(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のＡ又はＢのコンセンサス配列構造を有する３方向らせんジャンクション２次構造モチーフを含む、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に特異的に結合する核酸リガンドであって、
Ａは、
【化１】
0004531132.tif 000335
（Ｎ−Ｎ’は任意の塩基対であり、ＲはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ＫはＧ又はＴである）
であり、そして、
Ｂは、
【化２】
0004531132.tif 000336
である、上記核酸リガンド。
【請求項２】
以下の配列：
（ｉ）  Ｎ1Ｇ2Ｇ3Ｃ4Ｎ5Ｎ6Ｎ7
（ii）  Ｎ’7Ｎ’6Ｎ’5Ｇ4ＲＫＹＡ8Ｙ9Ｙ10
（iii）  Ｒ10Ｒ9Ｔ8Ｃ3Ｃ2Ｎ’1
（Ｎ1−Ｎ’1、Ｎ5−Ｎ’5、Ｎ6−Ｎ’6及びＮ7−Ｎ’7はいずれも任意の塩基対であり、ＲはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ＫはＧ又はＴであり、Ｇ2−Ｃ2、Ｇ3−Ｃ3、Ｃ4−Ｇ4、Ａ8−Ｔ8、Ｙ9−Ｒ9及びＹ10−Ｒ10は塩基対である）；
又は、以下の配列：
（ａ）  Ｃ1Ａ2Ｇ3Ｇ4Ｃ5Ｕ6Ａ7Ｃ8Ｇ9
（ｂ）  Ｃ10Ｇ11Ｔ12Ａ13Ｇ14Ａ15Ｇ16Ｃ17Ａ18Ｕ19Ｃ20Ａ21
（ｃ）  Ｔ22Ｇ23Ａ24Ｔ25Ｃ26Ｃ27Ｕ28Ｇ29
（Ｃ1−Ｇ29、Ａ2−Ｕ28、Ｇ3−Ｃ27、Ｇ4−Ｃ26、Ｃ5−Ｇ14、Ｕ6−Ａ13、Ａ7−Ｔ12、Ｃ8−Ｇ11、Ｇ9−Ｃ10、Ａ18−Ｔ25、Ｕ19−Ａ24、Ｃ20−Ｇ23及びＡ21−Ｔ22は塩基対である）
を含む、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に特異的に結合する核酸リガンドであって、３方向らせんジャンクション２次構造モチーフは、配列（ｉ）、（ii）及び（iii）との間、あるいは配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）との間の前記塩基対合により形成される、上記核酸リガンド。
【請求項３】
前記配列ＲＫＹは、ＡＧＣである、請求項１又は２に記載の核酸リガンド。
【請求項４】
前記配列ＲＫＹは、ＧＴＣ、ＧＴＴ、ＧＧＣ及びＧＧＴのいずれか１つである、請求項１又は２に記載の核酸リガンド。
【請求項５】
前記３方向らせんジャンクション２次構造モチーフは、以下の配列構造：
【化３】
0004531132.tif 000337
（ＰＥＧは、ペンタエチレングリコールである）
を含む、請求項１又は３に記載の核酸リガンド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号１７５に記載の塩基配列を含むか、あるいは、配列番号１７５に記載の塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１７５に記載の塩基配列を含む核酸リガンドと同じＰＤＧＦに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号１７６に記載の塩基配列を含むか、あるいは、配列番号１７６に記載の塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１７６に記載の塩基配列を含む核酸リガンドと同じＰＤＧＦに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号１７１に記載の塩基配列を含むか、あるいは、配列番号１７１に記載の塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１７１に記載の塩基配列を含む核酸リガンドと同じＰＤＧＦに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号１７５又は１７６に記載の塩基配列を含む核酸リガンドのＰＤＧＦへの結合についての解離定数に対して１又は２桁以内の範囲内にあるＰＤＧＦへの結合についての解離定数を有する、上記核酸リガンド。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号１７２〜１７４のいずれか１つに記載の塩基配列を含むか、あるいは、該塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ該塩基配列を含む核酸リガンドと同じＰＤＧＦに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
【請求項１１】
ＰＤＧＦに特異的に結合し、かつＰＤＧＦのＰＤＧＦ受容体への結合を阻止する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項１２】
ＰＤＧＦ−ＡＢ及び／又はＰＤＧＦ−ＢＢの特異的アンタゴニストである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項１３】
修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸リガンドであって、前記修飾は、該リガンドのインビボ安定性を増加させるか、又は該リガンドの送達を増強若しくは媒介し、かつ糖、リン酸塩及び／又は塩基の位置での化学的置換を含む、上記核酸リガンド。
【請求項１５】
デオキシリボ核酸である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項１６】
１本鎖である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項１７】
精製され単離された、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項１８】
治療用である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項１９】
前記ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＢＢダイマーである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項２０】
前記ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項２１】
前記ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡダイマーである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸リガンド。
【請求項２２】
前記ＰＤＧＦ受容体は、ααホモダイマーである、請求項１１に記載の核酸リガンド。
【請求項２３】
前記ＰＤＧＦ受容体は、αβヘテロダイマーである、請求項１１に記載の核酸リガンド。
【請求項２４】
前記ＰＤＧＦ受容体は、ββホモダイマーである、請求項１１に記載の核酸リガンド。
【請求項２５】
前記ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ受容体は、ヒトＰＤＧＦ及びヒトＰＤＧＦ受容体である、請求項１１に記載の核酸リガンド。
【請求項２６】
ＰＤＧＦ媒介疾患の治療のための医薬組成物の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＰＤＧＦに特異的に結合する核酸リガンドの使用。
【請求項２７】
前記疾患は、増殖性疾患である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記疾患は、腫瘍である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＢＢダイマーである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡダイマーである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
前記核酸リガンドはＰＤＧＦのＰＤＧＦ受容体への結合を阻害し、ここで当該ＰＤＧＦ受容体は、ααホモダイマーである、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
前記核酸リガンドはＰＤＧＦのＰＤＧＦ受容体への結合を阻害し、ここで当該ＰＤＧＦ受容体は、αβヘテロダイマーである、請求項２９又は３０に記載の使用。
【請求項３４】
前記核酸リガンドはＰＤＧＦのＰＤＧＦ受容体への結合を阻害し、ここで当該ＰＤＧＦ受容体は、ββホモダイマーである、請求項２９又は３０に記載の使用。
【請求項３５】
前記核酸リガンドはＰＤＧＦのＰＤＧＦ受容体への結合を阻害し、ここで当該ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ受容体は、ヒトＰＤＧＦ及びヒトＰＤＧＦ受容体である、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本明細書にはＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦに対する高親和性核酸リガンドを同定し、かつ調製する方法が記載される。このような核酸リガンドを同定するために本明細書において使用した方法は、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligans by EXponential enrichment）の頭字語であるＳＥＬＥＸと呼ばれる。本発明は、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦの高親和性核酸リガンドを含む。さらにＴＧＦβ１およびＰＤＧＦに対するＲＮＡおよびＤＮＡリガンド、およびｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンドを開示する。また、ピリミジンの２’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドも含まれる。さらに、２’−ＮＨ2−修飾または２’−Ｆ修飾を含有するＴＧＦβ１およびｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンド、および２’−Ｆ修飾を含有するＰＤＧＦに対するＲＮＡリガンドを開示する。本発明はまた、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦの高親和性核酸インヒビターも含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、薬剤または診断薬として有用である。
発明の背景
ＴＧＦβ
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）ポリペプチドは、多くの細胞型において増殖、分化、および遺伝子発現に影響を及ぼす。性状解析されたこのファミリーの第１のポリペプチドであるＴＧＦβ１は、共有結合している２つの同一の１１２アミノ酸サブユニットを有する。ＴＧＦβ１は、非常に保存されたタンパク質であり、ヒト型をマウス型から区別しているのはわずか１個のアミノ酸である。ＴＧＦβ遺伝子ファミリーには哺乳動物において発現される２つの他のメンバーがある。ＴＧＦβ２はＴＧＦβ１と７１％相同である（デ・マーティン（de Martin）ら，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３６７３−３６７７）が、一方ＴＧＦβ３はＴＧＦβ１と８０％相同である（デリンク（Derynck）ら，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３７３７−３７４３）。核磁気共鳴により測定されるＴＧＦβ１の構造的特徴（アーチャー（Archer）ら，（１９３３）Biochemistry ３２：１１６４−１１７１）は、ＴＧＦβ２の結晶構造に一致している（ダオピン（Daopin）ら，（１９９２）Science ２５７：３６９−３７４；シュラネッガーとグルッター（Schlunegger and Grutter），（１９９２）Nature  ３５８：４３０−４３４）。
ＴＧＦβ類は類似した三次元構造を有するが、これらは生理学的には決して同等ではない。受容体を有する細胞へのＴＧＦβの膜通過シグナル生成に関与する、少なくとも３つの異なる細胞外受容体、Ｉ、IIおよびIII型が存在する。総説については、デリンク（Derynck）（１９９４）ＴＩＢＳ  １９：５４８−５５３およびマッセーグ（Massague）（１９９０）Annu. Rev. Cell Biol  ６：５９７−６４１を参照のこと。ＴＧＦβ２がII型ＴＧＦβ受容体と有効に相互作用するためには、III型受容体も存在することが必要である（デリンク（Derynck）（１９９４）ＴＩＢＳ  １９：５４８−５５３）。血管内皮細胞にはIII型受容体が欠けている。代わりに内皮細胞は、エンドグリン（endoglin）と呼ばれる構造的に関連したタンパク質を発現する（チェイフェツ（Cheifetz）ら，（１９９２）J. Biol. Chem. ２６７：１９０２７−１９０３０）が、これは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のみに高親和性で結合する。すなわち、ＴＧＦβの相対活性は、細胞および臓器系において発現される受容体の型を反映している。
多因性シグナル生成経路における成分の制御に加えて、ＴＧＦβポリペプチドの合成の分布も生理学的機能に影響を及ぼす。ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の分布は、ＴＧＦβ１よりも限定されており（デリンク（Derynck）ら，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：３７３７−３７４３）、例えば、ＴＧＦβ３は、間充織由来の組織に限定されているが、一方ＴＧＦβ１は、間充織と上皮細胞の両方に存在する。
ＴＧＦβ１は、組織修復に決定的に重要な多機能性サイトカインである。高濃度のＴＧＦβは、血小板顆粒により創傷部位に送達される（アソイアンとスポーン（Assoian and Sporn），（１９８６）J Cell Biol.１０２：１２１７−１２２３）。ＴＧＦβ１は、白血球、単球および繊維芽細胞のような細胞の走化性、さらには血管新生、組織修復に関連する細胞分裂促進および炎症応答に関連する増殖因子およびサイトカインの制御を含む治癒を促進する一連の事象を開始させる。ＴＧＦβ１はまた、細胞外マトリックス成分の合成も促進（ロバーツ（Roberts）ら，（１９８６）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８３：４１６７−４１７１；スポーン（Sporn）ら，（１９８３）Science ２１９：１３２９−１３３０；マッセーグ（Massague），（１９８７）Cell  ４９：４３７−４３８）し、ＴＧＦβ１の病理生理学を理解する上で最も重要なことには、ＴＧＦβ１はそれ自体の合成を自己制御する（キム（Kim）ら，（１９８９）J Biol Chem ２６４：７０４１−７０４５）。
多くの疾患は、ＴＧＦβ１の産生過剰に関連している。ＴＧＦβ１産生過剰に関連した繊維形成性疾患は、腎臓、肺および肝臓の繊維症のような慢性症状と、皮膚瘢痕および再狭窄のようなより急性症状に分類することができる。腫瘍細胞によるＴＧＦβ１の合成と分泌は、進行性の脳腫瘍または乳癌の患者に見られるような免疫抑制を引き起こすこともある（アルティーガ（Arteaga）ら，（１９９３）J Clin Invest  ９２：２５６９−２５７６）。マウスにおけるリーシュマニア感染症の経過は、ＴＧＦβ１により激的に変化する（バラル−ネット（Barral-Netto）ら，（１９９２）Science ２５７：５４５−５４７）。ＴＧＦβ１は、この疾患を増悪させたが、一方ＴＧＦβ１抗体は、遺伝的に感受性のマウスにおけるこの疾患の進行を止めた。遺伝的に抵抗性のマウスは、ＴＧＦβ１の投与によりリーシュマニア感染症に感受性になった。
細胞外マトリックスの沈着に及ぼすＴＧＦβ１の大きな作用は、総説されており（ロッコとジヤデ（Rocco and Ziyadeh），（１９９１）Contemporary Issues in Nephrology ｖ２３、ホルモン、オータコイドおよび腎臓（Hormones, autocoids and the kidney）、ジェイ・スタイン（Jay Stein）編、チャーチル・リビングストン（Churchill Livingston）、ニューヨーク、３９１−４１０頁；ロバーツ（Roberts）ら，（１９８８）Rec. Prog. Hormone Res. ４４：１５７−１９７）、そして細胞外マトリックス成分の合成の促進と分解の阻害を含む。糸球体の構造と濾過性能は、主としてメサンギウムおよび糸球体膜の細胞外マトリックス組成により決定されるため、ＴＧＦβ１が腎臓に大きい作用を及ぼすことは驚くにあたらない。増殖性糸球体腎炎（ボーダー（Border）ら，（１９９０）Kidney Int. ３７：６８９−６９５）および糖尿病性腎症（モウアー（Mauer）ら，（１９８４）J. Clin Invest. ７４：１１４３−１１５５）におけるメサンギウムマトリックスの蓄積は、これらの疾患の明瞭かつ顕著な病的特性である。ヒトの糖尿病性糸球体硬化症（進行した腎症）ではＴＧＦβ１レベルが上昇する（ヤマモト（Yamamoto）ら，（１９９３）Proc. Natl. Acad. Sci. ９０：１８１４−１８１８）。ＴＧＦβ１は、多くの動物モデルにおける腎繊維症の発生における重要なメディエーターである（ファン（Phan）ら，（１９９０）Kidney Int. ３７：４２６；オクダ（Okuda）ら，（１９９０）J. Clin Invest. ８６：４５３）。ＴＧＦβ１に対する抗血清により（ボーダー（Border）ら，（１９９０）Nature  ３４６：３７１）、およびＴＧＦβ１に結合することができる細胞外タンパク質のデコリン（decorin）により（ボーダー（Border）ら，（１９９２）Nature  ３６０：３６１−３６３）、ラットにおいて実験的に誘導した糸球体腎炎の抑制が証明された。
ＴＧＦβ１が多すぎると皮膚瘢痕組織の形成が起こる。中和活性ＴＧＦβ１抗体をラットの治癒創傷の辺縁部に注入すると、創傷治癒の速度または創傷の引張力を妨げることなく瘢痕化を阻害することが証明された（シャー（Shah）ら，（１９９２）Lancet  ３３９：２１３−２１４）。同時に、血管新生が低下し、マクロファージおよび単球の数が低下し、瘢痕組織への分解したコラーゲン繊維の沈着量が低下した。
ＴＧＦβ１は、バルーン血管形成術後の動脈の平滑筋の増殖および細胞外マトリックスの沈着により生じる動脈壁の進行性肥厚における一因であるかもしれない。再狭窄した動脈の直径は、この肥厚により９０％低下することがあり、そして直径の低下は平滑筋細胞体よりはむしろ細胞外マトリックスのせいであるため、単に大量の細胞外マトリックス沈着を低下させることにより、これらの血管を５０％まで拡げることができるかもしれない。インビボでＴＧＦβ１遺伝子をトランスフェクションした無傷のブタ動脈において、ＴＧＦβ１遺伝子発現は、細胞外マトリックスの合成と過形成の両方に関係した（ネーベル（Nabel）ら，（１９９３）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ９０：１０７５９−１０７６３）。ＴＧＦβ１誘導性過形成は、ＰＤＧＦ−ＢＢで誘導したものほど大量ではなかったが、細胞外マトリックスはＴＧＦβ１トランスフェクション体の方が大量であった。この遺伝子転移ブタモデルにおいてＦＧＦ−１（ＦＧＦの分泌型）誘導性過形成では細胞外マトリックス沈着は関係しなかった（ネーベル（Nabel）（１９９３）Nature  ３６２：８４４−８４６）。
腫瘍により産生されるＴＧＦβ１が有害である数種の癌が存在する。ＭＡＴＬｙＬｕラット癌細胞（スタイナー（Steiner）とバラック（Barrack），（１９９２）Mol. Endocrinol. ６：１５−２５）およびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（アルティーガ（Arteaga）ら，（１９９３）Cell Growth and Differ. ４：１９３−２０１）は、マウスＴＧＦβ１を発現するベクターでトランスフェクション後、腫瘍形成性および転移性が高まった。乳癌において、予後の不良は、ＴＧＦβの上昇に関連しており（ディックソン（Dickson）ら，（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８４：８３７−８４１；カシッド（Kasid）ら，（１９８７）Cancer Res. ４７：５７３３−５７３８；ダリー（Daly）ら，（１９９０）J Cell Biochem ４３：１９９−２１１；バレット−リー（Barrett-Lee）ら，（１９９０）Br. J Cancer  ６１：６１２−６１７；キング（King）ら，（１９８９）J Steroid Biochem ３４：１３３−１３８；ウェルチ（Welch）ら，（１９９０）Proc. Natl. Acad. Sci.８７：７６７８−７６８２；ウォーカー（Walker）ら，（１９９２）Eur J Cancer  ２３８：６４１−６４４）、タモキシフェン治療によるＴＧＦβ１の誘導（ブッタ（Butta）ら，（１９９２）Cancer Res  ５２：４２６１−４２６４）が、乳癌のタモキシフェン治療の失敗と関連していた（トンプソン（Thompson）ら，（１９９１）Br. J Cancer  ６３：６０９−６１４）。抗ＴＧＦβ１抗体は、無胸腺マウスにおけるＭＤＡ−２３１ヒト乳癌細胞の増殖を阻害する（脾臓ナチュラルキラー細胞活性の増大に関連する処置）（アルティーガ（Arteaga）ら，（１９９３）J Clin Invest ９２：２５６９−２５７６）。潜伏ＴＧＦβ１でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞も、ヌードマウスにおけるＮＫ活性の低下および腫瘍増殖の増大を示した（ワリック（Wallick）ら，（１９９０）J Exp Med １７２：１７７７−１７８４）。すなわち、乳癌により分泌されるＴＧＦβ１は、内分泌性の免疫抑制を引き起こしうる。
ＴＧＦβ１の高い血漿濃度は、進行した乳癌患者の予後不良を示すことが証明されている（アンシャー（Anscher）ら，（１９９３）N Engl J Med  ３２８：１５９２−８）。高用量化学療法および自己骨髄移植の前に血中ＴＧＦβの高い患者は、肝静脈閉塞症（死亡率５０％までの全患者の１５−５０％）および特発性間質性肺炎（全患者の４０−６０％）の高リスクを有する。これらの知見の意味するところは、１）ＴＧＦβ１の血漿レベルの上昇はリスク患者の同定に使用することができること、および２）ＴＧＦβ１の低下は乳癌患者に対するこれら普通の治療の罹患率と死亡率を低下させることができることである。
ＰＤＧＦ
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、もともと血小板溶解物から単離され、血清には存在するが血漿には存在しない主要な増殖促進活性として同定された。２つの相同的なＰＤＧＦアイソホームのＰＤＧＦ  ＡおよびＢが同定されたが、これらは、別の遺伝子（染色体７および２２上）によりコードされている。血小板からの最も豊富な分子種は、ＡＢヘテロダイマーであるが、３つ全ての可能なダイマー（ＡＡ、ＡＢおよびＢＢ）が天然に存在する。翻訳後、ＰＤＧＦダイマーはプロセシングを受けて約３０kDaの分泌タンパク質になる。高親和性でＰＤＧＦに結合する２つの細胞表面タンパク質、ａおよびβが同定された（ヘルディン（Heldin）ら，Proc. Natl. Acad. Sci.７８：３６６４（１９８１）；ウィリアムズ（Williams）ら，Proc. Natl. Acad. Sci.７９：５８６７（１９８１））。両方の種とも、５つの免疫グロブリン様の細胞外ドメイン、単一の膜通過ドメインおよびキナーゼ挿入ドメインにより分離された細胞内チロシンキナーゼドメインを含有する。機能性の高親和性受容体はダイマーであり、ＰＤＧＦによる受容体の細胞外ドメインの連動によりいくつかのチロシン残基の交差リン酸化（１つの受容体のチロシンキナーゼがダイマー中のもう一方をリン酸化する）が起こる。受容体リン酸化により、核への細胞分裂促進性または走化性のシグナルの変換に至るカスケード現象が起こる。例えば、ＰＤＧＦβ受容体の細胞内ドメインにおいて、リン酸化されると、ホスホリパーゼＣ−ｇ、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ、ＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質、およびＳｈｃ、Ｇｒｂ２およびＮｃｋのようないくつかのアダプター分子を含む、異なるｓｒｃ−相同性２（ＳＨ２）ドメイン含有タンパク質と相互作用する９つのチロシン残基が同定されている（ヘルディン（Heldin）, Cell, ８０：２１３（１９９５））。最近数年間に、３つの受容体ダイマー（ａａ、ａβ、およびββ）に対する３つのＰＤＧＦアイソホームの特異性が解明されている。ａ−受容体ホモダイマーは、３つ全てのＰＤＧＦアイソホームに高親和性で結合し、β−受容体ホモダイマーは、ＰＤＧＦ  ＢＢのみに高親和性で結合してＰＤＧＦ  ＡＢには約１０倍低い親和性で結合し、そしてａβ−受容体ヘテロダイマーは、ＰＤＧＦ  ＢＢおよびＰＤＧＦ  ＡＢに高親和性で結合する（ウェスターマークとヘルディン（Westermark and Heldin）, Acta Oncologica,３２：１０１（１９９３））。これらの特異性のパターンは、Ａ−鎖がａ−受容体のみに、そしてＢ−鎖がａおよびβ−受容体サブユニットの両方に高親和性で結合する能力から生じる。
ＰＤＧＦ発現が悪性トランスフォーメーションに関係していることを最も早く示したのは、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖のアミノ酸配列が、サル肉腫ウイルス（simian sarcoma virus）（ＳＳＶ）のトランスフォーミングタンパク質のｐ２８sisのそれと事実上同一であるという知見であった（ウォーターフィールド（Waterfield）ら，Nature, ３０４：３５（１９８３）；ジョンソン（Johnsson）ら，ＥＭＢＯＪ．，３：９２１（１９８４））。ＰＤＧＦ−Ｂ鎖遺伝子および少ないながらＰＤＧＦ−Ａ遺伝子のトランスフォーミング能力が、その後すぐに証明された（クラーク（Clarke）ら，Nature, ３０８：４６４（１９８４）；ガジット（Gazit）ら，Cell, ３９：８９（１９８４）；ベックマン（Beckmann）ら，Science,２４１：１３４６；バイウォーター（Bywater）ら，Mol. Cell. Biol., ８：２７５３（１９８８））。それ以来多くの腫瘍細胞加水分解がＰＤＧＦを産生および分泌し、そのいくつかはＰＤＧＦ受容体も発現することが証明されている（レインズ（Raines）ら，ペプチド増殖因子およびこれらの受容体（Peptide Growth Factors and Their Receptors）、スプリンガー−フェアラーク（Springer-Verlag）、第Ｉ部、１７３頁（１９９０））。したがってＰＤＧＦによるパラクリン、およびいくつかの細胞株ではオートクリン増殖促進が可能である。例えば、ヒト神経膠腫からの生検の分析により、２つのオートクリンループの存在が明らかになった：腫瘍関連内皮細胞におけるＰＤＧＦ−Ｂ／β−受容体、および腫瘍細胞におけるＰＤＧＦ−Ａ／ａ−受容体（ハーマンソン（Hermansson）ら，Proc. Natl. Acad. Sci., ８５：７７４８（１９８８）；ハーマンソン（Hermansson）ら，Cancer Res., ５２：３２１３（１９９２））。高度の神経膠腫への進行には、腫瘍関連内皮細胞におけるＰＤＧＦ−Ｂとβ−受容体、および神経膠腫細胞におけるＰＤＧＦ−Ａの発現の増大が伴った。ＰＤＧＦおよび／またはＰＤＧＦ受容体の発現の増大は、繊維肉腫（スミッツ（Smits）ら，Am. J. Pathol., １４０：６３９（１９９２））および甲状腺癌（ヘルディン（Heldin）ら，Endocrinology, １２９：２１８７（１９９１））を含む他の悪性腫瘍においても観察されている。
増殖性疾患における重要性から考えて、ＰＤＧＦのアンタゴニストは有用な臨床応用が見い出されるであろう。現在、ＰＤＧＦに対する抗体（ジョンソン（Johnsson）ら，（１９８５）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８２：１７２１−１７２５；ファーンズ（Ferns）ら，（１９９１）Science １５３：１１２９−１１３２；ヘレネット（Herrenet）ら，（１９９３）Biochimica et Biophysica Acta １１７３，１９４−３０２）および可溶性ＰＤＧＦ受容体（ヘレネット（Herrenet）ら，（１９９３）Biochimica et Biophysica Acta １１７３，１９４−３０２；デュアネット（Duanet）ら，（１９９１）J. Biol. Chem.２６６：４１３−４１８；タイスマン（Teisman）ら，（１９９３）J. Biol. Chem.２６８：９６２１−９６２８）がＰＤＧＦの最も強力で特異的なアンタゴニストである。ＰＤＧＦに対する中和活性抗体は、ＳＳＶで形質転換した表現型を復帰させ（ジョンソン（Johnsson）ら，（１９８５）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８２：１７２１−１７２５）、かつ動脈損傷後の新脈管内膜病変の発生を阻害する（ファーンズ（Ferns）ら，（１９９１）Science １５３：１１２９−１１３２）ことが証明されている。スラミン（ウィリアムズ（Williams）ら，（１９８４）J. Biol. Chem.２５９：５２８７−５２９４；ベトショルツ（Betsholtz）ら，（１９８４）Cell  ３９：４４７−４５７）、ネオマイシン（ヴァスボトン（Bassbotn）ら，（１９９２）J. Biol. Chem.２６７：１５６３５−１５６４１）およびＰＤＧＦアミノ酸配列から誘導されたペプチド（エングストローム（Engstroem）ら，（１９９２）J. Biol. Chem.２６７：１６５８１−１６５８７）のようなＰＤＧＦの他のインヒビターが報告されているが、これらは、良好な薬剤候補となるには、毒性が強すぎるか、または十分な特異性または活性に欠けている。臨床利用の可能性ある他の型のアンタゴニストは、ＰＤＧＦ受容体のチロシンキナーゼを選択的に阻害する分子である（ブックダンジャー（Buchdunger）ら，（１９９５）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ９２：２５５８−２５６２；コバレンク（Kovalenk）ら，（１９９４）Cancer Res. ５４：６１０６−６１１４）。
ｈＫＧＦ
ａ）ｈＫＧＦの生化学的性質
ヒトケラチン細胞増殖因子（ｈＫＧＦ）は、小さな（２６−２８KD）塩基性のヘパリン結合増殖因子であり、ＦＧＦファミリーの一員である。ｈＫＧＦは、比較的新規に同定された分子であり、これはＦＧＦ−７としても知られている（フィンチ（Finch）ら，（１９８９）Science ２４４：７５２−７５５）。これは、上皮細胞に特異的な増殖因子であり（ルービン（Rubin）ら，（１９８９）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８６：８０２−８０６）、その主な機能は、発生／形態形成（ワーナー（Werner）ら，（１９９４）Science ２６６：８１９−８２２）および創傷治癒（ワーナー（Werner）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８９：６８９６−６９００）におけるものである。インビボのｈＫＧＦの主要な供給源は、間質繊維芽細胞である（フィンチ（Finch）ら，（１９８９）Science ２４４：７５２−７５５）。微小血管（microvascular）内皮細胞（スモラ（Smola）ら，（１９９３）J. Cell Biol. １２２：４１７−４２９）、およびごく最近になって、活性化上皮内ｇｄＴ細胞（ボイスメニュ（Boismenu）ら，（１９９４）Science ２６６：１２５３−１２５５）もｈＫＧＦを合成することが証明された。ｈＫＧＦ発現は、創傷内で促進されている（ワーナー（Werner）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８９：６８９６−６９００）。いくつかのサイトカインが、ｈＫＧＦ誘導物質であること（ブラウクル（Brauchle）ら，（１９９４）Oncogene  ９：３１９９−３２０４）、そしてＩＬ−１が最も強力であること（ブラウクル（Brauchle）ら，（１９９４）Oncogene  ９：３１９９−３２０４；チェディッド（Chedid）ら，（１９９４）J. Biol. Chem.２６９：１０７５３−１０７５７）が証明された。ｂＦＧＦとは異なり、ｈＫＧＦは、シグナルペプチドを持っており、このため、産生細胞から分泌される（フィンチ（Finch）ら，（１９８９）Science ２４４：７５２−７５５）。ｈＫＧＦは大腸菌（E. coli）内で過剰発現させることができ、組換えタンパク質（〜１９−２１KD）は生物学的に活性である（ロン（Ron）ら，（１９９３）J. Biol. Chem.２６８：２９８４−２９８８）。大腸菌由来の組換えタンパク質は、天然のタンパク質よりも１０倍細胞分裂促進性である（ロン（Ron）ら，（１９９３）J. Biol. Chem.２６８：２９８４−２９８８）。この差は、グリコシル化のためでろう。天然タンパク質は、強力なＡｓｎグリコシル化部位を有する（ロン（Ron）ら，（１９９３）J. Biol. Chem.２６８：２９８４−２９８８）。
ｈＫＧＦの生物活性は、特異的な細胞表面受容体により媒介される（ミキ（Miki）ら，（１９９１）Science ２５１：７２−７５）。ｈＫＧＦ受容体は、ＦＧＦ−Ｒ２のＣ末端細胞外領域の別のスプライシングに起因する修飾ＦＧＦ受容体である（ミキ（Miki）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０）。ｈＫＧＦ受容体でトランスフェクションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、ｈＫＧＦに対する高親和性（〜２００pM）結合部位を発現する（ミキ（Miki）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０）。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞当たりの特異的結合部位の概数は、約５００，０００である（ディー・ボッタロ（D. Bottaro）とエス・アーロンソン（S. Aaronson）、私信）。ｈＫＧＦ受容体は、ｈＫＧＦおよびａＦＧＦに同様な親和性で結合し、ｂＦＧＦには約２０倍低い親和性で結合する（ミキ（Miki）ら，（１９９１）Science ２５１：７２−７５；ミキ（Miki）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０）。ヒト胃癌細胞株においてｈＫＧＦ受容体の一変種が見い出されたが、これはＫ−ＳＡＭと呼ばれる増幅遺伝子（すなわち、１つの遺伝子、多数のコピー）であった（ハットリ（Hattori）ら，（１９９０）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８７：５９８３−５９８７）。
ヘパリンは、ｈＫＧＦの生物活性のインヒビターであることが報告されている（ロン（Ron）ら，（１９９３）J. Biol. Chem.２６８：２９８４−２９８８）。このことは、ａＦＧＦに対するヘパリンのアゴニスト作用とは対照的である（スピバック−クロイクスマン（Spivak-Kroixman）ら，（１９９４）Cell  ７９：１０１５−１０２４）。
ｂ）ヒトの疾患におけるｈＫＧＦの役割
組換えｈＫＧＦ分子は、１９９３年から利用可能になったばかりである。したがって、ヒト疾患におけるｈＫＧＦの役割に関する情報は限られている。しかし発表された文献は、少なくとも２つのヒトの疾患、すなわち、乾癬と癌におけるｈＫＧＦの役割を強く示唆する証拠を含んでいる。ｈＫＧＦは、炎症性腸疾患にも関与している（ピー・フィンチ（P. Finch）、私信）。
乾癬
乾癬は、皮膚炎症と共に、表皮の過増殖とケラチン細胞の不完全分化を特徴とする（エイベル（Abel）ら，（１９９４）Scientific American Medicine  III−１〜III−１８；グリーブス（Greaves）ら，（１９９５）N Eng J Medicine  ３３２：５８１−５８８）、衰弱性の皮膚障害である（グリーブス（Greaves）ら，（１９９５）N Eng J Medicine  ３３２：５８１−５８８）。未だ乾癬に対する有効な治療法はない（匿名，（１９９３）Drug & Market Development ４：８９−１０１；エイベル（Abel）ら，（１９９４）Scientific American Medicine  III−１〜III−１８；グリーブス（Greaves）ら，（１９９５）N Eng J Medicine  ３３２：５８１−５８８）。乾癬は、スカンジナビアにおいて最も発病率が高く人口の０．５〜２．８パーセントに起こる。１９９２年に米国では、乾癬に罹患した４〜８百万人が、そのどれもが非常に有効というものはない種々の薬剤および関連治療のために約６百万ドルを費やしたと推定された。この支出の大部分は、１年の治療に１，０００〜１，５００ドルを費やす重症乾癬の患者約４００，０００名により行われた。毎年約２００，０００の新規症例がある。
この疾患の根本原因は未知であるが、表皮のケラチン細胞分裂促進を制御する機構における原発性または続発性の欠陥に起因する（エイベル（Abel）ら，（１９９４）Scientific American Medicine  III−１〜III−１８）。乾癬は、ステロイドとシクロスポリンに応答し、この意味で免疫疾患として特徴付けられる（エイベル（Abel）ら，（１９９４）Scientific American Medicine  III−１〜III−１８）。ｈＫＧＦはケラチン細胞に対する主要な特異的増殖因子であるため、この過剰発現および制御解除は、乾癬におけるケラチン細胞過増殖の原因として第一の候補である。免疫系がｈＫＧＦ放出の最も重要な制御因子であるという証明（ボイスメニュ（Boismenu）ら，（１９９４）Science ２６６：１２５３−１２５５；ブラウクル（Brauchle）ら，（１９９４）Oncogene  ９：３１９９−３２０４；チェディッド（Chedid）ら，（１９９４）J. Biol. Chem.２６９：１０７５３−１０７５７）は、ｈＫＧＦの制御解除が乾癬の原因であるというこの意見を増強する。さらに、ブタの創傷にｈＫＧＦを適用すると、乾癬に類似した組織化学的外観を呈し（スタイアノ−コイコ（Staiano-Coico）ら，（１９９３）Ｊ  Ｅｘ  Ｍｅｄ  １７８：８６５−８７８）；トランスジェニックマウスにおけるケラチン細胞由来ｈＫＧＦは、乾癬を暗示する病態を引き起こし（グオ（Guo）ら，（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：９７３−９８６）；インサイチューハイブリダイゼーション実験により、乾癬における、ｈＫＧＦおよびｈＫＧＦ受容体のそれぞれ中等度および強力なアップレギュレーションが証明された（ピー・フィンチ（P. Finch），私信）。インサイチューハイブリダイゼーション実験により、別の免疫疾患、すなわち、炎症性腸疾患へのｈＫＧＦの関与も証明された（ピー・フィンチ（P. Finch），私信）。
癌
増殖因子および増殖因子のｈＫＧＦおよび／またはその受容体の発現の制御解除が、いくつかのヒト癌におけるトランスフォーメーション事象であると予測されることは、文献上十分に確立されている。ｈＫＧＦ系のトランスフォーミング能力は、インビトロで証明されている（ミキ（Miki）ら，（１９９１）Science  ２５１：７２−７５）。別の研究において、癌細胞株は、ｈＫＧＦ受容体を発現し、かつａＦＧＦではなくｈＫＧＦに応答し、一方肉腫細胞株は、ｈＫＧＦ受容体を発現せず、ｈＫＧＦではなくａＦＧＦに応答することが見い出された（イシイ（Ishii）ら，（１９９４）Cancer Res  ５４：５１８−５２２）。
消化器癌
いくつかの分化不全の胃癌は、Ｋ−ｓａｍと呼ばれる増幅遺伝子を有するが、これはｈＫＧＦ−受容体のアイソホームである（カトー（Katoh）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８９：２９６０−２９６４）。ｈＫＧＦをラットにインビボで投与すると、膵管上皮細胞（イー（Yi）ら，（１９９４）Am J Pathol  １４５：８０−８５）、肝細胞、および消化管全体の上皮細胞の増殖が引き起こされる（ホウスリー（Housley）ら，（１９９４）J Clin Invest ９４：１７６４−１７７７）。
肺癌
ｈＫＧＦをラットに投与すると、肺癌の気管支肺胞細胞の一種に類似したII型肺細胞（pneumocyte）過形成が起こる（ウーリッチ（Ulich）ら，（１９９４）J Clin Invest ９３：１２９８−１３０６）。
乳癌
インビボで、ｈＫＧＦは、乳管拡張および暴発性上皮過形成を引き起こし、これらは両方とも乳癌の共通の特徴である（ウーリッチ（Ulich）ら，（１９９４）Am J Pathol  １４４：８６２−８６８；イー（Yi）ら，（１９９４）Am J Pathol  １４５：１０１５−１０２２）。しかし、授乳ラットの乳管上皮は、ｈＫＧＦの増殖促進作用に抵抗性であり、このことは、妊娠中の女性は乳癌に対する罹病性が低下し、乳牛はほとんど乳癌ができないという疫学的観察に関して重要である（クズマ（Kuzma），１９７７，乳房の病気（Breast in Pathology），モスビー社（Mosby Co.））。乳癌へのｈＫＧＦの関与を支持する別の証拠がある。ｈＫＧＦ  ｍＲＮＡは、健常なヒト乳房組織および試験した乳癌試料１５個中１２個において近年検出されている（クーズ（Koos）ら，（１９９３）J Steroid Biochem Molec Biol ４５：２１７−２２５）。乳癌におけるｈＫＧＦ  ｍＲＮＡの存在を、ｈＫＧＦが、非腫瘍性乳腺に存在するという観察、およびｈＫＧＦが、乳房上皮の暴発性増殖を引き起こすという観察と関連させて考えると、これは、ｈＫＧＦが、健常および腫瘍性の乳房上皮の増殖の制御において重要なオートクリンまたはパラクリン増殖因子であることを示唆している（ウーリッチ（Ulich）ら，（１９９４）Am J Pathol  １４４：８６２−８６８）。浸潤性導管腺癌は、癌への防御的宿主応答を表すと言われている繊維形成性間質により特徴的に囲まれている（ウーリッチ（Ulich）ら，（１９９４）Am J Pathol  １４４：８６２−８６８）。ｈＫＧＦは、間質由来であるため、繊維形成性間質は腫瘍の増殖を阻害するよりもこれに寄与する可能性が高い。
前立腺癌
前立腺腫瘍に及ぼすアンドロゲンの増殖促進作用は、アンドロゲンが前立腺間質細胞におけるｈＫＧＦの発現を誘導するため、ｈＫＧＦにより媒介されると考えられる（ヤン（Yan）ら，（１９９２）Mol Endo  ６：２１２３−２１２８）。インビボでアンドロゲン依存性である前立腺腫瘍は、インビトロではアンドロゲン非依存性であるが、ｈＫＧＦ依存性である（ヤン（Yan）ら，（１９９２）Mol Endo ６：２１２３−２１２８）。アンドロゲンにより支配されるプロセスである、ｈＫＧＦが、精嚢発生中の上皮誘導において機能するという観察は、アンドロメジン（andromedin）としてのｈＫＧＦの役割に一致している（アラリド（Alarid）ら，（１９９４）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ９１：１０７４−１０７８）。さらには、ｈＫＧＦは、アンドロゲン受容体の異常な活性化を引き起こし、このため恐らく前立腺癌におけるアンドロゲン除去療法の失敗に寄与している（クリグ（Culig）ら，（１９９４）Cancer Res. ５４：５４７４−５４７８）。この情報に基づき、遺伝子改変により、ｈＫＧＦをアンドロゲン制御から解放し、こうしてアンドロゲン依存性腫瘍をアンドロゲン非依存性の非常に悪性の腫瘍に変換させることが可能である。このような腫瘍はなお、ｈＫＧＦがアンドロゲン受容体の異常な活性化も引き起こすため、アンドロゲンに制御されるマーカーのＰＳＡを発現することが可能であろう。また、ｈＫＧＦは、老人男性の一般的な健康問題である良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の原因である可能性が高い。
ｄ）ｈＫＧＦ競合物質
現在までに、モノクローナル抗体および短鎖ｈＫＧＦ−受容体由来ペプチド（２５量体）がｈＫＧＦ競合物質として報告されている（ボッタロ（Bottaro）ら，（１９９３）J. Biol. Chem. ２６８：９１８０−９１８３）。１Ｇ４と呼ばれるモノクローナル抗体は、ｈＫＧＦに対して２００pMのＫｄを有する。この短鎖ペプチドは、ヒト受容体を発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞の細胞表面へのｈＫＧＦ結合を約１〜５μMのＫｉで阻害する。ボッタロ（Bottaro）ら（ＷＯ９４／２５０５７）は、ｈＫＧＦとその受容体との間の結合を阻害するｈＫＧＦ−受容体ペプチドを提供している。また、ｈＫＧＦ受容体が介在する細胞増殖を阻害する能力について試験化合物を評価する方法も提供している。
ｅ）受容体−増殖因子相互作用の評価
アンタゴニストを使用する、増殖因子およびリンホカインのこれらの細胞表面受容体との相互作用の阻止は、疾患治療の１つのアプローチである。このようなアンタゴニストの発見には、受容体−増殖因子またはリンホカイン相互作用の生化学的測定法が利用可能であることが必要である。古典的な測定法は、放射標識した増殖因子またはリンホカイン（トレーサー）のその細胞表面受容体への競合阻害である。これらの型の測定法は、表面に関連する受容体を発現する細胞株を利用して、種々の濃度のアンタゴニスト候補の存在下で細胞結合トレーサーの量を測定する。さらに、他の測定法は、関連する受容体を発現する細胞株からの膜抽出物を利用して、トレーサー結合に続いてフィルター結合を行う（ネンクエスト薬剤発見システム（Nenquest Drug Discovery System）：ヒト腫瘍壊死因子−アルファ、エヌイーエヌリサーチプロダクツ（NEN Research Products）、イーアイデュポンデニモアーズ社（E.I.DePont de Nemours & Co.（Inc.））、ボストン、マサチューセッツ州を参照のこと）か、または膜抽出物を固相支持体上に固定化する（アーダル（Urdal）ら，（１９８８）J. Biol. Chem. ２６３：２８７０−２８７７；スミス（Smith）ら，（１９９１）Bioch Bioph Res Comm  １７６：３３５−３４２）。受容体が誘導したトレーサーの電気泳動移動度シフトを適用して、受容体をトレーサーに架橋して、次に変性ゲル上で解析することにより、細胞表面受容体の存在およびサイズを同定した（例えば、クル（Kull）ら，（１９８５）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８２：５７５６−５７６０；ホーマン（Hohmann）ら，（１９８９）J. Biol. Chem.２６４：１４９２７−１４９３４；スタウバー（Stauber）ら，（１９８９）L. Biol. Chem.２６４：３５７３−３５７６を参照のこと）。未変性ゲルおよび非架橋複合体の使用は増殖因子またはリンホカインおよびこれらの受容体について記載されていないが、核酸タンパク質相互作用の検討に広く適用されている（サムブルーク（Sambrook）ら，（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州）。
ＰＣＲによるｈＫＧＦ受容体の存在に関する種々の癌細胞株のスクリーニングにより、全ての癌細胞株がｈＫＧＦ受容体ｍＲＮＡを発現するが、一方肉腫細胞株は発現しないことが明らかになった。ｍＲＮＡの存在は、必ずしもｈＫＧＦ受容体が、これらの細胞の表面上に存在することを意味するものではない。ｈＫＧＦについては、Ｂａｌｂ／ＭＫケラチン細胞（ワイスマン（Weissman），（１９８３）Cell  ３２：５９９−６０６）またはｈＫＧＦ受容体でトランスフェクションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ミキ（Miki），（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０）を使用する細胞に基づく測定法のみが報告されている。
セレックス
標的分子に対して高特異性結合を有する核酸分子のインビトロでの進化方法が開発されている。この指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）（セレックス（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる）方法は、現在は放棄されている米国特許出願第０７／５３６、４２８号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」）、１９９１年６月１０日出願の米国特許出願第０７／７１４，１３１号（標題「核酸リガンド」）、１９９２年８月１７日出願の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（標題「核酸リガンド」（現在、米国特許第５，２７０，１６３号、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８号も参照）に記載されており、この各々は本明細書に具体的に引用される。これらの各出願は本明細書においてまとめてセレックス（ＳＥＬＥＸ）特許出願と呼び、任意の所望の標的分子に対して核酸リガンドを作成するための基本的に新規な方法を記載している。
セレックス法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同じ一般的選択法を用いる結合、分配および増幅の段階的繰り返しを用いて、結合親和性と選択性の事実上すべての所望の基準を達成する。セレックス法は、核酸の混合物（好ましくは、ランダム化された配列のセグメントからなる）から出発して、結合に好ましい条件下で標的に混合物を接触させる工程、標的分子に特異的に結合した核酸から結合しなかった核酸を分離する工程、核酸−標的分子複合体を解離させる工程、核酸−標的分子複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃縮された核酸の混合物を得る工程、次に標的分子に対して高特異性、高親和性の核酸リガンドを得るのに必要な回数、結合、分離、解離および増幅工程を繰り返す工程からなる。
基本的なセレックス法は、多くの具体的な目的を達成するために修飾されている。例えば、１９９２年１０月１４日出願の米国特許出願第０７／９６０，０９３号（標題「構造の基本に基づく核酸の選択方法」）は、ゲル電気泳動とともにセレックスを用いて、具体的な構造的特徴（例えば、ベントＤＮＡ）を有する核酸分子を選択する。１９９３年９月１７日出願の米国特許出願第０８／１２３，９３５号（標題「核酸リガンドの光選択」）は、標的分子に結合および／またはこれを架橋および／または光不活性化することができる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するための、セレックスに基づく方法を記載する。１９９３年１０月７日出願の米国特許出願第０８／１３４，０２８号（標題「テオフィリンとカフェインを区別する高親和性核酸リガンド」）は、密接に関連した分子を区別することができる高特異性の核酸リガンドを同定するための方法（逆セレックス（Counter−ＳＥＬＥＸ）と呼ぶ）を記載する。１９９３年１０月２５日出願の米国特許出願第０８／１４３，５６４号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：溶液セレックス」）は、標的分子に対して高い親和性および低い親和性を有するオリゴヌクレオチドを効率よく分離する、セレックスに基づく方法を記載する。１９９２年１０月２１日出願の米国特許出願第０７／９６４，６２４号（標題「核酸リガンドの製造方法」）は、セレックス実施後の改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する。１９９５年３月８日出願の米国特許出願第０８／４００，４４０号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ケミ−セレックス（Chemi−ＳＥＬＥＸ）」）は、リガンドをその標的に共有結合させるための方法を記載する。
セレックス法は、リガンドに改良された特性（例えば、改良されたインビボの安定性または改良された送達特性）を与える修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸塩および／または塩基の位置での化学的置換がある。修飾ヌクレオチドを含有するセレックスで同定される核酸リガンドは、１９９３年９月８日出願の米国特許出願第０８／１１７，９９１号（標題「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」）に記載されており、これはピリミジンの５−および２’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許出願第０８／１３４，０２８号（前述）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）で修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含有する高特異性の核酸リガンドを記載する。１９９４年６月２２日出願の米国特許出願第０８／２６４，０２９号（標題「分子内求核性置換による２’修飾ピリミジンの新規調製法」）は、種々の２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する。
セレックス法は、１９９４年８月２日出願の米国特許出願第０８／２８４，０６３号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：キメラ−セレックス」）、および１９９４年８月２８日出願の米国特許出願第０８／２３４，９９７号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ブレンドセレックス」）に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と組合せを包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範囲の形や他の性質および効率的な増幅や複製能を、他の分子の好ましい性質と組合せることを可能にする。基本的なセレックス法の修飾を記載する前述の出願の各々は、参考のためその全体が本明細書に引用される。
発明の簡単な要約
本発明は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、およびヒトケラチン細胞増殖因子（ｈＫＧＦ）、および相同なタンパク質に対する核酸リガンドを同定および産生する方法、およびこうして同定および産生される核酸リガンドを含む。本出願の目的について、ＴＧＦβは、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３、およびこれらに実質的に相同的なＴＧＦβ類を含む。実質的に相同的とは、７０％以上のアミノ酸配列の同一性の程度を意味する。本出願の目的について、ＰＤＧＦとは、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＡＢ、およびＢＢアイソホームおよび相的同なタンパク質を意味する。具体的には、この定義にヒトＰＤＧＦ  ＡＡ、ＡＢおよびＢＢアイソホームが含まれる。詳細には、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦに特異的に結合することができるＲＮＡ配列が提供される。また、ＴＧＦβおよびＰＤＧＦに特異的に結合することができるｓｓＤＮＡ配列も提供される。具体的には、本発明には表３、１３、１６、および２３に示されるＲＮＡリガンド配列（配列番号：１２〜４２、１２８〜１７０、１８９〜２６２、２７２〜３０４）が含まれる。表３に示されるＴＧＦβのＲＮＡリガンド配列は、ＳＥＬＥＸの前および後の修飾の両方を含む。また、本発明には表６、８、９、および図３、４、および９に示されるＴＧＦβおよびＰＤＧＦのｓｓＤＮＡリガンド（配列番号：５５〜８９、９３〜１２４、１７１〜１７６）も含まれる。本発明には、恐らくＴＧＦβおよびｈＫＧＦのこれらの受容体との相互作用の阻害により、ＴＧＦβ１およびｈＫＧＦの機能を阻害する、ＴＧＦβ１およびｈＫＧＦのＲＮＡリガンドも含まれる。本発明にはまた、恐らくＰＤＧＦのその受容体との相互作用の阻害により、ＰＤＧＦの機能を阻害する、ＰＤＧＦのｓｓＤＮＡリガンドも含まれる。
さらに本発明には、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦよりなる群から選択される標的に対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列を同定する方法であって、（ａ）核酸の候補混合物を標的と接触させて、（ｂ）標的に対する親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分離し、そして（ｃ）選択された分子を増幅して、標的に対する結合の親和性が比較的高い核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得る工程を含むことを特徴とする方法が含まれる。
さらに具体的には、本発明は、表３および６に示されるリガンド（配列番号：１２〜４２、５５〜８９）を含む、上述の方法により同定されたＴＧＦβに対するＲＮＡおよびｓｓＤＮＡリガンドを含む。また、上記リガンドのいずれかに実質的に相同的であり、かつＴＧＦβに結合してＴＧＦβの機能を阻害する実質的に同じ能力を有する、ＴＧＦβに対する核酸リガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されるリガンドと実質的に同じ構造形態を有し、かつＴＧＦβに結合してＴＧＦβの機能を阻害する実質的に同じ能力を有する、ＴＧＦβに対する核酸リガンドも含まれる。
さらに本発明は、表８および１３、および図３、４、および９に示されるリガンド（配列番号：９３〜１２４、１２８〜１７６）を含む、上述の方法により同定されたＰＤＧＦに対するｓｓＤＮＡおよびＲＮＡリガンドを含む。また、上記リガンドのいずれかに実質的に相同的であり、かつＰＤＧＦに結合する実質的に同じ能力を有する、ＰＤＧＦに対するＤＮＡおよびＲＮＡリガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されるリガンドと実質的に同じ構造形態を有し、かつＰＤＧＦに結合する実質的に同じ能力を有する、ＰＤＧＦに対する核酸リガンドも含まれる。
さらに本発明は、表１６および２３に示されるリガンド（配列番号：１８９〜２６２、２７２〜３０４）を含む、上述の方法により同定されたｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンドを含む。また、上記リガンドのいずれかに実質的に相同的であり、かつｈＫＧＦに結合してｈＫＧＦのその受容体との相互作用を阻害する実質的に同じ能力を有する、ｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されたリガンドと実質的に同じ構造形態を有し、かつｈＫＧＦに結合してｈＫＧＦのその受容体との相互作用を阻害する実質的に同じ能力を有する、ｈＫＧＦに対する核酸リガンドも含まれる。
本発明はまた、本明細書で同定されたＲＮＡリガンドに基づく他の修飾ヌクレオチド配列、およびこれらの混合物も含む。
さらに本発明には、ｈＫＧＦ受容体−介在性細胞増殖を阻害する能力について試験化合物を測定する方法であって、（ａ）試験化合物をｈＫＧＦ核酸リガンドおよびケラチン細胞増殖因子と接触させる工程；そして（ｂ）ｈＫＧＦ核酸リガンドとケラチン細胞増殖因子との間の結合を阻害する試験化合物の能力を検出する工程を含むことを特徴とする方法が含まれる。
また、本発明には、増殖因子のその原形質膜結合受容体との相互作用を阻害する試験化合物の能力を測定する方法であって、（ａ）原形質膜結合受容体を含む細胞を可溶化し；（ｂ）細胞の原形質膜抽出物を作成し；（ｃ）抽出物を、標識した増殖因子単独、および試験化合物の存在下でこれと反応させて複合体を作成し；（ｄ）未変性条件下で電気泳動により複合体を解析し；（ｅ）イメージングにより複合体を可視化し；そして（ｆ）標識した増殖因子単独との抽出物のイメージを、試験化合物の存在下の抽出物のイメージと比較して、試験化合物が、増殖因子とその原形質膜結合受容体との間の相互作用を阻害したかどうか決定する工程を含むことを特徴とする方法も含まれる。
さらに本発明には、細胞が増殖因子原形質膜結合受容体を発現するかどうかを決定するための細胞の測定方法であって、（ａ）細胞を可溶化し；（ｂ）細胞の原形質膜抽出物を作成し；（ｃ）原形質膜抽出物を標識した増殖因子と反応させて；（ｄ）未変性条件下で電気泳動により原形質膜抽出物と標識した増殖因子との間の反応を解析し；（ｅ）工程（ｄ）の電気泳動を標識した増殖因子の電気泳動と比較し；そして（ｆ）電気泳動の結果を可視化して、標識した増殖因子単独の移動度に対して移動度が改変された複合体が形成されるかどうか決定する工程を含むことを特徴とする方法が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＧＦβ１に対する４０Ｄ７  ＤＮＡライブラリーの結合分析を示す。ラウンド１９（三角形）およびラウンド０（円形）から得られた結合データが示される。
図２は、オリゴヌクレオチド（０．１μM）または抗ＴＧＦβ（６０μg/ml）と共にインキュベートしたＴＧＦβ１（１０pM）のＰＡＩ−ルシフェラーゼ測定の結果を示す。
図３は、表９に示される配列セットのコンセンサス二次構造を示す。Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、ＮおよびＮ’は任意の塩基対を示す。
図４は、コンセンサス二次構造モチーフにより折り畳まれた最小リガンド２０ｔ、３６ｔおよび４１ｔを示す。［３’Ｔ］は、３’−エキソヌクレアーゼ分解を低下させるために付加した３’−３’結合したチミジンヌクレオチドを表す。
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、それぞれＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢおよびＢＢに対する最小の高親和性ＤＮＡリガンドの結合を示す。種々の濃度のＰＤＧＦに結合した32Ｐ５’末端標識ＤＮＡリガンドの画分は、ニトロセルロースフィルター結合法により測定した。試験した最小リガンドは、２０ｔ（○）、３６ｔ（△）、および４１ｔ（■）であった。これらの実験のオリゴヌクレオチド濃度は、〜１０pM（ＰＤＧＦ−ＡＢとＰＤＧＦ−ＢＢ）および〜５０pM（ＰＤＧＦ−ＡＡ）であった。非線形最小自乗法を用いて、データ測定点を式１（ＰＤＧＦ−ＡＡへのＤＮＡリガンドの結合に関して）または式２（ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＢへの結合に関して）に適合させた。結合反応は、結合緩衝液（０．０１％ＨＳＡを含むＰＢＳＭ）中で３７℃で行った。
図６は、最小ＤＮＡリガンドとＰＤＧＦ  ＡＢとの間の高親和性相互作用の解離速度測定を示す。全て０．１７nMでＰＤＧＦ  ＡＢ（１nM）に結合した５’32Ｐ末端標識リガンド２０ｔ（○）、３６ｔ（△）、および４１ｔ（■）の画分を、５００倍過剰の非標識競合物質の添加後の所定の時点でニトロセルロースフィルター結合により測定した。解離速度定数（Ｋoff）値は、データ測定点を式３に適合させることにより求めた。実験は、結合緩衝液中で３７℃で行った。
図７は、ＰＡＥ細胞で発現されたＰＤＧＦａ−受容体に対する125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢと125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡの結合に及ぼすＤＮＡリガンドの作用を示す。
図８は、ＰＡＥ細胞のＰＤＧＦβ−受容体発現に及ぼすＰＤＧＦ−ＢＢの細胞分裂促進効果に及ぼすＤＮＡリガンドの作用を示す。
図９は、ＰＤＧＦ−ＡＢへの高親和性結合に影響を及ぼさない２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシ−および２’−フルオロ−２’−デオキシリボヌクレオチド−置換パターンを示す。下線の記号は２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシヌクレオチドを示し；斜体の記号は２’−フルオロ−２’−デオキシヌクレオチドを示し；普通の字体は２’−デオキシリボヌクレオチドを示し；［３’Ｔ］は逆向き（３’３’）チミジンヌクレオチド（グレン・リサーチ（Glin Research）、スターリング、バージニア州）を示し；らせんIIおよびIIIのループ中のＰＥＧはペンタエチレングリコールスペーサーホスホルアミダイト（グレン・リサーチ（Glin Research）、スターリング、バージニア州）を示す。
図１０Ａは、ＰＣ−３細胞の表面上の放射標識ｈＫＧＦの飽和結合を示す。ＴＢ（全結合）は、競合する非標識ｈＫＧＦの非存在下で観察される結合であり、一方ＮＳＢ（非特異結合）は、１００倍モル濃度過剰の非標識ｈＫＧＦの存在下で観察される結合である。ＳＢ（特異的結合）は、特異的結合を示し、この曲線はＴＢ曲線からＮＳＢ曲線を差し引くことにより誘導した。図１０Ｂは、ＳＢ曲線について１０Ａに示されるデータ測定点のスキャチャード分析である。
図１１は、ＰＣ−３細胞からの原形質膜抽出物による電気泳動移動度のシフトを示す。レーン１〜８において、膜抽出物は、各レーンの下に示される種々の濃度の放射標識ｈＫＧＦと反応させた。レーン９〜１２については放射標識ｈＫＧＦに加えて（各レーンの下に示されるように）１００倍モル濃度過剰の非標識ｈＫＧＦを加えた。Ｃ１およびＣ２は、ＰＣ−３原形質膜抽出物中のｈＫＧＦ結合残基の存在による２つの観察された複合体を表す。
図１２Ａ−Ｄは、２’Ｆおよび２’ＮＨ2リガンドの提唱される整列を示す。小文字の斜体の配列残基は、鋳型の定常領域を示す。コンセンサス配列において、各ファミリーの８０％および６０％以上に見い出される残基にはそれぞれ大文字および小文字が使用されている。ＫdおよびＫi値も、各リガンドの呼称の次に示される。ここで示されるＫi値は、式Ｋi＝ＩＣ５０／（１＋（Ｃ／Ｋd））（式中、ＩＣ５０は、例１６に記載されるＰＣ−３細胞測定において測定された各リガンドの最大阻害濃度の半分であり；Ｃは、125Ｉ−ＫＧＦの濃度であり；そしてＫdは、その受容体に対するＫＧＦの平衡解離定数（約１５０pM）である）を用いて計算した。星印を付けたリガンドは、二相性結合曲線を示す。
図１２Ａおよび１２Ｂは、２’Ｆリガンドの提唱される整列を示す。多くの２’Ｆリガンドは、シュードナット（pseudoknot）構造に折り畳むことが可能である。記載されるように２つの分類が提案される。各クラスの要約構造も示される。ステム１（Ｓ１）に関係している塩基は、一本線で下線を引き、一方ステム２（Ｓ２）の塩基は二本線で下線を引いた。シュードナットの種々の要素の整列のためにスペースを入れた。
図１２Ｃおよび１２Ｄは、２’ＮＨ2リガンドの提唱される折り畳みを示す。これらのリガンドは２つのクラスに割り当てられる。要約構造に示されるように、クラス１およびクラス２のリガンドは、それぞれステム−ループおよびダンベル構造を形成することができる。配列を整列させるためにスペースを入れた。ステムに関係している残基に下線を引いた。要約構造において、ピリオド（．）は可変数の残基を示す。リガンド２Ｎおよび５４Ｎは、同じダンベル構造の環状置換である。対応するループの整列のため、これらのリガンドは２本の線上に分けて描いた。
図１３は、リガンド６Ｆおよび１４ＦのｈＫＧＦへの結合に必要な最小配列を示す。各リガンドの予測される折り畳みが示される。リガンドの定常領域は小文字で示される。保存配列に下線を引いた。円形と三角形は、それぞれ活性および不活性の端を切り取った形の３’末端の目印である。
発明の詳細な説明
本出願は、セレックスとして知られている方法により同定されるＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦに対する高親和性核酸リガンドを記載する。セレックスは、現在は放棄されている米国特許出願第０７／５３６，４２８号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」）、１９９１年６月１０日出願の米国特許出願第０７／７１４，１３１号（標題「核酸リガンド」）、１９９２年８月１７日出願の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（標題「核酸リガンド」（現在、米国特許第５，２７０，１６３号、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８号も参照）に記載されている。これらの出願の各々は本明細書に具体的に引用され、まとめてセレックス（ＳＥＬＥＸ）特許出願と呼ぶ。
最も基本的な形では、セレックス方法は以下の一連の工程により定義される：
１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般に固定配列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一位置に同一配列を含有する）とランダム化した配列を含む。固定配列領域は、（ａ）以下に記載される増幅工程を援助するため；（ｂ）標的に結合することが公知の配列を模倣するため；または（ｃ）候補混合物中の、特定の構造配置の核酸の濃度を上昇させるために、選択される。ランダム化された配列は、完全にランダム化（すなわち、任意の位置にある塩基を見い出す確率が４分の１）されるか、または一部のみがランダム化（すなわち、任意の位置にある塩基を見い出す確率が０と１００パーセントの間の任意のレベルを選択しうる）されていてよい。
２）候補混合物を、標的と候補混合物のメンバー間の結合に都合のよい条件下で、選択された標的に接触させる。これらの状況下では、標的と候補混合物の核酸間の相互作用により、標的と、標的に対する最も強力な親和性を有する核酸との間の核酸−標的対を形成すると考えられる。
３）標的に対して最も高い親和性を有する核酸は、標的に対して低い親和性を有する核酸から分画される。高親和性核酸に相当する極く少数の配列（おそらく１分子の核酸）しか候補混合物中に存在しないため、一般に、分画中かなりの量（約５〜５０％）の核酸が候補混合物に残るように、分画の基準を設定することが必要である。
４）分画中、標的に対して相対的に高い親和性を有するとして選択された核酸は次に、増幅されて、標的に対して相対的に高い親和性を有する核酸が濃縮されている新規な候補混合物を生成させる。
５）前述の分画と増幅工程を繰り返すことにより、新規に形成される候補混合物のユニークな配列の割合は徐々に少なくなり、標的に対する核酸の親和性の平均の程度は一般に上昇する。極限まで進めれば、セレックス方法は、標的分子に対する最も高い親和性を有する、元の候補混合物からの核酸である１つあるいは少数のユニークな核酸を含有する候補混合物を生成させる。
セレックス特許出願は、この方法を非常に詳細に記載している。ここには、この方法に使用することができる標的；最初の候補混合物の調製方法；候補混合物内の核酸を分画する方法；および分画した核酸を増幅して、濃縮した候補混合物を生成する方法も含まれる。セレックス特許出願はまた、核酸結合蛋白である蛋白とそうでない両者の蛋白標的を含む、多くの標的種に対して得られたリガンド溶液を記載している。
本明細書に記載の核酸リガンドは、親油性化合物（例えば、コレステロール）と複合体を形成するか、または親油性成分（例えば、リポソーム）からなる複合体に結合またはカプセル化することができる。複合体を形成した核酸リガンドは、細胞内の標的への核酸リガンドの送達のために、細胞による核酸リガンドの細胞性摂取を増強することができる。１９９５年５月４日出願の米国特許出願第０８／４３４，４６５号（標題「核酸リガンド複合体」）（参考のためこの全体が本明細書に引用される）は、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体の製造方法を記載する。
本明細書に記載の方法およびこのような方法により同定される核酸リガンドは、治療および診断目的に有用である。治療用途には、治療用途には、ヒト患者の疾患または症状の治療または防止がある。診断用途には、インビボまたはインビトロの応用がある。セレックス法は一般に、そして本発明で具体的に教示され特許請求されるセレックス法は、特に診断応用に適している。セレックスは、高親和性および驚くべき特異性で標的に結合することができる核酸リガンドを同定する。これらの特性はもちろん診断用リガンドで当業者が求める好ましい性質である。
本発明の核酸リガンドは、当業者の使用するいくつかの方法に従って日常的に診断目的に適合させてもよい。診断薬は、使用者が特定の位置または濃度である標的の存在が識別できればよい。標的と結合対を形成する能力は、診断目的の陽性のシグナルを発生させるのに充分であろう。当業者はまた、核酸リガンドの存在を追跡するための標識物を取り込むために、当該分野で公知の方法により、このようなリガンドを適合させることができるであろう。このような標識物は、多くの診断法で使用できる。本明細書に記載の核酸リガンドは、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦの同定に具体的に使用できる。
セレックスは標的分子に対する高親和性リガンドを提供する。これは、核酸研究の分野では前例のないユニークな業績である。本発明は、セレックス法をＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦの具体的標的に応用する。後述の例のセクションにおいて、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦに対する核酸リガンドを単離し同定するために使用される実験パラメータが記載される。
薬剤として有用な核酸を製造するために、核酸リガンドは、（１）標的に対して目的の効果を達成できる方法で標的に結合し；（２）目的の効果を得るためにできるだけ小さく；（３）できるだけ安定であり、；そして（４）選択されるリガンドに対して特異的なリガンドである、ことが好ましい。多くの場合、核酸リガンドは標的に対してできるだけ高い親和性を有することが好ましい。
同時係属中で同一出願人の１９９２年１０月２１日に出願された米国特許出願番号０７／９６４，６２４号（’６２４）（現在米国特許第５，４９６，９３８号）には、セレックスが行われた後改良された核酸リガンドを入手するための方法が記載されている。この「核酸リガンドを産生するための方法」という標題の’６２４出願は、参考のために具体的に本明細書に引用されている。この出願には、核酸リガンドの３次元構造の決定方法が含有される。このような方法は、セレックス誘導リガンドの数学的モデリングと構造修飾（例えば、化学的修飾およびヌクレオチド置換）を含む。
本発明では、４０または６０個のランダム位置（４０Ｎまたは６０Ｎ）を含有する縮重ライブラリーからＴＧＦβ１に対して特異的な高親和性を有するＲＮＡおよびＤＮＡリガンドを得るためにセレックス実験を行った（表１と５）。本発明は、例１および２に記載の方法により同定された表３（配列番号１２〜４２）に示すＴＧＦβ１に対する特異的ＲＮＡリガンドを包含する。本発明はさらに、おそらくはＴＧＦβ１とその受容体との相互作用を阻害することにより、ＴＧＦβ１機能を阻害するＴＧＦβに対するＲＮＡリガンドを包含する。本発明は、例５および６に記載の方法により同定された表６に示すＴＧＦβ１に対する特異的ｓｓＤＮＡリガンド（配列番号５５〜８９）を包含する。
本発明では、４０または５０個のランダム位置（４０Ｎまたは５０Ｎ）を含有する縮重ライブラリーからＰＤＧＦに対して特異的な高親和性を有するｓｓＤＮＡおよびＲＮＡを同定するために、２つのセレックス実験も行った。本発明は、例７および１５に記載の方法により同定された、表８、９、および１３および含む３、４、および９（配列番号９３〜１２４、１２８〜１７６）に示すＰＤＧＦに対する特異的ｓｓＤＮＡおよびＲＮＡリガンドを包含する。
本発明では、４０個のランダム位置（４０Ｎ）を含有する縮重ライブラリーからｈＫＧＦに対して特異的な高親和性を有するＲＮＡリガンドを探索するために、セレックス実験も行った。本発明は、例１６および１７に記載の方法により同定された、表１６および２３（配列番号１８９〜２６２、２７２〜３０４）に示すｈＫＧＦに対する特異的ＲＮＡリガンドを包含する。本発明はさらに、ｈＫＧＦとその受容体との相互作用を阻害するｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンドを包含する。
本発明により包含されるリガンドの範囲は、好ましくはセレックス法により同定される、修飾されたかまたは修飾されていない、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦに対するすべての核酸リガンドを含む。さらに詳しくは本発明は、表３、６、８、９、１３、１６、および２３、ならびに図３、４、および９に示すリガンドに実質的に相同的な核酸配列を包含する（配列番号１２〜４２、５５〜８９、９３〜１２４、１２８〜１７６、１８９〜２６２、２７２〜３０４）。実質的に相同的とは、７０％を超え、最も好適には８０％を超える一次配列相同性を意味する。ＴＧＦβについて表３と６（配列番号１２〜４２、５５〜８９）、ＰＤＧＦについて表８と１３（配列番号９３〜１２４、１２８〜１７０）、およびｈＫＧＦについて表１６と２３（配列番号１８９〜２６２、２７２〜３０４）に示す核酸リガンドの配列同族体を再検討すると、一次相同性がほとんどまたは全くない配列が、実質的に同じ結合能力で、ある標的に結合することがあることがわかった。このため本発明はまた、表３、６、８、９、１３、１６、および２３、ならびに図３、４、および９（配列番号１２〜４２、５５〜８９、９３〜１２４、１２８〜１７６、１８９〜２６２、２７２〜３０４）に示す核酸リガンドと実質的に同じ構造および実質的に同じＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦへの結合能力を有する核酸リガンドも包含する。ＰＤＧＦについて実質的に同じ構造には、ＰＤＧＦに親和性を与える図３に示す共通の構造成分を有するすべての核酸リガンドを含む。ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、またはｈＫＧＦに結合する実質的に同じ能力とは、親和性が、本明細書に記載のリガンドの親和性の数オーダーの範囲内であることを意味する。ある配列（本明細書に記載のものと実質的に相同的）がＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、またはｈＫＧＦに実質的に同じ能力で結合するか否かを決定することは、当業者の技術の範囲内である。
本発明はまた、前記のリガンドを含有し、ここでリガンドのインビボの安定性を増加させるか、またはリガンドの送達を増強または媒介するためにいくつかの化学的修飾が行われる。そのような修飾の例には、ある核酸配列の糖および／またはリン酸および／または塩基位置の化学的置換がある。例えば、１９９３年９月９日出願の米国特許出願第０８／１１７，９９１号（標題「修飾ヌクレオチド含有高親和性核酸リガンド」）を参照（これは参考のため本明細書に引用される）。他の修飾も当業者に公知である。このような修飾には、セレックス後（すでに同定された修飾されたまたは修飾されていないリガンドの修飾）またはセレックス操作中に取り込むことにより行われる。
例２０は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する核酸リガンドのセレックス後修飾を記載する。核酸リガンドは、ホスホロチオエートキャップを付加し、いくつかのリボプリンを２−デオキシ−２’−Ｏ−メチルプリンの置換により修飾する。
前述のように、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦに選択的に結合できる能力のため、本明細書に記載のＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、およびｈＫＧＦに対する核酸リガンドは薬剤として有用である。従って本発明はまた、ＴＧＦβに結合できる核酸リガンドを投与することによるＴＧＦβ媒介性疾患の治療法、ＰＤＧＦに結合できる核酸リガンドを投与することによるＰＤＧＦ媒介性疾患の治療法、およびｈＫＧＦに結合できる核酸リガンドを投与することによるｈＫＧＦ媒介性疾患の治療法、を包含する。
核酸リガンドの治療用組成物は、注射により非経口投与で投与されるが、他の有効な投与型（例えば、関節内注射、吸入ミスト、経口活性製剤、経皮的イオン導入法または坐剤）も使用できる。１つの好適な担体は生理食塩水であるが、他の薬剤学的に許容される担体も使用可能である。１つの好適な実施態様において、担体とリガンドは生理的適合性のある徐放製剤を構成する。このような担体の主要な溶媒は、天然では水溶性または非水溶性である。さらに担体は、製剤のｐＨ、浸透圧、粘性、清澄性、色、無菌性、安定性、溶解速度、または臭いを修飾または維持するための他の薬剤学的に許容される賦形剤を含有してよい。同様に、担体は、リガンドの安定性、溶解、放出もしくは吸収速度を修飾または維持するための薬剤学的に許容されるさらに別の賦形剤を含有してよい。このような賦形剤は、単位服用量または複数回投与型の非経口投与用の製剤の製造に普通に使用される物質である。
治療用組成物がいったん製剤化されれば、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存される。このような製剤は、即時使用型または投与直前に復元を必要とする型で保存される。全身性送達のための核酸リガンドを含有する製剤の投与方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内に、または膣もしくは直腸坐剤で投与される。
以下の例は、本発明を説明し例示するものであり、決して本発明を限定するものではない。例１〜４は、ＴＧＦβ１に対する特異的高親和性を有するＲＮＡを同定するための初期の実験を記載する。例１は、例２〜４で使用される種々の材料と実験方法を記載する。例２は、セレックス法によりＴＧＦβ１に結合するＲＮＡリガンドの代表的同定方法を記載する。例３は、ＴＧＦβ１に対してリガンドが有する親和性を記載し、リガンドはおそらくＴＧＦβ１とその受容体との相互作用を阻害することにより、ＴＧＦβ１の機能を阻害することができることを証明する。例４は、ＴＧＦβ１結合、およびＴＧＦβ１受容体結合の阻害に、リガンドのどの領域が必要と考えられるかを説明する。例５は、セレックス法による、ＴＧＦβ１に結合するＲＮＡおよびＤＮＡリガンドの別の代表的同定方法を記載する。例６は、ｓｓＤＮＡセレックスライブラリーの結合解析、バイオアッセイ、および配列について報告する。例７は、例８〜１３に示すＰＤＧＦに対するｓｓＤＮＡリガンドの進化に使用される種々の材料と実験方法を記載する。例８は、ＰＤＧＦに対するｓｓＤＮＡリガンド、および選択された核酸リガンドの予測される２次構造を記載する。例９は、高親和性結合に必要な最小の配列を記載する。例１０は、ＰＤＧＦ−核酸リガンド複合体の動力学的安定性を記載する。例１１は、選択されたリガンドの熱溶融性を記載する。例１２は、核酸リガンドとＰＤＧＦの光架橋を記載する。例１３は、培養細胞上のＰＤＧＦアイソフォームのＤＮＡリガンドによる阻害、およびＤＮＡリガンドによる細胞中のＰＤＧＦの細胞分裂促進作用の阻害を記載する。例１４は、修飾ヌクレオチドによるＰＤＧＦに対する核酸リガンドの修飾を記載する。例１５は、ＰＤＧＦに対するＲＮＡリガンドを進化するのに使用される実験法を記載し、リガンド配列を示す。例１６は、例１７〜１９に記載のｈＫＧＦに対する核酸リガンドを進化するのに使用される種々の材料と実験法を記載する。例１７は、ｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンド、ｈＫＧＦに対するリガンドが有する親和性、そしてｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンドの特異性を記載する。例１８は、細胞表面受容体へのｈＫＧＦ結合の阻害を記載する。例１９は、選択されたリガンドによるｈＫＧＦの分裂促進活性の阻害を記載する。例２０は、２−デオキシ−２’−Ｏ−メチルプリンを用いるｂＦＧＦに対する核酸リガンドの修飾を記載する。
例
例１．実験方法
本例は、例２〜４で使用され導入される一般的方法を提供する。
Ａ．材料
このセレックス法で使用されるヒト組換えＴＧＦβ１は、ジェネンテク（Genentech）から得た。ヒト組換えＴＧＦβ１はまた、アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から購入した。
ビオチン化ＴＧＦβ１は、５０mM  ＮａＨＣＯ3中の３．６μMのＴＧＦβ１を１１倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ピアス（Pierce）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ州、米国）と、氷浴中で３時間反応させて調製した。反応物を０．０３６部の１０％酢酸で酸性にし、シリコーン化ピペットチップ中に作成した４０mgのバイダック（Vydac）（ザセパレーションズグルーグ（The Separations Group）、ヘスペリア（Hesperia）、カリホルニア州、米国）逆相カラムに適用し、反応しなかったビオチンをビオチン化ＴＧＦβ１から分離した。カラムを２００μlのエタノールで次に２００μlの１％酢酸で前洗浄し、ビオチン化反応物を適用し、遊離ビオチンを２００μlの５０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、次に２００μlの２０％アセトニトリル、そして最後に２００μlの６０％アセトニトリルで洗浄した。試料を凍結乾燥し、５０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に４０μMで再懸濁し、４℃で保存した。回収率を追跡し、ビオチン化の前後にストレプトアビジンコーティングアガロースビーズ（ピアス（Pierce））に結合する放射能の割合を測定することによりビオチン化反応の成功を評価するために、ＴＧＦβ１に１００，０００cpmのヨード化ＴＧＦβ１を加えた。ビオチン化前後のＴＧＦβ１のアリコートを、逆相クロマトグラフィーにかけた。ビオチン化ＴＧＦβ１は実質的に単一のピークとして移動し、非ビオチン化ＴＧＦβよりおそかった。少量（５％）の未反応ＴＧＦβ１が検出された。ヨード化されビオチン化されたＴＧＦβ１のストレプトアビジン（ＳＡ）アガロースビーズ（３０μl）への結合の効率は、セレックス分離法で使用した結合条件下で３０％であった。
ヨード化ＴＧＦβ１は、バイオラッドエンザイモビーズ（Bio-Rad Enzymobeads）（バイオラッド（Bio-Rad）、リッチモンド、カリホルニア州、米国）を用いるラクトペルオキシダーゼ法（５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、０．１６％グルコース）により調製し、結合したヨードを、５０mM酢酸ナトリウム０．０１％ツイーン中でＧ２５セファデックスでゲル濾過して、遊離ヨードから分離した。
ＰＡＩ１プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するミンク肺細胞株（アベ（Abe）ら（１９９４）Anal. Biochem.２１６：２７６−２８４）は、ダン・リフキン（Dan Rifkin）博士（細胞生物学部門、ニューヨークメディカルセンター、ニューヨーク、ニューヨーク州１００１６）からの供与である。ルシフェラーゼは、アナリティカル・ルミネセンス・ラボラトリー（Analytical Luminescence Laboratory）、サンジエゴ、カリホルニア州、米国）から購入した試薬で測定した。
２’−ＮＨ2修飾ＣＴＰおよびＵＴＰは、ピエケン（Peken）らの方法（１９９１，Science ２５３：３１４−３１７）に従って調製した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社（NeXsdar Pharmaceutical, Inc.）（ボールダー（Boulder）、コロラド州、米国）またはオペロン・テクノロジーズ（Operon Technologies）（アラメダ（Alameda）、カリホルニア州、米国）で、標準的方法により合成された。すべての他の試薬および化学物質は、市販品を購入し、購入源を記載した。
Ｂ．セレックス法
ＴＧＦβ１に結合するセレックスリガンドは、基本的に米国特許第５，２７０，１６３号（ツエルクとゴールド（Tuerk and Gold）（１９９０）Science  ２４９：５０５−５１０）に記載の方法により得た。ＰＣＲ鋳型の出発プールを作成するために、それぞれ１６．１pmolの精製していない単一の標準的ＤＮＡ（少なくとも全部で２×１０12〜２×１０13の異なる分子）を含有する２０の別個のＰＣＲ反応物を、最初の転写の前にプールした。ＰＣＲ条件は、シリコーン化マイクロ遠心管中、５０mM  ＫＣｌ、１０mMトリス−塩酸（ｐＨ９）、０．１％トリトンＸ−１００、１．５mM  ＭｇＣｌ2、０．２mMずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、２μMずつのプライマー、および１００μlの０．０７５U/mlのＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった。すべてのＰＣＲサイクルは、アンプリワックス（Ampliwax）（パークアンドエルマー（Perk and Elmer）、ノーウォーク（Norwalk）、コネチカット州、米国）を用いる、ホットスタートを利用した。最初のＰＣＲは１０サイクル持続した：ＰＣＲサイクルは、９４℃−１分、５２℃−１分、７２℃−２分であった。最初の変性は、９４℃で４分であり、最後の伸長は７２℃で５分であった。ＰＣＲ反応物を合わせ、フェノール／クロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿（２．０Ｍ酢酸アンモニウム、５０％イソプロパノール）させて、プライマーを除去した。
転写反応物は、２００nM  ＤＮＡ、０．９mM  ＧＴＰ、０．９mM  ２’−ＮＨ2−ＵＴＰ、０．９mM  ２’−ＮＨ2−ＣＴＰ、０．５mM  ＡＴＰ、８７mM  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１７mM  ＭｇＣｌ2、４．４mM  スペルミジン、２２mM  ＤＴＴ、１００μg/mlアセチル化ＢＳＡ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州、米国）、および４U/μlのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有した。（２’−Ｆ  ＵＴＰと２’−Ｆ  ＣＴＰ（ユナイテッドステーツバイオケミカル社（United States Biochemical）、クリーブランド、オハイオ州、米国）は、３．０mMで使用し、ＵＴＰとＣＴＰは０．９mMで使用した）。転写反応は２８℃で一晩行った（少なくとも１０時間）。転写後、２μlのＲＱ１ Dnase（プロメガ（Promega））を加えて鋳型を２８℃で１５分間消化し、次にフェノール／クロロホルムで抽出し、次に酢酸アンモニウムから３回エタノール沈殿させた（３．９Ｍ酢酸アンモニウム、７２％エタノール）。
ＲＮＡ分子を、クレブス−リンゲル溶液（ＫＲ）（１２０mM  ＮａＣｌ、４．８mM  ＫＣｌ、１０mM  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１．２mM  ＭｇＳＯ4、２．６mM  ＣａＣｌ2）中で、下記のようにＳＡアガロースビーズに結合したＴＧＦβ１とインキュベートした。この緩衝液をＫＲＨＴと呼ぶ。
ビーズを洗浄して、ＴＧＦβ１−ＲＮＡ複合体を非結合ＲＮＡから分離した。アガロースビーズからの選択された２’−ＮＨ2またはＦピリミジン修飾ＲＮＡの回収は、グアニジンチオシアネート抽出（５Ｍ  ＧｎＳＣＮ、１０mMトリス−塩酸、０．１mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、０．１Ｍβ−メルカプトエタノール）が必要であったか、または２％ＳＤＳ（０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５０mM  ＮａＣｌ、１mM  Ｎａ2ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、１．５mM  ＤＴＴ）によりセラダイン（Seradyne）ＳＡコーティングビーズから回収した。普通の２’−ＯＨ  ＲＮＡは、０．２％ＳＤＳのみを含有するセラダインビーズに使用したものと同じ緩衝液を使用してあまり厳しくない条件下で容易に回収された。抽出し沈殿してＲＮＡを精製し濃縮した後、ＲＮａｓｅＨ配列が欠如したクローン化したＭＭＬＶ  ＲＴで試料を逆転写した。反応物は、１６nM未満またはこれに等しいＲＮＡ、１０μM  ３’プライマー、５０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、７５mM  ＫＣｌ、５mM  ＭｇＣｌ2、１０mM  ＤＴＴ、０．５mM  ｄＮＴＰを含有した。緩衝液と塩の添加後、反応物を２８℃で１０分間アニーリングさせてから、６００単位のスーパースクリプト（Superscript）逆転写酵素（ベセスダリサーチラボズ（Bethesda Research Labs）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州、米国）を加え、５０℃で１時間合成させた。
Ｃ．セレックスの分離法
２．５pmolのビオチン化ＴＧＦβ１を、２００μlのＫＲＨＴ中の３０μl  ＳＡアガロースビーズ（ピアス（Pierce））に結合させた。混合物を３７℃で１５〜３０分インキュベートした。ベクターに、遠心分離と２００μlの冷ＫＲＨＴへの再懸濁を３回行って、非結合ＴＧＦβ１を除去し、最終容量５００μlのＫＲＨＴに再懸濁した。２’−ＮＨ2ピリミジンを含有するＲＮＡを７０℃で３分間加熱し（２’−ＯＨまたは２’−Ｆピリミジンを含有するＲＮＡは９５℃で加熱した）、ＳＡビーズに結合したＴＧＦβ１を含有するＫＲＨＴ中に希釈した。ＲＮＡの最終濃度は１μMであり、ＴＧＦβ１は５nMであった。３７℃で３０分間回転させて結合を起こす。ビーズを２００μlの結合緩衝液で３回遠心分離と再懸濁を行って、非結合ＲＮＡを除去する。前述のようにビーズからＲＮＡを溶出した。
Ｄ．結合測定法
ＴＧＦβ１に対するリガンドについての２つの測定法は、いつも同等の結果を与えた。ＳＡビーズ測定法では、ビオチン化ＴＧＦβ１をポリエチレン試験管（リンブロ（Linbro）、アイシーエヌ（ＩＣＮ）、アービン（Irvine）、カリホルニア州、米国）中でＫＲＨＴで連続希釈し、前述のようにビーズに結合させた。非結合ＴＧＦβ１を洗い流した後、各試験管に微量の32Ｐ標識ＲＮＡ（＜０．１nM）を加え、ボルテックス混合した。３７℃で３０分間静止インキュベート後、非結合ＲＮＡを２００μlのＫＲＨＴで３回洗浄して除去した。
ニトロセルロースフィルター結合測定法では、担体としてトリトンＸ−１００の代わりに０．１％脱脂ＢＳＡ（フルカ（Fluka）ラジオイムノ測定等級、フルカ（Fluka）、ハウパーゲ（Hauppauge）、ニューヨーク、米国）を使用して、ＴＧＦβ１を希釈した。ＲＮＡトレーサーとのインキュベートは前述のように行った。マルチマーウェルピペッターを用いて、湿ったバイオラッド（Bio-Rad）０．４５ミクロンのニトロセルロースのシートを有するマルチウェルマニホールドに、試料を入れ、吸引し、そして２００μlのＫＲＨ（ＢＳＡは含有しない）で３回洗浄した。フィルターを空気乾燥し、液体シンチレーションカウンター（ベックマンインスツルメンツ（Beckman Instruments）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）で計測した。
ＴＧＦβ１へのリガンドの結合を適合させるのに使用した式は、質量作用の法則に従い、単一の結合部位がある受容体（この場合ＴＧＦβ１）へのリガンドの結合を記載する：Ｙ＝Ｂmax*Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）、ここでＹは、結合したリガンドの割合、Ｂmaxは結合したリガンドの最大の割合、ＸはＴＧＦβ１の濃度、そしてＫｄはＴＧＦβ１とリガンドの解離定数である。データ点は、コンピュータープログラムグラフパッドプリズム（Graphpad Prism）（グラフパッドソフトウェア（Graphpad Software）、サンジエゴ、カリホルニア州）を用いて、非線形回帰法で適合させた。アルゴリズムは、曲線からの点の実際の距離の平方の和を最小にするものである。２つの連続的繰り返しによる、平方和の変化が０．０１％未満の場合、収束したものとした。
Ｅ．クローニングと配列決定
セレックス実験は、表２に記載する。セレックス実験１と２からのプライマーは、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ（５’プライマーＴ７ＳａｃＢａｍ；配列番号７）とＸｂａＩ（３’プライマー３ＸＨ；配列番号９）の認識部位を含有する。セレックス実験１と２からのＰＣＲ産物は、ＳａｃＩ／ＸｂａＩ消化したｐＧｅｍ９ｚｆ（プロメガ（Promega））中に方向をそろえてクローン化した。５’プライマーＴ７ＳＢ２Ｎ（配列番号８）と３’プライマー３ＸＨ（配列番号９）は、セレックス実験３〜９に使用した。セレックス実験３〜９からのＰＣＲ産物は、修飾したｐＧｅｍ９ｚｆ：ＢａｍＨＩクローニングベクターのＢａｍＨＩ／ＸｂａI部位に方向をそろえてクローン化した。ＢａｍＨＩ部位を、以下のようにしてｐＧｅｍ９ｚｆ中に作成した。ＴＧＦβ１（配列は示していない）に結合しなかったライブラリー２（ｌｉｂ２−６−２）から単離したクローンを、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化した。修飾ｐＧｅｍ９ｚｆベクターのクローニング部位に隣接する配列を、表１に示す（配列番号１０〜１１）。
プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで消化しＣＩＰ（コウシ小腸ホスファターゼ）で脱リン酸化後、ベクターをゲル精製した。挿入体を結合させ、組換えプラスミドを大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ株（ベセスダリサーチラボズ（Bethesda Research Labs））に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解、ミニプレプ法により調製した。９つのユニーク配列を示す２２クローンを、ライブラリー１と２からランダムに配列決定した。単一のジデオキシＧ反応（Ｇトラックと呼ぶ）を使用して、ライブラリー３〜９から５０クローンの配列を決定した。配列決定ラダーを比較し、類似性について並べた。各ファミリーから選択されたクローンを、完全な配列決定解析のために選んだ。各ライブラリーで異なるＧ配列を示す転写体について、ＴＧＦβ１結合測定法を行った。全部で１４０の結合測定中、２７リガンドは１０nM未満のＫｄで結合し、これらのうち２１を配列決定した。クローンはシーケナーゼプロトコール（ユナイテッドステーツバイオケミカル社（United States Biochemical Corporation）、クリーブランド、オハイオ州）を用いて配列決定した。
Ｆ．リガンドのトランケーション
ＴＧＦβ１へのＲＮＡリガンドの高親和性結合に必要な最小配列を決定するために、トランケーション（truncation）実験を行った。３’境界の決定のために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して５’末端をγ−32Ｐ−ＡＴＰで標識した。５’境界は、α−32Ｐ−ｐＣｐとＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いて、３’末端標識リガンドで確立した。部分的アルカリ加水分解後、放射能標識ＲＮＡリガンドを、１nM〜５０nM濃度のＴＧＦβ１とインキュベートし、タンパク質結合ＲＮＡをニトロセルロース分離法により分離した。ＲＮＡトランケートを、高分解能変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。Ｇ−残基で終止する放射能標識リガンドのラダーを、部分的ＲＮａｓｅＴ１消化で作成し、マーカーとして使用した。
Ｇ．ＴＧＦβ１機能の阻害
ＴＧＦβ１シグナル導入は、細胞表面受容体への結合で始まり、種々の遺伝子の転写が導入される。これらの遺伝子の１つが、Ｐａｉｌである。ＴＧＦβ１測定法は、Ｐａｉｌプロモーターに融合したルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）を利用する。ＭＬＥＣはその細胞表面にＴＧＦβ１を有する。すなわち、一定の誘導時間後ルシフェラーゼ酵素活性を測定することにより、ＴＧＦβ１に対する細胞の応答および培地中のＴＧＦβ１の有効濃度を測定できる。
Ｐａｉ１／ｌｕｃ作製体を有するミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）は、１０％胎児牛血清と４００μg/mlＧ４１８を含有するＤＭＥ中で維持した。ＭＬＥＣ−Ｐａｉ１／ｌｕｃ細胞を、９６ウェルファルコン（Falcon）プレートのウェル当たり３．２×１０4細胞で、１００μlのＤＭＥ＋１０％胎児牛血清中に一晩蒔いた。培地をオートクレーブした水から作成した。無血清ＤＭＥ＋溶液Ａ（１：１）で細胞を３回洗浄した（１００μl）。溶液Ａは、３０mMヘペス（ｐＨ７７．６）、１０mMグルコース、３．０mM、ＫＣｌ、１３１mM  ＮａＣｌ、１．０mMリン酸塩二ナトリウムである。試料（１００μl）を、２０mMヘペス（ｐＨ７．５）と０．１％ＢＳＡ（フルカ（Fluka）ラジオイムノ測定等級）を含有するＤＭＥに加えた。すべての試料は３重測定である。５％ＣＯ2インキュベータ中３７℃で６時間後、培地を除去し、冷ＰＢＳで３回洗浄した（１００μlずつ）。溶解緩衝液（７５μl）（アナリティカル・ルミネセンス・ラボラトリー（Analytical Luminescence Laboratory））を加え、プレートを氷上で２０分間インキュベートした。プレートを密封し、測定するまで−８０℃で凍結した。アナリティカル・ルミネセンス・ラボラトリー（Analytical Luminescence Laboratory）（サンジエゴ、カリホルニア州、米国）のエンハンストルシフェラーゼ測定キット（Enhance Luciferase Assay Kit）を用いて、製造業者の説明書に従ってベルトールドミクロルマット（Berthold Microlumat）ＬＢ９６Ｐルミノメータを使用して、試料（２５μl）のルシフェラーゼ活性を測定した。発光は、再現性よく培地に加えたＴＧＦβ１濃度の関数である。
ＴＧＦβ１活性の阻害について試験したリガンドは、最小の５つの濃度で試験した。リガンドをポリプロピレン試験管中でＤＭＥ、２０mMヘペス（ｐＨ７．５）、０．１％フルカ（Fluka）ＢＳＡで連続希釈し、１２pMのＴＧＦβ１を含有する等量の培地を各試験管に加え、ボルテックスし、さらにインキュベートすることなく細胞に移した。各プレートに含まれるＴＧＦβ１標準曲線から、測定した発光の低下により、阻害リガンドの存在下でＴＧＦβ１の有効濃度を求めた。あるリガンドは３pMおよび６pMのＴＧＦβ１で試験し、同じ結果を得た。ＩＣ50（ＴＧＦβ１活性を５０％低下させるのに必要なセレックスリガンドの濃度）を測定するために、各リガンドについて得られた５つの値をプロットし、データの双曲線適合を仮定し非線形回帰を使用してグラフパッドプリズム（Graphpad Prism）を用いて、５０％阻害の値をグラフから求めた。
例２．ＴＧＦβ１に対するＲＮＡリガンド
Ａ．セレックス実験
ＴＧＦβ１に対するＲＮＡリガンドを作成するために、例１に記載の方法を使用して、９つのセレックス実験（表２に要約）を行った。表１に示すように、ＲＮＡプールは、分子の中心部分に存在するランダム塩基の数が異なる：４０Ｎ６（配列番号２）セレックス中の４０ヌクレオチド、および６４Ｎ６とｌｉｂ２−６−１ＲＮ６（配列番号１，３）セレックス実験中の６４ヌクレオチド。目標はＴＧＦβ１に結合するだけでなく受容体結合を阻止するＲＮＡリガンドを選択することであったため、大きなランダム領域（６４Ｎ）を選択した。２つの実験で、短いランダム領域（４０Ｎ）も含めた。ＴＧＦβ１に対するリガンドは４０Ｎではまれであり、定性的には選択した６４Ｎ６リガンドと同じであった。
セレックス実験からのクローンの配列を表３（配列番号１２〜４２）に示す。種々のセレックス実験で使用したピリミジンは、糖の２’位で異なっていた（表２）。最初の２つのセレックス実験で、リガンドを２’−ＯＨピリミジンとして進化させた。リガンドは、ＴＧＦβ１結合を保持しているかどうかを調べるために、２’−ＮＨ2または２’−Ｆ置換ピリミジンでセレックス後修飾した。２’置換はリガンドをＲＮａｓｅＡ耐性にしたため、ＴＧＦβ１活性の阻害について細胞培養測定法でも試験した。このようなリガンドの１つであるｌｉｂ２−６−１（Ｄ群、表３；配列番号３５）は２’−ＮＨ2−ＵＴＰおよび２’−Ｆ  ＣＴＰで置換した時、ティーＧ−カルテット受容体媒介活性を阻害することが証明された。より多くのリガンドを選択するために、進化プロセスで２’−Ｆおよび２’−ＮＨ2置換ピリミジンを使用して、さらに６つの独立したセレックス実験（ｌｉｂ３−７およびｌｉｂ９）を行った。実験ｌｉｂ８で、生物活性を有するクローンｌｉｂ２−６−１（配列番号３５）をランダム化し、クローンの結合および阻害挙動が改善されるか否かについて再選択した。ｌｉｂ８は２’−ＯＨピリミジンＲＮＡとして進化した。ある場合には、例えば２’−Ｆピリミジン置換で進化させたリガンドが２’−ＮＨ2置換でも結合するか否かを調べるために、実験３〜９で得られたＴＧＦβ１リガンドのセレックス後修飾を行った。
セレックス実験の各出発プールは、３×１０14のＲＮＡ分子（５００pmol）を含有した。ＴＧＦβ１に対する出発ＲＮＡの親和性は、５０mMより大きいと推定した。４ラウンドのセレックス後、進化するプールの親和性は約１０nM改善し、以後のラウンドで大きく変化しなかった。ＲＮＡをバルク配列決定した結果、非ランダムであることがわかり、クローン化した。
ラウンド１５までは最適濃度のＴＧＦβ１を使用しなかったためｌｉｂ１の進化に２０ラウンドが必要であり、ラウンド８まではセレックスの分離工程で結合リガンドの回収のために最適条件を導入しなかったため、ライブラリー５、６、および７では、進化により長くかかった。最適のＴＧＦβ１濃度および分離条件を例１に記載する。
Ｂ．ＲＮＡ配列
セレックスライブラリー中の多くのクローンは、配列が同じかまたは似ている。ライブラリーをＧトラックによりスクリーニングし、各Ｇトラック型の代表的のもののみを結合測定法で試験した。結合測定法は５点（１６．５nM、５．５nM、１．８nM、０．６nM、および０．２nM）であり、Ｋｄが１０nMより小さいセレックスクローンのみが検出できた。結合測定法で良好に（Ｋｄ＜１０nM）結合したＲＮＡリガンドのみを配列決定した。配列は肉眼で検査し、核酸配列を整列させて折り畳んで２次構造の領域を予測させるコンピュータープログラムを使用して解析した。配列相同性によりリガンドを５群（Ａ，Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびオーファン）に分類した。各群は特徴的な可能な２’置換を有した。
Ａ群リガンドに属させるための７つの別個のセレックス実験からＧトラックにより、５８クローンを同定した（表３；配列番号１２〜４２）。１５クローンを配列決定した；１３は似ていたが同じではなく、３つのクローン（ｌｉｂ３−１３（配列番号１２）、ｌｉｂ５−６、およびｌｉｂ５−１３）は同じであった。Ａ群リガンドは、２’−ＮＨ2、２’−ＯＨまたは２’−Ｆ置換ピリミジンとして進化するライブラリー、ならびに２’−Ｆ  ＵＴＰ、２’−ＮＨ2−ＣＴＰとして進化するライブラリーを含有する８つのセレックスライブラリーのうち７つから回収した。セレックス後修飾は、２’−ＮＨ2−ＵＴＰ、２’−Ｆ  ＣＴＰはＴＧＦβ１へのｌｉｂ８−９の結合を破壊せず、従ってＡ群リガンドの構造は、結合を維持するためにピリミジン糖上に特異的な２’残基を必要としないようであることを示す。
Ｂ群リガンドは、２’−ＮＨ2および２’−Ｆピリミジン置換ＲＮＡの両方に結合する。３つのライブラリーからＧトラック解析により、２８個のＢ群クローンを検出した。ライブラリーの２つは、２’−ＮＨ2として、そして１つは２’−Ｆライブラリーとして進化した。４クローンを配列決定し、２つは同じであった（ｌｉｂ５−４７およびｌｉｂ４−１２（配列番号２８）。Ｂ群ではｌｉｂ３−４４として内部欠失が起きることがある。４０Ｎオーファン、ｌｉｂ３−４２は、２次構造に基づき、Ｂ群に入れた。ｌｉｂ３−４４の内部欠失、結合親和性、生物活性、および境界実験はすべて、ｌｉｂ３−４４をこの群に入れることを支持する。
Ｃ群リガンドのメンバーはｌｉｂ１で２’−ＯＨリガンドとして進化しｌｉｂ６で２’−Ｆピリミジン置換リガンドとして進化したため、この群は予測されたように２’−ＯＨまたは２’−Ｆリガンドとして結合する。ｌｉｂ１−２０−３（配列３２）を２’−Ｆ誘導体としてセレックス後修飾した。ｌｉｂ１−２０−３は、取り込まれた２’−ＮＨ2ピリミジンには結合しなかった。
Ｄ群リガンドｌｉｂ２−６−１（配列番号３５）は２’−ＯＨセレックス後単離されたが、セレックス後修飾され、２’−ＮＨ2−ＵＴＰおよび２’−Ｆ  ＣＴＰピリミジン誘導体としてよく結合する。ｌｉｂ２−６−１は、２’−ＮＨ2、２’−Ｆまたは２’−Ｆ  ＵＴＰ、２’−ＮＨ2−ＣＴＰ置換ピリミジンではＴＧＦβ１によく結合しない。Ｄ群の変種は他の２つのセレックスでのみ再セレックスを行い（ｌｉｂ８、２’−ＯＨライブラリー、およびｌｉｂ９、２’−ＮＨ2−ＵＴＰ、２’−Ｆ  ＣＴＰライブラリー）、このリガンドでは２’ピリミジン位に対する特異性があるという観察結果を支持している。
群名をつけたオーファンはたがいに相同的ではなく、これらのリガンドの変種配列は測定されていない。Ｇトラックは、ｌｉｂ３−４５に類似の８つの４０Ｎクローンが、２つのライブラリーから単離されたことを示す。８つのうち２つの配列を決定し、その結果同じであった。ｌｉｂ３−４５（配列番号３９）は、それが２’−ＮＨ2または２’−Ｆ置換ピリミジンを含有しようが、２’−Ｆ  ＵＴＰ、２’−ＮＨ2−ＣＴＰ組合せを含有しようが、結合する。２’−ＯＨリガンドとして単離されたｌｉｂ１−２０−５（配列番号４０）は２’−Ｆとして結合し、一方ｌｉｂ１−２０−１２（配列番号４１）およびｌｉｂ２−６−８（配列番号４２）は２’−ＯＨピリミジンとしてのみ良好に結合し、２’−ＮＨ2または２’−Ｆセレックス後修飾は許容しない。
異なる修飾を有する異なるセレックス実験から同様の配列が得られることはあまりないため、例５と６（後述）に記載のようにＴＧＦβ１に対するＲＮＡおよびｓｓＤＮＡリガンドを探索するために別のセットのセレックス実験を行った。
例３．ＴＧＦβ１受容体結合の阻害
Ａ群リガンドについて表４に記載のＫｄとＢmaxは、特に明記しない場合はリガンドの２’−ＮＨ2置換したものについてのものである。Ａ群リガンドのＢmaxは０．３８±０．１２（ｎ＝１４）であり、これはニトロセルロースフィルター上の測定されたＴＧＦβ１の保持に一致する。Ａ群ライブラリーのＫｄはすべて似ており、２．２±１．１nM（ｎ＝１４）であった。測定した場合、ニトロセルロースとＳＡアガロースビーズ結合測定法は同等の結果を与えた。
特に明記しない場合は、Ａ群リガンドについての表４のＩＣ50はすべて、２’−ＮＨ2ピリミジン置換リガンドで試験した。２’−ＮＨ2リガンドはバイオアッセイの条件下で最も大きな安定性を示したため、これを組織培養バイオアッセイで使用した。試験したＡ群の１０個のリガンドのうち５つは、ＴＧＦβ１受容体活性を阻害した。このインヒビターのＩＣ50値は、典型的にはＴＧＦβ１のＫｄより２５倍大きかった。データは再現性があり、ｌｉｂ３−１３のＫｄは０．８３±０．１１nM（ｎ＝３）であり、ｌｉｂ３−１３（配列番号１２）のＩＣ50は２５±１４nM（ｎ＝４）であった。バイオアッセイのＲＮＡ濃度はすべて、仮定した吸光係数とリガンドの純度１００％に基づく推定値である。従ってＲＮＡ濃度は、バイオアッセイで過大に推定されており、従ってＩＣ50は過大に推定されているであろう。
Ａ群の別の５つのリガンドは、ＴＧＦβ受容体結合活性を阻害しなかった。生物活性のないリガンドであるｌｉｂ２−６−４（配列番号２０）、ｌｉｂ５−４８（配列番号１９）、およびｌｉｂ６−２３（配列番号２１）と、生物活性のあるリガンドの差は、ヌクレオチド７２での置換である。ｌｉｂ７−２１（配列番号２３）およびｌｉｂ７−４３（配列番号２４）は、２’−Ｆ  ＵＴＰ、２’−ＮＨ2−ＣＴＰリガンドとして生物活性を試験した。これらのリガンドは、ＴＧＦβに対して高い親和性を有するにもかかわらず生物活性はなかった。結論として、結合と生物活性は、ＴＧＦβ  Ａ群リガンドの異なる機能である。
Ｂ群のリガンドは、Ａ群リガンドとは異なる結合性を有する（表４）。Ｂ群リガンドでは、Ｋｄ（０．６３±０．５nM、ｎ＝４）およびＢmax（０．１４±０．０４、ｎ＝４）ともに低い。Ｂ群の１つのインヒビターであるｌｉｂ４−１２（配列番号２８）は、実際位低濃度で組織培養バイオアッセイでＴＧＦβ１活性を刺激するようである。この混合したアゴニスト／アンタゴニスト挙動の基礎は、決定されていない。この群の最も良いインヒビターであるｌｉｂ３−４２（配列番号３０）はＩＣ50が２２nMであり、試験した濃度範囲でアゴニスト挙動はなかった。
Ｃ群のリガンドは、２’−Ｆ誘導体として試験したが、生物活性はなかった。２’−Ｆオーファンｌｉｂ１−２０−５（配列番号４０）も同じであった。２’−ＮＨ2、４０Ｎオーファンであるｌｉｂ３−４５は、ＴＧＦβ１に対する高親和性を有するがＴＧＦβ１受容体結合を阻害する能力を持たないリガンドの別の例である。
Ｄ群リガンドは、２’−ＮＨ2−ＵＴＰ、２’−Ｆ  ＣＴＰ誘導体としてバイオアッセイで試験した。ｌｉｂ２−６−１（配列番号３５）と端を切り取ったｌｉｂ２−６−１−８１（配列番号３６）は、ＴＧＦβ１受容体結合を阻害することができる。しかし、５３位のＣからＧへの単一の突然変異が、クローンｌｉｂ８−２３の生物活性を低下させる。同様にｌｉｂ２−６−１（配列番号３５）のヌクレオチド６７と６８に対応する位置のクローンｌｉｂ６−３０（配列番号３４）中の２塩基対の欠失が、結合を１０倍上昇させ、生物活性を排除する。
ｌｉｂ２−６−１（配列番号３５）は、ＴＧＦβ１にのみ有効であり、ＴＧＦβ２とＴＧＦβ３には有効ではないことが証明された。ｌｉｂ２−６−１（配列番号３５）は、０．１％ＢＳＡ以外に細胞培養培地中に１０％ウマ血清の存在下で生物活性があった。すなわち、このリガンドは、測定法中にウマ血清が存在しても妨害されないＴＧＦβ１に対する特異性を示す。ＴＧＦβ１受容体結合の阻害は特異的な現象であることの最大の意味は、必ずしもすべてのＴＧＦβ１リガンドが受容体結合を阻止するのではなく、阻止するものは再現性よく阻止するということである。ＴＧＦβ１受容体結合活性を阻止してＴＧＦβ１に結合しないリガンドの例はない。
要約すると、ＴＧＦβ１受容体結合を阻止することができるＲＮＡリガンドは、リガンドのサブセットである。結合はバイオアッセイに必要であるが、充分ではない。試験した高親和性リガンドの約５０％はインヒビターであった。インヒビターのうち３０％は良好なインヒビターであった（ＩＣ50＜２５nM）。
例４．境界解析
結合に必要なヌクレオチドを決定するために、多くのＴＧＦβ１リガンドについてトランケーション実験を行った。Ａ群リガンドのｌｉｂ３−１３（配列番号１２）とｌｉｂ８−９（配列番号１６）の端を切り取り、一貫した結果を得た。断片ｌｉｂ３−１３−７９はＴＧＦβ１に結合し、従ってｌｉｂ３−１３中のヌクレオチド３’〜ヌクレオチド７９までのいずれも結合には必須ではない。同様にヌクレオチド５’〜３８のすべてが欠失されても、残りの断片ｌｉｂ３−１３−（３８−１２３）はまだＴＧＦβ１に結合することができる。５’境界は配列ｌｉｂ６−２３（配列番号２１）に一致し、これはｌｉｂ３−１３（配列番号２５）のヌクレオチド１９〜３６に対応する欠失を有するが、ＴＧＦβ１に結合する。Ａ群クローンのすべての高親和性結合決定基は、ランダム領域内にあり、４２ヌクレオチド断片ｌｉｂ３−１３−（３８−７９）に対応するかも知れない。Ａ群の多くのリガンドは、ｌｉｂ３−１３−（７２−８１）に対応する領域中の予測された必須の結合ドメイン内の欠失または置換を有する。ｌｉｂ４−３２中の欠失と置換は、ｌｉｂ３−１３のヌクレオチド８０に対応する３’境界には影響を及ぼさない。すなわち、３’境界はおそらく正しく、ヌクレオチド配列７２〜８１の変化は、結合に必要な核酸構造を大きく変化させることはないものである。しかし、この領域の突然変異（顕著にはヌクレオチド７２）は、前述のようにＴＧＦβ１受容体結合を阻止するリガンドの能力を変化させるかも知れない。
Ｂ群のリガンドｌｉｂ４−１２（配列番号２８）の３’末端の境界解析は、ヌクレオチド７２より先はＴＧＦβ１結合に必要でないことを予測させる。ｌｉｂ４−１２の５’境界を決定すると、最初の３つのヌクレオチド以外が結合に必要であり、これは５’定常領域は、少なくとも全長リガンドの境界が決定される時はリガンドの必須の部分であることを示している。ｌｉｂ３−４４（配列番号２９）はｌｉｂ４−１２（配列番号２８）と同様の結合決定基を有すると仮定すると、ｌｉｂ４−１２のヌクレオチド３７〜４２は、ｌｉｂ３−４４とｌｉｂ３−４２（配列番号３０）では欠失しているため、結合に必要ではないと結論できる。
Ｃ群とＤ群のリガンドでは、３’定常領域は結合に必要ではない。いずれのリガンド型も、定常領域内のこの３’ヌクレオチド無しで結合する。ｌｉｂ１−２０−３−８２（ｌｉｂ１−２０−３（配列番号３２）の８２ヌクレオチドの端を切り取ったもの）は、全長ｌｉｂ１−２０−３のように結合する。ｌｉｂ２−６−１の同様の結合と生物活性は、ｌｉｂ２−６−１−８１（配列番号３６）中に存在する３’末端の切り取りにより影響を受けない。
例５．実験方法
好適な実施態様において、４０個のランダム位置（４０Ｎ）を有する縮重ライブラリーから、ＴＧＦβ１に対する特異的高親和性を有するＲＮＡおよびＤＮＡリガンドを探すため、第２のセットのセレックス実験を行った。本例は、例６で使用し導入した一般的方法を示す。
Ａ．材料
Ｍ−ＭＬＶスーパースクリプト逆転写酵素は、ギブコビーアールエル（GibcoBRL）（ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）から購入した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社（NeXsdar Pharmaceutical, Inc.）（ボールダー（Boulder）、コロラド州、米国）の標準的方法に従って精製した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アンプリタク（Amplitaq））は、パーキンエルマー／シータス（Perkin Elmer/Cetus）、リッチモンド、カリホルニア州）から得た。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）、およびアルカリ性ホスファターゼは、ニューイングランドバイオラボズ社（New England Biolabs, Inc.）（ビバリー（Bevery）、マサチューセッツ州）から購入した。２’−アミノ置換ヌクレオチド三リン酸であるアミノ−ＵＴＰおよびアミノ−ＣＴＰは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社（NeXsdar Pharmaceutical, Inc.）（ボールダー（Boulder）、コロラド州）の標準的方法に従って合成した。この実験で使用した他の試薬は、入手できる最も高品質のものである。
Ｂ．核酸
ＲＮＡは、２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写により合成した。ＤＮＡオリゴヌクレオチド（表５）は、オペロン社（Operon INc.）、アラメダ（Alameda）、カリホルニア州）から購入し、６％分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。ＰＣＲ増幅は、５０mM  ＫＣｌ、１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．６）、２．５mM  ＭｇＣｌ2、１７０mg/ml  ＢＳＡ、およびｄＮＴＰ（各１mM）中で行った。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、０．１ml反応物当たり１００単位で使用し、５’プライマーおよび３’プライマーは、１mMで存在した。転写は、４０mM  ＮａＣｌ、１０mMジチオスレイトール、５０mMトリス−酢酸（ｐＨ８．０）、８mM酢酸マグネシウム、２mMスペルミジン、および２mM  ＮＴＰ中で行った。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは１U/mlで存在した。反応物は２８℃で１６時間インキュベートし、次に２０単位のＤＮＡｓｅＩで３７℃で１０分間処理した。反応物は半分量の添加緩衝液（９３％ホルムアミド、１０mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて停止させ、９５℃で３分間加熱した後、６％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素変性ゲルで電気泳動した。ＲＮＡ転写体をＵＶシャドーイングで可視化し、ゲルから切り出し、ＴＥ緩衝液（１０mMトリス−酢酸（ｐＨ８．０）、２mM  ＥＤＴＡ）に溶出した。ＲＮＡ転写体をエタノール沈殿させ、真空下で乾燥し、蒸留水に再溶解した。ＲＮＡの濃度ならびに１本鎖ＤＮＡの濃度は、Ａ260を測定し、１Ａ260単位は、それぞれ４０mg/mlと３３mg/mlと仮定して定量した。
Ｃ．高親和性リガンドの進化
ＴＧＦβ１に結合するセレックスリガンドは、基本的に米国特許第５，２７０，１６３号（ツエルクとゴールド（Tuerk and Gold）（１９９０）Science  ２４９：５０５−５１０も参照）に記載の方法により、表５に記載のオリゴヌクレオチド（配列番号４３〜５４）を使用して得た。ＤＮＡ鋳型は、混合ヌクレオチドＤＮＡ合成により作成した４０ヌクレオチド（４０Ｎ）可変配列、ならびに鋳型の増幅に必要な５’および３’固定配列を含有した。オリゴヌクレオチド４０Ｎ７（配列番号４３）と４０Ｎ８（配列番号４９）の５’固定配列はまた、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有した。最初のラウンドのＲＮＡセレックスのためのＲＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて１本鎖ＤＮＡ鋳型４０Ｎ７と４０Ｎ８上でプライマー伸長して作成した２本鎖ＤＮＡ鋳型から転写した。ＲＮＡセレックスは、１５ラウンドまでのＲＮＡ合成、標的への結合、結合と非結合ＲＮＡのニトロセルロース濾過による分離、ｃＤＮＡ合成、および２本鎖ＤＮＡ鋳型を再生するためのＰＣＲ増幅から構成された。ＲＮＡプールによる標的への結合は、結合緩衝液Ａ（１２０mM  ＮａＣｌ、２．５mM  ＫＣｌ、０．１２mM  ＭｇＳＯ4、４０mMヘペス、２０mM  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４、０．０１％ＨＳＡ）中で３７℃で少なくとも１０分間行った後濾過した。これに対して、１本鎖ＤＮＡセレックスの最初のラウンドは、合成法で合成したオリゴヌクレオチド４０Ｄ７と４０Ｄ８を直接用いて行った。セレックスは、２５ラウンドの標的への結合、結合と非結合１本鎖ＤＮＡのニトロセルロース濾過による分離、２本鎖ＤＮＡ集団を再生するためのＰＣＲ増幅、および次のラウンドのセレックスのための１本鎖ＤＮＡを精製するための分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動から構成された。１本鎖ＤＮＡプールへの標的の結合は、結合緩衝液Ｂ（１５０mM  ＮａＣｌ、１０mMトリス−酢酸（ｐＨ７．５）、０．００１％ＢＳＡ）中で３７℃で少なくとも１５分間行った後濾過した。ＲＮＡおよびＤＮＡレパートリーの放射能標識は、１０mlの容量中の５ピコモルの核酸、２単位のＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼ、および６mlの［γ32Ｐ］ＡＴＰ（８００Ci/mmol）を３７℃で３０分間インキュベートして行った。各ラウンドのセレックス実験の核酸の濃度は、１５００nMと１nMの間で変動し、標的ＴＧＦ−β１の濃度は１５０nMと０．０３nMの間で変動した。
Ｄ．リガンドのクローニングと配列決定
核酸レパートリーのクローニングは、ＰＣＲ増幅によりＲＮＡレパートリーから作成した２本鎖ＤＮＡを用いて、ツエルクとゴールド（Tuerk and Gold）（１９９０）Science ２４９：５０５−５１０の方法により行った。ＰＣＲ増幅したＤＮＡを、制限酵素ＳｐｈＩとＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＧＥＭ内の適合する部に結合させた。結合プラスミドを大腸菌（E. coli）内に形質転換し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド、イソプロピルチオガラクトシドと１００mg/mlアンピシリンを含有するＬＢ寒天上に蒔いた。β−ガラクトシダーゼを発現しないコロニーを解析した。ＤＮＡの配列決定は、サンガー（Sanger）ら（１９７７）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７のジデオキシヌクレオチド法を使用して、ツエルクとゴールド（Tuerk and Gold）（１９９０）が記載したように行った。プラスミドは、アルカリ分解ミニプレップ法（マニアティス（Maniatis）ら（１９８２）モレキュラークローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）により、大腸菌（E. coli）から単離した。ＤＮＡを、５０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０mM  ＮａＣｌ、６mM酢酸マグネシウム、および１mM  ＤＴＴ中で０．４mM  ｄＮＴＰと０．２mMのジデオキシ−ＮＴＰと、４８℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡポリメラーゼは、反応物中４単位で存在した。添加緩衝液１０mlを加えて９５℃に３分間加熱して反応を停止し、次に６％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素変性ゲルでゲル電気泳動を行った。Ｇトラック配列決定は既に記載したように行い、これは異なる配列のリガンドのクローン化ライブラリーを迅速にスクリーニングするための便利な方法である。簡単に説明すると、Ｇトラックスクリーニング反応物は、５０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０mM  ＮａＣｌ、６mM酢酸マグネシウム、および１mM  ＤＴＴを、０．４mM  ｄＮＴＰ、０．２mMのジデオキシ−ＮＴＰ、および４単位のＤＮＡポリメラーゼとともに含有した。反応を４８℃で２０分間行い、１０μlの添加緩衝液を加えて９５℃に３分間加熱して反応を停止し、次に６％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素変性ゲルでゲル電気泳動を行った。
例６．結合解析、バイオアッセイ結果、およびｓｓＤＮＡライブラリーの配列
ＴＧＦ−Ｂ１の４０Ｄ７  ＤＮＡライブラリーの結合解析は、図１に示す。ラウンド１９（三角）とラウンド０（丸）から得た結合データを示す。実験は、核酸（１nM未満）と結合緩衝液（１５０mM  ＮａＣｌ、１０mMトリス−酢酸（ｐＨ８．２）、０．００１％ＢＳＡ）中で記載した濃度のＴＧＦ−ｂ１を、０．１ml容量中で３７℃で１５分間インキュベートして行った。試料をニトロセルロースで濾過し、直ちに３mlのＴＥ緩衝液（１０mMトリス−酢酸（ｐＨ８．０）、０．１mM  ＥＤＴＡ）を加えた。ニトロセルロースフィルターに保持された放射能標識物と結合反応に加えた総放射能標識物の量から、結合した放射能標識のパーセントを計算した。結果は、４０Ｄ７ライブラリーの見かけのＫｄは１nMであり、出発プールの見かけのＫｄは３０nMであることを示す。すなわち、４０Ｄ７ライブラリーは、約３倍の結合の上昇を示す。
例５で作成した核酸ライブラリーの存在下でＴＧＦ−ｂ１を検出するためのＰＡＩ−ルシフェラーゼ測定法は、アベ（Abe）ら（１９９４）Anal. Biochem.  ２１６：２７６−２８４に記載のように行った。ＰＡＩ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するミンク肺上皮細胞を、ＴＧＦ−ｂ１（１０pM）およびＤＮＡライブラリーからのオリゴヌクレオチドまたは抗ＴＧＦＢ抗体（６０μg/ml）とともにインキュベートした。ミンク肺上皮細胞を１８時間インキュベートし、オリゴヌクレオチドをＴＧＦ−ｂ１とプレインキュベートしてから測定を行い、８時間後再度加えた。細胞培養物へのオリゴヌクレオチド単独（１００nM）の添加は、測定に影響しなかった（データは示していない）。オリゴヌクレオチドライブラリーの本体ならびにルシフェラーゼ活性へのその影響は、図２に示す。ｓｓＤＮＡライブラリー４０Ｄ７は、ＴＧＦ−Ｂ１の活性を完全に阻害し、一方対照（等しい濃度のランダム化核酸）はＴＧＦ−Ｂ１活性のわずかな刺激を示した。
結合解析とＰＡＩ−ルシフェラーゼ測定の結果に基づき、４０Ｎ７ライブラリーからのＤＮＡリガンドを、例５に記載のように配列決定した。配列を表６に示す（配列番号５５〜８９）。ＤＮＡ  ４０Ｎ７ライブラリーはＰＡＩ−ルシフェラーゼバイオアッセイで阻害を示したため、ライブラリーからの各クローンはＴＧＦβ１結合物質であることを示唆する。
例７．実験方法
本例は、ＰＤＧＦに対する核酸リガンドの進化のために例８〜１５で使用し導入した一般的方法を示す。
Ａ．材料
組換えヒトＰＤＧＦ−ＡＡ（分子量＝２９，０００）、ＰＤＧＦ−ＡＢ（分子量＝２７，０００）およびＰＤＧＦ−ＢＢ（分子量＝２５，０００）は、アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から、凍結乾燥型で担体タンパク質のない形で購入した。すべての３つのアイソフォームは、成熟ヒトＰＤＧＦ  Ａ−鎖の長い型（ベトショルツ（Betsholtz ９ら，（１９８６）Nature  ３２０：６９５−６９９）およびヒトＰＤＧＦ  Ｂ−鎖の天然に存在する成熟型（ジョンソン（Johnsson）ら，（１９８４）ＥＭＢＯ J. ３：９２１−９２８）の配列に基づく合成遺伝子から、大腸菌（E. coli）中で産生した。ランダム化されたＤＮＡライブラリー、ＰＣＲプライマー、およびＤＮＡリガンドと５’−ヨード−２’−デオキシウリジン置換ＤＮＡリガンドは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社（NeXsdar Pharmaceutical, Inc.）（ボールダー（Boulder）、コロラド州）またはオペロン・テクノロジーズ（Operon Technologies）（アラメダ（Alameda）、カリホルニア州）により、標準的固相ホスホラミダイト（phosphoramidites）法（シンハ（Sinha）ら，（１９８４）Nucleic Acids Res. １２：４５３９−４５５７）を使用して合成した。
Ｂ．１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）セレックス
セレックス法の基本的な特徴は、セレックス特許出願に（またツエルクとゴールド（Tuerk and Gold）（１９９０）Science ２４９：５０５；ジェリネック（Jellinek）ら，Biochemistry， ３３；１０４５０（１９９４）；ジェリネック（Jellinek）ら，Proc. Natl. Acad. Sci., ９０：１１２２７（１９９３））に詳細に記載されており、これらは参考のため本明細書に引用される。不変配列のプライマーアニーリング領域（表７；配列番号９０）が隣接する、連続的なランダム化された４０ヌクレオチド濃縮領域を含有する初期のｓｓＤＮＡライブラリーは、４つのホスホラミダイト等モル混合物を使用する固相ホスホラミダイト法によりランダム化された位置を作成して合成した。ｓｓＤＮＡライブラリーを、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動して精製した。全長ＤＮＡに対応するバンドをＵＶ光で可視化し、ゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出し、エタノール沈殿させ、遠心分離してペレットにした。ペレットを真空下で乾燥し、１mM  ＭｇＣｌ2を補足したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＭ＝１０．１mM  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８mM  ＫＨ2ＰＯ4、１３７mM  ＮａＣｌおよび２．７mM  ＫＣｌ、１mM  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）緩衝液に再懸濁した。タンパク質とインキュベートする前に、ｓｓＤＮＡをＰＢＳＭ中で９０℃で２分間加熱し、氷上で冷却した。約５００pmol（３×１０14分子）の５’32Ｐ末端標識ランダムｓｓＤＮＡをＰＤＧＦ−ＡＢと結合緩衝液（０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳＭ）中でインキュベートして、最初の選択を開始した。混合物を４℃で一晩インキュベートし、次に３７℃で短時間（１５分間）インキュベートした。８％ポリアクリルアミドゲル（１：３０ビスアクリルアミド：アクリルアミド）で４℃で５V/cmで、２mM  ＥＤＴＡを含有する８９mMトリス−ホウ酸（ｐＨ８．３）を泳動緩衝液として使用して電気泳動して、ＰＤＧＦ−ＡＢに結合したＤＮＡを、非結合ＤＮＡから分離した。遊離ｓｓＤＮＡの電気泳動度の約半分で泳動するＰＤＧＦ−ｓｓＤＮＡ複合体に対応するバンドを、オートラジオグラフィーで可視化し、ゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出した。次の親和性選択で、ｓｓＤＮＡをＰＤＧＦ−ＡＢと３７℃で１５分間結合緩衝液中でインキュベートし、ＰＤＧＦ結合ｓｓＤＮＡを、既に記載されているように（グリーン（Green）ら，（１９９５）Chemistry and Biology ２，６８３−６９５）ニトロセルロース濾過により、非結合ＤＮＡから分離した。すべての親和性選択したｓｓＤＮＡプールをＰＣＲで増幅し、ここでＤＮＡは、５０mM  ＫＣｌ、７．５mM  ＭｇＣｌ2、０．０５mg/mlウシ血清アルブミン、１mMデオキシヌクレオチド三リン酸、５μMプライマー（表７）および０．１単位／μl Ｔａｑポリメラーゼを含有する１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．４）中で、１２〜２０回の熱サイクリング（９３℃で３０秒、５２℃で１０秒、７２℃で６０秒）を行った。５’ＰＣＲプライマーをポリヌクレオチドキナーゼと［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５’末端標識し、３’プライマーは、ビオチンホスホラミダイト（グレンリサーチ（Glen Research）、スターリング（Sterling），バージニア州）を使用してビオチン化した。ＰＣＲ増幅後、ビオチン化プライマーに対して１０��モル過剰で、精製されていないＰＣＲ反応混合物にストレプトアビジン（ピアス（Pierce）、ロックフォード（Rockford），イリノイ州）を加えて、室温で１５分間インキュベートした。等量の停止溶液（９０％ホルムアミド、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０２５％ブロモフェノールブルー、およびキシレンシアノール）を加え、室温で２０分間インキュベートしてｄｓＤＮＡを変性させた。放射能標識した鎖を、１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動して、放射能標識した鎖をストレプトアビジン結合ビオチン化鎖から分離した。速く泳動する放射能標識（非ビオチン化）ｓｓＤＮＡ鎖をゲルから切り出し、前述のように回収した。ｓｓＤＮＡの量は、３３μg/ml/吸収単位の吸光係数を用いて２６０nmでの吸収から推定した（サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第２版、第３巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor））。
Ｃ．クローニングと配列決定
セレックスラウンド１２からの増幅された親和性濃縮したプールを、１２％ポリアクリルアミドゲルで精製し、大腸菌（E. coli）のＪＭ１０９株中のＨｉｎｄIIIとＰｓｔI部位の間にクローン化した（サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第２版、第３巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor））。各クローンを、アルカリ溶解法によりプラスミドを調製するのに使用した。前進配列決定プライマーとシーケナーゼ２．０（アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）を使用して製造業者のプロトコールに従って、プラスミドを挿入領域で配列決定した。
Ｄ．見かけの平衡解離定数と解離速度定数の決定
種々の濃度のＰＤＧＦへの低濃度のｓｓＤＮＡリガンドの結合は、既に記載されているニトロセルロースフィルター結合法により測定した（グリーン（Green）ら，（１９９５）Chemistry and Biology ２，６８３−６９５）。ＰＤＧＦストック溶液の濃度（ＰＢＳ中）は、２８０nmでの吸光度から、アミノ酸配列から計算したｅ280値（エス・シー・ギルとピー・エィチ・フォン・ヒペル（Gill, S.C., and von Hippel, P.H.）（１９８９）Anal. Biochem.  １８２：３１９−３２６）：ＰＤＧＦ−ＡＡは１９，５００Ｍ-1cm-1、ＰＤＧＦ−ＡＢは１５，７００Ｍ-1cm-1、ＰＤＧＦ−ＢＢは１１，８００Ｍ-1cm-1）に従って求めた。すべての結合実験のｓｓＤＮＡは、８％（＞８０ヌクレオチド）または１２％（＜４０ヌクレオチド）ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動して精製した。すべてのｓｓＤＮＡリガンドを９０℃で結合緩衝液中で高希釈（約１nM）で２分間加熱し、氷で冷却して、タンパク質溶液にさらに希釈した。結合混合物は典型的には３７℃で１５分間インキュベートしてから、ニトロセルロースフィルターで分離した。
ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐ）へのＤＮＡリガンド（Ｌ）の結合は、２分子結合モデルで説明され、平衡での結合ＤＮＡの割合（ｑ）は、式１により与えられる、
ｑ＝（ｆ／２［Ｌ］t）｛［Ｐ］t＋［Ｌ］t＋Ｋｄ−［（［Ｐ］t＋［Ｌ］t＋Ｋd）2−４［Ｐ］t［Ｌ］t］1/2｝      （１）
ここで、［Ｐ］tと［Ｒ］tは総タンパク質および総ＤＮＡ濃度であり、Ｋdは平衡解離定数であり、ｆはニトロセルロースフィルター上のタンパク質−ＤＮＡ複合体の保持効率である（アービン（Irvine）ら（１９９１）J. Mol. Biol.  ２２２：７３９−７６１；ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９３）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ９０:１１２２７−１１２３１）。
ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢへのＤＮＡリガンドの結合は２相性であり、ＤＮＡリガンドは、対応する解離定数Ｋd1とＫd2で説明される異なる親和性でタンパク質に結合する２つの非交換性成分（Ｌ1とＬ2）からなるモデルで説明できる（ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９３）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ９０：１１２２７−１１２３１）。この場合、結合ＤＮＡの割合（ｑ）の明確な解は、式２で与えられる、
0004531132.tif 000002
ここで、χ1とχ2（＝１−χ1）はＬ1とＬ2のモル分率である。ＰＤＧＦへのＤＮＡリガンドの結合のＫd値は、非線形最小自乗法によりデータ点を式１（ＰＤＧＦ−ＡＡについて）または式２（ＰＤＧＦ−ＢＢについて）を適合させて計算される。
解離速度定数（ｋoff）は、５００倍過剰の非標識リガンドの添加後、分離法としてニトロセルロースフィルター結合を用いて、時間の関数としてＰＤＧＦ−ＡＢ（１nM）に結合した32Ｐ末端標識最小リガンド（０．１７nM）の量を測定して、求めた。ｋoff値は、データ点を一次速度式（式３）にデータ点を適合させて求めた
（ｑ−ｑ∞）／（ｑ0−ｑ∞）＝ｅｘｐ（−ｋoffｔ）      （３）
ここで、ｑ、ｑ0およびｑ∞は、それぞれ任意の時間（ｔ），ｔ＝０、およびｔ＝∞のＰＤＧＦ−ＡＢに結合したＤＮＡの割合である。
Ｅ．最小リガンド測定
３’末端から連続的に端を切り取った５’末端標識ＤＮＡリガンド集団を作成するために、ＤＮＡリガンド鋳型（端を切り取ったプライマー５Ｎ２、表７；配列番号９２）の３’不変配列領域に相補的なプライマーを、［γ−32Ｐ］−ＡＴＰとＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端で標識し、鋳型にアニーリングし、そしてシーケナーゼ（アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）と４つのｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物で伸長した。結合緩衝液中で３７℃で１５分間インキュベート後、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する高親和性を保持するこの集団の断片を、ニトロセルロースフィルター分離により、弱い親和性を有するものから分離した。親和性選択の前後の、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルによる断片の電気泳動分離は、３’境界の決定を可能にする。５’末端から連続的に端を切り取った３’末端標識ＤＮＡリガンド集団を作成するために、ＤＮＡリガンドを、［γ−32Ｐ］−コルディセピン−５’−三リン酸（ニューイングランドヌクレア（New England Nuclear）、ボストン、マサチューセッツ州）とＴ４  ＲＮＡリガーゼ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）３’末端で標識し、ＡＴＰとＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端でリン酸化し、そしてラムダエキソヌクレアーゼ（ギブコビーアールエル（GibcoBRL）（ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）で部分的に消化した。７mMグリシン−ＫＯＨ（ｐＨ９．４）、２．５mM  ＭｇＣｌ2、１μg/ml  ＢＳＡ、１５μg  ｔＲＮＡ、および４単位のラムダエキソヌクレアーゼを有する１００μl容量中で、３７℃で１５分間１０ピコモルの３’標識リガンドの部分的消化を行った。５’境界を、３’境界に記載の方法と類似の方法で決定した。
Ｆ．融解温度（Ｔm）測定
最小ＤＮＡリガンドの融解プロフィールは、ケリー（Cary）モデル１Ｅ分光光度計で得た。オリゴヌクレオチド（３２０〜４００nM）をＰＢＳ、ＰＢＳＭ、または１mM  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で９５℃で加熱し、室温に冷却してから融解プロフィール測定を行う。試料を１℃／分の速度で１５から９５℃に加熱し、０．１℃毎に吸光度を測定して融解プロフィールを作成した。プロッティングプログラムであるカレイダグラフ（Kaleidagraph）（シネジ・ソフトウェア（Synergy Software）、リーディング（Reading）、ペンシルバニア州）を用いて、データ点の一次導関数を計算した。一次導関数値は、各側の２７個のデータ点で各点を平均する５５点平滑化関数を用いて、平滑化した。平滑化一次導関数曲線のピークを用いて、Ｔm値を推定した。
Ｇ．ＰＤＧＦ−ＡＢへの５−ヨード−２’−デオキシウリジン−置換ＤＮＡリガンドの架橋
チミジンの５’−ヨード−２’−デオキシウリジンによる単一のまたは複数の置換を有するＤＮＡリガンドを、固相ホスホラミダイト法を使用して合成した。架橋する能力について試験するために、微量の５’32Ｐ末端標識リガンドを、結合緩衝液中でＰＤＧＦ−ＡＢ（１００nM）と３７℃で１５分間インキュベートした後照射した。結合混合物を、サーモスタットで３７℃に温度を維持した１cm長のキュベットに移し、ＸｅＣｌ荷電ルモニクス（Lumonics）モデルＥＸ７４８エキシマレーザーを使用して、２０Hzで３０８nmで２５〜４００秒照射した。焦点のエネルギーは１７５ミリジュール/パルスで、キュベットを収束レンズの焦点の２４cm上に置いた。照射後、アリコートを、０．１％ＳＤＳを含有する等量のホルムアミド添加緩衝液と混合し、９５℃で５分間インキュベート後、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで遊離リガンドから架橋ＰＤＧＦ／リガンド複合体を分離した。
リガンド２０ｔ−Ｉ４について架橋のタンパク質部位を同定するために、結合および照射をより大規模に行った。ＰＤＧＦ−ＡＢと５’32Ｐ末端標識リガンド（それぞれＰＢＳＭ中１μM）を前記したように１mlの反応容器中でインキュベートし照射（３００秒）した。反応混合物を合わせ、エタノール沈殿し、０．３mlのトリス−塩酸緩衝液（１００mM、ｐＨ８．５）に再懸濁した。ＰＤＧＦ−ＡＢ／リガンド架橋複合体を、０．１７μg/μl修飾トリプシン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））で３７℃で２０分消化した。消化混合物をフェノール／クロロホルム、クロロホルムそして次にエタノールで抽出した。ペレットを水と、５％（v/v）β−メルカプトエタノール（ＳＤＳ無し）を含有する等量のホルムアミド添加緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間インキュベートし、４０cmの８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに溶解した。２つの密接に接近したバンドとして遊離リガンドの約１．５cm前に泳動する架橋トリプシンペプチド／リガンドをゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出し、エタノール沈殿させた。乾燥した架橋ペプチド（比活性に基づき約１６０ピコモル）をエドマン分解により配列決定した（ミッドウェストアナリティカル社（Midwest Analytical,Inc.）、セントルイス、ミズーリ州）。
Ｈ．受容体結合測定法
ＰＤＧＦ  α−またはβ−受容体でトランスフェクションしたブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞への125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡおよび125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合を、前記したように行った（ヘルディン（Heldin）ら，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１３８７−１３９４）。異なる濃度のＤＮＡリガンドを、１mg/mlのウシ血清アルブミンを補足した０．２mlのリン酸緩衝化生理食塩水中で125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡ（２ng、１００，０００cpm）または125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（２ng、１００，０００cpm）とともに、細胞培養物（１．５cm3）に加えた。４℃で９０分インキュベート後、細胞培養物を洗浄し、細胞に結合した放射能をガンマカウンターで測定した（ヘルディン（Heldin）ら，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１３８７−１３９４）。
Ｉ．［3Ｈ］チミジン取り込み測定法
２０ng/mlのＰＤＧＦ−ＢＢまたは１０％胎児牛血清に応答してかつ消化ベクター濃度のＤＮＡリガンドの存在下で、ＰＤＧＦβ−受容体を発現するＰＡＥ細胞への［3Ｈ］チミジン取り込みを、既に記載されているように行った（モリ（Mori）ら，（１９９１）Ｊ．Biol. Chem. ２６６，２１１５８−２１１６４）。３７℃で２４時間インキュベート後、ＤＮＡに取り込まれた3Ｈ−放射能をβカウンターを使用して測定した。
例８．ＰＤＧＦのｓｓＤＮＡリガンド
４０個の連続的な位置でランダム化された１本鎖ＤＮＡ（表７；配列番号９０）の約３×１０14分子（５００pmol）のライブラリーから、セレックス法によりＰＤＧＦ−ＡＢに対する高親和性ＤＮＡリガンドを同定した。最初のラウンドでポリアクリルアミドゲル電気泳動により、そして以後のラウンドでニトロセルロースフィルター結合により、ＰＤＧＦ結合ＤＮＡを非結合ＤＮＡから分離した。１２ラウンドのセレックス後、親和性が濃縮されたプールは見かけの解離定数（Ｋd）約５０pMでＰＤＧＦ−ＡＢに結合した（データは示していない）。これは、初期のランダム化されたＤＮＡライブラリーに比較して約７００倍の親和性の改善である。この親和性の濃縮されたプールを使用してクローニングライブラリーを作成し、ここでから３９個の単離体を配列決定した。これらのリガンドの３２はユニークな配列を有した（表８；配列番号９３〜１２４）。最小配列決定を行ったリガンドには、クローン番号の隣に星印（*）を付けた。最小リガンドとして高親和性結合を保持することがわかったクローン番号は、斜体で書いてある。表８に示すすべてのリガンドは、ニトロセルロースフィルター結合法を用いて、ＰＤＧＦ  ＡＢに結合する能力について試験した。この群から最適のリガンドを同定するために、ＰＤＧＦ−ＡＢに結合した５’32Ｐ末端標識リガンドの割合を、タンパク質濃度の範囲にわたって測定することにより、ＰＤＧＦ−ＡＢへの相対的親和性を測定した。高親和性でＰＤＧＦ−ＡＢに結合するリガンドについては、ＰＤＧＦ−ＢＢとＰＤＧＦ−ＡＡについての親和性も調べた。すべての場合で、ＰＤＧＦ−ＡＢとＰＤＧＦ−ＢＢに対するリガンドの親和性は同等であり、ＰＤＧＦ−ＡＡはかなり低かった（データは示していない）。
３２のユニークなリガンドのうち３１は、表９に示す配列ファミリーに分類することができる。最初はランダム化された領域（大文字）の配列を、コンセンサス３方向らせんジャンクションモチーフに従って整列させた。配列不変領域（小文字）中のヌクレオチドは、予測される２次構造に参加する場合のみ示してある。環状置換によるコンセンサスモチーフへの関連を示すため、いくつかのリガンドを「切断」した（同等性のシンボル）。塩基対に参加すると予測されるヌクレオチドは、下線を引いた逆さの矢印で示し、矢の先端はらせんのジャンクションに向いている。配列は、らせんジャンクション（ＡまたはＧ、らせんIIとIIIの間）の最初の１本鎖ヌクレオチド（５’末端から）に基づき、２群（ＡとＢ）に分けた。らせん領域で一致しないものは、対応する文字の下に点で示す（Ｇ−ＴおよびＴ−Ｇ塩基対は許容される）。単一のヌクレオチドバルジがある場所では、一致しないヌクレオチドは、その近辺の配列の残りの部分の上に示す。
この分類は一部はこれらのリガンド内の配列相同性に基づくが、大部分は共通の２次構造モチーフ（分岐点に３つのヌクレオチドループを有する３方向らせんジャンクション）に基づく（図３）。これらのリガンドはさらに２群に分類される。Ａ群のリガンドでは分岐点のループは不変配列ＡＧＣを有し、Ｂ群ではこの配列はＧ（Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ）である。提唱されるコンセンサス２次構造モチーフは、らせん内の非保存ヌクレオチドの塩基対共変動により支持される（表１０）。３方向ジャンクションは連続的ＤＮＡ鎖内にコードされているため、らせんの２つは、ジャンクションから遠い末端のループで終わる。これらのループは、長さおよび配列の両方の変動性が高い。さらに、コンセンサスモチーフの環状置換のために、ループは３つのらせんで起きるが、らせんIIとIIIで最も高頻度である。これらの観察結果はまとめると、らせんジャンクションから遠い領域は、ＰＤＧＦ−ＡＢへの高親和性結合に重要であることを示唆する。高度に保存されたヌクレオチドは確かにらせんジャンクションの近くに見いだされる（表９、図３）。
例９．境界解析
ＰＤＧＦ−ＡＢに対する６つの最適のリガンドについて、高親和性結合に必要な最小の配列を決定した。一般的に３’および５’最小配列境界の情報は、核酸リガンドを部分的に断片化し、次に標的に対する高親和性を保持する断片を選択することにより得られる。ＲＮＡリガンドでは、断片は穏やかなアルカリ加水分解により作成される（ツエルク（Tuerk）ら，J. Mol. Biol. ２１３：７４９−７６１；ジェリネック（Jellinek）ら，Biochemistry, ３３；１０４５０（１９９４）；ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９５）Biochemistry, ３４：１１３６３−１１３７２；グリーン（Green）ら，（１９９５）J. Mol. Biol. ２４７：６０−６８）。ＤＮＡは塩基に対してより耐性であり、ＤＮＡについて断片を作成するための別の方法が必要である。３’境界を決定するために、ジデオキシ配列決定法を使用してＤＮＡリガンドの３’不変配列にアニーリングした５’末端標識プライマーを伸長して、３’末端で連続的に端を切り取ったリガンド断片の集団を作成した。この集団をニトロセルロースフィルターにより親和性選択し、ＰＤＧＦ−ＡＢへの高親和性結合を保持している最も短い断片（３’末端から端を切り取った）をポリアクリルアミドゲル電気泳動により同定した。５’境界も同様に決定したが、５’末端で連続的に端を切り取った３’末端標識リガンド断片の集団は、ラムダエキソヌクレアーゼで限定消化して作成した。次に最小リガンドは、２つの境界の間の配列として規定した。これらの実験から得られる情報は有用であるが、境界は１回に１つの末端が調べられるため、示唆された境界は絶対的なものではないことに注意すべきである。端を切り取っていない（放射能標識）末端は、結合を増強するか、低下させるか、または影響を及ぼさない（ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９４）Biochemistry, ３４：１０４５０−１０４５６）。
実験的に境界を決定した６つの最小のリガンドのうち、２つ（２０ｔ（配列番号１７２）と４１ｔ（配列番号１７４）；リガンド２０と４１の端を切り取ったもの）は、全長類似体と同等（２倍以内）の親和性で結合し、４つは非常に低い親和性を有した。ＰＤＧＦへの高親和性結合を保持した２つの最小のリガンド（２０ｔと４１ｔ）は、予測された３方向らせんジャンクション２次構造モチーフを有する（図４）。高親和性でＰＤＧＦ−ＡＢに結合する第３の最小のリガンド（３６ｔ（配列番号１７３））は、コンセンサスモチーフの情報から推定された（図４）。以後の実験で、我々はリガンド２０ｔの５’末端の１本鎖領域は、高親和性結合に重要ではないことを見いだした。さらに、リガンド３６ｔ（ＧＣＡとＣＣＡ）中のらせんIIとIII内のトリヌクレオチドループは、ペンタエチレングリコールスペーサー（後述）で置換できる。これらの実験は、ＰＤＧＦ−ＡＢへの高親和性結合においてらせんジャンクション領域の重要性をさらに支持している。
異なる濃度のＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢへの最小のリガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔの結合を、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す。全長類似体の結合性に一致して、最小のリガンドはＰＤＧＦ−ＡＡに対するよりＰＤＧＦ−ＡＢとＰＤＧＦ−ＢＢに対して実質的に高い親和性で結合する（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ、表１１）。実際、ＰＤＧＦ−ＡＡに対するこれらの親和性は、ランダムＤＮＡのそれに匹敵するものである（データは示していない）。ＰＤＧＦ−ＡＡへの結合は１相性結合式で充分に説明され、一方ＰＤＧＦ−ＡＢとＰＤＧＦ−ＢＢに対する結合は、明らかに２相性である。以前のセレックス実験で、２相性結合は、異なる親和性で標的タンパク質に結合する別個の核酸分子種の存在の結果であることが見いだされている（ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９５）Biochemistry, ３４：１１３６３−１１３７２）、および未公表のデータ）。高親和性画分と低親和性画分の本体は現在不明である。これらの記載されたリガンドは化学的に合成されたため、低親和性でＰＤＧＦ−ＡＢやＰＤＧＦ−ＢＢに結合する画分は、化学的に不完全なＤＮＡである可能性がある。あるいは、高親和性および低親和性分子種は、異なる親和性でＰＤＧＦ  Ｂ−鎖に結合する安定なコンフォメーション異性体かも知れない。いずれにしても、高親和性結合成分は、すべての場合で最も多いリガンド種である（図５Ｂと５Ｃ）。比較のために、Ｋｄが０．５nMでヒトトロンビンに結合し、予測されたステム−ループ構造を有する３９量体ＤＮＡリガンド（リガンドＴ３９（配列番号１７７）：
5’-CAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTCGTGGAA［3’T］、ここで［3’T］は、3’−エキソヌクレアーゼ分解を低下させるために加えられた3’−3’結合チミジンヌクレオチドである）は、Ｋｄが０．２３μMでＰＤＧＦ−ＡＢに結合する（データは示していない）。
例１０．ＰＤＧＦ−核酸リガンド複合体の動力学的安定性
ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＤＮＡ複合体の動力学的安定性を調べるために、最小のリガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔ（配列番号１７２〜１７４）のＰＤＧＦ−ＡＢとの複合体の解離速度を、ＰＤＧＦ−ＡＢ（１nM）に結合した放射能標識リガンド（０．１７nM）の量を、過剰の非標識リガンドの添加後の時間の関数として測定して、求めた（図６）。これらのタンパク質およびＤＮＡリガンドの濃度で、ＤＮＡリガンドの高親和性画分のみがＰＤＧＦ−ＡＢに結合する。解離速度定数の以下の値は、図６のデータ点を一次速度式に適合させて得られた：リガンド２０ｔは４．５±０．２×１０-3ｓ-1（ｔ1/2＝２．６分）、リガンド３６ｔは３．０±０．２×１０-3ｓ-1（ｔ1/2＝３．８分）、リガンド４１ｔは１．７±０．１×１０-3ｓ-1（ｔ1/2＝６．７分）。解離定数と解離速度定数について計算された会合速度（ｋon＝ｋoff／Ｋd）は、２０ｔは３．１×１０7Ｍ-1ｓ-1、３６ｔは３．１×１０7Ｍ-1ｓ-1、そして４１ｔは１．２×１０7Ｍ-1ｓ-1である。
例１１．熱融解性
最小のリガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔが折り畳み構造を取る能力を試験するために、ＰＢＳＭまたはＰＢＳＥ緩衝液中のＵＢ吸光度対温度プロフィールからその溶融温度（Ｔm）を決定した。これらの実験で使用したオリゴヌクレオチド濃度（３２０〜４４０nM）では、非変性ポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドとしてモノマー種が観察された（データは示していない）。リガンド２０ｔと４１ｔは、ＰＢＳＭ緩衝液中のＴmがそれぞれ４３．８±０．４℃および４９．２±０．５℃である直線的な傾きのベースライン（ピーターシェイムとターナー（Petersheim and Truener）、（１９８３）Biochem.２２：２５６−２６３）を有する２状態（折り畳みおよび非折り畳み）モデルによりよく説明される温度溶融性を示した。ＰＢＳＥ緩衝液では同様のＴm値が得られた：リガンド２０ｔでは４４．８±０．５℃、そしてリガンド４１ｔでは４８．０±０．５℃。リガンド３６ｔは、より複雑な溶融プロフィールを示し、２つの明確な遷移が観察された。この場合、データは、充分に折り畳まれた状態と広がった状態が、部分的に広がった中間的結果により連結されている、３状態モデルによりよく説明された。このモデルを用いて、リガンド３６ｔのＴm値が得られた：ＰＢＳＭ緩衝液中で４７．０±０．９℃および６７．１±３．８℃、そしてＰＢＳＥ緩衝液中で４４．２±１．７℃および６４．３±４．１℃。
例１２．核酸リガンドとＰＤＧＦの光架橋
密接に接触しているＤＮＡリガンドとＰＤＧＦ上の部位を決定するために、５’−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＩｄＵ）−置換ＤＮＡリガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔ（配列番号１７２〜１７４）を用いて一連の光架橋実験を行った。３０８nmで単色光励起により、５−ヨード−および５−ブロモ−置換ピリミジンヌクレオチドは、最初のｎからπ*遷移システム間横断により、反応性トリプレット状態を占める。励起されたトリプレット状態は次に、近接している電子の豊富なアミノ酸残基（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＨｉｓ）と反応して共有架橋を与える。この方法は、光傷害を最小にする＞３００nmの光での照射を可能にするため、核酸−タンパク質相互作用の研究に広く使用されている（ウィリス（Willis）ら，（１９９４）Nucleic Acids Res.  ２２：４９４７−４９５２；ダブリュー・ティー・スタンプとケー・ビー・ホール（Stump, W.T., and Hall, K.B.）（１９９５）ＲＮＡ  １：５５−６３；ウィリス（Willis）ら，（１９９３）Science ２６２：１２５５−１２５７；ジェンセン（Jensen）ら，（１９９５）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ９２：１２２２０−１２２２４）。リガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔの類似体は、固相ホスホラミダイト法を使用してＩｄＵ残基ですべてのチミジン残基を置換して、合成した。ＰＤＧＦ−ＡＢへのこれらのＩｄＵ置換リガンドの親和性は、非置換リガンドに比較してやや増強されており、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上の遅い電気泳動度を有するバンドの出現に基づき、すべての３つの５’末端標識ＩｄＵ置換リガンドは、３０８nmの照射でＰＤＧＦ−ＡＢに架橋した（データは示していない）。最も高い架橋効率は、ＩｄＵ置換リガンド２０ｔで観察された。観察された架橋の原因である特異的ＩｄＵ位を同定するために、２０ｔの７つの単一のまたは複数のＩｄＵ置換類似体を、ＰＤＧＦ−ＡＢに光架橋する能力について試験した：リガンド２０ｔ−Ｉ１〜２０ｔ−Ｉ７（5’-TGGGAGGGCGCGT1T1CT1T1CGT2GGT3T4ACT5T6T6T6AGT7CCCG-3’（配列番号１７８〜１８４）、ここで番号は、７つのリガンドについて記載したチミジンヌクレオチドでのＩｄＵ置換を示す）。これらの７つのリガンドのうち、ＰＤＧＦ−ＡＢの効率的な架橋は、リガンド２０ｔ−１４でのみ観察された。光活性ＩｄＵ位置は、らせんジャンクションのループ中の３’近接チミジンに対応する（図４）。
ＰＤＧＦ上の架橋したアミノ酸残基を同定するために、５’末端標識２０ｔ−１４とＰＤＧＦ−ＡＢの混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、次に３０８nmで照射した。次に反応混合物を、修飾トリプシンで消化し、架橋した断片を８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで分離した。遊離ＤＮＡバンドに最も近く泳動したバンドから回収したペプチド断片のエドマン分解により、アミノ酸配列ＫＫＰＩＸＫＫ（配列番号１８５）（ここで、Ｘは２０個の誘導体化アミノ酸標準物質で同定できなかった修飾アミノ酸を示す）が明らかになった。このペプチド配列（ここでＸはフェニルアラニンである）は、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖（ジョンソン（Johnsson）ら，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．：９２１−９２８）中のアミノ酸８０〜８６に対応し、これはＰＤＧＦ−Ｂ鎖の結晶構造の中で溶媒に露出したループIIIの一部を含む（エフナー（Oefner）ら，（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．：３９２１−３９２６）。ＰＤＧＦ−Ａ鎖中では、このペプチド配列は存在しない（ベツホルツ（Betsholtz）ら，（１９８６）Nature  ３２０、６９５−６９９）。まとめるとこれらのデータは、リガンド２０ｔ中の特異的チミジン残基とＰＤＧＦ−Ｂ鎖のフェニルアラニン８４の間の点接触を確立する。
例１３．核酸リガンドによるＰＤＧＦの阻害
ＰＤＧＦに対するＤＮＡリガンドが、培養細胞に及ぼすＰＤＧＦアイソフォームの作用を阻害することができるかどうかを調べるために、トランスフェクションによりブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞中で安定に発現されるＰＤＧＦα−およびβ−受容体への125Ｉ標識ＰＤＧＦアイソフォームの結合に及ぼす影響を調べた。リガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔ（配列番号１７２〜１７４）はすべて、ＰＤＧＦα−受容体（図７）またはＰＤＧＦβ−受容体（データは示していない）への125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合を効率的に阻害し、最大効果の半分は約１nM  ＤＮＡリガンドであった。トロンビンを標的とし対照として含めたＤＮＡリガンドＴ３９は、作用はなかった。いずれのリガンドもＰＤＧＦα−受容体（図７）への125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡの結合を阻害することができず、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢに対するリガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔの観察された特異性に一致していた。
ＰＤＧＦβ−受容体を発現するＰＡＥ細胞に及ぼすＰＤＧＦ−ＢＢの分裂促進因子作用を阻害するＤＮＡリガンドの能力を調べた。図８に示すように、［3Ｈ］チミジン取り込みに及ぼすＰＤＧＦ−ＢＢの刺激作用を、リガンド２０ｔ、３６ｔ、および４１ｔにより中和した。リガンド３６ｔは、２．５nMの半分最大阻害を示した。リガンド４１ｔはやや効率が低く、２０ｔはさらに効率が低かった。対照リガンドＴ３９は何の作用もなかった。さらにいずれのリガンドも、これらの細胞で［3Ｈ］チミジン取り込みに及ぼす胎児牛血清の刺激作用を阻害せず、阻害作用はＰＤＧＦに特異的であることを証明している。
例１４．セレックス後ヌクレオチド置換
ヌクレアーゼに対する核酸の安定性は、核酸ベースの治療薬を開発するのに重要な考慮点である。実験では、セレックス誘導リガンド中の多くの（ある場合はほとんどの）ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に耐性の修飾ヌクレオチドと置換しても、高親和性結合を犠牲にしないことを証明した（グリーン（Green）ら，（１９９５）Chemistry and Biology ２，６８３−６９５；グリーン（Green）ら，J. Mol. Biol. ２４７，６０−６８）。ここで報告したＤＮＡリガンドを用いるこの種の実験は、多くの位置で修飾ヌクレオチドによる置換が可能であることを示唆する（図９；配列番号１７５〜１７６）。具体的には、我々は、一カ所がまたは複数の箇所が置換されたリガンド３６ｔのＰＤＧＦ−ＡＢ結合性を調べるために、リガンド３６ｔ中の２’−デオキシリボヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシ−および２’−フルオロ−２’−デオキシリボヌクレオチドで置換した。図９に示す置換パターンは、ＰＤＧＦ−ＡＢへの高親和性結合に一致する。さらにこのリガンドは、らせんIIとIIIの末端のトリヌクレオチドループのペンタエチレングリコールスペーサー（グレン・リサーチ（Glin Research）、スターリング、バージニア州）の代用を許容する。従って、これらのＤＮＡリガンドは、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢの新規なクラスの特異的アンタゴニストの主要な化合物である。
例１５．ＰＤＧＦに対する２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡリガンドの進化ための実験法および得られたＲＮＡ配列
Ａ．２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡセレックス
表１２に示すようにプライマー鋳型（配列番号１２５〜１２７）を使用して、ＰＤＧＦ−ＡＢを標的とする２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンを用いるセレックスを、前記したように行った（前記参照、およびジェリネック（Jellinek）ら，（１９９３，１９９４）前述）。簡単に説明すると、親和性選択ための２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成ＤＮＡ鋳型からインビトロ転写により調製した（ミリガン（Milligan）ら，Nucleic Acids Res., １５：８７８３（１９８７））。すでに詳細に記載されているインビトロ転写の条件（ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９４）前述）を使用したが、ＡＴＰおよびＧＴＰ（１mM）に対してより高濃度（３mM）の２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンヌクレオシド三リン酸（２’−Ｆ  ＵＴＰと２’−Ｆ  ＣＴＰ）を使用した。０．０１％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ中でＰＤＧＦ−ＡＢを２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡと３７℃で少なくとも１５分間インキュベートして、親和性選択を行った。タンパク質結合ＲＮＡからの遊離ＲＮＡの分離は、既に記載されているように（ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９３，１９９４）前述）、ニトロセルロースフィルターにより行った。親和性選択ＲＮＡの逆転写とＰＣＲによる増幅は、既に記載されているように（ジェリネック（Jellinek）ら，（１９９４）前述）行った。１９ラウンドのセレックスを行い、典型的には投入ＲＮＡの１〜１２％を選択した。選択の最初の８ラウンドで、スラミン（suramin）（３〜１５μM）を、選択緩衝液に加えて選択圧力を増加させた。親和性濃縮したプール（ラウンド１９）をクローン化し、既に記載されているように（シュナイダー（Schneider）ら，（１９９２）前述）配列決定した。４６のユニーク配列を同定し、配列を表１３に示す（配列番号１２８〜１７０）。ユニーク配列リガンドを、高親和性でＰＤＧＦ−ＡＢに結合する能力についてスクリーニングした。ランダム２’−フルオロピリミジンＲＮＡ（表１２）は解離定数（Ｋｄ）３５±７nMでＰＤＧＦに結合したが、多くの親和性選択リガンドは、約１００倍高い親和性でＰＤＧＦ−ＡＢに結合した。ユニークリガンドのうち、クローン９（Ｋd＝９１±１６pM）、１１（Ｋd＝１２０±２１pM）、１６（Ｋd＝１１６±３４pM）、２３（Ｋd＝１７３±３８pM）、２５（Ｋd＝８０±２２pM）、３７（Ｋd＝９７±２９pM）、３８（Ｋd＝７４±３９pM）、および４０（Ｋd＝９１±３２pM）は、ＰＤＧＦ−ＡＢに対して最も高い親和性を示した（ＰＤＧＦ−ＡＢへのこれらのリガンドの結合は２相性であり、高親和性結合成分のＫdが与えられる）。
例１６．実験方法
本例は、例１７〜１９で使用し導入した、ｈＫＧＦに対する核酸リガンドの進化ための一般的方法を提供する。
Ａ．材料と方法
組換えヒトケラチン細胞増殖因子（ｈＫＧＦ）とヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）は、アップステートバイオテクノロジー社（Upstate Biotechnology Inc.）（レークプラシッド（Lake Placid）、ニューヨーク州）から購入し、ｈａＦＧＦ、ｈｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦβ１、および抗ＫＧＦ中和モノクローナル抗体は、アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入した。組換えラットＫＧＦは、キューイーディーアドバンストリサーチテクノロジーズ（QED Advanced Research Technologies）（サンジエゴ、カリホルニア州）から購入した。ヒトトロンビンはエンザイムリサーチラボラトリーズ（Enzyme Research Laboratories）（サウスベント（South Bend）、インディアナ州）から購入した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＨｐａIIメチラーゼ、および制限酵素は、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州）から購入した。ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＡｍｐＳＫ（＋）クローニングキットは、ストラタジーン（Stratagene）（ラホイヤ、カリホルニア州）から購入した。ＡＭＶ逆転写酵素は、ライフサイエンシーズ（Life Sciences）（セントピーターズバーグ（St. Petersburg）、フロリダ州）から購入した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、パーキンエルマー（Perkin Elmer）（フォスターシティ（Foster City）、カリホルニア州）から購入した。高純度ヌクレオチド三リン酸は、ファルマシア（Pharmacia）（ピスカタウェイ（Piscataway），ニュージャージー州）から購入した。α−32ｐ−ＡＴＰ、γ−32ｐ−ＡＴＰ、および５’32ｐ−シチジン３’，５’−ビス（ホスフェート）（５’32ｐ−ｐＣｐ）は、デュポンＮＥＮリサーチプロダクツ（Dupont NEN Research Products）（ボストン、マサチューセッツ州）から得た。125Ｉ標識ＫＧＦは、既に記載されているように（ボッタロ（Bottaro）ら，（１９９０）J. Biol. Chem. ２６５：１２７６７−１２７７０）調製した。ＰＣ−３前立腺ガン細胞は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ１４３５）から得た。Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞と、ヒトＫＧＦ受容体でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＧＦＲ）は、エス・アーロンソン（S. Aaronson）（マウントサイナイメディカルセンター（Mt. Sinai Medical CEnter），ニューヨーク州）からの供与であり、別のところ（ミキ（Miki）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０；ミキ（Miki）ら，（１９９１）Science ２５１：７２−７５；ワイスマン（Weissman）ら，（１９８３）Cell  ３２：５９９−６０６）に記載されている。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、２’−ＮＨ2−および２’−Ｆ−修飾ＣＴＰおよびＵＴＰは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社（NeXsdar Pharmaceutical, Inc.）（ボールダー（Boulder）、コロラド州）から得た。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、オペロン・テクノロジーズ（Operon Technologies）（アラメダ（Alameda）、カリホルニア州）から得た。ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス（０．４５μm）ＨＡフィルターは、ミリポア（Millipore）（ベッドフォード（Bedford），マサチューセッツ州）から得た。カルシウムおよびマグネシウム含有ダルベッコーリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）は、ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）から購入した。化学物質は、少なくとも試薬等級であり、市販品を購入した。
Ｂ．セレックス
セレックス法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに詳細に記載されている（ツエルクとゴールド（Tuerk and Gold）（１９９０）Science ２４９：５０５−５１０も参照）。転写により最初のランダム配列ＲＮＡプールを作成するための２本鎖（ｄｓＤＮＡ）鋳型を作成するために１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プールを使用した。ＤＮＡ鋳型は、ＰＣＲとｃＤＮＡ合成のためのプライマーアニーリング部位のための、５’および３’固定領域が隣接する４０ランダムヌクレオチドを含有した（表１４；配列番号１８６〜１８８）。５’プライマーは、インビトロ転写のためのＴ７プロモーター配列を含有する。鋳型は、５０mM  ＫＣｌ、１０mM  トリス−塩酸（ｐＨ９．０）、０．１％トリトンＸ−１００、３mM  ＭｇＣｌ2、０．５mMずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、０．１U/mlのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および２．５nMずつの３Ｇ７と５Ｇ７プライマー（表１４；配列番号１８７〜１８８）中で、９３℃で３．５分の最初の変性、次に１５サイクルの、９３℃で３０秒の変性、６０℃で１分のアニーリング、および７２℃で１分の伸長により、ＰＣＲ増幅した。ｈＫＧＦのセレックス実験は、ＲＮＡのランダム配列プール（ここで、すべてのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾、または２’−Ｆ修飾されている）で開始した。転写反応は、約５μM  ＤＮＡ鋳型、５U/μlのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、４０mM  トリス−塩酸（ｐＨ８）、１２mM  ＭｇＣｌ、５mM  ＤＴＴ、１mM  スペルミジン、０．００２％トリトンＸ−１００、４％ＰＥＧ８０００、２〜４mMずつの２’−ＯＨＡＴＰ、２’−ＯＨ  ＧＴＰ、２’−ＮＨ2または２’−Ｆ  ＣＴＰ、２’−ＮＨ2または２’−Ｆ  ＵＴＰ、および０．２５μM  α32Ｐ  ２’−ＯＨ  ＡＴＰ（８００Ci/mmol）で行った。全長転写体は、使用前にゲル精製した。結合反応物を調製するために、ＲＮＡ分子を、０．０１％ヒト血清アルブミンを含有するカルシウムおよびマグネシウム含有ダルベッコーリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州、カタログ番号２１３００−０２５）中で組換えｈＫＧＦとインキュベートした。室温でインキュベート（１０分間〜１０時間）後、タンパク質−ＲＮＡ複合体を、ニトロセルロースで濾過して非結合ＲＮＡから分離した。ニトロセルロースフィルター結合ＲＮＡを、フェノール／尿素抽出により回収した。分離したＲＮＡは、５０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０mM  ＮａＣｌ、６mM  酢酸マグネシウム、１０mM  ＤＴＴ、５０pmol  ＤＮＡ  ３’プライマー（表１４）、０．４mMずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、１U/μlのＡＭＶ  ＲＴ中で４８℃で６０分、ＡＭＶ逆転写酵素によりｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、次のセレックスサイクルの開始に使用した。
Ｃ）ニトロセルロースフィルター分離法
タンパク質−ＲＮＡ複合体を分離するために、結合反応物を、ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス（０．４５μm孔径）（ミリポア（Millipore）（ベッドフォード（Bedford），マサチューセッツ州））で濾過した。濾過のために、フィルターを真空マニホールドにのせ、ＤＰＢＳ  ５mlを吸引して湿潤させた。結合反応物をフィルターから吸引し、５mlで洗浄後、フィルターをシンチレーションカウンター（ベックマン（Beckman））で計測した。表１５に示すように、選択の厳密性を増加させる手段として、ＤＰＢＳまたは０．５Ｍ尿素を含有するより多量の洗浄量を使用した。ゲル精製し、内部にα−32ｐ−ＡＴＰ標識転写体を、ＤＰＢＳ中の種々の濃度のｈＫＧＦと３７℃で１０分間インキュベートした。オリゴヌクレオチド−タンパク質混合物を、あらかじめ湿潤させた孔径０．４５μmのＨＡフィルターで濾過し、次にＤＰＢＳ  ５mlで洗浄した。フィルターに保持された放射能を計測し、タンパク質の非存在下でバックグランド結合について補正した。ソフトウェアパッケージであるカレイダグラフ（Kaleidagraph）（シネジ・ソフトウェア（Synergy Software）、リーディング（Reading）、ペンシルバニア州）を用いて、非線形最少自乗法により、データを１相性または２相性結合曲線に適合させ、平衡解離定数Ｋｄを得た（ジェリネック（Jellinek）ら，Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ９０：１１２２７−１１２３１）。２相性結合は、平衡状態にない２つの親和性分子種の結合であるとして説明される。
Ｄ）クローニングと配列決定
ラウンド８フィルターから回収されたＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲ増幅した。ＱＩＡクイックスピンカラム（キアゲン社（Quiagen Inc.）、チャッツワース（Chattsworth）、カリホルニア州）でカラムを精製後、エタノール沈殿し、増幅したＤＮＡをＨｐａIIメチラーゼでメチル化した（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州）。メチル化したＤＮＡを、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＡｍｐＳＫ（＋）クローニングキット（ストラタジーンクローニングシステムズ（Stratagene Cloning Systems）、ラホイヤ、カリホルニア州）を使用して、ｐＣＲ−Script Direct ＳＫ（＋）プラスミドのＳｒｆＩ制限部位にクローン化した。シーケナーゼ配列決定キット（ユナイテッドステーツバイオケミカル社（United States Biochemical Corporation）、クリーブランド、オハイオ州）を使用して、約８０クローンを配列決定した。配列解析と２次構造予測は、既に記載されているようにコンピューターソフトウェアを使用して行った（フェングとドリトル（Feng and Doolittle）（１９８７）J. Mol. Evol. ２５：３５１−３６０；イエーガー（Jaeger）ら，（１９８９）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０；イエーガー（Jaeger）ら，（１９９０）Methods Enzymol.１８３：２８１−３０６；ツッカー（Zucker）（１９８９）Sceince ２４４：４８−５２）。
Ｅ．結合に必要な最小配列の決定
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−32ｐ−ＡＴＰで５’末端を標識したか、または５’−32Ｐ−ｐＣｐとＴ４  ＲＮＡリガーゼで３’末端で標識したオリゴヌクレオチドリガンドを用いて、それぞれ３’境界と５’境界を確立した（フィッツウォーター（Fitzwater）ら，（１９９６）Methods Enzymol.２６７：２７５−３０１）。部分的アルカリ加水分解後、放射能標識オリゴヌクレオチドを、０．１、０．６、および３．０nM  ｈＫＧＦとインキュベートし、オリゴヌクレオチドに結合したタンパク質をニトロセルロース濾過により単離した。ニトロセルロースに保持されたオリゴヌクレオチドトランケートを、高分解変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。部分的ＲＮａｓｅＡＴ１消化により作成されるアルカリ加水分解ラダーとＧ残基で停止する放射能標識リガンドのラダーを使用して、３’境界および５’境界をマッピングした。
Ｆ．プロフィールの熱変性
オリゴヌクレオチドの融解プロフィールは、ケリー（Cary）モデル１Ｅ分光光度計を使用して得た。オリゴヌクレオチドをＰＢＳ（サムブルーク（Sambrook）ら，（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），第２版，コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor），ニューヨーク州）、または１０mMリン酸緩衝液中で９５℃で加熱し、室温に冷却してから融解プロフィール測定を行った。作成された溶融プロフィールは、温度の関数としての２６０nmの吸光度の変化を示す。記録の間、試料を１℃／分の速度で２０〜９５℃まで１℃／分の速度で加熱した。
例１７．ｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンド
Ａ．セレックス
ｈＫＧＦのＲＮＡリガンドを作成するために、２つの平衡セレックス実験を開始した（１つは４０個の連続的位置でランダム化された２’−ＮＨ2、および他の１つは２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮＡ分子）。各ラウンドのセレックス条件と結果は、表１５に示す。出発プールは、それぞれ５×１０14（５００ピコモル）と２．５×１０14（２５０ピコモル）の２’−ＮＨ2および２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮＡ分子を含有し、ＫDが約３０nMでｈＫＧＦに結合した。８ラウンドのセレックス後、進化したプールは、ＫDが０．６nMで結合した。以後の２つのラウンドでＫDのさらなる改善が観察された。前記したように、第８ラウンドのＲＮＡプールを逆転写し、ＰＣＲ増幅し、クローン化した。
Ｂ．ＲＮＡ配列
２’−ＮＨ2セレックスで、３１クローンのうち２９は、ユニークであった。配列決定したセレックスのすべての４３クローンは、ユニークであった。ユニークな配列とは、他のすべてのものから３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると定義される。表１６は、配列決定したすべてのクローンの配列（配列番号１８９〜２６２）を、１文字コードで示す（コーニッシュ−ボウデン（Cornish-Bowden），１９８５ Nucleic Acids Res. １３：３０２１−３０３０）。コンピューターによる全体的および局所的整列は、クローンの間で広範な相同性は示さず、明らかなファミリーはなかった。２’−ＮＨ2クローンは一般的にプリンが豊富であり、２’−Ｆクローンはピリミジンが豊富であった。整列パラメータを緩めると、フェング／ドリトル（Feng/Doolittle）アルゴリズムにより２’−ＮＨ2クローンが１つのファミリーに分類され、２’−Ｆクローンが別の群に分類された。配列を肉眼で観察すると、２’−ＮＨ2と２’−Ｆリガンドについてそれぞれ２つおよび３つの可能なファミリーが示唆された。保存された予測２次構造を使用して、３８の２’−Ｆリガンドが２つのクラスに割り当てられた（図１２Ａと１２Ｂ）。同様に、１５の２’−ＮＨ2リガンドが２つのクラスに割り当てられた（図１２Ｃと１２Ｄ）。２’−Ｆリガンドの２つの提唱されるクラスは、シュードナット構造に折り畳まれる（ワイアット（Wyatt）ら，（１９９３）The ＲＮＡ World  ４６５−４９６；イー・テン・ダム（ten Dam, E.）（１９９２）Biochemistry  ３１：１６６５−１６７６）。これらの構造は非常に関連があり、実際これらは共通の構造の環状置換である。クラス１シュードナットのループ３（Ｌ３）は、保存配列５’ＲＲＹｕｙを示し、クラス２リガンドのループ１（Ｌ１）は配列５’ＡｓＹＹを示す。これらの配列の両方とも、コンセンサス５’ＲＲＹＹを含有する。２’−Ｆリガンドのあるものは、ＲＲＹＹ配列の２〜３コピーを含有する（図１２Ａと１２Ｂ）。これらの構造の別の特徴は、ステム１（Ｓ１）中のプリンとピリミジンの均等でない分布である。このステムの１つの鎖は、ほとんどプリンを含有し、他の鎖はピリミジンを含有する。
２’−ＮＨ2リガンドのクラス１は、８つのメンバーを含有し、これらは内部対称または非対称ループを有するステムループ構造に折り畳まれる。ステムは３つの連続的ＧＣ塩基対を有する。末端ループは長く、保存配列５’ＧＧＡＡ（Ｎ）1-14ＹＡＡ（ｎ）1-7ＲＣＲＲ（配列番号２６３）を示す。クラス１リガンドの内部非対称ループの両側は、配列５’ＡＡを含有する。クラス２は、可変サイズのループを有するダンベルに折り畳むことができる。１つのループは保存配列５’ＹＧＡＹを含有し、他のループは保存配列５’ＧＧＡＡ（Ｎ）0-4ＹＧＡ（配列番号２６４）を含有する。クローン２Ｎと５４Ｎは、残存する５クローンの環状置換である。
Ｃ．親和性
ｈＫＧＦリガンドの解離定数は、表１７に記載のニトロセルロースフィルター結合により決定した。４１個の２’−Ｆ  リガンドのうち８個は２相性に結合した。残りの２’−Ｆおよび２’−ＮＨ2リガンドは１相性に結合した。タンパク質過剰では、２相性結合は、リガンドは平衡状態にない２つの親和性分子種（おそらくイソコンフォーマー）として存在することを示唆する。２’−Ｆ修飾リガンドであるＫ１４Ｆは、それぞれ０．３〜３pMと２〜１０nMの高親和性および低親和性解離定数で２相性に結合する。種々のクローンとランダムＲＮＡについてＫD測定で変動がいくつか観察されている。ＫD測定の実験的変動にもかかわらず、Ｋ１４Ｆの高親和性分子種は、ランダムＲＮＡより１，０００〜５，０００倍親和性が高い。１相性２’−Ｆ修飾リガンドのうち、Ｋ３８Ｆは０．３nMの最もよいＫＤを有した。最良の２’−ＮＨ2修飾リガンドは、ＫＤが０．４nMで結合し、これはランダムＲＮＡに対して７５倍の改善である。
Ｄ．結合に必要な最小配列の測定
結合に必要な最小配列を測定するために、さらに２つの２’−Ｆ  リガンド（６Ｆと１４Ｆ）（配列番号２２３と２３１）を試験した。３’末端と５’末端で標識したアルカリ加水分解ラダーをｈＫＧＦに結合させて、配列境界を決定した。部分的断片をニトロセルロース濾過により親和性精製し、高分解変性ゲルで解析した。両方のリガンドについて、境界は３’末端でのみ観察され（図１３）、図１２Ａに示すクラス１の提唱された折り畳みに一致する。次に端を切り取った鋳型を使用して境界を確認した（図１３）。７つの連続的ピリミジンでは境界の正確なマッピングができなかったため、３つのトランケートを６Ｆについて試験した。これらの３つのトランケートから、１つは図１３に示すようにＫＧＦ結合活性を阻止した。単一の１４Ｆトランケート（１４Ｆ３’Ｔと命名）を試験した。提唱されたシュードナット構造のステム２（Ｓ２）を伸長するために、このトランケートは観察された境界より２塩基長かった。１４Ｆ３’Ｔの端を切り取ったリガンドは、全長リガンドに類似の親和性で結合活性を保持した。全長リガンドのように、１４Ｆ３’ＴはＫＧＦに２相性に結合し、高親和性分子種は分子の約２０％であり、Ｋd値約０．３〜３pMであった。これらの高親和性分子種は、ＫＧＦへの親和性の差に基づき低親和性分子種から部分的に分離した時、中点が０．３〜３pMにあり最大のプラトーが約７０％である結合曲線を示した（データは示していない）。図１３は、それぞれ５３および４９塩基の長さの６Ｆと１４Ｆの最も短い活性トランケートの予測された折り畳みを示す。いずれの提唱されたシュードナット構造も、相対的に長いステムを含有する。６Ｆの２つの提唱されるステムは、非Ｈ型シュードナットを形成する単一の塩基により分離される。提唱される６Ｆ構造は、ＭＭＴＶ  ＲＮＡ中に存在するフレームシフト成分からの類似のシュードナットモチーフの溶解構造に似ている（シェン（Shen）ら，（１９９５）J. Mol. Biol. ２４７：９６３−９７８）。１４Ｆの２つのステム（Ｓ１とＳ２）は、全長が１６塩基対の同軸で重なったらせんとして描くことができるであろう（Ｈ型シュードナット）。同様のシュードナット構造が、ＮＭＲデータに基づき提唱されている（ヅ（Du）ら，（１９９６）Biochemistry  ３５：４１８７−４１９８）。Ｌ１は短いため、リガンド１４Ｆは非Ｈ型シュードナット（ここで、Ｓ１の最後のＧＵ塩基対は形成されず、より柔軟性のあるらせん領域とより長いＬ１を可能にする）を形成することができる。１４Ｆと１４Ｆ３’Ｔの温度融解曲線は、このリガンドの顕著な熱安定性を示唆する（データは示していない）。これらの融解曲線は、１５０mMの塩中で濃度依存性で２相性のようである。２相性融解曲線は、すでにｔＲＮＡでも観察されており（ヒルアース（Hilbers）ら，（１９７６）Biochemistry  １５：１８７４−１８８２）、ＲＮＡ分子の三次折り畳みが原因であるとされている。ＲＮＡシュードナットについて多相温度遷移が提唱されている（ヅ（Du）ら，（１９９６）Biochemistry  ３５：４１８７−４１９８）。観察される２相性曲線は、約５５℃の低Ｔmと８５〜９０℃以上の高Ｔmを含む。１０mMの塩では、１４Ｆの低Ｔmは観察されず、高Ｔmは７５〜７８℃まで移動し��くる。１４Ｆの融解プロフィールは、Ｔmは同じでも１４Ｆ３’Ｔより平らなようである。このデータは、観察された熱安定性は最小の４９量体が原因であることを示唆する。
結合を保持したより短いＫＧＦリガンドを同定するために、リガンド１４Ｆの最も短いトランケート（すなわち、１４Ｆ３’Ｔ）の種々の欠失の結合活性を試験した。欠失は、提唱されたシュードナット構造のすべての構造成分で試験された。結果を表２３に要約する（配列番号２７２〜３０４）。２’−Ｆピリミジンと２’−ＯＨプリンを含有するＲＮＡ転写体は、合成ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写により得られた。各リガンドの活性は、１４Ｆ３’Ｔ結合曲線の高（Ｈ）および低（Ｌ）活性成分を＋（活性）または−（不活性）に採点して示す。トランケートＴ３５とＴ３６は、１４Ｆ３’Ｔ分子の２つの相補的な半分ずつであり、等モル混合物中でさらに試験した。提唱されたシュードナット構造の構造成分は、（｜）で分離され、記号Ｓ１（ステム１）、Ｓ２（ステム２）、Ｌ１（ループ１）、およびＬ３（ループ３）により示される。１４Ｆ３’Ｔの提唱されるシュードナット構造は、非Ｈ型シュードナットであり、Ｌ２（ループ２）が欠如している。Ｓ１（Ｓ１とＳ１’）とＳ２（Ｓ２とＳ２’）を形成する相補的な配列は、１本および２本の下線で示す。表にした配列において、欠失した塩基はピリオド（．）で置換してある。提唱されたシュードナット構造のステムＳ１とＳ２の欠失を試みると、１４Ｆ３’Ｔリガンドで観察されたように、結合曲線の高（Ｈ）および低（Ｌ）活性成分の両方が喪失した。しかし、ループ３（Ｌ３）内の欠失は、ＲＲＹＹボックスの少なくとも１つのコピーが完全である限り、完全であった。活性を保持した最も短いリガンドは、４３量体であるＴ２２である。Ｌ３の端を切り取ってより短いリガンドを得るために、突然変異体であるＴ２２（Ｔ２２ｍｕと呼ぶ）を使用し、ここでは６位のＧからＵへの突然変異により、Ｓ１の最後のＧＣ塩基対を除去した。この突然変異の意味は、Ｓ１とＳ２の間の対をなさない塩基を可能にして、このリガンドの２本鎖領域の柔軟性を増強することである。この突然変異はＴ２２の結合に影響を与えなかったが、これはＬ３中のさらなる活性なトランケーションを許容しなかった。
Ｅ．ｈＫＧＦに対するＲＮＡリガンドの特異性
Ｋ１４Ｆリガンドの特異性を、ラットｈＫＧＦ、およびヘパリン結合ヒト増殖因子、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＰＤＧＦに対してＫDを測定して試験した（表１８）。結果は、ｈＫＧＦを除いて、Ｋ１４ＦはランダムＲＮＡのようにすべての試験した標的に結合すること、そしてファクター４００〜４０，０００でｈＫＧＦと他の類似のタンパク質を区別することができることを示唆する。
種々のヘパリン結合タンパク質に対してそのＫdを測定して、リガンド１４Ｆ３’Ｔの特異性を試験した。表２２に要約した結果は、リガンド１４Ｆ３’Ｔは、ファクター１．２×１０4〜３×１０10でｈＫＧＦと他のすべてのヘパリン結合タンパク質を区別することができることを示す。リガンド１４Ｆ３’Ｔは高親和性でＫＧＦにのみ結合し、一方これは、ランダムＲＮＡのように試験した他のすべてのヘパリン結合タンパク質に結合する。１４Ｆ３’ＴのラットＫＧＦ（これは、ヒトＫＧＦと９１％同じである）への結合は、親和性が約５〜１０倍低い。Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞のＫＧＦ誘導ＤＮＡ合成の阻害の間、同様の特異性が観察された。リガンド１４Ｆ３’Ｔは、Ｋiが１．８nMでＫＧＦ誘導性ＤＮＡ合成を阻害し、これはヒトＫＧＦで観察されたＫiより２５〜５０倍高い。リガンド１４Ｆ３’Ｔは、ＥＧＦ刺激ではなくＫＧＦ刺激の結果である時のみ、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞のＤＮＡ合成を阻害する（データは示していない）。
例１８．細胞表面受容体へのｈＫＧＦ結合の阻害
Ａ．受容体結合測定法
その細胞表面受容体へのｈＫＧＦの結合を競合的に阻害するｈＫＧＦリガンドの能力を試験するために、２つの細胞株を使用した。最初の細胞株（ＰＣ−３）は、グレードIVの前立腺腫からの単離物である（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３５）。第２の細胞株は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＦＧＦＲ−２と呼び、約０．５×１０6の高親和性ＫＧＦ結合部位／細胞で、ヒトｈＫＧＦ受容体を有する組換えＮＩＨ／３Ｔ３細胞株である（ミキ（Miki）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０）。
ＰＣ−３細胞を、約１０5細胞／ウェルで２４ウェルプレートに蒔いた。４８〜３６時間増殖後、細胞に２４時間血清を欠如させ、５００μlの冷ＤＰＢＳで２回洗浄し、次に０〜０．８nMの範囲の種々の濃度の125Ｉ−標識ＫＧＦを含有する、５００μlの結合緩衝液（ＢＢ１；ＤＰＢＳ、０．５mM  ＭｇＣｌ2、０．２％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）でインキュベートした。４℃で３〜３．５時間インキュベート後、結合混合物を吸引し、ウェルに接着した細胞を１mlのＢＢ１で２回洗浄し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを補足した１mlのＢＢ１で洗浄した。残りの結合した標識ｈＫＧＦを、６００μlの０．５％ＳＤＳ／０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で可溶化し、ガンマカウンター（ベックマン（Beckman））で計測した。非特異結合を、１００倍モル過剰の非標識ｈＫＧＦの存在下で測定した。競合的測定法のために、標識ｈＫＧＦを０．３nMで一定に維持し、０〜１，０００nMの範囲の結合反応物中に、種々の濃度の競合物質分子を含有させた。結合曲線を以下の式に適合させた：
［結合トレーサー］＝（［総トレーサー］*［受容体］）／（ＫD＋［総トレーサー］）
ここで、［総トレーサー］と［結合トレーサー］は固定して、ソフトウェアのカレイダグラフ（Kaleidagraph）（シネジ・ソフトウェア（Synergy Software）、リーディング（Reading）、ペンシルバニア州）を用いて、回帰解析によりＫDと［受容体］を求めた。
ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＧＦＲ細胞を、約１０5細胞／ウェルで２４ウェルプレートに蒔いた。一晩増殖後、細胞に１〜５時間血清を欠如させ、５００μlの結合緩衝液（ＢＢ２；無血清ＭＥＭ増殖培地、０．１％ＢＳＡ、２５mMヘペス、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次に１μg/mlのヘパリン（ウシ肺から、シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）、０．０３nMの125Ｉ標識ｈＫＧＦ、および種々の濃度の競合物質分子（３００nM〜０nM）を含有する２５０μlのＢＢ２とインキュベートした。室温で１時間インキュベート後、結合混合物を吸引し、ウェルを２５０μlの冷ＤＰＢＳで２回洗浄し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを補足した２５０μlの冷ＤＰＢＳで１回洗浄した。結合した標識ｈＫＧＦを、５００μlの０．５％ＳＤＳ中で可溶化し、シンチレーションカウンター（ベックマン（Beckman））で計測した。
ＲＮＡリガンドの阻害定数（Ｋi）を、データの非線形回帰解析により求めた。
ＰＣ−３細胞の表面上のＫＧＦ受容体を探索するために、１００倍モル過剰の非標識ｈＫＧＦの存在下で異なる濃度（０．００２Ｍ〜０．８nM）の125Ｉ−ｈＫＧＦを使用し、ＰＣ−３細胞の表面上のトレーサーの飽和結合を観察した。図１０は、トレーサーの総濃度の関数としての結合トレーサーの濃度のプロット、ならびに同じデータのスキャチャード解析を示す。データの解析は、細胞当たり約５，０００個の、ｈＫＧＦに対するＫDが１００〜２００pMの特異的ｈＫＧＦ結合部位があることを示唆する。このＫDは、報告されているｈＫＧＦに対するＫD２００pMによく一致する（ミキ（Miki）ら，（１９９２）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０）。
ＰＣ−３原形質膜抽出物は、未変性ゲル電気泳動で、放射能標識ｈＫＧＦの電気泳動度（ゲルシフト）を変化させたことがわかった（図１１）。電気泳動度シフトゲルのために、約３×１０7のＰＣ−３細胞を静かに遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、次に、等量の溶解緩衝液（４０mMヘペス（ｐＨ７．４）、１５０mM  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２％トリトンＸ−１００、０．１％アジ化ナトリウム、３mM  ＭｇＣｌ2、３mM  ＥＧＴＡ、２μMアプロチニン、２μMロイペプチン（leupeptin）、２mM  ＰＭＳＦ、および４００μMオルソバナジン酸ナトリウムを含有する）と混合して溶解させた。氷上で１５分間インキュベート後、抽出物を１１，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離して破片を除去し、上清を一定量に分割し、−７０℃で保存した。ゲル解析のために、２５μlの結合反応物を、０．０１％ＨＳＡ中３μlの１０倍希釈ＰＣ−３膜抽出物を含有するＤＰＢＳ、０．０１％ＨＳＡ、２mM  ＭｇＣｌ2、および種々の濃度の125Ｉ標識ｈＫＧＦ中に入れた。室温で１０分間インキュベート後、６×の添加色素を加えて１×濃度を達成し、試料を５％または１０％の未変性のＴＢＥポリアクリルアミドゲルにのせた。ゲルを室温で１００ボルトであらかじめ流した。のせてから、ゲルを２００ボルトで５分間流し、次に１００ボルトで室温で３０〜６０分流した。次に、放射性バンドをオートラジオグラフィーで可視化した。放射能標識ｈＫＧＦのゲルシフトは、１００倍モル過剰の非標識ｈＫＧＦの存在下で観察され（図１１）、ＰＣ−３膜抽出物中に見いだされる成分とｈＫＧＦの間の特異的相互作用を示している。ゲルシフト実験から推定されるＫＤは約８nMである。
文献（ミキ（Miki）ら，Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８９：２４６−２５０）に報告された競合的実験に一致して、非標識ｈＫＧＦとｂＦＧＦならびに無関係の小さい塩基性タンパク質（すなわち、ライソザイム）を用いてゲルシフト競合曲線が得られた。表２１は、この実験で得られたＩＣ５０を示す。従来の報告に一致して、表２１に示すデータは、ｂＦＧＦは、ＰＣ−３原形質膜抽出物中に存在するｈＫＧＦ受容体への結合について、ｈＫＧＦより競合は約２０倍劣ることを示す。もう１つの陽性荷電したリソザイムは、ＰＣ−３膜抽出物：ｈＫＧＦ複合体に対して、ｈＫＧＦ単独より約１００倍劣る親和性で競合するため、ゲルシフトで観察される相互作用は、ＦＧＦについての特異的な相互作用であり、電荷−電荷相互作用によるものではないようである。
ＰＣ−３測定法で得られた種々のＲＮＡリガンドのＩＣ５０値を表１９に示す。これらのリガンドのサブセットをＮＩＨ３Ｔ３／ＦＧＦＲ−２で試験した。競合阻害定数（Ｋi）は、完全な競合曲線から求め、これを表２０に要約する。Ｋi値の決定に際して、３Ｔ３細胞は５００，０００結合部位／細胞を有し、ＰＣ−３細胞は５，０００結合部位／細胞を有すると仮定した。
データは、いくつかのｈＫＧＦリガンドが、その細胞表面受容体へのｈＫＧＦの結合を競合的に阻害することができることを示す。これらのリガンドのいくつか（例えば、Ｋ１４Ｆ）は、低nM範囲のＫiの強力な競合活性を有する。
この研究は、ｈＫＧＦの核酸競合物質が得られることを証明するばかりでなく、小分子、抗体およびペプチドなどのｈＫＧＦ競合物質をスクリーニングするための新しい測定法も同定する。この新しい測定法は、前立腺ガン細胞株（ＰＣ−３）を使用する。
２つの細胞株（ＰＣ−３とＮＩＨ３Ｔ３／ＦＧＦＲ−２）は、わずかに異なる結果を与える（表２０）。ＰＣ−３細胞へのＫＧＦの結合は、いくつかのリガンドおよびヘパリンによる阻害に対して感受性が高い。しかしランダムＲＮＡは、ＰＣ−３細胞上のＫＧＦ結合について有効に競合する。ＮＩＨ３Ｔ３／ＦＧＦＲ−２へのＫＧＦの結合は、いくつかのＲＮＡリガンドやヘパリンによる阻害に耐性である。これは、ＮＩＨ３Ｔ３／ＫＧＦＲ測定法が１μg/mlのヘパリンの存在下で行われるため、より厳密性であるためである。ＮＩＨ３Ｔ３／ＦＧＦＲ−２のランダムオリゴヌクレオチド競合曲線は、Ｋi＞１０-4Ｍで完全に平たんである。２つの２’−ＮＨ2リガンド（１４Ｎと２９Ｎ）のみが、ＰＣ−３細胞に良好な活性を示す（Ｋi値１．４nM）。これらの２つのリガンドから、１４ＮのみがＮＩＨ３Ｔ３／ＦＧＦＲ−２測定法で阻害活性を示し、Ｋi値１００nMを示す。これらのリガンドは、ＫＧＦの代わりにＥＧＦで誘導された細胞に非増殖活性を有するものではないため（データは示していない）、これらのリガンドによるＫＧＦ分裂促進活性の観察された阻害は、細胞株の増殖活性への非特異作用によるのではない。
この研究は、ｈＫＧＦの核酸競合物質が得られることを証明するばかりでなく、小分子、抗体およびペプチドなどのｈＫＧＦ競合物質をスクリーニングするための新しい測定法も同定する。この新しい測定法は、前立腺ガン細胞株（ＰＣ−３）を使用する。
例１９．ＫＧＦの分裂促進活性の阻害
ＫＧＦの生物学的作用の１つは、上皮細胞の増殖の刺激である（ルビン（Rubin）ら，（１９８９）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８６：８０２−８０６）。ＫＧＦのこの増殖作用は、ＫＧＦへの暴露後の応答細胞の［3Ｈ］チミジン取り込みの刺激により測定できる。これらのこのような細胞株はすでに記載されている（ルビン（Rubin）ら，（１９８９）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８６：８０２−８０６）。種々のリガンドの抗分裂促進活性を試験するために、２つの細胞株を使用した。１つは、サルの上皮の継代数の小さい細胞株である４ＭＢｒ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２０８）（カプト（Caputo）ら，（１９７９）In Vitro  １５：２２２−２２３）であり、他の１つは、形質転換されたラットケラチン細胞株であるＢａｌｂ／ＭＫである（ワイスマンとアアロンソン（Weissman and Aaronson）（１９８３）Cell  ３２：５９９−６０６）。３０ng/ml、ＥＧＦ、および１０％ＦＣＳを含有するＦ１２Ｋ中で増殖させた４ＭＢｒ−５細胞をトリプシン処理し、１０mMヘペス（ｐＨ７．４）、および１０％ＦＣＳを含有するＭ１９９に１．４×１０5細胞／mlで再懸濁した。９６マイクロタイタープレートに１００μlの細胞懸濁液を接種し、１０ng/ml（０．５nM）のＫＧＦを加え、種々の濃度（０〜１０００nMの範囲）のＫ１４Ｆを加えた。各インキュベート反応物を少なくとも三重測定でセットした。３７℃で２４時間インキュベート後、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンを１０nMの非標識チミジンとともに加えた。細胞をさらに２４時間インキュベートし、上清を吸引し、残存する細胞を、２０μlの０．２Ｎ  ＮａＯＨで溶解して採取した。［3Ｈ］チミジン取り込みの程度を、ＴＣＡ沈殿とＧＦＣフィルターディスク（ワットマン（Whattman），ヒルスボロ（Hillsboro），オレゴン州）を用いる濾過により測定した。
１０％ＦＣＳ（透析および熱不活性化）と５ng/ml  ｒｈＥＧＦを含有する低Ｃａ++ＥＭＥＭ中で増殖させたＢａｌｂ／ＭＫをトリプシン処理し、１％ＦＣＳ（透析および熱不活性化）と０．５ng/ml  ｒｈＥＧＦを含有する低Ｃａ++ＥＭＥＭ中に再懸濁し、１００μlの総容量中４〜６×１０4細胞／ウェルで、９６ウェルのフィブロネクチンコーティング培養プレートに広げた。一晩増殖後、培地をＦＣＳまたはｒｈＥＧＦを含まない低Ｃａ++ＥＭＥＭで置換し、血清を約３０時間欠乏させた。次にそれぞれ１６および４９nMのヒト組換えＫＧＦまたはｒｈＥＧＦを、種々の濃度の競合物質（０〜１０００nM）とともに加えた。一晩インキュベート後、［3Ｈ］チミジンを０.２μCi/ウェルで加えて、さらに７〜８時間インキュベートを続けた。［3Ｈ］チミジン取り込みの程度を、ＴＣＡ沈殿とＧＦＣフィルターディスクを用いる濾過により測定した。
オリゴヌクレオチドリガンドの阻害定数（Ｋi）を、既に記載されているように（ギル（Gill）ら，（１９９１）J. Mol. Biol. ２２０：３０７−３２４）非線形回帰解析解析により求めた。
２つの測定法はわずかに異なる結果を与えた。４ＭＢｒ−５測定法は胎児牛血清の存在下で行い、Ｂａｌｂ／ＭＫは血清欠乏後に行った。Ｂａｌｂ／ＭＫ測定法はより高感度であり、ＫＧＦ誘導性分裂促進活性の原型的測定法である。ＰＣ−３細胞で得られる結果と同様に、４ＭＢｒ−５測定法はリガンド１４Ｆについて良好な活性を示した（Ｋi値９．８nM、しかし不完全な阻害）。同じ測定法において、ランダムオリゴヌクレオチドは、Ｋi値＞１μMを示し、中和性モノクローナル抗体はＫi値２．９nMを示した。リガンド１４Ｆは中和性モノクローナル抗体より良好またははるかに良好なようであり、リガンド１４Ｎは約２０〜４０％でプラトーになり、これはこれらの抗体がＫＧＦ分裂促進活性を完全には除去しないことを示唆している。モノクローナル抗体に対して、リガンド１４Ｆは、４ＭＢｒ−５細胞に及ぼすＫＧＦ分裂促進活性を完全に阻止する。Ｂａｌｂ／ＭＫ測定法では、１４ＮはＫi値１０nM（不完全な阻害）を示し、ランダムオリゴヌクレオチドはＫi値約３００nMを示した。６Ｆと１４Ｆに対するＫi値は、それぞれ８３０および９２pMである。４ＭＢｒ−５測定法と同様に、リガンド１４Ｆは、Ｋi値９８０pMを示す中和性モノクローナル抗体より良いということはなくても同程度に良好なようである。最良の阻害活性は、Ｋi値３４pMを有する１４Ｆ３’Ｔで観察された。
例２０
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に結合する核酸リガンドが、すでに米国特許第５，４５９，０１５号（米国特許第５，２７０，１６３号およびツエルクとゴールド（Tuerk and Gold）（１９９０）Science ２４９：５０５−５１０も参照）に記載のようにセレックス法で得られている。配列５’−ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＵＡＡＣＧＣＵＣＡＡＧＵＡＧＡＣＵＡＡＵＧＵＧＵＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＵＧＧＵＵＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＵＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣ（配列番号２６５）を有する２１Ａと呼ぶ２’−ＮＨ2修飾核酸リガンドを、欠失解析により、ｂＦＧＦへの高親和性結合に必要な最小配列情報について調べた。この解析により、端を切り取ったリガンド２１Ａ−ｔ（ＧＧＵＧＵＧＵＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＵＧＧｕｕｃ（配列番号２６６）、ここで下線を引いたＧは、転写効率を改善するために加えたグアニンであり、小文字は定常領域からのものである）が得られた。
ヌクレアーゼによる分解に対するリガンド２１Ａ−ｔの安定性を上昇させるために、短いホスホラミダイトキャップを５’末端と３’末端に付加した。さらに、グリーン（Green）ら，（１９９５）Chem. Biol. ２：６８３−６９５に記載の方法を使用して、ｂＦＧＦに対する結合親和性を失うことなく２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチルプリンで置換できる９つのリボプリン位置を同定し、ＮＸ−２８６（５’−ＴｓＴｓＴｓＴｓ  ｍＧｍＧａＵ  ｒＧａＵｒＧ  ａＵｒＧｒＧ  ｍＡｒＡｒＧ  ｍＡａＣｒＡ  ｒＧａＣｍＧ  ｍＧｍＧａＵ  ｍＧｍＧａＵ  ａＵａＣ  ＴｓＴｓＴｓＴｓＴ−３’（配列番号２６７）、ここで、ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ａＵとａＣはそれぞれ２’−デオキシ−２’−Ｏ−アミノシチジンと２’−デオキシ−２’−Ｏ−アミノシチジンであり、ｍＡとｍＧはそれぞれ２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチルアデノシンとグアノシン残基であり、ｒＡとｒＧはアデノシンとグアノシン残基であり、Ｔは２’−デオキシチミジンである）と呼ぶリガンドが得られた。この修飾核酸リガンドは、電気泳動度シフト測定法により、Ｋｄ  ０．４nMを有していた。
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配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：  ラリー・ゴールド（LARRY GOLD）；ネボジャ・ジャンジック（NEBOJSA JANJIC）；スティーブン・リングキスト（STEVEN RINGQUIST）；ニコス・パグラティス（NIKOS PAGRATIS）；ペネロピ・ジェイ・トゥースマン（PENELOPE J. TOOTHMAN）
（ii）発明の名称：トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびヒトケラチン細胞増殖因子（ｈＫＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド
（iii）配列の数：３０４
（iv）連絡住所：
（Ａ）宛名：スワンソンおよびプラットシュン、エルエルシー（Swanson & Bratschun, L.L.C.）
（Ｂ）通り：８４００東、プレンティス・アベニュー、スイート２００（８４００ E. Prentice Avenue, Suite  ２００）
（Ｃ）市：イングルウッド（Englewood）
（Ｄ）州：コロラド
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：８０１１１
（ｖ）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：ディスケット、３．５インチ、容量１．４４Mb
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト６．１（WordPerfect ６．１）
（vi）現行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ９６／
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／４５８，４２３
（Ｂ）出願日：１９９５年６月２日
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／４５８，４２４
（Ｂ）出願日：１９９５年６月２日
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／４６５，５９４
（Ｂ）出願日：１９９５年６月５日
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／４６５，５９１
（Ｂ）出願日：１９９５年６月５日
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／４７９，７２５
（Ｂ）出願日：１９９５年６月７日
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／４７９，７８３
（Ｂ）出願日：１９９５年６月７日
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号：０８／６１８，６９３
（Ｂ）出願日：１９９５年３月２０日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：バリー・ジェイ・スワンソン（Barry J. Swanson）
（Ｂ）登録番号：３３，２１５
（Ｃ）参照／整理番号：
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話：（３０３）７９３−３３３３
（Ｂ）ファックス：（３０３）７９３−３４３３
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１：
0004531132.tif 000031
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：２：
0004531132.tif 000032
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：３：
0004531132.tif 000033
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４：
0004531132.tif 000034
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５：
0004531132.tif 000035
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６：
0004531132.tif 000036
（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７：
0004531132.tif 000037
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８：
0004531132.tif 000038
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９：
0004531132.tif 000039
（２）配列番号：１０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：５０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０：
0004531132.tif 000040
（２）配列番号：１１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１：
0004531132.tif 000041
（２）配列番号：１２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：１２：
0004531132.tif 000042
（２）配列番号：１３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３：
0004531132.tif 000043
（２）配列番号：１４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４：
0004531132.tif 000044
（２）配列番号：１５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−アミノ（２’ＮＨ2）修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５：
0004531132.tif 000045
（２）配列番号：１６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１６：
0004531132.tif 000046
（２）配列番号：１７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−アミノ（２’ＮＨ2）修飾されている
（xi）配列：配列番号：１７：
0004531132.tif 000047
（２）配列番号：１８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−アミノ（２’ＮＨ2）修飾されている
（xi）配列：配列番号：１８：
0004531132.tif 000048
（２）配列番号：１９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−アミノ（２’ＮＨ2）修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９：
0004531132.tif 000049
（２）配列番号：２０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：２０：
0004531132.tif 000050
（２）配列番号：２１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１：
0004531132.tif 000051
（２）配列番号：２２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２：
0004531132.tif 000052
（２）配列番号：２３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’−Ｆウラシルである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’ＮＨ2シトシンである
（xi）配列：配列番号：２３：
0004531132.tif 000053
（２）配列番号：２４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’−Ｆウラシルである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’ＮＨ2シトシンである
（xi）配列：配列番号：２４：
0004531132.tif 000054
（２）配列番号：２５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５：
0004531132.tif 000055
（２）配列番号：２６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：２６：
0004531132.tif 000056
（２）配列番号：２７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−アミノ（２’ＮＨ2）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７：
0004531132.tif 000057
（２）配列番号：２８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−アミノ（２’ＮＨ2）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８：
0004531132.tif 000058
（２）配列番号：２９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１０８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９：
0004531132.tif 000059
（２）配列番号：３０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３０：
0004531132.tif 000060
（２）配列番号：３１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：６９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−アミノ（２’ＮＨ2）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３１：
0004531132.tif 000061
（２）配列番号：３２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３２：
0004531132.tif 000062
（２）配列番号：３３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３３：
0004531132.tif 000063
（２）配列番号：３４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３４：
0004531132.tif 000064
（２）配列番号：３５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’−Ｆウラシルである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’ＮＨ2シトシンである
（xi）配列：配列番号：３５：
0004531132.tif 000065
（２）配列番号：３６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’−Ｆウラシルである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’ＮＨ2シトシンである
（xi）配列：配列番号：３６：
0004531132.tif 000066
（２）配列番号：３７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’−Ｆウラシルである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’ＮＨ2シトシンである
（xi）配列：配列番号：３７：
0004531132.tif 000067
（２）配列番号：３８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’−Ｆウラシルである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’ＮＨ2シトシンである
（xi）配列：配列番号：３８：
0004531132.tif 000068
（２）配列番号：３９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３９：
0004531132.tif 000069
（２）配列番号：４０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：４０：
0004531132.tif 000070
（２）配列番号：４１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：４１：
0004531132.tif 000071
（２）配列番号：４２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：４２：
0004531132.tif 000072
（２）配列番号：４３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４３：
0004531132.tif 000073
（２）配列番号：４４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４４：
0004531132.tif 000074
（２）配列番号：４５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４５：
0004531132.tif 000075
（２）配列番号：４６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４６：
0004531132.tif 000076
（２）配列番号：４７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４７：
0004531132.tif 000077
（２）配列番号：４８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１−３位のＮはビオチンである
（xi）配列：配列番号：４８：
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（２）配列番号：４９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：４９：
0004531132.tif 000079
（２）配列番号：５０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５０：
0004531132.tif 000080
（２）配列番号：５１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５１：
0004531132.tif 000081
（２）配列番号：５２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５２：
0004531132.tif 000082
（２）配列番号：５３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５３：
0004531132.tif 000083
（２）配列番号：５４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１−３位のＮはビオチンである
（xi）配列：配列番号：５４：
0004531132.tif 000084
（２）配列番号：５５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５５：
0004531132.tif 000085
（２）配列番号：５６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５６：
0004531132.tif 000086
（２）配列番号：５７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５７：
0004531132.tif 000087
（２）配列番号：５８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５８：
0004531132.tif 000088
（２）配列番号：５９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：５９：
0004531132.tif 000089
（２）配列番号：６０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６０：
0004531132.tif 000090
（２）配列番号：６１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６１：
0004531132.tif 000091
（２）配列番号：６２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６２：
0004531132.tif 000092
（２）配列番号：６３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６３：
0004531132.tif 000093
（２）配列番号：６４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６４：
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（２）配列番号：６５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６５：
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（２）配列番号：６６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６６：
0004531132.tif 000096
（２）配列番号：６７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６７：
0004531132.tif 000097
（２）配列番号：６８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６８：
0004531132.tif 000098
（２）配列番号：６９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：６９：
0004531132.tif 000099
（２）配列番号：７０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７０：
0004531132.tif 000100
（２）配列番号：７１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７１：
0004531132.tif 000101
（２）配列番号：７２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７２：
0004531132.tif 000102
（２）配列番号：７３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７３：
0004531132.tif 000103
（２）配列番号：７４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７４：
0004531132.tif 000104
（２）配列番号：７５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７５：
0004531132.tif 000105
（２）配列番号：７６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７６：
0004531132.tif 000106
（２）配列番号：７７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７７：
0004531132.tif 000107
（２）配列番号：７８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７８：
0004531132.tif 000108
（２）配列番号：７９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：７９：
0004531132.tif 000109
（２）配列番号：８０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８０：
0004531132.tif 000110
（２）配列番号：８１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８１：
0004531132.tif 000111
（２）配列番号：８２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８２：
0004531132.tif 000112
（２）配列番号：８３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：６７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８３：
0004531132.tif 000113
（２）配列番号：８４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８４：
0004531132.tif 000114
（２）配列番号：８５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８５：
0004531132.tif 000115
（２）配列番号：８６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８６：
0004531132.tif 000116
（２）配列番号：８７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８７：
0004531132.tif 000117
（２）配列番号：８８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８８：
0004531132.tif 000118
（２）配列番号：８９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：８９：
0004531132.tif 000119
（２）配列番号：９０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９０：
0004531132.tif 000120
（２）配列番号：９１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１−３位のＮはビオチンである
（xi）配列：配列番号：９１：
0004531132.tif 000121
（２）配列番号：９２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９２：
0004531132.tif 000122
（２）配列番号：９３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９３：
0004531132.tif 000123
（２）配列番号：９４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９４：
0004531132.tif 000124
（２）配列番号：９５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９５：
0004531132.tif 000125
（２）配列番号：９６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９６：
0004531132.tif 000126
（２）配列番号：９７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９７：
0004531132.tif 000127
（２）配列番号：９８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９８：
0004531132.tif 000128
（２）配列番号：９９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：９９：
0004531132.tif 000129
（２）配列番号：１００の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１００：
0004531132.tif 000130
（２）配列番号：１０１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０１：
0004531132.tif 000131
（２）配列番号：１０２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０２：
0004531132.tif 000132
（２）配列番号：１０３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０３：
0004531132.tif 000133
（２）配列番号：１０４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０４：
0004531132.tif 000134
（２）配列番号：１０５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０５：
0004531132.tif 000135
（２）配列番号：１０６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０６：
0004531132.tif 000136
（２）配列番号：１０７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０７：
0004531132.tif 000137
（２）配列番号：１０８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０８：
0004531132.tif 000138
（２）配列番号：１０９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１０９：
0004531132.tif 000139
（２）配列番号：１１０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１０：
0004531132.tif 000140
（２）配列番号：１１１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１１：
0004531132.tif 000141
（２）配列番号：１１２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１２：
0004531132.tif 000142
（２）配列番号：１１３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１３：
0004531132.tif 000143
（２）配列番号：１１４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１４：
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（２）配列番号：１１５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１５：
0004531132.tif 000145
（２）配列番号：１１６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１６：
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（２）配列番号：１１７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１７：
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（２）配列番号：１１８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
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（２）配列番号：１１９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１１９：
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（２）配列番号：１２０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２０：
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（２）配列番号：１２１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２１：
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（２）配列番号：１２２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２２：
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（２）配列番号：１２３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２３：
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（２）配列番号：１２４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２４：
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（２）配列番号：１２５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２５：
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（２）配列番号：１２６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２６：
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（２）配列番号：１２７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１２７：
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（２）配列番号：１２８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１２８：
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（２）配列番号：１２９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１２９：
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（２）配列番号：１３０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３０：
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（２）配列番号：１３１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３１：
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（２）配列番号：１３２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３２：
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（２）配列番号：１３３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３３：
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（２）配列番号：１３４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３４：
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（２）配列番号：１３５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３５：
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（２）配列番号：１３６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３６：
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（２）配列番号：１３７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３７：
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（２）配列番号：１３８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３８：
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（２）配列番号：１３９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１３９：
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（２）配列番号：１４０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４０：
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（２）配列番号：１４１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４１：
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（２）配列番号：１４２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４２：
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（２）配列番号：１４３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４３：
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（２）配列番号：１４４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４４：
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（２）配列番号：１４５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４５：
0004531132.tif 000175
（２）配列番号：１４６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４６：
0004531132.tif 000176
（２）配列番号：１４７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４７：
0004531132.tif 000177
（２）配列番号：１４８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４８：
0004531132.tif 000178
（２）配列番号：１４９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１４９：
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（２）配列番号：１５０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５０：
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（２）配列番号：１５１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５１：
0004531132.tif 000181
（２）配列番号：１５２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５２：
0004531132.tif 000182
（２）配列番号：１５３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５３：
0004531132.tif 000183
（２）配列番号：１５４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５４：
0004531132.tif 000184
（２）配列番号：１５５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５５：
0004531132.tif 000185
（２）配列番号：１５６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５６：
0004531132.tif 000186
（２）配列番号：１５７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５７：
0004531132.tif 000187
（２）配列番号：１５８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５８：
0004531132.tif 000188
（２）配列番号：１５９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１５９：
0004531132.tif 000189
（２）配列番号：１６０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６０：
0004531132.tif 000190
（２）配列番号：１６１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６１：
0004531132.tif 000191
（２）配列番号：１６２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６２：
0004531132.tif 000192
（２）配列番号：１６３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６３：
0004531132.tif 000193
（２）配列番号：１６４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６４：
0004531132.tif 000194
（２）配列番号：１６５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６５：
0004531132.tif 000195
（２）配列番号：１６６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６６：
0004531132.tif 000196
（２）配列番号：１６７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６７：
0004531132.tif 000197
（２）配列番号：１６８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６８：
0004531132.tif 000198
（２）配列番号：１６９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１６９：
0004531132.tif 000199
（２）配列番号：１７０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−Ｆ修飾されている
（xi）配列：配列番号：１７０：
0004531132.tif 000200
（２）配列番号：１７１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１位および２３位のＮは相互に塩基対を形成し、１−４塩基対の長さであってよい
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：５位および１０位のＮは任意の塩基対である
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：６位および９位のＮは任意の塩基対である
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：７位および８位のＮは任意の塩基対である
（xi）配列：配列番号：１７１：
0004531132.tif 000201
（２）配列番号：１７２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：ヌクレオチド３８は逆向きＴ（３’−３’結合）である
（xi）配列：配列番号：１７２：
0004531132.tif 000202
（２）配列番号：１７３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：ヌクレオチド４０は逆向きＴ（３’−３’結合）である
（xi）配列：配列番号：１７３：
0004531132.tif 000203
（２）配列番号：１７４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：ヌクレオチド４５は逆向きＴ（３’−３’結合）である
（xi）配列：配列番号：１７４：
0004531132.tif 000204
（２）配列番号：１７５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：８、１１、２５および２６位のＣは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：９、１０、１７、１９および３５位のＧは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１２、２４および２７位のＡは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：３４位のＵは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：６位および２２位のＵは２’−フルオロ−２’−デオキシウリジンである（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２３、３２および３３位のＣは２’−フルオロ−２’−デオキシシチジンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：ヌクレオチド３６は逆向きＴ（３’−３’結合）である
（xi）配列：配列番号：１７５：
0004531132.tif 000205
（２）配列番号：１７６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：８位のＣは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：９、１７、および３１位のＧは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２２位のＡは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデニンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：３０位のＵは２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：６位および２０位のＵは２’−フルオロ−２’−デオキシウリジンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２１、２８および２９位のＣは２’−フルオロ−２’−デオキシシチジンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１０位および２３位のＮはペンタエチレングリコールホスホルアミダイトスペーサーである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：ヌクレオチド３２は逆向きＴ（３’−３’結合）である
（xi）配列：配列番号：１７６：
0004531132.tif 000206
（２）配列番号：１７７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：ヌクレオチド３９は逆向きＴ（３’−３’結合）である
（xi）配列：配列番号：１７７：
0004531132.tif 000207
（２）配列番号：１７８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１３、１４、１６および１７位のＴはＩｄＵで置換されている
（xi）配列：配列番号：１７８：
0004531132.tif 000208
（２）配列番号：１７９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２０位のＴはＩｄＵで置換されている
（xi）配列：配列番号：１７９：
0004531132.tif 000209
（２）配列番号：１８０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２３位のＴはＩｄＵで置換されている
（xi）配列：配列番号：１８０：
0004531132.tif 000210
（２）配列番号：１８１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２４位のＴはＩｄＵで置換されている
（xi）配列：配列番号：１８１：
0004531132.tif 000211
（２）配列番号：１８２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２７位のＴはＩｄＵで置換されている
（xi）配列：配列番号：１８２：
0004531132.tif 000212
（２）配列番号：１８３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：２８−３０位のＴはＩｄＵで置換されている
（xi）配列：配列番号：１８３：
0004531132.tif 000213
（２）配列番号：１８４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：３３位のＴはＩｄＵで置換されている
（xi）配列：配列番号：１８４：
0004531132.tif 000214
（２）配列番号：１８５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：５位のＸａａは同定できなかった修飾アミノ酸である
（xi）配列：配列番号：１８５：
0004531132.tif 000215
（２）配列番号：１８６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１８６：
0004531132.tif 000216
（２）配列番号：１８７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１８７：
0004531132.tif 000217
（２）配列番号：１８８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（xi）配列：配列番号：１８８：
0004531132.tif 000218
（２）配列番号：１８９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１８９：
0004531132.tif 000219
（２）配列番号：１９０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９０：
0004531132.tif 000220
（２）配列番号：１９１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９１：
0004531132.tif 000221
（２）配列番号：１９２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９２：
0004531132.tif 000222
（２）配列番号：１９３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９３：
0004531132.tif 000223
（２）配列番号：１９４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９４：
0004531132.tif 000224
（２）配列番号：１９５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９５：
0004531132.tif 000225
（２）配列番号：１９６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９６：
0004531132.tif 000226
（２）配列番号：１９７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９７：
0004531132.tif 000227
（２）配列番号：１９８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９８：
0004531132.tif 000228
（２）配列番号：１９９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：１９９：
0004531132.tif 000229
（２）配列番号：２００の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２００：
0004531132.tif 000230
（２）配列番号：２０１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０１：
0004531132.tif 000231
（２）配列番号：２０２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０２：
0004531132.tif 000232
（２）配列番号：２０３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０３：
0004531132.tif 000233
（２）配列番号：２０４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０４：
0004531132.tif 000234
（２）配列番号：２０５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０５：
0004531132.tif 000235
（２）配列番号：２０６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０６：
0004531132.tif 000236
（２）配列番号：２０７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０７：
0004531132.tif 000237
（２）配列番号：２０８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：６９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０８：
0004531132.tif 000238
（２）配列番号：２０９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２０９：
0004531132.tif 000239
（２）配列番号：２１０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１０：
0004531132.tif 000240
（２）配列番号：２１１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１１：
0004531132.tif 000241
（２）配列番号：２１２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１２：
0004531132.tif 000242
（２）配列番号：２１３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：８２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１３：
0004531132.tif 000243
（２）配列番号：２１４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１４：
0004531132.tif 000244
（２）配列番号：２１５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：５３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１５：
0004531132.tif 000245
（２）配列番号：２１６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１６：
0004531132.tif 000246
（２）配列番号：２１７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１７：
0004531132.tif 000247
（２）配列番号：２１８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１８：
0004531132.tif 000248
（２）配列番号：２１９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２１９：
0004531132.tif 000249
（２）配列番号：２２０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２０：
0004531132.tif 000250
（２）配列番号：２２１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２１：
0004531132.tif 000251
（２）配列番号：２２２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２２：
0004531132.tif 000252
（２）配列番号：２２３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２３：
0004531132.tif 000253
（２）配列番号：２２４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２４：
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（２）配列番号：２２５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２５：
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（２）配列番号：２２６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２６：
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（２）配列番号：２２７の情報：
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（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２７：
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（２）配列番号：２２８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（２）配列番号：２２９の情報：
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（Ａ）長さ：７２塩基対
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（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２２９：
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（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
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（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（Ａ）長さ：７０塩基対
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（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２３１：
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
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（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
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（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２３６：
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（２）配列番号：２３８の情報：
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（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２３８：
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（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
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（２）配列番号：２４１の情報：
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（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４１：
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（２）配列番号：２４２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４２：
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（２）配列番号：２４３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４３：
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（２）配列番号：２４４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４４：
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（２）配列番号：２４５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４５：
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（２）配列番号：２４６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４６：
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（２）配列番号：２４７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４７：
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（２）配列番号：２４８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４８：
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（２）配列番号：２４９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２４９：
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（２）配列番号：２５０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５０：
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（２）配列番号：２５１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５１：
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（２）配列番号：２５２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５２：
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（２）配列番号：２５３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５３：
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（２）配列番号：２５４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：６９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５４：
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（２）配列番号：２５５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５５：
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（２）配列番号：２５６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５６：
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（２）配列番号：２５７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５７：
0004531132.tif 000287
（２）配列番号：２５８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５８：
0004531132.tif 000288
（２）配列番号：２５９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２５９：
0004531132.tif 000289
（２）配列番号：２６０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２６０：
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（２）配列番号：２６１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２６１：
0004531132.tif 000291
（２）配列番号：２６２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２６２：
0004531132.tif 000292
（２）配列番号：２６３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２６３：
0004531132.tif 000293
（２）配列番号：２６４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２６４：
0004531132.tif 000294
（２）配列番号：２６５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：７６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’−ＮＨ2  ２  シトシンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’ＮＨ2  ２  ウラシルである
（xi）配列：配列番号：２６５：
0004531132.tif 000295
（２）配列番号：２６６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＣは２’−ＮＨ2  ２  シトシンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵは２’ＮＨ2  ２  ウラシルである
（xi）配列：配列番号：２６６：
0004531132.tif 000296
（２）配列番号：２６７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのＵおよびＣは２’−デオキシ−２’−アミノウリジンおよび２’−デオキシ−アミノシチジン残基である
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１４位および１７位のＡは２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチルアデノシンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：５、６、２２、２３、２４、２６および２７位のＧは２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチルグアノシンである
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：１−４位および３１−３５位のＴは２’−デオキシチミジンである
（xi）配列：配列番号：２６７：
0004531132.tif 000297
（２）配列番号：２６８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２６８：
0004531132.tif 000298
（２）配列番号：２６９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２６９：
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（２）配列番号：２７０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７０：
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（２）配列番号：２７１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−ＮＨ2修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７１：
0004531132.tif 000301
（２）配列番号：２７２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７２：
0004531132.tif 000302
（２）配列番号：２７３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７３：
0004531132.tif 000303
（２）配列番号：２７４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７４：
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（２）配列番号：２７５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７５：
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（２）配列番号：２７６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７６：
0004531132.tif 000306
（２）配列番号：２７７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７７：
0004531132.tif 000307
（２）配列番号：２７８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７８：
0004531132.tif 000308
（２）配列番号：２７９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２７９：
0004531132.tif 000309
（２）配列番号：２８０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８０：
0004531132.tif 000310
（２）配列番号：２８１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８１：
0004531132.tif 000311
（２）配列番号：２８２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８２：
0004531132.tif 000312
（２）配列番号：２８３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８３：
0004531132.tif 000313
（２）配列番号：２８４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８４：
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（２）配列番号：２８５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８５：
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（２）配列番号：２８６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８６：
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（２）配列番号：２８７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８７：
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（２）配列番号：２８８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８８：
0004531132.tif 000318
（２）配列番号：２８９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２８９：
0004531132.tif 000319
（２）配列番号：２９０の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９０：
0004531132.tif 000320
（２）配列番号：２９１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９１：
0004531132.tif 000321
（２）配列番号：２９２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９２：
0004531132.tif 000322
（２）配列番号：２９３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９３：
0004531132.tif 000323
（２）配列番号：２９４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９４：
0004531132.tif 000324
（２）配列番号：２９５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９５：
0004531132.tif 000325
（２）配列番号：２９６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９６：
0004531132.tif 000326
（２）配列番号：２９７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９７：
0004531132.tif 000327
（２）配列番号：２９８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９８：
0004531132.tif 000328
（２）配列番号：２９９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：１２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：２９９：
0004531132.tif 000329
（２）配列番号：３００の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３００：
0004531132.tif 000330
（２）配列番号：３０１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３０１：
0004531132.tif 000331
（２）配列番号：３０２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３０２：
0004531132.tif 000332
（２）配列番号：３０３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３０３：
0004531132.tif 000333
（２）配列番号：３０４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ：４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ｄ）他の情報：全てのピリミジンは２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾されている
（xi）配列：配列番号：３０４：
0004531132.tif 000334
【図１】
0004531132.tif 000338
【図２】
0004531132.tif 000339
【図３】
0004531132.tif 000340
【図４】
0004531132.tif 000341
【図５Ａ】
0004531132.tif 000342
【図５Ｂ】
0004531132.tif 000343
【図５Ｃ】
0004531132.tif 000344
【図６】
0004531132.tif 000345
【図７】
0004531132.tif 000346
【図８】
0004531132.tif 000347
【図９】
0004531132.tif 000348
【図１０Ａ】
0004531132.tif 000349
【図１０Ｂ】
0004531132.tif 000350
【図１１】
0004531132.tif 000351
【図１２Ａ】
0004531132.tif 000352
【図１２Ｂ】
0004531132.tif 000353
【図１２Ｃ】
0004531132.tif 000354
【図１２Ｄ】
0004531132.tif 000355
【図１３】
0004531132.tif 000356