(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ科動物からの食肉の柔らかさを評価するための方法であって、
配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、又は配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３の存否に関して該動物を試験するステップと、
該ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２又は３が存在する食肉を柔らかい食肉として評価するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記試験が、
（１）前記動物から生体サンプルを得るステップと、
（２）該サンプルからＤＮＡを抽出するステップと、
（３）前記ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、２又は３から、ＤＮＡを増幅するステップと、
（４）増幅した該ＤＮＡ中に存在する該対立遺伝子を同定するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡの増幅を、オリゴヌクレオチドプライマー
ｃａｓｔｄ    ５’ｃａｔ  ｔｔｇ  ｇａａ  ａａｃ  ｇａｔ  ｇｃｃ  ｔｃａ  ｃ  ３’、及び
ｃａｓｔｅ    ５’ｔｃｔ  ａｃｇ  ａｔｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｔｃａ  ａｇａ  ｇｇａ  ｇ  ３’
を用いて行う請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１の不存在に関して前記動物を試験する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２又は前記ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３の存在に関して前記動物を試験する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、又は配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３からなるウシ科動物の食肉の柔らかさに関する遺伝子マーカー。
【請求項７】
配列番号１に示すヌクレオチド配列、配列番号２に示すヌクレオチド配列、又は配列番号３に示すヌクレオチド配列からなる、単離ＤＮＡ分子。
【請求項８】
柔らかさが改善された食肉をもたらし易いウシ科動物を選択するための方法であって、
（１）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、又は配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３の存否に関して該動物を試験するステップと、
（２）該ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２又は３を有する該動物を選択するステップとを含む、方法。
【請求項９】
前記試験が、
（１）前記動物から生体サンプルを得るステップと、
（２）該サンプルからＤＮＡを抽出するステップと、
（３）前記ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、２又は３から、ＤＮＡを増幅するステップと、
（４）増幅したＤＮＡ中に存在する該対立遺伝子１、２又は３を同定するステップとを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡの増幅を、オリゴヌクレオチドプライマー
ｃａｓｔｄ    ５’ｃａｔ  ｔｔｇ  ｇａａ  ａａｃ  ｇａｔ  ｇｃｃ  ｔｃａ  ｃ  ３’、及び
ｃａｓｔｅ    ５’ｔｃｔ  ａｃｇ  ａｔｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｔｃａ  ａｇａ  ｇｇａ  ｇ  ３’
を用いて行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験をする対立遺伝子がＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２であり、この対立遺伝子について同型接合である動物を選択する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ウシ科動物の食肉の柔らかさに関する遺伝子マーカーを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、
該遺伝子マーカーが、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、又は配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３からなり、
該オリゴヌクレオチドプライマーが、ｃａｓｔｄ    ５’ｃａｔ  ｔｔｇ  ｇａａ  ａａｃ  ｇａｔ  ｇｃｃ  ｔｃａ  ｃ  ３’及び
ｃａｓｔｅ    ５’ｔｃｔ  ａｃｇ  ａｔｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｔｃａ  ａｇａ  ｇｇａ  ｇ  ３からなる群から選択される、オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１３】
ウシ科動物から得た食肉の柔らかさの評価、及び／又は柔らかさが改善された食肉をもたらし易い動物の選択のために使用されるキットであって、
食肉の柔らかさに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡを増幅するための手段とを含み、
該遺伝子マーカーが、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、又は配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３からなり、
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、
ｃａｓｔｄ    ５’ｃａｔ  ｔｔｇ  ｇａａ  ａａｃ  ｇａｔ  ｇｃｃ  ｔｃａ  ｃ  ３’及び
ｃａｓｔｅ    ５’ｔｃｔ  ａｃｇ  ａｔｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｔｃａ  ａｇａ  ｇｇａ  ｇ  ３’
からなる群から選択される、キット。
【請求項１４】
配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、又は配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３を有するウシ科動物を選択する工程と、
選択されたウシ科動物を繁殖に供する工程とを含む、柔らかな食肉をもたらし易いウシ科動物を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の肉の柔らかさに関する遺伝子マーカー、動物から得た肉の柔らかさを評価するための方法及びオリゴヌクレオチドプローブ、並びにその目的で使用するキットに関する。本発明は、繁殖や食用として屠殺する動物の選択において、肉の柔らかさに関して望ましい特性を示す動物を選択するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
食肉の柔らかさは消費者にとって重要な事項であり、とりわけ柔らかい食肉が市場で高値を付ける需要に大きく影響する。死後における筋肉構造の生理学的変化は複雑であるが、食肉の柔らかさには、明らかに少なくとも１つの要因があるようである。カルパイン／カルパスタチン系は、内因性カルシウム依存プロテイナーゼ系であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉タンパク質分解を開始させるものと理論上考えられている。カルパスタチンは、カルパイン活性を阻害すると考えられており、死後のタンパク質分解調節の際、食肉の柔らかさに関してある役割を持っていると考えられる。特にカルパインは、食肉の柔らかさに密接に関係する、筋原線維タンパク質の破壊に関し応答性を有する。
【０００３】
従って、カルパスタチン活性が食肉の柔らかさに関連しているのではないかと考えられる。事実、死後のカルパスタチン活性の増大につれて、食肉の柔らかさが低下している。そのような観察がなされたにもかかわらず、カルパスタチンをコードするＣＡＳＴ遺伝子と食肉の柔らかさとを明らかに結びつけるものは確認されていなかった。
【０００４】
例えば、Ｌｏｎｅｒｇａｎ他（１９９５）は、ＣＡＳＴの制限断片長多型分析を行ったが、８品種から得た種雄の交雑子孫では、カルパスタチン活性と、柔らかさのいずれとも、関連性を見出すことはできなかった。Ｃｈｕｎｇ他（１９９９）は、４７頭の純粋種アンガス牛で、カルパスタチン活性、Ｗａｒｎｅｒ−Ｂｒａｔｚｌｅｒせん断力、及び筋原線維断片化指数を測定した。しかし彼らは、「カルパスタチン遺伝子の１本鎖ＤＮＡ高次構造多型ＰＣＲ分析は、カルパスタチン活性、筋原線維断片化指数、又は食肉の柔らかさを予測するのに有用ではなかった」と結論付けた。
【０００５】
リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）の作用の１つが、コラーゲン線維の生成の初期段階で架橋形成を起こすことであることは、以前より知られている（例えばＣｒｏｎｌｕｎｄ他、１９８５）。リシルオキシダーゼの作用は、癌（Ｇｉａｍｐｕｚｚｉ他、２００１）、脈管構造（Ｎｅｌｌａｉａｐｐａｎ他）、及びその他の組織及び器官系における様々な面の重要性に関して何百もの刊行物で集中的に研究されている。
【０００６】
ＬＯＸは終始、コラーゲン成分の柔らかさに寄与する遺伝子について、生化学的な根拠となる有力な候補と見られていたが、遺伝子自体の変異は、牛肉の柔らかさの相違に関連付けられてはいなかった。遺伝的連鎖の分析は、半腱様筋の接着及びインストロン圧縮試験におけるファミリー変異の連鎖分析において、ＬＯＸを含むゲノム領域を示唆した（ＳＴＡＤＨ及びＳＴＩＣ；Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ他、１９９９）。しかし、ＬＯＸ自体は、個体群の関連性に関する研究において、柔らかさの測定と関連付けられてはいなかった。
【０００７】
死後の肉の軟化に影響を与える変化には、様々な原因があるので、食肉の柔らかさは複雑である。これらの要因には、獣類の加齢やその餌の特性、屠殺前のストレスの程度、屠体冷蔵、死後経過時間、調理及び試験方法などの、非遺伝的作用がある。食肉の柔らかさの変化の約３０％は、単一品種内での付加的遺伝子効果によって説明でき、その柔らかさの変化の約７０％は、環境及び非付加的遺伝子効果によって説明できることが示されている（例えばＫｏｏｈｍａｒａｉｅ（１９９４））。Ｌｏｎｅｒｇａｎの研究では、１才を過ぎたばかりの（４３０日）ウシを屠殺したが、そのサンプルは、わずか８３種の動物がランダムなピークフォース値を示すに過ぎず、そのサンプルは完全に、様々な雄牛の交雑種からなっていた。同様に、Ｃｈｕｎｇの研究では、生後わずか２８０日の純粋種のアンガス牛を使用した。さらに、どちらの研究においても極ピークフォース値を目的として動物を選択したわけではなく、それ故、環境及び不定の遺伝的効果が、ＣＡＳＴ遺伝子と食肉の柔らかさとの間の遺伝子関連性を同定する上で妨げになったものと思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の概要）
一定の遺伝子効果及び環境効果による影響を低減するように設計されたプロトコルを使用することにより、本発明者は、意外にも、ＣＡＳＴ遺伝子及びＬＯＸ遺伝子と食肉の柔らかさとの間に対立遺伝子による関係を示すことができた。簡単に述べると、本発明は、ＣＡＳＴ遺伝子及びＬＯＸ遺伝子の多型、又はこれらの遺伝子との間に対立遺伝子関係を示す多型である、食肉用に殺された動物の肉の柔らかさに対する遺伝子マーカーに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の第１の形態により、動物から得た肉の柔らかさを評価するための方法であって、
（１）ピークフォースの変動に関連するカルパスタチン（ＣＡＳＴ）をコードする遺伝子の対立遺伝子、又は当該ＣＡＳＴ対立遺伝子との対立遺伝子関係を示すＣＡＳＴ遺伝子以外に位置する遺伝的変異と、
（２）半腱様筋のインストロン圧縮の変動に関連するリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）をコードする遺伝子の対立遺伝子、又は該ＬＯＸ対立遺伝子との対立遺伝子関係を示すＬＯＸ遺伝子以外に位置する遺伝的変異と
からなる群から選択された遺伝子マーカーの存否に関して動物を試験するステップを含む、方法が提供される。
【００１０】
試験をする対立遺伝子は、ＣＡＳＴの３’ＵＴＲに位置することが好ましく、典型的には、下記の部分ＤＮＡ配列：
ｃａｔｔｔｇｇａａａａｃｇａｔｇｃｃｔｃａｃｇｔｇｔｔｃｔｔｃａｇｔｇｔｔｃｔｇａｔｔｔｃｔｃａｔｇａｃｃｃｃｔｔｔｃｃｔｃｔｔＧｇａｃｔｔｇｔｇｇｇａｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｔｇｔｔｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｇｔｔｇｔｔｔａｔａａｇｔｃａｇｔｃａｔａａＡａｔａｃｔｇｔｇｃａｔｔｇｇｇｃａｃａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇａｇｃｔｇｃｔａａｔｃｇｔａｇａ（配列番号１）
を有するＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、
下記の部分ＤＮＡ配列：
ｃａｔｔｔｇｇａａａａｃｇａｔｇｃｃｔｃａｃｇｔｇｔｔｃｔｔｃａｇｔｇｔｔｃｔｇａｔｔｔｃｔｃａｔｇａｃｃｃｃｔｔｔｃｃｔｃｔｔＡｇａｃｔｔｇｔｇｇｇａｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｔｇｔｔｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｇｔｔｇｔｔｔａｔａａｇｔｃａｇｔｃａｔａａＡａｔａｃｔｇｔｇｃａｔｔｇｇｇｃａｃａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇａｇｃｔｇｃｔａａｔｃｇｔａｇａ（配列番号２）
を有するＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、又は
下記の部分ＤＮＡ配列：
ｃａｔｔｔｇｇａａａａｃｇａｔｇｃｃｔｃａｃｇｔｇｔｔｃｔｔｃａｇｔｇｔｔｃｔｇａｔｔｔｃｔｃａｔｇａｃｃｃｃｔｔｔｃｃｔｃｔｔＡｇａｃｔｔｇｔｇｇｇａｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｔｇｔｔｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｇｔｔｇｔｔｔａｔａａｇｔｃａｇｔｃａｔａａＴａｔａｃｔｇｔｇｃａｔｔｇｇｇｃａｃａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｔｇａｇｃｔｇｃｔａａｔｃｇｔａｇａ（配列番号３）
を有するＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３であることが好ましい。
【００１１】
硬さの小さな食肉は、「１１」及び「１２」の遺伝子型の動物を排除し、「２２」又は「２３」の遺伝子型の動物を受け入れることによって選択される。上述の配列では、対立遺伝子の相違を大文字で強調している。Ｄ／Ｅ  ＤＮＡ断片におけるこれら３つの対立遺伝子は、２つのＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）によるものである。第１のＳＮＰは、Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｌ１４４５０の塩基２６５５にあり、これはＧｅｎｂａｎｋ配列ＡＦ１５９２４６の塩基２９５９と同じである。それは、対立遺伝子１がＧを有し、対立遺伝子２及び３がＡを有するようにＧからＡに変化している。第２のＳＮＰは、第１のＳＮＰの３’側の５８塩基対の箇所でＡからＴに変化したものである。この領域では、２つのＳＮＰによる３つの対立遺伝子のみが示されていることから、対立遺伝子２と対立遺伝子３との間には完全な連鎖不平衡があることが示唆され、対立遺伝子３は対立遺伝子２から発展したと考えられる。このことは、これらＳＮＰが５８塩基対離れていることから予想される。予測目的にとって、対立遺伝子３をもたらす第２のＳＮＰの試験は、対立遺伝子２をもたらす第１のＳＮＰの試験と同等である。これは、「２３」ヘテロ接合体である動物のピークフォース値に一致し、その全てのピークフォース値は低くなっている。理論に拘泥するものではないが、これら多型はカルパスタチン遺伝子内又はその遺伝子付近（おそらくはプロモーター又はイントロン）での突然変異に関係があり、その結果カルパスタチンの発現又は活性が低下すると考えられる。
【００１２】
ＣＡＳＴ遺伝子の５’ＵＴＲで存在する多型や、３’ＵＴＲの多型と対立遺伝子関係を示す他の多型が同定されている。そのため、これらの他型も、上述の柔らかさの特性に関する遺伝子マーカーとしての作用し、少なくともＣＡＳＴ遺伝子のコード領域並びに当該遺伝子の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ領域を包含するゲノムＤＮＡ内に存在すると思われる。さらに、ある種の個体群の大きさが最近縮小した所では、個々の特定のハプロタイプが比較的過剰に表れる。対立関係を減少させるのに必要な時間が不十分であると、遠くに離れている対立遺伝子に対してさえも連鎖不平衡が生じる。最近では、ウシなどの家畜種が、比較的小さいプールの野生原種から家畜化されており、このような種では、対立遺伝子関係が、物理的に離れている対立遺伝子間で見られる。このため、ＣＡＳＴ遺伝子の外部での遺伝的変異のある領域も、上記したＣＡＳＴ遺伝子の多型と対立遺伝子関係を示し、それ故、ピークフォースの変化の特性にとって好適な遺伝子マーカーになることが予測される。従って、これらの多型を使用して食肉の柔らかさを評価することもできる。
【００１３】
特に、ＣＡＳＴ５マイクロサテライト多型（Ｎｏｎｎｅｍａｎ他、１９９９）は、食肉の柔らかさに関する遺伝子マーカーとして有用であることがわかった。一般的な対立遺伝子の中で、対立遺伝子７及び９は低ピークフォースに関連し、対立遺伝子３は高ピークフォースに関連することがわかった。
【００１４】
従って本発明は、好ましい実施形態において、ピークフォースの変動に関連するカルパスタチンをコードする遺伝子の対立遺伝子など、１つ又は複数の追加の遺伝子マーカーの存否について試験をするさらなるステップを包含し、特に、ＣＡＳＴ５対立遺伝子７又は９の存否、並びに／或いはＣＡＳＴ５対立遺伝子３の存否について試験をするものである。ＣＡＳＴ  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２の存在が確かめられた場合、最も好ましい結果は、存在するＣＡＳＴ５対立遺伝子７又は対立遺伝子９も有する場合に得られる。これに対し、ＣＡＳＴ  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２の存在による利点は、その動物がＣＡＳＴ５対立遺伝子３も有する場合には、ある程度弱められる。
【００１５】
ＬＯＸ多型も食肉の柔らかさに関する遺伝子マーカーであることが示され、対立遺伝子１又は対立遺伝子２を試験することができる。ＣＡＳＴ遺伝子に関しては、ＬＯＸ遺伝子の外部に位置する対立遺伝子にも対立遺伝子関係が示されている。
【配列表１】
【００１７】
本発明の第２の態様によれば、ＣＡＳＴ遺伝子の多型形態であるＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ多型又はＬＯＸ多型である、動物の食肉の柔らかさに関する遺伝子マーカーが提供される。
【００１８】
本発明の第３の態様によれば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に記載されるヌクレオチド配列を含む、単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００１９】
本発明の第４の態様によれば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３で記載されたヌクレオチド配列からなる、単離されたＤＮＡ分子が提供される。
【００２０】
本発明の第５の態様によれば、柔らかさが改善された食肉をもたらし易い動物を選択するための方法であって、
（１）低ピークフォースに関連するカルパスタチン（ＣＡＳＴ）をコードする遺伝子の対立遺伝子、又は当該ＣＡＳＴ対立遺伝子と対立遺伝子関係を示すＣＡＳＴ遺伝子以外に位置する遺伝的変異の存在、並びに／或いは半腱様筋の低インストロン圧縮に関連するＬＯＸ遺伝子の対立遺伝子、又は当該ＬＯＸ対立遺伝子と対立遺伝子関係を示すＬＯＸ遺伝子以外に位置する遺伝的変異の存在について、動物の試験をするステップと、
（２）ＣＡＳＴ及び／又はＬＯＸ対立遺伝子、並びに／或いはそれらと対立遺伝子関係のある遺伝的変異を有する動物を選択するステップとを含む、方法が提供される。
【００２１】
動物から得た肉の柔らかさの評価、及び／又は柔らかさが改善された食肉をもたらし易い動物の選択のために、試験は、
（１）動物から生体サンプルを得るステップと、
（２）サンプルからＤＮＡを抽出するステップと、
（３）ＣＡＳＴ又はＬＯＸ遺伝子、並びに／或いはＣＡＳＴ遺伝子又はＬＯＸ遺伝子の一方の多型に対して対立遺伝子関係を示す遺伝的変異の領域から、ＤＮＡを増幅するステップと、
（４）増幅したＤＮＡ中に存在する対立遺伝子を同定するステップと
を含むことが有利である。
【００２２】
一般に、ステップ（４）で同定した対立遺伝子は、上述のＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子１、ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子２、及びＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ対立遺伝子３の何れか１つ、並びに／或いは上述のＣＡＳＴ５対立遺伝子である。
【００２３】
生体サンプルは血液であることが好ましいが、ＤＮＡを増幅することができるその他の生体サンプルを使用することができる。例えば毛根サンプル、頬の擦過物、皮膚などを使用することができる。
【００２４】
一般に増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行うが、リガーゼ連鎖反応などのその他のＤＮＡ増幅法が当技術分野で周知であり、代わりにそれを使用することができる。
【００２５】
対立遺伝子は、ＳＳＣＰなどのポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、又はＲＦＬＰ分析などの当業者に周知のその他の方法によって同定することが好ましい。
【００２６】
第６の形態において、本発明は、ピークフォースの変動に関連する遺伝子マーカーを増幅するためのオリゴヌクレオチドプローブを提供し、当該遺伝子マーカーは、カルパスタチン（ＣＡＳＴ）をコードする遺伝子の対立遺伝子、又は当該対立遺伝子と対立遺伝子関係を示すＣＡＳＴ遺伝子以外に位置する遺伝的変異体である。
【００２７】
典型的には、そのプローブは、
ｃａｓｔｄ    ５’  ｃａｔ  ｔｔｇ  ｇａａ  ａａｃ  ｇａｔ  ｇｃｃ  ｔｃａ  ｃ  ３’
ｃａｓｔｅ    ５’  ｔｃｔ  ａｃｇ  ａｔｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｔｃａ  ａｇａ  ｇｇａ  ｇ  ３’
ＣＡＳＴ５Ｕ１  ５’−ＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧ−３’
ＣＡＳＴ５Ｄ１  ５’−ＧＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧ−３’
からなる群から選択される。
【００２８】
プライマーをＣＡＳＴＤ及びＣＡＳＴＥとして指定することに鑑み、ＣＡＳＴ遺伝子の増幅断片を必要に応じてＣＡＳＴ  Ｄ／Ｅ断片と呼び、多型をＣＡＳＴＤ／Ｅ多型と呼ぶ。
【００２９】
本発明の第７の態様によれば、半腱様筋のインストロン圧縮の変動に関連する遺伝子マーカーの増幅のためのオリゴヌクレオチドプローブが提供され、この遺伝子マーカーは、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）をコードする遺伝子の対立遺伝子、又は当該対立遺伝子との対立遺伝子関係を示すＬＯＸ遺伝子以外に位置する遺伝的変異体である。
【００３０】
典型的には、そのオリゴヌクレオチドプローブは、
ＬＯＸ  Ｋ５：５’  ｔａｔ  ｃａｃ  ｔｇａ  ｔｇｔ  ｃａａ  ａｃｃ  ｔｇ  ３’
ＬＯＸ  Ｋ６：５’  ａｃｔ  ｃａｇ  ｇｃａ  ｃｃａ  ａａｔ  ａｇｃ  ｔｇ  ３’
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブである。
【００３１】
本発明の第８の態様によれば、動物から得た肉の柔らかさの評価、及び／又は柔らかさが改善された食肉をもたらし易い動物の選択のために使用されるキットが提供され、このキットは、食肉の柔らかさに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーを増幅するためのオリゴヌクレオチドプローブと、ＤＮＡを増幅するための手段とを含み、当該遺伝子マーカーは、カルパスタチン（ＣＡＳＴ）をコードする遺伝子の対立遺伝子、又は当該対立遺伝子と対立遺伝子関係を示すＣＡＳＴ遺伝子以外に位置する遺伝的変異、或いは半腱様筋の低インストロン圧縮に関連するＬＯＸ遺伝子の対立遺伝子、又はＬＯＸ対立遺伝子と対立遺伝子関係を示すＬＯＸ遺伝子以外に位置する遺伝的変異である。
【００３２】
ＤＮＡを増幅するのに使用されるプライマーは、ＣＡＳＴ５多型を増幅するために、ＣＡＳＴＤ及びＣＡＳＴＥプライマー、並びに／或いはＣＡＳＴ５Ｕ１及びＣＡＳＴ５Ｄ１プライマーが使用される。しかし、これらがＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ多型又はＣＡＳＴ５多型以外の多型を増幅するプライマーであるか、その他のプライマーがＣＡＳＴ５多型のＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ断片を増幅することが可能であるかに拘らず、食肉の硬さの低減に関連する多型を増幅することが可能な他のプライマーが考えられる。
【００３３】
本発明の方法は、フィードロットに入れるための育種動物の選択及び非純血種動物の選択の両方に使用することができる。後者の場合は本発明の方法により、血統が不適切な動物をフィードロットから排除することが可能になるが、それは、これらの動物をフィードロットで長期間飼育した後であっても、そのような動物からは非常に柔らかい食肉を得ることが難しいことに基づいている。また、そのような測定によって、食肉の柔らかさが最高に達するのに最適な時間を決定することが可能になる。従って本発明は、本発明の方法によって選択された場合の動物、その子孫と、選択された動物及びその子孫の繁殖のための使用、並びにこれらの動物から得られた食肉にも関する。
【００３４】
本発明の方法は、ウシと、水牛及びバイソンを含むその他のウシ科の動物と、ヒツジ、ヤギ、及びシカを含むその他の有蹄類と、ブタ及びニワトリとを含むがこれらに限定されない動物に、利用可能である。
【００３５】
この明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特に他に指定しない限り、非排他的な意味で使用する。
【００３６】
いくつかの従来技術の文献を本明細書で参照するが、これらの参照は、それらの文書のいずれも、オーストラリア又は任意のその他の国における当技術分野での一般共通認識の一部を形成すると承認したものではないことが、明らかに理解されよう。
【００３７】
次に添付図面を参照しながら、単なる例として、本発明の好ましい実施形態について述べる。
【実施例１】
【００３８】
ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ多型の同定
できる限り多様な遺伝的背景及び表現型背景を有するように、オーストラリア、Ｂｒｉｓｂａｎｅ所在のＣａｔｔｌｅ  ａｎｄ  Ｂｅｅｆ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｅｎｔｒｅのＤＮＡバンクからウシを選択した。ＣＲＣデータベースに記憶された情報を使用して、動物を選択した。極値のピークフォースを有する動物を選択した。但し、ピークフォース値が１２よりも高い動物はそのピークフォース測定を混乱させる可能性があるので除外した。本質的にこの手順は、１頭の種雄が子孫の一団の親にならないように、かつ各極値ごとに全ての市場及び最終形態が含まれるように、表現型極値を持つ各世代群におけるウシを選択して、極値を特定の市場又は最終形態によって偏ることがないようにした。第１のサンプルに関し、合計で１６９のサンプルを得た（表１）。７７の動物の第２のサンプル（表６）を、同じ対立遺伝子関係が別のサンプルで観察されるかどうかを検出するためのチェックとして分析した。
【００３９】
ｃａｓｔｄ    ５’  ｃａｔ  ｔｔｇ  ｇａａ  ａａｃ  ｇａｔ  ｇｃｃ  ｔｃａ  ｃ  ３’
ｃａｓｔｅ    ５’  ｔｃｔ  ａｃｇ  ａｔｔ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｔｃａ  ａｇａ  ｇｇａ  ｇ  ３’
を使用して、ＣＡＳＴ（カルパスタチン）Ｄ／Ｅ  ＤＮＡ断片に対する、これらＤＮＡサンプルの遺伝子型を特定した。
【００４０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の条件は、アニーリング温度が摂氏６０度であり、塩化マグネシウム２．５ｍＭであり、試薬混合物はＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得たものである。ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ中にその断片に32Ｐ  ｄＣＴＰを組み込むことにより標識し、断片は、一晩室温に曝したＸ線フィルムを使用するオートラジオグラフィによって視覚化した。対立遺伝子に、移行が最速の対立遺伝子を番号１にする番号順でスコアを付けた。
【００４１】
Ｓ−ＰＬＵＳソフトウェアを介して実行される、ピークフォース＝１＋固定効果の範囲で組み込まれた遺伝子型＋誤差という等式に従い、一般化された線形モデル（ＧＬＭ）を使用して遺伝子型を分析した。考えられる固定効果は、品種、最終地（オーストラリア、韓国、日本）、同世代群（コーホート）、地域（牧草対穀物、北対南）、及び最終体重の共分散値であった。タウリンの種雄から純血育種した子孫は、北部において放牧しなかったので、遺伝子型を地域及び品種の範囲でネストさせた。遺伝子型に関連する効果の大きさは、分散の比較によって評価した（例えばＡｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｋｌｕｎｄ及びＲｅｎｄｅｌ、１９９３）。遺伝子型置換に関連する効果の大きさを評価するために、カルパスタチン遺伝子型を持たない同じモデルを適用した。残差を差し引き、カルパスタチン遺伝子型と比較した。これらは、分散分析を使用して分析し、各遺伝子型ごとに補正された平均値を得た。カルパスタチン遺伝子型に対する生ピークフォース値及び残差ピークフォース値をプロットした。
【実施例２】
【００４２】
ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ多型の分析
ＣＡＳＴ  Ｄ／Ｅ多型には２つの一般的な対立遺伝子（図１）と少なくとも１つのまれな対立遺伝子がある。一般的な対立遺伝子の両方は、全ての品種に見られるが、品種間で遺伝子型の頻度に明らかな違いがある。このサンプルではタウリン種よりもコブウシ種の「１１」遺伝子型（表２及び７）の頻度が大きい。
【００４３】
次いで、生の値（図２ａ及び２ｂ）を、ＣＡＳＴ遺伝子型（図３ａ及び３ｂ）に対してプロットしたところ、これらの関連性は、ピークフォースと遺伝子型との関連によって可視的に示す上で充分に強かった。ＣＡＳＴ、品種、即ちタウリン対コブウシに関する文献で考慮される最も重要な遺伝的影響を、サンプル中に、各品種から得たピークフォースが高い動物と低い動物が存在するように慎重に適合させた。この場合、品種は説明変数にならないと予測される。
【００４４】
ＣＡＳＴ遺伝子型の分析（表３）は、ＣＡＳＴ遺伝子又はＣＡＳＴ遺伝子付近の配列がピークフォースに影響を及ぼすことを強く確証させる証拠を示す。この分析は、品種の影響がないことを示すが、サンプルは各品種ごとに高いピークフォース及び低いピークフォースを持つ個体からなるので、これは予期しなかったものではない。この多型に関連する効果の大きさは、主な効果として評価される約７．９パーセントの表現型の分散であり、地域内の品種にネストされたＣＡＳＴ遺伝子型に関連する偏差は、１２１．４である（１７ｄｆ、Ｐ＝０．００１８９４）。品種とＣＡＳＴ遺伝子型との非ネスト相互作用条件をこのサンプルに関して計算したが、統計上有意なものではなかった。残差ピークフォース測定値に対するＣＡＳＴ遺伝子型のＧＬＭ（表４）は、地域及び品種の範囲内でネストされる場合より、主な効果とされたＣＡＳＴ遺伝子型（表３）の関連性と同様な統計上有意なレベルの関連性を示す。
【００４５】
遺伝子型のボックスプロット対残差ピークフォース測定値（図４）は、分布に明らかな違いがあることを示し、「１１」遺伝子型と「１２」遺伝子型の中央値同士の差は、約１．２ｋｇの補正ピークフォース値である。分散分析から得られた補正平均値によれば（表５）、ホモ接合体の遺伝子型同士のピークフォースの差が１．３４ｋｇである。残差の全標準偏差は１．６１である。
【００４６】
７７の動物の確認試料のＧＬＭは、高いピークフォースと関連付けられる「１」対立遺伝子で、ＣＡＳＴ遺伝子型とピークフォースとの間に統計上有意な関連を示した。完全モデルを計算した場合には、比較的小さいサンプルサイズの結果、おそらくは統計上有意な因子は何もなかったであろう。基準としてＡＩＣの縮小モデルを使用して、このモデルでの項目を１つずつ減らした。カルパスタチン遺伝子型以外の全ての条件をこの自動的な手順で落としたが（表８）、これは、表現型の分散が９．５パーセントであることを説明する、１７．９の偏差（２ｄｆ、ｐ＜０．０５）を示す。これは、第１のサンプルでピークフォースに対するその他の因子なしでＣＡＳＴ遺伝子型を比較した場合に見出された８．９パーセントと類似する。
【００４７】
考察
ここで得られた結果は、ＣＡＳＴ遺伝子での遺伝的変異が、品種起源と無関係に個体間のＷａｒｎｅｒ−Ｂｒａｔｚｌｅｒピークフォース測定値の変動を説明する際に重要であることを示す。サンプルは、品種の影響を制御し、かつ異なる種雄系統、同世代群、食餌及び最終形態の全体にわたってできる限り広くサンプルが分散するように選択し、いずれの極値の個体も確実に各品種、同世代群、食餌及び最終形態からできる限り多く得られるよう注意を払った。このようにして、ピークフォースに対するこれら因子の体系的効果は、ピークフォース値に影響を及ぼすその他の因子によって不注意に対立遺伝子の効果が続行しないように制御した。実際、その他の固定効果の説明がつかない場合であっても、この位置での対立遺伝子置換に起因するピークフォースには統計上有意な偏差がある。生データの検討により、異なる遺伝子型に関して品種内において頻度の差が示され、「１」対立遺伝子は、ピークフォース値がより低い極値でよりまれに存在する。
【００４８】
「１」対立遺伝子とより高いピークフォース測定値との関連は、極値領域動物の第２のより小さいサンプルで確認される。これらの動物は、第１のサンプルの場合よりも極値領域が狭いが、極値領域が残されており、それらは、カルパスタチン遺伝子型が重要であることを示すだけではなく、そのような小さいサンプルでは、重要であることが知られている他の因子に統計上の有意性が見られないことを、明らかに示している。このような十分に適合しているサンプルでは、分析するサンプルの選択を通してその他の因子による影響をできる限り排除しようと試みているので、問題はない。
【００４９】
ホモ接合体置換のサイズは、ＬＤに関するピークフォースが約１．３４ｋｇであり、標準偏差０．８３に等しい。この値は、分布の極値を使用したので過大評価される傾向があり、適正な評価をするには、ピークフォースの完全分布からランダムに選択した動物が必要である。それにもかかわらず、これは単一マーカーに関連する遺伝的変動の有用な量であり、このマーカーは、育種及びフィードロットストリーミングのための直接ＤＮＡマーカー試験に有用であることが予想される。
【００５０】
この分析では、ピークフォースに対する遺伝子型相互作用による品種の証拠が示されておらず、いくつかの品種で対立遺伝子関係が異なり又は存在しないという証拠がないことを意味している。これは、カルパスタチンとピークフォースとの関連に関して品種内で不均一性がないことを意味すると解釈される。
【００５１】
対立遺伝子関係に関する陽性検査は一般に、原因となる突然変異がＤＮＡマーカーに近いことを示す。その他の研究での関連性は、量的形質遺伝子座に比較的近いＤＮＡマーカーですら、関連性に関する証拠を見い出だせないほど、対立遺伝子関係が極めて速い速度で減衰することを示している（例えばＣｏｌｅｍａｎ他、１９９５；Ｂａｒｅｎｄｓｅ、１９９７）。これは、原因となる突然変異がＣＡＳＴ  Ｄ／Ｅ多型に極めて近いことを示している。
【実施例３】
【００５２】
ＣＡＳＴ５マイクロサテライト多型の同定
ＣＡＳＴ遺伝子中のその他の多型が柔らかさに関連しているかどうかを判断するため、ウシのサンプル（表１及び６）の両方の遺伝子型を、先に報告されたＤＮＡ配列（Ｃｏｎｇ他、１９９８）から得られたＣＡＳＴ５マイクロサテライト多型（Ｎｏｎｎｅｍａｎ他、１９９９）で特定した。
【００５３】
この多型を増幅するプライマー配列は、範囲１３０〜１５９ｂｐ内に増幅断片を持つ、
ＣＡＳＴ５Ｕ１  ５’−ＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧ−３’及び
ＣＡＳＴ５Ｄ１  ５’−ＧＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧ−３’
であり、サイズはＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列決定器で決定した。対立遺伝子及び遺伝子型は、１３の対立遺伝子をもたらすこれらのサイズ断片に基づいて割り当て、対立遺伝子のサイズの分布は図５に示す。
【００５４】
異なる二組の分析を行った。第１の分析では、ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ多型での遺伝子型とＣＡＳＴ５マイクロサテライトとを比較し、ＤＮＡ配列に存在するハプロタイプの結果として、遺伝子型同士で有意な関連があるかどうか決定した。ＣＡＳＴ５及びＣＡＳＴ３が有意なハプロタイプを示す場合、それらが、ＣＡＳＴコード配列のどちらかの側にあることから、ＣＡＳＴコード配列に対する全ての多型は、これらＤＮＡマーカーのどちらか又は両方との間に連鎖不均衡があることが予想される。第２の分析では、ＣＡＳＴ５マイクロサテライト対立遺伝子とＬＤピークフォース測定値とを比較して、ＣＡＳＴ５と柔らかさの間に何らかの関連があるかどうかを決定した。
【００５５】
ＣＡＳＴ５とＣＡＳＴ３とのハプロタイプ
これらの動物の親の遺伝子型を入手できなかったので、ＣＡＳＴ５とＣＡＳＴ３の一方又は両方が同型の遺伝子型を有する動物を分析することによってハプロタイプを決定した。これらハプロタイプの頻度を表に示した（表９）。一般化線形モデルを使用して、これらの頻度を、不均一性に求めるために試験し、不均一性が高いことを見出した（表１０）。これは、ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅでの各対立遺伝子が、ＣＡＳＴ５マイクロサテライトでの特異的な対立遺伝子と優先的に関連付けられることを意味している。
【００５６】
柔らかさとＣＡＳＴ５との関連
ＣＡＳＴ５は１３の対立遺伝子を有し、９１の遺伝子型が存在する可能性があるので、この研究のように、これら遺伝子型の全てが２４０サンプルのサンプル中に見られるわけではない。従って、関連性は対立遺伝子に関してで評価した。ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ  ＤＮＡマーカーに関しては、多型と生のＬＤピークフォース値とを比較し（表１１ａ）、品種間の相互作用の相違について多型を検査し（表１１ｂ）、市場、コーホート、品種、及び最終形態後のＬＤピークフォース値と比較して、その影響を明らかにした（表１１ｃ）。これらの分析の終わりに、ＣＡＳＴ３の分析の場合と同様に、ＣＡＳＴ５対立遺伝子を最終形態及び品種にネストした。
【００５７】
これらの分析は、ＣＡＳＴ５対立遺伝子の頻度とＬＤピークフォース上での品種との間に相互作用がなく、ＣＡＳＴ５と生のＬＤピークフォース値との間の関連が閾値Ｐ＜０．０１で統計上有意であるが、ＣＡＳＴ５対立遺伝子が品種及び最終形態にネストされた場合には、その関連性が、０．１＞Ｐ＞０．０５の偏差であることを示している。ＬＤピークフォースを説明する際にＣＡＳＴ５と品種との相互作用が不十分であることは、品種間の遺伝子頻度のいかなる相違も、ＣＡＳＴ５とＬＤピークフォースとの関連性に寄与していないことを意味する。表１１のセクションａ及びｂにおけるＣＡＳＴ５とＬＤピークフォースとの関連は、ＣＡＳＴ５を、ＬＤピークフォースと関連付けるいくつかの証拠を示すが、依然として偏りがあり、そのことが、市場やコーホート、品種、最終形態などの因子も補正される理由となっている。これらの因子を補正すると、関連性を支えるものを欠くことになる。ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ分析では、追加の因子の補正によって、関連性に関する証拠が改善され、同じサンプルを使用するので、どの方向に偏差が生じるかがわかる。かくして、関連性の支持の欠如は、おそらく、多数のカテゴリーの創出が原因で、品種及び最終形態にネストされた多数の対立遺伝子によって関連性を見出すことができないことを意味する。より多くの数の対立遺伝子は、純粋にカテゴリーの数が原因で、関連性の強さを弱めることが予想される（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、１９９５参照）。
【００５８】
ＬＤピークフォースを予測するために、ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ多型と併せてＣＡＳＴ５多型を使用することができる。ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅの場合、ｃ１１遺伝子型は、より高いピークフォース値に関連し、ｃ１２遺伝子型は中間の値に関連し、ｃ２２遺伝子型はより低いピークフォース値を有する。第２に、ＣＡＳＴ３  Ｄ／ＥとＣＡＳＴ５の間には連鎖不均衡がある。ハプロタイプの表を確認し、共通のマイクロサテライト対立遺伝子を見ると、ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ  ａ１（対立遺伝子１）は、ｍ７及びｍ９に対してその存在量が低いＣＡＳＴ５  ｍ３（対立遺伝子３）と最もよく関連付けられる。対照的に、ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ  ａ２（対立遺伝子）２は、ＣＡＳＴ５  ｍ９に最もよく関連し、ｍ３に対しても同様に関連性が大きく、ｍ７に対しては小さいがそれでも有意な関連性を有する。各ＣＡＳＴ５マイクロサテライト対立遺伝子に関して生のＬＤピークフォース値をプロットした図６を見ると、ＣＡＳＴ５  ｍ７及びｍ９のピークフォース値は低く、一方ＣＡＳＴ５  ｍ３のピークフォース値はより高いことが示されている。ｍ３対立遺伝子のほとんどは、実際にＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ  ａ２に関連し、ａ１には関連していないので（１０８対１４）、この高い値はＣＡＳＴ  Ｄ／Ｅ  ａ１の影響ではないと考えられる。低いピークフォース値を有するようにするため、ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ  ａ２を持つように選択された動物は、ＣＡＳＴ５  ｍ３を持つ場合には、依然としてより高いピークフォース値を有するので、むしろ、より正確に動物をグループ分けする手段を提供することができる。ＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ  ａ２並びにＣＡＳＴ  ｍ７又はｍ９の両方を持つ場合は、より低いピークフォース値を有する可能性がより大きくなると予想される。
【実施例４】
【００５９】
この実施例は、ＳＴＩＣ及びＳＴＡＤＨに対する個体群の関連性に関するＬＯＸ遺伝子でのＤＮＡマーカーの試験を示す。遺伝子型とＳＴＩＣ及びＳＴＡＤＨの両方との間には、統計上有意なポジティブな関連が繰り返し見出された。これは、通常と異なり、ヘテロ接合体が、若干の超優性を示す極値遺伝子型の１つであると考えられる。これらの関連は、連鎖不均衡を検出する構造を用いた６品種のウシの研究で見出され、遺伝子ＬＯＸが、結合組織強度に関連する遺伝因子を含むか又はその遺伝因子付近に位置することを示す。
【００６０】
材料及び方法
できる限り多様な遺伝的背景及び表現型背景を有するように、ＣＲＣ  ＤＮＡバンクからウシを選択した。２つのグループの動物を選択し、その第１の大きい組は関連を試験するために、また第２の小さい組はその関連性の対極部分を確認するために選択した（Ｂａｒｅｎｄｓｅ  １９９７；Ｂａｒｅｎｄｓｅ他、２０００参照）。ＣＲＣデータベースに記憶された情報を使用して、動物を選択した。半腱様筋のインストロン圧縮の極値を持つ動物を選択した。これらの動物の接着測定値もデータベースから抽出した。本質的にこの手順は、１頭の種雄が子孫の一団の親にならないように、かつ各極値ごとに全ての市場及び最終形態が含まれるように、表現型極値を持つコーホートごとにウシを選択して、極値は特定の市場又は最終形態によって偏ることがないようにした。合計で２５３の個体を選択したが、これらには、１６６の動物の第１のサンプルと、８７の動物の第２のサンプルが含まれていた（表１１）。
【００６１】
ＬＯＸ（リシルオキシダーゼ）ＤＮＡ断片に関し、プライマーＬＯＸ  Ｋ５：５’  ｔａｔ  ｃａｃ  ｔｇａ  ｔｇｔ  ｃａａ  ａｃｃ  ｔｇ  ３’及びＬＯＸ  Ｋ６：５’  ａｃｔ  ｃａｇ  ｇｃａ  ｃｃａ  ａａｔ  ａｇｃ  ｔｇ  ３’を使用して、ＤＮＡの遺伝子型を特定した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の条件は、アニーリング温度が摂氏６０度であり、塩化マグネシウム２．５ｍＭであり、試薬混合物はＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得た。ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ中にその断片に32Ｐ  ｄＣＴＰを組み込むことにより標識した。断片を、摂氏３７度で一晩かけてＨｉｎｆＩで消化し、その後、ゲル上に分離した。この断片を、オートラジオグラフィによって、室温で一晩かけてＸ線フィルムで視覚化した。対立遺伝子に、移行が最速の対立遺伝子を番号１にする番号順でスコアを付けた。
【００６２】
Ｓ−ＰＬＵＳソフトウェアを介して実行される、ＳＴＩＣ＝１＋固定効果にネストされた遺伝子型＋誤差という等式に従い、一般化線形モデル（ＧＬＭ）を使用して遺伝子型を分析した。ＳＴＡＤＨには同じモデルを使用する。考えられる固定効果は、品種、市場（国内、韓国、日本）、コーホート、地域（牧草対穀物、北対南）、及び年齢の共分散であった。年齢を含めたのは、ＬＯＸがコラーゲンの架橋に影響を及ぼしかつ架橋が年齢に関係したプロセスであって、架橋は時間と共に増大するものでからである。タウリンの種雄から純血育種した子孫には、北では牧草を与えなかったので、遺伝子型を地域及び品種にネストした。遺伝子型に関連する効果の大きさは、分散の比較によって評価した（例えばＡｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｋｌｕｎｄ及びＲｅｎｄｅｌ、１９９３）。遺伝子型置換に関連する効果の大きさを評価するために、ＬＯＸ遺伝子型を持たない同じモデルを適用した。残差を差し引き、ＬＯＸ遺伝子型と比較した。これらは、分散分析を使用して分析し、各遺伝子型ごとに補正された平均値を得た。
【００６３】
結果
ＬＯＸ多型には２つの対立遺伝子（図７）があり、これら対立遺伝子は共に全ての品種に見られるが、それらの品種間では遺伝子型の頻度に明らかな違いがある。遺伝子型の頻度に関し、コブウシ種とタウリン種の間には一貫した相違はない（表１２）。ヘレフォード種は、サンプル中のその他の品種全てに対して遺伝子型頻度が根本的に異なっている。ヘレフォード種は、遺伝子型「２２」の頻度が高いが、その他の品種全てでは遺伝子型「１１」の頻度が高い。
【００６４】
ＳＴＩＣ値とＳＴＡＤＨ値はＲ＝０．５２で相関している（図８〜１０）。このプロットでは、ＳＴＩＣ値が２つの明らかな極値領域を示すのに対し、ＳＴＡＤＨ値には長いテール部しかなく２つの離散的分散が示されていない。これは、サンプルがＳＴＩＣに関してのみ選択されたことを反映している。
【００６５】
ＳＴＩＣ及びＳＴＡＤＨに対するＬＯＸの分析（表１３及び１４）は、一貫した統計上有意な関連を示している。第１及び第２のサンプル、並びにＳＴＩＣ及びＳＴＡＤＨの両方を合わせたサンプルは、Ｐ＜０．０５でＬＯＸ遺伝子型に対して関連性を示す。ＬＯＸの関連性は、ＳＴＩＣよりもＳＴＡＤＨに対してより強いように思われる。ＳＴＡＤＨ表現型の第２のサンプルにおける関連性は統計上の有意性が極めて高いが、これは小さい母集団でのサンプリング及び極値表現型の特定の遺伝子型との一致性に起因すると考えられる。ＳＴＡＤＨの組合せ分析は第２のサンプルよりも極値領域が狭いが、ＬＯＸに対する確実な結びつきを示す（Ｐ＜０．０１）。
【００６６】
それにもかかわらず、これらは遺伝子型置換の効果は大きくなく、いくつかの実験では統計上の有意性を示さないことが明らかである。ＬＯＸ遺伝子型を残差ＳＴＩＣ及びＳＴＡＤＨと比較した場合、これらの関連は、サンプルであろうとデータを組み合せたものであろうと統計上全く有意性がなかった（表１５）。興味深いことに、これら比較のいくつかでは、ヘテロ接合体が極値表現型のものであり、この遺伝子座で超優性の可能性を開いたことを示す。これは、遺伝子型置換の影響が大きいＬＯＸ遺伝子でのその他の多型を使用して確認することが必要である。
【００６７】
考察
これまで行った分析の通り、サンプルがＳＴＩＣに関して極値的であるとしても、特性同士の相関関係に起因してＳＴＡＤＨ値が通常よりも大きく分散するだけであり、ＳＴＡＤＨ値はＳＴＩＣ値よりもＤＮＡマーカーとの関連がより大きいことが示される（図９）。ＳＴＩＣは、ＳＴＡＤＨより極値が選択されるように選択した。しかしこれらの測定値はいずれも、結合組織強度の態様を評価するものであり、接着は、簡単に言えば筋肉を引き離すのに必要とされる力、すなわち線維束に垂直に加えられる力を測定し、一方インストロン圧縮は、どのくらいの筋肉が断裂したり切断されずに平坦状態とすることができるかを測定する。ＳＴＩＣ値及びＳＴＡＤＨ値の分布を検査することによってわかるように、これらは完全には相関していない（図１０）。
【実施例５】
【００６８】
マーカーとＳＴＩＣとの関連は、極値的動物の２つのバッチを使用して実施例４で調べた。結果は、マーカーの遺伝子型とＳＴＩＣ（インストロン圧縮、Ｐ＜０．０５）及びＳＴＡＤＨ（接着、Ｐ＜０．０１）との間に有意な関連があることを示す。この結果は、遺伝子ＬＯＸが、結合組織強度に関連する遺伝因子を含むか、その遺伝因子付近に位置することを示している。
【００６９】
この調査は極値的動物のみ含む比較的小さい母集団（２５３）で行ったので、関連が依然として有効であるか否かを知るために同じマーカーを異なる母集団で試験した。
【００７０】
材料及び方法
母集団の他、ＬＯＸ遺伝子調査に関するインストロン圧縮（ＬＤＩＣ、１３６）及びピークフォース（ＬＤＰＦ、１３１）という２つのテール部から選択された動物を含む、別の２つの群がある。これら３つの極値的な群は、５５９の非極値的な個体と一緒に、ＬＯＸマーカーに関するこれらの分析の基礎を形成する。合計で９１７の個体を使用して調査をした（表１６）。
【００７１】
母集団の性質のため、分析は３つのデータセットに対して行った。
極値的動物のみ（３８９）：ＬＤＩＣ、ＬＤＰＦ、及びＳＴＰＦからの極値的動物を一緒にプールした。
非極値的動物（５５９）
組合せデータ（９１７）：１と２の組合せ。
【００７２】
ＳＴＩＣ、ＬＤＰＦ、及びＬＤＩＣの特性の他、その他の食肉の品質特性にＬＯＸ遺伝子が何らかの影響を与えるかどうかを知るために、その他の特性の範囲も評価した（表１７）。ＬＤ＿ＦＡＴ％及びＮＩＲ＿ＦＡＴ％からの筋肉内脂肪測定値を組合わせて、１つの特性を得た。
【００７３】
ＳＡＳ（バージョン８．０）の混合モデル手順（ＭＬＸ）を使用して、統計分析を実行した。このモデルの固定効果は、最終のグループ及びＬＯＸマーカーを含む。種雄及び同世代群は、不規則な影響因子として取り扱っている。これら効果の全てを個々の品種にネストした。使用した統計的モデルは下記の通りである。
特性＝平均＋品種内の種雄＋品種内の同世代群＋品種内の最終形態＋品種内のＬＯＸ＋屠体重量
【００７４】
同世代群は、集団起源、コーホート、及び屠殺コードの組合せと定義した。電気的刺激のない個体は分析データから除去した。屠体重量は、年齢差を調節する共変量として使用している。
【００７５】
有意なマーカー特性関連が混合モデル（又はＧＬＭ）分析から確認された場合は、完全対照モデルが実行される。そのような試験を行う目的は、ＬＯＸマーカーの遺伝子型における付加的、優性又は超優性な効果の可能性をさらに検査することである。３つの遺伝子型（１１、１２、及び２２）の完全対照は、ＳＡＳで下記の通りに設定する。
対照  「付加試験」ｌｏｘ（ｂコード）  １  ０  −１；
対照  「ホモ接合体１対ヘテロ接合体」  １  −１  ０
対照  「ヘテロ接合体対ホモ接合体２」  ０  １  −１
対照  「優性試験」ｌｏｘ（ｂコード）  −１  ２  −１；
対照  「劣性試験」ｌｏｘ（ｂコード）  −１  −１  ２；
対照  「超優性試験」ｌｏｘ（ｂコード）  ２  −１  −１
【００７６】
極値表現型を有する動物の遺伝子型を特定した極値母集団では、特性の潜在的相関関係を考慮するために多重特性論理回帰法（Ｈｅｎｓｈａｌｌ及びＧｏｄｄａｒｄ、１９９９）を適用した。この方法は回帰法をベースにするが、表現型を遺伝子型に回帰するのではなく、この回帰は表現型へ遺伝子型を回帰するものである。これは、表現型が選択されないという仮説に代え、遺伝子型に基づく選択は行われないという仮説を用いるものである（Ｈｅｎｓｈａｌｌ及びＧｏｄｄａｒｄ、１９９８）。論理回帰法を使用する前に、ＭＬＸモデルを全データ（９１７の動物）に使用して、個々の動物の予測値を導き出した。次いで有意な固定効果を調節した後に極値動物に関して予測された表現型の値を使用して、論理回帰分析を行った。この分析は単一特性論理回帰法から始め、次いで多重特性論理回帰法へと進めた。
【００７７】
異なる母集団におけるマーカーの遺伝子型頻度分布を表１８に示す。この表から、ヘレフォード種は、その遺伝子型頻度が、母集団におけるその他の品種全てと著しく異なることがわかる。全ての結果に対するヘレフォード種の歪んだ遺伝子型の潜在的な効果を調査するため、一組の追加の分析を、データセットからヘレフォード個体を除去することによって、その母集団に対して行なった。
【００７８】
結果及び考察
パートＩ  極値動物（表１９）
ＬＤＩＣに関する極値動物
最初の試験は、ＬＤＩＣに関して選択された動物（１３６）を含むサンプルに対して行った。分散分析から得た結果によれば、ＬＯＸマーカーの任意の遺伝子とＬＤＩＣとの間に密接な関連はないことが明らかにされる。これと同じ結果が、その他の食肉品質特性に対して得られた。
【００７９】
ＬＤＰＦに関する極値動物
ＬＤＩＣサンプルと同様に、ＬＤＰＦに関して選択されたバッチの動物では、ＬＯＸマーカーと任意の食肉品質特性との間に有意な変動は検出されなかった。結果は、ＣＢＸ実験での柔らかさに関する初期ＱＴＬが半腱様筋のインストロン圧縮測定で確認されたように、驚くべきものではない。
【００８０】
組合せ極値動物データ
分散分析。種雄の効果はその他の効果と混同するので、モデルから除去して、ＧＬＭ（一般化線形モデル）を実行した。この場合、同世代群は、不規則な効果ではなく固定効果として取り扱った。分散分析によれば、試験をした２１の食肉品質特性のうち、ＳＴＩＣ及びＬＤＬが有意な結果をもたらしたことが示される（Ｐ＜０．０５）。
【００８１】
完全対照モデル。完全対照モデルからの結果を以下に示す。ＳＴＩＣの場合、２つのホモ接合遺伝子型（１１と２２）の間には付加効果がなかったことがわかる。しかし、１１と１２の表現型の間の非常に有意な差は、優性効果及び超優性効果の検出に明らかに寄与していた。ＬＤＬに関しては何も顕著ではなかった。
【００８２】
論理回帰。全データに対する有意な固定効果を目的として調節した後、論理回帰をＳＴＩＣに適用した。ＳＴ測定値（ＳＴＩＣ、ＳＴＰＦ、ＳＴＡＤＨ）間の潜在的な相関関係が考慮されるよう、多特性論理回帰モデルも当てはめた。この結果は、他の方法から得た知見を確認するものである。すなわち、ＬＯＸ遺伝子型はＳＴＩＣに相関していた。ｌｏｘマーカーとＳＴＩＣとの回帰相関係数を、論理手順の出力に示す（下記）。ｌｏｘマーカーの対立遺伝子置換作用は、データ全体の総分散に基づいてＨｅｎｓｈａｌｌ及びＧｏｄｄａｒｄ（１９９９）により提示された式から得られた。ＳＴＩＣ、ＳＴＰＦ、及びＳＴＡＤＨに関する多特性論理回帰試験は、ＳＴＩＣとＳＴＰＦの両方がＬＯＸ遺伝子マーカーに対して著しい影響を及ぼすことを示している。ＳＴＰＦは、ＧＬＭ分析ではわずかに非有意的であった。（表２０）
【００８３】
パートＩＩ  ＣＲＣ非極値動物
ＣＲＣ  ＩのＬＯＸマーカーに対し、非極値動物（５５９）の遺伝子型を特定したが、この動物は、マーカー評価フェーズＩＩＩに関与する動物の一部ではない。分散の混合モデル分析は、ＳＴＩＣの他に、有意なマーカー特性関連が、筋肉内脂肪（ＦＡＴ）及びＬＤＰＨに対しても検出されたことを示す。しかし、ＳＴＩＣ及びＦＡＴに対する完全対照試験では、有意な結果をもたらす遺伝子型を正確に指摘することができていない。ＬＤＰＨの場合、２２遺伝子型はその結果を決定するのに重要な役割を持っていたと思われる。（表２１）
【００８４】
パートＩＩＩ  組合せデータ
極値及び非極値動物を一緒にプールした場合、分散の混合モデル分析から得た結果は、ｌｏｘマーカーがＳＴＩＣに関連していたことをやはり示している（Ｐ＜０．０５）。有意な結果は、屠体の色の濃さの測定値であるＳＴＬでも見られた。しかしどちらの場合も、完全対照モデルでは有意な遺伝子型の源を確認することができなかった。（表２２）
【００８５】
パートＩＶ  組合せ母集団からのヘレフォード個体の除去
ヘレフォード種のｌｏｘ遺伝子型のスキュー分布の可能性ある効果を試験するために、ヘレフォード種を除去した組合せデータに対しても追加の分析を行った。結果は、ヘレフォード種の動物を除去しても、組合せ母集団における全体的に有意なＳＴＩＣの結果にはほとんど変化がなかったことを示している。遺伝子型頻度分布表から、非極値ＣＲＣ母集団からの１つの動物を除き、大多数のヘレフォード個体が３つの極値母集団からのものであることがわかる。（表２３）
【００８６】
食肉品質特性に対するＬＯＸ遺伝子の影響に関する調査から得た全体的な結果は、３つの母集団（極値、非極値、及び組合せ）を通して一致していた。すなわち、ＬＯＸ遺伝子マーカーと半腱様筋のインストロン圧縮測定値とは強力な関連がある（Ｐ＜０．０５）。その他の食肉品質特性から得た有意な結果は、１つの母集団と別の母集団とでは異なっている。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、より柔らかい食肉をもたらす動物の選択及び繁殖に有用である。
【００８８】
【表１】
0004405152.tif 000002
【００８９】
【表２】
0004405152.tif 000003
【００９０】
【表３】
0004405152.tif 000004
【００９１】
0004405152.tif 000005
【００９２】
【表４】
0004405152.tif 000006
【００９３】
【表５】
0004405152.tif 000007
【００９４】
【表６】
0004405152.tif 000008
【００９５】
【表７】
0004405152.tif 000009
【００９６】
【表８】
0004405152.tif 000010
【００９７】
【表９】
0004405152.tif 000011
【００９８】
【表１０】
0004405152.tif 000012
【００９９】
【表１１】
0004405152.tif 000013
【０１００】
0004405152.tif 000014
【０１０１】
0004405152.tif 000015
【０１０２】
【表１２】
0004405152.tif 000016
【０１０３】
【表１３】
0004405152.tif 000017
【０１０４】
0004405152.tif 000018
【０１０５】
【表１４】
0004405152.tif 000019
【０１０６】
0004405152.tif 000020
【０１０７】
【表１５】
0004405152.tif 000021
【０１０８】
0004405152.tif 000022
【０１０９】
【表１６】
0004405152.tif 000023
【０１１０】
【表１７】
0004405152.tif 000024
【０１１１】
【表１８】
0004405152.tif 000025
【０１１２】
【表１９】
0004405152.tif 000026
【０１１３】
0004405152.tif 000027
【０１１４】
【表２０】
0004405152.tif 000028
【０１１５】
0004405152.tif 000029
【０１１６】
【表２１】
0004405152.tif 000030
【０１１７】
0004405152.tif 000031
【０１１８】
0004405152.tif 000032
【０１１９】
【表２２】
0004405152.tif 000033
【０１２０】
0004405152.tif 000034
【０１２１】
【表２３】
0004405152.tif 000035
【０１２２】
参考文献
下記の文書の内容を、参照により本明細書に援用する。
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｋｌｕｎｄ，Ｌ．及びＲｅｎｄｅｌ，Ｊ．１９９３、ウシの乳脂肪分に対する主遺伝子とアミラーゼＩローカスとの連鎖（Ｌｉｎｋａｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｍｙｌａｓｅ−Ｉ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｍｉｌｋ  ｆａｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ）、アニマルジェネティクス（Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）２４、１０１〜１０３
Ｂａｒｅｎｄｓｅ，Ｗ．１９９７、脂質代謝の評価（Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００８８２
Ｗ．Ｂａｒｅｎｄｓｅ及びＢ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ（２００１）多様な品種のウシの候補遺伝子リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）の遺伝子型の半腱様筋におけるインストロン圧縮及び接着に対する効果の分析（Ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｉｎｓｔｒｏｎ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｕｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  Ｌｙｓｙｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ（ＬＯＸ）ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂｒｅｅｄｓ）、ＣＲＣコマーシャルインコンフィデンスリポート（ＣＲＣ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ−ｉｎ−ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｒｅｐｏｒｔ）
Ｂａｒｅｎｄｓｅ，Ｗ．、Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｂ．、及びＬｉ，Ｙ．２０００、多様な品種のウシにおける候補遺伝子カルパスタチンでの遺伝子型のピークフォースに対する影響の分析（Ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｅａｋ−ｆｏｒｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂｒｅｅｄｓ）、牛肉品質ＣＲＣの機密報告書（Ｃｏｎｆｉｄｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｅｆ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ＣＲＣ）
Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｙ．、Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｅ．及びＨｉｎｅｓ，Ｈ．Ｃ．１９９９、ＳＳＣＰ分析によって検出されたウシカルパスタチン遺伝子のＤＮＡ多型（Ａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、アニマルジェネティクス（Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３０、８０
Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｙ．、Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｅ．Ｈｉｎｅｓ，Ｈ．Ｃ．、及びＷｕｌｆ，Ｄ．Ｍ．１９９９、ウシカルパスタチン遺伝子座でのＰＣＲ−ＳＳＳＣＰと、カルパスタチン活性及び食肉の柔らかさとの関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ａ  ＰＣＲ−ＳＳＳＣＰ  ａｔ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｗｉｔｈ  Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅａｔ  Ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）、オハイオライン掲示板特別回覧（Ｏｈｉｏｌｉｎｅ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ）１７０〜９９、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇ．ｏｈｉｏ−ｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｏｈｉｏｌｉｎｅ／ｓｃ１７０／ｓｃ１７０＿３．ｈｔｍｌ
Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｂ．、Ｃｕｃｃａ，Ｆ．、Ｈｅａｒｎｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｃｏｒｎａｌｌ，Ｒ．Ｊ．、Ｒｅｅｄ，Ｐ．Ｗ．、Ｒｏｎｎｉｎｇｅｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｕｎｄｌｉｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｎｉｓｔｉｃｏ，Ｌ．、Ｂｕｚｚｅｔｔｉ，Ｒ．、Ｔｏｓｉ，Ｒ．、Ｐｏｃｉｏｔ，Ｆ．、Ｎｅｒｕｐ，Ｊ．、ｏｒｎｅｌｉｓ，Ｆ．、Ｂａｒｎｅｔｔ，Ａ．Ｈ．、Ｂａｉｎ，Ｃ．、及びＴｏｄｄ，Ｊ．Ａ．１９９５、クロモソーム２ｑ３１〜ｑ３３に対するＩ型糖尿病罹患遺伝子（ＩＤＤＭ７）の連鎖不均衡マッピング（Ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ（ＩＤＤＭ７）ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２ｑ３１−ｑ３３）、ネイチャージェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）９、８０〜８５
Ｃｒｏｎｌｕｎｄ，Ａ．Ｌ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｄ．、Ｋａｇａｎ，Ｈ．Ｍ．１９８５、リシルオキシダーゼとＩ型コラーゲンの線維との結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｔｏ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、結合組織リサーチ（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１４、１０９〜１１９
Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．、Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｂ．、Ｂｙｒｎｅ，Ｋ．、Ｂｏｔｅｒｏ，Ｆ．Ａ．、Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍ．、Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｐ．、Ｌｅｎａｎｅ，Ｉ．、Ｌｉ，Ｙ．、Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｒ．、及びＭｏｏｒｅ，Ｓ．Ｓ．１９９９、食肉品質に対する候補遺伝子（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅａｔ  Ｑｕａｌｉｔｙ）、１９９８〜１９９９年研究計画に関する素案、ウシ及び牛肉ＣＲＣの商業上機密の報告書（Ｃａｔｔｌｅ  ａｎｄ  Ｂｅｅｆ  ＣＲＣ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ−Ｉｎ−Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔ）
Ｅｋｈｏｌｍ，Ｅ．Ｃ．、Ｒａｖａｎｔｉ，Ｌ．、Ｋａｈａｒｉ，Ｖ．、Ｐａａｖｏｌａｉｎｅｎ，Ｐ．及びＰｅｎｔｔｉｎｅｎ，Ｒ．Ｐ．２０００、細胞外マトリックス遺伝子の発現：ラチリスムに罹ったラットの脛骨骨折治癒における形質転換成長因子（ＴＧＦ）β１及びｒａｓ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｅｎｅｓ：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−ｂｅｔａ１  ａｎｄ  ｒａｓ  ｉｎ  ｔｉｂｉａｌ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｔｈｙｒｉｔｉｃ  ｒａｔｓ）、ボーン（Ｂｏｎｅ）２７、５５１〜５５７
Ｇｅｅｓｉｎｋ，Ｇ．Ｈ．及びＫｏｏｈｍａｒａｉｅ，Ｍ．１９９９、ヒツジ長期死後貯蔵期間中の、筋肉倍増形質及び正常な小ヒツジの大腿二頭筋での死後タンパク質分解及びカルパイン／カルパスタチン活性（Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｌｐａｉｎ／ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｌｌｉｐｙｇｅ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｌａｍｂ  ｂｉｃｅｐｓ  ｆｅｍｏｒｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｓｔｏｒａｇｅ）、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．７７、１４９０〜１５０１
Ｇｉａｍｐｕｚｚｉ，Ｍ．、Ｂｏｔｔｉ，Ｇ．、Ｃｉｌｌｉ，Ｍ．、Ｇｕｓｍａｎｏ，Ｒ．、Ｂｏｒｅｌ，Ａ．、Ｓｏｍｍｅｒ，Ｐ．、Ｄｉ  Ｄｏｎａｔｏ，Ａ．２００１、Ｒａｓ癌原遺伝子の恒常的活性化によって特徴付けられたＮＲＫ−４９Ｆ細胞におけるリシルオキシダーゼ誘発型腫瘍化のダウンレギュレーション（Ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＮＲＫ−４９Ｆ  ｃｅｌｌｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
Ｊ．Ｈｅｎｓｈａｌｌ及びＭ．Ｇｏｄｄａｒｄ（１９９９）論理回帰を使用して選択的に遺伝子型を特定した後の量的形質遺伝子座の多形質マッピング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｒａｉｔ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ  ａｆｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１５１：８８５〜８９４
Ｙ．Ｌｉ（２０００）ＣＲＣ分子遺伝学プログラム年次報告（ＣＲＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ）、ＣＲＣコマーシャルインコンフィデンスリポート（ＣＲＣ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ−ｉｎ−ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｒｅｐｏｒｔ）
Ｌｏｎｅｒｇａｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｅｒｎｓｔ，Ｃ．Ｗ．、Ｂｉｓｈｏｐ，Ｍ．Ｄ．、Ｃａｌｋｉｎｓ，Ｃ．Ｒ．、及びＫｏｏｈｍａｒａｉｅ，Ｍ．１９９５、ウシカルパスタチン遺伝子座での制限断片長多型（ＲＦＬＰ）と、カルパスタチン活性及び食肉の柔らかさとの関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＲＦＬＰ）ａｔ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｔｏ  ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅａｔ  ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ  ７３、３６０８〜３６１２
Ｋｏｏｈｍａｒａｉｅ，Ｍ．１９９４、筋肉タンパク質分解酵素及び食肉熟成（Ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｅａｔ  ａｇｉｎｇ）、ミートサイエンス（ｍｅａｔ  Ｓｃｉ．）３６：９３
Ｎｅｌｌａｉａｐｐａｎ，Ｋ．、Ｒｉｓｉｔａｎｏ，Ａ．、Ｌｉｕ，Ｇ．、Ｎｉｃｋｌａｓ，Ｇ．、及びＫａｇａｎ，Ｋ．Ｍ．２０００、完全に処理されたリシルオキシダーゼ触媒は細胞外スペースから大動脈平滑筋細胞に転位する（Ｆｕｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ  ｉｎｔｏ  ｎｕｃｌｅｉ  ｏｆ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｍｏｏｔｈ−ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９、５７６〜５８２
Ｎｏｎｎｅｍａｎ，Ｄ．、Ｋａｐｐｅｓ，Ｓ．Ｍ．、及びＫｏｏｈｍａｒａｉｅ，Ｍ．１９９９、速報：ウシカルパスタチン遺伝子のプロモーター領域における多型マイクロサテライト（Ｒａｐｉｄ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ｇｅｎｅ）、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ  ７７、３１１４〜３１１５
Ｓｌｅｅ，Ｒ．Ｂ．、Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．Ｇ．、Ｌａｒｇｕｅ，Ｐ．、Ｈａｒｌｏｗ，Ｃ．Ｒ．、Ｍｉｅｌｅ，Ｇ．、およびＣｌｉｎｔｏｎ，Ｍ．２００１、ラット顆粒膜細胞における結合組織成長因子及びリシルオキシダーゼメッセンジャーリボ核酸の分化依存発現（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌｓ）、内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）１４２、１０８２〜１０８９
Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｊ．Ｄ．１９９５、形質座位と１つ又は複数の多型マーカー座位との連鎖不均衡を分析するための強力尤度法（Ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ  ａｎｄ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｌｏｃｉ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５６、７７７〜７８７
Ｗｈｉｐｐｌｅ，Ｇ．、Ｋｏｏｈｍａｒａｉｅ，Ｍ．、Ｄｉｋｅｍａｎ，Ｍ．Ｅ．、Ｃｒｏｕｓｅ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｎｔ，Ｍ．Ｃ．、Ｋｌｅｍｍ，Ｒ．Ｄ．１９９０、  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ及びＢｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓウシの最長筋の柔らかさに影響を及ぼす属性の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｈａｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ  ｃａｔｔｌｅ）、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６８、２７１６〜２７２８
Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｂ．Ｗ．、ＤｅＮｉｓｅ，Ｓ．Ｋ．、及びＭａｒｃｈｅｌｌｏ，Ｊ．Ａ．２０００、半同胞の非去勢ウシ及び去勢ウシから得た生前及び死後の筋肉におけるカルパスタチン活性測定値の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｅ−ａｎｄ  ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｒｏｍ  ｈａｌｆ−ｓｉｂ  ｂｕｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｅｒｓ）、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．７８、８０４〜８０９
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】左から右に１１、２２、ブランク、１１、１２、１２、１２、１２、１１、２２と並ぶＣＡＳＴ３  Ｄ／Ｅ多型の遺伝子型を示す、１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）ゲルの写真である。
【図２】図２ａ及び図２ｂは、それぞれ１６９及び７７の動物の２つのサンプルでの、Ｗａｒｎｅｒ−Ｂｒａｔｚｌｅｒピークフォース測定値の分布を示す図である。極値を使用したので、その分布に中間がないことに留意されたい。分布は２モードを示唆していない。これらの図では尺度が異なることに留意されたい。
【図３】図３ａ及び図３ｂは、ＣＡＳＴ遺伝子型に対する生のＷａｒｎｅｒ−Ｂｒａｔｚｌｅｒピークフォース測定値をプロットした図である。分布の極値を使用したので、中間にギャップがあることに留意されたい。２つのサンプルの分布は類似していることに留意されたい。
【図４】第１のサンプルの各遺伝子型に関する残差Ｗａｒｎｅｒ−Ｂｒａｔｚｌｅｒピークフォース測定値（Ｘ１）をボックスプロットした図である。中央値から４分の１及び４分の３パーセンタイル、ウィスカー、及び外れ値を示す。
【図５】ＣＡＳＴ５マイクロサテライトに関するＤＮＡ断片サイズの分布を示す図である。水平軸は各対立遺伝子の頻度であり、垂直軸はＤＮＡ断片サイズである。対立遺伝子は、ＤＮＡ断片サイズを増大する際に標識し、従ってこの分布における対立遺伝子ｍ１は１３２ｂｐ未満であり、ｍ２＜１３６ｂｐ、ｍ３＜１３８ｂｐ、ｍ４＜１４２ｂｐ、ｍ５＜１４４ｂｐ、ｍ６＜１４６ｂｐ、ｍ７＜１４８ｂｐ、ｍ８＜１５１ｂｐ、ｍ９＜１５３ｂｐ、ｍ１０＜１５５ｂｐ、ｍ１１＜１５７ｂｐ、ｍ１２＜１５９ｂｐ、ｍ１３＜１６１ｂｐである。ＤＮＡ断片は、いくつかの２ｂｐのまとまりの一部、例えば１３４ｂｐ未満のまとまりでは見られず、これらは極めてまれか又は存在しなかった。
【図６】垂直軸に沿って示した各ＣＡＳＴ５マイクロサテライト対立遺伝子に対し、水平軸に沿って生のＬＤピークフォース値を示したボックスプロットである。ボックスは、ドットで表した中央値を含み、ボックスは２５及び７５パーセンタイルを表し、ウィスカーは予測される分布範囲を示し、外れ値は白抜きの円で示す。ｍ１やｍ２、ｍ１３などいくつかの対立遺伝子がまれに存在するので、この図を解釈する際には注意を払わねばならず（全分布に関しては図５参照）、かくしてこれらの対立遺伝子についてなされた解釈は、特に参考になるものではない。これは極値の分布であり、従って中央値は、サンプルの半分が高い値である場合に低い値から高い値まで振れることに特に留意されたい。
【図７】左から右に１１、１１、１２、１２、１２、１１と並ぶＬＯＸの遺伝子型を示す、１本鎖高次構造多型ゲルの写真である。
【図８】１６６と８７の動物の２つのサンプルを合わせた、インストロン圧縮測定値の分布を示す図である。極値を使用したので分布に中間がないことに留意されたい。この分布は２モードであることを示唆していない。
【図９】１６６と８７の動物の２つのサンプルを合わせた、接着測定値の分布を示す図である。サンプルは、インストロン圧縮の極値に対して選択したが、これは一連の極値的な接着測定値に変換されていない。
【図１０】合わせたサンプルのＳＴＡＤＨに対するＳＴＩＣのプロットを示す図である。選択されたＳＴＩＣ値によって不均一性が生じたことに留意されたい。
【配列表】
0004405152.tif 000036
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【図１】
0004405152.tif 000038
【図２】
0004405152.tif 000039
【図３】
0004405152.tif 000040
【図４】
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【図５】
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【図６】
0004405152.tif 000043
【図７】
0004405152.tif 000044
【図８】
0004405152.tif 000045
【図９】
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【図１０】
0004405152.tif 000047