(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するヒートショックタンパク質８６遺伝子のｍＲＮＡの一部の増幅を、プライマーセットとして配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡと配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡとを用いかつＮＡＳＢＡ技術を用いて行う工程、及び、得られた増幅生成物とプローブとしての配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程、を有することを特徴とするクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するヒートショックタンパク質８６遺伝子のｍＲＮＡの一部を増幅するための配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡと配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡとからなるプライマー、及び、得られた増幅生成物に特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ、を含むことを特徴とするクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの検出用試薬キット。
【請求項３】
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のクリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）に由来するＲＮＡの検出方法、検出用試薬キット、及び、新規な塩基配列を有するＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
クリプトスポリジウム・パルバムは、胞子虫類コクシジウム目アイメリア亜目に属する直径５μｍの小型類円形の消化管寄生原虫である。この原虫に感染すると、一般に激しい下痢と腹痛が主症状で感染から１〜４週間後には自然治癒するケースが多いが、乳幼児や高齢者では長期化、重症化するケースもある。またＡＩＤＳ患者では年余にわたってクリプトスポリジウム・パルバムが腸粘膜で増殖を繰り返し、やがて衰弱死するケースが多い。
この原虫は塩素に対して耐性を示すため通常の浄化施設では完全な処理が困難である。このことから、近年水系による下痢症の集団発生を起こす病原微生物として大きな問題となっている。
【０００３】
感染経路は、糞便の経口感染に起因するヒトからヒトへの感染、飲料水、食品汚染による経口感染に起因する家畜からヒトへの感染、放牧場、畜舎周辺、有機肥料使用の農地等の環境汚染による水を介してのヒトへの感染等様々な経路がある。
【０００４】
クリプトスポリジウム・パルバムに対する有効な薬剤や治療法は確立していない。そのため早期発見による予防処置が大変重要である。実際の環境水の感染リスクを正確に知るためには、生存するオーシストの有無を知ることが必要となる。現在クリプトスポリジウム・パルバムの生死判定法としては、ＤＡＰＩ／ＰＩ染色が知られている。この方法は、ＤＡＰＩ及びＰＩ溶液で試料を染色し、その染まり具合の差を顕微鏡で観察する方法であるが、熟練を要し時間がかかる等の問題点がある。
【０００５】
クリプトスポリジウム・パルバムのＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、電気泳動やハイブリダイゼーションを用いて検出する方法は既に開発されており、この方法により簡便かつ迅速に試料中のオーシストを検出できるが、一般的にＤＮＡは生物の死亡後も長期間残っており、サンプル中からＰＣＲによってクリプトスポリジウム・パルバムのＤＮＡを増幅し検出した場合、死亡しているクリプトスポリジウム・パルバムからのＤＮＡも検出してしまう可能性が高い。そのため、実際のリスクよりも高く評価してしまう可能性がある。
【０００６】
一方、ｍＲＮＡは、生物の死亡後すばやく分解されるため、生きた生物にしか検出されない（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９９８）６４，１３１３−１３１８）。したがってクリプトスポリジウム・パルバムのｍＲＮＡを増幅し検出することで、生存するクリプトスポリジウム・パルバムのオーシストのみを検出できる可能性がある。
【０００７】
これまでに、ＲＴ−ＰＣＲを用いてクリプトスポリジウム・パルバムのＲＮＡを検出する前例（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９９６）６２，３３８５−３３９０）はあるが、ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡとともにＤＮＡも増幅するため、増幅生成物がＲＮＡ由来のものかＤＮＡ由来のものか区別できない。そのためＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの増幅を行う前に試料をＤＮａｓｅにより処理する必要がある。それに対しＮＡＳＢＡ等により増幅する方法はＲＮＡのみを増幅するため、ＤＮａｓｅ処理を必要としない。またＲＴ−ＰＣＲに比べ、短時間で増幅が行われる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、迅速かつ簡便にクリプトスポリジウム・パルバムを検出するための、クリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの検出方法、検出用試薬キット、及び、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な新規な塩基配列を有するＤＮＡを提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する行程、及び、得られた増幅生成物とプローブとをハイブリダイゼーションさせる行程を有するクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの検出方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
クリプトスポリジウム・パルバムのＲＮＡを検出する方法としては既にヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、検出する方法が既に発表されているが、本発明は更に効率のよい方法を提供する。
【００１１】
本発明は、サンプル中から抽出したＲＮＡを増幅し、その増幅生成物にクリプトスポリジウム・パルバムに対し特異的なプローブをハイブリダイズさせることによって、サンプル中のクリプトスポリジウム・パルバムの存在を決定するものである。
【００１２】
本発明においては、まず、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する。
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡとしてはクリプトスポリジウム・パルバムに特異的であれば特に限定されないが、ヒートショックタンパク質８６（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８６、以下、ＨＳＰ８６という）遺伝子のｍＲＮＡが好適に用いられる。
本発明に用いる核酸増幅領域は、ＨＳＰ８６遺伝子内の塩基配列の一部であり、ＨＳＰ遺伝子は一般に熱ショックをかけることにより大量のｍＲＮＡを生成する利点がある。
配列番号１に示すＤＮＡは、増幅されるＨＳＰ８６遺伝子の一部分であり、ハイブリダイゼーションの標的領域配列である。配列番号１に示す塩基配列は新規なものである。
【００１３】
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡは、クリプトスポリジウム・パルバムが含まれている試料から抽出される。
上記試料としては特に限定されず、例えば、生体試料や環境試料等を挙げることができる。
上記生体試料としては、糞便検体や生検試料等を挙げることができる。
上記環境試料としては、水道水、排液のような環境中から採取された試料を挙げることができる。
【００１４】
本発明において、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する工程においては、配列番号２に示す塩基配列の少なくとも一部分を含み少なくとも１０ヌクレオチドの鎖長であるＤＮＡと、配列番号３に示す塩基配列の少なくとも一部分を含み少なくとも１０ヌクレオチドの鎖長であるＤＮＡとを、プライマーセットとして用いるのが好ましい。配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列は、いずれも新規なものである。
また、増幅工程においては、ＮＡＳＢＡ技術を用いるのが好ましい。
増幅は、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡが検出可能なレベルにまで行うことが必要である。
【００１５】
ＮＡＳＢＡ技術による増幅の際には、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドにＴ７プロモーター配列を連結させた配列番号４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるのが好ましい。配列番号４に示す塩基配列は新規なものである。
【００１６】
本発明においては、次いで、得られた増幅生成物とプローブとをハイブリダイゼーションさせる。
本発明において、上記プローブには、ストリンジェントな条件下で得られた増幅生成物に対して特異的なハイブリダイズを達成することが可能なすべてのオリゴヌクレオチドが含まれる。したがって、上記増幅生成物に対して必ずしも完全に相補的な塩基配列である必要はない。即ち、上記増幅生成物に相補的な塩基配列に対して、１つ又は複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加した塩基配列によって構成され、上記増幅生成物に特異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドをも含む。また、ハイブリダイズに必要な塩基配列で構成される部分に対して、更に付加的な領域を持つこともできる。また、上記プローブはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００１７】
本発明においてストリンジェントな条件としては特に限定されず、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％ブロッキング試薬、０．５％ポリビニルピロリドンＫ−３０、１％ＳＤＳ、５５℃でのハイブリダイゼーション、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃での洗浄という条件を挙げることができる。これらの条件は限定されるものではなく、同様のストリンジェンシーを与える条件も含まれる。
【００１８】
上記プローブとしては、配列番号５に示す塩基配列の少なくとも一部分を含むＤＮＡを好適に用いることができる。なお、配列番号５に示す塩基配列は新規なものである。
配列番号５に示す塩基配列の少なくとも一部分を含むＤＮＡは、少なくとも１０塩基の鎖長であるのが好ましい。ストリンジェントな条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するには、より好ましくは２０〜３０塩基の鎖長である。
【００１９】
本発明において、上記プローブは標識して用いる。上記プローブを標識するための標識物質及びそれをプローブに修飾する方法としては特に限定されず、例えば、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、32Ｐ、他の認識されうる官能基、ビオチン、蛍光色素、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等の容易に検出可能な反応生成物を生成することのできる酵素、又は、それに対して特異的な抗血清又はモノクローナル抗体が得られる抗原等を標識物質として用いてプローブを修飾する方法を挙げることができる。
このうち、ジゴキシゲニンのような抗原やアルカリフォスタファーゼのような酵素によって修飾したものをプローブとして用いるのが好ましい。
【００２０】
本発明においては、増幅生成物とプローブとをハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる。
本発明において、ハイブリダイゼーションとは核酸の２本の相補鎖を一緒にして２本鎖分子を形成させることをいう。
ハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させるとは、融解温度（Ｔｍ）よりも低い温度条件下で、両者を接触させることを意味する。Ｔｍは、相補的な塩基配列を構成する部分の塩基組成、ハイブリダイゼーション環境の塩濃度、又は、共存する各種の成分等によって決定される。Ｔｍに近いほどストリンジェンシーが高い条件ということができ、特異的なハイブリダイズが発現される。
増幅生成物と標識プローブとの接触は、ｍＲＮＡの増幅反応後に行うことができる。
【００２１】
本発明において、得られた増幅生成物とプローブとをハイブリダイゼーションさせる方法としては特に限定されず、例えば、スロットブロットハイブリダイゼーション法、ドットブロットハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。
【００２２】
本発明において、検出とはある試料中にクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡが一定の基準を超えて存在しているかどうかを判定するための試験をいう。
クリプトスポリジウム・パルバムの管理基準が設定されている場合には、その値を基準として、基準を越えている場合に陽性の結果を得られるように検出系の感度を設定してもよい。
感度の調整は、ＮＡＳＢＡの反応サイクルやプライマーセットの使用量といったＲＮＡ増幅反応の条件を一定にすると共に、増幅生成物に対する標識プローブの添加濃度等を適宜調整することによって行うことができる。
【００２３】
本発明の検出方法は、検出のみならず、分離された微生物がクリプトスポリジウム・パルバムであるかどうかを判定するための試験である同定に利用することもできる。
【００２４】
本発明はクリプトスポリジウム・パルバムのオーシストの直接検出を可能にし顕微鏡観察を必要としない。本発明は糞便検体及び水道水、下水のような環境サンプル中のクリプトスポリジウム・パルバムの検出を可能にする。
【００２５】
本発明１のクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの検出方法は、本発明２の検出用試薬キットを用いて実施することができる。
即ち、本発明２は、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅するためのプライマー、及び、得られた増幅生成物に特異的にハイブリダイズすることができるプローブを含むクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの検出用試薬キットである。
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するＲＮＡを増幅するためのプライマーとしては、本発明１において用いるプライマーと同様のものを挙げることができる。
増幅生成物に特異的にハイブリダイズすることができるプローブとしては、本発明１において用いるプローブと同様のものを挙げることができる。
本発明２の検出用試薬キットは、更に、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、反応液を構成する緩衝液成分、そして校正用の標準試料等を含んでいてもよい。本発明２の検出用試薬キットは、これら核酸試料の分析用試薬類に加えて、各種生体試料、又は、環境試料からクリプトスポリジウム・パルバムの核酸を抽出するための界面活性剤や酵素成分等を前処理用の試薬として更に含んでいてもよい。
【００２６】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
クリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株のオーシスト懸濁液を段階希釈した。各濃度の希釈液をそれぞれのチューブに入れ、４２℃で２０分間熱処理した後、ＲＮＡを抽出した。
【００２７】
（ＲＮＡ抽出）
ＲＮＡ抽出はＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡績社製）を用いて行った。
まず熱処理したオーシスト希釈液を３０００×ｇで５分間遠心した。上清を捨て、２−メルカプトエタノールを１％含む７００μＬの溶解・吸着液を加えて懸濁した。この懸濁液をドライアイス−エタノールで凍結し、６５℃に設定したホットブロックで融解した。この凍結−融解処理を５回行った。懸濁液に５μＬの磁性ビーズ溶液を加え、ボルテックスで２０秒間攪拌した。室温に１分間放置して懸濁液中のＲＮＡを磁性ビーズに吸着させた。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨てた。６００μＬの洗浄液Ｉを加え、ボルテックスで１０秒間攪拌した。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨てた。８００μＬの洗浄液IIを加え、ボルテックスで１０秒間攪拌した。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨てた。再度８００μＬの洗浄液IIを加え、同様のことを行った。溶出液５μＬを加え、ボルテックスで５秒間攪拌した。６５℃で２分間放置し、ビーズに吸着したＲＮＡを溶出させた。再度ボルテックスで５秒間攪拌した。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清に含まれるＲＮＡを回収した。
【００２８】
（ＮＡＳＢＡ法）
抽出したＲＮＡをＮＡＳＢＡキット（東洋紡績社製）を用いて増幅した。まずＮＡＳＢＡ凍結乾燥試薬に、ＮＡＳＢＡ溶解液５０μＬを加えて溶解した。次いで５１．６μＬの水、８．４μＬのＫＣｌ（２Ｍ）、５μＬのプライマー１（配列番号２、１００μＭ）、５μＬのプライマー２（配列番号４、１００μＭ）を加えてプライマー溶液を作成した。作成したプライマー溶液１０μＬをチューブにそれぞれ加え、更にオーシスト懸濁液から抽出した５μＬのＲＮＡ溶液を加えた。各チューブを６５℃、５分、次いで４１℃、５分処理した。更に各々にＮＡＳＢＡ酵素溶液５μＬを加え、軽くタッピングした後４１℃、５分保温した。これを軽く遠心した後、４１℃で１時間半保温しＲＮＡを増幅させた。
【００２９】
（プローブの作成）
実験に用いたプローブの作成は、ＤＩＧ  ＤＮＡ標識及び検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて行った。まずクリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株のＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、配列番号５の領域を増幅した。得られた増幅生成物を精製し、精製物の内の４５μＬを１００℃、５分で変成し、氷上で急冷した。これに６μＬのヘキサヌクレオチド混合液、６μＬのｄＮＴＰ標識溶液および２μＬのＫｌｅｎｏｗ酵素（２ｕｎｉｔ／μＬ）を加え、３７℃で２０時間インキュベーションしてプローブを作成した。エタノール沈殿によってプローブを沈殿させ、沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させて５０μＬの超純水に溶かし、これをプローブ溶液として使用した。
【００３０】
（ドットブロットハイブリダイゼーション）
ＮＡＳＢＡ増幅生成物はドットブロットハイブリダイゼーションにより検出した。まずナイロンメンブレンを適切な大きさに切り、各ＮＡＳＢＡ増幅生成物を１μＬずつブロットしていった。ブロットしたメンブレンを０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌに２分間浸し、ＲＮＡを変性させた。メンブレンを５×ＳＳＣ（０．６Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム二水和物  ｐＨ７．０）中に移し、数分間振とうした。メンブレンを乾いた濾紙の上に置き風乾した。乾いたメンブレンをラップに包み、ブロットした面を下にして、ＵＶトランスイルミネーター上に置いた。５分間ＵＶを照射してＲＮＡを固定した。
【００３１】
ＲＮＡが固定されたメンブレンを５×ＳＳＣで湿らせた。メンブレンをハイブリバック（コスモ・バイオ社製）に移し、５ｍＬのハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ブロッキング試薬、０．５％ポリビニルピロリドンＫ−３０、１％ＳＤＳ）を加えた後、５５℃のウォーターバス中で３０分間インキュベーションした。メンブレンを新しいハイブリバックに入れ、３μＬのプローブ溶液を含む１ｍＬのハイブリダイゼーションバッファーを加えて５５℃で一晩インキュベートした。
【００３２】
メンブレン上のスポットは、ベーリンガーマンハイム社製のＤＩＧ  ＤＮＡ標識及び検出キットを用いて発色させ、検出した。
メンブレンをチューブから取り出し、５０ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸して、室温で５分間振とうした。これを２回行なった。５０ｍＬの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸して、５５℃で２０分間振とうした。これを２回行なった。５０ｍＬの洗浄バッファー（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）に浸して室温で１０分振とうした。その後メンブレンを１０ｍＬのバッファー２（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ブロッキング剤、ｐＨ７．５）に浸して室温で１時間静置した。２μＬのアルカリフォスファターゼ標識−抗ジゴキシゲニン抗体（７５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのバッファー２の中にメンブレンを移し、更に１時間静置した。メンブレンを５０ｍＬの洗浄バッファーに移し室温で１５分振とうした。これを２回行なった。メンブレンを１０ｍＬの検出バッファーに浸した後、２００μＬのＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液を含む１０ｍＬの発色溶液に移して発色させた。結果は図１に示した。なお、図１において、スポット１はオーシスト１０5 個、スポット２はオーシスト１０4 個、スポット３はオーシスト１０3 個、スポット４はオーシスト１０2 個、スポット５はオーシスト１０1 個、スポット６はオーシスト１０0 個、スポット７はオーシストなし、を示す。
図１に示したとおり、２０分後には１０0 〜１０5 個のスポットすべてにはっきりとした発色が現れた。この結果オーシスト１個からでも検出可能であることが示された。
【００３３】
実施例２
表１に示した、クリプトスポリジウム・パルバム杏林大株、クリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株、クリプトスポリジウム・バイレイタイプ株、サッカロマイセス・セレビシエ、エシェリヒア・コリの５株を用いた以外は、実施例１と同様に行った。
【００３４】
【表１】
0004431775.tif 000002
【００３５】
結果を図２に示した。図２において、スポット１はクリプトスポリジウム・パルバム杏林大株、スポット２はクリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株、スポット３はクリプトスポリジウム・バイレイタイプ株、スポット４はサッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ  ０２３４株、スポット５はエシェリヒア・コリＩＦＯ  ３３０１株、を示す。
図２に示したとおり、クリプトスポリジウム・パルバム杏林大株とクリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株のみを特異的に検出した。
【００３６】
【発明の効果】
今まで検査時間が長くかかったり、煩雑な操作が必要とされたクリプトスポリジウム・パルバムの検出が、本発明によるプローブ及びプライマーを用い、迅速かつ簡便に行えるようになる。更に、生きたクリプトスポリジウム・パルバムのみを検出できる。そのため、水道水や環境水等におけるクリプトスポリジウム・パルバムに対するリスク管理が今まで以上に迅速かつ安価に行えるようになる。
【００３７】
【配列表】
0004431775.tif 000003
0004431775.tif 000004
0004431775.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における各濃度のオーシスト懸濁液のＲＮＡから増幅したＮＡＳＢＡ増幅生成物についてドットブロットハイブリダイゼーションを行った結果を示す図である。
【図２】実施例２における微生物５株のＲＮＡを増幅したＮＡＳＢＡ増幅生成物についてドットブロットハイブリダイゼーションを行った結果を示す図である。
【図１】
0004431775.tif 000006
【図２】
0004431775.tif 000007