(57)【要約】  定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法などである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
【請求項２】
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを用いる請求項１に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
【請求項３】
更に、定量ＰＣＲにより、試料中のβ−アクチン遺伝子の量を測定する工程を含み、
前記β−アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーとを用いる請求項１から２のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
５’−ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６）
５’−ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ−３’  （配列番号：７）
【請求項４】
前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを用いる請求項３に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
５’−ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ−３’  （配列番号：８）
【請求項５】
定量されるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量が、絶対量、及びβ−アクチン遺伝子の量に対する相対量の少なくともいずれかである請求項１から４のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
【請求項６】
定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対であって、
前記プライマー対が、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とするプライマー対。
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
【請求項７】
定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せであって、
前記プライマー対が、請求項６に記載のプライマー対であり、
前記プローブが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブであることを特徴とするプライマー対とプローブとの組合せ。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
【請求項８】
定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、
請求項６に記載のプライマー対を含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
更に、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを含む請求項８に記載のキット。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
【請求項１０】
更に、β−アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーを含む請求項８から９のいずれかに記載のキット。
５’−ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６）
５’−ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ−３’  （配列番号：７）
【請求項１１】
更に、前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを含む請求項８から１０のいずれかに記載のキット。
５’−ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ−３’  （配列番号：８）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及び定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭＴＳ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ）５は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関連する酵素である。【０００３】
前記ＡＤＡＭＴＳ５は、その含有量が、関節リウマチに対して抗ＴＮＦα抗体薬が有効か否かを評価する際の指標となることが知られている（例えば、特許文献１、２参照）。【０００４】
一般的に、遺伝子のｍＲＮＡの定量は、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる。前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｍＲＮＡを定量化する場合も、β−ａｃｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ等のコントロール遺伝子のｍＲＮＡの量に対するＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｍＲＮＡの量の比（以下、「相対比」と称することがある）で表すことが多い。【０００５】
近年、リアルタイムＰＣＲの手法として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（サーモ・フィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた手法が広く普及している。前記ＭＧＢプローブは、ＴｍエンハンサーであるＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ）構造により、Ｔｍ値７０℃のプローブを２０塩基以下の長さで設計することができるなどの利点を有する。
しかしながら、前記ＭＧＢプローブを用いるとコストが高くなってしまうという問題がある。【０００６】
また、上述のように、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の含有量は、薬効予測の指標となることから、より高感度に測定することができる方法の開発が求められている。【０００７】
したがって、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができる方法は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０３８８４０号
【特許文献２】特開２０１１−１０９９２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法、前記定量方法に好適に用いることができるプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
＜２＞  定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対であって、
前記プライマー対が、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とするプライマー対である。
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
＜３＞  定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せであって、
前記プライマー対が、前記＜２＞に記載のプライマー対であり、
前記プローブが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブであることを特徴とするプライマー対とプローブとの組合せである。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
＜４＞  定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、
前記＜２＞に記載のプライマー対を含むことを特徴とするキットである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法、前記定量方法に好適に用いることができるプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、試験例１−１におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験例１−３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２−１におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２−３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）
本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法は、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程（以下、「ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１４】
＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程は、定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程である。
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程では、前記試料中における前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｍＲＮＡの量が定量される。
【００１５】
＜＜試料＞＞
前記試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、末梢血、関節滑膜、関節液、これらからＲＮＡを抽出した試料、前記ＲＮＡをｃＤＮＡとした試料などが挙げられる。これらの中でも、末梢血、前記末梢血からＲＮＡを抽出した試料、前記ＲＮＡをｃＤＮＡとした試料が、採取が簡便である点で、好ましい。
前記試料の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒトが好ましい。
【００１６】
前記末梢血、関節滑膜、関節液を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記末梢血などからＲＮＡを抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００１７】
＜＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子＞＞
前記ＡＤＡＭＴＳ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ）５は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関連する酵素である。
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の塩基配列は公知であり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００７０３８．３で入手可能である。
【００１８】
＜＜定量ＰＣＲ＞＞
前記定量ＰＣＲは、本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対（以下、「ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対」と称することがある）を用いて行う。
【００１９】
−ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対−
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対は、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる。
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
なお、配列番号：３で表される塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００７０３８．３の２，１４９番目〜２，１２９番目の塩基に相当し、エクソン３の一部とエクソン４の一部とに対応するものである。配列番号：３で表される塩基配列中、５’端側の「ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣ」はエクソン３に、３’端側の「ＣＡＴＧＧＣ」はエクソン４に対応する。
【００２０】
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
【００２１】
−ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ−
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
【００２２】
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブは、その５’末端がレポーター色素で修飾されており、３’末端がクエンチャー色素で修飾されていることが好ましい。
【００２３】
前記レポーター色素と、クエンチャー色素との組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＡＭとＴＡＭＲＡとの組合せ、ＨＥＸとＴＡＭＲＡとの組合せ、ＴＥＴとＴＡＭＲＡとの組合せ、ＦＡＭとＢＨＱ１との組合せ、ＨＥＸとＢＨＱ１との組合せ、ＴＥＴとＢＨＱ１との組合せ、ＴＡＭＲＡとＢＨＱ２との組合せ、Ｃｙａｎｉｎｅ５とＢＨＱ３との組合せなどが挙げられる。
【００２４】
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
【００２５】
−定量ＰＣＲ−
前記定量ＰＣＲとしては、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対を用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲが好ましく、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブを用いたリアルタイムＰＣＲがより好ましい。
前記定量ＰＣＲでは、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の絶対量、及び後述するコントロール遺伝子に対する相対量（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量／コントロール遺伝子の量）の少なくともいずれかを定量することができる。
【００２６】
前記定量ＰＣＲの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
例えば、前記リアルタイムＰＣＲに用いる反応試薬としては、特に制限はなく、公知の試薬を目的に応じて適宜選択することができるが、タカラバイオ株式会社製のＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ）を用いることが好ましい。
【００２８】
前記リアルタイムＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
前記リアルタイムＰＣＲに用いる前記フォワードプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が９００ｎＭ程度が好ましい。
前記リアルタイムＰＣＲに用いる前記リバースプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が３００ｎＭ程度が好ましい。
前記リアルタイムＰＣＲに用いる前記プローブの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が７５ｎＭ程度が好ましい。
【００３０】
前記リアルタイムＰＣＲの反応時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（１）９５℃、３０秒間の後、（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間を複数サイクル行うことが好ましい。
前記（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間のサイクル数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０サイクル程度が好ましい。
【００３１】
前記リアルタイムＰＣＲによる定量方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検量線法などが挙げられる。
前記検量線法は、検量線を作成し、その検量線からサンプルの定量を行う方法である。
前記検量線法のコントロールＤＮＡの鋳型として用いるＤＮＡとしては、濃度が既知であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、健常人から採取し、必要に応じて精製したＡＤＡＭＴＳ５の全ｃＤＮＡや、前記ＡＤＡＭＴＳ５  ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドなどが挙げられる。
【００３２】
前記リアルタイムＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの装置の中で逆転写反応を行うものであってもよいし、予め作製したｃＤＮＡを用いるものであってもよい。
【００３３】
前記定量ＰＣＲに用いる装置としては、特に制限はなく、公知の装置を目的に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コントロール遺伝子（「内部標準として用いる遺伝子」と称することもある）の量を測定する工程（以下、「コントロール遺伝子量測定工程」と称することがある）などが挙げられる。
【００３５】
＜＜コントロール遺伝子量測定工程＞＞
前記コントロール遺伝子量測定工程は、定量ＰＣＲにより、試料中のコントロール遺伝子の量を測定する工程である。
前記コントロール遺伝子量測定工程では、前記試料中における前記コントロール遺伝子のｍＲＮＡの量が定量される。
【００３６】
−試料−
前記試料は、上記した＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の項目における＜＜試料＞＞と同様である。
【００３７】
−コントロール遺伝子−
前記コントロール遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、β−アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子などが挙げられる。これらの中でも、β−アクチン遺伝子が、好ましい。
【００３８】
−−β−アクチン遺伝子−−
前記β−アクチン遺伝子の塩基配列は公知であり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトβ−アクチン遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００１１０１．２で入手可能である。
【００３９】
−−定量ＰＣＲ−−
以下、前記コントロール遺伝子として、前記β−アクチン遺伝子を用いる場合の定量ＰＣＲについて説明する。
前記β−アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いるプライマー対としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のβ−アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対（以下、「β−アクチン遺伝子用プライマー対」と称することがある）が好ましい。
前記β−アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いるプローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のβ−アクチン遺伝子の検出用プローブが好ましい。
前記β−アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いるプライマー対と、プローブとの組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のβ−アクチン遺伝子用プライマー対と、以下のβ−アクチン遺伝子の検出用プローブとの組合せが好ましい。
【００４０】
−−−β−アクチン遺伝子用プライマー対−−−
前記β−アクチン遺伝子用プライマー対は、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる。
５’−ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６）
５’−ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ−３’  （配列番号：７）
なお、配列番号：６で表される塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００１１０１．２の６４番目〜８３番目の塩基に相当し、エクソン１の一部とエクソン２の一部とに対応するものである。配列番号：６で表される塩基配列中、５’端側の「ＣＣＡＧ」はエクソン１に、３’端側の「ＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ」はエクソン２に対応する。
【００４１】
前記β−アクチン遺伝子用プライマー対の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
【００４２】
−−−β−アクチン遺伝子の検出用プローブ−−−
前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブは、下記配列番号：８で表される塩基配列からなる。
５’−ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ−３’  （配列番号：８）
【００４３】
前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブは、その５’末端がレポーター色素で修飾されており、３’末端がクエンチャー色素で修飾されていることが好ましい。
前記レポーター色素と、クエンチャー色素との組合せは、上記した＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の−ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ−の項目において記載したものと同様である。
【００４４】
前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
【００４５】
−−−定量ＰＣＲ−−−
前記β−アクチン遺伝子の定量ＰＣＲとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲが好ましい。
前記β−アクチン遺伝子の定量ＰＣＲにより、β−アクチン遺伝子の絶対量を定量することができる。また、上記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の前記試料における相対量の定量に用いることができる。
【００４６】
前記β−アクチン遺伝子の定量ＰＣＲの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
例えば、前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる反応試薬としては、特に制限はなく、公知の試薬を目的に応じて適宜選択することができるが、タカラバイオ株式会社製のＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ）を用いることが好ましい。
【００４８】
前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる前記フォワードプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が９００ｎＭ程度が好ましい。
前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる前記リバースプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が３００ｎＭ程度が好ましい。
前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる前記プローブの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が５０ｎＭ程度が好ましい。
【００５０】
前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲの反応時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（１）９５℃、３０秒間の後、（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間を複数サイクル行うことが好ましい。
前記（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間のサイクル数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０サイクル程度が好ましい。
【００５１】
前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲによる定量方法は、上記した＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の−定量ＰＣＲ−の項目において記載したものと同様である。
【００５２】
前記β−アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの装置の中で逆転写反応を行うものであってもよいし、予め作製したｃＤＮＡを用いるものであってもよい。
【００５３】
前記β−アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いる装置としては、特に制限はなく、公知の装置を目的に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
（プライマー対）
本発明のプライマー対は、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対である。
【００５５】
＜プライマー対＞
前記プライマー対は、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の−ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対−の項目に記載のものと同様である。
【００５６】
（プライマー対とプローブとの組合せ）
本発明のプライマー対とプローブとの組合せは、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せである。
【００５７】
＜プライマー対＞
前記プライマー対は、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の−ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対−の項目に記載のものと同様である。
【００５８】
＜プローブ＞
前記プローブは、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の−ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ−の項目に記載のものと同様である。
【００５９】
（キット）
本発明のキットは、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、本発明のプライマー対を少なくとも含み、必要に応じて更にプローブなどのその他の構成を含む。
【００６０】
＜本発明のプライマー対＞
前記プライマー対は、上記した本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対である。
【００６１】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ、コントロール遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対（以下、「コントロール遺伝子用プライマー対」と称することがある）、コントロール遺伝子の検出用プローブ、ＰＣＲに用いる試薬などが挙げられる。
【００６２】
＜＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ＞＞
前記プローブは、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の−ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ−の項目に記載のものと同様である。
【００６３】
＜＜コントロール遺伝子用プライマー対、コントロール遺伝子の検出用プローブ＞＞
前記コントロール遺伝子は、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜その他の工程＞の＜＜コントロール遺伝子量測定工程＞＞の−コントロール遺伝子−の項目に記載のものと同様であり、好ましい遺伝子も同様である。
【００６４】
前記キットは、前記その他の構成として、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブを含むことが好ましく、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ、及び前記β−アクチン遺伝子用プライマー対を含むことがより好ましく、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ、前記β−アクチン遺伝子用プライマー対、及び前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブを含むことが好ましい。
【００６５】
前記前記β−アクチン遺伝子用プライマー対、及び前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブは、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜その他の工程＞の＜＜コントロール遺伝子量測定工程＞＞の−−−β−アクチン遺伝子用プライマー対−−−及び−−−β−アクチン遺伝子の検出用プローブ−−−の項目に記載のものと同様である。
【実施例】
【００６６】
以下、調製例、試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例等に限定されるものではない。【００６７】
（調製例１：ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡの調製）
ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡとして、配列番号：１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプラスミドに挿入後、制限酵素処理をすることにより調製した。前記配列番号：１で表される塩基配列は、ＡＤＡＭＴＳ５（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＮＭ＿００７０３８．３）の１，９１４番目〜２，３４３番目（４３０ｂｐ）の塩基に相当する。【００６８】
（調製例２：ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブの調製）
ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対及びＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、以下のものを化学合成により調製した。
・  フォワードプライマー
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
・  リバースプライマー
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
・  プローブ
５’−ＦＡＭ−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’  （配列番号：４）
前記配列番号：４で表されるプローブは、５’末端がＦＡＭ（レポーター色素）で修飾されており、３’末端がＴＡＭＲＡ（クエンチャー色素）で修飾されている。【００６９】
（調製例３：β−アクチン遺伝子のｃＤＮＡの調製）
β−アクチン遺伝子のｃＤＮＡとして、配列番号：５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプラスミドに挿入後、制限酵素処理をすることにより調製した。前記配列番号：５で表される塩基配列は、β−アクチン（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＮＭ＿００１１０１．２）の３番目〜４６９番目（４６７ｂｐ）の塩基に相当する。【００７０】
（調製例４：β−アクチン遺伝子用プライマー対及びプローブの調製）
β−アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対及びβ−アクチン遺伝子の検出用プローブとして、以下のものを化学合成により調製した。
・  フォワードプライマー
５’−ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６）
・  リバースプライマー
５’−ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ−３’  （配列番号：７）
・  プローブ
５’−ＦＡＭ−ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’  （配列番号：８）
前記配列番号：８で表されるプローブは、５’末端がＦＡＭ（レポーター色素）で修飾されており、３’末端がＴＡＭＲＡ（クエンチャー色素）で修飾されている。【００７１】
（試験例１：リアルタイムＰＣＲによる定量）
本発明のプライマー対及びプローブを用いて、下記試験例１−１〜１−４のリアルタイムＰＣＲを行った。
＜試験例１−１＞
コントロールＤＮＡとして、前記調製例１で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０−３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０−６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
プライマー対及びプローブとして、前記調製例２で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対（配列番号：２、３）及びプローブ（配列番号：４）を用いた。
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表１−１に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。【００７２】
【表１−１】
2017199418.tif 000002
【００７３】
−反応時間−
以下の順に行った。
（１）  ９５℃、３０秒間
（２）  サイクル数：５０
条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間【００７４】
前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図１Ａ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図１Ａ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０−３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０−６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ）を示す。
前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。【００７５】
＜試験例１−２＞
健常人のｃＤＮＡを２種（以下、「サンプル１」、「サンプル２」と称することがある）用意し、これを２倍希釈し、サンプルとした。
プライマー対及びプローブとして、前記調製例２で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対（配列番号：２、３）及びプローブ（配列番号：４）を用いた。
リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例１−１におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例１−１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。【００７６】
前記試験例１−１で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、１．０７×１０−３μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、２．１８×１０−３μｇ／ｍＬであった。【００７７】
＜試験例１−３＞
コントロールＤＮＡとして、前記調製例３で調製したβ−アクチン遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０−３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０−６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
プライマー対及びプローブとして、前記調製例４で調製したβ−アクチン遺伝子用プライマー対（配列番号：６、７）及びプローブ（配列番号：８）を用いた。
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表１−２に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。【００７８】
【表１−２】
2017199418.tif 000003
【００７９】
−反応時間−
以下の順に行った。
（１）  ９５℃、３０秒間
（２）  サイクル数：５０
条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間【００８０】
前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図１Ｂ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図１Ｂ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０−３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０−６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ）を示す。
前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。【００８１】
＜試験例１−４＞
健常人のｃＤＮＡを２種（サンプル１、サンプル２）用意し、これを５０倍希釈し、サンプルとした。
プライマー対及びプローブとして、前記調製例４で調製したβ−アクチン遺伝子用プライマー対（配列番号：６、７）及びプローブ（配列番号：８）を用いた。
リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例１−３におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例１−３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。【００８２】
前記試験例１−３で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のβ−アクチン遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、５．００μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、６．４０μｇ／ｍＬであった。【００８３】
試験例１−１〜１−４の結果から、健常人のｃＤＮＡ２種（サンプル１、サンプル２）におけるβ−アクチン  ｍＲＮＡ量に対するＡＤＡＭＴＳ５  ｍＲＮＡ量の相対比（Ｉｎｄｅｘ）は、サンプル１では、２．１４Ｉｎｄｅｘ、サンプル２では、３．４１Ｉｎｄｅｘとなった。【００８４】
（試験例２：リアルタイムＰＣＲによる定量）
市販のプライマー対及びプローブ（ＭＧＢプローブ）を用いて、下記試験例２−１〜２−４のリアルタイムＰＣＲを行った。
＜試験例２−１＞
コントロールＤＮＡとして、前記調製例１で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０−３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０−６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
プライマー対及びプローブとして、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号  Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表２−１に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。【００８５】
【表２−１】
2017199418.tif 000004
【００８６】
−反応時間−
以下の順に行った。
（１）  ５０℃、３０秒間
（２）  ９５℃、１０分間
（３）  サイクル数：５０
条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間【００８７】
前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図２Ａ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図２Ａ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０−３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０−６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ）を示す。
前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。【００８８】
＜試験例２−２＞
健常人のｃＤＮＡを２種（サンプル１、サンプル２）用意し、これを２倍希釈し、サンプルとした。
プライマー対及びプローブとして、前記試験例２−１と同様に、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号  Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例２−１におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例２−１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。【００８９】
前記試験例２−１で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、５．８６×１０−４μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、９．８０×１０−４μｇ／ｍＬであった。【００９０】
＜試験例２−３＞
コントロールＤＮＡとして、前記調製例３で調製したβ−アクチン遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０−３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０−６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
プライマー対及びプローブとして、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のβ−アクチン遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号  ４３３３７６２Ｆ；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表２−２に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。【００９１】
【表２−２】
2017199418.tif 000005
【００９２】
−反応時間−
以下の順に行った。
（１）  ５０℃、３０秒間
（２）  ９５℃、１０分間
（３）  サイクル数：５０
条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間【００９３】
前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図２Ｂ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図２Ｂ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０−３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０−６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ）を示す。
前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。【００９４】
＜試験例２−４＞
健常人のｃＤＮＡを２種（サンプル１、サンプル２）用意し、これを５０倍希釈し、サンプルとした。
プライマー対及びプローブとして、前記試験例２−３と同様に、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のβ−アクチン遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号  ４３３３７６２Ｆ；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例２−３におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例２−３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。【００９５】
前記試験例２−３で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のβ−アクチン遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、２．１２μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、２．７４μｇ／ｍＬであった。【００９６】
試験例２−１〜２−４の結果から、健常人のｃＤＮＡ２種（サンプル１、サンプル２）におけるβ−アクチン  ｍＲＮＡ量に対するＡＤＡＭＴＳ５  ｍＲＮＡ量の相対比（Ｉｎｄｅｘ）は、サンプル１では、２．７７Ｉｎｄｅｘ、サンプル２では、３．５８Ｉｎｄｅｘとなった。【００９７】
試験例１及び２の結果をまとめたものを表３に示す。【００９８】
【表３】
2017199418.tif 000006
【００９９】
試験例１及び２の結果から、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いてリアルタイムＰＣＲで定量した健常人のｃＤＮＡにおけるＡＤＡＭＴＳ遺伝子の発現量（Ｉｎｄｅｘ値）（試験例１）は、市販のＭＧＢプローブを用いてリアルタイムＰＣＲで定量した健常人のｃＤＮＡにおけるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の発現量（Ｉｎｄｅｘ値）（試験例２）とほぼ同じ値であった。
したがって、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いることにより、β−アクチン  ｍＲＮＡ量に対するＡＤＡＭＴＳ５  ｍＲＮＡ量の相対比を、従来の高コストであるＭＧＢプローブを用いる場合よりも低コストで、かつ同一の性能で定量できることが示された。【０１００】
（試験例３：リアルタイムＰＣＲの性能の比較）
前記調製例２で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対（配列番号：２、３）及びプローブ（配列番号：４）と、前記市販のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブセット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号  Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）とについて、リアルタイムＰＣＲの性能の比較を以下のようにして行った。【０１０１】
＜試験例３−１：本発明のプライマー対及びプローブ＞
前記試験例１−１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、各濃度のコントロールＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲを５回行い、それぞれについてＣｔ値を求めた。結果を表４に示す。【０１０２】
＜試験例３−２：市販のプライマー対及びプローブ＞
前記試験例２−１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、各濃度のコントロールＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲを５回行い、それぞれについてＣｔ値を求めた。結果を表４に示す。【０１０３】
【表４】
2017199418.tif 000007
【０１０４】
試験例３の結果から、低濃度（１．０×１０−６μｇ／ｍＬ）のコントロールＤＮＡをサンプルＤＮＡとした場合のＣｔ値は、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いた場合（試験例３−１：３２．３２）のほうが、市販のプライマー対及びプローブの組合せを用いた場合（試験例３−２：３４．８４）よりも有意（ｐ＜０．０１）に低かった。
したがって、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いることにより、ＡＤＡＭＴＳ５  ｍＲＮＡ量の絶対量を、従来のＭＧＢプローブを用いる場合よりも高い感度で検出できることが示された。【０１０５】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
＜２＞  前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを用いる前記＜１＞に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
＜３＞  更に、定量ＰＣＲにより、試料中のβ−アクチン遺伝子の量を測定する工程を含み、
前記β−アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーとを用いる前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
５’−ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６）
５’−ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ−３’  （配列番号：７）
＜４＞  前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを用いる前記＜３＞に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
５’−ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ−３’  （配列番号：８）
＜５＞  定量されるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量が、絶対量、及びβ−アクチン遺伝子の量に対する相対量の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
＜６＞  定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対であって、
前記プライマー対が、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とするプライマー対である。
５’−ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ−３’  （配列番号：２）
５’−ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （配列番号：３）
＜７＞  定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せであって、
前記プライマー対が、前記＜６＞に記載のプライマー対であり、
前記プローブが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブであることを特徴とするプライマー対とプローブとの組合せである。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
＜８＞  定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、
前記＜６＞に記載のプライマー対を含むことを特徴とするキットである。
＜９＞  更に、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを含む前記＜８＞に記載のキットである。
５’−ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ−３’  （配列番号：４）
＜１０＞  更に、β−アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーを含む前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載のキットである。
５’−ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６）
５’−ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ−３’  （配列番号：７）
＜１１＞  更に、前記β−アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを含む前記＜８＞から＜１０＞のいずれかに記載のキットである。
５’−ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ−３’  （配列番号：８）
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法によれば、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができるので、試料中の前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を指標とする薬剤の薬効予測などに好適に利用可能である。
本発明のプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキットは、本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法などに好適に利用可能である。【０１０７】
前記試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を指標とする薬剤の薬効予測としては、例えば、関節リウマチに対して抗ＴＮＦα抗体薬が有効か否かを評価する方法が挙げられる。
具体例としては、内在性コントロールとしてβ−アクチンを用いた場合における、ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量／β−アクチンのｍＲＮＡの発現量）が、０．６×１／２５より小さい場合には、関節リウマチに対してインフリキシマブが有効であると評価することができる。また、内在性コントロールとしてβ−アクチンを用いた場合における、ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量／β−アクチンのｍＲＮＡの発現量）が、４．０×１０−４以上の場合には、関節リウマチに対してアダリムマブが有効であると評価することができる。
【図１Ａ】
2017199418.tif 000008
【図１Ｂ】
2017199418.tif 000009
【図２Ａ】
2017199418.tif 000010
【図２Ｂ】
2017199418.tif 000011
【配列表】
2017199418000001.app
【国際調査報告】
2017199418.tif 000012
2017199418.tif 000013
2017199418.tif 000014
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