(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡまたは遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１または２に記載の塩基配列全長であり、
（ｂ）それら若しくはそれらの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列からなる、パーキンソン病の予防・治療・診断に用いられるＤＮＡまたは遺伝子であって、配列表の配列番号１に記載の１〜４６５のアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列表の配列番号２に記載の１〜４３７のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、ＤＮＡまたは遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号１または２に記載の塩基配列に対して、エクソン４、またはエクソン３と４が欠失されたものである請求項１に記載のＤＮＡまたは遺伝子。
【請求項３】
配列表の配列番号１または２に記載の塩基配列に対して、配列ＧＧＴ（コドン１７９）から１個のグアノシンが除去される１塩基欠失である、請求項１に記載のＤＮＡまたは遺伝子。
【請求項４】
配列表の配列番号１または２に記載の塩基配列に対して、３６６位のＡｒｇをＴｒｐに置換させる多型である、請求項１に記載のＤＮＡまたは遺伝子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列長は、１２個の各エクソン間に１１個のイントロン配列をゲノム上で介在させており、該塩基配列の内１０２〜１４９６の部分的配列には、１〜４６５のアミノ酸配列をもつ蛋白質をコードする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項７】
前記エクソンとイントロンの境界領域におけるイントロンの塩基配列は、下記構成よりなるものである請求項６に記載の遺伝子。
エクソン１とエクソン２の間に介在するイントロンは、エクソン１の３’末端に隣接して配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有し、エクソン２の５’末端に隣接して配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有し、
エクソン２とエクソン３の間に介在するイントロンは、エクソン２の３’末端に隣接して配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有し、エクソン３の５’末端に隣接して配列表の配列番号６に記載の塩基配列を有し、
エクソン３とエクソン４の間に介在するイントロンは、エクソン３の３’末端に隣接して配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有し、エクソン４の５’末端に隣接して配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有し、
エクソン４とエクソン５の間に介在するイントロンは、エクソン４の３’末端に隣接して配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有し、エクソン５の５’末端に隣接して配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有し、
エクソン５とエクソン６の間に介在するイントロンは、エクソン５の３’末端に隣接して配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を有し、エクソン６の５’末端には配列表の配列番号１２に記載の塩基配列を有し、
エクソン６とエクソン７の間に介在するイントロンは、エクソン６の３’末端に隣接して配列表の配列番号１３に記載の塩基配列を有し、エクソン７の５’末端には配列表の配列番号１４に記載の塩基配列を有し、
エクソン７とエクソン８の間に介在するイントロンは、エクソン７の３’末端に隣接して配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を有し、エクソン８の５’末端には配列表の配列番号１６に記載の塩基配列を有し、
エクソン８とエクソン９の間に介在するイントロンは、エクソン８の３’末端に隣接して配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を有し、エクソン９の５’末端には配列表の配列番号１８に記載の塩基配列を有し、
エクソン９とエクソン１０の間に介在するイントロンは、エクソン９の３’末端に隣接して配列表の配列番号１９に記載の塩基配列を有し、エクソン１０の５’末端に隣接して配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を有し、
エクソン１０とエクソン１１の間に介在するイントロンは、エクソン１０の３’末端に隣接して配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を有し、エクソン１１の５’末端に隣接して配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を有し、
エクソン１１とエクソン１２の間に介在するイントロンは、エクソン１１の３’末端に隣接して配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有し、エクソン１２の５’末端に隣接して配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を有する。
【請求項８】
請求項１〜４、６、および７のいずれかに記載のＤＮＡまたは遺伝子によってコードされた蛋白質。
【請求項９】
配列表の配列番号１に記載の１〜４６５のアミノ酸配列、または配列表の配列番号２に記載の１〜４３７のアミノ酸配列からなる請求項８に記載の蛋白質。
【請求項１０】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の内１〜７２のユビキチン様部分的アミノ酸配列を含有し、 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の内４１８〜４４９のジンクフィンガー蛋白質様部分的アミノ酸配列を含有する請求項８に記載の蛋白質。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の蛋白質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
【請求項１２】
下記（１）〜（４）のいずれかの塩基配列を有するプライマーセットであり、請求項１〜４、６、および７のいずれかに記載のＤＮＡまたは遺伝子の塩基配列、遺伝的変異、欠損、発現量を調べることに用いるか、或いはそれらの濃縮に用いるプライマーセット。
（１）請求項１に記載のパーキンソン病の予防・治療・診断に用いられる遺伝子のエクソン３と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べることに用いるものであり、配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号２９に記載の塩基配列と、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を有する。
（２）請求項１に記載のパーキンソン病の予防・治療・診断に用いられる遺伝子のエクソン４と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べることに用いるものであり、配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３１に記載の塩基配列と、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を有する。
（３）請求項１に記載のパーキンソン病の予防・治療・診断に用いられる遺伝子のエクソン４と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べることに用いるものであり、配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３３に記載の塩基配列と、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を有する。
（４）請求項１に記載のパーキンソン病の予防・治療・診断に用いられる遺伝子のエクソン５と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べることに用いるものであり、配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３５に記載の塩基配列と、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３６に記載の塩基配列を有する。
【請求項１３】
配列表の配列番号１または配列番号２に記載の各エクソン配列の塩基配列、遺伝的変異、欠損を調べることに用いるか、或いはその遺伝子座のハプロタイピングに用いる、請求項１２に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
請求項７に記載の各イントロン配列の塩基配列、遺伝的変異、欠損を調べることに用いるか、或いはその遺伝子座のハプロタイピングに用いる、請求項１２に記載のプライマーセット。
【請求項１５】
パーキンソン病の予防・治療・診断に用いられる遺伝子のエクソンと隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べるための、請求項１２〜１４のいずれかに記載のプライマーセットの使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、パーキンソン病の発病に関与する遺伝子に関するものである。パーキンソン病患者には本発明遺伝子の一部が欠失していることから、本発明遺伝子はパーキンソン病診断用遺伝子として極めて有用であり、当該遺伝子を用いて得られる蛋白質や医薬活性物質等はパーキンソン病の予防・治療にも使用できる可能性がある。
背景技術
各種慢性進行性疾患の原因となる遺伝子は一つだけではないことが多いと考えられており、これら疾患の原因遺伝子が明らかになれば、当該疾患の診断を出生前後から行うことができるのみならず、現在の技術水準からすれば遺伝子治療による上記疾患の治療も不可能ではない。
パーキンソン病も慢性疾患の一つであるが、パーキンソン病に関与する遺伝子としては１９９７年に報告されたアルファシヌクレインが知られているのみである。イタリア人の家系では上記遺伝子が変異し、常染色体優性のパーキンソン病が発症することがある旨報告されているが、この遺伝子を用いたとしてもパーキンソン病の診断ができるケースは非常に限られる。従ってパーキンソン病の診断に当たっては、振戦、固縮、無動、姿勢反射障害などの神経症状による臨床診断を採用しているのが現状であり、本疾患の根本的治療法はないが対症療法として、レボドーパまたはドパミン作動性化合物（作動薬）が投与されている程度にすぎない。
発明の開示
本発明は上記問題点に着目してなされたものであり、その目的は、パーキンソン病に関与し該疾患の診断や治療等に有用なＤＮＡまたは遺伝子または遺伝子断片；組換えベクター；蛋白質またはポリペプチド；モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；プライマーまたはプローブまたは固定化核酸またはＤＮＡチップ；オリゴヌクレオチド等を提供することにある。
上記課題を解決することのできた本発明のＤＮＡまたは遺伝子とは、
▲１▼配列表の配列番号１または配列番号２［配列番号２は、配列番号１の塩基配列のうち６３６〜７１９（後記するエクソン５に相当）の塩基部分を含まない、即ちオルタナティブスプライシングによるバリアントである］に記載の塩基配列全長、またはその部分的配列、またはそれら若しくはそれらの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列からなり、且つパーキンソン病に関与するＤＮＡまたは遺伝子であるところに要旨を有するものである。
更に本発明では上記▲１▼に加え、下記▲２▼〜▲８▼の態様からなるＤＮＡまたは遺伝子、または遺伝子断片も包含される。
▲２▼上記▲１▼に記載の塩基配列、またはそれを含有する、またはそれらを部分的に含有する塩基配列からなり、且つその遺伝的欠損がパーキンソン病の原因となるＤＮＡまたは遺伝子、またはそれら若しくはそれらの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡまたは遺伝子。
▲３▼上記▲１▼または▲２▼に記載の塩基配列であって、オルタナティブスプライシングによるバリアントとして生じ、パーキンソン病に関与する塩基配列のＤＮＡまたは遺伝子、またはそれら若しくはそれらの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡまたは遺伝子。
▲４▼上記▲１▼〜▲３▼のいずれかに記載の塩基配列であり、その遺伝子産物が、配列表の配列番号１に記載の１〜４６５のアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列表の配列番号２に記載の１〜４３７のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同等の機能を有する蛋白質をコードする遺伝子。
▲５▼上記▲１▼〜▲４▼のいずれかに記載の塩基配列に対して、エクソンの欠失、ナンセンス塩基置換、ミスセンス塩基置換、塩基の欠失、塩基の付加、塩基の挿入、スプライシングの異常、フレームシフトを生じさせた遺伝子、またはそれら若しくはそれらの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列からなり、且つ、パーキンソン病に関与するＤＮＡまたは遺伝子。
▲６▼上記▲１▼〜▲５▼のいずれかに記載のＤＮＡまたは遺伝子の部分的塩基配列をもつＤＮＡまたは遺伝子、または遺伝子断片、またはそれら若しくはそれらの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡまたは遺伝子、または遺伝子断片。
▲７▼以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の１〜４６５のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つパーキンソン病に関与する蛋白質。
▲８▼以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の１〜４３７のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｄ）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つパーキンソン病に関与する蛋白質。
ここで、前記配列番号１に記載の塩基配列全長は、１２個の各エクソン間に１１個のイントロン配列をゲノム上で介在させており、該塩基配列の内１０２〜１４９６の部分的配列には、１〜４６５のアミノ酸配列をもつ蛋白質をコードするものであり、これらエクソンとイントロンの境界領域におけるイントロンの塩基配列は、下記構成よりなるものである。
エクソン１とエクソン２の間に介在するイントロンは、エクソン１の３’末端に隣接して配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有し、エクソン２の５’末端に隣接して配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有し、
エクソン２とエクソン３の間に介在するイントロンは、エクソン２の３’末端に隣接して配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有し、エクソン３の５’末端に隣接して配列表の配列番号６に記載の塩基配列を有し、
エクソン３とエクソン４の間に介在するイントロンは、エクソン３の３’末端に隣接して配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有し、エクソン４の５’末端に隣接しては配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有し、
エクソン４とエクソン５の間に介在するイントロンは、エクソン４の３’末端に隣接して配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有し、エクソン５の５’末端に隣接して配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有し、
エクソン５とエクソン６の間に介在するイントロンは、エクソン５の３’末端に隣接して配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を有し、エクソン６の５’末端には配列表の配列番号１２に記載の塩基配列を有し、
エクソン６とエクソン７の間に介在するイントロンは、エクソン６の３’末端に隣接して配列表の配列番号１３に記載の塩基配列を有し、エクソン７の５’末端には配列表の配列番号１４に記載の塩基配列を有し、
エクソン７とエクソン８の間に介在するイントロンは、エクソン７の３’末端に隣接して配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を有し、エクソン８の５’末端には配列表の配列番号１６に記載の塩基配列を有し、
エクソン８とエクソン９の間に介在するイントロンは、エクソン８の３’末端に隣接して配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を有し、エクソン９の５’末端には配列表の配列番号１８に記載の塩基配列を有し、
エクソン９とエクソン１０の間に介在するイントロンは、エクソン９の３’末端に隣接して配列表の配列番号１９に記載の塩基配列を有し、エクソン１０の５’末端に隣接して配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を有し、
エクソン１０とエクソン１１の間に介在するイントロンは、エクソン１０の３’末端に隣接して配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を有し、エクソン１１の５’末端に隣接して配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を有し、
エクソン１１とエクソン１２の間に介在するイントロンは、エクソン１１の３’末端に隣接して配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有し、エクソン１２の５’末端に隣接して配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を有する。
尚、上記▲１▼〜▲８▼のいずれかに記載のＤＮＡ断片または遺伝子を含有する組換えベクターも本発明の範囲内に包含される。
また、上記課題を解決することのできた本発明の蛋白質とは、
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の１〜４６５のアミノ酸配列、または配列表の配列番号２に記載の１〜４３７のアミノ酸配列からなり、且つ、パーキンソン病に関与する蛋白質、またはそれと実質的に同等の機能を有する蛋白質であるところに要旨を有するものである。
詳細には、本発明蛋白質またはポリペプチドには、下記（ｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）の態様も包含される。
（ｉｉ）上記▲１▼〜▲４▼のいずれかに記載の遺伝子から発現するパーキンソン病に関与する蛋白質、またはそれと同一または実質的に同等の機能を有する蛋白質。
（ｉｉｉ）上記▲５▼に記載の遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列からなり、且つ、パーキンソン病に関与する蛋白質、またはそれと同一または実質的に同等の機能を有する蛋白質。
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列のうち、１カ所以上でアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、パーキンソン病に関与する蛋白質。
（ｖ）上記（ｉｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の内１〜７２のユビキチン様部分的アミノ酸配列を含有し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の内４１８〜４４９のジンクフィンガー蛋白質様部分的アミノ酸配列を含有する蛋白質。
（ｖｉ）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の１〜４６５のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つパーキンソン病に関与する蛋白質。
（ｖｉｉ）以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の１〜４３７のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｄ）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つパーキンソン病に関与する蛋白質。
（ｖｉｉｉ）上記請求項（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載のアミノ酸配列の部分断片からなる、または該部分断片を含有する、または該アミノ酸配列の全長を含有するポリペプチドまたは蛋白質。
尚、上記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかに記載の蛋白質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も本発明の範囲内に包含される。
また、本発明のプライマーまたはプローブまたは固定化核酸またはＤＮＡチップは下記（Ｉ）〜（ＩＶ）の用途に好適に使用される。
（Ｉ）上記▲１▼〜▲８▼のいずれかに記載のＤＮＡまたは遺伝子の塩基配列、遺伝的変異、欠損、発現量を調べることに用いるか、或いはそれらの濃縮に用いるか、
（ＩＩ）上記▲１▼〜▲８▼のいずれかに記載のＤＮＡまたは遺伝子のいずれかに記載のＤＮＡ又は遺伝子から転写、プロセシングされるＲＮＡの塩基配列、遺伝的変異、欠損、発現量を調べることに用いるか、或いはそれらの濃縮に用いるか、
（ＩＩＩ）配列表の配列番号１または配列番号２に記載の各エクソン配列の塩基配列、遺伝的変異、欠損を調べることに用いるか、或いはその遺伝子座のハプロタイピングに用いるか、
（ＩＶ）前述の各イントロン配列の塩基配列、遺伝的変異、欠損を調べることに用いるか、或いはその遺伝子座のハプロタイピングに用いるか、
具体的には、下記（１）〜（１４）に示す１４種類のプライマーまたはプローブのセットを少なくとも１個、使用することができる。
（１）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン１と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を有する。
（２）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン２と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を有する。
（３）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン３と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を有する。
（４）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン４の塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を有する。
（５）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン４と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するもプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を有する。
（６）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン５と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３６に記載の塩基配列を有する。
（７）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン６と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３７に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３８に記載の塩基配列を有する。
（８）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン７の塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号３９に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４０に記載の塩基配列を有する。
（９）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン７と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４１に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４２に記載の塩基配列を有する。
（１０）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン８と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４３に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４４に記載の塩基配列を有する。
（１１）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン９と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４５に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４６に記載の塩基配列を有する。
（１２）上記▲１▼記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン１０と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４７に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４８に記載の塩基配列を有する。
（１３）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン１１と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号４９に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号５０に記載の塩基配列を有する。
（１４）上記▲１▼に記載のパーキンソン病関与遺伝子のエクソン１２と隣接するイントロンの塩基配列、またはその遺伝子座を調べる為の、下記塩基配列を有するプライマーまたはプローブ。
配列番号１のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号５１に記載の塩基配列を有し、配列番号１の相補鎖のゲノム上での５’−３’方向に沿って配列表の配列番号５２に記載の塩基配列を有する。
更に本発明には、下記（ａ）〜（ｃ）のオリゴヌクレオチドまたオリゴヌクレオチド類似体またはそれらの修飾物も包含される。
（ａ）上記▲１▼〜▲８▼のいずれかに記載の塩基配列の部分的配列からなるか、或いは上記▲１▼〜▲８▼のいずれかに記載の塩基配列にハイブリダイズするもの。
（ｂ）ヒトＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ法、ヒトｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法、またはＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかの方法により、上記▲１▼〜▲８▼のいずれかに記載の全塩基配列または部分的塩基配列を増幅する、或いは上記▲１▼〜▲８▼のいずれかに記載の全塩基配列または部分的塩基配列を部分的に含有して増幅するためのもの。
（ｃ）配列表の番号１または２に記載のエクソンと、それらに隣接する前述のイントロンを含有する塩基配列をＰＣＲ法により増幅する、或いはその塩基配列の一部をＰＣＲ法により増幅するのためのオリゴヌクレオチド。
発明を実施する為の最良の形態
パーキンソン病或いはパーキンソン症候群は、遺伝的要因及び環境要因等が関与して発症すると考えられており、個々の要因を解き明かしていくことは、同病、同症候群発症機序の根本的な解明及び治療にとって急務である。本発明者らは、パーキンソン病の発症に関与する遺伝子を見出すべく鋭意検討してきた。その結果、パーキンソン病の一つである若年性パーキンソン病は、６番染色体のｑ２５．２−ｑ２７の領域、詳細には染色体マーカーＤＳ４３７とＤ６Ｓ２６４の間の１７ｃＭの領域と密接に関連することが分かった（Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６０（１９９７）５８８−５９６）。そこで若年性パーキンソン病を発症した患者を用い、後記する実施例に基づいて本疾患に関与する遺伝子を特定し、本発明を完成したのである。
以下、本発明遺伝子を見出すに至った実験経緯に沿って本発明を詳述する。ただし、下記実施例は本発明を制限するものではなく、前・後記の趣旨を逸脱しない範囲で変更実施することは全て本発明の技術範囲に包含される。
実施例１：若年性パーキンソン病患者における染色体欠失領域
本実施例に用いたパーキンソン病患者の家系図を第１図に示す。図中、□は男性、○は女性、●は女性患者を夫々意味し、各記号に斜線の引いた者は既に死亡していることを意味する。該患者の両親及び兄弟はいずれも健常人であったが、患者は十代にパーキンソン様症状を呈して本疾患と診断され、その後も症状は徐々に進行し、現在に至っている。
第１図中＊の付した被験者（患者及び健常人２名）のゲノムＤＮＡに対し、６番染色体マーカーの一つであるＤ６Ｓ３０５を用いたＰＣＲ法によるハプロタイピングを行った。その結果を第２図に示す。
第２図より、Ｄ６Ｓ３０５は患者の両親及び兄弟のＤＮＡテンプレートから増幅されたが、患者ＤＮＡテンプレートからは増幅されなかった。従ってこの患者は、染色体マーカーの一つであるＤ６Ｓ３０５が欠失していることが判明した。
実施例２：Ｄ６Ｓ３０５を含むゲノム断片のスクリーニングとエクソントラッピング
実施例１より、本患者にはマーカーＤ６Ｓ３０５に対応するゲノムＤＮＡが欠失していることから、この領域には、本疾患に関連する遺伝子が存在する可能性がある。そこで、Ｄ６Ｓ３０５の一部の塩基配列を有するアンプリイマーを用いて、９６，０００種のゲノム断片からなる正常ヒトゲノムライブラリー（ＫｅｉｏヒトＢＡＣライブラリー）のＰＣＲ法によるスクリーニングを行った。その結果、約１１０ｋｂの大きさからなるゲノム断片ＫＢ７６１Ｄ４とＫＢ４３０Ｃ４の二つのクローンが得られた。
次に、これらのゲノム断片中に存在する遺伝子のエクソン断片を単離するためにエクソントラッピングを行った。エクソントラッピングは、エクソントラッピングシステム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用い、附属の操作マニュアルに従って行った。その結果、上記二つのゲノム断片は約１１０ｋｂと非常に大きかったにも拘わらず、単離されたエクソンはＪ−１７だけであった。
次いで、このエクソンＪ−１７の塩基配列に基づき、このエクソンＪ−１７自身を増幅するためのＰＣＲプライマ−（Ｊ−１７Ｉｎｎｅｒ）及びＢＡＣ  ＫＢ７６１Ｄ４をテンプレートにしてエクソンＪ−１７に隣接するイントロンの塩基配列を決定し、その配列を基にＪ−１７を含む断片を増幅するためのＰＣＲプライマー（Ｊ−１７  Ｏｕｔｅｒ）の２種類のプライマーセットを作製し、実施例１に供した被験者（患者、健常な両親及び兄弟）のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。その結果を第３図に示す。尚、同図には本実施例及び後記する実施例６の結果も併記している。
第３図に示す様に、父（レーン１）、母（レーン２）及び兄弟（レーン４）の健常人ゲノムＤＮＡからはＰＣＲ産物が見出されたのに対し、本患者ＤＮＡ（レーン３）からは全く見出されなかった。従って、本患者では少なくとも本遺伝子のエクソンＪ−１７に相当する染色体部分が欠失していることが分かった。
実施例３：正常ヒトｃＤＮＡライブラリーからの本遺伝子のスクリーニング
次に、このＪ−１７を含む遺伝子全長、合わせて翻訳配列全長をカバーするｃＤＮＡ群を単離するため、ｃＤＮＡライブラリーから本遺伝子をスクリーニングを行った。具体的には、正常ヒト胎児の脳及び骨格筋のｃＤＮＡライブラリーをクローンテック社より購入し、プローブとしては、実施例２で得られた本遺伝子のエクソンの一部であるＪ−１７断片を第１のプローブとして用いると共に、更にこのプローブを用いた第１次スクリーニングで得られた陽性クローンのインサートＤＮＡ断片を第２次スクリーニング用プローブとして用いた。その結果、第４図に示す７個のｃＤＮＡ［ＨＦＢ１，３，４，５及びＳＫＭ１，３，８］が得られた。陽性クローンのインサートＤＮＡ断片は、ベクター特異的プライマー２種（Ｆ１０ｉｎｎｅｒ：５′−ＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧ−３′及びＲ１０ｉｎｎｅｒ：５′−ＧＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣ−３′）を用いて増幅した。
この様にして増幅された陽性ＤＮＡ断片について、プライマーウオーキング法により直接塩基配列の決定を行った。サイクル配列の決定に当たっては、これらプライマーと市販のキット［ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）］を用い、操作マニュアルに準じてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製「ＡＢＩモデル３７７ＤＮＡシークエンサー」により行った。
その結果、７個のｃＤＮＡは第４図に示した重なりの関係になっていた。これらのうち最長のＳＫＭ８は２９６０塩基からなり、その塩基配列中に１３９５塩基（ｎｔ１０２〜ｎｔ１４９６；終止コドンを含めるとｎｔ１４９９まで）で４６５個のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする翻訳配列全長を含んでいた。
また、上記ｃＤＮＡ断片のうち４個（ＨＦＢ３，４及びＳＫＭ１，３）については、ｎｔ６３６〜７１９の８４塩基（ｂｐ）が欠失していた。このことは、ゲノムの本遺伝子から成熟したｍＲＮＡがスプライシングを受けて生成する際にその切れ方が少なくとも二通りあることを示している。
尚、本遺伝子によってコードされる上記１〜４６５個のアミノ酸配列からなる蛋白質のうち、Ｎ末端近傍（１番のメチオニンから７２番のアルギニンまで）では、第５図に示す通りユビキチンと中程度の相同性が見られた（同一アミノ酸３３％）。
このユビキチンは細胞内で不要になった蛋白質を除去するのに重要な物質として知られ、各種神経変性疾患への関与も指摘されている。例えばアルツハイマー病におけるｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＰＨＦｓ）や、パーキンソン病におけるＬｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓなとは、抗ポリユビキチン抗体で染まることが知られている。そのメカニズムは、まずユビキチンが各種蛋白質に結合し、ユビキチン同士が結合を繰り返してマルチユビキチン鎖を形成し、プロテアソーム系に分解を誘導して代謝されると考えられている。
このユビキチン同士の結合には４８番目のリジン残基が必須であるとされており、上記蛋白質においても４８番目にリジンが存在すると共に、その前後（例えば４４〜４８番、及び５１番）のアミノ酸配列も一致することから、上記蛋白質はユビキチン様の機能を持つ可能性が示唆される。更に近年、Ｎ末端部にユビキチン様部分を含んだ、融合蛋白がいくつか発見されており、この場合、ユビキチン部分は分子シャペロンとしての働きが示唆されている。
この様に本蛋白質のＮ末端付近ではユビキチンとの相同性が観察されるが、７３番目以降のアミノ酸配列においてはユビキチンとの相同性はほとんど見られない。一方、Ｃ末端付近（４１８〜４４９番）では、システイン残基が非常に多い特定のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ９−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓを有しており、この配列は、ジンクフィンガー蛋白質（亜鉛と結合し細胞の成長・分化及び発生に深く関与している蛋白質）の亜鉛結合部分の配列の一種であるリングフィンガーモチーフ（Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ（９−３９９）−Ｃｙｓ−Ｘ（１−３）−Ｈｉｓ−Ｘ（２−３）−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ（４−４８）−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ）と極めて類似している。従って、本発明蛋白質は、新規なジンクフィンガー蛋白質の一種であると推定される。
実施例４：ゲノムライブラリーからの本ゲノム遺伝子のスクリーニング
前記実施例２で得られた二つの陽性ゲノムクローン（ＫＢ７６１Ｄ４及びＫＢ４３０Ｃ４）にはエクソン（Ｊ−１７）以外は含まれていなかったので、その他のエクソン配列を含むゲノム断片を得るため、本実施例では、前記ｃＤＮＡライブラリーの陽性クローンのうち最もサイズの大きいＳＫＭ８をプローブとして、９５，２３２クローンからなるゲノムライブラリー（ＫｅｉｏヒトＢＡＣライブラリー）からハイブリダイゼーションによるＢＡＣクローンのスクリーニングを行った。その結果、新たに２４個の陽性クローンが得られた。
また、ｃＤＮＡの塩基配列のＮ末端部分はエクソン１に相当するが、エクソン１を増幅するＰＣＲプライマーを作製し、ＰＣＲ法によるＢＡＣライブラリーのスクリーニングを行い、更にもう一つの陽性クローンを得た。
この様にして得られた合計２５個のクローンを用いて、プライマーウォーキング法（ＢＥＥ法）により各エクソンの同定及び各エクソンに隣接するイントロン配列の決定を行った。その結果、エクソン１〜３，５，６，８〜１２はこれらの２５個のＢＡＣクローンのいずれかにマップされた。またＪ−１７はエクソン７に相当していた。しかし、エクソン４を含むゲノム配列をもつＢＡＣクローンはこれらの２５個のＢＡＣクローン中には含まれていなかった。
そこで更に、エクソン４を増幅するＰＣＲプライマーを作製し、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．の有するゲノムライブラリーのＰＣＲスクリーニングを行うことにより新たに２つの陽性クローンを得た。前述のプライマーウォーキング法により、２７クローンのＢＡＣ−ＤＮＡをテンプレートにして、各エクソンとその隣接イントロンの塩基配列を決定した。プライマーウォーキング法に用いたプライマーは、ｃＤＮＡ配列に基づいて適当に合成した。各プライマーに対応するＢＡＣクローンは、プライマーそのものをプローブとしたオリゴヌクレオチドコロニーハイブリダイゼーション法により仕分けした。シーケンシングにはＤＮＡシークエンサーを用いた。
その結果、この新規遺伝子のエクソンとイントロンの構成が明らかになり、本発明の遺伝子はゲノム上で全長５００ｋｂ以上の非常に大きな遺伝子であり、１２のエクソンとその間にある非常に大きな１１のイントロンから構成されていることが明らかになった。これらエクソンとイントロンの境界領域におけるイントロンの塩基配列は前述した通りであるが、表１に、エクソンとイントロンの境界領域における塩基配列をまとめて示す。
0004430815.tif 000002
実施例５：ゲノムＤＮＡエクソン部分の塩基配列の確認
次に、実施例４で明らかになったエクソン部分の塩基配列を増幅してｃＤＮＡの対応部分と一致するかどうかを確認する為に、各エクソンの５′側と３′側近傍のイントロンの塩基配列に基づく（一部のプライマーはエクソンの部分配列に基づく）プライマーセット１４組を合成し、正常ヒト末梢血の白血球を用いて常法により調整したＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行った。参考の為に、本実施例に用いたプライマーセット１４組の塩基配列を表２に記載する。
0004430815.tif 000003
上記ＰＣＲ法は以下の様にして行った。各反応液（１０ｍｌ）中に、１００ｎｇのＤＮＡ、１×ＰＣＲ緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２，２５℃），１４ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．７５ｍＭのＭｇＣｌ２］，各３５０μＭのｄＮＴＰ，各０．５μＭのプライマー及び０．３５単位のＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含有し、ＰＣＲ条件：９４℃で３０秒，５０〜５３℃で３０秒，６８℃で３０秒〜１分を１サイクルとして合計３５サイクル実施した。
この様にして増幅された各ＤＮＡ断片の塩基配列を、適切なプライマーと市販のキットを用いて決定した。その結果を表２に併記する。
表２に示す通り、上記プライマーを用いたＰＣＲ法により得られたものは、いずれもｃＤＮＡより得られた塩基配列の対応部分と一致することが分かった。
実施例６：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の部分欠失（その１）
次いで、実施例１における若年性パーキンソン病患者及びその家族において、本発明遺伝子に異常があるかどうかを検討した。
詳細には、これら被験者の白血球よりゲノムＤＮＡを調製して鋳型として用いると共に、表２のプライマーセットのうちエクソン２，３，Ｊ−１７インナー，Ｊ−１７アウター及びエクソン８の５′側と３′側のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。その結果を第３図に示す。
第３図より、パーキンソン患者の父親（レーン１）、母親（レーン２）及び兄弟（レーン４）のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合は、各エクソンに相当する配列が増幅されており、これらのＤＮＡには欠失若しくは大きな変異はないことが分かる。これに対してパーキンソン病患者のＤＮＡを鋳型とした場合（レーン３）は、エクソン３，４，５，６，７に相当する部分の塩基配列の増幅は全く見られなかった。従って本患者のゲノム遺伝子は、エクソン３〜７に相当する長い塩基配列が欠失していることが明らかになった。
更に、上記被験者のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、電気泳動で分離し、ナイロンメンブレン上にサザンブロットを行い、放射性ＰでラベルしたｃＤＮＡプローブＳＫＭ８を用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、第６図に示す通り、患者の両親及び兄弟では、少なくとも８個のＥｃｏＲＩ断片が見出されたのに対し、患者には４個の断片しか見出されなかった（図中、＊は検出されなかった４個のＥｃｏＲＩ断片を示す）。従って、この結果からも患者のゲノム遺伝子は、特定部分が欠失若しくは変異していることを確認できる。
実施例７：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の部分欠失（その２）
実施例６より、若年性パーキンソン病患者には本発明遺伝子が欠失等していることが明らかになった。従って本発明遺伝子の欠失等は若年性パーキンソン病を誘発することが極めて強く示唆されたが、この点を確定する為に、別の患者を用いて同様に実験した。
詳細には、第７図に示す家系図を有する若年性パーキンソン病患者の家族のゲノム解析を行った。尚、６人の兄弟姉妹のうち２人の兄弟は健常であったが、その他の４人の兄弟姉妹はいずれも若年性パーキンソン病患者であった。図中、＊を付した者（即も、母親と２人の健常な兄弟及び本疾患を有する２人の姉妹）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例５と同様の方法により、各エクソンに相当するプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果を第８図に示す。
第８図より、本実施例に用いた２人の患者のゲノムＤＮＡ（レーン２及び３）ではエクソン４が欠失しているのに対し、健常人である母親（レーン１）及び２人の姉妹のＤＮＡ（レーン５及び６）には欠失は見られなかった。
更に、このうちの一人の患者の脳組織より、標準ＡＧＰＣ法を用いてｍＲＮＡを抽出し、全量１ｍｇのｍＲＮＡをＴｉｔａｎ  ＴＭ  ｏｎｅ  ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）に５０℃で３０分間プライムした後、反応液をそのまま用いて順方向のプライマー（配列表１のｎｔ３５１〜ｎｔ３７１）５′−ＧＧＡＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣ−３′及び逆方向のプライマー（配列表１のｎｔ９６３〜ｎｔ９８３）５′−ＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＡＡＧＧ−３′と共にＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒、次いで５６℃で３０秒、更に６８℃で１分というサイクルを合計４５回実施した。この様にして得られたＰＣＲ産物につき、ｃＤＮＡ塩基配列を解析した結果を第９図に示す。
第９図より、この患者のｍＲＮＡではエクソン４が完全に欠失し、エクソン３とエクソン５が直接結合していることが明らかになった。従って、独立２家系の若年性パーキンソン病患者において、本発明遺伝子の欠失が確認され、本発明遺伝子の欠失が若年性パーキンソン病を誘発することが明らかになった。
実施例８：各種組織における本遺伝子ｍＲＮＡの発現
本発明遺伝子のｍＲＮＡ［Ｐｏｌｙ（Ａ）＋］がヒトの各組織中にどの程度発現しているかを調べる為、ゲノム断片Ｊ−１７を用いたノザンブロット分析を行った。
詳細には、多組織のノザンブロットをクローンテック社より購入すると共に、プローブとして本発明遺伝子のエクソン４に相当するＪ−１７を用い、操作マニュアルに準じてノザンブロッティングを行った。その結果を第１０図及び第１１図に示す。尚、第１０図中（（ａ）に示す組織は、左から順に脾臓，胸腺，前立腺，精巣，卵巣，小腸，結腸，末梢血白血球；同図（ｂ）に示す組織は、左から順に心臓，脳，胎盤，肺，肝臓，骨格筋，腎臓，膵臓；同図（ｃ）に示す組織は、左から順に胃，甲状腺，脊髄，リンパ節，気管，副腎，骨髄の意味である。また、第１１図中（ａ）に示す組織は、左から順に小脳，大脳皮質，延髄，脊髄，後頭極，前頭葉，側頭葉，被殻；同図（ｂ）に示す組織は、左から順に扁桃体，尾状核，脳梁，海馬，全脳，黒質，視床下核，視床の意味である。
第１０図，第１１図の結果より、本実施例で検討した全ての組織中に、ポリＡテールを含む４．５ｋｂのｍＲＮＡが検出されたが、特に脳、心臓、精巣および骨格筋には豊富に発現していた。このうち脳内領域における発現はいずれのセクションでも認めるが、大脳皮質や前頭葉には一層多く発現していることが分かった。
実施例９：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の部分欠失（その３）
本実施例に用いたパーキンソン病患者の家系図を第１２図に示す。図中、１〜７の番号を付した者（即ち、両親と３人の健常な姉妹、及び本疾患を有する２人の兄弟）の白血球よりゲノムＤＮＡを調整して鋳型として用いると共に、表３に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行った。
0004430815.tif 000004
すべての反応は以下の様にして行った。２５μｌ反応混合物中には、５０ｍＭのＫＣｌ，１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３），１．５ｍＭのＭｇＣｌ２，０．０２％のゼラチンを、プライマー類，１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ，及び２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と共に含有しており、ＰＣＲ条件：９４℃で１０分間の最初の変性に引続き、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間を１サイクルとして合計４０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の最終のエクステンションを行った。この様にして得られたＰＣＲ産物を、臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルで可視化し、標的エクソンの有無を調べた。その結果を第１３図に示す。
同図に示す様に、パーキンソン病の２人の患者のＤＮＡを鋳型とした場合（レーン６，７）には、エクソン５に相当する部分の塩基配列の増幅は全く見られなかった。
更に上記被験者のうちパーキンソン病患者（第１２図中の６に相当する）及びその父親のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、電気泳動で分離し、ナイロンメンブレン上にサザンブロットを行い、放射性ＰでラベルしたＤＮＡプローブＳＫＭ８を用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、第１４図に示す通り、患者の父親では少なくとも８個のＥｃｏＲＩ断片が見出されたのに対し、患者には７個の断片しか見出されなかった（図中、＊は検出されなかった１個のＥｃｏＲＩ断片を示す）。従って、この結果からも患者のゲノム遺伝子は、特定部分が欠失若しくは変異していることを確認できる。
実施例１０：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の部分欠失（その４）
実施例９とは異なる別の患者を用いて同様に実験を行った。詳細には、第１５図に示す家系図を有する若年性パーキンソン病患者の家族のゲノム解析を行った。尚、７人の姉妹のうち４人の姉妹は健常であったが、その他の３人の姉妹は、いずれも若年性パーキンソン病患者であった。図中、１〜６の番号を付した者のゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例９と同様の方法により、各エクソンに相当するプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果を第１６図に示す。
同図に示す様に、パーキンソン病患者のＤＮＡを鋳型とした場合（レーン３，６）には、エクソン３に相当する部分の塩基配列の増幅は全く見られなかった。
実施例１１：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の部分欠失（その５）
更に別の患者を用いて実施例９と同様に実験を行った。詳細には、第１７図に示す家系図を有する若年性パーキンソン病患者の家族のゲノム解析を行った。尚、５人の兄弟姉妹のうち３人の兄弟姉妹は健常であったが、その他の２人の兄弟姉妹は、いずれも若年性パーキンソン病患者であった。図中、１〜３の番号を付した者のゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例９と同様の方法により、各エクソンに相当するプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果を第１８図に示す。
同図に示す様に、パーキンソン病患者のＤＮＡを鋳型とした場合（レーン１）には、エクソン４に相当する部分の塩基配列の増幅は全く見られなかった。
実施例１２：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の部分欠失（その６）
更に別の患者を用いて実施例９と同様に実験を行った。詳細には、第１９図に示す家系図を有する若年性パーキンソン病患者の家族のゲノム解析を行った。尚、患者の両親はいずれも健常人であり、８人の兄弟姉妹のうち６人の兄弟姉妹は健常であったが、その他の２人の兄弟姉妹は、いずれも若年性パーキンソン病患者であった。図中、１〜８の番号を付した者のゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例９と同様の方法により、各エクソンに相当するプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果を第２０図に示す。
同図に示す様に、パーキンソン病患者のＤＮＡを鋳型とした場合（レーン４，８）には、エクソン３および４に相当する部分の塩基配列の増幅は全く見られなかった。
実施例１３：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の部分欠失（その７）
更に別の患者を用いて実施例９と同様に実験を行った。詳細には、第２１図に示す家系図を有する若年性パーキンソン病患者の家族のゲノム解析を行った。尚、患者の両親はいずれも健常人であり、５人の兄弟姉妹のうち１人の兄弟は健常であったが、その他の４人の兄弟姉妹は、いずれも若年性パーキンソン病患者であった。図中、１〜６の番号を付した者のゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例９と同様の方法により、各エクソンに相当するプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果を第２２図に示す。
同図に示す様に、パーキンソン病患者のＤＮＡを鋳型とした場合（レーン２〜６）には、エクソン５に相当する部分の塩基配列の増幅は全く見られなかった。
実施例１４：エクソン５の一塩基欠失ホモ接合体の同定
第２３図に示す家系図等に示す家系図を有する若年性パーキンソン病患者のうち各１人につき、直接配列ＰＣＲ法によって欠失、挿入または点変異をスクリーニングした。ＰＣＲ法は、オリゴヌクレオチドプライマー配列に特異的であって、その５’末端に標準的な配列プライマー（Ｍ１３  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ）の配列を有するキメラプライマーを用いて行った。得られたＰＣＲ産物から過剰なプライマー及びｄＮＴＰを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて除去した後、精製したＰＣＲ産物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いたデオキシ鎖終結法によって配列決定した。
その結果、上記被験者では、エクソン５の１塩基欠失が同定された（第２４図）。第２４図のうち上図（Ｎ）は、野生型対立遺伝子のエクソン５のＰＣＲ産物を直接配列決定した結果を、下図（Ｍ）は、変異型対立遺伝子のエクソン５のＰＣＲ産物を直接配列決定した結果を夫々示す。
詳細には、１塩基欠夫により１個のグアノシンが配列−ＧＧＴ−（コドン１７９）から除去される結果、フレームシフトが起こり、アミノ酸位置１８７において停止コドンができた。ヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を第２５図に示す。図中、「Ｎｏｒｍａｌ」は野生型対立遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸配列を、「Ｍｕｔａｎｔ」は、１塩基欠失の見られた変異型対立遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸配列を夫々示す。尚、この様な１塩基欠失は健常人では検出されなかった。
次に、第２３図に示す家系図を有する患者（図中３）の１塩基欠失を確認すると共に、その両親及（図中１及び２）び本疾患を有していない患者の姉妹（図中４）の遺伝子型を確認するため、ＮｌａＩＶ制限部位分析を行った。詳細には前述に記載の方法により、プライマー対を用いてエクソン５を増幅させた後、ＰＣＲ産物をＮｌａＩＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で消化した。得られたＰＣＲ産物を３％ゲル（２％Ａｇａｒｏｓｅ／１％ＮｕＳｉｅｖｅ−Ａｇａｒｏｓｅを含有）で電気泳動し、臭化エチジウムで可視化した。これらの結果を第２６図に示す。第２６図中、レーン１は父親、レーン２は母親、レーン３は本疾患を有する姉妹の患者、レーン４は健常な姉妹を夫々示す。
野生型対立遺伝子はエクソン５ではＮｌａＩＶ部位として検出可能であり、ＮｌａＩＶの消化により、２個の断片（１５９ｂｐおよび６８ｂｐ）に切断されるのに対し、１塩基欠失による変異型対立遺伝子は２２７ｂｐの１個の断片となる。この制限部位分析によれば、本実施例の患者はエクソン５の１塩基欠夫による変異型ホモ接合体であるが、彼女の両親は野生型ヘテロ型接合体であり、一方、患者の健常な姉妹は野生型ホモ接合体であることが分かる。これらの結果は常染色体劣性の態様を示すものである。
実施例１５：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子の免疫組織学分析および免疫蛍光分析
本発明遺伝子（パーキンと略記する場合がある）の変異によって誘発される黒質（ＳＮ）の分子メカニズムを解明する為、本発明蛋白質に対する抗体を用い、若年性パーキンソン病（ＡＲ−ＪＰ）患者、散在性パーキンソン病（ＰＤ）患者、及び健常人の脳中における本発明蛋白質の局在化について調べた。
詳細には、１５名のＰＤ患者、３名のＡＲ−ＪＰ患者、および８名の健常人について調べた。ＡＲ−ＪＰ患者のうち、ケース１及び２は姉妹で本発明遺伝子のエクソン４が欠失しており、コドン１３８の後の６個のアミノ酸がフレームシフトして生じたストップコドンのため、１４３個のアミノ酸が欠失している（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）。一方、ケース３のＡＲ−ＪＰ患者は５２歳の女性患者でエクソン３が欠失しており、５８位のアミノ酸の後がフレームシフトして９６位のアミノ酸でｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（終了）していた。
また、本実施例では、２種類のウサギポリクローナル抗体（Ｍ−７３及びＭ−７４）、アルファシヌクレインに対するウサギポリクローナル抗体、ポリユビキチンに対するマウスモノクローナル抗体を夫々用いた。
まず、免疫組織学染色を以下の要領で実施した。ホルマリン固定パラフィンで包埋した上記被験者の中脳、前頭皮質小葉、及び被殻の各切片を、３’−３’−ジアミノベンジジンを用いたアビジン−ビオチン複合体標準法によって適切に希釈して可視化した後、抗パーキン抗体Ｍ−７４、抗アルファシヌクレイン抗体、または抗ポリユビキチン抗体で処理した。また、二重免疫蛍光法は、ウサギ抗パーキン抗体Ｍ−７４およびマウス抗ポリユビキチンモノクローナル抗体を用い、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ），ビオチニル化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ）、およびアビジン−ローダミン（ｓｉｇｍａ）と共にインキュベーションし、蛍光性焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）顕微鏡ＭＲＣ−１０２４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で観察して実施した。これらの結果を第２７図及び第２８図に示す。
このうち第２７図は、抗パーキン抗体Ｍ−７４を用い、脳切片中の本発明遺伝子を免疫組織化学染色した顕微鏡写真であり、図中Ａ〜ＣはＰＤ患者（ケース２）；Ｄ〜Ｆは健常人（ケース１）；Ｇ〜ＩはＡＲ−ＪＰ患者（ケース１）の結果を夫々示す。また、Ａ，Ｄ，ＧはＳＮ中のメラニン含有ニューロン；Ｂ，Ｅ，Ｈは被殻；Ｃ，Ｆ，Ｉは前頭皮質小葉の顕微鏡写真である。写真中、矢印はニューロンを、矢の根部分はニューロメラニン、バーの単位は５０μｍである。
第２７図より、ＳＮ（青斑を含む）中のメラニン含有ニューロンは、ＰＤ患者および健常人中では強度に染色されたのに対し、ＡＲ−ＪＰ患者では染色されなかった（図中Ａ，Ｄ，Ｇ）。また、ＳＮ中のメラニン含有ニューロンでは、細胞質、顆粒構造、およびニューロン突起は均一に染色されたが核は染色されず、グリア細胞では弱い染色が見られた（図中Ａ−Ｆ）。一方、ＰＤ患者および健常人については、被殻および前頭皮質小葉中のニューロンは、細胞質および核周囲構造で弱く染色された（図中Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｆ）。
また、第２８図は、脳切片中の本発明遺伝子、ポリユビキチン、及びアルファシヌクレインを免疫組織化学染色した顕微鏡写真であり、図中Ａ〜Ｃは、ＰＤ患者（ケース１）のＳＮ中メラニン含有ニューロンで、抗パーキン抗体Ｍ−７４（Ａの緑部分）及びモノクローナル抗ポリユビキチン抗体（Ｂの赤部分）が二重染色された写真；Ｄ〜ＦはＰＤ患者（ケース１）の中脳横断面図で、抗アルファシヌクレイン抗体が染色された写真；Ｇ〜ＩはＰＤ患者（ケース１）の中脳横断面図で、抗パーキン抗体Ｍ−７４が染色された写真を夫々示す。図中、矢の根部分はＬｅｗｙ  ｂｏｄｙ，バーの単位は５０μｍである。
二重免疫蛍光を行った結果、ＳＮ中メラニン含有ニューロンのＬｅｗｙ  ｂｏｄｙでは、抗パーキン抗体および抗ポリユビキチン抗体の両方が染色された（図中Ａ〜Ｃ）。また、中脳横断面の染色結果より、ＰＤ患者のＬｅｗｙ  ｂｏｄｙでは本発明遺伝子およびアルファシヌクレインの両方が局在化していることが分かった（図中Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ）。これに対し、ＡＲ−ＪＰ患者の脳組織では、この様な染色は見られなかった（データは示さず）。
以上の結果より、本発明蛋白質は、散在性ＰＤ患者及び健常人の脳中に観察されるのに対し、ＡＲ−ＪＰ患者の脳中には観察されないことが分かった。また、ＰＤ患者のＬｅｗｙ  ｂｏｄｙのなかには本発明蛋白質が観察された。
実施例１６：若年性パーキンソン病患者における本発明遺伝子のイムノブロット分析
実施例１５に引続き、本発明蛋白質に対する抗体を用い、ＡＲ−ＪＰ患者、ＰＤ患者、及び健常人の脳中に存在する本発明遺伝子をイムノブロット分析した。
まず、上記被験者の前頭皮質小葉、黒質、および被殻の組織ブロックを、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを用い、等張シュクロース溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，０．３２Ｍのシュクロース，１ｍＭの酢酸亜鉛，１５μｇ／ｍのロイペプチン，５μｇ／ｍｌのｐ−アミジノフェニル−メタン−スルホニルフルオリドの塩酸塩（ＡＰＭＳＦ）及び５０ｎｇ／ｍｌのペプスタチンを含有）でホモジナイズした。得られたホモジネート液を４回遠心分離し、細胞核分画（６００×ｇで１０分間遠心分離したペレット）、ミトコンドリア分画（７０００×ｇで１０分間遠心分離したペレット）、ミクロソーム分画（１００，０００×ｇで１時間遠心分離したペレット）、及びサイトゾル分画（９００，０００×ｇで１時間遠心分離した後の上清）を得た。更に９００，０００×ｇのペレットを、０．２５Ｍシュクロース含有ＴＥＳ緩衝液で再懸濁した後、シュクロースを密度勾配法により積層した（０．２５Ｍ，０．８６Ｍ及び１．３Ｍ）後、ＳＷ２８ローターで、４℃、２８，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。上層の脂質を吸引した後、０．５Ｍのシュクロース層と０．８６Ｍのシュクロース層の間の中間面をゴルジ分画として集めた。
これら種々の分画中の蛋白質は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分離した後、ＰＶＤＦ膜ブロット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。このブロットは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び５％ウシ血清アルブミン含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有）中で、５２℃で１時間浸漬した後、４℃で一晩、ブロキング溶液中にて、抗パーキン抗体Ｍ−７４等の種々の抗体でプローブした。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄した。内部コントロールとして抗β−チュービュリン抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）を用い、Ｇｏｌｊｉマーカーとして抗γ−アダプチン抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いた。次に、このブロットを、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ（Ｄａｋｏ）および抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）で室温にて１時間処理した。得られた反応産物は化学蛍光試薬（ｃｈｅｍｉ−Ｉｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ．Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で可視化した。
得られた結果を第２９図〜第３１図に示す。これらは、抗パーキン抗体Ｍ−７４を用い、種々のホモジネートにおける本発明蛋白質のイムノブロット分析結果を示す顕微鏡写真であり、このうち第２９図は、３名の健常人（ケース１〜３）、３名のＰＤ患者（ケース１〜３）、及び２名のＡＲ−ＪＰ患者（ケース１，２）の前頭皮質小葉全ホモジネート（左側のゲルはサイズマーカー、β−チューブリンは内部マーカーである）；第３０図は、健常人（ケース１）の前頭皮質小葉組織の亜細胞分画（左から順に核、ミトコンドリア、ミクロソーム、サイトゾル、及びゴルジ体を夫々示す。尚、γ−アダプチンはゴルジマーカーである）；第３１図は２名の健常人（ケース１，２）及び２名のＰＤ患者（ケース２，３）におけるＳＮ、被殻及び前頭皮質小葉の全ホモジネートの結果を夫々示す。
その結果、ＰＤ患者および健常人の前頭皮質小葉全ホモジネート中には５２ｋＤａの本発明蛋白質（図中、Ｐａｒｋｉｎと示す）が検出されたのに対し、ＡＲ−ＪＰ患者の前頭皮質小葉全ホモジネート中では検出されなかった（第２９図）。また、ＰＤ患者には、４１ｋＤａの二番目の蛋白質バンド、おそらくパーキン蛋白質のプロセシングされた型が見られた。尚、抗体Ｍ−７４の代わりに抗体Ｍ−７３を用いても同様の結果が得られた（データは示さず）。
また、健常人の前頭皮質小葉ホモジネートの亜細胞分画では、サイトゾル分画およびゴルジ分画中に本発明蛋白質の大部分が検出されたのに対し、ミクロソーム分画では、少量の蛋白質しか検出されなかった（第３０図）。
更に、健常人およびＰＤ患者のＳＮ、被殻および前頭皮質小葉のホモジネートをイムノブロットした結果、ＳＮ中には脳の他の部分に比べ、本発明蛋白質が豊富に存在していた（第３１図）。このうちＰＤ患者のＳＮ中の本発明蛋白質は、黒質ニューロンの減少に従って明らかに減少していた。
以上の実験結果より、本発明蛋白質は、ＡＲ−ＪＰ患者の脳のいずれの領域においても検出されるのではなく、ＳＮ中のメラニン含有ニューロンに存在することが明らかになった。
実施例１７：散発性パーキンソン病（ＰＤ）患者および健常人におけるパーキンの多型
本実施例では、ＰＤにおける多型頻度を調査した。詳細には、１６０名のＰＤ患者、および神経変性疾病の見られない１６０名の健常人を対象にし、以下の要領で遺伝性多型について分析した。尚、本実施例では４０歳以下で発症した患者は除いており、発症平均年齢は５５．４±１０．７歳であった。ＰＤ患者の家族にはＰＤの履歴を有するものはなく、症状の日周変動も見られなかった。また、健常人の年齢は４０〜９８歳であった。
まず、上記被験者のゲノムＤＮＡを末梢白血球から抽出し、抽出直後に用いるか、或いは分析時まで−２０℃で保存した。本発明遺伝子のエクソン４及び１０は、２個のプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅した（エクソン４：順方向のプライマー，５’−ａｃａａｇｃｔｔｔｔａａａｇａｇｔｔｔｃｔｔｇｔ−３’，逆方向のプライマー，５’−ａｇｇｃａａｔｇｔｇｔｔａｇｔａｃａｃａ−３’，エクソン１０：順方向のプライマー，５’−ａｔｔｇｃｃａａａｔｇｃａａｃｃｔａａｔｇｔｃ−３’，逆方向のプライマー，５’−ｔｔｇｇａｇｇａａｔｇａｇｔａｇｇｇｃａｔｔ−３’）。
エクソン４には１６７位のＳｅｒをＡｓｎ（Ｓ１６７Ｎ）に置換させる多型（Ｇ→Ａ）、エクソン１０には３６６位のＡｒｇをＴｒｐ（Ｒ３６６Ｗ）に置換させる多型（Ｃ→Ｔ）、および３８０位をＶａｌからＬｅｕに置換（Ｖ３８０Ｌ）させる多型（Ｇ→Ｃ）が存在した。Ｓ１６７Ｎの対立遺伝子については制限酵素Ａ１ｗＮＩにより（野生型のみ切断される）、Ｒ３６６Ｗの対立遺伝子は制限酵素ＮｃｉＩにより（野生型のみ切断される）、またＶ３８０Ｌの対立遺伝子は制限酵素Ｂｓｐ１２８６Ｉによって（変異型のみ切断される）それぞれ野生型と変異型を識別できる。
詳細には、ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルで電気泳動した後、臭化エチジウムで可視化した結果、Ａ１ｗＮＩでは５０ｂｐ／１３１ｂｐのバンド［第３２図のＡ）］；Ｎｃｉ１では６８ｂｐ／９７ｂｐのバンド［第３２図のＢ）］；Ｂｓｐ１２８６Ｉでは５７ｂｐ／１０８ｂｐのバンド［第３２図のＣ）］が夫々検出された（第３２図）。
尚、エクソン４に対するＰＣＲ条件は以下の通りである。最初に９４℃で１０分間の変性を行い、次いで９４℃で３０秒間の変性，５３℃で１分間のアニーリング，７２℃で１分間のエクステンションを１サイクルとして合計４０サイクル行った後、最後に７２℃で１０分間のエクステンションを行う。また、エクソン１０に対するＰＣＲ条件は以下の通りである。最初に９４℃で１０分間の変性を行い，９４℃で３０秒間の変性，５５℃で３０秒間のアニーリング，７２℃で４５秒間のエクステンションを１サイクルとして４０サイクル行った後，最後に７２℃で１０分間のエクステンションを行う。
上記被験者について、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ），野生型／変異型ヘテロ接合体（ｗ／ｍ），及び変異型ホモ接合体（ｍ／ｍ）の頻度を調べた。
表４及び表５に、Ｓ１６７Ｎにおける対立遺伝子頻度および遺伝子型の頻度を示す。尚、表５中の予想頻度はハーディ・ワインベルグの平衡則に従って計算した。
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上記結果によれば、対立遺伝子及び遺伝子型の頻度は、ＰＤ患者と健常人の間で、いずれも有意な差は見られなかった。また、１６７位Ｓｅｒのホモ接合体及び１６７位のＳｅｒがＡｓｎへ置換したヘテロ接合体の頻度は、両者の間で有意な差は見られなかった。
更に表５より、３種の遺伝子型の観察頻度は、健常人の予想頻度との間でも、患者の予想頻度との間でも有意な差は見られないことが分かった。尚、コンピューター解析により、この置換によって遺伝子産物の二次構造は変化していないことが明らかになった。
次に、Ｖ３８０Ｌにおける対立遺伝子頻度および遺伝子型の頻度を表６に示す。
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表６に示す通り、Ｖ３８０Ｌにおける対立遺伝子頻度は、ＰＤ患者と健常人の間で有意な差は見られなかった。また、その観察頻度は予想頻度と一致しており、多型変異によって遺伝子産物の二次構造は変化しないことも確認した。
次に、Ｒ３６６Ｗにおける対立遺伝子頻度および遺伝子型の頻度を表７に示す。
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Ｒ３６６Ｗにおいては、３種の遺伝子型の予想頻度は、ＰＤ患者および健常人の間で全く差がなかったが、Ｒ３６６Ｗの対立遺伝子頻度は、ＰＤ患者と健常人の間で有意な差が見られた。即ち、ＰＤ患者の対立遺伝子頻度は１．２％であるのに対し、健常人では４．４％であり、ＰＤ患者は健常人に比べて有意に低下していた。また、この対立遺伝子の保有についての健常人とＰＤ患者間の違いの程度（ｏｄｄ  ｒａｔｉｏ）は３．６０であった。
また第３３図は、Ｒ３６６Ｗのアミノ酸配列のｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  Ｉｎｄｅｘをグラフ化したものであり、＋は疎水性領域を、−は親水性領域を夫々示す。図中の矢印部分では、３６６位のＡｒｇがＴｒｐに置換したため、親水性から疎水性へ変化したことを示している。
更に第３４図はＲ３６６Ｗにおける二次構造の変化を示す図であり、３６６位のＡｒｇがＴｒｐに置換したため、３６１位から３７６位のαヘリックス部分がβシート構造（３６０位から３６０位）へ変化したことが分かる。
以上の結果より、上述した３個の多型のうちＳ１６７Ｎ及びＶ３８０ＬはＰＤへの影響はないと考えられるのに対し、Ｒ３６６Ｗの遺伝子頻度はＰＤ患者で非常に低く、上記ｏｄｄ  ｒａｔｉｏが３．６０と算出されたことから、この対立遺伝子はＰＤ発症阻止因子ではないかと示唆される。
産業上の利用可能性
本発明は以上の様に構成されており、パーキンソン病に関与する遺伝子が明らかにされたのみならず、該遺伝子の一部が欠失や変異等すると本疾患を惹起することも明白になった。従って、上記遺伝子の異常の有無を検出すれば本疾患の発症を容易に判断することが可能になり、パーキンソン病の早期発見に極めて有用である。
また、本発明遺伝子をパーキンソン病患者に導入して治療を行う所謂遺伝子治療も可能であり、本遺伝子を用いて得られる組換え蛋白質はパーキンソン病の予防・治療用医薬として有用である他、この組換え蛋白質に対する抗体（モノクローナル抗体やポリクローナル抗体）も本疾患の診断に用いることができる。更にこの組換え蛋白質を用いれば、パーキンソン病の予防・治療・診断に極めて有用な医薬物質も合成し得る等、パーキンソン病を中心とする種々の遺伝子治療・医薬物質等への発展に寄与できる点で本発明は極めて意義深いものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第２図は、第１図のパーキンソン病患者を用い、ＰＣＲ法によるハプロタイピングを行った結果を示す図。
第３図は、第１図のパーキンソン病患者及びその家族における遺伝子欠失の有無を示す図。
第４図は、実施例３で得られた、６個のｃＤＮＡ断片と１個の完全長遺伝子の構成を示す図。
第５図は、本発明遺伝子のＮ末端部分のアミノ酸配列とユビキチンとの相同性を示す図。
第６図は、第１図のパーキンソン病患者及びその家族におけるゲノムＤＮＡ断片のＥｃｏＲＩ消化物をゲル電気泳動した結果を示す図。
第７図は、実施例７に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第８図は、第７図のパーキンソン病患者及びその家族における遺伝子欠失の有無を示す図。
第９図は、実施例７で得られた、第７図のパーキンソン病患者のｃＤＮＡ断片を示す図。
第１０図は、ヒトの各種組織中に発現される本発明遺伝子のｍＲＮＡを示す図。
第１１図は、ヒトの各種組織中に発現される本発明遺伝子のｍＲＮＡを示す図。
第１２図は、実施例９に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第１３図は、第１２図のパーキンソン病患者及びその家族における遺伝子欠失の有無を示す図。
第１４図は、第１２図のパーキンソン病患者及びその家族におけるゲノムＤＮＡ断片のＥｃｏＲＩ消化物をゲル電気泳動した結果を示す図。
第１５図は、実施例１０に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第１６図は、第１５図のパーキンソン病患者及びその家族における遺伝子欠失の有無を示す図。
第１７図は、実施例１１に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第１８図は、第１７図のパーキンソン病患者及びその家族における遺伝子欠失の有無を示す図。
第１９図は、実施例１２に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第２０図は、第１９図のパーキンソン病患者及びその家族における遺伝子欠失の有無を示す図。
第２１図は、実施例１３に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第２２図は、第２１図のパーキンソン病患者及びその家族における遺伝子欠失の有無を示す図。
第２３図は、実施例１４に用いたパーキンソン病患者の家系図を示す説明図。
第２４図は、野生型対立遺伝子及び変異型対立遺伝子のエクソン５からのＰＣＲ産物の直接配列を示すクロマトグラム。
第２５図は、野生型（Ｗ）パーキン遺伝子のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列、並びに１塩基欠失を有する変異型（Ｍ）パーキン分子の予想される配列を示す図。
第２６図は、実施例１４のＰＣＲ産物のＮ１ａＩＶ制限部位分析の結果を示す図。
第２７図は、脳切片中に発現される本発明遺伝子の免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真。
第２８図は、脳切片中に発現される本発明遺伝子、ポリユビキチン、及びαシヌクレインの免疫染色の結果を示す顕微鏡写真。
第２９図は、健常人、ＰＤ患者及びＡＲ−ＪＰ患者の前頭皮質小葉全ホモジネートをイムノブロットした結果を示す図。
第３０図は、健常人の前頭皮質小葉亜細胞分画をイムノブロットした結果を示す図。
第３１図は、健常人、ＰＤ患者及びＡＲ−ＪＰ患者のＳＮ、被殻及び前頭皮質小葉をイムノブロットした結果を示す図。
第３２図は、エクソン４及び１０からのＰＣＲ産物をゲル電気泳動した結果を示す図。
第３３図は、本発明蛋白質のアミノ酸配列をＨｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｐｌｏｔしたグラフ。
第３４図は、３６６位のＡｒｇがＴｒｐへ置換するのに伴い、αヘリックス部分がβシート構造に変化する様子を説明する図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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