(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を含む液状試料と、粒子を前記被検物質に特異結合する免疫特異結合物質で感作して得られる感作粒子を含むドライ化試薬と、を混合する混合部を具備するセンサデバイスであって、
空気孔、第１接続部及び第２接続部を有するとともに、前記液状試料と、前記ドライ化試薬とを混合するための混合チャンバー、
前記第１接続部で前記混合チャンバーと接続され、前記液状試料を前記混合チャンバーに供給する第１流路、
並びに前記第２接続部で前記混合チャンバーと接続され、前記混合チャンバーで混合された前記液状試料と前記ドライ化試薬との混合物を前記混合チャンバーから送出する第２流路、並びに
前記混合チャンバー、前記第１流路及び前記第２流路を含むセンサデバイスを、重力方向と平行な回転軸を中心に、所定方向に、一体的に回転させるように支持する支持部、を備え、
前記第２流路が、複数の直線部と、前記複数の直線部を接続する少なくとも１つの湾曲部と、を有し、
前記第１接続部が前記第２接続部よりも前記回転軸の近くにあり、
前記湾曲部の少なくとも１つの頂点が、前記混合チャンバーよりも、前記回転軸を中心とする回転の前方にあり、かつ前記第１接続部よりも前記回転軸の近くにある、センサデバイス。
【請求項２】
前記混合チャンバーよりも前記回転軸の近くで前記支持部により支持された液状試料収納部をさらに具備し、
前記第１流路が、前記混合チャンバーを前記液状試料収納部と連絡している、請求項１記載のセンサデバイス。
【請求項３】
前記液状試料が、前記回転の遠心力により、前記液状試料収納部から前記第１流路を介して、前記混合チャンバーに移送される、請求項２記載のセンバイス。
【請求項４】
前記ドライ化試薬が、前記混合チャンバー及び前記第１流路の少なくとも一方で保持されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンサデバイス。
【請求項５】
前記混合チャンバーよりも前記回転軸の遠くで前記支持部により支持された測定部をさらに具備し、
前記第２流路が、前記混合チャンバーを前記測定部と連絡している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンサデバイス。
【請求項６】
前記混合物が、前記被検物質と前記ドライ化試薬とが反応することで生成した免疫凝集複合体を含み、前記回転の遠心力により、前記混合部から前記第２の流路を介して前記測定部に移送される、請求項５記載のセンサデバイス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサデバイスと、
前記支持部を、前記回転軸を中心に、所定方向に回転する回転装置と、
前記回転装置の回転数を制御する制御装置と、
前記測定部で前記混合物に含まれる前記免疫凝集複合体の量を光学的に測定する読取機器と、を具備し、
前記制御装置が、前記液状試薬と前記ドライ化試薬との混合により開始される免疫凝集反応の開始時点から完了時点にかけて、前記回転の遠心力が連続的または段階的に小さくなるように前記回転数を制御する、センサデバイス用測定装置。
【請求項８】
前記読取機器が、前記免疫凝集複合体の透過光強度または散乱光強度に基づいて、前記前記免疫凝集複合体の量を測定する、請求項７記載のセンサデバイス用測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として臨床検査分野において適用されるアッセイ方法、およびそれを実施するためのセンサデバイスに関し、特にＰＯＣＴ分野のアッセイ・センサデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析・解析・検査技術の進歩により、様々な物質を測定することが可能となっている。特に、臨床検査分野においては、免疫反応の特異結合反応に基づく測定原理の開発により、病態に反映する体液中の物質を測定することが可能となっている。
なかでも、ポイント・オブ・ケア・テスティング（以下、ＰＯＣＴともいう。）と呼ばれる臨床検査分野が注目されている。ＰＯＣＴは簡易迅速測定を第一の目的とし、これに対しては、検体を採取してから検査結果が得られるまでの時間を短縮する取り組みが行われている。このため、ＰＯＣＴの測定原理が簡易であることが要求され、小型で携帯性および操作性に優れた測定装置が求められている。
【０００３】
近年の技術開発の進歩により、例えば、ＨｂＡ１ｃセンサとして知られるＤＣＡ２０００システムなど、簡易な測定が可能な小型の測定機器が開発されている。
ＰＯＣＴの波及効果については、迅速な測定結果の取得による迅速かつ正確な診断の実現に加え、検査にかかるコストの低減、血液等の検体の少量化に伴う被検者の負担の軽減、および感染性廃棄物の少量化等が考えられる。現在、臨床検査はＰＯＣＴへ急速に移行しており、そのニーズに応えるべくＰＯＣＴ対応測定機器の開発が進められている。
【０００４】
ここで、ＰＯＣＴ測定機器の開発において、重要な要素となるのは、センサデバイスにおける酵素や抗体等の生体試薬のドライ化である。ドライ化の目的は、上記に示すような不安定な生体試薬を安定的に保持し、センサデバイスの取り扱いを容易にするためである。
生体試薬のドライ化の要件としては、以下の２つが挙げられる。１つは、酵素や抗体等の生体試薬に安定化剤や賦形剤を加えて、凍結乾燥法などの方法により、生体試薬をドライ化して比較的強度を持たせることである。もう一つは、センサデバイスとして機能させるために、ドライ化された試薬を血液のような液状試料に触れさせることにより再溶解・均一化させ、酵素反応や免疫反応を生じさせることである。
なお、ここで上記「強度を持たせる」とは、乾燥担持させた生体試薬が、衝撃などで粉々にならずにその形状を保持し得る程度の強度を有することをいう。また、上記「均一化」とは、再溶解のときのとけ残り（塊）がなく、さらに、再溶解した液体中でどの領域においても一様の状態を有していることを意味する。
【０００５】
即ち、安定化剤や賦形剤を加えたドライ化試薬を含むセンサデバイスでは、ドライ化試薬に強度を持たせる構成とする必要がある一方で、前記ドライ化試薬が再溶解・均一化し易い機構を設ける必要がある。
特に、ＢＦ分離が不要であると知られている免疫凝集反応に基づく免疫測定原理においては、再現性よく凝集複合体を生成させるために、再溶解・均一化は重要な要素である。
【０００６】
例えば、試薬の再溶解・均一化を効率よく行う方法として、ＤＣＡ２０００システムのように、外部からの回転機構による振とう工程を含む測定方法が提案されている（特許文献１参照）。この方法では、実質的に水平方向（重力方向に垂直な方向）を回転軸として回転する反応カセットが用いられている。
この反応カセットは、液状試料を内部に導入するための注入口と、この注入口と連通する反応路とを具備する。また、上記反応路は、分析試薬を組み込んだ試薬域と、重力により液状試料の流れを乱すよう液状試料に接触し、水平方向を回転軸とする反応カセットの回転により液状試料を攪拌する手段とを有している。
【０００７】
そして、反応カセットの回転による振動により、反応カセット内に導入された液状試料を反応路に沿って流動させて、分析試薬と液状試料とを接触させ、反応路内で分析試薬と液状試料との混合液が攪拌される。この攪拌によって所定の反応が促され、液状試料中の分析対象物を分析測定することができる。
【特許文献１】特開平３−４６５６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述のような従来の構成では、ＰＯＣＴ分野の測定装置として、１つの重要な要素である小型化への対応に限界がある。小型化に必要な要素の一つとして、センサデバイスのキャピラリ内での測定が可能であることが挙げられる、キャピラリ内に設けられたドライ化試薬は、混合された液状試料に再溶解され、均一化される。
しかし、キャピラリによる毛細管力の影響が大きいため、上記従来のような外部からの回転機構を備えたＤＣＡ２０００システムでは、ドライ化試薬は液状試料中に均一に混合されにくく、濃度ムラが生じやすいという問題がある。
【０００９】
さらに、毛細管力に加えて、試薬のドライ化のために用いられる安定化剤や賦形剤など試薬により、反応系内に存在する液体の粘度が通常よりも上昇し易い。このため、均一化および反応に悪影響を及ぼしてしまうおそれがある。特に、ＢＦ分離が不要な抗原抗体凝集反応に基づく簡易な免疫測定原理を用いる場合、結果として、感度の低下や反応時間の延長等をもたらしてしまう。
そこで、本発明は、上記従来の問題を解決するために、濃度ムラのない状態で反応させることができ、かつ反応時間や感度等に悪影響を及ぼさないアッセイ方法、およびそれを実施するためのセンサデバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
被検物質を含む液状試料と、粒子を前記被検物質に特異結合する免疫特異結合物質で感作して得られる感作粒子を含むドライ化試薬と、を混合する混合部を具備するセンサデバイスであって、
空気孔、第１接続部及び第２接続部を有するとともに、前記液状試料と、前記ドライ化試薬とを混合するための混合チャンバー、
前記第１接続部で前記混合チャンバーと接続され、前記液状試料を前記混合チャンバーに供給する第１流路、
並びに前記第２接続部で前記混合チャンバーと接続され、前記混合チャンバーで混合された前記液状試料と前記ドライ化試薬との混合物を前記混合チャンバーから送出する第２流路、並びに
前記混合チャンバー、前記第１流路及び前記第２流路を含むセンサデバイスを、重力方向と平行な回転軸を中心に、所定方向に、一体的に回転させるように支持する支持部、を備え、
前記第２流路が、複数の直線部と、前記複数の直線部を接続する少なくとも１つの湾曲部と、を有し、
前記第１接続部が前記第２接続部よりも前記回転軸の近くにあり、
前記湾曲部の少なくとも１つの頂点が、前記混合チャンバーよりも、前記回転軸を中心とする回転の前方にあり、かつ前記第１接続部よりも前記回転軸の近くにある、センサデバイスを提供する。
【００１２】
上記本発明のセンサデバイスは、
前記混合チャンバーよりも前記回転軸の近くで前記支持部により支持された液状試料収納部をさらに具備し、前記第１流路が、前記混合チャンバーを前記液状試料収納部と連絡している、のが好ましい。そして、前記液状試料は、前記回転の遠心力により、前記液状試料収納部から前記第１流路を介して、前記混合チャンバーに移送されるのが好ましい。
【００１３】
前記ドライ化試薬は、前記第１の流路または前記混合部に保持されていればよい。
また、センサデバイスにより導入された液状試料は、別に導入される試薬液と、回転制御により混合されることが好ましい。
ここでいう試薬液とは、例えば、希釈液のようなものである。例えば後述するＨｂＡｌｃなどの測定対象物は、血液中で一番多い蛋白質ヘモグロビンの種類の一つであり、これを光学的に測定するためには、希釈する必要がある。
【００１４】
また、前記センサデバイスは、前記粒子感作免疫特異結合物質が、前記混合部において、前記液状試料中に含まれる前記被検物質と免疫凝集複合体を形成しながら、前記回転に伴う遠心力により前記回転軸を中心として反対側に移動する構成を有するのが好ましい。
前記混合部は、前記回転軸を中心として反対側に、前記免疫凝集複合体を集めるための狭部領域を具備するのが好ましい。
【００１５】
前記センサデバイスは、前記免疫凝集複合体の量を測定する測定部と、前記混合部内の前記免疫凝集複合体を、前記回転に伴う遠心力により前記測定部に移送する第２の流路と、を具備するのが好ましい。
また、前記センサデバイスが回転体で構成されているのが好ましく、前記回転体は例えばディスク状またはチップ状であってよい。
【００１６】
さらに、本発明は、前記測定部を具備する本発明のセンサデバイスと、前記センサデバイスを回転させる回転装置と、前記測定部における前記免疫凝集複合体の量を光学的に測定する読取機器と、を具備するセンサデバイス用測定装置をも提供する。
前記読取機器は、前記免疫凝集複合体の透過光強度または散乱光強度を測定する構成を有するものであればよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、センサデバイス内に設けられるドライ化試薬を液状試料により溶解・懸濁させた後、センサデバイスを回転させて、回転により生じる遠心力で反応液面を安定化させることにより、濃度ムラをなくすことができる。これにより、免疫反応を再現性よく実施することができる。
さらに、回転数を制御して、粒子を回転軸と反対側へ移送・濃縮させることにより、安定化剤や賦形剤等のドライ化用試薬による反応系内の粘度の上昇を抑制することができ、粘度上昇による反応時間および感度への悪影響を軽減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．アッセイ方法について
本発明は、重力方向を回転軸とする回転条件下（例えば、重力方向と略一致する回転軸を有する回転面上）で免疫アッセイを実施することを特徴とするアッセイ方法に関する。
かかる本発明に類似する技術として、例えば、小型の遠心分離器を用いて、エッペンチューブを回転させている間に、エッペンチューブ内で免疫抗原抗体反応を行わせるアッセイ方法があるが、本発明によれば、例えば抗原抗体反応において、このような従来のアッセイ方法に対して、より顕著に上述のような効果を得ることができる。
【００１９】
本発明のセンサデバイスは、ＰＯＣＴ対応の小型機器に適用可能であることを基本的な目的としているため、キャピラリ構造は流路、チャンバー構造および空気孔を含むキャピラリ構造を有することを特徴とする。
ここで、キャピラリ構造では毛細管力が生じるため、キャピラリ構造を有する領域内にある免疫アッセイの反応液は毛細管力が生じる部分の方へ引っ張られ、結果として、反応液は２つに分けられる。そのため、正確な免疫反応が実施できない。これに対し、本発明においては、反応液を含むキャピラリ構造を有する領域を回転させることにより、遠心力を反応液に働きかけ、キャピラリ構造を有する領域内で液面を乱れさせずに整えることにより、反応液の表面の均一性を高めることができる。
【００２０】
本発明における回転条件とは、毛細管力（壁面に対する液体の表面張力とも言える。）を打ち消す方向に遠心力がかかるように設定される条件であり、通常は、小さな回転数であっても十分に反応液の均一性を高める効果を発揮できるが、数１００×Ｇ以上あればより確実に反応液の均一性を実現することができる。
本発明の回転条件下で行う免疫アッセイは、非ＢＦ分離を必要とする免疫アッセイにおいて効果的である。非ＢＦ分離方式とは、測定対象物である抗原と、測定対象物に対して作製された抗体との結合体（Ｂｉｎｄｉｎｇ）から、結合体を形成していないフリーの測定対象物、もしくはフリーの抗体を分離することなく測定対象物を測定する方式であり、一般的には、免疫凝集反応原理に基づく方式である。
【００２１】
本発明の免疫アッセイにおいて用いることのできる免疫凝集反応の原理は、測定対象物を抗体と反応させて凝集体を形成することにより、反応前後で分子の大きさを変化させて、その変化量を光学的に検出することを基本としている。
免疫アッセイの具体的な方法としては、免疫比濁法、免疫比ろう法、またはラテックス免疫凝集法などが挙げられる。これらの方法における測定原理は均一化反応であり、正確な測定を行うためには反応液が均一であることが重要な要素である。したがって、本発明のポイントは、キャピラリ構造内でこれらの免疫アッセイを実施する場合に、回転条件下で測定対象物（抗原）と抗体とを反応させて、反応液の液面を整える点にある。
【００２２】
本発明の免疫アッセイの試薬には、例えば粒子に免疫特異結合物質を感作して得られる感作粒子を好適に用いることができる。上記粒子としては、例えば、ラテックス粒子、金コロイド、銀コロイド、磁気微粒子等があり、特に、免疫凝集反応に対してはラテックス粒子が用いられる。さらに、ラテックス粒子の粒子サイズは、目的とする測定対象物の測定レンジによって決定され、ラテックス粒子が大きいほど高感度測定レンジ域に対応させることができる。
免疫特異結合物質とは、抗原または抗体であり、測定対象物が抗原である場合、抗体が免疫特異結合物質であり、逆に、測定対象物が抗体である場合、抗原が免疫特異結合物質となる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体等の抗体の作製方法が確立されていることより、一般的に抗体の方が免疫特異結合物質として使用される。すなわち、測定対象物が抗体である場合、抗体に特異的に結合する抗体（２次抗体）が使用される。
【００２３】
上記粒子、特にラテックス粒子に抗体を感作させる方法としては、例えば、物理吸着による方法、化学結合による方法がある。物理吸着の場合、ｐＨ、塩の種類、感作される抗体の等電点、感作濃度、感作温度および感作時間等を適宜調整すればよい。また、その物理吸着による感作原理が、静電的または疎水的な相互作用により誘引されるため、ラテックス粒子の材質や抗体のアミノ酸配列等の物性による影響も考慮する必要がある。
一方、化学結合の場合、例えば、カルボニル基、アルデヒド基、アミノ基が修飾されたラテックス粒子を用い、これらの官能基に対して抗体のアミノ基やカルボン酸と反応させて化学結合を形成することにより感作させる。この場合も、感作条件として、ｐＨ、塩の種類、感作される抗体の等電点、感作濃度、感作温度および感作時間等を適宜調整すればよい。
【００２４】
本発明の免疫凝集反応に基づくアッセイ方法には、測定対象物である抗原量に応じて生成される免疫凝集複合体が大きくなる場合と、小さくなる場合のいずれも含まれる。
測定対象物である抗原量に応じて生成される免疫凝集複合体が大きくなる場合、その量が増えていく現象を光学的に検出する。この場合、抗体試薬には、多数の抗原決定基と結合し凝集複合体を形成しやすいポリクローナル抗体試薬や、抗原に対してそれぞれ異なった抗原決定基を認識する多種類のモノクローナル抗体の混合試薬（人工ポリクローナル抗体試薬）が適している。
また、抗原が多量体である場合は、単一のモノクローナル抗体でもよい。代表例としては、５量体であるＣ反応性蛋白質（Ｃ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＰ）があり、このＣＲＰを測定するためのラテックス標識抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、体外診断薬として様々なメーカーから市販されている。
【００２５】
一方、本発明の免疫凝集反応に基づくアッセイ方法で、測定対象物である抗原量に応じて生成される免疫凝集複合体が小さくなる場合には、その量が減っていく現象を光学的に検出する。これは、一般的には免疫凝集阻止法と呼ばれている。すなわち、測定対象物である抗原の抗原決定基を有する擬似的な多価抗原を調製し、これと、抗原決定基を認識するモノクローナル抗体とを凝集反応させる方法である。この方法では、抗原が測定系内に入ると、多価抗原と抗体の凝集反応は阻害され、結果的に凝集複合体の大きさが小さくなり、その量が減少するのである。
この場合の抗体試薬の代表例としては、ＨｂＡ１ｃ(ヘモグロビンＡ１ｃ)が挙げられる。ＨｂＡ１ｃとは、ヘモグロビンのβサブユニットのＮ末端がフルクトシル化された蛋白質である。ＨｂＡ１ｃを免疫凝集阻止反応により測定する場合、フルクトシル化Ｎ末端アミノ酸構造を含む多価抗原と、フルクトシル化Ｎ末端アミノ酸構造を認識する抗体があればよい。なお、抗体試薬は、上記に示すようにラテックス粒子等の粒子に感作された抗体も含まれている。
【００２６】
上記の本発明のアッセイ方法では、回転条件を、免疫凝集反応の開始時点から完了時点にかけて、回転に伴う遠心力が連続的または段階的に小さくなるように設定するのが好ましい。これにより、免疫凝集複合体自身は、回転に伴う遠心力の影響を受けず、液面のみを整えることができ、より正確に免疫アッセイを実施することができる。
ここで、免疫凝集反応の開始時点とは、ラテックス粒子に抗体を感作して得られる感作粒子などの抗体試薬と、測定対象物である抗原と、を混合した時点である。また、免疫凝集反応の完了時点とは、混合した後、開始された免疫凝集反応において、凝集形成が光学的に飽和した時点である。
【００２７】
一般的に、凝集形成されて免疫凝集複合体の大きさが大きくなるにつれて、回転に伴い生じる遠心力が作用する方向に凝集複合体が移動し易くなり、この後の光学的な検出に悪影響を及ぼす可能性がある。この悪影響を避けるために、凝集体の大きさに応じて、最適な大きさの遠心力が得られるように回転条件を調整する。
例えば、対象としている免疫凝集反応における凝集形成分布を、粒度分布計等を用いて、任意の時間における最大の凝集複合体の大きさを分析した上で、最適な回転数を設定することができる。当然、その媒体の粘度の影響により多少は回転数の設定も変わってくるため、その都度、条件設定することが好ましい。
【００２８】
例えば、凝集複合体の大きさが３００〜５００ｎｍの場合、遠心力は９３００×Ｇであるのが好ましく、凝集複合体の大きさが５００〜８００ｎｍの場合は、遠心力は２２００×Ｇであるのが好ましい。また、凝集複合体の大きさが８００ｎｍを超える場合は、遠心力は１２００×Ｇであるのが好ましい。遠心力が上記範囲であれば、免疫凝集複合体は遠心力の向きにより確実に移送され得る。
また、上記以外に、凝集複合体形成時における回転数を、凝集複合体が所定の大きさになった時に、凝集複合体が遠心力の向きに移送し始めるように設定することが好ましい。これによれば、センサデバイスの回転軸を中心として反対側において、局所的に反応試薬の濃度を高めることができ、凝集形成時間を短縮させ、さらに感度を向上させることができる。
【００２９】
測定対象物である抗原が存在する場合、形成される凝集複合体が所定の大きさに達すると、当該凝集複合体は、遠心力の影響による凝集複合体の回転軸を中心として反対側への移動するとともに、反応試薬も、回転軸を中心として反対側に集めることができる。そのため、凝集形成を促進させることができる。
その後（上記の完了時点後）は、凝集複合体が回転軸を中心として反対側に集まらないように、遠心力の大きさ（すなわち回転数）を設定すればよい。上記のような回転条件の設定は、安定化剤や賦形剤のような別の試薬により反応系内の粘性が高くなり、凝集形成が抑制される場合に、特に有効である。
【００３０】
しかし、回転数を調整したとしても、反応混合液中の凝集複合体は、多少なりとも回転軸を中心として反対側に集まるおそれがある。このため、反応混合液中の凝集複合体を分散して、反応混合液の均一化を図るのが好ましい。
この均一化方法として、例えば、以下の２つの方法が用いられる。すなわち、（１）一旦回転を止めて、反応混合液を毛細管力等で逆方向（回転軸側）へ引っ張り、その後、回転させて、液面を再度整える。（２）別の領域（例えば、測定部）へ反応混合液を移送させる。簡易で効果的である点からは、後者がより好ましい。
【００３１】
２．センサデバイスについて
本発明のセンサデバイスは、毛細管等の機能的な第１の流路を含み、実質的に重力方向と一致する方向に延びる回転軸を中心として回転し、遠心力が働いた状態で使用されるものである。
回転軸の位置については、回転軸がセンサデバイス本体を通過する場合（自ら回転する回転形態）でもよく、センサデバイス本体を通過しない場合（所定半径の円周軌道上を移動する回転形態）でもよい。
【００３２】
すなわち、本発明のセンサデバイスは、被検物質を含む液状試料と、前記被検物質に特異結合する粒子感作免疫特異結合物質を含むドライ化試薬と、を混合する混合部を具備し、重力方向を回転軸として回転可能であり、回転しながら前記混合部において免疫凝集反応を生起させる構成を有することを特徴とする。
本発明のセンサデバイスは、例えば、キャピラリ構造を有するカセット状、ディスク状またはチップ状などのセンサデバイス本体に、液状試料の注入口や空気孔を連通させたチャンバーを基本要素として、複数のチャンバーを流路で連結させることにより構成される。
そして、上記チャンバーが、上記混合部や、後述する流路および液状試料収納部などとして機能する。
【００３３】
例えば、第１のチャンバーのうちの回転軸から遠い部分に液状試料注入口を設け、回転軸に近い部分に液状試料注出口を設ける。そして、前記第１のチャンバーの液状試料注出口と、前記第１のチャンバーよりも回転軸を中心として反対側に位置する別の第２のチャンバーの液状試料注入口と、を流路により連結する。
そして、重力方向を回転軸として回転する本発明のセンサデバイスにおいては、回転に伴う遠心力の大きさを制御し易いため、上記第１のチャンバー、第２のチャンバー及び流路は略水平方向に沿って配置されるのが好ましい。
【００３４】
上記チャンバーは、反応場、試薬混合場またはドライ化試薬保持場として機能する。このように、チャンバーにより、目的とするアッセイプロセスを実施するための様々な機能を有する場を提供することができる。
流路は、センサデバイス内に導入される液体が毛細管現象を利用して移送できる構成を有していればよい。ただし、この流路内の液体移送に際しては、空気の流れが重要な要素である。すなわち、液体が流路を流れるためには、同時に、空気が流れなければならない。したがって、液状試料等の液体を確実に流すためには、チャンバーに必ず空気孔を設ける必要がある。
【００３５】
本発明のセンサデバイスは、例えば、チャンバーとして、液状試料注入口を備え、粒子感作免疫特異結合物質を含むドライ化試薬を保持する混合部を具備することにより構成される。
このような構成の場合、液状試料注入口から、測定対象物である抗原を含む液状試料が混合部内に注入されて、ドライ化試薬を溶解・懸濁させると同時に、重力方向を回転軸とする回転条件下で連続的または段階的に免疫反応を生起させることができる。
【００３６】
また、本発明のセンサデバイスは、例えば、被検物質を含む液状試料と、粒子を前記被検物質に特異結合する免疫特異結合物質で感作して得られる感作粒子を含むドライ化試薬と、を混合する混合部を具備する。
このとき、本発明のセンサデバイスは、重力方向を回転軸とする回転に伴う遠心力により、前記液状試料収納部内の前記液状試料を前記混合部に移送する第１の流路を具備することにより構成される。
【００３７】
そして、ドライ化試薬は、前記第１の流路上または前記混合部に保持され、液状試料収納部は混合部よりも回転軸側に配置される。
このような構成の場合、回転に伴う遠心力により、液状試料収納部内の液状試料は流路を介して混合部に流入することにより、液状試料にドライ化試薬を溶解・懸濁させると同時に、回転条件下で連続的または段階的に免疫反応を生起させることができる。
【００３８】
これにより、混合部内において、ドライ化試薬を液状試料により溶解・懸濁させるとともに、センサデバイスを回転させて、回転により生じる遠心力で反応液面を安定化させることにより、濃度ムラをなくすことができる。これにより、免疫反応を再現性よく実施することができる。
さらに、混合部内において、粒子感作免疫特異結合物質を回転軸と反対側へ移送・濃縮させることにより、安定化剤や賦形剤等のドライ化用試薬による反応系内の粘度の上昇を抑制することができ、粘度上昇による反応時間および感度への悪影響を軽減することができる。
【００３９】
本発明のセンサデバイスは、例えば、三層構造を有し、チャンバーに対応する部分を形成した層と、チャンバーと流路に対応する部分を形成した層と、基板となる層と、を順に積層することにより得ることができる。
これにより、流路をキャピラリ構造とし、チャンバーの厚さを流路の厚さよりも大きくなるように変化させることより、液状試料の流れを一時静止させるキャピラリーバルブの機能を容易にもたせることができる。また、センサデバイスは、二層で構成してもよく、例えば、チャンバーおよび流路に対応する部分を形成した層、および基板となる層を積層すればよい。
【００４０】
このような層構造における各層を構成する材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ガラス、ポリカーボネート等が挙げられる。したがって、各層同士を貼り合わせる方法としては、例えば、ホットメルトシートを使用して熱により圧着させる方法、または超音波を用いた方法がある。
いずれにしても対象となる液状試料が漏れないことが大前提であり、工法的に簡易である点から、センサデバイスは２層構造であるのが好ましい。
【００４１】
センサデバイスの流路は、流路内の流体が、チャンバーの側面（回転軸とは反対側の端面）から回転軸の方向Ｘに向かい、チャンバーの回転軸側の端面よりもさらに回転軸側の所定の位置まで流れ、その後、上記所定の位置から回転軸とは反対の方向Ｙに向かって流れるように構成されている。
なお、ここでいう方向Ｙとは、センサデバイスの回転によってセンサデバイス内の流体に遠心力が作用する向きである。したがって、上記方向Ｘおよび方向Ｙは、実質的に同じ平面上に位置する。
【００４２】
ここで、上記流路の一例の具体的な構成を図面を参照して説明する。流路の形状としては、例えば、逆Ｕ字形の流路が用いられる。ここで、逆Ｕ字形の流路が接続されたチャンバーの一例として、流路パーツ１１を図１に示す。本発明のセンサデバイスは２以上の流路パーツ１１で構成され、チャンバー１１２が上記液状試料収納部または上記混合部に相当する。
図１に示す流路パーツ１１は、図示しないが、図１の紙面に略平行な面で回転するセンサデバイス上に搭載されるものである。すなわち、図１において紙面に略垂直な方向が、センサデバイスの回転軸Ａの軸方向である。
【００４３】
流路パーツ１１は、希釈、混合、反応および検出などの分析工程を行うための場となるチャンバー１１２、チャンバー１１２に連通する空気孔１１３、ならびに逆Ｕ字形の流路１１１が形成されている。チャンバー１１２には、流路１１１が接続された部位とは別に、他の流路を接続するための延長部分１１２ａが設けられ、空気孔１１３は流路１１１および延長部分１１２ａから離隔してチャンバー１１２に形成されている。
【００４４】
図１に示すように、チャンバー１１２からの流体は、チャンバー１１２の側面（回転軸とは反対側の端面）１１２ｂから回転軸Ａへの方向Ｘに向かい、チャンバー１１２の回転軸Ａ側の端面１１２ｃを含む面１１５よりもさらに回転軸Ａ側の所定の位置（すなわち頂点部）１１４まで流れ、その後、上記所定の位置（頂点部）１１４から回転軸Ａとは反対の方向Ｙに向かって流れるように構成されている。なお、図１において、上記面１１５は、回転軸Ａと回転方向Ｒとで規定される回転円の径方向に略垂直である。
逆Ｕ字形の流路１１１の頂点部１１４を、上記面１１５より回転軸Ａ側に配置することにより、回転に伴って生じる遠心力によりチャンバー１１２内、および流路１１１のうち頂点部１１４よりチャンバー１１２側の部分に流体を保持することができる。
【００４５】
チャンバー１１２内、および流路１１１のうち頂点部１１４よりチャンバー１１２側の部分に流体が保持された後、回転を停止すると、流体が遠心力から解放され、毛細管現象により、例えば１１１ａに続く次のチャンバーに流体を移送させることができる。
また、回転時にチャンバー１１２内に液体を保持せずに、連続的に流体を流し続ける場合には、逆に、頂点部１１４を上記面１１５からみて回転軸Ａとは反対側の位置に設定すればよい。
【００４６】
本発明のセンサデバイスにおいては、チャンバー１１２に接続されるキャピラリ構造の流路において、その流路より断面積の大きな領域（以下、「キャピラリーバルブ」ともいう。）を、適宜設けてもよい。
ここで、キャピラリーバルブを備えた流路の一例として、流路パーツ１１２を図２に示す。図２に示す流路パーツ１２は、全体として略逆Ｕ字形であってその両端が一方向に傾けられた流路１２１と、流路１２１上に配置されかつ流路１２１よりも断面積の大きい空間が形成されたキャピラリーバルブ１２２と、を有する。
【００４７】
キャピラリーバルブ１２２は、毛細管現象による流体の移送を静止する静止手段であり、その断面積を前後に配される流路１２１の断面積より十分に大きくすることにより、センサデバイス本体の回転を停止した後に毛細管現象により流路１２１内の流体の流れを停止させ、所要の区間において流体を静止させることができる。キャピラリーバルブは、流体を静止したい箇所、タイミング、区間を考慮して、流路に適宜設ければよい。
【００４８】
ここで、上記ドライ化試薬としては、例えば、粒子に免疫特異結合物質を感作して得られる感作粒子に、適当な賦形剤や、上記感作粒子を活性的に安定化させる安定化剤を加えて、これを乾燥させて得られるものが用いられる。
このときの乾燥方法としては、例えば自然乾燥法および凍結乾燥法が挙げられるが、ドライ化試薬の保存性および再溶解性の観点から、凍結乾燥法が好ましい。
【００４９】
凍結乾燥法としては、例えば、感作粒子に賦形剤や安定化剤などを所定の割合で混合して得られる混合液を、−５０℃以下で凍結させて、真空に引きながら連続的もしくは段階的に加温して昇華させる方法が用いることができる。凍結温度や昇華乾燥時間は、混合液の共晶点やガラス転移温度等の相転移点などの物性が、混合液の混合比などで変化するため、それに合わせて条件を適宜設定すればよい。
例えば、０．１％ＢＳＡおよび５％スクロースを含むラテックス感作抗体の場合、液体窒素雰囲気下で、急速に凍結させて、−５０℃から２５℃まで６時間かけて加温する過程で昇華乾燥を実施すればよい。
【００５０】
上記賦形剤としては、例えば、蛋白質、アミノ酸、アルコール類、炭化水素化合物などが用いられる。蛋白質としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンなどが挙げられる。アミノ酸としては、グリシン、アルギニン、アラニンなどが挙げられる。アルコール類としては、マンニトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。炭化水素としては、グルコース、フルクトースなどの単糖類や、乳糖、マルトース、スクロース、トレハロースなどの二等類や、デキストラン、シクロデキストランなどの多糖類などが挙げられる。その他、金属類、界面活性剤、ポリマー、緩衝塩などを用いてもよい。
安定化剤としては、水を分子に保持しやすい物質、糖類が一般的には好ましい。
【００５１】
ドライ化試薬をセンサデバイスの所定の領域に保持させる方法としては、センサデバイスの組み立て時に、凍結乾燥後のドライ化試薬を、センサデバイスの所定の領域に配置する、または粘着性ＰＥＴなどを介して所定の領域に貼り付ける方法が挙げられる。所定の領域とは、チャンバー内でも、流路上でもよい。
センサデバイス内に導入された液状試料は、上述のように、回転に伴い生じる遠心力によりドライ化試薬が保持された領域に移送されることにより、前記領域ないしは別のチャンバーで構成された混合部において、ドライ化試薬と溶解・懸濁させることができる。
【００５２】
例えば、上述したチャンバーとして液状試料収納部および混合部、ならびに両者を連結する第１の流路を具備したセンサデバイスにおいて、液状試料に血液検体を用いる場合、まず、血液検体を液状試料収納部内に注入する。その後、回転により血球分離を実施し、回転停止後、血漿のみを毛細管現象により流路内を通じて、混合部の手前まで移送させる。その後、再び回転させ、血漿を次の混合部内へ移送させる。
混合部内にドライ化試薬が保持されている場合、混合部内において、血漿はドライ化試薬を溶解・懸濁させる。これと同時に、血漿内に測定対象とする被検物質が含まれる場合、被検物質とドライ化試薬中の感作粒子上の免疫特異結合物質との免疫凝集反応が進行する。
【００５３】
このように、回転条件、流路、およびチャンバーを適宜設定することにより、目的とするアッセイの前処理も合わせて、連続的にアッセイを実施でき、より簡易な操作が可能なセンサデバイスが得られる。
ここでいう前処理工程としては、上述の血球分離工程、別の試薬を用いる場合の試薬希釈工程、ＨｂＡ１ｃのような測定対象物が赤血球に含まれる場合の溶血工程、ＨｂＡ１ｃを免疫学的に測定する場合に行われる変性工程等が挙げられる。
【００５４】
混合部における上記感作粒子は、回転条件下で液状試料中に含まれる被検物質と免疫結合複合体を形成しながら、混合部中において回転軸と反対側に移動する。そのため、免疫反応系内の濃度が高くなり、免疫凝集複合体の形成速度が向上する。
すなわち、水（液体）成分が排他的に除外され、凝集反応をより促進させる方向に進む。凝集複合体の形成とは不溶化するということであるとも言えるため、反応系内の疎水性が高まれば高まるほどよい。
【００５５】
上記センサデバイスの回転条件は、特にドライ化試薬の組成によって決定される。ドライ化試薬を形成するためには、上記のように、賦形剤や安定化剤、場合によっては界面活性剤が必要となる。これらの試薬は、反応系内において粘度だけでなく、親水性度および疎水性度にも影響を及ぼし、その結果、凝集形成速度に影響を及ぼす。
したがって、回転条件の設定に際しては、回転させない状況での免疫凝集体の形成分布を分析・解析し、それに応じた条件を適宜選定する必要がある。
【００５６】
ここで、上記混合部は、回転軸と反対側において、免疫凝集複合体を集めるための狭部領域を有するのが好ましい。例えば、混合部において、さらに回転軸と反対側に設けられた次のチャンバー（例えば、測定部）へ混合液を移送するための流路が接続され、この流路に向かってすり鉢状の領域が狭部領域として形成される。これにより、回転軸と反対側に集められた免疫凝集体が、混合部における回転軸と反対側の壁に、液体とともに残留しないようにすることができ、次の回転停止および回転開始時に、効率よく次のチャンバーへ混合液を移送することができる。
【００５７】
３．センサデバイス用測定装置
本発明のセンサデバイス用測定装置は、上記センサデバイスと、上記センサデバイスを回転させる回転装置と、前記測定部における免疫凝集複合体の量を光学的に測定する読取機器とを具備する。
前記読取機器においては、例えば透過光強度または散乱光強度を測定すればよい。前者の場合、センサデバイスを介して、光源に対して前方１８０度に検出器を設置すればよく、後者の場合、センサデバイスの側方９０度以下に検出器を設置すればよい。
【００５８】
上記センサデバイスとしては、例えば、ディスク状またはチップ状の回転体を用いることができる。チップ状回転体の場合は、読取機器を設けた、回転数を制御可能な回転装置にセンサデバイスを設置することにより、回転させながら容易に測定することができる。
以下においては、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
本実施例では、ヘモグロビンβサブユニットフルクトシル化Ｎ末端アミノ酸配列（４アミノ酸）をもつ多価擬似抗原（凝集剤、ロシュ社製の体外診断薬の一部）、およびヘモグロビンβサブユニットフルクトシル化Ｎ末端アミノ酸配列を認識する抗ＨｂＡ１ｃ抗体（ロシュ社製の体外診断薬でラテックス標識抗ＨｂＡ１ｃ抗体）を使用した。
また、本実施例では、上述した図１に示す逆Ｕ字形流路が接続されたチャンバー１１２を含む流路パーツ１１および図２に示すキャピラリーバルブを含む流路パーツ１２を組み合わせ、最終的には図８に示す構造を有する本発明のセンサデバイスを構成した。
【００６０】
上記の流路パーツ１１および１２の作製方法を、図３〜７を参照しながら説明する。
ここで、図３は、流路パーツ１１および１２の作製に用いた両面粘着性シートの構造を示す概略断面図である。図４は図１（流路パーツ１１）のII−II方向における分解縦断面図であり、図５は図１のII−II方向における縦断面図である。図６は図２（流路パーツ１２）のIII−III方向における分解縦断面図であり、図７は図２のIII−III方向における縦断面図である。また、図８は本実施例において作製した本発明のセンサデバイスの概略正面図である。
【００６１】
（１）流路パーツ１１の作製
まず、図３に示すような、厚さ５０μｍの芯材層２３と、芯材層２３の両面に形成された厚さ２５μｍの一対の接着剤層２２とで構成された両面粘着性シート２１（フレックスコン社（FLEXCON Corporation）製）を用いて、流路パーツ１１を作製した。なお、両面粘着性シート２１の両面には剥離紙２４が配されている。なお、芯材層はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）で構成し、接着剤層には一般的な接着剤を用いた。
つぎに、図４に示すように、カッテイングプロッター（グラフテック社（GRAPHTECH Corporation）製のＣＥ３０００−４０）を用いて、両面粘着性シート２１において図１のチャンバー１１２の一部および流路１１１に対応する部分２９を切り取り、流路構成部材２５を作製した。このとき、両面粘着性シート２１のうち、下面側の剥離紙２４以外の部分に層に切り込みを入れ、芯材層２３および一対の接着剤層２２の一部を取り除き、チャンバー１１２の一部および流路１１１に相当する部分２９ｂを構成した。
【００６２】
つぎに、ポリカーボネート製の円盤状基材（厚さ１．２ｍｍ）上に、ポリスチレン（ＰＳ）（シグマアルドリッチ社（Sygma-Aldrich Corporation）製）を１重量（ｗ／ｖ）％含む２−アセトキシ−１−メトキシプロパン溶液をスピンコートした。その後、上記円盤状基材を一晩真空状態で十分に乾燥させ、ベース基盤２７を作製した。
また、ポリカーボネート製シート（厚さ０．６ｍｍ）に、厚さ方向に貫通する空気孔１１３を開け、切り取りによりチャンバー１１２の一部に対応する凹部２９ａを形成し、透明なトップカバー２６を作製した。そして、流路構成部材２５から剥離紙２４を剥がし、流路構成部材２５、ベース基盤２７およびトップカバー２６の順に貼り合せ、図５に示す流路パーツ１１を作製した。
【００６３】
（２）流路パーツ１２の作製
カッテイングプロッターを用いて、上記と同じ両面粘着性シート２１において、流路１２１およびキャピラリーバルブ１２２の一部に対応する部分３９ｂを切り取ることにより、図６に示す流路構成部材３５を作製した。
一方、トップカバー２６と同じ材料を用い、キャピラリーバルブ１２２の一部に対応する凹部３９ａを形成して、トップカバー３６を作製した。また、流路構成部材３５から剥離紙３４を剥がし、流路構成部材３５、ベース基盤２７およびトップカバー３１の順に貼り合せ、図７に示す流路パーツ１２を作製した。
【００６４】
（３）センサデバイスの作製
上記の流路パーツ１１および１２を適宜組み合わせることにより、図８に示すように、検体注入孔４１ａ、検体保持チャンバー４１（すなわち液状試料収納部）、ドライ化試薬４５を収納するドライ化試薬保持チャンバー４２（すなわち混合部）、検出チャンバー４３（測定部）、および流路４４ａ、４４ｂ、４４ｃからなる流路パターン４０を４つを含む、３層構造の円盤状のセンサデバイス４を作製した。
逆Ｕ字状の流路４４ａは、検体保持チャンバー４１とドライ化試薬保持チャンバー４２とを接続し、逆Ｕ字状の流路４４ｂは、ドライ化試薬保持チャンバー４２と検出チャンバー４３とを接続し、流路４４ｃは、検出チャンバー４３の流路４４ｂと対向する面において接続した。
なお、センサデバイス４において流路およびチャンバーなどは層の下に隠れていてもよく、また、流路やチャンバーは、例えば１枚の円盤の上に、流路やチャンバーの形を有する成形物などを配置することによって構成することもできる。
【００６５】
円盤状のセンサデバイス４は、円盤の中心を通る回転軸Ａを軸として回転する。４つの流路パターン４０は、回転軸Ａのまわりに等間隔で配置され、径方向において回転軸Ａから外側に向けて、検体注入孔４１ａ、検体保持チャンバー４１、ドライ化試薬保持チャンバー４２および検出チャンバー４３の順に配置した。
【００６６】
（４）ドライ化試薬の作製
ラテックス標識抗ＨｂＡ１ｃ抗体液に最終濃度５％スクロースとなるように、２０％スクロース液を点着し、これを６μｌ分注して、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥機（宝製作所（株）製）を用いて、ドライ化試薬（凍結乾燥体）を作製した。なお、凍結乾燥プログラムは、−５０℃から２５℃へ６時間かけて加温する過程で昇華乾燥されるように設定した。このように作製されたドライ化試薬は湿度に弱いため、センサデバイス４に組み込む前は、モレキュラーシーブを含む容器の中に保存した。
センサデバイス４へのドライ化試薬の封入は、トップカバー２６または３６と両面粘着性シート２１を貼り合せた際に、ドライ化試薬をドライ化試薬保持チャンバー４２に入れた後、ベース基盤２７に貼り合せることにより実施した。
【００６７】
（５）流体移送状態の確認および凝集応答性の確認
上記で作製されたセンサデバイス４に、多価擬似抗原液６μｌを検体注入孔４１ａから注入し、検体保持チャンバー４１に多価擬似抗原液を保持させた。この液は、流路４４ａ内におけるチャンバー４２の手前でキャピラリーバルブ機能により静止させた。
そして、図９に示す回転装置７００にセンサデバイス４を、回転軸Ａが重力方向と略一致するように水平方向に設置した後、回転制御により流体を移送させ、回転条件下で免疫凝集反応を実施した。
【００６８】
ここで、図９の回転装置７００について説明する。図９の回転装置７００は、センサデバイス４を固定するクランパー７１１と、センサデバイス４を支持するターンテーブル７１３と、ターンテーブル７１３を回転させるスピンドルモーター７１４と、スピンドルモーター７１４の回転を制御する制御デバイス７１５とで構成されている。
検体をセンサデバイス４の注入孔より注入した後、まず、１５００ｒｐｍの回転により、多価擬似抗原液をドライ化試薬保持チャンバー４２に移送し、ドライ化試薬をドライ化試薬保持チャンバー４２内で、多価疑似抗原液中に溶解・懸濁させて混合液を得た。
【００６９】
溶解・懸濁を確認した後、ただちに静止し、混合液を毛細管現象により検出用チャンバー４３の手前まで移送させた後、１５００ｒｐｍで回転させて、検出用チャンバー４３へ移送させた。その後、８００ｒｐｍまで回転数を低減させ、その状態で５分間維持させた。この間に混合液において、免疫凝集反応を効率よく進行させた。
ここで、８００ｒｐｍをかけないと、毛管現象により、検出チャンバー４３から出ている２つの流路（流路４４ｂおよび流路４４ｃ）に混合液は引っ張られて、分断された形になり、効率よく凝集反応が進行しなくなった。
【００７０】
形成された凝集体の大きさを、光学顕微鏡（株式会社ニコン製のECLIPSE E600）を用いて簡易的に確認することができた。凝集体の量を数値化する場合は、図９に示す回転装置７００に、光学ドライブのように光源と検出器を付加すればよい。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のセンサデバイスは、キャピラリ構造を基本とする小型センサデバイスとして用いることができ、臨床検査分野で、特に、最近注目されているＰＯＣＴ分野に貢献し得る検査システムにおいて好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明のセンサデバイスを構成する流路パーツを示す正面図である。
【図２】本発明のセンサデバイスを構成する他の流路パーツを示す正面図である。
【図３】本発明のセンサデバイスの構成材料である両面粘着性シートの縦断面図である。
【図４】図１のII-II方向における分解縦断面図である。
【図５】図１のII-II方向における縦断面図である。
【図６】図２のIII-III方向における分解縦断面図である。
【図７】図２のIII-III方向における縦断面図である。
【図８】本発明のセンサデバイスの概略正面図である。
【図９】本発明のセンサデバイスを回転させる回転装置を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【００７３】
１１  流路パーツ
１２  流路パーツ
２１  両面粘着性シート
２５、３５  流路形成部材
２６、３６  トップカバー
２７  ベース基盤
２９ａ、３９ａ  凹部
２９ｂ、３９ｂ  切り取り部分
４  センサデバイス
４０  流路パターン
４１ａ  検体注入孔
４１  検体保持チャンバー
４２  ドライ化試薬保持チャンバー
４３  検出チャンバー
４４ａ、４４ｂ、４４ｃ  流路
７１    回転制御装置
１１２、１２２    チャンバー
１１５  チャンバーの上面
【図１】
0004531677.tif 000002
【図２】
0004531677.tif 000003
【図３】
0004531677.tif 000004
【図４】
0004531677.tif 000005
【図５】
0004531677.tif 000006
【図６】
0004531677.tif 000007
【図７】
0004531677.tif 000008
【図８】
0004531677.tif 000009
【図９】
0004531677.tif 000010