(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不純物を含むＬ−カルノシンの粗体を精製する精製工程を含むＬ−カルノシンの製造方法であって、前記精製工程が、前記粗体の水溶液とアルコールとを混合して得られた混合溶液にＬ−カルノシンの種結晶を添加し、３０℃〜８０℃で１〜１０時間熟成させる熟成工程と、前記工程で熟成された混合溶液にアルコールを加え、高純度化されたＬ−カルノシン結晶を析出させる結晶析出工程とを、含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記熟成工程の前工程として不純物を含むＬ−カルノシンの粗体の水溶液を活性炭処理する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フタロイル−β―アラニンの酸クロライドとトリメチルシリル基で保護されたL−ヒスチジンとを反応させて得たフタロイル−L−カルノシンをヒドラジンで脱保護することにより不純物を含むL−カルノシンの粗体を得る工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不純物を含むＬ−カルノシンの粗体を精製することにより高純度Ｌ−カルノシンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルノシンはβ−アラニンとＬ−ヒスチジンから合成されるジペプチドであり、組織修復促進作用、免疫調整作用、抗炎症作用を有していることから、医薬品や健康食品などの需要が高まっている。また、容易に金属とキレート結合をつくることから、亜鉛と錯形成したポラプレジンクなどの抗潰瘍薬、味覚障害治療薬へ応用されている。これら医薬品に使用されるＬ−カルノシンは高純度のものでなければならず、一般的には９９．５％以上の純度が要求される。
【０００３】
前記したようにＬ−カルノシンは、β−アラニン又はその誘導体とＬ−ヒスチジン又はその誘導体とを原料として合成されるが、反応により得られるＬ−カルノシン粗体の精製には、一般に晶析が採用されている。（非特許文献１、２、及び３参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ３８  （１１）  ｐ３１４０−３１４６  （１９９０）
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８ｐ３９３−３９５  （１９８３）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （７５）  ｐ２５１１−２５１２  （１９５３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般に、Ｌ−カルノシンの粗体に含まれる不純物は、極性などＬ−カルノシンと非常に似ている挙動を示すため、精製が困難である。このため、十分な純度まで精製を行うと収率が低くなってしまうという問題があった。例えば前記非特許文献３では、水とエタノールの混合溶液により再結晶をし、精製されたＬ−カルノシンの結晶を析出させているが、この時の収率は６５％と低い。
【０００６】
そこで、本発明は、高純度のＬ−カルノシンを効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するものであり、不純物を含むＬ−カルノシンの粗体を精製する精製工程を含むＬ−カルノシンの製造方法であって、前記精製工程が、前記粗体の水溶液とアルコールとを混合して得られた混合溶液にＬ−カルノシンの種結晶を添加し、３０℃〜８０℃で１〜１０時間熟成（ripening）させる熟成工程と、前記工程で熟成された混合溶液にアルコールを加え、高純度化されたＬ−カルノシン結晶を析出させる結晶析出工程とを、含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法によれば、Ｌ−カルノシンを高純度、高収率で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の製造方法は、不純物を含むＬ−カルノシンの粗体を精製する精製工程を含む。該精製工程の原料となる粗体としては、従来の製法、即ち、β−アラニン又はその誘導体とＬ−ヒスチジン又はその誘導体とを原料として合成された粗体が特に制限無く使用できる。しかしながら、ヒスチジンからの収率が例えば９０％と非常に高く、しかも粗体自体の純度（ここで、純度とは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った時に得られるチャートにおけるピーク面積を基準とする純度を意味する。以下同じ。）が９８％以上と高いことから、フタロイル−β―アラニンの酸クロライドとトリメチルシリル基で保護されたL−ヒスチジンとを反応させて得たフタロイル−L−カルノシンをヒドラジンで脱保護する方法より得られた粗体を使用するのが好適である。該方法については、例えばＤｏｋｌａｄｉ  ｎａ  Ｂｕｌｇａｒｓｋａｔａ  Ａｋａｄｅｍｉｙａ  ｎａ  Ｎａｕｋｉｔｅ  ４４  （８）  ｐ５３−５６  （１９９１）に記載されているが、その概要を以下に説明する。
【００１０】
上記粗体の製造方法で使用されるフタロイル−β−アラニンは、試薬或いは工業原料を使用することもできるが、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （７５）  ｐ２３８８−２３９０  （１９５３）に記載されているように無水フタル酸とβ−アラニンを高温下反応させる事で得ることも可能である。
【００１１】
フタロイル−β−アラニンの酸クロライド化は、二塩化オキサリルもしくは塩化チオニルと反応させる事で得られる。この場合、トルエンやジクロロメタンなどの溶媒下、フタロイル−β−アラニンに対して1〜３０当量の二塩化オキサリルもしくは塩化チオニルを滴下し、溶媒還流下で行ってもよいし、無溶媒下で２０〜１００℃で反応を行っても良い。反応後は残留する二塩化オキサリルなどを溶媒留去することでフタロイル−β−アラニンの酸クロライドが得られる。
【００１２】
また、前記方法で使用されるトリメチルシリル基で保護されたL−ヒスチジンは、次のように合成される。即ち、硫酸触媒下、３〜１０当量の１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン中で還流下反応させ、ｐH調節後、キシレンなどの溶媒を加え、溶媒留去し、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化溶媒で再結晶によりトリメチルシリル基で保護されたL−ヒスチジンを得る。
【００１３】
前記粗体の製造方法では、上記のようにして得られたフタロイル−β−アラニンの酸クロライドとトリメチルシリル基で保護されたL−ヒスチジンとを、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化溶媒下混合し、室温で反応させることにより、フタロイル−L−カルノシン塩酸塩を得る。そして、得られたフタロイル−L−カルノシン塩酸塩をアルコール中で、水酸化リチウム1水和物などのアルカリで中和しすることにより、フタロイル−L−カルノシンとし、これを水中でヒドラジン水和物により脱保護し、酢酸処理した後にｐH調節することにより、Ｌ−カルノシンの粗体を含む反応液を得ることができる。
【００１４】
このようにして得られた粗体を含む反応液（水溶液）はそのまま、或いは水を添加することにより濃度調整を行って精製工程に供することができるが、多量に含まれる副生物を除去するために精製工程に供する前に一旦単離するのがこのましい。例えば、前記した方法で得られる粗体の反応液（水溶液）には、フタルヒドラジド等のヒドラジン由来の副生成物が多く含まれるが、該反応液から水を留去した後、残渣をアルコールで再沈殿することにより、これらヒドラジン由来の副生成物が除去されたＬ−カルノシンの粗体を得ることができる。このようにして単離された粗体は通常、９５〜９８％程度の純度を有する。
【００１５】
本発明の製造方法においては、晶析による精製工程を行う前に粗体の純度はできるだけ高くしておくことが好ましい。また、上記のような反応により得られる粗体には、晶析による除去が困難な着色成分を含まれることがあるので、晶析による精製を行う前に活性炭処理によりこのような着色成分を除去するのが好ましい。活性炭処理は、Ｌカルノシンの粗体の水溶液を活性炭と接触させた後に、活性炭を除去することにより行うことができる。
【００１６】
このとき活性炭としては、試薬として或いは工業的に入手可能なものが特に制限なく使用できる。好適に使用できる活性炭を具体的に例示すれば、次のようなもの挙げることができる。
【００１７】
日本ノーリット社のＰＫ、ＰＫＤＡ  ＭＥＳＹ／ＭＲＸ、ＥＬＯＲＩＴ、ＡＺ０、ＤＡＲＣＯ、ＨＹＤＲＯＤＡＲＣＯ  ３０００／４０００、ＤＡＲＣＯ  １２Ｘ２０ＬＩ、ＤＡＲＣＯ１２Ｘ２０ＤＣ、ＰＥＴＲＯＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＭＲＸ、ＧＡＣ、ＧＡＣ  ＰＬＵＳ、ＤＡＲＣＯ  ＶＡＰＵＲＥ、ＧＣＮ、Ｃ−ＧＲＡＮＵＬＡＲ等の破砕活性炭類、ＣＡ、ＣＮ、ＣＧ、ＤＡＲＣＯ  ＫＢ／ＫＢＢ、Ｓ−５１、Ｓ−５１−ＨＦ、Ｓ−５１−ＦＦ、ＰＲＥＭＩＵＭ  ＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＧＦＰ、ＨＤＣ／ＨＤＲ／ＨＤＨ、ＧＲＯ  ＳＡＦＥ、ＦＭ−１、ＤＡＲＣＯ  ＴＲＳ、ＤＡＲＣＯ  ＦＧＤ、ＳＸ、ＳＸ  ＵＬＴＲＡ、ＳＡ、Ｄ−１０、ＰＮ、ＺＮ、ＳＡ−ＳＷ、Ｗ、ＧＬ、ＨＢ  ＰＬＵＳ等の粉末活性炭類、ＲＯＷ、ＲＯ、ＲＯＸ、ＲＢ、Ｒ、Ｒ．ＥＸＴＲＡ、ＳＯＲＢＯＮＯＲＩＴ、ＧＦ  ４０／５０、ＣＮＲ、ＲＯＺ、ＲＢＡＡ、ＲＢＨＧ、ＲＺＮ、ＲＧＭ等の成型活性炭・添着活性炭類、ＰＩＣＡ社の粒状活性炭類、球状活性炭類、粉末活性炭類、日本エンバイロケミカル社のモルシーボン、ＷＨＡ、粒状白鷺（Ｘ２Ｍ、ＧＭ２Ｘ、ＧＨ２Ｘ、ＧＨＸＵＧ、ＧＳ１Ｘ、ＧＳ３Ｘ、ＧＴＸ、ＧＴＳＸ、Ｇ２Ｘ、ＧＳ２Ｘ、ＧＡＡＸ、ＭＡＣ−Ｗ、ＧＯＣ、ＧＯＸ、ＧＯＨＸ、ＡＰＲＣ、ＴＡＣ、ＭＡＣ、ＸＲＣ、ＮＣＣ、ＳＲＣＸ）等の機能性活性炭類、粒状白鷺（Ｇ２Ｃ、Ｃ２Ｃ、ＷＨ２Ｃ、Ｗ２Ｃ、ＷＨ５Ｃ、Ｗ５Ｃ、ＬＧＫ−４００、ＬＧＫ−１００、ＬＨ２Ｃ、ＫＬ、Ｇ２Ｘ、ＧＨ２Ｘ、ＷＨ２Ｘ、Ｓ２Ｘ、Ｃ２Ｘ、Ｘ７０００Ｈ、Ｘ７１００Ｈ、Ｘ７００Ｈ−３、Ｘ７１００Ｈ−３、ＬＧＫ−７００、ＤＸ７−３）、Ｘ−７０００、Ｘ−７１００、Ｘ−７０００−３、Ｘ−７１００−３、等の粒状活性炭類、白鷺（Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＰＨＣ、ＦＡＣ−１０）、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、精製白鷺２、特製白鷺、白鷺ＤＯ−２、白鷺ＤＯ−５、白鷺ＤＯ−１１等の粉末活性炭類、ハニカムカーボ白鷺、モールドカーボン、カーボンペーパー、白鷺Ｃ−ＤＣ、カルボラフィンＤＣ、粒状白鷺ＤＣ、アルデナイト、アルデナイトＳＰ等の活性炭加工品類二村化学工業社のＳＧ、ＳＧＰ等の顆粒活性炭類、ＴＡ、ＴＳ、ＴＧ、ＴＭ等の造粒活性炭類、Ｓ、ＦＣ、ＳＡ１０００、Ｋ、Ａ、ＫＡ、ＡＣ、Ｍ、Ｐ、ＩＣ、ＩＰ、ＣＢ、ＧＢ、ＧＬＰ、ＣＬＰ、Ｗ等の粉末活性炭類、ＣＧ４８Ｂ、ＣＧ４８ＢＲ、ＣＷ１３０Ｂ、ＣＷ１３０Ａ、ＣＷ１３０ＢＲ、ＣＷ１３０ＡＲ、ＣＷ４８０ＳＺ、ＣＷ６１００ＳＺ、ＧＬ１３０Ａ、ＧＬ２４０Ａ、ＧＭ１３０Ａ、ＧＭ２４０Ａ、ＧＭＣ等の破砕活性炭類。
【００１８】
これらの中でも、ＣＡ、ＣＮ、ＣＧ、ＤＡＲＣＯ  ＫＢ／ＫＢＢ、Ｓ−５１、Ｓ−５１−ＨＦ、Ｓ−５１−ＦＦ、ＰＲＥＭＩＵＭ  ＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＧＦＰ、ＨＤＣ／ＨＤＲ／ＨＤＨ、ＧＲＯ  ＳＡＦＥ、ＦＭ−１、ＤＡＲＣＯ  ＴＲＳ、ＤＡＲＣＯ  ＦＧＤ、ＳＸ、ＳＸ  ＵＬＴＲＡ、ＳＡ、Ｄ−１０、ＰＮ、ＺＮ、ＳＡ−ＳＷ、Ｗ、ＧＬ、ＨＢ  ＰＬＵＳや白鷺（Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＰＨＣ、ＦＡＣ−１０）、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、精製白鷺２、特製白鷺、白鷺ＤＯ−２、白鷺ＤＯ−５、白鷺ＤＯ−１１等の粉末活性炭類が好適であり、特に白鷺（Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｐ）、精製白鷺、精製白鷺２、特製白鷺、ＣＡ、ＣＮ、ＣＧが好適である。
【００１９】
これら活性炭の使用量は、着色成分の除去性及び経済性の観点から、Ｌ−カルノシンの質量に対して０．０１〜１０倍、好ましくは０．０２〜５倍の質量とするのが好適である。
【００２０】
粗体水溶液と活性炭との接触は流通法又はバッチ法で行うことができる。流通法では活性炭を充填した塔又はカラムに粗体水溶液を流通させればよい。また、バッチ法では、容器内で活性炭と粗体水溶液を混合すればよい。
【００２１】
活性炭処理温度は、低温度ほど活性炭効果が出やすく好ましいが、Ｌ−カルノシンが結晶化してしまう恐れがあるため、通常−５℃〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲で行われる。活性炭処理時間は、あまり短いと充分な効果が得られず、あまり長くても、分解などにより不純物が増加する場合もあるため、通常０．１時間〜１０時間、好ましくは０．５〜８時間の範囲で行われる。また、バッチ法を採用した場合における活性炭処理後の活性炭の分離は、濾過により行うことができる。
【００２２】
このような活性炭処理を行うことにより着色成分が除去されたＬ−カルノシン粗体（通常、純度９７〜９９％）を得ることができる。
【００２３】
本発明の製造方法は、必要に応じて活性炭処理を施したＬ−カルノシン粗体を下記（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含んでなる精製工程で精製する。
【００２４】
（Ａ）  Ｌ−カルノシン粗体の水溶液とアルコールとを混合して得られた混合溶液にＬ−カルノシンの種結晶を添加し、３０℃〜８０℃で１〜１０時間熟成させる熟成工程、及び
（Ｂ）前記工程で熟成された混合溶液にアルコールを加え、高純度化されたＬ−カルノシン結晶を析出させる結晶析出工程。
【００２５】
粗体の水溶液に単にアルコールを添加してＬ−カルノシンの結晶を析出させた場合、或いは種結晶を加えて熟成を行う場合でも熟成条件が本発明で規定する条件から外れる場合には、９９．５％以上の純度のＬ−カルノシンを高収率で得ることが困難である。また、種結晶を加えて熟成を行ってもそのまま冷却して結晶を析出させた場合には、収率が低下する。
【００２６】
前記工程（Ａ）で使用するＬ−カルノシン粗体の水溶液におけるＬ−カルノシンの濃度は、高純度、高収率で精製できるという理由から、水溶液全体の質量を基準として５〜３０質量％、特に１０〜２０質量％とするのが好ましい。
【００２７】
（Ａ）工程において上記水溶液と混合されるアルコールとして、高純度で精製できるという理由から、炭素数１〜４の直鎖アルコールを使用するのが好ましい。好適に使用できるアルコールを具体的に例示すると、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールが挙げられる。
【００２８】
工程（Ａ）において混合溶液を調製する際の水とアルコールの混合溶液の比率は、不純物除去性と収率のバランスから水：アルコールの比率が１：０．５〜１：１０、特に１：１〜１：５となるようにするのが好ましい。粗体水溶液とアルコールとを混合する際に別途水を供給し濃度調節を行うことも可能である。不純物除去性、結晶の取り出し易さ、収率、及び一バッチあたりの収量の観点から、混合液中の含まれるＬ−カルノシンの濃度は、溶液全体の質量を基準として１〜１５質量％、特に５〜１０質量％とするのが好ましい。
【００２９】
混合溶液の調製は、Ｌ−カルノシン粗体の水溶液にアルコールを滴下するのが好ましい。アルコールにＬ−カルノシン粗体水溶液を滴下すると、滴下直後に結晶が析出することがあり高純度化が図れないことがある。アルコールを滴下するときの液温は、０〜１００℃、特に５〜８０℃に保つのが好適である。液温があまり低いと結晶化が促進され、アルコール滴下時に結晶化が起こり、不均一な純度を持ったＬ−カルノシンが形成される可能性があり、あまり高いと溶媒が蒸発してしまい、水とアルコールの比率が変化し、純度が低下することがある。
【００３０】
工程（Ａ）においては、混合溶液を調製した後に種結晶を添加し、３０〜８０℃で１〜１０時間熟成する必要がある。こうすることにより、より高純度なＬ−カルノシンを得ることが可能となる。種結晶の添加量は、あまり少ないと二次核が発生し、均一な結晶を得ることができず、あまり多くても経済的ではないため、通常、Ｌ−カルノシンの質量を基準として通常、０．００１〜０．５倍、好ましくは０．００５〜０．３倍の質量の種結晶を添加する。種結晶添加後の熟成温度は、３０〜８０℃であればよいが、さらに高純度で精製できるという理由から４０〜７０℃とするのが好ましい。温度や水とアルコールの比率、溶媒量にもよるが、熟成時間は１〜１０時間程度で十分である。
【００３１】
工程（Ｂ）では、このようにして熟成した混合溶液にアルコールを加え、高純度化されたＬ−カルノシン結晶を析出させる。アルコールを添加せずに結晶を析出させた場合には収率を高くすることができない。このとき添加するアルコールとしては混合溶液調製時に使用したのと同種のアルコールを使用するのが好ましい。添加するアルコールの量は、純度、収率、経済性、及び一バッチあたりの収量の観点から、含有するＬ−カルノシンの質量に対して０．５〜１５倍、特に１〜１０倍の質量とするのが好ましい。
【００３２】
（Ｂ）工程では、収率を高くするため、アルコールを滴下後、溶液を冷却するのが好ましい。このとき、純度及び生成効率の観点から冷却速度は、０．０１℃／分〜５℃／分、特に０．０５℃／分〜２℃／分とするのが好ましい。冷却による最終到達温度は、−１０〜３０℃、特に０〜２５℃とするのが好ましく、最終到達温度で１〜２時間保持することにより高純度のＬ−カルノシンを高収率で回収することができる。
【００３３】
このようにして析出したＬ−カルノシンの結晶は、ろ過や遠心分離などにより固液分離し、自然乾燥、送風乾燥、真空乾燥などにより乾燥することにより単離される。
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何等制限されることはない。
【００３５】
製造例１
攪拌羽、温度計、ガス吸収装置を備えた１，０００ｍｌ四つ口フラスコにフタロイル−β−アラニン１０７ｇ（０．４８８ｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ‘−ジメチルホルムアミド１０ｍｌ存在下、二塩化オキサリル６００ｍｌを加え、室温で２時間攪拌後、二塩化オキサリルを真空留去し、黄色結晶を得た（１）。別の１，０００ｍｌ四つ口フラスコにＬ−ヒスチジン６２．０８ｇ（０．４０ｍｏｌ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン２５６ｍｌ（１．２ｍｏｌ）、濃硫酸０．１ｍｌ加え、還流下３０分間攪拌した。冷却後、キシレン１５０ｍｌ加え、７５℃で溶媒留去し、残渣をクロロホルム８０ｍｌで再結晶した（２）。１をクロロホルム４００ｍｌに溶解し、（２）に滴下し、室温で８時間攪拌した。攪拌後エタノール４００ｍｌ加え３０分攪拌後、結晶をろ過し１５４ｇのフタロイル−Ｌ−カルノシン塩酸塩を得た。
【００３６】
１，０００ｍｌ四つ口フラスコにメタノール８００ｍｌ、水酸化リチウム１水和物１７．１ｇとフタロイル−Ｌ−カルノシン塩酸塩１５４ｇを加え、室温で３０分間攪拌し、還流下１５分間攪拌した。冷後、結晶をろ過し、乾燥した結果、フタロイル−Ｌ−カルノシン１３８ｇ得た。
【００３７】
１，０００ｍｌ四つ口フラスコにフタロイル−Ｌ−カルノシン１３８ｇ、ヒドラジン水和物２３ｍｌ（０．４６ｍｏｌ）、水４６０ｍｌ投入し、還流下１時間攪拌した。その後、酢酸３１ｍｌを滴下し１０分間攪拌し、冷却した。得られた固体をろ過で除去し、ｐHを調節後、エタノールにより再沈殿し、さらに水を加えて黄色味を帯びたＬ−カルノシン粗体水溶液（Ｌ−カルノシン８１．２ｇ／水４０６ｇ）を得た。なお、Ｌ−カルノシンのＨＰＬＣ純度は９７．９％であった。
【００３８】
実施例１
攪拌羽と温度計を備えた１，０００ｍｌ四つ口フラスコに製造例１で得たＬ−カルノシン粗体水溶液を、５℃に冷却後、日本エンバイロケミカル社製活性炭白鷺Ａを８．１ｇ加え、２時間攪拌した。攪拌後活性炭をろ過し、活性炭を２０ｍｌの水で洗浄し、無色澄明水溶液を得た。該水溶液に含まれるＬ−カルノシンのＨＰＬＣ純度は９９．０％であった。
【００３９】
攪拌羽と温度計を備えた２，０００ｍｌ四つ口フラスコに活性炭処理後のＬ−カルノシン粗体水溶液５０５ｇを加え、５０℃に昇温し、メタノール７３０ｍｌを３０分間かけて滴下した。次いで混合溶液に種結晶を１．４ｇ添加し、５０℃で２時間熟成した。結晶が充分成長している事を確認してから新たにメタノール４０６ｍｌを３０分かけて滴下し、０．４℃／分のスピードで５℃まで冷却し、５℃で１時間保持した。その後、析出したＬ−カルノシンの結晶をろ過し、真空乾燥を行った結果、７３．６ｇ（精製収率９０．７％）、HPLC純度９９．８７％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００４０】
実施例２
製造例１と同様の方法で得たＬ−カルノシン水溶液使用し、活性炭に日本ノーリット社製ＣＡを８．１ｇ使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、７３．２ｇ（精製収率９０．１％）、HPLC純度９９．８５％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００４１】
実施例３
製造例１と同様の方法で得たＬ−カルノシン水溶液使用し、アルコールにエタノールを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、７３．２ｇ（精製収率９０．２％）、HPLC純度９９．８０％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００４２】
実施例４
製造例１と同様の方法で得たＬ−カルノシン水溶液使用し、アルコールにイソプロパノールを使用した以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、７３．３ｇ（精製収率９０．３％）、HPLC純度９９．８６％の白色Ｌ−カルノシンが得られた。
【００４３】
比較例１
製造例１と同様の方法で得たＬ−カルノシン水溶液使用し、熟成温度を２０℃で行った以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、７３．２ｇ（精製収率９０．２％）、HPLC純度９９．１３％のＬ−カルノシンが得られ、あまり精製されなかった。
【００４４】
比較例２
製造例１と同様の方法で得たＬ−カルノシン水溶液使用し、熟成を行わずに種結晶を加えてから直ちにメタノールに滴下して結晶を析出させた他は実施例１と同様の操作を行った。その結果、７３．３ｇ（精製収率９０．３％）、HPLC純度９９．０％のＬ−カルノシンが得られ、ほとんど精製されなかった。
【００４５】
比較例３
製造例１と同様の方法で得たＬ−カルノシン水溶液使用し、熟成後にメタノールを加えなかった以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、６２．８ｇ（精製収率７７．３％）、HPLC純度９９．９１％の白色Ｌ−カルノシンが得られ、収率が低下した。