(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む、貯蔵に対して安定なヒトパピローマウイルスワクチンの製造方法であって、
（ａ）０．１〜０．２ＭのＮａＣｌ、２〜２０ｍＭのＤＴＴ、０．０１〜０．５％のポリソルベート８０、０．５〜５ｍＭのＥＤＴＡ及び５〜１５ｍＭのｐＨ７〜１０のＴＲＩＳ緩衝液を含む低解離用混合物中で分解したＶＬＰが生成されるまでＶＬＰをインキュベートする段階と、
（ｂ）場合により、透析濾過、限外濾過、又は０．１〜０．２ＭのＮａＣｌ、０．０１〜０．０５％のポリソルベート８０及びｐＨ６．５〜７．５のリン酸緩衝液を含む透析液に対する透析によって、解離用混合物からＤＴＴを除去する段階、及び
（ｃ）透析濾過、限外濾過、又は０．５〜１．３５ＭのＮａＣｌ、０．５〜５ｍＭのＣａ＋２又は０．５〜５ｍＭのＭｇ＋２、ｐＨ６．０〜６．５の２０〜７０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０〜７０ｍＭのグリシン及びリン酸塩及び２０〜７０ｍＭのクエン酸塩及びリン酸塩からなる群から選択される緩衝液を含む再構築用緩衝液に対する透析によって分解したＶＬＰを再構築する段階を含む前記方法。
【請求項２】
さらに（ｄ）透析濾過、限外濾過又は０．２５〜１ＭのＮａＣｌ、５〜２０ｍＭのヒスチジンを含むｐＨ６〜６．５の最終緩衝液に対する透析によって、再構築されたＶＬＰを精製する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに（ｅ）段階（ｄ）で得られた再構築されたＶＬＰをアルミニウムアジュバントに吸着する段階を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＶＬＰがＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階（ａ）においてＶＬＰを１時間未満インキュベーションすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）における解離用混合物が、０．１６〜０．１８Ｍ  ＮａＣｌと、２〜２０ｍＭ  ＤＴＴと、０．０１〜０．０３％ポリソルベート８０と、０．５〜５ｍＭ  ＥＤＴＡと、ｐＨ８．２の５〜１５ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）における緩衝液が、０．１６〜０．１８ＭのＮａＣｌと、０．０１〜０．０３％のポリソルベート８０と、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸塩を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
再構築用緩衝液が、１．０ＭのＮａＣｌと、２ｍＭ  Ｃａ＋２と、ｐＨ６．２の５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５０ｍＭのグリシンとリン酸塩、及び５０ｍＭのクエン酸塩とリン酸塩からなる群から選択される緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｄ）における最終緩衝液が０．５Ｍ  ＮａＣｌと、ｐＨ６．２の１０ｍＭヒスチジンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む、貯蔵に対して安定なヒトパピローマウイルスワクチンの製造方法であって、
（ａ）０．５〜１．２５ＭのＮａＣｌと、２〜２０ｍＭのＤＴＴと、０．０１〜０．０５％のポリソルベート８０と、０．５〜５ｍＭのＥＤＴＡと、ｐＨ７〜１０の５〜１００ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液及び０〜５０ｍＭのリン酸緩衝液を含む高塩解離用混合物中で、分解したＶＬＰが生成するまでＶＬＰをインキュベートする段階、
（ｂ）場合により、解離用混合物から透析濾過、限外濾過又は少なくとも１ＭのＮａＣｌと、０．０１〜０．０５％ポリソルベート８０と、ｐＨ６．５〜７．５のリン酸緩衝液を含む緩衝液に対する透析により解離用混合物からＤＴＴを除去する段階、及び
（ｃ）透析濾過、限外濾過又は０．５〜１．３５Ｍ  ＮａＣｌと、０．５〜５ｍＭのＣａ＋２又は、０．５〜５ｍＭのＭｇ＋２と、２０〜７０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０〜７０ｍＭのグリシンとリン酸塩、及び２０〜７０ｍＭのクエン酸塩とリン酸塩から構成される群から選択されるｐＨ６〜６．５の緩衝液を含む再構築用緩衝液に対する透析により分解したＶＬＰを再構築させる段階を含む方法。
【請求項１１】
さらに（ｄ）透析濾過、限外濾過又は０．２５〜１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６〜６．５の５〜２０ｍＭのヒスチジンを含む最終緩衝液に対する透析によって、再構築されたＶＬＰを精製する段階を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに（ｆ）段階（ｄ）で得られた再構築されたＶＬＰをアルミニウムアジュバントに吸着する段階を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＬＰがＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びその組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ａ）においてＶＬＰを１時間未満インキュベーションし、解離用混合物が０．５ＭのＮａＣｌと、２〜２０ｍＭのＤＴＴと、０．０１〜０．０３％のポリソルベート８０と、０．５〜５ｍＭのＥＤＴＡと、ｐＨ８．２の５〜１００ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液及び０〜５０ｍＭのリン酸塩を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ｂ）における解離用混合物が、１ＭのＮａＣｌと、０．０１〜０．０３％のポリソルベート８０と、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸塩を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｃ）における再構築用緩衝液が、１．０〜１．３５ＭのＮａＣｌと、２ｍＭのＣａ＋２と、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭグリシンとリン酸塩、及び５０ｍＭクエン酸塩とリン酸塩から構成される群から選択されるｐＨ６．２の緩衝液を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｄ）における最終緩衝液が０．５Ｍ  ＮａＣｌと、ｐＨ６．２の１０ｍＭヒスチジンを含む請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の簡単な説明
本発明はキャプソメアに分解した後に再構築したウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチンに関する。本発明はＨＰＶ  ＶＬＰをより均質にし、貯蔵安定性を著しく改善させた前記ワクチンの製造方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は生殖管に感染し、種々の異形成、癌及び他の疾病に結び付けられている。これらの疾病は今日のワクチン開発の標的であり、Ｌ１又はＬ１＋Ｌ２タンパク質の組合せを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンが現在臨床試験中である。
【０００３】
しかし、酵母から精製した組換えＬ１タンパク質ＨＰＶ  ＶＬＰは溶液中又はアルミニウムアジュバント粒子に吸着させた場合のいずれも長期貯蔵中に不安定であることが判明した。
【０００４】
従来、様々の研究者がＨＰＶ  ＶＬＰの集合と分解の条件について研究している。例えば、ＭｃＣａｒｔｈｙら，１９９８“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １１  Ｖｉｒｕｓｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ”  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（１）：３２−４１はＶＬＰの均質調製物を得るために昆虫細胞から精製した組換えＬ１ＨＰＶ１１ＶＬＰの分解と再構築について記載している。比較的高濃度還元剤を生理的イオン強度で長時間インキュベート（約１６時間、４℃）してＶＬＰを分解し、より高いイオン強度で還元剤を除去してＶＬＰを再構築させている。しかし、この方法は非常に長時間を要する。
【０００５】
商業的に有用なワクチンを開発するためには貯蔵安定製剤が必要である。貯蔵安定ＨＰＶ  ＶＬＰ製剤を製造するために、比較的簡単で迅速で定量的な処理方法が得られるならば望ましい。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は安定なヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法として、
（ａ）比較的低濃度の還元剤と、１．２５Ｍまでの生理的イオン強度範囲で存在する塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む解離用混合物中で分解ＶＬＰが生成されるまでＶＬＰをインキュベートする段階と、
（ｂ）解離用混合物から還元剤を除去する段階と、
（ｃ）分解ＶＬＰをＶＬＰに再構築する段階を含む方法に関する。
【０００７】
態様によっては、再構築ＶＬＰをアルミニウムアジュバントに吸着させる。
【０００８】
本発明は、
（ａ）比較的低濃度の還元剤と、０．５Ｍ〜１．２５Ｍ塩の範囲で存在する塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む高塩解離用混合物中で分解ＶＬＰが生成されるまで精製ＶＬＰをインキュベートする段階と、
（ｂ）解離用混合物から還元剤を除去する段階と、
（ｃ）分解ＶＬＰを再構築させる段階と、
（ｄ）場合により、再構築ＨＰＶ  ＶＬＰをアルミニウムアジュバントに吸着させる段階を含む方法により製造したＶＬＰにも関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、
（ａ）比較的低濃度の還元剤と、ほぼ生理的イオン強度で存在する塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む低塩解離用混合物中で分解ＶＬＰが生成されるまで精製ＶＬＰをインキュベートする段階と、
（ｂ）解離用混合物から還元剤を除去する段階と、
（ｃ）分解ＶＬＰを再構築させる段階と、
（ｄ）場合により、再構築ＨＰＶ  ＶＬＰをアルミニウムアジュバントに吸着させる段階を含む方法により製造したＶＬＰに関する。
【００１０】
本発明の別の側面は、上記方法のいずれかにより製造したＶＬＰから製造したワクチンに関する。
【００１１】
本発明は上記方法により製造したＶＬＰを含み、製剤用緩衝液中に保存したワクチン製剤にも関する。製剤用緩衝液は塩と、ヒスチジン緩衝液と、非イオン界面活性剤を含む。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１は超遠心分析により測定したＨＰＶ１６ＶＬＰの分解と再構築を示すグラフである。
【００１３】
図２は超遠心分析により測定した分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰ（破線）と未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰ（実線）の粒度分布を示すグラフである。
【００１４】
図３はＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定したＨＰＶ１６−アルミニウムワクチンの加速貯蔵安定性（３７℃）を示すグラフである。
【００１５】
図４はＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定した、生理的塩類溶液中のＨＰＶ１６ＶＬＰの加速貯蔵安定性を示す。
【００１６】
図５はＵＶ濁度（曇点分析）により熱誘導凝集をモニターすることにより測定した各種ＨＰＶ１６ＶＬＰロットの熱安定性に及ぼす分解／再構築処理の効果を示す。
【００１７】
図６Ａ〜ＤはＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定した溶液中の４種（ＨＰＶ１６、１１、６ａ、１８）の異なる分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰと未処理対照ＨＰＶ  ＶＬＰの加速貯蔵安定性（３７℃）を示す。図６ＡはＨＰＶ６ａ、図６ＢはＨＰＶ１１、図６ＣはＨＰＶ１６、図６ＤはＨＰＶ１８を表す。
【００１８】
図７Ａ〜Ｈはアルミニウムアジュバントに吸着させた４種（ＨＰＶ１６、１１、６ａ、１８）の異なる分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰと未処理対照ＨＰＶ  ＶＬＰの加速貯蔵安定性を示す。試料はクエン酸溶液で処理してアルミニウムアジュバントから抗原を放出させた後にＢＩＡｃｏｒｅ分析によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性をアッセイした。図７Ａ及び７ＢはＨＰＶ６ａ、図７Ｃ及び７ＤはＨＰＶ１１、図７Ｅ及び７ＦはＨＰＶ１６、図７Ｇ及び７ＨはＨＰＶ１８を表す。
【００１９】
図８Ａ〜Ｆは生理的条件付近（低塩法）又は高塩濃度（高塩法）の分解法により製造した分解／再構築ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ１６ＶＬＰの熱安定性と流体力学的サイズ分布の比較を示す。ＨＰＶ  ＶＬＰのこれらの物性は曇点分析と超遠心分析により測定した。低塩法では０．１６６Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ８．２）中でＨＰＶ  ＶＬＰを分解し、高塩法では０．６３Ｍ  ＮａＣｌ、３５ｍＭリン酸及び１００ｍＭ  ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ８．２）中でＨＰＶ  ＶＬＰを分解する。どちらの溶液にもＥＤＴＡとポリソルベート８０を加える。図８Ａ及び８ＢはＨＰＶ６ａＶＬＰの曇点及び超遠心分析データを示し、図８Ｃ及び８ＤはＨＰＶ１１ＶＬＰについての同分析データを示し、図８Ｅ及び８ＦはＨＰＶ１６ＶＬＰについての同分析データを示す。
【００２０】
図９Ａ〜ＤはＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した未処理及び分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰの粒度分布と表面親和性を示す。図９ＡはＨＰＶ６ａ、図９ＢはＨＰＶ１１、図９ＣはＨＰＶ１６、図９ＤはＨＰＶ１８を表す。
【００２１】
本発明はより安定なＨＰＶ  ＶＬＰの製造方法に関し、これらのＶＬＰはＨＰＶワクチン製剤の総合安定性を著しく改善することが判明した。精製ＨＰＶ  ＶＬＰを生成し、キャプソメアであると予想される形態に分解し、再構築してＶＬＰとした後、ワクチン製剤の活性成分として使用する。
【００２２】
本発明によると、任意タイプのＨＰＶ  ＶＬＰをワクチン製剤の抗原部分として使用することができる。ＶＬＰはＬ１タンパク質のみを含むものでもよいし、Ｌ１タンパク質とＬ２タンパク質の両者を含むものでもよい。タンパク質は野生型アミノ酸組成でもよいし、突然変異を含むものでもよい。野生型アミノ酸組成のＬ１タンパク質のみを含むＶＬＰが好ましい。
【００２３】
好ましいＨＰＶは疾病に関連するものであり、例えばＨＰＶ１、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３、ＨＰＶ４、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ７、ＨＰＶ１０、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４１〜４４及びＨＰＶ５１〜５５が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいＨＰＶとしては、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８が挙げられる。更に、本発明の製剤はＨＰＶタイプの組合せにも適しており、例えば複数のＨＰＶ抗原（例えばＨＰＶ６、１１、１６及び１８）を含む多価ワクチンが挙げられる。
【００２４】
ＶＬＰは当分野で公知のように組換え技術により製造することが好ましい。ＶＬＰを製造するために使用する宿主細胞は酵母細胞が特に好ましいが、細菌、昆虫及び哺乳動物細胞等の他の細胞種も宿主として知られ、広く使用されている。理論に結び付けるものではないが、ＶＬＰにおけるＬ１タンパク質中のジスルフィド結合状態は組換えＬ１を発現させるために使用する宿主細胞とその後の精製方法によって異なると思われる。ＭｃＣａｒｔｈｙら，１９９８，前出は昆虫細胞で生産した組換えＶＬＰにジスルフィド架橋Ｌ１トライマーが存在すると記載している。他方、本発明によると、酵母で生産されるＶＬＰのＬ１タンパク質中のジスルフィド結合状態は一定していないので、最適な分解と再構築には異なる条件が必要であると思われる。
【００２５】
製剤によっては、アルミニウム吸着体が好ましい。一般にこの場合には、アルミニウムに吸着させるＨＰＶ  ＶＬＰの濃度は各ＨＰＶ  ＶＬＰタイプ毎に約１０〜２００μｇ／ｍＬである。これは特定タイプのＨＰＶの抗原性や、「カクテル」型ワクチンにおける複数タイプのＨＰＶの存在等の因子に応じて調節することができる。
【００２６】
分解
組換え宿主細胞でＶＬＰを生産させ、精製した後、解離用混合物中でインキュベートすることにより分解する。分解は生理的（「低塩法」とも言う）から１．２５Ｍ  ＮａＣｌ（「高塩法」とも言う）までの比較的広い範囲のイオン強度環境でジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤でジスルフィド結合を還元することにより主に実施される。解離用混合物は還元剤と、塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む。
【００２７】
還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）が好ましいが、他の還元剤も知られており、使用できる。ＨＰＶ粒子を分解するために他の還元剤（例えばβ−メルカプトエタノール、β−ＭＥ）も従来使用されている（例えば、ＭｃＣａｒｔｈｙら，１９９８，前出参照）が、その場合には比較的高濃度の還元剤（５％又は７１３ｍＭβ−ＭＥ）を使用した。これに対して、本発明の１側面は比較的低濃度の還元剤の使用にある。
【００２８】
本明細書及び請求の範囲において「比較的低濃度の還元剤」なる用語は、ＤＴＴを還元剤として使用する場合には約２ｍＭ〜２０ｍＭを意味し、別の還元剤を使用する場合には２〜２０ｍＭ  ＤＴＴを使用した場合とほぼ同一の効果をもつ別の還元剤の量を意味する。還元剤の好ましい量は約１０ｍＭ  ＤＴＴである。
【００２９】
解離用混合物の別の重要な成分は塩である。一般に、解離用混合物のイオン強度は塩の存在により維持される。イオン強度の調節に有効な塩は殆どいかなる塩をも使用することができる。イオン強度を調節するために使用可能な好ましい塩は任意の生理的に許容可能な塩であり、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びその混合物が挙げられる。特に好ましい塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＮａ２ＳＯ４、特にＮａＣｌである。
【００３０】
本発明の低塩態様では、解離用混合物はほぼ生理的なイオン強度でなければならない。本明細書及び請求の範囲において塩に関する「ほぼ生理的」なる用語は、ＮａＣｌを塩として使用する場合には０．１０〜０．２０Ｍ、好ましくは約０．１５〜０．１８Ｍ、より好ましくは約０．１６Ｍを意味する。他の使用可能な塩については、当業者はほぼ生理的なＮａＣｌ溶液と等価のモル濃度を計算することができる。
【００３１】
あるいは、高塩環境で解離を実施してもよい。本明細書で使用する「高塩」とは少なくとも０．５Ｍの塩及び少なくとも１０ｍＭの緩衝剤を意味する。使用する塩がＮａＣｌである場合には、好ましい高塩範囲は０．５〜１．２５Ｍであり、より好ましい範囲は０．６０〜０．１Ｍである。他の塩については、当業者は０．５Ｍ〜１．２５Ｍ  ＮａＣｌ溶液と等価のモル濃度を計算することができる。
【００３２】
高塩分解法を使用できるという点は全く予想外であり、Ｂｒａｄｙら，１９７７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３：７１７−７２４、Ｂｅｌｎａｐら，１９９５  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：２４９−２６３及び公開特許出願ＷＯ９９／１３０５６等の文献報告は塩濃度をを０．５Ｍ  ＮａＣｌ未満に制限している。しかし、高塩濃度はタンパク質凝集の危険を抑え、その結果、タンパク質総回収率が改善され、最終精製クロマトグラフィー段階で分解／再構築処理を開始することができ、従って、精製中に必要な処理段階数が減るという点から、高塩分解を使用すると有利であることが判明した。
【００３３】
好ましい高塩溶液（例えば１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．２）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％ポリソルベート８０及び２〜２０ｍＭ  ＤＴＴ）を使用すると、製造工程におけるＨＰＶタンパク質総回収率はほぼ１００％になることが意外にも判明した。別の高塩溶液（０．６３Ｍ  ＮａＣｌ、３５ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．２）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％ポリソルベート８０及び２〜２０ｍＭ  ＤＴＴ）も好ましい。
【００３４】
ＨＰＶ  ＶＬＰ分解の有効性に及ぼす高塩濃度の効果をよりよく理解し、特性決定するために、高（０．５〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ）及び低（生理的）塩分解条件下の両者で比較試験を実施した。静的光散乱強度の変化をモニターし、ＶＬＰ分解を調べた。結果は高塩条件と生理的塩条件の両者で非常によく似ており、（２０ｍＭ）ＤＴＴ添加から約２分以内に完全なＶＬＰ分解が生じることが分かった。更に、分解速度は塩濃度よりも還元剤濃度により制御されると思われ、所与温度及びｐＨでは還元剤の濃度が高いほど分解速度は増した。
【００３５】
生理的又は高塩下に分解再構築したＶＬＰの他の生物物理学的特性も試験した。高低塩条件下の両者で調製した分解／再構築ＶＬＰの熱安定性と流体力学的サイズ分布は似ている。他方、タンパク質総回収率は高塩分解法で調製した分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰのほうが比較的高かった（約１００％）。
【００３６】
解離用混合物の別の成分は非イオン界面活性剤である。非イオン界面活性剤はポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（登録商標）、ＮＰ−４０（登録商標）、Ｓｐａｎ８５及びプルロニック系非イオン界面活性剤の一員から構成される群から選択することができる。ポリソルベート８０が特に好ましい。ポリソルベート８０の好ましい濃度は約０．０１〜０．５０％、好ましくは約０．０１〜０．１０％、特に約０．０３％である。
【００３７】
解離用混合物は緩衝液の存在によりｐＨ調節すべきである。ＨＰＶ  ＶＬＰの分解は７．０〜１０等の塩基性ｐＨ範囲で実施することができる。好ましいｐＨは８．０〜８．５、好ましくは約８．２である。好ましい緩衝液は５〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭのＴＲＩＳであるが、リン酸等の他の緩衝液も使用できる。解離用混合物条件で良好なｐＨ及びイオン強度制御が得られることから、一般にはＴＲＩＳが好ましい。場合により、０〜５０ｍＭのリン酸緩衝液を加えてもよい。
【００３８】
解離用混合物にはＶＬＰの完全な分解を確保するために金属キレート剤も加える。好ましい金属キレート剤は０．５〜５ｍＭ、好ましくは約２ｍＭのＥＤＴＡであるが、他の公知キレート剤も使用できる。
【００３９】
特に好ましい解離用混合物は０．１６Ｍ〜０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、１０又は２０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０３％ポリソルベート８０を加えた１０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中に約３００μｇ／ｍＬのＨＰＶ  ＶＬＰタンパク質を含む。あるいは、解離用混合物は０．６３Ｍ  ＮａＣｌ、３５ｍＭリン酸、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．２）、１０又は２０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０３％ポリソルベート８０中に同一量のタンパク質を含む。
【００４０】
本発明の方法の１つの利点は、分解段階がかなり迅速であり、解離用混合物中でＶＬＰを室温で約１時間未満インキュベートするだけでよく、３０〜４０分程度まで短縮できるという点である。所望により、解離段階（及び分解／再構築処理の他の段階）は滅菌条件下に実施してもよい。例えば、緩衝液成分を滅菌濾過し、滅菌タンパク質溶液と共に使用してもよい。更に、使用前又はアルミニウムアジュバントに吸着する前に溶液中の分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰを滅菌濾過してもよい。
【００４１】
ＶＬＰ分解の完了後、還元剤を除去しなければならない。これは透析段階又は透析濾過／限外濾過段階を使用して実施することができる。透析段階は塩（生理的強度又は高塩法を使用した場合には１Ｍ等の高塩濃度）と、非イオン界面活性剤と、解離用混合物中に存在するものと同様であるが、解離用混合物中に存在するものよりも低ｐＨの緩衝液を含む溶液で透析することからなる。この透析段階に推奨されるｐＨ範囲は約６．５〜７．５、好ましくは約７．０である。好ましい透析溶液の１例は０．１６〜０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１〜０．０３％ポリソルベート８０、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）を含む。推奨される透析の別の例は０．１６６Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液による１：１００透析（３０分間ずつ３回交換）である。あるいは、好ましい溶液は１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸及び０．０３％ポリソルベート８０（０Ｈ７．０）である。
【００４２】
必要に応じて、ＤＴＴを除去するために使用する緩衝液にポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤を更に加え、製造工程を通してタンパク質に十分な非イオン界面活性剤濃度を維持するようにしてもよい。
【００４３】
あるいは、下記再構築用溶液を使用してＤＴＴを除去してもよい。
【００４４】
大容量の場合には、透析法の代わりに大規模化可能な透析濾過又は限外濾過システムを使用することができる。
【００４５】
再構築
次段階ではＶＬＰを再構築する。これは上記透析段階中、上記透析濾過／限外濾過段階中、又は別個もしくは付加的な透析段階中に実施することができ、数時間から約２４時間までとすることができる。別個の透析を使用する場合には、０．５〜１．３５Ｍ  ＮａＣｌの範囲のイオン強度の塩と、金属イオン源と、ｐＨ６．０〜６．５の緩衝液を含む再構築用緩衝液を使用して実施する。
【００４６】
塩は前段階で使用したと同一の塩が好ましいが、その濃度は高くしたほうが好ましい。例えば、ＮａＣｌを使用する場合には、０．５〜１．３５Ｍ、好ましくは約１．０Ｍの濃度とすべきである。
【００４７】
金属イオン源はＣａＣｌ２又はＭｇＣｌ２等のＣａ＋２又はＭｇ＋２源とすべきであり、再構築ＶＬＰに安定性を与えると予想される。亜鉛も使用できるが、一般には他のイオンのほうがよい。ＣａＣｌ２が好ましい。金属イオンの量は約１〜１０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭの濃度とすべきである。
【００４８】
再構築用緩衝液成分及び／又はｐＨ調節剤としてグリシン又はクエン酸ナトリウムを加える。その量は約２０〜７０ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭとする。
緩衝液はグリシンとリン酸又はクエン酸とリン酸の組合せでもよいし、クエン酸単独でもよい。リン酸緩衝液の単独使用は推奨されない。好ましい再構築用緩衝液は１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  Ｃａ＋２、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．２）及び０．０３％ポリソルベート８０である。
【００４９】
必要に応じて、再構築用緩衝液にポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤を更に加え、製造工程を通してタンパク質に十分な非イオン界面活性剤濃度を維持するようにしてもよい。
【００５０】
大容量の場合には、透析法の代わりに大規模化可能な透析濾過又は限外濾過システムを使用することができる。
【００５１】
緩衝液交換
最後に、反応体が残留している場合には最終透析用緩衝液で透析することにより除去することができる。１例は塩（好ましくはＮａＣｌ）と、非イオン界面活性剤と、場合によりヒスチジンを含む。塩はＮａＣｌの場合には約０．２５Ｍ〜１Ｍが好ましく、約０．５Ｍがより好ましい。ヒスチジンは２〜５０ｍＭ、好ましくは約５〜２０ｍＭでｐＨ６．０〜６．５、好ましくは約ｐＨ６．２とすることができる。非イオン界面活性剤（例えばポリソルベート８０又はポリソルベート２０）は０．０１〜０．０３％とすることができる。別の好ましい緩衝液交換は０．５Ｍ  ＮａＣｌと０．０３％ポリソルベート８０を使用する。
【００５２】
ＨＰＶ  ＶＬＰを分解／再構築させるために使用するこれらの多重透析段階は、透析濾過及び／又は限外濾過システム等の大規模装置で実施してもよい。必要に応じて、任意の分解／再構築用緩衝液にポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤を更に加え、製造工程を通してタンパク質に十分な非イオン界面活性剤濃度を維持するようにしてもよい。
【００５３】
所望により、公知技術を使用して分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰをアルミニウムアジュバントに吸着させてもよい。
【００５４】
場合により、ポリアニオンポリマー賦形剤を加えて再構築ＶＬＰ製剤の安定性を更に高めてもよい。本明細書及び請求の範囲を通して使用する「ポリアニオンポリマー」なる用語は長い単鎖化合物又は多重架橋鎖化合物を意味し、いずれの場合も溶液中で鎖に沿って負の多重電荷をもつ。ポリアニオンポリマーの例としては、タンパク質、ポリアニオン、ペプチド及びポリ核酸が挙げられる。特定安定剤はカルボキシメチルセルロース（特に１０〜８００ｃｐｓ）、ヘパリン（６〜３０ｋＤａ）、ポリアミノ酸（２〜１００ｋＤａ）［例えばポリ（Ｇｌｕ）、ポリ（Ａｓｐ）及びポリ（Ｇｌｕ，Ｐｈｅ）］、酸化グルタチオン［Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ］２（６１３Ｄａ）、ポリヌクレオチド（例えばポリシチジル酸（２００〜７００ｋＤａ）及びポリアデニル酸（２００〜７００ｋＤａ））、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び血清アルブミンから構成される群から選択することができる。
【００５５】
ポリアニオンポリマー賦形剤を加える場合、その濃度は約０．０１％〜約０．５％、特に約０．０５〜０．１％（重量／容量）であるが、これらの量の１０分の１のポリアニオン賦形剤（例えば０．０１％アルブミン、ＤＮＡ又はヘパリン）を加えても未処理ＨＰＶ  ＶＬＰ−アルミニウム製剤の安定性を高めることができる。
【００５６】
典型的なワクチン製剤は、１）１０〜２００μｇ／ｍＬの各ＨＰＶ  ＶＬＰタイプと０．１５〜０．３２Ｍ食塩水を含むアルミニウム吸着体と、２）５〜１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．２）と、３）０．００５〜０．０３％非イオン界面活性剤を含む。
【００５７】
この方法により得られるＨＰＶワクチン製剤は図７に示すように２〜８℃から室温で少なくとも６カ月間（試験続行中）安定である。
【００５８】
本発明の別の側面は分解／再構築ＶＬＰから製造したワクチンの安定な長期貯蔵を実現するための製剤用緩衝液の使用である。製剤用緩衝液は０．１５〜０．３２Ｍ  ＮａＣｌと、５〜１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．２）と、０．００５〜０．０１５％ポリソルベート８０を含む。これらのワクチン製剤は種々の温度範囲（４〜３０℃）で少なくとも６カ月間まで安定である。以下、実施例により本発明を更に説明するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。
【００５９】
実施例１
これらの実験の大半では、酵母由来組換えＬ１タンパク質ＨＰＶ１６ＶＬＰ（タンパク質純度＞９５％）の０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３％ポリソルベート８０凍結溶液（目標ｐＨ約６．２）を使用した。ＨＰＶ６ａＶＬＰとＨＰＶ１１ＶＬＰは０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３％ポリソルベート８０溶液とした。ＨＰＶ１８ＶＬＰは０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％ポリソルベート８０溶液とした。試験によっては１．２５Ｍ  ＮａＣｌを加えた７５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）でＨＰＶ６ａ、１１及び１６ＶＬＰを使用した。
【００６０】
引き続き行うｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析のためのアルミニウムアジュバントからのＨＰＶ  ＶＬＰの放出
アルミニウムアジュバントからＨＰＶ  ＶＬＰを放出させるために、クエン酸とポリソルベート８０を含む高塩溶液でＨＰＶ−アルミニウム製剤を希釈するアルミニウム溶解法を開発した。アルミニウム溶解法からのＨＰＶ  ＶＬＰサンプルをＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性アッセイで直接使用した。
【００６１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性アッセイ
０．０２％ポリソルベート８０を加えたｐＨ６〜６．５及び高イオン強度（約０．５Ｍ〜１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍクエン酸ナトリウム）の安定化溶液にアルミニウム溶解法からのＨＰＶ  ＶＬＰサンプルを溶かした。サンプルは（ＨＰＶ  ＶＬＰタイプ特異的中和抗体を使用して）それ以上希釈せずに直接ＢＩＡｃｏｒｅ分析した。溶液サンプル（アルミニウムアジュバントなし）はＢＩＡｃｏｒｅ分析前に約０．５〜１Ｍ  ＮａＣｌで目標濃度まで希釈した。全ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性データは（アルミニウムに吸着していない）凍結ＨＰＶ  ＶＬＰ対照サンプルを基準とする。
【００６２】
タンパク質濃度分析
ＨＰ８４５２Ａダイオードアレースペクトロフォトメーターと経路長１ｃｍのキュベットを使用して、バルク溶液と処方サンプル（アルミニウム溶解後）の両者におけるＨＰＶ  ＶＬＰのタンパク質濃度を周囲温度でＵＶ吸光度スペクトル測定により測定した。使用したサンプル容量は１００〜２５０μｌとした。多成分二次導関数分析法を使用してタンパク質濃度を計算した。一部の実験では、ＢＣＡ比色分析でもタンパク質濃度を測定した。
【００６３】
流体力学的サイズ分析。
【００６４】
未処理及び分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰの流体力学的サイズは動的光散乱、分析用超遠心及びＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定した。
【００６５】
動的光散乱測定はＭａｌｖｅｒｎ  ４７００光散乱システムを９０°で使用して周囲温度で実施した。ＨＰＶ  ＶＬＰの見掛けの流体力学的サイズをＺ平均流体力学的直径として測定した。各値は同一サンプルの５回の測定の平均を表す。
【００６６】
沈降速度実験はＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬＩ分析用遠心機と２８０ｎｍのＵＶ検出を使用して実施した。固定及び可変速度モードの２種の異なる方法を使用して沈降係数を決定した。
【００６７】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ測定はＷａｔｅｒｓ／Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ２６９０システムとＵＶ及び蛍光検出器を使用して周囲温度で実施した。７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を移動相として使用し、（ＨＰＶ  ＶＬＰでプレコンディショニングした）ＰＬ−ＧＦＣ  ４０００Åカラムを流速０．４ｍｌ／分で使用した。
【００６８】
電子顕微鏡分析
ネガティブ染色法を使用して透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析を実施した。サンプルを固定し、リンタングステン酸で染色し、ＪＥＯＬ  １２００ＥＸ透過型電子顕微鏡で試験した。調製したサンプルを含むランダム領域の３００００倍〜４００００倍顕微鏡写真を複数回撮影した。ネガからプリントに現像する際に更に３倍に拡大した。
【００６９】
実時間及び加速貯蔵安定性試験
ＨＰＶ−アルミニウム製剤貯蔵安定性試験を実施した。安定性試験の温度は一般に２〜８、１５、２５、３０及び３７℃とした。円二色性と蛍光スペクトロスコピーによる既存の配座安定データ（図示せず）によると、温度が４０〜４５℃以上になるとＨＰＶ  ＶＬＰのＬ１タンパク質に有意な配座変化が生じることが示されているが、このような状態は加速貯蔵安定性試験では絶対避けなければならない。
【００７０】
ＨＰ８４５Ｘ  ＵＶ−可視光システムソフトウェアと温度調節システムを搭載したＨＰ８４５２Ａダイオードアレースペクトロフォトメーターを使用して濁度アッセイを実施することによりＨＰＶ  ＶＬＰ熱安定性も評価した。温度を２４℃から７４℃まで制御速度で上げることによりプログラムの動態モード下に３５０ｎｍで（タンパク質凝集による）溶液の光散乱を追跡した。
【００７１】
マウス力価試験
ＨＰＶ  ＶＬＰのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性をＢＡＬＢｃマウスで評価した。ＨＰＶ  ＶＬＰサンプルをアルミニウムアジュバントに吸着させ、アルミニウムアジュバントで数種の目標濃度まで希釈し、マウスに注射した。血清を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイにより抗体濃度を分析した。
【００７２】
実施例２
超遠心分析により測定したＨＰＶ１６ＶＬＰの分解及び再構築
図１に示すように、ＨＰＶ１６ＶＬＰは１０ｍＭ  ＴＲＩＳ又はリン酸、０．１６６Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２ｍＭ  ＤＴＴを含有するｐＨ８．２緩衝液中で室温で２０分間インキュベーション後に分解する（中段曲線）。分解したＨＰＶ１６サンプルはＬ１キャプソメアであると予想される小さいＳ値にピークを示し、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質ペンタマーのサイズを示唆している。上段曲線は分解したＨＰＶ１６（キャプソメア）がその後、グリシン又はクエン酸の存在下に１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５〜１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ塩化カルシウムを含有するｐＨ６．２緩衝液で透析することによりＶＬＰに再構築したことを示す。下段曲線は未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰを示す。
【００７３】
実施例３
分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰの粒度分布
図２は実施例２に記載したように分解再構築させたＨＰＶ１６ＶＬＰ（破線）と未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰ（実線）の粒度分布を超遠心分析により測定した結果を示す。データから明らかなように、夫々ピークの位置と幅から見て、分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰのほうが粒度が大きく、分布が均質である。電子顕微鏡（ＥＭ）分析でも分解／再構築ＶＬＰのほうが均質であり、粒度の均質な平均直径約８０〜８５ｎｍの真円に近い粒子として存在しており（ＥＭデータは示さず）、超遠心分析を裏付けている。未処理サンプルのほうが粒度が小さく、形状と粒度分布が不均質であり、平均粒度は約５０〜６８ｎｍである。同様に、その後の一連のデータによると、未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰは平均粒度約４０ｎｍであるが、再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰは平均粒度約６０ｎｍである。
【００７４】
実施例４
ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定したＨＰＶ１６ＶＬＰ−アルミニウムワクチン製剤の加速安定性（３７℃）
分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰと未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰをアルミニウムアジュバント（１６０μｇ／ｍＬタンパク質に対して４５０μｇ／ｍＬ  Ａｌ）に吸着させ、０．３２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、０．０１５％ポリソルベート８０（ｐＨ６．２）に加えた。サンプルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性をＢＩＡｃｏｒｅ分析により指定時間でアッセイした。
【００７５】
図３は分解再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰを黒丸と白四角で示し、未処理サンプルを黒菱形で示す。試験１は再構築用緩衝液にクエン酸を加え、試験２はグリシンを加えた。データから明らかなように、分解／再構築処理の結果、アルミニウムアジュバントに吸着させたＨＰＶ１６ＶＬＰの加速貯蔵安定性は未処理ＨＰＶ  ＶＬＰに比較して有意且つ劇的に増加する。同様の実験を２５℃と４℃で３カ月間実施したが、アルミニウムアジュバントに吸着させた分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性の低下は認められなかった。
【００７６】
実施例５
ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定した生理的塩類溶液中のＨＰＶ１６ＶＬＰの加速安定性（３７℃）
分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰと未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰ  ８０μｇ／ｍｌを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、０．０１５％ポリソルベート８０（ｐＨ６．２）中で３７℃でインキュベートした。サンプルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性をＢＩＡｃｏｒｅ分析により指定時間にアッセイした。データから明らかなように、分解／再構築処理の結果、ＨＰＶ１６ＶＬＰの加速貯蔵安定性は未処理ＨＰＶ  ＶＬＰに比較して有意に増加する。これを図４に示し、分解／再構築ＶＬＰは白丸と白四角で示し、未処理ＶＬＰは黒菱形で示す。試験１は再構築用緩衝液にクエン酸を加え、試験２はグリシンを加えた。
【００７７】
実施例６
ＵＶスペクトロスコピー（曇点分析）により熱誘導濁り形成（凝集）をモニターすることにより測定した各種ＨＰＶ１６ＶＬＰロットの熱安定性に及ぼす分解／再構築処理の効果
標準曇点プロトコールをサンプルに適用し、溶液の光学密度３５０ｎｍでモニターしながら制御速度で２４℃から７４℃まで加熱した。図５に示すように、３種の異なるロットのＨＰＶ１６ＶＬＰ（ロット１、２、３）を分解／再構築処理の前（破線と白記号）と後（実線と黒記号）に分析した。これらのサンプルのうち、ＨＰＶ１６ＶＬＰ（ロット１）は３回試験した。データから明らかなように、分解／再構築処理の結果、熱誘導凝集に対するＨＰＶ１６ＶＬＰの固有安定性は有意に増加する。熱安定性増加に加え、分解／再構築処理の結果、より安定した均質な安定性プロフィルが得られる。
【００７８】
実施例７
未処理及び分解／再構築ＶＬＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性を大量のＨＰＶ１６ＶＬＰで更に評価し、未処理及び分解／再構築ＶＬＰの両者をアルミニウムアジュバント吸着前後に評価した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性はＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定し、タンパク質濃度はＵＶスペクトロスコピーとＢＣＡ比色アッセイにより測定した。次に、未処理及び分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰの両者の抗原対タンパク質比を測定した。例えば、分解／再構築及び未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰの抗原対タンパク質比は１．７であり、１．５〜１．９の範囲であった。この結果はＥＩＡ分析（平均１．６と範囲１．４〜１．８）とＩＶＲＰ分析（平均１．４と範囲１．３〜１．５）により裏付けられた。
【００７９】
未処理及び分解／再構築アルミニウム吸着ＨＰＶ１６ＶＬＰのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性をマウス力価試験により評価した。この試験ではマウスの５０％以上が血清変換するＨＰＶ  ＶＬＰの用量（μｇ）を表すＥＤ５０値を測定する。分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性は未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰと同等であるか、又はそれよりも良好であった。１回目の実験では、未処理サンプルのＥＤ値０．１４６に対して、２種の分解／再構築サンプルのＥＤ５０値は０．０３４〜０．０６２であった。２回目のマウス実験では、未処理サンプルのＥＤ５０値０．０７４に対して３種の分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰサンプルで＜０．０１２５のＥＤ５０値が得られた。
【００８０】
実施例８
ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定した溶液中とアルミニウムアジュバントに吸着させた未処理及び分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰの加速安定性（３７℃）
０．３２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、０．０１５％ポリソルベート８０を含有する溶液（ｐＨ６．２）中で８０μｇ／ｍＬ  ＨＰＶ  ＶＬＰを３７℃でインキュベートした。図６に示す時点でＢＩＡｃｏｒｅによりサンプルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性をアッセイした。データから明らかなように、分解／再構築処理の結果、加速貯蔵安定性試験中にＨＰＶ  ＶＬＰタイプ６ａ、１１及び１６の安定性は劇的に増加した。未処理ＨＰＶ１８ＶＬＰは他の３種の分解／再構築ＶＬＰに似た安定性プロフィルを示す。ＨＰＶ１８ＶＬＰの処理サンプルに有意安定性増加は認められず、これは恐らく分解／再構築処理がＨＰＶ１８ＶＬＰに作用できないためであると思われる（データは示さず）。本試験に使用したサンプルは低塩分解法で調製した。分解／再構築処理後の４種のタンパク質総回収率はＨＰＶ１１、１６及び１８ＶＬＰで約８５〜９５％であり、ＨＰＶ６ａＶＬＰで約６０〜７０％であった。分解／再構築処理後の収率はＶＬＰ凝集として特定ロットのＨＰＶ  ＶＬＰの品質に影響されると思われる。分解処理を高塩条件下に実施する場合、分解／再構築処理後のタンパク質総収率はほぼ１００％まで増加する。分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰの超遠心分析によると、分解／再構築処理はキャプソメアのほぼ定量的なＶＬＰ再構築を生じると予想される。
【００８１】
図７はアルミニウムアジュバントに吸着させたＨＰＶ  ＶＬＰの貯蔵及び加速安定性を示し、４００μｇ／ｍＬ  ＨＰＶ  ＶＬＰを４５０μｇ／ｍＬアルミニウムアジュバントに吸着させ、０．３２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジン、０．０１５％ポリソルベート８０を含有する溶液（ｐＨ６．２）中で４℃、１５℃、２５℃、３０℃及び３７℃でインキュベートした。クエン酸溶液で処理してアルミニウムアジュバントから抗原を放出させた後に図面に示す時点でＢＩＡｃｏｒｅによりサンプルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性をアッセイした。データから明らかなように、分解／再構築処理の結果、加速貯蔵安定性試験でアルミニウム吸着ＨＰＶ  ＶＬＰタイプ６ａ、１１及び１６の安定性は劇的に増加した。未処理ＨＰＶ１８ＶＬＰは他の３種の分解／再構築ＶＬＰに似た安定性プロフィルを示す。ＨＰＶ１８ＶＬＰの分解／再構築処理では有意安定性増加は認められない。
【００８２】
実施例９
低塩分解法と高塩分解法の両者により調製した再構築ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ１６ＶＬＰの熱安定性と流体力学的サイズ分布
サンプルを曇点分析と超遠心分析により評価した。低塩法では、０．１６６Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ８．２）中でＨＰＶ  ＶＬＰを分解し、高塩法では０．６３Ｍ  ＮａＣｌ、３５ｍＭリン酸及び１００ｍＭ  ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ８．２）中でＨＰＶ  ＶＬＰを分解する。どちらの溶液にもＥＤＴＡとポリソルベート８０を加えた。図８に示すデータから明らかなように、低塩法と高塩法により調製した分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰはＨＰＶ  ＶＬＰタイプ１１、６ａ及び１６では熱安定性と流体力学的サイズ分布が似ている。
【００８３】
実施例１０
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定したＨＰＶ  ＶＬＰの粒度分布と表面親和性
分解／再構築（図９、実線）及び未処理（破線）ＨＰＶ  ＶＬＰ（タイプ１１、１６及び６ａ）を４０００Ａ  ＧＰＣサイズ排除カラムで分析した。未処理ＨＰＶ  ＶＬＰは分布が不均質であったが、分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰからは単一ピークが得られた。分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰのモノマーピークは未処理ＨＰＶ  ＶＬＰのモノマーピークよりも溶出容量が小さく、分解／再構築ＶＬＰの粒度が比較的大きいことを示唆している。分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰは合計ピーク面積が比較的大きく、分解／再構築ＶＬＰの回収率が高いことを示しており、分解／再構築ＶＬＰは未処理ＶＬＰよりもカラム親和性が低いことを示唆している。未処理ＨＰＶ１８ＶＬＰは他の３種の分解／再構築ＶＬＰに似たＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィルを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  超遠心分析により測定したＨＰＶ１６ＶＬＰの分解と再構築を示すグラフである。
【図２】  超遠心分析により測定した分解／再構築ＨＰＶ１６ＶＬＰ（破線）と未処理ＨＰＶ１６ＶＬＰ（実線）の粒度分布を示すグラフである。
【図３】  ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定したＨＰＶ１６−アルミニウムワクチンの加速貯蔵安定性（３７℃）を示すグラフである。
【図４】  ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定した生理的塩類溶液中のＨＰＶ１６ＶＬＰの加速貯蔵安定性を示す。
【図５】  ＵＶ濁度（曇点分析）により熱誘導凝集をモニターすることにより測定した各種ＨＰＶ１６ＶＬＰロットの熱安定性に及ぼす分解／再構築処理の効果を示す。
【図６Ａ】  ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定した溶液中の異なる分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰと未処理対照ＨＰＶ  ＶＬＰの加速貯蔵安定性（３７℃）を示し、ＡはＨＰＶ６ａを表す。
【図６Ｂ】  ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定した溶液中の異なる分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰと未処理対照ＨＰＶ  ＶＬＰの加速貯蔵安定性（３７℃）を示し、ＢはＨＰＶ１１を表す。
【図６Ｃ】  ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定した溶液中の異なる分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰと未処理対照ＨＰＶ  ＶＬＰの加速貯蔵安定性（３７℃）を示し、ＣはＨＰＶ１を表す。
【図６Ｄ】  ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性により測定した溶液中の異なる分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰと未処理対照ＨＰＶ  ＶＬＰの加速貯蔵安定性（３７℃）を示し、ＤはＨＰＶ１８を表す。
【図７】  Ａ〜Ｈはアルミニウムアジュバントに吸着させた異なる分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰと未処理対照ＨＰＶ  ＶＬＰの加速貯蔵安定性を示し、それぞれＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１８を表す。
【図８】  Ａ〜Ｆは生理的条件付近（低塩法）又は高塩濃度（高塩法）の分解法により製造した分解／再構築ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ１６ＶＬＰの熱安定性と流体力学的サイズ分布の比較を示す。Ａ及びＢはＨＰＶ６ａＶＬＰの曇点及び超遠心分析データを示し、Ｃ及びＤはＨＰＶ１１ＶＬＰについての同分析データを示し、Ｅ及びＦはＨＰＶ１６ＶＬＰについての同分析データを示す。
【図９】  Ａ〜ＤはＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した未処理及び分解／再構築ＨＰＶ  ＶＬＰの粒度分布と表面親和性を示し、それぞれＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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