(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞にフォン・ヒッペル・リンドー遺伝子を導入し発現させることにより作成した、以下の性質：
（１）神経細胞特異的タンパク質として神経ペプチドＹ、神経フィラメントおよび微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）を発現する；
（２）神経として電気信号を伝達し、神経回路を形成し得る、成熟した神経細胞である；
（３）機能性を有する神経として活動電位を伝播し、神経回路を形成できる；
を有する宿主細胞。
【請求項２】
前記フォン・ヒッペル・リンドー遺伝子は、正常組織のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであって以下の１対のプライマー：
５’−CTGAATTCACCATGCCCCGGAGGGCGGAG−３’（配列番号１）；
および
５’−GAGAATTCTCAATCTCCCATCCGTTGATG−３’（配列番号２）；
を用いて増幅されて得られたＶＨＬｃＤＮＡである、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
胚性幹細胞にフォン・ヒッペル・リンドー遺伝子を導入し、神経幹細胞を経て、神経分化を誘導し、神経細胞を得る方法であり、
前記フォン・ヒッペル・リンドー遺伝子として、正常組織のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであって以下の１対のプライマー：
５’−CTGAATTCACCATGCCCCGGAGGGCGGAG−３’（配列番号１）；
および
５’−GAGAATTCTCAATCTCCCATCCGTTGATG−３’（配列番号２）；
を用いて増幅されて得られたＶＨＬｃＤＮＡを使用する、神経細胞を得る方法。

【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞等のガン細胞または胚性幹細胞にフォン・ヒッペル・リンドー遺伝子（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ、ＶＨＬ遺伝子）を導入し、発現させて得られる、神経細胞として機能しうる宿主細胞に関し、より詳細には、中枢神経系内あるいは末梢神経へ移植して生着させ、神経細胞として機能させることにより、障害された神経機能に関連した疾患の患者を治療するための上記宿主細胞に関する。
背景技術
神経細胞（ニューロン）は、高等生物個体の生命活動を統御する主要素であり、従来は、中枢神経系の神経細胞は生後一切分裂せず、刻々と脱落してゆくのみで決して再生することはないとされてきた。ところが、１９９０年代になって、まず胎児脳において神経細胞へ分化する前の神経幹細胞が発見され、更に、成人の大脳においても神経幹細胞の存在が証明されてから、中枢神経が再生する可能性が示唆され、神経幹細胞を用いた神経難病に対する治療や更にあらゆる細胞へ分化することが可能で万能細胞とも呼ばれている胚性幹細胞（ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ））を用いた治療の可能性が脚光を浴びて始めている。
しかしながら、ヒトの神経幹細胞は妊娠中絶したヒトの胎児の脳のみからしか採取できないため、倫理的な問題を克服しなければならないだけでなく、また採取量に限界があるため、神経疾患への治療のための使用量を確保するのが困難である。また、苦労して集めた神経幹細胞も一部しか神経細胞（ニューロン）へ分化せず、大部分は神経膠細胞（グリア）へ分化してしまうという問題がある。
この問題に関して、本発明者は、ＶＨＬ遺伝子およびＶＨＬ遺伝子産物が中枢神経系の神経細胞に特異的に発現しているということから、神経細胞の発生の段階から何らかの役割を担っていると考え、神経幹細胞におけるＶＨＬ遺伝子産物の発現を検討したところ、ＶＨＬ遺伝子産物は神経幹細胞が神経細胞へ分化するのに伴い主に細胞質に発現すること、更にＶＨＬ遺伝子を単純ヘルペスウイルスベクターを用いて神経幹細胞へ導入したところ神経細胞への分化が促進されたことが明らかとなり、神経幹細胞においてはＶＨＬ遺伝子は神経分化誘導に関与する遺伝子であることが分かった（Ｋａｎｎｏ  Ｈ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２８２０−４，２０００）。しかしながら、もともと神経幹細胞は、神経細胞（ニューロン）または神経膠細胞（グリア）のいずれかに分化する細胞であり、また塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）を培地中に添加しても同様な現象がみられることから、ＶＨＬ遺伝子そのものに直接的な神経への分化誘導能があるかどうかは明らかではない。
これに対し、不死化した癌細胞またはＥＳ細胞は、神経幹細胞と異なって試験管内で無限に培養可能であるが、それらの分化のメカニズムは不明であり、どのような遺伝子を操作したらどのように分化して再生医療へ使用できるようになるかについてはほとんど分かっていない。ましてや、神経幹細胞に比べて神経細胞へ分化誘導することがはるかに困難な不死化した癌細胞やＥＳ細胞に単に特定の遺伝子を導入するだけで直接、神経細胞へ分化誘導することについては誰も成功していなかった。ただ、癌細胞の中でも小児癌の一種で副腎の神経細胞から発生した神経芽腫より樹立された神経芽腫細胞はレチノイン酸を培地中に添加すると神経細胞様の突起を伸ばすことが知られていたが、電気信号を伝える機能を有する本当の神経細胞にまでは分化しない。培養しているＥＳ細胞を、神経幹細胞を経て神経細胞へ分化させる方法に関しては、レチノイン酸を培地中に添加したり（Ｆｒａｉｃｈａｒｄ  Ａ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ１０８：３１８１−８，１９９５）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加してやや高率に神経細胞へ分化させる方法（Ｏｋａｂｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  ５９：８９−１０２，１９９６）が知られているが、すべての細胞を神経細胞へ分化させることができるわけではなく、さらに神経幹細胞や神経細胞を選別する必要が生じる。また、このような方法でＥＳ細胞から神経細胞まで分化誘導するには、６日間以上の日数を要するとされている。
神経細胞への分化誘導とは逆に、分化を制御することも重要な技術であるが、これについては癌抑制遺伝子の一部がその様な機能を有するとの報告がなされている。しかしながら、神経分化を誘導する遺伝子の逆配列（アンチセンス）で神経分化を制御したのは、本発明者等がＶＨＬ遺伝子のアンチセンスで神経幹細胞から神経細胞への分化の制御を報告しているが（Ｋａｎｎｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：２８２０−２８２４，２０００）、癌細胞あるいはＥＳ細胞からの分化制御は報告されていない。
米国では、既に中絶した胎児脳をパーキンソン病の治療に用いる臨床試験が行われ、一定の効果が認められている。そして、動物実験レベルでは、神経幹細胞やＥＳ細胞を脳や脊髄に移植し、そこで神経細胞へ分化させることで、パーキンソン病だけでなく、脳梗塞、脊髄損傷などの難治性の神経疾患の治療を行う試みが行われ始めている。また、末梢神経の再生を試験管内あるいは生体内で神経線維の束の形にして再生する試みは以前からなされている。ところが、神経細胞は原則として分裂・増殖しないため、実用的な神経の束に作ることは困難である。末梢神経の断裂に対する神経移植においては通常は下肢の自家神経を切除してそれを移植する治療法がなされているが、神経移植のための自家神経にかわる人造の神経の製造には成功していない。
発明の開示
本発明の目的は、ガン細胞または胚性幹細胞にＶＨＬ遺伝子を導入し、発現して得られ、神経細胞として機能する宿主細胞を提供することにある。本発明の別の目的は、障害のある神経機能に関連した疾患の患者を治療するための神経細胞を神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞等のガン細胞または胚性幹細胞から得る方法を提供することにある。本発明の更なる目的は、アンチセンス技術による癌細胞あるいはＥＳ細胞からの神経細胞への分化を抑制する方法を提供することにある。
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＶＨＬ遺伝子を神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞等のガン細胞に導入することにより神経細胞へ分化できることならびに胚性幹細胞にＶＨＬ遺伝子を導入すると神経幹細胞を経て神経細胞へ分化することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ガン細胞にフォン・ヒッペル・リンドー遺伝子を導入し、発現させて得られる宿主細胞。
（２）ガン細胞が神経芽腫細胞である１項記載の宿主細胞。
（３）ガン細胞が神経系由来の未分化腫瘍細胞である１項記載の宿主細胞。
（４）以下の性質を有する１項記載の宿主細胞。
（イ）神経細胞特異的タンパク質として神経ペプチドＹおよび神経フィラメントを発現し、神経ペプチドＹを細胞外へ分泌する。
（ロ）神経細胞特有の瘤を持つ神経突起を出し、神経回路を形成できる。
（ハ）神経細胞特有の膜電位を有し、電気信号を伝達できる。
（ハ）試験管内で培養、増殖後、中枢神経系内あるいは末梢神経へ移植して生着する。
（５）胚性幹細胞にフォン・ヒッペル・リンドー遺伝子を導入し、発現させることにより作成した宿主細胞。
（６）以下の性質を有する５項記載の宿主細胞。
（イ）神経細胞特異的タンパク質として神経ペプチドＹ、神経フィラメントおよび微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）を発現する。
（ロ）神経として電気信号を伝達し、神経経路を形成できる成熟した神経細胞である。
（ハ）機能性を有する神経として活動電位を伝播し、神経回路を形成できる。
（ニ）試験管内で培養、増殖後、中枢神経系内あるいは末梢神経へ移植して生着する。
（７）中枢神経系内あるいは末梢神経へ移植して生着させ、神経細胞として機能させることにより、障害された神経機能に関連した疾患の患者を治療するための１項または５項記載の宿主細胞。
（８）疾患がパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、脳梗塞、脊髄損傷、脳挫傷または悪性腫瘍である７項記載の宿主細胞。
（９）ガン細胞にフォン・ヒッペル・リンドー遺伝子を導入して、神経分化を誘導し神経細胞を得る方法。
（１０）ガン細胞が神経芽腫細胞である９項記載の方法。
（１１）ガン細胞が神経系由来の未分化腫瘍細胞である９項記載の方法。
（１２）胚性幹細胞にフォン・ヒッペル・リンドー遺伝子を導入して、神経幹細胞を経て、神経分化を誘導し、神経細胞を得る方法。
（１３）ガン細胞または胚性幹細胞にアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを導入して、フォン・ヒッペル・リンドー遺伝子の発現を抑制し、神経幹細胞から神経細胞への分化を抑制する方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
脳腫瘍（血管芽腫）や腎癌を生じる遺伝性疾患のフォン・ヒッペル・リンドー（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）病の原因遺伝子であるＶＨＬ遺伝子は、一種の腫瘍抑制遺伝子である。この遺伝子は１９９３年に米国のツバー（Ｚｂａｒ）博士らのグループによりヒトの第３番染色体より単離された。この遺伝子および蛋白は神経細胞（ニューロン）に発現していることは報告されていたが、この遺伝子の神経系に関する機能については不明であった。そこで、本発明者等は、この遺伝子は胎児の発生段階で神経系が形成される時に関わっている可能性があるのではないかと考え、ラットの胎児脳から分離した神経幹細胞の分化を経時的に検討したところ、神経幹細胞が神経細胞への分化をするに伴い、ＶＨＬ蛋白が神経細胞に発現することを見出した。
すなわち、本発明は、（イ）小児癌の一種で副腎の神経細胞から発生したヒト神経芽腫の不死化した細胞にＶＨＬ遺伝子を導入し発現させることで、電気信号を伝導する神経本来の機能を有し、神経回路（ネットワーク）を形成することのできる増殖性の神経細胞（ニューロン）へ直接的かつ迅速に分化誘導できること、（ロ）高等生物個体を構成するあるゆる細胞へ分化する可能性を有し万能細胞とも呼ばれるＥＳ細胞にＶＨＬ遺伝子を導入し発現させることで、短期間で確実に神経幹細胞から神経細胞へ分化誘導できること、という知見に基づくものである。
ヒト神経芽腫細胞にＶＨＬ遺伝子を導入し発現させることにより作成した宿主細胞は、以下の性状を有する。
（イ）神経細胞特異的蛋白を発現し、その一部を分泌する。（ロ）神経細胞特有の瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）を持つ神経突起を出し、神経回路（ニューロネットワーク）を形成できる。（ハ）神経細胞特有の膜電位が測定でき、電気信号を伝達できる。（ニ）試験管内で培養・増殖後、中枢神経系内あるいは末梢神経へ移植して生着する。
また、ＥＳ細胞にＶＨＬ遺伝子を導入し発現した宿主細胞は以下の性状を有する。
（イ）神経として電気信号を伝達し、神経回路（ニューロネットワーク）を形成しうる成熟した神経細胞である。（ロ）試験管内で大量に増殖・培養し、中枢神経系内および末梢神経へ移植可能である。（ハ）生体内へ移植され、生着した細胞は神経細胞として機能し、障害された神経機能を回復する可能性を有する。
上記した、ＶＨＬ遺伝子は神経幹細胞において神経分化誘導能を有するという結果から、ＶＨＬ遺伝子はその他の神経系の細胞においても神経分化を誘導するのではないかと考え、小児癌の一種で副腎の神経細胞から発生したヒト神経芽細胞腫の不死化した細胞にＶＨＬ遺伝子を組み込んだプラスミドの発現ベクターを用いてＶＨＬ遺伝子を導入し、常にＶＨＬ遺伝子が強発現している神経芽細胞腫を作成した。そして、その作成した細胞の性質を調べたところ、細胞の形態が神経細胞特有に変化し、神経細胞でしか認められない物質の遺伝子と蛋白の発現を認め、さらに神経細胞でしか認められない細胞膜の微小電位を確認した。これらの結果から、ＶＨＬ遺伝子を導入した神経芽細胞腫は神経細胞に極めて近い細胞へ変化したことが明らかとなり、この人為的に作成した細胞あるいはＶＨＬ遺伝子を導入して神経細胞へ分化させた神経幹細胞を移植することにより、神経細胞が破壊される病気（パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄損傷、脳梗塞など）の治療が可能であるとの知見を得た。
また、神経幹細胞から神経細胞の分化を制御するために、ＶＨＬ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを設計して用いると、神経分化が抑制された。さらに、本発明者等は、ウイルスベクターを用いてＶＨＬ遺伝子を導入することにより神経幹細胞から神経細胞へ分化（転換）させることに成功した。これらのことから、ＶＨＬ遺伝子は神経幹細胞から神経細胞への分化を誘導していることが明らかとなった（Ｋａｎｎｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：２８４０−２８２４，２０００）。これまでにこうした能力を有する遺伝子は報告されていない。
同様な方法で、すべての細胞の元になる胚性幹細胞にＶＨＬ遺伝子を導入したところ、大部分の細胞が神経幹細胞を経て神経細胞へ分化することが明らかになった。この方法によって作成した神経細胞を移植することで、上記神経が破壊された疾患（神経難病）の治療に応用可能である。
宿主細胞へ導入するＶＨＬ遺伝子として用いたＶＨＬｃＤＮＡ（ｇ７−１１）は、以下のような方法によって得ることができる。まず、正常脳または腎組織を、グアニジンイソチオシアネートを含んだフェノール又はフェノール／クロロホルム溶液でホモジナイズし、高速遠心により水層と有機層に分離した後、水層に含まれる全ＲＮＡをイソプロパノールに加え沈殿させて回収する。次に、ｍＲＮＡから逆転写酵素の存在下にｃＤＮＡを合成したのち、５’−ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＧＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号２）をプライマーのセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりサーマルサイクラーを用いて目的の領域を増幅し、精製したのち、ベクターに組み込む。
このようなベクターとしては、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクターを用いることができる。ベクターに上記ＶＨＬ遺伝子を挿入するには、まず、精製された上記ＶＨＬ遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
上記ＶＨＬ遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、ＶＨＬ遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、イントロンの５’末端側に存在するスプライス供与部位およびイントロンの３’末端側に存在するスプライス受容部位からなるスプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で行う。なお、培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
形質転換体を培養する培地として、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
具体的には、上記ＶＨＬ遺伝子は、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたプラスミド発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；同ベクターは、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０複製起点、ネオマイシン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１、アンピシリン耐性遺伝子等を含む。）へ組み込む。
ＶＨＬ遺伝子を組み込んだプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１を、ネオマイシン（Ｇｅｎｅｃｉｔｉｎ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）濃度が２００μｇ／ｍＬになるようにした１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養中の神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）へ遺伝子導入試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社））を用いて導入して、発現しているクローンのみを選別し、増殖させる。この際、導入するために用いる細胞はＳＨ−ＳＹ５Ｙ以外の神経芽腫細胞であってもよい。また、ベクターもプラスミド発現ベクターでなくとも他の発現ベクターでもよい。
ＶＨＬ遺伝子を導入する前の神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）等のガン細胞は、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で、炭酸ガス培養装置内で３７℃、５％二酸化炭素の条件でペトリ・ディッシュ３００３（ファルコン社）にてディッシュ底に接着させて培養する。継代培養は、４日毎に１：６に分割して行う。
ＶＨＬ遺伝子導入後の神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）は、ネオマイシン（Ｇｅｎｅｃｉｔｉｎ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を２００μｇ／ｍＬの濃度になるように調整した１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、炭酸ガス培養装置内で３７℃、５％二酸化炭素の条件でペトリ・ディッシュ３００３（ファルコン社）にてディッシュ底に接着させて培養可能である。この細胞の継代培養は、６日毎に１：６に分割して行う。
ＶＨＬ遺伝子を導入前のＥＳ細胞の培養は、Ｂａｉｎらの方法（Ｂａｉｎ  Ｇ，ｅｔａｌ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６８：３４２−３５７，１９９５）に従って行う。
ＶＨＬ遺伝子を導入したガン細胞（神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞）およびＥＳ細胞（宿主細胞）におけるＶＨＬ蛋白および神経特異蛋白の発現は、以下の方法によって調べる。神経特異的蛋白質として、ＮＰＹ、ＮＦＨ、ＭＡＰｓを調べる。この方法は、Ｋａｎｎｏらの論文（ＫａｎｎｏＨ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：２８２０−２８２４，２０００）に記載された方法に準じて、蛍光免疫染色法にて行い、共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察する。ＶＨＬ蛋白と神経特異的蛋白が同時に同じ細胞に発現している。
ＶＨＬ遺伝子を導入したガン細胞（神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞）およびＥＳ細胞（宿主細胞）からの神経特異的蛋白の分泌は、別のＫａｎｎｏらの論文（ＫａｎｎｏＨ，ｅｔ  ａｌ：Ｃａｎｃｅｒ  ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ  ６（２）：１４７−１５４，１９９９）に記載された方法に準じてＥＬＩＳＡ法にて行う。宿主細胞においてはカリウムイオンによる細胞外電位刺激およびカルバコールによるコリン刺激により、ＮＰＹの開口放出が観察される。
ＶＨＬ遺伝子を導入したガン細胞（神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞）およびＥＳ細胞（宿主細胞）の形態は、位相差顕微鏡によって観察する。成熟した神経細胞へ分化している場合は、細胞突起に瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）が観察される。
神経電気生理学的所見は、以下の方法によって調べる。すなわち、パッチクランプ法により、微小針電極を細胞に刺して、細胞内電位を測定すると、神経細胞（ニューロン）にみられる大きなナトリウムチャンネル電流とカリウムチャンネル電流が測定される。
ＶＨＬ遺伝子導入ガン細胞（神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞）およびＥＳ細胞（宿主細胞）の移植は、以下の方法によって行う。すなわち、あらかじめ宿主細胞を十分に無血清のＤＭＥＭなどの培地で洗浄したのちに、０．１ｍＬの生理食塩水中に１０万個以上の濃度で細胞を含むように調整し、大脳への移植の場合は、１０万個〜１０００万個の細胞を、定位的脳手術装置を用いて脳内の目的の部位へ、あるいは既に脳に埋め込んである注入装置（オンマヤリザボアなど）を用い、あるいは脊髄注入針を用いて腰椎部から髄液腔内へ注入する方法にて行う。
本発明は、ＶＨＬをコードする核酸を標的とし、かつＶＨＬ発現を阻害可能なオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の好適なオリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドである。キメラオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのヌクレオチドから構築される、２以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、１以上の有利な性質（例えば、ヌクレアーゼ耐性、細胞内への取り込みおよびＲＮＡ標的に対する結合親和性の増加）を与える少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド領域およびＲＮａｓｅＨ切断のための基質である領域を含む。１つの好適な実施態様において、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾された少なくとも一つの領域および通常はＲＮａｓｅＨのための基質として機能する領域を含む。ＶＨＬをコードしている核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度であるオリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定することにより決定されるが、高いＴｍは、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる。より好適な実施態様では、ＶＨＬ  ｍＲＮＡ結合親和性を増加させるために修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位が修飾された２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾ヌクレオチド等を含む。上記した修飾オリゴヌクレオチドは、標的に対し、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高い標的結合親和性を有する。このように増加した親和性の効果は、ＶＨＬ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害を増加させる。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼであり、この酵素の活性化によって、ＲＮＡ標的は切断され、アンチセンス阻害がより効率的となる。別の好適な実施態様において、ヌクレアーゼ耐性を強化するためにキメラオリゴヌクレオチドも修飾される。細胞は、核酸を分解する種々のエキソ−およびエンド−ヌクレアーゼを含むので、多数の修飾ヌクレオチドおよびヌクレオシドを導入したオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより耐性となる。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽出物または単離ヌクレアーゼ溶液とともにインキュベートし、ゲル電気泳動により、残存するもとのオリゴヌクレオチドを定量することによって測定される。修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも寿命が長くなる。好適なオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのホスホロチオエート修飾を含む。標的核酸との結合親和性を増強させたオリゴヌクレオチド修飾は、ヌクレアーゼ耐性を高めることができる。
本発明の好適なオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート結合等を含む。最も好適オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートおよびＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２等を含む。別の好適な実施態様においては、蛋白質−核酸またはペプチド−核酸（ＰＮＡ）主鎖などのオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖によって置換されていてもよい。他の好適なオリゴヌクレオチドは、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、基などの一つを２’位に含んでいてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは、約８から約５０ヌクレオチドである。本発明において、８から５０ヌクレオチドの天然に存在しないオリゴマーを含んでいてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の固相合成法により合成できる。固相合成の装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって販売されている。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を使用する別のオリゴヌクレオチド製造法を使用してもよい。
ＶＨＬ  ｍＲＮＡの一部を標的とするある種のオリゴヌクレオチドがＶＨＬ発現の阻害に特に有用であることが見いだされた。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの例として以下の配列番号３および４で表されるものが挙げられる。
0004540294.tif 000002
本発明の方法においては、組織または細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる。本発明において、インビトロまたはエクスビボで細胞懸濁液または組織試料へアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えるか、または動物内の細胞または組織にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより組織または細胞を１または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる。
本発明により、治療目的ために細胞を阻害する方法が提供される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬として使用可能な担体とともに、特定の疾患の性質、その重篤度および患者の全体の状態によって変化する用量および期間において、治療を必要とする患者に投与される。
本発明の医薬組成物は、局所、経口、または静脈内滴注、静脈注射、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射により、非経口で投与される。
局所投与のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、水剤および散剤が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが使用される。
経口投与のための組成物には、散剤または顆粒剤、懸濁剤、水、非水溶剤、カプセル剤、錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤を使用してもよい。
非経口投与のための製剤としては、緩衝剤、希釈剤およびその他の適当な添加物を含んでいてもよい無菌水溶液等が挙げられる。
上記した医薬担体に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みが容易となるように、カチオン性液体を医薬製剤に加えても良い。
投与量は、処置される患者の状態の重篤度および応答の度合いによって変化する。処置は、治療の達成あるいは疾患状態の軽減の達成までの数日から数カ月続けられる。最適の投与計画は、体内の薬剤蓄積量から、最適投与量、投与法および繰り返し頻度を決定できる。最適な投与量は個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相対的有効性よって変化するが、一般的にはインビトロおよびインビボでの動物実験からのＥＣ５０に基づいて計算できる。例えば、化合物の分子量およびＩＣ５０などの有効量から、ｍｇ／ｋｇでの投与量が容易に計算される。
〔実施例〕
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。〔実施例１〕
遺伝子導入細胞が神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙの場合＞導入するＶＨＬ遺伝子として用いたＶＨＬｃＤＮＡ（ｇ７−１１）は、以下の方法によって得た。まず、腎癌の手術時に得られた正常腎組織を、グアジニンイソチオネートを含んだフェノール又はフェノール／クロロホルム溶液でホモジナイズし、高速遠心により水層と有機層に分離した後、水層に含まれる全ＲＮＡをイソプロパノールに加え沈殿させて回収した。次に、ｍＲＮＡから逆転写酵素の存在下にｃＤＮＡを合成したのち、５’−ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＧＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号２）をプライマーのセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて目的の領域を増幅し、ＤＮＡ精製用キット（Ａｍｉｃｏｎ社）にて精製したのち、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたプラスミド発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。
ＶＨＬ遺伝子を組み込んだプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１をネオマイシン（Ｇｅｎｅｃｉｔｉｎ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を、２００μｇ／ｍＬの濃度になるようにした１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）培地で培養中の神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）へ遺伝子導入試薬Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて導入して、発現しているクローンのみを選別し、増殖させた。
ＶＨＬ遺伝子を導入する前の神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）は、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で、炭酸ガス培養装置内で３７℃、５％二酸化炭素の条件でペトリ・ディッシュ３００３（ファルコン社）にてディッシュ底に接着させて培養。した。継代培養は、４日毎に１：６に分割して行った。
ＶＨＬ遺伝子導入後の神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）は、ネオマイシン（Ｇｅｎｅｃｉｔｉｎ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を２００μｇ／ｍＬの濃度になるように調整した１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で、炭酸ガス培養装置内で３７℃、５％二酸化炭素の条件でペトリ・ディッシュ３００３（ファルコン社）にてディッシュ底に接着させて培養した。この細胞の継代培養は、６日毎に１：６に分割して行った。
ＶＨＬ遺伝子を導入した神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（宿主細胞）におけるＶＨＬ蛋白および神経特異蛋白の発現は、以下の方法によって調べた。すなわち、神経特異的蛋白質として、ＮＰＹ、ＮＦＨを蛍光免疫染色法にて調べた。この方法は、Ｋａｎｎｏらの論文（ＫａｎｎｏＨ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：２８２０−２８２４，２０００）に記載された方法に準じて行い、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にて観察した。ＶＨＬ蛋白と神経特異的蛋白が同時に同じ細胞に発現していることが観察された。
ＶＨＬ遺伝子を導入した神経芽腫細胞（宿主細胞）からの神経特異的蛋白の分泌は、別のＫａｎｎｏらの論文（ＫａｎｎｏＨ，ｅｔ  ａｌ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６（２）：１４７−１５４，１９９９）に記載された方法に準じてＥＬＩＳＡ法にて行った。宿主細胞においてはカリウムイオンによる細胞外電位刺激およびカルバコールによるコリン刺激により、ＮＰＹの開口放出が観察された。
ＶＨＬ遺伝子を導入した神経芽腫細胞ＳＨ−５ＹＳＹ（宿主細胞）の形態は、位相差顕微鏡によって観察する。成熟した神経細胞へ分化している細胞には、細胞突起に瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）が観察された。
神経電気生理学的所見は、以下の方法によって調べた。すなわち、パッチクランプ法により、微小針電極を細胞に刺して、細胞内電位を測定すると、神経細胞（ニューロン）にみられる大きなナトリウムチャンネル電流とカリウムチャンネル電流が測定された。
ＶＨＬ遺伝子導入神経芽腫細胞ＳＨ−５ＹＳＹ（宿主細胞）の移植は、以下の方法によって行った。すなわち、あらかじめ宿主細胞を十分に無血清のＤＭＥＭなどの培地で洗浄したのちに、０．１ｍＬの生理食塩水中に１０万個以上の濃度で細胞を含むように調整し、大脳への移植するために、１０万個の細胞を、定位的脳手術装置を用いて大脳の線条体へ注入した。
〔実施例２〕
遺伝子導入細胞がＥＳ細胞の場合、導入するＶＨＬ遺伝子として用いたＶＨＬｃＤＮＡ（ｇ７−１１）は、以下の方法によって得た。まず、腎癌の手術時に得られた正常腎組織を、グアニジンイソチオシアネートを含んだフェノール又はフェノール／クロロホルム溶液でホモジナイズし、高速遠心により水層と有機層に分離した後、水層に含まれる全ＲＮＡをイソプロパノールに加え沈殿させて回収した。次に、ｍＲＮＡから逆転写酵素の存在下にｃＤＮＡを合成したのち、５’−ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＧＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号２）をプライマーのセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて目的の領域を増幅し、ＤＮＡ精製用キット（Ａｍｉｃｏｎ社）にて精製したのち、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたプラスミド発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。
ＶＨＬ遺伝子を導入前のＥＳ細胞の培養は、Ｂａｉｎらの方法（Ｂａｉｎ  Ｇ，ｅｔａｌ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６８：３４２−３５７，１９９５）に従って行った。
ＶＨＬ遺伝子を組み込んだプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１を遺伝子導入試薬Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いることにより、ネオマイシン（Ｇｅｎｅｃｉｔｉｎ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を２００μｇ／ｍＬの濃度になるように調整した１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）培地に添加して導入して、発現しているクローンのみを選別し、増殖させた。
ＶＨＬ遺伝子を導入したＥＳ細胞（宿主細胞）におけるＶＨＬ蛋白および神経特異蛋白の発現は、神経特異的蛋白質として、ＭＡＰｓを蛍光免疫染色法にて調べた。この方法は、Ｋａｎｎｏらの論文（Ｋａｎｎｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：２８２０−２８２４，２０００）に記載された方法に準じて行い、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にて観察した。ＶＨＬ蛋白と神経特異的蛋白が同時に同じ細胞に発現していることが観察された。
ＶＨＬ遺伝子を導入したＥＳ細胞（宿主細胞）からの神経特異的蛋白の分泌は、別のＫａｎｎｏらの論文（ＫａｎｎｏＨ，ｅｔ  ａｌ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６（２）：１４７−１５４，１９９９）に記載された方法に準じてＥＬＩＳＡ法にて行った。宿主細胞おいてはカリウムイオンによる細胞外電位刺激およびカルバコールによるコリン刺激により、ＮＰＹの開口放出が観察された。
ＶＨＬ遺伝子を導入したＥＳ細胞（宿主細胞）の形態は、位相差顕微鏡によって観察する。成熟した神経細胞へ分化している細胞には、細胞突起に瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）が観察された。
神経電気生理学的所見は、以下の方法によって調べた。すなわち、パッチクランプ法により、微小針電極を細胞に刺して、細胞内電位を測定すると、神経細胞（ニューロン）にみられる大きなナトリウムチャンネル電流とカリウムチャンネル電流が測定された。
ＶＨＬ遺伝子導入ＥＳ細胞（宿主細胞）の移植は、以下の方法によって行った。すなわち、あらかじめ宿主細胞を十分に無血清のＤＭＥＭなどの培地で洗浄したのちに、０．１ｍＬの生理食塩水中に１０万個以上の濃度で細胞を含むように調整し、脊髄への移植するために、手術用顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を用いて１０万個の細胞を胸椎の椎弓を切除した脊髄の硬膜内へ直接注入した。
産業上の利用可能性
本発明のＶＨＬ遺伝子を導入、発現した神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞などのガン細胞およびＥＳ細胞は、神経細胞へ分化するので、神経再生のために大量に神経細胞を提供することが可能となる。また、アンチセンス技術を用いることにより、神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞などのガン細胞およびＥＳ細胞の分化を制御できる。さらに、ＶＨＬ遺伝子を導入、発現した神経芽腫細胞、神経系由来の未分化腫瘍細胞およびＥＳ細胞を試験管内で培養、増殖後、中枢神経系内あるいは末梢神経へ移植して生着させ、神経細胞として機能させることにより、障害のある神経機能に関連した神経難病（パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、脳梗塞）および脊髄損傷、脳挫傷または悪性腫瘍疾患の治療が可能となる。またさらに、本発明で明らかにされたＶＨＬ遺伝子のメカニズムから、神経分化を誘導する新しい治療薬開発のための道が開かれた。
配列表フリーテキスト
配列番号１−４：合成ＤＮＡ
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