(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改良された基質受容を有しかつ  Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  又はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ  （Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼに由来する（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼに於て、位置１２８番目のトリプトファン残基を、アラニン、グリシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基で置き代えることを特徴とする、上記リアーゼ。
【請求項２】
Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又は  Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａから得られる組換え（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼに由来する、請求項１記載の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項３】
組換え（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの配列が完全な形であるか又は切りつめられている、請求項２記載の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項４】
位置１２８番目のトリプトファン残基をアラニン又はフエニルアラニンで置き代える、請求項１記載の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項５】
クイックチェンジサイト−  直接変異誘発キットを用いて、活性中心に至る疎水性チャンネル内で突然変異を行うことを特徴とする、請求項１記載の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを製造する方法。
【請求項６】
（Ｓ）−シアノヒドリンを製造するために、請求項１記載の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを使用する方法。
【請求項７】
脂肪族及び芳香族アルデヒド及びケトンをシアニド基ドナーの存在下に請求項１記載の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと反応させることを特徴とする（Ｓ）−シアノヒドリンの製造方法。
【請求項８】
有機相、水性相又は２−  相系中で又はエマルジョン中で反応を遂行する、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
生物触媒（biological catalyst)による化学反応の実施は、特にこれを使用する領域でますます重要性を増している。その使用の際、酵素に於てしばしば顕著である性質をキラル又はプロキラル成分を用いる反応で２つの対掌体のうちの１つを優先的に変換ことに利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
酵素のこのグループは、ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）族、特にHevea brasiliensis  ＨＮＬ（ＨｂＨＮＬ）及び Manihot esculenta  ＨＮＬ（ＨｅＨＮＬ）を包含する。この２つの酵素は、高い配列同定を示し、“α／βヒドロラーゼ折りたたみ(fold)”タイプのたん白質に属する。このタイプは特徴的な第三折りたたみ及び活性中心としてアスパラギン酸、セリン及びヒスヂジンを含有する、いわゆる触媒三つ組（triad)軸を示す。この際、活性中心は、疎水性チャンネルの内部末端に位置する。
【０００３】
原則として、ＨｂＨＮＬ及びＭｅＨＮＬは、大多数のカルボニル化合物、たとえば脂肪族、脂環式、不飽和、芳香族及びヘテロ芳香族アルデヒド及びケトンを対応する（Ｓ)-シアノヒドリンへ変換するのに適する。ＨＮＬｓは絶えず（Ｓ)-シアノヒドリンを製造するためのバイオ触媒(biocatalyst) としてより一層の重要性を増しているので、種々の試みがその触媒活性及び基質受容を改良するために常になされている。今まで得られているＨＮＬの基質受容は、大きい残基を有する出発化合物の場合満足のいくものではなく、その結果として対応するシアノヒドリンが低い変換率で及び（又は）低い対掌体過剰(enantiomeric excess) で得られる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、改良された基質受容を有する（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
それ故に、本発明は、変えられた基質受容、特に特定の基質の場合に改良された基質受容を有しかつ Hevea brasiliensis 及び Manihot esculentaから得られる（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼに由来する（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼに於いて、活性中心に至る疎水性チャンネル内の大きい(bulky) アミノ酸残基１種又はそれ以上を、それよりも大きくない（less bulky) アミノ酸残基によって置き換えることを特徴とする、上記（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼに関する。
【０００６】
本発明によるＨＮＬは、Hevea brasiliensis（ＨｂＨＮＬ）又は Manihotesculenta （ＭｅＨＮＬ）（Ｓ)-ＨＮＬｓの変異体であり、これは組換えで修飾された微生物、たとえばピチアパストリス(Pichia pastoris) 、サッカロマイセスセレヴィシアエ(Saccharomyces cerevisiaｅ）又は大腸菌(Escherichia coli)から得ることができる(WO 97/03204) 。
【０００７】
この場合、修飾すべき組換えＨＮＬｓは、一部切りつめられている(truncated) 配列を有していてもよく、この配列はたとえば配列中で第一アミノ酸を除くことによって得られる。
【０００８】
変異体は、活性中心に至る疎水性チャンネルを生じるこれらのアミノ酸の変性された配列を有する。
【０００９】
この場合、個々の大きいアミノ酸残基又はいくつかの大きいアミノ酸残基は、それよりも大きくないアミノ酸残基に置き換えられる。
【００１０】
大きいアミノ酸残基としてトリプトファンをこれよりも大きくないアミノ酸残基、たとえばアラニン、グリシン、バリン又はフエニルアラニンで置き換えるのが好ましい。
【００１１】
特に好ましくは、ＨｂＨＮＬ又はＭｅＨＮＬの完全な配列の位置１２８のトリプトファンがアラニン又はフエニルアラニンによって置き換えられている変異体である。
【００１２】
本発明によるＨＮＬｓを、組換えで修飾された微生物、たとえば Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae又は大腸菌中で、たとえば M. Hasslacher等, J. Biol. Chem. 1996, 271, 5884又は Wajant, H. 及び Pfizenmaier, K.1996, J. Biol. Chem. 25830-24834と同様に機能的に過発現させることによって産生する。この変異は、たとえばクイックチェンジサイト- 直接変異誘発キット(Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit ）（Stratagene) を用いて製造業者の仕様書に従って行われる。このクイックチェンジサイト- 直接変異誘発キットは、特定の変異体を産生するのにすぐに使用できるシステムであり、たとえばストラータジーン・クローニング・システム(Stratagene Cloning Systems)、La Jolla, ＣＡ（米国）によって市販されている。
【００１３】
得られたＨＮＬｓを標準法、たとえば Wajant, H. Pfizenmaier, K., J. BiolChem. 1996, 25830-25834 と同様に精製する。
【００１４】
本発明のＨＮＬｓは、従来技術に比して優れた変換率及び（又は）より高い対掌体過剰で（Ｓ)-シアノヒドリンを産生するのに適する。
【００１５】
本発明のＨＮＬｓを、特に脂肪族及び芳香族アルデヒド及びケトンを基質として使用する場合に使用する。
【００１６】
この際、脂肪族アルデヒドは炭素原子２〜２０個を有する飽和又は不飽和の、分枝状又は環状アルデヒドであるのが好ましい。
【００１７】
特に好ましくは、炭素原子４〜１８個を有する飽和又は不飽和分枝状アルデヒドである。
【００１８】
脂肪族及び芳香族アルデヒドは、置換されていないか又は反応条件下に不活性である基、たとえば場合により置換されたアリール- 又はヘテロアリール基、たとえばフエニル基又はインドリル基、又はハロゲン、エーテル、アルコール、アシル、カルボン酸、ニトロ又はアジド基によって置換されていてよい。
【００１９】
適当な脂肪族アルデヒドとして、たとえばヘキサナル、ヘキセナル、ヘプタナル、プロパナル、オクタナル、オクテナル及び２- メチルプロパナルが挙げられる。
【００２０】
適当な芳香族又はヘテロ芳香族基質として、たとえばベンズアルデヒド又は種々に置換されたベンズアルデヒド、たとえば３- フエノキシベンズアルデヒド、４- フルオロ-3- フエノキシベンズアルデヒド、２- クロロベンズアルデヒド、２- ニトロベンズアルデヒド、４- メチルベンズアルデヒド等々が挙げられる。
【００２１】
この基質を本発明のＨＮＬｓの存在下にシアニド基ドナーと反応させる。
【００２２】
適当なシアニド基ドナーは、シアン化水素、アルカリ金属のシアン化物又は一般式
Ｒ1 Ｒ2 Ｃ（ＯＨ)(ＣＮ）          Ｉ
のシアノヒドリンである。
【００２３】
式Ｉに於て、Ｒ1 及びＲ2 は相互に独立して水素又は非置換の炭化水素残基を示すか又はＲ1 及びＲ2 は一緒になって炭素原子４又は５個を有するアルキレン基を示す。但しこの際Ｒ1 及びＲ2 は同時に水素を示さない。炭化水素残基は脂肪族又は芳香族、好ましくは脂肪族基である。Ｒ1 及びＲ2 は炭素原子１〜６個を有するアルキル基を示すのが好ましい。シアニド基ドナーは、アセトンシアノヒドリンであるのが極めて好ましい。
【００２４】
シアニド基ドナーを、公知方法によって製造することができる。シアノヒドリン、特にアセトンシアノヒドリンも市場で入手することができる。
【００２５】
シアン化水素（ＨＣＮ），ＫＣＮ，ＮａＣＮ又はアセトンシアノヒドリンを、シアニド基ドナーとして使用するのが好ましい。但しこの際シアン化水素を使用するのが特に好ましい。
【００２６】
この場合、シアン化水素をその塩、たとえばＮａＣＮ又はＫＣＮのうちの１つから、反応直前に遊離し、物質そのものとして又は溶解された形で反応混合物に
加えることもできる。
【００２７】
反応を有機相、水性相又は２- 相システム中で又はエマルジョン中で実施することができる。
【００２８】
使用される水性相は、本発明のＨＮＬを含有する水溶液又は緩衝液である。この溶液又は緩衝液としては、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等々が挙げられる。
【００２９】
使用される有機希釈剤は、水と混和しないか又はほんの僅かしか混和しない脂肪族又は芳香族炭化水素であってよく、これは場合によりハロゲン化されたアルコール、エーテル又はエステル又はそれらの混合物であってよい。メチルｔ- ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル又は酢酸エチル又はこれらの化合物の混合物を使用するのが好ましい。
【００３０】
この場合、本発明のＨＮＬｓを有機希釈剤中にそのまま又は固定化して存在させることができる。しかし反応を非固定化ＨＮＬを用いて２相系中で又はエマルジョン中で実施することもできる。
【００３１】
【実施例】
次に本発明を例によって説明する。
〔例１〕
位置１２８で変異されたＨｂＨＮＬの産生。
【００３２】
特異変異体を Quik Change TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) を用いて産生する。ＨＮＬたん白質の位置１２８のアミノ酸交換とは別に、制限酵素ＡｃｃIIIに対する切断部位を、サイレント変異によって更に導入する。
【００３３】
次のオリゴヌクレオチドをこの目的のために使用する：
ａ）変異体Ｗ１２８Ａを産生するために：
【００３４】
【配列表】
0004430757.tif 000002
【００３５】
ｂ）変異体Ｗ１２８Ｆを産生するために：
【００３６】
【配列表】
0004430757.tif 000003
【００３７】
Hevea brasiliensis hnl遺伝子のｃＤＮＡを有する組換えプラスミドｐＨＮＬ１０４を変異誘発反応に対する鋳型として使用する(plasmid preparation in analogy with Hasslacher 等. 1996 J. Biol. Chem. 271, 5884)。次いで変異されたプラスミドで大腸菌を形質転換する〔Epicurian Coli (登録商標) XL1 La  Jolla, CA,米国）。
【００３８】
次いでプラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、変異と共に導入されたＡｃｃIII切断部位の存在について制限酵素ＡｃｃIIIで調べる。次いで正のクローンを、位置１２８の所望の変異の存在を立証するために及び望まない変異がｈｎｌ遺伝子の他の領域に導入される可能性を排除できるように、ｈｎｌ  ｃＤＮＡの領域で配列分析に付す。
【００３９】
夫々の変異されたＨＮＬをコードするフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＥCOＲＩによる消化、次いでアガロースゲル電気泳動によって対応するプラスミドから単離する。このフラグメントを発現ベクターｐＨＩＬ- Ｄ２のＤＮＡ  (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA,米国) に連結する。このＤＮＡはＥCOＲＩで線状化され、アルカリホスファターゼで脱ホスホリル化されている。この組換えＤＮＡで大腸菌ＳＵＲＥ（登録商標）（Stratagene clonong Systems, LaJolla, CA.米国) を形質転換する。
【００４０】
プラスミドＤＮＡをもう一度いくつかの形質転換体から産生し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩを用いてｐＨＩＬ- Ｄ２の aoxI プロモーターに対する hnlｃＤＮＡの存在及び（又は）配向について調べる。
【００４１】
適当なクローンからプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで線状化し、次いで電気形質転換(electrotransformation）によって Pichia pastoris  株ＧＳ１１５に導入する。但しその選択は使用される宿主株のヒスチジン栄養要求の相補に対して行われる。この様にして得られた形質転換体を次いで最小メタノール培地上で減数増殖についてテストする。次いでいくつかのこの様なＭｕｔS 形質転換体を、ＨＮＬたん白質を発現するその能力に関してテストし、適する発現株を２つのＨＮＬ変異体の夫々に対して選択する。この処理は、Pichia  発現キット(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA,米国) を用いる説明書中に詳述されている実験と同様に行われる。Pichia pastoris ゲノムへのｈｎｌ  ｃＤＮＡの組込み及び２つの発現株中に特異変異の存在を、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡフラグメントを配列することによって確かめる。Ausubel 等, Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-3, Greene Publishing Associates 及び Wiley-Interscience,ニューヨーク, 1995, に記載された方法を用いて単離された染色体ＤＮＡは、ＰＣＲに対する鋳型として役立つ。ＰＣＲプライマーの配列は次の通りである：
【配列表】
0004430757.tif 000004
0004430757.tif 000005
発現株を醗酵し、変異されたＨＮＬたん白質を Hasslacher 等, 1997, Protein Expression and Purification, 11, 61-71に記載されている様に単離し、精製する。
〔例２〕
位置１２８が変異されたＭｅＨＮＬの産生。
【００４２】
変異をクイックチェンジサイト- 直接変異誘発キット（Stratagene CloningSystems, La Jolla, CA,米国) を用いてｐＱＥ４- ＭｅＨＮＬｗｔに変える。このために２個の相補プライマー──これはＭｅＨＮＬのヌクレオチド３８３- ４３５ (5' AAG CTT TTG GAG TCG TTT CCT GAC GCG AGA GAC ACA GAG TAT TTT ACGTTC AC 3')に相当し、所望の変異（下線部分）を含有する──を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、生じる生成物をＤｐｎｌで処理する。次いで変異されたプラスミドで大腸菌ＸＬ１ブルーを形質転換する。変異体をＴ７ＤＮＡ分析システム(Pharmacia) を用いて Sanger 等(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 米国, 74, 5463-5467 と同様に変化された測定法による配列分析によって確かめる。
〔例３〕
（Ｓ)-３- フエノキシベンズアルデヒドシアノヒドリンの産生。
【００４３】
（Ｓ)-3-フエノキシベンズアルデヒドシアノヒドリン（ＰＢＡＣ）が、ｍ- フエノキシベンズアルデヒド（ＰＢＡ）１０又は５ｍｍｏｌ夫々とＨＣＮ１４．４又は７．７ｍｍｏｌ夫々とｔ- ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）中で、位置１２８がアラニンで置換されているＭｅＨＮＬ  Ｗ１２８Ａ又は組換えＭｅＨＮＬ(J. Hughes等, Arch. Biochem. Biophys. 1994, 311(2), pp. 496-502)又は組換えＨｂＨＮＬ−Ｅｘ．変異体の存在下に反応させることによって得られる。
【００４４】
このために、夫々の場合、酵素液１．３ｍｌ（ＨｂＨＮＬの場合０．２６ｍｌ）を５０ｍｍｏｌクエン酸ナトリウム緩衝液８．３ｍｌ、ｐＨ５．４（ＨｂＨＮＬの場合蒸留水９．７４ｍｌ）で希釈し、その後適量のＰＢＡ（１．９８ｇ／１ｇ）及びＭＴＢＥ３又は１．５ｍｌを加える。次いでアルデヒド０．０６ｍｌ（ＨＣＮ／ｍｌ）を急速に滴加する。反応の経過を、ＩＰモニターを用いてアルデヒド含有量の減少によって追跡する。反応を２時間後停止する。後処理のために、反応液を夫々の場合ＭＴＢＥ２．５ｍｌで希釈し、振とうし、遠心分離する。その結果は表１に示される。
【００４５】
0004430757.tif 000006
*)  １．５時間後
n.d.  測定されなかった
〔例４〕
有機培地中で、Manihot esculenta からの組換えＭｅＨＮＬ（野性型）と変異体ＭｅＨＮＬ  Ｗ１２８Ａの比較。
【００４６】
例３と同様に、酵素３ｍｇ、ニトロセルロース１００ｍｇ（２０ｍｍｏｌクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３．３で調製）、基質１ｍｍｏｌ及びＨＣＮ１５０μｌをジイソプロピルエーテル５ｍｌ中で反応させる。
【００４７】
その結果を表２中に示す。
【００４８】
0004430757.tif 000007
p-HBA  p-ヒドロキシベンズアルデヒド
PPA    フエニルプロピオンアルデヒド
CPA    シクロペンテン-1- イルアセトアルデヒド
BMK    ブチル  メチル  ケトン
BEK    ブチル  エチル  ケトン
〔例５〕
水性緩衝系中で組換えＭｅＨＮＬと変異体ＭｅＨＮＬ  Ｗ１２８Ａを比較。
【００４９】
例３と同様に、０．５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液２．５ｍｌ中に基質０．５ｍｍｏｌと共にある酵素１．２ｍｇをＫＣＮ  １ｍｍｏｌと０．５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液３．５ｍｌ、ｐＨ３．８中で反応させる。
【００５０】
その結果を表３中に示す。
0004430757.tif 000008