(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種アデノウイルスのヘキソンペプチドと融合したＣ６８ヘキソン蛋白質の配列番号１６の１種以上のフラグメントから構成されるヘキソンタンパク質を含むことを特徴とするアデノウイルスのカプシドを含んでなる組換え型アデノウイルスおいて、
前記カプシドが標的細胞へ送達するための分子であって、アデノウイルス５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ミニ遺伝子およびアデノウイルス３’ＩＴＲを含む分子を内包しており、かつ、
Ｃ６８ヘキソン蛋白質の前記１種以上のフラグメントが
（ａ）配列番号１６のアミノ酸１３１から４４１までのペプチド、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８から１６３までのペプチド、
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１６９から１７６までのペプチド、
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸１９４から２０４までのペプチド、
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸２３３から２４６までのペプチド、
（ｆ）配列番号１６のアミノ酸２５３から２６４までのペプチド、
（ｇ）配列番号１６のアミノ酸２８７から２９７までのペプチド、および
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸４０４から４３０までのペプチド
から成る群から選択される、上記組換え型アデノウイルス。
【請求項２】
カプシドがＣ６８以外のアデノウイルス由来のファイバー蛋白質、ペントン蛋白質、またはファイバー蛋白質とペントン蛋白質の両方をさらに含む、請求項１記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項３】
Ｃ６８ヘキソン蛋白質の前記フラグメントが該へキソンのループ領域である、請求項１または２記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項４】
Ｃ６８ヘキソン蛋白質の少なくとも１つのループ領域が異種アデノウイルス由来のループ領域により置換されている、請求項３記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項５】
ペントン蛋白質およびファイバー蛋白質がヒトアデノウイルス由来である、請求項２〜４のいずれかに記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項６】
ペントン蛋白質がＣ６８由来であり、かつ、ファイバー蛋白質が異なるアデノウイルス由来である、請求項２〜４のいずれかに記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項７】
ペントン蛋白質が配列番号１２のアミノ酸配列により特徴付けられる請求項６記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項８】
ファイバー蛋白質がＣ６８由来であり、かつ、ペントン蛋白質が異なるアデノウイルス由来である、請求項２〜４のいずれかに記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項９】
ファイバー蛋白質が配列番号２７のアミノ酸配列により特徴付けられる請求項８記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項１０】
両アデノウイルスＩＴＲがＣ６８に対して異種の血清型由来である、請求項１〜９のいずれかに記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項１１】
アデノウイルスがアデノウイルスＥ１ａ遺伝子およびアデノウイルスＥ１ｂ遺伝子において機能的欠失を有する請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項１２】
Ｃ６８ヘキソン蛋白質の配列番号１６の１種以上のフラグメントが異なるアデノウイルスのヘキソンペプチドとリンカーを介して融合している請求項１〜１１のいずれかに記載の組換え型アデノウイルス。
【請求項１３】
生理的に許容される担体と請求項１〜１２のいずれかに記載のアデノウイルスのカプシドを含んでなる組換え型アデノウイルスを含んでなり、かつ、前記カプシドが標的細胞に送達するための分子を内包する薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え型アデノウイルスの医薬製剤の調製における使用。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え型アデノウイルスの標的細胞に分子を送達するための医薬製剤の調製における使用。
【請求項１６】
分子が免疫原をコードする請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
分子が治療用分子をコードする請求項１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
遺伝子治療およびワクチン用途用の組換え型アデノウイルスを記述する。
【０００２】
アデノウイルスは、３種類の主要蛋白質であるヘキソン（ｈｅｘｏｎ）（ＩＩ）、ペントンベース（ｐｅｎｔｏｎ  ｂａｓｅ）（ＩＩＩ）およびノブドファイバー（ｋｎｏｂｂｅｄ  ｆｉｂｒｅ（ＩＶ）に加えて他のいろいろな主要でない蛋白質、即ちＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２で構成されている２０面体カプシド（ｃａｐｓｉｄ）を伴う特徴的な形態を有する（非特許文献１）。そのウイルスのゲノムは線状の２本鎖ＤＮＡであり、その５’末端［これは逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＩＴＲ）を有する］に末端の蛋白質が共有結合している。そのウイルスのＤＮＡは強塩基性の蛋白質であるＶＩＩおよびｍｕと呼ばれる小型ペプチドと密に結合している。このＤＮＡ−蛋白質複合体と一緒に別の蛋白質であるＶが詰め込まれていて、蛋白質ＶＩを通して前記カプシドに構造的に連結している。そのウイルスはまたウイルスがコード化した（ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ）プロテアーゼも含有しており、これは、構成蛋白質のいくつかを処理して成熟した感染性ウイルスを生じさせるに必要である。
【０００３】
組換え型ウイルスベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）およびそのようなベクターを製造する改良方法が継続して求められている。
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏ．、８１：２５７３−２６０４（２０００年１１月）
【発明の要約】
【０００４】
本発明は、１つの面において、細菌の形質転換体（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）を迅速に選別する方法を提供する。この方法は、原核緑色蛍光蛋白質（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＧＰ）をコード化する核酸配列［これは、それが宿主細胞の中で発現することを可能にする調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と操作可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）している］とトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含有する核酸カセット（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を含んで成る組換え型シャトルベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）を設計製作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ことを伴う。その後、そのシャトルベクターを宿主細胞に移入させた後、ＧＦＰの発現に関する選別を行う。緑色が存在しないこと（即ち白色）は、ある細胞が組換え型ウイルスを担持していることの指標である。ＧＦＰの発現はそのような緑色を蛍光で活性にすることで容易に検出され、それは親ウイルスの存在（即ち組換え型が存在しないこと）を示している。
【０００５】
本発明は、別の面において、他のＣ６８蛋白質から単離したＣ６８のカプシド蛋白質を提供し、これは本明細書に示すアミノ酸で特徴づけられる。
【０００６】
本発明は、更に別の面において、Ｃ６８カプシド蛋白質から誘導したアデノウイルスベクターおよびウイルスなしに標的に向かう蛋白質（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）［本明細書でＣ６８誘導構築物（Ｃ６８−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）と呼ぶ］を提供する。
【０００７】
以下に行う本発明の詳細な説明から本発明の更に別の利点が容易に明らかになるであろう。
（発明の詳細な説明）
本発明は、チンパンジーのアデノウイルスＣ６８の固有配列（ｕｎｉｑｕｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）から誘導した新規なアデノウイルスカプシド蛋白質を提供する。本発明のカプシド蛋白質は多様な目的［この目的には、ウイルスを用いないで細胞に標的送達すること（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ）が含まれる］で用いるに有用でありかつ組換え型ウイルスベクターを作り出すに有用である。このような蛋白質およびウイルスベクターは異種分子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を標的細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ）に送達するに有用である。
【０００８】
本発明は、更に、本発明の新規なアデノウイルスカプシドの構築中および他の多様なウイルスもしくは非ウイルス構築物の構築中に得た細菌の形質転換体を迅速に選別する新規な方法も提供する。この方法では、少なくとも、適切なプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下にあるマーカー遺伝子（ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ）、例えば緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子などを含有するシャトルベクターを設計製作する。形質転換を受けさせた細胞をマーカーの発現に関して選別する。ＧＦＰの場合には白色のコロニーが組換え体である一方、緑色のコロニーが残存親プラスミドである。
Ｉ．  新規なアデノウイルスカプシド蛋白質
本発明は、１つの面において、Ｃ６８のヘキソン領域、Ｃ６８のペントン領域およびＣ６８のファイバー領域およびこれらのフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を含有する固有のＣ６８アデノウイルスカプシド蛋白質を提供する。このようなカプシド蛋白質は適切に実質的に純粋であり得る、即ち他の蛋白質を含有しない。これらの蛋白質は好適には少なくとも１０％が同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）、より好適には６０％が同種、最も好適には９５％が同種である。
【０００９】
加うるに、本発明は、固有のＣ６８誘導カプシド蛋白質（Ｃ６８−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を提供する。本明細書で用いる如きＣ６８誘導カプシド蛋白質には、如何なるＣ６８カプシド蛋白質もこれのフラグメントも含まれ、そのようなフラグメントには、これらに限定するものでないが、Ｃ６８カプシド蛋白質に固有でありかつ他の蛋白質を含有しないポリペプチド、ペプチドまたはアミノ酸残基が少なくとも８個分の連続配列が含まれる。Ｃ６８誘導カプシド蛋白質には、また、この上に定義した如きＣ６８カプシド蛋白質もしくはこれのフラグメントを含有するカプシド蛋白質も含まれ、それらには、これらに限定するものでないが、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）カプシド蛋白質、融合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、人工カプシド蛋白質、合成カプシド蛋白質および組換え型カプシド蛋白質が含まれるが、そのような蛋白質を生じさせる手段には制限がない。このようなＣ６８誘導カプシド蛋白質は、適切に、１つ以上のＣ６８領域またはこれらのフラグメント（例えばヘキソン）と組み合わせて異なるアデノウイルス抗原型（ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ）またはアデノウイルスでない源（本明細書に記述する如き）のカプシド領域またはこれらのフラグメントも含有する。そのようなＣ６８誘導カプシド蛋白質は、ウイルスを用いないで有用分子を細胞に向かわせる（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｕｓｅｆｕｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ）用途または本明細書に記述する如きウイルスベクターを生じさせる用途で使用可能である。
【００１０】
本明細書で用いる如き「向性を変えることに関連したカプシド蛋白質の修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ）」には、特異性が変化するように修飾を受けたカプシド蛋白質（ａｌｔｅｒｅｄ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、即ちペントン、ヘキソンまたはファイバー蛋白質領域またはこれらのフラグメント、例えばファイバー領域のノブドメイン（ｋｎｏｂ  ｄｏｍａｉｎ）など、またはそれをコード化するポリヌクレオチドが含まれる。
【００１１】
１つの態様において、Ｃ６８ペントン蛋白質のアミノ酸配列を配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１２：
【００１２】
【表１】
0004399255.tif 000002
【００１３】
で示す。
【００１４】
このペントン蛋白質またはこれの固有フラグメントは適切に多様な目的で使用可能である。適切なフラグメントの例には、この上に示したアミノ酸番号付けを基にして配列番号１２の中の約５０、１００、１５０または２００個のアミノ酸から成るＮ末端および／またはＣ末端切断部（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）を有するＣ６８ペントンが含まれる。他の適切なフラグメントには、より短い内部、Ｃ末端もしくはＮ末端フラグメントが含まれる。その上、本分野の技術者に公知の多様な目的で前記ペントン蛋白質に修飾を受けさせることも可能である。
【００１５】
Ｃ６８ヘキソンの配列を配列番号１６に示す：
【００１６】
【表２】
0004399255.tif 000003
【００１７】
このヘキソン蛋白質またはこれの固有フラグメントは適切に多様な目的で使用可能である。適切なフラグメントの例には、この上に示したアミノ酸番号付けを基にして配列番号１６の中の約５０、１００、１５０、２００、３００、４００または５００個のアミノ酸から成るＮ末端および／またはＣ末端切断部を有するＣ６８ヘキソンが含まれる。他の適切なフラグメントには、より短い内部、Ｃ末端もしくはＮ末端フラグメントが含まれる。例えば、１つの適切なフラグメントはヘキソン蛋白質のループ領域（ドメイン）（ＤＥ１およびＦＧ１と表示）またはそれらの高度可変領域である。そのようなフラグメントには、Ｃ６８のアミノ酸残基約１２５から４４３に及ぶ領域、約１３８から４４１に及ぶ領域、またはより小さいフラグメント、例えば残基約１３８から残基１６３に及ぶフラグメント、約１７０から約１７６、約１９５から約２０３、約２３３から約２４６、約２５３から約２６４、約２８７から約２９７、および約４０４から約４３０に及ぶ領域が含まれる（配列番号１６を参照）。本分野の技術者は他の適切なフラグメントを容易に識別することができるであろう。その上、本分野の技術者に公知の多様な目的で前記ヘキソン蛋白質に修飾を受けさせることも可能である。
【００１８】
１つの例として、本発明のＣ６８ヘキソン蛋白質配列を用いて修飾ヘキソン蛋白質を有するアデノウイルスを生じさせるのが望ましい可能性がある。ヘキソン蛋白質に修飾を受けさせる他の適切な方法が米国特許第５，９２２，３１５号（これは引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されている。この方法では、アデノウイルスのヘキソンの少なくとも１つのループ領域を別のアデノウイルス抗原型の少なくとも１つのループ領域と交換する。このように、そのような修飾を受けさせるアデノウイルスヘキソン蛋白質の少なくとも１つのループ領域はＣ６８のヘキソンループ領域である。１つの態様では、Ｃ６８のヘキソン蛋白質のループ領域を別のアデノウイルス抗原型に由来するループ領域と交換する。別の態様では、Ｃ６８のヘキソンのループ領域を用いて別のアデノウイルス抗原型に由来するループ領域を交換する。本明細書に記述するように、ヒト抗原型および非ヒト抗原型の中から適切なアデノウイルス抗原型を容易に選択することができる。非ヒトアデノウイルスを選択する場合、好適には、抗原型をヒトでない霊長類から選択する。しかしながら、適切な抗原型の選択は本発明の限定ではない。本分野の技術者に本発明のＣ６８ヘキソン蛋白質配列の更に別の使用が容易に明らかになるであろう。
【００１９】
Ｃ６８ファイバー蛋白質の配列は配列番号２７：
【００２０】
【表３】
0004399255.tif 000004
【００２１】
である。
【００２２】
このファイバー蛋白質またはこれの固有フラグメントは適切に多様な目的で使用可能である。１つの適切なフラグメントはファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）であり、これは配列番号２７のアミノ酸ほぼ２４７から４２５に及ぶ。他の適切なフラグメントの例には、この上に示したアミノ酸番号付けを基にして配列番号２７の中の約５０、１００、１５０または２００個のアミノ酸から成るＮ末端および／またはＣ末端切断部を有するＣ６８ファイバーが含まれる。更に、他の適切なフラグメントには内部フラグメントが含まれる。その上、本分野の技術者に公知の多様な技術を用いて前記ファイバー蛋白質に修飾を受けさせることも可能である。
【００２３】
Ｃ６８の他の有用な遺伝子産物のアミノ酸配列を添付配列リストの配列番号１−１１、１３−１５、１７−２６および２８−３８の中に与える。より詳細には、そのような配列は下記の通りである。
【００２４】
【表４】
0004399255.tif 000005
【００２５】
【表５】
0004399255.tif 000006
【００２６】
従って、本発明は、組換えまたは他の方法で生じさせた固有のＣ６８蛋白質、ペプチドおよびこれらのフラグメントを提供する。そのようなフラグメントの長さは適切に少なくともアミノ酸８個分である。しかしながら、他の所望の長さを有するフラグメントの利用も容易である。加うるに、本発明は、Ｃ６８蛋白質もしくはフラグメントの収率および／または発現を向上させる目的で導入可能な如き修飾、Ｃ６８蛋白質もしくはフラグメントの全部または一部が向上用融合相手と融合［直接またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を通して］している融合分子（ｆｕｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の構築も包含する。他の適切な修飾には、これらに限定するものでないが、成熟した蛋白質または酵素が生じるように通常は開裂を起こすプレ−もしくはプロ−プロテイン（ｐｒｅ−  ｏｒ  ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）をなくす目的でコード付け領域（例えば蛋白質または酵素）を切り取ることそして／または分泌される遺伝子産物を生じさせるコード付け領域に変異を起こさせることが含まれる。本分野の技術者に更に別の修飾が容易に明らかになるであろう。本発明は、更に、本明細書に示すＣ６８蛋白質に少なくとも約９５％から９９％の同一性を示す蛋白質も包含する。
【００２７】
蛋白質またはこれのフラグメントを言及する時の用語「実質的に相同」または「実質的に同様」は、適切なアミノ酸挿入もしくは欠失を伴わせて別の蛋白質と一緒に最適に整列させた時にその整列させた配列の少なくとも約９５から９９％にヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００２８】
蛋白質もしくはこれらのフラグメントの文脈における用語「配列同一パーセント」または「同一」は、２つの配列を一致度合が最大限になるように整列させた時にそれらの中のアミノ酸が同じであることを指す。配列同一性比較（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）の長さが蛋白質、酵素、ポリペプチド、ペプチド、または少なくともアミノ酸約２００から５００個分の他のフラグメントの全長に渡り得るのが望ましい。しかしながら、また、より小さいフラグメント、例えば少なくともアミノ酸約８個分、通常は少なくともアミノ酸約２０から２４個分、少なくともアミノ酸約２８から３２個分、少なくともアミノ酸約５０個分またはそれ以上に渡って同一であるのも望ましい可能性がある。
【００２９】
本分野の技術者は本分野の技術者に公知のアルゴリズムおよびコンピュータープログラムに頼ることで同一性を容易に決定するであろう。本明細書に記述するように、いろいろな公もしくは商業的に入手可能なＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍｓのいずれか、例えばＷｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒｓを通してインターネットでアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」などを用いて整列を実施する。別法として、また、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユティリティー（ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ）も用いる。また、アミノ酸配列同一性を測定する時に使用可能なアルゴリズムは本技術分野で数多く知られており、それにはこの上に記述したプログラムに含まれているそれらが含まれる。一般的には、そのようなプログラムをデフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ）で用いるが、本分野の技術者は必要に応じてそのようなセッティングを変えることができるであろう。別法として、本分野の技術者は、少なくとも前記アルゴリズムおよびプログラムを用いて得られるような度合の同一性もしくは整列を与える別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを用いることができるであろう。
【００３０】
本明細書に記述するように、本発明のＣ６８誘導カプシド蛋白質は、特に、他のＡｄ抗原型が基になっていて標的に向かう（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）蛋白質およびベクターばかりでなく他のウイルスベクターの有効性が中和抗体によって低下する用途で用いるに良好に適する。本発明のＣ６８誘導構築物は、特に、繰り返し遺伝子治療または免疫反応増強（ワクチンタイター）の目的で再投与を行う時に有利である。
【００３１】
本発明では、また、人工のアデノウイルスカプシド蛋白質も提供し、これは、本発明のＣ６８アデノウイルスカプシド蛋白質を用いて構築した修飾体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）およびキメラカプシド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃａｐｓｉｄｓ）を包含する。本発明のチンパンジー（ｃｈｉｍｐ）Ｃ６８  Ａｄヘキソンのアミノ酸配列を用いてそのような人工のカプシド蛋白質を構築することができる。前記ヘキソン蛋白質はアデノウイルスの抗原型の決定因子であることから、そのような人工のヘキソン蛋白質を用いて人工の抗原型を有するアデノウイルスを生じさせることができるであろう。また、本発明のチンパンジーＡｄペントン配列および／またはファイバー配列および／またはこれらのフラグメントを用いて他の人工のカプシド蛋白質を構築することも可能である。
【００３２】
１つの態様では、Ｃ６８ヘキソンとＣ６８ファイバーと別のアデノウイルスに由来するペントンを用いてキメラＣ６８カプシドを構築する。別法として、Ｃ６８ヘキソンと異なる１種以上のアデノウイルスに由来するファイバーとペントンでキメラＣ６８カプシドを構成させる。Ｃ６８ファイバーと異なる１種以上のアデノウイルス抗原型に由来するペントンとヘキソンで別のキメラアデノウイルスカプシドを構成させる。Ｃ６８ペントンと異なる１種以上のアデノウイルス抗原型に由来するファイバーとヘキソンで更に別のキメラアデノウイルスカプシドを構成させる。Ｃ６８の蛋白質を用いて構築したそのようなキメラおよび人工のカプシドでは、適切に、Ｃ６８アデノウイルスのものでない成分を他のアデノウイルス抗原型から容易に選択することができるであろう。
【００３３】
特定の状況下では、Ｃ６８誘導カプシド蛋白質またはこれらのフラグメントの１種以上を用いて抗体を生じさせるのが望ましい可能性がある。本明細書で用いる如き用語「抗体」は、エピトープに特異的に結合し得る免疫グロブリン分子を指す。本発明における抗体はいろいろな形態で存在し、それらには、例えば高親和性のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、キメラ抗体、組換え型抗体および人体に適応させた抗体などが含まれる。そのような抗体は、免疫グロブリンの種類ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが源である。本技術分野で公知のいろいろな方法のいずれかを用いてそのような抗体を生じさせることができる。良く知られている通常技術、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの技術、そしてそれらのいろいろな公知の修飾形を用いて適切な抗体を生じさせることができる。そのような抗原に対して発生させたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体に公知の組換え技術を適用することで同様に望ましい高タイターの抗体を生じさせる［例えばＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２；英国特許出願公開番号ＧＢ２１８８６３８Ａ；Ａｍｉｔ他、１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７４７−７５３；Ｑｕｅｅｎ他、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３３；ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＷＯ９００７８６１；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｈｕｓｅ他、１９８８ａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１を参照］。別法として、本発明の抗原に対する動物もしくはヒト抗体の相補性決定領域を操作することで抗体を生じさせることも可能である［例えばＥ．ＭａｒｋおよびＰａｄｌｉｎ、「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、第４章、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１１３巻、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４年６月）；Ｈａｒｌｏｗ他、１９９９、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ他、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＢｉｒｄ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６を参照］。
【００３４】
別法として、本発明のＣ６８カプシド蛋白質の１つ以上を多抗原複合体（ｍｕｌｔｉ−ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）［例えば１９８９年１１月２日付けで公開されたヨーロッパ特許出願０３３９６９５を参照］として組み立て、それを用いて高タイターの抗体を発生させる。本発明では、更に、抗イディオタイプ抗原（Ａｂ２）および抗抗イディオタイプ抗原（Ａｂ３）も提供する［例えばＭ．Ｗｅｔｔｅｎｄｏｒｆｆ他、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｊ．ＣｅｒｎｙおよびＪ．Ｈｉｅｒｎａｕｘ編集、１９９０、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：２０３−２２９頁参照］。本分野の技術者に良く知られている技術を用いてそのような抗イディオタイプおよび抗抗イディオタイプ抗体を生じさせる。これらの抗体はいろいろな目的で使用可能であり、そのような目的には診断および臨床方法およびキットが含まれる。
【００３５】
特定の状況下では、本発明のＣ６８抗体または他の構築物に検出可能標識またはタグ（ｔａｇ）を導入するのが望ましい可能性がある。本明細書で用いる如き検出可能標識は、単独または他の分子との相互作用で検出可能シグナルを与え得る分子である。最も望ましくは、免疫組織化学分析または免疫蛍光顕微鏡法で容易に用いることができるように、その標識を目で検出できるようにし、例えば蛍光で検出できるようにする。例えば、適切な標識には、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、コリホスフィン−Ｏ（ＣＰＯ）またはタンデム染料、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）およびＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＥＣＤ）が含まれる。このような蛍光染料は全部商業的に入手可能であり、それらの使用は本技術分野で公知である。他の有用な標識にはコロイド状金標識が含まれる。更に別の有用な標識には放射性化合物または元素が含まれる。追加的に、標識には、検定中に比色シグナルを出すように働くいろいろな酵素系が含まれ、例えばグルコースオキシダーゼ（グルコースを基質として使用）は過酸化物を産物として放出し、この過酸化物はペルオキシダーゼおよび水素供与体、例えばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの存在下で酸化されたＴＭＢをもたらし、これは青色として見られる。他の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、そしてグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼと組み合わせたヘキソキナーゼ（それはＡＴＰ、グルコースおよびＮＡＤ＋と反応してとりわけＮＡＤＨ生成物を生じ、波長が３４０ｎｍの所の吸光度が高くなるとしてそれを検出する）が含まれる。本発明の方法で用いる他の標識系では、他の手段、例えば着色したラテックス微細粒子［Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａ］（この中に染料が埋め込まれている）を酵素の代わりに用いて標的配列との接合体（これは適用可能な検定で結果として生じる複合体が存在することを示すことができる目に見えるシグナルを与える）を生じさせることで検出可能である。
【００３６】
そのような標識を所望分子と連結または結合させる方法も同様に本分野の技術者に公知の通常方法である。標識を取り付ける公知方法は記述されている［例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｍ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、１９９６；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、１９９４／１９９５を参照］。このように、標識および連結方法の選択は本発明を限定するものでない。
【００３７】
本明細書に記述するＣ６８誘導蛋白質、ペプチドおよびフラグメントの製造は適切な任意手段（化学的合成または他の合成手段を包含）または組換え産生（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および通常の遺伝子工学方法で実施可能である。例えば、ペプチドの合成では、良く知られている固相ペプチド合成方法を用いてもよい［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６２）；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９６９）、２７−６２頁］。前記および他の適切な製造方法は本分野の技術者の知識の範囲内であり、本発明の限定ではない。
【００３８】
別法として、適切な組換え産生方法を用いてもよい。適切な発現系（発現ベクターを包含）および蛋白質発現および／またはウイルス詰め込み（ｖｉｒａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ）用の宿主細胞の選択は本分野の技術者の能力の範囲内であり、本発明の限定ではない［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照］。
【００３９】
米国特許第６，０８３，７１６号に示されている利用できる情報を用いてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９（Ｐａｎ−９）からＣ６８ゲノムの核酸配列を入手することができ、それの長さは３６５２１ｂｐである。この配列をまたＧｅｎＢａｎｋから入手することも可能である。他のチンパンジーアデノウイルス配列をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９および他の給源から入手することも可能である。望ましいチンパンジー株はＰａｎ  ５［ＡＴＣＣ  ＶＲ−５９１］、Ｐａｎ  ６［ＡＴＣＣ  ＶＲ−５９２］およびＰａｎ  ７［ＡＴＣＣ  ＶＲ−５９３］である。特に望ましい別のチンパンジーアデノウイルス株は、チンパンジーアデノウイルス株ＢｅｒｔｈａまたはＣｌ［ＡＴＣＣアクセス番号ＶＲ−２０］である。このＣ１抗原型の配列およびアデノウイルス遺伝子Ｅｌａ、Ｅｌｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５の位置が米国特許第６，０８３，７１６号（引用することによって本明細書に組み入れられる）に与えられている。場合により、チンパンジーではないサルのアデノウイルス配列を用いることも可能である。そのようなチンパンジーではないアデノウイルスには、ヒヒアデノウイルス株から得られたアデノウイルス［例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−２７５］、リーサスサルから単離されたアデノウイルス株［例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−２０９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２７５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３５３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３５５］、そしてアフリカグリーンモンキーから単離されたアデノウイルス株［例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−５４１；ＡＴＣＣ  ＶＲ−９４１；ＡＴＣＣ  ＶＲ−９４２；ＡＴＣＣ  ＶＲ−９４３］が含まれる。別法として、少なくとも５１種類の異なるヒト抗原型の中から容易に選択可能であり、それらには、これらに限定するものでないが、ヒトアデノウイルス抗原型１、２、３、４、５、１２、３５、３７および４０、そしてヒトでない他の霊長類のアデノウイルス抗原型が含まれる。その上、いろいろなデータベースから前記および他の適切な抗原型の配列を入手することができ、そのようなデータベースには、例えばＰｕｂＭｅｄおよびＧｅｎＢａｎｋが含まれる［例えば米国特許第５，２４０，８４６号を参照］。適切なアデノウイルスの選択は本発明の限定ではない。
【００４０】
本発明は、更に、本発明のＣ６８およびＣ６８誘導蛋白質の製造で用いるに有用な分子も提供し、そのような分子には、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ配列を包含）を担持している分子が含まれる。従って、本発明は、更に、本発明のＣ６８誘導構築物をコード化する核酸配列、それらの発現で用いるに有用な分子および宿主細胞（適切なＤＮＡ分子およびベクターを包含）も包含し、これらは本明細書で定義する如き適切な如何なる遺伝要素（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）であってもよい。そのようなベクターは好適にはＤＮＡが基になったベクター（例えばプラスミド）またはウイルスベクターである。
【００４１】
１つの態様では、本明細書に記述するＣ６８誘導カプシド蛋白質および他のＣ６８アデノウイルス蛋白質を、ウイルスではなく蛋白質を基にして遺伝子、蛋白質および他の望ましい診断用、治療用および免疫原性分子を送達する時に用いる。標的細胞に送達することが望まれる分子を適切な任意手段でＣ６８誘導カプシド蛋白質または他の蛋白質に結合させてもよく、そのような手段には、例えば共有または非共有結合が含まれる。例えば、Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  ＬＫ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１年５月；８（１０）：７９５−８０３およびＭｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  ＬＫ他、Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ．２００１年１２月；８（２３）：１７５３−１７６１に記述されている様式に類似した様式で配列番号１２のＣ６８ペントン配列を用いて融合蛋白質を生じさせることを通して、Ｃ６８ペントン蛋白質をそのような目的で容易に利用することができる。別法として、米国特許出願２００１００４７０８１に記述されているように、細胞表面の受容体と結合するリガンドと蛋白質ＩＸを結合させることで、Ｃ６８蛋白質ＩＸのアミノ酸配列を標的に向かうベクターで利用することも可能である。適切なリガンドにはＣＤ４０抗原、ＲＧＤ含有もしくはポリリシン含有配列などが含まれる。更に他のＣ６８蛋白質を前記および同様な目的で用いることも可能である。
【００４２】
その上、本発明のＣ６８アデノウイルス蛋白質は、Ｃ６８誘導カプシドの中に包み込まれているウイルスベクターを生じさせる時に用いるに特に良好に適する。適切には、そのようなアデノウイルスは、Ｃ６８ではない抗原型に由来するアデノウイルスＩＴＲを担持している核酸分子とミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）が本発明のＣ６８誘導アデノウイルスカプシドの中に包み込まれているように偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）である。別法として、Ｃ６８誘導カプシド蛋白質の中にＣ６８に由来する少なくとも５’ＩＴＲもしくは３’ＩＴＲが包み込まれているアデノウイルスを生じさせることができる。本明細書に記述するアデノウイルスベクターは、１種または２種以上のアデノウイルス株から誘導したアデノウイルス配列を含有していてもよい。更に別の代替法では、本明細書に記述する他のＣ６８要素を組換え型ベクターまたは他の望ましい構築物の産出で用いることも可能である。
【００４３】
本発明のＣ６８蛋白質は多様な目的で用いるに有用であり、そのような目的には組換え型ウイルスの構築が含まれる。本発明のＣ６８誘導カプシド蛋白質はハイブリッドベクター（ｈｙｂｒｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ）の産生で用いるに有用であり、そのようなベクターには、ハイブリッドＣ６８−アデノ関連ウイルス（ｈｙｂｒｉｄ  Ｃ６８−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスおよびレトロウイルスが含まれる［Ｃａｐｌｅｎ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：４５４−４５９（１９９９）；Ｔａｎ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７３：７５８２−７５８９（１９９９）］。そのようなウイルスには、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ［Ｌｉｅｂｅｒ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：９３１４−９３２４（１９９９）、Ｒｅｃｃｈｉａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：２６１５−２６２０（１９９９）］またはレンチウイルスＩＴＲ［Ｚｈｅｎｇ他、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：１７６−１８０（２０００）、Ｍａｌｏｎｅｙ白血病ウイルスの長い末端反復を使用］と一緒にベクターを内包する（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）Ｃ６８誘導カプシドが含まれる。
【００４４】
特に望ましい態様では、本明細書に記述するＣ６８誘導カプシド蛋白質および場合により他のＣ６８配列を用いて組換え型アデノウイルスおよび偽型アデノウイルスを生じさせる。しかしながら、本Ｃ６８誘導カプシド蛋白質および他の新規なＣ６８配列はいろいろな目的で使用可能であり、そのような目的には、以下に記述する治療用および免疫原用トランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）を担持している他の種類のウイルスベクター（例えばハイブリッドベクターなど）の製造が含まれることは容易に理解されるであろう。追加的に、本発明の固有のＣ６８蛋白質および他の配列を担持しているウイルスベクターを診断、治療および／または免疫処置の目的で用いるに有用な他の種類の分子（蛋白質、化学分子および他の部分を包含）を標的に向かわせそして／または送達する目的で用いることができることは容易に理解されるであろう。
ＩＩ．  組換え型アデノウイルスベクター
本発明の組成物は、治療もしくはワクチンのいずれかの目的で異種分子を細胞に送達するベクターを含有する。本明細書で用いる如きベクターには如何なる遺伝要素も含まれ得、それには、これらに限定するものでないが、コスミド、エピソーム、プラスミドまたはウイルスが含まれる。特に好適な態様におけるベクターは、本発明のＣ６８蛋白質から誘導したカプシド蛋白質を有するウイルスベクターである。別法として、そのようなベクターに本発明の他のＣ６８配列を含有させることも可能である。このようなウイルスベクターに適切にはミニ遺伝子を含有させる。「ミニ遺伝子」は、選択した異種遺伝子と遺伝子産物を宿主細胞の中で翻訳、転写および／または発現させるに必要な他の調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）の組み合わせを意味する。
【００４５】
アデノウイルスベクターの設計では、典型的に、最小限でも複製およびウイルス粒子の封じ込めに必要なシス要素（ｃｉｓ−ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含有するアデノウイルス配列を用いてミニ遺伝子がそれの５’末端および／または３’末端に隣接して位置するように設計を行う。従って、１つの態様では、そのようなベクターに、アデノウイルスのゲノムの少なくとも５’末端を包含するアデノウイルス配列、即ち５’逆方向末端反復配列（５’  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（これは複製の源として機能する）および未変性の５’パッケージングエンハンサードメイン（５’  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｄｏｍａｉｎｓ）［これは線状のＡｄゲノムおよびＥ１プロモーター用のエンハンサー要素（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を包み込む（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に必要な配列を含有する］を含有させる。このベクターにまたシス作用（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）３’ＩＴＲも装備する。適切には、前記ミニ遺伝子を５’アデノウイルス要素と３’アデノウイルス要素の間に位置させる。本発明のアデノウイルスベクターにまた追加的アデノウイルス配列を含有させることも可能である。例えば、選択可能なミニ遺伝子の位置はとりわけ機能的Ｅ１欠失部位または機能的Ｅ３欠失部位などの如き部位であり得る。別法として、望まれるならば、ミニ遺伝子を現存遺伝子領域の中に挿入することでその領域の機能を乱すことも可能である。
【００４６】
用語「機能的に欠失させた」または「機能的欠失」は、例えば変異または修飾などで遺伝子領域を充分な量で除去するか或はそれに他の様式で損傷を与えることでその遺伝子領域がもはや遺伝子発現の機能的産物を産生し得ないようにすることを意味する。望まれるならば、その遺伝子領域の全体を除去してもよい。
【００４７】
本発明のそのようなアデノウイルスベクターに、適切には、Ｃ６８から誘導した１種以上のアデノウイルス要素を含有させる。１つの態様では、本ベクターにＣ６８とは異なるアデノウイルス抗原型に由来するアデノウイルスのＩＴＲを含有させる。別法として、Ｃ６８のＩＴＲを本発明のウイルスベクターで用いることも可能であり、この場合のカプシドは天然に存在するカプシドではないが、それに１種以上のＣ６８蛋白質またはこれらのフラグメントを含有させる。ＩＴＲの抗原型およびベクターに存在させる他の任意のアデノウイルス配列の抗原型の選択は本発明の限定ではない。いろいろなアデノウイルス株を本明細書に記述する。
【００４８】
本明細書に記述するベクターの構築で用いるウイルス配列、ヘルパーウイルス（必要ならば）、および組換え型ウイルス粒子および他のベクター成分および配列をこの上に記述した如く入手する。例えば米国特許第５，２４０，８４６号を参照のこと。アデノウイルス配列のＤＮＡ配列を用いてベクターおよびこのベクターの調製で用いるに有用な細胞系を構築する。例えば米国特許第６，０８３，７１６号を参照のこと。
【００４９】
標準的な分子生物学技術を用いて、本発明のベクターが生じるように核酸配列に受けさせる修飾（配列の欠失、挿入および他の変異を包含）を起こさせることができ、それらは本発明の範囲内である。
Ａ．  「ミニ遺伝子」
トランス遺伝子の選択、「ミニ遺伝子」のクローニングおよび構築そしてそれをウイルスベクターの中に挿入する時に用いる方法は、本明細書に示す教示が与えられた本分野の技術の範囲内である。
１．  トランス遺伝子
トランス遺伝子は、興味の持たれるポリペプチド、蛋白質または他の産物をコード化する核酸配列であり、これは、このトランス遺伝子に隣接して位置するベクター配列とは異種である。核酸コード付け配列を調節成分にトランス遺伝子の転写、翻訳および／または発現が宿主細胞の中で起こることを可能にする様式で有効に連結させる。
【００５０】
このようなトランス遺伝子配列の組成は、結果としてもたらされるベクターの使用に依存するであろう。例えば、ある種のトランス遺伝子配列にはレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）配列が含まれ、これは発現時に検出可能シグナルを発生する。そのようなレポーター配列には、これらに限定するものでないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリ性ホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合蛋白質（例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニン蛋白質および本技術分野で良く知られている他の蛋白質が含まれる）［これに向かう高親和性抗体が存在するか或はそのような抗体を通常手段で生じさせることができる］、および融合蛋白質［とりわけヘマグルチニンまたはＭｙｃに由来する抗原タグドメイン（ｔａｇ  ｄｏｍａｉｎ）と適切に融合している膜結合蛋白質を含んで成る］をコード化するＤＮＡ配列が含まれる。そのようなコード付け配列は、それらの発現を推進する調節要素と結合した時、通常手段で検出可能なシグナルを発生し、そのような通常手段には、酵素、ラジオグラフ、比色、蛍光または他のスペクトログラフ検定、蛍光活性化細胞分類分け検定および免疫学的検定［酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含］が含まれる。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子の場合、そのシグナルを担持するベクターの存在はベータ−ガラクトシダーゼ活性の検定で検出される。トランス遺伝子がＧＦＰまたはルシフェラーゼの場合、そのシグナルを担持するベクターは色によって目で測定可能であるか或はルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて光の発生で測定可能である。
【００５１】
しかしながら、そのようなトランス遺伝子は、望ましくは、生物学および医学で用いるに有用な産物、例えば蛋白質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素または触媒作用ＲＮＡなどをコード化する非マーカー（ｎｏｎ−ｍａｒｋｅｒ）配列である。望ましいＲＮＡ分子には、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームのＲＮＡ、触媒作用ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが含まれる。有用なＲＮＡ配列の一例は、動物に処置を受けさせた時に標的核酸配列の発現を起こさせなくする配列である。
【００５２】
そのようなトランス遺伝子は、例えば癌の治療またはワクチンのような遺伝子欠失の治療、免疫反応の誘発そして／または予防ワクチンの目的で使用可能である。免疫反応の誘発を本明細書で用いる場合、これは、ある分子（例えば遺伝子産物）がこの分子に対するＴ細胞および／または体液の免疫反応を誘発する能力を指す。本発明は、更に、例えばマルチサブユニット（ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ）蛋白質によって引き起こされる状態を補正または改善する複数トランス遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）の使用も包含する。特定の状況下では、蛋白質の各サブユニットをコード化するか或は異なるペプチドまたは蛋白質をコード化する異なるトランス遺伝子を用いてもよい。これは、蛋白質のサブユニットをコード化するＤＮＡの大きさが大きい時に望ましく、例えば免疫グロブリン、血小板誘導増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはジストロフィン蛋白質などの場合に望ましい。ある細胞を異なるサブユニットの各々を含有する組換え型ウイルスに感染させることで、その細胞がマルチサブユニット蛋白質を産生するようにする。別法として、同じトランス遺伝子が蛋白質の異なるサブユニットをコード化するようにしてもよい。この場合の単一のトランス遺伝子は、そのサブユニットの各々をコード化するＤＮＡを含有し、各サブユニットのＤＮＡはインターナルリボチームエントリーサイト（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）で分離されている。これは、そのサブユニットの各々をコード化するＤＮＡの大きさが小さい時に望ましく、例えばそのサブユニットをコード化するＤＮＡおよびＩＲＥＳの全体の大きさが５キロベース（ｆｉｖｅ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ）未満の時に望ましい。ＩＲＥＳの代替として、そのＤＮＡは２Ａペプチド（これは翻訳出来事後に自己開裂する）をコード化する配列によって分離されていてもよい。例えばＭ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ１）：１３−２１（１９９７年１月）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１１）：８６４−８７３（２００１年６月）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１０）：８１１−８１７（２００１年５月）を参照のこと。この２ＡペプチドはＩＲＥＳよりも有意に小さいことから、空間が制限因子の時に用いるに良好に適する。しかしながら、その選択するトランス遺伝子は生物学的活性を示す如何なる産物または他の産物、例えば研究で望まれる産物などをコード化するものであってもよい。
【００５３】
本分野の技術者は適切なトランス遺伝子を容易に選択することができるであろう。このようなトランス遺伝子の選択は本発明の限定であると見なさない。
２．  調節要素
本ベクターに、この上にミニ遺伝子に関して示した主要な要素に加えて、また、必要な通常の制御要素（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（これはトランス遺伝子と本発明で生じさせたプラスミドベクターを移入したか或は本発明で生じさせたウイルスに感染させた細胞の中でそれの転写、翻訳および／または発現が起こるような様式で操作可能に連結している）も含有させる。本明細書で用いる如き「操作可能に連結している」配列には、興味の持たれる遺伝子に隣接して位置する発現制御配列および興味の持たれる遺伝子を制御するようにトランス（ｔｒａｎｓ）でか或はある距離を置いて作用する発現制御配列の両方が含まれる。
【００５４】
発現制御配列には、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；有効なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニレーション（ＰｏｌｙＡ）シグナルなど；細胞質のｍＲＮＡを安定にする配列；翻訳効率を向上させる配列（即ち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；蛋白質の安定性を向上させる配列；そして望まれるならば、コード化された産物の分泌を向上させる配列が含まれる。多種多様な発現制御配列（天然、構成、誘導および／または組織特異的であるプロモーターを包含）は本技術分野で公知であり、使用可能である。
【００５５】
構成プロモーターの例には、これらに限定するものでないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えばＢｏｓｈａｒｔ他、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が含まれる。
【００５６】
誘導プロモーターは、遺伝子発現の調節を許可し、これは外因的に供給された化合物、環境因子、例えば温度など、または特定の生理学的状態、例えば急性段階（ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ）、細胞の特別な分化状態［即ち複製している細胞のみ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎｌｙ）］の存在で調節され得る。誘導プロモーターおよび誘導系はいろいろな商業源から入手可能であり、そのような商業源には、これらに限定するものでないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄが含まれる。他の系も数多く記述されており、本分野の技術者はそれを容易に選択することができるであろう。例えば、誘導プロモーターには、亜鉛で誘導され得るヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、およびデキサメタソン（Ｄｅｘ）で誘導され得るマウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターが含まれる。他の誘導系には、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［ＷＯ  ９８／１００８８］；エクジソンインセクトプロモーター（ｅｃｄｙｓｏｎｅ  ｉｎｓｅｃｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）［Ｎｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラシクリン抑制系（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ）［Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラシクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、またＨａｒｖｅｙ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）も参照］が含まれる。他の系にはＦＫ５０６二量体、ＶＰ１６もしくはｐ６５使用カストラジオール、ジフェノールムリスレロン、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７）］およびラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７）］が含まれる。ある種の誘導プロモーターの効果は経時的に高くなる。そのような場合には、マルチプルレプレッサー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ）を縦列に挿入、例えばＴｅｔＲをＩＲＥＳでＴｅｔＲに連結させることなどでそのような系の効果を高くすることができる。別法として、所望機能の選別を行う前に少なくとも３日間待つことも可能である。所望蛋白質の発現が高くなった時点で公知手段を用いてその系の効果を高くすることができる。例えばＷｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＷＰＲＥ）を使用。
【００５７】
別の態様では、トランス遺伝子用の天然プロモーターを用いる。トランス遺伝子の発現が天然の発現に類似することが望まれる時には天然のプロモーターが好適であり得る。トランス遺伝子の発現を一時的または発生的に（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ）か、或は組織に特異的な様式でか、或は特定の転写刺激に対する反応で調節すべき時には天然のプロモーターを用いてもよい。さらなる態様では、また、他の天然の発現制御要素、例えばエンハンサー要素、ポリアデニレーションサイトまたはＫｏｚａｋコンセンサス配列などを用いて天然の発現を模擬することも可能である。
【００５８】
別の態様のトランス遺伝子には、組織に特異的なプロモーターと有効に連結しているトランス遺伝子が含まれる。例えば、発現を骨格筋の中で起こさせることが望まれる時には、筋肉の中で活性を示すプロモーターを用いるべきである。それらには、骨格β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコード化する遺伝子に由来するプロモーターばかりでなく、天然に存在するプロモーターが示す活性よりも高い活性を示す合成の筋肉プロモーターが含まれる［Ｌｉ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照］。組織に特異的なプロモーターの例は、とりわけ、肝臓［アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９（１９９６）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６）］、骨オステオカルシン［Ｓｔｅｉｎ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７）］；骨シアロプロテイン［Ｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６）］、リンパ球［ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖；ニューロン、例えばニューロンに特異的なエノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター［Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３）］、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子［Ｐｉｃｃｉｏｌｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１）］およびニューロンに特異的なｖｇｆ遺伝子［Ｐｉｃｃｉｏｌｉ他、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５）］などに関して公知である。
【００５９】
治療有効または免疫原性産物をコード化するトランス遺伝子を担持させたベクターに、場合により、また、選択性マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ）またはレポーター遺伝子も含有させてもよく、それらには、とりわけ、ゲネチシン、ヒグロミシンまたはプリミシン耐性をコード化する配列が含まれ得る。そのような選択性レポーターもしくはマーカー遺伝子（好適には、ウイルス粒子の中に包み込ませるべきウイルスゲノムの外側に位置させる）を用いて、細菌の細胞、例えばアンピシリン耐性細胞の中にプラスミドが存在すると言ったシグナルを送ることができる。本ベクターに含める他の成分には複製の源が含まれ得る。前記および他のプロモーターおよびベクター要素の選択は通常であり、そのような数多くの配列を利用することができる［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他およびそこに引用されている文献を参照のこと］。
【００６０】
本明細書に示した技術および配列を本分野の技術者に公知の技術と一緒に用いることでそのようなベクターを生じさせる。そのような技術には、ｃＤＮＡの通常のクローニング技術、例えばテキスト［Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ］に記述されている技術、アデノウイルスゲノムの重なり合うオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、そして所望のヌクレオチド配列を与える適切な如何なる方法も含まれる。
ＩＩＩ．  組換え型ウイルス粒子の製造
１つの態様では、チンパンジーアデノウイルスのプラスミド（または他のベクター）を用いて組換え型アデノウイルス粒子を生じさせる。１つの態様における組換え型アデノウイルスはＥ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子が機能的に欠失しておりそして場合により他の遺伝子も他の変異、例えば温度感受性変異（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）または欠失などを有する。他の態様では、その組換え型アデノウイルスがＥ１ａおよび／またはＥ１ｂ領域を無傷のまま保持するようにするのが望ましい。そのような無傷のＥ１領域をアデノウイルスのゲノムの天然の場所に位置させてもよいか、或は天然のアデノウイルスゲノムの中の欠失部位（例えばＥ３領域）に位置させてもよい。
【００６１】
ある遺伝子をヒト（または他の哺乳動物）の細胞に送達する目的で用いるに有用なチンパンジーアデノウイルスベクターの構築では、ある範囲のアデノウイルス核酸配列をそのベクターの中で用いてもよい。例えばアデノウイルスの遅延初期遺伝子（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ）Ｅ３の全部または一部を組換え型ウイルスの一部を構成するＣ６８アデノウイルス配列から除去してもよい。アデノウイルスのＥ３の機能は組換え型ウイルス粒子の機能および産生に関係しないと考えている。また、Ｅ４遺伝子の少なくともＯＲＦ６領域、より望ましくはＥ４領域全体（この領域の機能には重複性があることから）が欠失しているアデノウイルスベクターを構築することも可能である。本発明の更に別のベクターは、遅延初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を有するベクターである。また、チンパンジーアデノウイルスゲノムの後期（ｌａｔｅ）遺伝子Ｌ１からＬ５のいずれかに欠失を生じさせることも可能である。同様に、中間遺伝子ＩＸおよびＩＶａ２に欠失を生じさせるのもある目的で有用である。他の構造もしくは非構造アデノウイルス遺伝子に他の欠失を生じさせることも可能である。この上で考察した欠失は個々別々に使用可能である、即ち本発明で用いるアデノウイルス配列に含める欠失は単一領域のみであってもよい。別法として、生物学的活性を壊すに有効な遺伝子全体または一部の欠失を如何なる組み合わせで用いることも可能である。例えば、１つの典型的なベクターでは、アデノウイルス配列のＥ１遺伝子とＥ４遺伝子、またはＥ１とＥ２ａとＥ３遺伝子、またはＥ１とＥ３遺伝子、またはＥ１とＥ２ａとＥ４遺伝子（Ｅ３の欠失を伴うか或は伴わない）等々に欠失を生じさせてもよい。この上で考察したように、そのような欠失を他の変異、例えば温度感受性変異などと組み合わせて用いることで所望の結果を達成することも可能である。
【００６２】
必須アデノウイルス配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、ＯＲＦ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）のいずれかが不足しているアデノウイルスベクターを、その失われたアデノウイルス遺伝子産物（これらはウイルスの感染およびアデノウイルス粒子の増殖に必要である）の存在下で培養してもよい。そのようなアデノウイルスベクターを１種以上のヘルパー構築物（例えばプラスミドまたはウイルス）または詰め込み用宿主細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）の存在下で培養することで、そのようなヘルパー機能を与えてもよい。例えば１９９６年５月９日付けで公開された国際特許出願ＷＯ９６／１３５９７（引用することによって本明細書に組み入れられる）に示されている「最小（ｍｉｎｉｍａｌ）」ヒトＡｄベクターの調製に記述されている技術を参照のこと。
１．  ヘルパーウイルス
従って、ミニ遺伝子を含有する感染性組換え型ウイルス粒子を生じさせるに必要な充分な量のチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を得るには、そのミニ遺伝子の担持で用いるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子含有量に応じて、ヘルパーアデノウイルスもしくは非複製（ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ウイルスフラグメントが必要であり得る。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物に存在せずそして／または前記ベクターを移入させる詰め込み用細胞系が発現しない選択したアデノウイルス遺伝子配列を含有するウイルスである。１つの態様におけるヘルパーウイルスは複製欠陥（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ウイルスであり、これはこの上に記述した配列に加えていろいろなアデノウイルス遺伝子を含有する。そのようなヘルパーウイルスを望ましくはＥ１発現細胞系と組み合わせて用いる。
【００６３】
また、Ｗｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．ＦｉｓｈｅｒおよびＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９９：４９（１９９４年４月１日）に記述されているように、ヘルパーウイルスをポリカチオン接合体（ｐｏｌｙ−ｃａｔｉｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）にすることも可能である。場合により、ヘルパーウイルスに２番目のレポーターミニ遺伝子を含有させることも可能である。そのようなレポーター遺伝子は本技術で数多く知られている。レポーター遺伝子をアデノウイルスベクターに存在させるトランス遺伝子とは異なるヘルパーウイルスに存在させると、Ａｄベクターとヘルパーウイルスの両方を独立して監視することが可能になる。そのような２番目のレポーターを用いると、結果として生じる組換え型ウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を精製時に行うことが可能になる。
２．  補助細胞系
この上に記述した遺伝子のいずれかが欠失している組換え型チンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を生じさせる時、その欠失させた遺伝子領域の機能がそのウイルスの複製および感染に必須であるならば、その機能をヘルパーウイルスまたは細胞系、即ち補助（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）または詰め込み用細胞系を用いてその組換え型ウイルスに供給すべきである。数多くの状況下で、ヒトＥ１を発現する細胞系を用いてチンパンジーＡｄベクターのトランスコンプリメント（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を行うことができる。このことは、本発明のチンパンジーＡｄ配列と現在利用できる詰め込み用細胞に見られるヒトＡｄＥ１配列の間の多様性が理由で現在のヒトＥ１含有細胞を用いると複製および産生過程中に複製適格な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）アデノウイルスが生じないことから特に有利である。しかしながら、特定の状況下では、Ｅ１欠失チンパンジーアデノウイルスの産生で利用できるＥ１遺伝子産物を発現する細胞系を用いるのが望ましいであろう。そのような細胞系は記述されている。例えば米国特許第６，０８３，７１６号を参照。
【００６４】
望まれるならば、本明細書に示す配列を用いて、選択した親細胞系の中で発現させるプロモーターの転写制御下でアデノウイルスのＥ１遺伝子を最低でも発現する詰め込み用細胞もしくは細胞系を生じさせてもよい。この目的で誘導もしくは構成プロモーターを用いてもよい。そのようなプロモーターの例は本明細書の別の所で詳細に記述したプロモーターである。所望のＡｄ遺伝子のいずれかを発現する新規な細胞系を発生させる目的で親細胞を選択する。そのような親細胞系は、これらに限定するものでないが、とりわけ、ヒーラー［ＡＴＣＣアクセス番号ＣＣＬ  ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣアクセス番号ＣＣＬ  １８５、ＫＢ［ＣＣＬ  １７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ  ５１０、ＣＣＬ  ７２］およびＷＩ−３８［ＣＣＬ  ７５］細胞であり得る。そのような細胞系は全部Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９から入手可能である。他の給源から他の適切な親細胞系を入手することも可能である。
【００６５】
そのようなＥ１発現細胞系は、Ｅ１が欠失している組換え型チンパンジーアデノウイルスベクターを生じさせる時に用いるに有用である。加うるにか或は別法として、本発明は、１種以上のチンパンジーアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／またはＥ４  ＯＲＦ６などを発現する細胞系を提供し、これらの構築は、組換え型チンパンジーウイルスベクターを生じさせる時に用いた手順と本質的に同じ手順を用いて実施可能である。このような細胞系を用いて、そのような産物をコード化する必須遺伝子が欠失しているアデノウイルスベクターのトランスコンプリメントを行うか或はヘルパー依存ウイルス（例えばアデノ関連ウイルス）の詰め込みに必要なヘルパー機能を与えることができる。本発明に従う宿主細胞の調製は選択したＤＮＡ配列の組み立てなどの如き技術を必要とする。この組み立ては通常の技術を用いて達成可能である。そのような技術にはｃＤＮＡおよびゲノムクローニング（これらは良く知られており、この上に示したＳａｍｂｒｏｏｋ他が記述している）、アデノウイルスゲノムの重なり合うオリゴヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせて用いること、合成方法、そして所望のヌクレオチド配列を与える他の適切な如何なる方法も含まれる。
【００６６】
更に別の代替では、アデノウイルスベクターおよび／またはヘルパーウイルスを用いて必須アデノウイルス遺伝子産物をトランスで与える。そのような場合には、いずれかの生物学的有機体から適切な宿主細胞を選択してもよく、そのような有機体には、原核細胞（例えば細菌）細胞、および真核細胞（これには昆虫の細胞、酵母菌の細胞および哺乳動物の細胞が含まれる）が含まれる。特に望ましい宿主細胞をいずれかの哺乳動物種から選択し、そのような種には、これらに限定するものでないが、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、２９３細胞（これらは機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２および一次線維芽細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、ラビットおよびハムスターを包含）に由来する肝細胞および筋芽細胞の如き細胞が含まれる。そのような細胞を得る時の哺乳動物種の選択は本発明の限定ではなく、また哺乳動物の細胞の種類、即ち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などに限定するものでもない。
３．  ウイルス粒子の組み立ておよび細胞系のトランスフェクション
ミニ遺伝子を含んで成るベクターをトランスフェクションで送達する場合、一般に、そのようなベクターを約５μｇ−約１００μｇのＤＮＡ、好適には約１０−約５０μｇのＤＮＡから約１ｘ１０４個の細胞−約１ｘ１０１３個の細胞、好適には約１０５個の細胞の量で送達する。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択したベクター、送達方法および選択した宿主細胞の如き要因を考慮に入れて調整可能である。
【００６７】
このベクターは本技術分野で公知であるか或はこの上に開示した如何なるベクターであってもよく、それらには、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスなどが含まれる。このようなベクターを宿主細胞に導入する時、本技術分野で公知であるか或はこの上に開示した如き如何なる手段でそれを達成してもよく、そのような手段には、トランスフェクションおよび感染が含まれる。アデノウイルスの遺伝子の１つ以上を宿主細胞のゲノムの中に安定に一体化させ、エピソームとして安定に発現させるか或は過渡的に発現させる。その遺伝子産物の全部を過渡的にエピソーム上に発現させるか或は安定に一体化させるか、或は遺伝子産物のいくつかを安定に発現させる一方でその他を過渡的に発現させてもよい。その上、アデノウイルスの遺伝子の各々のプロモーターを構成プロモーター、誘導プロモーターまたは天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択してもよい。そのようなプロモーターの調節は有機体または細胞の特定の生理学的状態（即ち分化状態または複製もしくは休止細胞）または外因的に添加する因子などで実施可能である。
【００６８】
宿主細胞への分子（プラスミドまたはウイルスとして）の導入は、また、本分野の技術者に公知でありかつ本明細書全体に渡って考察した如き技術を用いることで達成可能である。好適な態様では、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクションまたはエレクトロポレーションなどを用いる。
【００６９】
アデノウイルスの選択したＤＮＡ配列（ばかりでなくトランス遺伝子および他のベクター要素）を組み立てていろいろな中間的プラスミドを生じさせそしてそのプラスミドおよびベクターを用いて組換え型ウイルス粒子を生じさせることを全部通常技術を用いて達成する。そのような技術には、通常のｃＤＮＡクローニング技術、例えばテキスト［この上で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ他］に記述されている技術、アデノウイルスゲノムの重なり合うオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、そして所望のヌクレオチド配列を与える適切な如何なる方法も含まれる。標準的トランスフェクションおよびコトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）技術、例えばＣａＰＯ４沈澱技術などを用いる。用いる他の通常方法には、ウイルスゲノムの同種組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、寒天オーバーレイ（ａｇａｒ  ｏｖｅｒｌａｙ）を用いたウイルスのプラーキング（ｐｌａｑｕｉｎｇ）、シグナル発生測定方法などが含まれる。
【００７０】
例えば、所望のミニ遺伝子を含有するウイルスベクターを構築して組み立てた後、そのベクターをインビトロでヘルパーウイルスの存在下で詰め込み用細胞系の中に移入させる。同種組換えがヘルパー配列とベクター配列の間で起こり、それによって、そのベクターの中のアデノウイルス−トランス遺伝子配列が複製してウイルス粒子カプシドの中に包み込まれ、その結果として、組換え型ウイルスベクター粒子が生じる。そのようなウイルス粒子を生じさせる現在の方法はトランスフェクションが基になっている。しかしながら、本発明をそのような方法に限定するものでない。
【００７１】
その結果として得た組換え型チンパンジーアデノウイルスは選択したトランス遺伝子を選択した細胞に移入させる時に用いるに有用である。このような組換え型ウイルスを詰め込み用細胞系の中で増殖させるインビボ実験において、本発明のＥ１欠失組換え型チンパンジーアデノウイルスベクターはトランス遺伝子をチンパンジーではない、好適にはヒトの細胞に移入させるに有用であることを立証する。
ＩＶ．  非ウイルスＣ６８蛋白質およびＣ６８誘導アデノウイルスの使用
本発明の組換え型アデノウイルスであるベクターは遺伝子をヒトまたはチンパンジーではない獣医患者にインビトロ、エクスビボおよびインビボで移入する時に用いるに有用である。加うるに、本明細書に記述する多様なＣ６８蛋白質は、ウイルスを用いないでトランス遺伝子、蛋白質、化学分子および他の部分もしくは分子を細胞に向かわせる（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）時に用いるに有用である。適切な送達方法および投与養生法はその標的になる分子（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）および標的に向かう蛋白質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に応じて容易に決定される。蛋白質媒介送達（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）で用いるに適した遺伝子および蛋白質源の例を以下の章に治療用および免疫原性分子のウイルス送達（ｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に関して示す。以下の考察はウイルスベクターに焦点を当てたものであるが、本発明のＣ６８誘導蛋白質は本明細書に記述するようにＣ６８誘導ウイルスベクターの目的で配合可能でありかつ同じ投与経路および養生法を利用することができることは理解されるであろう。
【００７２】
本明細書に記述する組換え型アデノウイルスであるベクターは、異種遺伝子がコード化する産物をインビトロで生じさせる時の発現ベクターとして使用可能である。例えば、Ｅ１欠失位置に挿入した遺伝子を含有する組換え型アデノウイルスをこの上に記述した如きＥ１発現細胞系の中に移入させてもよい。別法として、複製適格アデノウイルスを別の選択した細胞系で用いることも可能である。次に、その移入を受けさせた細胞を通常様式で培養することで、その組換え型アデノウイルスがその遺伝子産物をプロモーターによって発現するようにする。次に、公知の通常の蛋白質単離方法そして培養物からの回収方法を用いてその遺伝子産物を培養培地から回収してもよい。
【００７３】
本発明のＣ６８誘導ベクターまたはＣ６８誘導蛋白質を用いるならば、当該有機体が１種以上のＡＡＶ抗原型に対する中和抗体を有する場合でも選択したトランス遺伝子または他の分子を選択した宿主細胞にインビボまたはエクスビボで送達することを可能にする効率良い遺伝子輸送媒体（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｈｉｃｌｅ）を生じさせることができる。１つの態様では、ｒＡＡＶと細胞をエクスビボで混合し、その感染させた細胞を通常の方法で培養した後、その形質導入を受けさせた細胞を患者に再注入する。このような組成物は特に治療目的および免疫処置（保護免疫の誘発を包含）の目的で遺伝子を送達しようとする時に良好に適する。
【００７４】
より通常には、本発明のＣ６８誘導ベクターおよびＣ６８誘導蛋白質を以下に記述するように治療用もしくは免疫原性分子の送達で用いる。両方の用途とも、本発明のＣ６８誘導構築物は単一の投与を伴う養生法ばかりでなくアデノウイルスベクターの繰り返し送達またはウイルスを用いない標的送達（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）またはトランス遺伝子もしくは他の分子を細胞に繰り返し送達することを伴う養生法で用いるに有用であることは容易に理解されるであろう。
【００７５】
そのような養生法は、典型的に、ウイルスのカプシドが修飾を受けている一連のウイルスベクターを送達することを伴う。そのウイルスのカプシドを次に行う各投与時にか或は個々の抗原型のカプシドを前以て選択しておいた回数（例えば１回、２回、３回、４回またはそれ以上）で投与した後に変えてもよい。例えば、ある養生法は、Ｃ６８誘導カプシドを用いてｒＡｄを送達しそして別のヒトまたはヒトではない霊長類のアデノウイルス抗原型を用いてｒＡｄを送達することを伴い得る。場合により、そのような養生法に、ヒトではない他の霊長類のアデノウイルス、ヒトアデノウイルスまたは人工抗原型、例えば本明細書に記述する如き抗原型のカプシドを用いてｒＡｄを投与することを伴わせてもよい。別法として、このような養生法は、Ｃ６８誘導蛋白質を繰り返し投与するか或は他の蛋白質が基になった送達系を用いてウイルスを用いないで標的に向かわせる（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）目的でＣ６８誘導蛋白質を投与することを伴う。このような養生法の各段階は、単一のＣ６８誘導構築物を用いた一連の注射（または他の送達経路）に続く別のＡｄ抗原型構築物を用いた一連の注射投与を伴う。別法として、本発明のＣ６８誘導ベクターおよび蛋白質を他の非アデノウイルス媒介送達系（ｎｏｎ−ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）［他のウイルス系、非ウイルス送達系、蛋白質、ペプチド、および他の生物学的活性を示す分子が含まれる］を伴う養生法で用いることも可能である。
【００７６】
以下の章では本発明のアデノウイルスベクターを用いて送達可能な典型的な分子に焦点を当てる。
Ａ．  治療用分子のＡｄ媒介送達
１つの態様では、この上に記述したＣ６８誘導構築物を公開された遺伝子治療方法に従ってヒトに投与する。トランス遺伝子を担持させたＣ６８誘導構築物を好適には生物学的に適合する溶液または薬学的に受け入れられる送達用媒体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）の中に懸濁させて患者に投与してもよい。適切な媒体には無菌食塩水が含まれる。この目的で、薬学的に受け入れられる担体であることが知られておりかつ本技術分野の技術者に良く知られている他の水性および非水性の等張無菌注入用溶液そして水性および非水性の無菌懸濁液を用いてもよい。
【００７７】
本Ｃ６８誘導アデノウイルスベクターの投与を標的細胞が形質導入を受けそして遺伝子の移入および発現が過度の副作用なしに医学的に受け入れられる生理学的効果を伴って治療利点が得られるに充分な度合で起こるに充分な量で行うが、その量を医学技術の技術者は決定することができるであろう。薬学的に受け入れられる通常の投与経路には、これらに限定するものでないが、網膜への直接送達および他の眼内送達方法、肝臓への直接送達、鼻内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸、経口および他の非経口投与経路が含まれる。望まれるならば、投与経路を組み合わせてもよいか、或はトランス遺伝子または状態に応じて投与経路を調整してもよい。投与経路は主に治療を受けさせる状態の性質に依存するであろう。
【００７８】
本ウイルスベクターの投与量は、主に、治療を受けさせる状態、患者の年令、体重および健康状態などの如き要因に依存し、従って、患者と患者の間で異なるであろう。例えば、成人または獣医分野で本ウイルスベクターを投与する時の治療有効量は、一般に、ウイルス粒子を約１ｘ１０６から約１ｘ１０１５個の粒子、約１ｘ１０１１から１ｘ１０１３個の粒子、または約１ｘ１０９から１ｘ１０１２個の粒子の濃度で含有させた担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を約１００μＬから約１００ｍＬの範囲である。投与量の範囲は動物の大きさおよび投与経路に依存するであろう。例えば、ヒトまたは獣医分野で筋肉内注射する場合の適切な投与量（約８０ｋｇの動物の場合）は、単一部位に関して、１ｍＬ当たり約１ｘ１０９から約５ｘ１０１２の粒子の範囲である。場合により、複数の投与部位に送達することも可能である。別の例では、ヒトまたは獣医分野の適切な投与量は、経口用調剤の場合、約１ｘ１０１１から約１ｘ１０１５の粒子の範囲であり得る。
【００７９】
本発明のＣ６８蛋白質を標的送達で用いる場合の適切な投与量範囲、即ち本構築物を成人または獣医分野で投与する時の治療有効量は、一般に、蛋白質を約０．０１μｇから約１００ｍｇ、蛋白質を約０．１μｇから約１０ｍｇ、約１μｇから約１ｍｇの濃度で含有させた担体を約１００μＬから約１００ｍＬの範囲である。投与量の範囲は動物の大きさおよび投与経路に依存するであろう。投与経路は適切な如何なる経路からも容易に選択可能であり、そのような経路には、これらに限定するものでないが、この上に記述した経路が含まれる。
【００８０】
本分野の技術者はそのような投与量を投与経路およびＣ６８誘導構築物を用いる治療もしくはワクチン用途に応じて調整することができるであろう。トランス遺伝子の発現度合、または免疫原の場合には循環している抗体の濃度を監視することで、投与の頻度を決定することができるであろう。投与頻度を決定する更に別の方法は本分野の技術者に容易に明らかであろう。
【００８１】
任意の方法段階（ｍｅｔｈｏｄ  ｓｔｅｐ）は、本Ｃ６８誘導構築物を患者に投与すると同時、投与する前または投与した後に短期間作用する免疫調節因子（ｓｈｏｒｔ  ａｃｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を適切な量で一緒に投与することを伴う。その選択する免疫調節因子を、本明細書では、本発明の組換え型ベクターに向かう中和抗体の発生を抑制し得るか或は細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって本ベクターが除去されるのを抑制し得る因子であると定義する。このような免疫調節因子はＴヘルパーサブセット（ｓｕｂｓｅｔｓ）（ＴＨ１またはＴＨ２）とＢ細胞の間の相互作用を妨害することで中和抗体の発生を抑制し得る。別法として、そのような免疫調節因子はＴＨ１細胞とＣＴＬの間の相互作用を抑制することでＣＴＬが本ベクターを除去する率を低くし得る。有効な免疫調節因子そしてそれを使用する時の投与量がいろいろ開示されており、例えばＹａｎｇ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０（９）（１９９６年９月）；１９９６年５月２日に公開された国際特許出願番号ＷＯ９６／１２４０６；および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３０３５（全部引用することによって本明細書に組み入れられる）に開示されている。
１．  治療用トランス遺伝子
トランス遺伝子がコード化する有効な治療用産物には、ホルモンそして増殖および分化因子が含まれ、それらには、これらに限定するものでないが、インシュリン、グルカゴン、増殖ホルモン（ＧＨ）、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、増殖ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＦＧ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換増殖因子超科のいずれか１種（ＴＧＦ、アクチビン、インヒビンを包含）、または骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１−１５のいずれか、ヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）系列の増殖因子のいずれか１種、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、線毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、アグリン（ａｇｒｉｎ）、セマホリン／コラプシンの系列のいずれか１種、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホグ（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）およびチロシンヒドロキシラーゼが含まれる。
【００８２】
他の有用なトランス遺伝子産物には、免疫系を調節する蛋白質が含まれ、それには、これらに限定するものでないが、サイトカインおよびリンホカイン、例えばトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬー１８、単球化学誘因（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）蛋白質、白血病抑制因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子、そしてインターフェロンおよび幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドが含まれる。免疫系が産生する遺伝子産物もまた本発明で用いるに有用である。それらには、これらに限定するものでないが、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、人体に適応させた抗体、短鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子ばかりでなく、設計製作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれる。有用な遺伝子産物には、また、補体調節蛋白質、例えば補体調節蛋白質、膜補因子蛋白質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９も含まれる。
【００８３】
更に別の有用な遺伝子産物には、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節蛋白質および免疫系蛋白質の受容体のいずれか１種が含まれる。本発明はコレストロール調節用受容体を包含し、それには、低密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）受容体、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）受容体、非常に低密度のリポ蛋白質（ＶＬＤＬ）受容体、およびスカベンジャー受容体（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が含まれる。本発明は、また、ステロイドホルモン受容体超科の員（グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体を包含）、ビタミンＤ受容体および他の核受容体（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の如き遺伝子産物も包含する。加うるに、有用な遺伝子産物には、転写因子、例えばｊｕｎ、ｆｏｘ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清反応因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳ−ボックス（ｂｏｘ）含有蛋白質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合蛋白質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、Ｗｉｌｍｓ腫瘍蛋白質、ＥＴＳ結合蛋白質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合蛋白質、例えばＧＡＴＡ−３、そしてフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）系列の翼付き螺旋蛋白質（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が含まれる。
【００８４】
他の有用な遺伝子産物には、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、シスタチオンベータ−シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インシュリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ蛋白質、Ｔ蛋白質、のう胞フィブローシストランスメンブラン調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列が含まれる。
【００８５】
他の有用な遺伝子産物には、天然には存在しないポリペプチド、例えば天然には存在しないアミノ酸配列（挿入、欠失またはアミノ酸置換を含有）を有するキメラまたはハイブリッドペプチドなどが含まれる。例えば、設計製作した一本鎖免疫グロブリンは特定の免疫無防備状態の患者で用いるに有用である。天然には存在しない他の種類の遺伝子配列には、アンチセンス分子および触媒作用核酸、例えばリボチーム（これは標的の過剰発現を軽減する目的で使用可能である）などが含まれる。
【００８６】
遺伝子発現の減少および／または修飾は、特に、癌および乾癬のように細胞が過剰増殖することで特徴づけられる過剰増殖状態の治療にとって望ましいことである。標的ポリペプチドには、過剰増殖細胞の中の方が正常な細胞の中よりも過剰またはより高い濃度で生じるポリペプチドが含まれる。標的抗原には、腫瘍遺伝子、例えばｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎおよび転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦなどがコード化するポリペプチドが含まれる。標的抗原として、腫瘍遺伝子産物に加えて、抗癌治療および保護養生法の標的ポリペプチドには、Ｂ細胞リンパ腫が産生する抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域（これらをいくつかの態様ではまた自己免疫病の標的抗原としても用いる）が含まれる。腫瘍に関連した他のポリペプチド、例えば腫瘍細胞の中により高い濃度で存在するポリペプチド（これには、モノクローナル抗体１７−１Ａが認識するポリペプチドおよび葉酸塩結合ポリペプチドが含まれる）を標的ポリペプチドとして用いることも可能である。また、そのような標的ポリペプチドおよびこれらのリガンドは、本発明のＣ６８蛋白質との融合相手（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒｓ）を生じさせる時に用いるにも有用である。
【００８７】
他の適切な治療用ポリペプチドおよび蛋白質には、自己免疫病および障害に苦しんでいる個人に自己免疫に関連した標的［細胞受容体および自己に向かう（ｓｅｌｆ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）抗体を産生する細胞を包含］に対してブロードベースド（ｂｒｏａｄ  ｂａｓｅｄ）保護免疫反応を与えることで治療する時に用いるに有用であり得るポリペプチドおよび蛋白質が含まれる。Ｔ細胞介在自己免疫病には、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊髄炎、硬皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽種症、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。このような病気は各々Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が内因性抗原と結合して自己免疫病に関連した炎症カスケード（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃａｓｃａｄｅ）を開始させることを特徴とする。
【００８８】
本発明のＣ６８誘導構築物は、特に、トランス遺伝子を多数回送達することが望まれる治療養生法、例えば同じトランス遺伝子を再び送達することを伴う養生法または他のトランス遺伝子を送達することを伴う組み合わせ養生法などで用いるに良好に適する。そのような養生法は、Ｃ６８誘導構築物を投与した後に同じ抗原型のアデノウイルスから生じさせたベクターを再び投与することを伴い得る。特に望ましい養生法は、最初の投与で送達するウイルスベクターの抗原型と次の投与の１つ以上で用いるウイルスベクターの抗原型が異なるように本発明のＣ６８誘導構築物を投与することを伴う。例えば、ある治療養生法は、Ｃ６８誘導ベクターを投与しそして同じまたは異なる抗原型の１種以上のアデノウイルスベクターを繰り返し投与することを伴う。別の例の治療養生法は、アデノウイルスベクターを投与した後にその最初に送達したアデノウイルスベクターの抗原型とは異なる本発明のＣ６８誘導ベクターを繰り返し投与しそして場合により先の投与段階で用いたベクターの抗原型と同じまたは好適には異なる別のベクターを更に投与することを伴う。そのような養生法を本発明のＣ６８誘導カプシドを用いて構築したアデノウイルスベクターの送達に限定するものでない。むしろ、そのような養生法では、他のアデノウイルス抗原型［これには、これらに限定するものでないが、他のチンパンジーアデノウイルス抗原型（例えばＣ１など）、ヒトではない他の霊長類のアデノウイルス抗原型、またはヒトアデノウイルス抗原型が含まれる］から生じさせた構築物（これには、ウイルスではない標的に向かう蛋白質およびウイルスベクターが含まれる）を本発明のＣ６８誘導構築物の１種以上と組み合わせて容易に用いることができる。そのようなチンパンジー、ヒトではない他の霊長類およびヒトアデノウイルス抗原型の例は本資料の別の所で考察した例である。その上、そのような治療養生法は、本発明のＣ６８誘導構築物をアデノウイルスではないベクター、ウイルスではないベクターおよび／または他のいろいろな治療有効化合物もしくは分子と一緒に同時または逐次的のいずれかで送達することを伴い得る。本発明をそのような治療養生法に限定するものでなく、多様なそれらは本分野の技術者に容易に明らかであろう。
Ｂ．  免疫原性トランス遺伝子のＡｄ媒介送達
本発明のＣ６８誘導構築物（ウイルスベクターおよび蛋白質を包含）をまた免疫原性組成物として用いることも可能である。本明細書で用いる如き免疫原性組成物は、そのような免疫原性組成物を哺乳動物、好適には霊長類に送達した後にその送達されたトランス遺伝子産物に対して体液（例えば抗体）または細胞（例えば細胞毒性Ｔ細胞）反応が開始するような組成物である。本発明は、組換え型Ｃ６８誘導Ａｄ（これは、これのアデノウイルス配列のいずれかに所望免疫原をコード化する遺伝子が欠失していてもよい）または免疫原性分子を標的にし得るＣ６８蛋白質を提供する。そのようなＣ６８誘導アデノウイルスは、いろいろな動物種で用いられる生きている組換え型ウイルスワクチンとして用いるに、ヒトを源とするアデノウイルスの使用に比較して良好に適するが、本発明をそのような使用に限定するものでない。本組換え型アデノウイルスおよびＣ６８蛋白質は、いずれかの病原体［免疫反応の誘発に重要でありかつ病原体の拡散を制限し得る抗原１種または２種以上が同定されておりかつｃＤＮＡが入手可能である］に対する予防もしくは治療用ワクチンとして使用可能である。
【００８９】
そのようなワクチン（または他の免疫原性）組成物を調製する時、この上に記述した如き適切な送達用媒体を用いる。本免疫原性組成物の用量は、一般に、この上に治療用組成物に関して明記した範囲である。選択した遺伝子の免疫レベルを監視することで、ブースターが必要か否かを決定する。血清中の抗体タイターを検定した後、場合によりブースターによる免疫処置を行う方が望ましい可能性がある。
【００９０】
本発明のワクチン組成物の調製では、場合により、それに他の成分を含有させてもよく、そのような他の成分には、例えばアジュバント、安定剤、ｐＨ調整剤、防腐剤などが含まれる。そのような成分はワクチン技術分野の技術者に良く知られている。適切なアジュバントの例には、これらに限定するものでないが、リポソーム、みょうばん、モノホスホリル脂質Ａ、および生物活性因子、例えばサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンドなどのいずれか、そしてそれらの最適な組み合わせが含まれる。そのような生物活性因子の中の特定因子は、例えばポリヌクレオチド、プラスミドまたはウイルスベクターなどを通してインビボで発現させることができる。例えば、抗原をコード化する初回ＤＮＡワクチンと一緒にそのようなアジュバントを投与することで抗原特異的免疫反応を前記抗原をコード化するＤＮＡワクチンを単独で用いた初回抗原刺激時に生じる免疫反応に比較して向上させることができる。
【００９１】
そのような組換え型アデノウイルスを「免疫原量」、即ち組換え型アデノウイルスをある投与経路で所望細胞に移入させた時に選択した遺伝子が免疫反応を誘発するに充分な濃度で発現するに有効な量で投与する。保護免疫を与える場合の組換え型アデノウイルスは感染および／または再発病を防止するに有効なワクチン組成物であると見なす。
【００９２】
別法としてか或は加うるに、選択した免疫原に対する免疫反応を誘発するペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質をコード化するトランス遺伝子を本発明のベクターに含有させてもよいか或はＣ６８カプシドまたは他の蛋白質を用いてそのようなトランス遺伝子を標的に向かわせることも可能である。本発明のＣ６８誘導ウイルスは細胞溶解性Ｔ細胞および抗体（本ベクターが発現する挿入した異種抗原性蛋白質に対する）の誘発に高い効力を示すと期待する。
１．  免疫原性トランス遺伝子
免疫原は例えばいろいろなウイルス科から選択可能である。望ましいウイルス科（これに対する免疫反応を起こさせるのが望ましいであろう）の例には、ピコルナウイルス科［これには、リノウイルス属（通常の風邪の場合の約５０％がそれが原因である）が含まれる］、エンテロウイルス属［これにはポリオウイルス、コクサキーウイルス、エコウイルスおよびヒトエンテロウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルスなどが含まれる］、そしてアプトウイルス属（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）［これは足および口の病気、主にヒトではない動物の病気の原因になっている］が含まれる。ピコルナウイルス科のウイルスの範囲内の標的抗原にはＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧが含まれる。別のウイルス科には、カルキウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）科［これにはＮｏｒｗａｌｋ群のウイルス（これは流行性胃腸炎の原因である重要な因子である）が含まれる］が含まれる。ヒトおよびヒトではない動物に免疫反応を誘発する目的で標的に向かわせる抗原として用いるに望ましい更に別のウイルス科はトガウイルス科［これには、アルファウイルス属（これにはＳｉｎｄｂｉｓウイルス、ＲｏｓｓＲｉｖｅｒウイルスおよびＶｅｎｅｚｕｅｌａｎ、Ｅａｓｔｅｒｎ  ＆  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｅｑｕｉｎｅ脳炎ウイルスが含まれる）およびルビウイルス（風疹ウイルスを包含）が含まれる］である。フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科にはデング熱、黄熱、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原をＣ型肝炎またはコロナウイルス科から生じさせることも可能であり、それには、ヒトのウイルスではないいろいろなウイルス、例えば感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）およびヒト呼吸性コロナウイルス（これは通常の風邪および／またはＡ型でもＢ型でもＣ型でもない肝炎の原因になり得る）が含まれる。コロナウイルス科の範囲内の標的抗原には、Ｅ１（またＭもしくはマトリックス蛋白質とも呼ばれる）、Ｅ２（またＳまたはＳｐｉｋｅ蛋白質とも呼ばれる）、Ｅ３（またＨＥまたはヘマグルチン−エルテロースとも呼ばれる）、糖蛋白質（必ずしもあらゆるコロナウイルスに存在するとは限らない）またはＮ（ヌクレオカプシド）が含まれる。更に別の抗原は、ラプドウイルス科［これにはベシクロウイルス属（例えば水泡性口内炎ウイルス）およびリサウイルス属（例えば狂犬病）が含まれる］に対する標的になり得る。ラプドウイルス科の範囲内の適切な抗原は、Ｇ蛋白質またはＮ蛋白質に由来する抗原であり得る。フィロウイルス（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）科［これには出血性熱ウイルス、例えばマルブルグおよびエボラウイルスが含まれる］も適切な抗原源になり得る。パラミクソウイルス科には、１型パラインフルエンザウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、３型ウシパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス）、２型パラインフルエンザウイルス、４型パラインフルエンザウイルス、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ病ウイルス（鶏）、牛疫、麻疹ウイルス［これにはハシカおよびイヌのジステンパーが含まれる］および肺炎ウイルス（これにはＲＳウイルスが含まれる）が含まれる。インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科の範囲内に分類分けされ、これは適切な抗原源である（例えばＨＡ蛋白質、Ｎ１蛋白質）。ブンヤウイルス科には、ブンヤウイルス属［カリフォルニア脳炎、Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ）］、フレボウイルス（ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）［リストバレー熱］、ハンタウイルス（ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）［プレマラはヘマハギン熱ウイルスである］、ナイロウイルス（ナイロビヒツジ病、そして割り当てられていないいろいろなブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓｅｓ）が含まれる。アレナウイルス科はＬＣＭおよびＬａｓｓａ熱ウイルスに対する抗原源を与える。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス（これは子供の急性胃腸炎の原因である）、オルビウイルスおよびカルチウイルス（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｔｉｃｋ熱、Ｌｅｂｏｍｂｏ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）が含まれる。
【００９３】
レトロウイルス科には、オンコリウイルス亜科（これにはヒトおよび獣医分野の病気、例えばネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶ１およびＨＴＬＶ１Ｉが含まれる）、レンチウイルス［これにはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプマウイルスが含まれる］が含まれる。レンチウイルスに属する適切ないろいろな抗原が記述されており、容易に選択可能である。適切なＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例には、これらに限定するものでないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、ＮｅｆおよびＲｅｖ蛋白質ばかりでなく、これらのいろいろなフラグメントも含まれる。例えば、Ｅｎｖ蛋白質の適切なフラグメントには、それのサブユニット、例えばｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１などのいずれか、またはそれらのより小さいフラグメント、例えば長さが少なくともアミノ酸約８個分のフラグメントが含まれ得る。同様に、ｔａｔ蛋白質のフラグメントを選択することも可能である［米国特許第５，８９１，９９４号および米国特許第６，１９３，９８１号を参照］。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５（５）：２４６２−２４６７（２００１年３月）およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（２００１年４月６日）に記述されているＨＩＶおよびＳＩＶ蛋白質も参照のこと］。別の例では、そのようなＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性蛋白質もしくはペプチドを用いて融合蛋白質または他の免疫原性分子を生じさせることも可能である。例えば、２００１年８月２日付けで公開されたＷＯ  ０１／５４７１９および１９９９年４月８日付けで公開されたＷＯ  ９９／１６８８４に記述されているＨＩＶ−１  Ｔａｔおよび／またはＮｅｆ融合蛋白質および免疫化養生法を参照のこと。本発明を本明細書に記述したＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性蛋白質にもペプチドにも限定するものでない。加うるに、そのような蛋白質のいろいろな修飾形が記述されているか或は本分野の技術者はそのような修飾を容易に成し得るであろう。例えば米国特許第５，９７２，５９６号に記述されている修飾を受けたｇａｇ蛋白質を参照のこと。その上、所望の如何なるＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原も単独または組み合わせて送達可能である。そのような組み合わせには単一のベクターまたは複数のベクターを用いた発現が含まれ得る。場合により、別の組み合わせは、発現させた１種以上の免疫原を送達すると共に蛋白質形態の１種以上の免疫原を送達することを伴い得る。そのような組み合わせを以下により詳細に考察する。
【００９４】
パポバウイルス科には、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）および乳頭腫ウイルス亜科（癌または乳頭腫の悪性進行に関連）が含まれる。アデノウイルス科には、呼吸性病および／または腸炎の原因になるウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルス科にはネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンレウコペニアウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルスが含まれる。ヘルペスウイルス科には、アルファヘルペスウイルス亜科［これにはシンプレックスウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス（シュードラビ（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）、バリセラゾスター（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ））が含まれる］、およびベータヘルペスウイルス亜科［これにはサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）が含まれる］、およびガンマヘルペスウイルス亜科［これにはリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（Ｂｕｒｋｉｔｔｓリンパ種）、感染性鼻気管炎、Ｍａｒｅｋ病ウイルスおよびラジノウイルスが含まれる］が含まれる。ポックスウイルス科には、コルドポックスウイルス亜科［これにはオルソポックスウイルス属（バリオラ（痘瘡）およびワクシニア（牛痘瘡））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスが含まれる］、およびエントモポックスウイルス亜科が含まれる。ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）科にはＢ型肝炎ウイルスが含まれる。適切な抗原源であり得る分類分けされていないある種のウイルスはデルタ肝炎ウイルスである。更に別のウイルス源には、トリ感染性のう病ウイルスおよびブタ呼吸および生殖症候群ウイルスが含まれ得る。アルファウイルス科にはウマ動脈炎ウイルスおよびいろいろな脳炎ウイルスが含まれる。
【００９５】
本発明は、また、ヒトおよびヒトではない脊椎動物に感染する他の病原体（細菌、菌・カビ、寄生性微生物または多細胞寄生生物が含まれる）に対してヒトまたはヒトではない動物に免疫を与える目的で用いるに有用な免疫原または癌細胞または腫瘍細胞に由来する免疫原も包含し得る。細菌病原体の例には病原性グラム陽性球菌が含まれ、これには肺炎球菌、スタフィロコッカスおよびストレプトコッカスが含まれる。病原性グラム陰性球菌には髄膜炎菌、淋菌が含まれる。病原性腸グラム陰性桿菌には、腸内細菌科、シュードモナス、アシネトバクテリアおよびエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）、類鼻疽、サルモネラ、赤痢菌属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、Ｈ．ドゥクレイ（ｄｕｃｒｅｙｉ）［これはカンクロイド（ｃｈａｎｃｒｏｉｄ）の原因である］、ブルセラ属、フラニセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）［野兎病の原因である］、エルジニア属（パスツレラ）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリラム（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）が含まれ、グラム陽性桿菌には、リステリア菌、豚丹毒菌、コリネバクテリウム・ジフテリア（ジフテリア）、コレラ、Ｂ．アントラシス（ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ドノヴァン症（グラヌローマ・イングイナレ（ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｒｅ））、およびバルトネラ症が含まれる。病原性嫌気細菌が原因の病気には、破傷風、ボツリスム、他のクロストリジウム属、結核症、らい病および他のミコバクテリアが含まれる。病原性スピロヘータの病気には、梅毒、トレポネーマ症、フランベジア、ピンタおよび風土病性梅毒およびレプトスピラ症が含まれる。より高等な病原体である細菌および病原性菌・カビが原因の他の感染には、アクチノミセス症、ノカルジア症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス症、カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症、スポロトリクス症、パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス、そして皮膚糸状菌症が含まれる。リッケチアの感染には、発疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱およびリッケチア痘が含まれる。マイコプラスマおよびクラミジア属の感染の例には、肺炎マイコプラスマ、性病性リンパ肉芽種、オーム病および周産期のクラミジア感染が含まれる。病原性真核生物には病原性原生動物およびヘルミンス（ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）が含まれ、そしてそれらによってもたらされる感染には、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラスマ症、ヌモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）、トキソプラスマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、バベシア症、ジャルシア鞭毛虫症、旋毛虫症、フィラリア症、住血吸虫症、線虫、吸虫属または吸虫綱および条虫（さなだむし）感染が含まれる。
【００９６】
そのような有機体および／またはこれらが産生するトキシンの多くをＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ［（ＣＤＣ）、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、米国］は生物学的攻撃で用いられる可能性がある因子であるとして識別している。そのような生物学的因子のいくつかには、例えばバチルス・アントラシス（炭疽）、ボツリヌス菌およびこれのトキシン（ボツリスム）、ペスト菌（ペスト）、大痘瘡（痘瘡）、野兎病菌（野兎病）およびウイルス性出血熱［これらは全部カテゴリーＡの因子として現在分類分けされている］、コクシエラ・ブルネチ（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、リシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびこれのトキシン（リシントキシン）、ウエルチ菌およびこれのトキシン（イプシロントキシン）、スタフィロコッカス種およびこれらのトキシン（エンテロトキシンＢ）（これらは全部カテゴリーＢの因子として現在分類分けされている）、そしてＮｉｐａｎウイルス、多薬剤耐性結核症、黄熱病、ダニ媒介出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスおよびハンタウイルス（これらはカテゴリーＣの因子として現在分類分けされている）が含まれる。加うるに、分類分けされているか或は分類分けが困難な他の有機体も将来には識別されそして／またはそのような目的で用いられる可能性がある。本明細書に記述するウイルスベクターおよび他の構築物はそのような有機体、ウイルス、それらのトキシンまたは他の副生成物に由来する抗原（これらはそのような生物学的因子による感染または他の不利な反応を予防および／または治療するであろう）を送達する目的で用いるに有用であることは容易に理解されるであろう。
【００９７】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達する目的で本発明のベクターおよび蛋白質を投与すると免疫反応が現われるが、そのような免疫反応には、ＣＴＬがそのようなＴ細胞を除去することが含まれる。ＲＡでは、このような病気に関与しているＴＣＲのいくつかの特定可変領域が特徴づけられた。そのようなＴＣＲにはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶα−１７が含まれる。従って、そのようなポリペプチドの少なくとも１種をコード化する核酸配列を送達すると、ＲＡに関与するＴ細胞を標的にするであろう免疫反応が現われるであろう。ＭＳでは、このような病気に関与するＴＣＲのいくつかの特定可変領域が特徴づけられた。そのようなＴＣＲにはＶ−７およびＶα−１０が含まれる。従って、そのようなポリペプチドの少なくとも１種をコード化する核酸配列を送達すると、ＭＳに関与するＴ細胞を標的にするであろう免疫反応が現われるであろう。硬皮症では、このような病気に関与するＴＣＲのいくつかの特定可変領域が特徴づけられた。そのようなＴＣＲにはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２が含まれる。従って、そのようなポリペプチドの少なくとも１種をコード化する組換え型チンパンジーアデノウイルスを送達すると、硬皮症に関与するＴ細胞を標的にするであろう免疫反応が現われるであろう。
Ｃ．  Ａｄ媒介送達法
選択した遺伝子の治療レベル、即ち免疫のレベルを監視することで、ブースターが必要か否かを決定してもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞反応、または場合により血清の抗体タイターを検定した後、場合によりブースター免疫処置を行う方が望ましい可能性がある。場合により、本発明のＣ６８誘導構築物を単一投与またはいろいろな組み合わせ養生法、例えば他の活性材料を伴う養生法または治療過程との組み合わせまたはプライム−ブースト養生法（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ）で送達することも可能である。そのようないろいろな養生法が本技術分野に記述されており、容易に選択可能である。
【００９８】
例えば、プライム−ブースト養生法は、ＤＮＡ（例えばプラスミド）が基になったベクターを投与して免疫系を開始させ（ｐｒｉｍｅ）そして伝統的な抗原、例えば蛋白質またはそのような抗原をコード化する配列を担持させた組換え型ウイルスなどを用いた２番目のブースター投与を行うことを伴い得る。例えば２０００年３月２日付けで公開されたＷＯ  ００／１１１４０（引用することによって本明細書に組み入れられる）を参照のこと。別法として、免疫処置養生法は、抗原を担持させたベクター（ウイルスまたはＤＮＡが基になった）または蛋白質に対する免疫反応を増強させる目的で本発明の組換え型チンパンジーアデノウイルスベクターを投与することを伴い得る。更に別の代替免疫処置養生法は、蛋白質を投与した後にその抗原をコード化するベクターを用いたブースターを投与することを伴う。
【００９９】
本発明は、１つの態様において、選択した抗原を担持させたプラスミドＤＮＡベクターを送達した後に本発明の組換え型チンパンジーアデノウイルスベクターを用いて追加免疫を与えることで、前記抗原に対する免疫反応を開始させそして追加免疫を与える方法を提供する。１つの態様におけるプライム−ブースト養生法は、プライムおよび／またはブースト媒体を用いてマルチプロテイン（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎｓ）を発現させることを伴う。例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶに対する免疫反応を生じさせるに有用な蛋白質サブユニットを発現させるマルチプロテイン養生法を記述しているＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（２００１年４月６日）を参照のこと。例えばＤＮＡプライム（ｐｒｉｍｅ）を用いて単一の転写でＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、ＶＰＸおよびＶｐｒ、およびＥｎｖ、ＴａｔおよびＲｅｖを送達してもよい。別法として、本発明の組換え型アデノウイルス構築物を用いてＳＩＶ  Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＨＩＶ−１  Ｅｎｖを送達する。更に他の養生法がＷＯ  ９９／１６８８４およびＷＯ  ０１／５４７１９に記述されている。
【０１００】
しかしながら、そのようなプライム−ブースト養生法をＨＩＶのための免疫処置にもそのような抗原の送達にも限定するものでない。例えば、初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）で本発明の１番目のチンパンジーベクターを送達した後に２番目のチンパンジーベクターまたは抗原自身を蛋白質の形態で含有させておいた組成物を用いて追加免疫を与えることを伴わせてもよい。１つの例では、プライム−ブースト養生法を用いてウイルス、細菌または他の有機体（これから抗原を引き出す）に対する保護免疫反応を生じさせることができる。別の所望態様では、プライム−ブースト養生法で治療効果を与え、これは、治療薬を投与すべき状態の存在を検出する通常検定を用いて測定可能である。
【０１０１】
初回抗原刺激用組成物を用量依存様式で体のいろいろな部位に投与してもよく、それは、標的にすべき所望免疫反応に対する抗原に依存する。本発明を注射１回または２回以上の量にも位置にも薬剤担体にも限定するものでない。むしろ、そのような養生法に初回抗原刺激および／または追加免疫段階を伴わせてもよく、これらの各々に、単一の用量または投与量を時間単位、日単位、週単位、月単位または年単位で投与することを伴わせてもよい。一例として、哺乳動物にプラスミドが担体に約１０μｇから約５０μｇの範囲で入っている投与を１回または２回受けさせてもよい。ＤＮＡ組成物の望ましい量はＤＮＡベクターが約１μｇから約１０，０００μｇの範囲である。投与量は被験体の体重１ｋｇ当たり約１μｇから１０００μｇのＤＮＡに及んで多様であり得る。望ましくは、その哺乳動物の同定および状態を基にして送達量または部位を選択する。
【０１０２】
抗原を哺乳動物に送達する時に用いるに適したベクターの投与単位を本明細書に記述する。投与用ベクターの調製では、それをそのような投与に関する技術を有する技術者に明らかであろう薬学的または生理学的に受け入れられる担体、例えば等張食塩水、等張塩溶液または他の調剤に懸濁または溶解させることで調製を行う。適切な担体は本分野の技術者に明らかであると思われ、それは投与経路に大きく依存する。本発明の組成物はこの上に記述した経路に従って生分解性で生適合性の重合体を用いた徐放調剤（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の状態でか或はミセル、ゲルおよびリポソームを用いたオンサイト送達（ｏｎ−ｓｉｔｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）で哺乳動物に投与可能である。場合により、本発明の初回抗原刺激段階に、また、その初回抗原刺激用組成物と一緒にアジュバント、例えば本明細書に定義する如きアジュバントなどを適切な量で投与することも含めてもよい。
【０１０３】
好適には、追加免疫用組成物を前記初回抗原刺激用組成物を投与して約２から約２７週後の哺乳動物被験体に投与する。初回抗原刺激用ＤＮＡワクチンで投与した抗原と同じ抗原を含有するか或はそれを送達し得る追加免疫用組成物を有効量で用いることで追加免疫用組成物の投与を達成する。この追加免疫用組成物は同じウイルス源（例えば本発明のアデノウイルス配列）または別の源から誘導した組換え型ウイルスベクターで構成可能である。別法として、そのような「追加免疫用組成物」は、前記初回抗原刺激用ＤＮＡワクチンがコード化する抗原と同じ抗原ではあるが蛋白質またはペプチドの形態の抗原を含有する組成物（この組成物は宿主に免疫反応を誘発する）であってもよい。別の態様では、追加免疫用組成物に、哺乳動物細胞の中で起こる当該抗原の発現を指揮する調節配列の制御下でそれをコード化するＤＮＡ配列、例えば良く知られている細菌またはウイルスベクターの如きベクターを含有させる。そのような追加免疫用組成物の主な要求は、この組成物の抗原が同じ抗原であるか或は相互反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）抗原（初回抗原刺激用組成物がコード化する如き）である点にある。
【０１０４】
別の態様において、また、本発明のチンパンジーアデノウイルスベクターおよび標的に向かうＣ６８蛋白質は他の多様な免疫処置および治療養生法で用いるにも良好に適する。そのような養生法には、本発明のＣ６８構築物を異なる抗原型カプシドのＡｄ構築物と同時または逐次的に送達する養生法、本発明のＣ６８誘導構築物をＡｄではないベクターと同時または逐次的に送達する養生法、本発明のアデノウイルスベクターを蛋白質、ペプチドおよび／または他の生物学的に有用な治療用もしくは免疫原化合物と同時または逐次的に送達する養生法が含まれ得る。そのような使用は本分野の技術者に容易に明らかであろう。
Ｖ．  細菌形質転換体の迅速選別方法
本発明では、同種組換えまたは直接クローニング方法で生じさせた構築物を迅速に選別することを可能にする精密な選択方法を提供する。そのような構築物を本明細書で用いる場合、これらは好適にはウイルスであるが、これらには他の種類のベクター、例えばコスミド、エピソーム、プラスミド、または異種分子を細胞に送達する他の遺伝要素も含まれ得る。
【０１０５】
１つの所望態様における方法では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコード化する遺伝子を利用して組換え型の存在をＧＦＰ発現がないことで検出する緑色−白色選択方法（即ち組換え体は緑色の背景の中の白色として観察される）を提供する。別法として、そのような方法で別の適切なマーカー遺伝子を利用してもよく、それらには、これらに限定するものでないが、他の蛍光蛋白質およびルシフェラーゼが含まれる。
【０１０６】
一例として、本方法を、選択した宿主細胞の中にベクターを共移入させて同種組換えを起こさせることで組換え型構築物を生じさせる目的で用いる。本明細書で用いる如き宿主細胞は生物学的有機体から容易に選択可能であり、それらには、原核および真核細胞、例えば組換え型ウイルス粒子の産生に関連した章で考察した如き細胞が含まれる。宿主細胞の選択は本発明の限定ではない。
【０１０７】
適切には、ベクターの各々にマーカー遺伝子（例えばＧＦＰ）［これはこれが宿主細胞の中で発現することを指揮するプロモーターの制御下にある］を含有させる。別法として、親ベクターの各々に生じさせる組換え型構築物から区別可能なばかりでなく互いも区別可能な異なるマーカー遺伝子を含有させてもよい。原核ＧＦＰを用いる場合、好適には、それを原核プロモーター、例えばｌａｃＺに由来するプロモーターなどの制御下に置く。しかしながら、他の適切な原核もしくは非原核プロモーターも本明細書に記述しかつ本分野の技術者に公知のプロモーターから容易に選択可能である。有利には、ＧＦＰ蛋白質を同種組換え中に除去されたベクター部分に位置させ、従って、生じさせる組換え型ベクターに由来するＧＦＰ蛋白質を存在させない。このようにすると、組換えを受けていない親ベクターの存在は前記マーカー遺伝子を発現するとしてフェーズコントラスト（ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）蛍光顕微鏡（または他の適切な検出手段）で容易に検出され、組換え型構築物は前記マーカーを発現しない。両方の親ベクターにＧＦＰを用いる方法では、組換え型は緑色の背景の中の白色として現われる。
【０１０８】
別の例では、本方法を同種組換えを伴う組換え型構築物産生で用い、この場合、その宿主細胞は前記組換え型構築物の産生で用いた親構築物の少なくとも１種を安定に含有する。この態様では、その宿主細胞にトランスフェクションを１回受けさせてもよい。更に別の態様では、本発明の方法をトリプルトランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）で用いてもよい。この上に記述したダブルトランスフェクションの場合と同様に、親構築物に同じマーカー遺伝子を含有させてもよいか或は異なるマーカー遺伝子を含有させてもよい。
【０１０９】
別の例では、本発明の方法を直接クローニングで組換え型構築物を生じさせる時に用いる。この態様では、適切に、存在させるマーカー遺伝子はクローニング過程中に検出される親構築物の一部である。例えば、マーカー遺伝子発現カセット（即ち、遺伝子、プロモーターおよび他の必要ないずれかの調節配列）に設計製作を受けさせてアデノウイルスベクターのＥ１−もしくはＥ３領域を生じさせ、この中にトランス遺伝子またはミニ遺伝子カセットをクローン化する（ｃｌｏｎｅｄ）。標的領域への直接クローニングの成功はマーカー遺伝子が発現しなくなることで容易に検出可能である。
【０１１０】
場合により、本発明の方法は、組換え型構築物、例えば組換え型アデノウイルスを生じさせる時に商業的に有用なフォーマット（ｆｏｒｍａｔ）の状態で入手可能なキット（ｋｉｔ）の形態に容易に組み立て可能である。そのようなキットに、典型的には、適宜組換え部位の上流もしくは下流地点に挿入されているマーカー遺伝子を含有する所望のウイルスゲノムを含有するプラスミドバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）または異種遺伝子の直接クローニングのためのスプライス部位（ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ）の所に挿入されているマーカー遺伝子を含有するプラスミドバックボーンを含有させる。前記キットに、更に、適切な培養培地、宿主細胞、試験対照、説明書および他の適切な材料を含有させてもよい。
【０１１１】
以下に示す実施例では、本方法をアデノウイルスの産生で用いる。しかしながら、本方法を他の種類のアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスではないウイルスベクターを生じさせる時の使用にも容易に適合させることができることは容易に理解されるであろう。
【０１１２】
以下に示す実施例は本発明を説明する目的で示すものであり、本発明の範囲を限定するものでない。以下の実施例に特定の反応体および条件の概略を示すが、修飾を成すことも可能であり、それらを本発明の精神および範囲に包含させることを意味することを本分野の技術者は理解するであろう。
【実施例１】
【０１１３】
組換え体の緑色−白色選択を用いてチンパンジーアデノウイルスＣ６８が基になったＥ１欠失ベクターを作成
遺伝子輸送で用いる目的でＣ６８の複製欠陥バージョン（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ）を単離した。このＥ１が欠失した組換え体を生じさせる古典的な方策をＥ１発現細胞系における同種組換えで実施した。１番目の段階は、ｍ．ｕ．０から１．３に続いてＣＭＶプロモーターによって向上した緑色蛍光を示す蛋白質（ＧＦＰ）を発現するミニ遺伝子が付加しておりかつ９−１６．７ｍ．ｕ．に渡るＣ６８配列を含有するプラスミドを生じさせる段階であった。この線状のプラスミドをＥ１発現細胞系にＳｓｐ  Ｉで消化させたＣ６８プラスミド（ＳｓｐＩは３．６ｍ．ｕ．の所を切断して同種組換え用の４６４４ｂｐを残存させる）と一緒に共移入した。ヒトＡｄ５に由来するＥ１を有する２９３細胞を用いて実験を開始し、それはトランスコンプリメンテーションに充分であると期待した。実際、所望の組換え体に相当するプラスミドが生じた。その結果として得たベクターをＣ６８−ＣＭＶ−ＧＦＰと呼んだ。
【０１１４】
そのような組換え体を生じさせる方策に修飾を受けさせて、組換え体を有効かつ迅速に単離することができるようにした。１番目として、初期シャトルベクターの中のアルカリ性ホスファターゼＤＮＡをｌａｃＺに由来する原核プロモーターによって操縦される（ｄｒｉｖｅｎ）原核ＧＦＰ遺伝子に置き換えた。それによって、所望真核ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩ転写単位をシャトルベクターの中に取り込ませる試みを行う時の細菌形質転換体を効率良く選別することが可能になった。その結果として生じた形質転換体をＧＦＰの発現に関して選別することができ、白色のコロニーは組換え体である一方、緑色のコロニーは残存する親プラスミドである。
【０１１５】
緑色−白色選択を用いてヒトＡｄ５組換え体を単離するためのコトランスフェクション産物を選別した［Ａ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａ．、５：１１４８−１１５２（１９９８）］。本システムでは、Ｄａｖｉｓとは対照的に、初期シャトルベクターに変換を受けさせてそれが９から２６ＭＵの細長い３’配列を含有するようにした。このベクターを、元々のＣ６８−ＣＭＶ−ＧＦＰ単離物にＸｂａ  Ｉ（これはＭＵ１６．５の所を切断する）を用いて特定部位を切断しておくことで同種組換えで９．５Ｋｂが重なり合うようにしておいたウイルスＤＮＡと一緒に共移入させた。その結果として生じたプラークをフェーズコントラスト蛍光顕微鏡で所望組換え体に相当する単離物（これは蛍光を発しない）を選別した。これは構造またはトランス遺伝子発現が基になった標準的方法に比較して選別が非常に簡単であった。従って、この方法を他の種類のアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスでないウイルスベクターを生じさせる時の使用に容易に適合させることができる。
Ａ．  シャトルプラスミド
組換え型Ｃ６８ウイルスを生じさせるためのプラスミドシャトルベクターを構築する目的で、プラスミドｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にＢｇｌ  ＩＩを用いた消化、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いた末端部のフィリングイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）そして１２ｂｐの合成Ｐａｃ  Ｉリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いた連結反応による修飾を受けさせることで、ｐＳＰ７２−Ｐａｃを得た。Ｃ６８ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｅフラグメントを含有するｐＮＥＢ−ＢａｍＥプラスミドからＣ６８ゲノムのマップユニット（ｍａｐ  ｕｎｉｔ）（ｍ．ｕ．またはＭＵ）０−１．３に渡る４５６ｂｐのＰａｃ  Ｉ／ＳｎａＢ  Ｉフラグメントを単離した後、Ｐａｃ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｖで処理しておいたｐＳＰ７２−Ｐａｃにクローン化させることで、ｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ０−１．３を得た。ＳＶ４０ポリＡシグナルを伴ってｌａｃＺを操縦するシトメガロウイルス初期プロモーターから成るミニ遺伝子カセットをｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとして分離した後、同じ組の酵素で特定部位を切断しておいたｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ  ０−１．３と連結させ、その結果として、ｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ  ０−１．３−ＣＭＶＬａｃＺを得た。
【０１１６】
Ｃ６８の９−１６．７ＭＵ領域を単離する時の初期段階では、ｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＭＩ）およびｐＢＳ−Ｃ６８−ＢａｍＦの両方にＢａｍＨＩおよびＳｐｈ  Ｉ酵素による二重消化を受けさせた。次に、ｐＢＳ−Ｃ６８−ＢａｍＦに由来する２９３ｂｐのフラグメントをｐＧＥＭ−３Ｚバックボーンと連結させることで、ｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ  ９−９．８を生じさせた。ｐＢＳ−Ｃ６８  ＢａｍＨＢクローンにＸｂａＩによる消化を受けさせ、フィリングイン反応そして次にＢａｍＨＩ処理を受けさせた後にＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ二重消化を受けさせておいたｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ  ９−９．８にクローン化させてｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ  ９−１６．７を生じさせることで、Ｃ６８  ＭＵ  ９．８−１６．７を含有する２．４ｋｂのフラグメントを得た。ｐＧＥＭ−Ｃ６８−ＭＵ  ９−１６．７にＥｃｏＲＩによる消化、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）による末端部のフィリングイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）そして１２ｂｐの合成ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（ＮＥＢ）による連結反応そして次にＨｉｎｄＩＩＩによる消化を受けさせることで、Ｃ６８の９−１６．７ｍ．ｕ．領域を単離した。このＣ６８のＭＵ  ９−１６．７に渡る２．７ｋｂのフラグメントをｐＳＰ−Ｃ６８−ＭＵ  ０−１．３−ＣＭＶｌａｃＺのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化させることで、最終シャトルプラスミドであるｐＣ６８−ＣＭＶ−ＬａｃＺを生じさせた。加うるに、８２０ｂｐのアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）ｃＤＮＡフラグメントもｐＡｄＣＭＶＡＬＰ（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２（１９９６）から単離した後、ｐＣ６８−ＣＭＶ−ｌａｃＺのＮｏｔ  Ｉ部位の所のｌａｃＺと交換し、その結果として、ｐＣ６８−ＣＭＶ−ＡＰを得た。
Ｂ．  組換え型ウイルスの構築
Ｅ１が欠失している組換え型Ｃ６８−ＣＭＶＥＧＦＰベクターを生じさせる目的で、最初に、ｐＣ６８−ＣＭＶ−ｌａｃＺの中のｌａｃＺトランス遺伝子を向上した緑色蛍光を示す蛋白質（ＥＧＦＰ）の遺伝子に置き換えることで、ｐＣ６８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰシャトルプラスミドを構築した。この置換クローニング過程を下記の如く実施した。ＢａｍＨＩによる消化でｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）の中のＥＧＦＰコード付け配列の５’末端に追加的ＮｏｔＩ制限部位を導入し、フィリングイン反応を起こさせそして８ｂｐの合成ＮｏｔＩリンカー（ＮＥＢ）で連結させた。両方の構築物にＮｏｔＩによる特定部位切断を受けさせた後、その修飾を受けさせたｐＥＧＦＰ−１からＥＧＦＰ配列を単離し、そしてこれを用いてｐＣ６８−ＣＭＶ−ｌａｃＺの中のｌａｃＺ遺伝子と交換した。このｐＣ６８−ＣＭＶＥＧＦＰ構築物（３μｇ）をＳｓｐ  Ｉで消化させておいたＣ６８のゲノムＤＮＡ（１μｇ）と一緒に以前に記述［Ｇ．Ｇａｏ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：８９３４−８９４３（１９９６）］された如き同種組換え用２９３細胞の中に共移入させた。プラーク精製、拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）そしてＣｓＣｌ勾配沈降による精製（この上に引用したＧ．Ｇａｏ他）を２回行うことで、蛍光顕微鏡で見て緑色のプラークを単離した。
【０１１７】
本発明は緑色／白色選択方法［Ａ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａ．、５：１１４８−１１５２（１９９８）］に特殊な修飾を受けさせた変法を提供する。本実施例では、この方法を組換え型Ｃ６８ベクターの構築で用いることを説明する。ｐＢＳＣ６８−ＢａｍＢプラスミドをＡｇｅＩおよびＢｓｉｗＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した後にｐＣ６８−ＣＭＶ−ＡＰシャトルプラスミドのＡｓｐ７１８およびＡｇｅＩ部位にクローン化させる結果としてｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ３６と呼ぶ新規なプラスミドを生じさせることで、９から３６ＭＵに渡る７．２ｋｂのフラグメントを単離した。受けさせたさらなる修飾は、Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＮｒｕＩによる消化でｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ３６から２６−３６ｍ．ｕ．を除去することであった。そのｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ２６と呼ぶ新規なシャトルプラスミドは、３’がミニ遺伝子の方向である同種組換え用領域が短くなっている（即ち１６．７−２６ＭＵ）。組換え型Ｃ６８ベクターを生じさせる目的で、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）を興味の持たれる遺伝子に置き換える。結果として得たｐＣ６８ＣＭＶ−Ｎｕｇｅｎｅ−ＭＵ２６構築物をＸｂａ  Ｉ（１６．５ＭＵ）で特定部位を切断しておいたＣ６８−ＣＭＶＧＦＰウイルスＤＮＡと一緒に２９３細胞の中に移入させた後、トップアガーオーバーレイ（ｔｏｐ  ａｇａｒ  ｏｖｅｒｌａｙ）を行う。ｐＣ６８ＣＭＶ−Ｎｕｇｅｎｅ構築物とＣ６８ウイルスバックボーンの間の共通の１６．７−２６ＭＵ領域の同種組換えによって組換え型ウイルスのプラーク（白色）が生じ、この白色のプラークを形成する組換え体を未切断Ｃ６８−ＣＭＶＧＦＰウイルスの緑色プラークから選択する。
【０１１８】
この緑色／白色選択機構をまた興味の持たれる遺伝子をＣ６８シャトルプラスミドにクローン化する方法にも導入した。ｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ３６およびｐＣ６８ＣＭＶ−ＡＰ−ＭＵ２６の両方のＡＰ遺伝子をｐＧＦＰＭＵ３１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から単離したｌａｃＺプロモーターによって操縦される原核ＧＦＰ遺伝子のカセットに置き換えた。このように、細菌形質転換体の白色コロニーは組換え型プラスミドを含有するであろう。そのように細菌のコロニーを選択する緑色／白色選択方法では、多数の微細調製（ｍｉｎｉｐｒｅｐｅｄ）ＤＮＡを作成して特徴づける必要性が回避され、その結果として、組換え型Ｃ６８ベクターを生じさせる時の効率が更に向上した。
【実施例２】
【０１１９】
チンパンジーＣ６８ウイルスストックおよび複製
以下の実施例３から５にチンパンジーＣ６８の追加的特徴付けを示す。本分野の技術者は、新規な組換え型チンパンジーアデノウイルス構築物を構築する時に本情報を容易に利用できることを理解するであろう。
【０１２０】
Ｃ６８ウイルスストック（ｓｔｏｃｋ）をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手して、２９３細胞（ＡＴＣＣ）［ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＳｉｇｍａまたはＨｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を１０％およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を１％補充しておいたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の中で培養］の中で増殖させた。２９３細胞の感染をＦＣＳを２％補充しておいたＤＭＥＭ中で最初２４時間実施した後、ＦＣＳを添加して１０％の最終濃度にした。感染させた細胞の１００％がウイルス誘発細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すようになった時点で細胞を収穫し、集めた後、遠心分離で濃縮した。細胞のペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に入れて再び懸濁させた後、凍結解凍を３サイクル行うことで溶解させた。塩化セシウムの密度勾配を用いた超遠心分離段階を２回行うことでウイルス調剤を得た後、ウイルスのストックを１０ｍＭのＴｒｉｓ／１００ｍＭのＮａＣｌ／５０％のグリセロールの中で希釈して１ｍｌ当たり１ｘ１０１２個の粒子の数になるようにした後、−７０℃で貯蔵した。
【実施例３】
【０１２１】
ウイルスゲノムＤＮＡのクローニングおよび配列決定
標準的方法に従って、その精製したウイルス調剤からゲノムＤＮＡを単離した後、１６種の制限酵素から成る一団の制限酵素を製造業者の推奨に従って用いて消化させた。特に明記しない限り、あらゆる制限酵素および修飾用酵素をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＸｂａＩで消化させた後、そのフラグメントをプラスミドにサブクローン化させた（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）［Ｋ．Ｌ．ＢｅｒｋｎｅｒおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１：６００３−２０（１９８３）］。除蛋白後、１０ｂｐの合成ＰａｃＩリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）にＰａｃＩとＢａｍＨＩもしくはＰｓｔＩを用いた二重消化を受けさせた。
【０１２２】
Ｃ６８から生じさせたＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローンをそれぞれ図１のパートＣ、ＤおよびＥに示す。影付きボックスで示すフラグメントはクローン化していないが、ゲノム全体の配列を、重なり合うクローンとウイルスＤＮＡを直接配列決定することで決定した（影無しボックス）。そのクローン化したフラグメントおよび挿入断片の大きさを表１に記述する。下記の表において、ｐＢＳ＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐＳＫ＋クローン；ｐＮＥＢ＝ｐＮＥＢ１９３クローン；ｐＢＲ＝ｐＢＲ３２２クローン；接頭辞なし＝クローン化していないフラグメント。
【０１２３】
【表６】
0004399255.tif 000007
【０１２４】
チンパンジーアデノウイルスＣ６８をＡＴＣＣから入手して、ヒト２９３細胞の中で増殖させた。確立された手順［Ａ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａ．、５：１１４８−１１５２（１９９８）］を用いてウイルス粒子を精製しそして一団の制限酵素を用いて消化させることでウイルスのゲノムＤＮＡを単離したが、そのデータは以前の研究（データは示していない）［Ｇ．Ｒ．Ｋｉｔｃｈｉｎｇｍａｎ、Ｇｅｎｅ、２０：２０５−２１０（１９８２）；Ｑ．ＬｉおよびＧ．Ｗａｄｅｌｌ、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１０１：６５−７７（１９９８）；Ｒ．Ｗｉｇａｎｄ他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ．３０：１−９（１９８９）］と一致していた。Ｃ６８のゲノム全体に渡る制限フラグメントをプラスミドにサブクローン化した。Ｃ６８ゲノムの図式図を図１Ａに示し、そしプラスミドベクターにクローン化したＰｓｔ−Ｉ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをそれぞれ図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄに影なしボックスで示す。また、クローン化したフラグメント、フラグメントの大きさおよびゲノムの位置も表１に示す。プラスミドクローンとゲノムＤＮＡの両方を配列決定用鋳型として用いた。両方の方向のプライマーウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）を用いてゲノムの配列を決定し、平均で約４回行った反応に各塩基を含めた。
【０１２５】
Ｃ６８ゲノムの長さは３６５２１ｂｐである［米国特許第６，０８３，７１６号を参照］。ＧｅｎＢａｎｋ配列との予備比較で、他のヒトおよび動物のアデノウイルスとの類似性の度合はいろいろであることに加えてウイルスゲノムの全体長もいろいろであることが示された。以前に記述されたアデノウイルス遺伝単位（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｕｎｉｔｓ）、初期領域（ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ）１−４および主要後期（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ）遺伝子の全部に相同性を示す領域がＣ６８ゲノムに見られた（図１Ａ）。完全な配列を決定したＣ６８とヒトアデノウイルスの間のＤＮＡ相同性、即ちＡｄ２（ＮＣ００１４０５）、Ａｄ５（ＮＣ００１４０５）、Ａｄ１２（ＮＣ００１４６０）、Ａｄ１７（ＮＣ００２０６７）およびＡｄ４０（ＮＣ０１４６４）を用いてクローンを配列させた。開放読み枠（ＯＲＦ）を決定し、そして他のヒトアデノウイルスとの相同性を基にして遺伝子を識別した。主要アデノウイルス初期および後期遺伝子の全部がＣ６８に存在している。逆方向末端反復（ＩＴＲ＝ｓ）の長さは１３０ｂｐである。
【実施例４】
【０１２６】
Ｃ６８配列の分析
ＧｅｎＢａｎｋから入手可能なマスタデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属のあらゆる員（いろいろな種から単離した単離物を包含）の完全なヌクレオチド配列にＣ６８との同一性に関する選別を受けさせた。Ａｄ４ミニゲノム（ｍｉｎｉｇｅｎｏｍｅ）を下記のＧｅｎＢａｎｋ配列から組み立てた：左側ＩＴＲ（Ｊ０１９６４）、Ｅ１Ａ領域（Ｍ１４９１８）；ＤＮＡ  ｐｏｌおよびｐＴＰ（Ｘ７４５０８、７４６７２）、ＶＡ  ＲＮＡ−１、ＩＩ（Ｕ１０６８２）、５２、５５Ｋ（Ｕ５２５３５）、ｐＶＩＩ（Ｕ７０９２１）ヘキソン（Ｘ８４６４６）；エンドプロテアーゼ（Ｍ１６６９２）、ＤＮＡ結合蛋白質（Ｍ１２４０７）、ファイバー（Ｘ７６５４７）、右側ＩＴＲ（Ｊ０１９６５）。下記の配列データを用いてＡｄ７複合ゲノムを生じさせた：Ｍｕ  ３−２１（Ｘ０３０００）、ＶＡ  ＲＮＡ−１、ＩＩ、ｐＴＰおよび５２、５５Ｋ（Ｕ５２５７４）、ペントン（ＡＤ００１６７５）；ｐＶＩ、ヘキソンおよびエンドプロテアーゼ（ＡＦ０６５０６５）、ＤＮＡ結合蛋白質（Ｋ０２５３０）、Ｅ３およびファイバー領域（ＡＦ１０４３８４）、右側ＩＴＲ（Ｖ０００３７）。
【０１２７】
Ｊａｌｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｉｃｈｅｌｅ／ｊａｌｖｉｅｗ／）編集のＣｌｕｓｔａｌ  Ｘを用いてアミノ酸配列整列を生じさせそしてＢｏｘｓｈａｄｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いて分析した。あらゆるヒトアデノウイルス抗原型から公に入手可能なヘキソン蛋白質配列を最初に整列させることでＣ６８に最も高い相同性を示すセット（ｓｅｔ）を同定した。
【０１２８】
Ｃ６８ゲノムの中のあらゆる重要な開放読み枠のヌクレオチド配列および予測したアミノ酸配列を公知のＤＮＡおよび蛋白質配列と比較した。Ｃ６８のヌクレオチド配列をＡｄ２、４、５、７、１２、１７および４０の配列と比較した。以前の制限分析（この上に引用したＫｉｔｃｈｉｎｇｍａｎ）と一致して、Ｃ６８は大部分がヒトＡｄ４（サブグループＥ）に類似している。
【０１２９】
Ｃ６８のＥ１Ａ領域はｎｔ４８０の所のＴＡＴＡボックスから１５２１の所のｐｏｌｙ  Ａ付加部位に及ぶ。コンセンサススプライスドナー（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｐｌｉｃｅ  ｄｏｎｏｒ）およびアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）部位は、ヒトＡｄ相対物の位置と類似した位置にあり、２８．２Ｋおよび２４．８Ｋの蛋白質の大きさはヒトＡｄ蛋白質の大きに類似している。Ｃ６８の最も小さいＥ１Ａ蛋白質のＯＲＦは、他のアデノウイルスのほぼ６０個のアミノ酸とは対照的に１０１個の残基をコード化すると予測する。Ｃ６８では残基６０（他のアデノウイルスではしばしばＴＧＡ終止コドンが存在する）の所にＴＴＡコドンが存在する。Ｃ６８  Ｅ１Ａ  １００Ｒ蛋白質の最初の６０個の残基はＡｄ４同族体に対して８５％の同一性を示す。
【０１３０】
Ｃ６８ゲノムは４種類のＥ１Ｂ蛋白質、即ち２０．５Ｋ、５４．７Ｋ、１０．１Ｋおよび１８．５ＫばかりでなくｐＩＸの遺伝子をコード化する。Ｃ６８がコード化する５種類の蛋白質は全部大きさが他のＡｄのＥ１ＢおよびｐＩＸ蛋白質のそれに類似している。Ｅ１Ｂ  ２１Ｋ蛋白質のＡｄ４の同族体が有するアミノ酸は１４２個のみであり、Ｃ６８は１８６個の残基を有するが、他のヒトアデノウイルスは１６３−１７８個の残基を有する。Ｃ６８およびＡｄ４蛋白質は最初の１３４ａａに渡って９５％の同一性を共有し、その後に類似性が終了しており、そしてＡｄ４蛋白質は１４２個のアミノ酸で終結している。
【０１３１】
Ｃ６８ゲノムはＥ２Ａ、５５Ｋ  ＤＮＡ結合蛋白質およびＩｖａ２成熟蛋白質ばかりでなくＥ２Ｂ末端蛋白質およびＤＮＡポリメラーゼの同族体をコード化する。Ｅ２領域の蛋白質は全部大きさがそれらのヒトＡｄ相対物の大きさに類似しており、特にＥ２Ｂ蛋白質は良好に保存されている。Ｃ６８のＥ２Ｂ  １２３．６Ｋ  ＤＮＡポリメラーゼは１１２４個の残基であると予測される一方、Ａｄ４は１１９３個の残基を有すると予測されるが、他のヒトアデノウイルスが有するポリメラーゼはより小さい。Ａｄ４ポリメラーゼの残基１−７１は他の如何なるＡｄのポリメラーゼとも類似しておらず、その蛋白質は実際に内部ＡＴＧコドンを開始させる可能性がある。Ａｄ４とＣ６８のポリメラーゼアミノ酸７２−１１９３のアミノ酸同一性は９６％である。
【０１３２】
今までに配列決定したヒトアデノウイルスのＥ３領域は配列およびコード付け能力に関してかなりの変動を示す。Ａｄ４０は５種類のＥ３領域遺伝子を有し、Ａｄ１２は６種類、Ｃ６８およびＡｄ５は７種類、Ａｄ３８は８種類、そしてＡｄ３ばかりでなくＡｄ７（サブグループＢのヒトアデノウイルス）は９種類の推定Ｅ３領域遺伝子を有する。Ａｄ４のＥ３領域はまだ配列決定されていない。Ａｄ３５のＥ３領域と対比して、Ｃ６８ゲノムの中の７種類のＥ３遺伝子同族体は全部同定された［Ｃ．Ｆ．ＢａｓｌｅｒおよびＭ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１５：１６５−１７７（１９９６）］。
【０１３３】
Ｃ６８のＥ４領域は６種類のＯＲＦを有し、これらは各々ヒトＡｄ５、１２および４０のＥ４領域の中の蛋白質に相応している。Ｅ４の名称は混乱を招く、と言うのは、Ｃ６８、Ａｄ１２およびＡｄ４０のＯＲＦ２同族体の残基数は約１３０である一方、Ａｄ５には残基数が６４および６７の蛋白質をコード化するＯＲＦが２つ存在し、それらはそれぞれより大きなＯＲＦ２蛋白質のアミノおよびカルボキシ末端部に相応しているからである。我々の名称にはＯＲＦ５を省いた、と言うのは、Ｅ４領域の中の５番目のＯＲＦは幅広く研究されているヒトＡｄ５のＯＲＦ６蛋白質に相応しているからである。
【０１３４】
Ｃ６８ゲノムの主要後期プロモーターおよび３部分に分かれているリーダー（ｌｅａｄｅｒ）配列の位置を決めた。１５種類の主要後期蛋白質をコード化する可能性のあるＯＲＦの位置を決めた。Ｃ６８の後期蛋白質の大きさは全部それらのヒトＡｄ相対物の大きさに類似している。チンパンジーとヒトのＡｄ後期蛋白質の間のアミノ酸同一性パーセントはかなり多様である。Ｃ６８のファイバー蛋白質とＡｄ４の蛋白質のアミノ酸同一性は９０％であると予測するが、他のヒトＡｄファイバー蛋白質との類似性はずっと小さい。ファイバーノブの中のＣＡＲ結合部位がＣ６８に存在する。
【実施例５】
【０１３５】
ウイルス中和抗体検定
Ｃ６８とヒトアデノウイルスの種類特異的抗血清の間に相互反応性が存在するか否かを測定する試験をいくつか実施した。血清の中和活性を下記の如く試験した。正常なヒト被験体（Ｎ＝５０）、リーサスサル（Ｎ＝５２）およびチンパンジー（Ｎ＝２０）から得た一団の血清にＡｄ５およびＣ６８が基になったベクターに対する中和抗体に関する評価を２９３細胞を指標細胞系として用いて受けさせた。個々のヒト、リーサスサルまたはチンパンジーから集めた血清に不活化を５６Ｃで３０分間受けさせた。各サンプルの一連の希釈液（ＦＣＳを１０％入れておいた１００μｌのＤＭＥＭに１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、１：３２０）を等しい量のＨ５．０１０ＣＭＶＥＧＦＰ（１０００ＰＦＵ／ウエル）またはＣ６８ＣＭＶＥＧＦＰウイルスに加えて、４Ｃで２時間インキュベートした。この混合物を１５０ミクロリットルの量で９６個ウエルフラットボトムプレート（９６  ｗｅｌｌ  ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅｓ）に入れておいた２ｘ１０２９３細胞の上に移した。対照ウエルは等しい量のウイルス（血清を添加しないで）に感染させた。サンプルを５％ＣＯ２下３７℃で４８時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で検査した。感染させた対照に比較して緑色蛍光焦点の＞５０％減少を示したサンプル希釈液を中和抗体に関して陽性であると評価した。
【０１３６】
期待した通り、正常なヒト被験体の約３５％がＡｄ５に対する中和抗体を示し、その頻度は、リーサスサルおよびチンパンジーの血清で観察されたそれよりもずっと高かった。Ｃ６８に対する中和抗体はチンパンジーの８０％に観察されたが、正常なヒト被験体またはリーサスサルに観察されたそれは２％のみであった。標的でない種における中和抗体のタイターは一般に低かった。
【０１３７】
Ｃ６８とヒトアデノウイルスベクターの相互反応性を更に評価する目的で、マウスにＡｄ２、４、５、７および１２ばかりでなくＣ６８を２ｘ１０７個のプラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）（ｐｆｕ）で用いた免疫処置を受けさせた。２週間後に血清を収穫して、Ａｄ５またはＣ６８ベクターのいずれかを中和する抗体に関する試験を行った。Ａｄ５による免疫処置を受けさせた動物ではＡｄベクターに対する中和抗体のみが検出された。重要なことは、Ｃ６８ベクターによる免疫処置を受けさせた動物のみがＣ６８ベクターに対する中和抗体を有していたことであり、試験を受けさせたヒト抗原型（Ａｄ４を包含）のいずれもＣ６８をインビトロで中和する抗体をマウスに発生させなかった。
【０１３８】
Ｃ６８ベクターをヒトの試験で使用する時の重要性はヒト集団に中和抗体が存在しないことである。我々の試験では、選抜した５０人の正常なヒト被験体に同じ検定（チンパンジーの＞５０％に中和抗体が見られた）を受けさせた時に中和抗体が全く有意には検出されなかった（＞１：１０）。その上、複数のヒトＡｄ抗原型（Ａｄ４を包含）を用いた免疫処置を受けさせたマウスの血清はＣ６８による感染を中和しなかった。
【実施例６】
【０１３９】
ヘキソン蛋白質の構造分析
Ｃ６８とヒト抗原型の間に中和抗体が存在しないことが分かったことから、我々は、種類特異的エピトープを有すると思われるヘキソン領域の中に構造的な差があるか否かをより注意深く評価した。Ｃｒａｗｆｏｒｄ−ＭｉｋｓｚａおよびＳｃｈｎｕｒｒ［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７０：１８３６−１８４４（１９９６）］によって行われた以前の試験により、そのようなエピトープはヘキソンが有する７個の超可変領域の中に位置することが示唆されていた。ヘキソン蛋白質のアミノ酸配列をＣ６８と数種のヒトアデノウイルスの間で比較した結果を図３に示す。実際、Ｃ６８はそのような超可変配列を有する重要な領域が実質的に異なっている。
【実施例７】
【０１４０】
ヒトファイバー遺伝子を含有するＣ６８誘導カプシドの構築
向性が変化したＣ６８誘導ベクターを生じさせる目的で、Ｃ６８のテール（ｔａｉｌ）およびシャフト（ｓｈａｆｔ）に融合したＡｄ５ファイバーノブを含有するキメラファイバー遺伝子構築物をＣ６８ゲノムを担持しているプラスミドの中に組み込む。野生型Ｃ６８のファイバー遺伝子を正確に置き換える目的で、ＣＭＶプロモーターによって操縦される緑色蛍光蛋白質を担持しているプラスミドをＣ６８のファイバーの修飾で用いる。その結果として得たトランスファーベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）はＣＭＶプロモーターによって操縦される緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現カセット（Ｅ３領域の中に挿入）、キメラＣ６８／Ａｄ５ファイバー遺伝子およびＥ４を含有している。このトランスファーベクターを用いて、大腸菌の中で同種組換えを起こさせることで、ＧＦＰカセットおよび修飾を受けたファイバー遺伝子をＥ３が欠失しているＣ６８感染性プラスミドのバックボーンの中に組み込んだ。そのウイルスのゲノムを前記プラスミドからＰａｃＩによる消化で放出させ、それを２９３細胞のトランスフェクションで用いた。本明細書に記述した技術を用いたトランスフェクションを行って約３週間後にキメラＣ６８誘導ウイルスが生じる。他のＣ６８誘導カプシドを構築する目的で同様な技術を容易に利用することができる。
【０１４１】
本明細書に引用した出版物は全部引用することによって本明細書に組み入れられる。特に好適な態様を言及することで本発明を記述してきたが、本発明の精神から逸脱しない限り修飾を成し得ることは理解されるであろう。そのような修飾形を添付請求の範囲の範囲内に入れることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１に、チンパンジーアデノウイルスＣ６８ゲノムの遺伝子構成を要約する。上部の図１ＡにＣ６８チンパンジーアデノウイルスのゲノムをボックスで図式的に示す。逆方向末端反復が影付き黒色でありそして初期領域が影付き灰色である。ボックスの上の矢尻は初期遺伝子の発現方向を示している。ボックスの下の線はゲノムを１００マップ単位に分割している線を示している。前記線の下の矢印は５種類の後期遺伝子領域および各領域がコード化する蛋白質を示している。ボックスまたは矢印の下の数字は各領域の開始（プロモーターまたは開始コドン）および終止（公式に認められたＰｏｌｙＡシグナル）を示している。＊はＥ２Ａ後期プロモーターを示している。図１ＢにＰｓｔＩクローンを示し、図１ＣにＢａｍＨＩクローンを示す。図１ＤにＨｉｎｄＩＩＩクローンを示す。部分１Ｂ−１Ｄの影が付いていない領域は、フラグメントがプラスミドベクターにクローン化していることを示す一方、影付き領域は制限フラグメントがクローン化していないことを示している。各断片のフラグメント名（Ａのアルファベットが付いているフラグメントが最も大きなフラグメントである）およびフラグメントの大きさをボックスの上に示しそしてフラグメント終止点をボックスの下に示す。
【図２】図２に、Ｃ６８ヘキソン蛋白質［配列番号１６のａａ１３１から４４１］と一緒にＡｄ４［配列番号３４］、Ａｄ１６［配列番号３５］、Ａｄ３［配列番号３６］、Ａｄ７［配列番号３７］およびＡｄ２［配列番号３８］の配列整列を示す。Ｃ６８チンパンジーアデノウイルスと非常に類似しているヒトアデノウイルスヘキソンの結論付けられたアミノ酸配列をＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘで比較した。抗原型およびサブグループを左端に示し、その後に残基の番号を示す。番号付けは翻訳開始点を基準にしたアミノ酸の位置を指す。Ｃ６８に関する配列の類似（灰色）および同一（黒色）を目立たせるようにアミノ酸に影を付ける。ループドメインＤＥ１およびＦＧ１の中の７種類の超可変領域に標識を下部に沿って付け、そしてこれらは整列させた時に下記のＡｄ２配列に相当する：配列番号１６のＨＶＲ１、１３７−１８８；ＨＶＲ２、１９４−２０４；ＨＶＲ３、２２２−２２９；ＨＶＲ４、２５８−２７１；ＨＶＲ５、２７８−２９４；ＨＶＲ６、３１６−３２７およびＨＶＲ７、４３３−４６５。示した配列のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号は下記である：ＡＡＤ０３６５７（Ａｄ４）、Ｓ３７２１６（Ａｄ１６）、Ｓ３９２９８（Ａｄ３）、ＡＡＤ０３６６３（Ａｄ７）およびＮＰ０４０５２５（Ａｄ２）。
【図３】図３に、チンパンジーＣ６８（Ｐａｎ−９）［配列番号２７のアミノ酸２４７から４２５］およびヒトアデノウイルス抗原型２［配列番号３９］および５［配列番号４０］のファイバーノブドメインのアミノ酸配列の整列を示す。
【図４】図４に、ヒトアデノウイルス抗原型５［配列番号４１］およびチンパンジーＣ６８（Ｐａｎ−９）［配列番号１６のアミノ酸１２５から４４３］アデノウイルス配列に関するカプシドヘキソンのＬ１およびＬ２ループの一部のアミノ酸配列の整列を示す。介在する保存領域はアデノウイルス抗原型の間で保存されている基礎ドメインの一部である。
【配列表】
0004399255.tif 000008
0004399255.tif 000009
0004399255.tif 000010
0004399255.tif 000011
0004399255.tif 000012
0004399255.tif 000013
0004399255.tif 000014
0004399255.tif 000015
0004399255.tif 000016
0004399255.tif 000017
0004399255.tif 000018
0004399255.tif 000019
0004399255.tif 000020
0004399255.tif 000021
0004399255.tif 000022
0004399255.tif 000023
0004399255.tif 000024
0004399255.tif 000025
0004399255.tif 000026
0004399255.tif 000027
0004399255.tif 000028
0004399255.tif 000029
0004399255.tif 000030
0004399255.tif 000031
0004399255.tif 000032
0004399255.tif 000033
0004399255.tif 000034
0004399255.tif 000035
0004399255.tif 000036
0004399255.tif 000037
0004399255.tif 000038
0004399255.tif 000039
0004399255.tif 000040
0004399255.tif 000041
0004399255.tif 000042
0004399255.tif 000043
0004399255.tif 000044
0004399255.tif 000045
0004399255.tif 000046
0004399255.tif 000047
0004399255.tif 000048
0004399255.tif 000049
0004399255.tif 000050
0004399255.tif 000051
0004399255.tif 000052
0004399255.tif 000053
0004399255.tif 000054
0004399255.tif 000055
0004399255.tif 000056
0004399255.tif 000057
0004399255.tif 000058
0004399255.tif 000059
0004399255.tif 000060
0004399255.tif 000061
0004399255.tif 000062
0004399255.tif 000063
0004399255.tif 000064
0004399255.tif 000065
0004399255.tif 000066
0004399255.tif 000067
【図１】
0004399255.tif 000068
【図２】
0004399255.tif 000069
【図３】
0004399255.tif 000070
【図４】
0004399255.tif 000071