(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するバクテリアが産生するリパーゼの存在下、９，１１−オクタデカジエン酸および１０，１２−オクタデカジエン酸を含む共役リノール酸の異性体混合物を、有機溶媒を含まない反応系で直鎖高級アルコールと１０，１２−オクタデカジエン酸を選択的エステル化反応させ反応混合物を得て、該反応混合物から１０，１２−オクタデカジエン酸エステルを含むエステル画分を分画することにより、９，１１−オクタデカジエン酸が遊離脂肪酸画分中に濃縮されることを特徴とする、共役リノール酸異性体の精製方法。
【請求項２】
前記反応混合物を、前記リパーゼの存在下で更に一回以上、直鎖高級アルコールと１０，１２−オクタデカジエン酸を選択的エステル化反応させることを特徴とする、請求項１に記載の共役リノール酸異性体の精製方法。
【請求項３】
直鎖高級アルコールが、炭素数６〜１８のものである請求項１または２に記載の共役リノール酸異性体の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共役リノール酸異性体の精製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、共役リノール酸はその特異的な生理作用から注目を集めている。特にこのうち、９，１１−オクタデカジエン酸は、生体における強い生理活性作用が注目されている。共役リノール酸は、炭素数１８個で共役ジエン結合を有する脂肪酸の総称である。共役リノール酸の製造方法は、エチレングリコールやプロピレングリコールに代表される有機溶媒を使用するアルカリ共役化法（Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３６，６３１（１９５９）、第３４回油化学討論会講演要旨集ｐ１７１（１９９５）、基準油脂分析試験法２．４．１６−７１、特開平１０−１３０１９９号公報等)が知られている。しかし、これらの方法で製造すると、その二重結合位置の違いによる異性体が生成する。なかでも、９，１１−オクタデカジエン酸と１０，１２−オクタデカジエン酸が主に生成する異性体である。
【０００３】
従来、これら共役リノール酸の異性体混合物を精製する方法として、クロマトグラフィーによる方法が知られている。しかしこの方法では、溶剤およびカラムの使用等でコストがかかりすぎる問題がある。また、ＷＯ９７／１８３２０号公報には、異性体を濃縮精製する方法として、酵素による脂肪酸とアルコールの反応によって９，１１−オクタデカジエン酸と１０，１２−オクタデカジエン酸の組成比を変えることが報告されている。しかし、この方法で、９，１１−オクタデカジエン酸を得ようとする場合、エステル画分に９，１１−オクタデカジエン酸が濃縮されるため、これを遊離脂肪酸にするのにアルカリ加水分解が必要となり、その結果、酸化劣化などの副反応がおこり、純度や収率が低下してしまうという問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、高純度および高収率で精製可能な共役リノール酸異性体、とくに９，１１−オクタデカジエン酸の精製方法を提供することにある。また、産業上極めて有用な医薬品、食品、生化学試薬等に十分に利用可能な共役リノール酸異性体の精製方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に基づいて鋭意研究を行い、共役リノール酸異性体の選択的エステル化反応に関するリパーゼの脂肪酸特異性を検討した結果、バクテリアが産生するリパーゼが、共役リノール酸の異性体混合物と直鎖高級アルコールとの選択的エステル化反応を触媒することを見出した。その結果、特定の共役リノール酸異性体、例えば１０，１２−オクタデカジエン酸が選択的エステル化され、ワックス状の脂肪酸エステル（１０，１２−オクタデカジエン酸エステル）が容易にエステル画分に生成されることを見出した。生成したワックスは、リパーゼの基質にはなりにくいことから反応系外に出されるため、平衡がエステル化反応の方向にあり、可逆的な分解反応は起こりにくい。この反応機構を突き止めることにより、残った遊離脂肪酸画分中の脂肪酸が、精製目的化合物、例えば９，１１−オクタデカジエン酸を、高収率かつ高純度で遊離脂肪酸画分中に濃縮させ精製できることを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するバクテリアが産生するリパーゼの存在下、９，１１−オクタデカジエン酸および１０，１２−オクタデカジエン酸を含む共役リノール酸の異性体混合物を、有機溶媒を含まない反応系で直鎖高級アルコールと１０，１２−オクタデカジエン酸を選択的エステル化反応させ反応混合物を得て、該反応混合物から１０，１２−オクタデカジエン酸エステルを含むエステル画分を分画することにより、９，１１−オクタデカジエン酸が遊離脂肪酸画分中に濃縮されることを特徴とする、共役リノール酸異性体の精製方法を提供するものである。
【０００７】
さらに本発明は、前記反応混合物を、前記リパーゼの存在下で更に一回以上、直鎖高級アルコールと１０，１２−オクタデカジエン酸を選択的エステル化反応させることを特徴とする、の共役リノール酸異性体の精製方法を提供するものである。
【００１１】
さらに本発明は、直鎖高級アルコールが、炭素数６〜１８のものである前記の共役リノール酸異性体の精製方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
本発明における精製前の共役リノール酸の異性体混合物は、例えば、９，１１−オクタデカジエン酸と、１０，１２−オクタデカジエン酸の混合物であり、その割合は、例えば、モル比で約１：１である。
本発明は、とくに９，１１−オクタデカジエン酸の精製に優れている。
【００１３】
本発明において使用される直鎖高級アルコールとしては、炭素数６〜１８のものが好ましい。
【００１４】
本発明における「有機溶媒」とは、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル、トルエンおよびベンゼン等の有機溶媒(アルコールを除く)をいい、「有機溶媒を含まない反応系」とは、脂肪酸、直鎖高級アルコール、水および酵素等で構成されている反応用混液をいう。
【００１５】
本発明において使用するバクテリア由来のリパーゼとしては、シュードモナス属に属する微生物、好ましくはシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が産生するリパーゼが挙げられる。このリパーゼは市販されているものを利用することができ、例えば天野製薬(株)製商品名ＬｉｐａｓｅＰＳ等が挙げられる。但し、本発明において使用するリパーゼは、上記シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来のものに限らない。例えば、一次構造に相同性のあるリパーゼは同じような作用特性を示すので、シュードモナス属だけでなく、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属等に属するバクテリア由来のリパーゼもこの選択的エステル化反応には有効である。
【００１６】
また、リパーゼの使用形態は特に限定されず、ケイソウ土、イオン交換樹脂およびセラミック担体などに固定されたリパーゼを用いてもよいが、そのまま用いるのが好ましい。リパーゼの使用量は、その活性や所望の共役リノール酸異性体の分画などによっても異なるが、共役リノール酸の異性体混合物、直鎖高級アルコールおよび水の反応用混液１ｇ当たり３０〜２０００ユニット、好ましくは１００〜１０００ユニット程度が使用される。ここでの１ユニットとは、オリーブ油を基質とし、１分間に１μモルの脂肪酸が生成するのに必要なリパーゼ量を示す。
【００１７】
選択的エステル化反応を行うための反応用混液中の共役リノール酸の異性体混合物と直鎖高級アルコールとの原料比(モル比)は、１：１〜１：１０、好ましくは１：２〜１：８程度で行われる。選択的エステル化反応は、通常行われているリパーゼの反応条件で行ってよい。即ち、前記リパーゼを用いて、反応用混液中の共役リノール酸の異性体混合物に対して、０．５〜１００重量％の水分量の下、１５〜６０℃の温度条件(１５℃未満ではリパーゼの反応が遅くなり、６０℃を超えるとリパーゼの失活が著しい)で、３０分から７２時間静置または攪拌することにより選択的エステル化反応を行う。
【００１８】
但し、本発明において使用するリパーゼの活性を十分に発現させるためには、以下の条件がより好ましい。すなわち、▲１▼共役リノール酸の異性体混合物に対して５〜５０重量％の水分量であること、▲２▼２５〜４０℃の温度条件であること、▲３▼攪拌して反応させること(選択的エステル化反応は静置したままでも進行するが、攪拌により反応効率が大幅に上昇する)、▲４▼脂肪酸の酸化的劣化を防止するため、窒素雰囲気下で１〜３０時間程度の短時間で反応させることがより好ましい。
【００１９】
上記のようにして行った選択的エステル化反応後の反応混合物中には、遊離脂肪酸画分、脂肪酸エステル(ワックス)および未反応のアルコールが含まれている。したがって、アルコールを除去して、遊離脂肪酸画分および脂肪酸エステル(ワックス)を分画する必要がある。
【００２０】
分画方法としては、通常行われているアルカリによる抽出法(アルカリ反応させて脂肪酸塩とした後、水層別に分画する方法)、溶剤液−液分配による方法、分子蒸留による方法および精密真空蒸留による方法等が挙げられる。
【００２１】
前記選択的エステル化反応において、一回のリパーゼ処理で所望の共役リノール酸異性体を多く含む遊離脂肪酸画分は得られるが、更に高純度の共役リノール酸異性体を望む場合には、一回目の反応によって得られた共役リノール酸異性体を含む遊離脂肪酸画分を、同様な条件下で更に一回以上繰り返し直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応を行い、遊離脂肪酸画分を分取することにより、更に高純度の共役リノール酸異性体を精製することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００２３】
（実施例１）
サフラワー油をアルカリ共役化して得た共役リノール酸の異性体混合物画分（異性体比率（モル比）、９，１１−オクタデカジエン酸：１０，１２−オクタデカジエン酸＝４９．６：５０．４）とドデカノールからなる反応用混液４．０ｇ(モル比１：２)にシュードモナス・エスピー産生リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＰＳ、天野製薬(株)製）８００ユニットを溶解した蒸留水１ｍＬを加え(反応混液１ｇ当たり酵素量２００ユニットとした)、窒素雰囲気下で攪拌しながら４０℃で２４時間選択的エステル化反応を行った。次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混合物に水酸化ナトリウムを加え、遊離脂肪酸画分中の遊離脂肪酸を脂肪酸塩に変換した。脂肪酸塩は水層側に抽出してエステル、アルコールと分画した後、塩酸を加え中和し、ｎ−ヘキサンで抽出することにより、共役リノール酸の異性体混合物として分取することができた。この画分の共役リノール酸異性体組成を測定したところ、モル比で、９，１１−オクタデカジエン酸：１０，１２−オクタデカジエン酸＝７１．９：２８．１であった。
【００２４】
（実施例２）
実施例１の選択的エステル化反応で得られた共役リノール酸の異性体画分１．０ｇを用い、実施例１と同様の条件で再度選択的エステル化反応を行った。該反応混合物から実施例１と同様にして共役リノール酸異性体混合物を得た。この画分の共役リノール酸異性体組成を測定したところ、モル比で、９，１１−オクタデカジエン酸：１０，１２−オクタデカジエン酸＝８３．７：１６．３であった。
【００２５】
（実施例３）
サフラワー油をアルカリ共役化して得た共役リノール酸の異性体混合物画分（異性体比率（モル比）、９，１１−オクタデカジエン酸：１０，１２−オクタデカジエン酸＝４９．６：５０．４）とオクタノールからなる反応用混液４．０ｇ(モル比１：２)にシュードモナス・エスピー産生リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ  ＰＳ、天野製薬(株)製）８００ユニットを溶解した蒸留水１ｍＬを加え(反応混液１ｇ当たり酵素量２００ユニットとした)、窒素雰囲気下で攪拌しながら４０℃で２４時間選択的エステル化反応を行った。次いで、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混合物に水酸化ナトリウムを加え、遊離脂肪酸画分中の脂肪酸を脂肪酸塩に変換した。脂肪酸塩は水層側に抽出してエステル、アルコールと分画した後、塩酸を加え中和し、ｎ−ヘキサンで抽出することにより、共役リノール酸異性体混合物として分取することができた。この画分の共役リノール酸異性体組成を測定したところ、モル比で、９，１１−オクタデカジエン酸：１０，１２−オクタデカジエン酸＝７０．７：２９．３であった。
【００２６】
（実施例４）
実施例３の選択的エステル化反応で得られた共役リノール酸異性体画分１．０ｇを用い、実施例３と同様の条件で再度選択的エステル化反応を行った。該反応混合物から実施例３と同様にして共役リノール酸異性体混合物を得た。この画分の共役リノール酸異性体組成を測定したところ、モル比で、９，１１−オクタデカジエン酸：１０，１２−オクタデカジエン酸＝８２．７：１７．３であった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素による選択的エステル化反応により、高純度および高収率で精製可能な共役リノール酸異性体、とくに９，１１−オクタデカジエン酸の精製方法が提供される。また、産業上極めて有用な医薬品、食品および生化学試薬等に十分に利用可能な共役リノール酸異性体の精製方法が提供される。