(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列を移動度改変するための組成物であって、該組成物は、以下の構造式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【化１】
0004452445.tif 000021
に従う、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに連結された移動度改変ポリマーを含む、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーまたはその塩を含み、ここで：
Ｒ２は、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキル、アリール、（Ｒ８）３Ｓｉ−、塩基安定性保護基、およびＲ５−Ｘ−［（ＣＨ２）ａ−Ｏ］ｂ−（ＣＨ２）ａ−からなる群より選択され、ここで、各Ｒ８は、直鎖および分枝鎖のアルキルおよびアリールからなる群より独立して選択され；
各Ｒ１０は、水素およびＲ２からなる群より独立して選択され；
Ｒ５は、水素、保護基、レポーター分子、およびリガンドからなる群より選択され；
Ｒ３は、
【化２】
0004452445.tif 000022
であり；
各Ｒ４は、水素およびＲ２からなる群より独立して選択され；
各Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より独立して選択され；
各ａは、独立して、１〜６の整数であり；
各ｂは、独立して、０〜４０の整数であり；
各ｄは、独立して、１〜２００の整数であり；そして
ＯＬＩＧＯは、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであるが、
ただし、少なくとも１つのＲ１０または少なくとも１つのＲ４は、水素ではなく、そして該移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、
【化２Ａ】
0004452445.tif 000023
でもなく、ここでｂｚはベンゾイルであり；ＭｅＯＴｒはモノメトキシトリチルであり；ｔｂｄｓは（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシリルであり；ｎｐｅは２−（４−ニトロフェニル）エチルであり；そしてｎｐｅｏｃは２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニルである、組成物。
【請求項２】
各ＸがＯである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
各ａが２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
各ｂが４である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＯＬＩＧＯが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡアナログ、またはＲＮＡアナログオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＯＬＩＧＯが、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドのアナログである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＯＬＩＧＯが、少なくとも１つの非負荷電内部ヌクレオチド連結を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記内部ヌクレオチド連結が、モノアルキルリン酸トリエステルである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ５がレポーター分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記レポーター分子が、フルオロフォア、化学発光部分、またはリガンドである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＯＬＩＧＯが検出可能な標識を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
ＯＬＩＧＯがポリエチレンオキシドポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記移動度改変ポリマーが、前記配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に結合されたポリエチレンオキシドポリマーをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記移動度改変ポリマーが、前記配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に結合されたポリエチレンオキシドポリマーをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｒ２が、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびネオペンチルから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｒ１０が、独立して、水素、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびネオペンチルから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｒ４が、独立して、水素、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびネオペンチルから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリエチレンオキシドポリマーが、モノメチルポリエチレンオキシドポリマーである、請求項１３、１５および１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリエチレンオキシドポリマーが、少なくとも２０００ダルトンの分子量を有する、請求項１３、１５および１６に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリエチレンオキシドポリマーが、少なくとも５０００ダルトンの分子量を有する、請求項１３、１５および１６に記載の組成物。
【請求項２４】
複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを含む組成物であって、該ヌクレオ塩基ポリマーの各々が請求項１に従う化合物であり、そして該ヌクレオ塩基ポリマーの各々が、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する、組成物。
【請求項２５】
前記複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの各々が、ＯＬＩＧＯを含み、そして各ＯＬＩＧＯが、同数のヌクレオ塩基単位を有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
１つ以上の標的核酸中の複数の選択されたヌクレオチド配列を検出する方法であって：
少なくとも１つ以上の標的核酸と、複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーとを、該標的核酸にハイブリダイズするこれらのヌクレオ塩基ポリマーを識別する条件下で接触させる工程であって、該ヌクレオ塩基ポリマーの各々が請求項１に従う化合物であり、そして該ヌクレオ塩基ポリマーの各々が、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する、工程；および
該標的核酸にハイブリダイズしたこれらのヌクレオ塩基ポリマーを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオ塩基ポリマーのＯＬＩＧＯ部分が、同数のヌクレオ塩基単位で構成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の標的核酸が、固体支持体に固定されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ヌクレオ塩基ポリマーの各々が検出可能な標識を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出可能な標識が、放射性同位元素、化学発光部分、フルオロフォア、またはリガンドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出工程が：
前記標的核酸にハイブリダイズしたこれらのヌクレオ塩基ポリマーを回収する工程；および
該回収したヌクレオ塩基ポリマーを電気泳動により分離する工程、
を包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記電気泳動が、非ふるい媒体におけるキャピラリー電気泳動により実行される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上の標的核酸中の複数の選択されたヌクレオチド配列を検出する方法であって：
該標的核酸と、第１の複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブおよび第２の複数の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブとを、該標的核酸にハイブリダイズするこれらのプローブ間を識別する条件下で接触させる工程であって、該移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの各々が請求項１に従う化合物であり、そして該ヌクレオ塩基ポリマーの各々が、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する、工程；
同一の標的核酸分子に隣接してハイブリダイズする第１のプローブおよび第２のプローブの対峙する末端ヌクレオ塩基残基を共有結合して、連結産物を形成する工程であって、該連結産物の各々が、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する、工程；ならびに
該連結産物を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
連結産物の各々が同数のヌクレオ塩基を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の標的核酸が、固体支持体に固定されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのうちの少なくとも１つが、検出可能な標識を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が、放射性同位元素、化学発光部分、生物発光部分、フルオロフォア、またはリガンドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出工程が：
前記連結産物を回収する工程；および
該回収した連結産物を電気泳動により分離する工程、
を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記電気泳動が、非ふるい媒体におけるキャピラリー電気泳動により実行される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記共有結合がリガーゼによって達成される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記リガーゼが熱安定性リガーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記接触工程、ハイブリダイズ工程、連結工程、および放出工程が、複数回繰り返される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
複数の標的核酸分子を分離する方法であって：
請求項１に記載の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを、該複数の標的核酸の各々に結合し、それによって、複数の移動度改変標的核酸を形成する工程であって、同数のヌクレオチド残基を有する標的核酸の各々は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する、工程；および
該複数の移動度改変標的核酸を分画する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記複数の標的核酸が、連鎖終結配列決定法および化学切断配列決定法からなる群より選択される配列決定法により生成される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
１つ以上の標的核酸中の複数の選択されたヌクレオチド配列を検出する方法であって：
ａ）該標的核酸と、複数のヌクレオ塩基ポリマープライマーとを接触させる工程であって、それによって第１のヌクレオ塩基ポリマープライマーおよび第２のヌクレオ塩基ポリマープライマーの各々が、複数の選択されたヌクレオチド配列の各々の反対端で相補鎖にハイブリダイズし、該第１のヌクレオ塩基ポリマープライマーおよび該第２のヌクレオ塩基ポリマープライマーの各々の少なくとも１つは、請求項３に記載される移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーである、工程；
ｂ）該第１のヌクレオ塩基ポリマープライマーの各々および該第２のヌクレオ塩基ポリマープライマーの各々を、デオキシリボヌクレオシド三リン酸基質の存在下で、ＤＮＡ重合活性により伸長する工程；
ｃ）伸長した各第１のヌクレオ塩基ポリマープライマーと該標的核酸との間および伸長した各第２のヌクレオ塩基ポリマープライマーと該標的核酸との間の塩基対形成相互作用により形成される複数の塩基対構造を変性する工程；
ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を複数回繰り返して複数のポリメラーゼ連鎖反応産物を形成する工程であって、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の各々は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する、工程；ならびに
ｅ）該ポリメラーゼ連鎖反応産物を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応産物の各々が、同数のヌクレオ塩基を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つ以上の標的核酸が、固体支持体に固定されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１のヌクレオ塩基ポリマープライマー、前記第２のヌクレオ塩基ポリマーポリマー、または基質デオキシリボヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つが、検出可能な標識を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出工程が、非ふるい媒体におけるキャピラリー電気泳動による前記複数のポリメラーゼ連鎖反応産物の分画を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
以下の構造：
【化３】
0004452445.tif 000024
を有する移動度改変ホスホルアミダイト試薬であって、ここで：
Ｒ２は、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキル、アリール、（Ｒ８）３Ｓｉ−、塩基安定性保護基、およびＲ５−Ｘ−［（ＣＨ２）ａ−Ｏ］ｂ−（ＣＨ２）ａ−からなる群より選択され、ここで、各Ｒ８は、直鎖および分枝鎖のアルキルおよびアリールからなる群より独立して選択され；
Ｒ５は、水素、保護基、レポーター分子、およびリガンドからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、およびＣ２０〜Ｃ２７アリールアルキルからなる群より選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より独立して選択され；
各ａは、独立して、１〜６の整数であり；そして
ｂは、０〜４０の整数であり、
ただし、該移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、
【化３Ａ】
0004452445.tif 000025
ではない、移動度改変ホスホルアミダイト試薬。
【請求項５１】
少なくとも１つの移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを備えるキットであって、該移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーが、以下の構造式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【化４】
0004452445.tif 000026
に従う、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに連結された移動度改変ポリマーまたはその塩を含み、ここで：
Ｒ２は、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキル、アリール、（Ｒ８）３Ｓｉ−、塩基安定性保護基、およびＲ５−Ｘ−［（ＣＨ２）ａ−Ｏ］ｂ−（ＣＨ２）ａ−からなる群より選択され、ここで、各Ｒ８は、直鎖および分枝鎖のアルキルおよびアリールからなる群より独立して選択され；
Ｒ５は、水素、保護基、レポーター分子、およびリガンドからなる群より選択され；
Ｒ３は、
【化５】
0004452445.tif 000027
であり；
各Ｒ１０は、水素およびＲ２からなる群より独立して選択され；
各Ｒ４は、水素およびＲ２からなる群より独立して選択され；
各Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より独立して選択され；
各ａは、独立して、１〜６の整数であり；
各ｂは、独立して、０〜４０の整数であり；
各ｄは、独立して、１〜２００の整数であり；そして
ＯＬＩＧＯは、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであるが、
ただし、少なくとも１つのＲ１０または少なくとも１つのＲ４は、水素ではなく、そして該移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、
【化５Ａ】
0004452445.tif 000028
でもなく、ここでｂｚはベンゾイルであり；ＭｅＯＴｒはモノメトキシトリチルであり；ｔｂｄｓは（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシリルであり；ｎｐｅは２−（４−ニトロフェニル）エチルであり；そしてｎｐｅｏｃは２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニルである、キット。
【請求項５２】
少なくとも１つの移動度改変ホスホルアミダイト試薬を含むキットであって、該試薬が、以下の構造：
【化６】
0004452445.tif 000029
を有し、ここで：
Ｒ５は、水素、保護基、レポーター分子、およびリガンドからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、およびＣ２０〜Ｃ２７アリールアルキルからなる群より選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より選択され；
ａは、１〜６の整数であり；
Ｒ２は、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキル、アリール、（Ｒ８）３Ｓｉ−、塩基安定性保護基、およびＲ５−Ｘ−［（ＣＨ２）ａ−Ｏ］ｂ−（ＣＨ２）ａ−からなる群より選択され、ここで、各Ｒ８は、直鎖および分枝鎖のアルキルおよびアリールからなる群より独立して選択され；そして
ｂは、０〜４０の整数であり、
ただし、該移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、
【化６Ａ】
0004452445.tif 000030
でもなく、ここでｂｚはベンゾイルであり；ＭｅＯＴｒはモノメトキシトリチルであり；ｔｂｄｓは（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシリルであり；ｎｐｅは２−（４−ニトロフェニル）エチルであり；そしてｎｐｅｏｃは２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニルである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は、該して、ヌクレオ塩基ポリマー官能化試薬、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー、複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを含む組成物、ならびに種々のアッセイ（例えば、１つ以上の標的核酸中の複数の選択されたヌクレオチド配列の検出のためのアッセイ）におけるこのようなポリマーおよび組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．発明の背景）
標的核酸中の選択されたヌクレオチド配列を検出するために使用される方法は、非常に多くの実用（親子鑑定、法医学的分析、器官提供者受容者適合、疾患診断、予後および処置、ならびに出生前カウンセリングが挙げられるがこれらに限定されない）の基礎を成している。
【０００３】
均一な実験条件下で（好ましくは、単一の自動化されたアッセイ反応において）、複数の選択されたヌクレオチド配列を同時に検出および分析することを可能にする材料および方法に対する必要性が、当該分野で存在する。この必要性を満たすための１つのアプローチは、改変されたヌクレオ塩基ポリマーの有効サイズを増大するよう作用する配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに結合され得る移動度改変ポリマーの開発である。移動度改変ポリマーの電荷  対  並進摩擦抵抗の比が、結合されるヌクレオ塩基ポリマーの電荷  対  並進摩擦抵抗の比と異なる場合、得られる改変ヌクレオ塩基ポリマーは、非改変ヌクレオ塩基ポリマーの電気泳動移動度と異なる移動度を有する。電荷  対  並進摩擦抵抗の比のこの変化は、ふるい条件および非ふるい条件下での類似の大きさのヌクレオ塩基ポリマーの電気泳動分離をもたらすための種々の適用において使用され得る。
【０００４】
最も一般的に用いられる移動度改変ポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であり、標準的なＤＮＡ化学を用いてヌクレオ塩基ポリマーに結合される（Ｇｒｏｓｓｍａｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（２１）：４５２７−３４）。標準的なＤＮＡ化学を用いてヌクレオ塩基ポリマーに付加され得る例示的な標準的なＰＥＯホルホロアミダイト試薬（「ＰＥＯ試薬」）を以下に示す。
【０００５】
【化８】
0004452445.tif 000002
この図において、ＤＭＴはジメトキシトリチルを表し、ｉＰｒはイソプロピルを表す。ｘ＝５の場合、ヌクレオ塩基ポリマーに付加される各ＰＥＯ試薬は、ヌクレオ塩基ポリマーに、ふるい電気泳動条件および非ふるい電気泳動条件下の両方で、非改変ヌクレオ塩基ポリマーと比較して、約２ヌクレオチドの電気泳動遅延を与える。ＤＮＡ化学の限界に起因して、約４０以下のＰＥＯ試薬のみが、ヌクレオ塩基ポリマーに連結され得、そして均一な生成物を生じ得る。従って、これらの標準的なＰＥＯ改変試薬を用いて達成され得る最も大きな電気泳動移動度の遅延は、約８０ヌクレオチドである。
【０００６】
しかし、単一の実験において非常に多くのヌクレオチド配列（例えば、嚢胞性線維症に関連する同定された２００個の対立遺伝子）を同時に分析することに対する必要性の増加の観点から、現在利用可能な移動度改変ポリマーと異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有し、そして利用可能なＰＥＯ改変試薬を用いて達成可能な８０ヌクレオチドより大きな電気泳動移動度の遅延を与え得る、新規の移動度改変ポリマーに対する必要性が、当該分野で存在する。このような新規の移動度改変ポリマーの利用可能性は、利用可能な移動度改変のレパートリーを大きく増加させ、それによって、単一の（好ましくは、自動化された）形式において極めて複雑な配列分析を実施する能力を可能にする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（３．発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ポリマー部分およびホスホルアミダイト部分を含む移動度改変ホスホルアミダイト官能化試薬を提供する。ホスホルアミダイト部分は、従来のホスホルアミダイト試薬において使用されるβ−シアノエチル酸素保護基と大きく異なり、塩基性条件（例えば、従来のホスホルアミダイトリゴヌクレオチド合成および脱保護において使用される条件および試薬）に対して安定な酸素保護基を含む。この安定な酸素保護基の結果として、官能化試薬と官能化される化合物との間で形成される結合は、非荷電リン酸トリエステルである。本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、広範な種々の物質および材料を官能化し、その全体の正味の電荷を実質的には変更することなくこの物質または材料に質量および大きさを付加するのに使用され得る。
【０００８】
本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、標準的なホスホルアミダイト合成スキームと適合性であり、そして市販のヌクレオ塩基ポリマー合成機器と共に使用され得る。従って、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、特に、移動度改変合成配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー（例えば、２’−デオキシオリゴヌクレオチド）に対して都合がよい。それらは、特定の用途および／または移動度改変の所望される程度に依存して、ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に容易に結合され得る。
【０００９】
ホスホルアミダイト部分に対して遠位に存在するポリマー部分の末端は、所望の合成条件下で選択的に除去可能な基により保護され得るか、またはそれは、本質的に非反応性の基（例えば、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基など）を含み得る。先の実施形態において、保護基は、１つ以上のさらなるホスホルアミダイト試薬の連続的な縮合のために、選択的に除去され得る。適切な選択的に除去可能な保護基は、保護される基の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に依存し、そしてこれは当業者に明らかである。ヒドロキシル基を保護するのに適切な、選択的に除去可能な基としては、従来のヌクレオシドホスホルアミダイトリゴヌクレオチド合成試薬の５’−ヒドロキシルを保護するために一般的に使用される酸不安定基（例えば、酸不安定トリチル基（例えば、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルなど））のいずれかが挙げられる（これは例示であって、限定ではない）。
【００１０】
本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、移動度改変物質（例えば、ヌクレオ塩基ポリマー）に対して単独で使用され得、その全体的な正味の電荷を変化させずにヌクレオ塩基ポリマーに質量および大きさを付加する。あるいは、これらは、移動度改変物質（例えば、ヌクレオ塩基ポリマー）に対して、従来の移動度改変試薬（例えば、上述されたＰＥＯ試薬）と組み合わせて使用され得る。本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、ヌクレオ塩基のような物質に対して、その全体的な電荷を変化させずに質量および大きさを追加するために使用され得るので、ＰＥＯ試薬のような従来の試薬と組み合わせて使用される場合、これらは、ヌクレオ塩基ポリマーのような物質に付加され得る利用可能な移動度改変のレパートリーを大きく増加させる。
【００１１】
この試薬を構成するポリマー部分は、使用の所望の条件下で可溶性であり、代表的には標準的な当該分野で公知の化学を用いて好都合にホスホルアミダイト部分に変換され得る官能基（例えば、第一級ヒドロキシル基）を含むかまたは含むよう改変され得るかのいずれかである、任意の種々のポリマーであり得る。代表的なポリマーとしては、ポリオキシド、ポリアミド、ポリイミン、およびポリサッカリドが挙げられるがこれらに限定されない。このポリマーは、単独でかまたは組み合わせで（例えば、コポリマーまたはブロックポリマーの形態で）使用され得る。例示的なポリマーとしては、約２〜約１０のモノマー単位を含む、直鎖または分枝鎖の酸化ポリアルキレン、またはそれらの誘導体が挙げられる。代表的な誘導体としては、例えば、末端ヒドロキシルが、スルファニル基またはアミン基で置換された誘導体が挙げられる。有用な酸化ポリアルキレンポリマーは、ポリエチレングリコールである。このポリマーは、必要に応じて、標識もしくは他のレポーター基もしくはレポーター分子、引き続く合成反応の間に、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを保護するための保護基、または例えば、他の部分もしくは化学種（例えば、リガンドなど）に移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを結合するための他の基を含み得る。
【００１２】
先に議論されたように、本発明の試薬のホスホルアミダイト酸素原子を保護する基は、合成ヌクレオ塩基ポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）を脱保護および／または切断するのに使用される塩基性条件に対して安定である。従って、酸素保護基は、一般的に、約１８時間の期間にわたる５５℃の温度での水酸化アンモニウムによる処理に対して安定であるはずである。当然、より穏やかな脱保護条件および／または切断条件が使用される場合、酸素保護基は、より穏やかなこれらの条件に対してのみ安定である必要がある。本発明のホスホルアミダイト試薬の酸素原子を保護するために使用され得るこのような塩基性条件に対して安定な基は、当業者に明らかであり、そしてこれらとしては、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキル、アリール、および（Ｒ８）３Ｓｉ−（ここで、各Ｒ８は、直鎖および分枝鎖のアルキルおよびアリールからなる群より独立して選択される）が挙げられる（これは、例示であって、限定ではない）。あるいは、酸素保護基は、上記のような選択的に除去可能な末端保護基を必要に応じて有するポリマーセグメントであり得る。この後者の実施形態において、本発明の試薬は、分枝したポリマーセグメントまたは樹状のポリマーセグメントを含む移動度改変物質の形成を可能にする。
【００１３】
１つの好都合な実施形態において、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬のポリマー部分は、酸化ポリアルキレンであり、その例示的な実施形態を、以下の式（Ｉ）として示す。
【００１４】
【化９】
0004452445.tif 000003
ここで：
Ｒ５は、水素、保護基、レポーター分子、およびリガンドからなる群より選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より選択され；
各ａは、独立して、１〜６の整数であり；
ｂは、０〜４０の整数であり；
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、およびＣ２０〜Ｃ２７アリールアルキルからなる群より選択され；そして
Ｒ２は、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキル、アリール、（Ｒ８）３Ｓｉ−（ここで、各Ｒ８は、直鎖および分枝鎖のアルキルおよびアリールからなる群より独立して選択される）、塩基安定性保護基、およびＲ５−Ｘ−［（ＣＨ２）ａ−Ｏ］ｂ−（ＣＨ２）ａ−からなる群より選択される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬単独でかまたは従来の移動度改変試薬と組み合わせてのいずれかで移動度が改変された、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを提供する。このような配列特異的移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーは、一般的に、移動度改変ポリマーセグメントおよび配列特異的ヌクレオ塩基セグメントを含む。
【００１６】
このヌクレオ塩基ポリマーセグメントは、代表的に、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡオリゴマーまたはＲＮＡオリゴマー）であるが、後の節でより詳細に記載されるような、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの任意の多くの異なるアナログまたは誘導体でもあり得る。ヌクレオ塩基ポリマーは、標的核酸の所望のヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオ塩基の配列を有し、その結果、このヌクレオ塩基ポリマーセグメントは、特定の条件下で、標的配列に特異的に結合する。
【００１７】
移動度改変ポリマーセグメントは、所定の電気泳動媒体において、ヌクレオ塩基ポリマーセグメントの電荷  対  並進摩擦抵抗の比と異なる比を有する。結果として、移動度改変ポリマーセグメントによって、本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、対応する非改変ヌクレオ塩基ポリマーの電気泳動移動度と比較して、遅延した電気泳動移動度を有する。
【００１８】
本発明の１つの例示的な実施形態に従って、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、以下の構造式（ＩＩ）：
【００１９】
【化１０】
0004452445.tif 000004
に従う化合物またはその塩である。ここで：
Ｒ２、Ｒ５、Ｘ、ａ、およびｂは、式（Ｉ）と同様であり；そして
ＯＬＩＧＯは、少なくとも５つのヌクレオ塩基を含む配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーである。
【００２０】
移動度改変ポリマーは、ＯＬＩＧＯの５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合され得る。移動度改変ポリマーはまた、第１ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端および第２ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に結合され得、それによって、２つのヌクレオ塩基ポリマーセグメントに連結する移動度改変ポリマーセグメントを有する移動度改変オリゴヌクレオチドポリマーを提供する。
【００２１】
式（ＩＩ）に従う移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーにおける置換基Ｒ２によって、示されるリン酸トリエステルは、生理学的ｐＨで荷電しない。従って、示される移動度改変ポリマー基は、ＯＬＩＧＯに対して、質量のみ追加し、電荷を追加しない。
【００２２】
本発明の移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーは、非荷電リン酸トリエステル結合のみを含む移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーに限定されない。非荷電リン酸トリエステル結合と荷電リン酸トリエステル結合との組み合わせを慎重に選択することにより、利用可能な移動度改変のレパートリーが劇的に増加し得る。従って、第２の例示的な実施形態において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、以下の構造式（ＩＩＩ）：
【００２３】
【化１１】
0004452445.tif 000005
に従う化合物またはその塩である。ここで：
Ｒ３は、
【００２４】
【化１２】
0004452445.tif 000006
であり；
Ｒ２、Ｒ５、ａ、ｂ、Ｘ、およびＯＬＩＧＯは、式（Ｉ）および（ＩＩ）において先に定義された通りであり；
各ｄは、独立して、１〜２００の整数であり；そして
各Ｒ４および各Ｒ１０は、水素およびＲ２からなる群より独立して選択されるが、ただし、少なくとも１つのＲ１０または少なくとも１つのＲ４は、水素ではない。
【００２５】
構造式（ＩＩＩ）の化合物において、各ａ、ｂ、ｄ、Ｘ、Ｒ１０、およびＲ４は、互いに独立して、同じであっても異なってもよい。構造式（ＩＩＩ）の化合物の特定の実施形態において、少なくともいくつかのＲ１０および／またはＲ４は、水素ではない。Ｒ１０およびＲ４が水素以外の場合、Ｒ１０および／またはＲ４は、Ｒ２である。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、複数の本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを含む組成物を提供する。ここで、特定の実施形態において、各移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーは、構造式（ＩＩ）および構造式（ＩＩＩ）からなる群より独立して選択される構造を有する。この複数の移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーのうちの少なくとも２つは、別個の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有し、その結果、２つ以上の移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーの各々は、別個の電気泳動移動度を有する。別個の電荷  対  並進摩擦抵抗の比は、この分子の移動度改変ポリマーセグメントの長さ（すなわち、モノマー単位の数）の差、ヌクレオ塩基ポリマーに結合された移動度改変ポリマーセグメントの数の差（すなわち、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）における変数ｄの差）、複数の移動度改変ポリマーセグメントを連結する電荷、非荷電サブユニットに対する荷電サブユニットの数、ヌクレオ塩基ポリマーの長さおよび電荷、またはこれらの特徴の組み合わせに起因し得る。
【００２７】
なお別の局面において、本発明は、１つ以上の標的核酸中の複数のヌクレオチド配列を検出する方法を提供する。この方法に従って、複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブ（これらは各々、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群より独立して選択される構造を必要に応じて有する）は、一般的に、塩基特異的な様式で標的核酸にハイブリダイズする移動度改変プローブと、そのようにハイブリダイズしないプローブとを区別する条件下で、１つ以上の標的核酸と接触される。次いで、標的にハイブリダイズする移動度改変ヌクレオ塩基ポリマープローブは、電気泳動により分画される。標的核酸における選択された配列の存在は、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマープローブの観察される電気泳動移動速度に従ってか、または、必要に応じて、標識の特性に従ってか、あるいはそれらの組み合わせによって、検出される。
【００２８】
移動度改変ヌクレオ塩基ポリマープローブは、標識されていてもされていなくてもよい。あるいは、それらは、以下により十分に記載されるように、この方法の間に標識を含むように改変され得る。標識されない場合、移動度改変プローブの電気泳動移動速度は、従来の手段により（例えば、吸光スペクトルにより）モニタリングされ得る。例えば、フルオロフォアで標識される場合、電気泳動移動速度は、この標識を検出することによりモニタリングされ得る。
【００２９】
本発明の１つの実施形態において、多重アッセイにおいて移動度改変プローブの検出を容易にするために、移動度改変プローブは、異なる蛍光標識（例えば、５−カルボキシフルオロセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオロセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオロセイン（ＨＥＸ−１）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−５−カルボキシフルオロセイン（ＨＥＸ−２）、２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシフルオロセイン（ＺＯＥ）、４，７，２’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシフルオロセイン（ＴＥＴ−１）、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオロセイン（ＮＡＮ−２）、および１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４，７−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセインが挙げられるがこれらない限定されない）で標識される。適切な蛍光標識を選択する手引きは、Ｓｍｉｔｈら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：２６０−３０１、Ｋａｒｇｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４９５５−４９６２、Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅ．）において見出され得る。例示的な蛍光標識としては、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、Ｋｈａｎｎａらに対する米国特許第４，３１８，８４６号およびＬｅｅら（１９８９）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １０：１５１−１６４に開示される誘導体）、ならびに上記のような、６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１、またはＮＡＮ−２などが挙げられる。複数の蛍光色素が使用される場合、それらは、多くの場合、スペクトルにより分離可能であるべきである。
【００３０】
この方法の１つの好都合な実施形態において、標的核酸は、固体支持体上に固定される。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブは、代表的に、洗浄によって除去され、そしてハイブリダイズしたプローブは、代表的に、ハイブリッドを変性させることによって回収され、そしてこれらの回収されたハイブリダイズしたプローブは、上記のように電気泳動により分画される。
【００３１】
この方法の別の実施形態において、標的核酸に特異的にハイブリダイズする移動度改変プローブは、標識を組み込むように改変される。この改変は、多くの異なる方法によって達成され得る。例えば、米国特許第５，８０７，６８２号、同第５，７０３，２２２号、および同第５，４７０，７０５号を参照のこと。これらは、塩基特異的な様式で標的核酸に結合する場合のプローブの選択的な改変のために有用な方法および組成物を開示する。１つの一般的な方法において、検出可能な標識を含む第２の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブは、ハイブリダイズされた移動度改変プローブに共有結合される。この第２の標識プローブはまた、必要に応じて、移動度改変ポリマーを含み得る。この２つのプローブは、これらの両方が、同一の標的核酸分子に対して隣接してハイブリダイズする場合、互いに共有結合され得る（すなわち、プローブは、標的核酸の隣接する塩基と塩基対を形成する対峙する末端ヌクレオ塩基残基を有する）。共有結合は、化学的手段または生物学的手段により（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼにより）達成され得る。
【００３２】
従って、本発明のこの局面に従って、溶液中に存在するかまたは固定され得る標的核酸は、本発明に従う第１の複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブ（これらの各々は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有し、そして、必要に応じて、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群より選択される）、および第２の標識された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブと、一般的に、配列特異的な様式で標的にハイブリダイズするプローブを区別する条件下で接触される。次いで、同一の標的核酸分子に隣接してハイブリダイズするプローブは、一緒に共有結合され（連結され）、移動度改変標識連結産物を形成する。各標識連結産物は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。さらなる局面において、３つ以上のヌクレオ塩基ポリマープローブが、少なくとも３つのプローブが共有結合して連結産物を形成するような様式で、標的核酸の隣接配列にハイブリダイズされる。そのように連結したプローブの少なくとも１つは、検出可能な標識を含み、そしてこのような連結したこれらのプローブの少なくとも１つは、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブ（必要に応じて、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群より選択される）であり、その結果、その連結産物は、標識を有し、そして異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。標的核酸にハイブリダイズされた、標識連結産物は、上記のように、電気泳動により回収および分画される。
【００３３】
このハイブリダイゼーション、連結、および変性のサイクルは、形成される連結産物の濃度を増幅するために反復され得る。この場合、連結は、熱安定性リガーゼにより達成され得る。さらに、さらなるヌクレオ塩基ポリマープローブ（これらは合わせて、それらにハイブリダイズする連結産物に対して十分相補的であり、上記のように互いに共有結合される）もまた含まれ、それによって、連結産物の幾何学的増幅（すなわち、リガーゼ連鎖反応）がもたらされる。従って、このようなリガーゼ連鎖反応の産物は、２つの鎖からなる二本鎖分子であり、各々の鎖は、少なくとも２つの配列特異的なヌクレオ塩基ポリマープローブの連結の産物である。従って、本発明のさらに別の実施形態において、リガーゼ連鎖反応産物中に組み込まれる少なくとも１つの配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、検出可能な試薬を含み、そして少なくとも１つの配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群より選択される移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであり、その結果、リガーゼ連鎖反応産物の少なくとも１つの鎖は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗を有する。
【００３４】
第２の一般的な方法において、改変は、鋳型特異的充填反応またはＰＣＲを通じて達成される。この局面において、溶液中に存在し得るかまたは固定され得る標的核酸は、複数の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブと接触され、これらのうちの２つは、標的核酸中の目的のヌクレオチド配列に隣接する相補鎖の対向端にハイブリダイズする。ハイブリダイズした配列特異的プローブの伸長（必要に応じて、熱安定性ポリメラーゼによる）、伸長産物の熱変性および解離、ならびにアニーリングのサイクルの反復により、２つのヌクレオ塩基ポリマープローブにより枠組みされた領域の幾何学的増幅が提供される。従って、このようなポリメラーゼ連鎖反応の産物は、２つの鎖からなる二本鎖分子であり、これらは各々、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブを含む。本発明のこの局面において、少なくとも１つの配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブは、本発明に従う移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブ（必要に応じて、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群より選択されるプローブ）であり、その結果、二本鎖ポリメラーゼ連鎖反応産物は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。本発明のこの局面において形成されるポリメラーゼ連鎖反応産物はさらに、プライマーとして使用される配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブのいずれかの中に組み込まれ得る標識を含むか、またはこれは重合酵素により使用される基質デオキシヌクレオシド三リン酸中に組み込まれ得る。他の例において、ポリメラーゼ連鎖反応産物は、挿入色素による挿入によってか、または検出可能な指標分子との他の非共有結合によって標識され得る。さらに別の局面において、形成されるポリメラーゼ連鎖反応産物は、分離された一本鎖産物を提供する変性条件下で分析される。この局面において、少なくとも１つの一本鎖産物は、標識ならびに必要に応じて構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群より選択される、本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの両方を含み、その結果、二本鎖ポリメラーゼ連鎖反応産物由来の一本鎖産物は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。当該分野で周知のように、このような一本鎖産物はまた、プライマーとして使用される２つの配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブのうちの１つを限定量用いるＰＣＲ反応を実施することにより生成され得る。
【００３５】
第３の一般的な実施形態において、結合した移動度改変プローブは、レポーター標識ヌクレオチド三リン酸分子と、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で反応され、このプローブの３’末端にレポーター基が結合される。レポーター基としては、放射活性部分および蛍光部分が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
第４の一般的な実施形態において、各移動度改変プローブは、プローブが標的核酸に結合した場合に酵素により切断され得る配列を含む。この切断反応は、ヌクレオ塩基ポリマーセグメントの一部を除去し、プローブの電荷／並進摩擦抵抗を改変し得るか、またはプローブの一端に保有されたレポーター標識と、プローブの他端に保有されたポリマー鎖を分離し、レポーター標識を保有する部分の電荷／並進摩擦抵抗を改変し得る。このような現象を検出する１つの方法は、蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれるプロセスに基づく。このプロセスにおいて、エネルギーは、フルオロフォアドナー分子とフルオロフォアアクセプター分子との間を移動する。従って、この実施形態の１つの局面において、移動度改変プローブは、切断部位によって隔てられた、光子ドナーおよび光子アクセプターとして作用する２つの部分を含む。アクセプター分子がフルオロフォアでない場合、その効果は、ドナーの蛍光の消光である。標的核酸に結合した結合移動度改変プローブの切断は、ドナー部分とアクセプター部分とを物理的に分離し、そしてドナー部分による蛍光を回復し、これは容易に、そして選択的に検出される。
【００３７】
第４の一般的な実施形態のさらに別の局面において、標的核酸に結合された場合に切断され得る配列を含む各移動度改変プローブは、このプローブの標識された末端（このプローブの５’末端または３’末端のいずれかであり得る）に結合された第１の移動度改変ポリマー、およびこのプローブの非標識末端に結合された第２の移動度改変ポリマーを含む。本発明のこの局面は、非限定的な様式において、「インベーダーアッセイ」における本発明の移動度改変ポリマーの使用により例示される。このアッセイは、標的核酸にハイブリダイズする２つの重複ヌクレオ塩基ポリマーにより形成される構造のフラップエンドヌクレアーゼ切断に基づくＳＮＰ同定手順である（例えば、Ｃｏｏｋｓｅｙら、２０００、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４４：１２９６−１３０１を参照のこと）。このような切断反応は、「下流」のヌクレオ塩基ポリマーの５’末端ヌクレオ塩基に対応する生成物を放出する。これらの切断産物が標識されており、そして非切断ヌクレオ塩基ポリマーから分離され得る場合、インベーダーアッセイは、例えば、ゲノム配列またはＰＣＲ増幅ゲノム配列における単一塩基の差を識別するために使用され得る。
【００３８】
インベーダーアッセイにおいて使用される下流のヌクレオ塩基ポリマーの標識５’末端への、本発明の移動度改変ポリマーの結合は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する切断産物を提供する。従って、複数のＳＮＰが、複数の配列特異的下流ヌクレオ塩基ポリマーを用いて同時に分析される。ここで、配列特異的下流ヌクレオ塩基ポリマーは、標識された５’末端に結合された本発明の移動度改変ポリマーを含み、その結果、各ＳＮＰにおけるフラップエンドヌクレアーゼ切断により生成される生成物は、異なる電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。
【００３９】
インベーダーアッセイのさらなる局面において、例えば、下流ヌクレオ塩基ポリマー（標識および５’末端に接続された本発明の第１移動度改変ポリマーを有する）は、３’末端に接続された第２移動度改変ポリマーを、さらに含む。第２移動度改変ポリマーの存在は、フラップエンドヌクレアーゼ産生産物（５’末端、標識、および第１移動度改変ポリマーを含む）の電気泳動移動度と未切断下流ヌクレオ塩基ポリマーの電気泳動移動度との間の差異を増強することによって、インベーダーアッセイの感受性を増加させる。従って、第２移動度改変ポリマーは、少なくとも２０００の分子量を有する。他の実施形態において、第２移動度改変ポリマーは、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、および少なくとも１００，０００の分子量を有する。１つの実施形態において、第２移動度改変ポリマーは、本発明の移動度改変ポリマーであり、一方、他の実施形態では、第２移動度改変ポリマーは、当該分野の移動度改変ポリマーであり、これは、１つの例示的な非限定的な例として、非荷電モノメチルポリエチレングルコールポリマーがある。さらに、第２移動度改変ポリマーは、異なる分子量の種の混合物を含み得るが、但し、これらの種は、シグナル産物（すなわち、フラップエンドヌクレアーゼ産生産物（５’末端、標識、および第１移動度改変ポリマーを含む））の検出を実質的に妨害しない（実施例５以下を参照のこと）。
【００４０】
第５の一般的な実施形態において、結合移動度改変プローブが、レポーター分子と接触され、このレポーター分子としては、インターカレーティング色素が挙げられるが、これに限定されず、この色素は、プローブと標的核酸との間に形成される二重鎖ＤＮＡ構造に非共有様式で結合する。このようなレポーター分子は、二重鎖ＤＮＡ構造に結合した場合、蛍光複合体を形成し得るか、または非共有結合レポーター分子は、例えば、放射性部分または他の検出可能部分、または同族（ｃｏｇｎａｔｅ）結合対の１つのメンバーを形成する化学基を含み得、これによって、標的核酸に結合した移動度改変プローブを改変する。
【００４１】
なお別の局面において、本発明は、標的核酸分子を分離する方法を提供し、この核酸分子は、異なる数のヌクレオチド残基を含み得るが、それにもかかわらず、実質的に同じ比の電荷  対  並進摩擦抵抗（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｆｒｉｃｔｉｏｎａｌ  ｄｒａｇ）を有する。この方法は、標的核酸分子の混合物と移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー（必要に応じて、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群より選択される構造を有する）とを接触させる工程；移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを、移動度改変標的核酸を形成する実質的に全ての標的核酸に接続し、それによって、同じ数のヌクレオチド残基を有するそれぞれの標的核酸分子に、独特の比の電荷  対  並進摩擦抵抗を提供する工程；および移動度改変標的分子を分離する工程、を包含する。一般的に、このように形成された移動度改変標的分子が、電気泳動によって（例えば、キャピラリー電気泳動によって、または非ふるい分け（ｎｏｎ−ｓｉｅｖｉｎｇ）媒体中でのキャピラリー電気泳動によって）、分離される。
【００４２】
このような標的分子の混合物は、１つの実施形態において、鎖停止反応または化学切断配列決定反応によって作製され、この場合、標的核酸は、一般的に、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。標的分子が鎖停止反応によって作製される場合、これらの標的分子は、プライマー伸長産物である。この局面において、プライマー伸長産物および配列特異的移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーは、適切な条件下で、テンプレート核酸とさらに接触される。テンプレート核酸は、少なくとも４つのヌクレオチド残基を含む３’領域および少なくとも４つのヌクレオチド残基を含む５’領域を有し、ここで、３’領域は、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端残基に相補的であり、そして、５’領域は、プライマー伸長産物のそれぞれの５’末端残基に対して相補的であり、その結果、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーおよびプライマー伸長産物がテンプレート核酸にハイブリダイズする場合、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端残基は、プライマー伸長産物の５’末端残基と接する。従って、この実施形態において、テンプレート核酸は、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーおよびプライマー伸長産物を、適切な条件下で整列させるために使用され、その結果、ハイブリダイズされ、整列されたヌクレオ塩基ポリマーは、必要に応じて酵素的連結によって、互いに共有結合され得る。これによって形成された産物は、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーおよびプライマー伸長産物を含み、但し、移動度改変プライマー伸長産物は、独特の比の電荷  対  並進摩擦抵抗を有する。一般的に、本発明のこの局面において、プライマー伸長産物は、さらに、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。検出可能な標識（移動度改変配列特異的プライマー、デオキシリボヌクレオチド基質またはジデオキシリボヌクレオチド基質のうちの１つ以上に組み込まれ得る）は、非限定的な例として、放射性標識または蛍光標識であり得る。１つの実施形態において、鎖停止配列決定反応は、４つのジデオキシリボヌクレオチド基質のそれぞれを含み、ここで、それぞれは、異なる蛍光部分を標識され、そして４つの異なる蛍光部分のそれぞれは、互いにスペクトル的に分離可能である。この実施形態の他の局面において、４つの別々の鎖停止配列決定反応が実行され、ここで、これら４つの反応のそれぞれが、単一のジデオキシリボヌクレオチド基質、および単一のスペクトル的に分離可能な蛍光部分を有する移動度改変配列特異的プライマーを含む。この例において、配列決定反応が停止され、そして組み合わされて、プライマー伸長産物の混合物を提供し、このプライマー伸長産物のそれぞれは、ジデオキシリボヌクレオチド残基で停止され、そしてそのジデオキシリボヌクレオチド残基に対応するスペクトル的に分離可能な蛍光部分で標識される。
【００４３】
この方法の別の局面において、使用されるテンプレート核酸は、少なくとも４ヌクレオチド残基を含む３’領域、少なくとも４ヌクレオチド残基を含む５’領域、および３’領域と５’領域との間に配置される中心領域を有し、ここで、テンプレート核酸の３’領域は、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端残基に相補的であり、そしてテンプレート核酸の５’領域は、それぞれのプライマー伸長産物の５’末端残基に相補的である。この場合に、配列特異的移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーおよびプライマー伸長産物の、テンプレート核酸分子へのハイブリダイゼーションは、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端残基が、テンプレート核酸の中心領域に対応するヌクレオ塩基配列によって、プライマー伸長産物の５’末端ヌクレオチド残基から分離される構造を提供する。この場合において、ギャップが、ハイブリダイズしたヌクレオ塩基ポリマー間に残り、このギャップは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート基質の存在下でＤＮＡポリメラーゼで充填され、これによって、伸長移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを形成する。このギャップを充填する際に、この伸長移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、プライマー伸長産物の５’末端ヌクレオチド残基に連結されて、独特の比の電荷  対  並進摩擦抵抗を有する移動度改変プライマー伸長産物を形成する。得られる産物はまた、検出可能な標識を含み得、これは、移動度改変配列特異的プライマー、デオキシリボヌクレオチド基質のうちの１つ以上に組み込まれ得る。検出可能な標識は、限定しないが、放射性標識または蛍光標識であり得る。
【００４４】
本発明はまた、本発明の方法を実行するのに有用なキットを含む。本発明のキットは、１つ以上の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを含む。キットはまた、第２ヌクレオ塩基ポリマー（代表的には、オリゴヌクレオチド）（これは、必要に応じて移動度を改変されている）を含み得、ここで、意図されるアッセイは、第２オリゴヌクレオチド；例えば、オリゴヌクレオチド連結アッセイおよびＰＣＲ分析のためのキットを必要とする。同様に、リガーゼ連鎖反応増幅のために設計されたキットは、さらに、少なくとも２つのさらなるヌクレオ塩基ポリマーを含み、これらは、ともに、診断リガーゼ反応産物に相補的である。このキットはまた、さらに、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ、ミスマッチ結合タンパク質、リガーゼ、およびエキソヌクレアーゼのような試薬を処理する工程を包含し得る。単一ヌクレオチド多型を検出するための配列決定アッセイまたはオリゴヌクレオチド伸長アッセイに適切なプライマー伸長キットは、さらに、ヌクレオオシドトリホスフェートおよび／または連鎖停止ヌクレオチドを含む。従って、本発明のキットの成分としては、１つ以上の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー、１つ以上の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー、ならびに／あるいは１つ以上のヌクレオシドトリホスフェートおよび／または連鎖停止ヌクレオチドを含み、ここで、これらの成分の１つ以上が、レポーター標識を含み得る。このキットはまた、ハイブリダイゼーションおよび酵素処理を実行するための反応緩衝液を含み得る。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は、本発明の１つ以上の移動度改変ホスホルアミダイト試薬を含むキットを含む。このようなキットにおける、１つ以上の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、さらに、１つ以上の保護基、レポーター分子、またはリガンドを含み得る。このようなキットはまた、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの合成に使用するための１つ以上の溶媒、試薬、または固体表面結合ヌクレオ塩基モノマーを含み得る。
【００４６】
本発明の移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーは、以下のように、現在利用可能な改変オリゴヌクレオチドに対して１つ以上の利点を提供する。例えば、本発明の移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーの合成は、ＤＮＡ合成のための従来の自動化機器において使用される試薬および方法と適合性である。さらに、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーは、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に従うヌクレオ塩基ポリマーのような非荷電ホスフェートトリエステル連結のみを含み、現在の使用における荷電ＰＥＯ改変剤と比較して、電気泳動移動度の実質的により大きな改変が達成され得る。以下に提供される実施例に示されるように、本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー間の電気泳動移動度において、大きな差異が存在する（これは、単一の移動度改変モノマー単位のみによって異なる）。結果として、本発明は、従来のＰＥＯ改変剤を使用して達成され得るよりも高い移動度改変を可能にする。有意なことには、１００個より多いヌクレオチドの電気泳動移動度の遅延は、標準的なＤＮＡおよびＲＮＡ化学を使用して容易に達成され得る。
【００４７】
さらに、非荷電ホスフェートトリエステル連結（例えば、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に従う移動度改変ヌクレオ塩基ポリマー）を伴う、荷電ホスフェートジエステル連結の使用は、利用可能な分離可能な移動度改変のレパートリーを大きく増大させる。従って、本発明は、現在利用可能なＰＥＯ改変剤を使用して分析され得るよりも、多くの数の標的核酸配列について同時分析する能力を可能にする。
【００４８】
（４．好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、ヌクレオ塩基ポリマー官能基化試薬、およびヌクレオ塩基ポリマー官能基化試薬の合成のための方法、ならびにこのような官能基化試薬の重合のための手順およびそれらのヌクレオ塩基ポリマーへの結合のための手順を提供する。
【００４９】
本発明はまた、新規な移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに関し、このヌクレオ塩基ポリマーは、非荷電連結を介して接続される１つ以上の移動度改変ポリマーサブユニットを介して、ヌクレオ塩基ポリマーに接続される少なくとも１つの移動度改変ポリマーを含む。移動度改変配列特異的核酸およびヌクレオ塩基ポリマーは、改善された比の荷電  対  並進摩擦抵抗を提供し、これは、ふるい分け電気泳動媒体および非ふるい分け電気泳動媒体の両方において、大部分の集団の核酸内における個々のヌクレオ塩基ポリマーのより効果的な電気泳動分離を可能にする。
【００５０】
本発明はまた、本明細書中に開示される移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを使用して、１つ以上の標的核酸内のヌクレオチド配列の検出のための方法を提供する。
【００５１】
（４．１  略語および決まり）
天然に存在するコードヌクレオ塩基をいうために、本明細書中および図をとおして使用される略語は、以下の通りである：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）。
【００５２】
他に特定しない限り、一連の一文字略語として表されるヌクレオ塩基ポリマー配列および／または標的核酸配列は、５’→３’の方向で提示される。
【００５３】
（４．２  定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される：
「レポーター標識（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｌａｂｅｌ）」、「レポーター標識（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｌａｂｅｌ）」、「標識」または「タグ」とは、発蛍光団、発色団、放射性同位体、化学発光、スピン標識、または酵素（これは、検出可能な事象を引き起こすか、または適切な検出器による標識化ヌクレオ塩基ポリマープローブの直接的検出を可能にする、あるいは、検出可能な抗リガンド、抗ハプテン、または他の第２のメンバーの同族結合対に対して特異的に高い親和性で結合し得るリガンドまたは他の第１メンバーの同族結合対（例えば、限定しないが、レポーター標識アビジンまたはレポーター標識抗体）をいう。
【００５４】
「スペクトル的に分離可能」とは、１組の蛍光色素を参照して、それぞれの色素の蛍光発光バンドが十分に独特（すなわち、十分に非重複）であり、これは、この色素が、単独でまたは他の分子もしくは物質に結合した場合のいずれかで、標準的な光検出システム（例えば、一連のバンドパスフィルターおよび光電子増倍管、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、分光器などを使用する光検出器）を使用してそれらの蛍光シグナルに基づいて、互いに識別可能であることを意味し、米国特許第４，２３０，５５８号および同第４，８１１，２１８号、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、１９８５、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ｐｐ２１〜７６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されるシステムによって例示される。一般的に、スペクトル的に分離可能なセットの色素を含む色素の全てが、単一光源によって励起可能である。
【００５５】
「ヌクレオ塩基」とは、核酸において通常見出される型の置換または非置換の窒素含有親ヘテロ芳香族環をいう。代表的には、必要ではないが、ヌクレオ塩基は、適切な相補性ヌクレオ塩基と、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋおよび／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合を形成し得る。ヌクレオ塩基は、天然に存在し得る（例えば、天然に存在するコードヌクレオ塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵ）か、またはこれらは改変され得るかまたは合成であり得る。通常の改変または合成ヌクレオ塩基または合成ヌクレオ塩基としては、３−メチルウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、６−ジメチルアミノプリン、６−メチルアミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−８−ブロモプリン、イノシン、５−メチルシトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシンが挙げられる。標的核酸を構成し得る改変ヌクレオ塩基または合成ヌクレオ塩基のさらなる非限定的な例は、Ｆａｓｍａｎ、ＣＲＣ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１９８５、ｐｐ．３８５−３９２；Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ’ｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（これらの全てが、このようなヌクレオ塩基の構造、特性および調製を記載する刊行物に対する参照を提供する）に見出され得る。
【００５６】
当業者によって認識されるように、上記改変ヌクレオ塩基または合成ヌクレオ塩基の多くは、天然に存在するコードヌクレオ塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＵとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成相互作用を形成し得る。しかし、本発明の特定の実施形態において、ヌクレオ塩基ポリマー合成において、天然に存在するコードヌクレオ塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵのいずれかならびに／または通常のそのアナログとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成し得ないが、非標準的な（すなわち、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対を互いに形成し得る、ヌクレオ塩基を含むことが望ましくあり得る。これらの特性を有するヌクレオ塩基は、本明細書中において、「非標準合成」ヌクレオ塩基と呼ばれる。このような非標準合成ヌクレオ塩基の例としては、限定しないが、イソ−グアニン（ｉｓｏ−Ｇ）、イソ−シトシン（ｉｓｏ−Ｃ）、キサンチン（Ｘ）、カッパ（Ｋ）、ヌクレオ塩基Ｈ、ヌクレオ塩基Ｊ、ヌクレオ塩基Ｍおよびヌクレオ塩基Ｎが挙げられる（米国特許第６，００１，９８３号を参照のこと）。これらの非標準的な合成ヌクレオ塩基は、以下の非標準的な塩基対を形成するために互いに塩基対を形成する：ｉｓｏ−Ｃ・ｉｓｏ−Ｇ，Ｋ・Ｘ，Ｈ・ＪおよびＭ・Ｎ。これらの非標準的な塩基対のそれぞれは、３つの水素結合を有する。さらなる非標準的な合成ヌクレオ塩基、ならびにそれらの合成のための方法およびそれらをヌクレオ塩基ポリマーに組み込むための方法は、米国特許第５，４３２，２７２号、同第５，９６５，３６４号および同第６，００１，９８３号に見出され、これらの開示は、本明細書中において参考として援用される。
【００５７】
「ヌクレオ塩基ポリマー」とは、一連のヌクレオ塩基をいい、このヌクレオ塩基は、連結ポリマーが、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対または非標準的な塩基対により、ヌクレオ塩基の相補的配列を有する標的核酸にハイブリダイズする連結により互いに接続されるか、またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成規則による三重鎖構造を形成するために二重鎖標的核酸にハイブリダイズし得る。相補的核酸にハイブリダイズし得る種々のヌクレオ塩基ポリマーは、当該分野において記載される。これらのヌクレオ塩基ポリマーの全てが、本発明の範囲内である。このようなヌクレオ塩基ポリマーの例としては、ネイティブＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡのアナログが挙げられる。通常のアナログとしては、限定しないが、それぞれの２’−デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドが、ホスホネート連結、ホスホルアミダイト連結、ホスホロチオエート連結、ホスホネートトリエステル連結によって接続されるＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。ヌクレオ塩基ポリマーとしてはまた、正に荷電した糖−グアニジル連結を有する分子が挙げられ、例えば、これは、米国特許第６，０１３，７８５号および米国特許第５，６９６，２５３号に記載される（Ｄａｇａｎｉ，１９９５、Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ４−５：１１５３；Ｄｅｍｐｅｙら、１９９５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：６１４０−６１４１もまた参照のこと）。糖が２’−デオキシリボースである糖−グアニジルアナログは、ＤＮＧと呼ばれ、一方、糖がリボースである糖−グアニジルアナログは、「ＲＮＧ」と呼ばれる。
【００５８】
アルキルアミン側鎖を有する正に荷電したポリアミド骨格を有するヌクレオ塩基ポリマーの例は、米国特許第５，７８６，４６１号；米国特許第５，７６６，８５５号；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ９８／０３５４２に記載される（Ｈａａｉｍａら、１９９６，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｅｄ．  ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３５：１９３９−１９４２；Ｌｅｓｎｉｋら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ．１６：１７７５−１７７９；Ｄ’Ｃｏｓｔａら、１９９９、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：１５１３−１５１６も参照のこと、Ｎｉｅｌｓｏｎ、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５も参照のこと）。
【００５９】
非荷電骨格を有するヌクレオ塩基ポリマーもまた、当該分野において記載されている。例えば、非荷電ポリアミド骨格を有するヌクレオ塩基ポリマーは、ＷＯ９２／２０７０２および米国特許第５，５３９，０８２号に記載される。非荷電モルホリノ−ホスホラミデート骨格を有するヌクレオ塩基ポリマーは、米国特許第５，６９８，６８５号、米国特許第５，４７０，９７４号、米国特許第５，３７８，８４１号および米国特許第５，１８５，１４４号に記載される（Ｗａｇｅｓら、１９９７、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１１１６−１１２１もまた参照のこと）。
【００６０】
ヌクレオ塩基ポリマーを含み得るさらなるヌクレオ塩基連結としては、限定しないが、以下が挙げられる：ペプチドに基づく核酸模倣連結（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号を参照のこと）、カルバメート連結（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ＆  Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、１９８７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２を参照のこと）、アミド連結（例えば、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ、１９９４、Ｓｙｎｌｅｔｔ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ、１９９４：１３７を参照のこと）、メチルヒドロキシルアミン連結（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照のこと）、３’−チオホルムアセタール連結（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照のこと）、スルファメート連結（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照のこと）、およびロックされたヌクレオシドアナログ（ＬＮＡ）を含む連結（単鎖核酸および二本鎖核酸と配列特異的二重鎖構造および三重鎖構造を形成し得るヌクレオ塩基ポリマーに組み込まれ得る二環式および三環式ヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログを含む）（例えば、ＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）。
【００６１】
ヌクレオ塩基ポリマーは、全体的に単一の型の連結から構成され得るかまたは異なる連結の組合せを含み得る。特定の実施形態において、ヌクレオ塩基ポリマーは、ネイティブＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその通常のアナログである。
【００６２】
「アルキル」とは、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、飽和または不飽和の分枝、直鎖または環式の一価炭化水素基をいう。代表的なアルキル基としては、限定しないが、メチル；エチル（例えば、エタニル、エテニル、エチニル）；プロピル（例えば、プロパン−１−イル、プロパン−２−イル、シクロプロパン−１−イル、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル、シクロプロプ−１−エン−１−イル；シクロプロプ−２−エン−１−イル、プロプ−１−イン−１−イル、プロプ−２−イン−１−イルなど）；ブチル（例えば、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル、２−メチル−プロパン−１−イル、２−メチルプロパン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イルなど）；などが挙げられる。特定のレベルの飽和が意図される場合、命名法「アルカニル」、「アルケニル」、および／または「アルキニル」が使用される。特定の実施形態において、アルキル基は、（Ｃ１〜Ｃ６）直鎖アルキル基である。さらに、本明細書中で使用される場合、用語「低級アルキル」とは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル基をいい、特定の実施形態において、低級アルキル基は、（Ｃ１〜Ｃ６）直鎖アルキルである。
【００６３】
「アリール」とは、親の芳香族環系の単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、１価芳香族炭化水素基をいう。代表的なアリール基としては、限定しないが、以下から誘導される基が挙げられる：アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなど。特定の実施形態において、アリール基は、（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールであり、特定の実施形態において、（Ｃ５〜Ｃ１０）である。さらなる実施形態において、アリールは、シクロペンタジエニル、フェニルおよびナフチルである。
【００６４】
「キャピラリー電気泳動」とは、キャピラリー管またはチャネルにおける電気泳動を意味し、ここで、チャネル断面の最も多きな内側寸法（円である必要はない）は、約２５〜５００ミクロンの間であり、分離媒体全体で効率的な熱放散が可能であり、結果として、媒体内で低い熱対流を有する。
【００６５】
「ふるいマトリクスまたはふるい媒体」とは、電場中において荷電種の移動を遅くするのに有効なネットワークを作製する、架橋または非架橋ポリマーを含む電気泳動媒体をいう。ふるいマトリクスの例は、架橋ポリアクリルアミドまたはアガロースに基づくふるいマトリクスである。ふるい媒体はまた、米国特許第５，５６７，２９２号に開示されるように、ポリラクタム（例えば、ポリビニルピロリドン、Ｎ，Ｎ−二置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミド）を含み得る。
【００６６】
「非ふるいマトリクスまたは非ふるい媒体」とは、分析物の移動度を遅くするのに有効であるポリマーのメッシュまたはネットワークを実質的に含まない、液体媒体をいう。
【００６７】
「独特の電気泳動移動度」とは、特定の電気泳動媒体において電場中で分析物が移動する速度をいう。独特の移動度とは、試験されるサンプル中に存在する検出可能な他の全ての分析物の電気泳動移動度と比較した、分析物の独特の電気泳動移動度をいう。
【００６８】
「多型または多型的配列」とは、集団のメンバー間の変動を示す、集団中に存在する配列をいう。例えば、多型は、単一ヌクレオチドの違い（単一ヌクレオチド多型：ＳＮＰ）に関連し得るかまたは違いは反復配列の数にある。
【００６９】
「エンドヌクレアーゼ」とは、核酸を内部的に切断する任意の酵素をいう。エンドヌクレアーゼは、単鎖核酸または二重鎖核酸のいずれかで作用し得る。
【００７０】
「短いタンデムヌクレオチド反復」とは、異なる単純なタンデムな反復のコレクションをいい、これは、多くの生物のゲノム全体に存在する。非限定的な例として、反復配列の１つのセットは、一般式（ＡｗＧｘＴｙＣｚ）ｎを有する配列として特徴付けられ、ここで、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣは、４つのヌクレオチドを表し、そしてｗ、ｘ、ｙ、およびｚは、０〜７の数字を表し、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３〜７の範囲であり、ｎは、反復数である（Ｅｄｗａｒｄｓ、Ａ．ら、ＤＮＡ  ｔｙｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９１）４９（４）：７４６−５６；Ｃａｓｋｅｙ、Ｃ．Ｔ．ら、米国特許第５，３６４，７５９号）。
【００７１】
「リガンド」とは、第２メンバーの同族結合対によって安定な複合体中に特異的に認識されそして結合される１つのメンバーの同族結合対に対応する化学部分または構造をいう。このような同族結合対の例としては、限定しないが、ビオチン−アビジン、およびビオチン−ストレプトアビジンが挙げられる。他の例としては、アミノサリチル酸由来のフェニルボロン酸試薬およびフェニルボロン酸複合体形成試薬が挙げられる（例えば、米国特許第５，５９４，１５１号を参照のこと）。従って、本明細書中で使用される場合、用語リガンドは、用語ハプテンを包含し、これは、化学部分または構造（例えば、ジゴキシゲニン）（同族結合対の１つのメンバーとして）をいい、この同族結合対の第２メンバーは、免疫系の要素（限定しないが、インタクトな抗体、単鎖抗体、または抗体フラグメントが挙げられる）である。
【００７２】
「並進摩擦抵抗」とは、定義されたふるい媒体または非ふるい媒体を通って移動する場合のポリマーの摩擦抵抗の尺度をいう。
【００７３】
「独特の比の電荷  対  並進摩擦抵抗」とは、分析されるサンプル中に存在する他の検出可能な核酸またはヌクレオ塩基ポリマー（改変および非改変の両方）と比較した、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーの独特の電気泳動移動度をいう。
【００７４】
（４．３  移動度改変ホスホルアミダイト試薬）
１つの実施形態において、本発明は、式（Ｉ）：
【００７５】
【化１３】
0004452445.tif 000007
に従う構造を有するヌクレオ塩基ポリマー官能基化試薬である移動度改変ホスホルアミダイト試薬を提供し、ここで：
Ｒ５は、水素、保護基、レポーター分子、およびリガンドからなる群より選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より選択され；
各ａは、独立して、１〜６の整数であり；そして
ｂは、０〜４０の整数であり；
Ｒ６およびＲ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、およびＣ２０〜Ｃ２７アリールアルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され；そして
Ｒ２は、少なくとも２個の炭素原子を含むアルキル、アリール、（Ｒ８）３Ｓｉ−からなる群より選択され、ここで、各Ｒ８は、直鎖および分枝鎖アルキルおよびアリール、塩基安定保護基、およびＲ５−Ｘ−［（ＣＨ２）ａ−Ｏ］ｂ−（ＣＨ２）ａ−からなる群より独立して選択される。
【００７６】
特定の実施形態において、Ｒ６およびＲ７は、両方ともイソプロピルである。移動度改変ホスホルアミダイト試薬のダイマーおよび／またはポリマーが望ましく、Ｒ５は、特に、Ｈ、または他の反応性部分である。さらに、このようなダイマーおよび／またはポリマーは、本発明の試薬を、単独でまたは当該分野の他の移動度改変ホスホルアミダイト試薬とともにのいずれかで含み得る。多くの実施形態において、Ｒ５は、水素ではなく、多くの実施形態において、Ｒ５は、保護基である。Ｒ５が保護基である場合、例えば、移動度改変ホスホルアミダイト試薬のダイマーまたはポリマーは、標準的なホスホルアミダイト合成化学を使用して、移動度改変ホスホルアミダイト試薬モノマーの連続的付加によって形成される。本明細書中で使用される場合、句、保護基は、ホスホルアミダイト化学において周知であり、幅広く使用され、以下に開示される従来の汎用性、選択的切断可能保護基だけではなく、ホスホルアミダイト化学の手順および状態によって容易に除去されないか、選択的に除去されない代替の保護基もまた包含する。このような代替の保護基（特に、塩基性条件下で除去に耐える基）は、本発明の特定の実施形態において使用される。例えば、特定の実施形態において、代替の保護基、Ｒ５が、アルキルまたは他の容易に切断可能でないかまたは選択的に切断可能でない部分（非制限的な例として、式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｄ−Ｏ−［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−］ｂ−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−の化合物が挙げられる）である。ここで、ａおよびｂは、上記式（Ｉ）に規定される通りであり、そしてｄは、０〜５の範囲の整数である。
【００７７】
本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、一般に、スキームＩに従って、当業者に周知の方法および試薬を使用して、合成され、このスキームは、例えば、本発明の例示的な移動度改変ホスホルアミダイト試薬（７）を提供する。スキーム（Ｉ）において、ＤＭＴとは、ジメトキシトリチルを表し、ｉＰｒとは、イソプロピルを表し、そしてＲ２およびｂは、構造式（Ｉ）に対して先に定義された通りである。
【００７８】
【化１４】
0004452445.tif 000008
スキーム（Ｉ）を参照すると、標準的なホスホルアミダイトＤＮＡ化学と共に使用され得る、ＤＭＴで保護されたポリエチレンオキシドホスホルアミダイト試薬７が、調製される。
【００７９】
最初に、三塩化リン１が、溶媒（例えば、トルエン）中のジイソプロピルアミン２と反応して、ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンエステル３を形成する。引き続いて、テトライソプロピルアミノホスフィン３がアルコール４のヒドロキシル基と反応し、これによって、Ｒ２−ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファイトエステル５を生成する。遊離ヒドロキシルを有する適切に保護された移動度改変ポリマー（例えば、ＤＭＴ保護されたポリエチレンオキシド６）を、活性化剤（例えば、テトラゾール）と共に添加することによって、ホスホルアミダイト、試薬７、Ｒ２−ジイソプロピルアミノホスファイトエステルを生じ、ここで、このポリマーは、エステル結合を介してリン原子に付着する。
【００８０】
ホスホルアミダイト試薬７は、移動度改変ポリマーを新生ヌクレオ塩基ポリマーに結合させるための、ＤＮＡ合成における使用のために適切である。実施例２に記載され、そして以下のスキーム（ＩＩ）に示される通りである。
【００８１】
本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、標準的なホスホルアミダイト合成スキームに適合性であり、従って、ヌクレオ塩基ポリマー合成のための市販の器具とともに使用され得る。さらに、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端または３’末端のいずれかに、容易に結合する。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、以下のスキームＩＩに図示されるように、固体支持体（８）に付着したヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に付加される。この例において、本発明の代表的な移動度改変ホスホルアミダイト試薬（７）は、表面結合ヌクレオ塩基ポリマーの遊離５’ヒドロキシ部分と縮合して、中間体構造（９）を与え、これが引き続いて、脱保護されて塩基不安定な保護基および酸不安定な保護基を除去され、生成物を固体支持体から切断し、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマー（１２）を与える。この実施形態において、エステル化部分Ｒ２は、上記反応スキームの各工程において安定であり、従って、リン酸トリエステル結合は荷電しない。さらに、表面結合中間体（１０）は、マイルドな酸（例えば、３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ））で処理されて、ＤＭＴ保護基を除去され得、遊離ヒドロキシル部分を提供し、次いで（７）と縮合して、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に２分子の（７）が結合した、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを提供することが、当業者に明らかである。従って、ｎサイクルの試薬の添加を介するこの（７）との縮合反応の繰返しは、ｎ分子の本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬がヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に付着した、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを提供する。
【００８３】
別の実施形態において、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、改変されるべきヌクレオ塩基ポリマーの５’末端よりむしろ、または５’末端に加えて、ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に付加される。この実施形態の１つの例示的な例において、以下のスキームＶに図示される。この合成スキームにおいて、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬（７）は、ヌクレオ塩基の残基チミジンの５’ヒドロキシル部分に縮合し、これが、このヌクレオ塩基の残基の３’ヒドロキシル部分を介して、固体支持体に付着される。次いで、得られる縮合生成物（２３）は、リン酸トリエステル（２４）に酸化され、マイルドな酸で脱保護されて、（２５）の遊離ヒドロキシル部分を提供する。合成されたリン酸トリエステルは、キラルな化合物であり、そして本明細書中に開示される方法に従って合成される場合、ＲとＳとの両方のエナンチオマーが形成される。合成されるリン酸トリエステルのラセミ混合物が、エナンチオマー的に純粋なＲ形態およびＳ形態に分離されることなく使用される。５’保護されたヌクレオチドホスホルアミダイト試薬（２６）との（２５）の縮合は、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬が２つのヌクレオ塩基モノマー間に位置する、ジヌクレオ塩基中間体を与える（２７）。５’保護されたヌクレオチドホスホルアミダイトとの縮合の繰返しのサイクル、脱保護および引き続く固体支持体からの切断は、そのヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に移動度改変ポリマーを有するヌクレオ塩基ポリマー（２９）を提供する。上記のように、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬の１つ以上が、単独でか、または当該分野において公知の１種以上の移動度改変ホスホルアミダイト試薬と組み合わせてかのいずれかで、ヌクレオ塩基ポリマーに付加され得る。従って、移動度改変ホスホルアミダイト試薬間、または移動度改変ホスホルアミダイト試薬とヌクレオ塩基ポリマーとの間に形成される、１つ以上の連結基は、荷電したリン酸ジエステル結合であり得る。さらに、使用される移動度改変試薬の１つ以上は、分枝化合物（例えば、構造（２１）におけるように）であり得る。但し、５’保護されたヌクレオチドホスホルアミダイトが縮合されるのは、５’近位部分ではない。
【００８４】
別の実施形態において、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、固体支持体（例えば、細孔が制御された（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ）ガラスまたはポリスチレン）に結合した、容易に切断される化学結合に付着される。固体支持体に結合される、このような容易に切断される化学結合の例は、化合物３３である：
【００８５】
【化１５】
0004452445.tif 000009
３３の合成を、以下に記載する：
【００８６】
【化１６】
0004452445.tif 000010
この様式で、３’末端に移動度改変試薬を保有するヌクレオ塩基ポリマーが、スキームＶおよび化合物（２９）に図示されるように、この分子の３’末端にさらなるヌクレオ塩基の残基を有さずに、組み立てられる。しかし、スキームＶに図示される一般的な方法の利点は、ヌクレオ塩基が結合した固体支持体が市販されているのみでなく、これらはまた予め組み立てられたカートリッジの形態で提供され、これらのカートリッジは、ヌクレオチドが結合した固体支持体で満たされ、そして自動化ヌクレオ塩基ポリマー合成機と適合性である。
【００８７】
本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端および／または３’末端のいずれかまたは両方に結合する場合、ならびに本発明の別の移動度改変ホスホルアミダイト試薬と結合する場合に、荷電していないリン酸トリエステル結合を与える。従って、エステル化部分（すなわち、式ＩのＲ２、ならびに特定の実施形態において、以下の式ＩＩおよびＩＩＩのＲ１０および／またはＲ４）は、従来のホスホルアミダイト化学の全ての工程に対して安定である。すなわち、エステル化部分は、とりわけ、例えばスキームＩＩＩおよびＶに図示される脱保護工程の間に、除去されるべきではない。より具体的には、エステル化部分は、保護されたアミンの脱保護、および固体支持体からの移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーの切断のために必要とされる、手順および条件に対して安定であるべきであり、その結果、移動度改変モノマー単位間、および移動度改変モノマー単位とヌクレオ塩基ポリマーの３’末端または５’末端との間の結合は、荷電していないリン酸エステルである。
【００８８】
従って、式ＩのＲ２、ならびに以下の式ＩＩおよびＩＩＩのＲ１０および／またはＲ４がアルキルである場合、Ｒ２、ならびにＲ１０および／またはＲ４は、少なくとも２個の炭素原子を含むアルキルからなる群より選択される（例えば、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖アルキル）。
【００８９】
本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬はまた、当該分野において公知の他の移動度改変ホスホルアミダイト試薬（例えば、エステル化シアノエチル部分を含む、上記の代表的なＰＥＯホスホルアミダイト試薬が挙げられる）と組み合わせて使用され得る。以下のスキームＩＩＩに図示されるように、表面結合したヌクレオ塩基ポリマー中間体（１０）（これは、１分子の本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬を含む）は、マイルドな酸（例えば、３％ＤＣＡ）で処理されてＤＭＴ保護基を除去され得、遊離ヒドロキシル部分を保有する表面結合化合物（１３）を提供する。ＰＥＯホスホルアミダイト試薬（１４）と表面結合化合物（１３）との縮合は、ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に結合した２つの移動度改変試薬を有するヌクレオ塩基ポリマーを提供する。このスキームにおいて、脱保護および固体表面からの生成物の切断はまた、試薬（１４）のエステル化シアノエチル基の除去を生じる。従って、この実施形態において、付加される第二の移動度改変試薬（１４）と移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーとの間に形成される結合は、荷電したリン酸ジエステル結合である。
【００９０】
さらなる実施形態において、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、２つのエステル化された移動度改変基が各リン原子に結合した、樹状試薬を包含する。このような化合物の例（２１）およびその合成のための一般的なスキームは、以下のスキームＩＶに図示されている。当業者に明らかであるように、試薬（２１）との縮合の繰返しのサイクルは、以下のスキームＩＶに図示される合成方法に従って、表面結合したヌクレオ塩基ポリマーに付着した移動度改変ホスホルアミダイト試薬の数の幾何学的増加を提供する。一般に、以下のスキームＩＩ、ＩＩＩまたはＶに従って、ヌクレオ塩基ポリマーは、１つ以上の移動度改変ホスホルアミダイト試薬（７）、（１４）および（２１）で改変されて、１つ以上の分枝鎖および／または非分枝鎖の、荷電および／または非荷電の移動度改変部分を有する、一連の移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーを提供し得ることもまた、当業者に明らかである。
【００９１】
（４．４  移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーの組成物）
本発明の１つの局面において、移動度改変ポリマー鎖は、連結基によって、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに付着される。この実施形態に適合可能な種々のポリマーとしては、とりわけ、ポリオキシド、ポリアミド、ポリイミン、および多糖類が挙げられる。この組成物はまた、モノマーユニット間に１つ以上の非荷電リンカーを有する、コポリマーまたはブロックポリマーの形態のポリマー鎖（例えば、ポリエチレンオキシドおよびポリアミン（例えば、Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，Ｓ．Ｖ．（１９９８）Ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，９：８０５−１２を参照のこと））を取り入れる。
【００９２】
１つの実施形態において、移動度改変ポリマーは、ポリオキシドまたはポリエーテルである。この文脈において、用語ポリオキシドは、主鎖に酸素原子を有するポリマーを表すために使用され、特に、［Ｏ−（ＣＨ２）ｎ］の型のモノマー単位を有するものを、それらの誘導体とともに表し、ここで、ｎは、１〜１５の範囲から選択される整数であり、特定の実施形態において、ｎは、２〜６の範囲から選択され、そして他の実施形態において、ｎ＝２である。組成物に適用可能な直鎖ポリオキシドとしては、例えば、ポリ（メチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（トリメチレンオキシド）およびポリ（テトラメチレンオキシド）が挙げられる。分枝鎖ポリオキシドは、いくつかの場合において、移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーに、直鎖ポリマー鎖によって提供されるものとは異なる並進摩擦抵抗を与えることによって、移動度改変のためのさらなる基礎を提供する。水性溶媒にかなり可溶性の分枝鎖ポリマー（例えば、ポリ（プロピレン）オキシド）は、特定の実施形態において使用される。他の適用可能な分枝鎖ポリマーとしては、ポリ（アセトアルデヒド）およびポリ（ブト−１−エンオキシド）が挙げられる。
【００９３】
別の実施形態において、移動度改変ポリマーは、種々の水性溶媒および有機溶媒への高度な溶解度に起因して、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の単分散直鎖ポリオキシドである。さらに、ポリ（エチレンオキシド）の化学ならびに化学的および生物学的化合物を修飾するための使用方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｐ．Ｄ．ら、米国特許第５，７７７，０９６号；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．ら（１９８１）Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂａｓｅ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ：ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：９５−１１９；Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ．（１９９２）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｎｋｅｒ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６７９−８４を参照のこと）。従って、当業者は、移動度改変ポリマーにおけるポリエチレン単位の数を容易に変化させて、移動度改変された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーへの並進摩擦抵抗に対する電荷の特色ある比を与え得る。
【００９４】
さらに、この実施形態の移動度改変ポリマーは、ヒドロキシル基、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）基、アミノ基またはアミド基のような官能基をさらに含み得る。これらの官能基は、種々のレポーター分子、リガンド、または他のポリマー鎖の付着を可能にする。移動度改変ポリマーが配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに結合される場合、または配列特異的な移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーとの他の官能基の反応の間に、保護基が、この官能基上に存在し得る。特定の官能基を保護するために適切な基は、除去の方法を含めて、当該分野において周知であり、従って、当該分野は、適切な保護試薬を選択するための十分な指針を提供する（例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照のこと）。例えば、ヒドロキシル基は、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）のような酸不安定な基で、またはフルオレニルメチルクロロホルメート（Ｆｍｏｃ）のような塩基不安定な基で、保護可能である。
【００９５】
本発明において有用な保護基は、周知でありホスホルアミダイト化学において広範に使用されている、上記のような、従来の、用途の広い、選択的に切断可能な保護基を包含するのみでなく、ホスホルアミダイト化学の手順および条件によって容易にも選択的にも除去されない代替の保護基もまた、包含する。このような代替の保護基（特に、塩基性条件下での除去に抵抗性の保護基）は、本発明の特定の実施形態において使用される。例えば、特定の実施形態において、保護基の代替として、Ｒ５は、アルキルまたは他の容易にも選択的にも切断され得ない部分（非限定的な例として、式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｃ−Ｏ−［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−］ｂ−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−の化合物が挙げられ、ここで、ａおよびｂは、上記式（Ｉ）において定義された通りであり、そしてｃは、０〜５の範囲の整数である）である。
【００９６】
本発明の別の局面は、移動度改変ポリマーを配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに付着させる、連結基を含む。一般的な実施形態において、移動度改変ポリマー鎖をヌクレオ塩基ポリマーに付着させる基は、リン酸トリエステル結合、ホスホネート結合、ホスホアミデート結合、ホスホチオエステル結合、またはホスホジチオエート結合を含む。ホスホネート結合およびリン酸トリエステル結合は、他の化学構築物がリン原子に結合することを可能にして、移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマー間の並進摩擦抵抗に対する電荷の比のさらなる差異をもたらす。従って、１つの実施形態は、リン酸メチルのようなアルキルホスホネート結合を含む。
【００９７】
さらなる実施形態において、結合は、遊離エステルが種々の化学基（例えば、アルキル、官能基化されたアルキル、またはポリマー）を結合し、これによって、リンカーを非荷電にしている、リン酸トリエステルである。この化学基がアルキルである場合、この化合物は、直鎖または分枝鎖のアルキルであり得、一般に、低級アルキル基である。直鎖アルキルとしては、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基が挙げられるが、これらに限定されず、一方で分枝鎖アルキルとしては、イソプロピル基またはｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、遊離エステルに結合する化学基は、一般に、従来のホスホルアミダイト化学の全ての工程（脱保護工程、ならびに特に、保護されたアミンの脱保護のために必要とされる手順および条件）に対して安定である基に限定され、その結果、得られる結合は、非電荷のリン酸トリエステルである。従って、このような基がアルキルである場合、この基は一般に、メチル以外のアルキル（例えば、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖アルキル）である。なぜなら、モノメチルリン酸トリエステルは、高次アルキルリン酸トリエステルより安定性が低い傾向があるからである。アルキル基はまた、結合された官能基（例えば、レポーター、リガンドまたはビオチン分子）を有し得る。レポーター分子としては、蛍光分子、化学発光分子、または生物発光分子が挙げられるが、これらに限定されず、一方でリガンドとしては、コレステリル、ジゴキシゲニン、２，４ジニトロフェノール、およびビオチンのような分子が挙げられるが、これらに限定されない。この化学基がポリマーである場合、上記と同じ型のポリマー（ポリオキシド、ポリアミド、ポリイミン、多糖類、およびポリウレタンが挙げられるが、これらに限定されない）が、適切な置換基として機能する。
【００９８】
本発明の１つの実施形態における配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、天然物または合成物である。天然の核酸およびオリゴヌクレオチドは、所望のフラグメントをクローニングベクターにクローニングし、そして所望の核酸フラグメントを制限酵素消化によって単離することによって、得られる。あるいは、これらの分子は、オリゴヌクレオチドテンプレートおよび酵素合成（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００））を使用して、作製される。
【００９９】
別の実施形態において、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、合成されたヌクレオ塩基ポリマーである。合成された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの複合体を含む。デオキシリボ核酸またはリボ核酸のヌクレオ塩基のさらなる改変は、可能である。改変された塩基としては、イノシン、デオキシナフトシン（ｄｅｏｘｙｎａｐｔｈｏｓｉｎｅ）、エテノアデノシンおよびシチジン、ならびにブロモデオキシウリジンが挙げられる。ヌクレオ塩基ポリマー合成において容易に使用される、他の改変された塩基は、７−デアザプリン、Ｎ６メチルアデノシン、Ｏ６メチルグアノシン、および２−アミノプリンである。
【０１００】
別の実施形態において、配列特異的な核酸およびヌクレオ塩基ポリマーは、アナログ（例えば、リン酸ヌクレオ塩基ポリマー）、１つ以上のロックされたヌクレオシドアナログを含むヌクレオ塩基ポリマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートヌクレオ塩基ポリマー、リン酸トリエステルヌクレオ塩基ポリマー、または鎖終結ヌクレオシドを有するヌクレオ塩基ポリマーである。
【０１０１】
リン酸ヌクレオ塩基ポリマーは、ヌクレオチド間のホスホネート結合を含む骨格を有する。ヌクレオ塩基ポリマー合成の分野において公知のホスホネートとしては、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート）、２−アミノエチルホスホネート、およびベンジルホスホネート（Ｓａｍｓｔａｇ，Ｗ．（１９９６）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｅｎｚｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．６：１５３−５６；Ｆａｔｈｉ，Ｒ．，（１９９４）ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ，ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ：ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４１６−２４；Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．（１９９０）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−Ｈ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９：６９１−６；Ｚｈｏｕ，Ｙ．（１９９６）Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｅ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏ−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｏｎｅ−２’ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２６５２−２６５９）が挙げられる。ホスホネート結合を有するヌクレオ塩基ポリマーの利点は、安定な三重ヘリックス構造を容易に形成するそれらの特性、およびヌクレアーゼ作用に対するそれらのより高い耐性である。
【０１０２】
ロックされたヌクレオシドアナログ（ＬＮＡ）としては、一本鎖および二本鎖の核酸と配列特異的な二重鎖構造および三重鎖構造を形成し得るヌクレオ塩基ポリマーに組み込まれ得る、二環式および三環式のヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログが挙げられる。ＬＮＡを含む配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーを含む、二重鎖構造および三重鎖構造は、アナログを含まないヌクレオ塩基ポリマー分子で形成された対応する構造より熱安定性である（例えば、ＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）。
【０１０３】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、アミノ酸Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンの繰返し単位を含み、これにアデニン、シトシン、グアニン、チミンのような塩基がメチレンカルボニル基を介して結合した、合成ポリアミドである。プソイドイソシトシン、５メチルシトシン、プソイドウラシル、ヒポキサンチンを含む、他の塩基が、ＰＮＡへの組み込みに適切である。ヌクレアーゼに対するＰＮＡヌクレオ塩基ポリマーの耐性、およびＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの高い安定性は、ヌクレアーゼ処理を必要とする方法においてを除いて、これらの分子を標的ポリヌクレオチドの同定のための所望のプローブにする（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら（１９９２）Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｏｌｉｇｏｎｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｃｈｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−１８７６；Ｈａｎｖｅｙ，Ｊ．Ｃ．（１９９２）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１４８１−５：Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．ら（１９９３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ＰＮＡ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１９７−２００）。
【０１０４】
ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合を有する、オリゴヌクレオチドおよびヌクレオ塩基ポリマーのアナログは、リンに結合した非架橋リガンドとして、酸素の代わりに硫黄原子を有する（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９８５），Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４：３１７−４０２）。ホスホロチオエートジエステルは、リン原子においてキラルであり（ＲｐおよびＳｐ）、そしてそれらのヌクレアーゼに対する耐性に起因して、ヌクレオ塩基ポリマープローブおよびアンチセンス分子としての有用性を有する（Ｚｏｎ，Ｇ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，８７−１０８頁）。ホスホロジチオエートでは、両方の非架橋リガンドが、硫黄原子のようにリンに結合している（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら（１９９２）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ．２１１：３−２０）。
【０１０５】
本発明の別の実施形態において、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーアナログは、異なる組合せのヌクレオチド間結合を含む。従って、ヌクレオ塩基ポリマーは、メチルホスホネート、リン酸ジエステル、およびＮ−（２−アミノエチル）−グリシンのヌクレオチド間結合を含み得る（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９９）、Ａ  ｐｓｏｒａｌｅｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：５７２−５７７：Ｇｉｌｄｅａ，Ｂ．Ｄ．ら、米国特許第６，６０６３，５６９号）。他の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーアナログは、ホスホロチオエート−ホスフェートジエステルヌクレオチド間結合の組合せを含み得る（例えば、Ｇｈｏｓｈ  Ｍ．Ｋ．（１９９３），Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｅｓｔｅｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ：ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ，８（１）：１５−３２を参照のこと）。異なるヌクレオチド間結合の組合せは、ヌクレオ塩基ポリマーに、異なるハイブリダイゼーション特徴およびヌクレアーゼ耐性を与える。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、移動度改変された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、少なくとも１つの、負に荷電していないヌクレオチド間結合を含む。１つの非限定的な例において、移動度改変された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの少なくとも１つのヌクレオチド間結合は、非荷電のものアルキルリン酸トリエステル結合であり、一方で別の非限定的な例において、ヌクレオチド間結合は、アルキルアミン側鎖を含む正に荷電したアミド結合である。この実施形態において、負に荷電していないヌクレオチド間結合は、本発明の移動度改変された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの、並進摩擦抵抗に対する電荷の比を、さらに変化させる。別の非限定的な例において、移動度改変された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの少なくとも１つのヌクレオチド間結合は、ホスホロアミデート結合であり、これは、本発明の移動度改変された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの、並進摩擦抵抗に対する電荷の比を変化させる、別の負に荷電していないヌクレオチド間結合である。ホスホロアミデートヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、米国特許第５，４７６，９２５号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【０１０７】
別の実施形態において、移動度改変された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、種々のレポーター、リガンドおよびポリマー分子に結合体化される。移動度改変された配列特異的核酸またはヌクレオ塩基ポリマーの全ての構成要素は、容易に結合体化でき、内部または末端のヌクレオチド残基において、ヌクレオ塩基ポリマーおよび移動度改変されたポリマーにポリマーを結合させる、リン酸トリエステル基を含む。当業者は、適切な改変を作成して所望の結合体を形成することに十分に精通している（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、第８章〜第９章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．（１９８６），Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｔｔａｃｈｉｎｇ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ５’ｅｎｄｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６２２７−４５；Ｎｅｌｓｏｎ，（１９９２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０（２３）：６２５３−６２５９を参照のこと）。この結合体が、移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーのポリマーに対するものである場合、このポリマーは、１つ以上のレポーターおよびリガンド分子の結合を可能にする、ヒドロキシル基、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）基、アミド基またはアミノ基のような適切な官能基を有する。この結合体が、リン酸トリエステル結合基に対するものである場合、遊離エステルが、連結部位を提供する。
【０１０８】
種々のレポーターおよびリガンド部分の結合体化は、配列特異的な、移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーの検出、改変または固定を可能にする。これらはまた、配列特異的な移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーの、さらなる移動度改変を可能にする。レポーター分子としては、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、シアニン色素、およびアクリジン色素）が挙げられるが、これらに限定されない。リガンドとしては、２，４ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン、およびコレステリン、ならびに配列特異的な移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーに付着され得る酵素または酵素基質が挙げられるが、これらに限定されない。結合体化されたリガンド（ビオチンが挙げられるが、これに限定されない）は、アビジンまたはストレプトアビジンに結合することによって、移動度改変されたヌクレオ塩基ポリマーの単離、検出、または固定を可能にする。
【０１０９】
上記の実施形態を考慮して、配列特異的な、移動度が改変された核酸またはヌクレオ塩基ポリマーの特定の実施形態は、構造式（ＩＩ）または構造式（ＩＩＩ）に従う構造：
【０１１０】
【化１７】
0004452445.tif 000011
またはこれらの塩を有し、ここで、Ｒ３は：
【０１１１】
【化１８】
0004452445.tif 000012
である；
Ｒ２，Ｒ５，Ｘ，ａおよびｂは、構造式（Ｉ）のとおりである；
各々のＲ１０は水素およびＲ２からなる群から独立して、選択される；
各々のＲ４は水素およびＲ２からなる群から独立して、選択される；
各々のｂは、独立して、０〜４０の整数である；
各々のｄは、独立して、１〜２００の整数である；そして
ＯＬＩＧＯは、少なくとも１つのＲ１０または少なくとも１つのＲ４が水素以外である場合、少なくとも５つのヌクレオ塩基を代表的に含む配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーである。
【０１１２】
構造式（ＩＩ）および構造式（ＩＩＩ）の種々の、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマーの間で、これら化合物の中の各々のＸはＯであり、各々のａは同一（一般的には２）であり、各々のｂは１〜１５の範囲内にあり、そして特定の実施形態おいてｂは１〜６の範囲内にあり、そしてＯＬＩＧＯは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ、オリゴマーであり、各々のｄは、１〜２００の範囲内にあリ、特定の実施形態において、１〜１００の範囲内にあり、そしてさらなる実施形態において、１〜５０の範囲内にある。
【０１１３】
構造式（ＩＩＩ）の化合物において、各々のＲ１０および／またはＲ４は、互いに独立して、水素原子であり得る。Ｒ１０および／またはＲ４が水素である場合、得られたリン酸エステル基は、代表的に０〜１の範囲内のｐＫａを有する。従って、このアッセイ条件のｐＨがｐＫより高くなる場合、通常の生物学的アッセイのケースと同様に、この水素原子は溶媒と交換され、そして少なくともリン酸エステル基の正味の分画は、負に荷電される。リン酸エステル基のイオン化可能性に起因して、当業者は、本発明を規定する目的のために、得られたリン酸エステル基の非イオン化形態およびイオン化（すなわち、負に荷電された）形態の両方をその範囲内に含む水素であるようにＲ１０および／またはＲ４を選択することを理解する。
【０１１４】
同様に、図示されるか、または記載された化合物内の他の基は、イオン化可能であり得る。さらに、多くの化合物はキラル中心を含み得るか、または異なる互変異性形態、もしくは幾何異性形態内で存在し得る。任意の構造図が単一のイオン化可能形態、互変異性形態、鏡像異性形態または幾何異性形態のみを示し得るが、これは、構造図を限定することを意図せず、そして化合物の任意の図示されないイオン可能形態、互変異性形態、鏡像異性形態または幾何異性形態が本発明の範囲内にあることを意図していると理解される。
【０１１５】
構造式（ＩＩ）および構造式（ＩＩＩ）の、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマーにおいて、この分子の移動度を改変するセグメントは、分枝状または直鎖状であり得る。直鎖状の場合、各々のＲ１０およびＲ４は水素（可能な場合）、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキルまたはアリールのいずれかである。分枝状の場合、少なくとも１つのＲ１０またはＲ４は、Ｒ５‐Ｘ［（ＣＨ２）ａ‐Ｏ］ｂ‐（ＣＨ２）ａ‐である。これらの実施形態において、非電荷のリン酸エステルの連結が所望される場合、遊離エステルに付着される化学基は、脱保護工程および特に保護されるアミンの脱保護に必要な手順および基礎条件を含む、従来のホスホルアミダイト化学の全ての工程に対して安定であるこれらの基に一般的に限定される。従って、メチルリン酸トリエステルは、より高次のアルキルリン酸トリエステルより安定性が低い傾向があるため、このような基がアルキルの場合、この基は、メチル以外のアルキル、例えば、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖状アルキルである。
【０１１６】
同一の、または異なる、移動度を改変するポリマーの組み合わせは、特有の予測可能な移動度の変化を伴う、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーを提供するため、使用され得る。この配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、上記のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらのアナログを含む。このＯＬＩＧＯは、標識されても、標識されなくてもよい。当業者は、以下の種々の方法による１つ以上の標的核酸内の選択された核酸配列を検出するために有用なヌクレオ塩基ポリマー配列を考え出すことをよく知っている。
【０１１７】
（４．５  合成方法）
本発明のヌクレオ塩基ポリマー官能化試薬を合成する方法、およびこれらの官能化試薬を含む、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの種々の組成物を合成する方法は、配列特異的なヌクレオ塩基ポリマー合成および改変に使用される公知の反応スキームのバリエーションに従う。この実施形態の、移動が改変するポリマーに関して、種々のポリマーを合成する方法が、周知である。移動度が改変する因子として適切なポリマーとしては、とりわけ、ポリオシド、ポリアミド、ポリイミン、そして多糖類が挙げられる（例えば、Ｍｏｌｙｎｅｕｘ，Ｐ．，Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４；Ｇｒａｖｅｒｔ，Ｄ．Ｊ．，（１９７７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ：ｎｅｗ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１（１）：１０７−１３を参照のこと）。機能的な部分を結合体化するためのスペーサーアームとして使用される親油性のＣ１６アルコールのような長鎖アルコールはまた、移動度改変因子として適切である。ポリオキシド上のヒドロキシルのような官能基は、４’，４’−ジメトキシトリチルクロリドのような、適切な保護剤によって保護される。特定の官能基を保護するのに適切な基、ならびに除去する方法は周知であり、そして、当業者には明らかである。保護剤を選択するためのガイダンスは、例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）の中に、見い出され得る。
【０１１８】
移動度を改変するポリマー鎖に付着したヌクレオ塩基ポリマーは、規定されたヌクレオチド配列を有する天然の核酸または合成の核酸である。１つの実施形態において、この配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、天然のＤＮＡまたは天然のＤＮＡである。天然の核酸は、クローニングベクター中の所望のフラグメントをクローン化し、そして組み換えられた分子の制限酵素の消化による所望の核酸フラグメントを単離することによって容易に作製される。あるいは、これらは、ポリメラーゼ連鎖反応のような、酵素的合成によって核酸テンプレートから作製される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、前出）。
【０１１９】
１つの実施形態において、ヌクレオ塩基ポリマーは、溶液中か、または適切な不活性の固体支持体上のいずれかで、ホスホルアミダイト法、またはリン酸トリエステル法を使用して、化学的に合成される。ヌクレオ塩基ポリマー合成方法は、当業者に周知である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：１−１７；Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ３９２  ａｎｄ  ３９４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，（１９９０），６−１ページから６−２２ページ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．９０１２３７を参照のこと）。
【０１２０】
ホスホルアミダイト法は、配列特異的なオリゴデオキシリボ核酸およびオリゴリボ核酸の１つの合成方法である。一般的に、保護されるヌクレオシドは、固体支持体に結合体化され、次いで、酸（例えば、トリクロロ酢酸）で処理して、５’‐ヒドロキシル保護基を取り除き、このようにして、引き続いてのカップリング反応のための遊離ヒドロキシル基を生成する。保護されるヌクレオシドホスホルアミダイトモノマーおよびテトラゾールのような活性試薬は、固体保持体に結合したヌクレオシドと反応される。活性化剤は、この曝露されたヒドロキシル基によって亜リン酸原子の求核攻撃を可能にするホスホルアミダイトの窒素をプロトン化する。ヌクレオシドの添加後、成長する鎖は、反応し損なう任意のヌクレオチド鎖を終結するために、一般的に無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いてキャップされる。このヌクレオチド間の亜リン酸連結は、好ましい酸化剤としてヨウ素を用いて、より安定なリン酸トリエステルに酸化される。酸化後、このヒドロキシル保護基は、トリクロロ酢酸のような、弱酸を用いて取り除かれ、そしてこの反応サイクルは、所望の長さおよび配列のヌクレオ塩基ポリマーの形成が完成するまで繰り返される。塩基処理は、固体保持体からヌクレオ塩基ポリマーを切断し、そしてまた、βーシアノエチルのような任意のリン酸保護基を取り除く。ヌクレオシド塩基上の環外のアミノ基の完全な脱保護は、上昇した温度にて塩基中で（例えば、濃縮水酸化アンモニウム中５５℃）ヌクレオ塩基ポリマーを処理することによって達成される。逆相ＨＰＬＣが選り抜きの精製方法の場合、残存する保護基（通常は、５’−ヒドロキシル上のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基）は、合成の間に取り除かれるか、または、かわりに、５’‐ヒドロキシル上に残され得る。合成後、このヌクレオ塩基ポリマーは、以下の標識に供される：５’末端（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９０）編，第８章，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｒｇｅｌら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：６５１３；米国特許第５，１１８，８００号を参照のこと）、リン酸ジエステルヌクレオチド間の連結（例えば、Ｏｒｇｅｌら、前記の第９章を参照のこと）、または３’末端（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，（１９９３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２５３−６２５９を参照のこと）。
【０１２１】
別の実施形態において、ヌクレオ塩基ポリマーは、塩基、糖、または骨格の改変を有するアナログである。骨格における改変としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ポリアミド（すなわち、ペプチド核酸）、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホジチオエステル、およびホスホアミデートのヌクレオチド間の連結。改変されたヌクレオチド間の連結を有する配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーアナログを合成する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．編  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９０）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，（１９９３），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第２０巻，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【０１２２】
ヌクレオ塩基間にポリアミド骨格を有する配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーはまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として公知であリ、これらの１例は、これらのヌクレオ塩基にＮ‐（２‐アミノエチル）‐グリシンの繰り返し単位を有するポリマーがメチレンカルボニル基を介して付着される（Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７１５００）。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、「ＰＮＡ」とは、非電荷ポリアミド骨格を介して、互いに連結されるヌクレオ塩基ポリマーをいう。ＰＮＡ骨格は、ヌクレオ塩基が付着され得る非環式の、アキラルな、中性のポリアミド連結の任意の骨格であり得、そしてこれは上記で考察された判定基準を満たす。本発明の方法において有用なＰＮＡが、例えば米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ  ９２／２０７０２に記載され、これらの開示は、本明細書中で参考として援用する。ポリアミド骨格を形成するアミノ酸は、同一であり得るか、または異なり得るが、一般的には同一である。特定の実施形態において、ＰＮＡは、ヌクレオ塩基がＮ‐（２‐アミノエチル）‐グリシンの骨格、すなわち、ペプチド様、アミド連結単位（例えば、米国特許第５，７１９，２６２号；Ｂｕｃｈａｒｄｔら  １９９２，ＷＯ  ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００を参照のこと）に付着されるものである。
【０１２４】
ＰＮＡ合成のための種々のストラテジーは、利用可能である。１つの方法において、合成のために使用されるＰＮＡモノマーは、ベンジロキシカルボニル（Ｚ）によって保護される環外アミノ基を有するが、このアミンは、ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）を用いて保護される。固体基材に結合した保護されたモノマーは、次のＰＮＡモノマーに対する引き続いての結合のための、遊離アミノ基を生成するために、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような、強酸を使用して、脱保護される。例えば、カルボジイミジンまたはＯ‐（７アザベンゾトリアゾール‐ｌ‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルロホスフェート（ＨＡＴＵ）によって活性化されたＰＮＡモノマーは、アミド結合を形成するためにＰＮＡを結合した固体支持体の遊離アミノ基と反応する。ＰＮＡ鎖のキャッピングは、Ｎ‐メチルピロリドンおよびピリジンの存在下で無水酢酸を用いて達成される（例えば、Ｋｏｃｈ，Ｔ．ら（１９９７）Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＰＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｂｏｃ／Ｚ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．４９：８０−８８；Ｍａｉｓｏｎ，Ｗ．（１９９１）Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＰＮＡｓ：Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９：５８１−５８４を参照のこと）。完全なヌクレオ塩基ポリマーは、強酸（例えば、フッ化水素酸またはトリフルオロメタンスルホン酸）を用いて、固体支持体から取り出される。ＰＮＡを合成するための他のストラテジーは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基、またはモノメトキシトリチル保護基の使用を含む（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ，Ｇ．ら（１９９６）、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡｓ）ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｆｍｏｃ／Ｍｍｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：６６５−６７０；Ｗｉｌｌ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ  ｓｔｒａｔｅｇｙ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１：１２０６９−１２０８２）。ヌクレオ塩基上の環外のアミンに対して酸に不安定な骨格保護基および塩基に不安定な保護基を使用するＰＮＡ合成方法もまた利用可能である（Ｇｉｌｄｅａ，Ｂ．Ｄ．，米国特許第６，０６３，５６９号）。
【０１２５】
ホスホネートのヌクレオ塩基ポリマーアナログはＨ‐ホスホネートまたはアルキルホスホネートのヌクレオチド間の連結を有する。合成サイクルに使用されるヌクレオシド水素ホスホネートモノマーは、ホスホルアミダイト合成スキームにおいて通常に使用される保護基によって適切に保護される。固体支持体に結合された保護されたヌクレオシド上の５’‐ＯＨ保護基は、ジクロロ酢酸のような酸を用いて、取り除かれる。カップリング工程においては、ヌクレオシドホスホネートモノマーは、例えば、ピバロイルクロリド、１−アダマタンカルボニルクロリド、またはジペンタフルロロフェニルカルボネートによって活性化され、その結果、ヌクレオシドを結合した固体支持体上の遊離ヒドロキシル基と反応する無水物の形成が生じる。キャッピングは、活性化試薬の形式に依存する：パイバロイルクロリドのような、妨害されない活性化試薬の使用は、キャッピングを必要としなくてもよい。さもなければ、キャッピングは、シアノエチル‐Ｈ‐ホスホネートまたはイソプロピル‐Ｈ‐ホスホネートのような薬剤を用いて実行される。上記のホスルアミダイト法とは異なり、ホスホネートのヌクレオチド間の連結の酸化はない。引き続いての塩基処理は、固体支持体からの完全なヌクレオ塩基ポリマーの放出、および環外の保護基の除去を生じる（例えば、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．（１９９０），Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｈ−ｐｈｏｓｐｈｐｎａｔｅ  ｉｎｔｅｍｅｄｉａｔｅｓ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９（９）６９１−９６を参照のこと。
【０１２６】
アルキルホスホネートのヌクレオチド間の連結を有するヌクレオ塩基ポリマーアナログは、いくつかの方法によって容易に合成される（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．，編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ１３７−１５４）。例として、1つの代表的な方法は、合成反応のためのアルキルホスホンアミダイト化学を使用する。この方法において、合成反応のために使用されるヌクレオシドモノマーは、適切な保護基で保護される環外アミン（例えば、ベンゾイル基、イソブチリル基、またはｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル（ｔ−ＢＰＡ）基）を有するが、５’ヒドロキシルは、ピキシルまたはジメトキシトリチルのような基で保護される（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ら（１９９４），Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｒｔ  ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ  ａｍｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２（１５）：３１１９−２３：Ｈｏｇｒｅｆｅ，Ｒ．Ｉ．ら（１９９３），Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｙｌｐｈｏｎａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１４３−６３；Ｚｈｏｕ，Ｙ．（１９９６），Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−２−ｐｙｒｉｍｉｄｏｎｅ−２’’ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏ−２−ｐｙｒｉｍｉｄｏｎｅ‐２’‐ｄｅｘｏｒｉｂｏｓｉｄｅ  ｍｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２４：２６５２−２６５９）。アルキルホスホンアミダイトヌクレオシド試薬は、適切に保護されるヌクレオシドを有するメチルジクロロホスフィン、およびジイソプロピルアミンのような、反応性アルキルジクロロホスフィンを含むホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｉｏｎ）によって作製され、これによって５’が保護されたヌクレオシドジイソプロピルメチルホスホンアミダイトを形成する。ヌクレオ塩基ポリマー合成サイクルにおいて、固体基材に結合するモノマーは、酸（例えばジクロロ酢酸）を使用して、脱保護され（すなわち、脱ピキシル化または脱トリチル化）、そしてテトラゾールのような活性化剤の存在下でアルキルホスホンアミダイトヌクレオシド試薬と反応される。遊離ＯＨ基は、メチルホスホナイト中間体を生成する亜リン酸原子を攻撃する。キャッピング工程に先行する引き続いての酸化は、メチルホスホネートの連結への変換を生じる。キャッピングは、無水酢酸およびジメチルアミノピリジンを用いて達成される。脱保護、カップリング、酸化およびキャッピングの連続サイクルは、所望のオリゴヌクレオチドを生成する。固体支持体からの放出は、穏やかな脱保護、例えば、エチレンジアミンまたはヒブラジンハイドレートを用いる処理によってもたらされる（例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅ,Ｒ．Ｉ．，Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏ��  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第２０巻  Ｓｕｄｈｉｒ  Ａｇｒａｗａｌ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３を参照のこと）。ベンジルホスホネートおよびアミノエチルホスホネートのような、他のホスホネートはまた、ヌクレオチド間の連結として作用し得る（Ｓａｍｓｔａｇ、Ｗ．ら、前出；Ｆａｔｈｉ、Ｒ．ら、前出）。
【０１２７】
ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート配列のヌクレオ塩基ポリマーアナログは、亜リン酸原子に結合した非架橋リガンドとして、酸素の代わりにイオウを有する。ホスホロチオエート連結を有する配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの合成は、Ｈ‐ホスホネートまたはホスホルアミダイト化学を含む種々の方法によって達成される。１つの代表的な方法が、ヌクレオ塩基ポリマーの合成スキームにおける任意の点でのホスホロチオエートの連結の導入を可能にする合成経路にホスホルアミダイトを使用する。この方法において、ＤＭＴと共に５’ＯＨ基において保護されるヌクレオシドを結合した固体支持体は、脱保護され、そしてテトラゾールのような、活性化剤の存在下で、次のヌクレオシドホスホルアミダイト試薬にカップリングされる。β‐シアノエチルホスフィンの連結は、二硫化テトラエチルチウラム（ＴＥＴＤ）、３Ｈ‐１，２‐ベンゾジジチオール（ｂｅｎｚｏｔｄｉｔｈｉｏｌｅ）‐３‐オン‐１,１,‐ジオキシド（Ｂｅａｃａｕｇｅ試薬）、またはジベンゾイルテトラスルフィドのような、硫化試薬を用いてホスホロチオエートに変換される。固体支持体からのキャッピングおよび放出は、正常なホスホルアミダイト化学の手順に従う。
【０１２８】
ジチオエートアナログは、ヌクレオシド３’ホスホロチオアミダイトが使用されるのを除けば、ホスホロチオエートと同様に調製される。これらのシントンは、例えば、適切に保護されるヌクレオシド、およびテトラゾール活性化剤と共にトリス（ピロリジノ）ホスフィンを使用して生成される。得られたヌクレオシドジアミダイトは、２，４ジクロロベンジルメルカプタンの付加を伴うホスホルチオアミダイトに変換される（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ら（１９９２）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ．２１１：３−２０を参照のこと）。脱保護された、固体支持体に結合したヌクレオシドとの反応は、２，４ジクロロベンジルメルカプタンを有するチオホスフィントリエステル連結を伴うヌクレオ塩基ポリマーを生じる。元素状態のイオウの導入は、ホスホロジチオエート誘導体を産生する。脱保護は、２，４ジクロロベンジルメルカプタンを取り除くチオフェノールで達成されるが、塩基を用いた処理は、固体支持体からオリゴヌクレオチドを放出する。
【０１２９】
本発明の中で実施される別のヌクレオ塩基ポリマーアナログとしては、リン酸トリエステル連結を有するヌクレオ塩基ポリマーが挙げられる。リン酸トリエステルアナログの合成は、適切に保護される（例えば、ベンゾイル保護基、イソブチリル保護基、またはイソプロポキシアセチル保護基）Ｏ‐アルキル‐Ｎ，Ｎ  ジイソプロピルホスホルアミダイトを使用する。アルキル基としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：メチル、エチル、トリフルオロエチル、イソプロピル、およびネオペンチル。これらの実施形態において、遊離エステルに付着する化学基は、脱保護工程および特に、保護されるアミンの脱保護のために必要とされる手順および条件を含む従来のホスホルアミダイト化学の全ての工程に安定な化学基に一般的に限定され、その結果、得られる連結は、非荷電リン酸トリエステルである。従って、このような基がアルキルの場合、この基は、特定の実施形態において、メチル以外のアルキル、例えばＣ２〜Ｃ６の直鎖状アルキルである。なぜならば、メチルホスホトリエステルがより高次のアルキルリン酸トリエステルより安定性が低い傾向があるからである。合成は、固体支持体への連結（例えば、オキサリルリンカー）および合成後の固体支持体からの放出（例えば、２５％ＮＨ３水溶液）におけるバリエーションを有する一般的なホスホルアミダイト化学に従う。本発明において実施される他のヌクレオ塩基ポリマーアナログとしては、ボラノホスフェート連結、およびホスホフルオデートの連結を含む。これらの合成方法は、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第２０巻，第１１章および第１２章，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編，１９９３，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されており、本明細書中で参考として援用される。
【０１３０】
本発明において実施された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、同種のヌクレオチド間連結を有する配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーに限定されず；ヌクレオチド間連結の１つより多い型を含む配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーもまた、本発明によって包含される。従って、リン酸ジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、およびアルキルホスホネートのヌクレオシド間の連結の組み合わせを有する、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、本発明の範囲内に全て含まれる。ヌクレオチド間の連結の種々の組み合わせを有する配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの合成は、当業者に周知であり、そしてこれらの合成を記載している文献を、本明細書中で参考として援用する（例えば、Ｚｈｏｕ，Ｌ．（１９９４），Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４５３−４５６；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．（１９９９）．Ｐｓｏｒａｌｅｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：５７２−５７７を参照のこと）。
【０１３１】
別の局面において、本発明の移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、改変された塩基を含み、これらの多くが文献に記載されている。保護され、改変された塩基の合成方法、およびこれらのヌクレオ塩基ポリマーの中への組み込み方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ａ．，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｓｉｓ，Ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，前出を参照のこと）。核酸の中に組み込まれ得る塩基アナログとしては、とりわけ、デオキシナプトシン、エテノアデノシンおよびシチジン、６−チオグアノシン、４-チオチミジン、７−デアザプリン、Ｎ６-メチルアデノシン、Ｏ６−メチルグアノシン、ならびに２−アミノプリンが挙げられる。
【０１３２】
本発明の別の実施形態において、配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーへ移動度を改変するポリマー鎖を付着するために使用される連結は、リン酸ジエステル連結以外の種々のリン酸エステルアナログは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸トリエステル、アルキルホスホネート、およびホスホロチオエート基、または他の適切な連結。以下に示されるように、種々の連結を生じる合成方法は、ヌクレオ塩基ポリマーの合成に使用される合成ストラテジーを採用し得る。
【０１３３】
１つの局面において、配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーと、移動度を改変するポリマー鎖との間の連結は、アルキルホスホネートの連結である。１つの合成スキームにおいて、メチルジクロロホスフィンは、ジイソプロピルアミンと反応されて、メチルクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィンを形成する。ＤＭＴペンタエチレンオキシドのような、適切に保護されるポリマーの添加は、ジイソプロピルアミンの存在下で、付着したポリマーを有するメチルホスホンアミダイト誘導体を生成する。保護された固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドの遊離ヒドロキシル基へのメチルホスホアミダイト誘導体のカップリングは、テトラゾールのような活性化剤の存在中に生じ、メチルスルホナイトの連結を生じる。例えば、ヨウ素を用いる引き続いての酸化は、メチルスルホン酸へのメチルスルホナイトの変換を生じる。ベンジルホスホネートのような、他のホスホネート連結基は、べンジルホスホネートオリゴヌクレオチドを生成するために使用される類似の化学に従って合成され得る。
【０１３４】
１つの実施形態において、配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーへの、移動度が改変されたポリマーの連結は、リン酸トリエステル連結を介して達成される。種々の合成経路は、移動度を改変するポリマーと配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーとの間にリン酸トリエステル連結を形成するために利用可能である。１つの実施形態において、ヌクレオ塩基ポリマーにポリマー鎖を付着させることは、実施例１および実施例２に詳細に記載されているように、そして以下のスキーム（ＩＩ）およびスキーム（ＩＩＩ）に図示されるように、移動度を改変するエチレンオキシドポリマーを用いるホスホルアミダイト化学に従う。
【０１３５】
スキーム（ＩＩ）およびスキーム（ＩＩＩ）において、ＤＭＴは、ジメトキシトリチルを表し、ｉＰｒは、イソプロピルを表し、そしてＲ２およびｂは、構造式（Ｉ）について、以前規定されている通りである。
【０１３６】
【化１９】
0004452445.tif 000013
スキーム（ＩＩ）を参照して、Ｒ２‐Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルアミノホスファイト７は、新生ヌクレオ塩基ポリマー８の遊離５’ヒドロキシルと反応され、それよって、Ｒ２亜リン酸トリエステル連結により５’末端に付着した、移動度を改変するポリマーを有するヌクレオ塩基ポリマーを生成する。ヨウ素を用いる引き続いての酸化、および塩基を用いる脱保護は、亜リン酸連結をＲ２リン酸トリエステル連結へ変換する。得られた、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマー１０は、塩基を用いて（例えば、ＮＨ４ＯＨ，５５℃，４時間）固体支持体から切断され、１１を生じる。オリゴヌクレオチド１１は、例えば、逆相ＨＰＬＣによって精製され得、そして残存するトリチル基は弱酸（例えば、ＣＨ２Ｃｌ２中の３％ジクロロ酢酸）で除去されて、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマー１２を生じ、これは、例えば、ＰＤ１０カラムのクロマトグラフィーによって、さらに精製され得る。あるいは、トリチル基は固体支持体から切断される前に除去され得、そして、得られた移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマーは、従来の手順によって精製される。
【０１３７】
当業者によって理解されているように、Ｒ２がアルキルの場合、ヌクレオ塩基ポリマーに、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマーセグメントをカップリングするために、使用されるアルキルホスホルアミダイト試薬は、種々の長さの直鎖状または分枝状のアルキルを有し得る。このリン酸エステルが荷電されない場合、遊離エステルに付着した化学基は、従来のホスホルアミダイト化学の脱保護工程を含む全ての工程に安定である基、および特に、保護された、アミンの脱保護に必要な手順および条件に一般的に限定され、その結果、得られた連結は、非荷電のリン酸トリエステルである。従って、このような基がアルキルの場合、この基は、メチル以外のアルキル（例えば、Ｃ２〜Ｃ６直鎖状アルキル）である。なぜならば、モノメチルリン酸トリエステルは、より高次のモノアルキルリン酸トリエステルよりも安定性が低い傾向があるからである。本発明の実施形態はまた、レポーター、およびリガンド分子のような機能的部分を有する種々の改変されたアルキルの付着を想定する。例えば、結合体化した機能的部分を有するβ‐シアノエトキシホスホルアミダイトとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ビオチン、ソラレン、アクリジン色素、コレステロール、フルオレセイン、ローダミン、２，４  ジニトロフェノール、ｔｒｉｓ−（２，２’−ビピリジンルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）（ＩＩ）キレート（ＴＢＲ）、およびヒスチジンは、当業者に周知である。（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｈ．（１９９９），Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｉｄｙｌ  ａｎｄ  Ｄｉｈｉｓｔｉｄｙｌ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０：６４７−６５２；Ｋｅｎｔｅｎ，Ｊ．Ｈ．（１９９２），Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｓａｙｓ：ｒａｐｉｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，３８：８７３−９）。一般的に、これらの機能的な部分は、ポリオキシド上に存在するヒドロキシル基、または誘導体化された部分に結合された脂肪族スペーサーアームによってホスホルアミダイトに結合される。したがって、誘導体化され、機能化された部分を有する同族のアルキルホスホルアミダイト試薬，および付着した移動度を改変するポリマーは、本出願において提供される合成スキームを採用することによって、当業者により容易に合成され得る。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施形態において、複数の移動度改変ポリマーが、ヌクレオ塩基ポリマーに結合される。一実施形態において、複数の移動度改変ポリマーは、無電荷結合（例えば、リン酸トリエステル結合（構造式（ＩＩ）の化合物により例示される））によって、または荷電結合（例えば、負に荷電したリン酸エステル結合（構造式（ＩＩＩ）の化合物により例示される））によってのいずれかで、互いに直鎖状に結合される。標準的なホスホルアミダイトＤＮＡ化学を使用するこれらのタイプの移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを合成するための方法は、以下のスキーム（ＩＩＩ）に例示される：
スキーム（ＩＩＩ）
【０１３９】
【化２０】
0004452445.tif 000014
スキーム（ＩＩＩ）において、種々の略語および置換基は、スキーム（Ｉ）および（ＩＩ）について定義された通りである。
【０１４０】
スキーム（ＩＩＩ）を参照すると、支持体結合新生移動度改変ヌクレオ塩基ポリマー１０（これは、スキーム（ＩＩ）で例示されたように合成される）を、弱酸（この場合、ジクロロメタン中３％のジクロロ酢酸）で処理して、ＤＭＴ保護基を除去して、支持体結合化合物１３を得る。支持体結合化合物１３を、活性化因子（例えば、テトラゾール（代表的には、アセトニトリル中０．５Ｍ）の存在下で、ＤＭＴで保護したポリエチレンオキシドβ−シアノエチルホスホルアミダイト試薬１４と結合する。ホスホルアミダイト試薬１４は、標準的な合成法を使用して調製され得る。例えば、ホスホルアミダイト試薬１４を、化合物４を２−シアノエタン−１−オールに替えることによって、スキーム（Ｉ）に従って調製し得る。例えば、テトラヒドロフラン、２，６−ルチジンおよびヨウ素の水溶液との反応による酸化により、化合物１５を得る。樹脂からの切断、ヌクレオ塩基を保護する任意の基の除去およびＤＭＴ保護基の除去により、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマー１６を得る。ＤＭＴ基を化合物１５から除去し、これをホスホルアミダイト試薬７または１４と反応させることによって、さらなるポリマーを付加し得る。
【０１４１】
例えば、自動ＤＮＡ合成機器におけるように、ポリマーが連続的に付加される場合、さらなる移動度改変ポリマー鎖の付加は、この移動度改変ポリマー鎖の末端上のＯＨ保護基を脱保護し、上記のカップリングおよび酸化のサイクルを繰り返すことによって、達成される。異なる移動度改変ポリマー鎖が、各サイクルで付加されて、特有の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを提供する。
【０１４２】
あるいは、本発明はまた、ポリマーセグメントが分枝構造または樹状構造である移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを企図する。このような分枝および／または樹状移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを合成するために標準的なＤＮＡ合成化学と共に使用され得るホスホルアミダイト試薬を合成するための例示的な方法は、以下のスキーム（ＩＶ）に例示される。スキーム（ＩＶ）において、種々の略語および置換基は、スキーム（Ｉ）および（ＩＩ）について定義された通りである。
【０１４３】
スキーム（ＩＶ）
【０１４４】
【化２１】
0004452445.tif 000015
スキーム（ＩＶ）は、適切に保護されたポリマー（例えば、ＤＭＴ保護ポリ（アルキレンオキシド）６がアルコール４に替わり、それにより結合ポリマーを有するビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファイト２０を形成すること以外は、スキーム（Ｉ）と類似している。第２の移動度改変ポリマー６の引き続くカップリングにより、２つの移動度改変ポリマー鎖を有するホスホルアミダイト試薬２１が生成する。固体支持体結合配列特異的ポリマーの遊離ヒドロキシル基へのカップリング、引き続く酸化により、分枝移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーが生成する。
【０１４５】
移動度改変ポリマーのさらなる付加が、可能である。配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに結合した移動度改変ポリマー上の保護基（例えば、ＤＭＴ）は、弱酸で除去され、従って遊離ヒドロキシル基が生成する。結合移動度改変ポリマーを有する誘導体化Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルアミノホスファイトとの反応は、遊離ヒドロキシル基へのさらなる移動度改変ポリマーのカップリングを生じる。任意の移動度改変ポリマー単位のカップリングは、他の結合移動度改変ポリマーが非反応性末端を有する場合、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに結合した移動度改変ポリマーの１つのみに限定され得る。あるいは、１つのヌクレオ塩基ポリマーに結合したポリマーのヒドロキシル基を、ＤＭＴ保護基を除去するために使用される試薬に対して安定な保護基（例えば、レブリニル）で保護することは、任意のさらなるポリマー単位のカップリングをＤＭＴで保護されたポリマーに制限する（Ｉｗａｉ，Ｓ．（１９８８），５’−Ｌｅｖｕｌｉｎｙｌ  ａｎｄ  ２’−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎｙｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｓ  Ｒｅｓ，１６：９４４３−５６）。この直交ストラテジーは、相互排除的な条件下で、保護基を除去する。
【０１４６】
本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬はまた、以下に示されるスキームＶに従って、ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に付加される：
スキーム（Ｖ）
【０１４７】
【化２２】
0004452445.tif 000016
スキームＶによると、本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬は、スキームＩＩに示されるような固体支持体に結合したヌクレオ塩基ポリマーの遊離５’ヒドロキシルではなく、固体支持体（スキームＶにおいて黒丸で示される）に結合しているヌクレオ塩基モノマー残基の遊離５’ヒドロキシルと縮合される。スキームＶの第１工程は、ヌクレオ塩基モノマーリンカーを介して固体支持体に結合された移動度改変ホスホルアミダイトポリマーを精製する（２４）。２４の穏やかな酸処理は、ＤＭＴ保護基を切断し、それにより、遊離ヒドロキシル部分を提供し、この場合、ヌクレオ塩基ポリマーは、一般的には自動化機器を使用して、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、活性化された保護ホスホルアミダイトヌクレオ塩基モノマーの繰返し縮合サイクルにより構築される。例えば、８回のさらなるサイクルが実施され、ここで以下のモノマーがこの順序で付加される：Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ。
【０１４８】
本発明の表面結合移動度改変ポリマーへの所望の特定のヌクレオ塩基ポリマー配列の付加の後、この移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー（ここでこの移動度改変ポリマーセグメントは、ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に保持されている）は、脱保護され、固体支持体から切断されて、上記の例示的な合成を続けて、（２０）に従う生成物を生じる：
【０１４９】
【化２３】
0004452445.tif 000017
あるいは、ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に結合した移動度改変ポリマーを有する基材結合分子（例えば、スキームＶの構造（２８））は、穏やかな酸処理にのみ供され、５’−ＤＭＴ部分を除去され、そして基材結合ヌクレオ塩基ポリマー構造上の遊離ヒドロキシル基を提供し、これは、スキーム（ＩＩ）の（８）と類似している。本発明の移動度改変ホスホルアミダイト試薬との引き続く縮合は、３’末端と５’末端の両方に結合した移動度改変ポリマーセグメントを有する配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを提供する。
【０１５０】
別の実施形態において、第１のヌクレオ塩基ポリマーの５’末端および第２のヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に結合した移動度改変ポリマーを含む移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーが、合成される；すなわち、この移動度改変ポリマーは、ヌクレオ塩基ポリマーに「挿入」されている。１つの非限定的な例示的なアプローチにおいて、移動度改変ポリマーを含むヌクレオ塩基ポリマーは、スキームＩＩに従って合成されて、中間体（１０）を提供し、この中間体（１０）は、固体基材に結合された第１のヌクレオ塩基ポリマーを含み、そしてこの第１のヌクレオ塩基ポリマーの５’末端上に移動度改変ポリマーを有する。穏やかな酸（３％ＤＣＡ）での（１０）の処理により、ＤＭＴ保護基を除去し、第２のヌクレオ塩基がスキームＶに従って付加される、化合物（２５）と類似した構造を提供し、それにより、移動度改変ポリマーが、第１のヌクレオ塩基ポリマーの５’末端および第２のヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に結合している第１および第２のヌクレオ塩基ポリマーを含む移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを提供する。
【０１５１】
従って、本発明はまた、第１の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端および第２の配列特異的拡散液ポリマーの５’末端に結合した移動度改変ポリマーを含む移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー（構造式（ＩＶ）に従う）またはその塩に関する：
【０１５２】
【化２４】
0004452445.tif 000018
ここで、各Ｒ１１は、水素、少なくとも２つの炭素原子を含むアルキル、アリール、（Ｒ８）３Ｓｉ−（ここで、各Ｒ８は、独立して、直鎖および分枝鎖のアルキルおよびアリールからなる群から選択される）、塩基安定性保護基、Ｒ５−Ｘ−［（ＣＨ２）ａ−Ｏ］ｂ−（ＣＨ２）ａ−、保護基、レポーター分子およびリガンドからなる群から選択され、ただし、少なくとも１つのＲ１１が、水素ではなく；
各Ｘは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群から選択され；
各ａは、独立して、１〜６の整数であり；
各ｂは、独立して、０〜４０の整数であり；
ｄは、１〜２００の整数であり；
ＯＬＩＧＯ１は、第１の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであり；そして
ＯＬＩＧＯ２は、第２の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーである。
【０１５３】
ＯＬＩＧＯ１およびＯＬＩＧＯ２は、代表的には、少なくとも５個のヌクレオ塩基から構成される配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーである。さらに、所望される場合、第１のヌクレオ塩基ポリマーと第２のヌクレオ塩基ポリマーとの間に位置する移動度改変ポリマー（構造式Ｖに従う）に加えて、本発明の移動度改変ポリマーはまた、第１のヌクレオ塩基ポリマーの５’末端および／または第２のヌクレオ塩基ポリマーの３’末端に、それぞれ、一般的にスキームＶおよびＩＩに従って付加される。
【０１５４】
さらに別の実施形態において、これらの複数の移動度改変ポリマー鎖は、独立して合成され得、次いで、一工程で配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに結合される。配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーとは無関係に複数の移動度改変ポリマー鎖を合成するための種々のスキームが、考案され得る。ある方法において、移動度改変ポリマー鎖（例えば、ペンタエチレンオキシド）は、相互排除的な脱保護条件下で除去可能な２つの異なる保護基で保護される。１つのこのような直交ストラテジーは、このポリマーの一方の末端のヒドロキシル基をジメトキシトリチルで保護し、他方の末端のヒドロキシル基をレブリニルで保護することである。あるいは、このポリマーは、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー合成のための固体支持体へのヌクレオシドの結合と同様に、ＤＭＴの脱保護条件に対して耐性の結合を介して固体支持体に結合される。いずれの場合においても、弱酸での処理は、ＤＭＴ保護基を優先的に除去し、それにより、遊離ＯＨを露出させ、一方、他のヒドロキシル基は保護されたままである。活性化剤（例えば、テトラゾール）の存在下で、結合した移動度改変ポリマーを有する誘導体化ホスホルアミダイト試薬は、ヒドロキシル基と反応して、２つのポリマーのカップリングを生じる。引き続く中間体のホスファイトの酸化は、カップリングのために使用されるホスホルアミダイトのタイプに依存して、β−シアノエチルホスフェートまたはβ−シアノエチルホスフェートを生成する。脱保護、カップリングおよび酸化のサイクルの繰返しは、結合した移動度改変ポリマー鎖を生成し、ここで複数の移動度改変ポリマー鎖は、一方の末端をＤＭＴで保護され、他方の末端をレブリニルで保護される。ヒドラジンでこのレブリニルを除去することによる脱保護、または固体支持体から結合したポリマーを切断することは、遊離ヒドロキシルを露出し、これは次いで、誘導体化ホスホルアミダイト試薬（例えば、結合した複数の移動度改変ポリマー鎖を有するアルキル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスファイト）を合成するために利用可能になる。適切に保護されたヌクレオ塩基ポリマーへの誘導体化ホスホルアミダイト試薬のカップリングは、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーへの複数の移動度改変ポリマー鎖の結合を生じる。引き続くヨウ素での酸化、続く塩基での処理は、移動度改変配列特異的核酸またはヌクレオ塩基ポリマーの固体支持体からの解放を伴って、環外アミン上の全ての保護基およびホスフェート上のβ−シアノエチル基を除去する。弱酸での処理は、移動度改変ポリマー上の全ての残りのＤＭＴ保護基を除去する。
【０１５５】
（４．６  使用方法）
本発明は、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを使用する方法、および複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを含む組成物をさらに包含し、ここでこの移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーの各々は、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群から独立して選択される構造を必要に応じて有し、そしてこの移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーの各々は、特有の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有し、そして１つ以上の標的核酸内の１つ以上の選択されたヌクレオチド配列を特徴付ける。
【０１５６】
１つの局面において、本発明は、１つ以上の標的核酸内の複数の配列を検出する方法を提供し、この方法は、複数の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマー（ここで、各々の移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーは、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群から独立して選択される構造を有する）と、１つ以上の標的核酸とを、一般的に標的核酸にハイブリダイズする移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを識別する条件下で、接触させる工程、およびこの標的核酸にハイブリダイズした移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを検出する工程、を包含する。
【０１５７】
この方法の１つの局面において、この標的核酸は固定されている。この局面において、この固定された標的核酸は、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブ（これは検出可能な標識をさらに含む）と、この標的核酸にハイブリダイズするのに十分な相同性を有するプローブを識別する条件下で、接触される。ハイブリダイズしていないプローブは、洗浄され、そしてハイブリダイズしたプローブ（これは、膜上に固定された標的核酸に結合している）が、検出される。あるいは、ハイブリダイズしていないプローブが、洗浄され、そしてハイブリダイズしたプローブが、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブと固定された標的核酸との間で形成される塩基対構造の変性の後に、単鎖生成物として回収される。
【０１５８】
この方法の別の局面において、固定され得る標的核酸は、複数の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブと接触され、それにより、２つのヌクレオ塩基ポリマープローブは、標的核酸の隣接配列にハイブリダイズし、その結果、１つのヌクレオ塩基ポリマープローブ（これは一般に、５’−ホスフェート部分を有する）の５’末端は、第２のヌクレオ塩基ポリマープローブの３’末端に隣接し、その結果、これら２つのヌクレオ塩基ポリマープローブは、互いに共有結合し得、特定の実施形態において、ＤＮＡの化学的連結活性または酵素的連結活性を有して連結生成物を形成する。この方法の局面において、連結生成物は、２つのヌクレオ塩基ポリマープローブの結合によって形成され、このうち少なくとも１つは、検出可能な標識を含み、そしてこのうちの少なくとも１つは、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群から選択される移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであり、その結果、この連結生成物は、特有の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。さらなる局面において、３つ以上のヌクレオ塩基ポリマープローブが、少なくとも３つのヌクレオ塩基ポリマープローブが共有結合して連結生成物を形成し得るような様式で、標的核酸の隣接配列にハイブリダイズされ、ここで、このように結合されたヌクレオ塩基ポリマープローブの少なくとも１つは、検出可能な標識を含み、このように結合されたヌクレオ塩基ポリマープローブの少なくとも１つは、構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群から選択される移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブであり、その結果、この連結生成物は、特有の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。一般的に、標的核酸にハイブリダイズされる連結生成物は、変性によって解放され、そして特有の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する単鎖連結生成物が、検出および分析されて、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列に関する情報を提供する。
【０１５９】
このハイブリダイゼーション、結合および変性のサイクルは、形成される連結生成物の濃度を増加するために、繰り返され得る。この例において、結合は、必要に応じて、熱安定性連結酵素によって達成される。これらの反応は、熱的に安定なリガーゼを用いて、サーマルサイクリングマシンにおいて簡便に実施される（Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．（１９９１），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｌｉｇａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１）：１８９−１９３；Ｈｏｕｓｂｙ  Ｊ．Ｎ．ら（２０００），Ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｌｉｇａｓｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔ．ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  ａｎｄ  Ｒｈｏｔｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅｓ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｉｇａｓｅｓ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（３）：Ｅ１０）。
【０１６０】
さらに、さらなるヌクレオ塩基ポリマー（これらは一緒に、連結生成物に対して、これにハイブリダイズするのに十分相補的であり、そして上記のように、互いに共有結合される）がまた、含まれ、それにより、この連結生成物の幾何的増幅（すなわち、リガーゼ連鎖反応）を提供する（Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．およびＷａｌｌａｃｅ  Ｂ（１９８９），Ｔｈｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＡＲ）−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｒｏｕｎｄｓ  ｏｆ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９；Ｂａｒａｎｙ，（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９；Ｂａｒａｎｙ，（１９９１），ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．，１：５）。移動度改変された第２のオリゴヌクレオチドの相補対とオリゴヌクレオチドの第２の対との間で形成される平滑末端化ハイブリッドの所望しない連結を抑制するために、平滑末端化連結を阻害する条件および試薬（例えば、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよびホスフェート）が、連結反応に含まれる。
【０１６１】
従って、このようなリガーゼ連鎖反応の生成物は、２つの鎖からなる二本鎖分子であり、その各々は、少なくとも２つの配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブの結合の生成物である。従って、本発明のさらに別の局面において、リガーゼ連鎖反応生成物内に組み込まれる配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの少なくとも１つは、検出可能な標識を含み、そしてこの配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの少なくとも１つは、構造式（ＩＩ）および（ＩＩ）からなる群から選択される移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであり、その結果、このリガーゼ連鎖反応生成物は、特有の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する。
【０１６２】
上記のオリゴヌクレオチドリガーゼアッセイの別の局面において、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列と、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーおよび第２のオリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方との間に存在するミスマッチ（すなわち、非相補的ヌクレオ塩基）は、ハイブリッド形成を妨害することによってか、または隣接末端ヌクレオチド残基の適切な結合を妨害することによってのいずれかにより、２つのヌクレオ塩基ポリマーの連結を妨げる。従って、結合条件が、少なくとも１つのミスマッチにもかかわらず、両方のヌクレオ塩基ポリマーのハイブリダイゼーションを可能にするように選択される場合、移動度改変連結生成物の形成は、少なくとも、２つのヌクレオ塩基ポリマーの末端の隣接残基に関して、選択されたヌクレオチド配列が標的核酸内に存在する場合、このヌクレオチド配列の配列を明らかにする。当業者は、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列にヌクレオ塩基ポリマーを選択的にハイブリダイズするための、カチオン濃度、温度、ｐＨおよびオリゴヌクレオチド組成の様な適切な結合条件の選択を熟知している。
【０１６３】
末端の隣接残基の塩基対形成は、連結に影響するので、一実施形態において、結合反応に関与する３’末端ヌクレオ塩基を提供するヌクレオ塩基ポリマーは、標的配列に完全に相補的であるように設計され、一方、この結合反応に関与する５’末端ヌクレオ塩基残基を提供するヌクレオ塩基ポリマーは、５’末端ヌクレオ塩基以外の全てに完全に相補的であるように設計される。別の実施形態において、ヌクレオ塩基ポリマーは、３’末端ヌクレオ塩基を提供するヌクレオ塩基ポリマーが、３’末端ヌクレオ塩基残基以外に完全に相補的であるように設計され、一方、５’末端ヌクレオ塩基を提供するオリゴヌクレオチドは、完全に相補的である（Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．およびＷａｌｌａｃｅ，Ｂ．，（１９８９），Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｉｃｋ−ｃｌｏｓｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ，Ｇｅｎｅ  ７６：２４５−２５４；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら（１９８８）Ａ  ｌｉｇａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４１：１０７７−１０８０）。
【０１６４】
上記の方法の改変において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブは、標的配列に相補的であるヌクレオ塩基配列を含むが、非標的配列に関して非末端ミスマッチを含む。本発明のこの局面において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブの組成および実験条件の性質は、プローブが標的配列にハイブリダイズするだけであるようなものである。この実施形態において、例えば、ハイブリダイズした移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマープローブの上流または下流のいずれかの標的ヌクレオ塩基にハイブリダイズする第２のヌクレオ塩基ポリマーが、このプローブに連結されて、標的ヌクレオチド配列の存在に診断的である連結された移動度改変生成物を形成し得る。
【０１６５】
上記の実施形態のさらなる改変において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、目的の部位にすぐ隣接している標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列にハイブリダイズされる。第２の配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、標的核酸内の選択された領域にハイブリダイズされ、その結果、このハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１ヌクレオチド残基のギャップだけ離される。別の実施形態においてこのギャップの長さは、標的核酸中の単一のポリヌクレオチド多型を示す単一のヌクレオチド残基である。ハイブリダイゼーションの後、この複合体（これは、標的核酸にハイブリダイズされた２つのヌクレオ塩基ポリマーから構成される）は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、核酸ポリメラーゼで処理される。提供されるデオキシリボヌクレオシド三リン酸が標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド残基（これはギャップを規定する）に相補的である場合、ポリメラーゼは、２つのハイブリダイズされたヌクレオ塩基ポリマーの間のギャップを満たす。続くリガーゼでの処理は、この２つのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを結合して、連結された移動度改変生成物を形成し、これは、一実施形態において、末端解離によりテンプレートから分離され、それにより、特有の電荷  対  並進摩擦抵抗の比を有する診断用生成物を提供する。この診断用生成物は、一般に、レポーター分子を含み、これは、上で開示された方法を使用して、重合活性により付加された１つ以上のヌクレオ塩基に結合されているか、またはヌクレオ塩基ポリマーの共有結合の後に付加されたかのいずれかの、連結されたヌクレオ塩基ポリマー内に含まれ得る。４つより少ないヌクレオシド三リン酸の存在下でポリメラーゼを用いて処理することによって、ギャップを含むヌクレオチド残基が、決定され得る。連結された移動度改変生成物のさらなる増幅は、変性、アニーリング、核酸ポリメラーゼギャップの充填、および少なくとも１つのヌクレオシド三リン酸の存在下における連結の繰返しサイクルによって、達成される。
【０１６６】
核酸ポリメラーゼでの処理が、１つの標識ヌクレオシド三リン酸または１つの標識ヌクレオシド三リン酸と３つの非標識ヌクレオシド三リン酸とを含む混合物の存在下で行われる場合、少なくとも１つの組み込まれた標識ヌクレオシドを含む連結された移動度改変生成物は、標識された移動度改変連結生成物の電気泳動分離の際に、容易に検出される。ヌクレオチド混合物を、１つの標識ヌクレオシド三リン酸と３つの鎖終結ヌクレオシド三リン酸とを有するヌクレオチド混合物に改変することは、間違って組み込まれたヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチドの望まない連結を抑制する。
【０１６７】
本発明の移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーはまた、チェーンターミネーター（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法（当業者に周知の方法）による核酸配列の分析のためのプライマーとして、有用である。1つの実施形態において、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマーは、標的核酸にハイブリダイズされ、そしてヌクレオシド三リン酸および鎖終結ヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下において、核酸ポリメラーゼによって伸展される。このポリメラーゼ反応は、鎖終結した移動度が改変された複数の核酸フラグメント（例えば、キャピラリー電気泳動によって分離される）を産生する。この組み込まれた鎖終結ヌクレオシド三リン酸による鎖終結は、終結された核酸フラグメントの３’末端残基を同定する。
【０１６８】
この鎖終結した種を検出する目的のために、移動度が改変された核酸フラグメントの種々の置換基が、検出可能なレポーター分子との結合に受け入れられる。これらは、移動度を改変するポリマー上の官能基、移動度を改変するポリマーを配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーに連結するリン酸トリエステル基、または、核酸の中に組み込まれるヌクレオシド三リン酸前駆体（チェーンターミネーターを含む）を含む。検出可能なレポーター分子は、放射性分子、化学発光分子、生物発光分子、蛍光分子またはリガンド分子であり得る。１つの実施形態において、この検出可能な標識は、蛍光分子であり、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、およびシアニン色素ならびにこれらの誘導体である。別の実施形態において、これらの蛍光色素は、蛍光標識によって引き起こされる核酸の電気泳動移動度における変動を減少するように移動度が改変される（例えば、Ｊｕ，Ｊ．ら（１９９５）。Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１：１３１−４０；Ｍｅｔｚｋｅｒら（１９９６）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：１４２０−２２；Ｈｕｎｇ  Ｓ．Ｃ．ら（１９９７）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｄｏｎｏｒ−ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｄｙｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２：７７−８８；Ｔｕ，Ｏ．ら（１９９８）Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２７９７−２８０２）を参照のこと）。
【０１６９】
1つの実施形態において、本発明の移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、標的ポリヌクレオチド内の選択された領域を配列決定するための形式で使用され、ここで４つのスペクトルで分解可能な蛍光分子のうちの１つが、４つの鎖終結ヌクレオシド三リン酸うちの１つを有する、反応系中の核酸フラグメントを標識するために使用される。この実施形態の別の局面において、本発明の移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、標的ポリヌクレオチド内の選択された領域を配列決定するために使用され、ここで、４つのスペクトルで分解可能な蛍光分子のうちの１つが、４つの鎖終結ヌクレオシド三リン酸のうちの１つを含む、反応系中のオリゴヌクレオチドプライマーを標識するために使用される。従って、この実施形態の両局面において、鎖終結した核酸フラグメントの蛍光の色を検出することによって、３’末端ヌクレオチド残基を同定する。代表的に単一のゲルレーンまたはキャピラリーでの、４つのスペクトルで分解可能な蛍光分子の同時オンライン検出を伴う、電気泳動による鎖終結した生成物の分離は、分離された核酸フラグメントの色からの迅速な配列決定を可能にする（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８５），Ａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  Ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：３３６−３４１；Ｋａｒｇｅｒ，Ａ．Ｅ．ら（１９９１），Ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１８）：４９５５−６２）。
【０１７０】
目的のヌクレオチド配列が標的核酸の小さな領域（例えば、単一ヌクレオチド多型を含む部位）の場合、改変された配列決定形式が、必要に応じて、使用される。１つのこのような実施形態において、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの３’末端ヌクレオチド残基が目的部位に直接隣接するような、配列特異的様式でハイブリダイズされる。ハイブリダイズされたヌクレオ塩基ポリマーは、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシド三リン酸の存在下で、核酸ポリメラーゼによって伸長され、鎖終結ヌクレオチドが、ハイブリダイズされた移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの３’末端の直ぐ下流にある標的核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）残基に相補的である場合、このオリゴヌクレオチドは、１ヌクレオチドだけ伸長する。伸長され、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの分離および検出は、ハイブリダイズされた移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマープライマーに直接隣接する残基のアイデンティティー（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を提供する。この実施形態において、複数の異なる、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの使用は、単一分離における複数の標的配列の同時の検出および分析を可能にする。
【０１７１】
この伸長されたプライマーを検出することは、伸長され、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーに結合されたレポーター分子を含むことによって達成され、これは、標準的な配列決定反応に関する上記の様式と同じ様式でプライマーとして使用される。従って、１つの実施形態において、この鎖終結ヌクレオシド三リン酸は、蛍光標識が鎖終結ヌクレオシドを固有に同定するような、４つのスペクトルで分解可能な蛍光分子のうちの１つで標識される。ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーに直接隣接した残基の組成は、次いで、この伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの色から容易に確認される。当業者には明白であるが、この改変された配列決定形式は、蛍光標識された鎖終結ヌクレオシド三リン酸の他の混合物に適合可能である。従って、この実施形態は、２つまたは４つの鎖終結ヌクレオシド三リン酸を有するヌクレオチドの組み合わせを含み、ここで１つのみのチェーンターミネーターが、４つの分解可能なレポーター標識のうちの１つで識別される。伸長反応の生成物を混合し、その後単一のゲルレーンまたはキャピラリーで伸長された生成物を分離および検出することによって、このハイブリダイズされたプライマーに隣接するヌクレオチド残基における全ての可能な配列バリエーションを決定する能力が提供される。この方法の感度のさらなる増大は、実質的にエキソヌクレアーゼ耐性のチェーンターミネーター（例えば、チオエステルヌクレオチド間の連結を形成して、ポリメラーゼ関連エキソヌクレアーゼによる、組み込まれたチェーンターミネーターの除去を減少させるチェーンターミネーター）を使用することによって、可能である。
【０１７２】
別の実施形態において、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、１つ以上の標的核酸内の選択されたヌクレオチドを検出および増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される。（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−Ｇｌｏｂｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｃｋｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｅｍｉａ，Ｉｎ  ＰＣＲ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｑｕｉｒｋｅ，およびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）。本発明のこの局面において、この検出方法は、標的核酸内のヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅を含む。この局面において、固定化され得る標的核酸は、複数の配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーと接触され、そのうちの２つが、標的核酸内のヌクレオチド配列の反対端において、相補鎖にハイブリダイズする。このハイブリダイズされた配列特異的なオリゴヌクレオチドの伸長の繰り返されるサイクルは、必要に応じて熱耐性ポリメラーゼ、伸長された生成物の熱変性および熱解離、ならびにアニーリングによって、２つのヌクレオ塩基ポリマーによって挟まれた領域の幾何学的な伸長を提供する。従って、このようなポリメラーゼ連鎖反応生成物は、２本の鎖からなる二本鎖の分子であり、これらの各々が配列特異的なヌクレオ塩基ポリマープローブを含む。本発明のこの局面において、少なくとも１つの配列特異的なオリゴヌクレオチドは、二本鎖のポリメラーゼ連鎖反応生成物が電荷対並進摩擦抵抗（ｆｒｉｃｔｉｏｎａｌ  ｄｒａｇ）の特有の比を有するように、構造式（ＩＩ）および構造式（ＩＩＩ）からなる群から選択される、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーである。本発明のこの局面において形成されるポリメラーゼ連鎖反応生成物は、標識をさらに含み、この標識は、プライマーとして使用される配列特異的なヌクレオ塩基ポリマープローブのいずれの中に組み込まれ得るか、または重合酵素によって使用される、基質デオキシリボヌクレオシド三リン酸内に組み込まれ得る。さらなる別の局面においては、形成されるポリメラーゼ連鎖反応生成物は、分離された一本鎖の生成物を提供する変性する条件下で分析される。この局面において、この一本鎖生成物の少なくとも1つは、標識と、構造式（ＩＩ）および構造式（ＩＩＩ）からなる群から選択された、移動度が改変された配列特異的な核酸ポリマープライマーとの両方を含み、その結果、二本鎖のポリメラーゼ連鎖反応生成物に由来する一本鎖の生成物が、電荷対並進摩擦抵抗の特有の比を有する。当業者に周知であるが、このような一本鎖の生成物はまた、プライマーとして使用される２つの配列特異的なヌクレオ塩基ポリマープローブのうちの１つの量を限定してＰＣＲ反応を行うことによって、生成され得る。特有の移動度が改変された配列特異的な核酸またはヌクレオ塩基をプライマーとしてのポリマー使用することによって、ＰＣＲ反応は、１つのＰＣＲ生���物を別のものから分離することを可能にすることによって、単一アッセイにおいて１つ以上の標的ポリヌクレオチド内での多くの選択された領域を検出し得る。さらに、当業者は、ヌクレオ塩基ポリマープライマーの種々の組み合わせを使用することが、特有の、移動度が改変されたＰＣＲ生成物を生成するさらなる方法を提供することを認識する。例えば、ＰＣＲ反応における移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマーおよび第二のヌクレオ塩基ポリマープライマーのペアの組み合わせは、移動度が改変された１本鎖を有するＰＣＲ生成物を生成する。他方において、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマー、および同様に移動度が改変された第二のヌクレオ塩基ポリマーの組み合わせは、移動度が改変される両方の鎖を有するＰＣＲ生成物を生成し、従ってこれ自身を移動度が改変された１つの鎖を有するＰＣＲ生成物から区別する。従って、移動度を改変する基の型、および移動度が改変される核酸鎖を変えることによって、この実施形態は、複数の標的セグメントを検出する能力を拡大する。
【０１７３】
ＰＣＲ生成物の検出は、電気泳動での分離の間か、または電気泳動での分離後のいずれかで達成され得る。インターカレーティング色素（臭化エチジウム、臭化エチジウムダイマーのような色素、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、またはＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、およびＢＯＢＯのような、シアニン色素ダイマー）は、分離検出後に利用可能である（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，１９９６）。あるいは、このＰＣＲ生成物としては、さらに以下のレポーター分子が挙げられるが、これらに限定されない：電気泳動分離の間か、または電気泳動分離後かのいずれかでの検出を可能にする、放射分子、化学発光分子、生物発光分子、蛍光分子、またはリガンド分子。移動度が改変されたＰＣＲ生成物を標識する方法は、以下に記載される他の方法で標識するために提示される一般的なスキームに従う。
【０１７４】
ＰＣＲ増幅による標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列を検出することはまた、標的核酸のセグメント内の配列の改変体を同定することを包含する。これらの改変体としては、とりわけ、単一ヌクレオチド多型、および配列タグ部位（ＳＴＳ）によって規定されるような可変ヌクレオチドタンデムリピート（ＶＮＴＲ）の多型、およびショートタンデムリピート（ＳＴＲ）における多型を含む。多型遺伝子座を同定することは、特別の目的である。なぜならば、これらは、しばしば疾患感受性についての遺伝子マーカーであるからである（例えば、Ｇａｓｔｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．，（１９９５），Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，４（１０）：１８２９−３６；Ｋｉｍｐｔｏｎ，Ｃ．Ｐ．，（１９９３）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｌｏｃｉ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３（１）：１３−２２を参照のこと）。この多型が、ＶＮＴＲ配列またはＳＴＲ配列における改変体に関連する場合、この生成物は、ヌクレオチドの長さが異なるので、さらなる処理のないＰＣＲ生成物の直接的な分析が、多型を検出するのに十分である。しかし、移動度が改変されたＰＣＲ生成物の存在は、単一反応において、複数の多型遺伝子座を検出するためのＰＣＲ分析の能力を拡大する。
【０１７５】
多型が単一ヌクレオチドの差異に関連する場合、これらの改変体は、標的核酸内の選択された核酸配列との、ミスマッチを有するように設計されるヌクレオ塩基ポリマープライマーを使用してＰＣＲ反応を行うことによって、検出可能である。ヌクレオ塩基ポリマープライマーと、標的核酸内の選択された核酸配列とのハイブリダイゼーションによって形成された、二重鎖内の意図的なミスマッチの存在は、これらの構造のＴｍに反映される、これらの二重鎖分子の熱的安定性に影響し、従って、選択された条件下では、別のものと比較して１つの標的セグメントの優先的な増幅を生じる。このような対立遺伝子特異的なポリメラーゼ連鎖反応は、１つ以上の標的核酸内の、他のヌクレオチド配列の高バックグラウンド間の低コピー数の１つの選択されたヌクレオチド配列を含む単一細胞、または単一組織における変異の同定を可能にする（Ｃｈａ，Ｒ．Ｓ．，（１９９３）、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（ＭＡＭＡ）：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−Ｈ−ｒａｓ  ｇｅｎｅ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２（１）１４−２０；Ｇｌａａｂ．，Ｗ．Ｅ．ら（１９９９）、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ５’  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  （ＴａｑＭａｎ（登録商標））  ａｎｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４３０：１−１２）。
【０１７６】
さらなる別の局面において、単一ヌクレオチドの差異が，配列に依存する様式で、形成する一本鎖の核酸のより高次のコンフォメーションの分析によって区別される。この実施形態において、一本鎖の核酸は、一本鎖へとＰＣＲ生成物を分離することによるか、またはＰＣＲ反応（すなわち、片面ＰＣＲ）における制限量の１つのプライマーを使用することにより、一つの鎖を優先的に増幅することによって生成される。選択された条件下で、この一本鎖核酸が、一本鎖核酸の分子内水素結合によってより高次の構造を形成することを可能とする。当業者は、より高次の構造を形成するため、このような許容的な条件（すなわち、温度、変性濃度、ｐＨ、カチオン濃度等）を規定することによく精通している。従って、配列依存性であり、そして単一ヌクレオチドの変化に対して極端に敏感であり得る、これらのコンフォメーションは、核酸の電気泳動移動度に影響し、従って、これらの固有の電気泳動移動度プロフィールによる、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列におけるバリエーションを示す。より高次の構造を増強するために、改変がＰＣＲ反応のために使用されるヌクレオ塩基ポリマープライマーの中に導入される。例えば、ヌクレオ塩基ポリマープライマーは、配列改変体を含む標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列の一部に相補的なさらなる塩基を用いて操作され、その結果、ヌクレオ塩基ポリマープライマー上のさらなる塩基が、正常な配列に対して「スナップバック（ｓｎａｐｂａｃｋ）」または再アニール（ｒｅ−ａｎｎｅａｌ）するが、改変体配列に対しては「スナップバック」も再アニールもしない場合、より高次のコンフォメーションが形成する（Ｗｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．（１９９８）Ｓｎａｐｂａｃｋ  ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．  １１（３）：２５２−８）。単一ヌクレオチド改変体の検出の信頼性は、一本鎖のヌクレオ塩基ポリマーの大きさによって影響されるので、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマー（電荷対並進摩擦抵抗の特有の比の電荷を有する）を使用するコンフォメーション分析は、より高次の構造を形成するのに必要な最適の長さを維持している間に、標的核酸内の複数の選択されたヌクレオチド配列の検出を可能にする（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．，（１９９３），Ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６（２）：３２５−３２）。
【０１７７】
本発明のさらなる局面において、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーが、１つ以上の標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列を検出するために切断される。１つのこのような実施形態において、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、１つ以上の標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列にハイブリダイズされる。別の実施形態において、少なくとも１つの移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーを含む移動度が改変されたＰＣＲ生成物は、制限酵素のような、配列特異的な酵素の基質として作用する。酵素による基質の消化は、標的ポリヌクレオチドの配列組成に関する情報を提供する、電荷対平行運動摩擦抵抗の特有の比を有する切断された生成物を生成する。制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析のこの形態は、当業者に周知である（例えば、Ｋｉｄｄ，Ｉ．Ｍ．，（１９９８）Ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ６  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ７，  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＨＨＶ−６  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７０  （１）：２９−３６；Ｇｅｌｅｒｎｔｅｒ，Ｊ．，（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｓｉｔｅｓ（ＳＴＳ）Ｔａｑ  Ｉ  ＲＦＬＰ  ａｔ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９（８）：１９５７を参照のこと）。
【０１７８】
別の局面において、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列にハイブリダイズした、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマー（ここで標的核酸中の対応するヌクレオ塩基に相補的でない少なくとも１つのヌクレオ塩基が存在する）が、非塩基対形成ヌクレオチド残基を特異的に切断する薬剤を用いて、処理される。一般的に、この不対残基は、ハイブリダイズした、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマー上に存在する（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら（１９８９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．１７，６８２１−６８４０）。染色体ＤＮＡは、標的核酸として、作用し得るが、標的核酸は、標的核酸の選択されたヌクレオチド配列を含むクローン化されたＤＮＡフラグメント、または標的核酸の選択されたヌクレオチド配列を含むＰＣＲ増幅生成物である。
【０１７９】
切断は、化学試薬または酵素試薬のいずれかを用いて達成され得る。化学切断反応において、少なくとも１つの非相補的ヌクレオ塩基を含むハイブリッドが、不対残基を特異的に改変する化学物質を用いて処理され、改変ヌクレオシドのヌクレオチド間の連結を加水分解に対して感受性にする。適切な化学薬品には、カルボジイミド、四酸化オスミウム、ヒドロキルアミン、過マンガン酸カリウム／塩化テトラエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない（Ｅｌｌｉｓ，Ｔ．Ｐ．ら（１９９８）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈ：  ａ  ｎｅｗ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ａｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．１１：３４５−５３；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅ．，（１９９７）、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｅｒｍａｎｇａｎａｔｅ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｒｅ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｏｓｍｉｕｍ  ｔｅｔｒａｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３７７−７８）。四酸化オスミウムよりもむしろ過マンガン酸カリウム／塩化テトラエチルアンモニウムの使用が、Ｔ／Ｇミスマッチした対における切断を増強する。
【０１８０】
酵素的に切断する試薬は、不対領域を認識する種々のヌクレアーゼを含む。これらとしては、以下の１本鎖の特異的なヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｕｅに由来するＳ１ヌクレアーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍに由来するＰ１ヌクレアーゼ、およびマングビーンヌクレアーゼ  （Ｓｈｅｎｋら（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２  ９８９−９３）。これらのヌクレアーゼは、単一ヌクレオチドのミスマッチに対してより反応的でないが、これらは、より長い挿入および欠失によって生成される不対残基を消化し得る（Ｄｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．ら（１９７７）Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ＤＮＡ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６：２３７４−４９）。Ｃｅｌ１エンドヌクレアーゼおよびＳＰエンドヌクレアーゼは、標的核酸の選択されたヌクレオチド配列内の欠失、挿入、およびミスセンス変異を含むヌクレオチド配列改変体から生じる、不対ヌクレオチド残基に対する活性を示す（Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ａ．，（１９９８）、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｎｔ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：４５９７−６０２；Ｙｅｕｎｇ，Ａ．Ｔ．，米国特許５，８６９，２４５号）。バクテリオファージおよび酵母のような種々の供給源に由来するレソルバーゼは、本発明のこの実施形態において有用な，切断酵素のさらなる別クラスを示す。レソルバーゼの代表的な例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ファージによりコードされるＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩおよびＴ７エンドヌクレアーゼＩ（この両方がミスマッチにおいて切断する）。（Ｃｏｔｔｏｎ，Ｒ．Ｇ．Ｈ．，米国特許第５，９５８，６９２号；Ｓｏｌａｒｏ，ら（１９９３），Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ｔ４  Ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０：  ８６８−８７７；（Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９１）、Ｂａｓｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９（１７）：４７６１−６６）。
【０１８１】
別の局面において、本発明は、不対残基における切断を阻害する方法を包含する。タンパク質には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：二重鎖核酸構造における単一ヌクレオチドのミスマッチ部位に結合するＥ．ｃｏｌｉ．のＭｕｔＳタンパク質（Ｓｕ，Ｓ．Ｓ．ら（１９８６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５０５７−５０６１）。ＭｕｔＳタンパク質は、メチル化Ｅ  ｃｏｌｉ指向性ＭｕｔＨ／Ｓ／Ｌミスマッチ修復システムの一部であり、その相同体は、他の細菌、酵母および哺乳動物の中に存在する。（Ｅｉｓｅｎ，Ｊ．Ａ．，（１９９８），Ａ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭｕｔＳ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：４２９１−３００；Ａｌａｎｉ，Ｅ．（１９９６），Ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｓｈ２  ａｎｄ  Ｍｓｈ６  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒｍ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｄｕｐｌｅｘ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：５６０４−１５；Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．ら（１９９６），Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ，ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１０１−３３）。従って、本発明の１つの実施形態において、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列を有する、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーのハイブリダイゼーションによって形成される少なくとも１つの非塩基対形成ヌクレオ塩基単位を含む二重鎖構造は、ＭｕｔＳのようなミスマッチ結合タンパク質を用いて処理され、次いで一方向性の様式で二重鎖を分解する１つ以上のエキソヌクレアーゼに曝露される。結合したミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含む鎖上に対するエキソヌクレアーゼのさらなる作用を阻害し、それによって規定された長さの核酸生産物を提供し、これらは、特有の電荷対並進摩擦抵抗比を所有する（Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ａ．，（１９９４），ＭｕｔＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１３）：２７１０−１；Ｔａｙｌｏｒ，  Ｇ．Ｒ．，米国特許第５，９１９，６２３号）。このアッセイにおける使用に適切な一方向性のエキソヌクレアーゼには、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：エキソヌクレアーゼＩＩＩ、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ、およびＴ７  ＤＮＡ  ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ、および  Ｖ��ｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ。
【０１８２】
さらなる別の局面においては、内部ＲＮＡセグメントがＤＮＡセグメントによって隣接される場合、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列を検出するための切断ベースの方法において使用される、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ核酸ポリマーであり得る。この３部からなる移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、全体の（すなわち、３部ヌクレオ塩基ポリマー）のＴｍより低い温度において、標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列にハイブリダイズされる。適切なＲＮａｓｅによるこの二重鎖構造の消化は、ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズされる場合、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡヌクレオ塩基ポリマーのＲＮＡ部分のみを加水分解する。１つの実施形態において、このＲＮａｓｅは、温度安定性ＲＮａｓｅ  Ｈである（Ｂｅｋｋａｏｕｉ，Ｆ．，（１９９６）Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０（２）：２４０−８）。内部ＲＮＡセグメントの消化後に残存している、隣接しているＤＮＡセグメントのＴｍよりも高く反応温度が維持される場合、これらのＤＮＡセグメントが解離し、従って別のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴマーが標的ポリヌクレオチドと結合することを可能にする。繰り返されるハイブリダイゼーション、ＲＮＡ切断、および隣接ＤＮＡセグメントの解離は、検出可能な解離ＤＮＡセグメントのレベルを増幅する。この反応温度は、１つの実施形態において、増幅工程の間一定に保持され、従って熱サイクリングのためにすべての必要なものを取り除く（Ｄｕｃｋ，Ｐ．（１９９０），Ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ９：１４２−４８；Ｍｏｄｒｕｓａｎ，Ｚ．（１９９８）Ｓｐｅｒｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １２：１０７−１６）。本発明のこの局面において、使用される配列特異的ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡヌクレオ塩基ポリマーは、少なくとも１つの移動度を改変するポリマー、および隣接するＤＮＡセグメントのいずれかまたは両方に結合した少なくとも１つのレポーター分子を含み、それによって電荷対並進摩擦抵抗の比を有する標識された消化生成物を提供する。
【０１８３】
別の局面において、移動度が改変されたヌクレオ塩基ポリマーの切断に基づいた１つ以上の標的核酸内の選択されたヌクレオチド配列の検出は、Ｂｒｏｗら，米国特許第５，８４６，７１７号に記載されるような、侵襲性ハイブリダイゼーションによって形成される切断基質に依存する。この実施形態において、レポーター分子を含み、そして標的核酸にハイブリダイズする移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの５’部分は、同一領域にハイブリダイズする第二のヌクレオ塩基ポリマーによって置換され、そしてそれによって、その置換された配列を、切断試薬を用いた切断にて曝露する。この実施形態を実施することにおいて、この標的核酸を、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーおよび第二のヌクレオ塩基ポリマーと接触させる。移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーは、標的核酸内に含まれる選択されたヌクレオチド配列の第二の領域に相補的な５’セグメントおよび標的核酸内に含まれる選択されたヌクレオチド配列の第三の領域に相補的な３’部分を有し、ここでこの第二の領域は、第三の領域から下流にある。この第二のヌクレオ塩基ポリマーは、標的核酸内に含まれる選択されたヌクレオチド配列の第一の領域に相補的な５’セグメント、および標的核酸内に含まれる選択されたヌクレオチド配列の第二の領域に相補的な３’セグメントを有し、ここで第一の領域は、第二の領域から下流にある。選択された条件下で、ハイブリッドは、その中に、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーおよび標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする第二のヌクレオ塩基ポリマーを形成し、その結果、第二のヌクレオ塩基ポリマーがハイブリダイズされた移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの５’部分を置換し、その一方、移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの３’部分および第二のヌクレオ塩基ポリマーの５’部分は、標的核酸内に含まれる選択されたヌクレオチド配列にアニールされたままである。移動度が改変された配列特異的なヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に対応する塩基対でない１本鎖セグメントである置換された鎖は、その後、切断ヌクレアーゼに対する基質として作用し、従って、標的ポリヌクレオチド上の特異的配列の存在を反映する電荷対並進摩擦抵抗の特有の比を有する別個の移動度が改変された消化生成物を生成する。
【０１８４】
置換された鎖を認識する切断酵素は、天然に存在するヌクレアーゼか、または改変されたヌクレアーゼのいずれかである。天然に存在する構造特異的なヌクレアーゼには、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｉｉ  ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、熱安定性のＭｅｔｈｏａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、酵母Ｒａｄ２、および酵母Ｒａｄ１／酵母Ｒａｄ１０複合体（Ｋａｉｓｅｒら、米国特許第６，０９０，６０６号、Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ；  Ｋａｉｓｅｒら、米国特許第５，８４３，６６９号，Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｍｅｔｈｏａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＦＥＮ−１  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）。切断反応に適切な他の構造特異的な酵素は、公知のヌクレアーゼおよびポリメラーゼの改変体に由来する。（Ｄａｈｌｂｅｒｇら、米国特許第５７９５７６３号，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｄａｈｌｂｅｒｇら、米国特許第６，６１４，４０２号、５’Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）。ポリメラーゼ活性を欠損するが、まだ５’−ヌクレアーゼ活性を保持する、改変されたポリメラーゼはまた、切断試薬として、使用される。
【０１８５】
別の実施形態は、標的核酸にハイブリダイズする２つの重複するヌクレオ塩基ポリマーによって形成された構造のフラップエンドヌクレアーゼ切断に基づくＳＮＰを同定する手順「インベーダーアッセイ（ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ）」における本発明の移動度を改変するポリマーの使用に関する（例えば、Ｃｏｏｋｓｅｙら、２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｉｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４４：１２９６−１３０１を参照のこと）。このような切断反応は、「下流」ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端ヌクレオ塩基（単数または複数）に対応する生成物を放出する。これらの切断生成物が標識され、そして切断されないヌクレオ塩基ポリマーから分離され得る場合、インベーダーアッセイは、例えば、ゲノム配列またはＰＣＲで増幅されたゲノム配列の単一塩基の相違を識別するために使用され得る。
【０１８６】
インベーダーアッセイに使用される下流のヌクレオ塩基ポリマーの標識された５’末端への本発明の移動度を改変するポリマーの付着は、特有の電荷対並進摩擦抵抗比を有する、検出可能な標識された切断生成物を提供する。従って、複数のＳＮＰが、複数の配列特異的な下流のヌクレオ塩基ポリマーを同時に使用して分析され、ここで配列特異的な下流のヌクレオ塩基ポリマーは、標識された５’末端に付着された本発明の移動度を改変するポリマーを含み、その結果、各々のＳＮＰにおいてフラップエンドヌクレアーゼの切断によって生成される標識された生成物は、電荷対並進摩擦抵抗の特有の比を有する。
【０１８７】
このインベーダーアッセイのさらなる局面において、例えば、標識および５’末端に付着された本発明の第一の移動度を改変するポリマーを保持する、下流のヌクレオ塩基ポリマーは、３’末端に付着された第二の移動度を改変するポリマーをさらに含む。この第二の移動度を改変するポリマーの存在は、５’末端、標識、および第一の移動度を改変するポリマー、ならびに切断されない下流のヌクレオ塩基ポリマーを含む、フラップエンドヌクレアーゼで生成された生成物の電気泳動移動度間の差異を増強することによって、インベーダーアッセイの感度を増大する。従って、第二の移動度を改変するポリマーは、少なくとも２０００の分子量を有する。他の実施形態においては、第二の移動度を改変するポリマーは、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、および少なくとも１００，０００の分子量を有する。１つの実施形態においては、第二の移動度を改変するポリマーは、本発明の移動度を改変するポリマーであり、その一方、他の実施形態においては、第二の移動度を改変するポリマーは、当該分野の移動度を改変するポリマーであり、これは、１つの例の限定されない例として、荷電されないモノメチルポリエチレングリコールポリマーである。さらに、第二の移動度を改変するポリマーは、異なる分子量の種の混合物を、これらの種が、シグナル生成物（例えば、５’末端、標識、および第一の移動度を改変するポリマーを含む、フラップエンドヌクレアーゼで生成される生成物）の検出を実質的に妨害しないことを条件に含み得る（下記の実施例５を参照のこと）。
【０１８８】
より一般的に、本発明の他の実施形態において、下流のオリゴヌクレオ塩基（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）ポリマーが、標識および下流のオリゴヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域に結合した本発明の移動度改変ポリマー、ならびに下流のオリゴヌクレオ塩基ポリマーの第２の領域に結合した第２の高分子量移動度改変ポリマーを含むインベーダーアッセイが、実行され、ここで、第１および第２の領域は、フラップエンドヌクレアーゼ切断部位によって分離される。この実施形態の１つの局面は、上記および実施例５に記載され、ここで、標識および本発明の移動度改変ポリマーは、配列特異的オリゴヌクレオ塩基ポリマーの５’末端に結合され、そして第２の高分子量移動度改変ポリマーは、配列特異的オリゴヌクレオ塩基の３’末端に結合される。他の実施形態において、例えば、第２の高分子量移動度改変ポリマーは、リンカーアームのヌクレオチド残基を介して、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの５’末端または３’末端よりも、配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーに結合される。従って、第２の高分子量移動度改変ポリマーは、下流のヌクレオ塩基ポリマーの第２の領域内の任意のヌクレオ塩基残基か、または５’末端もしくは３’末端（どちらかが下流のオリゴヌクレオ塩基ポリマーの第２の領域内に含まれる）に結合される。同様に、いくつかの実施形態において、特定の非限定的な例における蛍光染料である標識はまた、下流ヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域内の任意のヌクレオ塩基残基でのリンカーアームのヌクレオチド残基を介して、結合される。このようなリンカーアームのヌクレオチド（例えば、リンカーに対する蛍光染料または荷電していないモノメチルポリエチレングリコールポリマー）の合成およびカップリングは、当該分野の範囲内である（特に、上記の節４．５を参照のこと）。さらに、例えば、リンカーアームのヌクレオチドのホスホルアミダイトモノマーならびに蛍光部分を含むリンカーアームのヌクレオチドのホスホルアミダイトモノマーは、市販されている（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）。これらの実施形態において、本発明の移動度改変ポリマーは、下流のヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域に結合し、この結合の点は、５’末端または３’末端（どちらかが、下流のヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域内に囲まれている）であり得るか、または本発明の移動度改変ポリマーは、下流のヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域内に取り込まれ得、構造式（ＩＶ）に従う分子を提供する。従って、これらの実施形態の各々において、下流のヌクレオ塩基ポリマーの第２の領域に結合した第２の高分子量移動度改変ポリマーの存在は、標識および本発明の移動度改変ポリマーを含むフラップエンドヌクレアーゼ生成産物（すなわち、下流のオリゴヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域）の電気泳動的移動度と切断されていない下流のヌクレオ塩基ポリマーの電気泳動的移動度との間の差異を増強することによって、インベーダーアッセイの感受性を増大させる。
【０１８９】
インベーダーアッセイのなおさらなる実施形態において、下流のヌクレオ塩基ポリマーは、標識および第１の移動度改変ポリマーを保持し、このポリマーは、１つの非限定的な実施形態において、当該分野の標準的なＰＥＯ移動度改変ポリマーであり、これは、下流のヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域および下流のヌクレオ塩基ポリマーの第２の領域に結合される第２の高分子量移動度改変ポリマーに結合される。上記のように、第２の移動度改変ポリマーの存在は、フラップエンドヌクレアーゼ生成産物（すなわち、標識および第１の移動度改変ポリマーを含む下流のヌクレオ塩基ポリマーの第１の領域）の電気泳動的移動度と、切断されていない下流のヌクレオ塩基ポリマーの電気泳動的移動度との間の差異を増強することによってインベーダーアッセイの感受性を増大させる。従って、第２の移動度改変ポリマーは、少なくとも２０００の分子量を有する。他の実施形態において、第２の移動度改変ポリマーは、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、および少なくとも１００，０００の分子量を有する。１つの実施形態において、第２の移動度改変ポリマーは、本発明の移動度改変ポリマーであるが、他の実施形態において、第２の移動度改変ポリマーは、当該分野の移動度改変ポリマーであり、これは１つの例示的な非限定的な例において、切断されていないモノメチルポリエチルグリコールポリマーである。
【０１９０】
本発明の別の局面において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｇ．ら、米国特許第５，９９４，０６９号に記載されるような複数の連続的切断反応を含む検出反応における切断基質としての機能を果たす。この実施形態において、第１の切断構造は、上記のように形成され、本発明の実施形態において、第１のヌクレオ塩基ポリマーが、必要であれば移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであることを除く。反応混合物は、第２の標的核酸および第３のヌクレオ塩基ポリマーをさらに含み、これは移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーであり、そして少なくとも１つの結合されたレポーター分子をさらに含む。第２の標的ポリヌクレオチドは、第１、第２および第３の領域を有し、ここで、この第１の領域は、第２の領域の下流であり、そして第２の領域は、第３の領域の下流である。第３のヌクレオ塩基ポリマーは、第２の標的ポリヌクレオチドの第２の領域と完全に相補的な５’位および第２の標的ポリヌクレオチドの第３の領域と完全に相補的な３’位を有する。第１の切断構造の処理は、第４のヌクレオ塩基ポリマーの放出を生じ、これは、第２の標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な５’位および第２の標的ポリヌクレオチドの第２の領域と完全に相補的な３’位を有する。この放出された第４のヌクレオ塩基ポリマーは、第３のヌクレオ塩基ポリマーの３’位および第４のヌクレオ塩基ポリマーの５’位が第２の標的ポリヌクレオチドにアニールされたままの条件下で、第２の標的ポリヌクレオチドおよび第３のヌクレオ塩基ポリマーを有する切断構造を形成する。切断試薬を用いての第３のヌクレオ塩基ポリマーの切断は、レポーター分子および移動度改変ポリマーを含む第５および第６のヌクレオ塩基ポリマーのいずれかまたは両方を生成し、これによって、電荷と並進摩擦抵抗の特有の比を有する消化産物を提供する。第５のヌクレオ塩基ポリマーは、切断の際に放出されるが、第６のヌクレオ塩基ポリマーは、変性によって分離するまで、第２の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたままである。引き続く第５および第６のヌクレオ塩基ポリマーの分離および検出は、標的核酸内の第１および第２の選択されたヌクレオチド配列の存在についての情報を提供する。
【０１９１】
複数の連続的な切断反応を含むヌクレオチド配列の検出方法に関する、本発明のさらなる局面において、第１の切断構造は、上記に示されたような標的核酸内の第１および第２のヌクレオ塩基ポリマーおよび選択されたヌクレオチド配列によって形成される。この方法のこの局面は、移動度改変配列特異的第２標的ヌクレオ塩基ポリマーをさらに含み、これは第１、第２および第３の領域を含み、ここで、第１の領域は、第２の領域の下流であり、そして第２の領域の上流の第３の領域は、選択された条件下で、ハルピン構造を形成するように、自己に完全に相補的であり、また第２の領域に相補的である。切断試薬を用いての第１の切断構造の切断は、第４のヌクレオ塩基ポリマーを生成し、これはヌクレオ塩基ポリマーの、第１の領域に相補的な５’位および第２の領域に完全に相補的な３’位を有する。移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの第１および第２の領域に放出された第４のヌクレオ塩基ポリマーのハイブリダイゼーションは、第２の領域に相補的である置換された第３の領域を有する第２の切断構造を形成する。この第２の切断構造の切断は、第５および第６のヌクレオ塩基ポリマーを生成し（これらのいずれかは、移動度改変ポリマーおよび標識を含む）、これによって、荷電と並進摩擦抵抗の特有の比を有する消化産物を提供し、そしてこの分離および検出は、第１の標的核酸および第２のヌクレオ塩基ポリマーの存在についての情報を提供する。
【０１９２】
以下に示されるように、切断されたヌクレオ塩基ポリマーを標識しそして検出する方法は、切断反応の産物の標識および検出に等しく適用される。さらに、放出された切断産物の標識はまた、鋳型依存ポリメラーゼ（米国特許第６，０９０，６０６号（本明細書中で参考として特に援用される）に記載されるような末端トランスフェラーゼおよびポリＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない）による産物の伸長によって確立される。
【０１９３】
なお別の局面において、本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを一般的な方法において使用して、非ふるい媒体中において異なるサイズの標的核酸の電気泳動分離をもたらす。正常に、異なる長さの核酸（すなわち、異なる数のヌクレオ塩基残基からなる）は、それにもかかわらず、荷電と並進摩擦抵抗との本質的に不可欠な不変の比率を示す。従って、このような分子は、非ふるい媒体において、電気泳動的に分離され得ない。しかし、異なる長さの核酸を標的化するための本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの結合は、非ふるい媒体中において電気泳動分離をもたらす様式で、そして、それに十分な程度、標的核酸の荷電と並進摩擦抵抗との比率を変更する。さらに、ふるい媒体における電気泳動分離とは対照的に、本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーが結合されるより長い核酸は、同じ移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーが結合されるより短い核酸よりも迅速に移動する。出願人は、この意見に固執されることを望みはしないが、この分離は、質量およびサイズが規定された移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの、短い鎖の核酸分子よりも長い鎖の核酸分子に対する結合のほうが比例的に少ない効果に基づくということを、信じている。続いて、荷電と並進摩擦抵抗との比率は、より長い鎖の方が大きく、電場においてより長い鎖の核酸に、より速い速度を提供する。
【０１９４】
構造式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなる群から選択される移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの、異なる長さの核酸集団への結合は、種々のアプローチ（酵素的ライゲーション、または本発明の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの、分離されるべき異なる長さの核酸集団への直接的、合成的な組込み）によって達成され得る。
【０１９５】
この方法の１つの局面において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、異なる長さではあるが、５’末端に共通のヌクレオチド配列を有する核酸集団に酵素的に連結され、この５’末端の共通のヌクレオチド配列は、鎖終結核酸配列決定反応の産物内で見られるか、または、核酸基質の標識化５’末端を含む配列以外の全ての配列に認識されない化学的切断配列決定反応物において効果的に見られる。この実施形態において、合成鋳型オリゴヌクレオチド（２つの異なる配列領域を有する）を鋳型として使用して、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーのハイブリダイズ化３’末端を整列して、その結果、ハイブリダイズ化５’末端（これは、一般的にリン酸化される）に直接的に沿い（このことは、分離されるべき核酸集団に共通である）、２つの分子が共有結合されるのを可能にする。従って、合成鋳型オリゴヌクレオチド５’領域は、分離されるべき分子の共通の５’末端配列に相補的であるヌクレオチド配列からなるが、合成鋳型の３’領域は、結合されるべき移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの３’末端と相補的である配列からなる。このアプローチの別の実施形態において、分離されるべき核酸集団の共通の５’末端は、配列特異的制限エンドヌクレアーゼにより生成されるものに対応する。従って、合成鋳型核酸は、少なくとも８つのヌクレオ塩基からなり、これらの少なくとも３個は、分離されるべき分子集団の共通の５’配列に相補的である。このような鋳型核酸の設計、ならびにハイブリダイズされる標的核酸および移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの酵素的結合が行なわれる条件は、当業者に周知である。従って、本発明のこの実施形態は、異なるサイズの任意の分子集団に適用可能であり、ただし、それぞれは、少なくとも３つのヌクレオチド、特定の実施形態では少なくとも４つのヌクレオチド、およびさらなる実施形態では、少なくとも８つのヌクレオチドの共通の５’末端配列を有する。同様の手順（ここで、異なるサイズの分子集団に共通の配列が、３’末端に生じ、その結果、結合されるべき移動度改変配列特異的核は、３’末端に結合された移動度改変ポリマーでリン酸化された５’末端を有する）はまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１９６】
さらなる実施形態において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、例えば、配列決定ベクター内のヌクレオチド配列に相補的であるように、すなわち、サンガーの酵素的連鎖終結配列決定反応で使用される配列決定プライマーの結合部位の上流（すなわち、５’末端）となるように合成される。この実施形態において、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーは、連鎖終結配列決定反応の間の配列決定プライマーの伸長の前か、または後のいずれかに配列決定プライマーに酵素的に連結される。この実施形態において、移動度改変配列特異的核酸配列が合成されて、その結果、一旦鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされると、その３’末端は、ハイブリダイズされた配列決定プライマーの５’末端に直接的に沿うか、または３’末端は、配列決定プライマーの５’末端の上流の配列にハイブリダイズするかのいずれかである。後者の例において、得られたギャップは、核酸ポリメラーゼで充填され、そして、伸長された分子は、次いで、配列決定プライマーに酵素的に連結される。
【０１９７】
本発明の別の実施形態は、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーおよび移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリヌクレオチドの分離および検出に関する。オリゴヌクレオチドの分離は、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析によってもたらされる。電気泳動を使用する方法において、フォーマットは、薄く平らのチャンバーであり得る。別の実施形態において、分離は、キャピラリーチューブ中での電気泳動によって行われる。キャピラリー電気泳動の利点は、効率的な熱損失であり、これは、分離能を増大して、そして、高電場下での迅速な分離を可能にする。さらに、キャピラリーチューブの小さい直径は、キャピラリーアレイにおける複数のサンプルの分離を可能にする。
【０１９８】
ふるい媒体または非ふるい媒体は、本明細書中で開示される検出方法において生成される反応産物を含むが、これに限定されない移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーの分離に適用可能である。ふるい媒体としては、共有結合的に架橋されたマトリクス（例えば、ビスアクリルアミドで架橋されたポリアクリルアミド）（例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９８）Ｒａｐｉｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：９６６０；Ｓｗｅｒｄｌｏｗ，Ｈら、（１９９０）、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８（６）：１４１５−１４１９）、または直鎖状ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、またはヒドロキシエチルセルソース）（Ｚｈｕら、（１９９２），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４８０：３１１−３１９；Ｎａｔｈａｋａｒｎｉｋｉｔｋｏｏｌ，Ｓ．ら、（１９９２），Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １３：１８−３１を参照のこと）が挙げられる。
【０１９９】
１つの実施形態において、電気泳動媒体は、非ふるい媒体である。ポリヌクレオチドは非ふるい媒体中では容易に分離可能ではないけれども、移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーおよび移動度改変ヌクレオ塩基ポリヌクレオチドは、ヌクレオ塩基ポリマーおよびヌクレオ塩基ポリヌクレオチドが同じ長さである場合でさえ、非ふるい媒体中での分離を可能にする、荷電と並進摩擦抵抗との異なる比率を有する。
【０２００】
（４．７  キット）
本発明のキットは、１つ以上の移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを含む。このキットはまた、第２のヌクレオ塩基ポリマー、代表的にはオリゴヌクレオ塩基を含み、これは、必要に応じて、移動度が改変され、ここで、企図されるアッセイは、第２のオリゴヌクレオチドを必要とする；例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイおよびＰＣＲ分析のためのキット。同様に、リガーゼ鎖反応増幅のために設計されたキットは、少なくとも２つのさらなるヌクレオ塩基ポリマーをさらに含み、これらは共に、診断リガーゼ反応産物に相補的である。このキットはさらに、処理試薬（例えば、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ、ミスマッチ結合タンパク質、リガーゼおよびエキソヌクレアーゼ）もまた含み得る。配列決定に適切なプライマー伸長キット、または、単一塩基多型を検出するためのオリゴヌクレオチド伸長アッセイはさらに、ヌクレオシド三リン酸、および／または鎖終結ヌクレオチドを含む。このキットはまた、ハイブリダイゼーションおよび酵素処理を実行するための反応緩衝液を含み得る。
【０２０１】
本発明はさらに、本発明の１つ以上の移動度改変ホスホルアミダイト試薬を含むキットを含む。このようなキット中の１つ以上の移動度改変ホスホルアミダイト試薬はさらに、１つ以上の保護基、レポーター分子、またはリガンドを含み得る。このようなキットはまた、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの合成における使用のための、１つ以上の溶媒、試薬または固相表面結合ヌクレオ塩基材料を含み得る。
【実施例】
【０２０２】
（５．実施例）
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を図示するために役立ち、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきでない。
【０２０３】
（実施例１）
（ＤＭＴ保護ポリ（エチレンオキシド）アルカリホスホラミダイトの合成）
ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンを、トルエン中で三塩化リンおよびジイソプロピルアミンを反応させることにより合成した。５０ｍｌの得られたビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを、２５０ｍｌのフラスコに配置し、そして、３．０１ｍｌのエタノールを、２分間にわたりゆっくりと添加して、数日間この反応を進行させた。混合物の濾過および溶媒の除去後、ビス（ジイソプロピルアミノ）エチルホスファイトエステル試薬の構造を、３１Ｐおよび１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ中の３１Ｐ  ＮＭＲ、１２５．９ｐｐｍ）で分析した。
【０２０４】
モノジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護化ペンタエチレンオキシド（３．０ｇｍ、５．５ｍｍｏｌｅ）テトラゾールジイソプロピルアミン塩（０．０９５ｇｍ、０．０５５ｍｍｏｌｅ）を、１０ｍｌのメチレンクロリド中に溶解して、ビス（ジイソプロピルアミノ）エチルホスファイトエステル（１．７５ｇｍ、７．２ｍｍｏｌｅ）と１５時間反応させた。ホスホラミダイト産物、ＤＭＴ−ペンタエチレンオキシドエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイトを、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で２回洗浄し、その後、飽和ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、そして、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。この溶液を、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１００μｌ）を添加して塩基化し、そして、溶媒を除去した。回収された粗製物（４．２ｇｍ）を、シリカゲルクロマトグラフィーを使用して精製して、２．８ｇｍの産物（ＣＤ３ＣＮ中の３１Ｐ  ＮＭＲ、１４５．３ｐｐｍ）を得た。エチルエステルが欠如した移動度改変ホスホラミダイト試薬を合成するために、ＤＭＴ保護テトラエチレンオキシドを、βシアノエチルクロロＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスファイトと、標準的条件下（例えば、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ．Ｃ．ら、米国特許第４，９１４，２１０号を参照のこと）で反応させた。
【０２０５】
（実施例２）
（移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの合成）
３’ヌクレオシドで、テトラメチルローダミンを用いて標識された配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーを、標準的ホスホラミダイト化学を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４合成機で合成した。移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを合成するために、実施例１のホスホラミダイト試薬を、固定されたヌクレオ塩基ポリマーの５’ＯＨ末端と反応させた。その後のヨウ素を用いた酸化、および塩基を用いた脱保護は、βシアノエチルホスファイト結合をリン酸ジエステル結合に転換するが、エチルホスファイト結合は、エチルリン酸トリエステル結合に転換される。固体支持体からの切断および５５℃での４時間の塩基を用いた脱保護の後、ヌクレオ塩基ポリマーを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。８０％の酢酸１００μｌでの１５分間の処置により、最終ＤＭＴ保護基を除去した。移動度改変ヌクレオ塩基ポリマーを、を、ＰＤ１０カラムで精製した。
【０２０６】
（実施例３）
（移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの分離特性）
一連の１２残基のヌクレオ塩基ポリマー（「１２ｍｅｒ」）を合成し、ここで、このポリマーは、荷電リン酸ジエステル（ＰＥＯ）結合、または非荷電エチルリン酸トリエステル（ＰＥＥ）結合のいずれかを介してペンタエチレンオキシドの異なる移動度改変モノマーユニットに結合しており、これらを、実施例２に記載のように合成した。各化合物についての相対的な電気泳動移動度プロフィールを、非ふるい媒体におけるキャピラリー電気泳動（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）による分離によって評価した。蛍光内部サイズ標準により、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）ソフトウェアを使用するピーク遅延分析についての参照マーカーを提供した。
【０２０７】
非改変の１２ｍｅｒヌクレオ塩基ポリマーは、２４．７の明らかな塩基サイズで移動する。負に荷電したリン酸ジエステル結合を介してヌクレオ塩基ポリマー部分に共有結合されたペンタエチレンオキシドの３つのユニットの結合は、５．３塩基だけ１２ｍｅｒの移動度を遅延させるが、非荷電エチルリン酸トリエステル結合を介して結合されたペンタエチレンオキシドの単一のモノマーユニットだけでの改変は、８．３塩基だけ移動度を遅延させる。さらに、非荷電エチルリン酸トリエステル結合を介して結合された、さらなるペンタエチレンオキシドユニットの結合は、オリゴヌクレオチドの移動度の非線形の減少を生じる。
【０２０８】
【表１】
0004452445.tif 000019
ＴＭＲＡ：カルボキシテトラメチルローダミン
ＰＥＯ：リン酸ジエステル結合ペンタエチレンオキシド
ＰＥＥ：エチルリン酸トリエステル結合ペンタエチレンオキシド
（実施例４）
（インベーダーアッセイの合成改変オリゴヌクレオチド産物の分析）
インベーダーアッセイと一般にいわれるＳＮＰ同定手順は、標的核酸にハイブリダイズする２つの重複するオリゴヌクレオチドによって形成された構造のフラップエンドヌクレアーゼ切断に基づく（例えば、Ｃｏｏｋｓｅｙら、２０００、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４４：１２９６−１３０１を参照のこと）。このような切断反応は、下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドまたは５’末端オリゴヌクレオチドに対応する産物を放出する。これらの切断産物を標識し、そして、非切断オリゴヌクレオチドから分離し得る場合、インベーダーアッセイを使用して、例えば、ゲノム配列またはＰＣＲ増幅ゲノム配列中の単一塩基差異を識別し得る。
【０２０９】
例えば、インベーダーアッセイにおける使用のための、本発明の移動度改変ポリマーセグメントの有用性を立証するために、表２（これは、インベーダーアッセイ内で生成し得る例示的な反応産物を示す）の化合物を、上に開示される方法を使用して合成した。表２の化合物の各々を、指標として蛍光色素を用いて、５’末端を標識した。これらの化合物の各々の相対的移動度を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ機器、モデル番号３１０を使用して、キャピラリー電気泳動により決定し、そして、データ分析を、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアバージョン２．１ｆｃ４を使用して実施した。
【０２１０】
【表２】
0004452445.tif 000020
ＦＡＭ：カルボキシフルオレセイン
ＰＥＯ：リン酸ジエステル結合ペンタエチレンオキシド
ＰＥＥ：エチルリン酸トリエステル結合ペンタエチレンオキシド
表２中のデータは、本発明の移動度改変ポリマーセグメントにより提供される移動度に対して、特に、当該分野のリン酸ジエステル結合ペンタエチレンオキシドモノマーと比較して、予想外の大きな効果を立証する。表２のデータはさらに、本発明の移動度改変ホスホラミダイト機能付与試薬を使用して得られ得る電気泳動分離の程度を実証する。さらに、表２のデータはまた、中間移動の化合物が、本発明の移動度改変ホスホラミダイト機能付与試薬と、非限定的な例として、当該分野のリン酸ジエステル結合ペンタエチレンオキシドモノマーとを合わせることによって得られる、ということを立証する。
【０２１１】
（実施例５）
（インベーダーアッセイの切断化改変オリゴヌクレオチド産物の分析）
本発明の第１の移動度改変ポリマー、移動度改変ホスホラミダイト機能付与試薬（（ＰＥＥ）２）のダイマーに連結された蛍光色素（ＦＡＭ）を含むインベーダーアッセイプローブを、標準的ＤＮＡ合成方法およびＰＥＥホスホラミダイト試薬を使用して合成し、これらは以下のオリゴヌクレオチドに連結される：５’−ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＧＣ−３’−ＮＨ２。支持体からの切断および５５℃での４時間の塩基を用いた脱保護の後、このオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで精製した。オリゴヌクレオチド：５’−ＦＡＭ−（ＰＥＥ）２−ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＧＣ−３’−ＮＨ２を、水に溶解して、ＮａＨＣＯ３の存在下にて２時間、第２の移動度改変ポリマー、モノ−メチルポリエチレングリコール５０００プロピオン酸Ｎ−スクシニミジルエステル（Ｆｌｕｋａ）と連結させ、そして、ＨＰＬＣで精製し、誘導化された移動度改変産物５’−ＦＡＭ−（ＰＥＥ）２−ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＧＣ−３’−ＰＥＧ  ５０００を得た。
【０２１２】
インベーダーアッセイを、以下のＰＣＲプライマーを使用して、ＴＮＦ−α遺伝子に対応するヒトゲノムＤＮＡのセグメントの増幅により生成した５２７ｂｐのＰＣＲ産物を鋳型として使用して、実施する：５’−ＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＡＴＧＡ（順方向）および５’−ＴＣＴＣＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧ（逆方向）。インベーダーアッセイの最初の工程において、約０．２ｐｍｏｌｅのＰＣＲ産物を、９５℃で５分間、５ｐｍｏｌｅのインベーダープローブ（ｉｎｖａｄｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ）（５’−ＧＡＧＧＣＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＴ）の存在下で変性させた。第２の工程において、５０ｎｇのＣｌｅａｖａｓｅ  ＶＩＩを、１０ｐｍｏｌｅの５’−移動度改変オリゴヌクレオ塩基プローブ（５’−ＦＡＭ−（ＰＥＥ）２−ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＧＣ−３’ＰＥＧ  ５０００）を一緒に添加して、１０μｌの総反応容積はさらに、１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．０）、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０および０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含む。インベーダーアッセイを、６６℃にて１５時間インキュベートする。この反応を終結して、その１μｌのアリコートをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ機器、モデル番号３１０で電気泳動して、データ分析をＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアバージョン２．１ｆｃ４を使用して実施した。結果の分析は、切断産物である５’−ＦＡＭ−（ＰＥＥ）２−Ｇの存在を実証して、これらは、非切断プローブ（５’−ＦＡＭ−（ＰＥＥ）２−ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＧＣ−３’−ＰＥＧ  ５０００）から十分に分離される。非切断プローブを、第２の移動度改変ポリマーとして、３’末端標識プローブ（５’−ＦＡＭ−（ＰＥＥ）２−ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＧＣ−３’）に結合した市販のモノメチルポリエチレングリコールポリマー産物内に含まれる複数の分子量種から生じる、複数の近間隔ピークとして検出した。
【０２１３】
本明細書中で言及される全ての出版物および特許は、本明細書中でその全体が参考として援用される。分子生物学の当業者によって認識されるように、移動度改変配列特異的ヌクレオ塩基ポリマーの使用は、種々の方法に適応可能である。上記の方法および組成物の様々な改変およびバリエーションが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、当業者に理解される。特定の例として、本発明の様々な実施形態が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて記述的に例示され得るが、当業者は、記述された実施形態が、他のヌクレオ塩基ポリマーもまた（ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドのアナログおよび誘導体を含む）を用いて作動することを理解する。特許請求の範囲の特定の好ましい実施形態が記載されるが、特許請求される本発明は、特定の実施形態に限定されるべきでない。当業者に明らかな、記載された型式の様々な改変が、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【配列表】
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