(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を検出するための方法における標識基としての一般式Ｉ
【化１】
0004465121.tif 000027
〔式中、
Ｙは、酸素またはＮ−Ｒ８を表わし、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ８は、それぞれが出現する際に無関係に水素、フェニル基、アルキル鎖中に１〜３個のＣ原子を有するフェニルアルキル基、場合によっては有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルコキシ基および／またはアルコキシカルボニル基から選択された１個以上の置換基を有することができる、２０個までのＣ原子、有利に６個までのＣ原子を有するポリエーテル基もしくは炭化水素基を表わすか、またはＲ１基、Ｒ２基、Ｒ３基およびＲ８基の１個以上に１個の隣接した置換基で１つの環系を形成させ、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、フェニル、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基もしくはカルボキシ基または１５個までのＣ原子を有する炭化水素基を表わし、この場合炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基および／またはヘテロアリール基を含みかつ場合によってはそれぞれ有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および／またはアルコキシカルボニル基から選択された１個以上の置換基を有していてよく、
この場合Ｒ４基、Ｒ６基およびＲ７基の中の１個以上の基は、隣接した置換基で１つの環系を形成することができ、
Ｃｙｃは、芳香環、ヘテロ芳香環、キノイド環および／または脂環式環から選択された環系を含み、この環系が場合によっては有利にハロゲン、アミノ基、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および／またはアルコキシカルボニル基から選択された１個以上の置換基を有していてよい有機基を表わし、
Ｘは、場合によっては電荷平衡のために存在する陰イオンを意味する〕で示される化合物の使用。
【請求項２】
化合物Ｉを検出すべき検体に対して特異的なレセプターに共有結合する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
検出法を核酸ハイブリダイゼーション法および免疫化学的方法から選択する、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
【化２】
0004465121.tif 000028
〔式中、
Ｙ、Ｒ１〜Ｒ７およびＣｙｃは、請求項１記載の意味を有し、
Ｘは、場合によっては電荷平衡のために存在する陰イオンを表わし、
但し、Ｙが酸素である場合には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、メチルであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、水素であり、
Ｃｙｃは、式ＩＩまたはＩＩＩ
【化３】
0004465121.tif 000029
で示される構造を有していない〕で示される化合物。
【請求項５】
Ｒ１がＲ７と架橋しておりおよび／またはＲ２がＲ４と架橋しており、１つの環系、殊に５または６員環を形成している、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｃｙｃが式ＩＶ、ＶまたはＶＩ
【化４】
0004465121.tif 000030
【化５】
0004465121.tif 000031
〔式中、
Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は、請求項１に記載のＲ１、Ｒ２およびＲ３と同様に定義され、Ｒ９〜Ｒ１１は、請求項１に記載のＲ４〜Ｒ７と同様に定義される〕で示される構造を有している、請求項４または５記載の式Ｉの化合物。
【請求項７】
Ｒ１′がＲ１１とおよび／またはＲ２′がＲ１０と架橋しており、１つの環系、殊に５または６員環を形成している、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
一般式ＶＩＩａ〜ＶＩＩｆの中の１つが次式
【化６】
0004465121.tif 000032
【化７】
0004465121.tif 000033
〔式中、
点線は、場合によっては二重結合を表わし、
二重結合が存在する場合には、点線により結合されたＲ基を欠き、
Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、請求項４または５の記載と同様に定義され、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は、請求項６または７の記載と同様に定義され、Ｒは、それぞれ無関係に請求項４に記載のＲ４と同様に定義される〕に対応している、請求項４から７までのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｙが酸素である、請求項４から８までのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ５が場合によっては置換された芳香族の環系を含む、請求項４から９までのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
共有結合の能力を有する基を有している、請求項４から１０までのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
カップリング基が−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨおよび／または−ＳＨである、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
カップリング基により担体および／または生体分子にカップリングされている、請求項１１または１２記載の化合物。
【請求項１４】
担体が多孔質ガラス、イオン交換樹脂、プラスチック、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体および／または親水性ポリマーから選択されたものである、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
生体分子がペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、核酸類似物および／またはハプテンから選択されたものである、請求項１３記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、検体を検出する方法における標識基としてのアミドピリリウム化合物の使用ならびに新規のアミドピリリウム化合物に関する。
【０００２】
キサンテンは、久しく公知で十分に研究された蛍光染料に数えられる。変換された基本骨格を有する使用された染料、３，１０−ビス−（ジメチルアミノ）−５−メチル−６−オキソ−６Ｈ［１］−ベンゾピラノ［３，２−ｃ］キノリニウム陽イオン、は、H. Harnisch, Liebigs Ann. Chem. 751, 155-158 (1971)によって記載された。
【０００３】
この種の化合物は、ピランとの類似性のために、F.P. Schaefer, Topics in Applied Physics, Vol. I, Dye Laser, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1973 中のK.H. Drexhage, Structure and Properties of Laser Dyesによってアミドピリリウム化合物とも呼称されている。この刊行物中には、さらに染料１４０および１４１と呼称されるアミドピリリウム化合物が記載されている。分析学における蛍光−標識基としてのアミドピリリウム化合物の使用に対する指摘は、刊行物中には見出されない。
【０００４】
これまで、化学的分析、医学的分析および生物学的分析において使用された蛍光染料は、多くの場合に６００ｎｍ未満の範囲で吸収する。このことから標識基としての使用の場合、殊に生物学的系の場合には、重大な欠点が明らかになる：診断学的系のためには、安価な光源、例えばレーザーダイオード（６３５または６８０ｎｍ）またはヘリウム−ネオンレーザー（６３３ｎｍ）を使用することができることは、好ましい。蛍光染料の効果のある励起を保証するために、吸収最大は、できるだけ使用される光源の放出波長の付近にある。しかし、これは、公知の染料の場合には、しばしば定められていない。更に、多くの場合には、公知の染料の吸収スペクトルは、生物学的系からの蛍光物質の吸収と重なり合っている。従って、蛍光染料を記載された欠点なしに生物学的系中での検体の信頼できる正確な検出のために提供することは、望ましい。
【０００５】
検体のための検出方法における標識基としての使用のために、信頼できる簡単な検出可能性と共に、種々の溶剤中、殊に水性系中での良好な溶解性が必要とされる。更に、この種の化合物は、簡単で安価に製造することができ、良好な保持可能性、即ち貯蔵能力を有するはずである。
【０００６】
従って、本発明の課題は、公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に回避するために、殊に吸収最大を有し、安価な光源の使用を許容し、生物学的試料中に含有されている物質の吸収範囲外で吸収し、良好な溶解性を示しおよび／または蛍光量子収率を示す、検体を検出するための方法に適した、標識基として使用するための蛍光染料を提供することであった。
【０００７】
この課題は、検体を検出するための方法における標識基としての一般式Ｉ
【０００８】
【化８】
0004465121.tif 000002
【０００９】
〔式中、
Ｙは、酸素またはＮ−Ｒ８を表わし、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ８は、それぞれが出現する際に無関係に水素、フェニル基、アルキル鎖中に１〜３個のＣ原子を有するフェニルアルキル基、場合によっては有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルコキシ基および／またはアルコキシカルボニル基から選択された１個以上の置換基を有することができる、２０個までのＣ原子、有利に６個までのＣ原子を有するポリエーテル基もしくは炭化水素基を表わすか、またはＲ１基、Ｒ２基、Ｒ３基およびＲ８基の１個以上に１個の隣接した置換基で１つの環系を形成させ、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、フェニル、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基もしくはカルボキシ基または１５個までのＣ原子を有する炭化水素基を表わし、この場合炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基および／またはヘテロアリール基を含みかつ場合によってはそれぞれ有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および／またはアルコキシカルボニル基から選択された１個以上の置換基を有していてよく、
この場合Ｒ４基、Ｒ６基およびＲ７基の中の１個以上の基は、隣接した置換基で１つの環系を形成することができ、
Ｃｙｃは、芳香環、ヘテロ芳香環、キノイド環および／または脂環式環から選択された環系を含み、この環系が場合によっては有利にハロゲン、アミノ基、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および／またはアルコキシカルボニル基から選択された１個以上の置換基を有していてよい有機基を表わし、
Ｘは、場合によっては電荷平衡のために存在する陰イオンを意味する〕で示される化合物の使用によって解決された。
【００１０】
一般式Ｉの化合物は、検体を定性的および／または定量的に測定するための方法における標識基として使用されることができる。これらの測定は、水性液体中、例えば体液、例えば血液、血清、血漿もしくは尿の試料中、廃水試料または食品中で実施されることができる。この方法は、例えばキュベット中での湿式試験として実施されることができるか、または相応する試薬担体上での乾式試験として実施されることができる。この場合、検体の測定は、唯一の反応により行なうことができるかまたは一連の反応によって行なうことができる。
【００１１】
意外なことに、一般式Ｉの化合物の使用は、検体を測定するための化学的検出法、殊に医学的検出法および生物学的検出法において極めて良好な結果を示した。
【００１２】
一般式Ｉの化合物は、蛍光染料が標識基として適しているような全ての公知の化学的検出法、医学的検出法および生物学的検出法において使用されることができる。この種の方法は、当業者に公知であり、したがってこれ以上記載する必要はない。
【００１３】
特に好ましい実施態様において、一般式Ｉの化合物は、検出すべき検体に対して特異的なレセプターに共有結合される。特異的なレセプターは、全ての適した化合物または全ての適した分子であり、有利には、ペプチド、ポリペプチドまたは核酸である。化合物Ｉまたはこの化合物の共有結合は、例えば核酸ハイブリダイゼーション法または免役化学的方法で使用されることができる。この種の方法は、例えばSambrook他, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harborに記載されている。
【００１４】
本発明のもう１つの課題は、殊に検体の検出法において標識基としての使用に適しておりかつ公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に回避する新規のアミドピリリウム化合物を提供することにあった。
【００１５】
この課題は、一般式Ｉ
【００１６】
【化９】
0004465121.tif 000003
【００１７】
〔式中、
Ｙ、Ｒ１〜Ｒ７およびＣｙｃは、請求項１記載の意味を有し、
Ｘは、場合によっては電荷平衡のために存在する陰イオンを表わし、
但し、Ｙが酸素である場合には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、メチルであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、水素であり、
Ｃｙｃは、式ＩＩまたはＩＩＩ
【００１８】
【化１０】
0004465121.tif 000004
【００１９】
【化１１】
0004465121.tif 000005
【００２０】
で示される構造を有していない〕で示される化合物によって解決された。
【００２１】
化合物Ｉの利点は、殆んど任意の置換基の変形によって個々の化合物の性質、例えば吸湿性の性質、吸収最大の位置、溶解性の性質、蛍光減少時間および量子収率の高さが著しく変動し、それによって所望通りに選択されることができることにある。こうして、試料、例えば血清、血液または血漿等中での妨害物質での干渉は、減少されることができるかまたはむしろ全体的に回避されることができる。化合物Ｉの製造は、自体公知の方法により簡単で安価な方法で、次の実施例で詳説されているように行なうことができる。更に、この化合物は、問題なく取り扱うことができる。化合物Ｉのもう１つの利点は、蛍光の大きなストークスの移動にあり、それによって励起ビームの良好な分離が可能になる。更に、この化合物は、高い安定性を示し、このことは、殊に貯蔵能力に対してプラスの作用を示す。
【００２２】
好ましくは、Ｙは、酸素を表わしおよび／またはＲ５は、場合によっては置換された芳香族の環系を含む。
【００２３】
前記化合物は、有利に共有結合の能力を有する基、例えば−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨおよび／または−ＳＨを有している。これらのカップリング基により、この化合物は、公知方法により担体および／または生体分子にカップリングされることができる。担体としては、全ての適当な材料、例えば多孔質ガラス、プラスチック、イオン交換樹脂、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体および／または親水性ポリマーが使用されることができる。生体分子は、有利にペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、核酸類似物および／またはハプテンから選択される。
【００２４】
意外なことに、吸収最大および蛍光量子収率は、本発明による化合物を上記の担体および生体分子にカップリングすることによって本質的に変化しない。
【００２５】
１つの好ましい化合物種において、Ｒ１はＲ７と架橋しておりおよび／またはＲ２はＲ４と架橋しており、殊に５または６員環を有する環系が形成される。特に好ましい物質種において、式Ｉ中のＣｙｃは、式ＩＶ、ＶまたはＶＩ
【００２６】
【化１２】
0004465121.tif 000006
【００２７】
【化１３】
0004465121.tif 000007
【００２８】
〔式中、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は、上記のＲ１、Ｒ２およびＲ３と同様に定義され、Ｒ９〜Ｒ１１は、上記のＲ４〜Ｒ７と同様に定義される〕で示される構造を有している。
【００２９】
他の好ましい化合物種において、Ｒ１′はＲ１１と架橋しておりおよび／またはＲ２′はＲ１０と架橋しており、環系、殊に５員環または６員環が形成される。
【００３０】
特に好ましい化合物種の例は、一般式ＶＩＩａ〜ＶＩＩｆ：
【００３１】
【化１４】
0004465121.tif 000008
【００３２】
【化１５】
0004465121.tif 000009
【００３３】
〔式中、
点線は、場合によっては二重結合を表わし、この二重結合が存在する場合には、点線により結合されたＲ基を欠き、
Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は、上記と同様に定義され、Ｒは、それぞれ無関係に上記のＲ４と同様に定義される〕に表わされている。
【００３４】
本発明による化合物の具体的な例は、次の第１表に表わされている。
【００３５】
【表１】
0004465121.tif 000010
【００３６】
【表２】
0004465121.tif 000011
【００３７】
【表３】
0004465121.tif 000012
【００３８】
【表４】
0004465121.tif 000013
【００３９】
【表５】
0004465121.tif 000014
【００４０】
【表６】
0004465121.tif 000015
【００４１】
【表７】
0004465121.tif 000016
【００４２】
【表８】
0004465121.tif 000017
【００４３】
本発明は、次の実施例によって詳説される。図１、図２および図３は、本発明による化合物ＪＡ２２７（５）、ＮＫ１３（１６）またはＮＫ１４（１８）の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す。
【００４４】
実施例
アミドピリリウム化合物の製造
Ａ．Ｒ５＝Ｈを有する染料
前駆生成物の合成は、ハルニッシュ（Harnisch）およびブラク（Brack）（Liebigs Ann. Chem. 740 (1970), 164-168）の合成法と同様に行なわれる。染料合成は、１００℃に減少された反応温度で実施される。この染料合成は、構造５（ＪＡ２２７）および構造１５（ＪＡ２１０）について例示的に記載される。エダクトの製出は、次の実施例に含まれているかまたは刊行物に公知である。
【００４５】
化合物ＪＡ２１０
第１工程：
９−エチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン
７−アミノ−１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン３．５ｇおよびマロン酸ジエチルエステル３．７ｇを１８０〜１９０℃に加熱する。カラム（長さ：１０ｃｍ；直径：０．５ｃｍ）を介して、フラスコ中で固体が形成されるまでエタノールを留去する。固体をアセトン３０ｍｌ中で希釈し、吸引濾過し、沈殿物をメタノールで洗浄する。沈殿物を五酸化燐上で乾燥する。
【００４６】
収量：２．０ｇ
ＣＤＣｌ３中での１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００４７】
【外１】
0004465121.tif 000018
【００４８】
第２工程：
９−エチル−４−メトキシ−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン
９−エチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン２ｇ（８．２ミリモル）をジメチルホルムアミド２５ｍｌ中に懸濁させ、水酸化カリウム６．７ｇ（０．１２モル）を添加する。そのために、最大６０℃でジメチルスルフェート８．６ｇ（０．０７モル）を滴加する（氷／食塩浴での冷却）。この懸濁液を水２００ｍｌ中に搬送する。良好に濾過可能な沈殿物が形成され、この沈殿物を吸引濾過し、かつ乾燥する。
【００４９】
収量：１．８ｇ
融点：分解下に２０８℃
ＣＤＣｌ３中での１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００５０】
【外２】
0004465121.tif 000019
【００５１】
第３工程：
９−エチル−４−ヒドロキシ−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン
９−エチル−４−メトキシ−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン０．５ｇ（１．８ミリモル）を１０％の塩酸５ｍｌ中で還流下に２時間加熱する。この懸濁液を１０％の酢酸ナトリウム溶液でｐＨ５に中和する。沈殿物を吸引濾過し、デシケーター中で乾燥する。
【００５２】
ｄ６−ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００５３】
【外３】
0004465121.tif 000020
【００５４】
第４工程：
４−クロル−９−エチル−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン−３−カルボアルデヒド
ジメチルホルムアミド３ｍｌに５０〜５５℃でオキシ塩化燐０．４ｇを滴加する。この溶液をなお５０℃で１時間、攪拌する。引続き、同じ温度で攪拌しながらジメチルホルムアミド６ｍｌ中に溶解した９−エチル−４−メトキシ−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン０．５ｇ（１．８ミリモル）を添加する。なお、８０〜９０℃で５時間攪拌する。濃く黄色に呈色した溶液を水５０ｍｌおよび氷１０ｇ上に搬送し、室温で１２時間攪拌する。明黄色の沈殿物を濾別し、乾燥する。
【００５５】
ＣＤＣｌ３中での１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００５６】
【外４】
0004465121.tif 000021
【００５７】
第５工程：
ＪＡ２１０
９−エチル−４−ヒドロキシ−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン０．１８ｇ（１．６９ミリモル）および４−クロル−９−エチル−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン−３−カルボアルデヒド０．２ｇ（０．６９ミリモル）を氷酢酸２０ｍｌ中に溶解し、１００℃の熱い油浴中で２０分間加熱する。この溶液を水１００ｍｌ中に注入し、沈殿物を濾別する。染料をクロマトグラフィー処理により精製する。
【００５８】
ＤＭＳＯ−ｄ６中での１Ｈ−ＮＭＲデータ：
【００５９】
【外５】
0004465121.tif 000022
【００６０】
化合物ＪＡ２２７
４−（７−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノール−１−イル）−酪酸エチルエステル１．２ｇ（４．５ミリモル）および４−クロル−７−ジメチルアミノ−１−メチル−キノール−２−オン−３−カルボアルデヒド１．２ｇ（４．５ミリモル）を氷酢酸５０ｍｌ中に溶解し、１００℃の熱い油浴中で５分間加熱する。この溶液を１５％の塩化ナトリウム溶液５００ｍｌ中に滴加し、沈殿物を濾別する。染料をクロマトグラフィー処理により精製する。
【００６１】
Ｂ．Ｒ５＝（置換）フェニル環を有する染料
化合物の好ましい製出を構造１８（ＮＫ１４）、構造２０（ＮＫ１６）および構造２３（ＮＫ２１）につき例示する。エダクトの合成を、これが刊行物に公知でない限り、前記部分Ａに記載の例と同様に実施する。ベンゾイル−安息香酸誘導体の合成を、６−（２−カルボキシ−３，４，５，６−テトラクロルベンゾイル）−１−エチル−７−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−１，２−ジヒドロキノリンの刊行物に公知の製出と同様に行なう。
【００６２】
化合物ＮＫ１４
２−（４−ジメチルアミノ−２−ヒドロキシ）−ベンゾイル−安息香酸１．２ｇ（３．９ミリモル）および９−エチル−４−ヒドロキシ−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン１．０ｇ（３．９ミリモル）を１，１，２，２−テトラクロルエタン４０ｍｌ中で物質が完全に溶解するまで、還流下に加熱する。次に、全部で五酸化燐５ｇを少量ずつ添加し、反応混合物をさらに３時間還流下に煮沸する。冷却後、前記混合物をフラスコからのそれぞれ水５０ｍｌおよびクロロホルム５０ｍｌで溶解し、有機相の分離後に水相をなお３回、クロロホルムそれぞれ５０ｍｌで抽出する。合わせた有機相をロータリーエバポレーターにより処理して乾燥物にし、引続き染料をカラムクロマトグラフィー処理により精製する。
【００６３】
染料の画分をロータリーエバポレーターにより処理し、残留物をエタノール５０ｍｌ中に溶解し、（６０％の）過塩素酸１０ｍｌの添加後に水の滴加によって沈殿させる。吸引濾過後、染料の過塩素酸塩を注意深く水で洗浄し、デシケーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
【００６４】
収量：７００ｍｇ
化合物ＮＫ１６
９−（２−カルボキシベンゾイル）−８−ヒドロキシ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ベンゾ［ｉｊ］キノリジン０．７５ｇ（２．２２ミリモル）および９−エチル−４−ヒドロキシ−１−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−ピリド［２，３−ｇ］キノール−２−オン０．５７ｇ（２．２２ミリモル）を１，１，２，２−テトラクロルエタン４０ｍｌ中で物質が完全に溶解するまで、還流下に加熱する。次に、全部で五酸化燐５ｇを少量ずつ添加し、反応混合物をさらに３時間還流下に煮沸する。冷却後、前記混合物をフラスコからのそれぞれ水５０ｍｌおよびクロロホルム５０ｍｌで溶解し、有機相の分離後に水相をなお３回、クロロホルムそれぞれ５０ｍｌで抽出する。合わせた有機相をロータリーエバポレーターにより処理して乾燥物にし、引続き染料をカラムクロマトグラフィー処理により精製する。
【００６５】
染料の画分をロータリーエバポレーターにより処理し、残留物をエタノール５０ｍｌ中に溶解し、（６０％の）過塩素酸１０ｍｌの添加後に水の滴加によって沈殿させる。吸引濾過後、染料の過塩素酸塩を注意深く水で洗浄し、デシケーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
【００６６】
収量：１６０ｍｇ
化合物ＮＫ２１
６−（２−カルボキシベンゾイル）−１−エチル−７−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチル−１，２−ジヒドロ−キノリン１．１３ｇ（３．１ミリモル）および７−ジメチルアミノ−４−ヒドロキシ−１−メチル−キノール−２−オン０．６８ｇ（３．１ミリモル）を１，１，２，２−テトラクロルエタン６０ｍｌ中で物質が完全に溶解するまで、還流下に加熱する。次に、全部で五酸化燐４ｇを少量ずつ添加し、反応混合物をさらに３時間還流下に煮沸する。冷却後、前記混合物をフラスコからのそれぞれ水５０ｍｌおよびクロロホルム５０ｍｌで溶解し、有機相の分離後に水相をなお３回、クロロホルムそれぞれ５０ｍｌで抽出する。合わせた有機相をロータリーエバポレーターにより処理して乾燥物にし、引続き染料をカラムクロマトグラフィー処理により精製する。
【００６７】
染料の画分をロータリーエバポレーターにより処理し、残留物をエタノール２５ｍｌ中に溶解し、（６０％の）過塩素酸８ｍｌの添加後に水の滴加によって沈殿させる。吸引濾過後、染料の過塩素酸塩を注意深く水で洗浄し、デシケーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
【００６８】
収量：５０ｍｇ
Ｃ．共役形成に関する例
ＮＫ４１−マレインイミド
ＮＫ４１  １００ｍｇ（０．２ミリモル）を無水ＤＭＳＯ  １０ｍｌ中に溶解し、無水マレイン酸１００ｍｇ（１ミリモル）を添加する。この溶液を室温で約２４時間攪拌する。１０％の過塩素酸ナトリウム水溶液５０ｍｌを滴加し、沈殿した固体を濾別する。固体を酢酸ナトリウム２５ｍｇと一緒に無水酢酸５ｍｌ中に懸濁させ、３０分間約８０℃に加熱する。冷却後、１０％の過塩素酸ナトリウム３０ｍｌを添加し、濾過し、固体を乾燥させる。
【００６９】
【化１６】
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【００７０】
ＮＫ４１−マレインイミド−システイン共役
ＭＫ４１−マレインイミド７０ｍｇ（０．１６ミリモル）をエタノール２０ｍｌ中に溶解し、システイン２２ｍｇ（０．１６ミリモル）を少量ずつ添加する。室温で攪拌し、３０分後に１０％の過塩素酸ナトリウム溶液約５０ｍｌを滴加する。沈殿した固体を濾別し、乾燥させる。
【００７１】
【化１７】
0004465121.tif 000024
【００７２】
ＮＫ２７−活性エステル
ＮＫ２７  ５０ｍｇ（０．１ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．２ミリモルおよびジシクロヘキシルカルボジイミド０．２ミリモルと共にアセトニトリル２０ｍｌ中に溶解する。室温で５時間攪拌し、生成物混合物をロータリーエバポレーターにより処理する。生成は、クロマトグラフィーにより行なう。
【００７３】
【化１８】
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【００７４】
ＮＫ２７−ｄＵＴＰ共役
５−（３−アミノアリル）−ｄＵＴＰ１０モルを０．１Ｍの硼酸ナトリウム緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ８）中に溶解し、アミン不含のジメチルホルムアミド１ｍｌ中のＮＫ２７−活性エステル５モルからなる溶液を添加する。この溶液を室温で１５時間攪拌する。溶剤を真空中で留去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する。
【００７５】
【化１９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による化合物ＪＡ２２７（５）のエタノール中での吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す線図。
【図２】  本発明による化合物ＮＫ１３（１６）のエタノール中での吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す線図。
【図３】  本発明による化合物ＮＫ１４（１８）のエタノール中での吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す線図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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