(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の検体の検出のために生物特異的親和性反応を利用し、
ｉ．サンプル(検体)および分析的検出可能な反応体(反応体＊)を、フローマトリックス内の流路を通って、堅く固定された生物特異的親和性反応体(捕獲体)が存在するマトリックス内に位置する検出ゾーン(ＤＺ)に移動させること、
ii．反応体＊は検出ゾーン(ＤＺ)で捕獲されること、その量はサンプル中の検体の量と関連している、
を含み、
Ａ)反応体＊が分析的検出可能な基として粒子を有する、そして
Ｂ)捕獲体が固定化粒子を介してマトリックスに固定され、その表面に親水性基を呈示する
ことを特徴とする、フローマトリックスにおける分析法に関連する方法。
【請求項２】
流れがマトリックスの側面で起こることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
流れが毛細管力により生ずることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
捕獲体が、生物特異的親和性を介して反応体に結合でき、次にその反応体が検体に生物特異的に結合することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
反応体が検体と検出ゾーン(ＤＺ)に到達する前に反応できるように、該反応体をサンプルと共に適用するか、または検出ゾーン(ＤＺ)の上流のマトリックス内に予め保持することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
捕獲体を固定する粒子が、マトリックスの流路の最小内側寸法よりも小さい最大外側寸法を有することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
捕獲体を固定する粒子が、０.１−１０００μmの範囲の最大外側寸法を有することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
捕獲体を固定する粒子が、０.１−１００μmの範囲の最大外側寸法を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標識粒子が０.０１−５μmの直径を有することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
流路が０.４−１０００μmの範囲の最小内側寸法を有することを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
流路が０.４−１００μmの範囲の最小内側寸法を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標識粒子が蛍光性であるかまたは着色されていることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
反応体＊がマトリックス内に検出ゾーン(ＤＺ)の上流またはマトリックス内にサンプル適用部位の上流で予め保持されていることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
捕獲体をマトリックスに固定する粒子が、その表面に親水性基を呈示する合成ポリマーまたは半合成ポリマーまたはバイオポリマーであることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
測定法が、三要素複合体反応体'−−−検体−−−反応体＊(反応体'および反応体＊は同時に検体に生物特異的に結合でき、反応体'は捕獲体または捕獲体が生物特異的親和性を介して結合し得る反応体に堅く固定されている)の形成により反応体＊を検出ゾーン(ＤＺ)に捕獲するサンドイッチタイプであることを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
検体が反応体'または反応体＊のいずれかに特異性を有する抗体であり、
ａ)検体の抗体特異性が反応体'に対するとき、反応体'は抗原／ハプテンであり、反応体＊は検体上の定常抗体領域に対する抗体である、または
ｂ)検体の抗体特異性が反応体＊に対するとき、反応体＊は抗原／ハプテンであり、反応体'は検体上の定常抗体領域に対する抗体である
ことを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
検体が抗原であり、反応体'および反応体＊が、検体上のエピトープに特異性を有する抗体であることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
検体がアレルゲンに対するＩｇＥクラスであることを特徴とする、請求項１５または１６のいずれかに記載された方法。
【請求項１９】
測定法がアレルギーまたは自己免疫疾患の検出と関連して行われることを特徴とする、請求項１から１８のいずれかに記載された方法。
【請求項２０】
サンプル中の検体の検出のために生物特異的親和性反応を利用し、(ｉ)堅く固定された生物特異的親和性反応体(捕獲体)が存在する検出ゾーン(ＤＺ)を有するフローマトリックス、および(ii)分析的検出可能反応体(反応体＊)を含み、
Ａ)反応体＊が分析的検出可能基として粒子を有する、そして
Ｂ)捕獲体が固定化粒子を介してマトリックスに固定され、その表面に親水性基を呈示する
ことを特徴とするフローマトリックスにおける分析法を実施するための試験キット。
【請求項２１】
流れがマトリックスの側面で起こることを特徴とする、請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
マトリックスでの流れが毛細管力により生ずることを特徴とする、請求項２０または２１記載のキット。
【請求項２３】
捕獲体が、生物特異的親和性を介して反応体に結合でき、次にその反応体が検体に生物特異的に結合することを特徴とする、請求項２０から２２のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】
反応体が検体と検出ゾーン(ＤＺ)に到達する前に反応できるように、該反応体をサンプルと共に適用するか、または検出ゾーン(ＤＺ)の上流のマトリックス内に予め保持することを特徴とする、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
捕獲体を固定する粒子が、マトリックスの流路の最小内側寸法よりも小さい最大外側寸法を有することを特徴とする、請求項２０から２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
捕獲体を固定する粒子が、０.１−１０００μmの範囲の最大外側寸法を有することを特徴とする、請求項２０から２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
捕獲体を固定する粒子が、０.１−１００μmの範囲の最大外側寸法を有することを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
標識粒子が０.０１−５μmの直径を有することを特徴とする、請求項２０から２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
流路が０.４−１０００μmの範囲の最小内側寸法を有することを特徴とする、請求項２０から２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
流路が０.４−１００μmの範囲の最小内側寸法を有することを特徴とする、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
標識粒子が蛍光性であるかまたは着色されていることを特徴とする、請求項２０から３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
反応体＊がマトリックス内に検出ゾーン(ＤＺ)の上流またはマトリックス内にサンプル適用部位の上流で予め保持されていることを特徴とする、請求項２０から３１のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
捕獲体をマトリックスに固定する粒子が、その表面に親水性基を呈示する合成ポリマーまたは半合成ポリマーまたはバイオポリマーであることを特徴とする、請求項２０から３２のいずれかに記載のキット。
【請求項３４】
キットが、三要素複合体反応体'−−−検体−−−反応体＊(反応体'および反応体＊は同時に検体に生物特異的に結合でき、反応体'は捕獲体または捕獲体が生物特異的親和性を介して結合し得る反応体に堅く固定されている)の形成により反応体＊を検出ゾーン(ＤＺ)に捕獲するサンドイッチタイプの測定法を意図されたものであることを特徴とする、請求項２０から３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
検体が反応体'または反応体＊のいずれかに特異性を有する抗体であり、
ａ)検体の抗体特異性が反応体'に対するとき、反応体'は抗原／ハプテンであり、反応体＊は検体上の定常抗体領域に対する抗体である、または
ｂ)検体の抗体特異性が反応体＊に対するとき、反応体＊は抗原／ハプテンであり、反応体'は検体上の定常抗体領域に対する抗体である
ことを特徴とする、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
検体が抗原であり、反応体'および反応体＊が、検体上のエピトープに特異性を有する抗体であることを特徴とする、請求項３４記載のキット。
【請求項３７】
検体がアレルゲンに対するＩｇＥクラスであることを特徴とする、請求項３４または３５のいずれかに記載されたキット。
【請求項３８】
測定法がアレルギーまたは自己免疫疾患の診断と関連して行われることを特徴とする、請求項２０から３７のいずれかに記載されたキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、サンプル中の検体を測定するために、生物特異的親和性反応を、分析的に検出可能な反応体(反応体*)と組合わせて使用する方法に関する。本方法は、検体および反応体をマトリックス中／上の検出ゾーン(ＤＺ)に輸送するマトリックスで囲まれた液体流の利用を含む。検出ゾーンにおいて、マトリックスに堅く固定された生物特異的親和性反応体(捕獲体)が存在し、サンプル中の検体の量を反映した量の複合体(反応体*および捕獲体を含む)の検出ゾーンでの形成を可能にする。本発明はまた本方法を行う試験キットにも関する。
【０００２】
生物特異的親和性を示し(生物親和性反応体)、したがって、本発明で利用し得る反応体(検体を含む)は、反応体対の個々のメンバーを意味する：抗原／ハプテン−抗体；ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン；核酸の二つの相補的な一本鎖等。抗体に関して、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ)2'、一本鎖Ｆｖ(scFv)抗体等のような抗原結合抗体フラグメントが考慮される。関連した反応体は天然に存在するだけでなく、合成的に製造した分子／結合剤であり得る。
【０００３】
当該試験法のタイプは、先に、特に、いわゆる免疫化学測定法に関連して、用いる反応体対の少なくとも一部がタンパク質構造を示す生物特異的親和性反応体を主に用いている。
生物特異的親和性反応は主に水性媒体(水のような)中で行う。
【０００４】
以前に使用された方法
捕獲体を適当なタイプのマトリックスにどのように固定するかは先に知られている。別法として、これは、マトリックス中／上に保持(deposit)されている粒子を介して行われている。捕獲体は、次ぎに、検出ゾーンで反応体*の捕獲に使用した条件下で安定である結合を介して粒子に結合している。捕獲体と粒子の間の結合は、一般に、共有結合であるが、物理的および生物特異的吸着も用い得る。とりわけ、Abbott/Syntex US4,740,468; Abbott EP 472,476; Hybritech EP 437,287およびEP 200,739; Grace & Co. EP 420,053; Fuji Photo Film US 4,657,739; Boehringer Mannheim WO 94/06012参照。関連するタイプの試験に使用する反応体*に適切な標識基は既知であり、例えば、粒子(Pharmacia AB WO 96/22532; Unilever WO 88/08534; Abbott Laboratories US 5,120,643, Becton Dickinson EP 284,232等)である。検出可能基としての粒子および固定粒子としての粒子の組合わせはまた上記の刊行物のいくつかから既知である。例えば、Boehringer Mannheim EP 462,376参照。
【０００５】
先行技術の欠点および本発明の目的
先に既知の記載の決定法に関連して、しばしば、検出感受性の改善の必要性がある。またしばしば製造が容易なシステムが望まれる。
本発明はこれらの問題の改善を目的とする。
【０００６】
本発明
我々は、好ましくはフローマトリックス内の流路の最小内部直径よりも小さい粒子を介した捕獲体の固定が、分析的指示可能基が粒子である反応体*と一緒に驚くほど良好に働くことを発見した。したがって、本発明は：
Ａ)標識基としての分析的に検出可能な反応体(反応体*)が粒子を有する、そしてＢ)捕獲体が、それ自体、マトリックスを通過して流れ中を輸送されるような大きさの、粒子を介してマトリックスに固定されている
ことを最初に記載し、を特徴とする試験法であるものである。
【０００７】
粒子は、特に、それらがマトリックスの流路よりも小さい場合、その表面に、好ましくは、粒子に結合した生物特異的親和性反応体に属さない親水性基を呈示する。好ましい親水性基は非電荷である(通常、アルコール性ヒドロキシル基の形)。
原則として、固定粒子が検出ゾーンの反応体*の検出を妨害しないことが観察されれば、標識粒子および固定粒子は、同じタイプであり得る。
【０００８】
ＤＺに捕獲体を固定することを意図した粒子は、上記のように、好ましくは流路の最小内部直径より小さい。適当な粒子サイズ(最大外部サイズ／直径)は、０.１−１０００μm、好ましくは０.１−１００μｍの範囲である。使用するマトリックスの流路の最小内部直径に関連する各具体例を考慮しなければならない。使用する粒子は、多分散または単分散であり得る。その形は、球状から完全にふぞろいまで変化し得る。特記できる適当な粒子物質は、例えば、ＳｉＯ2および
（ａ)合成ポリマー、例えば、縮合ポリマー、付加ポリマーなど。付加ポリマーの中で、アルキルビニルエーテル、アリールビニルエーテル、ビニルアレン(スチレンおよびジビニルベンゼンのような)、アルキルアルケン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド等を特記できる、そして
(ｂ)所望により合成的に架橋していてもよい(半合成ポリマーが例)バイオポリマー、例えば、ポリサッカライド(アガロース、デキストラン、澱粉)等
から選択される有機ポリマーのような他の重合物質である。
【０００９】
これに関連して、しばしば重合化スチレンまたは他の重合化アルケン／アルカジエンであるいわゆるラテックス粒子がしばしば使用される。固定粒子は、有孔性または無孔性であり得る。
【００１０】
疎水性および親水性性質に関して中庸である固定粒子の選択がしばしば重要である。理由は、当該フローマトリックスがしばしば著しい疎水性を示すが、それらは水性液体媒体中で流れるのに十分親水性であるためである。例えば、ポリスチレンの著しい疎水性粒子は、このように、非常に強くニトロセルロース膜に吸着する。同じことがまた親水性と疎水性の性質の間が平衡している他のフローマトリックスに関しても言える。不運なことに、粒子の疎水性性質は、反応体*および／または検体の非特異的吸着を促進する。これは、試験法の感受性を減少させる。我々のシステムにおいて、我々は、したがって、疎水性粒子の、例えば、その表面に、ヒドロキシ基のような親水性基を挿入することによる親水化を選択した。疎水性粒子を、好ましくは疎水性基、例えば、フェニルのようなヒドロカルビル基で置換されたポリヒドロキシポリマーまたは他の親水性ポリマーで被覆することが特に簡便である。利用可能なヒドロカルビル置換親水性ポリマーの例は、ポリサッカライド構造を有するもの、例えば、フェニルデキストランを特記できる。親水性ポリマーへの疎水性基の存在は、ポリマーの疎水性粒子への吸着を促進する。これは、次ぎに、架橋を介した吸着ポリマーの安定化の必要性を減少させる。生産工学において、特に、本発明に関連してしばしば使用される小サイズの粒子に関して、架橋が容易に粒子凝集を導くため、非常に重要であり得る。粒子への疎水性基の挿入は、生物特異的親和性反応体の粒子への共有結合的結合が、より容易に達成できることを意味する。また、親水化それ自体が、検出ゾーンでの非特異的吸着の傾向を減少させる。
【００１１】
検出可能な反応体*に関して意図される粒子は、通常、固定に利用するものより小さい。適当な粒子直径は、通常、０.００１−５μm、しばしば、好ましくはコロイド状特徴、いわゆるゾルから選択される(即ち、０.００１−１μmの間のサイズを有する、通常球状および単分散である)。原則として、固定粒子と同じ粒子物質を使用し得る。既知の標識粒子は、金属粒子(例えば金ゾル)、非金属粒子(ＳｉＯ2、炭素、ラテックス(ポリスチレン)ならびに殺された赤血球および細菌)である。非コロイド状特性の粒子に関して、それらがマトリックスの輸送に有効な条件下で沈殿されないべきであることが当て嵌まる。したがって、多かれ少なかれふぞろいであり、多かれ少なかれ多分散である炭素粒子(＜１μm)が使用されている(Pharmacia AB, WO 96/22532)。粒子は、例えば、発色団、蛍光団、放射活性化合物、酵素等を備えることにより、その検出を容易にした基と共に提供され得る。本発明において、炭素粒子のような、着色粒子よりむしろ蛍光粒子が意外に有利であることが示されている。
【００１２】
標識粒子の疎水性と親水性性質の平衡に関する要求は、固定粒子に関して当て嵌まるものと同様である。
【００１３】
固定粒子を伴う捕獲体が検出ゾーンに保持されているとき、マトリックスへの物理的吸着が促進される条件を選択するのが必須である。乾燥はしばしば必須である。マトリックスと固定粒子の間の結合が一度形成されたら、それらを破壊することはしばしば困難である。しかし、反応体*は懸濁液に維持すべき反応体を促進し、マトリックスへの粒子の物理的吸着を促進しない条件下で適用すべきである。反応体*がマトリックスに予め保持されている場合、マトリックスへの輸送のための急速な再懸濁を促進する方法で行うのが必須である。下記“検体以外の生物特異的親和性反応体適用ゾーン(ＡRＺ)”と比較。
【００１４】
検出ゾーンにおいて、検体は直接的または間接的に捕獲体と結合し得る。後者の場合、捕獲体は、生物特異的親和性を介して検体に結合できる更なる反応体と結合できる生物特異的親和性反応体である。この場合、この更なる反応体は、最初からマトリックスに固定からされる必要はなく、検出ゾーンから離れた領域またはゾーン内のマトリックスに可動性(拡散性)に予め保持されているか、サンプルと一緒にまたは別々に添加し得る。この更なる反応体が可溶性形である場合、捕獲体は有利には特異的結合対の一つのメンバーであり、他方のメンバーは反応体に結合するか、接合する。このような特異的結合対の例は、抗原−抗体およびハプテン−抗体、ビオチン−アビジンまたは−ストレプトアビジン、レクチン−糖、核酸二本鎖のような免疫学的結合対である。
【００１５】
本発明の粒子システムは、検体(最も多くの場合、ＩｇＥクラス)と反応するアレルゲンが通常１００個またはそれ以上のタンパク質の複合混合物であるアレルギー試験で特に有利である。タンパク質の粒子への結合およびその予め保持により、非常に強い固定化アレルゲンが得られ、受動的にマトリックスに吸着しているアレルゲンと比べて、そのアレルゲンはある成分の殆どを選択的に漏洩しない。これを粒子ラベルが非常に良好なシグナルを提供するという事実と組合わせて、アレルギーの特別な試験系をもたらす。上記は、複合結合剤、例えば、自己免疫疾患の決定の自己抗原が使用される全ての試験に適用される。
【００１６】
予め保持した、またはサンプルと一緒に添加された可溶性反応体(アレルゲン)の変異体は、一方で、粒子標識とアレルゲン／検体のインキュベーション時間がかなり長く、他方で、可溶性アレルゲンが、アレルゲンが固相に結合したときよりも検体との反応により利用可能であるため、アレルギー試験で他の利点を提供し得る。
【００１７】
マトリックス
マトリックスは、反応体が輸送される空間を画定する。マトリックスは単一流路(例えば、キャピラリー)の内部表面であり得、流路のシステムを有する多孔性マトリックスの内部表面はそれを通って伸びる。このタイプのマトリックスは以下でフローマトリックスと呼ぶ。フローマトリックスはモノリス、シート、カラム、膜、キャピラリー寸法を有する単一流路またはこのような流路の統合システムの形等で存在し得る。それらは、カラム包装、圧縮繊維に詰められた粒子の形等でも存在し得る。マトリックスの内部表面は親水性であり、水性媒体(通常水)がマトリックスに吸収され、輸送され得る。流路の最小内部直径は、使用する反応体がマトリックスを通して輸送されるのに十分大きくなければならない。つまみの規定は、マトリックスが相互に関係する流路のシステムを有する場合、０.４−１０００μm、好ましくは０.４−１００μmの間の最小内部直径の流路を有するものの中から、適当なマトリックスを選択可能とするものである。広い間隔(１０００μmまで)で上部に最小内部寸法を有する流路は、外部からの圧力／吸引により駆動される流れのとき主として興味深い。
【００１８】
目的のマトリックスは、ポリマー、例えば、ニトロセルロース、ナイロンなどから構築される。マトリックスの物質ならびに、流路の物理的および幾何学的設計は流れに沿って変化し得、マトリックスのどの特定部位を使用するかに依存する(Pharmacia AB WO96/22532; Medix WO94/15215)。
【００１９】
マトリックス内の輸送の流れに沿って、サンプル(ＡSＺ)、反応体(ＡRＺ)、緩衝液(ＡBＺ)等の適用のためのゾーン、および検出(ＤＺ)およびキャリブレーター(ＣＺ、下記)のためのゾーンが存在し得る。
【００２０】
特定の試験のタイプで使用し得る種々のフローマトリックスが先の特許公報に記載されている(Behringwerke US 4,861,711、Unilever WO 88/08534、Abbott US 5,120,643およびUS 4,740,468; Becton Dickinson EP 284,232およびUS 4,855,240；Pharmacia AB WO 96/22532等)。
【００２１】
輸送流
輸送流の方向は、適用ゾーンから検出ゾーン(ＤＺ)に向かう。正確にどのゾーンを輸送流が通過するかは、特定の試験プロトコールにより決定される。輸送流は放射状に広がり、円形周辺の形の流れ先端の点またはその一部から出発し得る。輸送流はまたバンドの形のゾーンから出発し得、流れの方向に垂直の真直ぐな流れ先端を有し得る。
【００２２】
あまり好ましくない変法において、輸送流は同時に検出ゾーンでもあるサンプル適用ゾーンから前進する。この変法において、流れは好ましくは適用／検出ゾーンから、好ましくは放射状に広がり、恐らく、更なる下流の検出ゾーンを通過し得る。
【００２３】
特定のタイプのマトリックスを通る輸送流は、毛管力の作用により、例えば、実質的に乾燥したマトリックスで始めることにより達成し得る。吸収体を、補助のために流れの一番端に置いても良い。主に溶解成分の輸送のみを考慮された流れは、電場をマトリックスを横切って負荷した場合(流れの方向)に、達成され得る。
利用する流れは好ましくは横向きであり、即ち、マトリックスの上部表面と並行である。他のタイプの流れ(マトリックスの奥へ)も使用し得る。
【００２４】
関連試験プロトコール
本発明は、主に非競合的(非阻害)試験変法に適用されるが、競合的(阻害)試験変法にも適用し得る。異なる試験プロトコールで形成された複合体は、下記に模式的に示す。関連反応体は、利用する結合部位に関して１価であると仮定される。プロトコールは、検体および負荷反応体に関して同時または連続変法として流し得る。同時変法は、検体(サンプル)および当該反応体が、少なくとも輸送の間に一部分同時輸送され、好ましくは検出ゾーンに同時に到達することを意味する。連続変法は、検体(サンプル)が、検出ゾーンに向かう輸送の少なくとも一部分、反応体の前を移動し、好ましくは検出ゾーンに反応体の前に到着することを意味する。本発明の試験プロトコールは、検体および反応体*に関して常に同時または連続である。“−”は最初からの堅い固定に関する。“−−−”は生物特異的親和性を介した結合に関する。
【００２５】
Ａ．サンドイッチプロトコール：
捕獲体および反応体*は検体に生物特異的親和性を有する。ｘはマトリックス上の捕獲体のモル数である。ｙは、捕獲体に結合している検体のモル数である(＝反応体*のモル)。
検出ゾーンで形成される複合体：
マトリックス(−捕獲体)x-y(−捕獲体−−−検体−−−反応体*)y。
【００２６】
Ｂ．サンドイッチプロトコール：
捕獲体は反応体Ｉに生物特異的親和性を有し、次いで、それは検体に生物特異的親和性を有する。反応体*は検体に生物特異的親和性を有する。ｘはマトリックス上の捕獲体のモル数である。ｙは、反応体Ｉを介して捕獲体に結合している検体のモル数である(＝反応体*のモル)。ｙ＋ｚは捕獲体に結合した反応体Ｉのモル数である。
検出ゾーンで形成される複合体：
マトリックス(−捕獲体)x-z-y(−捕獲体−−−反応体Ｉ)z(−捕獲体−−−反応体Ｉ−−−検体−−−反応体*)y。
【００２７】
Ｃ．阻害プロトコール：
捕獲体は検体アナログであり、検体の結合部位と同等な結合部位を有する。反応体IIは検体および捕獲体に生物特異的親和性を有する。反応体*は反応体IIに生物特異的親和性を有する。ｘはマトリックス上の捕獲体のモル数である。ｙは、捕獲体を介してマトリックスに結合した反応体IIのモル数である(＝反応体*のモル数)。反応体IIはサンプル中の検体の量に比例した量の複合体の一部である。
検出ゾーンで形成される複合体：
マトリックス(−捕獲体)x-y(−捕獲体−−−反応体II−−−反応体*)y。
【００２８】
Ｄ．阻害プロトコール：
捕獲体は、検体および反応体*の両方に生物特異的親和性を示す。反応体*は検出可能な可溶性検体アナログである。ｘおよびｙは、各々、捕獲体を介してマトリックスに結合した反応体*および検体のモル数である。ｘ＋ｙはマトリックス上の捕獲体のモル数である。
検出ゾーンで形成される複合体：
マトリックス(−捕獲体−−−反応体*)x(−捕獲体−−−検体)y。
【００２９】
サンプル適用ゾーン(ＡsＺ)
このタイプのゾーンは意図する検体の検出ゾーンの上流に見られるべきである。
【００３０】
検体以外の生物特異的親和性反応体適用ゾーン(ＡRＺ)
適用ゾーンの順番は、試験プロトコールが検体および反応体*に関して同時または連続的であることを確実にすべきである。これは、反応体*(ＡR*Ｚ)のためのものを含む反応体適用ゾーン(ＡRＺ)が常に検出ゾーンの上流になければならないことを意味する。１個またはそれ以上の反応体を同じ適用ゾーンに添加し得る。適用ゾーンがサンプルと少なくとも一つの反応体(＝ＡRＺ／ＡSＺ)、例えば、反応体*(＝ＡR*Ｚ／ＡSＺ)で共通である場合、適用を同時に行い、例えば、サンプルおよび反応体をゾーンに提供する前に混合する。所望の場合、反応体が適用前に検体または他の成分に意図した方法で結合するように、混合物をプレインキュベートし得る。種々のプロトコールの知識により、当業者はどのゾーンを必要とするか、およびどの順序でそれらを位置すべきかを容易に決定できる。
【００３１】
本方法に使用する反応体は、その各々のゾーンに予め保持しているか、測定法の実行に関連して添加し得る。予めの保持は、液体の流れが開始するまで、適用ゾーンの外側に広がらないような方法での、前もっての当該反応体の適用を含む。
【００３２】
反応体の予めの保持は、それ自体既知の方法で行い得る(例えば、Behringwerke US 4,861,711; Unilever WO 88/08534; Abbott US 5,120,643; Becton Dickinson EP284,232参照)。液体が予め保持させた反応体に到達したときに、当該反応体が溶解しなければならないという事実を考慮することは重要である。速い溶解を達成するために、使用すうｒ液体媒体との接触により速く溶解する物質内に関連半の歌いを包含させることは一般的である。このタイプの物質はしばしば、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、スルホネート等の極性および／または荷電基を有する親水性である。特に、例えば、炭水化物構造、モノ−、ジ−およびオリゴサッカライドを含む単純糖ならびに対応する糖アルコール(マンニトール、ソルビトール等)を有する、親水性の速く溶解するポリマーを特記し得る。当該適用ゾーンを、最初に速く溶解する物質の層で被覆し、所望により更なる速く溶解する物質の層の添加に続いて、反応体を適用するのは一般的な実施である。別法は、速く溶解する物質の粒子内に反応体を包含させ、次いでマトリックスの関連ゾーンに保持させることによる。
【００３３】
緩衝液ゾーン(ＡBＺ)
必要な緩衝システムは、サンプルおよび反応体と同時に添加する溶液に包含され得る。伝統法において、緩衝液の添加は、他の全ての適用ゾーンの上流に位置する適用ゾーンで行われる。これは、しばしばサンプル適用ゾーンと同じである。本発明において、緩衝液の添加は所望の位置で行い得る(下記参照)。
【００３４】
同時ＰＣＴ出願“２つまたはそれ以上の位置における添加を含む分析法ならびにその装置および試験キット”(SE9704934-0が基礎)において、我々は、一つの変法が本発明の好ましい態様を提供するものである発明を記載する。この特許出願は、本明細書に引用して包含させる。この別の特許出願における発明は、上流ゾーンに液体を適用するのと同時にまたはその前に下流のゾーン(ＡＺ１)に液体を適用した場合、フローマトリックス中の二つの連続ゾーン(ＡＺ２およびＡＺ１)由来の液体が混合せずに互いの後に移動し得るという発見に基づく。この発見は、液体中に存在する任意の反応体の、検出ゾーンに向かうゾーンワイズな移動の達成の能力により導かれた。サンプル適用ゾーン(ＡSＺ)が反応体*適用ゾーン(ＡR*Ｚ)の下流に位置する場合、試験プロトコールは、反応体*に関して同時となる。ＡR*ＺとＡSＺの間に液体単独(緩衝液)の適用のための一つのゾーン(ＡBＺ)が存在する場合、検出ゾーンＤＺの洗浄が検体および反応体*の捕獲の間に行われる。このような中間緩衝ゾーン(ＡBＺ)は下流に位置するゾーンに適用する反応体(検体を含む)が、上流に位置する適用ゾーンから出発して、反応体の前にＤＺに到着することを確実にし得る。後者は、マトリックス自体が下流に位置するゾーンに適用されている反応体を遅らせる場合、重要であり得る。
【００３５】
反応体はゾーンに適用する液体に包含され得る。あるいは、液体の適用に関して、対応する液体を適用するゾーンまたは、これと下流に位置する最も近いゾーンの間に位置するゾーンにおいて予め保持し得る。
【００３６】
この別の発明は、所望の位置で行う本発明における緩衝液の適用を可能にする。慣用法にしたがって、緩衝液の添加は、他の適用ゾーの上流である適用ゾーンにおいてのみ可能である。
本発明の本態様は、反応体*に関して連続的である方法で特に興味深い。
【００３７】
検体
本発明は、最初に記載のタイプの生物特異的親和性反応体の決定に主に適している。検体は細胞またはウイルスまたはその一部であり得る。免疫グロブリンまたは抗体のような抗原を特記し得る。免疫グロブリンに関して、測定はあるＩｇおよび／またはあるＩｇサブクラスに関し得る。抗体に関して、測定はある特異性の抗体、所望によりまた抗体のＩｇクラスまたはＩｇサブクラスに関連し得る。関連ＩｇクラスはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである。関連Ｉｇサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。
【００３８】
サンドイッチ変法(上記プロトコールＡおよびＢにしたがった)において、検体は、アレルゲン／抗原／ハプテンに方向付けされた抗体であり、特定種、特定Ｉｇクラスまたは特定Ｉｇサブクラスに由来する。この場合、反応体*は、捕獲体(プロトコールＡ)および反応体Ｉ(プロトコールＢ)ならびにアレルゲン／抗原／ハプテンにより、種、ＩｇクラスまたはＩｇサブクラスに特異的であるエピトープに方向付けされる。あるいは、逆も選択され、即ち、捕獲体および反応体Ｉは各々検体に方向付けされた抗体である。検体が一般に抗原である場合、プロトコールＡに関して、捕獲体および反応体*は両方抗原に方向付けされた抗体であり得る。プロトコールＢに関して、抗原に方向付けされた抗体であるのは、反応体Ｉおよび反応体*である。
【００３９】
競合的変法は、主に、低分子量検体に関して最も興味深い。説明的例は抗原およびハプテンである。プロトコールＣにおいて、捕獲体はマトリックスに堅く結合した抗原またはハプテン、反応体IIは抗原に方向付けされた抗体、および反応体*は反応体IIに方向付けされた抗体である。プロトコールＤにおいて、捕獲体は検体に方向付けされた抗体および反応体*は分析的に検出可能な基で標識された検体であり得る。
【００４０】
本発明の方法は、アレルギーまたは自己免疫疾患の診断の一部として行い得る。
ＩｇＥまたはＩｇＧクラスの抗−アレルゲン抗体の測定が、発明者にとって特に興味深く、後者の場合、好ましくは記載のサブクラスのいくつかに重きを置く。アレルゲン特異的抗体の測定は、ＩｇＥ介在アレルギーの診断と関連して用い得る。
【００４１】
本発明は、既に上記のように、捕獲体が、異なる成分の混合物から成る、例えば、しばしば数個の異なるアレルゲン性成分の混合物から成るアレルゲンの場合、および検体が混合物の個々の成分に方向付けされた抗体である場合、特に適している。
【００４２】
サンプル
適切なサンプルは、生物学的起源、例えば、異なる体液(全血、血清、血漿、尿、涙液、髄液等)、細胞培養培地、生物工学における加工方法、食糧、環境(環境分析サンプル)等から由来し得る。サンプルは、例えば、マトリックス、関与する試験プロトコール等に適合するように予備処理し得る。
【００４３】
キャリブレーター
本発明が関与するタイプの測定法は、分析的に検出可能な反応体(反応体*)からの検出可能シグナルの測定、および測定シグナル(サンプル値)を、サンプル中の検体の目盛りとして取ることに関する。測定シグナルを実際の検体の量に移行するために、シグナルを既知の標準量の検体(キャリブレーター)の対応するシグナル(キャリブレーター値)と比較する。本発明に関連して、新規キャリブレーターシステムが開発されており、本発明の構造を最良の態様で適用させる。
【００４４】
この別の発明は、予め、キャリブレーターが、好ましくはサンプルランに使用するのと同じタイプのマトリックスに固定(マトリックスキャリブレーター)されていることを意味する。キャリブレーター値の測定のとき、マトリックスキャリブレーターは反応体*と結合でき、次いで、反応体*からのシグナルをそれ自体既知の方法で測定する。異なる量のマトリックスキャリブレーターの使用により、一連のキャリブレーター値がサンプル中の異なる予め決定された量の検体に対応して得られ得る(標準量、用量反応曲線、キャリブレーション曲線)。
【００４５】
マトリックスに前もってキャリブレーターを固定する代わりに、キャリブレーターに結合できる反応体を固定し、次いで、キャリブレーターをキャリブレーター値の測定に関連して添加し得る。キャリブレーター結合剤がマトリックスに結合するとき、キャリブレーターは、検出ゾーンから離れたゾーンまたは領域に可動性(拡散性)に予め保持されているか、サンプルと一緒にまたは別々に添加し得る。
【００４６】
本発明の、我々の新規キャリブレーターシステムへの適用は、輸送流が、各々のキャリブレーターゾーン(ＫＺ)においてマトリックスに堅く固定されたキャリブレーターを有する１個またはそれ以上のゾーンを通過することに関する。
【００４７】
キャリブレーターまたはキャリブレーター結合剤のキャリブレーターゾーン内のマトリックスへの結合は、反応体Ｉの検出ゾーンへの固定と同じ原理で行い得る。キャリブレーター結合剤は、通常、特異的結合対(反応体対)のメンバーの一方であり、結合対の他方のメンバーはキャリブレーター物質に結合しているか、接合している。このような具体的結合対の例は、捕獲体の記載に関連して上記である。
【００４８】
キャリブレーターゾーンは、反応体*の輸送を意図した、液体の適用ゾーンの下流に位置すべきである。検出ゾーン(ＤＺ)に関連して、キャリブレーターゾーンは好ましくは上流に位置する。
キャリブレーターに関連する我々の発明は、“新規キャリブレーターの使用法および本キャリブレーターを含む装置および試験キット”(SE9704933-2が基礎)と題する同時継続ＰＣＴ出願に詳述する。この出願は引用して本明細書に包含させる。
【００４９】
本発明の第２の主態様
本発明のこの態様は、(ａ)標識基が粒子である、分析的検出可能生物特異的親和性反応体(反応体*)を、(ｂ)捕獲体が、好ましくは流路の最小直径よりも小さい粒子を介して堅く固定されている検出ゾーンを有するフローマトリックスと一緒に呈示するキットである。関連する粒子および流路は、上記で記載のものに従う。フローマトリックスは、上記にしたがって適用ゾーン、予め保持した反応体等を示し得る。
本発明を実施例部分で説明し、特許請求の範囲で定義する。
【００５０】
実施例
実施例１：検出ゾーンに粒子を介して結合した、または直接検出ゾーンに吸着させた樺(birch)アレルゲンの比較
本実施例は、樺アレルゲンに特異的なＩｇＥの測定に基づく。本発明の強度を示すために、多くの患者サンプルから得られた応答を、１)アレルゲン抽出物が、検出ゾーンに保持したフェニルデキストランで被覆させたポリスチレン粒子に共有結合的に結合しているのと、２)アレルゲン抽出物が直接保持し、ニトロセルロース膜に受動的に結合している試験変法で比較する。
【００５１】
方法および材料
フェニルデキストランのポリスチレン粒子への吸着：種々の濃度でダウtイオン水に溶解させたフェニルデキストラン(置換度：５個のモノサッカライド単位当り１フェニル基＝２０％、Ｍｗデキストラン４０,０００、Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を、ポリスチレン粒子(０.４９μm, Bangs Laboratories, USA)：１)４−５mg／ml、８−１０％粒子懸濁液、RT  １ｈ、２)５mg／ml、５％粒子懸濁液、ＲＴ  １ｈ、３)２０mg／ml、２％粒子懸濁液と、一晩、撹拌することにより吸着させた。粒子を続いて２回脱イオン水で洗浄した。粒子懸濁液を各インキュベーション毎に遠心し、洗浄した(１２,１００×ｇ、３０分、Beckman, J2-21)。
【００５２】
ｔ３の抽出(樺花粉、Betula verrucosa)：樺花粉(Allergon, Sweden)の１部(重量)を、１０部(容量)の０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.４で抽出した。抽出は、２時間、＋４℃で、シェーカー机上(２００パルス／分)で続けた。抽出物を４０００rpmで１.７５時間遠心した。濾過後、ｔ３抽出物をPD-10カラム(Pharmacia Biotech AB, Sweden)に付し、０.１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８.５で溶出した。ｔ３溶出物(命名：ｔ３抽出物１／１４)を、タンパク質の全レベルの測定の溜めに分析に取った。
【００５３】
ｔ３抽出物のポリスチレン粒子への結合(ｔ３粒子)：ｔ３抽出物をＣＤＡＰ(１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムブロミド)(Kohn  J and Wilchek M, FEBS Letters, 154 (1) (1983) 209-210)によりフェニルデキストラン被覆ポリスチレンに結合させた。３０％(容量)アセトン中のフェニルデキストランで被覆したポリスチレン粒子(２１２８mg)の２％粒子懸濁液を９５４mgのＣＤＡＰ(３０％アセトン中１００mg／ml)および７.６３ml  ０.２Ｍトリエチルアミン(TEA、Riedel-de Haen, Germany)で活性化させた。ＣＤＡＰを撹拌しながら添加し、ＴＥＡを９０秒間滴下し、合計１２０秒撹拌した。反応を３０％アセトン(４倍量)添加により停止させ、１２,４００×ｇ、３５分遠心した。粒子を１回脱イオン水で洗浄した。
【００５４】
０.１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８.５中の６４０mlのｔ３抽出物１／１４を活性化粒子に添加し、結合反応を１時間、シェーカー机上で続けた。懸濁液を遠心して傾捨し、その後、０.１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８.５中の０.０５Ｍアスパラギン酸および０.０５Ｍグルタミン酸で不活性化した。シェーカー机で一晩、＋４℃でインキュベーションした。粒子を５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０.０５％ＮａＮ3、ｐＨ７.４中で遠心することにより洗浄した。
【００５５】
粒子の濃度を、対照としての非処理粒子と共に、６００nmで分光測光法で測定した。ｔ３結合ポリスチレン粒子を、タンパク質の全レベルの測定のためにアミノ酸分析に付した。
【００５６】
ｔ３抽出物およびｔ３粒子の膜への保持(検出ゾーン)：ポリエステル裏打ちのあるニトロセルロースのシート(Whatman, ８μm、５cm幅)上に、ｔ３抽出物１／１４を、１μl／ｓおよび１μl／ｓの流れで、Linear Striper(IVEK Corporation)で適用した。ｔ３抽出物１／１４を非希釈および０.１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８.５の１：１希釈(ｔ３抽出物１／２８)で保持させた。ｔ３粒子を、５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、６％ラクトース、０.０５％  ＮａＮ3、ｐＨ７.４で４％粒子レベルまで希釈した。保持物質を含むシートを１時間、３０℃で乾燥させた。シートを０.５cm切片に切断した(Matrix 1201 Membrane Cutter, Kinematics Automation)。
【００５７】
炭素粒子接合体(反応体*)：WO 96/22532にしたがって、モノクローナル抗−ヒトＩｇＥ抗体(抗−ｈＩｇＥ)を炭素粒子(sp100、＜１μm、Degussa, Germany)上に吸着させた。試験緩衝液で希釈した最終懸濁液は、３００μl／ml炭素粒子を含んだ。
【００５８】
試験方法：切片を、台盤平面から約１６°傾けて表面に重ねた。重ねた膜(３cm幅、Whatman, 17 Chr)を切片の端の０.５cmに置いた。一定圧を得るために、金属重りを吸収膜上に置いた。
【００５９】
サンプルおよび試薬を以下の順番でピペット輸送した。各サンプルおよび試薬容量は、続く容量をピペット輸送する前に膜内に移動させた。
１)３０μl試験緩衝液(０.１Ｍ  Tris−ＨＣｌ、０.６Ｍ  ＮａＣｌ、１０％スクロース、３％ウシ血清アルブミン、０.０５％ウシガンマグロブリン、ｐＨ７.４)
２)３０μl血清サンプル
３)２０μlの試験緩衝液(段階１と同じ)
４)２０μlの炭素粒子接合体(炭素粒子に吸着した抗−ｈＩｇＥ抗体、３００μg／ml、試験緩衝液で希釈)
５)２×３０μlの試験緩衝液
６)反応ゾーンの炭素黒化を、Ultroscan XL, Enhanced Laser Densitometer(LKB)で吸光度として測定した。
【００６０】
結果
検出ゾーンのタンパク質の量
【表１】
0004531252.tif 000002
【００６１】
【表２】
0004531252.tif 000003
*＝標識が結合しているときの、反応ゾーン内の吸光度(×１０００)。
【００６２】
結論
本実験は、結合粒子の形で保持した同じ量の樺アレルゲンが、アレルゲンを直接膜に保持させたものと比較して、樺特異的ＩｇＥ抗体の有意に高い結合を提供することを示す。
【００６３】
同様の実験において、異なる単分散ポリスチレン粒子(Bangs Laboratories)を固定粒子として、そして炭素粒子の代わりに使用し、異なる直径の蛍光ポリスチレンを使用した。固定粒子の直径は、０.２８−３μmの間で、異なる実験で変化した。標識粒子の直径は、０.１−０.５μmの間で、異なる実験で変化した。結果は、一般に、上記に詳述のような炭素粒子の結果に従う。
【００６４】
実施例２：アレルゲンが適用ゾーンに予め保持している試験変法での樺特異的ＩｇＥの測定
方法および材料
樺花粉アレルゲンのビオチニル化：ｔ３(樺花粉、Betula verrucosa)の抽出を、遠心および濾過溶液をPD-10カラムに付し、脱イオン水に溶出する以外、先に記載のように行った。ｔ３溶出物を凍結乾燥した(LSL SECFROID, LYOLAB F, ポンプ：LEYBOLD TRIVAC D8B)。
【００６５】
凍結乾燥ｔ３物質を０.１５Ｍ  ＫＰＯ4、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.８に溶解した。含量の測定をアミノ酸分析により行った。本物質に、125Ｉ−標識ｔ３を添加し、混合物を、２５mlの０.１５Ｍ  ＫＰＯ4、０.１５mＮａＣｌ、ｐＨ７.８で平衡化したPD-10カラムに適用した。ｔ３アレルゲンのビオチニル化を、供給者(Pierce)が推奨する条件にしたがって行った。３mgの溶出ｔ３抽出物(２.０ml)に、次いで、０.１３８mlのビオチン-LC-Sulfo-NHS(３.５９ｍＭ、Pierce)を添加し、インキュベーションをシェーカーで１時間、室温で行った。結合反応を５０μLの２Ｍグリシンの添加により停止させた。次いで、抽出物を、５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.４で平衡化したゲル濾過カラムに適用した。収率および最終タンパク質濃度は、得られた放射活性から測定した。
【００６６】
ストレプトアビジンのポリスチレン粒子への結合：
ストレプトアビジン(Molecular Probes)を、ＣＤＡＰ(１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムブロミド)によりフェニルデキストラン吸着ポリスチレン粒子に結合させた(Kohn J and Wilechek M, FEBS Letters 154 (1) (1983) 209-210)。
【００６７】
ストレプトアビジンの脱塩および緩衝液交換を、ＮａＨＣＯ3、０.１Ｍ、ｐＨ８.５中のゲル濾過(PD-10)により行った。３０％(容量)アセトン中の２％溶液の６００mgのフェニルデキストラン被覆ポリスチレン粒子を、４.５mlのCDAP(０.４４Ｍ)および３.６mlのＴＥＡ(０.２Ｍトリエチルアミン、Riedel-DeHaen)により活性化した。ＣＤＡＰを６０秒およびＴＥＡを１２０秒の撹拌で添加した。次いで、粒子を３０％(容量)アセトンで洗浄し、１２,１００ｇ(２５分、Beckman, J-21, JA-20, 10,000rpm)で遠心した。
【００６８】
２０.６mgのストレプトアビジンを３５０mgの活性化粒子に、シェーカーで１.５時間、＋４℃でインキュベーションすることにより結合させた。次いで、粒子を遠心し、その後不活性化を、ＮａＨＣＯ3緩衝液中の０.０５Ｍグルタミン酸および０.０５Ｍアスパラギン酸で行った。インキュベーションを、一晩、＋４℃で撹拌しながら行った。結合粒子を、次いで、２回、５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０.０５％ＮａＮ3、ｐＨ７.４で洗浄した。
粒子濃度は、分光測光法でＡ600nmで、非処理粒子を対照として測定した。
【００６９】
ストレプトアビジン結合粒子のニトロセルロース膜への保持：ポリエステル裏打ちのあるニトロセルロースのシート(Whatman, ８μm、５cm幅)上に、１０ｍＭ  ＮａＰＯ4、５％スクロース、５％デキストラン５０００、ｐＨ７.４で１％粒子含量に希釈したストレプトアビジン結合粒子のゾーンを、Linear Striper (IVEK Corporation)で適用した。
保持流は２.５μl／cmおよび速度は２０mm／秒であった。保持物を１時間、３０℃で乾燥させ、その上で、シートを０.５cm幅切片に切った(Matrix 1201 Membrane Cutter, Kinematics Automation)。
【００７０】
濾紙へのビオチニル化アレルゲンの保持：１０×５mmフィルターを濾紙から切った(Whatman 3)。５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.４、ＢＳＡ６％中の１０μlのビオチニル化ｔ３(７７ng)をフィルターに分配し、フィルターを３０℃で４５分乾燥させた。
【００７１】
検出粒子への抗ｈＩｇＥ抗体の結合：ペプシンでfab'２フラグメントに開裂させたｈＩｇＥへの抗体を、表面にアルデヒド基を有する蛍光ポリスチレン粒子に結合させた(Molecular Probes C-17177 TransFluoSpheres, アルデヒド−スルフェートマイクロスフェア、０.１μm、６３３／７２０、２％固体)。２３mgの抗体を、５０ｍＭ  ＮａＰＯ4緩衝液、ｐＨ６中の６６mgの粒子に一晩、室温で結合させた。次いで、２０５μLのＮａＣＮＢＨ4(５Ｍ)を添加して、結合を３時間、室温で減少させた。２０,８００×ｇ(Eppendorf 5417R中５０分、１４,０００rpm)で遠心後、不活性化を、脱イオン水、ｐＨ６.５中の０.０５Ｍグルタミン酸および０.０５Ｍアスパラギン酸で、一晩、室温で撹拌して行った。次いで、遠心を２０,８００×ｇ(５０分)で行った。０.０５％ＮａＮ3含有５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７.４中の０.２％ＢＳＡでの遮断および一晩＋４℃でのインキュベーション後、遠心を再び２０,８００×ｇ(５０分)行った。２回の洗浄および遮断緩衝液中への貯蔵を次いで行った。粒子濃度を、螢光計(Perkin-Elmer LS50B)で、元々の粒子で調製した標準曲線により決定した。結合タンパク質濃度を、結合中に存在する放射活性抗ｈＩｇＥを有することにより測定した。
【００７２】
試験法：切片を、台盤平面から約１６°傾けて表面に重ねた。吸収膜(３.５cm幅、Schleicher & Schuell, GB004)を膜の上端から０.５cmに置いた。一定圧を得るために、金属重りを吸収膜上に置いた。次いで、サンプルおよび試薬を、連続的に下記に記載のようにピペット輸送した。各サンプルおよび試薬容量を次ぎの容量をピペット輸送する前に膜に重ねた。
【００７３】
１)３０μLの５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.４で予備洗浄。
２)予め保持させたビオチニル化ＩｇＥを有するフィルターを切片の底に置いた。
３)３０μLの血清を各フィルターにピペット輸送した。
４)２０μLの試験緩衝液(０.１  ＮａＰＯ4、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％スクロース、３％ＢＳＡ、０.０５％ウシガンマグロブリン、０.０５％ＮａＮ3、ｐＨ７.４)をフィルターに添加した。
５)アレルゲンフィルターを除去した。
６)試験緩衝液で希釈した２０μlの検出接合体(７５μg／mL)。
７)２×３０μLの試験緩衝液。
８)検出ゾーンの蛍光を、走査赤色レーザーフルオロメーター(６３５nm)で反応領域(Vmm)として測定した。
選択した血清サンプルは、陰性、弱い陽性および強い陽性血清を含んだ。
【００７４】
結果
【表３】
0004531252.tif 000004
【００７５】
結果は、適用ゾーン中の予め保持させたアレルゲン(または抗原)および反応ゾーン中の一般的結合剤が十分機能することを示す。