(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を含有する細胞懸濁液中の血小板の数の測定値の確定方法であって、以下の：
懸濁液中の小粒子の数を計数し、
気体の存在下で懸濁液を攪拌し、
攪拌後に懸濁液中の小粒子の数を計数し、そして
血小板の数の測定値を得るために２つの計数を比較する
工程を含む方法。
【請求項２】
前記気体が空気、あるいは１以上のその構成気体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
小粒子の数の最初計数を得るために前記懸濁液が攪拌される前に前記懸濁液の１以上のアリコートを粒子計数機に通し、その後、標本中の小粒子の数の二回目の計数を得るために攪拌後に前記懸濁液の１以上のその他のアリコートを粒子計数機に通す請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞懸濁液が等張である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも７フェントリットルの容積を有する小粒子を前記懸濁液中の小粒子の数の計測値を得るために検出する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記懸濁液にオスモル濃度における一連の変更を施し、多数の異なるオスモル濃度で懸濁液中の小粒子の計数を得る請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁液との接触における空気の量、攪拌強度および攪拌継続時間のうちの少なくとも１つを測定する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
産業上の利用分野
本発明は、遊離細胞、特に血球の標本の分析方法に関する。
【０００２】
発明の背景
血球を計数し、大きさで分類する自動血液分析機は、臨床医学の分野における大きな進歩を象徴しているが、しかしいくつかの欠点を依然として有している。それらは本質的に、類似サイズの粒子を弁別することができない。自動計数は粒子の総数に関しては正確であるが、しかし伝統的方法は、小赤血球、寄生虫も、または血小板のような細胞の小片も計数しない。良質の血小板計数を必要とする人は、手動計数法が自動的な大きさによる分類および計数計器に一般的に付随するいくつかのエラーを回避するという理由で、自動血液分析機がほとんどなくて、より良質の完全血球計数を提供するアフリカかアジアに旅行するよう適切に助言される。血小板計数に際してのエラーは、それらが不必要な検査、不適切な治療または誤診を引き起こし得るので、患者に対する重大な結果を有する。擬似に低血小板数の既知の原因は、ＥＤＴＡ依存性集塊、冷血小板凝集、血小板付随性、血小板ではない類似サイズの粒子の存在である。
【０００３】
血液学テキスト、試験所およびメーカーはすべて、長年、自動血小板計数の不正確性に気づいており、異常血小板数を有するすべての患者に対する血液フィルムの手動検査を助言しており、これはほとんどの血液学試験所において慣行されている。今日、メーカーは、それらがセンサーに達する前に、光の屈折を検出する（血小板はより屈折性であるため）ことによって、あるいは血小板に適用された染料を検出することによりエラーを低減しようと試みている。血小板測定が正常範囲外であるたびに手動的立証の実施をすることは、患者にとって心強いが、しかし試験所にとっては経費が掛かる。しかしながら、従来、誤って正常範囲内になった高血小板数を有する患者に対する手動的立証の必要性を試験所に警告する方法はなかった。したがって、自動血小板計数は、血小板の計数が低い場合には限定値を示し、計数が正常である場合には不確定値を示し、そして計数が高くなる（血小板増加症）と、完全に確かであるというわけではなくなる。
【０００４】
以下で考察するように、本出願人は、既存の自動血球分析機により検出されず且つ適正に区別されないその他の小粒子、細胞断片が存在することを発見した。細胞脆砕性または細胞断片の生成の重要性は、従来認識されていなかった。
発明の要約
本発明の一局面によれば、血小板を含有する細胞懸濁液中の血小板数の測定値の確定方法であって、懸濁液中の小粒子の数を計数し、気体の存在下で懸濁液を攪拌し、攪拌後に懸濁液中の小粒子の数を計数し、そして血小板の数の測定値を得るために２つの計数を比較する工程を含む方法が提供される。
【０００５】
本発明の方法は、単純な生理学的特性を利用してその他の小粒子から血小板を弁別し、擬似に低い自動血小板数を除去する。血小板の数および機能の正確な測定は、患者の健康に多大な重要性を有する。血小板減少症（不十分な血小板）から死に至る出血の他に、血小板は卒中、心臓発作および炎症の危険構成成分であり、そして上皮悪性疾患および転移の増殖における重要な要素である。
【０００６】
赤血球はすべて、浸透圧ストレスに非常に感受性であり、ほとんどの細胞が機械的ストレスに感受性である。血小板は、空気との接触に曝露された場合を除いて、機械的および浸透圧ストレスに対して相対的に非感受性である、ということが判明した。血小板懸濁液は、空気、またはその構成成分気体への曝露時に、それらが同時にストレスを加えられる場合にはより大きく、それらの特性を変える。検査前および検査中に血小板の取扱いを注意深く制御することにより、空気への懸濁液の曝露を排除または調節することにより、より正確な血小板の計数が得られる。それらにストレスを受けさせながら、空気に血小板を故意に曝露することにより、血小板集団中のあらゆる誘導変化を記録し得る。既存の方法は空気の作用を無視するという理由で、それらはその血小板計数においてエラーを誘発している。
【０００７】
WO97/24598号、WO97/24599号およびWO97/24601号に記載された方法は、粒子のサイズ、形状および数を測定するための方法を提供するが、一方、粒子は同時に種々の浸透圧勾配に同時に曝露される。しかしながら、それを本発明を組合せることにより、この検査からさらなる情報が得られる。例えば、浸透圧ストレス下で全血懸濁液を検査し、そして空気の存在下での機械的攪拌後に同一標本に対する結果と比較することにより、空気の存在下での機械的攪拌により変えられる標本集団の構成成分を確定し得る。さらに、型および各型の割合を単一手法で明示し得る。したがって、赤血球、白血球、微球細胞および細菌は空気の存在下での機械的攪拌による影響を受けないが、一方、血小板のみは消失する。この方法の利点は、血小板を弁別し、計数する方法を説明する他に、それは、既存の計器にそれらの計数の精度を増大する非常に簡単な方法を提供する。
【０００８】
本出願において、機械的ストレスが細胞の断片化を誘発するために、細胞脆砕性の測定方法も我々は開示する。細胞計数器で細胞を計数する場合、溶解も、断片化もゴーストも誘発されない。細胞に浸透圧ストレスを施すと、それらは溶解し、ゴースト化しまたは断片化し、あるいはいずれもが生じる。機械的攪拌の付加はその作用を増強し、攪拌懸濁液中への空気の付加は、その作用をさらに強める。したがって、細胞断片および血小板を分別するためには、オスモル濃度に対して空気の存在下で攪拌の前後に小粒子の計数を比較するのが望ましい、ということが見出されている。これらの小粒子の性質を誘導するこの工程は、その温度を上げることによる未知の流体の同定になぞらえ得る。それが78℃で沸騰する場合、それはエチルアルコールであり、100 ℃で沸騰する場合にはそれは水であり、そして357 ℃の場合は水銀である。
【０００９】
本発明から定量測定を提供するためには、以下の：Ａ）懸濁液との接触に際しての空気量、Ｂ）攪拌の強度、およびＣ）攪拌の継続時間の少なくとも１つをモニタリングし、そして２つの計数間の差にこの測定値を関連させることが望ましい。
本発明の方法で計数される小粒子としては、血小板、細菌、細胞断片および微球細胞が挙げられ、これらは典型的には7 〜10フェントリットルの容積を有する。
【００１０】
本発明の別の局面によれば、in vitroでの遊離細胞の標本の分析方法は、既知量または同定可能量のストレスを標本に適用し、ストレスの適用前後に標本を測定して、適用ストレスにより引き起こされる標本の細胞断片の数に関して定量的情報を確定し得る少なくとも１つの示度を提供し、そしてこの示度をストレスの量に関連させて細胞脆砕性の指標を提供することを包含する。
【００１１】
赤血球が死ぬと、それらはその内容物を喪失するが、これは溶解と呼ばれる工程である。次にそれらは、一部は細胞の膜特性によって、そして一部は誘発によって、ゴースト細胞または断片に変形される。従来、このメカニズムはほとんど認識または理解されていなかった。
本発明は、血球、特に赤血球のような細胞がin vitroでストレスを加えられる場合、適用ストレスと標本に対する断片化との間の関係は、正常標本および多数の疾患に特有である、という認識に基づいている。ある細胞（血小板）は検出可能断片を生成しないが、ある細胞（赤血球）は多数を生成するため、この方法はある種の細胞型間の区別方法も提供する。
【００１２】
既存の自動粒子分析機は、食作用増大によりin vivo で除去された断片化を同定できないので、断片の検出に際して用途が限定され、そして断片が食作用されなかった場合、それは、血小板、アポトーシス体、微球細胞、寄生虫およびノイズからそれらを容易に弁別できない。身体の生理学的清掃メカニズムはそれらが生成されるのと同じくらい速く断片を除去するため、その細胞が断片化しつつあり、しかも、既存の方法により断片が検出されない多数の患者が存在する。
【００１３】
本発明の方法は、ストレスがかかった場合にその細胞が断片化する患者を検出するため、ある種の血液異常を同定するのに顕著に良好である、ということが見出された。適用ストレスは赤血球断片および血小板に異なるように影響を及ぼすため、２つを区別することができる。血小板および赤血球断片は通常は個別に測定されないため、これは、従来技術の粒子計数機ではできなかった。さらに、標本はストレス適用の前、最中および後に検査することができるので、誘導作用は生理学的断片化能力および生理学的除去率の指標を提供する。
【００１４】
古い細胞は容易に断片化するが、一方新しい細胞は容易には断片化しないため、本発明は、細胞集団の年齢を同定するために用い得る。これは、例えば、特定範囲のストレスを用いて特定の細胞集団を選択的に破壊し、それにより古い細胞を捨ててユニットの寿命を延長させるために、血液貯蔵に有用であり得る。
適用ストレスは、機械的、化学的、熱、音波、光、電気的、電磁的または膜ストレスを誘発するあらゆるその他の手段、例えば細胞標本のin vitro加齢であり得る。好ましくは、細胞は、浸透圧勾配を施される。それらを、攪拌棒により、激しく振盪することにより、またはあらゆるその他の種類のストレスによっても攪拌し得る。１つより多いストレスメカニズムを、必要な場合には同時に用い得る。実際、これはある種の異常の同定に有用であり得る。
【００１５】
しかしながら、既知のストレスを適用するのが好ましく、低減しつつあるかまたは偶然であり得るが、しかし、赤血球断片の数と適用ストレスとの間の関係のプロットを得るために、好ましくは増大しつつある一連のストレスを適用するのがより望ましい。この範囲のストレスは、種々の期間および／または強度で、例えば標本を徐々に激しく機械的に攪拌することにより、定速で長時間標本を機械的に攪拌することにより、溶液で標本を稀釈してオスモル濃度を徐々に低減することにより、またはこれらのメカニズムのあらゆる組合せにより、適用し得る。後者のアプローチは、WO97/24529号に開示された、オスモル濃度勾配を生じる装置を用いて実行し得る。
【００１６】
細胞断片の数に関連して定量的情報を提供する特徴には、断片それ自体の検出、多数細胞集団の頻度分布の変化、総粒子計数の増大、無傷細胞濃度の変化、膜またはサイトゾル部分の濃度の変化、例えばヘモグロビン放出、あるいは誘発性細胞断片化に関連したその他のこのような現象が含まれる。
小粒子数の計数工程は、好ましくは、慣用の市販粒子計数機を用いて、またはWO97/24600号に開示された装置を用いてなされる。両方の場合に、血液標本は、センサー、典型的にはそのサイズが光学的に、音響的に、熱的に、電子的に、またはその他の手段により検出される開口部を通して流される。インピーダンスセンサーでは、細胞の通過に対する電場の応答が一連の電圧パルスとして記録され、各パルスの振幅は細胞断片サイズおよび頻度の関数である。
【００１７】
適用ストレスの不存在下では、既存の計器は血小板と、例えば赤血球断片とを区別できない。異なる種類の細胞は各々、それ自体の生化学的個性および断片化に対するそれ自体の感受性を有するので、細胞の種類、感受性および病状を同定する同定特性として、その応答を用いることができる。例えば、断片とサイズが似ている血小板は、それらがストレスを加えられると異なって応答するので、断片から弁別される。断片、血小板、ゴースト細胞およびその他の細胞部分の弁別および同定は、細胞株を選択的に染色するか、または特定の細胞部分、例えば細胞膜の内側および外側に結合するか、あるいは血小板だけを染色する着色剤および染料を用いることにより促進し得る。例えば、WO97/24598号、WO97/54599号およびWO97/24601号におけるようにストレスが血液標本に適用された場合、それは細胞を強いて既知の形状にさせることにより正確な容積およびその他の細胞測定値を得るために実施された。本明細書中に開示した方法は、細胞を断片化させて、断片化の結果を測定する。これは、例えば、断片のサイズ範囲に上下閾値電圧を設定することにより、標本の化学的調製にヘパリンまたはその他の適切な化学物質を適用することにより断片化を促すことにより、および／または断片化に十分な時間進行させることにより注目の断片以外のすべての粒子を除去することにより、増強し得る。断片の誘導、検出および定量は、WO97/24598号、WO97/54599号およびWO97/24601号により示された測定値ならびに誘導されたまたは既存の断片により変えることができるその他の測定値を増強し得る。
【００１８】
電気粒子計数機を用いる場合、閾値は細胞を検出するのに十分低いほぼ０フェントリットルの容積に設定するべきである。0.08mVの閾値容積は、既存の装置で十分に作用することが判明している。その他の粒子集団は、電子的に、デジタルに、機械的に、またはその他の手段により排除し得る。
市販粒子計数機およびWO97/24600号に開示された装置は、本発明に適切な示度を提供するために用い得る。しかしながら、開口の横断面対赤血球断片または血小板の平均横断面の比が実質的に4:1 であるように、いずれかの装置中の開口のサイズが低減される場合に、さらに正確な示度が得られる。
【００１９】
慣用の血球分析技術では、分析前に標本を抗凝固薬、例えばＥＤＴＡで処理するのが普通である。しかしながら、それは断片化を抑制する傾向がある。したがって、抗凝固薬で標本を処理しないか、または断片化を抑制しないかまたは促す抗凝固薬、例えばヘパリンを用いるのが望ましいことが判明した。
本発明の実施例を、添付の図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２０】
詳細な説明
本発明の方法を用いて得られた結果の例を、WO97/24529号に開示された装置およびWO97/24600号に開示された電極を用いて検査した細胞の標本に関する漸増ストレスに対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である、添付の図面の図１〜５を参照しながら、ここで説明する。
【００２１】
このような頻度分布は、例えば正常な非断片化赤血球のそれぞれ細胞透過性、オスモル濃度および細胞形状の指標を提供するために、例えば、WO97/24598号、WO97/24599号およびWO97/24601号において従来用いられてきた。
検査した標本は、ヘパリンで処理し、空気中での攪拌または振盪により機械的に攪拌し、次にWO97/24529号に開示された装置を用いて浸透圧勾配処理を施した。
【００２２】
図１は、健常人からの血液標本である。ストレスが点Ａから前方に増大されると、細胞は膨潤し始めて、平均細胞サイズの漸増を生じる。あるオスモル濃度で、細胞はそれ以上増大し得ず、ストレスがさらに増大すると、細胞はその内容物を排出して、領域Ｂに示したような「ゴースト細胞」になる。細胞のこれらの特徴は、本発明の技術と並んで有用な診断情報を生じる。しかしながら、本発明はこれらの特徴には無関心で、且つそれらとは無関係であるが、しかし、代わりに、図１のグラフのベースラインに沿って現れる細胞に関係する。これらのベースライン細胞の性質を、浸透圧ストレスに対するそれらの分布、機械的ストレスに対するそれらの分布および／または空気との接触に対するそれらの応答により弁別し得る。
【００２３】
血小板は、検査した範囲内（300 〜100mOsm/Kg）の浸透圧ストレスによる影響を受けない。しかしながら、断片は、浸透圧ストレスの影響を強く受ける。それらは溶解の誘発を伴わずに出現することは稀で、溶解が増大するとより多くなる。したがって、断片はオスモル濃度とは逆に変化する。機械的ストレスは血小板と断片に反対の作用を及ぼし、その影響は空気への同時曝露により強められる。それは断片の出現を起こさせるが、しかしそれは血小板の溶解を誘導して、それらを目に見えなくする。
【００２４】
図２Ａ〜Ｆは、空気中での漸進的攪拌（それぞれの攪拌期間は0 、1 、2 、6 、10および15秒）により血小板が目に見えなくされる、ということを実証する。図２Ａのベースラインに沿った信号は、それらの頻度が全オスモル濃度でほぼ同一で、そして空気中での２秒間の攪拌でもほぼ完全な消失を誘導し得る（図２Ｃ参照）ため、血小板の存在に帰し得る。その現象は、図３Ａ〜Ｆが、他の種類の細胞が存在しない場合に純血小板懸濁液中で同一現象を示しているため、赤血球または白血球との血小板結合（付随性）には帰し得ない。
【００２５】
図４Ａ〜Ｅは、時間に伴う空気中での機械的攪拌の作用を実証する。攪拌期間が４Ａから下って４Ｅに進行すると、生成される断片の数が増大する。同時に、血小板は急速に目に見えなくされる（しかし、これらの特定の図でこれを観察するのは難しい）。図５Ａ〜Ｄは、空気を伴う振盪時の全血標本中の血小板低減を実証する。このような頻度分布は、例えばWO97/24598号、WO97/24599号およびWO97/24601号において従来用いられてきた。
【００２６】
好ましい方法は、既存の自動血小板計数機を用いて、空気の不存在下で標本を混合し、検査して血小板を測定する工程を包含する。やむおえず多少の空気が存在する場合には、標本に及ぼす影響を限定するために標本メニスカスの表面積を最小にすべきであり、あるいは血小板に影響を及ぼさない気体を用いるべきである。この１回の測定は、血小板と類似のサイズの粒子を含有しない全標本に関する正確な計数を提供する。反復測定は、血小板を自動分析機に対して非可視的にさせるために、空気との制御攪拌後におこなわれる。２回の測定からの集団間の差は、血小板の数、それらの年齢および生理学的特性の測定を提供する。全血標本中では、血小板のみが消失する。例えば、空気との攪拌前後の細胞計数が異ならない場合には、懸濁中に血小板は認められない。
【００２７】
種々の実験条件下で、即ち、純血小板懸濁液中で、他のすべての血球要素の存在下で、ガラス、ポリスチレンおよびポリエチレンの容器中で、薄膜の種々の表面積への曝露後、そして種々の量のガラスビーズとともに振盪することにより、種々の浸透圧、機械的、熱および音波ストレスへの曝露後、ならびに空気および窒素との機械的攪拌後に、我々は血小板を測定した。
【００２８】
これらすべてのストレスに対する血小板数を測定することにより、血小板を電子的に非可視的にさせるが、一方他の種類の細胞は変えられないかまたは変形されず、しかし自動分析機に対して依然として可視的である条件を我々は見出した。さらに、消失の速度および特徴は、血小板の健康および機能の指標である。
全試験所において、あらゆる血液標本に関する分析の前に、標本を先ず振盪させて、互いに、そして血漿に関して無作為に細胞型を混合する。攪拌は、自動計器での分析工程中継続し、細胞を、可変量の空気の存在下で、故意にそして偶発的にの両方で、攪拌に曝露する。実際、血液の各ボーラスを分離するための、または試験管および計器導管を清浄にするための一方法として、多くの計器が空気気泡を使用する。
【００２９】
ガラスビーズを用いての振盪は、血小板計数に小さい作用を及ぼし、したがって、目的が血小板消失を回避することである場合、初期標本混合のためには、空気または他の何かの気体を用いた振盪より望ましい。それが空気を含有しなかった（血液懸濁液で満たされている）場合、ただ空気だけを含有して空になるまで、円錐形フラスコからアリコートを連続的に抜き出すことにより、振盪の機械的作用を、空気混合の作用とさらに弁別した。その間中、血液懸濁液を連続的に攪拌棒で攪拌した。フラスコがいっぱいに満たされている限り、血小板数は一定のままであったが、しかし標本／空気の比が半分以下に下がると、血小板は消失し始め、フラスコ中の空気の容積に直接比例して消失した。空気の不存在下では、血小板は、空気の存在下でのように２秒以内に評価可能なほどには消失しない。したがって、空気（またはその構成成分）を用いた攪拌の継続期間および強度に対する血小板の計数は、それらを減少させるか完全に消失させるが、しかし細菌、断片、血中に見出され得るその他のあらゆる要素は減少も消失も伴わない。
【００３０】
本方法は、以下において有用である：
１．疾患診断の改良。より正確な血小板計数は良好な疾患診断および予後をもたらす。
２．血液検査の既存方法。不活性気体を用いることにより、または混合から空気を排除することにより、自動計器は血小板計数および大きさによる分類の精度および反復可能性を改良する。
【００３１】
３．血小板の健康の新規の測定法。この方法を用いることにより、空気に対するそれらの感受性ならびにそれらの消失および再出現速度から、血小板の健康についての新しい情報が得られる。
４．血液採取。Currently Vacutainers （カレントリーバキュテイナー、商標）（部分的真空ガラス試験管）は空気を含有し、さらに、標本が必要とされるよりも小さい場合に、時として入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図２】  多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図３】  多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図４】  多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図５】  多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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