(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）神経細胞においてカルボキシル末端側切断型アポリポ蛋白質E（apoE）が形成されるのを触媒するセリンプロテアーゼを阻害する阻害剤であって、該カルボキシル末端側切断型apoEがカルボキシル末端側切断型apoE4（Δ272-299）であり、かつ該ペプチドがAla-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）、およびAla-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：4）から選択される、前記阻害剤、および、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む組成物。
【請求項２】
薬学的に許容される賦形剤が前記阻害剤の血液脳関門の通過を可能にする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
シクロオキシゲナーゼ-2インヒビター、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、非ステロイド系抗炎症剤、およびモノアミンオキシダーゼインヒビターから選択される追加の治療薬をさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
アポリポ蛋白質E関連疾患を治療するための薬剤の製造におけるペプチド作用薬の使用であって、アポリポ蛋白質E関連疾患がアルツハイマー病であり、該ペプチド作用薬がAla-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）、およびAla-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：4）から選択される、前記使用。
【請求項５】
アポリポ蛋白質EがapoE4である、請求項４記載の使用。
【請求項６】
apoE4がカルボキシル末端側切断型apoE4（Δ272-299）である、請求項５記載の使用。
【請求項７】
神経細胞においてカルボキシル末端側切断型アポリポ蛋白質Eの形成を減少させる生物活性作用薬をスクリーニングするインビトロの方法であって、該カルボキシル末端側切断型アポリポ蛋白質Eがカルボキシル末端側切断型apoE4（Δ272-299）であり、
酵素を、被検作用薬と、酵素による作用を受けると検出可能な生成物を生じる基質とに接触させる工程であって、該酵素が神経細胞においてカルボキシル末端側切断型apoEが形成されるのを触媒するセリンプロテアーゼであり、該基質がAla-Ala-Pro-Phe-X（配列番号：1）、Ala-Ala-Pro-Leu-X（配列番号：3）、およびAla-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe-X（配列番号：4）から選択されるペプチドであり、Xが該ペプチドのカルボキシル末端に結合する部分であり、かつセリンプロテアーゼによる作用を受けて該ペプチドから切断されると検出可能なシグナルをもたらす前記工程、および、
検出可能な生成物の形成に対する被検作用薬の効果を測定する工程
を含む方法。
【請求項８】
Xが発色性タグ、蛍光発生タグ、化学発光性タグ、および放射性標識されたタグから選択される、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
相互参照
本出願は、2000年11月3日に出願された米国特許仮出願第60/245,737号の利益を主張するものである。この文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明はアポリポ蛋白質Eに関するものであり、特に、apoEに関連した疾患を治療する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトアポリポ蛋白質（apo）Eには３つの主要なアイソフォーム、apoE2、apoE3、およびapoE4がある（総説としては、MahleyとHuang（1999）Curr. Opin. Lipidol. 10: 207-217を参照のこと）。apoE4は、血漿コレステロール値の上昇、および冠状動脈性心臓病を発病するリスクが高くなることに関連することが確認されている。Dallongeville（1992）J. Lipid Res. 33:447-454。また、apoE4はアルツハイマー病の病因とも関連する。apoE4対立遺伝子は、散発性または家族性アルツハイマー病の約40〜65％の症例に関係する主要な危険因子または感受性遺伝子であり、この遺伝子は、この病気の発症を増加せるとともに、発病年齢を低下させる。Corderら、（1993）Science 261:921-923。さらに、apoE4対立遺伝子は、急性頭蓋骨損傷および脳梗塞の患者における臨床結果の不良にも関連する。Slooterら、（1997）JAMA 277:818-821、およびNicollら、（1996）Neuropathol. Appl. Neurobiol. 22:515-517。
【０００４】
アルツハイマー病の神経病理学的に顕著な特徴は、脳内における神経突起のアミロイド斑および神経原繊維変化である。Selkoe、（1991）Neuron 6:487-498、およびRosesら、（1994）Curr. Opinion Biotechnol. 5:663-667。神経突起上の斑点はアミロイドの細胞外沈着を示すものである。この沈着物の主要な成分はアミロイドのベータ（Aβ）ペプチド（DS487）で、これは、アミロイド前駆体タンパク質（APP）のタンパク質分解産物である。アミロイド斑とは対照的に、神経原線維変化は、大部分が、高度にリン酸化された微小管結合タンパク質であるtau（p-tau）、およびそれほどまではリン酸化されていないNF-H（p-NF-H）からなる、主に細胞内の沈着物である。ApoEは、アミロイド斑と神経原線維変化の両方に存在する。
【０００５】
apoE4対立遺伝子とアルツハイマー病の進行との関わりを説明するための仮説は、脳におけるアミロイドβ（Aβ）沈着またはクリアランス排除をapoE4が調節するというもの、また、apoE4が、微小管に結合して安定させる微小管結合タンパク質であるtauとの相互作用を失うというものなど、数多くある。
【０００６】
アルツハイマー病は、現在のところ治療法がない潜行性で進行性の神経疾患である。アルツハイマー病に対する適切な治療法がないため、この神経疾患に対する新規の治療法が必要とされている。本発明は、apoE4に関連する疾患を治療する方法、および、アルツハイマー病に伴う神経原線維変化を減少させる方法を提供する。
【０００７】
参考文献
Huangら、（2001）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8838-8843；米国特許第6,046,381号。
【０００８】
発明の概要
本発明は、神経原線維変化の形成を阻害する方法、および、対象者においてアポリポ蛋白質E（apoE）に関連した疾患を治療する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、対象者の神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型apoEの量を低下させることを含む。さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸分子を含む単離細胞、および、この細胞を用いて化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、さらに、apoE切断酵素を阻害し、神経細胞における神経原線維変化の形成を低下させる化合物を提供する。さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸を導入遺伝子として含む、ヒト以外のトランスジェニック動物、および、トランスジェニック動物を使用して化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、カルボキシル末端側切断型apoEが、培養神経細胞において神経原線維変化様構造物の形成を誘導するという観察結果に基づくものである。apoEのカルボキシル末端から30番目までのアミノ酸を切断すると、培養神経細胞において細胞内封入体が形成される。本発明者らは、完全長のapoEではなくC末端側切断型のapoEが、微小管結合タンパク質p-tauのリン酸化型、および高分子量のリン酸化された神経繊維フィラメントp-NF-Hと相互作用して、細胞において神経原線維変化（NFT）様構造物を誘導することを発見した。この作用は神経細胞特異的である。
【００１０】
C末端側切断型apoEによって誘導されるNFT様構造物は、アルツハイマー病（AD）患者の脳に見られるNFTにいくつかの点で類似している。第一に、C末端側切断型apoEによって誘導されるNFT様構造物は神経細胞特異的である。第二に、このNFT様構造物は、AD脳におけるNFTの主要成分であるp-tauと、AD脳中のNFTにも見られるpNF-Hを含む。第三に、電子顕微鏡によって、切断型apoEによって誘導されるNFT様構造物は、多数の不規則なフィラメントからできており、直径10〜20 nmであり、ヒトAD脳で見られるNFTのあるものに類似している。
【００１１】
本発明は、神経原線維変化の形成を阻害する方法、および、対象者においてアポリポ蛋白質E（apoE）に関連した疾患を治療する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、対象者の神経細胞におけるカルボキシル末端（C末端）側切断型apoEの量を低下させること、および/または、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを妨害することを含む。
【００１２】
さらに、本発明は、C末端側切断型apoEをコードする核酸分子を含む単離細胞を提供する。本細胞は、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを妨害し、それによって、神経原線維変化の形成を低下させる化合物をスクリーニングするのに役立つ。
【００１３】
本発明は、さらに、細胞内においてカルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させ、および/または、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを妨害する化合物をインビトロでスクリーニングする方法を提供する。カルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させる化合物を同定するためのインビトロスクリーニング法では、完全長のapoEであって、その後タンパク質分解処理されてカルボキシル末端側切断型apoEを産生する宿主細胞が使用される。カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを妨害する化合物を同定するためのインビトロスクリーニング法では、通常、本宿主細胞であって、C末端側切断型apoEをコードする核酸分子を含む細胞が使用される。本発明に係るインビトロスクリーニング測定法を用いて同定される化合物が、ADなど、C末端側切断型apoEが神経細胞に存在するために生じる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００１４】
さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸を導入遺伝子として含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。これらヒト以外のトランスジェニック動物は、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを妨害する化合物をスクリーニングするのに役立つ。
【００１５】
さらに、本発明は、細胞内においてカルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させ、および/または、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを妨害する化合物をインビボでスクリーニングする方法を提供する。カルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させる化合物を同定するためのインビボスクリーニング法では、完全長のapoEをコードする核酸を導入遺伝子として含むヒト以外のトランスジェニック動物であって、神経細胞の中でその後タンパク質分解処理されてカルボキシル末端側切断型apoEとなる完全長のapoEを産生するトランスジェニック動物が使用される。カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを妨害する化合物を同定するためのインビボスクリーニング法では、通常、C末端側切断型apoEをコードする核酸を導入遺伝子として含むヒト以外のトランスジェニック動物であって、神経細胞の中でカルボキシル末端側切断型apoEを産生するトランスジェニック動物が使用される。本発明に係るインビボスクリーニング測定法を用いて同定される化合物が、ADなど、C末端側切断型apoEが神経細胞に存在するために生じる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００１６】
本発明は、さらに、apoE切断酵素を阻害する化合物、および、この化合物を含む組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。これらの化合物は、ADなどの疾患を治療するのに有用である。
【００１７】
定義
本明細書において、「ApoEに関連する疾患」、「カルボキシル末端側切断型apoEに関系した疾患」、および「カルボキシル末端側切断型apoEに関連する病気」という語は、各個体においてカルボキシル末端側切断型apoEが存在することに随伴する病気または疾患を意味するものとして互換的に使用される。カルボキシル末端側切断型apoEに関係する病気または疾患は、個体中にカルボキシル末端側切断型apoEが存在することで直接的または間接的にもたらされることがある。例えば、カルボキシル末端側切断型apoEに関係する病気または疾患は、神経細胞の中で神経原線維変化が形成される結果として生じる病気または疾患である。また、カルボキシル末端側切断型apoEに関係する病気または疾患とは、例えば、各個体にカルボキシル末端側切断型apoEが存在することが各個人の病気または疾患を進行させる危険性を増大させる危険因子であるという、カルボキシル末端側切断型apoEが危険因子である病気または疾患でもある。カルボキシル末端側切断型apoEに関連する病気または疾患には、散発性アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病、例えば冠状動脈疾患など、血漿コレステロール値の上昇に伴う病気、急性頭蓋骨損傷患者における臨床結果の不良、および脳梗塞患者における臨床結果の不良などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書において、「アルツハイマー病」（本明細書においては「AD」と略記する）という語は、学習・記憶機能障害だけでなく、主に海馬および大脳皮質において、アミロイドβタンパク質を含む神経突起状の斑点が形成されることを伴う症状を意味する。ここで「AD」とは、ADとともにAD型病変をも含む意味である。
【００１９】
本明細書において、「アルツハイマー病に関連した現象」という語は、ADに随伴する構造的、分子的、または機能的な事象、特に、動物モデルで容易に測定することができる事象などを意味する。そのような事象には、アミロイド沈着、神経病理学的症状の進行、学習および記憶上の欠陥、および他のADに関連した特徴などであるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書において、「測定」、「測量」「評価」および「アッセイ」という語は互換的に使用され、定量的測定および定性的測定の両方を意味する。
【００２１】
「生物試料」は、個体から得られるさまざまな試料タイプを含み、診断や観察のためのアッセイに使用することができる。この定義には、生物に由来する血液およびその他の液体試料、例えば、生検標本または組織培養物、それから得られた細胞、およびその後代などの固体組織試料が含まれる。また、この定義には、試料が得られた後、例えば、ポリヌクレオチドなど一定の成分について、試薬による処理、可溶化、または濃縮などの方法で処理された試料も含まれる。「生物試料」という語は臨床試料を含み、また、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物の体液、および組織などの試料も含む。
【００２２】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という語は互換的に使用され、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体を意味する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体を含むことができる。ヌクレオチドは、そのような三次元構造を採っていてもよく、既知であると未知であるといずれの機能を果たすこともできる。「ポリヌクレオチド」という語には、一本鎖、二本鎖、三本鎖の分子が含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、通常、約5〜約100ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖のDNAからなるポリヌクレオチドを意味する。しかし、本開示の目的にとって、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。また、オリゴヌクレオチドは、オリゴマーまたはオリゴとしても知られており、遺伝子から単離されたり、当技術分野において既知の方法により化学合成される。
【００２３】
本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」という語は互換的に使用され、あらゆる長さのアミノ酸重合体であって、コードされたアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導されたアミノ酸、および修飾されたペプチドの骨組みをもつポリペプチドを含む重合体を意味する。この語は、異種由来のアミノ酸配列との融合タンパク質、異種由来または同種由来の先導配列、N末端にメチオニン残基があるものとないもの、免疫学的に標識したタンパク質、例えば、融合パートナーとして蛍光性タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質のような、検出可能な融合パートナーをもつ融合タンパク質などであるが、これらに限定されない融合タンパク質を含む。
【００２４】
本明細書において、「単離された」という語は、天然に存在する環境とは異なった環境に存在するようになった、目的とする化合物を表すものである。「単離された」とは、目的とする化合物が実質的に濃縮されており、および/または、その中で目的とする化合物が部分的または実質的に精製されている試料の中に存在する化合物を含む意味である。
【００２５】
本明細書において、「実質的に純粋な」という語は、天然の環境から取り出された化合物であって、天然に結合している他の成分から少なくとも60％、好ましくは75％、最も好ましくは90％解離している化合物を意味する。
【００２６】
本明細書において、「導入遺伝子」という語は、生きた動物に移植するために、細胞、特に哺乳動物細胞のゲノムに人為的に挿入されているか、または、挿入されようとしている遺伝物質を表すために使用される。導入遺伝子は、外来DNAを取り込んだ後に細胞の中で永久的または一時的な遺伝的変化、好ましくは、永久的な遺伝的変化が誘導されることを意図して、細胞の形質転換に用いられる。永久的な遺伝的変化は、通常、DNAを細胞のゲノムの中に導入することによって行なわれる。安定に組み込ませるためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス、およびその他の動物ウイルス、YACsなどがある。目的とするのは、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど、特に、例えば、ラットやマウスなどの齧歯類のトランスジェニック哺乳動物である。
【００２７】
本明細書において、「治療」や「治療する」などという語は、哺乳動物、特にヒトにおける病気または症状を治療することを含んで使用されており、a）病気に対する素因をもつ可能性があるが、まだ発病していると診断されていない対象者において、その病気、症状、またはその病気または症状の病徴が起きるのを防止すること、b）病気、症状、またはその病気または症状の病徴を阻害すること、例えば、患者においてその進展を停止させること、および/またはその開始または発現を遅延させること、および/またはc）病気、症状、またはその病気または症状の病徴を軽減させること、例えば、症状または病気、および/または病徴の退行をもたらすことを含む。
【００２８】
本明細書において、「対象者」、「宿主」、「患者」、および「個体」という語は互換的に使用され、診断または治療が望ましい哺乳類の被検動物、特にヒトを意味する。この他の被検動物には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどがある。
【００２９】
本発明についてさらに詳しく説明する前に、本発明は、記載されている特定の態様に制限されるものではなく、当然ながら、さまざまなものがありうると解されるべきである。また、本発明の範囲は、本明細書に付記した請求の範囲によってのみ制限されるものであるから、本明細書において使用されている用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、制限的になることを意図したものではないと解されるべきである。
【００３０】
数値範囲が示されている場合、その範囲の上限値と下限値、およびその表示された範囲内にある、表示されているか、その間にある別の数値との間にあるあらゆる数値が、文中に別段の記載がない限り、下限値の単位の10分の1の単位まで本発明に含まれると解される。この表示された範囲において具体的に除外される限界値にしたがって、このより狭い範囲の上限値および下限値を、別個にこのより狭い範囲に含ませることもできる。この表示された範囲が限界値の一方または両方を含む場合は、これら包含される限界値の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００３１】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野において一般的に理解されていると同じ意味である。また、本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等のものも、本発明を実施または試験するときに使用することができるが、好ましい方法および材料は以下に記載する通りである。本明細書に記載された刊行物はすべて、該刊行物を引用した方法および/または材料を開示・記載するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００３２】
本明細書および本請求の範囲において、「一つの」、「および」、「その」という単数形は、別段の記載がない限り、複数形の対象物も含むことに留意されたい。したがって、例えば、「カルボキシル末端側切断型apoE」というときには、このタンパク質が複数の場合を含み、「その細胞」というときには、一個以上の細胞、および、当技術分野において既知のその同等物を含み、以下同様である。
【００３３】
本明細書において検討されている刊行物は、本出願の出願日前に開示されていたため提示したものに過ぎない。本明細書のいかなる記述も、本発明が先行発明によって、このような刊行物に先行するものとなりえないことを認めるものと解さるべきではない。さらに、表示された出版日は、実際の出版日と異なることがあるので、それぞれ別個に確認する必要があるかもしれない。
【００３４】
apoEポリペプチド断片
本発明は、単離されたapoEポリペプチド断片、および、そのようなポリペプチド断片を含む組成物を提供する。apoEポリペプチド断片には、カルボキシル末端側切断型apoE、および、apoEの少なくとも第244〜260番目のアミノ酸を含む断片などがある。カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドは、以下に述べるように、神経原線維変化の形成を低下させる作用薬を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。apoEの少なくとも第244〜260番目のアミノ酸を含む断片は、apoEがp-tauおよびp-NF-Hに結合するのを阻害して、神経原線維変化の形成を低下させるのに役立つ。
【００３５】
apoEのカルボキシル末端側切断型には、p-tauおよびp-NF-Hの両方に結合して、神経細胞中にカルボキシル末端側切断型apoE、p-tauおよびp-NF-Hを含む神経原線維変化が形成されるのを誘導するカルボキシル末端側切断型apoEが含まれる。所定のカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドがp-tauに結合し、p-NF-Hに結合して、神経細胞の中で神経原線維変化を形成するか否かは、既知のアッセイ法を用いて当業者が容易に判定することができる。例えば、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチド、p-tauおよびp-NF-Hを含む複合体の形成は、例えば、実施例の記載に従って、これらのタンパク質のそれぞれに特異的な抗体を用い、例えば、確立された細胞染色技術、確立された共免疫沈殿技術、タンパク質（「ウェスタン」）ブロッティングなどを用いて検出することができる。例えば、神経細胞内の細胞内封入体を観察することによって神経原線維変化の形成を可視的に測定することができる。このような神経原線維変化がカルボキシル末端側切断型apoE、p-tauおよびp-NF-Hを含むか否かを、各タンパク質に特異的な抗体を用いて判定することができる。
【００３６】
apoE3またはapoE4のカルボキシル末端から約28〜約30個、約30〜約35個、約35〜約40個、約40〜約45個、または約45〜約48個のアミノ酸を欠失させると、p-tauに結合し、p-NF-Hに結合し、神経細胞における神経原線維変化の形成を誘導するするカルボキシル末端側切断型apoEが得られる。神経原線維変化を生じさせる特異的なカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドには、apoE4Δ272-299、apoE3Δ272-299、apoE4Δ261-299、およびapoE4Δ252-299などがあるが、これらに限定されない。
【００３７】
さらに、本発明はp-tauおよびp-NF-Hと相互作用するapoEの部位に相当するapoEの断片を提供する。このような断片は、apoEポリペプチドの少なくとも第244〜260番目のアミノ酸（apoE244-260）を含む。また、apoE244-260断片に含まれるのは、さらに約1〜約5個、約5〜約10個、約10〜約15個、約15〜約20個のアミノ酸がカルボキシル末端および/またはアミノ末端に付加したapoE244-260断片である。このような断片は、apoEがp-tauおよびp-NF-Hに結合するのを阻害するのに役立つ。
【００３８】
核酸および宿主細胞
本発明は、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸とともに、該核酸を含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞が単離されている。別の態様では、本発明に係る核酸を導入遺伝子として含むヒト以外のトランスジェニック動物の一部である。
【００３９】
核酸
本核酸分子は、後述するように、本発明に係るヒト以外のトランスジェニック動物を作製するときに使用するため、または、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドを産生する組換え宿主細胞を作製するためのベクター（「構築物」）の一部であってもよい。さらに、本発明に係る核酸分子は、本発明に係るカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドの全部または一部をコードすることができるため、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドを産生させるときに発現ベクターの一部として役に立つ。
【００４０】
マウスapoE遺伝子の配列がGenbankアクセッション番号D00466として存在する。さまざまな霊長類のapoE遺伝子の配列が、Genbankアクセッション番号AF200508、AF200507、AF200506、およびAH009953（ヒロバテス・ラル（Hylobates lar）、すなわちギボン）、AH009952、AF200503、AF200504、およびAF200505（ポンゴ・ピグマエウス（Pongo pygmaeus）、すなわちオランウータン）、AH009951、AF200500、AG200501、およびAF200502（ゴリラ・ゴリラ（Gorilla gorilla））、AH009950、AF200497、AF200498、およびAF200499（パン・トログロディテス（Pan troglodytes）すなわちチンパンジー）として存在する。どのapoEコード配列を改変しても、上記したようなカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドをコードさせることができる。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明に係る核酸は、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドをコードする読み枠（オープンリーディングフレーム）、1個以上のイントロンを含み、さらに、発現の調節に関係する隣接5’および3’の非コード塩基配列を含むことも可能であり、一般的には全長約10 kbまでであるが、もっと長くすることも可能である。組換えapoEの全部または一部をコードするDNA配列はゲノムDNA、またはその断片である。カルボキシル末端側切断型apoEをコードするapoE遺伝子は、染色体外で維持するため、または宿主に組み込むために適当なベクターの中に導入することができる。
【００４２】
目的とするゲノム配列は、開始コドンと終止コドンの間に存在し、本来の染色体に通常存在しているイントロンのすべてを含む核酸であるが、上記したように、カルボキシル末端側アミノ酸をコードするヌクレオチドを含まない。さらに、成熟mRNAに存在する3’側および5’側の非翻訳領域を含んでいてもよい。さらに、転写領域の3’末端または5’末端のいずれかに隣接する約1 kb、場合によってはそれ以上の長さを含む、プロモーター、エンハンサーなど、転写および翻訳を特異的に調節する配列を含んでいてもよい。ゲノムDNAは、隣接する染色体配列を実質的に含むことなく、100 kbp以下の断片として単離することができる。
【００４３】
この5’側領域の配列、さらに5’側上流配列および3’側下流配列は、apoEを発現する組織内での発現を行わせる、エンハンサー結合部位などのプロモーター因子として利用することができる。組織特異的発現は、発現パターンを決定するのに役立ち、また、本来の発現パターンを模倣するプロモーターを提供するのにも役立つ。プロモーター領域における自然な多型性は、発現の自然変異、特に、病気と関係する変異を判定するのに役立つ。または、突然変異をプロモーター領域に導入して、発現を変化させた場合の効果を、実験的に規定した系の中で測定することも可能である。例えば、既知の結合モチーフとの配列類似性、ゲル遅延分析研究など、転写因子の結合に関与する特異的DNAモチーフを同定する方法が当技術分野において知られている。例えば、Blackwellら、Mol Med 1:194-205 (1995) ; Mortlockら、Genome Res. 6:327-33 (1996); およびJoulinとRichard-Foy, Eur J Biochem 232:620-626 (1995)を参照のこと。
【００４４】
調節配列を用いて、特に、発生の異なった組織や段階においてapoE発現の転写または翻訳の調節に必要なcis作用配列を同定し、また、発現を調節または媒介するするcis作用配列またはtrans作用因子を同定することができる。このような転写または翻訳の調節領域は、培養細胞、または胚、胎児、もしくは成人の組織において遺伝子治療のためカルボキシル末端側切断型apoE、またはそれ以外の目的とするタンパク質の発現を促進させるために、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドをコードするapoE遺伝子に機能可能なように結合させることができる。
【００４５】
いくつかの態様において、調節因子としては、機能可能なように結合した、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸を神経細胞で特異的に発現させる調節因子などがある。神経細胞特異的調節因子（プロモーター、エンハンサーなど）は当業者に知られている。神経細胞特異的調節因子には、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）遺伝子（Hannas-Djebarraら、(1997) Brain Res. Mol. Brain Res. 46:91-99）；PDGF遺伝子；Th1遺伝子（例えば、マウスThy1.2（Caroniら、(1997) J. Neurosci. Mehtods 71:3-9）；神経フィラメント遺伝子（例えば、NF-L、NF-M、およびNF-L）；グリアフィランメント酸性タンパク質遺伝子；ミエリン塩基性タンパク質遺伝子；微小管結合タンパク質遺伝子；シナプトフィジン遺伝子；チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子などの調節因子がある。
【００４６】
別の態様において、本発明に係る核酸分子は、本発明に係るカルボキシル末端側切断型apoEタンパク質をコードする配列を含むcDNAを含む。本発明において使用される核酸組成物は、必要に応じて、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドの全部または一部をコードすることができる。常法にしたがってオリゴヌクレオチドを化学合成したり、制限酵素消化、PCR増幅などによってDNA配列の断片を得ることができる。大抵の場合、DNA断片は少なくとも15ヌクレオチド（nt）、普通は少なくとも18 nt、より普通には少なくとも約50 ntであろう。このような小さなDNA断片は、PCRプライマーやハイブリダイゼーションスクリーニング法などに有用である。より大きなDNA断片、例えば100 ntよりも大きな断片は、コードされたポリペプチドを産生させるのに有用である。PCRなどの増幅反応には、一対のプライマーを使用する。
【００４７】
いくつかの態様において、本発明に係る核酸分子は、ゲノムのapoE遺伝子の塩基配列を、上記したように、コードされているapoEタンパク質がカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドになるよう改変したものを含む。別の態様において、本発明に係る核酸分子は、コードされているapoEタンパク質がカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドになるよう改変したapoE遺伝子のコード領域を含む（例えば、カルボキシル末端側切断型apoEをコードするcDNA分子）。
【００４８】
さらに、本発明は、p-tauに結合し、p-NF-Hに結合して、神経細胞の中で神経原線維変化が形成されるのを誘導するカルボキシル末端側切断型apoEタンパク質をコードする塩基配列であって、コードされているapoEタンパク質がカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドになるよう改変されているマウスのゲノムapoE遺伝子の一つとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする塩基配列、および、コードされているapoEタンパク質がカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドになるよう、上記したように改変されているマウスapoE遺伝子のコード領域を含む核酸分子を提供する。ストリンジェントな条件の例は、0.1ｘSSC（9 mM NaCl/0.9 mMクエン酸ナトリウム）の中で50℃以上でハイブリダイゼーションと洗浄を行なうものである。
【００４９】
さらに、本発明は、p-tauに結合し、p-NF-Hに結合して、神経細胞の中で神経原線維変化が形成されるのを誘導するカルボキシル末端側切断型apoEタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸分子であって、コードされているapoEタンパク質がカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドになるよう改変されているマウスのゲノムapoE遺伝子の一つと少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、またそれよりも高い塩基配列一致率をもつ核酸分子、および、コードされているapoEタンパク質がカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドになるよう、上記したように改変されているマウスapoE遺伝子のコード領域を含む核酸分子を提供する。
【００５０】
本核酸分子には、これら以外に、あらゆる長さのapoEでない核酸分子（異種由来の核酸分子）が含まれる。例えば、本核酸分子は、その5’および/または3’末端が、約1 nt〜約10 nt、約10 nt〜約20 nt、約20 nt〜約50 nt、約50 nt〜約100 nt、約100 nt〜約250 nt、約250 nt〜約500 nt、または約500 nt〜約1000 nt、またはそれ以上の長さをもつ異種の核酸分子に隣接していてもよい。例えば、本核酸分子にハイブリダイズできる核酸分子を検出するためのプローブとして使用する場合、本核酸分子は、どのような長さの異種配列に隣接していてもよい。異種配列には、レポータータンパク質などをコードする配列があるが、これらに限定されない。
【００５１】
また、本核酸分子は、当技術分野においてさまざまなものが知られており、ここで詳しく説明する必要もないベクターの一部として提供することもできる。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、人工染色体（YAC、BACなど）、ミニ染色体等があるが、これらに限定されない。ベクターは、例えば、分子生物学の簡易プロトコール（Short Protocols in Molecular Biology）、(1999) F. Ausubelら編、ワイリー・アンド・サンズ社（Wiley & Sons）など、当業者に周知の数多くの刊行物に十分に説明されている。本核酸分子を発現させるため、もしくは本核酸分子を増加させるため、またはその両方のためにベクターを提供することができる。
【００５２】
本核酸分子は、通常、完全な染色体以外のものとして、実質的に純粋な形で単離して得られる。普通、DNAは、本遺伝子のDNAの配列または断片を含まない他の塩基配列から実質的に分離して得られ、一般的には、少なくとも約50％、大抵は少なくとも約90％純粋で、典型的には「組換え」られている。すなわち、天然の染色体上では通常結合していないヌクレオチドに隣接している。
【００５３】
本核酸分子組成物は、上記したように、本発明に係るカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドの全部または一部を調製するときに利用することができる。発現のためには、発現カセットを用いることができる。発現ベクターは、コード領域が転写開始領域の転写調節の下で機能に結合している、誘導型または定常型の転写および翻訳の開始領域、および転写および翻訳の終結領域を提供する。これらの調節領域は、本ペプチドをコードする遺伝子に本来備わっているものでも、外来の由来源から得られたものでもよい。
【００５４】
発現ベクターは、通常、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限酵素部位を持ち、異種タンパク質をコードする塩基配列の挿入を可能にさせる。発現宿主の中で機能する選抜マーカーが存在する。発現ベクターは、融合タンパク質を産生させるために用いることもでき、その場合には、外来の融合ペプチドが付加的な機能、すなわち、タンパク質合成の増加、安定性、一定の血清との反応性、酵素、または、例えばβ-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなど、その他のタンパク質マーカーを提供する。
【００５５】
転写開始領域、その遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含む発現カセットを調製することができる。特に関心の対象となるのは、機能的なエピトープまたはドメインの発現を可能にする配列であって、普通、長さが少なくとも約8アミノ酸、より普通には、少なくとも長さ約15アミノ酸から約25アミノ酸まで、または、上記の断片のいずれかの配列、およびその遺伝子の完全なオープンリーディングフレームまでの配列を使用することである。DNAを導入した後、選抜マーカーという手段によって、この構築物を含む細胞を選抜し、細胞を展開させてから発現に使用することができる。
【００５６】
タンパク質およびポリペプチドは、発現目的に応じて、常法にしたがい、原核生物または真核生物の中で発現させることができる。大規模なタンパク質生産を行なうためには、大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）、出芽酵母（S. cerevisiae）などの単細胞生物、昆虫細胞をバキュロウイルスベクターと組み合わせたもの、脊椎動物などの高等生物の細胞、特に、例えばCOS 7細胞、Neuro-2A細胞など、哺乳動物の細胞を発現宿主細胞として使用することができる。場合によっては、コードされたタンパク質が本来のフォールディングと翻訳後修飾が行なわれるという利点があるため、真核生物細胞の中でその遺伝子を発現させるのが望ましいこともある。また、小さなペプチドを実験室で合成することもできる。本タンパク質の全長配列の部分集合であるポリペプチドを用いて、機能に重要なタンパク質部分を同定・調査することができる。
【００５７】
目的とする特異的発現系には、バクテリア、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞に由来する発現系などがある。当業者にとって、このような発現系にはさまざまなものが知られている。
【００５８】
宿主細胞
本核酸分子を含む組換え宿主細胞は、本発明に係るカルボキシル末端側切断型apoEの由来源として用いることができる。また、カルボキシル末端側切断型apoE4が、神経細胞においてp-tauおよびp-NF-Hに結合するのを減少させる作用薬を同定するための薬剤スクリーニングアッセイ法において使用することもできる。
【００５９】
いくつかの態様において特に関心の対象となるのは、正常にapoEを産生する哺乳動物細胞、および、外部環境からapoEを正常に取り込む細胞である。このような細胞の例には、神経細胞、ミクログリア細胞、および星状細胞がある。不死化された神経細胞、ミクログリア細胞、および星状細胞も関心の対象である。
【００６０】
トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、特に、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドのコード領域を含む外来核酸を導入遺伝子として含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物は、神経細胞におい、カルボキシル末端側切断型apoE4のp-tauおよびp-NF-Hへの結合を低下させ、それによって、神経原線維変化の形成を低下させる作用薬をスクリーニングするのに役立つ。このような化合物は、アルツハイマー病、およびそれに随伴する病状を治療するのに有用な候補作用薬である。
【００６１】
多くの態様において、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする導入遺伝子は、カルボキシル末端側切断型apoEが主に神経細胞の中で産生されるようにするため、神経細胞特異的調節因子を含む。ただし、神経原線維変化はp-tauおよびp-NF-Hを産生する細胞、すなわち神経細胞の中でのみ形成されるものであるため、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする導入遺伝子は、必ずしも神経細胞特異的調節因子を含まなくてもよい。
【００６２】
トランスジェニック非ヒト動物、特に、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法は当技術分野において既知である。例えば、米国特許第6,268,545号、第6,255,554号、第6,222,094号、および第6,204,43号；「トランスジェニック動物技術（Transgenic Animal Technology）」C.A. Pinkert編（1997）、アカデミックプレス社（Acad. Press）；「遺伝子ノックアウトプロトコール（Gene Knockout Protocols）」M.J. Tymmsら編（2001）、ヒューマナプレス社（Humana Press）；および「遺伝子ターゲティング：実際的方法（Gene Targeting: A Practical Approach）」A.L. Joyner編（2000）、オクスフォード大学出版（Oxford Univ. Press）を参照のこと。
【００６３】
トランスジェニック動物は、染色体外因子として存在するか、または、その細胞の全部または一部、特に生殖細胞に安定的に組み込まれた外来核酸配列を含む。別段の記載がない限り、トランスジェニック動物は生殖系列の配列に安定した変化を有する。この動物を最初に構築する際、一部の細胞だけが変更されたゲノムをもつ「キメラ」または「キメラ動物」を作製する。キメラは、主に、所望のトランスジェニック動物を作出するという育種目的で使用される。キメラを育種することによって、ヘテロ接合的な変異をもつ動物を作製する。ホモ接合動物を作製するため、一般的には、オスとメスのヘテロ接合体を育種する。
【００６４】
いくつかの態様において、内在するapoE遺伝子がノックアウトされている（例えば、無機能化されている）。本発明において、トランスジェニックノックアウト動物は、内在apoE遺伝子の一方の対立遺伝子または両方の対立遺伝子において、一部または完全に機能を失っている。
【００６５】
トランスジェニック動物がノックアウト動物である場合、標的遺伝子の発現は検出できないか、僅かなものである。内在apoE遺伝子をノックアウトするとは、内在apoEタンパク質の機能が実質的に減少して、発現を検出できないか、ごく僅少量存在することを意味する。これは、例えば、1個以上の終止コドンを挿入したり、DNA断片などを挿入したり、コード配列を欠失させたり、コード配列の停止コドンを置換したりなど、さまざまなメカニズムによって実施することができる。いくつかの場合、外来の導入遺伝子の配列は最終的にゲノムから消失し、本来の配列に対して最終的な変化が残る。さまざまな方法を用いて「ノックアウト」を達成することができる。米国特許第5,464,764号、第5,627,059号、および、Capecchiらに関連する特許および刊行物を参照のこと。非コード領域、特にプロモーター領域、3’側調節配列、エンハンサーを欠失させること、または、apoE遺伝子の発現を活性化する遺伝子を欠失させることなども含み、本来の遺伝子の全部または一部が染色体上から欠失するのを誘発することができる。
【００６６】
また、機能的なノックアウトは、アンチセンス構築物を導入することによっても行なうことができる（例えば、LiおよびCohen, Cell 85:319-329 (1996)を参照のこと）。また、「ノックアウト」には、例えば、標的遺伝子の変化を促進する基質に動物を曝すと、標的遺伝子に変化が生じる場合のような条件的ノックアウト、標的遺伝子部位における組換えを促進する酵素（例えばCre -lox系におけるCre）を導入する方法、または、出生後に標的遺伝子の変化を誘発する別の方法などもある。
【００６７】
apoE導入遺伝子はカルボキシル末端側切断型apoEをコードし、上記したような遺伝子操作された配列であり、コードされるタンパク質がカルボキシル末端側切断型apoEタンパク質となるよう、コード領域の中に欠失を含む。導入される配列は、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドをコードしていて、さらに、例えば、レセプタータンパク質（例えば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチドなど、さらに別のコード配列を含むことができる。導入遺伝子は、定常型または誘導型のプロモーター、および、それ以外の調節配列で宿主動物の中で発現するのに必要な配列に機能可能なように結合している、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする塩基配列を含む。「機能可能なように結合している」とは、例えば、転写活性化因子タンパク質など適当な分子が調節配列に結合したとき遺伝子発現が可能なように、DNA配列と調節配列が連結していることを意味する。
【００６８】
相同的組換えのためのDNA構築物は、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする塩基配列を含み、標的遺伝子座に相同的な領域を含む。ランダムに組み込むためのDNA構築物は、組換えを仲介するための相同性領域を含む必要はない。適宜、積極的または消極的な選抜を行なうためのマーカーを含ませることもできる。相同的組換えによって標的遺伝子に改変箇所をもつ細胞を作製する方法が当技術分野において知られている。哺乳動物細胞を形質転換させるためのさまざまな技術については、Keownら、Methods in Enzymology 185:527-537 (1990)を参照のこと。
【００６９】
胚幹（ES）細胞については、ES細胞系列を用いることができる。または、例えば、マウス、ラット、モルモットなどの宿主から胚細胞を新鮮な形で得ることができる。このような細胞は、適当な線維芽支持細胞層上で増殖させるか、白血病抑制因子（LIF）などの適当な成長因子存在下で増殖させる。ES細胞を形質転換したら、トランスジェニック動物を作出するために用いることができる。トランスジェニック動物を作出する方法については、米国特許第5,387,742号、第4,736,866号、および第5,565,186号を参照のこと。形質転換後、細胞は適当な培地の中、支持細胞層上で培養する。選抜培地を用いて、構築物を含む細胞を検出することができる。コロニーが成長するのに十分な時間経過した後、それらを取り出し、相同的組換えの発生または構築物の組み込みについて解析する。そして、胚の操作および胚盤胞注入のために陽性コロニーを使用することができる。4〜6週齢の過剰排卵されたメスから胚盤胞を得る。ES細胞をトリプシン化処理し、改変された細胞を胚盤胞の胞胚腔の中に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠させたメスの各子宮角に戻す。そして、メスに分娩させ、生まれた仔をスクリーニングして、構築物をもつ変異細胞がないかを調べる。異なった表現型の胚盤胞およびES細胞を提供することによって、キメラ後代を容易に検出することができる。
【００７０】
改変遺伝子の存在を調べるためにキメラ動物をスクリーニングし、改変されたオスとメスを交配してホモ接合体の後代を作出する。遺伝子の変化が発生のいずれかの時点で致死をもたらす場合には、組織または器官を、アレルギー誘発性または類似遺伝子型の移植片または移植物として、またはインビトロ培養で維持することができる。
【００７１】
組成物
本発明は、さらに、本発明に係る作用薬、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、および宿主細胞を含む、薬学的組成物などの組成物を提供する。これらの組成物は、作用薬、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、または宿主細胞の所望の用途に応じて選ばれる緩衝液を含むことができ、目的とする用途に適した別の物質を含むこともできる。非常に多様な緩衝液が知られているが、当業者は、目的とする用途に合った適当な緩衝液を容易に選択することができる。場合によっては、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができるが、さまざまな賦形剤が当技術分野において知られており、本明細書において詳細に検討する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro (1995) 「レミントン：薬剤の科学と実践（Remington: Science and Practice of Parmacy）」、第19版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス社（Lippincott, Williams & Wilkins）など、さまざまな刊行物に十分に記載されてきている。
【００７２】
スクリーニングアッセイ法
本発明は、神経細胞における神経原線維変化の形成を低下させる化合物を同定する方法を提供する。細胞内の神経原線維変化の量を低下させる作用薬には、apoEのタンパク質分解を低下させる作用薬、および、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよびp-NF-Hと相互作用するのを低下させる作用薬などがある。本発明に係るアッセイ法において有効な被検作用薬が、カルボキシル末端側切断型apoEに関連した疾患を治療するための候補薬となる。
【００７３】
いくつかの態様において、このアッセイ法は、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させ、および/または、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよびp-NF-Hと相互作用するのを阻害する化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法である。
【００７４】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させる化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法は、後にタンパク質分解によるプロセッシングを受けてカルボキシル末端側切断型apoEとなる完全長apoEを産生する宿主細胞を使用することを含む。この方法は、通常、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型apoEの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、カルボキシル末端側切断型apoEの量、および/または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００７５】
別の態様において、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを阻害する化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法は、通常、C末端側切断型のapoEをコードする核酸を含む本宿主細胞を使用することを含む。この方法は、通常、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型apoEの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、apoEのp-tauおよびp-NF-Hに対する結合、および/または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００７６】
別の態様において、本発明に係るスクリーニングアッセイ法は、インビトロの無細胞法である。インビトロの無細胞スクリーニング法は、通常、apoEのタンパク質分解による切断を仲介する酵素を、(1)酵素が活性になったとき検出可能なシグナルを提供する、この酵素の基質、および(2)被検作用薬と接触させることを含む。対照用の試料は、酵素と基質は含むが、被検作用薬は含まない。酵素は精製することができるが、精製する必要はない。この酵素は、カルボキシル末端側切断型apoEを産生する細胞の溶解物の中に存在ことがあり、部分的に単離することもでき、または、実質的に（例えば、純度約90％、約95％、または約98％に）単離することもできる。
【００７７】
本発明に係るインビトロのスクリーニングアッセイ法を用いて同定された化合物は、ADなど、神経細胞中にC末端側切断型のapoEが存在することが原因で起きる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００７８】
別の態様において、スクリーニングアッセイ法はインビボのスクリーニングアッセイ法である。いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させる化合物を同定するためのインビボスクリーニングアッセイ法は、完全長のapoEをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中で、後にタンパク質分解によるプロセッシングを受けてカルボキシル末端側切断型apoEとなる完全長のapoEを産生するトランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。別の態様において、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを阻害する化合物を同定するためのインビボのスクリーニング法は、通常、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中でカルボキシル末端側切断型apoEを産生する本トランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。
【００７９】
これらの方法は、通常、トランスジェニック非ヒト動物を被検作用薬に接触させること、および、カルボキシル末端側切断型apoEの量、および/または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果があるようならば、それを対照と比較して測定する。適当な対照は、被検作用薬と接触させていないトランスジェニック動物などである。本発明に係るインビボスクリーニングアッセイ法を用いて同定された化合物は、ADなど、神経細胞中にC末端側切断型のapoEが存在することが原因で起きる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００８０】
候補作用物質（本明細書において「被検作用薬」とも称する）には多数の化学的分類が含まれるが、典型的にはそれらは有機分子、例えば分子量が50を上回って約2,500ダルトン未満である低分子有機化合物である。候補作用物質は通常、蛋白質との構造的相互作用、例えばファンデルワールス相互作用および水素結合に必要な官能基を含み、少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含んでいてもよく、これらの官能化学基のうち少なくとも2つを含んでいてもよい。候補作用物質はしばしば、上記の官能基の1つまたは複数が置換された形で環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。また、候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組み合わせを非制限的に含む生体分子からも見出される。
【００８１】
候補作用物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、非常に多岐にわたる源から入手しうる。例えば、非常に多岐にわたる有機化合物および生体分子のランダムおよび定方向（directed）合成には、ランダム化されたオリゴペプチドの発現を含む多数の手段を用いることができる。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーが入手可能であり、または容易に作製しうる。さらに、天然または合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために用いることもできる。既知の薬理作用物質に対して、構造的類似体を作製するためにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（amidification）などの定方向性またはランダムな化学修飾を行ってもよい。新たな治療薬となる可能性のある作用物質を、推論的（rational）薬物設計またはコンピュータモデル化などの方法を用いて作り出すこともできる。
【００８２】
スクリーニングは、既知の薬理学的活性化合物、およびその化学的類似体に対して、または、合理的薬剤設計によって作出された作用薬など、未知の特性をもつ新規の作用薬に対して行なうことができる。効果的な候補薬は表現形質によって同定することができる。すなわち、野生型動物と本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物とを比較して、特定の認知行動の停止または逆転によって同定することができる。
【００８３】
本発明に係るアッセイ法において効果をもつ作用薬は、周知のアッセイ法を用いて、さらに、細胞毒性、生物学的利用能などについて調べることができる。本発明に係るアッセイ法において有効な作用薬に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミディフィケーション（amidification）などの特異的またはランダム、および/または特異的化学修飾を行なって、構造類似体を作製することができる。このような構造類似体には、生物学的利用能が高まり、および/または細胞毒性が低下したものがある。当業者は、非常に多様な構造類似体を容易に考え出して作製することができ、生物学的利用能の増加、および/または細胞毒性の低下、および/または血液脳関門を通過する能力など、所望の特性について調べることができる。
【００８４】
スクリーニングアッセイ法に種々のその他の試薬を含めてもよい。これらには、最適な蛋白質-蛋白質結合の促進および／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用の軽減のために用いられる、塩類、アルブミンなどの中性蛋白質、界面活性剤などの試薬が含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのアッセイ法の効率を改善させる試薬を用いることができる。成分の混合物は、必要な結合がもたらされる任意の順序で添加される。インキュベーションは任意の適した温度、典型的には4℃から40℃の間で行われる。インキュベーション期間は最適な活性に関して選択されるが、迅速な高スループットスクリーニングが促進されるように最適化してもよい。典型的には0.1から1時間の間で十分と考えられる。
【００８５】
インビトロでの細胞を用いたスクリーニングアッセイ法
いくつかの態様において、本発明は、細胞内で神経原線維変化が形成されるのを抑制する化合物を同定する方法であって、一般的に、インビトロの細胞を被検作用薬に接触させること、また、細胞内における神経原線維変化の形成に対して被検作用薬に効果があれば、それを測定することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、細胞内でのカルボキシル末端側切断型apoEの存在および/または量を検出する方法であって、カルボキシル末端側切断型apoEの量が減少すると、通常、神経原線維変化の量の減少がもたらされる方法を提供する。カルボキシル末端側切断型apoEの量を減少させる被検作用薬は、通常、細胞内における神経原線維変化の形成を低下させる作用薬である。
【００８６】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させる化合物を同定するためのインビトロでの細胞を用いたスクリーニング法は、その後、タンパク質分解によってカルボキシル末端側切断型apoEにプロセッシングされる完全長apoEを産生する宿主細胞の使用を含む。このような宿主細胞は、全長apoEをコードする核酸を適当な細胞の中に導入することによって作出される。この方法は、一般的に、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型apoEの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、カルボキシル末端側切断型apoEの量、および/または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００８７】
別の態様において、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを阻害する化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法は、通常、C末端側切断型のapoEをコードする核酸を含む本宿主細胞を使用することを含む。適当な細胞には、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸を含む本宿主細胞などがある。この方法は、通常、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型apoEの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、apoEのp-tauおよびp-NF-Hに対する結合、および/または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００８８】
スクリーニング法において使用される細胞は、細胞質にカルボキシル末端側切断型apoEを含み、p-tauおよびp-NF-Hも産生する細胞である。通常、細胞は神経細胞であり、多くの態様においては、細胞は神経細胞系である。神経細胞系は、当技術分野において周知されており、neuro-2A細胞、B103、PC12、NT2などがあるが、これらに限定されない。
【００８９】
スクリーニング法に使用される細胞は、細胞質の中にカルボキシル末端側切断型apoEを含んでいる。カルボキシル側切断型apoEは、この細胞によって産生するか、外来のものとして調達することができる。
【００９０】
いくつかの態様において、apoEをコードする塩基配列含む核酸を、上記したように細胞の中に導入して、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸を一過的または安定的に細胞内で発現させる。
【００９１】
別の態様において、完全長apoEをコードする塩基配列を含む核酸を細胞に導入すると、産生される完全長apoEポリペプチドは細胞内でタンパク質分解による切断を受け、細胞質でカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドが得られる。
【００９２】
別の態様において、細胞をカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチド（「外来のカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチド」）と接触させる。細胞は、培地から外来のカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドを取り込む。外来のカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドの取り込みを促進するために、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドを、真核細胞への取り込みを促進する化合物と複合させることができる。このような化合物には、例えばβ-VLDLのような超低密度リポタンパク質（VLDL）、リン脂質/apoE複合体、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸-グリコール酸コポリマー、デキストランなどがあるが、これらに限定されない。
【００９３】
既知の技術を用いて、被検作用薬が細胞内での神経原線維変化の形成に対して作用するか否かを判定する。例えば、p-tau、p-NF-H、またはapoEに特異的で、検出用に標識された抗体で細胞を染色して、神経原線維変化の細胞内封入体を可視化するなどする。
【００９４】
いくつかの態様において、細胞を解析して、被検作用薬がカルボキシル末端側切断型apoEの量に対して効果をもつか否かを判定する。被検作用薬がカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドの量を低下させるのに有効であるか否かは、一般的に、カルボキシル末端側切断型apoEの存在および/または量について細胞を解析することによって判定する。
【００９５】
インビトロでの無細胞アッセイ法
別の態様において、本発明に係るスクリーニングアッセイ法は、インビトロの無細胞法である。インビトロの無細胞スクリーニング法は、通常、apoEのタンパク質分解による切断を仲介する酵素を、(1)酵素が活性になったとき検出可能なシグナルを提供する、この酵素の基質、および(2)被検作用薬と接触させることを含む。対照用の試料は、酵素と基質は含むが、被検作用薬は含まない。
【００９６】
酵素は精製することができるが、精製する必要はない。この酵素は、カルボキシル末端側切断型apoEを産生する細胞の溶解物の中に存在ことがあり、部分的に単離することもでき、または、実質的に（例えば、純度約90％、約95％、または約98％に）単離することもできる。
【００９７】
適当な基質とは、該基質が酵素による作用を受けたとき検出可能なシグナルをもたらす基質である。このような基質の非限定的な例は、(P3)nP2P1-Xという化学式をもち、ここでP4P3P2P1がペプチドであり、Xがペプチドのカルボキシル末端に結合する部分（「タグ基」）であり、また、酵素による作用を受けて該ペプチドから切断されると検出可能なシグナルをもたらすペプチドである。なお、P1は、ロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンなどの疎水性残基であり、P2はプロリン、P3は、アラニンなどの疎水アミノ酸、また、n≧2である。適当なペプチドの非限定的な例には、Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Pro-Met（配列番号：2）、Ala-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）、およびAla-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：4）などがある。
【００９８】
Xは、放射性標識されたタグ、光化学的タグ、比色タグ、発色性タグ、蛍光性タグ、蛍光発生タグ、燐光性タグ、電気化学的タグ、化学発光性タグ、または生物発光性タグを検出するアッセイ法によって検出することができるタグ基である。
【００９９】
化合物は、ペプチドのC-末端部位にタグを有する。タグは、酵素アッセイ法に使用される、当業者に既知のものである。タグには、放射性標識によって、または、光化学法、比色法、発色法、蛍光法、蛍光発生法、燐光法、電気化学法、化学発光法、もしくは生物発光法、もしくは免疫アッセイ法によって、通常は定量的に測定することができるタグがあるが、これらに限定されない。典型的なタグは、比色、発色、蛍光、蛍光発生、燐光、化学発光、もしくは生物発光によるアッセイ法で検出可能なタグである。さらに典型的なタグは、放射性標識された基、または蛍光発生タグ、発色性タグ、または化学発光性タグとなりうるタグ基を含むタグである。これらの指標はすべて、P1アミノ酸とアミド結合またはエステル結合を形成し、これらの結合が酵素によって切断できるようになっている。
【０１００】
発色性および蛍光発生性の標識、ならびにその用途が当技術分野において知られている（例えば、さまざまなタンパク質分解酵素用の特異的な発色性または蛍光発生性の基質のリストを含む、米国特許第4,448,715号、第3,884,896号、第3,886,136号、第4,016,042号、第4,028,318号、第4,119,620号、第4,147,692号、第4,155,916号、第4,191,808号、第4,191,809号、第4,207,232号、および第4,167,449号を参照のこと；比色性物質は、米国特許第4,217,269号、第4,210,497号、および第4,221,706号に表されている）。
【０１０１】
本発明に係る方法において使用するのに適した蛍光発生性または蛍光性のタグは、放射性ハロゲンまたは3Hで標識したダンシル基、4-メチルクマリル-7-アミノ基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミノ基、ナフチルアミノ基、7-オキシクマリル基、5-アミノ-イソ-フタル酸ジ（低級アルキル基、好ましくはメチル基またはエチル基）エステル、クマリル-7-アミノ基、または、放射性ハロゲンまたは3Hで標識したナフチルアミノ基であるが、これらに限定されない。典型的な蛍光発生性タグは、4-メチルクマリル-7-アミノ基または4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミノ基である。タグは、蛍光発生性タグの場合、4-メチルクマリル-7-アミノ基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミノ基、ナフチルアミノ基、7-オキシ-クマリル基、5-アミノ-イソフタル酸ジエチルエステル、ダンシル基、クマリル-7-アミノ基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミノ基、2-メチルアントラニル酸などでありうる。
【０１０２】
本発明に係る方法において使用するのに適した比色性または発色性のタグは、放射性ハロゲンで標識されたパラ-ニトロアニリノ基、パラ-ニトロフェノキシ基、オルト-ニトロフェノキシ基、オルト-カルボキシフェノキシ基、ニトロフェニルアミノ基、1-カルボキシ-2-ニトロフェン-5-イルアミノ基、1-スルフォ-2-ニトロフェン-5-イルアミノ基、ナフチルアミノ基、μ-ナフチルアミノ基、β-ナフチルアミノ基、ニトロナフチルアミノ基、5-ニトロ-α-ナフチルアミノ基、メトキシナフチルアミノ基、4-メトキシ-μ-ナフチルアミノ基、キノニルアミノ基、キノン-5-イルアミノ基、ニトロキノニルアミノ基、8-ニトロキノン-5-イルアミノ基、4-メチルクマリル-7-アミノ基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミノ基、およびナフチルアミノ基などであるが、これらに限定されない。
【０１０３】
タグが発色性タグの場合、例えば、p-ニトロ-アニリノ基、p-ニトロ-フェノキシ基、ニトロフェニルアミノ基、ナフチルアミノ基、メトキシナフチルアミノ基、キノリルアミノ基、ニトロキノリルアミノ基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミノ基、またはナフチルアミノ基でありうる。
【０１０４】
本発明に係る方法において使用するのに適した化学発光性のタグは、ルミノール(5-アミノ-2,3-ジヒドロ-1,4-フタルアジンジオン)、イソ-ルミノール(6-アミノ-2,3-ジヒドロ-1,4-フタルアジンジオン)、およびN-(4-アミノブチル)-N-エチル-イソ-ルミノール(6-(N-(4-アミノブチル)-N-エチルアミノ)-2,3-ジヒドロフタルアジン-1,4-ジオン)などであるが、これらに限定されない。Simpsonら、（1979）Nature 279:646を参照のこと。
【０１０５】
本発明に係る方法において使用するのに適した放射性標識されたタグは、14C-または3Hで標識されたアニリノ基、ベンジルアミノ基、または低級アルコキシ基、または、ヒドロキシアニリノ基、ナフチルアミノ基、ヒドロキシベンジルアミノ基、またはクマリル-7-アミノ基の中のハロ標識などであるが、これらに限定されない。
【０１０６】
または、タグは、アミノ-イソルミノール、アミノ-ルミノール、もしくはその他のルミノール誘導体などの化学発光性タグ、または、ルシフェリン、特に、セレンテラジン、またはルシフェラーゼなど、切断されると、それぞれ適当なルシフェラーゼおよびルシフェリンと反応することができる生物発光性タグのようなレポーターでもよい。また、考えられるのは、レポーターで標識した抗体（または抗原、すなわちリガンド）がX上の抗原（レセプター）に結合する免疫レポーターで。およびビオチン/アビジンに結合したレポーターである。
【０１０７】
インビボでのスクリーニングアッセイ法
いくつかの態様において、アッセイ法は、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物を被検作用薬と接触させること、および、動物において神経原線維変化の形成、または、神経原線維変化の存在に伴う疾患に対してその作用薬に効果があれば、それを測定することを含む。
【０１０８】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させる化合物を同定するためのインビボスクリーニングアッセイ法は、完全長のapoEをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中で、後にタンパク質分解によるプロセッシングを受けてカルボキシル末端側切断型apoEとなる完全長のapoEを産生するトランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。完全長のapoEをコードする塩基配列を含む核酸を導入遺伝子として含むトランスジェニック非ヒト動物が当技術分野において知られている。例えば、米国特許第6,046,381号、Raberら、（1998）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10914-10919、Muttini（1999）J. Neurosci. 19:4867-4880を参照のこと。
【０１０９】
別の態様において、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよび/またはp-NF-Hと相互作用するのを阻害する化合物を同定するためのインビボのスクリーニング法は、通常、カルボキシル末端側切断型apoEをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中でカルボキシル末端側切断型apoEを産生する本トランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。
【０１１０】
これらの方法は、通常、トランスジェニック非ヒト動物を被検作用薬に接触させること、および、カルボキシル末端側切断型apoEの量、および/または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果があるようならば、それを対照と比較して測定する。適当な対照は、被検作用薬と接触させていないトランスジェニック動物などである。本発明に係るインビボスクリーニングアッセイ法を用いて同定された化合物は、ADなど、神経細胞中にC末端側切断型のapoEが存在することが原因で起きる疾患を治療するための候補化合物となる。
【０１１１】
本発明のトランスジェニック動物を用いるスクリーニングには、動物モデルで容易に評価しうる、学習障害、痴呆または認知障害に伴うあらゆる現象を用いることができる。これらのスクリーニングには、1）分子マーカー（例えば、脳組織におけるカルボキシル末端側切断型apoEタンパク質のレベル、および神経突起斑の形成）の分析、2）記憶および学習に関連した行動上の症状の評価、3）大脳辺縁系の連合新皮質および前脳基底核の進行性および不可逆性の求心路遮断を特徴とする神経変性の検出（神経変性は例えば、脳組織におけるシナプトフィジンの発現の検出によって測定しうる）（例えば、Gamesら、Nature 373：523〜7（1995）を参照されたい）を非制限的に含む現象の評価が含まれうる。これらの現象はスクリーニング解析において単独または任意の組み合わせによって測定しうる。
【０１１２】
一般的に、スクリーニングには対照値（例えば、被験化合物の非存在下での被験動物における神経原線維変化形成レベル）が含まれると考えられる。陽性と考えられる、すなわちアポEを介した疾患の治療に有益である可能性が高いと思われる被験物質は、神経原線維変化の形成および関連した疾患に対して実質的な効果をもつもの（例えば、カルボキシル末端側切断型apoEの生成によって生じる行動障害を更生しうる被験作用物質）と考えられる。
【０１１３】
これらの現象を評価するための方法、およびアポEに関連した障害の治療のための候補作用物質に関して予想される効果は、当技術分野で公知である。例えば、ADに対する効果に関する化合物の試験などのための種々のスクリーニング解析においてトランスジェニック動物を用いるための方法は、1996年12月19日に発行された国際公開公報第9640896号、1996年12月19日に発行された国際公開公報第9640895号、1995年5月4日に発行された国際公開公報第9511994号（Aβのインビボでのモニタリングのための方法および組成物を記載したもの；これらはそれぞれこのようなスクリーニング解析および技法のための方法および組成物の開示に関して参照として本明細書に組み入れられる）に見いだされる。これらの現象の評価の例は以下に提供されるが、これは制限を目的としたものではない。
【０１１４】
病理学的試験
候補作用物質に対して曝露した後に動物を屠殺し、1）神経原線維変化（NFT）、ならびに／または 2）カルボキシル末端側切断型apoEのレベルを免疫組織学的に分析する。脳組織を固定（例えば4％パラホルムアルデヒド中にて）および切片化し、切片をカルボキシル末端側切断型apoE、および／またはp-tau、および／またはp-NF-Hと反応する抗体により染色する。一次抗体の検出には、フルオレセイン、ローダミン、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを結合させた二次抗体を用いる。これらの実験により、神経原線維変化の同定およびこれらのNFTを脳の特定領域に対して位置づけることが可能となる。
【０１１５】
Alz-50、A2B5、Aβ、ニューロン特異的エノラーゼおよび神経変性の特徴であるその他のものなどの抗原を認識するその他の診断的抗体で切片を染色することもできる。神経炎性局面およびNTF内部のAβ沈着の共存を分析するために、チオフラビンおよびコンゴーレッドによる染色を行うこともできる。
【０１１６】
カルボキシル末端側切断型apoE産生の解析
ウエスタンブロット分析：ハーロウ（Harlow）ら、抗体：実験室マニュアル（Antibodies：A laboratory manual）、Cold Spring Harbor、N.Y.（1988）、ブラウン（Brown）ら、J. Neurochem 40：299〜308（1983）、テート-オストロフ（Tate-Ostroff）ら、Proc Natl Acad Sci 86：745〜749（1989）、およびファン（Huang）ら（2001）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98：8838〜8843により記載された通りに、組織ホモジネートおよび細胞可溶化物から蛋白質画分を単離して、ウエスタンブロット分析に用いることができる。以下には簡単な説明を示す。
【０１１７】
蛋白質画分はレムリ試料緩衝液中にて変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動にかけることができる。続いてエレクトロブロッティングによって蛋白質をニトロセルロースフィルターに移行させる。フィルターをブロックし、一次抗体とともにインキュベートし、酵素を結合させた二次抗体と最後に反応させる。引き続いて適切な基質（この基質は検出可能なシグナルを提供する）とインキュベートすることにより、カルボキシル末端側切断型apoE蛋白質の位置が明らかとなる。
【０１１８】
行動試験
学習および記憶能の低下を評価するためにデザインされた行動試験を用いることができる。このような試験の1つの例にモリス水迷路（Morris Learn Motivat 12：239〜260（1981））がある。この手順では、脱出用プラットフォームが水の表面の直下に隠されている、水を満たした環状のプールに動物を入れる。プラットフォーム上には視認しうるマーカーが配置され、動物が近くの視覚的手がかりを求めて動き回ることによってそれを見いだせるようになっている。または、プラットフォームの位置を示す正式な手がかりがない、より複雑な形式の試験を動物に行うことも考えられる。この形式では、動物は遠方の視覚的手かがりに対する相対的なプラットフォームの位置を学習しなければならない。または、もしくはこれに加えて、学習記憶障害に関する3走路パネル（3 runway panel）を用いて記憶および学習能の低下を検討することもできる（4つの選択ポイントに3つのパネルゲートがあり、うち2つが誤ったパネルであるものを通過させる試行）（Ohnoら、Pharmacol Biochem Behav 57：257〜261（1997））。
【０１１９】
神経細胞障害の動物モデルの検討
外傷性事象によって生じる神経細胞障害の程度におけるアポE3およびアポE4の役割、ならびにこの種の傷害によるニューロンのリモデリング、修復および回復におけるそれらの役割を明らかにすることを目的として、神経細胞障害、例えば脳虚血のために生じる神経細胞障害の齧歯類モデルを検討することができる。全体的虚血（global ischemia）および限局性虚血（focal ischemia）の双方に関する脳虚血の齧歯類モデルは、脳虚血の発生を司る機序、および虚血性事象によって生じる損傷の治療に関する可能性のある治療戦略を研究するために有用である。通常は一過性である全体的虚血に関する動物モデルでは、脳の領域が広く侵されるが、典型的には選択的に易損性の脳領域にニューロンの変質が生じる。このようなモデルの例には、前脳虚血の二枝閉塞モデル、前脳虚血の四枝閉塞モデル、および脳脊髄液圧上昇が関与する虚血モデルが非制限的に含まれる。参照として本明細書に組み入れられるギンズバーグ（Ginsberg）およびブスト（Busto）、Stroke 20：1627〜1642（1989）を参照のこと。限局性虚血のモデルは虚血脳卒中損傷に類似していると考えられ、典型的には限局的な脳梗塞が生じる。限局性虚血のモデルの例には、中大脳動脈閉塞、光化学的に誘発される限局性脳血栓、血栓塞栓、マイクロスフェア塞栓などが非制限的に含まれる。参照として本明細書に組み入れられるマコーリー（McAuley）、Cerebrovasc. Brain Metab. Review 7：153〜180（1995）を参照されたい。
【０１２０】
神経原線維変化の形成を阻害する方法
本発明は、神経細胞において神経原線維変化の形成を阻害する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型apoEの形成を減少させることを含む。
【０１２１】
神経細胞における神経原線維変化量の減少は、以下によって行なうことができる。（1）カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドの量を減少させること、（2）apoEポリペプチドがタンパク質分解によってカルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドに切断されるのを減少すること、（3）カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドがp-tauと相互作用するのを減少させること、（4）カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドがp-NF-Hと相互作用するのを減少させること、（5）apoEを切断してカルボキシル末端側切断型apoEを生成させる酵素の量および/またはタンパク質分解活性を低下させること。
【０１２２】
いくつかの態様において、本方法は、apoEの少なくとも244〜260番目のアミノ酸を含むペプチドであって、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよびp-NF-Hに結合するのを阻害するペプチドを感染した細胞の中に導入することを含む。
【０１２３】
別の態様において、本方法は、カルボキシル末端側切断型apoEを産生する細胞を、apoEを切断してカルボキシル末端側切断型apoEを生成させる酵素のタンパク質分解活性を阻害する作用薬に接触させることを含む。いくつかの態様において、作用薬はキモトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターである。キモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害し、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を阻害する作用薬を、本発明に係る方法において使用することができる。
【０１２４】
キモトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターである作用薬は、米国特許第5,288,707号、第6,127,340号および第6,281,206号で開示されているものなどである。キモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する作用薬はX-(aa4)m-(aa3)n-(aa2)-(aa1)-Zなどであるが、これに限定されない。ここでaa1、aa2およびaa3は、天然または非天然の酸残基であり、(aa4)mは、aa3のアミノ基に結合した1個以上の選択的アミノ酸残基を表している。または、1個以上の選択的アミノ酸（aa）群は、α位の水素が置換基に置き換えられている、アミノ酸残基の類似体でもよい。Xは、N末端アミノ基のHまたは置換基を表し、Zは、例えば、当技術分野において知られているような--COOHまたはC末端伸長基（カルボキシ置換基）である。化合物によっては、Zは、ヘテロアトム原子酸基（heteroatom acid group）、例えば、--B(OH)2、--P(OH)2、もしくはPO(OH)、またはそれらの誘導体、例えば、カルボキシル酸エステル、ジオキソ-ボロネート[--B(O置換基)2]、またはリン酸[--PO(O置換基)2]またはBF2である。典型的なヘテロ原子類似体群は、--B(OH)2および-P(O)(OM)2 S(O)2OHである。いくつかの態様において、P2-P1天然ペプチド結合は、N置換P2-P1天然ペプチド結合以外の他の結合部分により置換される。
【０１２５】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を阻害する作用薬はペプチドインヒビターである。このようなインヒビターの非限定的な例は、(P3)nP2P1という化学式をもつペプチドである。ここで、P4P3P2P1がペプチドであり、P1は、ロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンなどの疎水性残基であり、P2はプロリン、P3はアラニンなどの疎水アミノ酸、また、n≧2である。適当なペプチドの非限定的な例には、Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Pro-Met（配列番号：2）、Ala-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）、およびAla-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：4）などがある。
【０１２６】
治療薬
本発明は、本明細書に記載する方法を用いて同定された作用薬を提供する。apoE4関連疾患を治療するためにカルボキシル末端側切断型apoEの量および/または活性を低下させる作用薬を使用する。有効な用量の活性成分を宿主に投与するが、ここで、「有効な用量」とは、所望の結果を生むのに十分な投薬量を意味する。通常、所望の結果とは、対照と比較すると、神経細胞の中で少なくとも、カルボキシル末端側切断型apoE量の低下、および/または神経原線維変化の量が低下することである。通常、より詳しく後述するように、本発明に係るスクリーニング法によって同定される作用薬は、1種類以上の薬学的に許容される賦形剤とともに処方される。
【０１２７】
本発明は、神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型apoEの形成を減少させる治療薬を提供する。治療薬には、神経細胞内でapoEのタンパク質分解を触媒して、カルボキシル末端側切断型apoE断片を産生させる酵素（「apoE切断酵素」）や、神経細胞におけるAβ1-42によるapoE切断酵素の活性化を抑制し、および/またはapoE切断酵素とAβ1-42との相互作用を阻害する作用薬などがある。治療薬は特異的であって、例えば、神経細胞において神経原線維変化の形成を誘導するカルボキシル末端側切断型apoE断片を産生するapoE切断酵素を阻害するが、神経細胞内の他の酵素は阻害しない、および/または、神経細胞においてAβ1-42によるapoE切断酵素の活性化を抑制するが、神経細胞内における他の酵素の活性化には実質的な影響を与えない、および/または、神経細胞においてapoE切断酵素とAβ1-42との相互作用を阻害するが、神経細胞における他のタンパク質-タンパク質相互作用は阻害しない。これらの治療薬は、神経細胞内にカルボキシル末端側切断型apoEが存在することに関係する疾患を治療するための本発明に係る方法において有用である。
【０１２８】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を阻害する作用薬はペプチドインヒビターである。このようなインヒビターの非限定的な例は、(P3)nP2P1という化学式をもつペプチドである。ここで、P4P3P2P1がペプチドであり、P1は、ロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンなどの疎水性残基であり、P2はプロリン、P3はアラニンなどの疎水アミノ酸、また、n≧2である。適当なペプチドの非限定的な例には、Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Pro-Met（配列番号：2）、Ala-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）、およびAla-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：4）などがある。
【０１２９】
多くの態様において、作用薬は、薬学的に許容される賦形剤とともに調剤される。さまざまな調剤法が当業者に知られており、詳しくは後述する。
【０１３０】
本発明は、キモトリプシン様プロテアーゼインヒビターのインヒビター、および、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、非ステロイド系抗炎症剤、シクロオキシゲナーゼ-2インヒビター、およびモノアミンオキシダーゼインヒビターからなる群より選択される作用薬、および、薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤を提供する。
【０１３１】
いくつかの態様において、本発明は、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を触媒する酵素のインヒビター、および、少なくとも1種類の他の治療薬剤よりなる組成物を提供する。apoE切断酵素を阻害する作用薬は上述した。カルボキシル末端側切断型apoEの形成を触媒する酵素のインヒビターとともに調剤することのできる別の治療薬には、ADに罹った個体を治療するために使用される作用薬があるが、それに限定されず、そのような作用薬には、アリセプト（Aricept）（ドネペジル（donepezil））、エクセロン（Excelon）（リバスティグミン（rivastigmine））、メトリフォネート（metrifonate）、およびタクリン（tacrine）（コグネクス社（Cognex））などのアセチルコリンエステラーゼインヒビター、イブプロフェン（ibuprofen）およびインドメタシン（indomethacin）などの非ステロイド系抗炎症剤、セレブレックス（Celebrex）などのシクロオキシゲナーゼ-2（Cox2）インヒビター、および、セレギレン（Selegilene）(エルデプリル（Eldepryl）およびデプレニル（Deprenyl）)などのモノアミンオキシダーゼインヒビターがあるが、これらに限定されない。キモトリプシン様プロテアーゼの既知のインヒビターは、ADを治療するために使用される別の治療薬とともに調剤することができる。上記作用薬のそれぞれについての投薬量は当技術分野において知られており、apoE切断酵素インヒビターとともに薬学的製剤に使用することができる。例えば、アリセプトは、通常、1日当たり50 mgを6週間経口投与し、個体が十分に耐えられるようならば、その後、1日当たり10 mgを投与する。
【０１３２】
薬学的に許容される賦形剤は当業者に知られており、例えば、A. Gennaro (1995) 「レミントン：薬剤の科学と実践（Remington: Science and Practice of Parmacy）」、第19版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス社（Lippincott, Williams & Wilkins）など、さまざまな刊行物に十分に記載されている。
【０１３３】
さらに、本発明は、神経細胞においてapoE切断酵素を阻害する作用薬を含むキットを提供する。この作用薬は薬学的に許容される賦形剤とともに調剤することができる。さらに、本キットは、上記したような（例えば、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、非ステロイド系抗炎症剤、Cox-2インヒビター、モノアミンオキシダーゼインヒビターなど）ADを治療する別の作用薬を含むことができ、薬学的に許容される賦形剤とともに調剤することができる。さらに、本キットは、調剤を各個体に投与するための装置を含むことができる。装置は、針、注射器、カテーテルなどであるが、これらに限定されない。本キットは、さらに、服用量、投与法などの関する情報など、キットの成分を使用するために情報を含むことができる。この情報は、印刷物などの形で提供することができるが、印刷物には限定されない。
【０１３４】
apoE関連疾患の治療法
本発明は、各個体におけるapoE関連疾患（例えば、各個体の神経細胞の中にカルボキシル末端側切断型apoEが存在することに随伴する疾患；ADなど）を治療する方法を提供する。本方法は、通常、apoE関連疾患をもつ個体に、神経細胞内でのカルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させ、および/または神経原線維変化の形成を低下させ、および/またはp-tauおよびp-NF-Hへのカルボキシル末端側切断型apoEの結合を低下させる化合物を有効量投与することを含む。
【０１３５】
「有効量」の化合物とは、化合物が存在しないときの各個体の神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型apoEの量、および/または神経原線維変化の量、および/またはp-tauおよびp-NF-Hへのカルボキシル末端側切断型apoEの結合と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、またはそれ以上、各個体の神経細胞内におけるカルボキシル末端側切断型apoEの形成を低下させ、および/または神経原線維変化の形成を低下させ、および/またはp-tauおよびp-NF-Hへのカルボキシル末端側切断型apoEの結合を低下させる量のことである。
【０１３６】
いくつかの態様において、本発明はアルツハイマー病の治療法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型apoEの存在を測定すること、および、神経細胞内でカルボキシル末端側切断型apoEの形成を触媒する酵素のインヒビターを投与することを含む。別の態様において、本方法は、キモトリプシン様プロテアーゼのインヒビターを、神経細胞内でのカルボキシル末端側切断型apoEの形成を触媒する酵素を阻害するのに有効な量投与して、酵素を阻害し、各個体の神経細胞における神経原線維変化の量を低下させることを含む。
【０１３７】
さらに、本発明は、神経細胞においてカルボキシル末端側切断型apoEが存在していることに関連する症状にあると臨床的に診断された個体を治療する方法を提供する。本方法は、通常、神経細胞においてカルボキシル末端側切断型apoEが存在していることに関連したapoE関連疾患をもつと臨床的に診断された個体の神経細胞を含む生体試料を解析することを含む。神経細胞にカルボキシル末端側切断型apoEが存在することが、apoEに伴う症状の臨床的診断の確認となる。
【０１３８】
次に、神経細胞において検出されたカルボキシル末端側切断型apoEに基づいて、apoEに関連する症状をもつと臨床的に診断された各個体に最も有効な治療計画を選択する。治療には、神経細胞におけるapoE切断酵素を阻害する作用薬を含む組成物を投与することが含まれる。
【０１３９】
上記のようにして得られた情報を用いて、各作用薬に対する各個体の反応を予測することができる。このように、本発明は、さらに、apoEに関連する症状の薬物治療に対する患者の応答可能性を予測する方法であって、カルボキシル末端側切断型apoEが神経細胞内に存在するか否かを判定し、カルボキシル末端側切断型apoEが存在すれば、その症状の薬物治療に対して応答する可能性があると予測できる方法を提供する。
【０１４０】
調剤、投薬量、および投薬経路
本発明は、カルボキシル末端側切断型apoEの量および/または活性を低下させる作用薬を含む、薬学的調剤などの調剤を提供する。「有効な量」とは、例えば、カルボキシル末端側切断型apoEの量および/または活性の低下、神経原線維変化の減少、学習や記憶などの改善などという所望の結果を生むのに十分な投薬量を意味する。通常、所望の結果とは、対照と比較すると、カルボキシル末端側切断型apoEの量および/または活性が低下することである。カルボキシル末端側切断型apoEの量および/または活性を低下させる作用薬は、詳しく後述するように、血液脳関門を回避するようにして送達することができる。カルボキシル末端側切断型apoEの量および/または活性を低下させる作用薬は、より詳しく後述するように、該作用薬が血液脳関門を通過することができるように調剤および/または改変することができる。
【０１４１】
調剤
本発明の方法において、カルボキシル末端側切断型apoEの量および/または活性の所望の低下、apoE4関連神経疾患の軽減、apoE4関連活性の低下などをもたらすことができる方法を適宜用いて、活性成分を宿主に投与することができる。
【０１４２】
したがって、治療用に投与するために、作用薬をさまざまな調剤に組み入れることができる。具体的には、本発明に係る作用薬は、薬学的に許容される適当な担体または希釈剤と組み合わせて薬学的組成物に調剤することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐薬、注射液、吸入剤、およびエアロゾルなど、固体、半固体、液体、または気体という形状の製剤に処方することができる。
【０１４３】
薬剤投与形態で、作用薬は、薬学的に許容される塩の形で投与することができ、または、単独、もしくは、他の薬学的な活性化合物と併用するだけでなく、適当に結合させて用いることもできる。以下の方法および賦形剤は単なる例示であり、決して制限的なものではない。
【０１４４】
経口用製剤としては、錠剤、粉剤、顆粒剤、またはカプセル剤にするため、本作用薬を単独、または適当な添加剤と組み合わせて用いることができる。例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンなどの通常の添加剤、例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および、望ましい場合には、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、および香料と組み合わせることができる。
【０１４５】
本作用薬は、水性溶媒、または、植物油もしくはその他同類の油脂、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、もしくはプロピレングリコールなどの非水性溶媒に、望ましい場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤など通常の添加剤とともに溶解、懸濁、または乳化することによって注射用製剤に調剤することができる。
【０１４６】
本作用薬は、吸入によって投与されるエアロゾル調製剤にして利用することができる。本発明に係る化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴霧剤に調剤することができる。
【０１４７】
さらに、本作用薬は、乳化基剤、または水溶性基剤などさまざまな基剤と混合することによって坐薬にすることができる。本発明に係る化合物は、坐薬によって直腸に投与することができる。坐薬は、ココアバター、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなど、体温では溶けるが室温では固化する媒体を含むことができる。
【０１４８】
シロップ、エリキシル、および懸濁剤など、経口または直腸経由で投与するための単位投薬形態であって、例えば、ティースプーン1杯分、テーブルスプーン1杯分、錠剤、または坐薬という各剤形単位が、１種類以上のインヒビターを含む組成物を所定量含む単位剤形を提供することができる。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、またはそれ以外の薬学的に許容される担体中の溶液として、組成物中にインヒビターを含むことができる。
【０１４９】
本明細書において、「単位剤形」とは、ヒトまたは動物の被検体にとって単位用量として適した物理的に分離した単位量であって、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体、または媒体とともに所望の効果を生じるのに十分量となるよう計算された、所定量の本発明に係る化合物を含むを意味する。本発明に係る新規の単位剤形に関する明細は、使用される特定の化合物、および達成されるべき効果に依存し、宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
【０１５０】
別の投薬方式も、本発明で使用される。例えば、本発明に係る作用薬は、坐薬に調剤することができ、場合によっては、エアロゾルおよび鼻腔内組成物として調剤することができる。坐薬用には、媒体の組成物は、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの伝統的な結合剤および担体を含む。このような坐薬は、約0.5％から約10％（w/w）、好ましくは約1％から約2％の範囲で活性成分を含む混合物から形成することができる。
【０１５１】
経鼻投与用調製剤は、普通、鼻粘膜を刺激せず、毛様体の機能を大きく損なわない媒体を含む。水、生理食塩水、またはこれら以外の既知の物質を本発明で使用することができる。経鼻用調製剤も、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含むことがある。界面活性剤を入れて、鼻粘膜による本発明のタンパク質の吸収を促進することができる。
【０１５２】
本発明に係る作用薬を注射剤として投与することができる。一般的には、注射用組成物は、溶液または懸濁液として調製されるが、注射前に液状媒体に入れて溶液または懸濁液にするのに適した固体も調製することができる。この調製物は乳化することもでき、また、その活性成分をリポソーム媒体に封入することもできる。
【０１５３】
適当な賦形剤となる媒体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、および、それらを併用したものである。さらに、所望であれば、この媒体は、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤など少量の補助物質を含むことができる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者にとって既知であるか明白である。例えば、レミントンの薬剤科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）、ペンシルバニア州イーストン（Easton, Pennsylvania）、マックパブリッシングカンパニー社（Mack Publishing Company）、第17版、1985；レミントン：薬剤の科学と実践（Remington: Science and Practice of Parmacy）」、A.R. Gennaro (2000) リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス社（Lippincott, Williams & Wilkins）を参照のこと。投与される組成物または調製剤は、いずれにせよ、治療を受けている対象者において所望の状態を実現するのに適した一定量の作用薬を含む。
【０１５４】
媒体、アジュバント、担体、または希釈剤など、薬学的に許容される賦形剤は、一般人が簡単に利用できる。その上、pH調整剤および緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤など、薬学的に許容される補助物質は一般人が簡単に利用できる。
【０１５５】
投薬量
用いられる投薬量は到達しようとする臨床目的に応じて変化するが、適当な投薬量の範囲は、神経原線維変化の形成を低下させる、および/または、カルボキシル末端側切断型apoEの量を低下させる、および/または、apoEとp-tauおよびp-NF-Hとの相互作用を低下させる作用薬を約1μgから約1,000μgまたは約10,000μgまで提供する投薬範囲であり、一回用量にして投与することができる。または、神経原線維変化の形成を低下させる、および/または、カルボキシル末端側切断型apoEの量を低下させる、および/または、apoEとp-tauおよびp-NF-Hとの相互作用を低下させる作用薬の標的用量は、作用薬を投与してから最初の24〜48時間内に採血した宿主の血液試料中約0.1〜1000μM、約0.5〜500μM、約1〜100μM、または約5〜50μMの範囲にあると考えることができる。
【０１５６】
当業者は、投薬量は、具体的な化合物、病状の重さ、および副作用に対する対象者の感受性の関数として多様であると、容易に理解することができよう。所定の化合物にとって好ましい投薬量は、さまざまな方法によって当業者が容易に決定することができる。
【０１５７】
投薬経路
インビボおよびエクスビボの方法など、また、全身および局所投与経路など、薬剤送達に適した方法および経路で利用できるものを用いて、神経原線維変化の形成を低下させる、および/または、カルボキシル末端側切断型apoEの量を低下させる、および/または、apoEとp-tauおよびp-NF-Hとの相互作用を低下させる作用薬を各個体に投与する。
【０１５８】
通常の薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、腫瘍内、皮下、皮内、局所施用、静脈内、経直腸、経鼻、経口、および、これら以外の非経口投与経路がある。投与経路は、望ましい場合には、作用薬および/または所望の効果に応じて併用したり、調整することができる。組成物は、一回投与量または複数回投与量にして投与することができる。
【０１５９】
全身経路または局所経路など、通常の薬剤を送達するのに適した利用可能な通常の方法および経路を用いて、作用薬を宿主に投与することができる。通常、本発明が想定する投与経路は、経腸経路、非経口経路、または吸入経路であるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１６０】
吸入経路以外の非経口投与経路は、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、関節内経路、脊髄内経路、および静脈経路、すなわち、消化管を経由しない投与経路であり、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、作用薬の全身または局所への送達をもたらすように行なうことができる。全身への送達が望ましい場合、投与は、一般的に、侵襲的、または全身に吸収される局所または粘膜への薬剤投与を含む。
【０１６１】
また、本作用薬は、腸への投与によっても対象者に送達することができる。腸からの投与経路とは、経口および直腸から（例えば、坐薬を用いて）送達することであるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１６２】
皮膚または粘膜を経由する薬剤投与法は、適当な薬剤の局所施用、経皮透過、注射、および上皮への投与などであるが、必ずしもこれらに限定されない。経皮透過させには、吸収促進またはイオン導入法が適した方法である。イオン導入による透過は、数日以上の間、電気パルスによって傷んでいない皮膚を通して生成物を継続的に送達する市販の「パッチ」を用いて行なうことができる。
【０１６３】
改善が広義で用いられ、例えば、apoE4関連神経疾患およびそれに伴う痛みなど、治療を受けている病理状態に伴う症状などのパラメータの程度を少なくとも軽減することを意味する場合、治療とは、宿主を苦しめている病理状態に関連した症状を改善することを意味する。したがって、治療は、病理状態、または、少なくともそれに伴う症状を完全に阻害する、例えば、発症を防止したり、停止する、例えば、終結させると、宿主はその病理状態、または、少なくとも、その病理状態を特徴づけている症状に苦しむことはなくなる。
【０１６４】
さまざまな宿主（ここで、「宿主」という語は、「対象者」および「患者」と互換的に使用される）は、本発明の方法によって治療することが可能である。通常、このような宿主は「哺乳動物」または「哺乳類」であるが、これらの用語は、広く、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）など、哺乳類に含まれる生物を表すために使用される。多くの態様において、宿主はヒトである。
【０１６５】
例えば、経口用量または注射用量など、単位投薬量の活性成分を含むキットが提供される。このようなキットは、単位用量を含む容器以外に、対象とする病理状態を治療する際の使用法および該薬剤の副次的利益について記載した能書からなる。
【０１６６】
血液脳関門の通過
血液脳関門は、多くの治療薬が通常の循環から脳および脊髄に取り込まれるのを制限している。血液脳関門を通過する分子は、2つの主要なメカニズム、すなわち、自由な拡散（free diffusion）および促進輸送を利用する。血液脳関門があるため、中枢神経系（CNS）において所定の治療薬が有益な濃度になるには、薬剤輸送方法を用いる必要があるかもしれない。CNSへの治療薬の輸送は、いくつかの方法によって達成することができる。
【０１６７】
一つの方法は神経外科的技術に基づく。自己の犠牲者やさまざまなタイプの痴呆を患う重篤な患者の場合、手術による介入は、それに伴うリスクがあるにもかかわらず正当なものと見なされる。例えば、薬剤の脳室内注入またはくも膜下注入など、CNSに直接物理的に導入することによって、治療薬を輸送することができる。脳室内注入は、例えば、オンマヤ（Ommaya）リザーバーのようなリザーバーに接続している脳室内カテーテルによって促進することができる。また、導入方法は、再充填可能か生物分解性の装置によって行なうことができる。別の方法は、血液脳関門の透過性を上昇させる物質によって血液脳関門を破壊する方法である。例としては、マンニトールのような難拡散性薬剤、エトポシド（etoposide）のような脳血管透過性を上昇させる薬剤、または、ロイコトリエンなどの血管作用薬を動脈内注入することなどがある。NeuweltとRappoport（1984）Fed. Proc. 43:214-219; Babaら、（1991）J. Cereb. Blood Flow Metab. 11:638-643；およびGennusoら、(1993) Cancer Invest. 11:638-643。
【０１６８】
さらに、薬剤は、治療を必要としている領域に局所的に投与することが望ましいことがあり、例えば、手術中の局所注入、注射、カテーテルという手段、または、シラスティック膜や繊維などの多孔性、無孔性、またはゼラチン状素材などのインプラントという手段によって行なうことができる。
【０１６９】
また、治療用化合物は、化学修飾、または血液脳関門を通過する類似化合物をスクリーニングするなどの薬理学的技術を用いて送達することもできる。化合物を修飾して、分子の疎水性を増強したり、分子の正味電荷または分子量を減少させたり、分子を修飾したりして、正常に血液脳関門を通過する化合物に似せることができる。Levin (1980) J. Med. Chem. 23:682-684; Pardridge (1991) 「脳へのペプチド薬輸送（Peptide Drug Delivery to the Brain）」より；およびKostisら、（1994）J. Clin. Pharmacol. 34:989-996。
【０１７０】
リポソームなどの疎水環境に薬剤を封入することも、CNSに薬剤を送達するのに効果的である。例えば、WO 91/04014は、正常に血液脳関門を通過して輸送される分子が添加されているリポソームの中に薬剤を封入するリポソーム送達系を記載している。
【０１７１】
血液脳関門を通過する薬剤を調剤する別の方法は、シクロデキストリンの中に薬剤を封入することである。J-シクロデキストリン、K-シクロデキストリン、およびそれらの誘導体など、血液脳関門を通過する適当なシクロデキストリンを用いることができる。一般的には、米国特許第5,017,566号、第5,002,935号、および第4,983,586号を参照のこと。また、このような組成物も、米国特許第5,153,179号に記載されているようなグリセロール誘導体を含むことができる。
【０１７２】
また、治療薬を可搬剤に接合させて新しいキメラ可搬治療薬を得て送達を行なうこともできる。例えば、血管作用性小腸ペプチドアナログ（VIPa）は、特異的な担体分子であるトランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体（Mab）に接合して始めてその血管作用性効果を発揮することができ、血液脳関門を通過してVIPa-Mab接合体の吸収を促進した。Pardridge (1991)；およびBickelら、（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2618〜2622。この他いくつかの特異的輸送系が同定されている。これらは、インシュリン、またはインシュリン様成長因子IおよびIIを移動させる系であるが、それらに限定されない。この以外の安定した非特異的担体には、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体などがあるが、これらに限定されない。中枢神経系に入り込んだところで、薬剤が担体から切断されて活性薬になるという、ある種のプロドラッグについて記載がある。米国特許第5,017,566号。
【０１７３】
本発明に係る治療薬による治療に適した対象者
さまざまな対象者が本発明に係る方法によって同定された作用薬による治療に適している。適当な対象者は、apoE関連疾患を患う個体、apoE関連疾患を発症する危険のある個体、apoE関連疾患を患ったことがあり、apoE関連疾患を再発する危険のある個体、または、apoE関連疾患から回復しつつある個体、特にヒトなどである。
【０１７４】
このような対象者には、アルツハイマー病であると診断された個体、1回以上脳梗塞を起こしたことのある個体、外傷性頭蓋骨傷害を受けたことのある個体、血清コレステロール値の高い個体、脳組織にAβ沈着がある個体、1回以上心臓病を起こしたことのある個体、心臓手術を受けた対象者、および多発性硬化症患者などであるが、それらに限定されない。
【０１７５】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施方法を当業者に完全に開示・説明するために提示するものであって、本発明者らが発明と見なすものの範囲を限定するものではなく、また、以下の実験は、実施したすべて、または唯一の実験であることを示すものである。用いられた数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するために努力が払われてきたが、実験誤差および偏差もあると見なされるはずである。別段の記載がない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で表記されており、また、圧力はほぼ気圧である。
【０１７６】
実施例１：神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型apoEの特徴づけ
材料と方法
最少必須培地（MEM）、N2-培地添加物、およびウシ胎児血清（FBS）をライフテクノロジーズ社（Life Technologies, Inc.）から購入した。パラホルムアルデヒド、ストレプトリシン-O（STP-O）、およびトリトン-100をシグマ社（Sigma）（ミズーリ州セントルイス（St Louis, MO））から購入した。ウエスタンブロット用の増強化学発光（ECL）検出キットをアマーシャム・ライフサイエンス社（Amersham Life Science）から購入した。プロテイン-Aアガロースをベーリンガー・マンハイム社（Beohringer Mannheim）から購入した。組換えヒトapoE3、apoE4、apoE3(Δ272-299)、またはapoE4(Δ272-299)を大腸菌の中で発現させて、確立された技術を用いて精製した。
【０１７７】
ポリクローナル抗ヒトapoE抗体をカリバイオケム社（Calbiochem）から購入した。抗apoE-カルボキシ末端抗体（アミノ酸番号272〜299）は、ポリクローナル抗apoE抗体を、apoE3(Δ272-299)およびapoE4(Δ272-299)の混合物を結合したセファロースCL-4Bカラムに3回通して得られた。非結合画分を抗apoE-カルボキシ末端抗体として用いた。完全長のapoE、およびapoE(Δ272-299)に対するウエスタンブロッティングによって、apoEのアミノ末端部位（アミノ酸番号1〜271）に対する抗体が完全に除去されたことを確認した。
【０１７８】
リン酸化依存型モノクローナル抗tau抗体であるAT8（p-Ser202およびp-Thr205）、AT100（p-Ser212およびp-Thr214）、AT180（p-Thr231）、AT270（p-Thr181）などはエンドゲン社（Endogen）から購入した。リン酸化依存型モノクローナル抗tau抗体であるtau-1（de-p-Ser202およびde-p-Thr205）およびリン酸化依存型モノクローナル抗NF-H抗体RT97をベーリンガー・マンハイム社から購入した。リン酸化依存型モノクローナル抗NF-H抗体SM-31は、スターンバーガー・モノクローナルズ社（Sternberger Monoclonals Inc.）から購入した。モノクローナル抗NF-68抗体、NR4抗体、抗NF-160抗体、NN18抗体、抗NF-200（NF-H）抗体、N52抗体、およびモノクローナル抗FLAGタグ抗体のM2をシグマ社から購入した。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-、ローダミン-、またはCy5-に結合した抗ウサギまたは抗マウスのIgGをベクター社（Vector）から購入した。HRP-結合抗ウサギまたは抗マウスIgGをダコー社（Dako）から購入した。
【０１７９】
apoE発現ベクターの調製−ポリメラーゼ連鎖反応を利用した分子クロニーング法を用いてさまざまなapoE発現ベクターを構築した。野生型または改変型のapoE3またはapoE4をコードするPCR産物を、N末端FLAG融合ペプチドおよびプレプロトリプシンシグナル配列を持つため、発現されたタンパク質の分泌をもたらすpFLAG-CMV-3ベクター（シグマ社）、または、N末端FLAG融合ペプチドは持つが、シグナル配列を持たないため、細胞質内でのタンパク質発現をもたらすpFLAG-CMV-4ベクター（シグマ社）にサブクロニーングした。いくつかの実験では、野生型または改変型のapoE3またはapoE4をコードするPCR産物を、アミノ末端にシグナル配列なしに緑色蛍光タンパク質（GFP）の融合タンパク質をもつため、GFP-apoE融合タンパク質の細胞質内での発現がもたらされるpEGFP-C1ベクター（クローンテック社（Clontech））にサブクロニーングした。全てのベクターで、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）の最初期プロモーターがタンパク質の発現を促進している。本研究で使用されたDNA構築物のすべてとそれらの性質を表1に示した。
【０１８０】
【表１】
本研究で使用されたDNA構築物とそれらの性質
0004399160.tif 000002
【０１８１】
細胞培養−マウス神経芽細胞腫（Neuro-2a）細胞をアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（メリーランド州ロックビル（Rockville, MD））から購入した。Neuro-2a細胞は、非必須アミノ酸、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加した10％FBS含有MEMの中で、加湿した5％CO2インキュベーター中37℃で維持した。
【０１８２】
ヒト奇形癌細胞（NT2）を、5％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むOpti-MEM-I（ギブコ社（GIBCO））の中で維持した。レチノイン酸処理によってNT2細胞を分化させた。簡単に説明すると、NT2細胞を1μMレチノイン酸で週2回インキュベートし、これを4週間続ける。そして、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM高グルコース（DMEM/ＨＧ）の中で細胞を再培養した。1日後、NT2細胞をマトリゲル（Matrigel）でコートした培養皿（コラボレーティブ・リサーチ社（Collaborative Research））上で再培養した。その後2週間、分化したNT2（NT2-N）細胞を、10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、1-β-D-アラビノフラノシルシトシン（1μM）、フルオロデオキシウリジン（10μM）、およびウリジン（10μM）を含むDMEM/HGの中で維持した。その後、5％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むOpti-MEM-Iの中でNT2-N細胞を維持した。
【０１８３】
前述したように、17日齢のマウス胚から皮質ニューロンの一次培養物を調製した。Fiumelliら（1999）Eur. J. Neurosci. 11:1639-1646。簡単に説明すると、切り開いた大脳皮質を2.5％トリプシン溶液に37℃で15分間懸濁し、無カルシウムおよび無マグネシウムのハンクス平衡塩類液（Hank’s balanced salt solution）で3回洗浄してから、ガラスピペットで粉砕して細胞を分離させた。次に、ポリリジン処理した培養皿またはチャンバー・スライド上に2×105/cm2の密度で塗末植菌し、1 mMグルタミン、7.5 mM炭酸水素ナトリウム、5 mM HEPES緩衝液（pH 7.0）、0.1 mg/mlストレプトマイシン、および0.06 mg/mlペニシリンを添加したDME培地の中で細胞を培養した。25μg/mlインシュリン、100μg/mlトランスフェリン、60μMプトレシン、20 nMプロゲステロン、および30 nＭセレン酸ナトリウムを含む、ホルモンと塩の混合液を培養培地に加えた。細胞を、加湿した95％大気および5％CO2の中で37℃に6日間置いた。以前にも報告されているように（NS3307）、6日間インビトロで培養した皮質培養を細胞特異的抗体で免疫染色すると90％よりも高い収率でニューロン特異的なエノラーゼ-免疫反応性細胞が得られる。
【０１８４】
細胞の一過的形質転換−Neuro-2a, NT2-N, または培養マウス一次ニューロンを、表1に列挙してあるよう、さまざまなapoE構築物によってリポフェクタミン法を用いて一時的に形質転換した。簡単に説明すると、2μgのapoE DNAを、N2補助剤を含む、200μlの無血清MEMに7μlのリポフェクタミンを入れたものと室温で30分間インキュベートした。N2補助剤を含む無血清MEMを800μl加えた後、この混合液を無血清MEMで3回洗浄した細胞に加えた。10〜48時間後、形質転換細胞をさまざまな実験に用いた。
【０１８５】
免疫細胞化学法−Neuro-2a細胞を2穴チャンバースライドの中で24時間増殖させてから、上記したとおり、さまざまなapoE3またはapoE4のDNA構築物で一過的に形質転換した。形質転換細胞は、PBSで2回洗浄した後、PBS中3％パラホルムアルデヒドによって室温で30分間固定した後、PBSで2回洗浄してから、トリトンX100で5分間透過処理し、その後PBSで3回洗浄した。
【０１８６】
非特異的反応を阻害するために、すべてのスライドは、2％BSAと、二次抗体の由来源と同一の生物種（ヒツジまたはウサギ）に由来する10％正常血清（ベクター社）とを含むPBSとともに室温で1時間インキュベートした後、2％BSAを含むPBSの中で一次抗体（単一特異性ウサギ抗ヒトapoE、1:500；モノクローナル抗p-tau、1:100〜1:1000、抗p-NF-H、1:100〜1:500）とともに１時間インキュベートした。
【０１８７】
次に、2％BSAを含むPBSでスライドを3回洗浄し、二次抗体（抗原結合抗ヒトapoEを検出するためにはFITC-結合抗ウサギIgG、抗原結合抗-p-tauまたは抗-p-NF-Hを検出するにはローダミンまたはCy5を結合した抗マウスIgG）とともに室温で1時間インキュベートした。2％BSAを含むPBSで3回洗浄した後、免疫蛍光標識したスライドをベクタシールド（VectaShield）(ベクター社)にマウントし、オプティフォト-2（Optiphot-2）顕微鏡（ニコン社（Nikon）、東京）に取り付けたMRC-1024レーザー走査共焦点装置（バイオラド社（Bio-Rad））を用いて観察した。
【０１８８】
二重標識するには（apoEおよびp-tau、p-NF-H、またはFLAGタグ）、FITCおよびCy5またはローダミンというチャンネルを個別に観察し、得られた画像にアドビ・フォトショップ（Adobe Photoshop）（バージョン5.5、アドビシステム社（Adobe System）、カリフォルニア州サンノゼ（San Jose, CA））を用いて緑色（FITC）または赤色（Cy5またはローダミン）で模擬彩色した。
【０１８９】
GFP-apoE DNA構築物で一過的に形質転換した細胞については、3％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで2回洗浄した後、前記したMRC-1024レーザー走査共焦点装置（バイオラド社（Bio-Rad））で緑色蛍光を直接観察した。実験によっては、GFP-apoE断片を発現する、一過的に形質転換されたNeuro-2a細胞を、上記したようにp-tauおよびp-NF-Hについて免疫染色して、apoE断片と、p-tauおよびp-NF-Hが同一部位に局在するのを検出した。
【０１９０】
ストレプトリシン-Oおよびトリトンx-100による細胞の示差的透過処理−いくつかの実験では、細胞内封入体が細胞質に存在するのか、細胞成分オルガネラに存在するのかを判定するため、apoE4またはapoE4（Δ272-299）を発現するNeuro-2a細胞をセラミン処理して、細胞表面に結合したapoEを除去し、3％パラホルムアルデヒドで固定してから、500 U/mlのストレプトリシン-O（STP-O）によって4℃で15分間インキュベートして、細胞成分オルガネラの膜を破壊することなく細胞の原形質膜を透過処理するか、または、0.5％トリトンx-100で処理して、原形質膜と細胞成分膜の両方を透過処理する。そして、上記のようにして抗apoE免疫染色を行なった。
【０１９１】
免疫沈殿およびウエスタンブロッティング−Neuro-2a細胞を6穴プレートまたは15-cmシャーレの中で80％コンフルエントな状態になるまで増殖させた後、上記したようにして、さまざまなapoE DNA構築物で一過的に形質転換した。24時間から48時間後に細胞を回収し、氷冷したリーシス緩衝液中に30分間置いて細胞溶解させた。核を除去するために遠心した（13,000 rpmで15分間）後、上清中のapoEを単一特異性ウサギ抗ヒトapoE抗体およびプロテインAアガロースビーズで免疫沈殿した。免疫沈殿物をリーシス緩衝液で2回、PBSで3回洗浄した。免疫沈殿物の中にapoE、p-tau、またはp-NF-Hが存在しているかを、対応する抗体を用いてウエスタンブロッティングによって解析した。または、細胞溶解液の上清をモノクローナル抗p-tauまたは抗p-NF-H抗体で免疫沈殿してから、抗apoEウエスタンブロッティングによりapoEの存在を解析した。
【０１９２】
いくつかの実験について、正常な個体またはアルツハイマー病患者からの脳組織を、氷冷したリーシス緩衝液I（50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% ノニデットP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤の混合液）の中でホモジナイズした。4℃、14,000 rpmで30分間遠心して、可溶化タンパク質（上清）を得た後、沈殿物を氷冷リーシス緩衝液II（50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 4% SDS, 1% ノニデットP-40、1% デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤の混合液）の中でさらにホモジナイズした。上清も可溶化した沈殿物もSDS-PAGEを行って、上記したようにウエスタンブロットで解析した。
【０１９３】
電子顕微鏡解析−GFPまたはapoE4（Δ272-299）をコードするDNA構築物で一過的に形質転換したNeuro-2a細胞を、0.05％トリプシンおよび0.05 mM EDTAを用いて、プレートから取り出した。蛍光細胞分析分離装置（FACS）によってGFP陽性の細胞を選別し、遠心分離によって沈殿させた。そして、0.1 Mカコジル酸緩衝液中2.5％グルタルアルデヒドによって細胞を1時間固定し、2％ OsO4の中で1時間再固定した。細胞を脱水し、エポン（Epon）812に包埋し、ライヘルト・ウルトラカットE（Reichert Ultracut E）を用いて切片（80 nm）を作製し、さらに、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。そして、ジオル（JEOL）CCX-100II電子顕微鏡を用いて細胞を撮影した。
【０１９４】
結果
apoE4の発現は、Neuro-2a細胞において細胞内封入体の形成を誘導する。
NFT形成におけるapoEの役割を評価するために、apoE3またはapoE4のcDNA構築物（表1）によって一過的に形質転換したマウス神経芽細胞腫細胞（Neuro-2a）におけるapoE3またはapoE4とtauタンパク質との相互作用を調べた。apoE4を発現するNeuro-2a細胞をポリクローナル抗apoE抗体とモノクローナル抗p-tau抗体で二重免疫染色したところ、apoEおよびp-tauの免疫反応性細胞内封入体はどちらも形質転換された細胞の成分内にあることが明らかになった。また、これらの細胞内封入体は、p-NF-Hに対するモノクローナル抗体によっても認識された。アルカリホスファターゼ処理によって、細胞内封入体におけるtauまたはNF-Hのリン酸化が確認され、それによって、抗p-tauまたは抗p-FN-Ｈの免疫染色は無効になった。これらの結果は、apoE、p-tauおよびp-NF-Hを含む複合体が少数のapoE4形質転換細胞の中に存在することを示唆している。しかし、apoE3を発現するNeuro-2a細胞を免疫染色しても、細胞内封入体の形成は明らかでなかった。
【０１９５】
アミロイド-ベータ（Aβ）および小胞体（ER）ストレスは、apoE4を発現するNeuro-2aにおける細胞内封入体の形成を増加させる。
Aβ沈着がアルツハイマー病患者の脳内における主要な病態学的要素であるため、本発明者らは、apoEを発現するNeuro-2aにおけるapoEおよびp-tauの免疫反応性細胞内封入体の形成に対するAβ処理の効果を測定した。結果を図1に示す。Aβ1-42処理によって、封入体陽性apoE4を発現する細胞の数は2.7±1.2％から6.7±1.5％（P<0.001）に、apoE3を発現する細胞の数は0％から2.8±0.6％（P<0.001）に明らかに増加した。これらの結果は、Aβ1-42が、apoEを発現するNeuro-2aにおける細胞内封入体の形成を増強することを示唆している。
【０１９６】
細胞をAβ処理するとERストレスを生じることがある（TN98）ため、ブレフェルジン（Brefeldin）A（BfA）やツニカマイシン（tunicamycin）(TN98)などの他のERストレス誘導物質を用いて、ERストレスがapoEで形質転換されたNeuro-2a細胞において細胞内封入体の形成を増加させることができるかを判定した。BfAまたはツニカマイシンでインキュベートすると、封入体陽性細胞が、apoE4発現細胞では2.7±1.2％から7.2±2.1％（P<0.001）に、apoE3発現細胞では0％から3.2±1.1％（P<0.001）に増加した。
【０１９７】
apoEが直接的にp-tauおよびp-NF-Hと相互作用するか否かを調べるために、Aβ1-42またはBfAで処理した、apoE4により形質転換されたNeuro-2a細胞の細胞溶解液に対して共免疫沈殿実験を行なった。抗p-tauを用いた免疫沈殿によって、ウエスタンブロット上で抗p-tau抗体によって検出されるバンドが2〜3本（分子量50〜60 Kd）存在することが明らかになった。さらに、この複合体において、p-NF-H（分子量〜200 Kd）も検出された。しかし、抗apoEウエスタンブロッティングでは、完全長のapoEは明らかにならず、より分子量の低いバンド（34 Kdではなく〜30 Kd）が明らかになった。これらの結果、Neuro-2a細胞の細胞内封入体がp-tauおよびp-NF-Hよりなることが確認され、また、この複合体中のapoE4は、全長apoEよりも10〜15％小さい分子量をもつ切断型であることが実証された。
【０１９８】
カルボキシル末端側切断型apoEは、Neuro-2aにおける細胞内封入体の形成を誘導する。
apoEのアミノ末端側とカルボキシル末端側のどちらが細胞内封入体の形成を誘導することができるのかを判定するために、Neuro-2a細胞を、apoEのアミノ末端切断型またはカルボキシル末端切断型を有する構築物で形質転換した。apoE4のアミノ末端側アミノ酸を最大28個まで（〜10％）欠失させたところ、細胞内封入体の形成は起きなかった。しかし、カルボキシル末端側アミノ酸を28個（〜10％）欠失させると、apoE3（Δ272-299）またはapoE4（Δ272-299）で形質転換された細胞のそれぞれ32±5％または78±8％が細胞内フィラメント状封入体の存在を示した。apoE4（Δ272-299）で形質転換したNeuro-2a細胞における細胞内封入体は抗-apoE、抗-p-tau、および抗-p-NF-Hと免疫反応性であった。抗-apoEおよび抗-p-tauについて示されたように、封入体の免疫反応性は完全に併合しており、apoEとp-tauが同一場所に局在することを示している。apoE3（Δ272-299）によって誘導される細胞内封入体も同様であるが、より小さく、ずっと少ない数の細胞でしか見られなかった。これらの結果は、カルボキシル末端側切断型apoE、特にapoE4（Δ272-299）が、細胞質にあるp-tauおよびp-NF-Hと相互作用して、Neuro-2a細胞における細胞内封入体の形成を誘導することを示唆している。
【０１９９】
apoE4（Δ272-299）で形質転換したNeuro-2a細胞を示差的透過処理し、その後、抗apoE免疫蛍光染色によって、封入体の局在をより正確に確認した。細胞成分オルガネラ膜を透過させることなく原形質膜を透過させるストレプトリシン-O（STP-O）処理は、apoE4で形質転換したNeuro-2a細胞における抗apoE免疫反応性を有意にもたらすことはなかったが、apoE4（Δ272-299）で形質転換した細胞における細胞内封入体の強度の抗apoE免疫反応性をもたらした。このことは、封入体が細胞質に分布していることを示唆している。しかしながら、トリトンX-100処理によって原形質膜と細胞成分オルガネラ膜の両方を透過処理すると、apoE4およびapoE4（Δ272-299）で形質転換した両方の細胞において強度の抗apoE免疫反応性がもたらされた。総合すれば、これらの結果は、細胞内封入体が細胞質に分布していることを示しており、また、小胞体（ER）で合成されたapoE4（Δ272-299）が分泌経路を逃れて細胞質に入り込むために、細胞質にあるp-tauおよびp-NF-Hとの相互作用が生じることを示唆している。または、分泌されたapoE4（Δ272-299）が再吸収され、エンドソーム-リソソーム経路を逃れて細胞質に入り込む。第一の可能性を支持する根拠は、apoE4（Δ272-299）で形質転換された細胞では、apoE mRNAレベルがapoE4細胞と同じであるにもかかわらず、培地に分泌されるapoEがずっと少なかったという観察結果に基づく。
【０２００】
細胞質apoE（Δ272-299）はNeuro-2a細胞において細胞内封入体の形成を誘導する。
次に、本発明者らは、Neuro-2a細胞の細胞質でapoE（Δ272-299）を直接に発現させると、大量の細胞内封入体の形成を誘導するか否かを調べた。シグナルペプチドをコードする配列を持たないGFP- apoE3（Δ272-299）またはGFP- apoE4（Δ272-299）のDNA構築物でNeuro-2a細胞を形質転換した。緑色蛍光タンパク質（GFP）をapoEのN-末端に融合して細胞内分布を観察した。apoEは培地内に分泌されなかった。Neuro-2a細胞を一過的に形質転換すると、GFPだけが細胞全体に非常に拡散して分布した。一方、GFP- apoE4（Δ272-299）を細胞質で発現させると、細胞体の中で大量の細胞内フィラメント状封入体が形成され、そのうちの一部が神経突起の中にまで伸長したのに対して、GFP- apoE3（Δ272-299）は、GFP- apoE4（Δ272-299）に較べると、Neuro-2a細胞において細胞内封入体の形成を誘導することができなかった。
【０２０１】
これに対して、GFP- apoE3（全長）は、点状または小胞状の分布パターンを示しながら、細胞質の核の周囲、および神経突起に分布していた。他方、GFP- apoE4（全長）の分布はGFP- apoE3に較べれば点状ではなかった。神経原線維変化様封入体を含む細胞の割合は、図2に示すように、GFP- apoE3（Δ272-299）で形質転換された細胞では、GFP- apoE4（Δ272-299）で形質転換された細胞に較べて低かった。これらの結果は、apoEのカルボキシ末端側28アミノ酸が、apoEがp-tauおよびp-NF-Hと相互作用するのを防いでおり、それによって、細胞内封入体の形成が防止される。
【０２０２】
apoE4（Δ272-299）を発現するNeuro-2a細胞において形成される細胞内封入体は、ヒトアルツハイマー病の脳で見られる神経原線維変化に類似した超構造的および生化学的特徴を有する。
細胞質GFP-apoE4（Δ272-299）を発現するNeuro-2a細胞において形成される細胞内封入体の超構造および組成を決定した。超構造分析については、電子顕微鏡によって、GFP-apoE4（Δ272-299）を発現するNeuro-2a細胞において形成されるフィラメント状の集合体が明らかになったが、これらはGFPだけを発現する細胞では見られなかった。フィラメントは勝手な方向を向いており、膜には結合していなかった。高倍率にしたところ、封入体は、直径10〜20 nmの多数の直線状フィラメントで構成されていることが明らかになったが、これらはアルツハイマー病の脳に見られる濃縮体のあるものに似ている。また、GFP-apoE4（Δ272-299）を発現する細胞も、高電子密度の膜結合したオルガネラを示し、変性したオルガネラを連想させた。
【０２０３】
細胞内封入体の組成の特徴をより詳しく調べるために、2組のモノクローナル抗体を用いた（表2）。すなわち、tauタンパク質のさまざまな位置にあるリン酸化されたセリンまたはスレオニン残基を認識する抗-p-tau抗体（AT8, AT100, AT180, AT270,およびtau-2）、および、非リン酸化tauタンパク質を認識するtau-1、ならびに、リン酸化されたNF-Hを認識する抗神経フィラメント抗体RT97およびN14、および非リン酸化NF-Hを認識するN52を用いた。
【０２０４】
【表２】
NFT様構造体とp-tauまたはp-NF-Hに対するさまざまなモノクローナル抗体との免疫反応性
0004399160.tif 000003
＊ヒトtauまたはNF-Hの残基またはモチーフ
【０２０５】
アルツハイマー病患者の脳における濃縮体がp-tauおよびp-NF-Hの両方を含んでいることが報告されている。GFP-apoE4（Δ272-299）を発現するNeuro-2a細胞を免疫蛍光染色したところ、ヒトアルツハイマー病脳における対らせん状フィラメント（PHF）中のp-tauを認識するモノクローナル抗体のすべてではないが、それらの一部に対して封入体が陽性を示すことが明らかになり（表2）、tauタンパク質のすべてではないが、その一部が、Neuro-2a細胞中の細胞内封入体においてリン酸化されていることが示唆された。抗-p-NF-H抗体であるRT97で免疫染色したところ、細胞内封入体にはp-NF-Hも含まれていることが明らかになった。
【０２０６】
p-tauおよびp-NF-Hの存在を確認するために、apoE4（Δ272-299）で形質転換されたNeuro-2a細胞から得られた封入体を含む細胞溶解物を抗-apoE抗体で免疫沈殿した。そして、抗-p-tau抗体によるウエスタンブロッティングによって、p-tauタンパク質である、分子量40〜60 Kdのタンパク質の存在が明らかになった。同様に、抗-p-NF-H抗体（RT97）によるウエスタンブロッティングによって、分子量200 Kdをもつp-NF-Hの存在が明らかになった。分子量40〜60 Kdで、tauアイソフォームの特徴をもつ別のバンドもモノクローナル抗体RT97によって認識された。モノクローナル抗体RT97はリン酸化されたtauと交差反応することが報告されているため、これらのバンドはp-tauタンパク質である可能性がある。
【０２０７】
一方、apoE4（Δ272-299）で形質転換された細胞溶解物を、p-tauまたはp-NF-Hに対するモノクローナル抗体で免疫沈殿させると、抗-apoEによるウエスタンブロッティングは、〜30 KDの分子量をもつバンド、すなわちapoE4（Δ272-299）が存在することを明らかにした。総合すると、これらの結果は、apoE4（Δ272-299）がp-tauおよびp-NF-Hと複合体を形成して、Neuro-2a細胞の中で細胞内封入体を形成することを示唆している。これらの細胞内封入体は、ヒトアルツハイマー病の脳で見られる神経原線維変化（NFT）に類似した超構造的および生化学的特徴もつ。
【０２０８】
apoEの244〜260番目のアミノ酸は、p-tauおよびp-NF-Hと相互作用して、Neuro-2a細胞の中でNFT様構造体を形成する。
p-tauおよびp-NF-Hと直接に相互作用してNFT様構造体を形成するapoEの領域を決定するために、GFP-apoE4（Δ272-299） DNA構築物（シグナルペプチドなし）に対するカルボキシ末端側切断物の別のシリーズを調製して、Neuro-2a細胞を形質転換した。切断部位を図3Aに示す。結果を図3Bに示す。アミノ酸番号260で切断したもの（apoE4（Δ261-299）は、カルボキシル末端側切断型apoE4がNFT様構造体の形成を誘導する能力を変えることはなかったが、一方、アミノ酸番号252で切断したもの（apoE4（Δ252-299）は、細胞内NFT様構造体の形成を僅かに低下させた。しかし、アミノ酸番号244で切断したもの（apoE4（Δ244-299）は、細胞内NFT様構造体を形成しなくなった。このことは、244〜260番目の領域に、p-tauおよびp-NF-Hと結合してNeuro-2a細胞においてNFT様構造体を形成するのに関与する重要な残基が存在することを示唆している。
【０２０９】
この観察結果を確認するために、apoEの38アミノ酸のみ（アミノ酸番号233〜271）（シグナルペプチドなし）をコードするGFP-apoE（Δ1〜232、Δ272-299）DNA構築物をNeuro-2a細胞に形質転換した。結果は図3Bに示す。apoE（Δ1〜232、Δ272-299）は、Neuro-2a細胞においてNFT様構造体の形成を誘導した。ただし、GFP-apoE4（Δ272-299）で形質転換された細胞と比較すると、これらの構築物はずっと小さくて、幾分少ない形質転換細胞の中で生じた。このように、これらの結果は、apoEの244〜260番目のアミノ酸がNeuro-2a細胞においてNFT様構造体の形成を誘導するのに必要であり、また、apoEのアミノ末端側ドメインがNFT様構造体の形成程度に影響を与えるという結論を支持している。
【０２１０】
apoEのアミノ末端側ドメインは、カルボキシル末端側切断型apoEがNFT様構造体を形成する能力を変更する。
244〜260番目のアミノ酸配列はapoE3とapoE4で同一であるため、なぜapoE4（Δ272-299）の方がapoE3（Δ272-299）よりもNFT様構造体を形成する能力が高いのかという疑問が生じる。apoEのアミノ末端側ドメインが、NFT様構造体の形成を誘導する244〜260番目のアミノ酸の能力を変更することができるか否かを判定するために、図3Aに示すように、GFP-apoE4（Δ272-299）DNA構築物の一連のアミノ末端側切断物を作製した。結果を図3Cに示す。最初の20アミノ酸（Δ1〜20、Δ272-299）、最初のα-ヘリックス（Δ1〜45、Δ272-299）、および二番目のα-ヘリックス（Δ1〜84、Δ272-299）を切断しても、GFP-apoE4（Δ272-299）がNeuro-2a細胞においてNFT様構造体の形成を誘導する能力に変更を与えなかった。しかし、三番目のα-ヘリックス（Δ1〜126、Δ272-299）を除去すると、NFT様構造体の形成を誘導するGFP-apoE4（Δ272-299）の能力を劇的に低下させた。四番目のα-ヘリックス（Δ1〜170、Δ272-299）を切断しても、NFT様構造体の形成をそれ以上低下させることはなかった。これらの結果は、apoE3ではシステイン、apoE4ではアルギニンである第112位のアミノ酸を含む、三番目のα-ヘリックス（アミノ酸番号85〜126）中の配列が、NFT様構造体の形成を誘導するapoE4（Δ272-299）の能力を変更することを示唆している。
【０２１１】
apoE4（Δ272-299）によって誘導されるNFT様構造体の形成はニューロンに特異的である。
apoE4（Δ272-299）によって誘導されるNFT様構造体の形成がニューロンに特異的であるか否かを判定するために、本発明者らは、初代培養マウス胚脳ニューロン、および分化したヒト奇形癌NT2細胞（NT2-N）という、さらに2種類の神経細胞、および、4種類の非神経細胞をGFP-apoE4（Δ272-299）（シグナルペプチドなし）で形質転換した（表3）。
【０２１２】
【表３】
GFP-apoE4（Δ272-299）によって誘導されるNFT様構造体のニューロン特異的形成
0004399160.tif 000004
NFT様構造体は、実験手順に記載されたように、抗apoEおよび抗p-tau二重免疫蛍光染色によって測定した。
【０２１３】
上記表3に示されているように、細胞質におけるGFP-apoE4（Δ272-299）の発現は、神経細胞においてNFT様構造体の形成を誘導したが、非神経細胞においては誘導しなかった。これらの結果は、apoE4（Δ272-299）によって誘導されるNFT様構造体の形成はニューロン特異的であり、これは、tauおよびNF-Hの発現がニューロン特異的であることと一致している。
【０２１４】
内部移行した外来性apoE4（Δ272-299）は、Neuro-2a細胞におけるNFT様構造体の形成を誘導することができる。
ヒトニューロンはapoEを産生することができるが、ヒトの脳において、apoEは、主に星状細胞によって合成および分泌される。分泌されたapoEはニューロンによって内部移行しうる。内部移行したapoE4（Δ272-299）が、ニューロンにおいてNFT様構造体の形成を誘導することができるか否かを判定するために、Neuro-2a細胞を、脂質輸送用媒体β-VLDLと複合体を形成している組換えapoE4（Δ272-299）とともにインキュベートした。30時間インキュベートした後、細胞における神経突起の成長とNFT様構造体の形成を測定した。脂質輸送用媒体のみと30時間インキュベートしたNeuro-2a細胞は、神経突起の成長を示した。しかし、外来性apoE4（Δ272-299）とインキュベートした細胞は細胞の形態を変えたが、神経突起の成長は示さなかった。このことは、内部移行したapoE4（Δ272-299）が、細胞骨格の構造と機能を損なう可能性を示唆している。抗apoE免疫蛍光染色によって、外来性apoE4（Δ272-299）とインキュベートしたNeuro-2a細胞においてNFT様構造体が形成されることが明らかになった。こららの構造体は、細胞質でGFP-apoE4（Δ272-299）を発現するNeuro-2a細胞の中で形成される濃縮体様構造と一致していた。したがって、内部移行したapoE4（Δ272-299）は、エンドソーム-リソソーム経路を逃れて、細胞質のp-tauおよびp-NF-Hと相互作用することができる。
【０２１５】
カルボキシル末端側切断型apoEはニューロンの内部で生成されうる。
カルボキシル末端側切断型apoEがニューロンの内部で自然に生成されるか否かを判定するために、Neuro-2a細胞を全長apoE3またはapoE4（シグナルペプチドなし）で形質転換するか、または、Neuro-2a細胞を外来性の全長apoE3またはapoE4とともにインキュベートした。細胞を溶解させてから、細胞内apoEを単一特異的抗apoE抗体で免疫沈殿させた。抗apoEウエスタンブロッティングによって、全長apoEのバンドと、それよりも小さな分子量、apoE（Δ272-299）と同じ分子量（〜30 Kd）のバンドの存在が明らかになった。apoE3よりもapoE4からより多くの断片が生じた。アミノ末端側15アミノ酸を認識するモノクローナル抗体6C5によって検出すると、分子量の低い方のバンドはカルボキシル末端側切断型apoEを表していた。したがって、短い方の断片は、約270アミノ酸からなるカルボキシル末端側切断型apoEである。この結論は、形質転換した、アミノ末端FLAGタグとともにapoE4を発現するNeuro-2a細胞において確認された。抗FLAG抗体も、分子量〜30 Kdのタンパク質バンドを認識した。
【０２１６】
Aβ1-42は、apoE4を発現するNeuro-2a細胞において細胞内封入体が形成されるのを増加したため、本発明者らは、次に、形質転換細胞をAβで処理すると、カルボキシル末端側切断型apoEが生成されるのを促進するか否かを判定した。apoE3またはapoE4を発現するNeuro-2a細胞をAβ1-42とインキュベートした後、細胞内apoEを免疫沈殿し、抗apoEウエスタンブロッティングによって検出した。形質転換細胞をAβ1-42で処理すると、apoE3およびapoE4とも、カルボキシル末端側切断型の量が有意に増加したが、apoE4の方がより多く増加した。同様の結果が、外来のapoE3またはapoE4を、Aβ1-42存在下でNeuro-2a細胞とインキュベートしたときにも得られた。これらの結果は、Aβ1-42が、apoE、特にapoE4を、そのカルボキシル末端で切断する未知のタンパク質分解性酵素を活性化して、生物活性のある切断型を生成させうることを示唆している。
【０２１７】
カルボキシル末端側切断型apoEはアルツハイマー病患者の脳で見られる。
カルボキシル末端側切断型apoEをヒトの脳においてインビボで生成することができるか否かを判定するために、本発明者らは、全長apoEまたはapoEのカルボキシル末端部位（アミノ酸番号272〜299）に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、正常者またはアルツハイマー病患者の脳溶解物におけるapoEを解析した。結果を図4A〜Eに示す。
【０２１８】
ポリクローナル抗apoEによって、全長apoEは、正常者またはアルツハイマー病患者から得た脳溶解物の上清および沈殿の両方に存在することが明らかになった。分子量〜29 KdのapoE断片も、正常者およびアルツハイマー病患者の脳から得た上清においてポリクローナル抗apoEによって認識されたが、アルツハイマー病患者の脳の方がより程度が高かった。29 KdのapoE断片は、アルツハイマー病脳の沈殿物中にも見られたが、正常者の脳の沈殿物には見られなかった。さらに、分子量〜14〜19 Kdのより短い断片は、アルツハイマー病脳の上清および沈殿物の両方で見られたが、正常脳では見られなかった。
【０２１９】
しかし、apoEのカルボキシル末端部位（アミノ酸番号272〜299）に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングは、全長apoEが存在するのを明らかにしたのみで、上清および沈殿物の両方でapoE断片が存在することを明らかにすることはできなかった。このことは、それらの断片がカルボキシル末端側切断型apoEであることを示唆している。また、抗全長apoEおよび抗p-tauによって、アルツハイマー病脳の沈殿物において大きな複合体（220 Kdよりも大きな分子量）が検出されたが、抗カルボキシル末端apoEによっては検出されなかった。このことは、これら大きな複合体がカルボキシル末端側切断型apoEとp-tauを含んでいることを示唆している。総合すると、これらの結果は、アルツハイマー病脳において、カルボキシル末端側切断型apoEが、正常脳におけるよりもずっと高い程度生成され、それらの大部分が不溶性型で存在し、おそらくp-tauと複合体を形成することを示唆している。
【０２２０】
実施例２：apoE3またはapoE4を特にCNSニューロンで発現するトランスジェニックマウスの解析
トランスジェニックマウスの作製
apoE3またはapoE4を特に中枢神経系（CNS）のニューロンで発現するトランスジェニックマウスは、以前報告したように（Raber J. ら、Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 1998, 95:10914-10919; Muttini M.ら、J. Neurosci. 1999, 19:4867-4880）、グラッドストーン研究所（Gladstone Institutes）で作製された。apoE導入遺伝子の発現は、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーターによって促進した。導入遺伝子の脳内での発現レベルが同程度であるNSE-apoE3系統およびNSE-apoE4系統を選抜して、ジャクソン研究所（Jackson Laboratories）（メイン州バーハーバー（Bar Harbor, ME））から入手したapoE-/-マウス（C57BL/6J-apoEtmlUnc）と交配させた。得られた子孫の間で2世代交配させて野生型apoE対立遺伝子を消失させた後、トランスジェニックマウスをさらにapoE-/-マウスと交配して、C57BL/6Jの遺伝的背景を少なくとも95％もつNSE-apoE3マウスおよびNSE-apoE4マウスを作出した。NSE-apoE3またはNSE-apoE4をジャクソン研究所から入手したC57BL/6J-apoetmlUncマウスと交配させるとapoE-/-同腹子も得られたので、対照として使用した。
【０２２１】
トランスジェニックマウスの遺伝子型判定
ヒトapoEに対するDNAプローブを用いたゲノムテールDNAをサザンブロット解析法によってNSE-apoE3またはNSE-apoE4を遺伝子導入したマウスを同定した。NSE-apoE3マウスおよびNSE-apoE4マウスをPCRによって識別した。ヒトapoEの第3イントロンはNSE-apoE4構築物に含まれるが、NSE-apoE3構築物には含まれないため、第3イントロンにかかるプライマー（フォワードプライマー：ヌクレオチド番号3158〜3175；リバースプライマー：ヌクレオチド番号3815〜3834、Genbankアクセッション番号M10065）によって生成されるアンプリコンは、NSE-apoE4マウスでは670塩基対（bp）、NSE-apoE3マウスでは100 bpであった。プロテイナーゼKで消化した尻尾の組織（1:100希釈、2μl）に対し、各プライマー（0.2μM）、dNTPs（それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP）、および0.15μlのAmpliTaq GoldR DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー社製（Perkin-Elmer）、コネティカット州ノーウォーク（Norwalk, CT））を用いて全反応用量25μlでタッチダウンPCRを行なった。反応は、ジーンアンプPCR装置9600サーモサイクラー（GeneAmp PCR System 9600 thermocycler）(パーキン・エルマー社製)上で行なった。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物を1.5％アガロースゲル上で解析した。
【０２２２】
NSE-apoE4トランスジェニックマウスの脳におけるC末端側切断型apoE4の年齢依存的蓄積
メスのNSE-apoE4マウスだけが、6月齢を過ぎた後神経変性表現型を示すため（Raber J.ら、（1998）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10914-10919、Muttini M.ら、（1999）J. Neurosci. 19:4867-4880）、本発明者らは、C末端側切断型apoE4がこれらのマウスに存在しうるか否かを判定した。抗全長apoE免疫ブロットによって、分子量14〜20 kDaのC末端側切断型apoE断片が7月齢のNSE-apoE4マウスの脳溶解物で顕著に蓄積するが、同月齢のNSE-apoE3マウスの脳溶解物には蓄積しないことが明らかになった。NSE-apoE4マウスの脳の上清画分と可溶化した沈殿物画分の両方でC末端側切断型apoE4断片が年齢に応じて蓄積した。図5に示すように、老齢のNSE-apoE3マウスの脳ではずっと少ない量のC末端側切断型apoE3断片が存在した。これらの結果は、ヒトAD脳におけると同様、NSE-apoE4マウスの脳においてもC末端側切断型apoE4断片が年齢依存的に直積したことを示していた。
【０２２３】
NSE-apoE4トランスジェニックマウスの脳におけるp-tauの年齢依存的蓄積
抗-p-tau（AT8）免疫ブロットによって、9月齢になるまでの年齢では、NSE-apoE4マウスの脳溶解物の上清画分と沈殿物画分の両方において可溶性p-tau（〜50〜60 kDa）が蓄積するが、NSE-apoE3マウスでは蓄積しないことが明らかになった。可溶性p-tau（〜50〜60 kDa）の量は、18月齢のNSE-apoE4マウス脳溶解物の上清において減少したが、同年齢のNSE-apoE4マウス脳溶解物の上清においては増加した。しかし、図6に示すように、18月齢のNSE-apoE4マウスの脳溶解物の沈殿物において不溶性p-tau（>200 kDa）が劇的に蓄積した。不溶性p-tau（>200 kDa）は、18月齢のNSE-apoE3マウスの脳溶解物の沈殿物においても増加したが、同年齢のNSE-apoE4マウスと比較するとずっと低い程度までであった。このように、NSE-apoE4トランスジェニックマウスの脳において、不溶性p-tauと可溶性p-tauがともに年齢依存的に蓄積したが、この結果は、ヒトAD脳で得られた観察結果と同じであった。
【０２２４】
NSE-apoE4トランスジェニックマウスの海馬におけるp-tau（AT8）陽性細胞内封入体の出現
NFTにおけるtauのリン酸化したser202残基とser205残基を認識するモノクローナル抗体AT8で脳切片を免疫染色したところ、NSE-apoE4マウスの海馬におけるCA3領域と歯状回門に神経細胞内封入体が存在することが明らかになった。これらのp-tau陽性神経細胞内封入体は、C末端側切断型のapoEも含んでいた。図7に示すように、NSE-apoE3マウスの海馬では、ずっと少ないp-tau陽性神経細胞内封入体が見られた。したがって、C末端側切断型のapoEは、tauのリン酸化を促進し、NSE-apoE4マウスにおいてp-tau陽性神経細胞内封入体を誘導することができる。
【０２２５】
マウス脳溶解物におけるapoE切断酵素の存在
NSE-apoE4トランスジェニックマウスの脳にC末端側切断型のapoE4が蓄積することは、マウス脳の中にapoE4を優先的に切断するapoE切断酵素が存在することを示唆している。この仮説を調べるために、精製したヒトapoE3またはapoE4をapoEノックアウトマウスの脳溶解物と37℃で3時間インキュベートして、抗apoEウエスタンブロットによってapoEのタンパク質分解を解析した。抗apoEは、全長apoE、28〜30 kDaのapoE断片、および14〜20 kDaの断片が存在し、apoE3よりもapoE4からずっと多くの断片が生成されることを明らかにした。抗C末端側apoEウエスタンブロットは、これらの断片がC末端側切断型apoEであることを示した。これらの結果は、apoEを切断して、ヒトAD脳およびNSE-apoE4トランスジェニックマウスにおいてみられる断片と同じC末端側切断断片を生成する酵素がマウスの脳に存在することを示唆している。これらの結果は、apoE4がタンパク質分解による切断により感受性が強う遺伝子ことも示唆している。
【０２２６】
実施例３：apoE切断酵素の特徴づけ
apoE切断酵素はセリンプロテアーゼである。
推定apoE切断酵素の生化学的性質を決定するために、本発明者らは、4つの主な分類に属するにプロテアーゼ、すなわちセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼに対するさまざまな既知のインヒビターの効果を調べた。EDTAとEGTAはどちらもapoE4の切断を阻害しなかったが、このことは、この酵素がメタロプロテアーゼであることを示唆している。同様に、ペプスタイン（pepstain）およびインドアセチミド（Indoacetimide）、またはE-64もapoE4の切断を阻害しなかった。このことは、この酵素がアスパラギン酸プロテアーゼでもシステインプロテアーゼでもないことを示している。PMSFは切断活性を完全に奪うが。このことは、この酵素がセリンプロテアーゼであることを示唆している。この結論と整合して、PMSFを含む完全なインヒビターの混合液もapoE4の切断を有意に阻害した。
【０２２７】
apoE切断酵素はキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。
セリンプロテアーゼは、塩基性残基（すなわちArgまたはLys）のカルボキシル側基で切断するトリプシン様セリンプロテアーゼ、芳香族側鎖（すなわち、PheまたはTrp）のカルボキシル側基で切断するキモトリプシン様セリンプロテアーゼ、より長い側鎖をもつ疎水基（すなわちMet）のカルボキシル側基で切断するキモトリプシン様セリンプロテアーゼ、および疎水基（すなわちAlaまたはVal）のカルボキシル側基で切断するエラスターゼ様セリンプロテアーゼという4つのグループに分類することができる。apoE切断酵素の特異性を調べるために、本発明者らは、それぞれ、トリプシン様、キモトリプシン様、およびエラスターゼ様のセリンプロテアーゼの基質となる可能性のある、C末端にArg/Lys、Phe、またはVal/Alaをもつ多数のトリペプチドまたはテトラペプチドを、粗精製したapoE切断酵素とインキュベートした。
【０２２８】
切断活性を観察するために、発色団（p-ニトロアニリド（p-nitroanilide））をC末端の最後のカルボキシル測基を付加した。酵素が、最後のアミノ酸とp-ニトロアニリドとの間の結合を切断したら、解離したp-ニトロアニリドによって黄色を発色し、分光光度計によって約390〜410 nmのところで観察することができる。図8は、これらのペプチド基質から得られた典型的な結果を示している。
【０２２９】
これらの結果は、推定apoE切断酵素が芳香族側鎖（フェニルアラニン、Phe）のカルボキシル側基、およびより長い側鎖をもつ疎水基（ロイシン、Leu；メチオニン、Met）のカルボキシル側基で切断するため、この酵素はキモトリプシン様セリンプロテアーゼであることを示している。重要なのは、P2位にあるプロリンと、P3およびP4位にある2つの疎水性アミノ酸（アラニン、Alaなど）が、切断の効率を決定する上で非常に重要だということである。総合すると、推定apoE切断酵素はキモトリプシン様セリンプロテアーゼで、基質ペプチドまたはタンパク質中にあるAla-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Pro-Met（配列番号：2）、Ala-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）というモチーフ、またはこれらの類似配列を認識する。Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリドを基質として用いて、apoE切断活性を阻害する薬剤、作用薬、または化合物をスクリーニングするための大量高速処理方として発色アッセイ法を用いることができる。約390〜410 nmで分光光度測定法によってパラ-ニトロアニリドを検出する。
【０２３０】
Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：4）、およびAla-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）はapoE切断酵素のペプチドインヒビターである。
1 mMのAla-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリドを基質として用いる発色アッセイ法を用いて、本発明者らは、apoE切断酵素の活性を阻害するために多くのペプチドをスクリーニングした。図9に示したように、6 mMのAla-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）、Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Phe（配列番号：4）、およびAla-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）というペプチドが、20時間インキュベートしたところでapoE切断酵素の活性を、それぞれ67％、58％、および56％阻害した。興味深いことに、7μMのapoE4がapoE切断酵素の活性を89％阻害した。
【０２３１】
ペプチドAla-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）とAla-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）を、さらにapoE切断の阻害について試験した。ペプチド（1 mM）を4μgのapoE4とともに３時間37℃にて部分的に精製したapoE切断酵素の存在下でインキュベートした後、抗apoEウェスタンブロットにより、両ペプチドによりapoE切断が有意に阻害されることが明らかになった。このように、ペプチドAla-Ala-Pro-Phe（配列番号：1）とAla-Ala-Pro-Leu（配列番号：3）はともに、apoE切断酵素のペプチドインヒビターとして使用することができる。
【０２３２】
上記実施例から、本発明が、カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチド、カルボキシル末端側切断型apoEを誘導する宿主細胞、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を抑制する化合物を同定するためにカルボキシル末端側切断型apoEトランスジェニック動物モデルを使用する方法、および、apoEの形成を阻害する化合物を提供していることは明らかである。カルボキシル末端側切断型apoEポリペプチドは、カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよびp-NF-H apoEと相互作用するのを阻害する化合物を選抜するスクリーニング法に使用するための、apoEを含む宿主細胞を作製する上で有用である。カルボキシル末端側切断型apoEがp-tauおよびp-NF-H apoEと相互作用するのを阻害する化合物、および、カルボキシル末端側切断型apoEの形成を抑制する化合物は、神経原線維変化の形成を抑制し、したがって、アルツハイマー病、およびそれに関連した疾患など、神経原線維変化の形成に関連した疾患を治療するのに有用である。
【０２３３】
本発明を具体的態様を参照しつつ説明したが、当業者は、この発明の真の精神と範囲に反することなく種々に変更を加えたり、同等物と置き換えることができる。さらに、本発明の目的、精神、および範囲に適合するよう、特定の状況、材料、物質組成、方法、または工程に種々の変更を加えることができるものである。そのような変更はすべて、本明細書に添付した請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  apoEを産生するNeuro-2A細胞における細胞内封入体形成に対するAβ1-42の効果を示すグラフである。
【図２】  神経原線維変化を含むGFP-apoE3(Δ272-299)形質転換細胞およびGFP-apoE4(Δ272-299)形質転換細胞の割合を示すグラフである。
【図３Ａ〜Ｃ】  apoEの構造（図3A）、p-tauおよびp-NF-Hと相互作用するapoEのアミノ酸を示す結果（図3B）、および神経原線維変化の形成において、apoEのアミノ末端ドメインが果たす役割を示す結果（図3C）である。
【図４】  正常な個体（N1およびN2）とアルツハイマー病の個体（AD1、AD2、およびAD3）から得た脳溶解物を抗apoE抗体で免疫沈殿したタンパク質ブロットを示す。
【図５】  NSE-apoE3マウスおよびNSE-apoE4マウスの脳におけるカルボキシル末端側切断型apoE3およびapoE4を示すグラフである。
【図６】  NSE-apoEマウスの脳におけるp-tauが月齢に依存して蓄積することを示すグラフである。
【図７】  NSE-apoE4トランスジェニックマウスの海馬においてp-tau陽性の神経細胞内封入体が発生することを示すグラフである。
【図８】  apoEのタンパク質切断を触媒する酵素の酵素活性に対するさまざまな作用薬の効果を示すグラフである。
【図９】  さまざまなペプチドによってapoE切断酵素を阻害した結果を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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