(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々単一のビーズを収容する２次元的に規則的に配列された複数のビーズ固定部位と、前記ビーズ固定部位同士を結合する微細溝とを有する微細構造パターンが表面に形成された硬質基板と、
弾性基板と、
前記硬質基板の前記微細構造パターンが形成された表面に前記弾性基板を接触させ加圧するための手段と
を備えることを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスにおいて、前記複数のビーズ固定部位に、表面に生物活性プローブ分子を結合した複数のビーズが相互に非接触の状態で収容されていることを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項３】
請求項２記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスにおいて、前記ビーズは直径が１〜１００マイクロメートルであることを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスにおいて、前記複数のビーズ固定部位は内部に２個以上のビーズが入ることのできない内容積を有し、前記微細溝はビーズの直径より小さい幅を有することを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスにおいて、前記硬質基板の表面に、前記弾性基板を前記硬質基板に押しつける加重を検知するための傾斜構造部位を有することを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスにおいて、前記硬質基板は、前記微細構造パターンの試料溶液導入端に接続される貫通孔と、前記微細構造パターンの試料溶液排出端に接続される貫通孔とを有し、試料溶液は前記硬質基板の前記微細構造パターンが形成された面と反対側の面から前記貫通孔を介して前記微細構造パターンに導入され、前記微細構造パターンを流通した試料溶液は前記貫通孔を介して前記硬質基板の前記微細構造パターンが形成された面と反対側の面から排出されることを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスにおいて、前記複数のビーズ固定部位が２次元格子状に配置され、２次元格子の各列のビーズ固定部位は前記微細溝によって連通していることを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスにおいて、前記複数のビーズ固定部位と前記微細溝によって網状の流路が形成され、流路の合流点に前記ビーズ固定部位が設定され、合流点と合流点を結ぶ流路部分が微細溝となっていることを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイス。
【請求項９】
硬質基板上に２次元状に規則的に配列されたビーズ固定部位とそれを結合する微細溝から成る微細構造パターンを形成する工程と、
前記微細構造パターン中のビーズ固定部位にビーズを配置する工程と、
前記硬質基板の前記微細構造パターン形成面に透明な弾性基板を加圧して張り合わせることでビーズが内部に固定されたマイクロ流路を形成する工程と
を含むことを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイスの作製方法。
【請求項１０】
請求項９記載のマイクロ流路ビーズアレイデバイスの作製方法において、硬質基板上の溝構造に設けた傾斜構造部位への前記弾性基板の侵入程度を観察し、前記弾性基板を前記硬質基板に押しつける加重を制御する工程を有することを特徴とするマイクロ流路ビーズアレイデバイスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流路中に配置したビーズを用いる分析装置、及びその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物学的マイクロアレイ分析技術は、遺伝子多型のタイピングなどの網羅的な生物学的検査を行うための手段である。この技術では２次元固相支持体上に多数の異なる生物活性物質（プローブ）を空間的にアドレス指定が可能な形で配置したチップを用いて分析を行うが、単一チップ上に配置される生物活性プローブの数は通常、１０００から１０００００までの数に及ぶため、空間的にアドレス指定が可能な形でプローブを配置したチップは、製造方法に関わらずに本質的に高価なものとなる。これを避ける代替的なアプローチに、蛍光性色素を取り込ませた微小球を用いて生物学的多重化アレイを生成させるという考え方がある。ここでは各微小球のアドレス指定を、各微小球からの蛍光信号を検出することで行う。微小球を二次元状に配置してマイクロアレイとして利用することにより、リソグラフィーのような高価な手法を使うことなく、高密度なアレイを作製することが可能になる。このような高密度ビーズアレイとしては、イメージングファイバーの端面をエッチングすることによって得られるマイクロウェルアレイにビーズをはめ込むことでビーズアレイを形成する手法（Science, 287, 451-452 (2000)）などが提案されている。
【０００３】
一般的に、生物学的マイクロアレイ分析技術などの基板表面に固定された生物活性プローブが溶液中の分析対象物質を捕捉する現象を検出する分析装置において、短時間に分析処理を行うことは難しい。この分析時間を短縮する方法として、微小空間において化学反応などを行う技術が発展しつつある。微小空間においては、溶液内に存在する分析対象物質が拡散によって生物活性プローブが固定された表面に到達するために要する時間が圧倒的に短くなる。微小空間中にビーズを配置したものとしては、キャピラリー中にビーズを配置する手法（特開2000-346842号公報）、シリコンの異方性エッチングにより作製したマイクロウェル（貫通孔）アレイにビーズを配置したもの（Analytical Chemistry, 75, 4732-4739 (2003)）が提案されている。
【特許文献１】特開2000-346842号公報
【非特許文献１】Science, 287, 451-452 (2000)
【非特許文献２】Analytical Chemistry, 75, 4732-4739 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在利用されているバイオアレイ分析用チップは、高価である点、及び分析に時間がかかる点に問題があり、より安価で分析時間の短縮を実現する新たなデバイスに対するニーズが存在する。
【０００５】
マイクロビーズアレイは分析用チップのコストダウンの点から注目される技術であるが、基板表面に作製されたマイクロビーズアレイを利用する場合、分析時間に関しては従来のバイオアレイ分析チップと同様に時間がかかる点が問題である。キャピラリーなどのマイクロ流路にマイクロビーズを充填する方法では、ビーズ同士が互いに接触した状態で固定される。ビーズの集合体の蛍光顕微鏡画像に基づいて各スポットからの信号を解析する場合、マイクロビーズ同士が互いに接触している状態では、各スポットからの信号を分離することが困難であり、分析結果の信頼性を低下させる問題がある。また、ビーズが規則的に配列していない場合には、同一スキームによる反復的な分析作業ができなくなり、分析作業の効率が低下する問題がある。シリコンの異方性エッチングにより作製したマイク
ロウェル（貫通孔）アレイにビーズを配置したものでは、ビーズ同士が互いに非接触の状態で固定されるが、そのサイズはマイクロウェル底面の開口部の大きさにより限定されるため、高密度化は困難である。実際、直径８０マイクロメートル以上のビーズのみが使用されている。マイクロウェルを有する基板は、極めて薄い上に多くの貫通孔があいた構造であり強度に問題がある。この基板がマイクロギャップ中に保持される必要があるため、特に、多数のビーズを固定するために基板面積が大きくなった場合、基板が容易に損傷することが予想される。また、マイクロウェルを有する基板だけではなく、マイクロギャップを有する基板２枚を別途形成する必要があり、作成工程が複雑である。
【０００６】
また、ビーズをマイクロ流路中で利用する場合、ビーズを配置することで圧力損失が増大し、送液時の液体の内圧が高くなる。その結果、「漏れ」が起こりやすくなるため、マイクロ流路形成に広く利用されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の接着性を利用した基板間接合は使用できない。一方、熱的手法による強固な接合方法は、熱に弱い生体活性プローブを破壊するため使用できない。非可逆な基板間接合、あるいは、ビーズの固定を行った場合には、作製したチップが使い捨てになってしまうため、分析コストがかかる。また、チップ上の生物活性プローブのセットを簡単には変更できない問題点も生じる。
【０００７】
本発明は、これらの問題を解決できるマイクロ流路ビーズアレイデバイス及びその作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
基板表面に作製したアレイを利用する場合、溶液中に存在する分析対象物質が基板表面まで拡散現象によって移動して来なければならないため、分析時間がかかる。これを解決するためには、アレイに利用するマイクロビーズをマイクロ流路中に配置することで拡散現象による移動距離を短くすることが有効である。マイクロビーズを配置するマイクロ流路として、ビーズ固定部位をビーズの移動を妨げる微小溝で結合した２次元微細構造パターンを利用することで、マイクロビーズを相互に非接触の状態でビーズを規則的に２次元配列することが可能になる。本発明においてビーズとは微小球に限らない。直径が１〜１００マイクロメートルの微小球に相当する大きさであり、ビーズ固定部位に１個づつ配置が可能な物体であれば、多面体状のもの、棒状のもの、または、粉砕により作製される、個々の粒子が不規則な形状を有するものを含む。
【０００９】
微細構造を作製した硬質基板とゴム弾性基板の張り合わせにより、マイクロ流路を形成する。このときに、ゴム弾性基板を硬質基板に押しつける加重を適正に制御することで漏れの起こらないマイクロ流体デバイスを形成する。上記の張り合わせは可逆な基板間接合であるので、容易に分解し、再構成することができる。その際にチップ上のビーズを入れ替えることで、チップ上の生物活性プローブのセットを変更することができる。
【００１０】
すなわち、本発明によるマイクロ流路ビーズアレイデバイスは、各々単一のビーズを収容する２次元的に規則的に配列された複数のビーズ固定部位と、ビーズ固定部位同士を結合する微細溝とを有する微細構造パターンが表面に形成された硬質基板と、弾性基板と、硬質基板の微細構造パターンが形成された表面に弾性基板を接触させ加圧するための手段とを備えることを特徴とする。硬質基板としては、石英ガラス、一般ガラス、フッ化カルシウム、シリコンカーバイド、アクリル、PMMA、サファイヤ、アルミナ、水晶、ダイヤモンド等の透明材料、または、各種プラスチック類、シリコンなどの半導体、セラミックス、アルミニウム、ステンレスなどの金属を含む不透明な硬質材料を用いることができる。弾性基板としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をはじめとするシリコーン樹脂、天然ゴム、ニトリルゴム、フッ素ゴムなどのゴム材料を用いることができる。これらの基板は貼り合わせて使用するため平滑な表面を有する必要があり、顕微鏡による蛍光観察を行うために、硬質基板と弾性基板のうちのすくなくとも一方は透明な基板である必要が
ある。硬質基板と弾性基板は接着することなく張り合わされている。
【００１１】
一例として、複数のビーズ固定部位には、表面に生物活性プローブ分子を結合した複数のビーズが相互に非接触の状態で収容されている。ビーズは直径が１〜１００マイクロメートルであるのが好ましい。より好ましくは、直径６６マイクロメートル以下のビーズを使用することによって１ミリメートル角あたり１００個以上のビーズを配置する。複数のビーズ固定部位は内部に２個以上のビーズが入ることのできない内容積を有し、微細溝はビーズの直径より小さい幅を有する。弾性基板は、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂とすることができる。また、硬質基板の表面に、弾性基板を前記硬質基板に押しつける加重を検知するための傾斜構造部位を設けることができる。
【００１２】
硬質基板は、微細構造パターンの試料溶液導入端に接続される貫通孔と、微細構造パターンの試料溶液排出端に接続される貫通孔とを有し、試料溶液は硬質基板の微細構造パターンが形成された面と反対側の面から貫通孔を介して微細構造パターンに導入され、微細構造パターンを流通した試料溶液は貫通孔を介して硬質基板の微細構造パターンが形成された面と反対側の面から排出される。このような構造とすることで、弾性基板と硬質基板の張り合わせの圧力と、流体の流出入するためのチューブ接続時に必要な圧力とを独立して制御可能となる。
【００１３】
微細構造パターンの一例として、複数のビーズ固定部位が２次元格子状に配置され、２次元格子の各列のビーズ固定部位は前記微細溝によって連通しているパターンがある。微細構造パターンの他の例としては、複数のビーズ固定部位と微細溝によって網状の流路が形成され、流路の合流点にビーズ固定部位が設定され、合流点と合流点を結ぶ流路部分が微細溝となっているパターンがある。
【００１４】
本発明によるマイクロ流路ビーズアレイデバイスの作製方法は、硬質基板上に２次元状に規則的に配列されたビーズ固定部位とそれを結合する微細溝から成る微細構造パターンを形成する工程と、微細構造パターン中のビーズ固定部位にビーズを配置する工程と、硬質基板の微細構造パターン形成面に弾性基板を加圧して張り合わせることでビーズが内部に固定されたマイクロ流路を形成する工程とを含む。硬質基板上の溝構造に設けた傾斜構造部位への弾性基板の侵入程度を観察し、弾性基板を硬質基板に押しつける加重を制御する工程を有していてもよい。
【００１５】
マイクロ流路中に配置したビーズによる（２次元）アレイ構造は、核酸（ＤＮＡ）をはじめとする生体分子の網羅的検出手法である生物学的マイクロアレイ分析に利用される。また、本デバイスの作製手法は、試料の量を非常に少なくして多くの反応、分離、分析等を行うのに用いるマイクロリアクター、ケミカルチップ、パイオチップ、Lab-on-a-chip、ナノチップ等のマイクロビーズデバイスの製造方法として利用される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、安価で分析時間が短く、かつ分析精度の高いデバイスを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
本発明のマイクロ流路ビーズアレイデバイスは、次の４段階の工程を経て作製した。(1)硬質基板上へのマイクロ流路の作製（ビーズ固定用微細構造パターン、送液用幅広流路、及び、貫通孔の作製を含む）、(2)マイクロ流路中のビーズ固定部位へのビーズの充填、(3)硬質基板とゴム弾性基板の加重を制御した状態での張り合わせ、(4)試料溶液の導入及び排出のための送液用チューブの接合。以下、上記４段階の工程について説明する。
(1) 硬質基板上へのマイクロ流路の作製（ビーズ固定用微細構造パターン、送液用幅広流路、及び、貫通孔の作製を含む）
【００１８】
硬質基板としては、化学的安定性及び透明性に優れた石英基板を使用した。石英基板は一辺２センチメートルの正方形、厚さ２ミリメートルのものを用いた。石英基板表面へのビーズ固定用微細構造パターンの作成は、レーザー誘起背面湿式加工法(LIBWE法)（特許3012926号及びJ. Wang, H. Niino, A. Yabe, Appl. Phys. A, 68, (1999), pp 111-113.参照）によって行った。本加工法により、マスクを通してパターン化したレーザー光を１／８倍の縮小露光することで、石英基板の中央部の１ミリメートル角の領域に微細構造パターンを一括形成した。
【００１９】
図１は、ビーズ固定用微細構造パターンの例を示す平面図である。図１（ａ）から図１（ｃ）は、ビーズ固定部位を直線的に連結した構造が平行に設置されている構造例を示し、図１（ｄ）は、ビーズ固定部位が２次元的に連結された平面状の構造例を示している。作製したビーズ固定用微細構造パターンは、２次元的に規則的に配置されたビーズ固定部位１を断面積が小さくビーズが移動できない微小溝２で結合した構造を有する。図１（ａ）に示した微細構造パターンは、格子状に配列された複数のビーズ固定部位１の各列を、それぞれ試料溶液の流路となる直線状の微小溝２によって連結したものである。図１（ｂ）に示した微細構造パターンは、格子状に配列された複数のビーズ固定部位１の各列を、ビーズ固定部位を含む流路がジグザグ形状となるように微小溝２によって連結したものである。図１（ｃ）に示した微細構造パターンは、試料溶液の流路となる直線状の微小溝２を複数本平行に設け、各微小溝２に対して平面形状が台形のビーズ固定部位１を複数配置したものである。図１（ｄ）に示した微細構造パターンは、網状に流路を形成し、流路の合流点をビーズ固定部位１とし、合流点と合流点を結ぶ流路を断面積が小さくビーズが移動できない微小溝２としたものである。
【００２０】
これらの微細構造パターンの形状は、加工時に使用するマスクを交換することで自由に選択することが可能である。図示したビーズ固定用微細構造パターンの左右の端の部分は、複数のビーズ固定用微細構造パターンを並べて作製するときの結合部位、あるいは、送液用の幅の広い流路への結合部位として使用する。
【００２１】
ビーズのサイズが小さくなると、その移動を妨げる微小溝２の幅が著しく小さくなり、その結果、溶液の流通が著しく困難になるため、ビーズは直径が１マイクロメートル以上のものを利用するのが好ましい。また、スポッティングによるＤＮＡアレイよりも高密度のアレイを作製するという観点から、ビーズの直径は１００マイクロメートル以下であることが好ましい。このサイズのビーズを、それぞれのビーズからの信号を容易に分離できるよう、直径の１．５倍以上の間隔で配置することが好ましい。これらの条件のもとでは、１ミリメートル角あたりの最大ビーズ配置密度は、直径１マイクロメートルの場合には４４３５５６個、直径１００マイクロメートルの場合には３６個である。また、１ミリメートル角あたり１００個以上のビーズを配置するにはビーズの直径が６６マイクロメートル以下であることが必要である。
【００２２】
実施例として作製した構造は、直径１０マイクロメートルのビーズを配置するためのものであり、例えば、図１（ａ），（ｂ）の構造において、ビーズ固定部位１は一辺１５マイクロメートルの正方形で深さが１５マイクロメートルであり、この固定部位を幅が５マイクロメートルの微小溝２が結合している。
【００２３】
図２に、図１に示した各微細構造パターンにビーズを配置した様子を示した。石英基板２１の表面に形成した微細構造のビーズ固定部位１にビーズ３を配置した後に、ＰＤＭＳ板２５と張り合わせることにより流路が形成される。図２（ａ），（ｂ），（ｃ）は、図
１（ａ）に対応する。図２（ｂ）及び図２（ｃ）は、石英基板２１にＰＤＭＳ板２５を張り付けた後の、ビーズ固定部位の断面図及び微小溝の断面図である。図２（ｂ）は図２（ａ）のＡＡ′断面に相当し、図２（ｃ）は図２（ａ）のＢＢ′断面に相当する。また、図２（ｄ），（ｅ），（ｆ）は、それぞれ図１（ｂ），（ｃ），（ｄ）に対応する。
【００２４】
実際作製した図２（ａ）のパターンでは、１ミリメートル角の領域に３０個のビーズを配置できる流路が３２本並んでおり、１mm2あたり９６０個のビーズが配置できる。図２（ａ）のパターンでは試料溶液が主としてビーズの片側の側面を流通するのに対し、図２（ｄ）のパターンでは、試料溶液がビーズの両側面を流通する。図２（ｅ）のパターンでは、ビーズを固定する部分の壁を斜めにすることで、試料溶液がビーズの側面（図で下側に描かれている側面）に回り込みやすい構造になっている。このパターンでは、１列当たりのビーズが５０個であり、１mm2あたり１６００個のビーズを配置できる。図２（ｆ）のパターンでは、各ビーズ固定部位が幅６．２マイクロメートルの４本の微細溝で２次元的に網状に結合されており、流路全体としての断面積が大きく溶液の流通が容易になる。１mm2あたり２７０９個のビーズが配置できる。
【００２５】
レーザー誘起背面湿式加工法（LIBWE法）においては、１ミリメートル角の領域にこのような微細構造パターンを一括加工により造り込むことができる。必要に応じて１ミリメートル角の微細構造パターンを並べることで、固定できるビーズの数を増やすことが可能である。後述する図３の例では、１ミリメートル角のビーズ固定用微細構造パターンを２ｘ２＝４個配置した。なお、ここではビーズ固定用微細構造パターンの作製をレーザー誘起背面湿式加工法（LIBWE法）によって実施したが、反応性イオンエッチング等の他の微細加工法を用いてもよい。また、作製された微細構造を鋳型とする熱エンボス法などにより作製することも可能である。
【００２６】
図３は、ビーズ固定用微細構造パターンを形成した石英基板の全体図である。図３（ａ）は基板表面の平面図、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡＡ′断面図、図３（ｃ）は図３（ａ）のＢＢ′断面図である。
【００２７】
図示するように、石英基板の中央部には、LIBWE法で作製された１ミリメートル角のビーズ固定用微細構造パターン１５が４個配置されている。ビーズ固定用微細構造パターン１５の両端には、外部との接続を容易にするために幅の広い流路１２，１３を形成した。流路１２，１３は、レーザー誘起背面湿式加工法（LIBWE法）による加工と超音波加工機による加工を併用して形成した。ビーズ固定用微細構造パターン１５は、幅１ミリメートル、深さ４０マイクロメートルのLIBWE法によって作製した幅広流路１３に結合した。この流路１３は１ミリメートル角の加工領域を、レーザーを照射しながら移動させることで形成しており、幅広流路１３の末端には傾斜構造部位１４が存在する。この傾斜構造部位１４は、ゴム弾性基板を石英基板に張り合わせるときの適正な加重の検出に利用できる。流路１３は、超音波加工機で作製した幅１ミリメートル、深さ２００マイクロメートルの流路１２を通じて直径１ミリメートルの貫通孔１１につながっている。流路１２，１３は、貫通孔１１から導入された試料溶液をビーズ配列部位１５に導くものであり、幅および深さは１０マイクロメートル〜１ミリメートルの範囲で自由に選ぶことができ、他の加工法を利用することも可能である。また、必要に応じて溶液の導入口を２個以上に増やしてもよい。
【００２８】
(2) ビーズの充填
表面にカルボキシル基を有するサイズの均一なビーズは、バングズラボラトリーズ社、ポリサイエンス社などから購入可能である。蛍光標識ビーズは水に不溶性の蛍光色素によって調製される。例えば、Ｅｕ錯体のテトラヒドロフラン溶液の濃度が０．００１Ｍから１Ｍまでのもののそれぞれに、ビーズを懸濁して、２時間程度、撹拌することで色素をビ
ーズに含浸する。この方法は、Analytical Chemistry, 22, 5618-5624 (2000)に開示されている。２またはそれ以上の色素を異なる濃度比率で含浸させることで、多数のビーズの識別が可能になる。この方法については、特表平10-500951号公報及び特表2002-524739号公報に述べられている。また、色素分子の代わりに蛍光性半導体ナノ粒子（Nature Biotechnology, 19, 631-635 (2001)）を用いることも可能である。
【００２９】
蛍光標識を行った後、ビーズに、以下に記述する方法でオリゴヌクレオチドなどの生物活性プローブの表面固定化反応を行った。この工程は、本技術分野において公知の手順（バングズラボラトリーズ社TechNOTE ＃205及びバングズラボラトリーズ社TechNOTE ＃302）に基づき実施可能である。
【００３０】
ビーズをｐＨ７．０、濃度１００ｍＭのイミダゾールバッファーで２回洗浄した。１ミリグラムのビーズに対して、２０マイクログラムの５’末端をアミノ基で修飾したオリゴヌクレオチドを加えて、５０℃で３時間、撹拌しつつインキュベートした。反応後、集めたビーズを０．５％のＳＤＳを含有するＳＳＣバッファーで室温において３回、ＲＮＡ分解酵素を含有しない水で２回洗浄した。以上の手順により得られたビーズを、０．２％のＮａＮ３を含有するＰＢＳバッファーに再懸濁して４℃で保存した。また、ビーズ表面にあらかじめアビジンあるいはストレプトアビジンを固定しておき、５’末端をビオチン基で修飾したオリゴヌクレオチドをアビジン−ビオチン法により固定することもできる。
【００３１】
石英基板のビーズ固定用微細構造パターン１５上に直径１０マイクロメートルのビーズを含有した水溶液を滴下した後、カバーグラスで溶液を覆い、カバーガラスを軽く押しつけた状態で前後左右に動かすことにより、液体中のビーズをビーズ固定用微細構造パターン内部のビーズ固定部位に配置した。ビーズの配置は、粉末状のビーズを微細構造パターン上に降りかけ、布などでこすることでビーズ固定部位に配置することも可能である。J.
A. Ferguson, J. Steemers, D. R. Walt, Analytical Chemistry, 72, (2000) pp 5618-5624.には、ビーズの水溶液を滴下し、溶媒の蒸発を待った後で、静電気防止処理のされた綿棒で余分なビーズをふき取る方法が開示されている。
【００３２】
表面など固定部位以外の部分に残ったビーズは、リークの原因になるので、弾性基板を貼り付ける前に完全に取り除く必要がある。ビーズの除去には、接着性を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（ダウコーニング社製、シルポッド１８４）の平板を用いた。石英ガラス基板より大きなＰＤＭＳ板の表面をエタノールによって洗浄した後、ビーズを配置した微細構造パターンのある面全体に押しつけた。５秒程度、押しつけた後にＰＤＭＳ板をはがすと、石英ガラス基板の表面に残留していたビーズはすべてＰＤＭＳ板表面に貼り付いた形で除かれた。ビーズ固定部位に配置されたビーズはこの処理によって除去されない。ＰＤＭＳ板表面に写し取られたビーズはエタノールによる洗浄で取り除かれる。
【００３３】
(3) ゴム弾性基板との加重を制御した張り合わせ
ビーズを配置した石英基板をゴム弾性基板と貼りあわせることでデバイスを組み立てた。ゴム弾性基板としては、接着性があり、透明性に優れたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（ダウコーニング社製、シルポッド１８４）の板を利用した。アクリル板で作製した１ミリメートル、又は、２ミリメートルのギャップの間でシルポッド１８４を硬化させることによって厚さ１ミリメートル及び２ミリメートルのＰＤＭＳ板を作製し、適当な形状に切断して使用した。
【００３４】
デバイスの組み立てについて、図４を用いて説明する。図４（ａ）は、石英基板２１とＰＤＭＳ板２５の張り付けによる流路の形成を説明する図、図４（ｂ）はＰＤＭＳ板２５への加重を制御する機構、および、溶液の入出力口の取り付けの説明図である。
【００３５】
図４（ａ）に示すように、ビーズを配置した石英基板２１をアルミ又はステンレス製の基板保持具２２にのせ、厚さ５ミリメートルアクリル製の押さえ板２３で挟み込み、ねじ２４（４本）で締め付けることにより完全に固定した。基板保持具２２の下面開口部から、開口部のサイズ（１６ミリメートル角）に合わせた大きさの２ミリメートル厚のＰＤＭＳ板２５を石英基板２１の表面に、気泡が入らないように注意して貼りあわせた。さらに、ＰＤＭＳ板２５の下に２センチメートル角、厚さ３ミリメートルのアクリル製スペーサー２６を設置した。
【００３６】
図４（ｂ）に示すように、ＰＤＭＳ板２５の下面は基板保持具２２の石英基板保持部分の下面よりも下にあり、スペーサー２６の上面は、基板保持具２２とは接しておらず、ＰＤＭＳ板２５のみと接している。組み立て後、スペーサー２６の下面は、基板保持具２２から下に出る形になる。次に、３ミリメートル厚のアクリル製押さえ板２７を、ばね２８を通したねじ２９（４本）で固定した。押さえ板２７は、基板保持具２２とは接しておらず、スペーサー２６のみと接しており、押さえ板２７がスペーサー２６を介してＰＤＭＳ板２５を石英基板２１に押しつける形になる。ねじ２９のねじ込み量を調節することで、ＰＤＭＳ板２５を石英基板２１に押しつける加重が制御される。
【００３７】
(4) 試料溶液の導入及び排出のための送液用チューブの接合
図４（ｂ）に示すように、石英基板２１の微細構造パターン形成面と反対側の面上の貫通孔１１の上に円環状に切断したＰＤＭＳ板３０をおき、シール材として使用した。このシール材を介してチューブコネクタ３１を接続し、外径１／３２インチのPEEKチューブを接続した。これらのチューブにより液体の導入及び排出を行うことが可能になる。このチューブを通してシリンジポンプによる送液を行った。
【００３８】
作製したデバイスにおいて、ＰＤＭＳ板２５を石英基板２１に押しつける加重が大きすぎるとマイクロ流路部分にＰＤＭＳが入り込んでふさいでしまうのに対して、加重が弱すぎるとマイクロ流路の液圧が高くなったときに漏れを起こす。シリンジポンプとマイクロ流通デバイスの間に液圧を測定する圧力計を設置して液圧をモニターし、加重をかけない状態で送液を行った場合、液圧が１４ｋＰａに達した時にリークが発生した。ＰＤＭＳ板に適正な加重をかけることによって流路をふさぐことなく、リークのないマイクロ流路を形成することが可能になる。
【００３９】
本発明では、石英基板上の幅広流路中の傾斜構造部位１４の流路中に侵入したＰＤＭＳとの接触状態を観察することで適正な加重を検出できる。図５を参照して説明する。図５は、溝構造を有する石英基板２１とＰＤＭＳ板２５を張り合わせて形成された流路の形成状体を示す断面模式図である。図５（ａ）はＰＤＭＳ板２５に加重をかけない場合、図５（ｂ）はＰＤＭＳ板２５に適正な加重をかけた場合、図５（ｃ）はＰＤＭＳ板２５に過大な加重をかけた場合を示している。ＰＤＭＳ板２５に加重をかけない場合には、石英基板上に形成された溝構造１３へのＰＤＭＳの入り込みはないが、溝構造１３を流れる液体のリークが生じる。一方、ＰＤＭＳ板２５に過大な加重をかけると、溝構造１３に入り込んだＰＤＭＳ３２が流路をふさいでしまう。
【００４０】
図５（ｄ）は石英基板２１上の幅広流路中の傾斜構造部位１４を上面（または下面）から観察した図、図５（ｅ）はそのＡＡ′断面図、図５（ｆ）はＢＢ′断面図である。加重によるＰＤＭＳの流路への侵入の程度は、図５（ｄ）中のＬ１，Ｌ２の長さとして観測され、これらの値は加重の大きさに比例する。ここで、Ｌ１は加重により流路内に侵入したＰＤＭＳと傾斜構造部位１４との接触部分３３が傾斜構造部位１４の全幅をふさいでいる長さ、Ｌ２は接触部分３３の先端までの長さである。加重が１３ｋＰａの状態では、Ｌ２の値から、流路中央部分で１０マイクロメートル程度のＰＤＭＳの侵入があることが示さ
れた。このデバイスでは、毎時０．０３ｍＬの送液を行った場合に、液圧が２５ｋＰａ程度で安定な流通状態が得られた。この液圧は、加重をかけない状態でリークが起こった液圧を１１ｋＰａ超過している。ＰＤＭＳの流路への侵入を最小とするために、加重はできるだけ小さいことが望ましい。このデバイスにおいては、適正な加重は１２ｋＰａから１６ｋＰａまでの範囲にするのが好ましい。適正な加重の値は、デバイスの中で連続する微細構造パターンの数、流路の長さなどの条件によって変化し得る。
【００４１】
図６は、組み立てられた本発明のマイクロ流路ビーズアレイデバイスを用いた分析操作の説明図である。
【００４２】
作製したデバイス４３は、シリンジポンプ４６に接続した状態で顕微鏡４１のステージ４２上にセットし、顕微鏡のステージ４２上で試料溶液の導入、反応処理などを行う。このすべての過程を蛍光顕微鏡画像により観察することができる。シリンジポンプ４６とデバイス４３を結ぶPEEKチューブの途中には液圧測定用圧力計が設置されている。画像はフィルターシステムを備えるＣＣＤカメラ４４で記録され、コンピューターによる画像処理を行うことで、直ちに数値データを取り出すことができる。蛍光観察用の励起光、観察光の光路中には干渉フィルターがそれぞれ４種類セットされており、適時切り換えて使用することにより、異なる蛍光色素からの蛍光信号を識別することができる。画像観察は１ミリメートル角の微細構造パターンに対して一括で行うことができ、必要に応じてステージを移動させることですべてのビーズからの信号を検出できる。これらのステージ、フィルター、ＣＣＤカメラの動作をすべてコンピューターにより制御可能することにより、分析操作を自動化できる。
【００４３】
図１（ｃ）のパターンに直径１０マイクロメートルの蛍光色素含有ビーズを配置したものの蛍光顕微鏡像を図７に示す。個々のビーズが非接触の状態で規則的に配列されていることがわかる。このビーズアレイは、１ミリメートル角あたり１６００個のビーズが配置した高密度アレイであり、それぞれのビーズが独立した状態で固定されているため、それぞれのビーズからの信号を分離して検出する分析操作の自動化が容易になる。
【００４４】
ビーズ固定部位に入ったビーズは、ビーズを配置した石英基板を超音波洗浄機で洗浄することで除去が可能である。ビーズを除去した石英基板に別のビーズ群を配置し、再び、デバイスとして組み立てて分析操作に用いることができるので、本発明によると、微細構造を作製した基板を使い捨てにすることなく、再利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ビーズ固定用微細構造パターンの例を示す平面図。
【図２】ビーズ固定用微細構造パターンへビーズを配置した様子を示す図。
【図３】ビーズ固定用微細構造パターンを形成した石英基板の全体図。
【図４】デバイスの組み立てを説明する図。
【図５】傾斜構造部位を用いたＰＤＭＳ板への適正な加重を検出する方法の説明図。
【図６】分析操作の説明図。
【図７】蛍光色素含有ビーズを配置したデバイスの蛍光顕微鏡像。
【符号の説明】
【００４６】
１：ビーズ固定部位、２：微小溝、3：ビーズ、１１：貫通孔、１２：流路、１３：流路、１４：傾斜構造部位、１５：ビーズ配置用微細構造パターン、２１：石英基板、２２：基板保持具、２３：押さえ板、２４：ねじ、２５：ＰＤＭＳ板、２６：スペーサー、２７：押さえ板、２８：ばね、２９：ねじ、３０：ＰＤＭＳ製Ｏリング、３１：チューブコネクタ、３２：流路内に入り込んだＰＤＭＳ、３３：流路内に入り込んだＰＤＭＳと傾斜構造部位との接触部分、４１：顕微鏡、４２：ＸＹステージ、４３：マイクロビーズアレイ
デバイス、４４：ＣＣＤカメラ、４５：液圧測定用圧力計、４６：シリンジポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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