分光蛍光光度計F-7000（日立製作所（株）製）を用いて、励起スペクトル極大波長、蛍光スペクトル極大波長、および励起波長４９０ｎｍでの蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。励起スペクトルは検出する蛍光波長を固定して励起光の波長を走査して蛍光強度を測定した。蛍光スペクトルは励起光の波長を固定して蛍光強度を測定した。【００５９】
また、スルホン化前の原料および本化合物の１Ｈ−ＮＭＲ測定を行ない、目的のスルホン化物が得られている事を確認した。
スルホン化前の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CDCl3）（化合物（３））：  δ= 1.31(s, 6H), 1.59(s, 6H), 1.77(t, 2H), 1.83(t, 2H), 3.29(t, 2H), 3.38(t, 2H), 7.30(s, 1H), 7.36(t, 1H), 7.47(t, 1H), 7.94(d, 1H), 8.00(d, 1H), 8.83(s, 1H)
スルホン化後の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CD3OD）（アミノクマリン化合物Ｉ）：  δ= 1.37(s, 6H), 1.59(s, 6H), 1.83(s broad, 2H), 1.89(s broad, 2H), 3.52(s broad, 2H), 3.61(s broad, 2H), 7.46(s, 1H), 7.95(d, 1H), 8.11(d, 1H), 8.53(s, 1H), 8.69(s, 1H)【００６０】
【化４】
2018151072.tif 000006
【００６１】
【化５】
2018151072.tif 000007
［実施例２］
式（３）で表わされる化合物の代わりに下記式（４）で表わされる化合物（４）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（ＩＩ）で表わされるアミノクマリン化合物ＩＩを得た。アミノクマリン化合物ＩＩの収率は８２％であった。【００６２】
アミノクマリン化合物ＩＩを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長、蛍光スペクトル極大波長、および蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。
スルホン化前の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CDCl3）（化合物（４））：  δ= 1.99(m, 4H), 2.79(t, 2H), 2.94(t, 2H), 3.33(s broad, 4H), 7.05(s, 1H), 7.34(t, 1H), 7.46(t, 1H), 7.92(d, 1H), 8.00(d, 1H), 8.80(s, 1H)
スルホン化後の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CD3OD）（アミノクマリン化合物ＩＩ）：  δ= 1.95(m, 4H), 2.78(t, 2H), 2.84(t, 2H), 3.36(m, 4H), 7.20(s, 1H), 7.89(d, 1H), 7.94(d, 1H), 8.38(s, 1H), 8.80(s, 1H)【００６３】
【化６】
2018151072.tif 000008
【００６４】
【化７】
2018151072.tif 000009
［実施例３］
式（３）で表わされる化合物の代わりに下記式（５）で表わされる化合物（５）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（ＩＩＩ）で表わされるアミノクマリン化合物ＩＩＩを得た。アミノクマリン化合物ＩＩＩの収率は８０％であった。【００６５】
アミノクマリン化合物ＩＩＩを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長および蛍光スペクトル極大波長を測定した。結果を表１に示す。【００６６】
【化８】
2018151072.tif 000010
【００６７】
【化９】
2018151072.tif 000011
［実施例４］
式（３）で表わされる化合物の代わりに下記式（６）で表わされる化合物（６）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（ＩＶ）で表わされるアミノクマリン化合物ＩＶを得た。アミノクマリン化合物ＩＶの収率は７５％であった。【００６８】
アミノクマリン化合物ＩＶを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長および蛍光スペクトル極大波長を測定した。結果を表１に示す。
スルホン化前の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CDCl3）（化合物（６））：  δ= 1.98(m, 4H), 2.78(t, 2H), 2.93(t, 2H), 3.33(m, 4H), 6.98(s, 1H), 7.30(d, 1H), 7.31(d, 1H), 7.57(t, 1H), 7.78(t, 1H), 8.50(s, 1H)
スルホン化後の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CD3OD）（アミノクマリン化合物ＩＶ）：  δ= 1.97(s broad, 4H), 2.80(m, 2H), 2.87(m, 2H), 3.39(m, 4H), 7.19(s, 1H), 7.72(d, 1H), 7.87(d, 1H), 8.05(s, 1H), 8.65(s, 1H)【００６９】
【化１０】
2018151072.tif 000012
【００７０】
【化１１】
2018151072.tif 000013
［実施例５］
式（３）で表わされる化合物の代わりに下記式（７）で表わされる化合物（７）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（Ｖ）で表わされるアミノクマリン化合物Ｖを得た。アミノクマリン化合物Ｖの収率は７０％であった。【００７１】
アミノクマリン化合物Ｖを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長および蛍光スペクトル極大波長を測定した。結果を表１に示す。
スルホン化前の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CDCl3）（化合物（７））：  δ= 1.98(m, 4H), 2.78(t, 2H), 2.93(t, 2H), 3.33(m, 4H), 6.98(s, 1H), 7.30(d, 1H), 7.31(d, 1H), 7.57(t, 1H), 7.78(t, 1H), 8.50(s, 1H)
スルホン化後の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CD3SOCD3）（アミノクマリン化合物Ｖ）：  δ= 1.97(s broad, 4H), 2.80(m, 2H), 2.87(m, 2H), 3.39(m, 4H), 7.19(s, 1H), 7.72(d, 1H), 7.87(d, 1H), 8.05(s, 1H), 8.65(s, 1H)【００７２】
【化１２】
2018151072.tif 000014
【００７３】
【化１３】
2018151072.tif 000015
［実施例６］
式（３）で表わされる化合物の代わりに下記式（８）で表わされる化合物（８）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（ＶＩ）で表わされるアミノクマリン化合物ＶＩを得た。アミノクマリン化合物ＶＩの収率は７５％であった。【００７４】
アミノクマリン化合物ＶＩを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長および蛍光スペクトル極大波長を測定した。結果を表１に示す。【００７５】
【化１４】
2018151072.tif 000016
【００７６】
【化１５】
2018151072.tif 000017
［比較例１］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりに下記式（ｉ）で表わされるアミノクマリン化合物ｉを用いたこと以外は実施例１と同様に、蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。【００７７】
【化１６】
2018151072.tif 000018
［比較例２］
式（３）で表わされる化合物の代わりに上記式（ｉ）で表わされるアミノクマリン化合物（ｉ）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（ｉｉ）で表わされるアミノクマリン化合物ｉｉを得た。【００７８】
アミノクマリン化合物ｉｉを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長、蛍光スペクトル極大波長、および蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。
スルホン化前の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CDCl3）（アミノクマリン化合物（ｉ））：  δ= 1.25(t, 6H), 3.46(q, 4H), 6.56(s, 1H), 6.67(d, 1H), 7.36(t,1H), 7.48(m, 2H), 7.99(d, 1H), 8.01(d, 1H), 8.90(s, 1H)
スルホン化後の１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, CD3SOCD3）（アミノクマリン化合物ｉｉ）：  δ= 1.67(t, 6H), 3.51(m, 4H), 6.68(s, 1H), 6.86(d, 1H), 7.41(d, 1H), 7.78(d, 1H), 7.91(d, 1H), 8.30(s, 1H), 9.03(s, 1H)【００７９】
【化１７】
2018151072.tif 000019
［比較例３］
式（３）で表わされる化合物の代わりに下記式（９）で表わされる化合物（９）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（ｉｉｉ）で表わされるアミノクマリン化合物ｉｉｉを得た。【００８０】
アミノクマリン化合物ｉｉｉを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長および蛍光スペクトル極大波長を測定した。結果を表１に示す。【００８１】
【化１８】
2018151072.tif 000020
【００８２】
【化１９】
2018151072.tif 000021
［比較例４］
式（３）で表わされる化合物の代わりに下記式（１０）で表わされる化合物（１０）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法により、下記式（ｉｖ）で表わされるアミノクマリン化合物ｉｖを得た。【００８３】
アミノクマリン化合物ｉｖを用いて、実施例１と同様に励起スペクトル極大波長および蛍光スペクトル極大波長を測定した。結果を表１に示す。【００８４】
【化２０】
2018151072.tif 000022
【００８５】
【化２１】
2018151072.tif 000023
【００８６】
【表１】
2018151072.tif 000024
［実施例７］
アミノクマリン化合物Ｉ  １４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。【００８７】
この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。この溶液に反応開始剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌し、その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。以上の操作により、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉを得た。【００８８】
得られたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉの分散液から、純水による洗浄を行い、余剰の樹脂原料やアミノクマリン化合物などの不純物を除いた。具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。【００８９】
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉの平均粒径をＳＥＭ画像の粒子直径より算出した。結果を表２に示す。【００９０】
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉを0.0189mg/mLに希釈して100uLを取り、蛍光用ミクロセルに入れて、分光蛍光光度計F-7000（日立製作所（株）製）を用いて、励起波長４９０ｎｍで蛍光強度を測定した。結果を表２に示す。【００９１】
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉを、下記のＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）およびＦＩＳＨ（Fluorescence in situ hybridization ）に供した。
（ＦＡＣＳ評価）
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉの末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＨＥＲ２抗体を結合させた。【００９２】
ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手したＣＯＬＯ２０１の凍結細胞を３７℃の恒温槽で融かし、１×１０5個／ｍＬ程度の細胞を培地に懸濁して、２５ｃｍ2フラスコで最初の培養を実施した。1×１０6個／ｍＬ程度に細胞が増えた培養液をトリプシン処理し、フラスコからはがした細胞の一部をCellバンカー液(10％DMSO)で希釈し、凍結乾燥して、保存細胞とした。残りの細胞は継代して目的量５×１０7個程度まで培養し、スクレーパーで浮かして回収後、一部をＦＡＣＳ測定に使用した。【００９３】
培養細胞表面に存在するＨＥＲ２タンパク質を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商品名；ベクトン・ディッキンソン社製）で計測した。アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＩのＰＢＳ溶液と上述のように培養したＣＯＬＯ２０１との混合液を４℃ で、３０分間インキュベイトし、その１００μｌを測定用チューブに採り、Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（商品名、ベクトン・デッキンソン社製）で２ｍｌに希釈して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにインジェクトした。【００９４】
結果を表２に示す。表２中にＦＡＣＳの結果として示された図は、４９０ｎｍ励起光による５３０ｎｍの蛍光強度を横軸に、カウント数を縦軸にしたヒストグラムである。この図においては、ヒストグラムが右側にシフトしているほど蛍光強度が強い、つまり明るいことを示す。この図では、実施例７の結果は、下記のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子ｉを用いた比較例５の結果と比較して示されている。他の実施例および比較例６〜８についても同様である。蛍光強度９０付近にピークを有するヒストグラムが比較例５のヒストグラムであり、蛍光強度５００付近にピークを有するヒストグラムが実施例７のヒストグラムである。実施例７のヒストグラムは、比較例５のヒストグラムからかなり右側にシフトしていることがわかる。この結果から、実施例７のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉは、比較例５のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子ｉより、蛍光強度が強く、明るいことがわかる。
（ＦＩＳＨ評価）
〔ＢＡＣプローブの調製〕
ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ．２００６；４５（１）５９の記載の方法に従って、以下のように核酸分子を調製した。ＧＳＰ社から購入したＨＥＲ２−ＤＮＡクローン（約１５０ｋｂｐ）１μｇ（５μＬ）に対して、ニックトランスレーション用のキット（製品名「ＧＳＰ−ニックトランスレーションキット」Ｋ−０１５、ＧＳＰ社製）のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、ＨＥＲ２のＤＮＡクローン（核酸分子）のｄＴＴＰをＤＮＰ標識ｄＵＴＰで置換した。【００９５】
〔ニックトランスレーションによる標準的なビオチン標識方法〕
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・１０×ＮｉｃｋＢｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７．２]、ＭｇＳＯ4、ＤＴＴ）・・・２．５μＬ
・ＢＳＡ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＢＳＡ）・・・１．５μＬ
・ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ）・・・５μＬ
・ｄＴＴＰ・・・０．５μＬ、
・ＤＮＰ−１１−ｄＵＴＰ（製品番号NEL551001EA、PerkinElmer社製、２５０ｎｍｏｌ／２５μＬ）・・・０．１５μＬ
・純水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ）・・・３μＬ
・上記ＨＥＲ２−ＤＮＡクローン約１５０ｋｂｐ  １μｇの水溶液・・・５μＬ
・ＤＮＡ  ＰоｌｙｍｅｒａｓｅＩ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７．５]、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、ｇｌｙｃｅｒоｌ）・・・１μＬ
・ＤＮａｓｅＩ・・・５μＬ
次に、１５℃で４時間反応させ、７０℃で１０分間加熱して反応を停止させた。反応後の遠心チューブに２５μＬの蒸留水を添加した。ビオチン標識済みのＢＡＣプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−２００ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。【００９６】
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍ１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、最終濃度１μｇ／２５０μＬのＤＮＰ標識されたＢＡＣプローブの溶液を得た。【００９７】
〔アミノクマリン化合物内包樹脂粒子と上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブの調製〕
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉの表面アミノ基にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を反応してマレイミドを導入し、これに抗ＤＮＰ抗体を結合させた。【００９８】
上記ニックトランスレーションによりＤＮＰ標識したＢＡＣプローブを２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)および抗ＤＮＰ抗体で表面修飾されたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子を１．０μＬ（５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ試薬を得た。【００９９】
〔ＤＮＡプローブの保存〕
上述のように得られたＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション緩衝液（２５％脱イオン化したホルムアミド、２×ＳＳＣ、２００ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト溶液、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭＥＤＴＡ）に終濃度１〜５ｎｇ／μＬとなるように希釈した。必要に応じて、Ｓ３００サイズのスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により遊離のリガンドを除去した。直ぐに使用しない場合、ＤＮＡプローブを−２０℃で冷凍保存した。【０１００】
〔ＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定〕
ＦＩＳＨによりＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定した。ＦＩＳＨは以下に示すように、脱パラフィン処理、検体スライドの前処理、酵素処理、検体の固定処理、プローブの準備、検体スライドのＤＮＡの変性処理、ハイブリダイゼーション処理、スライドグラスの洗浄処理、およびＤＡＰＩ染色処理をこの順で行うことで実施した。【０１０１】
〔脱パラフィン処理〕
ＨＥＲ２陽性染色対照標本の検体スライド（パソロジー研究所社製「ＨＥＲ２−ＦＩＳＨコントロールスライド  Ｃｏｄｅ ＰＳ−０９００６」）を、以下の（１）〜（４）の順で処理することで脱パラフィン処理を行った。（１）ヘモディー（Ｈｅｍｏ−Ｄｅ）に常温で１０分間浸漬する。（２）検体スライドを新しいＨｅｍｏ−Ｄｅに常温１０分間浸漬する。同じ操作を３回繰り返す。（３）検体スライドを１００％エタノールで常温で５分間浸漬し、２回洗浄し、脱水処理を行う。（４）検体スライドを風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマー上で乾燥させる。【０１０２】
〔検体スライドの前処理〕
ＤＮＡプローブの到達性を向上させるために、上記検体スライドに対し以下の（１）〜（６）の順で前処理を行い、細胞膜及び核膜の蛋白質の除去を行った。（１）検体スライドを０．２ｍоｌ／Ｌ  ＨＣｌで室温、２０分間処理する。（２）検体スライドを精製水に３分間浸漬する。（３）検体スライドを洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｉｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）に３分間浸漬する。（４）検体スライドを８０℃の前処理溶液(１Ｎ  ＮａＳＣＮ)に３０分間浸漬する。（５）検体スライドを精製水に１分間浸漬する。（６）検体スライドを洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ）に５分間浸漬し、この浸漬操作を２回繰り返す。【０１０３】
〔酵素処理〕
前処理を行った検体スライドに対して、以下の（１）〜（４）の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。（１）前処理した検体スライドを取り出し、ペーパータオルにスライドグラスの下端をつけて余分な洗浄緩衝液を取り除く。（２）検体スライドを３７℃に加温したプロテアーゼ溶液に１０〜６０分間浸漬する。この浸漬処理は、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、２５ｍｇ  プロテアーゼ（２５００−３０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）［ペプシン］／１Ｍ  ＮａＣｌ［ｐＨ２．０］５０ｍＬで３７℃、６０分間）で処理することが望ましい。（３）検体スライドを洗浄緩衝液に５分間浸漬する。この操作を２回繰り返す。（４）検体スライドを風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマー上で２〜５分間乾燥させる。【０１０４】
〔検体の固定〕
検体の固定処理として、前処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（３）の処理を行った。（１）検体スライドを１０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬社製「４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液」、製品番号１６３−２０１４５）に常温で１０分間浸漬する。（２）検体スライドを洗浄緩衝液に５分間浸漬する。これと同じ操作を２回繰り返す。（３）検体スライドを風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマー上で２〜５分間乾燥させる。【０１０５】
〔プローブの準備〕
冷凍保存しておいたＤＮＡプローブ試薬の溶液を室温に戻し、正確な容量を採液可能なピペッティング操作ができる程度まで溶液の粘度を十分にさげて、ボルテックスミキサー等で溶液を混和した。【０１０６】
〔検体スライドのＤＮＡの変性〕
検体スライド上のＤＮＡの変性処理として、検体の固定処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（８）の処理を行った。（１）検体スライドの作成前に水で湿らせたペーパータオルを底に敷いた湿潤箱（気密性の容器であり、その側面をペーパータオルでテーピングしたもの）を３７℃インキュベータ内に載置して予備加熱する。（２）変性溶液（７０％  ホルムアミド／ＳＳＣ［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム］）のｐＨが常温でｐＨ７．０〜８．０であることを確かめる。変性溶液をコプリンジャーに入れ、溶液が７２℃±１℃になるまで温浴槽で加温する（７２±１℃の温浴槽に少なくとも３０分間置く）。（３）ハイブリダイゼーション領域がどの部分か分かるように、検体スライドの裏側に領域を囲むようにダイアモンドペン等でマークする。（４）検体スライドを７２±１℃の変性溶液の入ったコプリンジャー中に浸漬し、検体スライドのＤＮＡを変性する。（５）ピンセットを使って、検体スライドを変性溶液から取り出し、すぐに常温の７０％エタノール中に入れる。ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体スライドを１分間浸漬する。（６）検体スライドを７０％エタノールから取り出し、８５％エタノール中に入れ、ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体を１分間浸漬する。１００％エタノールで同じ操作を２回繰り返す。（７）ペーパータオルに検体スライドグラスの下端をつけてエタノールを取り除き、ペーパータオルでスライドグラスの裏側を拭く。（８）検体スライドをドライヤーで風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマーで２〜５分間乾燥させる。【０１０７】
〔ハイブリダイゼーション〕
上記変性処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（３）の処理をこの順で行うことで、検体スライドに対して上述したように調製したＤＮＡプローブ１０μＬ（１０〜５０ｎｇ）を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。（１）検体スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記ＤＮＡプローブを１０μＬ添加し、すぐに、２２ｍｍ×２２ｍｍのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げる。ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにする。（２）ペーパーボンドでカバーグラスをシールする。（３）前もって加温した湿潤箱に検体スライドを入れて蓋をして３７℃のインキュベータで１４〜１８時間ハイブリダイゼーションを行う。【０１０８】
〔スライドグラスの洗浄〕
上記ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（６）の処理をこの順で行うことで、検体スライドの洗浄処理を行った。（１）ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０）をコプリンジャーに入れる。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が７２℃±１℃になるまで温浴槽で予備加熱をする（７２℃±１℃の温浴槽に少なくとも３０分間置く）。（２）ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、常温に維持する。（３）ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除く。（４）検体スライドをポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れる。カバーグラスは自然に溶液中で剥がれるのを待つ。（５）溶液から検体スライドを取り出し、余分な溶液を取り去り、７２±１℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液に２分間浸す。ここで、７３℃を超える温度や処理時間として２分を超えないようにするのが望ましい。（６）コプリンジャーから検体スライドを取り出し、遮光下（締め切った引出や締め切ったキャビネットの棚等）で風乾する。【０１０９】
〔ＤＡＰＩ染色〕
ＤＡＰＩ染色は以下のように行った。まず、１０μＬのＤＡＰＩ対比染色液を検体スライドのハイブリダイゼーション領域に添加した。次に、ハイブリダイゼーション処理した後、細胞数をカウントするためにＤＡＰＩ染色（２μｇ／ｍＬＰＢＳ）を２５℃、１０分間行うことで細胞核を染色し、カバーガラスを被せて、シグナルの計測まで検体スライドを遮光して保存した。ＤＡＰＩ （４'，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−Ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ, Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ） はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｄ１３０６）を使用した。【０１１０】
〔観察〕
＜蛍光顕微鏡観察＞
蛍光顕微鏡観察では、HER2遺伝子染色済み組織切片を、蛍光顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  ｉｍａｇｅｒ（Ｃａｍｅｒａ：ＭＲｍモノクロ・冷却機能付、対眼レンズｘ１０、対物レンズ×６０油浸、Zeiss製フィルターセットＨＥ４６(励起フィルター500nm±12.5nm、ビームスプリッター515nm、蛍光フィルター535nm±15nm）)にセットし、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブのアミノクマリン化合物内包樹脂粒子の蛍光発光を、蛍光画像（蛍光静止画像）として取得した。【０１１１】
得られた蛍光画像から輝点の数を計測した結果を表２に示す。計測された起点数に差があらわれたのは、比較例の場合には緑のバックグランド（ノイズ）の中から緑輝点（シグナル）を見つけ出すのが比較的困難であるのに対して、実施例の場合には高い輝度なのでノイズの影響を受けずに検出できるためである。
［実施例８〜１２］
実施例８〜１２においては、アミノクマリン化合物Ｉの代わりにアミノクマリン化合物ＩＩ〜ＶＩをそれぞれ用いたこと以外は実施例７と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＩＩ〜ＶＩを作製した。【０１１２】
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＩＩ〜ＶＩを用いて、実施例７と同様に平均粒径測定、蛍光強度測定、ＦＡＣＳおよびＦＩＳＨを行った。ただし、実施例１０および１１においては、ＦＡＣＳは行わなかった。結果を表２に示す。
［比較例５〜８］
比較例５〜８においては、アミノクマリン化合物Ｉの代わりにアミノクマリン化合物ｉ〜ｉｖをそれぞれ用いたこと以外は実施例７と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ｉ〜ｉｖを作製した。【０１１３】
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ｉ〜ｉｖを用いて、実施例７と同様に平均粒径測定、蛍光強度測定、ＦＡＣＳおよびＦＩＳＨを行った。結果を表３に示す。表３に示したＦＡＣＳの結果より、比較例６〜８では、蛍光色素がスルホン化されているにもかかわらず、ヒストグラムが比較例５のヒストグラムからそれほどシフトしていないことがわかる。      【０１１４】
【表２】
2018151072.tif 000025
【０１１５】
【表３】
2018151072.tif 000026
［実施例１３］
アミノクマリン化合物Ｉ ３．４ｍｇに塩化チオニル０．１ｍLを加え、６５℃４時間、加熱混合した後、真空乾燥を行なって余剰の塩化チオニルを除去した。得られたアミノクマリン化合物と塩化チオニルの反応物と３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬを１．２ｍＬのＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。【０１１６】
得られたオルガノアルコキシシラン化合物液０．３ｍＬを、９９％エタノール２４ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．３ｍＬ、超純水０．７５ｍＬ、および２８質量％のアンモニア水０．７５ｍＬと２５℃で３時間混合した。【０１１７】
上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。この沈殿に対して、エタノールを加えて、沈殿物を分散させ、再度遠心分離をするリンスを行った。さらに同様のリンスを２回繰り返し、アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は６０ｎｍであった。
［実施例１４］
超純水０．８５ｍＬ、アンモニア水０．８５ｍＬとしたこと以外は実施例１３と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は８０ｎｍであった。
［実施例１５］
超純水１．１０ｍＬ、アンモニア水１．１０ｍＬとしたこと以外は実施例１３と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＩＸを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。【０１１８】
なお、実施例１５で作製された粒子ＩＸについて、蛍光強度測定、ＦＡＣＳおよびＦＩＳＨの評価を行ったところ、表２の実施例と同様の結果が得られた。
［実施例１６］
超純水１．１５ｍＬ、アンモニア水１．１５ｍＬとしたこと以外は実施例１３と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子Ｘを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１９５ｎｍであった。
［実施例１７］
超純水１．２０ｍＬ、アンモニア水１．２０ｍＬとしたこと以外は実施例１３と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＸＩを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は２２０ｎｍであった。
［比較例９］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりに緑色色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を用いたこと以外は実施例１５と同様の方法で、色素内包粒子ｖを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。
［比較例１０］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりに緑色色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を用いたこと以外は実施例７と同様の方法で、色素内包粒子ｖｉを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。
［比較例１１］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりに赤色色素であるスルホローダミン１０１を用いたこと以外は実施例７と同様の方法で、色素内包粒子ｖｉｉを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。
［実施例７Ａ］
実施例７で作製したアミノクマリン化合物内包粒子Ｉを用いて、下記の方法により免疫染色を行った。
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有するＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、５℃で１時間反応させた。【０１１９】
この混合液を、１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後に、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基がついたアミノクマリン化合物内包粒子Ｉを得た。【０１２０】
１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬを２１０μＬのボレートバッファーに加えた後、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２−イミノチオラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）７０μＬを加え、室温で1時間反応させた。これにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対してチオール基（−NH−C（＝NH2+Cl-）−CH2−CH2−CH2−SH）を導入した。【０１２１】
このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、上記シリカ系粒子に結合可能なストレプトアビジンを得た。このストレプトアビジン全量（０．０４ｍｇ含有)とＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて上記０．６７ｎＭに調整したシリカ系粒子７４０μＬとを混合し、室温で１時間反応させた。【０１２２】
１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉを得た。
（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。該溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが３０オングストロームであるリンカー試薬「（＋）−Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ6‐ＮＨ‐Ｍａｌ」（ＰｕｒｅＰＥＧ社製,製品番号2461006-250）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。【０１２３】
この反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社製，Cat.#89882）に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液をビオチン化２次抗体の溶液とした。
（染色）
（１）標本処理工程
（１−１）脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片として、ＨＥＲ２（３＋）とＨＥＲ２（−）の組織アレイスライド（コスモバイオ社製「ＣＢ−Ａ７１２のシリーズ」）を用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。【０１２４】
（１−２）賦活化処理工程
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。【０１２５】
（２）免疫染色処理工程
（２−１）１次反応
ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、ベンタナ社製「抗ＨＥＲ２ウサギモノクロナール抗体（４Ｂ５）」を０．０５ｎＭに調整し、該１次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。【０１２６】
（２−２）２次反応
１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで６μｇ／ｍＬに希釈した上記ビオチン化２次抗体と室温３０分間反応させた。【０１２７】
（２−３）蛍光標識処理
２次反応を行った組織アレイスライドに対して、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで０．０２ｎＭに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉを、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７.４）室温の条件下で３時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。【０１２８】
（３）形態観察染色工程
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行った。【０１２９】
（４）固定処理工程
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（メルク社製「エンテランニュー」）を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。【０１３０】
（５）観察・計測工程
固定化処理工程を終えた組織切片に対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ−５３」）、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）により観察および撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで５７５〜６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターを通すことで６１２〜６９２ｎｍに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４０００μ秒に設定）して撮像した。ＨＥＲ２（３＋）の組織の輝点数は、４００倍で撮像した画像をもとにＩｍａｇｅＪ  ＦｉｎｄＭａｘｉｍｓ法により計測した１０００細胞の平均値とした。【０１３１】
視野内の細胞膜上の輝点数Ｓおよび視野内の細胞外の輝点数Ｎを測定し、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表４に示す。
［実施例１４Ａ〜１７Ａ］
実施例１４Ａ〜１７Ａでは、それぞれ、実施例１４〜１７で作製したアミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩ〜ＸＩを用いて、下記の方法により免疫染色を行った。
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩ〜ＸＩをそれぞれ使用したこと以外は実施例７Ａと同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩ〜ＸＩをそれぞれ得た。
（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例７Ａと同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。
（染色）
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩ〜ＸＩをそれぞれ使用したこと以外は実施例７Ａと同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表４に示す。
［実施例８Ａ］
実施例８Ａでは、実施例８で作製したアミノクマリン化合物内包粒子ＩＩを用いて、下記の方法により免疫染色を行った。
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子ＩＩを使用したこと以外は実施例７Ａと同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩを得た。
（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例７Ａと同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。
（染色）
（１）標本処理工程
（１−１）脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片としてＰＤＬ１の組織アレイスライドを用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。【０１３２】
（１−２）賦活化処理工程
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。【０１３３】
（２）免疫染色処理工程
（２−１）１次反応
ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、Cell Signaling Technology社製「抗PD-L1ウサギモノクロナール抗体(E1L3N)」を０．０５ｎＭに調整し、該１次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。【０１３４】
（２−２）２次反応
１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで６μｇ／ｍＬに希釈した上記ビオチン化２次抗体と室温３０分間反応させた。【０１３５】
（２−３）蛍光標識処理
２次反応を行った組織アレイスライドに対して、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで０．０２ｎＭに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩを、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７.４）室温の条件下で３時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。【０１３６】
（３）形態観察染色工程
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行った。【０１３７】
（４）固定処理工程
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（メルク社製「エンテランニュー」）を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。【０１３８】
（５）観察・計測工程
実施例７Ａと同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表４に示す。
［比較例９Ａ−１］
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりに色素内包粒子ｖを使用したこと以外は実施例７Ａと同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子ｖを得た。
（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例７Ａと同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。
（染色）
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子ｖを使用したこと以外は実施例７Ａと同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表４に示す。
［比較例９Ａ−２］
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりに色素内包粒子ｖを使用したこと以外は実施例１と同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子ｖを得た。
（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例１と同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。
（染色）
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子ｖを使用したこと以外は実施例８Ａと同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表４に示す。【０１３９】
【表４】
2018151072.tif 000027
表４より、式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物Ｉを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行うと、式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物以外の色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を内包した色素内包粒子を用いた場合に比較して、Ｓ／Ｎが向上することが確認された。
［実施例７Ｂ］
実施例７で作製したアミノクマリン化合物内包粒子Ｉを用いて、下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
（色素内包粒子の修飾）
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Ｉの末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＨＥＲ２抗体を結合させ、抗ＨＥＲ２抗体結合アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を作製した。【０１４０】
上記と同様に、色素内包粒子ｖｉｉの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｋｉ６７抗体を結合させ、抗Ｋｉ６７抗体結合色素内包粒子を作製した。
（組織標本の免疫染色）
下記工程（１）〜（１３）によりヒト乳房組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。【０１４１】
工程（１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。【０１４２】
工程（２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。【０１４３】
工程（３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。【０１４４】
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。【０１４５】
工程（５）：１２１℃で５分間オートクレーブ処理を行った。【０１４６】
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。【０１４７】
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。【０１４８】
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＨＥＲ２抗体結合アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を組織標本に載せて一晩放置し、ＨＥＲ２を標識した。【０１４９】
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を１５分浸漬させた。【０１５０】
工程（１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗Ｋｉ６７抗体結合色素内包粒子を、組織標本に載せて一晩放置し、Ｋｉ６７を標識した。【０１５１】
工程（１１）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を３０分浸漬させた。【０１５２】
工程（１２）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。【０１５３】
工程（１３）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
（顕微鏡観察）
蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤（緑色用および赤色用）に対応する下記２種類を使用した。【０１５４】
【表５】
2018151072.tif 000028
免疫染色後の組織標本をステージに設置し、緑色用および赤色用の２種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、組織標本の蛍光像の蛍光輝点数を計測した。結果を表６に示す。
［実施例８Ｂ］
実施例８Ｂにおいては、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＶＩＩの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子ＩＩを使用したこと以外は実施例７Ｂと同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表６に示す。
［比較例１０Ｂ］
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＶＩＩの代わりに色素内包粒子ｖｉを使用したこと以外は実施例７Ｂと同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表６に示す。【０１５５】
【表６】
2018151072.tif 000029
表６より、ＨＥＲ２およびＫｉ６７の二重染色の結果、式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物ＩまたはＩＩを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行うと、式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物以外の色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を内包した色素内包粒子を用いた場合に比較して、緑色輝点の赤色輝点への漏れ込みが少ないことが確認された。【０１５６】
さらに、式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物ＩまたはＩＩを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行った場合、二重染色の赤輝点数への影響はほとんどないことが表６から確認された。
【国際調査報告】
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2018151072.tif 000037