(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）一端又は両端にホモポリマー部を有する2本鎖DNAを調製する工程、但し、前記ホモポリマー部はホモポリマー及び非ホモポリマーからなり、前記非ホモポリマーの少なくとも一部がクラスIIＳ制限酵素認識部位である、及び
（ｂ）前記ホモポリマー部を有する2本鎖DNAに、前記クラスIIＳ制限酵素認識部位を認識するクラスIIＳ制限酵素を作用させて、非ホモポリマーの少なくとも一部が前記クラスIIＳ制限酵素認識部位である前記ホモポリマー部の一部又は全部を除切する工程、
を含む方法で調製された2本鎖DNAの一方又は両方を鋳型とし、かつポリメラーゼを用いて塩基配列の決定を行うことを特徴とする塩基配列の決定方法。
【請求項２】
2本鎖DNAが2本鎖ｃDNAである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
2本鎖DNAが人為的に改変された2本鎖ｃDNA又は化学合成された2本鎖DNAである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
2本鎖DNAのホモポリマー部が有するホモポリマーが、オリゴdG:dC対又はオリゴdA:dT対である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
クラスIIＳ制限酵素がAlwI、AlwXI、Alw26I、BbsI、BbvI、BbvII、BcefI、BccI、BcgI、BciVI、BinI、BmrI、BpmI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BspMI、BsrDI、BstF5I、EarI、Eco31I、Eco57I、Esp3I、FauI、FokI、GsuI、HgaI、HinGUII、HphI、Ksp632I、MboII、MmeI、Mn1I、NgoVIII、PleI、RleAI、SapI、SfaNI、TaqII、Tth111II、BsmI、BsrI、BsmFI及びBseMIIからなる群から選ばれる少なくとも１種の制限酵素である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
2本鎖DNAのホモポリマー部を除く部分の片鎖の一部に化学修飾を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
化学修飾がメチル基である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
化学修飾がシトシン又はアデニンに導入されている請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記制限酵素が、認識部位又は切断部位に化学修飾を有する2本鎖DNAには作用しない制限酵素である請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記制限酵素が、化学修飾としてメチル基を有する2本鎖DNAの部位に対しては作用しない制限酵素である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記制限酵素が、BbvI、HgaI又はGsuIである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記除切により調製された2本鎖DNAをPCR法により又は微生物を用いた増幅により行った後に、塩基配列の決定を行う請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
調製された2本鎖が、オリゴdG:dCの一部または全部を除切したものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
塩基配列の決定が、2本鎖DNAの核酸転写物を、核酸転写のターミネーターの存在下、形成し、得られた核酸転写物を解析することにより行われる請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸転写をRNAポリメラーゼを用いて行う請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、末端にホモポリマー部を有する2本鎖DNAから、前記ホモポリマー部の一部又は全部を除去した2本鎖DNAの調製方法及びこの方法で得られた2本鎖DNAを用いた塩基配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
塩基配列決定法は、全長鎖cDNAライブラリーの作成とともに機能ユニットとしての遺伝子転写物の解析法として、医学生物学分野における必須の技術である。ヒトやマウスでは10万種類ともいわれるcDNAクローンを得て、そのゲノム上の位置を特定することは、遺伝子の特定や機能を解析するのに大変重要である。
【０００３】
cDNAライブラリーの作成法にはいくつかの方法が提案されているが、本発明者らは、完全長cDNAの合成効率の高い方法として以下の方法を提案し、かつ実用に向けてさらに研究を進めている。
この方法では、ポリ(A)RNAをテンプレート、特定の制限酵素部位を5'側にかつアンカー部位を3'側にもつオリゴdTをプライマーとして第1鎖cDNAを合成し、得られた第１鎖cDNA 3'末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼのような酵素を用いてオリゴdGを付加する。次に5'側に制限酵素部位をもつオリゴdCをプライマーとして第2鎖cDNA合成を行い、cDNAの両端に存在する制限酵素部位を利用してベクターに導入する。ここで、第１鎖cDNA合成に基質としてdCTPの代わりにメチル化dCTPを使用し、かつ制限酵素としてヘミメチレーション感受性の制限酵素を用いることにより、cDNAの両端の制限酵素部位のみが切断されるように工夫がされている。このような方法で全長鎖cDNAライブラリーを作成する方法は、WO98/20122やCarninci, P. et al. Genomics 37 (1996) 327-336、Carninci, P. et al. DNA Res. 4 (1997) 61-66などに詳細が記述されており、実際に膨大な数の全長鎖cDNAクローンが得られている。また得られた全長鎖cDNAクローンについては塩基配列についての解析が進められている。このような作業を進めることによって、cDNAのゲノム上での位置が特定されるのである。
【０００４】
しかし、上記方法により得られたcDNAライブラリーの両末端にはオリゴdA:dT及びオリゴdG:dCのホモポリマーが存在する。つまり、制限酵素でベクターから切り出された2本鎖cDNAの両端のうち一方にはオリゴdA:dTが存在し、他方にはオリゴdG:dC（通常１１〜１６塩基対）が存在する。オリゴdA:dTは、mRNAが本来有するポリA鎖に由来するものであり、一方のオリゴdG:dCは、2本鎖DNAを作製する際にプライマーを付着させるサイトとして導入されたdGテイリングに由来するものである。
【０００５】
ところが、この2本鎖cDNAを鋳型としてシークエンシングし、その塩基配列を決定する場合、上記ホモポリマー部が配列決定法において障害となることが判明した。2本鎖cDNAを鋳型とするシークエンシング法には、サンガー法を利用したDNAポリメラーゼを用いるダイデオキシ法と、本発明者らが開発したRNAポリメラーゼを用いる転写シークエンス法とがあるが、いずれの方法も、ポリメラーゼによる鎖の伸長を停止させるターミネーターの存在下で得られる反応生成物のターミナル部の塩基と鎖の長さとから、塩基配列を決定するものである。
【０００６】
ところが、その原因は必ずしも定かではないが、2本鎖cDNAの末端にホモポリマー部があると、シークエンシングの結果、配列が読み取りにくいという問題がある。さらに、2本鎖cDNAをシークエンシング前にＰＣＲ法で増幅すると、ポリメラーゼがこのホモポリマー部の鎖長（繰り返し塩基数）を間違えて合成してしまい、本来長さが同一であるべき、ある塩基をターミナル部として有するフラグメントの鎖長が異なってしまい、ある特定の長さのフラグメントに末端の塩基が異なる複数のフラグメントが含まれるという結果となり、シークエンシング不能となってしまうことがある。特に、少なくとも一方にオリゴdG:dCをその末端に持つ2本鎖cDNAを鋳型とする場合にこの傾向が強い。
【０００７】
上記問題は、DNAの塩基配列決定法においてきわめて憂慮すべき問題であることが分かってきた。更に、上記障害のため、cDNAライブラリーの膨大な数にのぼるクローンについて、効率よく、迅速に、正確に塩基配列を決定することが難しく、全長鎖cDNAライブラリーにおいて各々の遺伝子がゲノムのどこに位置しているかを特定することも困難となる。
上記問題は、例えば、オリゴdA:dT及びオリゴdG:dCの鎖長を短くすることである程度は軽減できるが、実際の反応において、オリゴdA:dT及びオリゴdG:dCの鎖長を短くすることは、容易ではない。オリゴdA:dTは前述のように mRNAが本来有するポリA鎖に由来するものであるが、転写反応の際に使用するプライマー中のオリゴdTを短くすることで、理論的にはオリゴdA:dTを短くできる。しかし、プライマー中のオリゴdTが短いと転写産物の収率が低下するという問題があり、実用的ではない。また、オリゴdG:dCは、前述のように、2本鎖DNAを作製する際にプライマーを付着させるサイトとして導入されたdGテイリングに由来するものであり、dGテイリングを短くすることで、オリゴdG:dCを短縮できる。しかし、dGテイリングを所望の鎖長に調整することも現実には困難である。
【０００８】
【発明が解決しょうとする課題】
そこで本発明の目的は、塩基配列決定に際して障害となる、2本鎖DNA末端に存在するホモポリマー部の一部又は全部を選択的に除切した2本鎖cDNAを調製する方法を提供することにある。
さらに本発明の目的は、上記方法により得られる、末端に存在するホモポリマー部の一部又は全部を除切した2本鎖DNAを鋳型として用いた塩基配列の決定方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一端又は両端にホモポリマー部を有する2本鎖DNAに、認識部位の外に切断部位を有する制限酵素を作用させて、少なくとも一方の前記ホモポリマー部の一部又は全部を除切することを特徴とする2本鎖DNAの調製方法に関する。
さらに本発明は、2本鎖DNAの一方又は両方を鋳型として、この2本鎖DNAの塩基配列を決定する方法であって、前記鋳型となる2本鎖DNAが、上記本発明の方法により調製した2本鎖DNAであることを特徴とする塩基配列の決定方法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の2本鎖DNAの調製方法は、一端又は両端にホモポリマー部を有する2本鎖DNAに、認識部位の外に切断部位を有する制限酵素を作用させて、少なくとも一方の前記ホモポリマー部の一部又は全部を除切することを特徴とする。
本発明の方法でホモポリマー部の一部又は全部を除切する対象としては、一端にオリゴdG:dCまたはオリゴdA:dTからなるホモポリマー部を有する2本鎖DNA、一端にオリゴdG:dCまたはオリゴdA:dTからなるホモポリマー部を有し、他端にオリゴdG:dCまたはオリゴdA:dTからなるホモポリマー部を有する2本鎖DNAであることができる。両端にホモポリマー部を有する場合、通常は、一方の端がオリゴdA:dTであれば、他方の端はオリゴdG:dCであるが、これに限らず、両端がオリゴdA:dTであっても、両端がオリゴdG:dCで有っても良い。また、ホモポリマー部の鎖長には制限はなく、通常は5〜20の間であり、ホモポリマー部の鎖長に応じて、後述の「認識部位の外に切断部位を有する制限酵素」を適宜選択できる。ホモポリマー部の一部を除切する場合、残るホモポリマー部の鎖長は、塩基配列決定法に与える影響を小さくすると言う観点から適宜決定することができる。
【００１１】
本発明の2本鎖DNAの調製方法では、「認識部位の外に切断部位を有する制限酵素」を用いる。「認識部位の外に切断部位を有する制限酵素」は、認識部位と離れたところに切断部位を有する制限酵素であって、そのような制限酵素として、例えば、クラスIIS制限酵素が知られている。
クラスIIS制限酵素が例えばBbvIの場合、以下の式に示すように、5'-GCAGCとその相補鎖からなる認識部位とこの認識部位から離れた部位に切断部位(▼▲)を有する。認識部位の配列及び認識部位と切断部位との間隔は、制限酵素の種類により異なる。
【００１２】
【化１】
0004430762.tif 000002
【００１３】
クラスIIS制限酵素としては、具体的には、例えば、AlwI, AlwXI, Alw26I, BbsI, BbvI, BbvII, BcefI, BccI, BcgI, BciVI, BinI, BmrI, BpmI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI, BspMI, BsrDI, BstF5I,  EarI, Eco31I, Eco57I, Esp3I, Esp3I, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HinGUII, HphI, Ksp632I, MboII, MmeI, Mn1I, NgoVIII, PleI, RleAI, SapI, SfaNI, TaqII, Tth111II, BsmI, BsrI, BsmFI, BseMII（Szybalski, W. et al. Gene 100 (1991) 13-26、ならびにNew England Biolab, Inc.カタログ http://www.neb.com を参照) 等がある。
いくつかの制限酵素の認識部位及び切断部位は以下の通りである。BbvI (GCAGC 8/12)、HgaI (GACGC 5/10)、BsmFI (GGGAC 10/14)、SfaNI (GCATC 5/9)、BspMI (ACCTGC 4/8)(カッコ内は認識部位及び切断部位を表す）
【００１４】
本発明の調製方法では「一端又は両端にホモポリマー部を有する2本鎖DNA」を出発原料として、「少なくとも一方の前記ホモポリマー部の一部又は全部を除切した2本鎖DNA」を調製するが、出発原料となる「一端又は両端にホモポリマー部を有する2本鎖DNA」は、例えば、WO98/20122やCarninci, P. et al. Genomics 37 (1996) 327-336、Carninci, P. et al. DNA Res. 4 (1997) 61-66に開示された方法により調製することができる。但し、本発明の調製方法では、上記「認識部位の外に切断部位を有する制限酵素」を用いるため、ホモポリマー部の末端にこの制限酵素の認識部位を予め導入した2本鎖DNAを用いる。ホモポリマー部の末端に上記制限酵素の認識部位を予め導入した2本鎖DNAは、2本鎖DNAの調製の際に使用するプライマーとしてホモポリマーと認識部位の配列を含む非ホモポリマーとを有するものを使用することで作製することができる。
【００１５】
制限酵素により処理される２本鎖DNAとしては、例えば、２本鎖cDNAを挙げることができる。更に、制限酵素により処理される２本鎖DNAは、人為的に改変された２本鎖cDNA又は化学合成された２本鎖DNAであってもよい。
さらに、前記制限酵素で処理する２本鎖DNAとしては、ホモポリマー部を除く部分の片鎖の一部に化学修飾を有するものを使用することができる。化学修飾は、特に限定はないが、例えばメチル化による修飾を挙げることができる。メチル化の方法は当業者に公知であり、２本鎖DNAの第一鎖の合成時にメチル化された核酸を基質として使用する方法等を用いることができる。上記化学修飾は、いずれの核酸にも行うことができるが、メチル化シトシン及びメチル化アデニンは自然界に存在し、メチル化シトシンは市販されており入手容易であるため、好ましくは、シトシン又はアデニンを導入することができる。
【００１６】
完全長cDNAライブラリーの作成に際し、完全長cDNAを増幅するために、2本鎖cDNAをプラスミドに導入して宿主を形質転換する場合、2本鎖cDNAの少なくとも一方に粘着末端を作成する必要がある。しかし、粘着末端作成のために使用する制限酵素の切断部位がcDNAの配列中にも内在すると、2本鎖cDNAが途中で切断されてしまう。そこで、粘着末端作成のために使用する制限酵素により、2本鎖cDNAが途中で切断されるのを防止するために、2本鎖cDNAの片鎖にメチル化を導入し、かつ粘着末端作成のためにヘミメチル化感受性制限酵素を用いる方法がある（Carninci, P. et al. Genomics 37 (1996) 327-336、Carninci, P. et al. DNA Res. 4 (1997) 61-66）。この方法では、特定の制限酵素部位をもつホモポリマー部を両端に導入して全長鎖cDNAライブラリーを作成するにあたって、2本鎖cDNAの片鎖にメチル化を導入する。但し、粘着末端作成するための配列には、メチル化を導入していないプライマーを用いる。この片鎖にメチル化を導入した2本鎖cDNAにヘミメチル化感受性制限酵素を作用させることで、cDNA内部にある制限酵素切断部位は切断されず、粘着末端が形成される。このヘミメチル化をcDNAに導入する方法は、cDNA合成の際にプライマー/リンカー部位とcDNA内との制限酵素感受性を区別する方法（Huse, W. D. et al. US Patent (1997) 5681726)に基づいて考えられたものである。
【００１７】
本発明の調製方法においても、制限酵素により処理される２本鎖DNAとして、片鎖がメチル化したヘミメチル化cDNAを挙げることができる。しかしながら、制限酵素のうち両鎖メチル化感受性のものは多く知られているが、ヘミメチル化については余り知られていない。両鎖メチル化に感受性であっても、ヘミメチル化に感受性とは限らない（Paroush, Z. et al. Cell 63 (1990) 1229-1237）。そこで、本発明においても、制限酵素により処理される２本鎖DNAが片鎖がメチル化したヘミメチル化cDNAである場合、「認識部位の外に切断部位を有する制限酵素」として、ヘミメチル化に感受性のものを用いる。
後述の実施例に示す条件で調べた限りでは、前記クラスIIS制限酵素のうち少なくともBbvI (GCAGC 8/12)、HgaI (GACGC 5/10) 及びGsuI (CTGGAG 16/14) （カッコ内は認識部位ならびに切断部位を表す）は、ヘミメチル化に感受性である。
【００１８】
本発明の末端ホモポリマー部を除いた2本鎖DNAの調製方法をヘミメチル化したcDNAの場合を例に、以下に示すスキームに基づいて説明する。
【００１９】
【化２】
0004430762.tif 000003
【００２０】
ホモポリマー部を除く部分の片鎖の一部にヘミメチル基を導入した1本鎖(1)を用意する。この1本鎖(1)は、3'末端にオリゴdGを有し、5'末端にオリゴdTを有する。この1本鎖(1)は、例えば、Carninci, P. et al. Genomics 37 (1996) 327-336、Carninci, P. et al. DNA Res. 4 (1997) 61-66に記載の方法により作成できる。尚、上記スキームでは、3'末端にオリゴdGを有し、5'末端にオリゴdTを有する場合について説明しているが、本発明の方法は、これ以外のオリゴ鎖を有する1本鎖についても同様に適用できる。
【００２１】
次にこの1本鎖(1)をテンプレートとして用い、かつプライマーとして1本鎖(1)が3'末端に有するオリゴdGに相補的なホモポリマーを用いて、ホモポリマー部を有する2本鎖DNA(2)を合成する。但し、前記プライマーは、その5'末端にホモポリマー部の除切に使用する制限酵素、例えばBbvI(スキーム参照)の認識配列を含有する非ホモポリマー配列を有する。このようなテンプレート及びプライマーを用いて合成される２本鎖DNAの一端のホモポリマー部((2)で示される２本鎖DNAの左端)は、オリゴdG:dCからなるホモポリマー及び前記制限酵素(例えばBbvI)の認識配列を含む非ホモポリマーからなる。合成される２本鎖DNAの他端((2)で示される２本鎖DNAの右端)は、例えばオリゴdA:dTからなるホモポリマーと非ホモポリマーからなり、非ホモポリマーは制限酵素の認識配列を含むことができる。尚、この場合の制限酵素は、クラスIIS制限酵素を含むクラスIIに属するいずれの制限酵素であってもよい。例えば、非ホモポリマーが２本鎖DNAの左端切断用の制限酵素(例えばBbvI)の認識配列を含むことができ、この場合、２本鎖DNAの両端を同時に切断することもできる。
前記２本鎖DNA(2)を「認識部位の外に切断部位を有する制限酵素」(スキームではBbvI)で処理し、左端のホモポリマー部の一部又は全部を除切する。結果として、少なくとも一端のホモポリマー部を除切された２本鎖DNA(3)を得ることができる。
【００２２】
得られた２本鎖DNA(3)は、ベクターに導入し、さらにこのプラスミドで形質転換したホストを培養することで増幅することもできる。そのためには、例えば、5'端にオリゴdGGGGの突出末端を有するリンカーを２本鎖DNA(3)にライゲーションする。また、このリンカーは、ベクターに導入し易い様に、オリゴdGとは反対の末端に、例えばEcoRI等の制限酵素部位を有する。このようなリンカーを２本鎖DNA(3)にライゲーションすることで、制限酵素部位からなる突出末端を有する２本鎖DNA(5)が得られる。この場合、スキーム中の２本鎖DNA(4)は経由しない。
あるいは、２本鎖DNA(3)を以下の方法により処理することもできる。１本鎖DNAに特異的に作用するエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて、上記制限酵素で処理して残った末端の１本鎖DNA(２本鎖DNA(3)の左端)を特異的に分解し、平滑末端を有する２本鎖DNA(4)を得る。次に、ベクターに導入し易い様に、適当なリンカー、例えばEcoRIの制限酵素部位を有するリンカーを２本鎖DNA (4)の平滑末端にライゲイションして突出末端を形成して制限酵素部位からなる突出末端を有する２本鎖DNA(5)が得られる。
このようにして得られた２本鎖DNA(5)の右端(制限酵素BbvIで処理されなかった末端、スキームではdA:dTホモポリマー末端)を適当な制限酵素(スキーム中ではXhoI)で処理する。この場合の制限酵素は、上述のようにクラスIIS制限酵素を含むクラスIIに属するいずれの制限酵素であってもよい。得られた２本鎖DNAは、適当なベクターに導入し、増幅させることができる。
【００２３】
上記方法以外に、２本鎖DNA(2)は、例えば、２本鎖DNA(2)をテンプレートとして用いたＰＣＲ法により増幅することもできる。
【００２４】
上記方法により切除されるホモポリマーの長さは、使用する「認識部位の外に切断部位を有する制限酵素」の種類により決まるので、ホモポリマー部に含まれるホモポリマーの長さを考慮して、適宜制限酵素は選択する。また、使用する制限酵素の種類に応じて、制限酵素の認識部位を含む非ホモポリマーの配列を適宜決定することができる。
【００２５】
さらに、前記制限酵素として、その認識部位又は切断部位に化学修飾を有する２本鎖DNAには作用しないものを使用することで、２本鎖DNA中に制限酵素の認識部位が内在する場合であっても、２本鎖DNAの一端又は両端のホモポリマー部のみを除切することができる。そのような制限酵素としては、化学修飾としてメチル基を有する２本鎖DNAの部位に対しては作用しない制限酵素を使用することができる。そのような制限酵素を使用することにより、ホモポリマー部以外の２本鎖DNAに化学修飾としてのメチル基を導入して切断から保護することが可能になる。化学修飾としてメチル基を有する２本鎖DNAの部位に対しては作用しない制限酵素としては、例えば、BbvI、HgaI及びGsuIを挙げることができる。
【００２６】
塩基配列決定方法
本発明の塩基配列決定方法は、2本鎖DNAの一方又は両方を鋳型として、この2本鎖DNAの塩基配列を決定する方法であって、前記鋳型となる2本鎖DNAが、上記の本発明の方法により調製した2本鎖DNAであることを特徴とする。
詳しくは、本発明の方法では、上記本発明の方法を用いて調製した一端又は両端のホモポリマー部を除切された２本鎖DNAの一方又は両端を鋳型として、この２本鎖DNAの塩基配列を決定する。但し、鋳型として用いられる２本鎖DNAは、微生物によりまたはPCRにより適宜増幅した後に鋳型として用いられる。いずれの増幅法も周知の技術である。但し、鋳型として用いられる２本鎖DNA をPCR法により増幅する場合、調製された2本鎖が、除切するホモポリマーはオリゴdG:dCの一部または全部であることが好ましい。
【００２７】
2本鎖DNAを鋳型とするシークエンシング法としては、例えば、サンガー法を利用したDNAポリメラーゼを用いるダイデオキシ法やRNAポリメラーゼを用いる転写シークエンス法(例えば、WO96/14434に開示されている)等を用いることができる。いずれの方法も、ポリメラーゼによる鎖の伸長を停止させるターミネーターの存在下で得られる反応生成物のターミナル部の塩基と鎖の長さとから、塩基配列を決定するものである。
塩基配列の決定は、例えば、核酸転写のターミネーターの存在下、2本鎖DNAの核酸転写物を形成し、得られた核酸転写物を解析することにより行うことができる。前記核酸転写を触媒する酵素としては、RNAポリメラーゼ等を用いることができる。特に、RNAポリメラーゼを用いる転写シークエンス法では、ＰＣＲで増幅した生産物を精製することなしにシークエンスすることが可能であり、さらに、少量の試料で高速にシークエンスできることから好ましい。
【００２８】
転写シークエンス法は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び前記ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むDNA断片の存在下、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド5'トリフォスフェート類並びに3'dATP、3'dGTP、3'dCTP、3'dUTP及びそれらの誘導体からなる1種又は2種以上の3'デオキシリボヌクレオシド5'トリフォスフェート(3'dNTP)を反応させて核酸転写生成物を得、得られる核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取るDNAの塩基配列決定方法である。鋳型となるDNA断片（２本鎖DNA）は、前記ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。
さらにＲＮＡポリメラーゼとして、野性型ＲＮＡポリメラーゼ用いることができる。あるいは、3'dNTP誘導体を取り込む能力を(対応する野性型ＲＮＡポリメラーゼの能力と比較して)増加させるように、少なくとも１つのアミノ酸が修飾された野性型ＲＮＡポリメラーゼからなる変異型ＲＮＡポリメラーゼを用いることもできる。
【００２９】
本発明の塩基配列決定法においては、配列の読み取りに障害となるホモポリマー部の一部又は全部を除切した2本鎖DNAを鋳型として用いるため、塩基配列の決定の精度を向上させることができる。
【００３０】
【実施例】
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
実施例１
クラスIIS制限酵素のうちでBbvI (GCAGC 8/12), HgaI (GACGC 5/10), BsmFI (GGGAC10/14), SfaNI (GCATC 5/9), BspMI (ACCTGC 4/8) （カッコ内は認識部位ならびに切断部位を表す）のそれぞれの認識部位を含むオリゴデオキヌクレオシド５０ｍｅｒ：5'-ＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（oligoI）ならびにその相補鎖（oligoII）を作成する（エスペックオリゴ社）。また、Ｃの代わりに5-メチルＣを使ってメチル化oligoI（m-oligoI）ならびにメチル化oligoII（m-oligoII）を作成する（エスペックオリゴ社）。これらのオリゴマーはポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Sambrook, J. Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd Ed.1989, Cold Spring Harbor Laboratory) により精製後使用した。ＲＩ標識ならびにアニーリング：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるＤＮＡ5'末端標識キット（タカラMEGALABEL）とγ-32Ｐ-ＡＴＰ（アマーシャム）とを用いて、２種類のオリゴマーの標識とアニーリングを行う。反応液20μl中に次の組み合わせで２種類のオリゴマー各10μgを加え、３７℃１時間反応させる。組み合わせとしては1）oligoI+oligoII、2）m-oligoI+oligoII、3）oligoI+m-oligoII、4）m-oligoI+m-oligoIIの４種類である。反応後６５℃２０分熱処理を行い、キナーゼを不活化した後、４５℃２０分間以後３７℃で徐冷して、二重鎖オリゴマーをスピンカラムにて回収した。
【００３１】
次に回収した二重鎖オリゴマー100 ngについてクラスIIS制限酵素５種類（BbvI , HgaI , BsmFI , SfaNI , BspMI：いずれもNew England Biolabs製）の中１種類を0.5ユニットまたは5ユニット添加し、３７℃１時間制限酵素処理を行い（反応液20μl、酵素ならびにオリゴマー以外の反応組成はNew England Biolabs添付の処方に従う）、3 μlをポリアクリアミドゲル電気泳動にアプライし、バイオ・イメージングアナライザーＢＡＳ２０００でバンドを検出した。
【００３２】
その結果、図１に示すようにBbvIについては、レーン３〜８ではオリゴマーが切断されておらず、ヘミメチル化を含めてメチル化感受性である。 HgaI については、レーン１ではオリゴマーが切断されていないが、レーン２では切断されておりHgaIの濃度を調整することにより制限酵素として働くが、レーン３から８では、オリゴマーはいずれも切断されていないのでヘミメチル化を含めてメチル化感受性である。しかしながら、BspMIについては、レーン１〜８のいずれのオリゴマーも切断されておらず、本実施例の条件では制限酵素として働かないことが分かった。 BsmFIならびに SfaNIについては、レーン１及び２のオリゴマーを切断し、更にレーン４のヘミメチル化オリゴマーを切断しており、完全にヘミメチル化感受性ではないことが分かった。
【００３３】
従って、BbvI、BsmFI、HgaI、及びSfaNI を用いて少なくとも2本鎖DNAの末端に存在するホモポリマーも一部又は全部を除切することが可能である。但し、２本鎖DNAに使用するクラスIIS制限酵素認識部位が含まれている場合には、制限酵素が２本鎖DNAも切断してしまうおそれがあるため、メチル化等の化学修飾により２本鎖DNAを保護する必要がある。従って、２本鎖DNAの部分を切断から保護するためにヘミメチル化した２本鎖DNAを処理する場合には、上記実験によりヘミメチル化感受性であることが示されたBbvI及びHgaIを用いることにより、２本鎖DNAを切断することなくその末端のホモポリマー部の一部又は全部を除切することができる。尚、詳細な実験結果は示さないが、BbvI及びHgaIの代わりにGsuIを用いても２本鎖DNAを切断することなくその末端のホモポリマー部の一部又は全部を除切することができることを確認した。
【００３４】
例えば、以下のように全長鎖cDNAライブラリーを作成することにより、このcDNAライブラリーの塩基配列決定をより速やかに正確に行うことができる。即ち、前記スキームに示したように、BbvIや HgaIや GsuIの制限酵素部位をホモポリマーの末端に導入した全長鎖cDNAを作成し、BbvIや HgaIや GsuI などの制限酵素で処理してホモポリマーを除いた後、クローニングに必要なリンカーを接続して、全長鎖cDNAライブラリーを作成する。より具体的にはBbvIや HgaI や GsuIなどの制限酵素処理の後、制限酵素処理で形成された突出末端に、EcoRIなどの突出末端をもつリンカーをライゲーションして、適当なベクターにクローニングすることにより、全長鎖cDNAライブラリーを作成できる。あるいは、BbvIや HgaI や GsuIなどの制限酵素処理の後、制限酵素処理で形成された突出末端をＳ１ヌクレースなどで平滑末端とし、次いでこの平滑末端に突出末端をもつEcoRIなどのリンカーをライゲーションして、適当なベクターにクローニングすることにより、全長鎖cDNAライブラリーを作成することもできる。
【００３５】
【発明の効果】
DNA末端に存在するホモポリマーの一部又は全部を取り除くことにより、cDNAクローンの塩基配列を正確に決めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ２本鎖オリゴデオキヌクレオシド５０ｍｅｒを制限酵素処理したゲル電気泳動パターン。制限酵素としては、BbvI、 BsmFI、BspMI、 HgaI、 SfaNIを用いた。用いた濃度は、レーン１、３、５、７については0.5ユニット、レーン２、４、６、８については５ユニットである。また、２重鎖オリゴマーとして、レーン１、２ではoligoI+oligoII、レーン３、４ではm-oligoI+oligoII、レーン５、６ではoligoI+m-oligoII、レーン７、８ではm-oligoI+m-oligoIIを各100 ng用いた。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは各々制限酵素処理をしないときの２本鎖オリゴデオキヌクレオシドoligoI+oligoII、m-oligoI+oligoII、oligoI+m-oligoII、m-oligoI+m-oligoIIの泳動位置を示す。
【図１】
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