(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼストスポンギア種（Xestospongia sp.）に属する青色海綿を均質化（ホモジナイズ）した後、リン酸緩衝液を用いてｐＨを５．５〜７．５に保ちながらシアン化カリウムで処理し、そのメタノール抽出液からクロマトグラフィー法により分離精製することによる下記の一般式（Ｉ）で表される新規レニエラマイシン系化合物の取得方法。
【化１】
0004399175.tif 000012
［式中、下記の部分構造（１）は、下記の部分構造（２）または部分構造（３）を示す。Ｚ１とＺ２は、水素原子と水素原子の組み合わせまたは水素原子と水酸基の組み合わせを示す。］
【化２】
0004399175.tif 000013
【化３】
0004399175.tif 000014
【化４】
0004399175.tif 000015
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規レニエラマイシン系化合物の取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２０世紀後半より、新規薬用資源を海洋生物に求めて世界的な調査・探索研究が実施されてきた。レニエラマイシン（Renieramycin）系化合物は、１９８２年に米国のファルクナー（Faulkner）教授によりメキシコ湾岸で採取されたレニエラ種（Reniera sp.）に属する海綿から極微量に見出されたイソキノリンキノン系化合物であり、下記の構造式（ＩＩ）で表されるレニエラマイシンＡをはじめとする数種の化合物が、その抗菌活性試験結果を含めて下記の非特許文献１などに記載されている。
しかしながら、レニエラマイシン系化合物は、天然から極微量にしか取得することができないことに加え、下記の構造式（ＩＩＩ）で表されるレニエラマイシンＥなどは、２１位が水酸基でありα−アミノアルコール構造を有していることから化学的に不安定な物質である。従って、これまでレニエラマイシン系化合物の大量供給は必ずしも容易なことではなかった。
【０００３】
【化５】
0004399175.tif 000002
【０００４】
【化６】
0004399175.tif 000003
【０００５】
【非特許文献１】
フリンク  ジェイ  エム（Frincke,J.M.）；ファルクナー  ディー  ジェイ（Faulkner,D.J.）,  ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティー（J.Am.Chem.Soc.），1982年，104巻，p.265-269
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明においては、化学的安定性に優れた新規なレニエラマイシン系化合物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の点に鑑みて種々の検討を行った結果、シアン化カリウムを用いた化学処理を採用することで、ゼストスポンギア種（Xestospongia sp.）に属する青色海綿から新規なレニエラマイシン系化合物をグラムスケールで取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、請求項１記載の通り、ゼストスポンギア種（Xestospongia sp.）に属する青色海綿を均質化（ホモジナイズ）した後、リン酸緩衝液を用いてｐＨを５．５〜７．５に保ちながらシアン化カリウムで処理し、そのメタノール抽出液からクロマトグラフィー法により分離精製することによる下記の一般式（Ｉ）で表される新規レニエラマイシン系化合物の取得方法である。
【化７】
0004399175.tif 000004
［式中、下記の部分構造（１）は、下記の部分構造（２）または部分構造（３）を示す。Ｚ１とＺ２は、水素原子と水素原子の組み合わせまたは水素原子と水酸基の組み合わせを示す。］
【化８】
0004399175.tif 000005
【化９】
0004399175.tif 000006
【化１０】
0004399175.tif 000007
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の新規レニエラマイシン系化合物は、ゼストスポンギア種（Xestospongia sp.）に属する青色海綿を均質化（ホモジナイズ）した後、リン酸緩衝液を用いてｐＨを５．５〜７．５に保ちながらシアン化カリウムで処理し、そのメタノール抽出液からクロマトグラフィー法により分離精製することにより取得される。クロマトグラフィー法は、例えば、カラムクロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなど、天然有機化合物の分離精製のために通常使用されるものを使用して行われる。カラムクロマトグラフィーにおいては、例えば、順相系であるＴＳＫ−Ｇ３０００Ｓ、ダイヤイオンＨＰ−２０、セファデックスＬＨ−２０、ＤＥＡＥセファデックス、逆相系のＲＰ−１８などが使用できる。また、薄層クロマトグラフィーにおいてはシリカゲルのほか、ＲＰ−１８などが使用できる。
【００１０】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定されるものではない。
【００１１】
【実施例】
実験１：レニエラマイシンＭとレニエラマイシンＮの単離構造決定
２００１年１２月、タイ国バンコク東側に位置するシーシャン島（Schang Island）付近の水深３ｍ〜５ｍからゼストスポンギア種（Xestospongia sp.）に属する青色海綿（湿重量８．４ｋｇ）を採取した。これをメタノール中で均質化（ホモジナイズ）した後、リン酸緩衝液を添加してｐＨが７．０のホモジナイズド溶液９Ｌを得た。この溶液に対し、１０％シアン化カリウム溶液６０ｍＬを滴下した後、５時間攪拌した。その後、５Ｌのメタノールを加えて抽出処理を行ってからろ過してろ液を得た。この操作を合計３回行い、得られた３回分のろ液をまとめて減圧濃縮した。こうして得られた含水メタノール抽出溶液８００ｍＬに酢酸エチル５００ｍＬを加えて分配して酢酸エチル抽出液を得た。この操作を合計４回行い、得られた４回分の酢酸エチル抽出液を濃縮して酢酸エチル抽出物１６．２ｇを得た。
【００１２】
上記の酢酸エチル抽出物をメタノールで咀嚼することで、オレンジ色の沈殿物として下記の構造式（ＩＶ）で表される新規なレニエラマイシンＭを６８１ｍｇ得た。また、母液を減圧濃縮することで得られた残留物１３．９ｇをヘキサン−酢酸エチル溶媒（７：３〜１：１）を用いたシリカゲルクイックカラムクロマトグラフィーにてレニエラマイシンＭを１．１４１ｇ得た（合計１．８２２ｇ：酢酸エチル抽出物から１２．０４％収率）。さらに、ヘキサン−酢酸エチル１：１溶媒で溶出することでオレンジ色の結晶柱として下記の構造式（Ｖ）で表される新規なレニエラマイシンＮを２４７ｍｇ得た。
【００１３】
【化１１】
0004399175.tif 000008
【００１４】
【化１２】
0004399175.tif 000009
【００１５】
レニエラマイシンＭの物理化学的性状は以下の通りである。
酢酸エチルから暗黄色結晶柱として得られる。mp 194.5-197oC; [α]20D -49.5 (c 1.0, CHCl3); CD Δεnm (c 68 μM, methanol, 22oC) -5.2 (359), -1.9 (305), -8.7 (282), 0 (270), +9.5 (258), 0 (243), -2.2 (232), 0 (223), +10.5 (211); IR (KBr) 3270, 2940, 2320w, 1705, 1690, 1650, 1640, 1605 cm-1; UV λmax (log ε) 269 (4.63), 370 (3.11) nm; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 5.92 (1H, qq, J = 6.8, 1.5 Hz, 26-H), 4.55 (1H, dd, J = 12.0, 3.0 Hz, 1-CH), 4.12 (1H, dd, J = 12.0, 3.0 Hz, 1-CH), 4.11 (1H, d, J = 2.0 Hz, 11-H), 4.02, 3.99 (each 3H, s, OCH3), 4.00-3.99 (2H, m, 21-H and 1-H)*, 3.40 (1H, ddd, J = 7.7, 3.9, 0.9 Hz, 13-H), 3.12 (1H, ddd, J = 11.6, 2.8, 2.8 Hz, 3-H), 2.90 (1H, dd, J = 17.2, 2.3 Hz, 4-Hα), 2.76 (1H, dd, J = 21.2, 7.7 Hz, 14-Hα), 2.31 (1H, d, J = 21.2 Hz, 14-Hβ), 2.27 (3H, s, NCH3), 1.94, 1.90 (each 3H, s, 6-CH3 and 16-CH3), 1.82 (3H, dq, J = 6.8, 1.6 Hz, 26-CH3), 1.57 (3H, dd, J = 1.6, 1.5 Hz, 25-CH3), 1.37 (1H, ddd, J = 16.2, 11.6, 2.7 Hz, 4-Hβ) (*the signal overlapped with methyl signals); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ 185.8 (C-15), 185.4 (C-5), 182.4 (C-18), 180.9 (C-8), 166.5 (C-24), 155.8 (C-7), 155.2 (C-17), 142.0 (C-20), 141.3 (C-10), 140.5 (C-26), 135.7 (C-9), 135.0 (C-19), 128.4 (C-6), 126.5 (C-16), 126.2 (C-25), 116.9 (21-CN), 61.9 (C-22), 61.0 (OCH3), 60.9 (OCH3), 58.4 (C-21), 56.2 (C-1), 54.5 (C-13), 54.2 (C-11), 54.1 (C-3), 41.4 (NCH3), 25.4 (C-4), 21.3 (C-14), 20.3 (C-28), 15.7 (C-27), 8.7 (6-CH3), 8.5 (16-CH3); EI-MS m/z (%) 575 (M+, 3), 464 (4), 462 (3), 260 (11), 221 (22), 220 (100), 219 (16), 218 (25), 204 (11), 83 (11), 55 (14); anal. C 64.52%, H 5.84%, N 7.11%, calcd for C31H33N3O8, C 64.68%, H 5.78%, N 7.30%.
【００１６】
レニエラマイシンＮの物理化学的性状は以下の通りである。
エチルアルコールから薄黄色結晶柱として得られる。mp 162.5-164oC; [α]20D -24.7 (c 0.015, methanol); CD Δεnm (c 45 μM, methanol, 22oC) 0 (398), -1.0 (355), 0 (310), +0.5 (300), 0 (287), -1.7 (266), 0 (248), +11.8 (222), +25.2 (206); IR (KBr) 3700-3070, 2230w, 1740, 1720, 1655, 1630 cm-1; UV λmax (log ε) 273 (3.99), 370 (2.70) nm; 1H NMR (pyridine-d5, 270 MHz) δ 10.68 (1H, br s, OH), 9.30, 7.60 (each 1H, br s, OH), 5.70 (1H, qq, J = 7.3, 1.3 Hz, 26-H), 5.18 (1H, s, 14-Hβ), 4.94 (1H, d, J = 2.6 Hz, 21-H), 4.74 (1H, d, J = 2.0 Hz, 11-H), 4.58 (1H, dd, J = 11.6, 2.6 Hz, 1-CH), 4.51 (1H, dd, J = 11.6, 2.0 Hz, 1-CH), 4.37 (1H, ddd, J = 2.6, 2.6, 2.0 Hz, 1-H), 3.96 (1H, dd, J = 2.6, 2.0 Hz, 13-H), 3.94 (3H, s, 7-OCH3), 3.74 (3H, s, 17-OCH3), 3.60 (1H, dd, J = 17.8, 2.6 Hz, 4-Hα), 3.44 (1H, ddd, J = 11.2, 2.6, 2.6 Hz, 3-H), 2.70 (3H, s, NCH3), 2.40 (3H, s, 16-CH3), 2.20 (1H, ddd, J = 17.8, 11.2, 2.6 Hz, 4-Hβ), 1.92 (3H, s, 6-CH3), 1.74 (3H, dq, J = 7.3, 1.7 Hz, 26-CH3), 1.44 (3H, dq, J = 1.7, 1.3 Hz, 25-CH3); 13C NMR (pyridine-d5, 67.5 MHz) δ 183.6 (C-5), 179.1 (C-8), 164.8 (C-24), 153.8 (C-7), 145.2 (C-15), 144.2 (C-17), 140.3 (C-10), 139.4 (C-18), 136.5 (C-26), 133.9 (C-9), 125.4 (C-25), 124.9 (C-6), 117.8 (21-CN), 115.9 (C-19), 115.7 (C-16), 114.7 (C-20), 63.1 (C-13), 62.0 (C-14), 60.5 (C-22), 58.3 (17-OCH3), 57.7 (7-OCH3), 55.2 (C-21), 54.6 (C-11), 54.4 (C-1), 53.1 (C-3), 40.8 (NCH3), 22.9 (C-4), 17.7 (C-28), 13.1 (C-27), 7.3 (16-CH3), 6.3 (6-CH3); EI-MS m/z (%) 593 (M+, 0.1), 455 (4), 315 (10), 245 (50), 244 (17), 243 (100), 204 (12), 100 (18), 83 (25), 82 (15), 57 (12), 55 (42), 45 (19), 43 (66); anal. C 61.00%, H 6.07%, N 6.68%, calcd for C31H35N3O9-H2O, C 60.88%, H 6.10%, N 6.87%.
【００１７】
実験２：レニエラマイシンＮの酸化によるレニエラマイシンＯの取得
レニエラマイシンＮの酢酸エチル溶液５ｍＬ（レニエラマイシンＮ２３．７ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）と５％炭酸水素ナトリウム溶液５ｍＬを混合し、２５℃で一晩攪拌した。その後、反応液を５ｍＬの水で希釈し、酢酸エチル５ｍＬで合計３回分画した。３回分の酢酸エチル溶液をまとめてから１０ｍＬの水で洗浄した後、乾燥し、減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライし、ヘキサン−酢酸エチル３：１溶媒を用いて分離精製することにより、下記の構造式（ＶＩ）で表されるキノン化合物である新規なレニエラマイシンＯを薄黄色アモルファスとして得た（１６．３ｍｇ，収率６９％）。
【００１８】
【化１３】
0004399175.tif 000010
【００１９】
レニエラマイシンＯの物理化学的性状は以下の通りである。
[α]20D -134.4 (c 0.7, CHCl3); CD Δεnm (c 88 μM, methanol, 22oC) 0 (380), -0.5 (352), 0 (310), -1.9 (278), -0.4 (246), 0 (241), +7.1 (213); IR (CHCl3) 3513, 1720, 1670, 1630 cm-1; UV λmax (log ε) 269 (4.62), 370 (3.10) nm; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 5.98 (1H, qq, J = 7.3, 1.7 Hz, 26-H), 4.53 (1H, dd, J = 11.6, 3.0 Hz, 1-CH), 4.37 (1H, s, 14-H), 4.23 (1H, d, J = 2.6 Hz, 21-H), 4.09 (1H, dd, J = 11.1, 3.4 Hz, 1-CH), 4.09 (1H, dd, J = 3.3, 1.3 Hz, 11-H), 4.03, 4.02 (each 3H, s, 7-OCH3 and 17-OCH3), 3.98 (1H, m, 1-H), 3.52 (1H, br s, OH), 3.42 (1H, br s, 13-H), 3.05 (1H, ddd, J = 11.6, 3.3, 2.3 Hz, 3-H), 2.87 (1H, dd, J = 17.2, 2.3 Hz, 4-Hα), 2.46 (3H, s, NCH3), 1.94, 1.92 (each 3H, s, 6-CH3 and 16-CH3), 1.82 (3H, dq, J = 7.3, 1.3 Hz, 26-CH3), 1.57 (3H, dq, J = 1.7, 1.3 Hz, 25-CH3), 1.27 (1H, ddd, J = 17.2, 11.6, 2.6 Hz, 4-Hβ); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ 187.8 (C-15), 185.4 (C-5), 182.8 (C-18), 180.8 (C-8), 166.5 (C-24), 155.8 (C-17), 155.6 (C-7), 141.1 (C-10), 141.0 (C-20), 140.6 (C-26), 135.7 (C-9), 135.3 (C-19), 128.6 (C-6), 128.4 (C-16), 126.2 (C-25), 116.3 (21-CN), 62.4 (C-13), 62.1 (C-22), 62.0 (C-14), 61.1 (7-OCH3), 61.1 (17-OCH3), 56.4 (C-1), 56.4 (C-21), 55.0 (C-11), 53.4 (C-3), 42.4 (NCH3), 25.3 (C-4), 20.3 (C-28), 15.7 (C-27), 8.7 (6-CH3), 8.4 (16-CH3); EI-MS m/z (%) 591 (M+, 3), 577 (7), 575 (6), 566 (7), 476 (9), 464 (5), 462 (8), 460 (8), 315 (7), 260 (14), 243 (43), 236 (18), 235 (25), 221 (24), 220 (100), 219 (23), 218 (50), 205 (11), 204 (24), 83 (14), 55 (11); HR-EIMS m/z 591.2222 [M+] (calcd for C31H33N3O9, 591.2217).
【００２０】
実験３：レニエラマイシンＭからレニエラマイシンＥへの変換
レニエラマイシンＭをアセトニトリル−水３：２溶媒２．５ｍＬに溶解し（レニエラマイシンＭ２３．８ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）、続いて硝酸銀１４０ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ，２０当量）を加えて室温で４８時間攪拌した。その後、反応液に飽和塩化ナトリウム溶液−飽和炭酸ナトリウム溶液１：１混合溶液４０ｍＬを添加し、ジクロロメタン２０ｍＬで合計３回分画した。３回分のジクロロメタン溶液をまとめてからこれを乾燥し、セルロースパウダーのパッドに通してろ過した。得られたろ液を濃縮することで黄色固形物としてレニエラマイシンＥを得た（１４．５ｍｇ，収率６４％）。このレニエラマイシンＥの物理化学的性状は、以下のレニエラマイシンＥ標準品のデータと完全に一致した。
【００２１】
IR (CHCl3) 3390, 1700, 1655, 1615 cm-1; UV λmax (log ε) 269 (4.63), 370 (3.11) nm; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 5.92 (1H, qq, J = 7.3, 1.4 Hz, 26-H), 4.45 (1H, dd, J = 11.2, 3.1 Hz, 1-CH), 4.44 (2H, m, 1-H and 21-H), 4.15 (1H, dd, J = 11.2, 3.1 Hz, 1-CH), 4.00, 3.98 (each 3H, s, 7-OCH3 and 17-OCH3), 3.92 (1H, dd, J = 2.5, 1.0 Hz, 11-H), 3.21 (1H, br d, J = 7.3 Hz, 13-H), 3.16 (1H, ddd, J = 11.0, 2.7, 2.5 Hz, 3-H), 2.75 (1H, dd, J = 16.2, 2.7 Hz, 4-Hα), 2.66 (1H, dd, J = 20.9, 7.3 Hz, 14-Hα), 2.25 (3H, s, NCH3), 2.21 (1H, d, J = 20.9 Hz, 14-Hβ), 1.91, 1.91 (each 3H, s, 6-CH3 and 16-CH3), 1.80 (3H, dq, J = 7.3, 1.4 Hz, 26-CH3), 1.57 (3H, dq, J = 1.4 Hz, 25-CH3), 1.31 (1H, ddd, J = 16.2, 11.0, 2.0 Hz, 4-Hβ); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 186.0 (C-15), 184.0 (C-5), 182.5 (C-18), 181.0 (C-8), 166.5 (C-24), 158.0 (C-17), 156.0 (C-7), 142.0 (C-10), 141.8 (C-20), 140.0 (C-26), 138.5 (C-9), 133.0 (C-19), 128.8 (C-6), 128.2 (C-16), 126.5 (C-25), 83.0 (C-21), 63.6 (C-22), 61.0 (7-OCH3), 61.0 (17-OCH3), 58.0 (C-13), 54.2 (C-1), 53.5 (C-11), 51.0 (C-3), 41.8 (NCH3), 26.1 (C-4), 20.9 (C-14), 20.8 (C-28), 15.8 (C-27), 8.7 (6-CH3), 8.7 (16-CH3); HR-FABMS m/z 549.2247 [M + H - H2O] (calcd for C30H33N2O9, 549.2250).
【００２２】
実験３から、レニエラマイシンＭはレニエラマイシンＥの安定等価体であり、これまで天然から極微量にしか取得することができなかったレニエラマイシンＥをレニエラマイシンＭから大量に供給することができることがわかった。
【００２３】
実験４：レニエラマイシンＭ，Ｎ，Ｏの抗腫瘍活性
10％ウシ胎児血清を含むMcCoy's 5A培地を用いてインビトロ培養により維持したヒト大腸癌細胞株HCT116（ATCCより入手）のシングルセルサスペンジョンをマイクロプレート中に注入し（2×103cell/well）、ここに各種濃度のレニエラマイシンＭ，Ｎ，Ｏを加え、４日間培養した後、細胞計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて細胞増殖の程度を測定し、対照群と比較して細胞増殖を50％阻害する濃度（IC50）を求めた。また、同様にしてヒト肺癌細胞株QG56、ヒト肺癌細胞株NCI-H460、ヒト大腸癌細胞株DLD1に対するIC50を求めた。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0004399175.tif 000011
【００２５】
表１から明らかなように、レニエラマイシンＭ，Ｎは特にヒト肺癌細胞株QG56に対して強力な抗腫瘍活性を示した。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、化学的安定性に優れた新規なレニエラマイシン系化合物が提供される。