(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養培地、及び、試料中に非遊離で微生物に特異的な少なくとも一種の第一の酵素によって加水分解されて標識を生じることの可能な少なくとも一種の基質を含む、試料中に存在する微生物の検出用及び／又は識別用の培地であって、
更に、前記第一の酵素と同一の、前記試料中に遊離していて微生物に由来しない少なくとも一種の第二の酵素に対する少なくとも一種の阻害剤を含み、
前記第一の酵素はエステラーゼであり、
前記阻害剤は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
0004585509.tif 000016
式中、
Ｒ１は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
Ｒ２は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
Ｒ３は、存在しない、又は、アルキル基、アリール基若しくはＮＯ２基である：である
ことを特徴とする培地。
【請求項２】
前記微生物は細菌である
ことを特徴とする請求項１に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項３】
前記細菌はサルモネラ属に属する
ことを特徴とする請求項２に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項４】
前記微生物は酵母である
ことを特徴とする請求項１に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項５】
前記酵母はカンジダ属に属する
ことを特徴とする請求項４に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項６】
前記阻害剤は、Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート及び／若しくはＯ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート及び／若しくはＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート、並びに／又は、これらの物質の誘導体の少なくとも一種である
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項７】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、０．１〜１５ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項６に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項８】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、１〜１０ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項６又は７に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項９】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項６に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項１０】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、１０〜５０ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項６又は９に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項１１】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート又はその誘導体の濃度は、１〜１０００ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項６に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項１２】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート又はその誘導体の濃度は、３０〜１００ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項６又は１１に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項１３】
前記基質は、発色性基質である
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項１４】
前記基質は、インドキシル又はその誘導体のエステルである
ことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検出用及び／又は識別用の培地。
【請求項１５】
微生物を検出及び／又は識別する方法であって、
以下：
識別目的である微生物を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の検出用の培地上に播種すること、
識別目的である微生物を播種した検出用の培地をインキュベートすること、及び、
基質が加水分解されて生じた標識物質を検出することにより微生物の存在を決定すること：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の検出用及び／又は識別用の培地の、微生物を識別するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、生化学的手法による微生物の分析、特に、反応培地の播種による微生物の検出及び識別である。
【０００２】
本発明の範囲内において、重要な点は、より具体的には、病原体又は品質指標としての（特に細菌又は酵母等の）微生物の医療環境又は産業環境における検出及び識別である。
【背景技術】
【０００３】
現在のところ、上記微生物を検出するための培地が多数存在する。この検出は、特に、検出目的である微生物の酵素に特異的な特定の基質の使用に基づく可能性がある。一般的に、酵素の合成基質は、明らかにする酵素活性に特異的な第一の部分、及び、標識の役割をし、かつ、一般的に発色性又は蛍光性である第二の部分からなる。反応が存在するか否かに応じて上記基質を選択することによって、微生物の性質を特徴付けることが可能である。
【０００４】
従って、細菌の場合、大腸菌株の実証は、β−グルクロニダーゼ活性又はβ−ガラクトシダーゼ活性等のオシダーゼ（ｏｓｉｄａｓｅ）型酵素活性を明らかにすることにより実施されることが多い。同様に、β−グルコシダーゼ活性の実証によりリステリア菌属の検出が可能である。
【０００５】
また、アミノペプチダーゼ活性によって細菌の属又は種を明らかにすることが可能である。従って、例えば、アラニン−アミノペプチダーゼ活性により、グラム陰性菌とグラム陽性菌との識別が可能である。
【０００６】
最後に、特にサルモネラ属を実証するための、エステラーゼ活性の検出についても挙げることができる。これは、サルモネラ属が発色性の合成基質（例えばインジゴ生成基質）を加水分解できる非特異的なエステラーゼを有していることによるものである。サルモネラ菌、より具体的にはエステラーゼ活性を有する細菌を検出する場合、従来は、エステラーゼ活性を有する細菌であると考えられるコロニーの検出及び／又は識別が可能な寒天培地又は液体培地を分離して、これらの細菌の検出及び／又は識別を実施する。
【０００７】
しかし、特定の試料、特に糞便試料を使用する場合、検出目的である微生物に非特異的で、試料中に遊離しており（下記の「遊離酵素」を参照）、その後発色性基質と反応可能な酵素の存在が観察される。このような「遊離」酵素は、特に糞便試料等の生体試料中に存在する可能性があり、かつ、消化管、肝臓及び膵臓の細胞に由来する可能性があるため、これらの器官を経由する生体試料中に存在する可能性がある。また、遊離酵素は、分析目的である、例えば家禽の肝臓等の食物試料中に存在する可能性がある；この場合、この酵素は肝臓の細胞に由来する。遊離酵素は陽性反応の疑いを誘発するが、この疑いは確認不可能である：実際には汚染されていないのに汚染が考えられる試料のある場合があるが、その後の診断に非常に大きな影響を及ぼす可能性がある。従って、エステラーゼ型酵素活性の実証によってサルモネラ菌を検出する場合、サルモネラ菌汚染のない糞便試料中に「遊離」エステラーゼが含まれる可能性があり、この「遊離」エステラーゼによって培養培地中の基質が加水分解され、通常サルモネラ菌に特異的なマゼンタ色が放出される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、微生物に非特異的な遊離酵素が試料中に存在するために発生する不正確な陽性反応を制限することにより、一般的に市販される微生物検出用培地の改善を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
予想外にも、本発明者らは、ある特定の化学化合物を使用すると、非遊離酵素（すなわち検出目的である微生物に由来する酵素）を阻害せずに、試料中の遊離酵素を阻害できることを実証した。
【００１０】
また、本発明は、
培養培地、及び、試料中に非遊離で微生物に特異的な少なくとも一種の第一の酵素によって加水分解されて標識を生じることの可能な少なくとも一種の基質を含む、特に生体試料又は食品試料等の試料中に存在する微生物の検出用の培地であって、
更に、上記試料中に遊離していて目的微生物に由来しない少なくとも一種の第二の酵素に対する少なくとも一種の阻害剤を含む
ことを特徴とする培地
に関する。上記第二の酵素は、上記第一の酵素と異なっていても同一であってもよい。
【００１１】
本発明の目的について、「微生物」という用語は、細菌、酵母、及び、より一般的には、研究所内で増殖かつ取扱い可能な、一般的に肉眼では見えない単細胞生物である生物を含む。
【００１２】
本発明のある好ましい実施形態によれば、上記微生物は、グラム陰性菌若しくはグラム陽性菌、又は、酵母である。
【００１３】
グラム陰性菌について、次の属の細菌を挙げることができる：シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プローテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ菌、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属及びレジオネラ属。
【００１４】
グラム陽性菌について、次の属の細菌を挙げることができる：エンテロコッカス菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス、リステリア菌、クロストリジウム属、マイコバクテリウム属及びコリネバクテリウム属。
【００１５】
酵母について、次の属の酵母を挙げることができる：カンジダ属、クリプトコッカス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【００１６】
本発明のある好ましい実施形態によれば、上記微生物は、（好ましくはサルモネラ属に属する）細菌、又は、（好ましくはカンジダ属に属する）酵母である。
【００１７】
本発明の目的について、「培養培地」という用語は、微生物の生存及び／又は増殖に必要な全ての要素を含む培地を意味するものとする。実際には、当業者であれば、完全に公知で当業者の範囲内にある基準によって、目的の微生物に対して培養培地を選択できるであろう。細菌については、例えば次の型の選択培地を挙げることができる：マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）型、コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）ＡＮＣ型、ＰＡＬＣＡＭ型、トリプケース−ソイ（ｔｒｙｐｃａｓｅ  ｓｏｙ）型の非選択培地、及び、栄養培地。酵母については、培養培地として、サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）・ゲンタマイシン−クロラムフェニコール培養培地、又は、サブロー培養培地を挙げることができる。
【００１８】
本発明の培養培地は、例えば次に挙げるもの等の任意の他の添加物を含んでいてもよい：ペプトン、一種以上の増殖因子、炭水化物、一種以上の選択剤、バッファー、一種以上のゲル化剤等。この培養培地は、そのまま使用可能な、すなわちチューブ中、フラスコ中又はペトリ皿上にそのまま播種可能なゲル状液体であってもよい。
【００１９】
本発明の目的について、「基質」は、加水分解されて、直接又は間接的に微生物を検出できる物質を生じることが可能な任意の基質から選択される。この基質は、次のものを含むことが好ましい：
＊明らかにする酵素活性に特異的な第一の部分；この第一の部分は、目的微生物に特異的な上記第一の酵素と相互作用可能であるが、上記第二の酵素とも相互作用可能である：
＊蛍光性であっても発色性であってもよい、標識の役割をする第二の部分（以下、標識部分と呼ぶ）。
【００２０】
蛍光性基質については特に、ウンベリフェロン若しくはアミノクマリン（ａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ）に基づく基質、レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）に基づく基質、又は、フルオレセインに基づく基質を挙げることができる。
【００２１】
固体支持体（フィルタ、寒天、電気泳動ゲル）に対してより適切な発色性基質については特に、オシダーゼ活性及びエステラーゼ活性の検出が可能な、インドキシル及びその誘導体に基づく基質、並びに、ヒドロキシキノリン又はエスクレチン及びそれらの誘導体に基づく基質を挙げることができる。また、ニトロフェノール及びニトロアニリン並びにそれらの誘導体に基づく基質を挙げることもできる。この場合、ニトロフェノールに基づく基質の場合にはオシダーゼ活性及びエステラーゼ活性を、ニトロアニリンに基づく基質の場合にはペプチダーゼ活性を検出する。最後に、ナフトール及びナフチルアミン並びにそれらの誘導体に基づく基質を挙げることもできる。この場合、ナフトールによってオシダーゼ活性及びエステラーゼ活性を、ナフチルアミンによってペプチダーゼ活性を検出可能である。この基質は特に、オシダーゼ活性、ペプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性等の酵素活性を検出可能であるが、この限りではない。
【００２２】
「試料」という用語は、微生物の存在を検出する目的の任意の種類の試料を意味するものとする。この試料は、生体試料であっても食品試料であってもよい。この試料は特に、血液試料、尿試料、糞便試料、食品試料等に由来するものであってもよいが、この限りではない。
【００２３】
「第一の酵素」という用語は、試料中に非遊離の酵素、すなわち検出目的の微生物に由来する酵素を意味するものとする。この酵素は特に、オシダーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、ホスファターゼ等であってもよいが、この限りではない。この酵素は、基質を加水分解して標識物質を生じることが可能である。
【００２４】
「第二の酵素」という用語は、第一の酵素とは異なる又は同一であるが、試料中に遊離している、すなわち目的微生物に由来しない酵素を意味するものとする。この第二の酵素は、上記基質と反応可能であり、不正確な陽性反応を誘導する可能性がある。この酵素は特に、オシダーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、ホスファターゼ等であってもよいが、この限りではない。
【００２５】
本発明のある好ましい実施形態によれば、上記第一の酵素はエステラーゼである。従って、好ましくは、上記阻害剤は、有機リン酸エステルファミリーに属し、式（Ｉ）の化合物である：
【００２６】
【化１】
0004585509.tif 000002
【００２７】
式中、
＊Ｒ１は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
＊Ｒ２は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
＊Ｒ３は、存在しない、又は、アルキル基、アリール基若しくはＮＯ２基である。
【００２８】
本発明によれば、「アリール基」という用語は特に、Ｃ６〜Ｃ１０芳香環、特にフェニル基、ベンジル基、１−ナフチル基又は２−ナフチル基を意味するものとする。「アルキル基」という用語は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、すなわち炭素原子を１〜６個有する直鎖又は分岐のアルキル基を意味するものとする。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基及びヘキシル基を挙げることができる。
【００２９】
本発明のある好ましい実施形態によれば、上記阻害剤は、
・  Ｒ１及びＲ２がエチル基であり、
・  Ｒ３がＮＯ２基である、
式（Ｉ）の化合物である。
【００３０】
この化合物は、式のＯ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェートである：
【００３１】
【化２】
0004585509.tif 000003
【００３２】
本発明のある好ましい実施形態によれば、上記阻害剤は、
＊Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、
＊Ｒ３がＮＯ２基である、
式（Ｉ）の化合物である。
【００３３】
この化合物は、式のＯ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェートである：
【００３４】
【化３】
0004585509.tif 000004
【００３５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記阻害剤は、
＊Ｒ１及びＲ２がクロロエチル基であり、
＊Ｒ３が式の環である、
式（Ｉ）の化合物である：
【００３６】
【化４】
0004585509.tif 000005
【００３７】
点線は、本発明の式（Ｉ）の化合物中の上記環の位置を視覚化できる。
【００３８】
この化合物は、式のＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートである：
【００３９】
【化５】
0004585509.tif 000006
【００４０】
また、上記阻害剤は上述の物質の誘導体であってもよい。
【００４１】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、好ましくは０．１〜１５ｍｇ／ｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｌである。
【００４２】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート又はその誘導体の濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｌ、より好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｌである。
【００４３】
検出用の培地中のＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート又はその誘導体の濃度は、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｌ、より好ましくは３０〜１００ｍｇ／ｌである。
【００４４】
本発明のある好ましい実施形態によれば、上記第一の酵素はオシダーゼ、好ましくはグルコシダーゼ、より好ましくはα−グルコシダーゼである。当業者であれば、グルコシダーゼ阻害剤の選択にあたって、Ｌｅ  Ｍｅｒｒｅｒらによる出版物（１９９７年，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５巻（３），５１９−５３３頁）を参照できる。
【００４５】
好ましくは、上記阻害剤はカスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）、すなわち式（ＩＩ）の化合物：
【００４６】
【化６】
0004585509.tif 000007
【００４７】
又はこの化合物の誘導体である。
【００４８】
カスタノスペルミン誘導体は特に、Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄらによる出版物（Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ  ２００１年，第７巻１１号）中に記載されている。
【００４９】
検出用の培地中のカスタノスペルミン又はその誘導体の濃度は、好ましくは０．５〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは１〜１０ｇ／ｌである。
【００５０】
本発明のある好ましい実施形態によれば、上記基質は発色性基質、好ましくはインドキシル又はその誘導体のエステル、より好ましくは式（ＩＩＩ）のインドキシルエステルである：
【００５１】
【化７】
0004585509.tif 000008
【００５２】
式中、
ｎは１〜１２の間であり、かつ、
Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺはＨ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ及びＩから選択される。
【００５３】
更により好ましくは、上記基質は、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルカプリレート（マゼンタＣ８，ＣＡＳ  Ｎｏ．２０９３４７−９４−４）又は５−ブロモ−３−インドキシルノナノエート（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）である。
【００５４】
また、本発明は、
微生物を検出及び識別する方法であって、
以下：
＊識別目的である微生物を上記に定義する検出用の培地上に播種すること、
＊識別目的である微生物を播種した検出用の培地をインキュベートすること、及び、
＊基質が加水分解されて生じた標識物質を検出することにより微生物の存在を決定すること：を含む
ことを特徴とする方法
にも関する。
【００５５】
微生物（特に細菌又は酵母等）の播種は、当業者に公知の任意の播種方法によって実施可能である。また、インキュベートは、微生物の増殖、及び、検出目的である酵素活性が最大となるような温度で実施されるのが好ましく、この温度は、検出目的の酵素活性に応じて当業者であれば容易に選択可能である。例えば、上記インキュベートは、３６〜３８℃で実施されるのが好ましい。
【００５６】
本発明は、上記に定義する検出用及び／又は識別用の培地の、微生物を識別するための使用に関する。
【００５７】
また、本発明は、上記に定義する試料中の遊離酵素、好ましくは遊離エステラーゼを阻害するための、式（Ｉ）の化合物の使用にも関する：
【００５８】
【化８】
0004585509.tif 000009
【００５９】
式中、
＊Ｒ１は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
＊Ｒ２は、水素原子、又は、アルキル基、アリール基若しくはハロゲン基であり、
＊Ｒ３は、存在しない、又は、アルキル基、アリール基若しくはＮＯ２基である。
【００６０】
また、本発明は、上記に定義する試料中の遊離酵素、好ましくは遊離オシダーゼ、好ましくは遊離グルコシダーゼ、更に好ましくは遊離α−グルコシダーゼを阻害するための、式（ＩＩ）の化合物の使用にも関する：
【００６１】
【化９】
0004585509.tif 000010
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
下記実施例は説明のために記載するものであって、本質的に何ら限定的なものではない。
下記実施例により、本発明のより明瞭な理解が可能になるであろう。
【００６３】
（実施例１）
＜サルモネラ菌の識別における、Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害＞
本実施例中に示す実験の目的は、（サルモネラ菌で汚染された糞便試料中の）遊離エステラーゼに対するＯ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート（パラオキソン（Ｒ）エチル；Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ社，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス））の阻害効果を調べることである。
【００６４】
（検出用の培地の調製）
検出用の培地２５０ｍｌを、次の組成の粉末培地から調製する：
ペプトン        ６．２５ｇ／ｌ
Ｔｒｉｓ        ０．１６ｇ／ｌ
ラクトース      ６ｇ／ｌ
胆汁酸塩        １．５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ        ５ｇ／ｌ
寒天            １４ｇ／ｌ
【００６５】
１００℃で融解させた培地を、１２１℃で１５分間オートクレーブする。その後、この培地に次の添加物を添加する：マゼンタＣ８（５００ｍｇ／ｌ；Ｂ−７１０２、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社、Ｓｔａａｄ（スイス））；Ｘ−グルコシド（７５ｍｇ／ｌ；Ｂ−７２５０、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社、Ｓｔａａｄ（スイス））；セフスロジン（１０ｍｇ／ｌ；Ｃ  ４７８６，シグマ社、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス））、及び、様々な濃度の阻害剤Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート（パラオキソン（Ｒ）エチル；ＣＡＳ  Ｎｏ．３１１−４５−５；３６１８６，Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ社，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス）；０、１、５又は１０ｍｇ／ｌ）。
【００６６】
その後、上記で得られたそれぞれの検出用の培地をペトリ皿中に注ぐ。
【００６７】
（サルモネラ菌の播種）
糞便１０μｌをペトリ皿上に付着させ、この糞便懸濁液をサルモネラ菌（０．５ＭｃＦ）の懸濁液１０μｌと混合して又は混合せずに、ペトリ皿上に三か所に分ける。様々な塩及び本出願人が保存している株に由来する様々なサルモネラ菌株を、このプロトコルに従って使用する。ペトリ皿を３７℃で２４時間インキュベートする。糞便付着箇所（「付着」欄）及びサルモネラ菌コロニー（「コロニー」欄）における着色の出現を、半定量スケールに従って読み取る。
０＝非着色
０．５＝微量の着色
１＝弱い着色
２＝強い着色
【００６８】
得られた結果を、表１中に示す。
【００６９】
表１：サルモネラ菌の識別における、糞便試料中の遊離エステラーゼの活性に及ぼす阻害剤Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェートの影響
【００７０】
【表１】
0004585509.tif 000011
【００７１】
表１中に示すように、糞便付着箇所の着色は阻害剤の存在下で減少するが、一方、菌コロニー中の着色は阻害剤の存在の有無に関わらず維持される。従って、糞便中に遊離していて（本発明の開示において「第二の酵素、遊離」として参照する）主として糞便付着箇所に存在する酵素は阻害剤によって明らかに阻害されるが、一方、細菌に由来する（本発明の開示において「第一の酵素、非遊離」として参照する）主としてサルモネラ菌コロニー中に存在する酵素は阻害されていない。
【００７２】
菌株の非存在下で糞便を付着させた場合に観察される付着箇所の着色により、サルモネラ菌汚染由来ではなく試料由来の遊離酵素の存在に関連する反応の存在が実証される。
【００７３】
これらの結果は、「遊離酵素」の存在による非特異的な酵素反応が、阻害剤Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェートの存在下において顕著に阻害され、これによって不正確な陽性反応の検出が制限されることを実証する。
【００７４】
（実施例２）
＜サルモネラ菌の識別における、Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害＞
本実施例中に示す実験の目的は、サルモネラ菌で汚染された糞便について、遊離エステラーゼに対するＯ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート（パラオキソン（Ｒ）メチル；Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ社，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス））の阻害効果を実証することである。
【００７５】
（検出用の培地の調製）
検出用の培地２５０ｍｌを、次の組成の粉末培地から調製する：
ペプトン        ６．２５ｇ／ｌ
Ｔｒｉｓ        ０．１６ｇ／ｌ
ラクトース      ６ｇ／ｌ
胆汁酸塩        １．５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ        ５ｇ／ｌ
寒天            １４ｇ／ｌ
【００７６】
１００℃で融解させた培地を、１２１℃で１５分間オートクレーブする。その後、この培地に次の添加物を添加する：マゼンタＣ８（５００ｍｇ／ｌ；Ｂ−７１０２、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社、Ｓｔａａｄ（スイス））；Ｘ−グルコシド（７５ｍｇ／ｌ；Ｂ−７２５０、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社、Ｓｔａａｄ（スイス））；セフスロジン（１０ｍｇ／ｌ；Ｃ  ４７８６，シグマ社、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス））、及び、様々な濃度の阻害剤Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート（パラオキソン（Ｒ）メチル；ＣＡＳ  Ｎｏ．９５０−３５−６；Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ社，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス）；５、１０、２５ｍｇ／ｌ）。
【００７７】
その後、上記で得られたそれぞれの検出用の培地をペトリ皿中に注ぐ。
【００７８】
（サルモネラ菌の播種）
実施例１と同様に、このペトリ皿について、接種し、インキュベートし、値を読み取る。
【００７９】
得られた結果を、表２中に示す。
【００８０】
表２：サルモネラ菌の識別における、試料中の遊離エステラーゼの活性に及ぼす阻害剤Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェートの影響
【００８１】
【表２】
0004585509.tif 000012
【００８２】
表２中に示すように、糞便付着箇所の着色は阻害剤の存在下で減少するが、一方、菌コロニー中の着色は阻害剤の存在の有無に関わらず維持される。従って、糞便中の遊離酵素は上記阻害剤によって明らかに阻害されるが、一方、細菌由来の酵素は阻害されない。
【００８３】
これらの結果は、「遊離酵素」の存在による非特異的な酵素反応が、阻害剤Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェートの存在下において顕著に阻害され、これによって不正確な陽性反応の検出が制限されることを示す。
【００８４】
（実施例３）
＜サルモネラ菌の識別における、Ｏ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害＞
本実施例中に示す実験の目的は、サルモネラ菌で汚染された試料（糞便）中の遊離エステラーゼに対するＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート（ハロキソン（Ｒ）；シグマ社，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス））の阻害効果を実証することである。
【００８５】
（検出用の培地の調製）
Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェートを様々な濃度のＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート（ハロキソン（Ｒ）；ＣＡＳ  Ｎｏ．３２１−５５−１；Ｒ２７６９９５，シグマ社，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス）；０、１、１０、１００又は１０００ｍｇ／ｌ）で置き換えて、実施例１の培地２５０ｍｌを実施例１の方法に従って調製する。
【００８６】
その後、上記で得られたそれぞれの選択培地をペトリ皿中に注ぐ。
【００８７】
（サルモネラ菌の播種）
実施例１と同様に、このペトリ皿について、接種し、インキュベートし、値を読み取る。
【００８８】
得られた結果を、表３中に示す。
【００８９】
表３：サルモネラ菌の識別における、試料中の遊離エステラーゼの活性に及ぼす阻害剤Ｏ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートの影響
【００９０】
【表３】
0004585509.tif 000013
【００９１】
表３中に示すように、糞便付着箇所の着色は阻害剤の存在下で減少するが、一方、菌コロニー中の着色は阻害剤の存在の有無に関わらず維持される。従って、糞便中の遊離酵素は上記阻害剤によって明らかに阻害されるが、一方、細菌由来の酵素は阻害されない。これらの結果は、「遊離酵素」の存在による非特異的な酵素反応が、阻害剤Ｏ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートの存在下において顕著に阻害され、これによって不正確な陽性反応の検出が制限されることを実証する。
【００９２】
（実施例４）
＜酵母の識別における、Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート及びＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートの使用による、試料中の遊離エステラーゼの阻害＞
本実施例中に示す実験の目的は、カンジダ属酵母で汚染された糞便について、遊離エステラーゼに対するＯ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート及びＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートの阻害効果を実証することである。
【００９３】
（検出用の培地の調製）
検出用の培地２５０ｍｌを、次の組成の粉末培地から調製する：
ペプトン        １０ｇ／ｌ
グルコース      １ｇ／ｌ
Ｔｒｉｓ        ０．１６ｇ／ｌ
寒天            １４ｇ／ｌ
【００９４】
１００℃で融解させた培地を、１２１℃で１５分間オートクレーブする。その後、この培地に次の添加物を添加する：マゼンタＣ８（５００ｍｇ／ｌ；Ｂ−７１０２、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社、Ｓｔａａｄ（スイス））；Ｘ−グルコシド（７５ｍｇ／ｌ；Ｂ−７２５０、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社、Ｓｔａａｄ（スイス））；セフスロジン（１０ｍｇ／ｌ；Ｃ  ４７８６，シグマ社、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ（フランス））、及び、エステラーゼ阻害剤：
＊Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート：５ｍｇ／ｌ
＊Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート：２５ｍｇ／ｌ、又は、
＊Ｏ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート：７５ｍｇ／ｌ。
【００９５】
その後、上記で得られたそれぞれの選択培地をペトリ皿中に注ぐ。
【００９６】
（カンジダ属酵母の播種）
糞便１０μｌをペトリ皿上に付着させ、この糞便懸濁液をカンジダ属の懸濁液１０μｌと混合して又は混合せずに、ペトリ皿上に三か所に分ける。様々な糞便及び本出願人が保存している株に由来する様々なカンジダ属株を、このプロトコルに従って使用する。ペトリ皿を３７℃で２４時間インキュベートする。
【００９７】
糞便付着箇所及びカンジダ属コロニー中の着色の出現を、半定量スケールに従って読み取る。
０＝非着色
０．５＝微量の着色
１＝弱い着色
２＝強い着色
【００９８】
得られた結果を、表４中に示す。
【００９９】
表４：カンジダ属酵母の識別における、試料中の遊離エステルの活性に及ぼす阻害剤Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート及びＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートの影響
【０１００】
【表４】
0004585509.tif 000014
【０１０１】
表４中に示すように、糞便付着箇所の着色はそれぞれの阻害剤の存在下で減少するが、一方、酵母コロニー中の着色は阻害剤の存在の有無に関わらず維持される。従って、糞便中の遊離酵素は上記阻害剤によって明らかに阻害されるが、一方、酵母由来の酵素は阻害されない。
【０１０２】
これらの結果は、「遊離酵素」の存在による非特異的な酵素反応が、阻害剤Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート及びＯ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェートの存在下において顕著に阻害され、これによって不正確な陽性反応の検出が制限されることを実証する。
【０１０３】
（実施例６）
＜細菌の識別における、カスタノスペルミンの使用による、試料中の遊離α−グルコシダーゼの阻害＞
本実施例中に示す実験の目的は、黄色ブドウ球菌株で汚染された試料（糞便）中の遊離α−グルコシダーゼに対する、カスタノスペルミンの阻害効果を実証することである。
【０１０４】
（検出用の培地の調製）
Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェートを様々な濃度（０、１、２、４及び８ｇ／ｌ）のカスタノスペルミンで置き換えて、実施例１の培地２５０ｍｌを実施例１の方法に従って調製する。
【０１０５】
その後、上記で得られたそれぞれの検出用の培地をペトリ皿中に注ぐ。
【０１０６】
（黄色ブドウ球菌株の播種）
実施例１と同様に、このペトリ皿について、接種し、インキュベートし、値を読み取る。
【０１０７】
得られた結果を、表６中に示す。
【０１０８】
表６：黄色ブドウ球菌株の識別における、試料中の遊離α−グルコシダーゼの活性に及ぼすカスタノスペルミンの影響
【０１０９】
【表６】
0004585509.tif 000015
【０１１０】
表６中に示すように、糞便付着箇所の着色はカスタノスペルミンの存在下で減少するが、一方、菌コロニー中の着色は阻害剤の存在の有無に関わらず維持される。従って、糞便中の遊離酵素は上記阻害剤によって明らかに阻害されるが、一方、細菌由来の酵素は阻害されない。
【０１１１】
これらの結果は、「遊離酵素」の存在による非特異的な酵素反応が、阻害剤カスタノスペルミンの存在下において顕著に阻害され、これによって不正確な陽性反応の検出が制限されることを実証する。
【０１１２】
注目するべきは、実施例１〜６の変形形態は、阻害剤を、培養培地に直接添加するのではなく試料培地に添加する形態である。
【０１１３】
（実施例７）
＜本発明による少なくとも一種の第二の酵素に対する阻害剤を識別する方法＞
この方法は、実施例１又は２の実験に、次の置き換えを加えた実施である：
ｉ）（酵素基質を含む）上述の培養培地を、目的微生物に適切な培地で置き換える；
ｉｉ）糞便を、上記微生物について調べる目的であり、かつ、培地中に含まれる一種以上の酵素基質と寄生的に反応する試料で置き換える；
ｉｉｉ）阻害剤Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジ−（２−クロロエチル）−Ｏ−（３−クロロ−４−メチルクマリン−７−イル）ホスフェート又はカスタノスペルミンを、様々な濃度の、試験したい潜在的阻害剤で置き換える。