(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一点に集光する光を発生する光源と、
光源からの光をスリット光に変換するスリット光形成手段と、
試料が載せられる透明板と、
前記光源の集光する点は顕微鏡の対物レンズの瞳面内の一点に形成し、前記スリット光形成手段からのスリット光を前記透明板と試料側の媒質の界面に全反射角より小さい角度で入射させ、その屈折光を、その厚みが前記スリット光の厚みより薄く、かつ前記界面に対し極薄照明光が発生する角度で試料側の媒質に射出させる顕微鏡の対物レンズと、
前記極薄照明光が前記界面に対して一定の角度を保ちながらレンズ中心光軸上にて異なる高さになるように前記スリット光形成手段のスリットを移動させ前記スリット光の光路を変更するスリット光光路変更手段と、
から構成した顕微鏡用極薄照明光発生装置。
【請求項２】
前記光源はレーザ光源であり、前記透明板はカバーガラスであり、前記対物レンズの、前記スリット光形成手段からのスリット光を入射させる位置は、対物レンズの周縁部であることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置。
【請求項３】
前記スリット光形成手段は、光源からの光を最小のスリット光に変換する第１スリット板と、前記スリット板で形成された側帯回折光を除去する第２スリット板から構成されている請求項１記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置。
【請求項４】
請求項１記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置を用いる顕微鏡観察方法であって、
顕微鏡の前記透明板に標本を配置するステップと、
前記スリット光の光路を前記スリット光光路変更手段により移動させることにより前記極薄照明光を界面に対し一定の角度を保ちながらレンズ中心光軸上にて標本内の異なる高さ位置に形成し、この極薄照明光の通過した１以上の切断面から前記極薄照明光に励起されて発生した信号光の情報を取得するステップと、
前記切断面の情報に基づいて切断面の情報または複数の切断面の情報よりなる立体情報を再生するステップから構成した顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料を光学的に断面する顕微鏡用極薄照明光発生装置および前記装置を用いた観察方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や組織の切断・断層像を得る従来の方法は微分干渉法や共焦点走査顕微鏡法である。これらは約１マイクロメートルの厚みの断層像を形成する。
これらの光学的切断法は、ピンホールまたはプリズムによる焦点面画像の選択的取得に基づいており、焦点面前後の面から到来する光がこれらの光学素子によって排除されることで、断層像ができる。
ピンホールの大きさで切断の厚みが決まるが、ピンホールを小さくしすぎると暗い像となる。プリズムの場合は、もっぱら対物レンズの開口数の作用によって切断能が決まる。光自体は薄いものとはなっておらず、標本上での照明領域は大きい。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は従来方法では、達成できなかった極めて薄い極薄照明光を発生する顕微鏡用極薄照明光発生装置を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は前記顕微鏡用極薄照明光発生装置を用いて、細胞等の立体情報を獲得することができる観察方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明による請求項１記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置は、一点に集光する光を発生する光源と、
光源からの光をスリット光に変換するスリット光形成手段と、
試料が載せられる透明板と、
前記光源の集光する点は顕微鏡の対物レンズの瞳面内の一点に形成し、前記スリット光形成手段からのスリット光を前記透明板と試料側の媒質の界面に全反射角より小さい角度で入射させ、その屈折光を、その厚みが前記スリット光の厚みより薄く、かつ前記界面に対し極薄照明光が発生する角度で試料側の媒質に射出させる顕微鏡の対物レンズと、
前記極薄照明光が前記界面に対して一定の角度を保ちながらレンズ中心光軸上にて異なる高さになるように前記スリット光形成手段のスリットを移動させ前記スリット光の光路を変更するスリット光光路変更手段と、から構成されている。
【０００５】
本発明による請求項２記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置は、請求項１記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置において、前記光源はレーザ光源であり、前記透明板はカバーガラスであり、前記対物レンズの、前記スリット光形成手段からのスリット光を入射させる位置は、対物レンズの周縁部であることを特徴とする。
本発明による請求項３記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置は、請求項１記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置において、
前記スリット光形成手段は、光源からの光を最小のスリット光に変換する第１スリット板と、前記スリット板で形成された側帯回折光を除去する第２スリット板から構成されている。
なお、第１スリット板と第２スリット板は連動しまたは独立して移動させることができる。
【０００６】
本発明による請求項４記載の方法は、請求項１記載の顕微鏡用極薄照明光発生装置を用いる顕微鏡観察方法であって、
顕微鏡の前記透明板に標本を配置するステップと、
前記スリット光の光路を前記スリット光光路変更手段により移動させることにより前記極薄照明光を界面に対し一定の角度を保ちながらレンズ中心光軸上にて標本内の異なる高さ位置に形成し、この極薄照明光の通過した１以上の切断面から前記極薄照明光に励起されて発生した信号光の情報を取得するステップと、
前記切断面の情報に基づいて切断面の情報または複数の切断面の情報よりなる立体情報を再生するステップから構成されている。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下図面等を参照して本発明による装置の実施の形態を説明する。図１は、本発明による顕微鏡用極薄照明光発生装置の原理を説明するための略図である。
図１に示すように水相とカバーガラスのような透明板５との界面を想定し、その中に細胞等の標本１０が存在している場合について検討する。その界面の入射光７の入射角θを臨界角より僅かに小さく取ると、全反射を生ずることなく、光は水側へ抜ける光の成分が発生する。この抜けた光（屈折光）８は界面に平行に近い。この条件において、入射光７がこの紙面に直角方向に幅を持ち光の厚さをｄ1 とすると屈折光８は同様な幅を持ち厚みｄ2 はｄ1 よりは遙に薄くなる。本件発明者は前記原理を利用して水相中の標本１０を光学的に切断して、その切断面１０’の情報を得ようとするものである。
以下本願明細書において入射光７に相当するスリット状の光をスリット光７といいこの光が界面で屈折して発生する光８を極薄照明光８と言うことにする。
【０００８】
図２は本発明による顕微鏡用極薄照明光発生装置のスリット光形成手段出力までの光路の実施例を示す略図である。
レーザ発振器２０からのレーザ光は反射鏡２１，２２により光路が変更され、凹レンズ２３によって発散させられ凸レンズ２４により、コリメートまたは収束されて反射鏡２５で反射されたレーザ光１が、前述したスリット光７を形成するスリット光形成手段９に入射される。スリット光形成手段９の出力は顕微鏡の鏡筒内に入射させられ、反射鏡６により前述したスリット光７として利用される。
【０００９】
次に図４を参照して、本発明による顕微鏡用極薄照明光発生装置で使用するスリット光形成手段の第１の実施例を説明する。なお通常スリット光形成手段と後述する対物レンズ間には、適宜な反射鏡やダイクロイックミラーなどの光学素子が用いられるが、説明を容易にするために省略してある。スリット光形成手段９Ａに入射されるレーザ光１ｃは集光されており、第１のスリット２に入射させられる。これによって光が狭められるとともに回折が起こり、サイドバンドが生ずる。この第１のスリット２を横に移動することで走査の機能を果たすことができる。第２のスリット３で、サイドバンドを遮断する。第１のスリット２を横方向の移動に連動して第２のスリット３を適当量横に移動して、主光を通して、スリット光７を形成する。スリット光７は顕微鏡の対物レンズ４の周縁部に入射される。対物レンズ４とカバーガラス５の間には結合油が封入されている。１２Ａ，１２Ｂは標本（蛍光ビーズ）であり、それを切断するように極薄照明光８が通る。対物レンズを上下してフォーカスを合わせる。切断面の蛍光発光を確認することにより極薄照明光８の効果を確認できる。
【００１１】
図３は、標本である細胞１１を観察する例を示す図である。
スリット光７を前述のようなスリット光形成手段９で形成し、反射鏡６により対物レンズ４に入射する。このスリット光を上記原理によってさらに細くして回折限界に達する薄い極薄照明光８を形成する。
これを細胞からなる標本１１に照射し、照明された部分をそれに垂直な方向から観察して細胞等の断層像を得る。細胞の内部にある蛍光性の物質の像（蛍光像）が得られる。スリット光の位置をずらすことにより、細胞等の光切断位置を走査することにより、各面の２次元画像を記録し、それをコンピュータ上で再構成することで細胞の３次元像が得られる。特に、超高開口数対物レンズ(NA=1.65) を利用して、このような配置を取ることは容易であり、実用的な装置として構築できた。また前記極薄照明光８は１ミクロン以下の厚さにすることができる。
【００１２】
本発明による顕微鏡観察方法は、前記装置を使用するものである。
顕微鏡の前記透明板カバーグラスに標本を配置するステップにより、細胞等の標本を水相に配置する。前記スリット光の光路を選択して前記極薄照明光の通過した１以上の切断面の前記極薄照明光に励起された信号光の情報を取得する。
そして前記前記切断面の情報に基づいて断面のまたは立体情報を再生する。
これにより、細胞等の立体像を再構成することができる。
【００１３】
【発明の効果】
以上、説明したように本発明は１ミクロン以下の厚さの極薄照明光をカバーグラスに略平行に作りだすことができ、これにより獲得できる断面の情報に基づいて、細胞等の３次元情報を再構成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による顕微鏡用極薄照明光発生装置の原理を説明するための略図である。
【図２】  本発明による顕微鏡用極薄照明光発生装置のスリット光形成手段出力までの光路を示す略図である。
【図３】  本発明による顕微鏡用極薄照明光発生装置の実施例を示す略図である。
【図４】  本発明による顕微鏡用極薄照明光発生装置で使用するスリット光形成手段の第１の実施例を示す略図である。
【符号の説明】
１  レーザ光
２  第１のスリット
３  第２のスリット
４  対物レンズ
５  透明板（カバーガラス）
６  反射鏡
７  スリット光
８  極薄照明光
９，９Ａ  スリット光形成手段
１０，１１  標本
１２Ａ，１２Ｂ  標本
１３  顕微鏡鏡筒
２０  レーザ発振器
２１，２２  反射鏡
２３  凹レンズ
２４  凸レンズ
２５  反射鏡
【図１】
0004465460.tif 000002
【図２】
0004465460.tif 000003
【図３】
0004465460.tif 000004
【図４】
0004465460.tif 000005