(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）攪乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系であって、
ｉ）  ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｐｔｓＨ遺伝子、
ｉｉ）  活性ホスホエノールピルベート−タンパク質リン酸転移酵素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｐｔｓＩ遺伝子、および
ｉｉｉ）  活性グルコース−特異的ＩＩＡ構成要素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｃｒｒ遺伝子、の１または複数を含むもの、
ｂ）活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性ｇａｌＰ遺伝子であって、前記アップレギュレートがガラクトース−プロトン同伴輸送体活性の増加をもたらすもの、
ｃ）活性グルコキナーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性ｇｌｋ遺伝子であって、前記アップレギュレートがグルコキナーゼ活性の増加をもたらすもの、
ｄ）活性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝的にダウンレギュレートされた内在性ｇａｐＡであって、前記ダウンレギュレートがグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらすもの、
ｅ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、
ｆ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、および
ｇ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、を含み、これにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が適切な炭素源をグリセロール、１，３−プロパンジオール、または、グリセロールおよび１，３−プロパンジオールへ生物変換することができることを特徴とする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
【請求項２】
ａ）攪乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系であって、
i）  ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｐｔｓＨ遺伝子、
ii）  ホスホエノールピルベート−タンパクリンクリン酸転移酵素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｐｔｓＩ遺伝子、および
iii）  グルコース−特異的ＩＩＡ構成要素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｃｒｒ遺伝子、の１または複数を含むもの、
ｂ）活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性ｇａｌＰ遺伝子であって、前記アップレギュレートがガラクトース−プロトン同伴輸送体活性の増加をもたらすもの、
ｃ）活性グルコキナーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性ｇｌｋ遺伝子であって、前記アップレギュレートがグルコキナーゼ活性の増加をもたらすもの、
ｄ）活性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝的にダウンレギュレートされた内在性ｇａｐＡ遺伝子であって、前記ダウンレギュレートがグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらすもの、
ｅ）活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ａｒｃＡ遺伝子、
ｆ）活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性ｐｐｃ遺伝子であって、前記アップレギュレートがホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増加をもたらすもの、
ｇ）活性ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性ｂｔｕＲ遺伝子であって、前記アップレギュレートがｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ活性の増加をもたらすもの、
ｈ）活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされたｙｑｈＤ遺伝子であって、前記アップレギュレートがアルコールデヒドロゲナーゼ活性の増加をもたらすもの、
ｉ）活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｍｇｓＡ遺伝子、
ｊ）活性酢酸キナーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ａｃｋＡ遺伝子、
ｋ）活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｐｔａ遺伝子、
ｌ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＡの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ａｌｄＡ遺伝子、
ｍ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＢの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ａｌｄＢ遺伝子、
ｎ）活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｅｄｄ遺伝子、
ｏ）活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｇｌｐＫ遺伝子、
ｐ）活性ＮＡＤＨ−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ｇｌｄＡ遺伝子、
ｑ）ｐＳＹＣＯプラスミド配列番号：６５、６６、６７、または６８のヌクレオチド配列のいずれか１つ、
ｒ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、
ｓ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、および
ｔ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、を含みこれにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が適切な炭素源をグリセロール、１，３−プロパンジオール、またはグリセロールおよび１，３−プロパンジオールへ生物変換することができることを特徴とする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
【請求項３】
適切な条件下で、請求項１または２に記載の大腸菌株を適切な炭素基材と接触させるステップを含むことを特徴とする１，３−プロパンジオールの生物生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一微生物による、発酵性炭素源の１，３−プロパンジオールへの生物変換のための方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールは、ポリエステル線維の生産およびポリウレタンおよび環状化合物の製造において、潜在的有用性を有するモノマーである。
【０００３】
１，３−プロパンジオールへの多様な化学経路が知られている。例えば触媒上で、ホスフィン、水、一酸化炭素、水素、および酸の存在下、アクロレインの触媒的液相水和作用とそれに続く還元によって、エチレンオキシドを１，３−プロパンジオールに転換しても良く、あるいは周期表のＶＩＩＩ族からの元素を有する触媒上で、グリセロールなどの化合物を一酸化炭素および水素の存在下で反応させても良い。これらの方法によって１，３−プロパンジオールを生じさせることは可能であるが、それらは高価であり、環境汚染物質を含有する不要流出物を生じる。
【０００４】
グリセロールの発酵から１，３−プロパンジオールが生産できることは一世紀以上にわたって知られている。例えばシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびペロバクター（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ）などの類に、１，３−プロパンジオールを生産できる菌株が見つかっている。それぞれの事例研究において、グリセロールは酵素が触媒する二段階の反応順序で１，３−プロパンジオールに転換される。第１のステップでは、デヒドラターゼが、グリセロールの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）および水への転換を触媒する（式１）。第２のステップでは、３−ＨＰＡがＮＡＤ＋−結合酸化還元酵素によって１，３−プロパンジオールに還元される（式２）。１，３−プロパンジオールはさらに代謝されず、その結果、培養液中に蓄積する。
グリセロール→３−ＨＰＡ＋Ｈ２Ｏ（式１）
３−ＨＰＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→１，３プロパンジオール＋ＮＡＤ＋（式２）
全体的反応は、補助因子、還元β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の形態である還元当量を消費し、それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に酸化される。
【０００５】
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、およびクロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）では、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ１−３またはｄｈａＢ、ＣおよびＥ）の３個の構造的サブユニットをコードする遺伝子は、特異的１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子に隣接する。遺伝的編成はこれらの微生物の間でいくらか異なるが、これらの遺伝子は、ｏｒｆＸおよびｏｒｆＺ（グリセロールデヒドラターゼのデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子）、ならびにｏｒｆＹおよびｏｒｆＷ（機能不明の遺伝子）も含む一群に集まっている。これらの微生物の特異的１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ’ｓ）は、ＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属することが知られており、それぞれが保存された鉄結合モチーフを示し、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ結合１，３−プロパンジオールおよび３−ＨＰＡの相互転換に対する優先度を有する。しかし１，３−プロパンジオールと３−ＨＰＡとのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ結合相互転換は、動力学的パラメーターの効率がより低いとはいえ、デヒドラターゼ酵素に特異的に結合していないアルコールデヒドロゲナーゼ（例えばウマ肝臓およびパン酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１））によっても触媒される。グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）およびジオール［１，２プロパンジオール］デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）は関連しているが異なる酵素であり、異なる遺伝子によってコードされる。クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からのジオールデヒドラターゼ遺伝子は、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子に類似し、ｏｒｆＸおよびｏｒｆＺに類似した遺伝子を含む一群に集まっている（非特許文献１）、（非特許文献２）、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＡＦ０２６２７０）。
【０００６】
グリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産は、概して嫌気的条件下で唯一の炭素源としてグリセロールを使用して、その他の外来性還元当量受容体の不在下で実施される。これらの条件下では、例えばシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の菌株で、最初にＮＡＤ＋−（またはＮＡＤＰ＋−）結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールからジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化を伴うグリセロールへの平行径路が作動する（式３）。ＤＨＡは、ＤＨＡキナーゼによるジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）へのリン酸化（式４）に続いて、生合成のため、そして例えば解糖を通じたＡＴＰ生成のサポートのために利用できるようになる。
グリセロール＋ＮＡＤ＋→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋（式３）
ＤＨＡ＋ＡＴＰ→ＤＨＡＰ＋ＡＤＰ（式４）
１，３−プロパンジオール経路とは対照的に、この経路は炭素およびエネルギーを細胞に提供し、ＮＡＤＨを消費するよりは、むしろ生産するかもしれない。
【０００７】
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびシトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）では、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の機能的に結合した活性をコードする遺伝子は、ｄｈａレギュロンによって包含される。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびシトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）中のｄｈａレギュロンは、転写活性化タンパク（ｄｈａＲ）をコードする遺伝子をも包含する。シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）からのｄｈａレギュロンは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現され、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転換することが示されている。
【０００８】
化学方法はエネルギー集約的であり、生物学的方法は高価な開始材料グリセロールからの比較的低い力価に制限されるので、１，３−プロパンジオール生産について上で述べた化学的または生物学的方法のいずれもが、工業的規模の生産には良く適していない。これらの欠点は、低いエネルギー投入および炭水化物または糖などの安価な開始材料を必要とする方法によって、あるいはグリセロールプロセスの代謝効率を増大させることによって克服できうる。どちらの方法の開発も糖からグリセロール、およびグリセロールから１，３プロパンジオールへの転換に関与する遺伝的機構を操作する能力を必要とする。
【０００９】
グリセロールの調製のための生物学的方法は既知である。グリセロールの生産株の圧倒的多数は酵母であるが、細菌、その他の真菌類、および藻類もいくつか知られている。細菌および酵母の両者は、解糖中の果糖−１，６−ビスリン酸経路や、あるいはエムデン−マイエルホーフ−パルナス経路を通じて、グルコースまたはその他の炭水化物を転換することで、グリセロールを生産する。ジヒドロキシアセトンリン酸は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によってグリセロール−３−リン酸に転換され、グリセロール−３−リン酸は、グリセロール−３−ホスファターゼの作用によってグリセロールに転換される。
【００１０】
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＡＲ１，ＧＰＤ１）をコードする遺伝子はクローン化されており、Ｓ．ジアスタチカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）（非特許文献３）から配列決定されている。ＤＡＲ１遺伝子は、シャトルベクターにクローン化され、大腸菌を形質転換するために使用され、発現によって活性酵素が生産される。（非特許文献３）は、ＤＡＲ１が細胞浸透圧環境によって制御されることを認識するが、組換え型微生物において１，３−プロパンジオール生産を亢進するするために、どのように遺伝子が使用できうるかについては示唆していない。
【００１１】
その他のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素が単離されている。例えばｓｎ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼが出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からクローン化されて配列決定されており、（非特許文献４）、（非特許文献５）は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＰＤ１のクローン化を教示する。（非特許文献３）と同様、（非特許文献５）および（非特許文献４）の両者は、この遺伝子の制御の浸透圧感受性を認識するが、組換え型微生物での１，３−プロパンジオール生産において、遺伝子がいかに使用できうるかについては示唆していない。
【００１２】
Ｇ３ＰＤＨについては、グリセロール−３−ホスファターゼが出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されており、タンパクはＧＰＰ１およびＧＰＰ２遺伝子によってコードされるものと同定されている（非特許文献６）。Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子同様、ＧＰＰ２は浸透圧感受性であるように見える。
【００１３】
（特許文献１）および（非特許文献７）は、「ＰＴＳ」（−）／グルコース（＋）表現型を有する大腸菌株について述べている。（特許文献２）は、エネルギー効率を改善するためのＮＡＤＨデヒドラターゼＩＩの遺伝子の欠失について開示する。（特許文献３）は、３−ヒドロキシプロピオン酸生産のための「アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ」および「アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ」の有用性について述べる。
【００１４】
（特許文献４）（米国特許公報（特許文献５））（本願特許出願人）は、デヒドラターゼ活性を含む単一微生物を使用した、グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の炭素基材（特に例えばグルコース）からの１，３−プロパンジオール生産のための方法を開示する。（特許文献６）（本願特許出願人）は、内在性活性グリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼの片方または双方を撹乱しながら、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−リン酸ホスファターゼの片方または双方の外来性活性を発現することに派生する利点を有する、同様の方法を開示する。（特許文献７）（米国特許公報（特許文献８）、本願特許出願人）は、外来性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ、デヒドラターゼ、および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（例えば，ｄｈａＴ）を含む単一微生物を使用した、１，３−プロパンジオール生産のための方法について述べる。（特許文献９）（米国特許公報（特許文献１０）、本願特許出願人）は、デヒドラターゼおよびタンパクＸ（後にデヒドラターゼ再活性化因子ペプチドであると同定された）をさらに含む組換え型微生物を含む、１，３−プロパンジオール生産のための方法を開示する。（特許文献１１）（本願特許出願人）は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する、（ｄｈａＴによってコードされる１，３−プロパンジオール酸化還元酵素から区別される）非特異的触媒活性のおかげで、力価（リットル当たり生成物グラム数）の顕著な増大が得られる方法の改善について述べる。米国特許公報（特許文献１２）（２００３）（米国特許公報（特許文献１３）（２００２）本願特許出願人）は、１，３−プロパンジオール生産のために有用なベクターおよびプラスミドを開示する。本願特許出願人の出願は、その内容全体を本願明細書に引用したものとする。
【００１５】
１，３−プロパンジオールの生物生産は、二段階逐次反応のための中間基材としてグリセロールを要し、そこではデヒドラターゼ酵素（典型的に補酵素Ｂ１２−依存性デヒドラターゼ）がグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに転換し、それが次にＮＡＤＨ−（またはＮＡＤＰＨ−）依存性酸化還元酵素によって１，３−プロパンジオールに還元される。補助因子要件の複雑性により、１，３−プロパンジオール生産のためこの反応順序を利用する工業的方法のために、ホールセル（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ）触媒を使用することが必要となる。
【００１６】
グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産をもたらす生物学的方法における特異的欠損は、発酵によって得られる低収率生成物であった。（特許文献１１）（本願特許出願人）は、２４％〜３５％の範囲にあるグルコースからの１，３−プロパンジオールの重量収率について述べる。解決すべき問題は、いかに１，３−プロパンジオールをグルコースまたはその他の糖などの安価な炭素基材から、単一微生物により高収率で生物学的に生産するかである。
【００１７】
【特許文献１】国際公開第９６３４９６１号パンフレット
【特許文献２】欧州特許出願公開第１１７０３７６  Ａ１号明細書
【特許文献３】国際公開第２００１０１６３４６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９６３５７９６号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，６８６，２７６号明細書
【特許文献６】国際公開第９９２８４８０号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９８２１３３９号パンフレット
【特許文献８】米国特許第６，０１３，４９４号明細書
【特許文献９】国際公開第９８２１３４１号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第６，１３６，５７６号明細書
【特許文献１１】国際公開第２００１０１２８３３号パンフレット
【特許文献１２】米国特許出願第１０／４２０５８７号明細書
【特許文献１３】米国特許出願第６０／３７４９３１号明細書
【特許文献１４】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献１５】国際公開第２００１０１２８３３  Ａ２号パンフレット
【特許文献１６】米国特許第５，３５６，８１２号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，００８，４７３号明細書
【特許文献１８】国際公開第９８２１３４０  Ａ１号パンフレット
【非特許文献１】ダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２、５５３（１９９９）
【非特許文献２】トラヤおよびモリ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、３３７２（１９９９）
【非特許文献３】ウァン（Ｗａｎｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７６、７０９１〜７０９５（１９９４）
【非特許文献４】ラールソン（Ｌａｒａｓｏｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０、１１０１（１９９３）
【非特許文献５】アルバーティン（Ａｌｂｅｒｔｙｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、４１３５（１９９４）
【非特許文献６】ノルベック（Ｎｏｒｂｅｃｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、１３８７５（１９９６）
【非特許文献７】エルナンデス−モンタルボ（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｎｔａｌｖｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７：１８６〜１９１（２００１）
【非特許文献８】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３、３０２１〜３０３０（１９８５）
【非特許文献９】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９、３４５〜３７３（１９８４）
【非特許文献１０】トビマツら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１、４１１０（１９９９）
【非特許文献１１】ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびリン（Ｌｉｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９、２０５０（１９８７）
【非特許文献１２】ダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７、２１５１（１９９５）
【非特許文献１３】レウルス（Ｌｅｕｒｓ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４、３３７（１９９７）
【非特許文献１４】ヴェイガ・ダ・ダンハ（Ｖｅｉｇａ  ｄａ  Ｄｕｎｈａ）、およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８、２００５（１９９２）
【非特許文献１５】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）第１１章および表１１．１
【非特許文献１６】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）９．５０〜９．５１
【非特許文献１７】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）１１．７〜１１．８
【非特許文献１８】「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３）
【非特許文献１９】「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」レスク（Ｌｅｓｋ）Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８
【非特許文献２０】「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３
【非特許文献２１】「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第一部、グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４
【非特許文献２２】「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」フォン・ハインェ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７
【非特許文献２３】「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）Ｊ．編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１
【非特許文献２４】デュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４）
【非特許文献２５】ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４〜２４４８（１９８８）
【非特許文献２６】「ＢＬＡＳＴマニュアル（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ）」、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．、Ｎａｔｌ．Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｍｅｄ．（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ）ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４
【非特許文献２７】アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）
【非特許文献２８】アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、「ギャップＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパクデータベース研究プログラム（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７）
【非特許文献２９】ハイン（Ｈｅｉｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６〜６４５（１９９０）
【非特許文献３０】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）
【非特許文献３１】エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７、９５（１９９５）
【非特許文献３２】トーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）「生物工学：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第二版（１９８９）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．
【非特許文献３３】デシュパンデ、ムクンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６、２２７（１９９２）
【非特許文献３４】デ・マンチルハ（ＤｅＭａｎｃｉｌｈａ）ら、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．１４、３１３（１９８４）
【非特許文献３５】バネイクス（Ｂａｎｅｙｘ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１０：４１１
【非特許文献３６】ロス（Ｒｏｓｓ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０：５３７５
【非特許文献３７】デハセス（ｄｅＨａｓｅｔｈ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０：３０１９
【非特許文献３８】スモルケ（Ｓｍｏｌｋｅ）およびキースリング（Ｋｅａｓｌｉｎｇ）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｅｒｉｎｇ（２００２）８０：７６２
【非特許文献３９】シュワルツ（Ｓｗａｒｔｚ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１）１２：１９５
【非特許文献４０】マ（Ｍａ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００２）１８４：５７３３
【非特許文献４１】「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）
【非特許文献４２】ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７、６６４０〜６６４５（２０００）
【非特許文献４３】パルメロス（Ｐａｌｍｅｒｏｓ）ら、Ｇｅｎｅ  ２４７、２５５〜２６４（２０００）
【非特許文献４４】ミラー、Ｊ．Ｈ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．）、「微生物遺伝学短期講習。大腸菌と関連細菌に関する実験室マニュアルおよびハンドブック（Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」（１９９２）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【非特許文献４５】Ｔ．Ｅ．バーマン（Ｔ．Ｅ．Ｂａｒｍａｎ）、「酵素ハンドブック（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」（１９８５）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ
【非特許文献４６】フロレス（Ｆｌｏｒｅｓ）およびガンセード（Ｇａｎｃｅｄｏ）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１２、５３１〜５３４（１９９７）
【非特許文献４７】フォレージ（Ｆｏｒａｇｅ）およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５６９、２４９（１９７９）
【非特許文献４８】ホンダら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３、１４５８（１９８０）
【非特許文献４９】ベル（Ｂｅｌｌ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０、７１５３（１９７５）
【非特許文献５０】タン（Ｔａｎｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０、１８２（１９９７）
【非特許文献５１】フロレス（Ｆｌｏｒｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、６２０〜６２３（１９９６）
【非特許文献５２】リーヴィ（Ｌｅｖｙ）ら、Ｇｅｎｅ  ８６、２７〜３３（１９９０）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本願特許出願人らは前述の問題を解決した。本発明は、単一微生物の使用によってこれまで得られていたよりも高い収率で、発酵性炭素源を１，３−プロパンジオールに生物転換する。得られる収率は３５％を超え、好ましくは４０％を超える。グルコースがモデル基材として、大腸菌がモデル宿主微生物として使用され、有用な遺伝的修飾および撹乱についてここで詳述する。
【００１９】
本願特許出願人らは、
ａ）活性ＰＥＰ−グルコースリン酸転移酵素系タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系、
ｂ）活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードするアップレギュレートされた内在性ｇａｌＰ遺伝子、
ｃ）活性グルコキナーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｇｌｋ遺伝子、および
ｄ）活性グリセロールアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするダウンレギュレートされた内在性ｇａｐＡ遺伝子
を含む大腸菌株を提供した。
【００２０】
本願特許出願人らは、撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系が、
ａ１）活性ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ｐｔｓＨ遺伝子、
ａ２）活性ホスホエノールピルベート−タンパクリン酸基転移酵素の発現を妨げる撹乱された内在性ｐｔｓＩ遺伝子、および
ａ３）活性グルコース−特異的ＩＩＡ構成要素の発現を妨げる撹乱された内在性ｃｒｒ遺伝子
の１つまたは複数を含む、上述の大腸菌株も提供した。
【００２１】
上述の大腸菌実施形態は、
ｅ）活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ａｒｃＡ遺伝子、
ｆ）活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｐｐｃ遺伝子、
ｇ）活性ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｂｔｕＲ遺伝子、および
ｈ）活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードするアップレギュレートされたｙｑｈＤ遺伝子
の１つまたは複数をさらに含むことができる。
【００２２】
上述の大腸菌実施形態は、
ｉ）活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｍｇｓＡ遺伝子、
ｊ）活性酢酸キナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ａｃｋＡ遺伝子、
ｋ）活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｐｔａ遺伝子、
ｌ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＡの発現を妨げる撹乱された内在性ａｌｄＡ遺伝子、および
ｍ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＢの発現を妨げる撹乱された内在性ａｌｄＢ遺伝子
の１つまたは複数をさらに含むことができる。
【００２３】
上述の大腸菌実施形態は、
ｎ）活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｅｄｄ遺伝子、
ｏ）活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｇｌｐＫ遺伝子、および
ｐ）活性ＮＡＤＨ−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｇｌｄＡ遺伝子
の１つまたは複数をさらに含むことができる。
【００２４】
さらに１，３−プロパンジオールは、発酵に適した条件下で、ここで述べる大腸菌株をグルコースなどの適切な炭素基材と接触させて生物生産できる。さらに１，３−プロパンジオールは、発酵に適した条件下で、活性
（ｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、
（ｉｉ）グリセロール−３−ホスファターゼ、
（ｉｉｉ）デヒドラターゼ、および
（ｉＶ）デヒドラターゼ再活性化活性
をさらに含む、ここで述べる大腸菌株を適切な炭素基材と接触させて生物生産できる。
【００２５】
さらに上で開示する実施形態のいずれかは、コンストラクトｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、ｐＳＹＣＯ１０９、あるいはそれらの対応するヌクレオチド配列配列番号：６５、６６、６７、または６８を含んでも良い。
【００２６】
（配列説明および生物学的寄託）
以下の詳細な説明、図１、添付の配列表と説明、および本出願の一部を形成する生物学的寄託から、発明をより詳しく理解できる。
【００２７】
ここに添付した６８の配列説明および配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）で述べられる、特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列開示を司る規則に適合し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ２．５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）で示される対応する米国特許商標局規則に一致する。配列説明は、参照によってここに編入する（非特許文献８）および（非特許文献９）で述べられるＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に準拠して定義されるように、ヌクレオチド配列性状のための１文字コード、およびアミノ酸のための３文字コードを含む。
配列番号：１は、ｌｏｘＰ５１１−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ５１１カセットをコードするｐＬｏｘＣａｔ２７の部分的ヌクレオチド配列である。
配列番号：２〜３は、ａｒｃＡ撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：４〜５は、ａｒｃＡ撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：６は、ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットをコードするｐＬｏｘＣａｔ１の部分的ヌクレオチド配列である。
配列番号：７〜８は、染色体ｇａｌＰプロモーターのｔｒｃプロモーター置換のためのテンプレートプラスミドである、ｐＲ６ＫｇａｌＰを構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：９〜１０は、染色体ｇｌｋプロモーターのｔｒｃプロモーター置換のためのテンプレートプラスミドである、ｐＲ６Ｋｇｌｋを構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：１１は、ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰＴｒｃカセットのヌクレオチド配列である。
配列番号：１２〜１３は、染色体ｇａｌＰプロモーター置換のための配列番号：１１の組み込みを確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：１４〜１５は、染色体ｇｌｋプロモーターの置換のための配列番号：１１の組み込みを確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：１６〜１７は、ｅｄｄ撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：１８〜１９は、ｅｄｄの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：２０は、選択されたｔｒｃプロモーター調節ｇｌｋ発現のためのヌクレオチド配列である。
配列番号：２１は、標準ｔｒｃプロモーターの部分的ヌクレオチド配列である。
配列番号：２２〜２３は、ｇａｐＡの増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：２４〜２５は、ｇａｐＡからＧＴＧへの開始コドン変更に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：２６〜２７は、ｇａｐＡからＴＴＧへの開始コドン変更に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：２８は、短１．５ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号：２９〜３０は、短１．５ＧＩプロモーターを有する染色体ｇａｐＡプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：３１は、短１．２０ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号：３２は、短１．６ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号：３３〜３４は、短１．２０ＧＩプロモーターを有する染色体ｇａｐＡプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：３５は、短１．６ＧＩプロモーターを有する染色体ｇａｐＡプロモーター置換のために使用される配列番号３３を有するオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：３６〜３７は、ｍｇｓＡ撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：３８〜３９は、ｍｇｓＡの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：４０〜４１は、短１．６ＧＩプロモーターを有する染色体ｐｐｃプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：４２は、ｐｐｃプロモーター置換を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：４３〜４４は、短１．６ＧＩプロモーターを有する染色体ｙｃｉＫ−ｂｔｕＲプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：４５〜４６は、ｙｃｉＫ−ｂｔｕＲプロモーター置換を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：４７〜４８は、短１．６ＧＩプロモーターを有する染色体ｙｑｈＤプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：４９は、ｙｑｈＤプロモーター置換を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ番号：５０〜５１は、ｐｔａ−ａｃｋＡ撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ番号：５２〜５３は、ｐｔａ−ａｃｋＡの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ番号：５４〜５５は、ｐｔｓＨＩｃｒｒ撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：５６は、ｐｔｓＨＩｃｒｒの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：５７〜５８は、ａｌｄＡ撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：５９〜６０は、ａｌｄＡの撹乱を確認するのに使用される
オリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：６１〜６２は、ａｌｄＢ撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：６３〜６４は、ａｌｄＢの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号：６５は、ｐＳＹＣＯ１０１プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号：６６は、ｐＳＹＣＯ１０３プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号：６７は、ｐＳＹＣＯ１０６プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号：６８は、ｐＳＹＣＯ１０９プラスミドのヌクレオチド配列である。
【００２８】
本願特許出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
【００２９】
【表１】
0004592418.tif 000002
【００３０】
寄託物は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００３１】
ここでの用法では、「ＡＴＣＣ」は、米国ＶＡ２０１１０〜２２０９マナッサスのユニバーシティ・ブールヴァード１０８０１（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９  Ｕ．Ｓ．Ａ．）に所在する米国微生物系統保存機関を指す。「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣに寄託された培養物の受け入れ番号である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、単一微生物を使用して、発酵性炭素源を直接１，３−プロパンジオールに生物転換する改善された方法を提供する。方法は、これまで得られたことのないレベルの改善された１，３−プロパンジオール収率によって特徴づけられる。
【００３３】
開示された生産宿主菌株は、炭素から非生産的化合物への転換を妨げる、種々の欠失変異を組み込むことで遺伝子操作されて、経路の代謝効率が最大化されている。１，３−プロパンジオール生産の亢進のために、特定の酵素活性を調節するように、形質転換および変異を組み合わせられることが考察された。したがって１，３−プロパンジオール生産の増大につながるホールセル触媒の変更を予測することは、本発明の範囲内である。
【００３４】
（用語および定義）
発明は、請求の範囲および明細書で使用される以下の用語および定義を参照して、より完全に理解できる。
【００３５】
（欠失させられる遺伝子）
「ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩ」、「ＮＤＨＩＩ」、および「Ｎｄｈ」という用語は、ユビキノン−８＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋からユビキノール−８＋ＮＡＤ＋への転換を触媒するタンパクであるＩＩ型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを指す。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩの典型は、ＥＣ１．６．９９．３である。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩは、大腸菌ではｎｄｈによってコードされる。
【００３６】
「有気呼吸制御タンパク」および「ＡｒｃＡ」と言う用語は、グローバル制御タンパクを指す。有気呼吸制御タンパクは、大腸菌ではａｒｃＡによってコードされる。
【００３７】
「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ」および「Ｅｄｄ」と言う用語は、６−ホスホ−グルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−グルコン酸＋Ｈ２Ｏへの転換を触媒するタンパクを指す。ホスホグルコン酸デヒドラターゼの典型は、ＥＣ  ４．２．１．１２である。ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、大腸菌ではｅｄｄによってコードされる。
【００３８】
「ホスホキャリアタンパクＨＰｒ」および「ＰｔｓＨ」と言う用語は、大腸菌ではｐｔｓＨによってコードされるホスホキャリアタンパクを指す。「ホスホエノールピルベート−タンパクリン酸基転移酵素」および「ＰｔｓＩ」と言う用語は、大腸菌ではｐｔｓＩによってコードされるリン酸基転移酵素ＥＣ  ２．７．３．９を指す。「ＰＴＳシステム」、「グルコース−特異的ＩＩＡ構成要素」、および「Ｃｒｒ」と言う用語は、大腸菌ではｃｒｒによってコードされるＥＣ  ２．７．１．６９を指す。ＰｔｓＨ、ＰｔｓＩ、およびＣｒｒが、ＰＴＳシステムを構成する。
【００３９】
「ホスホエノールピルベート−糖リン酸転移酵素系」、「ＰＴＳシステム」、または「ＰＴＳ」という用語は、ホスホエノールピルベート−依存性糖摂取システムを指す。
【００４０】
「メチルグリオキサールシンターゼ」および「ＭｇｓＡ」と言う用語は、ジヒドロキシ−アセトン−ホスフェートからメチル−グリオキサール＋ホスフェートへの転換を触媒するタンパクを指す。メチルグリオキサールシンターゼの典型は、ＥＣ  ４．２．３．３である。メチルグリオキサールシンターゼは大腸菌ではｍｇｓＡによってコードされる。
【００４１】
「アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ」および「ＡｌｄＡ」と言う用語は、Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤ＋＋アルデヒドからＮＡＤＨ＋アルコールへの転換を触媒するタンパクを指す。アルデヒドデヒドロゲナーゼＡの典型は、ＥＣ  １．２．１．２２である。アルデヒドデヒドロゲナーゼＡは、大腸菌ではａｌｄＡによってコードされる。
【００４２】
「アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ」および「ＡｌｄＢ」と言う用語は、Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤ＋＋アルデヒドからＮＡＤＨ＋アルコールへの転換を触媒するタンパクを指す。アルデヒドデヒドロゲナーゼＢの典型は、ＥＣ  １．２．１．２２である。アルデヒドデヒドロゲナーゼＢは、大腸菌ではａｌｄＢによってコードされる。
【００４３】
（発現が修飾される遺伝子）
「ガラクトース−プロトン同伴輸送体」および「ＧａｌＰ」と言う用語は、周辺質から細胞質への糖およびプロトンの輸送を触媒するタンパクを指す。Ｄ−グルコースがＧａｌＰのための好ましい基材である。ガラクトース−プロトン同伴輸送体は、大腸菌ではｇａｌＰによってコードされる。
【００４４】
「グルコキナーゼ」および「Ｇｌｋ」と言う用語は、Ｄ−グルコース＋ＡＴＰからグルコース−６−ホスフェート＋ＡＤＰへの転換を触媒するタンパクを指す。グルコキナーゼの典型はＥＣ  ２．７．１．２である。グルコキナーゼは、大腸菌ではｇｌｋによってコードされる。
【００４５】
「グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＧａｐＡ」と言う用語は、グリセルアルデヒド−３−リン酸＋ホスフェート＋ＮＡＤ＋から３−ホスホ−Ｄ−グリセロイル−ホスフェート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋への転換を触媒するタンパクを指す。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの典型は、ＥＣ  １．２．１．１２である。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌ではｇａｐＡによってコードされる。
【００４６】
「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」および「Ｐｐｃ」と言う用語は、ホスホエノールピルベート＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２からホスフェート＋オキザロ酢酸への転換を触媒するタンパクを指す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの典型は、ＥＣ  ４．１．１．３１である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大腸菌ではｐｐｃによってコードされる。
【００４７】
「ＹｃｉＫ」と言う用語は、大腸菌ではＣｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｂｔｕＲに翻訳的に連結される、ｙｃｉＫによってコードされる推定上の酵素を指す。
【００４８】
「ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ」と言う用語は、デオキシアデノシル部分のＡＴＰから還元コリノイドへの転移を担う酵素を指す。ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの典型は、ＥＣ  ２．５．１．１７である。ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼは、大腸菌では遺伝子「ｂｔｕＲ」（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２１５２８）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）では「ｃｏｂＡ」（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ０８８９０）、そしてシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）では「ｃｏｂＯ」（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ６２８６６）によってコードされる。
【００４９】
（追加的定義）
「短１．２０ＧＩプロモーター」と言う用語は、配列番号：３１を指す。「短１．５ＧＩプロモーター」と言う用語は、配列番号：２８を指す。「短１．６ＧＩプロモーター」および「短野生型プロモーター」と言う用語は、同義的に使用され配列番号：３２を指す。
【００５０】
「グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「Ｇ３ＰＤＨ」と言う用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）Ｇ３ＰＤＨは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、またはＦＡＤ−依存性であっても良い。補助因子特異的グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼに具体的に言及する場合、「ＮＡＤＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」、「ＮＡＤＰＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」およびＦＡＤ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」と言う用語を使用する。概してＮＡＤＨ−依存性およびＮＡＤＰＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼが、（例えばｇｐｓＡによってコードされる遺伝子によって）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを同義的に使用できるように、ＮＡＤＨ−依存性およびＮＡＤＰＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと言う用語は、同義的に使用される。ＮＡＤＨ−依存性酵素（ＥＣ  １．１．１．８）は、例えばＧＰＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ７４０７１ｘ２）、またはＧＰＤ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ３５１６９ｘ１）、またはＧＰＤ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ９８４１８２）、またはＤＡＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ７４０７１ｘ２）をはじめとするいくつかの遺伝子によってコードされる。ＮＡＤＰＨ−依存性酵素（ＥＣ１．１．１．９４）は、ｇｐｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ３２１６４３、（ｃｄｓ  １９７９１１−１９６８９２）Ｇ４６６７４６およびＬ４５２４６）によってコードされる。ＦＡＤ−依存性酵素（ＥＣ１．１．９９．５）は、ＧＵＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ４７０４７ｘ２３）、またはｇｌｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ１４７８３８）、またはｇｌｐＡＢＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２０９３８）によってコードされる（参照によってここに編入する（特許文献６）およびその参考文献を参照されたい）。
【００５１】
「グリセロール−３−ホスファターゼ」、「ｓｎ−グリセロール−３−ホスファターゼ」、または「ｄ，ｌ−グリセロールホスファターゼ」、および「Ｇ３Ｐホスファターゼ」と言う用語は、グリセロール−３−リン酸および水からグリセロールおよび無機ホスフェートへの転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。Ｇ３Ｐホスファターゼは、例えばＧＰＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ４７０４７ｘ１２５）、またはＧＰＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ１８８１３ｘ１１）によってコードされる（参照によってここに編入する（特許文献６）およびその参考文献を参照されたい）。
【００５２】
「グリセロールキナーゼ」と言う用語は、グリセロールおよびＡＴＰからグリセロール−３−リン酸およびＡＤＰへの転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。高エネルギーホスフェート供与体ＡＴＰは、生理学的代替物（例えばホスホエノールピルベート）によって置き換えられも良い。グリセロールキナーゼは、例えばＧＵＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ１１５８３ｘ１９）およびｇｌｐＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ１９２０１）によってコードされる（参照によってここに編入する（特許文献６）およびその参考文献を参照されたい）。
【００５３】
「グリセロールデヒドロゲナーゼ」と言う用語は、グリセロールからジヒドロキシアセトン（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）への、あるいはグリセロールからグリセルアルデヒド（Ｅ．Ｃ．１．１．１．７２）への転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。グリセロールからジヒドロキシアセトンへの転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドは、「ジヒドロキシアセトン還元酵素」とも称される。グリセロールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、ＮＡＤＰＨ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．７２）またはその他の補助因子（例えばＥ．Ｃ．１．１．９９．２２）に依存しても良い。ＮＡＤＨ−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、例えばｇｌｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ００００６）によってコードされる（参照によってここに編入する（特許文献６）およびその参考文献を参照されたい）。
【００５４】
「デヒドラターゼ酵素」、または「デヒドラターゼ」と言う用語は、グリセロール分子から生成物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの転換を触媒するあらゆる酵素活性を指す。本発明において、デヒドラターゼ酵素は、それぞれグリセロールおよび１，２−プロパンジオールである好ましい基材を有する、グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）およびジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）を含む。デヒドラターゼ酵素の遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）で同定されている。それぞれの場合、デヒドラターゼは、大型または「α」サブユニット、中型または「β」サブユニット、および小型または「γ」サブユニットの３個のサブユニットから構成される。文献で使用される遺伝子命名法に幅広い変動があるために、表１に比較チャートを提示して、同定を容易にする。遺伝子については、例えば（非特許文献１）および（非特許文献２）でも述べられている。表１について述べると、グリセロールデヒドラターゼの大型または「α」サブユニットをコードする遺伝子としては、ｄｈａＢ１、ｇｌｄＡ、およびｄｈａＢが挙げられ、中型または「β」サブユニットをコードする遺伝子としてはｄｈａＢ２、ｇｌｄＢ、およびｄｈａＣが挙げられ、小型また「γ」サブユニットをコードする遺伝子としては、ｄｈａＢ３、ｇｌｄＣ、およびｄｈａＥが挙げられる。また表１では、ジオールデヒドラターゼの大型または「α」サブユニットをコードする遺伝子としてｐｄｕＣおよびｐｄｄＡが挙げられ、中型または「β」サブユニットをコードする遺伝子としてｐｄｕＤおよびｐｄｄＢが挙げられ、小型また「γ」サブユニットをコードする遺伝子としてｐｄｕＥおよびｐｄｄＣが挙げられている。
【００５５】
【表２】
0004592418.tif 000003
【００５６】
【表３】
0004592418.tif 000004
【００５７】
グリセロールおよびジオールデヒドラターゼは、グリセロールおよびその他の基材による機序ベースの自殺不活性化を受ける（非特許文献１）。「デヒドラターゼ再活性化因子」と言う用語は、デヒドラターゼ活性再活性化を担うタンパクを指す。「デヒドラターゼ再活性化活性」、「デヒドラターゼ活性を再活性化する」または「デヒドラターゼ活性を再生する」と言う用語は、基材の触媒作用ができないデヒドラターゼを基材の触媒作用ができるものに転換する現象、またはデヒドラターゼの不活性化を阻害する現象、または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のデヒドラターゼ酵素の有用な半減期を延長させる現象を指す。２種のタンパクがデヒドラターゼ再活性化因子に関与するとして同定されている（参照によってここに編入する（特許文献９）（米国特許公報（特許文献８））およびその参考文献、（非特許文献１）、（非特許文献２）、および（非特許文献１０）を参照されたい）。表１において、タンパクの１つをコードする遺伝子としては、ｏｒｆＺ、ｄｈａＢ４、ｇｄｒＡ、ｐｄｕＧ、およびｄｄｒＡが挙げられる。また表１において、２つのタンパクの２つめをコードする遺伝子としては、ｏｒｆＸ、ｏｒｆ２ｂ、ｇｄｒＢ、ｐｄｕＨ、およびｄｄｒＢが挙げられる。
【００５８】
「１，３プロパンジオール酸化還元酵素」、「１，３プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」または「ＤｈａＴ」と言う用語は、このような活性をコードする遺伝子が、その自然な（すなわち野生型）設定で、デヒドラターゼ酵素に物理的または転写的に結合していることが分かっていると言う条件で、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールとの相互転換を触媒できる酵素活性を担うポリペプチドを指す。例えばクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのｄｈａＴの場合のように、ｄｈａレギュロン内に遺伝子が見つかっている。表１において、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子としては、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、およびクロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）からのｄｈａＴが挙げられる。これらの各遺伝子は、ＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属するポリペプチドをコードし、保存された鉄結合モチーフを示し、３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ結合相互転換に対する優先度を有する（非特許文献１１）、（非特許文献１２）、および（非特許文献１３）。同様の物理特性を有する酵素が、ブレビス乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）およびブッフネリ乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されている（非特許文献１４）。
【００５９】
「ｄｈａレギュロン」と言う用語は、デヒドラターゼ活性、再活性化活性、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をはじめとするが、これに限定されるものではない種々の生物学的活性をコードする関連した遺伝子または読み取り枠のセットを指す。典型的にｄｈａレギュロンは、ここで述べるような読み取り枠ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、およびｏｒｆＺを含む。
【００６０】
「非特異的触媒活性」と言う用語は、３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールの相互転換を触媒するのに十分な酵素活性を担うポリペプチドを指し、特に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を除外する。典型的にこれらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。このような酵素は、ＦＡＤまたはＦＭＮなどのフラビンをはじめとするが、これに限定されるものではないＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ以外の補助因子を用いても良い。例えば非特異的アルコールデヒドロゲナーゼ（ｙｑｈＤ）の遺伝子は、大腸菌Ｋ１２菌株内で、内因的にコードされ機能的に発現することが分かっている。
【００６１】
「機能」または「酵素機能」と言う用語は、特異的化学反応を実施するのに要するエネルギーを変化させる酵素の触媒活性を指す。このような活性は、生成物または基材のいずれかの生産が、適切な条件下で達成されても良い、平衡状態にある反応に適用しても良いものと理解される。
【００６２】
「ポリペプチド」および「タンパク」と言う用語は、同義的に使用される。
【００６３】
「炭素基材」および「炭素源」と言う用語は、本発明の宿主微生物によって代謝されることができる炭素源、特に単糖類、オリゴ糖、多糖類、および１炭素基材またはそれらの混合物より構成される群から選択される炭素源を指す。
【００６４】
「宿主細胞」または「宿主微生物」と言う用語は、外来性または異種性遺伝子を受容し、それらの遺伝子を発現して活性遺伝子生成物を生産できる微生物を指す。
【００６５】
「外来性遺伝子」、「外来性ＤＮＡ」、「異種性遺伝子」、および「異種性ＤＮＡ」と言う用語は、種々の手段によって宿主微生物内に配置された、１つの生物にとって天然である遺伝物質を指す。関心のある遺伝子は、自然発生的遺伝子、変異遺伝子、または合成遺伝子であっても良い。
【００６６】
「形質転換」および「形質移入」と言う用語は、核酸の組み込み後の細胞中での新しい遺伝子の獲得を指す。獲得された遺伝子は、染色体ＤＮＡ中に統合されても、あるいは余分の染色体複製配列として導入されても良い。「形質転換体」と言う用語は、形質転換の産物を指す。
【００６７】
「遺伝子改変」と言う用語は、形質転換または変異によって、遺伝因子を変化させるプロセスを指す。
【００６８】
「組換え型微生物」および「形質転換された宿主」と言う用語は、異種性または外来性遺伝子または相同遺伝子の余剰コピーで形質転換されているあらゆる微生物を指す。本発明の組換え型微生物は、適切な炭素基材からの１，３−プロパンジオール生産のために、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ１）、グリセロール−３−ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３）、デヒドラターゼ再活性化因子（ｏｒｆＺおよびｏｒｆＸ）、そして任意に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）をコードする外来性遺伝子を発現する。好ましい実施形態は、これらの遺伝子で形質転換されているが、機能性のｄｈａＴを欠く大腸菌である。大腸菌以外の宿主微生物も、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールとの相互転換のために、開示された遺伝子、および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）を特に除外する、非特異的触媒活性のための遺伝子を含有するように形質転換できる。
【００６９】
「遺伝子」とは、コード領域に先行し（５’非コード）、それに続く（３’非コード）制御配列をはじめとする、特定タンパクを発現する核酸断片を指す。「天然」および「野生型」と言う用語は、それ自体の制御配列と共に自然界に見られる遺伝子を指す。
【００７０】
「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」と言う用語は、転写および翻訳機序を通じ、それによって遺伝子がアミノ酸配列を生産するプロセスを指す。具体的なアミノ酸配列をコードするプロセスは、コードされるアミノ酸における変化を引き起こさない塩基の変化が関与しても良く、あるいは１つまたは複数のアミノ酸を変更するかもしれないが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパクの機能特性に影響しない塩基の変化が関与する、ＤＮＡ配列を含むものと理解される。したがって発明は、具体的例証配列を超えて包含するものと理解される。
【００７１】
「単離された」と言う用語は、それが自然に結合する少なくとも１つの構成要素から除去された、タンパクまたはＤＮＡ配列を指す。
【００７２】
「単離された核酸分子」は、一本鎖または二重鎖の任意の合成非天然または変性ヌクレオチド塩基を含有する、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態である単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数セグメントを含んでなっても良い。
【００７３】
「実質的に同様」とは、１つまたは複数のヌクレオチ塩基の変化が１つまたは複数のアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパクの機能特性に影響しない核酸分子を指す。「実質的に同様」とは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたはコサプレッション技術による遺伝子発現変化を仲介する、核酸分子の能力に影響しない核酸分子も指す。「実質的に同様」とは、アンチセンスまたはコサプレッション技術による遺伝子発現変化を仲介する能力、または結果として生じるタンパク分子の機能特性の変化に関して、結果として生じる転写物の機能特性に実質的に影響しない、本発明の核酸分子の変更（１つまたは複数ヌクレオチド塩基の欠失または挿入など）も指す。発明は、具体的例証配列を超えて包含する。
【００７４】
例えば特定部位で化学的に等価のアミノ酸の生産をもたらすが、コードされるタンパクの機能特性に影響しない遺伝子の変化が一般的であることは、技術分野で周知である。本発明の目的では、置換は以下の５つの群中の１つの交換として定義される。
１．小型脂肪族，非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２．極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
３．極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４．大型脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００７５】
したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのためのコドンは、別のより疎水性が低い残基（グリシンなど）または疎水性がより高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換されても良い。同様に、１つの負に帯電した残基を別のものにする（グルタミン酸からアスパラギン酸など）、または１つの正に帯電した残基を別のものにする（アルギニンからリジンになど）置換をもたらす変化も機能的に等しい生成物を生産することが期待できる。
【００７６】
多くの場合、タンパク分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もタンパク活性を変更させるとは考えられない。
【００７７】
それぞれの提案される変更は、技術分野のルーチン技術の十分に範囲内であり、コードされる生成物の生物学的活性保持の判定も同様である。さらに当業者は、本発明によって包含される実質的に同様の配列が、厳密な条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄、引き続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で、ここで例証する配列とハイブリッド形成するそれらの能力によっても定義されることを認識する。本発明の好ましい実質的に同様の核酸断片は、そのＤＮＡ配列が、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一の核酸断片である。より好ましい核酸断片は、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも９５％同一の核酸断片である。
【００７８】
温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸断片の一本差が形態が、別の核酸断片にアニールできる場合、核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片に「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリッド形成および洗浄条件は周知であり、（非特許文献１５）で例証される（その内容全体を本願明細書に引用したものとする）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリッド形成の「強度」を決定する。相同的核酸の予備スクリーニングのためには、５５°のＴｍに対応する厳密さの低いハイブリッド形成条件が使用できる。例えば５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミドや、あるいは３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ。中程度の厳密さのハイブリッド形成条件は、より高いＴｍに対応する。例えば４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣなど。ハイブリッド形成の厳密さ次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリッド形成は、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸をハイブリッド形成する適切な厳密さは技術分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリッド形成の相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（（非特許文献１６）参照）。より短核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリッド形成のためには、ミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を定める（（非特許文献１７）参照）。一実施形態では、ハイブリッド形成可能核酸の長さは、少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリッド形成可能核酸の好ましい最小の長さは、少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さは少なくともヌクレオチド３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で、必要に応じて調節できることを認識する。
【００７９】
「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（（非特許文献１８）、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照されたい）などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、ポリペプチドまたは遺伝子の推定上の同定が得られるのに十分な、そのポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパクまたは遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含む遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドプローブを遺伝子同定（例えばサザンハイブリッド形成）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成）配列−依存性方法で使用しても良い。さらにプライマーを含む特定の核酸分子を得るために、塩基１２〜１５個の短オリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅プライマーとして使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含む核酸分子の特異的同定および／または単離ができるようにする十分な配列を含む。本願明細書は、１つまたは複数の特定タンパクをコードする、部分的または完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する当業者は、ここで報告する配列の利益を持って、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を当業者に既知の目的のために使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告されたような完全な配列、ならびに上で定義されたようなこれらの配列のかなりの部分を含む。
【００８０】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリッド形成できるヌクレオチド塩基間の関係について述べる。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に同様の核酸配列に相補的な単離された核酸分子も含む。
【００８１】
技術分野で既知の「パーセント同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野で「同一性」とは、場合によっては、このような配列のストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、（非特許文献１９）、（非特許文献２０）、（非特許文献２１）、（非特許文献２２）、（非特許文献２３）で述べられたものをはじめとするがこれに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最大の整合を与えるように設計される。
【００８２】
同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を判定する好ましいコンピュータプログラム方法としては、それらの標準デフォルト値がｇａｐ形成ペナルティ＝１２およびｇａｐ延長ペナルティ＝４である、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用した、ＧＣＧプログラムパッケージにあるＧＣＧパイルアッププログラム（非特許文献２４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（非特許文献２５）が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給元から一般に入手できる（非特許文献２６）、（非特許文献２７）、（非特許文献２８）。パーセント同一性を判定する別の好ましい方法は、ヨッタン−ハイン（Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ）アルゴリズムを使用したＤＮＡＳＴＡＲタンパクアライメントプロトコル法による（非特許文献２９）。アラインメントのためのヨッタン−ハイン（Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ）法のデフォルト変数は、複数アラインメントではｇａｐペナルティ＝１１、ｇａｐ長さペナルティ＝３、対合アラインメントではｋｔｕｐｌｅ＝６である。一例として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチドあたり５点の変異を含んでも良いこと以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることを意味する。換言すると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の５％までのヌクレオチドが、欠失しまたは別のヌクレオチドで置換されていても良く、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドの数が、参照配列中に挿入されていても良い。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端部位で生じても、あるいはこれの末端部位間のあらゆる位置で、参照配列中の、または参照配列中の１つまたは複数の隣接するグループ中のヌクレオチドに個別に挿入されて生じても良い。同じように参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が参照アミノ酸の各１００個のアミノ酸あたり５個までのアミノ酸の変化を含むこと以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に同一であることを意味する。換言すると参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中の５％までのアミノ酸残基が欠失しまたは別のアミノ酸で置換されていても良く、あるいは参照配列中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸の数が、参照配列中に挿入されていても良い。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端部位で生じても、あるいはこれらの末端部位間のあらゆる位置で参照配列中の、または参照配列中の１つまたは複数の隣接するグループ中の残基間に個別に挿入されて生じても良い。
【００８３】
「相同的」と言う用語は、特定の宿主細胞において天然または自然発生的なタンパクまたはポリペプチドを指す。発明は組換えＤＮＡ技術を通じて、相同的タンパクを生成する微生物を含む。
【００８４】
「パーセント相同性」と言う用語は、ポリペプチド間のアミノ酸配列同一性の程度を指す。第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列と同一である場合、第１および第２のアミノ酸配列は１００％相同性を示す。あらゆる２つのポリペプチド間の相同性は、どちらかの配列の特定部位の整合アミノ酸総数の一次関数であり、例えば２つの配列のどちらかのアミノ酸総数の半分が同一ならば、２つの配列は５０％の相同性を示すと言われる。
【００８５】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コード中の分岐を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００８６】
結果として生じるタンパク分子の機能特性に実質的に影響しない、沈黙変化を生じる配列中の欠失、挿入または置換などの配列の変更も考察された。例えば遺伝子コードの縮重を反映する、あるいは特定部位で化学的に等価のアミノ酸の生産をもたらす遺伝子配列中の変化が考察された。したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシンなどの疎水性がより低い別の残基、あるいはバリン、ロイシン、またはイソロイシンなどのより疎水性が高い残基をコードするコドンによって置換されても良い。同様に、グルタミン酸に換わるアスパラギン酸などの１個の負に帯電した残基の別のものによる置換をもたらす変化、またはアルギニンに換わるリジンなどの１個の正に帯電した残基の別のものによる置換をもたらす変化も、生物学的に等しい生成物を生産することが期待できる。タンパク分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の変化をもたらすヌクレオチドの変化が、タンパクの活性を変更することは期待されない。場合によってはタンパクの生物学的活性変化の効果を研究するために、配列の変異体を作り出すことが実際望ましいかもしれない。提案される各変更は、技術分野のルーチン技術の十分に範囲内であり、コードされる生成物中の生物学的活性保持の判定についても同様である。さらに当業者は、本発明によって包含される配列が、厳密な条件下（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）において、ここで例証する配列とハイブリッド形成するそれらの能力によって定義されることを認識する。
【００８７】
「発現」と言う用語は、遺伝子生成物配列の遺伝子コードから遺伝子生成物への転写および翻訳を指す。
【００８８】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二重鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる源から誘導された一本鎖または二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共に、プロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特異性ベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特異性ベクターを指す。
【００８９】
（組換え型生物の構築）
炭素基材の１，３プロパンジオールへの転換のために酵素経路をコードするのに必要な遺伝子を含有する組換え型生物は、技術分野で周知の技術を使用して構築されても良い。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ１）、グリセロール−３−ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３）、デヒドラターゼ再活性化因子（ｏｒｆＺおよびｏｒｆＸ）および１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの生来の宿主から単離され、大腸菌ＤＨ５α、ＥＣＬ７０７、ＡＡ２００、またはＫＬＰ２３などの宿主菌株を形質転換するために使用された。
【００９０】
（遺伝子の単離）
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学技術分野で一般的かつ周知である。例えば遺伝子配列が既知である場合、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なゲノムライブラリーを作り出しても良く、所望の遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーンしても良い。配列が単離されると、適切なベクターを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準プライマーに特異的な増幅方法（米国特許公報（特許文献１４））を使用してＤＮＡを増幅し、形質転換に適したＤＮＡの総量を得ても良い。
【００９１】
代案としては、コスミドライブラリーを作り出して、ゲノムＤＮＡの大型セグメント（３５〜４５ｋｂ）をベクター内にパッケージして、適切な宿主を形質転換するのに使用しても良い。コスミドベクターは、大量のＤＮＡを収容できることにおいてユニークである。概してコスミドベクターは、外来性ＤＮＡのパッケージングとそれに引き続く環化に必要なｃｏｓＤＮＡ配列の少なくとも１つのコピーを有する。これらのベクターはｃｏｓ配列に加えて、ＣｏｌＥ１などの複製の原点、およびアンピシリンまたはネオマイシンに抵抗性の遺伝子などの薬剤耐性マーカーも含有する。適切な細菌宿主の形質転換のためにコスミドベクターを使用する方法は、（非特許文献３０）で詳しく述べられている。
【００９２】
典型的にコスミドをクローン化するには、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して外来性ＤＮＡを単離し、適切なリガーゼを使用して、コスミドベクターのｃｏｓ領域に隣接させてライゲートする。線形化した外来性ＤＮＡを含有するコスミドベクターは、次にバクテリオファージなどのＤＮＡパッケージングビヒクルと反応させられる。パッケージングプロセスにおいて、ｃｏｓ部位は分割され、外来性ＤＮＡは細菌ウイルス粒子の頭部分内にパッケージされる。次にこれらの粒子は、大腸菌などの適切な宿主細胞に形質移入するために使用される。細胞内に注入されると、外来性ＤＮＡはｃｏｓ粘着末端の影響下で環化する。このようにして外来性ＤＮＡの大型セグメントは、組換え型宿主細胞に導入され発現できる。
【００９３】
（グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３）、デヒドラターゼ再活性化因子（ｏｒｆＺおよびｏｒｆＸ）、および１，３プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子の単離およびクローン化）
本発明のコンテクストで、コスミドベクターおよびコスミド形質転換法を使用して、グリセロールを１，３−プロパンジオールにプロセスできる遺伝子をプロセスすることが知られている細菌属から、ゲノムＤＮＡの大型セグメントをクローン化した。具体的には技術分野で周知の方法によってＫ．ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からゲノムＤＮＡを単離し、コスミドベクターＳｕｐｅｒｃｏｓ  １への挿入のために制限酵素Ｓａｕ３Ａで消化して、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩパッケージング抽出物を使用してパッケージした。ベクターの構築に続いて、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲ細胞をコスミドＤＮＡで形質転換した。グリセロール存在下で細胞を培養し、培養液を１，３−プロパンジオール形成について分析して、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転換する能力について形質転換体をスクリーンした。
【００９４】
１，３−プロパンジオール陽性形質転換体の２つを分析し、コスミドをｐＫＰ１およびｐＫＰ２と命名した。ＤＮＡ配列決定からは、Ｃ．フロインディ（ｆｒｅｕｎｄｉｉ）からのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子との高度な相同性が明らかになり、これらの形質転換体がグリセロールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含有することが実証された。その他の１，３−プロパンジオール陽性形質転換体を分析し、コスミドをｐＫＰ４およびｐＫＰ５と命名した。ＤＮＡ配列決定からは、これらのコスミドがジオールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを運ぶことが明らかになった。
【００９５】
本発明はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）コスミド内からの単離された遺伝子を利用するが、デヒドラターゼ遺伝子およびデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子の代案の供給源としては、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（表１参照）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９６】
（Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子）
本発明は、宿主細胞内でのＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ活性の発現に適した遺伝子を提供する。
【００９７】
Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子は既知である。例えばＧＰＤ１は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から単離されている（非特許文献３）。同様に、Ｇ３ＰＤＨ活性は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から単離されており、ＧＰＤ２によってコードされている（非特許文献３１）。
。
【００９８】
本発明の目的では、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転換を触媒できる、ＮＡＤＨ−依存性Ｇ３ＰＤＨ活性を担うポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子が適切であることが考察された。さらに本発明において、遺伝子ＤＡＲ１、ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＰＤ３、およびｇｐｓＡに対応するＮＡＤＨ−依存性Ｇ３ＰＤＨのアミノ酸配列をコードするあらゆる遺伝子が機能性であることが考察され、そこではアミノ酸配列が、酵素機能を変更しないアミノ酸置換、欠失または付加を包含しても良い。当業者は、その他の供給源から単離されたＧ３ＰＤＨをコードする遺伝子も本発明で適切であることを理解するであろう。Ｇ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子は既知である。例えばＧＰＰ２は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されている（非特許文献６）。
【００９９】
本発明の目的では、Ｇ３Ｐホスファターゼ活性をコードするあらゆる遺伝子が方法で使用するのに適し、そこでは活性がグリセロール−３−リン酸およびＨ２Ｏから、グリセロールおよび無機ホスフェートへの転換を触媒できる。さらにＧ３Ｐホスファターゼ酵素の機能を変更しないアミノ酸置換、欠失または付加を包含するあらゆるアミノ酸配列をはじめとする、遺伝子ＧＰＰ２およびＧＰＰ１に対応するＧ３Ｐホスファターゼのアミノ酸配列をコードするあらゆる遺伝子が、本発明で機能性である。当業者は、その他の供給源から単離されるＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子も本発明で適切であることを理解するであろう。
【０１００】
（宿主細胞）
１，３−プロパンジオールの組換え型による生産のための適切な宿主細胞は、原核生物または真核生物のどちらであっても良く、１，３−プロパンジオール経路のために活性酵素を発現する宿主細胞能力によってのみ制限される。適切な宿主細胞は、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの微生物である。本発明で好ましいのは、大腸菌、エシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびアエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）である。最も好ましいのは大腸菌（ＫＬＰ２３（特許文献１５）、ＲＪ８．ｎ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１６），大腸菌：ＦＭＰ’：：Ｋｍ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ４７３２）、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ７００９２６））である。
【０１０１】
（ベクターおよび発現カセット）
本発明は、適切な宿主細胞へのＧ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、デヒドラターゼ、およびデヒドラターゼ再活性化因子のクローン化、形質転換、および発現に適した多様なベクター、および形質転換および発現カセットを提供する。適切なベクターは、用いられる微生物と適合性のものである。適切なベクターは、例えばバクテリア、ウイルス（バクテリオファージＴ７またはＭ−１３由来ファージなど）、コスミド、酵母または植物から誘導できる。このようなベクターを得て使用するプロトコルは技術分野で既知である（非特許文献３０）。
【０１０２】
所望の宿主細胞においてＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子（それぞれＤＡＲ１およびＧＰＰ２）の発現を駆動させるのに有用なイニシエーション調節領域、またはプロモーターは多数有り、当業者にはよく知られている。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌における発現に有用）をはじめとするが、これに限定されるものではない、実質的にこれらの遺伝子を駆動できるあらゆるプロモーターが、本発明において適切である。
【０１０３】
また終止調節領域は、好ましい宿主に生来の種々の遺伝子から誘導されても良い。任意に、終止部位は必要ないかもしれないが、含まれれば最も好ましい。
【０１０４】
本酵素の効果的な発現のためには、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成に帰結するように、酵素をコードするＤＮＡが、イニシエーションコドンを通じて、選択された発現調節領域に作動可能に連結する。
【０１０５】
本発明で特に有用なのは、ベクターｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、およびｐＳＹＣＯ１０９である。必須要素は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたｄｈａレギュロンに由来する。それぞれが３つの個別のオペロンに配列された読み取り枠ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ＤＡＲ１、およびＧＰＰ２を含み、それらのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、および配列番号：６８を与えられる。ベクター間の違いは、以下のチャートで例示される［接頭語「ｐ−」はプロモーターを示す。各「（  ）」内に含有される読み取り枠は、オペロンの組成を表す］。
ｐＳＹＣＯ１０１（配列番号：６５）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）その他の２つの経路オペロンと比較して反対向き、
ｐ−１．６ｌｏｎｇＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６ｌｏｎｇＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）。
ｐＳＹＣＯ１０３（配列番号：６６）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）その他の２つの経路オペロンと比較して同じ向き、
ｐ−１．５ｌｏｎｇＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．５ｌｏｎｇＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）。
ｐＳＹＣＯ１０６（配列番号：６７）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）その他の２つの経路オペロンと比較して同じ向き、
ｐ−１．６ｌｏｎｇＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６ｌｏｎｇＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）。
ｐＳＹＣＯ１０９（配列番号：６８）：
ｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）その他の２つの経路オペロンと比較して同じ向き、
ｐ−１．６ｌｏｎｇＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６ｌｏｎｇＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ）。
【０１０６】
（適切な宿主の形質転換および１，３−プロパンジオール生産のための遺伝子発現）
ひとたび適切なカセットが構築されると、それらは適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、デヒドラターゼ、およびデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を含有するカセットの宿主細胞内への導入は、形質転換（例えばカルシウム透過化処理細胞、電気穿孔法を使用した）によって、あるいは組換え型ファージウイルスを使用した形質移入などの既知の手順によって達成されても良い（非特許文献３０）。
【０１０７】
一般方法および実施例で完全に述べるように、本発明では大腸菌を形質転換するのにカセットを使用した。
【０１０８】
（変異体）
例証される細胞に加えて、本方法が、特に１，３プロパンジオールの生産を亢進するようにデザインされた単一または複数の変異を有する細胞を使用できることが考察された。炭素供給原料を非生成経路に通常迂回させる、あるいは顕著な異化代謝産物抑制を示す細胞は、これらの表現型の欠陥を防ぐように変異できる。例えば多くの野生型細胞は、培養液中のグルコースおよび副産物からの異化代謝産物抑制を受け、グルコース抑制に抵抗性の１，３−プロパンジオール生産をできるこれらの野生型生物の変異株菌株が、本発明において特に有用であることが考察された。
【０１０９】
変異体を作り出す方法は、技術分野で一般的であり周知である。例えば野生型細胞を放射線または化学的突然変異誘発要因などの多様な作用物質に曝して、次に所望の表現型をスクリーニングしても良い。放射線を通じて変異を作り出す場合、紫外線（ＵＶ）またはイオン化放射線のどちらかが使用できる。遺伝的変異に適した短波ＵＶの波長は２００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内にあり、２５４ｎｍが好ましい。この波長のＵＶ放射線は、主に核酸配列内でグアニジンおよびシトシンから、アデニンおよびチミジンへの変化を引き起こす。あらゆる細胞はＵＶ誘発性変異のほとんどを修復するＤＮＡ修復機序を有するので、カフェインおよびその他の阻害剤などの作用物質を添加して修復プロセスを妨げ、効果的な変異の数を最大化しても良い。３００ｎｍ〜４００ｎｍ範囲の光を使用した長波ＵＶ変異も可能であるが、ＤＮＡと相互作用するソラレン染料などの種々の活性化因子と共に使用されない限り、概して短波長ＵＶ光ほど効果的でない。
【０１１０】
化学物質による突然変異誘発も変異体を発生させるのに効果的であり、一般に使用される物質としては、非複製ＤＮＡに影響するＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨなどの化学薬品、ならびにフレームシフト変異を引き起こすアクリジン染料などの複製ＤＮＡに影響することが顕著な作用薬が挙げられる。放射線または化学物質を使用して変異体を作り出す具体的方法は、技術分野で文書で十分に立証されている。例えば参照によってここに編入する（非特許文献３２）または（非特許文献３３）を参照されたい。
【０１１１】
突然変異誘発が生じた後、所望の表現型を有する変異体は、多様な方法によって選択されても良い。ランダムスクリーニングが最も一般的であり、突然変異を起こした細胞が所望の生成物または中間体を生産する能力について選択される。代案としては、突然変異を起こした細胞集団を抵抗性コロニーのみが生育できる選択培養液で培養して、変異体の選択的単離が実施できる。変異株選択の方法は、微生物工学技術分野で高度に発達し周知である。例えば（非特許文献３２）、（非特許文献３４）を参照されたい。
【０１１２】
上述の変異体を作り出す方法に加えて、炭素基材から１，３−プロパンジオールへの転換に関与する選択された遺伝子を、当業者に既知の多様な方法によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートしても良い。遺伝子のアップレギュレートまたはダウンレギュレートは、例えば対応する（または変更されていない）野生型遺伝子によってコードされるタンパクの活性などの対照活性レベルに対する、遺伝子によってコードされるタンパク活性の変化を指すことはよく理解されている。
【０１１３】
（アップレギュレート）
酵素経路に関与する特異的遺伝子をアップレギュレートして、それらがコードする機能の活性を増大させても良い。例えば選択された遺伝子の追加的コピーを宿主細胞内にｐＢＲ３２２などの多コピープラスミド上に導入しても良い。このような遺伝子はまた、適切な制御配列を持つ染色体中に統合されて、それらのコードされる機能の活性増大をもたらしても良い。ターゲット遺伝子は、非天然プロモーターまたは変性天然プロモーターの調節の下にあるように修飾されても良い。内在性プロモーターは、変異、欠失、および／または置換によって、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で変性できる。
【０１１４】
（ダウンレギュレート）
代案としては特定遺伝子の発現を所定の活性レベルに対して減少させる、または排除することが有用かもしれない。本発明の目的では、減少と排除を区別することが有用である。遺伝子の「ダウンレギュレート」および「ダウンレギュレートする」と言う用語は、減少を指すが、コードされるタンパクの活性の完全排除ではない。遺伝子をダウンレギュレートするおよび撹乱する方法は、当業者に既知である。
【０１１５】
ダウンレギュレートは、コード領域および／または制御（プロモーター）領域の欠失、挿入、または変化によって生じさせることができる。特定のダウンレギュレートは、無作為変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって、あるいは遺伝子配列が既知である場合、当業者に既知の分子生物学的方法による直接介入によって得ても良い。特に有用であるが、これに限らないダウンレギュレートをもたらす方法は、プロモーター強度の変更である。
【０１１６】
（撹乱）
遺伝子の撹乱は、例えば１）コード領域および／または制御（プロモーター）領域を欠失させる、２）外来性核酸配列をコード領域および／制御（プロモーター）領域に挿入する、および３）（例えばＤＮＡ塩基対変化を作り出すことによって）コード領域および／または制御（プロモーター）領域を変化させることで生じるかもしれない。このような変化は、関心のあるタンパクの発現を妨げ、あるいは非機能的タンパクの発現をもたらす。特定の撹乱は、無作為変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって、あるいは遺伝子配列が既知である場合、特定の撹乱は、当業者に既知の分子生物学的方法による直接介入によって得ても良い。特に有用な方法は、顕著な量のコード領域および／または制御（プロモーター）領域の欠失である。
【０１１７】
組み換えタンパク発現を変化させる方法は、当業者に既知であり、（非特許文献３５）、（非特許文献３６）、（非特許文献３７）、（非特許文献３８）、（非特許文献３９）、および（非特許文献４０）で、ある程度考察されている。
【０１１８】
（１，３−プロパンジオール生産経路における変化）
（代表的酵素経路）
グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産は、以下の一連のステップによって達成できる。この一連のステップは、当業者に既知のいくつかの経路の代表的なものである。グルコースは解糖経路の酵素によって、一連のステップでジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）および３−ホスホグリセルアルデヒド（３−ＰＧ）に転換される。次にグリセロールは、ＤＨＡＰのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への加水分解とそれに続く還元、あるいはＤＨＡＰのグリセロール３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元とそれに続く加水分解のいずれかによって形成される。加水分解ステップは、それらの基材について非特異的であることが分かっているいくつかの細胞ホスファターゼのいずれかによって触媒でき、あるいは活性は、組み換えによって宿主に導入できる。還元ステップはＮＡＤ＋（またはＮＡＤＰ＋）結合宿主酵素によって触媒でき、あるいは活性は、宿主に組み換えによって導入できる。ｄｈａレギュロンが、式３の可逆性反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）を含有することは、注目に値する。
グリセロール→３−ＨＰＡ＋Ｈ２Ｏ（式１）
３−ＨＰＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→１，３プロパンジオール＋ＮＡＤ＋（式２）
グリセロール＋ＮＡＤ＋→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋（式３）
グリセロールは、上で詳述したように中間体３−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）を経由して１，３−プロパンジオールに転換される。中間体３−ＨＰＡは、宿主によってコードできる、または組み換えによって宿主に導入できるデヒドラターゼ酵素によってグリセロールから生産される（式１）。このデヒドラターゼは、グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）、あるいはこの形質転換を触媒できるあらゆるその他の酵素であることができる。ジオールデヒドラターゼを除くグリセロールデヒドラターゼは、ｄｈａレギュロンによってコードされる。１，３−プロパンジオールは、ＮＡＤ＋−（またはＮＡＤＰ＋）結合宿主酵素によって３−ＨＰＡから生産され（式２）、あるいは活性は組み換えによって宿主内に導入できる。１，３−プロパンジオール生産におけるこの最後の反応は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）またはその他のアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒できる。
【０１１９】
（炭素チャネリングに影響する変異および形質転換）
１，３−プロパンジオール生産経路の変動を含む多様な変異微生物は、本発明において有用であろう。１，３−プロパンジオール生産経路の中間体の代案の経路を遮断する変異もまた、本発明に有用であろう。例えばグリセロールキナーゼの除外は、Ｇ３Ｐホスファターゼの作用によってＧ３Ｐから形成されるグリセロールが、ＡＴＰを消費してＧ３Ｐに再転換されるのを防止する。またグリセロールデヒドロゲナーゼ（例えばｇｌｄＡ）の除外は、ＮＡＤＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によってＤＨＡＰから形成されるグリセロールが、ジヒドロキシアセトンに転換されるのを防止する。変異は、酵素活性を障害するまたは改善するように構造遺伝子に向けることができ、あるいは酵素活性の発現レベルを調節するように、プロモーター領域およびリボゾーム結合部位をはじめとする制御遺伝子に向けることができる。
【０１２０】
従って１，３−プロパンジオール生産の亢進のため特定の酵素活性を調節するように、形質転換および変異を組み合わせられることが考察された。従って１，３−プロパンジオールの生産増大をもたらす、ホールセル触媒の変更を期待することは、本発明の範囲内である。
【０１２１】
本発明は、糖基材からの１，３−プロパンジオールの生産のために、炭素フローがグルコースからＤＨＡＰ、Ｇ３Ｐ、グリセロール、３−ＨＰＡ、そして最後に１，３−プロパンジオールに移動する、好ましい経路を利用する。本生産菌株は、炭素から非生産的化合物への転換を妨げる種々の欠失変異を組み込むことで、経路の代謝効率を最大化するために遺伝子操作されている。上述のように、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼまたはグリセロールキナーゼを通じたＤＨＡまたはＧ３Ｐのどちらかへの形質転換により、３ＨＰＡへの転換から迂回されても良い。したがって本生産菌株は、ｇｌｄＡａｎｄｇｌｐＫ遺伝子に欠失変異を含有する。同様にＤＨＡＰは、トリオースリン酸イソメラーゼによって３−ＰＧに迂回させても良いので、本生産微生物はこの遺伝子にも欠失変異を含有する。本方法は、グリセロールから３ＨＰＡへの転換のためにデヒドラターゼ酵素をさらに組み込み、それはｄｈａレギュロンのｏｒｆＸおよびｏｒｆＺによってコードされる再活性化因子と協力して機能する。３ＨＰＡの１，３−プロパンジオールへの転換は、典型的に１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を通じて達成されるが、本方法は、最終生成物１，３プロパンジオールのより大きな力価および収率を生じる、非特異的触媒活性を利用する。このような方法では、１，３−プロパンジオールの少なくとも１０ｇ／Ｌの力価が達成され、２００ｇ／Ｌの力価が期待される。
【０１２２】
代案としては、１，３−プロパンジオール生産のための改善された方法が、グリセロールまたはジヒドロキシアセトンを基材として用いても良く、そこでは経路が、最後の３つの基材、グリセロール→３ＨＰＡ→１，３−プロパンジオールのみを含む。このような方法でもまた、非特異的触媒活性（アルコールデヒドロゲナーゼであることが期待される）の利益となるように酸化還元酵素は除外されるが、培養物にグリセロールを添加するエネルギーへの考慮から、欠失変異の必要性は帳消しになる。このような方法では、少なくとも７１ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールの力価が得られ、２００ｇ／Ｌの力価が期待される。
【０１２３】
同様に、ｄｈａＴ活性の欠失または変異によって修飾されている野生型微生物の変異体を提供して、改善された１，３−プロパンジオール生産株を作り出すことも発明の範囲内である。例えば１，３−プロパンジオール酸化還元酵素活性をコードするｄｈａＴ遺伝子を不活性化するように、ｄｈａレギュロンの全ての要素を自然に含有する微生物を操作しても良い。これらの微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼであることが期待される内在性触媒活性の存在によって仲介されて、より高い収率および力価の１，３−プロパンジオールを生産することが期待される。このような微生物の例としては、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２４】
（培養液および炭素基材）
本発明の発酵培養液は、適切な炭素基材を含有しなくてはならない。適切な基材としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、そしてラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２５】
本発明では、好ましい炭素基材はグルコースである。
【０１２６】
適切な炭素源に加えて、発酵培養液は、培養物の生育、および１，３−プロパンジオール生産に必要な酵素経路の促進に適した、当業者に既知の適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液およびその他の構成要素を含有しなくてはならない。Ｃｏ（ＩＩ）塩および／またはビタミンＢ１２またはその前駆物質に特別な注意が払われる。
【０１２７】
アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ１２）は、デヒドラターゼ活性のための必須補助因子である。補酵素Ｂ１２の合成は原核生物に見られ、例えばエシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種など化合物を新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）に合成できるものもあり、一方他のものは部分的反応を遂行できる。例えば大腸菌は、コリン環構造を作ることができないが、コビナミドのコリノイドへの転換を触媒でき、５’−デオキシアデノシル基を導入できる。したがってビタミンＢ１２などの補酵素Ｂ１２前駆物質が、大腸菌発酵中に提供されなくてはならないことは、技術分野で既知である。
【０１２８】
大腸菌発酵へのビタミンＢ１２添加は、一定の速度で連続的に、または細胞集団の生成と同時に段階的に添加しても良く、あるいは単一または複数の大量瞬時添加で添加しても良い。細胞集団（ＯＤ５５０）に供給されるビタミンＢ１２（ｍｇ）の好ましい比率は、０．０６〜０．６０である。細胞集団（ＯＤ５５０）に供給されるビタミンＢ１２（ｍｇ）の最も好ましい比率は、０．１２〜０．４８である。
【０１２９】
本発明の形質転換大腸菌にはビタミンＢ１２が添加されるが、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）Ｂ１２生合成できるその他の微生物もまた適切な生産細胞であり、これらの微生物へのＢ１２の添加が不必要であることが考察された。
【０１３０】
（培養条件）
典型的に細胞は、３５℃において適切な培養液中で培養された。本発明の好ましい生育培養液は、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）ブロス、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）ブロス、またはイースト培地（Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＹＭ）ブロスなどの一般的な商業的に調製された培養液である。その他の特定または合成培養液を使用しても良く、特定微生物の生育に適した培養液は、微生物または発酵科学の当業者には既知である。異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている、例えば環状アデノシン２’：３’−モノホスフェートなどの作用薬の使用を反応培養液中に組み込んでも良い。同様に１，３−プロパンジオール生産の亢進をもたらす酵素活性（例えばメチルビオロゲン）を調節することが知られている作用薬を遺伝子操作と併せて、あるいはそれに対する代案として使用しても良い。
【０１３１】
発酵に適したｐＨはｐＨ５．０〜９．０の範囲であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。
【０１３２】
反応は好気的または嫌気的条件下で実施しても良く、微生物の要件に基づいて好気的、無酸素、または嫌気的条件が好ましい。
【０１３３】
流加バッチ発酵は、例えば限定的または過剰なグルコースなどの炭素供給と共に実施しても良い。
【０１３４】
（バッチおよび連続発酵）
本方法は、バッチ発酵法を用いる。古典的なバッチ発酵は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の最初に設定され、発酵中の人為的変化を受けない。したがって発酵開始時に培養液に所望の微生物または微生物を接種し、発酵を起こさせてシステムには何も添加しない。しかし典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物質量組成は、発酵が停止する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。対数期にある細胞が、概して最終生成物または中間体の生産の大部分を担う。
【０１３５】
標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵の進行と共に基材が段階的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含む。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培養液中に限定量の基材を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基材濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ発酵は、技術分野で一般的であり周知であって、実例は（非特許文献３２）にある。
【０１３６】
本発明はバッチモードで実施されるが、方法が連続発酵法に適合性であるかどうかが考察された。連続発酵は、開放システムであり、特定発酵培養液が生物反応器に継続的に添加され、等量の調整済み培養液が同時に処理のために除去される。連続発酵は、概して培養を一定の高密度に維持し、細胞は主に対数増殖期にある。
【０１３７】
連続発酵は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響する、１つの因子またはいくつもの因子のモジュレーションを可能にする。例えば一方法は、炭素源または窒素などの栄養制限物質レベルを定率に維持し、その他の全パラメータを調節できるようにする。その他のシステムでは、培養液の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ったまま、増殖に影響するいくつかの因子を継続的に変化させられる。連続システムは、定常状態増殖条件を維持することを目指すので、培養液を抜き取ることによる細胞の損失は、発酵中の細胞成長率に対して均衡を保たれなくてはならない。連続発酵プロセスのために栄養素および増殖因子をモジュレートする方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が（非特許文献３２）によって詳述されている。
【０１３８】
バッチ、流加バッチ、または連続プロセスを使用して本発明を実施すること、およびあらゆる既知の発酵様式が適することが考察された。さらに細胞を基材上にホールセル触媒として固定し、１，３−プロパンジオール生産の発酵条件に曝すことが考察された。
【０１３９】
（１，３−プロパンジオールの同定および精製）
発酵培養液からの１，３−プロパンジオールの精製方法は、技術分野で既知である。例えば反応混合物を有機溶剤、蒸留、およびカラムクロマトグラフィ（米国特許公報（特許文献１６））によって抽出することで、細胞培養液からプロパンジオールを得られる。この方法に特に良好な有機溶剤は、シクロヘキサン（米国特許公報（特許文献１７））である。
【０１４０】
１，３−プロパンジオールは、培養液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析することで、直接同定しても良い。本発明で好ましいのは、発酵培養液がアイソクラティック様式の０．０１Ｎ硫酸の移動相を使用して、分析イオン交換カラム上で分析される方法である。
【０１４１】
（一般方法および材料）
リン酸化、ライゲーション、および形質転換の手順は、技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、（非特許文献３０）にある。
【０１４２】
細菌培養の維持および増殖に適した材料と方法は、技術分野で周知である。以下の例で使用するのに適した技術は、（非特許文献４１）または（非特許文献３２）にある。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得られた。
【０１４３】
略語の意味は次のとおり。「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、５０ａｍｐは５０μｇ／ｍＬのアンピシリンであり、そしてＬＢ−５０ａｍｐは５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロスである。
【０１４４】
表中では以下の略語を使用する。「Ｃｏｎ．」は転換、「Ｓｅｌ．」は炭素に基づく選択性、および「ｎｄ」は非検出。
【０１４５】
以下の例で使用され構築される菌株およびベクターを下のチャートに列挙する。
【０１４６】
【表４】
0004592418.tif 000005
【０１４７】
【表５】
0004592418.tif 000006
【０１４８】
菌株：
ＫＬＰ２３  （特許文献１５）、
ＲＪ８．ｎ  （ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１６）、
ＭＧ１６５５  ＡＴＣＣ  ７００９２６（市販される）
【０１４９】
プラスミド： 
ｐＡＨ４８  （特許文献１８）
ｐＤＴ２９  （特許文献１５）
ｐＫＰ３２  （特許文献１５）
ｐＳＹＣＯ１０１  配列番号：６５
ｐＳＹＣＯ１０３  配列番号：６６
ｐＳＹＣＯ１０６  配列番号：６７
ｐＳＹＣＯ１０９  配列番号：６８
【０１５０】
プラスミドｐＫＤ３、ｐＫＤ４、ｐＫＤ１３およびｐＫＤ４６、およびｐＣＰ２０については（非特許文献４２）で述べられている。プラスミドｐＬｏｘＣａｔ２およびｐＪＷ１６８については、（非特許文献４３）で述べられている。
【０１５１】
（遺伝子ノックアウト、プロモーター置換、および染色体変異導入のための染色体組み込み）
ＤＮＡを染色体の特定領域に統合するためには、挿入するＤＮＡの目的染色体部位に対する相同性および選択マーカーが必要である。組み込み後にマーカーが容易に除去できれば有利である。Ｐ１ファージからのｌｏｘＰ／Ｃｒｅリコンビナーゼシステム、および酵母からのＦＲＴ／Ｆｌｐリコンビナーゼシステムが、マーカーを除去する機序を提供する。ｌｏｘＰおよびＦＲＴ部位は、ＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼのための認識部位である。ＣｒｅおよびＦｌｐは部位特異的リコンビナーゼであり、直接的反復認識部位から介在性ＤＮＡを切除する。
【０１５２】
目的染色体部位に相同的なアームを含有し、ｌｏｘＰ（非特許文献４３）またはＦＲＴ（非特許文献４２）部位が隣接する選択マーカーをコードする組み込みカセットは、ｐＫＤ４６を含む目的細胞に形質転換される（非特許文献４２）。成功した組み込み体は、抗生物質存在下における細胞の増殖によって選択される。引き続いてｐＫＤ４６を細胞から取り除き、次に抗生物質遺伝子の除去のために、リコンビナーゼプラスミドを組み込み体に導入する。ｌｏｘＰカセットと統合される菌株は、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｐＪＷ１６８で形質転換される（非特許文献４３）。ＦＲＴカセットを含有する菌株は、ＦｌｐリコンビナーゼをコードするｐＣＰ２０で形質転換される（非特許文献４２）。統合マーカーの除去後、リコンビナーゼプラスミドは菌株から取り除かれる。
【０１５３】
Ｐ１ｖｉｒ形質導入を上述のようにして実施した（非特許文献４４）。
【０１５４】
（酵素アッセイ）
（グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）活性のアッセイ）
グルコースからグルコース−６−ホスフェートへの転換に続いて、グルコキナーゼ反応をグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４９）の反応に共役して、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ）活性を３４０ｎｍにおける分光測定でアッセイした。アッセイは０．５ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ、および１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中２単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。代案のアッセイは、（非特許文献４５）にある。
【０１５５】
（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイ）
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイは、ＮＡＤＨの出現によって、細胞フリー抽出物中で測定した。アッセイに先だってイオン交換カラムを使用して、遠心分離した（５０，０００×ｇ、１ｈ、４℃）細胞フリーの上清を部分的に精製した。アッセイは０．２ｍＭのグリセルアルデヒド３−リン酸、２．５ｍＭのＮＡＤ＋、２ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのシステアミン、２０ｍＭのリン酸カリウム、および４０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ８．９）を含有した。代案のアッセイは、（非特許文献４５）にある。
【０１５６】
（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）活性のアッセイ）
共役アッセイ（非特許文献４６）によって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）活性を細胞フリー抽出物中で測定した。この方法は、遠心分離した（５０，０００×ｇ、１ｈ、４℃）細胞フリー抽出物サンプルを０．２２ｍＭのＮＡＤＨ、１．１ｍＭのホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、０．２５ｍＭのアセチル−ＣｏＡ、および０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中の６Ｕのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を含有するキュベット内で、１１ｍＭの重炭酸水素ナトリウムおよび１１ｍＭの硫酸マグネシウムと共に、総容積１．０ｍＬで室温において培養することを伴う。酵素およびＮＡＤＨの背景反応速度をＰＥＰの不在下で３４０ｎｍで最初に判定した。第２の基材であるＰＥＰを引き続いて添加し、経時的な吸光度の変化をさらにモニターした。全体速度から背景速度を差し引いて、Ｐｐｃ活性を特定した。代案のアッセイは、（非特許文献４５）にある。
【０１５７】
（デヒドラターゼ酵素のアッセイ）
グリセロールまたは１，２−プロパンジオールのいずれかを基材として使用して、細胞フリー抽出物中のデヒドラターゼ活性を判定した。典型的には、フレンチプレスとそれに続く細胞細片の遠心分離を使用した細胞撹乱によって、細胞フリー抽出物を調製した。アルデヒドのメチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾンとの反応に基づくアッセイは、（非特許文献４７）で述べられている。
【０１５８】
（非特許文献４８）は、デヒドラターゼの再活性化を測定するアッセイを開示する。デヒドラターゼ活性は、トルエン添加ホールセル内で、グリセロールまたは１，２−プロパンジオールのいずれかを基材として使用して、ＡＴＰ有りまたは無しで判定した。再活性化は、ＡＴＰ添加有り−対−添加無しで、生成物形成比率によって判定した。生成物形成（グリセロールまたは１，２−プロパンジオールを基材としてそれぞれ使用した場合、３−ＨＰＡまたはプロピオンアルデヒド）をＨＰＬＣを使用して直接測定し、あるいはメチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾン試薬を使用して間接的に測定した。代案としては、ＮＡＤＨ結合アルコールデヒドロゲナーゼを使用したアルデヒドのそれぞれのアルコールへの転換を共役させて、ＮＡＤＨの消失をモニターして生成物形成を判定した。
【０１５９】
（１，３−プロパンジオール酸化還元酵素のアッセイ）
（非特許文献１１）で述べられたように１，３−プロパンジオールおよびＮＡＤ＋を基材として使用して、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼと称されることもある、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素の活性を溶液中で、あるいはスラブゲル中で、細胞フリー抽出物について判定した。代案としては、ＮＡＤＨの消失によって、３−ＨＰＡおよびＮＡＤＨの１，３−プロパンジオールおよびＮＡＤ＋への転換を判定した。スラブゲルアッセイは、サイズ分離に基づいて、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）の活性を非特異的アルコールデヒドロゲナーゼの活性から区別する潜在的利点を有する。シトロバクター・フレンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびクロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）からの１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）の天然分子量は、通常大きく、３３０，０００〜４４０，０００ダルトン程度である。ブレビス乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）およびブッフネリ乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）は、既知の１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）と同様の特性を有する、デヒドラターゼ連携１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を含有する。
【０１６０】
（グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイ）
（非特許文献４９）で発表された方法からの手順を下のように修正して使用した。この方法は、細胞フリー抽出物サンプルを０．２ｍＭのＮＡＤＨ、２．０ｍＭのジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）、および０．１Ｍｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中の酵素を含有するキュベット内で、５ｍＭＤＴＴと共に、１．０ｍＬの総量で３０℃において培養することを伴う。酵素およびＮＡＤＨの背景反応速度を３４０ｎｍで最初に少なくとも３分間判定した。第２の基材であるＤＨＡＰを引き続いて添加し、経時的な吸光度の変化を少なくとも３分間さらにモニターした。全体速度から背景速度を差し引いて、Ｇ３ＰＤＨ活性を特定した。
【０１６１】
（グリセロール−３−ホスファターゼ活性のアッセイ）
抽出物をビス−トリスまたはＭＥＳおよびマグネシウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で、有機リン酸基材と共に培養して、酵素活性のアッセイを実施した。使用した基材は、ｌ−α−グリセロールホスフェート、またはｄ，ｌ−α−グリセロールホスフェートのどちらかであった。アッセイ中の試薬の最終濃度は、緩衝液（２０ｍＭのビス−トリスまたは５０ｍＭのＭＥＳ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、および基材（２０ｍＭ）である。サンプル中の総タンパクが低く、酸クエンチで可視的沈殿が生じない場合、サンプルをキュベット内で都合良くアッセイした。この方法は、２０ｍＭの基材（５０μＬ、２００ｍＭ）、５０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ６．５）緩衝液を含有するキュベット内で、酵素サンプルを培養することを伴う。最終ホスファターゼアッセイ容積は、０．５ｍＬであった。酵素含有サンプルを反応混合物に添加し、キュベットの内容を混合し、次にキュベットを温度３７℃の循環水浴に５〜１２０分間入れたが、時間の長さは、酵素サンプル中のホスファターゼ活性が２〜０．０２Ｕ／ｍＬの範囲にあるかどうかに左右された。酸モリブデン試薬（０．４ｍＬ）を添加して、酵素反応をクエンチした。フィスク・スバロウ試薬（０．１ｍＬ）および蒸留水（１．５ｍＬ）を添加した後、溶液を混合して発色させた。１０分間完全に発色させた後、Ｃａｒｙ  ２１９  ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計を使用して、サンプルの吸光度を６６０ｎｍで読み取った。原液無機ホスフェート溶液（０．６５ｍＭ）を使用して、最終無機ホスフェート濃度が０．０２６〜０．１３０μモル／ｍＬの範囲にある６つの標準を作成して調製された標準曲線と、放出された無機ホスフェートの量とを比較した。
【０１６２】
（グリセロールキナーゼ活性アッセイ）
典型的に細胞フリー粗抽出物である適量の酵素を４０ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、２１ｍＭの均一１３Ｃ標識グリセロール（９９％、ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））および０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９）を含有する反応混合物に２５℃で７５分間かけて添加した。グリセロールからグリセロール３−リン酸への転換は、次によって検知された。１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）：グリセロール（６３．１１ｐｐｍ、δ、Ｊ＝４１Ｈｚおよび７２．６６ｐｐｍ、ｔ、Ｊ＝４１Ｈｚ）；グリセロール３−リン酸（６２．９３ｐｐｍ、δ、Ｊ＝４１Ｈｚ；６５．３１ｐｐｍ、ｂｒｄ、Ｊ＝４３Ｈｚ；および７２．６６ｐｐｍ、ｄｔ、Ｊ＝６，４１Ｈｚ）。
【０１６３】
（ＮＡＤＨ−結合グリセロールデヒドロゲナーゼアッセイ）
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク分離後に、大腸菌菌株からの細胞フリー抽出物中のＮＡＤＨ−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ活性（ｇｌｄＡ）を判定した。フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）を媒介物として使用して、グリセロールおよびＮＡＤ＋から、ジヒドロキシアセトンおよびＮＡＤＨへの転換を３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）から濃色のホルマザンへの転換に共役させた（非特許文献５０）。
【０１６４】
天然ゲル（カリフォルニア州サンディエゴのノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からの８〜１６％ＴＧ、１．５ｍｍ、１５レーンゲル）を使用して、標準手順によって電気泳動を二連で実施した。３×５０ｍＭトリスまたは炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ９）で１０分間の洗浄によって、残留グリセロールをゲルから除去した。５０ｍＭのトリスまたは炭酸カリウム（ｐＨ９）、６０ｍｇの硫酸アンモニウム、７５ｍｇのＮＡＤ＋、１．５ｍｇのＭＴＴ、および０．５ｍｇのＰＭＳを含有する１５ｍＬのアッセイ溶液中で、グリセロール（最終濃度ほぼ０．１６Ｍ）有りおよび無しで二連のゲルを展開した。
【０１６５】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続いて、精製Ｋ．ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）に対して産生されるポリクローナル抗体との反応によって、大腸菌菌株（ｇｌｄＡ）中のＮＡＤＨ−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ活性の存在または不在も判定した。
【０１６６】
（１，３−プロパンジオールの単離および同定）
（発酵生成物のＨＰＬＣ分析）
グルコースから１，３−プロパンジオールへの転換をＨＰＬＣによってモニターした。標準クロマトグラフィーを使用して、分析を実施した。適切な一方法は、ＲＩ検出を使用したウォーターズ・アライエンス（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ）ＨＰＬＣシステムを用いる。カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラド（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））からのカチオンＨ詰め替えカートリッジプレカラム（４．６ｍｍ×３０ｍｍ）を装着し、５０℃に温度調節され、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで５ｍＭのＨ２ＳＯ４を移動相として使用した、カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラド（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））からのアミネクス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ８７Ｈカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）にサンプルを注入した。システムを毎週、既知濃度の標準に対して較正した。典型的にはグルコース、グリセロール、１，３-プロパンジオール、および酢酸の滞留時間は、それぞれ１２．７分、１９．０分、２５．２分、および２１．５分であった。
【０１６７】
（発酵方法のＧＣ／ＭＳ分析）
ＧＣ／ＭＳによって１，３−プロパンジオールの生産を確認した。ＧＣ／ＭＳの当業者が利用できる標準技術および材料を使用して、分析を実施した。適切な一方法は、ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）５９７１シリーズ質量選択検出器（ＥＩ）およびＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）に連結された、ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフを使用した。生成した１，３−プロパンジオールの滞留時間および質量スペクトルを基準１，３−プロパンジオール（ｍ／ｅ：５７，５８）と比較した。
【０１６８】
ＧＣ／ＭＳの代案の方法は、サンプルの誘導体化を伴った。１．０ｍＬのサンプル（例えば培養上清）に、３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を添加した。混合後、サンプルを凍結乾燥した。凍結乾燥物質にビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドとピリジン（３００μＬ）との１：１混合物を添加し、激しく混合して６５℃に１時間おいた。遠心分離によって不溶性物質をサンプルから除去した。結果として生じる２相に分かれた液体の上方を分析で使用した。サンプルをＪ＆Ｗサイエンティフィック（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、０．２５μｍ膜厚）上でクロマトグラフにかけ、培養上清から得られた１，３−プロパンジオール誘導体の滞留時間および質量スペクトルを基準試料から得られたものと比較した。ＴＭＳ−誘導化１，３−プロパンジオールの質量スペクトルは、２０５、１７７、１３０、および１１５  ＡＭＵの特徴的イオンを含有する
【０１６９】
（培養液組成）
ＴＭ２培養液（ＴＭ２）は基本の処方であり、それに炭素源（典型的に２０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌのグルコース）、適切な抗生物質、およびその他の構成要素が添加される。ＴＭ２培養液は以下の構成要素を含有する。Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２ｇ／Ｌ）、クエン酸一水和物（２ｇ／Ｌ）、クエン酸アンモニウム第二鉄（０．３ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）、微量元素溶液（１ｍｌ）。ｐＨを６．８に調節する。微量元素の溶液は、クエン酸Ｈ２Ｏ（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（３．０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．０１０ｇ／Ｌ）、およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）を含有する。
【０１７０】
ＴＭ３培養液（ＴＭ３）は、０．５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有すること以外は、ＴＭ２培養液と同一である。
【０１７１】
ＬＢ培養液（ＬＢ）は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのトリプトン、および１０ｇ／ＬのＮａＣｌを含有する。ＬＢプレート（またはＬＡ）は、ＬＢ培養液＋２％寒天である。２ＹＴ培養液（２ＹＴ）は、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１６ｇ／Ｌトリプトン、および１０ｇ／ＬＮａＣｌを含有する。グルコース（ＳＢＧ１％）添加ソイブロスは、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）からの１０ｇ／Ｌのソイトーン（Ｓｏｙｔｏｎｅ）、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、および１０ｇ／Ｌのグルコースを含有する。
【０１７２】
（発酵プロトコル（１４Ｌ））
既述したあらゆる菌株（ＫＬＰ２３、ＲＪ８．ｎ、ＭＢ  １６５５）のフラスコ振盪培養は、実施例で詳細に述べるような適切な抗生物質を含有する２ＹＴ培養液またはＬＢのどちらかで培養して、発酵槽に接種するための前培養を作り出した。培養は、凍結保護物質として１５％グリセロールと共に調製した凍結シード・バイアル、あるいは５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加した新鮮なＬＡプレート上に生育した単一コロニーのどちらかから開始した。凍結バイアルから開始される培養は、２Ｌフラスコ内の５００ｍＬの特定培養液で培養し、単一コロニーを使用して前培養を開始した場合、それを２５０ｍＬバッフル付きフラスコ内の３０ｍＬの特定培養液中に入れた。培養を３４℃および３００ｒｐｍの振盪で、ＯＤ５５０がほぼ１．０  ＡＵになるまで培養して使用し、発酵槽に接種した。場合によってはシード発酵槽を使用して、生産発酵槽に接種するためにより大量の前培養を提供した。シード発酵槽は、ビタミンＢ１２がシードタンクに添加されないこと以外は、生産発酵槽と概して同一である。シード発酵槽を使用する手順の詳細は、該当実施例で述べられている。
【０１７３】
シードおよび生産発酵槽は、ＫＨ２ＰＯ４（７．５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２ｇ／Ｌ）、クエン酸一水和物（２ｇ／Ｌ）、クエン酸アンモニウム第二鉄（０．３ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．２ｇ／Ｌ）、硫酸（９８％；１．２ｍＬ／Ｌ）、泡止め剤としてのＭａｚｕ  ＤＦ２０４（０．４ｍＬ／Ｌ）、酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）、微量元素溶液（１０ｍｌ／Ｌ）を含有する同一培養液で調製した。微量元素溶液は、クエン酸・Ｈ２Ｏ（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（３．０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．０１０ｇ／Ｌ）、およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）を含有する。滅菌後、２０〜２８％のＮＨ４ＯＨでｐＨを６．８に調節し、グルコース（６０〜６７％（ｗ／ｗ）溶液からの１０〜２５ｇ／Ｌ）および適切な抗生物質（詳細は具体例参照）を添加した。接種後の発酵槽容積は６リットルであった。
【０１７４】
１４Ｌの撹拌されるタンク発酵槽を上述の培養液で調製した。温度を３４℃に調節し、アンモニア水（２０〜２８重量％）を使用して、ｐＨを６．８に調節した。背圧を０．５ｂａｒｇに調節し、ｄＯ調節を５％に設定した。軽微な逸脱を除いて、グルコース濃度は６０〜６７％（ｗ／ｗ）の供給で０ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌに維持された。ビタミンＢ１２の添加、およびここで述べる一般手順のその他のあらゆる変更は、実施例で言及される。
【０１７５】
割合または％のいずれかであるモル収率は、（グリセロール生成モル＋１，３−プロパンジオール生成モル）／（グルコース消費モル）を表す。概して％で示される重量収率は、（１，３−プロパンジオール生成グラム数）／（グルコース消費グラム数）を表す。
【実施例】
【０１７６】
（実施例１）
（１，３−プロパンジオール生産のためのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩマイナス（Δｎｄｈ）大腸菌株構築）
（ＫＬｎｄｈ８１の構築）
コード領域にｌｏｘＰ５１１カセットを割り込ませて、ｎｄｈ変異を得た。上流および下流側面領域を持つｎｄｈ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照）は、大腸菌ＭＧ１６５５からＰＣＲ増幅してクローン化した。ｎｄｈカセットをＳｔｕＩで消化し遺伝子のほぼ中央で切断して、ｎｄｈ遺伝子に対して反対向きのｃａｔ遺伝子で、ｌｏｘＰ５１１−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ５１１カセットをこの部位内にクローン化した。Ｓｐｅ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｖによる消化と、それに続くブラントエンドを生成するためのフィルイン、および１．１ｋｂ断片のゲル精製により、プラスミドｐＬｏｘＣａｔ２７［配列番号：１］からｌｏｘＰ５１１−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ５１１カセットを得た。ｌｏｘＰ５１１部位は、ｌｏｘＰ部位の変異体である（非特許文献４３）。ｎｄｈ：：ＣａｔカセットをＰＣＲ増幅し、ＫＬＰ２３適格細胞内に電気穿孔して、菌株ＫＬｎｄｈ８１：：Ｃｍを作り出した。Ｃｒｅリコンビナーゼによってクロラムフェニコールマーカーを除去し（非特許文献４３）、１個のｌｏｘＰ５１１部位を含有する９６ｂｐの中断配列が残された。この菌株をＫＬｎｄｈ８１と命名した。代案としてはコード領域をｌｏｘＰ部位のないＣａｔカセットで中断してｎｄｈ変異を得て、菌株ＫＬＮＤＨ４１３を得た。
【０１７７】
（ＲＪ８．ｎの構築）
Ｋｌｎｄｈ８１：：Ｃｍからのｎｄｈ側面配列およびｌｏｘＰ５１１−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ５１１を含有するカセットをＰＣＲ増幅し、ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ［インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］内にクローン化して、ｐＡＨ１１１を作り出した。ｐＡＨ１１１からのｎｄｈ−ｌｏｘＰ５１１−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ５１１カセットを菌株ＲＪ８／ｐＫＤ４６内に統合した。組換え菌株をクロラムフェニコール耐性について選択した。カセットのｎｄｈへの組み込み成功は、ＰＣＲで確認した。Ｃｒｅリコンビナーゼ（非特許文献４３）を使用して、クロラムフェニコールマーカーを除去し、菌株ＲＪ８．ｎを作り出した。
【０１７８】
（実施例２）
（大腸菌株ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９およびＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２による１，３−プロパンジオールおよびグリセロール生産の比較）
プラスミドｐＡＨ４８およびｐＤＴ２９またはｐＫＰ３２で、菌株ＫＬＰ２３を形質転換した。一般方法で述べたようにして、１，３−プロパンジオール（およびグリセロール）の生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。解凍した凍結バイアルを２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加５００ｍＬの２ＹＴ中で培養し、それを使用して各発酵の前培養を調製した。フラスコの全内容物を使用して、発酵槽を接種した。発酵槽を３５℃およびｄ６設定値１０％で操作した。その他の全調節パラメータは一般方法で述べたとおりである。各発酵のビタミンＢ１２ストラテジーは、下で詳述する。
【０１７９】
（ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９での発酵）
本実施例では、接種３時間後に開始して、１６ｍＬ／時間の速度でビタミンＢ１２（０．０７５ｇ／Ｌ、５００ｍＬ）を供給した。大腸菌菌株ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を使用した、グルコースから１，３−プロパンジオール（１，３ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概要を表２．１に示す。１，３−プロパンジオールの収率は、２４重量％（１，３プロパンジオールのグラム数／グルコース消費グラム数）であり、力価６８ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールが得られた。
【０１８０】
【表６】
0004592418.tif 000007
【０１８１】
２倍濃度での同一ビタミンＢ１２の供給、あるいは発酵の経時変化に沿ったビタミンＢ１２の大量瞬時添加でも同様の結果が得られた。得られた最高力価は７７ｇ／Ｌであった。
【０１８２】
（ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２による改善された発酵）
大腸菌菌株ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を使用した、グルコースから１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概要を表２．２に示す。接種３時間後に開始して、１６ｍＬ／時間の速度でビタミンＢ１２（０．１５０ｇ／Ｌ、５００ｍＬ）を供給した。グルコース供給の連続した添加を可能にするために、３６時間後にほぼ２Ｌの発酵ブロスをパージした。１，３−プロパンジオールの収率は、２６重量％（１，３−プロパンジオールのグラム数／グルコース消費グラム数）であり、力価１１２ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールが得られた。
【０１８３】
【表７】
0004592418.tif 000008
【０１８４】
半分の濃度での同一ビタミンＢ１２の供給、あるいは発酵の経時変化に沿ったビタミンＢ１２の大量瞬時添加でも同様の結果が得られた。得られた最高力価は１１４ｇ／Ｌであった。
【０１８５】
（実施例２Ａ）
（大腸菌株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９およびＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２による１，３−プロパンジオールおよびグリセロール生産の比較）
解凍した凍結バイアルを２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加５００ｍＬの２ＹＴ中で培養し、それを使用してＲＪ８／ｐＡＨ４８ｐＤＴ２９およびＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２の前培養を調製した。フラスコの全内容物を使用して、発酵槽を接種した。発酵槽を３５℃およびｄ６設定値１０％で操作した。その他の全調節パラメータは一般方法で述べたとおりである。ｄｈａＴ欠失があったこと以外は、ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２はＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９と同一であった。各発酵のビタミンＢ１２ストラテジーは下で詳述する。
【０１８６】
（ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９による発酵）
大腸菌菌株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を使用した、グルコースから１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概要を表２Ａ．１に示す。ビタミンＢ１２を２、１６、および１６ｍｇの大量瞬時添加で、それぞれ２、８、および２６時間目に提供した。１，３−プロパンジオールの収率は３５重量％（１，３−プロパンジオールのグラム数／グルコース消費グラム数）であり、力価５０．１ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールが得られた。
【０１８７】
【表８】
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【０１８８】
（ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２による改善された発酵）
大腸菌菌株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を使用した、グルコースから１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概要を表２Ａ．２に示す。ビタミンＢ１２を４８および１６ｍｇの大量瞬時添加で、それぞれ２６および４４時間目に提供した。１，３−プロパンジオールの収率は３４重量％（１，３−プロパンジオールのグラム数／グルコース消費グラム数）であり、力価１２９ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールが得られた。
【０１８９】
【表９】
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【０１９０】
（大腸菌株ＲＪ８．ｎ／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２による１，３−プロパンジオールおよびグリセロール生産）
プラスミドｐＡＨ４８およびｐＫＰ３２で、菌株ＲＪ８．ｎを形質転換した。一般方法で述べたようにして、１，３−プロパンジオール（およびグリセロール）の生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。解凍したＲＪ８．ｎ／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２の凍結バイアルを２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加５００ｍＬのＬＢに移して、前培養を調製した。培養をシード発酵槽に移し、１Ｌの培養を生産発酵槽に移す前に１６時間培養した。その時点で、ＯＤ５５０は５０  ＡＵ超に達し、３０ｇ／Ｌのグリセロールがブロス中に蓄積した。シードおよび生産発酵槽のどちらも３５℃およびｄ６設定値１０％で操作した。その他の全調節パラメータは一般方法で述べたとおりである。
【０１９１】
ビタミンＢ１２を１６ｍｇの大量瞬時添加で、１２時間、１７．３時間、２２．８時間、および２７．５時間目に生産タンクに提供した。最終力価は１１２．７ｇ／Ｌ  ３Ｇであり、質量収率は３１．６％であった。
【０１９２】
（実施例３）
（ａｒｃＡグローバル制御因子に欠失がある大腸菌株の構築およびフラスコ振盪成績）
０．６ｋｂコード領域をｐＫＤ３のＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットで置換することで、ａｒｃＡ欠失［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を作り出した。ｐＫＤ３をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：２および配列番号：３で、置換カセットを増幅した。プライマー配列番号：２は、ａｒｃＡの５’末端に対して４１ｂｐの相同性、ｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を含む。プライマー配列番号：３は、ａｒｃＡの３’末端に対して４２ｂｐの相同性、ｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を含む。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株をＬＢプレート上で１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールにより選択した。プライマーペア配列番号：４および配列番号：５を使用して、ａｒｃＡ遺伝子の欠失をＰＣＲで確認した。野生型菌株は０．７ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方、組換え菌株は特徴的な１．１ｋｂのＰＣＲ生成物を与える。菌株をＭＧ１６５５  ΔａｒｃＡ：：Ｃｍと命名した。Ｐ１溶菌液を調製し使用して、変異を菌株ＫＬｎｄｈ８１内に移し、ＫＬｎｄｈ８１  ΔａｒｃＡ：：Ｃｍを形成した。
【０１９３】
ＫＬｎｄｈ８１  ΔａｒｃＡ：：Ｃｍ菌株およびＫＬｎｄｈ８１対照菌株をプラスミドｐＳＹＣＯ１０１でエレクトロ形質転換した。各菌株の１個のコロニーを５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加ＬＢ培養液中で１０時間培養した。次に４０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、および２ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２添加１０ｍＬのＴＭ２培養液を含有する２５０ｍＬバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに、これらの培養の２００μＬ容量を移した。フラスコを３００ｒｐｍおよび３４℃で４０時間培養した。表３の結果は、ａｒｃＡ変異がグリセロールおよび１，３プロパンジオール生産のモル収率を改善することを示す。
【０１９４】
【表１０】
0004592418.tif 000011
【０１９５】
（実施例４）
（ガラクトース−プロトン同伴輸送体（ｇａｌＰ）およびグルコキナーゼ（ｇｌｋ）の発現レベルを調節するＴＲＣプロモーターを有するリン酸転移酵素システムマイナス（ＰＴＳ−）大腸菌株の構築）
（ｌｏｘＰ−ＣＡＴ−ｌｏｘＰ−Ｔｒｃカセット（ｐＴｒＣｍ４２）の構築）
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ａ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））から直鎖ＤＮＡを得て、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで充填し、環状化して、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））からの大腸菌ＴＯＰ−１０に形質転換した。５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含有するルリア寒天プレート上での選択に続いて、結果として生じるプラスミド（ｐＴｒｃ１）を精製し、制限酵素分析にかけてして元来ＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩの間に存在していたＤＮＡ領域が不在であることを確認した。
【０１９６】
ｐＴｒｃ１（ｔｒｃプロモーターの−３５領域の上流）内のユニークなＢｓｐＭ１部位を使用して、ｌｏｘＰ部位が側面にあるクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ）を含有するカセットを挿入した。ＢｓｐＭ１で消化されたｐＴｒｃ１から直鎖ＤＮＡを得て、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を使用してゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで充填して、ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットにライゲートした。Ｓｔｕ１およびＢａｍＨ１で消化して、プラスミドｐＬｏｘＣａｔ１からｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットを得た（配列番号：６参照）。ｐＬｏｘＣａｔ１はｐＬｏｘＣａｔ２に類似する（非特許文献４３）。ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ−１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび２０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール添加ルリア寒天プレート上で選択を実施した。プラスミドを得て、制限酵素分析を実施した。ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ−ＴｒｃをｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットと共に、ｔｒｃプロモーターに対して同一および反対方向に含有する２個のプラスミドをそれぞれ、ｐＴｒＣｍ４１およびｐＴｒＣｍ４２と命名した。
【０１９７】
（ｇａｌＰ（ｐＲ６ＫｇａｌＰ）のためのｔｒｃプロモーター置換テンプレートの構築）
プライマーペア配列番号：７および配列番号：８を使用して、ｐＴｒＣｍ４２から、ｔｒｃプロモーターおよびｌａｃオペレーターを上流ｌｏｘＰ−ＣＡＴ−ｌｏｘＰカセットと共に含有するＤＮＡカセットをＰＣＲ増幅した。プライマーペアは、ｇａｌＰ上流領域に対する４０ｂｐの相同性をＰＣＲ生成物の両端に組み込む。ＰＣＲパラメータは９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間、Ｔａｑポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して３０サイクルであった。生成物をＥｃｈｏ  ｐＵｎｉ／Ｈｉｓ５  Ｒ６Ｋ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にサブクローニングして、プラスミドｐＲ６ＫｇａｌＰを生成した。
【０１９８】
（ｇｌｋ（ｐＲ６Ｋｇｌｋ）のためのｔｒｃプロモーター置換テンプレートの構築）
プライマーペア配列番号：９および配列番号：１０を使用して、ＰＣＲによるｐＴｒＣｍ４２から、ｔｒｃプロモーターおよびｌａｃオペレーターを上流ｌｏｘＰ−ＣＡＴ−ｌｏｘＰカセットと共に含有するＤＮＡカセットを増幅した。プライマーペア配列番号：９および配列番号：１０は、ｇｌｋ上流領域に対するそれぞれ３９（１塩基欠失）および４０ｂｐの相同性をＰＣＲ生成物の両端に組み込む。ＰＣＲパラメータは９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間、Ｔａｑポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して３０サイクルであった。生成物をＥｃｈｏ  ｐＵｎｉ／Ｈｉｓ５  Ｒ６Ｋ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にサブクローニングして、プラスミドｐＲ６Ｋｇｌｋを生成した。
【０１９９】
（大腸菌ΔｐｔｓＨＩｃｒｒ菌株（ＫＬｐｔｓ７）の構築）
大腸菌株ＮＦ９の誘導体を供与体としてを使用して、Ｐ１ｖｉｒ形質導入により、大腸菌株ＫＬｎｄｈ８１のＰＴＳマイナス誘導体（ΔｐｔｓＨＩｃｒｒ）を得た（非特許文献５１）。形質導入は、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、およびｃｒｒを含むオペロンをカナマイシン抗生物質耐性マーカーで置換して（非特許文献５２）、菌株ＫＬｐｔｓ７を与える。マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）（ラクトース−）寒天＋１％グルコース上に平板培養すると、ＫＬｐｔｓ７は白色コロニー表現型を示す。
【０２００】
（天然ｇａｌＰプロモーターの合成ｔｒｃプロモーター（ＫＬｇａｌＰ−ｔｒｃ）による置換）
ｒＴｔｈＲＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））、ｐＲ６ＫｇａｌＰをテンプレートとして、およびプライマーペア配列番号：７および配列番号：８を使用して、ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ−Ｔｒｃカセットを含みｇａｌＰ上流領域に対する４０ｂｐの相同性を両端に組み込んだ、ＰＣＲ増幅生成物［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を生成した。（非特許文献４２）で述べられたようなλレッドシステムを使用して、組み込みのためのｐＫＤ４６を含有するエレクトロ−コンピテントＫＬｐｔｓ７細胞に、ＰＣＲ増幅された組み込みカセットを形質転換した。１０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール添加ＬＢプレート上で選択を実施した。このカセットの成功した組み込みは、ｇａｌＰ  ＡＴＧ開始コドン上流の３８〜１８１ｂｐ領域（ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照）をｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ−Ｔｒｃカセット（配列番号：１１）で置き換えて、菌株ＫＬｐｔｓ：：ｇａｌＰ−ｔｒｃを提供する。プライマーペア配列番号：７および配列番号：８（組み込み部位を増幅して１．４ｋｂの生成物を与える）と、プライマーペア配列番号：１２および配列番号：１３（上流および下流領域含めた組み込み部位を増幅して２．１ｋｂの生成物を与える。）を使用して、ＰＣＲ分析によって組み込みを確認した。ＰＣＲパラメータは９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間、ＴａｑポリメラーゼまたはｒＴｔｈポリメラーゼを使用して３０サイクルであった。マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）（ラクトース−）寒天＋１％グルコース上に平板培養すると、ＫＬｐｔｓ：：ｇａｌＰ−ｔｒｃは淡紅色コロニー表現型を示す。（非特許文献４３）で述べられたようにして、クロラムフェニコールマーカーを除去した。プライマーペア配列番号：１２および配列番号：１３（１．１ｋｂの生成物を与える）を使用してＰＣＲ分析によって除去を確認し、結果として得られる菌株をＫＬｇａｌＰ−ｔｒｃと命名した。
【０２０１】
（天然ｇｌｋプロモーターの合成ｔｒｃプロモーター（ＫＬＧＧ）による置換）
ｒＴｔｈ  ＲＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））、ｐＲ６Ｋｇｌｋをテンプレートとして、およびプライマーペア配列番号：９および配列番号：１０を使用して、ｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ−Ｔｒｃカセットを含み、ｇｌｋ上流領域に対するほぼ４０ｂｐの相同性を両端に組み込んだＰＣＲ増幅生成物［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を生成した。上述のλレッドシステムを使用して、組み込みのためのｐＫＤ４６を含有するエレクトロ−コンピテントＫＬｇａｌＰ−ｔｒｃ細胞に、ＰＣＲ増幅された組み込みカセットを形質転換した。１０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択を実施した。このカセットの成功した組み込みは、ｇｌｋ  ＡＴＧ開始コドン上流の４０〜１３７ｂｐ領域（ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照）をｌｏｘＰ−Ｃａｔ−ｌｏｘＰ−Ｔｒｃカセット（配列番号：１１）で置き換える。プライマーペア配列番号：１４および配列番号：１５（上流および下流領域を含めた組み込み部位を増幅して２．４ｋｂの生成物を与える）を使用して、ＰＣＲ分析によって組み込みを確認した。マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）（ラクトース−）寒天＋１％グルコース上に平板培養すると、コロニーは深紅色を示し、親株（ＫＬｇａｌＰ−ｔｒｃ）と比較して、グルコースから酸への転換の増大が示された。上述のようにしてクロラムフェニコールマーカーを除去し、引き続くＰＣＲ分析（プライマーペア配列番号：１４および配列番号：１５を使用して１．３ｋｂの生成物を与える）から菌株ＫＬＧＧが得られた。
【０２０２】
（グローバル制御因子（ＫＬＧＧ  ΔａｒｃＡ）をコードするａｒｃＡ遺伝子の欠失）
ＭＧ１６５５  ΔａｒｃＡ：：Ｃｍ菌株のＰ１溶菌液を調製して使用し、変異を菌株ＫＬＧＧに移した。結果として生じるクロラムフェニコール抵抗性クローンＫＬＧＧ  ΔａｒｃＡ：：ＣｍをゲノムＰＣＲによって調べ、変異が存在することを確実にした。ＦＬＰリコンビナーゼを使用して、クロラムフェニコール耐性マーカーを除去し（非特許文献４２）、この菌株をＫＬＧＧ  ΔａｒｃＡと命名した。
【０２０３】
（６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼ遺伝子をコードするｅｄｄ遺伝子（ＫＬＧＧ  ΔａｒｃＡ  Δｅｄｄ、ＦＭＰとも称される）の欠失）
１．７ｋｂのコード領域をｐＬｏｘＣａｔ２からのｌｏｘＰ−ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットで置換してｅｄｄ欠失［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を得た。プライマーペア配列番号：１６および配列番号：１７で置換カセットを増幅した。プライマー配列番号：１６は、ｅｄｄの５’末端に対する８０ｂｐの相同性、およびテンプレートｐＬｏｘＣａｔ２に対する１８ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：１７は、ｅｄｄの３’末端に対する７８ｂｐの相同性、およびｐＬｏｘＣａｔ２に対する１９ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＫＬＧＧ  ΔａｒｃＡ／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株をＬＢプレート上で１２．５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールによって選択した。プライマーペア配列番号：１８および配列番号：１９を使用して、ｅｄｄ遺伝子の欠失をＰＣＲで確認した。野生型菌株は２．２ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方組換え型は特徴的な１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を与える。菌株をＫＬＧＧ  ΔａｒｃＡ  Δｅｄｄ：：ｃａｔと命名した。Ｃｒｅリコンビナーゼ（非特許文献４３）を使用して、クロラムフェニコールマーカーを除去し、この菌株をＫＬＧＧ  ΔａｒｃＡ  Δｅｄｄ、あるいは代案としてはＦＭＰと命名した。
【０２０４】
（グルコース消費速度の亢進を示すＦＭＰ菌株の選択および性質決定）
ΔｐｔｓＨＩｃｒｒ、天然ｇａｌＰプロモーターのｔｒｃプロモーター置換、および天然ｇｌｋプロモーターのｔｒｃプロモーター置換（これらの３つ全ての変更については実施例４で述べられる）を含む細胞は、最初に緩慢な増殖を示した。また引き続く選択（下で述べるような）は、常に生育がより早い誘導体をもたらした。細胞フリー抽出物からアッセイされたグルコキナーゼ活性は、生育のより早い誘導体で、生育がより緩慢な親株と比較して典型的に３倍高かった。
【０２０５】
プラスミドｐＳＹＣＯ１０３で形質転換された大腸菌株ＦＭＰは、本質的に実施例２で述べたようにして１４Ｌ発酵槽で培養した。発酵の間に−８０℃（１５％グリセロール原液）での保存のためのバイアルを作成した。３３時間（ＯＤ５５０は３０．７  ＡＵ）で採取したアリコートからＬＢプレートをストリークし、単一コロニーを回収し「選択ＦＭＰ／ｐＳＹＣＯ１０３」と命名した。プラスミドを含有しない菌株ＦＭＰから単一コロニーを同様に得て、「選択ＦＭＰ」と命名した。
【０２０６】
ｔｒｃプロモーター領域を含むｇａｌＰおよびｇｌｋ遺伝子は、プライマーペア配列番号：１２／配列番号：１３およびプライマーペア配列番号：１４／配列番号：１５をそれぞれ使用して、「選択ＦＭＰ／ｐＳＹＣＯ１０３」の２個のコロニー、および「選択ＦＭＰ」の１個のコロニーからＰＣＲ増幅した。これらの３個のサンプルの配列分析は、同一プライマーを使用して実施した。それぞれの場合、ｇａｌＰ遺伝子およびプロモーター領域は、親株と変わらないままで、一方ｇｌｋ遺伝子およびプロモーター領域は、親株と比較した際に同一の単一塩基対の変化を含有した。「選択ＦＭＰ／ｐＳＹＣＯ１０３」の２個の分離株、および「選択ＦＭＰ」の１個の分離株は、対応する親株配列配列番号：２１と比較した際に、ｇｌｋ発現を調節するｔｒｃプロモーターの−３５〜−１０領域中の配列番号：２０として同定された配列を含有した。それからｇａｌＰおよびｇｌｋ配列が得られる「選択ＦＭＰ」に由来する菌株を菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍと命名した。
【０２０７】
（実施例５）
（菌株ＦＭＰ／ｐＳＹＣＯ１０３およびＦＭＰ’：：Ｋｍ／ｐＳＹＣＯ１０３を使用したグルコースから１，３−プロパンジオールへの発酵の比較例）
菌株ＦＭＰおよびＦＭＰ’：：ＫｍをプラスミドｐＳＹＣＯ１０３で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、１，３−プロパンジオールの生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。解凍したＦＭＰ／ｐＳＹＣＯ１０３の凍結バイアルを５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加５００ｍＬの２ＹＴに移して前培養を調製した。ｄＯ設定値は１５％であった。ビタミンＢ１２を１６ｍｇの大量瞬時添加で発酵槽に３０、４３、および５１時間目に添加した。
【０２０８】
解凍したＦＭＰ’：：Ｋｍ／ｐＳＹＣＯ１０３凍結バイアルを５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加５００ｍＬのＳＢＧ１％に移して前培養を調製した。ビタミンＢ１２を１６ｍｇの大量瞬時添加で発酵槽に２１、４０、および４０．５時間目に添加した。
【０２０９】
図１は、１，３−プロパンジオールのＦＭＰ’：：Ｋｍ／ｐＳＹＣＯ１０３による生産が、ＦＭＰ／ｐＳＹＣＯ１０３によるものよりも早いことを示す。
【０２１０】
（実施例６）
（グルコースからの１，３プロパンジオール生産のための大腸菌株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）変性発現の遺伝子操作）
（開始コドンを変化させることによるＧａｐＡ発現の低下）
ｇａｐＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンをＧＴＧまたはＴＴＧ開始コドンで置き換えて、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＧａｐＡのレベルを低下させた。
【０２１１】
プライマーペア配列番号：２２および配列番号：２３を使用して、大腸菌株ＭＧ１６５５からのＰＣＲによって、大腸菌ｇａｐＡ遺伝子と上流および下流側面配列を増幅した。ＰＣＲ生成物をＰＣＲ反応から直接ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化して、ｐＤＴ５０を形成した。プラスミドｐＤＴ５０およびｐＬｉｔｍｕｓ  ２８（ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））をＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、ｇａｐＡ遺伝子断片およびベクターをそれぞれゲル精製してライゲートした。結果として生じたプラスミドｐＤＴ５１を大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。
【０２１２】
カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））からのストラタジーン・クイックチェンジ１日部位特異的突然変異誘発方法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ１−Ｄａｙ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、ｇａｐＡ変異株プラスミドを構築した。テンプレートプラスミドｐＤＴ５１をプライマーペア配列番号：２４および配列番号：２５と混合してＧＴＧ変異を作り出し、あるいはプライマーペア配列番号：２６および配列番号：２７と混合してＴＴＧ変異を作り出した。ＰＣＲ増幅後、反応をＤｐｎＩによって消化し、テンプレートプラスミドを除去し、増幅プラスミドのみを残した。次にプラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。
【０２１３】
プライマーペア配列番号：２２および配列番号：２３を使用して、ｇａｐＡ−ＧＴＧおよびｇａｐＡ−ＴＴＧコンストラクトをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成物をｇａｐＡノックアウト菌株ＫＬＰ２３Ａ１１２内に電気穿孔した。ＣｍＲマーカーを含有するｇａｐＡ欠失菌株大腸菌ＤＳ１１２（大腸菌遺伝子ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ））から得られたＰ１ファージ溶菌液でＫＬＰ２３を形質導入して、大腸菌株ＫＬＰ２３Ａ１１２を構築した。グルコースを含まないＬＢプレート上での増殖、およびクロラムフェニコール感受性によって、組み換え体を選択した。配列決定によって、ＧＴＧおよびＴＴＧ変異の成功した組み込みを確認した。変異菌株をそれぞれＫＬＰＡＧＴＧおよびＫＬＰＡＴＴＧと命名した。ＫＬＰＡＧＴＧおよびＫＬＰＡＴＴＧ菌株中でのＧａｐＡ活性の測定は、ＧａｐＡレベルが対照菌株ＫＬＰ２３のそれぞれ４％および＜１％であることを示した。
【０２１４】
菌株ＫＬＰ２３、ＫＬＰＡＧＴＧ、およびＫＬＰＡＴＴＧをプラスミドｐＳＹＣＯ１０１で形質転換し、４０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、および１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有するＴＭ２培養液中で、１，３−プロパンジオールの生産について試験した。結果を表４に示す。
【０２１５】
【表１１】
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【０２１６】
（プロモーターの置換によりＧａｐＡ発現を変化させる）
２２５ｂｐの上流ｇａｐＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照）をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび遺伝子操作プロモーターで置き換え、合成の短１．５ＧＩプロモーター（配列番号：２８）による天然ｇａｐＡプロモーターの置換を行った。ｐＫＤ３をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：２９および配列番号：３０によって置換カセットをＰＣＲで増幅した。プライマー配列番号：２９は、ＡＴＧｓｔａｒｔを含むｇａｐＡに対する３９ｂｐの相同性を含有し、短１．５ＧＩプロモーターを含有し、テンプレートｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：３０は、上流ｇａｐＡ配列に対する５９ｂｐの相同性、およびｐＫＤ３に対する２１ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔して、ＭＧ１６５５  １．５ｇａｐＡ：：Ｃｍを得た。１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で、組換え菌株を選択した。カセットの成功した組み込みは、ｇａｐＡ  ＡＴＧ開始コドンの３４〜２５８ｂｐ上流領域をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴ−短１．５ＧＩプロモーターカセットで置き換える。Ｐ１ファージ溶菌液を調製し使用して、変異をＦＭＰ’：：Ｋｍに移した。この菌株をＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡ：：Ｃｍと称する。
【０２１７】
ＭＧ１６５５  １．５ｇａｐＡ：：Ｃｍ中の短１．５  ＧＩ  ｇａｐＡプロモーターを短１．２０  ＧＩプロモーター（配列番号：３１）または短１．６  ＧＩプロモーター（配列番号：３２）で置き換えた。１．２０  ｇａｐＡ菌株を作り出すために、ＭＧ１６５５  １．５ｇａｐＡ：：ＣｍからのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：３３および配列番号：３４で、置換カセットをＰＣＲ増幅した。プライマー配列番号：３３は、ｇａｐＡ上流領域に対する２４ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：３４は、ＭＧ１６５５  １．５ｇａｐＡ：：ＣｍのｇａｐＡ上流領域に対する相同性を含有し、短１．２０  ＧＩプロモーターを含有する。１．６ｇａｐＡ菌株を作り出すために、テンプレートとしてＭＧ１６５５  １．５ｇａｐＡ：：ＣｍからのゲノムＤＮＡを使用して、プライマーペア配列番号：３３および配列番号：３５で、置換カセットをＰＣＲ増幅した。プライマー配列番号：３５は、ＭＧ１６５５  １．５ｇａｐＡ：：ＣｍのｇａｐＡ上流領域に対する相同性を含有し、短１．６  ＧＩプロモーターを含有する。短１．２０  ＧＩプロモーター置換カセットおよび短１．６  ＧＩプロモーター置換カセットを使用して、上述のＭＧ１６５５の天然ｇａｐＡプロモーターを置き換え、それぞれ菌株ＭＧ１６５５  １．２０ｇａｐＡ：：ＣｍおよびＭＧ１６５５  １．６ｇａｐＡ：：Ｃｍを得た。ＭＧ１６５５  １．２０ｇａｐＡ：：ＣｍおよびＭＧ１６５５  １．６ｇａｐＡ：：Ｃｍを使用して、（上述のようにＰ１形質導入を使用して）菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍの天然ｇａｐＡプロモーターを置き換え、それぞれ菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．２０ｇａｐＡ：：ＣｍおよびＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．６ｇａｐＡ：：Ｃｍを得た。
【０２１８】
菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．２０ｇａｐＡ：：Ｃｍ、ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡ：：Ｃｍ、ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．６ｇａｐＡ：：Ｃｍ、および対照としてのＦＭＰ’：：Ｋｍから調製した細胞フリー抽出物を使用して、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を判定した。値を対照と比較して得られた値は、菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．２０ｇａｐＡ：：Ｃｍ、ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡ：：Ｃｍ、ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．６ｇａｐＡ：：Ｃｍで、それぞれ１０％、２５％、および１４０％であった。
【０２１９】
ＧＩプロモーター置換体を含有する菌株をプラスミドｐＳＹＣＯ１０６で形質転換し、２０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、および１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有するＴＭ２培養液中で、１，３−プロパンジオール生産について親菌株と比較した。結果を表５に示す。
【０２２０】
【表１２】
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【０２２１】
（実施例７）
（ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡ：：Ｃｍからのマーカーの除去）
菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡ：：Ｃｍから（一般方法の節で述べたように）クロラムフェニコールマーカーを除去して、菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡを得た。
【０２２２】
ＫＬｎｄｈ８１  ＰＴＳマイナス（ΔｐｔｓＨＩｃｒｒ）を作り出した結果として、ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡに導入されたカナマイシンマーカーをＭＧ１６５５  ΔｐｔｓＨＩｃｒｒ：：Ｃｍからの除去可能なＦＲＴ−Ｃｍ−ＦＲＴカセットで、Ｐ１形質導入によって置き換えた。テンプレートとしてｐＫＤ３を使用して、プライマーペア配列番号：５４および配列番号：５５で増幅された置換カセットにより、ＭＧ１６５５中のｐｔｓＨＩｃｒｒ欠失を作り出した。プライマー配列番号：５４は、菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡの染色体中に残るｐｔｓＨの残りの領域に対して７８ｂｐの相同性、およびｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：５５は、菌株ＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡ中のｃｒｒの残りの領域に対する７７ｂｐの相同性、およびｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール添加ＬＢプレート上で選択した。カセットの成功した組み込みは、ＰＣＲ分析で確認した。マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）（ラクトース−）寒天＋１％グルコース上で平板培養すると、ＭＧ１６５５  ΔｐｔｓＨＩｃｒｒ：：Ｃｍは白色コロニー表現型を示す。Ｐ１ファージ溶菌液を調製し、ＣｍマーカーをＦＭＰ’：：Ｋｍ  １．５ｇａｐＡに形質導入した。組換え菌株をクロラムフェニコール上で選択し、カセットの成功した組み込みをＰＣＲ分析で確認した。Ｆｌｐリコンビナーゼを使用して、クロラムフェニコールマーカーを除去し、配列決定（プライマー配列番号：５６を使用）によって、クロラムフェニコールマーカーの除去を確認した。結果として生じる菌株をＦＭＰ’１．５ｇａｐＡと命名した。
【０２２３】
（実施例８）
（大腸菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ／ｐＳＹＣＯ１０６を使用したグルコースからの１，３−プロパンジオールの高収率の実証）
菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡをプラスミドｐＳＹＣＯ１０６で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、１，３−プロパンジオールおよびグリセロールの生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。解凍したＦＭＰ’１．５ｇａｐ／ｐＳＹＣＯ１０６の凍結バイアルを５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加５００ｍＬのＳＢＧ１％に移して、前培養を調製した。ビタミンＢ１２を１６ｍｇの大量瞬時添加で発酵槽に接種前および接種２８時間目に添加した。最終１，３−プロパンジオール濃度は１２９ｇ／Ｌであり、質量収率は４０．２％であった。
【０２２４】
（実施例９）
（大腸菌におけるメチルグリオキサール合成酵素（ｍｇｓＡ）変異株の遺伝子操作）
０．４ｋｂのコード領域をｐＫＤ４のＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットで置き換えてｍｇｓＡ欠失［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を作り出した。ｐＫＤ４をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：３６および配列番号：３７で、置換カセットをＰＣＲ増幅した。プライマー配列番号：３６は、ｍｇｓＡの５’末端に対する４０ｂｐの相同性、テンプレートＤＮＡであるｐＫＤ４に対する２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：３７は、ｍｇｓＡの３’末端に対する４０ｂｐの相同性、ｐＫＤ４に対する２０ｂｐの相同性の相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を１２．５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。プライマーペア配列番号：３８およびＱＩＤ番号：３９を用して、ＰＣＲによってｍｇｓＡ遺伝子の欠失を確認した。野生型菌株は１．３ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な２．４ｋｂのＰＣＲ生成物を与える。この菌株をＭＧ１６５５  ΔｍｇｓＡ：：ｋａｎと命名した。ｍｇｓＡ変異株がＭＧ１６５５中に得られたら、Ｐ１ファージ溶菌液を調製して使用し、変異をＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ内に移した（実施例８）。ＦＬＰリコンビナーゼを使用してカナマイシン耐性マーカーを除去し（非特許文献４２）、この菌株をＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡと命名した。
【０２２５】
ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡおよびその親株をプラスミドｐＳＹＣＯ１０６で形質転換して、ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡ／ｐＳＹＣＯ１０６およびＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ／ｐＳＹＣＯ１０６をそれぞれ得た。
【０２２６】
菌株を１，３−プロパンジオール生産について、２０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、および１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有するＴＭ２培養液中で試験した。結果を表６に示す。
【０２２７】
【表１３】
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【０２２８】
（実施例１０）
（大腸菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡ／ｐＳＹＣＯ１０６を使用したグルコースから１，３−プロパンジオールへの発酵）
菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡをプラスミドｐＳＹＣＯ１０６で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、１，３−プロパンジオール（およびグリセロール）の生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡ／ｐＳＹＣＯ１０６の新鮮なプレート（５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加ＬＡ）からの単一コロニーを２５０ｍＬフラスコ内の１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加３０ｍＬのＬＢ中に移して、前培養を調製した。３４℃および３００ｒｐｍでＯＤ５５０が１  ＡＵになるまで培養後、１０．８ｍＬの培養を発酵槽に移した。操作のほぼ全体に渡り、発酵槽をグルコース限界で操作した。ビタミンＢ１２を１６ｍｇの大量瞬時添加で、接種前、接種２８時間目および３８時間目に発酵槽に添加した。最終１，３−プロパンジオール濃度は１３０ｇ／Ｌであり、質量収率は４７．５％であった。グルコース過剰（０〜２０ｇ／Ｌ）を維持した操作で、１４１ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールおよび４３．６％の質量収率を得た。
【０２２９】
（実施例１１）
（直鎖ＤＮＡ形質転換によるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）のための遺伝子操作されたプロモーターを有する大腸菌株の構築）
ＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび遺伝子操作されたプロモーターを含有する５９ｂｐの上流ｐｐｃ配列カセットを置き換えて、合成の短１．６  ＧＩプロモーターによる天然ｐｐｃプロモーターの置換を作り出した。ｐＫＤ３をテンプレートとして使用して、ＰＣＲ生成物をプライマーペア配列番号：４０および配列番号：４１で増幅した。プライマー配列番号：４０は、上流ｐｐｃ配列に対して８０ｂｐの相同性、テンプレートｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：４１は、上流ｐｐｃ配列に対して３９ｂｐの相同性を含有し、短１．６  ＧＩプロモーター配列を含有し、ｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール添加ＬＢプレート上で選択し、ＭＧ１６５５  １．６ｐｐｃ：：Ｃｍを得た。成功したカセットの組み込みは、ｐｐｃＡＴＧｓｔａｒｔの上流９０〜１４８ｂｐ領域［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴ−短１．６  ＧＩプロモーターカセットで置き換える。プライマーペア配列番号：４０および配列番号：４１によって、上流ｐｐｃ領域への組み込みを確認した。野生型菌株は０．２ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な１．２ｋｂのＰＣＲ生成物を与えた。プライマー配列番号：４２を使用してこのＰＣＲ生成物が配列決定され、プロモーター置換効率的に起きたことが示された。Ｐ１ファージ溶菌液を調製して使用し、変異を菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐ  ΔｍｇｓＡに移した。この菌株をＦＭＰ’１．５ｇａｐ  Δｍｇｓ  １．６ｐｐｃ：：Ｃｍと命名した。ＦＬＰリコンビナーゼを使用して、クロラムフェニコール耐性マーカーを除去し（非特許文献４２）、結果として得られる菌株をプラスミドｐＳＹＣＯ１０６でエレクトロ形質転換し、ＦＭＰ’１．５ｇａｐ  Δｍｇｓ  １．６ｐｐｃ／ｐＳＹＣＯ１０６を得た。
【０２３０】
フラスコ振盪培養を使用して、大腸菌のＦＭＰ’１．５ｇａｐ  Δｍｇｓ／ｐＳＹＣＯ１０６およびＦＭＰ’１．５ｇａｐ  Δｍｇｓ  １．６ｐｐｃ／ｐＳＹＣＯ１０６菌株におけるグルコースから１，３−プロパンジオールへの転換を評価した。５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加ＬＢ培養液中で１０時間培養した菌株を使用して、１０ｍＬのＴＭ２培養液、２０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、および２ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有する２５０ｍＬバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに接種した（２００μＬ）。フラスコを３００ｒｐｍおよび３４℃で培養した。代表的結果を表７に示す。親菌株に対する１．６ｐｐｃの変異の追加によって、モル収率増大およびアセテート生産減少の双方が観察された。
【０２３１】
【表１４】
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【０２３２】
すぐ上で述べたフラスコ振盪から得られた細胞フリー抽出物から、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）活性を測定した。対数中期において細胞のアリコートを収集し、細胞をフレンチプレスを二回通して破壊し、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、５０，０００ｒｐｍで１時間超遠心分離した。上清を除去し、タンパク源として使用した。ＰＰＣの特異的活性を下の表８に報告する。天然ｐｐｃプロモーターの短１．６  ＧＩプロモーターによる置換は、Ｐｐｃ酵素活性を３倍に上昇させる。
【０２３３】
【表１５】
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【０２３４】
（実施例１１Ａ）
（大腸菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡ／ｐＳＹＣＯ１０６を使用したグルコースから１，３−プロパンジオールへの発酵）
一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡ  １．６ｐｐｃ／ｐＳＹＣＯ１０６による１，３−プロパンジオールの生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡ  ΔｍｇｓＡ  １．６ｐｐｃ／ｐＳＹＣＯ１０６の新鮮なプレート（５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加ＬＡ）からの単一コロニーを２５０ｍＬフラスコ内の１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加３０ｍＬのＬＢ中に移して、前培養を調製した。３４℃および３００ｒｐｍでＯＤ５５０が１  ＡＵになるまで培養後、１０．８ｍＬの培養を発酵槽に移した。ビタミンＢ１２を１６ｍｇの大量瞬時添加で、接種前、接種２８時間目および３８時間目に発酵槽に添加した。最終１，３−プロパンジオール濃度は１３５．３ｇ／Ｌであり、質量収率は４６．１％であった。
【０２３５】
（実施例１２）
（直鎖ＤＮＡ形質転換によるｙｃｉＫ／ｂｔｕＲのための遺伝子操作されたプロモーターを有する大腸菌株の構築）
遺伝子ｙｃｉＫおよびｂｔｕＲは、大腸菌の単一オペロン内に存在する。ｙｃｉＫ−ｂｔｕＲの上流に１．３ｋｂのカセットを挿入して、天然ｙｃｉＫ−ｂｔｕＲプロモーターの合成短１．６  ＧＩプロモーターによる置換を作り出した。ｐＫＤ１３をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：４３および配列番号：４４によって、ＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび遺伝操作されたプロモーターを含有する置換カセットをＰＣＲ増幅した。プライマー配列番号：４３は、上流ｙｃｉＫ−ｂｔｕＲ配列に対する７０ｂｐの相同性を含有し、テンプレートｐＫＤ１３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：４４は、上流ｙｃｉＫ−ｂｔｕＲ配列に対する３０ｂｐの相同性を含有し、短１．６  ＧＩプロモーター配列を含有し、ｐＫＤ１３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を２５．０ｍｇ／Ｌのカナマイシン添加ＬＢプレート上で選択し、ＭＧ１６５５  １．６ｙｃｉＫ−ｂｔｕＲ：：Ｋｍを得た。カセットの成功した組み込みは、ｙｃｉＫ  ＡＴＧ開始コドン上流のｂｐ２７およびｂｐ２８間［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］へのＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴ−短１．６ＧＩプロモーターカセットの挿入をもたらす。上流ｙｃｉＫ／ｂｔｕＲ領域への組み込みは、プライマーペア配列番号：４５および配列番号：４６によって確認された。野生型菌株は１．４ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な２．８ｋｂのＰＣＲ生成物を与える。Ｐ１ファージ溶菌液を調製して使用し、変異をＴｒｉｐｌｅと称される菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐ  Δｍｇｓ  １．６ｐｐｃ誘導体に移した。抗生物質を除去した後、菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲを得た。
【０２３６】
（実施例１２Ａ）
（Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ／ｐＳＹＣＯ１０９を有する大腸菌株を使用したグルコースから１，３−プロパンジオールへの発酵）
菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲをｐＳＹＣＯ１０９で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ／ｐＳＹＣＯ１０９による１，３−プロパンジオールの生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ／ｐＳＹＣＯ１０９の新鮮なプレート（５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加ＬＡ）からの単一コロニーを２５０ｍＬフラスコ内の１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加３０ｍＬのＬＢ中に移して、前培養を調製した。３４℃および３００ｒｐｍでＯＤ５５０が１  ＡＵになるまで培養後、１０．８ｍＬの培養を発酵槽に移した。ビタミンＢ１２を８ｍｇの大量瞬時添加で、接種前、接種２８時間目および３８時間目に発酵槽に添加した。最終１，３−プロパンジオール濃度は１２３ｇ／Ｌであり、質量収率は４５．７％であった。
【０２３７】
（実施例１３）
（直鎖ＤＮＡ形質転換によるｙｑｈＤのための遺伝子操作されたプロモーターを有する大腸菌株の構築）
ｙｑｈＣ遺伝子を含む９６７ｂｐの上流ｙｑｈＤ配列をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび遺伝子操作されたプロモーターを含有するカセットで置き換えて、合成短１．６  ＧＩプロモーターによる天然ｙｑｈＤ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター置換を作り出した。ｐＫＤ３をテンプレートとして使用して、ＰＣＲ生成物をプライマーペア配列番号：４７および配列番号：４８で増幅した。プライマー配列番号：４７は上流ｙｑｈＤ配列に対して７８ｂｐの相同性、テンプレートｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を含有した。プライマー配列番号：４８は上流ｙｑｈＤ配列に４１ｂｐの相同性（１ｂｐの欠失あり）、短１．６  ＧＩプロモーター配列に４０ｂｐの相同性、そしてｐＫＤ３に１９ｂｐの相同性を組み込んだ。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を１２．５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール添加ＬＢプレート上で選択し、ＭＧ１６５５  １．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍを得た。成功したカセット組み込みは、ｙｑｈＤ  ＡＴＧ  ｓｔａｒｔの上流５０〜１０１６ｂｐ領域［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴ−短１．６  ＧＩプロモーターカセットで置き換える。プライマー配列番号：４９による配列決定で上流ｙｑｈＤ領域への組み込みが確認され、プロモーター置換が効率的に起きたことが示された。Ｐ１ファージ溶菌液を調製し使用して、変異をに菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲに移した。抗生物質を（上述のように）除去した後、菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤが得られた。
【０２３８】
（実施例１３Ａ）
（大腸菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０９を使用したグルコースから１，３−プロパンジオールへの発酵）
菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤをｐＳＹＣＯ１０９で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０９による１，３−プロパンジオールの生産を１４Ｌ発酵槽内で判定した。Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０９の新鮮なプレート（５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加ＬＡ）からの単一コロニーを２５０ｍＬフラスコ内の１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加３０ｍＬのＬＢ中に移して、前培養を調製した。３４℃および３００ｒｐｍでＯＤ５５０が１  ＡＵになるまで培養後、１０．８ｍＬの培養を発酵槽に移した。ビタミンＢ１２を１６ｍｇの大量瞬時添加で、発酵経過２０．６時間目に発酵槽に添加した。最終１，３−プロパンジオール濃度は１１３．３ｇ／Ｌであり、質量収率は４８．８％であった。
【０２３９】
（実施例１４）
（直鎖ＤＮＡ形質転換による酢酸キナーゼ（ａｃｋ）およびリン酸トランスアセチラーゼ（ｐｔａ）に欠失変異を有する大腸菌株の構築）
３．３ｋｂのコード領域をｐＫＤ３のＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットで置き換えて、ｐｔａ−ａｃｋＡ欠失［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を作り出した。ｐＫＤ３をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：５０および配列番号：５１で置換カセットを増幅した。プライマー配列番号：５０は、ｐｔａの５’末端に対する８０ｂｐの相同性、およびテンプレートＤＮＡ、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：５１は、ａｃｋＡの３’末端に対する８０ｂｐの相同性、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製して、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で選択し、菌株ＭＧ１６５５  ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍを得た。プライマーペア配列番号：５２および配列番号：５３を使用して、ＰＣＲによりｐｔａ−ａｃｋＡ遺伝子の欠失を確認した。野生型菌株は３．８ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を与えた。Ｐ１ファージ溶菌液を調製して使用し、変異を菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤに移し、菌株Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ  ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：Ｃｍを形成した。ＦＬＰリコンビナーゼを使用して、クロラムフェニコール耐性マーカーを除去し（非特許文献４２）、Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ  ΔａｃｋＡ−ｐｔａ（Ｔｒｉｐｌｅ  Ｔｒｉｐｌｅ（ＴＴ）と改名される）を得た。Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤおよびＴＴ菌株をプラスミドｐＳＹＣＯ１０９でエレクトロ形質転換した。
【０２４０】
（実施例１５）
（菌株ＴＲＩＰＬＥ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０９と比較した菌株ＴＲＩＰＬＥ  ＴＲＩＰＬＥ／ｐＳＹＣＯ１０９におけるリン酸トランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）酵素活性の測定）
一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、１４Ｌ発酵内でＴＴ／ｐＳＹＣＯ１０９およびＴｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０９による発酵を実施した。Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０６による典型発酵については、実施例１３Ａで述べた。
【０２４１】
２５０ｍＬフラスコ内の３０ｍＬのＬＢ中で１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンと共に、ＯＤ５５０がほぼ１  ＡＵになるまでＴＴ／ｐＳＹＣＯ１０９の前培養を培養した。既述のようにして調製したシード発酵槽を１０．８ｍＬの培養で接種した。３０．５時間の発酵時間後、１．２Ｌの培養を生産発酵槽に移した。ビタミンＢ１２を１回の１６ｍｇの大量瞬時添加で、発酵経過１時間目に発酵槽に添加した。典型的発酵における１，３−プロパンジオールの最終濃度は１１４ｇ／Ｌ、収率は４８％であった。
【０２４２】
典型的Ｔｒｉｐｌｅ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｇｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０９発酵からのサンプルをＰｔａ酵素活性について分析した。０．４Ｕ／ｍｇタンパクの特異的活性を得た。典型的ＴＴ／ｐＳＹＣＯ１０９発酵からアッセイしたサンプルは、検出可能なＰｔａ酵素活性を示さなかった。
【０２４３】
（実施例１６）
（ＴＲＩＰＬＥ  １．６ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ／ｐＳＹＣＯ１０９と比較した菌株ＴＴ／ｐＳＹＣＯ１０９におけるモル収率の改善された安定性）
二連のフラスコ振盪培養を菌株Ｔｒｉｐｌｅ  ｂｔｕＲ  １．６ｙｑｈＤ、ｐＳＹＣＯ１０９、およびＴＴ  ｐＳＹＣＯ１０９で培養した。ＬＢ＋５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン中で１個のコロニーを１０時間培養した後、１００ｍＬの培養を５０ｐｐｍのスペクチノマイシン有りまたは無しで、２％のグルコース添加３０ｍＬのＴＭ２培養液に移した（１日目）。収率の安定性を研究するために、５０ｐｐｍのスペクチノマイシン有りまたは無しで、２％のグルコースを含有する３０ｍＬ容積の新鮮なＴＭ２培養液に、１日目の培養の１００ｍＬ容量を２４時間後に移した。これを４回繰り返した。各２４時間の期間終了後に、モル収率を実施例２のように計算して、結果を下の表９に示す。ａｃｋＡ−ｐｔａ欠失がモル収率を安定化させることで、１，３−プロパンジオール生産が改善する。
【０２４４】
【表１６】
0004592418.tif 000017
【０２４５】
（実施例１７）
（直鎖ＤＮＡ形質転換によるアルデヒドデヒドロゲナーゼ中に欠失変異を有する大腸菌株の構築）
１．３ｋｂのコード領域をｐＫＤ３のＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットで置き換えて、ａｌｄＡ欠失［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を作り出した。ｐＫＤ３をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：５７および配列番号：５８で、カセットを増幅した。プライマー配列番号：５７は、ａｌｄＡの５’末端に対する８０ｂｐの相同性、テンプレートＤＮＡ、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を有する。プライマー配列番号：５８は、ａｌｄＡの３’末端に対する８０ｂｐの相同性、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール添加ＬＢプレート上で選択した。プライマーペア配列番号：５９および配列番号：６０を使用して、ＰＣＲによってａｌｄＡ遺伝子の欠失を確認した。野生型菌株は２．０ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な１．８ｋｂのＰＣＲ生成物を与える。その菌株のＰ１溶菌液を調製して使用し、変異を菌株ＴＴに移して、ＴＴ  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍ菌株を形成した。ＦＬＰリコンビナーゼ使用してクロラムフェニコール耐性マーカーを除去し（非特許文献４２）、ＴＴ  ａｌｄＡを作り出した。
【０２４６】
１．５ｋｂのコード領域をｐＫＤ３のＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットで置き換えて、ａｌｄＢ欠失［ＧｅｎＢａｎｋ目録番号Ｕ０００９６参照］を作り出した。ｐＫＤ３をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号：６１および配列番号：６２で置換カセットを増幅した。プライマー配列番号：６１はａｌｄＢの５’−末端に対する８０ｂｐの相同性、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。プライマー配列番号：６２は、ａｌｄＢの３’末端に対する８０ｂｐの相同性、ｐＫＤ３に対する２０ｂｐの相同性を含有する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール添加ＬＢプレート上で選択した。プライマーペア配列番号：６３および配列番号：６４を使用して、ＰＣＲによってａｌｄＢ遺伝子の欠失を確認した。野生型菌株は１．５ｋｂのＰＣＲ生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な１．１ｋｂのＰＣＲ生成物を与える。Ｐ１溶菌液を調製して使用し、変異をＴＴ菌株に移して、ＴＴ  ΔａｌｄＢ：：Ｃｍ菌株を形成した。プライマーペア配列番号：６３および配列番号：６４によりクロラムフェニコール抵抗性クローンをゲノムＰＣＲでチェックし、変異が存在することを確実にした。
【０２４７】
（実施例１７Ａ）
（菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐ／ｐＳＹＣＯ１０６によるグリセロールの生産）
菌株ＦＭＰ’１．５ｇａｐＡをプラスミドｐＳＹＣＯ１０６で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、１４Ｌ発酵槽内でグリセロールの生産を判定した。解凍したＦＭＰ’１．５ｇａｐ／ｐＳＹＣＯ１０６の凍結バイアルを５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加５００ｍＬのＳＢＧ１％に移して、前培養を調製した。ビタミンＢ１２を発酵槽に添加した。典型的発酵からはモル収率１１５％で、２０２ｇ／Ｌのグリセロールの生産がもたらされた。
【０２４８】
（実施例１７Ｂ）
（菌株ＴＴ／ｐＳＹＣＯ１０９によるグリセロール生産）
一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、１４Ｌ発酵槽中でグリセロール生産を判定した。５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン添加ＬＢプレート上のＴＴ／ｐＳＹＣＯ１０９の単一コロニーを２５０ｍＬフラスコ内の１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン添加３０ｍＬのＬＢに移した。ＯＤ５５０がほぼ１  ＡＵになったとき、１０．８ｍＬの培養を使用して上述のように調製した発酵槽を接種した。発酵槽にビタミンＢ１２は添加しなかった。典型的発酵からは、モル収率１３７％で３０２ｇ／Ｌのグリセロールの生産がもたらされた。
本発明は、特許請求の範囲に記載の発明を含め、以下の発明を包含する。
（１）  ａ）活性ＰＥＰ−グルコースリン酸転移酵素系タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系、
ｂ）活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードするアップレギュレートされた内在性ｇａｌＰ遺伝子、
ｃ）活性グルコキナーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｇｌｋ遺伝子、および
ｄ）活性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするダウンレギュレートされた内在性ｇａｐＡ遺伝子
を含むことを特徴とする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
（２）  前記撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系が、
ｉ）活性ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ｐｔｓＨ遺伝子、
ｉｉ）活性ホスホエノールピルベート−タンパクリン酸転移酵素の発現を妨げる撹乱された内在性ｐｔｓＩ遺伝子、および
ｉｉｉ）活性グルコース−特異的ＩＩＡ構成要素の発現を妨げる撹乱された内在性ｃｒｒ遺伝子
の１つまたは複数を含むことを特徴とする（１）に記載の大腸菌株。
（３）  ｅ）活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ａｒｃＡ遺伝子、
ｆ）活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｐｐｃ遺伝子、
ｇ）活性ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｂｔｕＲ遺伝子、および
ｈ）活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードするアップレギュレートされたｙｑｈＤ遺伝子
の１つまたは複数をさらに含むことを特徴とする（１）または（２）に記載の大腸菌株。
（４）  ｉ）活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｍｇｓＡ遺伝子、
ｊ）活性酢酸キナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ａｃｋＡ遺伝子、
ｋ）活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｐｔａ遺伝子、
ｌ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＡの発現を妨げる撹乱された内在性ａｌｄＡ遺伝子、および
ｍ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＢの発現を妨げる撹乱された内在性ａｌｄＢ遺伝子
の１つまたは複数をさらに含むことを特徴とする（１）、（２）、または（３）に記載の大腸菌株。
（５）  ｎ）活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｅｄｄ遺伝子、
ｏ）活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｇｌｐＫ遺伝子、および
ｐ）活性ＮＡＤＨ−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｇｌｄＡ遺伝子
の１つまたは複数をさらに含むことを特徴とする（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の大腸菌株。
（６）  適切な条件下で、（１）、（２）、（３）、（４）または（５）に記載の大腸菌株を適切な炭素基材と接触させるステップを含むことを特徴とする１，３−プロパンジオールの生物生産方法。
（７）  前記大腸菌株が
（ｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、
（ｉｉ）グリセロール−３−ホスファターゼ、
（ｉｉｉ）デヒドラターゼ、および
（ｉｖ）デヒドラターゼ再活性化因子
をさらに含むことを特徴とする（６）に記載の方法。
（８）  ａ）活性ＰＥＰ−グルコースリン酸転移酵素系タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系、
ｂ）活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードするアップレギュレートされた内在性ｇａｌＰ遺伝子、
ｃ）活性グルコキナーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｇｌｋ遺伝子、
ｄ）活性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするダウンレギュレートされた内在性ｇａｐＡ遺伝子、
ｅ）活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ａｒｃＡ遺伝子、
ｆ）活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｐｐｃ遺伝子、
ｇ）活性ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ｂｔｕＲ遺伝子、
ｈ）活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードするアップレギュレートされたｙｑｈＤ遺伝子、
ｉ）活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｍｇｓＡ遺伝子、
ｊ）活性酢酸キナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ａｃｋＡ遺伝子、
ｋ）活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｐｔａ遺伝子、
ｌ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＡの発現を妨げる撹乱された内在性ａｌｄＡ遺伝子、
ｍ）活性アルデヒドデヒドロゲナーゼＢの発現を妨げる撹乱された内在性ａｌｄＢ遺伝子、
ｎ）活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｅｄｄ遺伝子、
ｏ）活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｇｌｐＫ遺伝子、
ｐ）活性ＮＡＤＨ−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ｇｌｄＡ遺伝子、および
ｑ）ｐＳＹＣＯコンストラクト配列番号：６５、６６、６７、または６８のヌクレオチド配列のいずれか１つ
を含むことを特徴とする大腸菌株。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】本質的に一般方法で述べたような２つの発酵操作間で比較した１，３−プロパンジオール生産を示す。一例では使用菌株はＦＭＰ’：：Ｋｍ／ｐＳＹＣＯ１０３であった。もう一例では使用菌株はＦＭＰ／ｐＳＹＣＯ１０３であった。
【図１】
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【配列表】
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