(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞の産生を必要とする個体の心臓に心筋細胞を産生するための医薬組成物であって、心筋細胞を産生するのに有効な量の間葉幹細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が心臓組織の少なくとも１個の損傷部分に直接投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が注射により投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が薬理的に許容可能な液状の注射用担体で投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が１０×１０6〜４０×１０6間葉幹細胞数／ｍｌを含む少なくとも２０μｌで最大で５０μｌの懸濁液中に存在する、医薬組成物。
【請求項６】
請求項２に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が切開手術手順の間に投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が注射により投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が液状形態で注射可能でありまた損傷した心筋細胞の部位で半固形になる生物適合性媒質で投与されるためのものであって、前記媒質がコラーゲンおよびその誘導体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および細胞外基質よりなるグループから選択されることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が固形の可撓性基質である生物適合性媒質で投与されるためのものであり、該媒質がゲルフォーム（ミシガン、カラマズー、アプジョン）であることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の医薬組成物であって、ここで固形可撓性基質が切開手術手順の間に心臓の少なくとも１個の損傷部分に適用されることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の医薬組成物であって、ここで固形可撓性基質が半固形生物適合性媒質に含浸される１個もしくはそれ以上の線維層を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞がヒト間葉幹細胞であることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が処置される個体に自己由来のものであることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、ここで間葉幹細胞が処置される個体と同種異系であることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の医薬組成物であって、ここで少なくとも一部の間葉幹細胞が外因性遺伝子物質を含むように修飾されていることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物であって、ここで外因性遺伝子物質が増殖因子、筋原性因子、転写因子、サイトカイン、ホメオボックス遺伝子、血管形成刺激因子および血管再生強化因子よりなるグループから選択される発現産物をコード化することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１７】
心筋細胞の産生を必要とする個体の心臓に心筋細胞を産生するための医薬組成物であって、心筋細胞に分化するように試験管内で誘導された間葉幹細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１８】
個体の心臓組織に心筋細胞を産生するための組成物の調製における、ヒト間葉幹細胞の使用。
【請求項１９】
受容体の心臓に移植される心臓弁に細胞を再設置するための間葉幹細胞の医薬組成物であって、この心臓弁は間葉幹細胞に生体外で接触するためのものであり、生体外で前記間葉幹細胞が前記心臓弁に浸潤しそれを再設置することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２０】
梗塞を起こした心臓組織の瘢痕形成を少なくするための医薬組成物であって、梗塞組織に心筋細胞を産生するのに有効な量の間葉幹細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２１】
心筋梗塞を治療するための医薬組成物であって、心筋細胞を産生するのに有効な量の間葉幹細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２２】
心機能を増強するための医薬組成物であって、心筋細胞を産生するのに有効な量の間葉幹細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２３】
うっ血性心不全を治療するための医薬組成物であって、心筋細胞を産生するのに有効な量の間葉幹細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１、７、または１９〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が薬理的に許容可能な液状の注射用担体中で投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１、７、または１９〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が静脈内に投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１７、または１９〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が心臓組織の少なくとも１個の損傷部位に直接投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が注射によって投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が薬理的に許容可能な液状の注射用担体中で投与されるためのものである、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２６に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が１０×１０6〜４０×１０6間葉幹細胞数／ｍｌを含む少なくとも２０μｌで最大で５０μｌの懸濁液中に存在する、医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１７、または１９〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が液状形態で注射可能でありまた損傷した心筋細胞の部位で半固形になる生物適合性媒質で投与されるためのものであって、前記媒質がコラーゲンおよびその誘導体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および細胞外基質よりなるグループから選択される、医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１７、または１９〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞がヒト間葉幹細胞である、医薬組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が処置される個体に自己由来のものである、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項３１に記載の医薬組成物であって、前記間葉幹細胞が処置される個体と同種異系のものである、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
この出願は１９９７年７月１４日に受理された合衆国暫定出願連続番号第６０／０５２，９１０号の優先権を主張する。この発明は心臓組織と心筋の置換および再生に関する。
今年３０万人以上のアメリカ人はうっ血性心不全で死ぬことになるであろう。衰弱した心筋を増大する能力は心筋症と心不全の治療にとっては大きな進歩となるであろう。心不全の医学的治療の進歩にも拘らず、この疾患に帰因する死亡率は依然として高水準にあり、大抵の患者は診断後１年乃至５年で死亡する。
老年人口に共通の心臓疾患は不適切な心臓弁、とりわけ大動脈弁のそれである。機械的置換による弁が広く使用されてはいるが、それは患者に連続して血液希釈液の摂取を必要とする。死体あるいは異種（ブタ）から得た弁も患者自身の組織を置換するためよく使用される。弁は凍結乾燥され、あるいはコラーゲン原線維を安定させ抗原性およびタンパク質分解を減少するために例えばグルタルアルデヒドを用いて化学的に架橋される。しかしこれらの弁は無細胞のままであり、機械的菌株あるいはカルシウム沈着の故で数年後には機能しなくなる。適切な宿主細胞の内部成長と何回となく繰返された組織の更新を可能にする生体適合性物質から誘導される置換弁が望ましい。
間葉幹細胞（ＭＳＣS）は１種以上の型の間葉細胞系列内に分化できる細胞である。間葉幹細胞（ＭＳＣS）はトリ、およびマウス、ラット、ラビット、イヌならびにヒトを含む哺乳類から同定され培養されている（キャプラン、１９９１年、キャプラン他、１９９３年および合衆国特許番号５，４８６，３５９号を参照されたい）。ヒト間葉幹細胞の分離、精製および培養拡張がここで詳細に説明されている。
発明の概要
この発明に従って、間葉幹細胞（ＭＳＣS）は疾患あるいは変性を通じて損傷を受けた横紋心筋を再生もしくは修復するために使用される。間葉幹細胞は心筋細胞に分化し、死滅あるいは損傷細胞の機能を置換するために患者の健全組織に組込み、これにより心筋を全体として再生する。心筋は通常修復能を持っていない。間葉幹細胞は、例えば数多くの主要な適応、すなわち（ｉ）虚血性心臓移植、（ii）うっ血性心不全患者への治療、（iii）冠状動脈バイパス移植を受けた患者の更なる疾病の予防、（iv）導電性組織再生、（ｖ）血管平滑筋再生および（vi）弁再生、などのための心筋再生に使用される。かくして間葉幹細胞はまた受容体に配置される置換心臓弁の組織に組込むために使用される。間葉幹細胞は望ましくは自系のもので弁組織を再生し、適当な弁機能を可能にする。
間葉幹細胞心筋治療は、例えば次のような順序に基づく。つまり間葉幹細胞含有組織の収穫、間葉幹細胞の分離／拡張、損傷心臓への（安定化基質と生化学的操作ありもしくはなしでの）移植および心筋層のその部位での形成である。このアプローチは伝統的な組織工学とは異なっており、後者では組織は生体外で成長しその最終分化形態で移植される。宿主環境からの生物学的、生体電気、およびもしくは生体力学トリガーは十分であろうし、あるいはある状況下では完全組込み機能組織を確立するための治療処方計画の一部として増加されるであろう。
従って、この発明の一つの見地は、それを必要とする一つの個体に間葉幹細胞の心筋産生量を投与することを含む前記個体に心筋細胞を産生する一つの方法を提供する。採用される間葉幹細胞は均質組成物であるか、あるいは間葉幹細胞で富化された混合細胞集団である。均質ヒト間葉幹細胞組成物は粘着性骨髄細胞あるいは骨膜細胞を培養することにより得られる。間葉幹細胞はユニークモノクローナル抗体で同定される特異的細胞表面マーカーにより同定される。間葉幹細胞で富化された細胞集団を得る方法は、例えば合衆国特許番号第５，４８６，３５９号で説明される。
細胞の投与は各種の手順により心臓に指向することができる。局所投与が望ましい。間葉幹細胞は、優先順位で自系、同種異系あるいは異種を含む広範な領域の源からのものであり得る。下記のものを含むこの見地のいくつかの実施例が存在する。
この見地の一つの実施例において、間葉幹細胞は注射用に薬理許容液状媒質での細胞懸濁液として投与される。注射はこの実施例では局所的、すなわち心筋層の損傷部分に直接に、あるいは全身に行うことができる。ここで再び局所投与が望ましい。
この見地のも一つの実施例において、間葉幹細胞は生体適合性媒質として投与され、それは心筋損傷の部位で半固形あるいは固形基質でありあるいはその部位でこれらのものになる。例えば、この基質は（ｉ）コラーゲンおよびその誘導体、ポリ乳酸あるいはポリグリコール酸などのような損傷心筋層の部位で半固形ゲルに「組立てられる」（あるいは重合する）注射可能液、あるいは（ii）含浸線維基質などのようなその最終形態で移植される１層もしくは複数の可撓性固形基質の層である。この基質は、例えばゲルフォーム（ミシガン、カラマズー、アプジョン）である。基質は間葉幹細胞を損傷部位で適所に保持し、すなわち「足場」の機能を果す。これは代りに増殖し、分化しそして最終的に完全成長心筋細胞となるように投与された間葉幹細胞の機会を高める。心筋環境下での間葉幹細胞の局在化の結果として、それは次いで受容体の周辺心筋層に組込まれる。これらの事象は前記液状注射実施例でも同じように起こるが、この実施例はよりきびしい治療が指示される所で望ましいものである。
この見地のも一つの実施例において、間葉幹細胞は横紋筋細胞の分化およびもしくは維持のために重要なタンパク質を発現する遺伝子を含むように遺伝子修飾あるいは操作される。その例は成長因子（ＴＧＦ−β，ＩＧＦ−１，ＦＧＦ）、筋形成因子（ｍｙｏＤ，ミオゲニン，Ｍｙｆ５，ＭＲＦ）、転写因子（ＧＡＴＡ−４）、サイトカイン（カルジオトロフィン−１）、ノイレグリン科のメンバー（ノイレグリン１，２および３）およびホメオボックス遺伝子（Ｃｓｘ，ティンマン，ＮＫｘ科）を含む。更に検討されたのは脈管形成と血管再生を刺激する因子（例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））をコード化する遺伝子である。ＤＮＡを導入するいずれの公知の方法も適切であるが、電気穿孔法、レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが現在は望ましいものである。
かくして、遺伝子操作間葉幹細胞を用いる前記見地の実施例と関連して、この発明は更に前記の適応を処置する新規な遺伝子操作間葉幹細胞および組織組成物を提供する。この組成物は影響される間葉幹細胞の全数との関連で発現される外因性物質の量を調節するための各種の割合の遺伝子修飾間葉幹細胞および未修飾間葉幹細胞を含むことができる。
この発明は更に試験管内方法を用いて心筋細胞表現型に部分的に分化する間葉幹細胞の潜在能に関する。この技術はある環境の下で間葉幹細胞を前処理することにより心臓系列に間葉幹細胞を転換することを最適化する。これは更に一度細胞が投与されると完全な分化に必要とされる時間を短くする能力を持つ。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ−１Ｃは微細針を用いて試験管内染料標識間葉幹細胞と共に注射された心筋を示す。脂肪親和性染料ＰＫＨ２６（シグマ・ケミカル社）あるいはＣＭ−ＤｉＩ（モレキュラー・プローブ社）が動物に導入される前に間葉幹細胞を標識するために利用された。これらの染料は組織部位が１−２ケ月後に収穫される時に可視のまま残る。我々は更にこのような染料が試験管内検定で間葉幹細胞に干渉しないことを示した。図１Ａは染料標識細胞を注射され、後にＴ字切開が部位で行われたラット心臓の低倍率像を示す。図１Ａと１Ｂは外表面から見た心室壁での標識間葉幹細胞を明らかにする。図１Ｃは心室壁の断面、および細胞が３ｍｍ厚の心筋の外側１−２ｍｍに存在することを示す。
望ましい実施例の詳細な説明
適切な環境刺激は間葉幹細胞を心筋細胞に転換する。間葉幹細胞の心臓系列への分化は心臓環境に存在する因子により制御される。間葉幹細胞の刺激心臓環境への露出は特異的な心筋系列マーカーの発現により検出されたように心臓分化に指向する。局所での化学、電気および機械的環境の影響は多能性間葉幹細胞を変化させ心臓に移植されたこの細胞を心臓系列に転換する。
上皮−間葉転換に続く胚芽成長の初期に、体の左側と右側からの予定運命心臓間葉は腹部正中線に移動する。ここでの他の細胞型との相互作用が連続心臓発生を誘導する。間葉幹細胞の心筋細胞への試験管内転換はネズミ胚芽幹細胞あるいは心筋細胞との同時培養もしくは融合、心臓細胞溶離液での間葉幹細胞の処置、特異的可溶性成長因子での保温、あるいは機械的刺激および電気的刺激への間葉幹細胞の露出により検定される。
心臓特異的遺伝子の発現を誘導するために、間葉幹細胞に適用できる一連の特異的処置がここで開示される。この条件はラット、イヌおよびヒトの間葉幹細胞に有効である。間葉幹細胞の処置は（１）胎仔、新生仔および成体のラット心臓細胞との間葉幹細胞の同時培養、（２）胎仔、新生仔および成体での間葉幹細胞のヘテロカリオンを創出するための化学的融合原（例えばポリエチレングリコールあるいはセンダイウイルス）の使用、（３）細胞外基質および心臓組織で見出される関連分子を含む哺乳類心臓の抽出物との間葉幹細胞の保温、（４）成長因子および分化剤での間葉幹細胞の処置、（５）間葉幹細胞の機械およびもしくは電気的刺激、ならびに（６）心筋細胞との間葉幹細胞の機械的およびもしくは電気的結合を含む。心筋細胞に向けて進化する間葉幹細胞はまず胎仔心臓組織に見出されるタンパク質を発現し、次いで成体形態に進む。心筋細胞特異的タンパク質の発現の検出は、例えばミオシン重鎖モノクローナル抗体ＭＦ２０（ＭＦ２０）、筋形質細網カルシウム・アデノシントリホスファターゼ（セルカ１）（ｍＡｂ  １０Ｄ１）、あるいはコネキシン４３に対する抗体を用いるギャップジャンクションなどへの抗体を用いて達成される。
心臓損傷は移植間葉幹細胞を用いて筋形成を高める組織応答を促進する。かくして、間葉幹細胞は瘢痕形成の度合いを少なくし心室機能を増強するために、梗塞帯に導入される。心筋はこれにより梗塞心筋区内で創出される。間葉幹細胞は直接梗塞組織帯に浸潤される。これらの細胞の組込みおよび続く分化は前に説明されたように特徴付けられる。介入のタイミングは、急性心筋梗塞の患者がまず医学的注意を引き、最良質の治療を受け、安定化が続き、そしてもし必要ならば心筋置換治療の介入を受けるような臨床環境をまねるように設計される。
心臓の４個の心房心室の内、左心室は体循環系を通じる圧の下で血液を送り出すことに主な役割がある。それはもっとも厚い心筋壁を持ち、うっ血性心不全から生じる心筋損傷のもっともよく起こる部位である。うっ血性心不全の進行の度合いあるいは発病度は、適当な供与体器官が利用できるとすぐ心臓移植が指示される場合のものから、恒常的な損傷は殆どあるいは全然みられず処置も本来的に予防のためのものまである。
生じる心筋梗塞の発病度、すなわち関係する左心室の筋量の割合は約５％乃至約４０％にわたる。これは一つの近接虚血としてあるいはより小さな虚血損傷として、約２ｃｍ2乃至約６ｃｍ2の垂直影響域および約１−２ｍｍ乃至１−１．５ｃｍの厚みを持つ影響組織域を表す。梗塞の発病度は血管が関係し、処置介入が開始される前にどれだけの時間が過ぎたかにより著しく影響を受ける。
この発明に基づく間葉幹細胞は、優先順位の下で自系、同種異系あるいは異種のものであり、その選択は処置の必要の緊急度に広く依存している。緊急に生命の危険な状態を提示する患者は心肺維持装置で維持され、一方十分な数の自系間葉幹細胞が培養され、あるいは最初の処置が自系間葉幹以外のものを用いて提供される。
この発明の間葉幹細胞治療は下記のものを含むいくつかのルートでの投与により提供することができる。まず切開手術手順の必要を避ける心筋内注射は、間葉幹細胞が注射可能液状態濁調製品である場合、あるいはそれらが液状形態で注射可能であり損傷心筋層の部位で半固体になる生物適合性媒質にある場合には使用できる。従来の心臓内注射器あるいは制御可能関節鏡送達装置は、剪断力が間葉幹細胞を損傷しない針管腔あるいは孔が十分な径（例えば３０ゲージもしくはそれ以上）を持つ限り使用することができる。注射可能液状懸濁液である間葉幹細胞調製品は更に連続滴下あるいは塊薬のいずれかで静脈内に投与することもできる。心臓への直接の物理的接近を伴う切開手術手順の間、間葉幹細胞送達調製品のこれまでに記載された形態のすべてが利用できる選択肢である。
用量範囲の代表的な例として、その範囲は１０−４０×１０6ＭＳＣS／ｍｌを含む約２０乃至約５０μｌの注射可能懸濁液の量である。担体媒質が液状か固形であるかを問わず単位量当り細胞濃度は事実上同じ範囲内に留まる。送達される間葉幹細胞の量は、固形「パッチ」型適用が切開手順の間に行われるが、注射による追加治療が前述の通りであるように行われる場合には通常より大きくなるであろう。治療の頻度と継続は、しかし前に記述（例えば５−４０％の左心室量）したように組織係り合いの度合い（パーセンテージ）に依存するであろう。
組織係り合いで５−１０％の範囲にある場合には、２０−５０μｌの注射調製品内で１００万個の間葉幹細胞の単一投与よりできるだけ少なくて治療が可能である。注射媒質はいずれかの薬理許容等張液であることができる。その例は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ＤＭＥＭ（望ましくは無血清のもの）、生理食塩水あるいは５％デキストロース水（Ｄ５Ｗ）などの培養媒質を含む。
約２０％の範囲以上の組織係り合い発病水準を持つ場合には、２０−５０μｌ（１０−４０×１０6ＭＳＣS／ｍｌ）の多重注射が予見される。再度の治療は追加の用量を伴う。
例えば４０％の組織係り合い発病水準にある非常に深刻な場合には、より延長された期間の多重等量用量と長期（数ケ月にわたる）維持用量のアフターケアが指示されよう。
この発明はそれに限定されないが、以下の実施例により更に説明される。
実施例１
正常心筋への間葉幹細胞の移植
間葉幹細胞を用いて、筋系列への間葉幹細胞の転換のために、生体内細胞−細胞接触を維持することが望ましい。環境信号は心臓分化に導くための生体内機械的および電気的合図に呼応して前記の行為を同定した。
一次ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣS）が直接注射により無胸腺ラット心筋組織に導入される。移植細胞の組込み、それに続く分化、心臓細胞との結合の形成、およびそれらの長期生存は、顕微鏡、組織構造、免疫蛍光顕微鏡、電子顕微鏡および原位置ハイブリッド形成などで特徴付けられる。
ヒト間葉幹細胞が多くの外部細胞を破壊するのに必要な免疫応答を欠いている無胸腺ラットの心筋（菌株ＨＳＤ：ＲＨ−ＲＮＵ／ＲＮＵ）に適切に移植されるかどうかも同じく検討される。
ラット間葉幹細胞がラットの心筋に移植される。数週にわたり注射された細胞を分析するため、また免疫系拒絶の可能性を最小にするために、間葉幹細胞は意図された間葉幹細胞受容体と同じ同系繁殖系菌株（同一遺伝子型）であるフィッシャー３４４ラットから収穫される。
間葉幹細胞はその受容体への導入に先立ち各種の方法で標識することができる。これは間葉幹細胞移植に続き何週かして増殖し分化するにつれて間葉幹細胞の運命を追跡することを可能にする。いくつかの方法が注射細胞を決定的に同定するために利用されるが、それは膜脂質染料ＰＫＨ２６あるいはＣＭ−ＤＩ  Ｉおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）あるいはガラクトシダーゼを発現するマローニーマウス白血病ウイルスなどのアデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）もしくはレトロウイルスでの遺伝子標識である。ＰＣＲもまた雌動物に移植された雄細胞のＹ染色体を検出するために使用される。染料標識細胞は容易に検出され、注射細胞を直接追跡するもっとも簡単な方法を提供する。この方法は少なくとも４週までの回数で信頼できる。受容体動物への導入の日に、間葉幹細胞はトリプシン消化され、製造業者（モレキュラー・プローブ社）の推薦に従ってＣＭ−ＤＩ  Ｉで標識される。間葉幹細胞の半密集単層培養が無血清培地で５ｍＭのＣＭ−ＤＩ  Ｉで２０分保温され、トリプシン消化され、過剰の無染料媒質で２回洗浄され、注射に利用される。
選択肢として、間葉幹細胞はＡＡＶ−ＧＦＰベクターを使用することによるなどで注射の前に遺伝子的に標識される。このベクターは選択マーカーを欠いてはいるが、各種の分裂終了細胞および幹細胞型で形質導入された遺伝子の高水準の発現を実現する。組換えＡＡＡ−ＧＦＰは低血清の間葉幹細胞の低密度単層に加えられる。３７℃で４時間保温に続き、上澄みが除去され新鮮培地で置換される。形質導入の９６時間後に、細胞は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）活性を検定される。典型的には細胞の５０％が形質導入遺伝子を発現される。限界希釈により分離されたクローン系列上の未選択間葉幹細胞は注射に利用される。細胞はトリプシン処置の後収集され、洗浄されまた高濃度で注射（１０００万乃至１億細胞／ｍｌ）に使用される。
心臓環境内でヒト間葉幹細胞が心筋細胞になったかどうかを検定するために、生後１０週の無胸腺ラットの心臓が染料標識あるいはＧＦＰ標識のヒト間葉幹細胞で注射された。すべての手順が厳密な無菌条件下で行われた。この動物はメトキシフルラン麻酔薬で吸収スポンジを含むガラスジャーに置かれた。無菌条件の下で、２０ｍｍの前部開胸が行われ、左心室の視覚化に続いて無血清培地で１０，０００乃至１００，０００個の間葉幹細胞を含む細胞懸濁液１０μｌが３０ゲージ針を用いて左心室尖に注射された。この手順は気管内挿管法と機械的換気補助装置で急速に行われた。切開は縫合糸で閉じられた。換気補助装置は通常は胸部閉鎖の少し後で不必要であった。図１Ａは染料標識細胞を注射され、その後Ｔ字切開が心室壁の注射細胞を明らかにするため部位で行われたラット心臓の低倍率像を示す。図１Ａは切開された心臓の肉眼で見える位の写真である。図１Ｂおよび１Ｃは心室壁の標識された間葉幹細胞を明らかにする。図１Ｃは細胞が３ｍｍ厚のラット心筋の外部１−２ｍｍに存在していたことを示している。
犠牲にされた時、心臓は除去され、血管の血栓あるいは塞栓の存在を顕微鏡で試験され、パラフィン包埋されまた切断される。連続切断部分の組織構造が染料染色細胞の運命を決定するために試験される。切断部分は次いで供与体間葉幹細胞が生体内で心筋細胞に分化したかどうかを確認するために、導入された間葉幹細胞の領域で心筋の免疫組織化学マーカーで検定される。移植手術は１，２，４および６週（各時点で４匹の動物）に犠牲とされる動物について行われ、移植片を受け入れた心臓は組織構造および免疫学的に分析される。
表現型特徴として、心臓は除去され免疫蛍光顕微鏡検査で組織構造を処置される。間葉幹細胞の分化はサコメリックミオシン重鎖，セルカ１（ＳＥＲＣＡ１）およびホスホランバンの免疫蛍光局在化により決定される。ギャップジャンクションタンパク質コネキシン４３に対する配列特異的抗体は商業的に利用可能（ザイメド社）であり心臓組織でギャップジャンクションを検出するものであり、これが使用される。
間葉幹細胞は更にＩ型コラーゲンなどのように高められた重合が観察されるかどうかを決定するために生物基質材料に移植される。間葉幹細胞は少量で急速に基質と混合され、心室壁に注射される。生物基質は０．１ｍｇ／ｍｌあるいはそれ以上の濃度で使用される。例えば、生物基質は１０００万乃至１億個細胞／ｍｌを含む１乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。組織は前に記載のように１，２，４および６週の時点で分析される。
実施例２
間葉幹細胞を用いる心臓弁の再生
異種移植弁あるいは同種移植弁は細胞死に導く凍結乾燥により、あるいは酵素処置それに続く細胞および細胞破片の洗剤抽出で無細胞にされる。後者のアプローチはヴェーズリおよび協力者により皮膚および大動脈の線維芽細胞で再植民されるブタ弁で採用された。カーティル他は１９９７年に凍結乾燥ブタを使用し、ヒト線維芽細胞および内皮細胞で弁の再植民を試みた。これらの研究はまだ始まったばかりで試験管内での短期の研究に限定された。
自己由来ヒト間葉幹細胞により植民される無細胞弁がすべての弁表面に細胞を確実に負荷するためにタンブリング容器で培養拡張ヒト間葉幹細胞と共に保温される。この弁は次いでヒト間葉幹細胞が浸潤し弁を再植民できるように１−２週ヒト間葉幹細胞と共に培養される。培養容器内で、弁は次いで弁膜の作動を可能にし、体内に存在する送出し運動をシミュレートするようにポンプに付加される。弁はポンピング動作の圧力と関連する細胞の改造を可能にするために１−２週ポンピングモードで維持される。一度十分な細胞改造が生じると、弁は患者の身体に移植される。
この発明のこの見地のも一つの実施例はまず弁をヒト間葉幹細胞で再植民し、後で弁の管腔にならぶ血管移植片から分離された自己由来平滑筋と共にポンピング段階の間弁組織を保持することにある。
【図１Ａ】
0004562816.tif 000002
【図１Ｂ】
0004562816.tif 000003
【図１Ｃ】
0004562816.tif 000004