(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の細胞破砕物から核酸を分離する方法であって、
（ａ）前記試料を２〜４のｐＨを有する酸媒体に適用することにより、試料の核酸が正味の負電荷を帯びている混合物を製造する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で製造された混合物をゲルに注入する工程と、
（ｃ）前記混合物を有する前記ゲルを電気泳動にかけることにより、正味の電荷を有していない細胞破砕物及び正味の正電荷を帯びている細胞破砕物から前記混合物中の前記核酸を分離する工程と
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記細胞破砕物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電気泳動が２．５のｐＨで行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料中の細胞破砕物からＲＮＡを精製する方法であって、
（ａ）前記試料を２〜４のｐＨを有する酸媒体に適用することにより、試料のＲＮＡが正味の負電荷を帯びている混合物を製造する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で製造された混合物をゲルに注入する工程と、
（ｃ）前記混合物を有する前記ゲルを電気泳動にかけることによって、正味の電荷を有していない細胞破砕物及び正味の正電荷を帯びている細胞破砕物から前記試料中のＲＮＡを分離して、それにより前記ＲＮＡを精製する工程と、
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、生物学的試料中のタンパク質のような細胞破砕物から核酸を分離する方法に関する。具体的には、本発明は、正味の電荷が正である物質から核酸を分離するために低いｐＨにおいて電気泳動を使用することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような非常に巧妙な増幅技法の開発をはじめとし、微量の核酸を検出する技術がこの２０年間で急速に進歩してきた。研究者らは、このような技術の価値が、人や動物の被験体において疾患や遺伝的特徴を検出することにあることを容易に認識している。
【０００３】
ＰＣＲは、当該技術分野における顕著な進歩であって、極微量の目的核酸の検出を可能ならしめるものである。ＰＣＲの詳細については、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されているが、この分野の文献数は急速に増加しつつある。詳細には説明しないが、ＰＣＲには、重合剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）とデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下、目的とする核酸の鎖（「鋳型」とみなされる）にプライマーを適当な条件下でハイブリダイズさせる工程が含まれる。その結果、鋳型に相補的なヌクレオチドが鋳型に沿って付加されたプライマー伸長生成物が形成される。
【０００４】
このプライマー伸長生成物を変性すると、鋳型の複製物が一つ調製されたことになり、このプライミング、伸長及び変性のサイクルを所望の回数実施することにより、目的核酸と同一の配列を有する核酸の量を対数増加させることができる。実際に、目的の核酸を、その検出が一層容易となるように何回も複製（又は増幅）する。
【０００５】
目的の核酸を効果的に増幅し検出するためには、或いは、目的の核酸をクローニング又は配列決定するためには、その核酸を他の妨害となる生体分子の混合物から単離又は分離しなければならないことが多い（Ｍｏｏｒｅ  Ｄ．，１９７７，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｕｎｉｔ  ２．２  Ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０００６】
現在のところ、核酸調製物からタンパク質その他の不純物を取り除くために数種類の手順が用いられている。伝統的には、生物学的試料をプロテアーゼで消化し、不純物を有機抽出法により核酸から除去する（Ｍｏｏｒｅ  Ｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
しかしながら、この方法には、有害な有機溶媒を使用することや、水相を新しいチューブへ何回も移す必要があるため退屈で、労働集約的であり、しかも試料の交雑汚染の危険性が増す、等の多くの欠点があることが認識されている。
【０００７】
最近では、カオトロピック塩においてガラスに吸着させる方法による核酸の精製法が普及してきた（Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：４９５−５０３）。しかしながら、この分離法も、バインディング容量の非常に小さいガラスを使用すること、カオトロピック塩を使用すること、そしてガラス／核酸複合体を何度も洗浄し、その洗浄液を除去しなければならないために退屈で時間がかかること、といった多くの欠点に悩まされる。
【０００８】
ＤＮＡ精製のためのポリマー捕捉法であるイオン交換法を使用して核酸を単離することも行われている（米国特許第５，５８２，９８８号、同第５，４３４，２７０号及び同第５，５２３，３６８号）。残念ながら、この方法は、ＲＮＡが捕捉、解放のどちらの際にも分解するため、特に現在実施されている条件下でＲＮＡを精製する場合には適さない。ポリマー／核酸の最適な捕捉条件下ではリボヌクレアーゼが高いためにＲＮＡの分解をもたらし、また核酸をポリマーから解放するのに必要な高いｐＨが化学的加水分解をもたらす。
【０００９】
電気泳動による分離法は、有害な物質、高いｐＨ及び退屈な操作を回避するように設計できるため、魅力的な技法である。さらに、電気泳動による分離法は自動化されたフォーマットに適合しやすい。電気泳動法はほとんどが分析的規模で採用されているが、小規模の調製手順もまた数多く開発されている（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ａ．Ｔ．，１９８６，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  Ｔｈｅｏｒｙａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。ポリビニルピロリドン／アガロースゲル上での電気泳動により腐植物質その他のＰＣＲを阻害する不純物からＤＮＡを分離する方法も報告されている（Ｈｅｒｒｉｃｋｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：６８７−６９４及びＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１９７２−１９７４）。さらに、Ｓｈｅｌｄｏｎとその共同研究者は、核酸の電気泳動による精製のための装置を開発した。細胞又は血液試料をプロテアーゼで溶解し、その溶解物を当該装置に装填する。核酸は、ポリマー層中の電気泳動により不純物から分離され且つ、分子量で仕切る膜によりコレクションチャンバーに保持される一方、分解されたタンパク質その他低分子量物質は当該膜を通過する（Ｓｈｅｌｄｏｎ  Ｅ．Ｌ．，１９９７．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐにて発表、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．，Ｊｕｎｅ  ９，１９９７）。
【００１０】
電気泳動による分離法は、上記の例をはじめとし、ほとんどが中性に近いｐＨで行われているが、低いｐＨでの電気泳動が有利な場合もある。例えば、巨大分子の中には低いｐＨの方が分離効率が高くなるものがある。ヌクレオチド又は低分子量ポリヌクレオチドの混合物は低いｐＨの方が分離性が良くなる。これは、ヌクレオチドの電荷が、ｐＨ＝２〜５の範囲では−１〜０の変動を示すが、ｐＨ＝６〜８の範囲ではほとんどが同一の電荷（−２）を示すからである（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，１９７６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２：３５０−３６１）。同様に、等電点電気泳動法では、酸性タンパク質がｐＨ勾配中のｐＫａにおいて単離される（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ａ．Ｔ．，１９８６）。さらに、低いｐＨの方が安定性が高くなる構造もある。ＴｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒとＣｌａｒｋｅは、酸性条件（ｐＨ＝２．５）が電気泳動時のタンパク質メチルエステルの加水分解を最小限に抑えるのに役立つことを報告している（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３０６７−７５）。同様に、温和な酸性条件（ｐＨ＝４．５）でＢ−ＤＮＡのトリプルヘリックス構造が安定化される（Ｍｉｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４：１５１２−１６）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、核酸、特に血液や血漿のようなタンパク質の豊富な源に由来する核酸を調製するための電気泳動に低いｐＨ条件を採用できれば望ましく且つ有利であろう。遍在し且つ電気泳動中に核酸を分解するヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼは、低いｐＨにおいて不活化される（Ｋａｌｎｉｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９５９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４：１５１２−１６）。その上、ほとんどの核酸とタンパク質は、酸性条件下では反対の電荷を有するため、電界の中で逆方向に移動する。ｐＨ＝２において、第一ホスフェート基のｐＫａは２未満であるがアミン基のｐＫａは２〜５の範囲にあるため、核酸はなおも負に帯電する（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，１９７６）。他方、ほとんどのタンパク質は、そのすべてのアミン基及び大部分のカルボキシル基のｐＫａが２よりもはるかに高いため、完全にプロトン化し、よって正に帯電する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は上記課題を解決すべく、低いｐＨにおいて正味の電荷が正である物質から酸性条件下での電気泳動により核酸を分離するのに必要な手段を提供する。低いｐＨにおける電気泳動は、核酸精製のための現行法にまつわる問題の多くを解決することにもなる。上述のように、低いｐＨではヌクレアーゼ活性が低くなるため、核酸は中性ｐＨにおけるよりも安定性が高くなる。その上、試料を装填してしまえば、電気泳動は手がかからない方法である。最後に、有害な材料を必要とすることもまったくない。
本発明の様々な目的、利点については本発明の詳細な説明で明らかとなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、核酸をその他の細胞破砕物、特に低いｐＨにおいて正味の電荷が正である物質から、酸性条件下での電気泳動により分離するための方法に関する。本発明の精製法では、試料を電気泳動ゲルにアプライしその試料を酸性条件下で電気泳動させることにより、核酸が同一の生物学的試料中のタンパク質から分離される。至適ｐＨは、試料の種類によって異なる可能性があるが、当業者であれば容易に求めることができる。当該分離を約２〜約４のｐＨ範囲で行うことが好ましい。より好ましくは、電気泳動をｐＨ＝２．５で実施する。
【００１４】
約２〜４のｐＨ範囲では、ホスフェート基のｐＫａが低いためにほとんどの核酸は正味の電荷が負となるが、ほとんどのタンパク質は、その官能基（アミノ基及びカルボキシル基）がはるかに高いｐＫａを有するために、正味の電荷が正となる。その結果、ほとんどの核酸とタンパク質は、約２〜４のｐＨ範囲での電気泳動に際して反対方向に移動する。この方法は、核酸を調製するための現行の電気泳動法、すなわち核酸とタンパク質とが同一方向（アノード方向）に移動するようなｐＨにおいて実施される方法とは相違する。分子が反対方向に移動すると、分離は完全性、効率共に一層高くなる。
【００１５】
試料のｐＨは、ｐＨシフトによりＲＮＡａｓｅ活性を迅速且つ効率的に阻害する必要があるため、試料をゲルにアプライする前に調整すべきである。本発明において酸性ｐＨを達成するために使用するのに適した試薬として、ＨＣｌ、グリシン−ＨＣｌ、硫酸又はリン酸、その他のホスフェート、フタレート、フマレート、タルトレート、シトレート、グリシルグリシン、フロエート又はホルメートのような緩衝剤が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００１６】
本発明を実施するために各種の装置及びフォーマットを使用することができる。後述の実施例ではＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を使用するが、その他の予め組み立てられた直接注入装置でも好適である。その上、目的の分子を、均質マトリックス中の電気泳動で得られるよりも不純物からきれいに分離するために、調製用の等電点電気泳動法、特にｐＨ勾配を固定した方式を使用することができる（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ及びＷｅｎｉｓｃｈ，１９９７，ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｒｙ．ＩｓｏＰｒｉｍｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ；Ｎｏ．１  Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
【００１７】
本発明の分離法により、有害材料、退屈な移し替え又は抽出が無いなど、従来の核酸精製法よりも有利な点が数多く得られる。さらに、中性付近のｐＨの代わりに酸性条件下（ｐＨ≦３）で電気泳動を行うので、ヌクレアーゼは実質的に不活性であり、ＲＮＡの化学的安定性が高くなる。その上、ｐＨ＝２．５のような酸性条件下では、核酸とほとんどのタンパク質とは反対の電極に向かって移動するので、分離の効率、完全性共に高くなる。
【００１８】
核酸が、生物学的試料中に存在するタンパク質から分離されたら、電界を取り除き、そして分離された核酸を当該技術分野で周知の技法によりゲルから取り出すことができる。その後、このように精製された核酸は、ＰＣＲやリガーゼ連鎖反応等の標準的な増幅法及び／又は検出法に用いるのに適したものとなる。
【００１９】
ＰＣＲによる核酸の増幅、検出のための一般原理及び条件については周知であり、その詳細については米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）をはじめとする多数の文献に記載されており、本明細書ではこれらを参照することにより明細書の一部とする。このように、当該技術分野の教示及びその中の具体的な教示に照らして、当業者であれば、増幅アッセイにおいて完全なＲＮＡもしくはＤＮＡの回収効率が低いことによるか又は増幅インヒビターの存在による偽陰性の結果を排除するために本発明を実施することに何ら困難を伴うことはないはずである。
用語「生物学的試料」には、細胞材料、ウイルス材料、毛髪、体液又は検出できる核酸を含む細胞材料が包含されるが、これらに限定はされない。
【００２０】
本明細書に記載した方法を用いて、感染疾患、遺伝病もしくは細胞病、例えばガン、又はその他のこれらのカテゴリーに具体的に含まれない何らかの疾患状態に関連する特異的な核酸配列を検出することができる。また、法医学的調査やＤＮＡタイピングにも使用することができる。本発明の目的に関し、遺伝病にはすべての生物に由来するゲノムＤＮＡの特異的欠失又は変異、例えば、鎌型赤血球貧血、嚢性線維症、α−地中海貧血、β−地中海貧血その他当業者に自明なものが包含される。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を本発明で分類することができる。検出可能なバクテリアとして、血液中に存在し得るバクテリア、サルモネラ、連鎖球菌種、クラミジア種、淋菌種、マイコバクテリア種（例、ヒト結核菌及び鳥結核菌の複合体）、マイコプラズマ種（例、インフルエンザ菌及び肺炎マイコプラズマ）、レジュネラ・ニューモフィラ菌、ボレリア症菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ）、ニューモシスティス・カリニ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、キャンピロバクター種、エルジニア種、赤痢菌種及びリステリア種が挙げられるが、これらに限定はされない。検出可能なウイルスとして、単純性庖疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、呼吸性合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレトロウイルス、合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレトロウイルス（例、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ−Ｉ及びＨＩＶ−ＩＩ）が挙げられるが、これらに限定はされない。さらに、原生動物寄生体及び菌類（酵母やカビを含む）も検出可能である。その他の検出可能な種については当業者であれば自明である。本発明は、各種バクテリア又はウイルスに関連するＲＮＡの有無を検出する場合に特に有用である。
【００２１】
【実施例】
材料
塩酸はＢａｋｅｒ社の試薬級とした。グリシン（分子生物学級）、子牛胸腺ＤＮＡ、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ  ｒＲＮＡ及びＥ．Ｃｏｌｉ由来の１６Ｓ＋２３Ｓ  ｒＲＮＡはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のものとした。ｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１転写体は、製造業者の指示に従いインビトロ転写系でＡｍｂｉｏｎのＭｅｇａｓｃｒｉｐｔを含むＡｍｂｉｏｎ社（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１プラスミドから合成した。アガロースは、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）のＳｅａＫｅｍ  ＬＥとした。ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）電気溶離装置を使用し、製造業者の指示を下記実施例２に記載したように変更することにより、ＲＮＡをタンパク質から分離した。タンパク質の水準については、Ｐｉｅｒｃｅ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のＢＣＡタンパク質アッセイ用試薬キットを製造業者の指示に従い使用して測定した。
【００２２】
実施例１
酸性条件下での電気泳動に際して核酸がアノードの方向へ移動することを確かめるため、１％アガロースゲルを調製し、どちらもｐＨ＝２．５の３ｍＭのＨＣｌ又は５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌにおいて実験した。子牛胸腺ＤＮＡ（図１中第１レーン）、１．９ｋｂ  ｍＲＮＡ（ｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１転写体；第２レーン）、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来の１６Ｓ＋２３Ｓ  ｒＲＮＡ（第３レーン）及びＥ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ  ｒＲＮＡ（第４レーン）の試料各０．５μｇを、上記ゲルのカソード端におけるウェルに添加し、１００Ｖを１５分間印加した。そのゲルをエチジウムブロミドで染色し、そしてＵＶ透照により撮影した。
図１に示したように、ｐＨ＝２．５のＨＣｌ（パネルＡ）又はグリシン−ＨＣｌ（パネルＢ）においてＤＮＡ及び三種類のＲＮＡのいずれもカソードから離れてアノードの方向に移動した。したがって、これらの核酸はｐＨ＝２．５において正味の負電荷を維持している。
【００２３】
実施例２
酸性条件下での電気泳動に際して核酸とタンパク質が反対方向に移動することを例証するため、変更したＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）装置（図２）においてｒＲＮＡを血漿タンパク質から分離した。これらの装置は、アガロース又はポリアクリルアミドのゲル片から電気泳動によりＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を溶離するように設計した。製造業者の所期の使用法に従い、目的の核酸又はタンパク質のバンドを含むゲル片をピックアップしてＧｅｌ  ＰＩＣＫ（商標）に入れ、その後そのＧｅｌ  ＰＩＣＫ（商標）をアガロースゲルで満たし、ＧｅｎｅＴＲＡＰ（商標）を組み合わせた。Ｇｅｎｅ  ＴＲＡＰ（商標）の一端には、電子は通過させるが巨大分子は捕捉するような膜（おそらくは透析膜）がある。組み合わせたＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を電気泳動用緩衝液に浸し、トラップをアノードの方向に向け、そして膜に隣接するトラップ中の残留緩衝液（２５〜４０μＬ）の中へ電気泳動により核酸又はタンパク質を溶離した。
【００２４】
本実験の目的のため、血漿とｒＲＮＡの混合物をＧｅｌ  ＰＩＣＫ（商標）中のアガロースにおいて流延し、そしてＧｅｌ  ＰＩＣＫ（商標）の両端にＧｅｎｅ  ＴＲＡＰ（商標）を組み合わせてどちらかの方向に移動する巨大分子を捕捉した。これを達成するため、Ｇｅｌ  ＰＩＣＫ（商標）の一端をパラフィンでふさいだ。アガロースを１１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ＝２．５）に２．２％で煮沸により溶解し、そしてアガロースが固化しないように２５０μＬのアリコートを５０〜６０℃に置いた。溶解したアガロースに、１００μＬの血漿と、２００μＬの８０ｍＭのＨＣｌと、各２０μｇのＥ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ、１６Ｓ及び２３Ｓ  ｒＲＮＡを添加して、ｐＨ＝２．５において１％アガロース及び５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの最終濃度を得た。この混合物をボルテックス攪拌し、すぐに上記のふさいだＧｅｌ  ＰＩＣＫ（商標）にピペットで入れた。両方のトラップに１００μＬの５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌを添加し、そしてこれらをピックと組み合わせて気泡が駆逐されるように傾けて保持した。１％アガロース水溶液を使用してトラップをピックに封止した。組み合わせたＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を水平型電気泳動チャンバーにおいて５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌに浸し、そして１００Ｖを１時間印加した。製造業者が推奨するように、ＲＮＡを膜から解放するために、電流を逆にして６０秒間流した。ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を電気泳動用緩衝液から取り出し、製造業者の指示に従い、膜に隣接する残留緩衝液を両方のトラップから取り出した。予備実験において、残ったＲＮＡ及びタンパク質の一部が電流を逆にして６０秒間流した後にも捕捉膜に吸着していたことが発見された。それゆえ、この膜をトラップから取り出し、１００μＬの５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ＝２．５）において３７℃で１時間溶離した。また、アガロースゲルをトラップから取り出し、溶融し、そして残留するＲＮＡとタンパク質についても分析した。各画分を、１×ＴＢＥ（８９ｍＭのトリス−ホウ酸塩、２ｍＭのＥＤＴＡ）における標準の１％アガロースゲル上で等比率で流すことによって、ＲＮＡの有無についてチェックした。さらに、各画分のアリコートをタンパク質含有量についてアッセイした。
【００２５】
表１に示したように、タンパク質は、アガロースゲル（第４列）において又はＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）のカソードもしくは負極端において、トラップ中（第２列）又は膜上（第５列）のいずれかにおいて検出された。アノード又は正極端においては、回収された全タンパク質の５％しか認められなかった（第３列及び第６列）。一方、図３のアガロースゲル上に示したように、ＲＮＡは、トラップ中（第３列）又は膜上（第６列）のいずれかにおいて、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）のアノードもしくは正極端においてのみ検出された。第１レーンの全ＲＮＡとの強度比較により求められるように、ＲＮＡの一部しか回収されなかった。ＲＮＡのバルクは、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）の上又は正極膜上の左側に吸着したようである。しかしながら、タンパク質が見つかったカソード端又は負極端においては何も検出されなかった（第２レーン及び第５レーン）。
したがって、これらの核酸とタンパク質は、実際にｐＨ＝２．５での電気泳動の際に反対方向に移動した。
【００２６】
本発明をその好適な具体的態様を特に参照しながら詳説したが、当業者であれば、本発明の精神、範囲内での変更、バリエーションが可能であることは理解される。
本明細書中で参照した刊行物は、これらをすべて本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＨ＝２．５におけるアガロースゲル上での核酸の電気泳動の結果を示す図面代用写真である。１％のアガロースゲルを調製し、ｐＨ＝２．５において、Ａ．３ｍＭのＨＣｌ又はＢ．５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌにおいて流した。第１レーン＝子牛胸腺ＤＮＡ、第２レーン＝ｐＴＲｌ−Ｘｅｆ転写体、第３レーン＝１６Ｓ＋２３Ｓ  ｒＲＮＡ、第４レーン＝５Ｓ  ｒＲＮＡ。１レーン当たり核酸０．５μｇ。
【図２】図２は、核酸及びタンパク質をアガロースゲル及びアクリルアミドゲルから電気溶離するためのＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）の使用を示す。ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の販促用文献から転載。
【図３】図３は、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）におけるｐＨ＝２．５での電気泳動後のｒＲＮＡの回収を示す図面代用写真である。実施例に記載したように、１％アガロースゲルを調製し、ＴＢＥにおいて流した。第１レーン＝各１μｇの２３Ｓ、１６Ｓ及び５ＳのｒＲＮＡ、第２〜６レーン＝表１に列挙したように、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）由来の等比率画分。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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