(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 被検者から得た生物学的サンプル中のアネキシンI及びアネキシンIIから選択されるアネキシンタンパク質を定量的に検出し、そして
(b) 対照サンプルと比較して被検者のサンプル中に検出されるアネキシンタンパク質の濃度増加が肺がん、乳がん、もしくは食道がん患者の指標となるので、被検者のサンプル中に検出されたタンパク質濃度を対照サンプル中に検出されたタンパク質濃度と比較すること、からなる
肺がん、乳がん、もしくは食道がん患者の指標を検出する方法。
【請求項２】
アネキシンタンパク質を免疫検定法で検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫検定法が免疫沈降法である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが肺組織サンプルである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
がんが肺がんである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
(a) 免疫特異的に抗原抗体結合反応が生じるような条件下で被検者から得た生物学的サンプルとアネキシンI及びアネキシンIIから選択されるアネキシンタンパク質抗原を含むサンプルを接触させ、そして
(b) 自己抗体の存在が被検者に肺がん、乳がん、もしくは食道がんが存在することを示すので、被検者の生物学的サンプルにおいてアネキシンタンパク質に対する抗体の免疫特異的な結合を検出すること、からなる、
肺がん、乳がん、もしくは食道がん患者の自己抗体の存在の検出方法。
【請求項７】
被検者の生物学的サンプル中の自己抗体検出の段階に、被検者の生物学的サンプル中に存在する抗体に結合する標識2次抗体を使用することからなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
(a) 1以上のアネキシンタンパク質を膜あるいは基質の上に固定し、
(b) その膜あるいは基質を被検者の生物学的サンプルと接触させ、そして
(c) 自己抗体の存在が肺がん、乳がん、もしくは食道がんの存在を示すので、被検者の生物学的サンプル中の1以上のアネキシンタンパク質に特異的な自己抗体の存在を検出すること、からなる免疫検出法によって生物学的サンプル中の自己抗体の存在を測定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
がんが肺がんである請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプル中のアネキシンI及びアネキシンIIから選択されるアネキシンタンパク質の存在を検出するための抗アネキシン抗体を含む、被検者における肺がん、乳がん、もしくは食道がんの診断及び予後診断のためのキット。
【請求項１１】
抗アネキシン抗体が標識されている、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
標識が放射能、蛍光、カロリメーターまたは酵素標識である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
免疫特異的に抗アネキシン抗体に結合する標識2次抗体をさらに含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
サンプル中のアネキシンI又はアネキシンIIの自己抗体の存在を検出するためのアネキシンI又はアネキシンIIタンパク質を含む、被検者の肺がん、乳がん、もしくは食道がんの診断及び予後診断のためのキット。
【請求項１５】
アネキシンI又はアネキシンIIタンパク質が標識されている請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
アネキシンI又はアネキシンIIタンパク質が固相に固定されている請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
アネキシンI抗原又はアネキシンII抗原に結合するアネキシンI又はアネキシンIIの自己抗体の検出のためのアネキシンI又はアネキシンIIタンパク質をさらに含む請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、被検者の血清中に存在する特異なアネキシンタンパク質抗原に対する血清自己抗体の存在を検出することによって、被検者におけるがんの診断、予後あるいはがんに対する罹患性についてスクリーニングする方法に関するものである。また、本発明は、被検者から得た生物学的サンプル中のアネキシンタンパク質発現程度の増加を検出することにより、被検者におけるがんの診断及び予後をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、がんになるリスクを持つ被検者を発見するために使用することもできる。本発明の方法は、アネキシンタンパク質発現またはアネキシン由来ペプチドまたは抗原の発現の存在とそのレベル、及び/または循環する特異アネキシンタンパク質抗原に対する自己抗体の存在とそのレベル、を測定するための被検者由来生物学的サンプルの使用を含んでいる。さらに、本発明は上記スクリーニング方法を実施するためのキットを提供する。そのキットはアネキシンタンパク質の上昇したレベルについて被検者をスクリーニングするために使用することができ、あるいはがんの診断、予測または予後の指標としてアネキシンタンパク質に対する自己抗体の検出のために使用することができる。本発明は、アネキシンタンパク質のレベルの上昇、及びアネキシンタンパク質に反応する循環自己抗体レベルの上昇が被検者の血清中に認められた実例によって示されている。
【０００２】
（背景技術）
種々のがん患者の体液中に、多数の細胞性タンパク質が増加して存在することが示されている。がん患者においてそのようなタンパク質のレベル上昇は、がんに対する診断及び予後判定のためのアッセイに使用し得る。例えば、前立腺特異抗原（PSA）の上昇した血清レベルは、しばしばヒト前立腺がん存在の指標として使用されている。
【０００３】
自己免疫疾患及び心血管系疾患のような病気では、場合によっては疾患が明らかな症状を示す以前に、正常または修飾された細胞性タンパク質に対する自己抗体が患者により生産されていることが知られている。種々のがん患者において多くの細胞内及び表面抗原に対する抗体の同定に示されるように、ヒトにおけるがんに対する液性免疫応答の証拠が増えている（Gourevitch et al., 1995, Br.J.Cancer 72:934-938; Yamamoto et al., 1996, Int.J.Cancer, 69:283-289; Stockert et al., 1998, J.Exp.Med. 187:1349-1354; Gure et al., 1998, Cancer Res. 58:1034-1041）。例えば、体細胞のp53遺伝子の変化は、影響を受けた患者の30‐40%に液性応答を引き起こす（Soussi, 1996, Immunol.Today 17:354-356）。ある例では、抗p53抗体の検出はがんの診断に先行する（Lubin et al., 1995, Nat.Med. 7:701-702; Cawley et al., 1998, Gastroenterology 115:19-27）。United States Patent No. 5,405,749は、がんによる網膜疾患自己抗原のスクリーニング法及び自己抗原に対する自己抗体に関する患者血清の試験方法を公開している。さらに、腫瘍細胞骨格タンパク質の相対的合成速度の増加が、白血病細胞の表面及び変異原及びEpstein-Barrウイルスにより形質転換したリンパ球の表面において観察された（Bachvaroff, R.J. et al., 1980, Proc.Natl Acad. Sci. 77:4979-4983）。
【０００４】
確認され、液性応答を引き起こすがん由来の抗原のほとんどは、変異遺伝子の産物ではない。種々の抗原及び腫瘍に過剰発現している遺伝子産物を含んでいる（Old and Chen, 1998, J.Exp.Med. 187:1163-1167）。何故あるタイプの腫瘍患者の一部のみが個別抗原に対して液性応答をするのか明らかではない。免疫応答に影響を与える因子には主要組織適合複合体分子の個体間のばらつきが含まれるであろう。タンパク質が、翻訳後の修飾、類似の腫瘍の間でも違いがありうる過程、を経た後に免疫原になる可能性もある。
【０００５】
肺がんは米国では最も多いがんであり、米国におけるがんによる死亡の4分の1以上（28%）を占めている（Travis et al., 1996, Cancer 77:2464-2470）。c-myc増幅、Ki-rasまたはp53変異などの多くの分子変化は腫瘍の反応に影響を及ぼすことを明らかにした（Mao et al., 1994, Cancer Res 54:1634-1637, Mills et al., 1995, J.Natl.Cancer Inst. 87:1056-1060, Gao et al., 1997, Carcinogenesis 18:473-478）。c-myc（Ben-Mahres et al ., 1990, Int.J.Cancer 46:35-38）, c-myb (Sorokine et al., 1991, Int.J.Cancer 47:665-669), c-erbB-2 (Pupa et al., 1993, Cancer Res 53:5864-5866), ras (Takahashi et al., 1995, Clin. Cancer 1:107)及びp53 (Peyrat et al., 1995, Lancet 345:621-622; Iizasa et al., 1998, Cancer Immunol.Immunother. 46:345-349) のような、がん遺伝子及びがん抑制遺伝子産物に対する血清自己抗体は種々の悪性疾患患者について報告されている。L-mycがん遺伝子産物に対する自己抗体は肺がん患者の10%の血清で報告されている（Yamamoto et al., 1996, Int.J.Cancer 69:283-289）。また、p53に対する血清自己抗体は非小細胞性肺がん患者（NSCLC）の血清に検出されている（Iizasa et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother. 46:345-349）。抗p53自己抗体の血清力価上昇がNSCLC患者の約20%に存在したし、またこの自己抗体の存在はp53変異及び p53過剰発現を反映している（Yamamoto et al., 1996, Int.J.Cancer 69:283-289）。
【０００６】
細胞抗原に対する自己抗体の検出及び自己抗体を誘導するタンパク質の同定は種々の方法を用いて実施されてきた。例えば、増殖性細胞核抗原（PCNA）は、最初紅斑性ろうそう患者から得られた核抗原に結合する抗体として記述された（Miyachi,K., Fritzler,M.J. and Tan,E.M., 1978, J.Immunol 121:2228-2234）。次いで、核染色で示される分裂促進因子で刺激されたリンパ球とは逆に、休止リンパ球は抗体と反応しないことが観察された。このことが結局、紅斑性ろうそうにおいてこの自己抗体によって認識された、PCNAと呼ばれるタンパク質の同定につながる（Tan,E.M., Ogata,K, and Takasaki,Y., 1987, J.Rheumatol., 13:89-96）。その他の例としては、p53の研究で行われたように、候補タンパク質を単離し、そして患者において抗体を誘導することができるかどうかを検討した（Crawford,L.V., Firm,D.C., Bulbrook,R.D., 1984, Int.J.Cancer 30:403-408）。更にSEREXと呼ばれる技術は腫瘍抗原を同定するための組換えcDNA発現ライブラリーの血清学的解析による。（Old,L,ら.1998,J.Exp.Med. 187:1163-1167）。このように、多くの研究に追随し、それに拮抗して自己抗体が産生される可能性のあるタンパクが探索されている。
【０００７】
アネキシンは高度に進化した及び進化していない真核生物の異なる組織と細胞型に偏在して発現するカルシウム依存性リン脂質結合タンパクの族である(Benz,J. and Hofmann,A., 1997, Biol.Chem 378:177-183)。少なくとも12種のアネキシンタンパクが同定されている。アネキシン族のタンパクに対して示唆されている多くの役割の中で、制御されたエクソサイトーシスに関与するタンパクに影響を与えるという可能性が高い(Donnelly,SR and Moss SE,Cell,1997, Mol.Life Sci. 53:533-538)。典型的なアネキシンタンパクは二つの異なる特徴をもっている。（i）リン脂質に対するCa2+依存性結合、及び（ii）その族の既知の物質の中で4回あるいは8回繰り返される約70種の保存されたアミノ酸の配列単位の存在。アネキシンの免疫細胞化学的研究によってそれらはカルシウムをキレート化する細胞内オルガネラの近傍の、原形質膜のすぐ近くに存在することが示されている(Gerke,V and Moss,SE,1997, Biochimica et Biophysica Acra 1357:129-154)。アネキシンに関連した物理的性質にはフォスフォリパーゼA2、抗凝固活性、細胞骨格タンパクに対する結合、細胞膜と小胞の集合およびカルシウム選択性チャンネル活性の阻害がある。多発性硬化症及び実験的神経炎を含む多くの疾患に関連してアネキシンの濃度の増加が認められてきた。
【０００８】
（発明の開示）
被験者の生体標本中アネキシン自己抗体濃度の上昇を検出することによって、癌の診断及び予後判定の評価、癌の素因を持つ被験者の識別、及び癌治療を受けている患者のモニタリングに対するスクリーニング法を提供することが本発明の目的である。本発明はまた癌の診断上のもしくは予後判定の指標としてアネキシンタンパクの過剰産生及び／もしくはアネキシンタンパク群の過剰産生を検出する方法を提供する。
【０００９】
本発明は癌もしくは前癌病変のある被験者の血清中アネキシンタンパク抗原に対する自己抗体を検出することによる癌の診断上の評価及び予後判定に関連する。アネキシンタンパクに対する自己抗体の血清中濃度の増加を確認することにより癌のスクリーニング、診断及び予後のための新しい方法を構築する。
【００１０】
本発明はアネキシンタンパク抗原に対する血清自己抗体の存在を確認するために計画された免疫検定法におけるアネキシンタンパク抗原の利用法を提供する。このような免疫検定は癌の診断及び予後に利用することが可能である。本発明によって、被験者の血清中アネキシン自己抗体濃度の測定は癌の早期診断に用いることができる。さらに、血清自己抗体濃度のモニタリングは疾患の進行を段階づけるために予後的に利用することが可能である。
【００１１】
本発明はさらに被験者の標本中アネキシンタンパク濃度を測定するために開発された検定法に関連する。このような検定法にはアネキシンタンパクが抗アネキシン特異性抗体との相互作用によって検出される免疫検定法がある。例えば、アネキシン抗体もしくは抗体の断片が被験者の標本中アネキシンタンパクの存在及び含有量を量的に確認するために利用される可能性がある。
【００１２】
本発明はまたアネキシンタンパク抗原の発現レベルの増加を特徴とする疾患をもつ患者を免疫する抗原としてのアネキシンタンパクの利用法に関連している。このような抗原に対する免疫学的反応を刺激することによって、とりわけ腫瘍細胞の成長を阻害しもしくは腫瘍細胞の死滅を促進するような、腫瘍細胞に対する更に効果的な攻撃を誘発することを意図している。個々の癌に関連するアネキシンタンパク抗原に対する自己抗体の同定によって疾患の免疫療法の基礎が得られる。
【００１３】
本発明は更に癌もしくは癌発生の素因をもつ患者を診断するための臨床的装置に都合よく利用できるパック入りの診断用キットを提供する。そのキットはまた癌の治療に用いられる薬剤の有効性をモニターするために利用することが可能である。本発明の具体例として、そのキットには標本中のアネキシン抗原に対する自己抗体濃度の確認及び／もしくは測定用の成分が含まれる。第二の具体例として本発明のキットには生体標本中のアネキシン抗原を検出及び／もしくは測定する成分が含まれる。
【００１４】
本発明は肺腺癌もしくは肺扁平上皮細胞癌の被験者から採取された腫瘍組織標本中でアネキシンＩ及びIIの発現レベルが増加するという発見に基づいている。更に、肺腺癌及び扁平上皮細胞癌の被験者の血清中においてアネキシンI及びIIに拮抗する自己抗体の増加が認められた。癌の被験者から採取された標本中においてアネキシンタンパク及びアネキシン自己抗体の濃度が増加するという結果によって、癌の様々な治療法の有効性をモニタリングする方法と同様に診断及び予後判定法の開発の基礎が得られる。
【００１５】
（発明を実施するための最良の態様）
本発明は非常に望ましい目的、すなわち癌の被験者の診断上の及び予後判定の評価法を提供すること、また癌発生の素因を示す被験者の識別法を提供すること、を達成する。本発明の検定法には、被験者の血清もしくは他の生体標本中のアネキシンタンパク産生のレベルの上昇、あるいはアネキシン自己抗体の存在を確認するために計画された方法が含まれる。本発明の目的のために、アネキシンタンパクは一続きの約70のアミノ酸が少なくとも4回繰り返されている標準的なモチーフが特徴である(Wallner,B.P..ら1986, Nature 320:77-80; Weber,K.及びJohnson,N., 1986, FEBS Lett. 203:95-98; Saris,C.J.M.ら1986 ,Cell 46:201-212; Huang K.S.ら1986, Cell 46:191-199)。
【００１６】
特に、本発明には次の事柄を含む被験者の癌の診断及び予後判定の方法が含まれる。
（a）被験者から採取された生体標本中のアネキシンタンパクの定量的測定、および
（b）被験者の標本中に検出されたタンパク濃度を対照標本中に検出されたタンパク濃度と比較すること。
ここでは対照の検体と比較した時、被験者の標本中に検出されたアネキシンタンパク濃度の上昇が癌のもしくは癌の危険性の増大した被験者の指標である。アネキシンタンパクの検出に加えて、アネキシン誘導ペプタイド、抗原もしくは特異的に修飾されたアネキシンタンパクを癌の診断及び／もしくは予後判定のために測定してもよい。
【００１７】
アネキシンタンパクを含有する可能性のある広範囲の種類のタンパク混合物を調製しタンパク発現のレベルを測定してもよい。好ましい具体例として、癌の疑いのある被験者もしくは癌の素因のある被験者の標本が、肺組織標本に限るわけではないが、アネキシンタンパク産生のレベルの上昇をスクリーニングするために用いられる可能性がある。
【００１８】
本発明には次のような癌の被験者の診断及び予後判定のための方法が含まれる。
（a）免疫特異性抗原抗体結合反応がおこる可能性のある条件下で被験者から採取した抗体を含有する生体標本をアネキシンタンパク抗原を含有する標本に接触させること、および
（b）アネキシンタンパクに対する被験者の生体標本中に存在する自己抗体の免疫特異性結合の存在を確認すること。
ここでは自己抗体の免疫特異性結合の存在が被験者の癌の存在を示す。
【００１９】
本発明の特定の具体例として、アネキシンタンパクは、アネキシンIとIIおよびそれらから誘導されたペプタイドに限ったことではないが、感受性の高いまた急速な免疫吸着検定法あるいは他の方法によって、このようなタンパク抗原に対する循環自己抗体の存在について被験者の血清をスクリーニングするために精製され利用される。
【００２０】
本発明はまた上記の方法を実施するためのキットを提供する。例えば、その方法は抗アネキシン抗体のようなアネキシンタンパクを検出するための少なくとも一種の試薬を含むパック入りの診断用キットを利用することによって実施できる。標本を採取した被験者のアネキシン自己抗体の検出のために診断用キットはアネキシンタンパクもしくは抗原タンパク断片のどちらかを含有する。
【００２１】
本発明はアネキシンI及びIIタンパク濃度が癌の被験者から採取された肺腺癌および肺扁平上皮癌で増加するという発見に基づいている。さらに、アネキシンタンパクに拮抗して反応する循環自己抗体濃度の増加が肺腺癌及び肺扁平上皮細胞癌の被験者の血清中に認められた。
【００２２】
５．１．アネキシン産生の検出のための検定法
本発明のように、被験者から採取された標本中のアネキシンタンパク濃度の測定を癌のような疾患の早期診断に利用することができる。さらに、アネキシンタンパク濃度のモニタリング及び定量はその疾患の進行を段階づけるために、また癌患者の治療のために用いられる薬剤の有効性を評価するために予後的に利用できる。
【００２３】
被験者から採取された標本中のアネキシンタンパクの検出は多くの方法のいずれかによって実施することが可能である。被験者の生体標本中のアネキシンタンパクの検出のための好ましい診断法には、たとえば、アネキシンタンパクがアネキシン特異性抗体との相互作用によって検出される免疫検定法がある。本発明に有用な抗体はアネキシンもしくはそのアネキシン断片の存在を定量的にあるいは定性的に検出するために用いることができる。さらに、例えばアネキシンタンパクに特異的に結合するポリペプタイドのような、抗体以外の試薬がアネキシンタンパク発現のレベルを測定するための検定法に利用することが可能である。いずれかの方法で、アネキシンタンパクの検出は、例えば、フォスフォリパーゼA、及び抗凝固活性のようなアネキシンタンパクに関連した生物学的性質のレベルを検出及び測定することによって行なうことが可能である。
【００２４】
本発明の実施に有用な免疫検定法には、ウェスタンブロット法のような手法をもちいた検定システムに限ったことではなく、少数例をあげればラジオイムノアッセイ、ELISA(免疫吸着検定に関連した酵素)、「サンドイッチ」免疫検定法、免疫沈降検定法、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散検定法、凝集検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、タンパクＡ免疫検定法がある。
【００２５】
肺組織もしくは他の生体組織のような、アネキシンタンパクを含有する可能性のある生体標本は個々の癌もしくは癌の危険性をもった疑いのある被験者から採取する。全体の組織あるいは細胞の部分標本は専門家には周知のいろいろ異なった反応混液のいずれか一種類を用いて可溶化する。例えば、組織は脱イオン水で希釈した（１リットル当たり）８Ｍ尿素、20ｍl Nonidet P-40界面活性剤、20ml両性電解質(pH 3.5-10)、20ml 2-メルカプトエタノール、及び0.2mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF)を含有する溶解緩衝液の追加により可溶化することができる。
【００２６】
アネキシンタンパクの発現を検出するための免疫検定法には代表的なものとして、免疫特異性抗原抗体結合反応が起こる可能性のあるような条件下で抗アネキシン抗体を用いて被験者から採取された組織標本のような生体標本への接触、および抗体による免疫特異性結合量の検出あるいは測定が含まれる。特定の側面としては、例えば、抗体のこのような結合はアネキシンタンパク産生の増加が罹患の指標である場合に、アネキシンタンパク産生の存在及び増加を確認するために利用できる。生体標本中のアネキシンタンパク濃度は同年令及び同性の正常な個体と癌のないもしくは前癌状態の様々な被験者に対して設けられた基準値と比較する。
【００２７】
本発明の具体例として、組織抽出液のような生体標本を標本内のあらゆるタンパクを固定化する目的で、ニトロセルロースのような固相支持物質に接触させる。その後支持物質は適当な緩衝液で洗浄し、続いて検出できるようにラベルされたアネキシン特異性抗体で処理する。固相支持物質はその後結合していない抗体を除去するために緩衝液で2回洗浄する。固相の支持物質に結合した抗体量はその後周知の方法に従って測定する。専門家であれば日常の実験法を用いて個々の測定のための任意の検定条件を設定できるであろう。
【００２８】
アネキシンタンパクが検出できるようにラベルすることが可能な一つの方法は、酵素免疫検定法(EIA)に用いられる方法のように、酵素に抗体が結合することによる(Voller, A.,”The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”1978, Diagnostic Horizons 2:1-7 Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller, Aら1978, J.Clin.Pathol. 31:507-520; Butler, J.E., 1981, Meth.Enzymol.73:482-523)。抗体に結合した酵素は、例えば分光光度計、蛍光計または視覚的手段によって検出できる化学成分を産出するような方法で、おそらく色素産生性の基質である適当な基質に反応する。抗体を検出できるよう標識するために用いることができる酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含むが、それに限定されるものではない。検出は、酵素に対する発色基質を採用する比色法によっても行うことができる。
【００２９】
アネキシン抗体の検出は、他のさまざまな方法によっても行うことができる。例えば、抗体または抗体のフラグメントを放射性物質で標識することにより、放射免疫測定法（RIA）を用いてアネキシン蛋白の発現を検出することが可能である（例えば、Weintraub, B. Principles of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986参照）。放射性同位体は、γ計数器またはシンチレーション計数器を用いるような方法もしくはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【００３０】
抗体は蛍光性化合物でも標識することができる。このうち最もよく用いられる蛍光性標識化合物は、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンおよびフルオレサミンである。同様に、生物発光化合物も、アネキシン抗体の標識に用いられる。生物発光蛋白の有無は、発光の有無を検出することにより測定できる。標識を目的とした重要な生物発光化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンがある。
【００３１】
本発明の特有の具体的実例として、生物学的試料中のアネキシン蛋白の濃度を、二次元ゲル電気泳動により分析することができる。二次元ゲル電気泳動の方法は、技術に熟練を要することが知られている。組織試料のような生物学的試料を、一次元目において、電荷に基き蛋白を分離する等電点電気泳動による分離を行うために電気泳動ゲルに添加する。多数の一次元目ゲル調製品が利用できるが、それには両性担体に基く分離のためのチューブゲルまたは固定化勾配に基く分離のためのゲルストリップなどがある。一次元目の分離の後、蛋白を二次元目のゲルに移し、平衡化処理を行った後、分子量に基き蛋白を分離するSDS PAGEを用いて分離を行う。異なる被験者由来の生物学的試料を比較するときは、複数のゲルを個々の生物学的試料（正常コントロールからの試料を含む）から調製する。
【００３２】
分離後、蛋白を二次元ゲルから一般にウエスタンブロッティングに用いるメンブレン上に移す。ウエスタンブロッティングおよびその後の蛋白視覚化の手法も、良く知られた技術である（Sambrook et al., “Molecular Cloning, A Laboraory Mannual” 2nd Edition, Volume 3, 1989, Cold Spring Harbor）。標準的な手順を用いるか、もしくはその手順が特定のタイプの蛋白、例えば高度に塩基性または酸性、または脂溶性などのタイプを同定する技術において知られているような変更を加えることができる（例えば、Ausubel et al., 1999年、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons Inc., N.Y. 参照）。アネキシン蛋白に結合する抗体を、インキュベーションの段階で、ウエスタンブロット分析の手法に従って利用する。一次抗体に特異的な二次抗体をウエスタンブロット分析の手法で利用して、一次抗体と反応した蛋白を視覚化する。
【００３３】
生物学的試料中のアネキシン蛋白濃度の測定は、治療中に用いた抗癌剤の有効性の可能性をモニターするために用いることもできる。例えば、アネキシン蛋白産生レベルは、治療前および治療中に測定することができる。薬剤の有効性は、治療期間全体にわたりアネキシンの発現量を比較することにより追跡できる。効果を発現する薬剤は、その薬剤を用いた治療が進行するにつれて、アネキシン蛋白産生レベルを低下させる薬剤である。
【００３４】
本発明は、例として、肺腺癌および扁平上皮細胞肺癌に罹患した患者由来の組織試料中でアネキシン蛋白濃度の上昇が検出されたところで立証されている。特に、アネキシンIおよびIIの濃度の上昇は、肺癌患者由来の試料中で検出された。生物学的試料中のアネキシン蛋白の検出および／または定量法は、アネキシン蛋白が過剰発現するある種の癌または他の増殖性疾患を発現するリスクがある被験者のスクリーニングに用いることができる。さらに、蛋白のアネキシンファミリーの異なるメンバーの血清または生物学的液体中に生じるパターンの定量的差を、癌または癌のリスクのスクリーニング、診断または予後の指標として利用することができる。
【００３５】
５．２抗アネキシン自己抗体検出のための測定法
本発明は、被験者の体内に循環しているアネキシン自己抗体の検出に基き癌のような疾患の診断および予測法を提供する。本法は、癌を有する被験者ならびに年齢と性別をマッチさせた癌のないコントロールから得た生物学的試料を用いることにより確認されている。自己抗体が含まれている可能性がある生物学的試料、例えば血清などを、特定の癌が疑われる被験者または癌を発現する素因があることが疑われる被験者から採取する。同じ体液を、癌のないコントロールの被験者から採取する。
【００３６】
本発明に従って、アネキシン蛋白抗体に対して反応する自己抗体の測定を、癌のような疾患の早期診断に用いることができる。さらに、自己抗体レベルのモニタリングは、疾患進行の段階を予測するのに用いることができる。患者の血清試料中の自己抗体は、多くの方法により検出することができる。このような方法には、ほんの一例として、ウエスタンブロット、放射免疫測定法、ELISA（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体結合測定法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、蛋白A免疫測定法などのような技術を用いたアッセイシステムが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
このような免疫測定法は、免疫特異性抗原−抗体結合反応が生じ、自己抗体による免疫特異性結合の検出または定量を行うことができるという条件下で、アネキシン蛋白抗原含有試料の被験者由来の血清試料と接触させる方法により行う。特異的な面において、このような組織切片による抗体の結合は、例えば、自己抗体の検出が疾患の状態を示すような自己抗体の有無の検出に用いることができる。血清試料中の自己抗体のレベルを、疾患を有しない被験者から得た類似の血清試料中に存在するレベルと比較する。
【００３８】
免疫測定法は、種々の方法で行うことができる。このような測定を行うひとつの方法には、例えば、アネキシン蛋白を固体の支持体に固定し、そこに特異的に結合する抗アネキシン抗体を検出する方法などがある。本発明の測定法で利用されるアネキシン蛋白は、よく知られた技術である遺伝子組換えDNA技術により調製することができる。例えば、アネキシン蛋白またはその抗原フラグメントをコードするDNA分子を、遺伝子工学を用いて適切な発現ベクターに挿入し、アネキシン蛋白を大規模に調製することができる。アネキシン蛋白の標識、固定化または検出を促進できる融合蛋白をつくることは、有利であると思われる。例えば、Sambrookらが、1989年に、Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.で報告した方法を参照のこと。あるいは、アネキシン蛋白を天然資源から精製すること、例えば、よく知られた技術である蛋白分離法を用いて、細胞から精製することも考えられる。このような精製法には、分子ふるいクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーなどが含まれるが、これに限定されるものではない。実際には、マイクロタイタープレートが、アネキシン蛋白の固体の支持体として用いるのに便利である。表面を予め調製して保管してもよい。
【００３９】
本発明は、例として、癌患者の血清中で検出されるいくつかのアネキシン蛋白抗原に対して反応性のある循環している自己抗体のレベルが上昇しているところで立証されている。血清中の循環している抗−アネキシン自己抗体の検出および／または定量は、アネキシン蛋白レベルが上昇する癌またはその他の増殖性疾患のリスクがある被験者のスクリーニングに用いることができる。
【００４０】
５．３免疫療法
本発明は、アネキシン蛋白抗原の産生を特徴とする疾患に罹患した患者を免疫する抗原としてのアネキシン蛋白の利用とも関連している。このような抗原に対して免疫学的反応を刺激することは、腫瘍細胞により効果的な攻撃を惹起すること、とりわけ腫瘍細胞増殖阻害、または腫瘍細胞死滅促進のような攻撃を惹起することを意図している。特定の癌と関連するアネキシン蛋白抗原に対する自己抗体を同定することは、疾患の免疫療法の根拠となる。
【００４１】
患者は、アネキシン蛋白抗原で免疫されて、腫瘍細胞死滅促進または腫瘍細胞増殖阻害のような免疫反応が惹起される。アネキシン蛋白抗原は、上述の蛋白精製法を用いて調製することができる。
【００４２】
本発明の具体化において、自己抗体を発現した癌を有する患者に対する精製アネキシン蛋白抗原を構成する免疫原を、免疫反応を惹起するために用いる。投与については、蛋白抗原に対する免疫反応を増大させるために、アネキシン蛋白抗原は適切なアジュバントを用いて製剤化しなければならない。適切なアジュバントには、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロン酸ポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油乳剤のような界面活性物質があり、BCG（bacilli Calmett-Guerin）および（Corynebacterium parvum）のように有用なヒトアジュバントとなり得るものが含まれるが、これに限定されるものではない。上記由来の製剤を投与するために多くの方法を用いることができ、こうした方法には経口、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下投与などが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
５．４キット
本発明は、さらに上述の測定法を実施するためのキットもある。本稿で述べる測定法は、例えば、少なくともアネキシンペプチド（アネキシン自己抗体検出用）、またはアネキシン抗体試薬（アネキシン蛋白検出用）からなる予めパッケージ化された診断キットを用いることにより実施することができ、これは、例えば臨床において癌のような疾患を診断するために、便利に使用することができる。
【００４４】
これに限定されるものではないが、具体化の第一シリーズとして、本発明によるキットは、アネキシン抗原を指向するヒトIgG抗体を検出および／または測定するための成分からなる。1例として、抗体が酵素免疫測定法（ELISA）により検出および／または測定されるところでは、このような成分は標的抗原からなり、少なくともひとつ、できれば多数の異なるアネキシン抗原またはそのエピトープの形をしており、固相と結合しており、標的抗原と結合するヒト抗体を検出するための手段である。このような検出手段は、例えば、ヒトIgGの不変の領域を指向する抗体（例えば、ウサギ抗ヒトIgG抗体）であり、これ自身を検出できるよう標識する（例えば放射能、蛍光、色または酵素の標識）か、もしくは標識した二次抗体により検出することができる（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体）。
【００４５】
これに限定されるものではないが、具体化の第二シリーズとして、本発明によるキットは、被験者の生物学的試料中のアネキシン抗原を検出および／または測定する成分からなる。例えば、アネキシン蛋白を酵素結合免疫測定法（ELISA）により検出および／または測定するところでは、このような成分はアネキシン蛋白のエピトープを指向する抗体からなり、これは生物学的試料中のアネキシン発現レベルを検出および／または定量するために用いることができる。抗体自身は、検出できるよう放射能、蛍光、色または酵素の標識で標識することができる。あるいは、キットに標識された二次抗体を含めることもできる。
【００４６】
６．例：  アネキシン（ＡＮＮＥＸＩＮ）蛋白質に特異的な自己抗体の検出および癌患者からのサンプルにおけるアネキシン蛋白質発現のレベルの増大
本発明の方法を用い、癌患者から得た血清をアネキシン蛋白質についてスクリーニングした。
癌患者からの血清サンプルはアネキシン蛋白質に対して反応性であることが判明した。加えて、癌患者からの組織サンプル中にアネキシン蛋白質産生のレベルが増大していることが判明した。
【００４７】
６．１．材料および方法
６．１．１．試薬
ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびピリドキシンヒドロクロリドを含む）、ダルベッコのリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）、子牛胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを含む全ての細胞培養試薬はＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（グランド  アイランド、Ｎ．Ｙ．）から得た。マウス  モノクロナル抗―アネキシンＩおよびＩＩ抗体はＩＣＮ（コスタ  メサ、Ｃ．Ａ．）から得た。マウス  モノクロナル抗―ヒトＩｇＭ抗体はシグマケミカル社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。セイヨウワサビ  ペルオキシダーゼー結合マウス抗―ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体はＺｙｍｅｄ社（サンフランシスコ、ＣＡ）から購入した。セイヨウワサビ  ペルオキシダーゼー結合羊抗―ヒトＩｇＧおよび抗―マウスＩｇＧモノクロナル抗体、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットおよびハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）  ＭＰはアメルシャム（アーリントン  ハイツ、ＩＬ）から得た。イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ  ＰＶＤＦ（ポリビニリデン  フルオライド）膜はミリポア社（ベッドフォード、Ｍａｓｓ）から購入した。第一次元電気泳動に用いるアクリルアミド、尿素、アンモニウム  パーサルフェイトおよびＰＤＡ（ピペラジン  アクリルアミド）は全てバイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（ロックビル  センター、Ｎ．Ｙ．）から購入した。第二次元電気泳動で用いるアクリルアミドはセルバ（Ｓｅｒｖａ）社（クレッセント  ケミカル、ホウポウグ、Ｎ．Ｙ．）から購入した。キャリアー  アンホライト（ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）（ｐＨ４−８）およびＮＰ−４０は両方ともガラード（Ｇａｌｌａｒｄ）/シュレジンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）社（カール  プレイス、Ｎ．Ｙ．）から購入した。その他の全ての試薬および薬品はフィッシャーまたはシグマ社のいずれかから得、得られうる最高純度のものであった。
【００４８】
６．１．２．  細胞培養および抽出液の調製
Ａ５４９ヒト  アデノカルチノーマ細胞系を、６％ＣＯ2―加湿インキュベータ中、１０％子牛胎児血清、１００Ｕ/ｍｌペニシリンペニシリンよび１００Ｕ/ｍｌストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ中で３７℃で培養した。細胞は７０−８０％の集合となった後、毎週継代培養した。
【００４９】
新しい腫瘍組織は肺癌患者から診断時に（すなわち、バイオプシー組織）採取した。実験プロトコールはヒト患者を含む認可研究についてのミシガン大学協会検討委員会によって認可された。インフォームド  コンセントは研究前に患者（またはその家族）から得た。腫瘍組織は摘出後直ちに−８０℃に凍結し、その後少量の腫瘍組織を可溶化緩衝液中で可溶化し、使用するまで−８０℃に保存した。培養細胞を、８Ｍ尿素、２％ＮＰ−４０，２％キャリアー  アンホライト（ｐＨ４−８）、２％β―メカプトエタノールおよび１０ｍＭ  ＰＭＳＦからなる２００μｌの可溶化緩衝液を添加して溶解し、細胞スクレイパーを用いて採取した。さらに１００μｌの可溶化緩衝液を加えた後、細胞抽出液を含む溶液をマイクロフュージ  チューブに移し、使用するまで−８０℃に保存した。
【００５０】
６．１．３．２−Ｄ  ＰＡＧＥおよびウエスターン  ブロッテイング
培養細胞または固形腫瘍の両方の抽出液から得た蛋白質を、先に述べたように若干修飾して、次元別に分離した（ストラーラー他、１９８９、蛋白質の二次元ポリアクリルアミド  ゲル  電気泳動、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」  Ｔ．Ｅ．クレイトン（ｅｄ.）ＩＲＬ出版、オックスフォード、Ｕ．Ｋ．，ｐｐ６５−９２）。簡潔に言えば、可溶化緩衝液中における細胞溶解に次いで、およそ２．５×１０6細胞から得た培養細胞または可溶化腫瘍組織の３５μｌアリコットを等電点電気泳動ゲル上に置く。ｐＨ４−８キャリアー  アンホライトを用いて、７００Ｖで１６時間、次いで１０００Ｖでさらに２時間、等電点電気泳動を行った。
【００５１】
第一次元のチューブ  ゲルを、第二次元のサンプル緩衝液（１０％グリセロール、２％ＳＤＳ，１％ジチオスレイトールおよびブロモフェノール  ブルーを含有する、１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８））において平衡後、第二次元ゲルを含むカセットに加えた。第二次元の分離には、１１％−１４％のアクリルアミド勾配を用い、色素の前面がゲルの反対側に到達するまでサンプルを電気泳動にかけた。分離した蛋白質をイモビロンーＰＰＶＤＦ膜に移した。ゲル中の蛋白質のパターンは銀染色により、イモビロンーＰ膜に関しては、膜のクーマッシー  ブルー染色により、視覚化した。
【００５２】
ハイブリダイゼーションのために調製したきれいな膜はブロッキング緩衝液（１．８％の脱脂ドライミルクおよび０．１％トウイーン２０を含むＴｒｉｓ緩衝塩類液（ＴＢＳ）を包含する）で２時間インキュベートし、次いで、洗浄し、そして患者から得た血清、または正常な対照血清（３００μｌの血清、１：１００希釈）のいずれかと室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液で３回洗浄した後、膜をセイヨウワサビ  ペルオキシダーゼー結合羊抗ヒトＩｇＧ抗体（１：１０００希釈で）と室温で３０分間インキュベートした。膜を０．１％トウイーン２０を含有するＴＢＳで５回洗浄し、ＴＢＳ中で一度、ＥＣＬ中で暫時インキュベートし、ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（登録商標）に１０−３０分間曝した。患者血清とハイブリダイゼーション後、視覚化したパターンを、蛋白質との関係を測定するため、同じサンプルからのクーマッシーブルー染色ブロット、ならびに自己抗原の特異性を測定するため、対照血清または他の固形腫瘍を有する患者からの血清について同じサンプルから得たブロットのハイブリダイゼーションから得たパターンの両方と、直接比較した。別途に、膜を、セイヨウワサビ  ペルオキシダーゼー結合羊抗ヒトＩｇＭ抗体とインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ抗体とのインキュベーションと同様に処理した。
【００５３】
患者血清では視覚化されたが、対照血清では視覚化されなかった肺アデノカルチノーマ細胞系の溶解物および腫瘍の両方における蛋白質スポットをさらに特徴づけた。Ａ５４９細胞溶解物を２−Ｄ  ＰＡＧＥにかけ、その後、分離した蛋白質をイモビロンーＰ膜に移し、次いでクーマッシーブルーで染色した。興味ある蛋白質スポット膜から削り取り、Ｎ−末端アミノ酸配列決定および質量分析にかけた。得られた配列およびペプチド質量は蛋白質同定のためのデータベース  サーチに用いた。
【００５４】
６．１．４  免疫ブロット法によるアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｉ及びＩＩの検出
２つの抗体、抗−アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｉ及びＩＩモノクロナール抗体を用いた。これらの一次抗体は免疫ブロットアッセイにおいて、１：５０００に希釈して使用し、患者の血清をインキュベートしたものを処理した。
【００５５】
６．２  結果
６．２．１  ウェスタンブロット分析によって検出された、肺癌蛋白質を有する肺癌患者の血清の反応性
Ａ５４９細胞蛋白質を２−Ｄ  ＰＡＧＥによって分離し、インモービロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）  ＰＶＤＦ膜の上に移した。ウェスタンブロット分析のために、各々の膜は１つの血清サンプルで処理した。血清を含むサンプルは、肺腺癌の患者１８人、扁平上皮細胞肺癌の患者１１人、小細胞肺癌の患者４人、大細胞肺癌の患者２人、分類されていない肺癌の患者１９人；その他の癌患者３７人（乳癌１１人、黒色腫癌７人、肝臓癌１１人及び食道癌８人）の診断時に入手し、また、以前に癌又は自己免疫疾患の病歴のない、健康な被験者１５人からも入手した。
【００５６】
銀で着色した、Ａ５４９の２−Ｄゲルの見本が図１に示されている。一次抗体としての患者の血清と、二次抗体としての羊抗−ヒトＩｇＧとを用いた、膜のハイブリダイゼーションは、肺癌患者の血清中で様々な反応パターンを示した。同一のハイブリダイゼーションを繰り返したところ、同様のパターンが結果として得られた。総体的に、いくつかの反応性スポットが、ほとんどの血清で観察された。反応性スポットのいくつかは、コントロールの血清でも観察され、従って、これらは非特異的反応性を示すものであると考えられた。その他のスポットは、肺癌患者の血清に限定された。後者の中で最も注目できるものは、Ａ１で示されている、隣接する蛋白質のスポットのグループにおける強烈な反応性であり、ｐＩが６．３〜６．８、分子量が３７ｋＤａのものであって（図２）、１８人の肺腺癌患者のうちの８人、１１人の扁平上皮細胞肺癌患者のうちの４人、４人の小細胞肺癌患者のうちの１人及び１９人の分類されていない肺癌患者のうちの２人の血清において観察され、これは、健康な人の血清とハイブリダイズしたＡ５４９膜には存在しないものであった。Ａ２で示されている、隣接する蛋白質のスポットの第２のグループ（図３）は、ｐＩが７．２〜７．８、分子量が約３６ｋＤａのものであって、１８人の肺腺癌患者のうちの７人、１１人の扁平上皮細胞肺癌患者のうちの３人、４人の小細胞肺癌患者のうちの２人及び１９人の分類されていない肺癌患者のうちの６人の血清において観察されたが、これは、健康な人の血清中には存在しないものであった。全体として、１８人の肺腺癌患者のうちの１１人、１１人の扁平上皮細胞肺癌患者のうちの６人、及び４人の小細胞肺癌患者のうちの３人の血清がＡ１及び／又はＡ２に反応性を示した。
【００５７】
６．２．２  肺癌蛋白質に対するＩｇＭの免疫反応
Ａ１及び／又はＡ２蛋白質に対して、ＩｇＧに基づく免疫反応を示した血清が、ＩｇＭに基づく免疫反応をもまた示したかどうかを調べるために、Ａ１及び／又はＡ２に対してＩｇＧに基づく免疫反応を示した肺腺癌患者３人の血清と、２つのネガティブコントロールとをこの分析において用いた。膜含有Ａ５４９溶解物を患者及びコントロールの血清とハイブリダイズし、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合羊抗−ヒトＩｇＭ抗体とともにインキュベートした。Ａ１及び／又はＡ２に対してＩｇＧに基づく反応性を示した患者の血清のみが、これら２つの隣接してセットされた蛋白質に対して、ＩｇＭに基づく反応性を示した（図３）。
【００５８】
６．２．３  肺癌蛋白質に対するＩｇＧサブタイプの免疫反応
Ａ１及び／又はＡ２蛋白質に対してＩｇＧに基づく免疫反応を示したＩｇＧサブタイプの血清を調べるために、Ａ１及び／又はＡ２蛋白質に対してＩｇＧ免疫反応を示した肺腺癌患者３人の血清と、２つのネガティブコントロールとをこの分析において用いた。膜含有Ａ５４９溶解物を患者及びコントロールの血清とハイブリダイズし、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合マウス抗−ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体とともにインキュベートした。Ａ１及び／又はＡ２に対してＩｇＧに基づく反応性を示した患者の血清のみが、これら２つの隣接してセットされた蛋白質に対して、ＩｇＧ１に基づく反応性を示した（図４）。
【００５９】
6.2.4.  肺癌に対するA1およびA2 IgG抗体の特異性
膜含有A549溶解物を、メラノーマ、乳癌、肝癌または食道癌患者の血清とハイブリザイズした。いずれの血清もA2に対してIgGに基づく免疫反応性を示さず、A1蛋白質は食道癌患者（5/8）および乳癌患者（1/11）に存在し、メラノーマ患者（0/7）および肝癌患者（0/11）には存在しなかった。
【００６０】
6.2.5.  肺癌患者血清とアネキシンIおよびIIとの反応性
A1およびA2蛋白質を同定するため、追加の膜をA549肺アデノカルシノーマ細胞溶解物から調製し、蛋白質をクーマシーブルー染色により視覚化した。A1およびA2スポットを膜から切り出し、溶出しトリプシン消化に付した。ペプチド断片をマススペクトルにより分析した。４つの隣接するセクションである、A1a、A1b（Alaの直ぐ左側、即ちより酸性）、A1c（A1bの直ぐ左側、即ちより酸性）およびA1d（A1cの直ぐ左側、即ちより酸性）をブロットから切り出した。これら４つの領域は全部で免疫反応性の全A1領域を含んでいた。これら４つのセクション由来のペプチドのマススペクトル分析により、アネキシンIおよびアネキシンII変異体がセクションA1aを除いてより優勢なアネキシンIアイソフォームであることが分かり、セクションA1aは何らの結果も示さなかった。A2蛋白質については、２つのセクションである、A2aおよびA2b（A1bの直ぐ左側、即ちより酸性）をブロットから切り出した。これらのセクション由来のペプチドのマススペクトル分析により、アネキシンII変異体（A2a）およびアネキシンII変異体（A2b）がより優勢なアネキシンIIアイソフォームであった。追加的に、A1およびA2スポットを膜から切り出し、直接N末端配列決定に付した。アネキシンはアセチル化によりN末端がブロックされているため、如何なる結果も得られなかった。
【００６１】
6.2.6.  アネキシンIおよびIIアイソフォームの更なる確認
スポットA1およびA2がそれぞれアネキシンI混合物あるいはアネキシンII混合物からなることを確認するため、A549アデノカルシノーマセルラインから調製した膜を、アネキシンIと反応する市販されているマウスモノクローナル抗体あるいはマウスモノクローナルアネキシンII抗体とハイブリザイズさせた。得られた免疫反応性パターンを、同じタイプの細胞溶解物のクーマシーブルー染色ブロットおよび肺癌患者の血清との免疫反応性のパターンと比べた。抗アネキシンＩ抗体および抗アネキシンＩＩ抗体は、肺癌患者血清でそれぞれ視覚化したA1およびA2スポット中の蛋白質と免疫反応した（図６）。印象的には、幾つかの付加的な低分子免疫反応スポットが、用いた両者のモノクローナル抗アネキシンＩ抗体および抗アネキシンII抗体のハイブリダイゼーションの結果として観察された。これらのスポットは、テストしたいずれの患者血清とも免疫反応性を示さなかった。
【００６２】
本発明は、実施例に記載した態様の範囲に限定されるものではなく、実施例は本発明の一つの局面を説明するためのものであり、機能的に等価の如何なる組成物および方法も本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載し示したものに加えて各種の修正はこれまでの記載から当業者には明らかであろう。そのような修正はクレーム範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  A549細胞溶解物の二次元ゲル電気泳動法。ゲルはタンパクを視覚化するために銀色に染色した。
【図２】  肺癌の患者の血清で処理されたA549細胞溶解物の二次元ゲル分離のウェスタンブロット法。pI6.3〜6.8及び分子量37kDaのA1を示した一群の連続的なタンパクのスポットにおいて反応性が観察された。
【図３】  肺癌タンパクに拮抗するIgM免疫反応性。肺癌患者の血清で処理されたA549溶解物の二次元ゲル分離のウェスタンブロット法。続いて膜はセイヨウワサビ過酸化酵素結合ヒツジ抗ヒトIgM抗体と共にインキュベートした。
【図４】  肺癌患者の血清に拮抗するIgGサブタイプ免疫反応性。肺癌患者の血清で処理されたA549溶解質の二次元ゲル分離のウェスタンブロット法。続いて膜はセイヨウワサビ過酸化酵素結合マウス抗ヒトIgG1、IgG2、IgG3あるいはIgG4抗体と融合させた。
【図５】  肺癌患者の血清に対するA1およびA2 IgG抗体の特異性。A549溶解物を含有する膜は黒色腫、乳癌、肝癌もしくは食道癌の患者の血清と融合させた。食道癌の患者の血清(5/8)、乳癌の患者の血清(1/11)で認められ、黒色腫の患者の血清(0/7)及び肝癌の患者の血清(0/11)では認められなかったA2、A1タンパクに拮抗するIgGによる免疫反応性はどの血清でも見られなかった。
【図６】  抗アネキシンI、及び抗アネキシンII抗体はそれぞれA1及びA2スポットのタンパクに拮抗する免疫反応性をもつ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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