(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便試料と、水もしくはｐＨ緩衝液と、第四級アンモニウム塩と、クロロフォルム、四塩化炭素、フェノール、ベンゼン、エーテル、アセトン及びアルコールからなる群より選ばれる少なくとも一の有機溶媒とを混合し、攪拌後、遠心することにより、糞便試料中の夾雑物が前記有機層に移行して除去された糞便試料由来の核酸を含む水もしくはｐＨ緩衝液層を得る、糞便試料からの核酸精製方法。
【請求項２】
糞便試料が懸濁した水もしくはｐＨ緩衝液を４０〜１００℃に加熱し、加熱後の水もしくはｐＨ緩衝液の糞便懸濁液と、水又は第四級アンモニウム塩と、クロロフォルム、四塩化炭素、フェノール、ベンゼン、エーテル、アセトン及びアルコールからなる群より選ばれる少なくとも一の有機溶媒とを混合する、請求項１に記載の糞便試料からの核酸精製方法。
【請求項３】
遠心して得られた水もしくはｐＨ緩衝液層に、エタノールを加え糞便試料由来の核酸を含む沈殿物を得る、請求項１又は２に記載の糞便試料からの核酸精製方法。
【請求項４】
第四級アンモニウム塩として、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)、ヘキサデシルピリジニウムクロライド(Hexadecylepyridinium Chloride)、ヘキサジメチリンブロミド(Hexadimethrine Bromido)、ヘキサフルオレニウムブロミド(Hexafluorenium Bromido)、及び、メチルアゾリニウムブロミド(methylthiazolium bromido)からなる群より選ばれる少なくとも一の第四級アンモニウム塩を用いる請求項１から３のいずれかに記載の糞便試料からの核酸精製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸を用いて各種の操作を行う場合の試料となる核酸を得るための核酸精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸を精製する方法としては、プロテネースなどの酵素によりタンパク質を分解した後、フェノールクロロフォルム抽出法によりタンパク質や脂溶性の夾雑物成分を取り除く方法が一般的に用いられてきた。
上記の他に、ガラスビーズに核酸を吸着させ、核酸以外の成分を取り除く方法、フィルターを用いて核酸のみ濾過して精製する方法などが開発されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記の方法では糞便から純度の高い核酸を得ることはできない。プロテネースによる酵素処理後のフェノールクロロフォルム抽出法では、脂溶性以外の夾雑物成分を取り除くことができない。ガラスビーズに吸着させる方法では、糞便中の夾雑物が核酸のガラスビーズへの吸着を阻害する。フィルターを用いる方法では、糞便中の夾雑物によりフィルターの目詰まりがおこるために濾過ができない。
【０００４】
実際に糞便を試料としてプロテネースによる酵素処理とフェノールクロロフォルム抽出により核酸の精製操作を行った後、エタノール沈殿法により核酸の沈殿を得ると、その沈殿は黄色ないし褐色に着色したものであった。これは糞便の夾雑物が除去されずに、高純度に核酸の精製が行われていないことを示している。
【０００５】
本発明の目的は、高純度に核酸を精製することが難しい糞便からの核酸精製において、糞便に由来する核酸以外の夾雑物を高効率で除去し、純度の高い核酸を得る方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、糞便試料を、第四級アンモニウム塩を用いて精製することを特徴とする核酸精製法である。
ここで、第四級アンモニウム塩として、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(Hexadecyltrimethylammonium Bromide)、ヘキサデシルピリジニウムクロライド(Hexadecylepyridinium Chloride)、ヘキサジメチリンブロミド(Hexadimethrine Bromido)、ヘキサフルオレニウムブロミド(Hexafluorenium Bromido)、メチルアゾリニウムブロミド(methylthiazolium bromido)などを挙げることができるが、これに限定されない。第四級アンモニウム塩の濃度としては０．０１％から３０％であるが、好ましくは０．１％から５％である。これは０．０１％より少ないと精製効果がなく、３０％を超えると第四級アンモニウム塩が析出するからである。
温度条件としては、４０〜１００℃の温度に加熱後、第四級アンモニウム塩を添加するのが好ましい。加熱の方法としては、例えば試料を懸濁させた後プラスチックチューブに入れ、ヒートブロック用いて加熱することが挙げられるが、これに限定されず、ビーカーに入れバーナーなどで加熱してもよい。
【０００７】
糞便として、ヒト、家畜、昆虫に由来するものを挙げることができるが、これらに限定されず、動物一般の糞便に適用できる。
また、第四級アンモニウム塩と同時に有機溶媒を用いることもできる。このとき有機溶媒としてクロロフォルム、四塩化炭素、フェノール、ベンゼン、エーテル、アセトン、アルコールなどを用いることができるが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明において、上記の試薬を用いる手順として、糞便を水もしくはｐＨ緩衝溶液に懸濁させ、これに第四級アンモニウム塩を加え撹拌し、ついで有機溶媒を加えて撹拌し遠心することで、核酸を精製することができる。ただし、この手順に限定されず、第四級アンモニウム塩と有機溶媒を同時に加えても良い。また、糞便を懸濁させるｐＨ緩衝溶液としては、例えばりん酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液などを用いることができるが、これらに限定されない。
【０００９】
なお、本発明において、核酸とはＤＮＡ、ＲＮＡの両方を意味し、動物の糞便中に存在する細菌、ウイルスおよび原虫の核酸、詳しくは動物の糞便中に存在する感染症の原因となる細菌、ウイルスおよび原虫の核酸、動物の糞便中に存在する腫瘍細胞などの異形細胞の核酸を得る。
【００１０】
【実施例】
[実験例１]
本例では試料として、牛の糞便を用いて、糞便に含まれる腸内細菌の核酸の精製を行った。
【００１１】
牛の糞便１ｇをリン酸緩衝溶液９ｍＬに加え撹拌し、糞便の懸濁液を得た。これを３分間放置して、糞便に含まれる固形分を沈殿させ、糞便懸濁液の上清を得た。
腸内細菌の細胞を破壊し、核酸を溶液中に抽出することを目的として、上記の糞便懸濁液上清を１００℃で５分間加熱した。
【００１２】
上記の加熱した上清１ｍＬに第四級アンモニウム塩として、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを濃度が１％になるように加え、撹拌した後有機溶媒としてクロロフォルムを１ｍＬを加えた。この時の状態を図１に示す。図１から解るように核酸を含む水層（上層）１は糞便に含まれる夾雑物により強く着色していた。また、有機層（下層）２は透明であった。
【００１３】
上記の図１の状態のものを撹拌した後、遠心力１０、０００Ｇで５分間遠心した。この時の状態を図２に示す。図２から解るように、糞便に含まれる夾雑物が水層１から有機層２に移行して、水層１は透明になり有機層２が着色した。このことは核酸を含む水層１から糞便に含まれる夾雑物が除去され、核酸が精製されたことを示している。
【００１４】
上記の透明になった水層１を別の新しいチューブにとり、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを加えて遠心することで、糞便中腸内細菌の核酸をペレットとして得ることができた（核酸のエタノール沈殿）。このペレットは白色であり、高純度に精製されていることが解った。
【００１５】
[実験例２]
本例では試料として、ヨーネ病に感染した牛の糞便を用いて、糞便に含まれるヨーネ菌の核酸の精製を行った。本発明に従って精製された核酸と従来法により精製された核酸をＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして反応を行い、反応産物の収率を比較することで精製の程度を比較した。
【００１６】
本発明による従った方法として、実験例１と同様の方法でヨーネ病感染牛の糞便から精製した核酸を得た。
【００１７】
従来法として、ヨーネ病感染牛の糞便からプロテネースによる酵素処理の後、フェノールクロロフォルム抽出により核酸の精製を行った。
【００１８】
本発明によって精製された核酸と従来法によって精製された核酸をヨーネ菌に特異的な遺伝子であるＩＳ９００の核酸配列を増幅するＰＣＲ反応系に投入し反応させた。この時のＰＣＲのプライマー配列はGATCGGAACGTCGGCTGGTCAGGとACGACGACGCGCAGCGATTGCTCTであり、酵素はTaqポリメラーゼを用いた。反応の温度条件は９７℃ー３０秒、６５℃ー３０秒、７２℃ー３０秒の４０サイクルであった。
【００１９】
上記ＰＣＲ反応の産物をアガロース電気泳動法により検出した。その結果を図３に示す。図３中レーン１、４は分子量マーカ、レーン２は本発明により精製された核酸を鋳型としたＰＣＲ産物、レーン３は従来法により精製された核酸を鋳型としたＰＣＲ産物の電気泳動図である。
図３から解るように本発明によって精製された核酸からは目的の反応産物が検出されているが、従来法の核酸からは反応産物が検出されていない。この違いは、従来法では糞便の夾雑物の除去が十分ではなく、ＰＣＲ反応が阻害されたためである。この実験から、本発明によれば糞便からＰＣＲ反応に用いるのに十分な純度で核酸を精製できることが示された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、精製された核酸を得ることが難しい糞便から、高純度の核酸を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製前の糞便試料を示す図
【図２】精製後の糞便試料を示す図
【図３】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動による検出図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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