(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】
下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【請求項４】
前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項３に記載の組み換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項６】
前記細胞は、エシェリヒア・コリに由来することを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項５または６に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項８】
下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項９】
請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造するＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列
(b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項１２】
下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【請求項１４】
前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項１３に記載の組み換えＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項１６】
前記細胞は、エシェリヒア・コリに由来することを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１８】
下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項１９】
請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−カルバミルアミノ酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質および５置換ヒダントインを加水分解する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２１】
請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する第１のタンパク質製造工程と、
請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造する第２のタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質および前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、Ｄ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２２】
請求項９に記載のＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２３】
請求項１０、１９、２０または２１に記載のＤ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄ−アミノ酸の製造に好適に利用できるＤ−ヒダントインハイドロラーゼ（Ｄ−ヒダントイナーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼ（Ｄ−カルバミラーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、該遺伝子を含む組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、およびＤ−アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素を用いたアミノ酸製法の一つとして、化学的に安価に合成される５置換ヒダントイン化合物を出発物質として、これを光学活性なアミノ酸に不斉分解する方法が知られている。この５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物などの製造に重要な方法である。
【０００３】
この５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法では、以下の▲１▼、▲２▼の酵素が必要である。
▲１▼５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素：ヒダントインハイドロラーゼ（ヒダントイナーゼ）。
▲２▼生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素：Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ（カルバミラーゼ）。
【０００４】
ここで、５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、上記▲１▼ヒダントイナーゼおよび▲２▼カルバミラーゼのうち、少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。
【０００５】
このうち、Ｄ−アミノ酸生産菌または当該菌が産生する酵素含有物を用いて５置換ヒダントイン化合物からＤ−アミノ酸を製造する方法として、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌を用いる方法（特公昭５６−００３０３４号公報）、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌を用いる方法（特開平０３−０１９６９６号公報）などが知られている。これらのＤ−アミノ酸生産菌では、一般的に、そのヒダントイナーゼ活性がＤ体の５置換ヒダントインに対して特異的であることが多く、ＤＬ−５置換ヒダントイン（ここでは５−ベンジルヒダントイン）を出発物質とした場合、下記反応式に示すように、Ｄ体のみが加水分解されてＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸となり、さらにＤ体のみに作用するＤ−カルバミラーゼによって加水分解されて、最終的にＤ体のアミノ酸（ここではＤ−フェニルアラニン）のみが得られる。
【０００６】
【化１】
0004561010.tif 000002
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、Ｄ−アミノ酸生産菌の培養菌体を用いて５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する場合には、反応に必要な酵素の生産量を増加させるため、ヒダントイン誘導体などの誘導物質を使用したり、培養菌体を大量に使用する必要があるなどの問題点がある。
【０００８】
また、光学活性アミノ酸を効率良く製造するためには、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離し、遺伝子増幅、転写および翻訳活性を高めることによってこの酵素の生産量を高めた組み換え体を用いることが好ましい。しかしながら、従来の方法では反応に多くの時間を要し、反応の中間体であるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が副生するなどの問題点があった。
【０００９】
本発明は上述の問題点を解決するために成されたものであり、５置換ヒダントイン化合物をＤ−アミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離して、そのアミノ酸配列やコードする遺伝子の塩基配列を解明するとともに、該酵素の生産量を高めた組み換え体を作製し、５置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を効率良く製造する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記問題に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは５置換ヒダントイン化合物をＤ−アミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下のとおりである。
【００１２】
（請求項１）  下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００１３】
（請求項２）  下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００１４】
（請求項３）  請求項１または２に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【００１５】
（請求項４）  前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項３に記載の組み換えＤＮＡ。
【００１６】
（請求項５）  請求項３または４に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００１７】
（請求項６）  前記細胞は、エシェリヒア・コリに由来することを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【００１８】
（請求項７）  請求項５または６に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【００１９】
（請求項８）  下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００２０】
（請求項９）  請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造するＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【００２１】
（請求項１０）  請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【００２２】
（請求項１１）  下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列
(b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００２３】
（請求項１２）  下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００２４】
（請求項１３）  請求項１１または１２に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【００２５】
（請求項１４）  前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項１３に記載の組み換えＤＮＡ。
【００２６】
（請求項１５）  請求項１３または１４に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００２７】
（請求項１６）  前記細胞は、エシェリヒア・コリに由来することを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
【００２８】
（請求項１７）  請求項１５または１６に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【００２９】
（請求項１８）  下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００３０】
（請求項１９）  請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−カルバミルアミノ酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【００３１】
（請求項２０）  請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質および５置換ヒダントインを加水分解する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【００３２】
（請求項２１）  請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する第１のタンパク質製造工程と、
請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造する第２のタンパク質製造工程と、
前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質および前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、Ｄ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【００３３】
（請求項２２）  請求項９に記載のＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【００３４】
（請求項２３）  請求項１０、１９、２０または２１に記載のＤ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、
[I]Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
[II]Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法
[III]Ｄ−アミノ酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
なお、本明細書においては、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をＤ−ヒダントイナーゼと呼ぶことがあり、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＤ−カルバミラーゼと呼ぶことがある。
【００３６】
[I]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡ
本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡは、特公昭５６−０１５８７８号に記載のパスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）の染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである。なお、パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）はモラキセラ  ノンリクエファシエンス(Moraxella nonliquefaciens)として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)に分類されることが判明した。現在では、パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）として経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００３７】
これらの微生物について、細菌の分類学書であるバージェーズ  マニュアル  オブ  デターミネイティブ  バクテリオロジー  第１巻（第９版  1994年、ウイリアム  アンド  ウイルキンス社出版）に照らしあわせて生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
【００３８】
パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１の再同定結果
0004561010.tif 000003
【００３９】
以上の菌学的性質より、ＡＪ１１２２１菌をパスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)と同定した。
【００４０】
本発明者らは、ＡＪ１１２２１菌の染色体ＤＮＡを用いて作製した遺伝子ライブラリーより、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離、取得することに成功した。これらの遺伝子は、染色体上で離れた位置に存在するものと考えられる。
【００４１】
なお、遺伝子の単離の際に用いたＰＣＲ法の操作については、White, T.J. et al., Trends Genet.５巻、１８５ページ、１９８９年などに記載されている。また、染色体ＤＮＡを調製する方法や、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press（１９８９年）などに記載されている。
【００４２】
さらに、単離されたＤ−ヒダントイナーゼ若しくはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc.（１９８５年）などに記載されている。また、Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。
【００４３】
なお、添付した本発明の配列表において、上記方法によって特定されたＡＪ１１２２１菌由来のＤ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡを配列番号１に示し、Ｄ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡを配列番号３に示す。
【００４４】
これらのＤＮＡは、いずれもＤ−アミノ酸の製造に係わるタンパク質をコードするものである。
【００４５】
また、配列表の配列番号２に、配列表の配列番号１の塩基配列がコードするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列表の配列番号４に、配列表の配列番号３の塩基配列がコードするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００４６】
配列表の配列番号２に記載のＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質、および、配列表の配列番号４に記載のＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質は、下記反応式に示すように、５−ベンジルヒダントインに代表される５置換ヒダントインから、Ｄ−フェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒する。
【００４７】
【化１】
0004561010.tif 000004
【００４８】
次に、本発明のＤ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡおよびＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡについて詳細に説明する。
【００４９】
(1)Ｄ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子は、前述したようにパスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子（ＷＯ９６／２０２７５号公報）と７７％（アミノ酸配列において７６％）の相同性を示す。
【００５０】
ここで、本発明のＤ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡだけではない。即ち、パスツレラ属に属する細菌の種や株ごとに塩基配列の違いが観察される。
【００５１】
なお、本発明のＤＮＡは単離されたＤ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、単離されたＤ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであっても、Ｄ−ヒダントイナーゼをコードする場合には本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method in Enzymol.１５４ページ、１９８７年などに記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００５２】
また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。また、「Ｄ−ヒダントイナーゼ活性」とは、５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによってＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する活性であればよい。
【００５３】
さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡがコードするＤ−ヒダントイナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。即ち、
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡである。
【００５４】
なお、上記（a）、（b）のアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、ＤＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。「Ｄ−ヒダントイナーゼ活性」とは、５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによってＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００５５】
(2)Ｄ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡ
次に、本発明のＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡについて説明する。
配列表の配列番号３の塩基配列を有する本発明のＤ−カルバミラーゼは、パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子（特許公報２９０２１１２号）と７８％（アミノ酸配列において８１％）の相同性を示し、既知のシュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子（特許公報２９０２１１２号）と６７％（アミノ酸配列において５９％）の相同性を示す。
【００５６】
なお、本発明のＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号３に示されるＤＮＡだけではない。即ち、パスツレラ属に属する細菌の種および株ごとに塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
【００５７】
また、単離されたＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであっても、Ｄ−カルバミラーゼをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method in Enzymol.１５４ページ、１９８７年などに記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００５８】
また、配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。また、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによってＤ−アミノ酸を生成する活性であればよい。
【００５９】
また、上記ＤＮＡがコードするＤ−カルバミラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。即ち、
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡである。
【００６０】
なお、上記（a）、（b）のアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、ＤＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによってＤ−アミノ酸を生成する活性であればいかなるものでもよい。ただし、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００６１】
[II]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼの製造方法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼを製造する方法について説明する。なお、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質などの有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００６２】
図２は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼの製造工程のフローチャートである。
まず、本発明のＤ−ヒダントイナーゼＤＮＡおよび／またはＤ−カルバミラーゼＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。
次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを生成蓄積させる(ステップＳ４)。
その後、ステップＳ５に進み、該酵素を回収・精製することによってＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを大量生産する。
また、ステップＳ５で生産した酵素またはステップＳ４の酵素が蓄積された培地を用いてアミノ酸を合成することで、目的とするアミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ６)。
【００６３】
なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡは、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼが発現可能であればよい。
【００６４】
ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子としては、上述の
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
などを使用できる。
【００６５】
また、ベクターＤＮＡと接続されるＤ−カルバミラーゼ遺伝子としては、
(a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
などを使用できる。
【００６６】
さらに、これらのＤＮＡの他、上記Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子とＤ−カルバミラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡなどを用いることもできる。この場合には、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび本発明のＤ−カルバミラーゼが同時に発現することになる。
【００６７】
ところで、組み換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることができる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。以下、形質転換された大腸菌を用いてＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを製造する方法を説明する。
【００６８】
Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモーターとしては、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーターなどの強力なプロモーターが挙げられる。
【００６９】
また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。
【００７０】
Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００７１】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）などのように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
【００７２】
プロモーター、Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子、ターミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得ることができる。
【００７３】
該組み換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換し、この細胞を培養すると、Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼが発現生産される。なお、形質転換を行う方法および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press （１９８９年)などに記載されている方法を適用することができる。
【００７４】
また、生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。さらに、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌などの種類に応じて適宜選択する。酵素生産量を高めるため、培地にイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加したり、温度上昇などの酵素誘導処理を行うことも好ましい。
【００７５】
培養菌体を遠心分離操作などにより回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵素液として使用することができる。菌体破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕などの方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、または、これらを適宜組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィーなどの手法により、これらの酵素を精製して用いることも可能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００７６】
上述の組み換え体を用いる方法によって得られる本発明のＤ−ヒダントイナーゼは、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質である。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００７７】
また、上述の組み換え体を用いる方法によって得られる本発明のＤ−カルバミラーゼは、下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質である。
(c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００７８】
なお、ここで、「数個」および「Ｄ−ヒダントイナーゼ活性」、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」の定義は、[I]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
【００７９】
[III]Ｄ−アミノ酸の製造方法
次に、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法について述べる。
【００８０】
本発明のＤ−アミノ酸の製造方法は、ヒダントイナーゼおよびカルバミラーゼのうち、少なくとも一方に本発明の酵素を用いるものであり、ヒダントイナーゼおよびカルバミラーゼの組み合わせとしては下記の３通りが考えられる。
(i)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ ＋カルバミラーゼ
(ii)ヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＤ−カルバミラーゼ
(iii)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＤ−カルバミラーゼ
【００８１】
(i)の場合、本発明のＤ−ヒダントイナーゼとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００８２】
また、このようなＤ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養することによって得られたＤ−ヒダントイナーゼを用いることもできる。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−ヒダントイナーゼを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からＤ−ヒダントイナーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。即ち、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有する画分であれば、全てを使用することが可能である。
【００８３】
本発明のＤ−ヒダントイナーゼの基質としては、当該酵素の基質特異性において加水分解できる５置換ヒダントイン化合物であればいかなるものも使用できる。例えば、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントインなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチルヒダントイン、５−（３,４−メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
【００８４】
本発明のＤ−ヒダントイナーゼと組み合わせて用いるカルバミラーゼとしては、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することによりＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素または当該酵素含有物であれば、特に限定なく公知のものを用いることができる。すなわち、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸のみに特異的に作用するカルバミラーゼ（Ｄ−カルバミラーゼ）であっても、光学選択性を有しないカルバミラーゼであってもよい。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げられる。
【００８５】
Ｄ−カルバミラーゼとしては、例えばシュードモナス（Pseudomonas）や、アグロバクテリウム（Agrobacterium）にその存在が知られている（特許２９０２１１２号公報）。
【００８６】
次に(ii)の場合について説明する。本発明のＤ−カルバミラーゼとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００８７】
また、このようなＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養することによって得られたＤ−カルバミラーゼを用いることもできる。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−カルバミラーゼを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。即ち、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有する画分であれば、全てを使用することが可能である。
【００８８】
また、本発明のＤ−カルバミラーゼの基質としては、当該酵素の基質特異性において加水分解できるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であればいかなるものも使用できる。即ち、上述した５置換ヒダントイン化合物より得られるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸以外のＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であっても基質として使用することができる。
【００８９】
さらに、本発明のＤ−カルバミラーゼと組み合わせて用いるヒダントイナーゼとしては、５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素または当該酵素含有物であれば、特に限定なく公知のものを用いることができる。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げられる。ただし、本発明のＤ−カルバミラーゼは、Ｄ体特異的であるので、光学特異性のないヒダントイナーゼまたはＤ体に特異的に作用するＤ−ヒダントイナーゼを用いる必要がある。光学特異性のないヒダントイナーゼは、例えばマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株にその存在が知られている（特願２００１−０６５８１４号）。
また、Ｄ体ヒダントイン化合物に特異的に作用するＤ−ヒダントイナーゼは、例えばアグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.）ＡＪ１１２２０株にその存在が知られている（特公昭５６−００３０３４号公報）。なお、マイクロバクテリウム  リクエファシエンスＡＪ３９１２株は、１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与された微生物である。また、アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.）ＡＪ１１２２０株（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）はシュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp.）として１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.）に分類されることが判明した。現在では、アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.）ＡＪ１１２２０（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）として独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００９０】
次に、(iii)の場合について説明する。(iii)では、(i)で説明した本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび(ii)で説明した本発明のＤ−カルバミラーゼを組み合わせて用いる。(i)〜(iii)のうち最も好ましい組み合わせは(iii)である。
【００９１】
ここで、反応工程としては、Ｄ−ヒダントイナーゼとＤ−カルバミラーゼの混合物を５置換ヒダントイン化合物に作用させてもよいし、Ｄ−ヒダントイナーゼを５置換ヒダントイン化合物に作用させた後、Ｄ−カルバミラーゼを作用させてもよい。反応工程の簡素化の観点からは前者の方法が好ましい。
【００９２】
なお、上記(i)〜(iii)の方法によってＤ−アミノ酸を製造する際に、Ｌ体のＮ−カルバミルアミノ酸やアミノ酸を製造することも可能である。例えば、本発明のＤ−ヒダントイナーゼを用いて、ＤＬ−５置換ヒダントインからＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造したあと、残存するＬ−５置換ヒダントインとＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸とを分離して、Ｌ−５置換ヒダントインを回収し、これを加水分解させることによりＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を、さらに加水分解反応を進行させることによりＬ−アミノ酸を製造できる。当該加水分解反応には、Ｌ体に作用する加水分解酵素を用いてもよいが、亜硝酸等による化学的な加水分解処理を施すことによっても、光学活性を維持したまま、高収率でＬ−アミノ酸を製造することが可能である。
【００９３】
また、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物をＤ−アミノ酸へと変換させる際には、５置換ヒダントイン化合物の自発的ラセミ化若しくは化学的なラセミ化若しくはヒダントインラセマーゼを用いるラセミ化反応などを組み合わせることにより、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物からモル収率５０％以上でＤ−アミノ酸を製造することが可能となる。
【００９４】
換言すれば、Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼの他、さらにヒダントインラセマーゼを用いることが好ましい。ヒダントインラセマーゼとしては、例えば、特願２００１−０６５８１５号に記載のマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来のヒダントインラセマーゼを好ましく用いることができる。この場合、下記反応式に示すように、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼが５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが可能となる。
【００９５】
【化２】
0004561010.tif 000005
【００９６】
なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例えば、上記混成タンパクにＤ−カルバミラーゼの阻害剤などを添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造できる。
【００９７】
本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、または、精製酵素を含む反応液を２５〜６０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
【００９８】
また、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ、形質転換された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日間培養することが好ましい。
【００９９】
培養液あるいは反応液中のＤ−アミノ酸の定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはMerck製のHPTLC CHIRなどを利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ダイセル化学工業製のCHIRALPAK WHなどの光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。
【０１００】
培養液あるいは反応液中に蓄積されたＤ−アミノ酸は、定法により培養液あるいは反応液中より採取することができる。例えば、濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、結晶化などの操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることができる。特に、高濃度の５置換ヒダントイン化合物からの変換を行った際には、培養液あるいは反応液を冷却し、ｐＨを調整するなどによってＤ−アミノ酸を容易に結晶として得ることができる。
【０１０１】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例における５置換ヒダントイン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用いた。分析条件は以下のとおりである。
カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ
移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4
カラム温度：５０℃
流速：１．５ ｍｌ/分
検出：ＵＶ210
【０１０２】
（実施例１）ＡＪ１１２２１菌由来のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子の単離
【０１０３】
１．菌体の取得
パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容の坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。
【０１０４】
２．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００×ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌの５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。
さらに、この懸濁液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行った。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ProteinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパクを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌの１０:１ ＴＥに溶解させた。
【０１０５】
３．遺伝子ライブラリーからのＤ−カルバミラーゼ遺伝子の単離
まず、パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡ２００μｇに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを１Ｕ添加し、３７℃にて１５分間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡからアガロース電気泳動にて３〜８ｋｂｐの断片を回収した。これをプラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ切断物とライゲーションさせ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。これをアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、アンピシリン０．０１％、寒天２％、ｐＨ７．０）にプレーティングした後、コロニーをＮ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源とする液体培地（グルコース０．２％、Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニン０．２％、Ｎａ2ＨＰＯ4  ０．６％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．３％、ＮａＣｌ  ０．０５％、ＭｇＳＯ4  ０．０１２％、ＣａＣｌ2  ０．１ｍＭ、アンピシリン０．０１％、チアミン０．０００１％、ｐＨ７．０）に植菌し、集積培養することによってＮ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源として生育可能な株を選抜した。こうして得られた形質転換体を単離し、アンピシリンとイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地にて培養後、遠心・集菌した菌体を０．５％のＮ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液に１％添加し、３７℃にて５時間反応させた。反応液を解析したところ、Ｄ−フェニルアラニンの生成が確認できたことから、この形質転換体が目的とする遺伝子を含むプラスミドを保持していると確認した。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＵＣ４１３−１と命名した。
【０１０６】
４．挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣ４１３−１の挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定し、配列表の配列番号５に示した。その結果、挿入断片の長さは約２．８ｋｂｐであり、約０．９ｋｂのＯＲＦ（ＯＲＦ１；塩基番号１１４１〜２０６４）を含むことが明らかとなった（図１）。
【０１０７】
５．ＯＲＦ１と既知配列との相同性
ＯＲＦ１について、既知配列との相同性検索を行ったところ、既知のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子と７８％（アミノ酸配列において８１％）、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子と６７％（アミノ酸配列において５９％）の相同性を示した。この結果より、ＯＲＦ１はＤ−カルバミラーゼ遺伝子を含んでいることが予想された。しかし、Ｄ−ヒダントイナーゼと相同性を示す配列は確認されなかった。Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号３に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示した。
【０１０８】
６．遺伝子ライブラリーからのＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子の単離
そこで、上記３において作製したパスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の遺伝子ライブラリーを用いて、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子の単離を行った。選抜の際には、形質転換体をアンピシリンを含むＬＢプレートにて生育させた後、ｐＨ指示薬を含む選抜プレート（Ｄ−５−ベンジルヒダントイン０．５％、クレゾールレッド０．００５％、ＭｎＣｌ2  １ｍＭ、寒天２％、ｐＨ８．５）に写し取り、Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンの生成に伴うｐＨ指示薬の変色が見られた株を選抜した。この形質転換体よりＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製し、ｐＵＣ４１３−２と命名した。
【０１０９】
７．挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣ４１３−２の挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定し、配列表の配列番号６に示した。その結果、挿入断片の長さは約２．３ｋｂｐであり、約１．４ｋｂのＯＲＦ（ＯＲＦ２；塩基番号１８４〜１５７２）を含むことが明らかとなった（図１）。
【０１１０】
６．ＯＲＦ２と既知配列との相同性
ＯＲＦ２について、既知配列との相同性検索を行ったところ、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子と７７％（アミノ酸配列において７６％）の相同性を示した。この結果より、ＯＲＦ２はＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含んでいることが予想された。Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示した。
【０１１１】
（実施例２）ＡＪ１１２２１株由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
【０１１２】
１．発現プラスミドの構築
両遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃを以下のようにして構築した。まず、パスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した。これらの断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラスミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃと命名した。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
２．Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼ活性測定
得られた発現株を実施例１と同様にして培養し、無細胞抽出液を調製してＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。ｐＵＣ４１３Ｈを用いて形質転換した株ではＤ−ヒダントイナーゼ活性が検出され、ｐＵＣ４１３Ｃを用いて形質転換した株にはＤ−カルバミラーゼ活性が検出されたことから、両遺伝子がパスツレラ  ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子であり、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で発現されていることを確認した。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
（実施例３）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いたＤ−フェニルアラニンの生産
実施例２と同様にして培養したＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃの洗浄菌体を調製し、１ｇ／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダントインを含む０．１ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させた。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルアラニンを定量した。
【０１１７】
その結果を表３に示した。この表に示されるように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、ベンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニルアラニンを生成させることができた。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
（実施例４）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いたＤ−アミノ酸の生産
実施例３と同様にして調製したＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃの洗浄菌体を、１ｇ／ｄｌの各種５置換ヒダントイン化合物を含む０．１ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させた。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより生成したＤ−アミノ酸を定量した。
【０１２０】
その結果を表４に示した。この表に示されるように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、各種５置換ヒダントイン化合物から効率良くＤ−アミノ酸を生成させることができた。
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
（実施例５）ヒダントインラセマーゼによるラセミ化との組み合わせによるＤ−フェニルアラニンの生産
特願２００１−０６５８１５号に記載のマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来のヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドｐＵＣＦＨＲを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄菌体を調製した。
また、実施例３と同様にしてＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｈ洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃ洗浄菌体を調製し、上記ヒダントインラセマーゼ発現株の洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベンジルヒダントインを含む０．１ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させた。反応２４、４８、７２時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルアラニンを定量した。
【０１２３】
その結果を表５に示した。この表に示されるように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、ＤＬ体のベンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニルアラニンを生成させることができた。
【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
（実施例６）実施例５と同様にして反応を行い、Ｄ−フェニルアラニンを含む反応液５００ｍｌを得た。この反応液を遠心分離（１０，０００ｇ×１０分）して菌体を分離し、遠心上清を減圧濃縮操作により２０ｍｌまで濃縮することによって、Ｄ−フェニルアラニンの結晶を析出させた。析出結晶は、濾紙を用いて濾過により回収し、粗結晶とした。粗結晶（２．４g）に水１０ｍｌ、濃硫酸１ｍｌを加えて溶解させ、これに１００mgの活性炭を加え、溶液の脱色を行わせた。次に、濾過により活性炭を除いた後、濾液に２８％アンモニア水を５ｍｌ加えてｐＨ３．５とし、Ｄ−フェニルアラニンを再結晶させた。その後、濾紙を用いて濾過により回収した析出結晶を乾燥させ、１．８ｇのＤ−フェニルアラニンを得た。ＨＰＬＣ分析に供したところ、物質純度９９%、光学純度は９９%e.e.以上であった。
【０１２６】
【発明の効果】
本発明によって、Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大量に発現させることが可能となった。この結果、このような形質転換体から該酵素を容易に調製することができるようになり、該形質転換体やその抽出液、精製酵素等を用いることによって医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に有用なＤ−アミノ酸を効率良く生産できるようになった。
【０１２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＪ１１２２１株のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子の配置を示す図である。
【図２】本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラーゼの製造工程を示すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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