(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルに対して２次元核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーを実行する方法であって、
ＮＭＲ活性の原子核が過偏極を受け、サンプルが液体状態へ変換されるＤＮＰを用いて、ハミルトニアン（Ｈ  ＝  ＨS＋ＨIS＋ＨI）に基づいた第１の核スピン種（Ｉ）及び第２の核スピン種（Ｓ）を含むサンプルを過偏極する工程と、
ＲＦパルスのシーケンスを使用して前記サンプルに対して２次元ＮＭＲスペクトロスコピーを実行して少なくとも２つのＮＭＲスペクトルを生成する工程であって、該パルスシーケンスは同じ原子核に対するか異なる原子核に対するかのいずれかとした少なくとも２つのＲＦパルスを含み、かつ、シングルスキャン・パルスシーケンスを使用し、ｔS−ｔIS面内の軌道を使用し、２時空間の正方形部分内に観測点からなる正方配列を生成する、前記少なくとも２つのＮＭＲスペクトルを生成する工程と、
前記サンプルの特性決定を得るために前記少なくとも２つのＮＭＲスペクトルを解析する工程と、
を含み、
該パルスシーケンスは、２次元エボリューション時空（ｔS，ｔIS）の軌道となるＩ及びＩＳのＲＦパルスを含んでいると共に、該パルスシーケンスは、
Ｓに対する９０°パルスで点（０，０）から開始し、点（Ｎ，Ｎ）までＮ＋１個の点（ｉ，ｉ）を観測する工程（３００）と、
（Ｎ，−Ｎ）に至るまでパルスＩ（すなわち、Ｉに対する１８０°）を実行する工程（３０５）と、
（Ｎ＋１，−Ｎ＋１）に至るまで１時間単位だけ待機する工程（３１０）と、
（−Ｎ−１，−Ｎ＋１）に至るまでパルスＩＳ（ＩとＳの両者に対する１８０°パルス）を実行する工程（３１５）と、
（Ｎ−２，Ｎ）までの点を観測する工程（３２０）と、
（Ｎ−２，Ｎ）までパルスＩを実行する工程（３２５）と、
（Ｎ＋１，−Ｎ＋３）までの点を観測する工程（３３０）と、
を含んでいる、ＮＭＲスペクトロスコピー法。
【請求項２】
サンプルに対して２次元核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーを実行する方法であって、
ＮＭＲ活性の原子核が過偏極を受け、サンプルが液体状態へ変換されるＤＮＰを用いて、ハミルトニアン（Ｈ  ＝  ＨS＋ＨIS＋ＨI）に基づいた第１の核スピン種（Ｉ）及び第２の核スピン種（Ｓ）を含むサンプルを過偏極する工程と、
ＲＦパルスのシーケンスを使用して前記サンプルに対して２次元ＮＭＲスペクトロスコピーを実行して少なくとも２つのＮＭＲスペクトルを生成する工程であって、該パルスシーケンスは同じ原子核に対するか異なる原子核に対するかのいずれかとした少なくとも２つのＲＦパルスを含み、かつ、シングルスキャン・パルスシーケンスを使用し、ｔS−ｔIS面内の軌道を使用し、２時空間の正方形部分内に観測点からなる正方配列を生成する、前記少なくとも２つのＮＭＲスペクトルを生成する工程と、
前記サンプルの特性決定を得るために前記少なくとも２つのＮＭＲスペクトルを解析する工程と、
を含み、
該パルスシーケンスは、２次元エボリューション時空（ｔS，ｔIS）の軌道となるＩ及びＩＳのＲＦパルスを含んでいると共に、該パルスシーケンスは、
Ｓに対する９０°パルスで点（０，０）から開始し、点（Ｎ，Ｎ）までＮ＋１個の点（ｉ，ｉ）を観測する工程（３００ｂ）と、
（Ｎ，−Ｎ）に至るまでパルスＩ（すなわち、Ｉに対する１８０°）を実行する工程（３０５ｂ）と、
（Ｎ＋１，−Ｎ＋１）に至るまで１時間単位だけ待機する工程（３１０ｂ）と、
（−Ｎ−１，−Ｎ＋１）に至るまでパルスＩＳ（ＩとＳの両者に対する１８０°パルス）を実行する工程（３１５ｂ）と、
（Ｎ−２，Ｎ）までの点を観測する工程（３２０ｂ）と、
両時間符号を反転させると共に（−Ｎ＋２，−Ｎ）に至るまでパルスＳを実行する工程（３４０ｂ）と、
（Ｎ，Ｎ−２）までの点を観測する工程（３４５ｂ）と、
（Ｎ，−Ｎ＋２）までパルスＩを実行する工程（３５０ｂ）と、
（Ｎ＋１，−Ｎ＋３）までの点を観測する工程（３５５ｂ）と、
を含んでいる、ＮＭＲスペクトロスコピー法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーに関する方法及び構成、具体的にはＮＭＲ信号の強度を強化するために過偏極を受けたサンプル向けに適応させたＮＭＲスペクトロスコピーを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、過去数１０年にわたって利用及び開発が劇的に増大した解析技法である。この利用は、構造生物学、薬剤学、代謝研究、固体化学（ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、凝縮体物理学、レオロジー及び医学的用途など多様な分野に及んでいる。最後のケースでは、ＮＭＲは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）と呼ばれる非侵襲性撮像法として使用されることが多い。ＮＭＲ解析法には、その有用性を高めるためや新規の領域を探求するために高度な数学的及び物理学的方法（例えば、フーリエ変換（ＦＴ）や多次元解析）が組み込まれている。
【０００３】
ＮＭＲやＭＲＩの基本である共鳴現象を生じさせるためには、非ゼロ核スピンを有する同位体を存在させる必要がある。これのことを、本明細書ではＮＭＲ活性原子核（ＮＭＲ  ａｃｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉ）と呼ぶことにする。ＮＭＲはあまり高感度な技法ではないため、特に撮像目的やより高度なＮＭＲ解析（例えば、２次元（２Ｄ）ＮＭＲ）に関しては、比較的高い濃度及び／または高い磁気回転比が必要であり、ＮＭＲ技法がかなり感度が低いという問題に主たる注目が注がれてきた。サンプルに対する過偏極の導入、あるいはＭＲＩの場合では過偏極式コントラスト強調剤の使用によって、かなりの改良が達成されている。本明細書において、過偏極（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）という用語は、ＮＭＲ解析で使用することを目的とした非ゼロスピン原子核に対して核スピン偏極が与えられていること、すなわち、基底状態と励起状態の間の占有数の差が平衡分布の場合と比べてより大きくなっていること、を意味している。
【０００４】
過偏極は当技術分野で周知の多くの方法によって達成することができる。特に興味深い方法では、電子スピンを介した動的核偏極（ｄｙｎａｍｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＤＮＰ）を利用している。こうした方法は例えば、本特許出願と同じ出願人によるＷＯ第９９／３５５０８号及びＷＯ第０１／９６８９５号に開示されている。ＤＮＰ方式は、オーバーハウザー効果（いわゆる、固体効果（ｓｏｌｉｄ  ｅｆｆｅｃｔ）及び熱混合効果（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｉｘｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ））を含んでいる。このオーバーハウザー効果は、電子−核間の相互作用が電子ラーモア周波数の逆数以下のタイムスケールに対して時間依存性（熱運動や緩和効果に由来する）をもつ場合、並びにその電子スピンが強力なマイクロ波照射によって飽和されている場合に生じる緩和駆動の過程である。電子−核間の交差緩和のために、格子とのエネルギーのやり取りが生じ、これが核偏極の増強につながる。この全体的な増強は、スカラー及びダイポールの電子−核間相互作用の相対強度、並びにマイクロ波電力に依存する。静的な系では、熱混合と固体の両方の効果が作用する。固体効果では、電子スピン系が、電子と核とのラーモア周波数の和または差に対応した周波数で照射を受ける。核ゼーマン・リザーバがこのエネルギー差を吸収または放出してそのスピン温度が修正を受けるため、核偏極が増強されることになる。この効率は、電子−核間のダイポール相互作用の非永年項による核状態の混合のために可能となる本来禁止の遷移に関する遷移確率に依存する。熱混合は、電子−電子間ダイポール・リザーバが核ゼーマン・リザーバとの熱的接触を確立した時点で生じる。このことは、特性電子共鳴線幅が概ね核のラーモア周波数にある場合に生じる。電子スピンのオフレゾナンス照射によって、電子スピン−スピン熱リザーバの冷却が生じると共に、この後者の電子−核間相互作用を介した核ゼーマン・エネルギー・リザーバとの熱的接触を通じて、核偏極が増強される。熱混合では、禁止遷移と許容遷移の両者が関係する可能性がある。
【０００５】
過偏極の方法（またＭＲＩの場合における、過偏極型コントラスト強調剤の利用）は、ＮＭＲ解析で記録される信号を劇的に増強することが分かっている。この方法は、解析で必要なサンプルの量を低減させ、またある種の用途では解析に要する計測時間を劇的に短縮させるために、非過偏極のサンプルでは可能でないような計測を実施する際に利用されている。
【０００６】
したがって、ＤＮＰやその他の方法を通じた過偏極によれば、ＮＭＲ用途の感度を向上させる一方法が提供される。しかし、過偏極は、サンプルの取り扱い方法、及びＮＭＲスペクトロスコピーの実施方法に対してある種の要件を課すことになる。
【０００７】
要件の１つは、その過偏極が極めて非平衡な熱力学状態を示すこと、すなわち過偏極されたサンプルが熱平衡状態にならないことに起因する。これによって、縦緩和時間Ｔ１のパラメータによって特徴付けされる縦緩和を介してスピン系の熱平衡へ向かう緩和が生ずることになる。これは一般に知られた問題であり、比較的長いＴ１を有するＮＭＲ活性原子核を選択し、緩和速度をさらに低下させるように（例えば、本発明と同じ出願人によるＷＯ第０１９６８９５号に教示されるようにして）計測値が取得されることがある。こうした周知の計測を実施する場合であっても、ＮＭＲ解析を過偏極の後に直ちに、すなわちできる限り速やかに実施することが最も重要である。これに対しては、参照によって本明細書に組み込んだ同じ出願人による出願ＷＯ第０２３７１３２号及びＷＯ第０２３６００５号によって対処されている。さらに、ＮＭＲ解析は、ＮＭＲ活性原子核の緩和時間Ｔ１の域内で実行できるようにするため比較的迅速でなければならない。このことは、ＮＭＲのより高度な利用法（例えば、２Ｄ  ＮＭＲや拡散研究）における問題の１つであり、周知の方法のＮＭＲスペクトロスコピーでは過偏極したサンプルを使用するには時間が長くかかり過ぎるのが典型的である。このことは、標準的な２Ｄ  ＮＭＲ研究は実行に数時間を要する可能性があるが、周囲温度における過偏極はこれよりかなり短い緩和時間を有するのが典型的であることで例証されよう。
【０００８】
最近では、例えば、Ｌ．Ｆｒｙｄｍａｎらによる「Ｔｈｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｃａｎ」（Ｐｒａｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，９９：１５８５８〜６２、Ｄｅｃ  １０，２００２）の記載など、比較的高速で高度なＮＭＲ方法が提唱されている。こうした方法は計測時間に関して大きな改善を示しているが、信号対雑音比が悪いという欠点を有する。
【０００９】
過偏極サンプルを使用する際の別の要件は、ＮＭＲスペクトロスコピーで使用されるのが典型的であるようなＲＦパルス自体が過偏極に影響を及ぼすことに起因する。周知の多くのシーケンスでは、過偏極サンプルに対して使用する場合に、過偏極によって得られる可能性のある信号強度の増大を利用できていない。
【００１０】
過偏極サンプルの利用に関連する要件は、以下のように要約することができる。
・縦緩和時間により与えられる時間制約によって、迅速なＮＭＲ解析が要求されること、並びに
・サンプルの過偏極により得られる情報の消失を回避するようにＮＭＲスペクトロスコピーを設計しなければならないこと。
【００１１】
従来技術の方法はいずれもこれらの要件を満足していない。
【特許文献１】ＷＯ第９９／３５５０８号
【特許文献２】ＷＯ第０１／９６８９５号
【特許文献３】ＷＯ第０２３７１３２号
【特許文献４】ＷＯ第０２３６００５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
目標とする課題は、過偏極されたサンプル（特に、ＤＮＰ法によって過偏極されたサンプル）によって得られる信号強度の増大を有効に活用するパルスシーケンスを使用したＮＭＲスペクトロスコピーの方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題は独立請求項に規定している方法によって解決される。さらに改良した方法は、従属請求項で言及した特徴を有する。
【００１４】
本発明に従って核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーを実行する方法は、ＮＭＲ活性の原子核が過偏極を受け取るようにＤＮＰを用いてサンプルを過偏極する工程と、ＲＦパルスのシーケンスを使用して該サンプルに対してＮＭＲスペクトロスコピーを実行する工程であって、該パルスシーケンスは同じ原子核に対するか異なる原子核に対するかのいずれかとした少なくとも２つのＲＦパルスを含み、かつ該パルスシーケンスは過偏極サンプル向けに適応させており、これにより少なくとも２つのＮＭＲスペクトルが生成可能となる実行工程と、該サンプルの特性決定を得るためまたはＮＭＲスペクトロスコピー工程で使用するための中間結果を得るためにＮＭＲスペクトルのうちの少なくとも２つを解析する工程と、を含む。
【００１５】
本発明の一実施形態では、そのパルスシーケンスは、先頭の１つの９０°パルスの後に複数のスピンエコー・パルスが続くようなシングルスキャン・パルスシーケンスを用いることによって過偏極サンプルに対して適応させている。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、そのパルスシーケンスは、先頭の励起パルスの後で過偏極の少なくとも一部分を維持するために小さいフリップ角で反復式の励起パルスを用いることによって過偏極サンプルに対して適応させている。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、その方法は、多次元ＮＭＲスペクトロスコピー向けに適応されていると共に、時間パラメータが異なるカップリング定数によって変調を受ける期間である多次元時空グリッドのマッピングを可能とするエボリューション期間を従えたパルスを含んだパルスシーケンスと、周波数領域データへの変換を含んだ多次元時間領域データに対する後続の解析と、を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上で概説した本発明に関する特徴及び利点は、全体を通じて同じ参照番号が同じ要素を示すようにした図面と関連させた以下の詳細な説明でより完全に記載することにする。
【００１９】
ここで本発明の実施形態を図面を参照しながら説明することにする。
【００２０】
本発明による方法は、たんぱく質などの有機分子の研究（ただし、これに限らない）を含め広範なサンプルに対するインビトロ研究に関して適当である。本発明による方法では、そのサンプルは例えば、分子の構造解析、拡散係数の計測及び動的特性の計測（ただし、これらに限らない）を含め様々な方法で特徴付けすることができる。
【００２１】
サンプルはＮＭＲに適した原子核、すなわち本明細書においてＮＭＲ活性原子核と呼ぶ非ゼロ核スピンをもつ原子核を含んでいなければならない。こうした原子核の例には、１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、１９Ｆ及び／または１Ｈが含まれる。さらにこれらの原子核は、過偏極過程、特にＤＮＰに従う過程に適している。１３Ｃ及び１５Ｎが特に適しており、また１３Ｃが最も好ましい。適当な原子核のうちの幾つかは、ある種の用途においてＮＭＲスペクトロスコピーに関して十分な天然存在度（例えば、１３Ｃ（１．１％））を有する。別の用途では、適当なＮＭＲ活性原子核に関してサンプルを高濃度化すると有利となり得る。例えば１３Ｃに関してサンプルを高濃度化する方法は当技術分野において周知である。サンプルが複数種のＮＭＲ活性原子核を含むこともある。
【００２２】
本発明の実施形態では、加えられる磁場の角度を規定する表記は回転座標系を示しており、これはＮＭＲ分野で通常使用される表記法となっている。「対炭素パルス」、「対水素パルス」その他の表現は、その原子核のラーモア周波数に対応するように、無線周波数パルス（ＲＦパルス）が該核及び静磁場に適応させた周波数を有するものと理解されたい。角度、周波数及びパルス持続時間に関するある種の変動は受け容れ可能であり、また計測装置において通常見られるものであることは当業者であれば理解されよう。したがって、「９０°パルス」などの用語は、該パルスと一般に関連付けされるスピン系向けの物理学的効果が付与されたパルスであると解釈すべきである。
【００２３】
上で述べたように、また従来技術の方法と対照的に、過偏極サンプルを利用するＮＭＲスペクトロスコピーの有効な方法は、過偏極によって課せられる要件を満足するように設計しなければならない。本発明による方法は、これらの要件を満足させると共に、過偏極によって得られる信号強度の増強を十分に利用できるように慎重に適応させている。
【００２４】
本発明による方法は、以下の主要工程、
ａ）ＮＭＲ活性原子核が過偏極を受け取るようなＤＮＰ、並びに液体状態へのサンプルの変換（例えば、融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）または溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）による）によってサンプルを過偏極する工程と、
ｂ）ＲＦパルスのシーケンスを使用してサンプルに対してＮＭＲスペクトロスコピーを実行する工程であって、該パルスシーケンスは同じ原子核に対するまたは異なる原子核に対する少なくとも２つのＲＦパルスを含み、かつ該パルスシーケンスは過偏極サンプル向けに適応させており、これにより複数のＮＭＲスペクトルを生成させている実行工程と、
ｃ）該サンプルの特性を得るため、あるいはＮＭＲスペクトロスコピーで使用するための中間結果またはサンプルの特性決定を提供するように別の中間結果との組み合わせを得るためにＮＭＲスペクトルのうちの少なくとも２つを解析する工程と、
を含む。
【００２５】
過偏極の工程（ａ）は、固体サンプルに適したＤＮＰに基づく周知の任意の過偏極方法、あるいは将来的な過偏極方法によって実施されることがある。こうした方法は例えば、ＷＯ第９９／３５５０８号及びＷＯ第０１／９６８９５号、並びにこれらの参考文献に開示されている。
【００２６】
ＮＭＲスペクトロスコピーからなる第２の主要工程（ｂ）は、過偏極により課せられる上で述べた要件を満足するように注意を払わなければならない工程である。従来技術の多くのパルスシーケンスは、再磁化及び収集を可能とするように複数の９０°パルスと後続の待機期間を使用している。９０°パルスは、典型的には、すべての磁化ベクトルを横断面までフリップさせており、複数の９０°パルスを使用する従来技術シーケンスは過偏極したサンプル向けには使用することができない。本発明による方法は、先頭パルスの後にスピンエコー・パルス（複数のこともある）を使用してできる限り多くの情報が抽出されるようなシングルスキャン（ワンショット）パルスシーケンスを使用すること、あるいはスペクトロスコピー中に縦方向の過偏極をできる限り多く維持させるために小フリップ角で反復式のパルスを使用すること、のいずれかによってこの課題に対処している。この２つの代替形態のうちのどちらを使用するかは、計測の使用目的及びサンプルの特性によって判定される。以下に記載する実施形態で例証することにするが、過偏極サンプルによって設定される条件向けに適応させるべきものはパルスシーケンスの初期「フリップ」パルスだけではなく、典型的には、過偏極を十分に利用するために標準シーケンスに対して完全シーケンスを修正すべきである。
【００２７】
上で検討したように、実際の計測に対する時間をできる限り短く保つことのみならず、サンプルの過偏極とＮＭＲスペクトロスコピーによる計測値の取得の間の時間をできるだけ大幅に短縮することが重要である。本発明と同じ出願人によるＷＯ第０２３７１３２号及びＷＯ第０２３６００５号はそれぞれ、過偏極サンプルに関する極めて迅速な溶解及び融解の方法を教示している。クライオスタットの強い磁場内で材料（サンプル）が偏極を受け、また依然としてクライオスタット内にある間に溶液となる（または、融解される）。さらに、過偏極とＮＭＲスペクトロスコピーが同じ装置内で実施されており、かつ該装置の内部にあるＲＦコイルなどの同じ装置を部分的に利用するような方法及び装置も開示している。ＷＯ第０２３７１３２号及びＷＯ第０２３６００５号は、参照により本出願に包含させるものとする。サンプルを融解する方法は本出願にとって特に興味深い。ＷＯ第０２３６００５号には、ダイオード・レーザーを利用してサンプルを加熱する。またしたがって融解すること、サンプルを比較的高い温度の液体と熱的接触状態にさせること、並びに電熱素子を使用することを含む融解方法が教示されている。過偏極のできる限り多くを保持するためには、Ｔ１のタイムスケール上で融解が生じることが重要である。この過程はさらに、以下に示す方法と構成、またはこれらの組み合わせを含むことがある。
【００２８】
・サンプルを加熱するためにはループ−ギャップ共振子を使用することができる。これによって、サンプルを選択により最大電場（最大Ｅフィールド）または最大磁場（最大Ｂフィールド）の状態にすることが可能となる。
・ＤＮＰ過程と融解の両方のためにマイクロ波共振構造を使用することが可能である。
・同じクライオスタットの内部にＤＮＰ増強位置から融解位置までのサンプルの移送手段を存在させることが可能である。
・サンプルは電流からの損失を増加させるような伝導性表面を有する可能性がある。
・サンプルに対して吸収用染料（ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  ｄｙｅｓ）が追加される可能性がある。
・融解のための熱を発生させるために激しい発熱性化学変化が使用される可能性がある。
・融解と溶解が組み合わせられる可能性がある。このことが、溶解状況で有利となる可能性がある。
・光を導くためにミラーが使用される可能性がある。
・高い圧力において固体が液体となる。
・加熱のために収束させた光（必ずしもレーザーに限らない）が使用される可能性がある。
・磁気または静電気エネルギー蓄積による抵抗性加熱。
・溶着（静電放電）による融解。
・加熱を提供するために低温のサンプルを高温の場所に移動させる。
・収束性の超音波を熱源とする。
・核エネルギーを熱源とする。
・安定な温度を維持するために温度制御が使用される可能性がある。
・融解によって例えば２Ｄ試行に関して試行の反復が可能になる。
【００２９】
上述した主要工程からなる本発明による方法は、過偏極サンプルを異なる態様で特徴付けするような極めて多様な方法で適応させることができる。こうした変形形態には、異核Ｊカップリング相関スペクトロスコピー（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｊ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、異核シフト相関スペクトロスコピー（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｓｈｉｆｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、拡散強調スペクトロスコピー（ただし、これらに限らない）が含まれる。これらのスペクトロスコピー法は、例えばカップリングした原子核間の接続性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）、原子核間のスカラー・カップリング（Ｊカップリング）を決定するため、サンプル内の分子に関する構造情報を解明するため、並びに拡散係数を決定するために使用される。これらの解析法を例証している本発明の実施形態を以下に示すことにする。
（各スピン種の１Ｄスペクトルを用いた過偏極サンプル向けの異核Ｊカップリング相関スペクトロスコピー）
【００３０】
図１ａ〜ｂを参照して記載している第１の実施形態では、本発明による方法を、サンプル内の各ＮＭＲ活性核種に対して１Ｄ  ＮＭＲスペクトルを用いる異核Ｊカップリング相関スペクトロスコピー向けに適応させている。
【００３１】
本発明のこの実施形態は、異核をそのスカラー（Ｊ）カップリングによって相関させる課題に関連する。過偏極サンプルを使用する場合、通常のＮＭＲ技法は上で述べたような理由のためにインビトロ異核シフト相関スペクトロスコピーで利用可能ではない。１Ｈと１３Ｃの間でのカップリングの相関が特に興味深く、この実施形態は１Ｈ及び１３Ｃを非限定の例として記載することにする。別のカップリング（例えば、１Ｈと１５Ｎの間のカップリング）も等しく同様に検討対象とすることができる。さらに、１３Ｃ原子核は高濃度化させていない（すなわち、その存在度が天然に生じる存在度（すなわち１．１％）である）と仮定している。
【００３２】
適当な方法（例えば、ＤＮＰ）を用いることによって核スピンが先ず固体状態で過偏極を受ける。溶解／融解の後、図１ａ〜ｂに示した２つの核スピン種１Ｈ及び１３Ｃの各々について各１つとした２つの１次元（１Ｄ）スペクトルが記録される。１Ｈスペクトル（図１ａ）では、１３Ｃのない分子に起因するシングレット・ピークと、該シングレットを中心に対称となった残りの分子（１．１％）に起因するダブレットと、の重ね合わせが観測される。このダブレットの分離は、１Ｈと１３Ｃの間のスカラー・カップリング（ＪＣＨ）に等しい。１３Ｃスペクトル（図１ｂ）では共鳴が、ｎ個の同一のプロトンを伴うスカラー・カップリングによって、ｎ＋１個のピークに分離される。この分離はさらに、プロトン・スペクトル内で観測されるスカラー・カップリング（ＪＣＨ）に等しい。２つの異なるスペクトル内で同じ分離が特定されるとある特定の炭素とスカラー・カップリングしたプロトンがピンポイント特定される。
【００３３】
この実施形態におけるＮＭＲスペクトロスコピーを実行する主要工程（ｂ）は、
１００：サンプル内の第１の核スピン種（１Ｈ）の第１の１次元スペクトルを記録する工程と、
１１０：サンプル内の第２の核スピン種（１３Ｃ）の第２の１次元スペクトルを記録する工程と、
を含む。
本発明の本実施形態における比較の主要工程（ｃ）は、
１２０：第１のスペクトル内でシングレット・ピーク及び対応するダブレットを特定する工程と、
１３０：同じ分離を比較しかつ特定することによって、２つのスペクトル内のピーク（ピークからなる群）を相関させ、これによってどのプロトンがある特定の炭素とスカラー・カップリングされているかを判定する相関工程と、
を含む。
【００３４】
本発明のこの実施形態は、そのパルスシーケンスがＮＭＲ活性原子核ごとにパルスを１つだけ含むという過偏極により課せられる要件を満足している。このスペクトロスコピー工程に要する時間は、非常に短く（好ましくは、１０ｓ未満に）保つことができる。
完全な解析過程は、コンピュータ・プログラム成果物によって自動化しコンピュータ制御すると好ましくなり得る。この過程は、すべての工程において完全に自動化させることもあるが、必要であればさらにオペレータを関与させることがある。このプログラムは例えばすべてのピーク値及び隣接するピーク同士の分離の値を計算することがあり、またオペレータは、異なるスペクトル間でのピーク（ダブレット）のマッチングを実行することがある。
（試行例）
【００３５】
ＯＸ０６３をＨＰ００２内に溶解させて１５ｍＭのラジカル濃度を得た。この溶液を液体窒素内に滴らせ、概ね１．５ｍｍ直径のビーズ（ｂｅａｄｓ）を形成させた。９４ＧＨｚに近いマイクロ波を用いて１．１Ｋ及び３．３５Ｔにおいて２時間にわたって偏極した後、サンプルを偏極ユニットの内部において現場で高温の水に溶解させた。形成した溶液は、５ｍｍのＮＭＲチューブに移し、これを手作業で９．４Ｔ分光計に移送した。２つの連続する１パルス・スペクトル（１つは１３Ｃスペクトルであり、また１つは１Ｈスペクトルである）を記録した。溶解と検出の間の時間は１３秒と推定された。
【００３６】
この試行では１Ｈの緩和時間が短いため、検出の時点においてその過偏極状態を維持しているのは本質的に１３Ｃのみである。したがってそのプロトン・スペクトルは主に、周囲温度及び分光計の検出マグネット内部の磁場において熱的に偏極を受けた部分から構成されることになる。１Ｈと１３Ｃの間のダイポール・カップリングのために、核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）により生じる可能性がある１３Ｃから１Ｈへの縦磁化の遷移が存在することになる。このために１３Ｃを含む分子（１．１％）のみが影響を受けるが、それでも初期の１３Ｃ偏極が大きいためにプロトン・スペクトルにおいて観察可能な効果となる。ＮＯＥに由来するプロトン信号は、その熱平衡信号と逆位相となり、このため実際上スペクトルの解釈が簡単となる。図１ａにおいて１１７５Ｈｚにあるダブレットは１４３．３Ｈｚの分離を有しており、また−２６Ｈｚにあるダブレットは１６３．０Ｈｚの分離を有している。１３Ｃスペクトル（図１ｂ）では、炭素をｎ個の同一プロトンにカップリングさせたときにｎ＋１個のピークを有するような１Ｈとのスカラー・カップリングによる信号の分離が観測される。図１ｂでは、２つの１３Ｃトリプレットが観測され、各１３Ｃ原子核ごとに２つの同一の１Ｈへのカップリングを示している。６５３６Ｈｚには１４３．３Ｈｚに等しい分離が観測され、また７６２Ｈｚには１６２．３Ｈｚに等しい分離が観測される。この観測から、１１７５Ｈｚの１Ｈは、１４３．４Ｈｚに等しいカップリングを有する６５３６Ｈｚの１３Ｃとスカラー・カップリングしているという結論が導かれる。同様の特定は別の１Ｈ／１３Ｃ対に対しても実施することができる。
【００３７】
（過偏極サンプル向けの異核シフト相関スペクトロスコピー）
図２ａ〜ｂを参照して記載している第２の実施形態では、本発明による方法を過偏極サンプルの異核シフト相関スペクトロスコピー向けに適応させている。
【００３８】
スカラー・カップリング（Ｊカップリング）によって接続された異種原子核間の化学シフトを相関させるには選択性のデカップリングを使用することができる。この実施形態の基本原理は、原子核のうちの一方のドメイン内にある（選択性）デカップリング周波数からなる配列をつくり、かつこれ以外の原子核の周波数ドメインにおいてその効果を観測することである。
【００３９】
この実施形態は、例えば１Ｈなどのあるスピン種Ｉの共鳴を選択性に照射し、これを例えば１３Ｃなどの異種核（スピンＳ）からデカップリングさせてＳ原子核のスペクトル上でその影響を監視することを含む。デカップラー周波数がスピンＩスペクトルのピークの共鳴に一致すると、スカラー・カップリングさせる相手方の原子核に関してＳスピン・スペクトルの共鳴の分離のつぶれ（ｃｏｌｌａｐｓｅ）が生じることになる。デカップリングのためには２種類の方式を考えることができる。１つの方式は、Ｉスピンの全体スペクトルにわたってある小さい増分でデカップラー・オフセットをステップ状に変更することであり、またもう１つはＩスピンのスペクトル内の既知の周波数にわたってデカップラーをステップ状に変更することである。Ｓ原子核のスペクトルにおけるデカップリングの影響は、２つの連続するデカップリング間で監視されることになる。いずれの場合にも、デカップリング手順が生じる前に、先ずスピンＩのスペクトルが収集される。第１の方式では、残留カップリングから情報を取得することができる。部分的デカップリングによって、共鳴オフセットに応じてＳスピン・スペクトル内のマルチプレットの分離のスケール調整が得られる。この種のオフレゾナンス・デカップリングは、複雑な１３Ｃスペクトルの割り当てに広範に使用されてきた。第２の方式では、本試行で使用するデカップリング周波数の配列を特定するために、ＦＩＤの自動フーリエ変換及び後続の「ピークピック処理（ｐｅａｋ−ｐｉｃｋｉｎｇ）」が必要となる。
【００４０】
さらに、異なるデカップラー・オフセットに対してこの試行を反復する方法も２種類存在する。図２ａに示した本実施形態の第１の代替形態では、小フリップ角方式を使用し、デカップラー周波数の事前定義の配列の長さに等しい必要な回数だけこの試行を反復することができる。小フリップ角を使用することによって、その過偏極が（少なくとも部分的に）保全される。フリップ角は、任意選択において、緩和を考慮に入れるように調整することができ、したがって各サイクル中において横断面内に同じ磁化を提供することができる。
【００４１】
図２ｂに示した本実施形態の第２の代替形態では、９０度パルスによってＳスピンの全体磁化を横断面に移転させ、その後でリフォーカシング・パルス列（スピンエコー・パルス）をＳ原子核に対して用いてスピンエコーの列を生成させている。各スピンエコーの間には異なるデカップラー周波数を使用すると共に、Ｓスピンの信号を監視することができる。したがって、デカップラー周波数の異なる設定値に対応する一連のスペクトルが収集される。横緩和時間Ｔ２が長い場合には本実施形態の第２の代替形態の方が好ましく、また一方第１の代替形態は長いＴ２にそれ程は依存しないという利点を有する。
【００４２】
しかしこの方法は、プロトンと、スピンＳのただ１つの種との間のカップリングの監視に限定されない。サンプルが（有機分子で多くの場合にそうであるように）別の異種原子核（例えば、１５Ｎ）からなるスピン系を有する場合、これらの原子核に対しても同じ仕組みを実行することができる（ただし、多重チューニング式のＮＭＲプローブ（multiply tuned NMR probe）が利用可能であるものとする）。異なるＳ原子核に対するスピンエコー・パルスシーケンスは、連続式と同時式のいずれかで動作させることができる。次いで、プロトンと異なる核種との間の接続性に対するシングルショット検出が可能になる。
【００４３】
この実施形態におけるＮＭＲスペクトロスコピーの実行の主要工程（ｂ）は、
２００：デカップリングさせるＩ原子核（１Ｈ）の第１のスペクトルを記録する工程と、
２１０：Ｉスピンに対してデカップリング手順を実行し、同時にＳスピン・スペクトルを監視する工程であって、
２１０：１：Ｓ原子核に対して、Ｓスピンの全体磁化を横断面に移転させる第１の９０°パルスと後続のリフォーカシング・パルス列（スピンエコー・パルス）とからなるパルスシーケンスを作用させる（各スピンエコーの間に異なるデカップラー周波数を使用しＳ原子核の信号を監視する）こと、
また別法として、
２１０：２：Ｓ原子核に対して、複数の小フリップ角パルスからなるパルスシーケンスを作用させる（このフリップ角αは、各パルスごとに異なることがある。各パルスの後に異なるデカップラー周波数を使用しＳ原子核の信号を監視する）こと、
による監視工程と、
を含む。
【００４４】
本発明の本実施形態の解析の主要工程（ｃ）は、
２２０：Ｉ原子核に対する第１のスペクトルを用いて、デカップリング手順で使用する周波数領域を決定する工程と、
２３０：指定された周波数におけるデカップリングの影響を、Ｓスピン・スペクトルにおける共鳴の分離のつぶれと相関させ、これによってどのＩ原子核がある特定のＳ原子核とスカラー・カップリングしているかを判定する工程と、
を含む。
【００４５】
パルス角αは、そのループの後続の反復において同じとなるように選択することがあり、またこれを可変とすることもある。例えば角度αは、各反復において増加させ、等しい量の横方向磁化が生成されようにすることがある。こうしたスキームによれば、利用可能な磁化が最も効率よく利用されることになる。このパルス角は、帰納公式α（ｎ＋１）＝ａｒｃｓｉｎ（ｅｘｐ（τ／Ｔ１）＊ｔａｎ（α（ｎ））（ここで、τは励起パルス間の時間であり、またＴ１は縦緩和時間である）に従って増加させることが好ましい。
【００４６】
本発明のこの実施形態は、そのパルスシーケンスがＮＭＲ活性原子核ごとに１つの９０°パルス、また別法として、フリップ角が小さいパルスからなるシーケンスを含むのみであることにおいて過偏極により課せられる要件を満足させている。このスペクトロスコピー工程に要する時間は、非常に短い時間、好ましくは１０ｓ未満に維持することができる。
【００４７】
（ワンショットＪシフト・スペクトル向けのパルスシーケンス）
多次元ＮＭＲスペクトロスコピーは、分子を特徴付けするための強力なツールとして登場した。上で検討したように、例えば２Ｄ  ＮＭＲスペクトロスコピーで通常使用されるパルスシーケンスは、過偏極サンプルで使用するのに適していない。主にこのために、「標準の」パルスシーケンスでは複数のフリップパルスを利用するが、過偏極はわずか１つのフリップパルスの後でも失われてしまう。図３ａ〜ｂを参照して記載している本発明の第３の実施形態では、過偏極条件向けに適応させたパルスシーケンスについて記載することにする。この実施形態について２Ｄスペクトルを与えるシーケンスによって例証しているが、本発明による方法は多次元ＮＭＲスペクトロスコピーに対して容易に適応させることができる。
【００４８】
２Ｄ  ＮＭＲ解析は典型的には、よく知られた試行スキーム（すなわち、そのエボリューション（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）フェーズが９０°励起パルスで開始されその後続のフェーズでは１８０°パルスが使用される準備−エボリューション−混合−検出のスキーム）に従う。過偏極によって設定される要件のために、シングルスキャン方式が課せられる。以下では、スピン種ＩとカップリングしたスピンＳを含む系について検討することにする。実際には複数のスピンＳが存在することになるが、以下の検討では、検討するスピンＳを１つだけとする。スピンＳ及びＩを含むスピン系のハミルトニアンは以下となる。
【００４９】
Ｈ  ＝  ＨＳ＋ＨＩＳ＋ＨＩ        （式１）
ここで、
ＨＳ  ＝  σＳ＋ＳＺ        （回転座標系による）
【００５０】
【数１】
0004599490.tif 000002
（式２）
【００５１】
過偏極サンプルに適した方法の開発には以下の観測が主に重要となる。
【００５２】
１．１８０°パルスを差し挟んだエボリューション期間は部分ハミルトニアンのエボリューションに対して異なる時間を使用することによって一定に記述することができる。すなわち、ある所与の時点の密度マトリックスは以下のように記述することができる。
σ  ＝  ｅｘｐ［−ｉ（ＨＳｔＳ＋ＨＩＳｔＩＳ）］σ（０）ｅｘｐ［ｉ（ＨＳ＋ｔＳ＋ＨＩＳｔＩＳ）］    （式３）
【００５３】
また、計測される（複素）信号＜Ｓ＋＞は次式に等しい。
＜Ｓ＋（ｔＳ，ｔＩＳ）＞  ＝  Ｔｒ（ｅｘｐ［ｉ（ＨＳｔＳ＋ＨＩＳｔＩＳ）］Ｓ＋ｅｘｐ［−ｉ（ＨＳｔＳ＋ＨＩＳｔＩＳ）］σ（０））        （式４）
【００５４】
初期密度マトリックスは、Ｏｙの周りでＳに対して９０°パルスを印加することによってＳｘに比例するように選択される。Ｓに対する後続のすべてのパルスはＯｘの周りに来ることになり、したがってσ（０）の形態に影響を与えない。
【００５５】
２．様々なパルス（常に、１８０°）の影響は以下のようになる。
Ｉ：  ｔＳ→ｔＳ；ｔＩＳ→−ｔＩＳ
Ｉ，Ｓ：  ｔＳ→−ｔＳ；ｔＩＳ→ｔＩＳ 
Ｓ：  ｔＳ→−ｔＳ；ｔＩＳ→−ｔＩＳ      （式５）
【００５６】
３．パルス間の自由エボリューションの期間中に、この２つの時間は等しい量だけ増加する。
【００５７】
４．（式４）によって、この２つの時間の相対する値に対応する信号は複素共役値となる。
シングルスキャンを利用する従来技術の方法（例えば、Ｌ．Ｆｒｙｄｍａｎ及びＪ．Ｐｅｎｇによる「Ｎｏｎ−Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅｓ  ａｎｄ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ２Ｄ  ＮＭＲ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｃａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ」（Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔ．，  ２２０：３７１〜７７、１９９４）に記載の方法）は、過偏極サンプルの使用に由来する要件に対処するように適応されていない。さらに、従来技術の方法は、ｔＳ−ｔＩＳ面内で利用している軌道が関心エリアの全体に及んでいない。したがって、後続の解析工程において有用な情報が失われることがある。本発明の実施形態によるパルスシーケンスは、過偏極サンプルにより得られる利点を十分に活用しているだけではなく、ｔＳ−ｔＩＳ面内で効率のよい軌道を使用するように意図している。これらは、すべてのピークを純粋吸収で得るために２時空間(two-time space)の正方形部分内に観測点からなる正方配列が生成されるように意図している。
【００５８】
（第３の実施形態の第１のシーケンス）
本実施形態の第１の代替的シーケンスは、所与の値ｔＳ、ｔＩＳに対するある点を観測する際に、これらの時間の相対する値を有する点を観測せずにその値を前者の複素共役から導き出しているということにおいてポイント４を利用している。異なる点間の時間間隔τが選択され、さらに両次元方向でこの単位時間の−Ｎ倍から＋Ｎ倍まで拡がる正方形を満たすようにする。点を観測できるのはパルス同士の間だけではなく、パルスの直前及び直後にも観測できると仮定する。座標ｔＳ＝ｉτ、ｔＩＳ＝ｊτをもつ点の表記を（ｉ，ｊ）とする。このシーケンスは、本発明による方法の第２の主要工程（ｂ）に含まれるような以下の工程、
３００：Ｓに対する９０°パルスによって点（０，０）から開始し、点（Ｎ，Ｎ）までのＮ＋１個の点（ｉ，ｉ）を観測する工程と、
３０５：（Ｎ，−Ｎ）に至るまでパルスＩ（すなわち、Ｉに対する１８０°）を実行する工程と、
３１０：（Ｎ＋１，−Ｎ＋１）に至るまで１時間単位(one time unit)だけ待機する工程と、
３１５：（−Ｎ−１，−Ｎ＋１）に至るまでパルスＩＳ（ＩとＳの両者に対する１８０°パルス）を実行する工程と、
３２０：（Ｎ−２，Ｎ）までの点を観測する工程と、
３２５：（Ｎ−２，−Ｎ）に至るまでパルスＩを実行する工程と、
３３０：（Ｎ＋１，−Ｎ＋３）に至るまでの点を観測する工程と、
３３５：パルスＩＳを実行する工程と、（以下同様）
を含む。
【００５９】
得られる全体軌道を図３ａに表している。ポイント４に従って穴を埋め合わせた後、面心正方配列の形態をしたグリッド点のうちの半数だけが取得され、また残りに半分は４つの点からの補間によって取得され、ｔＳについて−Ｎから＋Ｎまで、またｔＩＳについて−（Ｎ−１）から＋（Ｎ−１）まで及ぶ点（上側及び下側エッジでは観測される点は３つだけである）からなる正方配列が得られる。
【００６０】
このシーケンスの総持続時間はＮ（Ｎ＋１）τに等しい。例えばＮ＝１００であり、かつそのシーケンスに関する妥当な持続時間が例えば１．５ｓ（τ＝１５０μｓに対応する）であれば、すなわちスペクトル幅はΔｖ＝１／（２πτ）≒１．０６ｋＨｚとなる。値ｔＳｍａｘ＝ｔＩＳｍａｓ＝０．０１５ｓでは、スペクトル分解能δｖ≒１０．６Ｈｚが得られる。
【００６１】
この第１のシーケンスに従った様々な点に対する実際の観測時間はｔＳ＋ｔＩＳと比べてはるかに長く、また全体シーケンス中の緩和崩壊が大きいために最終スペクトルにピーク歪みが予期される。ある種のケースでは、データに対する適正な補正が必要となる。
【００６２】
（第３の実施形態の第２のシーケンス）
第３の実施形態の第２のシーケンスは、ｔＳ−ｔＩＳ面内のグリッド全体における観測の実施を目的としている。最初の５つの工程は第１のシーケンスの場合の工程と同じであり、これにより点（Ｎ−２，Ｎ）まで至る。本発明による方法の第２の主要工程（ｂ）に含めるべきシーケンスは、
３００ｂ：Ｓに対する９０°パルスによって点（０，０）から開始し、点（Ｎ，Ｎ）までのＮ＋１個の点（ｉ，ｉ）を観測する工程と、
３０５ｂ：（Ｎ，−Ｎ）に至るまでパルスＩ（すなわち、Ｉに対する１８０°）を実行する工程と、
３１０ｂ：（Ｎ＋１，−Ｎ＋１）に至るまで１時間単位だけ待機する工程と、
３１５ｂ：（−Ｎ−１，−Ｎ＋１）に至るまでパルスＩＳを実行する工程と、
３２０ｂ：（Ｎ−２，Ｎ）までの点を観測する工程と、
３４０ｂ：両時間符号を反転させて（−Ｎ＋２，−Ｎ）に至るまでパルスＳを実行する工程と、
３４５ｂ：（Ｎ，Ｎ−２）までの点を観測する工程と、
３５０ｂ：（Ｎ，−Ｎ＋２）に至るまでパルスＩを実行する工程と、
３５５ｂ：（Ｎ＋１，−Ｎ＋３）までの点を観測する工程と、
３６０ｂ：（−Ｎ−１，−Ｎ＋３）に至るまでパルスＩを実行する工程と、（以下同様）（工程３５０〜３５５を反復する）
３６５ｂ：（Ｎ，−Ｎ）にあるときに、（−Ｎ，−Ｎ）に至るまでＩパルスを印加し（０，０）までの点を観測することによりグリッドの充足を完成させる（この場合も、観測点が全く異なる時点で実施されかつ異なる緩和崩壊による影響を受けるため、そのフーリエ変換の歪みを回避するように信号を取り扱うことが必要となる）工程と、
を含む。
【００６３】
得られる軌道を図３ｂに表している。
【００６４】
第２のシーケンスの持続時間は第１のシーケンスと比べて長さが２倍（２Ｎ（Ｎ＋１））であり、緩和に伴う問題を生じる可能性がある。この問題は、使用する観測点間の時間間隔を上述の場合と比べて半分に短くすることによって対処することができる。
【００６５】
この両シーケンスに共通の特徴は、点間の「時間」間隔が両次元方向で同じであること、並びに点の数も１単位以内で同じとなることである。
【００６６】
このように作成したＪシフト・スペクトルの使用に関しては、好ましい実施形態は、これらのうちスピンＳを観測することによる１つとスピンＩを観測することによる１つという２つを作成し、かつそのそれぞれの異核Ｊ値の同等性によってそれぞれの化学シフトを相関させることになる。この相関は、本発明による方法の解析の主要工程（ｃ）に含めることが好ましい。
【００６７】
本発明の実施形態を２Ｄスペクトルを与えるシーケンスによって例証しているが、このパルスシーケンスは多次元ＮＭＲスペクトロスコピーに対して適応させることができる。こうした拡張では、その時空グリッドは、例えば高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を用いた解析の際に多次元周波数空間を提供するように多次元的とすることになる。２Ｄの場合と同様に、実際上その解析に要する空間のすべての部分（面積、体積、その他）にわたるように時空グリッド内の軌道を選択するように注意を払う必要がある。
【００６８】
（インビトロＮＭＲにおける過偏極向けのシングルショット拡散強調シーケンス）
拡散強調ＮＭＲスペクトロスコピーは、例えばリガンド（ｌｉｇａｎｄ）−たんぱく質間の相互作用に関する情報をもたらすことが知られている。しかし、過偏極サンプルを使用すると通常のＮＭＲ技法では、上で検討した理由のために、インビトロ拡散強調ＮＭＲスペクトロスコピーに関して限定された適用性しか提供できない。
【００６９】
本発明の第４の実施形態では、拡散強調ＮＭＲスペクトロスコピーに適したパルスシーケンスを、過偏極サンプルに対する利用向けに適応させている。上述の実施形態と同様に、９０°フリップパルスを１つだけを使用した後で、シングルスキャン方式で複数のスピンエコー・パルスを続けている。多重エコーＮＭＲシーケンスを使用するため、シーケンスの単一の実行中に累進的な拡散減衰を伴う幾つかのスペクトルの収集が可能となる。これによって、例えば潜在的な標的分子の存在下で過偏極リガンドの拡散係数の迅速な計測が可能となる。
【００７０】
拡散強調ＮＭＲは広範に利用される方法となっている。一例として、組織内の水分子の拡散によって、組織の微小構造にリンクさせた磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）におけるコントラスト機構が提供される。拡散強調ＮＭＲスペクトロスコピーはさらに、溶液内の分子の自由度の特定に役立てることができる。例えば、分子がある表面またはマクロ分子に吸着されると分子の拡散係数が低下する。したがって、いわゆる拡散オーダー式スペクトロスコピー（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＤＯＳＹ）によってリガンド−たんぱく質間結合に関する情報を提供することができる。
【００７１】
拡散強調ＮＭＲスペクトロスコピーに使用されるよく知られたパルスシーケンスは、パルス傾斜スピンエコー（ＰＧＳＥ）として知られており、傾斜パルスを伴う９０°−τ−１８０°−τのスピンエコー・シーケンスとなる。傾斜の持続時間及び振幅によって、拡散強調の度合いが決定される。ＰＧＳＥシーケンスは異なる拡散強調を用いて数回実行される。拡散強調パラメータｂに対する個別のスピンエコーのリダクション（傾斜強度、持続時間及びタイミングの関数）によって拡散係数の値Ｄが得られる。
【００７２】
過偏極サンプルでは、利用可能な磁化をすべて横断面内にフリップさせる際に９０°パルスを注意深く使用すべきである。しかし、低フリップ角を使用する場合であっても、ＰＧＳＥシーケンスの各実行は拡散係数の計算に要する幾つかのデータ点のうちの１つだけしか提供していない。したがって、異なる拡散強調を用いたＰＧＳＥシーケンスの数回の実行と同じ情報をシングルスキャンで得られるように小フリップ角、または磁化の多重リフォーカシングのいずれかに基づいた方式は考慮に値しよう。こうした方式について以下で例証することにする。
【００７３】
一般にＢＵＲＳＴとして知られる周知のシーケンスは、その間に一定の磁場傾斜が印加される低フリップ角パルス列に基づいている。１８０°パルスによって磁化をフリップさせると共に、スピンエコーの列（この場合も、同じ傾斜の存在下）が記録される。ｊ番目のスピンエコーは、（ｎ−ｊ−１）番目のパルス（ｎをパルスの総数とする）によって生じている。例えば過偏極１２９Ｘｅなどの過偏極種の拡散を異なる液体中で首尾よく計測するためには、第１のシーケンスが使用されてきた。しかし、このシーケンスの欠点は、ＮＭＲスペクトルに含まれる化学シフト情報が損なわれることである。したがって、このシーケンスは、ＮＭＲスペクトル内にある高強度ピークが１つだけである場合の拡散計測にのみ使用することが望ましいことになる。
【００７４】
すべての化学シフト情報を保持するこの実施形態によるシーケンスを図４に表している。これは、確立されたＢＰＰＳＴＥ（バイポーラパルス対誘導エコー）シーケンスを多重デコードに拡張したものである。このシーケンスは上述のシーケンスと同様に、拡散減衰エコーの列を生成させる。しかし第１の場合と異なり、ＦＩＤの記録の間は傾斜が加えられておらず、また１Ｄ  ＮＭＲスペクトルの化学シフト情報が完全に保持される。これによって、スペクトル内のすべてのピークに関して個々に拡散係数を計測することができ、そのサンプルが例えば幾つかの異なるリガンドを含む場合に非常に有用となり得る。同様のシーケンス（例えば、Ｄｉｆｆｔｒａｉｎの名称で知られるシーケンス）も記述されてきたが、これでは過偏極サンプルの使用により提起される要件に対処していない。この実施形態によるＮＭＲスペクトロスコピーを実行する主要工程（ｂ）は、
【００７５】
４０５：各シーケンスごとに１回だけ実行される初期フェーズであって、
４０５：１：第１の９０°パルス、
４０５：２：第１の方向をもつ傾斜磁場を印加すること、
４０５：３：第１の１８０°パルス、
４０５：４：第１の方向と反対の第２の方向をもつ傾斜磁場を印加すること、
４０５：５：第２の９０°パルス、
からなる初期フェーズを行う工程と、
【００７６】
４１０：ｎ回反復させるスピンエコー収集フェーズであって、
４１０：１：角度αをもつパルス、
４１０：２：第１の方向をもつ傾斜磁場を印加すること、
４１０：３：１８０°スピンエコー・パルス、
４１０：４：第１の方向と反対の第２の方向をもつ傾斜磁場を印加すること、
４１０：５：ＦＩＤを記録すること、
からなるスピンエコー収集フェーズを行う工程と、
を含む。
【００７７】
本発明の本実施形態による解析の主要工程（ｃ）は、
４２０：記録されたｎ個のスペクトルまたはこれらの一部分を比較する工程（スピンエコーの減衰から拡散係数Ｄの値が導出される）を含む。
【００７８】
第１の９０°パルスと１８０°パルス（時間τだけ離れている）は時刻２τにおいてスピンエコーを生じさせる。厳密にこの時点で別の９０°パルスが印加される。したがって、磁化がｚ軸に沿って「保存される（ｓｔｏｒｅｄ）」、すなわち第２の９０°パルス後に生成される状態はＴ１緩和を受けるがＴ２緩和は受けないことになる。このことはＴ１が長い場合に特に有利である。このバイポーラ傾斜対（１８０°パルスに関して対称）によって「拡散エンコード」が提供される。
【００７９】
図に示したループは、パルス角α＜＜９０°のパルスに続く１８０°パルス、及び磁場傾斜の別のバイポーラ対からなる。このαパルスは初期パルスによって生成された状態を若干摂動させる役割を果たしている。複数のエコーを発生させることによってループを反復するためには、フリップ角を９０°よりかなり小さくし後続のエコーのためにｚ方向に十分な磁化を残すことが重要である。パルス角αは、後続のループ反復においても同じとなるように選択することや、あるいは可変とすることもある。例えば角度αを各反復において増加させ、等しい量の横方向磁化が生成されるようにし、かつ最終のαパルスは９０°パルスとなるようにすることがある。こうしたスキームによれば、利用可能な磁化が最も効率よく利用されることになる。ここでもαパルスに続く１８０°パルスは、スピンエコーを生成する役割をする。このスピンエコーは、ＮＭＲ分光計の受信器によって検出される。このエコーをフーリエ変換するとＮＭＲスペクトルが得られる。
【００８０】
第２のバイポーラ傾斜対は、第１の対の影響を「巻き戻す（ｒｅｗｉｎｄｉｎｇ）」目的をもっている。このことは、先頭の傾斜パルスの影響下でデフェーズを受けたスピンの集団がここでリフェーズを同じ量だけ受けることになることを意味する。しかしこれは、静的なスピン集団に対してのみ当てはまる。分子拡散のために第１と第２の傾斜対の間の期間（Δｉｎｉｔ）中にスピンが移動すると、第２の傾斜対によってデフェーズが完全には補償されないことになる。したがって、エコーの振幅がこれに応じて低下することになり、またその減衰の度合いは傾斜の強度及び持続時間、ＮＭＲパルスシーケンス・タイミング（特に、Δｉｎｉｔ）、並びに核スピンの拡散係数（すなわち、ＮＭＲ感受性核スピンを含む対応する分子）に依存することになる。これが、ＮＭＲを用いて拡散計測を実行する原理である。ＮＭＲスペクトルの対応する「ピーク」がこの減衰を反映することになる。サンプル内に複数のＮＭＲ「視認可能な（ｖｉｓｉｂｌｅ）」分子種が存在する場合、かつ異なる分子が異なる拡散係数を有する場合、ＮＭＲスペクトルの対応するピークは異なる程度まで減衰を受けることになる。したがって、そのそれぞれの拡散の度合いに従って種を識別することが可能である。
【００８１】
後続のループ反復では、初期磁場傾斜対と対応するエコーを読み出す前の対との印加の間の該当する時間はΔｉｎｉｔより大きくなる。ｎ番目のエコーでは、この時間はΔｎ＝Δｉｎｉｔ＋（ｎ−１）・Δとなり、分子拡散による減衰の程度が異なることになる。次いで、スペクトル内でΔｎの関数としてプロットされた各ピークのＮＭＲ信号強度の「包絡線（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）」から拡散係数を計算することができる。
【００８２】
上で簡単に言及したように、初期９０°−１８０°−９０°パルスによって生成された状態もいわゆるスピン格子緩和すなわちＴ１緩和を受ける。このことは、拡散係数を計算する際に考慮に入れる必要がある。しかし、ＮＭＲパルスシーケンスのタイムスケールと比べてＴ１が非常に長い場合、ＮＭＲ信号（複数のこともある）のＴ１緩和による減衰は無視することができる。
【００８３】
エコーの減衰はＴ１緩和と拡散の両方に由来する。この２つの機構を識別するには、第２のシーケンスを２回（傾斜なしで１回また拡散傾斜を伴った１回）実行することができる。拡散計測のための参照スキャンの役割をする以外に、傾斜なしの第２のシーケンスは、同様にシングルスキャンＴ１計測と見なすこともできる。しかし、過偏極種のＴ１緩和時間は一連の低フリップ角パルスによって容易に得られる。第２のシーケンスが過偏極磁化の一部が保全されるように十分に短ければ、第２のシーケンスに続いて低フリップ角Ｔ１シーケンスが直ちに実行されることがある。
【００８４】
リガンドは任意の位置において、例えば１３Ｃまたは１５Ｎを高濃度化することが可能である。この位置の選択は、標的に結合したときにリガンド全体の拡散定数が影響を受けるため、純粋に局所的なＴ１緩和時間の最大化に基づいて実施することができる。実際には、結合が発生してもその緩和特性が影響を受けない高濃度化箇所を選択することが好ましい。高濃度化位置の決定に関するこの相対的な自由さが、緩和時間や化学シフトの変化に依存するために計測中の過偏極磁化の破壊の加速に影響されることがあるような別のＮＭＲ方法に対して、拡散ベース結合評価の潜在的な利点となっている。
【００８５】
上述の実施形態では、サンプルの過偏極によりもたらされる感度の増大を十分に利用するようにパルスシーケンスを設計し適応させる方法に関する多くの例を提供した。様々なタイプのＮＭＲスペクトロスコピーやイメージングで使用される別のパルスシーケンスも、過偏極サンプルと共に使用できるように同様の方法によって有利に適応させることが可能であることは当業者には明らかであろう。最近提唱された比較的高速で高度なＮＭＲ法（例えば、Ｌ．Ｆｒｙｄｍａｎらによる「Ｔｈｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｃａｎ」（Ｐｒａｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，９９：１５８５８〜６２，Ｄｅｃ  １０，  ２００２）に記載されているような方法）が特に興味深い。この方法では、複数の（数十または数百の）空間位置特定された部分、すなわちスライスにサンプルを区分するために撮像傾斜を使用する。各スライスはシングルＮＭＲスキャンを受け、すべてのスライスからの信号が同時に監視される。この方式は実質的に、多次元試行を１回のスキャンまで圧縮していると共に、計測時間を劇的に短縮させている。この方法やその他のシングルスキャン法は、計測時間に関して大きな改良を示すが信号対雑音比が悪いという欠点を有しており、このため極めて感度が高い器具を使用する必要がある。これらのケースでは、過偏極サンプルを使用すると、過偏極サンプルからの信号強度の増大によって信号対雑音比の本質的な改良が提供されるため、非常に有利となる。過偏極により設定される要件を満足させるためには、上述の実施形態で例証したように新規で高速な方法が必要である。
【００８６】
本発明について最も実用的でありかつ好ましい実施形態であると目下のところ考えられる形態に関連して記載してきたが、本発明は開示した実施形態に限定されるものではなく、それどころか添付の特許請求の範囲の趣旨の域内に包含される様々な修正や等価的構成を含むように意図していることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１ａ】本発明の第１の実施形態で取得されるＮＭＲスペクトルの例を表した図である。
【図１ｂ】本発明の第１の実施形態で取得されるＮＭＲスペクトルの例を表した図である。
【図２ａ】本発明の第２の実施形態によるパルスシーケンスの模式図である。
【図２ｂ】本発明の第２の実施形態によるパルスシーケンスの模式図である。
【図３ａ】本発明の第３の実施形態によるパルスシーケンスによって使用される２次元空間の軌道の図である。
【図３ｂ】本発明の第３の実施形態によるパルスシーケンスによって使用される２次元空間の軌道の図である。
【図４】本発明の第４の実施形態によるパルスシーケンスの模式図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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