(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0004537512.tif 000010
〔式中、Ｅは３級炭素を含んでいる（Ｃ４−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ１はＭｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、またはＦであり；
Ｒ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、もしくはＯＥｔであるか、またはＲ２は、Ｒ３、およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｆ、Ｃｌ、またはＯＭｅであり；
ただし、
ａ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＭｅである場合は；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌまたは３，５−ジ−Ｆであり；
ｂ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌであり；
ｃ）Ｒ１がＥｔであり、かつＲ２がＯＭｅまたはＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは
ｉ）３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌ、３−ＯＭｅ、２−Ｃｌ−５−Ｍｅ、２−Ｃｌ、または３−Ｍｅであり；または
ｉｉ）Ｒ６がＨであり、Ｒ４がＭｅであり、さらにＲ５はＦ、Ｃｌ、またはＣＨ２ＯＨであり；
ｄ）Ｒ１がｉ−Ｐｒである場合は；Ｒ２はＯＭｅまたはＯＥｔであり；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｅ）Ｒ３がＥｔである場合は；Ｒ２はＨであり、Ｒ１はＦまたはＣｌであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｆ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ環を形成する場合は；Ｒ１はＭｅまたはＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｇ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、ジヒドロフリル環またはジヒドロピリル環を形成する場合は；Ｒ１はＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；および
ｈ）Ｒ２がＯＨである場合には；Ｒ１はＥｔであり、Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅである。〕のリガンド；
を含む外来遺伝子発現を調節するための医薬組成物であって、
前記遺伝子発現の調節が、
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンド結合ドメイン；
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；および
ｄ）前記式Ｉのリガンド
を含むエクダイソンレセプター複合体を、
ａ）外来遺伝子；および
ｂ）応答配列；
を含み、
ａ）前記外来遺伝子が前記応答配列の制御下にあり；さらに
ｂ）前記式Ｉのリガンドの存在下で前記ＤＮＡ結合ドメインの前記応答配列への結合が前記外来遺伝子の活性化または抑制をもたらす；
ＤＮＡ構造と接触させることを含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
有効量の式Ｉ：
【化２】
0004537512.tif 000011
〔式中、
Ｅは３級炭素を含んでいる（Ｃ４−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ１はＭｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、またはＦであり；
Ｒ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、もしくはＯＥｔであるか、またはＲ２は、Ｒ３、およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｆ、Ｃｌ、またはＯＭｅであり；
ただし、
ａ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＭｅである場合は；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌまたは３，５−ジ−Ｆであり；
ｂ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌであり；
ｃ）Ｒ１がＥｔであり、かつＲ２がＯＭｅまたはＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは
ｉ）３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌ、３−ＯＭｅ、２−Ｃｌ−５−Ｍｅ、２−Ｃｌ、または３−Ｍｅであり；または
ｉｉ）Ｒ６がＨであり、Ｒ４がＭｅであり、さらにＲ５はＦ、Ｃｌ、またはＣＨ２ＯＨであり；
ｄ）Ｒ１がｉ−Ｐｒである場合は；Ｒ２はＯＭｅまたはＯＥｔであり；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｅ）Ｒ３がＥｔである場合は；Ｒ２はＨであり、Ｒ１はＦまたはＣｌであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｆ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ環を形成する場合は；Ｒ１はＭｅまたはＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｇ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、ジヒドロフリル環またはジヒドロピリル環を形成する場合は；Ｒ１はＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；および
ｈ）Ｒ２がＯＨである場合には；Ｒ１はＥｔであり、Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅである。〕のリガンドを植物に投与することを含み、
前記植物の細胞が
ａ）１）ＤＮＡ結合ドメイン；
２）リガンド結合ドメイン；および
３）トランスアクチベーションドメイン；
を含むエクダイソンレセプター複合体；並びに
ｂ）１）外来遺伝子；および
２）応答配列；
を含み、
ａ）前記外来遺伝子が前記応答配列の制御下にあり；さらに
ｂ）前記リガンドの存在下で前記ＤＮＡ結合ドメインの前記応答配列への結合が遺伝子の活性化または抑制をもたらす；
ＤＮＡ構造を含む、植物中で、前記外来遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項３】
ａ）式Ｉ：
【化３】
0004537512.tif 000012
〔式中、
Ｅは３級炭素を含んでいる（Ｃ４−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ１はＭｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、またはＦであり；
Ｒ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、もしくはＯＥｔであるか、またはＲ２は、Ｒ３、およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｆ、Ｃｌ、またはＯＭｅであり；
ただし、
ａ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＭｅである場合は；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌまたは３，５−ジ−Ｆであり；
ｂ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌであり；
ｃ）Ｒ１がＥｔであり、かつＲ２がＯＭｅまたはＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは
ｉ）３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌ、３−ＯＭｅ、２−Ｃｌ−５−Ｍｅ、２−Ｃｌ、または３−Ｍｅであり；または
ｉｉ）Ｒ６がＨであり、Ｒ４がＭｅであり、さらにＲ５はＦ、Ｃｌ、またはＣＨ２ＯＨであり；
ｄ）Ｒ１がｉ−Ｐｒである場合は；Ｒ２はＯＭｅまたはＯＥｔであり；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｅ）Ｒ３がＥｔである場合は；Ｒ２はＨであり、Ｒ１はＦまたはＣｌであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｆ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ環を形成する場合は；Ｒ１はＭｅまたはＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｇ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、ジヒドロフリル環またはジヒドロピリル環を形成する場合は；Ｒ１はＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；および
ｈ）Ｒ２がＯＨである場合には；Ｒ１はＥｔであり、Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅである。〕のリガンドに暴露されることに反応しない細胞を選択し；
ｂ）１）遺伝子が応答配列の制御下にある
ａ）ポリペプチドをコードする外来遺伝子；および
ｂ）応答配列；
を含むＤＮＡ構造；および
２）ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンドのための結合ドメイン；および
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；
を含むエクダイソンレセプター複合体
を前記細胞中に導入し；さらに
ｃ）前記細胞を前記リガンドに暴露する工程を含むポリペプチドを製造する方法。
【請求項４】
式Ｉ：
【化４】
0004537512.tif 000013
〔式中、
Ｅは３級炭素を含んでいる（Ｃ４−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ１はＭｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、またはＦであり；
Ｒ２はＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、もしくはＯＥｔであるか、またはＲ２は、Ｒ３、およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成するか、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｆ、Ｃｌ、またはＯＭｅであり；
ただし、
ａ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＭｅである場合は；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌまたは３，５−ジ−Ｆであり；
ｂ）Ｒ１がＭｅであり、かつＲ２がＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌであり；
ｃ）Ｒ１がＥｔであり、かつＲ２がＯＭｅまたはＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは
ｉ）３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌ、３−ＯＭｅ、２−Ｃｌ−５−Ｍｅ、２−Ｃｌ、または３−Ｍｅであり；または
ｉｉ）Ｒ６がＨであり、Ｒ４がＭｅであり、さらにＲ５はＦ、Ｃｌ、またはＣＨ２ＯＨであり；
ｄ）Ｒ１がｉ−Ｐｒである場合は；Ｒ２はＯＭｅまたはＯＥｔであり；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｅ）Ｒ３がＥｔである場合は；Ｒ２はＨであり、Ｒ１はＦまたはＣｌであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｆ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ環を形成する場合は；Ｒ１はＭｅまたはＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｇ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、ジヒドロフリル環またはジヒドロピリル環を形成する場合は；Ｒ１はＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；および
ｈ）Ｒ２がＯＨである場合には；Ｒ１はＥｔであり、Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅである。〕
のリガンドを含む、トランスジェニック有機体、ただし、有機体がヒトである場合を除く、における内因性または異種遺伝子発現を制御するための医薬組成物であって、
前記トランスジェニック有機体における内因性または異種遺伝子発現の制御が、前記式Ｉのリガンドを有機体の細胞の中で
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンドのための結合ドメイン；および
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；
を含むエクダイソンレセプター複合体と接触させることを含み、
前記細胞がさらに、リガンドと組み合わせられるときのエクダイソンレセプター複合体に結合するＤＮＡ結合シークエンスを有し、エクダイソンレセプター複合体−リガンド−ＤＮＡ結合シークエンス複合体の形成が遺伝子の発現を誘導する、前記医薬組成物。
【請求項５】
Ｅがｔ−ブチルである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
Ｅがｔ−ブチルである、請求項１または４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
エクダイソンレセプター複合体がキメラエクダイソンレセプター複合体であり、ＤＮＡ構造がさらにプロモータを含む請求項２または３に記載の方法。
【請求項８】
エクダイソンレセプター複合体がキメラエクダイソンレセプター複合体であり、ＤＮＡ構造がさらにプロモータを含む請求項１または４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
下記式：
【化５】
0004537512.tif 000014
のリガンドを含む、外来遺伝子発現を調節するための医薬組成物であって、
前記外来遺伝子発現の調節が、
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンド結合ドメイン；
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；および
ｄ）前記リガンド：
を含むエクダイソンレセプター複合体を、
ａ）外来遺伝子；および
ｂ）応答配列；
を含み、
ａ）前記外来遺伝子が前記応答配列の制御下にあり；さらに
ｂ）前記リガンドの存在下で前記ＤＮＡ結合ドメインの前記応答配列への結合が前記外来遺伝子の活性化または抑制をもたらす；
ＤＮＡ構造と接触させることを含む、前記医薬組成物。
【請求項１０】
植物中で、外来遺伝子の発現を調節する方法であって、
下記式：
【化６】
0004537512.tif 000015
で表される有効量のリガンドを植物に投与することを含み、
前記植物の細胞が、
ａ）１）ＤＮＡ結合ドメイン；
２）リガンド結合ドメイン；および
３）トランスアクチベーションドメイン；
を含むエクダイソンレセプター複合体、並びに
ｂ）１）外来遺伝子；および
２）応答配列；
を含み、
ａ）前記外来遺伝子が前記応答配列の制御下にあり；さらに
ｂ）前記リガンドの存在下で前記ＤＮＡ結合ドメインの前記応答配列への結合が遺伝子の活性化または抑制をもたらす；
ＤＮＡ構造を含む、前記方法。
【請求項１１】
（ａ）下記式：
【化７】
0004537512.tif 000016
で表されるリガンドに暴露されることに反応しない細胞を選択し；
（ｂ）１）遺伝子が応答配列の制御下にある
ａ）ポリペプチドをコードする外来遺伝子；および
ｂ）応答配列；
を含むＤＮＡ構造；並びに
２）ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンドのための結合ドメイン；および
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；
を含むエクダイソンレセプター複合体
を前記細胞中に導入し；さらに
（ｃ）前記細胞を前記リガンドに暴露する工程を含む、
ポリペプチドを製造する方法。
【請求項１２】
下記式：
【化８】
0004537512.tif 000017
で表されるリガンドを含む、トランスジェニック有機体、ただし、有機体がヒトである場合を除く、における内因性または異種遺伝子発現を制御するための医薬組成物であって、
前記トランスジェニック有機体における内因性または異種遺伝子発現の制御が、前記リガンドを有機体の細胞の中で、
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンドのための結合ドメイン；および
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；
を含むエクダイソンレセプター複合体と接触させることを含み、
前記細胞がさらに、リガンドと組み合わせられるときのエクダイソンレセプター複合体に結合するＤＮＡ結合シークエンスを有し、エクダイソンレセプター複合体−リガンド−ＤＮＡ結合シークエンス複合体の形成が遺伝子の発現を誘導する、
前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、動物および植物細胞における外来遺伝子（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ）の発現の誘導または抑制に役立つ非−ステロイダル（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ）リガンドに関する。
遺伝子工学の分野においては、遺伝子発現の正確な時間の制御、すなわち、遺伝子の活性化または抑制の能力、は発生および他の生理的プロセスを研究、操作および制御することにおける貴重なツールである（例えば、ＥｖａｎｓおよびＮｏ、ＰＣＴ国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０およびその中に引用されている参考文献参照）。哺乳類の系においては、誘導性遺伝子ターゲティング、毒性および催奇形性遺伝子の過剰発現、アンチセンスＲＮＡ発現、および遺伝子治療の用途を含む。植物の系においては、植物特性の制御、雄性または雌性ねん性；植物保護剤の過剰発現；および天然および非天然材料の両方を含む所望の植物生成物の生産または改良の用途を含む。動物および植物の両方に関しては、誘導性は外来タンパク質生産、例えば、治療タンパク質、産業用酵素、ポリマーなどに役立つことができる。
【０００２】
しばしば「遺伝子スイッチ」と呼ばれる遺伝子発現を制御するのに使用される薬剤は、制御されるべき遺伝子が存在している有機体に通常存在しないものであることが重要である。これは遺伝子の予期しない発現または抑制を避けるためである。例えば、誘導性テトラサイクリン制御システムが案出されトランスジェニックマウスにおいて利用されており、それによって、抗生物質の非存在下で遺伝子活性は誘導され、その存在下で抑制される。残念なことに、このケースではテトラサイクリンの薬物動態が、効果的な「オン−オフ」遺伝子スイッチとしてのその使用を妨げるであろう。
【０００３】
国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１１９５はステロイド（例えば、２０−ヒドロキシエクダイソンおよびムリステロン（Ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ）および特定の非−ステロイダル誘導剤（ｉｎｄｕｃｅｒ）の両方に反応する遺伝子スイッチとして働くことができるＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（「ＨＥｃＲ」）から単離された昆虫ステロイドレセプターを記載する。この系およびステロイドと非−ステロイド誘導剤の両方に反応する他の多くの系においては、例えば、より低い製造コスト、代謝安定性、昆虫、植物または哺乳類での非存在、環境的に受け入れられることを含む多くの理由について、非−ステロイダル誘導剤はステロイド類を超える明確な利点を有している。ＰＣＴ出願は、ＨＥｃＲシステムについての遺伝子スイッチとして２つのジベンゾイルヒドラジン類、１，２−ジベンゾイル−１−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジンおよびテブフェノジド（ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ）（Ｎ−（４−エチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジン）の利用を記載し、さらに米国特許第５１１７０５７号で開示されるような他のジベンゾイルヒドラジン類がシステムにおける遺伝子スイッチとして機能することもできることを示唆する。しかし、これは真実であろうけれども、これらのジベンゾイルヒドラジン類の活性は特定されていない。特に、米国特許第５１１７０５７号は非常に広範囲のジベンゾイルヒドラジン類のクラスを示しており、そこに現れる多くは遺伝子スイッチとして不活性である。国際特許出願ＧＢ９６／０１１９５号は、２０種のそのようなジベンゾイルヒドラジン類が試験されたとき、たった７つしか活性を示さなかったことを示す。
【０００４】
国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のエクダイソンレセプターについての化学リガンドとしてのテブフェノジドの使用を開示する。このレセプターはトランスジェニック植物における遺伝子発現を制御するために使用され、農業上重要な様々な特性の制御をもたらす。
【０００５】
残念なことに、上述の参考文献において記載されたリガンドは単離された細胞においてレポーター遺伝子誘導活性を示すけれども、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）植物および動物のような有機体全体におけるそれらの使用は考慮されていない。  よって、公知のリガンドと比較して増強されたまたは一貫した活性を有し、インタクト植物および動物における活性を示す非−ステロイダルリガンドを開発する継続した必要性が存在する。我々は、単離された細胞においてレポーター遺伝子誘導活性を示すだけでなく、インタクト植物および動物で使用された場合に、その改良された輸送および分布特性、代謝安定性、残留活性、レセプターへの親和性、および有害な効果の欠落による、公知のジアシルヒドラジン類、１，２−ジベンゾイル−１−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジンおよびテブフェノジドを超える利点も有する、ジベンゾイルヒドラジン誘導体の限定された群を見い出した。
【０００６】
本発明は、
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンド結合ドメイン；
ｃ）トランスアクチベーション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン；および
ｄ）リガンド；
を含むエクダイソンレセプター複合体を、
ａ）外来性遺伝子；および
ｂ）応答配列；
を含み、
ａ）外来遺伝子が応答配列の制御下にあり；さらに
ｂ）リガンドの存在下でＤＮＡ結合ドメインの応答配列への結合が遺伝子の活性化または抑制をもたらす；
ＤＮＡ構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と接触させることを含む外来遺伝子発現を調節する方法であって、
式Ｉ
【化６】
0004537512.tif 000002
〔式中、
Ｅは３級炭素を含んでいる（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは３級炭素を含んでいるシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；
Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ２は、Ｒ３、およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを、フェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を、またはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２およびＲ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを、フェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を、またはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔであり；
ａ）Ｒ１がＭｅであり、Ｒ２がＯＭｅである場合は；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌまたは３，５−ジ−Ｆであり；
ｂ）Ｒ１がＭｅであり、Ｒ２がＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌであり；
ｃ）Ｒ１がＥｔであり、Ｒ２がＯＭｅまたはＯＥｔである場合は；Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは
ｉ）３，５−ジ−ＯＭｅ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｆ、２，４−または２，５−ジ−Ｃｌ、３−ＯＭｅ、２−Ｃｌ−５−Ｍｅ、２−Ｂｒ−５−Ｍｅ、２−Ｃｌ、２−Ｂｒ、または３−Ｍｅであり；または
ｉｉ）Ｒ６がＨであり、Ｒ４がＭｅであり、さらにＲ５はＥｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅ、またはＳＥｔであり；
ｄ）Ｒ１がｉ−Ｐｒである場合は；Ｒ２はＯＭｅまたはＯＥｔであり；Ｒ３はＨであり；さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｅ）Ｒ３がＥｔである場合は；Ｒ２はＨであり、Ｒ１はＦまたはＣｌであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｆ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ環を形成する場合は；Ｒ１はＭｅまたはＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｇ）Ｒ２およびＲ３がそれらが結合されているフェニル炭素と一緒になって、ジヒドロフリル環またはジヒドロピリル環を形成する場合は；Ｒ１はＥｔであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｈ）Ｒ１がホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２である場合は；Ｒ２はＯＭｅまたはＯＥｔであり、Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅであり；
ｉ）Ｒ２がＭｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅまたはＮＨ−ＣＮである場合には；Ｒ１はＥｔであり、Ｒ３はＨであり、さらにＲ４、Ｒ５およびＲ６の組合せは３，５−ジ−Ｍｅである。〕
の化合物からリガンドが選択される方法に関する。
【０００７】
本発明は、
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンド結合ドメイン；
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；および
ｄ）式Ｉの化合物からなるリガンド；
を含むエクダイソンレセプター複合体を、
ａ）外来性遺伝子；および
ｂ）応答配列；
を含み、
ａ）外来遺伝子が応答配列の制御下にあり；さらに
ｂ）リガンドの存在下でＤＮＡ結合ドメインの応答配列への結合が遺伝子の活性化または抑制をもたらす；
ＤＮＡ構造と接触させることを含む外来遺伝子発現を調節する方法にも関する。
【０００８】
ａ）リガンド結合およびその結果の遺伝子スイッチ活性と、ｂ）インタクト植物および動物における移送、システミシティー（ｓｙｓｔｅｍｉｃｉｔｙ）、毒性、および代謝安定性の間の最適なバランスを達成するために、式Ｉの化合物の置換基の位置およびサイズは重要である。特性の最適なバランスは、Ｅがｔ−ブチルであり、Ｒ１がエチルであり、Ｒ２がエトキシであり、Ｒ３が水素であり、さらにＲ４、Ｒ５、およびＲ６の組み合わせが３，５−ジメチルである場合に生じる。これらの「Ｒ」基の各組成はかなり変化されることができる。しかし、式Ｉの化合物のサイズ、形および全体の極性における有意な変化を導く変化は、最適なバランスおよび、その結果として、化合物の改良された特性を減少させる傾向があるであろう。この理由から、任意の１つの特定のＲ基が最適なものから変化された場合に、残ったＲ基の組み合わせの変化は限定されるべきである。
【０００９】
好ましくは、Ｅは（Ｃ４−Ｃ５）アルキルである。より好ましくは、Ｅはｔ−ブチルである。
好ましくはＲ１はＭｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、またはＣＦ２ＣＦ３である。より好ましくは、Ｒ１はＭｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、またはＣＦ２ＣＦ３である。さらにより好ましくは、Ｒ１はＭｅ、Ｅｔ、ｉ−ＰｒまたはＦである。最も好ましくは、Ｒ１はＭｅまたはＥｔである。
【００１０】
好ましくはＲ２はＥｔ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＣＦ２ＣＦ３、アジド、ＯＣＦ３であるか、またはＲ２は、Ｒ３および、Ｒ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを、フェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を、またはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロピリル環を形成する。より好ましくは、Ｒ２はＥｔ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＦ２ＣＦ３であるか、またはＲ２は、Ｒ３および、Ｒ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成し、またはフェニル炭素に隣接する酸素と共にジヒドロフリル環を形成する。さらにより好ましくは、Ｒ２はＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔであるか、またはＲ２は、Ｒ３および、Ｒ２とＲ３が結合されるフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを形成し、またはフェニル炭素に隣接する酸素と共にジヒドロフリル環を形成する。最も好ましくは、Ｒ２はＯＭｅまたはＯＥｔである。
【００１１】
好ましくは、Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ３は、Ｒ２および、Ｒ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを、フェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を、またはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロピリル環を形成する。より好ましくは、Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ３は、Ｒ２および、Ｒ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを、またはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成する。さらにより好ましくは、Ｒ３は、Ｒ２および、Ｒ２とＲ３が結合されているフェニル炭素と結合してエチレンジオキシを、またはフェニル炭素に隣接した酸素と共にジヒドロフリル環を形成する。
【００１２】
好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立してＭｅ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、またはＯＭｅである。さらにより好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立してＭｅ、Ｆ、またはＣｌである。さらにより好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６の組み合わせは、３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌまたは３，５−ジ−Ｆである。最も好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６の組み合わせは、３，５−ジ−Ｍｅである。
【００１３】
用語「Ｍｅ」、「Ｅｔ」、「ｎ−Ｐｒ」、「ｉ−Ｐｒ」、および「Ａｃ」とは、それぞれ、メチル、エチル、ノルマルプロピル、イソプロピルおよびアセチルを意味する。Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６で言及される、用語「２，４」、「２，５」、「３，５」等は基が結合されているフェニル環上の相対位置をいう。
【００１４】
用語「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
用語「調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」とは、リガンド／レセプター複合体の外来遺伝子の転写活性を誘導または抑制する能力を意味する。
用語「外来遺伝子」とは、対象に固有でない遺伝子、すなわち、形質転換プロセスを通じて対象に導入された遺伝子、または内因性突然変異遺伝子の非突然変異バージョンを意味する。形質転換の方法は本発明において重要ではなく、対象に適するこの分野の公知の任意の方法であることができる。例えば、トランスジェニック植物は形質転換細胞から再生されることによって得られる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはそのＴ１プラスミドを用いるアグロインフェクション（ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、植物細胞およびプロトプラストのマイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）形質転換のような文献から多くの形質転換方法が知られる。動物細胞の形質転換およびトランスジェニック動物におけるそのような形質転換細胞の再生について補完する技術が知られている。外来遺伝子は天然または合成遺伝子のどちらでであることもでき、さらに、ＤＮＡまたは逆転写酵素によるようなＤＮＡ中間体を通じて働くことができるＲＮＡの形で対象に導入される治療遺伝子であることができる。そのような遺伝子は標的細胞に導入され、対象に直接的に導入され、または対象に形質転換細胞を移すことによって間接的に導入されることができる。用語「治療遺伝子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、そのような遺伝子が発現される宿主細胞に有利な機能を与える遺伝子を意味する。治療遺伝子は宿主細胞に本来的には認められない。
【００１５】
用語「エクダイソンレセプター複合体」とは概して、ステロイドレセプターファミリーの２つのメンバー、エクダイソンレセプター（「ＥｃＲ」）およびウルトラスパイラクル（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ「ＵＳＰ」）タンパク質、からなるヘテロダイマータンパク質複合体（Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，４７６−４７９；Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ７１，６３−７２参照）をいう。機能的エクダイステロイドレセプター複合体は、イムノフィリンのような追加のタンパク質を含むこともできる。転写因子として知られている（ＤＨＲ３８、ｂｅｔａＦＴＺ−１または他の昆虫の相同体）ステロイドレセプターファミリーのタンパク質の追加のメンバーはＥｃＲおよび／またはＵＳＰのリガンド依存性または非依存性のパートナーであることもできる。エクダイソンレセプター複合体はエクダイソンレセプタータンパク質とウルトラスパイラクルタンパク質の脊椎動物の相同体であるレチノイン酸−Ｘ−レセプター（「ＲＸＲ」）タンパク質とのヘテロダイマーであることもできる。エクダイソンレセプタータンパク質またはＵＳＰのホモダイマー複合体もある条件下で機能することができる。
【００１６】
エクダイステロイドレセプター複合体は活性エクダイステロイドまたはＥｃＲを含み、複合体の他のタンパク質を排除することなく、複合体のタンパク質の１つに結合された非−ステロイダルリガンドによって活性化されることができる。
【００１７】
エクダイソンレセプター複合体は、全てのメンバーがヒンジ領域によって分けられたアミノ末端トランスアクチベーションドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴づけられるステロイドレセプタースーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。ファミリーのメンバーはＬＢＤのカルボキシ末端側に他のトランスアクチベーションドメインを有することもできる。ＤＢＤはエクダイソン応答配列に対する特異性を与える２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボックス（Ｐ−ｂｏｘ）とＤ−ボックス（Ｄ−ｂｏｘ）の間の２つのシステインジンクフィンガーによって特徴づけられる。これらのドメインは天然体、修飾体、または異種のレセプタータンパク質の異なるドメインのキメラであることができる。
【００１８】
用語「応答配列」（「ＲＥ」）はエクダイソンレセプター複合体のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を通じて媒介されるプロモータに応答を与える１以上のシス−作用ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントはそのシークエンスがパリンドローム（完全または不完全）、または様々な数のヌクレオチドで分けられたシークエンスモチーフまたはハーフサイト（ｈａｌｆ  ｓｉｔｅｓ）からなることができる。ハーフサイトは類似または同一であり、直接または逆繰り返しとして配列されることができる。エクダイソンレセプター複合体は、リガンドの存在下または非存在下で、ＲＥのＤＮＡシークエンスに結合し、この応答配列の制御下にある下流遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクダイソンレセプターのＲＥのＤＮＡシークエンスの例としては、ＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（Ｃｈｅｒｂａｓ  Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９１），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５，  １２０−１３１参照）；ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ、ここでＮ（ｎ）は１以上のスペーサーヌクレオチドであることができる（Ｄ’Ａｖｉｎｏ  ＰＰ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ，１１３，１−９参照）；およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ  Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４、４４６５−４４７４参照）を含む。
【００１９】
外来遺伝子、応答配列、およびエクダイソンレセプター複合体を形作るＤＮＡシークエンスはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたは他の腸内細菌のような原核細胞に組み込まれることができる。
しかし、遺伝子によって発現された多くのタンパク質が細菌中で不正確にプロセスされるので、真核細胞が好ましい。外来遺伝子、応答配列、およびレセプター複合体のためのヌクレオチドシークエンスはＲＮＡ分子として組み込まれることもでき、好ましくはたばこモザイクウイルスのような機能的ウイルスＲＮＡの形である。エクダイソンレセプターのためのリガンドに反応する分子を本来的に欠くので、真核細胞では脊椎動物細胞が好ましい。その結果、それらは本発明のリガンドに反応しない。よって、本発明のリガンドは形質転換細胞または有機体全体に生理的なまたは他の影響をごくわずかしか有しないであろう。よって、細胞は、実質的にリガンド自体の存在によって影響されることなく、成長し、所望の生成物を発現することができる。
【００２０】
用語「対象」とは、インタクト植物または動物、または植物または動物からの細胞を意味する。対象が菌類または酵母であるばあいは、リガンドは等しくよく働くであろうことも予想される。対象がインタクト動物の場合には、好ましくは動物は脊椎動物であり、最も好ましくは哺乳類である。
【００２１】
本発明のリガンドは、外来遺伝子とリンクした応答配列に順番に結合されるエクダイソンレセプター複合体と一緒に使用されるとき、外来遺伝子の発現の外からの時間的な調節のための手段を提供する。様々なコンポーネントが互いに、すなわち、リガンドをレセプター複合体に、さらにレセプター複合体を応答配列に結合する順番は重要ではない。典型的には、外来遺伝子の発現の調節はエクダイソンレセプター複合体の特定の制御または調節ＤＮＡエレメントへの結合に応じる。エクダイソンレセプタータンパク質は、ステロイドレセプターファミリーの他のメンバーのように、少なくとも３つのドメイン、トランスアクチベーションドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを有する。このレセプターは、ステロイドレセプターファミリーのサブセットのように、ヘテロダイマー化特性の原因である、十分に明確にされていない領域も有する。ＵＳＰまたはＲＸＲタンパク質とのヘテロダイマー化の後の、エクダイソンレセプタータンパク質のリガンド結合ドメインへのリガンドの結合は、ヘテロダイマータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを活性化された形で、応答配列と結合させることを可能にし、よって外来遺伝子の発現または抑制が生じる。このメカニズムは、リガンドがＥｃＲまたはＵＳＰに結合するための位置を除外せず、結果として、活性ホモダイマー複合体（例えば、ＥｃＲ＋ＥｃＲまたはＵＳＰ＋ＵＳＰ）を形成する。好ましくは、１以上のレセプタードメインはキメラ遺伝子スイッチを生ずるように変化されることができる。典型的には、３つのドメインの１以上は、他のドメインのソースと異なるソースから選択されることができるので、キメラレセプターは選択された宿主細胞または有機体におけるトランスアクチベーティング活性、リガンドの相補的結合（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、および特定の応答配列の認識のために最適化される。さらに、応答配列自身は、酵母由来のＧＡＬ−４タンパク質（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ｅｔ．ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５，５６３−５６４参照）またはＥ．ｃｏｌｉ由来のＬｅｘＡタンパク質（Ｂｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８５），Ｃｅｌｌ，４３，７２９−７３６参照）のような他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインの応答配列で修飾または置換され、キメラエクダイソンレセプター複合体を適応させる。キメラシステムの他の利点は、所望の最終結果に応じた外来遺伝子を働かせるために使用されるプロモータの選択を可能にすることである。発現のタイミングおよび発現が起こる細胞の両方が制御されることができるので、そのような２重制御は、特に細胞障害タンパク質が生産されるとき、遺伝子治療の分野で特に重要である。用語「プロモータ」とは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される特定のヌクレオチドシークエンスを意味する。そのシークエンスは、適正な条件下で転写が特異的に開始されることができるサイトである。好適なプロモータに機能的にリンクされた外来遺伝子が対象の細胞に導入されるとき、外来遺伝子の発現が本発明のリガンドの存在によって制御される。プロモータは構成的または誘導的であることができ、または組織特異的（すなわち、特定のタイプの細胞にのみ発現される）または有機体の特定の発生ステージに特異的であることができる。
【００２２】
本発明の他の態様は、有効量、すなわち、所望の遺伝子発現または抑制を顕在化させるのに必要とされる量の式Ｉの化合物を含むリガンドを有機体に投与することを含み、さらに有機体の細胞が
ａ）１）ＤＮＡ結合ドメイン；
２）リガンド結合ドメイン；および
３）トランスアクチベーションドメインを含むエクダイソンレセプター複合体：および
ｂ）１）外来遺伝子；および
２）応答配列を含むＤＮＡ構造
を含み、
ａ）外来遺伝子が応答配列の制御下にあり、
ｂ）リガンドの存在下、ＤＮＡ結合ドメインの応答配列への結合の結果、遺伝子を活性化または抑制する、
有機体中で１以上の外来遺伝子の発現を調節する方法である。
【００２３】
本発明の第３の態様は、細胞がエクダイソンレセプターのためのＤＮＡ結合シークエンスを有し、エクダイソンレセプター−リガンド−ＤＮＡ結合シークエンス複合体の形成が遺伝子の発現を誘導する、有機体の細胞の中で式Ｉの化合物を含むリガンドをエクダイソンレセプターと接触させることを含むトランスジェニック有機体における内因性または異種遺伝子発現を制御するための方法である。
【００２４】
本発明の第４の態様は、
ａ）式Ｉの化合物を含むリガンドに暴露されることに実質的に反応しない細胞を選択し；
ｂ）１）遺伝子が応答配列の制御下にある
ａ）ポリペプチドをコードする外来遺伝子；および
ｂ）応答配列；
を含むＤＮＡ構造；および
２）ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
ｂ）リガンドのための結合ドメイン；および
ｃ）トランスアクチベーションドメイン；
を含むエクダイソンレセプター複合体
を細胞中に導入し；さらに
ｃ）細胞をリガンドに暴露する工程を含むポリペプチドを製造する方法である。
【００２５】
細胞によるポリペプチド生産を時間的に制御する利点と同様に、そのようなポリペプチドの蓄積が細胞にダメージを与えることができる場合において、ポリペプチドの発現が短期間に限定されることができる場合において、本発明のこの態様はさらなる利点を提供する。そのような制御は、外来遺伝子が治療遺伝子である場合に特に重要である。治療遺伝子は、糖尿病患者におけるインスリンの生産のような、必要とされる機能を制御するポリペプチドを生産することを要求されることができる。それらは、ガン細胞に対する致死性のような、ダメージを与えるかまたは致死性タンパク質すら生産させるために使用されることもできる。そのような制御は、トランスジェニック植物におけるような、生産されるタンパク質レベルが成長または再生のメタボリックドレイン（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｒａｉｎ）を構成することができる場合に重要である。
【００２６】
様々なポリペプチドをコードする多くのゲノム性およびｃＤＮＡ核酸シークエンスが公知である。本発明のリガンドに役立つ外来遺伝子材料は、例えば、細胞から放出されることができる分泌タンパク質；毒性物質から非毒性物質に、または不活性物質から活性物質に代謝することができる酵素；調節タンパク質；細胞表面レセプター等のような生物学的に活性なタンパク質をコードする遺伝子を含む。役立つ遺伝子は、血液凝固因子、インスリン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、アルファおよびベータセミナルインヒビンおよびヒト成長ホルモンのようなホルモンをコードする遺伝子；酵素のような、その欠損が異常状態を生じさせるタンパク質をコードする遺伝子；インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子−１、腫瘍壊死因子、およびエリスロポエチンのような、サイトカインまたはリンホカインをコードする遺伝子；アルファ１−アンチトリプシンのような阻害物質をコードする遺伝子；ジフテリアトキシンおよびコレラトキシンのような医薬品として機能する物質をコードする遺伝子；等も含む。役立つ遺伝子はガン治療および遺伝子異常の治療に役立つそれらも含む。これらの当業者は実質的に全ての公知の核酸シークエンス情報にアクセスし、核酸分子を公共の供託者、シークエンスを公表した機関から直接得るか、またはルーチン法を行い分子を調製することができる。
【００２７】
遺伝子治療の用途においては、ここで記載されるリガンドは、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、軟膏剤、エリキシル剤および注射可能な組成物のような薬学上受け入れられるキャリアに組み込まれることができる。薬学製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）は０．０１重量％〜９９重量％のリガンドを含むことができる。製剤は単一または複数の用量の形態であることもできる。任意の具体的な薬学製剤におけるリガンドの量は有効用量、すなわち、所望の遺伝子発現または抑制を誘発するのに必要な用量に応じるであろう。
【００２８】
薬学製剤の好適な投与経路は経口、直腸（ｒｅｃｔａｌ）、トピカル（ｔｏｐｉｃａｌ）（ダーマル（ｄｅｒｍａｌ）、バッカル（ｂｕｃｃａｌ）および舌下（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ）を含む）、経膣（ｖａｇｉｎａｌ）、非経口投与（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）（皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、脊髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）およびエピデュラル（ｅｐｉｄｕｒａｌ）を含む）、および経鼻胃管による、を含む。好ましい投与経路は、処理される条件に応じるであろうし、レシピエントの状態のような要因で変化することができることが当業者に理解されるであろう。
【００２９】
ここで記載されるリガンドは、他の薬学的活性化合物と組み合わせて投与されることもできる。ここで記載されるリガンドと組み合わせて使用される薬学的活性化合物は、レシピエントへの有害な効果または化合物の間の望まれない相互作用を避けるように選ばれることができることが当業者に理解されるであろう。リガンドと組み合わせて使用されることができる薬学的活性化合物の例としては、例えば、エイズ化学療法剤、アミノ酸誘導体、鎮痛剤、麻酔剤、肛門直腸製品（ａｎｏｒｅｃｔａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、制酸薬および抗膨満薬（ａｎｔｉｆｌａｔｕｌｅｎｔｓ）、抗生物質、抗凝血剤、解毒薬、抗繊維素溶解薬、抗ヒスタミン薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、駆虫薬、抗原虫薬、解熱薬、防腐剤、鎮痙薬および抗コリン作用薬、抗ウイルス薬、食欲抑制薬、関節炎薬剤、生体応答調節物質、骨代謝調節薬、腸排泄薬（ｂｏｗｅｌ  ｅｖａｃｕｔａｎｔｓ）、心血管薬、中枢神経系刺激薬、脳代謝増強薬、耳垢溶解薬、コリンエステラーゼ阻害薬、風邪および咳製剤、コロニー刺激因子、避妊薬、サイトプロテクティブエージェント（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ）、歯科製剤、脱臭剤、外皮用薬、解毒剤、糖尿病薬、診断用薬、下痢製剤、ドパミンレセプターアゴニスト、電解質、酵素および消化薬、麦角製剤、受精剤（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｇｅｎｔｓ）、ファイバーサプリメント（ｆｉｂｅｒ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）、抗真菌薬、乳汁漏出阻害薬、胃酸分泌阻害薬、ガストロインテスティナルプロキネティックエージェント（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、ゴナドトロピン阻害薬、毛髪成長刺激薬、造血薬、ヘモレオロジックエージェント（ｈｅｍｏｒｒｈｅｏｌｏｇｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、止血薬、ヒスタミンＨ２レセプターアンタゴニスト、ホルモン類、高血糖薬、ハイポリピデミクス（ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃｓ）、免疫抑制薬、緩下薬、抗らい病薬、白血球搬出アジャンクツ（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ａｄｊｕｎｃｔｓ）、肺サーファクタント、偏頭痛製剤、粘液溶解薬、筋弛緩薬アンタゴニスト、筋弛緩薬、麻酔剤アンタゴニスト、鼻内噴霧、吐き気製剤、ヌクレオシドアナログ、栄養サプリメント、骨粗鬆症製剤、分娩促進薬、副交感神経遮断薬、副交感神経作用薬、パーキンソン病治療薬、ペニシリンアジュバント、ホスホリピド、血小板阻害薬、ポルフィリン症薬、プロスタグランジンアナログ、プロスタグランジン、プロトンポンプ阻害剤、かゆみ薬、向精神薬、キノロン、呼吸興奮薬、唾液刺激薬、ソルトサブステチュート（ｓａｌｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）、硬化剤、皮膚創傷製剤、喫煙中止助剤、スルホンアミド、交感神経遮断薬、血栓溶解薬、Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ症候群薬、振せん製剤、結核製剤、尿酸排泄薬、尿路薬、子宮収縮薬、子宮弛緩薬、膣製剤、めまい薬、ビタミンＤアナログ、ビタミン類、および医用画像コントラストメディア（ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）を含む。いくつかの場合においては、例えば、特定の薬物を代謝する酵素を生産する遺伝子を「止める」リガンドは薬物治療の付属物として役立つことができる。
【００３０】
農業上の適用に対しては、上述の適用に加え、本発明のリガンドはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素のような農薬タンパク質の発現を制御するために使用されることもできる。そのような発現は組織または植物特異的に起こることができる。さらに、特に植物有害生物の防除が必要とされる場合に、１以上の農薬がここで記載されるリガンドと組み合わせられ、よって、仮に農薬が別々に適用される場合よりも、より少ない全体の適用量を有し、追加の利点と効果を提供する。農薬との混合物が用いられる場合、組成物中の各成分の相対的比率は、処理されるべき作物、有害生物、および／または雑草については相対的な効力および各農薬の所望の適用速度に応じるであろう。農薬の混合物は農薬が単独で使用されるよりも、活性のより広いスペクトルのような利点を提供することを当業者は理解するであろう。組成物中で、ここに記載されるリガンドと組み合わせられることができる農薬の例としては、殺菌剤、除草剤、殺虫剤、殺ダニ剤、および殺微生物剤を含む。
【００３１】
ここで記載されるリガンドは、従来の高リットル液圧スプレー（ｈｉｇｈ−ｌｉｔｅｒ  ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｓｐｒａｙｓ）、低リットルスプレー（ｌｏｗ−ｌｉｔｅｒ  ｓｐｒａｙｓ）、エア−ブラスト、およびエアリアルスプレーのような一般に使用される方法による水性スプレーとして植物葉面に適用されることができる。希釈および適用量は用いられる装置のタイプ、方法、適用物に望まれる頻度、およびリガンド適用量に応じて変化するであろう。スプレータンク中に追加のアジュバントを含むことが望まれる。そのようなアジュバントは、界面活性剤、分散剤、展着剤、固着剤、消泡剤、乳化剤、およびＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎによって年一回出版される、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、およびＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ中に記載されている他の同様の材料が含まれる。リガンドは、その適用前に肥料または成長促進材料（ｆｅｒｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）と混合することもできる。リガンドと固体の成長促進材料は混合またはブレンド装置で混合されることもでき、またはそれらは顆粒配合物中で肥料と組み合わせることができる。処理されるべき作物と雑草に好適な肥料の任意の相対比率が使用されることができる。ここで記載されるリガンドは成長促進組成物の５％〜５０％を一般に含むであろう。これらの組成物は、所望の植物の成長速度を増大させ、同時に遺伝子発現を制御する成長促進材料を提供する。
【００３２】
本発明のリガンドは公知の化合物、または当業者が米国特許第５１１７０５７号、第５５３００２８号および第５３７８７２６号に記載される方法に適合させることによって容易に製造される。２ステッププロセスが典型的に使用される。
第１ステップでは式ＩＩの置換された塩化安息香酸が式ＩＩＩの置換されたヒドラジンと結合され、式ＩＶのモノアシルヒドラジンを生じさせる。式ＩＶのモノアシルヒドラジンは第２ステップで式Ｖの他の塩化安息香酸と結合され式Ｉの化合物を形成した。
【００３３】
【化７】
0004537512.tif 000003
【００３４】
次の実施例は本発明のリガンドの活性を示す。
次のリガンドと比較例のリガンドが評価された。
【００３５】
【化８】
0004537512.tif 000004
【００３６】
【表１】
0004537512.tif 000005
【００３７】
ＣＥ−１＝テブフェノジド（ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ）
ＣＥ−２＝１，２−ジベンゾイル−１−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジン
ＣＥ−３＝ムリステロンＡ（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅＡ）
【００３８】
遺伝子構造
ｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）はＶｇＥｃＲおよびＲＸＲの両方を発現し、改変されたヘテロダイマー核レセプターを形成させる、８７２８ｋｂプラスミドである（Ｎｏ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，３３４６−３３５１参照）。エクダイソンレセプター（ＶｇＥｃＲ）は天然Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａエクダイソンレセプターに由来するか、およびＶＰ１６トランスアクチベーションドメインを含むように改変される（Ｃｒｅｓｓ，Ｗ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，８７−９０；Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．，ｅｔ．ａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，５６３−５６４；Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８８），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２，７１８−７２９；Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８８），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２，７３０−７４２参照）。ＲＸＲは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａエクダイソンレセプター（Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，４７６−４７９；Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，６３−７２参照）の天然パートナーであるＵＳＰ（ウルトラスピラクル、ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）の哺乳類ホモローグである。ＶｇＥｃＲ  ＤＮＡ結合ドメインのＰ−ボックス領域は、グルココルチコイド応答配列からの１／２−サイト（Ｕｍｅｓｏｎｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９８９），Ｃｅｌｌ  ５７，１１３９−１１４６）および天然エクダイソン応答配列からの１／２−サイトからなるハイブリッドエクダイソン応答配列を認識するように改変された。このハイブリッド応答配列は天然エクダイソン応答配列（ＥｃＲＥ）に結合することができるｆａｒｓｅｎｏｉｄＸレセプターとの如何なる可能な相互作用を減少させる。サイトメガロウイルスエンハンサー−プロモータはＶｇＥｃＲの発現を駆動させ、さらにラウス肉腫ウイルスプロモータはＲＸＲの発現を駆動させる。ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）はｐｃＤＮＡ３．１に基づいた５０２４ｂｐベクターである。それは、ｐＶｇＲＸＲおよび最小ヒートショックプロモータから発現される改変されたエクダイソンレセプターによって認識される５つのハイブリッドＥ／ＧＲＥｓを含む（Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ，３６６，４７６−４７９参照）。ｐＩＮＤ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）はレポーター酵素としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む８１７０ｂｐプラスミドである。ｐＩＮＤ／ｌａｃＺとｐＶｇＲＸＲのコトランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、ムリステロンＡのようなエクダイソンアゴニストの添加の下で、β−ガラクトシダーゼ発現の誘導が生じる。レポータープラスミドｐＩＮＤ／ｌｕｃは、ｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｅ１７４１）からホタルルシフェラーゼ遺伝子を、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＩＮＤ中に、ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてサブクローニングすることによって構成され��。
【００３９】
哺乳類細胞系の維持および形質転換
ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）は１０％胎児牛血清（ＦＢＳ、完全培地；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、１６０００−０３６）を補給したＦ−１２栄養培地（Ｈａｍ’ｓ  培地）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、１１７６５−０５４）中で維持された。これらの細胞は３７℃、９５％雰囲気空気５％ＣＯ２中で維持された。
【００４０】
ＣＨＯ細胞は１２−ウエル組織培養プレート中に、１ウエルあたり０．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種された。脂質Ｐｆｘ−８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔ９３０−１８）は一過性にエクダイソン誘導性発現系を形質転換するのに用いられた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｋ１０００−０１）。エクダイソン誘導性発現系は、レセプターサブユニットをコードしているｐＶｇＲＸＲ、および応答配列とそれぞれがβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼを有している、レポーター遺伝子ｐＩＮＤ／ｌａｃＺまたはｐＩＮＤ／ｌｕｃからなる。細胞接種２４時間後、脂質／ＤＮＡ溶液が、滅菌水中で、ＶｇＲＸＲ０．５ｍｇ／ｍｌおよびｐＩＮＤ／ｌａｃＺまたはｐＩＮＤ／ｌｕｃ  ＤＮＡ０．５ｍｇ／ｍｌによって調製された。３６μｌのＰｆｘ−８は、１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を含む（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ３１９８５）、滅菌１７×１００ｍｍポリスチレンチューブ中で稀釈された。６μｌのプラスミドＤＮＡストックは、他のポリスチレンチューブ中で１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合された。ＤＮＡおよび脂質溶液は混合され、３ｍｌの形質転換溶液を作成した（トリプリケートのサンプル１セットに充分である）。細胞は、細胞から培地を吸引することによって、リン酸緩衝液（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、１４１９０−１４４）で３回洗浄された。ウエルあたり、１ｍｌの形質転換溶液を加えた。細胞は４時間培養され、形質転換培地は同体積の完全培地と置き変えられた。細胞はさらに２０時間培養された。
【００４１】
安定に形質転換された哺乳類細胞系
ｐＶｇＲＸＲおよびｐＩＮＤ／ＬａｃＺ（ＳＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）で安定に形質転換されたＣＨＯ細胞が、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、３００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）および３００μｇ／ｍｌヒグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂを含むＨａｍ  Ｆ−１２培地中で維持された。別のｐＩＮＤベクターである、ｐＩＮＤ（ＳＰＩ）は、３つのシスアクティングＳＰＩエレメントの存在によりｐＩＮＤのそれよりも５倍大きな絶対的発現レベルを誘導することができる。基礎の発現レベルは対応してより大きい。
【００４２】
リガンド処理
ムリステロンＡのエタノール溶液および本発明の非ステロイダルリガンドのアセトン溶液であるストック溶液（１０−２Ｍ）がそれぞれ調製され、−２０℃で貯蔵された。形質転換の２４時間後、試験化合物は最終濃度が１０μＭ（１０−５Ｍ）となるように、１ｍｌの細胞培養ウエルのそれぞれに添加された。１０μＭの濃度のムリステロンＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７８８８）が正のコントロールとして使用された。負のコントロールとしてアセトンだけが添加された。
【００４３】
レポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子発現は一過性にトランスフェクトされた細胞の、試験リガンド処理の２４−４８時間後、または安定な形質転換細胞系の試験リガンド処理の２４時間後に評価された。β−ガラクトシダーゼは、固定された細胞を染色することによって、または細胞溶解産物中の酵素活性を測定することによってアッセイされた。β−ガラクトシダーゼはβ−ガラクトシド、固定された細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ１４６５−０１）中で青色を生じさせ顕微鏡下で見られることができるＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）の加水分解を触媒する。別の方法では、レポーター溶解緩衝液（ＲＬＢ；Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｅ３９７Ａ）が、化学発光基質、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（Ｔｒｏｐｉｘ／ＢＭ１００Ｓ）、を用いるβ−ガラクトシダーゼ活性の検出のために細胞を溶解するのに使用された。各１２−ウエルプレート中の細胞は２５０μｌのＲＬＢで溶解された。それぞれの抽出物２０μｌは１００μｌの基質でアッセイされた。
【００４４】
ルシフェラーゼ活性の検出のために、細胞はＰＢＳで２回洗浄され、１ウエルあたり２５０μｌのＲＬＢで溶解された。１０分後、プレートは−８０℃で１０分間凍結され、室温に戻された。溶解液のサンプル２０μｌは１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１５００）と混合された。β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼアッセイの両方とも、基質の移送のためのオートインジェクタが備えられている、ＤＹＮＥＸ  ＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメータ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて、室温で発光が検出された。
【００４５】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｋｃ細胞からの細胞質エクダイソンレセプター抽出物の調製
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの胚由来の双翅類細胞系Ｋｃ１６７（Ｅｃｈａｌｉｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｏｈａｎｅｓｓｉａｎ，Ａ．（１９６９）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２６８，１７７１参照）がＤｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｃｈｅｒｂａｓ（Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得られ、（Ｃｈｅｒｂａｓ，Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４４，１６１−１７９）に記載されるように維持された。４００ｍｌのＫｃ細胞の培養液（３×１０７細胞／ｍｌ）が７００×ｇで１０分間室温で遠心分離され、細胞をペレットにした。上澄液は吸引され、ペレットは７０ｍｌの冷ＴＭ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．２）中に再懸濁された。氷上で１０分間インキュベート後、細胞は２，３００×ｇで遠心分離された。上澄液は捨てられた。細胞ペレットは−２０℃で１時間、凍結された。凍結された細胞ペレットはゆっくりと氷上で溶かされ、冷Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザー中で、５００にセットして、１０回の上下ストロークで、４℃で、Ｃａｆｒａｍｏホモジナイザーモーター上のテフロン乳棒を用いて、ホモジナイズされた。このスラリーは、スイングバケットローター中で６０分間１００，０００×ｇで遠心分離された。細胞質タンパク質抽出物を含んでいる上澄液はＴ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．２）で、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで稀釈された。この抽出物は直ちにリガンド結合アッセイに使用された。
【００４６】
Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ細胞からの核エクダイソンレセプターの調製
レピドプテラン（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａの成虫体のウイングディスク（ｗｉｎｇ  ｄｉｓｃｓ）に由来する細胞系ＩＡＬ−ＰＩＤ２がＨ．Ｏｂｅｒｌａｎｄｅｒから得られ、（Ｌｙｎｎ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ  Ｏｂｅｒｌａｎｄｅｒ，Ｈ．，（１９８３），Ｊ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２９，５９１−５９６）に記載されているように維持された。３００ｍｌのＰ．ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ細胞の定常期培養液が７００×ｇ、１０分間、室温で遠心分離され、細胞がペレットにされた。上澄液は吸引され、細胞ペレットは３５ｍｌのＴＭＴ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．１％含有するＴＭ緩衝液）に再懸濁された。懸濁液は、氷上のＤｏｕｎｃｅホモジナイザーの２０回上下ストロークでホモジナイズされた。ホモジネートは氷上で１０分間インキュベートされ、次いで、９００×ｇで１５分間遠心分離された。ペレットは１５ｍｌのＴＭ緩衝液に再懸濁され、２，３００×ｇで遠心分離された。このペレットはＴＭＫ緩衝液（８００ｍＭのＫＣｌを含有するＴＭ緩衝液）中でガラス棒を用いることにより、ゼラチン性スラリーが形成されるまでペレットを砕き抽出され、さらに、１５分間氷上でインキュベートされた。抽出物は１００，０００×ｇで、スイングバケットローター中で、６０分間遠心分離された。核抽出物を構成する上澄液は、Ｔ緩衝液で平衡化された１０ＤＧ脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、７３２−２０１０）で脱塩された。核抽出物中の全タンパク質濃度は１ｍＭのＤＴＴを含むＴ緩衝液で、１ｍｌあたり５ｍｇに調節された。
【００４７】
細菌グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の調製
ＣＤＥＦドメインのみを有しているスプルースバッドワーム（ｓｐｒｕｃｅ  ｂｕｄｗｏｒｍ）（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（ＣｆＥｃＲ）およびウルトラスピラクルタンパク質（ＣｆＵＳＰ）との融合タンパク質細菌グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、がラジオリガンド置換アッセイにも使用された。ＣｆＥｃＲのＣＤＥＦドメインをコードしているｃＤＮＡが構成され、次いで、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイトを含むプライマーを使用するＰＣＲ増幅がされた（Ｐｅｒｅｒａ  ＳＣ，Ｍ  Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｋｒｅｌｌ  ＰＪ，Ｒｅｔｎａｋａｒａｎ  Ａ，ＤｈａｄｉａｌｌａＴＳ，ＳＲ  Ｐａｌｌｉ，１９９９  Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）。ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから得られたｐＧＥＸ−３Ｘベクターにクローンされた。ＣｆＵＳＰコード領域はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイトを含むプライマーを用いることにより増幅され、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから得られたｐＧＥＸ−２Ｔベクターにクローンされた。各２つのベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉは培養され、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧＳＴ−ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎに記載されているような融合タンパク質の生産が誘導された。
【００４８】
エクダイソンレセプター競合的結合アッセイ
強力なフィトエクダイステロイドの（６６，０００ｄｐｍ；比活性１７０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）３ＨポナステロンＡが、０．８×５０ｍｍガラステストチューブ内で、１０μＭの非放射性２０−ヒドロキシエクダイソン（２０Ｅ）の非存在下または存在下で、１００μｌのＫｃ細胞質またはＰｌｏｄｉａ核エクダイソンレセプター抽出物と混合され、全体または非−特異的それぞれのトリチウム標識ポナステロンＡの結合の評価を得た。チューブはボルテックスされ、結合反応を平衡状態に到達させるため、Ｋｃ細胞質抽出物を一晩、４℃で、またはＰｌｏｄｉａ核抽出物を１．５時間インキュベートした。平衡結合時間の終わりに、氷冷６００μｌまたは３００μｌのデキストラン−コーテッド（ｄｅｘｔｒａｎ−ｃｏａｔｅｄ）活性炭溶液（５００ｍｇのシグマＨＣＬ−洗浄活性炭、５０ｍｇのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ７０、５０ｍｌのＴ緩衝液）を、ＫｃまたはＰｌｏｄｉａ抽出物にそれぞれ添加することにより、結合したトリチウム標識ポナステロンＡは結合していないものから分けられた。チューブは簡単にボルテックスされ、７，０００×ｇで遠心分離され、活性炭をペレットにした。タンパク質に結合しているトリチウム標識ポナステロンＡを含むＫｃまたはＰｌｏｄｉａ抽出物反応物の６００μｌまたは３００μｌのそれぞれの上澄液は吸引され、それぞれ５ｍｌのシンチレーションカクテル（ＲｅａｄｙＳａｆｅ（登録商標）、Ｂｅｃｋｍａｎ）を有する液体シンチレーションバイアルに入れられる。混合物はボルテックスされ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ５００液体シンチレーションカウンタで、トリチウムの計数効率６０％で、全体または非特異的結合の放射活性の量が測定された。
【００４９】
ＫｃまたはＰｌｏｄｉａ細胞抽出物および細菌融合タンパク質におけるエクダイステロイドレセプター複合体に結合している３Ｈ−ポナステロンＡの競合的阻害のＫｄ値の決定
ＫｃまたはＰｌｏｄｉａ核抽出物、またはＣｆＥｃＲ（ＣＤＥＦ）−ＧＳＴおよびＣｆＵＳＰ−ＧＳＴ融合タンパク質を生産する細菌の抽出物を試験化合物の（０．１ｎＭ〜１０μＭ）濃度範囲の存在下で、３Ｈ−ポナステロンＡ（反応あたり６６，０００ｄｐｍ）とインキュベートすることによって、トリチウム標識ポナステロンＡ結合の５０％を阻害する競合剤の濃度（ＩＣ５０）が決定された。細菌融合タンパク質を用いる結合反応の場合には、それぞれ、ＣｆＥｃＲ（ＣＤＥＦ）−ＧＳＴまたはＣｆＵＳＰ−ＧＳＴ融合タンパク質を生産する細菌の抽出物２０または１μｌが結合反応あたり含有された。アッセイ条件および全体および非特異的結合の決定は上述の如くである。溶媒中の競合剤の体積は、２０Ｅまたは溶媒単独に対するように、１００倍濃縮ストック溶液を用いることにより全反応物体積の１％に保たれた（すなわち、ストック溶液の１００倍稀釈）。アッセイの残部は上述の如くであった。各反応は、試験化合物あたり濃度あたり２回繰り返して行われた。３Ｈ−ポナステロンＡの特異的結合は、全体（競合剤なし）から、非特異的結合（１０μＭの２０Ｅの存在下で得られた）または競合された放射活性結合を引くことにより決定された。各試験化合物のデータはＩＧＯＲ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ，Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ，ＯＲ）を使用することによって分析され、ＩＣ５０値を算出した。試験化合物に対する結合定数（μＭでのＫｄ）はＩＧＯＲ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅにＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Ｍｕｎｓｏｎ  ＰＪ．ａｎｄ  Ｒｏｄｂａｒｄ  Ｄ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７，２２０−２３９参照）を組み入れることによって算出された。
【００５０】
表１−３は得られたデータを要約する。
【００５１】
【表２】
0004537512.tif 000006
【００５２】
【表３】
0004537512.tif 000007
【００５３】
【表４】
0004537512.tif 000008
【００５４】
これらのデータは、本発明のリガンドが、公知の化合物ＣＥ−１およびＣＥ−２に匹敵するか、より小さい濃度で遺伝子発現を誘導することができることを示す。
【００５５】
改良された遺伝子発現調節能力に加えて、リガンドは、その優れた移送および代謝特性により、インタクト植物および動物で、より大きな有用性を有することが期待される。次の実施例は、植物における公知のリガンド（ＣＥ−１）に比べて、本発明のリガンド（リガンド３）の改良された植物移送を示す。
【００５６】
トランスラミナームーブメント（Ｔｒａｎｓｌａｍｉｎａｒ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔ）
モデル系として、新生児のビートアーミーワーム（ｂｅｅｔ  ａｒｍｙｗｏｒｍ）幼生、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、を用いて、コットン葉において、２つの化合物のトランスラミナームーブメントを評価するための試験が行われた。
２つの処理が評価された：ＣＥ−１とリガンド３（それぞれ５％および１９％）の乳剤を１００μｇ／ｍｌの濃度で、スプレータンク濃度をシミュレートした。次いで、これらの処理は優秀なトランスラミナームーブメントを有すると知られる化学標準品（エマメクチンベンゾエート（ｅｍａｍｅｃｔｉｎ  ｂｅｎｚｏａｔｅ）、０．１６％  ＥＣ〔２０μｇ／ｍｌ〕、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）で処理された植物および非処理植物と比較された。
【００５７】
４週齢のコットン、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ、植物は対応する処理でシングルレプリケート葉／植物の上面をペイントすることによる各処理で処理された。植物は必要とされるまで、２７℃に維持された、制御された環境の温室中で保たれた。残存する有効性は、処理および非処理の葉に新生児ビートアーミーワーム幼生、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ（Ｈuｂｎｅｒ）を、処理後（ＤＡＴ）１、７および１４日の３つの日にチャレンジすることによって評価された。各サンプル日において、単一処理された葉／植物は、処理あたり５つの植物のそれぞれから採取された。次いで、葉は、ペトリ皿（１００×２０ｍｍ）の上蓋に固定され、次いで１０匹の第１齢幼生を寄生させた。第１齢ビートアーミーワーム幼生は一般に、葉の下面を食べ、概して上面を食べない。よって、化合物は葉の上面のみに適用されたため、幼生に影響を与えるには、材料のトランスラミナームーブメントが必要である。幼生の死亡率は寄生から４日後に記録された。さらに、任意の生きている幼生は脱皮促進化合物の特徴の徴候（新たなクチクラおよび／またはスリップトヘッドカプセル（ｓｌｉｐｐｅｄ  ｈｅａｄ  ｃａｐｓｕｌｅ）の形成）が観察された。各処理は５回繰り返された。
【００５８】
パーセント死亡率データは平方根のアークサインに変換され、次いでＪＭＰ（Ｖｅｒ．３．２．１）を用いるＡＮＯＶＡによって分析された。平均値はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒテスト（Ｐ＝０．０５）によって抽出された。
結果はリガンド３はＣＥ−１よりも、トランスラミナームーブメントによるＳ．ｅｘｉｇｕａ幼生の殺虫において、有意により効果的であり、よって植物においてより高いシステミシティーを有することが期待される。
【００５９】
【表５】
0004537512.tif 000009