(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭ １１２４８の下、１９９６年１０月１８日に寄託されたＡＡＶ ＤＮＡ。
【請求項２】
ＤＳＭ １１８１７の下、１９９７年１０月１５日に寄託されたＡＡＶ ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＡＡＶ ＤＮＡ、ｒＡＡＶベクターおよび哺乳類細胞を含有してなる系であって、該細胞が、ＡＡＶの吸着および増殖を可能にする、系。
【請求項４】
ヘルパーウイルスが混入していないｒＡＡＶウイルス粒子製剤の生産のための、請求項１または２記載のＡＡＶ ＤＮＡの使用。
【請求項５】
ヘルパーウイルスが混入していないｒＡＡＶウイルス粒子製剤の生産のための、請求項３記載の系の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヘルパーウイルス配列を有するＡＡＶ  ＤＮＡ、かかるＤＮＡを含む系およびその使用に関する。
ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）は、パルボウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウイルスである。それらの複製のため、すなわち、ウイルス粒子を形成するため、ＡＡＶは、ヘルパーウイルス、具体的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイルスを必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、宿主細胞のゲノム、具体的には、第１９染色体の特異的な部位に組み込む。
ＡＡＶのゲノムは直鎖状であり、約４６８０ヌクレオチドの長さを有する。それは、構造遺伝子および非構造遺伝子をコードする２つの読み枠を含有する。該構造遺伝子をｃａｐ遺伝子という。それは、Ｐ４０プロモーターにより制御され、３つのキャプシドタンパク質をコードする。該非構造遺伝子をｒｅｐ遺伝子といい、Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする。前者２つのタンパク質は、Ｐ５プロモーターの制御下で発現し、一方、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０の発現は、Ｐ１９プロモーターにより制御されている。Ｒｅｐタンパク質の機能は、とりわけ、ＡＡＶゲノムの複製と転写の制御により代表される。
組換え（ｒ）ＡＡＶウイルス粒子の標品は、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスが頻繁に混入していることが知られている。この混入は、遺伝子治療のためのｒＡＡＶウイルス粒子の使用を著しく限定する。ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離または濾過法によりヘルパーウイルスを除去するためになされた努力は、これまで、ほとんど成功をおさめず、とりわけ、これらの方法は、コストおよび収率の点で消極的であることを証明するステップを含む。
したがって、本発明の目的は、ｒＡＡＶウイルス粒子がヘルパーウイルスの混入なしに提供されうる産物を提供することにある。
本発明によれば、これは、請求項に規定された主題により達成される。
したがって、本発明の主題は、ＡＡＶウイルス粒子の生成に必要なヘルパーウイルス配列を有するＡＡＶ  ＤＮＡに関する。
本発明は、本発明のＡＡＶ  ＤＮＡが細胞に一般に存在するｒＡＡＶベクターを誘導し、かつｒＡＡＶウイルス粒子を生じさせる目的のヘルパーウイルスの添加を必要とすることなく同じ目的の外来ＤＮＡを含むために役に立つという出願人の知見に基づく。
「ＡＡＶ  ＤＮＡ」の語は、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要なヘルパーウイルス配列を含んでもよいいかなるＡＡＶ  ＤＮＡ配列をも含有する。
「ヘルパーウイルス配列」の語は、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要なヘルパーウイルスのいかなる配列にも関する。かかる配列は、具体的には、ヘルペスウイルスおよび／またはアデノウイルス由来であり、より具体的にはアデノウイルス５由来である。該配列は、ウイルスゲノム全体またはその断片を含有してもよい。
「ｒＡＡＶベクター」の語は、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要である、ヘルパーウイルスのＤＮＡを除く外来ＤＮＡを含んでもよい、いかなるＡＡＶウイルス粒子およびそのＤＮＡをも含有する。
前記例外において、「外来ＤＮＡ」の語は、ＡＡＶベクターに組み込まれうるいかなるＤＮＡにも関する。該外来ＤＮＡは、非コードまたはコードであってもよい。前者の場合、該外来ＤＮＡは、ＤＮＡ複製および／または転写の制御エレメントであってもよい。後者の場合、外来ＤＮＡが発現可能であることが好ましく、発現が、組織特異的なプロモーターなどの誘導可能なプロモーターにより制御されることが特に有利である。さらに、該外来ＤＮＡは診断用および／または治療用タンパク質をコードしてもよい。治療用タンパク質の例示は、腫瘍壊死因子、血漿タンパク質およびレセプターなどである。さらに、該外来ＤＮＡは、ＡＡＶベクターのいかなる部位にも挿入してもよい。
本発明のＡＡＶ  ＤＮＡは一般の方法により調製されうる。補遺として、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら，モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・ハンドブック〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ〕（１〜３巻），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（１９８９）が参照される。さらに、実施例１において、本発明のｐＴＧ９５８５  ＡＡＶ  ＤＮＡの調製が参照される。このＡＡＶ  ＤＮＡは、ヘルパーウイルス配列として、Ｅ１領域を除く完全なアデノウイルス５配列を含有する。ｐＴＧ９５８５が好ましい。それは、ＤＳＭ〔Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ〕，ブラウンシュヴェーグに、ＤＳＭ  １１２４８の番号の下、プラスミドｐＴＧ９５８５として、１９９６年１０月１８日に寄託された（本寄託は、ブダペスト条約に基づく国際寄託である）。また、本発明のＡＡＶ  ＤＮＡは、アデノウイルス５配列の構造遺伝子Ｌ１、具体的には１６６１４〜１８６６９のヌクレオチドの領域における欠失を有するｐＴＧ９５８５とは異なるものが好ましい。このＡＡＶ  ＤＮＡを、ｐＴＧ９５８５Δ１６６１４〜１８６６９という。なお、本発明のＡＡＶ  ＤＮＡは、全１８３２３塩基対から、一方の欠失がアデノウイルスのキャプシド遺伝子の大部分に関し、他方の欠失がアデノウイルスのＥ３領域に関する２つの欠失を含有する点でｐＴＧ９５８５とは異なるものが好ましい。このＡＡＶ  ＤＮＡをｐＤＧといい、ＤＳＭに、プラスミドｐＤＧとして、ＤＳＭ  １１８１７の番号の下、１９９７年１０月１５日に寄託された（本寄託は、ブダペスト条約に基づく国際寄託である）。
本発明のさらなる主題は、前記の成分、すなわち、ＡＡＶ  ＤＮＡ、ｒＡＡＶベクターおよび任意に細胞を含有する系に関する。該ＡＡＶ  ＤＮＡおよび／または該細胞は、ｒＡＡＶベクターのＡＡＶ配列に関して、相補体を表わす。「細胞」の語は、ＡＡＶの吸着および増殖を可能にする、いかなる細胞、特に哺乳類細胞にも関する。
本発明により、ヘルパーウイルスを使用することがないｒＡＡＶウイルス粒子標品を提供することが可能である。したがって、該ｒＡＡＶウイルス粒子標品もヘルパーウイルスを含まない。これは、特に本発明のｐＤＧ  ＡＡＶ  ＤＮＡが使用されるときに示される。さらに、該ｒＡＡＶウイルス粒子標品は、ＡＡＶ野生型を含まない点が特徴的である。それらも本発明の主題を表わす。
本発明のｒＡＡＶウイルス粒子標品は、細胞の形質導入に完全に適する。それらの使用に先立って該標品をＤＮアーゼで遊離のＡＡＶ  ＤＮＡが分解されるように処理することが好ましい。考慮される細胞は、身体に存在する、あるいは身体から単離されるあらゆる細胞である。それゆえ、本発明により、エクス・ビボおよびイン・ビボ遺伝子治療用の処置を講ずることが可能である。
図面の説明
図１は、本発明のｐＴＧ９５８５  ＡＡＶ  ＤＮＡを得るためのクローニングストラテジーを示す。
図２は、本発明のｐＤＧ  ＡＡＶ  ＤＮＡを得るためのクローニングストラテジーを示す。
本発明を下記実施例により説明する。
実施例１：本発明のＡＡＶ  ＤＮＡ  ｐＴＧ９５８５の調製
ｐＴＧ９５８５を得るためのクローニングストラテジーを図１に示す。ＰＵＣ８ＭＭＴＶ〔ファゼル（Ｆａｓｅｌ）ら，（１９８２），ＥＭＢＯ  Ｊ．１，３〜７頁〕由来のＭＭＴＶ  ＬＴＲ断片をプラスミドｐＢＳＳＫＩＩ（＋）〔ストラタジーン社〕のマルチクローニング部位に挿入する。ついで、完全なｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにＡＡＶ２プロモーターであるｐ１９およびｐ４０を含む、ｐＡＶ２由来の４２３５ｐｂのＡＡＶ２配列〔Ｇｅｎｅ  ２３，６５−７３（１９８３）〕を、合成オリゴヌクレオチドアダプターにより該プラスミドに挿入する。したがって、得られたプラスミドｐＢＭＡ２において、Ｒｅｐ７８タンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現をそれぞれ制御するＡＡＶ２プロモーターｐ５が、ＭＭＴＶプロモーターにより置き換えられる。ついで、ＭＭＴＶ−ＬＴＲならびにＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子からなる完全な発現カセットを、ベクターｐＡｄＲＳＶβｇａｌ〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，６２５−６３０〕にＲＳＶ−βｇａｌ断片の代わりに挿入する。このように得られたプラスミドｐＡＭＡ２中において、該ＭＭＴＶ−ＡＡＶ２断片は、アデノウイルスの配列が両側に隣接する〔５’：０−１．０マップ単位；３’：９．４−１８マップ単位〕。
相同組換え〔シャルティエ（Ｃｈａｒｔｉｅｒ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，４８０５−４８１０頁（１９９６）〕により、ｐＡＭＡ２由来のＭＭＴＶ−ＡＡＶ２断片をプラスミドｐＴＧ３６０２〔前記、シャルティエ（Ｃｈａｒｔｉｅｒ）らを参照〕に挿入する。したがって、得られたプラスミドｐＴＧ９５８５は、ＭＭＴＶ−ＡＡＶ２断片により置き換えられるＥ１領域を除き、完全なアデノウイルス５配列を含む。ｐＴＧ９５８５は、本発明のＡＡＶ  ＤＮＡを表す。
実施例２：本発明のｐＴＧ９５８５Δ１６６１４−１８６６９  ＡＡＶ  ＤＮＡの調製
ＲｓｒＩＩを用いる制限消化により、ヌクレオチド１０９８３−１８６７０の欠失（値はアデノウイルス５配列に関する）を実施例１で調製したＡＡＶ  ＤＮＡ  ｐＴＧ９５８５に挿入する。その後、欠失させたＤＮＡ分子にヌクレオチド１０９６３−１６６１３を含むサブフラグメントを再び挿入する。したがって、該欠失は、アデノウイルス５の構造遺伝子Ｌ１由来の２０５６ｂｐ（ヌクレオチド１６６１４−１８６６９）の範囲を含有する。本発明のｐＴＧ９５８５Δ１６６１４−１８６６９  ＡＡＶ  ＤＮＡが得られる。
実施例３：本発明のｐＤＧ  ＡＡＶ  ＤＮＡの調製
ＣｌａＩおよびＳｇｆＩを用いる制限消化により、実施例１で調製したＡＡＶ  ＤＮＡ  ｐＴＧ９５８５に、ヌクレオチド５５２８−２３６７７の欠失を挿入する。この欠失（１８１４９塩基対）は、ｒＡＡＶウイルス粒子の形成に重要なアデノウイルス５キャプシド遺伝子およびＶＡ領域の大部分を含有する。この領域（１７０４塩基対）を、ｐＴＧ９５８５の残りのＣｌａＩ／ＳｇｆＩ断片に再び付加する。この目的のために、アデノウイルスのＶＡ領域っをＰＣＲにより増幅し、前記ＣｌａＩ／ＳｇｆＩ断片と連結しうるＶＡ断片を得るように、それぞれ、ＣｌａＩおよびＳｇｆＩに和合可能な５’末端および３’末端それぞれとともに提供する。１６４４５塩基対の欠失を含むＡＡＶ  ＤＮＡ  ｐＴＧ９５８５が得られる。このＡＡＶ  ＤＮＡをｐＴＧ９５８５Δ１６４４５という。
さらなる欠失をｐＴＧ９５８５Δ１６４４５に挿入する。それはアデノウイルス５−Ｅ３領域に関連し、１８７８塩基対（３０８２７−３２７０５）を含有するＸｂａＩ断片として存在する。この目的のために、ｐＴＧ９５８５をＢｇｌＩ消化に供し、アデノウイルス５−Ｅ３領域を含有するＢｇｌＩ断片（２７０９７−３．４４５）を単離し、ｐＢＳＳＫＩＩ（ストラタジーン）にクローン化する。得られたＤＮＡ分子は、前記ＸｂａＩ断片を分離しうるように、ＸｂａＩ消化に供される。該ＤＮＡ分子の残りを再連結し、ＢｇｌＩ消化後、アデノウイルス５−Ｅ３領域を欠く得られたＢｇｌＩ断片を相同組換えによりｐＴＧ９５８５Δ１６４５５に挿入する。本発明のｐＤＧ  ＡＡＶ  ＤＮＡが得られる。
【図１】
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【図２】
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