(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステル、またはそれらの塩。
【請求項２】
配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
そのアミド、もしくはそのエステル、またはそれらの塩。
【請求項３】
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステル、またはそれらの塩。
【請求項４】
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステル、またはそれらの塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項６】
前記塩基配列が配列番号：２３で表される塩基配列である請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】
前記塩基配列が配列番号：４で表される塩基配列である請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項８】
前記塩基配列が配列番号：２５で表される塩基配列である請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項９】
前記塩基配列が配列番号：１０で表される塩基配列である請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項５記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換体を培養し、請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチドを生成せしめることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の製造法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチドまたはその塩の軟骨分化抑制機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチドまたはその塩を含有してなる請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の軟骨分化抑制機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる組成物。
【請求項１７】
請求項１３記載の抗体を含有してなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な分泌性細胞機能調節蛋白質およびそのDNAに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞はその原核性、真核性を問わず、その固有の機構で多種多様な蛋白質を分泌している。特に多細胞生物（生体）は、その分化、増殖および恒常性の維持のためにさまざまな情報を細胞間で交換しているが、そこで中心的役割を果たす各種液性因子もその多くが分泌蛋白質或いはその成熟体であり、その構造的、機能的特徴等からホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子等に分類されている。近年の組換えDNA技術と細胞培養技術の進歩により、これら分泌蛋白質をコードする遺伝子と蛋白質構造の解明が着実に進んでいる。一方でこうした因子の発見は、細胞表面に発現しているその受容体の解析を飛躍的に前進させ、さらには各細胞内での情報伝達のメカニズム解明にもつながり、その生理機能を特徴づけることになる。ヒトにおける多くの疾病、あるいは各種疾患モデル動物の病態では、こうした本来恒常性を保つべき何らかの液性因子の異常な発現がその原因となったり、結果として増悪化につながる場合も多く見出される他、例えば癌において特異的に発現の亢進が認められるいわゆる腫瘍マーカー等、各種疾患の診断分野で応用可能な現象もあり、その発現制御機構は創薬研究を行う上での重要な標的にもなっている。
【０００３】
１９９４年にBleschらが発表した黒色腫阻害蛋白質MIA (melanoma inhibitory activity)もそうした範疇に含まれる分泌蛋白質の一種で、当初、その名が示す通りヒト黒色腫細胞に対する抗増殖活性を指標に黒色腫細胞の培養上清から単離され、その遺伝子も取得された(キャンサー・リサーチ(Cancer Research) 54, 5695-5701, 1994)。その後1996年Sandellらによって本蛋白質の相同遺伝子が、ウシ軟骨細胞が産生するレチノイン酸感受性蛋白質CD-RAP (cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein)として再び同定され、生理学的には関節の形成・維持に機能することが示唆されている（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry) 271, 3311-3316, 1996）。MIA/CD-RAP遺伝子はヒト、マウス、ラット、ウシの種間でアミノ酸レベルで８５％以上の高い相同性を有しているものの、これまでに公知の蛋白質で相同性のあるものは見つかっておらず、またウシ、ラットにおける遺伝的解析から、本遺伝子の類似遺伝子は他に存在しないと考えられていた（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry) 271, 3311-3316, 1996）。
【０００４】
一方、現在、一つの生物のもつ全DNA、つまりゲノムの構造解析が、バクテリアでは既にいくつか終わり、ヒトのそれも数年で完成の見通しが立っているが、その予想される遺伝子数はヒトにおいては十万とも言われている。確かにこれまで数多くの分泌蛋白質或いは分泌ペプチドをコードする遺伝子が単離されてきているものの、その数は全ゲノムからみればとてもそのすべてを網羅したとはいえない。個体レベルの生命現象を理解する上でその中で起こっているあらゆる細胞間の情報交換が説明可能になっていかなければならないが、こうした既知の遺伝子以外にも未だ知られていない液性の機能分子が重要な生理的役割を果たしている可能性が高く、そうした物質の発見が強く望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は新規細胞機能調節分泌蛋白質（以下MLP蛋白質またはMLPと称する場合がある）、その部分ペプチドまたはその塩、該タンパク質をコードするDNA、組換えベクター、形質転換体、該タンパク質の製造法、該タンパク質またはDNAを含有する医薬、該タンパク質に対する抗体、レセプターアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法並びにスクリーニング用キット、該スクリーニングで得られるレセプターアゴニスト／アンタゴニスト並びにその医薬等を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
新たな細胞機能調節分泌蛋白質の単離は、細胞の分化、増殖、癌化等のメカニズムに新たな知見を与え、ひいては個体の発生、恒常性の維持等の生命現象の解明をより一層進展させることができ、該蛋白質に対して阻害活性或いは促進活性を発揮し、種々の疾患の予防や診断、治療に役立つ新たな医薬品の開発ができる。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト胎児脳、マウス胎児由来cDNAライブラリーからそれぞれ新規な塩基配列を有するcDNAをクローニングすることに成功した。そして、本発明者らは、得られたc DNAにコードされる蛋白質が有用な細胞機能調節活性を有するMIA／CD-RAP様蛋白質MLPの前駆体蛋白質であり、MLP前駆体からシグナル配列が切断されて生成するMLPが分泌蛋白質であることを見出した。これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（３）配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列である前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（４）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列である前記（２）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（５）配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列である前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（６）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列である前記（２）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（７）前記（１）記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（８）前記（１）記載のポリペプチドをコードする塩基配列が配列番号：２３で表される塩基配列である前記（６）記載のＤＮＡ、
（９）前記（１）記載のポリペプチドをコードする塩基配列が配列番号：４で表される塩基配列である前記（６）記載のＤＮＡ、
（１０）前記（１）記載のポリペプチドをコードする塩基配列が配列番号：２５で表される塩基配列である前記（６）記載のＤＮＡ、
（１１）前記（１）記載のポリペプチドをコードする塩基配列が配列番号：１０で表される塩基配列である前記（６）記載のＤＮＡ、
（１２）前記（１）記載のポリペプチドをコードする塩基配列が配列番号：４８で表される塩基配列である前記（６）記載のＤＮＡ、
（１３）前記（１）記載のポリペプチドをコードする塩基配列が配列番号：４６で表される塩基配列である前記（６）記載のＤＮＡ、
（１４）前記（６）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（１５）前記（１４）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１６）前記（１５）記載の形質転換体を培養し、該ポリペプチドを生成せしめることを特徴とする前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の製造法、
（１７）前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
（１８）前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする前記（１）記載のポリペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１９）前記（１）記載のポリペプチドまたはその塩を含有してなる前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２０）前記（１８）記載のスクリーニング方法または前記（１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２１）前記（１８）記載のスクリーニング方法または前記（１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２２）前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
（２３）前記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる骨・関節疾患または病的血管新生の予防・治療剤、
（２４）前記（１７）記載の抗体を含有してなる診断剤などに関する。
【０００８】
さらには、本発明は、
（２５）配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と約５０％以上（好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２６）配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、▲１▼配列番号：２４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：２４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜４０個程度、より好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：２４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩等を提供する。
さらに本発明のＤＮＡ、およびポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩等は、分子量マーカー、組織マーカー、染色体マッピング、遺伝病の同定、プライマー、プローブの設計等の基礎研究に利用できる可能性がある。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、ヒト型ポリペプチドと称することがある）、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、マウス型ポリペプチドと称することがある）、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、ラット型ポリペプチドと称することがある）およびヒト型ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、ヒト型ポリペプチドおよびヒト型ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを総称して本発明のポリペプチドと称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等に由来するポリペプチドであってもよく、組換えポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
また、本発明のポリペプチドがシグナルペプチドを有している場合は、ポリペプチドを効率よく細胞外に分泌させることができる。
【００１０】
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられ、具体的には、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列または配列番号：４９で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをヒトＭＬＰまたはヒトＭＬＰ蛋白質と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをマウスＭＬＰまたはマウスＭＬＰ蛋白質と、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをラットＭＬＰまたはラットＭＬＰ蛋白質と称することがあり、これらをＭＬＰと総称することがある。
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとして具体的には、例えば、配列番号：６で表されるアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド等があげられる。
配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられ、具体的には、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列または配列番号：４７で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをヒトＭＬＰ前駆体またはヒトＭＬＰ前駆体蛋白質と、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをマウスＭＬＰ前駆体またはマウスＭＬＰ前駆体蛋白質と、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをラットＭＬＰ前駆体またはラットＭＬＰ前駆体と称することがあり、これらをＭＬＰ前駆体と総称することがある。
【００１１】
本発明の配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチド等が好ましい。
また、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチド等が好ましい。
実質的に同質の性質としては、例えば、分泌され液性因子として作用すること等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が定性的に同質であることを示す。したがって、分泌作用や溶解度等の性質が同等（例、約０．１〜１００倍、好ましくは約０．５〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの性質の程度、ポリペプチドの分子量等の量的要素は異なっていてもよい。
【００１２】
また、配列番号：２４または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしてより具体的には、例えば、▲１▼配列番号：２４または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：２４または配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜４０個程度、より好ましくは、１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、なかでも好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：２４または配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、▲４▼配列番号：２４または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチド等のいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されないが、配列番号：２４、配列番号：２６および配列番号：４９のそれぞれの配列番号で表されるアミノ酸配列に共通するアミノ酸配列以外の位置、配列番号：６、配列番号：１２および配列番号：４７のそれぞれの配列番号で表されるアミノ酸配列に共通するアミノ酸配列以外の位置等が挙げられる。
【００１３】
本明細書におけるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、本発明のポリペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基等のＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。
本発明のポリペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。
さらに、本発明のポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ1-6アルカノイル等のＣ1-6アシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ1-6アルカノイル基等のＣ1-6アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ポリペプチド等の複合ポリペプチド等も含まれる。
【００１４】
本発明のポリペプチドまたはその塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のポリペプチド（タンパク質）の精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１５】
本発明のポリペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のポリペプチド（タンパク質）合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂等を挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミド等が用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOB tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１６】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド（タンパク質）縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドン等の酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリル等のニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチル等のエステル類あるいはこれらの適宜の混合物等が用いられる。反応温度はポリペプチド（タンパク質）結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。
活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１７】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmoc等が用いられる。
【００１８】
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチル等の直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化等によって保護することができる。
【００１９】
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基等の低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基等のアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基等が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基等である。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチル等が用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmoc等が用いられる。
【００２０】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕等が用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ-炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液等による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元等も用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオール等のようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア等によるアルカリ処理によっても除去される。
【００２１】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化等は公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。
縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
ポリペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２２】
本発明のポリペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせて本発明のポリペプチドポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００２４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質（例、免疫原性等）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ等を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２３で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられる。
配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２３で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられる。
また、配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとして、具体的には、配列番号：２５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質（例、免疫原性等）有するポリペプチドをコードするＤＮＡ等を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ等があげられる。
配列番号：２５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２５で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられ、具体的には、配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられる。
さらに、配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとして、具体的には、配列番号：４８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質（例、免疫原性等）有するポリペプチドをコードするＤＮＡ等を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ等があげられる。
配列番号：４８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４８で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられ、具体的には、配列番号：４１または配列番号：４６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２３で表される塩基配列を有するＤＮＡ等が、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡ等が、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表される塩基配列を有するＤＮＡ等が、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ等が、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４８で表される塩基配列を有するＤＮＡ等が、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４６で表される塩基配列を有するＤＮＡ等が用いられる。
【００２６】
本発明のポリペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、MutanTM-G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、Gapped duplex法やKunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２７】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルス等の動物ウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、β-アクチン等が挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。
【００２８】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Geneticin耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、組換え体細胞をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列等が、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等がそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２９】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕等が用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕等が用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１等が用いられる。
【００３０】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）等が用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞等が用いられる。
【００３１】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)等に記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)等に記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）等に記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）等に記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖等、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等の無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子等を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３２】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞外または細胞内に本発明のポリペプチドを生成せしめることができる。
【００３３】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TM等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられる。
【００３４】
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素または蛋白分解酵素等を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。これらの酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ等が用いられる。
かくして生成する本発明のポリペプチドまたはその塩の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロット解析等により測定することができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のポリペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドまたはその塩は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス等が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００３６】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等の温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素等で標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識したポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、約１〜２０％、好ましくは約１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、約１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））等を用いることができる。培養温度は、通常約２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３７】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧ等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００３８】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと称することもある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列等が挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のポリペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列等）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置等を用いて製造することができる。
【００４０】
本発明のポリペプチドがシグナルペプチドを有する場合は、細胞外に効率よく分泌され、液性因子として、シグナル伝達や自己防衛等のための重要な生物活性を発揮する。
以下に、本発明のポリペプチドまたはその塩（以下、本発明のポリペプチドと略記する場合がある）、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００４１】
（１）本発明のポリペプチドは、軟骨組織特異的に発現しているため、組織マーカーとして使用することができる。すなわち組織の分化、病態、癌の転移等の検出のためのマーカーとして有用である。また、対応するレセプター、リガンド、結合ポリペプチド等の分取にも利用できる。さらに、自体公知のハイスループットスクリーニングのためのパネルにして、生物活性を調べるのに利用できる。また、染色体マッピングを行い、遺伝病の研究にも利用できる。
（２）本発明のポリペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のポリペプチドは、生体内（特に軟骨組織）で液性因子として存在し、軟骨分化を抑制する機能を有するため、本発明のポリペプチド、または本発明のＤＮＡ等に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が異常に減少または亢進している場合、種々の疾病が発症する。
発明のＤＮＡ等が欠損している場合あるいは発現量が異常に減少している場合、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、大理石病等の骨・関節疾患、病的血管新生等、種々の疾病が発症する。
したがって、本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば変形性関節症、慢性関節リウマチ、大理石病等の骨・関節疾患、病的血管新生等、種々の疾病の治療・予防剤等の医薬として使用することができる。
例えば、生体内において本発明のポリペプチドが減少あるいは欠損しているために、細胞における情報伝達が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のポリペプチドを該患者に投与すること等によって、該患者における本発明のポリペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドを上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のような天然産出植物油等を溶解または懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０等）等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００４３】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、骨・関節疾患の治療目的で本発明のポリペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき本発明のポリペプチドを約１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約１０〜２００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、本発明のポリペプチドの１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、骨・関節疾患の治療目的で本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ポリペプチドを約１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは約１〜２００ｍｇ程度、より好ましくは約１０〜１００ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４４】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のポリペプチドは生体内（特に軟骨組織等）で液性因子として存在し、軟骨分化を抑制する機能を有するため、本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物またはその塩は、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、大理石病等の骨・関節疾患、病的血管新生等の治療・予防剤等の医薬として使用できる。
一方、本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの産生過剰に起因する疾患、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨形成不全症、骨粗鬆症、骨折、大腿骨頭壊死症、軟骨形成不全症等の骨・関節疾患、病的血管新生等の治療・予防剤等の医薬として使用できる。
したがって、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のポリペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする本発明のポリペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物もしくはその塩（以下、促進剤と略記する場合がある）、または本発明のポリペプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物（以下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドまたはその塩を含有するものである。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等とすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、骨・関節疾患治療の目的で本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、骨・関節疾患治療の目的で本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】
（３）本発明のポリペプチドまたはその塩の定量
本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量等に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
【００４８】
また、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のポリペプチドの定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕等が用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００４９】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリー等に用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体等を用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー等が好適に用いられる。
【００５１】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書等を参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol.  92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)等を参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドの濃度を定量することによって、（１）本発明のポリペプチドの濃度の増多が検出された場合、例えば、骨・関節疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨形成不全症、骨粗鬆症、骨折、大腿骨頭壊死症、軟骨形成不全症等）、病的血管新生（例えば、腫瘍血管新生等）の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、（２）本発明のポリペプチドの濃度の減少が検出された場合、例えば、骨・関節疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、大理石病、等）、病的血管新生（例えば、腫瘍血管新生等）の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織等の被検体中に存在する本発明のポリペプチドを検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析等のために使用することができる。
【００５２】
（４）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）における本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））、 ＤＮＡマイクロアレイ等により実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションやＤＮＡマイクロアレイにより発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法やＤＮＡマイクロアレイによりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、骨・関節疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、大理石病、等）、病的血管新生（例えば、腫瘍血管新生等）の疾病である可能性が高いと診断することができる。
【００５３】
（５）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内における本発明のポリペプチドまたは本発明のＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、本発明のポリペプチドの発現過多に起因する疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨形成不全症、骨粗鬆症、骨折、大腿骨頭壊死症、軟骨形成不全症等の骨・関節疾患、腫瘍血管新生等の病的血管新生）の治療・予防剤として使用することができる。
上記アンチセンスＤＮＡを上記の治療・予防剤として、前記した本発明のＤＮＡを含有する各種疾病の治療・予防剤と同様に使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５４】
（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの発現過多に起因する疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨形成不全症、骨粗鬆症、骨折、大腿骨頭壊死症、軟骨形成不全症等の骨・関節疾患、腫瘍血管新生等の病的血管新生）の治療・予防剤等の医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、骨・関節疾患治療の目的で本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。
【００５５】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated  castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤等が例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５６】
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞等に対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等により目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞等に目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養等に利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
【００５７】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット等が用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統等、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統等）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤ等）等が好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒト等が挙げられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異等）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換等が生じたＤＮＡ等が用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡ等が用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクター等）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００５８】
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージ等のバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルス等のレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルス等の動物ウイルス等が用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミド等が好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルス等）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシン等のプロモーター等が用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーター等が好適である。
【００５９】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネーター等が用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部等をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
【００６０】
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【００６１】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
【００６２】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製等が考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症等を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシン等のポリペプチド（タンパク質）分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べること等ができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法等を用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６３】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００６４】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部または全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナル等）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００６５】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得する等の目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したもの等も良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配（バッククロス）することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００６６】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、約５％炭酸ガス、約９５％空気または約５％酸素、約５％炭酸ガス、約９０％空気）で約３７℃で培養する等の方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常約０.００１−０.５％トリプシン／約０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／約１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法等がとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋等の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. EvansおよびM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin  プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチドの細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６７】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【００６８】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明および治療法の検討に有用である。
【００６９】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷等に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷等に起因する疾病（骨・関節疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ大理石病、等）、病的血管新生（例えば、腫瘍血管新生）等）に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷等に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状等の変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射等が用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質等にあわせて適宜選択す
ることができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質等にあわせて適宜選択することができる。
例えば、腫瘍血管新生に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に癌細胞移植を行ない、癌細胞移植前または移植後に試験化合物を投与し、該動物の腫瘍マーカー値および腫瘍塊サイズ等を経時的に測定する。
【００７０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷等によって引き起こされる疾患（骨・関節疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ大理石病、等）、病的血管新生（例えば、腫瘍血管新生）等）に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤等の医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、骨・関節疾患治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、骨・関節疾患の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７１】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものが挙げられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子等が好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【００７２】
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒド等で固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００７３】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸）や塩基（例、有機酸）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、骨・関節疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ大理石病、等）、病的血管新生（例えば、腫瘍血管新生）等の疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤等の医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００７４】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、骨・関節疾患の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、骨・関節疾患の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７５】
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
さらに、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、マウスやヒトにおいて、特に軟骨組織で極めて大量に発現していることから、該遺伝子のプロモーター配列は、目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）を非ヒト温血動物の軟骨組織で大量に発現させるためのプロモーターとして好都合である。非ヒト温血動物としては、例えば上述の温血動物として例示したものと同様のもの等があげられる。
すなわち、本発明は、配列番号：６、配列番号：１２または配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチドをコードする遺伝子のプロモータ−領域の下流（３'末端側）に目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）を連結し、非ヒト動物に導入することによる目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）を非ヒト温血動物の軟骨組織優位に発現させる方法を提供する。
該目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）としては、例えば、サイトカイン（例、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血因子）、増殖因子（例、EGF（epidermal growth factor）またはそれと実質的に同一の活性を有する物質（例えば、EGF、ハレグリン（HER2リガンド）等）、インシュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する物質（例えば、インシュリン、IGF（insulin-like growth factor）−１、IGF−２等）、FGF（fibroblast growth factor）またはそれと実質的に同一の活性を有するもの（例えば、aFGF、bFGF、KGF(Keratindcyte Growth Factor)、HGF(Hepatocyte Growth Factor)、FGF-10等）、その他の細胞増殖因子（例えば、CSF（colony stimulating factor）、EPO(erythropoietin)、IL-2（interleukin-2）、NGF(nerve growth factor)、PDGF（platelet-derived growth factor）、TGFβ（transforming growth factorβ））等）、ホルモン（例、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン(ＧＨ−ＲＨ）、プロラクチン、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、モチリン、ソマトスタチン、セクレチン、グルカゴン、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ等、消化酵素（例、アミラーゼ、ペプシノーゲン、リパーゼ等）、病原体に対する抗体（例、病原性サルモネラ菌等の病原性細菌に対する抗体、インフルエンザ等の病原性ウイルスに対する抗体、エキノコックス等の寄生虫に対する抗体等）、抗菌ポリペプチド（例、セクロピン、ヒスタチン、インドリシジン、プロテグリン、ディフェンシン、リゾチーム等）等の有用遺伝子産物等があげられる。
上記の目的タンパク質のうち、
▲１▼  サイトカインを軟骨特異的に発現させることによって、例えば、非ヒト温血動物の免疫活性の増強、調節等が達成でき、
▲２▼  増殖因子を軟骨特異的に発現させることによって、例えば、非ヒト温血動物の軟骨組織の保護等が達成できる。
【００７６】
以下に、配列番号：６、配列番号：１２または配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチドをコードする遺伝子のプロモータ−領域の下流（３'末端側）に目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを連結し、非ヒト動物に導入することによる目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）を非ヒト温血動物の軟骨特異的に発現させる方法についてより具体的に記載する。
まず、配列番号：６、配列番号：１２または配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチドをコードする遺伝子のプロモータ−は、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションやＰＣＲ等の自体公知の方法（例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning） 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法等）によって得ることができる。また、プロモーター活性を有する領域の同定は、レポーターアッセイ等の自体公知の方法（例えば、アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry），１８８巻，２４５頁（1990年）に記載の方法等）によって得ることができる。
次に上記の方法によって得られるプロモータ−の下流（３'末端側）に目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）を連結するためには、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドを構築するための自体公知の方法（例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning） 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法等）によって目的を達成する事が出来る。
プロモータ−の下流（３'末端側）に目的タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）をコードするＤＮＡを連結したものを非ヒト温血動物に導入するためには、エレクトロポーレイションを用いる方法、遺伝子銃を用いる方法、レトロウイルスベクターを用いる方法（例えば、ブラッド セルズ（Blood Cells），１７巻，４０７頁（1991年）に記載の方法等）、アデノウイルスベクターを用いる方法（例えば、パソロジー（Pathology），３０巻，３３５頁（1998年）に記載の方法等）等がある。
【００７７】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
0004579378.tif 000002
【００７８】
0004579378.tif 000003
【００７９】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
0004579378.tif 000004
【００８０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］
実施例１で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：２］
実施例１で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：４］
配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するヒトＭＬＰ前駆体をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］
配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するヒトＭＬＰ前駆体に含まれるシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］
ヒトＭＬＰ前駆体のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：７］
実施例２で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：８］
実施例２で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＭＬＰ前駆体をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１１］
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＭＬＰ前駆体に含まれるシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１２］
マウスＭＬＰ前駆体のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１３］
実施例３で用いられたＧ３ＰＤＨ特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１４］
実施例３で用いられたＧ３ＰＤＨ特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１５］
実施例３で用いられたアグリカン特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１６］
実施例３で用いられたアグリカン特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１７］
実施例３で用いられたII型コラーゲン特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１８］
実施例３で用いられたII型コラーゲン特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１９］
実施例３で用いられたＸ型コラーゲン特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２０］
実施例３で用いられたＸ型コラーゲン特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２１］
実施例３で用いられたマウスＭＬＰ特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２２］
実施例３で用いられたマウスＭＬＰ特異的オリゴＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２３］
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するヒトＭＬＰをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２４］
ヒトＭＬＰのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２５］
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を有するマウスＭＬＰをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：２６］
マウスＭＬＰのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２７］
実施例４および実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：２８］
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：２９］
実施例１で得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
［配列番号：３０］
実施例２で得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
［配列番号：３１]
実施例６で用いられた合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：３２］
実施例６でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：３３］
実施例６でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：３４］
実施例６でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：３５］
実施例６でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：３６］
実施例６でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：３７］
実施例６でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：３８］
実施例６でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：３９］
実施例９で得られたＤＮＡにコードされるラットＭＬＰ前駆体の部分アミノ酸配列を示す。
［配列番号：４０］
実施例９で得られたラットＭＬＰ前駆体の一部をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：４１］
実施例９で得られたラットＭＬＰ前駆体の一部をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：４２］
実施例９でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：４３］
実施例９でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：４４］
実施例９でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：４５］
実施例９でPCRプライマーとして用いられたオリゴDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：４６］
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を有するラットＭＬＰ前駆体をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：４７］
ラットＭＬＰ前駆体のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４８］
配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を有するラットＭＬＰをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：４９］
ラットＭＬＰのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：５０］
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を有するラットＭＬＰ前駆体に含まれるシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
【００８１】
後述の実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）XL10-Gold／pDRL128vHは、平成１１年６月１１日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７５０として、平成１１年６月２５日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６２９２として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）XL10-Gold／pDRL128vMは、平成１１年６月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７４７として、平成１１年６月２５日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ  １６２９３として寄託されている。
寄託されている。
後述の実施例９で得られた形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）XL10-Gold/pDRL128vRは、平成１２年５月１９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１６７として、平成１２年５月２６日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６４３９として寄託されている。
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【００８２】
実施例1  ヒトMLP 前駆体タンパク質をコードする cDNA のクローニング
ヒト胎児脳由来 poly(A)+ RNA を用いて以下の要領で 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA End)、 3' RACE を行うことによりヒトMLP 前駆体タンパク質をコードする cDNA のクローニングを行った。ヒト胎児脳由来 poly(A)+ RNA ( Clontech 社 ) 1 μgより、制限酵素部位に続く poly(T) を持つ anchored primerと Super script II MMLV 逆転写酵素 ( Gibco  BRL 社 )を用いて1st. strand  cDNA を合成後、RNA ligase ( 宝酒造 ) を用いて該1st. strand cDNA の3'末端にanchored primerを付加した。次に、配列番号：1で表されるオリゴDNAをアンチセンス鎖プライマーとして5' RACE を、同じく配列番号：2で表されるオリゴDNAをセンス鎖プライマーとして3' RACE を行い、それぞれ各プライマーを起点とする 5'上流側の配列、3' 下流側の配列を得た。ここで得られた各２本鎖DNAの塩基配列を決定したところ、オーバーラップする共通配列が存在していたことから、両配列は同一遺伝子に由来することが判った。そこで、この5' RACE、3' RACEで得られた各cDNA 断片をこの共通配列部分で接合し、最終的にpoly(A)+ 鎖を含む配列番号：29で表される全長 923塩基対（bp）のcDNA 断片を得た。このcDNA 断片には配列番号：5で表される 18 アミノ酸残基の典型的なシグナル配列を含む、 配列番号：6で表される128 個のアミノ酸からなる新規なヒトMLP 前駆体タンパク質がコ−ドされていた。このヒトMLP 前駆体タンパク質はヒトMIA前駆体タンパク質と相同性が最も高く、4 カ所存在するシステイン残基の位置が一致していた（図１）が、その両者間の相同性はアミノ酸レベルで 23.4%にすぎなかった。
本実施例で得られたヒトＭＬＰ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドpDRL128vHを大腸菌(Escherichia coli) XL10-Goldに導入して、形質転換体：大腸菌(Escherichia coli) XL10-Gold／pD RL128vHを得た。
【００８３】
実施例２  マウスMLP前駆体タンパク質をコードするcDNAのクローニング
マウスMLP 前駆体タンパク質をコードする cDNA のクローニングは、マウス17.5 日胎児由来 poly(A)+ RNA を用いて、ヒトMLP 前駆体タンパク質をコードする cDNA のクローニングの場合と同様にして 5' RACE ( Rapid Amplification of cDNA End )、 3' RACE を行うことにより行った。マウス17.5 日胎児からグアニジンチオシアネ−ト法によって total RNA を分画後、この total RNA をオリゴ (dT) スパンカラム (ファルマシア ) にかけて poly(A)+ RNA を調製した。この マウス17.5 日胎児由来 poly(A)+ RNA 1 μgより、制限酵素部位に続く poly(T) を持つ anchored primerとSuperscript II MMLV 逆転写酵素 ( Gibco BRL社 )を用いて 1st. strand cDNA を合成後、RNA ligase ( 宝酒造 ) を用いて合成した 1st. strand cDNA の 3' 末端にanchored primer を付加した。5' RACE、3' RACE に用いたプライマーの配列は、実施例１で得られたヒト MLP 前駆体タンパク質をコードするcDNAの塩基配列をクエリー（query） にして public EST (Expressed Sequence Tag)データベースから見いだした、マウス MLP 前駆体タンパク質をコードするcDNAの 3'側の領域を含むと考えられる唯一のESTであるAA222797 の配列を基に作製した。配列番号：7で表されるオリゴDNAをアンチセンス鎖プライマーとして5' RACE を、配列番号：8で表されるオリゴDNAをセンス鎖プライマーとして3' RACE を行い、それぞれ各プライマーを起点とする 5'上流側の配列、3'下流側の配列を得た。ここで得られた各２本鎖DNAの塩基配列を決定したところ、オーバーラップする共通配列が存在していたことから、両配列は同一遺伝子に由来することが判った。そこで、この5'RACE、3' RACEで得られた各cDNA 断片をこの共通配列部分で接合し、最終的にpoly(A)+ 鎖を含む全長947 bpの cDNA 断片を得た（配列番号：30）。 この cDNA 断片にはヒト MLP 前駆体タンパク質と同様に、配列番号：11で示される 18 アミノ酸残基の典型的なシグナル配列を含む、配列番号：12で表される128個のアミノ酸からなる新規マウスMLP 前駆体タンパク質がコ−ドされていた。このマウスMLP 前駆体タンパク質は、ヒトおよびマウスのMIA前駆体タンパク質、またヒト MLP前駆体タンパク質で4 カ所存在するシステイン残基の位置がすべて一致していた（図１）。また、マウスMLP 前駆体タンパク質とヒトMLP 前駆体タンパク質とのアミノ酸レベルでの相同性は84.3% に達したが、マウスMIA前駆体タンパク質とマウスMLP前駆体タンパク質との相同性は 22.6% にとどまった。
本実施例で得られたマウスＭＬＰ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドpDRL128vMを大腸菌(Escherichia coli)XL10-Goldに導入して、形質転換体：大腸菌(Escherichia coli) XL10-Gold／pDRL128vMを得た。
【００８４】
実施例３  in vitro軟骨分化モデルにおけるMLPの発現
マウス胚性腫瘍由来細胞株ATDC5は、前駆軟骨細胞の性質を極めてよく保持し、またインスリン存在下の培養で高率に軟骨分化が誘導され、その後骨形成においてみられる軟骨分化の全ての段階をシミュレーションすることができることから、in vitro軟骨分化モデルとして用いられている。(Cell Diff. Dev., 30:109-116, 1990, J. Cell Biol., 133:457-468, 1996, J. Bone Min. Res., 1 0:S234, 1995)。そこで、以下の要領でRT-PCR法を行うことで各分化段階での各種遺伝子の発現変化を調べた。まず、分化モデル培養系の各ステージのATDC5細胞から、同細胞をフェノールとチオシアン酸グアニジンを含む均一な液体ISOGEN（ニッポンジーン）に溶解し、クロロホルムを加えて遠心分離することによりRNAを含む水相画分を採取し、さらにイソプロパノールを加えて攪拌後再び遠心し沈殿させることにより精製total RNAを取得した。次にTAKARA RNA PCR Kit (AMV)Ver.2.1（宝酒造）中のAMV Reverse Transcriptase XLとRandom９mersを用いて各被検total RNAを逆転写してcDNAを得、次にそれらを鋳型DNAとして用い、またハウスキーピング遺伝子としてG3PDH（グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素）特異的オリゴDNA（配列番号：13，配列番号：14）、或いは軟骨分化マーカー遺伝子特異的オリゴDNA（アグリカン（配列番号：15，配列番号：16）、II型コラーゲン（配列番号：17，配列番号：18）、 X型コラーゲン（配列番号：19，配列番号：20））をプライマーDNAとして用い、TaKaRa Ex  TaqTM（宝酒造）の反応系でPCR反応を行った。得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、その生成量を比較した。その結果、各遺伝子についてそれぞれ軟骨細胞の分化段階に対応した表１のような発現パターンを検出することができた。そこで同cDNAサンプル群に対してマウスＭＬＰ前駆体タンパク質をコードするcDNAに特異的なオリゴDNA（配列番号：21、配列番号：22）をプライマーDNAとして用いて、それ以外は全く同一反応条件でRT-PCRを行ったところ、ステージ２からステージ４にかけてマウスＭＬＰ前駆体mRNA量の顕著な亢進が認められた。このことからＭＬＰ前駆体の遺伝子は軟骨分化の初期段階に発現が増加する遺伝子であることがわかった。
【表１】
0004579378.tif 000005
（表中の＋の数は、各分化ステージでの各々の遺伝子の発現量の差異を表し、その数が多いほど発現量が多いことを示す。）
【００８５】
実施例４  COS7細胞におけるマウスMLP-FLAG融合タンパク質の発現とその検出
ＭＬＰが分泌タンパク質であることを確かめるため、マウスMLPについて、以下の要領でCOS7細胞におけるマウスMLP-FLAG融合タンパク質の発現とその検出を行った。まず実施例２で得たマウスＭＬＰ前駆体ポリペプチドをコードするcDNAの塩基配列 に基づき、２種のプライマーDNAを化学合成した。一つは 5'-CGAATTCCCACCATGGCAAGGATATTGATTCTTTTGCTTG-3'（配列番号：27 ）であり、これは制限酵素EcoRI認識部位を含むアンカー配列を5'末端側に持つ +1〜+28（翻訳開始部位を +1 とする）までのセンス配列を含むオリゴDNAである。もう一つは 5'-GTACAGTCGACTTCACAGAAGAAGTCAATATCCGTGGTTG-3'（配列番号：28）であり、これは制限酵素SalI認識部位を含むアンカー配列の3'側に+355〜+378 までのアンチセンス配列がつながった配列を有するオリゴDNAである。実施例２で得たプラスミドpDRL128vMを鋳型としてこれら２種のプライマーDNAおよびTaKaRa LA TaqTM（宝酒造）を用い、サーマルサイクラーGeneAmpTM PCR system 9700（パーキンエルマー社）にて、最初 98℃で 30秒間置いた後、98℃で 10 秒、55℃で 20秒、72℃で 2分を 1反応サイクルとして 25 サイクル増幅反応を繰返し、最後に 72℃で5分間伸長反応を行った。得られたDNA断片を精製後、制限酵素EcoRIとSalIで末端消化の後再精製し、動物細胞用発現ベクターpCAN618FLAGのEcoRI、SalI部位へ挿入、連結した。pCAN618FLAGは、プラスミドベクターpCAN618に由来し、選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子を持つと共に、目的タンパク質をコードするDNA断片をそのクローニング部位であるEcoRI 、SalI部位に挿入することでサイトメガロウイルスの極初期遺伝子エンハンサーとその下流のβ−アクチンプロモーター制御下で該タンパク質を発現させることができるのみならず、SalI部位直後に存在する8アミノ酸のFLAGエピトープ配列(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)をコードする塩基配列と終止コドンに読み取り枠を合わせることで該目的タンパク質をFLAG融合タンパク質として発現させることも可能である。上述のPCRクローニングDNA断片のpCAN618FLAGへの挿入もマウスＭＬＰ前駆体全長とFLAGエピトープの融合タンパク質（間にValを１残基挿む）を発現する目的で行い、その結果、発現ベクタープラスミドpMMLP-Fを得た。
次にCOS7 細胞 1.2×105 細胞を 6 穴プレートを用いて、10%牛胎児血清（ FBS ）を含むダルベッコ変法最小培地（ DMEM ）で 24 時間培養し、この細胞に上記の発現プラスミドpMMLP-F（１ウェルあたり0.4 μg） をリポフェクトアミン（ Gibco BRL ）を用いて導入した。導入 24時間後上記の新しい培地に交換し、さらに 5  時間後に FBS 不含有 Opti-MEM（ Gibco BRL ）に換えて36 時間培養後、その培養上清と細胞抽出液を得た。細胞抽出液は細胞を生理食塩を含むリン酸緩衝液（ PBS ）で 2 回洗浄後、トリスSDSサンプル緩衝液で溶解抽出し、一方、培養上清は限外濾過（分子量 3000 カット）で適宜濃縮後、等容のトリスSDSサンプル緩衝液と混合した。これらのサンプルを熱処理後 15%-25% SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、さらにそのゲルからPVDF 膜上（ Amersham pharmacia biotech社 ）に転写した。次に該PVDF 膜をブロックエース（雪印乳業）で 1 時間ブロッキングし、0.05% Tween 20 を含む PBS（ PBS-T ）中で抗 FLAGモノクローナル抗体（ 10μg／ml；Kodak社）と 2 時間反応させた。PBS-T で 3 回洗浄後、PBS-T 中で、西洋ワサビ過酸化酵素標識抗マウス IgGヤギ抗体（ Amersham pharmacia biotech社；5000 倍希釈）と 1 時間反応した。PBS-T で 5 回洗浄後、ECLplus 発色キット（ Amersham pharmacia biotech社 ）および ECL film （ Amersham pharmacia biotech社）を用いて化学発光を検出した。その結果、細胞抽出液と共に培養上清中にも約１４kDaの遺伝子産物が検出されたことから、COS7細胞においてマウスMLP-FLAG融合タンパク質が発現し、分泌されていることが明らかとなった。
そこで、次に該マウスMLP-FLAG融合タンパク質の N末端アミノ酸配列の決定を行った。まず、上述の方法に準じて発現させたマウスMLP- FLAGを含むCOS7細胞培養上清から、Anti-FLAGTM M2-Agarose Affinity Gel (Sigma社)を用いたアフィニティクロマトグラフィーで酸性溶出画分（Glycine-HClバッファー (pH3.5)で溶出） を取得した。該画分を濃縮した後、本実施例既述同様のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてCBB 染色を行ったところ、目的タンパク質であるマウスMLP-FLAGに相当する単一のバンドのみが観察された。そこで同画分の濃縮試料を同様に電気泳動し、そのゲルから該タンパク質をPVDF膜上に転写した後、パルスリキッドアミノ酸シーケンサー Procise CLC491 (ＰＥバイオシステムズ社製)にかけ、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、N 末端から順に 1.ヒスチジン、2. グリシン、3.バリン、4. フェニルアラニンの各アミノ酸残基が検出され、配列番号：２６で表されるマウスMLPのN末端配列に一致した。以上の結果から、マウスMLP-FLAGタンパク質はマウスMLP-FLAG前駆体タンパク質のN末端の１８アミノ酸残基のシグナル配列が切断され、１９残基目のヒスチジン残基から始まるマウスMLP-FLAG成熟タンパク質としてCOS7細胞より培地中に分泌されることがわかった。
【００８６】
実施例５ マウスMLP−FLAG融合タンパク質発現CHO−K1細胞株の樹立
以下の要領でマウスMLP−FLAG融合タンパク質発現CHO−K1細胞株を樹立した。
CHO−K1細胞3.3ｘ104細胞を、10cm径プラスチックシャーレ上、10%牛胎児血清（FBS）を含むF−12培地（Gibco BRL社）で24時間培養し、これらの細胞に、実施例４で得られた発現プラスミドpMMLP−F（1シャーレあたり1.5μg）をリン酸カルシウム法（ CellPhect Transfection Kit （Amersham Pharmacia Biotech社））を用いて導入した。導入12時間後、細胞をFBSを含まないF−12培地で2回洗浄後、15%グリセロールを含む等張HEPES溶液( pH 7.5) 3mlを用いて3分間グリセロールショックを与えた。 その後再びFBSを含まないF−12培地で2回洗浄し、FBSを含むF−12培地でさらに12時間培養後に500mg / L Geneticin(Gibco BRL社) と10% FBSを含むF−12選択培地（以下、選択培地）に交換した。10日後、シャーレ中で形成されたGeneticin耐性のコロニーをそれぞれ24穴プレートに移し、選択培地で3日間培養した。次に選択培地中で増殖した細胞を6穴プレートに移し、さらに選択培地で4日間培養した後、0.02% CHAPS、0.1mM p−ABSF（和光純薬工業（株））を含むOpti−MEM( Gibco BRL社 )培地1mlに交換し、さらに48時間培養後、その培養上清を回収した。得られた培養上清は、Centricon YM -3限外濾過膜（Amicon社）を用いて濃縮後、等容のトリスSDSサンプル緩衝液と混合した。このサンプルを９５℃、５分間熱処理をおこなった後、18％ SDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、さらにそのゲルから泳動タンパク質をナイロン膜上に転写した。次に該ナイロン膜をブロックエース（雪印乳業（株））で1時間ブロッキングし、0.05% Tween20を含むPBS（PBS−T）中で抗FLAG抗体（ 1 / 2000希釈、SIGMA ）と1時間反応させた。PBS−Tで5回洗浄後、PBS−T中でHRP標識抗マウスIgGヒツジ抗体（ 1 / 2000希釈、Amersham Pharmacia Biotech社）と1時間反応した。 PBS−Tで5回洗浄後、ECL発色キット（Amersham Pharmacia Biotech社）および、Hyperfilm ECL（ Amersham Pharmacia Biotech社 ）を用いて化学発光を検出した。その結果、CHO−K1/mMLP.FLAG#2-1株由来の細胞培養上清中におよそ16kDaの目的遺伝子産物が最も多く検出されたことから、該細胞株をマウスMLP−FLAG融合タンパク質発現CHO−K1細胞株として選択した。
【００８７】
実施例６ MLP抗血清の作製と該抗血清を用いた組換えMLP蛋白質の検出
抗MLP抗血清は以下の要領で作製した。まず、マウスMLP前駆体蛋白質の105残基目のバリンから124残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列に対応するペプチド鎖のC末端にさらにシステイン１個が付加された配列番号：３１で表される合成ペプチド（Val-Lys-Glu-Gln-Arg-Val-Tyr-Gln-Glu-Ala-Thr-Lys-Glu-Ile-Pro-Thr-Thr-Asp-Ile-Asp-Cys）を公知の方法により化学合成した。このペプチドにキャリアとしてKLH (keyhole limpet hemocyanin)を結合したものを抗原とし、ウサギ(SPF Japanese White Rabbit)に免疫した。計７回の免疫を行った後、全採血を行い、公知の方法により血清画分を取得し、保存剤としてアジ化ナトリウム（最終濃度0.1%）を添加後、該標品を抗MLP抗血清とした。
次に該抗血清の各種組換えタンパク質に対する反応性をウエスタンブロット解析によって調べた。まず、実施例４に記載したマウスMLP-FLAG融合タンパク質に加え、マウスMLPタンパク質（FLAGタグなし） 、ヒトMLP-FLAG融合タンパク質、ヒトMLPタンパク質（FLAGタグなし）、マウスMIA-FLAG融合タンパク質、マウスMIAタンパク質（FLAGタグなし）の各発現ベクタープラスミドを構築した。構築は実施例４同様、pCAN618FLAGのクローニング部位であるEcoRI 、SalI部位に予めPCRクローニングした目的DNA断片を挿入することで行った。各PCR反応に用いたプライマーDNAセットの各塩基配列は、マウスMLPタンパク質（FLAGタグなし）については配列番号：２７と配列番号：３２、ヒトMLP-FLAG融合タンパク質については配列番号：３３と配列番号：３４、ヒトMLPタンパク質（FLAGタグなし）については配列番号：３３と配列番号：３５、マウスMIA-FLAG融合タンパク質については配列番号：３６と配列番号：３７、マウスMIAタンパク質（FLAGタグなし）については配列番号：３６と配列番号：３８で表わされる塩基配列である。また鋳型DNAとしては、マウスMLPタンパク質（FLAGタグなし） は実施例4と同様にpDRL128vMを、ヒトMLP-FLAG融合タンパク質とヒトMLPタンパク質（FLAGタグなし）は実施例1で得られたpDRL128vHを、またマウスMIA-FLAG融合タンパク質とマウスMIAタンパク質（FLAGタグなし）はマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６より調製したcDNAを用いた。このようにして得られた各発現ベクタープラスミドのCOS-7細胞への導入、また取得された各培養上清についての抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット解析は実施例４の方法に準拠して行った。また、抗MLP抗血清を用いたウエスタンブロット解析は、１次抗体として該抗血清（1000倍希釈）を、２次抗体として西洋ワサビ過酸化酵素標識抗ウサギ IgG抗体（Amersham pharmacia biotech社；5000 倍希釈）を用いる以外は抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット解析時の方法に準拠して行った。
図２に抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット解析、図３に抗MLP抗血清を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。抗MLP抗血清は、抗原ペプチドの由来タンパク質であるマウスMLPとともにヒトMLPに対しても交差性を示し、その反応性はほとんど変わらなかった。また、マウスMLP-FLAG融合タンパク質、ヒトMLP-FLAG融合タンパク質も該抗血清に反応したことから、FLAGタグの存在にも影響されなかった。一方、マウスMIA-FLAG融合タンパク質とマウスMIAタンパク質（FLAGタグなし）については全くシグナルが検出されなかったことから、該抗血清がMLP分子種に特異的であることが判った。
さらに、該抗血清を用いて実施例５で取得されたマウスMLP-FLAG発現CHO細胞株に対し公知の方法に準じて免疫染色を行った結果を図４に示す。免疫前ウサギ血清を用いた対照実験では各細胞は染色されていないが、該抗血清使用時にはすべての細胞が染色されたことから、該抗血清は未変性のMLPタンパク質とも反応することが明らかとなった。
【００８８】
実施例７ 軟骨組織中でのMLPタンパク質の発現
実施例６で得られた抗MLP抗血清を用いて軟骨組織中でのMLPタンパク質の検出を試みた。被検試料としては、マウス(BALB/c)大腿骨骨頭軟骨を液体窒素で凍結破砕し、TRIS SDS βME SAMPLE BUFFER（第一化学薬品）で抽出後、遠心して残査を除去したものを用いた。1レーンあたりマウス1匹分由来相当量の試料をSDS-PAGE(15-25%)で電気泳動の後、実施例６と同様の方法で抗MLP抗血清によるウエスタンブロット解析を行った。その結果、マウスMLP組換えタンパク質とほぼ同じ泳動位置にシグナルが検出されたことから、 MLPタンパク質が該軟骨組織中で発現していることが明らかとなった。
また、軟骨組織以外の各種ヒト組織でのヒトMLP mRNAの発現を調べるために、実施例１で得られたヒトMLP前駆体タンパク質をコードするDNA断片と［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Amersham pharmacia biotech社：6000 Ci/mmol）を用いて、Multiprime DNA labelling system (Amersham pharmacia biotech社：RPN. 1601Y) の方法でプローブを作製し、該プローブ（比活性1.3×1010 cpm/μg）を用いて、Human MTETM Array（CLONTECH社：＃7775-1）に対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズの条件は該アレイ膜添付のマニュアルに従い、最終的な洗浄は0.1×SSC、0.1％ SDS 55℃で行い、検出はＢＡＳ−２０００（フジフィルム）を用いて行った。その結果、該アレイ上でシグナルが得られたのは、コントロールのヒト染色体DNA (100ng、500ng)とともにわずかに黒質、胎児脳のスポットであったが、いずれのシグナルも検出限界付近であり、その発現量は転写段階で極めて低いと判断された。よって、MLPタンパク質は軟骨組織で特異的に発現していることが強く示唆された。
【００８９】
実施例８ in vitro軟骨分化モデルにおける各種遺伝子発現変動に対するMLP組換えタンパク質の添加効果
実施例３記載のATDC5細胞を用いたin vitro軟骨分化モデルにおいて、各種遺伝子発現変動に対するMLP組換えタンパク質の添加効果を調べた。 MLP組換えタンパク質は、実施例４と同様に、マウスMLP-FLAG融合タンパク質を発現させたCOS-7細胞培養上清より抗FLAG抗体によるアフィニティカラムクロマトグラフィーを公知の方法で行い、精製濃縮された標品を用いた。該タンパク質をモデル系設定初日よりATDC5細胞に2日おきに添加し、10日間培養後細胞を回収して、実施例3同様のRT-PCR法により各遺伝子発現を調べた。その結果、該タンパク質添加細胞群では、 アグリカン、II型コラーゲン、 X型コラーゲン等、分化に伴って発現量が増加する各マーカー遺伝子の発現抑制が認められた。一方、軟骨への分化に抑制的に働いているPTH/PTHr受容体発現にはその変動に有意な影響は見られなかった。このことから、MLPタンパク質はATDC5を用いた本モデル系において軟骨分化に抑制的に作用することが判った。
【００９０】
実施例９ ラットMLP前駆体タンパク質（rMLP）をコードする遺伝子の解析
まず、rMLPの一部をコードするDNA断片を以下のようなPCR法により取得した。
すなわち、配列番号：２１で示されるオリゴDNAをセンス鎖プライマーとして、配列番号：２２で示されるオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマーとして各々4 pmol含み、さらに10 x AdvantageTM 2 PCR Buffer （クロンテック社）2μｌ、50 x dNTP mix（クロンテック社）0.4 μl、50 x Advantage 2 Polymerase Mix（クロンテック社）0.4μｌ、鋳型DNAとしてSD(IGS)ラット下垂体由来のcDNA溶液 ２μｌを含む混合液20μｌを調製し、サーマルサイクラー（GeneAmpTM PCR system model 9700（パーキンエルマー社））を用いて９５℃、1分、続いて９５℃、１０秒→ ５４℃、１０秒→７２℃、１分を３５サイクル繰り返し、さらに７２℃、３分で伸長反応させるプログラムでＰＣＲ反応を行った。反応終了液を２．０％アガロースゲルを用いて電気泳動後、そのゲルをSYBRTM Green I nucleic acid gel stain（モレキュラープローブ社）で染色したところ、分子量マーカー換算で300bp付近の位置にPCR反応で増幅されたDNAに対応するバンドを確認した。キアクィックゲルエキストラクションキット（キアゲン社）を用いて該ＤＮＡ断片を回収し、塩基配列を決定する為にpCRTM2.1-Topo（インビトロジェン社）を用いてＴＡクローニングし、該プラスミドを大腸菌（Escherichia coli）Epicurian Coli XL10-GoldTM株（ストラタジーン社）のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有LB寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中から、外来ＤＮＡ断片が挿入されていたプラスミドを保持していたクローンを選択し、同クローンから該プラスミドＤＮＡ、pDRL128vRを調製した。 挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するため、 pDRL128vRを鋳型ＤＮＡ、市販プライマーＤＮＡ（Bca BEST Primer RV-P（宝酒造(株））をシーケンスプライマーとし、ABI PRISMTM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（ パーキンエルマー社 ）を用いたシーケンス反応を添付資料の条件にしたがって、サーマルサイクラー（GeneAmpTM ＰＣＲ system model 9700（パーキンエルマー社））で行った後、該反応試料をＤＮＡシーケンサーABI PRISMTM 377（パーキンエルマー社）で分析した。
その結果、 pDRL128vRには、配列番号：３９で示される87個のアミノ酸からなる新規ラットMLP前駆体タンパク質の一部をコードする配列番号：４０で示される261塩基対のDNA断片を含む、配列番号：４１で示される307塩基対のＤＮＡ断片が含まれていた。
次に、該タンパク質をコードする遺伝子について、上記塩基配列よりさらに5’上流側及び3’下流側の構造を調べるために、genome walkingを行った。被検材料としてRat GenomeWalkerTM Kit（クロンテック社）を用い、方法はＰＣＲ反応用の酵素としてTaKaRa Ex TaqTM（宝酒造）を用いた点を除いては同キットの添付資料に従った。まず、 gene specific  primerとして、配列番号：４０で示される塩基配列の一部にあたる２種のオリゴDNA （rMLPGW F1(配列番号：４２)、 rMLPGWF2(配列番号：４３))と該配列の一部に相補的な配列の２種のオリゴDNA （rMLPGWR1(配列番号：４４)、 rMLPGWR2(配列番号：４５))をそれぞれ化学合成した。これらは、3’下流側DNA取得の為の1st PCR反応ではrMLPGWF1、続くnested PCR反応ではrMLPGWF2を用い、また5’上流側DNA取得の為の1st PCR反応ではrMLPGWR1、続くnested PCR反応ではrMLPGWR2を用いた。これらの反応によって得られた各増幅DNA断片について、上記プライマー配列部位を起点としてヒト及びマウスMLP 前駆体タンパク質をコードするcDNAの塩基配列との相同性を比較しながら各々の塩基配列を解析した。その結果、判明したゲノムの一次構造から、ラットMLP前駆体タンパク質は、配列番号：４６で示される384塩基のDNAでコードされる配列番号：４７で示される128個のアミノ酸残基からなるタンパク質であることが明らかとなった。ラットMLP 前駆体タンパク質とヒトMLP前駆体タンパク質及びマウスMLP前駆体タンパク質とのアミノ酸レベルでの相同性は それぞれ84.3%、96.0% に達したが、ラットMIA前駆体タンパク質とラットMLP前駆体タンパク質との相同性は26.5% にとどまった。ラットMLPは、配列番号４８：で示される330塩基のDNAでコードされる配列番号：４９で示される110個のアミノ酸残基からなるタンパク質であり、ラットMLP前駆体タンパク質から配列番号：５０で表される、マウスMLPと同様１８アミノ酸残基からなるシグナルペプチドがプロセスされて生成されるものと考えられる。
本実施例で得られたラットMLP前駆体タンパク質の一部をコードするDN Aを保持するプラスミドpDRL128vRを大腸菌（Escherichia coli）XL10-Goldに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）XL10-Gold / pDRL128vRを得た。
【００９１】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡは、例えば、骨・関節疾患、病的血管新生の診断、治療、予防などに使用することができる。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進もしくは阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの検出、定量、中和等に使用することができる。
さらに本発明のプロモーターを使用することにより、タンパク質（任意の有用遺伝子産物等）を非ヒト温血動物の軟骨で優位に（好ましくは特異的に）しかも大量に発現させることが可能になるので、遺伝子治療の分野に貢献することができる。
【００９２】
【配列表】
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【００９３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＭＬＰ前駆体（hMLP）、マウスＭＬＰ前駆体（mMLP）、ヒトＭＩＡ前駆体（hMIA）、マウスＭＩＡ前駆体（mMIA）、ラットＭＩＡ前駆体（rMIA）およびウシＭＩＡ前駆体（bMIA）のアミノ酸配列を示す。
【図２】実施例６で行われたウエスタンブロット解析の結果を示す。一次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体を用いた。
図中、レーン１はマウスＭＬＰ（ＦＬＡＧタグなし）、レーン２はマウスＭＬＰ−ＦＬＡＧ、レーン３はマウスＭＩＡ（ＦＬＡＧタグなし）、レーン４はマウスＭＩＡ−ＦＬＡＧ、レーン５はヒトＭＬＰ（ＦＬＡＧタグなし）、レーン６はマウスＭＬＰ−ＦＬＡＧをそれぞれ導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清を電気泳動したレーンを示す。
【図３】実施例６で行われたウエスタンブロット解析の結果を示す。一次抗体として抗ＭＬＰ抗血清を用いた。
図中、レーン１はマウスＭＬＰ（ＦＬＡＧタグなし）、レーン２はマウスＭＬＰ−ＦＬＡＧ、レーン３はマウスＭＩＡ（ＦＬＡＧタグなし）、レーン４はマウスＭＩＡ−ＦＬＡＧ、レーン５はヒトＭＬＰ（ＦＬＡＧタグなし）、レーン６はマウスＭＬＰ−ＦＬＡＧをそれぞれ導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清を電気泳動したレーンを示す。
【図４】実施例６で行われた免疫染色の結果を示す。左のパネルは免疫前ウサギ血清を用いた対照実験の結果を示し、右のパネルは抗ＭＬＰ抗血清を用いた実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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