(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）神経成長因子；
（ｂ）等浸透圧の維持に十分な量の生物学的に許容され得る塩；
（ｃ）製剤のｐＨを４.５から６.０に維持するのに十分な量の緩衝剤；
（ｄ）４ないし６mg／mlの生物学的に許容され得る水溶性タンパク質キャリアー；および、
（ｅ）水、
を含んでなる、水性医薬製剤。
【請求項２】
（ａ）神経成長因子が水性製剤の０.０００１ないし０.１２５重量％含まれて成り；
（ｂ）塩が水性製剤の０.５ないし１.０重量％含まれて成り；さらに、
（ｃ）緩衝剤が水性製剤のｐＨを４.５から６.０に維持するのに十分な量で存在する、請求の範囲第１項記載の製剤。
【請求項３】
ｐＨが５.０から５.４である、請求の範囲第１項または第２項記載の製剤。
【請求項４】
ＮＧＦを１０ないし５００μg／ml、ＨＳＡを５mg／ml、ＮaＣlを８.７mg／ml、クエン酸を２.１mg／ml、および水を含んでなり、製剤のｐＨが５.２に調整されている、請求の範囲第３項記載の水性製剤。
【請求項５】
ヒトにおけるニューロン機能不全の処置に使用するための、請求の範囲第１から４項のいずれか１項記載の製剤。
【請求項６】
ヒトにおけるアルツハイマー病の処置に使用するための、大脳室内注入形態の、請求の範囲第５項記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、神経成長因子の医薬製剤に関する。本発明は、また、凍結乾燥に適した神経成長因子製剤処方に関する。
発明の背景
非常に多くのポリペプチド類およびタンパク質類が、細胞の成長または生存を調節しており、このような分子は、“成長因子”と称される。成長因子の例には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、および神経成長因子（ＮＧＦ）がある。これらの中で、ＮＧＦが同定および特性化された最初のものであった（レビモンタルチーニ、Ｒ.等、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ズーロジー、１１６巻、３２１頁、１９５１年）。
ＮＧＦは、ある種の神経細胞の生存および活性を増進する。加えて、ＮＧＦは、未熟ニューロン細胞の有糸分裂後の成熟ニューロンへの分化を増進する。
マウス顎下腺由来のＮＧＦを精製した結果、３つのサブユニット、α、β、およびγからなる複合体であることが同定された。ＮＧＦの神経栄養活性は全て、約１３,０００Ｄaの分子量を有する１１８アミノ酸タンパク質であるβサブユニットに存すると考えられている（ヴァロン、Ｓ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、５７巻、１７８２−１７８９頁、１９６７年；グリーン、Ｌ.Ａ.等、ニューロバイオロジー、１巻、３７−４８頁、１９７１年）。溶解状態では、βサブユニットは、分子量約２６,５００Ｄaの二量体を形成する。
ＮＧＦは、末梢神経系および中枢神経系両方のある種の変性疾患を処置するのに有効であることが示唆されている。ＮＧＦの投与は、ＮＧＦの欠損、その受容体の異常、またはその輸送または細胞内作用の変化が、ニューロン機能の低減、萎縮、または細胞死さえも導くような疾患を処置するのに有益であり得ることが示唆されている。このような疾患には、遺伝性の知覚および運動ニューロパシー（神経障害）、遺伝性および散発的に発生する組織変性（hereditary and sporadically occurring system degeneration）、筋萎縮側索硬化症、パーキンソン病、およびアルツハイマー病がある（ゴーダート、Ｍ.等、モレキュラー・ブレイン・リサーチ、１巻、８５−９２頁、１９８６年；モブレイ、Ｗ.Ｃ.等、ソーシャル・ニューロサイエンス・アブストラクト、１３巻、１８６頁、１９８７年；モブレイ、Ｗ.Ｃ.等、ソーシャル・ニューロサイエンス・アブストラクト、４巻、３０２頁、１９８８年；ヘフティ、Ｆ.等、アナルス・オブ・ニューロロジー、２０巻、２７５−２８１頁、１９８６年）。ＮＧＦは、ある種の毒素、例えば、６−ヒドロキシ−ドーパミン（アロエ、Ｌ.、アルチブス・イタリエン・デ・ビオロジー、１１３巻、３２６−３５３頁、１９７５年）、ビンブラスチンおよびコルチシン（メネシニ−チェン、Ｍ.Ｇ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、７４巻、５５５９−５５６３頁、１９７７年；ジョンソン、Ｅ.Ｍ.、ブレイン・リサーチ、１４１巻、１０５−１１８頁、１９７８年）、およびカプサイシン（オッテン、Ｕ.、ネイチャー、３０１巻、５１５−５７７頁、１９８３年）にさらした後のニューロン細胞死を低減するとも考えられている。
記憶および学習に関連する領域である海馬においてＮＧＦ mＲＮＡの発現が高いことは、ＮＧＦの臨床的応用が、痴呆の処置に有効であり得ることを示唆している（カイショ、Ｙ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１７４巻、３７９−３８５頁、１９９１年）。ＮＧＦの脳室内投与により、軸索切断後の基底前脳コリン作動性ニューロンの死を妨げることが報告されており、ＮＧＦが損傷後の細胞生存を増進するのに有効であり得ることを示唆している。（ヘフティ、Ｆ.、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、６巻、２１５５−２１６２頁、１９８６年；ウィリアムス、Ｌ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、８３巻、９２３１−９２３５頁、１９８６年；クロマー、Ｌ.、サイエンス、２３５巻、２１４−２１６頁、１９８７年）。
治療を目的とするＮＧＦの使用は、重要な問題を抱えている。これらの問題は、１）製造、精製、または貯蔵中に変化し得るＮＧＦの生物活性を維持すること；および２）比較的大きい、親水性分子であるＮＧＦを、それが有効であるために充分な量で活性部位に達するように投与することに関連するものである。ＮＧＦの生物活性は、他のタンパク質同様、その二次および三次構造によって変わる。ＮＧＦのβサブユニットは、３つの内部ジスルフィド結合を有し、これが、生物活性に重要であると考えられている（カナヤ、Ｅ.等、ジーン、８３巻、６５−７４頁、１９８９年；イワネ、Ｍ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１７１巻、１１６−１２２頁、１９９０年；フー、Ｇ.Ｌ.およびニート、Ｋ.Ｅ.、ジーン、７０巻、５７−６５頁、１９８８年）。更に、あらゆるタンパク質が変性するような範囲まで、生物学的に活性なＮＧＦの有効量を減らされる。従って、製造および貯蔵中、並びに投与中、タンパク質の完全状態を維持しなければならない。タンパク質は、特に、昇温時に変性し易い。
一般に、低温では、タンパク質変性は低減する。しかしながら、タンパク質を約４℃の冷蔵温度で貯蔵するよりも、室温、即ち、約２５℃で貯蔵するほうが一層経済的である。それ故に、室温での貯蔵または約４℃での冷蔵のいずれかに対する製剤処方の安定性が望まれている。
安定性の問題に加えて、ＮＧＦは、他の多くのタンパク質同様、各種表面に非特異的に付着する。このような非特異的付着は、ガラスおよびプラスチック、例えば、ポリエチレンまたはポリプロピレンを含む様々な材料に対して起こり得る。これらの材料は、製造、貯蔵、または投与中にＮＧＦと接触することになり得る、バイアル、チューブ、シリンジ、インプラント用注入装置、またはその他の容器の形態であり得る。
ＮＧＦのようなタンパク質を治療剤として投与する際の他の難点は、体内吸収性に乏しいこと、および胃酸により分解されることである。従って、一般に、経口投与は不適である。そのようなタンパク質の注射および注入は、このような吸収障壁を克服するために必要となろう。
処置部位に容易にアクセス可能であるときは、注射が有用である。しかしながら、その部位が中枢神経系（ＣＮＳ）などのように比較的アクセスしにくい場合、連続注入が長期投与にはより実用的であり得る。このような投与は、様々の複雑な要因のために非実用的であった。例えば、連続注入は、脳内にＮＧＦポンプを注入することによって行うことができるが、タンパク質を長時間体温にさらすと、しばしば、タンパク質の変性が起こる。また、時間をかけすぎたとき、ポンプチャンバーにタンパク質が吸着することによって、更に損失を生ずる場合もある。
ＮＧＦの投与に関連する問題に加えて、その製造時から投与まで長期間貯蔵されることに関連する問題もある。生物学的タンパク質の変性、凝集、および／または非特異的吸着を防ぐ長期間貯蔵法の１つは、凍結乾燥である。しかしながら、凍結乾燥法自身に難点が存在する。凍結処理中に液量が減少するので、実効塩濃度が劇的に増大し、これがタンパク質を変性させ、再生時の有効な治療活性を低減させ得る。加えて、凍結処理中の氷結晶の生成により、変性がおこり、また、利用できる生物活性なＮＧＦの有効量も減少する。従って、製剤処方は、塩濃度の変動を防ぎ、氷結晶の生成を最小にするようなものでなければならない。
本発明の目的の１つは、約４℃から約４０℃の範囲の温度で、少なくとも１カ月以上、生物活性を保持する、ＮＧＦの水性製剤を提供することである。
本発明の別の目的は、生物活性が凍結乾燥および再生後も維持されている、ＮＧＦの製剤処方を提供することである。
本発明の更なる目的は、生物学的に活性なＮＧＦを溶解状態で貯蔵する方法を提供することである。
発明の概要
本発明は、タンパク質の量または活性を実質的に損失することなく、周辺温度、準周辺温度、および高めた温度で貯蔵可能である、神経成長因子の安定な製剤を提供するものである。この製剤処方は：
（a）神経成長因子；
（b）所望により、生物学的に許容され得る水溶性キャリアー；
（c）等浸透圧の維持に十分な量の生物学的に許容され得る塩；
（d）製剤のｐＨを約４.５から約６.０に維持するための緩衝剤；および
（e）水
からなる水性溶液を含んで成る。
別の態様では、本発明は、凍結乾燥に適したＮＧＦの医薬製剤処方を提供する。
凍結乾燥に適した本発明の医薬製剤処方は：
（a）神経成長因子；
（b）生物学的に許容され得る増量剤；
（c）製剤のｐＨを約５.５から約６.５に維持するための緩衝剤；
（d）所望により、生物学的に許容され得る、水溶性キャリアー；および
（e）水
からなる水性溶液を含んで成る。
本発明の更なる実施態様は、製剤から水を実質的に除去した凍結乾燥製剤である。所望により生物学的に許容され得るキャリアーを含む再生用媒体を用いて再生する際、本発明の凍結乾燥製剤は、治療の必要な患者に投与するのに適している。
本発明は、約４℃から約４０℃の温度で、本発明の水性製剤中のＮＧＦを貯蔵する方法もまた提供する。
本発明のその他の実施態様は、本発明のＮＧＦ製剤を治療上有効量投与することを含んで成る、ヒトにおけるニューロン機能不全を処置する方法である。
発明の詳細な説明
ＮＧＦに対する安定な非経口投薬形態の開発には、投与経路、吸着相互作用、および、処理設備および落差利用輸送（ポテンシャルデリバリー）装置との適合性を含む、多くの要因の評価が要求される。更に、周辺温度、準周辺温度、および高めた温度での水性製剤中におけるＮＧＦの安定性も考慮される。本発明の一実施態様は、ある温度範囲、特に、高めた温度（少なくとも、約４０℃で）で安定性を示す、ＮＧＦの水性溶液製剤処方である。この製剤は、ＮＧＦ、塩、および緩衝剤からなるｐＨ約４.５ないし約６.０を有する水性溶液を含んで成る。この製剤は、更に、所望により、キャリアーを含んで成ることもできる。この各成分の組み合わせは、驚くべきことに、該溶液に非常に好適な特性、特に、昇温時の安定性に関する特性を与えるものである。また、凍結乾燥に適したＮＧＦの製剤も提供する。本発明は、ＮＧＦの貯蔵法も提供する。
本明細書で使用するとき、“生物学的に許容され得る”とは、インビボで逆の生物学的作用がないことにより特徴付られる物質に適用される。“室温”とは、約２２℃ないし約２５℃である。“体温”とは、約３６℃ないし約４０℃である。“凍結乾燥可能製剤”とは、湿分含量約２％以下まで凍結乾燥でき、再生時になお最初のＮＧＦ生物活性の少なくとも約７０％を保持する、ＮＧＦの水性製剤を意味する。“等浸透圧の”とは、１リットル当たり約３００ミリモルの血清とほぼ同一の浸透圧を有する溶液を意味する。“キャリアー”とは、何かの表面へのＮＧＦの吸着を低減する生物学的に許容され得る乳化剤、分散剤、界面活性剤、またはタンパク質である。
“ＮＧＦ”とは、生物学的活性を示し、ＮＧＦ受容体に結合する神経成長因子のあらゆる形態、好ましくは、神経成長因子のβサブユニットを意味する。ＮＧＦの用語は、ＮＧＦ受容体に結合し、ＮＧＦ生物活性を保持する、ＮＧＦのハイブリダイズした形態、および修飾した形態をも含む。ＮＧＦの修飾した形態には、イワイ、Ｓ.等、ケミカル・ファーマシューティカル・ブレティン、３４巻、４７２４−４７３０頁、１９８６年、およびカナヤ、Ｅ.等、ジーン、８３巻、６５−７４頁、１９８９年に記載されているような融合タンパク質、および、あるアミノ酸が欠失または置換されているが、治療活性を提供するのに充分なＮＧＦ生物活性および受容体結合を維持している、ＮＧＦフラグメントおよびハイブリッドをも含め得る。
ＮＧＦの好ましい形態は、ヒトＮＧＦ（hＮＧＦ）である。hＮＧＦの最も好ましい形態は、組換えhＮＧＦ（rhＮＧＦ）である。本発明の製剤に使用するのに適したＮＧＦを得る方法は、当業者には知られている。例えば、適切なrhＮＧＦは、バキュロウイルス発現系（バーネット、Ｊ.等、エクスペリメンタル・ニューロロジー、１１０巻、１１−２４頁、１９９０年；ＥＰＯ ３７０,１７１）、酵母発現系（カナヤ、Ｅ.等、ジーン、８３巻、６５−７４頁、１９８９年）、哺乳類細胞（ＣＨＯ）発現系（イワネ、Ｍ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１７１巻、１１６−１２２頁、１９９０年）、またはＣＯＳ発現系（ブルス、Ｇ.等、ニューロバイオロジカル・エイジング、１０巻、８９−９４頁、１９８９年）により生産できる。ＮＧＦは、少なくとも純度６５％；好ましくは、少なくとも純度８５％；より好ましくは、少なくとも純度９５％；および、最も好ましくは少なくとも純度９８％であるべきである。本製剤に使用する単離したＮＧＦの純度は、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または当業者には知られている他の手段により測定できる。
提供される水性ＮＧＦ製剤中で、ＮＧＦは、治療上有効量で存在する。好ましくは、ＮＧＦは、水性組成物の約０.０００１から約０.１２５重量％を含んで成り、それは約１ないし約１２５０μg／mlに相当する。より好ましくは、ＮＧＦは、水性製剤の約０.００１から約０.１０重量％（１０ないし１０００μg／ml）の量で存在する。更に、より好ましくは、ＮＧＦは、水性製剤の約０.０１から約０.１０重量％（１００ないし１０００μg／ml）の量で存在する。最も好ましくは、ＮＧＦは、水性製剤の約０.０１から約０.０５重量％（１００ないし５００μg／ml）の量で存在する。
水性ＮＧＦ製剤は、所望によりキャリアーを含む。製剤中にキャリアーが存在すると、様々な表面へのＮＧＦの吸着が低減または防止される。キャリアーが必要であるかどうかは、水性組成物中のＮＧＦ濃度に依存する。顕著に高い（約５００μg／ml以上）ＮＧＦ濃度では、表面吸着により失われた量を補うに充分なＮＧＦが溶解状態で残る。適切なキャリアーは、ツイーン（登録商標）８０などのポリソルベート類、プルロニック（登録商標）Ｆ６８などのポロキサマー類、および血清アルブミンなどのタンパク質であるが、これらに限定されるわけではない。好ましいキャリアーは、タンパク質である。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、特に好ましい。キャリアーに対するＮＧＦの重量比は、約０.０００１：１から約１：１である。より好ましい重量比は、約０.０１：１から約１：１である。キャリアーに対するＮＧＦの最も好ましい重量比は、約０.０１：１から約０.５：１である。従って、ＨＳＡをキャリアーとして使用する場合、好ましいＨＳＡ濃度は、水性製剤の約０.１から約１.２５重量％（即ち、１ないし１２.５mg／ml）である。好ましい製剤処方は、ＨＳＡが水性製剤の約０.３ないし０.７重量％であり、より好ましいのは、ＨＳＡが水性製剤の約０.４ないし０.６重量％である。最も好ましい製剤処方は、ＨＳＡが水性製剤の約０.５重量％（即ち、５mg／ml）である。
ＮＧＦ製剤は、液体張度を維持するのに充分な量の生物学的に許容され得る塩を含有する。塩は、また溶解状態のＮＧＦを維持するように働く。好ましくは、ＮＧＦ製剤は、生理学的に許容され得る範囲内で、ヒト血液または大脳脊髄液と等浸透圧であるために十分な塩を含有する。好ましい塩は、塩化ナトリウム（ＮaＣl）であるが、他の生物学的に許容され得る塩類、例えば、塩化カリウム（ＫＣl）、塩化カルシウム（ＣaＣl2）、および塩化マグネシウム（ＭgＣl2）も使用できる。この塩は、１種の塩、または複数塩の組み合わせであってもよい。好ましい製剤は、水性製剤の約０.５ないし１.０重量％（即ち、５ないし１０mg／ml）の塩を含んでなる。より好ましい製剤は、製剤の約０.６ないし０.９重量％の塩を含んでなる。より好ましくは、製剤は、水性製剤の約０.７ないし０.９重量％の塩を含んでなる。最も好ましい製剤は、水性製剤の約０.８７重量％（即ち、８.７mg／ml）の塩を含んでなる。
ＮＧＦ製剤は、貯蔵中のｐＨを維持するために、更に、生物学的に許容され得る緩衝剤を含有する。ＮＧＦは、低ｐＨでより安定であることが分かっている。好ましい安定なＮＧＦ製剤は、生物学的に許容され得る緩衝剤を用いてｐＨを約４.５ないし約６.０の間に、より好ましくは約５.０ないし約５.４の間に調整する。該製剤の最も好ましいｐＨは、約５.２である。好ましい緩衝剤は、クエン酸であるが、所望の範囲内のｐＨを維持する能力のある他の緩衝剤も採用される。その他の適切な緩衝剤は、酢酸／酢酸塩、およびマレイン酸／マレイン酸塩である。緩衝液の好ましい量は、使用する緩衝剤の種類、およびその緩衝能力によって変わる。緩衝剤は、製剤の最終ｐＨを好ましいｐＨ範囲に維持するのに十分な量で製剤中に存在すべきである。安定なＮＧＦ製剤のために好ましい緩衝剤濃度は、水性製剤の約０.０１ないし約０.３重量％（０.１ないし３.０mg／ml）であり、より好ましい緩衝剤濃度は、水性製剤の約０.１ないし約０.２５重量％（１.０ないし２.５mg／ml）であり、最も好ましい緩衝剤濃度は、水性製剤の約０.２重量％（２.０mg／ml）である。
製剤は、製剤成分の適切な濃度を達成するのに十分な量の水を含む。
好ましい安定な水性ＮＧＦ製剤は、ＮＧＦを約１ないし１２５０μg／ml、ＨＳＡを１ないし１２.５mg／ml、ＮaＣlを５ないし１０mg／ml、クエン酸を０.２ないし３.０mg／mlおよび水を含んで成り、ここで製剤のｐＨは、約４.５ないし約６.０、より好ましくは約５.０から約５.４に調整されている。ＮＧＦの最も好ましい安定な製剤は、ＮＧＦを１０ないし５００μg／ml、ＨＳＡを５mg／ml、ＮaＣlを８.７mg／ml、クエン酸を２.１mg／mlおよび水を含んで成り、ここで製剤のｐＨは、約５.２に調整されている。
本発明の凍結乾燥製剤は、特に、昇温温度でＮＧＦを長期間貯蔵する場合に特に有用なものである。本発明の凍結乾燥可能製剤は、ＮＧＦ、生物学的に許容され得る増量剤、製剤のｐＨを約５.５から約６.５に維持するための緩衝剤、所望による生物学的に許容され得る塩、所望による生物学的に許容され得る水溶性キャリアー、および水を含んで成る。
ＮＧＦは、水性製剤中と同様の濃度範囲で凍結乾燥可能製剤中に存在する。増量剤は、一般に、凍結乾燥処理中ならびに処理後、マトリックスにその形状を維持させることにより、構造的支持を与えるものである。１種またはそれ以上の糖類を増量剤として使用できる。本明細書で使用する糖類には、モノサッカライド類、オリゴサッカライド類、およびポリサッカライド類があるが、これらに限定されるものではない。安定な糖類の例には、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、およびデキストランがあるが、これらに限定されるものではない。また、糖は、糖アルコール類、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールを含む。糖類の混合物も、本発明に従い使用することができる。
好ましい増量剤は、糖類の組み合わせを含む。好ましい増量剤は、スクロースとマンニトールの組み合わせである。理論に束縛されることなく、スクロースは、フリージングし、次いで凍結乾燥すると、無定形ガラス状物を形成すると考えられ、かくしてＮＧＦを堅いガラス状物中に分子分散させることにより、タンパク質の潜在的安定性の増大（例えば、凝集を防ぐ）が可能となる。安定性は、糖が凍結乾燥時に失われた水の代替物として働くことによっても高められていると思われる。水分子よりもむしろ糖分子の方が、水素結合によりタンパク質に結合し易い。マンニトールを１：１の質量比でスクロース（−３６℃のガラス状態への遷移温度を有する）と混合した場合、製剤のガラス状態への遷移温度は、５℃ないし−３１℃まで上がる。これは、凍結乾燥中の製剤の一次乾燥時間をかなり短縮するものであり、その間、依然として無定形ガラス状製剤マトリックスのままで保たれるので、大規模生産装置において有利であると考えられる。これらの特性を有するその他の増量剤をこれらの糖の一方、または両方の代わりに使用することもできる。
凍結乾燥される本発明の製剤は、好ましくは、凍結乾燥されない、または再生される製剤よりも高いｐＨを有する。本発明の凍結乾燥可能製剤中に存在する増量剤（糖類）は、一般に、高ｐＨでより安定である。凍結乾燥前の製剤のｐＨは、好ましくは、約５.５ないし約６.５の間である。より好ましくは、凍結乾燥可能なＮＧＦ製剤のｐＨは、約５.８ないし約６.２の間である。最も好ましい凍結乾燥可能ＮＧＦ製剤のｐＨは、約６.０である。スクロースが増量剤として存在する場合、凍結乾燥可能製剤の好ましいｐＨは、６.０であるが、これは、酸性ｐＨでは、ある種の非還元ジサッカライドであるスクロースが、還元糖Ｄ−フルクトースとＤ−グルコースに加水分解してしまうためである。クエン酸塩は、凍結乾燥可能なＮＧＦ製剤には最も好ましい緩衝剤であるが、マレイン酸塩などの他の生物学的に許容され得る緩衝剤も使用できる。酢酸が凍結乾燥中に揮発する傾向にあるので、酢酸塩以外の緩衝剤類が好ましい。最終ｐＨを、酸、または塩基を用いて調整することが必要な場合があると認識されるべきである。ｐＨが約６.０と高めであることによる、水性ＮＧＦの長期安定性におけるいかなる損失も、ＮＧＦの凍結乾燥による安定性の増大により、克服されるようである。
理想的には、緩衝剤の選択に際し、凍結乾燥中に緩衝剤成分の一連の結晶化により生じるｐＨ移動の可能性を考慮に入れる。例えば、リン酸緩衝剤を用いる場合、塩基性成分は、酸性成分よりも高い共晶点を有するため、最初に塩基性成分が晶出し、次いでｐＨが下がる。クエン酸緩衝剤は、両方の緩衝剤成分が、ほぼ同一の共晶点を持つため、温度が下がっても殆どｐＨ変動がないと考えられるので、好ましい。その他の適切な緩衝剤は、同一か、または類似の共晶点を有する成分を持つものである。
凍結乾燥可能製剤は、また、所望により生物学的に許容され得る塩を含む。塩は、水性製剤の場合に有用な塩類と同一のものから選択され得るものであり、凍結乾燥可能製剤中に、水性製剤の場合と同一か、または低い濃度で存在する。塩濃度は、凍結乾燥中に増大することがあるため、凍結乾燥可能製剤中に存在する塩の濃度を減少させることが、タンパク質変性を阻止するために望ましい。凍結乾燥可能製剤中の塩濃度の減少分は、再生中に補って、各個体への投与に適する十分に等張性の最終製剤とすることができる。
所望により、凍結乾燥可能製剤は、生物学的に許容され得る水溶性キャリアーを含む。本発明の凍結乾燥可能製剤に使用され得るキャリアーおよびキャリアーの濃度は、本発明の水性製剤での使用に適した濃度と同一である。
好ましい凍結乾燥可能製剤は、ＮＧＦを約１ないし１２５０μg／ml、スクロースを１５ないし４５mg／ml、マンニトールを１５ないし４５mg／ml、所望によりＮaＣlを７ないし９mg／ml、およびクエン酸を０.１ないし０.７mg／ml、ｐＨ約５.５ないし約６.５で含んで成る。ＮＧＦの最も好ましい凍結乾燥可能製剤は、ＮＧＦを約１００ないし１２５０μg／ml、スクロースを３０mg／ml、マンニトールを３０mg／ml、ヒト血清アルブミンを５mg／ml、所望によりＮaＣlを８.７mg／ml、およびクエン酸を０.３mg／ml含んで成る。凍結乾燥可能製剤の最も好ましいｐＨは、約６.０である。
本発明の凍結乾燥可能製剤は、残存湿分含量約２％以下まで凍結乾燥される；しかしながら、それより高い、または低い量の湿分含量でＮＧＦの生物学的活性を保持するような製剤をも企図している。
好ましい凍結乾燥製剤は、神経成長因子０.００１ないし１.２５部、糖３０ないし９０部、および水約１部以下を含んで成る。
凍結乾燥したＮＧＦ製剤は、再生して得られた製剤が、液体水性製剤と同様に、即ち、ＮＧＦが約１ないし１２５０μg／ml、ＨＳＡが１ないし１２.５mg／ml、ＮaＣlが５ないし１０mg／ml、クエン酸が０.２ないし３.０mg／ml、スクロースが１.５ないし３０mg／ml、およびマンニトールが１.５ないし３０mg／ml、ｐＨ５.２であるために要求され得るように、クエン酸などの緩衝剤を含有する希釈剤、および塩化ナトリウムなどの塩を用いて再生される。
本発明の凍結乾燥したＮＧＦ製剤は、安定な凍結乾燥ＮＧＦを、処置の必要な患者に投与するために、適切な媒体で迅速、かつ容易に再生し得る形態で提供する便利で経済的な方法を提供するためのキットの成分としても有用である。凍結乾燥ＮＧＦ製剤に加えて、本発明のキットも、再生用媒体を含んでなる。再生用媒体は、滅菌水、および最終的に再生した製剤を実質的に等張性にするのに充分な量の塩を含んでなる。また、再生用媒体は、さらに緩衝剤を含むこともできる。キット中に存在する再生用媒体の総容量は、処置の必要な個人に投与するのに適した最終ＮＧＦ濃度を達成するのに充分であるべきである。本発明の好ましい実施態様では、２つのバイアルを含むキットを提供する。１つのバイアルは、本発明の無菌凍結乾燥ＮＧＦ製剤を含んでなり、第２のバイアルは、無菌再生用媒体を含んでなる。キットを使用するためには、適切な量の再生用媒体を、凍結乾燥ＮＧＦ製剤を含んでなるバイアルに移す。凍結乾燥製剤が溶解したら、再生した製剤を直ちに患者に投与することができる。
本発明の再生製剤は長期安定性を有するので、再生製剤を複数用量に供するのに充分量で調製することも可能である。
本発明の製剤は、ＮＧＦ治療に感応する症状の個体を処置するのに有用である。代表的には、これらの製剤は、無菌状態であり、かつ静脈内、筋肉内、非経口的、または大脳室内投与に適している。このような治療は、ニューロン損傷またはＮＧＦ応答ニューロンの変性に関わるニューロン機能不全を処置するのに有用であり得る。ＮＧＦは、特に、アルツハイマー病などの中枢コリン作動性ニューロン（central cholinergic neurons）の損失に起因する疾患の処置に有用であり得る。ヨーロッパ特許０ ３７０ １７１には、アルツハイマー病および他の形態の痴呆処置剤として、ＮＧＦが記載されている。
本発明の製剤は、痴呆の処置剤として、特定の末端使用によって変わる様々な定形処置のいずれによっても投与することができる。最適な経路は、用途および処置対象によって変わるものである。
血液脳関門によってひき起こされる難点を克服するために、ＮＧＦを、直接脳室内注射により、または薬剤含浸インプラントまたはポンプを介してＣＮＳ内に投与することができる。その他の投与経路は、大脳室内カニューレ装置を通す連続注入によるものである。他にも、ＮＧＦをトランスフェリンなどのキャリアー分子とコンジュケーションすることも血液脳関門を貫通するのに必要であり得る。
治療上有効量のＮＧＦは、１日当たり約０.００１から約０.５mg、好ましくは、１日当たり約０.０１から約０.１０mg、最も好ましくは、１日当たり約０.０２から約０.０６mgであると思われる。正確な投与用量および投与法は、多くの要因、例えば、投与経路、および処置を受ける個体の苦痛の程度によって変わるものである。
アッセイ法
逆相ＨＰＬＣを用いるＮＧＦの同定および定量
ＮＧＦは、ダイナマックス３００Å５μm ４.６mm×１.５cmガードカラムの付いた４−６mm×２５cm Ｌダイナマックス（レイニン・インストルメント社、ウオバーン、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）３００Å５μm分析用逆相カラム、および２２０nmに設定した二極管配列ＵＶ検出器を備えた、逆相ＨＰＬＣ（ヒュレット・パッカードHP1090液体クロマトグラフ）を用いて、試料１００μlを分析することにより、同定および定量した。移動相は、（Ａ）水中０.１％トリフルオロ酢酸、および（Ｂ）アセトニトリル中０.１％トリフルオロ酢酸であり、圧力１７００−２０００psi、周囲温度、流速０.５ml／分で４５分の間に、勾配を（Ｂ）２５％から（Ｂ）６０％に変えた。
ＮＧＦの同定は、試料の保持時間を、同じロット由来のＮＧＦから新たに調製し定量した標準ＮＧＦ溶液のそれぞれの保持時間と比較することにより、確認した。試料中のＮＧＦの量は、濃度の分かっている一連の希釈液で得られた標準曲線と比較することにより算出した。
ＥＬＩＳＡによるＮＧＦ濃度（μg／ml）の測定
ＮＧＦ濃度は、ＥＬＩＳＡによってもアッセイした。標準と試料の両方を三重にアッセイした。各プレートには、完全な標準曲線を描くＮＧＦとＮＧＦを含まない対照ブランクを入れた。
コーティング抗体（rhＮＧＦに対して産生したマウスモノクローナル２４Ｃ１）１００μlを９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに加えた後、プレートを湿らせたペーパータオルと共にサランラップで包み、冷蔵庫中２〜８℃で一晩インキュベートした。ウェルを空にし、洗浄緩衝液（５００mＭトリス、２Ｍ塩化ナトリウムを含有し、ｐＨ７に調整したもの）２５０μl／ウェルを分配するように設定したウィートン自動充填注射器を用いて３回洗浄し、パッティング乾燥させた。続いて、非特異的部位をブロックするために、ブロッキング緩衝液（blocking buffer）２００μl（１％ウシ血清アルブミン溶液）を各ウェルに加え、試料５０μlを各ウェルに加え、平台震盪器（platform shaker）で混合しながらプレートを最低１時間、室温でインキュベートした。ウェルを再び空にして、パッティング乾燥させ、標準溶液、および試料溶液５０μlを加えた。次いで、プレートを覆い、室温で２時間インキュベートした。プレートのウェルを再び空にし、洗浄緩衝液で４回洗浄し、パッティング乾燥させた。ビオチン化抗体（rhＮＧＦに対して産生したマウスモノクローナル８Ｃ１）５０μlを各ウェルに加え、プレートを覆い、２時間インキュベートした。プレートのウェルを、上記のように空にし、洗浄および乾燥して、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン５０μlを各ウェルに加えた。プレートを覆い、平台震盪器で混合しながら、室温で２０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した。オルソ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質緩衝液５０μlを各ウェルに加えた後、プレートを覆い、暗所で１時間インキュベートした。
Ｖmaxキネティック・マイクロプレート（モレキュラー・デバイス、マウンテン・ビュー）リーダーを用いて、各ウェルの吸光度を測定した。各ウェルについて、６５０nmでのバックグラウンド吸光度を４５０nmでのピーク吸光度から引いて、正味の吸光度を得た。試料中のＮＧＦ濃度は、ＮＧＦ標準曲線と比較して定めた。
ＮＧＦ活性の測定
ＮＧＦの生物活性は、ＰＣ−１２バイオアッセイにより測定した。ＰＣ−１２バイオアッセイは、ＮＧＦにさらしたときの、ＰＣ−１２褐色細胞腫細胞の代謝活性増大に基づくものである（グリーン、トレンズ・ニューロサイエンス、７巻、９１頁、１９８６年）。ＰＣ−１２細胞の代謝活性は、３−［４,５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｃ18Ｈ16Ｎ5Ｂr）（ＭＴＴ）の細胞取り込みにより測定するが、これは細胞のデヒドロゲナーゼにより不溶性細胞内青色結晶に変換される。
９６ウェルプレートの各ウェルは、ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ）５０μl中、約３０,０００のＰＣ−１２細胞を含有した。各試料および標準の一連の希釈液を調製して、０.２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０中、１ml当たりrhＮＧＦ０.００６ないし４００ngの溶液を生成した。その後、各溶液５０マイクロリットルを各ウェルに加えて、１ml当たりＮＧＦ０.００３ないし２００ngの濃度を得、各濃度を三重にアッセイした。プレートを３７℃、５％ＣＯ2中で２日間維持した後、ＭＴＴ１０μgを各ウェルに加え、プレートを更に４時間インキュベートした。次いで、５０％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ＳＤＳの一定量を加え、プレートをセロファンで包み、プラスチック袋内に封止し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、５７５nmに設定したＶmaxプレートリーダーを用いてプレートを読んだ。標準ＮＧＦ曲線のＥＤ50に対する試料曲線のＥＤ50の比率は、２つの調製物の相対的な有効性の尺度を与えるものである。
実施例１
ＮＧＦ製剤
rhＮＧＦを１、１０、１００、および１０００μg／ml、ＨＳＡを５mg／ml、塩化ナトリウム８.７mg／ml、およびクエン酸２.１mg／ml、および製剤１０mlを調製するのに充分な水を含んで成る、ｐＨ５.２に調整した水性製剤を調製した。クエン酸および塩を総容量の約７０％中に溶解した後、ＮaＯＨ／ＨＣlを用いてｐＨを調整し、ＨＳＡおよびＮＧＦを水と一緒に穏やかに撹拌しながら水と一緒に加えて、容量を満たし、この製剤を０.２μミリポア・ミレックス−ＧＶフィルターを通して濾過した。
バーネット、Ｊ.等、エクスペリメンタル・ニューロロジー、１１０巻、１１−２４頁、１９９０年に記載されているように、製剤を調製するのに使用したrhＮＧＦを、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現させ、イオン交換、および逆相クロマトグラフィーにより精製した。
実施例２
５℃および２５℃でのＮＧＦ製剤の安定性
実施例１のＮＧＦ製剤１００μg／mlの２５０μlずつを、ポリエチレン製ドロップ−チップバイアル中、５℃および２５℃（室温）で６カ月間まで貯蔵した。これらの試料の（上記）ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびバイオアッセイ分析は、６カ月にわたり、タンパク質の損失がなかったことを示した（表１）。
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実施例３
ポリエチレンカテーテル中３７℃で貯蔵した様々なＮＧＦ製剤の安定性
実施例１に記載のようにして得られたrhＮＧＦを１から１,０００μg／ml含有するＮＧＦ製剤の２５０μlずつを、非放射線不透過性ポリエチレンカテーテル（内径０.０３０インチおよび外径０.０４８インチ）中、３７℃で４週間貯蔵した。結果は、表２に示した通りであり、タンパク質含量（ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定）、またはＮＧＦ活性（ＰＣ−１２バイオアッセイにより測定）の有意な損失がないことを示している。
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実施例４
様々な投与装置中でのＮＧＦ製剤の安定性
実施例１のＮＧＦ製剤１００μg／mlの１部ずつを、インフューセッド・モデル６００インプラント用注入ポンプ（シレイ−インフューセッド社、ノーウッド、マサチューセッツ州）、メドトロニックス・シンクロームドインプラント用注入ポンプ（メドトロニックス社、ミネアポリス、ミネソタ州）、またはアルゼット・モデル２ＭＬ４ミニ浸透性注入ポンプ（アルザ社、パロ・アルト、カリフォルニア州）のいずれかに充填した。ポンプを３７℃の水浴中に置き、ポンプからの製剤流出を開始した。４週間にわたり、週毎に試料を集め、タンパク質含量および活性をＲＰ−ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびＰＣ−１２バイオアッセイにより分析した。
表３のデータは、ＮＧＦ濃度、または活性における有意な増加は、何ら観察されなかったことを示している。
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実施例５
ｐＨ４ないし１０でのＮＧＦ製剤の安定性研究
ＮＧＦを１００μg／ml、ＨＳＡを１mg／ml、および塩化ナトリウムを９mg／ml含んでなり、ｐＨを４〜１０に緩衝化した水性製剤を、実施例１の方法で調製し、０.２μフィルター（ミレックス−ＧＶ；ミリポア社）を通して滅菌濾過した。ｐＨ４ないし５の製剤を酢酸塩で緩衝化し、ｐＨ６〜１０の製剤をトリスで緩衝化した。１mlずつをポリプロピレン製ドロップ−チップバイアルに移し、次いで、これを室温（２３℃ないし２５℃）または３７℃のいずれかでインキュベートした。様々な時点で試料を取り出し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。溶液からのＮＧＦの損失を表す一次反応速度定数をｐＨの関数としてプロットした。溶液中のＮＧＦ変性速度は、約４.５以下および約６.０以上のｐＨで増大することが分かった。最大安定性は、ｐＨ５.２で生じた。
実施例６
キャリアー濃度の関数としてのＮＧＦ製剤の安定性
ＮＧＦ安定性への影響を測定するために、キャリアーの種類と量を試験した。実施例１に記載の水性製剤１００μg／ml、およびその他のキャリアーを含んでなる水性製剤を調製して、表４に列挙している。各製剤を０.２μミリポアミレックス−ＧＶフィルターを通して濾過滅菌した。様々な製剤中のＮＧＦの安定性は、ＮＧＦ製剤をポリプロピレン製ドロップ−チップバイアル中、３７℃でインキュベートすることにより、測定した。２週間後、試料を取り出し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、タンパク質含量について測定した。
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実施例７
凍結乾燥用ＮＧＦ製剤
ＮＧＦ１００μg／ml、スクロース３０mg／ml、マンニトール３０mg／ml、ＨＳＡ ５mg／ml、およびクエン酸０.３mg／mlを含んでなり、ＮaＯＨを用いてｐＨ６.０に調製した水性ＮＧＦ製剤を室温で調製した。総容量の約７０％にクエン酸および糖を溶解した後、ｐＨを調整し、ＨＳＡおよびＮＧＦを十分量の水と一緒に穏やかに撹拌しながら加えて、用量を満たした。
実施例８
ＮＧＦ製剤の凍結乾燥
実施例７の製剤中における水性ＮＧＦの凍結乾燥安定性を試験した。実施例７に従い調製したＮＧＦ製剤１mlずつを、凍結乾燥ストッパーで覆った５mlのＩ型ガラスバイアルに入れた。製剤含有バイアルを、フリージング開始に先立ち、５℃で平衡化したフリーズドライアーチャンバー（ＦＴＳシステム社）中に装填した。次いで、チャンバーの温度を−４０℃に下げた。−４０℃で２時間置いた後、チャンバーを排気して、窒素吹流により圧力を８０ないし１００ミリトルに調節した。最終乾燥温度が２５℃に達するまで、１時間当たり４℃の温度勾配を実施した。その周期で、約３０時間で生成物の１％および２％の間の最終水分含量を達成した。
フリーズドライした粉末を５℃で貯蔵し、３日後室温で、塩化ナトリウム８.７mg／mlおよびクエン酸１.１mg／mlを含んでなる、ｐＨ５.２に緩衝化した希釈剤１mlを用いて再生した。試料をＲＰ−ＨＰＬＣによりＮＧＦ濃度について分析した。凍結乾燥後タンパク質の損失がないことが、観察された。
実施例９
２〜８℃でガラスバイアルに貯蔵した場合のＮＧＦ製剤の安定性研究
rhＮＧＦ １００または１,０００μg／mlを含んでなる水性製剤を、バッチサイズを１.５リットルに増やした以外は、実施例１の方法を用いて調製した。４.２mlずつをブチルゴム、テフロン加工ストッパーの付いたＩ型フリントガラスバイアル中に入れ、２〜８℃で貯蔵した。結果は、下記表５に示したが、タンパク質含量（ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡにより測定）、またはＮＧＦ活性（ＰＣ−１２バイオアッセイにより測定）の有意な損失がないことを示している。
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逆相ＨＰＬＣを用いるＮＧＦの同定および定量
本実施例９において、使用した方法は、下記の通りである：
４〜６mm×２５０mm、バッカーボンド・ワイドポア・ブチル（Ｃ４）３００Åポアサイズ（Ｊ.Ｔ.バッカー社、ニュージャージー州フィリップスバーグ、アメリカ合衆国）、および２１０nmに設定した二極管配列ＵＶ検出器を備えた逆相ＨＰＬＣ（ヒュレット・パッカードＨＰ1090液体クロマトグラフ）を用いて、試料１００μlを分析することにより、ＮＧＦを同定および定量した。移動相は、（Ａ）水中０.２％トリフルオロ酢酸、および（Ｂ）緩衝液（Ａ）中６０％アセトニトリルであり、１１０バールの圧力、周辺温度、流速１.０ml／分で６５分間、勾配を（Ｂ）２９％から（Ｂ）７５％に変えた。
以後、アッセイ法のＨＰＬＣのところで上記した操作を使用した。