(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在について評価する工程を含み、その際、Ｍａファミリーポリペプチドが、
a）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
b）Ｍａ１（配列番号：４）、
c）Ｍａ２（配列番号：７）、
d）Ｍａ３（配列番号：９）、
e）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
f）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択され、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在が新生物の存在と関連する神経学的障害の存在を示す、個体における新生物の存在と関連する神経学的障害の検出方法。
【請求項２】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ１である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ２である請求項１記載の方法。
【請求項４】
新生物の存在と関連する神経学的障害が、腫瘍随伴性辺縁系脳炎もしくは脳幹脳炎、または腫瘍随伴性辺縁系脳炎および脳幹脳炎の両方である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の非存在について評価する工程を含み、その際、Ｍａファミリーポリペプチドが、
a）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
b）Ｍａ１（配列番号：４）、
c）Ｍａ２（配列番号：７）、
d）Ｍａ３（配列番号：９）、
e）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
f）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択され、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の非存在が新生物の存在と関連する神経学的障害の非存在を示す、個体における新生物の存在と関連する神経学的障害の検出方法。
【請求項６】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ１である請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ２である請求項５記載の方法。
【請求項８】
新生物の存在と関連する神経学的障害が、腫瘍随伴性辺縁系脳炎もしくは脳幹脳炎、または腫瘍随伴性辺縁系脳炎および脳幹脳炎の両方である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ａ）  存在する場合、抗体がＭａファミリーポリペプチドに結合可能な条件下、個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドが、
1）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
2）Ｍａ１（配列番号：４）、
3）Ｍａ２（配列番号：７）、
4）Ｍａ３（配列番号：９）、
5）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
6）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択される、Ｍａファミリーポリペプチド試料に接触させ、それにより接触試料を生成させる工程；並びに
ｂ）  接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を、基準量と比較する工程、
を含み、接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量が基準量と同じか又は基準量より多いことが、新生物の存在と関連する神経学的障害の存在を示す、個体における新生物の存在と関連する神経学的障害の検出方法。
【請求項１０】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１を含有してなる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ２を含有してなる請求項９記載の方法。
【請求項１２】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１及びＭａ２を含有してなる請求項９記載の方法。
【請求項１３】
試験試料が、血液、血清、脳脊髄液、尿、鼻分泌物及び唾液からなる群より選ばれる試料を含有してなる請求項９記載の方法。
【請求項１４】
試験試料が、体液又は体組織の試料から単離された抗体を含有してなる請求項９記載の方法。
【請求項１５】
ａ）  存在する場合、抗体がＭａファミリーポリペプチドに結合可能な条件下、個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドが、
1）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
2）Ｍａ１（配列番号：４）、
3）Ｍａ２（配列番号：７）、
4）Ｍａ３（配列番号：９）、
5）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
6）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択される、Ｍａファミリーポリペプチド試料に接触させ、それにより接触試料を生成させる工程；並びに
ｂ）  接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を、基準量と比較する工程、
を含み、接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量が基準量より少ないことが、新生物の存在と関連する神経学的障害の非存在を示す、個体における新生物の存在と関連する神経学的障害の検出方法。
【請求項１６】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１を含有してなる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ２を含有してなる請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１及びＭａ２を含有してなる請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
試験試料が、血液、血清、脳脊髄液、尿、鼻分泌物及び唾液からなる群より選ばれる試料を含有してなる請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
試験試料が、体液又は体組織の試料から単離された抗体を含有してなる請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
ａ）  存在する場合、抗体がＭａファミリーポリペプチドに結合可能な条件下、個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドが、
1）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
2）Ｍａ１（配列番号：４）、
3）Ｍａ２（配列番号：７）、
4）Ｍａ３（配列番号：９）、
5）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
6）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択される、Ｍａファミリーポリペプチド試料に接触させ、それにより接触試料を生成させる工程；
ｂ）  接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を測定する工程；並びに
ｃ）  接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を、少なくとも１つの比較陰性対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量と比較する工程、
を含み、接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量が比較陰性対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量よりも有意に多いことが、新生物の存在と関連する神経学的障害の存在を示す、個体における新生物の存在と関連する神経学的障害の検出方法。
【請求項２２】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１を含有してなる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ２を含有してなる請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１及びＭａ２を含有してなる請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
試験試料が、血液、血清、脳脊髄液、尿、鼻分泌物及び唾液からなる群より選ばれる試料を含有してなる請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
試験試料が、体液又は体組織の試料から単離された抗体を含有してなる請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
ａ）  存在する場合、抗体がＭａファミリーポリペプチドに結合可能な条件下、個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドが、
1）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
2）Ｍａ１（配列番号：４）、
3）Ｍａ２（配列番号：７）、
4）Ｍａ３（配列番号：９）、
5）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
6）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択される、Ｍａファミリーポリペプチド試料に接触させ、それにより接触試料を生成させる工程；
ｂ）  接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を測定する工程；並びに
ｃ）  接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を、少なくとも１つの比較陰性対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量と比較する工程、
を含み、接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量が比較陰性対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量よりも有意に多くないことが、新生物の存在と関連する神経学的障害の非存在を示す、個体における新生物の存在と関連する神経学的障害の検出方法。
【請求項２８】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１を含有してなる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ２を含有してなる請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１及びＭａ２を含有してなる請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
試験試料が、血液、血清、脳脊髄液、尿、鼻分泌物及び唾液からなる群より選ばれる試料を含有してなる請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
試験試料が、体液又は体組織の試料から単離された抗体を含有してなる請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在について評価する工程を含み、その際、Ｍａファミリーポリペプチドが、
a）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
b）Ｍａ１（配列番号：４）、
c）Ｍａ２（配列番号：７）、
d）Ｍａ３（配列番号：９）、
e）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
f）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択され、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在が新生物の存在を示す、個体における新生物の検出方法。
【請求項３４】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ１である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
新生物が、乳癌、結腸癌、耳下腺癌、肺癌、精巣癌及び生殖細胞腫からなる群より選ばれる請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ２である請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
新生物が、精巣癌もしくは生殖細胞腫、または精巣癌および生殖細胞腫の両方である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
個体由来の試験試料を、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在又は非存在について評価する工程を含み、その際、Ｍａファミリーポリペプチドが、
a）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
b）Ｍａ１（配列番号：４）、
c）Ｍａ２（配列番号：７）、
d）Ｍａ３（配列番号：９）、
e）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
f）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択され、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の非存在が新生物の非存在を示す、個体における新生物の検出方法。
【請求項３９】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ１である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
新生物が、乳癌、結腸癌、耳下腺癌、肺癌、精巣癌及び生殖細胞腫からなる群より選ばれる請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ＭａファミリーポリペプチドがＭａ２である請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
新生物が、精巣癌もしくは生殖細胞腫、または精巣癌および生殖細胞腫の両方である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
a）Ｍａファミリーポリペプチドが、
1）脳もしくは精巣により、または脳および精巣の両方により発現され、かつＭａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）、およびＭａ５（配列番号：１３）からなる群より選択される1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチド、
2）Ｍａ１（配列番号：４）、
3）Ｍａ２（配列番号：７）、
4）Ｍａ３（配列番号：９）、
5）Ｍａ４（配列番号：１１）、ならびに
6）Ｍａ５（配列番号：１３）
からなる群より選択される、Ｍａファミリーポリペプチド試料
b）抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体に結合する検出用抗体
を含んでなる、新生物の存在と関連する神経学的障害の診断に使用するキット。
【請求項４４】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１を含有してなる請求項４３記載のキット。
【請求項４５】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ２を含有してなる請求項４３記載のキット。
【請求項４６】
Ｍａファミリーポリペプチド試料がＭａ１及びＭａ２を含有してなる請求項４３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｍａファミリーポリペプチド及び抗−Ｍａ抗体に関する。
本発明は、国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ）の助成金ＮＳ−２６０６４及び国立ガン研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の助成金０８７４８により、全体又は一部が支援された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍随伴性症候群として知られる、特定の神経学的障害を伴う癌の併発の存在は、広範囲の、又は侵襲性の（ｉｎｖａｓｉｖｅ）研究をしばしば必要とし、あるいは剖検により確認される。腫瘍随伴性症状は、通常、癌の検出に先行し、神経系のいずれかの部分に影響することがあり、癌自体よりも衰弱性であることが多い。腫瘍随伴性辺縁系脳炎（ＰＬＥ）は、これらの症候群の１つであり、１９６８年に最初に認知された（コーセリス（Ｃｏｒｓｅｌｌｉｓ）、Ｊ．Ａ．Ｎ．ら、Ｂｒａｉｎ  ９１：４８１〜４９６頁（１９６８））。ＰＬＥの顕現性の症状としては、被刺激性、うつ病、発作、重度の記憶欠如及び痴呆である。これらの症状は、主要な病理学的関連部分（海馬、扁桃、視床下部ならびに島皮質及び帯状皮質）を有する神経系の領域に相関するが、ほとんどの研究では、脳幹脳炎（ＢＥ）及び臨床的に無症候性であったり、なかったりすることがある他の領域における異常も示す（バクハイト（Ｂａｋｈｅｉｔ），Ａ．Ｍ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５３：１０８４−１０８８（１９９０）；ヘンソン（Ｈｅｎｓｏｎ），Ｒ．Ａ．及びユーリッチ（Ｕｒｉｃｈ），Ｈ．、Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケイションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、オックスフォード、米国、１９８９、３１４〜３４５頁）。
【０００３】
臨床症状の多様性及び特異的マーカーがないことがよくあることにより、ＰＬＥは診断されにくい。既知の癌の患者において、ＰＬＥの症状は、脳への転移、毒性及び代謝性脳障害、感染症並びに癌治療の副作用を含む他の合併症に属し得る。患者の約６０％では、ＰＬＥは腫瘍の検出に先行し、その臨床的認知をなおさら困難にする（ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．ら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７１：５９−７２（１９９２）；アラモウィッチ（Ａｌａｍｏｗｉｔｃｈ），Ｓ．ら、Ｂｒａｉｎ  １２０：９２３−９２８（１９９７））。ＭＲＩ検査における近心側頭葉に関連する異常の所見は、ＰＬＥの疑いを生ずることがあるが、診断は確定しない。
【０００４】
神経系に影響する腫瘍随伴性症候群のいくつかは、ニューロンタンパク質及び原因となる腫瘍と反応する抗体〔オンコニューロナル（ｏｎｃｏｎｅｕｒｏｎａｌ）抗原〕に関連する（グリーンリー（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ），Ｊ．Ｅ．、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ  １２：１０２（１９８２）；グラウス（Ｇｒａｕｓ），Ｆ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３５：５３８−５４３（１９８５）；ブッデ−ステフェン（Ｂｕｄｄｅ−Ｓｔｅｆｆｅｎ），Ｃ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２３：５２８−５３１（１９８８）；ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．及びポスナー（Ｐｏｓｎｅｒ），Ｊ．Ｂ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：３１８−３２８（１９９７））。これらの抗体のいくつかは、異なる型の癌に関連する特定の神経学的疾患症候群のマーカーである（ファーネアウックス（Ｆｕｒｎｅａｕｘ），Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：１８４４−１８５１（１９９０）；ルーク（Ｌｕｑｕｅ），Ｆ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２９：２４１−２５１（１９９１）；ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．ら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７１：５９−７２（１９９２））。いくつかの抗体の存在は非常に特異的であるため、以前に脳の生検により、又は剖検により同定された疾患は、今では血清学的に診断され得る（ヘンソン（Ｈｅｎｓｏｎ），Ｒ．Ａ．ら、Ｂｒａｉｎ８８：４４９−４６４（１９６５）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ），Ｎ．Ｅ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４：５５９−５６７（１９８８）；ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２７：５４４−５５２（１９９０）；ポスナー（Ｐｏｓｎｅｒ），Ｊ．Ｂ．（編）、Ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、フィラデルフィア、ＦＡ  デイビス社（ＦＡＤａｖｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、３５３〜３８５頁（１９９５））。腫瘍によるニューロンタンパク質の発現は、そうでなければ正常なニューロンタンパク質にとって、免疫寛容が破壊される、おそらく非常に重要な工程である（カーペンティア（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ）ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：Ａ３５４−３５５（１９９８））。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに、特徴的な抗ニューロン抗体が、数種の腫瘍随伴性障害のみにおいて、発見されている。臨床症状の多様性及び特異的マーカーがないことがよくあることに加え、腫瘍随伴性症候群の衰弱性の性質のため、腫瘍随伴性症候群を診断する新しい手段を同定することが重要である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｍａファミリーポリペプチドの活性若しくは機能的誘導体又は断片に加え、単離されたＭａファミリーポリペプチド、特に、Ｍａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）及びＭａ５（配列番号：１３）に関する。また、本発明は、Ｍａファミリーポリペプチドをコードする核酸及び調節配列に作動可能に連結された、本明細書に記載の核酸分子を含有してなる核酸構築物、並びに調節配列に作動可能に連結された、本明細書に記載の核酸分子を含有してなる組換え宿主細胞に関する。また、本発明は、Ｍａファミリーポリペプチド又はその活性誘導体又は断片に選択的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合性断片に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、（例えば、体液若しくは体組織の、又は体液若しくは体組織から単離された抗体の）試験試料を、Ｍａ１及び／又はＭａ２等のＭａファミリーポリペプチドに結合する抗体の存在、非存在又は量について評価することによる、個体における腫瘍随伴性症候群の診断方法に関する。Ｍａファミリーポリペプチドに結合する抗体の存在は、腫瘍随伴性症候群の存在を示し；Ｍａファミリーポリペプチドに結合する抗体の非存在は、腫瘍随伴性症候群の非存在を示す。本発明は、さらに、（例えば、体液若しくは体組織の、又は体液若しくは体組織の試料から単離された抗体の）試験試料を、Ｍａ１及び／又はＭａ２等のＭａファミリーポリペプチドに結合する抗体の存在、非存在又は量について評価することによる、個体における新生物の診断方法に関する。Ｍａファミリーポリペプチドに結合する抗体の存在は、新生物の存在を示し；Ｍａファミリーポリペプチドに結合する抗体の非存在は、新生物の非存在を示す。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチド
このように、本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリヌクレオチド産物に加え、単離されたＭａファミリーポリペプチドに関する。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーをいい、特定の鎖長のものではなく；従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲に含まれる。本明細書で使用する「Ｍａファミリーポリペプチド」は、脳及び／又は精巣により発現され、Ｍａ１、Ｍａ２、Ｍａ３、Ｍａ４及び／又はＭａ５とかなりの同一性を共有するポリペプチドをいう。「かなりの同一性を共有する」ポリペプチドとは、Ｍａ１、Ｍａ２、Ｍａ３、Ｍａ４及び／又はＭａ５と、約７５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。低度の同一性を示すポリペプチドも、特に、ポリペプチドの１以上の特定のドメインにおいて、Ｍａ１、Ｍａ２、Ｍａ３、Ｍａ４及び／又はＭａ５と、高度の、例えば、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸同一性を示す場合、有用であり、Ｍａファミリーポリペプチドとみなすことができる。例えば、抗体結合性活性を含む特定の活性に必要なドメインにおいて、高度の同一性を共有するポリペプチドは、これに含まれる。本発明の好ましい態様において、Ｍａファミリーポリペプチドは、Ｍａ１（配列番号：４）、Ｍａ２（配列番号：７）、Ｍａ３（配列番号：９）、Ｍａ４（配列番号：１１）又はＭａ５（配列番号：１３）である。また、「Ｍａファミリーポリペプチド」という用語は、脳及び／又は精巣により発現され、Ｍａ１、Ｍａ２、Ｍａ３、Ｍａ４及び／又はＭａ５に特異的に結合する抗体により認識されるポリペプチドを含む。本発明のＭａファミリーポリペプチドは、部分的に、又は実質的に精製（例えば、同種に精製）され得る。
【０００９】
本発明のＭａファミリーポリペプチドは、種々の方法により、組換え細胞培養物から単離又は精製（例えば、同種に）され得る。「単離された」ポリペプチドは、その天然の状態において伴う成分からの分離などにより、天然で会合する成分を実質的に含まない。したがって、化学的に合成されたり、又はそれが天然に存在する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、天然で会合する成分を実質的に含ないであろうから、「単離された」とみなされる。単離の方法には、限定されないが、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフニティークロマトグラフィー並びに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。使用される特定の方法は、ポリペプチドの性質及び宿主細胞の選択に依存し；適切な方法は、当業者に容易にわかるであろう。
【００１０】
本発明によれば、Ｍａファミリーポリペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在するポリペプチド（例えば、Ｍａ１、配列番号：４、Ｍａ２、配列番号：７、Ｍａ３、配列番号：９、Ｍａ４、配列番号：１１又はＭａ５、配列番号：１３）のそれであり得、それにおける改変を含有してなり得る。そのような改変には、保存的又は非保存的アミノ酸置換、１以上のアミノ酸の付加及び欠失が含まれる；しかしながら、そのような改変は、Ｍａファミリーポリペプチドの少なくとも１つの活性を保存すべき、すなわち、改変又は変異体ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの活性又は機能的誘導体であるべきである。例えば、変異体は、好ましくは、元のポリペプチドの抗体結合部位の三次元立体配置を保存し得る。また、断片は、結合のための免疫学的エピトープの共有に加えて、免疫原性機能等の他の免疫学的活性を保持する。
【００１１】
Ｍａファミリーポリペプチド活性の存在又は非存在は、限定されないが、抗−Ｍａ抗体（すなわち、Ｍａ１又はＭａ２に対する抗体）又は抗−Ｔａ抗体（すなわち、Ｍａ２に対する抗体）の該ポリペプチドへの結合のアッセイを含む種々の標準的な機能アッセイにより決定される。さらに、Ｍａファミリーポリペプチドの機能に必須のアミノ酸は、当該分野で既知の方法により同定することができる。特に有用な方法には、免疫グロブリン遺伝子のスーパーファミリーにおける保存アミノ酸の同定、部位特異的突然変異誘発及びアラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異誘発（例えば、カニングハム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）及びウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））、結晶化及び核磁気共鳴が含まれる。これらの方法により生成させた改変ポリペプチドは、免疫原性及び抗原性を含む特定の生物学的活性について試験され得る。
【００１２】
具体的には、適当なアミノ酸改変は、疎水性、塩基性若しくは酸性の特性、荷電、極性、サイズ、官能基（例えば、−ＳＨ又はグリコシル化部位）の存在又は非存在及び芳香族特性を含むいくつかの基準に基づいて行うことができる。上述の性質に基づく、種々のアミノ酸の類似基への割り振りは、当業者に容易にわかるだろう；さらに、適切なアミノ酸変化は、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０））にも見ることができる。
【００１３】
本発明のＭａファミリーポリペプチドの他の改変には、例えば、グリコシル化、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種で）、酵素的修飾、アミノ酸（例えば、天然アミノ酸を含む）のアナログの取り込み、置換された結合（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｌｉｎｋａｇｅｓ）及び当該分野において既知の修飾が含まれ、共に、天然および非天然に存在する。
【００１４】
本明細書に記載の本発明は、本明細書に記載の単離されたポリペプチドの断片にも関連する。「断片」という用語は、単離されたポリペプチドの、上述したような（例えば、免疫原性又は抗原性機能）１以上の機能又は生物学的活性を保持する、本明細書に記載のポリペプチドの一部分を包含するものとする。例えば、断片は、少なくとも約２０個の隣接するアミノ酸から少なくとも約２００個の隣接するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０個のアミノ酸、よりいっそう好ましくは少なくとも約１００個のアミノ酸、よりいっそう好ましくは少なくとも約１５０個のアミノ酸であり得る。
【００１５】
また、Ｍａファミリーポリペプチドは、１以上の付加的成分に融合した、Ｍａファミリーポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を含有する融合タンパク質であり得る。代表的な融合パートナーには、免疫グロブリン、細菌性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、及び酵母α接合因子が含まれる。放射性同位体及び抗原性タグ等の付加的成分は、ポリペプチドの単離又は精製を補助したり、又はポリペプチドの半減期を延長するために選択することができ；例えば、ヘキサヒスチジンタグにより、ニッケルクロマトグラフィーによる精製が容易になるだろう。さらに、本発明のポリペプチドは、Ｍａファミリーポリペプチドの前駆体でありえ；前駆体は、切断されて活性なＭａファミリーポリペプチドを形成する分子である。
【００１６】
本明細書に記載のＭａファミリーポリペプチドは、天然に存在する供給源から単離されるか、化学的に合成されるか、又は組換え的に製造され得る。例えば、本明細書に記載の核酸分子は、細菌又は真核細胞によるプロセスを介し、コードされたポリペプチドの組換え型を製造するのに使用することができる。ポリヌクレオチド配列の、発現ベクター等の遺伝子構築物へのライゲーション、及び真核（酵母、トリ類、昆虫、植物又は哺乳類）又は原核（細菌細胞）のいずれかの宿主への形質転換又はトランスフェンクションは、他の周知のタンパク質の製造に使用される標準法である。同様の方法、又はその変形法は、細菌による手段又は組織培養技術により、本発明による組換えポリペプチドの製造に使用することができる。
【００１７】
本発明の核酸
また、本発明は、上述のＭａファミリーポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関連する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）又はｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ等のＤＮＡであり得る。ＤＮＡ分子は、二本鎖又は一本鎖でありえ；一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡは、コード（センス）鎖又は非コード（アンチセンス）鎖のいずれかであり得る。好ましくは、核酸分子は、少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチド、よりいっそう好ましくは約６０個の隣接するヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１００個の隣接するヌクレオチド、よりいっそう好ましくは少なくとも約１５０個の隣接するヌクレオチド、よりいっそう好ましくは少なくとも約３００個の隣接するヌクレオチドを含有する。核酸分子は、Ｍａファミリーポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも断片をコードするポリヌクレオチドのみであり得；また、核酸分子は、イントロン及び非コード３’及び５’配列（例えば、調節配列を含む）等の付加的な非コード配列とともに、Ｍａファミリーポリペプチドをコードする核酸の少なくとも断片を含み得る。さらに、核酸分子は、ポリペプチドの単離又は精製を補助するために、マーカー配列、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。このような配列には、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質をコードするもの、及びインフルエンザ由来の血球凝集素Ａ（ＨＡ）ペプチドマーカーをコードするものが含まれる。好ましい態様において、核酸分子は、Ｍａ１（配列番号：３）をコードする配列；Ｍａ２（配列番号：６）をコードする配列；Ｍａ３（配列番号：８）をコードする配列；Ｍａ４（配列番号：１０）をコードする配列；又はＭａ５（配列番号：１２）をコードする配列を有する。
【００１８】
本明細書で使用されているように、「単離された」又は「実質的に純粋な」核酸分子は、通常（天然で）、その遺伝子又はヌクレオチド配列をフランキングする（ゲノム配列におけるように）、及び／又は、他の転写された配列から完全に又は部分的に精製されている（ｃＤＮＡ又はＲＮＡライブラリーにおけるように）ヌクレオチド配列にフランキングされていないヌクレオチド配列を意味するものとする。このように、単離されたヌクレオチド配列は、化学的に、又は組換え手段により合成されたヌクレオチド配列を含み得る。したがって、ベクターに含まれる組換えＤＮＡは、本明細書に使用されるような「単離された」という定義に含まれる。また、単離されたヌクレオチド配列は、溶液中の部分的又は実質的に精製されたＤＮＡ分子に加えて、異種宿主細胞内の組換えＤＮＡ分子を含む。本発明のＤＮＡ分子のインビボ及びインビトロＲＮＡ転写物も、「単離された」ヌクレオチド配列に包含される。このような単離されたヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質の製造において、相同配列の単離用（例えば、他の哺乳類種から）、遺伝子マッピング用（例えば、染色体とのインサイチューハイブリダイゼーションにより）、又はノーザンブロット分析等による、Ｍａファミリーポリペプチドの組織内（例えば、ヒト組織）での発現の検出用のプローブとして有用である。
【００１９】
また、本発明は、必ずしも天然には見られないが、Ｍａファミリーポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このように、天然に存在するヌクレオチド配列とは異なる配列を含有するが、遺伝コードの縮重により、本発明のＭａファミリーポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、本発明の主題である（例えば、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１又は配列番号：１３をコードする核酸分子）。また、本発明は、Ｍａファミリーポリペプチドの一部、アナログ又は誘導体をコードするもの等、本発明のヌクレオチド配列の変異を包含する。このような変異は、対立遺伝子変異の場合のように天然に存在するものでありえ、又は、種々の変異原及び変異誘発手法により誘発されたもの等の非天然に存在するものであり得る。意図される変異は、限定されないが、付加及び欠失を含む保存的又は非保存的アミノ酸変化をもたらし得る、１以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換を含む。好ましくは、ヌクレオチド又はアミノ酸の変異は、サイレントである若しくは保存されている；すなわち、それらは、Ｍａファミリーポリペプチドの特性又は活性を変更しない。
【００２０】
本発明の核酸分子の他の変形は、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート類、ホスホトリエステル類、ホスホアミデート類、カルバメート類）等の標識、メチル化、ヌクレオチド間修飾、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類）、ペンダント部（例えば、ポリペプチド類）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ））、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えば、アルファ芳香族核酸）を含み得る。また、水素結合及び他の化学的相互作用を介しての指定の配列に結合する能力において核酸分子をまねる合成分子が含まれる。そのような分子は、例えば、分子の主鎖においてペプチド結合がリン酸結合に置き換わるものを含む。
【００２１】
また、本発明は、本明細書に記載の単離された核酸分子の断片に関する。「断片」という用語は、上述のＭａファミリーポリペプチドの断片をコードする部分等の、本明細書に記載の核酸配列の一部を包含するものとする。例えば、断片は、少なくとも約１５個の隣接するヌクレオチドから少なくとも約３００個の隣接するヌクレオチド又はそれ以上の長さの核酸の一部であり得る。１以上のイントロンも存在し得る。そのような断片は、例えば、診断方法用のプローブとして、及び、プライマー又はプローブとして有用である。特に好ましいプライマー及びプローブは、本明細書に記載のＭａファミリーポリペプチドをコードする核酸分子に、選択的にハイブリダイズする。例えば、本明細書に記載のＭａファミリーポリペプチドの抗原性領域をコードする断片は有用である。
【００２２】
また、本発明は、媒体下、より好ましくは高度にストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、選択的ハイブリダイゼーション用）、本明細書に記載の核酸分子の一部にハイブリダイズする核酸分子に関する。適切なストリンジェンシー条件は、当業者に知られており、あるいは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、（１９９８）、６．３．１．−６．３．６．等の標準テキストに見出すことができる。そのようなハイブリダイズ可能な核酸分子は、診断用途用のプローブ又はプライマーとして有用である。例えば、サザン・ブロッティングのための高度にストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、算出したＴｍ（Ｔｍは、プローブのヌクレオチド配列に基づき、各プローブについて計算することができる）よりも約１２〜２０℃低い温度での条件を含み；また、高度にストリンジェンシーな条件は、低塩条件を含む。
【００２３】
従って、本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列と実質的に同一性を有する核酸分子に関する。特に、本明細書に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸分子が好ましい。また、この場合、本明細書に記載のＭａファミリーポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が特に好ましい。例えば、Ｍａファミリーポリペプチドと同じ又は類似の免疫原性又は抗原性を有するポリペプチドをコードする好ましい核酸分子は、本発明の範囲内である。全体的に低度の相同性を有する核酸分子も、それらがポリペプチドの断片において実質的に同一性を有するならば、本明細書に含まれる。例えば、Ｍａファミリーポリペプチドは、それぞれ、セグメントを含み（約１５個のヌクレオチドから約１００個のヌクレオチドの範囲であり、１２０個から３６０個までのヌクレオチドのセグメントを含む）、互いに実質的に相同性を有する（少なくとも６０％から少なくとも９５％の範囲）。Ｍａ１及びＭａ２は、独立した５つのセグメントにおいて、６０％から７６．５％の範囲の実質的な同一性を共有する：Ｍａ２のヌクレオチド１１〜３８及びＭａ１のヌクレオチド６７８〜７０５（７１．４％相同）；Ｍａ２のヌクレオチド７８〜１０９及びＭａ１のヌクレオチド７４５〜７７６（６８．８％相同）；Ｍａ２のヌクレオチド１５０〜１６５及びＭａ１のヌクレオチド８１４〜８２９（６０％相同）；Ｍａ２のヌクレオチド１８４〜２００及びＭａ１のヌクレオチド８４６〜８６４（７６．５％相同）；Ｍａ２のヌクレオチド２４６〜３４１及びＭａ１のヌクレオチド９１０〜１００５（７４％相同）。いくつかのセグメントにおける実質的な相同性は、コードされたポリペプチドが密接に関連していることを示す。したがって、Ｍａファミリーポリペプチドに対して同様に全体的に低度の相同性を有するが、Ｍａファミリーポリペプチドの１以上の領域に対して実質的な相同性を有する核酸分子は、本発明に包含される。
【００２４】
また、本発明は、Ｍａファミリーポリペプチド又はその活性な誘導体若しくは断片をコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。このようなベクターの多くは、商品として入手可能であり、他の好適なベクターは、当業者により容易に作製され得る。「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が可能なように調節配列に連結されることを意味するものとする。調節配列は、当該分野において認知されており、Ｍａファミリーポリペプチド又はその活性な誘導体を生成するように選択される。したがって、「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び、ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州、（１９９０）に記載された他の発現調節要素を含む。例えば、元の調節配列又は形質転換された宿主細胞の元の調節配列を使用することができる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主の選択及び／又は発現させたいタンパク質の型等の因子に依存するかもしれないということを理解されたい。例えば、本発明の核酸分子にコードされるポリペプチドは、クローン化遺伝子又はその一部を、原核細胞、真核細胞又はその両方のいずれかにおいて、発現に好適なベクターにライゲートすることにより製造することができる（例えば、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｍ．イノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ）編、（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８３）、８３頁；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒｔａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９）、第１６章及び第１７章を参照のこと）。典型的には、発現構築物は、限定されないが、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、及びネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン及びストレプマイシン耐性へ耐性を付与する遺伝子を含む、１以上の選択マーカーを含むであろう。また、ベクターは、例えば、自律複製配列（ＡＲＳ）、発現調節配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、分泌シグナル及びｍＲＮＡ安定化配列を含み得る。
【００２５】
記載のベクターにより形質転換された原核宿主細胞及び真核宿主細胞も、本発明により提供される。例えば、本発明のベクターで形質転換され得る細胞は、限定されないが、大腸菌（例えば、大腸菌Ｋ１２株）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等の細菌細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を含む昆虫細胞（バキュロウィルス）、酵母細胞等のカビ細胞、植物細胞、並びに、胸腺細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞等の哺乳類細胞を含む。宿主細胞は、記載のベクターにより、種々の方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又は他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフェクション、ベクターがレトロウィルスゲノム等の感染性の作因である感染、及びその他の方法）により、細胞宿主の型に基づいて形質転換され得る。
【００２６】
本発明の核酸分子は、例えば、上述のように、好適な宿主細胞における複製により製造することができる。他方、核酸分子は化学合成によっても製造できる。
【００２７】
本発明の抗体
また、本発明は、１つのＭａファミリーポリペプチド（又は、複数のポリペプチド）に結合する単離された抗体又は抗原結合性断片に関する。例えば、非ヒト抗体及びヒト抗体、ヒト化された抗体、キメラ抗体及びその抗原結合性断片を含む、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・ウィリー＆サンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、（１９９４）；欧州特許出願第１７３，４９４号、（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ））；国際公開第８６／０１５３３号（ニューバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）；及び米国特許第５，２２５，５３９号（ウィンターズ（Ｗｉｎｔｅｒｓ）））は、記載のＭａファミリーポリペプチドに結合し、本発明の範囲内である。マウス、ラット、ハムスター又はウサギ等の哺乳類を、免疫原性の型のＭａファミリーポリペプチド（例えば、タンパク質又は抗体応答を誘導することができるタンパク質の抗原性断片を含有するペプチド）で、免疫化することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を付与するための技術には、担体へのコンジュゲーション、又はその他の当該分野で周知の技術が含まれる。タンパク質又はポリペプチドは、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、プラズマ又は血清の抗体力価の検出により監視することができる。抗体の量を評価するために、抗原として免疫原を用い、標準的なＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイを使用することができる。
【００２８】
免疫化の後、抗−ペプチド抗血清を得ることができ、所望により、ポリクロナール抗体を血清から単離することができる。モノクロナール抗体も、当該分野で周知の標準技術により製造することができる（コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；コズバール（Ｋｏｚｂａｒ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４：７２（１９８３）；及びコール（Ｃｏｌｅ）ら、  ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、アラン  Ｒ．リス・インク（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、７７〜９６頁（１９８５））。本明細書で使用の「抗体」という用語は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2 ’等の抗体の断片を含むものとする。そのような抗体は、放射性標識等の標識との組み合わせで、例えば、組織試料からの細胞内の発現されたタンパク質の存在をアッセイするのに使用することができる。そのような抗体も、Ｍａファミリーポリペプチドを単離するために、ＥＬＩＳＡ等の免疫吸着方法において使用することができる。アッセイ可能な組織試料には、霊長類、特にヒト、組織、例えば、分化又は未分化細胞が含まれる。例には、脳及び精巣が含まれる。
【００２９】
本発明の診断方法
ＭａファミリーポリペプチドＭａ１及びＭａ２と、腫瘍随伴性症候群との関連性により、個体由来の試験試料をＭａファミリーポリペプチド（類）に対する抗体の存在又は非存在について評価することにより、今では、個体における腫瘍随伴性症候群の存在又は非存在を診断する方法が得られる。Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在は腫瘍随伴性症候群の存在を示し；Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の非存在は腫瘍随伴性症候群の非存在を示す。本明細書に使用する「腫瘍随伴性症候群」という用語は、新生物（癌）の存在に関連するが、新生物による神経系への直接浸入によるもの、又は治療の副作用、感染症、代謝不良及び栄養不良及び脳血管性障害等の他の合併症によるものでない神経学的障害をいう。好ましい態様では、Ｍａファミリーポリペプチド、Ｍａ１に結合する抗体の存在は、腫瘍随伴性症候群を示す。他の好ましい態様では、Ｍａファミリーポリペプチド、Ｍａ２に結合する抗体の存在は、腫瘍随伴性症候群を示す。特に好ましい態様では、Ｍａ２に結合する抗体の存在は、腫瘍随伴性症候群、腫瘍随伴性辺縁系脳炎及び／又は脳幹脳炎、特に、間脳機能不全を伴うことを示す。１種を超えるＭａファミリーポリペプチド（例えば、Ｍａ１及びＭａ２の両方）に結合する抗体の存在も、腫瘍随伴性症候群の存在を示す。
【００３０】
さらに、個体由来の試験試料をＭａファミリーポリペプチド（類）に対する抗体の存在又は非存在について評価することにより、今では、個体における新生物の存在又は非存在を診断する方法が得られる。腫瘍随伴性症候群は、潜伏性の新生物の発見の前に生ずることが多いため、これらの方法は、神経学的障害を腫瘍随伴性症候群であると同定することにより、新生物の存在の同定を容易にする。さらに、Ｍａファミリーポリペプチド（類）に対する抗体は、腫瘍随伴性の病状が存在しない（すなわち、腫瘍随伴性症候群が存在しない）個体に存在する（例えば、少ない量で）ことがある；本発明の方法は、これらの個体においても同様に新生物の存在の同定を容易にする。Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在は、腫瘍随伴性症候群の存在を示し、従って、新生物の存在を示す。好ましい態様において、ＭａファミリーポリペプチドＭａ１に結合する抗体（例えば、抗−Ｍａ抗体）の存在は、新生物の存在を示す。特に好ましい態様では、新生物は、乳癌、結腸癌、肺癌、精巣癌、生殖細胞腫又は耳下腺癌である。他の好適な態様では、ＭａファミリーポリペプチドＭａ２に結合する抗体（例えば、抗−Ｔａ抗体）の存在は、精巣新生物及び／又は生殖細胞腫又は胚癌の存在を示す。Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の非存在は、腫瘍随伴性症候群の非存在を示し、従って、新生物の非存在を示す。
【００３１】
本発明の方法では、腫瘍随伴性症候群の疑いのある個体などの個体由来の試験試料を使用する。試験試料は、また、癌の疑いがあるが、腫瘍随伴性症候群を示さない個体由来のものであり得る。試験試料は、血液、血清、脳脊髄液、尿、鼻分泌物、唾液、又は他の体液若しくは体組織を含有し得る。また、試験試料は、個体由来の体液又は体組織の試料から単離した抗体を含有し得る。試料が単離された抗体である場合、単離された抗体には、単一の型の抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体）、又はすべての型の抗体が含まれ得；また、１以上の型の抗体（ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、又はＩｇＭ及びＩｇＧ抗体）を単離することができる。好ましい態様では、試験試料は、個体由来の血清試料又は脳脊髄液試料である。
【００３２】
１つのＭａファミリーポリペプチドに対し（又は、１つを超えるＭａファミリーポリペプチドに対し）結合する抗体の存在又は非存在について、試験試料を評価する。本発明の１つの態様では、上述の１つ以上のＭａファミリーポリペプチドを、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体の存在を検出するのに用いることができる。これらの方法では、Ｍａファミリーポリペプチド試料を用いる。本明細書で使用する、用語「Ｍａファミリーポリペプチド試料」とは、Ｍａファミリーポリペプチドあるいはその活性誘導体又は断片を含む試料であり得る。Ｍａファミリーポリペプチド試料は、１つを超えるＭａファミリーポリペプチドあるいは活性誘導体又は断片も含み得る（例えば、Ｍａ１とＭａ２を含むＭａファミリーポリペプチド試料）。好ましい態様では、Ｍａファミリーポリペプチド試料は、Ｍａ１及び／又はＭａ２を含有してなる。Ｍａファミリーポリペプチド試料は、単離されたＭａファミリーポリペプチドの試料であり得る；他方、Ｍａファミリーポリペプチド試料は、Ｍａファミリーポリペプチドを含有してなる試料であり得る（例えば、ヒト脳若しくはラット脳由来のニューロン組織、又はＭａファミリーポリペプチドを含むことが知られている他の組織等の組織片、あるいはＭａファミリーポリペプチドを含むことが知られている組織のホモジェネート）。
【００３３】
Ｍａファミリーポリペプチド試料を個体由来の試験試料に接触させる。Ｍａファミリーポリペプチド試料と個体由来の試験試料との接触により、「接触試料」となり、それは、Ｍａファミリーポリペプチド試料と試験試料の混合物である。もし、Ｍａファミリーポリペプチドに対する抗体が試料中に存在するようであれば、接触試料を、かかる抗体がＭａファミリーポリペプチドに結合可能な適切な条件下に維持する。本明細書で使用する、用語「抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体」又は「抗−Ｍａファミリーポリペプチド自己抗体」とは、上述のＭａファミリーポリペプチドに特異的に結合する抗体をいう。次いで、抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の存在又は非存在を評価する。
【００３４】
本発明の１つの態様では、接触試料中のＭａファミリーポリペプチドに結合した抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を、あるとすれば、基準量と比較する。本明細書で使用する、用語「基準量」とは、腫瘍随伴性症候群又は新生物の診断と相互に関連する抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量をいう。基準量は、例えば、腫瘍随伴性症候群を患っていることがわかっている個体由来の接触試料（例えば、「陽性対照試料」）中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量と、腫瘍随伴性症候群を患っていないことがわかっている個体由来の接触試料（例えば、下記の「陰性対照試料」）中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量とを比較し、かつ疾患と相互に関連する抗体の量を決定することにより、決定し得る。基準量は、接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を決定すると共に、陽性及び／又は陰性対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を決定することにより決定し得る；他方、基準量は、歴史的に決定された量であり得る（即ち、接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を決定する以前に決定された量）。例えば、１つの態様では、「基準量」は、比較対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量より統計的に有意に多い、試験試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量であり得る。１つの態様において、比較対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量より、２標準偏差（ｔｗｏ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）が高い場合には、試験試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチドの量は統計的に有意である。
【００３５】
異なる型の抗体の量（即ち、１つを超える型の抗体の量を含む合計）を、基準量と比較し得る；他方、１つの特定の型の抗体の量（例えば、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体の量）を、基準量と比較し得る。好ましい態様では、抗体はＩｇＧ抗体である。基準量は、接触試料中で評価された抗体と同じ型の抗体の量である：例えば、接触試料についての異なる型の抗体の量の合計（即ち、１つを超える型の抗体を含む）を、基準量と比較する場合には、それらの型の抗体の量の合計を、基準量にも使用する。接触試料中の１つの特定の型の抗体の量（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体の量）を、基準量と比較する場合には、その型の抗体の量を、基準量にも使用する。
【００３６】
１つの態様では、基準量と同じ又は多い量の存在は、腫瘍随伴性症候群（の存在を示す）の診断と相互に関連する。同様に、基準量と同じ又は多い量の存在は、新生物の存在と相互に関連する。基準量より少ない量は、腫瘍随伴性症候群の非存在（を示す）と相互に関連する。同様に、基準量より少ない量の存在は、新生物の非存在と相互に関連する。
【００３７】
本発明の他の態様では、接触試料を評価して、あるとすれば、Ｍａファミリーポリペプチドと結合した抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を決定する。該アッセイで、異なる型の抗体（即ち、１つを超える型の抗体を含む）の量の合計である量を決定できる；他方、該アッセイで、１つの特定の型の抗体の量を決定できる（例えば、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体の量）。好ましい態様では、接触試料を評価し、ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体の量を決定する。
【００３８】
接触試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量を、少なくとも１つの比較陰性対照試料（即ち、腫瘍随伴性症候群に悩まされていない個体由来の試料）中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量と比較する。陰性対照試料は、腫瘍随伴性症候群に悩まされていないいずれかの個体由来の試料であり得る。陰性対照試料は、疾患のない個体に由来する必要はない：例えば、陰性対照試料は、癌を患っているが腫瘍随伴性症候群を患ってはいない個体由来の試料であり得る。「比較」陰性対照試料は、試験試料と同じ型の体液又は体組織の試料である；他方、試験試料が、体液又は体組織の試料から単離された抗体である場合には、比較陰性対照試料は、同じ型の体液又は体組織から単離された抗体の試料である。１つを超える対照試料を用い得る。陰性対照試料のアッセイで、接触試料のアッセイと同じ型の抗体を決定する：例えば、異なる型の抗体（即ち、１つを超える型の抗体を含む）の量の合計を、接触試料について検出する場合には、それらの型の抗体の量の合計も、陰性対照試料について測定される。アッセイで、接触試料中の１つの特定の型の抗体（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体の量）の量を測定する場合には、その型の抗体の量も、陰性対照試料について測定する。好ましい態様では、１つを超える対照試料を用い得る。
【００３９】
固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）若しくは他の固相免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、比濁分析法、電気泳動法、免疫蛍光法、ウエスタンブロット（イムノブロット）又は他の方法（１９９７年までの補遺を含む、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、特にユニット１１．２（ＥＬＩＳＡ）及び１１．１６（特異的抗体力価の測定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｉｔｅｒ））を参照のこと）を含む、標準技術を用いる種々の方法により抗体の量又は抗体の存在若しくは非存在を、決定し得る。好ましい態様では、力価をＥＬＩＳＡで決定する；他の好ましい態様では、抗体の量（又は存在若しくは非存在）をウエスタンブロットで決定する。例えば、該量（又は抗体の存在若しくは非存在）を、Ｍａファミリーポリペプチド試料として、ヒト及び／又はラット脳等のニューロン組織の切片を用いて決定し得る；該切片を試験試料とインキュベートし、次いで、抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の存在若しくは非存在又は量を、検出用抗体又は間接免疫蛍光法等による適切な方法により評価し得る。他の例では、該量（又は抗体の存在若しくは非存在）を、ホモジェナイズしたニューロン組織を用い、ウエスタンブロットにおいてタンパク質を分離することにより決定し得る；次いで、ブロットを試験試料とインキュベートし、次いで、抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の存在若しくは非存在又は量を、検出用抗体又は間接免疫蛍光法等による適切な方法により評価し得る。適切な重量における（例えば、Ｍａファミリーポリペプチドの分子量における）タンパク質バンドの存在は、抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の存在を示す。特に好ましい態様では、Ｍａファミリーポリペプチドは、固体支持体に付着する。典型的には、Ｍａファミリーポリペプチド試料に結合する抗体の量を、抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体に結合する検出用抗体を用いて測定し得る。
【００４０】
比較対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量より有意に多い、試験試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量の存在は、腫瘍随伴性症候群の存在と相互に関連する。比較対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量より有意に多くない、試験試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量の存在は、腫瘍随伴性症候群の非存在と相互に関連する。例えば、免疫組織化学を用いる場合、対照試料中よりも１：５００に希釈した患者の血清中により大きな反応性が存在することは、腫瘍随伴性症候群の診断と相互に関連する；１：５００に希釈した患者の血清中に明確な反応性が存在しないということは、腫瘍随伴性症候群の非存在を示す。他の態様では、ウエスタンブロットを用いる場合、対照試料中よりも１：１０００に希釈した患者の血清中により大きな反応性が存在することは、腫瘍随伴性症候群の診断と相互に関連する；１：１０００に希釈した患者の血清中に明確な反応性が存在しないということは、腫瘍随伴性症候群の非存在と相互に関連する。同様に、比較対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量より有意に多い、試験試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量の存在は、新生物の存在と相互に関連する。比較対照試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量より有意に多くない、試験試料中の抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体の量の存在は、新生物の非存在と相互に関連する。
【００４１】
本発明は、本発明の方法において用いられるキットも含む。キットは、以下の成分を含み得る：（１）Ｍａファミリーポリペプチド試料；及び、任意に、（２）抗体、好ましくは抗−Ｍａファミリーポリペプチド抗体に結合する標識された検出用抗体。検出用抗体は、酵素、放射性分子又は蛍光試薬等の検出可能試薬に結合した抗体を含有してなり得る。検出用抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の、添加基質と反応し着色産物を生ずる酵素に結合する場合には、キットは基質も含み得る。キット中のＭａファミリーポリペプチド試料は、固体支持体に接着され得る。
【００４２】
以下の実施例は、本発明を説明する目的で挙げられ、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書で引用する全ての参照文献の教示は、参照により、本明細書中に取り込まれる。
【００４３】
【実施例】
実施例１  腫瘍随伴性神経学的障害の患者の血清により認識されるニューロン及び精巣特異的タンパク質Ｍａ１の同定
腫瘍随伴性症候群が疑われる患者の血清を抗ニューロン抗体について試験した。新規抗ニューロン抗体（抗−Ｍａと呼ぶ）が、腫瘍随伴性神経学的症候群の４名の患者の血清中で同定された。ラット並びに正常なヒト組織及び腫瘍中の標的抗原の発現の同定、並びに抗−Ｍａ血清により認識される新規ニューロン及び精巣特異的タンパク質Ｍａ１のクローニングを下記のようにして行った。
【００４４】
Ａ．材料及び方法
患者、血清及び組織
腫瘍随伴性抗ニューロン抗体についてスクリーニングするために送られた１，７０５例の患者由来の血清（又は入手可能な場合は脳脊髄液）を研究に用いた。これら血清を採取した時点において、９８４例の患者が癌と診断された。対照として用いた血清は、５２例の正常個体由来の血清；十分に特徴的な腫瘍随伴性症候群の９６例の患者由来の血清（４４例は抗−Ｈｕ関連脳脊髄炎及び感覚神経障害（ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｙ）；１７例は抗−Ｙｏ関連小脳変性；１１例はＰ／Ｑ型の電位依存カルシウム−チャンネル抗体［ＶＧＣＣ］を伴うランバート−イートン筋無力症候群；２例は抗−Ｒｉ関連小脳運動失調及び眼球クローヌス；６例は抗−Ｔｒ関連小脳機能不全；５例は胸腺腫に関連する重症筋無力症；及び１１例は神経芽腫に関連する眼球クローヌス）；腫瘍随伴性神経学的症候群はないが癌（４４例の精巣、１０例の結腸、１０例の卵巣、４０例の肺、２２例の胸部、２０例の脳腫瘍及び３３例の神経芽腫）のある１７９例の患者由来の血清；癌のない筋萎縮側索硬化症の６例の患者由来の血清；並びに胸腺腫のない重症筋無力症の４例の患者由来の血清を含んだ。
【００４５】
血清は−７０℃で凍結して保存した。ヒト神経系及び全身の組織を、神経学的に正常な個体の剖検又は生検研究から得た。腫瘍随伴性症候群のない患者由来の５３例の癌組織（１５例の結腸、５例の胸部、５例の膀胱、３例の耳下腺、５例の神経芽腫、５例の非小細胞肺癌及び１５例の精巣生殖細胞腫）及び腫瘍随伴性障害に関連する抗体を有する患者由来の１３例の癌組織（４例の卵巣、４例の肺、２例の子宮、１例の膀胱、１例の咽頭及び１例の軟骨肉腫）は、メモリアル・スローン−ケターリング・キャンサー・センター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）のチューモア・プロキュアメント・サービス（Ｔｕｍｏｒ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）により提供された。
【００４６】
ウイスターラットを麻酔し、生理的食塩水で灌流した後、脳及び他の組織を取り出した。ヒト及びラットの組織の試料は−７０℃で保存した；同じ組織由来の他の試料を、オプティマル・カッティング・テンペラチャー（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）媒体（ＯＣＴ、マイルズ・インク（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ）、米国）に包埋し、液体窒素により冷却したイソペンタン中で凍結した。
【００４７】
ヒト腫瘍の研究及び免疫組織化学的競合アッセイのため、患者の血清由来のＩｇＧをプロテイン−Ｇセファロースカラム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントスイス、ミズーリ州）を用いて単離した後、ビオチンで標識した（ファーノー（Ｆｕｒｎｅａｕｘ），Ｈ．Ｍ．ら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：１８４４−１８５１頁（１９９０））。
【００４８】
ウエスタンブロット分析のため、ヒト組織を、０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０並びにプロテアーゼ阻害剤：ＰＭＳＦ（５０μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（１μｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（１μｇ／ｍｌ）、及びロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）（全てシグマ（Ｓｉｇｍａ）製）中でホモジェナイズした。
【００４９】
免疫組織化学
ラット及びヒトの脳及び小脳の７ミクロン厚の凍結切片を、ホルマリン、１００％メタノール又は冷アセトン（４℃）中で固定し、続いて、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中の０．３％過酸化水素と共に１０分間、１０％正常ヤギ血清と共に２０分間、１：５００に希釈した患者の血清と共に２時間、１：２，０００に希釈したビオチニル化ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリフォルニア州）と共に３０分間、並びにアビジンビオチンペルオキシダーゼ複合体（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ））と共に３０分間、インキュベートした。ＰＢＳ中の０．０１％過酸化水素及び０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と共に０．０５％ジアミノベンジジン四塩酸塩（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で、反応を顕現させた。患者の血清及び二次抗体をＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清にて希釈した。各工程間に、スライドをＰＢＳで洗浄した。
【００５０】
内因性ＩｇＧとの反応性を排除するため、全身のヒト組織及び腫瘍に関する全ての免疫組織化学的研究に、患者血清から単離した、ビオチニル化ＩｇＧを使用した。１０％正常ヒト血清との切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）のプレインキュベーションを用いて非特異的ＩｇＧ結合をブロックしたことを除き、全工程を前記のようにして行い、二次抗体は用いなかった。
【００５１】
競合アッセイのため、組織切片を患者の１例の血清（１：５に希釈）と共に１時間プレインキュベートした後、別の患者の血清（１：２５に希釈）から単離したビオチニル化ＩｇＧと共にインキュベートした。正常ヒト血清、又は対照としての他の抗ニューロン抗体（１：５に希釈）を有する患者由来の血清と共に組織をプレインキュベートした。一方の患者のビオチニル化ＩｇＧの反応性が、別の患者由来の血清との組織のプレインキュベーションにより排除された場合、血清は、同じエピトープに対して競合するとみなした。
【００５２】
小脳ｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング
λＺＡＰヒト小脳ライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）を、５×１０4 ｐｆｕ／１５０ｍｍプレートの密度で、スクリーニングした。４２℃で３時間インキュベートした後、プレートに、１０ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）に浸したフィルターを重層し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、プレートを４℃で２０分間冷却し、フィルターを取り除き、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により４℃で１２時間ブロックし、腫瘍随伴性脳幹及び小脳機能不全を伴う患者由来の血清（１：１，０００に希釈）とともに３時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、フィルターをＩ125 プロテインＡ（０．１μＣｉ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートし、洗浄、乾燥して、ＸＡＲ５フィルムに−７０℃で２４時間曝露した。陽性の結果を与えるクローンを、収量１００％で陽性のプラークが得られるまで抗体スクリーニングを数回行うことにより精製した。ファージクローンを、インビボ・エキサイション・ファージ・レスキュー・プロトコル（ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｐｈａｇｅｒｅｓｃｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔでサブクローニングした。
【００５３】
ＤＮＡシークエンシング
配列分析を、自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７）により、ダイターミネーター蛍光法（リー（Ｌｅｅ），Ｌ．Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２４７１−２４８３（１９９２））を用いて行った。二本鎖ＤＮＡを、キアゲンプラスミドミディ−プレップシステム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、サンタクラリタ、カリフォルニア州）を用いて精製し、両鎖についてシークエンシングした。ＳＫ及びＫＳプライマーに加えて内部オリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
【００５４】
ウエスタンブロット分析
融合タンパク質及び大腸菌タンパク質抽出物を、個々のコロニーを光学濃度０．６まで増殖させ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＰＴＧにより３７℃で３時間誘導することにより得た。細胞を、遠心分離により単離し、ＰＢＳ中０．１％ＮＰ−４０及び２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に再懸濁させることにより溶解した。
【００５５】
融合タンパク質のライセート、又はヒト及びラットの組織から抽出したタンパク質を、１０％ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移した（トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ），Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４３５０−４（１９７９））。５％乾燥Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）ミルクでブロックした後、ニトロセルロースストリップを、患者の血清（１：１，０００に希釈）とともに２時間、及び１：２０，０００に希釈したヒツジ抗−ヒトホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ＩｇＧ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントンハイト、イリノイ州）とともに１時間、順次インキュベートした。次いで、ストリップを、強化化学発光溶液（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントン、イリノイ州）に１分間浸漬し、コダック  ＸＡＲ５フィルム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）に曝露した。工程間では、ストリップをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。すべてのインキュベーションは、室温（ＲＴ）で行なった。
【００５６】
ノーザンブロット分析
配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識した。Ｍａ１用プローブとして、以下のオリゴヌクレオチド：５’−ＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＧＧＧ−３’（配列番号：１；ｃＤＮＡ塩基対（６４７〜６３０）、及びβ−アクチン用プローブとして、以下のオリゴヌクレオチド：５’−ＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号：２）を使用した。標識したプローブを、フェノールクロロホルムで抽出し、Ｇ−２５セファデックスカラムで精製した。プローブ（１×１０7 ｃｐｍ／ｍＬ）を「ヒューマン・マルチプル・ティシュ・ノーザンブロッツＩアンドＩＩ（“Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ”）」（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、パロアルト、カリフォルニア州）に、一晩、４２℃で、ＲａｐｉｄＨｙｂ緩衝液（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））中で、ハイブリダイズさせた。ブロットを、ＲＴで５×ＳＳＣ（２０×＝ＮａＣｌ  ３Ｍ及びクエン酸Ｎａ3 塩０．３Ｍ、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ中で；４２℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で；及び４２℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、１５分間洗浄した。Ｍａ１プローブとのハイブリダイゼーション後、ブロットを０．５％ＳＤＳ中で１０分間煮沸することによりストリッピングし、β−アクチンプローブとハイブリダイズさせた。可視化のため、ブロットをＸＡＲフィルムに−８０℃で７２時間曝露した。
【００５７】
Ｂ．  結果
臨床的及び病理学的所見
１７０５例の血清の研究の結果、抗−Ｍａと称する新規な抗ニューロン抗体を保有する患者４例が確認された。これらの患者の臨床的情報を表１にまとめる。
【００５８】
０．１％ＳＤＳ。Ｍａ１プローブとのハイブリダイゼーション後、ブロットを０．５％ＳＤＳ中で１０分間煮沸することによりストリッピングし、β−アクチンプローブとハイブリダイズさせた。可視化のため、ブロットをＸＡＲフィルムに−８０℃で７２時間曝露した。
【００５９】
Ｂ．  結果
臨床的及び病理学的所見
１７０５例の血清の研究の結果、抗−Ｍａと称する新規な抗ニューロン抗体を保有する患者４例が確認された。これらの患者の臨床的情報を表１にまとめる。
【００６０】
【表１】
0004402223.tif 000002
【００６１】
神経学的症状は、３例の患者において腫瘍の診断に先行し、１例の患者において、６年前に診断された乳癌の再発に先行した。３例の患者は、小脳及び／又は脳幹併発の症状を有し；その関連する癌は、乳、耳下腺及び結腸であった。中度の嚥下困難、近位虚弱（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｗｅａｋｎｅｓｓ）及び１年間の性的不能の病歴をもつ別の患者は、右気管支の大細胞癌腫の縦隔鏡検査及び生検を受けた；麻酔後、彼は呼吸筋衰弱を示した。ランバート−イートン筋無力症候群に対する神経生理学的検査及び血清学的試験（Ｐ／Ｑ型電位依存カルシウムチャネル抗体）は陰性であった。この患者は追跡できず、この患者が他の神経学的症状を示したかはわからない。
【００６２】
臨床的情報が得られた患者３例のうち、２例は免疫調節治療を受けた（静脈内免疫グロブリン、プロテインＡカラム免疫吸収（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、血漿交換）が、いずれも神経学的欠損は改善しなかった。１例の患者は生存、２例は、一方が多数の全身性問題（腹膜癌種症、敗血症、凝血異常）、他方が進行性脳幹機能不全で死亡した。
【００６３】
剖検では、１例の患者は乳癌が広範囲の全身性転移及び小結節性硬変を有した。神経系（脊髄は検査せず）において転移は何も同定されなかった。小脳にはプルキンエ細胞はほとんど全くなく、ベルグマン神経膠症に関連し、小脳白質深部に中度の炎症性浸潤物があった。神経炎プラークが、皮質（主に、後頭葉に）に確認されたが、他の異常は大脳皮質、小脳扁桃及び脳幹においてみられなかった。この患者は、アルツハイマー病を示す病歴はなかった。
【００６４】
他の患者の剖検は脳に留め、臨床的に検出されない全身性転移の可能性を除外することはできなかった。中脳の蓋領域及び被蓋領域、橋被蓋並びに髄は、広範囲の血管周囲及び腸に、小グリア小節を伴う炎症性浸潤物を示した。重度のニューロン減少及び神経膠症が、下位オリーブ核及び周囲の組織において見られた。また、プルキンエ細胞及び歯状核のニューロンの病巣減少もあり、ベルグマン神経膠症を伴った。炎症性浸潤物が、小脳白質深部に見られた。やや中度の血管周囲及び腸のリンパ球性浸潤物が、視床下部及び無名質において観察された。
【００６５】
両患者において、Ｂ（ＣＤ２０）細胞、Ｔ（ＣＤ３）細胞及びＴ細胞の亜群（ＣＤ４及びＣＤ８）に対するマーカーによる、炎症性浸潤物の免疫組織化学的分析により、細胞のほとんど（＞９０％）がＴリンパ球、主に、ＣＤ８＋（Ｔ細胞の＞７５％）であることが示された。
【００６６】
研究所所見
抗−Ｍａ抗体は、正常な脳及び精巣と特異的に反応する
上記４例の患者の血清は、交感神経及び背根神経節を含む中枢及び抹消神経系のすべてのニューロン、並びに腸節神経叢と特徴的なパターンで反応した。抗−Ｍａ抗体は、主に、ニューロンの亜核成分（ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（核及び核小体）内で、低い程度で細胞質内で反応した。非ニューロン細胞は反応しなかった。反応性は、ホルマリン、メタノール又はアセトン固定により影響されなかったが、パラフィン包埋組織におけるよりも凍結組織において、より良好に保存された。凍結ラット組織において、ニューロン核は、反応性の斑点状のパターンを示し、多くのニューロンにおいて、それは、核小体に限られているようであった；これに対して、細胞質は、中程度で散在的だが、粒状ではないパターンで反応した。凍結ヒト組織及びパラフィン包埋ヒト組織では、反応性は、ニューロンの核小体により集中しているようであり、細胞質の中度の標識もあった。肺、肝臓、腎臓、脾臓、甲状腺、膵臓、小腸、結腸、心臓、骨格筋及び卵巣を含む、ヒト及びラットの全身の組織は、抗−Ｍａ  ＩｇＧと反応しなかったが、精巣生殖細胞、特に、精母細胞及び初期精子細胞は反応した。ラットの精巣では、精細管の生殖細胞に選択的に関連する斑点状の染色があったが、間質におけるライジッヒ細胞の標識は何も観察されなかった。ヒト精巣生殖細胞における抗−Ｍａ標識は、核反応性の数個の斑点に留まり、核及び細胞質のやや中程度で散在的な染色を伴った。
【００６７】
同じ全身の組織、脳ホモジェネート及び精製したニューロン（皮質性ニューロン及びプルキンエ細胞）からのタンパク質抽出物のイムノブロットにおいて、４つの抗−Ｍａ血清が、精製したニューロン並びに脳及び精巣のホモジェネートのみにおいて発現したタンパク質と反応した。脳において、反応性の２つの別個のバンドが、３７及び４０ｋＤａに確認された。精巣では、３７ｋＤａのタンパク質のみが見つかった。３３７例の対照血清のいずれも、上記の免疫組織化学的及びウエスタンブロット反応性を示さなかった。
【００６８】
抗−Ｍａ抗体は腫瘍随伴性腫瘍を特異的に認識する
パラフィン包埋腫瘍組織を、抗−Ｍａ抗体を有する４例の患者のうち３例から得た。組織の脱パラフィン及び抗原取り出しの後（カットレッティ（Ｃａｔｔｏｒｅｔｔｉ），Ｇ．ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７１：８３〜９８頁（１９９３））、すべての３腫瘍（胸の腺癌、結腸の腺癌及び耳下腺癌）が、抗−Ｍａ  ＩｇＧ抗体により同定された抗原を発現するが、ニューロンとは対照的に、反応性は細胞質に集中することがわかった。抗−Ｍａ抗体は、腫瘍細胞の細胞質と反応した；正常なヒトＩｇＧ抗体では、反応性は何も同定されなかった。
【００６９】
また、Ｍａ抗原の発現を、腫瘍随伴性症候群のない患者由来の５３例の腫瘍及び他の抗体関連腫瘍随伴性症候群の患者由来の１３例の腫瘍を含む凍結又はパラフィン包埋腫瘍において検査した：いずれも抗−Ｍａ抗体と反応しなかった。
【００７０】
初期の免疫組織学的所見を、２例の異なる患者由来のビオチニル化抗−Ｍａ  ＩｇＧを用いて再現し、さらに、任意の抗−Ｍａ血清との組織のプレインキュベーションが別の抗−Ｍａ患者由来のビオチニル化ＩｇＧの反応性を排除する競合アッセイにより確認した。
【００７１】
Ｃ．Ｍａ１抗原のクローニング及び特性評価
Ｍａ１抗原のクローニング
λＺＡＰヒト小脳ライブラリーのスクリーニングは、３種の組換えバクテリオファージクローンの単離をもたらした。いずれも、正常ヒト血清とは反応しなかった。ファージクローンを、ファージエキサイションプロトコル（ｐｈａｇｅ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。得られた細菌性ｃＤＮＡプラスミドは、２１３９ｂｐの挿入物を含み、配列分析により、すべてのクローンが同一の挿入物を有することが示された。クローン８−３Ａ１由来のプラスミドｐ８Ａを用い、さらなる研究を行った。
【００７２】
ｃＤＮＡ配列（配列番号：３、図１に示す）により、１つのコドンから分離した２つの推定開始ＡＵＧコドンを伴うオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ヌクレオチド２７２のこれらの第１のものは、コザックコンセンサスルール（Ｋｏｚａｋ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｕｌｅ）（コザック（Ｋｏｚａｋ），Ｍ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５−８１４８（１９８７））に最も厳密にあてはまるので、翻訳開始コドンであるようである。ＯＲＦは、ヌクレオチド１２５８の第１イン−フレーム終始コドンまで伸び、３３０個のアミノ酸（配列番号：４、図１）の、推定分子量３６．８ｋＤａのタンパク質をコードする。我々は、この遺伝子産物をＭａ１と呼んだ。ＯＲＦに加えて、ｃＤＮＡクローンは、５’非コード配列及び３’ポリアデニル化シグナル（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＡＦ０３７３６４、図１に配列番号：３として示す）を含む。ＥＭＢＬ／ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースの調査により、Ｍａ１  ｃＤＮＡヌクレオチド２７２〜５４６が、ヒトＣｐＧ島ＤＮＡゲノム断片（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＨＳ１９Ａ６Ｒ）と９７％同一性を有すること（クロス（Ｃｒｏｓｓ），Ｓ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：２３６−２４４（１９９４））、及びヌクレオチド７９４〜１２３０が、ヒト結腸癌腫細胞株（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＡＡ３１４００９）（アダムス（Ａｄａｍｓ），Ｍ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：３−１７４（１９９５））及び乳児脳（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＨＯ６３４１）由来のｃＤＮＡクローンと９８％相同性を有することが明らかになった。これらのクローンは、ＣｐＧ島に対するスクリーニングの間に誘導され、配列タグを発現した；さらなる特性は公表されていない。タンパク質の部分配列モチーフに対するいくつかのデータベースの調査により、Ｍａ１タンパク質が数種の潜在的なカゼインキナーゼＩＩ及びプロテインキナーゼＣホスホリル化部位を含むが、他の容易に同定可能なドメインは何も含まないことが明らかになった。
【００７３】
腫瘍随伴性症候群の患者由来の血清はＭａ１融合タンパク質を認識する
Ｍａ１融合タンパク質のイムノブロットを用い、抗−Ｍａ関連腫瘍随伴性症候群の患者４例すべての血清は、約３７ｋＤａのバンドと反応した。シャム（ｓｈａｍ）タンパク質（挿入物なしの親プラスミドを有する大腸菌の抽出物）とでは、反応性は何も観察されなかった。３３７例の対照血清（癌であるが、腫瘍随伴性神経学的症状［乳、結腸、肺又は精巣生殖細胞の癌］はない患者、及び腫瘍随伴性神経学的症状のある患者［抗−Ｈｕ関連、抗−Ｙｏ関連］）は、いずれもＭａ１と反応しなかった。
【００７４】
Ｍａ１に対する抗体が、脳及び精巣と反応する同じ抗体に対応するか否かを決定するために、これらの組織の切片及び脳のイムノブロットを、Ｍａ１融合タンパク質又はシャムタンパク質と予備吸収（ｐｒｅａｂｓｏｒｂｅｄ）させた抗−Ｍａ１血清とともにインキュベートした。シャムタンパク質とではなく、Ｍａ１タンパク質との免疫吸収では、精巣との反応性のすべて、及び脳との反応性の８０％を排除した（ほんのわずかの点状の反応性の粒子が、ニューロンの核において陽性のままであった）。さらに、Ｍａ１と予備吸収させた血清は、３７ｋＤａニューロンタンパク質とはもはや反応しなかったが、４０ｋＤａバンドとは反応性を維持し、これは、３７ｋＤａタンパク質はクローン化Ｍａ１に対応することを示す。
【００７５】
ヒト組織におけるＭａ１  ｍＲＮＡの発現
Ｍａ１特異的オリゴヌクレオチドプローブの、多数のヒト組織由来のｍＲＮＡのノーザンブロットへのハイブリダイゼーションにより、Ｍａ１  ｍＲＮＡが脳及び精巣により発現されるが、胎盤、肺、肝臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、結腸又は抹消血白血球では発現されないことが示された。ブロットにより、脳及び精巣の両方において、約２．６キロベースの単一のバンドが明らかになった。心臓、骨格筋、腎臓及び膵臓において観察されたかすかなシグナルは、非常に少ない量のＭａ１  ｍＲＮＡ発現、又は、これらの臓器に含まれる神経組織の痕跡を示す可能性がある。免疫組織化学的アッセイ及びイムノブロットアッセイ（上記参照のこと）では、これらの組織は抗−Ｍａ血清と反応せず、これは、Ｍａ１タンパク質発現がないことを示した。
【００７６】
実施例２  精巣腫瘍並びに腫瘍随伴性辺縁系及び脳幹脳炎の患者由来の血清
抗体を用いた癌−脳抗原の同定
Ａ．  材料及び方法
血清及び組織
抗ニューロン抗体試験のために我々のもとに送られてきた、組織学的に癌であると証明された患者９８６例の血清（又は、入手可能な場合はＣＳＦ）を、本研究に使用した。全部で３０４例の血清を対照として使用した；これらの対照は、癌及び腫瘍随伴性症候群（４５例のＰＬＥ及び精巣癌以外の腫瘍［１３抗−Ｈｕポジティブ］；２３例の抗−Ｈｕポジティブ脳脊髄炎−感覚神経障害；２０例の抗Ｙｏ−関連小脳変性；５例のランバート−イートン筋無力症候群、すべてＰ／Ｑ型ＶＧＣＣ抗体に対してポジティブ；６例の抗−Ｒｉ関連小脳性運動失調症及び眼球クローヌス；並びに９例の重症筋無力症及び胸腺腫）を伴う患者、癌であるが腫瘍随伴性症候群でない患者（４４例の精巣癌；１０例の結腸癌；１０例の卵巣癌；２１例の乳癌）、及び種々の障害（４１例の多発性硬化症；３５例の全身性紅斑性狼瘡）を伴う患者並びに２４例の正常個体を含んだ。すべての血清は、−７０℃で凍結して保存した。
【００７７】
腫瘍組織は、委託の医師及びメモリアル・スローン−ケターリング・キャンサー・センター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）のチューモア・プロキュアメント・サービス（ＴｕｍｏｒＰｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）により提供された。それらは、ＰＬＥ−ＢＥの患者由来の４例の精巣腫瘍；腫瘍随伴性症候群でない患者由来の４５例（２５例の精巣生殖細胞腫、５例の結腸、４例の乳、３例の肺、２例の耳下腺及び６例のＳＣＬＣ）、及び他の腫瘍随伴性症候群の患者由来の８例（４例のＳＣＬＣ、３例の卵巣、１例の膀胱）を含んだ。正常ヒト組織及びウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットの組織を、報告されたようにして入手し（ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：８８１−６（１９９２））、−７０℃に保存した。同じ組織由来の他の試料は、「オプティマル・カッティング・テンペラチャー（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」媒体（ＯＣＴ、マイルズ・インク（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．）、米国）に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン中にスナップ凍結（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）した。
【００７８】
ウエスタンブロット分析のために、報告されたようにして、組織を０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０及びプロテアーゼ阻害剤中でホモジェナイズした（ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：８８１−６（１９９２））。
【００７９】
免疫組織化学
ラット及びヒトの組織の７ミクロン厚の凍結切片を、１０％ホルマリン、１００％メタノール又は冷アセトン（４℃）で固定し、既報の免疫組織学的方法（ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：８８１−６（１９９２）を用いて、患者の血清、ＩｇＧ又はＣＳＦとともにインキュベートした。
【００８０】
内在性ＩｇＧとの反応性を排除するため、ヒト組織を用いた全ての免疫組織学的研究では、患者の血清から精製し、ビオチンで標識したＩｇＧを用いた。同じＩｇＧを、免疫競合アッセイに使用した：組織の一方の血清とのプレインキュベーションが、他方の血清のＩｇＧの反応性を排除した場合、２つの血清は同じエピトープに対して競合するとみなした。
【００８１】
Ｔａ抗体の鞘内合成
Ｔａ抗体の鞘内合成を、シュラー式（Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ’ｓ  ｆｏｒｍｕｌａ）（シュラー（Ｓｃｈｕｕｌｅｒ），Ｅ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（マロス（Ｍａｒｒｏｓｕ），Ｍ．Ｇ．、シアンチェッティ（Ｃｉａｎｃｈｅｔｔｉ），Ｃ．及びタボラト（Ｔａｂｏｌａｔｏ），Ｂ．編）、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９０、３〜１２頁）により計算した。鞘内抗体特異活性（ＡＳＡ）／血清ＡＳＡの比率＞２を鞘内合成陽性とみなした。
【００８２】
Ｍａ２  ｃＤＮＡのクローニング、単離及び配列分析
腫瘍随伴性脳幹機能不全の患者の血清を用い、λＺＡＰヒト小脳ライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）を、５×１０４ｐｆｕ／１５０ｍｍプレートの密度でスクリーニングした。４２℃での４時間の培養後、プラークに、１０ｍＭイソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）に浸したニトロセルロースフィルターを重層し、３７℃で１２時間インキュベートした。フィルターを取り除き、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中１％ウシ血清アルブミンでブロックし、患者の血清（１：１０００に希釈）とともに室温で２時間インキュベートした。ポジティブファージコロニーを同定し、抗体スクリーニングを数回行うことにより精製した後、インビボ・エキサイション・ファージ・レスキュー・プロトコル（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｐｈａｇｅ  ｒｅｓｃｕｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔでサブクローニングした。
【００８３】
二本鎖Ｍａ２  ｃＤＮＡを、キアゲン・プラスミド・ミディ−プレップ・システム（Ｑｉａｇｅｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、サンタ・クラリタ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、カリフォルニア州）を用いて精製し、両方の鎖について配列決定した。ＳＫ及びＫＳプライマーの他に、内部オリゴヌクレオチドプライマーを用いた配列分析を、自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、モデル３７７）により、ダイ・ターミネーター蛍光法（ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ）（リー（Ｌｅｅ），Ｌ．Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２４７１−２４８３（１９９２））を用いて行った。
【００８４】
ウエスタンブロット分析
融合タンパク質、大腸菌タンパク質並びにヒト及びラットの組織由来のタンパク質を、先述（ダルマウ（Ｄａｌｍａｕ），Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：８８１−６（１９９２）；マンリー（Ｍａｎｌｅｙ），Ｇ．Ｔ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３８：１０２−１１０（１９９５））のようにして得、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移した。次いで、ニトロセルロースストリップを患者の血清（１：１，０００に希釈）とともにインキュベートし、強化化学発光法（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントン、イリノイ州）により、反応性を明らかにした。
【００８５】
ノーザンブロット分析
配列特異オリゴヌクレオチドプローブを、［ｇ−32Ｐ］ＡＴＰにより、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識し、Ｇ−２５セファデックスカラムで精製した。Ｍａ２用プローブとして以下のオリゴヌクレオチドを使用した：５’−ＧＧＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号：５）（ｃＤＮＡ塩基対２３４〜２１７）、また、β−アクチン用プローブとして以下のオリゴヌクレオチドを使用した：５’−ＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号：２）。プローブ（１×１０7 ｃｐｍ／ｍＬ）を、「ヒューマン・マルチプル・ティシュ・ノーザン・ブロッツＩアンドＩＩ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ）（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロ  アルト、カリフォルニア州）に、４２℃で一晩、Ｒａｐｉｄ  Ｈｙｂ緩衝液（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））中で、ハイブリダイズさせた。ブロットを、ＲＴで５×ＳＳＣ（２０×＝ＮａＣｌ  ３Ｍ及びクエン酸Ｎａ3 塩０．３Ｍ、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ中；４２℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中；及び４２℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中にて、１５分間洗浄した。Ｍａ２プローブとのハイブリダイゼーション後、ブロットを０．５％ＳＤＳ中で１０分間煮沸することによりストリッピングし、β−アクチンプローブとハイブリダイズさせた。可視化のため、ブロットをＸＡＲフィルムに−８０℃で７２時間曝露した。
【００８６】
Ｂ．  結果
患者
血清をオンコニューロン抗体について検査した、数種の癌の患者９８６例のうち、２０例は精巣癌及び多様な腫瘍随伴性症候群を有した。これら２０例の患者のうち１０例は、Ｔａと命名した類似の抗ニューロン抗体を保有し（下記参照のこと）、１０例すべては、ＰＬＥ、ＢＥ、又は両方を患った（表２）。ＰＬＥの患者９例のうち１例のみは、Ｔａ抗体を保有しなかった。
【００８７】
【表２】
0004402223.tif 000003
【００８８】
Ｔａ抗体を有する患者の臨床的特徴を表３に示す。８例の患者はＰＬＥを有し（２例はＢＥに関連）；症状は、重度の記憶喪失（ｎ＝５患者）、発作（ｎ＝６）及び視床下部−間脳機能不全（２例の高体温、１例の過眠症、１例の重量の病理学的増加、１例の下垂体ホルモン欠乏）を含んだ。さらに別の２例の患者は、顕著な目の運動異常を伴う顕著なＢＥを有した。中度の小脳症状が３例の患者において同定され、すべてＢＥの顕著な徴候を伴った。
【００８９】
【表３】
0004402223.tif 000004
【００９０】
神経学的症状が、８例の患者において腫瘍の診断の前に現れた（中央値６ヶ月、２〜３６ヶ月の範囲）；他の２例では、腫瘍の診断が神経学的障害に先行した（７及び１２ヶ月）。頭部ＭＲＩは、７例のＰＬＥ患者において異常であった；典型的な所見は、側頭葉の内側面において明るいシグナルを含み、間脳にも含まれることがあった。４例の患者は脳生検を受け；すべて炎症性浸潤、神経膠症及びニューロン変性を示した。右側頭葉においてより強度のシグナルが、脳生検後の局所浮腫に対応し、これは、血管周囲の炎症性浸潤及び多数のＴ細胞のニューロン周囲の浸潤を示した。２例の患者は、再発性及び緩解性神経学的症状を有した：一方は別途に報告され（バートン（Ｂｕｒｔｏｎ），Ｇ．Ｖら、Ｃａｎｃｅｒ  ６２：２２４８−２２５１（１９８８））、他方は、血清Ｔａ抗体の検出が腫瘍随伴性ＢＥの診断を確立し、腫瘍の発見に至るまで１２ヶ月間症状を有した。すべての患者は精巣癌を有した（４例のセミノーマ及び６例の非セミノーマ性生殖細胞腫）。腫瘍診断時、４例の患者は全身性転移を有した。
【００９１】
１０例の患者はすべて除睾術を受け、５例は化学療法を受け、１例は放射線療法を受けた。神経学的疾患は、ステロイド（ｎ＝４）、血漿交換（ｎ＝２）及び静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、ｎ＝１）により治療した。ＩＶＩＧ及びステロイドで治療した１例の患者のみ、改善した。全体的に、５例の患者が神経学的に改善し（２例は全緩解（ｔｏｔａｌ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ））、２例が安定のまま、１例が悪化、２例が死亡した（一方は化学療法による合併症により；他方は神経学的疾患により）。
【００９２】
Ｔａ抗体の検出
精製したヒトニューロンのイムノブロットを用い、１０例の患者の血清（及び６例から得たＣＳＦ）を、４０ｋＤａタンパク質と反応させた。反応性の分布及びパターンを、数種の固定剤及び異なる組織処理法を用い、ヒト及びラット組織の免疫組織化学により検査した。すべての血清及びＣＳＦは、類似した脳特異的反応性を示した。最も強い免疫標識を、凍結組織及びアセトン若しくはメタノール−アセトン固定により得た。これらの条件を用いると、中枢神経系のニューロンのほとんどは、別個の亜核及び細胞質反応性構造を示した；反応性は、核小体及び核周囲部に集中しているようであった。ホルマリン固定組織では、類扁桃複合体（ａｍｙｇｄａｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ）のニューロン、脳幹の大ニューロン及び小脳の歯状核の部分群のみが、ポジティブのままであった。８つの血清のいずれかとの組織のプレインキュベーションは、他の２つの血清から単離されたＩｇＧの反応性を消失させ、これは、すべての血清が類似のエピトープ特異性を有したことを示す。
【００９３】
これらのイムノブロット及び免疫組織化学的技術により規定される反応性は、「Ｔａ」（インデックスの患者名の最初の２文字にちなんで）と呼んだ。Ｔａ抗体は、癌及び腫瘍随伴性症候群の患者を含む３０４例の対照血清においては同定されなかった（４５例のＰＬＥ及び精巣癌以外の腫瘍［１３例の抗−Ｈｕポジティブ］；２３例の抗−Ｈｕポジティブ脳脊髄炎−感覚神経障害；２０例の抗−Ｙｏ関連小脳変性；５例のランバート−イートン筋無力症候群、すべてＰ／Ｑ−型ＶＧＣＣ抗体に対してポジティブ；6 例の抗−Ｒｉ関連小脳運動失調症及び眼球クローヌス；及び９例の重症筋無力症及び胸腺腫）、癌であるが腫瘍随伴性症候群でない患者（４４例の精巣癌；１０例の結腸癌；１０例の卵巣癌；２１例の乳癌）及び種々の障害を伴う患者（４１例の多発性硬化症；３５例の全身性腫瘤エリテマトーデス）、並びに２４例の正常個体（抗体−Ｈｕ：ザボ（Ｓｚａｂｏ），Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ６７：３２５−３３３（１９９１）参照のこと；抗−Ｙｏ：ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ），Ｋ．  ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４２：１９３１−３７（１９９２）参照のこと；抗−Ｒｉ：ルーク（Ｌｕｑｕｅ），Ｆ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２９：２４１−２５１（１９９１）参照のこと）。
【００９４】
別の患者
他の個体のさらなる研究により、抗−Ｔａ抗体を伴う別の患者も精巣癌を有することが明らかになった。これらの男性患者すべての神経学的症状は、間脳機能不全を伴う脳幹及び／又は辺縁系脳炎であった。
【００９５】
さらに、３例の女性が抗−Ｔａ抗体により確認されている。これら３例の患者は、脳幹脳炎及び／又は小脳機能不全を有した。３例のうち２例は肺癌を有し、１例は初期部位が不明の癌のリンパ節への転移を有した。
【００９６】
Ｃ．  Ｍａ２のクローニング及び特性評価、Ｔａ抗体により認識された抗原Ｍａ２のクローニング
患者の血清によるλＺＡＰヒト小脳ライブラリーのスクリーニングは、ポジティブクローンの単離をもたらし、これを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおけるサブクローニングにより回収した。得られたプラスミド（ｐ５６１Ａ）は、６１４ｂｐの挿入物を含んだ。配列分析により、推定分子量が２１．９ｋＤａの、１９５個のアミノ酸からなる不完全オープン・リーディング・フレーム（ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＡＦ０３７３６５、図２に配列番号：６として示す）の存在が明らかになった。核酸配列（配列番号：６）及び推定アミノ酸配列（配列番号：７）を図２に示す。５８６ｂｐにおける終始コドンのほぼすぐ後に、明らかなポリアデニル化シグナルが続く。アミノ酸１２及び２１のメチオニンは、クローンが５’末端で完全でなくなる開始コドンについてのコザックコンセンサスルール（Ｋｏｚａｋ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｕｌｅ）に厳密にあてはまらない。このｃＤＮＡにより発現されたタンパク質をＭａ２と呼んだ。
【００９７】
Ｍａ２のｃＤＮＡ配列は、部分的にＭａ1 と相同であることがわかり（Ｆｉｇｕｒｅ３Ａ及び３Ｂ）、腫瘍随伴性抗原が脳及び精巣で発現した（実施例１参照のこと）。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースの調査により、Ｍａ２ｃＤＮＡが、多発性硬化症の患者の脱髄病変部から抽出したＲＮＡ由来のヒトｃＤＮＡクローン（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）Ｎ４７７８４）と８４％相同性を有することが明らかになった。さらなる分析により、最も高い相同性（９５％）の領域がＭａ２の推定タンパク質コード領域の範囲内にあることが示され、実際、シークエンシングエラーが説明され、２つのクローンは、この領域において同一であるようである。Ｎ４７７８４クローンは、Ｍａ２終始コドンを超えて伸びる潜在的なＯＲＦ有する。さらに、Ｍａ２は、成体マウス精巣から単離されたｃＤＮＡクローン（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）９１８１０３）と、６０％相同性を有することがわかった。
【００９８】
精巣癌及びＰＬＥ−ＢＥの患者は、Ｍａ２に対する血清抗体を保有し、これらの抗体の鞘内合成を有する
Ｍａ２融合タンパク質のイムノブロットを用い、Ｔａ抗体を有する患者由来のすべての血清及びＣＳＦを、約３２ｋＤａのバンドと反応させた。シャムタンパク質（挿入物なしの親プラスミドを有する大腸菌）のイムノブロットでは反応性は何も得られなかった。３０４例の対照血清は、いずれもＭａ２と反応しなかった。
【００９９】
Ｍａ２が、Ｔａ抗体により同定された４０ｋＤａニューロンタンパク質に対応するか否かを決定するために、ニューロンタンパク質のイムノブロットを、Ｍａ２と予備吸収させた抗−Ｔａ血清とともにインキュベートした。シャムタンパク質ではなくＭａ２との予備吸収は、４０ｋＤａのニューロンタンパク質との血清反応性を排除し、これは、このタンパク質がＭａ２であることを示す。
【０１００】
Ｔａ抗体の鞘内ＡＳＡ／血清ＡＳＡの比は、０．７４、４．４、６．２、１６．９及び２３．５であり、５例の患者のうち４例におけるポジティブな鞘内合成（＞２）に一致した。
【０１０１】
Ｍａ２は正常脳及びＰＬＥ−ＢＥの患者の腫瘍により発現される
多数のヒト組織から抽出したｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、Ｍａ２ｍＲＮＡが、脳では発現されるが、胎盤、肺、肝臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、精巣、小腸、結腸又は抹消血白血球では発現されないことが示された。ノーザンブロットにより、脳において発現された約６，５００キロベースの単一の転写物が明らかになった。プローブとしてビオチニル化抗−Ｔａ  ＩｇＧを用いた、同じ組織の免疫組織化学的及びウエスタンブロット分析により、脳のみがＭａ２反応性を現すことが示された。
【０１０２】
ＰＬＥ−ＢＥ及びＴａ抗体を有する４例の患者の腫瘍を、ホルマリン−固定し、パラフィン−包埋したブロックとして得た。組織の脱パラフィン及び抗原除去後、すべての４例の腫瘍は、抗−Ｔａ  ＩｇＧとの反応性を示した。ＩｇＧをＭａ２タンパク質と予備吸収させておいた場合、反応性は何も観察されなかった。結果は、切片又は脂肪海馬（ｆａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）に類似した。Ｍａ２反応性は、腫瘍随伴性症候群のない、又は他の腫瘍随伴性障害のある患者由来の５３例の多様な腫瘍（２５例の精巣癌を含む）では現れなかった。
【０１０３】
Ｄ．  Ｍａ１及びＭａ２は、神経学的症状及び腫瘍の異なる特徴に関連する免疫学的応答の標的である
Ｍａ１とＭａ２との間の配列相同性のため、抗−Ｔａ及び抗−Ｍａ血清が両方のタンパク質と反応するか否かを試験した。これらの研究により、すべての抗−Ｔａ血清は排他的にＭａ２と反応するが、抗−Ｍａ血清は両方のＭａタンパク質を認識することが示された。これらのタンパク質のいずれかとの抗−Ｍａ血清の予備吸収は、他の１つとの反応性を排除せず、これは、Ｍａ１及びＭａ２におけるエピトープが異なることを示す。さらに、ラット脳切片並びにニューロンタンパク質及びＭａ２のイムノブロットと抗−Ｍａ血清のいずれかとのプレインキュベーションは、抗−Ｔａ  ＩｇＧとの反応性を消失はさせないが低下させ、これは、すべてではないが、いくつかのＭａ２エピトープが、血清の両方の型により認識されることを示す。これらの研究から導かれる臨床的−免疫学的関連性をＦｉｇｕｒｅ４にまとめる。
【０１０４】
実施例３  Ｍａ３、Ｍａ４及びＭａ５の同定
小脳ライブラリーからのＭａ１及びＭａ２の単離で上述したのと同じ技術を用いた、ヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、Ｍａ３及びＭａ２との相同性を有するさらに３つのクローンの単離をもたらした；これらを、Ｍａ３、Ｍａ４及びＭａ５と呼んだ。Ｍａ３は、８３３ヌクレオチド長で、２１キロダルトンの融合タンパク質をコードする。Ｍａ４は、１５７４ヌクレオチド長で、３６キロダルトンの融合タンパク質をコードする。Ｍａ５は、２２４８ヌクレオチド長で、５６キロダルトンの融合タンパク質をコードする。融合タンパク質は、クローンとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の５’−末端との融合であるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいて、ｃＤＮＡクローンにより発現されるそれらタンパク質である。Ｍａ３、Ｍａ４及びＭａ５に対するｃＤＮＡは、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）に、ＡＦ０８３１１４（Ｍａ３、Ｆｉｇｕｒｅ５に配列番号：８として示す）、ＡＦ０８３１１５（Ｍａ４、Ｆｉｇｕｒｅ６Ａ〜６Ｂに配列番号：１０として示す）、及びＡＦ０８３１１６（Ｍａ５、Ｆｉｇｕｒｅ７Ａ〜７Ｂに配列番号：１２として示す）として寄託した。Ｍａ３、Ｍａ４及びＭａ５に対する推定されるコードされたポリペプチドを、Ｆｉｇｕｒｅ５（配列番号：９）、６Ａ〜６Ｂ（配列番号：１１）、及び７Ａ〜７Ｂ（配列番号：１３）にそれぞれ示す。
【０１０５】
本発明を、その好ましい態様を参照しながら特に示し、記載しているが、当業者は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の主旨及び範囲から逸脱せずに、本発明において、形態及び詳細における種々の変更を行い得ることを理解できるであろう。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明は、Ｍａファミリータンパク質、Ｍａファミリータンパク質をコードする核酸、及び該タンパク質の腫瘍随伴性症候群との関連性に関する。本明細書に記載のように、出願人らは、５つのタンパク質、Ｍａ１、Ｍａ２、Ｍａ３、Ｍａ４及びＭａ５、並びにそれらをコードする核酸を同定した。Ｍａ１は、脳及び精巣で発現される３７キロダルトンのタンパク質であり；Ｍａ１に対する抗体（本明細書では「抗−Ｍａ抗体」ともいう）の存在は腫瘍随伴性症候群、特に脳幹又は小脳に影響するものに関連する。Ｍａ２は、脳で発現される４０キロダルトンのタンパク質であり；Ｍａ２に対する抗体（本明細書では「抗−Ｔａ抗体」ともいう）の存在は、特に精巣癌又は肺癌並びに腫瘍随伴性症候群腫瘍随伴性辺縁系脳炎（ＰＬＥ）及び脳幹脳炎（ＢＥ）に関連する。Ｍａ３は２１キロダルトンのタンパク質であり；Ｍａ４は３６キロダルトンのタンパク質であり；そして、Ｍａ５は５６キロダルトンのタンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｍａ１のｃＤＮＡ（配列番号：３）及び推定アミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【図２】図２は、Ｍａ２のｃＤＮＡ（配列番号：６）及び推定アミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【図３】図３は、Ｆｉｇｕｒｅ３Ａであり、Ｍａ１のｃＤＮＡ（配列番号：３）とＭａ２のｃＤＮＡ（配列番号：６）、及びマウスｃＤＮＡ（配列番号：１４）との相同性を示す。
【図４】図４は、Ｆｉｇｕｒｅ３Ｂであり、Ｍａ１のｃＤＮＡ（配列番号：３）とＭａ２のｃＤＮＡ（配列番号：６）、及びマウスｃＤＮＡ（配列番号：１４）との相同性を示す。
【図５】図５は、Ｆｉｇｕｒｅ４であり、Ｍａ１及びＭａ２に対する抗体の、腫瘍随伴性症候群との臨床的−免疫学的関連性の概要を示す。
【図６】図６は、Ｆｉｇｕｒｅ５であり、Ｍａ３のｃＤＮＡ（配列番号：８）及び推定アミノ酸配列（配列番号：９）を示す。
【図７】図７は、Ｆｉｇｕｒｅ６Ａであり、Ｍａ４のｃＤＮＡ（配列番号：１０）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。
【図８】図８は、Ｆｉｇｕｒｅ６Ｂであり、Ｍａ４のｃＤＮＡ（配列番号：１０）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。
【図９】図９は、Ｆｉｇｕｒｅ７Ａであり、Ｍａ５のｃＤＮＡ（配列番号：１２）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。
【図１０】図１０は、Ｆｉｇｕｒｅ７Ｂであり、Ｍａ５のｃＤＮＡ（配列番号：１２）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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