(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に順方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号４に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項２】
無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項３】
無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に２個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項４】
昆虫培養細胞由来抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に順方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項５】
無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項６】
無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号８に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項７】
無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に順方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項８】
タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号４に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項９】
タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項１０】
タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に２個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項１１】
タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する、昆虫培養細胞由来抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれたものである記載の鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項１２】
タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項１３】
タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号８に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項１４】
タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項１５】
無細胞系タンパク質合成における転写鋳型として使用される、請求項８〜１０及び１２〜１４のいずれかに記載の鋳型ＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項８〜１０及び１２〜１４のいずれかに記載の鋳型ＤＮＡより転写して得られるｍＲＮＡであって、無細胞系タンパク質合成における翻訳鋳型として使用されるｍＲＮＡ。
【請求項１７】
請求項８〜１０及び１２〜１４のいずれかに記載の鋳型ＤＮＡまたはそれを転写して得られるｍＲＮＡを含有する無細胞系タンパク質合成用反応液。
【請求項１８】
節足動物由来の抽出物を含有する、請求項１７に記載の反応液。
【請求項１９】
節足動物由来の抽出物が昆虫組織から抽出されたものである、請求項１８に記載の反応液。
【請求項２０】
昆虫組織が、カイコ組織である請求項１９に記載の反応液。
【請求項２１】
カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有するものである、請求項２０に記載の反応液。
【請求項２２】
節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、請求項１8に記載の反応液。
【請求項２３】
昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来の培養細胞である、請求項２２に記載の反応液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳反応を促進させる機能を有するＤＮＡ断片、およびそれを用いた鋳型ＤＮＡ、鋳型ＤＮＡを転写して得られるｍＲＮＡ、ならびにこれらを用いた無細胞系タンパク質合成用反応液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞（昆虫培養細胞）などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系または遺伝情報転写／翻訳系を試験管内に取り揃え、反応鋳型として目的タンパク質をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡ（転写鋳型）またはｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する抽出液（無細胞系タンパク質合成用抽出液）として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。
【０００５】
ところで真核生物のｍＲＮＡは、ＤＮＡより転写された後、スプライシングやポリＡテールの付加、５'キャップ構造の付加などの様々な修飾が行われていることが知られている。ポリＡテールおよび５'キャップ構造の付加により、真核生物ｍＲＮＡは、リボソームの４０ｓサブユニットへの結合が促進される。したがって従来、真核生物由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いる場合、効率的な翻訳反応を行うために、転写反応系に市販のキャップアナログを添加してｍＲＮＡのキャッピングを行ってきた。しかし、キャップアナログは高価であり、転写効率を著しく減少させｍＲＮＡも少量しか得られないという問題があった。さらに、未反応のキャップアナログは翻訳反応も阻害するため、転写反応終了後にはこの未反応のキャップアナログをスピンカラムなどを用いて完全に除去する必要があり、ハイスループットにサンプルを処理していく上で大きな問題となっていた。
【０００６】
このような背景のもと、河原崎らはタバコモザイクウィルス由来の５'非翻訳領域（５' ｕｎ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ、以下「５'ＵＴＲ」と略す）がキャップ非依存性の（キャップ構造をとることなく）翻訳促進活性を持つことを明らかとした（たとえば、非特許文献１を参照）。非特許文献１では、小麦胚芽抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、タバコモザイクウィルス由来の５'ＵＴＲを、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子の５'上流側に付加させたＤＮＡより転写して得られたｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いたところ、キャップ構造を付加させたｍＲＮＡと同様の翻訳効率が得られたことが報告されている。また、ウサギ網状赤血球由来の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、ラビットβ−グロビンの５'ＵＴＲが同様の作用を持つことも報告されている（たとえば、非特許文献２を参照）。
【０００７】
無細胞系タンパク質合成用抽出液としては、上記小麦胚芽、ウサギ網状赤血球の他、大腸菌、昆虫培養細胞など由来のものが、従来より知られている。我々は、これまでカイコ組織由来の抽出液（カイコ抽出液）や昆虫培養細胞由来の抽出液（昆虫培養細胞抽出液）を使用した無細胞系タンパク質合成方法を提案してきている（たとえば、特願２００２−３５５９０６号明細書、特願２００２−３６５１４２号明細書、特願２００２−３８２４１５号明細書）。我々が提案するカイコ抽出液や昆虫培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法では、従来の方法と比較して、抽出液の調製が格段に容易であり、真核生物由来であるため糖タンパク質の合成も可能であるという利点があり、非常に有用である。したがってこのような抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成においても、より迅速かつ高収量に無細胞系タンパク質合成を行い得るべく、キャップ構造に依存しない翻訳促進配列を見出すことは非常に重要な課題であった。
【０００８】
【非特許文献１】河原崎 ｅｔ ａｌ， 「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ」Ｖｏｌ．３， ｐ５１７−５２１（２０００）．
【非特許文献２】Ａｎｎｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ， 「Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ」Ｖｏｌ．３， ｐ３７５０（１９９１）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、カイコ抽出液または昆虫培養細胞抽出液といった節足動物由来の抽出物を含む無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、キャップ構造に依存することなく翻訳効率を向上し得るＤＮＡ断片を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に順方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号４に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔２〕無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔３〕無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に２個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔４〕昆虫培養細胞由来抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に順方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔５〕無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔６〕無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に逆方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号８に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔7〕無細胞系タンパク質合成において翻訳反応促進のために使用される、合成するタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に順方向に１個組み込まれ、前記合成するタンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔8〕タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号４に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔9〕タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔１０〕タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に２個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号６に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔１１〕タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する、昆虫培養細胞由来抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成反応液を用いた無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれたものである記載の鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔１２〕タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、前記タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号７に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔１３〕タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号８に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔１４〕タンパク質をコードする構造遺伝子と、前記構造遺伝子の５'上流側に組み込まれたＤＮＡ断片とを有する無細胞系タンパク質合成用の鋳型ＤＮＡであって、タンパク質がルシフェラーゼの場合にルシフェラーゼコントロールRNAに対するルシフェラーゼの相対合成量が３００％以上となる翻訳反応促進活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ断片が、前記構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれたものである鋳型ＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列表の配列番号１０に示される塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片。
〔１５〕無細胞系タンパク質合成における転写鋳型として使用される、請求項８〜１０及び１２〜１４のいずれかに記載の鋳型ＤＮＡ。
〔１６〕  〔８〕〜〔１０〕及び〔１２〕〜〔１４〕のいずれかに記載の鋳型ＤＮＡより転写して得られるｍＲＮＡであって、無細胞系タンパク質合成における翻訳鋳型として使用されるｍＲＮＡ。
〔１７〕  〔８〕〜〔１０〕及び〔１２〕〜〔１４〕のいずれかに記載の鋳型ＤＮＡまたはそれを転写して得られるｍＲＮＡを含有する無細胞系タンパク質合成用反応液。
〔１８〕節足動物由来の抽出物を含有する、〔１７〕に記載の反応液。
〔１９〕節足動物由来の抽出物が昆虫組織から抽出されたものである、請求項１８に記載の反応液。
〔２０〕昆虫組織が、カイコ組織である〔１９〕に記載の反応液。
〔２１〕 カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有するものである、〔２０〕に記載の反応液。
〔２２〕節足動物由来の抽出物が昆虫培養細胞から抽出されたものである、〔１8〕に記載の反応液。
〔２３〕昆虫培養細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来の培養細胞である、〔２２〕に記載の反応液。
【発明の効果】
【００１１】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、節足動物由来の抽出物を含む無細胞系タンパク質合成用抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成において、キャップ構造に依存することなく翻訳効率を向上し得るＤＮＡ断片を提供することができる。さらに、本発明は、このＤＮＡ断片を利用した鋳型ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞系タンパク質合成用反応液をも提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡ断片は、キャップ構造に依存することなく、無細胞系タンパク質合成において翻訳反応を促進する機能を有するものである。ここで「翻訳反応を促進」とは、本発明のＤＮＡ断片を使用して無細胞系タンパク質合成反応を行うことで、このＤＮＡ断片を使用しなかった場合と比較して、１．２倍以上（好適には、２倍以上）に向上されることを指す。
【００１３】
本発明のキャップ非依存性の翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片としては、具体的には、配列表の配列番号１〜１１のいずれかに示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片、またはそれと均等な（上記配列番号１〜１１のいずれかに示される塩基配列より、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された）塩基配列を有し、且つ翻訳反応促進活性を有する二本鎖ＤＮＡ断片が挙げられる。
配列表の配列番号１〜１１に示す塩基配列は、それぞれ、カイコまたはバキュロウイルスにおける５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）として公知の塩基配列である。具体的には、配列番号１に示す塩基配列はカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号２に示す塩基配列はカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号３に示す塩基配列はＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号４に示す塩基配列はＢｍＣＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号５に示す塩基配列はＥｓＣＰＶ（Ｅｕｘｏａ ｓｃａｎｄｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号６に示す塩基配列はＨｃＮＰＶ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号７に示す塩基配列はＣｒＮＰＶ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号８に示す塩基配列はＥｏＮＰＶ（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号９に示す塩基配列はＭｎＮＰＶ（Ｍａｌａｃｏｓｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号１０に示す塩基配列はＳｆＮＰＶ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列、配列番号１１に示す塩基配列はＷｓＮＰＶ（Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリヘドリン遺伝子の５'ＵＴＲの塩基配列として、それぞれ公知である。本発明は、これらの塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは機能を損なわない範囲で均等なＤＮＡ断片が、無細胞系タンパク質合成において、特に有用な翻訳反応促進活性を発揮することを見出したものである。なお、本発明におけるＤＮＡ断片は、カイコまたはバキュロウイルスの５'ＵＴＲに由来するものであれば、上記塩基配列を必ずしも有してなくともよい。
本発明のＤＮＡ断片は従来公知のいかなる方法により得られてもよい。たとえば、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
【００１４】
本発明のＤＮＡ断片は、タンパク質をコードする構造遺伝子の５'上流側に１または複数個組み込まれ、鋳型ＤＮＡとして構築されるのが好ましい。かかる鋳型ＤＮＡも、本発明に包含される。本発明の鋳型ＤＮＡは、環状でも直鎖状であってもよい。本発明の鋳型ＤＮＡにおいて、上記ＤＮＡ断片は、構造遺伝子の５'上流側において、順方向（５'→３'）に組み込まれてもよいし、逆方向（３'→５'）に組み込まれてもよい。また、本発明の鋳型ＤＮＡにおいては、２個以上のＤＮＡ断片が組み込まれたものであってもよく、その場合、組み込まれたＤＮＡ断片は同じものであっても互いに異なるものであってもよい。また、２個以上のＤＮＡ断片が組み込まれた場合、全てのＤＮＡ断片が同じ方向に組み込まれていなくともよい。ＤＮＡ断片は、構造遺伝子の５'上流側において、構造遺伝子に隣り合うように組み込まれてもよいし、構造遺伝子との間に１塩基以上の塩基配列を介在させた状態で組み込まれてもよい。かかる鋳型ＤＮＡは、公知の遺伝子操作技術を適用することで適宜構築することができる。
【００１５】
本発明の鋳型ＤＮＡにおける構造遺伝子は、無細胞系にて合成させる目的タンパク質をコードする領域である。構造遺伝子がコードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。
【００１６】
本発明の鋳型ＤＮＡは、ＤＮＡ断片の５'上流側に、通常、プロモーター配列を有する。プロモーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
【００１７】
また、本発明の鋳型ＤＮＡは、上記構造遺伝子の３'下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
【００１８】
なお、本発明の鋳型ＤＮＡのうち、顕著な翻訳反応促進活性を発揮し、特に好適なものとして以下のものが例示される。
（１）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（３）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（４）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に逆方向に２個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（５）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（６）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に逆方向に２個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（７）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（８）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（９）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（１０）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に順方向に２個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（１１）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に逆方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（１２）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ；
（１３）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つ翻訳反応促進活性を有するＤＮＡ断片が、構造遺伝子の５'上流側に順方向に１個組み込まれた鋳型ＤＮＡ。
【００１９】
上述してきた本発明の鋳型ＤＮＡは、無細胞系タンパク質合成における転写鋳型として好適に使用することができる。すなわち、無細胞系タンパク質合成は、一般に、ｍＲＮＡ（翻訳鋳型）の情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成（翻訳系）、ならびに鋳型ＤＮＡ（転写鋳型）よりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成（転写／翻訳系）とに大きく分けられるが、本発明の鋳型ＤＮＡは、このうち転写／翻訳系の無細胞系タンパク質合成における転写鋳型として好適に使用することができる。
【００２０】
また本発明の鋳型ＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡは、翻訳系の無細胞系タンパク質合成における翻訳鋳型として好適に使用することができる。このような上記鋳型ＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡも、本発明の範囲に包含される。本発明のｍＲＮＡは、従来公知の適宜の方法にて上記鋳型ＤＮＡを転写して調製することができるが、自体公知のインビトロ転写によって上記鋳型ＤＮＡを転写し、調製するのが好ましい。インビトロ転写は、たとえば、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）などを利用して行うことができる。ｍＲＮＡは、転写後、自体公知の方法にて精製して単離し、後述するように無細胞系タンパク質合成用の翻訳鋳型として、翻訳系用反応液に適用することができる。
【００２１】
また、上記鋳型ＤＮＡまたはそれを転写して得られたｍＲＮＡを反応鋳型として用いる無細胞系タンパク質合成用反応液も、本発明に包含される。本発明の無細胞系タンパク質合成用反応液は、上記翻訳系の合成反応を行うための反応液（以下、「翻訳系用反応液」と呼ぶ。）、上記転写／翻訳系の合成反応を行うための反応液（以下、「転写／翻訳系用反応液」と呼ぶ。）のいずれの形態であってもよい。すなわち、上記鋳型ＤＮＡを転写鋳型として含有する転写／翻訳系用反応液であってもよいし、上記鋳型ＤＮＡより転写して得られるｍＲＮＡを翻訳鋳型として含有する翻訳系用反応液であってもよい。
【００２２】
無細胞系タンパク質合成用反応液には、通常、翻訳装置としてのリボソームなどを含有する生体由来抽出物が含まれる。本発明の無細胞系タンパク質合成用反応液に含まれる抽出物は、翻訳鋳型を翻訳して該鋳型にコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば如何なるものであってもよく、従来公知の大腸菌、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物、及びホウレンソウなど植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球などから抽出された抽出物、抽出液を特に制限なく使用することができる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液の場合、Ｚｕｂａｙ Ｇ「Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ」Ｖｏｌ．７， ｐ２６７−２８７（１９７３）などに記載の方法等に準じて調製することもできる。市販のタンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来では、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｏｒ ｌｉｎｅａｒ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（プロメガ社製）などが挙げられ、ウサギ網状赤血球由来ではｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）など、コムギ胚芽由来ではｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ（プロメガ社製）、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡績社製）などが挙げられる。
【００２３】
このように本発明の無細胞系タンパク質合成用反応液には、上述のような公知の抽出物、抽出液が含まれていてもよいが、本発明者らが提案してきている節足動物由来の抽出物が含まれているものであることが好ましい。すなわち、上述したように本発明のＤＮＡ断片は、それぞれカイコあるいはバキュロウィルスにおける５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）としては公知の塩基配列であり、無細胞系タンパク質合成用反応液中における抽出物の由来生物との相関性がより密接であればあるほど、無細胞系タンパク質合成における翻訳反応促進活性はより顕著に発揮されるためである。
【００２４】
ここで「節足動物」とは、後生動物の一門であって、左右相称、裂体腔を有する旧口動物を指し、鋏角亜門、大顎亜門のいずれに属するものであってもよく、たとえば、昆虫綱、クモ綱などに属する動物を包含する。中でも、昆虫綱またはクモ綱（特に、クモ亜綱）に属する節足動物が好ましく、昆虫綱に属する節足動物が特に好ましい。昆虫綱に属する節足動物としては、たとえば、鱗翅目（チョウ目）、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などに属するものが挙げられ、特に制限されるものではないが、中でも、カイコガ科、ヤガ科などの鱗翅目に属するものが好適に使用される。
本発明における翻訳反応用溶液中に含有される上記抽出物は、上記節足動物由来であるならば、成長段階のいずれを問わずいかなる組織から抽出されたものであってもよく、また、節足動物のいずれの組織由来の培養細胞より抽出されたものであってもよい。中でも、カイコ組織または昆虫培養細胞から抽出されたものであるのが特に好ましい。
【００２５】
「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００２６】
無細胞系タンパク質合成用反応液がカイコ組織由来の抽出物を含有する場合、組織としてはカイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織であってよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織であってもよい。なおカイコ組織は、カイコ組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）である必要はない。
【００２７】
ここで、カイコ組織の「絹糸腺」とは、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
またカイコ組織の「脂肪体」とは、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
また「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指す。
【００２８】
またカイコ組織に由来する抽出物を含有する場合、カイコ幼虫の絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれか由来の抽出物であるのが好ましい。カイコ幼虫の絹糸腺（特に、後部絹糸腺）より調製を行うと、短時間で大量のタンパク質が合成可能であるという特に優れた利点がある。またカイコ幼虫の脂肪体から抽出液を調製すると、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製できる利点がある。さらに、カイコの胚から調製を行うと、胚が１つの個体であるために他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製できるという利点がある。
【００２９】
カイコを抽出対象とする場合、カイコは１齢期〜５齢期の幼虫であればよいが、５齢期のカイコ幼虫が好ましい。これは、カイコ幼虫は繭の形成期に近づくにつれて組織が成熟し、特に５齢期のカイコ幼虫においては組織が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しているため、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済むためである。中でも、５齢期のカイコ幼虫の絹糸腺または脂肪体（好ましくは５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、より好ましくは５齢期の３日〜７日のカイコ幼虫の後部絹糸腺）からの抽出物を含有すると、他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質が合成可能な無細胞系タンパク質合成用反応液が得られるという利点もあり、特に好ましい。
【００３０】
また、上述したように無細胞系タンパク質合成用反応液に含有される節足動物由来の抽出物は、従来公知の節足動物を由来とする培養細胞から得られたものであってもよい。かかる培養細胞としては、培養細胞株が多く樹立されており、また、多くの哺乳類系の培養細胞と異なり二酸化炭素雰囲気下での培養を必要とせず、無血清培地においても培養が可能であることから、鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の培養細胞（昆虫培養細胞）を使用するのが好ましい。昆虫培養細胞も、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができるが、中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来の昆虫培養細胞を使用するのが好ましい。特には、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能である、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が好適な昆虫培養細胞として例示される。
【００３１】
上記節足動物由来の抽出物を含有する無細胞系タンパク質合成用反応液は、従来公知の適宜の組成の抽出用液を用いて、節足動物の組織または培養細胞より抽出操作を行って得られた抽出液（抽出液＝抽出用液＋抽出物）を調製し、これに後述するような翻訳反応に要する成分、場合によっては翻訳反応および転写反応に要する成分を適宜添加することで、調製することができる。
【００３２】
節足動物からの抽出操作に用いられる抽出用液としては、特には制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、節足動物由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として節足動物由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、節足動物由来の抽出物にはセリンプロテアーゼが含まれることが多いことから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、無細胞系タンパク質合成に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３３】
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
【００３４】
上記カリウム塩としては、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３５】
上記マグネシウム塩としては、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３６】
上記ＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３７】
上記緩衝剤は、抽出用液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、得られた抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３８】
また抽出対象である節足動物が昆虫培養細胞である場合、上記組成に加えて、塩化カルシウムおよびグリセロールをさらに含有してなる抽出用液を用いると、タンパク質合成能がより向上された昆虫培養細胞抽出液を得ることができるため好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
【００３９】
抽出液を抽出する方法についても特に制限はなく、従来公知の適宜の方法にて行うことができる。
たとえば、節足動物由来の抽出物として、カイコ組織由来の抽出物または昆虫培養細胞由来の抽出物を使用する場合、上述したような組成の抽出用液を使用して、本発明者らが提案している抽出方法にて抽出液を調製するのが、好適である。
以下、それぞれの場合について詳述する。
【００４０】
〔Ａ〕カイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。
次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢中ですり潰し、これに上述した抽出用液を添加して抽出操作を行う。
あるいは、上記抽出用液の添加後、一旦抽出用液も凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）、薬さじで攪拌しながら溶解する。その後、再度液体窒素で完全に凍結させた後、シャーベット状になるまで（具体的には、ウェットな黄色いシャリシャリ状態の氷になるまで）薬さじで攪拌しながら溶解させる。かかる方法によれば、タンパク質合成に関与する成分が効率的に抽出され且つ安定化されるという利点がある。
このようにして、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物を得る。
【００４１】
次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。該遠心分離を１回行った後の上清（上清Ａ１）をそのまま用いて抽出液とするようにしてもよいし、また、該上清Ａ１に上記と同様の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清（上清Ａ２）を抽出液としてもよい。
また、上記上清Ａ１と、上記１回目の遠心分離後の沈殿から上記抽出用液を用いてさらに抽出を行った後に、上記と同様の条件にて遠心分離して得られた上清（上清Ａ３）とを混合して、抽出液として調製するようにしてもよい。このように上清Ａ１と上清Ａ３とを混合して抽出液を調製することで、上清Ａ１、上清Ａ３を単独で抽出液とする場合と比較して、タンパク質合成効率が向上するという利点がある。またさらに、上清Ａ２を、上清Ａ３と混合して抽出液を調製してもよい。これにより上記効果はさらに増強される。勿論、上記上清Ａ１〜上清Ａ３を混合して、抽出液を調製するようにしてもよい。
この場合、調製される混合物（抽出液）における上清Ａ１および／または上清Ａ２（両方混合する場合には、その総量）と上清Ａ３との混合割合に特に制限はないが、タンパク質の合成効率の観点からは、体積比で１０：９０〜９０：１０であるのが好ましく、２０：８０〜８０：２０であるのがより好ましい。
【００４２】
なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにしてもよい。しかしながらタンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。
【００４３】
なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が最も高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を使用し、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液に、グリセロールをさらに添加したものであることが好ましい。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。
【００４４】
〔Ｂ〕昆虫培養細胞由来の抽出物を含有する抽出液の調製方法
昆虫培養細胞から抽出液を調製する場合、本発明者らが提案する、抽出用液中に懸濁した昆虫培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する方法によって調製するのが好ましい。ここで「急激に凍結」とは、１０秒以下、好ましくは２秒以下にて、昆虫培養細胞を凍結させることを指す。また昆虫培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。上記昆虫培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
かかる方法によって昆虫培養細胞からの抽出を行うことにより、緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができ、従来よりもタンパク質の合成量の高い無細胞系タンパク質合成用抽出液を容易に調製することができる。さらに、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
【００４５】
上記本発明者らが提案する抽出液の調製方法では、上述した急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて昆虫培養細胞を破砕し、抽出を行えばよい。中でも、上記昆虫培養細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫培養細胞を破砕するのが好ましい。
【００４６】
上記急激に凍結した昆虫培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。解凍した昆虫培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。かかる遠心分離後の上清には、目的とする昆虫培養細胞の抽出物が含有される。
【００４７】
細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清Ｂ１）をそのまま抽出液としてもよいし、上清Ｂ１をさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清Ｂ２）を抽出液としてもよい。さらに、上記上清Ｂ１または上清Ｂ２をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
まず、上清Ｂ１または上清Ｂ２についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
【００４８】
また上記ゲル濾過で得られた吸収の大きな画分を、さらに遠心分離にかけて、得られた上清（上清Ｂ３）を抽出液とするようにしてもよい。このゲル濾過後の遠心分離は、翻訳反応を阻害する不溶性の成分を除去するという理由から、３０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行うのが、好ましい。
【００４９】
なお、本発明の調製方法に供する昆虫培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、プロテアーゼインヒビター、塩化カルシウムおよびグリセロールを含有しない以外は、上述した昆虫培養細胞用の好適な抽出用液と同じ組成の洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液での洗浄は、昆虫培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの昆虫培養細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
【００５０】
本発明の抽出液中における節足動物由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
なお上記範囲の量の節足動物由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００５１】
無細胞系タンパク質合成方法においては、たとえば上述したようにして調製された抽出液を用いて、翻訳系用反応液または転写／翻訳系用反応液を調製する。翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液のいずれの場合であっても、上記抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように調製されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、節足動物由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
以下、節足動物由来の抽出物を含有する抽出液を用いた場合における（１）翻訳系用反応液、（２）転写／翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。
【００５２】
（１）翻訳系用反応液
翻訳系用反応液は、上記節足動物由来抽出液を除く成分として、翻訳鋳型（上述した本発明のＤＮＡ断片を組み込んだ鋳型ＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡ）、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００５３】
なお翻訳系用反応液に用いる翻訳鋳型は、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得、かつ本発明における翻訳反応促進活性を発揮し得るならば、使用される全ての翻訳鋳型が同じ塩基数でなくともよく、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された翻訳鋳型が混在していてもよい。
翻訳系用反応液中において、翻訳鋳型は、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５４】
翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５５】
翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５６】
翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５７】
翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】
翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５９】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６０】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６１】
翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６２】
翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する節足動物由来のＲＮａｓｅによって、無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６３】
翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６４】
翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６５】
また翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００６６】
さらに、翻訳系用反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、無細胞系タンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６７】
すなわち、翻訳系用反応液としては、節足動物由来抽出物を含有する抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの翻訳鋳型、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００６８】
上記翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（翻訳系合成反応）は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００６９】
（２）転写／翻訳系用反応液
転写／翻訳系用反応液は、上記抽出液および節足動物由来ｔＲＮＡを除く成分として、転写鋳型（上述した本発明のＤＮＡ断片を組み込んでなる鋳型ＤＮＡ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも含有するのが好ましい。かかる転写／翻訳系用反応液を使用して転写／翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００７０】
なお転写／翻訳系用反応液に用いる転写鋳型は、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得、かつ本発明における翻訳反応促進活性を発揮し得るならば、使用される全ての転写鋳型が同じ塩基数でなくともよく、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された転写鋳型が混在していてもよい。上述した本発明のＤＮＡ断片のうち互いに異なる塩基配列のＤＮＡ断片が組み込まれた鋳型ＤＮＡが混在していても、勿論よい。
転写鋳型は、転写／翻訳系用反応液中において、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。転写鋳型が０．１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７１】
転写／翻訳系用反応液に用いるＲＮＡポリメラーゼは、転写鋳型が有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、転写鋳型がＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また転写鋳型が、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３
ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中に０．０１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．０１Ｕ／μＬ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００７２】
転写／翻訳系用反応液中におけるＡＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７３】
転写／翻訳系用反応液中におけるＧＴＰは、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７４】
転写／翻訳系用反応液中におけるシチジン５'−三リン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＣＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７５】
転写／翻訳系用反応液中におけるウリジン５'−三リン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＵＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７６】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７７】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７８】
転写／翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７９】
転写／翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。ｔＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００８０】
転写／翻訳系用反応液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有するのが好ましい。
【００８１】
転写／翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８２】
転写／翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８３】
転写／翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１００ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００８４】
転写／翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する節足動物由来のＲＮａｓｅによって、転写／翻訳系合成反応の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８５】
上記スペルミジンは、転写における伸張反応を促進する目的で添加されるものであり、転写／翻訳系用反応液中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満であると、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下するというような傾向にあるためであり、またスペルミジンが１００ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８６】
転写／翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８７】
また転写／翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、転写／翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００８８】
すなわち、転写／翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、さらに３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬの転写鋳型、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴＴ、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有するように実現されるのが好ましい。
【００８９】
上記転写／翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）についても、上記翻訳系合成反応の場合と同様、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００９０】
上記翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【実施例】
【００９１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１
：ベクターｐＴＮＴ−Ｌｕｃの構築
ルシフェラーゼをコードする構造遺伝子を有するｐＧＥＭ−Ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用い、９６℃２分で鋳型を変性させた後、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行い、構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。これとは別に、ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらをライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドを、配列表配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ Ｄｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、２５サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ由来の５'−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
【００９２】
実施例１
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＦｉｂ−Ｌｕｃ）の作製
上記参考例１で作成したプラスミドベクターｐＴＮＴ−Ｌｕｃを鋳型にして、配列表配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ｐ Ｒｖ）と、配列表配列番号１６に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ−ＡＴＧ）を用い、９６℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃５分、３０サイクルのＰＣＲを行った。反応終了後、電気泳動でＰＣＲ産物を分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ ＧｅｌＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて精製し、これをライゲーション反応に用いた。このようにして、５'ＵＴＲの挿入の効果を確認すべく、プラスミドベクターｐＴＮＴ−ＬｕｃからＳＰ６プロモーター配列、５'−βグロビンリーダー配列およびルシフェラーゼをコードする構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失せしめたプラスミドベクターを得た。
配列表配列番号１に示す塩基配列を有するカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲのセンス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ合成機で合成し、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）によってその５'末端のリン酸化を行った。反応終了後、センス鎖とアンチセンス鎖とを混合し、９５℃５分間熱処理した。これを室温になるまで静置しセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせた。エタノール沈殿により精製した後、水に溶解させた。ＳｉｇｍａＳｐｉｎ Ｐｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（シグマ社製）によって、過剰のＡＴＰを取り除いた後、再度エタノール沈殿により精製した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、カイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクターを選択した。このようにして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間にカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲが順方向に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＦｉｂ−Ｌｕｃと名付けた。
【００９３】
実施例２
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＳｅｒ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号２に示す塩基配列を有するカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は実施例１と同様にして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するカイコのセリシン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｅｒ−Ｌｕｃと名付けた。
【００９４】
実施例３
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号３に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は実施例１と同様にして、Ｔ７プロモーター配列と構造遺伝子との間に、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するＡｃＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＡｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【００９５】
実施例４
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＦＡｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
実施例１にてカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲより調製した二本鎖ＤＮＡ断片と、実施例３にてＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲより調製した二本鎖ＤＮＡ断片とを共にインサートとして用い、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、５'側から順にカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子の５'ＵＴＲおよびＡｃＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ順方向（５'→３'）に１個ずつ組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＦＡｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【００９６】
実施例５
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＢｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号４に示す塩基配列を有するＢｍＣＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は実施例１と同様にして、Ｔ７プロモーター配列とルシフェラーゼ遺伝子との間に、配列表配列番号４に示す塩基配列を有するＢｍＣＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を作製した。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＢｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【００９７】
実施例６
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＢｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＢｍＣＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例５と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＢｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
【００９８】
実施例７
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＥｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号５に示す塩基配列を有するＥｓＣＰＶ（Ｅｕｘｏａ ｓｃａｎｄｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、実施例１と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、５'側から順にＥｓＣＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ順方向（５'→３'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃと名付けた。
【００９９】
実施例８
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＥｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃ）の作製
５'側から順にＥｓＣＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ逆方向（３'→５'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例７と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１００】
実施例９
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＨｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号６に示す塩基配列を有するＨｃＮＰＶ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、実施例１と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＨｃＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０１】
実施例１０
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＨｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＨｃＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例９と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０２】
実施例１１
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＨｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃ）の作製
５'側から順にＨｃＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲがそれぞれ逆方向（３'→５'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例９と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＨｐｈｄ−ＲＲ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０３】
実施例１２
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＣｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号７に示す塩基配列を有するＣｒＮＰＶ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、実施例１と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＣｒＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＣｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０４】
実施例１３
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＣｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＣｒＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例９と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＣｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０５】
実施例１４
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号８に示す塩基配列を有するＥｏＮＰＶ（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、実施例１と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＥｏＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＥｏｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０６】
実施例１５
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＭｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号９に示す塩基配列を有するＭｎＮＰＶ（Ｍａｌａｃｏｓｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、実施例１と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＭｎＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に２個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＭｐｈｄ−ＦＦ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０７】
実施例１６
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＭｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃ）の作製
ＭｎＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが逆方向（３'→５'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１５と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＭｐｈｄ−Ｒ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０８】
実施例１７
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号１０に示す塩基配列を有するＳｆＮＰＶ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、実施例１と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＳｆＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＳｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１０９】
実施例１８
：鋳型ＤＮＡ（ベクターｐＷｐｈｄ−Ｌｕｃ）の作製
配列表配列番号１１に示す塩基配列を有するＷｓＮＰＶ（Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）のポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲを用いた以外は、実施例１と同様にして作製した二本鎖ＤＮＡ断片をインサートとし、上記ＳＰ６プロモーター配列、βグロビンリーダー配列および構造遺伝子の５'上流側マルチクローニングサイトを欠失したｐＴＮＴ−Ｌｕｃ由来のベクターとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた。得られた大腸菌よりプラスミドを調製した後、塩基配列解析を行った。このようにして、ＷｓＮＰＶのポリへドリン遺伝子の５'ＵＴＲが順方向（５'→３'）に１個組み込まれたベクター（鋳型ＤＮＡ）を選択した以外は、実施例１と同様にして行った。得られた鋳型ＤＮＡを、ｐＷｐｈｄ−Ｌｕｃと名付けた。
【０１１０】
参考例２
：カイコ抽出液の調製
５齢期４日目のカイコ幼虫１５匹よりハサミ、ピンセット、メス、スパーテルを使用して、後部絹糸腺３．０７ｇを摘出し、これを−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３０，０００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３０，０００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。
得られた抽出液について、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。
抽出液中におけるカイコ幼虫の後部絹糸腺の含有量は、タンパク質濃度で１７．５ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１１】
実験例１
：カイコ組織由来の抽出物を含有する翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
（１）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
上記実施例１〜１８で作製した各ベクターを、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間のインビトロ転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
（２）翻訳反応
参考例２で調製したカイコ抽出液を用い、上記（１）で得られた各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ カイコ抽出液
・１６０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．０ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で６時間行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【０１１２】
図１は、実験例１の結果を示すグラフであり、ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ（プロメガ社製）を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
【０１１３】
参考例３
：昆虫培養細胞抽出液の調製
（１）昆虫培養細胞の培養
細胞数２．１×１０７個の昆虫培養細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ２）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０８個、湿重量１．２１ｇとなった。
【０１１４】
（２）昆虫培養細胞抽出液の調製
まず、上記（１）で培養した昆虫培養細胞を集菌し、下記組成の洗浄液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した。
〔洗浄液の組成〕
・６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ 酢酸カリウム
・４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４ｍＭ ＤＴＴ
洗浄後の昆虫培養細胞に、下記組成の抽出用液を１ｍＬ加え、懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、昆虫培養細胞抽出液とした。
【０１１５】
実験例２
：昆虫培養細胞由来の抽出物を含有する翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成
（１）インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製
上記実施例１〜６、８、１０〜１８で作製した各ベクターを、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたベクター１μｇを鋳型として、ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を用い２０μｌスケールで３７℃４時間のインビトロ転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃１５分インキュベートし、鋳型を消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μｌの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした後、滅菌水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
（２）翻訳反応
参考例３で調製した昆虫培養細胞抽出液を用い、上記（１）で得られた各ｍＲＮＡそれぞれについて、下記組成の翻訳系用反応液を調製し、翻訳反応を行った。
〔翻訳系用反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫培養細胞抽出液
・３２０μｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。翻訳反応は反応温度２５℃で８時間行い、反応液量は２５μＬとした。
合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【０１１６】
図２は、実験例２の結果を示すグラフであり、ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ（プロメガ社製）を１００％とした場合の相対合成量を縦軸に示している。
【配列表のフリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１：
カイコフィブロインＬ鎖遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号２：
カイコセリシン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号３：
ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号４：
ＢｍＣＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号５：
ＥｓＣＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号６：
ＨｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号７：
ＣｒＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号８：
ＥｏＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号９：
ＭｎＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１０：
ＳｆＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１１：
ＷｓＮＰＶポリヘドリン遺伝子５'ＵＴＲの塩基配列
配列番号１２：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号１３：
プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号１４：
プライマー Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
配列番号１５：
プライマー Ｔ７ｐ Ｒｖ
配列番号１６：
プライマー ＬＵＣ−ＡＴＧ
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】実験例１の結果を示すグラフである。
【図２】実験例２の結果を示すグラフである。
【図１】
0004400687.tif 000002
【図２】
0004400687.tif 000003
【配列表】
0004400687000001.app