(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 1に規定される残基1〜40からなるβ-アミロイドタンパク質をヘパランサルフェートと共に、in vitroで30〜45℃にて少なくとも3〜7日間、コ-インキュベーションすることを含み、ここでβ-アミロイドタンパク質対ヘパランサルフェートの重量比が1：8から1：100の範囲である、コンゴレッドで染色され偏光の下で見たときにマルタ十字形パターンをそして透過電子顕微鏡で見たときに「アミロイドスター」の外観を示す球形あるいは緻密な形状のアミロイドプラークをin vitroで形成する方法。
【請求項２】
β-アミロイドタンパク質のヘパランサルフェートとのコ-インキュベーションが、蒸留水あるいはトリス緩衝生理食塩水（pH7.0〜7.4）中で行われる、請求項1の方法。
【請求項３】
β-アミロイドタンパク質対ヘパランサルフェートの重量比が1：8あるいは1：16である、請求項1または2の方法。
【請求項４】
コ-インキュベーションの工程が、7日の期間である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
β-アミロイドタンパク質のヘパランサルフェートとのコ-インキュベーションの工程が37℃で行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
a）アミロイドタンパク質あるいは硫酸化高分子を標識すること、
b）請求項1に記載の方法により、標識されたアミロイドタンパク質からin vitroでアミロイドプラークを予め形成すること、
c）既知量の潜在的プラーク治療薬を所定の時間添加すること、
d）アミロイドプラークの破壊あるいは崩壊を検出すること、
を含む、抗アミロイドプラーク治療薬の同定方法。
【請求項７】
アミロイドタンパク質あるいは硫酸化高分子の標識が、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、および抗原標識からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
シンチレーションカウンター、ガンマカウンター、セルソーター、分光光度計、蛍光光度計および比濁計からなる群から選択される検出システムをさらに含む、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
アミロイドプラーク沈着あるいは残存を阻害あるいは崩壊するための候補治療薬を選択するためのin vivoアッセイであって：
a）請求項1に記載の方法により、in vitroでコンゴ好染性マルタ十字形アミロイドプラークを予め形成すること、
b）第一のカニューレと浸透ポンプを用いて、予め形成したコンゴ好染性マルタ十字形アミロイドプラークを、非ヒト動物の組織あるいは器官の中に選択された時間の間連続的に注入すること、
c）第一のカニューレと浸透ポンプを第二のカニューレと浸透ポンプに取り替えて、候補治療薬を投与すること、そして
d）候補治療薬が持つ、前記非ヒト動物の組織あるいは器官中のコンゴ好染性マルタ十字形アミロイドプラークの沈着／存続を崩壊、減少あるいは消失させる能力を検出すること、
を含む、前記in vivoアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
発明は、特定のアミロイドプラークの形成、及びアルツハイマー病及びプリオン病の治療におけるそのようなプラークの診断的及び治療的適用に関する。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病は、βアミロイドタンパク質又はＡβと呼ばれる３９〜４８個のアミノ酸ペプチドが線維状の形態で、細胞外アミロイドプラークとして、及び脳血管壁におけるアミロイドとして蓄積することを特徴とする。アルツハイマー病における線維性Ａβアミロイドの沈着は、患者には有害であり、最終的には毒性となり、アルツハイマー病の顕著な特徴である神経細胞の死を招くと考えられている。多様な、形態的に異なったタイプのＡβ含有プラークがアルツハイマー病患者の脳で認められ、その中には、拡散型プラーク（Ａβの免疫反応性はあるが、ゴンゴレッドやチオフラビンＳのようなアミロイド染色を用いた線維性アミロイドについては染色されない）、神経性プラーク（コンゴレッド及びチオフラビンＳで染色される中心アミロイドコアを含有し、栄養障害性の神経炎に取り囲まれる）、及び緻密性の、薬が効かなくなった、又は「アミロイドスター」プラーク（コンゴレッドで染色し、偏光で観察したとき、通常マルタ十字形のパターンを示す）が包含される。研究者達は、アルツハイマー病では、拡散型プラークが神経性プラークへ、更に緻密性の薬が効かなくなったプラークへと変換していく可能性があるという仮説を立ててきた。しかしながら、この変換のメカニズム及び関与する必須の成分については解明されていない。さらに、コンゴレッドで染色し、偏光下で観察したとき、マルタ十字形パターンを示すようなｉｎ  ｖｉｔｒｏでの緻密性プラークの形成は未だ達成されていない。
【０００３】
発明の開示
本発明は、ヒトアルツハイマー病の脳に存在するコンゴ好染性マルタ十字形緻密性プラークと事実上同一であるｉｎ  ｖｉｔｒｏコンゴ好染性マルタ十字形球状アミロイドプラーク（すなわち、「緻密性プラーク」又は「アミロイドスター」）を形成するのに必要なメカニズムや本質的な成分の発見、及び抗プラーク療法を同定するための数多くの様々なアッセイ技術及び動物モデルに利用するためにそのようなアルツハイマープラークを一貫して形成する記載された方法に関する。緻密性アミロイドプラークは、本明細書に記載されている様に、Ａβ：硫酸化プロテオグリカン／ＧＡＧ類のモル／重量比が適切な条件下で、３７(Ｃにて３〜５日間培養したとき、βアミロイドタンパク質（Ａβ）（１〜４２残基ではなく１〜４０残基）とパールカン、その他に高度に硫酸化されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ類）（すなわち、ペパラン硫酸及びヘパリン）又は関連した硫酸化高分子（すなわち、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸、及びポリビニルスルホン酸）との共培養ののち形成された。Ａβ１−４０又は１−４２のみを１週間インキュベート（３７(Ｃ）した後、又はＡβ１−４０又は１−４２を、Ｐ成分、アルファ1抗キモトリプシン、Ａｐｏ−Ｅ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、ラミニン、フィブロネクチン又はＩＶ型コラーゲンを含むヒトアルツハイマー病の脳に存在するその他の既知のアミロイドプラーク成分と共に同一の条件下で１週間インキュベートした場合、そのような緻密性コンゴ好染性マルタ十字形アミロイドプラークは形成されなかった。Ａβ１−４０とパールカン、その他の高度に硫酸化されたＧＡＧ類又は関連した硫酸化高分子とのコ−インキュベーションによって形成される１０〜４０μｍのアミロイドプラーク（平均直径＝２５μｍ）は、以下を含むヒトアルツハイマー病の脳に存在する緻密性アミロイドプラークのあらゆる特徴を有する：１）コンゴレッドで染色し、偏光下で観察したとき、マルタ十字形パターンを示すアミロイドプラーク、２）透過型電子顕微鏡で観察したとき、プラークの中央から発していると思われるアミロイド線維（それぞれに７〜１０ｎｍの線維直径）の放射状の束を伴った球状「アミロイド・スター」の形態、及び３）走査電子顕微鏡で観察した場合、アルツハイマー病の脳に由来する単離されたアミロイドコアに、表面の形態及び球状の形状において似ているアミロイドプラーク。本発明はさらに、アルツハイマー病抗プラーク療法を同定するためのスクリーニングツールとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される、そのようなアミロイドプラークの利用に関する。
【０００４】
発明の概要
本発明は、コンゴ好染性マルタ十字形アミロイドプラーク（すなわち、「緻密性プラーク」又は「アミロイド・スター」プラーク）のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける形成のメカニズム及び関与する必須成分を決定し、アルツハイマー病の治療について抗プラーク療法を発見するためにこの技術を使用するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特有の方法論及び動物モデルの方法論を記載する。パールカン（アルツハイマー病のアミロイドーシスに関係すると見なされる具体的なヘパラン硫酸プロテオグリカン）、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカン類（ＧＡＧ類）（すなわち、ヘパリン及びヘパラン硫酸）、及び関連する硫酸化ＧＡＧ高分子（すなわち、デキストラン硫酸、ペントサン硫酸、ポリビニルスルホン酸）は、すべてｉｎ  ｖｉｔｒｏでベータアミロイドタンパク質（Ａβ）（１〜４０残基）がアミロイドプラーク沈着物（構成成分の適切な混合及び濃度とともに、３７℃で３〜５日間）に変化することを誘導することが見い出され、これらは事実上ヒトアルツハイマー病の脳に存在するコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークと同一である。その他の必須成分（上述）に対するＡβ（１〜４０）のモル比及び／又は重量比はアミロイドプラーク形成に重要である。アルツハイマー病プラークに存在するとして、又はアルツハイマー病アミロイドーシスに関係があるとして知られている、Ｐ成分、アルファ1−抗キモトリプシン、ＡｐｏＥ、Ｃｌｑ、Ｃ３、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン及びパールカンを含む種々の共通成分について、その緻密性アミロイドプラークの形成誘導能を調べた。成分をベータアミロイドタンパク質（Ａβ）１〜４０及び１〜４２と共に３７℃にて長期間（１週間まで）インキュベートした。アルツハイマー病の脳に認められる緻密性コンゴ好染性マルタ十字形の「アミロイドスター」プラークの形成を倍加するという目的で、様々な条件（すなわち、濃度、モル／重量比、インキュベート時間）を試した。本明細書で開示するように、適切な条件下では、パールカン（上で示すような他のプラーク成分ではなく）は、Ａβ１〜４０を誘導して、コンゴ好染性マルタ十字形の球状アミロイド「スター」プラークを形成することができた。ヘパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸及びデルマタン硫酸を含む、様々なＧＡＧ類及び関連する高分子を調べることにより、適切な条件下ではヘパリン／ヘパラン硫酸ＧＡＧ類も効果的なアミロイドプラーク誘発剤（すなわち、コンゴ好染性マルタ十字形および緻密性アミロイドプラーク）でもあることが示された。同様のアミロイドプラーク誘発は、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸及びポリビニルスルホン酸を含むその他の高度に硫酸化された高分子でも達成されたが、Ａβ：硫酸化高分子の適切なモル比／重量比が定められた後のみであった。Ａβ１〜４０を用いた、パールカン、高度に硫酸化されたＧＡＧ類及び関連する硫酸化高分子による緻密性アミロイドプラーク形成の誘導は、同一条件下でＡβ１〜４２を用いた場合には起きなかった。この後者の知見は、ヒトアルツハイマー病の脳では緻密性アミロイドプラークの形成は、Ａβ１〜４２のカルボキシル末端における２つの疎水���残基が切断されるまで起きそうにないことを示唆している。さらに、試験によって、ヘパリンから硫酸を部分的に又は完全に除去すると緻密性アミロイドプラークの形成が完全に消失することから、緻密性アミロイドプラークの誘導には、ＧＡＧ類又は関連する硫酸化高分子の硫酸残基が重要であることが示された。透過型電子顕微鏡及び走査電子顕微鏡によれば、パールカン、高度に硫酸化されたＧＡＧ類又は高度に硫酸化されたＧＡＧ関連の高分子をＡβ（１〜４０）と共にインキュベートすることにより形成されるアミロイドプラークは、ヒトアルツハイマー病の脳から単離されたアミロイドプラークコアと事実上同一の特徴及び形態を有することが示された。このような知見は、アルツハイマー病の脳に認められるコンゴ好染性マルタ十字形及び緻密性アミロイドプラークは、パールカン及び／又は高度に硫酸化されたＰＧ類／ＧＡＧ類がＡβ１〜４０と共に長い時間をかけて共沈着し、共蓄積することによって形成されるらしいことを示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて一貫してアミロイドプラークを形成する必要条件を理解することは、アルツハイマー病の治療について抗アミロイドプラーク療法を同定するための新しいスクリーニング技術を考慮することになる。
【０００５】
発明の特徴
本発明の第１の目的は、ヒトアルツハイマー病の脳における緻密性アミロイドプラークと類似した特徴を有する緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて形成する方法を提供することである。これらのプラークのそのような特徴には、ａ）球状又は緻密性の形状、ｂ）コンゴレッドで染色し、偏光下で観察したときのコンゴ好染性のマルタ十字形パターン（すなわち、プラークの緑色に対して９０度における赤色プラーク）、ｃ）蛍光顕微鏡で観察したとき、チオフラビンＳによる染色が陽性、ｄ）透過型電子顕微鏡で観察したとき、球状及び／又は「アミロイドスター」の外観、及び／又は、ｅ）走査電子顕微鏡で観察したとき、球状又は緻密性の形状（直径１０〜４０μｍのプラークを伴う）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００６】
本発明のもう１つの目的は、Ａβ及び硫酸化プロテオグリカン類（ＰＧ類）又はそれらの一部を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてコンゴ好染性マルタ十字形の緻密性アミロイドプラークを形成する方法を提供することである。そのような硫酸化ＰＧ類には、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はケラタン硫酸類のグリコサミノグリカン類（ＧＡＧ類）を含有するＰＧ類が挙げられるが、これに限定されるものではない。このようなＰＧ類にはパールカン、約２２０ｋＤａのＨＳＰＧ（本明細書に記載されている）、グリピカン、セレブログリカン、アグレカン、シナプトグリカン（ＳＶ２ＰＧ）、シンデカン、Ｎ−シンデカン（すなわちシンデカン−３）、シンデカン−１、シンデカン−４、ニューロカン、ホスファカン、デコリン、ビグリカン、ベルシカン、アンフィグリカン、ルミカン、ＰＧ−Ｍ、ＰＧ−Ｍ（３）、アグリン、ベータグリカン、クラウストリン、ブレビカン、アピカン、エピカン、及びニューログリカン−Ｃ、又はそれらの断片が挙げられるが、これに限定するものではない。
【０００７】
好ましい実施態様では、そのような緻密性アミロイドプラークの形成は、本明細書に記載される様な適切なＡβ：パールカンの重量比及び／又はモル比にて、蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中、３７℃で１週間、Ａβ１〜４０をパールカンと共にインキュベートすることによって達成される。好ましい実施態様では、１ｍｇのＡβ１〜４０を１ｍｌの二回蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解し、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成する。その後２５μｌのＡβ１〜４０ストック溶液を２０μｇの凍結乾燥したパールカン（Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２０：４３３−４４４，１９９６に記載されたようにＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍から単離）を含有する微量遠心管に加え、その後最終容量を２５０μｌまで増やし、３７℃にて１週間インキュベートする。この好ましい実施態様では、Ａβ：パールカンのモル比は２５０：１であり、そしてＡβ：パールカンの重量比は１：０．８である。他の好ましい実施態様では、２５μＭのＡβ１〜４０を蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中にて１２５ｎＭのパールカンと共にインキュベートするか、又は１２５μＭのＡβ１〜４０を蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中にて０．６２５μＭのパールカンと共にインキュベートする。これら後者２つの好ましい実施態様では、Ａβ：パールカンのモル比は２００：１であり、そしてＡβ：パールカンの重量比は１：１である。
【０００８】
緻密性アミロイドプラークの形成に好ましい実施態様では、Ａβ１〜４０をパールカン（パールカンの推定分子量８００，０００）と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートし、そのときのＡβ：パールカンのモル比は５０：１〜５００：１の範囲であり、その中にはＡβ：パールカンのモル比50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1, 155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1が包含されるが、好ましくは２００：１及び２５０：１である。
【０００９】
緻密性アミロイドプラークの形成に好ましい他の実施態様では、Ａβ１〜４０をパールカンと共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートし、そのときのＡβ：パールカンの重量比は１：０．４〜１：１００の範囲であり、その中にはＡβ：パールカンの重量比1:0.4, 1:0.5, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：１及び１：０．８である。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、Ａβ及びＧＡＧ類又はそれらの一部を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する方法を提供することである。そのようなＧＡＧ類には、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ケラタン硫酸及び／又はヒアルロン酸が挙げられるが、これに限定するものではない。好ましい実施態様では、そのような緻密性アミロイドプラークの形成は、本明細書に記載される様に適切なＡβ：ヘパリン／ヘパラン硫酸の重量比及び／又はモル比のもとで、３７℃にて１週間、Ａβ１〜４０をヘパリンと共に、又はＡβ１〜４０をヘパラン硫酸と共にインキュベートすることにより達成される。
【００１１】
好ましい実施態様ではコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークは、Ａβ１〜４０をヘパリンと共に利用して形成される。この好ましい実施態様では、２５μＭ又は１２５μＭのＡβ１〜４０がヘパリンと共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：ヘパリンのモル比は１：０．５〜１：１００であり、1:0.5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００１２】
もう１つの好ましい実施態様ではコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークは、Ａβ１〜４０を非抗凝固性ヘパリンと共に利用して形成される。この好ましい実施態様では、２５μＭ又は１２５μＭのＡβ１〜４０が、ヘパリン様分子である非抗凝固性ヘパリン又はその断片と共に、蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：非抗凝固性ヘパリンのモル比は１：０．５〜１：１００であり、1:0.5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００１３】
好ましい実施態様ではコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークは、Ａβ１〜４０をヘパラン硫酸と共に利用して形成される。この好ましい実施態様では、Ａβ１〜４０がヘパラン硫酸と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：ヘパラン硫酸の重量比は１：１〜１：１００であり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：８又は１：１６である。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、Ａβ及び硫酸化高分子又はその一部を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する方法を提供することである。そのような硫酸化高分子には、少なくとも１つ、しかし好ましくは２つより多く硫酸化部分を含有するいずれかの及びすべての化合物が挙げられる。そのような化合物には、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸、ポリビニルスルホン酸、コンゴレッド、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ（２−アシルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸−コ−アクリロニトリル）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸−コ−ステレン）、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ（ビニル硫酸）、ポリ（４スチレンスルホン酸ナトリウム）、ポリ（アクリル酸）のスルホン酸誘導体、ポリ（メチルアクリレート）のスルホン酸誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）のスルホン酸誘導体、ポリ（ビニルアルコール）のスルホン酸塩誘導体、スルホン化スクロース、スクロースオクタスルホン酸、５−デオキシ−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−アルファ−Ｄ−キシロフラノース−５−スルホン酸、エタンスルホン酸、スクロースオクタ硫酸、硫酸エチル、２−アミノエタン−１−オル硫酸、１，２−エテンジオールジ硫酸、１−プロパンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、１−プロパノール硫酸、１，２−エタンジオールジ硫酸、１，３−プロパンジオールジ硫酸、１，４−ブタンジオールジ硫酸、１，５−ペンタンジオールジ硫酸、１，４−ブタンジオールモノ硫酸、１，３−プロパンジスルホン酸、１，４−ブタンジオールジ硫酸、１，４−ブタンジスルホン酸、１，５−ペンタンジスルホン酸、タウリン、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸、２−アミノエタンスルホン酸、テトラヒドロチオフェン−１，１−ジオキシド−３，４−ジスルホン酸、４−ヒドロキシブタン−１−スルホン酸、１−ブタンスルホン酸、１−デカンスルホン酸、２−プロパンスルホン酸、３−ペンタンスルホン酸、４−ヘパンスルホン酸、１−デカンスルホン酸、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸硫酸、１，７−ジヒドロキシ−４−ヘプタンスルホン酸、２−［（４−ピリジニル）アミド］エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、テトラヒドロチオフェン−１，１−ジオキシド−３，４−ジスルホン酸、１，３−ベンゼンジスルホン酸、２，５−ジメトキシ−１，４−ベンゼンジスルホン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−１−ナフタレンスルホン酸、３、４−ジアミノ−１−ナフタレンスルホン酸、１，７−ジヒドロキシ−４−ヘプタンスルホン酸、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールジ硫酸、２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオールジ硫酸、１，３−シクロヘキサンジオールジ硫酸、２，３，４，３’，４’−スクロースペンタ硫酸、２−ヒドロキシエチルスルファミン酸硫酸、３−ヒドロキシプロピルスルファミン酸硫酸、１，３，５，７−ヘプタンテトラ硫酸、１，３，５，７，９−ノナンペンタ硫酸、２−アミノエタンスル��ン酸（タウリン）、システイン酸（３−スルホアラニン又はアルファ−アミノ−β−スルホプロピオン酸）、メチル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド、２，３−ジサルフェート、１，３−シクロヘキサンジオールジサルフェート、１，３，５−ヘプタントリオールトリサルフェート、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールトリサルフェート、２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオールトリサルフェート、１，３，５，７−ヘプタンテトラオールテトラサルフェート、１，３，５，７，９−ノナンペンタサルフェート、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールトリサルフェート、２−ベンジルオキシ−１、３−プロパンジオールジサルフェート、３−ヒドロキシプロピルスルファミン酸サルフェート、２，２’−イミノエタノールジサルフェート、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）スルファミン酸ジサルフェート、３−（ｎ−モルホリノ）プロパン硫酸、テトラヒドロチオフェン−１，１−ジオキシド−３，４−ジオールジ硫酸、メチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド２，３−ジサルフェート、２，３，４，３’，４’−スクロースペンタサルフェート、１，３：４，６−ジ−Ｏ−ベンジリデン−Ｄ−マンニトール２、５−ジサルフェート、Ｄ−マンニトール２，５−ジサルフェート、２，５−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−マンニトールテトラサルフェート、トレハロースオクタサルフェート・オクタナトリウム塩、スクロースオクタサルフェート・オクタナトリウム塩、メチル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド・テトラナトリウム塩、メチルβ−Ｄ−ラクトシドヘプタサルフェート・ヘプタナトリウム塩、エタンスルホン酸ナトリウム、１−プロパンスルホン酸ナトリウム、１−ペンタンスルホン酸・ナトリウム塩、及び薬理学上許容可能なそれらの塩が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００１５】
好ましい実施態様ではコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークは、Ａβ１〜４０をデキストラン硫酸と共に利用して形成される。この好ましい実施態様では、２５μＭ又は１２５μＭのＡβ１〜４０がデキストラン硫酸と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：デキストラン硫酸のモル比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００１６】
もう１つの好ましい実施態様ではコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークは、Ａβ１〜４０をペントサンポリ硫酸と共に利用して形成される。この好ましい実施態様では、２５μＭ又は１２５μＭのＡβ１〜４０がペントサンポリ硫酸と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：ペントサンポリ硫酸のモル比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, .1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００１７】
もう１つの好ましい実施態様ではコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークは、Ａβ１〜４０をポリビニルスルホン酸と共に利用して形成される。この好ましい実施態様では、Ａβ１〜４０がポリビニルスルホン酸と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：ポリビニルスルホン酸の重量比は１：３〜１：１００の範囲内にあり、1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：２０及び１：４０である。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、Ａβ１〜４０及び陰イオン系高分子又はその一部を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する方法を提供することである。そのような陰イオン系高分子には、少なくとも１つ、しかし好ましくは２つより多くの陰イオン基を含有するいずれかの及びすべての化合物が包含される。そのような陰イオン基には、硫酸基、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、環状硫酸基、スルトン基、テトラゾール基、［３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、１０，１０−ジオキシド、５，５−ジチオビス（１−フェニルテトラゾール）、１Ｈ−テトラゾール、５−フェニル−１Ｈ−テトラゾール、及び５−（２−アミノエタン酸）−１Ｈ−テトラゾール、及び薬理学的に許容可能なそれらの塩を包含するが、これに限定されない］、スルファメート、ホスホネート、ホスフェート、及びカルボン酸、又はそれらの混合物（すなわち、異なった陰イオン基、例えば硫酸基とスルホン酸基の組合せ）が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、Ａβを、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍及び／又は脳と腎臓を包含するが，これらに限定しない組織から単離した約２２０ｋＤａのヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）又はその一部を一緒に用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する方法を提供することである。好ましい実施態様では、そのような緻密性アミロイドプラークの形成は、本明細書に記載される様な適切なＡβ：約２２０ｋＤａＨＳＰＧの重量比及び／又はモル比のもとで、３７℃にて１週間、Ａβ１〜４０を約２２０ｋＤａＨＳＰＧと共にインキュベートすることにより達成される。そのような好ましい実施態様では、Ａβ１〜４０が約２２０ｋＤａＨＳＰＧと共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：約２２０ｋＤａＨＳＰＧの重量比は５０：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1.8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは５：１である。
【００２０】
本発明の更にもう１つの目的は、硫酸化ＰＧ及び硫酸化ＧＡＧ又は硫酸化高分子、又はその一部をＡβと共に用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する方法を提供することである。好ましい実施態様では、パールカン（本明細書に記載される様なＡβ：パールカンの適切なモル比および／または重量比において）をＡβ１〜４０と共に硫酸化ＧＡＧ又は硫酸化高分子（本明細書に記載する様な適切なＡβ：硫酸化ＧＡＧ又は硫酸化高分子の比率で）の存在下で３７℃にて１週間インキュベートする。そのようなコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドのための硫酸化ＧＡＧ又は硫酸化高分子は上で説明している。好ましい実施態様では、パールカン及びデキストラン硫酸と共にＡβ１〜４０を、本明細書に記載する様な適切なＡβ：パールカン：デキストラン硫酸の重量比及び／又はモル比にて３７℃で１週間インキュベートする。そのような好ましい実施態様では、２５μＭ又は１２５μＭのＡβ１〜４０がパールカン（パールカンの推定分子量、８００，０００）と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：パールカンのモル比は５０：１〜５００：１の範囲内にあり50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1, 155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1が包含されるが、好ましくは２００：１及び２５０：１であり、また、Ａβ：デキストラン硫酸のモル比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００２１】
もう１つの好ましい実施態様では、Ａβ１〜４０がパールカンと共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：パールカンの重量比は１：０．４〜１：１００の範囲内にあり1:0.4, 1:0.5, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：１及び１：０．８であり、また、Ａβ：デキストラン硫酸のモル比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００２２】
更にもう１つの好ましい実施態様では、パールカン及びペントサンポリ硫酸と共にＡβ１〜４０を、本明細書に記載する様な適切なＡβ：パールカン：ペントサンポリ硫酸の重量比及び／又はモル比にて３７℃で１週間インキュベートする。好ましい実施態様では、パールカン及びペントサンポリ硫酸と共にＡβ１〜４０を、本明細書に記載する様な適切なＡβ：パールカン：ペントサンポリ硫酸の重量比及び／又はモル比にて３７℃で１週間インキュベートする。そのような好ましい実施態様では、２５μＭ又は１２５μＭのＡβ１〜４０がパールカン（パールカンの推定分子量、８００，０００）と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：パールカンのモル比は５０：１〜５００：１の範囲内にあり、Ａβ：パールカンのモル比には、50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1, 155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1が包含されるが、好ましくは２００：１及び２５０：１であり、また、Ａβ：ペントサンポリ硫酸のモル比は１：３〜１：１００の範囲内にあり1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００２３】
もう１つの好ましい実施態様では、Ａβ１〜４０がパールカンと共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：パールカンの重量比は１：０．４〜１：１００の範囲内にあり1:0.4, 1:0.5, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：１及び１：０．８であり、また、Ａβ：ペントサンポリ硫酸のモル比は１：３〜１：１００の範囲内にあり、1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００２４】
更にもう１つの好ましい実施態様では、パールカン及びコンドロイチン−４−硫酸と共にＡβ１〜４０を、本明細書に記載する様な適切なＡβ：パールカン：コンドロイチン−４−硫酸の重量比及び／又はモル比にて３７℃で１週間インキュベートする。そのような好ましい実施態様では、２５μＭ又は１２５μＭのＡβ１〜４０がパールカン（パールカンの推定分子量、８００，０００）と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＡβ：パールカンのモル比は５０：１〜５００：１の範囲内にあり、Ａβ：パールカンのモル比には、50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1, 155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1が包含されるが、好ましくは２００：１及び２５０：１であり、また、Ａβ：コンドロイチン−４−硫酸のモル比は１：３〜１：１００の範囲内にあり、1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００２５】
本発明のもう１つの目的は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストルアスラー症候群及びクールーを包含するヒトのプリオン病における緻密性アミロイドプラークと類似した特徴を有する緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成する方法を提供することである。これらのプラークのそのような特徴には、ａ）  球状又は緻密性の形状、ｂ）コンゴレッドで染色し、偏光下で観察した場合のコンゴ好染性のマルタ十字形、ｃ）チオフラビンＳによる染色性、ｄ）電子顕微鏡で観察したとき、球状及び／又は「アミロイドスター」の外観、ｅ）走査電子顕微鏡で観察したとき、形状が球状又は緻密性（直径１０〜４０μｍのプラークを伴う）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明のもう１つの目的はプリオンタンパク質（ＰｒＰ）と硫酸化プロテオグリカン類（ＰＧ類）、又はその一部を用いて、コンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成する方法を提供することである。そのような硫酸化ＰＧ類には、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はケラタン硫酸類のグリコサミノグリカン類（ＧＡＧ類）を含有するＰＧ類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このようなＰＧ類にはパールカン、約２２０ｋＤａのＨＳＰＧ（本明細書に記載されている）、グリピカン、セレブログリカン、アグレカン、シナプトグリカン（ＳＶ２ＰＧ）、シンデカン、Ｎ−シンデカン（すなわちシンデカン−３）、シンデカン−１、シンデカン−４、ニューロカン、ホスファカン、デコリン、ビグリカン、ベルシカン、アンフィグリカン、ルミカン、ＰＧ−Ｍ、ＰＧ−Ｍ（３）、アグリン、ベタグリカン、クラウストリン、ブレビカン、アピカン、エピカン、及びニューログリカン−Ｃ、又はそれらの断片が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００２７】
好ましい実施態様では、パールカンと共にＰｒＰ（Ｍｒ＝２７，０００）を、本明細書に記載する様な適切なＰｒＰ：パールカンの重量比及び／又はモル比にて蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃で１週間インキュベートする。好ましい実施態様では、１ｍｇのＰｒＰを１ｍｌの二回蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解し、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液（３７μＭ）を作成する。その後２５μｌのＰｒＰストック溶液を２０μｇの凍結乾燥したパールカン（Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２０：４３３−４４４，１９９６に記載されたようにＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍から単離）を含有するマイクロ遠心管に加え、その後最終容量を２５０μｌまで増やし、３７℃にて１週間インキュベートする。この好ましい実施態様では、ＰｒＰ：パールカンのモル比は３７：１であり、ＰｒＰ：パールカンの重量比は１：０．８である。他の好ましい実施例では、３．７μＭのＰｒＰを蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中にて１２５ｎＭのパールカンと共にインキュベートするか、又は１８．５μＭのＰｒＰを蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中にて０．６２５μＭのパールカンと共にインキュベートする。これら後者２つの好ましい実施態様では、ＰｒＰ：パールカンのモル比は３０：１であり、ＰｒＰ：パールカンの重量比は１：１である。
【００２８】
緻密性アミロイドプラークを形成する他の好ましい実施態様では、ＰｒＰがパールカン（パールカンの推定分子量、８００，０００）と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＰｒＰ：パールカンのモル比は１０：１〜５００：１の範囲内にあり、ＰｒＰ：パールカンのモル比には10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1, 155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1が包含されるが、好ましくは３０：１及び３７：１である。
【００２９】
緻密性アミロイドプラークを形成する他の好ましい実施態様では、ＰｒＰがパールカンと共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＰｒＰ：パールカンの重量比は１：０．４〜１：１００の範囲内にあり、ＰｒＰ：パールカンの重量比には1:0.4, 1:0.5, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：１及び１：０．８である。
【００３０】
本発明のもう１つの目的は、ＰｒＰとＧＡＧ類又はその一部を用いて、コンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する方法を提供することである。そのようなＧＡＧ類には、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ケラタン硫酸、及び／又はヒアルロン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい実施態様では、そのような緻密性アミロイドプラークの形成は、本明細書に記載される様な適切なＰｒＰ：ヘパリン／ヘパラン硫酸の重量比及び／又はモル比のもとで、３７℃にて１週間、ＰｒＰをヘパリンと共に、又はＰｒＰをヘパラン硫酸と共にインキュベートすることにより達成される。
【００３１】
好ましい実施態様では、ヘパリンと共にＰｒＰを利用してコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する。この好ましい実施態様では、３．７μＭ又は１８．５μＭのＰｒＰがヘパリンと共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＰｒＰ：ヘパリンのモル比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：５である。
【００３２】
好ましい実施態様では、ヘパラン硫酸と共にＰｒＰを利用してコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する。この好ましい実施態様では、ＰｒＰがヘパラン硫酸と共に蒸留水又はトリス緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３７℃にて少なくとも３〜５日間、しかし好ましくは１週間インキュベートされ、このときのＰｒＰ：ヘパラン硫酸の重量比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100が包含されるが、好ましくは１：８又は１：１６である。
【００３３】
本発明のその他の目的は、ＰｒＰおよび硫酸塩化高分子またはその一部分を用いて、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成させる方法を提供するものである。このような硫酸塩化高分子には、少なくとも１コ、好ましくは２コ以上の硫酸塩化部分をもったすべての化合物が含まれる。このような化合物としては、デキストランサルフェート、ペントザンポリサルフェート、ポリビニルスルホネート、コンゴレッド、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ（２−アシルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸コアクリルニトリル）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸コスチレン）、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ（ビニル硫酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）、ポリ（アクリル酸）のスルホン酸誘導体、ポリ（メチルアクリレート）のスルホン酸誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）のスルホン酸誘導体、ポリビニルアルコールのスルホネート誘導体、スルホネート化スクロース、スクロースオクタスルホネート、５−デオキシ−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−アルファ−Ｄ−キシロフラノース−５−スルホン酸、エタンスルホン酸、スクロースオクタサルフェート、エチル硫酸、２−アミノエタン−１−オル硫酸、１，２−エテンジオールジ硫酸、１−プロパンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、１−プロパノールジ硫酸、１，２−エタンジオールジ硫酸、１，３−プロパンジオールジ硫酸、１，４−ブタンジオールジ硫酸、１，５−ペンタンジオールジ硫酸、１，４−ブタンジオールモノ硫酸、１，３−プロパンジスルホン酸、１，４−ブタンジオールジ硫酸、１，４−ブタンジスルホン酸、１，５−ペンタンジスルホン酸、タウリン、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、２−アミノエタンスルホン酸、テトラヒドロチオフェン−１，１−ジオキシド３，４−ジスルホン酸、４−ヒドロキシブタン−１−スルホン酸、１−ブタンスルホン酸、１−デカンスルホン酸、２−プロパンスルホン酸、３−ペンタンスルホン酸、４−ヘパンスルホン酸、１−デカンスルホン酸、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸サルフェート、１、７−ジヒドロキシ−４−ヘプタンスルホン酸、２−[（４−ピリジニル）アミド]エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、テトラヒドロチオフェン−１，１−ジオキシド３，４−ジスルホン酸、１，３−ベンゼンジスルホン酸、２，５−ジメトキシ−１，４−ベンゼンジスルホン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−１−ナフタレンスルホン酸、３，４−ジアミノ−１−ナフタレンスルホン酸、１，７−ジヒドロキシ−４−ヘプタンスルホン酸、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールジ硫酸、２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオールジ硫酸、１，３−シクロヘキサンジオールジ硫酸、２，３，４，３'，４'−スクロースペンタ硫酸、２−ヒドロキシエチルスルファミン酸硫酸、３−ヒドロキシプロピルスルファミン酸硫酸、１，３，５，７−ヘプタンテトラ硫酸、１，３，５，７，９−ノナンペンタ硫酸、２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）、システイン酸（３−スルホアラニンまたはアルファ−アミノ−β−スルホプロピオン酸）、メチル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド−２，３−ジサルフェート、１，３−シクロヘキサンジオールジサルフェート、１，３，５−ヘプタントリオールトリサルフェート、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールトリサルフェート、２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオールトリサルフェート、１，３，５，７−ヘプタンテトラオールテトラサルフェート、１，３，５，７，９−ノナンペンタサルフェート、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールトリサルフェート、２−ベンジロキシ−１，３−プロパンジオールジサルフェート、３−ヒドロキシプロピルスルファミン酸サルフェート、２，２'−イミノエタノールジサルフェート、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）スルファミン酸ジサルフェート、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン硫酸、テトラヒドロチオフェン−１，１−ジオキシド−３，４−ジオールジ硫酸、メチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド２，３−ジサルフェート、２，３，４，３'，４'−スクロ−スペンタサルフェート、１，３：４，６−ジ−Ｏ−ベンジリデン−Ｄ−マンニトール２，５ジサルフェート、Ｄ−マンニトール２，５−ジサルフェート、２，５−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−マンニトールテトラサルフェート、トレハロースオクタサルフェート・オクタナトリウム塩、スクロースオクタサルフェート・オクタナトリウム塩、メチル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド・テトラナトリウム塩、メチルβ−Ｄ−ラクトシドヘプタサルフェート・ヘプタナトリウム塩、エタンスルホネートナトリウム、１−プロパンスルホネートナトリウム、１−ペンタスルホン酸・ナトリウム塩、およびこれらの薬理学上使用可能な塩が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００３４】
好ましい実施態様として、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークは、ＰｒＰとデキストランサルフェートを用いて形成される。この好ましい実施態様において、ＰｒＰは３．７μＭまたは１８．５μＭで、蒸留水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で、デキストランサルフェートと共に、３７℃で少なくとも３日から５日、望ましくは１週間インキュベートされ、このときのＰｒＰ：デキストランサルフェートのモル比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００３５】
他の好ましい実施態様として、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークは、ＰｒＰとペントサンポリサルフェートを用いて形成される。この好ましい実施態様において、ＰｒＰは３．７μＭまたは１８．８μＭで、蒸留水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で、ペントサンポリサルフェートと共に、３７℃で少なくとも３日から５日、望ましくは１週間インキュベートされ、このときのＰｒＰ：ペントサンポリサルフェートのモル比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００３６】
他の好ましい実施態様として、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークは、ＰｒＰとポリビニルスルホネートを用いて形成される。この好ましい実施態様において、ＰｒＰは蒸留水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で、ポリビニルスルホネートと共に、３７℃で少なくとも３日から５日、望ましくは１週間インキュベートされ、このときの、ＰｒＰ：ポリビニルスルホネートの重量比は１：１〜１：１００の範囲内にあり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：２０および１：４０の比率で培養される。
【００３７】
本発明の他の目的は、ＰｒＰおよび陰イオン性高分子またはその部分を用いて、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏに形成させることである。このような陰イオン性高分子としては、少なくとも１コ、望ましくは２コ以上の陰イオン基を含むすべての化合物が含まれる。このような陰イオン基には、サルフェート基、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、環状サルフェート基、スルトン基、テトラゾール基[３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−チオキサンテン−９−オン、１０，１０−ジオキシド、５，５−ジチオビス（１−フェニルテトラゾール）、１Ｈ−テトラゾール、５−フェニル−１Ｈ−テトラゾール、および５−（２−アミノエタン酸）−１Ｈ−テトラゾール、およびそれらの薬理学的に使用可能な塩を含むが、それに限定されるものではない]、スルファメート、ホスホネート、ホスフェート、カルボキシル酸、それらの組合せ（即ち、異なる陰イオン基の組合せ、例えば、サルフェートとスルホネートの組合せ）を含むが、それらに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の他の目的は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍、または脳および腎臓を含むがそれらに限定されないその他の組織から分離された、約２２０ｋＤａのヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）またはその部分とＰｒＰを共に用いて、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏに形成する方法を提供することにある。好ましい実施態様として、このような緻密性アミロイドプラークの形成は、ＰｒＰと約２２０ｋＤａのＨＳＰＧを、３７℃で１週間、本明細書中に記載されるようなＰｒＰ：約２２０ｋＤａのＨＳＰＧの適切な重量比および／またはモル比でコ−インキュベートすることにより達成される。このような好ましい実施態様では、ＰｒＰは蒸留水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で、約２２０ｋＤａと共に、３７℃で少なくとも３日から５日、好ましくは１週間インキュベートされ、この場合にＰｒＰ：約２２０ｋＤａ重量比は５０：１から１：１００の範囲内であり、1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは５：１の比率である。
【００３９】
本発明のさらに別の目的は、ＰｒＰを硫酸化ＰＧ類および硫酸化ＧＡＧ類または硫酸化高分子と共に使用することにより、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成するための方法を提供することにある。好ましい実施態様においてＰｒＰはパールカン共に（本明細書中に記載されるようなＰｒＰ：パールカンの適切なモル比および／または重量比で）、硫酸化ＧＡＧ類または硫酸化高分子の存在下で（本明細書中に記載されるようなＰｒＰ：硫酸化ＧＡＧ類または硫酸化高分子の適切な比率で）、３７℃で１週間インキュベートされる。このようなコンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドのための硫酸化ＧＡＧ類または硫酸化高分子については上述されている。このような好ましい実施態様においては、ＰｒＰはパールカンおよびデキストランサルフェートと共に、３７℃で１週間、本明細書中に記載されるようなＰｒＰ：パールカン、デキストランサルフェートの適切な重量比および／またはモル比でインキュベートされる。このような好ましい実施態様では、３．７μＭまたは１８．５μＭのＰｒＰはパールカン（パールカンの推定分子量８００，０００）と共に、蒸留水またはトリス緩衝食塩水中で、３７℃で少なくとも３日〜５日、好ましくは１週間インキュベートされ、この場合にＰｒＰ：パールカンのモル比は１０：１〜５００：１の範囲内であり、10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1, 155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1を含むが、好ましくは３０：１および３７：１の比率であり、ＰｒＰ：デキストランサルフェートのモル比は１：１〜１：１００の範囲内であり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００４０】
他の好ましい実施態様において、ＰｒＰはパールカンと共に、蒸留水またはトリス緩衝食塩水中で、３７℃で少なくとも３日〜５日間、好ましくは１週間インキュベートされ、この場合にＰｒＰ：パールカンの重量比は１：０．４〜１：１００の範囲内であり、1:0.4, 1:0.5, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：１および１：０．８であり、ＰｒＰ：デキストランサルフェートのモル比は１：１〜１：１００の範囲内であり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００４１】
さらに別の好ましい実施態様において、ＰｒＰはパールカンおよびペントサンポリサルフェートと共に３７℃で１週間、本明細書中に記載されるようなＰｒＰ：パールカン：ペントサンポリサルフェートの適切な重量比および／またはモル比でインキュベートされる。好ましい実施態様として、ＰｒＰはパールカンおよびペントサンポリサルフェートと共に、３７℃で１週間、本明細書中に記載されるようなＰｒＰ：パールカンおよびペントサンポリサルフェートの適切な比率でインキュベートされる。このような好ましい実施態様において、３．７μＭまたは１８．５μＭのＰｒＰは、パールカン（推定分子量８００，０００）と共に、蒸留水またはトリス緩衝食塩水中で、３７℃で少なくとも３日〜５日、好ましくは１週間インキュベートされ、この場合にＰｒＰ：パールカンのモル比は１０：１から５００：１の範囲内であり、10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1, 155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1を含むが、好ましくは３０：１および３７：１であり、ＰｒＰ：ペントサンポリサルフェートのモル比は１：１から１：５００の範囲内であり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００４２】
他の好ましい実施態様において、ＰｒＰはパールカンと共に、蒸留水またはトリス緩衝食塩水中で、３７℃で少なくとも３日〜５日の間、好ましくは１週間インキュベートされ、この場合にＰｒＰ：パールカンの重量比は１：０．４から１：１００の範囲内であり、1:0.4, 1:0.5, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：１か１：０．８であり、そして、ＰｒＰ：ペントサンポリサルフェートのモル比は１：１から１：１００の範囲内であり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００４３】
更にもう１つの好ましい実施態様では、ＰｒＰはパールカンおよびコンドロイチン−４−サルフェートと共に、３７℃で１週間、本明細書中に記載されるようなＰｒＰ：パールカン：コンドロイチン−４−硫酸の適切な重量比および／またはモル比でインキュベートされた。このような好ましい実施態様では、３．７μＭおよび１８．５μＭのＰｒＰがパールカン（パールカンの推定分子量８００，０００）と共に、蒸留水またはトリス緩衝食塩水中で、３７℃で、少なくとも３日〜５日、好ましくは１週間インキュベートされ、この場合にＰｒＰ：パールカンのモル比は１０：１から５００：１の範囲内であり、10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 120:1, 125:1, 130:1, 135:1, 140:1, 145:1, 150:1.155:1, 160:1, 165:1, 170:1, 175:1, 180:1, 185:1, 190:1, 195:1, 200:1, 205:1, 210:1, 215:1, 220:1, 225:1, 230:1, 235:1, 240:1, 245:1, 250:1, 255:1, 260:1, 265:1, 270:1, 275:1, 280:1, 285:1, 290:1, 295:1, 300:1, 305:1, 310:1, 315:1, 320:1, 325:1, 330:1, 335:1, 340:1, 345:1, 350:1, 355:1, 360:1, 365:1, 370:1, 375:1, 380:1, 385:1, 390:1, 395:1, 400:1, 405:1, 410:1, 415:1, 420:1, 425:1, 430:1, 435:1, 440:1, 445:1, 450:1, 455:1, 460:1, 465:1, 470:1, 475:1, 480:1, 485:1, 490:1, 495:1, 500:1を含むが、好ましくは３０：１および３７：１の比率であり、そしてＰｒＰ：コンドロイチン−４−サルフェートのモル比は１：１から１：１００の範囲内であり、1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００４４】
他の好ましい実施態様では、ＰｒＰはパールカンと共に、蒸留水またはトリス緩衝食塩水中で、３７℃で少なくとも３日〜５日間、好ましくは１週間インキュベートされ、この場合にＰｒＰ：パールカンの重量比は１：０．４〜１：１００の範囲内であり、1:0.4, 1:0.5, 1:0.8, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55.1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：１および１：０．８であり、そしてＰｒＰ：コンドロイチン−４−サルフェートのモル比は１：３から１：１００の範囲内であり、1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100を含むが、好ましくは１：５の比率である。
【００４５】
本発明のさらに他の目的は、本明細書中に記載されるように生成された、緻密性アミロイドプラークをアルツハイマー病またはプリオン病の可能性のある治療法としての抗プラーク治療薬をｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定するためのスクリーニング方法のために用いることにある。好ましい実施態様としては、このようなスクリーニング法は放射性標識されたアミロイドタンパク質（ＡβまたはＰｒＰ）、ＰＧ類、硫酸化ＧＡＧ類、および／または硫酸化高分子を用いるだろう。適切な標識剤には、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、抗原標識があるが、これらに限定されるものではない。これらのスクリーニング法は、本明細書中に記載されるような、液相および／または固相アッセイを用いて行うことができ、およびシンチレーションカウンター、ガンマカウンター、分光光度計、蛍光光度計または比濁計のような適切な検出システムをを用いて行なうことができる。
【００４６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗プラーク治療薬を同定するスクリーニング法のために、このようにして生成された緻密性アミロイドプラークを用いる好ましい実施態様において、コンゴ好染性なマルタ十字形の球状アミロイドプラークを阻止し、崩壊させ、排除する薬剤を偏光顕微鏡を用いて同定することができる。このような好ましい実施態様において、アミロイドプラークのコアがｉｎ  ｖｉｔｒｏでまず形成され、コンゴレッドで染色して偏光下で観察すれば、代表的なマルタ十字形状を示す。試験化合物と共に（経験的に決められた、適切な薬品使用量と培養時間で）インキュベートした後、所定の化合物または薬剤が、アミロイドプラーク構造を阻止、崩壊、排除する能力があり、その結果、コンゴ好染性および／またはマルタ十字形の生成が失われるか否かを決定するために、偏光顕微鏡下でアミロイドプラークコアを観察する。このような偏光顕微鏡を用いる技法で最初に同定された化合物はプラークの阻止、崩壊、または排除を同定するため透過電子顕微鏡および／または走査電子顕微鏡を用いる第２第３のアッセイでさらに解析することができる。
【００４７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗プラーク治療薬を同定するためのスクリーニング法として、このように生成された緻密性アミロイドプラークを用いるさらに別の好ましい実施態様において、球状のアミロイドプラーク構造（大きさおよび／または直径）を阻止し、崩壊する薬剤を、セルソーターを活用する方法を用いて同定することができる。このようなアッセイ法において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される緻密性球状のアミロイドプラークは、そのプラークの平均直径（および直径の分布範囲）を測定するためのセルソーターに掛けられる。これらのプラークは色々な化合物や薬剤と共に培養され（経験的に決められた所定の用量とインキュベート時間で）、その後、分解過程で、そのプラークのサイズ（ここでは直径）を崩壊する上で有効かを決めるために再びセルソーターに掛けられる。
【００４８】
本発明のさらに別の目的は、コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｖｏで示す新しい動物モデルを提供することにある。このような方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークを脳または他の組織に注射、注入、またはその他の方法により挿入することが含まれるが、それらに限定されるものではない。このような動物は緻密性アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｖｏでの沈着および持続の効果を研究するための新しい手段を提供すると共に、抗プラーク治療法の動物モデルでの有効性をテストする新しい手段を提供することになる。
【００４９】
本発明のさらに別の目的は、Ａβ含有のコンゴ好染性なマルチーズクロス形の緻密性アミロイドプラークについてのｉｎ  ｖｉｖｏの新しい動物モデルを提供することである。好ましい実施態様において、本明細書中に記載された方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたＡβを含有する緻密性アミロイドプラークを動物の脳に、注射、注入、あるいはその他の方法で挿入される。このようなアミロイドプラークモデルを使用して、アミロイドプラークの脳内での沈着と持続の影響を研究することができ、動物モデルでの抗プラーク治療法の有効性をテストするための新しい方法を提供することになる。更に、このようなモデルを使用して、アルツハイマー病の治療のための抗プラーク治療法を同定することができる。このようなアミロイドプラークモデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミロイドプラークの沈着および持続に対する細胞の反応（すなわち、食作用、分解、代謝変化）を研究することができる。
【００５０】
本発明のさらに別の目的は、ＰｒＰ含有コンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークをｉｎ  ｖｉｖｏで持っている新しい動物モデルを提供することである。好ましい実施態様において、本明細書中に記載された方法で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークを含むＰｒＰは動物の脳に注射、注入またはその他の方法で挿入されることになる。このアミロイドプラークモデルを使用して、脳内でのアミロイドプラーク沈着および持続の影響を研究することができ、動物モデルでの抗プラーク治療法の有効性をテストする方法を提供する。更に、このようなモデルを使用して、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストラウスラー症候群、クールーおよび動物ククラピーを含むプリオン病の治療のための抗プラーク治療法を同定することができる。
【００５１】
定義
本明細書中で使用する「散在性プラーク」という用語は、ヒトのアルツハイマー病の脳中のアミロイドプラークを示し、それは数多くの異なる抗Ａβ抗体と免疫反応を起こすが、通常、フィブリルアミロイドについては（すなわち、コンゴレッド、チオフラビンＳ）染色されない（Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１１３−１２２，１９８９；Ｖｅｒｇａら，Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｌｅｔｔ．１０３：２９４−２９９，１９８９）。
【００５２】
本明細書中で使用する「神経炎性プラーク」は、球状アミロイドプラークのコアを取り巻くジストロフィー性軸策を含むヒトのアルツハイマー病の脳内のプラークを示すために用いる（Ｂａｒｃｉｋｏｗｓｋａら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ，７８：２２５−２３１，１９８９；Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１１３−１２１，１９８９；Ｍａｓｌｉａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５２：６１９−６３２，１９９３）。これらのプラーク内のアミロイドコアはＡβ免疫陽性で、コンゴレッドおよびチオフラビンＳで染色される。更に、神経炎性プラーク内のアミロイドプラークコアは、通常は球状で、コンゴレッドで染色され、偏光下で見るとマルタ十字形に似ている（Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１１３−１２２，１９８９；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：３３７−３４７，１９８９；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４７：５０３−５１５，１９９５）。
【００５３】
「緻密性」や「消耗性（ｂｕｒｎｅｄ−ｏｕｔ）」プラークという用語は、一般的により成熟したプラーク形成の形を示すと考えられ、ヒトのアルツハイマー病またはプリオン病の脳内のプラークの状態を示している（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：３３７−３４７，１９８９；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４７：５０３−５１５；Ｄｉｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６：３２１−３３９，１９９７）。これらの球状プラークはＡβまたはプリオンタンパク質免疫反応陽性で、コンゴレッド（偏光下で見る場合、マルタ十字形に似ている）およびチオフラビンＳで染まる。「緻密性」あるいは「消耗性」プラークはコンゴレッドで染色し偏光下で観察すると、マルタ十字の形をしていることも示す。
【００５４】
本明細書中で「コンゴ好染性」という用語は、フィブリル状アミロイドが沈着していることを示すのに用い、コンゴレッドで染色して偏光下で見ると、赤／アップル・グリーンの複屈折を示す。コンゴ好染性な沈着は必ずしもマルタ十字の形を示さない（定義については次の項目参照）。
【００５５】
「マルタ十字形」という用語は、球状で緻密性アミロイドプラークに関し、コンゴレッドで染色し偏光下で見た場合、マルタ十字の形を示す（即ち、赤色はアップル・グリーンの色に対して９０度になっている）ことを意味している。偏光面を回転させると、プラークの色が移動し、赤色はアップル・グリーン色になり、アップル・グリーン色は赤色に変わる（即ち赤色／グリーンの複屈折）。本発明で記載されているようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたアミロイドプラーク、ヒトのアルツハイマー病の脳中の神経炎プラークのアミロイドコア、ヒトのアルツハイマー病の脳中の「緻密性」または「消耗性」プラーク、およびヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストラウスラー症候群およびクールーの小脳中のアミロイドプラークは総て、コンゴレッドで染色し偏光下で見ると「マルタ十字」の形を示す。
【００５６】
本明細書中で「アミロイドスター」という用語は、「緻密性」または「消耗性」アミロイドプラークを指し、電子顕微鏡で見ると、アミロイドが星状に沈着しているのに似ているからである（Ｓｅｌｋｏｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４６：１８２０−１８３４，１９８６；Ｓｎｏｗら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３３：４５６−４６３，１９８８）。プラークの「アミロイドスター」の外観は、放射状のアミロイドフィブリルの束がプラークの中心から出ているように見えることによる。
【００５７】
本明細書中の「誘導」または「形成」という用語は、適切な条件下で、３７℃でインキュベートした場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される緻密性アミロイドプラークに対して用いられる。インキュベーション成分を緩やかに撹拌することは、「誘導」または「形成」という用語について検討した様に、本発明の考慮の範囲内にある。
【００５８】
本明細書中の「抗プラーク療法」という用語は、ａ）緻密性プラークの構成、染色性、構造を直接的に溶解、阻害、崩壊する、および／または、ｂ）緻密性プラークが他の細胞（即ち、神経）、組織、器官に対して持つかもしれない有害な影響（即ち、神経毒性）を阻害すること、に有効な化合物または薬剤を指すのに使う。
【００５９】
「ベータ・アミロイドタンパク質（Ａβ１−４０）」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を示し、ヒトの病気において生じる（例えば、アルツハイマー病では、Ａβ１−４０で１コのアミノ酸置換が起こっていることが知られている）、または種の変化でも起こる（例えば、齧歯類のＡβ１−４０は、ヒトのＡβ１−４０と比較すると、３コのアミノ酸が異なっていることが知られている）、総ての単一または複数のアミノ酸置換が含まれる。
【００６０】
本発明を実施する最良の態様
以下の実施例、図面および討議は、本発明の実施態様の説明であり、本発明の範囲を限定するものではない。以下の節もまた、本発明をよりよく理解するための背景を付加すべく提供されたものである。
【００６１】
アルツハイマー病
アルツハイマー病は、中高年期における痴呆の最も一般的な原因であり、記憶・言語・視覚空間、知覚、および行動面で障害が進行することにより明らかになる（Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｒｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７）。アルツハイマー病と思われる場合の診断は臨床上の基準に基づいて行なえるが（通常他に病気がないこと、記憶テストなど）、確実な診断には、剖検で得られる脳組織の中の特定な異常を組織学的に検査する必要がある。
【００６２】
アルツハイマー病では、認識過程にとって不可欠な脳の部分、例えば、記憶、注意力、言語力、および推理力が退化し、その結果、犠牲者から、独立心を含む、われわれをヒトとしている多くのものを奪い取ってしまう。アルツハイマー病の遺伝性のいくつかの場合では、発現は中年だが、より一般的に徴候が現われるのは６０歳台半ばから先である。アルツハイマー病はベータアミロイドタンパク質、Ａβまたはβ／Ａ４という３９−４８コのアミノ酸ペプタイドが沈着し蓄積することが特徴である（Ｇｌｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２０：８８５−８９０，１９８４；Ｍａｓｔｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４２４５−４２４９，１９８５；Ｈｕｓｂｙら，Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ  ７１：１０５−１０８，１９９８）。Ａβはベータアミロイド前駆体タンパク質（またはβＰＰ）と名付けられた大きな前駆体から誘導され、それについては、いくつかの択一的にスプライシングされた変異体がある。最も豊富なβＰＰの形は６９５，７５１，および７７０のアミノ酸を含むタンパク質である（Ｔａｎｚｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２８−５３０，１９８８；Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５３０−５３２，１９８８；Ｐｏｎｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２５−５２８，１９８８）。その小さいＡβペプチッドが主要成分であり、それが、アルツハイマー病患者の脳の中で神経炎「プラーク」のアミロイド沈着を作り上げ、血管の壁の中へ沈着する（脳血管性のアミロイドとして知られている）。更に、アルツハイマー病では、ニューロン細胞質内に異常に集積されたペアのヘリカルフィラメントからなる、多くの神経細線維の「からみ」の存在が特徴的である（Ｇｕｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４９１３−１９１７，１９８６；Ｋｏｓｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４４０４−４０４８，１９８６，Ｌｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：６７５−６７８，１９９１）。アルツハイマー病の病理学的な特徴は、したがって、「プラーク」と「からみ」が、プラークの中央コアおよび血管壁内に沈着したアミロイドと共に存在することである。所謂、「正常に年をとった脳」にもいくらかのアミロイドプラークと神経細線維のからみがあるということに注意する必要がある。しかし、それらを比較すると、アルツハイマー病の脳の方が、「プラーク」と「からみ」が過剰に多いことを示している。従って、アルツハイマー病の脳と普通の脳の差を診断観点から見ると、第１には、「プラーク」と「からみ」の定量的な評価分析に基づくことになる。
【００６３】
アルツハイマー病の脳では、通常、何千という神経炎のプラークが存在する。この神経炎のプラークは、通常は膨張した軸索とシナプシスのターミナルで囲まれ（神経として知られている）、アミロイドコアからなる細胞外沈着物、および、異常な樹状突起と共に、色々の数の浸潤した小神経膠細胞やそれを取巻く星状神経細胞からできている。アルツハイマー病の脳にある神経細線維の「からみ」は主としてタウタンパク質からなり、それは微細管が付属したタンパク質である（Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４９１３−４９１７，１９８６；Ｋｏｓｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４０４４−４０４８，１９８６；Ｌｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：６７５−６７８，１９９１）。超微細構造レベルでは、「からみ」は１８０ｎｍの特定の交差周期を持つリボンのようにねじれたペアのヘリカルフィラメントからなる。多くの場合、神経細線維の「からみ」の中に、ペアのヘリカルフィラメントと真っすぐなフィラメントがある。更に、神経細胞は多くの場合死に、その結果としてフィラメントが残る。それらは死んだニューロンの繊維状の残りであるため、これらの「からみ」は「ゴースト・タングル」として知られている。
【００６４】
アルツハイマー病患者の脳内に見られる病変のその他の主要なタイプは、脳実質内および脳外にある大きな髄膜容器の壁内でのアミロイドの沈着である。血管の壁の部分に限定したアミロイドの沈着は脳血管性アミロイドまたはコンゴ好染性な血管障害と言われる（Ｍａｎｄｙｂｕｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４５：７９−９０，１９８６；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４９：１３９４−１４０１，１９８７）。
【００６５】
その上、アルツハイマー病患者では、ニューロンとシナプシスが減少していることが分かった。更に、これらの患者はアセチルコリンのような神経伝達物資も減っている。初めてＦＤＡが承認したアルツハイマー病用の医薬はコリンエステラーゼ阻害剤である。しかし、この薬はその効果が限定的であることが分かった。効果があるとすれば、アルツハイマー病患者の認識面での改善であり、元々から肝臓への毒性という主要な副作用がある。
【００６６】
長年アルツハイマー病の「アミロイド」の重要性について科学的な論議が行なわれており、この病気の特徴である「プラーク」と「からみ」が原因なのか、単なるこの病気の結果なのかが論議されてきた。ここ数年間における最近の研究結果は、アミロイドは現実にアルツハイマー病の原因要素であり、単なる無害の傍観者でないことが明らかにされた。アルツハイマー病のＡβのタンパク質は短時間で神経細胞を分解することが明らかになった（Ｐｉｋｅら，Ｂｒ．Ｒｅｓ．５６３：３１１−３１４，１９９１；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：２５３−２６５，１９９４）。研究成果から、神経毒の原因になっているのは、すべてアミロイドの特徴である原線維の構造であることが推定されている。このＡβは又、アルツハイマー病で影響を受ける主要記憶部分の海馬のスライス培養では、神経毒であることが分かった（Ｈａｒｒｉｇａｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １６：７７９−７８９，１９９５）。そして、遺伝子導入マウスでは神経細胞の死を引き起こした（Ｇａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：５２３−５２７，１９９５；Ｈｓｉａｃら，Ｎｅｕｒｏｎ  １５：１２０３−１２１８，１９９５）。更に、アルツハイマー病のＡβをラットの脳に注射すると、記憶障害と神経の機能障害が起きる（Ｆｌｏｏｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３３６３−３３６６，１９９１；Ｂｒ．Ｒｅｓ．６６３：２７１−１７６，１９９４）。これは、アルツハイマー病の追加された２つの特徴である。多分、アミロイド（即ち、ベータ・アミロイドタンパク質）がアルツハイマー病の病因として直接関与していることを支持する最も説得力がある証拠は遺伝子研究から来ている。Ａβの生成は、ベータ・アミロイド前駆タンパク質として知られる前駆物質から作られることが発見された（Ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１１２０−１１２２，１９９０；Ｅｕｒｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８５：８−１９，１９９５；Ｍｕｒｒｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：９７−９９，１９９１；Ｈａａｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１２９１−１２９６，１９９５）。この前駆物質タンパク質は、普通にプロセスが進めば、通常は毒性のあるＡβを極く少量生成するに過ぎない。家族性アルツハイマー病を早期に発病させるアミロイド前駆体タンパク質遺伝子に変異が確認されたことは、アミロイドがこの疾患の基底にある病因プロセスの中心であることの最も強力な根拠である。病気を発症させる変異について４つの報告があり、家族性アルツハイマー病の発症には、ベータ・アミロイドタンパク質の重要性が証明されている（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｈａｒｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１：２３３−２３４，１９９２）。これらの研究のすべてが、ヒトの患者の脳の中の細線維状のＡβの形成、沈着、集積、および／または持続を減少させ、阻止するための薬の提供が最も有効な治療法と考えなければならないことを示している。
【００６７】
散在性プラーク、神経炎性プラーク、および、緻密性（「アミロイドスター」）プラーク
散在性プラーク、神経炎性プラーク、および緻密性（「アミロイドスター」）プラークを含め、アルツハイマー病患者の脳内の各種の形態の異なるタイプのＡβ含有プラークのことが記載されている。散在性プラークは初期病変と考えられていた。その理由は、それらはジストロフィー性神経炎と連合せず、年を取っても痴呆にならない。Ａβ沈着優先で若いダウン症候群の脳で最初に病変が発見された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７６：５４１−５４９，１９８８；Ａｌｌｓｏｐら，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１５：５３１−５４２，１９８９；Ｇｉａｃｃｏｎｅら，Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｌｅｔｔ．９７：２３２−２３８，１９８９；Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：１３３−１８７，１９８９；Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１１３−１２２，１９８９；Ｍａｎｎら，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１５：３１７−３２９，１９８９；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：３３７−３４７，１９８９；Ｐａｐｐｏｌａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４１：１１５１−１１５９，１９９２；Ｌｅｍｅｒｅら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３：１６−３２，１９９６）。散在性プラークは、多くの異なる抗Ａβ抗体と免疫反応するが、一般的に細線維アミロイドに対して染着しない（即ち、コンゴレッドで染色し偏光下で見ると赤／緑の複屈折、チオフラビンＳでの正の蛍光）（Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１１８−１２２，１９８９；Ｖｅｒｇａら，Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｌｅｔｔ．１０５：２９４−２９９，１９８９）。更に散在性のプラークは一般的にジストロフィー性神経炎や付属するグリアを含まない（Ｇｉａｃｃｏｎｅら，Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｌｅｔｔ．９７：２３２−２３８，１９８９；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：３３７−３４７，１９８９；Ｐａｐｐｏｌｌａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３９：５９９−６０７，１９９１）。神経炎性プラークはもっと成熟しており、球状のアミロイドプラークのコアを取り囲んでいる（Ｂａｒｃｉｋｏｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：２２５−２３１，１９８９；Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１１３−１２２，１９８９，Ｍａｓｌｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５２：６１９−６３２，１９９３）。これらのプラーク内のアミロイドのコアはＡβ免疫反応陽性でコンゴレッドおよびチオフラビンＳで染まる。更に、神経炎性プラーク内のアミロイドプラークのコアは通常球状でコンゴレッドで染め偏光下で見た場合マルタ十字形に似ている（Ｉｋｅｄａら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：１１３−１２２，１９８９，Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：３３７−３４７，１９８９；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４７：５０３−５１５，１９９５）。神経炎性プラークのコアは電子顕微鏡でみた「アミロイド・スター」に似ている（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：３３７−３４７，１９８９）。緻密性アミロイドコア（「消耗性」または「コア」プラー���と言われる）は電子顕微鏡で見ると、「アミロイドスター」に似ている（Ｓｅｌｋｏｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４６：１８２０−１８３４，１９８６；Ｓｎｏｗら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３３：４５６−４６３，１９８８）。そして、緻密性アミロイドコアはプラーク形成ではより成熟した形を現していると信じられている（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．７８：３３７−３４７，１９８９；Ｓｃｈｍｉｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４７：５０３−５１５，１９９５；Ｄｉｃｋｓｏｎｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６：３２１−３３９，１９９７）。これらの球状プラークはＡβ免疫反応プラスで、コンゴレッドおよびチオフラボンＳで染められる（偏光顕微鏡で見たマルタ十字形に似ている）。
【００６８】
緻密性「アミロイドスター」プラークはアルツハイマー病患者の脳の中に存在するばかりでなく、もっと一般的に、クロイツフェルト−ヤコブ病を含む所謂プリオン病に悩まされる患者の小脳の中に見られる（Ｂｏｃｋｍａｎｎら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１２：４３−７８，１９８５；Ｋｉｔａｍｏｔｏら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０：２０４−２０８，１９８６；Ｍａｎｅｕｌｉｄｉｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ．４４：１−１７，１９８５；Ｂｒｏｗｎら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０：５９７−６０２，１９８６）。ゲルストマン−ストラウサー症候群（Ｔａｔｅｉｓｈｉら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４：３５−４０，１９８８，Ｈｓｉａｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．１：６８−７１，１９９２）。およびクールー（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７：９４３−９６０，１９７７；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．８８：６１３−６１７，１９９２）。これらのアミロイドプラークは又形状が球状で、抗ＰｒＰ抗体に対して免疫反応があり、コンゴレッドおよびティオフラボンＳで染色される（原線維のアミロイドに対して指標的）（Ｐｅｒｌｍａｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．３８：１２４９−１２５４，１９８８）。これらの緻密性プラークはヒトのアルツハイマー病のようにコンゴレッドで染めて偏光下で見るとマルタ十字形の形を示す。
【００６９】
アルツハイマー病では、散在型プラークから神経炎性プラーク、次いで、緻密性プラークへの転化が最もありそうなことだと研究者は仮定してきた。しかし、転化のメカニズムおよび影響を及ぼす必須の要素がまだ発見されていない。更に、神経炎的プラークおよび緻密性プラークの形成の始まりが充分解明されていないので、誰もｉｎ  ｖｉｔｒｏでアルツハイマー病および／またはプリオン病の患者の脳内にみられるこれらのプラークに似た、プラークの沈着をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成させることができない。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏのプラークの形成がユニークな抗プラーク治療の可能性を持ち、アルツハイマー病および／またはプリオン病の治療への新しいアプローチとして貢献する可能性があるかもしれない薬剤を評価識別する上で使用されるようになろう。現在アルツハイマー病およびプリオン病の解明と発展に関し、現在知識が不足していることから、アミロイドプラークの成長を阻止し、中断させる可能性のある薬剤のスクリーニングと識別に使える化合物とその評価技術が必要とされている。このような化合物と評価分析する方法はアルツハイマー病およびプリオン病の発病と進行に関連して、アミロイドプラーク形成を評価分析する上で有用である。
【００７０】
このような目的およびその他の目的は、コンパクトなコンゴ好染性なマルタ十字形のアミロイドプラークの形成のメカニズムおよびそれに必要な必須部分を確定し、抗プラーク治療法を識別するための数多くの異なる評価技術に使用するため、アルツハイマー病のプラークを変わることなく形成する方法を示している本発明により達成された。パールカン（アルツハイマー病およびプリオン病に影響を与えている特定のヘパラン硫酸塩のプロテオグリカン）、約２２０ｋＤａのＨＳＰＧ、高度硫酸化グリコサミングリカン（ＧＡＧ）（即ち、ヘパリンおよびヘパランの硫酸塩）および関連する硫酸化ＧＡＧ高分子（即ち、デキストラン硫酸塩、ペントサン硫酸塩、ポリビニルスルホン酸塩）はベータ・アミロイドタンパク質（Ａβ（残渣１−４０）を、ヒトのアルツハイマー病の脳内に存在する緻密性アミロイドプラークと実質上同一のアミロイドプラークコア沈着物（３７℃で３日から５日間以内、成分を正しい成分濃度で正しく混合して）へｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した。Ａβ（１−４０）とその他の必須成分のモル比および重量比がアミロイドプラークコアの形成にとって極めて重要であることが分かった。本発明は更に、アルツハイマー病の抗プラーク治療法のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの識別のためのスクリーニングの用具として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作った人工アミロイドプラークコアの使用に関連する。
【００７１】
図１は、コンゴ好染性なマルタ十字形球状アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成を示し、ヒトのアルツハイマー病の脳内に存在することが知られている高分子に関連する、その他のアミロイドプラークではない。これらの研究で、２５μＭのＡβ（１−４０）を２回蒸留水またはトリス緩衝食塩水中で３７℃で１週間、そのまま（図１Ｃ）、あるいは、それぞれ１００ｎＭのＰ成分存在下（図１Ｄ）、アルファ１−抗キモトリプシン存在下（図１Ｅ）、アポＥ存在下（図１Ｆ）、Ｃｌｑ存在下（図１Ｇ）、ラミニン存在下（図１Ｈ）、フィブロネクチン存在下（図１Ｉ）、タイプＩＶコラーゲン存在下（図１Ｊ）、またはパールカン存在下（図１Ｋおよび１Ｌ）で培養した。それぞれの培養混合物の５μＬアリコートは、ゼラチンをコートしたスライド上で風乾し、コンゴレッドで染色して偏光下で観察した。Ａβ１−４０とパールカン存在下で、１週間３７℃で、好ましいＡβ：パールカンをモル比２５０：１（即ち、重量比１：０．８）で行なった事前培養では、コンゴ好染性なマルタ十字形の球状アミロイドプラーク様沈着が形成された（図１Ｋと１Ｌ）。１２５μＭのＡβ（１−４０）と０．６２５μＭパールカン（即ち、Ａβ：パールカンモル比２００：１、Ａβ：パールカン重量比１：１）で同様のアミロイドプラークの形成が認められたが、１２μＭのＡβ（１−４０）と０．６２５μＭの上記の（示されていない）他のアミロイドプラーク共成分では、このようなプラークの形成は認められなかった。パールカンで誘導されたアミロイドプラークは形態学的および染色性（即ち、コンゴレッドで染色後のマルタ十字形）の面で、ヒトのアルツハイマー病の脳にみられる緻密性アミロイドプラーク（図１Ｋと図１Ｌと図１Ａとの比較）と実質的に同一であった。図Ａ，ＢおよびＫのバーは長さ２５μｍ。図Ａ、図Ｃ、およびＨは同倍率で撮影、図Ｂ、Ｄ−Ｇ、Ｉ−Ｊも同様である。
【００７２】
図２は、高度硫酸化グリコサミノグリカン（即ち、ヘパリンおよびヘパラン硫酸塩）および関連の高分子硫酸塩（即ち、デキストラン硫酸塩、ペントサン硫酸塩）による、コンゴ好染性でマルタ十字形の球状アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成を示している。これらの研究では、２５μＭのＡβ１−４０が２回蒸留水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で、３７℃で１週間、そのまま（図２Ｂ）あるいは種々の量のヘパリン（図２Ｃ）、ヘパリン硫酸塩（図２Ｄ）、デルマタン硫酸塩（図２Ｅ）、コンゴレッド（図２Ｆ）、ペントサンポリ硫酸塩（図２Ｇ）、またはデキストラン硫酸塩（図２Ｉ）の存在下で培養された。培養混合物の５μＬのアリコートは、ゼラチンをコートしたスライド上で風乾し、コンゴレッドで染色し、偏光下で観察した。予備実験で、緻密性アミロイドプラーク形成に最適なＡβ：ＧＡＧ／硫酸化高分子比がヘパリン、デキストラン硫酸塩、およびペントサンポリ硫酸塩では１：５、ヘパラン硫酸塩では１：８、但し、Ａβ１−１０は２５μＭ。上記と同様の結果は、１２５μＭのＡβ１−４０を２回蒸留水を用いた場合にも得られた。ヘパリン、ヘパラン硫酸塩、ペントサン硫酸塩またはデキストラン硫酸塩をＡβ１−４０と、３７℃で１週間、コンゴ好染性なマルタ十字形の球状アミロイドプラークの沈着を形成したのと同じモル比で事前培養した（図２Ｃ、２Ｄ、２Ｇ−２Ｉ）。これらの高度硫酸化ＧＡＧにより誘導されたアミロイドプラークはヒトのアルツハイマー病の脳（図２Ａと比較）内の緻密性アミロイドプラークと事実上同一だった。図Ａ、ＢおよびＩのバーは２５μｍで、図ＢとＥと同様、図Ａ、Ｃ、ＤおよびＨは同一倍率で撮影された。
【００７３】
図３はポリビニルスルホン酸塩（ＰＶＳ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコンゴ好染性でマルタ十字形の球状アミロイドプラークを示し、Ａβ：ＰＶＳの重量比の変化が緻密性アミロイドプラークの形成にいかに影響するかを示している。これらの研究では、５０μｇのＡβ１−４０を２回蒸留水中で、３７℃で１週間、２５μｇＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比２：１）  （図８Ａ）、５０ｇ  ＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：１）（図３Ｂ）、２００μｇＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：４）  （図３Ｃ）、２５０μｇ  ＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：５）（図３Ｄ）、４００μｇＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：８）  （図３Ｅ）、５００μｇ  ＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：１０）（図３Ｆ）、８００μｇＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：１６）  （図３Ｇ）、２０００μｇ  ＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：４０）（図３Ｈ）、４０００μｇＰＶＳ（Ａβ：ＰＶＳ重量比１：８０）（図３Ｉ）の存在下でＰＶＳの量を増加しながら、合計１００μＬで#培養した。５μＬまたは１０μＬのアリコートを培養液混合物から取り、ゼラチンコートしたスライド上で風乾し、コンゴレッドで染め、偏光下で観察した。コンゴ好染性なマルタ十字形の球状プラーク形成がＰＶＳで誘導された。但し、Ａβ：ＰＶＳ重量比１：５以上の場合だけ。最適のアミロイドプラークコアの形成はＡβ：ＰＶＳ重量比１：４０（図３Ｈ）の場合だった。図ＡおよびＣ中のバーは２５μｍ。図Ａ、Ｂ、Ｈ、およびＩは図Ｃ−Ｇ同様に同一倍率。
【００７４】
図４はエンゲルブレス−ホルム−スワム腫瘍から分離された約２２０ｋＤａヘパラン硫酸塩プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）により誘導されたコンゴ好染性なマルタ十字形の緻密性アミロイドプラーク形成を示している。５０μｇのＡβ（１−４０）を１００μＬトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）の中で、３７℃で１週間、そのまま、または１０μｇの約２２０ｋＤａのＨＳＰＧ（Ａβ：ＨＳＰＧ重量比５：１）存在下で培養した。図４ＡはＡβだけの場合で、不規則なコンゴ好染性なアミロイドの沈着（矢印）が形成されていることを示し、明確なコンゴ好染性でマルタ十字形のアミロイドプラークは形成されなかった。図４Ｂは、コンゴ好染性なマルタ十字形のアミロイドプラーク（矢印）が、Ａβ１−４０、約２２０ｋＤａのＨＳＰＧで１週間培養することで形成されたことを示している。この形成されたアミロイドプラークはヒトのアルツハイマー病の脳の中にある（図１Ａおよび２Ａ参照）ものと同一である。図ＡおよびＢは同一倍率でバーは２５μｍである。
【００７５】
図５はパールカンで誘導されたプラスチックに固着している状態の球状アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成を示している。この研究では、１２５μＭのＡβ１−４０が２回蒸留水中で、３７℃で１週間、０．６２５μＭのパールカン（Ａβ：パールカンのモル比２００：１、Ａβ：パールカンの重量比１：１）の存在下で培養された。この培養混合物から１０μＬのアリコートは、プラスチックのペトリ皿上で１時間風乾され、その場で３％グルタルアルデヒドの０．１ＭのＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．３）で１０分間固定された。濾過蒸留水で３回洗滌後、それらは１％オスミウムテトラオキシド液で１０分間後固定され、次いで蒸留水で１０分間洗滌され、その後１晩風乾された。この図はパールカンで誘導されたアミロイドプラーク様沈着物がプラスチックス内にあり、相コントラスト光顕微鏡で観察した結果を示している。パールカンはＡβを誘導して、球状アミロイドプラーク沈着物を形成させ（図５Ａおよび５Ｂ、矢印）、それらは中心からアミロイドの神経細線維の束が放出しているように放射線状になっており、アミロイドプラークの「星」の形になっている。これらの形成されたプラークはヒトのアルツハイマー病の脳から分離されたアミロイドプラークに似ている。バーは２５μｍ。
【００７６】
図６はパールカンで誘導された球状「アミロイドスター」の形成を示し、それは透過電子顕微鏡で見た場合、ヒトのアルツハイマー病の脳から取り出されたアミロイドプラークコアから分離されたものと事実上同一であることを示している。この研究では、１２５μＭのＡβ１−４０が２回蒸留水で３７℃で１週間、０．６２５μＭのパールカン（Ａβ：パールカンモル比２００：１、Ａβ：パールカン重量比１：１）存在下で培養された。パールカンで誘導されたアミロイドプラークコア（図６Ｃおよび６Ｄ）はアミロイド細線維の放射状の束が中心から発している状態で「アミロイドスター」が形成されている。個々のアミロイド細線維の直径は７−１０ｎｍである。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたアミロイドプラークはヒトのアルツハイマー病の脳から分離されたアミロイドプラークと実質上同一である（図６Ａおよび６Ｃ）。バーは２μｍ。図ＡおよびＢは図ＣおよびＤ同様に同一倍率。
【００７７】
図７はパールカンまたはデキストラン硫酸塩で誘導され、走査電子顕微鏡で観察されたアミロイドプラークコアを示している。この研究では１２５μＭのＡβ１−４０が２回蒸留水で３７℃で１週間培養され、それだけ（図７Ｂ）または０．６２５μＭのパールカン（Ａβ：パールカン、モル比２００：１）（図７Ｄおよび７Ｅ）、またはデキストラン硫酸塩（Ａβ：デキストラン硫酸塩、モル比１：５）で培養された。更に、０．６２５μＭのパールカンだけで３７℃で１週間培養された（図７Ｃ）。アミロイドコアの形成はＡβ（図７Ｂ）またはパールカン（図７Ｃ）だけでは認められなかった。しかし、Ａβとパールカン存在下（図７Ｄおよび７Ｅ）あるいはデキストラン硫酸塩存在下（図７Ｆ）では、緻密性アミロイドプラーク形成が誘導された。パールカンまたはデキストラン硫酸塩で誘導されたアミロイドプラークの形はヒトのアルツハイマー病の脳から取り出され、分離され、走査電子顕微鏡で観察されたアミロイドプラークコアとその形および一般形態学的に似ている。倍率は各図の下に示されている。
【００７８】
【実施例】
以下の実施例は、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、高度に硫酸化されたＧＡＧ、および関連する硫酸化されたマクロ分子によって誘導される、アミロイドプラークコアのインビトロでの形成の好ましい実施態様を詳細に開示するために提供される。しかし、本発明は、これらの特定の実施態様には限定されないと解釈される。
【００７９】
実施例１
パールカン（Ｐｅｒｌａｃａｎ）によるが他のアミロイドプラーク同時構成成分にはよらない、アミロイドプラークコア形成の誘導
ヒトのアルツハイマー病の脳におけるアミロイドプラーク中に存在することが公知である種々の同時構成成分を、それらの、Ｐ成分（Ｃｏｒｉａら、Ｌａｂ．ｉｎｖｅｓｔ．５８：４５４−４５８、１９８８）、α1−抗キモトリプシン（Ａｂｒａｈａｍら、Ｃｅｌｌ  ５２：４８７−５０１、１９８８）、ＡｐｏＥ（Ｎａｍｂａら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５４１：１６３−１６６、１９９１；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１１１８３−１１１８６、１９９４；ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒおよびＲｏｓｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４７２５−４７２７、１９９５）、Ｃ１ｑ（Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌ．５６：２５９−２６２、１９８９；ＭｃＧｅｅｒら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃ．１６：５１６−５２７、１９８９；Ｒｏｇｅｒｓ，ＣＮＳ  ｄｒｕｇｓ  ４：２４１−２４４、１９９４）、Ｃ３（Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌ．５６：２５９−２６２、１９８９；ＭｃＧｅｅｒら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃ．１６：５１６−５２７、１９８９；Ｒｏｇｅｒｓ，ＣＮＳ  ｄｒｕｇｓ  ４：２４１−２４４、１９９４）、ならびにパールカン（Ｓｎｏｗら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３３：４５６−４６３、１９８８；Ｓｎｏｗら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４４：３３７−３４７、１９９４）を含有するコンゴ好染性（ｃｏｎｇｏｐｈｉｌｉｃ）のマルターゼが通過する緻密性アミロイドプラークの形成を誘導する能力について、試験した。さらに、ラミニン（Ｍｕｒｔｏｍａｋｉら、Ｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．３２：２６１−２７３、１９９２；ＰｅｒｌｍｕｔｔｅｒおよびＣｈｕｉ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．２４：６７７−６８６、１９９０；Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒら、Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．２８：２０４−２１５、１９９４）、フィブロネクチンおよびＩＶ型コラーゲン（Ｋａｗａｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３７：１４３５−１４４６、１９９０；ＬｕｔｈｅｒｔおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｌｅｔｔ．１２６：１１０−１１２、１９９１；Ｋａｗａｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５９２：２７８−２８２、１９９２；ＢｒａｎｄａｎおよびＩｎｅｓｔｒｏｓａ、Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍ．２４：１０６３−１０６８、１９９８）を含む他の基礎膜構成成分（すなわち、パールカンの他の）もまた、試験した。最初に、種々の条件（すなわち、濃度、Ａβプラーク同時構成成分の分子／重量比、インキュベーション時間）が、ヒトのアルツハイマー病の脳において観察される、球形のコンゴ好染性のマルターゼを通過する「アミロイドスター」プラークの形成を合成するための努力において、試験された。
【００８０】
図１Ａ（矢印）は、コンゴレッドでの染色後に局在化した光の下で見られるような、アルツハイマー病を有する８６歳の男性の海馬における、３個のマルターゼを通過するアミロイドプラーク（およそ１５〜３０μＭの直径）の存在を実証する（Ｐｕｃｈｔｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１０：３５５−３６４、１９６２）。球形の形状の緻密性アミロイドプラーク、およびマルターゼ通過パターンにおけるそれらの伝統的な赤／アップルグリーンの複屈折（すなわち、赤色が９０度からアップルグリーン色に）が注目される。極性の回転の際には、プラークの色における移動が、赤色がアップルグリーンに変化し、そしてアップルグリーンが赤色に変化するように起こる（従って、用語「赤／アップルグリーンの複屈折」）。図１Ｂは、以前に記載されている（Ｓｎｏｗら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３３：４５６−４６３、１９８８；Ｓｎｏｗら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４４：３３７−３４７、１９９４）ような、パールカンの、２人の神経炎患者のプラーク（図１Ｂ、矢印）およびヒトのアルツハイマー病の脳における小さい毛細血管（図１Ｂ、矢印の先）のアミロイドコアへの免疫局在化を実証する（パールカンコアタンパク質を認識するポリクローナル抗体（Ｈａｓｓｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４４９４−４４９８、１９８０））を使用する）。
【００８１】
試験チューブ中で球形のコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を合成することを試みるために、種々の技術を試験した。予備実験は、緻密性アミロイドプラークの形成が、以下の方法論を使用して、パールカンのみ（そして他のアミロイドプラーク同時構成成分または他の基礎膜構成成分は含まないを用いて起こり得ることを示した。１ｍｇのＡβ  １−４０（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ  ＣＡ）を１ｍｌの２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中に溶解させて、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液を生成した。次いで、２５μｌのＡβ  １−４０ストック溶液を、２０μｇの凍結乾燥させたパールカン（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６に記載されているような、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍から単離された）を含有する微量遠心分離チューブに添加し、次いで、最終容量を２５０μｌにした。Ａβ：パールカンのモル比は、２５０：１であり、そしてＡβ：パールカンの重量比は、１：０．８であった。同様の結果が、１２５ｎｍのパールカンとともに２５μＭのＡβ  １−４０を使用して（すなわち、２００：１のＡβ：パールカンのモル比、１：１のＡβ：パールカンの重量比）、または０．６２５μＭのパールカンとともに１２５μＭのＡβ  １−４０を使用して（すなわち、２００：１のＡβ：パールカンのモル比）観察された。次いで、上記に記載したインキュベーション混合物を、３７℃にてインキュベートした。最初の予備実験は、同様のコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成が、Ａβ＋／−パールカンが２倍の滅菌した脱イオン水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．０）中でインキュベートした場合に、無関係に起こったことを示した。ゴムのアタッチメントを取り付けたガラスピペットを、３７℃でのインキュベーションの前に３０秒間、上下の、穏やかなインキュベーション混合物のピペッティングによって、Ａβ＋／−パールカンを混合するために使用した。１日、３日、５日、および１週間を含む種々のインキュベーション時間後に、インキュベーション混合物の５μｌまたは１０μｌのアリコート（４つのアリコートを１つのスライドから採取した）を採取し、そしてゼラチンでコーティングしたスライド上に配置した（予備実験は、ゼラチンでコーティングしたかまたはリジンでコーティングしたスライドが、染色手順後の風乾させたアリコートを保持するための使用に最良であることを示した）。ガラススライドの裏側を、最初に、エッチングペンを使用して４つの小さい円によって、風乾のためい各スライド上に４つのアリコートを配置する前にエッチングした。それぞれのインキュベーション時間（上記）後、およびガラススライド上へのアリコートの配置の前に、インキュベーション混合物を再度、物質を平らに配置することを確実にするために、穏やかに１５秒間上下にピペッティングした。次いで、ゼラチンでコーティングしたスライド上に配置したアリコートを、室温で一晩風乾させた。次の日に、スライドをコンゴレッド（Ｐｕｃｈｔｌｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１０：３５５−３６４、１９６２）で染���し、そしてカバースライドをかけた。形成された任意のアリコートのプラークコアを、４つの５μｌのアリコート内のプラークコアの数を数えることによって盲目的に定量した。
【００８２】
種々のＡβ：パールカンのモル比および／または重量比でパールカンおよびＡβを使用する最初の研究は、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成が、２つの成分の好ましい範囲内で主に生じることを示した（図１Ｋおよび１Ｌを参照のこと）。この好ましい混合物が、局在化させた光の下で観察したコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの可視化については、２倍の滅菌水中に１００ｎＭのパールカンとともに２５μＭのＡβ  １−４０（すなわち、Ａβ：パールカンのモル比＝２５０：１；Ａβ：パールカン重量比＝１：０．８）（図１）、または２倍の滅菌水中に０．６２５ｎＭのパールカンとともに１２５μＭのＡβ  １−４０（すなわち、Ａβ：パールカンのモル比＝２００：１；Ａβ：パールカン重量比＝１：１）のいずれかであることを決定した（図１Ｋおよび１Ｌ）。平均して３０〜４０個のコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークが、５μｌのアリコートあたりで観察された（表１）。これらの研究に利用したパールカンは、本発明によって１つの項目として以前に記載した（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６（このテキストは本明細書中で参考として援用されている））、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍から単離されたマウスのパールカン（Ｍr＝約８００ｋＤａ）であった。マウスのパールカンは、ヒトのパールカンに対して約８５〜９０％の相同性を有することが公知である（Ｎｏｏｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２９３９−２２９４７；１９９１、Ｍｕｒｄｏｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８５４４−８５５７、１９９２；ＫａｌｌｕｎｋｉおよびＴｒｙｇｇｖａｓｏｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１６：５５９−５７１、１９９２）。パールカン調製物の最終的な純度および質は、アリシアンブルー染色、クマシーブルー染色、銀染色、ならびに以前に記載されるような（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６）、パールカン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびフィブロネクチンに対する抗体を使用する一連のウェスタンブロットによって評価される。本研究において利用されるパールカンは、他の基礎膜構成成分またはＥＨＳ腫瘍によって産生される他のタンパク質／ＰＧによる他のものの混入を含まないことが見出された（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６）。このことは、ＥＨＳ腫瘍に由来するパールカン調製物中へのラミニンの混入が、通常はＡβ繊維形成阻害活性を含むので、重要である（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６）。
【００８３】
上記のようなＡβおよびパールカン混合物を利用する、時間経過の研究（１時間、１日、３日、および７日での分析を用いる）は、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークコアが、即座には形成されず、むしろ、好ましくは、形成を誘導するための、３７℃での、１日以上、または３日から５日間のインキュベーションを必要とすることを明らかにした。より小さいが、おそらく受容可能な結果が、１日から１０日の範囲で可能であるとなお考えられるが、これらの開示される方法においては、７日が好ましいインキュベーション期間である。さらに、アミロイドプラークコアの形成は、Ａβ−４０を使用して明らかであったが、驚くべきことに、Ａβ  １−４２を使用しては、上記に記載するような同じ条件下、または種々の条件（種々の濃度のＡβ  １−４２：パールカンのモル／重量比、ならびに１ヶ月までのインキュベーション時間を含む）を試験することによっても、アミロイドプラークの形成は観察されなかった（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）。
【００８４】
次いで、種々の異なるアミロイドプラークの同時構成成分を、同様のコンゴ好染性のマルターゼ球形アミロイドプラークを形成するそれらの能力について、パールカンと比較した（表１、図１）。これらの研究においては、２５μＭのＡβ  １−４０または１−４２（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を、単独で、または１００ｎＭのＰ成分（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｍr＝２５ｋＤａ）、α1−抗キモトリプシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｍr＝６５ｋＤａ）、ＡｐｏＥ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；ヒト血漿に由来する；Ｍr＝８４ｋＤａ）、Ｃ１ｑ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；多量体形態、Ｍr＝４６０ｋＤａ）、Ｃ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；二量体形態、Ｍr＝１９５ｋＤａ）、ラミニン（Ｓｉｇｍａ；ＥＨＳ腫瘍に由来する、Ｍr＝約８００ｋＤａ）、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ；ウシ血漿に由来する、Ｍr＝約４５０ｋＤａ）、ＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ；ＥＨＳ腫瘍に由来する、Ｍr＝約５４０ｋＤａ）、およびパールカン（ＥＨＳ腫瘍に由来する）（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６）を含有する成分の存在下のいずれかで、３７℃にて１週間の、２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。Ａβ：プラーク同時構成成分のモル比は、２５０：１であった。
【００８５】
図１は、３７℃にて１週間のインキュベーション後に局在化した光の下でゼラチンでコーティングしたスライド上で可視化した場合の、種々のインキュベーション混合物（１００ｎｍの種々のプラーク同時構成成分とともに２５μＭのＡβ  １−４０使用する；２５０：１のＡβ：プラーク同時構成成分の比）による代表的な顕微鏡写真のモンタージュ写真である。Ａβ  １−４０のみでは、一貫して、小さく、そして不ぞろいのコンゴレッドで陽性である沈着物を示した（図１Ｃ、矢印の先）。コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラーク様沈着物の明らかな形成は、なかった。種々のロッドおよび供給源に由来するＡβ  １−４０を利用する２０以上の異なる実験は、同様の不ぞろいのコンゴレッド沈着物を示し、明らかなマルターゼ通過の形成は伴わなかった。Ｐ成分を伴うＡβ  １−４０（図１Ｄ、矢印）、α1−抗キモトリプシンを伴うＡβ １−４０（図１Ｅ、矢印）、またはＡｐｏＥを伴うＡβ  １−４０（図１Ｆ、矢印）は全て、コンゴレッドに陽性の沈着物の凝集した「凝集塊」を生じた。これは、形状は不ぞろいであり、そして明らかなマルターゼ通過形成は示さなかった。Ｃ１ｑを伴うＡβ  １−４０（図１Ｇ、矢印）、Ｃ８を伴うＡβ  １−４０（示さない）、またはラミニンを伴うＡβ  １−４０（図１Ｈ、矢印）だけが、薄い繊維または小さく不ぞろいなコンゴレッドに陽性の沈着物を示した。それにもかかわらず、フィブロネクチンを伴うＡβ  １−４０（図１Ｉ、矢印）、およびＩＶ型コラーゲンを伴うＡβ  １−４０（図１Ｊ）は、形状が不ぞろいであるコンゴレッド沈着物の凝集した「凝集塊」を同様に産生し、そしてマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の存在は含まなかった。一方、パールカンを伴うＡβ  １−４０は、複数（５μｌのアリコートあたり３０個以上のコア）の球形のアミロイドプラークコア様の沈着物を生じた（図１Ｋ、矢印の先）。これは、コンゴレッドに陽性であり、そして伝統的なマルターゼ通過パターンを示した（図１Ｌ、矢印）。これらのプラークは、１０μｍ〜５０μｍまでの直径の範囲であり、平均の直径は２５μｍであり、そしてヒトのアルツハイマー病の脳において観察される緻密性アミロイドプラークと実質的に同一である（図１Ａに対して図１Ｋまたは１Ｌを比較する）。コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラーク沈着物を形成させるための、パールカン（または、以下に記載するような他の高度に硫酸化されたＧＡＧおよび高度に硫酸化されたマクロ分子）による誘導は、明らかに、使用される手順（すなわち、コンゴレッド染色の前のガラススライド上での風乾）の人為的な結果ではない。なぜなら、実質的に同一であるマルターゼが通過するアミロイドプラーク沈着物もまた、インキュベーション混合物を溶液中でコンゴレッドで染色し（すなわち、風乾工程をとばす）、そして局在化した光の下で溶液を可視化した場合に観察されるからである（示さない）。
【００８６】
同様のコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークが、２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、０．６２５μＭのパールカンとともに１２５μＭのＡβ  １−４０を使用して（すなわち、２００：１のＡβ：パールカンのモル比、１：１のＡβ：パールカンの重量比）観察されたが、さらなるアミロイドプラークコアが、スライド上に存在した（より大量のＡβおよおびパールカンに起因する）（示さない）。さらに、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の同様の欠失が、２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、１２５μＭのＡβ  １−４０と０．６２５Ｍの他のプラーク同時構成成分とを使用して観察された（示さない）。
【００８７】
表１は、コンゴ好染性であり、そして球形のマルターゼが通過するアミロイドコア沈着物の誘導についての種々のプラーク同時構成成分を試験する最初の研究をまとめる。Ａβ  １−４０の存在下では、パールカンが、上記のこのような沈着物の形成を誘導することが可能であることに注目する。驚くべきことに、同じ条件下では、Ａβ１−４２は、コンゴ好染性であり、そして球形のマルターゼが通過するアミロイドコア沈着物の産生においては無効であり、このことは、Ａβ  １−４２の２つの疎水性残基が、インビトロでのアミロイドコアの形成を妨げ得ることをしめす。この後者の知見は、緻密性アミロイドプラークの形成が、１−４２のカルボキシル末端での２つの疎水性残基が切断されるまでは、インビボで起こらないようであることを示唆する。緻密性アミロイドプラークの形成が、ほぼおそらく、プラークの発生における後者の事象であるというこの概念は、Ａβ  １−４０（１−４２ではない）が緻密性アミロイドプラークの形成において重要であるようであるという発見ときめて十分に相関する。これは、コンゴレッドで染色し、そして局在化した光の下で可視化した場合のマルターゼ通過を実証する。Ａβのアミノ酸形態１−４０および１−４２（４３）に特異的なモノクローナル抗体を用いて行った研究は、Ａβ  １−４０よりもむしろＡβ  １−４２（４３）が、散在性のプラークおよび神経炎のプラークについて圧倒的に豊富であるが、Ａβ  １−４０（Ａβ  １−４２／１−４３よりもむしろ）が、「コアプラーク」については豊富であることを示した（Ｉｗａｔｓｕｂｏら、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：４５−５３，１９９４；Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４５：４５２−４６０、１９９４）。
【００８８】
【表１】
0004537577.tif 000002
【００８９】
実施例２
高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンによるアミロイドプラークコアの誘導（すなわち、ヘパラン（ｈｅｐａｒａｎ）硫酸およびヘパリン）
パールカンがヘパラン硫酸のクラスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含むことが公知であるので、次の研究を、ヘパラン硫酸および／または他の硫酸化ＧＡＧもまたコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を誘導し得るかどうかを決定するために行った。以前の研究は、ヘパラン硫酸ＧＡＧの他に、多数のＧＡＧの他のクラス（ＰＧ（特に、デコリン）（Ｓｎｏｗら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、４０：１０５−１１３、１９９２）、ケラタン硫酸ＰＧ（特に、シナプトグリカン）（Ｓｎｏｗら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３８：３０５−３１７、１９９６）、およびコンドロイチン硫酸ＧＡＧ（ＤｅＷｉｔｔら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２１：１４９−１５２、１９９３）を含むデルマタン硫酸を含む）が、ヒトのアルツハイマー病の脳におけるアミロイドプラークと関連することが、見出されている。従って、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、およびデルマタン硫酸を含む硫酸化ＧＡＧもまた、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を誘導するそれらの潜在的な能力において試験した。最初に、種々の条件（すなわち、濃度、Ａβ：硫酸化ＧＡＧ／硫酸化マクロ分子のモル／重量比、インキュベーション時間）を、ヒトのアルツハイマー病の脳において観察される球形のコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を倍加する努力において試験した。
【００９０】
２５μＭのＡβ  １−４０またはＡβ  １−４２（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を、２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中で、単独で、または種々の量のヘパリン（Ｓｉｇｍａ；腸粘膜に由来する；Ｍr＝５ｋＤａ）、ヘパリン硫酸（Ｓｉｇｍａ；ウシの腎臓に由来する；Ｍr＝２５ｋＤａ）、コンドロイチン−４−硫酸（Ｓｉｇｍａ；気管に由来する；Ｍr＝３１ｋＤａ）、コンドロイチン−６−硫酸（Ｓｉｇｍａ；気管に由来する；Ｍr＝５４ｋＤａ）、およびデルマタン硫酸（Ｓｉｇｍａ；粘膜に由来する；Ｍr＝１６ｋＤａ）の存在下のいずれかで、インキュベートした（表２）。実施例１に記載のように、１週間で、インキュベーション混合物の５μｌのアリコートを、ゼラチンでコーティングしたスライド上で風乾させ、コンゴレッドで染色し、そして局在化した光のもとで可視化した。形成されたコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークを、４つの５μｌのアリコートのそれぞれ中のプラークの数を数えることによって定量した。種々の異なる重量および／またはモル比を、１）他の硫酸化ＧＡＧもまたコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークコアの形成を誘導し得るかどうか、および２）このような誘導のための最適なＡβ：硫酸化ＧＡＧモル／重量比がいくらであるかを決定するために、予備実験において最初に試験した（ヘパリン硫酸の重量比の研究については表３を参照のこと）。
【００９１】
図２Ａ（矢印）は、家族性のアルツハイマー病を有する４６歳の男性の鳥距皮質中の２つのコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの存在を、コンゴレッド（対比染色を用いない）での染色および局在化した光の下での可視化後に、実証する。脈管障害を示す血管のすぐ近く（図２Ａ、矢印の先）でもまた、示される）。図２Ｂ（矢印）に示すように、１週間の３７℃でのインキュベーション後に、Ａβ  １−４０は単独では、小さくそして不ぞろいなコンパクトなコンゴレッドで陽性である沈着物を一貫して示し、明らかなマルターゼ通過の形成はなかった。一方、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成が、適切な条件下で、ヘパリン（図２Ｃ、矢印）およびヘパリン硫酸ＧＡＧ（図２Ｄ、矢印）の両方によって誘導された。コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成のために好ましいＡβ：ヘパリンのモル比が、約１：５（２５μＭでＡβ  １−４０を用いる）であることを見出した。一方、マルターゼが通過するアミロイドプラークの形成のために好ましいＡβ：ヘパリン硫酸のモル比は、１：８（すなわち、４００μｇのヘパラン硫酸を含む１００μｌの２倍の滅菌水中に５０μｇのＡβ  １−４０）であることを見出した（表２および３）。同様のコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を、上記と同じモル比または重量比でのヘパリンおよびヘパリン硫酸については、１２５μＭでＡβ  １−４０を用いて、観察した（示さない）。上記と同じモル比および／または重量比を使用しては、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成は、コンドロイチン−４−硫酸（示さない）、コンドロイチン−６−硫酸（示さない）、またはデルマタン硫酸（図２Ｅ、矢印）を用いては観察されなかった。このことは、高度に硫酸化されたＧＡＧはアミロイドプラークコアの形成の誘導に主に有効であることを示す。パールカンを用いて観察されるように、ヘパリンおよびヘパラン硫酸ＧＡＧは、Ａβ  １−４０とともにインキュベートした場合には、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークコアの形成のインデューサーとして有効であるが、Ａβ  １−４２を使用する場合には、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークコアの形成は、同じ条件下では観察されなかった（表２）。
【００９２】
【表２】
0004537577.tif 000003
【００９３】
実施例３
他の硫酸化したマクロ分子（すなわち、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸、およびポリビニルスルホネート）による緻密性アミロイドプラークの形成の誘導
ヘパリンおよびヘパリン硫酸ＧＡＧのような高度に硫酸化されたＧＡＧによる緻密性アミロイドプラーク形成の誘導は、ＧＡＧの硫酸含量が、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成に重要であり得ることを示唆する。従って、次の研究によって、同様のアミロイドプラークの誘導が、他の高度に硫酸化されたマクロ分子によってもまた誘導され得るという仮設を試験した。従って、他の高度に硫酸化されたマクロ分子（デキストラン硫酸（比較のために硫酸化されていないデキストランを用いる）、ペントサンポリ硫酸、コンゴレッド、およびポリビニルスルホネートを含む）を、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成をもまた誘導するそれらの潜在的な能力において試験した。これらの研究のために、２５μＭのＡβ  １−４０またはＡβ  １−４２（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を、２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、３７℃にて１週間、単独で、または種々の量のデキストラン硫酸（Ｓｉｇｍａ；Ｍr＝８ｋＤａ）、硫酸化されていないデキストラン（Ｓｉｇｍａ；Ｍr＝１１．３ｋＤａ）、ペントサンポリ硫酸（Ｓｉｇｍａ；Ｍr＝３ｋＤａ）、コンゴレッド（Ｓｉｇｍａ；Ｍr＝０．７ｋＤａ）、ポリビニルスルホネート（Ａｌｄｒｉｃｈ；水中で２５重量％）、および無機の硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ；Ｍr＝０．１４２ｋＤａ）の存在下のいずれかで、インキュベートした。実施例１に記載のように、１週間で、インキュベーション混合物の５μｌのアリコートを、ゼラチンでコーティングしたスライド上で風乾させ、コンゴレッドで染色し、そして局在化した光のもとで可視化した。種々の異なる重量および／またはモル比を、１）他の硫酸化されたマクロ分子もまたコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークコアの形成を誘導し得るかどうか、および２）このような誘導のための最適なＡβ：硫酸化ＧＡＧモル／重量比がいくらであるかを決定するために、予備実験において最初に試験した（ポリビニルスルホネートの研究については表３を参照のこと）。
【００９４】
コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成は、試験した任意の濃度では、コンゴレッド（図２Ｆ、矢印、１：５のＡβ：コンゴレッドのモル比）または無機硫酸塩（示さない）を用いては観察されなかった。しかし、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸、およびポリビニルスルホネートは全て、適切な条件下でのコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成のインデューサーとして有効であった（表２；表３）。図２Ｇ（矢印）に示すように、１：５の好ましいＡβ：ペントサンポリ硫酸のモル比（２５μＭまたは１２５μＭでＡβを維持する）では、ペントサンポリ硫酸は、３７℃で１週間のインキュベーション後に、コンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を誘導した（平均して５μｌのアリコートあたり３０〜５０個のコア）。デキストラン硫酸もまた、１：５の好ましいＡβ：デキストラン硫酸のモル比（２５μＭまたは１２５μＭでＡβを維持する）で使用した場合に、緻密性アミロイドプラークの形成の誘導において非常に有効であった（平均して５μｌのアリコートあたり５０個以上のコア）。図２Ｈ（矢印の先）および図２Ｉに示すように、デキストラン硫酸が誘導する、マルターゼの通過を伴うコンゴ好染性のアミロイドプラークの形成は、ヒトのアルツハイマー病の脳中のコンゴレッドに陽性である緻密性アミロイドプラークと実質的に同一である（図２Ａに対して図２Ｈを比較する）。一方、硫酸化していないデキストランは、アミロイドプラークの形成を誘導しなった。このことは、硫酸部分が重要であることを再度強調する（示さない）。
【００９５】
アミロイドの沈着／形成の阻害についての可能性のある治療薬であることが以前に主張された、ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）（Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１４３−１４８、１９９５）もまた、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの沈着物を形成するその潜在的な能力において試験した。なぜなら、ＰＶＳもまた、高度に硫酸化された化合物であるからである。これらの研究については、漸増量のＰＶＳ（Ａｌｄｒｉｃｈの２５％溶液ｗ／ｖ）を、緻密性アミロイドプラークの形成の能力についての最適なＡβ：ＰＶＳ重量比を決定するために使用した（表３）。より詳細には、５０μｇのＡβ  １−４０（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を、１００μｌの２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、３７℃にて１週間、単独で、または漸増量のＰＶＳ（２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、４００μｇ、８００μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、および４ｍｇ）の存在下のいずれかで、インキュベートした（図３；表３）。従って、これらの研究についてのＡβ：ＰＶＳの重量比は、２：１から１：８０までの範囲であった。実施例１に記載のように、１週間で、インキュベーション混合物の５μｌのアリコートを、ゼラチンでコーティングしたスライド上で風乾させ、コンゴレッドで染色し、そして局在化した光のもとで可視化した。
【００９６】
図３に示すように、２：１（図３Ａ、矢印の先）または１：１のＡβ：ＰＶＳの重量比が、５μｌのアリコートの周辺で主にアミロイドのコンゴ好染性の沈着を示した。ほんのわずかな複屈折のみが、それぞれの５μｌのアリコートの中心において観察され（図３Ａおよび３Ｂ）、このことは、最少のアミロイドの形成を示唆し、そしてアミロイドの凝固は明らかではなかった。コンゴ好染性であるアミロイド沈着の凝固における増大が、漸増量のＰＶＳを用いて、詳細には、１：２（示さない）および１：４（図３Ｃ）のＡβ：ＰＶＳ重量比を用いて観察された。一旦、１：５のＡβ：ＰＶＳ重量比（すなわち、１００μｌの全容量中の５０μｇのＡβおよび２５０μｇのＰＶＳ）に到達すると、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成が観察された（図３Ｄ）。漸増量のＰＶＳは、Ａβアミロイド沈着物の凝集および出現における一般的な形態学的な変化を誘導することが明らかであり、その結果、多数のコンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークが、最終的に形成された（表３、図３Ｅ−Ｈ）。１：８、１：１０、および１：１６のＡβ：ＰＶＳ重量比を、それぞれ、図３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇに示す。最適な数（５μｌのアリコートあたり５０個以上のコア）のコンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークを、１：４０のＡβ：ＰＶＳの重量比で観察した（図３Ｈ、矢印の先）。ＰＶＳによって誘導されるアミロイドプラークコアの数における増大を、なおより多数のＰＶＳ（すなわち、１：８０のＡβ：ＰＶＳ重量比）を用いて観察した（図３Ｉ）。このことは、最適なアミロイドプラークコアの形成を観察するための種々の成分の混合についての最適な比が存在することを、実証する。これらの研究は、再度、Ａβ：硫酸化マクロ分子の重量／モル比が、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の誘導に重要であることを実証した。
【００９７】
【表３】
0004537577.tif 000004
【００９８】
実施例４
Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍からのパールカンの単離の間に得られる約２２０ｋＤａのヘパラン硫酸プロテオグリカンによる、アミロイドプラークの形成の誘導
本発明者らの以前の研究は、パールカンが、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍から効率よく単離され得ることを実証した（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６）。これらの研究の経過の間に、本発明者らは、約２２０ｋＤａの凝集性のＰＧを同定した。これは、ゲル濾過クロマトグラフィーによってパールカンから分離され得る。この特定のＰＧは、ヘパリチナーゼ／ヘパリナーゼ消化研究によって実証されるように、ヘパリン硫酸ＧＡＧ鎖を含むことが見出された（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４３３−４４４、１９９６）。この特定のＰＧはまた、アリシアンブルー（Ｂｊoｒｎｓｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：２８２−２９１、１９９６）を使用して実証されるように、ヘパリン硫酸ＧＡＧ中に豊富であることが見出されたので、本発明者らはまた、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の誘導する可能性についても試験した。この研究のためには、５０μｇのＡβ  １−４０（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を、１００μｌのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、３７℃にて１週間、単独で、または１０μｇ（アリシアンブルーアッセイを使用して決定した）（Ｂｊoｒｎｓｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：２８２−２９１、１９９３）の２２０ｋＤａのＨＳＰＧ（５：１のＡβ：ＨＳＰＧ重量比）の存在下のいずれかで、インキュベートした。実施例１に記載のように、１週間で、インキュベーション混合物の５μｌのアリコートを、ゼラチンでコーティングしたスライド上で風乾させ、コンゴレッドで染色し、そして局在化した光のもとで可視化した。
【００９９】
図４Ｂ（矢印の先）に示すように、約２２０ｋＤａのＨＳＰＧもまた、コンゴ好染性であるアミロイドプラークの形成のインデューサーとして極めて有効であった（５μｌのアリコートあたり５０個以上のアミロイドプラークコアを産生する）。漸増濃度（すなわち、最終容量１００μｌ中に５０μｇまたは１００μｇ）のＥＨＳの約２２０ｋＤａのＨＳＰＧは、なおより多数のコンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークを産生することが明らかであった（示さない）。この研究は、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の誘導についての別のＨＳＰＧの使用を実証した。
【０１００】
実施例５
コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の誘導についての硫酸部分の重要性
従って、ずっと記載してきたこの研究は、ＧＡＧまたは他のマクロ分子の硫酸部分が、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の誘導に重要であることを示唆する。この仮説をさらに試験するために、次の研究によって、アミロイドプラークの形成をもまた誘導するそれらの能力について、改変したヘパリンを分析した。２５μＭのＡβ  １−４０（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を、２倍の滅菌水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、３７℃にて１週間、単独で、またはヘパリン（Ｓｉｇｍａ；腸粘膜に由来する；Ｍr＝５ｋＤａ）、完全に脱硫酸化された、Ｎ硫酸化ヘパリン（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ；Ｍr＝５ｋＤａ）、Ｎ−脱硫酸化、Ｎ−アセチル化ヘパリン（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ；Ｍr＝５ｋＤａ）、および完全に脱硫酸化された、Ｎ−アセチル化ヘパリン（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ；Ｍr＝５ｋＤａ）の存在下のいずれかで、インキュベートした。実施例１に記載のように、１：５のＡβ：ヘパリン／改変したヘパリンのモル比を、以前に記載したように使用した。１週間で、インキュベーション混合物の５μｌのアリコートを、ゼラチンでコーティングしたスライド上で風乾させ、コンゴレッドで染色し、そして局在化した光のもとで可視化した。
【０１０１】
表２（図２Ｃ）に示すように、ヘパリンは、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を誘導した（図２Ｃを参照のこと）。しかし、ヘパリンからの硫酸部分の除去（すなわち、完全に脱硫酸化した、Ｎ−アセチル化ヘパリン）は、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するプラークの形成の完全な欠失を生じた。緻密性アミロイドプラークの形成を誘導するヘパリンの能力の同様の欠失がまた、Ｏ−硫酸基をヘパリンから除去した（すなわち、完全に脱硫酸化したＮ−硫酸化ヘパリン）場合に観察された。しかし、Ｎ−脱硫酸化したＮ−アセチル化ヘパリン（すなわち、Ｎ−硫酸の除去）を使用した場合は、アミロイドプラークの形成はなお観察された。このことは、アミロイドプラークの誘導についてのＯ−硫酸基の重要性を示唆する。この研究によって、ＧＡＧの硫酸部分がコンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成に重要であることを確認した。
【０１０２】
実施例６
単離したヒトのアルツハイマー病のアミロイドプラークコア中に形成された緻密性アミロイドプラークと、透過性電子顕微鏡研究との比較
パールカン、高度に硫酸化されたＧＡＧ、または関連する硫酸化されたマクロ分子とのＡβ  １−４０のインキュベーション後に形成されたアミロイドプラークは、光学顕微鏡レベルでは、ヒトのアルツハイマー病の脳の中に存在するコンゴ好染性であるアミロイドプラークに対しては非常に類似するようである。コンゴレッドで染色し、そして局在化した光の下で可視化した場合には、両方の型のプラーク（すなわち、インビトロで形成されたプラークおよびアルツハイマー病の脳中に存在するプラーク）が、球形の形状であり、そして伝統的なマルターゼ通過（互いに９０度に向きを調節された、赤色およびアップルグリーン色を有するプラーク）を示した。次の研究においては、透過性の電子顕微鏡を、インビトロで形成されたアミロイドプラークに対してヒトのアルツハイマー病の脳から単離されたアミロイドプラークコアの超構造的な形態を比較するために、利用した。１）インビトロで人工的に産生されたアミロイドプラークコアが、ヒトのアルツハイマー病の脳から単離されたアミロイドプラークコアと同様の「アミロイドスター」超構造的形態学を有するかどうか、および２）インビトロで人工的に産生されたアミロイドプラークコア中の個々のアミロイド繊維の直径が、ヒトのアルツハイマー病のプラーク中に存在するアミロイド繊維と同様であるかどうか、を決定することが、重要である。
【０１０３】
これらの研究のために、神経炎のプラークのコアを、ヒトのアルツハイマー病の脳から、確立された方法（Ｓｅｌｋｏｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４６：１８２０−１８３４、１９８６）の改変（Ｄｅｗｉｔｔら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８）を使用することによって単離した。アミロイドプラークを含むことが確認されたアルツハイマー病の症例の前頭葉および側頭葉の皮質を、使用した。血管、髄膜、および白質を注意深く除去し、その後、組織を十分に細かく刻み、そして５倍容量の、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中の２％のＳＤＳ中で室温にて２時間インキュベートし、続いて、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（ｐｅｓｔｌｅ  Ａ）（Ｋｏｎｔｅｓ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）中での２０回のストロークによってホモジナイズした。次いで、ホモジネートを、１００℃にて１０分間加熱し、そして１００μＭのナイロンメッシュを通してふるいにかけた。８００×ｇで３０分間の遠心分離によって得られたペレットを、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ3中で洗浄し、そして３００×ｇで１０分間、再度遠心分離した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（ｐｅｓｔｌｅ  Ａ）を使用して得られたペレットを、５ｍｌの０．１％のＳＤＳ緩衝液（およそ５ｍｌ）中でホモジナイズし、そして３５μＭのナイロンメッシュを通してふるいにかけた。続いて、物質を、１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）中に溶解させた１．２Ｍ、１．４Ｍ、１．６Ｍ、および１．８Ｍのスクロースから構成された不連続な層の勾配上でロードした。７２，０００×ｇで６０分間の遠心分離後、全ての界面で物質を回収し、そして５倍容量の、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）中の０．１％のＳＤＳで稀釈し、そして３００×ｇで３０分間遠心分離した。各ペレットを、コンゴレッドでの染色によって老人性プラークのコアについてアッセイした（Ｐｕｃｈｔｌｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１０：３５５−３６４、１９６２）。ほとんどのアミロイドコアプラークは、以前に記載された（Ｓｅｌｋｏｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４６：１８２０−１８３４、１９８６））ように、１．４／１．６界面で見出された。次いで、１．４／１．６の界面に由来するサンプルを、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰ１ＣＳ細胞分離装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌｏｒｉｄａ）上でロードした。コアを、３×チップを通じる１４２８粒子／秒の流速で、移動させた。４８８ｎｍで最大の励起を有するアルゴンレーザーを、側面の散乱に基づく分類のために使用した。プラークコアを、大きさ（１２〜５０μＭ）に基づいて選択した。上記の方法によって得られたアミロイドプラークコアは、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｐｅｒｒｙ博士、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ大学、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡから寛大に譲りうけた。
【０１０４】
１２５μＭのＡβ  １−４０を、２倍の滅菌水中で、３７℃にて１週間、単独で、または０．６２５μＭのパールカンの存在下のいずれかで、インキュベートした（２００：１のＡβ：パールカンのモル比；１：１のＡβ：パールカンの重量比）。各サンプルの１０μｌのアリコート（上記で単離したヒトのアルツハイマー秒のプラークコアのサンプルを含む）を、プラスチックのペトリ皿上で１時間風乾させた。エッチングペンでそれぞれの乾燥したスポットを裏側から円で囲った後、サンプルを、０．１ＭのＮａＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．３）中の３％のグルタルアルデヒドで１０分間、固定した。濾過した水で３回リンスした後、次いで、サンプルを、滅菌水中の１％のオスミウムで１０分間、急いで固定し、上記のようにリンスし、そして一晩風乾させた。光学顕微鏡レベルでのペトリ皿上のサンプルの試験および画像化（図４）後、サンプルを、無水エタノールで３回洗浄し、エポキシ樹脂（Ｍｅｄｃａｓｔ，Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）で濾過し、そして６５℃にて４８時間重合化させた。冷却し、そして重合化したプラスチックの表面に対して位置を決定した円を移した後、プラスチック皿を、包埋したサンプルから分離した。表面の８０〜１００ｎｍの切片をサンプルの領域から採取し、ホルムバー（ｆｏｒｍｖａｒ）でコーティングした１００メッシュの銅格子、または裸の２００メッシュの格子上に載せた。切片を、７％の水溶性の酢酸ウラシルで染色し、続いてクエン酸塩を読み取り（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２０８−２１２、１９６３）、そしてＪＥＭ  １２００  ＥＸ１１（ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて８０ｋＶの加速電圧を使用して試験し、そして写真を撮った。
【０１０５】
図５に示すように、パールカンとのＡβ  １−４０の１週間の同時インキュベーションによって、球形のアミロイドプラーク様沈着物を産生した。多数のアミロイドプラーク様沈着物が、Ｏｌｙｍｐｕｓ光学顕微鏡を使用して可視化した場合に、包埋したプラスチック中に存在した（図５Ａおよび５Ｂ、矢印の先）。パールカンによって誘導されたアミロイドプラーク様沈着物は、球形の形状であり（図５Ａおよび５Ｂ、矢印の先）、そしてなお、光学顕微鏡によって、中心的な光源から放射される繊維の放射されている束状構造から構成されることを、明らかにした。ヒトのアルツハイマー秒の脳から単離され、そして上記のプラスチック中に包埋されたアミロイドプラークは、パールカンによって誘導されるものに、外観上は、非常に類似した（示さない）。Ａβ  １−４０のみのサンプルは、任意のこのような球形のプラーク様の出現は実証しなかった（示さない）。
【０１０６】
透過性の電子顕微鏡は、ヒトのアルツハイマー病の脳から単離された沈着物と、パールカンによって誘導されたアミロイドプラーク様沈着物の超構造的な類似性を示した（図６）。パールカンをともなうＡβ  １−４０の１週間のインキュベーション後に形成されたアミロイドプラーク沈着物の超構造的形態学は、アルツハイマー病の脳の顕微鏡観察によって単離されたものと実質的に同一であった。図６Ａおよび６Ｃは、アルツハイマー病を有するヒト患者の皮質に由来する、単一のアミロイドプラークコアの超構造的な出現を実証した。ヒトのプラークの「アミロイドスター」の出現が、プラークの中心からの放射を生じるように見える放射しているアミロイド繊維の束状構造を伴うことに、注目する（図６Ａ）。同様の「アミロイドスター」の超構造的形態学がまた、パールカンを伴うＡβ  １−４０の１週間のインキュベーション後に、観察された（図６Ｂ）。これらの沈着物はまた、緻密性であり、球形の形状であり、そしてプラークの中心からの放射を生じるように見える放射しているアミロイド繊維（従って、「スター」形状の外観）から構成される。人工的に産生されたアミロイドプラークにおける実際の差異は、それがしばしば、冠、コアの周辺部を含むことである（図６Ｂを参照のこと）。ヒトのアルツハイマー病のプラーク内の個々のアミロイド繊維、およびパールカンを伴うＡβが産生したプラークの直径は、両方とも、７〜１０ｎｍであることを決定した（１００，０００倍の倍率で可視化した際に繊維を測定することによって）。同様の「アミロイドスター」超構造的形態学をまた、デキストラン硫酸とのＡβ  １−４０（１：５のＡβ：デキストラン硫酸のモル比）、ならびにパールカンおよびデキストラン硫酸とのＡβ  １−４０（組み合わせ同時インキュベーションの詳細については、実施例９を参照のこと）の１週間の同時インキュベーション後に観察した。これらの超構造的研究は、パールカンおよび／または高度に硫酸化されたマクロ分子によって誘導されたアミロイドプラークが、ヒトのアルツハイマー病の脳中に存在する「アミロイドスター」プラークと実質的に同一であることを実証した。さらに、パールカン、硫酸化されたＧＡＧ、または関連する硫酸化されたマクロ分子との、Ａβ  １−４０のインキュベーション後に形成された「アミロイドスター」超構造的外見は、光学顕微鏡レベルで行われた観察と十分に相関する（すなわち、コンゴレッドでの染色および局在化した光の下での可視化後にマルターゼが通過する）。
【０１０７】
実施例８
単離されたヒトのアルツハイマー病のアミロイドプラークコアに対する、人工的なアミロイドプラークコアの比較：走査電子顕微鏡研究
次の研究においては、走査電子顕微鏡を、ヒトのアルツハイマー病の脳から単離されたアミロイドプラークコアと、パールカンまたは他の硫酸化されたマクロ分子によってインビトロで誘導されたアミロイドプラークコアとの間に、表面地形学における類似性が存在するかどうかを決定するために、利用した。この研究においては、１２５μＭのＡβ  １−４０（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ）を、２倍の滅菌水中で、３７℃にて１週間、単独で、または０．６２５μＭのパールカン（２００：１のＡβ：パールカンのモル比；１：１のＡβ：パールカンの重量比）またはデキストラン硫酸（１：５のＡβ：デキストラン硫酸のモル比）の存在下のいずれかで、インキュベートした。さらに、０．６２５μＭのパールカンを単独で、３７℃にて１週間インキュベートした。比較を、アルツハイマー病の脳に由来するアミロイドプラークコアに対して行った（単離手順については、実施例７を参照のこと）。２倍の滅菌した脱イオン水中の各サンプルの１０μｌのアリコートを、新たに切断したマウスの四角上で１時間風乾させた。次いで、乾燥したサンプルを、０．１ＭのＮａＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．３）中の３％のグルタルアルデヒドで１０分間、固定した。濾過した滅菌水で３回リンスした後、次いで、サンプルを、滅菌水中の１％のオスミウムで１０分間、急いで固定し、上記のようにリンスし、そして再度、風乾させた。次いで、四角を、銀ペーストを含み、そして１０〜２０ｎｍのＡｕ／Ｐｄで沫コーティングしたアルミニウムＳＥＭ台座上に載せた。次いで、サンプルを、ＪＳＭ  ６３００Ｆ（ＪＯＥＬ  Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）走査電子顕微鏡を用いて、１５ｋｖの加速電圧および３０℃の傾斜を使用して試験し、そして写真を撮った。
【０１０８】
図７Ａに示すように、ヒトのアルツハイマー病の脳に由来するアミロイドプラークコアは球形の形状であり、そしていくらかくしゃくしゃの表面形態を含んだ。ヒトのアミロイドプラークコアは、通常は、１５〜３０μＭの直径であった。Ａβ  １−４０は、単独で、３７℃での１週間のインキュベーション後に、変更しているパターン中の船員束上構造を示した（図７Ｂ）。球形のアミロイドプラークコア様構造は存在しない。パールカンは、単独では、不規則な形状である、小さな球形の構造を示し（図７Ｃ）、そしてまた、アミロイドプラーク様沈着物の明らかな形成がないことを示した。しかし、Ａβ  １−４０のパールカンとの１週間の同時インキュベーション後に、球形のアミロイドプラーク様構造が観察された（図７Ｄおよび７Ｅ）。ヒトのアルツハイマー病の脳に由来するアミロイドプラークコアと比較すると、パールカンをともなうＡβ  １−４０が、同様の球形（通常は、２０〜４０μＭの直径）であったが、ヒトのアミロイドプラークコアのくしゃくしゃの表面よりはいくらか平坦な表面地形を含んだ。さらに、多くの例においては、パールカンによって人工的に誘導されたアミロイドプラークコアは、表面からはみ出している顕著な球形の構造を有した（図７Ｄおよび７Ｅ）。デキストラン硫酸をともなうＡβ  １−４０は、３７℃での１週間のインキュベーション後には、ヒトのアミロイドプラークコアと非常によく似た表面地形を示し、両方が、非常にくしゃくしゃの表面地形を含んだ。デキストラン硫酸が高度に硫酸化されたマクロ分子であることが公知であるので、デキストラン硫酸によって誘導されたものに似ているヒトのアミロイドプラークコアのくしゃくしゃの形態は、硫酸が、くしゃくしゃの表面の観察の重要であり得ることを示唆する。それにもかかわらず、これらの研究は、球形のアミロイドプラークコア様沈着物が、パールカンまたは高度に硫酸化されたマクロ分子（例えば、デキストラン硫酸）によって誘導され、そして光学顕微鏡レベルで行われる観察と、透過性の電子顕微鏡による観察とが十分に相関することを示唆する。
【０１０９】
実施例９
Ａβ、およびパールカン、および硫酸化されたマクロ分子による緻密性アミロイド形成
パールカンとのＡβ  １−４０の１週間の同時インキュベーションによる、コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成の他に、さらに複数の研究が、安定な緻密性プラーク沈着物もまた、組み合わせインキュベーションによって得られ得ることを示した。例えば、パールカンおよび硫酸化されたマクロ分子をともなうＡβ  １−４０は、本明細書中に記載されると同様の緻密性プラーク沈着物をもまた生じるようである。このような研究においては、１２５μＭのＡβ  １−４０（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃ，ＣＡ）を、２倍の滅菌水中で、３７℃にて１週間、０．６２５μＭのパールカン（２００：１のＡβ：パールカンのモル比；１：１のＡβ：パールカンの重量比）、およびデキストラン硫酸（Ｓｉｇｍａ；Ｍr＝８ｋＤａ）またはペントサンポリ硫酸（Ｓｉｇｍａ；Ｍr＝３ｋＤａ）（１：５のＡβ：デキストラン硫酸またはＡβ：ペントサンポリ硫酸のモル比）の存在下で、インキュベートした。さらに、０．６２５μＭのパールカンを単独で、３７℃にて１週間インキュベートした。実施例１に記載のように、１週間で、インキュベーション混合物の５μｌのアリコートを、ゼラチンでコーティングしたスライド上で風乾させ、コンゴレッドで染色し、そして局在化した光のもとで可視化した。コンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を、パールカンおよびデキストラン硫酸をともなうＡβ  １−４０、またはパールカンおよびペントサンポリ硫酸をともなうＡβ  １−４０の全てのサンプル中で観察した。同様のコンゴ好染性であるマルターゼが通過するアミロイドプラークの形成を、パールカンおよびコンドロイチン−４−硫酸をともなうＡβ  １−４０（１：５のＡβ：Ｃ−４−Ｓのモル比）の、３７℃で１週間のインキュベーション後になお観察した。これらの研究は、硫酸化されたＧＡＧまたは硫酸化されたマクロ分子（すなわち、デキストラン硫酸またはペントサンポリ硫酸）の、パールカンをともなうＡβ  １−４０への添加が、インビトロでの緻密性プラークの形成をなお生じることを実証した。このことは、１）形成されるアミロイドプラークの安定性、および２）硫酸化された分子がこのようなコンゴ好染性であるマルターゼが通過する緻密性アミロイドプラークの形成を妨害しないようであることを、示す。
【０１１０】
実施例１０
インビトロで形成されたコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークの特徴
パールカンまたは硫酸化ＧＡＧ（すなわち、ヘパリンおよびヘパリン硫酸）または硫酸化されたマクロ分子（すなわち、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸、およびポリビニルスルホネート）との、Ａβ  １−４０の１週間のインキュベーションによって形成されたコンゴ好染性のマルターゼが通過するアミロイドプラークが、溶液（水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）中で非常に安定であることが見出され、そして溶液中での８週間後にもなお変化していないことを、見出した。さらに、予め形成された緻密性アミロイドプラークを使用する予備実験は、これらのプラークが、以前に記載された技術（Ｓｎｏｗら、Ｎｅｕｒｏｎ  １２：２１９−２３４、１９９４）を使用して、１または２週間の注入後に、げっ歯類の脳中で良好に浸出され得ることを、実証した。これらの後者の研究は、本明細書中に記載される方法論によって産生される緻密性アミロイドプラークの安定性だけではなく、インビボで抗プラーク治療薬をスクリーニングおよび同定するための、新規の動物モデルの開発のための、これらのアミロイドプラークの使用をもまた、示唆する。
【０１１１】
本発明のさらなる側面と用途
抗プラーク治療薬の判定用の利用
ここで記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成したコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークはアルツハイマー病あるいはプリオン病の治療における主要化合物としての抗プラーク治療薬を判定するスクリーニング方法のために使用することができる。好ましい実施例においてこのようなスクリーニング方法は放射線標識をしたアミロイドタンパク質（ＡβまたはＰｒＰ）、ＰＧ、硫酸化ＧＡＧ、硫酸化あるいは陰イオン性高分子、あるいはその断片を使用するであろう。好ましい実施例においてこのＡΒ１−４０あるいはＰｒＰは放射性ヨード（すなわち125Ｉ）のような放射線標識に結合している。しかし、その他の適当な標識試薬および技法も用いることができ、例をあげると、これに限定するわけではないが、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、あるいは抗原標識がある。同位体の中では、このＡΒまたはＰｒＰタンパク質あるいはその断片へと取り込むことのできるいかなる放射性物質を用いてもよい。好ましい同位体の例をあげると、これに限定するわけではないが、125Ｉ、129Ｉおよび131Ｉがある。131Ｉは半減期がより短くエネルギーレベルがより高い。ヨウ素の放射性同位元素は酸化的ヨウ素化によってこのタンパク質あるいはタンパク質断片へと取り込むことができる。また放射性ヨウ素はＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を使用し、３−ヨード−４−ヒドロキシフェニルプロピオニルあるいは８，６−ジヨード−４−ヒドロキシプロピオニル基をペプチド中の求核試薬に添加することによって取り込むことができる。
【０１１２】
その他の同位体もまた求核基あるいはペプチドとの反応によって取り込むことができる。例えばトリチウム（3Ｈ）はプロピオニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により取り込むことができ、あるいは放射性硫黄（35Ｓ）は同様の試薬により取り込むことができる。33Ｓを使用してＧＡＧあるいは硫酸化高分子を当該分野で知られた技法を用いて標識化することによってもまた下記に記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたアミロイドプラークコアを標識化しモニターすることができる。放射性リン（12Ｐ）は酵素法により取り込むことができる。さらに様々な放射性金属イオン、例えば99ｍテクネチウムなど、もまた、もし適当なキレート基を最初に添加するならば、ＡβあるいはＰｒＰ、あるいはそれらの断片の中に取り込むことができる。
【０１１３】
本発明に従う、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を用いた検知において、酵素標識もまた有用である。好ましい酵素標識としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼあるいはアルカリ性ホスファターゼなどのホスファターゼがある。
【０１１４】
抗体と結合する抗原基を添加することによりペプチドあるいはペプチド断片を修飾することにより、ペプチドあるいはペプチド断片自身を直接検出することができる。例えば抗原ジゴキシゲニンはペプチドと結合することができ、ついで標識化ジゴキシゲニン特異性抗体、あるいは標識化抗抗体によって可視化される。
【０１１５】
放射性同位元素よりも感度は下がるが、蛍光体もまたＡβあるいはＰｒＰペプチドに取り込むことができ、既知の蛍光検出技法によって検出することができる。適した蛍光体の例としてはフルオレセイン、テキサスレッドなどがあげられる。
【０１１６】
ジオキセタンなどの直接あるいは間接の化学発光標識もまた本発明に従い使用することができ、例えばＡβあるいはＰｒＰペプチドは分解するときに光りを発することのできる基を用いて修飾される。
【０１１７】
さらに、アビジン−ビオチンシステムをＡｖｗ−ｒあるいはＰｒＰペプチドあるいはペプチド断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析において検出するのに使用することもできる。例えば、ペプチドあるいは断片にビオチン官能性を与え、アビジンあるいはストレプタビジンを加えてこのタンパク質あるいは断片を検出する。
【０１１８】
このＡβあるいはＰｒＰを上記に記載のように適切に標識した後、これをここに記載のようにＰＧ、ＧＡＧ、硫酸化あるいは陰イオン性高分子と共に一週間３７℃でインキュベートし、コンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを形成する。標識されたプラークに対しては、その染色および構造上の特徴が標識なしに形成されたアミロイドプラークと同じであることを確認するためにテストをまず行う。適当な標識技法を行った後のプラークの安定性を確認するためのパラメータとしては下記のものがあげられる：
ａ）形成されたプラークの球状の、すなわち緻密な形状、ｂ）コンゴレッドで染色した後偏光のもとで見たときの、コンゴ好染性のマルタ十字形（すなわち赤色のプラークが緑色のプラークと９０度をなす）、ｃ）チオフラビンＳによるポジティブ染色、ｄ）電子顕微鏡で見たときに球状のおよび／または「アミロイドスター」の様相、およびｅ）走査電子顕微鏡で見たときに球状、すなわち緻密な形状（直径１０〜４０μＭのプラーク）。もし標識されたアミロイドプラークが上記に示す一つ以上の染色および構造上の特徴を示せば、これらは抗プラーク治療薬を判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏのさまざまな方法に使用することができる。
【０１１９】
このような一つの好ましい方法において、標識されたプラークコアを９６穴プレートへ蒔き、一晩結合させる。ウエルに結合するこのような標識プラークの最適条件を決定するためには当該分野で知られているいろいろな方法を用いることができるであろう。このような結合がなされると、さまざまな溶液／バッファー（経験的に決定される）中に溶かした多数の化合物あるいは薬剤を標識されたプラークを含有するウエルに添加し、いろいろな長さのインキュベーション時間（経験的に決定される）でインキュベートする。緻密性アミロイドプラークの染色特性あるいは構造をばらばらに壊す、分断する、あるいは消失させることのできる薬剤あるいは化合物（下記に記載）は化合物や薬剤を含有していない、あるいはプラークの構造を変える上で有効であると考えられていない化合物あるいは薬剤を含有するウエルのものとその染色および構造特性を比較することによって判定される。緻密性アミロイドプラークの染色特性あるいは構造をばらばらに壊す、分断する、あるいは消失させることのできる薬剤あるいは化合物は下記を含む様々な手段によって判定することができる：
１）化合物あるいは薬剤で処理されていないプラークのウエルと比較したときに、化合物あるいは薬剤で処理したプラークのウエル中の上澄み（すなわち液層）中の放射標識が増加している。放射性同位元素などの標識を検出する方法は同位体および対応するエネルギーレベルに応じて異なる。例えば、ガンマカウンターは125Ｉを検出することができるが、3Ｈ（トリチウム）あるいは35Ｓ−硫酸塩を検出することはできず、ここではシンチレーションカウンターを用いることが必要となる。上澄み中の標識の増加は分断あるいはばらばらに破壊されてしまったプラークであり、その化合物あるいは薬剤がプラーク構造をばらばらに破壊あるいは分断する上で有効であったことを示し、したがって潜在的な抗プラーク治療薬として判定される。このような判定された薬剤あるいは化合物はさらに二次、あるいは三次のスクリーニングにより判定することができる。二次、あるいは三次のスクリーニングとしては、これらに限定するわけではないが、１）この化合物あるいは薬剤がアミロイドフィブリル構造を減少あるいは変化させる上で有効であったこと、したがって潜在的抗プラーク治療薬として判定されることを示す、コンゴレッドで染色し偏光下で見たときの、コンゴ好染性のマルタ十字形の減少あるいは消失、２）この化合物あるいは薬剤がアミロイドフィブリル構造を減少あるいは変化させる上で有効であったこと、そしてそれゆえ潜在的な抗プラーク治療薬であると判定されることを示す、チオフラビンＳによるポジティブ染色の減少あるいは消失、３）この化合物あるいは薬剤がアミロイドフィブリル構造を減少あるいは変化させる上で有効であったこと、したがって潜在的な抗プラーク治療薬として判定されることを示す、電子顕微鏡で見たときの球状のおよび／または「アミロイドスター」の様相の減少、変化あるいは消失、さらに／または４）この化合物あるいは薬剤がアミロイドフィブリル構造を減少あるいは変化させる上で有効であったこと、したがって潜在的抗プラーク治療薬として判定されることを示す、走査電子顕微鏡により見たときの球状あるいは緻密な形（直径１０−４０μＭのプラーク）の減少、変化あるいは消失。
【０１２０】
Ａβ１−４０の未標識ペプチドはＢａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ  （Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）などの様々な供給源から購入することができる。別法として、このペプチドは下記に記載の技法を用いて固相フルオレニルメトキシカルボニル（“Ｆｍ℃インフィニティー）化学により合成することもでき（Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ，  ｐｐ．７４−１０３  ａｎｄ  １４７−１６８，  １９８４；ＤＨ  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１５３−２２０，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；ＧＲ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐａｇｅｓ  １９８−２０１，  ＥＳＣＯＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  （１９８８））これらの開示はここに参照として含めてある。
【０１２１】
芳香族アミノ酸を含有するペプチドはＮａ  125Ｉおよびクロラミン−Ｔを用いた酸化的放射性ヨウ素標識により放射標識され、ＷＭ  ＨｕｎｔｅｒおよびＦＣ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄの方法を用いた逆相吸収によりヨウ素から分離することができる（Ｎａｔｕｒｅ  １９４：４９５，  １９６２；ＡＥ  Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＷＭ  Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  １３３；５２９，  １９７３；および  ＨＰ  Ｔｏｏ  ａｎｄ  ＪＥ  Ｍａｇｇｉｏ，Ｍｅｔｈ，  Ｎｅｕｒｏｓｃ．６；２３２，１９９１）この開示はここに参照として含めてある。
【０１２２】
抗プラーク治療薬を判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのもう一つの方法はここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたコンゴレッドで染色され偏光のもとで見たときにマルタ十字形を示す未標識緻密性アミロイドプラークを使用するものである。この緻密性アミロイドプラークと適切な時間（経験的に決定される）インキュベートした後、プラークのコンゴ好染性マルタ十字形を阻害、減少あるいは消失することができる化合物あるいは薬剤は偏光顕微鏡により潜在的抗プラーク治療薬として判定される。このような方法において緻密性アミロイドプラークはまずｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成され、コンゴレッドによる染色の後、偏光のもとで見た時に（ここに記載のように）典型的なマルタ十字形を示す。試験化合物との（経験的に決定される適切な用量とインキュベーション時間での）インキュベーションの後、緻密性アミロイドプラークをゼラチン塗布スライド上で空気乾燥し（ここに記載のように）、コンゴレッドで染色して、偏光顕微鏡のもとでこの化合物あるいは薬剤がコンゴ好染性および／またはマルタ十字形成の損失が見られるほどのアミロイドプラーク構造の阻害、分断あるいは消失を行う能力を持っているかどうかを観察する。二次および三次のスクリーニングには薬剤あるいは化合物のインキュベーションに続いて透過および走査電子顕微鏡による分析が含まれる。
【０１２３】
抗プラーク治療薬を判定するためのもう一つのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法としては、ここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたチオフラビンＳで染色され、蛍光顕微鏡で見た時にチオフラビンＳポジティブ染色を示す緻密性アミロイドプラークを用いるものがあげられる。緻密性アミロイドプラークとの適切な時間（経験的に決定する）のインキュベーションの後、プラークのチオフラビンＳポジティブ染色を減少あるいは消失することのできる化合物あるいは薬剤は潜在的抗プラーク治療薬であると判定される。二次および三次のスクリーニングとしては薬剤あるいは化合物のインキュベーション後の透過および走査電子顕微鏡による分析があげられる。
【０１２４】
さらにもう一つの抗プラーク治療薬を判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法としては、ここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された透過電子顕微鏡で見たときに球状のおよび／または「アミロイドスター」の様相を示す緻密性アミロイドプラークを用いるものがあげられる。緻密性アミロイドプラークとの適切な時間（経験的に決定する）のインキュベーションの後、球状のあるいは「アミロイドスター」の様相を分断あるいは変化させることができる化合物あるいは薬剤は潜在的な抗プラーク治療薬として判定される。
【０１２５】
さらにもう一つの抗プラーク治療薬を判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法としては、ここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された走査電子顕微鏡により見たときにアミロイドプラーク直径が１０〜４０μｍ（平均プラーク直径が２５μｍ）の球形を示す緻密性アミロイドプラークを用いるものがあげられる。緻密性アミロイドプラークとの適切な時間（経験的に決定する）のインキュベーションの後、球形のプラーク形を分断あるいは変化させることのできる、あるいは実質的にアミロイドプラークの直径を減少させることのできる化合物あるいは薬剤は潜在的抗プラーク治療薬として判定される。
【０１２６】
さらにもう一つの抗プラーク治療薬を判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法は、ここに記載のように形成された緻密性アミロイドプラークの大きさと形を用いる。球形アミロイドプラークの構造（すなわち大きさおよび／または直径）を阻害、分断あるいは消失させる薬剤あるいは化合物はセルソーターを用いた方法論により判定することができる。このような分析において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密球状アミロイドプラークはセルソーターに置かれこのようなプラークの平均直径（および直径範囲）が求められる。一つの好ましい実施例において、形成されたアミロイドプラークコアはＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ  ＥＳＰ  セルソーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｈｉａｌｅａｈ，  Ｆｌｏｒｉｄａ）に装てんされ、１４２８粒子／秒の流速で１００μＭ３倍チップを通じてセルソーターにかけられる。励起ＭＡＸが４８８ｎｍのアルゴンレーザーを用いてサイドスキャッターに基づくソートを行う。選択されたプラークコアは大きさ（１０〜５０μＭ）に基づいている。電子顕微鏡によりわれわれの観察に基づき、このｉｎ  ｖｉｔｒｏでここに記載の方法により形成されたアミロイドプラークは、通常直径が１０〜４０μｍの範囲であり、平均直径は２５μｍである。適切な条件およびインキュベーション時間（経験により決定される）での化合物あるいは薬剤とのインキュベーションの後、平均プラーク直径（すなわち大きさ）をセルソーターを用いて評価することによって、薬剤あるいは化合物の不在下で形成されたプラークを薬剤あるいは化合物と共にインキュベートしたプラークと比較した。もう一つの方法において、ここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成したプラークを特定の時間（これは経験的に決定される）、化合物あるいは薬剤により処理し、その後かかる処理をされたプラークの平均直径をセルソーターを用いて測定し、未処理プラークの平均直径と比較する。もし化合物あるいは薬剤が緻密プラークの大きさ（したがって直径）をばらばらに分解し、あるいは分断するのに有効であるのなら、より小さな直径（すなわちより小さなプラークあるいはばらばらに壊れた成分）の割合の増加が観察されるであろう。緻密性アミロイドプラークと共に適切な時間（経験的に決定される）インキュベートした後、アミロイドプラークの直径を分断するあるいは大きく減じることのできる化合物あるいは薬剤は潜在的な抗プラーク治療薬として判定される。
【０１２７】
ここで記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたアミロイドプラークのもう一つの潜在的な利用法は、ＡβあるいはＰｒＰの神経毒性効果を減少させるあるいは取り除く上で有効である化合物あるいは薬剤を判定することである。始めの一連の実験においては、ここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークが培養物中および／または動物モデル中のニューロンに毒性を生じたかどうか（下記に記載）を調べることが重要となるであろう。このような細胞培養実験では、緻密性アミロイドプラークをまずここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成し、プライマリーニューロン（当該分野で知られている標準技法を用いて単離）あるいはニューロン細胞系を含有するペトリ皿に入れる。アミロイドプラークをニューロン培養物と長時間（すなわち４８あるいは７２時間）インキュベートした後、神経毒性のレベルを（当該分野で知られた標準分析法を用いて）測定し、アミロイドプラークを含有しない培養物と比較する。もし緻密性アミロイドプラークが細胞培養物において神経毒性効果を示すことができれば、これらのアミロイドプラークはさらに潜在的な抗神経毒療法である薬剤あるいは化合物をスクリーンし、判定するのに使用することができる。そのような方法においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークはプライマリーニューロン培養物あるいはニューロン細胞系中で長時間（すなわち４８あるいは７２時間）、試験化合物あるいは薬剤の存在下あるいは非存在下でインキュベートされる。アミロイドプラークのインキュベーションによって引き起こされる神経毒性を阻害あるいは減少することのできる薬剤あるいは化合物は抗神経毒剤と判定される。
【０１２８】
さらにもう一つの本発明の利用法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを示す新規の動物モデルを提供することである。このような方法の例をあげると、これに限るわけではないが、注射、注入あるいはその他の手段によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークを脳あるいはその他の組織へと入れることがあげられる。このような動物はｉｎ  ｖｉｖｏでの緻密性アミロイドプラークの沈着および残存効果を研究する新規の手段を提供し、動物モデル中での潜在的抗プラーク治療薬の有効性を試験するための新規手段を提供するであろう。好ましい実施例においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたＡβ含有緻密性アミロイドプラークを蒸留水中、あるいはトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に入れて注射、注入あるいは他の手段によって動物の脳内に入れる。このようなアミロイドプラークモデルは脳内の緻密性アミロイドプラーク沈着および残存効果を研究するために使用することができ、動物モデル中での潜在的抗プラーク治療の有効性をテストするための新規の方法を提供する。好ましい実施例において、このようなモデルはアルツハイマー病およびプリオン病の治療のための抗プラーク治療薬を判定するために使用することができる。
【０１２９】
アルツハイマー病抗プラーク治療薬を判定するための新動物モデルとしてのｉｎ  ｖｉｖｏのアミロイドプラーク
例えばアルツハイマー病緻密性アミロイドプラーク沈着の新規モデルとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（ここに記載のように）形成されたＡβ含有緻密性アミロイドプラークをいくつかのグループのラットあるいはマウスの海馬へと連続的に注入する。好ましい実施例において、オスのＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをまずペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、２７ゲージのステンレスのカニューレをブレグマを参照点（ＡＰ−４．８；ＭＬ３．５；ＤＶ３．０）として用いて海馬内に定位埋め込みし、機械ねじと歯科用アクリル樹脂で頭蓋へ固定した。このカニューレは１５ｃｍのビニールチューブのコイルを通じて肩甲骨の下の皮下に埋め込まれたモデル２００２浸透ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｉｎｃ．）へ接続した。注入した溶液はすべてビニルチューブのコイル内に保たれ、ポンプ内で３ｃｍのエアースペーサーにより水（食用着色料で青く染色した）から分離された。実験動物を屠殺した後、エアースペーサーと青い生理食塩水の動きを測定してポンプが成功裏に作動していることを確認する。ここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークを０．５μｌ／ｈｒの流速で一あるいは二週間直接海馬へと注入する。この注入期間の終わりに過量のペントバルビタールによりラットを屠殺し、１００ｍｌの生理食塩水で潅流し、続いて１５０ｍｌの４％の燐酸緩衝パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で潅流し、脳を取り出して４８時間の後固定おを行い、凍結組織の切り出しのために燐酸緩衝生理食塩水に移した。２５μｍの連続切片を滑走式ミクロトームを用いて連続して切り出しゼラチン被覆スライドの上においた。
【０１３０】
各動物より、１００枚の連続切片を続けて切り出しクレシルバイオレットで染色して注入部位が占めている領域を判定した。通常この注入部位は４０〜６０枚の連続切片に広がっている。それから全注入部位に渡り１０枚ごとの切片にコンゴレッド染色（Ｐｕｃｈｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  １０：３５５−３６４，１９６２）およびチオフラビンＳ蛍光（Ｅｌｇｈｅｔａｎｙ  ａｎｄ  Ｓａｌｅｅｍ，  Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈ．６３：２０１−２１２，１９８８）を使用してこれらの動物中の緻密性アミロイドプラーク沈着の範囲と密度とを測定した。コンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラーク沈着を含有する動物のパーセントを組織切片の盲目評点法（全注入部位に渡り１０枚目ごとのコンゴレッド染色切片の評点を得る）で評価した。さらに緻密性アミロイドプラークの数はその倍率の視野中で計数することにより定量することができる。注入したＡβ−含有緻密性アミロイドプラークの検出は、全注入部位に渡り（すなわち注入部位の１０枚目の切片毎に）切片をコンゴレッドで染色し、偏光の下で観察してｉｎ  ｖｉｖｏのコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを判定することによってモニターされる。さらに切片を全注入部位に渡り（すなわち注入部位を通じて１０枚目の切片毎に）チオフラビンＳで染色し、蛍光顕微鏡で観察して球形のチオフラビンＳアミロイドプラーク沈着を判定する。最後にＡβ−含有プラークを合成Ａβに対するポリクローナル抗体あるいはＡβの残基１−１７を認識するモノクローナル抗体（ＧＥ１０；Ｓｅｎｅｔｅｋ，ＵＳＡ）を用いた検出などの組織化学的技法を使用して判定する。抗−Ａβ抗体を持つ組織切片はすでに報告されている（Ｋｉｔａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＡｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５７：２３０−２３６，１９８７）ように免疫染色に先立ち８８％のギ酸で３〜５分予備処理すると隠れた抗原部位を暴露するのに役立つ。免疫染色用には一次抗体の代わりにトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を使用した陰性対照、および／または過剰の抗原の存在下で一次抗体を用いた予備吸収実験（Ｓｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３７：１２５３−１２７０，１９９０）。
【０１３１】
これらの動物モデルは緻密性アミロイドプラーク形成、沈着、蓄積および／または残存を標的とする潜在的抗プラーク治療薬速やかにスクリーンするのに使用することができる。好ましい実施例において、最初（ここに記載のように）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークと潜在的治療薬あるいは化合物を直接一群の動物の海馬（上記に記載のように）に注入し、緻密性アミロイドプラークのみ（すなわち試験化合物あるいは薬剤を入れずに）を注入した一群の動物と比較する。ｉｎ  ｖｉｖｏで緻密性アミロイドプラーク形成、沈着、蓄積および／または残存を減少、消失、あるいは分断することがわかった（コンゴレッドあるいはチオフラビンＳ評点により決定）化合物あるいは薬剤は潜在的抗プラーク治療薬としての価値を持つと判定される。
【０１３２】
もう一つの好ましい実施例において、長期間に渡り緻密性アミロイドプラークの残存を減少あるいは消失する上での化合物あるいは薬剤の有効性を試験することができる。このモデルにおいては動物群（通常一群につき１０匹）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成した緻密性アミロイドプラークと化合物あるいは薬剤を注入し、直接緻密性アミロイドプラークのみ（すなわち試験化合物あるいは薬剤なしで）を注入した動物群（通常一群につき１０匹）と比較する。一週間の注入（上記に記載のように）の後、カニューレを麻酔した動物から取り除き、動物を快復させ、その後１，３、６あるいは１２ヶ月後に屠殺する。連続切片を切り出し緻密性アミロイドプラークの残存について上記に記載のように評点を付ける。緻密性アミロイドプラークは時間をかけて脳に残存すると信じられている。潜在的な治療的化合物あるいは薬剤はこの治療的化合物あるいは薬剤を与えられていない動物と比較して観察された緻密性アミロイドプラークを効果的に減少あるいは消失していると観察よりわかったものとなろう。これらの化合物あるいは薬剤は従ってｉｎ  ｖｉｖｏで緻密性アミロイドプラークの残存を効果的に減少する化合物あるいは薬剤であると言うことができる。
【０１３３】
さらにもう一つの好ましい実施例では化合物あるいは薬剤を試験し、予め沈着された緻密性アミロイドプラークの減少あるいは消失について調べることができる。このモデルでは２群の動物（各群あたり通常１０匹）に緻密性アミロイドプラーク（ここに記載のように形成）を注入する。一週間の注入（上記に記載のように）の後、カニューレと浸透ポンプを取り替え（動物を麻酔下において）新しい浸透ポンプにビニールチューブで接続した新しいカニューレにビークルのみ（すなわち二回蒸留水）あるいは潜在的な治療的化合物あるいは薬剤のいずれかを含有させた。ビークルあるいは関心のある潜在的な治療的化合物あるいは薬剤のいずれかを一週間連続して注入し、動物を屠殺する。連続切片を全注入部位にわたり切り出し、上記に記載のように任意盲目評点法によって緻密性アミロイドプラークの範囲を測定する。潜在的治療的化合物あるいは薬剤は予め沈着した緻密性アミロイドプラーク沈着を効果的に除去することのできるもの、あるいは細胞に対しこのようなプラークが及ぼす可能性のある効果（すなわち神経毒性）を中和することのできるものであろう。ビークルのみを注入した動物群においては緻密性アミロイドプラークの量は殆どあるいは全く減少しないものと予測される。これらの化合物はしたがってｉｎ  ｖｉｖｏの予め沈着された緻密性アミロイドプラークを効果的に減少させる治療的化合物あるいは薬剤と呼ぶことができる。
【０１３４】
プリオン病抗プラーク治療薬を判定するための新規動物モデルとしてのＩｎ  ｖｉｖｏアミロイドプラーク
例えばプリオン病緻密性アミロイドプラーク沈着の新規モデルとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（ここに記載のように）形成されたＰｒＰ含有緻密性アミロイドプラークを連続していくつかの群のラットあるいはマウスの海馬（あるいは小脳）中に注入する。好ましい実施例において、オスのＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをまずペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、２７ゲージのステンレスのカニューレをブレグマを参照点（ＡＰ−４．８；ＭＬ３．５；ＤＶ３．０）として用いて海馬内に定位埋め込みし、機械ねじと歯科用アクリル樹脂で頭蓋へ固定した。このカニューレは１５ｃｍのビニールチューブのコイルを通じて肩甲骨の下の皮下に埋め込まれたモデル２００２浸透ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｉｎｃ．）へ接続した。注入した溶液はすべてビニルチューブのコイル内に保たれ、ポンプ内で３ｃｍのエアースペーサーにより水（食用着色料で青く染色した）から分離された。実験動物を屠殺した後、エアースペーサーと青い生理食塩水の動きを測定してポンプが成功裏に作動していることを確認する。ここに記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークを０．５μｌ／ｈｒの流速で一あるいは二週間直接海馬へと注入する。この注入期間の終わりに過量のペントバルビタールによりラットを屠殺し、１００ｍｌの生理食塩水で潅流し、続いて１５０ｍｌの４％の燐酸緩衝パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で潅流し、脳を取り出して４８時間の後固定おを行い、凍結組織の切り出しのために燐酸緩衝生理食塩水に移した。２５μｍの連続切片を滑走式ミクロトームを用いて連続して切り出しゼラチン被覆スライドの上においた。
【０１３５】
各動物より、１００枚の連続切片を続けて切り出しクレシルバイオレットで染色して注入部位が占めている領域を判定した。通常この注入部位は４０〜６０枚の連続切片に広がっている。それから全注入部位に渡り１０枚ごとの切片にコンゴレッド染色（Ｐｕｃｈｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  １０：３５５−３６４，１９６２）およびチオフラビンＳ蛍光（Ｅｌｇｈｅｔａｎｙ  ａｎｄ  Ｓａｌｅｅｍ，  Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈ．６３：２０１−２１２，１９８８）を使用してこれらの動物中の緻密性アミロイドプラーク沈着の範囲と密度とを測定した。コンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラーク沈着を含有する動物のパーセントを組織切片の盲目評点法（全注入部位に渡り１０枚目ごとのコンゴレッド染色切片の評点を得る）で評価した。さらに緻密性アミロイドプラークの数はその倍率の視野中で計数することにより定量することができる。注入したＰｒＰ−含有緻密性アミロイドプラークの検出は、全注入部位に渡り（すなわち注入部位の１０枚目の切片毎に）切片をコンゴレッドで染色し、偏光の下で観察してｉｎ  ｖｉｖｏのコンゴ好染性マルタ十字形緻密性アミロイドプラークを判定することによってモニターされる。さらに切片を全注入部位に渡り（すなわち注入部位を通じて１０枚目の切片毎に）チオフラビンＳで染色し、蛍光顕微鏡で観察して球形のチオフラビンＳアミロイドプラーク沈着を判定する。最後にＰｒＰ−含有プラークを合成Ａβに対するポリクローナル抗体あるいはＰｒＰタンパク質（多数のさまざまな供給源から市販されている）を認識するモノクローナル抗体（ＧＥ１０；Ｓｅｎｅｔｅｋ，ＵＳＡ）を用いた検出などの組織化学的技法を使用して判定する。抗−ＰｒＰ抗体を持つ組織切片はすでに報告されている（Ｋｉｔａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＡｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５７：２３０−２３６，１９８７）ように免疫染色に先立ち８８％のギ酸で３〜５分予備処理すると隠れた抗原部位を暴露するのに役立つ。免疫染色用には一次抗体の代わりにトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を使用した陰性対照、および／または過剰の抗原の存在下で一次抗体を用いた予備吸収実験（Ｓｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３７：１２５３−１２７０，１９９０）。
【０１３６】
これらの動物モデルは緻密性アミロイドプラーク形成、沈着、蓄積および／または残存を標的とする潜在的抗プラーク治療薬速やかにスクリーンするのに使用することができる。好ましい実施例において、最初（ここに記載のように）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークと潜在的治療薬あるいは化合物を直接一群の動物の海馬（上記に記載のように）に注入し、緻密性アミロイドプラークのみ（すなわち試験化合物あるいは薬剤を入れずに）を注入した一群の動物と比較する。ｉｎ  ｖｉｖｏで緻密性アミロイドプラーク形成、沈着、蓄積および／または残存を減少、消失、あるいは分断することがわかった（コンゴレッドあるいはチオフラビンＳ評点により決定）化合物あるいは薬剤は潜在的抗プラーク治療薬としての価値を持つと判定される。
【０１３７】
もう一つの好ましい実施例において、長期間に渡り緻密性アミロイドプラークの残存を減少あるいは消失する上での化合物あるいは薬剤の有効性を試験することができる。このモデルにおいては動物群（通常一群につき１０匹）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成した緻密性アミロイドプラークと化合物あるいは薬剤を注入し、直接緻密性アミロイドプラークのみ（すなわち試験化合物あるいは薬剤なしで）を注入した動物群（通常一群につき１０匹）と比較する。一週間の注入（上記に記載のように）の後、カニューレを麻酔した動物から取り除き、動物を快復させ、その後１，３、６あるいは１２ヶ月後に屠殺する。連続切片を切り出し緻密性アミロイドプラークの残存について上記に記載のように評点を付ける。緻密性アミロイドプラークは時間をかけて脳に残存すると信じられている。潜在的な治療的化合物あるいは薬剤はこの治療的化合物あるいは薬剤を与えられていない動物と比較して観察された緻密性アミロイドプラークを効果的に減少あるいは消失していると観察よりわかったものとなろう。これらの化合物あるいは薬剤は従ってｉｎ  ｖｉｖｏで緻密性アミロイドプラークの残存を効果的に減少する化合物あるいは薬剤であると言うことができる。
【０１３８】
さらにもう一つの好ましい実施例では化合物あるいは薬剤を試験し、予め沈着された緻密性アミロイドプラークの減少あるいは消失について調べることができる。このモデルでは２群の動物（各群あたり通常１０匹）に緻密性アミロイドプラーク（ここに記載のように形成）を注入する。一週間の注入（上記に記載のように）の後、カニューレと浸透ポンプを取り替え（動物を麻酔下において）新しい浸透ポンプにビニールチューブで接続した新しいカニューレにビークルのみ（すなわち二回蒸留水）あるいは潜在的な治療的化合物あるいは薬剤のいずれかを含有させた。ビークルあるいは関心のある潜在的な治療的化合物あるいは薬剤のいずれかを一週間連続して注入し、動物を屠殺する。連続切片を全注入部位にわたり切り出し、上記に記載のように任意盲目評点法によって緻密性アミロイドプラークの範囲を測定する。潜在的治療的化合物あるいは薬剤は予め沈着した緻密性アミロイドプラーク沈着を効果的に除去することのできるものであろう。ビークルのみを注入した動物群においては緻密性アミロイドプラークの量は殆どあるいは全く減少しないものと予測される。これらの化合物はしたがってｉｎ  ｖｉｖｏの予め沈着された緻密性アミロイドプラークを効果的に減少させる治療的化合物あるいは薬剤と呼ぶことができる。
【０１３９】
研究への応用
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密性アミロイドプラークは様々な異なる研究用途に有用であると予測される。一つの例において、予め形成された緻密性アミロイドプラークをその他の細胞（例：ニューロン、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）を含有する培養物中に入れ、培養物中のかかるアミロイドプラークへの細胞の反応（すなわち食細胞活動、分解）を測定することができる。もう一つの例においては、個々の高分子（すなわちアポリポタンパク質Ｅ、アミロイドＰ成分、補体因子、サイトカイン、炎症性因子などのアミロイドーシスに関与するその他の成分）の培養物中のこのような緻密性アミロイドプラークに対する反応を当該分野で公知の標準技法を用いて評価することもできる。
【０１４０】
さらに、細胞構造への緻密性アミロイドプラーク沈着、蓄積および残存、および／またはさまざまな高分子（すなわちβ−アミロイド前駆タンパク質、特定のプロテオグリカン）の代謝もまたｉｎ  ｖｉｖｏで研究することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの緻密性アミロイドプラークのこのように利用により、実際的で未だ試されたことのない応用が可能となり今後の研究における大いなる手段となろう。
【０１４１】
もう一つの本発明の潜在的な応用としては予め形成された緻密性アミロイドプラークを提供すること、あるいはキットの形でそのような緻密性アミロイドプラークを製造する能力を提供することである。このようなキットは抗プラーク治療薬として可能性をもつ化合物あるいは薬剤をスクリーニングおよび判定するために有用であろう。このようなキットはａ）Ａβ１−４０（溶液、あるいは凍結乾燥の形で）を緻密性アミロイドプラークの形成に必要な適切な量あるいは濃度（ここに記載）で含有する第一の容器、ｂ）パールカン、約２２０ｋＤａの特定のＧＡＧ（ヘパリンあるいはヘパランサルフェートなど）、特定の硫酸化高分子（デキストランサルフェート、ペントサンポリサルフェート、あるいはポリビニルスルホネート）を溶液あるいは凍結乾燥の形で緻密性アミロイドプラーク形成に必要である適切な量あるいは濃度（ここに記載）で含油する第二の容器を含有する。このようなコンゴ好染性マルタ十字形アミロイドプラーク形成は二つの容器のそれぞれから適切な量を取り出し混合した後３７℃で一週間インキュベートすることによって生じる。
【０１４２】
もう一つのキットにおいては緻密性アミロイドプラークを予め形成し、ついで凍結あるいは凍結乾燥して流通することができる。研究者、あるいは個人は受け取ると、適切な量の蒸留水またはトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適当な溶液中に入れて緻密性アミロイドプラークを再形成することができる。このようなキットは研究および／または商業的な用途に使用できる。
【０１４３】
上記に言及したものの、特にここで特定したり詳しく説明していない系および成分に関しては、このような系および成分の作用および規格、ならびに互いに、またここに記載した本発明の他の要素と共に協同して、ここに開示した目的を達成するために作成され、組み立てられあるいは使用される方法は、すべて充分に当業者の知りうる範囲内のことであると考えられる。したがってここでは当業者にとって一般に知られていることを再度繰り返すような協調努力は行っていない。
【０１４４】
法令に従い、本発明は構成の特徴に関しては幾分独特の言語で記載されている。しかし、ここに示した手段および構成は本発明を実行する上で好ましい形式を含有しているため、本発明はここに示した特定の特徴に限定されるものではないことを理解されたい。従って本発明は同等の原則に従い、適正に解釈された、添付のクレームの正しく法的に有効な範囲内であるいかなる様式あるいは修正によっても請求されているものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−１Ｌは本発明の方法の実施態様におけるコンゴ好染性なマルタ十字形の球状アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成についての顕微鏡写真である。
【図２】  図２Ａ−２Ｉは本発明の方法の他の実施態様における、コンゴ好染性でマルタ十字形の球状アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成を示す顕微鏡写真である。
【図３】  図３Ａ−３Ｉは本発明の方法の他の実施態様における、コンゴ好染性なマルタ十字形のアミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成に関する顕微鏡写真である。
【図４】  図４Ａ−４Ｂは本発明の方法の他の実施態様における、コンゴ好染性でマルタ十字形の緻密性アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成についての顕微鏡写真である。
【図５】  図５Ａ−５Ｂは本発明の方法の択一的実施態様における球状アミロイドプラークのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成の顕微鏡写真である。
【図６】  図６Ａ−６Ｄは透過電子顕微鏡で観察したとき、ヒトのアルツハイマー病の脳から取り出されたアミロイドプラークのコアと実質上同一のパールカンで誘導された球状「アミロイドスター」の形成についての顕微鏡写真である。
【図７】  図７Ａ−７Ｆはパールカンまたはデキストラン硫酸塩により誘導されたアミロイドプラークコアの形成および走査電子顕微鏡でみた顕微鏡写真である。
【配列表】
0004537577.tif 000005
【図１ａ】
0004537577.tif 000006
【図１ｂ】
0004537577.tif 000007
【図１ｃ】
0004537577.tif 000008
【図１ｄ】
0004537577.tif 000009
【図１ｅ】
0004537577.tif 000010
【図１ｆ】
0004537577.tif 000011
【図１ｇ】
0004537577.tif 000012
【図１ｈ】
0004537577.tif 000013
【図１ｉ】
0004537577.tif 000014
【図１ｊ】
0004537577.tif 000015
【図１ｋ】
0004537577.tif 000016
【図１ｌ】
0004537577.tif 000017
【図２ａ】
0004537577.tif 000018
【図２ｂ】
0004537577.tif 000019
【図２ｃ】
0004537577.tif 000020
【図２ｄ】
0004537577.tif 000021
【図２ｅ】
0004537577.tif 000022
【図２ｆ】
0004537577.tif 000023
【図２ｇ】
0004537577.tif 000024
【図２ｈ】
0004537577.tif 000025
【図２ｉ】
0004537577.tif 000026
【図３ａ】
0004537577.tif 000027
【図３ｂ】
0004537577.tif 000028
【図３ｃ】
0004537577.tif 000029
【図３ｄ】
0004537577.tif 000030
【図３ｅ】
0004537577.tif 000031
【図３ｆ】
0004537577.tif 000032
【図３ｇ】
0004537577.tif 000033
【図３ｈ】
0004537577.tif 000034
【図３ｉ】
0004537577.tif 000035
【図４ａ】
0004537577.tif 000036
【図４ｂ】
0004537577.tif 000037
【図５ａ】
0004537577.tif 000038
【図５ｂ】
0004537577.tif 000039
【図６ａ】
0004537577.tif 000040
【図６ｂ】
0004537577.tif 000041
【図６ｃ】
0004537577.tif 000042
【図６ｄ】
0004537577.tif 000043
【図７ａ】
0004537577.tif 000044
【図７ｂ】
0004537577.tif 000045
【図７ｃ】
0004537577.tif 000046
【図７ｄ】
0004537577.tif 000047
【図７ｅ】
0004537577.tif 000048
【図７ｆ】
0004537577.tif 000049