(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたかまたは組換えの核酸分子であって、該核酸分子は、
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０の１つ以上に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、
核酸分子。
【請求項２】
前記核酸が、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含み、
該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の単離されたかまたは組換えの核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子であって、
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む、
核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子であって、
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号４または配列番号６に示される核酸配列と少なくとも９５％同一である、
核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子であって、
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号４または配列番号６に示される核酸配列を有する、
核酸分子。
【請求項６】
前記シアリルトランスフェラーゼは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、二機能性シアリルトランスフェラーゼであり、そして
該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号４に示される核酸配列と、少なくとも９５％同一である、
請求項３に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分子を含む、発現カセット。
【請求項８】
請求項７に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有する単離されたかまたは組換え産生されたポリペプチドであって、
該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、組換え産生され、そして少なくとも部分精製されている、請求項１０に記載の単離されたかまたは組換え産生されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが異種宿主細胞によって発現されている、請求項１０に記載の単離されたかまたは組換え産生されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１２に記載の単離されたかまたは組換え産生されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：２ポリペプチドである、請求項１０に記載の単離されたかまたは組換え産生されたポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドであり、該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有し、そして配列番号３に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４由来のＬＯＳ生合成遺伝子座のＯＲＦ７ａによってコードされるｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有し、そして配列番号５に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１０由来のｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有し、そして配列番号７に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：４１由来のｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；ならびに
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号１０に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：２のｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
からなる群より選択される、
請求項１０に記載の単離されたかまたは組換え産生されたポリペプチド。
【請求項１６】
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
請求項１５に記載の単離されたかまたは組換え産生されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドポリペプチド。
【請求項１７】
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する、
請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
シアル化されたオリゴサッカリドの合成のための反応混合物であって、該反応混合物は、
配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド；
ガラクトシル化アクセプター部分；および
シアリルヌクレオチド糖
を含み；ここで、
該シアリルトランスフェラーゼは、α２，３結合において、該シアリルヌクレオチド糖から該ガラクトシル化アクセプター部分へと、第一のシアル酸残基を転移させ、そしてα２，８結合において，第二のシアル酸残基を該第一のシアル酸残基へとさらに転移させる、
反応混合物。
【請求項１９】
前記シアリルヌクレオチド糖は、ＣＭＰシアル酸である、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２０】
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２１】
前記ガラクトシル化アクセプターは、式Ｇａｌβ１，４−ＲまたはＧａｌβ１，３−Ｒを有する化合物を含み、ここで、該Ｒは、Ｈ；サッカリド；オリゴサッカリド；または少なくとも１つの炭水化物原子を有するアグリコン基；からなる群より選択される、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２２】
前記ガラクトシル化アクセプターは、タンパク質、脂質またはプロテオグリカンに付着している、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２３】
前記シアル化オリゴサッカリドは、ガングリオシド、ガングリオシド模倣物またはガングリオシドの炭水化物部分である、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２４】
前記シアル化オリゴサッカリドは、リゾガングリオシド、リゾガングリオシド模倣物、またはリゾガングリオシドの炭水化物部分である、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２５】
前記ガラクトシル化アクセプター部分は、Ｇａｌ４Ｇｌｃ−Ｒ1およびＧａｌ３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ2からなる群より選択される式を有する化合物を含み；ここで、
該Ｒ1は、セラミドおよび他の糖脂質からなる群より選択され、そして該Ｒ2は、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、および（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群より選択される、請求項２３に記載の反応混合物。
【請求項２６】
前記ガラクトシル化アクセプターは、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、Ｇａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、およびＧａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群より選択される、請求項２５に記載の反応混合物。
【請求項２７】
前記ガラクトシル化アクセプターは、アクセプターサッカリドをＵＤＰ−Ｇａｌおよびガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドと接触させることによって形成され、ここで、該ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｇａｌ残基を、該ＵＤＰ−Ｇａｌから該アクセプターへと転移させる、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２８】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、そして配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の反応混合物。
【請求項２９】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の反応混合物。
【請求項３０】
前記アクセプターサッカリドは、末端ＧａｌＮＡｃ残基を含む、請求項２７に記載の反応混合物。
【請求項３１】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼについての前記アクセプターサッカリドは、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼについてのアクセプターを、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドと接触させることによって形成され、ここで、該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、ＧａｌＮＡｃ残基を、該ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃから、該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼについてのアクセプターへと転移させる、請求項３０に記載の反応混合物。
【請求項３２】
前記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有し、そして配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の反応混合物。
【請求項３３】
前記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３２に記載の反応混合物。
【請求項３４】
シアル化オリゴサッカリドを合成するための方法であって、該方法は、
適切な条件下で反応混合物をインキュベートする工程であって、該反応混合物は、
配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド；
ガラクトシル化アクセプター部分；および
シアリルヌクレオチド糖
を含み、該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有し、該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α２，３結合において、該シアリルヌクレオチド糖から該ガラクトシル化アクセプター部分へ第一のシアル酸残基を転移させ、そしてα２，８結合において第二のシアル酸残基を該第一のシアル酸残基へとさらに転移させる、工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記シアル化オリゴサッカリドがガングリオシドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記シアル化オリゴサッカリドは、ガングリオシド、リゾガングリオシド、ガングリオシド模倣物、またはリゾガングリオシド模倣物である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物を含む、オリゴサッカリドの酵素合成の分野に関する。
【０００２】
（背景）
ガングリオシドは、しばしば、細胞膜において見出される、３つの成分からなる糖脂質のクラスである。１つ以上のシアル酸残基は、オリゴサッカリドまたは糖質コア部分に結合される。次いで、このシアル酸残基は、一般に細胞膜に包埋される疎水性脂質（セラミド）構造に結合される。このセラミド部分は、長鎖塩基（ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｂａｓｅ）（ＬＣＢ）部分および脂肪酸（ＦＡ）部分を含む。ガングリオシドおよび他の糖脂質、ならびにそれらの構造は、一般に、例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）２８７−２９５頁およびＤｅｖｌｉｎ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９２）において議論される。ガングリオシドは、糖質部分におけるモノサッカリドの数、ならびに糖質部分に存在するシアル酸基の数および位置に従って分類される。モノシアロガングリオシドは、と「ＧＭ」命名され、ジシアロガングリオシドは、「ＧＤ」と命名され、トリシアロガングリオシドは、「ＧＴ」と命名され、そしてテトラシアロガングリオシドは、「ＧＱ」と命名される。さらに、ガングリオシドは、シアル酸残基または残基の結合の位置に依存して分類される。さらなる分類は、４つのサッカリド残基を有するガングリオシド（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）を示す下付文字「１」、トリサッカリド（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）ガングリオシド、ジサッカリド（Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）ガングリオシド、およびモノサッカリド（Ｇａｌ−セラミド）ガングリオシドそれぞれを示す、下付文字「２」、「３」、および「４」を有する、オリゴサッカリドコアに存在するサッカリドの数に基づく。
【０００３】
ガングリオシドは、脳、特に、神経の末端において最も豊富である。これらは、アセチルコリンを含む、神経伝達物質についてのレセプター部位に存在すると考えられており、そしてまた、インターフェロン、ホルモン、ウイルス、細菌毒素などを含む、他の生体高分子についての特異的レセプターとして作用し得る。ガングリオシドは、大脳虚血性発作（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ）を含む、神経系障害の処置のために用いられている。例えば、Ｍａｈａｄｎｉｋら（１９８８）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓ．１５：  ３３７−３６０；米国特許第４，７１０，４９０号および同第４，３４７，２４４号；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（１９８８）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．１７４：５９３−６００；Ｋａｒｐｉａｔｚら（１９８４）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．１７４：４８９−４９７を参照のこと。特定のガングリオシドは、ヒト造血細胞の表面上で見出される（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄら（１９７２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２６０：２７２−２７８；Ｍａｃｈｅｒら（１９８１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：  １９６８−１９７４；Ｄａｃｒｅｍｏｎｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４２４：  ３１５−３２２；Ｋｌｏｃｋら（１９８１）  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ７：  ２４７）。これらのガングリオシドは、ヒト造血細胞の末端顆粒球分化において役割を果たし得る。Ｎｏｊｉｒｉら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７４４３−７４４６を参照のこと。これらのガングリオシド（「ネオラクト（ｎｅｏｌａｃｔｏ）シリーズといわれる」）は、式［Ｇａｌβ−（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（ｌ，３）］nＧａｌβ（ｌ，４）Ｇｌｃ（ここで、ｎ＝１−４）を有する中性コアオリゴサッカリド構造を有する。これらのネオラクトシリーズのガングリオシドとしては、３’−ｎＬＭl（ＮｅｕＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）Ｇａｌβ（１，４）−Ｇｌｃβ（１，１）−セラミド）および６’−ｎＬＭ1（ＮｅｕＡｃα（２，６）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）Ｇａｌβ（１，４）−Ｇｌｃβ（１，１）−セラミド）が挙げられる。
【０００４】
ガングリオシド「模倣物」は、いくつかの病原性生物と関連する。例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９株の低分子量ＬＰＳのコアオリゴサッカリドは、ガングリオシドに分子相同性を示すことが示された。１９７０代後半以降、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉは、ヒトにおける急性胃腸炎の重要な原因であると認識されている（Ｓｋｉｒｒｏｗ（１９７７）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．２：９−１１）。疫学的な研究は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染よりも先進国において、より一般的であり、そしてこれらはまた、発展途上国における下痢症状の主な原因であることを示している（Ｎａｃｈａｍｋｉｎら（１９９２）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）。急性胃腸炎を引き起こすことに加えて、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ感染は、ギャン−バレー諸侯群の発症のよくある前駆状態（全身麻痺の最も通常の原因である神経障害の形成）として考えられている（Ｒｏｐｐｅｒ（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１１３０〜１１３６）。ギャン−バレー症候群と最も一般的に関連するＣ．ｊｅｊｕｎｉの血清型はＯ：１９であり（Ｋｕｒｏｋｉら（１９９３）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３：２４３〜２４７）、そしてこのことは、この血清型に属する株のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）の構造の詳細な研究へと駆り立てた（Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２１２２−２１２５；Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：２４１〜２４９；およびＡｓｐｉｎａｌｌら（１９９４ｃ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：２５０〜２５５）。
【０００５】
ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＭ１、およびＧＴ１ａのガングリオシドのオリゴサッカリド部分と同一の末端オリゴサッカリド部分は、種々のＣ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９株において見出されている。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４は、血清型Ｏ：１９に属し、そして下痢の発作の後にギャン−バレー症候群を発症した患者から単離された（Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４ａ）前出）。このことは、トリシアリル化ガングリオシドＧＴ１ａを模倣する外部コアＬＰＳを有することを示した。ＬＰＳのサッカリド部分による宿主構造の分子相同性は、免疫応答を回避するためのこのストラテジーを使用する種々の粘膜病原体の病原性因子であると考えられる（Ｍｏｒａｎら（１９９６ａ）  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１０５−１１５；Ｍｏｒａｎら（１９９６ｂ）Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ．３：５２１−５３１）。
【０００６】
従って、ＬＰＳ合成に関与する遺伝子の同定およびそれらの調節の研究を、これらの細菌により用いられる病原性機構のより良好な理解のためにかなり興味深いものにする。さらに、治療薬としてのガングリオシドの使用、およびガングリオシドの機能の研究は、所望のガングリオシドおよびガングリオシド模倣物を合成する簡便かつ効果的な方法により促進される。３’−ｎＬＭ1および６’−ｎＬＭ1の合成に対する酵素学的アプローチと化学的アプローチとの組み合わせが記載されている（ＧａｕｄｉｎｏおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１１４９−１１５０）。しかし、ガングリオシド合成のために以前に利用可能な酵素学的方法は、十分に低いコストで、実際的な大規模ガングリオシド合成のために、十分な量で酵素を有効に産生することの難しさに遇う。従って、大規模生産に受け入れられるガングリオシド合成に関与する新規の酵素の存在が必要である。ガングリオシドを合成するための、より有効な方法の存在もまた必要である。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼ酵素およびその酵素をコードする核酸を提供する。１つの実施形態において、本発明は、以下：
ａ）リピドＡ生合成アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４の生合成遺伝子座のヌクレオチド３５０−１２３４（ＯＲＦ  ２ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４の生合成遺伝子座のヌクレオチド１２３４−２４８７（ＯＲＦ  ３ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４の生合成遺伝子座のヌクレオチド２７８６−３９５２（ＯＲＦ  ４ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約１００アミノ酸長の領域にわたって少なくとも約５０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｄ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって少なくとも約７７％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｅ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを有するポリペプチドであって、上記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって少なくとも約７５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｆ）α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０の１つ以上に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって少なくとも６６％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｇ）シアル酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド６９２４−７９６１によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｈ）シアル酸生合成活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド８０２１−９０７６によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｉ）ＣＭＰシアル酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９０７６−９７３８によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｊ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９７２９−１０５５９によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；ならびに
ｋ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１０５５７−１１３６６によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離され、そして／または組換えの核酸分子を提供する。
【０００８】
現在好ましい実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する：ａ）α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７６％同一であるアミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；ｂ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドであって、上記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；およびｃ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、上記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を包含する、ポリペプチド。
【０００９】
本発明により提供されるのはまた、発現カセットおよび発現ベクターであって、ここで本発明のグリコシルトランスフェラーゼ核酸は、プロモーターおよび所望の宿主細胞においてそのグリコシルトランスフェラーゼの発現を容易にする他の制御配列と作動可能に連結される。本発明のグリコシルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞もまた提供される。
【００１０】
本発明はまた、以下からなる群より選択される、単離され、そして／または組換え産生されたポリペプチドを提供する：
ａ）リピドＡ生合成アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４の生合成遺伝子座のヌクレオチド３５０−１２３４（ＯＲＦ  ２ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４の生合成遺伝子座のヌクレオチド１２３４−２４８７（ＯＲＦ  ３ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４の生合成遺伝子座のヌクレオチド２７８６−３９５２（ＯＲＦ  ４ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約１００アミノ酸長の領域にわたって少なくとも約５０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｄ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって少なくとも約７７％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｅ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを有するポリペプチドであって、上記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって少なくとも約７５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｆ）α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０の１つ以上に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって少なくとも６６％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｇ）シアル酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド６９２４−７９６１によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｈ）シアル酸生合成活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド８０２１−９０７６によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｉ）ＣＭＰシアル酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９０７６−９７３８によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｊ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９７２９−１０５５９によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；ならびに
ｋ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１０５５７−１１３６６によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一である、アミノ酸配列を包含する、ポリペプチド。
【００１１】
現在好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する：ａ）α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７６％同一であるアミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；ｂ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドであって、上記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；およびｃ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、上記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を包含する、ポリペプチド。
【００１２】
本発明はまた、シアル化オリゴサッカリドの合成のための反応混合物を提供する。この反応混合物は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含む。その反応混合物に存在するのはまた、ガラクトシル化アクセプター部分およびシアリルヌクレオチド糖である。そのシアリルトランスフェラーゼは、第一のシアル酸残基を、α２，３結合においてそのシアリルヌクレオチド糖（例えば、ＣＭＰシアル酸）から、そのガラクトシル化アクセプター部分へと転移させ、そしてα２，８結合において第二のシアル酸残基をその第一のシアル酸残基へとさらに付加する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、シアル化オリゴサッカリドを合成するための方法を提供する。これらの方法は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、ガラクトシルアクセプター部分ならびにシアリルヌクレオチド糖を含む反応混合物を、適切な条件下でインキュベートする工程を包含する。ここで、そのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、第一のシアル酸残基を、α２，３結合においてそのシアリルヌクレオチド糖からそのガラクトシル化アクセプター部分へと転移させ、そしてα２，８結合において第二のシアル酸残基をその第一のシアル酸残基へとさらに転移させる。
【００１４】
（詳細な説明）
（定義）
本発明のグリコシルトランスフェラーゼ、反応混合物および方法は、モノサッカリドをドナー基質からアクセプター分子に転移させるために有用である。この付加は一般に、オリゴヌサッカリドまたは生体分子の炭水化物部分の非還元末端で起きる。本明細書で定義される場合、生体分子としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：生物学的に重要な分子（例えば、炭水化物、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、および脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質およびガングリオシド））。
【００１５】
本明細書中で以下の略語が使用される：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。
【００１６】
用語「シアル酸」とは、９炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーをいう。シアル酸ファミリーの最も普通のメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（２−ｋｅｔｏ−５−ａｃｅｔａｍｉｎｄｏ−３，５−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ−１−ｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））（しばしば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと省略される）である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコシル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここでは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙ−ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９）。９−置換シアル酸（例えば、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ）もまた含まれる。シアル酸ファミリーの概説については、例えば、Ｖａｒｋｉ（１９９２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０：６４−８９（１９８７）およびＳｃｈａｕｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：１３１−２３４）を参照のこと。シアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０に開示される。
【００１７】
グリコシルトランスフェラーゼについてのドナー基質は、活性化されたヌクレオチド糖である。このような活性化された糖は一般的には、ウリジン二リン酸およびグアノシン二リン酸およびこれらの糖のシチジン一リン酸誘導体からなり、ここでヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸は、脱離基として作用する。細菌系、植物系および真菌系はときどき、他の活性化ヌクレオチド糖を用い得る。
【００１８】
オリゴサッカリドは、そのサッカリドが還元末端で実際に還元糖であるか否かにかかわらず、還元末端および非還元末端を有するとみなされる。受け入れられた命名法に従って、オリゴサッカリドは、本明細書中で、非還元末端が左に、そして還元末端が右に表現される。
【００１９】
本明細書中に記載される全てのオリゴサッカリドは、非還元サッカリドについての名称または略語（例えば、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合（αまたはβ）の立体配置、環の結合、結合に関与する還元サッカリドの環の位置、次いで還元サッカリドの名称または略語（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）を用いて記載される。２つの糖の間の結合は、例えば、２，３、２→３、または（２，３）として表現され得る。各々のサッカリドは、ピラノースまたはフラノースである。
【００２０】
用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをいい、そして他に限定しない限り、天然に生じるヌクレオチドに類似の様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む。他に示さない限りは、特定の核酸配列は、その相補的な配列を含む。
【００２１】
用語「作動可能に連結される」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的な結合をいい、ここでこの発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を与える。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」は、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来するもの、または同一の供給源由来である場合、そのもともとの形態から改変されたものである。従って、宿主細胞における異種グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内在性であるが、改変されているグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。異種配列の改変は、例えば、制限酵素を用いてＤＮＡを処理して、プロモーターに作動可能に連結され得るＤＮＡフラグメントを産生することによって生じ得る。部位特異的変異誘発のような技術もまた、異種配列を改変するために有用である。
【００２３】
細胞に関連して使用される場合、用語「組換え」は、細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞中で見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブな形態の細胞において見出されるが、人工的な手段によって改変され、そして細胞に再導入された遺伝子を含む細胞を含む。この用語はまた、細胞由来の核酸を除去することなく改変された細胞に対して内在性である核酸を含む細胞を含む；このような改変は、当業者に公知の遺伝子置換、部位特異的変異、および関連する技術によって得られる改変を含む。
【００２４】
「組換え核酸」は、その天然の状態から変化した形態の核酸である。例えば、用語「組換え核酸」は、その核酸が、天然に存在する形態では連結されていない、プロモーターおよび／または他の発現制御領域、プロセシングシグナル、別のコード領域などに作動可能に連結されているコード領域を含む。「組換え核酸」はまた、例えば、天然に存在する対応する核酸と比較して１以上のヌクレオチドが置換、欠失、挿入されている、コード領域または他の核酸を含む。この改変としては、インビトロ操作、インビボ改変、合成法などによって導入された改変が挙げられる。
【００２５】
「組換え産生されたポリペプチド」は、組換えおよび／または異種の核酸によってコードされるポリペプチドである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中に導入された、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉグリコシルトランスフェラーゼコード核酸から発現されるポリペプチドは、「組換え産生されたポリペプチド」である。非ネイティブプロモーターに作動可能に連結されている核酸から発現されるタンパク質は、「組換え産生されたポリペプチド」の一例である。本発明の組換えによって産生されるポリペプチドを用いて、ガングリオシドおよび他のオリゴサッカリドをその未精製形態で（例えば、細胞溶解産物またはインタクトな細胞として）、または完全もしくは部分的に精製した後に合成し得る。
【００２６】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、このような配列に適合可能な宿主中の構造遺伝子の発現に作用し得る核酸エレメントを有する、組換え的にまたは合成的に産生された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーター、および必要に応じて、転写終結シグナルを含む。代表的には、組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）およびプロモーターを含む。発現をもたらすうえで必要であるか、または補助になるさらなる因子もまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞中からの、発現されたタンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。遺伝子発現に影響を与える、転写終結シグナル、エンハンサー、および他の核酸配列もまた、発現カセット中に含まれ得る。
【００２７】
「部分配列」とは、核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）それぞれの、より長い配列の一部分を含む、核酸またはアミノ酸の配列をいう。
【００２８】
用語「単離された」は、そのネイティブな状態において見出される物質に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいうことを意味する。代表的には、本発明の単離されたタンパク質または核酸は、少なくとも約８０％純粋、通常少なくとも約９０％、および好ましくは少なくとも約９５％純粋である。純度または均質性は、当該分野で周知の多くの手段（例えば、タンパク質サンプルまたは核酸サンプルのアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて染色による可視化）によって示され得る。特定の目的のために、高解像度が必要とされ、ＨＰＬＣまたは精製のための類似の手段が利用される。「単離された」酵素は例えば、酵素の活性を妨害する成分を実質的にまたは本質的に含まない酵素である。「単離された核酸」としては例えば、その核酸が天然に存在する細胞の染色体には存在しない核酸が挙げられる。
【００２９】
２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列の状況における、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してかまたは目視検査によって測定したとき、最大に一致するように比較されそして整列される場合に、同一かまたは指定されたパーセンテージの同一なアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。
【００３０】
２個の核酸またはポリペプチドの状況における、用語「実質的に同一」とは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してかまたは目視検査によって測定したとき、最大に一致するように比較されそして整列される場合に、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、２個以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そして最も好ましくは、この配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施態様において、この配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００３１】
配列の比較について、代表的には、１個の配列が参照配列として作用し、これに対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列を、コンピューターに入力し、必要とされる場合、続く調整を指定して、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、この配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムのパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算定する。
【００３２】
比較のための配列の最適な整列を、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の検索によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のコンピュータによる実行によって、または目視検査によって実施し得る（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃとの間の合弁会社（１９９５補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）。
【００３３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌら（１９７７）Ｎｕｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２にそれぞれ記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用可能である。例えば、比較は、ワード長（Ｗ）が１１、Ｇ＝５、Ｅ＝２、ｑ＝−２およびｒ＝１、ならびに両鎖の比較とともにＢＬＡＳＴＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０アルゴリズムを用いて行われ得る。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０アルゴリズム、ワード長（Ｗ）が３、Ｇ＝１１、Ｅ＝１およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリクスのデフォールト値とともに用い得る（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。
【００３４】
配列同一性パーセントを算定することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２個の配列間の類似性の統計学的分析を実行する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２個のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最少合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は、参照配列に類似するとみなされる。
【００３５】
句「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、配列が複合混合物（例えば、総細胞性）のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合、ストリンジェントな条件下で、その特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子が結合すること、二重体化すること、またはハイブリダイズすることをいう。用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる状況下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列について熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に対して相補的なプローブの５０％が、平衡において標的配列にハイブリダイズする温度である（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下）。（標的配列が一般に過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が、平衡を占められる）。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａイオン未満、代表的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａのイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０個〜５０個のヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０個のヌクレオチドを超える）に対しては、少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加により達成され得る。
【００３６】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、下記のように、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合、代表的には、第２のポリペプチドに実質的に同一である。２つの核酸配列が、実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子が、下記のように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００３７】
句「タンパク質に特異的に結合する」または「〜と特異的に免疫反応性である」とは、抗体を参照する場合に、タンパク質および他の生物剤の異種集団の存在下でタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定された抗体は、特定のタンパク質に優先的に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量で結合しない。このような条件下でのタンパク質に対する特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とする。種々のイムノアッセイ形式を使用し、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００３８】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変された改変」とは、同一のアミノ酸配列または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをいうか、またはポリヌクレオチドが、アミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列をいう。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧが、すべてアミノ酸アルギニンをコードする。従って、あらゆる位置で、アルギニンがコドンによって特定される場合、このコドンは、コードされたポリペプチドの変更を伴わずに、記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸改変は、「サイレントな改変」であり、これは、「保存的に改変された改変」の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中で記載されるあらゆるポリヌクレオチド配列はまた、別段の通知がある場合を除いて、あらゆる起こりうるサイレントな改変を記載する。当業者は、核酸中の各々のコドン（ＡＵＧを除く、これは、通常、メチオニンについての唯一のコドンである）が、標準的技術によって、機能的に同一な分子を得るために改変され得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各々の「サイレントな改変」は、各々の記載される配列に内在する。
【００３９】
さらに、当業者は、コードされた配列において、単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸（代表的には、５％未満、より代表的には、１％未満）を変更するか、付加するか、または欠失する個々の置換、欠失または付加が、「保存的に改変された改変」であることを認識し、ここで、この変更は、化学的に類似のアミノ酸を有するアミノ酸の置換を生じる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。当業者は、融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸の多くの保存的改変が、本質的に同一の産物を得ることを理解する。例えば、遺伝コードの縮重に起因して、「サイレントな置換」（すなわち、コードされたポリペプチドにおいて変更を生じない核酸配列の置換）が、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列の含蓄された特徴である。本明細書中で記載されるように、配列は、好ましくは、酵素を産生するために用いられる特定の宿主細胞（例えば、酵母、ヒトなど）における発現のために最適化される。同様に、アミノ酸配列中の１またはいくらかのアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は、高度に類似の性質を有する異なるアミノ酸で置換されるか（上記の定義の節を参照のこと）、また、特定のアミノ酸配列と高度に類似するように容易に同定されるか、またはアミノ酸をコードする特定の核酸配列に高度に類似するように容易に同定される。このような任意の特定の配列の保存的に置換された改変が、本発明の特徴である。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙもまた、参照のこと。さらに、コードされた配列における単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更するか、付加するか、または欠失する個々の置換、欠失または付加はまた、「保存的に改変された改変」である。
【００４０】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、新規なグリコシルトランスフェラーゼ酵素、ならびに酵素により触媒されるオリゴサッカリド合成に関与する他の酵素を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼを含み、これは、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、二機能性シアリルトランスフェラーゼを含む。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、シアル酸シンターゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、および他のグリコシルトランスフェラーゼもまた、提供される。本発明の酵素は、原核生物の酵素であり、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの種々の株におけるリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）の生合成に関与するものを含む。本発明はまた、これらの酵素をコードする核酸、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを発現する際に使用するための発現カセットおよび発現ベクターを提供する。さらなる実施形態においては、本発明は、オリゴサッカリドを合成するために１つ以上の酵素が使用される、反応混合物および方法を提供する。
【００４１】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、いくつかの目的のために有用である。例えば、これらのグリコシルトランスフェラーゼは、オリゴサッカリド（ガングリオシドおよび生物学的活性を有する他のオリゴサッカリドを含む）の化学−酵素合成のためのツールとして有用である。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ、およびこのグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸はまた、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのような、ガングリオシド模倣物を合成する生物の病因機構の研究のために有用である。これらの核酸は、例えば、ガングリオシド模倣物の合成に関与する遺伝子の発現を研究するためのプローブとして、使用され得る。グリコシルトランスフェラーゼに対して惹起される抗体はまた、病因に関与するこれらの遺伝子の発現パターンの分析のために、有用である。これらの核酸はまた、宿主の免疫系から病原体をマスクし得る、ガングリオシド模倣物の生合成に関与する、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ酵素の発現を阻害するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するために、有用である。
【００４２】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、以前に入手可能であったグリコシルトランスフェラーゼより優れたいくつかの利点を提供する。本発明のもののような細菌のグリコシルトランスフェラーゼは、対応する哺乳動物の構造と同じであるオリゴサッカリドの形成を触媒し得る。さらに、細菌の酵素は、哺乳動物のグリコシルトランスフェラーゼと比較して、多量の生成が容易でありかつ安価である。従って、本発明のもののような細菌のグリコシルトランスフェラーゼは、哺乳動物のグリコシルトランスフェラーゼ（これは、大量に入手することが困難であり得る）の魅力的な置換物である。本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、細菌起源であり、比較的安価な原核生物の発現系を使用して、酵素の大量の発現を容易にする。代表的に、ポリペプチド産物の発現のための原核生物系は、哺乳動物細胞培養系におけるポリペプチドの発現より、ずっと低い費用を含む。
【００４３】
さらに、本発明の新規な二機能性シアリルトランスフェラーゼは、生物学的に重要な分子（例えば、ガングリオシドであり、これは、α２，８結合によって第二のシアル酸に付着するシアル酸を有し、この第二のシアル酸が次に、ガラクトシル化アクセプターにα２，３結合する）の酵素的合成を簡単にする。これらの構造を合成するための以前の方法は、２つの別個のシアリルトランスフェラーゼを必要としたが、本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼを使用する場合には、１つのみのシアリルトランスフェラーゼが必要とされる。このことは、第二の酵素を得ることに関する費用を回避し、そしてまた、これらの化合物の合成に関与する工程の数を減少させ得る。
【００４４】
（Ａ．グリコシルトランスフェラーゼおよび関連する酵素）
本発明は、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド、ならびにオリゴサッカリド（ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物を含む）のグリコシルトランスフェラーゼにより触媒される合成に関与する他の酵素を提供する。現在好ましい実施形態おいては、このポリペプチドは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種のリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）遺伝子座内のオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドを含む（図１）。本発明の酵素のうちでもとりわけ、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ（二機能性シアリルトランスフェラーゼを含む））、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、およびβ１，３−ガラクトリストランスフェラーゼが、本明細書中に記載されるような他の酵素のうちでもとりわけ、含まれる。また、例えば、ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼ、シアル酸シンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、リピドＡ生合成に関与するアシルトランスフェラーゼ、およびシアル酸生合成に関与する酵素のような、補助酵素（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｅｎｚｙｍｅ）が提供される。
【００４５】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび補助ポリペプチド（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、天然供給源（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種のような原核生物）から精製され得る。現在好ましい実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉから、特に、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１９（ＯＨ４３８４株およびＯＨ４３８２株を含む）から得られる。また、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１０、Ｏ：４１、およびＯ：２から得られるグリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素が提供される。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが精製され得る方法は、標準的なタンパク質精製方法を含み、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと）。
【００４６】
現在好ましい実施形態において、本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素ポリペプチドは、本明細書中に記載される、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸および補助酵素をコードする核酸を使用して、組換え発現によって得られる。グリコシルトランスフェラーゼを生成するための発現ベクターおよび方法は、以下に詳細に記載される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、組換え的に産生されようとそれらの天然の細胞から精製されようと、それらの天然の環境から単離される。少なくとも約９０〜９５％の均一性の、実質的に純粋な組成が、いくつかの応用については好ましく、そして９８〜９９％以上の均一性が、最も好ましい。一旦、所望により部分的にまたは均一に精製されると、このポリペプチドは使用され得る（例えば、抗体産生もしくはオリゴサッカリドの合成のための免疫原として、または本明細書中に記載されるかもしくは当業者に理解されるような他の用途で）。しかし、このグリコシルトランスフェラーゼは、所望のサッカリド構造を合成するための使用については、部分的にさえ精製される必要は必ずしもない。例えば、本発明は、異種宿主細胞において、および／または組換え核酸から発現される、組換え的に産生された酵素を提供する。本発明のこのような酵素は、細胞溶解物内またはインタクトな細胞内に、ならびに精製された形態で存在する場合に、使用され得る。
【００４８】
（１．シアリルトランスフェラーゼ）
いくつかの実施形態において、本発明は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。このシアリルトランスフェラーゼは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有し、そしていくつかの場合は、α２，８シアリルトランスフェラーゼ活性をまた有する。これらの二機能性シアリルトランスフェラーゼは、適切なサッカリドアクセプター（例えば、末端ガラクトースを有するサッカリド）およびシアル酸ドナー（例えば、ＣＭＰ−シアル酸）を有する反応混合物中に配置される場合、α２，３結合におけるドナーからアクセプターへの、第１のシアル酸の移動を触媒し得る。次いで、シアリルトランスフェラーゼは、α２，８結合におけるシアル酸ドナーから第１のシアル酸残基への、第２のシアル酸の移動を触媒する。この型のシアα２，８−シアα２，３−Ｇａｌ（Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌ）構造は、しばしば、図４に示されるようなＧＤ３およびＧＴ１ａを含むガングリオシド中に見出される。
【００４９】
本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのようなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種に見出される例である。本発明の現在好ましい二機能性シアリルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１９のシアリルトランスフェラーゼである。二機能性シアリルトランスフェラーゼの１つの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４の例であり；このシアリルトランスフェラーゼは、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する。本発明の他の二機能性シアリルトランスフェラーゼは、一般的に、少なくとも約６０アミノ酸の長さの領域にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４二機能性シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に少なくとも約７６％同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明のシアリルトランスフェラーゼは、少なくとも６０アミノ酸の長さの領域にわたって、ＯＨ４３８４シアリルトランスフェラーゼアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一であり、そしてさらにより好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一である。現在好ましい実施形態において、パーセント同一性の領域は、６０アミノ酸よりも長い領域にわたって広がる。例えば、より好ましい実施形態において、類似性領域は、少なくとも約１００アミノ酸の長さの領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１５０アミノ酸の長さの領域にわたって、そして最も好ましくはシアリルトランスフェラーゼの全長にわたって広がる。従って、本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性のいずれかまたは両方を有し、そしてそれぞれのシアリルトランスフェラーゼ活性を保持するのに必要なポリペプチドの領域にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ  ４３８４  ＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼ（配列番号３）のアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％同一性、より好ましくは少なくとも約７０％同一性、より好ましくは少なくとも約８０同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０同一性であるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼの全長にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ  ４３８４  ＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼに同一である。
【００５０】
本発明はまた、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するが、α２，８シアリルトランスフェラーゼ活性をほとんどまたは全く有さないシアリルトランスフェラーゼを提供する。例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９  血清株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ）（配列番号９）のＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼは、株ＯＨ  ４３８４のシアリルトランスフェラーゼとは８アミノ酸だけ異なるが、それにもかかわらず実質的にα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性を欠損する（図３）。Ｏ：２血清型株ＮＣＴＣ１１１６８（配列番号１０）由来の対応するシアリルトランスフェラーゼは、ＯＨ４３８４のシアリルトランスフェラーゼに５２％同一であり、そしてまた、α２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性をほとんどまたは全く有さない。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株Ｏ：１０（配列番号５）およびＯ：４１（配列番号７）のＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼに実質的に同一であるシアリルトランスフェラーゼもまた、提供される。本発明のシアリルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１０（配列番号５）、Ｏ：４１（配列番号７）、Ｏ：１９血清株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ）（配列番号９）、またはＯ：２血清型株ＮＣＴＣ１１１６８（配列番号１０）のアミノ酸配列に、少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは少なくとも約９０％同一であるシアリルトランスフェラーゼを含む。本発明のシアリルトランスフェラーゼは、いくつかの実施形態において、Ｏ：１０、Ｏ：４１、Ｏ：１９血清株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ）またはＮＣＴＣ１１１６８  Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株のアミノ酸配列に同一であるアミノ酸を有する。
【００５１】
パーセント同一性は、検査によって決定され得るか、または例えば、デフォルトパラメーター（例えば、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）が３、Ｇ＝１１、Ｅ＝１およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックス）を用いるＢＬＡＳＴＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０アルゴリズムのような整列アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００５２】
本発明のシアリルトランスフェラーゼは、配列比較によってのみではなく、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４二機能性シアリルトランスフェラーゼまたは本明細書中に提供される他のシアリルトランスフェラーゼに対する抗体を調製し、そしてその抗体が目的のシアリルトランスフェラーゼと特異的に免疫反応性であるかどうかを決定することによってもまた同定され得る。二機能性シアリルトランスフェラーゼを得るために、詳細には、生物がα２，３およびα２，８−シアル酸結合の両方をその細胞表面上に提示するかどうかを測定することによって、二機能性シアリルトランスフェラーゼを産生する可能性がある生物を同定し得る。あるいは、またはさらに、単純に単離されたシアリルトランスフェラーゼの酵素アッセイを行い、両方のシアリルトランスフェラーゼ活性が存在するかどうかを測定し得る。
【００５３】
（２．β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）
本発明はまた、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチド（例えば、ＣｇｔＡ）を提供する。本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、反応混合物中に入れられた場合、ドナー由来のＧａｌＮＡｃ（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ）の適切なアクセプターサッカリド（代表的には、末端ガラクトース残基を有するサッカリド）への転移を触媒する。得られた構造、ＧａｌＮａｃβ１，４−Ｇａｌ−は、しばしばガングリオシドおよび他のスフィンゴイド、多くの他のサッカリド化合物中で見られる。例えば、ＣｇｔＡトランスフェラーゼは、ガングリオシドＧＭ３のＧＭ２への変換を触媒し得る（図４）。
【００５４】
本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのようなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種により産生されるものである。β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドの１例は、Ｃ．ｊｕｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のものである。これは、配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列を有する。本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、一般に、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたる、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、このアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたり、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一である。現在、好ましい実施形態では、同一性パーセントの領域は、５０アミノ酸より長い領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００アミノ酸の領域にわたって、そして最も好ましくはＧａｌＮａｃトランスフェラーゼの全長にわたって伸びる。従って、本発明のβ１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼは、β１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、そしてβ１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼ活性を保持するために必要なポリペプチドの領域にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４  β１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１３）に少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、本発明のβ１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼは、β１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼの長さの全体にわたってＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４  β１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼに同一である。
【００５５】
再度、同一性パーセントは、例えば、検査によって決定され得るか、または３のワード長（Ｗ）、Ｇ＝１１、Ｅ＝１、およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを用いるＢＬＡＳＴＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０アルゴリズムのような整列アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００５６】
当業者は、また免疫反応性により、本発明のβ１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼを同定し得る。例えば、当業者は、配列番号１３のＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４  β１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼに対する抗体を調製し得、そしてこの抗体が目的のβ１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼと特異的に免疫反応性であるか否かを決定し得る。
【００５７】
（３．β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ）
β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣｇｔＢ）もまた、本発明によって提供される。本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、適切な反応培地中に入れられた場合、ドナー由来のガラクトース残基（例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ）の適切なサッカリドアクセプター（例えば、末端ＧａｌＮａｃ残基を有するサッカリド）への転移を触媒する。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼにより触媒された反応では、ガラクトース残基のＧＭ２のオリゴサッカリド部分への転移があり、ＧＭ１オリゴサッカリド部分を形成する。
【００５８】
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのようなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種により産生されるものである。例えば、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドの１つは、Ｃ．ｊｕｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のものである。これは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５９】
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの別の例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＯ：２血清型株ＮＣＴＣ  １１１６８のものである。このガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１７に示される。このガラクトシルトランスフェラーゼは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中で良好に発現し、そして高い量の可溶性活性を示す。さらに、反応混合物が過剰のドナーを含むそして十分に長時間インキュベートされる場合、１つより多いガラクトースを付加し得るＯＨ４３８４  ＣｇｔＢとは異なり、ＮＣＴＣ  １１１６８  β１，３−ガラクトースは、有意な量のポリガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有さない。いくつかの適用については、ＯＨ４３８４酵素のポリガラクトシルトランスフェラーゼ活性は所望されるが、他の適用（例えば、ＧＭ１摸倣物の合成）では、末端ガラクトースの１つだけの付加が望ましい。
【００６０】
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、一般に、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたり、それぞれ配列番号１５および配列番号１７に示されるＯＨ４３８４のアミノ酸配列またはＮＣＴＣ  １１１６８  ＣｇｔＢのアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたり、これらのアミノ酸配列のいずれかに少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは配列番号１５および配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一である。現在、好ましい実施形態では、同一性パーセントの領域は、５０アミノ酸より長い領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００アミノ酸の領域にわたって、そして最も好ましくはガラクトシルトランスフェラーゼの全長にわたって伸びる。従って、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、そしてβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を保持するために必要なポリペプチドの領域にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４  β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１５）またはＮＣＴＣ  １１１６８ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１７）に少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの長さの全体にわたってＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４  β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはＮＣＴＣ  １１１６８  β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼに同一である。
【００６１】
同一性パーセントは、例えば、検査によって決定され得るか、または３のワード長（Ｗ）、Ｇ＝１１、Ｅ＝１、およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを用いるＢＬＡＳＴＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０アルゴリズムのような整列アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００６２】
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、それぞれのａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種から得られ得るか、または組換え的に産生され得る。当業者は、例えば、酵素活性のアッセイにより、または、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４  β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、または配列番号１７に記載のＣ．  ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼに対して惹起された抗体との特異的な免疫反応性を検出することにより、ガラクトシルトランスフェラーゼを同定し得る。
【００６３】
（４．ＬＯＳ生合成経路に関与するさらなる酵素）
本発明はまた、オリゴサッカリドの生合成に関与するさらなる酵素を提供する。例えば、これらの酵素は、細菌オリゴサッカリド脂質で見出された。例えば、シアリルトランスフェラーゼのドナーであるＣＭＰ−シアル酸の合成に関与する酵素が提供される。シアル酸シンターゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ  ４３８４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）８ａ（配列番号２１）および株ＮＣＴＣ  １１１６８のオープンリーディングフレーム８ｂによってコードされる（表３を参照のこと）。シアル酸合成に関与する別の酵素は、ＯＨ  ４３８４のＯＲＦ９ａ（配列番号２２）およびＮＣＴＣ  １１１６８のＯＲＦ９ｂによってコードされる。ＣＭＰ−シアル酸シンターゼは、それぞれＯＨ  ４３８４およびＮＣＴＣ  １１１６８のＯＲＦ１０ａ（配列番号２３）および１０ｂによってコードされる。
【００６４】
本発明はまた、リピドＡの生合成に関与するアシルトランスフェラーゼを提供する。この酵素は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ  ４３８４のオープンリーディングフレーム２ａ（配列番号１８）および株ＮＣＴＣ  １１１６８のオープンリーディングフレーム２Ｂによってコードされる。アセチルトランスフェラーゼもまた提供される；この酵素は、株ＯＨ  ４３８４のＯＲＦ１１ａ（配列番号２４）によってコードされる；相同体は、株ＮＣＴＣ  １１１６８のＬＯＳ生合成遺伝子座において見出されない。
【００６５】
３つのさらなるグリコシルトランスフェラーゼがまた提供される。３つの酵素は、株ＯＨ  ４３８４のＯＲＦ３ａ（配列番号１９）、４ａ（配列番号２０）、および１２ａ（配列番号２５）および株ＮＣＴＣ  １１１６８のＯＲＦ３ｂ、４ｂ、および１２ｂによってコードされる。
【００６６】
本発明は、これらの酵素の各々について、長さが少なくとも約５０アミノ酸の領域で、本明細書中で示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明の酵素は、長さが少なくとも５０アミノ酸の領域で、このそれぞれのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であり、なおさらに好ましくは、このアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一でる。現在好ましい実施形態において、同一パーセントの領域は、５０アミノ酸より長い領域、より好ましくは、少なくとも約１００アミノ酸の領域、そして最も好ましくは、この酵素の全長に拡大する。従って、本発明のこの酵素は、それぞれの活性を有し、そしてそれぞれの酵素活性を保持するのに必要であるこのポリペプチドの領域にわたって、本明細書中に示される対応する酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは約８０％同一、そして最も好ましくは少なくとも９０％同一である、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のこの酵素は、この酵素の全長にわたって対応するＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ  ４３８４酵素に同一である。
【００６７】
（Ｂ．グリコシルトランスフェラーゼおよび関連酵素をコードする核酸）
本発明はまた、本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素をコードする単離された核酸および／または組換え核酸を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、対応するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの組換え発現、ならびに他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を同定するためのプローブとして、およびこの酵素の調節および発現を研究することを含むいくつかの目的に関して有用である。
【００６８】
本発明の核酸は、完全グリコシルトランスフェラーゼ酵素（例えば、上記の酵素）をコードする核酸、ならびにグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの部分配列をコードする核酸を含む。例えば、本発明は、全長グリコシルトランスフェラーゼ酵素でないが、それでもなおグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ  ４３８４のＬＯＳ遺伝子座のヌクレオチド配列は、配列番号１として本明細書中に提供され、そしてそれぞれのリーディングフレームが同定される。さらにヌクレオチド配列がまた、以下に議論されるように提供される。本発明は、本明細書中に示されるヌクレオチド配列を含む核酸だけでなく、例示される実施形態に実質的に同一であるか、または実質的に相補的である核酸を含む。例えば、本発明は、本明細書中に示したヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％同一、より好ましくは７５％同一、なおより好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％同一、なおより好ましくは少なくとも９０％同一、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。同一性の領域は、少なくとも約５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドに拡大する。いくつかの実施形態において、特定の同一性パーセントの領域は、それぞれの酵素活性を保持するためのコードされた酵素の十分な部分のコード領域を含む。好ましい実施形態において、特定の同一性パーセントは、この酵素のコード領域の全長に拡大する。
【００６９】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、当業者に公知である方法を使用して得られ得る。適切な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、または部分配列（プローブ））が、インビトロ法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベース増幅系（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＴＡＳ））、自己持続性配列複製系（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＳＲ））によってクローニングされ得るか、または増幅され得る。広範種々のクローニングおよびインビトロ増幅方法論は、当業者に周知である。多数のクローニング訓練を介して当業者を指導するに十分なこれらの技術および説明の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．とのジョイントベンチャー（１９９４  補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎらの米国特許第５，０１７，４７８号およびＣａｒｒの欧州特許第０，２４６，８６４号において見出される。インビトロ増幅法を介して当業者を指導するのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７において見い出される。インビトロ増幅された核酸のクローニングの改良方法は、Ｗａｌｌ��ｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。
【００７０】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸、またはこれらの核酸の部分配列は、上記のような任意の適切な方法（例えば、適切な配列のクローニングおよび制限を含む）によって調製され得る。例として、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を慣習的なクローニング方法によって得ることが可能である。目的のグリコシルトランスフェラーゼをコードする公知の遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載される）は、ゲノムＤＮＡサンプルにおいてか、または全ＲＮＡサンプルにおけるｍＲＮＡに対して適した酵素をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを提供するために使用され得る（例えば、サザンブロットまたはノザンブロット）。好ましくは、サンプルは、原核生物（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種）より得られる。特に目的とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種の例としては、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉが挙げられる。多くのＣ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９株は、ガングリオシド模倣物を合成し、そして本発明のグリコシルトランスフェラーゼの供給源として有用である。
【００７１】
一旦、標的グリコシルトランスフェラーゼの核酸が同定されると、それは、当業者に公知の標準的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）に従って単離され得る。
【００７２】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸はまた、物理的特性、化学的特性、免疫学的特性に基づいたアッセイによって、その発現された産物を検出することによってクローン化される。例えば、クローン化された二機能性のシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を、この核酸によってコードされたポリペプチドがガラクトシル化された受容体へのα２，３−連結内のシアル酸の結合、続いて第２のシアル酸残基のα２，８連結内の第１のシアル酸への結合能力によって同定し得る。同様に、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼまたはβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするクローン化された核酸を、コードされたポリペプチドがＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧａｌＮＡｃ残基、またはＵＤＰ−Ｇａｌからのガラクトース残基の適切な受容体への転移をそれぞれ触媒する能力によって同定し得る。適切なアッセイ条件は、当該分野で公知であり、そして実施例に記載される条件を含む。特定の核酸から発現されるポリペプチドの他の物理的特性は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を同定する別の方法を提供するために、本発明の公知のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの特性（例えば、本明細書中に記載される特性）と比較され得る。あるいは、推定グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、変異され得、そしてグリコシルトランスフェラーゼとしてのその役割は、それぞれのグリコ抱合体を産生する能力における変異の検出によって確立される。
【００７３】
他の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、ＤＮＡ増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用してクローン化され得る。従って、例えば、核酸配列または部分配列は、好ましくは、１つの制限部位（例えば、ＸｂａＩ）を含むセンスプライマー、および別の制限部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）アンチセンスプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。これは、所望のグリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列または部分配列をコードし、そして末端制限部位を有する核酸を産生する。次いでこの核酸は、第２の分子をコードし、そして適切な対応する制限部位を有する核酸を含むベクターに容易に連結される。適切なＰＣＲプライマーが、本明細書中に提供される配列情報を使用して当業者によって決定され得る。適切な制限部位はまた、部位特異的変異誘発によって、本発明のグリコシルトランスフェラーゼまたはアミノ酸部分配列をコードする核酸に添加され得る。グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列または部分配列を含むプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断され、次いで標準的な方法に従って増幅および／または発現のための適切なベクターに連結される。
【００７４】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸の増幅に適した適切なプライマーの例は、表２に示される；プライマー対のいくつかは、増幅フラグメント上の５’ＮｄｅＩ制限部位および３’ＳａｌＩ部位で消化される。酵素をコードする配列または部分配列を含むプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断され、次いで標準的な方法に従って、増幅および／または適切なベクターに連結される。
【００７５】
グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をクローニングするための代替として、適切な核酸が、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする公知の配列から化学的に合成され得る。直接の化学合成方法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９のリン酸トリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１のリン酸ジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９〜１８６２のジエチルホスホラミダイト方法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持方法が挙げられる。化学合成は、１本鎖のオリゴヌクレオチドを産生する。これは、相補的な配列でのハイブリダイゼーションによってか、またはテンプレートとして１本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼでのポリメライゼーションによって２本鎖ＤＮＡに転換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は、しばしば約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列が、より短い配列の連結によって得られ得ることを理解する。あるいは、配列は、クローン化され得、そして適切な部分配列は、適切な制限酵素を使用して切断され得る。次いでフラグメントは、所望のＤＮＡ配列を産生するために連結され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、酵素をコードする核酸を改変することは望ましい。当業者は、所定の核酸構築物における改変を産生する多くの方法を認識する。このような周知の方法としては、部位特異的変異誘発、変化されたオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅、変異原性因子または放射に対して核酸を含む細胞の曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、より大きな核酸を産生するための連結および／またはクローニングと関連して）、および他の周知の技術が挙げられる。例えば、ＧｉｌｉｍａｎおよびＳｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：８１〜９７、Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１〜７３４を参照のこと。
【００７７】
現在好ましい実施形態において、本発明の細胞に存在する組み換え核酸は、選択された生物における核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提供するために改変される（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましいコドンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのコード核酸に置換される）。
【００７８】
本発明は、単離された核酸（すなわち、それらの天然の染色体位置に存在しない）、および／または組み換え核酸（すなわち、それらの元々の形態から改変され、非天然の生物に存在するなど）を含む。
【００７９】
（１．シアリルトランスフェラーゼ）
本発明は、上記のようなシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、二重機能性シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする。これらのシアリルトランスフェラーゼ核酸は、少なくとも約６０個のアミノ酸の長さの領域にわたって、配列番号３に示されるアミノ酸配列に少なくとも約７６％同一であるアミノ酸配列を有するシアリルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードする。より好ましくは、本発明の核酸によってコードされるシアリルトランスフェラーゼは、少なくとも６０個のアミノ酸の長さの領域にわたって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である。ここで好ましい実施形態において、パーセント同一性の領域は、シアリルトランスフェラーゼの６０個のアミノ酸よりも長い領域に対して、より好ましくは、少なくとも約１００個のアミノ酸の領域に対して、そして最も好ましくは、全長に対して伸長する。ここで好ましい実施形態において、本発明のシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００８０】
本発明の核酸の例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４の二重機能性シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸の単離された形態および／または組換え形態である。この核酸のヌクレオチド配列は、配列番号２に示される。本発明のシアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、代表的には、少なくとも約５０個のヌクレオチドの長さの領域にわたって、配列番号２の核酸配列に、少なくとも約７５％同一である。より好ましくは、本発明のシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、少なくとも５０個のアミノ酸の長さの領域にわたって、このヌクレオチド配列に少なくとも約８５％同一であり、そしてなお好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列に少なくとも約９５％同一である。ここで好ましい実施形態において、特定のパーセント同一性の閾値の領域は、シアリルトランスフェラーゼをコードする領域の、５０個よりも長いヌクレオチドの領域に対して、より好ましくは、少なくとも約１００個のヌクレオチドの領域に対して、そして最も好ましくは、全長に対して伸長する。従って、本発明は、配列番号２に示されるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＨＨ４３８４  ｃｓｔＩＩまたは株Ｏ：１０（配列番号４）の核酸に実質的に同一である、二重機能性シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供する。
【００８１】
本発明の他のシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するが、実質的なα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性を欠くシアリルトランスフェラーゼをコードする。例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ）Ｏ：１９由来のＣｓｔＩＩ  α２，３シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸（配列番号８）およびＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清株ＮＣＴＣ１１１６８由来のＣｓｔＩＩ  α２，３シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸が、本発明によって提供される；これらの酵素は、α２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性をほとんど有さないか、または全く有さない（表６）。
【００８２】
本発明の核酸を同定するために、目視検査を使用し得るか、または適切な整列アルゴリズムを使用し得る。本発明の二重機能性シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を同定し得る代替方法は、ストリンジェント条件下で、本明細書中に示されるシアリルトランスフェラーゼのポリヌクレオチド配列を含む核酸に、目的の核酸をハイブリダイズさせることによってである。
【００８３】
（２．β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）
β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた、本発明によって提供される。このポリヌクレオチド配列は、少なくとも約５０個のアミノ酸の長さの領域にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４  β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（これは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する）に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのポリペプチドをコードする。より好ましくは、本発明の核酸によってコードされるＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、少なくとも５０個のアミノ酸の長さの領域にわたって、このアミノ酸配列に少なくとも約８０％同一であり、そしてなお好ましくは、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一である。ここで好ましい実施形態では、パーセント同一性の領域は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドの５０個よりも長いアミノ酸の領域に対して、より好ましくは、少なくとも約１００個のアミノ酸の領域に対して、そして最も好ましくは、全長に対して伸長する。ここで好ましい実施形態において、本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本発明の核酸を同定するために、目視検査を使用し得るか、または適切な整列アルゴリズムを使用し得る。
【００８４】
本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼをコードする核酸の１つの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼをコードする核酸の単離された形態および／または組換え形態である。この核酸は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する。本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、代表的には、少なくとも約５０個のヌクレオチドの長さの領域に対して、配列番号１２の核酸配列に、少なくとも約７５％同一である。より好ましくは、本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼをコードする核酸は、少なくとも約５０個のアミノ酸の長さの領域にわたって、このヌクレオチド配列に少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは配列番号１２のヌクレオチド配列に少なくとも約９５％同一である。ここで好ましい実施形態において、特定のパーセント同一性の領域は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼをコードする領域の、５０個よりも長いヌクレオチドの領域に対して、より好ましくは、少なくとも約１００個のヌクレオチドの領域に対して、そして最も好ましくは、全長に対して伸長する。
【００８５】
本発明の核酸を同定するために、目視検査を使用し得るか、または適切な整列アルゴリズムを使用し得る。本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼをコードする核酸を同定し得る代替方法は、ストリンジェント条件下で、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を含む核酸に、目的の核酸をハイブリダイズさせることによってである。
【００８６】
（３．β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ）
本発明はまた、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド（ＣｇｔＢ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。本発明のこれらの核酸によりコードされるβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、好ましくは、配列番号１５に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４株のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列または配列番号１７に示されるようなＮＣＴＣ１１１６８のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のこれらの核酸によりコードされるガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、このアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、配列番号１５または配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一である。現在好ましい実施形態において、同一性パーセントの領域は、５０アミノ酸より長い領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸の領域にわたって、そして最も好ましくはこのガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする領域の全長にわたって、広がる。
【００８７】
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸の１つの例は、単離された形態および／または組換え形態のＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸である。この核酸は、配列番号１４に示されるようなヌクレオチド配列を含む。別の適切なβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ１１１６８株のヌクレオチド配列を含む、このヌクレオチド配列は、配列番号１６に示される。本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、代表的には、配列番号１４の核酸配列または配列番号１６の核酸配列と、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一である。より好ましくは、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、これらのヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つと少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、配列番号１４および／または配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％同一である。現在好ましい実施形態において、同一性パーセントの領域は、５０ヌクレオチドより長い領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの領域にわたって、そして最も好ましくはこのβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする領域の全長にわたって、広がる。
【００８８】
本発明の核酸を同定するために、視覚的検査を使用し得るし、または適切な整列アルゴリズムを使用し得る。本発明のガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸を同定し得る別の方法は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１４または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む核酸に目的の核酸をハイブリダイズすることによる。
【００８９】
（４．ＬＯＳ生合成経路に関与するさらなる酵素）
また、原核生物（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）のＬＯＳ生合成経路に関与する他の酵素をコードする核酸も、提供される。これらの核酸は、例えば、シアル酸シンターゼ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４株のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）８ａおよびＮＣＴＣ１１１６８株のオープンリーディングフレーム８ｂにコードされる）（表３を参照のこと）、シアル酸合成に関与する別の酵素（ＯＨ４３８４のＯＲＦ９ａおよびＮＣＴＣ１１１６８のＯＲＦ９ｂによりコードされる）、ならびにそれぞれＯＨ４３８４およびＮＣＴＣ１１１６８のＯＲＦ１０ａおよび１０ｂによりコードされるＣＭＰ−シアル酸シンテターゼのような、酵素をコードする。
【００９０】
本発明はまた、リピドＡ生合成に関与するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供する。この酵素は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４株のオープンリーディングフレーム２ａおよびＮＣＴＣ１１１６８株のオープンリーディングフレーム２Ｂによってコードされる。アシルトランスフェラーゼをコードする核酸もまた提供され、この酵素は、ＯＨ４３８４株のＯＲＦ１１ａによりコードされ、ＮＣＴＣ１１１６８株のＬＯＳ生合成遺伝子座には、ホモログは見いだされない。
【００９１】
また、さらなる３つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸も提供される。これらの酵素は、ＯＨ４３８４株のＯＲＦ３ａ、４ａおよび１２ａ、ならびにＮＨ  １１１６８株のＯＲＦ３ｂ、４ｂおよび１２ｂによりコードされる（図１）。
【００９２】
（Ｃ．このグリコシルトランスフェラーゼの発現カセットおよび発現）
本発明はまた、本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素を産生するために使用され得る、発現カセット、発現ベクター、および組換え宿主細胞も提供する。代表的な発現カセットは、目的のグリコシルトランスフェラーゼまたは他の酵素をコードする核酸に作動可能に連結された、プロモーターを含む。この発現カセットは、代表的には、適切な宿主細胞（好ましくは、原核生物宿主細胞）に導入される発現ベクター上に含まれる。１つより多くのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが、単一の発現ベクター中に複数の転写カセットを配置することによってか、１つより多くのグリコシルトランスフェラーゼからなる融合タンパク質をコードする遺伝子を構築することによってか、または各グリコシルトランスフェラーゼについて異なる発現ベクターを利用することによって、単一の宿主細胞において発現され得る。
【００９３】
好ましい実施形態において、この発現カセットは、原核生物宿主細胞におけるこのグリコシルトランスフェラーゼの発現に有用である。一般的に使用される原核生物の制御配列（本明細書中では、転写開始のプロモーター、必要に応じてオペレーターを、リボソーム結合部位配列とともに含むと規定される）としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター系およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：２１〜２５）；ならびにλ由来のＰLプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）のような、一般的に使用されるプロモーターが挙げられる。特定のプロモーター系は、本発明には重要ではなく、原核生物において機能する利用可能な任意のプロモーターが、使用され得る。
【００９４】
構成的プロモーターまたは調節されたプロモーターのいずれかが、本発明において使用され得る。調節されたプロモーターが有利であり得る。なぜなら、宿主細胞が、このグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの発現が誘導される前に、高密度まで増殖され得るからである。異種タンパク質の高レベル発現は、いくつかの状況では細胞の増殖を遅らせる。特に、Ｅ．ｃｏｌｉにおける使用に適切な制御されたプロモーターとしては、バクテリオファージλＰLプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２１）、およびバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）；Ｔａｂｏｒら（１９８５）が、挙げられる。これらのプロモーターおよびその使用は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に議論される。現在好ましい調節可能なプロモーターは、二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターであり、これは、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０５２８（国際公開番号ＷＯ９８２０１１１）に記載される。
【００９５】
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の原核生物細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの発現のために、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要とされる。このようなプロモーターは、これらの種からクローニングされた遺伝子から入手され得るし、または異種プロモーターが使用され得る。例えば、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉに加えて、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおいて機能する。真核生物宿主細胞における使用に適切なプロモーターは、当業者に周知である。
【００９６】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）が、原核生物宿主細胞における使用を意図される本発明の発現カセット中に都合よく含められる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＲＢＳは、開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置付けられた３〜９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる（ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４；Ｓｔｅｉｔｚ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）、第１巻、第３４９頁、１９７９、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ）。
【００９７】
翻訳共役を使用して、発現を増強し得る。この戦略は、翻訳系に対して天然の（ｎａｔｉｖｅ）高度に発現される遺伝子に由来する上流の短いオープンリーディングフレームを使用し、これは、プロモーター、および数個のアミノ酸コドンの後に停止コドンが続くリボソーム結合部位の下流に配置される。停止コドンの直前が第２のリボソーム結合部位であり、そしてこの停止コドンの後が翻訳開始のための開始コドンである。この系は、ＲＮＡにおける二次構造を解き、翻訳の効率的な開始を可能にする。Ｓｑｕｉｒｅｓら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２９７−１６３０２を参照のこと。
【００９８】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、細胞内に発現され得るか、または細胞から分泌され得る。細胞内発現は、しばしば、高収率を生じる。必要であれば、可溶性の活性なグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの量は、再折り畳み手順を実施することにより増大され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出：Ｍａｒｓｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２：８００；Ｓｃｈｏｎｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）３：１５１を参照のこと）。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが細胞から、ペリプラズムまたは細胞外培地のいずれかに分泌される実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、切断可能なシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列に連結される。このシグナル配列は、細胞膜を通したグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドのトランスローケーションを指向する。プロモーター−シグナル配列ユニットを含む、Ｅ．ｃｏｌｉにおける使用に適切なベクターの例は、ｐＴＡ１５２９であり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡプロモーターおよびシグナル配列を有する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：７２１２；Ｔａｌｍａｄｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：３９８８；Ｔａｋａｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０：２６７０を参照のこと）。
【００９９】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドはまた、融合タンパク質として産生され得る。このアプローチは、しばしば高収率を生じる。なぜなら、通常の原核生物の制御配列が、転写および翻訳を指向するからである。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｌａｃＺ融合物が、しばしば、異種タンパク質を発現するために用いられる。ｐＵＲ、ｐＥＸ、およびｐＭＲ１００系列のような適切なベクターが容易に利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。特定の適用には、精製後、融合タンパク質から非グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸を切断することが所望され得る。これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかにより達成され得、これには、臭化シアン、プロテアーゼによる切断、またはＸa因子による切断が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９８：１０５６；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１０６；Ｎａｇａｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：８１０；Ｓｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６１を参照のこと）。切断部位は、切断の所望される点において、融合タンパク質の遺伝子内に操作され得る。
【０１００】
Ｎ末端の完全性を維持するＥ．ｃｏｌｉ由来の組換えタンパク質を得るために適切な系は、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８−７０４（１９８９）により記載されている。この系では、目的の遺伝子は、ペプチダーゼ切断部位を含む酵母ユビキチン遺伝子の最初の７６残基に対するＣ末端融合物として生成される。２つの部分の連結部での切断は、インタクトな正確なＮ末端残基を有するタンパク質の生成をもたらす。
【０１０１】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、種々の宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、および種々の高等真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株、およびＨｅＬａ細胞株ならびに骨髄腫細胞株）を含む）において発現され得る。有用な細菌の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、およびＰａｒａｃｏｃｃｕｓ。組換えグリコシルトランスフェラーゼコード核酸は、各宿主に適切な発現制御配列に作動可能に連結される。Ｅ．ｃｏｌｉについて、これには、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはλプロモーター）、リボソーム結合部位、および好ましくは、転写終結シグナルが挙げられる。真核生物細胞については、制御配列としては、プロモーター、ならびに好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサー、およびポリアデニル化配列が挙げられ、そして、スプライスドナーおよびアクセプター配列が挙げられ得る。
【０１０２】
本発明の発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉについての塩化カルシウム形質転換および哺乳動物細胞についてのリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションのような周知の方法によって選択された宿主細胞へ移入され得る。プラスミドによって形質転換された細胞は、プラスミドに含まれる遺伝子（例えば、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、およびｈｙｇ遺伝子）によって付与される、抗生物質に対する耐性によって選択され得る。
【０１０３】
一旦発現されると、組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、当該分野の標準的な手順（硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む）（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと）に従って精製され得る。少なくとも約９０％〜約９５％均質な、実質的に純粋な組成物が好ましく、そして９８％〜９９％以上の均質性が最も好ましい。一旦、（所望により、部分的に、または均質になるまで）精製されると、次いでこのポリペプチドが（例えば、抗体生成のための免疫原として）用いられ得る。グリコシルトランスフェラーゼはまた、未精製状態または半精製状態で使用され得る。例えば、このグリコシルトランスフェラーゼを発現する宿主細胞は、透過化処理または他の細胞分裂のような処理をしてかまたはこのような処理なしで、グリコシルトランスフェラーゼ反応に直接使用され得る。
【０１０４】
当業者は、改変が、生物学的活性を消失することなく、グリコシルトランスフェラーゼタンパク質に対してなされ得ることを認識する。いくつかの改変がなされて、クローニング、発現、または融合タンパク質中への標的分子の取込みを容易にし得る。このような改変は、当業者に周知であり、そして例えば、開始部位を提供するアミノ末端に付加されたメチオニン、または好都合に位置する制限部位もしくは停止コドンもしくは精製配列を生成するいずれかの末端上に配置されるさらなるアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を含む。
【０１０５】
（Ｄ．オリゴサッカリドの合成のための方法および反応混合物）
本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼを使用して、所望のオリゴサッカリド（これは、２つ以上のサッカリドから構成される）を調製する反応混合物および方法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖、および代表的には可溶性の二価金属カチオンを含む反応媒体中で起きる。この方法は、基質（「アクセプター」とも称される）サッカリドへのサッカリドの付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼの使用に頼る。所望のオリゴサッカリド構造物を合成するグリコシルトランスフェラーゼを使用するの多数の方法が公知である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１、Ｉｔｏら（１９９３）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３、ならびに米国特許第５，３５２，６７０号、同第５，３７４，５４１号、および同第５，５４５，５５３号に記載される。
【０１０６】
例えば、本発明は、本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼの存在下で、活性化したシアル酸（例えば、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、ＣＭＰ−ＮｅｕＧｃなど）を含む反応混合物を、末端ガラクトース残基を含むアクセプター部分と接触させることによって、ガラクトース残基へα２，３結合でシアル酸を付加するための方法を提供する。本発明の好ましい実施形態において、この方法はまた、α２，８結合によって第１のシアル酸に連結される第２のシアル酸残基の付加を生じる。この方法の産物は、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌ−である。適切なアクセプターの例としては、β１，４結合によってＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃへと連結される末端Ｇａｌ、およびＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃのいずれかへβ１，３結合される末端Ｇａｌが挙げられる。シアル酸が結合される末端残基は、それ自体で、例えば、Ｈ、サッカリド、オリゴサッカリドまたは少なくとも１つの炭水化物原子を有するアグリコン基に結合し得る。いくつかの実施形態において、アクセプター残基は、例えば、タンパク質、脂質またはプロテオグリカンに結合されるオリゴサッカリドの部分である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ガングリオシド、リゾガングリオシド、ガングリオシド模倣物、リゾガングリオシド模倣物またはこれらの分子の炭水化物部分の合成のための反応混合物および方法を提供する。これらの方法および反応混合物は、代表的に、Ｇａｌ４Ｇｌｃ−Ｒ1およびＧａｌ３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ2からなる群から選択される式を有する化合物を、ガラクトシル化アクセプター部分として含む：ここで、Ｒ1は、セラミドまたは他の糖脂質からなる群から選択され、Ｒ2は、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、および（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群から選択される。例えば、ガングリオシド合成について、ガラクトシル化アクセプターが、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、Ｇａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、およびＧａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群から選択され得る。
【０１０８】
本発明の方法および反応混合物は、多数のガングリオシド、リゾガングリオシドおよび関連の構築物のうちのいずれかを生成するのに有用である。目的の多くのガングリオシドが、Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｈ．Ｆ．編、Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，ＶＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９８９，１０〜１５頁、およびその中で引用される参考文献に記載される。特に目的のガングリオシドには、例えば、脳に見出されるものならびに表１に列挙される他の供給源が挙げられる。
【０１０９】
【表１】
0004431283.tif 000002
本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼは、例えば、ガングリオシドＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃおよびＧＱ１ｂ、またはこれらのガングリオシドの炭水化物部分を合成するのに特に有用である。表１に示されるこれらのガングリオシドの構造は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を必要とする。本発明の方法および反応混合物によって与えられる利点は、これら両方の活性が、単一のポリペプチド中に存在することである。
【０１１０】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、さらなるグリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素と組み合わせて使用され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組合せを使用し得る。本発明のいくつかの実施形態において、二機能性シアリルトランスフェラーゼにより利用されるガラクトシル化アクセプターは、適切なアクセプターをＵＤＰ−Ｇａｌおよびガラクトシルトランスフェラーゼと接触させることによって形成される。本明細書中で記載されるものであり得るガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｇａｌ残基をＵＤＰ−Ｇａｌからアクセプターへ移動する。
【０１１１】
同様に、本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを、ガラクトシルトランスフェラーゼについてのレセプターを合成するために使用し得る。例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼについてのアクセプターサッカリドは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドと、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼについてのアクセプターとを接触させることによって形成され得、ここで、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、ＧａｌＮＡｃ残基を、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼについてのアクセプターに転移する。
【０１１２】
このグループの実施形態において、酵素および基質は、最初の反応混合液中で合わせられ得るか、または第２のグリコシルトランスフェラーゼサイクルのための酵素および試薬は、一旦、最初のグリコシルトランスフェラーゼサイクルがほぼ完了してから、反応媒体に添加され得る。単一の容器中で、順番に２つのグリコシルトランスフェラーゼサイクルを行うことによって、全体の収量は、中間体の種が単離される手順にわたって改善される。さらに、余分の溶媒および副産物の除去および処分が減少する。
【０１１３】
上記のプロセスによって産生した生成物は、精製することなく使用され得る。しかし、通常、生成物を回収することが好ましい。グリコシル化されたサッカリドの回収のための標準的な周知の技術（例えば、薄層クロマトグラフィーもしくは厚層（ｔｈｉｃｋ  ｌａｙｅｒ）クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィー）。膜濾過、より好ましくは逆浸透性膜を使用すること、または回収のための１以上のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好ましい。
【０１１４】
（Ｅ．本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび方法を用いて生成された糖結合体の使用）
本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび方法を用いて作製されたオリゴサッカリド化合物は、種々の適用（例えば、抗原、診断用薬剤、または治療剤として）において使用され得る。従って、本発明はまた、種々の症状を処置する際に使用され得る、薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、上記に記載の方法に従って、作製されたオリゴサッカリドからなる。
【０１１５】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬学送達システムにおける使用に適切である。本発明における使用のための適切な処方物については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版、編（１９８５）に見出される。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと）。
【０１１６】
薬学的組成物は、予防的処置および／または治療的処置のために、非経口的、鼻腔内、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）、経口的、または局所的（ｌｏｃａｌ）な投与（例えば、エアロゾル投与または経皮的投与による）について意図される。一般的に、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内）投与される。従って、本発明は、非経口投与のための組成物を提供し、この組成物は、受容可能なキャリア（好ましくは水溶性キャリア、例えば、水、緩衝化した水、生理食塩水、ＰＢＳなど）に溶解したかまたは懸濁した化合物を含む。その組成物は、生理的条件を模倣するために必要とされる、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含み得る。
【０１１７】
これらの組成物は、従来的な滅菌技術によって滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られる水溶液は、そのままで、または凍結乾燥して使用のためにパッケージングされ得、その凍結乾燥した調製物は、投与の前に滅菌水性キャリアと合わせられる。調製物のｐＨは、代表的には、３と１１との間、より好ましくは５〜９、そして最も好ましくは７〜８である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴサッカリドは、標準的なベシクル形成脂質から形成されたリポソームに組み込まれ得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、および同第４，８３７，０２８号に記載されるように、リポソームを調製するための種々の方法が利用可能である。種々の標的化薬剤を（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）使用するリポソームの標的化は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。
【０１１９】
オリゴサッカリドを含む組成物は、予防的処置および／または治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、上記のように、組成物は、その疾患およびその合併症の症状を治癒するか、またはそれを少なくとも部分的に静止させるために十分な量で、すでに疾患に罹患した患者に投与される。このことを達成するのに十分な量は、「治療的に有効な用量」として定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重篤さならびに患者の体重および一般的な状態に依存するが、一般的に、７０ｋｇの患者について、一日あたり約０．５ｍｇ〜約４０ｇのオリゴサッカリドの範囲、より一般的に使用される一日あたり約５ｍｇ〜約２０ｇの化合物の用量である。
【０１２０】
その組成物の単回または複数回投与は、処置する医者によって選択される用量レベルおよびパターンで実行され得る。いくつかの事象において、薬学的組成物は、患者を有効に処置するのに十分な、本発明のオリゴヌクレオチドの量を提供するべきである。
【０１２１】
そのオリゴサッカリドはまた、診断試薬としての用途を見出し得る。例えば、標識された化合物を使用して、炎症を有すると疑われる患者中の炎症または腫瘍の転移の領域を位置決めし得る。この用途のために、その化合物は、適切な放射性同位元素（例えば、125Ｉ、14Ｃ、またはトリチウム）を用いて標識され得る。
【０１２２】
本発明のオリゴサッカリドは、本発明の化合物と特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための免疫原として使用され得る。種々の免疫グロブリン分子の産生および操作のための、当業者に利用可能な多数の技術が、本発明において使用され得る。抗体は、当業者に周知の種々の手段によって産生され得る。
【０１２３】
非ヒト（例えば、マウス、ウサギ、ウマなど）モノクローナル抗体の産生は周知であり、そして例えば、本発明のオリゴサッカリドを含有する調製物を用いて動物を免疫することによって達成され得る。免疫された動物から得られた抗体産生細胞は、不死化され、そしてスクリーニングされるか、あるいは、所望の抗体の産生について最初にスクリーニングされて、次いで不死化される。モノクローナル抗体産生の一般的な手順の議論については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
【０１２４】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定するために提供されるわけではない。
【０１２５】
本実施例は、細菌性病原体（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４）（これはギヤン−バレー症候群に関連している（Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２１２２−２１２５））のＬＯＳ中のＧＴｌａガングリオシド模倣物生合成を担う、４つの遺伝子のクローニングのための２つのストラテジーの使用を記載する。Ａｓｐｉｎａｌら（（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：２４１−２４９）は、この菌株が、トリシアリル化ガングリオシドＧＴｌａを模倣する外殻ＬＰＳを有することを示した。本発明者らはまず、活性スクリーニングストラテジーを使用して、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ｃｓｔ−Ｉ）をコードしている遺伝子をクローニングした。次いで、本発明者らは、最近完全にされたＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８の配列からの未処理のヌクレオチド配列情報を使用して、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４からのＬＯＳ生合成に関連する領域を増幅した。ヘプトシルトランスフェラーゼＩおよびＩＩに位置するプライマーを使用して、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４由来の１１．４７ｋｂのＬＯＳ生合生遺伝子座を増幅した。配列決定は、遺伝子座が１３個の部分的なまたは完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードすることを明らかにしたが、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８における対応する遺伝子座は１３．４９ｋｂにわたり、そして１５個のＯＲＦを含み、このことは、これらの２つの菌株間の異なる構成を示す。
【０１２６】
潜在的なグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を、個々にクローン化し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて発現し、そして受容体として合成蛍光性オリゴサッカリドを使用してアッセイした。本発明者らは、β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−トランスフェラーゼ（ｃｇｔＡ）、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｃｇｔＢ）および二機能性シアリルトランスフェラーゼ（ｃｓｔ−ＩＩ）（これは、シアル酸をガラクトースのＯ−３へ、およびガラクトースにα−２，３−で結合されたシアル酸のＯ−８へ転移させる）をコードする遺伝子を同定した。各々の同定されたグリコシルトランスフェラーゼの結合特異性を、ナノモル量のインビトロで合成したモデル化合物についての６００ＭＨｚでのＮＭＲ分析により確認した。勾配逆転広域ナノＮＭＲプローブ（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｉｎｖｅｒｓｅｓ  ｂｒｏａｄｂａｎｄ  ｎａｎｏ−ＮＭＲ  ｐｒｏｂｅ）を使用して、配列情報を、グリコシド結合を介する3Ｊ（Ｃ，Ｈ）相関の検出により得た。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４中でのＧＴ１ａ模倣物の合成におけるｃｇｔＡおよびｃｓｔ−ＩＩの役割を、これらのＬＯＳ中のより短いガングリオシド模倣物を発現する２つの関連するＣ．ｊｅｊｕｎｉ菌株において対応する相同体と、それらの配列および活性を比較することにより確認した。従って、これらの３つの酵素をラクトースから始まるＧＴ１ａ模倣物の合成に使用し得る。
【０１２７】
以下の省略形を使用した：ＣＥ、キャピラリー電気泳移動法；ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＣＯＳＹ、相関分光法；ＦＣＨＡＳＥ、６−（５−フルオレセイン−カルボキサミド）−ヘキサン酸スクシミジルエステル；ＧＢＳ、ギヤン−バレー症候群；ＨＭＢＣ、異核多重結合コヒーレンス；ＨＳＱＣ異核一重量子コヒーレンス；ＬＩＦ、レーザー誘導蛍光；ＬＯＳ、リポオリゴサッカリド；ＬＰＳ、リポポリサッカリド；ＮＯＥ、核オーバーハウザー効果；ＮＯＥＳＹ、ＮＯＥ分光法；ＴＯＣＳＹ、総合相関分光法。
【０１２８】
（実験手順）
（菌株）
以下のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株を本研究において使用した：血清株（ｓｅｒｏｓｔａｉｎ）Ｏ：１９（ＡＴＣＣ＃４３４４６）；血清型Ｏ：１９（菌株ＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４をＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ）から得た）；および血清型Ｏ：２（ＮＣＴＣ＃１１１６８）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをＨｉｎｄＩＩＩライブラリーのために使用する一方で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ２０２（ＣＧＳＧ＃７２９７）を異なるクローン化グリコシルトランスフェラーゼを発現するために使用した。
【０１２９】
（基本的な組換えＤＮＡ方法）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株からのゲノムＤＮＡの単離を、以前に記載された（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）ようにＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−チップ５００／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して行った。プラスミドＤＮＡの単離、制限酵素消化、クローニングのためのＤＮＡフラグメントの精製、連結および形質転換を、酵素の供給業者か、または特定の手順のために使用したキットの製造者により推奨されるように行われた。長いＰＣＲ反応物（＞３ｋｂ）を、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）により記載されるようなＥｘｐａｎｄＴＭ  ｌｏｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステムを使用して行った。特定のＯＲＦを増幅するためのＰＣＲ反応を、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ）により記載されるようにＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）より購入した。ＤＮＡ配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｍｏｎｔｒｅａｌ）モデル３７０Ａ自動化ＤＮＡシーケンサーおよび製造業者のサイクル配列決定キットを使用して行った。
【０１３０】
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のシアリルトランスフェラーゼについての活性スクリーニング）
ゲノムライブラリーを、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４の染色体ＤＮＡの部分Ｈｉｎｄｌｌｌ消化を使用して調製した。部分消化物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）上で精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、連結混合物と一緒にエレクトロポレーションし、そしてこの細胞を１５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン、０．０５  ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１００μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を有するＬＢ培地上にプレーティングした。白いコロニーを１００個のプールに取り入れ、そして１５％グリセロールを有する１ｍＬの培地に再懸濁した。各々のプールの２０μＬを使用して、１５０μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢ培地に播種した。３７℃で２時間増殖後、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加し、そして培養物をさらに４．５時間増殖した。細胞を遠心分離により回収し、０．５ｍＬの５０ｍＭ  Ｍｏｐ（ｐＨ７、１０  ｍＭ  ＭｇＣ１2）中に再懸濁し、そして１分間超音波処理した。抽出物を、インキュベーション時間および温度がそれぞれ１８時間および３２℃であることを除いて、以下に記載するようにシアリルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。陽性のプールを単一のコロニーのためにプレーティングし、そして２００個のコロニーを取り上げ、１０個のプールにおける活性について試験した。最終的に、陽性のプールのコロニーを個々に試験し、これは２つの陽性クローン（ｐＣＪＨ９（５．３ｋｂ挿入物）およびｐＣＪＨ１０１（３．９ｋｂ挿入物））の単離を導いた。いくつかのサブクローニングされたフラグメントおよび特注のプライマーを使用して、２つのクローンの挿入物を両方の菌株について感染に配列決定した。個々のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを有するこのクローンをまた、シアリルトランスフェラーゼ活性について試験し、そして陽性のクローンのみの挿入物（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−中にクローン化された、１．１ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント）を、ＫｐｎＩ部位およびＰｓｔＩ部位を使用してｐＵＣ１１８に移入し、ｐｌａｃプロモーターに対して逆の位置の挿入物を得た。
【０１３１】
（ＬＰＳ生合成遺伝子座のクローニングおよび配列決定）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４のＬＰＳ生合成遺伝子座を増幅させるために使用されるプライマーは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ配列決定グループ（このグループは、菌株ＮＣＴＣ１１１６８の完全なゲノムを配列決定した）のウエブサイト（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｊｅｊｕｎｉ／）から入手可能な予備的な配列に基づく。ＥｘｐａｎｄTM長テンプレートＰＣＲシステムを用い、プライマーＣＪ−４２およびＣＪ−４３（すべてのプライマー配列は、表２に記載される）を使用して、１１．４７ｋｂ遺伝子座を増幅させた。このＰＣＲ産物を、Ｓ−３００回転カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのプライマーウォーキングとサブクローニングとの組み合わせを用いて、両方の菌株について完全に配列決定した。特定のオープンリーディングフレームは、表２に記載されるプライマーおよびＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅させた。このＰＣＲ産物は、適切な制限酵素（表２を参照のこと）を用いて消化し、そしてｐＣＷｏｒｉ＋にクローニングした。
【０１３２】
【表２】
0004431283.tif 000003
0004431283.tif 000004
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現およびグリコシルトランスフェラーゼアッセイ）
種々の構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ２０２に移し、そして１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いる４時間の誘導後、グリコシルトランスフェラーゼ活性の発現について試験した。抽出を超音波処理により行い、そして酵素反応を、３２℃で一晩で行った。ＦＣＨＡＳＥ標識した少糖類を、以前に記載されたように（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６−１９１７３）調製した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。すべての酵素アッセイについて１単位の活性を、１分間当たり１μｍｏｌの産物を生成する酵素の量として規定した。
【０１３３】
クローンのプールにおけるα−２，３−シアリルトランスフェラーゼの活性についてのスクリーニングアッセイは、１０μＬの最終体積中、１ｍＭ  Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥ、０．２ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、５０ｍＭ  Ｍｏｐｓ（ｐＨ７）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含んだ。種々のサブクローン化したオープンリーディングフレームを、１ｍＭ  培養物のＩＰＴＧを用いる４時間の誘導後の、グリコシルトランスフェラーゼ活性の発現について試験した。抽出は、超音波処理により行い、そして酵素反応を３２℃で一晩で行った。
【０１３４】
β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを、０．２ｍＭ  ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥ、１ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ、５０ｍＭ  Ｍｅｓ  ｐＨ６、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2および１ｍＭ  ＤＴＴを用いてアッセイした。β−１，４−ＧａＩＮＡｃトランスフェラーゼを、０．５ｍＭ  ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥ、１ｍＭ  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2を用いてアッセイした。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを、０．５ｍＭ  Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥ、０．２ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を用いてアッセイした。α−２，８−シアリルトランスフェラーゼを、０．５ｍＭ  ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥ、０．２ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2を用いてアッセイした。
【０１３５】
反応混合物を、１０ｍＭ  ＮａＯＨで適切に希釈し、そして以前に記載されたような分離条件および検出条件（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２８２７１−２８２７６）を用いて行われる、キャピラリー電気泳動法によって分析した。通電クロマトグラムのピークを、Ｐ／ＡＣＥ  Ｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いる手動ピーク積分を用いて分析した。酵素活性の迅速な検出のために、トランスフェラーゼ反応混合物からのサンプルを、以前に記載されたように（前出）、シリカ−６０  ＴＬＣプレート（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）での薄層クロマトグラフィーにより試験した。
【０１３６】
（ＮＭＲ分光法）
ＮＭＲ実験を、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ６００  ＮＭＲ分析計で行った。ほとんどの実験は、５ｍｍ  Ｚ勾配三重共鳴プローブ（Ｚ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｔｒｉｐｌｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ）を用いて行った。ＮＭＲサンプルは、０．３〜０．５ｍｇ（２００〜５００ナノモル）のＦＣＨＡＳＥ−グリコシドから調製した。この化合物を、Ｈ2Ｏに溶解し、ｐＨを希ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。凍結乾燥後、サンプルを６００μＬのＤ2Ｏに溶解した。すべてのＮＭＲ実験は、標準的な技術（例えば、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、１Ｄ−ＮＯＥＳＹ、１Ｄ−ＴＯＣＳＹおよびＨＳＱＣ）を使用して、以前に記載されたように（Ｐａｖｌｉａｋら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４１４６−１４１５２；Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：３２７８−３２９２）行った。プロトンケミカルシフト基準のために、内部アセトンのメチル共鳴を、２．２２５ｐｐｍ（1Ｈ）に合わせた。13Ｃケミカルシフト基準のために、内部アセトンのメチル共鳴を、６７．４０ｐｐｍに合わせた。単一の核の実験を、核５〜８時間のオーダーで行った。８０００スキャンおよびミキシング時間８００ｍ秒でのＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥ［０．３ｍＭ］についての１Ｄ  ＮＯＥＳＹ実験を、各８．５時間の持続時間で行い、そして２〜５Ｈｚの線広がりファクター（ｌｉｎｅ  ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）で処理した。４．１６ｐｐｍでの共鳴の１Ｄ  ＮＯＥＳＹについては、３０００スキャンを使用した。以下のパラメータを使用して、ＨＳＱＣスペクトルを取得した：１．０秒の緩和遅延、Ｆ2における６０００Ｈｚのスペクトル幅およびＦ1における２４１４７Ｈｚのスペクトル幅、１７１ｍ秒のｔ2における取得時間。ｔ1次元については、インクリメント当たり２５６スキャンを用いて、１２８の複合点を取得した。Ｆ1におけるサイン弁別（ｓｉｇｎ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を、Ｓｔａｔｅｓ法によって達成した。総獲得時間は、２０時間であった。ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥについては、ブロードな線のために、インクリメント当たりのスキャンが増加し、従ってＨＳＱＣを６４時間行った。位相感応性のスペクトルを、２０４８×２０４８ポイントに対するゼロフィリングの後に得た。非シフトガウシアンウインドウ関数を、両方の次元に適用した。ＨＳＱＣスペクトルを、13Ｃ次元においては２３Ｈｚ／ポイントの分解能で、そしてプロトン次元においては８Ｈｚ／ポイントの分解能でプロットした。多重線分割の観測については、前方線形予測およびπ／４シフト平方ｓｉｎｅｂｅｌｌ関数（π／４−ｓｈｉｆｔｅｄ  ｓｑｕａｒｅｄ  ｓｉｎｅｂｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて、２Ｈｚ／ポイントの分解能で1Ｈ次元を再処理した。すべてのＮＭＲデータは、ＶＮＭＲ５．１またはＶＮＭＲ６．１ソフトウェアで提供される、Ｖａｒｉａｎの標準的なシーケンスを用いて取得した。処理のために同じプログラムを使用した。
【０１３７】
勾配反広帯域ナノＮＭＲプローブ（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｂｒｏａｄｂａｎｄ  ｎａｎｏ−ＮＭＲ  ｐｒｏｂｅ）（Ｖａｒｉａｎ）を使用して、勾配ＨＭＢＣ（ＢａｘおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８，２０９３−２０９４；Ｐａｒｅｌｌａら（１９９５）Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．Ａ  １１２，２４１−２４５）実験を、ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥサンプルについて行った。このナノＮＭＲプローブは、高分解能の魔法角回転プローブであり、たった４０μＬに溶解した液体サンプルの、高分解能のスペクトルを生成する（Ｍａｎｚｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，９１５４−９１６３）。ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥ（質量＝１４８６．３３Ｄａ）を、もとの０．６ｍＬのサンプル（２００ナノモル）を凍結乾燥し、これを５ｍＭの最終濃度のために４０μＬのＤ2Ｏに溶解することによって調製した。このサンプルの最終ｐＨは測定し得なかった。
【０１３８】
勾配ＨＭＢＣ実験を、２９９０Ｈｚのスピン速度、１０２４複合点の４００インクリメント、インクリメント当たり１２８スキャン、０．２１秒の取得時間、1Ｊ（Ｃ，Ｈ）＝１４０ＨｚおよびnＪ（Ｃ，Ｈ）＝８Ｈｚで、１８．５時間の持続時間で行った。
【０１３９】
（質量分析法）
全ての質量測定を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｇｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）Ｅｌｉｔｅ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器を使用して得た。各々のオリゴサッカリドの約２μｇを、ジヒドロキシ安息香酸の飽和溶液を含むマトリックスと混合した。陽性マススペクトルおよび陰性マススペクトルを、リフレクターモードを使用して取得した。
【０１４０】
（結果）
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ系統におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性の検出）  グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングの前に、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４およびＮＣＴＣ１１１６８細胞を、種々の酵素活性について試験した。酵素活性が検出された場合、アッセイ条件を、最大活性を保証するために最適化（実験手順に記載）した。本発明者らが使用したキャピラリー電気泳動アッセイは、非常に感受性であり、そしてμＵ／ｍｌ程度での酵素活性の検出を可能とする（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）。本発明者らは、配列決定された系統ＮＣＴＣ１１１６８およびＧＢＳ関連系統ＯＨ４３８４の両方を、ＧＴ１ａガングリオシド擬態の合成に必要とされる酵素について試験した。予想されたように、系統ＯＨ４３８４は、以下の構造の合成に必要とされる酵素活性を有した：β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ、およびα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ。この系統のゲノム、ＮＣＴＣ１１１６８は、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性を欠いた。
【０１４１】
（活性スクリーニングストラテジーを使用する、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼのクローニング）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４由来の染色体ＤＮＡの分画されていない部分的ＨｉｎｄＩＩＩ消化から作成されるプラスミドライブラリーは、２，６００の白色コロニーを産生し、これを１００のプールを形成するために選択した。本発明者らは、「分断攻略」スクリーニングプロトコルを使用し、これから２つの陽性クローンを得、そしてｐＣＪＨ９（５．３ｋｂ挿入、３ＨｉｎｄＩＩＩ部位）およびｐＣＪＨ１０１（３．９ｋｂ挿入、４ＨｉｎｄＩＩＩ部位）と名付けた。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４染色体ＤＮＡを用いるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）分析およびＰＣＲ反応は、ｐＣＪＨ９が、染色体ＤＮＡ中に隣接していない挿入物を含むことを示した。ｐＣＪＨ９におけるヌクレオチド＃１４４０の下流配列はさらに研究しなかったが、第１の１４３９ヌクレオチドは、ｐＣＪＨ１０１の配列内に完全に含まれることが見出された。染色体ＤＮＡを用いるＯＲＦ分析およびＰＣＲ反応は、ｐＣＪＨ１０１  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの全てが、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４染色体ＤＮＡに隣接することを示した。
【０１４２】
４つのＯＲＦ（２つが部分、および２つが完全）を、ｐＣＪＨ１０１の配列中に見出した（図２）。第１の８１２ヌクレオチドは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のペプチド鎖終結因子ＲＦ−２（ｐｒｆＢ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＥ０００５３７）の最後の２６５ａ．ａ．残基と、６９％同一であるポリペプチドをコードする。鎖終結因子のＴＡＡ停止コドンの最後の塩基もまた、ｐＣＪＨ１０１のヌクレオチド＃８１２〜＃２１０４にまたがるオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンの最初の塩基である。このＯＲＦを、ｃｓｔ−Ｉ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ）と名付け、そしてこれはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｕ３２７２０）由来の推定ＯＲＦと相同な４３０アミノ酸ポリペプチドをコードする。この推定Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＯＲＦは、Ｃｓｔ  Ｉポリペプチドの中間領域（アミノ酸残基＃８０〜＃３３０）と３９％同一の２３１アミノ酸ポリペプチドをコードする。ｃｓｔ−Ｉの下流配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ硫酸アデニルイルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＥ０００３５８）の２つのサブユニット、ＣｙｓＤおよびＣｙｓＮと相同（＞６０％同一）なポリペプチドをコードするＯＲＦおよびＯＲＦの部分を含む。
【０１４３】
ｃｓｔ−Ｉ  ＯＲＦがシアリルトランスフェラーゼ活性をコードことを確認するために、本発明者らは、これをサブクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現させた。発現した酵素を、Ｇａｌ−β−１，４−Ｇｌｃ−β−ＦＣＨＡＳＥ（Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥ）にシアル酸を付加するために使用した。この産物（ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥ）を、Ｃｓｔ−ＩのＮｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ結合特異性を確認するために、ＮＭＲで分析した。
【０１４４】
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座の配列決定）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ１１１６８配列決定グループ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＫ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｊｅｊｕｎｉ／））で入手可能な仮配列データの分析は、ＬＰＳの内核の合成に関与する２つのヘプトシルトランスフェラーゼが、他の細菌性ヘプトシルトランスフェラーゼとの配列相同性によって、容易に同一視できることを明らかにした。２つのヘプトシルトランスフェラーゼの間の領域は、ＮＣＴＣ１１１６８の１３．４９ｋｂにまたがり、そしてＧｅｎＢａｎｋにおけるＢＬＡＳＴ検索に基づいて少なくとも７つの潜在的グリコシルトランスフェラーゼを含む。ＮＣＴＣ１１１６８のＬＯＳ外核について入手可能な構造がないため、この系統における推定グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能を示すことは不可能である。
【０１４５】
ヘプトシルトランスフェラーゼ配列における保存領域に基づいて、本発明者らは、プライマー（ＣＪ−４２およびＣＪ−４３）を設計し、それらの間の領域を増幅した。本発明者らは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ１１１６８由来の染色体ＤＮＡを使用して、１３．４９ｋｂのＰＣＲ産物を得、そしてＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４由来の染色体ＤＮＡをしようして１１．４７ｋｂのＰＣＲ産物を得た。系統ＮＣＴＣ１１１６８由来のＰＣＲ産物のサイズは、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒのデータと一致した。系統ＯＨ４３８４由来の、より小さいサイズのＰＣＲ産物は、２つのヘプトシルトランスフェラーゼ遺伝子の間の領域における系統間の異質性を示し、そして系統ＯＨ４３８４に特異的ないくつかのグリコシルトランスフェラーゼのための遺伝子が、その位置に存在し得ることを示唆する。本発明者らは、プライマーウォーキングおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ１３０９８４）のサブクローニングの組合わせを使用して、１１．４７ｋｂのＰＣＲ産物を配列決定した。ＤＮＡのＧ／Ｃ含有量は２７％であり、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ由来のＤＮＡに代表的である。配列の分析は、２つの部分的ＯＲＦに加えて、１１の完全なＯＲＦが、２つのヘプトシルトランスフェラーゼをコードすることを明らかにした（図２、表３）。推論されたアミノ酸配列を比較する場合、本発明者らは、２つの系統が、８０％より高く同一な６つの遺伝子、および５２％と６８％との間で同一な４つの遺伝子を共有することを見出した（表３）。４つの遺伝子は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ１１６８に独特であるが、１つの遺伝子はＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４に独特である（図２）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４における別個のＯＲＦ（ＯＲＦ＃５ａおよび＃１０ａ）に存在する２つの遺伝子を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ１１１６８におけるインフレーム融合ＯＲＦ（＃５ｂ／１０ｂ）において見出した。
【０１４６】
【表３】
0004431283.tif 000005
0004431283.tif 000006
（外殻（ｏｕｔｅｒ  ｃｏｒｅ）グリコシルトランスフェラーゼの同定）
種々の構築物を作製し、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４由来の２つのヘプトシルトランスフェラーゼの間に位置する、潜在的なグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の各々を発現した。プラスミドｐＣＪＬ−０９はＯＲＦ＃５ａを含み、そしてこの構築物の培養物は、アクセプターとしてＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥと使用してアッセイされた場合にＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を示した。Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥは弱い基質（ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥに対して観測される活性の２％未満）であるから、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、シアリル化したアクセプターに特異的であった。ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥから得られた反応生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるような正確な質量、およびＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥ基準と同一のＣＥアッセイにおける溶離時間を有した。Ｃ．ｊｅｊｙｎｉ  ＯＨ４３８４の外殻ＬＰＳの構造を考慮すると、このＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ｃｇｔＡ；Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａ）は、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥの末端Ｇａｌ残基に対するβ−１，４特異性を有する。ＣｇｔＡの結合特異性は、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥのＮＭＲ分析によって確認された（以下の文章、表４を参照のこと）。ＧＭ２擬態（ｍｉｍｉｃ）の合成におけるｃｇｔＡのインビボでの役割は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８２によって提供される天然のノックアウト変異体によって確認される（図１）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８２由来のｃｇｔＡ相同体の配列決定の際に、本発明者らは、短縮型ｃｇｔＡバージョン（３４７ａａの代わりの２９ａａ）の発現を生じる、フレームシフト変異（塩基番号７１の後の８個のＡの代わりの７個のＡのストレッチ）を見出した。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８２のＬＯＳ外殻構造は、β−１，４−ＧｌａＮＡｃトランスフェラーゼの非存在に対応している。なぜなら、内部ガラクトシダーゼ残基が、シアル酸のみで置換されるからである（Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３、２４１−２４９）。
【０１４７】
プラスミドｐＣＪＬ−０４はＯＲＦ＃６ａを含み、そしてこの構築物のＩＰＴＧ誘導培養物は、アクセプターとしてＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥを使用して、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を示し、それによってＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥを産生した。この産物は、β−１，３−ガラクトシダーゼに対して感受性であり、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって正確な質量を有することが見出された。Ｃ．ｊｅｊｙｎｉ  ＯＨ４３８４のＬＯＳ外殻の構造を考慮して、本発明者らは、このガラクトシルトランスフェラーゼ（ｃｇｔＢ；Ｃｏｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｂ）がＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥの末端ＧａｌＮＡｃ残基に対するβ−１，３−特異性を有することを示唆する。ＣｇｔＡの結合特異性は、Ｃｓｔ−Ｉ、ＣｇｔＡ、およびＣｇｔＢを順に使用することによって合成されたＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥのＮＭＲ分析によって確認された（以下の文章、表４を参照のこと）。
【０１４８】
プラスミドｐＣＪＬ−０３はＯＲＦ＃７ａを含み、そしてＩＰＴＧ誘導培養物は、アクセプターとしてＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥおよびＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥの両方を使用して、シアリルトランスフェラーゼ活性を示した。ＯＨ４３８４由来のこの第２のシアリルトランスフェラーゼは、ｃｓｔ−ＩＩと命名された。ｃｓｔ−ＩＩは、シアル酸α−２，３をＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥの末端Ｇａｌに、そしてまたα−２，８−をＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥの末端シアル酸に転移し得るので、二機能性であることが示された。Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥと共に形成された反応生成物のＮＭＲ分析は、Ｇａｌ上の第１シアル酸のα−２，３−結合、および第２シアル酸のα−２，８−結合を確認した（下の文章、表４を参照のこと）。
【０１４９】
【表４】
0004431283.tif 000007
0004431283.tif 000008
（シアリルトランスフェラーゼの比較）
トリシアリル化ＧＴ１ガングリオシド模倣物の合成におけるＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４由来のｃｓｔ−ＩＩのインビボでの役割は、ジ−シアリル化ＧＤ１ａガングリオシド模倣物を発現する、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９（血清株）由来のｃｓｔ−ＩＩホモログとの比較により支持される。これらの２つのｃｓｔ−ＩＩホモログの間には、８のアミノ酸差異に翻訳する２４のヌクレオチド差異が存在する（図３）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される場合、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９（血清株）由来のｃｓｔ−ＩＩホモログは、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するが、α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性は非常に低く（図５）、これは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９（血清株）のＬＯＳ外殻（Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，２４１−２４９）において末端α−２，８−結合シアル酸が存在しないことと一致する。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ１１１６８由来のｃｓｔ−ＩＩホモログは、Ｏ：１９（血清株）またはＯＨ４３８４由来のホモログよりさらに低いα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を発現し、そしてα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性は、検出されない。本出願人らは、ＮＣＴＣ１１１６８由来のｃｓｔ−ＩＩが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される場合に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のＩＰＴＧ−誘導可能なバンドを検出し得た（データは示されない）。このＮＣＴＣ１１１６８由来のＣｓｔ−ＩＩタンパク質は、Ｏ：１９（血清株）またはＯＨ４３８４由来のホモログと、５２％の同一性のみを共有する。本出願人らは、配列差異が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された低い活性に起因するか否かを決定し得なかった。
【０１５０】
ｃｓｔ−Ｉは、ＬＯＳ生合成遺伝子座の外側に位置するが、その最初の３００残基は、４４％の同一性を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４またはＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８のいずれか由来のＣｓｔ−ＩＩと共有する（図３）ので、明らかにｃｓｔ−ＩＩと相同性である。これら２つのＣｓｔ−ＩＩホモログは、それらの間で５２％の同一な残基を共有し、そしてＣｓｔ−ＩのＣ末端の１３０のアミノ酸が、欠失している。Ｃ末端において１０２のアミノ酸を欠失している短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）バージョンのＣｓｔ−Ｉは、活性であることが見出され（データは示されない）、このことは、Ｃｓｔ−ＩのＣ末端ドメインが、シアリルトランスフェラーゼ活性に必ずしも必要ではないということを示す。Ｃ末端における１０２の残基は、インビトロ酵素活性に重要でないが、これらの残基は、調節の目的、または正確な細胞局在化のいずれかのためにインビボで他の細胞成分と相互作用し得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉシアリルトランスフェラーゼ間の低いレベルの保存性は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のα−２，３−シアリルトランフェラーゼについて以前に観測された保存性（ｌｓｔトランスフェラーゼは、２つの種間、および同じ種の異なる単離物（ｉｓｏｌａｔｅｓ）間で、タンパク質レベルで９０％より高い同一性である）とかなり異なる（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）。
【０１５１】
（表５  Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のシアリルトランスフェラーゼの活性の比較。）種々のシアリルトランスフェラーゼが、ベクターｐＣＷｏｒｉ＋でマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｓｃｉ．３，４６７−４７５）。音波処理した抽出物を、５００μＭのＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥまたはＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥのいずれかを用いてアッセイした。
【０１５２】
【表５】
0004431283.tif 000009
a活性は、抽出物中の全タンパク質１ｍｇ当たりのμＵ（１分間当たりの産物のｐｍｏｌ）で表される。
b比（百分率）は、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥでの活性を、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥでの活性で割ったのもである。
【０１５３】
（合成されたモデル化合物のナノモル量でのＮＭＲ分析）
同定されたグリコシルトランスフェラーゼの結合特異性を正確に評価するために、その産物をＮＭＲ分光法により分析した。酵素産物の精製に必要な時間を短縮するために、ＮＭＲ分析を、ナノモル量で実施した。全ての化合物は、可溶性であり、そしてＨ−１アノマー二重線（Ｊ1,2＝８Ｈｚ）が、十分に分解されるので、２、３Ｈｚの線幅を有する鋭い共鳴を与えた。唯一の例外は、おそらく凝集に起因するブロードな線（約１０Ｈｚ）を有するＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥであった。ナノ−ＮＭＲプローブにおける５ｍＭのＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥ溶液のプロトンスペクトルについては、アノマーシグナルの線幅は、増大した濃度に起因して、４Ｈｚのオーダーであった。また、時間が経つにつれて、おそらくサンプルの分解に起因するさらなるピークが観測された。おそらくサンプルを０．３ｍＭから５ｍＭに濃縮した際のｐＨの変化に起因して、いくつかの化学シフトもわずかに変化した。プロトンスペクトルを、ＨＤＯ共鳴が、アノマー共鳴と重なることを避けるために、種々の温度で得た。プロトンスペクトルから評価されるように、全ての化合物は、純粋であり、存在した不純物または分解産物は、上記のように実施されたＮＭＲ分析を妨害しなかった（Ｐａｖｌｉａｋら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４１４６−１４１５２；Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，３２７８−３２９２）。
【０１５４】
全てのＦＣＨＡＳＥグリコシドについては、類似のグリコシドの13Ｃの帰属（ＳｅｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９８６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８，２０６８−２０８０；Ｍｉｃｈｏｎら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６，８３９９−８４０５；Ｓａｂｅｓａｎら（１９８４）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２，１０３４−１０４５）が、利用可能である。ＦＣＨＡＳＥグリコシドについては、まず標準的同種核２Ｄ実験（ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、およびＮＯＥＳＹ）からのプロトンスペクトルを帰属し、次いでＨＳＱＣ実験（Ｃ−Ｈ相関を検出する）からの13Ｃの帰属を検証することにより、13Ｃの帰属を検証した。ＨＳＱＣ実験は、シアル酸のＣ−１およびＣ−２のような４級炭素を検出しないが、ＨＭＢＣ実験は検出する。主にＧｌｃ共鳴について、ＨＳＱＣスペクトルから得られたプロトン化学シフトは、13Ｃデカップリングの間のサンプルの加熱に起因して、同種核実験から得られた化学シフトと異なる。種々の温度で得られた一連のプロトンスペクトルから、Ｇｌｃ残基の化学シフトが、最も温度に敏感であるということが分かった。全ての化合物において、ＧｌｃＨ−１およびＨ−２共鳴は、０．００４ｐｐｍ／℃変化し、Ｇａｌ（１−４）Ｈ−１は、０．００２ｐｐｍ／℃変化し、そしてＮｅｕ５ＡｃＨ−３および他のアノマー共鳴については、０．００１ｐｐｍ／℃未満であった。ＬＡＣ−ＦＣＨＡＳＥについては、ＧｌｃＨ−６共鳴は、０．００８ｐｐｍ／℃変化した。
【０１５５】
Ｇｌｃ共鳴の大きな温度係数は、ＦＣＨＡＳＥのアミノフェニル基への結合により誘起される環電流シフトに起因する。ＨＳＱＣ実験の間のサンプルの温度を、ＧｌｃＨ−１およびＨ−２共鳴の化学シフトから測定した。ＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥについては、溶液中のＮａ＋対イオンおよびｐＨを調整するために使用されたＮａＯＨの存在に起因して、温度は１２℃から２４℃まで変化した。他のサンプルではより穏やかな加熱（＜５℃）であった。全ての場合において、温度によるプロトン化学シフトの変化は、ＨＳＱＣスペクトルにおける共鳴の帰属において、全く問題を生じなかった。表４および表６に、全てのＨＳＱＣスペクトルから取られた化学シフトがある。
【０１５６】
アグリコン上の結合部位を、以前に１０のシアリルオリゴサッカリドについて決定したように（Ｓａｌｌｏｗａｙら、（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４，２９４５−２９４９）、主に、酵素産物の13Ｃ化学シフトを、前駆体の化学シフトと比較し、グリコシド化シフトを決定することにより決定した。13Ｃスペクトルを得るために、１００倍多い物質が必要とされるため、本明細書では、13Ｃスペクトルを比較する代りに、ＨＳＱＣスペクトルを比較する。前駆体化合物のＨＳＱＣスペクトルからの13Ｃ化学シフトを酵素産物の化学シフトと比較する場合、主に低磁場シフトが常に結合部位において起こり、一方で前駆体の他の化学シフトは、実質的に変化しない。プロトン化学シフト差は、遠隔コンホーメーション効果、サンプル調製、および温度に対して非常に感受性である。付加された新しい糖の正体は、実質的にグリコシド化の際にグリコンのアノマー化学シフトのみが変化するので（ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ、前出）、新しい糖の13Ｃ化学シフトを、モノサッカリドまたは任意の末端残基と比較することにより速やかに同定され得る。
【０１５７】
１Ｄ  ＴＯＣＳＹまたは１Ｄ  ＮＯＥＳＹ実験から得られた隣接プロトンスピン−スピン結合（ＪHH）もまた使用して、この糖の正体を決定する。ＮＯＥ実験を行い、アノマーグリコンプロトン（シアル酸についてＨ−３ｓ）共鳴とアグリコンプロトン共鳴との間のＮＯＥの観察によって、この糖を配列決定する。最も大きいＮＯＥは、通常、連結プロトンに対するが、他のＮＯＥもまた、連結部位に近位するアグリコンプロトン共鳴に対して生じ得る。６００ＭＨｚでは、多くのテトラサッカリドおよびペンタサッカリドのＮＯＥは、ポジティブであるか、または非常に小さいが、これら全ての化合物は８００ｍｓの混合時間で良好なネガティブなＮＯＥを生じ、これは、おそらく、大きいＦＣＨＡＳＥ部分の存在に起因する。
【０１５８】
合成Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥについて、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥのラクトース部分についての13Ｃアサイメントを、上記に概要した２Ｄ法によって確認した。Ｇｌｃ単位の全てのプロトン共鳴を、１８０ｍｓの混合時間でのＧｌｃのＨ−１共鳴に対する１Ｄ−ＴＯＣＳＹ実験から帰属させた。Ｇａｌ  Ｈ−１についての１Ｄ−ＴＯＣＳＹ実験を使用して、Ｇａｌ単位のＨ−１〜Ｈ−４共鳴を帰属させた。次いで、Ｇａｌ単位の残りのＨ−５およびＨ−６ｓを、ＨＳＱＣ実験から帰属させた。糖単位についての隣接プロトンスピン−スピン結合値（ＪHH）は、以前のデータ（Ｍｉｃｈｏｎら、前出）に従った。ＦＣＨＡＳＥ部分についての化学シフトは、以前に与えられている（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２８２７１−２８２７６）。
【０１５９】
Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥからのＣｓｔＩの酵素産物の正確な質量決定は、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥアクセプターに対するシアル酸の付加と一致した（図４）。この産物は、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥとして同定された。なぜなら、この産物の糖部分のプロトンスペクトルおよび13Ｃ化学シフト（表６）は、ＧＭ３オリゴサッカリドまたはシアリルラクトースについてのプロトンスペクトルおよび13Ｃ化学シフトに非常に類似したからである（αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃ；ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ、前出）。ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥのプロトン共鳴を、ＣＯＳＹスペクトル、ＨＳＱＣスペクトル、およびこのプロトンおよび13Ｃ化学シフトのαＮｅｕＡｃ（２−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ−ＦＣＨＡＳＥのプロトンおよび13Ｃ化学シフト（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）との比較から帰属させた。これら２つの化合物について、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ残基についてのプロトンおよび13Ｃ化学シフトは、互いの誤差限界内であった（同上）。Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥおよびＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥのＨＳＱＣスペクトルの比較から、結合部位は、Ｇａｌ  Ｃ−３であることが明らかであり、これは、（２−３）シアリルオリゴサッカリドに代表的なシアリル化に対する、Ｇａｌ  Ｈ−３およびＧａｌ  Ｃ−３についての大きな低磁場シフトに起因する（ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ、前出）。また、αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ−ＦＣＨＡＳＥについて以前に観察されたように（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）、シアル酸のＨ−３axからＧａｌのＨ−３へのＮＯＥは、αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）Ｇａｌ結合に代表的に観察された。
【０１６０】
【表６】
0004431283.tif 000010
0004431283.tif 000011
Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥからのＣｓｔ−ＩＩの酵素産物の正確な質量決定は、２つのシアル酸がＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥアクセプターに付加されていたことを示した（図４）。プロトン共鳴を、ＣＯＳＹ、１Ｄ  ＴＯＣＳＹおよび１Ｄ  ＮＯＯＥＳＹ、ならびに公知の構造との化学シフトの比較から帰属させた。Ｇｌｃ  Ｈ−１〜Ｈ−６共鳴およびＧａｌ  Ｈ−１〜Ｈ−４共鳴を、Ｈ−１共鳴に対する１Ｄ  ＴＯＣＳＹから帰属させた。Ｎｅｕ５Ａｃ共鳴を、ＣＯＳＹから帰属させ、そして１Ｄ  ＮＯＥＳＹによって確認した。４．１６ｐｐｍでのＨ−８、Ｈ−９  Ｎｅｕ５Ａｃ共鳴の１Ｄ  ＮＯＥＳＹを使用して、Ｈ−９ｓおよびＨ−７共鳴を位置付けた（Ｍｉｃｈｏｎら、前出）。小さい隣接結合定数から生じるＮｅｕ５Ａｃ（２−３）のＨ−７共鳴のシングレットの出現は、２−８結合に代表的である（同上）。他の共鳴を、末端シアル酸についてのＨＳＱＣスペクトルおよび13Ｃアサイメントから帰属させた（同上）。Ｇａｌ単位のプロトンおよび13Ｃ炭素化学シフトは、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥにおける化学シフトと類似し、これは、αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）Ｇａｌ結合の存在を示す。２つのシアル酸のＪHH値、プロトンおよび13Ｃ化学シフトは、α（２−８）結合型Ｎｅｕ５ＡｃトリサッカリドにおけるαＮｅｕ５Ａｃ（２−８）Ｎｅｕ５Ａｃのそれらに類似し（Ｓａｌｌｏｗａｙら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４，２９４５−２９４９）、これは、この結合の存在を示す。従って、この産物を、ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥとして同定した。Ｎｅｕ５ＡｃのＣ−８でのシアル化は、そのＣ−８共鳴における７２．６ｐｐｍから７９，１ｐｐｍへの−６．５ｐｐｍの低磁場シフトを引き起こした。
【０１６１】
ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥについての残基間ＮＯＥもまた、αＮｅｕ５Ａｃ（２−８）αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）βＧａｌ配列に代表的であった。Ｎｅｕ５Ａｃ（２−３）およびＮｅｕ５Ａｃ（２−８）の１．７〜１．８ｐｐｍでの２つのＨ−３ax共鳴からの最も大きい残基間ＮＯＥは、Ｇａｌ  Ｈ３および−８）Ｎｅｕ５Ａｃ  Ｈ−８共鳴に対する。Ｇａｌ  Ｈ−４および−８）Ｎｅｕ５Ａｃ  Ｈ−７に対するより小さい残基間ＮＯＥもまた、観察される。ＦＣＨＡＳＥ共鳴に対するＮＯＥもまた、ＦＣＨＡＳＥ共鳴のＨ−３ax共鳴との重なりに起因して観察される（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）。Ｎｅｕ５Ａｃ（２−３）のＨ−３eqからＧａｌ  Ｈ−３への残基間ＮＯＥもまた、観察される。また、残基内も、プロトンアサイメントを確認した。２−８結合についてのＮＯＥは、−８Ｎｅｕ５Ａｃα２−ポリサッカリドについて観察されたＮＯＥと同じである（Ｍｉｃｈｏｎら、前出）。
【０１６２】
シアル酸グリコシド結合もまた、ＨＭＢＣ実験の使用によって確認され得、このＨＭＢＣ実験は、グリコシド結合を越える3Ｊ（Ｃ，Ｈ）相関を検出する。α−２，３結合およびα−２，８結合の両方についての結果は、２つのＮｅｕ５ＡｃアノマーＣ−２共鳴とＧａｌ  Ｈ−３および−８）Ｎｅｕ５Ａｃ  Ｈ−８共鳴との間の3Ｊ（Ｃ，Ｈ）相関を示す。２つのＮｅｕ５Ａｃ残基のＨ−３axおよびＨ−３eq共鳴に対する残基内相関もまた、観察された。Ｇｌｃ（Ｃ−１，Ｈ−２）相関もまた、観察される。なぜなら、ＨＭＢＣスペクトルにおける、１０１ｐｐｍでの交差ピーク（ｃｒｏｓｓｐｅａｋ）の１００．６ｐｐｍでの交差ピークとの部分的重なりが存在するからである。
【０１６３】
ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥからのＣｇｔＡの酵素産物の正確な質量決定は、Ｎアセチル化ヘキソースユニットがＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥアクセプターに付加されたことを示した（図４）。グリコシドプロトンおよび13Ｃ化学シフトがＧＭ２オリゴサッカリド（ＧＭ２ＯＳ）の化学シフト（Ｓａｂｅｓａｎら（１９８４）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２，１０３４−１０４５）に類似していたので、この産物をＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥと同定した。ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥのＨＳＱＣスペクトルおよびそのプロトンスペクトルの積算から、新たなアノメリック「ｄ１」とともに４．１７ｐｐｍおよび４．１８ｐｐｍで２つの新たな共鳴ならびに２．０４ｐｐｍで２つのＮＡｃ基が存在する。ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ実験から、４．１８ｐｐｍでの共鳴を、Ｈ−１とＨ−３との間の強いＮＯＥが原因でＧａｌ  Ｈ−３に明白に帰属した。βガラクトピラノースについては、プロトンの軸位置およびそれらの短いプロトン間距離に起因して、Ｈ−１とＨ−３との間およびＨ−１とＨ−５との間に強い残基間ＮＯＥが観察された（Ｐａｖｌｉａｋら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４１４６−１４１５２；Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，３２７８−３２９２；Ｓａｂｅｓａｎら（１９８４）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２，１０３４−１０４５）。ＴＯＣＳＹスペクトルならびにＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥおよびＧＭ２０ＳのＨ１化学シフトの比較（Ｓａｂｅｓａｎら，前出）から、４．１７ｐｐｍでの共鳴を、Ｇａｌ  Ｈ−４と帰属した。同様に、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルから、ＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃのＨ−１からＨ−５、ならびにＮｅｕ５ＡｃのＨ−３からＨ−６を帰属した。線の広がり（ｂｒｏａｄ  ｌｉｎｅ）に起因して、共鳴の多重項パターンは観察することができなかった。他の共鳴を、前駆体のＨＳＱＣスペクトルと、ＧＭ２ＯＳについての13Ｃ帰属との比較により帰属した（Ｓａｂｅｓａｎら，前出）。ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥおよびＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥのグリコシドのＨＳＱＣスペクトルを比較することによって、前駆体と生成物との間で９．９ｐｐｍの低磁場シフトが、Ｇａｌ  Ｃ−４共鳴に対して発生した。βＧａｌＮＡｃのＨ−３およびＨ−５に対する残基間ＮＯＥとともに、４．１７ｐｐｍでのＧａｌＮＡｃ  Ｈ−１からＧａｌ  Ｈ−４までの残基間ＮＯＥはまた、βＧａｌＮＡｃ（１−４）Ｇａｌ配列が確認されたことを観察した。この観察されたＮＯＥは、ＧＭ２ガングリオシドのコンホメーション特性（Ｓａｂｅｓａｎら，前出）から予測されたＮＯＥであった。
【０１６４】
ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥからのＣｇｔＢの酵素産物の正確な質量決定は、ヘキソースユニットが、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥアクセプターに付加されたことを示した（図４）。グリコシドの13Ｃ化学シフトがＧＭ１ａオリゴサッカリドの化学シフト（同書）に類似していたので、この産物を、ＧＭｌａ−ＦＣＨＡＳＥと同定した。プロトン共鳴を、ＣＯＳＹ、１Ｄ  ＴＯＣＳＹおよび１Ｄ  ＮＯＥＳＹから帰属した。産物のさらなる「ｅ１」共鳴に対して１Ｄ  ＴＯＣＳＹにより、βガラクトピラノースに代表的な多重項パターンを有する４つの共鳴を観察した。βＧａｌＮＡｃのＨ−１共鳴に対して、１Ｄ  ＴＯＣＳＹおよび１Ｄ  ＮＯＥＳＹにより、Ｈ−１からＨ−５の共鳴を帰属した。ＧａｌＮＡｃ  Ｈ−１からＨ−４の多重項パターンは、βガラクトピラノシル構成に代表的であり、この糖の正体がＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥであると確認した。グリコシド化の際に、主要摂動が、βＧａｌＮＡｃ共鳴に関して生じ、そしてＧａｌＮＡｃ  Ｃ−３共鳴に対してアクセプターと産物との間で−９．１ｐｐｍの低磁場シフトが存在した。また、ＧａｌのＨ−３、Ｈ−５に対する残基間ＮＯＥとともに、Ｇａｌ  Ｈ−１からＧａｌＮＡｃ  Ｈ−３までの残基間ＮＯＥおよびＧａｌＮＡｃ  Ｈ−４に対するより小さな残基間ＮＯＥが観察され、βＧａｌ（１−３）ＧａｌＮＡｃ配列を確認した。この観察されたＮＯＥは、ＧＭ１ａガングリオシドのコンホメーション特性（Ｓａｂｅｓａｎら，前出）から予測したＮＯＥであった。
【０１６５】
発表されたデータ（Ｓａｂｅｓａｎら，前出）から明らかになったＧＭ２ＯＳおよびＧＭ１ＯＳにおけるＣ−３およびＣ−４のβＧａｌ（１−４）共鳴の帰属にはいくらか矛盾があった。以前には、この帰属は、13Ｃ化学シフトと公知の化合物との比較に基づいていた。ＧＭｌａ−ＦＣＨＡＳＥに関して、Ｇａｌ（１−４）のＨ−３についての帰属は、プロトン次元において２Ｈｚ／点で分析したＨＳＱＣスペクトルにおいて直接、大きな隣接カップリング（Ｊ2,3＝１０Ｈｚ）を観察することによって確認した。Ｈ−４多重項は、ガラクトースにおけるＨ−４の赤道位置に起因して（Ｓａｂｅｓａｎら、前出）、非常に狭かった（＜５Ｈｚ）。表６において、（−８Ｎｅｕ５Ａｃ２−）3におけるシアル酸の１つのＣ−４およびＣ−６帰属も、Ｈ−４およびＨ−６の帰属から確認したように、逆になった（Ｍｉｃｈｏｎら，前出）。
【０１６６】
ＨＳＱＣスペクトルから得られたＦＣＨＡＳＥグリコシドの13Ｃ化学シフトは、表６に示した参照オリゴサッカリドの化学シフトときわめて一致した。１ｐｐｍを超える差異は、いくつかの共鳴に対して観察され、そしてこれらは、還元末端における異なるアグリコンに起因する。これらの共鳴を除くと、ＦＣＨＡＳＥグリコシドとそれらの参照化合物との間の化学シフトにおける差異の平均は、±０．２ｐｐｍ未満であった。それ故、プロトン化学シフト、ＪHH値、および13Ｃ化学シフトと、公知の構造との比較、ならびにＮＯＥまたはＨＭＢＣの使用を、全て、種々のグリコシルトランスフェラーゼについての結合特異性を決定するために用いた。ＨＳＱＣスペクトルを使用する利点は、プロトン帰属が、結合部位における原子の13Ｃ共鳴の帰属を確認するために独立して証明され得ることである。感度に関して、プロトンＮＯＥは、最も感度が高く、次いで、ＨＳＱＣ、次いでＨＭＢＣである。同じ量の材料に対して、５ｍｍ  ＮＭＲプローブの代わりにナノＮＭＲプローブを使用することにより、合計捕捉時間をかなり短縮し、このことにより、ＨＭＢＣ実験の捕捉を一晩にすることが可能になる。
【０１６７】
（議論）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉからＬＯＳグリコシルトランスフェラーゼをクローニングするために、本発明者らは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからα−２，３シアリルトランスフェラーゼをクローニングするために使用した活性スクリーニングストラテジー（Ｇｉｌｂｅｒｔら，前出）と類似の活性スクリーニングストラテジーを用いた。活性スクリーニングストラテジーにより、同じα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｓｔ−Ｉ）の２つのバージョンをコードする２つのクローンを得た。ＯＲＦ分析により、４３０残基のポリペプチドがα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を担うことが示唆された。ＬＯＳ生合成に関与する他の遺伝子を同定するために、本発明者らは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８の完全ゲノム配列中のＬＯＳ生合成遺伝子座と、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４に由来する対応する遺伝子座とを比較した。完全なオープンリーティングフレームを同定し、そして分析した。オープンリーディングフレームのいくつか（β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−トランスフェラーゼ（ｃｇｔＡ）、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｃｇｔＢ）および二機能性シアリルトランスフェラーゼ（ｃｓｔ−ＩＩ）を含む）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて個々に発現させた。
【０１６８】
ナノモル量のガングリオシド模倣物の蛍光誘導体のインビトロ合成およびそれらのＮＭＲ分析により、４つのクローニングしたグリコシルトランスフェラーゼの結合特異性が明らかに確認される。これらのデータに基づくと、本発明者らは、図４に記載された経路がＧＴ１ａ模倣物を合成するためにＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４により使用されることを示唆する。ｃｇｔＡのこの役割は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３４２（これは、この遺伝子の不活性バージョンを保有する）がそのＬＯＳ外側コアにβ−１，４−ＧａｌＮＡｃを有さないという事実によりさらに支持される（図１）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４由来のｃｓｔ−ＩＩ遺伝子は、インビトロアッセイにおいてα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を示す一方、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９（血清型株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ））由来のｃｓｔ−ＩＩは、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性のみを示した（表５）。このことは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４における末端α−２，８結合シアル酸の付加におけるｃｓｔ−ＩＩの役割と一致し、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４の両方が、同一のｃｓｔ−ＩＩ遺伝子を有するが、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９（血清型株、図１を参照のこと）は有さない。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９（血清型株）由来のＣｓｔ−ＩＩホモログとＯＨ４３８２／８４由来のＣｓｔ−ＩＩホモログとの間には８アミノ酸の差異がある。
【０１６９】
ｃｓｔ−ＩＩの二機能性は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ感染の結果に影響を有し得る。なぜなら、末端ジシアリル化エピトープの発現が、ギヤンバレー症候群のような神経変性合併症の発症に関与し得ることが示唆されたからである（Ｓａｌｌｏｗａｙら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４，２９４５−２９４９）。その二機能性活性がこれまで記載されたシアリルトランスフェラーゼのなかでも新規であることもまた注目に値する。しかし、二機能性グリコシルトランスフェラーゼ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロース酸（ｏｃｔｕｌｏｓｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）トランスフェラーゼについて記載されてきた（Ｂｅｌｕｎｉｓ，Ｃ．Ｊ．およびＲａｅｔｚ，Ｃ．Ｒ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，９９８８−９９９７）。
【０１７０】
ｃｓｔ−ＩＩの一機能性／二機能性活性およびｃｇｔＡの活性化／不活化は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉが宿主に提示する異なる表面糖質を作製することを可能にする相バリエーション機構の２つの形態であるようである。３つのＯ：１９株（血清型株、ＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４）の中で見出されたそれらの小さな遺伝子改変に加えて、この遺伝子座がＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４とＮＣＴＣ  １１１６８（Ｏ：２株）との間で比較される場合に、主要な遺伝子再配置が存在する。ｐｒｆＢ遺伝子を除いて、ｃｓｔ−Ｉ遺伝子座（ｃｙｓＮおよびｃｙｓＤを含む）は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４にのみ見出される。ＯＨ４３８４株とＮＣＴＣ  １１１６８株との間のＬＯＳ生合成遺伝子座の組織化にはかなりの差異がある。この遺伝子のいくつかは、十分に保存されており、それらのいくつかは、あまり保存されていないが、その一方で、他の遺伝子は、一方または他方の株で特有である。ＯＨ４３８４に別個のＯＲＦとして存在する２つの遺伝子（＃５ａ：ｃｇｔＡおよび＃１０ａ：ＮｅｕＡ）は、ＮＣＴＣ  １１１６８中のインフレーム融合ＯＲＦ（ＯＲＦ  ＃５ｂ／＃１０ｂ）として見出される。β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性は、この株において検出され、このことは、この融合物の少なくともｃｇｔＡ部分が、活性であり得ることを示唆する。
【０１７１】
まとめると、この実施例は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒにおけるリポポリサッカリドの合成に関与する酵素をコードするいくつかのオープンリーディングフレームの同定を記載する。
【０１７２】
本明細書中に記載された例および実施形態は、例示目的にすぎず、そしてこれらの例および実施例を鑑みて種々の改変または変更が当業者に示唆されることが理解され、そして本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきである。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜Ｃは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９株由来のリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）外部コア構造を示す。これらの構造は、Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，２４１−２４９により記載され、そしてガングリオシドのオリゴサッカリド部分と類似性を示す部分は、囲みにより区切られる。図１Ａ：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９血清株のＬＯＳ（ＡＴＣＣ番号４３４４６）は、ガングリオシドＧＤ１ａのオリゴサッカリド部分に構造的類似性を有する。図１Ｂ：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｏ：１９株ＯＨ４３８４のＬＯＳは、ガングリオシドＧＴ１ａのオリゴサッカリド部分に構造的類似性を有する。図１Ｃ：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４のＬＯＳは、ガングリオシドＧＤ３のオリゴサッカリド部分に構造的類似性を有する。
【図２】  図２Ａ〜２Ｂは、ＯＨ４３８４由来のｃｓｔ−Ｉ遺伝子座の遺伝子構成、およびＯＨ４３８４由来のＬＯＳ生合成遺伝子座と、ＮＣＴＣ１１１６８由来のＬＯＳ生合成遺伝子座との比較を示す。スケールマーカーの間の距離は、１ｋｂである。図２Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ（番号ＡＦ４３０４６６）から利用可能であるヌクレオチド配列に基づく、ＯＨ４３８４  ｃｓｔ−Ｉ遺伝子座の模式図を示す。部分的ｐｒｆＢ遺伝子は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のペプチド鎖放出因子（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＥ０００５３７）に類似の部分であるが、ｃｙｓＤ遺伝子および部分的ｃｔｓＮ遺伝子は、スルフェートアデニルトランスフェラーゼサブユニットをコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＥ０００３５８）に類似する。図２Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ（番号ＡＦ１３０９８４）からのヌクレオチド配列に基づく、ＯＨ４３８４  ＬＯＳ生合成遺伝子座の模式図である。ＯＨ４３８２  ＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチドは、ｃｇｔＡ遺伝子を除くＯＨ４３４８の遺伝子座（これは、「Ａ」を欠く）と一致する（本文およびＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１６７３４５を参照のこと）。ＮＣＴＣ  １１１６８  ＬＯＳ生合成遺伝子座の配列は、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｊｅｊｕｎｉ／）から利用可能である。対応する相同遺伝子は、ＯＨ４３８４遺伝子について後ろに「ａ」、およびＮＣＴＣ１１１６８遺伝子について後ろに「ｂ」を有する、同じ番号を有する。ＯＨ４３８４株に固有の遺伝子は、空白で示され、そしてＮＣＴＣ１１１６８に固有の遺伝子は、グレーで示される。ＯＨ４３８４ＯＲＦの番号５および番号１０ａは、ＮＣＴＣ１１１６８中のインフレームの融合ＯＲＦ（番号５ｂ／１０ｂ）として見出され、そしてアスタリスク（＊）で示される。各ＯＲＦについて提唱された機能は、表４に示される。
【図３】  図３は、シアリルトランスフェラーゼについての推定のアミノ酸配列のアライメントを示す。ＯＨ４３８４  ｃｓｔ−Ｉ遺伝子（初めの３００残基）、ＯＨ４３８４  ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子（ＯＨ４３８２  ｃｓｔ−ＩＩと同一）、Ｏ：１９（血清株）ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１６７３４４）、ＮＣＴＣ  １１１６８  ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ推定ＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｕ３２７２０）は、ＣｌｕｓｔａｌＸアライメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，４８７６−８２）を用いてアライメントされた。シェーディングは、プログラムＧｅｎＤｏｃ（Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｋ．Ｂ．およびＮｉｃｈｏｌａｓ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｉｓ．ｃｏｍ／〜ｋｅｔｃｈｕｐ／ｇｅｎｅｄｏｃ．ｓｈｔｍｌ）によりされた。
【図４】  図４は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４グリコシルトランスフェラーゼを用いるグリコシド模倣物の酵素学的合成についてのスキームを示す。合成アクセプター分子から始まり、一連のガングリオシド模倣物は、示される配列を使用して、組換えα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃｓｔ−Ｉ）、β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＣｇｔＡ）、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣｇｔＢ）、および二機能性α−２，３／α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃｓｔ−ＩＩ）を用いて合成された。全ての産物は、質量分析により解析され、そして観察された単一の同位数（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）の質量（括弧で示す）は、全て理論質量の０．０２％以内であった。ＧＭ３模倣物、ＧＤ３模倣物、ＧＭ２模倣物、およびＧＭ１ａ模倣物はまた、ＮＭＲ分析により分析された（表４を参照のこと）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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