(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０１５として寄託されている新規微生物バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis） Ｘ−２。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規微生物に関し、さらに詳しくは有機性廃液および／または生物性汚泥に含まれるタンパク質を分解することができるバチルス・サブチリス（Bacillus Subtilis)に属する新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、活性汚泥による有機物分解は汚泥中に生息する微生物の集団でなされており、特に分解性の高い菌に着目してこれらの菌類を積極的に有機物の分解に利用した例はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、汚泥を発生しない屎尿処理場などから排出される生物性汚泥から、プロテアーゼ活性を示すを多くの菌種が単離されており、これらの菌の利用により、廃水および有機性／生物性汚泥に含まれるタンパク質成分を分解し、汚泥の発生量を抑える効果が期待されている。
本発明の課題は、有機性廃液および／または生物性汚泥に含まれるタンパク質を分解することができるプロテアーゼ活性の高い性能を備えた新規微生物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、有機性廃液および／または生物性汚泥中に含まれるタンパク質成分を効率的に分解する機能を備えた微生物を検索すべく鋭意検討を重ねた結果、所望の特性を有した新規微生物を単離し、その種まで同定するに到り、本発明を完成するに至ったものである。すなわち、本願で特許請求される新規微生物は以下のとおりである。
【０００５】
（１）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０１５として寄託されている新規微生物バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis） Ｘ−２。
【０００７】
本発明によって取得された新規微生物バチルス・サブチリスＸ−２の生物学的特徴を決定するために、この微生物が有する菌学的性質、すなわちＡ．形態的性質、Ｂ．培地における生育状態、Ｃ．生理学的性質およびＤ．遺伝学的性質に関して検定を行った。その結果を以下に示す。
【０００８】
Ａ．形態的性質
(1) 細胞の形および大きさ：培地としてニュートリエントブロス（ＯｘｉｄＣＭ−１）０．８％、グルコース０．８％、乾燥酵母エキス０．０２％および食塩０．６％（いずれもＷ／Ｖ％）に寒天１．４Ｗ／Ｖ％を加えたものからなる寒天培地において３２℃で培養を行った。２４時間培養したところ、１．５×５μｍのグラム陽性の桿菌であり、さらに室温で５日間培養を行った場合、長い連鎖上のものが多く観察された。
【０００９】
(2) 運動性の有無：運動性は懸濁標本で確認することができ、周毛性の運動であった。
(3) 胞子の有無：芽胞を形成し、形は卵円形で菌体より膨脹している。
(4) グラム染色：コロニー形成の初期のサンプリングで染色性を示した。この時点での細胞は栄養細胞であり、胞子化は認められなかった。
Ｂ．培地における生育状態 (1)標準寒天培地：３２℃２４時間培養のコロニーの形態は乳白色のしわのあるコロニーであった。
【００１０】
Ｃ．生理学的性質
(1) グラム染色性：＋、(2) 硝酸塩の還元能：＋、(3) 脱窒反応：＋、(4) ＶＰテスト：＋、(5) インドールの生成：＋、(6) デンプンの加水分解：＋、(7) 大豆油分解性：＋、(8) 無機窒素源の利用：＋、(9) オキシダーゼ：＋、(10)カタラーゼ：＋、
(11)生育の範囲：温度１３〜５０℃
生育温度について、低温側は液体培地を用い、５〜１５℃まで１℃刻みで設定し、２４時間での生育を観察した。高温側は４０、４５、５０、５５℃に設定し、液体培地と斜面培地で２４時間での生育を観察した。
(12)酸素に対する態度：好気性、(13)Ｏ−Ｆ試験：グルコース  −＋、(14)アンモニアの利用性：＋、(15)ＮａＨＳの分解性：＋
【００１１】
Ｄ．遺伝学的性質
Ｇ＋Ｃ含量は４２．７モル％で、Bacillus subutilisの文献値(Holt J. G. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, ９th ed., Vol., ed. By  P.H.A. Sneath, Williams＄ Wilkins, Baltimore, 1986, pp.1104-1139 ) の範囲内であった。
測定方法はあらかじめＭｇＳＯ4 ・４〜５Ｈ2 ＯとＭｎＳＯ4 を用いてそれぞれ１２００mg／ｌ溶液を調整し、減菌後の培地に無菌的にＭｇ+ として４mg／ｌ、Ｍｎ2+として１．５mg／ｌとなるように加え、２７℃で４〜５日間胞子形成直前まで培養を行った。遠心分離して得た菌体は０．１ＭＥＤＴＡ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、−２０℃保存した。一般的な方法に従ってＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの分解はＤＮＡ  ＧＣ分析キット（ヤマサ醤油社製）を用いて５０℃で１時間行った。Ｇ＋Ｃ含量の分析はＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ−９ＡおよびＳＤＰＤ−６Ａ）を用い、２７０ｎｍで検出し、カラムはＡＱ−３１２（（株）ワイエシイ製、６．０×１５０mm）を用い、１０ｍＭ  Ｈ3 ＰＯ4 −１０ｍＭ  Ｈ2 ＰＯ4 （ｐＨ３．５±０．０１）、流量１．８ml／ｍｉｎで溶出させた。
【００１２】
遺伝学的解析方法として１６ＳリボゾームＲＮＡの解析を採用した。この解析は、一般に行われている方法で回収した菌のＤＮＡを、PE Applied Biosystems 社製のキットを使用し、このプロトコールに従って１６ＳｒＲＮＡの増幅を行った。なお、使用したプライマーは５ｆ、３３８ｆ、５１５ｆ、７７６ｆ、１０８７ｆ、１１７４ｆおよび３５７ｒ、５３１ｒ、８１０ｒ、１１０４ｒ、１１９３ｒ、１５４０ｒである。ＰＣＲの温度条件は９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒で３０ｃｙｃｌｅ行った。シークエンスはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０を使用して解析した。得られたシークエンスデータはPE Applied Biosystems 社のMicroSeq data baseを使用してバチルス・サブチリスに対する相同性を算出した。相同性は９９．８４％であった。解析した塩基配列は５ｂａｓｅから１５４０ｂａｓｅであり、配位番号１であった。
【００１３】
上記した新規微生物の諸性質はバチルス・サブチリスが所有する諸性質とよく対応したのでバチルス・サブチリスＸ−２（Bacillus subtilis X-2)と命名した。
なお、得られたバチルス・サブチリスＸ−２は、平成１２年９月４日に本願出願人によって茨城県つくば市東町１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にて寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０１５が付与されている。本発明はこの寄託微生物自体はもちろん、前述した能力を有するその変異体および子孫をも含むものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明における新規微生物バチルス・サブチリスＸ−２は以下のようにして単離した。
採取した汚泥をブレンダーで１０秒間分散した汚泥懸濁液０．１mlを減菌した０．６％食塩水で１０2 、１０4 、１０6 倍希釈した。各希釈液０．１mlを後述のＡ培地からなる寒天平面に撒き、３２℃で培養した。細菌の識別はコロニーの形状、菌体の顕微鏡観察および生化学試験によった。また、平面や斜面でＢａｃｉｌｌｕｓ属菌は胞子を形成するので、コロニーが出現してから２〜５日後に各コロニー菌株の胞子形成の有無を判定した。複数の菌株がコロニー中で混じっているときはさらに希釈法で分離した。グラム陰性菌とＢａｃｉｌｌｕｓ属菌が希釈法で分離できなかったときは、下記のＡ培地からなる斜面で培養して生じたＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の胞子を減菌した０．６％食塩水に懸濁し、８５℃１０分間加熱して分離できないグラム陰性菌を除いて単離した。
Ａ培地組成
ニュートリエントブロル（Ｏｘｏｉｄ  ＣＭ−１）        ８ｇ
グルコース                                            ８ｇ
ＮａＣｌ                                              ６ｇ
乾燥酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）                          ０．２ｇ
寒天                                                １４ｇ
ＤＷ                                          １０００ｍｌ
【００１５】
単離した３種の菌株Ｘ−１、Ｘ−２、Ｘ−１０について、タンパク質分解性の試験を行った。タンパク質分解試験は、クックドミート（日水製薬社製、ＯｃｉｄＣＭ−８１を使用）２００ｍｇを０．５％食塩水６ｍｌに懸濁し、３２℃８日間振とう培養して残留する懸濁物質量を計測し、懸濁物質消費率を下記式により求めることにより行った。
懸濁物消費率（％）＝［（Ａ−Ｂ）／Ａ］×１００
Ａ：加えたクックドミート懸濁物質量
Ｂ：残留した懸濁物質量
【００１６】
クックドミートのタンパク質分解性試験結果を下記に示したが、菌株Ｘ−２の懸濁物質消費率が非常に高く、プロテアーゼ活性の高い菌株であることが判明した。この菌株Ｘ−２をバチルス・サブチリスＸ−２と命名した。バチルス・サブチリスＸ−２は配列番号１の１６ＳｒＲＮＡの核酸塩基配列を有していた。
0004540211.tif 000002
【００１７】
【発明の効果】
本発明の新規微生物バチルス・サブチリスＸ−２によれば、プロテアーゼ活性の高い性能を備えているため、有機性廃液および／または生物性汚泥に含まれるタンパク質を分解し、汚泥の発生量を大幅に低減することができる。
【００１８】
【配列表】
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0004540211.tif 000004