(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微生物種が存在する微生物叢の増殖環境に、上記微生物叢の増殖を促進せしめるのに有効な量の２,６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンを存在せしめることを特徴とする活性汚泥微生物叢の増殖促進方法。
【請求項２】
グリコーゲン、プルラン、カードラン、セルロースおよびグルコマンナンからなる群より選ばれる多糖の少なくとも一種を上記増殖環境に更に存在せしめる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
α−ケトグルタル酸及び／又は乳酸ナトリウムを上記増殖環境にさらに存在せしめる請求項１ないし２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種の微生物が存在する微生物叢の増殖促進方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
活性汚泥処理や野外環境に放出された有害物質の無毒化または無害化処理等においては、複数種の微生物が関与していることが知られている。これら有益な微生物叢は、その微生物群全体を活発に増殖せしめる必要がある。また、ある微生物叢から特定の微生物種を単離しようとするときは、対象微生物叢に含まれる微生物群の全体を増殖せしめる必要があることが多い。さらに、自然界ではさまざまな微生物が複合してお互いに影響し合いながら有用物質を生産している例が多い。このような面での工業的な利用も今後期待される。
【０００３】
微生物叢の増殖を促進せしめる方法としては、実際の微生物叢の増殖環境が野外環境であることなどを考慮して、実験室内に作製された人工模擬環境であっても、温度、好気条件（たとえば酸素富化）、ｐＨ等の物理条件を調節することにより行われていた（「微生物工学技術ハンドブック」、９―１１頁、（朝倉書店）１９９０年発行）。栄養などの化学的条件については、実験室内において寒天完全培地で微生物叢を増殖せしめることを除けば、無機塩を微生物叢の増殖環境に富化する程度に止まっていた（「土壌微生物実験法」、３９７頁、（養賢堂）１９９７年発行）。さらに最近、平板培養法により河川細菌群の計数を行う際に、培地にピルビン酸ナトリウムを添加するとコロニー数が大幅に増加することが報告された（杉立ら、Microbes and Enviroments, Vol. 14, 85-87, (1999)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、効率のよい活性汚泥処理や野外環境の有害物質の処理のために、あるいはある微生物叢から特定の微生物種の単離のために、さらに効率的な物質生産のために、微生物叢の増殖を促進せしめる方法の改良の必要が依然存在している。この発明の課題は、故に、微生物叢の増殖を促進する方法を改良することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、複数種の微生物が存在する微生物叢の増殖環境に、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、および２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンからなる群より選ばれるシクロデキストリン化合物の少なくとも一種、またはグリコーゲン、プルラン、カードラン、セルロース、およびグルコマンナンからなる群より選ばれる多糖の少なくとも一種を存在せしめることにより、微生物叢の増殖を促進せしめることができることを見出した。
【０００６】
すなわち、この発明は、複数種の微生物が存在する微生物叢の増殖環境に、上記微生物叢の増殖を促進せしめるのに有効な量の、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンおよび２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンからなる群より選ばれるシクロデキストリン化合物の少なくとも一種、またはグリコーゲン、プルラン、カードラン、セルロースおよびグルコマンナンからなる群より選ばれる多糖の少なくとも一種を存在せしめることを特徴とする微生物叢の増殖促進方法、である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
増殖促進の必要がある微生物叢としては、その微生物叢において、複数の微生物種が活性汚泥処理や有害物質の無毒化等に関与していて、一種の微生物だけでは活性汚泥処理や有害物質の無毒化等の目的が達成されないものである。または、ある微生物叢より特定の微生物種を単離しようとする際の、その微生物叢である。
【０００８】
増殖促進の必要がある微生物叢の例示としては、活性汚泥処理微生物叢が挙げられる。活性汚泥処理微生物叢は、例えば、Paracolobacterium aerogenoides, Flavobacterium sp., Bacillus cereus, Escherichia intermidium, Nocardia  actinomorpha, Escherichia coli, Pseudomonas ovalis, Alcaligenes faecalis, Bacillus lentus, Ｚoogloea ramigera等が含まれていることが知られている。
【０００９】
他の増殖促進の必要がある微生物叢としては、反芻動物のルーメン微生物叢、土壌中等に存在する有害な化学物質を無毒化する、例えば、有機化学物質を順次分解して無毒化するような微生物叢、高濃度産業廃液等のメタン発酵微生物叢、オリーブオイル等食用搾油廃液の脱色、無毒化に関与する微生物叢、ディーゼルオイル等で汚染した土壌を無毒化する微生物叢等がある。
【００１０】
そこから特定の微生物種を単離しようとする微生物叢の例としては、ヒト等の高等動物、昆虫、土壌原生動物もしくは海洋生物等の生物体内における微生物叢、土壌、泥、湖水、河水、沼水等の温和な環境から採取される微生物叢、深海、高温多湿地、極寒地、火山地、強酸性地、高塩地および乾燥地等の極地から採取される微生物叢、腐敗などにより少数の微生物種が大量に存在する天然環境から採取される微生物叢、ならびに病院や食品工場における空気および活性汚泥や食品加工産業原料（風味付け汁等）等の人工環境から採取される微生物叢を挙げることができる。
【００１１】
野外または人工増殖環境としては、これら環境において複数種の微生物が活性汚泥処理や有害物質の無毒化等に関与しているような環境である。例えば、野外土壌環境、活性汚泥処理環境、実験室環境、化学物質の複合微生物による人工的分解処理環境等が含まれる。また、特定の微生物種を単離するために、微生物叢の微生物全体を増殖させる実験室環境である。
【００１２】
実験室環境としては、周知のように、大別すれば、固体培地環境と液体培地環境がり、それぞれ好気環境と嫌気環境がある。これら環境におけるエネルギー源や窒素源等、および温度やｐＨは、微生物叢の採取源や単離しようとする微生物種に主に依存し、種々様々であることがよく知られている。
【００１３】
これら野外または人工増殖環境に、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、および２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンからなる群より選ばれるシクロデキストリン化合物の少なくとも一種、またはグリコーゲン、プルラン、カードラン、セルロース、およびグルコマンナンからなる群より選ばれる多糖の少なくとも一種を存在せしめる。
【００１４】
ここにおいて「存在せしめる」とは、例えば、活性汚泥処理においては、曝気槽に上記シクロデキストリン化合物または上記多糖を投入することであり、また野外土壌中に存在する有害物質を無毒化することにおいては、土壌に上記シクロデキストリン化合物もしくは上記多糖溶液または粉末を散布することである。あるいは、実験室環境においては、微生物叢の増殖培地に上記シクロデキストリンまたは上記多糖を添加することである。
【００１５】
「該微生物叢の増殖を促進せしめるのに有効な量」は、微生物叢の特徴や環境に依存していて、一律ではないが、当業者は、このような量を容易に定めることができる。すなわち、異なる量のシクロデキストリン化合物または多糖を存在せしめた環境における、微生物の菌数を測定すればよい。このようなことは、当業者には、日常的作業の範囲内のことである。
【００１６】
上記シクロデキストリン化合物の少なくとも一種および上記多糖の少なくとも一種の両方を上記増殖環境に存在せしめることにより、より良い結果が得られることが多い。
【００１７】
微生物叢の増殖環境に有機酸の少なくとも一種をさらに存在せしめることにより、より微生物叢の増殖を促進できることがある。このような有機酸の例示としては、これらに限定されるものではないが、乳酸およびα−ケトグルタル酸を挙げることができる。
【００１８】
微生物叢の、その他の増殖環境条件は、知られている条件が、この発明の方法においても適用できる。
【００１９】
かくして、この発明の方法により、種々の微生物叢の増殖を促進せしめることができる。
【００２０】
【実施例】
実施例１
食品工場由来の活性汚泥１０ｍｌをガーゼで濾過し、濾液をミキサーで攪拌し、次に超音波処理し、さらに生理食塩水を加えてミキサーで攪拌して、菌体を分散させた。この菌体分散液を生理食塩水で希釈し、生菌数３×１０４細胞／ｍｌ［6-carboxy-fluorescein diacetateによる生菌染色により測定(J. Porterら、J. Appl. Bacteriol., Vol. 79, 399-408 (1995))］とした。
【００２１】
培地として、Nutrient Broth（Difco）（Bact Beef ExtractとBacto Peptoneの１：３混合物）にグルコース０．２％、寒天２％を加えたものを加熱滅菌し、プレート中に固化したものを用いた。
【００２２】
このプレートに、表１に示すシクロデキストリン化合物（予め滅菌した）を０．１重量％を加え、次いで上記微生物分散液０．１ｍｌを播いた。
【００２３】
プレートを３０℃に置き、２日目および１０日目にプレート上のコロニー数を計数した。
【００２４】
表１に示すように、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンおよび２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンは、微生物叢の増殖促進効果を示した。
【００２５】
【表１】
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実施例２
実施例１のシクロデキストリン化合物に替えて、表２に示す多糖０．１％をプレートに添加した。
【００２６】
３０℃での培養２日目および１０日目に、プレート上に形成されたコロニーを計数した。
表２から分かるように、グリコーゲン、プルラン、カードラン、セルロースおよびグルコマンナンは、微生物叢の増殖促進効果を示した。
【表２】
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実施例３
実施例１のシクロデキストリン化合物に替えて、表３に示す有機酸０．１％をプレートに添加した。
３０℃での培養２日目および１０日目に、プレート上に形成されたコロニーを計数した。
表３から分かるように、乳酸およびα−ケトグルタル酸は、微生物叢の増殖促進効果を示した。
【表３】
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実施例４
土壌（殺菌していない）５０ｇにアンスラニル酸１０ｍｇを加え、よく攪拌混合した。
一方、Nutrient Broth８ｇとグルコース２ｇをよく混ぜ合わせ（Ａ）、これにグリコーゲン１ｇ（Ｂ）または２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン１ｇ（Ｃ）を添加し、再度よく攪拌混合した。
前記土壌１０ｇに、それぞれ０．２ｇのＡ（土壌Ａ）、Ｂ（土壌Ｂ）またはＣ（土壌Ｃ）を加えてよく攪拌混合した。
得られた土壌Ａ、土壌Ｂおよび土壌Ｃを３０℃、湿度８５％の恒温槽内に置き、５日目および１０日目にサンプルを採取し、土壌中の生菌数（５日目および１０日目）とアンスラニル酸の含量（１０日目）を測定した。結果を表４に示す。
【表４】
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【発明の効果】
本発明の方法によれば、上に述べたように、複数種の微生物が存在する微生物叢の増殖を促進することができ、それによって活性汚泥処理や土壌中の有害物質の無毒化を効率的に進めることができる。また、微生物叢中の特定の微生物種を効率よく単離することが可能になる。