【手続補正書】
【提出日】平成18年9月7日(2006.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
この出願の前記(1)の発明方法は、次いで、これらの組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼ発現ベクターとともに、アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクトする。レコンビナーゼ発現ベクターとしては、例えば、ＣreレコンビナーゼまたはＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターを使用することができる。ＣreレコンビナーゼはloxＰ配列を認識し、２つのloxＰ配列に挟まれたDNA配列を切り出す（Nucleic Acids Res. 17:147-161, 1989）。また、ＦＬＰレコンビナーゼはＦＲＴ配列を認識し、２つのＦＲＴ配列に挟まれたＤＮＡ配列を切り出す（Trends Genet. 9:413-421, 1993）。従って、これらのレコンビナーゼ発現ベクターと前記の組換えコスミドアデノウイルスベクターとを共にホスト細胞に導入すると、レコンビナーゼの作用によって環状ＤＮＡのloxＰ配列またはＦＲＴ配列に挟まれたコスミドベクター配列が切り出され、アデノウイルスゲノムＤＮＡと発現カセットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
なお、この前記発明(12)のＦＬＰ  コンビナーゼ産生293細胞は、公知の方法によって作製することができる。例えば、ＦＬＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片を動物細胞用発現ベクターに組込み、このベクターを293細胞に導入することによって、ＦＬＰレコンビナーゼ産生293細胞を作製することができる。ＦＬＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片は、公知の発現ベクターpOG44（Stratagene社製）等から切り出して使用することができる。また、動物細胞用発現ベクターには、前記のベクターpOG44を直接使用することができる他、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する公知のベクターを使用することができる。発現ベクターを293細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。さらに、ＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターには、ピューロマイシン等の薬剤耐性遺伝子を併せて組み込み、ベクターが導入された細胞の選択マーカーとすることもできる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【実施例】
実施例１：コスミドアデノウイルスベクターの構築
コスミドベクターSuperCos１はStragene社(La Jolla,ＣＡ）より、loxＰ配列を含むプラスミドｐＢＳ246はGIBCO BRL社（Rockville, MD）より購入した。ｐＢS246のloxＰで挾まれる領域中のHind IIIサイトをXba Iへ、BamHＩサイトをSwa Iへ変更した。これをNot Iで切断し、２個のloxＰを持つ260bpの断片を分離した。SuperCos Iに１か所あるXba Iサイトは予め破壊しておき、Not lで切断したところに２個のloxＰを持つ260bpの断片を挿入し、コスミドベクター配列（ｐＬＣコスミド）を調製した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
以上の結果は、この出願の発明方法が、きわめて均一な組換えアデノウイルス
ベクターを産生することが可能であり、このベクターにより動物細胞中で導入遺
伝子を確実に発現させることが可能であることを示している。
実施例６：Ｃreレコンビナーゼ産生２９３細胞の作製
Ｃreレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびピューロマイシン耐性遺伝子をｐＣＡＧＧＳ（Gene 108(2):193-199, 1991）のＥcoＲＩサイトに挿入してＣreレコンビナーゼ発現プラスミドｐCAGGS−cre−puroを構築し、２９３細胞にトランスフェクトし、２μgのピューロマイシン／ml含有培地で培養した。ピューロマイシン耐性コロニーを単離し、２９３細胞にレポータープラスミドｐＣＡＧ−ＣＡＴ−ＺをトランスフェクションすることによってＣreレコンビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープラスミドは、ＣＡＧプロモーターとlacＺ遺伝子の間に、loxＰ配列で挟まれたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が挿入されており、Ｃreレコンビナーゼの作用によってＣＡＴ遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるため、２９３細胞のＣreレコンビナーゼ産生をテストすることができる（Biochem. Biophys. Res. Commun. 17(2):393-401, 1995）。このテストによって、Ｃreレコンビナーゼ産生能を有する細胞株２９３cre15を得た。
実施例７：２９３cre15における組換えアデノウイルスベクターの作製
実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）１μg/wellを、実施例６で作製した２９３cre15にトランスフェクションした。９穴のトランスフェクション細胞の全てにおいてＣＰＥが観察され、ＣＰＥの全スポットには強いＥＧＦＰが観られた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
これらの結果から、レコンビナーゼ産生２９３細胞を用いることにより、レコンビナーゼ発現ベクターを使用せずとも、組換えコスミドアデノウイルスベクターから効率よく組換えアデノウイルスベクターが作製可能であることが確認された。
実施例８：ＦＬＰ  コンビナーゼ産生293細胞の作製
ＦＬＰレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびピューロマイシン耐性遺伝子をpgk（phosphoglycerate kinase）プロモーターの下流に挿入してＦＬＰレコンビナーゼ発現プラスミドpgk-FLP-puroを構築し、293細胞にトランスフェクトし、２μgのピューロマイシン／ml含有培地で培養した。ピューロマイシン耐性コロニーを単離し、293細胞にレポータープラスミドpＮＥＯβＧＡＬをトランスフェクションすることによってＦＬＰレコンビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープラスミドは、ＳＶ40プロモーターの下流のlacＺ遺伝子の途中に、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が挿入されており、ＦＬＰレコンビナーゼの作用によってネオマイシン耐性遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるため、293細胞のＦＬＰレコンビナーゼ産生をテストすることができる。このテストによって、ＦＬＰレコンビナーゼ産生能を有する細胞株293ＦＬＰを得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターの作業工程の概要を示す模式図である。実施例２のｐＡＬＣ−ＩＬ−５を大腸菌ＤＨ10Ｂを用いて増殖・精製し、ｐＭＣｌ−creプラスミドと共に２９３細胞にトランスフェクションした。一過性に発現するＣreレコンビナーゼは、効率よく７kbのコスミド配列を切り出し、最終的に、ＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カセットを含む感染性の組換えアデノウイルス粒子が産生された。