(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合反応によりサンプル中の分析物を測定する方法であって、
ｉ．サンプル中に存在する成分の輸送流が起こり得る流動マトリックス上のサンプル適用領域(ＡＳＺ)にサンプルを適用し、該流動マトリックスがさらに、
ａ）分析的に検出可能な結合反応物Ｒ＊適用領域(ＡＲ＊Ｚ)、
ｂ）ＡＳＺの下流に位置し、かつ、マトリックスにしっかり固定されたもう１つの結合反応物からなるキャプチャーを含んでなり、そこで本方法の際にキャプチャーおよび分析物ならびに/またはＲ＊を含むシグナル複合体が形成される、検出領域(ＤＺ)
を含んでなり、さらに、
ii．検出領域においてシグナル複合体を検出し、測定された当該シグナルは分析物を測定するのに使用されること
を含んでなり、
流動マトリックスがＡＳＺとＤＺの間に少なくとも１つの分離領域(ＳＺ)を含んでなり、またこの領域ＳＺがリガンド構造を呈示し、該リガンド構造が、
（ｉ）マトリックス内に輸送される分析物以外の少なくとも１つの成分であって、ＤＺに輸送されたならば測定可能なシグナルに影響を及ぼすであろう成分がＳＺ中で遅延されることによってＤＺにおける分析物の検出を実質的に阻害しない、少なくとも１つの成分に対する選択的結合能、または
（ii）リガンドに対する分析物の結合能が測定される場合には、分析物に対する結合能を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
該成分が、キャプチャーおよび／またはＲ＊との結合を互いに競合することに関して分析物とヘテロ型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
輸送流が毛管力によるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくともＤＺおよびマトリックスの隣接部分が膜形態であり、かつ、少なくともＤＺへの、ＤＺにおける、ＤＺからの輸送流が横方向である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分離領域が、荷電され、かつ、該成分を引き付けるリガンドを呈示する、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
分離領域が、該成分に向けられる生物特異的親和性を有するリガンドを呈示する、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分離領域が該成分に対して免疫化学的親和性を有するリガンドを呈示する、請求項１−４および６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該成分が（ｉ）に記載のものであり、かつ、リガンドの結合能が該成分上の結合部位に対するものであり、またこの結合部位が、分析物との結合に利用できる程度が、該成分との結合に利用できる程度よりも低い、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
検出領域においてキャプチャーが、該成分に対しても利用できる分析物上の結合部位に対して結合能を示す、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ＊を使用し、これがａ）分析物および該成分の双方に対して、またはｂ）分析物に対してのみ利用できる結合部位に対する結合能を有する、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
分析物および該成分がヘテロ型であって、炭水化物構造に関して異なっている、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
測定を阻害する他の成分を含まないサンプルにおいて分析物を測定する試験キットであって、
Ａ．１つの同一の輸送流中に
ａ）分析物含有サンプル適用領域(ＡＳＺ)、
ｂ）分析物または分析物が関係する反応物に向けられ、かつ、ＤＺのマトリックスにしっかり固定されている、生物特異的親和性反応物であるキャプチャーが存在する検出領域(ＤＺ)
を含んでなる流動マトリックス、
Ｂ．分析物またはキャプチャーのいずれかに対して生物特異的親和性を有する分析的に検出可能な反応物Ｒ＊
を含んでなり、
流動マトリックスがＡＳＺとＤＺの間に、少なくとも１つの阻害成分に対して選択的結合能を有するリガンド構造を呈示し、実質的に該阻害成分のすべてを遅延し得る分離領域(ＳＺ)を含んでなることを特徴とするキット。
【請求項１３】
少なくともＤＺおよびマトリックスの隣接部分が膜形態であり、かつ、少なくともＤＺへの、ＤＺにおける、ＤＺからの輸送流の方向が横方向である、請求項１２に記載の試験キット。
【請求項１４】
流動マトリックスの輸送チャネルが毛管状を有し、かつ水性媒質が毛管力によって輸送され得るような形態および表面特性のものである、請求項１２−１３のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１５】
該阻害成分が、キャプチャーおよび／またはＲ＊との結合を互いに競合することに関して分析物とヘテロ型である、請求項１２−１４のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１６】
マトリックスが使用される条件下で、リガンド構造が１以上の正および／または負荷電を示す、請求項１２−１５のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１７】
リガンド構造が生物特異的親和性反応物である、請求項１２−１５のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１８】
キャプチャーが生物特異的親和性反応物である、請求項１２−１７のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１９】
流動マトリックスがＲ＊適用領域ＡＲ＊Ｚを含んでなり、かつ、ＡＲ＊ＺがＳＺの上流および／または下流で、常にＤＺの上流に位置する、請求項１２−１８のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項２０】
Ｒ＊がＡＲ＊Ｚに予め付着されている、請求項１９に記載の試験キット。
【請求項２１】
リガンドの分析物に対する結合能を測定するための試験キットであって、
Ａ．１つの同一の輸送流に
ａ）分析物適用領域ＡＳＺ、
ｂ）分析物または分析物に関係する反応物に向けられ、かつＤＺのマトリックスにしっかり固定されている、生物特異的親和性反応物であるキャプチャーが存在する検出領域ＤＺ、
を含んでなる流動マトリックス
Ｂ．分析物またはキャプチャーのいずれかに対して生物特異的親和性を有する分析的に検出可能な反応物Ｒ＊
を含んでなり、
流動マトリックスがＡＳＺとＤＺの間に、該リガンドを呈示する分離領域ＳＺを含んでなることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明はサンプル中の分析物を測定する方法および当該法に用いるキットに関する。
【０００２】
先行技術から始まり、本発明の方法は以下の工程を含んでなる。
ｉ．サンプル中に存在する成分の輸送が起こり得る(輸送流)流動マトリックス上のサンプル適用領域(ＡＳＺ)にサンプルを適用する。
この流動マトリックスはさらに、
ａ）所望により、分析的に検出可能な結合反応物(反応物＊＝Ｒ＊)適用領域(ＡＲ＊Ｚ)、
ｂ）ＡＳＺの下流に位置し、かつ、マトリックスにしっかり固定されたもう１つの結合反応物(キャプチャー)を呈示し、そこで当該法においてキャプチャーおよび分析物ならびに／または反応物＊を含む複合体(シグナル複合体)が形成される検出領域(ＤＺ)
を含んでなる。
ii．流れによりサンプル成分の輸送が達成される。
iii．検出領域においてシグナル複合体を検出し、測定されたシグナルを分析物を測定に使用する。
【０００３】
本発明は主として、例えば、免疫クロマトグラフィーにおいてこれまでに使用されていたものと同種のものであってもよい流動マトリックスに向けられる。以下を参照。
【０００４】
好適な結合反応物としては、いわゆる親和性反応、特に生物特異的親和性反応、および共有結合反応、特に遊離チオールと反応性ジスルフィド間の交換反応ならびに穏やかな求電子物質と穏やかな求核原子間のその他の反応に関与するものがある。一般的な生物特異的親和性反応には免疫化学、すなわち抗体と抗原またはハプテン間のものがある。他のタイプの生物親和性反応としては、相補的な核酸間(オリゴヌクレオチドを含む)のハイブリダイゼーション、レクチンと炭水化物構造間の反応、Ｉg(Ｆc)構造とＡタンパク質またはＧタンパク質などのＩg(Ｆc)結合性タンパク質間の反応がある。生物親和性反応としては、生体分子と合成により製造されたリガンド／キャプチャー間の反応が含まれる。
【０００５】
問題の方法の種類について、非競合法、例えばサンドイッチ技術および競合法について記載する。サンドイッチ技術とは、通常、分析物が２種の生物親和性対応物に結合する、分析的に検出可能な複合体が形成され、その一方が分析的に検出可能であり、他方がキャプチャーであるということを意味する。一般的な競合的変法では、分析物および分析的に検出可能な分析物類似体が限定量の生物親和性対応物をめぐって競合する。２種の競合的変法の例としては、ａ）しっかり固定されたキャプチャーの形の限定量のリガンドをめぐる、分析物と標識された分析物類似体の間の競合、およびｂ）可溶性で、かつ、分析的に検出可能な限定量の生物親和性対応物をめぐる、分析物としっかり固定されたキャプチャーの形の分析物類似体の間の競合を用いるものが挙げられる。
【０００６】
本発明の技術分野内においてこれまでに用いられていた方法論に関するさらなる情報については、ＵＳ−Ａ−４,８６１,７１１(Ｂehringwerke)、ＷＯ ８８／０８５３４(Ｕnilever)、ＵＳ−Ａ−５,１２０,６４３および４,７４０,４６８(Ａbbott)、ＥＰ−Ａ−２８４,２３２およびＵＳ−Ａ−４,８５５,２４０(Ｂecton Ｄickinson)ならびにＷＯ ９６／２２５３２(Ｐharmacia ＡＢ)を参照。
【０００７】
ヘテロ型
上記の結合反応の１つによって対応物への結合に関して競合し得る化合物。ヘテロ型はタンパク質のイソ型、例えばイソ酵素などであり得る。ヘテロ型という用語には特に種々の形態の生物親和性複合体が含まれ、これらは上記の定義を満たすことで互いに「相似している」。例としては、抗原は同一であるが抗体が種々のクラス／サブクラスのものである免疫複合体が挙げられる。さらには下記のタイトル「分析物」を参照。
【０００８】
２種の化合物が互いにヘテロ型であるかどうかは、いわゆる阻害試験において決定され得る。
【０００９】
本発明により解決すべき問題
ＤＺにおいて検出されるシグナルに作用するか、または影響を及ぼし得るサンプルの成分は、２つの主要な群：ａ）分析物およびｂ）直接的または間接的に検出を阻害する成分に分類することができる。直接的阻害成分には、例えば複合体が蛍光によって検出される場合の血清中の蛍光成分など、シグナルを干渉するものがある。間接的阻害成分の例としては、キャプチャーおよび／または付加された生物親和性反応物Ｒ(例えばＲ*)に関するヘテロ型が挙げられる。その他の間接的阻害成分、例えば異種親和性抗体が最初のサンプル中に存在していてＤＺにおけるシグナル複合体の形成を阻害する場合もある。本発明のある具体例では、本発明の分離領域から放出されるリガンドが阻害的に作用し得る(実施例１を参照)。
【００１０】
低濃度で存在する分析物に関しては、サンプル中の阻害成分に伴う問題から阻害成分の分離と検出は異なる系で実施されていることが多い。
【００１１】
イオン交換分離後に免疫学的系によるかまたは吸収基のオンライン測定(４６０nm)のいずれかにより分析が実施されている例としては、炭水化物欠損トランスフェリン(ＣＤＴ＝ＣＤトランスフェリン＝アシアロ−、モノシアロ−およびジシアロ−トランスフェリン)の測定がある。ＣＤＴが相対的に高い濃度(１０-9Ｍ)で存在する場合には、両検出法とも可能であったが、低濃度の分析物には免疫測定が必要である。イオン交換クロマトグラフィー分離は進んだ、コストの高い装置で制御されており、これには特別に教育された人員が必要である。また、従来の免疫学的試験もコストが高く、かつ、十分に教育された人員を必要とする。
【００１２】
クロマトグラフィー分離工程後の免疫学的オンライン測定に関する技術はＡfeyanら(Ｎature ３５８（１９９２）６０３−６０４)およびＩrthら(Ａnal. Ｃhem. １４（１９９５）３５５−３６１)により記載されており、その問題点もＫrullら(ＬＣ−ＧＣ １５（７）（１９９７）６２０−６２９)により要約されている。
【００１３】
ＤＺへの全細胞の輸送は検出複合体からのシグナルを阻害し得る。より密度の高い前領域において細胞が機械的に(濾過により)捕捉される流動マトリックスの使用がこれまでに知られている(Ｏudheusdenら，Ａnn. Ｃlin. Ｂiochem. ２８（１９９１）５５−５９)。
【００１４】
ＥＰ−Ａ−６９６,７３５では、分析物の測定範囲を拡張するために、サンプル適用領域に所定量の分析物結合性抗体が固定されており、一定量の分析物がそこに保持されるといった、クロマトグラフィー免疫分析系が開示されている。
【００１５】
ＥＰ−Ａ７０２,２３３では、ＥＰ−Ａ−６９６,７３５に記載されたものと同様の方法で、標識された反応物(次に、これが検出領域において検出される)と反応する前に一定量の分析物を捕捉することによってサンプルの希釈効果を達成するといった、クロマトグラフィー免疫分析系が開示されている。
【００１６】
ＷＯ ９７／３５２０５には、（ｉ）分析物に結合していない標識された分析物結合性反応物の検出領域、および（ii）分析物結合性反応物と分析物との間の複合体の検出領域を有する、免疫分析用のクロマトグラフィー膜が開示されている。非結合分析物結合性反応物と分析物の反応複合体の相対的な量によりサンプル中の分析物の量の測定値が得られる。
【００１７】
ＷＯ ９４／０６０１２には、分析物検出領域の前に配置された負の制御領域を有する分析試験装置が開示されている。この負の制御領域はサンプルにおいて、分析物検出に作用し、それが信頼できないものとなるほどの成分の存在を示す機能を有する。
【００１８】
本発明の目的
本発明の第１の主要な目的は、阻害成分の存在下で分析物の測定を助ける簡単かつ迅速な方法を作り出すことである。特に本発明の目的は、注目される液体媒質に可溶性であるかまたは懸濁し得る阻害成分に伴う問題を回避することである。
【００１９】
本発明の第２の主要な目的は、個々のヘテロ型またはその組合せ、特に多種の生理学的に活性な化合物を含む、ペプチド、炭水化物または脂質構造を示すヘテロ型のより迅速かつ簡単な測定にある。脂質の中にはステロイドおよびその他の脂溶性物質が含まれる。
【００２０】
本発明の第３の主要な目的は、特に分析物の阻害性ヘテロ型含有サンプルに対して、＜１０-7Ｍ、特に＜１０-9Ｍという濃度範囲の分析物の測定を助けることにある。
【００２１】
本発明の第４の主要な目的は、生物学的材料に由来するサンプル中の個々のヘテロ型またはその組合せの測定を簡単にすることにある。
【００２２】
本発明の第５の主要な目的は、化合物ライブラリー、例えば組合せライブラリーなどの化学物質ライブラリーのより迅速かつ簡単な評価を提供することにある。
【００２３】
上記の４つの主要な目的の副次的な目的として、屋外環境において(通常、半定量的に)、ならびに、進んだ実験室において(正確な定量の可能性を有する)測定に実施の可能性を高めることにある。
【００２４】
本発明
上記の目的は、流動マトリックスがＡＳＺとＤＺの間に１以上の分離領域(ＳＺ)を含み、それによりＤＺにおいてシグナル複合体からのシグナルに影響を及ぼし得る少なくとも１つの成分の遅延／分離が可能となる場合に、本明細書の導入部分に記載された方法を用いて達成され得る。これは以下に記載のリガンド相互作用によりＳＺにおいて起こるはずであり、それは可逆的でも、不可逆的でもあり得る。その成分は阻害成分であても、分析物であってもよい。成分が分析物でない場合には、遅延とは、成分がＳＺを通って分析物よりもよりゆっくりと移動するか、またはＳＺに不可逆的に結合し、それによってＤＺに到達しなくなり、その結果、ＤＺにおける分析物の検出が問題の成分によって実質的に阻害されなくなるということを意味する。通常、これは影響を受けるサンプル中の阻害成分の実質的にすべてに対して十分量のリガンドが存在していなければならないことを意味する。「実質的にすべて」とは、成分の相対的な濃度にもよるが、通常、阻害成分の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも９９％が分離領域において遅延または捕捉されることを意味する。１以上のリガンドの分析物に結合する能力を調べたい場合には、成分は分析物であり得る。この場合にはかかるリガンドは分離領域に固定化される。
【００２５】
分離領域で遅延する構造／リガンドの選択は遅延される成分によって決定される。遅延は多少ともリガンド構造と遅延される成分間の種々の特異的な相互作用に基づき得る。以下のタイトル「分離領域」を参照。ＳＺを通過後、分析物は輸送流とともに検出領域(ＤＺ)に移動し、そこでキャプチャーおよび分析物ならびに／またはＲ*を含む複合体が形成される。
【００２６】
１種以上の阻害成分の遅延を意図する場合には、シグナル複合体の形成はその不在下で起こる。ＤＺにおけるシグナル複合体の検出は分析物の定性および定量値として取ってもよい。
【００２７】
分析物の遅延を意図する場合には、シグナル複合体の形成時点が変更されるか、またはＳＺにおける分析物−リガンド結合が不可逆的である場合には、シグナル複合体の形成は完全に阻害され可能性がある。ＤＺにおけるシグナル複合体の形成はＳＺにおける分析物のリガンドに対する結合能の測定値となる。
【００２８】
図１〜３は本発明の流動マトリックスの種々の変形を示すものである。
図１は、ＡＳＺ、ＡＲＺ、ＳＺおよびＤＺを有する簡単な変形である。ＡＲＺとＡＳＺは分離されている。
図２Ａは、主として、同一のリガンドを有する５個の分離領域を有することで図１の変形とは異なる。ＡＲＺとＡＳＺは分離されている。
図２Ｂは、ＡＲＺとＡＳＺが一致しているという点を除いては、図２Ａの変形と同様である。
図３は、実施例１において使用される、３つの分離領域を有する本発明の流動マトリックスの変形を示す。このうち２つの領域(ＳＺ１)はあるリガンドを呈示し、もう１つの領域(ＳＺ２)は別のリガンドを呈示する。ＡＳＺとＡＲＺ(＝ＡＲ＊Ｚ)は分離されている。
【００２９】
図１のより詳細な記載はタイトル「マトリックスおよび輸送流」に、図２〜３に関しては実施例１の導入部に示されている。図１〜３で示される流動マトリックスは原則として以下のいずれかの幾何学的具体例を有し得る。
【００３０】
マトリックスおよび輸送流
マトリックスは、いわゆる免疫クロマトフラフィー検出法においてこれまでに使用されたものと同種のもの(流動マトリックス)であり、反応物とサンプル成分が輸送される区画を規定する。従って、マトリックスは単一の流動チャンネル(例えば毛管)の内部表面、流動チャンネルの浸透系を有する有孔マトリックス(有孔マトリックス)の内部表面などであり得る。マトリックスはモノリス、シート、カラム、膜、分離流動チャンネル、例えば毛管状のもの、またはかかる流動チャンネルの集合系などの形態であり得る。また、それらはカラムカートリッジまたはカット溝に充填された粒子、圧縮ファイバーなどの形態でもあってもよい。あるいはいわゆる液体クロマトグラフィーナノカラム、すなわちマイクロ平板印刷により作製された約２μm以下のチャンネルを有するシリコーンまたは石英プレートがある(例えば、Ｈe. Ｂ.ら，Ａnal. Ｃhem. １９９８，７０，３７９０−３７９７を参照)。マトリックスの内表面、すなわち流動チャンネルの表面は、毛管力によるかまたは加圧もしくは吸引のいずれかによって水性媒質(主として水)がマトリックスを通って輸送されるよう十分親水性でなければならない。流動チャンネルの最小内寸(球形チャンネルに関しては直径として測定される)は、分析物、付加反応物、および検出領域において相互作用し、かつＳＺにおいて遅延される成分がマトリックスを通って輸送されるよう十分大きくなければならない。経験則としては、好適なマトリックスは０.１〜１０００μmの範囲の最小内寸を有する流動チャンネルを有するものの中から選択すればよく、マトリックスが連絡流動チャンネル系を有する場合には０.４〜１００μmが好ましい。外的な加圧／吸引によって駆動される流れについては、主として広い範囲(１０００μmまでの)の高い方に最小寸法を有する流動チャンネルが注目される。
【００３１】
好適なマトリックスはポリマー、例えばニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチルスルホン、ナイロン、硝酸／酢酸セルロース、セルロース、再生セルロースから構築されることが多い。これらの膜は例えばポリエステルの堅い裏貼りをともなって提供するのが有利である。
【００３２】
マトリックスの材料ならびに流動チャンネルの物理的および幾何学的設計はマトリックスのある部分の意図した使用に応じた流れに沿って可変である［ＷＯ ９６／２２５３２(Ｐharmacia ＡＢ)、ＷＯ ９４／１５２１５(Ｍedix)］。１つの同一のマトリックスは平行であるかまたは共通中心から放射状に向けられたいくつかの輸送流を、例えば個別のチャンネルの形態で含んでなってもよい。いくつかの最も重要な具体例では、少なくとも検出領域およびマトリックスの最も近い部分は、ＤＺへの、ＤＺにおける、またＤＺからの輸送流がマトリックスにおいて横方向に起こり得るような形態であるべきであり、すなわち、マトリックスの少なくともこの部分は膜ストリップまたはカット溝を有するプレートなどの形態である。
【００３３】
問題のタイプの試験に使用してよい種々の流動マトリックスは、先行する特許公報に記載されている。例えば、ＵＳ−Ａ−４,８６１,７１１(Ｂehringwerke)、ＷＯ ８８／０８５３４(Ｕnilever)、ＵＳ−Ａ−５,１２０,６４３およびＵＳ−Ａ−４,７４０,４６８(Ａbbott)、ＥＰ−Ａ−２８４,２３２およびＵＳ−Ａ−４,８５５,２４０(Ｂecton Ｄickinson)、ＷＯ ９６／２２５３２(Ｐharmacia ＡＢ)を参照。
【００３４】
優先日の本発明の最も重要な具体例は流動マトリックスにおける液体輸送に基づいており、それは例えば膜ストリップの形態である(図１を参照)。このストリップは輸送流（１）を規定するマトリックスから作製し、また液体−堅い裏貼り（２）に適用し、プラスチック製が好適である。マトリックス上にはサンプル適用領域（３、ＡＳＺ）およびその下流に位置する検出領域（４、ＤＺ）がある。輸送流はＡＳＺからＤＺへ向かう方向にある。サンプル適用領域(ＡＳＺ)および検出領域の間には分離領域（５、ＳＺ）がある。輸送流には、特定の具体例に必要とされる場合には付加反応物適用領域（６）(Ｒ、例えばＲ*、適用領域ＡＲＺに関しては、例えばＡＲ*Ｚ)が存在してもよい。該領域間にはその唯一の機能が反応物を輸送することである領域（７）が存在してもよい。適用領域ＡＲＺ(ＡＲ*Ｚ)の位置は使用される試験プロトコールによって決定され、ＡＳＺの上流もしくは下流にあってもよいし、またはＡＳＺと一致していてもよい。ＡＲＺ(例えばＡＲ*Ｚ)がＡＳＺの上流にある場合に関しては、ＡＳＺにおける液体の付加がその上流に位置する領域ＡＲＺ(ＡＲ*Ｚ)における液体の付加と実質的に同時に起これば有利である。発明者らの初期に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ９８／０２４６３を参照(出展明示により本明細書の一部とする)。ある種の試験プロトコールに関しては、ＡＲＺ(ＡＲ*Ｚ)はＤＺは一致していてもよい。
【００３５】
いくつかの具体例では、反応物Ｒ、例えばＲ*が予め付着されていれば有利である。これは特にＡＲＺがＡＳＺの下流に位置する場合であり、同時に使用される試験プロトコールの変法が生じ、すなわち、反応物Ｒおよび分析物がＤＺに実質的に同時に移動する。
【００３６】
分析物が反応物(Ｒ)の前にＤＺに輸送されるというような連続した変法を使用するのが望ましい場合には、反応物適用領域(ＡＲＺ)がＡＳＺの下流にあれば、ＲはサンプルがＡＲＺを通過した後に加えられるべきである。連続法はまた、ＡＲＺがＡＳＺの上流にある場合にも達成され、その場合Ｒは所望によりＡＲＺに予め付着されていてもよい。
【００３７】
別の具体例では、反応物(Ｒ)、例えばＲ*は分析物をＤＺに輸送する流れのものとは別の方向からの分離した輸送流においてＤＺに移動されてもよい。例えば、ＵＳ−Ａ−４,８５５,２４０(Ｂecton ＆ Ｄickinson)を参照。
【００３８】
１つの同一の輸送流において種々の分析物または種々の濃度範囲の同一の分析物を意図したいくつかの検出領域が存在してもよい。分析物が異なる場合に関しては、個々のＤＺにおけるキャプチャーは、もちろん、いずれの分析物に対してもいずれの実質的な交差反応性も示してはならない。
【００３９】
ＡＳＺから分離領域(ＳＺ)を通り、さらに検出領域(ＤＺ)へ向かう輸送流は毛管力により駆動される液流であってよい。要すれば、流動マトリックスは輸送液に浸漬され、ＡＳＺの上流に適用される有孔マトリックスの形態で液体貯蔵槽（８）および／またはＤＺの下流に位置する吸引有孔マトリックス（９）を示してもよい。液体貯蔵槽および吸引マトリックスは流れの維持を助けるものである。液流はまた、マトリックスを通じての圧力または吸引によっても達成され得る。従って、圧力は、例えばマトリックスの一部が、垂直に位置し、かつ、その出口が水平に位置した流動マトリックスと直接液体連絡するミニカラムとして設計することにより、静水的にてかけてもよい。後者の形態では、水平に位置したマトリックスの一部はストリップ／膜形態であり得る。分析物、反応物および阻害成分の輸送の別法として、マトリックスへ電場を適用してもよい。
【００４０】
また、図１と同様の領域配列は他種の流動マトリックス、例えば、毛細管および輸送流が深層にあるマトリックスに対しても構築され得る。
【００４１】
上記の１以上のマトリックス／輸送流はともに、例えば共通の裏貼り上に、所望によりそれらの間に液体遮断層をともなって配置してもよい。所望により、流れは共通のＡＳＺ、共通のＡＲＺ(ＡＲ*Ｚ)などを有してもよい。基本的には、ＤＺは各々の輸送流に対して分離されている。
【００４２】
上記の変法では、分離領域を有するマトリックスを使用して１種のヘテロ型(分析物)を測定する。分離領域のないマトリックスを使用すれば、分析物に対するものと類似の方法でサンプル中に存在する分析物のすべてのヘテロ型を測定できる。これら２種の領域配列を組み合わせれば、サンプル中の分析物の相対量ならびに絶対量を容易に測定することができる。
【００４３】
分離領域(ＳＺ)
分離領域は、ＤＺにおいて検出を阻害したと考えられる１以上のサンプル成分に対して結合能を有するリガンド／構造を呈示する。マトリックスがＳＺにおいて阻害成分に機械的障害(濾過)を与えるからではなく、分離が数種の特異的／選択的結合反応によって達成されることが特徴である。特に特異性、結合力(親和力)および速度論に関する分離／遅延するリガンド／構造の選択の指標となる原理はイオン交換クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーをはじめとするアフィニティークロマトフラフィー、およびキャプチャーに対して固相技術が使用される生物特異的分析法におけるものと同様である。結合力(親和力(affinity，avidity))および速度論に関しては、本発明の目下のところ好ましい変法の主たる目的は、分析物に対して阻害成分を遅延させることであり、その結果、ＤＺにおける検出がこれらの成分の不在下で起こり得る。一般に、このことは阻害成分が分離領域においてできる限り効率的に遅延される、またはできる限り強く、かつ、迅速に結合されなければならないことを意味する。
【００４４】
従って、ＳＺにおいて分離を行うリガンドは、ａ）荷電したもの(陰イオンのもの、陽イオンのもの、両性のもの＝イオン交換リガンド)、両性のもの／両親媒性のもの、生物親和性のもの、キレート化している、硫黄含有である(いわゆる硫黄親和性に関しては主としてチオエーテル)、共有結合クロマトグラフィーを可能にするもの(ピリジルジスルフィドなどの反応性ジスルフィド)、またはπ−π相互作用するもの、疎水性のものなどであってよい。
【００４５】
阻害成分が遅延される場合には、経験則としては１種以上の阻害成分に対するリガンドの結合能が分析物に対するものよりも強くなければならない。これをＳＺにおける分離に使用される条件に適用する。どれほど分離が成功するかを決定する因子は分離領域の長さ、リガンド密度、リガンドの有効性、温度、流速、バッファー、イオン強度、pＨなどである。
【００４６】
生物特異的親和性リガンドの中でも、主としていわゆる免疫リガンド、すなわち、抗体およびその抗原結合性断片、ならびに抗原およびハプテンが挙げられる。その他の親和性リガンドの例としては、レクチン(例えば、シアル酸結合レクチン)、Ｉg(Ｆc)結合性タンパク質(Ａタンパク質およびＧタンパク質など)、一本鎖もしくは二本鎖形態のオリゴまたはポリヌクレオチドなどの核酸、酵素の基質類似体、酵素阻害剤などが挙げられる。生物特異的親和性リガンドに関しては、特異性は遅延される成分上の１以上の結合部位に向けられるものであってよい。相当する結合部位は分析物には同程度には利用できないものであるべきである(これには非露出形態では存在しさえしない場合も意図される)。
【００４７】
問題のリガンド／構造は、物理的または生物特異的吸着のいずれかによるマトリックスへの共有結合によって分離領域に固定され得る。後者の例としてはビオチンとストレプトアビジン間、高親和性の抗体とハプテン間の相互作用などが挙げられる。マトリックスへの固定はポリマーまたはその他の置換基を介して起こってもよく、次に、それは分離に使用される、共有結合的に、物理的吸着により、または生物特異的に結合したリガンドを保持する。もう１つの可能性としては所望の種類のリガンドを呈示する高分子粒子の付着がある。この粒子は親水性または疎水性のものであってよく、またこれにリガンド構造を示す化合物が吸着または共有結合されている。分離するリガンドをマトリックスＳＺに結合する技術は基本的には、ＤＺにおけるキャプチャーに関してこれまでに知られているものと同様にして選択すればよい。例えば、発明者らの初期に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ９８／０２４６２、ＰＣＴ／ＳＥ９８／０２４６３およびＰＣＴ／ＳＥ９８／０２４６４を参照(なお、それらはキャプチャーの検出領域への導入に関しては、出典明示により本明細書の一部とする)。この点について、共有結合されたリガンドを有する市販の膜、例えばＤＥＡＥセルロース紙(ジエチルアミノエチル)(ＤＥ８１、Ｗhatman Ｉnternational Ｌtd，Ｅngland)があるということが記載できる。
【００４８】
検出領域
検出領域のキャプチャーは分離領域のリガンドに適用されるものと同様の規定に従って選択され得る(ただし、キャプチャーの結合能は分析物に、および／または分析物が関係する反応物に向けられるべきである)。リガンドの捕捉に関して迅速な速度論を有する高親和性のキャプチャーを選択することが有利である。抗体または抗原／ハプテンの使用が主として注目され、それに関しては高親和性抗体を見出すことが容易であることが多い。
【００４９】
分析物が関係する反応物は、付加され、かつ、ＤＺを通って移動する際にサンプル中の分析物の存在に比例する量でキャプチャーに結合し得る反応物(Ｒ)を意味する。分析物が関係する反応物の例としては、ａ）固相に結合された限定量の抗分析物抗体をめぐる競合を使用する競合法における標識された分析物類似体、およびｂ）固相に結合された分析物類似体と分析物間の、溶解した形態の限定量の抗分析物抗体をめぐる競合／阻害を使用する方法における標識されたまたは非標識の可溶性抗分析物抗体の形態のＲ*が挙げられる。
【００５０】
キャプチャーは分離領域にリガンドを結合するために使用されたものと類似の技術により検出領域に固定すればよい。
【００５１】
分離領域における分離原理と検出領域における種々の捕捉原理とを組み合わせること、例えば、分離用イオン交換クロマトグラフィーとＤＺにおける捕捉用免疫化学的吸着が好適であり得る。２つの領域において遅延と捕捉に同一の原理を使用することが実用的であり得る場合もある(例えば、異なる特異性を有する２種のモノクローナル抗体、実施例を参照)。
【００５２】
分析物
分析物とは定量または定性される化合物を意味する。定量は絶対量ならびに相対関係の測定に関するものである。分析物の定性はいずれかの有無を検出すること(イエス／ノー試験)、またはあるリガンドへの親和性結合能など、化合物の質的特性に関するものである。
【００５３】
相対的測定とは得られる測定値が１以上の選択されたヘテロ型の合計とヘテロ型のもう１つの組合せの合計の割合であることを意味する。例としてはある対応物に関する分析物量とすべてのヘテロ型の総量の割合が挙げられる(総量は分析物量を含む)。
【００５４】
本発明は結合性反応物として機能し得る分析物に適用できる。これは上記のようなキャプチャーを提供できれば分析物は基本的にはいずれの物質であってもよいということを意味する。特異な例としては、抗原／ハプテン、酵素または抗体または完全にか、または部分的に一本鎖形態である核酸が挙げられる。分析物はアミノ酸／ペプチド、炭水化物または脂質構造を示し得る。
【００５５】
ヘテロ型とともに存在する分析物に対して、キャプチャーおよび／または付加反応物Ｒ、例えばＲ*への結合能に関して特に大きな利点が得られる。これは特に分析物が＜１０-7Ｍ、特に１０-9Ｍのサンプル濃度中に存在する場合に適用される。この種のヘテロ型の例としては、ａ）例えば、分析物としてＣＤＴを用いるイソトランスフェリン、例えば分析物としてＨbＡlcを用いるイソヘモグロビンなど、荷電において互いに異なる化合物、ｂ）付加的に挿入されたまたは切断された(例えば分解による)アミノ酸、またはペプチド鎖の部分的相違など、基本構造のある部分において互いに異なる化合物、ｃ）異なる物質／構造が基本構造に付加されているという点によって互いに異なる化合物、例えば共有結合した炭水化物構造、ｄ）高分子中で、受容体リガンド複合体における受容体とリガンド間および免疫複合体における抗原と抗体間の生物親和性結合などの非共有結合によって、または例えば抗体の鎖間のシステイン架橋によって互いに結合する２個以上のサブユニットからなる高分子が挙げられる。
【００５６】
可能性ある使用／分析物の例としては以下のものが挙げられる。
【００５７】
ａ）分析物は炭水化物含量(グリコシル化)に関してその他のヘテロ型と異なるヘテロ型、例えば同一か、または同様のタンパク質部分を有する糖タンパク質である。この種のヘテロ型の変種は癌、炎症および肝疾患などのいくつかの疾病症状において知られている(Ｔurner Ｇ Ａ，”Ｎ−glycosylation of serum proteins in disease and its investigation using lectins”，Ｃlin. Ｃhim. Ａcta ２０８（１９９２）１４９−１７１；およびＶarki Ａ，”Ｂiological roles of oligosaccharides：all of the theories correct”，Ｇlycobiology ３（２）（１９９３）９７−１３０)。特に、ｉ）アシアロ−、モノシアロ−およびジシアロ−トランスフェリンの組合せの測定(これに関する分離はＳＺにおけるイオン交換リガンドおよびレクチンリガンドによって行えばよい)ならびに、ii）ＨbＡlcの測定(これはイオン交換またはボロネートリガンドによって分離すればよい)が挙げられる。タンパク質の炭水化物含量における変種はまた、正常な生物学的変化、例えば月経周期および年齢および性別における相違に関しても知られている。
【００５８】
ｂ）組換えタンパク質のグリコシル化度はイオン交換、ＳＺにおけるレクチンまたはボロネートリガンドによって測定することができる。この場合には、分析物はＳＺにおいてリガンドに結合する炭水化物構造を含まない組換えタンパク質の画分であり、それゆえＳＺを最も迅速に移動する。
【００５９】
ｃ）分離ハンドルが挿入されている組換えタンパク質、例えばヒスチジン配列またはＩgＧ結合性配列は、ハンドルの完全な切断が重要であるが、それぞれ金属キレートリガンドまたは、およびＩgＧ(Ｆc)リガンドによるＳＺにおける分離後に確認できる。この場合分析物は、それからそれぞれヒスチジン配列またはＩg(Ｆc)結合性配列が切断除去されている組換えタンパク質の画分である。
【００６０】
ｄ）酵素は、ＳＺにおいて問題の酵素の基質類似体または阻害剤であるリガンドによって活性および不活性型に分離できる。分析物は不活性酵素である。
【００６１】
ｅ）特異的受容体への結合によりそれらの生物学的機能を発揮するタンパク質、ペプチドまたはその他の生体分子は、ＳＺにおいて生体分子の受容体であるリガンドによって分離できる。分析物は受容体への結合能を欠くか、または低下した分子の画分である。
【００６２】
ｆ）タンパク質(例えば、ＩgＥ)はin vivoでそれに結合した自己抗体(ＩgＧ、ＩgＡ、ＩgＭ)を有し得る。これらの自己抗体は一方でタンパク質の免疫化学的測定において異なる応答を生じ、他方、変化したターンオーバー速度／機能を生じる。分離領域において問題の自己抗体に対する抗体をリガンドとして用いることによって、遊離型および免疫複合体結合型の自己抗体を分離することができ、また遊離型のタンパク質(＝分析物、例えばＩgＥの)量を算出することができる。
【００６３】
ｇ）タンパク質のある結合部位に向けられ、かつ、ＳＺに固定化されたモノクローナル抗体によって、結合部位を示さないタンパク質のヘテロ型(＝分析物)の存在はＤＺにおける定量により検出できる。
【００６４】
ｈ）輸送タンパク質に結合する種々の物質、例えばアルブミンに結合した薬剤の存在は、ＳＺにおいて好適なリガンドを使用することによって測定できる。ＳＺにおける好適なリガンドの選択によって、結合した薬剤を含む、または含まない輸送タンパク質をＤＺにおいて測定できる。
【００６５】
ｉ）特定のリウマチ性疾患または自己免疫疾患においては、血清中のＩgＧおよびＩgＡが種々の表面への吸着が増加している。荷電特性を持つＩgＧおよびＩgＡに結合し得るリガンドを分離領域に固定することによって、ＤＺにおいて非荷電吸着特性を持つＩgＧとＩgＡの割合(＝分析物)を測定することができる。対応する自己抗原／ハプテンをＤＺにキャプチャーとして持つことによって、ＩgＧまたはＩgＡクラスの特異的自己抗体が良好な感度で測定できる。
【００６６】
ｊ）多数の生物学的に活性な化合物(例えば、ペプチドまたはステロイド)は血清中でバインダータンパク質との複合体の形態で輸送される。ＳＺにおいてリガンドとしてバインダータンパク質に対する抗体を使用することにより、これらの化合物の非複合体結合型(遊離型)(＝分析物)が後に続く検出領域で免疫化学的に測定できる。例としてはトリヨードチロニンおよびチロキシンがあり、これらはチロキシン結合性グロブリン(ＴＢＧ)またはチロキシン結合性プレアルブミン(ＴＢＰＡ)と結合して輸送される。同様に、性ホルモン結合性グロブリンと結合した形態で輸送される遊離型のエストラジオールおよびテストステロンも測定できる。
【００６７】
ｋ）本発明を用いて、第１の化合物(＝分析物)の第２の化合物への結合能が測定できる。この具体例では、あるものは、ＳＺにリガンドとしての第２の化合物を、ＤＺには分析物に対して公知の結合能を有するキャプチャーを有する。ＳＺにおける捕捉／遅延は分析物の結合能の測定値となり、これはＤＺにおいて測定できる。
【００６８】
本発明のこの具体例はＳＺにおいてリガンドとしてライブラリーメンバーを有する化合物の種々のライブラリー(例えば、化学物質ライブラリー)のスクリーニングにおいて特に有利であり得る。
【００６９】
ｌ）本発明によってアミノ酸が切断除去されているタンパク質の分解イソ型が測定できる。例えば、クレアチンキナーゼ(ＣＫ)の分解イソ型は興味深い心臓病マーカーである。
【００７０】
ＤＺにおける検出および標識反応物(Ｒ*)
シグナル複合体の検出および定量は分析的に検出可能な反応物(反応物*＝Ｒ*)によって行えばよい。分析物自体が検出可能で、かつ、シグナル複合体の一部である場合には、検出および定量はＲ*を用いずに行える。
【００７１】
Ｒ*は通常、酵素活性団、放射性団、蛍光団、発色団、ハプテン、ビオチン、粒子など、分析的に検出可能な原子団で標識された生物特異的親和反応物である。また、分析的に検出可能な反応物(Ｒ*)としては、それ自体結合部位または結合性を有し、該反応物がシグナル複合体の一部である場合には分析的に検出され得る反応物が挙げられる。反応物が抗体である場合、かかる結合部位の例としては、Ｉgクラス特異的およびＩgサブクラス特異的抗原決定基であり、その抗原結合部分を用いて検出領域で複合体を形成する。
【００７２】
分析上標識される反応物の通常形態としては、標識抗体および標識抗原／ハプテンがある。標識抗体は主に下記のような用途を持つ。
Ａ)サンドイッチ法などの非競合法、ここではキャプチャーは
ａ）標識抗体と同じ抗原(＝分析物)に向けられる抗体、または
ｂ）抗原／ハプテンである、または
Ｂ)競合法、ここでは限定された量の抗分析物抗体をめぐって、分析物と固相結合分析物類似体との間で競合が起こり、固相上のフリーな部位または占有部位の検出はそれぞれ標識抗分析物抗体と抗抗分析物抗体によりなされ得る。
【００７３】
標識抗原／ハプテンは主として下記のような用途を持つ。
Ａ)競合法、ここでは標識抗原／ハプテンが限定された量の抗体(キャプチャー)をめぐって非標識抗原／ハプテンと競合する、または
Ｂ)サンドイッチ法、ここでは抗原／ハプテン特異的抗体がキャプチャーとしての抗抗体を用いて求められる。
【００７４】
分析的に検出可能な反応物(Ｒ*)を用いない本発明の変法の例としては、分析物自体が複合体の一部である場合にＤＺにおいて検出可能な場合である。これは分析物としての酵素を、分析的に検出可能な生成物を与える基質、例えば不溶性であるべき発色または蛍光生成物を与える基質と併用して用いて例示される。
【００７５】
Ｒ*は限定されるものではないが、ＳＺにおいて分離される阻害成分に対して結合能を示す。Ｒ*が結合能を有する限り、ＳＺに対するＲ*の結合量による阻害性ヘテロ型のレベルの測定が望まれるとしても、その適用領域は分離領域(ＳＺ)の下流に置くべきである。
【００７６】
特に有用な標識団としては、蛍光団または発色団(それぞれ、蛍光粒子および発色粒子)など、所望により上記の検出可能な原子団を１つ含む粒子である。有用な粒子としては０.００１ないし５μmの範囲、好ましくは０.０５ないし５μmの範囲のサイズである場合が多い。該粒子はコロイド状、いわゆるゾル(すなわち、通常０.００１ないし１μmの範囲のサイズを有する球形の単分散)であってもよい。特に、金属粒子(例えば金ゾル)、非金属粒子(例えばＳiＯ2、炭素、ラテックスならびに死滅した赤血球および細菌)が挙げられる。また非コロイド状粒子も使用されている。これらの粒子は多少不規則で、多少多分散である(例えば炭素粒子＜１μm；Ｐharmacia ＡＢ，ＷＯ ９６／２２５３２)。
【００７７】
本発明において粒子が標識団である場合、ＤＺにおける複合体は視覚的に、または光学測定装置(例えば、画像解析用の特殊なソフトウエアを備えたコンピューターに接続したＣＣＤカメラまたはレーザースキャナ)により検出されることが多い。
【００７８】
標識団としての粒子については、ＷＯ ８８／０８５３４(Ｕnilever)；ＵＳ−Ａ−５,１２０,６４３(Ａbbott)；ＥＰ−Ａ−２８４,２３２(Ｂecton Ｄickinson)他に記載されている。
【００７９】
サンプル
本発明は主として生物学的サンプル、例えば血液(血清、血漿、全血)、唾液、涙、尿、脳骨髄液、汗などを意図したものである。本発明はまた、例えば発酵溶液、反応混合物、ＳＺにおけるリガンドに対する結合能が調べられるあるタンパク質を含有する溶液など、その他のサンプルにも適用できる。上記タイトル「分析物」を参照。環境上のサンプルの分析に対する本発明を使用が特に注目されよう。
【００８０】
本方法の他、本発明はまた、上記で定義された流動マトリックスを含有する装置およびキットそれぞれに関する。
【００８１】
上記の国際出願ＰＣＴ／ＳＥ９８／０２４６２、ＰＣＴ／ＳＥ９８／０２４６３およびＰＣＴ／ＳＥ９８／０２４６４に開示される発明は、関連部分において本発明の好ましい具体例をなす。３つの出願はすべて出典明示により本発明の一部とみなす。
【００８２】
特許実施例
実施例１．遊離ＩgＥ、ＩgＧに結合したＩgＥ、およびＩgＥに対する抗体の割合の測定のための試験ストリップ
図２Ａ、２Ｂおよび３では、輸送流の方向が矢印（１０）で示されている。各変法では輸送流の最初にサンプル用の領域ＡＳＺ（１１）、その下流に領域ＤＺ（１２）、輸送流の末端に吸引部（１３）、および各種領域の間に輸送領域としてのみ働く部分（１４）があってよい。
図２Ａ：この図面の変法は５つの分離領域(ＳＺ)(ここでリガンドは同一であっても異なっていてもよいし、あるいは異なる量で存在していてもよい（１５−１９）)および試薬用のＡＲ*Ｚ（２０）を有する。
図２Ｂ：これはＡＳＺ（１１）とＡＲ*Ｚ（２０）が一致している（２１）こと以外は図２Ａと同様の領域配列である。この領域配列はまた、分析物自体がＤＺにおけるシグナル複合体の一部である場合に検出可能な場合にも使用してよい。この時、ＡＲ*Ｚは必要でない。
図３：この図面の領域配列は２つのタイプの分離領域、それぞれＳＺ１（２２、２３）およびＳＺ２（２４）と、ＳＺ１（２３）とＳＺ２（２４）の下流に独立にＡＲ*Ｚを示す。
【００８３】
自己抗体(ＩgＡ、ＩgＧおよびＩgＭ)に対する遊離のＩgＥおよびＩgＥ複合体結合の測定が注目される。しかしながら上記すべてのうち、遊離ＩgＥは厳密に定量しなければならない。ＩgＥの測定に関する現行の試験では、自己抗体は試薬抗体(抗ＩgＥ抗体)と同じＩgＥエピトープに結合でき、次いでこれはこの試験の設計によっても異なるが、誤った低すぎる総ＩgＥレベルを与える。ＩgＥの測定前にＩgＧ、ＩgＭおよびＩgＡを分離することで、遊離ＩgＥが検出され得る。自己抗体の量はまた、複合体としても、ＩgＥに向けられた遊離ＩgＧ抗体としても定量されるはずである。
【００８４】
一般試験の大部分は希釈率の高い血清サンプルと相互作用させる固相(ＤＺに相当)に結合したＩgＥを用いる方法により遊離抗体を測定する。この血清サンプルが抗ＩgＥ抗体を含むならば、後者は免疫複合体を形成する固相に結合する。非結合血清成分を洗い去った後、例えば酵素で標識した抗ＩgＧ抗体(Ｒ*)を加える。過剰量の標識抗体(Ｒ*)を除去し、固定化された免疫複合体に結合した酵素標識抗ＩgＧ抗体(Ｒ*)の量を好適な基質の添加により求める。これらの試験の感受性は固相に対するＩgＧの非特異的結合により制限される。このＩgＧ集団のＩgＥ特異的部分は一般に非常に小さく、非特異的に結合したＩgＧの量から区別するのは困難であると考えられる。ＩgＧを固相に捕捉し、ＩgＥの結合を測定することで、この制限は回避できる。
【００８５】
ＩgＧ複合体と結合したＩgＥを測定する場合、ＩgＧは、共有結合した抗ＩgＧ抗体(キャプチャー)を支持する固相(ＤＺに相当)に捕捉される。標識された抗ＩgＥ抗体(Ｒ*)を加えることで、複合体結合ＩgＥの量が測定できる。
【００８６】
流れがまず１以上の分離領域(ＳＺ)を、次に、検出領域(ＤＺ)を通る上記のような横方向の液体輸送に基づく免疫アッセイ技術の使用により、ＩgＥ−ＩgＧ関連パラメーターの単純な測定に多くの可能性が開かれる。例えばまず、遊離ＩgＥおよびＩgＧクラスのヒト抗ＩgＥ抗体と結合したＩgＥの混合物を含むサンプルを作製して、固相に結合した抗ヒトＩgＧ抗体(ＳＺにおけるリガンド)を含有する領域、次に、固相に結合した抗ＩgＥ抗体(ＤＺにおけるキャプチャー)を含有する領域を通過させ、ＩgＥとＩgＧクラスの抗ＩgＥ抗体との複合体のサンプル含量が分離領域に結合し、一方、遊離のＩgＥは検出領域へと進み、そこでそれは検出領域（１２）の上流であり、単に検出領域を通すためだけの分離領域（１５−１９）の下流に標識された抗ＩgＥ抗体(Ｒ*)を加えることにより測定される(図２Ａの領域２０での添加)。抗ＩgＥ抗体(Ｒ*)も分離領域を通過させることで、抗ヒトＩgＧ(リガンド)と結合することによって分離領域に捕捉されるＩgＥ−ＩgＧ複合体の量も測定され得る(ＡＳＺとＡＲ*Ｚが一致)(図２Ｂの領域２１における添加、ＡＳＺはＡＲ*Ｚと共通)。分離領域では、ＩgＥとＩgＧクラスの抗ＩgＥ抗体との複合体の他、ＩgＥに対する遊離の抗体も存在する。後者の量は、標識ＩgＥ(Ｒ*1)を分離領域に通すことにより測定され得る。次いで標識ＩgＥ(Ｒ*1)は別の試験でＳＺの上流のメンブランストリップに添加される。
【００８７】
血清中のＩgＧの量が極めて高い場合には、高濃度の抗ＩgＧを伴うバンドがいくつかＳＺとして使用しなければならない。複合体と結合した、また遊離の抗ＩgＥ抗体は次に双方ともＩgＧの総量によるいくつかのバンドにわたって阻害され、これらのバンドのシグナル強度の合計がＩgＥに対する抗体の量を示す。
【００８８】
以下の実施例では、人工的に製造したＩgＥとＩgＧの複合体の試験成分を示している。当該複合体はＩgＥに対するモノクローナル抗体を用いて製造したが、それゆえマウスＩgＧに対する抗体は分離膜に結合している。この検出系では、複合体を形成している抗体以外のエピトープに対して向けられたＩgＥ抗体が用いられている。これにより検出系において遊離のＩgＥと同様に複合体の測定が可能となる。
【００８９】
分離膜１(ＳＺ１)：４℃にて２０時間、２５mＭ リン酸バッファー、pＨ ６.６中で、１.０mg／mlの抗体と２０mg／mlポリスチレンアルデヒド粒子を混合することにより、ヒツジ抗マウスＩgＧ(Ｆc)(リガンド１)とポリスチレンアルデヒド粒子(直径０.２９μm，ＩＤＣ，Ｐortland，Ｏregon，Ｕ.Ｓ.Ａ.)とを結合させた。該粒子を２０mＭ ホウ酸バッファー、pＨ ８.６中で洗浄し、粒子５０mgにつき１５mgのＮaＣＮＢＨ3(Ｓigma−Ａldrich Ｃhemie，Ｓteinheim，Ｇermany)と２０時間反応させた。次いでこの粒子を２０mＭ ホウ酸バッファー、pＨ ８.６中で繰り返し懸濁させ、遠心分離し、デカントすることで洗浄した。この粒子懸濁液を３％ トレハロース、２０mＭ ホウ酸バッファーで希釈して２５mg粒子／mlとした。希釈した懸濁液を、ニトロセルロース膜(ポリエステル上のニトロセルロース、孔径５μm、Ｗhatman Ｉnternational Ｌtd，Ｅngland)のストリップ(２０cm×３cm)にストリップの長辺に平行な幅０.３cmの２本のラインとなるように噴霧した。噴霧装置(ＩＶＥＫライナーストリッパー，ＩＶＥＫ Ｃorporation，Ｖermont，Ｕ.Ｓ.Ａ.)では、各ラインにつき約５０μgのポリスチレン粒子／cmが送達された。当該膜を室温で乾燥させた後、小片に切断した(０.５cm×３cm)。
【００９０】
分離膜２(ＳＺ２)：マウスＩgＧ(リガンド２)を２０mＭ ホウ酸バッファーで希釈して３.４mgタンパク質／mlとした。希釈した抗体をニトロセルロース膜(上記と同様のタイプ)のストリップ(２０cm×４cm)上に、約６.８μg抗体／cmを含む幅０.３cmのライン状になるように噴霧した(上記の噴霧装置)。この膜を室温で乾燥させた後、小片に切断した(０.５cm×１cm)。
【００９１】
検出膜(ＤＺ)：マウス抗ＩgＥモノクローナル抗体(ＩgＥのドメイン４に対して向けられたもの、キャプチャー)を２０mＭ ホウ酸バッファーで希釈して１.０mgタンパク質／mlとした。希釈した抗体をニトロセルロース膜(上記と同様のタイプ)のストリップ(２０cm×４cm)上に、約１μg抗体／cmを含む幅０.１５cmのライン状になるように噴霧した(上記の噴霧装置)。この膜を室温で乾燥させた後、抗体を含んだラインが短辺と平行となるように小片に切断した(０.５cm×４cm)。
【００９２】
複合膜：図３を参照。一枚の分離膜１(０.５cm×３cm、それぞれ図３のＳＺ１、２２および２３)を一枚の分離膜２(０.５cm×１cm、図３のＳＺ２、２４)に貼り付け、このようにして得られた複合分離膜を次に検出膜のストリップ(０.５cm×４cm、図３のライン＝ＤＺ＝１２)に組み込んだ(短辺に対してそれらの間にギャップを持つ短辺)。これらの小片を接着テープで底辺にともに固定した。上辺には、隣り合う２辺の短辺といく分か重ねてニトロセルロース片(０.５cm×０.３cm)(Ａ１００、１２μm、Ｓchleicher and Ｓchull，Ｄassel，Ｇermany)を置いた。後者の小片はさらに接着テープで正しい位置に固定した。セルロースフィルター(図３の１３)(０.５cm×２cm；ＧＢ００４、Ｓchleicher and Ｓchull，Ｄassel，Ｇermany)を検出膜の固定されていない短辺と重ねて吸引膜として固定した。領域の配列はＡＳＺ、ＳＺ１、ＳＺ２、ＤＺであった。
【００９３】
炭素粒子複合体(Ｒ*)の製造：
炭素懸濁液(原液)：２ｇの炭素粒子(sp １００、Ｄegussa，Ｇermany)を５mＭ ホウ酸バッファー、pＨ ８.４ ２００mlに懸濁し、氷浴中で、１００％ 振幅、９.９＋２秒パルスにて５分間３回音波処理を施した(ＶibraＣell ６００Ｗ，１.５cm探針，Ｓoniced Ｍaterials，Ｄanebury，Ｃonnecticut，Ｕ.Ｓ.Ａ.)。
【００９４】
炭素粒子複合体(Ｒ*)：抗ＩgＥモノクローナル抗体(ＩgＥのドメイン３に向けられたもの)のＦab' ３５μg／mlと炭素粒子(２５０μg／ml)懸濁液とを３時間混合した。ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を１％まで加え、粒子をさらに３０分間混合した後、１％ ＢＳＡ(０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.５、０.０５％ ＮaＮ3)中で遠心分離することで洗浄し、洗浄バッファーで希釈して０.８mg炭素／mlとした。調製済みの炭素複合体を洗浄バッファー中４℃で保存した。
【００９５】
サンプル材料：
ＩgＥとＩgＧとの複合体の製造：１mgのＩgＥ(ＮＤ)／mlと５mg／mlのマウス抗ＩgＥモノクローナル抗体(ＩgＧクラスのもので、ドメイン２に向けられたもの)を５０mＭ リン酸バッファー、pＨ ７.５中、室温で２.７５時間反応させた。サンプル混合物(０.３５ml)をＳuperdexTM ２００prep級、１６／６０(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｓweden)で分離した。この分離により識別できる２つの複合体ピークが得られ、一方のピークはＩgＥ−ＩgＧに相当し、もう一方のピークはＩgＧ−ＩgＥ−ＩgＧに相当した。
【００９６】
125Ｉ−標識タンパク質による制御(標識抗ＩgＥ抗体および標識ＩgＥ)：
分離膜１(リガンド＝抗マウスＩgＧ)：マウス抗ＩgＥ抗体(ＩgＥのドメイン２に向けられたもの)とＩgＥを125Ｉ(クロラミンＴ)で、抗ＩgＥ抗体については０.０３、ＩgＥについては１.５の標識度で標識した。この標識タンパク質を６％ ＢＳＡ(５０mＭ ホウ酸バッファー、pＨ ７.５)で希釈し、抗ＩgＥ抗体は約２.４μg／ml、ＩgＥは０.０６μg／mlとした。より高レベルの抗ＩgＥ抗体を測定するために125Ｉ−抗ＩgＥ抗体(ドメイン２)と非標識の抗ＩgＥ抗体(ドメイン２に向けられたもの)とを混合した。吸引膜(０.５cm×２cm、ＧＢ００４、Ｓchleicher and Ｓchull，Ｄassel，Ｇermany)を、ヒツジ抗マウスＩgＧ(Ｆc)を吸着させた一枚の分離膜１(０.５cm×４cm)の一方の末端にテープで貼り付けた。１０μlの０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.５(６％ ＢＳＡ、０.０５％ ＮaＮ3)、次いで１０μlの125Ｉ−タンパク質溶液を分離膜の固定されていない末端につけた。次いで４×１０μlの０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.５(１％ ＢＳＡ、０.０５％ ＮaＮ3)を固定されていない末端へ添加することにより横方向の流れを開始させた。液体がすべて膜へ移動した後、シートの種々の領域(分離および輸送領域)の放射能を測定するために細かく切断した。ガンマカウンターで測定を行い、遊離の放射性ヨウ素量の補正をした後に、種々の領域で捕捉された125Ｉ−タンパク質(標識抗ＩgＥ抗体および標識ＩgＥ、各々)の割合を算出した。ＩgＥは、ＩgＧ抗体がリガンドである分離領域には、中間の輸送領域以上には結合しなかった。８５％を超えるＩgＥが膜を通過した。他方、１２０ngまでの抗ＩgＥ抗体を添加した場合には、標識抗ＩgＥ抗体はすべて２つの分離領域へ結合した。１０００ngの抗ＩgＥ抗体を添加した場合には、２００ngがそれぞれの抗マウスＩgＧ領域(分離領域)に結合し、５００ngが通過した。ヒト血清中のＩgＧに関しては、血清を１／１００(約１０００ngのＩgＧ)希釈し、より多くの抗ＩgＧ抗体(ヒトＩgＧに対するもの)がしっかりと固定されたリガンドとして使用されば、この能力で十分であると考えられる。
【００９７】
分離膜２(リガンド＝マウスＩgＧ)：この膜を導入して、分離膜１から遊離した可能性がある、あるいはバックグラウンドシグナルを強める結果となる、検出領域に結合するであろう抗マウスＩgＧ抗体のいずれをも結合させた(抗マウスＩgＧ抗体は２つのＦab部分を有しており、そのため双方がマウスＩgＧであるＲ*およびキャプチャーと同時に結合する)。遊離したヒツジ抗ＩgＧの量は検出領域の前のマウスＩgＧを含む分離領域で結合させるのが有利である。この捕捉領域(ＳＺ２)によって、検出領域における非特異的な結合を６倍を超えて低下させることができる。
【００９８】
分離と免疫化学測定を併用する標準プロトコール：
２０μlの洗浄バッファー(１％ ＢＳＡ、０.９％ ＮaＣl、１％ Ｔween２０、０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.４、０.０５％ ＮaＮ3)を上記のもの(配列ＳＺ１、ＳＺ２、ＤＺ)の複合ストリップ上の分離膜１の固定されていない末端の縁(図３のＡＳＺ＝１１)につけた。次いで１０μlのＩgＥ標準(ＩgＥ、４〜５００kＵ／ｌ、０.０１〜１.２μg／ml)およびサンプル(約１μg複合体／mlのＩgＥ−ＩgＧ複合体、約１.３μg複合体／mlのＩgＧ−ＩgＥ−ＩgＧ複合体)をそれぞれ添加した。両サンプルおよび標準は６％ ＢＳＡおよび０.０５％ ＮaＮ3を含む５０mＭ リン酸バッファー、pＨ ７.５で希釈した。洗浄バッファー、０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.４(１％ ＢＳＡ、０.９％ ＮaＣl、１％ Ｔween２０、０.０５％ ＮaＮ3)を含む０.６cm×０.６cm×０.３cmのセルローススポンジをストリップの分離部分の固定されていない末端に置くことで横方向の流れを開始させた。試験溶液は分離領域(図３の２２、２３、２４)および検出領域(図３の１２)を通って、吸引セルローススポンジ(図３の１３)へと移動した。７分間流した後、１０μlの炭素粒子と抗ＩgＥ抗体の複合体(Ｒ*)(０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.４(１％ ＢＳＡ、０.０５％ ＮaＮ3)中、０.８mg炭素／ml)を検出領域とストリップの分離部分（２５）との間の位置に添加した。さらに５分間流した後、検出領域は灰色ないし黒色となった。黒色化部分をレーザースキャナ(Ｕltroscan，Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala，Ｓweden)で読み取り、ピーク強度を算出し、ＩgＥ標準曲線で読み取ることで濃度を求めた。ＩgＥ濃度が高いほど、シグナルは黒みを増す。
【００９９】
対照として、リガンドを含まないニトロセルロースに置き換えた分離領域１を有するストリップについても同様評価した(標準およびサンプル)。
【０１００】
結果：
標準(ＩgＥ)では両測定系において黒色化曲線での強度は同等であった。ＳＺ１をリガンドを含まないニトロセルロースに置き換えた場合には、複合体(ＩgＥ−ＩgＧおよびＩgＧ−ＩgＥ−ＩgＧ)はＤＺにおける強い黒色シグナルとして検出された。ＳＺ１がリガンドとして抗マウスＩgＧを含んでいる場合には、ＤＺにおいて複合体のシグナルは検出できなかった。
【０１０１】
表１
【表１】
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【０１０２】
このように抗マウスＩgＧを含む分離領域では９７％を超えるまでの複合体が捕捉された。
【０１０３】
実施例２．患者サンプルにおけるＣＤ−トランスフェリンの測定法
陰イオン交換特性を有する分離膜：ニトロセルロース膜(５μm、ポリエステル上のニトロセルロース、Ｗhatman Ｉnternational Ｌtd，Ｅngland)を超高純度の水(Ｍilli Ｑ，Ｍillipore Ｃorp.，Ｂedford，ＭＡ，Ｕ.Ｓ.Ａ.)中の０.１％ ポリエチレンイミン(ＰＥＩ,Ｓigma，Ｓt Ｌouis，ＭＯ，Ｕ.Ｓ.Ａ.)溶液に入れた。この溶液を３時間振盪し、次いで３０分間Ｔween２０中に入れ、風乾させ、その後、プラスチックバッグに入れて４℃で保存した。膜の変性度はブロモフェノールブルー(pＫ＝４.１)で確認した。
【０１０４】
荷電タンパク質と相互作用する変性膜の機能を、シートのストリップにおいて横方向の液流で125Ｉ標識タンパク質(クロラミンＴ法により標識したウシ血清アルブミン、テトラアシアロトランスフェリンおよびアシアロトランスフェリン)を輸送することにより確認した。最も高いpＩを有するタンパク質が液流とともに移動する傾向が最も強かった。別の試験において液体が漸増濃度のＮaＣl(０〜１０００mＭ)を含んでいる場合、最も低いpＩを有するタンパク質の移動率がか最も影響を受けた。これらの２つの機能の制御は、ポリエチレンイミンによる処理において正電荷を持つ官能基が導入され、これらの官能基がタンパク質およびＮaＣlのイオン交換基として機能し得るということを支持するものである。
【０１０５】
検出膜：４℃にて１８時間、２５mＭ リン酸バッファー、pＨ ６.６中で、１.３mg／mlの抗体と２２mg／mlポリスチレンアルデヒド粒子とを混合することにより、抗トランスフェリンモノクロナール抗体とポリスチレンアルデヒド粒子(直径０.２９μm，ＩＤＣ，Ｐortland，Ｏregon，Ｕ.Ｓ.Ａ.)とを結合させた。該粒子を２０mＭ ホウ酸バッファー、pＨ ８.６中で洗浄し、粒子４０mg／mlにつき５mgのＮaＣＮＢＨ3(Ｓigma−Ａldrich Ｃhemie，ＧmbＨ Ｓteinheim，Ｇermany)と１８時間反応させた。この粒子を２０mＭ ホウ酸バッファー、pＨ ８.６中で洗浄し、６％ トレハロースを含む２０mＭ ホウ酸バッファーで希釈して１４mg粒子／mlとした。希釈した懸濁液を、ニトロセルロース膜(５μm、ポリエステル支持体上のニトロセルロース、Ｗhatman Ｉnternational Ｌtd，Ｅngland)のストリップ(２０cm×４cm)にストリップの中央に、かつストリップの長辺に平行な幅１.４mmのラインとなるように噴霧した。噴霧装置は実施例１と同一のものであり、これにより約１４μgのポリスチレン粒子／cmが送達された。当該膜を室温で乾燥させた後、プラスチック袋に入れて４℃で保存した。
【０１０６】
複合膜：図１を参照。分離膜のストリップ(０.５cm×３cm)(図１の＝ＳＺ＝５)の末端を０.５cmに短くした検出膜のストリップ(０.５cm×３.５cm、図１の抗体を含むライン＝ＤＺ＝４)の末端の下辺にテープで貼り付けた。この末端間のギャップはニトロセルロース片(０.３cm×０.５cm、Ａ１００、１２μm、Ｓchleicher and Ｓchull，Ｄassel，Ｇermany)を重ねることでブリッジし、これをテープで固定した。吸引膜(図１の９)としてセルロースフィルター(０.５cm×２cm、ＧＢ００４、Ｓchleicher and Ｓchull，Ｄassel，Ｇermany)を検出膜から送達されるストリップの固定されていない末端と重ねてテープで固定した。
【０１０７】
炭素粒子複合体(Ｒ*)
炭素懸濁液(原液)：２ｇの炭素粒子(sp４、Ｄegussa，Ｇermany)を５mＭ ホウ酸バッファー、pＨ ８.４ １００mlに懸濁し、実施例１と同じ装置を用いて、氷浴中で、１００％ 振幅、５＋５秒パルスにて５分間音波処理を施した。
【０１０８】
炭素粒子複合体：抗トランスフェリンモノクロナール抗体１００μg／mlと炭素懸濁液(２５０μg／ml)とを２時間混合した。ＢＳＡを１％まで加え、粒子をさらに３０分間混合した後、０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.５、(１％ ＢＳＡおよび０.０５％ ＮaＮ3を含む)中で遠心分離することで洗浄し、洗浄バッファーで希釈して１.９mg炭素／mlとした。調製済みの炭素複合体を洗浄バッファー中４℃で保存した。
【０１０９】
サンプル材料：
テトラアシアロトランスフェリン：テトラアシアロトランスフェリンをヒトトランスフェリン(主としてテトラアシアロトランスフェリン)の鉄で飽和した調製物からＭono Ｑ(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala Ｓweden)イオン交換クロマトグラフィーにより単離した。
【０１１０】
アシアロトランスフェリン：トランスフェリンの鉄で飽和した調製物(Ｓigma，Ｓt Ｌouis，ＭＯ，Ｕ.Ｓ.Ａ.)をノイラミダーゼ(Ｂehringwerke，Ｍarburg，Ｇermany)で処理した後、アシアロトランスフェリンをＭono Ｑ(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala Ｓweden)イオン交換クロマトグラフィーにより単離した。
【０１１１】
等電点(pＩ)：これらの値を個々のイソ型調製物とＢＳＡについて、Ｐhast系(Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala Ｓweden)における等電点電気泳動法により求めた。アシアロ型 pＩ＝５.７、テトラアシアロ型 pＩ＝５.３、およびウシ血清アルブミン pＩ＝４.７。
【０１１２】
トランスフェリン標準：上記のように調製したアシアロトランスフェリンを０.２％ ＢＳＡ、０.１％ Ｔween２０、０.１mＭ クエン酸鉄(III)、１mＭ ＮaＨＣＯ3および０.０５％ ＮaＮ3を含む２０mＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、pＨ ６.３で希釈して濃度０.０７〜１６.６μgトランスフェリン／mlとし、標準として使用した。
【０１１３】
血清サンプル：１１種の血清サンプルと６種の血清対照を０.１％ ウシγグロブリン(Ｓigma，Ｓt Ｌouis，Ｕ.Ｓ.Ａ.)、０.１％ Ｔween２０、０.１mＭ クエン酸鉄(III)、１mＭ ＮaＨＣＯ3および０.０５％ ＮaＮ3を含む２０mＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、pＨ ６.３で１／５０希釈した。血清サンプルを予めＣＤＴect(Ｐharmacia ＆ Ｕpjohn Ｄiagnostics ＡＢ，Ｕppsala Ｓweden)によってＣＤＴについて分析した。ＣＤＴectはＣＤ−トランスフェリンを測定するものである。
【０１１４】
分離と免疫化学測定を併用する標準プロトコール：２μlのサンプル(トランスフェリンの希釈系および希釈した血清サンプルそれぞれ)を上記のものの複合ストリップ上の分離領域を有する膜部分の固定されていない末端の縁(図１のＡＳＺ＝３)から１cmの位置につけた。１５mＭ ＮaＣlおよび０.１％ Ｔween２０を含む２０mＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳバッファー、pＨ ６.５を吸収させた０.６cm×０.６cm×０.３cmのセルローススポンジ(図１の８)を分離領域の固定されていない末端に置くことで横方向の液流を開始させた。分離領域(図１の５)では分析物(ＣＤ−トランスフェリン)とそのヘテロ型(他のトランスフェリン)は領域内にしっかりと固定された正電荷(ＰＥＩ処理により導入されたリガンド)によって引き寄せられ、大きな負電荷を有するヘテロ型(他のトランスフェリン)が小さな負電荷を有するヘテロ型(ＣＤ−トランスフェリン)より強く引き寄せられ、すなわちＣＤ−トランスフェリンはトリシアロ−、テトラアシアロ−、ペンタアシアロ−などのトランスフェリンよりも容易に液流とともに移動する。そのため複合ストリップ／マトリックスを通るその移動中、全トランスフェリン量の一定の割合が検出領域(図１のＤＺ＝４)において抗トランスフェリン抗体(キャプチャー)と結合できる。４分間流した後、５μlの炭素粒子と抗トランスフェリン抗体の複合体(Ｒ*)(３０％ トレハロース、１％ Ｔween２０、１％ ＢＳＡ、０.０５％ ＮaＮ3を含む０.１Ｍ ホウ酸バッファー、pＨ ８.４中、１.８mg炭素／ml)を分離領域と検出領域との間(図１の領域（６）(＝ＡＲ*Ｚ))に添加した。さらに５分間後、流れを止め、検出領域の黒色部をレーザースキャナ(Ｕltroscan，Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala，Ｓweden)で読み取り、アシアロトランスフェリンの希釈系の測定値に対して読み取って濃度を算出した。サンプルにおけるＣＤ−トランスフェリンのレベルが高いほど、黒色シグナルが強くなる。
【０１１５】
表２：結果
【表２】
0004579414.tif 000003
【０１１６】
本発明の方法によって得られた測定値はＣＤＴectによって得られたものとの非常に優れた一致(相関係数０.９７)を示した。本発明はＣＤＴectの実施よりも極めて迅速、かつ簡単である。
【０１１７】
実施例３．分離領域においてＳambucus Ｎigraレクチンを含む試験ストリップ
分離膜：セルロースシート(４cm×１２cm)(セルロースフィルター５４、Ｗhatman Ｉnternational Ｌtd，Ｅngland)をシアノ−ジエチル−アミノピリジン(ＣＤＡＰ)(ＫohnおよびＷilchek，Ａppl. Ｂiochem. Ｂiotechnol. ９（１９８４）２８５−３０４)によって活性化した。活性化したシートを０.１Ｍ ＮaＨＣＯ3、pＨ ８.４中の０.１mg／mlのＳambucus Ｎigraレクチン(炭素鎖の末端位にあるシアル酸と結合する；Ｖector Ｌaboratories Ｉnc.，Ｂurlingame. ＣＡ. Ｕ.Ｓ.Ａ)溶液に入れた。この溶液を２時間振盪し、次いでそのシートをａ）０.１Ｍ ＮaＨＣＯ3、ｂ）０.５Ｍ ＮaＣl、ｃ）蒸留水、ｄ）０.１Ｍ 酢酸バッファー、pＨ ４.５、ｅ）０.１Ｍ ＮaＨＣＯ3、pＨ ８.４、ｆ）０.５Ｍ ＮaＣl、ｇ）蒸留水、ｈ）０.１Ｍ 酢酸バッファー、pＨ ４.５、ｉ）０.１％ Ｔween２０を含む５mＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、pＨ ６.４中に入れた。種々の水浴間では、過剰な液体をキッチンロールペーパーで吸い取った。洗浄工程の後、シートを風乾させ、プラスチックバッグに入れて４℃で保存した。
【０１１８】
シートを使用する前に、シートを粘着プラスチック(７５μm粘着ポリエステルフィルム；Ｇelman Ｓcience Ｉnc，Ａnn Ａrbor，ＭＩ，Ｕ.Ｓ.Ａ.)に貼り付けた。
【０１１９】
検出領域と複合ストリップを含む膜：これらの膜を実施例２と同様の方法で作製すればよい。図１も参照。ＳＺにおけるリガンドはここではレクチンである。
【０１２０】
炭素粒子複合体(Ｒ*)と125Ｉ標識タンパク質：実施例２を参照。
【０１２１】
125Ｉ標識タンパク質による分離膜の制御：テトラアシアロおよびアシアロトランスフェリンとウシアルブミンを125Ｉ(クロラミンＴ、標識度０.０８〜０.１３)で標識した。標識タンパク質を０.１％ Ｔween２０、０.０４mＭ クエン酸鉄(III)および０.０５％ ＮaＮ3を含む１０mＭ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、pＨ ６.４で希釈して約０.３μg／mlとした。さらに０.４mgＢＳＡ／mlを加えた。
【０１２２】
分離膜のストリップ(０.５cm×４cm)と一枚のセルロース吸引膜(０.５cm×２cm、ＧＢ００４、Ｓchleicher and Ｓchull，Ｄassel，Ｇermany)を、それらの末端がある程度重なるように下辺でテープで貼り合わせた。１μlの125Ｉタンパク質溶液をそれぞれの分離膜の固定されていない末端から１cmの位置につけた。セルローススポンジ(０.６cm×０.６cm×０.３cm)を分離膜の固定されていない末端に置くことで横方向の流れを開始させた。このスポンジには０.１％ Ｔween２０とともに０.５Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＣaＣl2を含む２０mＭ ＴＲＩＳ−ＨＣＬバッファー、pＨ ７.５を吸収させた。２、４、６および１０分後それぞれにセルローススポンジを取り除き、流れを中断させて、分離膜の固定されていない末端から膜を２および３cm切断した。放射能を持つ膜片をガンマカウンターで測定し、２および３cm移動した添加の割合を算出した。１cm以上の移動についての値を表４に示している。
【０１２３】
表４：分離膜において１cmを超えて移動した全添加125Ｉタンパク質に対する％
【表３】
0004579414.tif 000004
【０１２４】
結論：この結果より、テトラアシアロトランスフェリンはＳambucus Ｎigraレクチンによって分離膜で著しく遅延されているが、アシアロトランスフェリンおよびＢＳＡではそれと同程度まで遅延されることがないことが明らかである。この結果により、Ｓambucus Ｎigraレクチンを含む分離膜を実施例２と同様の検出膜と組み合わせ、ＣＤ−トランスフェリンよりシアル酸の含量の高いトランスフェリンを含むサンプル中のＣＤ−トランスフェリンを定量するのに使用してもよいことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＡＳＺ、ＡＲＺ、ＳＺおよびＤＺを有する簡単な変形である。ＡＲＺとＡＳＺは分離されている。
【図２Ａ】  主として、同一のリガンドを有する５個の分離領域を有することで図１の変形とは異なる。ＡＲＺとＡＳＺは分離されている。
【図２Ｂ】  ＡＲＺとＡＳＺが一致しているという点を除いては、図２Ａの変形と同様である。
【図３】  実施例１において使用される、３つの分離領域を有する本発明の流動マトリックスの変形を示す。このうち２つの領域(ＳＺ１)はあるリガンドを呈示し、もう１つの領域(ＳＺ２)は別のリガンドを呈示する。ＡＳＺとＡＲＺ(＝ＡＲ＊Ｚ)は分離されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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