(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのキャリアー成分部分、１より多くの連結成分部分、少なくとも１つのスペーサー成分部分、少なくとも１つのシグナル成分部分および少なくとも１つの１次標的化成分部分を含んでなり、前記シグナル成分がスペーサー成分に共有結合しており、前記スペーサー成分が連結成分を介してキャリアー成分に共有結合している水溶性架橋結合体の調製方法であって、
ａ）少なくとも1つのキャリアー成分部分、１より多くの連結成分部分、少なくとも１つのスペーサー成分部分および少なくとも１つのシグナル成分部分を含んでなり、前記シグナル成分がスペーサー成分に共有結合しており、そして前記スペーサー成分が連結成分を介してキャリアー成分に共有結合している水溶性中間結合体を、
可逆的沈殿物が形成される条件下で、水溶液中で、連結成分に由来する未反応の反応性部分の反応を介して、少なくとも１つの１次標的化成分と反応させ、ここで前記可逆的沈殿物の形成は、１Ｍを超える濃度で存在するリオトロピック塩を用いての塩析により行われ；そして
ｂ）水性媒体中で水溶性架橋結合体を含んでなる可逆的沈殿物を再溶解させる；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記工程ｂ）の後に、ｃ）前記水溶性架橋結合体を精製する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのキャリアー成分部分、１より多くの連結成分部分、少なくとも１つのシグナル成分部分および少なくとも１つの１次標的化成分部分を含んでなり、前記シグナル成分が連結成分によりキャリアー成分に共有結合している水溶性架橋結合体の調製方法であって、
ａ）少なくとも１つのキャリアー成分部分、１より多くの連結成分部分、少なくとも１つのシグナル成分部分を含んでなり、前記シグナル成分が連結成分によりキャリアー成分に共有結合している水溶性中間結合体を、
可逆的沈殿物が形成される条件下で、水溶液中で、連結成分に由来する未反応の反応性部分の反応を介して、少なくとも1つの１次標的化成分と反応させ、ここで前記可逆的沈殿物の形成は、１Ｍを超える濃度で存在するリオトロピック塩を用いての塩析により行われ；そして
ｂ）水性媒体中で、水溶性架橋結合体を含んでなる可逆的沈殿物を再溶解させる；
ことを含んでなる方法。
【請求項４】
前記工程ｂ）の後に、ｃ）前記水溶性架橋結合体を精製する工程を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記沈殿工程ａ）が、少なくとも1.25Mの濃度で存在するリオトロピック塩による塩析により行われる、請求項１〜４のいずれれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リオトロピック塩が、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびアンモニウムの硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩および酒石酸塩並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記沈殿工程ａ）が６を超えるpHで実施される、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記キャリアー成分が、デキストラン、澱粉、グリコーゲン、アガロース誘導体、セルロース誘導体、天然ゴムおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記デキストランが、カルボキシメチルデキストランであり；前記澱粉が、ヒドロキシエチル澱粉又はヒドロキシプロピル澱粉であり；前記セルロース誘導体が、ヒドロキシエチル又はヒドロキシプロピルセルロースである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記キャリアー成分がデキストランである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記連結成分が、ジビニルスルホンおよびエピクロロヒドリンからなる群から選択される、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記連結成分がジビニルスルホンである、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記スペーサー成分が、タンパク質およびポリペプチドからなる群から選択される、請求項１、２または請求項５〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記スペーサー成分が、BSA、オバルブミンおよびグロブリンからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナル成分が染料である、請求項１〜14のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶性架橋結合体の水への溶解度が、25℃において水１mlあたり少なくとも10mg乾燥結合体である、請求項１〜15のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法により調製された結合体、リガンドおよび２次標的化成分を含んでなり、前記リガンドが２次標的化成分に共有結合しており、そして前記リガンドが結合体の1次標的化成分に非共有結合により結合している水溶性架橋結合体複合体の調製方法であって、
I）請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法により、水溶性架橋結合体を調製し；
II）水溶性架橋結合体を、２次標的化成分と共有結合しているリガンドと、水溶液中で反応させ；そして
III）反応を終了する；
ことを含んでなる方法。
【請求項１８】
前記工程II）における水溶性架橋結合体が、精製された水溶性架橋結合体である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程III)が遊離のリガンドの添加により実施される、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法により得られる水溶性架橋結合体。
【請求項２１】
請求項17〜19のいずれか１項に記載の方法により得られる水溶性架橋結合体複合体。
【請求項２２】
液体試料中の少なくとも１つの目的成分の有無を決定するための横流れ装置であって、
I）適用部、堆積部および検出部を有し、液体試料が前記適用部から前記堆積部を通って前記検出部に流れるように配置されている試験片；
II）試験片の堆積部に位置する、請求項20に記載の少なくとも１つの水溶性架橋結合体の乾燥堆積物、または請求項21に記載の少なくとも１つの水溶性架橋結合体複合体の乾燥堆積物、あるいはそれらの混合物；並びに
III）液体試料中に存在する１つまたは複数の目的成分と選択的に結合または選択的に反応できる、試験片の検出部に固定化されている少なくとも１つの不動の標的化成分；
を有する横流れ装置。
【請求項２３】
液体試料中の少なくとも１つの目的成分の有無を決定するための方法であって、
I）請求項22に定義された横流れ装置の適用部に、液体試料を添加し、或いは液体試料及び洗浄緩衝液を添加し；
II）適用された液体試料、或いは液体試料及び洗浄緩衝液が、適用部から堆積部を通って検出部に流れるための時間を十分にとり；そして
III ）検出部のシグナルの有無を検出する；
ことを含んでなる方法。
【請求項２４】
前記シグナルが裸眼により直接検出可能である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
検出部に試薬を添加した後で前記シグナルが裸眼により直接検出可能である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記液体試料が生物由来である、請求項23〜25のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記液体試料が、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、精液試料またはそれらの混合物である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
免疫化学アッセイ技術、ラジオイムノアッセイ(RIA)、比濁分析および濁度分析イムノアッセイ、免疫組織化学的方法、細胞化学的方法、フローサイトメトリー、in situハイブリダイゼーション技術、メンブレンハイブリダイゼーション技術、バイオセンサー、横流れ装置、またはレクチン／炭化水素相互作用に基づく方法において、目的成分を標的化する方法であて、請求項20に記載の水溶性架橋結合体の少なくとも１つの標的化成分が、前記目的成分に選択的の結合するようにする工程又は当該目的成分と選択的に反応するようにする工程を含む方法。
【請求項２９】
前記免疫化学アッセイ技術がエンザイムイムノアッセイ(EIA)である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記エンザイムイムノアッセイ(EIA)がELISAである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
免疫化学アッセイ技術、ラジオイムノアッセイ(RIA)、比濁分析および濁度分析イムノアッセイ、免疫組織化学的方法、細胞化学的方法、フローサイトメトリー、in situハイブリダイゼーション技術、メンブレンハイブリダイゼーション技術、バイオセンサー、横流れ装置、またはレクチン／炭化水素相互作用に基づく方法において、目的成分を標的化する方法であて、請求項21に記載の水溶性架橋結合体の少なくとも１つの標的化成分が、前記目的成分に選択的の結合するようにする工程又は当該目的成分と選択的に反応するようにする工程を含む方法。
【請求項３２】
前記免疫化学アッセイ技術がエンザイムイムノアッセイ(EIA)である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記エンザイムイムノアッセイ(EIA)がELISAである、請求項32に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、水溶性架橋結合体及び結合体複合体を調製する新規の方法、ならびに新しい水溶性架橋結合体及び結合体複合体それ自体に関する。結合体及び結合体複合体は、免疫化学分析における感度の改善を可能にするものであり、特に横流れ(lateral flow)装置で用いられる場合、及び液体サンプルに存在する少量の活性成分の存在を決定する方法で用いられる場合の感度の改善を可能にするものである。
【０００２】
発明の背景
免疫化学分析の信頼性と感度、例えば家庭での妊娠及び生殖力テストにおけるその信頼性と感度、を改善する方法を案出するために、大きな研究努力が現在まで払われてきており、したがって、このような免疫化学分析で用いたときに高い感度と特異性を示す結合体を調製する新しい改良された方法には変わらないニーズがある。高感度免疫化学分析で用いる新しい結合体を開発するとき、結合体に存在する"活性"成分の数、例えば抗体や抗原の数、及び"検出可能なユニット"、例えば染料分子、の数が極めて重要になることは明らかである。
【０００３】
免疫化学分析の感度と信頼性を改善するいろいろな戦略は、L.J. Kricka (1994) Clin. Chem. 40, 347-357,によって概観されている。
【０００４】
欧州特許第0 594 772 号は、ジビニル・スルホンから誘導される成分(moieties)を含む、ポリマーをベースとする水溶性の結合体に関する。欧州特許第0 594 772 号は、いわゆる"塩析"効果を利用して水溶性のキャリアー分子への、抗体や抗原などの分子種の付着を強化する可能性について述べている。しかし、塩の濃度を約1Mにまで高めると不可逆的な沈殿物が形成されるということが判明した。
【０００５】
このたび、驚くべきことに、反応混合物中の塩の濃度をさらに高めることによって、可逆的な（すなわち、再溶解可能な）沈澱が形成され、その中にはいろいろな免疫化学分析、例えば横流れ装置などにおける免疫化学分析で有用な"大きな"水溶性結合体が含まれているということが見出された。
【０００６】
発明の説明
本発明の第一の態様は、少なくとも1つのキャリアー成分部分(moieties)、1より多くの架橋成分部分、少なくとも1つのスペーサー成分部分、少なくとも1つのシグナル成分部分、及び少なくとも1つの一次標的化成分部分を含んで成り、前記シグナル成分がスペーサー成分に共有結合しており、前記スペーサー成分が連結成分を介してキャリアー成分に共有結合している水溶性の架橋結合体を調製する方法であって：
【０００７】
a) 少なくとも1つのキャリアー成分部分、1より多くの架橋成分部分、少なくとも1つのスペーサー成分部分、及び少なくとも一つのシグナル成分部分を含んで成り、前記シグナル成分がスペーサー成分に共有結合しており、そして前記スペーサー成分が連結成分を介してキャリアー成分に共有結合している水溶性の中間結合体を、
可逆的沈殿物が形成される条件の下で、水溶液中で連結成分に由来する未反応の反応性部分の反応を介して、少なくとも1つの1次標的化成分と反応させ；
b) 水性媒体中で水溶性架橋結合体を含んで成る可逆的沈殿物を再溶解させ；そして
c) 所望により、水溶性架橋結合体を精製する；
を含んで成る前記方法に関する。
【０００８】
この明細書において、架橋結合体に関連して用いられるときの"水溶性"という用語は、ここに開示された方法にしたがって得られた結合体が、水などの水性媒体に室温で可溶であるということ、すなわち、ここに開示された方法によって得られた結合体が、サンプルを目で検査して判断して、実質的に透明で均一な溶液を生ずるということを意味する。
【０００９】
本発明の一つの好ましい実施形態では、ここに開示された方法によって得られた結合体は、25℃において水1mlあたり乾燥結合体で少なくとも0.1mg、好ましくは少なくとも1mg，例えば少なくとも10mg，さらに好ましくは少なくとも50mg，例えば100mg，特に少なくとも200mgという水に対する溶解度を有する。
【００１０】
上記の沈澱ステップに関する詳しい議論に進む前に、つぎのことに注意しておくべきであろう。すなわち、この水溶性中間結合体は、
I) 少なくとも1つの水溶性キャリアー成分を、pHが7より高い水溶液中で、1種類より多くの架橋成分と反応させて、キャリアー成分の水溶性部分に架橋成分から誘導された反応性部分が共有結合で付着している水溶性中間前駆物質を含む水溶液を形成し；
II) 所望により、この水溶性中間前駆物質を精製し；
III) 所望により精製されていてもよい水溶性中間前駆物質を、前記反応性部分の反応によって、
i) pHが7より高い水溶液中で少なくとも1つのスペーサー成分と、反応性部分のある割合だけがスペーサー成分と反応し有意な量の未反応の反応性部分が残るという条件で反応させて、第二の水溶性中間前駆物質を形成し、
ii) 所望により、この第2の水溶性中間前駆物質を精製し、
iii) 所望により精製されていてもよい第二の水溶性中間前駆物質を、スペーサー成分の反応によって、pHが7より高い水溶液中で少なくとも一つのシグナル成分と、シグナル成分の大部分が、架橋成分ではなく、スペーサー成分と反応し有意な量の未反応の架橋成分の反応性部分が未反応のままに残るという条件で反応させて、水溶性中間結合体を形成し（すなわち、シグナル成分の小さな割合だけが架橋成分の反応性部分と反応する）；そして
IV) 所望により、ステップIII)で得られた水溶性中間結合体を精製する；
ことを含む方法によって調製できる。
【００１１】
上でステップI〜IVで一般的な形で略述された方法、及びそこで言及された成分が、図4に概略図で示されている。この図は、一つの実施形態の教訓的な例として取り上げただけであるから、単に説明のためのものとして用いるようにしなければならない。その中でこの方法の一部を成すいろいろな段階の中間物質や前駆物質が、読者がこの手順を追跡する助けとして概略で示されている。
【００１２】
水溶性キャリアー成分
本発明の文脈における"キャリアー成分"という用語は、結合体の"バックボーン"を表すのに用いられる、すなわち、キャリアー成分はそこのいろいろな分子を付着させることができるバックボーンとして機能する。
【００１３】
結合体の調製方法でキャリアー成分として機能する水溶性ポリマーは、きわめて多様なタイプのポリマーから選ぶことができる、例えば次ぎのようなものである：
【００１４】
天然及び合成多糖類、ならびにその誘導体、例えばデキストラン及びデキストラン誘導体、澱粉及び澱粉誘導体、セルローズ誘導体、アミロース及びペクチン、ならびにいくつかの天然ゴム及びその誘導体、例えばアラビアゴム及びアルギニン酸塩；
【００１５】
適当な反応性の官能基を有するホモポリ（アミノ酸）、例えばポリリジン、ポリヒスチジン、又はポリオルニチン；
天然及び合成ポリペプチド及びタンパク質、例えばウシ血清アルブミン及びその他の哺乳類アルブミン；及び
求核性官能基を有する合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリエチレングリコール、及び置換されたポリアクリレート。
【００１６】
本発明の目的に非常に適したポリマーは、多糖類とその誘導体：デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ヒドロキシエチル−及びヒドロキシプロピル−澱粉、グリコーゲン、アガロース誘導体、及びヒドロキシエチル−及びヒドロキシプロピル−セルローズ、である。この中の実施例から明らかなように（以下を見よ）、とりわけデキストランが本発明に関して特に適当なポリマーであり、今のところそれは最も好ましいキャリアー成分である。
【００１７】
既に述べたように、特に結合体の免疫化学的応用には、前記結合体が正味の電荷を何も、あるいは実質的に何も有していないということがしばしば望ましい。何故なら、このような場合、正味の正又は負の電荷は、とりわけ、関心があるもの以外の物質及び／又は材料に結合体が非特異的に結合するという望ましくない事態に導く可能性があるからである。多くの場合、この条件は、荷電分子種が持ち込まれない場合、単にポリマーのキャリアー成分自体が何も正味の電荷を持っていないようにすることによって満たされる。
【００１８】
すなわち、本発明の方法で用いる好ましいキャリアー成分は、その自由状態で、約4乃至約10の範囲のpHで実質的に線状であり実質的に無電荷である。後の方のpH区間は、大多数の免疫化学的手法、ハイブリダイゼーション手法及びその他の結合体の応用で実際に関連がある区間である。この基準に合致するいろいろなポリマーとしては、例えば、多くの多糖類とその誘導体、例えばデキストラン及びヒドロキシエチル-及びヒドロキシプロピル-セルローズ、などがある。
【００１９】
結合体が用いられる用途に応じて、結合体はある範囲の分子量を有する水溶性のポリマー・キャリアー成分に基づく。本発明のある実施形態では、ポリマー・キャリアー成分は、ピーク分子量が約40,000乃至40,000,000という範囲にある（前記水溶性のポリマー・キャリアー成分をDVSあるいはEPCHなどの架橋反応剤と反応させて、あるいは生じた水溶性中間前駆物質をスペーサー成分又はシグナル成分と反応させて、架橋結合体及び架橋結合体複合体を最終的に形成する前）。
【００２０】
かなり関心があるピーク分子量は、100,000乃至10,000,000という範囲のピーク分子量、例えば500,000乃至8,000,000という範囲、好ましくは500,000乃至4,000,000という範囲、例えば500,000乃至2,000,000という範囲、である。特に興味あるピーク分子量、特にポリマー・キャリアー成分としてのデキストランの場合、は約500,000,約1,000,000,約1,500,000、約2,000,000、2,500,000、約3,000,000、約3,500,000及び約4,000,000というピーク分子量である。
【００２１】
さらに詳しくは、20,000乃至2,000,000という分子量範囲のデキストランは、開始キャリアー成分として好ましい。最も好ましくは、20,000Daのデキストランはストレプタビジンを一次又は二次の標的として用いる結合体及び／又は結合体複合体に好ましいが、しかしそれだけに限定されない。さらに、500,000Daのデキストランは、いくつかの染料、酵素を、ある特定の結合分子と共に一次又は二次の標的として用いる結合体及び／又は結合体複合体に好ましいが、しかしそれだけに限定されない。さらに、2,000,000Daのデキストランは他のいくつかの染料で好ましいが、しかしそれだけに限定されない。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲でキャリアー成分に関連して用いられる"ピーク分子量"という用語は、存在量が最大の分子量、すなわち、ある分子量の分布のうちポリマーのあるサンプル又はバッチにおいて最大多数の分子が有する分子量、を表す。分子量分布が非常に狭い場合にポリマー画分を求める又は作成することは（特に最も高い分子量に関しては）困難であるため、このような仕方で多数のタイプのポリマーを特徴づけることはきわめて普通のことである。
【００２３】
本発明に関連して関心がもたれる多数の商業的に入手できるキャリアー成分の場合、メーカー又は配給業者は信頼できるピーク分子量データ（例えばゲル浸透クロマトグラフィーによって決定したもの）を提供することができ、それを基礎として適切な画分のポリマー・キャリアー成分を選ぶことができる。
【００２４】
ここで、本明細書および特許請求の範囲で引用されるピーク分子量の値（キャリアー成分に関連して用いられる場合）は問題の自由ポリマーのピーク分子量を指し、例えば架橋ポリマーユニットが、例えば、結合体の調製のための方法でDVSやEPCHなどの架橋成分との反応による二つ以上のポリマー分子の架橋の結果として、形成される可能性を何も考慮していないということを言っておかなければならない；このような架橋したユニットは、平均して、それを形成する個々の自由ポリマー分子より大きな分子量を有するだろう。
【００２５】
水溶性中間前駆物質の形成
この明細書において、"架橋成分"という用語は、他の−普通はもっと大きい−分子との間で共有結合のリンクを作ることができる二価性分子を表すことを意図している。本発明による方法に適当な架橋成分の例は、次のような二価性の反応基を有する分子である、例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、N、N'−フェニレンジマレイミド、N−サクシニミジル3−（2−ピリジルチオ）プロピオネート、p−ベンゾキノン、ビスオキシラン、ジビニルスルホン(DVS)及びエポキシド誘導体、例えば次の一般式1：
【化１】
0004430234.tif 000002
（ここで、R1は水素又はC1-4 アルキルであり、nは1-4の範囲の整数、すなわち、1,2,3又は4であり，そしてXは脱離基、例えばトシル、メシル、又はハロゲン例えばフッ素、塩素、臭素又は沃素など、好ましくは塩素、である）
で表わされるエポキシドである。
本明細書で、用語"C1-4 アルキル"は、1乃至4個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐した飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、n−プロピル、n−ブチル、イソプロピル、イソブチル等である。
【００２６】
ここで提供される実施例から明らかとなるように、非常に有望なエポキシドから誘導された架橋成分は、エピクロロヒドリン(EPCH)、すなわち、上の一般式1で、R1が水素であり、nが1であり，そして脱離基が塩素である化合物である。
好ましくは、架橋成分は水性環境で安定であるべきであり、したがって、架橋成分EPCHが、架橋成分DVSと共に、現在のところ本発明の方法に用いるのに最も好ましい架橋成分である。
【００２７】
第一のステップ、すなわち、水溶性の中間前駆物質が形成されるステップI)、は、pHが7より高い、例えば8.5を超える、特に9より高い、例えば10を超える、例えばpHがほぼ10，10.5，11，又は11.5，の水溶液中で好適に実行される。最も一般的な形として、反応は0〜60℃の範囲の温度で行うことができるが、例えばここで与えられる実施例において、デキストランなどのキャリアー成分の場合に示されるように、20〜25℃という範囲の温度が多くの場合に極めて適切である。本発明のある好ましい実施形態では、反応が行われるpHは、一般に約10〜11.5の範囲内にある。これは、たいていのタイプのキャリアー成分の反応性官能基が、今好ましいとされた架橋成分DVS及びEPCHに対して反応するようになるpH範囲である。
【００２８】
水溶液中のキャリアー成分の濃度に関していうと、それは一般に0.1〜20％w/v の範囲にあり、しばしば0.5〜10％w/v の範囲に、例えば0.5〜5％w/v の範囲に、特に0.5〜2％w/v の範囲にあり、例えば約0.5％w/v、約1％w/v、約1.5％w/v、又は約2％w/v、である。水溶液中の架橋成分の濃度は、実際に用いる架橋成分によるが、一般に0.1〜35％v/vの範囲にある。今好ましいとしている架橋成分、すなわち、DVS及びEPCH、の水溶液中の濃度は、普通、DVSの場合、0.1〜15％v/v の範囲にあり、しばしば1〜10％v/v の範囲にある。EPCHの場合、濃度は普通、1〜30％v/v の範囲にあり、しばしば3〜20％v/v の範囲にある。架橋成分の調製のための反応剤が固体である場合、濃度は一般に0.1〜10％w/v の範囲になると考えられる。
【００２９】
水溶液中での架橋成分とキャリアー成分との反応をどれだけの時間そのまま進行させるべきかに関する一般的な指針はない。何故なら、それは、例えば反応が起こる温度やpHによって、反応混合物中のキャリアー成分の濃度及び架橋成分の濃度によって、キャリアー成分の性質及び／又は分子量及び架橋成分の性質によって、及び例えばゲル化又は沈澱が起こる危険が生ずるまでにキャリアーの架橋が（例えばDVSとの反応によって）どの程度進行するかによって、かなり異なるからである。
【００３０】
しかし、問題の反応時間は普通5分から10時間までの範囲にあるだろう。ここで提供される実施例から明らかとなるように、DVSを架橋成分として用いた場合に必要になる反応時間は、普通5乃至120分の範囲にあり、例えば15乃至60分の範囲 、例えば約30分、であるのに対して、EPCHによるキャリアー成分の活性化には、一般にもっと長い反応時間が必要で、普通1乃至10時間の範囲にあり、例えば3乃至7時間の範囲で、例えば約5時間、である。
【００３１】
すでに述べたように、水溶性中間前駆物質のキャリアー成分は、二官能基架橋成分から誘導された一つ以上部分がそれに共有結合で付着しており、それら部分の各々は二官能基を持つ架橋成分の二つの官能基の一つとキャリアー成分の反応性官能基との間に形成される共有結合によって付着している。了解されるように、二官能基を持つ架橋成分の残りの官能基は自由になり（"ぶらさがり"）、したがって、例えば一次標的化成分、スペーサー成分及び／又はシグナル成分、と適当な条件の下で反応することができる（以下を見よ）。
【００３２】
"負荷"(road)、すなわち、[ステップI)でキャリアー成分に付着した架橋基の数は普通、キャリアー成分1グラムあたり約1乃至約5,000マイクロモル（μmoles）の架橋成分という範囲にあり、例えば次のサブレンジのいずれかにある（キャリアー成分1グラムあたりの、架橋成分のμmolesで表して）：約1乃至約50；約50乃至約300；約300乃至約1,000；又は約1,000乃至約5,000。キャリアー成分に付着した架橋基(linking group)の数は、それ自体は例えばPorath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49, に記述されているチオ硫酸滴定法などによって知られる滴定法で決定することができる。
【００３３】
ここで提供される実施例で明らかなように、架橋基(linker)の"負荷"は、普通、キャリアー1グラムあたりの架橋基のマイクロモル数（μmoles）で表して、ほぼ300から2,000超までにわたる。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、キャリアー成分1グラムあたりの架橋基のマイクロモル数（μmoles）で約1乃至約5,000μmolesというこの範囲は、特に200乃至3000、好ましくは500乃至2500、とすべきである。
【００３４】
所望により行われる精製ステップ（ステップII）は、例えば、透析などのプロセス（過剰な反応剤又は他の低分子量の分子種を除去するため）又はこの目的に適した、例えばゲル濾過などの何らかのクロマトグラフィー法を用いることができる。しかし、上記の精製方法は単に例としてあげただけであり、熟練した技術者であれば、個々の場合について、結合ステップで用いられる実際の条件、および結合ステップで用いられる実際の成分ならびに生産現場で利用できる設備に応じて最も適当な精製方法を選択することができるであろう。
【００３５】
本発明の方法で用いるのに適したキャリアー成分（それが、上で説明したように、結合体の"バックボーン"を構成する）は、最初は架橋していないもので、本発明の応用分野に関わりがあるpH値で本質的にゼロ電荷であることが好ましい。
【００３６】
結合の性質からして、本発明の方法で用いられる化学、すなわち、DVSやEPCHなどの二官能度分子から誘導された共有結合で結合された反応性部分をキャリアー成分上に確立するためには、一般に、キャリアー成分に反応性の官能基が、好ましくは求核性の官能基が、存在することが必要であろう。したがって、適当なキャリアー成分は、例えば、次のような官能基をもつポリマー・キャリアー成分となる：
【００３７】
−O-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のチロシン残基の脱プロトン化された芳香族ヒドロキシ基などの脱プロトン化フェノール・ヒドロキシ基）、−S-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基の脱プロトン化されたチオール基などの芳香族環の脱プロトン化チオール基又は脂肪族基）、−OH（例えば、グルコース又はその他のオリゴ糖又は多糖の単糖環など、糖リングの脂肪族ヒドロキシ基；又は、ポリビニルアルコールなど、ポリオルのアルコール・ヒドロキシ基；又は、セリン又はスレオノン残基など、ポリペプチド又はタンパク質のいくつかのアミノ酸残基のヒドロキシ基）、−SH（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基のチオール基）、一次アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のリジン又はオルニチン残基；又は、キトサンなど、いくつかの多糖又はその誘導体のアミノ置換糖環）、又は二級アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のヒスチジン残基における）。
【００３８】
上記の官能基がプロトン化された状態にあるか、脱プロトン化された状態にあるかという問題は、もちろん、反応混合物のpHなどの選択された反応条件に依存するということは熟練した技術者には理解されるであろう。
同様な理由により、本発明の中での標的化成分及びスペーサー成分（後記を参照のこと）における問題の官能基も、また、通常は求核性官能基、例えば上述のタイプのいずれかの求核性官能基、になる。
【００３９】
第二の水溶性中間前駆物質
本発明の方法のステップIII i)で、スペーサー成分が、架橋成分との反応によって、水溶性中間前駆物質に共有結合し第二の水溶性中間前駆物質を形成する。
上述のように、"スペーサー成分"は、架橋基を介して、キャリアー成分に共有結合で付着する。すなわち、本発明で用いる用語"スペーサー成分"は、染料などのシグナル成分の共有結合に利用できる複数の部位を有するタンパク質又はポリペプチドを意味することを意図している（後記を参照のこと）。
【００４０】
スペーサー成分を取り入れた一つの目的は、特にシグナル成分の付着に利用できる複数の部位を有するスペーサー成分の場合、この方法が、結合体に付着させることができるシグナル成分の数(すなわち、水溶性中間結合体におけるシグナル成分の"負荷"、前記を参照のこと）を増やし、いろいろな分析、例えば、ここで記述される免疫化学分析及び横流れ装置、に用いるときのこの結合体の感度を高める適切な手段になるということである（後記を参照のこと）。シグナル成分（例えば、染料分子）の結合が直接架橋成分と（スペーサー成分によってではなく）行われる実施形態では、（少なくとも原理的には）結合体に存在する架橋成分の一分子あたりシグナル分子は一つしか付着しないことになるということは理解されるであろう。
【００４１】
第二の水溶性前駆物質を調製したいくつかの実施形態で、スタートにおけるデキストラン1モルあたりのスペーサーのモル数は（スペーサーの"負荷"は）、1乃至500の範囲、特に2乃至100、最も多くの場合5乃至75、の範囲、にある。また、この明細書の実施例3Aで詳しく説明するように、第二の水溶性中間物質（したがって、ステップIII i)で行われる反応の効率）は、例えば、キャリアー成分1モルあたり付着するスペーサー成分の（モル）数によって表現することができる。
【００４２】
前に述べたように、水溶性中間物質の架橋成分の反応性部分のうちほんの一部だけがスペーサー成分と反応する。スペーサー成分及び架橋成分によるが、スペーサー成分との反応の後、架橋成分の未反応の反応性部分の1〜99％、好ましくは20〜99％、特に30〜99％、例えば40〜99％、特に50〜99％、が反応しないままで残される。これはすなわち、ある実施例で、ある条件の下では、未反応の架橋分子の1〜49％がスペーサー成分と反応したと言うことである。
【００４３】
好ましくは、スペーサー成分は、BSA、オバルブミン、グロブリン、等のタンパク質、又はホモポリペプチドなどのポリペプチド、例えばポリリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、である。しかし、スペーサー成分の選択は、用いられるシグナル成分（例えば、ある特定の結合体で用いられる実際の染料）ならびに用いられる架橋成分に依存することは、当業者には明らかであろう。
【００４４】
スペーサー成分、例えばタンパク質、の分子量は、好ましくは少なくとも10,000Da、であり、好ましくは10,000〜2,000,000の範囲,例えば20,000〜500,000の範囲、にある。導入されるスペーサー成分の特徴の一つは、シグナル成分の導入のために利用できる位置の数を増やすことにあるので、シグナル成分の付着のために利用できる官能基の数がスペーサー成分の1分子あたり少なくとも5個、好ましくは10〜1,000、特に10〜500,であることが好ましい。
【００４５】
あるいはまた、スペーサー成分は多糖又はポリ核酸であっても良い。水溶性中間結合体の調製の前にこれらのポリマーを化学的に変性することが必要になることがある。
【００４６】
前に述べたように、スペーサー成分の結合化学の性質からして（第二の水溶性中間前駆物質の形成においては架橋成分との結合、又はあとでの水溶性中間結合体の形成ではシグナル成分との結合、後記を参照のこと）、反応性の官能基、例えば求核性の官能基、がスペーサー成分に存在する。したがって、適当なスペーサー成分は、例えば、次のような求核性の官能基を有するものになる：
【００４７】
−O-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のチロシン残基の脱プロトン化された芳香族ヒドロキシ基など、脱プロトン化フェノール・ヒドロキシ基）、−S-（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基の脱プロトン化されたチオール基など、芳香族環の脱プロトン化チオール基又は脂肪族基）、−OH（例えば、セリン又はスレオノン残基など、ポリペプチド又はタンパク質のいくつかのアミノ酸残基に存在する脂肪族ヒドロキシ基）、−SH（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のシステイン残基のチオール基）、一次アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のリジン又はオルニチン残基）、又は二級アミノ基（例えば、ポリペプチド又はタンパク質のヒスチジン残基における）。
【００４８】
上記の官能基がプロトン化された状態にあるか、脱プロトン化された状態にあるかという問題は、もちろん、反応混合物のpHなどの選択された反応条件に依存するということは熟練した技術者には理解されるであろう。
【００４９】
本発明の方法のステップIII i)では、第二の水溶性中間前駆物質が形成されるが、このステップはpHが7より高い水溶液、例えば8を超える、特に9より高い、例えば10を超える、例えば10〜11までの、例えば10〜10.5までの、区間のpHで、好適に実行される。普通、この反応は0〜60℃の範囲の温度で行えば極めて十分であるが、最適温度は、とりわけ、実際に用いるpHに依存する。たいていの場合、特に反応が9よりも高いpHで行われる場合、そして特に反応が10よりも高いpHで行われる場合には、20〜40℃の範囲の温度、例えば30℃程度の温度、がしばしば極めて好適である。
【００５０】
反応時間に関しては、いくつかのパラメータが必要な反応時間に影響を及ぼすということを理解しておくべきである。すなわち、用いるpH、反応温度、ペプチド又はポリペプチドのスペーサー成分の濃度及び水溶性中間前駆物質の濃度、などに依存して反応時間は広い限界の中で変わる。しかし、適当な反応時間は、一般に1時間乃至48時間の範囲にあると考えられ、ここに提供される実施例から理解されるように、実施例3A及び3Bで開示される特定の反応条件の組を用いると、10〜30時間の範囲の反応時間、例えば15〜25時間の範囲にある、例えば約18時間という、反応時間が極めて適切である。
【００５１】
前に述べたように、水溶性中間物質の架橋成分の未反応の反応性部分のうち、ほんの一部だけしかスペーサー成分と反応しない。ということは、第二の水溶性中間物質はまだ相当な量の未反応の反応性部分を持っているということである。得られた第二の水溶性中間前駆物質は、精製ステップII)に関連して、すなわち、水溶性中間前駆物質の精製に関連して、すでに述べた方法によって精製することができる。ここで提供される実施例から明らかになるように、得られた第二の水溶性中間前駆物質を精製するのに適当な方法はゲル濾過である。
【００５２】
水溶性中間結合体の形成
ステップIII iii)において、シグナル成分が、スペーサー成分との反応によって、第二の水溶性中間前駆物質に共有結合で付着して、水溶性中間結合体を形成する。
ここで用いる場合、"シグナル成分"という用語は、直接物理的に検出できる成分、又は直接物理的に検出できる成分の前駆物質である成分、をカバーするように意図している。
【００５３】
言い換えると、シグナル成分は、当業者には公知の何らかの物理的方法によって、例えば分光測光、蛍光、ルミネッセンス、燐光、その他の方法、例えば、"Instrumental Method of Chemical Analysis （化学分析の計測方法）", G. W. Ewing, 5th Ed., McGraw-Hill Book Company, New York, 1988, に記述されているような方法、などの光学的方法という手段によって、容易に測定できるラベル又はマーカーとして機能しなければならない。あるいはまた、シグナル成分は−上で述べたように−このような物理的に検出できる成分の前駆物質であっても良い。このような前駆物質の典型的な例は、適当な基体への作用によって分子種を、好ましくは色があって、それを一つ以上の上記の物理的方法で検出できる分子種を、発生することができる酵素である。
【００５４】
上述の議論に照らしてみれば、シグナル成分は次のような物質から選ぶことができるということは熟練した技術者には明らかであろう、すなわち、染料；蛍光、ルミネッセント、燐光及びその他の発光物質；金属キレート物質、例えばイミノ二酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、及びデスフェリオキサミンB；放射性同位元素で標識された物質；重原子で標識された物質；及びそれらの混合物。
【００５５】
さらにいくつかの例をあげると、蛍光物質は、例えば、フルオレセイン（適当な形はフルオレセイン・イソチオシアネート、FITC）、フルオレセインアミン、1−ナフトール、2−ナフトール、エオシン、エリスロシン、モリン、O−フェニレンジアミン、ロダミン及び8−アニリノ−1−ナフタリン・スルホン酸、から選ぶことができる。関連ある放射性同位元素は、例えば、水素の同位元素（すなわち、トリチウム、3H）、炭素（14Cなど）、リン（32P）、イオウ（35S）、ヨウ素（131I）、ビスマス（212Bi）、イットリウム（90Y）、テクネチウム（99mTc）、パラジウム（109Pd）、及びサマリウム（153Sm）、から選ぶことができる。関連ある重い原子は、例えば、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、In、Ag、Au、Hg、I、Bi、Y、La、Ce、Eu、及びGd。金（Au）は、多くの場合に特に有用な重い原子である。
【００５６】
特に興味あると考えられるシグナル成分は、染料である。この明細書では、"染料"という用語は分光測光的に検出できる染料分子又はその誘導体を意味するように意図している。本発明の方法によって調製される結合体に取り入れるのに好ましい染料は、可視染料、燐光染料、蛍光染料、レーザー染料、赤外染料、及びランタニド・キレート、から導出される。
【００５７】
特に興味ある染料は、可視染料で、可溶可視染料を含み、溶剤染料、色素、バット染料、イオウ染料、媒染染料、ロイコバット染料、及びフルオレセイン、ロダミン及びそれらの誘導体（スルホロダミン、ロダミン−ハイドライド及びロダミン−ヒドラジッド）などの分子、ならびにオキサジン染料、シアニン染料、及びアゾル染料、などである。適当な染料の具体的な例としては、例えば、テキサスレッドヒドラジン、コンゴーレッド、トリパンブルー、レマゾールブラック、レマゾールブリリアントレッド、ロダミンBイソチオシアネート、Cy5-Osuモノファンクショナル・リアクティブ染料、リアクティブ・オレンジ16，ユニブルーA、等がある。
【００５８】
上記の染料は、本発明の目的でシグナル成分として有用なものであるが、全て当業者には周知のものであり、熟練した技術者には他の染料も本発明の目的でシグナル成分として使用できるということは明らかであろう。シグナル成分として用いられる染料のその他の例は、例えば、"Dyeing and Chemical Technology of Textile Fibers（繊維の染色および化学技術）", Trotman, 34th Ed., C. Griffin & Co., London 及び "The Chemistry of Synthetic Dye（合成染料の化学）", Vankataramon (Ed.), Academic Press, New York, 1979, であげられているような染料であり、この内容は参照することによってこの明細書に取り入れられる。
【００５９】
好ましくは、シグナル成分は、BSAなどのタンパク質と反応することができるものであり、及び／又は、以下で記述される他の実施形態では、架橋成分の未反応の反応性部分と反応できるものでなければならない。）さらに、シグナル成分は、スペーサー成分と反応又は結合したとき、得られた水溶性の中間結合体に望ましくない性質を付与しないことが好ましい、すなわち、シグナル成分は、制御できない非特異的結合を強めたり、結合体に結合した標的化成分（例えば、抗体）の活性を阻害したりしないことが好ましい。さらに、シグナル成分は、結合体の水への溶解度を著しく減少させないことが好ましい。
【００６０】
出発スタートのデキストランのサイズ、用いるシグナル成分のタイプ、そして特にスペーサーの"負荷"に依存して、シグナル成分の"負荷"は明らかに変化する。前に述べたように、各スペーサーは、いくつかのシグナル成分を収容することができる。好ましい実施形態では、スペーサー成分あたりのシグナル成分の数は、各成分のモルで表して、1〜100にわたっている。特に興味深いのは、このモル比が2〜80、特に2〜75までの範囲にある実施形態である。
【００６１】
前に述べたように、第二の水溶性中間物質の架橋成分のうち、水溶性の中間結合体を形成する際にシグナル成分と反応するのはほんの小さな一部だけである。シグナル成分、スペーサー成分に、そして架橋成分に依存して、シグナル成分と反応した後、第二の水溶性中間前駆物質にある未反応の反応性架橋成分の量と比較して、架橋成分の未反応の反応性部分の50乃至100％、好ましくは60〜100％、特に70〜100％、例えば80〜100％の範囲の、特に90〜100％、が反応しないまま残される（注意、第二の水溶性中間前駆物質に比較してである）。
【００６２】
個々の染料に依存して、本発明の方法によって調製された結合体は、可視範囲、UV範囲、あるいは近赤外範囲で、好ましくは可視範囲で、光子を吸収又は放出する。ロダミンなどの可視染料を使用すると、本発明の結合体は可視領域（例えば、ブルー）で光子を吸収するようになり、補色（例えば、赤）の波長の光を観測者へ透過させる。あるいはまた、蛍光染料を使用すると、本発明の結合体は、（照射されたとき）電子が基底状態に戻ることによって特定波長の光子を放出するようになる。
【００６３】
本発明の方法のステップIII iii)では水溶性の中間結合体が形成されるが、これはpHが7より高い水溶液中で、例えば8より高い、特に約8から約11までの範囲、例えば約8.5〜10.5の範囲、のpHの水溶液中で好適に実行される。実際に用いるシグナル成分によるが、水性の反応混合物は、0〜60％v/vの有機捕溶剤(cosolvent)を含むことがある。
【００６４】
すなわち、どちらかというと疎水性のシグナル成分（例えば、ある種の染料分子）を溶解させるために、いろいろな量の水と混合可能な有機捕溶剤、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)、エタノール、ジメチルホルムアミド(DMF)等、を水性の反応混合物に加えることが、用いたシグナル成分の十分な溶解を確保するために必要になることがある。すでに結合しているスペーサー成分（それは普通、ポリペプチド又はタンパク質である）の変性を回避するために、反応混合物中のこの有機捕溶剤の濃度はできるだけ低いことが好ましい。
【００６５】
水溶性中間前駆物質の形成及び第二の水溶性中間前駆物質の形成に関するステップに関連して上述したと同様に、このステップにおいても、0〜60℃の範囲の温度、例えば20〜40℃の範囲の、例えば約30℃などの温度、で反応を行えば十分である。
【００６６】
ここで提供される実施例から明らかになるように、反応時間は広い限界内で変わる。すなわち、反応時間は、例えばキャリアー成分へのスペーサー成分の"負荷"、ならびに通常の反応パラメータ、例えばpH、温度、及び反応物の性質や濃度、に依存する。しかし、一般に、反応時間は、1〜48時間の範囲にある。好ましくは、反応時間はできるだけ短い方が良い、すなわち、1〜24時間の範囲に、特に1〜12時間の範囲に、例えば1〜5時間の範囲に、あるようにする。
【００６７】
上述したと同様な仕方で、得られた中間結合体は、熟練技術者には公知のいろいろな異なる方法によって精製することができる。さらに、得られた中間結合体は、例えば、凍結乾燥又は溶剤の蒸発などの手段によって、固体の形で単離することができる。後者の場合、蒸発は、普通、減圧下で、例えば、（真空）乾燥器によって、行われる。
【００６８】
得られた中間結合体は、いろいろな仕方で特性を表すことができる。例えば、用いたシグナル成分が可視染料である場合、その吸収率を読み取って、中間結合体を（したがって、結合ステップIII iii)の効率を）、例えば、この明細書の実施例4Aで記述されているように、スペーサー成分1mgあたり中間結合体に存在する吸光単位(EU)の数で表すことが出きる。もちろん、熟練技術者なら、得られた中間結合体の特性を他のいくつかの仕方で表すことができるであろう。
【００６９】
これまで述べてきた本発明の方法では、スペーサー成分がキャリアー成分に架橋成分を介して結合され、その後でシグナル成分がスペーサー成分に付着されるということに注意すべきである。したがって、シグナル成分（染料など）がスペーサー成分に結合されるときには、スペーサー成分はすでにキャリアー成分に（架橋成分を介して）付着している。
【００７０】
水溶性中間結合体の形成に代わる仕方
前に述べたように、そしてこの明細書で示される実施例からも理解されるように、新合成分が共有結合で架橋成分に付着し、架橋成分がさらにキャリアー成分に付着する、すなわち、タンパク質やポリペプチドのスペーサー成分が結合体に組み込まれないという方法も、水溶性架橋結合体の調製に適する（後者を参照のこと）。
【００７１】
このような場合、もちろん、シグナル成分は、上記のシグナル成分の他に、フェリチン、フィコエリトリン、フィコシアニン、及びフィコビリンなどのタンパク質；ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、及びウレアーゼ、などの酵素；及びそれらの混合物、などの物質からも選択することができる。
【００７２】
当業者には明らかなように、シグナル成分はまた、スペーサー成分をキャリアー成分に（架橋成分を介して）結合する前に、スペーサー成分に共有結合で付着させることもできる。
【００７３】
ある好ましい実施形態では、ある条件の下で、水溶性中間物質の架橋成分の反応性部分のうちでほんの一部だけがシグナル成分と反応する。架橋成分に依るが、架橋成分の未反応の反応性部分のうち、シグナル成分との反応後、1〜99％が、好ましくは1〜89％が、特に1〜69％、例えば1〜59％の範囲、特に1〜49％が、反応しないで残る。すなわち、好ましい実施形態では、反応性部分の50〜99％がシグナル成分と反応したということである。
【００７４】
したがって、別の興味ある実施形態では、水溶性中間結合体は：
I) 少なくとも1つの水溶性キャリアー成分をpHが7より高い水溶液中で1より多くの架橋成分と反応させて、架橋成分に由来する反応性部分が共有結合したキャリアー成分の水溶性部分を含む水溶性中間前駆物質を含む水溶液を形成し；
II) 所望により、この水溶性中間前駆物質を精製し；
III) 所望により精製されていてもよい水溶性中間前駆物質を、前記反応性部分の反応を介して、少なくとも1つのシグナル成分が共有結合した少なくとも1つのスペーサー成分と、反応性部分のうち一部分だけが少なくとも1つのシグナル成分が共有結合したスペーサー成分と反応するという条件の下で、pHが7より高い水溶液中で反応させて、水溶性の中間結合体を形成し；そして
IV) 所望により、ステップIII)で得られた水溶性中間結合体を精製する；
ことを含む方法によって調製することができる。
【００７５】
精製／単離プロセスは、水溶性中間前駆物質の所望により行われる精製に関連してすでに論じた方法によることができる。
【００７６】
水溶性架橋結合体の形成
次に沈澱ステップの詳細な議論に目を向けると、本発明の方法の"キー・ステップ"は、可逆的沈殿物を生ずる反応条件の下で、一次標的化成分を中間結合体に付着させるステップa)であるということは、当業者には理解されるであろう。この明細書で、"可逆的沈殿物"という用語は、生じた沈殿物が25℃で水によって希釈されるときに再溶解できるということを意味することを意図する。
【００７７】
ここで用いられる用語、"一次標的化成分"は、分子特に生物起源の分子であって、生物起源の物質の相補的な分子又は相補的な構造領域に選択的に結合、又は選択的に反応することができる分子を表そうと意図している。該当する一次標的化成分の例は、例えば、次のようなものである、抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成オリゴ−及びポリヌクレオチド；天然及び合成モノ−、オリゴ−及びポリサッカライド；レクチン；アビジン；ストレプトアビジン；ビオチン；成長因子；ホルモン；レセプタ分子；タンパク質A及びタンパク質G；及びそれらの混合物。
【００７８】
本発明の目的に特に有益であると考えられる一次標的化成分の例は、例えば、次のようなものである、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（抗hCG)、家兎抗ヒトCRP、ストレプトアビジン、アビジン、抗HIV、抗C型肝炎、抗クラミジア、抗ヘルペス、抗甲状腺刺激ホルモン（抗TSH）、抗リステリア、及び抗サルモネラ。
該当する一次標的化成分で、ホルモンであるものは、例えば、ステロイド・ホルモン（例えば、エストロゲン、プロジェステロン、又はコルチゾン）、アミノ酸ホルモン（例えば、チロキシン）、及びペプチド及びタンパク質ホルモン（例えば、バソプレッシン、ボムベシン、ガストリン、又はインシュリン）、である。
【００７９】
欧州特許第0 594 772 号は、12ページ、20−38行で、分子種（抗体など）をキャリアー（デキストランなど）に付着させるとき、その有効性はいわゆる"塩析"効果を利用して高めることができると述べ、適当な濃度は0.5〜5の範囲のイオン強度に対応する濃度であろうと述べている。欧州特許第0 594 772 号に開示された例は、実際、塩の濃度をあるレベルまで高めるとキャリアーに結合されるいろいろな分子種の量に関してプラスの効果が得られたということを示している。しかし、塩濃度を約1Mにまで高めると不可逆的な沈殿物が形成された。
【００８０】
すでに述べたように、本発明者は、このたび驚くべきことに、反応混合物中のリオトロピック塩の濃度をさらに高めることによって、可逆的な沈殿物が形成され、そこには"大きな"結合体が含まれ、その結合体は：i)広範に架橋していると考えられ、ii)水溶性であり、かつiii)ここで開示されるような横流れ装置などのいろいろな分析に使用した場合に高い感度を有する（標的化成分の"高い"負荷及び／又はシグナル成分の"高い"負荷によって）（後記を参照のこと）、ということを見出した。ここで記述される方法によって得られる水溶性架橋結合体の利点を以下で詳しく論ずる。
【００８１】
特定の理論に拘束されるわけではないが、反応混合物中の塩の存在が中間結合体の活性係数を増加させ、それにより中間結合体の溶解度を減少させると現在考えられている。同様に、一次標的化成分（例えば、抗体）の活性係数が増加し、それによって一次標的化成分の溶解度が減少する。すなわち、一つの仮説は、中間結合体ならびに一次標的化成分が（多分、共に析出する水と一緒に）沈澱するときに、二つの反応物は非常に近づいて化学反応が起こる確率が高まる、すなわち、一次標的化成分が架橋成分のそれまで未反応であった反応性部分と反応する確率が高まる、ということであろう。
【００８２】
しかし、正確なメカニズムは現在まだ詳しく解明されていないということを強調しておかなければならない。、原理的には、一次標的化成分の広範な架橋／付着が溶液中で起こり、その後で架橋した結合体が沈澱したのかもしれない、あるいは、反応は沈澱が起こるときに行われるのかもしれない、あるいは、反応は（上で述べたように）沈澱が起こった後で行われるのかもしれない。しかし、一次標的化成分の広範な架橋／付着が起こる実際のメカニズムに関わりなく、本発明の方法を用いたときに得られる可逆的沈殿物は−欧州特許第0 594 772 号に開示された教説と反対に−不可逆的沈殿物に見られるような性質を有する結合体になる、と結論できるということを強調しておかなければならない。
【００８３】
特定の理論に限定されるわけではないが、現在、沈澱ステップに関連して形成される架橋は、少なくともある程度、二官能基を持つ架橋成分によって構成される、すなわち、架橋成分の第一の反応性部分がキャリアー成分の第一部分にある反応性の官能基に共有結合で付着し、架橋成分の第二の反応性部分がキャリアー成分の第二部分にある反応性の官能基に共有結合で付着する、と考えられている。分かり易い例として、例えば、DVSを架橋成分として用い、デキストランをキャリアー成分としたときの架橋の形成は次のようになるであろう：
デキストラン-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O-デキストラン
【００８４】
しかし、沈澱ステップでの個々のキャリアー成分の架橋は一次標的化成分によって助けられることもあると考えられ、したがって、例えば、DVSを架橋成分として用いた場合の二つのデキストラン・キャリアー成分の間の架橋は次のような構造になることもある：
デキストラン-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-"一次標的化成分"−
-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O-デキストラン
又は
デキストラン-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-"一次標的化成分"−
-O-デキストラン
【００８５】
多分、いくつかの架橋には二つ以上の一次標的化成分が組み込まれているだろうし、その一次標的化成分は第三又は第四の架橋成分とさえ反応してキャリアー成分の二つより多く部分の間に架橋を形成するだろう。実際、一次標的化成分は、それが有する反応性の部位の数だけの架橋成分と反応することが、少なくとも原理的には、可能である。
【００８６】
架橋度は、"塩析"プロセスの際に反応に利用できる架橋成分の未反応の反応性部分の量と直接関係していると考えられる。好ましい実施形態におけるスペーサー結合（第二の水溶性中間前駆物質の形成）後に残る未反応の反応性部分の量は、50〜99％の範囲にあり、その後のシグナル成分の結合（水溶性中間結合体の形成）後は、好ましい実施形態では、未反応の反応性部分の量は変化せず、50〜99％の範囲にあり、したがって、架橋に利用できる反応性部分の量、すなわち、高度の架橋の可能性、は大である。明らかに、（二つのデキストランの間で、スペーサーあるいは一次標的を介して、一つ以上の架橋成分による）架橋が広範であるほど、結合体の分子量は大きくなる。架橋度は、また、可逆的沈澱ステップに用いる方法とも関係していることは明らかである。
【００８７】
本発明の方法における沈澱ステップa)は、pHが6〜11の範囲の、好ましくは6〜10の範囲の、例えば8〜10の範囲の、特に8〜9の範囲の、水溶液中で好適に実行される。
反応時間及び反応温度に関して言うと、これらのパラメータは、用いる反応物の濃度及び／又は性質によって変わる。しかし、本発明者は、適当な反応温度は2〜30℃の範囲にあり、例えば4〜16℃の範囲、好ましくは4〜10℃の範囲、特に4〜6℃にある、ということを見出した。
反応時間は、1から36時間の間で変わるが、通常は6から24時間の間、例えば15から21時間の間、約18時間などである。
【００８８】
本発明の興味ある実施形態では、溶液中の最初の（すなわち、沈澱が起こる前の）中間結合体と一次標的化成分とのモル比は、1：1から1：50までの範囲にあり、例えば1：1から1：25までの範囲、例えば1：1から1：10までの範囲、好ましくは1：1から1：5までの範囲、特に1：2.5から1：5までの範囲、にある。
【００８９】
好ましくは、可逆的沈澱は、反応混合物にリオトロピック塩を加えるという手段で好適に得られる塩析によって行われる。適当なリオトロピック塩の例は、例えば、リチウム、ナトリウム、カルシウム、カリウム、又はアンモニウムの硫酸塩、燐酸塩、クエン酸塩、又は酒石酸塩、又はそれらの混合物、である。その他のリオトロピック塩の例は、参照してここに組み入れられる、"Purification Tool for Monoclonal antibodies（モノクローナル抗体の精製手段）"、Gagnon, P., Validated Biosystems, 1996, に示されている。
塩析プロセスの現在好ましいとされている実施形態では、リオトロピック塩として燐酸カルシウム及び硫酸アンモニウムが特に効果的である。
【００９０】
リオトロピック塩の濃度は、可逆的沈澱プロセスで架橋結合体が確実に生ずるのに十分でなければならない。望ましい効果を実現するために必要な塩の濃度は、リオトロピック塩の陽イオンと陰イオンの両方の性質に依存する。前に述べたように、1Mまでの塩濃度は、不可逆的な沈殿物を形成するという結果になり（欧州特許第0 594 772 号）、望ましい効果を実現しなかった。しかし、1Mを超える塩濃度、例えば1.25〜3Mまでの範囲の濃度、は所望の架橋結合体を生ずる。前述のように、ある特定の可逆的沈澱のための塩濃度は、用いる塩の選択によって変わる。
【００９１】
さらに、ある特定の可逆的沈澱のための塩濃度は成分の各々の負荷と性質によって変わる。架橋成分、スペーサー成分及びシグナル成分の負荷と選択が、（選ばれたある特定の塩の）精密な塩濃度に影響する。好ましい実施形態では、リオトロピック塩の濃度は1.25〜2.75Mの範囲にあり、例えば、少なくとも1.25M、又は少なくとも1.5M、又は少なくとも1.75M、又は少なくとも2M、又は少なくとも2.25M、又は少なくとも2.5M、又は少なくとも2.75Mである。
【００９２】
リオトロピック塩(lyotropic solt)は可逆的な沈殿物が確実に形成されるに十分な濃度で存在しなければならない、すなわち、リオトロピック塩、すなわち燐酸カルシウム又は硫酸アンモニウム、の濃度は、好ましくは1.25〜2.75の範囲、好ましくは1.75〜2.50Mの範囲、にある。
【００９３】
上で説明したように、塩沈澱ステップは一次標的化成分を非常に効率的に結合させるけれども、残っている架橋成分から誘導された自由な"ぶら下がり"グループは、可逆的沈殿物を含む水溶液に低分子量の不活性化分子を加えて不活性化することができる。適当な不活性化分子種の例は、例えば、エタノルアミン、メルカプトエタノール、又はいくつかのアミノ酸、すなわち、システイン、グリシン、アラニン、又はバリンなど、である。
【００９４】
可逆的塩沈澱ステップに続いて、（可逆的に）沈澱した結合体が水性媒質、好ましくは水、に再溶解される。ここに開示された方法にしたがって得られた結合体は、室温で水などの水性媒質に良く溶け、好ましくは水に対する溶解度が、25℃の水1mlあたり乾燥結合体で少なくとも0.1mgであり、好ましくは少なくとも1mg，例えば少なくとも10mg，さらに好ましくは少なくとも50mg，例えば少なくとも100mg，特に200mg、である。
【００９５】
明らかに、そして熟練技術者にははっきりと分かるように、得られた水溶性架橋結合体は、さらに精製及び／又は単離して、例えば、凍結乾燥などの手段によって固体の形にすることができる。精製／単離プロセスは、水溶性中間前駆物質のオプションとしての精製に関連してすでに述べた方法に依っても良い。
【００９６】
沈澱ステップは、好ましくは、反応混合物にリオトロピック塩を加えることによって行われるが、一次標的化成分の架橋／付着が起こるこのステップは、塩沈澱とは別の方法によって行うこともできると考えられる。上記の塩沈澱に代わる方法の一例は、反応を凍結した水溶液中で、すなわち、約−20℃から0℃までの温度で、行うことである。このような凍結溶液中には、水の小さな"ポケット"が生じ、その中では反応物が非常に高濃度で存在し、その結果化学反応が起こる確率が高くなっている、すなわち、一次標的化成分が架橋成分のそれまで未反応の反応性部分と反応する確率が高くなっている。
【００９７】
本発明の方法で有用であると考えられる方法のさらに別の例としては、例えば、溶媒沈澱、すなわち、水性の反応混合物に水と混合できる有機溶媒を加えるもの；ポリマー沈澱、すなわち、水性の反応混合物に一種類以上の不活性ポリマーを加えるもの；いろいろな濃縮手法、例えば、蒸発、好ましくは減圧下での蒸発、等がある。上記の方法全てに共通する特徴は、反応物の接近度を高めて、一次標的化成分が架橋成分のそれまで未反応の反応性部分と反応する確率を高めているということである。
【００９８】
水溶性の架橋結合体を凍結乾燥によって精製する実施形態で、残っている架橋成分の未反応の反応性部分が（不活性化分子によって）不活性化されない場合、架橋度は凍結乾燥プロセスで高められる可能性がある。架橋結合体が形成されるメカニズムに関する上述の仮説が反応物の接近に基づいていることを考えると、凍結乾燥はある程度、塩沈澱プロセスを一つ以上の側面でシミュレートしているかもしれない。すなわち、この実施形態では、架橋度、したがって、平均分子量が精製プロセスの前と比べて増加している楕ろう。逆に、別の実施形態では、架橋成分の未反応の反応性部分が、所望により行われる精製プロセスの前に前記の方法によって不活性化される。
【００９９】
すでに述べたように、ここで開示された方法で調製される水溶性架橋結合体の重要性は、現在のところ主として、以下で詳しく述べる横流れ装置における利用に関連して見られる。したがって、本発明者は、熟練技術者が本発明の方法で調製される効果的かつ好ましい水溶性架橋結合体を選ぶことを可能にする適当な横流れ装置分析を提供した。
【０１００】
すなわち、実施例7Aは、ここに開示された方法で調製される水溶性架橋結合体の感度のテストを開示している。このテストは、正確にここで述べているように用いる場合、シグナル成分が可視染料であり、一次標的化成分が家兎抗ヒトCRPである結合体に対してしか適切でないということを注意しておかなければならない。しかし、熟練技術者なら、このテストをどのように拡張して、他のシグナル成分を、そしてもっと重要であるが、他の一次標的化成分をも包含するようにできるか、分かるであろう。
【０１０１】
当業者には認められるように、そしてここに提供される実施例から明らかになるように、ここで開示された方法は、必ずしも"唯一つのタイプ"の結合体を生み出すのではなく、ある分子量分布を有する結合体を生み出すものである。上記のテストから、得られた水溶性架橋結合体がその目的に適当と判断されるか、あるいは、さらに精製／分画が望ましいか、を評価することができる。
【０１０２】
本発明者は、本発明の非常に興味ある実施形態では、沈澱ステップa)で得られた水溶性架橋結合体がゲル濾過によってさらに精製／分画されるということを見出した。すなわち、例えば横流れ装置システムでの使用に非常に適した水溶性架橋結合体は、水性媒質に再溶解した後、例えばゲル材料Sephacryl（商標）HR S-500 又はSephacryl（商標）HR S-1000 を用いて（ここに開示された実施例に指定された条件を用いて）ゲル濾過を行ったときに間隙容積に溶出するような結合体である。
【０１０３】
前に述べたように、この水溶性架橋結合体は公知の結合体に比べて"大きい"。熟練技術者には理解されるように、そして上で述べたように、ここに開示された方法によって調製される結合体は、一様な、単一の重量の結合体を生ずるのではなく、得られる結合体はある分子量分布を持つものとなる。このような不均一な結合体の、異なる種類の平均分子量は、熟練技術者には公知であるいくつかの可能な方法を用いて決定することができる。しかし、非常に適切な方法は、例えば、超遠心分析であり、特に、光散乱法である。
【０１０４】
こうして、本発明の興味ある実施形態において、ここに開示された方法で得られる結合体の質量平均分子量は、少なくとも2×106 、少なくとも3×106 、少なくとも4×106 、少なくとも5×106 、少なくとも6×106 、少なくとも7×106 、少なくとも8×106 、少なくとも9×106 、少なくとも107 、少なくとも2×107 、少なくとも3×107 、少なくとも4×107 、少なくとも5×107 、少なくとも6×107 、少なくとも7×107 、少なくとも8×107 、少なくとも9×107 、少なくとも 108 、少なくとも2×108 、少なくとも3×108 、少なくとも4×108 、少なくとも5×108 、少なくとも6×108 、少なくとも7×108 、少なくとも8×108 、少なくとも9×108 、少なくとも109 、少なくとも2×109 、少なくとも3×109 、少なくとも4×109 、少なくとも5×109 、
【０１０５】
少なくとも6×109 、少なくとも7×109 、少なくとも8×109 、少なくとも9×109 、少なくとも1010 、少なくとも2×1010 、少なくとも3×1010 、少なくとも4×1010 、少なくとも5×1010 、少なくとも6×1010 、少なくとも7×1010 、少なくとも8×1010 、少なくとも9×1010 、少なくとも1011 、少なくとも2×1011 、少なくとも3×1011 、少なくとも4×1011 、少なくとも5×1011 、少なくとも6×1011 、少なくとも7×1011 、少なくとも8×1011 、少なくとも9×1011 、少なくとも1012 、少なくとも2×1012 、少なくとも3×1012 、少なくとも4×1012 、少なくとも5×1012 、少なくとも6×1012 、少なくとも7×1012 、少なくとも8×1012 、少なくとも9×1012 、又は、少なくとも1013 g／mol である。
【０１０６】
結合体はできるだけ大きいことが好ましいが、横流れ装置で使用される固体支持物質（例えば、ニトロセルローズ）の孔サイズよりも大きくないことが好ましい。何故なら、結合体は前記孔の中を流れることができなければならないからである。本発明の特に興味ある実施形態では、ここに開示される方法で得られる結合体は質量平均分子量が約106 〜約1010 Daの範囲にあり、好ましくは106 〜約108 Daの範囲に、例えば約106 〜約108 Daの範囲にある。
【０１０７】
質量平均分子量を用いる場合、個々の結合体はサンプルにおけるその質量比率、mi／m、に従って荷重される。すなわち、この文脈において、"質量平均分子量"という用語は下の式IIを参照して定義される：
<M>＝(1／m)ΣimiMi      (II)
ここで、<M>は質量平均分子量、mはサンプルの全質量（すなわち、結合体の全質量）、そしてmiは分子量がMiである分子（すなわち、結合体）の全質量である。
【０１０８】
ゲル濾過プロフィール（図3a−3f）は、高イオン強度で調製された結合体の分子量（3a,c,e ）が、低イオン強度で調製された結合体の分子量（3b,d,f）よりも大きいことをはっきりと示している。すなわち、本発明の重要な特徴は、本発明の方法によって調製された結合体が、欧州特許第0 594 772 号に記述された方法によって調製されたポリマーをベースとする水溶性結合体に調製されたものと顕著に異なっているということにある。本発明の方法から得られる構造的な差異（架橋の度合及び性質）も一部働いて、分子量の差及びその他の特徴と合わせて、ポリマーをベースとする水溶性結合体に関して従来記述されていないような活動作用を付与している。
【０１０９】
前に"シグナル成分"という用語の定義に関連して言及したように、ここに開示された方法は、また、何もスペーサー成分がない、すなわち、酵素あるいは染料分子などのシグナル成分が架橋成分によって直接キャリアー成分に付着している水溶性架橋結合体の調製にも適している（水溶性中間結合体の形成に代わる仕方で述べたように）。
【０１１０】
すなわち、別の態様では、本発明は、少なくとも一つのキャリアー成分部分、一種類より多くの架橋成分部分、少なくとも一つのシグナル成分部分、及び少なくとも一つの一次標的化成分部分を含み、シグナル成分は架橋成分を介して共有結合でキャリアー成分に付着している水溶性の架橋結合体を調製する方法であって：
a) 少なくとも一つのキャリアー成分部分、1より多くの架橋成分部分、及び少なくとも一つのシグナル成分部分を含んで成り、前記シグナル成分が架橋成分を介して共有結合でスペーサー成分に付着している水溶性の中間結合体を、
水溶液中で、少なくとも1つの一次標的化成分と、架橋成分に由来する未反応の反応性部分の反応を介して、可逆的沈殿物が形成される条件の下で、反応させ；
b) 水溶性架橋結合体を含む可逆的沈殿物を、水性媒体中に再溶解させ；そして
c) 所望により、水溶性架橋結合体を精製する；
ことを含む前記方法に関する。
【０１１１】
同様に、上述の水溶性架橋結合体の調製に用いられる水溶性中間結合体は：
I) 少なくとも1つの水溶性キャリアー成分を、pHが7より高い水溶液中で、1より多くの架橋成分と反応させて、架橋成分に由来する反応性部分が共有結合で付着したキャリアー成分の水溶性部分を含む水溶性中間前駆物質を含む水溶液を形成し；
II) 所望により、この水溶性中間前駆物質を精製し；
III) 所望により精製されていてもよい水溶性中間前駆物質を、前記反応性部分の反応によって、少なくとも1つのシグナル成分と、反応性部分のうち一部分だけがシグナル成分と反応する条件の下で、pHが7より高い水溶液中で反応させ、水溶性中間結合体を形成し；そして
IV) 所望により、ステップIII)で得られた水溶性中間結合体を精製する；
ことを含む方法によって調製することができる。
【０１１２】
見られるように、ステップIII)における水溶性中間結合体の形成は、前に述べた水溶性中間結合体の調製方法と異なるステップである。一般に、上記のステップIII)は、シグナル成分のスペーサー成分への付着に関して以前に述べたものと非常に類似した条件の下で行うことができる。すなわち、上に開示された方法の、水溶性中間結合体が形成されるステップIII)は、pHが7より高い水溶液中で、例えば、pHが約8〜12の範囲、好ましくは約9〜12の範囲、特に10〜12の範囲、又は11〜12の範囲の水溶液中で、好適に実行される。
【０１１３】
実際に用いられるシグナル成分によっては、水性反応混合物は0〜60％v/vの有機捕溶剤を含むことがある。すなわち、かなり疎水性のシグナル成分（例えば、ある種の染料分子）を溶解させるために、いろいろな量の、水と混合可能な有機捕溶剤、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エタノール、ジメチルホルムアミド(DMF)等を水性反応混合物に加えて、用いるシグナル成分が十分確実に溶解できるようにする必要があるかも知れない。反応は0〜60℃の範囲の温度で、例えば15〜40℃の範囲、すなわち、20〜25℃の範囲、などの温度で行えば、通常、十分である。
【０１１４】
一般に、反応時間は1乃至48時間の範囲にある。しかし、好ましくは、反応時間はできるだけ短く、すなわち、1〜24時間の範囲、特に1〜12時間の範囲、例えば1〜5時間の範囲にあることが好ましい。
特に好ましい実施形態では、ピーク分子量が500,000のデキストランを使用し、活性化度が20〜30％の架橋成分DVSを使用し、スペーサー成分BSAを使用し、シグナル成分ロダミンBイソチオシアネートを使用し、一次標的化成分ストレプトアビジン又はモノクローナル又はポリクローナル抗体のどちらかを使用するというのが、キー可逆沈澱ステップに存在する成分である。
【０１１５】
前に述べたように、ここで記述される方法の"キー・ステップ"は、一次標的化成分が中間結合体に付着させられるステップa)であり、反応は可逆的沈殿物が形成されるようなものである。通常、ここで記述される結合体を調製するのに用いられる最も高価な反応物質は、一次標的化成分（抗体や抗原など）であり、同時に、可逆的な塩沈澱ステップは結合体の調製における最も時間がかかるステップの一つである。
【０１１６】
さらに、一次標的は実際に検出しようとする標的化成分によって変わるので、本発明の非常に興味ある一つの側面は、水溶性中間結合体（好ましくは、固体の形の）を含み、可逆的な塩沈澱ステップ、その後の可逆的沈殿物の再溶解、及びそれで形成された水溶性の架橋結合体の最終的精製（例えば、ゲル濾過による）、を実行するための指示が付けられたテスト・キットに関する。このキットのいろいろな変型も、例えば、食品産業や病院などで診断／分析によく用いられる一次標的化成分のセットを含めるなども、本発明の範囲内にある。もちろん、このキットに、ここで記述される横流れ装置における調製された結合体の使用に関する指示を付けることもできる。
【０１１７】
水溶性架橋結合体複合体の形成
別の興味ある態様では、本発明は、ここで開示された方法のいずれかによって調製された結合体、リガンドおよび二次標的化成分を含んでない、前記リガンドが共有結合で二次標的化成分と結合しており、そしてリガンドが結合体の一次標的化成分と非共有結合によって結合している水溶性架橋結合体複合体を調製する方法であって：
I) ここに開示された方法に従って水溶性結合体を調製し；
II) 所望により精製されていてもよい水溶性架橋結合体を、二次標的化成分に共有結合で結合しているリガンドと、水溶液中で反応させ；
III) 反応を終止させ；
IV) 所望により、水溶性架橋結合体複合体を精製する；
ことを含む前記方法に関する。
【０１１８】
この文脈において、"二次標的化成分"という用語は、分子特に生物起源の分子であって、生物起源の物質の相補的な分子又は相補的な構造領域と、選択的に結合、又は選択的に反応することができる分子を表す。したがって、二次標的化成分は、"一次標的化成分"という用語と関連して上述したのと同じクラスの分子から選ぶことができる、すなわち、興味深い二次標的化成分の例は、例えば次のようなものである：
【０１１９】
抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成オリゴ−及びポリヌクレオチド；天然及び合成モノ−、オリゴ−及びポリサッカライド；レクチン；アビジン；ストレプトアビジン；ビオチン；成長因子；ホルモン；レセプタ分子；タンパク質A及びタンパク質G；及びそれらの混合物。本発明の特に好ましい実施形態では、二次標的化成分は抗hCGである。
【０１２０】
ここで用いる場合、"リガンド"という用語は、実際に用いられる一次標的化成分に高い親和性を有し、水溶性架橋結合体に存在する一次標的化成分とリガンドの間で熱力学的に安定な非共有結合が確立されるような分子を意味することを意図している。したがって、本発明のある好ましい実施形態では、リガンド／一次標的化成分は、結合体の一次標的化成分とリガンドの間の結合定数が少なくとも106 、好ましくは少なくとも108 、例えば、少なくとも1010 、さらに好ましくは少なくとも1011 、例えば少なくとも1012 、特に少なくとも1013 、例えば少なくとも1014 、すなわち、少なくとも1015 l／mol、であるように選ばれる。
【０１２１】
上述したように、リガンドの選択は、もちろん、実際に用いる一次標的化成分に依存する。適当なリガンドの具体的な例は、例えば、ビオチン、抗ジニトロフェノール、又は抗ジオキシゲニン、特にビオチン、である。
【０１２２】
本発明のの非常に興味ある実施形態では、用いるリガンド／一次標的化成分は、"ビオチン／ストレプトアビジン・システム"又は"ビオチン／アビジン・システム"である、すなわち、リガンドがビオチンであり、一次標的化成分がストレプトアビジン又はアビジンである。上述のように、用いられるリガンドは、二次標的化成分に共有結合で結合しなければならないので、熟練技術者にはよく分かるように、ビオチン付加した化合物、例えばビオチン付加した抗体、が容易に利用できる。
【０１２３】
それは、例えば、Kendall et al., Journal of Immunological Methods (1993), 56, 329-339, に記述されているように調製することができる。したがって、ここで開示された方法で水溶性架橋結合体を調製することによって、興味があるビオチン付加した二次標的化成分を付着させることができる有用な"テンプレート"が得られる。しかし、"ハプテン／抗体システム"も、用いる抗体と用いるハプテンの間の結合定数が上に示した条件を満たすならば、リガンド／一次標的化成分として有用である可能性があるということは理解されるであろう。
【０１２４】
上記の反応ステップII)は、通常、室温で行われ、その後、反応は、例えば、反応混合物のpHを変える、及び／又は、過剰な自由リガンド、例えばビオチン、を加えることによって終止される[ステップIII)]。
熟練技術者には理解されるように、水溶性架橋結合体複合体は、前に水溶性架橋結合体の精製に関連して述べたものと同じ方法によって精製することが出きる。それに加えて、結合体複合体は、もちろん、前に結合体に関連して述べたと同様な仕方で固体の形で単離することができるということを注意しておかなければならない。
【０１２５】
水溶性架橋結合体と水溶性架橋結合体複合体は新しいクラスの化合物なので、本発明の別の態様は、少なくとも一つのキャリアー成分部分と、一種類より多くの架橋成分部分と、少なくとも一つのスペーサー成分部分と、少なくとも一つのシグナル成分部分と、少なくとも一つの一次標的化成分部分を含み、シグナル成分はスペーサー成分に共有結合で付着し、スペーサー成分はキャリアー成分に、架橋成分を介して共有結合で付着している水溶性架橋結合体であって、
【０１２６】
シグナル成分が、染料、タンパク質（フェリチン、フィコエリトリン、フィコシアニン、及びフィコビリンなど）、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、及びウレアーゼ、など）、蛍光、ルミネッセント、燐光及びその他の発光物質；金属キレート物質（例えばイミノ二酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、及びデスフェリオキサミンB)、放射性同位元素で標識された物質、重原子で標識された物質、及びそれらの混合物から成るグループから選ばれ；そして
スペーサー成分は、タンパク質及びポリペプチドから成るグループから選ばれることを特徴とする前記水溶性架橋結合体に関する。
【０１２７】
本発明のさらに別の態様は、ここで定義された水溶性架橋結合体と、リガンドと、二次標的化成分とを含み、リガンドが共有結合で二次標的化成分と結合し、リガンドが非共有結合によって結合体の一次標的化成分と結合していることを特徴とする水溶性架橋結合体複合体に関する。
【０１２８】
理解されるように、本発明の水溶性架橋結合体ならびに水溶性架橋結合体複合体の性質及び構成分に関する詳細は、上記の方法態様に関連して述べた水溶性架橋結合体ならびに水溶性架橋結合体複合体の性質及び構成分に関する詳細と同じ、又は類似している。このことは、該当する場合はいつでも、方法態様に関連してなされた言明は、必要な変更を加えて、そのようなものとして、結合体及び結合体複合体にもあてはまるということを意味する。
【０１２９】
結合体及び結合体複合体の装置及び利用
本発明は、また、液体サンプル中の少なくとも一つの標的化成分の存在又は不在を決定する横流れ装置に関し、前記横流れ装置は：
I) 適用部、堆積部、及び検出部を有し、液体試料が適用部から堆積部を通って検出部へ流れることができるように配置された試験片；
II) 試験片の堆積部に配置する、少なくとも1つのここで定義された結合体の乾燥堆積物、又は少なくとも1つのここで定義された結合体複合体の乾燥堆積物、又はそれらの混合物；並びに
III) 液体試料中に存在する1または複数の標的化成分と選択的に結合又は選択的に反応できる少なくとも一つの標的化成分であって、試験片の検出部に固定されている前記標的化成分；
を有する。
【０１３０】
別の興味ある態様では、本発明は、液体サンプル中の少なくとも一つの標的化成分の存在又は不在を決定する方法であって：
I) ここで定義されるような横流れ装置の適用部に液体試料を加え；
II) 所望により、横流れ装置の適用部に洗浄緩衝液を加え；
III) 加えられた液体、及び該当する場合洗浄緩衝液、が適用部から堆積部を通って検出部へ流れるに十分な時間放置し；そして
IV) 検出部でシグナルの存在又は不在を決定する；
ことを含む前記方法に関する。
【０１３１】
本発明の結合体及び／又は結合体複合体は、テスト・ストリップのデポジット部に、濡れた場合はその結合体及び／又は結合体複合体は毛管力によってテスト・ストリップの検出部へ（溶解した状態で）輸送されることができるように、（ドライ・デポジットとして）支持される。
【０１３２】
テスト・ストリップの検出部に支持される標的化成分は、標的化成分が不動でとどまり、したがって、毛管力によって輸送されることができないような仕方で支持される。したがって、標的化成分は、テスト・ストリップに、例えば、吸着、共有結合、等によって支持できる。抗体や抗原などの標的化成分を、支持物質上で不動にする手段は、当業者には一般に公知である。
本発明のある実施形態では、いわゆる"サンドイッチ"法が、当業者には公知のあらゆるバリエーションで、テスト分析に用いられる。
【０１３３】
当業者には理解されるように、テスト・ストリップのいわゆる"アプリケーション"部、すなわち、検出されるべき標的化成分（すなわち、分析物）を含むサンプルで濡らされることになるテスト・ストリップの部分、はデポジット部と同一であっても良い。したがって、本発明のある興味ある実施形態では、検出されるべき標的化成分を含むサンプルが結合体及び／又は結合体複合体を含むテスト・ストリップの部分に直接適用（apply）される。
【０１３４】
テスト・ストリップは、適用されたサンプルから標的化成分を吸収できるようなものであり、濡れたとき、毛管引力による標的化成分の流れを、アプリケーション部からデポジット部を通って（その際、結合体及び／又は結合体複合体のドライ・デポジットを溶かし、それが標的化成分に結合して一緒に運ばれる）検出部まで可能にする。
【０１３５】
用いられるテスト・ストリップは、本発明の結合体及び／又は結合体複合体、ならびに抗体及び／又は抗原などの標的化成分を支持できる材料から作られる。テスト・ストリップが作られる適当な材料の例としては、例えば、グラスファイバー、セルローズ、ナイロン、架橋デキストラン、いろいろなクロマトグラフィー・ペーパー、ニトロセルローズなどのセルローズ・エステル、等がある。現在、最も好ましい材料はニトロセルローズである。
【０１３６】
"試験片"と呼ばれ、その中で同じ平面内に、標的化成分を含む液体が毛管引力によってアプリケーション部から、デポジット部を通って、検出部まで流れることができるようにいろいろな部分が配置されているのであるが、支持物質は、もちろん、いろいろな部分と流動可能性に関する必要条件が満たされている限りどんな形であっても良い。
検出されるべき標的化成分を含む液体は、たいていの場合(必ずという訳ではないが）血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル、精液サンプル、又はそれらの混合物、などの生物起源のものである。
【０１３７】
ここで記述される横流れ装置は、少量のいろいろな標的化成分、例えば、抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成オリゴ−及びポリヌクレオチド；天然及び合成モノ−、オリゴ−及びポリサッカライド；成長因子；ホルモン；レセプタ分子；及びそれらの混合物。標的化成分の具体的な例は、例えば、次のようなものである、hCG、家兎ヒトCRP、HIV、C型肝炎、クラミジア、ヘルペス、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、リステリア、サルモネラ、及びそれらの混合物。
【０１３８】
本発明のある特に好ましい実施形態では、用いられた水溶性架橋結合体及び／又は結合体複合体のシグナル成分は、肉眼で直接検出できる線量である。したがって、ここで開示される横流れ装置にこのような結合体／結合体複合体が用いられた場合、適用された液体サンプルにおける標的化成分の有無を視覚的に判定することが可能になる。しかし、本発明の別の実施形態はここで記述されるような結合体／結合体複合体を用いるものであるが、シグナル成分は、個々で開示された横流れ装置に応用したとき、検出部に反応剤を加えた後で肉眼で検出できるようになるというものである。
【０１３９】
前に述べたように、本発明の結合体は従来技術で開示された結合体に比べてかなり"大きい"。本発明による結合体の正確な構造を明らかにすることは困難かもしれないが、広範な架橋が起こっており、それが結合体のサイズ（したがって、質量平均分子量）を大きくする原因になっていると現在考えられている。この中で開示される実施例から明らかになるように、分子量が大きいほど、実施例7Aに記述されている"標準横流れ性能テスト"でテストして良い性能（すなわち、高い感度）が得られるというのが一般則であるように思われる。
【０１４０】
欧州特許公開第0 291 194 A 号で開示されている横流れ装置は、本発明の水溶性架橋結合体及び／又は結合体複合体を取り入れることができる適当な横流れ装置の一例であるということに注意してかなければならない。欧州特許公開第0 291 194 号の内容は、参照することによってここに取り込まれる。
【０１４１】
さらに別の態様では、本発明は、また、ここで定義されたような水溶性架橋結合体の、及びここで定義されたような水溶性架橋結合体複合体の、免疫化学的分析手法における利用に関する、すなわち、ELISAなどの酵素免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、比濁及び濁度免疫分析、免疫組織化学手法、細胞化学手法、フローサイトメトリー、in situハイブリダイゼーション法、膜ハイブリダイゼーション法、サザン及びノーザン・ブロッティング法、バイオセンサ、横流れ装置、又はレクチン／炭水化物相互作用に基づく方法、など。
【０１４２】
本発明は、以下に記述される実施例によってさらに詳しく説明される。
実験
実施例1：水溶性中間前駆物質の形成
実施例1A．ピークMWが500,000及び2,000,000であるデキストランのDVS活性化
同じ量のデキストラン(Pharmacia, Sweden から入手）と、異なる濃度のDVS、及び0.25mgのナトリウム・ボロハイドライド／mlを含む別々の5つの溶液（A,B,C,D,及びE）が、0.25M燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム（pH11.5）の中で調製されて次の最終濃度が得られるようにした：
【０１４３】
【表１】
0004430234.tif 000003
【０１４４】
デキストランは室温（20〜25℃）で水に溶かされた。この溶液に、同量の0.5M燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム（pH11.5）と0.25mgボロハイドライド／mlを加えた。ナトリウム・ボロハイドライドが溶解した後、反応混合物は良く換気されるフードに移され、DVS(Merck Cat. No. 821215)が加えられた。磁気攪拌機によって30分間ゆっくりと攪拌された。活性化の後、反応混合物のpHが25％(v/v)塩酸によってpH7に調整された。
5つのサンプルはすべて水に対して十分に透析され、過剰な反応剤が除去された。透析後、各溶液の体積を測定し、最終的なデキストランの濃度が計算された。
【０１４５】
遊離の反応性のビニル基の量は、大きく過剰なチオ硫酸ナトリウムと反応させ、続いて、生じた水酸化イオンを標準化された塩酸で滴定して決定された。自由ビニル基とチオ硫酸塩との反応は、次の反応図式にしたがって起こる(Porath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49)：
(基質)-O-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 + S2O32- + H2O→
(基質)-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2 -S2O3- + OH-
【０１４６】
タイトレーションの結果は（下の表を参照のこと）、デキストラン1グラムあたりのビニル基のμモル数、及び／又は、デキストラン1モルあたりのビニル基のモル数、で好適に表される。活性化されたグルコース・ユニットの平均数がデキストラン分子におけるグルコース・ユニットの総量のパーセントで計算された（ピークMWが500,000のデキストランは、平均で2,778グルコース・ユニット／デキストラン分子を有し、ピークMWが2,000,000のデキストランは、平均で11,112グルコース・ユニット／デキストラン分子を有する）：
【０１４７】
【表２】
0004430234.tif 000004
【０１４８】
実施例1B．ピークMWが500,000であるデキストランのエピクロロハイドリン活性化
同量のピークMWが500,000のデキストランを含む三つの別々の溶液（A,B,及びC）が、次の最終濃度となるように調製された：
【０１４９】
【表３】
0004430234.tif 000005
【０１５０】
デキストランは、室温（20〜25℃）で水に溶解された。この溶液に水酸化ナトリウムが加えられ、混合物は良く換気されるフードに移され、エピクロロハイドリン（Merck Cat. No. 903296）が加えられた。磁気攪拌機で5時間ゆっくりと攪拌された。活性化の後、反応混合物のpHは、25％(v/v)塩酸でpH7に調整された。
【０１５１】
3つのサンプルはすべて水に対して十分に透析され、過剰な反応剤が除去された。透析後、各溶液の体積を測定し、最終的なデキストランの濃度が計算された。
遊離の反応性のエポキシ基の量は、実施例1Aで述べたように、大きく過剰なチオ硫酸ナトリウムと反応させ、続いて、生じた水酸化イオンを標準化された塩酸で滴定して決定された。
【０１５２】
得られた結果は次の通りであった：
【表４】
0004430234.tif 000006
与えられた実施例では、DVSもEPCHも高及び低分子量のデキストランに対する活性化剤として十分に役立つことが分かる。
【０１５３】
実施例2：第二の水溶性中間前駆物質の形成
実施例2A．ピークMWが500,000及び2,000,000のDVS活性化されたデキストランへのウシ血清アルブミン(BSA)の結合
DVS−活性化されたデキストランの5つの溶液（A,B,C,D,及びE）がBSAに結合された。BSAをDVS−活性化されたデキストランに結合する手順は次の通りであった：
【０１５４】
溶液  A：60mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW500,000、実施例1Aの"溶液A"で述べたように調製された）と200mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
溶液  B：30mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW500,000、実施例1Aの"溶液A"で述べたように調製された）と200mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
【０１５５】
溶液  C：152mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW2,000,000、実施例1Aの"溶液C"で述べたように調製された）と500mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
溶液  D：152mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW2,000,000、実施例1Aの"溶液D"で述べたように調製された）と500mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
溶液  E：152mgのDVS−活性化されたデキストラン（ピークMW2,000,000、実施例1Aの"溶液E"で述べたように調製された）と500mgのBSAが燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4，に溶解された。
【０１５６】
BSAが溶けた後、緩衝液を加えて次の最終濃度になるようにした：
17mg   BSA／ml
5.2mg  DVS−活性化されたデキストラン／ml
10mM   燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4
結合は30℃で18時間行われ、その後1M塩酸を加えて溶液のpHをpH6-7に調整することによって反応をストップさせた。
【０１５７】
結合したBSAの量はSephacryl HR S-300(Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0599-01）でゲル濾過によって決定された。すべてのゲル濾過は、FPLC(Pharmacia, Sweden)によって、直径2.7cm、ベッド体積230mlのSephacryl HR S-300 によるPharmacia カラム(Cat. No.XK26/40)を用いて行われた。ゲル濾過は、100mM塩化ナトリウム中で、3ml／分の流量、最大サンプル負荷20mlで行われた。分画はUVモニター(Pharmacia, Sweden, Cat. No. 19-2448-01/18-0601-01)とペンレコーダー(Pharmacia, Sweden, Cat. No.19-8004-01)を用いてモニターされた。
【０１５８】
Sephacryl HR S-300 での分離は、二つの別々の分画で集められた二つのピークを生じた。
ゲル濾過法を用いる場合、ゲルのいわゆる"排除リミット"を超える大きな分子はポア（孔）に入ることができず、したがって、このような大きな分子は、カラムからいわゆる"空隙容積"に溶出する、すなわち、空隙容積は個々のビーズの間の容積である。通常、空隙容積はカラムの全容積の約1／3である。
OD280nmが、集められた分画の両方について測定され、得られた結果は、デキストランのピークMWに対応する平均MWのデキストラン一分子に付着したBSA分子の数として表された。得られた結果は下にまとめられている。
【０１５９】
【表５】
0004430234.tif 000007
【０１６０】
上の値は、以下に述べるようにして計算できる：
30mgのデキストラン（ピークMW500,000）と200mgBSA（すなわち、溶液中のモル比はデキストラン：BSA＝1：25である）によって行われる結合は次のように計算できる：
A＝OD280nm、1cmキュベット、Sephacryl S-300 からのピーク1；
B＝OD280nm、1cmキュベット、Sephacryl S-300 からのピーク2；
C＝ピーク1の体積（単位ml）
D＝ピーク2の体積（単位ml）
ε(BSA、280nm、1cm、1mg／ml)＝0.65；
【０１６１】
ピーク1のmgBSA ＝(A×C)／0.65＝YmgBSA；
ピーク2のmgBSA ＝(B×D)／0.65＝ZmgBSA；
結合したBSAのパーセント＝(Y×100)／(Y+Z)；
結合したBSAのモル数／1モルのデキストラン＝（比デキストラン：BSA×結合したBSAの％)／100；
デキストランに結合したBSAを含む最初のピーク（すなわち、Sephacryl HR S-300の空隙容積で得られるピーク）は以下では"Dex-BSA"結合体と呼ぶ。
【０１６２】
"Dex-BSA"結合体が、Sephacryl HR S-500(Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0613-01)で測定された。すべてのゲル濾過はFPLC(Pharmacia, Sweden)によって、ベッド体積25mlのSephacryl HR S-500によるFPLCカラム(Cat. No. HR 10/30, Pharmacia, Sweden)を用いて行われた。ゲル濾過は、100mMの塩化ナトリウム中で流量1ml／分及び最大サンプル負荷（各ランで）100-500μlで行われた。
【０１６３】
Sephacryl HR S-500 での分離によって二つの部分的に融合したピークが得られた。第一のピーク（ピーク1）は"空隙容積"における8mlの後に溶出した(25mlのSephacryl HR S-500の空隙容積は8mlである）。
Sephacryl HR S-500での測定は、プロフィールの最初のピークにある"Dex-BSA"結合体（以下で"空隙容積に溶出した結合体"と呼ぶ）のパーセントで表された。画分のサイズの計算により、画分はピークのスタートからマーク5.25（すなわち、ゲル濾過のスタートから10.5ml）まで測定された。得られた結果は次の通りであった：
【０１６４】
【表６】
0004430234.tif 000008
【０１６５】
実施例2B．ピークMWが500,000のエピクロロハイドリン-活性化されたデキストランとウシ血清アルブミン(BSA)の結合
エピクロロハイドリン活性化されたデキストランの3種の溶液（A,B,及びC）がBSA(Boehringer Mannheim Cat. No. 100 350)に結合された。BSAをDVS-活性化されたデキストランに結合する手順は次の通りであった：
溶液A：90mgのエピクロロハイドリン活性化されたデキストラン（ピークMW500,000。実施例1Bの"溶液A"で記述したように調製された）と300mgのBSAが、燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4、に溶解された。
【０１６６】
溶液B：90mgのエピクロロハイドリン活性化されたデキストラン（ピークMW500,000。実施例1Bの"溶液B"で記述したように調製された）と300mgのBSAが、燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4、に溶解された。
溶液C：90mgのエピクロロハイドリン活性化されたデキストラン（ピークMW500,000。実施例1Bの"溶液C"で記述したように調製された）と300mgのBSAが、燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4、に溶解された。
【０１６７】
BSAが溶解した後、緩衝液を加えて次の最終濃度にした：
18mg   BSA／ml
5.5mg  エピクロロハイドリン活性化されたデキストラン／ml
10mM   燐酸水素二カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、pH10.4
結合は30℃で18時間行われ、その後1M塩酸を加えて溶液のpHをpH6-7に調整することによって反応をストップさせた。
結合したBSAの量は実施例2Aで述べたようにSephacryl HR S-300 でのゲル濾過によって決定された。
【０１６８】
得られた結果は次の通りであった：
【表７】
0004430234.tif 000009
【０１６９】
次に、実施例3Aで述べるように"Dex-BSA"結合体がSephacryl HR S-500で測定された。Sephacryl での分離は二つのピークを生じたが、空隙容積画分では"Dex-BSA"結合体のピークは何も観測されなかった。
与えられた実施例から、二つの異なるタイプのデキストラン活性化が、BSAをスペーサー成分に用いて満足すべき結合収率を与えるということが導かれる。
【０１７０】
実施例3：水溶性中間結合体の形成
実施例3A．DVS活性化されたデキストラン−BSA結合体へのロダミン染料の結合
二つの異なるピークMWのデキストラン（ピークMWが、それぞれ、500,000及び2,000,000)による"Dex-BSA"の3種の溶液（A,B,及びC）が、ロダミンBイソチオシアネート(Sigma, Cat. No. R 1755, Rhodamine ITC)と結合された。
【０１７１】
溶液A：ピークMW500,000の"Dex-BSA"が17moles BSA／mole デキストランに、実施例2Aの"溶液A"に関して述べたように結合された。
溶液B：ピークMW500,000の"Dex-BSA"が17moles BSA／mole デキストランに、実施例2Aの"溶液A"に関して述べたように結合された。
溶液C：ピークMW2,000,000の"Dex-BSA"が48moles BSA／mole デキストランに、実施例2Aの"溶液C"に関して述べたように結合された。
【０１７２】
3種の別々の溶液が20mgのBSA("Dex-BSA"として）及びロダミンITC（5mgロダミンITC／mlDMSOの溶液ストックから）を緩衝液と混合して次の最終濃度にした：
溶液A：  400μgロダミンITC／mlと2mgBSA／ml
溶液B+C：200μgロダミンITC／mlと2mgBSA／ml
三つの溶液はすべて30％DMSO及び0.2M炭酸水素ナトリウムを含み、pH8.6であった。
【０１７３】
結合は、30℃で3時間行われ、その後、溶液は10mM燐酸カリウム、pH7.2，に対して十分透析されて反応剤が除去された。
透析後、各溶液の体積を測定して、ロダミンITCに結合した"Dex-BSA"（以後"Dex-BSA-ロダミン"結合体と呼ぶ）の量を計算した。すべてのサンプルについて558nmでの光学的濃度（1cmキュベット）を測定し、各サンプルについて吸光単位(EU)が計算された。得られた結果は次の通りであった：
【０１７４】
【表８】
0004430234.tif 000010
【０１７５】
上の表に見られるように、結合したロダミンITCの量はOD558EU／mgBSAで表される。この値は次のように計算される：
A＝透析後の"Dex-BSA-ロダミン"溶液の体積
B＝結合に用いられたmgBSA
結合したOD558EU／mgBSA＝(A×OD558)／B
この"Dex-BSA-ロダミン"結合体の特性がSephacryl HR S-500 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0613-01)及びSephacryl S-300 (Pharmacia, Sweden, Cat. No. 17-0599-01)で測定された。
【０１７６】
すべてのゲル濾過は、S-500ゲル濾過に関して実施例2Aで述べたように、FPLC(Pharmacia, Sweden)によって25mlSephacryl HR S-300 、又は25mlSephacryl HR S-500 というベッド体積のFPLCカラム(Cat. No. HR 10／30, Pharmacia, Sweden)で行われた。ゲル濾過は、50mMトリス0.1M塩化ナトリウム、1％v/v Tween20を1M塩酸でpH9に調製、において行われた。流量は1ml／分であり、サンプルの負荷は、濃度によるが、（各ランで）100-500μlであった。得られた結果は次の通りであった：
【０１７７】
【表９】
0004430234.tif 000011
【０１７８】
実施例3B．ローダミン染料とEPCH活性化デキストランBSA結合体とのカップリング
ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の3つの溶液（A、BおよびC）をローダミンBイソチオシアネート(Sigma、カタログ番号R1755,ローダミンITC）と結合させた。
【０１７９】
溶液A：実施例2Bの「溶液A」と同様の4モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
溶液B：実施例2Bの「溶液B」と同様の5モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
溶液C：実施例2Bの「溶液C」と同様の6モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
【０１８０】
6mgのBSA(「Dex-BSA」として）およびローダミンITC(5 mgのローダミンITC／1mlのDMSOのストック溶液から）を含有する3つの別々の溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
200μgのローダミンITC／ml
0.5 mgのBSA／ml
30％のジメチルスルホキシド
0.2Mの炭酸水素ナトリウム、pH8.6
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。
透析後、558 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１８１】
【表１０】
0004430234.tif 000012
【０１８２】
Dex-BSA-ローダミン複合体を、実施例4Aで記載するように、セファクリルHR S-500およびセファクリルS-300に関して特性化した。唯一の差は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％v/vトゥイーン-20を含有する溶離剤であった。得られた結果を以下に示す：
【０１８３】
【表１１】
0004430234.tif 000013
【０１８４】
実施例3C．Cy5染料とDVS活性化デキストランBSA結合体とのカップリング
ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の2つの溶液（AおよびB）をCy5-OSuモノ機能性反応染料(Amersham Pharmacia Biotec UK、カタログ番号PA 15102)と結合させた。
溶液AおよびB：実施例2Aの「溶液A」と同様の17モルBSA／1モルデキストランと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA」。
BSA(「Dex-BSA」として）およびCy5（8 mgのC強い／1 mlのDMSOのストック溶液から）を含有する2つの別々の溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
【０１８５】
溶液A：2 mgのBSA／ml、4000μgのCy5／ml、50％DMSO、0.05 Mの炭酸水素ナトリウム、pH8.6。
溶液B：1 mgのBSA／ml、4000μgのCy5／ml、50％DMSO、0.05 Mの炭酸水素ナトリウム、pH8.6。
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。唯一の差は反応時間を2時間に低減したことであった。
透析後、655 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１８６】
【表１２】
0004430234.tif 000014
【０１８７】
実施例3D．反応オレンジ染料とDVS活性化デキストランBSA結合体とのカップリング
実施例2Aの「溶液A」と同様の17モルのBSA／1モルのデキストランと結合した、ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の溶液を、反応オレンジ16(Aldrich、カタログ番号30.650-9)と結合させた。
【０１８８】
10 mgのBSA(「Dex-BSA」として）および反応オレンジ16（5 mgの反応オレンジ16／1 mlのDMSOのストック溶液から）を含有する溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
5 mgのBSA／ml
250μgの反応オレンジ16／ml
5 ％DMSO
0.4 Mのリン酸カリウム、pH10.4
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。唯一の差は、反応時間を18時間に増大したことであった。
透析後、493 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１８９】
【表１３】
0004430234.tif 000015
【０１９０】
「Dex-BSA-反応オレンジ16」複合体を、実施例3Aと同様に、セファクリルHR S-500およびセファクリルHR S-300に関して特性化した。唯一の差は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％v/vトゥイーン-20を含有する溶離剤であった。得られた結果を以下に示す：
【０１９１】
【表１４】
0004430234.tif 000016
【０１９２】
実施例3E．ユニブルーA染料とDVS活性化デキストランBSA結合体とのカップリング
実施例2Aの「溶液A」と同様の17モルのBSA／1モルのデキストランと結合した、ピーク分子量500,000の「Dex-BSA」の溶液を、ユニブルーA(Sigme、カタログ番号29.840-9)と結合させた。
【０１９３】
10 mgのBSA(「Dex-BSA」として）およびユニブルーA（5 mgのユニブルーA／1 mlのDMSOのストック溶液から）を含有する溶液を緩衝液と混合して、以下の最終濃度を得た：
5 mgのBSA／ml
500μgのユニブルーA／ml
10 ％DMSO
0.4 Mのリン酸カリウム、pH10.4
実施例3Aと同様に、カップリングおよびその後の透析を実施した。
透析後、595 nm(1 cmキュベット）での光学密度を全試料に関して測定し、吸光単位(EU)を各試料に関して算出した。得られた結果を以下に示す：
【０１９４】
【表１５】
0004430234.tif 000017
【０１９５】
「Dex-BSA-ユニブルーA」複合体を、実施例3Aと同様に、セファクリルHR S-500およびセファクリルHR S-300に関して特性化した。唯一の差は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％v/vトゥイーン-20を含有する溶離剤であった。得られた結果を以下に示す：
【表１６】
0004430234.tif 000018
【０１９６】
所定の実施例から、DVSまたはEPCHで活性化されていたDex-BSA中間体に効率的に結合された多数の異なる染料が得られる。
【０１９７】
実施例4：水溶性中間複合体の生成
実施例4A．高イオン強度でのウサギ抗ヒトCRPとDVS活性化「Dex-BSA-ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」複合体の5つの溶液（A、B、C、DおよびE）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画（DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
溶液AおよびD：実施例3Aの「溶液A」と同様の29 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
溶液B、CおよびE：実施例3Aの「溶液B」と同様の13 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
【０１９８】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液AおよびB：0.0016μmolの抗体および0.000645μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
1.75 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.24 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5
【０１９９】
溶液C：0.007742μmolの抗体および0.001548μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.21 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／5
【０２００】
溶液D：0.003226μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.13 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5
【０２０１】
溶液E：0.0016μmolの抗体および0.000645μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.15 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5
【０２０２】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液C、DおよびE中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。5つの溶液すべてを10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有する沈殿物（ペレット）を脱イオン水中に溶解した。
【０２０３】
溶液AおよびBからのペレットを400μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を1％v/vとした。
溶液Cからのペレットを700μlの脱イオン水中に溶解した後、1 M塩酸を用いてpH7.2に調整した50 mMトリスおよび0.1 M塩化ナトリウムに対して1時間透析した。透析後、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％v/vとした。
溶液DおよびCからのペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％v/vとした。
【０２０４】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ローダミン」-結合抗体を、セファクリルHR S-300(Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0599-01)上でのゲル濾過により分離した。ゲル濾過はすべて、直径1 cmおよび床容積25 mlセファクリルHR S-300のPharmaciaカラム（カタログ番号HR 10/30）を用いて、FPLC(Pharmacia, Sweden）上で実施した。1 M塩酸でpH9に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、1％v/vトゥイーン20中で、溶液AおよびBのゲル濾過を実施した。溶液C、DおよびEのゲル濾過は、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、トゥイーン20中で実施した（溶液CおよびDのトゥイーン20の濃度：0.5％v/v。溶液Eのトゥイーン20の濃度：0.1％v/v)。ゲル濾過はすべて、1 ml／分の流量で実施した。
【０２０５】
セファクリルHR S-300上での分離は、2つのピークを生じた。「Dex-BSA-ローダミンITC」に結合したウサギ抗ヒトCRPを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後、「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体と呼ぶ。
「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体（「溶液B」から得られる）を、8〜10.5 mlから（図1に示したプロフィールでのマーク4〜5.25から）の一分画として収集した。
【０２０６】
「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体に関してOD558を測定し、次に、複合体をセファクリルHR S-500( Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0613-01）上で特性化した。ゲル濾過はすべて、25 mlセファクリルHR S-500の床容積を有するFPLCカラム（カタログ番号HR 10-30、Pharmacia, Sweden)を用いるFPLC(Pharmacia, Sweden)により実施した。1 M塩酸でpH9に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、1％v/vトゥイーン20中で、溶液AおよびBのゲル濾過を実施した。溶液CおよびEは、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、トゥイーン20中でゲル濾過を実施した（溶液Cのトゥイーン20の濃度：0.5％v/v。溶液Eのトゥイーン20の濃度：0.1％v/v）。ゲル濾過はすべて、1 ml／分の流量で実施した。
【０２０７】
セファクリルHR S-500上での分離（「溶液B」）は、図2に示したように7 ml後に溶離される一主ピークを生じた。しかしながら、溶液Cからの複合体のゲル濾過により、2つのピークを収集した。分画1は7〜10.5 mlから収集し、分画2は10.5〜18 mlから収集した。
セファクリルHR S-500上での特性化を、プロフィールの最初のピークに位置する「Dex-BSA-ローダミン／a-CRP」複合体の％で表し、以後、「空隙容量中の溶離複合体」と呼ぶ。分画のサイズは、ピーク1の開始から、ゲル濾過の開始から10.5 mlまでであった。得られた結果を以下に示す：
【０２０８】
【表１７】
0004430234.tif 000019
【０２０９】
実施例4B．高イオン強度でのウサギ抗ヒトCRPとEPCH活性化「Dex-BSA-ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」結合体の溶液を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画(DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
実施例3Bの「溶液C」と同様の25 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
【０２１０】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
0.003226μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.1 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5
【０２１１】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％w/vとした。
【０２１２】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ローダミン」-結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２１３】
【表１８】
0004430234.tif 000020
【０２１４】
実施例4C．高イオン強度での抗hCGモノクローナル抗体とDVS活性化「Dex-BSA-ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」複合体の溶液を、抗hCGモノクローナル抗体Mab(Genzyme MIH、バッチ番号M21452）と結合させた。
実施例3Aの「溶液A」と同様の29 OD 558単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
【０２１５】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
0.0016μmolの抗体および0.00064μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.06 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／2.5
【０２１６】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％w/vとした。
【０２１７】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ローダミン」-結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２１８】
【表１９】
0004430234.tif 000021
【０２１９】
実施例4D．高イオン強度でのウサギ抗ヒトCRPとDVSH活性化「Dex-BSA-反応オレンジ16」結合体のカップリング
「Dex-BSA-反応オレンジ16」複合体の溶液を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画（DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
実施例3Dと同様の1.4 OD 493単位／1mgのBSAと結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-反応オレンジ16」。
【０２２０】
抗体および「Dex-BSA-反応オレンジ16」を含有する以下の溶液を調製した：
0.00323μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-反応オレンジ16」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.23 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-反応オレンジ16」／抗体：1／2.5
【０２２１】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.5％w/vとした。
【０２２２】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-反応オレンジ16」-結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２２３】
【表２０】
0004430234.tif 000022
【０２２４】
実施例4E．高イオン強度でのウサギ抗ヒトCRPとDVS活性化「Dex-BSA-ユニブルーA」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ユニブルーA」結合体の2つの溶液（AおよびB）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画(DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
実施例3Eと同様に3OD595単位／1 mgのBSAに結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ユニブルーA」。
【０２２５】
抗体および「Dex-BSA-ユニブルーA」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液A：0.0015μmolの抗体および0.0015μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ユニブルーA」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.09 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ユニブルーA」／抗体：1／1
【０２２６】
溶液B：0.0030μmolの抗体および0.0015μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ユニブルーA」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.2 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ユニブルーA」／抗体：1／2
【０２２７】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、抗体のカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。両溶液を10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有するペレットを500μlの脱イオン水中に溶解し、トゥイーン20を付加して、最終濃度を5％w/vとした。
【０２２８】
試料中の遊離抗体および「Dex-BSA-ユニブルーA」−結合抗体を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％トゥイーン20中のセファクリルHR S-300上でのゲル濾過により分離し、セファクリルHR S-300からのピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500上で特性化した。セファクリルHR S-500上でのその後の分離（実施例4Aと同様）は、2つの重複ピークを生じた。最初のピークであるピーク1を、7 ml後に溶離した。得られた結果を以下に示す：
【０２２９】
【表２１】
0004430234.tif 000023
【０２３０】
実施例4F．高および低イオン強度でのウサギ抗ヒトCRPとDVS活性化「Dex-BSA-ローダミン」結合体のカップリングの比較
「Dex-BSA-ローダミン」結合体の2つの溶液（AおよびB）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン分画(DAKO, Denmark、カタログ番号Q 0329）と結合させた。
【０２３１】
溶液AおよびB：実施例3Aの「溶液B」と同様に13OD558単位／1 mgのBSAに結合させたピーク分子量500,000の「Dex-BSA-ローダミン」。
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液A：0.01548μmolの抗体および0.003097μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.21 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ユニブルーA」／抗体：1／5
【０２３２】
溶液B：0.00645μmolの抗体および0.00129μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.8、および水と混合して、以下の最終濃度を得た：
0.1 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH8.6
0.54 mgの抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／抗体：1／5
【０２３３】
混合後、沈殿物が溶液A中に観察された。両カップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、溶液A中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。次に溶液Aを10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離抗体および結合抗体を含有する沈殿物（ペレット）を1 mlの脱イオン水中に溶解した。再溶解沈殿物（溶液Aから得られる）および溶液B（沈澱を伴わない透明液）を、1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウムに対して、1時間透析した。
【０２３４】
ゲル濾過による特性化：
セファクリルHR S-300上でのゲル濾過から得られたピーク1を、実施例4Aと同様に、セファクリルHR S-500およびセファクリルHR S-1000上で特性化した。
セファクリルHR S-300、HR S-500およびHR S-1000上でのゲル濾過から得られたプロフィールを、図3a〜3fに示す。
【０２３５】
実施例4G．高イオン強度でのストレプタビジンのDVS活性化「Dex-BSA-ローダミン」結合体のカップリング
「Dex-BSA-ローダミン」結合体の5つの溶液（A、B、C、DおよびE）を、ストレプタビジン（KEM-EN-TEC, Denmark、カタログ番号4610H）と結合させた。実施例3Bの「溶液A」と同様の25 OD 558単位／1mgのBSAと結合させた全試料。
【０２３６】
抗体および「Dex-BSA-ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：
溶液A：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.004165μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.05 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／2
【０２３７】
溶液B：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.001667μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.11 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／5
【０２３８】
溶液C：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.000833μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.22 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／10
【０２３９】
溶液D：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.0004165μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.42 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／20
【０２４０】
溶液E：0.00833μmolのストレプタビジンおよび0.000208μmolのデキストラン(「Dex-BSA-ローダミン」として）を、3.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.5 Mのリン酸カリウム緩衝液、pH9
0.71 mgのストレプタビジン／ml
溶液中のモル比：「Dex-BSA-ローダミン」／ストレプタビジン：1／40
【０２４１】
混合後、沈殿物が溶液中に観察され、ストレプタビジンのカップリングを4〜6℃で18時間継続させた。カップリング後、システイン（Merck、カタログ番号1.02838）を試料に付加して、最終濃度を0.01 Mシステインとした。溶液への脱イオン水の付加により、全溶液中のリン酸塩緩衝液の濃度を1.75 Mに調整した。5つの溶液すべてを10,000 rpmで5分間回転させて、透明でほとんど無色の上清を、ピペットで注意深く吸引した。遊離ストレプタビジンおよび結合ストレプタビジンを含有する沈殿物（ペレット）を脱イオン水中に溶解した。
【０２４２】
全溶液からのペレットを1 mlの脱イオン水中に溶解した。1 M塩酸でpH7.2に調整した0.1 M塩化ナトリウムおよび50 mMトリスに対して1時間透析した。透析後、トゥイーン20を付加して、最終濃度を0.1％v/vとし、溶液を1,000 rpmで5分間回転させて、上清（試料）を注意深くピペットで吸引したが、一方、残りの複合体（ペレット）は用いなかった。
【０２４３】
試料中の遊離ストレプタビジンおよび「Dex-BSA-ローダミン」-結合ストレプタビジンを、セファクリルHR S-300(Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0599-01）上でのゲル濾過により分離した。ゲル濾過はすべて、直径1 cmおよび床容積25 mlのセファクリルHR S-300のPharmaciaカラム（カタログ番号HR 10/30）を用いて、FPLC(Pharmacia, Sweden)上で実施した。1 M塩酸でpH7.2に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、0.1％v/vトゥイーン20中で、1 ml／分の流量を用いて、全ゲル濾過を実施した。
【０２４４】
セファクリルHR S-300上での分離は、2つのピークを生じた。「Dex-BSA-ローダミンITC」に結合したストレプタビジンを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後、「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体と呼ぶ。
「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体を、8〜10.5 ml後の一分画として収集した。
【０２４５】
「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体に関してOD558を測定し、次に、複合体をセファクリルHR S-500（ Pharmacia, Sweden、カタログ番号17-0613-01）上で特性化した。ゲル濾過はすべて、25 mlセファクリルHR S-500の床容積を有するFPLCカラム（カタログ番号HR 10-30、Pharmacia, Sweden)を用いるFPLC(Pharmacia, Sweden)により実施した。1 M塩酸でpH9に調整した50 mMトリス、0.1 M塩化ナトリウム、1％v/vトゥイーン20中で、1 ml／分の流速を用いて、全溶液のゲル濾過を実施した。
【０２４６】
セファクリルHR S-500上での分離は、7 ml後に溶離される一主ピークを生じた。
セファクリルHR S-500上での特性化を、プロフィールの最初のピークに位置する「Dex-BSA-ローダミン／ストレプタビジン」複合体の％で表し、以後、「空隙容量中の溶離複合体」と呼ぶ。得られた結果を以下に示す：
【０２４７】
【表２２】
0004430234.tif 000024
【０２４８】
所定の実施例から、抗体または特異的結合分子である多数の異なる主要標的構成成分を、好ましくは高イオン強度で、スペーサー仔構成成分および染料を保有する活性化デキストランに結合させ得る、と推論される。
【０２４９】
実施例5：水溶性複合体の生成の代替法
実施例5A．染料とピーク分子量2,000,000を有するDVS活性化デキストランとのカップリング
デキストラン（ピーク分子量2,000,000)を、実施例1Aの「溶液C」と同様に（即ち、1％(w/v)のデキストランおよび3％(v/v)のDVSを用いて）、DVSで活性化した。活性化デキストランは、1 gのデキストラン当たり554μmolの反応ビニル基という含量を有した。DVS活性化デキストランの最終濃度は、8.3 mg活性化デキストラン／mlであった。
【０２５０】
同一濃度のDVS活性化デキストランを含有する4つの別々の世液（A、B、CおよびD)を調製した。リン酸水素二カリウム／水酸化ナトリウムの最終濃度が0.25 Mで、塩化ナトリウムの最終濃度が0.50 Mで、溶液のpHが11.5となるように、緩衝液を付加した。
0.45μmフィルターを通して濾過後に、染料（レマゾール-ブラックBグラン、DE HA 725, Hoechst)の濃縮液を付加した。DVS活性化デキストランおよび染料の最終濃度を以下に示す：
【０２５１】
【表２３】
0004430234.tif 000025
【０２５２】
溶液A、B、CおよびDを、室温（20〜25℃）で3時間インキュベートした。カップリング後、反応混合物のpHを、1 M塩酸でpH8に調整した。全試料を、50 mM塩化ナトリウムに対して十分に透析して、未結合染料を除去した。透析後、各溶液の容量を測定し、デキストランの最終濃度を算出した。
透析後、各試料をOD 600 nm（1 cmキュベット）で測定し、結合されたOD 600単位／1 mgデキストランの数値により特性化した。カップリング反応の結果を以下に列挙する：
【０２５３】
【表２４】
0004430234.tif 000026
【０２５４】
結合OD 600単位／1 mgデキストランの数値を、次式により算出した：
(AxB)／C＝結合OD 600単位／1mgデキストラン
（式中、Aは透析終結後に測定した場合のOD 600であり、Bは透析終結後に得られた溶液の容量であり、そしてCは実験に用いたDVS活性化デキストランの量(mg)である）。
【０２５５】
実施例5B．染料とピーク分子量2,000,000を有するDVS活性化デキストランとのカップリング
デキストラン（ピーク分子量2,000,000）を、実施例1Aの「溶液C」と同様に（即ち、1％(w/v)のデキストランおよび3％(v/v)のDVSを用いて）、DVSで活性化した。活性化デキストランは、1 gのデキストラン当たり554μmolの反応ビニル基という含量を有した。DVS活性化デキストランの最終濃度は、8.3 mg活性化デキストラン／mlであった。
【０２５６】
同一濃度のDVS活性化デキストランを含有する2つの別々の世液（AおよびB）を調製した。リン酸水素二カリウム／水酸化ナトリウムの最終濃度が0.25 Mで、塩化ナトリウムの最終濃度が0.50 Mで、溶液のpHが11.5となるように、緩衝液を付加した。
【０２５７】
0.45μmフィルターを通して濾過後に、染料（レマゾール-ブリリアントレッドF3B、DE BE 305, Hoechst）の濃縮液を付加した。DVS活性化デキストランおよび染料の最終濃度を以下に示す：
【０２５８】
【表２５】
0004430234.tif 000027
【０２５９】
溶液AおよびBを、室温（20〜25℃）で4時間インキュベートした。カップリング後、反応混合物のpHを、1 M塩酸でpH7に調整した。全試料を、50 mM塩化ナトリウムに対して十分に透析して、未結合染料を除去した。透析後、各溶液の容量を測定し、デキストランの最終濃度を算出した。
透析後、各試料をOD 530 nm（1 cmキュベット）で測定し、結合されたOD 530単位／1 mgデキストランの数値により特性化した。カップリング反応の結果を以下に列挙する：
【０２６０】
【表２６】
0004430234.tif 000028
結合OD 530単位／1 mgデキストランの数値を、実施例5Aと同様に算出した：
所定の実施例から、2つの異なる染料（黒または赤）は、ほぼ同量のODと結合した、と推論し得る。
【０２６１】
実施例6：水溶性架橋結合体の形成の代替法
実施例6A．高イオン強度でのDVS-活性化「Dex-Remazol Black」結合体へのウサギ抗ヒトCRPの結合
「Dex-Remazol Black」結合体の5つの溶液（A、B、C、DおよびE）を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン画分（ダコ(DAKO)、デンマーク、カタログ番号Q0329）と結合させた。
【０２６２】
溶液AおよびE：実施例5A中の「溶液A」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した11OD600単位／mgデキストラン
溶液B：実施例5A中の「溶液B」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した8OD600単位／mgデキストラン
溶液C：実施例5A中の「溶液C」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した4OD600単位／mgデキストラン
溶液D：実施例5A中の「溶液D」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Black」が結合した2OD600単位／mgデキストラン
【０２６３】
溶液A、B、C、およびD：0.003226μmol抗体と0.000645μmolデキストラン(「Dex-Remazol Black」として）を、3.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.8)と混合して、以下の最終濃度を得た：
1.75Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.6
0.6mg抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-Remazol Black」／抗体：1／5
【０２６４】
溶液E：0.000645μmol抗体と0.00129μmolデキストラン(「Dex-Remazol Black」として）を、3.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.8)と混合して、以下の最終濃度を得た：
2.2Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.6
0.22mg抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-Remazol Black」／抗体：1／5
【０２６５】
混合後、溶液中に沈殿物が観察され、抗体の結合を4〜6℃で18時間続けた。結合後、システイン（メルク(Merck)、カタログ番号1.02838）を、最終濃度0.01Mシステインになるように試料に加えた。溶液A、B、C、およびDを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH9)に対して、1時間透析した。透析後、ツイーン20を、最終濃度0.5％v/vになるように加えた。
溶液E中のリン酸緩衝液の濃度を、溶液に脱イオン水を加えて1.75Mに調整した。結合体を10,000rpmで5分遠心分離し、上清をピペットで注意深く吸引した。沈殿物（ペレット）を1mlの脱イオン水に溶解し、ツイーン20を、最終濃度0.5％v/vになるように加えた。
【０２６６】
試料中の遊離抗体と「Dex-Remazol Black」結合抗体を、セファクリルHR S-300（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン、カタログ番号17-0599-01）でゲルろ過して分離した。すべてのゲルろ過は、直径1cmでベッド容量25mlのセファクリルHR S-300を有するファルマシア(Pharmacia)カラム（カタログ番号HR 10/30)を使用して、FPLC（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）で行った。溶液A、B、C、およびDについて、ゲルろ過は、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH9)、0.5％v/vツイーン20で行った。溶液Eは、50mMトリス、0.1M塩化ナトリウム、0.5％ツイーン（1M塩酸でpH7.2に調整した）中でゲルろ過した。すべてのゲルろ過は、流速1ml／分で行った。
【０２６７】
セファクリルHR S-300での分離により、2つのピークが得られた。「Dex-Remazol Black」に結合したウサギ抗ヒトHRPを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体と呼ぶ。
【０２６８】
「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体を、8mlから1つの画分として採取した。「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体についてOD600を測定し、次に溶液A、B、C、およびDからの結合体を、セファクリルHR S-500（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン、カタログ番号17-0613-01）で性状解析した。すべてのゲルろ過は、ベッド容量25ml セファクリルHR S-500を有するFPLCカラム（カタログ番号HR10/30、ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）を使用して、FPLC（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）で行った。ゲルろ過は、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH9)、0.5％v/vツイーン20中で、流速1ml／分で行った。
【０２６９】
セファクリルHR S-500での分離により、2つの重複ピークが得られた。最初のピーク（ピーク1）を7ml後に溶出した。
セファクリルHR S-500による性状解析は、プロフィールの第1のピーク中に位置する「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体のパーセント（以後、「ボイド容量で溶出した結合体」）として表した。結果は以下の通りである：
【０２７０】
【表２７】
0004430234.tif 000029
【０２７１】
実施例6B．高イオン強度でのDVS-活性化「Dex-Remazol Brillant Red」結合体へのウサギ抗ヒトCRPの結合
「Dex-Remazol Brillant Red」結合体の溶液を、ウサギ抗ヒトCRP免疫グロブリン画分（ダコ(DAKO)、デンマーク、カタログ番号Q0329）と結合させた。
実施例5B中の「溶液A」について説明したように、最大分子量2,000,000の「Dex-Remazol Brillant Red」が結合した7OD530単位／mgデキストラン。
【０２７２】
抗体と「Dex-Remazol Brillant Red」を含有する以下の溶液を調製した：
0.000645μmol抗体と0.00129μmolデキストラン(「Dex-Remazol Brillant Red」として）を、3.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.8)と混合して、以下の最終濃度を得た：
1.75Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.6
0.57mg抗体／ml
溶液中のモル比：「Dex-Remazol Brillant Red」／抗体：1／5
【０２７３】
混合後、溶液中に沈殿物が観察され、抗体の結合を4〜6℃
で18時間続けた。結合後、システイン（メルク(Merck)、カタログ番号1.02838）を、最終濃度0.01Mシステインになるように試料に加えた。結合体を、0.1M塩化ナトリウム、50mMトリス（1M塩酸でpH9に調整した）に対して、1時間透析した。透析後、ツイーン20を最終濃度1％v/vになるように加えた。
試料中の遊離の抗体と「Dex-Remazol Brillant Red」結合抗体を、セファクリルHR S-300で、50mMトリス、0.1M塩化ナトリウム、1％ツイーン20（1M塩酸でpH9に調整した）でゲルろ過して分離した。流速は1ml／分であった。
【０２７４】
セファクリルHR S-300での分離により、2つのピークが得られた。「Dex-Remazol Brillant Red」に結合したウサギ抗ヒトHRPを含有するセファクリルHR S-300からのピーク1を、以後「Dex-Remazol Brillant Red/a-CRP」結合体と呼ぶ。Dex-Remazol Brillant Red結合体は、8mlから1つの画分として採取し、OD530を測定した：
セファクリルHR S-300でゲルろ過後に得られたピーク1のOD558
1.67
上記実施例から、1次標的化成分は、2つの色素を有するDVS活性化デキストランに結合することができることがわかる。
【０２７５】
実施例7：架橋結合体と架橋結合体複合体の装置と使用
実施例7A．「標準的横流れ性能試験」
以下の「標準的横流れ性能試験」は、再現性のある標準条件と市販の抗原のセットを使用して、着色結合体を試験する目的で計画する。
【０２７６】
材料：
ニトロセルロースペーパー：ミリポア(Millipore)SRHF、25×300mm、カタログ番号SRHF02020
グラスファーバーペーパー：結合剤を有するワットマングラスファーバーペーパー、20×300mm、カタログ番号9699-9432
吸収性パッド：ワットマン、20×300mm、セルロースペーパー、3mm、カタログ番号3030-9433
プラスチック裏張り：0.01白。アドヒーシブズリサーチ社(Adhesives Research Inc.)、P.O. Box 100, Glen Rock, Pennsylvania, 17327, USA
【０２７７】
抗原：ヒト血清交差反応性タンパク質(CRP) ダコ(DAKO)ヒト血清カリブレーター、カタログ番号X0925
抗体：ウサギ抗ヒトCRP、ダコ(DAKO)、カタログ番号Q0329
コーティング緩衝液：0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)
抗原緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)
ブロッキング緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)
【０２７８】
洗浄緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)
結合体緩衝液：50mmトリス／HCl+0.1M NaCl+0.5％ツイーン20(pH8.6)
結合体I：本特許に従って調製した1.49 OD558の「Dex-BSA-Rhodamine／aCRP」結合体：実施例4Aと同様に調製した
結合体II：WO93／01498に従って調製した1.74 OD558の「Dex-BSA-Rhodamine／aCRP」結合体
【０２７９】
方法：
横流れ試験ストリップの調製：
乾燥ニトロセルロースペーパーを、ストリップ（幅6mm、長さ6mm）に切断し、プラスチック裏張り（幅5mm、長さ6mm）にのせた。グラスファイーバーパッド（幅5mm、長さ20mm）を、ニトロセルロースストリップの一端にのせた。吸収性パッド（幅5mm、長さ20mm）を、ニトロセルロースストリップの他端にのせた。
【０２８０】
抗体溶液の調製：
ウサギ抗ヒトCRPを最終濃度0.125mg免疫グロブリン／mlコーティング緩衝液に希釈する。
抗原溶液の調製：
DAKOヒト血清カリブレーターを抗原緩衝液で希釈して、以下の抗原溶液を調製する（カリブレーター中のCRPの特定の濃度で血清カリブレーターを希釈する）：
A：250 ng CRP/ml
B：125 ng CRP/ml
C：63 ng CRP/ml
D：31 ng CRP/ml
E：16 ng CRP/ml
F：8 ng CRP/ml
G：0 ng CRP/ml
【０２８１】
結合体溶液の調製：
試験すべき結合体IとIIの希釈物を結合体緩衝液で調製する：
結合体：「Dex-BSA-Rhodamine/a-cCRP」結合体（実施例4Aの溶液Dから）「Dex-BSA-Black/a-cCRP」結合体（実施例6Aの溶液Eから）
希釈：吸収スペクトルの可視領域（すなわち、約450nm〜約650nmの範囲内）で1cmの光路を使用して、結合体の実際の吸収極大で測定した時、0.7の吸収を有する最終濃度に、結合体を希釈する。
【０２８２】
試験の実施：
1）A1、B1、C1、D1、E1、F1およびG1と名付けた7つの横向き流れ試験ストリップのそれぞれに、横向き流れ試験ストリップの中央のスポットとして、3μlのウサギ抗ヒトCRP（0.125mg免疫グロブリン／ml）を添加する。
2）各ストリップ上のグラスファイバーパッドの上端に25μlのブロッキング緩衝液を添加して、試験ストリップの残存するタンパク質結合能をブロックする。
3）緩衝液が毛細管流により、試験ストリップの他端の吸収性パッドに達するまで、約10分待つ。
【０２８３】
4）グラスファイバーパッドの上端で、各試験ストリップに25μlの抗原溶液を添加する。A1の試験ストリップには抗原溶液A（250ng CRP/ml）を添加し、B1の試験ストリップには抗原溶液Bを添加するなど、陰性対照である抗原溶液Gを添加したG1の試験ストリップまで行う。抗原溶液は、グラスファイバーパッドから「こぼれる」のを避けるために、徐々に加える。
5）抗原溶液が、試験ストリップの他端の吸収性パッドに流れるまで、10分待つ。
6）各試験ストリップのグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を添加する。10分待ち、各試験ストリップのグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を再度添加する。
【０２８４】
7）30分待つ。
8）各試験ストリップ上のグラスファイバーパッドの下端に50μlの結合体I希釈物を加える。
9）10分待つ。
10）各試験ストリップ上のグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を添加する。10分待ち、各試験ストリップのグラスファイバーパッドの下端に25μlの洗浄緩衝液を再度添加する。
【０２８５】
A2、B2、C2、D2、E2およびF2と名付けた新しいセットの横向き流れ試験ストリップを用いて、工程1を繰り返し、G2は、工程8の結合体II希釈物を使用して、工程2〜10を行う。
試験結果の評価：
試験ストリップ上に現れるスポットの色強度を、スコアリング試験により評価する。以下の数を使用して、現れるスポットの強度を解析する：
5：非常に強く着色したスポット
4：中程度に着色したスポット
3：弱く着色したスポット
2：スポットがかすかに見える
1：スポットは検出できない
【０２８６】
スポット試験の読み値：
【表２８】
0004430234.tif 000030
【０２８７】
実施例7B．異なる「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体による標準的横流れ性能試験
異なる「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体を、標準的横流れ性能試験で試験した。すべての試験は、実施例7Aに記載したように行った。
試験中の抗原濃度(CRP)と「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体濃度は、試験毎に異なり、従って各試験について別々に記載する。
すべての試験で抗体は、各スポットについて0.1mg抗体／mlと1μlの濃度でニトロセルロースストリップ上にスポットした。
【０２８８】
試験番号1
実施例4A、溶液Cからの「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体を用いて、横向き流れ性能試験を行った。
横向き流れ性能試験は、以下の結合体画分を使用して行った：
I：セファクリルロースHR S-300からのピーク1 濃度：OD558＝0.1
II：セファクリルロースHR S-500からのピーク1 濃度：OD558＝0.1
III：セファクリルロースHR S-500からのピーク2 濃度：OD558＝0.1
【０２８９】
試験ストリップ上に現れるスポットの色強度を、AGFAのフラットベッドスキャナーARUSIIを使用して、以下の設定条件で測定した：
原稿：反射性
モード：グレイスケール
入力：240 dpi
スケール：100％
範囲：ヒストグラム 最少＝130、最大＝254
トーン曲線：無し
シャープネス：無し
デスクリーン：無し
サイズ：A4ポートレイート
【０２９０】
強度単位で与えられた結果の計算のために、ウインドウズ用のソフトウェアCREAM(1-D, Kem-En-Tec A/S, コペンハーゲン、デンマーク、カタログ番号990012)を使用した。
結果：
【０２９１】
【表２９】
0004430234.tif 000031
【０２９２】
結論：
セファクリルHR S-500からの画分1（7〜10.5mlから採取した）中で採取した結合体は、画分2（10.5〜18mlから採取した）中で採取した結合体より有意に優れた応答を与える。セファクリルHR S-500からの2つの画分を含むセファクリルHR S-300からのピーク1の試験は、セファクリルHR S-500から得られた画分2とほとんど同じ応答を与える。上記試験結果は、水溶性高分子量結合体（すなわち、セファクリルHR S-500カラム上でゲルろ過した時、容量から完全にまたはほとんど排除される結合体）を使用することの利点を例示している。
【０２９３】
試験番号2
実施例4Bからの「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体を用いて、横向き流れ性能試験を行った。
上記結合体の性能を、実施例4A、溶液Eからの参照結合体（DVS活性化デキストランで調製）「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
I：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4B
II：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4A、溶液E（参照）
結合体濃度：OD＝0.5
結果：
【０２９４】
【表３０】
0004430234.tif 000032
【０２９５】
結論：
上記試験結果は、DVS活性化担体残基に基づく結合体と同様かまたはそれ以上の性能を有する高分子量結合体の基礎として、EPCH活性化担体残基を使用することの可能性を証明している。
【０２９６】
試験番号3
横流れ性能試験を実施例4Fの「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」結合体（高イオン強度（溶液A）および低イオン強度（溶液B）でそれぞれ調製）を用いて実施した。Sephacryl HR S-1000でのゲル濾過から集められたさまざまな画分および実施例4Aの参照結合体溶液Eも試験した。
【０２９７】
I：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4F、溶液A OD558=0.35
II：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4F、溶液B OD558=0.5
III：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」、実施例4A、溶液E（参照） OD558=0.5
IV：画分1(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、8〜10mlから集めたもの
V：画分2(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、10〜12mlから集めたもの
VI：画分3(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、14〜16mlから集めたもの
VII：画分4(Sephacryl HR S-1000、溶液Aより、18〜20mlから集めたもの
画分IV〜VIIは、OD558＝0.35の濃度を用いて試験した。
結果
【０２９８】
【表３１】
0004430234.tif 000033
Sephacryl HR S-1000から集めた画分の試験。
【０２９９】
【表３２】
0004430234.tif 000034
【０３００】
結論
この試験結果は、低イオン強度、すなわち反応物を（可逆的）沈殿させないで抗体のカップリングにより作られた結合体（結合体B）は、可逆的沈殿条件下で抗体のカップリングが行われた場合の結合体（結合体A）に比較して非常に劣った性能を与えることを示している。これらの結果は、結合体Bは結合体Aよりも分子量が著しく低い事実とも一致している。さらに、結合体が分子量の低い試料に分別されるとき、試料の性能は分子量とともに低下する、すなわち高分子量結合体がより高い性能を与えることも分かる。
【０３０１】
実施例7C．異なる「Dex-BSA-Dye-/a-CRP」および「Dex-Dye-/a-CRP」結合体による標準横流れ性能試験
異なる「Dex-BSA-Dye/a-CRP」および「Dex-Dye/a-CRP」結合体を、標準横流れ性能試験により試験した。全ての試験は、実施例7Aに記載のとおり行った。
ドットに用いた抗体濃度、ニトロセルロースストリップ上のスポッティングに用いた抗体の体積（μl）、抗原濃度(CRP)および結合体濃度は試験により異なるので、各試験毎に別々に記載する。
【０３０２】
試験番号1
実施例6A、溶液A、BおよびCの「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体を用いて横流れ性能試験を行った。
結合体の性能を、実施例4A溶液Eの参照結合体である「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
以下の条件で横流れ性能試験を行った。
「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体を試験する際には濃度1mg／mlの抗体3μlをスポットに用い、「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」参照結合体を試験するときには濃度0.1mg／mlの抗体1μlを用いた。
【０３０３】
I：「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体A OD600＝0.6
II：「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体B OD600＝0.6
III：「Dex-Remazol Black/a-CRP」結合体C OD600＝0.6
IV：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」実施例4A、溶液E（参照） OD558＝0.5
結果
【０３０４】
【表３３】
0004430234.tif 000035
この試験は、Remazol Blackをシグナル成分として使用できる可能性を示している。
【０３０５】
試験番号2
実施例4E、溶液AおよびBの「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体を用いて横流れ性能試験を行った。
結合体の性能を、実施例4A溶液Eの参照結合体である「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
以下の条件で横流れ性能試験を行った。
【０３０６】
「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体および「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」参照結合体を試験する際には濃度0.1mg／mlの抗体1μlをスポットに用いた。
I：「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体A OD595＝0.5
II：「Dex-BSA-UniblueA/a-CRP」結合体B OD595＝0.5
III：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」実施例4A、溶液E（参照） OD558＝0.5
結果
【０３０７】
【表３４】
0004430234.tif 000036
この試験は、Uniblue Aをシグナル成分として使用できる可能性を示している。
【０３０８】
試験番号3
実施例6Bの「Dex-Remazol Brilliant Red/a-CRP」結合体を用いて横流れ性能試験を行った。
結合体の性能を、実施例4A溶液Eの参照結合体である「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」と比較した。
以下の条件で横流れ性能試験を行った。
【０３０９】
「Dex-Brilliant Red/a-CRP」結合体を使用する際には濃度1mg／mlの抗体3μlをスポットに用い、「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」参照結合体を試験する際には濃度0.1mg／mlの抗体1μlを用いた。
I：「Dex-Remazol Brilliant Red/a-CRP」 OD530＝1.0
II：「Dex-BSA-Rhodamine/a-CRP」実施例5A、溶液E（参照） OD558＝0.5
結果
【０３１０】
【表３５】
0004430234.tif 000037
この試験は、Remazol Brilliant Redをシグナル成分として使用できる可能性を示している。
与えられた実施例から、可逆的沈殿条件は、スペーサー成分の有無に関わらず、可逆的沈殿条件なしに調製された結合体よりも横流れ試験片において高い性能を示す、抗体と染料が結合した結合体を与えるという結論が導かれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1：Dex-BSA-ロダミン／a-CRP結合体の精製
高イオン強度（1.75M燐酸カリウム緩衝液）で家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（実施例5A“溶液B”、ゲル濾過はSephacryl TM S-300 で行った）。メインピーク、(1)、は水溶性架橋“Dex-BSA-ロダミン”結合体を含む。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。同図は、自由な、束縛されない抗体、ピーク(2)、が結合体から分離できることを示している。
【図２】  図2：特性カーブ。Dex-BSA-ロダミン”結合体
高イオン強度（1.75M燐酸カリウム緩衝液）で家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（実施例5A“溶液B”、ゲル濾過はSephacryl TM S-300 で行った）。メイン画分、(1)、は水溶性架橋“Dex-BSA-ロダミン”結合体を含む。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。同図は、結合体が高い一定の分子量を有し、早い溶出と鋭いピークを生ずることを示している。
【図３ａ】  図3a：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｂ】  図3b：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｃ】  図3c：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｄ】  図3d：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｅ】  図3e：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図３ｆ】  図3f：高及び低イオン強度で沈澱した結合体の特性
高イオン強度（2.2M燐酸カリウム緩衝液）及び低イオン強度（0.1M燐酸カリウム緩衝液）で、家兎抗ヒトCRPとDVS-活性化された“Dex-BSA-ロダミン”結合体を結合して得られたサンプルのゲル濾過UV吸収プロフィール（図3a-b：Sephacryl TM HR S-300 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3c-d：Sephacryl TM HR S-500 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；図3e-f：Sephacryl TM HR S-1000 で行われたゲル濾過の特性プロフィール；）。
図3a、3c、3eは、高イオン強度で調製された結合体を示し、図3b、3d、3fは、低イオン強度で調製された結合体を示す。ラベル(1)は結合体を示し、ラベル(2)は自由な結合していない抗体を示す。横軸で各マークは2mlを表す。縦軸のマークは280nmにおける任意の吸収単位を示す。
ゲル濾過プロフィールは、はっきりと、高イオン強度で調製された結合体の分子量は低イオン強度で調製された結合体よりも大きいことを示している。
【図４ａ】  図4：水溶性架橋結合体複合体を調製するプロセスの概略
本文で言及された成分と前駆物質の調製のある実施形態の概略図が図4に示されている。同図は、読者がこの方法で述べられた手順の一般的アウトラインをたどるのを助けるために、ある実施形態の中の挿話的な例を示したものであるから、単に説明のためにのみ用いるべきである。
【図４ｂ】  図4：水溶性架橋結合体複合体を調製するプロセスの概略
本文で言及された成分と前駆物質の調製のある実施形態の概略図が図4に示されている。同図は、読者がこの方法で述べられた手順の一般的アウトラインをたどるのを助けるために、ある実施形態の中の挿話的な例を示したものであるから、単に説明のためにのみ用いるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
0004430234.tif 000044
【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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