(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
0004452329.tif 000012
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同じ又は異なり、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基を表す］の化合物の製造方法において、式ＩＩ：
0004452329.tif 000013
［式中、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記したものを表す］の化合物を、式ＩＩＩ：
Ｒ1−ＣＨ（ＮＨＺ）−ＣＯＯＨ          ＩＩＩ
［式中、Ｒ1は前記したものを表し、Ｚはベンジルオキシカルボニル保護基を表し、その際フェニル環は置換されていることができる］のアミノ酸を用いて縮合させ、前記保護基を除去し、得られた化合物をＮＨ2基の箇所で２箇所メチル化することを特徴とする式Ｉの化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規のテトラペプチド、その製造及び使用に関する。
ドラスタチン１５（Dolastatin 15）は、米国特許（ＵＳ−ＰＳ）第４８７９２７８号明細書に記載された次の式を有する物質である。
0004452329.tif 000002
ドラスタチン１５は多様な腫瘍に対するその高い有効性により重要である。著しく入手困難なダンゴウオ（Seehasen;lumpfish）からのその単離は、複雑で時間がかかり、その方法は、中程度の収率で再現性の乏しい品質で作用物質を供給する。動物試験のためのグラム単位の作用物質を得るために、ペティット（Pettit et al.,J.Am.Chem.Soc.113［1991］6692-6693）により合成方法が開発された。中心の中間体はこの場合、式Ｉａのテトラペプチドである
0004452329.tif 000003
ＷＯ９３／２３４２４には、その作用においてドラスタチン１５を上回る抗腫瘍性作用が記載されている。ＷＯ９３／２３４２４からの多数の作用物質は、式Ｉ：
0004452329.tif 000004
［式中、Ｒ1〜Ｒ4はＣ1〜Ｃ6アルキル基を表す］のテトラペプチドから製造される。
ＷＯ９３／２３４２４のペプチド及びドラスタチン１５の臨床試験のために十分な物質量を提供するために、テトラペプチドＩの工業的に実現可能な製造方法を見出さなければならなかった。
ＷＯ９３／２３４２４中に記載された固相合成は、比較的大量の生成物量の製造には適当でない。この合成は精製されていない生成物を提供し、これは煩雑なクロマトグラフィーにより精製しなければならない。
ペティット（Pettit et al.,J.Am.Chem.Soc.113［1991］6692-6693）はＩａに対する巧妙な実験室合成を記載している。この場合、トリペプチドＶａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅを式：
0004452329.tif 000005
（省略表記：Ｍｅ2Ｖａｌ−ＯＰｆｐ）と反応させて、テトラペプチドＩａにする。
Ｍｅ2Ｖａｌ−ＯＰｆｐの合成は、ペティット（Pettit et al.）（ＵＳ−ＰＳ４９７８７４４）により次のように行われる：
まず、バリンを窒素の箇所で２箇所メチル化する。こうして得られたジメチルバリンを縮合剤及びペンタフルオロフェノールと反応させなければならない。
0004452329.tif 000006
この方法は、多数の必要な反応工程により著しく煩雑である。さらに、ペンタフルオロフェノールは著しく高価な試薬であり、これはこの合成方法にとって十分な量で提供されない。さらに、この使用はフッ素含有の廃棄物を生じ、これは困難で、ジオキシン形成下で処理することができるにすぎない。
この合成の際の縮合剤の使用もまた同様に問題がある。ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いた処理は感作及び最も重いアレルギー反応を引き起こすことがあることは公知である。このバッチの後処理の際に、相応する尿素が生じ、これは煩雑でしばしば完全には生成物から除去できない。Ｎ−エチル−Ｎ′−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドのような水溶性の尿素に反応するカルボジイミドは、極端に費用がかかり、かつ工業的量で供給できない。
ペンタフルオロフェノール／カルボジイミドをペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート又はそのカーボネート、例えばペンタフルオロフェニル−１，２，２，２−テトラクロロエチルカーボネートで代用する（J.Org.Chem.52［1987］2364）ことも利点がない。
活性エステル形成及びペプチド結合の際に、ラセミ化が生じ、これはこの方法の場合大きな問題となる（J.Jones:The Chemical Synthesis of Peptides,Oxford 1991,S.57参照）。
カプリング試薬としてジエチルホスホリルシアニド（ＤＥＰＣ）を用いるジメチルバリンを他のアミノ酸と結合させる他の刊行物に記載された方法（T.Shioiri et al.:Tetrahedron 49［1993］1913-1924）も同様に重大な欠点を有する：ＤＥＰＣは著しく高価であり、大量に入手できず、腐食性で著しく毒性である。シアニド含有の母液及び洗浄液を特殊廃棄物として処理しなければならない。
本発明は、大量に入手可能な中間体から出発し、ラセミ化を起こさず、環境汚染なしで実施可能なテトラペプチドＩの製造方法に関する。
本発明の対象は、式Ｉ：
0004452329.tif 000007
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同じ又は異なり、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基を表す］の化合物を製造する方法において、式ＩＩ：
0004452329.tif 000008
［式中、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は上記のものを表す］の化合物を、
式ＩＩＩ：
Ｒ1−ＣＨ（ＮＨＺ）−ＣＯＯＨ      ＩＩＩ
［式中、Ｒ1は上記のものを表し、Ｚはベンジルオキシカルボニル保護基を表し、そのフェニル環は置換されていることができる］のアミノ酸を用いて縮合され、得られた化合物をＮＨ2基の箇所で２箇所メチル化することを特徴とする。
式Ｉ中で、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同じ又は異なり、有利に、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、ｓ−ブチル基、２−メチル−ｎ−ブチ−１−イル基又は３−メチル−ｎ−ブチ−１−イル基である。Ｒ4は有利にメチル基又はエチル基である。
テトラペプチド中のアミノ基は、有利にＬ−配置を有する。
式ＩＩとＩＩＩとのカプリング反応は、例えば混合無水物法（mixed anhydride method）を用いて実施することができる（Houben-Weyl,Bd.XV/2,1974;J.Am.Chem.Soc.74［1952］676;Coll.Czechoslov.Chem.Comm.27［1962］1273参照）。カプリング試薬として使用されたカルボン酸クロリド（有利に、ピバル酸クロリド
0004452329.tif 000009
２−エチル酪酸クロリド、イソ吉草酸クロリド）又はクロロギ酸エステル（有利に、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、イソブチルエステル、フェニルエステル、クロロエチルエステル及びトリクロロメチルエステルが使用される）は、有利な工業的量で入手可能な試薬であり、これは工業的規模で合成のために適している。本発明によるカプリングはラセミ化なしに進行するために特に有利である。
溶剤として、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチルエステル、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、トルエン、Ｎ−メチルピロリドン及びこれらの混合物が適している。塩化メチレン、トルエンもしくはこの混合物が有利である。塩基として、この反応に対して特に、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、ジイソプロピルエチルアミン及びＮ−メチルモルホリンが適しており、トリエチルアミン及びＮ−メチルモルホリンが有利である。
この反応は、−４０℃〜＋３０℃の間の温度で実施され、この温度範囲は−１５℃〜＋１５℃が有利である。
本発明の対象は、さらに、Ｒ4がメチル基を表す場合に、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同時にイソプロピル基ではない式Ｉの化合物並びにその多様な酸との塩である。
酸としては、例えば次のものが挙げられる：塩酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、硫酸、安息香酸及びシュウ酸。
式Ｉの化合物は、ドラスタチン１５及び高い抗腫瘍性の作用により優れているＷＯ９３／２３４２４に記載された多数の化合物（例２１４〜２４６及び他参照）の製造のために特に適当である。
式Ｉの化合物は、同様に充実性腫瘍（肺、胸、腸、膀胱、直腸、子宮、前立腺の腫瘍）に対して、白血病、リンパ腫及び他の腫瘍性疾患に対して有効である。
アミノ酸の省略のために、通常の三文字記号を使用する。Ｍｅ2ＶａｌはＮ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリン、ＭｅＶａｌはＮ−メチル−バリン、Ｍｅはメチル、ｔｅｒｔ．Ｌｅｕはｔ−ロイシン（ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ2）−Ｃ（ＣＨ3）3）、Ｍｅ2ｔｅｒｔ．ＬｅｕはＮ，Ｎ−ジメチル−ｔ−ロイシン及びＭｅ  ｔｅｒｔ．Ｂｕ  ＡｌａはＮ−メチル−ｔ−ブチル−アラニン（ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨＣＨ3）−ＣＨ2−Ｃ（ＣＨ3）3）、Ｈｙｐは４−ヒドロキシプロリン、Ｂｕはｎ−ブチル、ｔＢｕはｔ−ブチル、Ｈｘはｎ−ヘキシル及びＥｔはエチルを表す。
実施例
例１
Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅの製造
４００ｌの容器中で、Ｚ−バリン１７．８４ｋｇ（７０．８８ｍｏｌ）及びトリエチルアミン４．５９ｋｇ（７４．４２ｍｏｌ）を、塩化メチレン１７０ｌ中に溶かした。この溶液に、−５〜−１０℃で、ピバル酸クロリド８．５８ｋｇ（７０．８８ｍｏｌ）を添加した。−５℃で２ｈの反応時間の後、−５℃でＶａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ２４．２ｋｇの塩化メチレン８６ｌ中の溶液を供給した。さらに−５℃で２ｈの後に２０℃に加熱し、この温度で１２ｈ撹拌した。後処理のために水５０ｌを添加した。水相の分離の後に、有機相を１回２Ｎ塩酸４０ｌで、及び２Ｎ苛性ソーダ液４０ｌでそれぞれ２回抽出した。有機相を中性洗浄したあと、溶剤の塩化メチレンを留去し、ジイソプロピルエーテル３００ｌに置き換えた。油状の生成物のエマルションを、生成物の結晶化のために６０℃に温め、種結晶を添加し、６０℃で７ｈ保持した。結晶化を完了させるために、連続して５０℃で５ｈ、及び４０℃で５ｈさらに撹拌し、引き続き２０℃に冷却した。結晶懸濁液を１２０ｌの圧力濾過器を介して分離した。
収量：３２．２ｋｇ≒理論値の７９％
含有量：９８．５％（ＨＰＬＣ−面積％）
融点：１３４〜１３５℃
例２
Ｍｅ2Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ×ＨＣｌの製造
４００ｌの水素化容器中で、Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ２０ｋｇ（３４．８ｍｏｌ）を、メタノール２００ｌ中の５％のパラジウム炭素２ｋｇと一緒に装填した。引き続き、２０℃で冷却しながら、反応溶液中に出発材料がもはや検出されなくなるまで水素を導入した。引き続き、３７％のホルマリン溶液８．４６ｋｇ（１０４ｍｏｌ）を添加し、水素の吸収が終わるまで２０℃でさらに水素化した。触媒を容器内容物の取り出しの際に濾別した。後処理のために、４００ｌのほうろうの容器中で水流ポンプ真空中で５０ｌにまで濃縮した。その後、イソプロパノール２００ｌを添加し、新たに５０ｌにまで濃縮した。引き続き、メチル−ｔ−ブチルエーテル１３５ｌ中に溶かし、２０℃に冷却しながら１当量のイソプロパノール性のＨＣｌを添加した。生じた懸濁液を、なお２０℃で３〜４ｈ、及び０〜５℃で２ｈさらに撹拌し、次いで１２０ｌの圧力濾過器を介して濾過した。このフィルターケークを、新しいメチル−ｔ−ブチルエーテル５０ｌで１回洗浄した。
収量：１６．２≒理論値の９２．３％
含有量：９９．９％（ＨＰＬＣ−面積％）
融点：２２４℃（分解）
例３
最初の水素化段階の後、次のように後処理した場合、中間体のＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅを同様に単離することができた。
反応溶液から触媒を分離し、濃縮した。残留物を酢酸エステル中に収容した。酢酸エステル溶液を２Ｎ塩酸で２回抽出した。酸性の水相を苛性ソーダ液でｐＨ９に調節し、塩化メチレンで２回抽出した。塩化メチレン相を引き続き中性に洗浄し、蒸発させた。
ＨＰＬＣ    ９６．８％
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＴＭＳｉｎｔ．）：
δ（ｐｐｍ）：０．８４−１．０８（ｍ，１８Ｈ）；１．４５−１．６（ｓ，広幅，ＮＨ2）；１．８５−２．１５（ｍ，４Ｈ）；２．１８−２．３８（ｍ，３Ｈ）；３．１５（ｓ，Ｎ−ＣＨ3）；３．２５（ｄ，１Ｈ）；３．６５−３．７５（ｍ，１Ｈ）；３．７３（ｓ，Ｏ−ＣＨ3）；３．９−４．０５（ｍ，１Ｈ）；４．３８−４．４５（ｍ，１Ｈ）；４．７３−４．８３（ｍ，１Ｈ）；５．１２（ｄ，１Ｈ）；７．９（ｄ，ＮＨ）
例４
Ｍｅ2Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ×ＨＣｌの製造は、次の製造方法に従って行われ、その際、中間体のＺ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅの単離及び精製は行わなかった：
４ｌのフラスコ中でＺ−バリン１２８ｇ（０．５１ｍｏｌ）（含有量：９９．８％）及びトリエチルアミン５５．１ｇ（０．５４ｍｏｌ）（含有量：９９％）を塩化メチレン１．２ｌ中に溶かした。この溶液に、−５℃〜−１０℃でピバル酸クロリド６２．１ｇ（０．５１ｍｏｌ）（含有量：９９％）を添加した。−５℃で２ｈの反応時間の後、Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ１７４．６ｇ（０．５１ｍｏｌ）の塩化メチレン０．８ｌ中の溶液に供給し、−５℃で２ｈさらに撹拌し、２０℃に加熱しながらさらに１２ｈ撹拌した。その後、このバッチに水３７０ｍｌを添加した。相分離の後、塩化メチレン相を２Ｎ塩酸２９０ｍｌで１回、２Ｎ苛性ソーダ液２９０ｍｌでそれぞれ２回及び水３７０ｍｌで３回洗浄した。引き続き、塩化メチレンを蒸発させ、メタノール３ｌで置き換えた。この溶液に、水１１０ｍｌ中の５％のパラジウム炭素３０ｇの懸濁液を添加し、２５℃でガス供給撹拌機及び水素ビュレットを用いて、１当量の水素が吸収されるまで水素化した。その後、３７％のホルマリン溶液１２３ｇ（１．５３ｍｏｌ）を添加し、さらに水素２当量が吸収されるまで水素化した。その後、触媒を分離し、回転蒸発器で蒸発させた。残留した油状物を、イソプロパノール６７０ｍｌ及びメチル−ｔ−ブチルエーテル２．６ｌに溶かした。この溶液に、１当量のイソプロパノール性のＨＣｌを添加した。生じた懸濁液に２０℃で１２ｈさらに撹拌し、次いで吸引濾過した。フィルターケークを新たなメチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄し、引き続き真空中で４０℃で乾燥させた。
収量：１８２．８ｇ≒理論値の７１％
含有量：９９．４％（ＨＰＬＣ−面積％）
融点：２２４℃（分解）
例１〜４と同様にして次のものが製造された：
0004452329.tif 000010
使用例
Ｍｅ2Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＮＨＢｚｌ×ＨＣｌの製造
４００ｌの容器中でＭｅ2−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＶａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ×ＨＣｌ  １５．９ｋｇ（３１．５ｍｏｌ）を、トルエン１４０ｌ及びメタノール１５ｌと一緒に装填した。さらに、水酸化ナトリウムペレット３．１５ｋｇ（７６．３８ｍｏｌ）を添加した。完全に鹸化した後、つまり２０℃で約３ｈの後、イソプロパノール性のＨＣｌの添加により中和した。引き続き、トルエンとの共沸で１００ｍｂａｒでアルコール不含及び水不含になるまで蒸留した。留去した溶剤の容量を引き続きトルエンに置き換えた。引き続き、塩化メチレン８０ｌ及びトリエチルアミン６．４４ｋｇ（６３．０ｍｏｌ）を添加し、−５℃にまで冷却し、この温度でピバル酸クロリド３．８４ｋｇ（３１．５ｍｏｌ）を添加した。２ｈの反応時間の後、−５℃〜０℃で、Ｐｒｏ−ＮＨＢｚｌ×ＨＣｌ  ７．６ｋｇ（３１．５ｍｏｌ）を少しずつ添加した。−５℃で２ｈの後に、２０℃にまで温め、さらになお６ｈ反応させた。引き続き、５００ｍｂａｒで添加された塩化メチレンを留去し、トルエン８０ｌを添加した。その後、水５０ｌを添加し、水相のｐＨ値をｐＨ９に調節した。強力に撹拌した後、水相を分離し、有機相を水２５ｌで１回後洗浄した。引き続き、有機相を２Ｎ塩酸５０ｌでそれぞれ２回抽出した。生成物は酸性の水相から、ｐＨ９に調節した後、塩化メチレン５０ｌでそれぞれ３回抽出することにより逆抽出した。塩化メチレン相を中性洗浄した後、塩化メチレンを留去し、メチルエチルケトン１８０ｌにより置き換えた。この溶液を４０℃にまで加熱し、１当量（３１．５ｍｏｌ）のイソプロパノール性ＨＣｌを添加した。生じた懸濁液を、６０℃に加熱し、引き続き１２ｈ撹拌した。引き続き２０℃に冷却し、さらに５ｈ撹拌した。その後、５℃にまで冷却し、１２０ｌで圧力濾過器で濾過した。フィルターケークを新鮮な５℃に冷却したメチルエチルケトン６０ｌで洗浄した。濾過器で前乾燥した後、生成物を４０℃で真空中で一定重量になるまで乾燥させた。
収量：１４．３６ｋｇ≒理論値の６７％
含有量：９９．６％（ＨＰＬＣ−面積％）
融点：２１４℃（分解）
使用例と同様に次のものを製造した：
0004452329.tif 000011