(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、所定波長のみを透過させるカラーフィルタと、該カラーフィルタを透過した光を検出する光検出手段とを備えてなる蛍光検出装置において前記光検出手段に過大な光量が入射しないように前記光検出手段を保護する蛍光検出装置の光検出手段保護方法であり、
前記励起光を照射し、
前記光検出手段の感度を通常感度より低い確認時感度にしてバックグランドレベルを測定し、
該バックグランドレベルが所定値よりも高い場合に、前記カラーフィルタが不適合であると判定することを特徴とする蛍光検出装置の光検出手段保護方法。
【請求項２】
前記バックグランドレベルの測定の際に、前記励起光の出力を通常出力より低い確認時出力にすることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置の光検出手段保護方法。
【請求項３】
前記光検出手段の前記確認時感度を連続的または段階的に高くして前記バックグランドレベルを測定することを特徴とする請求項１または２記載の蛍光検出装置の光検出手段保護方法。
【請求項４】
蛍光標識検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、所定波長のみを透過させるカラーフィルタと、該カラーフィルタを透過した光を検出する光検出手段とを備えてなる蛍光検出装置において、
前記励起光を照射し、前記光検出手段の感度を通常感度より低い確認時感度にしてバックグランドレベルを測定し、該バックグランドレベルが所定値よりも高い場合に、前記カラーフィルタが不適合であると判定する制御手段を備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
前記制御手段が、前記バックグランドレベルの測定の際に、前記励起光の出力を通常出力より低い確認時出力にすることを特徴とする請求項４記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記制御手段が、前記光検出手段の前記確認時感度を連続的または段階的に高くして前記バックグランドレベルを測定することを特徴とする請求項４または５記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記制御手段が前記カラーフィルタが不適合であると判定した際にその旨を通知する通知手段を備えたことを特徴とする請求項４から６のいずれか１項記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、所定波長のみを透過させるカラーフィルタと、該カラーフィルタを透過した光を検出する光検出手段とを備えてなる蛍光検出装置において、光検出手段に過大な光量が入射しないように光検出手段を保護する蛍光検出装置の光検出手段保護方法および蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、例えば特許文献１に示すように、蛍光標識検体から発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置が知られている。この蛍光検出装置によれば、蛍光画像を読み取ることによって、遺伝子配列、遺伝子の発現レベル、蛋白質の分離、同定、あるいは分子量、特性の評価などを行うことができる。
【０００３】
具体的には、例えば、電気泳動させるべき複数のＤＮＡ断片を含む溶液の中に、蛍光色素を加えた後に、複数のＤＮＡ断片をゲル支持体上で電気泳動させる。あるいは、蛍光色素を含有させたゲル支持体上で、複数のＤＮＡ断片を電気泳動させる。そしてこの複数のＤＮＡ断片を、ゲル支持体上で、電気泳動させた後に、ゲル支持体を蛍光色素を含んだ溶液に浸すなどして、電気泳動されたＤＮＡ断片を標識し、励起光により、蛍光色素を励起して、生じた蛍光を検出することによって、画像を生成し、ゲル支持体上のＤＮＡ分布を検出することができる。
【０００４】
あるいは、複数のＤＮＡ断片を、ゲル支持体上で電気泳動させた後に、ＤＮＡを変性し、次いで、サザン・ブロッティング法により、ニトロセルロースなどの転写支持体上に、変性ＤＮＡ断片の少なくとも一部を転写し、目的とするＤＮＡと相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを蛍光色素で標識して調製したプローブと変性ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、プローブＤＮＡもしくはプローブＲＮＡと相補的なＤＮＡ断片のみを選択的に標識し、励起光によって蛍光色素を励起して、生じた蛍光を検出することにより画像を生成し、転写支持体上の目的とするＤＮＡ分布を検出することができる。
【０００５】
また、近年、生化学解析システムとしてマイクロアレイ解析システムが注目を集めている。例えば、蛍光物質を標識物質として利用したマイクロアレイ解析システムにおいては、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成などが既知の特異的結合物質を、スポッター装置を用いて滴下して、多数の独立したスポットを形成し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど、抽出、単離などによって生体から採取され、あるいは、化学的、化学修飾などの処理が施された生体由来の物質であって、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された物質を、ハイブリダイゼーションなどによって、特異的結合物質に、特異的に結合させたマイクロアレイに、励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光などを光電的に検出して、生体由来の物質を解析することができる。
【特許文献１】特開平１１−０３８５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
通常、上述した蛍光検出装置においては、カラーフィルタにより励起光と蛍光とを分離させ、蛍光のみを光検出手段により検出している。また、検出すべき蛍光は微弱であるため、光検出手段としては高感度のＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｅｉｅｒ  Ｔｕｂｅｓ：光電子増倍管）等が用いられている。
【０００７】
一般に励起光の強度は蛍光の強度に比べ１０３以上強いため、適正なカラーフィルタを用いて励起光を遮断しないと、光検出手段に過大な光量が入射し、光検出手段に一時的な感度低下を引き起こす等の悪影響を与えてしまうことになる。
【０００８】
そのため、カラーフィルタの種類を検出し、励起光の波長に対して不適合なカラーフィルタをユーザーが選択した場合には、ユーザーにその旨を通知して光検出手段に過大な光量が入射するのを防止することが考えられているが、このような態様とした場合、フィルタ種検出機能を備えることによりコスト増加を招くことになる、フィルタ種検出機能に対応したカラーフィルタしか使用できないためカラーフィルタの種類が限定されてしまう、フィルタ種検出機能が故障した場合に光検出手段を保護することができなくなる等の問題があった。
【０００９】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、蛍光標識検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、所定波長のみを透過させるカラーフィルタと、カラーフィルタを透過した光を検出する光検出手段とを備えてなる蛍光検出装置において、フィルタ種検出機能を備えずとも、光検出手段に過大な光量が入射しないように光検出手段を保護可能な蛍光検出装置の光検出手段保護方法および蛍光検出装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による蛍光検出装置の光検出手段保護方法は、蛍光標識検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、所定波長のみを透過させるカラーフィルタと、カラーフィルタを透過した光を検出する光検出手段とを備えてなる蛍光検出装置において光検出手段に過大な光量が入射しないように光検出手段を保護する蛍光検出装置の光検出手段保護方法であり、励起光を照射し、光検出手段の感度を通常感度より低い確認時感度にしてバックグランドレベルを測定し、バックグランドレベルが所定値よりも高い場合に、カラーフィルタが不適合であると判定することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明による蛍光検出装置の光検出手段保護方法においては、バックグランドレベルの測定の際に、励起光の出力を通常出力より低い確認時出力にすることが好ましい。
【００１２】
また、光検出手段の確認時感度を連続的または段階的に高くしてバックグランドレベルを測定することが好ましい。
【００１３】
本発明による蛍光検出装置は、蛍光標識検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、所定波長のみを透過させるカラーフィルタと、カラーフィルタを透過した光を検出する光検出手段とを備えてなる蛍光検出装置において、励起光を照射し、光検出手段の感度を通常感度より低い確認時感度にしてバックグランドレベルを測定し、バックグランドレベルが所定値よりも高い場合に、カラーフィルタが不適合であると判定する制御手段を備えたことを特徴とするものである。
【００１４】
本発明による蛍光検出装置において、制御手段は、バックグランドレベルの測定の際に、励起光の出力を通常出力より低い確認時出力にすることが好ましい。
【００１５】
また、制御手段は、光検出手段の確認時感度を連続的または段階的に高くしてバックグランドレベルを測定するものであることが好ましい。
【００１６】
また、制御手段がカラーフィルタが不適合であると判定した際にその旨を通知する通知手段を備えてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の蛍光検出装置の光検出手段保護方法および蛍光検出装置によれば、蛍光標識検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、所定波長のみを透過させるカラーフィルタと、カラーフィルタを透過した光を検出する光検出手段とを備えてなる蛍光検出装置において、励起光を照射し、光検出手段の感度を通常感度より低い確認時感度にしてバックグランドレベルを測定し、バックグランドレベルが所定値よりも高い場合に、カラーフィルタが不適合であると判定するようにしたことにより、フィルタ種検出機能を備えずとも、確実かつ安全にカラーフィルタが不適合であるかどうか判定することが可能となる。
【００１８】
また、バックグランドレベルの測定の際に、励起光の出力を通常出力より低い確認時出力にすることにより、より安全にカラーフィルタが不適合であるかどうか判定することが可能となる。
【００１９】
また、光検出手段の確認時感度を連続的または段階的に高くしてバックグランドレベルを測定することにより、より確実にカラーフィルタが不適合であるかどうか判定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、図面を参照して本発明の蛍光検出装の実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の蛍光検出装置を用いた蛍光検出システムの一例を示す構成図である。図１の蛍光検出システム１は、マイクロプレート上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出する蛍光を検出し蛍光画像データとして出力する蛍光検出装置１０と、蛍光検出装置１０から蛍光画像データを取得し、蛍光画像データの処理を行うコンピューター６０とを有している。
【００２１】
ここで、蛍光検出装置１０は、マイクロプレートを収容するために開閉するプレート収容部１０ａを有しており、このプレート収容部１０ａからマイクロプレートＭＰが装填される。このマイクロプレートＭＰは、図２に示すように、格子状の複数のスポットＷを有し、このスポットＷには特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在している。
【００２２】
図３は蛍光検出装置の一例を示す構成図であり、図１から図３を参照して蛍光検出装置１０について説明する。蛍光検出装置１０は、マイクロプレートＭＰに励起光を走査しながら照射する励起光照射手段２０と、励起光照射手段２０により励起光が蛍光標識検体に照射されたとき、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出する蛍光検出手段３０と、蛍光検出手段３０により検出された蛍光を蛍光画像データとして出力するデータ出力手段４０と、励起光照射手段２０、蛍光検出手段３０およびデータ出力手段４０等を制御する制御手段５０とを備えている。
【００２３】
ここで、励起光照射手段２０は、蛍光標識検体に用いられる蛍光色素の種類に応じて波長の異なる（例えば６４０ｎｍ、５３２ｎｍ、４７３ｎｍ）励起光ＦＬを射出する励起光源２１ａ、２１ｂ、２１ｃと、射出された励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光する集光レンズ２４と、励起光ＦＬを矢印Ｙ方向（主走査方向）に走査させるために集光レンズ２４を移動させるレンズ移動手段２５と、励起光を矢印Ｘ方向に走査させるためにマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるプレート移動手段２６とを備えている。
【００２４】
集光レンズ２４は、励起光源２１から射出された励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂを介し穴あきミラー２３の穴を貫通して入射されたときに、励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光するものである。
【００２５】
このとき、マイクロプレートＭＰには集光レンズ２４により集光された励起光ＦＬが矢印Ｘ方向およびＹ方向に走査しながら照射されるようになっている。具体的には、集光レンズ２４は揺動可能に設けられており、レンズ移動手段２５に接続されている。そして、レンズ移動手段２５は集光位置がマイクロプレートＭＰの矢印Ｙ方向に走査するように集光レンズ２４を揺動させるようになっている。また、マイクロプレートＭＰは、矢印Ｘ方向（副走査方向）に移動可能に設けられており、プレート移動手段２６に接続されている。そして、プレート移動手段２６はマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるようになっている。つまり、励起光ＦＬは、集光レンズ２４の移動により矢印Ｙ方向に走査し、マイクロプレートＭＰの移動により矢印Ｘ方向に走査することになるため、マイクロプレートＭＰ上に格子状に配列された複数の蛍光標識検体に対して励起光ＦＬを走査しながら照射することができる。
【００２６】
蛍光検出手段３０は、たとえばＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｅｉｅｒ  Ｔｕｂｅｓ：光電子増倍管）からなっており、蛍光がアナログ信号として検出されるようになっている。なお、蛍光標識検体から射出された蛍光は集光レンズ２４に入射されて平行光になり、穴あきミラー２３のミラー部分により反射されて波長透過特性の異なるカラーフィルタ３１ａ、３１ｂ、３１ｃのうちのいずれかに入射される。このカラーフィルタ３１は励起光の波長および蛍光の波長に応じて選択される。その後カラーフィルタ３１から射出した蛍光がミラー３２を介してレンズ３３に入射され、レンズ３３により蛍光検出手段３０に集光されるようになっている。
【００２７】
データ出力手段４０は、蛍光検出手段３０から出力されるアナログ信号をデジタル信号に返還するとともに信号処理を行うことにより、検出された蛍光を蛍光画像データとして出力する機能を有している。ここで、上述のようにマイクロプレートＭＰの各スポットＷには、励起光ＦＬが矢印Ｘ方向および矢印Ｙ方向に対して走査しながら照射されていく。このとき、蛍光検出手段３０が励起光ＦＬが蛍光標識検体に照射されるたびに射出される蛍光を検出し、データ出力手段４０が複数の蛍光標識検体からそれぞれ射出される蛍光を蛍光画像データとして出力するようになっている。
【００２８】
上記の励起光照射手段２０、蛍光検出手段３０およびデータ出力手段４０は、いずれも制御手段５０によりその動作が制御される。
【００２９】
図３を参照して蛍光検出装置１０の動作例について説明する。まず、励起光源２１から励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂおよび集光レンズ２４を介して、マイクロプレートＭＰのスポットＷに照射される。すると、励起光ＦＬが照射されたスポットＷに存在する蛍光標識検体から蛍光が射出する。射出した蛍光が蛍光検出手段３０により検出されてデータ出力手段４０から蛍光画像データとして出力される。このとき、レンズ移動手段２５およびプレート移動手段２６により、励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰに対して走査しながら照射されるため、マイクロプレートＭＰに存在する各スポットＷ毎にそれぞれ蛍光画像データが出力されていく。
【００３０】
上述の蛍光検出装置１０においては、カラーフィルタ３１が励起光源２１から射出される励起光の波長を遮断するものでないと、蛍光検出手段３０に過大な光量が入射し、蛍光検出手段３０に一時的な感度低下を引き起こす等の悪影響を与えてしまうことになる。そのため、本実施の形態においては、実際の測定に先立ってカラーフィルタ３１の適合性の判定を行い、蛍光検出手段３０に過大な光量が入射するのを防止している。
【００３１】
以下、カラーフィルタの適合性の判定方法について説明する。図４は、カラーフィルタの適合性の判定方法を示すフローチャートである。
【００３２】
まず、励起光源２１およびカラーフィルタ３１の種類を選択する（ステップＳＴ１）。次に、励起光源２１の出力を通常出力より低い確認時出力にして励起光ＦＬを照射するとともに、ＰＭＴ（蛍光検出手段３０）の感度を通常感度より低い確認時感度にしてバックグランドレベルＢＧの測定を行う（ステップＳＴ２）。
【００３３】
なお、バックグランドレベルＢＧの測定の際には、マイクロプレートＭＰ上の各スポットＷ以外の領域に励起光ＦＬを照射するか、装置にマイクロプレートＭＰを装填しないようにして、励起光ＦＬにより蛍光が発生しない状態で測定を行えばよい。
【００３４】
また、ＰＭＴは印加する電圧が高くなる程感度が高くなるが、バックグランドレベルＢＧの測定時には通常測定時よりも低い電圧を印加する。具体的には、通常測定時は８００Ｖ程度の電圧を印加するが、バックグランドレベルＢＧの測定時には印加電圧ＨＶは５０〜５００Ｖとする。この印加電圧ＨＶは、数式Ａ×Ｎ（ただしＡは係数、Ｎは変数）で表す通り変化させるものであり、本実施の形態においてはＡは５０Ｖ、Ｎは１〜１０としている。
【００３５】
ＰＭＴに５０Ｖの電圧を印加してバックグランドレベルＢＧの測定を行った結果を所定の閾値と比較し（ステップＳＴ３）、バックグランドレベルＢＧが閾値を超えている場合にはカラーフィルタ３１が不適合であると判定し、その旨を通知する（ステップＳＴ５）。
【００３６】
なお、カラーフィルタ３１が不適合である旨の通知は、蛍光検出装置１０の筐体にインジケータを設けてこのインジケータを点灯させる等して通知してもよいし、蛍光検出装置１０に接続されたコンピューター６０のモニタ上に表示させるようにしてもよい。
【００３７】
バックグランドレベルＢＧが閾値を超えていない場合には、目標電圧値である５００Ｖまで印加電圧ＨＶを５０Ｖずつ増加させ、印加電圧ＨＶを変更する毎にバックグランドレベルＢＧと閾値との比較を行う（ステップＳＴ３〜６）。
【００３８】
最終的に印加電圧を目標電圧値である５００Ｖまで増加させて、バックグランドレベルＢＧが閾値を超えなかった場合には、選択されたカラーフィルタ３１が適正なものであると判定し、励起光源２１の出力を通常出力にするとともに、ＰＭＴの印加電圧を通常測定時の８００Ｖまで増加させて、本測定を行うようにする。
【００３９】
なお、本実施の形態の蛍光検出装置１０においては、複数の波長の励起光源２１ａ、２１ｂ、２１ｃと、複数のカラーフィルタ３１ａ、３１ｂ、３１ｃとを備えているため、図５の表に示すように各励起光源２１と各カラーフィルタ３１の組合せ毎に適合性を判定して、ユーザーに通知するようにしてもよい。
【００４０】
以上、本発明の好ましい実施の形態について説明したが、本発明は上記態様に限定されるものではなく、本発明の効果が得られる範囲で適宜変更することが可能である。
【００４１】
例えば、バックグランドレベルＢＧと比較する閾値は、ＰＭＴの印加電圧毎に変更してもよいし、また励起光の波長とカラーフィルタ特性との組合せに応じて変更してもよい。
【００４２】
また、バックグランドレベルＢＧ測定時のＰＭＴの印加電圧については、上記に限定されるものではなく、どのような範囲としてもよい。さらに、上記のように整数倍に増加させるのではなく、ＰＭＴのゲイン特性に応じて増加させてもよい。例えば、一般にＰＭＴは印加電圧が所定電圧以下では感度が低く、印加電圧が所定電圧を超えると急激に感度がよくなるような非線形特性を有しているため、所定電圧以下では電圧を大きく増加させ、所定電圧以上では電圧を小さく増加させるようにしてもよい。  
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の蛍光検出装置を用いた蛍光検出システムの一例を示す構成図
【図２】上記蛍光検出システムに使用するマイクロプレートの一例を示す模式図
【図３】上記蛍光検出システムの蛍光検出装置の一例を示す構成図
【図４】上記蛍光検出装置におけるカラーフィルタの適合性の判定方法を示すフローチャート
【図５】上記蛍光検出装置における各励起光源と各カラーフィルタの組合せ毎の適合性を示す表
【符号の説明】
【００４４】
１     蛍光検出システム
１０   蛍光検出装置
２０   励起光照射手段
２１   励起光源
３０   蛍光検出手段
４０   データ出力手段
５０   制御手段
６０   画像処理装置
ＭＰ   マイクロプレート
Ｗ     スポット
【図１】
0004585429.tif 000002
【図２】
0004585429.tif 000003
【図３】
0004585429.tif 000004
【図４】
0004585429.tif 000005
【図５】
0004585429.tif 000006