(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着依存性細胞を培養容器内で培地交換操作及び継代培養操作から選ばれる少なくとも１種の操作を行いながら単層培養を行う細胞培養方法であって、
画像入力手段により培養容器内の接着依存性細胞の画像データを制御手段に入力し、その画像データに基づいて制御手段により接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率を算出し、
前記算出結果が所定の限界値以上である場合には、前記継代培養操作を実行し、
前記算出結果が前記限界値未満である場合には、前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、所定の培養時間における培地消費量を計算して累積培地消費量を求め、その累積培地消費量が所定量以上になるタイミングで前記培地交換操作を実行することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記継代培養操作を、培養容器内に細胞剥離剤を添加して培養容器の底面に接着した細胞を剥離させる細胞剥離工程と、前記細胞を剥離させる反応を停止させつつ細胞懸濁液を作製し、その細胞懸濁液を分配する細胞分配工程と、前記分配された細胞が培養容器の底面に接着した後に培地交換を行う接着後培地交換工程と、から構成し、
前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、前記接着後培地交換工程における接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率の増加率又は増加割合を計算し、その増加率又は増加割合が所定値未満になったところで前記接着後培地交換工程における培地交換操作を実行することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
接着依存性細胞を培養容器内で培地交換操作及び継代培養操作から選ばれる少なくとも１種の操作を行いながら単層培養を行うための細胞培養装置であって、
培養容器と、その培養容器内の接着依存性細胞の画像データを入力するための画像入力手段と、その画像データを処理するための制御手段と、その制御手段からの出力信号を出力するための出力手段と、から構成され、
画像入力手段により培養容器内の接着依存性細胞の画像データを制御手段に入力し、その画像データに基づいて制御手段により接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率を算出し、
前記算出結果が所定の限界値以上である場合には、前記継代培養操作の実行を指示する出力信号を前記出力手段に出力し、
前記算出結果が前記限界値未満である場合には、前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、所定の培養時間における培地消費量を計算して累積培地消費量を求め、その累積培地消費量が所定量以上になるタイミングで前記培地交換操作の実行を指示する出力信号を出力手段に出力することを特徴とする記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記培養容器に培養可能面積の異なる複数の培養皿を設けるとともに、前記出力手段を、各培養皿に培地を供給するための培地供給手段と、各培養皿に細胞剥離剤を供給するための細胞剥離剤供給手段と、各培養皿から液体を排出するための液体排出手段と、培養可能面積の小さい培養皿からその次に培養可能面積の大きい培養皿に細胞を移動させるための細胞移動手段と、から構成した請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記培養容器を横多角筒状に形成し、その培養容器の内側面に前記各培養皿を設けるとともに、前記各培養皿が設けられた培養容器の側面を培養容器の下端部に位置変更するための位置変更手段を設けた請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
接着依存性細胞を培養容器内で培地交換操作及び継代培養操作から選ばれる少なくとも１種の操作を行いながら単層培養を行うためのコンピュータ読み取り可能なプログラムを記録した記録媒体であって、
前記プログラムは、
画像入力手段により培養容器内の接着依存性細胞の画像データを入力するステップと、その画像データに基づいて接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率を算出するステップと、
前記算出結果が所定の限界値以上である場合には、前記継代培養操作を実行するステップと、
前記算出結果が前記限界値未満である場合には、前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、所定の培養時間における培地消費量を計算して累積培地消費量を求めるステップと、前記累積培地消費量が所定量以上になるタイミングで前記培地交換操作を実行するステップと、
を備えた方法を実行する、記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、接着依存性細胞を培養容器内で培養するための細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養プログラムを記録した記録媒体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、接着依存性細胞をインビトロ（in vitro）で培養する際には、ほとんど全ての培養操作が手作業により行われるとともに、その操作を実行するタイミングも経験的に決定されていた。前記培養操作としては、主として、培養容器内の古い培地（廃培地）を新しい培地に交換する際の培地交換操作と、培養容器内でコンフルエント状態（培養容器の底面の大半が細胞によって単層に覆われている状態）になった細胞を複数の別の培養容器に分配して増殖させるための継代培養操作が挙げられる。
【０００３】
すなわち、前記培地交換操作は、経験的に培地中の成分のうち最も消費されやすい成分が完全に消費し尽くされるまでの期間よりも短い期間を区切って行われており、その成分の欠乏によって細胞の増殖速度等に悪影響が現れないことが前提であった。また、前記継代培養操作も同様に、経験的に細胞が培養容器内でコンフルエント状態になるまでの期間を推定し、その期間を区切って行われていた。そして、前記培地交換操作を行う際にはまず、新しい培地を３７℃に加温した後、クリーンベンチ内で、細胞が接着している培養容器を適宜傾けながらピペットにて廃培地を抜き取り、前記３７℃に加温された新しい培地をピペットにて培養容器内に注入する。
【０００４】
一方、継代培養操作を行う際にはまず、クリーンベンチ内で、前記培養容器を適宜傾けながらピペットにて廃培地を除去した後、必要に応じて培養容器内のカルシウムイオン等を洗い流す。続いて、所定濃度のトリプシンを添加して細胞を培養容器の底面から剥離させた後、トリプシンインヒビターを添加して前記トリプシンによる細胞剥離反応を停止させる。次に、トリプシン、トリプシンインヒビター及び剥離された細胞を含む細胞懸濁液をピペットにて遠心チューブ内に移動させた後、遠心分離機を用いて１０００r.p.m.程度の低い回転速度で細胞のみを沈澱させる。最後に、トリプシン及びトリプシンインヒビターを含む上清を除去した後、新しい培地を注入して細胞を再懸濁し、複数の培養容器に分配する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の細胞培養方法では、ほとんど全ての培養操作が手作業で行われていたことから、培養操作が非常に煩雑であった。さらに、培地交換操作や継代培養操作を実行するタイミングの決定が経験的に行われていたことから、そのタイミング自体が非常に大雑把なものとなってしまい、現状に即した的確なものではあり得なかった。特に、対象となる細胞自体が予測不可能な要素を多分に含んでいることから、経験に基づいた細胞培養条件の決定のみでは不充分であると言える。
【０００６】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、細胞培養に適した条件を維持しつつ、培養操作を容易に行うことができる細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養プログラムを記録した記録媒体を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の細胞培養方法は、接着依存性細胞を培養容器内で培地交換操作及び継代培養操作から選ばれる少なくとも１種の操作を行いながら単層培養を行う細胞培養方法であって、画像入力手段により培養容器内の接着依存性細胞の画像データを制御手段に入力し、その画像データに基づいて制御手段により接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率を算出し、前記算出結果が所定の限界値以上である場合には、前記継代培養操作を実行し、前記算出結果が前記限界値未満である場合には、前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、所定の培養時間における培地消費量を計算して累積培地消費量を求め、その累積培地消費量が所定量以上になるタイミングで前記培地交換操作を実行することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項２に記載の発明の細胞培養方法は、請求項１に記載の発明において、前記継代培養操作を、培養容器内に細胞剥離剤を添加して培養容器の底面に接着した細胞を剥離させる細胞剥離工程と、前記細胞を剥離させる反応を停止させつつ細胞懸濁液を作製し、その細胞懸濁液を分配する細胞分配工程と、前記分配された細胞が培養容器の底面に接着した後に培地交換を行う接着後培地交換工程と、から構成し、前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、前記接着後培地交換工程における接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率の増加率又は増加割合を計算し、その増加率又は増加割合が所定値未満になったところで前記接着後培地交換工程における培地交換操作を実行することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項３に記載の発明の細胞培養装置は、接着依存性細胞を培養容器内で培地交換操作及び継代培養操作から選ばれる少なくとも１種の操作を行いながら単層培養を行うための細胞培養装置であって、培養容器と、その培養容器内の接着依存性細胞の画像データを入力するための画像入力手段と、その画像データを処理するための制御手段と、その制御手段からの出力信号を出力するための出力手段と、から構成され、画像入力手段により培養容器内の接着依存性細胞の画像データを制御手段に入力し、その画像データに基づいて制御手段により接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率を算出し、前記算出結果が所定の限界値以上である場合には、前記継代培養操作の実行を指示する出力信号を前記出力手段に出力し、前記算出結果が前記限界値未満である場合には、前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、所定の培養時間における培地消費量を計算して累積培地消費量を求め、その累積培地消費量が所定量以上になるタイミングで前記培地交換操作の実行を指示する出力信号を出力手段に出力することを特徴とするものである。
【００１１】
請求項４に記載の発明の細胞培養装置は、請求項３に記載の発明において、前記培養容器に培養可能面積の異なる複数の培養皿を設けるとともに、前記出力手段を、各培養皿に培地を供給するための培地供給手段と、各培養皿に細胞剥離剤を供給するための細胞剥離剤供給手段と、各培養皿から液体を排出するための液体排出手段と、培養可能面積の小さい培養皿からその次に培養可能面積の大きい培養皿に細胞を移動させるための細胞移動手段と、から構成したものである。
【００１２】
請求項５に記載の発明の細胞培養装置は、請求項４に記載の発明において、前記培養容器を横多角筒状に形成し、その培養容器の内側面に前記各培養皿を設けるとともに、前記各培養皿が設けられた培養容器の側面を培養容器の下端部に位置変更するための位置変更手段を設けたものである。
【００１３】
請求項６に記載の発明の記録媒体は、接着依存性細胞を培養容器内で培地交換操作及び継代培養操作から選ばれる少なくとも１種の操作を行いながら単層培養を行うためのコンピュータ読み取り可能なプログラムを記録した記録媒体であって、前記プログラムは、画像入力手段により培養容器内の接着依存性細胞の画像データを入力するステップと、その画像データに基づいて接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積又は接着細胞占有率を算出するステップと、前記算出結果が所定の限界値以上である場合には、前記継代培養操作を実行するステップと、前記算出結果が前記限界値未満である場合には、前記算出結果に基づいて、前記制御手段により、所定の培養時間における培地消費量を計算して累積培地消費量を求めるステップと、前記累積培地消費量が所定量以上になるタイミングで前記培地交換操作を実行するステップと、を備えた方法を実行する、ものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
（第１実施形態）
以下、この発明の第１実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
【００１５】
図１に模式的に示すように、細胞培養装置１１は、第１培養ユニット１２ａ及び第２培養ユニット１２ｂと、それらユニット１２ａ，１２ｂに液体配管１３を介して接続される細胞供給ユニット１４、液体供給ユニット１５及び廃液タンク１６と、培養ユニット１２ａ，１２ｂに気体配管１７を介して接続されるガス交換ユニット１８と、図示しない制御装置とから構成されている。前記第１培養ユニット１２ａと第２培養ユニット１２ｂとはほぼ同様な構造を有している。
【００１６】
図２及び図３に示すように、第１及び第２培養ユニット１２ａ，１２ｂの下端部には、有底四角箱状に形成されたステージ台２１が設けられている。各ステージ台２１の中央部には、画像入力手段としてのＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ２２がレンズ２２ａを上方に向けて配設されている。
【００１７】
ステージ台２１の上部開口部には、ガラス板やアクリル板等の透明板により四角板状に形成された傾斜手段を構成する傾斜ステージ２３が設けられ、ステージ台２１の一側部上端縁に対しヒンジ部２４を介して回動可能に蝶着されている。この傾斜ステージ２３の基端部には、上下動可能な回動棒２５ａを備えた傾斜手段を構成する回動装置２５が設けられ、回動棒２５ａを上下動させて傾斜ステージ２３を所定角度回動させることができるようになっている。また、この傾斜ステージ２３の上面には、透明な材料により四角板状に形成された保温プレート２６が載置され、その上面が所定温度（例えば３７℃）に保温されるようになっている。
【００１８】
この保温プレート２６の上面には、透明な合成樹脂により四角箱状に形成された培養容器３１が載置されている。この培養容器３１のヒンジ部２４側の側面である開口面３１ａは、培養容器３１に対して開閉可能に嵌合され、培養容器３１が開口又は密閉されるようになっている。また、培養容器３１の前後両内側面下端部には、横方向に延びる係合凸部３１ｂが突設されている。
【００１９】
第１培養ユニット１２ａの開口面３１ａの下端部には、第１液体供給配管３２ａ及び第１液体排出配管３３ａが接続されている。さらに、これら配管３２ａ，３３ａの上方には、第１ガス供給配管３４ａ及び第１ガス排出配管３５ａが接続されている。一方、第２培養ユニット１２ｂの開口面３１ａの下端部には、第２液体供給配管３２ｂ及び第２液体排出配管３３ｂが接続されている。さらに、これら配管３２ｂ，３３ｂの上方には、第２ガス供給配管３４ｂ及び第２ガス排出配管３５ｂが接続されている。また、これら培養容器３１の上方には、図示しない照明装置が配設され、培養容器３１の底部を照明するようになっている。
【００２０】
図３及び図４（ａ）、（ｂ）に示すように、第１培養ユニット１２ａの培養容器３１の底面上には第１培養皿４１ａが載置されている。この第１培養皿４１ａは、プレート４２、親水性フィルム４３、第１樹脂堰４４ａ及びクリップ４５から構成されている。
【００２１】
前記プレート４２は、ポリカーボネート等の透明な合成樹脂により四角板状に形成されている。このプレート４２の下面両側部には、前後方向に延びる左右一対の四角溝４２ａが穿設されている。このプレート４２の上面には、透明な親水性樹脂により四角形状に形成された親水性フィルム４３が載置されている。さらに、この親水性フィルム４３上には、シリコーン樹脂等の疎水性樹脂により四角枠状に形成された第１樹脂堰４４ａが載置され、この第１樹脂堰４４ａに取り囲まれた親水性フィルム４３上の第１培養空間４６ａ内で、接着依存性細胞が培養されるようになっている。また、この第１樹脂堰４４ａの一側部には、前記第１液体供給配管３２ａ及び第１液体排出配管３３ａが挿通されている。
【００２２】
図４（ｂ）に示すように、前記プレート４２、親水性フィルム４３及び第１樹脂堰４４ａを挟持固定するためのクリップ４５は、ほぼ長四角枠状に形成された四角枠４５ａと、その四角枠４５ａ内で上下動可能に配設された長四角板状の押圧板４５ｂと、その押圧板４５ｂを押圧するための押圧ネジ４５ｃとから構成されている。このクリップ４５は、四角枠４５ａの下端部を前記プレート４２の四角溝４２ａ内に係入させた状態で押圧ネジ４５ｃを螺進させることによって、押圧板４５ｂを下動させて第１樹脂堰４４ａの上面を押圧するようになっている。また、前記四角枠４５ａの下端部には、前記培養容器３１内の係合凸部３１ｂと係合するための係止突部４５ｄが突設されている。
【００２３】
一方、第２培養ユニット１２ｂを構成する培養容器３１の底面上には第２培養皿４１ｂが載置されている。図５に示すように、この第２培養皿４１ｂにおいて、第２樹脂堰４４ｂは、前記第１培養ユニット１２ａを構成する第１樹脂堰４４ａの第１培養空間４６ａよりも広い第２培養空間４６ｂが形成されている。また、この第２樹脂堰４４ｂの一側部には、前記第２液体供給配管３２ｂ及び第２液体排出配管３３ｂが挿通されている。それ以外の構成は上記第１培養ユニット１２ａと同様である。
【００２４】
図１に模式的に示すように、細胞供給手段を構成する細胞供給ユニット１４は、略示されるクリーンベンチ５１と、そのクリーンベンチ５１内に配設された細胞供給配管５２と、その細胞供給配管５２の先端部付近に設けられた供給スイッチ５３とから構成されている。前記細胞供給配管５２の一端はクリーンベンチ５１内に配設され、他端は第１電動バルブ５４に接続されている。
【００２５】
培地供給手段及び細胞剥離剤供給手段を構成する液体供給ユニット１５は、貯蔵培地タンク６１、剥離剤タンク６２及び剥離停止剤タンク６３を収容した簡易冷蔵庫６４と、加温培地タンク６５を収容した保温庫６６とから構成されている。貯蔵培地タンク６１、剥離剤タンク６２及び剥離停止剤タンク６３はそれぞれ、約５℃の温度に保冷された簡易冷蔵庫６４内に配設され、培地４７、トリプシン等の細胞剥離剤及びトリプシンインヒビター等の剥離停止剤を低温で貯蔵している。加温培地タンク６５は約３７℃の温度に保温された保温庫６６内に配設され、培地４７をその温度で保温している。この加温培地タンク６５には図示しない培地残量センサが設けられている。
【００２６】
前記貯蔵培地タンク６１及び加温培地タンク６５は、第１培地供給配管６７ａにより接続されている。この第１培地供給配管６７ａの途中には培地供給ポンプ６８が設けられている。前記加温培地タンク６５には第２培地供給配管６７ｂが接続されている。この第２培地供給配管６７ｂは前記第１電動バルブ５４に接続されている。一方、前記剥離剤タンク６２及び剥離停止剤タンク６３はそれぞれ、剥離剤配管６９ａ及び剥離停止剤配管６９ｂと接続されている。これら配管６９ａ，６９ｂは第２電動バルブ７０に接続されている。この第２電動バルブ７０は継代培養配管７１と接続されている。この継代培養配管７１の途中には表面積が大きくなるように形成されるとともに保温庫６６内に配設された加温部７１ａが設けられ、そこを通過する際に液体が加温されるようになっている。また、この継代培養配管７１は前記第１電動バルブ５４と接続されている。
【００２７】
第１電動バルブ５４は液体供給配管７２と接続されている。この液体供給配管７２は第３電動バルブ７３と接続されるとともに、その途中には液体供給ポンプ７４が設けられている。さらに、この第３電動バルブ７３は前記第１及び第２液体供給配管３２ａ，３２ｂと接続されている。
【００２８】
廃液タンク１６は培養容器３１内から排出される液体を一時的に収容するために設けられ、液体排出配管８１と接続されている。この液体排出配管８１は第４電動バルブ８２に接続されるとともに、その途中には液体排出ポンプ８３が設けられている。さらに、この第４電動バルブ８２は前記第１及び第２液体排出配管３３ａ，３３ｂと接続されている。これらにより液体排出手段が構成されている。一方、前記第２液体排出配管３３ｂの途中には、細胞移動手段を構成する細胞移動ポンプ８４が設けられ、第１培養ユニット１２ａ内の細胞懸濁液を第２培養ユニット１２ｂへと移動させることができる。
【００２９】
ガス交換ユニット１８はガス供給器９１、加湿器９２及びガスアナライザ９３から構成されている。前記ガス供給器９１は、図示しない炭酸ガスボンベ及び酸素ボンベから無菌状態の炭酸ガス及び酸素ガスを供給することができるとともに、図示しないフィルタを通して取り込まれる無菌状態の空気を供給及び排気して換気機能を発揮することができるようになっている。加湿器９２は水蒸気を発生させて湿気を付与することができるようになっている。
【００３０】
これらガス供給器９１及び加湿器９２は第１気体供給配管９４ａによって接続されている。さらに、前記加湿器９２には第２気体供給配管９４ｂが接続されている。この第２気体供給配管９４ｂは、第５電動バルブ９５と接続されるとともに、その途中にはガス循環ポンプ９６が設けられている。この第５電動バルブ９５は前記第１及び第２ガス供給配管３４ａ，３４ｂと接続されている。一方、前記第１及び第２ガス排出配管３５ａ，３５ｂは第６電動バルブ９７と接続されている。この第６電動バルブ９７は第１ガス循環配管９８ａと接続されている。
【００３１】
この第１ガス循環配管９８ａはガスアナライザ９３と接続されている。このガスアナライザ９３は、第１培養ユニット１２ａ又は第２培養ユニット１２ｂの培養容器３１内から排出されるガスの成分分析を行って、その成分分析データ（炭酸ガス濃度データ、酸素濃度データ及び湿度データ）を制御装置へと出力する。さらに、このガスアナライザ９３は第２ガス循環配管９８ｂと接続されている。この第２ガス循環配管９８ｂはガス供給器９１と接続されている。そして、前記ガスアナライザ９３で成分分析が終了したガスの一部は、ガス供給器９１に送り込まれて循環し、再利用されるようになっている。
【００３２】
図６に示すように、制御手段としての制御装置１０１は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、データファイル１０２、キーボード１０３、出力手段を構成するモニタ１０４、画像処理手段としての画像処理装置１０５及び計時装置１０６を備えている。ＲＯＭはＣＰＵが実行する細胞培養装置１１の制御プログラムを記憶している。ＣＰＵはＲＯＭに記憶された制御プログラムに従って、画像照合処理等の種々の演算処理を実行する。ＲＡＭはＣＰＵが実行した演算処理結果を一時的に保存する。
【００３３】
データファイル１０２は、あらかじめ所定の画像データとしての接着依存性細胞の細胞パターンデータを記憶するとともに、培地残量センサ６５ａ及びガスアナライザ９３における各閾値データ等を記憶している。そして、ＣＰＵは前記細胞パターンデータとＣＣＤカメラ２２にて撮影された画像データとの照合を行って、画像データ内の接着細胞濃度を算出する。また、前記閾値データと、培地残量センサ６５ａから入力される培地残量データ、又はガスアナライザ９３から入力される炭酸ガス濃度データ、酸素濃度データ若しくは湿度データとが一致するか否かを判別する。
【００３４】
キーボード１０３は前記制御プログラムの開始信号、停止信号、修正信号等をＣＰＵに出力する。モニタ１０４はＣＰＵから出力される細胞培養装置１１各部の種々の動作環境データを表示するとともに、ＣＣＤカメラ２２にて撮影された画像データを画面表示する。また、ＣＰＵは第１及び第２培養ユニット１２ａ，１２ｂ内に配設されたＣＣＤカメラ２２に切替信号を出力し、第１培養ユニット１２ａ又は第２培養ユニット１２ｂ内のＣＣＤカメラ２２からの画像データの出力を切替える。
【００３５】
画像処理装置１０５は正規化処理や特徴抽出処理等を行い、ＣＣＤカメラ２２にて撮影された画像データ内において、特徴抽出された部分領域データを切り出してＣＰＵに出力する。すなわち、ＣＰＵはＣＣＤカメラ２２にて撮影された画像データの部分領域データを画像処理装置１０５を介して取り込む。
【００３６】
ＣＰＵは供給スイッチ５３から入力信号が入力されたとき、第１及び第３電動バルブ５４，７３に切替信号を出力し、細胞供給配管５２、液体供給配管７２及び第１液体供給配管３２ａを連通させる。さらに、このＣＰＵは前記供給スイッチ５３が押圧されている間中、液体供給ポンプ７４に駆動信号を出力して細胞供給配管５２の先端から第１培養空間４６ａへと細胞懸濁液を移動させる。また、ＣＰＵは前記供給スイッチ５３があらかじめ設定された限界時間を越えて押圧された場合には、前記駆動信号の出力をオフして液体供給ポンプ７４の駆動を停止させる。計時装置１０６は供給スイッチ５３からの入力信号の入力により培養時間の計時を開始し、その培養時間データをＣＰＵに出力する。
【００３７】
培地残量センサ６５ａは加温培地タンク６５内の培地４７残量を計測した培地残量データをＣＰＵに出力する。そして、ＣＰＵは前記培地残量データがあらかじめ設定された加温培地量範囲内であるか否かを判別する。このとき、培地残量データが加温培地量範囲よりも低い場合には、ＣＰＵは培地供給ポンプ６８に駆動信号を出力して貯蔵培地タンク６１から加温培地タンク６５へと培地４７を移動させる。前記培地残量データが加温培地量範囲よりも高くなった場合には、ＣＰＵは前記駆動信号の出力をオフして培地供給ポンプ６８の駆動を停止させる。
【００３８】
ガスアナライザ９３は第１ガス循環配管９８ａから送られるガスの成分分析を行って、そのガスに含まれる炭酸ガス濃度データ、酸素濃度データ及び湿度データをＣＰＵに出力する。そして、ＣＰＵは前記炭酸ガス濃度データがあらかじめ設定された炭酸ガス濃度範囲（例えば５〜１０％前後）内であるか否かを判別するとともに、前記酸素濃度データがあらかじめ設定された酸素ガス濃度範囲（例えば１５〜２５％前後）内であるか否かを判別する。さらに、ＣＰＵは前記湿度データがあらかじめ設定された湿度範囲内であるか否かを判別する。
【００３９】
このとき、前記炭酸ガス濃度データが炭酸ガス濃度範囲よりも低い場合には、ＣＰＵはガス供給器９１に炭酸ガス供給信号を出力して炭酸ガスを供給させ、逆に高い場合には、ＣＰＵは前記炭酸ガス供給信号の出力をオフして炭酸ガスの供給を停止させる。また、前記酸素濃度データが酸素ガス濃度範囲よりも低い場合には、ＣＰＵはガス供給器９１に酸素ガス供給信号を出力して酸素ガスを供給させ、逆に高い場合には、ＣＰＵは前記酸素ガス供給信号の出力をオフして酸素ガスの供給を停止させる。一方、前記湿度データが湿度範囲よりも低い場合には、ＣＰＵは加湿器９２に加湿信号を出力して水蒸気を供給させ、逆に高い場合には、ＣＰＵは前記加湿信号の出力をオフして水蒸気の供給を停止させる。
【００４０】
一方、ＣＰＵは回動装置２５に所定時間上動信号を出力し、回動棒２５ａを上動させて傾斜ステージ２３を所定角度傾斜させる。また、ＣＰＵは回動装置２５に下動信号を出力し、回動棒２５ａを下動させて傾斜ステージ２３を水平状態に戻す。ＣＰＵは前記ＣＣＤカメラ２２に出力した切替信号と同調して、第１培養ユニット１２ａ又は第２培養ユニット１２ｂ内の保温プレート２６及び照明装置１０７に切替信号を出力し、それらの電源のオン／オフを同時に切替える。
【００４１】
ＣＰＵは第２電動バルブ７０に切替信号を出力し、剥離剤配管６９ａ又は剥離停止剤配管６９ｂと、継代培養配管７１とを連通させる。ＣＰＵは第４電動バルブ８２に切替信号を出力し、液体排出配管８１及び第１液体排出配管３３ａ、液体排出配管８１及び第２液体排出配管３３ｂ、又は第１液体排出配管３３ａ及び第２液体排出配管３３ｂを連通させる。ＣＰＵは液体排出ポンプ８３に駆動信号を出力し、培養容器３１内の液体を液体排出配管８１を通して廃液タンク１６内へと排出させる。ＣＰＵは細胞移動ポンプ８４に駆動信号を出力し、第１培養空間４６ａ内の細胞懸濁液を第２培養空間４６ｂへと移動させる。
【００４２】
ＣＰＵは、前記ＣＣＤカメラ２２に出力した切替信号と同調して、第５及び第６電動バルブ９５，９７に切替信号を同時に出力する。そして、第２気体供給配管９４ｂ、第１ガス供給配管３４ａ、第１ガス排出配管３５ａ及び第１ガス循環配管９８ａを同時に連通させるとともに、第２気体供給配管９４ｂ、第２ガス供給配管３４ｂ、第２ガス排出配管３５ｂ及び第１ガス循環配管９８ａを同時に連通させる。
【００４３】
上記細胞培養装置１１の作用について以下に記載する。
上記細胞培養装置１１を用いて細胞を培養する際にはまず、第１及び第２培養ユニット１２ａ，１２ｂ内に配設される培養容器３１を無菌的に組み立てる。すなわち、図２及び図３に示すように、各開口面３１ａの所定位置に液体供給配管３２ａ，３２ｂ、液体排出配管３３ａ，３３ｂ、ガス供給配管３４ａ，３４ｂ及びガス排出配管３５ａ，３５ｂを挿通させる。次に、図４（ａ）及び図５に示すように、第１及び第２樹脂堰４４ａ，４４ｂの一側部所定位置に、前記液体供給配管３２ａ，３２ｂ及び液体排出配管３３ａ，３３ｂを挿通させる。
【００４４】
次に、第１及び第２培養皿４１ａ，４１ｂを組み立てる。すなわち、各プレート４２の上面に親水性フィルム４３を積層した後、第１樹脂堰４４ａ又は第２樹脂堰４４ｂを積み上げる。続いて、図４（ｂ）に示されるクリップ４５の下端部を各四角溝４２ａに係入させた後、押圧ネジ４５ｃを螺進させて各押圧板４５ｂの下面で第１樹脂堰４４ａ又は第２樹脂堰４４ｂの上面を押圧し、第１及び第２培養空間４６ａ，４６ｂの下端部から培地４７が漏出しないように挟持固定する。
【００４５】
最後に、これら第１及び第２培養皿４１ａ，４１ｂを各培養容器３１の底面上に載置し、各係止突部４５ｄを係合凸部３１ｂに係合させながら開口面３１ａで各培養容器３１を密閉する。続いて、組み立てられた各培養容器３１を保温プレート２６の上面中央部に載置した後、貯蔵培地タンク６１、剥離剤タンク６２、剥離停止剤タンク６３、ガス供給器９１の炭酸ガスボンベ、酸素ガスボンベ及び加湿器９２内に、それぞれ充分量の培地４７、細胞剥離剤、剥離停止剤、炭酸ガス、酸素ガス及び水を充填し、キーボード１０３からＣＰＵに開始信号を入力する。
【００４６】
前記開始信号により、ＣＰＵはまず、図７に示されるステップＳ１（以下、Ｓ１とのみ記載する。その他のステップについても同様である）において細胞培養装置１１各部の動作環境確認を行う。すなわち、ＣＰＵは簡易冷蔵庫６４、保温庫６６、ガスアナライザ９３、ガス循環ポンプ９６及び培地残量センサ６５ａの電源をオンにするとともに、第１培養ユニット１２ａ内のＣＣＤカメラ２２、保温プレート２６及び照明装置１０７の電源をオンにする。
【００４７】
すると、第１培養ユニット１２ａ内の照明装置１０７が第１培養皿４１ａを照明し、ＣＣＤカメラ２２が第１培養空間４６ａ内の映像を撮影してその映像をモニタ１０４に映し出す。また、ＣＰＵは細胞培養装置１１各部の動作環境データをモニタ１０４の画面上に表示する。このとき、ＣＰＵは培地残量センサ６５ａから入力される培地残量データに基づいて培地供給ポンプ６８を駆動させ、加温培地タンク６５に所定量の培地４７を移動させる。
【００４８】
一方、ＣＰＵは第５及び第６電動バルブ９５，９７に切替信号を出力し、第２気体供給配管９４ｂ、第１ガス供給配管３４ａ、第１ガス排出配管３５ａ及び第１ガス循環配管９８ａを連通させ、ガスを第１培養ユニット１２ａの培養容器３１内へと供給させる。このとき、ＣＰＵはガスアナライザ９３から入力される成分分析データに基づいてガス供給器９１及び加湿器９２にガスの成分調整を行わせる。上記細胞培養装置１１の準備が完了したところで、ＣＰＵはモニタ１０４に動作環境データとしての準備完了信号を出力してモニタ１０４の画面上に準備完了表示させる。
【００４９】
次に、ＣＰＵはＳ２において細胞の接種を行う。すなわち、クリーンベンチ５１内で手作業により接着依存性細胞の細胞懸濁液を調製した後、その懸濁液に細胞供給配管５２の先端を挿入した状態で供給スイッチ５３を押圧する。このとき、ＣＰＵは第１、第３及び第４電動バルブ５４，７３，８２に切替信号を出力し、細胞供給配管５２、液体供給配管７２及び第１液体供給配管３２ａを連通させるとともに、第４電動バルブ８２を閉鎖させる。そして、ＣＰＵは前記供給スイッチ５３が押圧されている間中、液体供給ポンプ７４を駆動させて前記細胞懸濁液を第１培養ユニット１２ａの第１培養空間４６ａ内に移動させる。
【００５０】
次に、制御装置１０１はＳ３において部分領域データの取り込みを行う。すなわち、制御装置１０１はＣＣＤカメラ２２にて撮影された第１培養皿４１ａの底面に接着している細胞の画像を画像データとして画像処理装置１０５に取り込む。続いて、この画像処理装置１０５は前記画像データの特徴抽出処理を行って部分領域データを切り取り、ＣＰＵに出力する。続いて、ＣＰＵはＳ４において前記部分領域データとデータファイル１０２に記憶されている細胞パターンデータとを照合する。そして、ＣＰＵはＳ５において前記部分領域データと細胞パターンデータとが一致するか否かを判断し、一致しない場合には前記Ｓ３の処理を繰り返し、一致した場合にはＳ６の処理を行う。このＳ６において、ＣＰＵは前記部分領域データに基づいて第１培養空間４６ａの底部に接着している接着依存性細胞の細胞密度（接着細胞濃度）を算出してＲＡＭに記憶させる。
【００５１】
次に、ＣＰＵはＳ７において、前記接着細胞濃度と、その処理以前に記憶された最も新しい接着細胞濃度（前回算出結果）との差（増加率又は増加割合）を計算する。なお、前記前回算出結果がＲＡＭに記憶されていなかった場合には、その接着細胞濃度を０として処理する。そして、このＳ７において前記増加率又は増加割合がＲＯＭに記憶された設定値（所定値）以上である場合には、ＣＰＵはＳ８の処理を行って所定時間待機した後にＳ３の処理を繰り返す。逆に前記増加率又は増加割合が所定値未満であった場合には、ＣＰＵはＳ９において接着後培地交換工程における培地交換操作を行う。なお、前記所定値としては、好ましくは０又はほぼ０の値である。
【００５２】
このＳ９において、ＣＰＵはまず、第４電動バルブ８２に切替信号を出力し、第１液体排出配管３３ａと液体排出配管８１とを連通させる。次に、ＣＰＵは液体排出ポンプ８３を駆動させて第１培養空間４６ａ内の廃培地４７を廃液タンク１６へと排出させながら、回動装置２５の回動棒２５ａをゆっくりと上動させる。このとき、図３に示されるように、傾斜ステージ２３は回動棒２５ａの上動に伴って所定量回動されながら培養容器３１を傾斜させ、第１液体排出配管３３ａによる廃培地４７の排出を容易にさせる。この状態で、液体排出ポンプ８３は第１培養空間４６ａ内の廃培地４７及び親水性フィルム４３に接着されなかった接着不能細胞を第１液体排出配管３３ａの先端から汲み出す。そして、第１培養空間４６ａ内には親水性フィルム４３の上面に接着した細胞のみが残留する。
【００５３】
前記液体排出ポンプ８３に対する駆動信号がオフしたところで、ＣＰＵは第４電動バルブ８２を閉鎖させる。続いて、ＣＰＵは回動装置２５の回動棒２５ａを下動させて傾斜ステージ２３を水平状態に戻す。次に、ＣＰＵは第１及び第３電動バルブ５４，７３に切替信号を出力し、第２培地供給配管６７ｂ、液体供給配管７２及び第１液体供給配管３２ａを連通させる。さらに、ＣＰＵは液体供給ポンプ７４を駆動させて加温培地タンク６５内の加温培地４７を第１培養空間４６ａ内に供給させる。そして、前記液体供給ポンプ７４の駆動が停止したところで、ＣＰＵは第１及び第３電動バルブ５４，７３を閉鎖させる。
【００５４】
次に、ＣＰＵはＳ１０の処理を行って所定時間待機した後、図８に示されるＳ１１〜Ｓ１４の処理を行う。このＳ１１〜Ｓ１４は上記Ｓ３〜Ｓ６と同様の処理である。そして、Ｓ１５において、ＣＰＵは前記Ｓ１４においてＲＡＭに記憶された接着細胞濃度がデータファイル１０２に記憶された設定値（限界値）未満である場合にはＳ１６の処理を行い、前記接着細胞濃度が限界値以上である場合にはＳ１７の処理を行う。なお、前記限界値としては例えば、ほぼコンフルエント状態の接着細胞濃度である。
【００５５】
Ｓ１６において、ＣＰＵは前記Ｓ１４で記憶された接着細胞濃度及び前回算出結果を用いて、所定時間に第１培養空間４６ａ内の接着依存性細胞が消費した培地消費量と、現在の培地４７の状態を示す累積培地消費量とを計算する。すなわち、ＣＰＵはまず、データファイル１０２に記憶された接着依存性細胞の単位時間当たりの培地消費速度を読み出す。この培地消費速度としては、好ましくは培地４７中の成分のうち最も消費されやすい成分について、あらかじめ実験により求められたものである。次に、ＣＰＵは前記Ｓ１４で記憶された接着細胞濃度と前回算出結果との間の平均濃度を計算するとともに、前回算出結果を算出した時刻（培養時間）から現在に至るまでの経過時間を計算する。そして、ＣＰＵは前記培地消費速度に平均濃度及び経過時間を乗じることによって、前記経過時間内に消費された培地消費量を計算する。さらに、ＣＰＵは前記培地消費量をＲＡＭに記憶させるとともに、前回培地交換を行ってから現在に至るまでにＲＡＭに記憶された培地消費量の累積値（累積培地消費量）を計算する。
【００５６】
そして、ＣＰＵはＳ１８において前記累積培地消費量がデータファイル１０２に記憶された所定量未満であるか否かを判別する。前記累積培地消費量が所定量未満であった場合には、ＣＰＵはＳ１９の処理を行って所定時間待機した後にＳ１１の処理を繰り返す。逆に累積培地消費量が所定量以上であった場合には、ＣＰＵはＳ２０において上記Ｓ９と同様に培地交換操作を行った後にＳ１９の処理を行う。なお、前記所定量としては、第１培養空間４６ａ内の培地４７量に基づく前記培地４７中の成分量よりも少ない量であり、好ましくはその成分量とほぼ同じ量である。
【００５７】
一方、Ｓ１５において接着細胞濃度が限界値以上であった場合には、ＣＰＵはＳ１７において、現在第１培養ユニット１２ａ又は第２培養ユニット１２ｂのいずれから入力が行われているかを判断して継代培養操作が可能であるか否かを判別する。そして、ＣＰＵは継代培養操作が可能である（現在第１培養ユニット１２ａから入力されている）場合にはＳ２１で継代培養操作を行い、不可能である（現在第２培養ユニット１２ｂから入力されている）場合にはＳ２２の処理を行った後にＳ１９の処理を行う。
【００５８】
このＳ２２において、ＣＰＵはモニタ１０４に単層培養操作の終了を画面表示させる。なお、この画面表示はキーボード１０３からＣＰＵに対し停止信号又は修正信号が入力されるまで継続される。そして、ＣＰＵは前記停止信号が入力された場合には全ての処理を停止して電源をオフし、修正信号が入力された場合にはその指示に従う。
【００５９】
また、前記Ｓ２１において継代培養操作を行う場合には、ＣＰＵはまず、上記培地交換操作において第１培養空間４６ａ内から廃培地４７を汲み出す場合と同様に、第１液体排出配管３３ａと液体排出配管８１とを連通させた後、第１培養空間４６ａ内の廃培地４７を廃液タンク１６へと排出させながら回動棒２５ａを上動させる。廃培地４７の排出が終了したところで、第４電動バルブ８２を閉鎖した後、傾斜ステージ２３を水平状態に戻す。次に、ＣＰＵは第１〜第３電動バルブ５４，７０，７３に切替信号を出力し、剥離剤配管６９ａ、継代培養配管７１、液体供給配管７２及び第１液体供給配管３２ａを連通させた後、液体供給ポンプ７４を駆動させて剥離剤タンク６２内の細胞剥離剤を第１培養空間４６ａ内に供給させる。このとき、前記細胞剥離剤は保温庫６６内の加温部７１ａを通過する際に加温されることにより、細胞に対する温度ショックを低減させるとともに細胞剥離剤の活性が高められる。そして、所定量の細胞剥離剤を供給したところで、ＣＰＵは第１及び第３電動バルブ５４，７３を閉鎖させる。
【００６０】
次に、ＣＰＵはＣＣＤカメラ２２から画像処理装置１０５を介して入力される部分領域データに基づいて、親水性フィルム４３上に接着された細胞像がほとんど確認されなくなった（接着している細胞が剥離された）時点で剥離停止剤を第１培養空間４６ａ内に供給させる。すなわち、ＣＰＵはまず、第１〜第３電動バルブ５４，７０，７３に切替信号を出力し、剥離停止剤配管６９ｂ、継代培養配管７１、液体供給配管７２及び第１液体供給配管３２ａを連通させる。さらに、ＣＰＵは液体供給ポンプ７４を駆動させて剥離停止剤タンク６３内の剥離停止剤を第１培養空間４６ａ内に供給させる。所定時間静置させた後、ＣＰＵは第１及び第３電動バルブ５４，７３に切替信号を出力し、第２培地供給配管６７ｂ、液体供給配管７２及び第１液体供給配管３２ａを連通させる。続いて、ＣＰＵは液体供給ポンプ７４を駆動させて加温培地タンク６５内の培地４７を第１培養空間４６ａ内に送り込んで細胞懸濁液を調製する。
【００６１】
次に、ＣＰＵは第４電動バルブ８２に切替信号を出力し、第１及び第２液体排出配管３３ａ，３３ｂを連通させた後、細胞移動ポンプ８４を駆動させて第１培養空間４６ａ内の細胞懸濁液を第２培養空間４６ｂ内に送り込みながら、第１培養ユニット１２ａの傾斜ステージ２３を傾斜させる。そして、前記細胞移動ポンプ８４の駆動が停止したところで、ＣＰＵは第４電動バルブ８２を閉鎖させる。
【００６２】
最後に、ＣＰＵは第２培養ユニット１２ｂのＣＣＤカメラ２２、保温プレート２６及び照明装置１０７の電源をオンするとともに、第１培養ユニット１２ａのＣＣＤカメラ２２からの入力を第２培養ユニット１２ｂのＣＣＤカメラ２２からの入力に切り替える。さらに、ＣＰＵは第５及び第６電動バルブ９５，９７に切替信号を出力し、第２培養ユニット１２ｂの培養容器３１内にガスを供給させる。続いて、ＣＰＵはＳ３に戻って上記第１培養ユニット１２ａ内で行われていた処理と同様の処理を第２培養ユニット１２ｂで実行する。
【００６３】
なお、この第２培養ユニット１２ｂにおいてＳ９及びＳ２０の培地交換操作を行う際には、ＣＰＵはまず、第４電動バルブ８２に切替信号を出力し、第２液体排出配管３３ｂと液体排出配管８１とを連通させた後、液体排出ポンプ８３を駆動させて第２培養空間４６ｂ内の廃培地４７を廃液タンク１６へと排出させながら、傾斜ステージ２３を傾斜させる。そして、第２培養空間４６ｂ内の廃培地４７が排出されたところで、ＣＰＵは第４電動バルブ８２を閉鎖させるとともに傾斜ステージ２３を水平状態に戻す。次に、ＣＰＵは第１及び第３電動バルブ５４，７３に切替信号を出力し、第２培地供給配管６７ｂ、液体供給配管７２及び第２液体供給配管３２ｂを連通させた後、液体供給ポンプ７４を駆動させて加温培地タンク６５内の加温培地４７を第２培養空間４６ｂ内に供給させる。その後、第１及び第３電動バルブ５４，７３を閉鎖させる。
【００６４】
従って、この第１実施形態の培養装置１１は、ＣＣＤカメラ２２により培養容器３１内の細胞の画像データを制御装置１０１に入力し、その画像データに基づいて制御装置１０１により接着細胞濃度を算出し、その算出結果に基づいて培地交換操作及び継代培養操作を実行するタイミングを決定し、その操作を細胞培養装置１１各部に実行させるように構成されている。このため、制御装置１０１が常に細胞の状態を正確に把握して無駄のない培養操作を行うように指示するとともに、ほとんど全ての培養操作が自動的に行われ、細胞培養に要する手間、時間及び費用を著しく低減させることができることから、細胞培養に適した条件を維持しつつ、培養操作を容易に行うことができる。
【００６５】
特に、算出された接着細胞濃度の増加率又は増加割合に基づいて、接着後培地交換工程における培地交換操作のタイミングが決定されることから、より多くの接着可能な細胞を接着させることができるうえ、細胞剥離剤及び剥離停止剤に細胞が曝される時間を可能な限り短縮し、それらの細胞毒性による害を軽減させることができる。さらに、計算された累積培地消費量に基づいて、培地交換操作を行うタイミングが決定されることから、培地４７の無駄を低減させつつ、効率的な細胞培養を行わせることができる。加えて、前記従来の細胞培養方法と比較して、雑菌が混入する可能性を著しく低減させることもできる。また、この実施形態の細胞培養方法についても前記細胞培養装置１１と同様の効果が発揮される。
（第２実施形態）
この発明の第２実施形態を上記第１実施形態と異なる点を中心に説明する。
【００６６】
図９及び図１０（ａ）に示すように、第２実施形態の細胞培養装置１１は１つの培養ユニット１２を備えている。この培養ユニット１２を構成する培養容器３１は透明な合成樹脂により四角筒状に形成されている。この培養容器３１のヒンジ部２４側の側面である開口面３１ａは、培養容器３１に対して開閉可能に嵌合され、培養容器３１が開口又は密閉されるようになっている。また、図１０（ｂ）に示すように、前記開口面３１ａ及びその開口面３１ａと対向する前後両内側面の周縁部には、係合凸部３１ｂがほぼ四角枠状に突設されている。
【００６７】
図１０（ａ）に示すように、培養容器３１の中央には前後方向に延びる回転軸１１１が挿通されている。この回転軸１１１は、培養容器３１の前後両外側面を螺着固定するためのナット１１１ａを備えており、それら前後一対のナット１１１ａで前記両外側面を押圧することにより、回転軸１１１の所定位置に培養容器３１を支持固定することができるようになっている。この回転軸１１１は、培養ユニット１２のヒンジ部２４側に位置する図示しない回動基端部を中心に上下方向に所定角度回動させることができるうえ、回転軸１１１を上方に所定角度回動させた状態で、回転軸１１１を軸に培養容器３１を反時計方向に９０°ずつ回転させることができるようになっている。また、図１０（ｂ）に示すように、培養容器３１内に配設された回転軸１１１の中央には照明装置１１２が吊下され、培養容器３１の底部を常に照明するようになっている。
【００６８】
図１０（ａ）に示されるように、開口面３１ａの上下及び左右端部には、下端部から時計方向に順に第１液体供給配管３２ａ、第１液体排出配管３３ａ、第２液体供給配管３２ｂ、第２液体排出配管３３ｂ、第３液体供給配管３２ｃ、第３液体排出配管３３ｃ、第４液体供給配管３２ｄ及び第４液体排出配管３３ｄが接続されている。また、前記回転軸１１１の両側方位置の開口面３１ａには、ガス供給配管３４及びガス排出配管３５が接続されている。
【００６９】
図１０（ｂ）に示すように、この培養容器３１の回転軸１１１を取り囲む４つの内側面には、下から反時計方向に順に第１培養皿４１ａ、第２培養皿４１ｂ、第３培養皿４１ｃ及び第４培養皿４１ｄが添着されている。前記第１及び第２培養皿４１ａ，４１ｂはそれぞれ上記第１実施形態と同じ構造を有している。また、第３培養皿４１ｃは前記第２培養皿４１ｂの第２培養空間４６ｂよりも広い第３培養空間４６ｃを有する第３樹脂堰４４ｃを備えている。第４培養皿４１ｄは前記第３培養皿４１ｃの第３培養空間４６ｃよりも広い第４培養空間４６ｄを有する第４樹脂堰４４ｄを備えている。
【００７０】
図９に模式的に示すように、第１電動バルブ５４と接続された液体供給配管７２の他端は第７電動バルブ１１３と接続されている。さらに、この第７電動バルブ１１３は、第１液体分配配管１１４及び第２液体分配配管１１５と接続されている。前記第１液体分配配管１１４の他端は第８電動バルブ１１６と接続されている。この第８電動バルブ１１６は前記第１液体供給配管３２ａ及び第２液体供給配管３２ｂと接続されている。また、前記第２液体分配配管１１５の他端は第９電動バルブ１１７と接続されている。この第９電動バルブ１１７は前記第３液体供給配管３２ｃ及び第４液体供給配管３２ｄと接続されている。
【００７１】
一方、液体排出配管８１は廃液タンク１６及び第１０電動バルブ１２１と接続されている。この第１０電動バルブ１２１は第１液体移動配管１２２、第２液体移動配管１２３及び第３液体移動配管１２４と接続されている。前記第１液体移動配管１２２は第１１電動バルブ１２５と接続されている。この第１１電動バルブ１２５は前記第１液体排出配管３３ａ及び第２液体排出配管３３ｂと接続されている。また、第１液体排出配管３３ａの途中には第１細胞移動ポンプ１２６が設けられ、第２液体排出配管３３ｂの途中には双方向移動可能な第２細胞移動ポンプ１２７が設けられている。
【００７２】
前記第２液体移動配管１２３は第１２電動バルブ１２８と接続されている。この第１２電動バルブ１２８は前記第３液体排出配管３３ｃ及び第４液体排出配管３３ｄと接続されている。これら第３液体排出配管３３ｃ及び第４液体排出配管３３ｄの途中にはそれぞれ、いずれも双方向移動可能な第３細胞移動ポンプ１２９及び第４細胞移動ポンプ１３０が設けられている。さらに、前記第３液体移動配管１２４は継代培養時に細胞懸濁液を一時的に貯留するための細胞貯留タンク１３１と接続されている。
【００７３】
ガス交換ユニット１８を構成する加湿器９２は前記ガス供給配管３４と接続されている。このガス供給配管３４の途中には前記ガス循環ポンプ９６が設けられている。また、ガスアナライザ９３は前記ガス排出配管３５と接続されている。その他の構成は上記第１実施形態と同様である。
【００７４】
図１１に示すように、第２実施形態のＣＰＵは回転軸１１１に回転信号を出力し、図示しない回動基端部を中心に回転軸１１１を所定角度上動させるとともに、その回転軸１１１を軸に培養容器３１を９０°回転させた後、回転軸１１１を下動させて培養容器３１を傾斜ステージ２３上に載置する。ＣＰＵは第７電動バルブ１１３に切替信号を出力し、液体供給配管７２と、第１液体分配配管１１４又は第２液体分配配管１１５とを連通させる。ＣＰＵは第８電動バルブ１１６に切替信号を出力し、第１液体分配配管１１４と、第１液体供給配管３２ａ又は第２液体供給配管３２ｂとを連通させる。ＣＰＵは第９電動バルブ１１７に切替信号を出力し、第２液体分配配管１１５と、第３液体供給配管３２ｃ又は第４液体供給配管３２ｄとを連通させる。
【００７５】
ＣＰＵは第１０電動バルブ１２１に切替信号を出力し、第１液体移動配管１２２及び液体排出配管８１、第２液体移動配管１２３及び液体排出配管８１、第１液体移動配管１２２及び第３液体移動配管１２４、又は第３液体移動配管１２４及び第２液体移動配管１２３を連通させる。ＣＰＵは第１１電動バルブ１２５に切替信号を出力し、第１液体排出配管３３ａ及び第１液体移動配管１２２、又は第２液体排出配管３３ｂ及び第１液体移動配管１２２を連通させる。
【００７６】
ＣＰＵは第１細胞移動ポンプ１２６に駆動信号を出力して第１培養空間４６ａ内の液体（廃培地４７又は細胞懸濁液）を汲み出して廃液タンク１６又は細胞貯留タンク１３１に移動させる。ＣＰＵは第２細胞移動ポンプ１２７に駆動信号を出力し、第２培養空間４６ｂ内の液体（廃培地４７又は細胞懸濁液）を汲み出して廃液タンク１６又は細胞貯留タンク１３１に移動させるとともに、細胞貯留タンク１３１内の細胞懸濁液を第２培養空間４６ｂ内に移動させる。
【００７７】
ＣＰＵは第１２電動バルブ１２８に切替信号を出力し、第３液体排出配管３３ｃ及び第２液体移動配管１２３、又は第４液体排出配管３３ｄ及び第２液体移動配管１２３を連通させる。ＣＰＵは第３細胞移動ポンプ１２９に駆動信号を出力し、第３培養空間４６ｃ内の液体（廃培地４７又は細胞懸濁液）を汲み出して廃液タンク１６又は細胞貯留タンク１３１に移動させるとともに、細胞貯留タンク１３１内の細胞懸濁液を第３培養空間４６ｃ内に移動させる。ＣＰＵは第４細胞移動ポンプ１３０に駆動信号を出力し、第４培養空間４６ｄ内の液体（廃培地４７又は細胞懸濁液）を汲み出して廃液タンク１６又は細胞貯留タンク１３１に移動させるとともに、細胞貯留タンク１３１内の細胞懸濁液を第４培養空間４６ｄ内に移動させる。
【００７８】
この第２実施形態の制御装置１０１は、上記構成に加えて、保温プレート２６、照明装置１０７、第３電動バルブ７３、第４電動バルブ８２、液体排出ポンプ８３、細胞移動ポンプ８４、第５電動バルブ９５及び第６電動バルブ９７の構成がないこと以外は、上記第１実施形態と同様である。
【００７９】
上記細胞培養装置１１の作用について以下に記載する。
さて、上記細胞培養装置１１を用いて接着依存性細胞を培養する際にはまず、上記第１実施形態と同様に第１〜第４培養皿４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４１ｄを無菌的に組み立てた後、各培養皿４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４１ｄの各係止突部４５ｄを培養容器３１の係合凸部３１ｂに係合させて所定位置に添着させながら開口面３１ａで培養容器３１を密閉するとともに、培養容器３１に回転軸１１１を挿通する。続いて、第１培養皿４１ａが添着された側面を保温プレート２６の上面中央部に載置した後、前後一対のナット１１１ａにより培養容器３１を回転軸１１１に支持固定させる。そして、充分量の培地４７、細胞剥離剤、剥離停止剤、炭酸ガス、酸素ガス及び水を充填した後、キーボード１０３からＣＰＵに開始信号を入力する。
【００８０】
前記開始信号によりＣＰＵは上記第１実施形態と同様の処理を行う。すなわち、まずＳ１において細胞培養装置１１各部の動作環境確認を行って、ＣＣＤカメラ２２、保温プレート２６、照明装置１１２、簡易冷蔵庫６４、保温庫６６、ガスアナライザ９３、ガス循環ポンプ９６及び培地残量センサ６５ａの電源をオンにする。すると、照明装置１１２が第１培養皿４１ａを照明するとともに、ＣＣＤカメラ２２が第１培養空間４６ａ内の映像をモニタ１０４に映し出す。また、上記第１実施形態と同様に、細胞培養装置１１各部の動作環境データをモニタ１０４に表示するとともに、加温培地タンク６５内に所定量の培地４７を移動させる。さらに、ガスアナライザ９３から入力される成分分析データに基づいて調整されたガスをガス循環ポンプ９６により培養容器３１内に供給させる。最後に、モニタ１０４に準備完了表示させる。
【００８１】
次に、Ｓ２において細胞の接種を行う。すなわち、クリーンベンチ５１内で調製された細胞懸濁液に細胞供給配管５２の先端を挿入した状態で供給スイッチ５３を押圧することによって、ＣＰＵは第１、第７及び第８電動バルブ５４，１１３，１１６に切替信号を出力し、細胞供給配管５２、液体供給配管７２、第１液体分配配管１１４及び第１液体供給配管３２ａを連通させた後、液体供給ポンプ７４を駆動させて前記細胞懸濁液を第１培養空間４６ａ内に供給させる。続いて、制御装置１０１は上記第１実施形態と同様にＳ３〜Ｓ８の処理を行う。
【００８２】
Ｓ９において培地交換操作を行う際にはまず、ＣＰＵは第１０及び第１１電動バルブ１２１，１２５に切替信号を出力し、第１液体排出配管３３ａ、第１液体移動配管１２２及び液体排出配管８１を連通させた後、第１細胞移動ポンプ１２６を駆動させて第１培養空間４６ａ内の廃培地４７を廃液タンク１６へと排出させながら傾斜ステージ２３を傾斜させる。そして、第１培養空間４６ａ内の廃培地４７が排出されたところで第１１電動バルブ１２５を閉鎖させた後、傾斜ステージ２３を水平状態に戻す。次に、ＣＰＵは第１、第７及び第８電動バルブ５４，１１３，１１６に切替信号を出力し、第２培地供給配管６７ｂ、液体供給配管７２、第１液体分配配管１１４及び第１液体供給配管３２ａを連通させた後、液体供給ポンプ７４を駆動させて加温培地タンク６５内の加温培地４７を第１培養空間４６ａ内に供給させる。そして、前記液体供給ポンプ７４の駆動が停止したところで第１、第７及び第８電動バルブ５４，１１３，１１６を閉鎖させる。
【００８３】
次に、上記第１実施形態と同様にＳ１０〜Ｓ１５の処理を行う。このＳ１５において、ＣＰＵは前記Ｓ１４においてＲＡＭに記憶された接着細胞濃度がデータファイル１０２に記憶された設定値（限界値）未満である場合には、Ｓ１６及びＳ１８〜Ｓ２０の処理を行う。なお、このＳ２０における培地交換操作は前記第２実施形態のＳ９と同様である。逆に前記接着細胞濃度が限界値以上である場合にはＳ１７の処理を行う。
【００８４】
ＣＰＵはＳ１７において、現在接着依存性細胞が第１〜第４培養皿４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４１ｄのいずれの培養皿で培養されているかを判断して継代培養操作が可能であるか否かを判別する。そして、ＣＰＵは、継代培養操作が可能である（現在第１〜第３培養皿４１ａ，４１ｂ，４１ｃで培養が行われている）場合にはＳ２１で継代培養操作を行い、不可能である（現在第４培養皿４１ｄで培養が行われてる）場合には上記第１実施形態と同様にＳ２２の処理を行った後にＳ１９の処理を行う。
【００８５】
Ｓ２１において継代培養操作を行う際には、ＣＰＵはまず、上記培地交換操作において第１培養空間４６ａ内から廃培地４７を汲み出す場合と同様に、第１液体排出配管３３ａ、第１液体移動配管１２２及び液体排出配管８１を連通させた後、第１培養空間４６ａ内の廃培地４７を廃液タンク１６へと排出させながら傾斜ステージ２３を傾斜させる。廃培地４７の排出が終了したところで、第１１電動バルブ１２５を閉鎖させるとともに、傾斜ステージ２３を水平状態に戻す。次に、ＣＰＵは第１、第２、第７及び第８電動バルブ５４，７０，１１３，１１６に切替信号を出力し、剥離剤配管６９ａ、継代培養配管７１、液体供給配管７２、第１液体分配配管１１４及び第１液体供給配管３２ａを連通させる。さらに、ＣＰＵは液体供給ポンプ７４を駆動させて剥離剤タンク６２内の細胞剥離剤を第１培養空間４６ａ内に供給させた後、第１、第２、第７及び第８電動バルブ５４，７０，１１３，１１６を閉鎖させる。
【００８６】
次に、ＣＰＵはＣＣＤカメラ２２から入力される部分領域データに基づいて、親水性フィルム４３上に接着された細胞像がほとんど確認されなくなった時点で、剥離停止剤を第１培養空間４６ａ内に供給する。すなわち、ＣＰＵはまず、第１、第２、第７及び第８電動バルブ５４，７０，１１３，１１６に切替信号を出力し、剥離停止剤配管６９ｂ、継代培養配管７１、液体供給配管７２、第１液体分配配管１１４及び第１液体供給配管３２ａを連通させる。さらに、ＣＰＵは液体供給ポンプ７４を駆動させて剥離停止剤タンク６３内の剥離停止剤を第１培養空間４６ａ内に供給させる。所定時間静置させた後、ＣＰＵは第１、第７及び第８電動バルブ５４，１１３，１１６に切替信号を出力し、第２培地供給配管６７ｂ、液体供給配管７２、第１液体分配配管１１４及び第１液体供給配管３２ａを連通させた後、液体供給ポンプ７４を駆動させて加温培地タンク６５内の培地４７を第１培養空間４６ａ内に送り込んで細胞懸濁液を調製する。
【００８７】
次に、ＣＰＵは第１０及び第１１電動バルブ１２１，１２５に切替信号を出力し、第１液体排出配管３３ａ、第１液体移動配管１２２及び第３液体移動配管１２４を連通させる。続いて、ＣＰＵは第１細胞移動ポンプ１２６を駆動させて第１培養空間４６ａ内の細胞懸濁液を細胞貯留タンク１３１内に供給させながら、傾斜ステージ２３を傾斜させる。さらに、前記第１細胞移動ポンプ１２６の駆動が停止したところで、ＣＰＵは第１１電動バルブ１２５を閉鎖させる。
【００８８】
次に、ＣＰＵは回転軸１１１に回転信号を出力し、図示しない回動基端部を中心に回転軸１１１を上方に所定角度回動させ、回転軸１１１を軸に培養容器３１を９０°回転させた後、回動基端部を中心に回転軸１１１を下方に回動させて傾斜ステージ２３上に載置する。このとき、第２培養皿４１ｂが添着された培養容器３１の側面が傾斜ステージ２３上に載置され、この第２培養空間４６ｂ内で細胞を培養することができる状態になっている。
【００８９】
次に、ＣＰＵは第１０及び第１１電動バルブ１２１，１２５に切替信号を出力し、第２液体排出配管３３ｂ、第１液体移動配管１２２及び第３液体移動配管１２４を連通させた後、第２細胞移動ポンプ１２７を駆動させて細胞貯留タンク１３１内の細胞懸濁液を第２培養空間４６ｂ内に供給する。さらに、前記第２細胞移動ポンプ１２７の駆動が停止したところで、第１１電動バルブ１２５を閉鎖させた後、ＣＰＵはこの第２培養空間４６ｂ内の接着依存性細胞に対してＳ３の処理に戻った後に上記と同様な一連の処理を繰り返す。
【００９０】
そして、この細胞培養装置１１により培養されている接着依存性細胞は、第２培養空間４６ｂから第３培養空間４６ｃを経て第４培養空間４６ｄへと順次継代培養される。さらに、第４培養空間４６ｄ内における培養時に、図８のＳ１７において継代培養操作が可能でないと判断した場合には、上記第１実施形態と同様にＣＰＵはＳ２２の処理を行う。
【００９１】
なお、これら各継代培養操作において細胞懸濁液を移動させる際には、上記と同様に、細胞懸濁液は一旦細胞貯留タンク１３１内で貯留され、回転軸１１１を軸に培養容器３１を回転させた後に新しい培養皿内に移動されるという過程を経て移動される。また、培地交換操作及び継代培養操作において液体が供給される際には、上記と同様に、液体が収容されているタンクと、その液体が供給される培養皿との間を繋ぐ液体配管１３をＣＰＵにより適宜選択するとともに、その選択された配管に設けられたポンプを駆動させて液体の供給が行われる。液体を排出する場合も同様である。
【００９２】
従って、この第２実施形態の細胞培養装置１１は、上記第１実施形態と同様の効果を発揮することができるうえ、細胞培養装置１１の大型化を抑えつつ、より多くの継代培養操作を行うことができる。特に、多くの継代培養操作を行って大量の細胞を培養する際には、培養容器３１の個数を増やす必要はなく培養容器３１の側面の数とそれに伴う培養皿や液体配管１３等を付加することによって、ステージ台２１やＣＣＤカメラ２２等の複雑かつ高価な構成を追加することなく、ほぼそのままの簡単な構成で大量培養を行うことができる。
【００９３】
なお、上記各実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  親水性フィルム４３上に接着した細胞の密度を表す接着細胞濃度の代わりに、親水性フィルム４３上に接着した細胞の数を表す接着細胞数、親水性フィルム４３上に接着した細胞が占める面積を表す接着細胞占有面積、又は親水性フィルム４３の接着可能面積に対する前記接着細胞占有面積の割合を示す接着細胞占有率を算出すること。このように構成した場合でも同様な効果を奏する。
【００９４】
・  Ｓ１６において累積培地消費量を計算する代わりに、培養容器３１内に、培地４７中の成分（好ましくは最も消費されやすい成分又は測定が容易な成分、例えばグルタミン、グルタミン酸塩、グルコース、乳酸塩）の残量を測定するための培地成分残量測定センサを設け、そのセンサで測定された成分量に基づいて、Ｓ１８において培地交換操作を行うか否かを判断するように構成すること。このように構成した場合、培地交換操作を実行するタイミングをより正確に決定することができる。
【００９５】
・  培養容器３１を振動させるためのバイブレータ手段を傾斜ステージ２３の下面に設けること。このように構成した場合、継代培養操作における細胞剥離工程において培養容器３１を振動させることにより、細胞剥離剤による細胞の剥離反応をより一層高めることができる。
【００９６】
・  細胞培養装置１１に、カルシウムイオン不含リン酸緩衝液やカルシウムイオン不含無血清培地等のカルシウムイオン不含洗浄用等張液を収容するための洗浄液タンクを設け、そのタンクと第２電動バルブ７０との間に洗浄液配管を接続すること。さらに、継代培養する際の廃培地４７抜き取り操作の直後に、細胞が接着されている培養空間内に前記洗浄用等張液を供給して汲み出す操作を行って、前記培養空間内のカルシウムイオンを除去するように構成すること。このように構成した場合、細胞剥離工程の進行をより一層促進させることができる。
【００９７】
・  継代培養時に剥離停止剤を添加しないこと。このように構成した場合でも、培地４７中に含有されているカルシウムイオンによって細胞剥離剤の活性を抑制して細胞を親水性フィルム４３上に接着させることができるうえ、剥離停止剤による細胞毒性を低減させることができる。
【００９８】
・  第２実施形態において、Ｓ１７における継代培養操作が可能か否かを判断する際に、あらかじめキーボード１０３から入力された培養皿の個数に基づいてＣＰＵが判断するように構成すること。このように構成した場合、所望とする培養条件を容易に整えることができる。
【００９９】
・  第２実施形態の培養容器３１を例えば、横三角筒状、横六角筒状又は横八角筒状等の横多角筒状に形成するとともに、培養皿の個数を例えば、３個、６個又は８個とすること。このように構成した場合、細胞培養装置１１を用いて所望とする回数の継代培養操作を容易に行うことができる。
【０１００】
・  第２実施形態の各プレート４２を省略し、培養容器３１の４つの内側面に、親水性フィルム４３及び第１〜第４樹脂堰４４ａ，４４ｂ，４４ｃ，４４ｄを添着するように構成すること。このように構成した場合、培養容器３１の構成を簡略化することができる。
【０１０１】
・  第２実施形態において、傾斜ステージ２３及び回動装置２５を省略すること。さらに、保温プレート２６を培養皿４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４１ｄの下面に設けるか、或いはガス交換ユニット１８から所定温度（例えば３７℃）のガスを供給するように構成するのが好ましい。このように構成した場合、細胞培養装置１１の構成を簡略化することができるうえ、回動基端部を中心に培養容器３１を所定角度傾斜させることができることから、培養空間内の液体を効率的に除去することができる。
【０１０２】
・  第２実施形態において、回動基端部を中心に回転軸１１１を上下方向に回動させる代わりに、水平状態を保持したまま回転軸１１１を上下動させるように構成すること。或いは、回転軸１１１を回動しないように構成するとともに、傾斜ステージ２３を上下動させるように構成すること。このように構成した場合、培養容器３１を容易に回転させることができる。
【０１０３】
・  インターネットを利用して細胞培養装置１１各部の動作環境データを閲覧することができるように構成すること。さらに、インターネットを介して制御装置１０１を制御することができるように構成するのが好ましい。このように構成した場合、細胞の培養状態を遠方にいても容易に把握することができる。
【０１０４】
・  第１実施形態の細胞培養装置１１を、第１培養ユニット１２ａ又は第２培養ユニット１２ｂと、制御装置１０１のみによって構成すること。或いは、第２実施形態の細胞培養装置１１を、培養ユニット１２と、制御装置１０１のみによって構成すること。このように構成した場合、細胞培養装置１１の構成を簡略化することができる。さらに、画像入力手段としてのＣＣＤカメラ２２から取り込まれた細胞の状態等が、出力手段としてのモニタ１０４に操作の実行を指示する出力信号としての画面表示をさせることができることから、培養操作を行うタイミングを容易に把握することができる。
【０１０５】
・  第１実施形態の細胞培養装置１１の第２培養ユニット１２ｂ、剥離剤タンク６２、剥離停止剤タンク６３及びそれらに接続される配管、電動バルブ、ポンプ等を省略し、培地交換操作のみを自動的に行うように構成すること。さらに、細胞供給ユニット１４を省略してもよい。このように構成した場合、細胞培養装置１１の構成を簡略化しつつ、培地交換操作を自動的に行うことができる。
【０１０６】
・  Ｓ６において、ＲＡＭに記憶された接着細胞濃度の算出結果に基づいて、接着細胞濃度の増加率又は増加割合の増加曲線又は増加直線をＣＰＵに予測させ、その予測結果に基づいてＳ９における接着後培地交換操作を行う時期（タイミング）をモニタ１０４に出力するように構成すること。このように構成した場合、細胞培養に要する時間を容易に予測できることから、スケジュールの調整を容易に行うことができる。
【０１０７】
・  ＲＡＭに記憶された培地消費量の計算結果に基づいて、累積培地消費量の増加曲線又は増加直線をＣＰＵに予測させ、その予測結果に基づいてＳ２０における培地交換操作を行う時期（タイミング）をモニタ１０４に出力するように構成すること。このように構成した場合、細胞培養に要する時間を容易に予測できることから、スケジュールの調整を容易に行うことができる。
【０１０８】
・  Ｓ１４において、ＲＡＭに記憶された接着細胞濃度の算出結果に基づいて、接着細胞濃度の増加曲線又は増加直線をＣＰＵに予測させ、その予測結果に基づいてＳ２１における継代培養操作を行う時期（タイミング）をモニタ１０４に出力するように構成すること。このように構成した場合、細胞培養に要する時間を容易に予測できることから、スケジュールの調整を容易に行うことができる。
【０１０９】
・  ＣＣＤカメラ２２にスキャン装置を設け、レンズ２２ａの焦点深度を連続的に変化させて撮影するように構成すること。さらに、前記撮影された画像データから培養容器３１内に接種された細胞懸濁液中の全ての細胞数（接種細胞濃度）を算出するように構成すること。このように構成した場合、細胞接種操作時及び継代培養操作時において接種細胞濃度を算出することによって、その濃度を利用して細胞接着期（接着依存性細胞を培養容器に接種してからその培養容器の底面に接着するまでのステージ）における培養時間と細胞の接着率との関係を示す接着率曲線を求めることができる。
【０１１０】
さらに、前記接着率曲線の標準曲線を作製してデータファイル１０２に記憶させ、その記憶された標準曲線及び前記算出された接種細胞濃度に基づいて、ＣＰＵが細胞接種操作時及び継代培養操作時に、同種細胞の細胞接着期の細胞の挙動を予測して出力手段に出力するように構成すること。さらに、同種細胞を培養する度毎に接着率曲線を作製し、前記データファイル１０２に記憶された標準曲線を補正するように構成するのが好ましい。このように構成した場合、細胞培養に要する時間を容易に予測できることから、スケジュールの調整を容易に行うことができる。
【０１１１】
・  誘導期（前記細胞接着期の終了後から接着した細胞が細胞分裂を開始するまでのステージ）における接着細胞濃度の算出結果に基づいて、ＣＰＵに誘導期の期間を表すラグタイムを計算させた後、前記接種細胞濃度とラグタイムに基づいて、ＣＰＵが同種細胞の誘導期の細胞の挙動を予測して出力手段に出力するように構成すること。さらに、同種細胞を培養する度毎に予測結果と実測値とのずれを補正し、次回からの予測に利用できるように構成するのが好ましい。このように構成した場合、スケジュールの調整を容易に行うことができる。
【０１１２】
・  対数増殖期（前記誘導期の終了後から細胞がほぼコンフルエント状態になるまでのステージ）における接着細胞濃度の算出結果に基づいて、ＣＰＵに細胞分裂の間隔を表す平均の倍加時間又は見かけの倍加時間を計算させた後、その計算結果に基づいてコンフルエント状態になるまでの期間を予測させ、出力手段に出力するように構成すること。さらに、同種細胞を培養する度毎に予測結果と実測値とのずれを補正し、次回からの予測に利用できるように構成するのが好ましい。このように構成した場合、スケジュールの調整を容易に行うことができる。
【０１１３】
・  前記接種細胞濃度に基づいて、前記接着率曲線、ラグタイム、及び平均の倍加時間又は見かけの倍加時間を予測し、各培養時間（特に対数増殖期以降）における接着細胞濃度を予測し、その予測結果を出力手段に出力するように構成すること。このように構成した場合、細胞培養に要する時間を容易に予測できることから、スケジュールの調整を容易に行うことができる。
【０１１４】
・  各実施形態の細胞培養装置１１を用いて、接着依存性細胞を組織培養（多層化培養又は３次元培養）すること。すなわち、第１実施形態の第２培養空間４６ｂ内、又は第２実施形態の第４培養空間４６ｄ内でコンフルエント状態になった細胞を、必要に応じて組織培養用の培地４７に交換し、さらにその培養空間内で継続して培養するようにキーボード１０３からＣＰＵに修正信号を入力することができるように構成すること。このように構成した場合、細胞培養装置１１を用いて所望とする大きさの培養組織１４０を容易に得ることができる。
【０１１５】
なお、前記培養された組織を取出す際にはまず、図１２（ａ）に示すように、第１実施形態の第２培養皿４１ｂ又は第２実施形態の第４培養皿４１ｄから第２樹脂堰４４ｂ又は第４樹脂堰４４ｄを除去し、プレート４２、親水性フィルム４３及び培養組織１４０を取出す。続いて、棒状の把持部１４１と四角板状の密着板１４２とからなる組織取出し用治具１４３を用いて、前記培養組織１４０をプレート４２及び親水性フィルム４３から分離する。すなわち、まず前記把持部１４１を把持した状態で密着板１４２を培養組織１４０の上面に密着させた後、図１２（ｂ）に示されるように親水性フィルム４３の端部を密着板１４２の上面に折り返す。次に、把持部１４１を把持して密着板１４２、培養組織１４０及び親水性フィルム４３を持ち上げ、プレート４２と親水性フィルム４３とを分離する。最後に、親水性フィルム４３を培養組織１４０上から丁寧に剥離させることによって、密着板１４２上に密着した培養組織１４０が得られる。
【０１１６】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
（１）  接着依存性細胞を継代培養操作しながら単層培養を行うための培養容器であって、前記培養容器を横多角筒状に形成し、その培養容器の各内側面に培養可能面積の異なる複数の培養皿を設け、培養可能面積の小さい培養皿からその次に培養可能面積の大きい培養皿に細胞を移動させるための細胞移動手段を設けるとともに、前記各培養皿が設けられた培養容器の側面を培養容器の下端部に位置変更するための位置変更手段を備えたことを特徴とする培養容器。このように構成した場合、狭いスペースでより多くの継代培養を容易に行うことができる。
【０１１７】
（２）  前記培養容器を所定角度傾斜させるための傾斜手段を備えた細胞培養装置。このように構成した場合、充分な量の廃培地を容易に除去できることから培地交換効率を高めることができる。
【０１１８】
（３）  さらに、クリーンベンチ内に配設された細胞供給配管を含む細胞供給手段を備えた細胞培養装置。このように構成した場合、接着依存性細胞を容易に細胞培養装置内に供給することができる。
【０１１９】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明の細胞培養方法によれば、細胞培養に適した条件を維持しつつ、培養操作を容易に行うことができる。また、培地の無駄を少なくすることができる。
【０１２０】
請求項２に記載の発明の細胞培養方法によれば、請求項１に記載の発明の効果に加えて、継代培養操作時に、より多くの細胞を培養容器の底面に接着させることができるうえ、細胞に対するダメージを低減させることができる。
【０１２１】
請求項３に記載の発明の細胞培養装置によれば、細胞培養に適した条件を維持しつつ、培養操作を容易に行うことができる。また、培地の無駄を少なくすることができる。
【０１２２】
請求項４に記載の発明の細胞培養装置によれば、請求項３に記載の発明の効果に加えて、培養操作をさらに容易に行うことができる。
請求項５に記載の発明の細胞培養装置によれば、請求項４に記載の発明の効果に加えて、細胞培養装置の大型化を抑えつつ、より多くの継代培養操作を行うことができる。
【０１２３】
請求項６に記載の発明の記録媒体によれば、細胞培養に適した条件を維持しつつ、培養操作を容易に行うことができる。また、培地の無駄を少なくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  第１実施形態の細胞培養装置を示す模式図。
【図２】  第１実施形態の第１及び第２培養ユニットを示す斜視図。
【図３】  第１実施形態の第１培養ユニットを示す側断面図。
【図４】  （ａ）は第１実施形態の第１培養皿を示す斜視図、（ｂ）は同じくクリップを示す斜視図。
【図５】  第１実施形態の第２培養皿を示す斜視図。
【図６】  第１実施形態の制御装置の電気的構成を示すブロック図。
【図７】  第１及び第２実施形態の制御装置の処理を示すフローチャート。
【図８】  図７の処理動作の続きを示すフローチャート。
【図９】  第２実施形態の細胞培養装置を示す模式図。
【図１０】  （ａ）は第２実施形態の培養ユニットを示す斜視図、（ｂ）は図１０（ａ）の１０ｂ−１０ｂ線から見た培養容器を示す断面図。
【図１１】  第２実施形態の制御装置の電気的構成を示すブロック図。
【図１２】  （ａ）は実施形態以外の組織取出し操作を示す斜視図、（ｂ）は同じく正断面図。
【符号の説明】
１１…細胞培養装置、１３…培地供給手段及び細胞剥離剤供給手段を構成する液体配管、１５…培地供給手段及び細胞剥離剤供給手段を構成する液体供給ユニット、１６…液体排出手段を構成する廃液タンク、２２…画像入力手段としてのＣＣＤカメラ、２５…出力手段を構成する回動装置、３１…培養容器、４１ａ〜４１ｄ…培養皿としての第１〜第４培養皿、４３…培養容器の底面を構成する親水性フィルム、４７…培地、７４…出力手段、培地供給手段及び細胞剥離剤供給手段を構成する液体供給ポンプ、８３…出力手段及び液体排出手段を構成する液体排出ポンプ、８４…出力手段及び細胞移動手段を構成する細胞移動ポンプ、１０１…制御手段としての制御装置、１０４…出力手段を構成するモニタ、１０５…制御手段を構成する画像処理装置、１１１…出力手段及び位置変更手段を構成する回転軸、１２６，１２７，１２９，１３０…出力手段、液体排出手段及び細胞移動手段を構成する第１〜第４細胞移動ポンプ、１３１…細胞移動手段を構成する細胞貯留タンク。
【図１】
0004402249.tif 000002
【図２】
0004402249.tif 000003
【図３】
0004402249.tif 000004
【図４】
0004402249.tif 000005
【図５】
0004402249.tif 000006
【図６】
0004402249.tif 000007
【図７】
0004402249.tif 000008
【図８】
0004402249.tif 000009
【図９】
0004402249.tif 000010
【図１０】
0004402249.tif 000011
【図１１】
0004402249.tif 000012
【図１２】
0004402249.tif 000013