(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料中の遺伝子発現および染色体異常の同時検出方法であって、
（ａ）固体支持体に結合した核酸標的要素のアレイを提供し、ここにおいて、該核酸標的要素は、組織試料の遺伝子発現および染色体配列を示す核酸に予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で相補的なポリヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）少なくとも３種類の標識された核酸集団、
（ｉ）第一マーカーで標識され且つ組織試料に由来するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ集団、
（ｉｉ）第二マーカーで標識され且つ組織試料に由来する染色体ＤＮＡ集団、および
（ｉｉｉ）第三マーカーで標識された少なくとも一つの対照核酸集団
を提供し；
（ｃ）該アレイと該標識された核酸集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ；そして
（ｄ）少なくとも２種類の標的要素での第一、第二および第三マーカーそれぞれの存在および強度を検出する
ことを含む上記方法。
【請求項２】
前記標的要素がゲノムＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的要素がｃＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織試料がヒトに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アレイがｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ標的要素を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アレイが、標的要素を１００−１０，０００個の標的要素／平方センチメートルの範囲の密度で含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第一、第二および第三マーカーが、それぞれ異なった蛍光標識を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出工程（ｃ）からのデータをプログラム化された計算機で処理し、そのままのおよび処理されたデータをデータベース中に記憶し、そしてそのままのおよび処理されたデータを表示することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
未標識の保護核酸の添加を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
それぞれの標的要素で（ｉ）第一色および第三色間の（ｉｉ）第二色および第三色間の蛍光比を測定することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織が細胞系試料を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織試料が１種類の細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織試料がヒト腫瘍試料を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織試料が血液細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ゲノムＤＮＡが、２０ｋｂ−２５０ｋｂの範囲の複雑度を有するヒトゲノムＤＮＡを含む請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃＤＮＡが、１００ｂｐ−５，０００ｂｐの範囲の複雑度を有するｃＤＮＡを含む請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸要素が少なくとも一つのペプチド核酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法を中規模装置で行なう請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
組織試料中の遺伝子発現および染色体異常の同時検出方法であって、
（ａ）固体支持体に結合したゲノムＤＮＡを含む核酸標的要素のアレイを提供し、ここにおいて、該核酸標的要素は、組織試料の遺伝子発現および染色体配列を示す核酸に予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で相補的なポリヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）少なくとも３種類の標識された核酸集団、
（ｉ）第一蛍光色で標識され且つ組織試料に由来するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ集団、
（ｉｉ）第二蛍光色で標識され且つ組織試料に由来する染色体ＤＮＡ集団、および
（ｉｉｉ）第三蛍光色で標識された少なくとも一つの対照核酸集団
を提供し；
（ｃ）該アレイと該標識された核酸集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ；そして
（ｄ）少なくとも２種類の標的要素での第一、第二および第三蛍光色それぞれの存在および強度を検出する
ことを含む上記方法。
【請求項２０】
前記アレイが、基体の平面上に少なくとも１００個の標的要素を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アレイが、標的要素を１００−１０，０００個の標的要素／平方センチメートルの範囲の密度で含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
それぞれの標的要素で（ｉ）第一色および第三色間の（ｉｉ）第二色および第三色間の蛍光比を測定することを更に含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
検出工程（ｃ）からのデータをプログラム化された計算機で処理し、そのままのおよび処理されたデータをデータベース中に記憶し、そしてそのままのおよび処理されたデータを表示することを更に含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
未標識の保護核酸の添加を更に含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
染色体ＤＮＡ集団を、ＰＣＲを含む方法によって生産する請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織試料が１種類の細胞を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織試料がヒト腫瘍試料を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織試料が血液細胞を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織試料がヒト割球細胞またはヒト極体を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織試料は顕微解剖によって生産されたものである請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法を中規模装置で行なう請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
組織試料中の遺伝子発現および染色体異常の同時検出方法であって、
（ａ）固体支持体に結合した核酸標的要素のアレイを提供し、ここにおいて、該核酸標的要素は、組織試料の遺伝子発現および染色体配列を示す核酸に予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で相補的なポリヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）少なくとも３種類の標識された核酸集団、
（ｉ）第一蛍光色で標識され且つ組織試料に由来するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ集団、
（ｉｉ）第二蛍光色で標識され且つ組織試料に由来する染色体ＤＮＡ集団、および
（ｉｉｉ）第三蛍光色で標識された少なくとも一つの対照核酸集団
を提供し；
（ｃ）該アレイと該標識された核酸集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ；そして
（ｄ）少なくとも２種類の標的要素での第一、第二および第三蛍光色それぞれの存在および強度を検出する
ことを含む上記方法。
【請求項３３】
前記標的核酸要素が、２０ｂｐ−８０ｂｐの範囲のオリゴマーを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アレイが少なくとも１００個の標的要素を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記アレイが、標的要素を１００−１０，０００個の標的要素／平方センチメートルの範囲の密度で含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
それぞれの標的要素で（ｉ）第一色および第三色間の（ｉｉ）第二色および第三色間の蛍光比を測定することを更に含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
検出工程（ｃ）からのデータをプログラム化された計算機で処理し、そのままのおよび処理されたデータをデータベース中に記憶し、そしてそのままのおよび処理されたデータを表示することを更に含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
未標識の保護核酸の添加を更に含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
染色体ＤＮＡ集団を、ＰＣＲを含む方法によって生産する請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記組織試料が１種類の細胞を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記組織試料がヒト腫瘍試料を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記組織試料が血液細胞を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記組織試料は顕微解剖によって生産されたものである請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｃＤＮＡが、１００ｂｐ−５，０００ｂｐの範囲の複雑度を有するｃＤＮＡを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的核酸要素が少なくとも一つのペプチド核酸を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法を中規模装置で行なう請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的要素が、２０ｂｐ−８０ｂｐの範囲のポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織試料が膀胱組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項４９】
前記組織試料が肺組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織試料が前立腺組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５１】
前記組織試料が乳房組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５２】
前記組織試料が食道組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５３】
前記組織試料が頸部組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５４】
前記組織試料が卵巣組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５５】
前記組織試料が結腸組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組織試料が脳組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５７】
前記組織試料が胃組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５８】
前記組織試料が皮膚組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項５９】
前記組織試料が膵臓組織を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６０】
前記組織試料がヒト割球を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６１】
前記組織試料がヒト極体を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも２種類の対照核酸集団の使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも４種類の対照核酸集団の使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも２種類の対照核酸集団の使用を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも２種類の対照核酸集団の使用を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも２種類の対照核酸集団の使用を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６７】
前記組織試料が癌細胞系を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも４種類の別個の蛍光標識された核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請求項１９に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも８種類の別個の蛍光標識された核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請求項１９に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも４種類の別個の蛍光標識された核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請求項５に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも４種類の別個の蛍光標識された核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請求項３２に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも８種類の別個の蛍光標識された核酸集団を前記アレイとハイブリッド形成させる請求項３２に記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも一つの染色体イデオグラムをアレイデータと一緒に表示することを更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも一つの染色体イデオグラムをアレイデータと一緒に表示することを更に含む請求項２３に記載の方法。
【請求項７５】
少なくとも一つの染色体イデオグラムをアレイデータと一緒に表示することを更に含む請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府権利
米国は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＡＴＰプロジェクト第９４−０５−００２１号、授与番号７０ＮＡＮＢ５Ｈ１１０８の付与によって本発明の当然の権利を有する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、概して、ヒトまたは動物の組織試料中の核酸の評価に関する。より詳しくは、本発明は、組織試料中の遺伝子発現および染色体異常についての同時測定に関する。
【０００３】
【従来の技術】
遺伝子の発現における特定の遺伝子の発現のタイミングおよびレベル双方の異常は、癌および他のヒト疾患の根本的な原因である。ゲノムＤＮＡ、すなわち、染色体における異常も、癌および他のヒト疾患の根本的な原因であり、しばしば、遺伝子の過発現または発現不足をもたらす。染色体間の平衡転座および逆位、および塩基対変化などの若干の染色体異常は、ＤＮＡ配列コピー数の変化を伴わない。他のゲノムＤＮＡ異常は、染色体ごとの正常な１コピーからのＤＮＡ配列コピー数の変化を含む。これらゲノムＤＮＡ異常は、しばしば、コピー数増加に関して遺伝子増幅およびコピー数減少に関して遺伝子欠失と称される。例えば、乳癌の約２５−３０％で見られる一つの攻撃的な形の乳癌は、染色体１７のｑ１２バンドに位置するＨｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子の遺伝子増幅および過発現に起因する。この遺伝的異常のある乳癌患者は、全生存および無疾患生存双方について、この異常のない患者よりもかなり予後がかなりよくない。更に、Ｈｅｒ−２遺伝子の過発現は、その遺伝子の染色体遺伝子座の遺伝子増幅が不存在の場合、その疾患の初期のあまり攻撃的でない段階で起こる。Ｂｏｒｇら，“Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０，４３３２−４３３７（１９９０年７月１５日）。したがって、乳癌についての適切な評価および治療技術には、Ｈｅｒ−２遺伝子発現の存在およびＨｅｒ−２遺伝子染色体コピー数を測定する試験が必要である。
【０００４】
Ｈｅｒ−２遺伝子コピー数のような染色体異常は、蛍光インサイチオハイブリッド形成法（“ＦＩＳＨ”）を用いる検定によって評価することができる。ＦＩＳＨ検定は、組織試料の形態学的に自然のままの中期塗抹または間期細胞中に存在する染色体ＤＮＡへのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行なう。米国食品医薬品局は、最近、結節陽性乳癌患者におけるＨｅｒ−２コピー数の検出およびアドリアマイシン療法の結果の予想のためのＶｙｓｉｓｉ，Ｉｎｃ．（ダウナーズ・グローブ，イリノニイ州）から入手可能なＰａｔｈＶｙｓｉｏｎTMＨｅｒ−２診断用ＦＩＳＨ試験を認可した。
【０００５】
癌は、乳癌によって代表されるような多発型の疾患をもたらす多数の遺伝子の異常も伴い、この場合、大部分の症例でＨｅｒ−２癌遺伝子には異常がない。固体基体に結合した多数の核酸プローブの二次元アレイへのハイブリダイゼーションを用いる、いわゆる“ＤＮＡチップ（Ｃｈｉｐ）”または“ミクロアレイ”試験は、多数の遺伝子発現異常を同時に評価する。例えば、米国特許第５，４４５，９３４号，“Ａｒｒａｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｆｏｄｏｒら、同第５，８００，９９２号，“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”Ｆｏｄｏｒら、および同第５，８０７，５５２号，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒＦａｂｒｉｃａｔｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，”Ｂｒｏｗｎらを参照されたい。それらミクロアレイ遺伝子発現試験は、特定の疾患に的をしぼった新規薬物の開発で益々用いられている。
【０００６】
タンパク質レベルでの多数の遺伝子発現は、基体上の固定された抗原の二次元アレイである“ミクロドット”免疫検定の使用によって調べることもできる。例えば、１９８２年２月３日優先日の米国特許第５，４８６，４５２号，“Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｇｏｒｄｏｎら、およびＥｋｉｎｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２２７：７３−９６（１９８９）を参照されたい。Ｇｏｒｄｏｎらの固定された抗原には核酸が含まれ、それらは、１０5／１０平方センチメートル（または１，０００／ｃｍ2）の密度で配列されるように開示されている。Ｇｏｒｄｏｎらは、更に、そのアレイが、１９８２年に一般的な（Ｇｏｒｄｏｎら，項目１７を参照されたい）ピペッティング装置の寸法より低い“固有分離度”を有するので、より高い密度で抗原を含有しうると開示している。Ｇｏｒｄｏｎらは、それらアレイを、機械的転移装置、小形アプリケーター、リソグラフィー手順または高速電子プリントの使用によって製造することができることを開示している。
【０００７】
米国特許第５，６６５，５４９号，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ），”Ｐｉｎｋｅｌらは、多数の遺伝的異常の同時評価方法を開示している。ＣＧＨは、一つの蛍光色で標識された対照核酸集団および第二蛍光色で標識された試料核酸集団の、ヒト中期染色体塗抹などの対照ゲノムの全部または一部分への比較用多色ハイブリダイゼーションを行なう。得られた蛍光強度の対照ゲノムの位置での比較は、試料集団における染色体配列または発現された遺伝子配列のコピー数の決定を可能にする。ミクロアレイに基づくＣＧＨ試験は、多数のゲノムＤＮＡまたは遺伝子発現異常の評価についても開示されている。米国特許第５，８３０，６４５号，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｒｒａｙｓ，”Ｐｉｎｋｅｌら；同時係属および同一譲渡人の米国特許出願第０９／１８５，６２５号，“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，”Ｍｕｌｌｅｒら；およびＰｉｎｋｅｌら，“Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０巻，１９８８年１０月，２０７−２１１頁を参照されたい。Ｐｉｎｋｅｌらは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓで、ゲノムＤＮＡ中の単コピー変化を検出するミクロアレイ標的へのＣＧＨの能力を開示している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
今日までのところ、遺伝子発現および染色体異常についての評価には、追加の試料処理および試薬経費をもたらす組織試料での別々の試験が必要である。遺伝子発現および染色体異常について別々に試験することは、入手可能であるよりも多くの組織を必要とすることもありうる。先行技術では、ミクロアレイへの多色ハイブリダイゼーションを用いる遺伝子発現および染色体異常の同時測定が開示されていない。本発明の目的は、組織試料での遺伝子発現および染色体異常について同時試験を行なうことによって別々の試験を避けることである。もう一つの目的は、遺伝子発現および染色体異常を単一核酸ミクロアレイで同時に試験することである。本発明の他の目的は、以下に詳述されるであろう。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、組織試料中の遺伝子発現および染色体異常両方の同時検出のための、固体支持体に結合した核酸標的要素のアレイを用いる多色比較用ハイブリダイゼーション検定法を含む。本発明の方法は、第一の検出可能マーカーで標識された組織ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料、第二の検出可能マーカーで標識された組織ゲノムＤＮＡ試料、および第三の検出可能マーカーで標識された少なくとも一つの対照核酸のアレイへの比較用ハイブリダイゼーションを用いる。各標的要素でのそれぞれのマーカーの存在および強度を検出し、そして例えば、（１）第一および第三マーカーの、および（２）第二および第三マーカーのマーカー比率を、標的要素それぞれについて測定する。遺伝子発現および染色体異常は、このようにして、それらマーカー比の分析によって同時に検出される。好ましい実施態様において、それらマーカーは、それぞれ蛍光標識である。
【００１０】
本発明は、ヒト疾患の治療技術において療法選択に指針を与えるより完全な遺伝的評価データを与えることにより、ヒトおよび動物用薬物開発プログラムにおいて治療的候補作用を評価することにより、および細菌およびウイルスの病原体診断において広く用いられる。特定の癌は、増幅された遺伝子のｍＲＮＡの過発現と共役した遺伝子増幅を特徴とし、より攻撃的な疾患でありうるし、より攻撃的な療法を必要とする。過発現を駆動する機序は、治療的介入が適切でありうることを理解する場合の基礎でありうると考えられる。したがって、本発明の方法による遺伝子発現および増幅両方の特性決定は、改良された癌療法をもたらすことができる。
【００１１】
好ましい実施態様において、本発明は、組織試料中の遺伝子発現および染色体異常の同時検出方法であって、
（ａ）固体支持体に結合した核酸標的要素のミクロアレイを提供し、ここにおいて、該核酸標的要素は、組織試料中に存在する遺伝子発現の指標であり且つ染色体配列の指標である核酸に予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で実質的に相補的なポリヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）少なくとも３種類の標識されたプローブ核酸集団、
（ｉ）第一蛍光色で標識され且つ組織試料からのｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ集団、
（ｉｉ）第二蛍光色で標識され且つ組織試料に由来する染色体ＤＮＡ集団、および
（ｉｉｉ）第三蛍光色で標識された少なくとも一つの対照核酸集団
を提供し；
（ｃ）該ミクロアレイと該標識された核酸集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ；そして
（ｄ）少なくとも２種類の標的要素について第一、第二および第三蛍光標識色それぞれの存在および強度を検出する
ことを含む上記方法を含む。
【００１２】
同じ標的要素でのメッセージ、ゲノムおよび対照の核酸のハイブリダイゼーションの測定および比較は、発現およびゲノム変化の同時評価を提供する。本発明は、多数の対照核酸、例えば、第三蛍光色で標識されたゲノム対照ＤＮＡおよび第四蛍光色で標識された対照ｃＤＮＡ集団の使用も含む。それら核酸標的要素は、ゲノムＤＮＡか、オリゴマーＤＮＡかまたはｃＤＮＡでありうる。好ましい実施態様は、ゲノムＤＮＡ標的要素およびオリゴマーＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的要素の混合物を含むアレイを含み、それらオリゴマーＤＮＡ／ｃＤＮＡ標的は発現を測定し、ゲノムＤＮＡ標的は染色体変化を測定する。１平方センチメートル未満のチップ表面中に１，０００種類の異なった遺伝子およびゲノム遺伝子座を測定できる標的要素密度を有するミクロアレイを用いることも好ましい。
発明の詳細な記述
（１）定義
本明細書中において次の略語を用いる。
【００１３】
ｂｐ−塩基対
ＣＧＨ−比較用ゲノムハイブリダイゼーション
ＤＡＰＩ−４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール
ｄＣＴＰ−デオキシシトシン三リン酸
ＤＮＡ−デオキシリボ核酸（同様に機能しうる類似体を含めた一本鎖かまたは二本鎖の形の）
ｄＵＴＰ−デオキシウリジン三リン酸
ＦＩＳＨ−蛍光インサイチオハイブリダイゼーション
ｋｂ−キロベース
ｍｍミリメートル
ｍＲＮＡ−メッセンジャーＲＮＡ
ｎｇ−ナノグラム
ｎｌ−ナノリットル
ＲＮＡ−同様に機能しうる類似体を含めた一本鎖かまたは二本鎖の形のリボ核酸
μｇ−マイクログラム
μｌ−マイクロリットル
μｍ−マイクロメートル
μＭ−マイクロモル
“核酸”または“核酸分子”という用語は、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能しうる天然ヌクレオチドの既知の類似体を含めた一本鎖かまたは二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味する。
【００１４】
“エクソン”という用語は、成熟ｍＲＮＡ産物中に示される分断遺伝子の任意のセグメントを意味する。若干のタンパク質コーディング遺伝子は、非コーディングであるエクソン、例えば、ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のエクソン１を有している。おそらく、タンパク質コーディング遺伝子は全て、部分的にコードしている最初と最後のエクソンを有する。
【００１５】
“単コピー配列”または“ユニーク配列”という用語は、遺伝子のコーディングエクソン配列などの、典型的に、ハプロイドゲノム当り１回だけ存在する核酸配列を意味する。
【００１６】
“複雑度”という用語は、本明細書中において、Ｂｒｉｔｔｅｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２９：３６３（１９７４）によって確立されたようなこの用語の標準的な意味にしたがって用いられる。核酸複雑度の更に別の説明については、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＰａｒｔＩＩＩ，１２２８−１２３０頁も参照されたい。
【００１７】
“標的要素”という用語は、組織試料から単離された核酸にハイブリダイゼーション可能な固定されたまたは結合した核酸を含有する基体表面の部分を意味する。
【００１８】
“実質的に結合する”という用語は、組織核酸と標的要素核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、組織ポリヌクレオチド配列の所望の検出を行なうためにハイブリダイゼーション基剤のストリンジェンシーを低下させることによって適合されうる少ないミスマッチを包含する。
【００１９】
“特異的ハイブリダイゼーション”または“と特異的にハイブリッド形成する”という用語は、組織核酸が標的要素核酸に実質的に結合するが、規定のストリンジェンシー条件下でアレイ中の他の核酸に実質的に結合しないハイブリダイゼーションを意味する。当業者は、それらハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの緩和が、配列ミスマッチを許容させることを理解するであろう。許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適当な調整によって調節することができる。
【００２０】
当業者は、本明細書中で記載された特定の核酸の正確な配列を、他のものと“実質的に同一”であり、しかも相補的核酸に実質的に結合する能力を保持している組織核酸プローブまたは標的要素核酸を生じるようにある程度まで修飾することができるということも理解するであろう。このような修飾は、具体的には、本明細書中の個々の配列に関して述べられる。ポリヌクレオチド配列の“実質的な同一性”という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを用いる下記の方法を用いて対照配列と比較して少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
【００２１】
二つの核酸配列は、それら二つの配列のヌクレオチド配列が、下記のように最大限に一致するために並べられた場合に同様であるならば、“同一”であるといわれる。“に相補的”という用語は、本明細書中において、相補的配列が対照ポリヌクレオチド配列の全部または一部分に相補的であることを意味するのに用いられる。
【００２２】
二つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、配列類似性を有する局所部分を確認し且つ比較する“比較窓”の中の二つの配列について配列を比較することによって行なわれる。本明細書中で用いられる“比較窓”は、二つの配列を最適に並列させた後に同数の隣接位置の対照配列と配列を比較することができる少なくとも約２０個、通常は約５０−約２００個、より通常は約１００−１５０個の隣接位置のセグメントを意味する。
【００２３】
比較のために配列を最適に並列させることは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性探求法によって、およびこれらアルゴリズムの計算機処理された手段によって行なうことができる。
【００２４】
“配列同一性百分率”は、二つの最適に並列された配列を比較窓について比較することによって決定されるが、この場合、その比較窓内のポリヌクレオチド配列の一部分は、二つの配列の最適並列のための対照配列（付加または欠失を含まない）と比較される付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてよい。その百分率は、同一の核酸塩基が両方の配列中にある位置の数を測定して、対合する位置数を得、その対合位置数を比較窓内の全位置数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性百分率を生じることによって計算される。
【００２５】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるというもう一つの指標は、二つの分子が同様の配列にストリンジェント条件下でハイブリッド形成するかどうかである。ストリンジェント条件は配列依存性であり、様々な環境中で異なるであろう。概して、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃−約２５℃低いように選択される。そのＴｍは、ＤＮＡ二重らせんまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの鎖が半分解離するまたは変性する温度（規定のイオン強度およびｐＨにおいて）である。
【００２６】
本明細書中で用いられる“プローブ”は、１種類またはそれ以上の化学結合によって、通常は、水素結合形成によって相補的配列の核酸を含む標的要素に結合することができる組織核酸分子（ＲＮＡかまたはＤＮＡ）の集団または集合として定義される。それらプローブ集団は、下記のように直接的にまたは間接的に標識される。それらプローブ集団は、典型的に、高複雑度を有し、例えば、組織細胞または組織細胞集団から単離された全ゲノムＤＮＡまたは全ｍＲＮＡから製造される。
（２）概要
本発明の方法は、ミクロアレイ試験形式によって与えられる多数の核酸の評価能力と、ＣＧＨの多色比較用ハイブリダイゼーション能とを組合せて、同一組織試料中の遺伝子発現およびゲノム異常の両方を同時に評価する。本発明の方法は、組織試料に由来する核酸集団の多数の核酸標的要素を含む核酸アレイへの、適当なハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーションを用いる。それら核酸標的要素は、発現された遺伝子配列に相補的なゲノムＤＮＡか、オリゴマーかまたはｃＤＮＡ核酸、またはそれら２種類の混合物を含む。それら核酸集団は、異なった検出可能マーカーで別々に標識され、（１）組織試料中の遺伝子発現を示すｍＲＮＡまたはその相補的ｃＤＮＡの混合物、および（２）組織試料のゲノム状態を示すゲノムＤＮＡの混合物を含む。それら標識された核酸集団を、１種類またはそれ以上の対照核酸集団と一緒にアレイに同時ハイブリッド形成させるが、対照集団もそれぞれ、異なった検出可能マーカーでそれ自体標識されている。好ましくは、アレイに加えられる核酸集団全部を、それぞれ異なった蛍光マーカーで標識する。１種類または複数の対照核酸は、１種類または複数の対照に相対する組織試料の遺伝子発現状態またはゲノム状態の評価を可能にするように選択される。適当なハイブリダイゼーション時間後、蛍光色の存在および強度をアレイのそれぞれの標的要素で検出する。特定の標的要素での色間蛍光比の比較により、その標的要素に相補的であるゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列のコピー数が測定される。
【００２７】
ゲノムＤＮＡ配列は、概して、ＲＮＡで発現された配列の全部または一部分をコードする１個またはそれ以上の“エクソン”配列、およびヒトゲノム中の多数の地点で繰返される反復配列も含有することが多い１個またはそれ以上の非コーディング配列“イントロン”を両方とも含有する。ゲノム標的要素は、したがって、特定のゲノム配列にマッピングされる発現された遺伝子配列のためのハイブリダイゼーション標的として役立ちうる。同様に、特定の発現された遺伝子配列に相補的な標的要素は、ゲノムＤＮＡのエクソン配列にも相補的である。したがって、ゲノムＤＮＡ標的要素およびｃＤＮＡ標的要素は、それぞれ、ゲノムＤＮＡかまたは発現された遺伝子配列核酸へのハイブリダイゼーションのためのアレイ形式で用いることができる。本発明の方法で用いられるアレイ形式は、（１）特定のゲノムＤＮＡ配列または（２）特定の発現された遺伝子配列にそれぞれ相補的な別々の核酸標的要素のミクロアレイを含む。（１）に相補的な若干の標的要素および（２）に相補的ないくつかを含む標的要素混合物も用いることができる。
【００２８】
本発明の方法の顕著な利点は、遺伝子発現および染色体異常両方の同時決定である。Ｈｅｒ−２が関与する乳癌などの若干の攻撃的な悪性型の癌は、１種類またはそれ以上の癌遺伝子の過発現およびそれぞれの癌遺伝子の染色体遺伝子座の遺伝子増幅の両方を特徴とする。癌遺伝子だけの過発現について調べることは、疾患状態の完全な特性決定に不適切である。したがって、本発明の方法を用いる遺伝子発現および染色体異常両方についての同一組織試料の同時試験は、過発現および過発現の分子原因の両方を好都合に確認し、それによって適当な予後評価および療法選択を可能にする。
【００２９】
標的要素のゲノム、ｃＤＮＡまたは混合物の選択は、求められる組織および分析によって異なることがありうる。例えば、ｃＤＮＡ標的要素は、若干のゲノムＤＮＡ中に存在する反復配列の作用が減少し、発現される遺伝子のより正確な検出が可能であるので好都合である。ゲノムＤＮＡ標的要素は、より高い複雑度がより大きいシグナルを生じうるので好都合である。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ標的要素の混合物は、より詳細なゲノムおよび発現の分析を与えるのに用いることもできる。
（３）標的要素中の核酸
標的要素の核酸配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸またはそれらの混合物が含まれるが、それらに制限されるわけではない核酸または核酸類似体のいずれの種類も含むことができるし、ベクター配列も含むクローンとして存在しうるしまたは実質的に純粋でありうる。ペプチド核酸を含むアレイは、米国特許第５，８２１，０６０号，“ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈｉｐｓ  ａｎｄ  Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ，”Ｈ．Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓらで開示されている。
【００３０】
標的要素の核酸は、典型的に、ある選択されたゲノム（例えば、ヒトまたは動物のゲノムライブラリーからのクローンまたはいくつか隣接したクローン）の一定の部分にそれらの起原を有し、または完全であってよいしまたは完全でなくてよいある選択されたゲノム（例えば、完全または部分ｃＤＮＡ配列）の機能性遺伝子単位に相当する。それら標的核酸は、インターＡｌｕ、またはクローン化されたＤＮＡに由来する縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ産物を含むこともできる。
【００３１】
標的要素の核酸は、例えば、特定の遺伝子を含有することができるし、または目的の細胞、例えば、腫瘍細胞中に増加したまたは減少したコピー数で存在すると考えられる染色体部分に由来しうる。例えば、別々の標的要素は、下の表２に挙げられる癌遺伝子座それぞれに相補的なＤＮＡを含むことができる。その標的要素は、異常なレベルで転写されると考えられるｍＲＮＡまたはこのようなｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、例えば、下の表２の遺伝子座にマッピングされる発現された遺伝子を含有してもよい。
【００３２】
或いは、標的要素は、有意性または位置が知られていない核酸を含むことができる。このような要素のアレイは、完全なゲノム、１本の染色体または染色体の一部分が含まれるが、これらに制限されるわけではないゲノムのいずれか望ましい部分を連続してかまたは不連続地点でサンプリングする位置を示しうると考えられる。標的要素の数およびそれぞれの核酸の複雑度は、分析の密度を決定すると考えられる。例えば、それぞれの標的が異なったゲノムクーンからのＤＮＡを含有する３００個の標的要素のアレイは、完全なヒトゲノムを１０メガベース間隔でサンプリングしうる、すなわち、分析しうると考えられる。それぞれが１００ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する３，０００個の標的要素のアレイは、ヒトゲノムのユニーク配列部分の１メガベース間隔でほぼ完全な有効範囲を与えうると考えられる。同様に、アノニマスｃＤＮＡクローンからのまたは発現配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｓ；“ＥＳＴｓ”）に相補的な核酸を含む標的要素のアレイは、いくつかの目的の細胞中で異なって発現されるかもしれないそれら発現された遺伝子配列の識別を可能にし、それによって、これら遺伝子の研究または診断のための発現異常の確認に注意を集中させると考えられる。
【００３３】
当業者は、それぞれの標的要素が、異なった長さおよび配列を有する標的核酸の混合物を含むことができるということを理解するであろう。標的要素は、概して、クローン化されたまたは合成されたＤＮＡ片の２個以上のコピーを含むであろうが、それぞれのコピーは、異なった長さのフラグメントに破壊されうる。本発明の標的要素配列の長さおよび複雑度は、本発明には重要ではない。当業者は、これら因子を調整して、ある与えられたハイブリダイゼーション手順に最適なハイブリダイゼーションおよびシグナル生産を提供し且つ異なった遺伝子またはゲノム位置の中で必要な分解能を提供することができる。
【００３４】
それら標的要素は、広く利用可能な合成機を用いて容易に合成されうる８−約１００ｂｐ、好ましくは、２０−８０ｂｐ、そしてより好ましくは、約４０−約６０ｂｐの範囲のようなオリゴマーを含むことができる。標的要素中のオリゴマーは、当該技術分野において知られているようないずれかの方法によってアレイ基体上でインサイチオで合成することもできる。オリゴマー配列情報は、ＧＥＮＢＡＮＫなどの核酸配列データバンク、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（パロ・アルト，カリフォルニア州）製のＬＩＦＥＳＥＱなどの市販のデータベース、またはＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）の使用によって作成されるようなＥＳＴデータを含めたいずれかの好都合な源から得ることができる。オリゴマーまたは部分ｃＤＮＡ要素については、遺伝子のｍＲＮＡの一部分に相補的な、または遺伝子の識別可能な重要な配列（発現されたタンパク質、すなわち、受容体結合部位の機能性部分をコードする配列の意味で重要）に相補的な部分配列を合成することだけが必要である。
【００３５】
それら標的要素は、より小さいｃＤＮＡについては、合成されたかまたはクローン化された、好ましくは、約１００ｂｐ−約５，０００ｂｐの範囲の複雑度を有する部分または完全長さｃＤＮＡ配列を含むことができる。ｃＤＮＡ標的要素は、慣用法を用いて製造されるまたはＧｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（セント・ルイス，ミズーリ州）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ハンツビル，アラバマ州）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（サウス・サンフランシスコ，カリフォルニア州）によって維持されるライブラリーなどの市販の源から得られる、所望の組織からの発現された遺伝子配列ｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができる。
【００３６】
それらの標的要素は、任意の複雑度であるが、概して、約２０，０００ｂｐ−約２５０，０００ｂｐ、好ましくは、約５０，０００ｂｐ−約１７５，０００ｂｐの複雑度を有するゲノムＤＮＡ配列を含むことができる。ゲノムＤＮＡは、標準的なクローニング手順によって生産される任意のマッピングされたゲノムクローンから得ることができるし、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ロックビル，メリーランド州、以下ＡＴＣＣ）によって維持される染色体特異的ライブラリーなどの市販の源から得ることができる。好ましいゲノムライブラリー源は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって維持されるヒトＤＮＡ  ＢＡＣライブラリーである。
【００３７】
標的要素中で用いるのに選択されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの識別は、既知のまたは増幅された若しくは欠失したと確認される染色体配列の、または過発現されたまたは発現不足の遺伝子の位置によって決定することができる。ゲノムまたはｃＤＮＡクローンの識別は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｄｂｔｏｐ．ｈｔｍｌのＵ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅによって維持されるＧｅｎｅ  Ｍａｐ′９８の遺伝子データを用いてプライマー配列対を設計することによって行なわれる。例えば、Ｈｅｒ−２遺伝子は、約４０ｋｂのゲノム配列を含むと考えられ、ＰＣＲプライマー対は、公表されたｈｅｒ−２配列に基づいて設計することができる。次に、そのＰＣＲプライマー対またはＰＣＲアンプリコン産物を用いてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、相補的配列を含有するクローンを識別することができる。そのスクリーニングで識別されるゲノムＤＮＡクローンを、本発明の方法においてアレイ上で用いて、Ｈｅｒ−２遺伝子座のゲノム異常を識別することができる。
【００３８】
ヒトの遺伝的異常の検出と同時に、ウイルスおよびウイルス遺伝子発現を検出するアレイの使用について、標的要素は、既知のまたは識別されたウイルス配列に相補的な配列を含むことができる。それらアレイ標的要素は、ヒトまたは動物のゲノム中のウイルス組込み部位を検出するように設計することもできる。このような病原体アレイの使用は、例えば、ヒト子宮頸癌とヒトパピローマウイルス、およびヒト胃腸癌とｈ．ピロリ（ｐｙｌｏｒｉ）の既知の関係ゆえに、医学的に有意である。同様に、既知の細菌遺伝子配列を用いて、標的要素の核酸を設計することができる。病原体配列に基づくアレイの使用は、食品および環境の試験でも用いることができる。
（４）標的要素
標的要素は、種々の寸法、形状および面積を有することができる。それら標的要素は、プリント法、例えば、機械的転写、グラビア、インクジェットまたは捺印法によって生じる物理的に隔てられたスポットを含むことができる。それら標的要素は、米国特許第５，４４５，９３４号の写真平板インサイチオアレイ合成によって製造されるもののように、近くに隣接していることもできる。それら標的要素は、好ましくは、平面上の概して丸い形状である。概して、より小さい要素が好ましく、典型的な標的要素は、直径が５００ミクロン未満である。特に好ましい標的要素寸法は、高密度を得るように直径が約５ミクロン−２５０ミクロンである。
【００３９】
標的要素密度は、任意の望ましい密度でありうるが、好ましくは、核酸ミクロアレイに特有の、すなわち、標的要素約１００個／平方センチメートルより大きい密度である。ヒト疾患治療技術における好ましい使用には、標的要素密度は、好ましくは、チップ表面の１平方センチメートル当り約１００−約１０，０００個の標的要素の範囲である。より高いまたはより低い密度が望ましいことがあり、より高い密度は、より多数の発現された遺伝子配列の検査を可能にする薬物開発で用いるのに好ましいことがありうる。
（５）アレイ製造
ミクロアレイは、任意の望ましい方式で製造することができ、アレイ製造のためのロボット付着および合成インサイチオ法の両方が知られている。例えば、米国特許第５，４８６，４５２号、同第５，８３０，６４５号、同第５，８０７，５５２号、同第５，８００，９９２号および同第５，４４５，９３４号を参照されたい。ロボット付着方法および装置を用いてミクロアレイを製造することは好ましく、これは、１９８８年５月２７日出願の同時係属の同一譲渡人の米国特許出願第０９／０８５，６２５号，“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，”Ｍｕｌｌｅｒら（以下、“Ｍｕｌｌｅｒら”）で開示されたように、細管針またはピンによる核酸のロボット付着を用いて、クロムで被覆された基体上の列および段に固定される物理的に隔てられたすなわち“スポットの”標的要素の二次元ミクロアレイを生じる。
【００４０】
多数の細管針を含むロボットアプリケーターを用いることができる。異なった核酸の適用の間に洗浄されるピンを用いる、またはロボットピン交換器を用いる単針アプリケーターを用いることもできる。用いられる針は、好ましくは、３３ゲージ、１インチ長さステンレス鋼製細管注射針である。その針を核酸貯槽、好ましくは、Ｌｕｅｒロックシリンジ先端に連結させる。好ましい針および貯槽は、ＥＦＤ（イースト・プロビデンス，ロード・アイランド州）から商業的に入手可能である。それぞれ異なった核酸を付着している多数の細管針を用いることが好ましく、それによって、付着の間の洗浄工程が省かれる。
【００４１】
任意の適当な量の核酸をそれぞれの標的要素中に付着させるが、その標的要素寸法は、付着される量に依る。それぞれの標的要素について、その量は、１μｇ／μｌの核酸濃度の核酸溶液を約０．０５ｎｌ−約５．０ｎｌでありうる。標的要素１，０００個／ｃｍ2の密度について、標的要素当りの付着される個々の量は、１μｇ／μｌ溶液を約０．２ｎｌ−約２．０ｎｌである。核酸は、変性核酸の付着を可能にするであろう任意の溶媒中で与えられる。好ましくは、核酸は、１００ｍＭ  ＮａＯＨ中において１μｇ／μｌ濃度で与えられる。
【００４２】
ロボット製造を助けるために、自動追跡および標識の方法および装置を、例えば、特定の標的要素での付着に正しい核酸を供給する場合に用いることができる。例えば、異なった核酸を含有する細管ピンのバーコード化またはトランスポンダ標識または追跡は、所望の標的要素へ正しい核酸を確実に供給するのに有用である。バーコード化またはトランスポンダ標識の使用も、製造工程のより良い計算機制御を可能にする。
【００４３】
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ両方の標的要素を含むミクロアレイは、いずれの配置でも生じることができる。例えば、ｃＤＮＡ要素は、アレイの１か所に位置することができるし、またはゲノムＤＮＡ標的要素の中に散在することができる。平坦な基体表面上の二次元アレイの規則性は、容易な蛍光検出および分析を可能にするのに好ましいが、そのアレイは、いずれか望ましい配置で製造することができる。
【００４４】
個々の標的要素は、１回だけ生じることができるしまたは結果の分析に統計学的分析能を与えるように反復試験することができる。標的要素３，０００個／ｃｍ2の密度のアレイについて、それぞれの標的をそのアレイ上で３回反復試験するようにアレイを製造して、それら結果についてより良い較正を提供することが好ましい。出願人らは、１ｃｍ2未満の基体表面積のミクロアレイを用いる場合、それら反復試験片を、それら結果に重大な作用をもたらすことなく、互いに隣接してまたは分離して置くことができることを確認している。
【００４５】
好ましくは、個々のミクロアレイを、大型の基体プレートまたはウェファー上で製造し、これに、半導体産業で周知の手順を用いて個々のチップに分けるために刻みをつける。クロム被覆ガラスプレートまたはウェファーは、Ｎａｎｏｆｉｌｍ（ウェストレーク・ビレッジ，カリフォルニア州）から商業的に入手可能であり、慣用法を用いて刻みをつけることができる。したがって、多数のチップは、一つのロボットアプリケーターを用いて同一ウェファー上で一度に製造した後、個々のチップに分けることができる。プリントする前に、それらウェファーを、好ましくは、蒸留水、イソプロパノール、メタノールおよび蒸留水の洗浄を順に用いて洗浄する。窒素を用いて過剰の水を送風除去し、洗浄されたウェファーを乾燥させる。
【００４６】
好ましいＭｕｌｌｅｒら装置は、それぞれの核酸を付着させるために低空気圧の噴出を適用する細管ピンアプリケーターのためのＸ−ＹおよびＺ軸制御器を用いる。Ｍｕｌｌｅｒらの装置で適当なＺ軸制御器を用いて、細管ピンを基体表面と接触させないことは更に好ましい。その表面上、例えば、約１００μｍ上にピンの位置を定めることは、より良いスポットサイズ規則性およびより低い空気圧の使用を可能にする。
【００４７】
プリントを開始する場合、そのプレートまたはウェファーを室温まで平衡させる。次に、各チップのＺ軸高さを、ロボット制御器によって用いるために決定する。好ましくは、プリントは、並列調整のための各チップの一方の隅の３００μ直径“マーカー”スポットの付着で始める。窒素圧は低く、好ましくは、約１ｐｓｉまたはそれ未満であり、付着されるその粘度および量が与えられる特定の核酸を付着する十分な圧力である。窒素パルス長さは、概して、約１０ミリセカンドである。
【００４８】
種々の対照標的要素、例えば、（１）全ゲノムＤＮＡ、（２）ベクターＤＮＡ、（３）各標的要素からのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのプールされた混合物、（４）正常組織からの全ＲＮＡ、または（５）既知の異常がある組織からの全ゲノムまたはｃＤＮＡを含む標的要素などを含むことも好ましい。それら対照標的要素は、それぞれが特定の発現された遺伝子またはゲノム配列の既知のコピー数の核酸を含む一連の標的要素を含むこともできる。例えば、ヒトＸ染色体の１、２、３、４および５コピーを含む細胞系から抽出されたゲノムＤＮＡを用いることができる。
【００４９】
好ましいロボット付着製造の品質管理には、製造されたアレイを、立体顕微鏡およびＣＣＤカメラを用いて画像化することが好ましい。各チップの画像を捕捉し且つ分析する。失われた、寸法を誤ったまたは形の歪んだ標的要素を有するチップを識別し、印をつける。
【００５０】
クローン化ｃＤＮＡまたはクローン化ゲノムＤＮＡを用いる場合、ベクター配列は、いずれか適当な処理で付着する前に除去することができるし、またはそれらがハイブリダイゼーションを有意に妨げないならば保持することができる。クローン化ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡには、ベクター配列を除去しないことが好ましい。
【００５１】
米国特許第５，４４５，９３４号および同第５，８０７，５５２号で開示されたものを含めたいずれか適当な基体を用いることができる。その基体は、例えば、ガラス；ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホンおよびポリエステルなどのプラスチック；クロムおよび銅などの金属；金属被覆基体；および任意の材料のフィルターでありうるが、これらに制限されるわけではない。固定された核酸を有する基体表面は、好ましくは平坦であるが、アレイ標的要素を隔てる、例えば畝および溝を有する基体を含めたいずれか望ましい表面を用いることができる。それら核酸は、別個に識別可能であるビーズに結合させることもできる。Ｍｕｌｌｅｒらの平坦なクロム被覆ガラス基体が好ましい。
【００５２】
標的要素の核酸は、それらをハイブリダイゼーションに利用可能にさせる共有結合または非共有結合を含めたいずれか適当な方式で基体に結合させることができる。Ｍｕｌｌｅｒらの非共有結合法が好ましい。
（６）組織核酸
核酸集団は、ヒト、植物および動物の組織を含めた任意の組織源に由来しうる。その組織試料は、新規に得られた試料、凍結試料、生検試料、血液試料、羊水穿刺試料、パラフィン包埋固定組織試料などの保存組織（すなわち、組織塊）、または細胞培養物を含めた任意の組織を含む。したがって、その組織試料は、全血試料、皮膚試料、上皮細胞、軟組織細胞、胎児細胞、羊膜細胞、リンパ球、顆粒球、疑わしい腫瘍細胞、器官組織、割球および極体を含むことができる。検査される組織は、顕微解剖から得られて、より均一な細胞集団を生じることができる。パラフィン固定組織は、ろうを除去するいずれか適当な処理で予め処理されるが、パラフィン前処理キットは、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。体外受精操作中に検査されるヒト割球細胞などの単細胞を含めた任意の適当な量の組織を用いることができる。母親の血液試料から分離されるヒト胎児細胞を調べる場合のように、１個だけまたは数個の細胞が入手できる場合、核酸の量を増幅させる核酸増幅技術を用いることができる。
【００５３】
組織に由来する核酸集団は、いずれか適当な核酸分離法または精製法によって製造する。ゲノムＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ両方の核酸分離法は、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮＡ単離用ＱＩＡａｍｐ組織キットなどが商業的に入手可能である。例えば、ｍＲＮＡは、組織から抽出した後、逆転写酵素での処理によってｃＤＮＡに変換することができる。不十分なｃＤＮＡしか入手できない場合、そのｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができる。この周知の方法は、ＲＴ／ＰＣＲと称される。ｃＤＮＡを相補的ＲＮＡ（“ｃＲＮＡ”）に変換することも可能である。
【００５４】
概して、組織から約１００万個を越える細胞が入手できる場合、組織核酸を抽出し、そして増幅させることなく用いることができる。約１００万個未満の細胞しか入手できない場合、好ましくは、核酸増幅または濃縮を用いる。好ましくは、このような増幅技術はＰＣＲである。ＰＣＲでは、混入する何等かの人為物を避けるまたは識別するように注意し且つ適当に管理すべきである。
（７）対照核酸
対照核酸集団は、対照として役立つように選択される任意の適当な核酸集合物である。例えば、対照集団は、正常組織からの全ヒトゲノムＤＮＡ、検査され且つｃＤＮＡに変換される組織の正常試料から抽出される全ｍＲＮＡ、または特定の発現される遺伝子の合成または天然に存在するｃＤＮＡ混合物でありうる。対照はｃＲＮＡ集団でありうる。対照は、制御分析を可能にする“内標準化された（ｓｐｉｋｅｄ）”既知量の特定のゲノムまたはｃＤＮＡ配列を含むこともできる。
（８）標識付け
用いられる標識は、いずれの検出法によっても検出可能な任意の適当な非放射性マーカーでありうる。例えば、それら標識は蛍光分子でありうるし、またはタンパク質、ハプテンまたは酵素でありうる。更に、スズのいろいろな同位体のような“質量スペクトル”標識は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス介助レーザーデソープションイオン化）などのレーザー分離および質量分析法によって、アレイへのハイブリダイゼーション後に容易に検出することができる。Ｗｕら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６，１６３７（１９９４）およびＷｕら，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，７，１４２（１９３３）を参照されたい。好ましくは、それら標識はそれぞれ、フルオレセイン、テキサスレッドおよび５−（および６−）カルボキシテトラメチルローダミンのような、広範な“クロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）”補正を必要とすることなく互いに容易に区別されるように充分にスペクトルが分離している蛍光マーカーである。核酸への結合に有用な蛍光標識化合物の広範なリストは、米国特許第５，４９１，２２４号，“Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，”Ｂｉｔｔｎｅｒらで明らかである。使用に適した蛍光化合物は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ（ユージーン，オレゴン州）から商業的に入手可能である。フルオレセインで標識されたアビジンなどの蛍光タンパク質との接触によってアレイへのハイブリダイゼーション後に蛍光標識される、ビオチンおよびフィコエリトリンのような間接標識も用いることができる。
【００５５】
１種類または複数の対照集団、および組織核酸集団は、末端標識、ニックトランスレーションまたは化学形質転換などによるいずれか適当な方法で標識される。好ましくは、ＲＴかまたはＰＣＲ処理中に、標識組込み工程を用いて、得られたｃＤＮＡを望ましい蛍光色で標識する。分離された染色体ＤＮＡは、末端標識、ニックトランスレーションおよび化学標識を含めたいずれか適当な標識化学を用いて標識することができる。ニックトランスレーションを用いて、蛍光ｄＵＴＰまたはｄＣＴＰを用いる適当な蛍光色で染色体ＤＮＡを標識することは好ましい。適当な蛍光標識されたｄＣＴＰの製造は、以下、“Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ”と称されるＫ．Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，”（印刷中）で開示されている。
適当なニックトランスレーションキットは、商業的に入手可能である。
【００５６】
好ましくは、対照集団としての全ヒトゲノムＤＮＡの使用には、米国特許第５，５０６，３５０号，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏｎ，”Ｂｉｔｔｎｅｒらで開示されている重亜硫酸塩触媒アミノ交換法によって標識付けを行なう。このような方法で標識された全ヒトゲノムＤＮＡは、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（ダウナーズ・グローブ，イリノイ州）から商業的に入手可能である。
【００５７】
用いられる標識法は、核酸への発蛍光団の直接結合を用いる場合、好ましくは、約０．３−約６．０モル％標識ヌクレオチドの核酸集団それぞれの標識含量をもたらす。用いられる標識組織核酸および対照核酸それぞれの量は、好ましくは、約１００ｎｇ−約１μｇ、好ましくは、約３００ｎｇ−約４２５ｎｇの範囲である。
（９）アレイハイブリダイゼーション
組織および対照核酸集団を、適当なハイブリダイゼーション条件下、すなわち、ストリンジェンシーで、単コピーゲノム配列のハイブリダイゼーションの検出を可能にするように選択される一定時間、アレイにハイブリッド形成させる。そのハイブリダイゼーション条件には、緩衝液、ホルムアミドなどの変性剤、塩添加剤および促進剤の選択が含まれる。ＬＳＩ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）などの、ホルムアミドおよび硫酸デキストランを含有する規定のｐＨおよび塩類条件のハイブリダイゼーション緩衝液は、商業的に入手可能である。緩衝液は、好ましくは、約６．８−約７．２のｐＨ、約１．５×ＳＳＣ−約２．５×ＳＳＣの塩分、および約４０−５０％のホルムアミド含量を有する。適当な条件には、約４０−約８０摂氏度の温度、およびゲノムおよび発現両方のバックグラウンドを越えるシグナルを検出するのに充分な時間、約１−約７２時間、好ましくは、１２−２４時間が含まれうる。硫酸デキストランなどのハイブリダイゼーション促進剤は、所望ならば用いることができる。組織および核酸集団を全ての標的要素と接触させる適当な拡散が必要である。これは、単純な拡散によって、或いは揺動などによる機械的混合、またはアレイが入っているハイブリダイゼーション室を出入りする標識集団の微量流体ポンプ輸送などによる流体拡散を含めたいずれか適当な手段を用いて拡散を促進するまたは拡散限界を克服することによって達成できる。ハイブリダイゼーション後洗浄は、好ましくは、ハイブリダイゼーションの場合より大きいストリンジェンシーにおいて行われる。
【００５８】
ヒトゲノムＤＮＡ標的要素を含むアレイを用いる場合、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＣｏｔ１  ＤＮＡなどの過剰の未標識ヒト反復配列ＤＮＡをハイブリダイゼーション混合物に加えて、組織核酸集団中または用いられるならば対照ゲノムＤＮＡ中に存在する標識反復配列のハイブリダイゼーションから得られる非特異的シグナルを抑制することも好ましい。未標識反復配列ＤＮＡの使用は、概して、全標識ゲノムＤＮＡ（組織および対照両方）１ｎｇ当り約０．０２−約５．０μｇ、好ましくは、全標識ゲノムＤＮＡ１ｎｇ当り約０．１−約０．５μｇの量である。
【００５９】
ハイブリダイゼーションは、アレイと接触しているそれら集団を適当な時間維持するであろういずれか適当な装置中で行なうことができる。例えば、標識集団をアレイに加え、カバースリップで覆った後、オーブン中において予め選択された温度でインキュベートすることができる。好ましくは、その底面とアレイ基体上部との間に望ましいハイブリダイゼーション容積を与えるように設計されたカバースリップを用いる。標識集団は、１９９６年２月７日公開の欧州特許出願第０６９５９４１Ａ１号，“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒＰａｃｋａｇｉｎｇ  ａ  Ｃｈｉｐ，”で開示されたような密封カートリッジ装置中に含有されたアレイに微量流体注入および循環によって加えることができる。ハイブリダイゼーションは、１９９７年１月２３日公開のＰＣＴ特許出願第ＷＯ９７／０２３５７号，“Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ，”で開示されたような小形ハイブリダイゼーションおよび検定チップで行なうこともできる。このような小形チップは、中規模で製造される、すなわち、１０-8および１０-9リットルの量で測定される流路および反応室の容積を有して製造されるといわれる。
【００６０】
図１−５は、好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの成分を示す。図１は、第一成分であって、ミクロアレイ３２の固定された核酸標的要素３１を含有するクロム被覆ガラス“チップ”３０を示す。ミクロアレイ３２は、好ましくは、示されているようにチップ３０の中心に位置する。好ましい形式において、チップは、２５．４ｍｍ長さ×１６．９３ｍｍ幅×０．７ｍｍ厚みであり、ミクロアレイは１０．５ｍｍ長さ×６ｍｍ幅の面にわたる。図２で示される第二成分は、“アレイ窓”３４の四角および円形の２種類の別の形状で示される“プローブクリップ”３３である。プローブクリップ３３は、いずれか適当な材料、好ましくはプラスチックから製造することができる。アレイ窓３４は透明な材料から成り、ミクロアレイを容易に画像化させるような位置および大きさである。プローブクリップ３３は、ハイブリダイゼーション室を形成し、保持装置および保護カバーとしてアレーの上にぴったり適合している。好ましくは、アレイ窓３４は、直径１．２７ｍｍで、２５．４ｍｍ長さ×１６．７６ｍｍ幅のプローブクリップ３３の中心に位置する。
【００６１】
図３および４は、第四成分であるチップホルダー３６の平面図および側面図であり、これは好ましくは、物理的安定性を損なうことなく必要なハイブリダイゼーション温度に耐えることができる耐衝撃性ポリスチレンなどの頑丈な射出成形可能プラスチックから製造される。チップホルダー３６は、チップを保持するのに望ましい任意の寸法でありうるが、好ましくは、２５．４ｍｍ幅×７６．２ｍｍ長さ×３．２ｍｍ厚みである。示されているように、一方の先端近くに、チップホルダー３６は、ミクロアレイ３２を有するチップ３０を許容する大きさの、好ましくは、２６ｍｍ長さ×１８．５ｍｍ幅×１．７ｍｍ深さのキャビティ３７を含有する。キャビティ３７は、その長さに沿って両側に僅かに、好ましくは、０．５ｍｍ広くなって、アクセスギャップ３８を作り、プローブクリップおよび顕微鏡カバースリップの一層容易な着脱を可能にする。キャビティ底面には、浅い溝の刻みをつけて、チップを適所に保持するように考案された接着剤または固定剤の塗抹を容易にする。キャビティ３７の反対側の端のチップホルダー３６は、その上面のホルダーの幅に沿って微かに刻みをつけて、使用者がより把握しやすい表面を与えることができる。チップホルダー底部は、アレイ読取り機での並列を容易にするように溝を刻むことができる。
【００６２】
完成したカートリッジの製造においては、望ましい標的要素を含むミクロアレイを上記のように製造した後、いずれか適当な接着剤でキャビティ３７の底部に接着する。次に、そのアレイを有するチップホルダー３６を収縮包装し、プローブクリップ３３、アレイ画像化で用いられるカバースリップ、および核酸を標識する若しくは抽出するおよび／またはハイブリダイゼーションを実施するための任意の他の望ましい試薬と一緒にキット中に密閉する。本発明の方法を行なうために、使用者は、適当な緩衝剤および標識核酸集団（対照および組織）を含むハイブリダイゼーション溶液をミクロアレイ表面に適用し、プローブクリップ３３をそのミクロアレイの上に置く。完成したカートリッジを図５で示す。図５で更に重なって示されているのは、Ｃｈｅの好ましい画像化システムのカメラ視野３５である。次に、そのカートリッジを、オーブン中において望ましい湿度調整を用いて望ましいハイブリダイゼーション温度で所望の時間インキュベートする。
【００６３】
ハイブリダイゼーションが完了したら、プローブクリップ３３を除去し、そのチップを望ましいストリンジェンシーで、好ましくは、順に、２×ＳＳＣを用いて室温で５分間、２×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを用いて４０℃で３０分間、および２×ＳＳＣを用いて室温で１０分間洗浄して、ハイブリッド形成したプローブを除去する。Ｇｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｇａ，フォスターシティー，カリフォルニア州）およびＤＡＰＩをアレイに適用し、１８ｍｍ×１８ｍｍガラス顕微鏡カバースリップを、まだホルダー３６中にあるアレイ上に密封する。次に、カバーされたチップを画像化して、ハイブリダイゼーション結果を検出する。
（１０）アレイ検出
ハイブリダイゼーション後、それぞれの標識色について蛍光の存在および強度を、いずれか適当な検出器または読取り装置および方法によって検出し且つ測定する。レーザーによるアレイ走査検出器は、当該技術分野で知られている。米国特許第５，５７８，８３２号，“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ  ｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ，”Ｔｒｕｌｓｅｎらを参照されたい。アレイハイブリダイゼーションの光導波管検出法も開示されている。米国特許第５，８４３，６５１号，“Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｖｅｎｔｓ，”Ｄ．Ｓｔｉｍｐｓｏｎらを参照されたい。好ましくは、１９９８年３月２７日出願の同時係属、同一譲渡人の米国特許出願第０９／０４９，７９８号，“Ｌａｒｇｅ−Ｆｉｅｌｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ，”Ｄ．Ｃｈｅ（以下、“Ｃｈｅ”と称する）で開示されたような大視野画像化装置および方法を用いる。
【００６４】
Ｃｈｅの大視野蛍光画像化装置は、高電力白色光源によって生じる励起ビームをミクロアレイ表面上につなぐ反射光学素子を用いて高い照度を与え、その高い照度をアレイ検出器の高検出効率と組合せて高画像捕捉率を与える。光源によって生じる白色光を平行にし、計算機制御フィルターを通して励起ビームを与える。その励起ビームは、視野絞りを通過して明瞭なビームパターンを形成した後、凹面鏡を用いてアレイ表面上に投映される。その凹面鏡は、試料上の視野絞りを画像化するように配置されて、画像化光学素子の視野に対合する照明範囲を画成する。試料中で生じる蛍光は、励起色の散乱光を排除するように色フィルターを通され、そして画像化光学素子によってアレイ検出器上に画像化されて試料の蛍光画像が得られる。
【００６５】
アレイ画像化装置および方法は、画像化装置からのディジタル画像データのデータ分析、記憶および表示のために、プログラム化された計算機で用いられるディジタル画像処理アルゴリスムを用いることができる。いずれの適当なディジタル画像処理、データ記憶および表示ソフトウェアも、アレイハイブリダイゼーション結果の分析に用いることができる。ディジタル画像化法は、例えば、米国特許第５，６６５，５４９号，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”Ｋａｌｌｉｏｎｅｍｉらおよび米国特許第５，８３０，６４５号で開示されたように、当業者に知られている。
【００６６】
ハイブリダイゼーション画像は、好ましくは、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ（スコッツデール，アリゾナ州）製のＰＳＩインタフェースＳｅｎＳｙｓ１６００  Ｃａｍｅｒａなどの、検出光学素子から直接的に大視野画像を受像する高解像度ディジタル画像化カメラの使用によって捕捉され且つ分析される。他のいずれか適当なカメラも用いることができる。カメラによって捕捉された生画像データをいずれか適当な計算機データベースまたはデータ記憶ファイル中に記憶する。その生画像データを、適当な画像分析アルゴリズムを用いて処理し、ミクロアレイのそれぞれの標的要素でのマーカー強度を測定する。画像分析アルゴリズムは当業者に周知であり、多数のこのようなアルゴリズムのパッケージは、ＩＰＬａｂとしてＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓ（フェアファックス，バージニア州）から入手可能である。
【００６７】
好ましくは、画像分析アルゴリズムは、適当な計算機ソフトウェアで実行される次の操作を行なう。（ｉ）必要に応じたバックグラウンド補正；（ｉｉ）個々のアレイ要素の識別のためのアレイ標的要素すなわち“スポット”のセグメンテーション；（ｉｉｉ）各スポットへの段数および列数のスポットグリッド割当て；（ｉｖ）有効性および人工物の存在の検証、反復試験スポットのデータの平均化、全スポットからのデータの規格化、および多重実験比較および分析を含めたスポットデータ分析；（ｖ）それぞれの蛍光マーカー色の全強度、平均ＤＡＰＩ対比染色強度、蛍光強度の画素当りの比率の平均、モード、メディアンおよび相関係数、および“質量比”と称される、全組織核酸マーカー強度対対照強度の比率を含めた単スポット計算値；（ｖｉ）スポットの有効反復試験数、スポット当りの質量比の平均および変動係数、および全スポットにわたる画素当り比率の相関係数を含めた標的要約分析。好ましくは、用いられる画像分析は、窓に基づくモード推定値を用いてモード値が１．００であるように平均質量比を規格化する。
【００６８】
各標的要素での蛍光データを自動的に比較して、任意の望ましい組織および対照間のまたは組織間の比率を生じることができる。例えば、４種類の組織核酸（一次腫瘍ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、および転移ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）を２種類の対照（その腫瘍と同種の細胞の正常組織からの全ゲノムおよび全ｃＤＮＡ）と一緒に用いる場合、少なくとも８種類の異なった比率を計算することがありうる（それぞれの組織でそれぞれの対照の比率）。
【００６９】
画像分析は、好ましくは、（ｖｉｉ）飽和組織または対照色チャネルを有する画素を含むスポットの排除；（ｖｉｉｉ）排除のためのスポット寸法および形状判定基準；および（ｉｘ）域値未満の相対係数を用いるスポットの“関連係数”排除を含めた、個々の使用者による有効分析についての判定基準設定の方法も含む。アレイデータ分析は、個々の試験からのデータを、疾患の遺伝子型および表現型を含有するデータベース（すなわち、特定の疾患についての遺伝子発現および染色体異常のリスト）と比較する比較アルゴリズムも含むことができ、個々の試験結果に基づいて可能な診断または療法の選択を決定することができる。
【００７０】
好ましくは、画像分析は、例えば、計算機モニタ表示および計算機印刷について当業者に知られているような計算機表示および印刷アルゴリズムを用いる。データ表示は、組織および対照核酸の個々の蛍光色について使用者によって選択される“プソイドカラー”画像を含むことができる。アレイデータ表示は、慣用的な染色体イディオグラムの表示を用いて、本発明の方法によって確認される一層明確な詳細染色体異常および発現遺伝子異常に結びつけることができる。典型的なイディオグラムについては、米国特許第５，６６５，５４９号の図９を参照されたい。好ましくは、アレイデータは、更に、分析から排除されるスポットに、使用者が容易に識別するための印をつけるように表示される。これは、“誤差色”中のまたは周りに着色環を有するその標的要素を表示することによって行なうことができる。
【００７１】
好ましい実施態様において、アレイ読取り機およびソフトウェアは、（１）ＤＡＰＩ対比染色（青）、（２）組織ＤＮＡ（緑）、（３）組織ｃＤＮＡ（赤）および（４）対照ＤＮＡ（橙）に特異的なそれぞれのチップの４種類の画像を自動的に捕捉する。これら画像を着色面と称する。しかしながら、より多くのまたは異なった着色面の画像を得ることができる。ソフトウェアの画像分析部分は、好ましくは、標的要素およびそれらのグリッド中の位置を識別する色（好ましくは、ＤＡＰＩ画像）の一つを用いる。全てのスポットがいったん識別されたら、そのソフトウェアは、それぞれのスポット下のそれぞれの画素を残りの着色面それぞれの強度について分析する。適当なアルゴリズムを用いて、これら着色面それぞれの局所バックグラウンドを測定した後、これをそれぞれの色の全強度から差し引く。次に、バックグラウンドで補正された強度を、特定の標的スポットまたはスポット群下の全ての画素について平均することができ、この画素当りの平均強度（例えば、ＤＡＰＩ強度についてＡ、組織ＤＮＡ強度についてＢ、組織ｃＤＮＡ強度についてＣおよび対照強度についてＤ）を様々な分析に用いることができる。
【００７２】
例えば、強度Ａは、ＤＡＰＩ染色の強度が、標的スポットにおいて結合したＤＮＡの全量の関数であるので、標的スポット品質の指示薬として用いることができる。Ａについてある値未満（制御染色条件下）での標的要素ＤＮＡの量は、速度限界になりうる。対照ＤＮＡの強度Ｄは、この試薬が、好ましくは、所定の濃度で与えられ且つ品質管理されているので、ハイブリダイゼーション効率の指示薬として用いることができる。
【００７３】
好ましい分析において、最も重要な情報は、バックグラウンドで補正された対照強度に対するバックグラウンドで補正された組織強度の比率、すなわち、上の実施例に関して、Ｂ／ＤおよびＣ／Ｄの比率である。２種類以上の対照を用いる場合、追加の比率は、有益なデータを与えるように得ることができる。これらの比率は、スポット群、単スポット、またはそれぞれのスポット下のそれぞれの画素について決定することができる。
【００７４】
最も好ましい態様においておよび上に挙げた例に関して、Ｂ／ＤおよびＣ／Ｄ強度比は、それぞれの画素について決定されるが、これは、いずれの色でもそれらの絶対強度とは無関係なはずである。言い換えると、Ｂ対Ｄのプロットは、例えば、それぞれのスポット下のそれぞれの画素について、直線の周りにばらつきを生じるはずであり、バックグラウンド補正が適切であるとしても、ＸおよびＹ軸両方と０で交差するはずである。（適当なアルゴリズムは、デイスプレイ中のある与えられた標的スポットまたはスポット群の上で“クリックすること”によってこのようなプロットを生じることができる。）このプロットは、２種類の情報を示している。
【００７５】
第一に、線型回帰線の周りのばらつきの量は、データの品質を示すものであり、統計学的に評価して、理想的なスポットについては１である（すなわち、全ての画素値が回帰線上に来る）相関係数を生じることができる。１未満の値は、完全なデータより劣ることを示し、０．８またはそれ未満の値は、好ましくは、このようなスポットからのデータを疑わしいと考えるべきであるということを示すものとされる。このばらつきスポットは、単スポットまたはスポット群について生成することができる。第二に、この回帰線の勾配は、ある与えられたスポットまたはスポット群について、それぞれＢ／ＤまたはＣ／Ｄ強度比である。
【００７６】
所望の生物学的情報を抽出するために、そのＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比を、好ましくは、対照スポットまたはスポット群に関して規格化するが、これら比率を、試験プローブ混合物中の既知のレベルのＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相関させることができる。これは、次のように行なわれる。
【００７７】
ゲノムＤＮＡの分析には、組織ＤＮＡ配列の大部分が、それらの標準コピー数、すなわち、ゲノム当り２個（試験組織が男性ドナー由来である場合、性染色体からの配列を除く）で実際に存在していると仮定する。対照ＤＮＡについては、これが全ての配列（対照ＤＮＡが男性ドナー由来である場合、ＸまたはＹ染色体からのものを除く）について真であると仮定する。これらの仮定に基づいて、ソフトウェアは全ての標的スポットのＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比を比較し、極めて類似していると思われる比率群を選択する。この比率群は、試験組織中で標準である標的を示すと仮定され、その比率の平均を用いて他の比率を全て規格化する。言い換えると、全てのスポットのＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比を、この“標準群”の平均Ｂ／ＤまたはＣ／Ｄ比それぞれで割る。したがって、全ての標準スポットのＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比は１に近づくはずであるが、異数体である（２より大きいまたは少ないコピー数で存在する）標的からのＢ／ＤまたはＣ／Ｄ比は、約０．５またはそれ未満（欠失）または１．５以上（付加または増幅）であろう。
【００７８】
本発明の同時の発現およびゲノム分析組合せは、上記の比率を次のように用いることによって遺伝子コピー数への発現レベルの相関を可能にする。
【００７９】
Ｂが組織ゲノムＤＮＡの強度であり、Ｃが組織ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の強度であり、そしてＤが対照ゲノムＤＮＡの強度である検定を行なったと仮定する。次に、得られる比率は次のようである。
（Ｂ／Ｄ）＝バックグラウンドで補正された平均画素強度比
（Ｂｇ／Ｄｇ）＝“標準”組のバックグラウンドで補正された平均画素強度比
（Ｂ／Ｄ）／（Ｂｇ／Ｄｇ）＝規格化されたＢ／Ｄ比＝Ｂｎ／Ｄｎ
（Ｃ／Ｄ）＝バックグラウンドで補正された平均画素強度比
（Ｃｇ／Ｄｇ）＝“標準”組のバックグラウンドで補正された平均画素強度比
（Ｃ／Ｄ）／（Ｃｇ／Ｄｇ）＝規格化されたＣ／Ｄ比＝Ｃｎ／Ｄｎ
Ｂｎ／Ｄｎ比は、ある与えられた標的配列のゲノムコピー数を示し、Ｃｎ／Ｄｎ比は、ゲノム配列当りのｍＲＮＡコピーの相対数を示し、Ｃｎ／Ｂｎ比は、相対ｍＲＮＡコピー数が、ゲノムコピー数変化の相対変化と相関するかどうかを示すと考えられる。
（１１）アレイの例
本発明の方法において有用なミクロアレイの種類を代表するものは、反復試験片を含まない約１００個の標的要素の出生前アレイであって、これは、（ａ）（ｉ）全ヒトテロメアおよび（ｉｉ）全ヒト動原体（腕ｐおよびｑ双方から得られる）の反復配列領域のすぐ隣のユニーク配列領域；（ｂ）ディ・ジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）、スミス・マジェニス（Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ）、ダウン（Ｄｏｗｎｓ）、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、ヴェロカルディオフェイシャル（Ｖｅｌｏｃａｒｄｉｏｆａｃｉａｌ）、アラジル（Ａｌａｇｉｌｌｅ）、ミラー・ディーカー（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ）、ウォルフ・ヒルシュホルン（Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ）、ネコ鳴き（Ｃｒｉ  ｄｕ  Ｃｈａｔ）、ネコ眼（Ｃａｔ  Ｅｙｅ）、ランガー・ジーディオン（Ｌａｎｇｅｒ−Ｇｉｅｄｉｏｎ）、カルマン（Ｋａｌｌｍａｎｎ）およびプラーダー・ヴィリ（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ）／アンジェルマン（Ａｎｇｅｌｍａｎ）症候群の“微少欠失”症候群領域；および（ｃ）ステリルスルファターゼ欠損症、筋ジストロフィーおよび男性不妊症で確認される欠失領域からのゲノムＤＮＡ配列、およびそれぞれの染色体上のサブテロメアのユニーク配列領域の欠失を伴う精神遅滞につながると考えられるものを含む。
【００８０】
表１は、このようなアレイにおいて有用なヒトゲノムＤＮＡクローンを挙げる。この出生前アレイは、遺伝病を引起こす多数の粗大染色体変化を確実に検出するその能力ゆえに、強力な医学的有用性を有する。ヒト出生前アレイは、割球および極体についての出生後試験、胎児細胞試験および着床前遺伝子試験についても有用である。表１には、染色体遺伝子座およびそれぞれの遺伝子座に相関する疾患が含まれる。
【００８１】
【表１】
0004537520.tif 000002
【００８２】
【表２】
0004537520.tif 000003
【００８３】
【表３】
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【００８４】
【表４】
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【００８５】
もう一つの例は、表２で挙げられる５２種類の癌遺伝子座または増幅遺伝子座それぞれのゲノム配列を含有するＡｍｐｌｉＯｎｃTMゲノムＤＮＡ標的要素アレイである。
【００８６】
【表５】
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【００８７】
【表６】
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【００８８】
【表７】
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【００８９】
表２で挙げられたクローンに由来するゲノムＤＮＡ標的要素は、ＰＡＣ、Ｐ１またはＢＡＣベクター中の約５０ｋｂ−約２００ｋｂのヒトゲノムＤＮＡインサートを含有する。このアレイは、ベクター配列を分離することなく製造される。このアレイの使用は、これら癌遺伝子座それぞれのゲノム増幅、更には、これら領域をマッピングする遺伝子の発現の同時識別を可能にする。
【００９０】
さらに別の例は、ＡｍｐｌｉＯｎｃＩＩアレイであり、これは、ｐ５３、ＲＢ１、ＷＴ１、ＡＰＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＭＥＮ１、ＭＥＮＺＡ、ＤＰＣ４、ＭＳＨ２、ＭＣＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、Ｐ５７／ＫＩＰ２、ＰＴＣＨ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｐ１６／ＣＤＫＮ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＡＴＭおよびＴＰ７３遺伝子のヒト腫瘍サプレッサー遺伝子座からのゲノムＤＮＡによって補足された表２の癌遺伝子座からのゲノムＤＮＡを含有する。それらゲノムＤＮＡ標的要素は、ヒトゲノムライブラリーからこれら腫瘍サプレッサー遺伝子の遺伝子座をマッピングするゲノムＤＮＡクローンを選択することによって製造される。この選択は、遺伝子座または遺伝子からのＰＣＲプライマー対の製造、および引続きクローンを識別するライブラリースクリーニングによって行なわれる。この実施態様において、腫瘍サプレッサー遺伝子座のクローンは、約２０ｋｂ−２５０ｋｂの複雑度でありうるが、好ましくは、約５０ｋｂ−約２００ｋｂである。
（１２）発明の有用性
本発明の方法は、遺伝的研究、ヒト疾患治療技術、ヒト疾患臨床研究、ヒト疾患薬物開発および薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ヒト遺伝子研究、動物用薬物開発、動物疾患治療技術、動物遺伝子研究、および植物遺伝子研究の分野でかなり有用である。特に、疑わしい癌組織をより正確に遺伝的に詳しく説明可能にすることにより、本発明は、より注文通りの診断および療法選択によって改良された疾患治療技術を提供するであろう。それら方法は、ウイルスの存在、染色体中へのウイルス組込み、およびウイルス遺伝子の発現を確認するのに用いることもできる。その方法を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ異常、ヒト遺伝子発現、および細菌遺伝子の遺伝子発現を同時に検出することもできる。
【００９１】
本発明の方法は、癌および他の疾患のゲノム疾患治療技術に特に有用である。
例えば、それら方法は、乳癌、前立腺癌、肺（小細胞または非小細胞）癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、頭部および頸部癌、膵臓癌、胃癌、脳癌、軟組織および皮膚癌、および白血病およびリンパ腫などの様々な血液またはリンパ系癌を含めた癌の遺伝子型および表現型を分類するのに有用である。腫瘍組織遺伝子型および表現型が本発明の方法によっていったん分類されると、医師は、このデータを他の臨床データと組合せて、診断、予後、療法および療法への予想応答を決定することができる。
【００９２】
本発明の多色法によって与えられる性能は、薬物開発における迅速な比較試験を可能にする。例えば、癌細胞系に推定上の薬物化合物を用いて且つ望ましい時間間隔で投薬することができ、その後、細胞試料を取出すことができる。取出される細胞試料をそれぞれ、例えば、投薬後０時間、１０時間、２０時間および３０時間に集め、核酸抽出処理をした後、核酸を別々のフルオル（ｆｌｕｏｒ）でそれぞれ標識する。次に、それら４種類の集団を適当な対照と一緒にアレイに適用する。このようにして、発現および初期染色体状態への薬物の経時追跡作用を評価する。染色体変化は、概して、より長期間にわたって起こり、この実施例中に変化するとは考えられない。その方法は、特に、遺伝子増幅によって薬物耐性を生じることがありうるような薬物耐性細胞系において薬物効力を評価するのに適用することもできる。
【００９３】
【実施例】
次の実施例は、本発明を単に詳しく説明するためのものであり、制限すると解釈すべきではない。
実施例１
（Ａ）方法
（ｉ）試験アレイ製造：４インチ×４インチのクロム被覆プレート（Ｎａｎｏｆｉｌｍ）は、Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（エルジン，イリノイ州）によって刻みをつけられ、その刻みは２４の等寸のチップに印をつけた。１８０標的要素ミクロアレイをそれぞれのチップ上に製造した。核酸付着の前に、そのプレートを、蒸留水、イソプロパノール、メタノールおよび蒸留水で連続して洗浄し、乾燥させ、室温まで平衡させた。そのミクロアレイは各チップの中央に置かれ、チップ表面の約５ｍｍ×６ｍｍを占めた。そのミクロアレイは、Ｎｅｗ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ノースブルック，イリノイ州）によって供給された計算機制御された単針流体付着ロボットを用いて製造された。そのロボットは、レーザーによるＺ軸制御器、付着ピンに掛けられた圧力調整用窒素ガスライン、および１２個の４″×４″プレートを保持する大きさの定盤を加えることによって変更された。そのロボットは、ＥＦＤ製のＬｕｅｒロックシリンジ先端に連結されたそれぞれが３３ゲージ、１インチ長さの鋼製細管注射針である多数の付着ピンを用いた。それら細管ピンにはそれぞれ、異なったゲノムＤＮＡを針のルア（Ｌｕｅｒ）ロック部分に充填することによって充填した。その針は、定盤上の全てのチップ上にそれぞれの標的要素を付着後に手動によって交換した。ミクロアレイは、標的要素中心間がＸおよびＹ両方向に約４００ミクロン間隔となるように製造された。
【００９４】
ロボットは、そのロボットと一緒に与えられた計算機ソフトウェアで制御されたが、細管ピンをチップ表面と接触させるように、しかも接触時にそのピンの上に微量噴出窒素圧を与えるように変更された。接触および微量噴出時間は、標的要素当り約１０ミリセカンドであった。ガス圧は約１ｐｓｉであり、必要に応じて手動調節されて、充分な量の粘稠なゲノムＤＮＡをピンから押出した。制御条件は、約０．３ｎｌ／スポットの１００ｍｍ  ＮａＯＨ中１μｇ／μｌ核酸を付着させるように設定された。付着した要素はほぼ円形であり、ＤＡＰＩ染色後の顕微鏡検査下で容易に目につく変形を伴った。スポット寸法は、ＤＮＡの粘度によっても異なった。個々のチップを手動で分離した。
【００９５】
ミクロアレイは、３１個のヒトの推定上の増幅遺伝子座からのゲノムＤＮＡを含むスポット、１個の全ヒトゲノムＤＮＡスポット、それぞれのスポットがこれら癌遺伝子座の内１０個のゲノムＤＮＡの等量のプールであるプールされたゲノムＤＮＡの３個の対照スポット、および１個のλファージＤＮＡスポットを含んだ。これら３６スポットをミクロアレイ上で各５回繰返して１８０個のスポットのミクロアレイを製造した。３１個のヒトの推定上の増幅遺伝子座を以下に挙げるが、これらは、ＢＡＣ、ＰＡＣまたはＰＩクローニングベクター中に挿入されたゲノムヒトＤＮＡであった。これら遺伝子座のゲノムＤＮＡそれぞれを、単ＢＡＣ、ＰＡＣまたはＰＩクローンのＤＮＡを用いて製造したが、個々のインサート寸法は一定ではなかった。これらＢＡＣクローンは、入手可能なゲノムライブラリーを次のような遺伝子座それぞれのプライマー配列を用いてスクリーニングすることによって得られた。
【００９６】
【表８】
0004537520.tif 000009
【００９７】
（ｉｉ）組織抽出および標識付け：ＡＴＣＣから入手したＳＪＳＡ−１およびＣｏｌｏ３２０細胞系それぞれについて、それら細胞４℃において７，０００ｒｐｍで遠心分離して細胞ペレットを生じた。上澄みを捨てた。それらペレットを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔのＳｏｌｕｔｉｏｎ＃２中に再懸濁させた。それらペレットは、機械的ホモジナイザーを中位の設定で用いて均一化された。プロナーゼを加えて、各試験管中で１００μｇ／ｍｌのプロナーゼ濃度にした。それら試験管を６０℃で振とうしながら１時間インキュベートした。試験管を氷上に１０分間置いた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＃３を加え、それら試験管を再度氷上に５分間置いた。試験管を４℃において８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してタンパク質沈殿をペレット化した。その上澄みをデカントした。ＲＮアーゼをその上澄みに加えて２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ濃度にし、その上澄みを３７℃で１５分間インキュベートした。２倍容量のエタノールを加えた後、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄みをデカントした。それらＤＮＡペレットを、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃを用いた真空下で乾燥させた。それらＤＮＡペレットを水中に再懸濁させ、９９５μｌの５０ｍＭ水酸化ナトリウムを加えた。
【００９８】
Ａｍｅｒｓｈａｍ（アーリントン・ハイツ，イリノイ州）からのＣｙ−５ｄＵＴＰおよびＣｒｕｉｃｋｓｈａｎｋによって製造されたフルオレセイン標識ｄＣＴＰを、抽出されたＤＮＡを標識するニックトランスレーションで用いた。ＳＪＳＡ−１取込みのためのＣｙ−５ｄＵＴＰのニックトランスレーションには、Ｐｒｏｍｅｇａ（マディソン，ウィスコンシン州）ニックトランスレーションキットを用いる標準的なプロトコールを用いた。Ｃｏｌｏ３２０については、１０μｌのニックトランスレーション酵素および５μｌのニックトランスレーション緩衝液（両方ともＶｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．製）を、１μｇの抽出Ｃｏｌｏ３２０  ＤＮＡ、各４μｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１μｌのｄＣＴＰ、２μｌのＣｒｕｉｃｋｓｈａｎｋによって製造されたフルオレセインｄＣＴＰ、および５０μｌの溶液を生じるための充分な水と混合した。その混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。その酵素は８０℃で１０分間加熱することによって熱失活した。その溶液をＧ−２５  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎで精製し、標識されたプローブをＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ．で４０分間乾燥させた。
【００９９】
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション：ニックトランスレーションされたＤＮＡ（各４１５ｎｇ）、対照ＤＮＡ（４１５ｎｇのＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ  Ｔａｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．））およびＣｏｔ−１ＤＮＡ（１００μｇ）（ＬＴＩ，ベセスダ，メリーランド州）を、約１５μｌのＬＳＩ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）と混合して、２５μｌのハイブリダイゼーション混合物を生じた。そのハイブリダイゼーション混合物を、図１−５で示されているチップホルダー中に入っているチップ上にピペットで移した。そのチップを、ＲＴＶ１０３シリコーンゴムシーラント（ＧＥ，ウォーターフォード，ニューヨーク州）を用いてホルダー中の適所に接着した。図１−５のプローブクリップ３３を上記のように用いた。次に、ホルダーを密閉給湿室内において３７℃で一晩中インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、そのプローブクリップを除去し、そのチップを、２×ＳＳＣを用いて室温で５分間、２×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを用いて４０℃で３０分間、そして次に、２×ＳＳＣを用いて室温で１０分間洗浄した。洗浄されたチップを暗所において室温で乾燥させた。１０μｌのＧＥＬ／ＭｏｕｎｔTMおよびＤＡＰＩを加え、１８ｍｍ×１８ｍｍガラスカバークリップをホルダー中のアレイ上に置いた。
【０１００】
（ｉｖ）画像捕捉および分析：Ｃｈｅのブレッドボード画像化装置を用いて、ハイブリッド形成されたアレイの大視野画像をアレイ窓によってプローブクリップまたはカバースリップを除去することなく捕捉した。ブレッドボード画像には二重フィルターホイール（Ｌｕｄｌ）が含まれ、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅおよびＣｙ５それぞれのための単バンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，バトルボロ，バーモント州）を励起および発光に用いた。画像データは、次の工程を実施するＭａｃｌｎｔｏｓｈ計算機作動アルゴリズムを用いて処理された。（１）各標的要素スポットをＤＡＰＩ画像から配置し、そのグリッド位置を割当てる；（２）各スポットの各フルオルの蛍光強度を測定する；（３）モード、メディアンおよび質量による蛍光比を各スポットについて計算する；（４）スポット寸法および強度域値に基づく排除判定基準；（５）複合画像を作成し、計算機モニタで表示する；（６）表示される画像には、各スポットの周りに描かれた白色環およびグリット位置の数が含まれる；（７）慣用的な計算機によるプリンターの印刷性能；および（８）生および処理データおよび画像記憶。
（Ｂ）結果
対照と比較されるＣｏｌｏ３２０の蛍光比を表３に示す。表３に示されるように、癌遺伝子ＣＭＹＣをＣｏｌｏ３２０細胞中で３２倍に増幅させた。これは、２９±６倍（公開データの平均から計算される）のＣｏｌｏ３２０中で知られているＣＭＹＣの増幅に匹敵する。ハイブリダイゼーション結果のプソイドカラー複合画像は、ＣＭＹＣ要素の有意の色強度を示し、ＣＭＹＣ遺伝子座の増幅も示した。表４は、対照と比較されるＳＪＳＡ−１細胞についての蛍光比分析結果を示す。表４は、ＧＬＩ（９．４倍）、ＭＤＭ２（７．５倍）およびＣＤＫ４／ＳＡＳ（１２．１倍）遺伝子座がＳＪＳＡ−１細胞中でそれぞれ増幅されることを示している。ハイブリダイゼーション結果のプソイドカラー複合画像は、ＧＬＩ、ＭＤＭ２およびＣＤＫ４／ＳＡＳ要素の有意の色強度を示し、増幅も示した。表５は、大部分の標的のＳＪＳＡ−１シグナルと比較されるＣｏｌｏ３２０シグナルの蛍光比か約１であることを示している。しかしながら、ＧＬＩ（０．１２）、ＭＤＭ２（０．１３）およびＣＤＫ４／ＳＡＳ（０．０９）のより低い比率は、これら遺伝子座が、Ｃｏｌｏ３２０細胞に相対してＳＪＳＡ−１細胞中で増幅されたことを示している。標的ＣＭＹＣ（４０）の高い比率は、Ｃｏｌｏ３２０細胞中でのＣＭＹＣ増幅を示している。一つのチップに同時にハイブリッド形成した３種類のプローブ（二つの試料プローブおよび一つの対照プローブ）で認められた遺伝子増幅は、ＳＪＳＡ−１およびＣｏｌｏ３２０のＤＮＡの別々のチップへの別々のハイブリダイゼーションによって得られるものと同様であった。（データ収集後、ＡＫＴ２遺伝子座のクローンが正しくマッピングされなかったことが判った。したがって、ＡＫＴ−２標的要素について表３、４および５、および図６−１３で示されているデータは無意味である。）
この実施例１は、３種類以上の別々に標識された核酸集団の同一アレイへの比較ハイブリダイゼーションについて出願人が承知している最初の実例である。これら結果は、組織核酸の状態を検出するためのミクロアレイへの３種類の別々に標識された核酸集団の同時ハイブリダイゼーションを示している。
【０１０１】
【表９】
0004537520.tif 000010
【０１０２】
【表１０】
0004537520.tif 000011
【０１０３】
【表１１】
0004537520.tif 000012
【０１０４】
実施例２
（Ａ）方法
（ｉ）アレイ：実施例１と同様の１８０要素ミクロアレイを用いた。
【０１０５】
（ｉｉ）組織抽出および標識付け：この実験では、共にＡＴＣＣからの２種類の細胞系Ｃｏｌｏ３２０およびＫ５６２を用いた。それぞれ５百万個の細胞を回転させて（１．５Ｋ，１０分間）ペレット化した。デカントした後、１００μｌのＲＮアーゼ溶液および３００μｌの溶解溶液をそのペレットに加え、その混合物を高速で簡単に回転させた。それぞれの細胞系のｍＲＮＡを、ニトロセルロース−ポリＴによって、製造者（アンビオン，テキサス州）によって与えられた単離プロトコールを用いて単離した。
【０１０６】
単離されたｍＲＮＡをエタノール沈殿させ、Ｃｙ−５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下において慣用的なプロトコールを用いて逆転写し、ランダムｐＮ９によって開始されてＣｙ５標識ｃＤＮＡプローブを製造し、その５分の１をそれぞれのハイブリダイゼーション検定に用いた（各検定につき１００万個の細胞）。ＤＮＡをそれぞれの細胞系について、慣用的なフェノール−クロロホルム抽出を用いて単離し、実施例１の場合のようにフルオレセインｄＣＴＰの存在下においてニックトランスレーションを用いて標識してｇＤＮＡを生じた。
【０１０７】
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーションはそれぞれ、１５μｌのＬＳＩハイブリダイゼーション緩衝液（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）、２００ｎｇの細胞系ｇＤＮＡプローブ、２００ｎｇの細胞系ｃＤＮＡプローブ、対照として２００ｎｇのＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ  Ｔａｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）、２０μｇのサケ精子ＤＮＡおよび４０μｇのＣｏｔ−１  ＤＮＡから成る２５μｌの全容量においてであった。ハイブリダイゼーションは、実施例１の場合のようにプローブチップを含むチップホルダー中のミクロアレイに対してであり、密閉給湿室内において４２℃で３日間行なわれた。各細胞系について、ハイブリダイゼーションは二つのチップで二重に試験された。全工程を下に示す。
【０１０８】
【化１】
0004537520.tif 000013
【０１０９】
（ｉｖ）画像捕捉およびデータ分析：ハイブリッド形成されたチップの蛍光画像を、実施例１の場合のようにＣｈｅのブレッドボード二重フィルターホイール画像化システムを用いて得、分析した。単バンドパスフィルターを励起および発光両方に用いた。画像は、実施例１の場合と同様にソフトウェアを用いて分析した。
（Ｂ）結果
図面の一般的な説明：データは、散布図および／または棒グラフとして示されている。特定の標的クローンに該当するそれぞれの点を含む散布図は、データセットの統計学的表現として役立つ。任意の与えられた標的クローンについての情報は、棒グラフから抽出することができる。
【０１１０】
（ｉ）シグナル強度：ミクロアレイ中の遺伝子についてのバックグラウンド補正されたシグナルの強度は、組織ｃＤＮＡ（１０秒間暴露で１６５カウントの平均値）と組織ｇＤＮＡ（１０ｓ暴露で１８７カウントの平均値）との間で同様であった。ｃＤＮＡ検出に関係したバックグラウンドは、ｇＤＮＡの７３カウントと比較したところ、より高い１３２カウントであった。ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ双方に関して、最も弱いシグナルでさえも、充分なプローブがチップ上に付着しているという条件ならば、６０秒間暴露で充分にバックグラエウンドを越えた（Ｓ／Ｂ＞１）。
【０１１１】
（ｉｉ）データ信頼度：図６は、細胞系それぞれについて２回のハイブリダイゼーションから得られたゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションデータの相関を示す。Ｃｏｌｏ３２０およびＫ５６２についてのデータの線型回帰相関は、それぞれ０．９９６３および０．９９９９であり、データについて高い信頼度を示す。予想されるように、ヒト対照ｇＤＮＡに対する組織ｇＤＮＡの比率は、大部分の標的要素遺伝子の集落を形成した（規格化後のものの周囲）。その集落から遠く隔たった比率は、該当する遺伝子の細胞系中での遺伝子増幅を示している（Ｃｏｌｏ３２０中のＣＭＹＣおよびＫ５６２中のＡＢＬ）。試験された両方の細胞系について、“標準”集落が０．５−１．５の比率範囲にわたると示されていることは興味深い。この範囲内の比率の値は、実験間で極めて再現性があり、それらは、欠失するまたは増幅されるこの集落内の任意の特定の遺伝子を識別することは信頼できないと考えられるように分布していた。
【０１１２】
図７は、各細胞系について２回のハイブリダイゼーションから得られた遺伝子発現ハイブリダイゼーションデータの信頼度を示す。Ｃｏｌｏ３２０およびＫ５６２についての２組のデータの線型回帰相関は、それぞれ０．９９８９および０．９７９０であった。
【０１１３】
（ｉｉｉ）検定多重性：図８（Ｋ５６２細胞系について）および図９（Ｃｏｌｏ３２０細胞系について）は、新規検定形式を用いて得られた検定多重性を示す。別々のゲノムＤＮＡ検定を用いると、標的配列（緑色棒）のゲノムコピー数（ヒト対照に相対する）のみを検出しうると考えられる。発現ｃＤＡ検定を用いると、発現プロフィール（赤色棒の若干当量）を検出するだけでありうると考えられる。本発明の方法を用いると、ゲノムおよび発現データが同時に得られた。
【０１１４】
（ｉｖ）発現検定の対照としての標準ヒト全ｇＤＮＡの使用：通常は、“普遍的”すなわち“標準”対照がないので、２種類の試料の発現レベルは、それら２種類の試料の発現検定を別の検定において同一チップで行なう場合にのみ信頼して比較することができる。実施例２は、発現検定のための対照核酸として全標準ヒトｇＤＮＡを用いた。異なった色の蛍光色素で標識された組織ｃＤＮＡおよび対照ｇＤＮＡを用いる場合、ハイブリダイゼーション後、それら二つの色の蛍光強度比は、プローブ溶液中のｃＤＮＡおよび対照ｇＤＮＡの初期濃度比を反映しているはずである。特定の対照ｇＤＮＡが容易に入手可能であり、しかもその遺伝子特異的配列のコピー数が変化しない（すなわち、“安定”している）または無視しうる変化しかしないならば、それを全ての発現検定の普遍的対照として用いることができる。その発現プロフィールは、図１０で示されるように、対照ｇＤＮＡに対するｃＤＮＡの比率として表すことができる。この比率プロフィールは、いろいろある試料に依存性であるにすぎない。言い換えると、同一試料の２回の発現検定を、同一アレイを含む２種類の異なったチップ上において２回の別々のハイブリダイゼーションで行なうならば、それら２回の検定から得られる発現プロフィールは、全ての標的について一定であるスケーリング因子によってのみ異なるはずである。種々の試料は、異なった発現プロフィール（対照ゲノムＤＮＡに対する比率として表される）を示すであろう。図７および１０の比較は、それら発現プロフィールが、実際に、いろいろある試料に依存性であるにすぎないことを示している。本発明の方法において発現分析の対照として全ヒトゲノムＤＮＡを用いると、種々の試料の発現プロフィールは、それら検定が別個に且つ独立して行なわれるとしても比較することができる。
【０１１５】
（ｖ）遺伝子過発現へのゲノム増幅の相関：図１１および１２は、Ｋ５６２およびＣｏｌｏ３２０細胞系それぞれについてのゲノムコピー数対ｃＤＮＡ（両方とも対照ゲノムＤＮＡに相対する）のプロットである。
【０１１６】
予想されるように、細胞系内では、増幅された遺伝子がなけれけば、分析される遺伝子の残りの遺伝子の発現レベルは広く異なったが、それらのゲノムコピー数は比較的一定に維持される。図１０で示されるように、両方の細胞系において、ＪＵＮＢ、ＨＲＡＳ１、ＧＬＩなどの若干の遺伝子についてのｃＤＮＡはより豊富であるが、ＰＤＧＦＲＡ、ＢＥＫ、ＭＤＭ２などのその他のｃＤＮＡはあまり豊富でない。有意には、Ｃ−ＭＹＣおよびＡＢＬについて、それらの発現レベルは２種類の細胞について極めて異なり、その傾向は、ゲノムレベルでのそれらの増幅に従う。Ｃｏｌｏ３２０中でのＣ−ＭＹＣおよびＫ５６２中でのＡＢＬの過発現は、遺伝子増幅に起因することがありうる。図１３は、それら２種類の細胞系の間の“遺伝子発現”比対“遺伝子コピー数”比のプロットである。興味深いことに、それら二つの数の間には顕著な相関があった。（線型回帰結果，Ｙ＝０．２６２Ｘ＋０．７２４，相関０．９８５）。グラフ中において、両方の細胞系中で増幅されない遺伝子は集落を形成するが、２種類の細胞系中で不釣合に増幅される遺伝子は、その集落とは別に隔たてられている。このグラフ、またはより一般的には、同時ゲノムおよび発現検定は、過発現または発現不十分が確かに遺伝子増幅または欠失によるものとすることを助ける。
【０１１７】
本出願明細書は、発明の範囲を制限するためのものではない。本明細書中に引用される特許、特許出願および公表された参考文献は全て、本明細書中に援用される。本発明の範囲は、請求の範囲によって決定され、それらの同等物はいずれも全て含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の方法を実施する場合に用いるのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの成分を示す。
【図２】  図２は、本発明の方法を実施する場合に用いるのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの成分を示す。
【図３】  図３は、本発明の方法を実施する場合に用いるのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの成分を示す。
【図４】  図４は、本発明の方法を実施する場合に用いるのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの成分を示す。
【図５】  図５は、本発明の方法を実施する場合に用いるのに好ましいハイブリダイゼーションカートリッジの成分を示す。
【図６】  図６は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図７】  図７は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図８】  図８は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図９】  図９は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図１０】  図１０は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図１１】  図１１は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図１２】  図１２は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図１３】  図１３は、それぞれがヒト癌細胞系に由来する組織ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ集団であって、一方は赤色で標識され、他方は緑色で標識されたもの、および橙色で標識された全ヒトゲノムＤＮＡ対照集団とのハイブリダイゼーション後の核酸ミクロアレイからのデータを示し、これらは、同一核酸ミクロアレイで遺伝子発現および染色体異常両方を同時検出する本発明の方法の性能を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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