(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0004402296.tif 000016
［式中、
（Ａ１〜Ａ５）はヒトインスリンのＡ鎖における位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基であり、
（Ａ15〜Ａ19）はヒトインスリンのＡ鎖における位置Ａ15〜Ａ19のアミノ酸残基であり、
（Ｂ８〜Ｂ18）はヒトインスリンのＢ鎖における位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、
（Ｂ20〜Ｂ29）はヒトインスリンのＢ鎖における位置Ｂ20〜Ｂ29のアミノ酸残基であり、
Ｒ８はＴｈｒであり、
Ｒ９はＳｅｒであり、
Ｒ10はＩｌｅであり 、
Ｒ14はＴｙｒであり、
Ｒ21はＡｓｎであり、
Ｒ１はＰｈｅであり、
Ｒ２はＶａｌであり、
Ｒ３はＡｓｎ、ＨｉｓまたはＡｓｐであり、
Ｒ４はＧｌｎであり、
Ｒ30はＴｈｒ、または−ＯＨであり、
Ｚは水素原子、またはＨｉｓであり、
ただし、Ｚが水素原子である場合には、Ｒ３はＨｉｓまたはＡｓｐであり、Ｒ30はＴｈｒであり、ＺがＨｉｓである場合には、Ｒ３はＡｓｎであり、Ｒ30は−ＯＨである］
のインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩。
【請求項２】
Ｂ鎖は配列：
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys（配列番号：３）
を有する、Ｈｉｓ（Ｂ０）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリンである、請求項１記載のインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩。
【請求項３】
Ｂ鎖は配列：  
Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr（配列番号：１０）
を有する、Ｈｉｓ（Ｂ３）−ヒトインスリンである、請求項１記載のインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩。
【請求項４】
Ｂ鎖は配列：  
Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr（配列番号：１１）
を有する、Ａｓｐ（Ｂ３）−ヒトインスリンである、請求項１記載のインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩の製造方法において、アミノ酸配列II
Met-X2m-(Arg)p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21  （II)
［式中、
Ｘ1nはｎ個のアミノ酸残基（ｎは０〜３４の整数である）を有するペプチド鎖であり、
Ｘ2mはｍ個のアミノ酸残基（ｍは０〜２０の整数である）を有するペプチド鎖であり、
ｐは０、１または２であり、
他の記号は請求項１に述べた意味を有し、請求項１に述べたただし書きの条件はこの場合も適用される］
を有するインスリン同族体の前駆体をコードするＤＮＡ配列を含有する複製可能な発現ビヒクルの構築、宿主細胞における発現および化学的および／または酵素的方法を用いるその前駆体からのインスリン同族体の放出からなる方法。
【請求項６】
宿主細胞は細菌である請求項５記載の方法。
【請求項７】
細菌は大腸菌である請求項６記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞は酵母である請求項５記載の方法。
【請求項９】
酵母はSaccharomyces cerevisiaeである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項５記載のインスリン同族体の前駆体。
【請求項１１】
請求項１０記載のインスリン同族体の前駆体をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１記載のＤＮＡからなる発現ビヒクル。
【請求項１３】
請求項１２記載の発現ビヒクルを用いてトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１種のインスリン同族体および／またはその少なくとも１種の生理学的に許容されうる塩からなる医薬製剤。
【請求項１５】
インスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩を溶解型、無定形型および／または結晶型で含有する請求項１４記載の医薬製剤。
【請求項１６】
さらにデポ補助剤を含有する請求項１４または１５記載の医薬製剤。
【請求項１７】
デポ補助剤はプロタミン硫酸塩であり、インスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩はプロタミン硫酸塩との共晶として存在する請求項１６記載の医薬製剤。
【請求項１８】
付加的に修飾していないヒトインスリンを含有する請求項１４〜１７のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項１９】
付加的にインスリン同族体のGly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-ヒトインスリンを含有する請求項１４〜１８のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれかに記載の医薬製剤の溶解型からなるインスリン活性を有する注射用溶液。
【請求項２１】
１mlあたり１μg〜２mgの亜鉛を含有する請求項２０記載の注射用溶液。
【請求項２２】
１mlあたり５μg〜２００μgの亜鉛を含有する請求項２１記載の注射用溶液。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれかに記載のインスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩の作用発現遅延型インスリン活性を有する医薬製剤の製造のための使用。
【請求項２４】
インスリンヘキサマーおよびインスリンヘキサマーあたり４〜７個の亜鉛イオンからなるインスリン-亜鉛錯体において、インスリンヘキサマーは式Ｉ
【化２】
0004402296.tif 000017
［式中、
（Ａ１〜Ａ５）はヒトインスリンのＡ鎖における位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基であり、
（Ａ15〜Ａ19）はヒトインスリンのＡ鎖における位置Ａ15〜Ａ19のアミノ酸残基であり、
（Ｂ８〜Ｂ18）はヒトインスリンのＢ鎖における位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、
（Ｂ20〜Ｂ29）はヒトインスリンのＢ鎖における位置Ｂ20〜Ｂ29のアミノ酸残基であり、
Ｒ８はＴｈｒであり、
Ｒ９はＳｅｒであり、
Ｒ10はＩｌｅであり 、
Ｒ14はＴｙｒであり、
Ｒ21はＡｓｎであり、
Ｒ１はＰｈｅであり、
Ｒ２はＶａｌであり、
Ｒ３はＡｓｎ、ＨｉｓまたはＡｓｐであり、
Ｒ４はＧｌｎであり、
Ｒ30はＴｈｒ、または−ＯＨであり、
Ｚは水素原子、またはＨｉｓであり、
ただし、Ｚが水素原子である場合には、Ｒ３はＨｉｓまたはＡｓｐであり、Ｒ30はＴｈｒであり、ＺがＨｉｓである場合には、Ｒ３はＡｓｎであり、Ｒ30は−ＯＨである］
のインスリン同族体６分子から構成されるインスリン−亜鉛錯体。
【請求項２５】
インスリンヘキサマーは請求項１〜４のいずれかに記載の式Ｉのインスリン同族体６分子から構成される請求項２４記載のインスリン-亜鉛錯体。
【請求項２６】
式Ｉのインスリン同族体のＢ鎖は配列：
Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr（配列番号：１０）
を有する請求項２４記載のインスリン−亜鉛錯体。
【請求項２７】
式Ｉのインスリン同族体のＢ鎖は配列：
Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr（配列番号：１１）
を有する請求項２４記載のインスリン-亜鉛錯体。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれかに記載の少なくとも１種のインスリン-亜鉛錯体からなる医薬製剤。
【請求項２９】
請求項２４〜２７のいずれかに記載の少なくとも１種のインスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩ならびに適当量の亜鉛イオンの酸性溶液からなり請求項２４〜２７のいずれかに記載のインスリン−亜鉛錯体の形成を可能にする医薬製剤。
【請求項３０】
請求項１〜４のいずれかに記載のインスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩ならびに適当量の亜鉛イオンの酸性溶液からなり請求項２５記載のインスリン−亜鉛錯体の形成を可能にする請求項２９記載の医薬製剤。
【請求項３１】
請求項２６または２７記載の少なくとも１種のインスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩ならびに適当量の亜鉛イオンの酸性溶液からなり、請求項２６または２７記載のインスリン-亜鉛錯体の形成を可能にする請求項２９記載の医薬製剤。
【請求項３２】
インスリン−亜鉛錯体を溶解型、無定形型および／または結晶型で含有する請求項２８〜３１のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項３３】
請求項３２記載の医薬製剤の溶解型からなるインスリン活性を有する注射用溶液。
【請求項３４】
１mlあたり１μg〜２mgの亜鉛を含有する請求項３３記載の注射用溶液。
【請求項３５】
１mlあたり５μg〜２００μgの亜鉛を含有する請求項３４記載の注射用溶液。
【請求項３６】
請求項２４〜２７のいずれかに記載のインスリン−亜鉛錯体 の作用発現遅延型インスリン活性を有する医薬製剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、亜鉛結合能が増大したインスリン同族体、ヒトインスリンに比較して作用の遅延型プロファイルを有するその安定な亜鉛錯体、それらの製造方法、およびそれらの使用、とくに糖尿病Ｉ型およびまたII型の治療のための医薬製剤における使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
世界中で約１億２千万人が糖尿病に冒されている。これらの中で約１千２百万人はＩ型の糖尿病であり、それには、失われた内分泌性インスリン分泌の置換が現在可能な唯一の治療である。これらの患者にはインスリンの注射が処方され、通常１日数回の注射を一生続けることになる。Ｉ型糖尿病と異なり、II型糖尿病には基本的にインスリンの欠損はないが、大多数の症例で、とくに進行した段階では、必要に応じて経口抗糖尿病薬と組み合わせたインスリンによる治療が最も好ましい治療形態と考えられている。
【０００３】
健康人では、膵臓によるインスリンの放出は血中グルコース濃度に厳密に連携している。食後に起こるような血中グルコースレベルの上昇は、インスリン分泌の相当する上昇によって急速に補償される。絶食状態では、血漿インスリンレベルはインスリン感受性臓器および組織へのグルコースの連続的な供給を保証するのに十分な基底値に低下し、夜間の肝グルコース産生も低く保持される。内分泌性インスリン分泌の、多くの場合皮下へのインスリン投与による外因的置換では一般に、上述の血中グルコースの質的な生理学的調節はほとんど達成されない。多くの場合、上方または下方への血中グルコースの制御の喪失があり、これは、その最も重篤な形態では死の危険がある。さらに何年も血中グルコースレベルの上昇が続くと、初期症状はないが健康にかなりの危険がある。アメリカ合衆国における大規模なＤＣＣＴ研究（The Diabetes Control and Complications TrialResearch Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986）によれば、慢性的に上昇した血中グルコースレベルは糖尿病性後期障害の大きな原因となることが明らかに証明されている。糖尿病性後期障害は細小血管および巨大血管の障害であり、これはある種の環境下に、網膜症、腎症、または神経障害として発現し、失明、腎不全および四肢の喪失を招き、さらには心脈管系疾患の高い危険を伴う。これから、糖尿病の改良された治療ではまず、血中グルコースを可能な限り生理学的な範囲に保持しなければならないことが導かれる。インスリン強化療法の概念に従い、これは即時作用性および緩徐作用性インスリン製剤の１日に頻回の注射によって達成されなければならない。即時作用型処方は食事の際に血中グルコースの食後の上昇を平行化するために投与される。緩徐作用型の基礎的インスリンはとくに夜間に低血糖を招くことなく、インスリンの基礎的供給を保証しなければならない。
【０００４】
現在利用できる基礎的インスリンはこの要求を適当には達成していない。頻繁に使用されるＮＰＨインスリンは、とくに強度が著しすぎる最大作用を示して、全体的な作用は短すぎる。夕方に投与した場合には、これは夜間の低血糖および早朝の高血糖の危険をはらんでいる。
【０００５】
EP 0 821 006 号には、亜鉛との結合能が上昇したインスリン同族体が開示され、この亜鉛との組み合わせはヒトインスリンに比較して作用の遅延プロファイルを有する。これらの同族体は、主としてＡ鎖のＡ21の位置におけるアミノ酸の変化、およびＢ鎖のＢ30の位置にヒスチジン残基１〜５個を含有する２〜３５アミノ酸残基を有するペプチドの付加によりヒトインスリンと異なっている。
【０００６】
本発明の目的はさらに、亜鉛結合能が上昇し、インスリン同族体のヘキサマーおよび亜鉛からなる安定な錯体を形成し、適当な製剤とすると、ヒトインスリンに比べて遅延した作用プロファイルの結果として糖尿病Ｉ型およびII型への皮下注射による改良された治療を可能にするインスリン同族体（ヒトまたは動物インスリンの同族体）を提供することにある。
【０００７】
インスリン同族体は天然に存在するインスリンすなわちヒトインスリン（配列番号：１：ヒトインスリンＡ鎖および配列番号：２：ヒトインスリンＢ鎖参照）または動物インスリンから、天然に存在するインスリンのＡ鎖および／またはＢ鎖に対して少なくとも１個の天然に存在するアミノ酸残基の置換もしくは欠失および／または少なくとも１個のアミノ酸残基の付加によって誘導される。
【０００８】
この目的は以下の各項によって達成される。
１．式Ｉ
【化３】
0004402296.tif 000002
【０００９】
［式中、
（Ａ１〜Ａ５）は、ヒトインスリン（配列番号：１参照）もしくは動物インスリンのＡ鎖おける位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基であり、
（Ａ15〜Ａ19）は、ヒトインスリン（配列番号：１参照）もしくは動物インスリンのＡ鎖における位置Ａ15〜Ａ19のアミノ酸残基であり、
（Ｂ８〜Ｂ18）は、ヒトインスリン（配列番号：２参照）もしくは動物インスリンのＢ鎖における位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、
（Ｂ20〜Ｂ29）は、ヒトインスリン（配列番号：２参照）もしくは動物インスリンのＢ鎖における位置Ｂ20〜Ｂ29のアミノ酸残基であり、
Ｒ８はＴｈｒまたはＡｌａであり、
Ｒ９はＳｅｒまたはＧｌｙであり、
Ｒ10はＩｌｅまたはＶａｌであり 、
Ｒ14はＴｙｒ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｒ21はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、
Ｒ１は遺伝子でコード可能な任意の所望のアミノ酸残基であるか、存在しないかまたは水素原子であり、
Ｒ２はＶａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｒ３はＡｓｎ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｒ４はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｙまたはＧｌｕであり、
Ｒ30は遺伝子でコード可能な任意の所望のアミノ酸残基であるか−ＯＨであり、
Ｚは水素原子、または遺伝子でコード可能なアミノ酸残基１〜４個を有するペプチドであって、この場合ペプチドは１〜４個のヒスチジン（His）残基を含み、
ただし、Ｚが水素原子である場合には、Ｒ１またはＲ３はＨｉｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、もしＲ１が中性または陰性に荷電したアミノ酸残基であるならば、Ｒ３はHisであり、またただし、Ｚが水素原子である場合には、Ｒ14はＨｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびただし、さらに式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩がヒトインスリンと異なるのは式ＩのＲ３位置、またはＲ３とＲ21の組み合わせもしくはＲ３とＲ４の組み合わせにおけるアミノ酸残基の変動だけでない］
のインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩（配列番号：１および配列番号：２参照）。
【００１０】
このインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩は、好ましくは以下の１種である。
２．Ｒ８はＴｈｒであり、Ｒ９はＳｅｒであり、Ｒ10はＩｌｅである。
３．Ｒ１はＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｙである。
４．Ｒ30はＴｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒである。
５．Ｒ21はＡｓｎであり、Ｒ１はＰｈｅである。
６．本発明の好ましい実施態様は、式ＩにおいてＲ２はＶａｌであり、Ｒ３はＡｓｎであり、Ｒ４はＧｌｎであるインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩である。
【００１１】
式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩はさらに、Ｒ14が以下の場合、すなわち、
７．Ｔｙｒ
８．Ｈｉｓ
９．Ａｓｐ、または
10．Ｇｌｕ
に顕著であり、好ましい。
【００１２】
式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩はさらに、Ｒ30が以下の場合に、すなわち、
11．Ｔｈｒ
12．Ａｌａ
13．Ｓｅｒ、または
14．−ＯＨ
に顕著であり、好ましい。
【００１３】
式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩はさらに、Ｚが以下の場合に、すなわち
15．Ｈｉｓ
16．Ｈｉｓ−Ａｌａ−、または
17．Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−
に顕著であり、好ましい。
【００１４】
本発明によるインスリン同族体の例には以下のものがある。
18．式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩は、Ｂ鎖が以下の配列である場合に傑出している。
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys （配列番号：３）、たとえば、Ｈｉｓ(Ｂ０）、ｄｅｓ(Ｂ30）ヒトインスリン。
【００１５】
19．式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩は、Ｂ鎖が以下の配列である場合に傑出している。
His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr （配列番号：４）、たとえば、His(Ｂ０）−ヒトインスリン。
【００１６】
20．式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩は、Ｂ鎖が以下の配列である場合に傑出している。
His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr （配列番号：５）、たとえば、His(Ｂ−１）、Ala(Ｂ０）−ヒトインスリン。
【００１７】
21．式Ｉのインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩は、Ｂ鎖が以下の配列である場合に傑出している。
His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe   Tyr Thr Pro Lys Thr （配列番号：６）、たとえば、His(Ｂ−２）、Ala(Ｂ−１）、Ala(Ｂ０)−ヒトインスリン。
【００１８】
本発明はさらに、本発明によるインスリン同族体またはその生理学的に許容されうる塩の製造方法において、アミノ酸配列II
Met-X2m-(Arg)p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21（II)［式中、
Ｘ1nはｎ個のアミノ酸残基（ｎは０〜３４の整数である）を有するペプチド鎖であり、
Ｘ2mはｍ個のアミノ酸残基（ｍは０〜２０の整数である）を有するペプチド鎖であり、
ｐは０、１または２であり、
Ｒ30は遺伝子でコード可能な任意の所望のアミノ酸残基であるか、または存在せず、
Ｚは存在しないか、１〜４個のヒスチジン（His）残基を含む遺伝子でコード可能なアミノ酸残基１〜４個を有するペプチド残基であり、
他の変動は１．において述べた意味を有し、上述のただし書きの条件はこの場合も適用される］
を有するインスリン同族体の前駆体をコードするＤＮＡを含有する複製可能な発現ビヒクルの構築、宿主細胞における発現、および化学的および／または酵素的方法を使用するその前駆体からのインスリン同族体の放出からなる方法に関する。
【００１９】
宿主細胞は好ましくは細菌であり、とくに好ましくは大腸菌である。
宿主細胞は好ましくは酵母であり、とくに好ましくは Saccharomyces cerevisiae である。
【００２０】
大腸菌における発現時には、上述の融合タンパク質（配列番号７〜９）は一般に不溶性の封入体を形成し、これは、細胞破壊後に遠心分離によって単離され、カロオトロピックな添加物（たとえば８Ｍ尿素または６Ｍグアニジニウムクロリド）を用いて再び溶解できる。溶解した融合タンパク質はサルファイト分解に付し、これによりＳＨ基をＳ−スルフォネート基に変換することができる（たとえば、R. C. Marshall & A. S. Iglis, "Practical Protein Chemistry - A Handbook", A. Darbre編、 1986, 49-53頁）。融合タンパク質の溶解度はこれによって改善され、たとえば陰イオン交換またはゲル浸透クロマトグラフィーによる精製が容易になる。誘導体化融合タンパク質をネイティブな空間的構造および正しく形成されたジスルフィド橋（フォールディング）を有するプレプロインスリンに変換するには、希釈された水溶液中限られた量のＳＨ試薬たとえばメルカプトエタノール、システインまたはグルタチオンの添加、およびついで空気酸化によって行われる。別法として、溶解された、非誘導体化融合タンパク質はまた、類似の条件下に直接フォールディングすることも可能である（EP-A-0 600 372号；EP-A-0 668 292号）。プレプロインスリンはついで限定されたタンパク質分解切断によって生物学的に活性なインスリンに変換される。この目的には、式IIにおいてＭｅｔ−Ｘ2m−(Ａｒｇ)pによって指示されるプレ配列を除去し、Ｘ1n−Ａｒｇによって指示されるペプチド鎖を切断し、したがってＢ鎖およびＡ鎖を分離するトリプシンの使用が可能である。一般に、配列Ｘ1はＡｒｇ、 Ａｒｇ2またはそれが存在しないで（ｎ＝０）で開始され、したがって切断後には、インスリン誘導体は、Ｂ鎖のＣ末端においてArgまたはArg2により延長されて存在する。これらのアミノ酸はカルボキシペプチダーゼＢを用いて除去することができる。トリプシン切断もリジン（Ｂ29）における切断がさらに起こるように、トリプシン濃度を上げるかまたは反応時間を延長することにより実施することができる。この場合、des(Ｂ30)インスリン誘導体が生じる。
【００２１】
切断時に形成されるインスリン同族体は、標準的なクロマトグラフィー操作により（たとえばイオン交換および逆相クロマトグラフィー）精製することが可能で、最終的に沈殿、結晶化または単純な凍結乾燥によって単離される。
【００２２】
インスリン同族体の前駆体は好ましくは以下の配列：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：７）、たとえばHis(Ｂ０)−プレプロインスリンの配列、
【００２３】
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：８）、たとえばHis(Ｂ−１)、Ala(Ｂ０)−プレプロインスリンの配列、または
【００２４】
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：９）、たとえばHis(ｂ−２)、Ala(Ｂ−１)、Ala(Ｂ−０)−プレプロインスリンの配列を有する。
【００２５】
本発明はまた、本発明によるインスリン同族体の上述の前駆体、とくにプレプロインスリン、本発明によるインスリン同族体の前駆体をコードするＤＮＡ配列、本発明のインスリン同族体の新規な前駆体をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ビヒクル、およびこのような発現ビヒクルを用いてトランスフォームされた宿主細胞に関する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の少なくとも１種のインスリン同族体および／または少なくとも１種のその生理学的に許容されうる塩からなる医薬製剤に関する。
好ましくは医薬製剤は、インスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩を溶解型、無定形型および／または結晶型で含有する点で傑出している。
【００２７】
この医薬製剤は、またさらに、デポ補助剤好ましくはプロタミン硫酸塩を含有し、インスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩は好ましくはプロタミン硫酸塩との共晶として存在させることができる。
【００２８】
本発明の医薬製剤は、またさらに、未修飾ヒトインスリンおよび／または他のインスリン同族体、好ましくはＧｌｙ(Ａ21)−Ａｒｇ(Ｂ31)−Ａｒｇ(Ｂ32)−ヒトインスリンを含有する。
【００２９】
本発明はさらに、好ましくは１mlあたり亜鉛１μg〜２mgの亜鉛、とくに好ましくは５μg〜２００μgの亜鉛を含む溶解型での本発明の医薬製剤を含有するインスリン活性を有する注射用溶液に関する。
【００３０】
本発明はさらに、本発明のインスリン同族体および／またはその生理学的に許容されうる塩の、作用発現遅延型インスリン活性を有する医薬製剤の製造のための使用に関する。
【００３１】
最初の本発明の目的はさらに、インスリンヘキサマーおよびインスリンヘキサマーあたり４〜１０個の亜鉛イオンからなり、インスリンヘキサマーは式Ｉ
【化４】
0004402296.tif 000003
【００３２】
［式中、
（Ａ１〜Ａ５）は、ヒトインスリンもしくは動物インスリンのＡ鎖における位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基であり、
（Ａ15〜Ａ19）はヒトインスリンもしくは動物インスリンのＡ鎖における位置Ａ15〜Ａ19のアミノ酸残基であり、
（Ｂ８〜Ｂ18）はヒトインスリンもしくは動物インスリンのＢ鎖における位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、
（Ｂ20〜Ｂ29）はヒトインスリンもしくは動物インスリンのＢ鎖における位置Ｂ20〜Ｂ29のアミノ酸残基であり、
Ｒ８はＴｈｒまたはＡｌａであり、
Ｒ９はＳｅｒまたはＧｌｙであり、
Ｒ10はＩｌｅまたはＶａｌであり 、
Ｒ14はＴｙｒ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｒ21はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、
Ｒ１は遺伝子でコード可能な任意の所望のアミノ酸残基であるか、存在しないかまたは水素原子であり、
Ｒ２はＶａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｒ３はＡｓｎ、Ｈｉｓ、  ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｒ４はＡｌａ、Ｓｅｒ、  Ｔｈｒ、  Ａｓｎ、  Ａｓｐ、  Ｇｌｎ、  ＧｌｙまたはＧｌｕであり、
Ｒ30は遺伝子でコード可能な任意の所望のアミノ酸残基であるか−ＯＨであり、
Ｚは水素原子、または遺伝子でコード可能なアミノ酸残基１〜４個を有するペプチド残基であって、このペプチドは１〜４個のヒスチジン（His）残基を含む］
のインスリン同族体６分子から構成されるインスリン−亜鉛錯体によって達成される。
【００３３】
インスリン−亜鉛錯体は好ましくは、インスリンヘキサマーあたり５〜８個の亜鉛イオンを含有する。
インスリン−亜鉛錯体は好ましくは、本発明による上述の式Ｉのインスリン同族体６分子から構成されるインスリンヘキサマーを含有する。
【００３４】
本発明のインスリン−亜鉛錯体はまた、好ましくは式Ｉのインスリン同族体のＢ鎖が以下の配列、
Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr（配列番号：１０）、たとえばHis(Ｂ３)−ヒトインスリン、または
式Ｉのインスリン同族体のＢ鎖が以下の配列、
Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr（配列番号：１１）、たとえばAsp(Ｂ３)−ヒトインスリン
を有するものである。
【００３５】
本発明はまた、少なくとも１種の本発明のインスリン−亜鉛錯体からなる医薬製剤、および少なくとも１種のインスリン同族体および／またはその生理学的に耐容性のある塩ならびに適当量の亜鉛イオンの酸性溶液からなり、本発明のインスリン−亜鉛錯体の形成を可能にする医薬製剤、上述の本発明の式Ｉのインスリン同族体または式ＩにおいてＢ鎖は配列番号：３、４、５、１０または１１の配列を有するインスリン同族体を好ましくは含有するインスリン同族体および／またはその生理学的に耐容性のある塩を含有する医薬製剤に関する。
【００３６】
医薬製剤は好ましくは溶解型、無定形型および／または結晶型のインスリン-亜鉛錯体からなる製剤である。
【００３７】
本発明はまた、１mlあたり亜鉛１μg〜２mgを含む、とくに好ましくは１mlあたり５μg〜２００μgの亜鉛を含有する溶解型医薬製剤からなるインスリン活性を有する注射用溶液に関する。
【００３８】
本発明はまた、インスリン−亜鉛錯体の、作用発現遅延型のインスリン活性を有する医薬製剤の製造のための使用に関する。
【００３９】
本発明によるインスリン同族体は、生物学的に活性であり、８０μg／mlのＺn++（亜鉛／ml）を含有する弱酸性の澄明な溶液としてイヌに皮下投与後、強力な遅延型の作用を示す。Ｂ鎖のＮ−末端をヒスチジン、Ｈｉｓ(Ｂ０）、ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン（配列番号：３参照）によって延長したインスリン同族体の場合には、作用プロファイルはたとえば、添加された亜鉛イオンの量にきわめて強力に依存する。亜鉛を含まない製剤はデポ効果を全く示さず（総作用時間６〜８時間、実施例８）、ヒトインスリンと薬力学的にはほとんど変わらないが、亜鉛イオンを添加したのちには（８０μg／ml）、作用の強力な遅延が認められる（総作用時間約１６時間、実施例８）。観察されたデポ効果は、したがってＮＰＨ−インスリンの場合に比べて著しく有意である。さらに、この同族体はその薬力学が、ヒトインスリンでは不可能な、予め特定した亜鉛量によって、ある範囲内で制御できるという利点がある。迅速な作用発現を有する処方は、活性な物質を単に亜鉛の含量を変化させるだけで中等度または強度な遅延作用を有する場合と同様に調製できる。すなわち、作用プロファイルは、亜鉛含量が適切に与えられた製剤を使用するか、または高および低亜鉛含量の製剤を混合することによって、担当医または患者自身により患者の必要に個々に適合させることができる。
【００４０】
本明細書に記載した同族体はさらに、亜鉛イオンとの親和性が増大している。
中性水溶液中では、ヒトインスリンは、それぞれＨｉｓ(Ｂ１０）側鎖を介して２個の亜鉛イオンと錯体を作るヘキサマーを形成する。これらの亜鉛イオンは、中性溶液中では水性緩衝液に対する透析によっては除去できない。同じ条件下に、本明細書に記載の同族体は４個以上の亜鉛イオンと結合する。本発明のＨｉｓ(Ｂ０）−ｄｅｓ(Ｂ３０）−およびＨｉｓ(Ｂ３）−インスリンの場合は、これらは約７亜鉛イオン／ヘキサマーであり、Ａｓｐ(Ｂ３）インスリンの場合には、４.２亜鉛イオン／ヘキサマーの値が測定された（実施例９）。
【００４１】
中性溶液中で亜鉛は比較的高分子量の会合物の形成を導き、インスリンの沈殿を生じることが知られている。澄明に溶解したインスリンを含む弱酸性亜鉛含有製剤の注射後、インスリン−亜鉛錯体の形成が結果として、中和により皮下組織にインスリンの沈殿を生じる。インスリンは、この沈積から再び溶液中に入り、ついで血流中を通過して作用部位に遅延して到達する。この作用の遅延はヒトインスリンの場合にはわずかにすぎないが、本明細書に記載した同族体の場合は、亜鉛に対する親和性の増大により強力に発生する。すなわち、亜鉛の結合の増大が、上述の作用の亜鉛依存性延長の基盤である。したがって、本発明は、上述のインスリン同族体に関するのみでなく、会合したインスリン−亜鉛錯体にも関係する。これらの錯体は相当するヒトインスリン−亜鉛錯体とは、それらが強固に結合した高含量の亜鉛を有する点で異なっている。したがって亜鉛に加えて他の遷移金属イオンたとえばコバルトまたは銅も相当する錯体の形成に使用できる。
【００４２】
【実施例】
実施例１：Ｈｉｓ(Ｂ３）−プレプロインスリン変異体をコードするプラスミドｐＩＮＴ ３４５ｄの構築
特許番号第5358857号の米国特許にはプラスミドｐＩＮＴ ９０ｄが記載されている。このプラスミドのＤＮＡがプラスミドｐＩＮＴ ３４５ｄの構築の出発材料として用いられる。これはｐＩＮＴ ９０ｄと比べて２つの新規な性質を特徴を有する。一つにはそれは、Ｂ鎖の位置３におけるアスパラギンに代えてアミノ酸のヒスチジンを含有するプレプロインスリンをコードし、他方ではこのプレプロインスリン変異体をコードする配列の開始直前に、プレプロインスリンの配列決定の経過でＤｒａ ３切断部位が考慮されればプレプロインスリン同族体のＮ−末端の１０個のアミノ酸をコードする配列が容易に操作できるように、制限酵素ＢｓｓＨ ２の認識部位をもっている。プラスミドｐＩＮＴ ３４５ｄの構築には、二重消化混合物中においてプラスミドｐＩＮＴ ９０ｄのＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩにより位置２４０bpでおよび制限酵素Ｄｒａ ３により位置３５１bpで切断し、２つのフラグメントを形成させる。切断混合物をゲル電気泳動によって分離したのち、大きな残基のプラスミドＤＮＡフラグメントを単離する。このＤＮＡフラグメントをついで次の型：
【００４３】
0004402296.tif 000004
の合成ＤＮＡフラグメントとＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応で反応させる。コンピートな大腸菌Ｋ１２細胞をリゲーション混合物でトランスフォームし、２０mg／ｌのアンピシリンを含むＮＡプレート上で平板培養する。プレートは３７℃で一夜インキュベートする。得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素ＢｓｓＨ ２を用いて切断する。所望のプラスミドＤＮＡはこの経過において線状化され、したがってBssH ２切断部位を含まず、切断されないｐＩＮＴ ９０ｄのＤＮＡとは異なっている。
正しく挙動するクローンのプラスミドＤＮＡを、ｐＩＮＴ ３４５ｄと命名する。それは、以下に記載するプレプロインスリン変異体の構築の出発原料として使用される。
【００４４】
実施例２：Ｈｉｓ(Ｂ０）−プレプロインスリン変異体をコードするプラスミドｐＩＮＴ ３４２ｄの構築
プラスミドｐＩＮＴ ３４５ｄを酵素ＢｓｓＨ ２およびＤｒａ ３によって二重消化し、ゲル電気泳動後に大きな残基のプラスミドフラグメントを単離する。このＤＮＡフラグメントを次の型：
0004402296.tif 000005
の合成ＤＮＡフラグメントとＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応で反応させる。プラスミドｐＩＮＴ ３４２ｄが生成し、これは出発のプラスミドと比較してさらにＨｐａ １切断部位を有する。このプラスミドは、位置Ｂ０にヒスチジンを有するプレプロインスリン変異体をコードする。
【００４５】
実施例３：Ｈｉｓ(Ｂ−１）、Ａｌａ(Ｂ０）−プレプロインスリン変異体をコードするプラスミドｐＩＮＴ ３４３ｄの構築
実施例ｂに記載された残基プラスミドフラグメントのＤＮＡを次の型：
0004402296.tif 000006
の合成ＤＮＡフラグメントとＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応で反応させる。プラスミドｐＩＮＴ ３４３ｄが生成し、これはｐＩＮＴ ３４２ｄと同様に、出発のベクターと比較してさらにＨｐａ １切断部位を含有する。
【００４６】
実施例４：Ｈｉｓ(Ｂ−２）、Ａｌａ(Ｂ−１）、Ａｌａ(Ｂ０）−プレプロインスリン変異体をコードするプラスミドｐＩＮＴ ３４４ｄの構築
実施例ｂに記載された残基プラスミドフラグメントのＤＮＡを次の型：
His Ala Ala B1  B2  B3  B4  B5  B6  B7  B8  B9  B10 B11
5′-CG CGC CAC GCT GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA -3′
3′-     G GTG CGA CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG     -5′
1/2 BssH2                Hpa1                           1/2 Dra3
の合成ＤＮＡフラグメントとＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応で反応させる。プラスミドｐＩＮＴ ３４４ｄが生成し、これは出発のベクターと比較してさらにＨｐａ １切断部位を有する。
【００４７】
実施例５：構築されたインスリン変異体の発現
プラスミドｐＩＮＴ ３４２ｄ、 ３４３ｄおよび３４４ｄは、たとえば各場合とも大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０にトランスフォームする。各変異体に対するプラスミドを含有する組換え細菌をついで特許番号5227293号の米国特許の実施例４に従って発酵させ、このようにして各インスリン変異体の製造のための所望の原料が調製される。
【００４８】
実施例６：Ｈｉｓ(Ｂ０）、ｄｅｓ(Ｂ３０）−インスリンの製造
実施例５に従って、プレプロインスリン変異体を大腸菌内で発現させ、細胞の破壊後、遠心分離により封入体の型で単離する。封入体を尿素（８ mol／ｌ）に溶解し、サルファイト分解に付し、陰イオン交換（Q-Sepharose）およびゲル透過クロマトグラフィー（Sepharyl S 200）によって精製する。クロマトグラフィーに用いた緩衝液は、４Ｍ尿素および５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣl［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ＨＣl］ｐＨ ８.５を含有する。陰イオン交換樹脂上での分画溶出は、０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの勾配を適用して行う。尿素の濃度を、ついで、限外ろ過および希釈によって＜１Ｍに低下させ、プレプロインスリン−Ｓ−スルホネートをｐＨ４で沈殿させ、最後に乾燥する。
【００４９】
天然のプロインスリンに存在する正しいジスルフィド橋の形成には、プレプロインスリン−Ｓ−スルホネートを、２０mMグリシンを含有する緩衝液中ｐＨ １０.８に濃度０.３g／lで溶解し、メルカプトエタノール（プレプロインスリン 1 molあたり約２５〜５０mol）で処理し、一夜４℃で撹拌する。このバッチをついでリン酸によりｐＨ３.５に調整し、遠心分離する。上清に含有されるプレプロインスリンをインスリンに変換するため、Tris（２５mM）の添加後、ｐＨ８.２ に調整し、トリプシン（プレプロインスリン１ｇあたり１.５ｇ）で処理する。タンパク分解的切断の経過は逆相ＨＰＬＣでモニターする。約６時間後、バッチは高含量のＨｉｓ(Ｂ０）、ｄｅｓ(Ｂ３０）−インスリンを含有する。反応をｐＨ３.５の酸性にして終結させる。インスリン同族体をイオン交換クロマトグラフィー（S-Hyper-D, Sepracor）および逆相クロマトグラフィー（PLRP-S RP300, Polymer Laboratories）で精製する。イオン交換クロマトグラフィーは３０％の２−プロパノールおよび５０mMの乳酸を含む緩衝液（ｐＨ３.５）中で実施する。結合したインスリンは０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配により溶出する。逆相クロマトグラフィーは０.１％トリフルオロ酢酸中で実施し、溶出のためにはこれにアセトニトリルの量を漸次増加させて混合する。生成物はｐＨ５.４における沈殿で単離し、凍結乾燥する。
【００５０】
実施例７：非経口投与のためのインスリン同族体の製剤化
このパレーションは１mlあたり４０または１００ ＩＵのインスリン（１Ｕは約６.２nmolに相当）、２０mgの８５％グリセロール、２.７mgのｍ−クレゾールおよび必要に応じてＺｎ++（塩化亜鉛として）をｐＨ４の滅菌水溶液中に含有する。
【００５１】
実施例８：イヌにおける、Ｈｉｓ(Ｂ０）、ｄｅｓ(Ｂ３０）−インスリンの作用プロファイル
各場合、６匹のイヌ（ビーグル）に４０ ＩＵ／ml（実施例７）および指示含量の亜鉛を含有するプレパレーションの皮下投与を実施した。用量は 0.3ＩＵ/kgとした。さらに実験の経過において、血中グルコース濃度を、指示した時間後に測定した。値は各開始値に対し百分率によって標準化して、平均した。
【００５２】
【表１】
0004402296.tif 000007
【００５３】
実施例９：インスリン同族体の亜鉛結合
インスリンのプレパレーション［０.３mM インスリン、０.１３Ｍ ＮaＣl、０.１％フェノール、１００μg／ml Ｚn++（塩化亜鉛として）、２５mM Tris/ＨＣl、ｐＨ ７.４）を亜鉛を含まない中性緩衝液に対して徹底的に透析した（０.１５Ｍ ＮａＣl、１０mM Tris／ＨＣl ｐＨ７.４に対し室温で３時間、１０mM Tris／ＨＣl ｐＨ7.4に対し１５℃で７２時間、および１０mM Tris／ＨＣl ｐＨ 7.4に対し１５℃で１６時間）。透析物をついで酸性にして分析した。インスリンの濃度は逆相ＨＰＬＣによって、亜鉛の濃度は原子吸光分光分析によって測定した。亜鉛の値はインスリンを含まない対照バッチの亜鉛含量を用いて補正した。
【００５４】
【表２】
0004402296.tif 000008
【配列表】
0004402296.tif 000009
0004402296.tif 000010
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