【手続補正書】
【提出日】平成17年10月14日(2005.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【図１】図１はＳＭＡ遺伝子領域のＹＡＣ連続アッセイである。ＹＡＣは実線で示されている。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、白四角は単一コピープローブを示す。遺伝学的に定義されたＳＭＡ区間であるＣＭＳ-1-ＣＭＡ-Ｄ5Ｓ557および従来のＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間をＹＡＣ上方に示した。
【図２】図２はＳＭＡ領域の長距離制限地図である。低頻度切断(Rare Cutter)部位は実線上方に示した。マーカーの最小セットをpYMC4トリプトファンに対応する実線t下方または左端に示した。ｕはpＹＭＣ4ウラシルまたは右端に対応する。遺伝的に定義されたＣＭＳ-1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間およびＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間は、それぞれ550kbと1.1Mbであると推定される。
【図３Ａ】図３ＡはCATT-1部位の増幅を示す。対立遺伝子サイズは各レーンの下方に示した。(Ａ)はＹＡＣの増幅であり、ＧはゲノムＤＮＡを示す。
【図３Ｂ】図３ＢはCATT-1部位の増幅を示す。対立遺伝子サイズは各レーンの下方に示した。(Ｂ)は第５染色体移動選別ライブラリ由来のコスミドの増幅である。４つの異なる対立遺伝子をコスミド40G1(対立遺伝子15)、58G12(対立遺伝子12)、192F7(対立遺伝子10)および250B6(対立遺伝子7)によって示した。
【図４】図４は我々の連続系列からマッピングされたコスミドの代表例を示す。実線上方の垂直線はＥcoＲl部位である。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、黒四角は単一コピープローブを示し、白四角は転写配列を示す。Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡を示すＳＴＲｓは星印で示した。コスミドlＧ3とlＧ9はＹＡＣ 76 Ｃlコスミドライブラリから得られる。
【図５】図５はp151.2によって同定されるＳＭＡ領域の配列重複である。ＹＡＣのハイブリダイゼーションは、(Ａ)では700bpのフラグメント、(Ｃ)では500bpのフラグメントを用いた。ＹＡＣは、左から右に、セントロメアからテロメアまでが配列されている。コスミドのハイブリダイゼーションは、(Ｂ)では700bpのフラグメント、(Ｄ)では500bpのフラグメントを用いた。(Ｂ)では、12kbのフラグメントがコスミドに検出されたが、20kbのフラグメントは存在しない。2.5kbのフラグメントおよび600kbのフラグメントは、それぞれ3Ｂ3と、ＩＥＩに検出されたが、これらは末端フラグメントである。(Ｄ)では、３kbのフラグメントしかコスミドに検出されなかった。24Ｄ6の20kbバンドは(Ａ)では検出されていないが、(Ｃ)では存在することに留意されたい。700bpフラグメントは24Ｄ6に検出される場合もある。
【図６】図６はＩ型ＳＭＡと各種多形性5q13.1標識との間に観察される連鎖不平衡度が、40Ｇ1で不平衡ピークを示す図である。
【図７】図７は9クローンから構成されるＣＡＴＴ領域を含み、約400kbに及ぶＰＡＣ連続系列を示す。
【図８】図８はＳＭＡ遺伝子の構造を示す。エクソンを黒枠で示し、上方に番号を付けた。制限部位が図示されているが、ＢはＢamＨＩ、ＥはＥcoＲＩ、ＮはＮotlである。エクソン４およびエクソン５(方式＃１)または方式＃２のエクソン５および６は全てのタイプのＳＭＡでしばしば欠失している。
【図９Ａ】図９は図６、１、７、および８のそれぞれに開示された内容を単ページに配置した図である。図９(Ａ)は、病状表現型および物理地図を伴った６つの5q13.1標識について、Ｉ型ＳＭＡ家族に観察される連鎖不平衡度の相関を示す。本明細書記載の主要な組換えによって定義されるＳＭＡ含有区間が示されている。不均衡のピークが、組換え体によって規定されたＳＭＡ区間のセントロメア末端に隣接していることに留意されたい。
【図９Ｂ】図９(Ｂ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＹＡＣ連続系列である。ＹＡＣおよびＰＡＣの連続系列については、ＳＴＳsを黒三角で示し、多形性縦列反復の多形性を白三角で示し、単コピークローンを黒四角で示した。特に、以下の点を留意されたい。すなわち、我々の物理地図は、星印を付けた対立遺伝子９を含むＣＭＳ下位部位を他のＣＭＡ下位部位のテロメア側に配置しており、遺伝的組換えデータによれば逆転が観察されることから、我々は、5q13.1のこの領域に変異型が存在することを確信している。
【図９Ｃ】図９(Ｃ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＰＡＣ連続系列である。
【図９Ｄ】図９(Ｄ)は、図８に詳細に記載されたＮＡＩＰの遺伝子構造である。
【図１０】図１０は、ＰＡＣ、非ＳＭＡ個体由来の胎児脳cＤＮＡクローンおよびＳＭＡ患者由来のＲＴ-ＰＣＲクローンのエクソン内容である。Ｅ158はグルタミン酸残基の欠失を示している。ＲＴ-ＰＣＲは方式＃２のエクソン１３とエクソン４の間で行われたが、この領域の外側では未検出の欠失がさらに存在することが考えられる。
【図１１Ａ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。図１１Ａでは、方式＃２に基づくエクソンを番号付けした黒枠として記した。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。図１１Ｂでは、明細書中で言及されている3kbおよび9.4kbのＥcoＲＩバンドを検出するＥcoＲＶクローンをＥＶと記した。図１４では欠失した4.8kbのＥcoＲＩ/ＢamＨＩバンドも記した。
【図１１Ｃ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。エクソン５およびエクソン６を含む6kbの領域とこの欠失から生じる23kbのＢamＨＩを、図１１Ｃに示した。エクソン５およびエクソン６の欠失を同定するために使用するプライマーと欠失ＮＡＩＰ遺伝子の切断フラグメントを同定するために使用するプライマーとの位置は、上記のＮＡＩＰ構造に示されている。
【図１１Ｄ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。エクソン５およびエクソン６を含む6kbの領域とこの欠失から生じる23kbのＢamＨＩを、図１１Ｄに示した。エクソン５およびエクソン６の欠失を同定するために使用するプライマーと欠失ＮＡＩＰ遺伝子の切断フラグメントを同定するために使用するプライマーとの位置は、上記のＮＡＩＰ構造に示されている。
【図１２】図１２は、ＮＡＩＰ遺伝子のイントロン／エクソンスのスプライス配列である。
【図１３】図１３は、ＮＡＩＰ部位のエクソン１３(方式＃２)をプローブとした成人組織のノーザンブロットである。組織は標識化され、フィルターは50℃、0.2×ＳＳＣで洗浄され、４日間露呈させた。バンドは、肝臓および胎盤に6-7kbの範囲で観察することかができる。
【図１４】図１４は、近親婚のフランス系カナダ人のIII型ＳＭＡ家族の家系分析結果およびサザンブロット結果である。上のパネルは、ＢamＨＩ/ＥcoＲＩで切断したゲノムＤＮＡを、ＮＡＩＰのエクソン２から９(方式＃２)までを含むcＤＮＡプローブで探索した結果、エクソン５および６(方式＃２)を含む4.8kbのフラグメントが全患者で損失し、フレーム内欠失が生じていることを示している。その他全員は、ホモの正常な姉弟を除き、このバンドの用量は半分であった。下のパネルは、同じ家族のＢamＨＩ断片を示す。患者では、2つの重なった14.5kbの連続フラグメントがＢamＨＩ部位を含む6kb配列を欠失しており、その結果23kbのバンドが生成されている(図１１参照)。家系のすべての個体の23kbのＢamＨＩバンドの存在は、母集団全体のばらつきと一致することに留意されたい。同様に、ＰＡＣ238Ｄ12に含まれ、かつ図１１に示される方式＃２のエクソン１から６までの欠失を示す9.6kbのＢamＨＩバンドが、非ＳＭＡキャリアーを含む個体すべてに確認することができる。
【図１５】図１５は、エクソン５(方式＃２)を増幅するプライマー1864および1863を用いてIII型家系21470および24561をＰＣＲ増幅した結果である。この反応は、エクソン１３(方式＃２)のプライマー1258および1343を用いて多数回行い、結果を曖昧にするＰＣＲの不良を除外した。増幅不良は、エクソン５(方式＃２)のホモ接合の不在に一致し、病状表現型と共分離することがわかる。
【図１６】図１６は、ＳＭＡ組織および非ＳＭＡ組織から得られたＲＴ-ＰＣＲ増幅の結果である。文字ｎは、非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡを指し、aはＳＭＡ疾患組織由来のＲＮＡを指す。組織源は、各パネルの上に示した。lymはリンパ芽球を指し、fibは繊維芽細胞を指す。a５を除くすべての試料はＩ型ＳＭＡ患者から得られ、a５は図１５に示す近親婚のIII型ＳＭＡ家系24561から得られた。ＲＮＡは、エクソン１３(方式＃２)から逆転写された。パネルＡおよびパネルＢに示される一次ＰＣＲ産物には、エクソン１のプライマー1884とエクソン１３のプライマー1285または1974を使用し、パネルＣに示される一次ＰＣＲ産物にはエクソン６のプライマー1919とエクソン１３のプライマーとを使用した。パネルＡの二次ＰＣＲには、エクソン４のプライマー1886とエクソン１３のプライマー1974とを使用し、パネルＢの二次ＰＣＲには、エクソン５のプライマー1864とエクソン１１のプライマー1979とを使用し、パネルＣの二次ＰＣＲには、エクソン９のプライマー1864とエクソン１３のプライマー1974とを使用した。生成産物の不良または増幅は、パネルＡの脊髄組織およびリンパ芽球組織の試料a２、a３、a４、a５、a６およびa７から確認することができる。パネルＢは、a２およびa３においてサイズが減少したバンドが増幅されたことを示し、a７においては挿入断片と一致して大型産物が増幅されたことを示している。パネルＣは、a２、a３、a９およびa１１においてエクソン１１および１２(方式＃２)の欠失と一致してバンドサイズが低減することを示している。