(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
19-23 核酸塩基長である化学的に修飾されたかまたは非修飾の二本鎖核酸化合物を含む化合物であって、第一鎖が、配列番号17、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、59、61、65、67、69、73、および81からなる群から選択されるポリヌクレオチドの少なくとも 19の連続する核酸塩基を有し、第二鎖が該第一鎖に対して100%相補的である化合物。
【請求項２】
平滑末端であるか、または、各鎖の各3'末端に二本鎖核酸化合物において3'オーバーハングとして作用するデオキシチミジンダイマーを有する請求項1の化合物。
【請求項３】
糖、核酸塩基、またはインターヌクレオシド結合に対して少なくとも１つの化学修飾を含む請求項1または2の化合物。
【請求項４】
糖に対する各化学修飾が2’ 修飾である請求項 3の化合物。
【請求項５】
各2’ 糖修飾が、2’-O-メトキシエチル (2’-MOE)、2’-O-メチル、ロックされた核酸 (LNA)および2’-フルオロからなる群から独立して選択される請求項 4の化合物。
【請求項６】
糖に対する化学修飾が4’チオである請求項 3の化合物。
【請求項７】
少なくとも１つのインターヌクレオシド結合修飾を含む請求項3-6のいずれかの化合物。
【請求項８】
少なくとも１つのホスホロチオエート結合および少なくとも１つのホスホジエステル結合を含む請求項 7の化合物。
【請求項９】
第一鎖が配列番号81からなる請求項1の化合物。
【請求項１０】
化合物が二本鎖核酸化合物において3’オーバーハングとして作用するデオキシチミジンダイマーを各鎖の各3’末端に有する請求項9の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はスルビビン発現を調節する組成物および方法を提供する。特に、本発明はアンチセンス化合物、具体的にはヒトスルビビンをコード化する核酸とのハイブリッド形成が可能な二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。このようなオリゴヌクレオチドは、スルビビン発現を調節することが証明されている。
【０００２】
（発明の背景）
癌性細胞の顕著な特徴は無制限に増殖することである。腫瘍と正常細胞の違いとして、アポトーシスとしても知られるプログラム細胞死のプロセスに対する抵抗力が確認されている（アンブロシーニ（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ）ら、ネイチャーメディスン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、１９９７、３、９１７-９２１）。アポトーシスは、多細胞生物が細胞の無制限増殖を避け、疾患細胞、有害細胞、または必要でなくなった細胞を排除するために発達させたプロセスである。アポトーシスのプロセスは、タンパク質分解酵素およびＤＮＡエンドヌクレアーゼの協奏的作用を通じて細胞がその内部から分解され、その結果アポトーシス体が形成され、その後スカベンジャー細胞によってアポトーシス体が除去されるという多段階カスケードを含む。今日までの研究で、大部分の細胞内分解が、アスパラギン酸塩の残基付近で開裂するタンパク質分解酵素群系カスパーゼの作用を通じて行われることが証明されている（コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、バイオケミストリージャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９７、３２６、１-１６）。
【０００３】
大部分の腫瘍細胞が当該アポトーシスプロセスに対する抵抗力を示すという発見は、腫瘍細胞が有するアポトーシスに対する抵抗力の軽減を目的とした治療方針が腫瘍細胞の拡散を止めるための新規手段となり得るという見解につながった（アンブロシーニ（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ）ら、ネイチャーメディスン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、１９９７、３、９１７-９２１）。腫瘍細胞がアポトーシスに対する抵抗力を獲得すると考えられる機構の１つは、これは近年、ＩＡＰ（アポトーシス阻害剤）カスパーゼ阻害剤系に属するとされたスルビビンの過剰発現によるものである。今日まで、スルビビンの過剰発現は肺、大腸、膵臓、前立腺、乳房および胃の腫瘍、非ホジキンリンパ腫、および神経芽細胞腫にて検出されている（アディダ（Ａｄｉｄａ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１９９８、３５１、８８２-８８３；アンブロシーニ（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ）ら，ネイチャーメディスン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、１９９７、３、９１７-９２１；ルー（Ｌｕ）ら、キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、１９９８、５８、１８０８-１８１２）。神経芽細胞腫において詳細な分析が行われた。ここで、スルビビンの過剰発現が、予後不良と関係することで知られている腫瘍組織学で区別されることが発見された（アディダ（Ａｄｉｄａ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１９９８、３５１、８８２-８８３）。最後にアンブロシーニ（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ）らは、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体１（ＥＰＲ-１）をコード化するヒトｃＤＮＡの７０８ｎｔフラグメントを含む発現ベクターを持つＨｅＬａ細胞のトランスフェクションについて記述している。そのフラグメントのコード配列は、スルビビンのコード鎖に対して相補的である（アンブロシーニ（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．）、１９９８、２７３、１１１７７-１１１８２）。この構造が細胞生存性の減少をもたらした。
【０００４】
最近、スルビビンが細胞周期の制御に関与していることが発見された。スルビビンは制御された細胞周期のＧ２／Ｍ期に発現し、紡錘体の微小管と関係することが分かった。この相互作用の崩壊によって、スルビビンの抗アポトーシス機能が失われ、有糸分裂中のカスパーゼ-３活性が増加する。カスパーゼ-３はアポトーシス細胞死と関連する。そのため、スルビビンはＧ２／Ｍ期におけるアポトーシスのデフォルト帰納推論に対抗する可能性があると考えられている。また癌におけるスルビビンの過剰発現がこのアポトーシスチェックポイントを超え、癌細胞が不要に残存し、分裂する可能性があるとも考えられている。アンブロシーニ（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ）によるスルビビンアンチセンス構造は、ＨｅＬａ細胞にある内因性スルビビンを下方制御し、Ｇ２／Ｍ期における細胞内のカスパーゼ-３依存アポトーシスを増加させることが発見された。リー（Ｌｉ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９８、３９６、５８０-５８４。
【０００５】
多くの種において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入が強力且つ特異的な遺伝子の発現抑制を誘発する。この現象は、植物においても動物においても生じ、ウイルス防御機構およびトランスポゾンの発現抑制機構に関与する（ヨルゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）ら、植物分子生物学（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９９６、３１、９５７-９７３；ナポリ（Ｎａｐｏｌｉ）ら、植物細胞（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ）、１９９０、２、２７９-２８９）。
【０００６】
ｄｓＲＮＡが動物における遺伝子の発現抑制につながるという第一の証拠は、シノラブディスエレガンスという線虫の研究に由来する。この研究において、ｄｓＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の混合体）を供給、浸漬、または注入することによって、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを単独で注入するよりも格段に効果的に発現抑制が行われることが証明されている（クオ（Ｇｕｏ）および（Ｋｅｍｐｈｕｅｓ）、セル（Ｃｅｌｌ）、１９９５、８１、６１１-６２０；ファイア（Ｆｉｒｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３９１：８０６-８１１（１９９８）；モンゴメリー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）ら、全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９５：１５５０２-１５５０７（１９９８）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／３２６１９；（ファイア（Ｆｉｒｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９８、３９１、８０６-８１０；ティモンズ（Ｔｉｍｍｏｎｓ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２００１、２６３、１０３-１１２；ティモンズ（Ｔｉｍｍｏｎｓ）およびファイア（Ｆｉｒｅ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９８、３９５、８５４）。以降、該現象は、キイロショウジョウバエ（ケネデル（Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）９５：１０１７-１０２６（１９９８））およびマウス胚（ウィアニー（Ｗｉａｎｎｙ）ら、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）２：７０-７５（２０００））を含む多くの生物で見られている。
【０００７】
この転写後の遺伝子発現抑制現象は「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」と呼ばれ、一般にターゲットｍＲＮＡの分解を介して遺伝子発現を配列特異的に低下させるｄｓＲＮＡが関わる遺伝子発現抑制プロセスを意味するようになっている（タッシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら、遺伝子と発生（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）、１９９９、１３、３１９１-３１９７）。
【０００８】
３’オーバーハングを持つ２１-および２２-ｎｔ  ｄｓＲＮＡフラグメントはＲＮＡｉの標準配列特異的メディエーターであることが証明されている。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるこれらのフラグメントは、長鎖ｄｓＲＮＡからのＲＮａｓｅIII様処理反応によって生成される。化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、当該ｓｉＲＮＡの誘導鎖によってつながれた領域の中心近くに位置する開列部位を用いて、効率的なターゲットＲＮＡ開裂も仲介する。（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００１、４１１、４９４-４９８）。２１-２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡによって生じる内因性および異種遺伝子の発現抑制の特性は、ヒト胚腎臓（２９３）およびＨｅＬａ細胞（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、遺伝子と発生（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、２００１、１５、１８８-２００）を含む複数の哺乳類細胞系において調査されている。
【０００９】
近年、一本鎖ＲＮＡオリゴマー（ｓｓＲＮＡｉまたはａｓＲＮＡ）のアンチセンス極性が遺伝子発現抑制の強力な誘導因子となり得ること、また一本鎖オリゴマーが最終的にＲＮＡｉ現象に関与することが示されている（タイスターマン（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２、２９５、６９４-６９７）。
【００１０】
ここに参照することにより組み込まれる米国特許５，８９８，０３１および６，１０７，０９４は、それぞれＲＮＡ様特性を持つ特定のオリゴヌクレオチドについて記述している。ＲＮＡとハイブリッド形成する場合、これらのオリゴヌクレオチドは、ｄｓＲＮａｓｅ酵素によって生じるＲＮＡの開裂部分を持つｄｓＲＮａｓｅ酵素の基質として機能する（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）、２０００；クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）、１９９９）。
【００１１】
アポトーシス、およびスルビビン発現が多様な腫瘍細胞型に対する成長促進において果たすと考えられる役割の理解におけるこれらの進展の結果として、スルビビンの発現を調節できる組成物を提供することが切に望まれている。動物においてスルビビンをコード化する核酸の診断薬および検出方法を提供することも強く望まれている。また、スルビビン発現から生じる症状の診断および処置方法の提供も望まれている。さらに、スルビビンをコード化する核酸を検出および研究するための改良された研究キットおよび試薬も求められている。従って、本発明は一群のスルビビン新規阻害剤、それらの化合物を含む組成物、およびその化合物の使用方法を提供する。
【００１２】
（発明の要約）
本発明はオリゴマー化合物、特にスルビビンをコード化する核酸をターゲットとし、スルビビンの発現を調節する一本鎖および二本鎖アンチセンス化合物を対象とする。幾つかの実施態様において、当該アンチセンス化合物はオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施態様において、当該オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（主にＲＮＡまたはＲＮＡ様）である。他の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ  Ｈオリゴヌクレオチド（主にＤＮＡまたはＤＮＡ様）である。さらに他の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されていてもよい。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および他の組成物も提供される。さらに、細胞または組織を、１つまたは複数の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記細胞または組織におけるスルビビンの発現を調節する方法も提供される。さらに、スルビビンの発現に関連する病気または症状を持つ、またはそれらが起こりやすいと疑われる動物、特にヒトを、治療上または予防上効果のある量の１つまたは複数の本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与することによって処置する方法も提供する。別の実施態様において、本発明は、ここに開示する任意且つすべての病状について処置するための医薬物の製造に使用するために、本発明の化合物を提供する。
【００１３】
当該疾病または状態は増殖性の強い状態となり得る。ある実施態様において、増殖性の強い状態とは癌である。
【００１４】
本発明のオリゴマー化合物は、スルビビンの発現または過剰発現の阻害剤である。これらの化合物はスルビビンの発現または過剰発現の効果を阻害するため、当該化合物はスルビビン活性に関連する疾患の処置に有効である。従って、本発明の化合物は抗腫瘍薬である。
【００１５】
本化合物は、中枢神経系新生物（多形成グリア芽細胞腫、星状細胞腫、希突起膠腫、上衣および脈絡叢腫瘍、松果体部腫瘍、神経細胞腫瘍、髄芽腫、神経鞘腫、髄膜腫、髄膜肉腫）、眼の新生物（基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽腫）、内分泌腺新生物（下垂体新生物、甲状腺新生物、副腎皮質新生物、神経内分泌形新生物、胃腸膵管内分泌系新生物、生殖腺新生物）、頭部および頸部新生物（頭部および頸部癌、口腔、咽頭、喉頭、歯原性腫瘍）、胸部新生物（大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸部新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸部の第一胚細胞腫瘍）、消化管新生物（食道新生物、胃新生物、肝臓新生物、胆嚢新生物、膵臓外分泌線新生物、小腸新生物、完全型虫垂および腹膜、大腸および直腸腺癌、肛門新生物）、尿生殖路新生物（腎細胞腫瘍、腎盂および尿管新生物、膀胱新生物、尿道新生物、前立腺新生物、陰茎新生物、睾丸新生物）、女性生殖器新生物（外陰および膣新生物、頸部新生物、子宮体腺癌、卵巣癌、婦人科肉腫）、乳房新生物、皮膚の新生物（基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、皮膚線維肉腫、マーケル細胞腫瘍、悪性黒色腫、骨および軟組織新生物（骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、血管肉腫）、細網内皮系新生物（骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ＨＴＬＶ-１およびＴ-細胞白血病／リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞白血病）、および子供の新生物（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎腫瘍）等、の癌腫処置に有効であると考えられる。
【００１６】
従って、ある実施態様において、本発明は、効果のある量のスルビビンに関する一本鎖（ｓｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡｉまたはａｓＲＮＡ）または二本鎖（ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドを動物、特にヒトに投与することを含む感受性新生物の処置方法を提供する。当該ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、修飾しても未修飾でもよい。つまり、本発明はスルビビンを対象とした二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはその医薬組成物の使用、また感受性新生物の処置を提供する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、単離された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの化合物をスルビビンの発現または過剰発現を抑制するための薬剤製造における使用を提供する。従って、本発明は、上記の方法による感受性新生物の処置用医薬物の製造におけるスルビビンを対象とする単離された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００１８】
本発明の化合物は、特に膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、腎臓癌、グリア芽細胞腫、および非ホジキンリンパ腫の処置に有効である。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、アポトーシスの減少を特徴とする病気または症状を持つ動物、特にヒトの処置方法である。治療上効果のある量の８から８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を患者に投与する方法を含む。このアンチセンス化合物は、スルビビンの発現が抑制されるようにヒトスルビビンをコード化する核酸分子を標的とする。
【００２０】
本発明は、細胞と８から８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を接触させることを含む細胞内のアポトーシス調節方法も提供する。このアンチセンス化合物は、アポトーシスが調節されるようにヒトスルビビンをコード化する核酸分子を標的とする。
【００２１】
本発明のさらに別の実施態様は、細胞と８から８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を接触させることを含む細胞内の細胞質分裂調節方法である。このアンチセンス化合物は、細胞質分裂が調節されるようにヒトスルビビンをコード化する核酸分子を標的とする。
【００２２】
本発明は、細胞と８から８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を接触させることを含む細胞周期調節方法も提供する。このアンチセンス化合物は、細胞周期が調節されるようにヒトスルビビンをコード化する核酸分子を標的とする。
【００２３】
さらに別の本発明の実施態様において、細胞を有効量の８から８０核酸塩基長のアンチセンス化合物と接触させることを含む細胞増殖抑制方法が提供される。このアンチセンス化合物は、細胞の増殖が抑制されるようにヒトスルビビンをコード化する核酸分子を標的とする。ある実施態様において、該細胞は癌細胞である。さらに該方法は、患者への化学療法薬の投与を含む。
【００２４】
さらに別の実施態様において、細胞を有効量の８から８０核酸塩基長のアンチセンス化合物と接触させることを含む増殖性の強い細胞のアポトーシス調節方法が提供される。このアンチセンス化合物は、細胞のアポトーシスが調節されるようにヒトスルビビンをコード化する核酸分子を標的とする。ある実施態様において、細胞は増殖性の強い細胞であり、アポトーシスは該アンチセンス化合物によって強化される。別の実施態様において、アポトーシスの調節はアポトーシス刺激に対して感作性を持つ。ある実施態様において、アポトーシス刺激は細胞毒性の化学療法薬である。さらに当該方法は、細胞を化学療法薬と接触させることを含み得る。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、二本鎖および一本鎖オリゴマーアンチセンス化合物、特にＲＮＡまたはＲＮＡ様の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、およびＤＮＡまたはＤＮＡ様の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを、スルビビンをコード化する核酸分子の機能の調節、ひいては生成されるスルビビン量の調節に使用する。これは、特にスルビビンをコード化する１つまたは複数の核酸とハイブリッド形成するアンチセンス化合物を提供することによって実現できる。ここで使用する「ターゲット核酸」および「スルビビンをコード化する核酸」という用語は、スルビビンをコード化するＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体およびｍＲＮＡまたはその一部を含む）、またそのようなＲＮＡから派生するｃＤＮＡを含む。オリゴマー化合物とその相補的なセンス方向ターゲット核酸と特異的なハイブリッド形成は、核酸の正常機能に干渉する。ターゲット核酸を特異的にハイブリッド形成する化合物によるターゲット核酸の機能調節を一般に「アンチセンス」といい、かかる化合物はターゲットに関して「アンチセンス方向」にあると表現することができる。
【００２６】
干渉されるＤＮＡの機能には複製および転写が含まれる。干渉されるＲＮＡの機能には、例えばタンパク質翻訳部位への該ＲＮＡの転座、該ＲＮＡからのタンパク質翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を産生するためのＲＮＡスプライシング、および当該ＲＮＡに関与する触媒作用または当該ＲＮＡによって促進される触媒作用が含まれる。このようなターゲット核酸機能の干渉がもたらす全体的な影響は、当該ＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルでのスルビビン発現の調節である。本発明との関係において、「調節」とは当該発現の増加（刺激）または減少（抑制）のいずれかを意味する。本発明との関係において、抑制は遺伝子発現を調節する望ましい形態であり、ＲＮＡ、および幾つかの実施態様においてはｍＲＮＡが適切なターゲットとなる。
【００２７】
アンチセンスに特異的な核酸を標的とすることが適切である。本発明との関係において、特定の核酸に対するアンチセンス化合物の「ターゲッティング」は、多段階のプロセスである。通常、当該プロセスは機能が調節される核酸配列の同定から始まる。これは、例えばその発現が特定の疾病または病状と関連する細胞遺伝子（または当該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または病原菌からの核酸分子である。本発明において、該ターゲットはスルビビンをコード化する核酸分子である。該ターゲッティングプロセスには、この遺伝子内に望ましい効果、例えば該ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現の検出または調節が結果として得られるように、アンチセンス相互作用を生じさせる１つまたは複数の部位を決定することも含まれる。本発明との関係において、１つの遺伝子内部位は、当該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において、翻訳開始コドンは主に５’-ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子内；対応するＤＮＡ分子における５’-ＡＴＧ）であるため、当該翻訳開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。ＲＮＡ配列５’-ＧＵＧ、５’-ＵＵＧ、および５’-ＣＵＧを持つ翻訳開始コドンを含む遺伝子はごく少数であるが、翻訳開始コドン５’-ＡＵＡ、５’-ＡＣＧ、および５’-ＣＵＧは生体内で機能することが証明されている。従って、各例の開始アミノ酸は主に（真核生物において）メチオニンまたは（原核生物において）ホルミルメチオニンであるが、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、多くのコドン配列を含むことができる。真核および原核遺伝子が２つ以上の代替開始コドンを有してよく、そのいずれかを特定細胞型または組織、あるいは特定の条件下で選択的に翻訳開始に使用してよいということも、当該技術分野において周知である。本発明との関係において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、かかるコドンの配列に関係なく、スルビビンをコード化する遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するために生体内で使用される１つまたは複数のコドンを意味する。
【００２８】
また、遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）が５’-ＵＡＡ、５’  -ＵＡＧ、５’-ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’-ＴＡＡ、５’-ＴＡＧ、および５’-ＴＧＡ）の３配列のうち１つを持つことがあることも当該技術分野で周知である。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、ｍＲＮＡまたは遺伝子が約２５から５０の連続ヌクレオチドを翻訳開始コドンからの一方向（５’または３’）に含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を示す。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、ｍＲＮＡまたは遺伝子が約２５から５０の連続ヌクレオチドを翻訳終止コドンからの一方向（５’または３’）に含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を示す。
【００２９】
当該技術分野において周知のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コーディング領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を示し、効果的なターゲット領域でもある。他のターゲット領域は５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む。この未翻訳領域は、当該技術分野において翻訳開始コドンから５’方向にあるｍＲＮＡの一部を示すことが知られている。よって、５’キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンの間にあるヌクレオチド、または遺伝子上で対応するヌクレオチド、および３’未翻訳領域（３‘ＵＴＲ）を含む。当該３’未翻訳領域は、当該技術分野において翻訳終止コドンから３’方向にあるｍＲＮＡの一部を示すことが知られている。このため、翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３’端の間にあるヌクレオチド、または遺伝子上で対応するヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡの当該５’キャップは、５’-５’三リン酸塩結合によってｍＲＮＡの最も５’側のほとんどの残基と結合されるＮ７-メチル化グアノシン残基で構成される。ｍＲＮＡの当該５’キャップ領域は、当該キャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドとともに５’キャップ構造自体を含むと考えられる。当該５’キャップ領域は、有効なターゲット領域でもあり得る。
【００３０】
真核性のｍＲＮＡ転写物には直接翻訳されるものもあるが、多くは「イントロン」として知られる１つまたは複数の領域を含む。この領域は翻訳される前に転写物から削除される。「エクソン」として知られる残りの領域（およびその結果翻訳された領域）がともにスプライスされ、連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位（すなわち、イントロン-エクソン接合部）はターゲット領域でもあり、病気において異常なスプライシングに影響される部位、または病気において特定のｍＲＮＡスプライス生成物が過剰生産される部位において特に有効である。
【００３１】
１つまたは複数のターゲット部位が識別されると、ターゲットに対して十分に相補的な（すなわち、十分にハイブリッド形成し、十分な特異性を持つ）アンチセンスオリゴマー化合物、主にアンチセンスオリゴヌクレオチドが選択され、望ましい効果が得られる。
【００３２】
本発明との関係において、「ハイブリダイゼーション」は水素結合を意味する。これは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ-Ｃｒｉｃｋ）型、フーグスティン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型または逆フーグスティン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型水素結合である。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的な核酸塩基である。ここで使用する「相補的」とは、２つのヌクレオチドが正確に対合する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置におけるヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同位置にあるヌクレオチドと水素結合することができる。従って、当該オリゴヌクレオチドと当該ＤＮＡまたはＲＮＡはその位置で互いに相補的であると考えられる。当該オリゴヌクレオチドと当該ＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子における十分な数の対応位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドにおって占められている場合、互いに相補的である。よって、「特異的にハイブリッド形成可能な」および「相補的な」という表現は、当該オリゴヌクレオチドと当該ＤＮＡまたはＲＮＡターゲットの間で安定した特異的な結合が生じるような十分な相補性または正確な対合を示すために使用される。当該技術分野において、アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリッド形成可能であるために、そのターゲット核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが理解されている。アンチセンス化合物は、当該化合物とターゲットＤＮＡまたはＲＮＡ分子との結合がターゲットＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を干渉することによって、その機能が完全または部分的に喪失する場合、また特異的な結合が望まれる条件下（すなわち、治療上の処置における生理条件下、または生体外または生体内検査が実施される条件下）において、当該アンチセンス化合物と非ターゲット配列の非特異的結合を回避するのに十分な相補性がある場合に、特異的なハイブリッド形成が可能である。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベントに関与しないよう１つまたは複数のセグメントでハイブリッド形成することができる（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）。本発明の化合物は、標的となるターゲット核酸配列内のターゲット領域に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列相補性を持つ。例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基中１８の核酸塩基がターゲット領域に対して相補性を持つアンチセンス化合物は、特異的にハイブリッド形成し、９０％の相補性を示す。この例において、残りの非相補的な核酸塩基は相補的な核酸塩基とともにクラスタ化または分散されることができ、互いに隣接または相補的な核酸塩基に隣接する必要はない。このように、ターゲット核酸と完全相補の２領域に挟まれた４つの非相補的核酸塩基を持つ１８核酸塩基長のアンチセンス化合物は、ターゲット核酸と全体で７７．８％の相補性を示し、よって本発明の範囲に含まれる。
【００３３】
ターゲット核酸領域を有するアンチセンス化合物の相補率は、通常ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカル配列検索ツール）および当該技術分野において周知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、分子生物学ジャーナル（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９９０、２１５、４０３-４１０；チャン（Ｚｈａｎｇ）およびマッデン（Ｍａｄｄｅｎ）、ゲノムリサーチ（Ｇｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）、１９９７、７、６４９-６５６）を使用して判別できる。相同性率、配列同一性率、または相補性率は、例えばギャップ（Ｇａｐ）プログラム（ウィスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ユニバーシティ・リサーチ・パーク、ウィスコンシン州マディソン）で、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（上級応用数学（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．）、１９８１、２、４８２-４８９）のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を用いて決定できる。幾つかの実施態様において、当該アンチセンス化合物とターゲット間の相同性、配列同一性または相補性は約５０％から６０％の間である。当該アンチセンス化合物とターゲット間の相同性、配列同一性または相補性が約６０％から７０％の間である実施態様もある。当該アンチセンス化合物とターゲット間の相同性、配列同一性または相補性が約７０％から８０％の間である実施態様もある。当該アンチセンス化合物とターゲット間の相同性、配列同一性または相補性が約８０％から９０％の間である実施態様もある。幾つかの実施態様では、相同性、配列同一性または相補性が約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【００３４】
アンチセンス化合物は、一般に試験薬および診断薬として使用される。例えば、優れた特異性を持ち、遺伝子発現を抑制できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば当業者が特定遺伝子の機能を解明する場合に使用される。アンチセンス化合物は、例えば生物学的経路の様々な構成要素の機能を区別する際にも使用される。そのため、アンチセンス調節は研究のために利用されてきた。
【００３５】
短鎖合成オリゴヌクレオチドのそばに存在する複数の機構を使用して、哺乳類細胞における遺伝子発現を調節できる。一般に活用されるアンチセンス機構は標的となるＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ-依存的分解である。ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ鎖を加水分解しながらアンチセンスＤＮＡ-ＲＮＡヘテロ二本鎖を認識する普遍発現エンドヌクレアーゼである。さらにアンチセンス機構は、ＲＮＡ-ＲＮＡ二本鎖の開裂部に触媒作用を及ぼす酵素の利用を含む。これらの反応は、ＲＮＡｓｅIIIおよびＲＮＡｓｅ  Ｌを含むがこれらに限定されない一群のＲＮＡｓｅ酵素によって触媒される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる当該アンチセンス機構は、ＲＮＡ-ＲＮＡハイブリッド上などで作用する。
【００３６】
ＲＮａｓｅ  Ｈ-ベースのアンチセンス（通常は一本鎖化合物を使用する）およびＲＮＡ干渉（通常はｓｉＲＮＡとして知られる二本鎖化合物を使用する）はともにアンチセンス機構であり、主にターゲットＲＮＡの機能を喪失させる。
【００３７】
最適化されたｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅ  Ｈ-依存的オリゴマー化合物は、効力、最大効果、特異性および作用の持続時間、効率性の点において同様に振る舞う。さらに、ｄｓＲＮＡの活性が一般に、同一部位を標的とするＲＮａｓｅ  Ｈ-依存的一本鎖アンチセンス化合物の活性と相関して構成されることが示されている。主な例外としては、ＲＮａｓｅ  Ｈ-依存的アンチセンス化合物が一般に、ｍＲＮＡ前駆体におけるターゲット部位に対してアクティブであるが、ｓｉＲＮＡにおいてはアクティブでないことが挙げられる。
【００３８】
これらのデータは、一般にＲＮａｓｅ  Ｈ-依存的オリゴヌクレオチドでアクティブでなかったターゲットＲＮＡ上の部位がｓｉＲＮＡにとっても同様に好ましい部位でなかったことを示唆している。反対に、アクティブなＲＮａｓｅ  ＨオリゴヌクレオチドとｓｉＲＮＡの間に十分な相関関係が発見された。これは、ＲＮａｓｅ  Ｈオリゴヌクレオチドに対するハイブリッド形成に部位が使用可能である場合、その部位がｓｉＲＮＡ複合体によるハイブリッド形成および分割にも使用可能であることを示唆している。結果的に、適切なターゲット部位がアンチセンスアプローチのいずれか一方によって決定されると、これらの部位を代替アンチセンス機構によって作用する構成物の設計に使用することができる（ビッカーズ（Ｖｉｃｋｅｒｓ）ら、２００３、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎａ．）２７８、７１０８）。さらに、部位がＲＮＡｉまたはＲＮＡｓｅ  Ｈオリゴヌクレオチドのいずれかに対してアクティブであることが示されると、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｓｓＲＮＡｉまたはａｓＲＮＡ）を設計することができる。
【００３９】
本発明の幾つかの実施態様においては、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが適切である。これらの二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡまたはＲＮＡ様であり、修飾しても未修飾でもよい。修飾する場合、当該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド形成およびｄｓＲＮａｓｅの採用および（活性化）特性を保持する。他の実施態様において、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＲＮＡｉまたはａｓＲＮＡ）はＲＮＡ様である。
【００４０】
本発明の他の実施態様においては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが適切である。幾つかの実施態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドは「ＤＮＡ様」であってよく、その場合当該オリゴヌクレオチドは、例えばチオリン酸など複数の未修飾２’Ｈまたは安定した骨格を含む十分に特徴的な構造機能を持つ。つまり、構造的にターゲットオリゴヌクレオチドとの相互作用およびＲＮａｓｅの採用および（活性化）に適している。
【００４１】
オリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の一形態であるが、本発明は以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体を含むがこれに限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に記載の化合物は、約８から８０の核酸塩基で構成できる。別の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドは約１０から５０ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドは１２から３０ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドは１２から２４ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドは１９から２３ヌクレオチド長である。幾つかの実施態様は、スルビビンの発現を抑制するオリゴマー化合物配列の少なくとも８核酸塩基部分で構成される。スルビビンを対象とするｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子、およびスルビビンｍＲＮＡ発現におけるそれらの使用も本発明の範囲内の実施態様である。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、異なる塩基が当該オリゴヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチド位置に存在する変異体も含む。例えば、第一ヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン（またはＲＮＡの場合ウリジン）、グアノシンまたはシチジンを含む変異体が生成される可能性がある。これは、当該オリゴヌクレオチドの任意の位置で行われる。従って、２０量体部分は６０の変異体（２０位置ｘ各位置に３つの代替物）で含めてもよい。ここで、元のヌクレオチドは３つの代替ヌクレオチドと置き換えられる。その後、これらのオリゴヌクレオチドは、ここに記載する方法を使用してテストされ、スルビビンｍＲＮＡの発現を抑制する能力が判定される。
【００４３】
オリゴマー化合物
本発明との関連において、「オリゴマー化合物」という用語は核酸分子の領域に対してハイブリッド形成できるポリマー構造を示す。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、およびこれらのキメラ化合物を含む。オリゴマー化合物は、通常線形に生成されるが、結合するか、または円状に生成することができ、また分岐を含んでもよい。オリゴマー化合物は二本鎖構造、例えば、二本鎖化合物を形成するようにハイブリッド形成された二本の鎖、あるいは完全または部分的な二本鎖化合物のハイブリッド形成および形成に十分な自己相補性を持つ一本鎖を含む。本発明の一実施態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を包含する。ここで使用する「ｓｉＲＮＡ」は、第一鎖および第二鎖を持つ二本鎖化合物として定義され、前記第一鎖、第二鎖の間に中央相補部を備え、前記第一鎖、第二鎖の間またはターゲットｍＲＮＡと任意の相補性を持つ末端部を備える。各鎖は、約８から約８０核酸塩基長、１０から５０核酸塩基長、１２から３０核酸塩基長、１２から２４核酸塩基長または１９から２３核酸塩基長であってよい。当該中央相補部位は、約８から約８０核酸塩基長、１０から５０核酸塩基長、１２から３０核酸塩基長、１２から２４核酸塩基長または１９から２３核酸塩基長であってよい。末端部分は、１から６核酸塩基長となる。当該ｓｉＲＮＡは末端部を持たなくてもよい。ｓｉＲＮＡの二本の鎖は、フリーな３’または５’末端を残して内的に結合するか、または連続的なヘアピン構造またはループを形成するように結合できる。当該ヘアピン構造は、一本鎖形質を延長して、５’または３’末端のいずれかにオーバーハングを含んでよい。
【００４４】
本発明の一実施態様において、二本鎖アンチセンス化合物は標準ｓｉＲＮＡである。ここで使用する「標準ｓｉＲＮＡ」という用語は、それぞれ２１核酸塩基長であり、１９以上の核酸塩基が相補的である第一鎖および第二鎖を持つ二本鎖オリゴマー化合物、および各鎖の３’末端に二本鎖化合物が３’オーバーハングとして作用するデオキシチミジン二量体（ｄＴｄＴ）を持つ二本鎖オリゴマー化合物として定義される。
【００４５】
別の実施態様において、当該二本鎖アンチセンス化合物は、平滑末端ｓｉＲＮＡである。ここで使用する「平滑末端ｓｉＲＮＡ」は、末端オーバーハングを持たないｓｉＲＮＡとして定義される。つまり、当該二本鎖化合物の少なくとも一端が平滑である。標準ｓｉＲＮＡでも平滑ｓｉＲＮＡでも、ｄｓＲＮＡｓｅ酵素を発現させるように作用し、当該ＲＮＡｉアンチセンス機構の採用または作動を誘発する。さらに別の実施態様において、当該ＲＮＡｉアンチセンス機構を介して作用する一本鎖ＲＮＡｉ（ｓｓＲＮＡｉ）化合物が検討されている。
【００４６】
さらに、当該二本鎖化合物は修飾することができ、また１つの末端、選択された核酸塩基位置、糖位置、またはインターヌクレオシド結合の１つに接触する結合グループを含んでよい。代わりに、二本の鎖を非核酸部分またはリンカーグループを介して連結することができる。一本の鎖のみで形成した場合、ｄｓＲＮＡは複製を形成するために自分で折り返す自己相補ヘアピン型分子の形態をとる。従って、ｄｓＲＮＡは完全または部分的に二本鎖である。二本の鎖または自分で折り返す自己相補ヘアピン型分子の形態をとって複製を形成する一本鎖から形成する場合、二本の鎖（または一本鎖の複製形成領域）はワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ-Ｃｒｉｃｋ）型の塩基対である相補的ＲＮＡ鎖である。
【００４７】
一般に、オリゴマー化合物は連結グループと結合される単量体サブユニットの骨格を構成する。ここで、結合された単量体サブユニットは、それぞれ直接的または間接的に複素環塩基部分に接触する。オリゴマー化合物は、複素環塩基部分に連結しない単量体サブユニットを含んでもよく、それによって脱塩基部位を提供する。ヘミマー、ギャップマーおよびキメラを含む多様なモチーフを生じさせて、オリゴマー化合物を構成する連続ユニットの１つを修飾することができる。
【００４８】
当該技術分野において周知のように、ヌクレオシドは複素環塩基部分に結合する糖部分から構成される。このような複素環塩基の最も一般的な２つの群は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、さらに当該ヌクレオシドの糖部分と共有結合しているリン酸基を含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドの場合、より一般的な３’、５’-インターヌクレオシド結合またはそれほど一般的でない２’５’-インターヌクレオシド結合によって、リン酸基を糖の２’、３’または５’ヒドロキシル基のいずれかに連結させることができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドの糖部分と共有結合する。各末端はハイブリッド形成または共有結合の形成によって、円形構造を形成するように結合することができる。さらに、線系の化合物は内部核酸塩基相補性を持ち、そのため完全または部分的に二本鎖の化合物を製造する方法で折り重なってよい。オリゴヌクレオチド内で、当該リン酸基は一般的にインターヌクレオシド結合を形成するか、または糖環と連結して当該オリゴヌクレオチドの骨格を形成するとされている。ＲＮＡおよびＤＮＡの骨格を構成する正常なインターヌクレオシド結合は、３’から５’ホスホジエステル結合である。しかし、一般的には開いた線形構造が望ましい。
【００４９】
本発明との関連において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその模倣体のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語は、天然核酸塩基、糖および共有インターヌクレオチド結合から成るオリゴヌクレオチド、と同様にオリゴヌクレオチド類似体または同様に機能する１つまたは複数の非自然発生部位を持つ化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、さらなる細胞取り込み、核酸ターゲットに対するさらなる親和性、およびヌクレアーゼのさらなる安定性、等の望ましい特性を持つため、天然形態に適切である。
【００５０】
本発明との関連において、「オリゴヌクレオシド」という用語は、リン原子を持たないインターヌクレオシド結合によって結合される一連のヌクレオシドを示す。このタイプのインターヌクレオシド結合は、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子リンカー、および１つまたは複数の短鎖複素環リンカーを含む。これらのインターヌクレオシド結合は、シロキサン、硫化物、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケン、スルファミン酸、メチレンイミノ、メチレンヒドラジン、スルホン塩酸、スルホンアミド、アミドおよびその他Ｎ、Ｏ、Ｓの混合およびＣＨ２構成要素を持つものを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
上記オリゴヌクレオシドの生成を説明している代表的な米国特許として、５，０３４，５０６、５，１６６，３１５、５，１８５，４４４、５，２１４，１３４、５，２１６，１４１、５，２３５，０３３、５，２６４，５６２、５，２６４，５６４、５，４０５，９３８、５，４３４，２５７、５，４６６，６７７、５，４７０，９６７、５，４８９，６７７、５，５４１，３０７、５，５６１，２２５、５，５９６，０８６、５，６０２，２４０、５，６１０，２８９、５，６０２，２４０、５，６０８，０４６、５，６１０，２８９、５，６１８，７０４、５，６２３，０７０、５，６６３，３１２、５，６３３，３６０、５，６７７，４３７、５，７９２，６０８、５，６４６，２６９および５，６７７，４３９が挙げられるが、これらに限定されない。これらの各米国特許は、参照することにより本書に組み込まれる。
【００５２】
さらに本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、代替スプライサー、およびターゲット核酸の少なくとも一部に対してハイブリッド形成する他のオリゴマー化合物を含むアンチセンスオリゴマー化合物を含む。そのようなものとして、これらのアンチセンスオリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、円形またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入してもよく、内部または末端バルジ、ミスマッチ、またはループなどの構造要素を含んでよい。一般に、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）は「ＤＮＡ様」（すなわち、２’-デオキシ糖、および一般的にＴ塩基ではなくＵ塩基を持つ）または「ＲＮＡ様」（すなわち、２’-修飾糖、および一般的にＵ塩基ではなくＴ塩基を持つ）としてよい。一旦システムに導入されると、本発明の当該オリゴマー化合物は１つまたは複数の酵素または構造タンパク質の作用を引き出し、ターゲット核酸の修飾に影響を与えることがある。
【００５３】
本発明に関連する当該オリゴマー化合物は、約８から約８０の核酸塩基（例えば約８から約８０の結合核酸塩基および／または単量体サブユニット）から構成できる。当該技術分野における通常の技術を有する者は、本発明が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０核酸塩基長のオリゴマー化合物を統合していることを理解するであろう。
【００５４】
ある実施態様において、本発明の当該オリゴマー化合物は１０から５０核酸塩基長である。当該技術分野における通常の技術を有する者は、これが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０核酸塩基長のオリゴマー化合物を統合していることを理解するであろう。
【００５５】
別の実施態様において、本発明の当該オリゴマー化合物は１２から３０核酸塩基長である。当該技術分野における通常の技術を有する者は、これが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基長のオリゴマー化合物を統合していることを理解するであろう。
【００５６】
さらに別の実施態様において、本発明の当該オリゴマー化合物は１２から２４核酸塩基長である。当該技術分野における通常の技術を有する者は、これが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４核酸塩基長のオリゴマー化合物を統合していることを理解するであろう。
【００５７】
別の実施態様において、本発明の当該オリゴマー化合物は１９から２３の核酸塩基長である。当該技術分野における通常の技術を有する者は、これが１９、２０、２１、２２、または２３核酸塩基長のオリゴマー化合物を統合していることを理解するであろう。
【００５８】
ある特定のオリゴマー化合物の長さは約１２から約３０核酸塩基である。別の特定の長さは約１２から約２４核酸塩基である。さらに特に適切な長さは約１９から約２３核酸塩基である。
【００５９】
キメラオリゴマー化合物
オリゴマー化合物のすべての位置が一様に修飾される必要はない。実際、１つ以上の前記修飾を単一のオリゴマー化合物またはオリゴマー化合物内のヌクレオシドのような単一の単量体サブユニットにさえも組み込むことができる。本発明は、キメラオリゴマー化合物であるオリゴマー化合物も含む。本発明との関連において、「キメラ」オリゴマー化合物または「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴマー化合物である。各領域は、少なくとも１つの単量体ユニット（すなわち、核酸塩基オリゴマーの場合はヌクレオチド）を含んで構成される。
【００６０】
キメラオリゴマー化合物は、ヌクレアーゼ分解に対するさらなる抵抗力、さらなる細胞取り込み、負荷の変更および／またはターゲット核酸に対するさらなる結合親和性を与えるため、一般に少なくとも１つの修飾領域を含む。当該オリゴマー化合物の追加領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素の基質として作用することがある。例として、ＲＮａｓｅ  ＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。そのため、ＲＮａｓｅ  Ｈの作用によってＲＮＡターゲットが開裂し、それによって遺伝子発現抑制の効率が大いに向上する。従って、キメラを使用する場合、例えば同一ターゲット領域に対してハイブリッド形成するホスホロチオ酸デオキシオリゴヌクレオチドと比較して、短鎖のオリゴマー化合物でもしばしば同様の結果が得られる。当該ＲＮＡターゲットの開裂は、通常、ゲル電気泳動によって、また必要であれば、当該技術分野において周知の関連核酸ハイブリダイゼーション法によって検出できる。ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成し、ｄｓＲＮａｓｅの基質であるキメラの場合も同様の結果が得られる。
【００６１】
本発明のキメラオリゴマー化合物は、上記の２つ以上のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成してもよい。通常使用されるキメラ化合物は、ハイブリッド、ヘミマー、ギャップマー、逆ギャップマーおよびブロッカーを含むが、これらに限定されない。ここで、様々な位置の修飾および／または領域が天然ＤＮＡまたは修飾ＤＮＡ、およびＲＮＡ型ユニット、および／または例えばロックされた核酸（ＬＮＡ）（以下に示すＥＮＴＡ  ＴＵを含む）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、およびその他などの模倣型サブユニットから選択される。これらを以下に記載する。このようなハイブリッド構造の生成について説明している代表的な米国特許として、５，０１３，８３０、５，１４９，７９７、５，２２０，００７、５，２５６，７７５、５，３６６，８７８、５，４０３，７１１、５，４９１，１３３、５，５６５，３５０、５，６２３，０６５、５，６５２，３５５、５，６５２，３５６、および５，７００，９２２が挙げられるが、これらに制限されない。これらの各特許は、参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【００６２】
オリゴマー模倣体
本発明に基づく別のオリゴマー化合物グループは、オリゴヌクレオチド模倣体を含む。模倣体という用語は、オリゴヌクレオチドに適用されるため、オリゴマー化合物を含むことを意図している。ここで、フラノース環または当該フラノース環とインターヌクレオチドの結合は、新規のグループと置き換えられる。フラノース環のみの置換は、当該技術分野において、糖の代理を意味する。複素環塩基部分または修飾複素環塩基部分は、適切なターゲット核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【００６３】
このようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが証明されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡは好ましいハイブリダイゼーション特性、高度な生物学的安定性を有し、静電気的に中性の分子である。近年の研究において、ＰＮＡは遺伝子導入マウスにおける異常なスプライシングの訂正に使用された（サザーニ（Ｓａｚａｎｉ）ら、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００２、２０、１２２８-１２３３）。ＰＮＡオリゴマー化合物において、オリゴヌクレオチドの糖の骨格は、骨格を含むアミド、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられる。核酸塩基は、直接的または間接的に（以下に示すように-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ２-）当該骨格のアミド部分の炭素の代わりに窒素を含む原子と結合される。ＰＮＡオリゴマー化合物の生成について説明している代表的な米国特許として、５，５３９，０８２、５，７１４，３３１、および５，７１９，２６２が挙げられるが、これらに限定されない。これらの各特許は、参照することにより本書に組み込まれる。ＰＮＡはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社（米カリフォルニア州フォスター市）から商業的に入手可能である。
【００６４】
１９９１年にニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）と同僚たちによって紹介されて以来、基本的なＰＮＡ骨格に対して多くの修飾が行われている（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１、２５４、１４９７-１５００）。基本的な構造を以下に示す。
【化１】
0004579911.tif 000002
ここで、
Ｂｘは、複素環塩基部分であり、
Ｔ４は、水素、アミノ保護基、-Ｃ（Ｏ）Ｒ５、置換または非置換Ｃ１-Ｃ１０アルキル、置換または非置換Ｃ２-Ｃ１０アルケニル、置換または非置換Ｃ２-Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学的官能基、レポーター基、共役基、α-カルボキシル基を介するか、または所望によりアミノ酸がアスパラギン酸、またはグルタミン酸である場合にω-カルボキシル基を介して結合されるＤまたはＬα-アミノ酸、またはカルボキシル基を介して結合されるＤ、Ｌ、またはＤおよびＬの混合アミノ酸から派生したペプチドであり、ここで該置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルから選択される、
Ｔ５は、-ＯＨ、-Ｎ（Ｚ１）Ｚ２、Ｒ５、α-アミノ基を介するか、または所望により、該アミノ酸がリジンまたはオルニチンである場合に、ω-アミノ基を介して結合されるＤまたはＬα-アミノ酸、またはアミノ基を介して結合されるＤ、Ｌ、またはＤおよびＬの混合アミノ酸から派生したペプチド、化学的官能基、レポーター基または共役基であり；Ｚ１は水素、Ｃ１-Ｃ６アルキルまたはアミノ保護基であり；Ｚ２は水素、Ｃ１-Ｃ６アルキル、アミノ保護基、-Ｃ（＝Ｏ）-（ＣＨ２）ｎ-Ｊ-Ｚ３、α-カルボキシル基を介して、または所望により該アミノ酸がアスパラギン酸またはグルタミン酸である場合に、ω-カルボキシル基を介して結合されるＤまたはＬα-アミノ酸、またはカルボキシル基を介して結合されるＤ、ＬまたはＤとＬの混合アミノ酸から派生するペプチドであり；Ｚ３は水素、アミノ保護基、-Ｃ１-Ｃ６アルキル、-Ｃ（＝Ｏ）-ＣＨ３、ベンジル、ベンゾイルまたは-（ＣＨ２）ｎ-Ｎ（Ｈ）Ｚ１であり；各ＪはＯ、ＳまたはＮＨであり；Ｒ５はカルボニル保護基であり、
ｎは７から約７９である。
【００６５】
研究されている別のオリゴヌクレオチド模倣体群は、モルホリノ環に結合された複素環塩基を持つ結合モルホリノユニット（モルホリノ核酸）に基づく。多くの連結基がモルホリノ核酸においてモルホリノ単量ユニットを連結することが報告されている。ある連結基群が非イオンのオリゴマー化合物を提供するために選択されている。非イオンモルホリノベースのオリゴマー化合物が不適切に細胞タンパク質と相互作用する可能性は低い。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞タンパク質と不適切に相互作用する可能性の低いオリゴヌクレオチドの非イオン模倣体である（ドウェインＡ．ブラーシュ（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ）およびデービッドＲ．コーリー（Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２、４１（１４）、４５０３-４５１０）。モルホリノベースのオリゴマー化合物はゼブラフィッシュ胚において研究されている（ジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）、第３０巻、第３版、２００１年およびヒーズマン、Ｊ．（Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．）、発生生物学（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）、２００２、２４３、２０９-２１４を参照）。モルホリノベースのオリゴマー化合物に関するさらなる研究が報告されている（ナセヴィシヤス（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ）ら、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．）、２０００、２６、２１６-２２０、およびラセーラ（Ｌａｃｅｒｒａ）ら、全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２０００、９７、９５９１-９５９６）。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、１９９１年７月２３日発行の米国特許５，０３４，５０６において開示されている。当該モルホリノ群のオリゴマー化合物は、当該モノマーサブユニットを結合する様々な異なる連結基を含めて生成されている。
【００６６】
モルホリノ核酸は、当該モノマーサブユニットを結合する様々な異なる連結基（Ｌ２）を含めて生成されている。その基本的な形式を以下に示す。
【化２】
0004579911.tif 000003
ここで、
Ｔ１は水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり
Ｔ５は、水素またはリン酸塩、リン酸塩誘導体、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
Ｌ２は、キラルからアキラル、帯電からニュートラルに変えることができる連結基[米国特許５，１６６，３１５では-Ｏ-Ｐ（＝Ｏ）（Ｎ（ＣＨ３）２）-Ｏ-を含む連結を開示している；米国特許５，０３４，５０６では、アキラルインターモルホリノ結合、例えば-Ｓ（＝Ｏ）-Ｘ-（ＸはＮＨ、ＮＣＨ３、Ｏ、ＳまたはＣＨ２である）、-Ｃ（＝Ｙ）-Ｏ-（ＹはＯまたはＳである）、-Ｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）-ＣＨ２-、-Ｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）-Ｎ（Ｒ）-ＣＨ２-（ＲはＨまたはＣＨ３である）を開示している；また米国特許５，１８５，４４４では、キラルインターモルホリノ結合、例えば-Ｐ（＝Ｏ）（-Ｘ）-Ｏ-（Ｘは、Ｆ、ＣＨ２Ｒ、Ｓ-ＣＨ２ＲまたはＮＲ１Ｒ２であって、各々Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＣＨ３または塩基特異的な水素結合と干渉しないその他の部分である）を含むリンを開示している]であり、
ｎは７から約７９である。
【００６７】
別のオリゴヌクレオチド模倣体群は、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在する該フラノース環は、シクロヘニル環と置き換えられる。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホラミダイトモノマーが生成され、古典的なホスホラミダイト化学反応に従ってオリゴマー化合物の合成に使用されている。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物およびＣｅＮＡによって特定の位置を修飾されたオリゴヌクレオチドが生成、研究されている（ワン（Ｗａｎｇ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２０００、１２２、８５９５-８６０２を参照）。一般に、ＣｅＮＡモノマーをＤＮＡ鎖に組み込むと、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性が増加する。ＣｅＮＡオリゴアデニル酸塩は、天然複合体と同様の安定性を持つＲＮＡおよびＤＮＡ相補体とともに複合体を形成した。ＣｅＮＡ構造を天然核酸構造に組み入れる研究は、ＮＭＲおよび円偏光二色性によって証明され、容易な立体配座適合が進められている。さらに、ＣｅＮＡを配列ターゲッティングＲＮＡに組み込むことによって、血清に対して安定となり、大腸菌ＲＮａｓｅを活性化してターゲットＲＮＡ鎖を開裂することができた。
【００６８】
ＣｅＮＡの一般的な化学式を以下に示す。
【化３】
0004579911.tif 000004
ここで、
各々Ｂｘは、複素環塩基部分であり、
Ｌ３は、例えばホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合などの内部シクロヘキセニル結合であり、
Ｔ１は、水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
Ｔ２は、水素またはリン酸塩、リン酸塩誘導体、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物である。
【００６９】
別のオリゴヌクレオチド模倣体群（無水ヘキシトール核酸）は、１つまたは複数の無水ヘキシトールヌクレオシドから生成することができる（ウーターズ（Ｗｏｕｔｅｒｓ）およびハーデウィン（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ）、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）、１９９９、９、１５６３-１５６６を参照）。また、そのオリゴヌクレオチド模倣体は一般的な化学式を持つ。
【化４】
0004579911.tif 000005
ここで、
各々Ｂｘは、複素環塩基部分であり、
Ｌは、例えばホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合などの内部無水ヘキシトール結合であり、
Ｔ１は、水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
Ｔ２は、水素またはリン酸塩、リン酸塩誘導体、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物である。
【００７０】
別の修飾は、例えば「ロックされた核酸（ＬＮＡ）」などの二環式糖部分を含む。このＬＮＡにおいて、リボシル糖環の２’-ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子と結合することによって２’-Ｃ、４’-Ｃオキシメチレン結合を形成し、結果的に二環式糖部分を形成する（エラヤディ（Ｅｌａｙａｄｉ）ら、治験薬におけるカレントオピニオン（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ）、２００１、２、５５８-５６１、ブラーシュ（Ｂｒａａｓｃｈ）ら、ケミストリー・アンド・バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）、２００１、８１-７、およびオーラム（Ｏｒｕｍ）ら、分子治療におけるカレントオピニオン（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２００１、３、２３９-２４３に掲載。また米国特許６，２６８，４９０および６，６７０，４６１を参照）。当該結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を結合する（-ＣＨ２-）ｘ基となる。ここで、ｘ＝１の場合はＬＮＡが使用され、ｘ＝２の場合はＥＮＡ（商標）が使用される（シング（Ｓｉｎｇｈ）ら、ケミカルコミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９９８、４、４５５-４５６。ＥＮＡ（商標）：森田ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００３、１１、２２１１-２２２６）。従って、「ＥＮＡ（商標）」はＬＮＡの制限されない一例である。ＬＮＡおよび他の二環式糖類似体は、相補ＤＮＡおよびＲＮＡとの非常に高い二本鎖熱的安定性（Ｔｍ＝＋３から＋１０℃）、３’-外部核酸分解に対する安定性、および良好な溶解特性を示す。ＬＮＡはプロリゴ（ＰｒｏＬｉｇｏ）社から商業的に入手可能である（仏パリおよび米コロラド州ボールダー）。二環式システムに単一ＣＨ２結合を持つＬＮＡの基本構造を以下に示す。これは単にＬＮＡの一例を示している。
【化５】
0004579911.tif 000006
ここで、
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
各々Ｚ１は、例えばホスホジエステルまたはホスホロチオエートなどのインターヌクレオシド連結基である。
【００７１】
研究されているＬＮＡの異性体は、３’-エクソヌクレアーゼに対して優れた安定性を持つことが証明されているα-Ｌ-ＬＮＡである（フリーデン（Ｆｒｉｅｄｅｎ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３、２１、６３６５-６３７２）。該α-Ｌ-ＬＮＡは強力なアンチセンス活性を示すアンチセンスギャップマーおよびキメラに組み込まれている。α-Ｌ-ＬＮＡの構造を以下に示す。
【化６】
0004579911.tif 000007
【００７２】
生成、研究されている別の類似した二環式糖部分は、３’-ヒドロキシル基から単一のメチレン基を介して糖環の４’炭素原子に結合され、それによって３’-Ｃ、４’-Ｃオキシメチレン結合が形成される（米国特許６，０４３，０６０を参照）。
【００７３】
２Ｄ  ＮＭＲ分光法によって判別されるＬＮＡの構造は、一本鎖ＬＮＡにおいても二本鎖においても、ＬＮＡヌクレオチドのロックされた方向が、より高密度のＮ型構造を導入するようにリン酸の骨格を制限することを示している（ピーターセン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）ら、分子認識ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．）、２０００、１３、４４-５３）。これらの構造は、核酸塩基の改善されたスタッキングに関連している（ウェンゲル（Ｗｅｎｇｅｌ）ら、ヌクレオシド  ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１９９９、１８、１３６５-１３７０）。
【００７４】
ＬＮＡは極めて安定したＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖を形成することが証明されている（コシュキン（Ｋｏｓｈｋｉｎ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９８、１２０、１３２５２-１３２５３）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、最も熱的安定性のある核酸型二本鎖システムであることが示されており、ＬＮＡのＲＮＡ模倣特性は二本鎖レベルで確立されている。３つのＬＮＡモノマー（ＴまたはＡ）の導入によって、ＤＮＡ相補体に対する溶解点（Ｔｍ＝＋１５／＋１１）が大幅に上昇した。ＬＮＡ媒介のハイブリダイゼーションの普遍性は、非常に安定したＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖の形成によって強調されている。ＬＮＡのＲＮＡ模倣は、モノマーのＮ型構造的制限およびＬＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の第二構造に関して反映されている。
【００７５】
またＬＮＡは高い熱的安定性を持つ相補ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡとともに二本鎖を形成する。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、完全に修飾されたＬＮＡ（特にＬＮＡ：ＲＮＡ）を含む二本鎖は構造的にＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖と類似していることを示している。ＬＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の核磁気共鳴（ＮＭＲ）検査では、ＬＮＡモノマーの３’-内部構造が確認されている。二本鎖ＤＮＡの認識は、ＬＮＡによる鎖侵入を示唆している。ミスマッチ配列の研究は、ＬＮＡがワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対合ルールに従い、対応する未修飾の参照鎖と比較して一般的に改善された選択性を持つことを示している。ＤＮ／ＬＮＡキメラは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ内の様々な領域（５’-未翻訳領域、開始コドンの領域またはコード化領域）を標的とする場合に、遺伝子の発現を効果的に抑制することが示されている（ブラーシュ（Ｂｒａａｓｃｈ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００２、３０、５１６０-５１６７）。
【００７６】
新型のＬＮＡオリゴマー化合物は、ＬＮＡと同様に、幅広い診断的および治療的用途において有効である。このうち、アンチセンスアプリケーションは、ＰＣＲアプリケーション、鎖置換オリゴマー、核酸ポリメラーゼの基質、および一般にはヌクレオチドベースの薬物である。
【００７７】
ＬＮＡを含む強力で非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて記載されている（ワーレステッド（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ）ら、全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０００、９７、５６３３-５６３８）。当該著者は、ＬＮＡがアンチセンス化合物に対して幾つかの望ましい特性を付与すると記述している。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、血清および細胞抽出物中において即座に分解しなかった。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、定量法において強力なアンチセンス活性を示し、生きているラットの脳におけるＧ-タンパク-結合受容体のシグナル伝達および大腸菌におけるレポーター遺伝子の検出とは本質的に異なることが分かった。ヒト乳癌生細胞へのリポフェクチンを媒介とした効率的なＬＮＡ送達も実施されている。さらに、ＬＮＡに関するインビボ検査の成功例は、毒性のないラットのδオピオイド受容体の構造を示している（ワーレステッド（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ）ら、全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０００、９７、５６３３-５６３８）。また別の研究では、大きいサブユニットのＲＮＡポリメラーゼＩＩの翻訳障害が示されている（フルイター（Ｆｌｕｉｔｅｒ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、２００３、３１、９５３-９６２）。
【００７８】
ＬＮＡモノマーアデニン、シトシン、グアニン、５-メチル-シトシン、チミンおよびウラシルの合成および生成について、それらのオリゴマー化、および核酸認識特性とともに記載されている（コーシュキン（Ｋｏｓｈｋｉｎ）ら、テトラヒドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、１９９８、５４、３６０７-３６３０）。ＬＮＡおよびその生成については、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６にも記載されている。
【００７９】
ＬＮＡの第一類似体、ホスホロチオエート-ＬＮＡおよび２’-チオ-ＬＮＡも生成されている（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）、１９９８、８、２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含むロックされたヌクレオシド類似体の生成についても記載されている（ウェンゲル（Ｗｅｎｇｅｌ）ら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ０３／０２０７３９およびＷＯ９９／１４２２６）。さらに、２’-アミノ-ＬＮＡ、ハンドルを持つ配座固定された高親和性の新規オリゴヌクレオチド類似体は、当該技術分野において記述されている（シング（Ｓｉｎｇｈ）ら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、１９９８、６３、１００３５-１００３９）。さらに、２’-アミノ-および２’-メチルアミノ-ＬＮＡが生成されており、相補ＲＮＡ鎖および相補ＤＮＡ鎖を持つそれらの二本鎖の熱的安定性は以前に報告されている。
【００８０】
生成、研究されている本発明に基づく別のオリゴヌクレオチド模倣体は、トレオース核酸である。このオリゴヌクレオチド模倣体は、リボースヌクレオシドの代わりにトレオースヌクレオシドに基づき、以下の一般的な構造を持つ。
【化７】
0004579911.tif 000008
【００８１】
（３’,２’）-α-Ｌ-トレオース核酸（ＴＮＡ）に関する第一の関心事は、ＴＮＡをコピーするＤＮＡポリメラーゼが存在するかという問題である。特定のＤＮＡポリメラーゼは、ＴＮＡテンプレートの制限された伸張をコピーできることが発見されている（Ｃ＆ＥＮ／２００３年１月１３日で報告されている）。
【００８２】
別の研究において、ＴＮＡが相補ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＴＮＡオリゴヌクレオチドとの逆行性のワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型塩基対合が可能であることが断定されている（チャプット（Ｃｈａｐｕｔ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００３、１２５、８５６-８５７）。
【００８３】
ある研究において、（３’、２’）-α-Ｌ-トレオース核酸が生成され、２’および３’アミデート類似体と比較されている（ウー（Ｗｕ）ら、オーガニックレターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００２、４（８）、１２７９-１２８２）。当該アミデート類似体は、ＲＮＡおよびＤＮＡと結合し、ＲＮＡ／ＤＮＡのそれに匹敵する強さを持つことが証明されている。
【００８４】
さらに、オリゴヌクレオチド模倣体は、以下の化学式を持つ二環式および三環式ヌクレオシド類似体を含むように生成されている（以下のアミダイトモノマー）。
【化８】
0004579911.tif 000009
（ステファンズ（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ）ら、ヘルベチカ・シミカ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９７、８０、２４２６-２４３９、ステファンズ（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９９、１２１、３２４９-３２５５、レネバーグ（Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００２、１２４、５９９３-６００２、およびレネバーグ（Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．）、２００２、３０、２７５１-２７５７）。これらの修飾ヌクレオシド類似体は、ホスホラミダイトアプローチを使用してオリゴマー化されており、その結果得られた三環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれ自体に対してハイブリッド形成した場合、熱的安定性（Ｔｍ）の増大を示している。二環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ二本鎖に近い熱的安定性を示している。
【００８５】
別のオリゴヌクレオチド模倣体群は、その骨格にリン基を組み込むホスホノモノエステル核酸と呼ばれる。このオリゴヌクレオチド模倣体群は、核酸の検出器、および分子生物学において使用する補助装置として、遺伝子発現を抑制する領域に有効な物理的、生物学的、および薬理学的特性を持つことが報告されている（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、および三重鎖形成性オリゴヌクレオチド）。
【００８６】
一般的な化学式を以下に示す（マルクーシュ変数の定義については、米国特許５，８７４，５５３および６，１２７，３４６を参照。これらは参照することによりその全体が本書に組み込まれる）。
【化９】
0004579911.tif 000010
【００８７】
本発明に基づく別のオリゴヌクレオチド模倣体が生成されている。ここで、シクロブチル環が天然フラノシル環を置換する。
【００８８】
修飾インターヌクレオシド結合
本発明において有効なアンチセンスオリゴマー化合物の修飾インターヌクレオシド結合の特定例は、修飾された（例えば非天然の）インターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義するように、修飾インターヌクレオシド結合を持つオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するインターヌクレオシド結合、およびリン原子を持たないインターヌクレオシド結合を含む。本明細書の目的において、また当該技術分野においてしばしば参照されるように、そのインターヌクレオシド骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドとして考慮できる。
【００８９】
リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３’-アルキレンホスホン塩酸、５’-アルキレンホスホン塩酸、およびキラルホスホン塩酸を含む他のアルキルホスホン塩酸、ホスフィン塩酸、３’-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホン塩酸、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホノアセテート、およびチオノアルキルホスホン塩酸（シーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３、３１（１４）、４１０９-４１１８およびデリンジャー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００３、１２５、９４０-９５０を参照）、正常な３’-５’結合を持つセレノリン酸およびボラノリン酸、それらの２’-５’結合類似体、および逆の極性を持つ類似体を含む。ここで、１つまたは複数のインターヌクレオチド結合は３’-３’、５’-５’または２’-２’結合である。修飾インターヌクレオシド結合を含むリンは、３’-５’結合でリンクされるホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である。逆の極性を持つオリゴヌクレオチドは、最も３’側のインターヌクレオチド結合における単一の３’-３’結合、例えば脱塩基の単一逆ヌクレオシド残基（核酸塩基が喪失しているか、またはその場所にヒドロキシル基を持つ）で構成される。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
【００９０】
Ｎ３’-Ｐ５’-ホスホラミデートは、相補ＲＮＡ鎖に対する高い親和性とヌクレアーゼ抵抗の両方を示すことが報告されている（グリヤズノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９４、１１６、３１４３-３１４４）。インビボ研究で幾つかの成功例があるＮ３’-Ｐ５’-ホスホラミデートは、特に、ｃ-ｍｙｃ遺伝子の発現を下方規制する（スコルスキー（Ｓｋｏｒｓｋｉ）ら、全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９７、９４、３９６６-３９７１、およびフェイラ（Ｆａｉｒａ）ら、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００１、１９、４０-４４）。
【００９１】
結合を含む前記リンの生成について説明している代表的な米国特許として、米国特許３，６８７，８０８、４，４６９，８６３、４，４７６，３０１、５，０２３，２４３、５，１７７，１９６、５，１８８，８９７、５，２６４，４２３、５，２７６，０１９、５，２７８，３０２、５，２８６，７１７、５，３２１，１３１、５，３９９，６７６、５，４０５，９３９、５，４５３，４９６、５，４５５，２３３、５，４６６，６７７、５，４７６，９２５、５，５１９，１２６、５，５３６，８２１、５，５４１，３０６、５，５５０，１１１、５，５６３，２５３、５，５７１，７９９、５，５８７，３６１、５，１９４，５９９、５，５６５，５５５、５，５２７，８９９、５，７２１，２１８、５，６７２，６９７、および５，６２５，０５０が挙げられるが、これらに限定されない。これらの各特許は参照することにより本書に組み込まれる。
【００９２】
本発明の幾つかの実施態様において、オリゴマー化合物は１つまたは複数のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子インターヌクレオシド結合を持つ。具体的には、-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｏ-ＣＨ２-（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、および-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-ＣＨ２-（ここで、天然ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、-Ｏ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）-Ｏ-ＣＨ２-）である。ＭＭＩ型のインターヌクレオシド結合は、上記の米国特許５，４８９，６７７において開示されている。アミドヌクレオシド結合は、上記の米国特許５，６０２，２４０で開示されている。
【００９３】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、混合へテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環インターヌクレオシド結合によって形成される骨格を持つ。これらは、モルホリノ結合を持つ（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）骨格；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；メチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素を持つその他の骨格を含む。
【００９４】
上記オリゴヌクレオシドの生成について説明している代表的な米国特許として、米国特許５，０３４，５０６、５，１６６，３１５、５，１８５，４４４、５，２１４，１３４、５，２１６，１４１、５，２３５，０３３、５，２６４，５６２、５，２６４，５６４、５，４０５，９３８、５，４３４，２５７、５，４６６，６７７、５，４７０，９６７、５，４８９，６７７、５，５４１，３０７、５，５６１，２２５、５，５９６，０８６、５，６０２，２４０、５，６１０，２８９、５，６０２，２４０、５，７９２，６０８、５，６４６，２６９、および５，６７７，４３９が挙げられるが、これらに限定されない。これらの各特許は、参照することにより本書に組み込まれる。
【００９５】
修飾糖
本発明のオリゴマー化合物は、１つまたは複数の置換糖部分または修飾糖部分も含む。リボシルおよび関連する糖部分は通常、結合に関与しない任意の反応部位で修飾される。従って、糖置換基の適切な位置は２’-位であり、通常、自然な３’−５’−インターヌクレオシド結合では使用されない。他の適切な位置は３’および５’-末端である。３’-糖位は、２つの隣接糖ユニット間の結合が２’,５’-結合である場合、自由に修飾することができる。糖置換基は、ＯＨ；Ｆ；Ｏ-、Ｓ-、またはＮ-アルキル；Ｏ-、Ｓ-、またはＮ-アルケニル；Ｏ-、Ｓ-、またはＮ-アルキニル；またはＯ-アルキル-Ｏ-アルキルを含む。ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。特に適しているのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２である。ここで、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の適切なオリゴヌクレオチドは、Ｃ１からＣ１０低アルキル、置換低アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル（alkaryl）、アラルキル、Ｏ-アルカリルまたはＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、複素環アルキル、複素環アルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善する基、および同様の特性を持つ他の置換基から選択した糖置換基で構成される。
【００９６】
ある修飾は、例えばアルコキシアルコキシ基などの２’-メトキシエトキシ（２’-Ｏ-（２-メトキシエチル）または２’-ＭＯＥ）としても知られる２’-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含む（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、ヘルベチカ・シミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５、７８、４８６-５０４）。さらに別の修飾は、以下の例に示すように、例えばＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基などの、２’-ＤＭＡＯＥとしても知られる２’-ジメチルアミノオキシエトキシ、例えば２’-Ｏ-（ＣＨ２）２Ｏ-（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２などの２’-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２’-Ｏ-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチル、または２’-ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、およびＮ-メチルアセトアミド（ＮＭＡ、２’-Ｏ-ＣＨ２-Ｃ（＝Ｏ）-Ｎ（Ｈ）ＣＨ３としても知られる）を含む。
【００９７】
他の糖置換基は、メトキシ（-Ｏ-ＣＨ３）、アミノプロポキシ（-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、-Ｏ-アリル（-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）を含む。２’-糖置換基は、アラビノ（上方）位またはリボ（下方）位にある。２’-アラビノ修飾の一例は２’-Ｆである（ロック（Ｌｏｃ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２、４１、３４５７-３４６７を参照）。同様の修飾は、オリゴマー化合物の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上の糖の３’位、または２’-５’結合オリゴヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位でも行ってよい。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を持ってもよい。このような修飾糖構造の生成について説明している代表的な米国特許として、米国特許４，９８１，９５７、５，１１８，８００、５，３１９，０８０、５，３５９，０４４、５，３９３，８７８、５，４４６，１３７、５，４６６，７８６、５，５１４，７８５、５，５１９，１３４、５，５６７，８１１、５，５６７，４２７、５，５９１，７２２、５，５９７，９０９、５，６１０，３００、５，６２７，０５３、５，６３９，８７３、５，６４６，２６５、５，６５８，８７３、５，６７０，６３３、５，７９２，７４７、５，７００，９２０、および６，１４７，２００が挙げられるが、これらに限定されない。これらの各特許は、参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【００９８】
別の代表的な糖置換基は、化学式ＩａまたはＩＩａの基を含む。
【化１０】
0004579911.tif 000011
式中、
Ｒｂは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、
Ｒｄは、単結合、Ｏ、ＳまたはＣ（＝Ｏ）であり、
Ｒｅは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）であるか、または化学式IIIａ
【化１１】
0004579911.tif 000012
[ここで、
ＲｐおよびＲｑは、独立して、水素またはＣ１−Ｃ１０アルキルであり、
Ｒｒは-Ｒｘ-Ｒｙであり、
各々Ｒｓ、Ｒｔ、ＲｕおよびＲｖは、独立して水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換または非置換Ｃ１-Ｃ１０アルキル、置換または非置換Ｃ２-Ｃ１０アルケニル、置換または非置換Ｃ２-Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学的官能基または共役基であって、該置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから選択されるか、または所望により、ＲｕおよびＲｖは、一体となってそれらが結合している窒素と共にフタルイミド部分を形成し、各々Ｒｗは、独立して、置換または非置換Ｃ１−Ｃ10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ-ブトキシ、アリルオキシ、９-フルオレニルメトキシ、２-（トリメチルシリル）-エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ-ブチリル、フェニルまたはアリールである]であり、
Ｒｋは、水素、窒素保護基または-Ｒｘ-Ｒｙ
[Ｒｘは、結合または連結部分であり、
Ｒｙは、化学的官能基、共役基または固定支持媒体であり、各々ＲｍおよびＲｎは、水素、窒素保護基、置換または非置換Ｃ１-Ｃ10アルキル、置換または非置換Ｃ２-Ｃ10アルケニル、置換または非置換Ｃ２-Ｃ10アルキニル（ここで該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニルである）、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノおよびアシルであり、前記アシルは酸アミドまたはエステルである]であるか、または
ＲｋおよびＲｍが、一緒に、窒素保護基であるか、ＮおよびＯから選択される追加ヘテロ原子を所望により含む環構造に結合されているか、または化学的官能基である、
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、またはＮ（Ｒｚ）２であり、各々Ｒｚは、水素、Ｃ１-Ｃ８アルキル、Ｃ１-Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＲｕまたはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり、
Ｒｆ、ＲｇおよびＲｈは、約４から約７の炭素原子または約３から約６の炭素原子を有する環系、および１または２のヘテロ原子を含み、該ヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄から選択され、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、または飽和あるいは不飽和複素環である、
Ｒｊは、１から約１０個の炭素原子を持つアルキルまたはハロアルキル、２から約１０個の炭素原子を持つアルケニル、２から約１０個の炭素原子を持つアルキニル、６から約１４個の炭素原子を持つアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋまたはＣＮであり、
ｍａは１〜約１０であり、
各ｍｂはそれぞれ０または１であり、
ｍｃは０または１から１０の整数であり、
ｍｄは１から１０の整数であり、
ｍｅは０、１または２である、ただしｍｃが０である場合、ｍｄは１より大きい。
【００９９】
化学式Ｉの代表的な置換基は、米国特許６，１７２，２０９「キャップされた２’-オキシエトキシオリゴヌクレオチド」において開示されている。これは参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【０１００】
化学式ＩＩの代表的な環状置換基は、米国特許６，２７１，３５８「配座を事前設定したＲＮＡターゲット２’-オリゴマー化合物」において開示されている。これは参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【０１０１】
糖置換基は、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３））２を含み、ｎおよびｍは１から約１０である。
【０１０２】
化学式IIIで示される代表的なグアニジン置換基は、１９９９年７月７日出願の米国特許６，５９３，４６６「官能化オリゴマー」において開示されている。これは参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【０１０３】
代表的なアセトアミド置換基は、米国特許６，１４７，２００において開示されている。これは参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【０１０４】
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、国際公報ＷＯ００／０８０４４８９５「２’-Ｏ-ジメチルアミノエチルオキシエチル-オリゴマー化合物」において開示されている。これは参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【０１０５】
本発明のオリゴマー化合物は、２つ以上の同一または化学的に異なる糖、塩基およびインターヌクレオシド結合修飾の任意の組合せで構成してもよい。ここで使用する「化学的に異なる」という表現は、全体的または部分的に関わらず、異なる化学的エンティティを意味する。例えば、オリゴマー化合物は２’-フルオロおよび２’-ＭＯＥ修飾で構成される。これら２つの修飾は同一分子内に配置された化学的に異なるエンティティであると考えられる。
【０１０６】
修飾核酸塩基／天然核酸塩基
オリゴマー化合物は、核酸塩基（当該技術分野において、しばしば単に「塩基」または「複素環塩基部分」と呼ばれる）、修飾または置換も含む。ここで使用する「未修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。ここで複素環塩基部分と呼ばれる修飾核酸塩基は、５-メチルシトシン（５-ｍｅ-Ｃ）、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサンチン、２-アミノアデニン、６-メチル、アデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２-プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミンおよび２-チオシトシン、５-ハロウラシルおよびシトシン、５-プロピニル（-Ｃ＝Ｃ-ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５-ウラシル（偽ウラシル）、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシルおよび他の８-置換アデニンおよびグアニン、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチルおよび他の５-置換ウラシルおよびシトシン、７-メチルグアニンおよび７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニンおよび８-アザアデニン、７-デアザグアニンおよび７-デアザアデニンおよび３-デアザグアニンおよび３-デアザアデニン等、他の合成および天然核酸塩基も含む。
【０１０７】
複素環塩基部分は、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジンおよび２-ピリドンなど、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環と置換される部分を含む。さらに核酸塩基は、米国特許３，６８７，８０８で開示されている塩基、コンサイス版高分子大辞典（Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ｐｐ．８５８-８５９、クロシュヴィッツ、Ｊ．Ｉ．（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．Ｉ．）ら、ジョンウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９９０において開示されている塩基、イングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）ら、アンゲワンテ・ケミ（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ）、インターナショナルエディション、１９９１、３０、６１３において開示されている塩基、およびサングヴィ、Ｙ．Ｓ．（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．）、第１５章、アンチセンスリサーチおよびアプリケーション（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ｐｐ．２８９-３０２、クルック、Ｓ．Ｔ．（Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．）およびレブリュー、Ｂ．（Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．）、編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３において開示されている塩基を含む。これらの特定核酸塩基は、特に本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加するのに有効である。これらは、２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシルおよび５-プロイニルシトシンを含む５-置換ピリミジン、６-アザピリミジンおよびＮ-２、Ｎ-６およびＯ-６置換プリンを含む。５-メチルシトシン置換基は、０．６から１．２℃で核酸二本鎖の安定性を増加させることが示されており（サングヴィ、Ｙ．Ｓ．（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．）、クルック、Ｓ．Ｔ．（Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．）およびレブリュー、Ｂ．（Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．）、編、アンチセンスリサーチおよびアプリケーション（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカレイトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、１９９３、ｐｐ．２７６-２７８）、具体的に２’-Ｏ-メトキシエチル糖修飾物と結合される場合にも適切な塩基置換基である。
【０１０８】
本発明のオリゴマー化合物は、１つまたは複数の複素環塩基部分の代わりに多環式の複素環化合物も含むこともできる。多くの三環式複素環化合物は以前に報告されている。これらの化合物は通常、アンチセンスアプリケーションにおいて使用され、ターゲット鎖に対する修飾鎖の結合特性を増加させる。最も研究されている修飾は、グアノシンをターゲットとするため、それらはＧ-クランプまたはシチジン類似体とも呼ばれている。これらの多環式複素環化合物の多くは、一般的な化学式を示す。
【化１２】
0004579911.tif 000013
【０１０９】
第二鎖にあるグアノシンと３水素結合をなす代表的なシトシン類似体は、１，３-ジアザフェノキサジン-2-オン（Ｒ10＝Ｏ、Ｒ11-Ｒ14＝Ｈ）（クルチャホフ（Ｋｕｒｃｈａｖｏｖ）ら、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１９９７、１６、１８３７-１８４６）、１，３-ジアザフェノキサジン-2-オン（Ｒ10＝Ｓ、Ｒ11-Ｒ14＝Ｈ）（リン、Ｋ．  -Ｙ（Ｌｉｎ，Ｋ．-Ｙ．）；ジョーンズ，Ｒ．Ｊ．（Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．）；マテウチ，Ｍ．Ｊ．（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．）米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９５、１１７、３８７３-３８７４）および６、７、８、９-テトラフルオロ-１，３-ジアザフェノキサジン-2-オン（Ｒ10＝Ｏ、Ｒ11-Ｒ14＝Ｈ）（ワン、Ｊ．（Ｗａｎｇ，Ｊ．）；リン、Ｋ．-Ｙ．（Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．）、マテウチ，Ｍ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．）、テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、１９９８、３９、８３８５-８３８８）を含む。オリゴヌクレオチドに組み込まれるこれらの塩基修飾は、相補グアニンを用いてハイブリッド形成することが示されている。また、後者はアデニンを用いてハイブリッド形成し、拡張されたスタッキング相互作用によって、らせんの熱的安定性を強化することも示されている（２００２年５月２４日出願の米国特許１０／１５５，９２０「修飾ペプチド、核酸」および２００２年５月２４日出願の米国特許１０／０１３，２９５「ヌクレアーゼ抵抗キメラオリゴヌクレオチド」を参照。これらの両特許は、参照することによりその全体が本書に組み込まれる）。
【０１１０】
さらに、シトシン類似体／置換基が、固定された１，３-ジアザフェノキサジン-2-オン骨格に結合されているアミノエトキシ部分を持つ場合に、らせんの安定特性が観察されている（Ｒ10＝Ｏ、Ｒ11＝-Ｏ-（ＣＨ２）２-ＮＨ２、Ｒ12-14＝Ｈ）（リン，Ｋ．-Ｙ．（Ｌｉｎ，Ｋ．-Ｙ．）；マテウチ、Ｍ．（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．）米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９８、１２０、８５３１-８５３２）。結合試験は、単一の組み込みによって、５-メチルシトシン（ｄＣ５ｍｅ）との関連で最大１８度までの△Ｔｍで相補ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡに対するモデルオリゴヌクレオチドの結合親和性を強化できることを示した。これは、単一修飾に関して現在知られている最高の親和性強化である。一方、らせん安定性における結果によってオリゴヌクレオチドの特異性は変わらない。Ｔｍデータは、ｄｕｃ５ｍｅと比較して、完全一致配列およびミスマッチ配列との間にさらに大きな違いを示している。連結アミノ基が、追加の水素結合供与体として作用し、フーグスティン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）面、すなわち相補グアニンのＯ６と相互作用して、結果的に４水素結合を形成することが示唆されている。これは、Ｇ-クランプの増加した親和性が拡張塩基スタッキングと追加の特異的水素結合の組み合わせによって媒介されることを意味する。
【０１１１】
さらに、本発明に基づく三環式複素環化合物およびその使用方法は、米国特許６，０２８，１８３および米国特許６，００７，９９２において開示されている。両特許の内容は、参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【０１１２】
フェノキサジン誘導体は、拡張された結合親和性と、その変わらない配列特異性によって、さらに強力なアンチセンスベースの薬物開発のための貴重な核酸塩基類似体となる。実際、インビトロ試験から、フェノキサジン置換基を含む７-ヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを活性し、細胞取り込みを強化してアンチセンス活性を増加させるという期待できるデータが得られている（リン、Ｋ．-Ｙ．（Ｌｉｎ，Ｋ．-Ｙ．）；マテウチ、Ｍ．（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．）米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１９９８、１２０、８５３１-８５３２）。当該活性強化は、Ｇ-クランプの場合さらに顕著である。これは、単一置換が２０量体２’-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのインビトロでの効能を著しく改善することが示されているためである（フラナガン、Ｗ．Ｍ．（Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．）；ウルフ、Ｊ．Ｊ．（Ｗｏｌｆ，Ｊ．Ｊ．）；オルソン、Ｐ．（Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．）；グラント、Ｄ．（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．）；リン、Ｋ．-Ｙ．（Ｌｉｎ，Ｋ．-Ｙ．）；ワグナー、Ｒ．Ｗ．（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．）；マテウチ、Ｍ．（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．）全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９９、９６、３５１３-３５１８）。それでもやはり、オリゴヌクレオチド設計を最適化するため、また生物活動におけるこれらの複素環修飾の影響をさらに理解するために、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性対する影響を評価することが重要である。
【０１１３】
複素環塩基として有効な別の修飾多環式複素環化合物は、上記の米国特許３，６８７，８０８および米国特許４，８４５，２０５、５，１３０，３０２、５，１３４，０６６、５，１７５，２７３、５，３６７，０６６、５，４３２，２７２、５，４３４，２５７、５，４５７，１８７、５，４５９，２５５、５，４８４，９０８、５，５０２，１７７、５，５２５，７１１、５，５５２，５４０、５，５８７，４６９、５，５９４，１２１、５，５９６，０９１、５，６１４，６１７、５，６４５，９８５、５，６４６，２６９、５，７５０，６９２、５，８３０，６５３、５，７６３，５８８、６，００５，０９６、５，６８１，９４１、および２００１年１１月２８日出願の米国特許出願０９／９９６，２９２において開示されているが、これらに限定されない。これらは参照することにより本書に組み込まれる。
【０１１４】
共役
本発明の組成物で使用される共役オリゴマー化合物は、結果として生じるオリゴマー化合物の活性、細胞分配または細胞取り込みを強化するため、１つまたは複数の部分または共役体を持つように修飾することもできる。一実施態様において、そのような修飾オリゴマー化合物は、共役基をヒドロキシルまたはアミノ基などの官能基に共有結合することによって生成される。本発明の共役基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理学的特性を強化する基、およびオリゴマーの薬物動態を強化する基を含む。典型的な共役基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナンスリジン、アントラキン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、およびＣｙ３およびＡｌｅｘａを含むような色素を含む。本発明との関連において、薬理学的特性を強化する基は、オリゴマーの取り込みを改善し、分解に対するオリゴマー抵抗を強化して、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリッド形成を強化する基を含む。本発明との関連において、薬物動態特性を強化する基は、オリゴマーの取り込み、分配、代謝または排出を改善する基を含む。代表的な共役基は１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６において開示されている。参照することによりその開示内容全体が本書に組み込まれる。
【０１１５】
共役部分は、コレステロール部分（レッツィンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら、全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９４、４、１０５３-１０６０）、コール酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９４、４、１０５３-１０６０）、ヘキシル-Ｓ-トリチルチオールなどのチオエーテル（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、ニューヨーク科学アカデミー年報（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９２、６６０、３０６-３０９；（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９３、３、２７６５-２７７０）、チオコレステロール（オーベルハウザー（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１９９２、２０、５３３-５３８）、ドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（セゾン-ベモアラ（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら、イーエムビーオー・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、１９９１、１０、１１１１-１１１８；コバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら、エフイービーエス・レター（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．）、１９９０、２５９、３２７-３３０；スヴィナルチュク（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ）ら、ビオチネー（Ｂｉｏｃｈｉｎａｉｅ）、１９９３、７５、４９-５４）、ジヘキサデシルリン脂質-ｒａｃ-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２-ｄｉ-Ｏ-ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ-３-Ｈ-ホスホン塩酸などのリン脂質（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、１９９５、３６、３６５１-３６５４；シェイ（Ｓｈｅａ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１９９０、１８、３７７７-３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、ヌクレオシドおよびヌクレオチドＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１９９５、１４、９６９-９７３）、またはアダマンタン酢酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら、テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、１９９５、３６、３６５１-３６５４）、パルミチル部分（ミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）ら、ビオチン（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９９５、１２６４、２２９-２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）ら、薬理学および試験的治療ジャーナル（Ｊ。Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）、１９９６、２７７、９２３-９３７）等、の脂質部分を含むが、それらに制限されない。
【０１１６】
本発明のオリゴマー化合物は、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）-（＋）-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５-３ヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤、抗生物質などのアクティブな薬品成分と共役されてもよい。オリゴヌクレオチド薬共役体およびその製剤は、米国特許出願０９／３３４，１３０（１９９９年５月１５日出願）において記載されている。この特許は、参照することによりその全体が本書に組み込まれる。
【０１１７】
そのようなオリゴヌクレオチド共役体の生成について説明している代表的な米国特許として、米国特許４，８２８，９７９、４，９４８，８８２、５，２１８，１０５、５，５２５，４６５、５，５４１，３１３、５，５４５，７３０、５，５５２，５３８、５，５７８，７１７、５，５８０，７３１、５，５８０，７３１、５，５９１，５８４、５，１０９，１２４、５，１１８，８０２、５，１３８，０４５、５，４１４，０７７、５，４８６，６０３、５，５１２，４３９、５，５７８，７１８、５，６０８，０４６、４，５８７，０４４、４，６０５，７３５、４，６６７，０２５、４，７６２，７７９、４，７８９，７３７、４，８２４，９４１、４，８３５，２６３、４，８７６，３３５、４，９０４，５８２、４，９５８，０１３、５，０８２，８３０、５，１１２，９６３、５，２１４，１３６、５，０８２，８３０、５，１１２，９６３、５，２１４，１３６、５，２４５，０２２、５，２５４，４６９、５，２５８，５０６、５，２６２，５３６、５，２７２，２５０、５，２９２，８７３、５，３１７，０９８、５，３７１，２４１、５，３９１，７２３、５，４１６，２０３、５，４５１，４６３、５，５１０，４７５、５，５１２，６６７、５，５１４，７８５、５，５６５，５５２、５，５６７，８１０、５，５７４，１４２、５，５８５，４８１、５，５８７，３７１、５，５９５，７２６、５，５９７，６９６、５，５９９，９２３、５，５９９，９２８、および５，６８８，９４１が挙げられるが、それらに制限されない。これらの各特許は参照することによりここに組み込まれる。
【０１１８】
本発明の組成物中で使用されるオリゴマー化合物は、一般に一本鎖オリゴマー化合物の一端または両端、あるいは二本鎖のいずれかの鎖の３’または５’端と結合される１つまたは複数の安定基を持ち、ヌクレアーゼ安定性などの特性を強化するように修飾することもできる。安定基にはキャップ構造が含まれる。「キャップ構造または末端キャップ部分」はオリゴヌクレオチドのいずれかの末端で組み込まれている化学的な修飾を意味する（ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）ら、ＷＯ９７／２６２７０を参照。これは参照することによりここに組み込まれる）。これらの末端修飾は、末端核酸分子を持つオリゴマー化合物をエクソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達および／または局在化に役立つ。当該キャップは、５’-末端（５’キャップ）または３’-末端（３’キャップ）に存在するか、または両端に存在することもできる。このキャップ構造は、元々のｍＲＮＡ分子の５’端に存在する逆メチルグアノシン「５’キャップ」と混同されることはない。制限されない例において、当該５’キャップは、逆脱塩基残基（部分）、４’、５’-メチレンヌクレオチド；１-（β-Ｄ-エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５-無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ-ヌクレオチド；α-ヌクレオチド；修飾基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ-ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’-セコヌクレオチド；非環式３，４-ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’-３’-逆ヌクレオチド部分；３’-３’-逆脱塩基部分；３’-２’-逆ヌクレオチド部分；３’-２’-逆脱塩基部分；１，４-ブタンジオールホスホン酸；３’-ホスホルアミデート；ヘキシルリホスホン酸；アミノヘキシルホスホン酸；３’-ホスホン酸；３’-ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；あるいは結合または非結合メチルホスホン酸部分（詳細は、ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）ら、国際ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９７／２６２７０を参照。これは参照することによりここに組み込まれる）を含む。
【０１１９】
本発明の３’-キャップ構造は、例えば４’、５’-メチレンヌクレオチド；１-（β-Ｄ-エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’-アミノ-アルキルホスホン酸；１，３-ジアミノ-２-プロピルホスホン酸、３-アミノプロピルホスホン酸；６-アミノヘキシルホスホン酸；１，２-アミノドデシルホスホン酸；ヒドロキシプロピルホスホン酸；１，５-無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ-ヌクレオチド；α-ヌクレオチド；修飾基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ-ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’-セコヌクレオチド；３，４-ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’-５’-逆ヌクレオチド部分；５’-５’-逆脱塩基部分；５’ホスホルアミデート；５’-ホスホロチオエート；１，４-ブタンジオールホスホン酸；５’-アミノ；結合および／または非結合５’-ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、結合または非結合メチルホスホン酸および５'-メルカプト部分（詳細は、ヴューケージおよびタイヤ（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｔｙｅｒ）、１９９３、テトラヒドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）４９、１９２５を参照。これは参照することによりここに組み込まれる）を含む。
【０１２０】
さらに、１つまたは両方のオリゴマー化合物をキャップして、ヌクレアーゼ安定性を包含するために使用できる３’および５’-安定基は、２００３年１月１６日公開のＷＯ０３／００４６０２において開示されたものを含む。
３’-エンド修飾
【０１２１】
同二本鎖核酸の立体配座構成を記述する際は、ＲＮＡの場合「Ａ型」、ＤＮＡの場合「Ｂ型」という用語を使用する。ＲＮＡおよびＤＮＡ二本鎖の立体配座構成は、それぞれ核酸繊維のＸ線回折解析から判断される（アーノットおよびハキンス（Ａｒｎｏｔｔ  ａｎｄ  Ｈｕｋｉｎｓ）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションス（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）、１９７０、４７、１５０４）。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖はより安定しており、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖よりも高い溶解温度（Ｔｍ）を持つ（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、１９８４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ．；レスニク（Ｌｅｓｎｉｋ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９５、３４、１０８０７-１０８１５；コント（Ｃｏｎｔｅ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１９９７、２５、２６２７-２６３４）。ＲＮＡの安定性の向上は幾つかの構造的機能に貢献している。最も顕著なのは、Ａ型構造に起因する塩基スタッキング相互作用の改善である（サール（Ｓｅａｒｌｅ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．）、１９９３、２１、２０５１-２０５６）。ＲＮＡにおける２’ヒドロキシルの存在は、ノーザンパッカーとも呼ばれるＣ３’エンドパッカーに対して糖をバイアスする。これによって二本鎖がＡ型構造を支持する。さらに、ＲＮＡの２’ヒドロキシル基は、ＲＮＡ二本鎖を安定させる水媒介の水素結合ネットワークを形成することができる（エグリ（Ｅｇｌｉ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９６、３５、８４８９-８４９４）。一本、デオキシ核酸はサザンパッカーとしても知られるＣ２’エンド糖パッカーを好む。これは安定性の低いＢ型構造を付与すると考えられる（サンガー、Ｗ．（Ｓａｎｇｅｒ，Ｗ．）（１９８４）核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。ここで使用するＢ型構造は、Ｃ２’-エンドパッカーおよびＯ４’-エンドパッカーの両者を含む。これは、Ｂ型二本鎖を生じるフラノーゼ構成を考慮すると、Ｏ４’-エンドパッカーの貢献も考慮すべきであると指摘しているバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９８、２６、２４７３-２４８０と一致する。
【０１２２】
しかしＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖は通常、純粋なＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖よりも安定性が低く、配列によってＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖より安定性が高低する場合がある（サール（Ｓｅａｒｌｅ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１９９３、２１、２０５１-２０５６）。ハイブリッド二本鎖の構造はＡ型構造とＢ型構造の中間であり、乏しいスタッキング相互作用をもたらす（レーン（Ｌａｎｅ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９３、２１５、２９７-３０６；フェドロフ（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ）ら、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９９３、２３３、５０９-５２３；ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９５、３４、４９６９-４９８２；ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ら、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９９６、２６４、５２１-５３３）。ターゲットＲＮＡと合成配列の間に形成される二本鎖の安定性は、ＲＮＡｓｅＨ、ＲＮＡｉまたはオリゴマー化合物をＲＮＡターゲット鎖と結合するために必要な任意の機構を含むがそれに制限されないアンチセンス機構に対する治療の中核を成す。アンチセンスの場合、ｍＲＮＡを効果的に抑制するには、アンチセンス化合物がｍＲＮＡと十分な高結合親和性を持つことが必要である。そうでなければ、オリゴマーアンチセンス化合物とターゲットｍＲＮＡ鎖の望ましい相互作用があまり生じないため、結果的に有効性が減少する。
【０１２３】
通常使用される糖パッカリングを修飾方法は、２’-位で糖を当該糖配座に影響する置換基と置き換えることである。環構造への影響は、２’-位にある置換基の性質に依存する。それらの糖パッカリング効果を判定するために多くの異なる置換基が研究されている。例えば、２’-ハロゲンの研究は、２’-フルオロ誘導体がＣ３’-エンド型の最大密度（６５％）、２’-ヨウ素が最低密度（７％）を呈することを示している。アデノシン（２’-ＯＨ）対デオキシアデノシン（２’−Ｈ）の密度は、それぞれ３６％および１９％である。さらに、アデノシンニ量体の２’-フルオロ基（２’-デオキシ-２’-フルオロアデノシン-２’-デオキシ-２’-フルオロ-アデノシン）は、スタックされた構造の安定性にも関連する。
【０１２４】
予想どおり、関連する二本鎖の安定性は、２’-ＯＨ基を２’-Ｆ基と置き換えることによって強化することができ、それによってＣ３’-エンド密度が増加する。２’-Ｆ結合の高い極性と、Ｃ３’-エンドパッカリングに対する極度の優先によって、Ａ型二本鎖におけるスタックされた構造が安定すると想定される。ＵＶ淡色効果、偏円光二色性、および１Ｈ  ＮＭＲから得られたデータは、ハロ置換基の電気陰性度が減少するにつれて、スタッキングの度合いが減少することを示している。さらに、糖部分２’-位の立体バルクは、’Ｂ型二本鎖よりもＡ型二本鎖に適合する。このため、ジヌクレオチドモノリン酸の３’-末端上における２’-置換は、立体反発、フラノースパッカリング優先、静電気反発、疎水性誘引、および水素結合能力等のスタッキング配座に多大な影響を与えると考えられる。これら置換基の効果は、置換基の分子サイズ、電気陰性、および疎水性によって決定されると考えられる。相補鎖の溶解温度は、２’-置換アデノシン２リン酸とともに増加する。配座の３’-エンド優先または置換基の存在が結合の増加に関与するかどうかは不明である。しかし、隣接する塩基が大きく重なる（スタッキングする）と３’-エンド配座が実現する。
【０１２５】
本発明の一面において、オリゴマー化合物は、３’-エンド糖配座を誘引するように合成的に修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは複素環塩基、糖部分またはその両者の合成的修飾を組み込んで、望ましい３’-エンド糖配座を誘引することができる。これらの修飾ヌクレオシドを模倣ＲＮＡ様ヌクレオシドに使用すると、望ましい３’-エンド糖配座を維持しながらオリゴマー化合物の特定の特性を強化できる。ＲＮＡ干渉機構の要件（誘因）としてＲＮＡ型ニ本鎖（Ａ型らせん、主に３’-エンド）が明らかに好まれる。この機構は、２’-デオキシ-２’-Ｆ-ヌクレオシドを構成するニ本鎖はＣ．エレガンスシステムにおいてＲＮＡｉ応答を誘発するのに有効であるという事実によって一部支持される。より安定した３’-エンドヌクレオシドを使用することによって強化される特性は、タンパク質結合、タンパク質オフ比率、吸収およびクリアランスの修飾を通じた薬物動態特性の変調；ヌクレアーゼ安定性および化学的安定性の変調；オリゴマーの結合親和性および特異性の変調（酵素および相補配列の親和性および特異性）；およびＲＮＡ開裂の有効性の増加を含むが、それらに制限されない。本発明は、Ｃ３’-エンド型配座を好むように修飾された１つまたは複数のヌクレオシドを持つＲＮＡｉパスウェイの誘発剤として作用するオリゴマー化合物を提供する。
（配座スキーム）
【化１３】
0004579911.tif 000014
Ｃ２’-エンド／サザン            Ｃ３’-エンド／ノーザン
【０１２６】
ヌクレオシド配座は、ペントフラノシル糖の２’、３’、または４’-位の置換を含む様々な要素によって影響を受ける。電気陰性の置換基は、一般にアキシアル位を好むが、立体的に込み入った置換基は、一般にエクアトリアル位を好む（核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、ウルフガング  サンガー（Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｓａｎｇｅｒ）、１９８４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ）。３’-エンド配座を好むような２’位の修飾は、認識要素として２’-ＯＨを維持しながら実施できる（ガロ（Ｇａｌｌｏ）ら、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）（２００１）、５７、５７０７-５７１３、ハリー・オークル（Ｈａｒｒｙ-Ｏ’ｋｕｒｕ）ら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、（１９９７）、６２（６）、１７５４-１７５９およびタング（Ｔａｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）（１９９９）、６４、７４７-７５４）。
【０１２７】
代わりに、２’デオキシ-２’Ｆ-ヌクレオシドに例示される２’-ＯＨを削除することによって３’-エンド配座を優先させることができる（カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）（１９９３）、３６、８３１-８４１）。これは、アキシアル位に電気陰性のフルオリン原子を配置する３’-エンド配座を適用する。リボース環の他の修飾は、例えば４’-Ｆ修飾ヌクレオシドを生じる４’-位の置換である（ギレルム（Ｇｕｉｌｌｅｒｍ）ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）（１９９５）、５、１４５５-１４６０およびオーウェン（Ｏｗｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）（１９７６）、４１、３０１０-３０１７）。またはメタノカルバヌクレオシド類似体を産出する修飾（ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）ら、ケミストリー・レター（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）（２０００）、４３、２１９６-２２０３およびリー（Ｌｅｅ）ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）（２００１）、１１、１３３３-１３３７）も３’-エンド配座の優先を誘因する。同様に、ＲＮＡｉ反応を誘発するオリゴマー化合物は、例えば構成がロックされた核酸（ＬＮＡ、シング（Ｓｉｎｇｈ）ら、ケミカルコミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）（１９９８）、４、４５５-４５６）およびエチレン結合された核酸（ＥＮＡ（登録商標）、モリタ（Ｍｏｒｉｔａ）ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レター（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）（２００２）、１２、７３-７６）などのＣ３’-エンド型配座に固定されるように修飾される１つまたは複数のヌクレオシドで構成される。
【０１２８】
修飾ヌクレオシドおよびそのオリゴマーの好ましい配座は、分子ダイナミクス計算、核磁気共鳴分光学、およびＣＤ測定など様々な方法で予測できる。従って、オリゴマー化合物においてＲＮＡ様配座、Ａ型二本鎖配座を誘発すると予測される修飾が、本発明の修飾オリゴヌクレオチドにおいて使用するために選択される。本発明に基づく多くの修飾ヌクレオシドの合成は、当該技術分野において周知である（例えば、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）第１〜３巻、編．リロイ  Ｂ．タウンセンド（Ｌｅｒｏｙ  Ｂ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）、１９８８、Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｒｅｓｓ．および以下の例を参照）。
【０１２９】
一局面において、本発明は本来のＲＮＡ、対抗する核酸ターゲットと比べて強化された特性を持たせて生成されるオリゴマー化合物を対象としている。強化されたオリゴマー化合物の設計において、ターゲットが識別され、当該ターゲット配列部分に相補的な効果的な長さの配列を持つオリゴマー化合物が選択される。選択された配列の各ヌクレオシドは修飾を強化する可能性について綿密に調査される。修飾の一例は、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオシドを同一の３’-エンド配座に加えて強化された特性を持つヌクレオシドと置換することである。このような修飾によって、天然ＲＮＡに比べて化学的安定性およびヌクレアーゼ安定性を強化することができ、同時により低コストで簡単にオリゴヌクレオチドを合成および／または組み込むことができる。選択されたオリゴマー化合物配列はさらに複数領域に分割することができ、各領域のヌクレオシドは結果としてキメラ構成を生じる修飾を強化するために評価される。また１つまたは複数の末端ヌクレオシドに対して実施できる有効な修飾がしばしばあるため、５’および３’-末端も考慮する必要がある。本発明のオリゴマー化合物は、少なくとも１つの５’-修飾リン酸基を一本鎖または１つの二本鎖配列または複数配列の少なくとも１つの５’-位に含む。さらに、修飾はインターヌクレオシド結合、共役基、置換糖または塩基、ヌクレオシド模倣体を持つ１つまたは複数のヌクレオシドの置換基、および意図されたターゲットに対する選択された配列の親和性を増強する他の任意の修飾であると考えられる。
【０１３０】
ヌクレアーゼ抵抗を増加させ、ヌクレオチドに対する非常に高い結合親和性を付与する合成２’-修飾の一例は、２-メトキシエトキシ（２’-ＭＯＥ、２’-ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）側鎖である（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９７、２７２、１１９４４-１２０００）。２’-ＭＯＥ置換によって即時に得られる利益は、結合親和性の改善である。これは、Ｏ-メチル、Ｏ-プロピル、およびＯ-アミノプロピルなどを含む多くの類似２’修飾よりも優れている。２’-Ｏ-メトキシエチル置換基を持つオリゴマーは、インビボ使用にとって期待できる機能を持つ遺伝子発現のアンチセンス抑制剤であることも示されている（マーティン、Ｐ．（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）、ヘルベチカ・シミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５、７８、４８６-５０４；アルトマン（Ａｌｔｍａｎｎ）ら、シミカ（Ｃｈｉｍｉａ）、１９９６、５０、１６８-１７６；アルトマン（Ａｌｔｍａｎｎ）ら、バイオケミカル・ソサエティー・トランザクション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．）、１９９６、２４、６３０-６３７；およびアルトマン（Ａｌｔｍａｎｎ）ら、ヌクレオシド  ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１９９７、１６、９１７-９２６）。ＤＮＡに関連して、２’−ＭＯＥ修飾を持つオリゴマーは、向上したＲＮＡ親和性と、より高いヌクレアーゼ抵抗を示した。ヌクレオシド翼およびデオキシホスホロチオエートヌクレオチドの内部領域に２’-ＭＯＥ置換基を持つキメラオリゴマー（ギャップト（ｇａｐｐｅｄ）オリゴマーまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも呼ばれる）は、低量で動物モデルにおける腫瘍の成長を効果的に削減することが示されている。２’-ＭＯＥ置換オリゴマーは、幾つかの病状におけるアンチセンス化合物としての顕著な裏づけを示している。そのようなＭＯＥ置換オリゴマーの一例は、ＣＭＶ網膜炎の処置に認可されている。
【０１３１】
２’-ＭＯＥ置換の大部分は、Ｃ-Ｃ結合のエチルリンカーの周囲にゴーシュ（ｇａｕｃｈｅ）配座を示した。しかし、２つの例においてＣ-Ｃ結合の周囲のトランス（ｔｒａｎｓ）配座が観察されている。結晶における格子相互作用は、その副溝を介した相互の二本鎖パッキングを含む。そのため、２’-Ｏ-置換基の配座が隣接する二本鎖との関係によって影響される残基もある。一般に、置換基の配座変化（例えば、ｇ＋またはＣ-Ｃ結合の周りのｇ）によって、置換基間、両鎖間、副溝経由、および鎖内の相互作用が生じる。ある位置において、２つの残基からの置換基原子は副溝を通じてヴァン・デル・ワールス接触している。同様に、２つの隣接するストランド内残基からの置換基原子間で密接な接触が生じる。
【０１３２】
事前設定されたＡ-ＤＮＡニ本鎖の結晶構造は、同一の２’-Ｏ-メチルＴ残基を組み込む構造用であった。前記の２’-ＭＯＥ置換基用の結晶構造において、２’-ＭＯＥ残基の場合に保存されている水和パターンが観察されている。Ｏ２’、Ｏ３’および置換基のメトキシ酸素原子との間に単一の水分子が配置されている。この水分子は２．９および３．４Ａの間にあるＯ２’、Ｏ３’および置換基のメトキシ酸素原子すべてと接触する。さらに、置換基の酸素原子は、幾つかの他の水素結合接触と関与する。例えば、特定の２’-Ｏ-置換基のメトキシ酸素原子は、結合水分子を介して反対鎖からアデノシンのＮ３と水素結合を形成する。
【０１３３】
幾つかの例において、水分子は酸素原子Ｏ２’、Ｏ３’および修飾ヌクレオシドのＯＣ’の間に閉じ込められている。エチレングリコールリンカーのＣ-Ｃ結合の周囲にトランス（ｔｒａｎｓ）配座を持つ２’-ＭＯＥ置換基は、ＯＣ’とグアノシンのＮ２との間の反対鎖からの密接な接触、およびＯＣ’とＮ３（Ｇ）間の水媒介の密接な接触に関連する。２’-ＭＯＥ修飾鎖を含む二本鎖に関する有効な熱力学データを含めて考慮すると、この結晶構造によって、他の修飾に関するさらに詳細な構造安定性の分析が可能になる。
【０１３４】
結晶構造研究を進めるにあたり、２’-Ｏ-修飾を持つオリゴヌクレオチドのさらに強化された結合親和性を研究するため、分子モデリング実験を行った。当該オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドに２’-Ｏ-修飾を持つ配列番号：１０以上の化合物に関してコンピュータ・シミュレーションを実施した。このシミュレーションは、ＡＭＢＥＲ力場法によって、水溶液中でオリゴヌクレオチドを使用して行った（コーネル（Ｃｏｒｎｅｌｌ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９５、１１７、５１７９-５１９７）（カリフォルニア州サンフランシスコ、ＵＣＳＦ社製モデリングソフトウェアパッケージ）。Ｉｎｄｉｇｏ２  ＳＧＩ機械に関する計算が実施された（カリフォルニア州マウンテンビュー、シリコン・グラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ）社）。
【０１３５】
３’-エンド糖配座構成を付与する別の２’-糖置換基は２’-ＯＭｅ基である。２’-ＯＭｅ基を持つグアノシン、シチジン、およびウリジンジヌクレオシドリン酸の２’-置換基は、対応する天然（２’-ＯＨ）種に関して強化されたスタッキング効果を示した。これによって、結果的に糖がＣ３’-エンド配座を適用する。この場合、メチル基の魅力的な疎水力が立体バルクの不安定な効果を克服する傾向にあると考えられている。
【０１３６】
オリゴヌクレオチドが相補ターゲット鎖に結合する能力は、オリゴヌクレオチドとその相補鎖のハイブリダイゼーション複合体の溶解温度（Ｔｍ）を判定することによって比較される。溶解温度（Ｔｍ）、二重らせんの特徴的な物理特性は、５０％らせん（ハイブリッド形成された）対コイル（ハイブリッド形成されていない）型が存在する温度（摂氏）を示す。ＴｍはＵＶスペクトラムを使用して計測され、ハイブリダイゼーション複合体の形成および分解（溶解）を判別する。ハイブリダイゼーション中に起こる塩基スタッキングに伴って、ＵＶ吸収（淡色効果）が減少する。結果的に、ＵＶ吸収の減少が高いＴｍを示す。Ｔｍが高くなるほど、鎖間の結合力が強くなる。
【０１３７】
フレイヤー（Ｆｒｅｉｅｒ）およびアルトマン（Ａｌｔｍａｎｎ）、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（１９９７）２５：４４２９-４４４３は、以前にオリゴヌクレオチドの構造的修飾の影響に関して、ターゲットＲＮＡを持つその二本鎖の安定性についての研究を発表している。この研究において、著者はハイブリダイゼーション親和性およびＴｍが合成、評価されている２００以上の異なる修飾を含む一連のオリゴヌクレオチドを検討した。研究された糖修飾は、糖の２’-位上の置換、３’−置換、４’-酸素の置換、二環式糖の使用、および四員環置換を含んでいた。チミンの５または６位の置換、ピリミジン複素環の修飾、およびプリン複素環の修飾を含む幾つかの核酸塩基修飾も研究された。中性、リン、およびインターヌクレオシド結合を含む非リンを含む修飾インターヌクレオシド結合についても研究された。
【０１３８】
ＲＮＡターゲット鎖を標的とする修飾オリゴヌクレオチドにおけるＣ３’-エンド糖率を増加することによって、この鎖がＲＮＡと結合するように事前設定できるはずである。文献において報告および研究されている幾つかの糖修飾のうち、２’-フルオロまたは２’-アルコキシなどの電気陰性置換基を組み込むことによって、糖の配座が３’エンド（ノーザン）パッカー配座にシフトする。これが、Ａ型配座を持たせる修飾を組み込むオリゴヌクレオチドを事前に組織化する。このＡ型配座によって、ターゲットＲＮＡ鎖に対する当該オリゴヌクレオチドの結合親和性が増加する。
【０１３９】
さらに、エチレングリコールモチーフを含む２’-置換基の場合、側鎖のＯ-Ｃ-Ｃ-Ｏねじれを囲む酸素原子間のゴーシュ（ｇａｕｃｈｅ）相互作用が二本鎖に安定した効果を持つ場合がある（フレイヤー（Ｆｒｅｉｅｒ）アイビッド（ｉｂｉｄ．））。このようなゴーシュ（ｇａｕｃｈｅ）効果によって、二本鎖の形成に適した側鎖が構成される。この安定構成の正確な本質はまだ明らかになっていない。理論に固執したくはないが、アルキル側鎖に見られるランダムな分配ではなく、単一のゴーシュ（ｇａｕｃｈｅ）構成におけるＯ-Ｃ-Ｃ-Ｏねじれを保持することによって、二本鎖のエントロピー効果が提供されると考えられる。
【０１４０】
本発明に基づく代表的な２’-置換基は、結果として生じる二本鎖にＡ型配座特性（３’-エンド）を付与し、２’-Ｏ-アルキル、２’-Ｏ-置換アルキル、および２’-フルオロ置換基を含む。様々なアルキルおよびアリールエーテルおよびチオエーテル、アミンおよびモノアルキルおよびジアルキル置換アミンが置換基に適している。さらに、１つまたは複数の単量体サブユニット（ヌクレオシドが適当）および／またはインターヌクレオシド結合の複数部位で、１つまたは複数の本発明のオリゴマー化合物に複数の修飾を行い、特性を強化し得るが、本発明の選択された適用での活性を制限するものではない。
【０１４１】
２’-Ｏ修飾として包含するための本発明の環構造は、シクロヘキシル、シクロペンチルおよびフェニル環に似た空間フットプリントを持つ複素環とともに、シクロヘキシル、シクロペンチルおよびフェニル環を含む。本発明の２’-Ｏ-置換基は、２’-Ｏ-（トランス２-メトキシシクロヘキシル、２’-Ｏ-（トランス２-メトキシシクロペンチル）、２’-Ｏ-（トランス２-ウレイドシクロヘキシル）および２’-Ｏ-（トランス２-メチルオキシフェニル）を含むが、それらに制限されない。
【０１４２】
定義される化学反応
ここに別段の定義がない限り、Ｃ１-Ｃ12、Ｃ１-Ｃ８、またはＣ１-Ｃ６、直鎖または（可能であれば）分岐鎖脂肪族炭化水素を意味する。
【０１４３】
ここに別段の定義がない限り、ヘテロアルキルはＣ１-Ｃ12、Ｃ１-Ｃ８、またはＣ１-Ｃ６、鎖の末端部分を含めて、鎖に少なくとも１つまたは約１から約３のヘテロ原子を含む直鎖または（可能であれば）分岐鎖脂肪族炭化水素を意味する。ヘテロ原子はＮ、Ｏ、およびＳを含む。
【０１４４】
ここに別段の定義がない限り、シクロアルキルはＣ３-Ｃ12、Ｃ３-Ｃ８、またはＣ３-Ｃ６、脂肪族炭化水素環を意味する。
【０１４５】
ここに別段の定義がない限り、アルケニルはＣ２-Ｃ12、Ｃ２-Ｃ８、またはＣ２-Ｃ６アルケニルを意味する。これは直鎖または（可能であれば）分岐した炭化水素部分であり、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を含む。
【０１４６】
ここに別段の定義がない限り、アルキニルはＣ２-Ｃ12、Ｃ２-Ｃ８、またはＣ２-Ｃ６アルキニルを意味する。これは直鎖または（可能であれば）分岐した炭化水素部分であり、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を含む。
【０１４７】
ここに別段の定義がない限り、ヘテロシクロアルキルは、少なくとも３つの環員、そのうち少なくとも１つに炭素、また１、２、または３環員に炭素以外を含む環部分を意味する。炭素原子の数は１から約１２、１から約６に変えることができ、また環員の合計数は３から約１５、または約３から約８に変えることができる。環へテロ原子はＮ、Ｏ、およびＳである。ヘテロシクロアルキル基はモルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、ホモモルホリノ、ホモチオモルホリノ、ピロロジニル、テトラヒドロオキザゾリル、テトライドロイミダゾイル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソキサゾリル、テトラヒドロピラゾリル、フラニル、ピラニル、およびテトラヒドロイソチアゾリルを含む。
【０１４８】
ここに別段の定義がない限り、アリールは少なくとも１つのアリール環を含む任意の炭化水素環構造を意味する。アリール環は約６から約２０の環炭素を持つ。アリール環はフェニル、ナフチル、アントラセニル、およびフェナントレニルも含む。
【０１４９】
ここに別段の定義がない限り、ヘタリルは少なくとも１つの完全不飽和環を含む環部分、炭素および非炭素原子から成る環を意味する。当該環系は約１から約４の環を含むことができる。炭素原子の数は１から約１２または１から約６に変えることができ、また環員の合計数は３から約１５、または約３から８に変えることができる。環へテロ原子はＮ、Ｏ、およびＳである。ヘタリル部分は、ピラゾリル、チオフェニル、ピリジル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、プリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンジミダゾリル、ベンゾチオフェニルなどを含む。
【０１５０】
ここに別段の定義がない限り、部分がヘタリルアルキル（ヘタリルおよびアルキル）、アラルキル（アリールおよびアルキル）などの合成部分として定義される場合、各副部分はここに定義のとおりである。
【０１５１】
ここに別段の定義がない限り、電子求引基は、それが結合される炭素から離れて電荷を引き付けるシアノまたはイソシアナト基などの基である。注目すべき他の電子求引基は、その電子陰性が炭素の電子陰性を超える基、例えば垂直または並行位置において１つまたは複数のシアノ、イソチオシアナト、ニトロまたはハロ基と置換されたハロゲン、ニトロ、またはフェニルを含む。
【０１５２】
ここに別段の定義がない限り、ハロゲンおよびハロという用語はそれらの通常の意味を持つ。ハロ（ハロゲン）置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩである。
【０１５３】
前記の任意の置換基は、ここに別段の定義がない限り、意図される特性に応じて適切な置換基である。ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）は、アルキル、アルケニル、およびアルキニル部分、ＮＯ２、ＮＨ３（置換および非置換）、酸部分（例えばＣＯ２Ｈ、-ＯＳ０３Ｈ２など）、ヘテロシクロアルキル部分、ヘタリル部分、アリール部分などを含む。
【０１５４】
すべての前記化学式において、波線（〜）は５’-リン酸の酸素または硫黄結合を示す。リン酸保護基は、米国特許５，７６０，２０９、５，６１４，６２１、６，０５１，６９９、６，０２０，４７５、６，３２６，４７８、６，１６９，１７７、６，１２１，４３７、６，４６５，６２８において記載されている基を含む。これらの各特許は、その全体を参照することによりここに明示的に組み込まれる。
【０１５５】
オリゴマー合成
修飾および未修飾ヌクレオシドのオリゴマー化はＤＮＡ（オリゴヌクレオチドおよびアナログのプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ）、編．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）および／またはＲＮＡ（スカリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）、メソッド（Ｍｅｔｈｏｄｓ）（２００１）、２３、２０６-２１７．ゲイト（Ｇａｉｔ）ら、ＲＮＡにおける化学生成ＲＮＡの応用：タンパク質相互作用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、編．スミス（Ｓｍｉｔｈ）（１９９８）、１-３６、ガロ（Ｇａｌｌｏ）ら、テトラヒドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）（２００１）、５７、５７０７-５７１３）合成の文献手順に適宜従って実施される。さらに、本発明のオリゴマー化合物の合成に対する特定のプロトコルは、以下の例に示されている。
【０１５６】
本発明に従って使用されるオリゴマー化合物は、固相合成の周知の技術を通じて便宜的および日常的に生成できる。そのような合成のための装置は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社（カリフォルニア州フォスター市）を含むメーカー数社によって販売されている。そのような合成のための当該技術分野で周知の任意の他の装置も追加、または代替として使用してよい。同様の技術を用いてホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを生成することもよく知られている。
【０１５７】
本発明のオリゴマー化合物は、取り込み、分配および／または吸収を促進するためのリポソーム、受容体ターゲット分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合、封入、結合または関連付けてもよい。そのような取り込み、分配および／または吸収を促進する製剤の生成について説明している代表的な米国特許として、米国特許５，１０８，９２１、５，３５４，８４４、５，４１６，０１６、５，４５９，１２７、５，５２１，２９１、５，５４３，１５８、５，５４７，９３２、５，５８３，０２０、５，５９１，７２１、４，４２６，３３０、４，５３４，８９９、５，０１３，５５６、５，１０８，９２１、５，２１３，８０４、５，２２７，１７０、５，２６４，２２１、５，３５６，６３３、５，３９５，６１９、５，４１６，０１６、５，４１７，９７８、５，４６２，８５４、５，４６９，８５４、５，５１２，２９５、５，５２７，５２８、５，５３４，２５９、５，５４３，１５２、５，５５６，９４８、５，５８０，５７５、および５，５９５，７５６が挙げられるが、それらに制限されない。これらの各特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【０１５８】
塩、プロドラッグ、および生物学的同等物：
本発明のオリゴマー化合物は任意の医薬的に許容し得る塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際に、生物学的活性代謝物またはその残基を（直接的または間接的に）提供できる任意の他の化合物を含む。従って、本発明の化合物のプロドラッグおよび医薬的に許容し得る塩、そのプロドラッグの医薬的に許容し得る塩、および他の生物学的同等物も開示される。
【０１５９】
「プロドラッグ」という用語は、内部酵素の活性化または他の化学物質および／または症状によっては体内またはその細胞内で活性体（薬物）に変換される非活性または低活性体として調製される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグは、１９９３年１２月９日公開ＷＯ９３／２４５１０（ゴセリン（Ｇｏｓｓｅｌｉｎ）ら）またはＷＯ９４／２６７６４（インバッハ（Ｉｍｂａｃｈ）に開示されている方法に従って、ＳＡＴＥ（（Ｓ-アセチル-２-チオエチル）リン酸）誘導体として生成される。
【０１６０】
「医薬的に許容し得る塩」という用語は、本発明の化合物の生理的および医薬的に許容し得る塩を示す。例えば、親化合物の望ましい生物活性を保持し、それに対して望ましくない毒物学的効果を与えない塩を示す。
【０１６１】
医薬的に許容し得る塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンで形成される。イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および同等物である。適切なアミンの例は、Ｎ、Ｎ’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ-メチルグルカミン、およびプロカインである（例として、ベルゲ（Ｂｅｒｇｅ）ら、「医薬的な塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ）」ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・サイエンス（Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．）１９７７、６６，１-１９）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来の塩生成方法で遊離酸形態を十分な量の望ましい塩基と結合することによって生成される。当該遊離酸形態は、従来の方法で塩を酸と結合し、遊離酸を分離することによって再生成される。遊離酸形態は、極性溶媒中の溶解度など、特定の物理特性において各塩形態と異なる。それ以外は、塩は本発明の目的において、それぞれの遊離酸と同等である。ここで使用する「医薬的な付加塩」は本発明の組成の一化合物の酸形態の医薬的に許容し得る塩を含む。これらはアミンの有機または無機の酸性塩を含む。酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル塩酸、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適した医薬的に許容し得る塩は、当業者によく知られており、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸などの無機酸；プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４-アミノサリチル酸、２-フェノキシ安息香酸、２-アセトキシ安息香酸、恩貝酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸などの有機酸；および事実上タンパク質の合成に関与する２０α-アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸；またフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-１，２-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-２-スルホン酸、ナフタレン-１，５-ジスルホン酸、２-または３-ホスホグリセリン酸、グルコース-６-ホスホン酸、Ｎ-シクロヘキシルスルファミン酸（チクロ形成の場合）またはアスコルビン酸などの他の酸性有機化合物、等との様々な無機および有機酸の塩基性塩を含む。化合物の医薬的に許容し得る塩は、医薬的に許容し得るカチオンを用いて生成することもできる。適切な医薬的に許容しうるカチオンは、当業者にはよく知られており、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第４級アンモニウムカチオンを含む。炭素または炭化水素も使用可能である。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドの場合、医薬的に許容し得る塩の例は（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、およびスペルミンおよびスペルジミンなどのポリアミンイオンで形成される塩、（ｂ）塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、および同等物などの無機酸で形成される酸付加塩、（ｃ）酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギニン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、および同等物などの有機酸で形成される塩、および（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの基本的なイオンから形成される塩を含むがそれらに制限されない。一実施態様において、二本鎖オリゴマー化合物はナトリウム塩として提供される。
【０１６３】
ここで使用する「患者」という用語は、スルビビンの発現または過剰発現に関連する１つまたは複数の疾病に苦しむ哺乳動物を示す。最も適した患者がヒトであることは理解されるであろう。また、本発明は、特に哺乳類のスルビビン発現または過剰発現の抑制に関することも理解される。
【０１６４】
当業者が、有効量の本発明の化合物を使用して、当該疾病に苦しむ患者を処置することによってスルビビン発現または過剰発現に関連する疾病に影響を与え得ることが認識されている。このため「処置」および「処置する」という用語は、ここに記載されている疾病の進行を遅滞、阻害、阻止、制御、または停止するすべてのプロセスを示すことを意図しているが、すべての症状の完全廃絶を示すとは限らない。
【０１６５】
ここで使用する本発明の化合物の「有効量」または「治療上効果のある量」は、本明細書に記載の疾病の処置または予防に有効な量を示す。
【０１６６】
本発明のオリゴマー化合物は、診断薬、治療、予防に利用でき、また試験薬および試験キットとしても使用できる。治療学上、スルビビンの発現を調節することによって処置可能な病気または障害を持つと疑われるヒトなどの患者は、本発明に基づくアンチセンス化合物の投与によって処置される。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を適切な医薬的に許容し得る希釈剤または担体に添加することによって医薬組成に利用できる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用は、予防学的に、例えば感染、炎症または腫瘍形成の予防または遅延にも有効である。
【０１６７】
本発明は、そのオリゴマー化合物を含む医薬的組成および調剤も含む。本発明の医薬的組成は、局所的処置が望まれるか、または全身処置が望まれるかによって、また処置対象領域に応じて多くの方法で投与される。投与は、局所投与（眼への送達および膣や直腸を含む粘膜送達を含む）、経肺投与（例えば、噴霧器などを用いた粉末または噴霧質の吸入または吹送による）；気管内投与、経鼻投与、上皮投与、皮内投与および経皮投与、経口または非経口投与である。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射、点滴または注入、あるいはくも膜下または脳質内投与などの頭蓋内投与を含む。少なくとも１つの２’‐Ｏ‐メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、特に経口投与に有効であると考えられている。
【０１６８】
局所投与用の医薬組成物および剤形は、経皮貼布、軟膏、ローション、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末である。従来の薬品担体、水性、粉末またはオイルベース、増粘剤およびその他類似物を必須としても、または所望してもよい。コーティングしたコンドーム、グローブおよび同様物も有効である。
【０１６９】
経口投与用の組成物および剤形は、粉末または顆粒、水または非水性媒介の懸濁液または溶液、カプセル、小袋または錠剤を含む。増粘剤、香料添加剤、希釈剤、乳化剤、分散剤、または結合剤が所望され得る。経口投与用組成物は、拍動送達組成物および生体粘着性組成物も含む。これらについては、同時係属中の２００１年８月２２日出願の米国特許出願０９／９４４，４９３および２００１年８月２２日出願の０９／９３５，３１６に記載されている。その公開内容は、参照することによりその全体がここに組み込まれる。疾病処置のための経口投与はここに記載されている。しかし、経口投与が唯一の経路ではない。例えば、静脈経路も便宜上、または経口投与に関連して起こり得る合併症を防ぐために望ましい。本発明の化合物を静脈経路で投与する場合は、静脈ボーラスまたはゆっくりした注入が望ましい。
【０１７０】
非経口、くも膜下、または脳室内投与用の組成物および剤形は、滅菌水溶液を含む。この水溶液はバッファー、希釈液および浸透促進剤、担体化合物および他の医薬的に許容し得る担体または賦形剤、等の他の適切な添加物も含まれるが、それらに制限されない。
【０１７１】
本発明のオリゴマー化合物から成る医薬組成物および／または剤形は、オリゴヌクレオチドの栄養送達を強化するために浸透促進剤も含む。浸透促進剤は脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界面活性剤および非界面活性剤の５大領域の１つに分類される（リー（Ｌｅｅ）ら、（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１、８、９１-１９２；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）、治療薬剤担体システムにおける批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０、７：１、１-３３）。１つまたは複数のこれら領域の１つまたは複数の浸透促進剤を含んでよい。浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸（Ｃ１２）、カプリン酸（Ｃ１０）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレート、モノオレイン（ａ．ｋ．ａ．１-モノオレオイル-ｒａｃ-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１-モノカプレート、１-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセリド、およびその生理学上許容し得る塩（例えば、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノレン酸塩など）（リー（Ｌｅｅ）ら、治療薬剤担体システムにおける批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１、８：２、９１-１９２；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）、治療薬剤担体システムにおける批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０、７：１、１-３３；エル-ハリリ（Ｅｌ-Ｈａｒｉｒｉ）ら、ジャーナル・オブ・ファーマシー・アンド・ファーマコロジー（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９９２、４４、６５１-６５４）。幾つかの脂肪酸の例としては、０．５から５％の濃度で、単一または組み合わせて使用されるカプリン酸ナトリウムおよびラウリン酸ナトリウムがある。
【０１７２】
様々な中性胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は浸透促進剤として作用する。従って、「胆汁塩」という用語は、任意の天然胆汁の構成要素と任意の合成誘導体を含む。胆汁塩の例は、一般に０．５から２％の濃度で使用されるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）および／またはウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）である。
【０１７３】
１つまたは複数の浸透促進剤を含む混合製剤が使用される。例えば、胆汁塩を脂肪酸と組み合わせて使用することによって、混合製剤を生成する。ＣＤＣＡとカプリン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウムとの組み合わせが適切である（一般に０．５から５％）。
【０１７４】
キレート剤は、２ナトリウムエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ソーダ、５-メトキシサリチル酸およびホモバニリン酸）、コラーゲンのＮ-アシル誘導体、ラウレス-９およびβ-ジケトン（エナミン）のＮ-アミノアシル誘導体が含まれるが、それらに限定されない（リー（Ｌｅｅ）ら、治療薬剤担体システムにおける批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１、８：２、９２-１９２；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）、治療薬剤担体システムにおける批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０、７：１、１-３３；ブール（Ｂｕｕｒ）ら、Ｊ．コントロール  Ｒｅｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．）、１９９０、１４、４３−５１）。キレート剤はＤＮａｓｅ抑制剤としても作用するという別の利点も持つ。
【０１７５】
界面活性剤は、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-９-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-２０-セチルエーテル（リー（Ｌｅｅ）ら、治療薬剤担体システムにおける批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１、８：２、９２-１９１）；およびＦＣ-４３（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら、ジャーナル・オブ・ファーマシー・アンド・ファーマコロジー（Ｊ．Ｐｈａｒｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９８８、４０、２５２-２５７）などのパーフルオロ化合物乳剤を含む。
【０１７６】
非界面活性剤は、例えば不飽和環状尿素、１-アルキル-および１-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体（リー（Ｌｅｅ）ら、治療薬剤担体システムにおける批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１、８：２、９２-１９１）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）ら、ジャーナル・オブ・ファーマシー・アンド・ファーマコロジー（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｎｔａｃｏｌ．）、１９８７、３９、６２１-６２６）を含む。
【０１７７】
「医薬的に許容し得る担体」（賦形剤）は、医薬的に許容し得る溶媒、懸濁剤または１つまたは複数の核酸を動物に送達するための任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。医薬的に許容し得る担体は、液体または固体であってもよく、また核酸と特定の医薬組成の他の構成要素が組み合わされる場合、望ましい容量、密度などを提供するように考慮して計画された投与方法によって選択される。医薬的に許容し得る主な担体は、結合剤（例えば事前にゼラチン化されたトウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリルまたはカルシウムリン酸水素など）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、スターチ、グリコール酸ナトリウムスターチなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を含むが、それらに制限されない。徐放性経口送達システムおよび／または経口投与薬型の腸溶性コーティングについては、米国特許４，７０４，２９５、４，５５６，５５２、４，３０９，４０６、および４，３０９，４０４に記載されている。
【０１７８】
本発明の組成物は、通常医薬組成物中で従来的に見出される他の補助成分をさらに含んでよい。従って、例えば当該組成物は、追加の融和性医薬的に活性な物質、例えば、かゆみ止め薬、アストリンゼン、局部麻酔薬または抗炎症剤などを含んでよい。または、染料、香料添加剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤など、本発明の組成の様々な投与形態を物理的に形成するために有効な追加物質を含んでよい。しかし、そのような物質は、添加された場合に本発明の組成の化合物の生体活性を過度に干渉してはならない。
【０１７９】
本発明のオリゴマー化合物を患者に導入する方法に関わらず、コロイド分散系は、化合物のインビボ安定性を強化するため、および／または特定の器官、組織または細胞のタイプに該化合物を標的とするための送達ビヒクルとして使用され得る。コロイド分散系は、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび脂質（未同定構造のオリゴヌクレオチド複合体）を含む高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質基材系を含むが、それに制限されない。コロイド分散系の一例は、多数のリポソームである。リポソームは、二層構造に配置された脂質から成る１つまたは複数の外層に囲まれた水性核を持つ微小球体である（一般にはコーン（Ｃｈｏｎｎ）ら、バイオテクノロジーにおけるカレントオピニオン（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、１９９５、６、６９８-７０８を参照）。
【０１８０】
本発明の特定の実施態様は、リポソームおよび他の組成物、非アンチセンス機構によって機能する１つまたは複数の他の化学療法薬を提供する。そのような化学療法薬の例として、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ニトロゲンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６-メルカプトプリン、６-チオグアニン、シタラビン、５-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコフォルマイシン、４-ヒドロキシペロキシシクロホスホラミド、５-フルオロウラシル（５-ＦＵ）、５-フルオロデオキシウリジン（５-ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タクソール；ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ-１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、カーボプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられるが、それらに制限されない。一般に、メルクマニュアル―診断薬と治療（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１５版、１９８７、ｐｐ．１２０６-１２２８、ベルコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）ら、編．Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．を参照。本発明の化合物とともに使用する場合、そのような化学療法薬は個別に（例えば、５-ＦＵとオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば５-ＦＵとオリゴヌクレオチドを一定期間投与した後、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチドを投与する）、または１つまたは複数の他の化学療法薬と組み合わせて（例えば、５-ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、または５-ＦＵ、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）使用する。
【０１８１】
リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むがそれらに限定されない非ステロイド系抗炎症薬とコルチコステロイド、および抗ウイルス薬を含むがそれらに限定されない抗炎症薬は、本発明の組成と結合することもできる。一般に、メルクマニュアル―診断と治療（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１５版、ベルコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）ら、編．１９８７、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．ｐｐ．２４９９-２５０６および４６-４９を参照。他の非アンチセンス化学療法薬も本発明の範囲に含まれる。２つ以上組合せた化合物を、一緒に使用しても、または連続的に使用してもよい。
【０１８２】
治療用組成物の処方およびその後の投与は、当該技術分野における従来技術に含まれると考えられる。投薬は処置される病状の重篤度および感受性に依存する。その処置期間は数日から数ヶ月、または治療効果が現れるまで、または病状が減退するまでである。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物累積測定の結果から計算できる。当業者であれば、最適用量、投与方法および繰返し率を容易に判定できる。最適用量は個別のオリゴヌクレオチドの相対力によって変動し、一般にインビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であると判断されるＥＣ５０ｓに基づいて推定される。一般に、用量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇであり、１日に１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、または１年に１回投与される。当該技術分野における従来技術を有する者は、体液または組織内の測定された滞留時間および薬物濃度に基づいて投与の繰返し率を容易に推定できる。処置が成功した場合、患者はその後維持療法を受けて病状の再発を避けることが望ましい。ここで、維持量（体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇ）の当該オリゴヌクレオチドが１日に１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、または１年に１回投与される。二本鎖化合物の場合、用量は第二鎖の増加した核酸負荷（２つの個別の鎖を含む化合物を有する場合）または追加の核酸長（二本鎖領域を持つ自己相補的な一本鎖を有する場合）を考慮して計算する必要がある。
【０１８３】
二本鎖化合物は、多くの異なる方法で細胞に導入することができる。例えば、二本鎖化合物は、マイクロインジェクション、二本鎖化合物で覆われた微粒子衝撃、二本鎖化合物溶液への細胞浸積、二本鎖化合物の存在下で細胞電気穿孔、二本鎖化合物のリポソーム媒介送達、カルシウムホスホン酸、陽イオン性脂質などの化学物質によって媒介されるトランスフェクション、ウイルス感染、形質転換などによって投与できる。二本鎖化合物は、細胞によるＲＮＡ取り込みを強化し、アニーリル化した鎖を安定化し、またはターゲットとなるポリヌクレオチド配列の機能阻害を増加させる構成要素とともに導入することができる。細胞培養または組織エクスポアントの場合、細胞は二本鎖化合物を含む溶液中で便利に培養されるか、または脂質媒介の形質転換を受ける。
【０１８４】
スルビビンの発現または過剰発現に関連する病気の処置または予防目的でヒトまたは動物患者に投与される二本鎖化合物の最適量の決定は、その二本鎖オリゴヌクレオチドを含む治療薬または医薬組成物の投与方法とともに、医薬技術分野の範囲である。ヒトまたは動物患者への投与量は、症状、状態、または病気の性質、疾患細胞または組織の性質、患者の状態；体重；一般的な健康状態；性別；食事；時間、期間および投与経路；二本鎖化合物の吸収、送達、代謝および排出率；他の薬物の組み合わせ；薬理学上の重篤度、および処置される病状の反応性に依存する。投与される二本鎖化合物の量は、ターゲットポリヌクレオチド配列またはその領域の性質、および二本鎖化合物の性質にも依存し、望ましいレベルの有効性を獲得するために予め最適化することができる。処置の期間は数日から数週間または数ヶ月、あるいは治療の効果が現れるまたは病状の許容できる軽減または回避が達成されるまで継続する。最適な投与スケジュールは、処置の有効性と併せて、患者の体内における薬物累積の計測結果から計算できる。従来技術を有する者であれば、容易に最適用量、投与方法および繰返し率を判断できる。
【０１８５】
本発明の実施態様は特定の実施態様に従って特異性について記載しているが、以下の例は本発明を説明するためのものであり、それに制限することを意図していない。
（実施例）
【実施例１】
【０１８６】
実施例１：オリゴヌクレオチド合成デオキシおよび２’-アルコキシアミダイトのヌクレオシドホスホラミダイト
２’-デオキシおよび２’-メトキシβ-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、製造販売元から購入した（例えば、マサチューセッツ州ニードハンのケムジーン社（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）社、またはバージニア州スターリングのグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）社）。他の２’-Ｏ-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、米国特許５，５０６，３５１に記載のとおり生成される。この特許は、参照することによりここに組み込まれる。２’-アルコキシアミダイトを使用して合成されたオリゴヌクレオチドの場合、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待機段階が３６０秒まで増加することを除いて、未修飾オリゴヌクレオチドの標準周期が使用される。
【０１８７】
５-メチル-２’-デオキシシチジン（５-Ｍｅ-Ｃ）ヌクレオチドは、公開済みの方法（サンクヴィ（Ｓａｎｇｈｖｉ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９３、２１、３１９７-３２０３）に従って、購入可能なホスホラミダイト（バージニア州スターリングのグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社、またはマサチューセッツ州ニードハンのケムジーン社（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）社）を使用して合成される。
【０１８８】
２’-フルオロアミダイト
２’-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’-フルオロオリゴヌクレオチドは、前述の（カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー（Ｊ。  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、１９９３、３６、８３１-８４１）および米国特許５，６７０，６３３に記載のとおり合成した。これらは参照することによりここに組み込まれる。つまり、保護ヌクレオシドＮ６-ベンゾイル-２’-デオキシ-２’-フルオロアデノシンは、購入可能な９-β-Ｄ-アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、文献の手順を修飾することによって合成される。ここで、２’-α-フルオロ原子が２’-β-トリチル基のＳＮ２-置換に導入される。このため、Ｎ６-ベンゾイル-９-β-Ｄ-アラビノフラノシルアデニンが、３’、５’-ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として中間収率において選択的に保護される。ＴＨＰおよびＮ６-ベンゾイル基の脱保護は、標準的な方法を使用して行った。また標準な方法を使用して、５’-ジメトキシトリチル-（ＤＭＴ）および５’-ＤＭＴ-３’-ホスホラミダイト中間体を得た。
【０１８９】
２’-フルオロデオキシグアノシン
２’-デオキシ-２’-フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９-β-Ｄ-アラビノフラノシルグアニンを出発物質として、また中間ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの転換を使用して行った。ＴＨＰを持つヒドロキシル基の保護に続いてＴＰＤＳ基を脱保護し、ジイソブチリル２-ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。
【０１９０】
選択的なＯ-脱アシル化およびトリフレーションは、フッ化物を用いて粗製物を処理した後、ＴＨＰ基を脱保護した。標準的な方法論を用いて５’-ＤＭＴ-および５’-ＤＭＴ-３’-ホスホラミダイトを得た。
【０１９１】
２’-フルオロウリジン
２’-デオキシ-２’-フルオロウリヂンの合成は、文献の手順を修飾することによって行った。ここで、２，２’-無水素-１-β-Ｄ-アラビノフラノシルウラシルは、７０％水素フッ化ピリジンで処理される。標準的な手順を使用して、５’-ＤＭＴおよび５’-ＤＭＴ-３’ホスホラミダイトを得た。
【０１９２】
２’-フルオロデオキシチジン
２’-デオキシ-２’-フルオロウリジンのアミノ化を介して２’-デオキシ-２’-フルオロシチジンを合成した後、選択的保護によってＮ４-ベンゾイル-２’-デオキシ-２’-フルオロシチジンを得た。標準的な手順を使用して、５’-ＤＭＴおよび５’-ＤＭＴ-３’ホスホラミダイトを得た。
【０１９３】
２’-Ｏ-（２-メトキシエチル）修飾アミダイト
２’-Ｏ-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは、以下のように生成するか、または代替としてマーティン、Ｐ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）、ヘルベチカ・シミカ・アクタ（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｓｃｔａ）、１９９５、７８、４８６-５０４の方法に従って生成した。
【０１９４】
２，２’-無水（１-（β-Ｄ-アラビノフラノシル）-５-メチルウリジン）
５-メチルウリジン（リボシルチミン、銚子市ヤマサ（Ｙａｍａｓａ）社を通じて商業的に入手可能）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニル炭酸塩（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。その混合液を加熱し、攪拌しながら還流させた。これによって発生する二酸化炭素ガスを統制下で放出した。１時間後、わずかに暗くなった溶液を減圧下で濃縮した。結果として得られたシロップをジエチルエーテル（２．５Ｌ）に攪拌しながら注いだ。ガムが形成された。エーテルを静かに移し、残留物を最小量のメタノール（ｃａ．４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を新たなエーテル（２．５Ｌ）に注ぎ、固いガムを生成した。このエーテルを静かに移し、ガムを真空オーブンで乾燥させた（１ｍｍＨｇで６０℃、２４時間）。その結果、明るい黄褐色の粉末状に砕かれた固体が生成された（５７ｇ、粗製収率８５％）。ＮＭＲスペクトラムは構造と一致し、そのナトリウム塩であるフェノールで汚染された（ｃａ．５％）。この物質を、さらなる反応に使用した（または酢酸エチル中のメタノール勾配（１０-２５％）を使用し、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、白色固体を得た。ｍｐ２２２-４℃）。
【０１９５】
２’-Ｏ-メトキシエチル-５-メチルウリジン
２，２’-無水-５-メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２-メトキシエチル）ホウ酸塩（２３１ｇ、０．９８Ｍ）および２-メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌステンレス鋼圧力容器に入れ、１６０℃に予熱したオイルバスに入れた。１５５から１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開けて溶液を蒸発乾固させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で磨砕した。残留物を熱いアセトン（１Ｌ）で懸濁した。不溶性の塩をろ過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄して、そのろ液を蒸発させた。その残留物（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解して蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）に詰めた。その残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）に溶解し、シリカ（１５０ｇ）上に吸収させた後、カラムに乗せた。生成物をパッキング溶液とともに溶出し、１６０ｇ（６３％）の生成物を生じた。不純画分を再度処理することによって追加の物質が得られた。
【０１９６】
２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルウリジン
２’-Ｏ-メトキシエチル-５-メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）でと共に蒸発し、その乾燥残留物をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。ジメトキシトリチル塩化物の第一アリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、その混合物を室温で１時間攪拌した。ジメトキシトリチル塩化物の第二アリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、その反応液をさらに１時間攪拌した。次にメタノール（１７０ｍＬ）を加えて反応を止めた。ＨＰＬＣは約７０％の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させて、ＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）と共に磨砕した。残留物をＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）に溶解し、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣ０３および２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過して蒸発させた。残留物２７５ｇを得た。この残留物を３．５ｋｇシリカゲルカラム上で精製し、パックして、０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出した。純粋画分を蒸発させ、１６４ｇの生成物を得た。不純画分からさらに約２０ｇが得られ、合計収量は１８３ｇ（５７％）であった。
【０１９７】
３’-Ｏ-アセチル-２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルウリジン
２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（ＤＭＦ５６２ｍＬおよびピリジン１８８ｍＬから生成した３：１混合物７５０ｍＬ）および無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を混合し、室温で２４時間攪拌した。この反応を、ＭｅＯＨの添加によりｔｌｃサンプルをまず停止させ、ｔｌｃでモニターした。ｔｌｃから、反応が終了したと判断されたら、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、混合液を３５℃で蒸発させた。残留物をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ２００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ２００ｍＬ）で抽出した。２００ｍＬのＣＨＣ１３で水層を逆抽出した。合わせた有機体を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて１２２ｇの残留物を得た（約９０％の生成物）。残留物を３．５ｋｇシリカゲルカラム上で精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて９６ｇ（８４％）を産出した。後者の画分からさらに１．５ｇが得られた。
【０１９８】
３’-Ｏ-アセチル-２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチル-４-トリアゾールウリジン
最初の溶液を、ＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）に３’-Ｏ-アセチル-２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）を溶解することによって調製し、置いておく。
【０１９９】
ＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）にトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）を加えた溶液にトリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）を添加し、−５℃まで冷却してオーバーヘッド攪拌器で攪拌した。この攪拌した溶液にＰＯＣｌ３を０．５時間にわたって滴加し、０−１０℃で維持した。その結果生じた混合液をさらに２時間攪拌した。後者の溶液に最初の溶液を４５分間以上滴下添加した。反応混合液から塩を濾去し、溶液を蒸発させた。その残留物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、ろ液から不溶性固体を除去した。ろ液をＮａＨＣＯ３（１ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥、蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃで磨砕し、表題の化合物を得た。
【０２００】
２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルシチジン
３’-Ｏ-アセチル-２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチル-４-トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）をジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ４０Ｈ（３０ｍＬ）に加えた溶液を室温で２時間攪拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、その残留物をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）で共沸混合した。この残留物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２Ｌステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和したＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、容器を２時間１００℃まで加熱した（ｔｌｃは完全変換を示した）。容器の内容物を蒸発乾固させ、残留物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解して、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で一度洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて８５ｇ（９５％）の表題化合物を得た。
【０２０１】
Ｎ４-ベンゾイル-２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルシチジン
２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルシチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水ベンゾイン（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を加えて攪拌した。３時間攪拌した後、ｔｌｃは反応が約９５％完了したことを示した。この溶媒を蒸発させて、残留物をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で共沸混合した。残留物をＣＨＣ１３（７００ｍＬ）でインキュベートし、飽和ＮａＨＣＯ３（２ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥、蒸発させて残留物（９６ｇ）を得た。溶出溶媒として０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用して、この残留物を１．５ｋｇシリカカラムでクロマトグラフにかけた。純粋生成物の画分を蒸発させて９０ｇ（９０％）の表題化合物を得た。
【０２０２】
Ｎ４-ベンゾイル-２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルシチジン-３’-アミダイト
Ｎ４-ベンゾイル-２’-Ｏ-メトキシエチル-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-５-メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に溶解する。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２-シアノエトキシテトラ（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を窒素雰囲気下で攪拌しながら加えた。その結果生じる混合液を室温で２０時間攪拌した（ｔｌｃは反応が９５％完了したことを示した）。この反応混合液を飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。水性洗液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で逆抽出し、該抽出液を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥、濃縮した。溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用して、得られた残留物を１．５ｋｇシリカカラムでクロマトグラフにかけた。純粋な画分を合わせて、９０．６ｇ（８７％）の表題化合物を得た。
【０２０３】
２’-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトを米国特許６，１２７，５３３の方法に従って生成する。この特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【実施例２】
【０２０４】
実施例２：オリゴヌクレオチドの合成
ヨウ素による酸化を用いた標準ホスホロアミダイト化学反応を使用して、未置換および置換リン酸ジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル３８０Ｂ）で合成した。
【０２０５】
亜リン酸塩結合の段階的なチエーション（ｔｈｉａｔｉｏｎ）のために、アセトニトリルに３Ｈ-１，２-ベンゾジチオール-３-オン-１，１-ジオキサイドを加えた０．２Ｍ溶液で標準酸化ボトルを置き換えたことを除いて、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドに関して、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を合成した。チエーション（ｔｈｉａｔｉｏｎ）待機段階は６８秒まで増加し、その後にキャッピング段階が続いた。ＣＰＧカラムから切断し、５５℃で１８時間濃縮したアンモニウム水酸化物で脱ブロック化した後、０．５ＭＮａＣｌ溶液から２．５量のエタノールで二度沈殿させることによってオリゴヌクレオチドを精製した。ホスフィン酸塩オリゴヌクレオチドは、米国特許５，５０８，２７０に記載のとおり生成される。この特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【０２０６】
リン酸アルキルオリゴヌクレオチドは、米国特許４，４６９，８６３に記載のとおり生成される。この特許は、参照することによりここに組み込まれる
【０２０７】
３’-デオキシ-３’-リン酸メチレンオリゴヌクレオチドは、米国特許５，６１０，２８９または５，６２５，０５０に記載のとおり生成される。これらの特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【０２０８】
ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許５，２５６，７７５または５，３６６，８７８に記載のとおり生成される。これらの特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【０２０９】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、公開済みのＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ９４／１７０９３およびＷＯ９４／０２４９９として公開）に記載の方法で生成される。これは参照することによりここに組み込まれる。３’-デオキシ-３’-アミノホスホラミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許５，４７６，９２５に記載のとおり生成される。この特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【０２１０】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許５，０２３，２４３に記載のとおり生成される。この特許は、参照することによりここに組み込まれる
【０２１１】
ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許５，１３０，３０２および５，１７７，１９８に記載の方法で生成される。これらの特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【０２１２】
４-リボヌクレオシドおよび２’-デオキシ-４’リボヌクレオシド組成は、ナカ（Ｎａｋａ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１２２：７２３３-７２４３，２０００および米国特許５，６３９，８７３に記載の方法で生成される。これらは、その全体を参照することによりここに組み込まれる。
【実施例３】
【０２１３】
実施例３：オリゴヌクレオシドの合成
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレシド、アミド-３結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-３結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、アミド-４結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、さらにＭＭＩの代わりにＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ結合を持つ混合骨格化合物は、米国特許５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７、５，６０２，２４０、および５，６１０，２８９に記載のとおり生成される。これらの特許は、すべてを参照することによりここに組み込まれる。本発明のオリゴマー化合物は、混合結合を構成してもよい。その混合結合において、任意の数の複数の型の結合が、例えば、ホスホロチオエート結合を含む５’ハーフの化合物およびホスホジエステル結合を含む３’ハーフ等のオリゴマー化合物内の任意の位置に任意の順序で存在する。これらは混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合と呼ばれる。
【０２１４】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許５，２６４，５６２および５，２６４，５６４に記載のとおり生成される。これらの特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【０２１５】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許５，２２３，６１８に記載のとおり生成される。この特許は参照することによりここに組み込まれる。
【実施例４】
【０２１６】
実施例４：ＰＮＡの合成
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）：合成、特性、およびポテンシャルアプリケーション、バイオオーガニック・アンド・メディカル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９６、４、５-２３において参照される様々な手順に従って生成される。また米国特許５，５３９，０８２、５，７００，９２２、および５，７１９，２６２に従って生成してもよい。これらの特許は、参照することによりここに組み込まれる。
【実施例５】
【０２１７】
実施例５：キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドには、幾つかの異なるタイプがある。結合ヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが結合ヌクレオシドの５’「翼」セグメントと３’「翼」セグメントの間に位置する第一タイプと「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’または５’末端のいずれかに位置する第二「オープンエンド」タイプがある。第一タイプのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において「ギャップマー」またはギャップトオリゴヌクレオチドとして知られている。第二タイプのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において「ヘミマー」または「ウィングマー」として知られている。
【０２１８】
本発明の二本鎖化合物は、ｓｉＲＮＡ、標準ｓｉＲＮＡ、平滑末端ｓｉＲＮＡまたはヘアピンを含むがそれらに制限されない幾つかのタイプである。ＲＮＡｉアンチセンス機構を付与する本発明の一本鎖化合物も本発明の範囲内に含まれる。これらは、ｓｓＲＮＡｉおよびアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）を含むがそれらに制限されない。
【０２１９】
（２’-Ｏ-Ｍｅ）-（２’-デオキシ）-（２’-Ｏ-Ｍｅ）キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’-Ｏ-アルキルホスホロチオエートおよび２’-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを持つキメラオリゴヌクレオチドは、上記のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製自動ＤＮＡシンセサイザーモデル３８０Ｂを使用して合成される。オリゴヌクレオチドは自動シンセサイザーを使用して、ＤＮＡ部分の２’-デオキシ-５’-ジメトキシトリチル-３’-Ｏ-ホスホラミダイトおよび２’-ＭＯＥ修飾ヌクレオチドの５’-ジメトキシトリチル-２’-Ｏ-メチル-３’-Ｏ-ホスホラミダイトで合成される。標準的な合成周期は、テトラゾールおよび塩基送達後の待機段階を、ＲＮＡの場合の４倍、２’-Ｏ-メチルの場合の２倍の時間である６００秒まで増加させることによって修飾する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、リン酸基をアンモニア／エタノール（３：１）において室温で一晩脱保護した後、凍結乾燥した。メタノールアンモニアにおいて室温で２４時間処理して脱保護した後、すべての塩基およびサンプルを再度凍結乾燥した。ペレットを１Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦにおいて室温で２４時間懸濁して２’位を脱保護した。この反応を１Ｍ  ＴＥＡＡで停止させ、サンプルをロトバックによって半量まで減量した後、Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩した。キャピラリー電気泳動および質量分析によって、回収されたオリゴの収率および純度を分光光度法的に分析した。
【０２２０】
（２’-Ｏ-（２-メトキシエチル））-（２’-デオキシ）-（２’-Ｏ-（メトキシエチル））キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
（２’-Ｏ-（２-メトキシエチル））-（２’-デオキシ）-（-２’-Ｏ-（メトキシエチル））キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２’-Ｏ-メチルキメラオリゴヌクレオチドの場合、２’-Ｏ-メチルアミダイトの２’-Ｏ-（メトキシエチル）の置換基を用いて、上記の手順に従って生成する。
【０２２１】
（２’-Ｏ-（２-メトキシエチル）ホスホジエステル）-（２’-デオキシホスホロチオエート）-（２’-Ｏ-（２-メトキシエチル）ホスホジエステル）キメラオリゴヌクレオチド
（２’-Ｏ-（２-メトキシエチル）ホスホジエステル）-（２’-デオキシホスホロチオエート）-（２’-Ｏ-（メトキシエチル）ホスホジエステル）キメラオリゴヌクレオチドは、２’-Ｏ-メチルアミダイトの２’-Ｏ-（メトキシエチル）アミダイト置換基を用いて２’−Ｏ-メチルキメラオリゴヌクレオチドの上記の手順に従って生成し、ヨウ素で酸化して、キメラ構造の翼部分にホスホジエステルインターヌクレオチド結合を生成する、また３，Ｈ-１，２ベンゾジチオール-３-オン  １，１ジオキサイド（ヴューケージ試薬（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ））を使用して硫化し、中心ギャップのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を生成する。
【０２２２】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許５，６２３，０６５に従って合成される。この特許は、参照することにより本書に組み込まれる。
【０２２３】
ＲＮＡの合成
一般に、ＲＮＡ合成の化学的性質は、戦略的な中間体反応時に様々な保護基を選択的に組み込むことに基づく。当該技術分野における従来技術を有する者であれば、有機合成における保護基の使用を理解すると考えられるが、有効な保護基群はシリルエーテルを含む。特に、大量のシリルエーテルを使用して、２’-ヒドロキシル上にある酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて５’-ヒドロキシルを保護する。この保護基の組み合わせは、標準的な固相合成技術で使用される。他の合成段階がすべて終了した後、酸に不安定なオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。さらに、合成中にシリル保護基を早期使用することによって、必要な場合は、２’ヒドロキシルの望ましくない脱保護なしに容易に除去することができる。
【０２２４】
個別に除去される保護基および個別に化学的に不安定な保護基による２-ヒドロキシルの保護と組み合わせて、５’-ヒドロキシルの連続的な保護のこの手順を実施すると、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが合成される。
【０２２５】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、段階的に合成される。各ヌクレオチドを固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに連続的に加える（３’-から５’-方向）。鎖の３’-端にある第一ヌクレオシドは固体支持体と共有結合している。前駆ヌクレオチド、リボヌクレオシドホスホルアミダイト、および活性剤を加え、第二塩基を第一ヌクレオシドの５’-端に結合する。支持体を洗浄し、任意の未反応５’-ヒドロキシル基を無水酢酸でキャップして５’-アセチル部分を生成する。次に、この結合がさらに安定し、最終的には目的とするＰ（Ｖ）結合が得られるように酸化させる。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、５’-シリル基をフルオリドで開裂する。このサイクルを続く各ヌクレオチドに対して繰り返す。
【０２２６】
合成した後、ＤＭＦにおける１Ｍ ２ナトリウム-２-カルバモイル-２-シアノエチレン-１、１-ジチオレートトリハイドレート（Ｓ２Ｎａ２）を使用して、リン酸上のメチル保護基を３０分間開裂する。脱保護溶液を固体支持体結合オリゴヌクレオチドから水で洗い出す。次に４０％メチルアミンを用いて、この支持体を水中において１０分間５５℃で処理する。これによって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが溶液中に放出され、環外アミンを脱保護して２’-基を修飾する。この段階で、陰イオン交換ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを分析できる。
【０２２７】
２’-オルトエステル基は、最後に除去される保護基である。ダーマコン・リサーチ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社（コロラド州ラファイエット）が開発したエチレングリコールモノアセテートオルトエステル保護基は、以下の重要な特性を持つ有効なオルトエステル保護基の一例である。ヌクレオシドホスホラミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の状態は安定している。しかし、オリゴヌクレオチド合成後、当該オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドを固体支持体から開裂するだけでなく、オルトエステルからアセチル基を除去するメチルアミンで処理される。結果として生じるオーソエステルオルトエステル上の２-エチル-ヒドロキシル置換基は、電子求引性がアセチル化前駆体よりも低い。従って、修飾オルトエステルは酸性触媒の加水分解に対してさらに不安定になる。特に、開裂率はアセチル基を除去した後、約１０倍速くなる。そのため、このオルトエステルはオリゴヌクレオチド合成と適合するために十分な安定性を有するが、次に修飾された場合に、最後のＲＮＡオリゴヌクレオチド生成物に適合する比較的穏やかな水性状態下での脱保護を許可する。
【０２２８】
さらに、ＲＮＡ合成方法は当該技術分野においてよく知られている（スカリンジ、Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ．）論文、コロラド大学、１９９６；スカリンジ、Ｓ．Ａ．（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９８、１２０、１１８２０-１１８２１；マテウチ、Ｍ．Ｄ．（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．）およびカルザーズＭ．Ｈ．（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．）米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９８１、１０３、３１８５-３１９１；ヴューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）およびカルザーズＭ．Ｈ．（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．）、テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、１９８１、２２、１８５９-１８６２；ダール、Ｂ．Ｊ．（Ｄａｈｌ，Ｂ．Ｊ．）ら、アクタ・ケミカル・エスシーエーエヌディー（Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．）、１９９０、４４、６３９-６４１；レディー、Ｍ．Ｐ．（Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｐ．）ら、テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、１９９４、２５、４３１１-４３１４；ウィンコット、Ｆ．（Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１９９５、２３、２６７７-２６８４；グリフィン、Ｂ．Ｅ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．）ら、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、１９６７、２３、２３０１-２３１３；グリフィン、Ｂ．Ｅ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．）ら、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、１９６７、２３、２３１５-２３３１）。
【０２２９】
本発明のＲＮＡアンチセンス化合物（一本または二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、ここに記載の方法で合成するか、またはダーマコン・リサーチ（Ｄｈａｒａｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社（コロラド州ラファイエット）から購入できる。一旦合成されると、相補ＲＮＡアンチセンス化合物が当該技術分野において周知の方法でアニールされて二本鎖（重複）アンチセンス化合物を形成する。例えば、二本鎖は３０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチドの相補鎖（５０μＭ  ＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）と１５μ１の５Ｘアニーリングバッファー（１００ｍ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）をあわせて、９０℃で１分間、その後３７℃で１時間加熱することによって形成する。結果として得られた二本鎖アンチセンス化合物をキット、アッセイ、スクリーン、または他の方法で使用して、ターゲット核酸の役割の調査、または診断目的あるいは治療目的で使用することができる。
【実施例６】
【０２３０】
実施例６：オリゴヌクレオチドの単離
制御されたコアガラスカラム（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）から切断し、濃縮水酸化アンモニウムにおいて５５℃で１８時間脱ブロック化した後、２．５量エタノールを加えた０．５Ｍ  ＮａＣｌから二度沈殿させることによって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを精製する。合成オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ゲルを変性しながら分析したところ、全長が少なくとも８５％であると判定された。合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、３１Ｐ核磁気共鳴分光学によって定期的にチェックした。幾つかの研究では、チャン（Ｃｈｉａｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミカル（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）１９９１、２６６、１８１６２-１８１７１に記載のように、オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ精製物質で得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製物質で得られた結果と類似していた。
【実施例７】
【０２３１】
実施例７：オリゴヌクレオチドの合成-９６ウェルプレート形式
オリゴヌクレオチドを固相Ｐ（III）ホスホラミダイト化学反応を介して、９６配列を標準９６ウェル形式で同時に組み立てることができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、水性ヨウ素を用いる酸化によって提供される。ホスホルチオエートインターヌクレオチド結合は、無水アセトニトリル中で３，Ｈ-１，２ベンゾジチオール-３-ｏｎｅ  １，１ジオキサイド（ヴューケージ試薬（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ））を使用して、硫化することによって生成した。標準的な塩基保護βシアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトは、製造元から購入した（例えば、ＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ-Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、カリフォルニア州フォスター市、またはファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）。非標準ヌクレオシドは、周知の文献または特許された方法に従って合成される。これらを塩基保護βシアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトとして使用する。
【０２３２】
オリゴヌクレオチドを支持体から開裂し、５５から６０℃に加温しながら１２から１６時間濃縮ＮＨ４０Ｈで脱保護した。その後、放出された生成物を真空で乾燥させた。乾燥した生成物を、滅菌水中で再度懸濁し、すべての分析および試験プレートサンプルが配置されていたマスタープレートを自動分注器で希釈した。
【実施例８】
【０２３３】
実施例８：オリゴヌクレオチドの分析-９６ウェルプレート形式
各ウェルにおけるオリゴヌクレオチドの濃度をサンプルの希釈およびＵＶ光吸光度法によって検査した。個別の生成物の完全統合は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、９６ウェル形式で（ベックマン  Ｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ）／ＡＣＥＪ  ＭＤＱ）または個別に生成されたサンプルの場合は、商業的ＣＥ装置（例えば、ベックマン  Ｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ）／ＡＣＥＪ５０００、ＡＢＩ２７０）のいずれかによって評価した。塩基および骨格の組成は、化合物の質量分析によって、エレクトロスプレー電気質量計を使用して確認した。すべてのアッセイテストプレートを単一および複数チャンネル自動分注器を使用してマスタープレートから希釈した。プレートについては、プレート上の化合物の少なくとも８５％が、全長の少なくとも８５％である場合に許容できると判断した。
【実施例９】
【０２３４】
実施例９：細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
アンチセンス化合物がターゲット核酸の発現に与える影響は、ターゲット核酸が測定可能なレベルで存在するなら、あらゆる様々な細胞型でテストできる。これは通常、例えばＰＣＲまたはノーザンブロット分析を使用して判断される。説明目的で以下の細胞型を提示するが、他の細胞型も通常使用できる。
【０２３５】
ＭＣＦ７：
ヒト乳癌細胞線ＭＣＦ-７は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から入手した。ＭＣＦ-７細胞は通常どおり、１０％ウシ胎仔血清（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カリフォルニア州カールスバッド）で補完されたＤＭＥＭ低グルコース（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カリフォルニア州カールスバッド）において培養した。約９０％コンフルエンスに達した後、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代した。細胞を約７，０００細胞／ウェル密度で９６-ウェルプレート（ファルコン-プリマリア（Ｆａｌｃｏｎ-Ｐｒｉｍａｒｉａ）社＃３８７２）に播種してＲＴ-ＰＣＲ分析に使用した。ノーザンブロットまたは他の分析の場合、適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、細胞を１００ｍｍまたは他の標準細胞培養プレートに播種して同様に処理してもよい。
【０２３６】
ＨｅＬａ細胞：
ヒト類上皮性肉芽腫ＨｅＬａは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州マナサス）から入手した。ＨｅＬａ細胞は通常どおり、１０％ウシ胎仔血清（インビトロゲン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社、カリフォルニア州カールスバッド）で補完されたＤＭＥＭ高グルコース（インビトロゲン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社、カリフォルニア州カールスバッド）において培養した。約９０％コンフルエンスに達した後、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代した。細胞を約５０，０００細胞／ウェル密度で２４-ウェルプレート（ファルコン-プリマリア（Ｆａｌｃｏｎ-Ｐｒｉｍａｒｉａ）社＃３８４６）に播種するか、または約５，０００細胞／ウェル密度で９６-ウェルプレートに播種して、ＲＴ-ＰＣＲ分析に使用した。ノーザンブロットまたは他の分析の場合、約９０％コンフルエンスに達した時点で細胞を収穫した。
【０２３７】
Ｕ-８７ＭＧ細胞：
ヒトグリア芽腫Ｕ-８７ＭＧ細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州マナサス）から入手した。Ｕ-８７  ＭＧ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カリフォルニア州カールスバッド）で補完されたＤＭＥＭ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カリフォルニア州カールスバッド）において培養した。約９０％コンフルエンスに達した時点で、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代した。細胞を約１０，０００細胞／ウェル密度で９６-ウェルプレート（ファルコン-プリマリア（Ｆａｌｃｏｎ-Ｐｒｉｍａｒｉａ）社＃３８７２）に播種してＲＴ-ＰＣＲ分析に使用した。
【０２３８】
ノーザンブロットまたは他の分析の場合、適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、細胞を１００ｍｍまたは他の標準細胞培養プレートに播種して同様に処理してもよい。
【０２３９】
ＨＵＶＥＣ細胞：
ＨＵＶＥＣはＡＴＣＣから取得し、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓで補完されたＥＢＭ（クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）社、メリーランド州ウォーカーシル）で培養した。約９０％コンフルエンスに達した時点で、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代し、最高１５代まで維持した。９６-ウェルプレート（１０，０００細胞／ウェル）で成長した細胞の場合、ウェルを２００μＬ  ＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１（登録商標）血清低減培地（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））で一度洗浄し、次に１２μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および最終濃度２５ｎＭの望ましい二本鎖化合物を含むＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１（登録商標）１３０μＬで処理する。処理の５時間後、培地を新しい培地と置き換える。ｄｓＲＮＡ処理の１６時間後に細胞を収集した。この時点で、ＲＮＡが分離され、ＲＴ-ＰＣＲによってターゲット低下が測定される。
【０２４０】
オリゴマー化合物の処理：
細胞が８０％コンフルエンスに達した時点で、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。９６-ウェルプレートで成長した細胞の場合、ウェルを２００μＬ  ＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１血清低減培地（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））で一度洗浄し、次に３．７５μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＪ（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））および最終濃度１５０ｎＭの望ましいオリゴヌクレオチドを含むＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１（１３０μＬ）で処理する。ｄｓＲＮＡ化合物の場合、２ｘ１３０μＬのＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１を使用した。処理の４時間後、培地を新しい培地と置き換えた。オリゴヌクレオチド処理の１６時間後に細胞を収穫した。使用したオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株ごとに異なる。特定の細胞株に最適なオリゴヌクレオチド濃度を判断するため、一連の濃度の実対照オリゴヌクレオチドで細胞を処理する。ヒト細胞の場合、ＲＮＡｓｅ  Ｈオリゴヌクレオチドの実対照は、ヒトＨ-ｒａｓをターゲットとするホスホロチオエート骨格を持つＩＳＩＳ１３９２０、ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ、配列番号：１、２’-Ｏ-メトキシエチルギャップマー（太字で示す２’-Ｏ-メトキシエチル）である。マウスまたはラット細胞の場合、実対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットｃ-ｒａｆの両方を標的とするホスホロチオエート骨格を持つＩＳＩＳ１５７７０、ＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡ、配列番号：２、２’-Ｏ-メトキシエチルギャップマー（太字で示す２’-Ｏ-メトキシエチル）である。Ｈ-ｒａｓ（ＩＳＩＳ１３９２０の場合）またはｃ-ｒａｆ（ＩＳＩＳ１５７７０の場合）を８０％抑制する実対照オリゴヌクレオチドの濃度は、当該細胞株の次の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として使用される。８０％の抑制が達成されない場合、Ｈ-ｒａｓまたはｃ-ｒａｆ  ｍＲＮＡを６０％抑制する実対照オリゴヌクレオチドの最低濃度が、当該細胞株の次の実験におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として使用される。６０％の抑制が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドのトランスフェクション実験に適していないと判断される。
【実施例１０】
【０２４１】
実施例１０：スルビビン発現のオリゴヌクレオチド抑制の分析
スルビビン発現のアンチセンス調節は、当該技術分野において周知の様々な方法で試験できる。例えば、スルビビンｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または実時間ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）などで計量できる。現行では、実時間定量ＰＣＲが好まれている。ＲＮＡ分析は総細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施される。ＲＮＡ分離方法は、例えばオースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１巻、ｐｐ．４．１．１-４．２．９、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９６で説明されている。ノーザンブロット分析は、当該技術分野において周知であり、例えばオースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１巻、ｐｐ．４．２．１-４．２．９、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９６で説明されている。実時間定量（ＰＣＲ）は、ＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ-Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社（カリフォルニア州フォスター市）から購入可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システムを製造者の指示に従って使用して便利に実施できる。他のＰＣＲ手段も当該技術分野において周知である。
【０２４２】
スルビビンタンパク質レベルは、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析（免疫ブロット法）、ＥＬＩＳＡまたは蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）など、当該技術分野において周知の様々な方法で定量できる。スルビビンを対象とする抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（アエリー社（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミシシッピ州バーミンガム）等の様々な資料から識別および取得するか、または従来の抗体生成方法を介して生成することができる。ポリクローナル抗血清の生成方法は、例えばオースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２巻、ｐｐ．１１．１２．１-１１．１２．９、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９７で説明されている。モノクローナル抗体の生成については、例えば、オースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２巻、ｐｐ．１１．４．１-１１．１１．５、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９７で説明されている。
【０２４３】
免疫沈降方法は、当該技術分野において標準的であり、例えばオースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２巻、ｐｐ．１０．１６．１-１０．１６．１１、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９７で説明されている。ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析は当該技術分野において標準的であり、例えばオースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２巻、ｐｐ．１０．８．１-１０．８．２１、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９７で説明されている。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、当該技術分野において標準的であり、例えばオースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２巻、ｐｐ．１１．２．１-１１．２．２２、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９１で説明されている。
【実施例１１】
【０２４４】
実施例１１：ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの分離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、ミウラ（Ｍｉｕｒａ）ら、臨床化学（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．）、１９９６、４２、１７５８-１７６４に従って分離される。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ分離の他の方法は、例えばオースベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、分子生物学最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１巻、ｐｐ．４．５．１-４．５．３、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９３で説明されている。つまり、９６-ウェルプレートで成長した細胞の場合、成長培地を細胞から除去し、各ウェルを２００μＬの冷たいＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ-４０、２０ｍＭ  バナジルリボヌクレオシド複合体）を各ウェルに加え、プレートをやさしく振とうし、室温で５分間培養した。５５μＬの溶解物をオリゴｄ（Ｔ）でコーティングした９６-ウェルプレート（ＡＧＣＴ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州アーバイン）に移した。プレートを室温で６０分間培養し、２００μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-Ｃｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄後、ペーパータオルでプレートの余分な洗浄バッファーを拭き取り、次に５分間空気乾燥させる。７０℃に予熱した６０μＬの溶出バッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-Ｃｌ  ｐＨ７．６）を各ウェルに加え、そのプレートを９０℃のホットプレートで５分間培養した。次に、溶出液を新たな９６-ウェルプレートに移した。
【０２４５】
１００ｍｍまたは他の標準プレートで成長した細胞は、適切な量のあらゆる溶液を使用して同様に処理してよい。
【実施例１２】
【０２４６】
実施例１２：総ＲＮＡの分離
総ｍＲＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）社（カリフォルニア州バレンシア）から購入したＲＮＥＡＳＹ９６キットおよびバッファーを製造者が推奨する手順に従って使用して分離した。つまり、９６-ウェルプレートで成長した細胞の場合、成長培地を細胞から除去し、各ウェルを２００μＬの冷たいＰＢＳで洗浄した。１００μＬバッファーＲＬＴを各ウェルに加え、プレートを２０秒間激しく振とうした。次に、１００μＬの７０％エタノールを各ウェルに加え、その内容物をピペットによって３回上下に振り混ぜた。その後、廃棄物収集トレイを備えたＱＩＡＶＡＣ連結管および真空ソースに取り付けられたＲＮＥＡＳＹ  ９６ウェルプレートに当該サンプルを移した。１５秒間真空処理した。１ｍＬのバッファーＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ  ９６プレートの各ウェルに添加し、再度１５秒間真空処理を行った。バッファーＲＰＥ洗浄を繰り返し、さらに１０秒間真空処理を行った。その後プレートをＱＩＡＶＡＣ連結管から取り外し、ペーパータオルで拭き乾かした。１．２ｍＬ収集チューブを含む収集チューブラックを備えたＱＩＡＶＡＣ連結管に再度プレートを取り付けた。次に６０μＬの水をピペットし、１分間インキュベートして３０秒間真空処理を行うことによって、ＲＮＡを各ウェルに溶出した。当該溶出ステップをさらに６０μＬの水で繰り返した。
【実施例１３】
【０２４７】
実施例１３：スルビビンｍＲＮＡレベルの実時間定量ＰＣＲ分析
スルビビンｍＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  配列検出システム（ＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ-Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、カリフォルニア州フォスター市）を製造者の指示に従って使用し、実時間定量ＰＣＲによって判定した。これは、実時間でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の高性能定量が可能な閉管で非ゲルベースの蛍光検出システムである。ＰＣＲ完了後に増幅産物が定量される標準的なＰＣＲに対して、実時間定量ＰＣＲの生成物は、累積途中で定量される。これは、ＰＣＲ反応において、特に前進ＰＣＲと後進ＰＣＲプライマーの間にアニール化するオリゴヌクレオチドプローブを組み込み、２つの蛍光染料を含めることによって行う。レポーター染料（例えば、オペロン・テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）社、カリフォルニア州アラメダ、またはＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ-Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カリフォルニア州フォスターのいずれかから入手可能なＪＯＥまたはＦＡＭ）は、当該プローブの５’端に取り付けられ、消光染料（例えば、オペロン・テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）社、カリフォルニア州アラメダ、またはＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ-Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カリフォルニア州フォスターのいずれかから入手可能なＴＡＭＲＡ）は、当該プローブの３’端に取り付けられる。プローブおよび染料が正常な場合、レポーター染料の放出は、近接の３’消光染料によって抑制される。増幅中、ターゲット配列に対する当該プローブのアニールによって、Ｔａｑポリメラーゼの５’-エクソヌクレアーゼ活性によって開裂できる置換基が生成される。ＰＣＲ増幅周期の拡張相の間、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの開裂によってプローブの残りの部分（つまり消光部分）からレポーター染料が放出され、配列特異的な蛍光シグナルが生成される。各周期において、追加のレポーター染料分子が各プローブから切断され、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システムに内蔵されているレーザー光学によって、蛍光濃度が標準的な（６秒）間隔でモニターされる。各試験において、未処理対象サンプルからのｍＲＮＡの連続希釈を含む一連の平行反応によって、標準的な曲線が生成される。これは、テストサンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の抑制率を定量するのに使用される。
【０２４８】
ＰＣＲ試薬は、ＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社（カリフォルニア州フォスター市）から入手した。２５μＬのＰＣＲカクテル（１ｘＴＡＱＭＡＮバッファーＡ、５．５Ｍ  ＭｇＣｌ２、各３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、各１００ｎＭの前進プライマー、後進プライマー、およびプローブ、２０単位のＲＮＡｓｅ抑制剤、１．２５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ、および１２．５単位のＭｕＬ  Ｖ逆転写酵素）を２５μＬのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を含む９６ウェルプレートに添加することによってＲＴ-ＰＣＲ反応を実施した。当該ＲＴ反応は、４８℃で３０分間培養することによって行った。９５℃で１０分間培養して、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤを活性化した後、４０周期の２段階ＰＣＲプロトコルを実施した。９５℃で１５分間（変性）、その後６０℃で１．５分間（アニール／拡張）。ヒトスルビビンに対するプローブおよびプライマーは、公開済みの配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号Ｕ７５２８５、配列番号：３としてここに組み込まれる）を使用して、ヒトスルビビン配列に対してハイブリッド形成するように設計されている。ヒトスルビビンの場合、ＰＣＲプライマーは前進プライマー：ＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ（配列番号：４）後進プライマー：ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＧＴ（配列番号：５）であり、ＰＣＲプローブはＦＡＭ-ＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣ-ＴＡＭＲＡ（配列番号：６）である。ここで、ＦＡＭ（ＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、カリフォルニア州フォスター市）は消光染料である。ヒトＧＡＰＤＨの場合、ＰＣＲプライマーは、前進プライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号：７）、後進プライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号：８）およびＰＣＲプローブは５’ＪＯＥ-ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ-ＴＡＭＲＡ  ３’（配列番号：９）である。ここで、ＪＯＥ（ＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、カリフォルニア州フォスター市）は蛍光レポーター染料であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ-アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、カリフォルニア州フォスター市）は消光染料である。
【実施例１４】
【０２４９】
実施例１４：スルビビンタンパク質レベルのウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析（免疫ブロット分析）は、標準的な方法で実施される。細胞はオリゴヌクレオチド処理の１６から２０時間後に収穫し、ＰＢＳで一度洗浄してＬａｅｍｍｌｉバッファー（１００μｌ／ウェル）に懸濁した後、５分間沸騰させて１６％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で負荷する。１５０Ｖで１．５時間ゲルを流し、ウェスタンブロット用の膜に移した。スルビビンを対象とする適切な一次抗体は、その一次抗体種に対抗する放射性標識または蛍光標識二次抗体とともに使用される。バンドは、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（登録商標）（モルキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、カリフォルニア州サニーベール）を使用して視覚化される。
【実施例１５】
【０２５０】
実施例１５：スルビビンを標的とする二本鎖アンチセンス化合物（ｓｉＲＮＡ）の設計およびスクリーニング
本発明によると、本発明のアンチセンス化合物およびその相補体から成る一連の二本鎖オリゴマー化合物（ｓｉＲＮＡ）は、スルビビンを標的とするように設計することができる。二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、ここに記載するように、スルビビンを標的とする少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分から成る。１つまたは複数の天然または修飾核酸塩基を追加して重複部分を形成することによって、鎖の末端を修飾する場合がある。次に、ｄｓＲＮＡのセンス鎖をアンチセンス鎖の相補体として設計、合成する。各末端に対する修飾または追加を含んでもよい。例えば、ある実施例において、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両鎖は、それぞれ１つまたは両方の末端にオーバーハングを持ち、中央核酸塩基全体に対して相補性を持つ。
【０２５１】
例えば、配列：ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号：１０）およびデオキシチミジン（ｄＴ）の２つの核酸塩基オーバーハングを持つアンチセンス鎖から成る二本鎖は、以下の構造を持つ。
ｃｇａｇａｇｇｃｇｇａｃｇｇｇａｃｃｇＴＴ  アンチセンス（配列番号：１１）
ＴＴｇｃｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃ    相補（配列番号：１２）
このように、この二本鎖化合物は、標準的なｓｉＲＮＡを示す。
【０２５２】
別の実施例において、同一配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号：１０）を持つアンチセンス鎖から成る二本鎖は、平滑末端（一本鎖のオーバーハングがない）を用いて次のように生成してよい。
ｃｇａｇａｇｇｃｇｇａｃｇｇｇａｃｃｇ  アンチセンス（配列番号：１０）
ｇｃｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃ  相補（配列番号：１３）
このように、この二本鎖化合物は平滑末端ｓｉＲＮＡを示す。
【０２５３】
二本鎖のＲＮＡ鎖は、ここに開示する方法によって合成するか、またはダーマコン・リサーチ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）社（コロラド州ラファイエット）から購入できる。合成した後、相補鎖をアニール化する。一本鎖を等分し、５０μＭ濃度に希釈する。希釈した後、３０μＬの各鎖を１５μＬのアニール溶液５Ｘ溶液と混合する。前記バッファーの最終濃度は１００ｍＭ酢酸ナトリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ  ｐＨ７．４および２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終量は７５μＬである。この溶液を９０℃で１分間インキュベーションした後、１５秒間遠心分離した。このチューブを３７℃で１時間静置する。この時ｄｓＲＮＡ二本鎖を実験に使用する。ｄｓＲＮＡ二本鎖の最終濃度は２０μＭである。この溶液を冷凍保存し（-２０℃）、最高５回まで凍結融解する。
【０２５４】
生成後、ここに記載するプロトコルに従って、二本鎖アンチセンス化合物（ｓｉＲＮＡ）のスルビビン発現調節能力を評価する。
【０２５５】
細胞培養条件、ｄｓＲＮＡｓインビトロＩＣ５０のＩＣ５０値の決定：
本発明のｄｓＲＮＡインビトロＩＣ５０のＩＣ５０値は、様々なインビトロ濃度のｄｓＲＮＡをスルビビンの発現または過剰発現に関連する病理を示す適切な細胞株、組織、または器官と接触させることによって、またスルビビン病理学または発病機構の様々なステップ、段階、または側面を含むがそれらに制限されないパラメータに関して、そのような濃度におけるこれらｄｓＲＮＡの定量効果を判断することによって決定することができる。検査できる代表的なパラメータは、例えば、スルビビンｍＲＮＡまたはスルビビンタンパク質合成の翻訳、代理マーカーへの影響、またはインビトロで便利に計測できるｄｓＲＮＡの潜在的な治療効果を示すような任意の他のパラメータを含む。
【０２５６】
当該技術分野の状況から判断すると、当業者であれば、現在存在する細胞ベースの試験を採用するか、または全く新規のインビトロ試験を開発して、必要以上に試験を行うことなく、ここに開示するｄｓＲＮＡのＩＣ５０値を決定することが可能である。
【０２５７】
ウェスタンブロット：ウェスタンブロット分析の場合、７．５Ｘ１０５細胞／皿の密度で１０ｃｍ組織培養皿（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＃３００３）に細胞を播種する。ＲＴ-ＰＣＲ分析の場合、９６-ウェルプレート（コーニング・インコーポレーテッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）＃３５９６）は、１ｘ１０４細胞／ウェルでめっきされる。リポフェクチン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））トランスフェクション試薬を３μｌ／ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ血清低減培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））／１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ二本鎖の濃度で使用する。リポフェクチン試薬をＯＰＴＩＭＥＭ培地で３０分間培養した後、ｓｉＲＮＡを加える。望ましい量のｓｉＲＮＡを添加して混ぜ合わせる。さらに１：１希釈をＯＰＴＩＭＥＭで実施する。細胞を１Ｘリン酸緩衝生理食塩水で二度洗浄した後、ＯＰＴＩＭＥＭにおいてｓｉＲＮＡ／リポフェクチン混合物で処理する。４時間培養した後、ＯＰＴＩＭＥＭ培地を完全成長培地と置き換える。ウェスタンブロットまたはＲＴ-ＰＣＲ分析用の場合は、さらに１６から２０時間後に細胞を収穫する。
【０２５８】
培養期間の最後に、培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで二度洗浄する。プレートにバッファーを直接加えることによって、細胞をＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、および１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０）に、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）Ｍｉｎｉプロテアーゼ抑制剤タブレット（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社、＃１８３６１５３）および１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を加えた溶液に溶解する。溶解物をスクラッピングによって収集し、マイクロ遠心チューブに移して、４℃で３０分間遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）して細胞残屑を取り除く。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質試薬（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社）を使用して判断する。総細胞タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを経て、イモビロン-Ｐ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＃ＩＰＶＨ０９１）上に移される。膜はスルビビン（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社、＃ＡＦ８８６）およびβ-アクチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、＃Ａ５４４１）に対する一次抗体を使用して調査する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗-ラビットＩｇ、抗-マウスＩｇ、抗体（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）を二次抗体として使用する。抗原性抗体複合体は、スーパーシグマル・ウェスト・ピコ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｍａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ）化学発光試薬（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社）において５分間膜を培養した後、クールＣＣＤカメラを備えたＦｌｕｏｒ-Ｓ撮像装置（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）社）を使用して化学発光を撮影することによって視覚化される。各サンプルの話題となるタンパク結合は、クォンティティ・ワン（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ）というソフトウェア（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）社）を使用して定量する。各サンプルの抑制率は、サンプルのスルビビン／アクチンタンパク率と未処理対象のスルビビン／アクチンタンパク率を比較することで計算する。ＩＣ５０はグラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）というソフトウェア（グラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社）を使用して抑制率データの非線形回帰分析から得る。
【０２５９】
ＲＮＡの分離：
総ＲＮＡは、推奨されるプロトコル（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）９６キットを使用して分離する。つまり、成長培地を除去した後、２００μｌ  ＰＢＳで細胞を洗浄する。各ウェルに、１００μｌの７０％エタノールを添加し、ピペットで上下に３回振り混ぜる。次に、真空ソースに取り付けられたＱＩＡｖａｃ９６連結管のＱＩＡｖａｃトップベースに配置されたＲＮｅａｓｙ  ９６プレートのウェルにサンプルを適用する。３０秒間または移転が完了するまで真空処理を行う。各ウェルに、８０μｌのＤＮａｓｅ  Ｉ培養ミックス（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび２２５ユニット／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）を加え、室温で３０分間培養する。バッファーＲＷ１（１ｍｌ／ウェル）を加え、３０秒間真空処理する。バッファーＲＷ１およびＲＰＥ１を用いた洗浄ステップを再度繰り返す。次に、プレートを連結管から取り外し、ペーパータオルで拭き乾かす。ＱＩＡｖａｃ連結管にプレートを戻し、１０分間真空処理する。ＲＮＡを溶出するため、３０μｌのＲＮａｓｅが含まれていない水を各ウェルの膜に直接添加し、１分間培養した後、３０秒間真空処理する。総ＲＮＡの回収を最大限にするため、さらに３０μｌ／ウェルのＲＮａｓｅを含まない水を使用して溶出ステップを繰り返す。
【０２６０】
スルビビンの定量：スルビビンおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を使用し、実時間定量ＲＴ-ＰＣＲによって判定する。ＲＴ-ＰＣＲ反応は、１５μｌのＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、＃４３０９１６９）試薬（各１００ｎＭの前進プライマーおよび後進プライマー、および２００ｎＭのプローブを含む）を１０μｌの総ＲＮＡを持つ９６-ウェルプレートに添加することによって実施する。ヒトスルビビンの場合、前進ＰＣＲプライマーは、５’ＧＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＣ３’（配列番号：１８６）であり、および後進プライマーは、５’ＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＧＧ３’（配列番号：１８７）である。使用されるスルビビンＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、５’（ＦＡＭ）ＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＧ３’（配列番号：１８８）（バイオサーチ・テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）社）である。配列番号１４を対象としたこのプライマーとプローブのセットを、例１５以降のすべての試験に使用した。ヒトＧＡＰＤＨの場合は、ＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ対照試薬キット（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、＃４０２８６９）を使用する。各サンプルの抑制率は、サンプルのスルビビン／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ率と未処理対照のスルビビン／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ率を比較することによって計算する。ＩＣ５０は、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（グラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社）を使用して、抑制率データの非線形の回帰分析から得る。
【実施例１６】
【０２６１】
実施例１６：スルビビン抑制剤を使用するための表現型分析およびインビボ研究の設計
表現型分析：スルビビンを標的とする活性オリゴマー化合物が、ここに開示する方法によって同定されてから、該化合物を１つまたは複数の表現型分析でさらに調査する。各表現型分析は、特定の病状または症状の処置の効果を予測する測定可能な評価項目を持つ。
【０２６２】
それらを使用するための表現型分析試験、キット、および試薬は、当業者にとって周知であり、ここでは健康および病気におけるスルビビンの役割および／または関連を調査するために使用する。メーカー数社から購入できる代表的な表現型分析試験は、細胞の生死判別、細胞毒性、増殖または細胞生存を判別する試験（モルキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社（オレゴン州ユージーン）、パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社（マサチューセッツ州ボストン））、酵素測定を含むタンパクベース試験（パンベラ（Ｐａｎｖｅｒａ，ＬＬＣ）社（ウィスコンシン州マディソン）、ＢＤ  バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社（ニュージャージー州フランクリンレイク）、オンコジーン・リサーチ・プロダクツ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）社（カリフォルニア州サンディエゴ））、細胞調節、シグナル変換、炎症、酸化過程およびアポトーシス（アッセイ・デザインズ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｉｎｃ．）社（ミシガン州アンアーバー））、トリグリセリド累積（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）社（モンタナ州セントルイス））、血管形成試験、管形成試験、サイトカインおよびホルモン試験ならびに代謝試験（ケミコン・インターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）社（カリフォルニア州テメキュラ）、アメルシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社（ニュージャージー州ピスカッタウェイ））を含む。
【０２６３】
制限されない例において、特定の表現型試験に適切であると判断される細胞（例えば、乳癌研究用に選択されるＭＣＦ-７細胞；肥満研究用の含脂肪細胞）は、上記の方法で決定される最適濃度の対照化合物とともに、インビトロ研究で同定されるスルビビン抑制剤を用いて処理する。処理期間の最後に、試験特異的な１つまたは複数の方法で分析して、処理細胞および未処理細胞を表現型の結果および評価項目を決定する。
【０２６４】
表現型評価項目は、タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類または金属などの細胞性成分のレベルにおける変化とともに、経時的な細胞形態学における変化または処置用量を含む。ｐＨ、細胞周期の段階、細胞による生物学的指標の取込みまたは排出を含む細胞状態の計測も重要な評価項目である。
【０２６５】
処置後の細胞遺伝子型分析（１つまたは複数の細胞遺伝子の発現の測定）は、スルビビン抑制剤の有効性または能力の指標としても使用される。特徴的な遺伝子または特定の病状、状態または表現型と関連すると疑われる遺伝子は、処理および未処理細胞の両方において測定される。
【実施例１７】
【０２６６】
実施例１７：二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によるヒトスルビビン発現の調節
本発明によると、本発明のアンチセンス化合物から成る一連の二本鎖オリゴマー化合物およびその相補体は、スルビビンｍＲＮＡを標的とするように設計されている。ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、表１にリスト表示するアンチセンス鎖の逆相補体として設計および合成される。オリゴマー化合物はＨｅＬａ細胞において評価される。ＨｅＬａ細胞に使用される培養方法は、例えばｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで説明されている。
【０２６７】
９６-ウェルプレートで成長した細胞の場合、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１（登録商標）血清低減培地（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）社）で一度洗浄した後、１２μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）社）および最終濃度２５ｎＭの望ましいｄｓＲＮＡを含む１３０μＬのＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１（登録商標）で処理した。処理の５時間後、培地を新たな培地と置き換えた。ｄｓＲＮＡ処理の１６時間後に細胞を収穫した。この時点でＲＮＡを単離し、上記のようにＲＴ-ＰＣＲによってターゲットの低下を測定した。
【０２６８】
ｄｓＲＮＡオリゴマー化合物のアンチセンス配列を表１に示す。ＨｅＬａ細胞を処理する前に、例１６で概説される方法に従って、アンチセンス鎖およびセンス鎖をアニール化することによってｄｓＲＮＡオリゴマーを生成した。ターゲット部位は、配列ソース資料（Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号＿ＮＭ００１１６８．１、配列番号：１４としてここに組み込まれる）で指定されている最初の（最も５’側）ヌクレオチド番号によって示され、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖と結合する。
【０２６９】
表１の全化合物は、ｄｓＲＮＡ、５’から３’方向で最初にリストされるアンチセンス鎖（トップ鎖）を持つ全長２０ヌクレオチド、および５’から３’方向で次に表示されるセンス鎖（ボトム鎖）である。すべてのヌクレオシドはリボースであり、骨格結合はリン酸（Ｐ＝Ｏ）である。「ターゲット部位」とは、アンチセンス鎖が標的とされるスルビビンｍＲＮＡ上のターゲット領域の最も５’側の位を示す。このように、これらの化合物は平滑末端ｓｉＲＮＡである。
【０２７０】
ここに記載のとおり、実時間定量ＰＣＲによってデータを得た。ヒトスルビビンｍＲＮＡを標的とする二本鎖オリゴマー化合物（対応するセンス鎖に対してハイブリッド形成されたアンチセンス鎖で構成される）を用いて、ＨｅＬａ細胞を処理した。
ｄｓＲＮＡオリゴマー化合物によるヒトスルビビンｍＲＮＡレベルの抑制
【表１−１】
0004579911.tif 000015
【表１−２】
0004579911.tif 000016
【０２７１】
ＩＳＩＳ３３９０４６、３３９０４７、３３９０５３、３３９０６５、３３９０６８、および３３９０７２を除くすべてのｄｓＲＮＡ化合物は、スルビビン発現を４５％以上抑制した。
【０２７２】
用量反応実験において、本明細書の他の例で記載されているように、１００ｎＭオリゴヌクレオチドにつき３μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮと混合した１．１、３．３、１０および３０ｎＭの表示オリゴヌクレオチドを用いてＨｅＬａ細胞を処理した。未処理細胞を対照として使用した。処理の１６時間後、次の実時間ＰＣＲ分析用のＲＮＡを細胞から調製した。
【０２７３】
ヒトスルビビンｍＲＮＡ発現レベルを実時間ＰＣＲによって定量し、本明細書の他の例に記載のリボグリーンを使用して遺伝子ターゲット量を正常化した。２つの実験のデータを平均し、それを表２に示す。
【０２７４】
二本鎖の２つの鎖の性質は、最初に示されるアンチセンス鎖（アンチセンス鎖＿センス鎖）とともにアンダースコアで分けて表示される。
【表２】
0004579911.tif 000017
【０２７５】
表２に示すように、テストした化合物は、濃度依存的にＨｅＬａ細胞におけるヒトスルビビンｍＲＮＡ発現を抑制する。
【実施例１８】
【０２７６】
実施例１８：５’-リン酸塩キャップを持つ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によるヒトスルビビン発現の調節
本発明に基づいて、表１（ＩＳＩＳ３３９０４５−３３９０７３）に示すアンチセンス化合物から成る一連の二本鎖オリゴマー化合物、５’-末端リン酸基を修飾した各化合物、およびその相補体はスルビビンｍＲＮＡを標的とするように設計した。対応するｄｓＲＮＡ化合物は、ＩＳＩＳ３４１２０１-３４１２２９である（表３）。当該ｄｓＲＮＡのセンス鎖はアンチセンス鎖の相補体として設計、合成した。そのリストを表２に示す。当該オリゴマー化合物は、ＨｅＬａ細胞において評価した。ＨｅＬａ細胞に使用した培養手段については、例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで参照される。
【０２７７】
９６-ウェルプレートで成長した細胞の場合、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１（登録商標）血清低減培地（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）社）で一度洗浄した後、１２μｇ／ｍＬのリポフェクチン（ギブコ  ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）社）および最終濃度２５ｎＭのｄｓＲＮＡを含む１３０μＬのＯＰＴＩ-ＭＥＭ-１Ｍで処理した。処理の５時間後、培地を新しい培地と置き換えた。ｄｓＲＮＡ処理の１６時間後に細胞を収穫した。この時点でＲＮＡを分離し、ＲＴ-ＰＣＲによってターゲット低下を計測した。
【０２７８】
ｄｓＲＮＡオリゴマー化合物を表３に示す。ＨｅＬａ細胞を処理する前に、ｄｓＲＮＡオリゴマーを例１７に概説される方法に従って、アンチセンスおよびセンス鎖をアニール化することによって生成した。ターゲット部位は、配列ソース文献（Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号：ＮＭ００１１６８．１、配列番号：１４としてここに組み込まれる）に指定されるように、最初の（最も５’側の）ヌクレオチド番号によって示され、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖がその部位に結合する。
【０２７９】
表３のすべての化合物は、最初に示されるアンチセンス鎖および次に示されるセンス鎖の両方を５’から３’方向に持つ長さ２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。表３の化合物はリン酸（Ｐ＝Ｏ）骨格を持ち、各鎖の末端５’-リン酸キャップを含む。表３の化合物は平滑末端ｓｉＲＮＡである。
【０２８０】
本明細書中の他の例に記載のように、実時間定量ＰＣＲによってデータを取得した。ＨｅＬａ細胞をヒトスルビビンｍＲＮＡをターゲットとする二本鎖オリゴマー化合物で処理した。
【表３−１】
0004579911.tif 000018
【表３−２】
0004579911.tif 000019
【０２８１】
ＩＳＩＳ３４１２０３、３４１２０９、３４１２２１、３４１２２４および３４１２２５を除くすべてのｄｓＲＮＡ化合物は、スルビビン発現を４０％以上抑制した。これらのデータは、特定のターゲット部位において、５’リン酸を持つ二本鎖化合物がスルビビン発現を抑制するさらに強力な能力を示すことを示唆している（表１および３を比較）。
【実施例１９】
【０２８２】
実施例１９：スルビビンｍＲＮＡの同一部位をターゲットとするｓｉＲＮＡ構築体の比較：用量反応
本発明によると、ＨｅＬａ細胞におけるヒトスルビビンｍＲＮＡの抑制に対してＩＳＩＳ３３９０４８配列の置換が与える影響について調査した。ＩＳＩＳ３４３８６７（５’-ＵＵＵＧＡＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣ-３’：配列番号：８１）は、ＩＳＩＳ３３９０４８として、スルビビンｍＲＮＡ上の同一部位に結合する平滑末端ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖である。ＩＳＩＳ３４３８６７がＩＳＩＳ３３９０４８の５’-末端アデニン残基を持たない１９量体化合物である点で異なる。ＩＳＩＳ３４１８８１（ＵＵＵＧＡＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣＴＴ、配列番号：８２）は、ＩＳＩＳ３３０９０４８としてスルビビンｍＲＮＡ上の同一部位に結合する標準ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖である。ＩＳＩＳ３４１８８１が３’-末端（「ｄＴｄＴオーバーハング」）にｄＴｄＴ（デオキシチミジン-デオキシチミジン）を含むという点で異なる。ＩＳＩＳ３４３８６８は配列５’-ＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡＡＡ-３’（配列番号：８３）を持ち、ＩＳＩＳ３４３８６７に対応するセンス鎖である。ＩＳＩＳ３４１８８０（配列番号：８４）は、ＩＳＩＳ３４１８８１に対応するセンス鎖である。最初にアンチセンス鎖、次にセンス鎖がともに５’から３’方向に示される構築体を表４に示す。表４はスルビビンｓｉＲＮＡ構築体の配列、表５は用量反応の結果を示す。
【０２８３】
【表４】
0004579911.tif 000020
【０２８４】
【表５】
0004579911.tif 000021
【０２８５】
表５に示すように、当該化合物に関して、用量依存的方法でＨｅＬａ細胞におけるヒトスルビビンｍＲＮＡ発現の抑制を検査した。ＩＳＩＳ３４３８６７およびＩＳＩＳ３４１８８１は、最低用量を除くすべての用量において、スルビビンｍＲＮＡレベルの抑制に効果的であり、平滑末端１９量体  ｓｉＲＮＡまたは３’-末端にｄＴｄＴ修飾を持つ標準２１量体  ｓｉＲＮＡがＩＳＩＳ３３９０４８、元の平滑末端２０-ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡの有効な修飾になり得ることを示している。
【０２８６】
これら３化合物のＩＣ５０値（ｎＭ）は以下のとおりであった。
平滑末端ｓｉＲＮＡ（２０-ｍｅｒ）３３９０４８＿３３９０７８、０．２８ｎＭ
平滑末端ｓｉＲＮＡ（１９-ｍｅｒ）３４３８６７＿３４３８６８、０．１９ｎＭ
標準ｓｉＲＮＡ３４１８８１＿３４１８８０、０．１５ｎＭ
【０２８７】
ＩＣ５０はオリゴマー化合物の濃度として定義され、結果として未処理の対照と比較してｍＲＮＡ（またはタンパク質）発現を５０％抑制する。これらのデータから、標準ｓｉＲＮＡおよび平滑末端ｓｉＲＮＡ（１９量体）の両方が平滑末端ｓｉＲＮＡ（２０量体）よりはるかに良好に作動したと言える。
ヒトスルビビンを標的とする追加の平滑末端組成：修飾化合物
【０２８８】
ヒトスルビビンをターゲットとする一連のｓｉＲＮＡ化合物（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号：ＮＭ＿０１１６８．１、配列番号：１４）を設計した。それを５’から３’方向で表６に示す。
【表６】
0004579911.tif 000022
【０２８９】
表６における配列の修飾は以下のとおりである。
ＩＳＩＳ３４６２７２：全リボース、全Ｐ＝Ｏ結合
ＩＳＩＳ３４６２７９-３４６２８１、３４６２８６、３４６２８７：全Ｐ＝Ｓ結合
ＩＳＩＳ３４６２８２-３４６２８４、３４６２８９、３４６２９５および３４６２９６：代替Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ結合、Ｐ＝Ｏで開始  
ＩＳＩＳ  ３４６２９１、３４６２９２、３４６２９４、３４６２９５および３４６２９６：代替Ｐ＝Ｓ／Ｐ＝Ｏ結合；Ｐ＝Ｓで開始  
ＩＳＩＳ３４８３１：Ｐ＝Ｏ骨格を持つ全リボース
ＩＳＩＳ３５２５０５：５、８、１１、１４および１７-１９位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５０６：６、７、１０、１１および１７-１９位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ３５２５０７：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ３５２５０８：５、８、１１および１４位の２’-ＭＯＥ；１７-１９位の２’-Ｏ-メチル。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５０９：４、９および１８位の２’-ＭＯＥ。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５１０：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位の２’-ＭＯＥ。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５１１：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位の２’-ＭＯＥ。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５１２：各位の２’-メチル。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５１３：各位の２’-メチル。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５１４：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位の２’-ＭＯＥ。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５１５：１５-１９位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５２５１６：結合１−７のＰ＝Ｓリンカー。８-１８結合のＰ＝Ｏリンカー。
ＩＳＩＳ  ３５３５３７：１-３位および１７-１９位の４’-チオリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５３５３８：３、９、１２および１７-１９位の４’-チオリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５３５３９：１-３、９および１２位の４’-チオリボース。１７-１０位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５３５４０：１-３位の４’-チオリボース。１７-１９位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５５７１０：１-５位の２’-ａｒａ-フルオロ-２’-デオキシリボース。１５-１９位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５５７１１：１-５、８、９および１２−１６位の２’-ａｒａ-フルオロ-２’-デオキシリボース。６、７、１０、１１、１７-１９位の２’-Ｏ-メチルリボース。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５５７１２：５、８、１１、１４位のＬＮＡ。１７-１９位の２’-Ｏ-メチル。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５５７１３：２’-Ｏ-メチルリボース／２’-ａｒａ-フルオロ-２’-デオキシリボース置換、１位の２’ＯＭｅ。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５５７１５：４、９、１８位のＬＮＡ。Ｐ＝Ｏ骨格。
ＩＳＩＳ  ３５５７１６：１、２、６、１１、２０位のＬＮＡ。Ｐ＝Ｏ骨格。
【実施例２０】
【０２９０】
実施例２０：一本鎖ＲＮＡｉ化合物によるヒトスルビビン発現の調節
一連の一本鎖オリゴマー化合物（ａｓＲＮＡ）について、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるヒトスルビビンの抑制能力を評価した。ＨＵＶＥＣに使用する培養方法については、例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで説明されている。
【０２９１】
表７はａｓＲＮＡオリゴマー化合物の配列を示す。ターゲット部位は、配列ソース文献（Ｇｅｎｂａｎｋ受理番号ＮＭ＿００１１６８．１、配列番号：１４としてここに組み込まれる）第一（最も５’側の）ヌクレオチド番号で表示され、ａｓＲＮＡオリゴヌクレオチドと結合する。
【０２９２】
表７の全化合物は、全体にホスホロチオエート骨格結合および５ｐ端に末端リン酸を持つ長さ２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。また、これらはすべて５’から３’方向に示される。
【０２９３】
本明細書の他の例に記載の実時間定量ＰＣＲによって、データを取得した。
【表７】
0004579911.tif 000023
【０２９４】
表７に示すように、すべてのａｓＲＮＡ化合物が少なくとも４４％のスルビビン発現を抑制した。
【実施例２１】
【０２９５】
実施例２１：ヒトスルビビンに対するｄｓＲＮＡ構築体を使用したＨｅＬａ細胞におけるスルビビンｍＲＮＡ発現の抑制
ヒトスルビビンプライマープローブセット（配列番号１８６-１８８）を使用して上記のように様々なｄｓＲＮＡ組成をＨｅＬａ細胞においてテストし、ＩＳＩＳ  ３４３８６７  １９-ｍｅｒ（配列番号：８１）、３３９０４８  ２０-ｍｅｒ（配列番号：２３）上のＰＳ置換の影響、および２’-Ｏ-メチル（２’-ＯＭｅ）、２’-フルオロ（２’-Ｆ）、２’-Ｏ-メトキシエチル（２’-ＭＯＥ）および４’-チオ（４’-Ｓ）化学反応の影響を判断した。表８および９はその結果を示す。最初のＩＳＩＳ番号はアンチセンス鎖、二番目のＩＳＩＳ番号はセンス鎖を示す。
【表８】
0004579911.tif 000024
【０２９６】
これらのデータは、１９-ｍｅｒ平滑末端ホスホジエステルｓｉＲＮＡがスルビビン発現の抑制においてさらに有効であり、２０-ｍｅｒ対照物よりも１０折りたたみ分低いＩＣ５０を持つ（ラインＡおよびＢを比較）ことを示している。さらに、ＩＣ５０によって計測されたように、この増加した能力は、完全なホスホロチオエート結合によって骨格結合が置き換えられると喪失する。しかし、ターゲットとする低下は維持される（ラインＡおよびＣを比較）。
【０２９７】
また、ホスホジエステル結合を置換領域のアンチセンス鎖に再導入することによって、低下したＩＣ５０値によって計測されるように、完全なＰ＝Ｏ骨格のレベルまでではないが、その効率を回復できることが示された（例えば、ラインＤおよびＨを比較）。
【０２９８】
最後に、対向領域の場合（１つの鎖においてＰ＝Ｏ、もう一方の鎖においてＰ＝Ｓ）、各鎖における置換ホスホジエステル／ホスホロチオエート結合はＩＣ５０および発現レベルに最大の影響を与え、結果として天然の最適の構築体よりも良い値となった（ラインＩおよびＡを比較）。
【表９】
0004579911.tif 000025
【０２９９】
これらのデータは、１９-ｍｅｒと対照的に、平滑末端２０-ｍｅｒは、両鎖における完全なＰ＝Ｏを持つ２０-ｍｅｒと比較可能な２０-ｍｅｒ完全Ｐ＝ＳのＩＣ５０値を持つ両鎖におけるホスホロチオエート骨格修飾に対してより優れた耐性を持つことを示唆している（ラインＢおよびＣを比較）。
【０３００】
しかし、両方の２０ｍｅｒ構築体は、１９-ｍｅｒで見られるＩＣ５０を達成できなかった（ラインＢおよびＣとラインＡを比較）。
糖に対する化学的修飾の影響
【０３０１】
一連の平滑末端ｓｉＲＮＡを設計し、ヒトスルビビンｍＲＮＡの発現を抑制するための二本鎖化合物の能力に関する糖修飾の効果を調査した。本明細書の他の例に記載のとおり、ＨｅＬａ細胞において研究を実施し、ｍＲＮＡレベルをＲＴ-ＰＣＲによって判断した。
【０３０２】
化合物の修飾は以下のとおりである。
ＩＳＩＳ  ３５２５１１は２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８位における２’-Ｏ-メチル修飾（下線）を含む。
ＩＳＩＳ  ３５２５１２は、各２’位の２’-Ｏ-メチル修飾（下線）を含む。
ＩＳＩＳ  ３５５７１４は、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位の２’-フルオロ修飾（太字）および２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８位の２’-Ｏ-メチル修飾を含む。
ＩＳＩＳ  ３５２５１４は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８位の置換２’-ＭＯＥ修飾を含む。
他の化合物はすべて天然のＲＮＡ化合物である。表１０はその結果を示す。
【表１０】
0004579911.tif 000026
【０３０３】
これらのデータは、２’Ｆおよび２’ＯＭｅの置換モチーフを含む二本鎖化合物が、ヒトスルビビン発現の抑制に最適な構築体であることを示唆している。
【実施例２２】
【０３０４】
実施例２２：ヒトスルビビンに対するｄｓＲＮＡ構築体を使用したＨｅＬａ細胞における用量反応試験
用量反応試験において、ＨｅＬａ細胞を１００ｎＭオリゴヌクレオチドごとに３μｇ／ｍＬリポフェクチンと混合した０．０２、０．２、２．０および２０．０ｎＭの表示されたｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、本明細書の他の例に記載のとおり処理した。未処理の細胞を対照として使用した。処理の１６時間後、次の実時間ＰＣＲ分析に使用するためのＲＮＡを細胞から調製した。
【０３０５】
本発明の他の例に記載のとおり、ヒトスルビビンｍＲＮＡ発現レベルを実時間ＰＣＲによって定量し、遺伝子ターゲット量をリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）で正常化した。２つの実験から得たデータの平均を表１１に示す。アンチセンス鎖のＩＳＩＳ番号を最初に示し、次にセンス鎖のＩＳＩＳ番号を示した（アンチセンス＿センス）。
【表１１】
0004579911.tif 000027
【０３０６】
表１１に示すように、ｄｓＲＮＡ化合物の多くは、用量反応方法でＨｅＬａ細胞におけるヒトスルビビンｍＲＮＡ発現を抑制する。
【実施例２３】
【０３０７】
実施例２３：ヒトスルビビンに対するｄｓＲＮＡ構築体を使用したＨｅＬａ細胞における用量反応実験
用量反応実験において、本明細書の他の例に記載のとおり、１００ｎＭオリゴヌクレオチドごとに３μｇ／ｍＬのリポフェクチンを混合した０．０１４、０．０４、０．１２、０．３７、１．１１、３．３３、１０および３０ｎＭの表示ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドをＨｅＬａ細胞で処理した。未処理の細胞を対照として使用した。処理の１６時間後、次の実時間ＰＣＲ分析に使用するためのＲＮＡを細胞から調製した。
【０３０８】
本明細書の他の例に記載のとおり、実時間ＰＣＲによってヒトスルビビンｍＲＮＡ発現レベルを定量し、ターゲット量をリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）で正常化した。２つの実験から得たデータの平均を表１２に示す。アンチセンス鎖のＩＳＩＳ番号を最初に示し、次にセンス鎖のＩＳＩＳ番号を示した（アンチセンス＿センス）。
【表１２】
0004579911.tif 000028
【０３０９】
表１２に示すように、ｄｓＲＮＡ化合物の大部分が用量依存的な方法でＨｅＬａ細胞におけるヒトスルビビンｍＲＮＡ発現を抑制した。
【実施例２４】
【０３１０】
実施例２４：Ｕ-８７ＭＧ細胞におけるスルビビンｍＲＮＡ発現の用量依存的抑制
上記の方法を使用して、二本鎖化合物を、Ｕ-８７ＭＧ細胞におけるヒトスルビビンｍＲＮＡ発現の抑制能力についてテストした。ヒトスルビビンを標的とする様々なｄｓＲＮＡ構築体を０．００１９ｎＭ、０．００９６ｎＭ、０．０４８ｎＭ、０．２４ｎＭ、１．２ｎＭ、６．０ｎＭ、３０．０ｎＭ、および１５０．０ｎＭの濃度でテストした。表１３はその結果の要約である。アンチセンス鎖のＩＳＩＳ番号を最初に示し、次にセンス鎖のＩＳＩＳ番号を示した（アンチセンス＿センス）。
【０３１１】
【表１３】
0004579911.tif 000029
【０３１２】
表１３に示すように、大部分のｄｓＲＮＡ化合物が用量依存的方法でＵ-８７ＭＧ細胞におけるヒトスルビビンｍＲＮＡを抑制する。
【実施例２５】
【０３１３】
実施例２５：標準ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによるスルビビンの抑制
ヒトスルビビンを標的とする一連の標準ｓｉＲＮＡを設計した。以下に示すスルビビンに特異的な各ｄｓＲＮＡ配列はＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖の各鎖の３’末端に２つのデオキシチミジンヌクレオチドを含む（図示せず）。ダーマコン・リサーチ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）によって、遺伝子特異的なｓｉＲＮＡの合成、二本鎖形成および精製を行った。表において、「位置」はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が結合する遺伝子の位置を示す。表における各配列は、アンチセンス鎖（トップ鎖）が５’から３’方向に書き込まれ、その相補センス鎖（ボトム鎖）も５’から３’方向に書き込まれるようにリストされている。
【０３１４】
【表１４−１】
0004579911.tif 000030
【表１４−２】
0004579911.tif 000031
【表１４−３】
0004579911.tif 000032
【０３１５】
【表１４−４】
0004579911.tif 000033
【表１４−５】
0004579911.tif 000034
【表１４−６】
0004579911.tif 000035
【０３１６】
化合物Ｕ１７、Ｕ２０、Ｕ２３、Ｕ３６、Ｕ４８およびＵ５４について、上記のＲＴ-ＰＣＲおよび定量ウェスタンブロット試験を使用してスルビビンｍＲＮＡの抑制をテストしたところ、１００ｎＭより低いＩＣ５０を示した。
【０３１７】
化合物Ｕ１７は、定量ＲＴ-ＰＣＲ分析およびウェスタンブロット分析の両方において強力な活性を示すため、ここに記載する指標として特に好まれる。
【実施例２６】
【０３１８】
実施例２６：ヒトスルビビンを標的とする追加二本鎖化合物のＩＣ５０値
表１５および１６は、本明細書に記載の方法を使用して実施された様々なｄｓＲＮＡを用いて、ＩＣ５０値を概説している。テストした構築体は、５’から３’方向のアンチセンス鎖および５’から３’方向のセンス鎖を含む。表１５において、「Ｄ」は用量反応（ｍＲＮＡレベル）であり、「Ｗ」はウェスタンブロットである。すべてのインターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエート結合を示す小文字の「ｓ」による別段の定
義がない限り、ホスホジエステルである。
【表１５−１】
0004579911.tif 000036
【表１５−２】
0004579911.tif 000037
【０３１９】
【表１５−３】
0004579911.tif 000038
【表１５−４】
0004579911.tif 000039
【０３２０】
【表１６−１】
0004579911.tif 000040
【表１６−２】
0004579911.tif 000041
【実施例２７】
【０３２１】
実施例２７：ヒトグリア芽腫異種移植腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性の測定
当該技術分野において知られる動物モデルにおいて、本明細書に記載の１つまたは複数のオリゴマー化合物を、その抗腫瘍活性についてテストする。２つの動物モデルは、（１）Ｕ-８７ＭＧヒトグリア芽腫異種移植腫瘍モデル（キアリス  Ｈ、（Ｋｉａｒｉｓ  Ｈ）、シャリー  ＡＶ（Ｓｃｈａｌｌｙ  ＡＶ）、ヴァルガ  ＪＬ（Ｖａｒｇａ  ＪＬ）、裸マウス新生物におけるＵ-８７ＭＧヒトグリア芽腫の成長を抑制する成長ホルモン放出ホルモンの抑制因子。２０００年５月−６月、２（３）：２４２-５０）、および（２）ＹＵＳＡＣ-２ヒト黒色腫異種移植腫瘍モデル（グロスマン  Ｄ（Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｄ）、キム  ＰＪ（Ｋｉｍ  ＰＪ）、シェクナー  ＪＳ（Ｓｃｈｅｃｈｎｅｒ  ＪＳ）、アルティエリ  ＤＣ（Ａｌｔｉｅｒｉ  ＤＣ）、スルビビンターゲッティングによるインビボ黒色腫腫瘍成長の抑制。全米科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）。２００１年１月１６日；９８（２）：６３５-４０）である。各グループに合計１０  ＣＤ１ｎｕ／ｎｕ（チャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ））マウスを使用する。移植するため、腫瘍細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄して、同じくＰＢＳで、ＤＭＥＭ中６Ｘ１０７細胞／ｍｌ（Ｕ-８７ＭＧ）および４Ｘ１０７細胞／ｍｌ（ＹＵＳＡＣ-２）で懸濁する。移植直前に、動物に放射線照射し（４５０ＴＢＩ）、細胞をマトリゲル（１：１）に混合する。０．２ｍｌ量中合計６Ｘ１０６（Ｕ-８７ＭＧ）および４Ｘ１０６（ＹＵＳＡＣ-２）の腫瘍細胞を左後脇腹に経皮的（ｓ．ｃ．）に注入する。テストオリゴマー化合物（０．９％ＮａＣｌに溶解、注入グレード）またはミスマッチ対照オリゴヌクレオチド（０．９％ＮａＣｌに溶解）またはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を用いた処置を腫瘍細胞移植の３日後に開始する。Ｕ−８７ＭＧおよびＹＵＳＡＣ-２の研究の場合、化合物を腹腔内（ｉ．ｐ．）および静脈に（ｉ．ｖ．）それぞれ０．２ｍｌ量を一日おきに、Ｕ−８７ＭＧ研究の場合は合計約１２用量およびＹＵＳＡＣ-２研究の場合は約１３用量投与する。腫瘍の長さおよび幅を週に２回計測し、腫瘍の体積を計算式：腫瘍の体積＝（ＬＸＷ２）Ｘ０．５３６を使用して計算する。腫瘍の体積を各処置グループの主要移植後の日数に対してプロットする。
【０３２２】
１つまたは複数のオリゴマー化合物を用いた処置は、ビヒクルまたは２５ｍｇ／ｋｇミスマッチ対照オリゴヌクレオチドを用いて処置した腫瘍を持つ動物と比較すると、ヒトグリア芽腫および黒色腫の腫瘍成長を遅らせる。
【実施例２８】
【０３２３】
実施例２８：マウス血漿における２’-Ｏ-メチル／２’-フルオロｓｉＲＮＡ構築体の置換の安定性
前記の方法と同様に、抽出およびキャピラリー電気泳動方法を使用して、正常な二本鎖ＲＮＡを希釈したマウス血漿から分析した（リーズ、Ｊ．Ｍ．（Ｌｅｅｄｓ、Ｊ．Ｍ．）ら、１９９６、生物科学分析（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２３５、３６-４３；ギアリー  Ｒ．Ｓ．（Ｇｅａｒｙ  Ｒ．Ｓ．）ら、１９９９、生物科学分析（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２７４、２４１-２４８）。３-６ヶ月齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ））から得たヘパリン処理したマウス血漿を−８０℃から解凍し、リン酸バッファー生理食塩水（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸カリウム）を用いて２５％（ｖ／ｖ）に希釈した。１００μＭ濃度の約１０ｎｍｏｌの事前アニール済ｓｉＲＮＡを２５％血漿に追加し、３７℃で０、１５、３０、４５、６０、１２０、１８０、２４０、３６０および４２０分間培養した。指定の時間にアリコートを取出し、ＥＤＴＡで最終濃度２ｍＭになるまで処理して、キャピラリーゲル電気泳動（ｅＣａｐ  ＤＮＡキャピラリーチューブを持つＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ-ＵＶ）で分析されるまで０℃の氷上に配置した。ｓｉＲＮＡ二本鎖のピーク領域を計測し、それを使用して残りのｓｉＲＮＡ正常比率を計算した。２．５ｍＭ濃度のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を内部検定基準として各注射液に添加した。リン酸バッファー生理食塩水でｓｉＲＮＡを希釈することによってゼロ時点を取り、その後キャピラリー電気泳動を行った。時間に対して正常なｓｉＲＮＡ率をプロットすることによって、偽の一次半減を計算できた。表１７に結果を示す。
【０３２４】
【表１７】
0004579911.tif 000042
【０３２５】
ＩＳＩＳ  ３５３５３８  アンチセンス鎖は、３、８、１１、１７-１９位に４’チオ修飾を含み、未修飾のセンスＲＮＡ鎖と対合される。ＩＳＩＳ  ３５５７１３  アンチセンス鎖は、糖に対する置換２’Ｏメチル／２’Ｆ修飾を含み、置換２’Ｆ／２’Ｏメチル修飾を持つセンス鎖と対合わされる。置換修飾は対向領域にあり、１位に２’Ｏｍｅで修飾されるアンチセンス鎖を持つ。一方、センス鎖は１位の２’Ｆで修飾される。置換２’-Ｏ-メチル／２’-フルオロ構築体は、比較的変化せず、血清中で安定する。
【０３２６】
本明細書に記載の技術に加え、本発明の様々な変形例は、上記を読めば当業者にとって明白である。かかる変形例は、添付の請求項の範囲内に含まれることを意図している。本出願の各引用文献は、その全体を参照することによりここに組み込まれる。
【配列表】
0004579911000001.app