(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の組織に抗真菌剤を投与し、しかる後に抗真菌剤の作用及び／又は標的部位から、組織に対して一定方向に切り出した複数の薄片のうち、同一性の高い２枚以上ずつの薄片のうち一部の薄片については、該薄片より溶剤によって抽出される抗真菌剤の濃度を測定して夫々の薄片での抗真菌剤の定量値を得、一方、前記２枚以上の薄片のうちの他の一部の薄片については、該薄片に真菌を播種して培地に移植し、該薄片における真菌の生育に対する作用を鑑別して得られる抗真菌活性を得、かかる抗真菌活性と前記定量値とを対照させることにより、抗真菌剤の有効濃度を鑑別する方法。
【請求項２】
組織が、爪又は皮膚である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
真菌の生育に対する作用を、爪組織の薄片又は皮膚組織の薄片における真菌の性状が、菌糸を形成しているか又は分生子の状態であるかにより判定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培地に移植した真菌を播種した薄片において、真菌の生育抑制が認められた場合、さらに該薄片を、リン脂質及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとを含む培地に再度移植し、真菌が生育する場合には抗真菌剤の濃度が静菌的有効濃度であり、生育しない場合には殺菌的有効濃度であると鑑別する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真菌剤の鑑別法に関し、更に詳細には、組織における抗真菌作用を鑑別するのに有用な抗真菌剤の鑑別法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌症、取り分け、白癬症において、抗真菌剤が有効であるか否かを鑑別することは極めて困難なことである。通常真菌に対する抗真菌作用は、in vitroの系で生育阻害を最小発育阻止濃度（MIC）値等で評価することが多く行われている。しかしながら、この様なin vitroの系とは異なり、実際の治療の場では投与された抗真菌剤の一部は組織中で蛋白質などと結合し、効果を喪失することが知られており、in vitroの値ほど真菌の生育を阻害しないことが常識となっている。この様な過程でどの程度の薬剤が効力を失うのかは全く知られていないし、その様な特性を特定する手段も存しない。この様な効力の喪失は、抗真菌剤の種類によって異なる一種の特性値と考えられ、この値を知ることは、真菌症の治療における薬剤の選択に大きな恩恵をもたらすと考えられる。この様な特性値を求める試みの一つに、薬剤をモルモットの皮膚に投与し、皮膚を取り出して水平方向に薄片を切り進め、薄片における薬剤濃度を放射化ラベル体によって測定する技術が開発されている（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、この論文では、薬効は一般的な感染モデルで、濃度は未感染の動物で実施しており、同一条件ではないため、濃度的にも相関を取るのが難しいと言う欠点が存したし、加えて、蛋白などのトラップにより不溶化して、不活性化しているのか、抗真菌剤が皮膚内で抗真菌作用を発揮せず不活性化しているのかは不明であるし、抗真菌剤の作用が静菌的抑制作用であるか、殺菌的抑制作用であるかも不明である。又、実際の生体に投与した抗真菌剤がどの様に組織に分配してゆくかの要因についても何ら考察できない。更に、抗真菌剤の抗真菌活性が組織により異なることも全く知られていなかった。この様な抗真菌活性の対象組織による現れ方の差が、実際の臨床での実態と、評価におけるＭＩＣ等の評価値との乖離の原因となっていることも知られていないし、その様な示唆も存しない。
【０００３】
抗真菌剤を評価・鑑別する方法として、爪などの部位をパンチで打ち抜き、連続薄片切片を作成し、該薄片における、投与した抗真菌剤の濃度を測定し、薬剤のディストリビューションを求める方法は既に知られている（例えば、特許文献１を参照）が、この方法に於いてはディストリビューションはわかるものの、それが有効であるか否かは判らない。又、爪のみを栄養源として真菌を培養し、その条件下、爪を通過してくる薬剤の効果を鑑別する方法も既に知られている（例えば、特許文献２を参照）。しかしながら、抗真菌剤を投与した動物より採取した組織から複数の薄片を切り出し、しかる後、前記組織の薄片より溶剤によって抽出される抗真菌剤の濃度を測定し得られた定量値と、別途同一組織の薄片に真菌を播種した後に培養し、培養後の組織の薄片を培地に移植し、真菌の生育に対する作用を鑑別して得られる抗真菌活性値とを対照させる、抗真菌剤の有効濃度の鑑別法は全く知られていない。有効濃度が組織によって異なることも全く知られていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−６５６９５号公報
【特許文献２】特開２００１−１３３４４９号公報
【非特許文献１】Tadashi Arika et. al., Antimicrob. Agen. Chemotherap., 1993;363-365
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、生体に投与された抗真菌剤が、どの程度標的組織に到達し、該標的組織中でどの程度トラップされ、或いは不活化され、どの程度が有用に働いているかを組織ごとに明らかにする技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、生体に投与された抗真菌剤が、どの程度標的組織に到達し、該標的組織中でどの程度トラップされ、或いは不活化され、どの程度が有用に働いているかを明らかにする技術を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、動物の組織に、抗真菌剤を投与し、しかる後に抗真菌剤の作用及び／又は標的部位を、組織に対して一定方向に、例えば、体表組織であれば、体表に対して水平方向に薄片を切り出し、しかる後、前記組織の薄片より溶剤によって抽出される抗真菌剤の濃度を測定し得られた定量値と、別途同一性の高い組織の薄片に真菌を播種し、組織薄片における、真菌の生育に対する作用を鑑別して得られる抗真菌活性値とを対照させることにより、この様な鑑別が為しうることを見出し、発明を完成させるに至った。ここで、同一性が高い薄片とは、当該薄片の前後に切り出された薄片のように、当該薄片の極近傍に存在した蓋然性の高い薄片を意味する。具体的な手技としては、連続薄片を交互に抗真菌剤の定量用と、真菌の生育に対する作用鑑別用に用いることが例示できる。即ち、本発明は以下に示すとおりである。（１）動物の組織に、抗真菌剤を投与し、しかる後に抗真菌剤の作用及び／又は標的部位を、組織に対して一定方向に薄片を切り出し、しかる後、前記組織の薄片より溶剤によって抽出される抗真菌剤の濃度を測定し得られた定量値と、別途該薄片と同一性の高い組織の薄片に真菌を播種し、組織薄片における、真菌の生育に対する作用を鑑別して得られる抗真菌活性とを対照させることを特徴とする、組織に投与された抗真菌剤の有効濃度の動態の鑑別法。
（２）前記組織が爪又は皮膚であることを特徴とする、（１）に記載の鑑別法。
（３）真菌の生育を、爪組織の薄片又は皮膚組織の薄片における真菌の性状が菌糸を形成しているか、分生子の状態であるかで判定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の鑑別法。
（４）更に、真菌を播種した組織の薄片において、真菌の生育抑制が認められた場合、培地に移植した組織の薄片を、真菌の生育状況の判定後、リン脂質とポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとを含む培地に再度移植し、前記組織の薄片より真菌が生育するか否かを調べ、生育する場合には前記有効濃度は静菌的有効濃度であると鑑別し、生育しない場合には殺菌的有効濃度であると鑑別することを特徴とする、（１）〜（３）の何れか１項に記載の鑑別法。
【発明の効果】
【０００７】
生体に投与された抗真菌剤が、どの程度標的組織に到達し、該標的組織中でどの程度トラップされ、或いは不活化され、どの程度が有用に働いているかを明らかにする技術を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の組織に投与された抗真菌剤の有効濃度の動態の鑑別法は、動物の組織に、抗真菌剤を投与し、しかる後に抗真菌剤の作用及び／又は標的部位を、組織に対して一定方向に、例えば、体表組織であれば、体表に対して水平方向に薄片を切り出し、しかる後、前記組織の薄片より溶剤によって抽出される抗真菌剤の濃度を測定し得られた定量値と、別途該薄片と同一性の高い組織の薄片に真菌を播種し、組織薄片における、真菌の生育に対する作用を鑑別して得られる抗真菌活性値とを対照させることを特徴とする。ここで、同一性が高い薄片とは、当該薄片の前後に切り出された薄片のように、当該薄片の極近傍に存在した蓋然性の高い薄片を意味する。具体的な手技としては、連続薄片を交互に抗真菌剤の定量用と、真菌の生育に対する作用鑑別用に用いることが例示できる。
【０００９】
ここで、組織への抗真菌剤の投与は、動物の生体より予め取り出した組織に投与することも出来るし、生体に属したままの組織に投与することも出来る。組織の取り出しが道徳に反しない範囲において、人の組織を使用することも出来るが、後者の場合にはヒト以外の動物の組織を用いる。前記組織としては、特段の限定無く使用することが出来、内臓などの体内組織であっても、体表組織であっても構わないが、体表組織であることがよりこのましい。具体的には、皮膚、爪、毛髪などが好適に例示できる。これらの組織に於いては、同一の組織内濃度であっても、組織が異なると有効性が異なる場合が存する。従って、組織ごとに有効性を鑑別することが必要となる。この様な対象組織としては爪が特に好ましい。これは、薬剤の浸透、真菌の残存、再発などが爪では特に大きな問題であるためである。即ち、in vitroでのＭＩＣ等の抗真菌活性の指標と、組織内有効濃度との間に乖離が存する蓋然性が高いためである。
【００１０】
組織への薬剤の投与は、経口投与、注射、点滴、外用の場合は開放系でも、クローズドパッチのような閉塞系でも構わない。予め取り出した組織であれば、フランツ型セルなどのような器具を用いて投与することも出来る。薬剤の投与１回でも、数回でも構わない。好ましいのは１週間程度連続で投与する形態である。これは再現性を向上できるからである。
【００１１】
取り出した、薬剤の投与された組織は、常法に従って薄片を切り出すことが出来る。即ち、前記組織をミクロトーム、コールドトーム、クライオトームなどの薄片切り出し装置で切り出し、これを検体とする。前記組織が軟組織であれば、凍結状態で切り出すことも出来る。前記薄片の厚さは、抗真菌剤を担持出来、播種した真菌溶液が漏れない程度の厚さがあれば良く、具体的には、１〜２０μｍであることが好ましく、３〜１０μｍであることがより好ましい。
【００１２】
斯くして切り出された薄片は、一部は抗真菌剤の定量に用いられ、一部は抗真菌作用の鑑別に用いられる。組織薄片における薬剤の含有量の測定は、常法に従って行うことが出来、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、水などの溶媒で抽出し、しかる後、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ／Ｍａｓｓ／Ｍａｓｓ等の手段により、定量することが出来る。かかる測定における回収率より、組織にトラップされて不溶化している抗真菌剤の量が逆算できる。又、下記に示す手技で鑑別された生育抑制作用のドーズデペンデンスより、有効に組織中で働いている抗真菌剤の濃度を鑑別することが出来る。この真菌の生育抑制作用の鑑別は特許文献２に記載の方法に準じて行ってもよい。
【００１３】
真菌に対する作用は、組織の薄片に真菌を播種し、真菌の種類に応じた条件で培養し、組織の薄片上での真菌の生育に及ぼす影響を観察することにより、真菌に対する生育抑制効果として鑑別することが出来る。培養条件としては、例えば、日数１〜１０日間、温度３０〜４０℃、湿度８０〜１００％で培養するような条件が例示できる。組織の薄片への真菌の播種は常法に従えば良く、例えば、分生子数１０３〜１０１０個／ｍｌの播種が好ましい。こと前記培養の終了後、組織の薄片上の真菌又は/及び組織全体を染色し、顕微鏡下観察し、菌糸の形成が認められた場合には、真菌に対する生育抑制効果が存しなかったと鑑別し、分生子のみ認められる場合には生育抑制効果が存した鑑別する。染色としては、この様な生育状況が鑑別できる染色法であれば特段の限定無く適用することが出来、例えば、グロコット染色、ファンギフローラＹによる染色、ＦＵＮ−１による染色、クリスタルバイオレットによる染色、ニュートラルレッドによる染色、ＰＡＳ染色などが例示でき、ＰＡＳ染色がより好ましい。ＰＡＳ染色は、（１）サンプルを固定（２）流水洗浄（３）過ヨウ素酸処理（４）蒸留水洗浄（４）シッフ試薬処理（６）亜硫酸溶液処理（７）流水洗浄の７つの工程を経て行われる。この時、組織の薄片のみを栄養源とし、培養し、抗真菌活性値を測定することが特に好ましい。
【００１４】
前記生育抑制の鑑別において、生育抑制が認められた場合には、組織薄片を回収し、これをリン脂質とポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとを含む培地に移植し、再び１２〜７２時間培養し、組織薄片より真菌が生育するか否かを観察する。リン脂質としてはレシチン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンなどを用いることが出来、その含有量は培地中０．１〜５質量％が好ましく、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとして、ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレート、ＰＯＥ（２０）ソルビタンセスキオレート、ＰＯＥ（２０）ソルビタントリオレートなどが好適に例示でき、その含有量は培地中０．１〜５質量％が好ましい。この場合、真菌が生育しない場合には、前記生育抑制作用は殺菌的作用によるものであると鑑別し、真菌が生育した場合には、前記生育抑制作用は静菌的作用であると鑑別する。又、生育抑制の鑑別はPCRを用いた方法によって確認することも出来る。この様なリン脂質とポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとを含有する真菌培養用の培地には市販されているものが存し、かかる市販品を購入し利用することもできる。この様な市販の培地としては、例えば、和光純薬株式会社から販売されている「ＳＣＤＬＰ培地“ダイゴ”」、「ＳＣＤＬＰ寒天培地“ダイゴ”」等が存する。通常、抗真菌剤には真菌に対する生育阻止作用が存することは明らかなので、有効性にのみ注目する場合には、前記の「サブローデキストロース培地」での検討を略することもできる。
【００１５】
この様な鑑別が出来る、真菌としては、病原菌として知られている真菌であれば特段の限定無く適用することが出来、例えば、トリコフィトン・メンタグロファイテス、トリコフィトン・ルブルム、アスペルギルス・ニガー、カンディダ・アルビカンス、マラセチア・ファーファー、マラセチア・グロボーサ、マラセチア・レストリクタ等が好適に例示できる。
【００１６】
以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００１７】
健常人ボランティアより提供された手指の遊離縁をフランツセルにセットした（爪の厚さは２７０〜４９０μｍ、平均３９０μｍ）。爪甲側のセルは開放状態にして「Ｐｅｎｌａｃ（ペンラック）」（シクロピロクス製剤；アベンティス・ファーマシューティカルス社製）を１日５μＬずつ投与した。爪床側のセルには０．９％ＮａＣｌ含有アガロースを充填し密封した。これを２８℃・湿度５０％の恒温恒湿機に静置した。投与は２４時間毎で５日間、次の投与前に被膜を剥がした後に、水で２回拭き取った。投与終了後、爪をφ２ｍｍの生検用パンチで打ち抜き、コールドトームを用いて水平方向に、１０μｍの厚さに連続して薄切した。この薄切した爪（以下爪スライス）半数をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで薬物量の定量、半数を抗真菌活性の測定に供した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの高速液体クロマトグラフィーの条件は、使用カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ    ＨＳ  Ｃ１８ｆ２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、カラム温度：４５℃、移動層：アセトニトリル／水＝４５／５５、流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：５μＬ、検出波長：３００ｎｍであった。真菌としては、トリコフィトン・メンタグロファイテスを用いた。播種はスライドガラス上に静置した爪スライスに１０５分生子／ｍｌの液を1μＬ滴下して行った。培養は湿度１００％、３５℃、７日間の条件で行い、培養後ＰＡＳ染色して、顕微鏡下生育状況を観察した。結果を図１に示す。これより、抗真菌活性は１００〜１６０μｍの深さまでで認められ、そのときの薬物濃度は概ね１０００μｇ／ｃｍ３であることがわかる。
【実施例２】
【００１８】
実施例１と同様の手法にて、動物の皮膚について検討を行った。即ち、モルモット(Hartley, 雄性, ８週齢)の後肢足底部に「Ｍｙｃｏｓｐｏｒ（マイコスポール）」を１０μＬ塗布した。塗布後２４時間に塗布部位を水でふき取った後、足底部全体を切り出し、塗布部位中心部をφ４mmの生検用パンチで打ち抜いた。コールドトームを用いて水平方向に、１０μｍの厚さに連続して薄切した。この薄切した皮膚（以下皮膚スライス）半数をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで薬物量の定量、半数を抗真菌活性の測定に供した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの高速液体クロマトグラフィーの条件は、使用カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ    ＨＳ  Ｃ１８ｆ２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、カラム温度：４５℃、移動層：メタノール／５ｍＭギ酸水溶液＝８０／２０、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ(スプリット比；２：８)、注入量：５μＬであった。真菌としては、トリコフィトン・メンタグロファイテスを用いた。播種はスライドガラス上に静置した皮膚スライスに５ｘ１０５分生子／ｍＬの液を２μＬ滴下して行った。培養は湿度１００％、３５℃、７日間の条件で行い、培養後ＰＡＳ染色して、顕微鏡下生育状況を観察した。結果を図２に示す。これより、抗真菌活性は４０〜８０μｍの深さまでで認められ、そのときの薬物濃度は概ね１〜１０μｇ／ｃｍ３であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は抗真菌剤の作用の鑑別に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１の抗真菌剤の作用を示す図である。
【図２】実施例２の抗真菌剤の作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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