(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−セクレターゼの活性を検出する方法において、
１．融合タンパク質をコードし、以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３′末端において、タンパク質をコードする少なくとも１つの更なるコードヌクレオチド配列
を含有する導入遺伝子を使用し、
２．この導入遺伝子を細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、
３．融合タンパク質を細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号：１のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、
４．第二の部分タンパク質を、更なるコードヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を用いて検出する
ことからなり、
ここで１ｄ）のタンパク質は第一の部分タンパク質と第二の部分タンパク質との融合タンパク質として発現し、第二の部分タンパク質の検出のために使用することができる、
上記方法。
【請求項２】
γ−セクレターゼの活性を検出する方法において、
１．融合タンパク質をコードし、以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３′末端において、タンパク質をコードする少なくとも１つの更なるコードヌクレオチド配列
を含有する導入遺伝子を使用し、
２．この導入遺伝子を細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、
３．融合タンパク質を細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号：１のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、
４．第二の部分タンパク質の量を、更なるコードヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を用いて測定し、形成された第二の部分タンパク質の量からγ−セクレターゼの活性を決定する
ことからなり、
ここで１ｄ）のタンパク質は第一の部分タンパク質と第二の部分タンパク質との融合タンパク質として発現し、第二の部分タンパク質の検出のために使用することができる、
上記方法。
【請求項３】
第一のヌクレオチド配列はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその部分をコードする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第一のヌクレオチド配列は配列番号：４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第二のヌクレオチド配列はＡＰＰのシグナルペプチド(ＳＰ)をコードする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
シグナルペプチドは、配列番号：５のアミノ酸配列を有する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プロモーターは哺乳動物細胞、シーエレガンス、酵母またはショウジョウバエ細胞中における発現のためのプロモーターである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
プロモーターは、ＣＭＶ、ＨＳＶ ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＬＴＲ、unc１１９、unc５４、hsp１６−２、Ｇ0Ａ１、sel−１２、ＡＤＨ１、Ｇaｌ１、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＭＴ、Ａｃ５またはＤｓ４７プロモーターである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞は真核細胞である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞はヒト細胞である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞は非ヒト細胞である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞はＨeＬａ、２９３、Ｈ４、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｈ９、Ｃｏｓ、
ＣＨＯ、Ｎ２Ａ、ＳＬ−２またはSaccharomyces cerevisiae細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞はシーエレガンス細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
細胞はトランスジェニックシーエレガンスの構成成分である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
細胞は酵母細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
融合タンパク質は配列番号：６のアミノ酸配列を有するか、または含有する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
更なるコードヌクレオチド配列はＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有するタンパク質をコードする請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
更なるコードヌクレオチド配列は、Ｇａｌ４−結合ドメインおよびＶＰ１６の転写活性化ドメイン（Ｇａｌ４−ＶＰ１６）から構成されるタンパク質をコードする請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
細胞はレポータープラスミドでコトランスフェクトされ、レポータープラスミドは調節可能なプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含有する請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
調節可能なプロモーターは転写活性化ドメインによって活性化することができる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
レポータープラスミドはＥＧＦＰ（促進グリーン蛍光タンパク質）のレポーター遺伝子をコードし、調節可能なプロモーターはＧａｌ４結合部位およびＨＩＶの最小プロモーターを含有する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
導入遺伝子は配列番号：８のヌクレオチド配列を有する請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
導入遺伝子はベクター内に存在する請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
組換えベクターは配列番号：９のヌクレオチド配列を有する請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
細胞内に内因性γ−セクレターゼ活性は検出できない請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
細胞はｃＤＮＡバンクを使用してコトランスフェクトされる請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ヒトもしくは非ヒト組織またはヒトもしくは非ヒト細胞から調製されるｃＤＮＡはｃＤＮＡバンク中に存在する請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
γ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡの同定のために、
ａ）γ−セクレターゼの活性が検出できる細胞を同定し、
ｂ）この細胞から、γ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡを単離する請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項２９】
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインをコードする第一のヌクレオチド配列の３′末端における少なくともさらに１種のヌクレオチド配列からなる導入遺伝子。
【請求項３０】
第一のヌクレオチド配列はＡＰＰもしくはＡＰＰの部分をコードする請求項２９記載の導入遺伝子。
【請求項３１】
導入遺伝子は配列番号：８のヌクレオチド配列を有する請求項２９または３０のいずれかに記載の導入遺伝子。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれかに記載の導入遺伝子を含有するベクター。
【請求項３３】
ベクターは配列番号：９または配列番号：１２のヌクレオチド配列を有する請求項３２記載のベクター。
【請求項３４】
細胞は請求項３２および３３のいずれかに記載のベクターでトランスフェクトされるトランスジェニック細胞の製造方法。
【請求項３５】
請求項２９〜３１のいずれかに記載の導入遺伝子をシーエレガンスの生殖腺にマイクロインジェクションするトランスジェニックシーエレガンスの製造方法。
【請求項３６】
請求項２９〜３１のいずれかに記載の導入遺伝子を含有する細胞。
【請求項３７】
請求項２９〜３１のいずれかに記載の導入遺伝子を含有するトランスジェニックシーエレガンス。
【請求項３８】
請求項２９〜３１のいずれかに記載の導入遺伝子を含有する酵母細胞。
【請求項３９】
ａ）請求項２９〜３１のいずれかに記載の導入遺伝子、
ｂ）ｃＤＮＡバンク、および
ｃ）レポータープラスミド
を含有する細胞。
【請求項４０】
γ−セクレターゼのｃＤＮＡの同定方法において、
１）請求項３９記載の細胞を産生させ、
２）第二の部分タンパク質が形成されたか否かを決定する方法であって、
ここで第二の部分タンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列の内部でγ−セクレターゼによって切断されることにより形成された、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する、
上記方法。
【請求項４１】
γ−セクレターゼの活性を阻害する物質を同定する方法において、以下のプロセス工程：
１．以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３′末端において、タンパク質をコードする少なくとも１つの更なるコードヌクレオチド配列
を有する導入遺伝子を含有し、タンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子および、γ−セクレターゼをコードしているｃＤＮＡを輸送するレポータープラスミドを含有しているトランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞であり、導入遺伝子および、ｃＤＮＡによってコードされるγ−セクレターゼを発現するトランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞を産生し、
２．トランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞を検討される物質とインキュベートし、ついで
３．第二の部分タンパク質の量を、更なるコードヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を用いて測定する
ことからなり、
ここで１ｄ）のタンパク質は第一の部分タンパク質と第二の部分タンパク質との融合タンパク質として発現し、第二の部分タンパク質の検出のために使用することができ、
第一の部分タンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列の内部でγ−セクレターゼによって切断されることにより形成された、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）を含有し、
第二の部分タンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列の内部でγ−セクレターゼによって切断されることにより形成された、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する、
上記方法。
【請求項４２】
γ−セクレターゼの活性を阻害する物質を同定する方法において、
１．以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコード する第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３′末端において、タンパク質をコードする少なくとも１つの更なるコードヌクレオチド配列
を含有する導入遺伝子を使用し、
２．この導入遺伝子およびレポータープラスミドならびに、γ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡを細胞に導入し、導入遺伝子によってコードされる融合タンパク質および、ｃＤＮＡによってコードされるγ−セクレターゼを検討される物質の存在下に発現させ、
３．融合タンパク質は
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）を含有する第一の部分タンパク質およびアミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する第二の部分タンパク質を形成して切断されるか、または
ｂ）細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号：１のアミノ酸配列内に検出可能な量の第一および／または第二の部分タンパク質は形成されず、すなわち切断されず、
４．第二の部分タンパク質の量を、更なるコードヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を用いて測定する
ことからなり、
ここで１ｄ）のタンパク質は第一の部分タンパク質と第二の部分タンパク質との融合タンパク質として発現し、第二の部分タンパク質の検出のために使用することができる、
上記方法。
【請求項４３】
請求項１〜８、１７、１８および２２のいずれかで定義された導入遺伝子または請求項２９〜３１のいずれかに記載の導入遺伝子によりコードされた融合タンパク質を含有する、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法を用いたγ−セクレターゼ活性を定性的および／または定量的に検出するための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、γ−セクレターゼ活性を測定する方法、その方法の個々の成分およびその方法の使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
アルツハイマー病は辺縁系および大脳皮質において細胞レベルでのニューロンの大量の喪失を伴う脳の神経変性疾患である。冒された脳の領域にはアルツハイマー病の主要な特徴である分子レベルでのタンパク質の沈着いわゆるプラークを分子レベルで検出することができる。これらのプラーク中に最も頻繁に存在するタンパク質はサイズ４０〜４２アミノ酸のペプチドであり、これはＡβ−ペプチドと命名されている。このペプチドは有意により大きな６９５〜７７０アミノ酸の切断生成物いわゆるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）である。
【０００３】
ＡＰＰは最初に脂質二重層を通過する内在性膜貫通タンパク質である。このタンパク質のかけ離れて大きな部分は細胞外にあるが、短いＣ−末端ドメインは細胞質ゾルに向けられている（図１）。Ａβ−ペプチドは図１中に暗灰色で示している。Ａβ−ペプチドの約３分の２は細胞外ドメインに由来し、約３分の１はＡＰＰの膜貫通ドメインに由来する。
【０００４】
膜ベースのＡＰＰのほかに、ＡＰＰの大きなエクトドメインから構成される、ＡＰＰsec(分泌ＡＰＰ）と呼ばれるアミロイド前駆体タンパク質の分泌型がある。ＡＰＰsecはＡＰＰから蛋白質分解的切断によって形成され、これはα−セクレターゼによって行われる。蛋白質分解的切断はＡβ−ペプチドのアミノ酸配列内のＡＰＰのアミノ酸配列の部位（Ａβ−ペプチドのアミノ酸残基１６のあと）で起こる。α−セクレターゼによるＡＰＰの蛋白質分解は、したがってＡβ−ペプチドの形成を除外する。
【０００５】
したがって、Ａβ−ペプチドはＡＰＰから別のプロセッシング経路でのみ形成される。このプロセッシング経路にはさらに２種のプロテアーゼが関与し、β−セクレターゼと命名される１つのプロテアーゼはＡＰＰ中のＡβ−ペプチドのＮ−末端を切断し、γ−セクレターゼと呼ばれる第二のプロテアーゼはＡβ−ペプチドのＣ−末端を遊離させると考えられている（Kang Jら, Nature, 325, 733）（図１）。
【０００６】
今日まで、３種のセクレターゼまたはプロテアーゼ（α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ）のいずれも同定することができていない。しかしながら、セクレターゼの知識はとくにアルツハイマー病および関連するタンパク質の同定の研究の関係で大きな興味をもたれ、それはまた研究を継続する標的ともなっている。一方では、β−セクレターゼおよびとくにγ−セクレターゼの阻害はＡβの産生を減少させるのに対して、他方ではα−セクレターゼの活性化はＡＰＰsec中のＡＰＰのプロセッシングを増大し、したがって同時にＡβ−ペプチドの形成を低下させる。このような研究の過程で発見されたトランスジェニックシーエレガンスが未公開ドイツ特許出願198 49 073.9に記載されている。
【０００７】
Ａβ−ペプチドがアルツハイマー病の発症にきわめて重大な因子であるという事実の多くの指示がある。とくに、細胞培養においてＡβ−原繊維には神経毒性があると考えられている（Yankner B. A.ら, 1990, Proc Natl Acad Sci USA, 87, 9020）。ＡＰＰが付加的なコピーとして生じるダウン症候群の患者では、３０歳の年齢でもアルツハイマー病に特徴的な神経の病変が起こる。この場合はＡβ−ペプチドへの変換の増加がＡＰＰの過剰発現をもたらすものと推測される（Rumble，B.ら, 1989, N．Engl，J．Med., 320, 1446）。
【０００８】
Ａβ−ペプチドの中心的な役割の最も強力な指示は多分、アルツハイマー病によく知られている形態であろうと思われる。この場合、β−およびγ−セクレターゼ切断部位の領域の周辺のＡＰＰ遺伝子中またはさらに２つのＡＤ−関連遺伝子（プレセニリン）に突然変異が見いだされ、これが細胞培養においてＡβの産生の有意な増大を招来する（Scheuner，D.ら, 1996, Nature Medicine, 2, 864）。
【０００９】
ＡＰＰは、そのプロセッシング時の順序において、最初にβ−セクレターゼによってＡβ−ペプチドに切断され、これに続いて、γ−セクレターゼの基質として働くという事実の多くの指示がある（Maruyama，K.Y.ら, 1994, Biochem．Biophys Res Commun, 202, 1517; Estus，S.ら, 1992, Science, 255, 726）。したがって、γ−セクレターゼはＡβ−ペプチドの形成にきわめて重要な役割を有する。慣用的に用いられているγ−セクレターゼ活性の証明はＡβ−ペプチドの検出であるが、これには多くの場合、困難を伴うことが明らかにされている。
【００１０】
この大きな理由はＡＰＰのわずかな部分のみしかＡβ−ペプチドに変換されないことである（Simons，M.ら, Neurosci, 1996, 1; 16(3): 899-908）。しかも、Ａβ−ペプチドは約４kDaのきわめて小さい切断フラグメントであり、その疎水性の性質のため自己凝集を起こす傾向があって、生理学的な条件下には容易に沈殿してしまう（Hilbich，C.ら, 1991, J．Mol．Biol., 218, 149）。
【００１１】
真核細胞内のＡβ−ペプチドの検出は免疫生物学的方法、たとえばＥＬＩＳＡ，免疫沈降、ならびにウエスタンブロッティングによって行われる（Suzuki，N.ら, Science, 1994, 27, 264(5163) 1336; Haass Cら, 1992, Nature, 359, 322）。これらの方法は、適当な抗体とのインキュベーションを包含し、細胞培養またはモデル生物体（とくに、シーエレガンス）から得られる使用細胞の破壊を必要とするので比較的労力を要する。
【００１２】
【発明の開示】
本発明は、γ−セクレターゼ活性の測定およびγ−セクレターゼの検出のための新規な方法に関し、その方法の特定の実施態様は、一方では、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡの同定方法に関し、他方では、γ−セクレターゼの活性を阻害できる物質の同定方法に関する。このような物質は、それらがたとえばアルツハイマー病の治療のための医薬活性化合物として使用できるのでとくに重要である。
【００１３】
本発明は、γ−セクレターゼの検出方法において、
１．融合タンパク質をコードし、以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）
を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）適宜、更なるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列を含有する導入遺伝子をそれぞれ調製して使用し、
２．この導入遺伝子を細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、
３．融合タンパク質を細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号：１のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、
４．第一の部分タンパク質および／または第二の部分タンパク質を検出することからなる方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、γ−セクレターゼの活性を検出する方法において、
１．融合タンパク質をコードし、以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）
を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）適宜、更なるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列を含有する導入遺伝子をそれぞれ調製して使用し、
２．この導入遺伝子を細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、
３．融合タンパク質を細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号：１
のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）
を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）
を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、
４．第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の量からγ−セクレターゼの活性を決定することからなる方法に関する。
【００１５】
この方法（「Ａβ−ペプチドスクリーニングアッセイ」、「γ−セクレターゼアッセイ」）は、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼ活性のインビボ検出に適当であり、たとえば、普遍的な高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）の方法に採用することが可能である。これらの方法は慣用検出方法の上述の欠点を示さず、とくに労力を要する単離および検出工程を必要としない。これらの方法のベースは、Ｃ−末端ＡＰＰフラグメントがγ−セクレターゼによって２つのフラグメントに切断されることである。すなわち、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する第二の部分タンパク質に切断され、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する第二の部分タンパク質は細胞の細胞質ゾル中に拡散する（図２）。この第二の部分蛋白質は細胞の細胞質ゾル中で、例えばγ−セクレターゼもしくはγ−セクレターゼ活性の検出に役立つレポーター遺伝子の補助によって容易に検出することが可能である。γ−セクレターゼの切断部位は、ＡＰＰの膜貫通ドメイン内に存在する（Kang Jら, 1987, Nature, 325, 733）。ＡＰＰ膜貫通ドメインはアミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ40ＩＡ42ＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬを有する。γ−セクレターゼはＶ40、Ａ42またはＴ43のあとを切断する。これに反して、真核細胞中細胞培養によって産生されるＡβ−ペプチドはメジウム上清中に分泌される。
【００１６】
適当なレポーターシステムの補助により第二の部分タンパク質の放出はレポータータンパク質の発現を活性化し、それは真核細胞中で検出することができる。レポーター蛋白質の検出によって、γ−セクレターゼの切断はＡＰＰ中で起こることを証明することができる。その結果、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼ活性は定性的および／または定量的に検出することができる。
【００１７】
この方法の構成は以下のように詳細に特徴づけることができる。
第一のヌクレオチド配列はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその部分をコードする。好ましくは、第一のヌクレオチド配列はアミノ酸配列（配列番号：４）を含有するタンパク質をコードする。配列番号：４は配列番号：１を含有する。
【００１８】
第二のヌクレオチド配列はシグナルペプチド、好ましくはＡＰＰのシグナルペプチド（以下「ＳＰ」と略す）をコードする。シグナルペプチドは、たとえば、アミノ酸配列、配列番号：５を含有する。
【００１９】
プロモーターとしては、調節可能または構成的プロモーターを使用することができる。プロモーターは、たとえば哺乳動物細胞、シーエレガンス、酵母またはショウジョウバエでの発現に適当なものでよい。哺乳動物細胞に適当なプロモーターとしては、たとえばＣＭＶ（たとえばClontech, Heidelberg, Germany）、ＨＳＶ ＴＫ（たとえばClontech）、ＲＳＶ（たとえばInvitrogen, NV Leek, Netherlands）、ＳＶ４０（たとえばClontech）とＬＴＲ（たとえばClontech）がある。シーエレガンスに使用できるプロモーターはたとえば、unc１１９、unc５４、hsp１６−２、Ｇ0Ａ１、およびsel−１２がある。酵母における発現にはプロモーターＡＤＨ１（構成的）(Vlckovaら，1994, Gene, 25(5), 472-4）、Ｇal１（条件的に誘導性）(Selleckら，1987, Nature, 325, 173-7）、ＭＥＴ３（条件的）(Cherestら，1987, Mol Gen Genet, 210, 307-13）とＭＥＴ２５が適当である。ショウジョウバエではプロモーターＭＴ（メタロチオニン）(たとえば、Invitrogen）、Ａｃ５（Invitrogen）またはＤｓ４７（Invitrogen）が使用可能である。
【００２０】
好ましくは、この方法には細胞は真核細胞、たとえばヒト細胞または非ヒト細胞たとえばサル、ハムスター、マウス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュまたは酵母が使用される。たとえばＨｅＬａ、２９３、Ｈ４、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｈ９、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｎ２Ａ、ＳＬ−２またはSaccharomyces cerevisiae細胞が使用できる。本発明の特定の実施態様においては、シーエレガンス細胞が使用される。細胞は、トランスジェニック、非ヒト動物の構成成分であってもよい。特定の実施態様においては、トランスジェニック細胞はトランスジェニックシーエレガンスの構成成分である。とくに本発明は、たとえば株ＭＡＶ２０３（Life Technologies, Rockville, MD, USA）またはＥＧＹ４８（OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD, USA）からの酵母細胞を使用する方法に関する。
【００２１】
導入遺伝子は融合タンパク質をコードする。これは第一および第二のヌクレオチド配列ならびに、適宜更なるヌクレオチド配列によりコードされる部分タンパク質から構成される。したがって、融合タンパク質は第一の部分タンパク質および第二の部分タンパク質ならびに、適宜更なる部分タンパク質を含有する。融合タンパク質はたとえば、配列番号：６のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
とくに、ヌクレオチド配列、配列番号：８を有する導入遺伝子は、この方法に用いることができる。この方法のとくに好ましい実施態様においては、導入遺伝子はベクター内に存在する。組換えベクターは配列番号：９のヌクレオチド配列をもっていてもよい。本発明のこの特定の実施態様はまた、ＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６システムとも呼ばれる。この場合、ＡＰＰのシグナルペプチド、ＡＰＰのＣ１００フラグメント、Ｇａｌ４およびＶＰ１６からなる融合タンパク質が発現される。膜貫通ドメインに位置するこのタンパク質は、Ｃ１００フラグメントおよび第二の部分タンパク質内すなわちＣ１００フラグメント、Ｇａｌ４およびＶＰ１６の一部分を含有する融合タンパク質の部分内で切断され、レポータープラスミドの補助により検出される。
【００２３】
導入遺伝子構築体ＳＰＣ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６のほかに他のレポーター構築体も考慮できる。これには、たとえば、転写活性化ドメインを膜貫通ドメインとＳＰＣ１００またはＴａｇ（たとえばＭＹＣ，ＦＬＡＧ）の細胞質ゾルドメインの間、ならびにＮ−およびＣ−末端上およびＳＰＣ１００の膜貫通と細胞質ゾルドメインの間に挿入できる。
【００２４】
更なるコードヌクレオチド配列は、たとえば第二の部分タンパク質の検出に使用できるタンパク質をコードすることができる。したがって好ましくは、更なるコードヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列の３′末端に位置する。更なるコードヌクレオチド配列は、たとえばキメラタンパク質、または多数のドメインから構築された他のタンパク質たとえばＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有するタンパク質をコードする。本発明の特定の実施態様においては、更なるコードヌクレオチド配列は、Ｇａｌ４結合ドメインおよびＶＰ１６の転写活性化ドメイン（Ｇａｌ４−ＶＰ１６）から構成されるタンパク質をコードし、したがって更なる部分タンパク質は配列番号：７のアミノ酸配列を有することが好ましい。酵母細胞においては、更なる部分タンパク質はまたＬｅｘＡ−結合ドメイン（たとえばＬｅｘＡ−ＶＰ１６）を含有してもよい。この更なる部分タンパク質は、株ＥＧＹ４８の酵母細胞が使用される場合の方法にとくに適している。
【００２５】
とくに、本発明は、レポータープラスミドでコトランスフェクトされた細胞を使用する方法に関する。レポータープラスミドは、調節可能なプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含有する。たとえば、レポーター遺伝子はＧＦＰおよびその誘導体、たとえばＥＧＦＰ（促進グリーン蛍光タンパク質）、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰ、ＧＦＰｕｖまたはルシフェラーゼ（たとえばPromega, Mannheim, Germany）、ＣＡＴ（たとえばPromega）、ＳＥＡＰ（たとえばClontech）、β−Ｇａｌ（たとえばClontech）またはアポトーシス誘発因子、たとえばＦａｓ、ＴＮＦ−Ｒ１、細胞死ドメインおよび類縁体（Tartagliaら, 1993, Cell, 74, 845-53）、ced３、ced４、ced９をコードすることができる。調節可能なプロモーターとしては、レポータープラスミドは例えばＨＩＶの最小プロモーター、ＣＤ４プロモーターまたはmec７プロモーターを含有することができる。適当に調節可能なプロモーターの選択は用いられた転写活性化ドメインに依存する。
【００２６】
本発明の特定の実施態様は、使用される細胞は酵母細胞である方法の実施に関する。特定の実施態様においてＭＥＴ−２５プロモーターが使用された酵母発現ベクターｐＤＢＴＲＰ（Life Technologies Inc.）(配列番号：１１）の代替として（配列番号：１２参照）、異なるプロモーター（たとえば誘導性Ｇａｌ１プロモーターおよびＭＥＴ−２５プロモーター、あるいは構成的に活性なＡＤＨ１プロモーター）および異なる選択マーカー（ＡＤＥ，ＬＥＵ，ＴＲＰ，ＨＩＳ，ＬＹＳ，ＰＨＥ）を有する他の多数の発現ベクターを選択することができる。
【００２７】
特定の実施態様は、ゲノム中に安定にインテグレートされるかまたは染色体外に存在するＧａｌ４−またはＬｅｘＡ−誘導性レポーター遺伝子を含有する酵母細胞の使用に関する。これらの実施態様のためには、株ＭａＶ２０３（Life Technologies, Rockville, MD, USA）またはＥＧＹ４８（Origene Technologies, Inc. Rockville, MD, USA）の酵母の使用が好ましい。
【００２８】
これらの方法の特定の実施態様は、更なる組換えベクターで付加的にトランスフェクトされた細胞の使用に関する。これらの実施態様に使用する細胞は通常、全くまたはほとんど内因性γ−セクレターゼもしくは内因性γ−セクレターゼ活性が上述の方法を用いては検出できないことが好ましい。この細胞はγ−セクレターゼをコードするヌクレオチド配列−好ましくはｃＤＮＡ−を含有する更なるベクターを用いてトランスフォームすることができる。たとえば、ｃＤＮＡバンクを使用することができる。ついでこの方法の実施態様がとくにγ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡを同定するために用いられる。γ−セクレターゼを検索できるｃＤＮＡバンクは細胞または組織、たとえばＢ細胞、ニューロン、グリア細胞、海馬、全脳、胎盤、腎臓から調製することができる。好ましくは、ｃＤＮＡはヒト細胞またはヒト組織から調製されるが、他の生物体（たとえば、ハムスター、ラット、マウス、イヌ、サル）からも調製される。
【００２９】
トランスフェクションを行わないとγ−セクレターゼ活性を示さないがｃＤＮＡバンクでトランスフェクション後にはγ−セクレターゼ活性を示す細胞の場合、細胞中に存在するｃＤＮＡはγ−セクレターゼをコードする。この挙動を示す細胞から、既知の方法でこのｃＤＮＡを単離し、確認することができる。
【００３０】
本発明はまた、融合タンパク質をコードし、以下の成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）
を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３′末端にＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインをコードする少なくとも１個の更なるヌクレオチド配列を含有する導入遺伝子に関する。
【００３１】
好ましくは、第一のヌクレオチド配列はＡＰＰまたはＡＰＰの部分をコードする。導入遺伝子はたとえば、配列番号：８のヌクレオチド配列を有することができる。導入遺伝子はベクター中に存在させてもよい。これはたとえば配列番号：９のヌクレオチド配列を有することができる。
【００３２】
本発明の方法は、トランスジェニック細胞の産生のための導入遺伝子および／またはベクターの使用に関し、細胞は非ヒト生物体の構成成分とすることが可能である。たとえば、導入遺伝子および／またはベクターは、トランスジェニックシーエレガンスの産生のために使用することができる。他の特定の実施態様においては、導入遺伝子および／またはベクターはトランスジェニック酵母細胞たとえばS.cerevisiae細胞の産生のために使用することができる。
【００３３】
本発明はまた、非ヒト生物体たとえばトランスジェニックシーエレガンスの産生方法において、導入遺伝子および／または導入遺伝子を含有するベクターを、生物体たとえばシーエレガンスの生殖腺にマイクロインジェクションする方法に関する。本発明はまた、本発明による導入遺伝子を含有する細胞、および本発明による導入遺伝子を含有するトランスジェニックシーエレガンスに関する。本発明はまた、本発明による導入遺伝子、好ましくは適当なベクター中に存在する導入遺伝子を含有する細胞とくに酵母細胞に関する。本発明はとくに本発明による導入遺伝子および付加的なｃＤＮＡバンクを含有する細胞、好ましくは酵母細胞に関する。
【００３４】
本発明は、トランスジェニックまたは組換え細胞、好ましくは酵母細胞またはトランスジェニックシーエレガンスの、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼ活性の測定のための使用、これらの細胞またはトランスジェニックシーエレガンスのγ−セクレターゼ活性阻害剤の同定方法における使用、およびその方法自体に関する。
【００３５】
とくに本発明は、γ−セクレターゼの活性を阻害する物質の同定方法において、以下のプロセス工程：
１．以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）
を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーターを有する導入遺伝子を含有するトランスジェニック非ヒト生物体たとえばトランスジェニックシーエレガンスもしくはSaccharomyces cerevsiaeまたはトランスジェニック細胞であり、さらに
トランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞は、さらにレポータープラスミドを含有し、レポータープラスミドはタンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子、ならびに、
適宜、γ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞を産生させ、
このトランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞に導入遺伝子および、適宜ｃＤＮＡによりコードされるγ−セクレターゼを発現させ、
２．このトランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞を検討される物質とインキュベートし、ついで
３．第二の部分タンパク質の量を検出することからなる方法に関する。
【００３６】
本発明は、γ−セクレターゼの活性を阻害する物質を同定する方法において、
１．以下の構成成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：１）を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５′末端においてシグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、ならびに
ｄ）適宜、更なるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列を含有する導入遺伝子を調製し、
２．この導入遺伝子およびレポータープラスミドならびに適宜γ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡを細胞に導入し、導入遺伝子によってコードされる融合タンパク質および、適宜ｃＤＮＡによってコードされるγ−セクレターゼを検討される物質の存在下に発現させ、
３．融合タンパク質は配列番号：１のアミノ酸配列内で細胞中に存在するγ−セクレターゼによって
ａ）切断され、または
ｂ）切断されず、その結果、
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：２）
を含有する第一の部分タンパク質およびアミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）
を含有する第二の部分タンパク質が形成されるか、
ｂ）検出可能な量の第一および／または第二の部分タンパク質が形成されなず、
４．第二の部分タンパク質が形成されたか否かを測定することからなる方法に関する。
【００３７】
本発明はまた、γ−セクレターゼの活性を阻害する物質を同定する方法において、シグナルペプチドおよび配列番号：１を含有するタンパク質をコードする導入遺伝子を検討される物質およびレポータープラスミドの存在下に発現させ、形成されたアミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号：３）を含有する第二の部分タンパク質の量に対する検討される物質の効果を測定する方法に関する。
【００３８】
本発明はまた、本発明の方法によって同定されるγ−セクレターゼの阻害剤に関する。
本発明はまた、医薬の製造のために、上述の方法の補助により同定された医薬的に活性な化合物（たとえば阻害剤）をさらに医薬的に耐性のある担体と製剤化および／または混合手段によって処理する方法に関する。
【００３９】
本発明はまた、上述の方法を実施するための試験キットに関する。
とくに、これらの方法は、たとえばＣ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６システム（すなわちＣ１００、Ｇａｌ４およびＶＰ１６から構成される融合タンパク質または相当する融合タンパク質をコードする核酸の使用）と接合させて、
１．γ−セクレターゼの活性の同定および測定（定性および定量）、
２．様々な組織、細胞および生物体または種におけるγ−セクレターゼの同定、このγ−セクレターゼのコードに関与するｃＤＮＡの同定および単離、ならびにこのｃＤＮＡの更なる使用、
３．たとえば酵母細胞（Saccharomyces cereviriae）またはシーエレガンス中におけるインビボスクリーニング（免疫生物学的方法を使用しないでγ−セクレターゼ活性の測定が可能である）、
４．γ−セクレターゼの活性を修飾するたとえば医薬的に活性な化合物、たとえばγ−セクレターゼ阻害剤のような物質の同定および特性解析のための方法の使用［とくにこの方法はＨＴＳ（高スループットスクリーニング）に使用できる。たとえばアルツハイマー病の治療および／またはその予防的処置のために使用できる物質の同定が可能である］、
５．アルツハイマー病に関連しての、たとえば突然変異ＡＰＰまたはＣ１００の検討、
６．記載された融合タンパク質／導入遺伝子の検討（たとえば、ＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６中のＣ１００は全ＡＰＰおよびγ−セクレターゼによって置換が可能であり、その活性および調節は同様にこれらの方法の補助によって検討が可能である）
に使用することができる。
【００４０】
【実施例】
実施例１：
発現プラスミドＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６の構築
このプラスミドは、ＡＰＰのＣ−末端１００アミノ酸残基（Ｃ１００）に融合するＡＰＰシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする。Ｃ１００はＡβ−ペプチドのＮ−末端に始まり、ＡＰＰのＣ−末端に終わる。さらにそれはＡβ−ペプチドを放出するためにはγ−セクレターゼで切断されねばならない。
【００４１】
Ｇａｌ４−ＶＰ１６はＳＰ−Ｃ１００のＣ−末端に融合した。Ｇａｌ４−ＶＰ１６は酵母の転写アクティベーターＧａｌ４の最初の１４７アミノ酸残基とＶＰ１６の７８Ｃ−末端アミノ酸残基、ヘルペス単純ウイルスからの転写アクティベーターから構成される。融合タンパク質としてＧａｌ４フラグメントはＤＮＡの結合機能を引き継ぎ、一方ＶＰ１６フラグメントは転写を活性化する（Sadowskiら, 1988, Science, 335, 563）。ｐｃＤＮＡ３.１＋（Invitrogen, Netherlands）はベクタープラスミドとして働く。
【００４２】
実施例２：
レポータープラスミドｐＧＬ２ ＭＲＧ５ ＥＧＦＰの構築
レポータープラスミドｐＧＬ２ ＭＲＧ５はＨＩＶ−ＴＡＴＡボックスの前に５つのＧａｌ４結合部位を有する。細胞培養液中での簡単な検出には、ルシフェラーゼの遺伝子を、ベクターｐＥＧＦＰ Ｎ１（Clontech, Heidelberg）からＥＧＦＰ（促進グリーン蛍光蛋白質）の遺伝子に交換した。
【００４３】
実施例３：
ヒト神経芽細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）を両プラスミドでコトランスフェクトし、ついでＥＧＦＰを励起させる波長４８０nmの光を照射しながら顕微鏡下に解析した。一部の例では、強い緑色を発光する細胞を検出することができた。
【００４４】
この効果は特異的な活性化はなくレポータープラスミドによるＥＧＦＰの発現にも基づき、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はレポータープラスミドによってのみトランスフェクトされた。これらの細胞では、緑色の蛍光は検出できなかった。したがって、発現はＡＰＰ−Ｃ末端の蛋白分解的放出が予測されるＧａｌ４−ＶＰ１６によって活性化されねばならない。今日まで、γ−セクレターゼのほかにＡＰＰを膜貫通ドメイン内もしくは細胞質部分で蛋白分解的にプロセッシングする他の蛋白分解活性は報告されていない。したがって、Ｇａｌ４−ＶＰ１６に融合したＡＰＰ−Ｃ末端の放出はγ−セクレターゼの活性に基づくものと考えられる。
【００４５】
実施例４：
ｃＤＮＡバンク中のγ−セクレターゼ活性をコードするｃＤＮＡの検出のためのＣ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６の使用
ＳＰＣ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６を、ＭＥＴ２５プロモーターの制御下に酵母発現ベクターｐＤＢＴＲＰ（Life Technologies, Rockville, MD, U.S.A.）にクローン化し、これらの構築体を用いて酵母株ＭａＶ２０３（Life Technologies）をトランスフォームした。酵母株ＭａＶ２０３は遺伝子的に修飾され、３つのＧａｌ４−誘導性レポーター遺伝子（ＵＲＡ３，ＨＩＳ３，ＬａｃＺ）を含有し、これらは安定にゲノム中にインテグレートされた。ＭａＶ２０３中ＳＰＣ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６ ｃＤＮＡの発現はレポーターのわずかな活性のみを与え、このシステムはｃＤＮＡバンク中のγ−セクレターゼの検索に適している。
【００４６】
実施例５：
たとえばγ−セクレターゼの同定またはヒトＢ細胞ｃＤＮＡバンク（American Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A）のスクリーニングのために実施例４からの組換えＭａＶ２０３細胞を使用することができる。同様に、酵母発現ベクターｐ４１５−ＭＥＴ２５（ATCC, Nucleic Acid Research, 1994, Vol. 22, No. 25, 5767）またはｐ４１５−ＡＤＨ１（ATCC, Gene, 1995, 158: 119-122）中にインテグレートしたヒト海馬ｃＤＮＡバンクも、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼ活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用することができた。
【００４７】
引用文献
− Estusら, 1992, Science 255, 726。
− Haassら、 1992, Nature 359, 322。
− Hilbichら、1991, J.Mol. Biol. 218, 149。
− Kangら、1987, Nature 325, 733。
− Maruyamaら、1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 202, 1517。
− Rumbleら、1989, N.Engl. J.Med. 320, 1446。
− Sadowskiら、1988, Nature 335, 563。
− Scheunerら、1996, Nature Medicine 2, 864。
− Simonsら、1996, Neurosci. 1; 16(3): 899-908。
− Suzukiら、Science 1994 May 27; 264(5163): 1336-40。
− Yanknerら、1990, Proc Natl Acad Sci USA 87, 9020。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はアミロイド前駆体タンパク質（アイソフォームＡＰＰ６９５およびアイソフォームＡＰＰ７７０または７５１）およびセクレターゼ切断生成物を示す。
【図２】  本発明の方法が基盤とする原理を模式的に示す。Ｎ−末端にけるβ−セクレターゼ切断部位、膜貫通ドメインにおけるγ−セクレターゼ切断部位、Ｃ１００＝ＡＰＰのＣ１００フラグメント、Ｇａｌ４−ＶＰ１６＝ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン（ＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクティベーターからなる）、これはレポータープラスミドのＤＮＡ上のタンパク質結合ドメインに結合する。
【図３】  発現プラスミドＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６の構築。
ａａ＝アミノ酸；制限切断部位SacＩ、Hind IIIおよびKpnＩはプラスミド上の切断部位の位置を指示する。
【図４】  発現プラスミドｐＤＢＴＲＰ−ＭＥＴ２５−ＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６。
酵母における導入遺伝子の発現のための発現プラスミドの構築。
【配列表】
0004594529.tif 000002
0004594529.tif 000003
0004594529.tif 000004
0004594529.tif 000005
0004594529.tif 000006
0004594529.tif 000007
0004594529.tif 000008
0004594529.tif 000009
0004594529.tif 000010
【図１】
0004594529.tif 000011
【図２】
0004594529.tif 000012
【図３】
0004594529.tif 000013
【図４】
0004594529.tif 000014