(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学走査システムであって、
光軸および視野を規定する対物レンズであって、サンプルに近接して位置決めされており、光の入射ビームを受取り、前記ビームをサンプルに導き、サンプル上で照明されるスポットを生じさせ、前記スポットから放出される光を集めてリトロビームを形成するものであり、横方向の色収差を減じさせる一方で前記システムに特定量の軸上色収差を導入することにより前記視野にわたり実質的に均一な検出感度を与える光学特性を有する対物レンズと、
それぞれ異なる波長を放射し、入射ビームに複数の光の波長を供給する複数のビーム源と、
複数のビーム源の各々と光学的に結合したビーム拡大器であって、前記システムにおける軸上色収差を補償する光学特性を有し、これにより前記ビームにおける実質的に全ての前記光が前記サンプルの共通の焦点面に衝突するようにしたビーム拡大器と、
前記光軸において、前記サンプル面で前記スポットを走査するための手段と、
検出器と、
前記検出器に近接して位置決めされ、実質的に透過させる開口を有し、後方に散乱する光を制限して信号応答を増大させる空間フィルタと、
前記リトロビームの経路に配置され、前記リトロビームを前記開口に導くための結像レンズ手段であって、前記対物レンズにより導入される軸上色収差を補償する光学特性を有する結像レンズ手段と、
前記光軸において前記ビーム源と前記対物レンズとの間に位置決めされ、前記入射ビームを前記リトロビームから分離するための分離手段と、
ピンホールと、
前記ピンホールを通過する光を平行化するように位置決めされたコリメートレンズとを含み、
前記対物レンズは前記リトロビームを前記分離手段に導き、前記分離手段は前記リトロビームを前記開口を通して前記検出器に導くものであり、
前記ピンホールは、前記ビーム源と前記分離手段との間に配置され、
前記コリメートレンズは、前記分離手段と前記ピンホールとの間に配置され、
前記ビーム源は、前記ピンホールにおいて光学的に結像した光の非コヒーレント源である光学走査システム。
【請求項２】
前記リトロビームの経路において前記走査手段と前記空間フィルタとの間に位置決めされた瞳ストップをさらに含み、前記瞳ストップは前記リトロビームの直径を規定する、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項３】
前記対物レンズは、走査装置に近接して位置決めされる対物レンズから十分に離れた外部入射瞳を規定する、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項４】
前記開口の直径は前記スポットの直径に等しく、共焦点システムを形成する、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項５】
光学走査システムであって、
光軸および視野を規定する対物レンズであって、サンプルに近接して位置決めされており、光の入射ビームを受取り、前記ビームをサンプルに導き、サンプル上で照射されるスポットを生じさせ、前記スポットから放出される光を集めてリトロビームを形成するものであり、横方向の色収差を減じさせる一方で特定量の軸上色収差を前記システムに導入することにより前記視野にわたり実質的に均一な検出感度を与える光学特性を有する対物レンズと、
それぞれ異なる波長を放射し、入射ビームに複数の光の波長を供給する複数のビーム源と、
複数のビーム源の各々と光学的に結合したビーム拡大器であって、前記システムにおける軸上色収差を補償する光学特性を有し、これにより前記ビームにおける実質的に全ての前記光が前記サンプルの共通の焦点面に衝突するようにしたビーム拡大器と、
前記光軸において、前記サンプル面で前記スポットを走査するための手段と、
検出器と、
前記検出器に近接して位置決めされ、実質的に透過する開口を有し、後方に散乱する光を制限して信号応答を増大させる空間フィルタと、
前記リトロビームの経路に配置され、前記リトロビームを前記開口に導くための結像レンズ手段と、
前記光軸において前記ビーム源と前記対物レンズとの間に位置決めされ、前記リトロビームから前記入射ビームを分離するための分離手段と、
ピンホールと、
前記ピンホールを通過する光を平行化するように位置決めされたコリメートレンズとを含み、
前記対物レンズは前記リトロビームを前記分離手段に導き、前記分離手段は前記リトロビームを前記開口を通して前記検出器に導くものであり、
前記ピンホールは、前記ビーム源と前記分離手段との間に配置され、
前記コリメートレンズは、前記分離手段と前記ピンホールとの間に配置され、
前記ビーム源は、前記ピンホールにおいて光学的に結像した光の非コヒーレント源である、光学走査システム。
【請求項６】
前記結像レンズ手段は、前記対物レンズにより導入される軸上色収差を補償する光学特性を有する、請求項５に記載の光学走査システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に蛍光撮像において使用するための光学走査撮像システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光顕微鏡法は、分子生物学、生化学および他のライフサイエンスの分野で使用されることが多い。用途の一例として、抗体を用いて特定の抗原を識別することが挙げられる。抗体とは、感染に対する防御として脊椎動物が生成するタンパク質である。抗体は、何百万もの異なる形からなり、その各々が異なる結合部位を有し、かつ抗体の生成を誘起する抗原を特定的に認識する。抗原を識別するために、蛍光染料に結合された特定の抗体を含む細胞のサンプルが与えられる。細胞は次に蛍光性について評価される。抗体の正確な抗原特異性という利点を活かして、蛍光特性を有する細胞が特定の抗原を含むものだとわかる。
【０００３】
元来、細胞の蛍光性は、従来の顕微鏡法を用いて、手作業で視覚による検査により評価されていた。これは時間も費用もかかることがわかった。高速自動システムが必要であることがこうしてあきらかになった。共焦点顕微鏡といった、多くの高速撮像システムが細胞のサンプルを分析するのに利用できる。照明および集光オプティクスが、その相対的なジオメトリとともに、大部分において他のシステムの構成要素のパラメータを決定する。
【０００４】
蛍光顕微鏡システムの感度を高めるために、色収差の減少を示す改良された光学素子を含む、多数の工程が採用されている。さらに、サンプルが放出するのではない背景の蛍光の中で、サンプルが放出する蛍光を際立たせる技術を用いて、信号対雑音比を向上させる工程が採用されている。色収差と同様、システムにおいてかなりの量の背景蛍光が、システムに働きかける光学成分から生じる。
【０００５】
利用可能な光学成分は多数ある。たとえば、コブ(Cobb)他への米国特許第５，４０４，２４７号は、空気分離型で、回折が制限された、７素子のテレセントリックｆ−θレンズを開示している。しかしながら、伝統的なｆ−θレンズの設計は主として単色照明のためのものであり、これは蛍光顕微鏡システムの色収差を悪化させる可能性があることが多い。
【０００６】
先行技術による高速撮像システムは図１に示され、ｆ−θ対物レンズ１０を含み、対物レンズ１０はサンプル１１の上方で、対物レンズの表面がサンプルの法線に垂直となるように位置決めされる。レーザ光源１２はビーム１３を生成する。対物レンズ１０はビーム１３を、サンプルの面上のスポットを照明するように導く。振動する反射面１４が光源１２と対物レンズ１０との間の、システムの瞳１５に配置され、ビーム１３を１本の軸に沿い前後に偏向させる。サンプルはテーブル上に配置され、テーブルはサンプルを第１の走査方向と垂直な方向に移動させて、サンプルの表面上に二次元の走査パターンを生じさせる。対物レンズの設計は同軸集光を意図するものではないため、サンプル面から反射した光は、対物レンズとは別の、対物レンズから離されたコンデンサアセンブリ１６によって集められる。このようなジオメトリにより、システムのフットプリントの増大、光学的複雑性の増大、および立体角集光の制限が生じる。集められた光は次に光検出器１７上に結像される。
【０００７】
図１と関連付けて述べたのと同様の先行技術による高速撮像システムが、リチャードＬ．シューメーカ（Richard L. Shoemaker）他により、「デジタル撮像分析のための超高速レーザ走査顕微鏡（An Ultrafast Laser Scanner Microscope for Digital Imaging Analysis）」、ＩＥＥＥトランザクションズ・オン・バイオメディカル・エンジニアリング（IEEE Transactions on Biomedical Engineering）、Vol. BME-29, No.2、１９８２年２月、８２−９１頁において開示されている。上記２つのシステム間の主な相違点は、走査装置に関する。シューメーカ他は、検流スキャナの代わりに、回転ポリゴンミラーを用いてサンプル面にわたりスポットを走査することを必要とする。
【０００８】
他の先行技術による高速撮像システムは、サワムラ（Sawamura）他による米国特許第４，２８４，８９７号で開示されており、この場合、レーザ光は２つの検流ミラーおよび１つのダイクロイックミラーを通して反射され、これらミラーによりビームは対物レンズを通して導かれサンプル面上のスポットを照射する。検流ミラーは適切な方向に揺動してスポットがサンプルの面全体を走査できるようにする。照射しているスポットに反応して、サンプルは蛍光を放出する。対物レンズはコンデンサレンズの役割を果たし、光を第１のダイクロイックミラーを通して戻す。第１のダイクロイックミラーの後方には第２のダイクロイックミラーが配置され、第２のダイクロイックミラーは、蛍光を第１のプローブにより第１の波長で生成された光と、第２のプローブにより第２の波長で生成された光とに分割する。第１および第２の波長はそれぞれの光検出器に送られる。
【０００９】
クマガイ（Kumagai）への米国特許第５，２９６，７００号は、直接関係する部分として、１対の走査ミラーと対物光学系との間に配置された中間光学系を含む、蛍光共焦点顕微鏡を開示する。中間光学系は対物光学系によりもたらされる倍率の色収差を相殺するように設計される。
【００１０】
ブリトン（Bliton）への米国特許第５，２６０，５７８号は、直接関係する部分として２つのビーム源を含む走査共焦点顕微鏡を開示する。１つのビーム源は紫外光を発生させる。１つのビーム源は可視光を発生させる。光学アセンブリが共通の光学列に含まれ、色度について誘起された走査上の誤差を補正する。
【００１１】
ディクソン（Dixon）他による米国特許第５，３８１，２２４号は、反射された光の共焦点および非共焦点の撮像を同時に可能にする走査レーザ撮像システムを開示する。このシステムは関連する部分として、ビーム拡大器を通り、対物レンズにより規定される光軸に配置された単一のミラーに衝突するビームを発生させるレーザを含む。対物レンズは、可動ステージ上に配置されたサンプルにビームを導く。対物レンズとサンプルとの間には、サンプルが放出した光を集めるように設計されたビームスプリッタが配置される。ビームスブリッタはサンプルから放出された光の一部をコンデンサレンズに導き、コンデンサレンズは今度はその光を非共焦点検出器に導く。ビームスプリッタにより集められた光の一部は、先のビームと同じ経路に沿って逆方向に導かれ、リトロビームを形成する。リトロビームは、走査ミラーとレーザとの間に配置された第２のビームスプリッタに衝突する。第２のビームスプリッタは光を結像レンズに導く。結像レンズは、開口を有する共焦点視野絞りに近接して位置決めされる。
【００１２】
ストロンジン（Strongin）への米国特許第５，０９５，２１３号では、背景蛍光を減じさせる新規の顕微鏡スライドが採用される。このスライドは、不透明性および実質的な非蛍光性をもたらす光学特性を有するプラスチックからなる。この光学特性は、プラスチックに十分な量の黒い炭素パウダーを与えることによって生まれる。
【００１３】
クリーガ（Creager）他への米国特許第５，０９１．６５３号は、背景蛍光を減じさせるための装置および方法を開示する。この装置は光ファイバ線量計である。背景蛍光を減少させる方法は、赤外刺激源を変調することを含む。こうして、赤外刺激放射がないときに放射露出中の背景蛍光の測定が可能になる。次に背景蛍光が赤外刺激下で総信号から減じられる。
【００１４】
ダンドリカ（Dandliker）他への米国特許第４，８７７，９６５号は、標本から発する特定的な蛍光を測定するための蛍光測定器を開示する。刺激放射は一度に発生し、この放射は次に標本に向かって導かれ蛍光が生じる。蛍光の検出のタイミングは、背景蛍光と標本から放出される蛍光との間の光学的減衰の相違の利点を利用するように制御される。そのために、刺激放射は標本に一度に導かれ、検出器への光の経路は周期的に遮断される。
【００１５】
先行技術によるシステムは蛍光顕微鏡法には適しているが、走査フィールドにおける光学的収差を補正し、サンプルから放出された光を効率的に集めるのにさらに他のオプティクスを必要とする。先行技術によるシステムはまた、背景蛍光を減じさせるために特別の構成要素を必要とする。その結果、システムのコストおよびサイズが実質的に増大する。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、ミクロおよびマクロスケール双方で、サンプルの像をポイントごとに示す、信号対雑音比が向上した、高速かつ低コストの光学走査システムを提供することが必要になる。
【００１７】
さらに、先行技術のシステムよりも実質的に小さく、既存の同軸照明および集光システムよりも走査フィールドが大きい撮像システムを提供することが必要である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
（発明の概要）
色収差を減少させることにより平坦な視野にわたって実質的に均一的な検出感度を保つ一方で、自発蛍光を減少させることにより感度を向上させるように設計された、同軸照明および集光光学走査システムが提供される。本出願のために、自発蛍光は、テストの対象となっているサンプル領域の蛍光放射と関連性のない蛍光放射として規定される。具体的には、対物レンズは、レンズの光路において接着剤のような自発蛍光材料を過剰に用いることを避けるように形成される。
【００１９】
対物レンズはまた、軸上色収差の増大を犠牲にして、横方向の色収差を減少させるように設計される。軸上色収差は、システムに既存の他のレンズを用いて除去される。
【００２０】
システムの残りの光学成分からの自発蛍光は、光路に沿いフィルタを選択的に設けることにより除去される。具体的には、こうした光学成分に関連する自発蛍光は、２つの異なる軌跡で到着した際にシステムの検出器によって発見される。
【００２１】
軌跡の一方は対物レンズの焦点通過曲線（through-focus-curve）と関連する。
【００２２】
すなわち、サンプル面近くで発生する自発蛍光は、この蛍光を導く対物レンズを介して検出器に導かれる。サンプル面から離れたところで発生する自発蛍光は、散乱軌跡を辿る。この自発蛍光は点光源からの放出のように、球面状に放射する。
【００２３】
光源は対物レンズと光学的に通じている。光源は平行ビームを発生し、このビームは、対物レンズを通して導かれサンプル上のスポットを照明することによって、サンプルの小さな領域を刺激し光を放出させる。対物レンズはまたコンデンサの役割を果たし、サンプルが放出する光を集める。対物レンズは、横方向の色収差を補正し、軸上色収差は補正しないように設計される。対物レンズは集めた光を逆に、入射ビームが通過したのと同じ経路に沿い反対方向に導く。波長弁別ダイクロイックフィルタが、光源と対物レンズとの間に光軸に沿って設けられ、放出された光を入射ビームから分離させ、結像レンズは集められた光を光検出器に導く。光検出器は、検出した、放出された光に応答して、光を放出するサンプルを表わす信号を発生させる。結像レンズは、異なる波長の光に対し一定の焦点距離を保つために、２つの素子を用いるダブレットレンズである。ダブレットレンズはリトロビームの経路に配置され、システムの他の場所、たとえば対物レンズにおいて導入される軸上色収差を補正するのに必要な軸上色収差を導入するように光学的に設計される。サンプル全体を走査するために、反射素子を有する二次元走査装置が入射ビームの経路に配置される。表示装置が設けられ、走査装置と同期が取られ、サンプルの像を再生する。
【００２４】
他の実施例では、複数の光源が与えられ、その各々は残余のレーザと異なる１つ以上の波長を放出する。複数の光源の各々は、入射ビームに複数波長の光を与える共通のビーム拡大器と光学的に通じている。共通のビーム拡大器は、入射ビームに関し、対物レンズにより導入された軸上色収差を相殺する軸上色収差を導入する光学特性を有する。
【００２５】
【発明を実施するための最良の形態】
図２は、光の励起／入射ビーム１９を発生させる光源１８を示す。ビーム１９は、入射ビーム１９の望ましくない波長を減少させる励起フィルタ２０を通して導かれる。ビーム１９は励起フィルタ２０から出ると、ビーム拡大器２１に、次にビームスプリッタ２３に衝突する。ビームスプリッタ２３はビーム１９を二次元走査装置２５に導く。二次元走査装置２５はビーム１９を対物レンズ２７を通して導く。対物レンズ２７はビーム１９をサンプル２９上のスポット（図示せず）を照明するように導いて、サンプル２９の小さな領域を刺激し、光を放出させる。一般的に、サンプル２９により放出される光は蛍光である。対物レンズ２７はコンデンサとして働き、蛍光を集め、リトロビーム３１を形成し、リトロビーム３１を入射ビーム１９と同一の経路に沿い導くが、その方向は反対である。リトロビーム３１は、開口を有する空間フィルタからなる瞳ストップ３２を通過する。瞳ストップ３２を通過した後、リトロビーム３１はビームスプリッタ２３に衝突する。ビームスプリッタ２３はレーザ光から蛍光を分離させ、リトロビーム３１を帯域フィルタ３４を介して結像レンズ３３に導く。結像レンズ３３はリトロビーム３１を空間フィルタ３７の透過開口３５に導き、リトロビーム３１を光検出器３９に衝突させる。
【００２６】
好ましくは、光源１８はコヒーレント光の平行ビームを発生させるレーザである。しかしながら、たとえば発光ダイオードといった、コリメートオプティクスと光学的に結合されて入射光ビームを発生させる非コヒーレント光源を用いることが可能である。もしＬＥＤのような非コヒーレント光源を用いるならば、ＬＥＤの前方にピンホールおよびコリメートレンズが配置され、小さなスポットに結像可能な平行化された励起／入射ビームを発生させる。帯域フィルタ３４は一般的に、長い波長を透過させる一方で励起波長を拒絶する。
【００２７】
ビームスプリッタ２３は、入射ビームの光をリトロビームの光から分離させることができるならば先行技術のいずれのものでもよい。たとえば、ビームスプリッタ２３はダイクロイックフィルタまたは５０％ビームスプリッタでもよい。その代わりとして、偏光感度を有するスプリッタを用いてビーム１９および３１の分離を行なってもよい。この実施例は、ビームスプリッタと対物レンズとの間に位置決めされた１／４波長板を含むことが可能である。こうするとビーム１９が１／４波長板を通過して円偏光が生じるであろう。分離手段はフレネルレフレクタでもよい。サンプル２９はポイントごとに照明され、サンプル２９の領域全体にわたってラスタ走査様式でスポットが走査される。
【００２８】
例として回転ポリゴンミラー、回転ホログラフィスキャナ、または振動プリズムといった、二次元走査をもたらす何らかの走査メカニズムを用いることができる。音響光学偏向器またはペンタプリズム走査偏向器を用いることもできる。しかしながら、好ましい実施例は、２つの垂直軸に関し旋回可能な１つのビーム反射素子４３を入射ビームの経路において有する走査システムを用いることである。反射素子４３は平坦なミラーであるが、これは重要ではない。ミラーは凹状または凸状でもよい。屈折または回折偏向素子を、反射素子４３として使用することもできる。ミラー４３は軸Ａについて旋回可能である。ミラー４３を、モータ４５などの先行技術では周知の手段によって動かすことができるが、一般的には検流計ミラーである。ミラー４３およびモータ４５は、ステッパモータ４９によって回転させられる可動プラットフォーム４７の最上部に載置される。ステッパモータ４９はプラットホーム４７を動かし、軸Ａに直交する軸Ｂに関しミラー４３を旋回させる。
【００２９】
図３を参照して、対物レンズ２７は一般的に、システムの外部瞳を形成し、同軸照射および集光をもたらす。集光の効率を最大にするには、対物レンズ２７が大きな開口数を有することが好ましい。入射ビーム１９に関し、対物レンズ２７は像面において無限焦点である。対物レンズ２７は一般的にテレセントリックまたはにテレセントリックに近い。対物レンズ２７がテレセントリックの性質を有するため、サンプル２９の表面は常に対物レンズ２７から出た入射ビーム１９の主光線に対し直角をなす。入射ビーム１９に関し、対物レンズの面はサンプル２９に近接している。ビーム１９は、３つの異なる位置で対物レンズ２７に進入するように示されており、ビーム１９は各々の位置において異なる入射角を有する。ビーム１９の対物レンズ２７への入射の角度にかかわらず、対物レンズ２７を通過したビーム１９の主光線は、サンプル２９の面に直交ずる。このテレセントリックな対物レンズを有することの利点は、この対物レンズのおかげでシステムの倍率が焦点位置の誤差から比較的影響を受けにくくなることである。さらに、対物レンズ２７は、たとえば一次波長プラスおよそ２００ｎｍまたはそれ以上の広帯域の光の波長に対して動作するように設計しなければならない。こうすれば対物レンズ２７は種々の波長のレーザとともに動作し、広範囲にわたる蛍光色素からの光を集めることができる。
【００３０】
このシステムの重要な面は、システムの検出感度を減少させる、色収差を原因とする視野における光学的損失の量を低減することである。図４は、フィールド位置と、横方向の色収差に対する補正が行なわれないシステムの相対的な検出感度との関係を、検出された光学エネルギの割合対サンプル２９に衝突するスポットのサイズの関数として示す。対物レンズにより規定される、光軸で検出された光の量５１は、２分の１のフィールド位置で検出される光の量５３よりも実質的に大きい。検出される光の量が最低なのは全フィールド位置５５であり、視野は対物レンズにより規定されるものである。横方向の色収差は視野角が増大すると大きくなる。システムにおけるレンズの視野にわたり検出される光の非均一性は、一般には横方向の色収差およびコマ収差のような他のフィールド劣化の結果である。図５および２を参照して、横方向の色収差は、たとえば光の緑の波長５７に開口３５を通過させる一方でより長い黄色の波長５８を視野絞り３７によって遮断し、検出感度の低下を生じさせ得る。
【００３１】
横方向の色収差に関連する問題を回避するためには、対物レンズ２７が走査システムにおけるすべての横方向の色収差について補正を行なうことが好ましい。
【００３２】
これは対物レンズの視野を減少させることによって可能であろう。しかしながら、対物レンズ２７に大きな視野を与えることには利点がある。たとえば、例として１００万個までの標本を含む平坦なフィールドアレイといった、サンプルの大きなアレイを走査するためには、大きな（マクロ）視野が有用である。それにもかかわらず、視野が増大すると、レンズの視野が増大するにつれて横方向の色収差の補正がより困難になるため、横方向の色収差に関する問題が悪化する。マクロ視野は横方向色収差をより顕著にするため、視野にわたって均一的な解像度を得るのがより困難になる。
【００３３】
上記の概念を考慮すると、対物レンズ２７の２つの実現化例に対するパラメータは以下のとおりとなる。
【００３４】
【表１】
0004405591.tif 000002
【００３５】
上記よりわかるように、示されたミクロおよびマクロ対物レンズが、システムに０．６から２０μｍの解像度をもたらすことが可能になるであろう。
【００３６】
図６は、軸上色収差が増大することを犠牲にして達成される、マクロ対物レンズの横方向の色収差の低減を示す。軸上色収差の増大は、図４に示されるものよりも実質的に小さい、３μｍの位置で検出される光の量によって示される。具体的には、検出器３９が検出するのは、主光線から３μｍの、サンプル２９に衝突する軸上の光６５のおよそ４０％である。図４では、主光線から３μｍで検出される軸上光の量５１はほぼ８０％である。それにもかかわらず、横方向の色収差の全体的な効果は実質的に減少するものとして示されている。これは、所与のスポットサイズに対し、軸上６５、２分の１フィールド光６７および全フィールド６９位置での光について、検出される光の量は実質的に同じであることによって示される。すなわち、マクロ対物レンズの視野にわたり検出感度は実質的に均一である。さらに、図６は主光線から１０μｍのところでは、全てのフィールドポイントからの集光は９０％よりも大きいことを示す。図７は、マクロ対物レンズの光学素子を示し、その仕様は以下のとおりである。
【００３７】
【表２】
0004405591.tif 000003
【００３８】
上記のレンズパラメータおよび仕様は単に例示として挙げたものである。レンズの設計を調整して所望のとおりにより大きなおよびより小さなフィールドを与えることができる。これは、レンズの半径、厚み、ガラスの種類などを修正することによって可能である。大きく異なるパラメータを有するレンズを設計して、他の解像度およびフィールドサイズでの最適性能を得るようにできる。加えて、レンズを上記のレンズと同じ解像度およびフィールドサイズに対して設計し、一方ではたとえば作動距離およびフィールドの平坦度といった異なるパラメータを満たすようにできる。
【００３９】
図８を参照して、横方向の色収差と同様、軸上色収差は、レンズの焦点距離を波長に依存させてシステムの検出感度を減少させる。たとえば、光の緑の波長７１は検出器３９に衝突する前に焦点に集まり、一方より長い、光の黄色の波長７３は検出器３９によって検出される。しかしながら横方向の色収差と異なり、軸上色収差はフィールド位置によって変化するものではない。したがって、対物レンズ２７が導入する軸上色収差を一定にしておく一方で横方向の色収差の補正を行なうことができる。再び図１を参照すると、入射ビーム１９は単色であるため、入射経路において軸上色収差を修正する必要はない。むしろ、軸上色収差は戻りの（リトロ）経路で修正できる。結像レンズ３３が、システムにおけるすべての軸上色収差を補正するまたは取除くことが好ましい。そうすれば対物レンズ２７の製造にかかる費用が減少する。なぜなら、単一レンズにおいて軸上および横方向双方の色収差を補正するとコストが大幅に増大するからである。加えて、システムのサイズ／フットプリントは最低に抑えられる。結像レンズ３３はリトロビーム３１を開口３５に集めるのに必要であるので、軸上色収差を減じさせるためのさらなるオプティクスは含まれない。一般的には、結像レンズ３３はシステムの軸上色収差を補正するのに必要な光学特性を有するダブレットである。結像レンズ３３は、ビームの焦点を合わせ軸上色収差を補正する、バイナリ素子からなるものまたは当該技術で周知の他の設計のものとすることができる。
【００４０】
図２を再び参照して、表２において先に示した対物レンズ設計に伴う利点は、システムの自発蛍光が大幅に減少することである。具体的には、システムにおける光学成分に関連する自発蛍光は、２つの異なる軌跡をたどって到達した際に検出器３９によって発見されることがわかっている。サンプル２９近くで放出される自発蛍光は一般的に、リトロビームの経路をたどる。これは、対物レンズ２７の光学素子から放出される自発蛍光について、または対物レンズ２７の焦点通過曲線内にある他の自発蛍光については事実である。したがって、この自発蛍光は焦点通過自発蛍光（ＴＦＡ）と称される。サンプル２９から離れたところで発生する自発蛍光は、対物レンズ２７の焦点通過曲線内にはない。この自発蛍光はリトロビーム３１の経路をたどって検出器３９に届くことはない。むしろ、サンプル２９から離れたところで放出された自発蛍光は検出器３９からすれば、点光源から球面状に放射するように見え、球面自発蛍光（ＳＡＦ）と称される。
【００４１】
一般的に、ＴＦＡの結果検出器３９に届く自発蛍光の光量子の正味線束は、ＳＡＦの結果として検出器３９に到達する自発蛍光光量子の数を上回る。ＴＦＡの源を分析すると、ＴＦＡは対物レンズ２７だけでなく、たとえばスライドおよびサンプルなどのサンプル構成要素により生じることがわがった。対物レンズ２７については、ＴＦＡの源は光学素子の材料、および光学素子を結合させるのに用いられた接着剤が原因であった。
【００４２】
接着剤に起因する自発蛍光の量を決定するために、対物レンズ２７などの合成レンズ系を作成するのに一般に用いられるガラスレンズ素子について、一連のテストが行なわれた。テストされた接着剤は、Ｊ−９１およびＵＶ−７４という商品名の、ペンシルバニア州フォートワシントン（Fort Washington）に在する、ＥＭＳアクイジション（EMS Acquisition）の一部門であるサマーズオプティカル（Summers Optical）により製造されたものである。テストは、レンズに衝突する２つの異なる波長λの光で行われた。各波長λについて、ＴＦＡに起因する光量子の数は、光電子増倍管を用いて測定された。λ＝５３２ｎｍの場合、結果は以下のとおりであった。
【００４３】
【表３】
0004405591.tif 000004
【００４４】
λ＝６３３ｎｍの場合、結果は以下のとおりであった。
【００４５】
【表４】
0004405591.tif 000005
【００４６】
表３および４は、ＴＦＡのかなりの量は、光路にある対物レンズ２７のレンズ素子の部分の接着剤に起因することを示している。さらに、所与の接着剤により発生したＴＦＡの量は波長に依存することが示されている。したがって、対物レンズ２７を構成するレンズ素子の部分から接着剤を除去することにより、これに関連するＴＦＡは大幅に減じられ、波長に依存しないものとなるであろう。このようにして、信号対雑音比の向上に貢献し、複数の波長の光について使用するのに適した対物レンズを提供することができる。
【００４７】
図９を参照して、レンズ素子を光路「Ｐ」に沿い空間位置で固定するのに必要なレンズハウジング２７ａの１実施例が示される。図示のように、レンズハウジング２７ａは、各々がレンズ素子を支持する環状のショルダを形成する複数の段状部を含む。具体的には、レンズ素子２”、４”、６”、８”、１０”、１２”および１４”がそれぞれ、環状のショルダ２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆ、２７ｇおよび２７ｈに載置される。レンズ素子各々の位置を固定するために、ハウジング２７ａの一方の端部は複数のねじ山２８を含む。中空のシリンダ３０はねじ山２８と係合しレンズ素子１４”を押圧するようにされる。この様式で、対物レンズ２７のレンズ素子は、光路において接着剤の使用を必要とすることなく適所で保持され、空気分離型対物レンズを規定する。空気分離型対物レンズでは、複数のレンズ素子２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆ、２７ｇおよび２７ｈの各々は、隣接するレンズ素子から間隔を置かれている。こうして光路「Ｐ」において接着剤を用いることを回避する。レンズ素子２７ｂはシステムに搭載されるときには、サンプル２９に近接して位置決めされる。
【００４８】
その代わりとして、レンズ素子２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆ、２７ｇおよび２７ｈを、光路「Ｐ」において接着剤を用いずにハウジング２７ａに取付けることができる。そのためには、接着剤を各レンズ素子の周辺部で用いて、レンズ素子の側端部がハウジング２７ａの側部に接着されるようにできる。これは例として、接着剤３２がハウジング２７ａとレンズ素子８”との間に設けられるものとして示される。２つのレンズ素子を結合させるのにこの素子間での接着剤の使用が必要であれば、接着剤を、図１０に示すように環状のリング３６として用いることができる。こうすれば接着剤なしでレンズ３８の中央部分を残すことができ、そうするとこの中央部分を光路「Ｐ」に設けることができる。接着剤の環状のリング３６を用いることにより、ＴＦＡを回避する一方で近軸像の利点を得ることができる。
【００４９】
図１１を参照して、球面状の自発蛍光（ＳＡＦ）に起因するシステムでの自発蛍光をさらに減少させるために、フィルタが光路の種々のポイントに設けられた。具体的には、上記のように、ＳＡＦは検出器３９からすれば、点光源から球面状に放射されるように見える。視野絞３７はリトロ経路において光検出器３９に近接するように位置決めされているため、光検出器３９に衝突するＳＡＦは２つの変数に依存する。上記の変数とは、ＳＡＦの点光源間の距離「ｄ」と点光源とリトロ経路４０との間の角度αであり、リトロ経路４０は光がビームスプリッタ２３および光検出器３９から進行する経路として規定される。
【００５０】
たとえば、ＳＡＦはビーム拡大器２１の光学素子から放出されることがわかった。ＳＡＦがポイントＢで発生するならば、ＳＡＦは光線Ｃとして示すように外に向かって放射されるであろう。図示のように、光線Ｃ1の角度αは、視野絞３７における開口３５を通過して伝播するのに十分である。その結果、種々の光学素子から反射した光線Ｃ1は光路にあり、光検出器３９に平行化されたように見える、すなわち、リトロ経路４０に平行に進行している。図示のように、光線Ｃ1は対物レンズ２７から反射して結像レンズ３３に衝突し、ここで光検出器３９に導かれる。かなりの量の光線Ｃは、ビーム拡大器２１を収容する容器２１ａによって遮断される。光検出器３９に衝突する可能性のある光線Ｃ1およびその他の光線を遮断するために、ラインフィルタ２２を、ビーム拡大器２１と、ビーム１９のみを通過させるビームスプリッタ２３との間に設けてもよい。ラインフィルタ２２は、ＳＡＦが開口３５を通過しないようにするために、立体角で点光源Ｂから放射される光を遮断するのに十分な寸法を有さねばならない。この様式では、ビーム拡大器２１の光学成分からのＳＡＦは光検出器３９に衝突することはないであろう。
【００５１】
コンデンサレンズ３３もまたＳＡＦを発生させることがわがった。その原因は、サンプル２９からのビーム１９の反射、およびビームスプリッタ２３の非効率性である。ビームスプリッタ２３はビーム１９をビーム３１から分離させる役割をするが、分析によると、サンプル２９から反射するビーム１９の一部はビームスプリッタ２３を通過する。コンデンサレンズ３３に衝突する、ビーム１９の上記の一部分により、ＳＡＦが生じる。コンデンサレンズ３３で発生するＳＡＦはポイントＢで発生するものと比較すれば最小であるが、開口３５を通過する正味線束はより大きくなる。その原因は、コンデンサレンズ３３がリトロ経路４０にあり、ＳＡＦに関連する光量子が開口３５を通過する可能性を増大させることである。具体的には、コンデンサレンズ３３により発生するＳＡＦのかなりの量の光線がリトロ経路４０と平行に進行する。このことがコンデンサレンズ３３と光検出器３９との間の相対的に短い距離とともに、ビーム拡大器２１で発生するＳＡＦと比較すると、サンプルに到達するＳＡＦの量が大きくなる原因を作っている。コンデンサレンズ３３により生じるＳＡＦを避けるために、帯域フィルタ３４がビームスプリッタ２３とコンデンサレンズ３３との間に配置され、励起波長を拒絶する一方で、ビーム３１に関連する波長を透過させる。
【００５２】
図１２を参照して、システムの動作について述べる。好ましくは、このシステムは共役焦点（共焦点）技術を用いる検出の利点を利用する。この態様では、図示のように、サンプル２９上の回折限界スポットを焦点とした入射ビームにより照明される点光源に対応するポイント７５から、リトロビーム３１が放出される。リトロビーム３１は、開口３５を通過した後検出器３９で撮像される。空間フィルタ３７内の開口３５は、システムの検出が実質的に照明するスポットと一致するように孤立させるので、開口３５とポイント７５とは互いに光学的に共役となる。いかなる光検出器を用いてもよいが、光電子増倍管を用いることが好ましい。光電子増倍管からの信号は電気接続７７を通りビデオ表示スクリーン８１を含むビデオ表示システムの信号プロセッサ７９へと進行する。光電子増倍管３９からの信号は、出力線８３を通してプロセッサ７９から表示スクリーン８１に送られる画像信号の強度を変調する。走査信号発生器８５は、ライン８９を介した信号プロセッサ７９による制御の下、電気接続８７を通して電気信号を走査装置２５に与える。走査装置２５は発生器８５の信号に応答して移動する。光電子増倍管３９からの信号は数値化されメモリにストアされ、同時にディスプレイへの走査が可能である。
【００５３】
蛍光共焦点撮像が好ましい実施例であるが、共焦点でない態様でシステムを使用してもよい。この様式では、視野絞３７および開口３５は、共焦点でない態様で光をフィルタリングすることができる。この態様でも、空間フィルタ３７および開口３５は信号対雑音比を向上させる。瞳ストップ３２は、リトロビーム３１に関する対物レンズの開口数を制御するように構成される。瞳ストップ３２がなければ、所与の走査角度での開日数は、対物レンズ２７の口径食により確立されるだろう。実際、瞳ストップ３２は対物レンズ２７の視野にわたりリトロビーム３１の強度の均一度を高め、結像レンズ３３に衝突するリトロビーム３１の直径、およびシステムの開口数双方を規定する。瞳ストップ３２は走査装置２５とビームスプリッタ２３との間に位置決めされるように示されているが、瞳ストップ３２を走査装置２５と結像レンズ３３との間のリトロ経路のどこかに位置決めすることができる。
【００５４】
明らかに、システムは反射撮像の分野に拡張される。すなわち、反射されたレーザビームを、蛍光ビームの代わりに検出器で集めることができる。もし二次ダイクロイックビームスプリッタを一次ダイクロイックビームスプリッタの後に位置決めするならば、反射されたビームおよび蛍光ビーム双方を異なる検出器で読出すことが可能である。または同じ態様で、複数の二次ビームスプリッタおよび検出器を用いることにより、複数の蛍光ラベルを検出することができる。
【００５５】
図１３を参照して、本発明の第２の実施例が示され、リトロ経路におけるすべての軸上色収差を補正することのさらなる利点について述べられる。システムの第２の実施例は、図１に関して述べた上記のシステムの特徴すべてを含むが、相違点は、２つ以上の光源１１７および１１８が設けられ、各々が残りの光源とは異なる波長を放出し、多色の光を含む入射ビーム１１９を形成することである。
【００５６】
これら光源を同時に用いてもよく、または、所望されない光源を消すまたは閉じることにより、各々を個々に走査することが可能である。ビーム拡大器１２１は光源１１７および１１８の少なくとも一方に光学的に結合され、平行化されたビームの直径を制御し、入射ビーム１１９経路に沿うシステムにおける何らかの軸上色収差についての補正を行なう。この様式で、入射ビーム１１９を含む実質的にすべての光が、サンプル１２９の同じ焦点面に衝突することになる。このことは、非常に効率の高い共焦点撮像システムを提供する上で特に有利である。
【００５７】
各光源１１７および１１８を個別にビーム拡大器と関連付けることができる。
【００５８】
しかしながら、システムのサイズおよびコスト双方を減少させるためには、図示のようにすべての光源が共通のビーム拡大器と光学的に通じていることが好ましい。そのために、ダイクロイックフイルタ１２０が、光源１１７、１１８、およびビーム拡大器１２１の間に配置される。ダイクロイックフィルタ１２０は、光源１１７からの光を通過させる一方で、光源１１８からの光を反射するため、双方からの光はビーム拡大器１２１に入る前に入射ビーム１１９を形成する。ビーム拡大器１２１は、たとえばビーム拡大器１２１に続き、システムにおいて対物レンズ１２７などの光学素子が導入する軸上色収差を相殺する軸上色収差を導入する光学特性を有し、ビーム１１９を含むずべての波長の光が確実にサンプル１２９の同じ焦点面に衝突する。
【００５９】
図１４を参照して、リトロ経路においてすべての軸上色収差を補正することによって使用できる、他の対物レンズシステムが示される。集光レンズ２３３を顕微鏡型システムにおいて使用することができる。このようなシステムでは、対物レンズ２２７は接眼レンズ２３０を介して反射素子２４３に光学的に結合される。システムの残りの素子は図２に示されるものと同一である。
【図面の簡単な説明】
【図１】先行技術によるレーザ走査顕微鏡の簡単な側面図である。
【図２】本発明の光学成分の側面図である。
【図３】図２に示された対物レンズを通過する走査ビームの詳細な図である。
【図４】共通の顕微鏡システムを用い、像面に配置された検出器に衝突する光学エネルギの量を示すグラフである。
【図５】横方向の色収差の効果を示す概略図である。
【図６】本発明の大きな視野の対物レンズを用い、像面の検出器に衝突する光エネルギの量を示すグラフである。
【図７】本発明の大きな視野の対物レンズを含む光学素子の概略図である。
【図８】軸上色収差の効果を示す光学素子の平面図である。
【図９】図７に示された光学素子が設けられるハウジングの平面図である。
【図１０】本発明の対物レンズにおいて用いることができるレンズ素子の簡単な平面図である。
【図１１】図２に示された光学成分の一部であり、自発蛍光を遮断するラインフィルタを含む部分の詳細な図である。
【図１２】図２に示された光学成分の簡単な側面図であり、本発明に従うサンプルの像を再生するビデオ表示システムを含む。
【図１３】代替実施例に従う図２に示された発明の側面図である。
【図１４】本発明の代替実施例の側面図である。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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