(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロスタグランジンＦ２受容体の第２細胞外ループ由来のアミノ酸配列からなるプロスタグランジンＦ２受容体アンタゴニストであって、該アミノ酸配列は：ilghrdyk（ＰＣＰ−８；配列番号１）；wedrfyll（ＰＣＰ−１０；配列番号２）；YQDRFYLL（ＰＣＰ−１４；配列番号３）；ILGHRDYK（ＰＣＰ−１３；配列番号１）；ILAHRDYK（ＰＣＰ−１３．７；配列番号４）；ILaHRDYK（ＰＣＰ−１３．８；配列番号４）；ILGFRDYK（ＰＣＰ−１３．１１；配列番号５）；ILGHKDYK（ＰＣＰ−１３．１３；配列番号６）；ILGHRNYK（ＰＣＰ−１３．１４；配列番号７）；ILGHQDYK（ＰＣＰ−１３．１８；配列番号８）；ILGHRDY−アミド（ＰＣＰ−１３．２０；配列番号９）；ILGHRDYK−アミド（ＰＣＰ−１３．２１；配列番号１）；ILGWRDYK（ＰＣＰ−１３．２２；配列番号１０）；ILGXRDYK（ＰＣＰ−１３．２４；配列番号１１）、ここでXはシクロヘキシルアラニンである；SNVLCSIF（ＰＣＰ−１５；配列番号１２）（ここで、小文字はＬ−アミノ酸を、大文字はＤ−アミノ酸を示す）よりなる群から選択される１以上の配列からなる、前記アンタゴニスト。
【請求項２】
１または２アミノ酸残基が置換または欠失している配列番号１の配列からなるペプチドであって、そのペプチドは、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸を含み、かつプロスタグランジンＦ２受容体アンタゴニストである、前記ペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つの請求項１に記載のアンタゴニストを、医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む、胎児の早産を予防するための医薬組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの請求項１に記載のアンタゴニストを、医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む、月経困難症を予防および／または治療するための医薬組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの請求項１に記載のアンタゴニストを、医薬的に許容できるキャリヤーと共に含有する医薬組成物。
【請求項６】
プロスタグランジンＦ２α受容体の細胞外要素に結合しうるプロスタグランジンＦ２α受容体アンタゴニストとしての、請求項１に記載のアンタゴニストの活性を測定するための、下記の工程を含む方法：
ａ）該受容体を発現する細胞を培養し、または生理学的結果が該受容体に依存する動物組織をex vivoで同定し；
ｂ）それらの細胞または組織を、該受容体におけるアンタゴニスト活性について試験すべき１０−１０Ｍ〜１０−３Ｍの濃度のアンタゴニストと接触させ；そして
ｃ）細胞内カルシウムの増加、ホスホイノシチドの加水分解、細胞の増殖および／または分化、遺伝子発現の変化、ならびに平滑筋の収縮または弛緩よりなる群から選択される生理学的結果を生じる信号の伝達を変化させる応答を測定する。
【請求項７】
胎児の早産を予防する医薬の製造のための、療法有効量の請求項１に記載のアンタゴニストの使用。
【請求項８】
月経困難症を予防および／または治療する医薬の製造のための、療法有効量の請求項１に記載のアンタゴニストの使用。
【請求項９】
請求項２に記載のペプチドを、医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む、胎児の早産を予防するための医薬組成物。
【請求項１０】
請求項２に記載のペプチドを、医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む、月経困難症を予防および／または治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項２に記載のペプチドを、医薬的に許容できるキャリヤーと共に含有する医薬組成物。
【請求項１２】
胎児の早産を予防する医薬の製造のための、療法有効量の請求項２に記載のペプチドの使用。
【請求項１３】
月経困難症を予防および／または治療する医薬の製造のための、療法有効量の請求項２に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
（a）発明の分野：
本発明は、細胞の外側から天然リガンドのものと異なる様式でGタンパク質共役型受容体に結合するGタンパク質共役型受容体アゴニストまたはアンタゴニストの開発に関する。
【０００２】
（b）先行技術の説明：
プロスタグランジンは、プロスタグランジンシンセターゼによるアラキドン酸の酸素添加により誘導される。プロスタグランジンは下記のような多様な生理学的作用を仲介する：血管運動性、睡眠／覚醒サイクル、腸分泌、脂肪分解、糸球体濾過、マスト細胞脱顆粒、神経伝達、血小板凝集、黄体分解、子宮筋収縮および分娩、炎症および関節炎、動脈管開存、細胞の増殖および分化（Coleman，R．A．et  al．，1994，Pharmacol．Rev．，46：205−229；Goetzl，E．J．et  al．，1995，FASEB  J．，9：1051−10585）。プロスタノイドは、ロドプシン様の7回膜貫通ヘリックス受容体スーパーファミリーに属する異なる受容体に結合することによりそれらの作用を仲介する。これらの受容体はα、βおよびγサブユニットからなるヘテロ三量体Gタンパク質に結合し、これらは活性化されると細胞カルシウムの変化を引き起こし、ホスホイノシチド加水分解を開始させ、またはサイクリックアデノシン一リン酸の合成を促進もしくは抑制する（Strader，C．D．et  al．，1994，Ann．Rev．Biochem．，63：101−132）。
【０００３】
PGE2、PGI2、PGD2、PGF2αおよびTxA2に対する薬理学的に異なる5種類のプロスタノイド受容体ならびにそれらの多数のアイソフォームのうち、PGE2α受容体（FP受容体とも呼ばれる）は限られた組織分布を示し、主として黄体、子宮筋層、眼の小柱網に発現し、血管平滑筋にはより低度に発現する。分娩の開始は、PGF2αレベルの著しい上昇および子宮収縮の増大を特色とする。獣医産業において分娩を誘発するためにPGF2αが広く用いられていることは、PGF2αおよびその受容体が分娩に際してもつ主要な役割を示している。これは、FP受容体をもたないマウスは分娩を生じることができないという事実によって理解される（Sugimoto  et  al．，1997，Science，277：81−83）。早産および新生児関連合併症、たとえば脳性麻痺をもたらす脳室内出血、気管支肺異形成症および脳室周囲白質軟化症（periventricular  leukomalacia）の結果としてかかる経費の増加を考慮して、早産を停止させることによる妊娠延長が有効な予防療法である。早産予防のための短期療法として非ステロイド系抗炎症薬がかなり効果があるのは、プロスタグランジン、特にPGF2およびPGF2αの合成に対するそれらの阻害作用に基づく。しかし、PGF2αの阻害は、動脈管閉塞、腎不全および肺性高血圧症など、胎児に対する重大な合併症を伴う。
【０００４】
PGF2αは他のレベルで、閉経前の女性の5〜7％が罹患する症状である月経困難症において主要な役割をもつとされている。月経前にPGF2αレベルが上昇し、その結果生じる子宮筋痙縮が、この障害の病因の根底にある。長期療法に有効なFP受容体アンタゴニストがないことは早産および関連後遺症の予防の進歩を妨げており、そのようなアンタゴニストを設計することが本発明の課題である。
【０００５】
ヒトFP受容体は45kDaの膜統合糖タンパク質であり、359アミノ酸からなり、EP1受容体とはわずか47％の配列同一性をもち、他のプロスタノイド受容体との同一性はより低い（Abramovitz  et  al．，1994，J．Biol．Chem．，269：2632−2636）。EP受容体へのPGF2αの結合に伴って、Gαqβγ複合体の活性化、GαqサブユニットによるGTP結合の増大、ホスホリパーゼCβ活性の刺激、イノシトールリン酸の放出、細胞内カルシウムの増加、およびこれに続く信号伝達現象が起き、最終的には平滑筋収縮を生じる（Coleman，R．A．et  al．，1994，Pharmacol．Rev．，46：205−229）。FP受容体は療法薬の開発に有効な唯一のターゲットである。少数のGα−タンパク質が数百のGタンパク質共役型受容体の作用を触媒し、したがってこの受容体の下流のターゲットは本質的に有用性がほとんどないからである。
【０００６】
リガンドに基づく阻害薬は他のプロスタノイド受容体と交差反応性を示すので、リガンド結合部位に向けたFP受容体アンタゴニストの有用性は制限される可能性がある。分娩開始時および月経時の子宮筋層における著しいPGF2α濃度上昇を考慮すると、それらの有効性は発揮されないであろう。リガンドの不存在下で受容体の基礎活性が高いことにより、リガンドに基づく阻害薬の使用は制限される。
【０００７】
他のプロスタノイド受容体と交差反応せず、かつ過剰のリガンドの存在下ですら有効なFP受容体アゴニストまたはアンタゴニストを提供することは、きわめて望ましいであろう。
【０００８】
発明の概要：
本発明の目的の1つは、他のプロスタノイド受容体と交差反応しないFP受容体アゴニストまたはアンタゴニストを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、受容体タンパク質の細胞外ドメインをターゲティングする新規方式により、FP受容体の活性化薬または阻害薬を提供することである。
【００１０】
本発明によれば、天然リガンドのものと異なる様式でGタンパク質共役型受容体の膜近傍（juxtamembrane）細胞外構造要素に特異的に結合するGタンパク質共役型受容体アゴニストまたはアンタゴニストであって、細胞内信号の伝達を変化させるアゴニストまたはアンタゴニストが提供される。Gタンパク質共役型受容体アゴニストまたはアンタゴニストは、この受容体のアミノ酸配列に由来するものであってよい。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、アゴニストまたはアンタゴニストは他のプロスタノイド受容体と交差反応しない。
本発明のアンタゴニストは過剰のリガンドの存在下で有効である。
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストは、好ましくはプロスタノイド受容体の第1および／または第2細胞外ループに由来するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、本発明のアンタゴニストはプロスタノイド受容体の第1および第2細胞外ループに由来するアミノ酸配列を含む。
本発明の好ましい態様によれば、Gタンパク質共役型受容体はプロスタグランジンF2α受容体（FP受容体）である。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のアンタゴニストはプロスタグランジンF2α受容体に由来するアミノ酸配列を含む。
【００１３】
好ましくは、アンタゴニストには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ILGHRDYK（PCP−8；配列番号：1）；WEDRFYLL（PCP−10；配列番号：2）；YQDRFYLL（PCP−14；配列番号：3）；ILAHRDYK（PCP−13．7；配列番号：4）；ILGFRDYK（PCP−13．11；配列番号：5）；ILGHKDYK（PCP−13．13；配列番号：6）；ILGHRNYK（PCP−13．14；配列番号：7）；ILGHQDYK（PCP−13．18；配列番号：8）；ILGHRDY−アミド（PCP−13．20；配列番号：9）；ILGHRDYK−アミド（PCP−13．21；配列番号：1）；ILGWRDYK（PCP−13．22；配列番号：10）；ILGXRDYK（PCP−13．24；配列番号：11）；SNVLCSIF（PCP−15；配列番号：12）；そのタンパク質融合体およびペプチド模倣体（peptidomimetic）よりなる群から選択されるFP受容体のアミノ酸配列；該アミノ酸配列はL−および／またはD−アミノ酸を含む。
【００１４】
本発明によれば、配列番号：1〜12よりなる群から選択されるアミノ酸配列（そのアミノ酸配列はL−および／またはD−アミノ酸を含む）、配列番号：1〜12に少なくとも約90％相同なアミノ酸配列をもつペプチド、およびそのペプチド模倣体が提供される。
【００１５】
本発明によれば、少なくとも、本発明のGタンパク質共役型受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、その混合物、またはその機能性誘導体を、医薬的に許容できるキャリヤーと共に含有する医薬組成物が提供される。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、胎児の早産を予防する方法であって、その処置を必要とする雌に療法有効量のGタンパク質共役型受容体アンタゴニストまたはその機能性誘導体を投与する工程を含む方法が提供される。その際、アンタゴニストまたはその機能性誘導体は受容体の細胞外面に特異的に結合し、これにより子宮収縮を阻止する。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、月経困難症を予防および／または治療する方法であって、その処置を必要とする雌に療法有効量のGタンパク質共役型受容体アンタゴニストまたはその機能性誘導体を投与する工程を含む方法が提供される。その際、アンタゴニストまたはその機能性誘導体は受容体の細胞外面に特異的に結合して信号伝達を阻害し、これにより収縮に伴う痛みを減少させる。
【００１８】
本発明の他の態様によれば、天然リガンドのものと異なる様式でGタンパク質共役型受容体の細胞外要素に結合しうるGタンパク質共役型受容体アゴニストまたはアンタゴニストとしての化合物を同定するための、下記の工程を含む方法が提供される：
a）該受容体を発現する細胞を培養し、または生理学的結果が該受容体に依存する動物組織をex  vivoまたはin  vivoで同定し；
b）それらの細胞または組織を、該受容体におけるアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性について試験すべき化合物と接触させ；そして
d）細胞カルシウムの増加、ホスホイノシチドの加水分解、細胞のサイクリックアデノシン一リン酸の増加／減少、細胞の増殖および／または分化、遺伝子発現の変化、ならびに平滑筋の収縮または弛緩よりなる群から選択される生理学的結果を生じる信号の伝達を変化させる応答を測定し、その際、応答がアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を指示するものである。
【００１９】
本発明の他の態様によれば、天然リガンドのものと異なる様式でプロスタグランジンF2α受容体の細胞外要素に結合しうるプロスタグランジンF2α受容体アゴニストまたはアンタゴニストとしての化合物を同定するための、下記の工程を含む方法が提供される：
a）該受容体を発現する細胞を培養し、または生理学的結果が該受容体に依存する動物組織をex  vivoまたはin  vivoで同定し；
b）それらの細胞または組織を、該受容体におけるアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性について試験すべき化合物と接触させ；そして
c）細胞カルシウムの増加、ホスホイノシチドの加水分解、細胞の増殖および／または分化、遺伝子発現の変化、ならびに平滑筋の収縮または弛緩よりなる群から選択される生理学的結果を生じる信号の伝達を変化させる応答を測定し、その際、応答がアゴニストまたはアンタゴニスト活性を指示するものである。
【００２０】
本発明の目的に関して、下記の用語を以下に定義する。
”Gタンパク質共役型受容体アゴニストまたはアンタゴニスト”という表現は、それがGタンパク質共役型受容体の細胞外構造要素に特異的に結合して信号伝達を変化させうる限り、天然または合成の化合物、ペプチドタンパク質、抗体、ペプチド模倣体または小さい化学分子のいずれをも意味するものとする（これらに限定されない）。より好ましくは、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストは他のプロスタノイド受容体と交差反応しない。
【００２１】
Gタンパク質共役型受容体アゴニストまたはアンタゴニストの”機能性誘導体”という表現は、Gタンパク質共役型受容体アンタゴニストに関連する模倣化合物および／または構造的に関連のない化合物であって、同様にGタンパク質共役型受容体の細胞外構造要素に特異的に結合して信号伝達を変化させることができるものを意味するものとする。
【００２２】
”そのペプチド模倣体”という表現は、Gタンパク質共役型受容体アゴニストまたはアンタゴニストに関連するいずれかの化学物質、模倣化合物および／または構造的に関連のない化合物であって、同様にGタンパク質共役型受容体の細胞外構造要素に特異的に結合して信号伝達を変化させることができるものを意味するものとする。
【００２３】
発明の詳細な記述：
本発明によれば、細胞外面に結合して信号伝達を阻害する新規な一群のGタンパク質共役型受容体アンタゴニストが提供される。
【００２４】
この受容体の構造または機能の統合に関与する細胞外受容体ループをターゲティングする新規方法も提供される。アンタゴニストはこうして受容体の細胞外面のコグネイト要素に結合し、その信号の開始または伝達を妨害することにより受容体機能を阻害する。
【００２５】
FP受容体に対する本発明のアンタゴニストの選択性の証明は、それらがトロンボキサンA2に対する関連プロスタノイド受容体（TP受容体として知られ、同様に平滑筋収縮に関与する）に及ぼす影響がないのを示すことにより得られる。
【００２６】
［阻害薬の調製］
PCP−8およびPCP−10の化学合成：
2種類のペプチドPCP−8およびPCP−10を含めて、長さ8アミノ酸のペプチドはすべてF−moc化学および固相メリフィールド法により合成された。これらのペプチドをHPLCにより精製し、それらの純度を質量分析法により調べた。
【００２７】
本発明によれば、プロスタグランジンF2α受容体FPの細胞外ドメインに由来するペプチドを用いてFP受容体の信号伝達および機能結果を阻害するための新規方法が提供される。この方法はすべてのGタンパク質共役型受容体に一般化できる。FP受容体の第1および第2細胞外ループに由来するペプチドはFP受容体の有効な阻害薬であることが見出された。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例を参照することにより、本発明を容易に理解できる。これらは本発明を説明するために示されたものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００２９】
実施例I
［FP受容体を過剰発現している哺乳動物細胞においてペプチドPCP−8およびPCP−10がリガンド誘導ホスホイノシチド加水分解に及ぼす効果］
ヒトFP受容体を発現しているHEK293細胞において、PCP−8およびPCP−10の両方を試験した。この目的で、ヒトFP受容体を安定に発現しているHEK293細胞を、12ウェルプレート中で10％ウシ胎仔血清、ペニシリン（10U／ml）およびストレプトマイシン（10μg／ml）を含有するDMEM培地に接種し、5％CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で培養した。細胞が80％周密になった後、細胞を2μCi／mlの［3H］−myoイノシトールで一夜標識した。翌日、細胞をPBSで洗浄し、10mM  LiClおよび指示した濃度のPCPペプチドを含有するクレブス緩衝液0．5ml中で30分間インキュベートした。1μMのPGF2αを細胞に添加し、さらに30分間インキュベーションを行った。細胞を0．1N  NaOHで10分間溶解し、0．1Nギ酸で中和した。細胞溶解物を採集し、各1mlのメタノールおよびクロロホルムを順に添加し、短期間、渦撹拌した。遠心により相を分離した後、下記に従ってイオン交換クロマトグラフィーによりイノシトールリン酸を分離した（Berridge，M．J．et  al．，1983，Biochem．J．，212：473−482）。
【００３０】
要約すると、培地を廃棄し、0．6mlの氷冷メタノールを添加することによりIP3合成を停止した。細胞を掻き取り、ポリプロピレン製試験管中に採集した。蒸留水（0．5ml）およびクロロホルム（0．6ml）を添加し、2分間激しく渦撹拌した。6000×gで10分間の遠心により相を分離した。水相をAG−1X−8（商標）（ギ酸形）アニオン交換カラム（床体積1ml）に付与し、10mlの水、次いで0．1Mギ酸中の60mMギ酸アンモニウムにより、遊離イノシトールを溶離した。次いで、0．1Mギ酸中の1．2Mギ酸アンモニウム5mlにより、イノシトールリン酸を溶離した。3体積のシンチレーションカクテル（Optiphase−HiSafe  III）を添加した後、溶出物をシンチレーション分光測光法により計数した。
【００３１】
これらの実験の結果を図1に示す。データは、刺激していない対照と比較して、1μMのPGF2αによるイノシトールリン酸合成の刺激倍率として表される。FP受容体に対するPGF2αの作用により開始されたイノシトールリン酸合成を、PCP−8およびPCP−10の両方とも100μMで有効に阻止した。最大値半阻止濃度（half  maximal  inhibitory  concentration）は100μMよりわずかに低かった。
【００３２】
実施例II
［ブタアイカップモデルex  vivo血管運動アッセイにおけるPCPペプチド試験］
ex  vivoモデルを用いて前記ペプチドがFP機能を阻害しうるかどうかを調べるために、ブタアイカップモデル、すなわち本発明者らが先に報告および実証したブタ網膜における血管収縮のex  vivoアッセイを選択した（Li  et  al．，1996，J．Pharmacol．Expt．Therapeut．，278：370−377；Li  et  al．，1997，Am．J．Physiol．，273：R1283−90；Abran  et  al．，1997，Am．J．Physiol．，272：R995−1001）。周産期の高い循環プロスタグランジンレベルによるダウンレギュレーションのため新生児血管のFP受容体密度は最小であるので、新生ブタをプロスタグランジンシンセターゼ遮断薬イブプロフェンで処理して（30mg／Kg体重／8〜24時間）、受容体の密度およびそれらの血管運動作用を高めた。循環プロスタグランジンを阻害することにより、このアイカップモデルにおいてFP受容体仲介による第2メッセンジャー合成およびFP仲介による血管収縮の有効な阻止を示すことができた。
【００３３】
アイカップを調製するために、鋸状縁の3〜4mm後方で円形切開を行って、最小の網膜操作で内部セグメントおよびガラス体を除去した。20mlのクレブス緩衝液（pH7．35〜7．45）、プロテアーゼ阻害薬、ロイペプチンおよびアプロチニン（各10μg／ml）を含有し、21％酸素および5％二酸化炭素で平衡化した37℃の組織浴20ml中において、得られたアイカップをピンでワックス基材に固定した。この標本を30分間安定化させた。100μMのペプチドを添加し、30分間インキュベーションを続けた後、PGF2αを添加した。
【００３４】
PGF2αおよびTxA2模倣体U46619（10-10〜10-5M）の累積濃度応答曲線を別個に作成した。アンタゴニストの可逆性を評価するために、アイカップをインキュベーション培地で十分に洗浄し（これによりペプチドが洗い去られる）、PGF2αの濃度応答曲線を作成した。解剖顕微鏡（Zeiss  M400、商標）に取り付けたビデオカメラで血管外径を記録し、デジタル画像分析計（Sigma  Scan  Software，Jandel  Scientific，Corte  Madera，CA）により応答を定量した。薬剤の局所適用の前および10分後に、血管直径を記録した。各測定は3回繰り返され、＜1％の変動性を示した。
【００３５】
結果を図2に示す。ペプチドPCP−10は基礎緊張（小血管の直径）に影響を及ぼさなかった（図2A；左パネル）。1μMのPGF2α添加によりペプチドの不存在下では血管が明らかに収縮し（中上パネル）、これに対し100μMのPCP−10が存在するとPGF2α仲介による血管収縮が著しく阻止された（中下パネル）。このペプチドは、収縮に関連する他のプロスタノイド受容体、すなわちTP受容体に作用するTxA2模倣体U46619  1μMによる影響を受けた血管収縮に対しては、影響を及ぼさなかった（右パネル）。同様な結果がPCP−8についても得られた。PCP−8およびPCP−10ペプチドの存在下／不存在下での血管直径に対するPGF2αの用量応答を図2Bに示す。両ペプチドとも、PGF2α濃度が1μMを超える場合ですら、血管運動応答を阻止した。これは、予想どおりこれらのペプチドが非競合様式で作用している可能性を示唆する。ただし、これらのペプチドはトロンボキサンA2により生じる血管収縮には影響を及ぼさなかった（図2C）。
【００３６】
同様に、FP受容体の細胞外第1ループに由来するペプチドPCP−15も、PGF2α誘導による収縮（10-7M）を阻止した（非処理対照に対し88．1％；表1）。
【００３７】
実施例III
［ブタアイカップモデルex  vivo血管運動アッセイにおけるPCP−8のペプチド変異体の試験］
PGF2α誘導による血管収縮に対するPCP−8の構造要件を理解するために、PCP−8配列中の種々のアミノ酸を他のD−またはL−アミノ酸で置き換え、生じるペプチドを化学合成し、ex  vivo血管運動アッセイのブタアイカップモデルにおいて試験した。これらのペプチド変異体を表1に挙げる。
【００３８】
【表１】
0004431280.tif 000002
1  100μMのペプチドの存在下での血管運動応答％を、ペプチドの不存在下でみられた最大収縮と比較して、ペプチドの存在下でアイカップに添加した10-7MのPGF2αにより生じた平均血管直径の変化率％として計算する；
2  各ペプチドにより生じた阻害率％を、（100−血管運動応答％）として計算する。
【００３９】
小文字はL−アミノ酸、大文字はD−アミノ酸を示す。I＝イソロイシン；L＝ロイシン；G＝グリシン；H＝ヒスチジン；R＝アルギニン；D＝アスパラギン酸；Y＝チロシン；K＝リシン；A＝アラニン；W＝トリプトファン；E＝グルタミン酸；F＝フェニルアラニン；Q＝グルタミン；N＝アスパラギン；P＝プロリン；S＝セリン；X＝シクロヘキシルアラニン。ペプチドを実験の直前に10mM原液として新たにDMSOに溶解し、10-7MのPGF2αの添加の30分前にアイカップに添加した。
【００４０】
合計25種類のPCP−8を合成し、有効なペプチドを表1に挙げる。これらのペプチドは、L−アミノ酸からD−アミノ酸への変化、欠失、芳香性、イオン性相互作用に対比した水素結合供与状態および疎水性の微妙な変化を含む。これらのペプチドを少なくとも100μM濃度でブタ網膜血管運動アッセイにおいて試験し、結果を表1にまとめる。結果は下記のようにまとめられる：
【００４１】
1．PCP−8のすべてのL−アミノ酸をD−アミノ酸に変換すると（PCP−13）、阻害効力が著しく増大した。N−末端疎水性ジペプチド配列をPCP−8から除去するか（PCP−11）、またはPCP−10から除去すると（PCP−12）、ペプチドの阻害作用が有意に低下した；
2．グリシンからアラニンへの変換（13．7）はPCP−13の活性を変化させないのに対し、プロリンへの変換（13．16）、L−アラニンへの変換（13．8）、またはその残基の欠失（13．17）は、すべて活性損失を生じた。グリシンはHRDモチーフをIL疎水性配列から分離する重要なリンカー残基である；
3．HRDモチーフはPCP−13の活性にとって重要である。アラニン置換（13．1〜13．3）またはL−構造への変化（13．4〜13．6）は、PCP−13の阻害活性の損失を生じた。Hisの芳香性は正電荷より重要である。HからFへの（13．11）またはWへの（13．22）またはXへの（13．24）変換はペプチドの阻害効力を有意には低下させなかったが、Yへの変換（13．23）はそうではなかったからである。側鎖の長さはD残基の場合の方がRより重大であると思われる；DをEに変化させると（13．12）阻害活性の半分が失われたのに対し、RからK（13．13）またはQ（13．18）への変化がPCP−13の活性に及ぼした影響は中程度であった。DからNへの変化（13．14）は中程度の活性損失を生じたのに対し、セリン置換（13．19）はPCP−13の活性を著しく低下させた。
4．末端リシンの欠失（13．15）またはWによる置換（13．9）は、完全な活性喪失を生じた；しかし末端カルボキシラートをアミドに変換すると（13．20および13．21）、ペプチド阻害薬の活性を中程度に獲得した。芳香族残基YをEで置換すると（13．10）、PCP−13の阻害効力は完全に失われた。
【００４２】
したがってD−配置のPCP−13の構造は、中心のHRDモチーフからグリシン残基によって間隔をおいたN−末端疎水性アンカーを含み、おそらく活性ペプチドのターンコンホメーションを生じると思われる；カルボキシ末端の芳香族および疎水性相互作用もPCP−13の効力を増大させるであろう。
【００４３】
実施例IV
［ブタ子宮ストリップex  vivo基礎収縮アッセイにおけるPCPペプチドの試験］
ブタ子宮ストリップを用いるex  vivo実験において、前記ペプチドは基礎収縮およびPGF2α誘導による収縮の両方を阻止することができた。
【００４４】
妊娠していないブタ成体からの子宮組織を地元の屠畜場から入手し、氷に乗せて研究室に輸送した。長さ約1cmの子宮筋ストリップを、本発明者らが報告したように、21％酸素で37℃において平衡化したクレブス緩衝液を入れた臓器浴中に取り付けた（Potvin，W．et  al．，1990，Br．J．Pharmacol．，100：341−347；Varma，D．R．  and  Chemtob，S．，1993，J．Pharmacol．Exp．Ther．，265：1096−1104）。フォーストランスデューサーによりGrass−ポリグラフに収縮を記録した。ストリップを100μMのペプチドと共に、またはペプチドなしで30分間インキュベートした後、PGF2αを段階的に増加しながら（10-9〜10-6M）添加した。データを基礎レベルの平均張力（g）に対する増加率として表示した。
【００４５】
100μMのPCP−8の存在下および不存在下での自然子宮収縮（プロスタノイド、主にPGF2αに依存することが知られている）のグラフを図3Aに示す。ペプチドをストリップに添加すると、基礎収縮力が低下した。PCP−8およびPCP−10の存在下または不存在下での子宮収縮に対するPGF2αの用量応答を図3Bに示す。試験したすべてのPGF2α濃度において、60％以上（PCP−8）および80％以上（PCP−10）の子宮収縮低下がみられた。したがってこれらの両ペプチドは、子宮ストリップの自然収縮もPGF2α誘導収縮も低下させた。
【００４６】
実施例V
［ウシ子宮ストリップex  vivo基礎収縮アッセイにおけるPCPペプチドの試験］
妊娠していないウシ成体からの子宮組織を地元の屠畜場から入手し、氷に乗せて研究室に輸送した。長さ約1cmの子宮筋ストリップを、前記のように、21％酸素で37℃において平衡化したクレブス緩衝液を入れた臓器浴中に取り付けた。フォーストランスデューサーによりGrass−ポリグラフに収縮を記録した。ストリップを100μMのペプチドと共に、またはペプチドなしで30分間インキュベートした後、PGF2αを段階的に増加しながら（10-8〜10-6M）添加した。データを基礎レベルの平均張力（g）の変化として表示した。結果を図4に示す。100μMのPCP−10ペプチドを添加すると、子宮筋の基礎緊張（収縮状態）が逆転した。最高10μMのPGF2αの添加は、PCP−10により生じた弛緩に影響を及ぼさなかった。これは、前の結果にも示したようにPCPペプチドの効果がリガンドと無関係であることを示唆する。
【００４７】
本発明をその具体的態様に関して記載したが、本発明をさらに変更でき、本出願は一般に本発明の原理に従って本発明のいかなる変更、使用または適用をも包含し、本発明が関係する技術分野における既知の慣例内で生じるような本明細書の開示内容からの逸脱であって特許請求の範囲に含まれるものを包含することは、理解されるであろう。
【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の態様に従ってPGF2αで刺激した際に、PCP−8およびPCP−10がFP受容体機能に及ぼす阻害効果を示す。
【図２】  ２Ａは、PGF2αまたはトロンボキサンA2模倣体U46619で刺激した際に、PCP−8およびPCP−10がブタ網膜小血管の直径に及ぼす影響を示す。
２Ｂは、予めPCP−8またはPCP−10で処理したブタ小血管の直径に対するPGF2αの用量応答を示す。
２Ｃは、トロンボキサンA2模倣体U46619が、予めPCP−8およびPCP−10で処理したブタ小血管の直径に及ぼす影響を示す。
【図３】  ３Ａは、PCP−10が子宮平滑筋の自然収縮に及ぼす影響を示す。
３Ｂは、子宮平滑筋収縮に際しての、PCP−8およびPCP−10の存在下／不存在下でのプロスタグランジンF2αの用量応答を示す。
【図４】  FP受容体リガンドPGF2αの存在下ですらウシ子宮筋の基礎緊張が逆転することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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