(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）に導入され、遺伝学的に安定な日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）の全長ｃＤＮＡクローンを含む、感染性のあるＪＥＶを生産することができるＢＡＣベクター。
【請求項２】
前記全長ｃＤＮＡクローンが、ｃＤＮＡの５’末端の前にプロモーターを、ランオフ位置としてｃＤＮＡの３’末端の後に制限酵素認識配列を含む、請求項１に記載のＢＡＣベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが、ＳＰ６またはＴ７プロモーターである、請求項２に記載のＢＡＣベクター。
【請求項４】
前記制限酵素認識配列が、ＪＥＶゲノムＲＮＡに存在しないことを特徴とする、請求項２に記載のＢＡＣベクター。
【請求項５】
前記制限酵素認識配列が、ＸｈｏＩまたはＸｂａＩである、請求項２に記載のＢＡＣベクター。
【請求項６】
ＳＰ６プロモーターを有する配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５で表わされる配列及び、Ｔ７プロモーターを有する配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８で表わされる配列からなる群から選択される、請求項２に記載のＢＡＣベクター。
【請求項７】
前記ＢＡＣプラスミドが、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１である、請求項１に記載のＢＡＣベクター。
【請求項８】
前記全長ｃＤＮＡクローンが、５’非翻訳領域（ｎｏｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ（ＮＴＲ））、ポリペプチドコード領域及び３’ＮＴＲからなる、請求項２に記載のＢＡＣベクター。
【請求項９】
前記全長ｃＤＮＡクローンが、配列番号１５で表わされるヌクレオチド配列、またはそれと９８％相同性がある全長ＪＥＶゲノムＲＮＡのヌクレオチド配列を有する韓国型ＪＥＶに由来した、請求項８に記載のＢＡＣベクター。
【請求項１０】
配列番号４３で表わされるＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、配列番号４４で表わされるＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、配列番号４５で表わされるｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ、配列番号４６で表わされるＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、配列番号４７で表わされるＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、及び配列番号４８で表わされるＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩからなる群から選択される、請求項１に記載のＢＡＣベクター。
【請求項１１】
前記ｃＤＮＡクローンが、Ｔ７プロモーターを有するｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩである、請求項１０に記載のＢＡＣベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ１０３４６ＢＰ）。
【請求項１２】
前記ｃＤＮＡクローンが、ＳＰ６プロモーターを有するｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩである、請求項１０に記載のＢＡＣベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ１０３４７ＢＰ）。
【請求項１３】
１）請求項１のＢＡＣベクターに異種遺伝子を挿入して、組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡ発現ベクターを調整する工程；
２）前記組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡ発現ベクターからＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を産生する工程；
３）前記ＪＥＶ  ＲＮＡ転写物で形質転換された細胞を産生する工程；及び
４）前記細胞を培養して外来タンパク質を発現させる工程からなる異種遺伝子を発現させる方法。
【請求項１４】
前記外来遺伝子が、ＪＥＶ  ｃＤＮＡのＪＥＶ３’ＮＴＲの前に挿入する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、日本脳炎ウイルス（以下「ＪＥＶ」と略称する）の新規なゲノムＲＮＡ配列の決定、前記ＪＥＶゲノムＲＮＡに対する感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡの構成及び治療、ワクチン、診断利用のための前記クローンまたはこれらの誘導体の利用に関するものである。さらに、本発明は、例えば、異種起源の遺伝子発現システム、遺伝的免疫及び一時的遺伝子治療のためのＪＥＶベクターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＪＥＶは、フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に属するＲＮＡウイルスの一種で、蚊によって伝播される。ＪＥＶは、ヒト、特に子供に永久的な神経精神疾患（ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｌａｅ）を引き起こし、さらに死亡に至らせる重要な病原性ウイルスであると知られている。（非特許文献１〜３）。ほぼ毎年５０，０００件が発病し、その約２５％が死亡する。生存者の約半分は、永久的な神経疾患に苦しめられる。（非特許文献４、５）。ＪＥＶは、旧ソ連からインドに至るまで大部分のアジア地域に分布している。しかし、最近ＪＥＶウイルスの伝播が、南半球でも報告され、これは前記ＪＥＶウイルスが全世界的に公衆保健を脅す可能性があることを意味している。（非特許文献６〜８）。
【０００３】
ＪＥＶは、単一鎖）の小さい外皮（ｓｍａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ウイルスであり、長さ約１１ｋｂの陽性センス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡゲノムを有している。ゲノムは、一つの長い転写解読フレーム（以下「ＯＲＦ」と略称する）を有し、ＯＲＦの両端部位にウイルスの自己複製に重要な役割をするシス作用性（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）因子を有する５’及び３’非翻訳部位（ｎｏｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ；ＮＴＲ）で構成されている。ＪＥＶのＲＮＡゲノムは、５’−末端にタイプＩキャップ（ｃａｐ）構造を有しているが、３’−末端にポリ（Ａ）尾構造は有していない。ＯＲＦは、一つの大きい多重蛋白質（ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）として翻訳され、これは翻訳と同時または翻訳後にプロセッシングされ、三つの構造蛋白質と七つの非構造蛋白質が生産される。ここで、前記蛋白質に当たる遺伝子は、ＪＥＶ  ＲＮＡゲノム上で、Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ−ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５のような配列を有する。（非特許文献９〜１１）。ＪＥＶウイルス遺伝子産物の機能、ＪＥＶの自己複製、神経毒性及び病原性に関与する分子生物学的なメカニズムのような内容は、現在までよく知られていない。その理由として一番大きいのは、信頼できる逆相遺伝子系が存在しないためである。
【０００４】
陽性センスＲＮＡウイルスに対する研究は、逆相遺伝子システムの開発と共に急速に発展してきた。ここで、興味あるウイルスゲノムの感染性ｃＤＮＡクローンが製造され、これが合成されたウイルスを製造する感染性を有するＲＮＡ合成のための鋳型として作用する。逆相遺伝子システムでは、ＲＮＡ−ラウンチアプローチ方式とＤＮＡ−ラウンチアプローチ方式の二つの方法がある。伝統的な「ＲＮＡ−ラウンチ（ＲＮＡ−ｌａｕｎｃｈｅｄ）」アプローチ方法では、細胞が感染性を有するｃＤＮＡクローンから合成されたＲＮＡ転写物にトランスフェクトされ、前記細胞から合成されたウイルスが回収される。（非特許文献１２〜１６）。また、「ＤＮＡ−ラウンチ（ＤＮＡ−ｌａｕｎｃｈｅｄ）」アプローチ方法では、感染性を有するｃＤＮＡクローンを受容細胞（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｃｅｌｌ）に直接形質転換させることによって合成されたウイルスを製造する。前記方法は、ポリオウイルスに対して初めて適用されたもので、（非特許文献１７）、アルファウイルスに対しても適用された。（非特許文献１８）。
【０００５】
前記二つのアプローチ方法は、最も大きいＲＮＡゲノムを有しているコロナウイルス（非特許文献１９）を含め、多くの陽性−センスＲＮＡウイルスファミリーに対して感染性を有するｃＤＮＡクローンを製造するために使用されてきた。前記感染性を有するｃＤＮＡクローンは、陽性センスＲＮＡウイルスに対する多くの疑問点を解決するにおいて重要に使用されてきた。しかし、日本脳炎ウイルスについては、まだ逆相遺伝子システムが構築されていないため、ＪＥＶに対する研究は、進歩していない。これは、全長の感染性を有するｃＤＮＡクローンの構築が成功していないためである。その理由として一番大きいのは、クローンされたｃＤＮＡの遺伝子学的な不安定性に起因する。結局、多くの研究努力にも関わらず、現在までＪＥＶに対する遺伝学的に安定した全長の感染性を有するｃＤＮＡ分子クローンは、合成されていない実情である。（非特許文献２０〜２３）。
【０００６】
それで、本発明者らは、韓国に存在する野生の蚊から分離した韓国型（Ｋｏｒｅａｎ  ｉｓｏｌａｔｅ）ＪＥＶを使用してウイルスゲノムＲＮＡの真性の全長のヌクレオチド塩基配列を正確に証明し、前記ＪＥＶゲノムＲＮＡに対する全長の感染性を有するｃＤＮＡを合成することにより逆相遺伝子システムを開発した。このように開発された前記感染性を有するＪＥＶｃＤＮＡを利用した逆相遺伝子システムは、ＪＥＶ遺伝子産物に対する機能、ＪＥＶの自己複製、神経侵入性及び病原性に関与する分子生物学的なメカニズムを証明するのに有用に使用可能であり、また、前記感染性を有するＪＥＶｃＤＮＡを異種遺伝子の発現のためのベクターに有用に使用可能であることを証明することにより、本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｔｓａｉ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０００年、第１８（Ｓｕｐｐｌ  ２）巻、１−２５頁
【非特許文献２】Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、１９９７年、第２巻、１９１−１９９頁
【非特許文献３】Ｕｍｅｎａｉ等，Ｂｕｌｌ．Ｗ．Ｈ．Ｏ．，１９８５年、第６３巻、６２５−６３１頁
【非特許文献４】Ｖａｕｇｈｎ  ａｎｄ  Ｈｏｋｅ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９２年、第１４巻、１９７−２２１頁
【非特許文献５】Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｌｅａｋｅ、Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、１９８８年、６３−９２頁
【非特許文献６】Ｈａｎｎａ等，Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．，１９９９年、第１７０巻、５３３−５３６頁
【非特許文献７】Ｈａｎｎａ等，Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．，１９９６年、第１６５巻、２５６−２６０頁
【非特許文献８】Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ等，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４年、第１３６巻、４４７−４６７頁
【非特許文献９】Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｉｃｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００１年、９９１−１０４１頁
【非特許文献１０】Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９４年、第１２巻、９６６−９７５頁
【非特許文献１１】Ｃｈａｍｂｅｒ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９０年、第４４巻、６４９−６８８頁
【非特許文献１２】Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９年、第９６巻、７４３３−７４３８頁
【非特許文献１３】ｖａｎ  Ｄｉｎｔｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７年、第９４巻、９９１−９９６頁
【非特許文献１４】Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９１年、第９巻、１３５６−１３６１頁
【非特許文献１５】Ｒｉｃｅ等，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．，１９８９年、第１巻、２８５−２９６頁
【非特許文献１６】Ｒｉｃｅ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８７年、第６１巻、３８０９−３８１９頁
【非特許文献１７】Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８１年、第２１４巻、９１６−９１９頁
【非特許文献１８】Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｎｓｋｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９９年、第１０巻、４３４−４３９頁
【非特許文献１９】Ａｌｍａｚａｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０００年、第９７巻、５５１６−５５２１頁
【非特許文献２０】Ｍｉｓｈｉｎ等，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００１年、第８１巻、１１３−１２３頁
【非特許文献２１】Ｚｈａｎｇ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００１年、第９６巻、１７１−１８２頁
【非特許文献２２】Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９９５年、第１７１巻、１１４４−１１５１頁
【非特許文献２３】Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２年、第６６巻、５４２５−５４３１頁
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、日本脳炎ウイルスの新規なゲノムＲＮＡ、前記ゲノムＲＮＡに対する感染性を有するｃＤＮＡ及び前記ｃＤＮＡまたはこれの誘導体を利用して製造される新しい遺伝子発現ベクターを提供することである。
【０００８】
前記目的を達成するために、
１）本発明は、ＪＥＶウイルスの新規なゲノムＲＮＡを提供する。
２）本発明は、自己複製ができるＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を生産可能な感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを提供する。
３）本発明は、前記全長のＪＥＶゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡを含むベクターを提供する。
４）本発明は、前記ＪＥＶ  ｃＤＮＡベクターから合成された自己複製可能なＲＮＡ転写物を提供する。
５）本発明は、前記ＪＥＶ  ｃＤＮＡベクターから合成されたＲＮＡ転写物をトランスフェクトされた細胞から得られた組換えされたＪＥＶウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＪＥＶ  ｖｉｒｕｓ）を提供する。
６）本発明は、前記ＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むＪＥＶ発現ベクターを提供する。
７）本発明は、前記ＪＥＶ発現ベクターを利用して異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）を発現させる様々な方法を提供する。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
Ｉ．本発明は、ＪＥＶウイルスの新規なゲノムＲＮＡを提供する。
本発明の韓国型ＪＥＶゲノムＲＮＡは、５’−非翻訳部位、ポリペプチドコード部位及び３’−非翻訳部位で構成される。
【００１０】
上記でゲノムＲＮＡの全長は、１０，９６８ｂｐであり、９５ｂｐからなる５’−非翻訳部位、１０，２９９ｂｐからなるポリペプチドコード部位及び５７４ｂｐからなる３’−非翻訳部位で構成されている。
【００１１】
本発明の好ましい実施例によると、本発明のＪＥＶウイルスの新規なゲノムＲＮＡは、配列番号１５で表される配列である。また、前記配列番号１５で表されるＪＥＶウイルスのゲノムＲＮＡと９８％以上の相同性を有する配列も本発明の新規なゲノムＲＮＡに含まれる。
【００１２】
本発明の韓国型ＪＥＶウイルスは、韓国型日本脳炎ウイルスであるＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９ウイルスからプラーク分離精製（ｐｌａｑｕｅ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）技術を利用して再び分離精製されたウイルスとして「ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２」と命名した（図１参照）。
【００１３】
本発明者らは、韓国型日本脳炎ウイルスであるＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ウイルスの全長のヌクレオチド塩基配列を証明するため、長いＲＴ−ＰＣＲ（ｌｏｎｇ  ＲＴ−ＰＣＲ）方法でウイルスの５’−末端と３’−末端を除いた残りの部位を、三つの重畳するｃＤＮＡ、ＪＶＦ（ｎｔ  １−３８６５）、ＪＶＭ（ｎｔ  ３２６６−８１７０）及びＪＶＲ（ｎｔ  ７５６５−１０８９３）ｃＤＮＡで合成及び増幅して、各々約３．９ｋｂｐ（ＪＶＦ）、約４．９ｋｂｐ（ＪＶＭ）及び約３．３ｋｂｐ（ＪＶＲ）の切片を得て、これに対する塩基配列を証明した（図２のＡ参照）。
【００１４】
ウイルスゲノムＲＮＡの３’−末端の正確な塩基配列を証明するためには、まず、オリゴヌクレオチドＴをＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの３’−末端に接合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させなければならず、（図２のＢ参照）、ここで、オリゴヌクレオチドＴは、ｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅時に必要な特異なプライマーバインディング位置を提供する（図２のＢ参照）。アガロースゲル電気泳動を通じて増幅された産物は、約７００ｂｐの大きいバンドと約４５０ｂｐの小さいバンドの二種類のバンドに移動することが証明された（図２のＣ参照）。二つのバンドを精製してクローンさせ、前記大きいバンド、小さいバンドを含む１０乃至２０個の無作為に選択されたクローン各々を配列分析した。塩基配列を分析した結果、ＪＥＶウイルスの全体塩基配列が証明された大部分の分離株の場合において報告されたように、本発明者らは、大きい挿入体（約７００ｂｐ）を有する全てのクローンのウイルスゲノムＲＮＡの３’−末端が−ＧＡＴＣＴ１０９６８で終わることを発見した。一方、小さい挿入体（約４５０ｂｐ）を有する全てのクローンは、ウイルスＲＮＡゲノムの塩基配列１０，６８４番目で終結し、大きいバンドより２８４ｂｐ小さくなることが分かった。小さい挿入体の場合、ウイルスゲノムＲＮＡの３’−末端に２８４ヌクレオチドを含んでいないため、全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ結合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）過程の間、本発明者らは、大きい挿入体のヌクレオチド塩基配列を使用した。
【００１５】
ＣＮＵ／ＬＰ２ウイルスゲノムＲＮＡの５’−末端の正確な塩基配列を証明するため、まず、５’−末端に存在するキャップ構造をタバコ酸ピロホスファート（ｔｏｂａｃｃｏ  ａｃｉｄ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）と反応させて除去した。ここで、キャップ構造が除去されたウイルスゲノムＲＮＡは、自家接合（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）が行われ、接合された３’−５’部位は、ウイルス３’−末端近くの塩基配列（ｎｔ  １０２５９−ｎｔ  １０２７６）に相補的に結合するＲＴ−ＰＣＲのための陽性センスプライマーと、ウイルス５’−末端近くの塩基配列（ｎｔ  １６４−ｎｔ  １８１）に相補的に結合する陰性センスプライマーを使用してｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅した（図２のＤ参照）。アガロースゲルを利用した電気泳動の結果、ＰＣＲで増幅された産物は、約８５０ｂｐの大きさの単一バンドで現われた（図２のＥ参照）。このように増幅されたアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）をクローニングした後、無作為に選別した１２個のクローンの塩基配列を分析した結果、１２個全てのクローンでウイルス３’−末端塩基配列の−ＧＡＴＣＴ１０９６８に続いて５’−末端の塩基配列１ＡＧＡＡＧＴ−が連結されていることが分かった（図２のＢ及び図２のＣ参照）。
【００１６】
前記結果から、本発明者らは、配列番号１５で表されるＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）の完全な全長のヌクレオチド塩基配列を証明した。ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの全長は、１０，９６８ｂｐであり、これは９５ｂｐからなる５’−非翻訳部位、１０，２９９ｂｐからなるポリペプチドコード部位及び５７４ｂｐからなる３’−非翻訳部位の三つの部位で構成されている。本発明者らは、ＣＮＵ／ＬＰ２分離株の前記全体塩基配列を、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースで塩基配列が全て証明されている公知の２６個のＪＥＶウイルスのゲノムＲＮＡ（Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｋ９４Ｐ０５、ＦＵ、ＣＨ２１９５ＬＡ、ＣＨ２１９５ＳＡ、ＲＰ−２ｍｓ、ＲＰ−９、ＣＨ１３９２、Ｔ１Ｐ１、ＹＬ、ＪａＧＡｒ０１、ＨＶＩ、ＴＣ、ＴＬ、Ｂｅｉｊｉｎｇ−１、Ｌｉｎｇ、Ｖｅｌｌｏｒｅ  Ｐ２０７７８、ｐ３、ＳＡ１４−１４−２、ＳＡ（Ａ）、ＳＡ１４−１２−１−７、ＳＡ１４−２−８、ＳＡ１４、ＳＡ（Ｖ）、ＧＰ７８及びＪａＯＡｒＳ９８２ウイルス株）の全長のヌクレオチド塩基配列と比較した。比較分析に使用したウイルス株に対する分離地域、分離年度、出処及びジェンバンクアクセス番号（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）に関する情報を下に要約した（表１参照）。
【００１７】
（表１）
0004430543.tif 000002
ＩＵ：情報なし  
【００１８】
他のＪＥＶ菌株のヌクレオチド塩基配列を比較した結果、ＪＥＶ分離株ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムは、これらゲノムと各々８９．０％（Ｉｓｈｉｋａｗａ）、８９．１％（Ｋ９４Ｐ０５）、８９．３％（ＦＵ）、９５．８％（ＣＨ２１９５ＬＡ）、９５．９％（ＣＨ２１９５ＳＡ）、９７．１％（ＲＰ−２ｍｓ）、９７．２％（ＲＰ−９）、９７．３％（ＣＨ１３９２）、９７．３％（Ｔ１Ｐ１）、９７．０％（ＹＬ）、９７．４％（ＪａＧＡｒ０１）、９７．１％（ＨＶＩ）、９６．９％（ＴＣ）、９６．７％（ＴＬ）、９６．４％（Ｂｅｉｊｉｎｇ−１）、９６．３％（Ｌｉｎｇ）、９６．０％（Ｖｅｌｌｏｒｅ  Ｐ２０７７８）、９７．１％（ｐ３）、９７．４％（ＳＡ１４−１４−２）、９７．５％（ＳＡ（Ａ））、９７．５％（ＳＡ１４−１２−１−７）、９７．７％（ＳＡ１４−２−８）、９７．９％（ＳＡ１４）、９７．９％（ＳＡ（Ｖ））、９６．３％（ＧＰ７８）及び９７．１％（ＪａＯＡｒＳ９８２）の相同性を有する（表２参照）。したがって、本発明の配列番号１５で表される塩基配列と９８％以上の相同性を有するＪＥＶウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列は、本発明の権利範囲に属する。
【００１９】
（表２）
0004430543.tif 000003
【００２０】
本発明の塩基配列は、ＪＥＶポリペプチドコード部位以外にも、ウイルスの自己複製、転写及び翻訳を調節するシス作用性（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）因子を有している５’−非翻訳部位と３’−非翻訳部位の正確な塩基配列を分子生物学的な実験方法で証明した。これは、幾つかの研究で５’−末端及び３’−末端部位全てが試験管内（Ｙｏｕ  ａｎｄ  Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９年、第２７４巻、３３７１４−３３７２２頁）及び生体内（Ｋｈｒｏｍｙｋｈ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１年、第７５巻、６７１９−６７２８頁）フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ複製の開始に要求されることが知られているため、大変重要な意味を持つ。特に、本発明で、ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２の５’−末端及び３’−末端の塩基配列と証明された１ＡＧＡＡＧＴ−及び−ＧＡＴＣＴ１０９６８は、前記ウイルスの自己複製に重要な役割を果たすと思われる。
【００２１】
本発明者らは、上記で証明されたＪＥＶの完全な全長の塩基配列を有する合成ＲＮＡ転写物に細胞を形質転換させた時に、感染性を有する合成されたＪＥＶウイルスが生産されることを下記で実験的に証明することにより、ＪＥＶが自己複製の時に必要な完全な全長の塩基配列を機能的な側面から世界で最初に立証した。
【００２２】
ＩＩ．本発明は、自己複製ができるＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を生産可能な感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを提供する。
本発明の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡは、配列番号１５で表される塩基配列または配列番号１５と９８％以上の相同性がある全長のＪＥＶゲノムＲＮＡの塩基配列に基づいて合成され、試験管内転写を通じて自己複製ができるＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を合成するのに鋳型として使用される。本発明の全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡは、まず、５’−末端及び３’−末端を含むウイルスゲノムＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって数々の重畳するｃＤＮＡで増幅させた後、これを連結することにより製造される。
【００２３】
試験管内ランオフ転写反応を通じて全長の合成ＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を生産するため、ＪＥＶゲノムＲＮＡの５’−末端すぐ前にＳＰ６またはＴ７プロモーター塩基配列部位を含み、ＪＥＶゲノムＲＮＡの３’−末端すぐ後にランオフ位置を人為的に作るようにウイルスゲノムＲＮＡに存在しない唯一の制限酵素認識塩基配列を含む（図３のＡ参照）。本発明では、好ましい実施例としてＪＥＶゲノムＲＮＡに当たる三つの重畳するｃＤＮＡ（ＪＶＦ、ＪＶＭ及びＪＶＲ）、ＳＰ６またはＴ７プロモーター塩基配列を含む５’−末端部位及びランオフ位置として、ＸｈｏＩとＸｂａＩ認識塩基配列を含む３’−末端部位に当たる二つのｃＤＮＡを利用して、３個のＳＰ６−誘導された全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡと３個のＴ７−誘導された全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡを各々製造した（図３のＢ及び図３のＣ参照）。しかし、前記二つのプロモーター以外にも、他プロモーターを使用可能であることは、当業者において自明なことである。また、本発明で開発された全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡは、ランオフ位置としてＸｈｏＩとＸｂａＩと使用したが、それ以外にも他の制限酵素を使用可能であることは、当業者において自明なことである。
【００２４】
本発明のＪＥＶ  ｃＤＮＡクローンは、ＢＡＣであるｐＢｅｌｏＢＡＣ１１プラスミドをベクターとして使用して、上記のように数々の重畳するｃＤＮＡを含むサブクローンを製造した後、これを互いに連結することによって、全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡを提供する。
【００２５】
本発明者らは、好ましい実施例でＳＰ６プロモーターを有しながら配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５で表されるＪＥＶ  ｃＤＮＡとＴ７プロモーターを有しながら各々配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８で表されるＪＥＶ  ｃＤＮＡを提供する（図３のＢ及び図３のＣ参照）。全ての場合において、ランオフ転写反応以後にウイルスゲノムの３’末端が完全であることを立証するため、本発明者らは、ウイルスゲノムの末端にＸｈｏ  ＩまたはＸｂａ  Ｉの特異な制限酵素認識部位を挿入させた（図３のＢまたは図３のＣ参照）。
【００２６】
ＩＩＩ．本発明は、前記全長のＪＥＶゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡを含むベクターを提供する。
本発明のベクターは、前記ＪＥＶ全長の感染性を有するｃＤＮＡを含むことを特徴とする。本発明の好ましい実施例では、ＳＰ６プロモーターを有する配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５で表されるＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びＴ７プロモーターを有する配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８で表されるｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩベクターを提供する。本発明者らは、前記ベクター中で最も効率が良いｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩを、２００２年１０月２日付にて韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（アクセッション番号：ＫＣＴＣ  １０３４６ＢＰ、ＫＣＴＣ  １０３４７ＢＰ）。
【００２７】
ＩＶ．本発明は、前記ＪＥＶ  ｃＤＮＡベクターから合成された自己複製可能なＲＮＡ転写物を提供する。
試験管内ランオフ転写反応の場合、鋳型として使用されるＪＥＶ  ｃＤＮＡは、上記のようにウイルスゲノムの３’−末端すぐ後にランオフ位置としてエンジニアリングしたＸｈｏＩまたは  ＸｂａＩ制限酵素による消化により線形化される（図３参照）。ＸｈｏＩの処理により線形化された二つプラスミド（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩとｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ）は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ構造類似体の存在下でＳＰ６ポリメラーゼランオフ転写反応を通じて５’−末端にキャップ構造を有する同時に、３’−末端にウイルスと関連しない三つのヌクレオチドＣＧＡを有する合成ＲＮＡ転写物を生産するのに鋳型として使用する（図３のＢ参照）。これは、Ｘｈｏ  Ｉの切断により残された５’突出部位を複製した結果である。これと類似に、ＸｂａＩ−線形化されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩプラスミドは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ構造類似体の存在下でＳＰ６ポリメラーゼランオフ転写反応を通じて５’−末端にキャップ構造を有すると同時に、３’−末端にウイルスと関連しない四つのヌクレオチド  ＣＴＡＧを有する合成ＲＮＡ転写物を生産するのに鋳型として使用する（図３のＢ参照）。
【００２８】
本発明者らは、合成されたＪＥＶ  ＲＮＡ転写物の特異的感染力を定量するため、感染センターアッセイ法を実施した。その結果、合成されたＲＮＡ転写物に敏感な（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）ＢＨＫ−２１細胞を形質転換させた場合、全て高い感染性（３．４−４．３ｘ１０５ＰＦＵ／μｇ）を示した（表３参照）。これと同じく、Ｔ７プロモーターを有する三つの全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ  ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ及びｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩを鋳型として使用して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ構造類似体の存在下でＴ７ポリメラーゼランオフ転写反応を通じて合成したＲＮＡ転写物も、高い特異的感染性（２．９−３．８ｘ１０５ＰＦＵ／μｇ）を示した（表３参照）。
【００２９】
ある種のフラビウイルスの場合、感染性を有するｃＤＮＡから転写された合成ＲＮＡの３’−末端に、ウイルスと関連しないヌクレオチド塩基配列が存在すると、合成されたＲＮＡの特異的感染性が減少すれるかまたはなくなる（ａｂｒｏｇａｔｅ）ということが報告された（Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００１年、第２８１巻、２９４−３０４頁）。前記報告に基づいて本発明者らは、ＪＥＶ  ｃＤＮＡからＪＥＶの３’−末端にウイルスと関連しないヌクレオチド塩基配列が存在しない合成されたＲＮＡ転写物を製造し、これの特異的感染性を比較した。具体的に、本発明者らは、転写反応に先立って、Ｘｂａ  Ｉ処理により線形化したｐＢＡＣｓｐ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩプラスミドを、リョクトウヌクレアーゼ（ＭＢＮ）で処理することによりウイルスと関連しない配列が欠失した合成ＲＮＡを製造した。ＭＢＮ活性を立証するため、Ｘｂａ  Ｉ処理により線形化してＭＢＮで処理されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ  ｐｌａｓｍｉｄは、自家接合（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）され、これのウイルス３’末端の配列を分析した結果、四つの不必要なヌクレオチドであるＣＴＡＧが除去されたことが証明された。Ｘｂａ  Ｉ処理により線形化してＭＢＮで処理されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ（図３のＢ参照）及びｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ（図３Ｃ参照）から、ＲＮＡ転写物は、全て、ＭＢＮで処理していない転写物と比較して特異的感染性が増加した。その結果、ＭＢＮで処理したｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮｃＤＮＡ鋳型から転写されたＲＮＡの特異的感染性は、３．１×１０６ＰＦＵ／μｇと測定された。これは、ＭＢＮで処理していないｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ  ｃＤＮＡ鋳型から転写されたＲＮＡの特異的感染性である３．４×１０５ＰＦＵ／μｇより、約１０倍も高い（表３参照、ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）。また、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮｃＤＮＡから合成されたＲＮＡも、ＭＢＮ処理以後に増加された感染性を示した（２．７×１０６  ＰＦＵ／μｇ）（表３参照、ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）。したがって、本発明者らは、高い感染性を有する合成されたＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を生産するためには、ＪＥＶゲノムＲＮＡに完全な（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）３’−末端が存在しなければならないことを確認した。それで、本発明の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡクローンは、１０５−１０６ＰＦＵ／μｇの高い特異的感染性を有する合成されたＲＮＡ転写物を生産するランオフ転写反応のための鋳型として使用可能である。
【００３０】
このような全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを組換えるための以前の試みは（非特許文献２０〜２３）、クローニングされたＪＥＶ  ｃＤＮＡの遺伝的不安定性によって全て失敗した。このような問題を克服するため、鋳型が二つの重畳するＪＥＶ  ｃＤＮＡを、試験管内接合させて製造するシステムを利用した研究が試みられた（非特許文献２３）。以後、前記鋳型を試験管内感染性を有するＲＮＡ転写物を合成するために使用した。しかし、この転写物の特異的感染性は約１００ＰＦＵ／μｇで、ウイルスの分子生物学的及び遺伝学的分析のため、前記システムを有用に使用するには非常に低い感染性であった（非特許文献２３）。
【００３１】
本発明では、大腸菌から一つ乃至二コピーずつ維持されるＢＡＣプラスミドにＪＥＶ  ｃＤＮＡをクローニングすることにより、遺伝子の不安定性を克服できた。このように合成した感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡプラスミドの遺伝的構造及び機能は、少なくとも大腸菌で増殖される１８０世代の間は安定に維持された（図７参照）。したがって、本発明者らは、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）を導入することにより、全長の感染性を有するｃＤＮＡの合成時に発生するＪＥＶ  ｃＤＮＡの遺伝学的不安定性を克服できた。また、合成された感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを安定に扱えるようになった。
【００３２】
全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを鋳型として使用し、試験管内転写反応を通じて確実な５’−末端及び３’−末端を有するＪＥＶ合成ＲＮＡ転写物が合成可能であることは、非常に重要な意味を持つ。その理由は、幾つかの研究で５’−末端及び３’−末端部位全てが試験管内（Ｙｏｕ  ａｎｄ  Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９年、第２７４巻、３３７１４−３３７２２頁）及び生体内（Ｋｈｒｏｍｙｋｈ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１年、第７５巻、６７１９−６７２８頁）フラビウイルスＲＮＡ複製の開始に要求されることが知られているためである。このような目的を達成するため、本発明者らは、他フラビウイルスの感染性を有するｃＤＮＡを合成する時に使用された方法を応用した（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６年、第８３巻、２３３０−２３３４頁；  非特許文献１５）。ＪＥＶゲノムＲＮＡに存在するキャップ構造は、ジヌクレオチドであるＡＧと連結され、これはフラビウイルスで非常に保存された特性である（Ｒｉｃｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、１９９６年、９３１−９６０頁、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）。５’−末端の確実性は、ＳＰ６またはＴ７プロモーター転写出発に必要なヌクレオチド塩基配列を、ウイルスゲノムの始めの部位に位置させることにより確保された。ＳＰ６またはＴ７ポリメラーゼによる転写反応において、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ構造類似体を導入することにより（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８２年、第１０巻、６３５３−６３６２頁）、本発明者らは、感染しやすい細胞内へのトランスフェクションにより、高い感染性を有しながら完全な５’−末端及びキャップ構造を有するＲＮＡ転写物を合成した。また、ＳＰ６またはＴ７ポリメラーゼ−誘導転写反応でｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  キャップ構造類似体を導入することにより（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８２年、第１０巻、６３５３−６３６２頁）、ジヌクレオチドＡＧ上部にウイルスと関連しない追加的なＧヌクレオチドを位置させる。従来報告のように（非特許文献１５）、本発明者らも追加されたヌクレオチドが、生成されたＪＥＶ子孫（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ＪＥＶ  ｐｒｏｇｅｎｙ）のゲノムＲＮＡから喪失されることを確認した。また、追加的なＧヌクレオチドを添加した場合にも、本発明者らは、感染性を有するｃＤＮＡ鋳型から転写された合成ＲＮＡの特異的感染性または自己複製能力が変化しないことを観察した。
【００３３】
ＪＥＶ  ＲＮＡの３’−末端に位置するジヌクレオチドＣＴは、フラビウイルスで絶対的に保存されている（Ｒｉｃｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、１９９６年、９３１−９６０頁、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）。これは、前記ジヌクレオチドＣＴがウイルスの自己複製において非常に重要で、感染性を有するｃＤＮＡから生産されたＲＮＡ転写物は、完全な３’−末端を有しなければならないことを提示する。したがって、本発明者らは、合成されたＲＮＡ転写物が完全な３’−末端を有して終結可能な方法で、ＪＥＶに対する逆相遺伝子システムをデザインした。実際に本発明者らは、ウイルスと関連しない三つまたは四つのヌクレオチドを３’−末端に有しているＲＮＡ転写物より、完全な３’−末端を有するＲＮＡ転写物の特異的感染性が、約１０倍高いことを確認した。
【００３４】
Ｖ．本発明は、前記ＪＥＶ  ｃＤＮＡベクターから合成されたＲＮＡ転写物をトランスフェクトされた細胞から得られた組換えＪＥＶウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＪＥＶ  ｖｉｒｕｓ）を提供する。
本発明では、前記ＪＥＶ全長の感染性を有するｃＤＮＡから合成されたＪＥＶ  ＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた細胞から合成されたＪＥＶ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＪＥＶ）ウイルスが生産される。トランスフェクトされた細胞は、ＪＥＶウイルスの感染により誘導される強い細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示し、前記トランスフェクトされた細胞から得られた合成ＪＥＶ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＪＥＶ）ウイルスは、プラークの形態（ｐｌａｑｕｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）、細胞病原性（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、成長パターン、ウイルス蛋白質の発現及びウイルスＲＮＡ合成の観点から、最初の親ウイルス（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）であるＣＮＵ／ＬＰ２ウイルスと区別できなかった（図５参照）。また、ＪＥＶ  ｃＤＮＡ上の特定部位に位置指定突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導し、大腸菌で感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを分子遺伝学的に操作することにより、組換えウイルス突然変異体が製造可能である。したがって、本発明の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを利用した逆相遺伝子システムは、ＪＥＶゲノムの複製メカニズムに対する遺伝子分析研究に有用に使用できる。
【００３５】
ＶＩ．本発明は、前記ＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むＪＥＶ発現ベクターを提供する。
本発明は、様々な細胞形態でＪＥＶ  ｃＤＮＡの新規な発現ベクターとして使用できる用途を提供する。
【００３６】
最近、ＲＮＡウイルスの一員であるアルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）は、広く使用されている動物細胞で複製できるという長所から、細胞培養及び生体内で哺乳動物細胞発現ベクターとして成功的に開発されて使用されてきた（Ａｇａｐｏｖ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年、第９５巻、１２９８９−１２９４４頁；Ｆｒｏｌｏｖ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６年、第９３巻、１１３７１−１１３７７頁；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年、第１１巻、１８−２２頁）。アルファウイルスのように、ＪＥＶもヒト、マウス、サル、ブタ及びハムスターから由来した様々な種類の第１（ｐｒｉｍａｒｙ）及び連続細胞培養で、自己複製可能であることが報告されたことがある（Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｍｏｎａｔｈ，Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ，２００１年、１０４３−１１２５頁、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。このような性質は、ＪＥＶが様々な他細胞で異種遺伝子発現ベクターとして有用に使用できることを意味する。即ち、全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを発現ベクターに使用して異種遺伝子をＪＥＶ  ｃＤＮＡ上に挿入すると、異種遺伝子が含まれたＲＮＡ転写物が、試験管内転写反応過程を通じて生成される。この転写物に細胞を形質転換させると自己複製が可能であるので、多量の外来蛋白質が製造できる。
【００３７】
異種遺伝子を発現するための発現カセットは、ＪＥＶ  ３’ＮＴＲ開始部位に挿入することが好ましい。異種遺伝子発現カセットをＪＥＶ  ３’ＮＴＲ開始部位に挿入した理由は、ＣＮＵ／ＬＰ２だけではなく、全体塩基配列が証明された三つのＪＥＶウイルス株（Ｗｉｌｌｉａｍｓ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００年、第８１巻、２４７１−２４８０頁；Ｎａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，２００１年、第６５巻、３８８−３９２頁；Ｊａｎ等，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１９９６年、第５５巻、６０３−６０９頁）で、９−２５ｂｐの小さい欠失がウイルス３’ＮＴＲ開始部位で観察された。これは、前記部位が外来遺伝子を挿入させるための良い部位になり得ることを提示するためである。したがって、本発明で開発された感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡは、哺乳動物細胞を含む様々な種類の細胞で、所望する異種遺伝子の迅速な発現のための発現ベクターとして有用に使用できる。
【００３８】
ＶＩＩ．本発明は、前記ＪＥＶ発現ベクターを利用して異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）を発現させる様々な方法を提供する。
発現ベクターの機能は、異種遺伝子の発現のために、細胞内に目的とする異種遺伝子を伝達することである。本発明で、全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡは、哺乳動物細胞を含む様々な細胞形態で異種遺伝子発現ベクターとして使用できることを立証した。
【００３９】
また、本発明では、ＢＡＣ（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年、第７７巻、６４５０−６４６５頁）として作用する全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡに基づいた異種遺伝子の発現システムを説明している。一時的発現システムとして、ＪＥＶは、（ｉ）ウイルスの高い力価を速く生成する、（ｉｉ）前記ウイルスは、昆虫及び哺乳動物細胞形態を含む様々な宿主細胞を感染させられる、（ｉｉｉ）遺伝的に安定した感染性を有するｃＤＮＡが利用可能で、易しく操作することが可能である、また、（ｉｖ）ＲＮＡゲノムの細胞質複製は、宿主ゲノム内に挿入される可能性が少なく、したがって、好ましくない突然変異があまり起きないという長所を提供する。
【００４０】
本発明者らは、ＪＥＶに基づいたシステムが三つの異なる方式で外来遺伝子を発現するのに使用できることを立証した。一つは、外来遺伝子を含む感染性を有する組換えベクターＲＮＡ／ウイルスに関するものであり、二つ目は、ウイルス複製は可能であるが、他細胞への伝播能力は欠如したＪＥＶウイルスレプリコンベクターＲＮＡの生成に関するものである。三つ目は、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）形成のためのパッケージシステムの用途に関するものである。したがって、本発明では、ＪＥＶ  システムが、様々な哺乳動物細胞形態で目的とする外来遺伝子を速く発現させるＪＥＶウイルス／感染性を有するＲＮＡ／レプリコンＲＮＡ／ＶＲＰベクターを生成するのに使用できることを示した。
【００４１】
本発明の感染性があるかまたはレプリコンＪＥＶ  ｃＤＮＡベクターを使用して異種遺伝子を発現させる基本的な方法は、
１）感染性があるかまたはレプリコンＪＥＶ  ｃＤＮＡ発現ベクターに異種遺伝子を挿入させ組換えられたＪＥＶ  ｃＤＮＡ発現ベクターを製造する工程；
２）前記組換えられたＪＥＶ  ｃＤＮＡ発現ベクターからＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を製造する工程；
３）前記ＪＥＶ  ＲＮＡ転写物で宿主細胞を形質転換させ、形質転換体を製造する工程；及び
４）前記形質転換体を培養して外来蛋白質を発現させる工程で構成される。
【００４２】
本発明者らは、上記の方法でＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；緑色蛍光蛋白質）、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＦＰ；増進されたＧＦＰ蛋白質）、ＬＵＣ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；ルシフェラーゼ）、ＬａｃＺ遺伝子及び抗生剤ピュウーロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）に対する抵抗性を付与する優性の選択マーカーであるＰＡＣ（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ピュウーロマイシンＮ−アセチル転移酵素）を発現する全長の感染性を有する組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡを製造した（図８及び図９参照）。このように組換えられたＪＥＶ  ｃＤＮＡから転写されたＪＥＶ  ＲＮＡ転写物で、ＢＨＫ−２１細胞を形質転換させた。ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＬＵＣ、ＬａｃＺ及びＰＡＣ発現を図８及び図１０に提示する。また、前記異種遺伝子を含む組換え感染性を有するＪＥＶウイルス粒子を培養上澄み液から製造した。さらに、一般的に生命科学及び医学分野で多く使用される様々な動物細胞株（ＢＨＫ−２１、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＳＴ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫ、Ｂ１０３及びＳＨＳＹ−５Ｙ）を組換えウイルスで感染させ、前記異種遺伝子の発現を研究した。その結果、ウイルスゲノムＲＮＡに挿入されたＧＦＰまたはＬＵＣ遺伝子は、テストした全ての種類の細胞で発現した（表４参照）。したがって、組換えられたＪＥＶ  ｃＤＮＡ、ＪＥＶ  ＲＮＡ転写物及び組換えされたＪＥＶウイルス粒子は、様々な種類の細胞形態で、外来異種遺伝子の発現のためのベクターとして有用に使用できることを確認した。
【００４３】
ＪＥＶ  ＲＮＡ複製器具を使用して外来遺伝子を独立的に発現させるため、本発明者らは、厳しい安全基準を満たすウイルス構造遺伝子の一つ、二つまたは全ての遺伝子を欠失させ、自己複製が可能な自己制限されたウイルスレプリコンのパネルを製造した（図１１のＡ参照）。このウイルスレプリコンは、ＲＮＡトランスフェクション時に、複製及び遺伝子発現を始めることができた（図１１のＢ及び図１１のＣ参照）。
【００４４】
ＪＥＶレプリコンを基礎にした発現ベクターの利用は、トランス作用時に全てのＪＥＶウイルス構造蛋白質（Ｃ、ｐｒＭ及びＥ）を連続的に発現させる安定したレプリコンＰＣＬ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；パッケージ細胞株）のパネルを開発することによりさらに精巧化した（図１２参照）。これらＰＣＬは、ＪＥＶウイルスレプリコンの効率的なパッケージングのトランス補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を可能にした。それで、これらＰＣＬは、ＪＥＶウイルスレプリコンの導入時に、効率的に高い力価のウイルスＶＲＰを生成するのに使用できることを示す（図１２参照）。
【００４５】
また、本発明者らは、３ｋｂまで異種遺伝子を含める感染性を有するＪＥＶ組換えウイルス  ＲＮＡが、ウイルス粒子内にパッケージングできることを示した。ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ及びＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１のようなＪＥＶウイルスレプリコンベクターを選択すると、少なくとも５ｋｂの外来遺伝子をＪＥＶ  ＶＲＰ内にパッケージングさせることができると測定された。ＪＥＶビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）内にパッケージングできる外来遺伝子の大きさ制限を調査することは重要である。コード配列が大体４．５ｋｂである包嚢繊維症膜透過伝導性調節因子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（Ｆｌｏｔｔｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年、第２６８巻、３７８１−３７９０頁）のように、長さの長い遺伝子の発現を所望するなら、これは重要な問題になり得る。また、二つまたはそれ以上の発現単位を追加しようとするなら、ＪＥＶウイルスレプリコンの大きいパッケージング能力は有用である（Ｔｈｉｅｌ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年、第７７巻、９７９０−９７９８頁；Ａｇａｐｏｖ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年、第９５巻、１２９８９−１２９９４頁）。アデノ関連ウイルスに基づいたベクター（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ）の場合には、本来の大きさ制限を迂回してパッケージング能力を拡張させた（Ｄｕａｎ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０００年、第６巻、５９５−５９８頁；Ｙａｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００年、第９７巻、６７１６−６７２１頁）、これは類似の方式でＪＥＶウイルスレプリコンのパッケージング能力を拡張できることを示している。
【００４６】
また、他ＲＮＡウイルス誘導ベクター（Ａｇａｐｏｖ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，１２９８９−１２９９４頁；Ｐｕｓｈｋｏ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７年，第２３９巻，３８９−４０１頁；Ｂｅｒｇｌｕｎｄ等，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８年，第１６巻，５６２−５６５頁；Ｂａｓａｋ等，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１９９８年，第１８巻，３０５−３１３頁；Ｂａｒｃｌａｙ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８年，第７９巻，１７２５−１７３４頁；Ｋｈｒｏｍｙｋｈ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔａｗａｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７年，第７１巻，１４９７−１５０５頁；Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，１６４４−１６４８頁；Ｓｈｉ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００２年，第２９６巻，２１９−２３３頁；Ｖａｒｎａｖｓｋｉ  ａｎｄ  Ｋｈｒｏｍｙｋｈ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９年，第２５５巻，３６６−３７５頁；Ｐｅｒｒｉ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００年，第７４巻，９８０２−９８０７頁；Ｃｕｒｔｉｓ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００２年，第７６巻，１４２２−１４３４頁）のように、本発明者らは、日本脳炎ウイルスの構造蛋白質が、アルファウイルスに基づいた発現システムを使用してトランス作用で提供される時、パッケージングが可能な様々なＪＥＶウイルスレプリコンベクターＲＮＡをエンジニアリングできた（Ａｇａｐｏｖ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，１２９８９−１２９９４頁）。したがって、本発明では、生物学的に安全なＪＥＶベクターを効率的に生成可能なパッケージングシステムを明確に立証した。アルファウイルス（Ｆｒｏｌｏｖａ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７年，第  ７１巻，２４８−２５８頁；Ｗｈｉｔｅ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８年，第７２巻，４３２０−４３２６頁）及びレトロウイルス（Ｒｅｉｎ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９４年，第９巻，５１３−５２２頁）と違い、ＪＥＶを含むフラビウイルスによって利用されるパッケージング信号に関してはほとんど知られていない。ＪＥＶに対する本発明のトランス補完システム（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）は、全体ＪＥＶ構造部位がパッケージングに特別な役割を果たし得ない証拠を提示する。したがって、前記システムは、ＪＥＶ  ＲＮＡでパッケージング信号とＲＮＡの蛋白質膜化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）及び形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）と関連した構造蛋白質部位を糾明するのに有用である。さらに前記情報は、本発明のＪＥＶ発現システムの有用性を増進させる。
【００４７】
要約すると、本発明の全長のＪＥＶゲノムＲＮＡ及び前記ゲノムＲＮＡに対する感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡは、神経侵入性（ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）及び病原性に関与するＪＥＶ遺伝子を同定することだけではなく、ＪＥＶの複製、転写及び翻訳に関連した分子生物学的なメカニズムの研究に使用できる。また、日本脳炎の治療剤、治療用または予防用ワクチン、診断試薬及び診断用器具等の開発にも有用に使用でき、併せて真核細胞で異種遺伝子の発現ベクターとして有用に使用できる。また、全長のＪＥＶゲノムＲＮＡ及び感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡは、日本脳炎の治療剤、ワクチン、診断試薬及び診断キット及び真核細胞内目的とする異種遺伝子の発現ベクターの開発のために効果的に使用できる。また、ＤＮＡ免疫及び一時的遺伝子治療のため、本発明で説明したＪＥＶベクターシステムは、試験管内条件及び生体内条件で外来遺伝子を細胞内に運送可能な有望なシステムである。
【００４８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但、下記実施例は、本発明を例示するだけで、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：ＪＥＶウイルスの分離
＜１−１＞使用した細胞株及びウイルス
ＢＨＫ−２１細胞株は、ロックフェラ−大学のカルス・エム・ライス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｉｃｅ）博士から提供受け、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ビタミン及び抗生剤を含むα−ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養維持した。細胞の培養に使用する全ての試薬は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。ＪＥＶの韓国分離株であるＫ８７Ｐ３９（Ｃｈｕｎｇ等，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１９９６年，第５５巻，９１−９７頁）は、国立保健院（Ｋｏｒｅａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から分株を受けた。ＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９ウイルス株は、１９８７年に韓国の野生の蚊から分離されたもので、マウスの子（ｓｕｃｋｌｉｎｇ）の脳で５回継代培養（ｐａｓｓａｇｅ）した。黄熱病ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）ＹＦ１７Ｄウイルス株は、感染性を有するｃＤＮＡ  ｐＡＣＮＲ／ＹＦ１７Ｄ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｉｃｅから提供受けた）から下記の方法のように、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを利用した試験管内ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写反応により製造した。
【００５０】
＜１−２＞プラークの分離精製（ｐｌａｑｕｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
ＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９ウイルスに感染した敏感なＢＨＫ−２１細胞上に、１０％ＦＢＳ及び０．５％  ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）を含むＭＥＭ培養液で覆った後、５％ＣＯ２、３７℃が維持される培養器で３〜４日間培養した。３〜４日間培養した後、感染した細胞は、３．７％ホルムアルデヒドで室温で４時間固定させた後、覆われているアガロースを除去し、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）で染色してプラークを示した。上記のプラーク分析（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）の結果、Ｋ８７Ｐ３９ウイルスは、混合した多様な大きさのプラークを示した（図１のＡ、Ｋ８７Ｐ３９−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）。
【００５１】
したがって、本発明者らは、ＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９ウイルスから一定の大きさの大きいプラークで現れるＪＥＶウイルス株を分離するため、ＢＨＫ−２１細胞を使用して下記で説明するプラーク精製（ｐｌａｑｕｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法で分離し、ＣＮＵ／ＬＰ２と命名した。Ｋ８７Ｐ３９ウイルスに感染した敏感なＢＨＫ−２１細胞上に、１０％ＦＢＳ及び０．５％ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）を含むＭＥＭ培養液で覆った後、５％ＣＯ２、３７℃が維持された培養器で３〜４日間培養した。培養した後、各々のプラークを滅菌されたパステルピペットで選択した（ｐｉｃｋ）後、１ｍｌのα−ＭＥＭ培養液と共に４℃で２時間アガロースからウイルスを溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）した。溶離されたウイルス（ｅｌｕｔｅ）は、一回だけＢＨＫ−２１細胞で増幅してＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ウイルスのストック（ｓｔｏｃｋ）で使用するまで−８０℃に保管した。
【００５２】
ＢＨＫ−２１細胞を、このように分離されたＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ウイルスで感染させた時に現われるプラーク形態をＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９と比較するため、上記のプラーク分析（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）を遂行した。その結果、ＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９ウイルスが感染したＢＨＫ−２１細胞では、混合された様々な大きさのプラークが観察された（図１のＡ、Ｋ８７Ｐ３９−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）。一方、ＣＮＵ／ＬＰ２ウイルスが感染したＢＨＫ−２１細胞では、一定の大きさの大きいプラークが観察された（図１のＡ、ＣＮＵ／ＬＰ２−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）。また、ＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９及びＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２菌株で感染したＶｅｒｏ細胞を利用してプラーク形態を比較した時にも、類似の結果が観察された（図１のＢ）。
【００５３】
＜１−３＞免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
感染したＢＨＫ−２１細胞でＪＥＶウイルス蛋白質の発現を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で調査するため、本発明者らは、２×１０５細胞を４−ウェルチャンバースライドに分株して１２時間培養させた後、モック（ｍｏｃｋ）−感染させるかまたは本来の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）ＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９ウイルス株、ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）またはＹＦ１７Ｄウイルス株で１  ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で１８時間感染させた。ＪＥＶウイルス蛋白質に対する免疫染色のため、まず、０．３７％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドが添加されたＰＢＳと共に２５℃で３０分間培養することにより、細胞を固定化させた。次に、ＰＢＳを利用して細胞を洗浄した後、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００が添加されたＰＢＳで３７℃で１０分間浸透させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。再びＰＢＳで細胞を四回洗浄した後、ＰＢＳで１５分間再水和させ（ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ）、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで３７℃で１時間ブロックさせた。次に、１：５００に稀釈したＪＥＶに特異的なマウス過免疫腹水液で細胞を２５℃で２時間培養し、ＰＢＳで三回洗浄した後、１：５００に稀釈されたＦＩＴＣ結合した塩素抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）で２５℃で２時間培養した後、ＰＢＳで再び三回洗浄した。その後、細胞の核を視覚化するため、５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピディウム及び５μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａを含むＰＢＳで３７℃で３０分間細胞を培養させた後、８０％グリセロールでマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）を実施した。６３倍対物レンズ（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を装着したゼイスアキシオスコープ（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ）共焦点顕微鏡でＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ  １０２４及びレーザーシャープ（ＬａｓｅｒＳｈａｒｐ）ソフトウェアを利用してイメージを得た。
【００５４】
その結果、ＣＮＵ／ＬＰ２−感染したＢＨＫ−２１細胞の核週辺膜（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）で、ＪＥＶウイルス蛋白質の発現を観察し（図１のＣ、ＣＮＵ／ＬＰ２−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）、Ｋ８７Ｐ３９−感染したＢＨＫ−２１細胞の場合にも類似だった（図１のＣ、Ｋ８７Ｐ３９−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）。前記蛍光染色は、モック感染したＢＨＫ−２１細胞（図１のＣ、Ｍｏｃｋ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）または陰性対照群であるＪＥＶと非常に類似のフラビウイルスである黄熱病ウイルスＹＦ１７Ｄで感染したＢＨＫ−２１細胞（図１のＣ、ＹＦ１７Ｄ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）では観察されなかった。神経細胞株であるＳＨＳＹ−５Ｙ（ヒト）及びＢ１０３（マウス），非神経細胞株であるＶｅｒｏ（サル）及びＭＤＣＫ（犬）を含む様々な動物細胞株に対するＣＮＵ／ＬＰ２感染結果、培養上澄み液で高いウイルスタイター（１０６−１０７ＰＦＵ／ｍｌ）が観察された。したがって、本発明者らは、ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２を全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡの合成のための親ウイルス株（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｓｔｒａｉｎ）として使用した。
【００５５】
実施例２：完全なＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡのヌクレオチド塩基配列分析  
本発明者らは、製造社の指針により３００μｌのＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用し、１００μｌのウイルスを含む培養液からウイルスゲノムＲＮＡを抽出した後、２０μｌのＲＮａｓｅが除去された水に再浮游させた。ウイルスゲノムＲＮＡの完全な塩基配列を分析するため、５’−末端及び３’−末端を含む全体ウイルスゲノムＲＮＡを、長い（ｌｏｎｇ）ＲＴ−ＰＣＲ方法を利用して五つの重畳するｃＤＮＡ（ＪＶＦ、ＪＶＭ、ＪＶＲ、ＪＶ３ＮＴＲ及びＪＶ３５ＮＴＲ）で増幅させた（図２）。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅に使用したオリゴヌクレオチドは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに塩基配列が全て証明されている１６個のＪＥＶウイルスゲノムＲＮＡ（ＣＨ２１９５ＬＡ、ＣＨ２１９５ＳＡ、ＦＵ、ＧＰ７８、ＨＶＩ、ＪａＧＡｒ０１、ＪａＯＡｒＳ９８２、Ｋ９４Ｐ０５、Ｖｅｌｌｏｒｅ  Ｐ２０７７８、ｐ３、ＳＡ（Ａ）、ＳＡ（Ｖ）、ＳＡ１４、ＳＡ１４−１４−２、ＴＣ及びＴＬウイルス株）に共通する（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）塩基配列に基づいてデザインした。
【００５６】
＜２−１＞ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの塩基配列分析
１−３，８６５ヌクレオチドのＪＶＦアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を増幅するため、ＪＥＶゲノムの３，９８６−４，００３ヌクレオチドと相補的な配列番号１で表されるプライマーＪ７をｃＤＮＡ合成に使用した（図２のＡ）。ＪＶＦ  ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、下記のとおりである：１−１８ヌクレオチドに相補的な配列番号２で表されるプライマーＪ８；及び３，８４５−３，８６５ヌクレオチドに相補的な配列番号３で表されるプライマーＪ６。３，２６６−８，１７０ヌクレオチドのＪＶＭアンプリコンの場合には、８，１５０−８，１７０に相補的な配列番号４で表されるプライマーＪ４をｃＤＮＡ合成のために使用した。ＪＶＭ  ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、下記のとおりである：３，２６６−３，２８３ヌクレオチドに相補的な配列番号５で表されるプライマーＪ２０；及びプライマーＪ４。７，５６５−１０，８９３ヌクレオチドのＪＶＲアンプリコンの場合には、ｃＤＮＡ合成のために１０，９４７−１０，９６７ヌクレオチドに相補的な配列番号６で表されるプライマーＪ１を使用した。ＪＶＲ  ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、下記のとおりである：７，５６５−７，５８２ヌクレオチドに相補的な配列番号７で表されるプライマーＪ１２；及び１０，８７０−１０，８９３ヌクレオチドに相補的な配列番号８で表されるプライマーＪ２。標準ＲＴ反応は、１０μｌの抽出されたウイルスＲＮＡ、５ｐｍｏｌの上記の適当なプライマー、１００Ｕのスーパークリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ  ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、４０ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、０．１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合液及び製造社から供給されたＲＴバッファー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含む２０μｌの反応混合液で遂行した。反応混合液は、３７℃で１時間培養し、以後７０℃で１５分間加熱させた。５μｌ当量（ａｌｉｑｕｏｔ）のＲＴ混合液をピロベスト（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ）ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，日本）及び上記の適当なプライマー対をＰＣＲ増幅のために使用した。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｏｎ）させ、６０℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させた後、７２℃で５分間重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）させる過程を３０回反復実施した後、７２℃で１０分間最終的に延長させた。クローニングする間に起こり得る選択偏向（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｉａｓ）を避けるため、ＰＣＲ増幅産物のクローニングされないアンプリコンを使用して直接的に自動３７００ＤＮＡ  配列分析機を使用して両方向をすべてシーケンスすることにより、塩基配列分析を遂行した。
【００５７】
その結果、３’−末端及び５’−末端塩基配列を除いた配列番号９で表されるＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ウイルスゲノムの全体塩基配列を決定した。
【００５８】
＜２−２＞ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの３’−末端塩基配列の決定
ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの３’−末端の塩基配列を分析するため、本発明者らは、配列番号１０で表される合成オリゴヌクレオチドＴをウイルスゲノムＲＮＡの３’−末端に接合させることにより、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅のためのプライマー結合部位を提供した（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６年，第７０巻，３３６３−３３７１頁）。この方法は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの非常に保存された３’−末端の塩基配列を分析するために成功的に使用された（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６年，第７０巻，３３６３−３３７１頁）。オリゴヌクレオチドＴの３’−末端は、末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を利用してｄｄＡＴＰを挿入することにより最初に変形され、このようにすることにより、オリゴヌクレオチドＴの分子内（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ）及び分子間（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ）接合が起きないようにした。また、オリゴヌクレオチドＴの５’−末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドリン酸化酵素（Ｔａｋａｒａ）によりリン酸化された。以後、Ｔ４  ＲＮＡ接合酵素（ｌｉｇａｓｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を利用し、５’−リン酸化され３’−変形されたオリゴヌクレオチドＴをウイルスゲノムＲＮＡの３’−末端に接合させた。２０μｌの接合反応混合液は、１０ＵのＴ４  ＲＮＡ接合酵素、４０ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ、１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＴ、ウイルスゲノムＲＮＡ及び製造社（ＮＥＢ）から提供されたバッファーを含む。１６℃で１２時間培養した後、接合されたウイルスＲＮＡをフェノールで抽出してエタノールで沈澱させた後、２０μｌのＲＮａｓｅが除去された水に再浮游させた。順次的に、オリゴヌクレオチドＴと相補的な配列番号１１で表されるオリゴヌクレオチドＴＲを使用し、以前に記述された方法により１０μｌのオリゴヌクレオチドと接合したウイルスＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。合成されたｃＤＮＡの増幅は、ヌクレオチド１０，２５９−１０，２７６に相補的な配列番号１２で表されるプライマーＪ３５及びプライマーＴＲを使用して遂行した。ＰＣＲのため、５μｌ当量（ａｌｉｑｕｏｔ）のＲＴ混合液をピロベスト（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ）ＤＮＡ重合酵素を使用して９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間３０回反復実施した後、最終的に７２℃で１０分間延長させた。ＰＣＲ反応混合液の組成は、上記の組成と同じく使用した。陽性−センス及び陰性−センスプライマーに各々導入されたＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ認識部位を使用し、ｐＲＳ２ベクター（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｉｃｅから提供受けた）に上記で合成されたｃＤＮＡ  ＪＶ３ＮＴＲアンプリコンをクローニングさせた（図２のＢ）。
【００５９】
アガロースゲル電気泳動の結果、上記で増幅したＰＣＲ産物は、二つのバンドに移動し、大きいバンドは約７００ｂｐ、小さいバンドは約４５０ｂｐの大きさを有した（図２のＣ）。両バンドすべて精製した後、クローニングし、各々大きいバンド及び小さいバンドを含む２０〜１０個の無作為に選別したクローンを利用してＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２の３’−末端塩基配列を分析した。全体配列が証明された大部分のＪＥＶ分離株の場合で報告したように、本発明者らは、大きい挿入体（約７００ｂｐ）を有する全てのクローンのウイルスゲノムが−ＧＡＴＣＴ１０９６８で終わることを発見した。一方、小さい挿入体（約４５０ｂｐ）を有する全てのクローンは、ヌクレオチド１０，６８４で終結され、大きいバンドより２８４ｂｐ短いバンドを有した。小さい挿入体（約４５０ｂｐ）の場合、ウイルスゲノムＲＮＡの３’−末端に２８４個のヌクレオチドを含んでいないため、全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡの結合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）過程の間、本発明者らは、大きい挿入体（約７００ｂｐ）のヌクレオチド塩基配列を使用した。
【００６０】
＜２−３＞  ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの５’−末端塩基配列の決定
ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの５’−末端の塩基配列は、自家接合（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）されたウイルスＲＮＡを利用して決定した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｐｌｅｔｎｅｖ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００年，第２６９巻，２２５−２３７頁）。まず、タバコ酸ピロホスファターゼ（ｔｏｂａｃｃｏ  ａｃｉｄ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＴＡＰ）を使用してウイルスゲノムＲＮＡのキャップ構造を切断した。２０μｌの切断反応液は、１０ＵのＴＡＰ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．社，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０μｌのウイルスＲＮＡ及び製造社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．社）から供給されたバッファーを含む。３７℃で１時間培養した後、ＴＡＰ処理されたウイルスＲＮＡをフェノールで抽出してエタノールで沈澱させた後、ＲＮａｓｅが除去された２０μｌの水に再浮游させた。キャップが除去された（ｄｅｃａｐｐｅｄ）ウイルスＲＮＡの半分（１０μｌ）を、上記のようにＴ４  ＲＮＡ接合酵素を利用して２０μｌの反応混合液で自家接合させた。ｃＤＮＡ合成のために自家接合されたウイルスＲＮＡの１／４（５μｌ）を使用し、ここで、ヌクレオチド２１５−２３２と相補的な配列番号１３で表されるプライマーＪ４０を使用した。このように合成した一番目鎖（ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡは、ヌクレオチド１６４−１８１に相補的な配列番号１４で表されるプライマーＪ３９及びプライマーＪ３５を使用してＰＣＲ増幅した（図２のＤ）。アガロースゲル電気泳動結果、増幅された産物は、約８５０ｂｐの単一バンドであることを確認した（図２のＥ）。増幅されたｃＤＮＡ  ＪＶ３５ＮＴＲアンプリコンを、ＡｐｏＩ及びＳｐｅＩを使用して切断した後、ＡｐｏＩ及びＸｂａＩで切断されたｐＲＳ２ベクターに接合させてｐＲＳ２／ＪＶ３’５’を製造した。
【００６１】
ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡの５’−末端の塩基配列を分析するため、無作為に選択した１２個クローンの塩基配列を分析した。１２個の全てのクローンで、本発明者らは、ウイルス３’−末端の塩基配列  −ＧＡＴＣＴ１０９６８に続いて５’−末端の塩基配列１ＡＧＡＡＧＴ−が連結されていることが分かった（図２のＢ及び図２のＣ）。また、クローニングされないＰＣＲアンプリコンの直接的な塩基配列分析によっても同一の結果が得られた。したがって、本発明者らは、ＣＮＵ／ＬＰ２分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）の完全なヌクレオチド塩基配列が配列番号１５で表されることを確認した。
【００６２】
実施例３：全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡの製造  
ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２ゲノムＲＮＡに対する全長の感染性を有するｃＤＮＡをクローニングするための過程で、クローンされたＤＮＡが遺伝子再配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が起こるため、ウイルスゲノムの特定の部位は、大腸菌の高いコピー数（ｈｉｇｈ−ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ）のプラスミドでクローニングするのに適当ではなかった。また、上記の難しさは、他のフラビウイルスの場合にも存在することが報告されたことがある（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｐｌｅｔｎｅｖ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００年，第２６９巻，２２５−２３７頁；Ｐｏｌｏ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７年，第７１巻，５３６６−５３７４；Ｇｒｉｔｓｕｎ  ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５年，第２１４，６１１−６１８頁；非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献１５）。また、前記部位を低いコピー数（ｌｏｗ−ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ）のバクテリアプラスミドでクローンさせようとした場合にも、低いＤＮＡ収率と共に遺伝的不安定のため成功的ではなかった。したがって、本発明者らは、ＢＡＣであるｐＢｅｌｏＢＡＣ１１プラスミドをベクターとして使用することにより、ＪＥＶ全長の感染性を有するｃＤＮＡを合成しようとした。
【００６３】
＜３−１＞三つの長い重畳したＪＥＶ  ｃＤＮＡアンプリコンのサブクローニング
本発明者らは、標準手順による組換えＤＮＡ技術を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。まず、完全なヌクレオチド塩基配列を分析するために使用された三つの重畳するｃＤＮＡアンプリコン（ＪＶＦ、ＪＶＭ及びＪＶＲ）を、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１プラスミドの誘導体である配列番号４２で表されるｐＢＡＣ／ＳＶに各々サブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）した。ｐＢＡＣ／ＳＶプラスミドは、ｐＡＣＮＲ／ＮＡＤＬ（Ｍｅｎｄｅｚ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８年，第７２巻，４７３７−４７４５頁）の４９１ｂｐ  Ｎｏｔ  Ｉ−ＡａｔＩＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）処理）切片、ｐＳＩＮｒｅｐ１９（Ｆｒｏｌｏｖ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，１９９６年，第９３巻，１１３７１−１１３７７頁）の９，２１５ｂｐ  Ｓａｃ  Ｉ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理）−Ｓｓｐ  Ｉ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理）切片及びｐＢｅｌｏＢＡＣ１１の６，８７５ｂｐ  Ｓｆｉ  Ｉ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理）−Ｎｏｔ  Ｉ切片を含む。それで、３，８６３ｂｐの大きさのＪＶＦアンプリコンのＲｓｒＩＩ−ＡｖｒＩＩ切片、４，７１７ｂｐのＪＶＭアンプリコンのＢｓｐＥＩ−ＭｌｕＩ切片及び３，３２６ｂｐのＪＶＲアンプリコンのＲｓｒＩＩ−ＢｇｌＩＩ切片を同一の制限酵素で切断させた後、ｐＢＡＣ／ＳＶプラスミドに各々挿入させた。その結果、各々ｐＢＡＣ／ＪＶＦ、ｐＢＡＣ／ＪＶＭ及びｐＢＡＣ／ＪＶＲサブクローンが製造された。前記ＢＡＣプラスミドを大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞で成長させた後、挿入された三つのＪＥＶ  ｃＤＮＡアンプリコンの塩基配列を各々分析した。三つのサブクローンにクローニングされた全てのＪＥＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド塩基配列は、ｐＢＡＣ／ＪＶＲに存在するＮＳ５遺伝子の塩基置換（Ｔ８９０６→Ｃ）を除いては、親ウイルス（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）であるＣＮＵ／ＬＰ２のものと同一であった。前記置換は、蛋白質翻訳の観点では沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）し、無作為で選別した八つの個別クローンの塩基配列が８，９０６ヌクレオチド位置で全てＴ残基を示したため、クローニング過程でこのような塩基置換が発生したと推測される。Ｔ８９０６→Ｃ置換が対応するアミノ酸の配列を変形させないが、このようなヌクレオチド配列の変化がウイルスの複製に影響を及ぼすため（ｖａｎ  Ｄｉｎｔｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７年，第９４巻，９９１−９９６頁）、本発明者らは、再びＴ残基に置換させて本来の塩基配列を有するようにした。Ｔ８９０６→Ｃ置換を８，８２７−９，１４２に対応する３１５ｂｐ  ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切片を再クローニングすることにより矯正（ｃｏｒｒｅｃｔ）し、その結果ｐＢＡＣ／ＪＶＲＲが製造された。大腸菌ＤＨ１０Ｂ菌株での造作及び増殖過程で、三つのサブクローンＪＥＶ  ｃＤＮＡは、遺伝学的に安定したまま維持された。
【００６４】
＜３−２＞全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡの５’−末端にＳＰ６プロモーターの導入
バクテリオファージＳＰ６プロモーター転写出発点（ｓｔａｒｔ）を全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ５’−末端に正確に挿入させるため、本発明者らはｐＢＡＣ／ＪＶＦを変形させた。まず、配列番号１６で表されるプライマーＪ４１及びＳＰ６プロモーターの陰性センス配列に当たる配列番号１７で表されるプライマーＪ４３を使用してｐＢＡＣ／ＳＶをＰＣＲし、また、配列番号１８で表されるプライマーＪ４２及び配列番号１９で表されるプライマーＪ４０を使用してｐＢＡＣ／ＪＶＦをＰＣＲすることにより二つの切片を分離した。前記二つの切片をプライマーＪ４１及びＪ４０を使用してＰＣＲを遂行することにより融合させた。その結果生成されたアンプリコンをＰａｃＩ及びＰｍｅＩを使用して切断した後、同一のＰａｃＩ及びＰｍｅＩ酵素で切断されたｐＢＡＣ／ＪＶＦに接合させてｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦを生成した。
【００６５】
＜３−３＞ＳＰ６プロモーターを含む全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ製造
ウイルスゲノムの３’末端で線形化されたプラスミドのランオフ転写反応の間に、完全かほぼ完全な（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）３’末端を製造するため、本発明者らは、ｐＢＡＣ／ＪＶＲＲを変形させてＪＥＶウイルス完全な３’−末端のヌクレオチド塩基配列がＸｈｏＩまたはＸｂａＩの唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）制限酵素認識部位を有するようにした。ウイルスゲノムＲＮＡの３’−末端に唯一のＸｈｏＩ認識部位を含むｐＢＡＣ／ＪＶＲＲ／ＸｈｏＩサブクローンを製造するため、ｐＲＳ２／ＪＶ３’５’を配列番号２０で表されるプライマーＪ９０及びＸｈｏＩ認識部位を含む配列番号２１で表されるプライマーＪ４５を使用してＰＣＲを遂行することにより切片Ｉを合成した。２９８−ｂｐ  ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩ部位の切片ＩアンプリコンをＳｆｉＩ及びＮｈｅＩで切断したｐＢＡＣ／ＪＶＲＲに接合させた。ウイルスゲノムの３’−末端にＸｂａＩ認識部位を有するｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｂａＩサブクローンを製造するため、まず、ＰＣＲを利用してＮＳ５遺伝子のヌクレオチド９，１３１−９，１３６に既に存在するＸｂａＩ認識部位に沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）点突然変異（Ａ９１３４→Ｔ）を導入することにより制限酵素の認識部位を除去した。このようなｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｂａＩサブクローン構造で、「ｘ」表示は、本来のＸｂａＩ認識部位を除去させた沈黙点突然変異（Ａ９１３４→Ｔ）を示す。具体的に、ｐＢＡＣ／ＪＶＲＲを配列番号２２で表されるプライマーＪ３１及びＡ９１３４→Ｔ置換を導入させる配列番号２３で表されるプライマーＪ４７を利用して増幅させた。ヌクレオチド８，８２８−９，１４３に対応するｃＤＮＡアンプリコンの３１５ｂｐ  ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位をｐＢＡＣ／ＪＶＲＲにクローニングさせてｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘを製造した。次に、ｐＢＡＣ／ＪＶＲＲ／ＸｈｏＩの場合と同一の方法を使用してｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｂａＩサブクローンを製造した。したがって、プライマーＪ９０及びＸｂａＩ部位を含む配列番号２４で表されるプライマーＪ４６を使用してｐＲＳ２／ＪＶ３’５’をＰＣＲによって増幅することにより切片ＩＩを得た。切片ＩＩアンプリコンの２９８ｂｐ  ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩ部位をＳｆｉＩ及びＮｈｅＩで切断したｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘに接合させてｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｂａＩサブクローンを製造した。単一のＸｈｏＩ部位及びＡ９１３４→Ｔ置換部位を含むｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｈｏＩサブクローンを製造するため、切片Ｉアンプリコンの２９８ｂｐ  ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩ部位をＳｆｉＩ及びＮｈｅＩで切断したｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘに接合させてｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｈｏＩサブクローンを製造した。
【００６６】
上記の方法で、本発明者らは、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦ、ｐＢＡＣ／ＪＶＭ、ｐＢＡＣ／ＪＶＲＲ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｈｏＩの五つのプラスミドを製造した。前記プラスミドは、ＪＥＶゲノムＲＮＡを重畳して含み、下記のように全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを合成するのに使用した（図３）。まず、ｐＢＡＣ／ＪＶＭの４，７１７ｂｐ  ＢｓｐＥＩ−ＭｌｕＩ切片、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦの８，９７０ｂｐ  ＢｓｐＥＩ−ＸｂａＩ切片及びｐＢＡＣ／ＳＶの３，６７０ｂｐ  ＸｂａＩ−ＭｌｕＩ切片を接合することによりｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＭサブクローンを製造した。順次的に、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＭの二つの切片（８，１４２ｂｐのＰａｃＩ−ＳａｐＩ切片と４，８０１ｂｐのＰａｃＩ−ＢｓｒＧＩ切片）を、ｉ）ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩを製造するためにｐＢＡＣ／ＪＶＲＲ／ＸｈｏＩの５，６２０ｂｐ  ＳａｐＩ−ＢｓｒＧＩ切片と、ｉｉ）ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩを製造するためにｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｂａＩの５，６２２ｂｐ  ＳａｐＩ−ＢｓｒＧＩ切片と、またはｉｉｉ）ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩを製造するためにｐＢＡＣ／ＪＶＲＲｘ／ＸｈｏＩの５，６２０ｂｐ  ＳａｐＩ−ＢｓｒＧＩ切片と各々接合させた。最終的に生成された三つの全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡプラスミドは、各々ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩと命名し、配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５と記載した（図３のＢ）。前記ｃＤＮＡクローンは全てウイルスゲノムの始まり（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）部位にＳＰ６プロモーター転写出発（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ）部位を有し、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用した試験管内転写反応を通じて完全な（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）５’−末端を有する合成ＲＮＡ転写物が生産できる（図３のＢ、灰色ボックス）。ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写後、ウイルスゲノムの３’−末端を完全であるかまたは完全なものに近くするため、本発明者らは、ウイルスゲノムの末端にＸｈｏＩまたはＸｂａＩ制限酵素認識部位を位置させた（図３のＢ、下線）。したがって、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩは、ウイルスゲノムの末端にＸｈｏＩ認識部位を有する。ウイルスゲノムのＮＳ５遺伝子に既にＸｂａＩ認識部位が存在するため、ウイルスゲノムのすぐ末端にＸｂａＩ認識部位を有するようにするため、ＮＳ５遺伝子に存在するＸｂａＩ認識部位に沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）点突然変異（Ａ９１３４→Ｔ）を導入してＸｂａＩ認識部位を除去した。前記コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）をｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩと命名し、ここで「ｘ」表示は、本来の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）ＸｂａＩ認識部位が除去された沈黙点突然変異が存在することを意味する。三つ目のクローンであるｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩは、ウイルスゲノムの末端にランオフ位置としてＸｈｏＩ認識部位とＡ９１３４→Ｔ置換を全部含む。
【００６７】
本発明者らは、ＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩを、２００２年１０月２日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（アクセッション番号；ＫＣＴＣ  １０３４７ＢＰ）。
【００６８】
＜３−４＞Ｔ７プロモーターを含む全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ製造
前記実施例＜３−３＞と同一の方法で、本発明者らは、ＳＰ６−誘導された（ｄｒｉｖｅｎ）ＪＥＶ  ｃＤＮＡと共に、三つのＴ７−誘導された全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡのセットを製造した。まず、配列番号２５で表されるプライマーＪ８１及び配列番号２６で表されるプライマーＪ８０を使用してｐＢＡＣ／ＮＡＤＬｃＩｎ−／ＰＡＣ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｉｃｅから提供された）由来の切片をＰＣＲにより合成した。また、配列番号２７で表されるＪ４２プライマー及び配列番号２８で表されるＪ８２プライマーを使用してｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ由来の切片を合成した。前記二つの切片をプライマーＪ８１及びＪ８２を使用してＰＣＲの二回目の実行で融合させた。その結果、生成されたアンプリコンの７９３−ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ切片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断させたｐＲＳ２ベクターに挿入させてｐＲＳ２Ｔ７／５’ＪＶを製造した。ｐＲＳ２Ｔ７／５’ＪＶの６７５ｂｐ  ＰｖｕＩ−ＰｍｅＩ切片を、ｉ）ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩを製造するためにｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩの１８，３６４ｂｐ  ＰａｃＩ−ＰｍｅＩ切片と、ｉｉ）ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩを製造するためにｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩの１８，３６４ｂｐ  ＰａｃＩ−ＰｍｅＩ切片と、またはｉｉｉ）ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩを製造するためにｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩの１８，３６６ｂｐ  ＰａｃＩ−ＰｍｅＩ切片と各々接合させた。最終的に、三つの生成された全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡは、各々ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ及びｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩと命名し、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８と記載した。（図３のＣ）。各々のクローニング工程で、制限酵素及びヌクレオチド配列分析を広範囲に実施してクローニングされたｃＤＮＡの構造を分析した。その結果、欠失または再配列による挿入体の構造上の遺伝学的不安定性は観察されなかった。
【００６９】
本発明者らは、ＪＥＶ  ｃＤＮＡを含むｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩを、２００２年１０月２日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（アクセッション番号；ＫＣＴＣ  １０３４６ＢＰ）。
【００７０】
実施例４：転写及び形質転換  
本発明者らは、上記で合成した全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡを鋳型として使用し、試験管内転写反応により合成ＪＥＶ  ＲＮＡ転写物を生産した。これのため、１００−２００ｎｇの鋳型ＤＮＡをＸｈｏＩまたはＸｂａＩで切断して線形化させた後、製造社（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）によって提供されたバッファー、０．６ｍＭ  キャップ類似体［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａまたはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ，ＮＥＢ  Ｉｎｃ．］、０．５μＭの［３Ｈ］ＵＴＰ（１．０ｍＣｉ／ｍｌ，５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、１０ｍＭのＤＴＴ、各々１ｍＭのＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＡＴＰ、４０ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ及び１５ＵのＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で構成された２５μｌの反応混合液に添加した。前記反応混合液は、３７℃で１時間培養した。ＤＥ−８１濾過紙（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）にＲＮＡが吸収される［３Ｈ］ＵＴＰ陥入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に基づきＲＮＡを定量した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。その後、１〜１．５μｌ当量の反応混合液を利用してアガロースゲル電気泳動を実施し、実験の前までは反応混合液を−８０℃に保管した。
【００７１】
上記で合成されたＲＮＡ転写物を細胞内に形質転換させるため、ＥＣＭ８３０エレクトロポレーター（ＢＴＸ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して製造社の指針により、細胞に合成ＲＮＡをエレクトロポレーションさせた。要するに、亜飽和（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）状態の細胞にトリプシンを処理し、ＲＮａｓｅが除去された冷たいＰＢＳを利用して３回洗浄した後、２×１０７細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳに再浮游させた。４００μｌ当量の浮游物を２μｇの合成ＲＮＡと混合した後、以前実験で最適の条件と決定された条件（９８０Ｖ，９９−μｓパルス長及び５パルス）で細胞を直ちにエレクトロポレーションさせた。それから、エレクトロポレーションされた混合液を１０ｍｌの新鮮な培養液に移した。
【００７２】
また、合成ＲＮＡの特異的感染性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）を定量するため、感染センタ分析（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）を実施した。具体的に、ランオフ転写の場合、ＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型は、ＸｈｏＩまたはＸｂａＩ制限酵素の切断により線形化された。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ構造類似体の存在下でＸｈｏＩの処理によって線形化された二つのプラスミド（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩとｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ）は、ＳＰ６ポリメラーゼランオフ転写から５’−末端にキャップ構造を有し、３’−末端にウイルスと関連しないＣＧＡヌクレオチド塩基配列を有している合成ＲＮＡが生産された（図３のＢ）。このような結果は、ＸｈｏＩ切断によって残された５’突出部位が複製されたためである。これと類似に、ＸｂａＩ−線形化されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩプラスミドは、ＳＰ６ポリメラーゼランオフ転写から５’−末端にキャップ構造を有し、３’−末端にウイルスと関連しないＣＴＡＧヌクレオチド塩基配列を有している合成ＲＮＡが生産された（図３のＢ）。エレクトロポレーションされた細胞を順次的に１０倍ずつ稀釈し、６−ウェルプレートで成長する感染されていない単層細胞（５×１０５）に分株した。６時間培養してプレートに細胞を付着させた後、０．５％のＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガローズを含むＭＥＭ培地で、上記の方法で細胞を培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件で３〜４日間培養させた後、感染プラークセンターをクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）染色により視覚化させた。
【００７３】
その結果、敏感な（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）ＢＨＫ−２１細胞が上記の合成ＲＮＡでトランスフェクトされた時、全て高い特異的感染性を示した（表３）。即ち、最適のエレクトロポレーション条件でトランスフェクトされたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩから得られた合成ＲＮＡの場合、特異的感染性が各々３．５×１０５、４．３×１０５及び３．４×１０５ＰＦＵ／μｇであった（表３、ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）。これと類似の結果が、Ｔ７ポリメラーゼランオフ転写によってＴ７−誘導されたＪＥＶ  ｃＤＮＡから転写された合成ＲＮＡでも観察された（表３、ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）。
【００７４】
（表３）
全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡから合成されたＲＮＡ転写物の試験管内特異的感染性及びウイルス力価
0004430543.tif 000004
ａ：全ての全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ名前内に表示したランオフ転写に適当な制限酵素処理により線形化された。ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ及びｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮにおいて、ＸｂａＩ切断及びＭＢＮ処理により、これらｃＤＮＡ鋳型を線形化させて製造した。
ｂ：記載したように、ＳＰ６またはＴ７ＲＮＡ重合酵素を使用して試験管内転写後、ＢＨＫ−２１細胞をエレクトロポレーションするためにサンプルを使用し、感染プラークセンターを測定した。
ｃ：エレクトロポレーション後、２４及び４８時間後のウイルス力価  
【００７５】
＜４−１＞ＪＥＶ  ｃＤＮＡから合成されたＪＥＶ  ＲＮＡ転写物の３’−末端にウイルスと関連しないヌクレオチド塩基配列が欠如されたＪＥＶ  ＲＮＡ転写物の合成
ある種のフラビウイルスの場合、感染性を有するｃＤＮＡから転写された合成ＲＮＡの３’−末端にウイルスと関連しない配列が存在すると、特異的感染性が減少されるかまたはなくなる（ａｂｒｏｇａｔｅ）といることが報告されたことがある（Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１年，第２８１巻，２９４−３０４頁）。前記報告に基づき、本発明者らは、３’末端にウイルスと関連しない配列が欠如した合成ＲＮＡを製造して特異的感染性を比較した。具体的に、本発明者らは、追加に存在するＣＴＡＧヌクレオチドを転写反応前に除去するため、ＸｂａＩ−線形化されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩプラスミドをリョクトウヌクレアーゼ（ＭＢＮ）で処理することにより、ウイルスと関連しないヌクレオチド塩基配列を有していない合成ＪＥＶ  ＲＮＡを製造しようとした。ＸｂａＩ−線形化されてＭＢＮ−処理されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩから合成されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ（図３のＢ）及びｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩから合成されたｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ（図３のＣ）は、全てＭＢＮで処理していない転写物と比較した時、特異的感染性が増加した。正確には、ＭＢＮ−処理されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮから転写されたＲＮＡの特異的感染性は、３．１×１０６ＰＦＵ／μｇと測定されたが、これは変形されていない鋳型から転写されたＲＮＡの特異的感染性である３．４×１０５ＰＦＵ／μｇより約１０倍も高い（表３、ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）。また、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ（３．０×１０５ＰＦＵ／μｇ）由来のＲＮＡもＭＢＮ処理以後に増加した特異的感染性を示した（２．７×１０６ＰＦＵ／μｇ）（表３、ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）。したがって、本発明者らは、高い感染性を有する合成ＪＥＶ  ＲＮＡ転写物が生産されるためには、ＪＥＶゲノムＲＮＡに完全な（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）３’−末端が存在しなければならないことを確認した。
【００７６】
また、３または４個のＪＥＶウイルスと関連しないヌクレオチドが３’−末端に存在することによって変形されたＲＮＡ転写物の特異的感染性は、トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の培養上澄み液で収集したウイルス力価（ｔｉｔｅｒ）にも影響を及ぼした。ＭＢＮが処理されないｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ由来のＲＮＡ転写物でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞から放出されたウイルス力価は、形質転換後２４時間が経過した時、２．１−４．４×１０５  ＰＦＵ／ｍｌ範囲であった（表３、ウイルス力価２４時間）。この時点でトランスフェクトされた細胞の半分だけが相変わらず培養プレートに付着していたが、これはウイルスによって誘導される強い細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示す。前記力価は、形質転換後、４８時間が経過した時、３．２−５．２×１０６  ＰＦＵ／ｍｌ範囲で約１０倍増加したが（表３、ウイルス力価４８時間）、この時点で大部分の細胞は、死んで培養プレートの底に落ちた。しかし、ＭＢＮ−処理されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ由来のＲＮＡ転写物でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞から放出されたウイルス力価は、形質転換後２４時間が経過した時、既に６．２×１０６ＰＦＵ／ｍｌに到達し、ここで、多くのトランスフェクトされた細胞が死んだ（表３、ウイルス力価２４時間）。前記力価は、形質転換後、４８時間に１．４×１０６ＰＦＵ／ｍｌで少し減少した（表３、ウイルス力価４８時間）。また、上記で合成されたＴ７ポリメラーゼを利用したＲＮＡ転写物の場合にも、類似のパターンのウイルス生産が観察された（表３）。
【００７７】
実施例５：合成ＲＮＡ転写物の特異的感染性確認
本発明者らは、全長のｃＤＮＡクローンｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮを使用し、特異的感染性は全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡ転写を必要とすることを確認した（図４）。ｃＤＮＡ鋳型自体では感染性がなかったが（図４のＡ、レーン５及びＢ、ＳＰ６  Ｐｏｌ除外）、試験管内転写反応の間ＤＮａｓｅ  Ｉを処理すると感染性がなくなるため、転写反応の間には完全なｃＤＮＡ鋳型が要求されることを確認した（図４のＡ、レーン２及びＢ、ＤＮａｓｅ処理中）。完全な反応混合液と比較した時（図４のＡ、レーン  １及びＢ、未処理）、転写反応後にＤＮａｓｅ  Ｉを添加することは、影響を及ぼさなかった（図４のＡ、レーン３及びＢ、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理後）。しかし、反応後にＲＮａｓｅ  Ａを処理すると、転写された合成ＲＮＡの感染性が除去された（図４のＡ、レーン４及びＢ、ＲＮａｓｅ  Ａ処理後）。
【００７８】
実施例６：全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡから生産された合成ＪＥＶウイルス（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＪＥＶ）と親ウイルス（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）ＣＮＵ／ＬＰ２との特性比較
本発明者らは、全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ）鋳型から生産された合成ＪＥＶウイルス（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＪＥＶ）と、最初にｃＤＮＡに製造のため使用した親ウイルス（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）であるＣＮＵ／ＬＰ２を、プラーク形態、ウイルス成長キネティクス（ｇｒｏｗｔｈ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）、ウイルス蛋白質の合成及びウイルスゲノムＲＮＡの合成を各々比較した。
【００７９】
＜６−１＞プラーク分析（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）によるプラーク形態比較
本発明者らは、ＢＨＫ−２１細胞に上記の全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ）鋳型から得られた合成ＪＥＶウイルスと親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２を感染させ、１０％ＦＢＳ及び０．５％ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ）を含むＭＥＭ培養液で覆った後、５％ＣＯ２、３７℃が維持された培養器で培養した。３乃至４日間培養し、感染した細胞は、３．７％ホルムアルデヒドで室温で４時間固定させた後、覆われているアガロースを除去してクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）で染色してプラークを視覚化した。その結果、図５のＡから確認できるように、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ（プレート１）、ＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ（プレート２）、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ（プレート３）及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ（プレート４）から生産された合成ＪＥＶで感染したＢＨＫ−２１細胞は、ＣＮＵ／ＬＰ２で感染した細胞（プレート５）の場合と類似に、同一の大きさの（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）大きいプラークを形成した。
【００８０】
＜６−２＞ウイルスの成長キネティクス比較
本発明者らは、ＢＨＫ−２１細胞に上記の全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ）鋳型から得られた合成ＪＥＶウイルスと親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２を低い（０．０１ＰＦＵ／細胞）、中間（１．０ＰＦＵ／細胞）及び高い（１０ＰＦＵ／細胞）ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染させた後、時間が経過することによって感染したＢＨＫ−２１細胞で生産される感染性を有するＪＥＶウイルスの成長キネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を分析するため、細胞培養液を周期的に収集した。具体的に、指示された時点でウイルスを収穫し、上記のプラーク分析を通じてウイルス力価を測定した。その結果、図５のＢで見られるように、時間によって蓄積されるウイルス力価は、本発明で実施した三つのＭＯＩ（０．０１、１．０及び１０）で、四つの合成ＪＥＶウイルス（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ）及び親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２の場合に全て類似であった。
【００８１】
＜６−３＞ウエスタンブロット分析を通じたウイルス蛋白質の合成比較
本発明者らは、上記の全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ）鋳型から得られた合成ＪＥＶウイルスと親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２で感染したＢＨＫ−２１細胞で発現されるＪＥＶウイルスの蛋白質を比較した。具体的に、１ＭＯＩで感染した３×１０５ＢＨＫ−２１細胞を、２００μｌのサンプルローディングバッファー（８０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、２．０％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．２％ブロモフェニルブルー）を利用して溶解させ、溶解された細胞（ｌｙｓａｔｅ）の１／１０を５分間沸かした後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分留させた（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）。トランスブロット（ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ）ＳＤ電気泳動伝達細胞機械（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｃｈｉｎｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を利用し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからメタノルで活性化させたポリビニリデンジフルオライド膜に蛋白質を電気的に移した後、洗浄溶液（０．２％ツイーン２０が添加されたＰＢＳ）に溶解させた５％非脂肪粉乳を利用して室温で１時間膜をブロックさせた。洗浄溶液で３回洗浄した後、アクチン蛋白質の全ての同素体（ｉｓｏｆｏｒｍ）のＣ−末端に保存されているエピトーフ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識する単クローン抗アクチン抗体（Ａ４７００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＪＥＶに特異的なマウス過免疫性（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ）腹水液（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５９ＡＦ）で、室温で２時間膜を培養した。洗浄溶液で膜を３回洗浄した後、ＡＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で、室温で２時間培養した。膜を洗浄溶液で３回洗浄した後、ＰＢＳで１回洗浄した。膜に存在するアクチンまたはＪＥＶ蛋白質バンドは、基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスファート及びニトロブルーテトラゾリウムを、膜と共に培養することにより視覚化させた。その結果、合成ＪＥＶウイルス及び親ウイルス全てが類似の量と同一のパターンのＪＥＶウイルス特異的蛋白質を生産することを確認した（図５のＣ、上パネル）。サンプルローディング対照群としては、アクチン（ａｃｔｉｎ）蛋白質を使用し、同一の量のアクチン蛋白質がｍｏｃｋ−感染した細胞と合成ＪＥＶウイルス及び親ウイルスで感染した細胞に存在することを確認した（図５のＣ、下パネル）。
【００８２】
＜６−４＞ノーザンブロット分析を通じたウイルスゲノムＲＮＡの合成比較
本発明者らは、上記の全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ）鋳型から得られた合成ＪＥＶウイルスと親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２で感染したＢＨＫ−２１細胞で発現されるＪＥＶウイルスのＲＮＡを比較した。具体的に、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して３×１０５の感染したＢＨＫ−２１細胞から全体ＲＮＡを抽出した。ＪＥＶ−特異的ＲＮＡを分析するため、抽出された全体ＲＮＡの１／３に対してノーザンブロット分析を実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。２．２Ｍホルムアルデヒド−１％アガロースゲルでＲＮＡを電気泳動した後、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に伝達した。２５４ｎｍ光源（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して膜に存在するＲＮＡを膜と相互連結（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）させた後、ＪＥＶゲノムの９，１４３−９，３５１ヌクレオチド塩基配列に相補的に結合する［３２Ｐ］ＣＴＰ−標識されたアンチセンスリボプローブ（ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）と共に培養させることによりＪＥＶ−特異的ＲＮＡを検出した。ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩの２０９ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ切片を同一の酵素で切断したｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に挿入させてｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）／ＪＶ９１４３を製造した。前記ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）／ＪＶ９１４３をＢａｍＨＩ酵素で切断してＢａｍＨＩ−線形化されたｃＤＮＡクローンから、試験管内転写反応を通じて前記リボプローブを合成した。Ｔ７−ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して３．１２μＭの［α−３２Ｐ］ＣＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む２０μｌの反応混合液から製造社の指針に従い、前記ＢａｍＨＩ−線形化されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）／ＪＶ９１４３クローンを転写させた。ＤＮａｓｅ  Ｉを処理した後、転写反応に含まれていない（ｕｎｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）リボヌクレオサイドトリホスファ−トを除去するため、反応混合液をＱｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｇ−５０セパドクスカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）に適用させた。培養溶液［５×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド］で、５５℃で６時間膜を前培養させた後、１×１０７ｃｐｍの標識されたリボプローブを含む培養溶液で、５５℃で一晩培養させた。１×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳを使用して５５℃で１０分間３回膜を洗浄した後、０．１×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳを使用して１０分間１回洗浄した。ウイルスＲＮＡバンドを自家放射線写真（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）で視覚化させた後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ）を利用して定量した。その結果、全ての場合において、ウイルスＲＮＡの発現程度が類似であった（図５のＤ）。前記ブロットをイメージ分析機で定量した結果、ウイルスゲノムＲＮＡ（図５のＤ、上パネル）と１８Ｓ  ｒＲＮＡ（図５のＤ、下パネル）の比率に大きい差はなく、このような事実から、全ての場合にウイルスゲノムＲＮＡが類似の程度で発現されることを確認した。
【００８３】
上記の結果から、全ての全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ及びｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ）鋳型から得られた合成ＪＥＶウイルスは、プラーク形態、細胞病原性（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、ウイルス成長パターン、ウイルス蛋白質の合成及びウイルスゲノムＲＮＡの合成の観点で、親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２と区別できなかった。また、３’末端配列の分析の結果、ある合成ウイルスから誘導されたウイルスＲＮＡゲノムの３’末端でも、ウイルスと関連しない配列である追加的な三つ（ＣＧＡ）または四つ（ＣＴＡＧ）ヌクレオチドは発見されなかった。前記結果から、本発明で開発された感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡクローンを分子遺伝学的用途で使用できることを確認した。
【００８４】
実施例７：形質転換された培養液の親ウイルスによる汚染可否確認
上記の結果は、ＪＥＶ  ｃＤＮＡクローンがＳＰ６またはＴ７ポリメラーゼによる転写後に、高い感染性を有した合成ＲＮＡ転写物を生産可能であることを強く提示するが、形質転換された培養液が親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２に汚染された可能性を完全に排除できない。したがって、そのような可能性を完全に排除するため、本発明者らは、遺伝子マーカー（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ、ｇｍ）をｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩベクターに導入するためにＰＣＲを利用した位置指定突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を実施した。具体的に、ＰＣＲによる位置指定突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）誘導により、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩに存在するＮＳ５遺伝子内部に点突然変異Ａ８１７１→Ｃ（ｓｉｌｅｎｃｅ）を導入してｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩを製造した（図６のＡ）。点突然変異によってＮＳ５遺伝子内部に新しいＸｈｏＩ制限酵素認識部位が生成される。まず、Ａ８１７１  →Ｃ置換によってＸｈｏＩ認識部位が生成される配列番号２９で表されるプライマーＪ４８及び配列番号３０で表されるプライマーＪ３を使用し、ＰＣＲによってｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ由来の切片を製造した。その結果生成されたアンプリコンの６６５ｂｐ  ＭｌｕＩ−ＡｐａＩ切片を、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩの４，８０２ｂｐ  ＡｐａＩ−ＢｓｒＧＩ切片及び５，８７４ｂｐ  ＢｓｒＧＩ−ＭｌｕＩ切片と共に接合させてｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩを製造した。ＸｂａＩ−線形化されてＭＢＮ−処理されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮから合成されたＲＮＡ転写物でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞は、遺伝子マーカーを含む感染性を有する合成ＪＥＶウイルス（ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮと標記）を生産した（図６のＡ）。ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮの表現型的特性は、最初のウイルスＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮの場合と異なっていなかった。これは、Ａ８１７１→Ｃ置換がウイルス自己複製に影響を及ぼさないことを示す。
【００８５】
ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮウイルスがｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮのｃＤＮＡ鋳型から由来したことを証明するため、本発明者らは、ＢＨＫ−２１細胞で生産されたウイルスを０．１ＭＯＩで順次的に継代培養した。各々の継代培養で得たウイルスは、入力（ｉｎｐｕｔ）ＲＮＡ転写物と鋳型ｃＤＮＡプラスミドの汚染を避けるため、ＲＮａｓｅ  Ａ及びＤＮａｓｅ  Ｉを各々処理した後に継代培養した（Ｍｅｎｄｅｚ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８年，第７２巻，４７３７−４７４５頁）。Ａ８１７１→Ｃ置換を含む２，５８０ｂｐ  ＰＣＲ産物を増幅するため、１及び３継代培養で放出されたＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮ及びＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮウイルスから抽出されたウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに使用した（図６のＢ、レーン１、３及び５）。ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮから増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物をＸｈｏＩで処理する場合、１，５０６ｂｐ及び１，０７４ｂｐの二つの切片が生成された（図６のＢ、レーン２及び４）。一方、ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮから増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＸｈｏＩによって切断されなかった（図６のＢ、レーン５及びレーン６比較）。前記結果は、Ａ８１７１→Ｃ置換が実際にＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮウイルスＲＮＡに存在することを意味する。したがって、本発明者らは、合成されたＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮウイルスは、全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ  ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮから由来されたことを確認した。
【００８６】
実施例８：全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡの遺伝学的安定性分析
以前の全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡを合成しようとする研究では、構造蛋白質ｐｒＭ及びＥをコードする部位で時々ナンセンス（ｎｏｎｓｅｎｓｅ）突然変異が発生するということが報告されたことがある（非特許文献２３）。ＪＥＶに対する分子生物学的研究には信頼できる感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡクローンが必須的に要求されるため、本発明者らはｐＢＡＣＳＰ６／ｐＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩの遺伝子構造及び機能に関して幾つかの方法で深く分析した。
【００８７】
具体的に、感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡの遺伝子構造及び機能を下記のように分析した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ菌株をｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩで形質転換させた後、独立的に由来した二つのクローンを１２．５μｇ／ｍｌのクローラルフェニコールを含む１０ｍｌの２ｘＹＴ培養液に接種して３７℃で一晩培養した。前記一次培養細胞を毎日１０６倍ずつ稀釈しながら、９日間維持させた（非特許文献１９）。本発明の実験条件で、各々の継代培養は約２０世代を示し、これは以前報告で観察されたことと符合する（非特許文献１９）。３回、６回及び９回の継代培養後に、ＳＤＳ−アルカライン（ａｌｋａｌｉｎｅ）方法によって大きい規模（ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ）の感染性を有するｃＤＮＡプラスミドをＤＨ１０Ｂから分離し、セシウムクロライド密度傾斜遠心分離（ｃｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）でプラスミドを精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。プラスミドＤＮＡの遺伝子構造を制限酵素認識部位パターンによって調査した。０回、３回、６回及び９回の継代培養後に分離精製されたプラスミドを、制限酵素分析でプラスミドの遺伝子構造を調査した。３、６及び９回継代培養での制限酵素パターンは、０回継代培養時と比較すると、視覚的には差異がなかった。したがって、アガロースゲル電気泳動分析の解像度範囲内で、二つの感染性を有するｃＤＮＡクローンは、構造的に安定であるとみられる。
【００８８】
また、ＸｂａＩ切断及びエンドヌクレアーゼ（ＭＢＮ）処理によって線形化されたｃＤＮＡ鋳型から転写された合成ＲＮＡ転写物の特異的感染性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）を測定することにより、継代培養されたＪＥＶ  ｃＤＮＡプラスミドの遺伝学的安定性を機能的な側面で分析した。その結果、二つの独立的に分離及び精製されたｃＤＮＡから製造されたＲＮＡ転写物の特異的感染性は、０回継代培養と９回継代培養間で大きい差を示さなかった（図７）。前記結果から、感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡは、大腸菌での継代培養過程で構造的及び機能的に安定に維持されていることを確認した。
【００８９】
実施例９：感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを異種遺伝子の発現のためのベクターへの応用
以前に報告されたように（Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｍｏｎａｔｈ，Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ，２００１年，１０４３−１１２５頁，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、本発明者らは、ＪＥＶはヒト、マウス、サル、ブタ、犬、猫及びハムスターを含む様々な種類の真核細胞で自己複製できることを発見した。前記結果は、ＪＥＶが様々な種類の細胞で異種遺伝子の発現のためのベクターに有用に使用できることを意味する。これをテストするため、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ｅｌｅｍｅｎｔによって誘導される発現ベクターに、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ上のウイルス３’ＮＴＲ開始部位に一般的に使用される二つのリポーター遺伝子であるエクエオリアビクトリア（Ａｅｑｕｅｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及び北アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）を挿入させた（図８のＡ）。
【００９０】
このため、まず、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩ（図８のＡ）を製造するため、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ由来の切片を、配列番号３１で表されるプライマーＪ７２及び配列番号３２で表されるプライマーＪ７３を使用したＰＣＲによって増幅させた。また、配列番号３３で表されるプライマーＪ７４及び配列番号３４で表されるプライマーＪ７５を使用してｐＲＳＧＦＰ−Ｃ１の切片を増幅した。Ｊ７２及びＪ７５プライマーを使用したＰＣＲの２回目実行によって前記二つの切片を融合させた。その結果生成されたアンプリコンの９１３ｂｐ  ＫｐｎＩ−ＮｓｉＩ切片を、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩの８，０１１ｂｐ  ＮｓｉＩ−ＰａｃＩ及び１１，０２１ｂｐ  ＰａｃＩ−ＫｐｎＩ切片に接合させてｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩを製造した。
【００９１】
次に、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩ（図８のＡ）を製造するため、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ由来の切片を、プライマーＪ７２及び配列番号３５で表されるプライマーＪ７６を使用したＰＣＲによって増幅させた。また、配列番号３６で表されるプライマーＪ７７及び配列番号３７で表されるプライマーＪ７８を使用してｐＡＣＮＲ／ＮＡＤＬｃＩｎ−／ＬＵＣ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｉｃｅから受けた）の切片を増幅した。Ｊ７２及びＪ７８プライマーを使用したＰＣＲの２回目の実行によって前記二つの切片を融合させた。その結果生成されたアンプリコンの１，８０１ｂｐ  ＫｐｎＩ−ＮｓｉＩ切片を、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩの８，０１１ｂｐ  ＮｓｉＩ−ＰａｃＩ及び１１，０２１ｂｐ  ＰａｃＩ−ＫｐｎＩ切片に接合させてｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩを製造した。
【００９２】
ＮＳ３遺伝子の中央部分に８３個の５，５８１−５，６６３ヌクレオチドが欠失され、５，５９６ヌクレオチドでウイルス翻訳がプレターミネーションされるｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩベクター（図８のＡ）を製造するため、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩ切片を配列番号３８で表されるプライマーＪ８９及び配列番号３９で表されるプライマーＪ９１を使用してＰＣＲによって増幅させた。また、配列番号４０で表されるプライマーＪ９２及び配列番号４１で表されるプライマーＪ９３を使用してｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩの切片を増幅した。Ｊ８９及びＪ９３プライマーを使用したＰＣＲの２回目の実行によって前記二つの切片を融合させた。その結果生成されたアンプリコンの３，９６０ｂｐ  ＳｆｉＩ−ＥａｇＩ切片を、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩの６，４９３ｂｐ  ＥａｇＩ−ＳｆｉＩ及び１０，２９７ｂｐ  ＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ切片に接合させてｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩを製造した。
【００９３】
ＣＮＵ／ＬＰ２だけではなく、全体配列が証明された三つのＪＥＶウイルス株（Ｗｉｌｌｉａｍｓ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００年，第８１巻，２４７１−２４８０頁；Ｎａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，２００１年，第６５巻，３８８−３９２頁；Ｊａｎ等，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１９９６年，第５５巻，６０３−６０９頁）で、９−２５ｂｐの小さい欠失がウイルス３’ＮＴＲ開始部位で観察されたが、これは前記部位が異種遺伝子を挿入させるのに良い部位になれることを提示する。したがって、上記のように合成されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩとｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩ  ｃＤＮＡを鋳型として作られた合成ＲＮＡ転写物でＢＨＫ−２１細胞を形質転換させた時、異種遺伝子の挿入によって合成ＲＮＡ転写物の特異的感染性が変化しなかった。
【００９４】
ＧＦＰ発現を調査するため、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩＭＢＮｃＤＮＡ鋳型で転写された感染性を有する合成ＲＮＡ転写物で未処置のＢＨＫ−２１細胞を形質転換させた後、共焦点顕微鏡で調査した。具体的に、ＢＨＫ−２１細胞をｍｏｃｋ−トランスフェクションさせるかまたは２μｇのＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩＭＢＮＲＮＡを使用して形質転換させた。１×１０５のトランスフェクトされた細胞を４−ウェルチャンバースライドで３０時間培養させた。ＰＢＳを使用して細胞を２回洗浄した後、０．３７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを添加したＰＢＳに、２５℃で３０分間培養させて固定し、０．２ｍｌの８０％グリセロールでマウンティングを実施した。マウンティングした細胞は、共焦点顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰは核と細胞質間に拡散できる程度で充分に小さいため、（約３０ｋＤａ）、ＧＦＰを発現するＢＨＫ−２１細胞は、核と細胞質全てで緑色蛍光を示した（図８のＢ、ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩＭＢＮ）。予想されたように、このような蛍光は、ｍｏｃｋ−トランスフェクトされた細胞（図８のＢ、Ｍｏｃｋ）だけではなく、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ由来のＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた細胞では観察されなかった。
【００９５】
時間によるＬＵＣの誘導を定量的に分析するため、本発明者らは、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮ由来の複製適格性のＲＮＡ転写物だけではなく、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩＭＢＮ由来の複製非適格なＲＮＡ転写物も製造した（図８のＡ）。ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩＭＢＮ鋳型は、ＮＳ３遺伝子の中央部位であるヌクレオチド５，５８１−５，６６３に８３個ヌクレオチドが欠失している。したがって、ヌクレオチド５，５９６でウイルスの翻訳が予め終結されることにより、ウイルスＲＮＡの自己複製が起きない（図８のＡの＊参照、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩＭＢＮ）。
【００９６】
ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮ上のウイルスｃＤＮＡにエンジニアリングされたＬＵＣ遺伝子から発現されるルシフェラーゼ量を分析するため、８×１０６のＢＨＫ−２１細胞をｍｏｃｋ−トランスフェクションさせるか、２μｇのＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮＲＮＡまたはＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩＭＢＮＲＮＡで形質転換させた。６×１０５細胞／ウェルの濃度で細胞を６−ウェルプレートに分株して培養した。定められた時点で、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を除去したＰＢＳ溶液で細胞を洗浄した後、０．２ｍｌの溶解バッファー［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．８、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  １，２−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％トリトンＸ−１００（ｖ／ｖ）］を各々のウェルに添加して細胞を溶解させた。細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を室温で１０分間培養した後、細胞沈澱物（ｄｅｂｒｉｓ）を遠心分離で除去した。上澄み液を迅速に実験前まで−８０℃で保管した。ルシフェラーゼ活性を測定するため、２０μｌの細胞溶解物を１００μｌのルシフェラーゼ分析試薬［２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ、１．０７ｍＭ（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ、２．６７ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ  ＤＴＴ、２７０μＭ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、４７０μＭ  ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５３０μＭ  ＡＴＰ］が含まれている発光測程機（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）チューブに位置させた（ｐｌａｃｅｄ）。ルシフェラーゼ活性は、１０秒間測定した。各々のデータは、３回の独立的な実験の結果を示す。
【００９７】
その結果、複製適格ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞では（図８のＣ、黒い円）、トランスフェクション後６時間に最初ルシフェラーゼ活性が２．４±０．２×１０３ＲＬＵであった。このような活性は、形質転換後３０時間に５．３±０．１×１０４ＲＬＵで劇的に増加され、形質転換後５４時間には、７．８±０．１×１０５ＲＬＵに至り、この時点で＞５０％の細胞が死んだ。一方、複製非適格ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩＭＢＮＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞では、形質転換後６時間に最初ルシフェラーゼ活性が１．９±０．４×１０３ＲＬＵで（図８のＣ、白い円）ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮ−でトランスフェクトされた細胞の場合と類似であったが（図８のＣ、黒い円）、時間が経過することによって活性が漸進的に減少し、形質転換後５４時間には１６±１．２ＲＬＵに減少した。このような数値は、未処置の細胞の背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）ルシフェラーゼ活性水準である（図８Ｃ、白い円）。したがって、時間によって発現されるルシフェラーゼ活性の程度は、ウイルス複製の有無によって異なった形で現れる。
【００９８】
また、本発明者らは上記のように、ＧＦＰとＬＵＣ遺伝子を有した全長の感染性を有する組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡを製造した。組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡから合成したＪＥＶ  ＲＮＡ転写物でＢＨＫ−２１細胞を形質転換させた後、培養上澄み液からＧＦＰとＬＵＣ遺伝子を含んだ組換えられたＪＥＶ  ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩＭＢＮ及びＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮを製造した。このように生産された組換えＪＥＶウイルスからＧＦＰとＬＵＣ遺伝子の発現有無は、一般的に生命科学及び医学分野で多く使用される様々な動物細胞株（ＢＨＫ−２１，Ｖｅｒｏ，ＮＩＨ／３Ｔ３，ＳＴ，ＨｅＬａ，ＭＤＣＫ，ＣＲＦＫ，Ｂ１０３，及びＳＨＳＹ−５Ｙ）を前記ウイルスで感染させることにより観察した。その結果、ウイルスゲノムＲＮＡに挿入されたＧＦＰまたはＬＵＣ遺伝子は、分析した全ての種類の細胞で発現することが観察できた（表４）。したがって、組換えられたＪＥＶ  ｃＤＮＡ、ＪＥＶ  ＲＮＡ転写物及びＪＥＶウイルス粒子は、様々な種類の細胞内で外来異種遺伝子の発現のためのベクターとして有用に使用できることを確認した。
【００９９】
（表４）感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡ上にエンジニアリングされたＧＦＰ及びＬＵＣ遺伝子の発現
0004430543.tif 000005
ａ：組換えられたＪＥＶ  ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩＭＢＮで細胞を感染させた後、ＧＦＰの発現を分析した。
ｂ：組換えられたＪＥＶ  ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮで細胞を感染させた後、ＬＵＣ蛋白質の発現を分析した。
【０１００】
実施例１０：感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡの新規な異種遺伝子発現システムの用途
本発明者らは、追加的に目的とする外来遺伝子を発現するＪＥＶ発現システムの用途を研究した。まず、本発明者らは、三つの多く使用される様々な大きさの異形リポーター遺伝子、即ちＥＧＦＰ（ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ  ｇｅｎｅ，７６８  ｂｐ）、北アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のＬＵＣ遺伝子（１６５３ｂｐ）及びＬａｃＺ遺伝子（３０１２ｂｐ）を発現させるため、全長のウイルスゲノムをエンジニアリングした（図９のＢ）。本発明者らは、また、抗生剤ピュウーロマイシンに抵抗性を付与する優性選択マーカーＰＡＣ（６００ｂｐ）を導入させた（図９のＢ）。
【０１０１】
実施例１０−１：ＢＡＣで作用するバイシストロン全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡに基づいた異種遺伝子をコードする感染性を有する組換えＪＥＶの製造及び特性分析  
＜１０−１−１＞感染性を有する組換えＪＥＶベクターのプラスミド製造
標準分子生物学プロトコールによって全てのプラスミドを製造し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年）、ＰＣＲによって増幅された全ての部位は配列分析で確認した。本発明で使用された全ての組換えＪＥＶベクターをｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩに基礎して製造し（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）、以後、前記ベクターをｐＪＥＶ／ＦＬと命名する（図９のＡ）。
【０１０２】
本発明者らは、ＬＵＣ、ＥＧＦＰ、ＬａｃＺ及びＰＡＣ遺伝子を発現する四つの感染性を有する組換えＪＥＶベクターセットを製造した。ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣは、上記の実施例９で記述したｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩと命名されたコンストラクトと同一である（図９のＢ）。ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬａｃＺを製造するため、まず、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの２，４０９ｂｐ  Ｋｐｎ  Ｉ−Ａｖｒ  ＩＩ切片をＫｐｎ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉで切断したｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）内でサブクローンしてｐＧＥＭ／ＬＵＣを製造した。ｐＳｉｎＲｅｐ３／ＬａｃＺ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｃｅ博士から分譲を受けた）の３，１７７ｂｐ  Ｎｃｏ  Ｉ−Ｓｔｕ  Ｉ切片をｐＧＥＭ／ＬＵＣの３，９３５ｂｐ  Ｎｃｏ  Ｉ−Ｎｓｉ  Ｉ（Ｔ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ−処理）切片と接合させてｐＧＥＭ／ＬａｃＺを製造した。ｐＧＥＭ／ＬａｃＺの３，８７３ｂｐ  Ｋｐｎ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ切片をｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの７，４５６ｂｐ  Ｎｏｔ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ及び１１，０２１ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉ切片と接合させてｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬａｃＺを製造した（図９のＢ）。配列番号４９と記載されるＥＧＦＰＦプライマー及び配列番号５０と記載されるＥＧＦＰＲプライマーを使用し、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＰＣＲ増幅によってＥＧＦＰをコードする配列切片を製造した。ＥＧＦＰ切片アンプリコンの７７３ｂｐ  Ｎｃｏ  Ｉ−Ｓｔｕ  Ｉ部位をｐＲＳ／ＬａｃＺの３，２４１ｂｐ  ＥｃｏＲ  Ｖ−Ｓａｃ  ＩＩ及び２，０６２ｂｐ  Ｓａｃ  ＩＩ−Ｎｃｏ  Ｉ切片と接合させてｐＲＳ／ＥＧＦＰを製造した。ｐＲＳ／ＥＧＦＰの３，４０６ｂｐ  Ｓａｃ  ＩＩ−Ｎｏｔ  Ｉ切片をｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの７，４５６ｂｐ  Ｎｏｔ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ及び９，１０２ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｓａｃ  ＩＩ切片と接合させてｐＪＥＶ／ＦＬ／ＥＧＦＰを製造した（図９のＢ）。ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣを製造するため、ｐＡＣＮＲ／ＮＡＤＬｃＩｎｓ−／ＰＡＣ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｃｅ  博士から分譲を受けた）切片を配列番号５１と記載されるＰＡＣＦプライマー及び配列番号５２と記載されるＰＡＣＲでＰＣＲ−増幅させた。その結果、生産されたアンプリコンの８８１ｂｐ  Ｄｒａ  ＩＩＩ−Ｎｓｉ  Ｉ部位を、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの８，０１１ｂｐ  Ｎｓｉ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ、１０，０９６ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｎｄｅ  Ｉ及び８４２ｂｐ  Ｎｄｅ  Ｉ−Ｄｒａ  ＩＩＩと接合させてｐＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣを製造した（図９のＢ）。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳによって誘導された発現カセットをｐＪＥＶ／ＦＬのウイルス３’ＮＴＲの開始部位に挿入させた（図９のＡ及び図９のＢ）。
【０１０３】
＜１０−１−２＞ＥＧＦＰ発現分析
トランスフェクトされた細胞を３６−４８時間、四つのウェルチャンバースライド内でシード培養した。培養した後、０．３７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで培養することによって細胞を固定させ、０．２ｍｌ８０％グリセロールでマウンティングを実施した。適当なフィルターを利用した共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で細胞を観察した。ＥＧＦＰの発現をフローサイトメーター分析で調査した。具体的に、細胞をトリプシン処理してＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ内で０．３７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで再懸濁した後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。適当な正方向及び側面光分散計（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｓｉｄｅ  ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｇａｔｅｓ）によって死滅された細胞を排除した。生きている一万個の細胞を分析に使用した。
【０１０４】
＜１０−１−３＞β−ガラクトシダーゼ分析
ＰＢＳで細胞を１回洗浄して０．０５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを含んだＰＢＳで、室温で１５分間固定させた後、またＰＢＳで注意して３回洗浄した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）と染色溶液［５ｍＭフェリシアン化カリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有したＰＢＳ］を３７℃で共に反応させて細胞のβ−ｇａｌ活性を測定した。
【０１０５】
＜１０−１−４＞ルシフェラーゼ分析
上記の方法（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）によって基質にルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞のＬＵＣ活性を測定した。各実験は、３回反復して遂行して平均値を提示した。
【０１０６】
＜１０−１−５＞ピュウーロマイシンセレクション
細胞を３７℃で６時間の間６−ウェルプレートでシード培養した。ＰｕｒＲｆｏｃｉ形成を測定するため、０．５％ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）、加熱によって非活性化された１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含んだＭＥＭ培養液で細胞を覆った後、２日間３７℃で培養した。その以後に、ピュウーロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を添加するか排除させて追加的に３日間培養した。セレクション以後に、ホルムアルデヒド固定された細胞をクリスタルバイオレット染色によってＰｕｒＲ  ｆｏｃｉを観察した（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）。ＰｕｒＲ細胞培養のため、細胞をアガロースプラグで覆わないまま、２日間３７℃で完全培地で培養した。続いて、セレクションのため１０μｇ／ｍｌピュウーロマイシンを含んだ完全培地で２４−４８時間の間培養し、生きて残った細胞をクリスタルバイオレットで染色して観察した。
【０１０７】
＜１０−１−６＞追加的な発現単位を含む組換え合成ＪＥＶ  ＲＮＡ／ウイルスで形質転換／感染したＢＨＫ−２１細胞で発現される異形蛋白質
発現カセットの挿入がベクターの特異的な感染性／複製を変形させるかどうかを調査するため、本発明者らは、四つのＳＰ６−誘導された外来遺伝子を含有した感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡコンストラクトから転写された合成ＲＮＡの特異的な試験管内感染性を調査した（表５）。精製されたｐＪＥＶ／ＦＬ及びその誘導体プラスミドをＸｂａ  Ｉ処理によって線形化させてＭＢＮで処理した。上記のように、線形化されたプラスミドをＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを利用した試験管内転写反応（２５μｌ）に使用した。転写後に、反応混合液を追加的に１０ＵのＤＮａｓｅ  Ｉと３０分間反応させ、フェノールクロロホルムイソアミルアルコールでＲＮＡを抽出した。ＤＥ−８１濾過紙（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、ＵＫ）にＲＮＡが吸収される［３Ｈ］ＵＴＰ取り込みを基にしてＲＮＡを定量した。上記の方法によるエレクトロポレーションによって細胞内に流入されたＲＮＡ（２μｇ）で細胞を形質転換させた（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）。
【０１０８】
ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣ、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＥＧＦＰ、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ及びｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬａｃＺから誘導された合成ＲＮＡは、適格ＢＨＫ−２１細胞内に挿入され、各々３．５ｘ１０６、２．５ｘ１０６、３．４ｘ１０６及び１．１ｘ１０６ＰＦＵ／μｇの特異的感染性を示し、このような結果は親ベクターｐＪＥＶ／ＦＬ（３．２ｘ１０６ＰＦＵ／μｇ）の感染性と類似である。しかし、組換え合成ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞は、ｐＪＥＶ／ＦＬでトランスフェクトされた細胞に比べて、均一で小さいプラークを形成した（図９のＣ）。このような結果は、組換えＲＮＡでトランスフェクトされた細胞で観察される感染性を有するウイルス（表５、ウイルス力価）及び減少した細胞変性（表５、ＣＰＥ）の後期生産（ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）と一致する。また、本発明者らは、組換えＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞内ウイルス蛋白質（図９のＤ）の遅延型の蓄積は、以前に挿入された外来遺伝子の長さと相関関係があることを確認した（図９のＢ）。
【０１０９】
（表５）様々なリポーター遺伝子を含む全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ誘導体から生成された試験管内ＲＮＡ転写物の特異的感染性及び組換えウイルス力価
0004430543.tif 000006
ａ：試験管内転写反応に使用された全てのＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型は、Ｘｂａ  Ｉ切断で線形化された後に、ＭＢＮで処理して製造した。
ｂ：ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用した試験管内転写反応以後に、サンプルを使用してＢＨＫ−２１細胞をエレクトロポレーションし、感染性を有するプラークセンタを測定した（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）。
ｃ：エレクトロポレーション後、４８時間及び７２時間後のウイルス力価。
ｄ：全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ誘導体から生成されたＲＮＡ転写物でエレクトロポレーション以後にウイルス−誘導されたＣＰＥを観察した。エレクトロポレーションしてから２４時間後に、親ベクターｐＪＥＶ／ＦＬで「＋＋＋＋」と表示した強いＣＰＥを観察した。エレクトロポレーションしてから６０時間後に、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣ及びｐＪＥＶ／ＦＬ／ＥＧＦＰにおいては、「＋＋」と表示したＣＰＥを観察した。ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬａｃＺにおいては、「＋」と表示したようにエレクトロポレーションしてから７２時間後に明確なＣＰＥが現われ始めた。「−」は、どのようなＣＰＥも現わさないことを示す。
【０１１０】
感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡを使用した場合のＥＧＦＰ、ＬＵＣ、ＬａｃＺ及びＰＡＣ発現を図１０に示した。蛍光顕微鏡を使用してＪＥＶ／ＦＬ／ＥＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞で明るい緑色蛍光を観察した（図１０のＡ）。フローサイトメーター分析による場合、ｍｏｃｋでトランスフェクトされた細胞に比べて、緑色の蛍光細胞（−）は、９９．７％が前記蛋白質を含んでいることが測定された（図１０のＢ）。図１０のＣは、ＪＥＶ／ＦＬ／ＬａｃＺ  ＲＮＡを発現するＢＨＫ−２１細胞のＸ−ｇａｌ染色パターンを示す。また、本発明者らは、時間経過による複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞（●）またはｎｔ  ５５９６（＊）でウイルス蛋白質の解読を早期終結させる部位が欠如した複製的確性のＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣＲＥＰ−ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞（○）のＬＵＣ活性をモニターリングした。上記のように（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）このような結果は、増加されたウイルス複製は、増加されたＬＵＣ活性と相関関係があることを立証した（図１０のＤ）。また、ピュウーロマイシを処理したＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞のセレクション（図１０のＥ）は、生きて残ったＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣ  ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を示し、この細胞がピュウーロマイシンを含有した培地（プレート７）を完全に覆うかピュウーロマイシンを含有した培地を覆った半固体アガー下にＰｕｒＲ  ｆｏｃｉを形成した（プレート８）。一方、ｍｏｃｋでトランスフェクトされた細胞は、セレクション２４時間後に死滅した（プレート５−６）。予想したように、両細胞型全てピュウーロマイシンの欠如培地には、飽和するように成長した（プレート１−４）。
【０１１１】
＜１０−２＞ＪＥＶウイルスレプリコンの製造及びベクター特性
【０１１２】
＜１０−２−１＞ＪＥＶウイルスレプリコンベクターのプラスミド製造
構造蛋白質のコード配列内にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）欠失をエンジニアリングするため、全てのＪＥＶウイルスレプリコンのためのプラスミドは、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣに基礎して製造した。二つのアミノ酸残基、即ちＬｅｕ及びＧｌｕの挿入を誘発させる新規なＸｈｏ  Ｉ部位によって全ての欠失を区別した。第１に、本発明者らは、各構造蛋白質内に単一インフレーム欠失を含んだ四つのＪＥＶウイルスレプリコンベクターセットを製造した。Ｃ遺伝子に２７３個ヌクレオチド欠失（ｎｔ  １３２−４０４）を含むｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣＣ／ＬＵＣを製造するため、ｐＪＥＶ／ＦＬのＰＣＲ増幅によって二つの切片を合成した。即ち、配列番号５３で表されるＤｅｌＦプライマー及び配列番号５４で表されるＣ１Ｒプライマーを使用して切片Ｃ１を合成し、配列番号５５で表されるＣ２Ｆプライマー及び配列番号５６で表されるＤｅｌＲプライマーを使用して切片Ｃ２を合成した。二つの切片（Ｃ１切片アンプリコンの２６７ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ部位及びＣ２切片アンプリコンの２２６ｂｐ  Ｘｈｏ  Ｉ−ＢｓｉＷ  Ｉ部位）をｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの２０，０７３ｂｐ  ＢｓｉＷ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ切片と接合させてｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣＣ／ＬＵＣコンストラクトを製造した。Ｃ遺伝子に２０４−ヌクレオチド欠失（ｎｔ  ２０１−４０４）を含むｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣを製造するため、ｐＪＥＶ／ＦＬから切片Ｃ３をＤｅｌＦプライマー及び配列番号５７で表されるＣ３Ｒプライマーを使用してＰＣＲ増幅させた。その結果、生成されたアンプリコン３３６ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ切片をｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣＣ／ＬＵＣの１２，８５０ｂｐ  Ｘｈｏ  Ｉ−Ｒｓｒ  ＩＩ及び７，４４９ｂｐ  Ｒｓｒ  ＩＩ−Ｐａｃ  Ｉ切片と接合させてｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣコンストラクトを製造した。ｐｒＭ遺伝子に２８２−ヌクレオチド欠失（ｎｔ  ５３１−８１２）を含むｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ／ＬＵＣを製造するため、ｐＪＥＶ／ＦＬのＰＣＲ増幅によって二つの切片を製造した。即ち、ＤｅｌＦプライマー及び配列番号５８で表されるｐｒＭ１Ｒプライマーを使用して切片ｐｒＭ１を製造し、配列番号５９と記載されるｐｒＭ２Ｆプライマー及びＤｅｌＲプライマーを使用して切片ｐｒＭ２を製造した。二つの切片（ｐｒＭ１切片アンプリコンの６６６ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ部位及びｐｒＭ２切片アンプリコンの１，６１６ｂｐ  Ｘｈｏ  Ｉ−Ｓｆｉ  Ｉ部位）をｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの１０，２６４ｂｐ  Ｓｆｉ  Ｉ−Ｎｓｉ  Ｉ及び８，０１１ｂｐ  Ｎｓｉ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ切片と接合させてｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ／ＬＵＣコンストラクトを製造した。Ｅ遺伝子に１，１７０−ヌクレオチド欠失（ｎｔ  １，０３２−２，２０１）を含むｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＥ／ＬＵＣをエンジニアリングするため、ｐＪＥＶ／ＦＬのＰＣＲ増幅によって二つの切片を製造した。即ち、ＤｅｌＦプライマー及び配列番号６０と記載されるＥ１Ｒプライマーを使用して切片Ｅ１を製造し、配列番号６１と記載されるＥ２Ｆプライマー及びＤｅｌＲプライマーを使用して切片Ｅ２を製造した。二つの切片（ｐｒＭ１切片アンプリコンの１，１６７ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ部位及びｐｒＭ���切片アンプリコンの２２７ｂｐ  Ｘｈｏ  Ｉ−Ｓｆｉ  Ｉ部位）をｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの１０，２６４ｂｐ  Ｓｆｉ  Ｉ−Ｎｓｉ  Ｉ及び８，０１１ｂｐ  Ｎｓｉ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ切片と接合させてｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＥ／ＬＵＣコンストラクトを製造した（図１１のＡ）。
【０１１３】
第２、本発明者らは、ＪＥＶ構造遺伝子内に二重インフレーム欠失を含む三つのＪＥＶウイルスレプリコンベクターパネルを製造した。二つのｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ切片（１０，２６４ｂｐ  Ｓｆｉ  Ｉ−Ｎｓｉ  Ｉ及び８，０１１−ｂｐ  Ｎｓｉ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ切片）を、i）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ／ＬＵＣを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣの４３８ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ切片及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ／ＬＵＣの１，６４６ｂｐ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｆｉ  Ｉ切片と、ii）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔＥ／ＬＵＣを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣの８６６ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ切片及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＥ／ＬＵＣの３３０ｂｐ  Ｍｌｕ  Ｉ−Ｓｆｉ  Ｉ切片と、またはiii）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ／ＬＵＣの７８８ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ切片及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＥ／ＬＵＣの３０ｂｐ  Ｍｌｕ  Ｉ−Ｓｆｉ  Ｉ切片と各々接合させた（図１１のＡ）。
【０１１４】
第３、本発明者らは、全てのＪＥＶ構造蛋白質が欠失された二つのＪＥＶウイルスレプリコンベクターセットを製造した。ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣを製造するため、二つのｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ切片（１０，２６４ｂｐ  Ｓｆｉ  Ｉ−Ｎｓｉ  Ｉ及び８，０１１−ｂｐ  Ｎｓｉ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ切片）をｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ／ＬＵＣの５９０ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ切片及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＥ／ＬＵＣの３３０ｂｐ  Ｍｌｕ  Ｉ−Ｓｆｉ  Ｉ切片と接合させた。また、本発明者らは、Ｃ蛋白質の３５Ｎ−末端及び２４Ｃ−末端アミノ酸がＮＳ１蛋白質のＮ−末端に続き、その他のウイルスゲノムを含むｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣを製造した。まず、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣからの切片をＤｅｌＦプライマー及び配列番号６２と記載されるＮＳ１Ｒプライマーを使用してＰＣＲによって合成した。それから、ｐＪＥＶ／ＦＬからの切片を配列番号６３と記載されるＮＳ１Ｆプライマー及び配列番号６４と記載されるＰＲプライマーを使用して合成した。この二つの切片をＤｅｌＦ及びＰＲプライマーを使用したＰＣＲの２回目実行で融合させた。その結果得られるアンプリコンの４７４ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−ＡｐａＬ  Ｉ切片をｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣの３，０３８ｂｐ  ＡｐａＬ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ及び１５，１２２ｂｐ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ切片と接合させた（図１１のＡ）。
【０１１５】
ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣ及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣに追加し、また本発明者らは、八つの他ＪＥＶウイルスレプリコンベクターを製造した。ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＥＧＦＰの６，７９７ｂｐ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ切片を、i）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＥＧＦＰを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣの１１，５２９ｂｐ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ切片を、またはii）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＥＧＦＰを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣの１０，９６８ｂｐ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ切片と各々接合させた。ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬａｃＺの５，７９２ｂｐ  Ｓａｃ  ＩＩ−Ｎｏｔ  Ｉ切片を、i）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬａｃＺを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣの７，４５６ｂｐ  Ｎｏｔ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ及び７，４６４ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｓａｃ  ＩＩ切片と、またはii）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬａｃＺを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣの７，４５６−ｂｐ  Ｎｏｔ  Ｉ−Ｐａｃ  Ｉ及びｔｈｅ  ６，９０３ｂｐ  Ｐａｃ  Ｉ−Ｓａｃ  ＩＩ切片と各々接合させた。ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣの６，６６３ｂｐ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ切片を、i）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＰＡＣを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣの１１，５２９ｂｐ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ切片と、またはii）ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＰＡＣを製造するため、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣの１０，９６８ｂｐ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ切片と各々接合させた。
【０１１６】
＜１０−２−２＞様々な自己複製自己制限ＪＥＶウイルスレプリコンから発現される異形蛋白質
ＪＥＶ  ＲＮＡ複製開始を使用して外来遺伝子を独立的に発現させるため、本発明者らは、厳しい安全基準を充足させる自己複製自己制限ウイルスレプリコンのパネルを製造した（図１１のＡ）。最初に本発明者らは敏感で定量的な方式でウイルス複製のモニターリングが容易であるように、異種遺伝子としてＬＵＣリポーター遺伝子を使用した。したがって、各蛋白質の膜内位置（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を考慮し、ウイルスの一つ、二つまたは全ての構造遺伝子（Ｃ、ｐｒＭ及びＥ）をインフレーム欠失させてｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣのコンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）内に注意してエンジニアリングした（図１１のＡ）。
【０１１７】
様々なウイルスレプリコンでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞のＬＵＣ活性を時間経過によって作成した（図１１のＢ）。陽性対照群として複製可能なＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ  ＲＮＡ（●、黒）でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞において、形質転換してから６時間後、最初のＬＵＣ活性は５．５±０．３Ｘ１０３ＲＬＵであった。このような活性は、形質転換してから４８時間後には、２．７±０．５Ｘ１０６ＲＬＵと急激に増加し、形質転換してから９６時間後まで維持された。複製不可能なＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣＲＥＰ−  ＲＮＡ（◆、黒）でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞において、形質転換してから６時間後、入力ウイルスＲＮＡから発現された最初のＬＵＣ活性は、類似の５．２±０．６Ｘ１０３ＲＬＵであった。しかし、前記活性は、形質転換してから９６時間後には、８．８±１．０ＲＬＵと時間経過によって急激に減少し、これは未処置の細胞の背景発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）程度に相応する程度である。全てのフラビウイルスに保存されたと提案された３’ＮＴＲのサイクリゼーション（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）配列（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第８４巻，１２６１−１２６８頁；Ｌｏ等．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，１０００４−１００１４頁；Ｋｈｒｏｍｙｋｈ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１年，第７５巻，６７１９−６７２８頁）に相補的な配列が欠如されたｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣＣ／ＬＵＣ（◆、青）とは異なり、一つまたはその以上の構造蛋白質遺伝子の一部が欠失したウイルスレプリコンでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞のＬＵＣ活性は、複製可能なＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の形質転換してから６−４８時間の間の活性（●、黒）とほぼ同一であった。しかし、その以後これらの活性は、ＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣＲＥＰ−に類似にウイルス伝播の欠如により、時間経過によって急激に減少した。興味深いのはＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣ  ＲＮＡ（●、緑）に基づいたＬＵＣ活性（しかし、ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣ  ＲＮＡ（塗りつぶし四角、緑）は、影響を及ぼされない）は、他の複製可能なウイルスレプリコンの活性に比べ、全ての時間に渡って約５倍ほど高かった。
【０１１８】
ＪＥＶ特異的過免疫性血清を使用した免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）で定量した結果、ＬＵＣ発現形態（ｐｒｏｆｉｌｅ）は、ウイルス蛋白質蓄積方式と一致した（図１１のＣ）、また、本発明者らは、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥのようなＪＥＶレプリコンベクターを使用した場合に、様々な多く使用される動物細胞でリポーター遺伝子を効果的に発現させられることを確認した。
【０１１９】
＜１０−３＞ＪＥＶウイルスレプリコンのためのパッケージングシステムの製造
【０１２０】
＜１０−３−１＞ｐＳｉｎＲｅｐ１９ベクターに基づいたＪＥＶ構造蛋白質発現ベクターのプラスミド製造
本発明者らは、ｐＳｉｎＲｅｐ１９（Ａｇａｐｏｖ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，１２９８９−１２９９４頁）に基づいたＪＥＶ構造蛋白質発現ベクターを製造した。ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅを製造するため、Ｘｂａ  Ｉ部位（下線で表示）を挿入させた配列番号６５で表されるＪＥＶＣＦプライマー（５−ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡ）及びＰｍｅ  Ｉ部位（下線で表示）を挿入させた配列番号６６で表されるＪＥＶＥＲプライマー（５−ＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＴＧＧＴ）を使用してｐＪＥＶ／ＦＬの切片を増幅させた。その結果、生成されたアンプリコンの２，３９３ｂｐ  Ｘｂａ  Ｉ−Ｐｍｅ  Ｉ切片を、ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅを製造するため、ｐＳｉｎＲｅｐ１９の１０，８６４ｂｐ  Ｘｂａ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ−処理）切片と接合させた（図１２のＡ）。ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１を製造するため、ＪＥＶＣＦプライマー及びＰｍｅ  Ｉ部位（下線で表示）を挿入させた配列番号６７で表されるＪＥＶＮＳ１Ｒプライマー（５−ＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＴＧＴＧＡ）を使用してＰＣＲ増幅によってｐＪＥＶ／ＦＬ切片を製造した。それから、その結果生成されたアンプリコンの３，４４９ｂｐ  Ｘｂａ  Ｉ−Ｐｍｅ  Ｉ切片を、ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１を製造するため、ｐＳｉｎＲｅｐ１９の１０，８６４ｂｐ  Ｘｂａ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ−処理）切片と接合させた（図１２のＡ）。ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅ−ＢｇｌＩＩの製造のため、ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１の２，５５９ｂｐ  Ｘｂａ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ−処理）切片をｐＳｉｎＲｅｐ１９の１０，８６４ｂｐ  Ｘｂａ  Ｉ−Ｍｌｕ  Ｉ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ−処理）切片と接合させた（図１２のＡ）。
【０１２１】
＜１０−３−２＞ＪＥＶ−誘導されたレプリコンベクターＲＮＡのためのパッケージング細胞株の製造
ＪＥＶの全ての構造蛋白質（Ｃ、ｐｒＭ及びＥ）を継続的に発現し、ＪＥＶウイルスレプリコンの効率的なパッケージングのトランス補完が可能なＰＣＬ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；パッケージ細胞株）の開発により、ＪＥＶレプリコン発現ベクターの利用効率が増進された。セレクションを増進させるサブゲノムプロモーターによって誘導されるＰＡＣ遺伝子を含むｐＳｉｎＲｅｐ１９発現ベクター（図１２のＡ）に基づき、本発明者らは、Ｃ−Ｅ（ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅ）、Ｃ−Ｅ及びＮＳ１の５８Ｎ−末端残基（ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅ−ＢｇｌＩＩ）及びＣ−ＮＳ１（ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１）に対する配列をコードする三つの互いに違っているＪＥＶ構造蛋白質発現カセットコンストラクトを製造した。
【０１２２】
前記ベクターによって生成された蛋白質発現を、相応するベクターから試験管内転写した合成ＲＮＡで形質転換させたＢＨＫ−２１細胞で測定した。ｐＳｉｎＲｅｐ１９及びその誘導体をＸｈｏ  Ｉ切断によって線形化させた。上記の方法によって前記線形化されたプラスミドを、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用した試験管内転写反応（２５μｌ）に使用した。転写後に、反応混合液を追加的に１０ＵのＤＮａｓｅ  Ｉと３０分間反応させ、フェノールクロロホルムイソアミルアルコールでＲＮＡを抽出した。ＤＥ−８１濾過紙（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）にＲＮＡが吸収される［３Ｈ］ＵＴＰ陥入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に基づきＲＮＡを定量した。上記の方法によるエレクトロポレーションによって細胞内に流入されたＲＮＡ（２μｇ）で細胞を形質転換させた（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）。トランスフェクトされた細胞溶解物をＪＥＶ特異的過免疫性血清で免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって分析した時、三つのベクター各々形質転換させたＢＨＫ−２１細胞から全てウイルス糖蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｒｎ）Ｅの同一の量が検出された（図１２のＢ）。デザインしたように、ＮＳ１蛋白質はＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１  ＲＮＡで形質転換させた細胞でだけ検出された（図１２のＢ）。
【０１２３】
ＶＲＰ（ＪＥＶ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を生産する二つの方法を図１２のＣに概略化して示した。第一は、ＪＥＶ構造蛋白質を発現するＳｉｎＲｅｐ１９ベクターＲＮＡを、試験管内転写されたレプリコンベクターＲＮＡと共に一時的に共同形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させることである。パッケージされたＶＲＰの力価測定とモニターリングは、ＶＲＰで未処置のＢＨＫ−２１細胞を感染させた後、リポーター遺伝子発現を測定することによって可能である。何回の実験でＥＧＦＰを発現するＪＥＶウイルスレプリコンＲＮＡ［ＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＥＧＦＰ（□、緑）またはＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＥＧＦＰ（塗りつぶし四角、緑）］とＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１  ＲＮＡを共同形質転換させた結果、１．１−４．３Ｘ１０４ＩＵ／ｍｌ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｕｎｉｔ／ｍｌ）ＶＲＰを製造した（図１２のＤ）。ＬａｃＺを発現するＪＥＶウイルスレプリコン、即ちＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬａｃＺ（□、青）またはＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬａｃＺ（塗りつぶし四角、青）を使用した場合にも類似の結果が得られた。ＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１またはＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅ−ＢｇｌＩＩ  ＪＥＶ構造蛋白質発現カセットが使用される時にも、どのような差異も観察されなかった。しかし、ＥＧＦＰまたはＬａｃＺを発現するウイルスレプリコンとＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＥベクターＲＮＡの共同形質転換は、１００倍少ないＶＲＰを生成した（図１２のＤ）。このような観察は、ＬＵＣを発現するＪＥＶレプリコンＲＮＡ、即ちＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣ（□、黒）またはＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣ（塗りつぶし四角、黒）と全てのＪＥＶ構造蛋白質発現ベクターの共同形質転換によっても確認された（図１２のＤ）。
【０１２４】
ＪＥＶ  ＶＲＰを生産する他の方法は、ＪＥＶ構造蛋白質発現ベクターＲＮＡで細胞を形質転換させた後、ピュウーロマイシンでセレクションすることによって達成される連続的ＰＣＬ使用に基づいている。上記の方法のように、ＢＨＫ−２１細胞をＪＥＶ構造蛋白質発現ベクターで形質転換させた。形質転換以後に前記細胞を２４時間の間シード培養した後、１０μｇ／ｍｌのピュウーロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地に培地交換した。以後に前記細胞をピュウーロマイシン存在下で維持させ、親ＢＨＫ−２１細胞と共に継代培養するか凍結保管した。
【０１２５】
セレクトされた細胞は、宿主細胞にいかなる有害な影響も与えずＪＥＶ構造蛋白質を安定に発現させてＪＥＶに基づいたＶＲＰを生成する際に、親ＢＨＫ−２１細胞よりもう少し効率が高かった。全ての場合において、二つのベクターＲＮＡで親ＢＨＫ−２１細胞を共同形質転換させるプロトコールに比べ、ＪＥＶウイルスレプリコンベクターＲＮＡで前記ＰＣＬを形質転換させる場合に、より高いＶＲＰ力価（１．０Ｘ１０３−１．２Ｘ１０５  ＩＵ／ｍｌ）が生成された（図１２のＥ）。
【０１２６】
本発明で開発されたパッケージングシステムに複製可能なウイルス粒子が存在するかどうかを分析するため、未処置のＢＨＫ−２１細胞を７２時間の間１ＭＯＩで３Ｘ１０５ＩＵ  ＶＲＰで感染させた。存在するかも知れない複製可能なウイルス粒子の非常に少ない量を増幅させるため、前記感染した細胞から得られた原液上澄み液を追加的に３回継代培養した。３回の継代培養の結果、ＪＥＶ特異的過免疫性血清を使用したＩＦＡにより、感染した細胞からリポーター遺伝子またはウイルス蛋白質の発現をテストした。いかなる複製可能なウイルス粒子も検出されなかった。さらに、ＪＥＶ構造蛋白質を発現するＳｉｎｄｂｉｓレプリコンＲＮＡは、放出されたＶＲＰでまったく膜で取り囲まれなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
上記のように、本発明のＪＥＶゲノムＲＮＡの完全なヌクレオチド塩基配列及びそれから合成した全長の感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡは、神経侵入性（ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）及び病原性（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するＪＥＶ遺伝子を同定することだけではなく、ＪＥＶの自己複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）及び翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）に関連した分子生物学的なメカニズムの研究に使用できる。また、本発明は、日本脳炎の治療剤、ワクチン、診断試薬及び診断用器具の開発に適用でき、様々な外来遺伝子の発現ベクター（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）として使用できる。
【０１２８】
上述に開示した概念及び特定の態様が、本発明の目的と同じ目的を実施するための改変されたまたは設計された他の態様の根拠として容易に利用されうることは当業者に理解されるものと思われる。当業者はまた、そのような等価の態様が、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の精神及び範囲から逸脱しないことも理解するものと思われる。
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【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】日本脳炎ウイルスの韓国分離株Ｋ８７Ｐ３９とそれから分離した大きいプラークを形成するＪＥＶ分離体（ｌａｒｇｅ−ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ＪＥＶ  ｉｓｏｌａｔｅ）ＣＮＵ／ＬＰ２を比較したもので、ＪＥＶにｍｏｃｋ−感染したＢＨＫ−２１細胞（Ｍｏｃｋ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）、混合した様々な大きさのプラークを示すＪＥＶ  Ｋ８７Ｐ３９韓国分離株に感染したＢＨＫ−２１細胞（Ｋ８７Ｐ３９−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）、及び一定の大きいプラークを示すＣＮＵ／ＬＰ２に感染したＢＨＫ−２１細胞（ＣＮＵ／ＬＰ２−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）に対するプラーク分析結果（Ａ）、Ｖｅｒｏ細胞を使用した場合のプラーク分析結果（Ｂ）及び染色したＪＥＶ−特異的タンパク質（緑色蛍光）とヨウ化プロピディウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｄｏｄｉｎｅ、赤色蛍光）で染色した細胞の核を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で見た写真であり、ＢＨＫ−２１細胞をＫ８７Ｐ３９、ＣＮＵ／ＬＰ２、または黄熱病ウイルスＹＦ１７Ｄ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  １７Ｄ）で感染またはｍｏｃｋ−感染させた写真である（Ｃ）。１８時間経過後、細胞を固定し、ＪＥＶ−特異的マウス高度免疫（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ）腹水（ａｓｃｉｔｅ）で染色した後、イソチオシアン酸フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）が結合されたヤギ（ｇｏａｔ）アンチ−マウス免疫グロブリンＧを処理して共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。
【図２】Ａは、ＪＥＶの５’−末端と３’−末端を除外した全体ＪＥＶゲノムＲＮＡを示す三つの重畳するｃＤＮＡアンプリコンのＲＴ−ＰＣＲ増幅に対する概略図で、ＲＮＡは灰色でｃＤＮＡは黒色平行線で示し、ＣＮＵ／ＬＰ２  ＪＥＶゲノムＲＮＡ（全長：１０，９６８  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）を図式的に上部に示し、三つの重畳するｃＤＮＡであるＪＶＦ（ｎｔ  １−３，８６５）、ＪＶＭ（ｎｔ  ３，２６６−８，１７０）、及びＪＶＲ（ｎｔ  ７，５６５−１０，８９３）は下部に示した。Ｂは、ＣＮＵ／ＬＰ２  ＪＥＶゲノムＲＮＡの３’−末端の塩基配列を分析するための概略図で、５’−末端がリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）され、同時に３’−末端が詰まった（ｂｌｏｃｋｅｄ）オリゴヌクレオチド  Ｔ（Ｏｌｉｇｏ  Ｔ）を、Ｔ４  ＲＮＡ接合酵素（ｌｉｇａｓｅ）を使用してＪＥＶゲノムＲＮＡの３’−末端と接合させたものであり、接合されたＲＮＡは、矢印で表示したプライマーを使用してｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅を実施し、増幅された産物は、クローニングして塩基配列を証明するのに使用する。Ｃは、前記ＪＥＶゲノムＲＮＡから合成されたＪＥＶ−特異的アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を示した電気泳動写真で、一番目の鎖のｃＤＮＡは、オリゴＴと相補的に結合するオリゴヌクレオチドＴＲ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＴＲ）を使用して合成し、逆転写反応は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を添加するか（ｌａｎｅ１）、または添加せず（ｌａｎｅ２）遂行し、合成されたｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドＴＲとプライマーＪ３５を使用して増幅した後、増幅されたＪＥＶ−特異的アンプリコンは、１．２％アガロースゲル上で分離してＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した。Ｄは、ＣＮＵ／ＬＰ２  ＪＥＶゲノムＲＮＡの５’−末端の塩基配列を分析するための概略図で、ＪＥＶゲノムＲＮＡの５’−末端にあるキャップ（ｃａｐ）構造をまずＴＡＰ（ｔｏｂａｃｃｏ  ａｃｉｄ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）酵素で除去した後、Ｔ４  ＲＮＡ接合酵素で自家接合（セルフライゲーション）を実行した後、ｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅に使用し、増幅された産物は、クローニングして塩基配列を証明するのに使用する。Ｅは、前記ＪＥＶゲノムＲＮＡから合成されたＪＥＶ−特異的アンプリコンを示した電気泳動写真で、一番目の鎖のｃＤＮＡは、ｎｔ  ２１５−２３２と相補的に結合するプライマーを使用して合成し、逆転写反応は、逆転写酵素を添加するか（ｌａｎｅ１）、または添加せず（ｌａｎｅ２）遂行した。合成されたｃＤＮＡは、プライマーＪ３５とｎｔ  １６４−１８１と相補的に結合するプライマーＪ３９を使用して増幅し、増幅されたＪＥＶ−特異的アンプリコンは、１．２％アガロースゲル上で分離してＥｔＢｒで染色し、ここで、Ｍは１００  ｂｐ  ＤＮＡラダ−マーカー（ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ）として塩基対で示した。
【図３】Ａは、バクテリア人工染色体であるｐＢｅｌｏＢＡＣ１１に全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡをクローニングするための概略図を示したもので、本発明で合成された全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡをｃＤＮＡの両末端に太い線で表示されたＪＥＶゲノムの５’ＮＴＲ及び３’ＮＴＲとウイルスのタンパク質で図式化して模式図で示し、５’−末端のＳＰ６及びＴ７プロモーターの転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ）と３’−末端のランオフ転写（ｒｕｎ−ｏｆｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）のための唯一の制限酵素位置を各々示した。Ｂは、ＪＥＶゲノムＲＮＡのヌクレオチド塩基配列は、太い小文字のイタリック体で示し、四つのＳＰ６誘導された（ＳＰ６−ｄｒｉｖｅｎ）全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型の５’−末端及び３’−末端塩基配列を示し、Ｃは、四つのＴ７−誘導された（Ｔ７−ｄｒｉｖｅｎ）全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型の５’−末端及び３’−末端塩基配列を示す。ＳＰ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼランオフ転写物を合成するために、二つのＳＰ６−誘導された（Ｂ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩとｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ）と二つのＴ７−誘導された（Ｃ、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬ／ＸｈｏＩとｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｈｏＩ）ＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型は、ＸｈｏＩ処理してウイルスと関連しない三つのＣＧＡヌクレオチドを３’−末端に線形化させる。一つのＳＰ６−誘導された（Ｂ、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ）及び一つのＴ７−誘導された（Ｃ、ｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩ）ＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型は、ＸｂａＩ処理してウイルスと関連しない四つのＣＴＡＧヌクレオチドを３’−末端に線形化させる。また、ＸｂａＩ−処理したＳＰ６−誘導されたｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩと、ＸｂａＩ−処理したＴ７−誘導されたｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩのＪＥＶ  ｃＤＮＡ  ３’−末端に追加されたウイルスと関連しない四つのＣＴＡＧヌクレオチドは、リョクトウヌクレアーゼ（ＭＢＮ）によって除去することにより、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮとｐＢＡＣＴ７／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮ  ｃＤＮＡ鋳型を生産する。
【図４】本発明で合成した全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型単独では感染性がないが、試験管内転写過程を通じて感染性があるＲＮＡの製造のためには、前記ｃＤＮＡが必ず必要である事実を示したもので、試験管内転写過程に使用された全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型と、それから転写された合成ＲＮＡを示す電気泳動写真（Ａ）及び使用した全長のＪＥＶ  ｃＤＮＡ鋳型と転写した合成ＲＮＡを共にＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションさせた時に得られた感染性程度を示したグラフ（Ｂ）である。ここで、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＥＦＬｘ／ＸｂａＩ（１００−２００  ｎｇ）をＸｂａ  Ｉで線形化してＭＢＮ処理した後、ＤＮａｓｅ  Ｉ存在（Ａは、レーン２に、Ｂは、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理する）下に、または欠如（Ａは、レーン１に、Ｂは、ＤＮａｓｅ未処理する）下で、Ｓ＋Ｐ６ポリメラーゼ転写に用いる。合成した後、転写反応混合物を３７℃、３０分間ＤＮａｓｅ  Ｉで処理（Ａは、レーン３に、Ｂは、ＤＮａｓｅ処理後）するか、ＲＮａｓｅ  Ａで処理（Ａは、レーン４に、Ｂは、ＲＮａｓｅ処理後）する。対照群としての反応は、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ欠如下で遂行する。（Ａは、レーン５に、Ｂは、ＳＰ６ポリメラーゼ未処理する）。前記処理後に、反応混合物の５％を０．６％アガロースゲルで分離し、ｃＤＮＡ鋳型とＲＮＡ転写物をＥｔＢｒで染色して視覚化し、（Ａ）と反応混合物をＢＨＫ−２１細胞に形質転換に利用してプラークの感染中枢を測定した（Ｂ）。
【図５】感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡで合成されたＪＥＶウイルス（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＪＥＶ）と親ウイルス（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）ＣＮＵ／ＬＰ２を比較したもので、Ａは、感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡで合成されたＪＥＶウイルス（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＪＥＶ）と親ウイルス（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）ＣＮＵ／ＬＰ２を比較したもので、合成されたＪＥＶ及び親ウイルス  ＣＮＵ／ＬＰ２のプラーク分析のため、ＢＨＫ−２１細胞を親ウイルスまたは合成ウイルスで感染させ、アガロースゲルで覆った後、クリスタルバイオレットで３日後に染色して分析した写真である。Ｂは、０．０１、１及び１０のＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染合成したＪＥＶ及び親ウイルスＣＮＵ／ＬＰ２で感染したＢＨＫ−２１細胞で生成されるウイルスの成長動力学（ｇｒｏｗｔｈ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示すグラフであって、ウイルスをｈ．ｐ．ｉ（ｈｏｕｒ  ｐｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｉｃａｔｅｄ）で収集してそのタイター（ｔｉｔｅｒ）をプラーク分析で決定して分析したグラフである。Ｃは、ウイルス蛋白質の発現程度を示す免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）で、ＢＨＫ−２１細胞は、１  ＭＯＩで合成ＪＥＶ（レーン１乃至４）またはＣＮＵ／ＬＰ２（レーン５）またはｍｏｃｋ（レーン６）で感染させた後、１８時間培養した。約３ｘ１０４細胞で蛋白質抽出物を抽出して１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離する。ウイルス蛋白質をＪＥＶ−特異的高度免疫（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ）腹水（ａｓｃｉｔｅ）で免疫ブロットして観察する（上パネル）。これと平行するように、アクチン蛋白質はローディングして伝達対照群で検出する（下パネル）。ウイルスの蛋白質関連する切断中間体の位置とアクチンは、左側に矢印で示し、ｋＤａによる分子量マーカーを右側に示した。Ｄは、ウイルスＲＮＡの発現程度を示すノーザンブロット（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）で、約１ｘ１０５細胞で全体ＲＮＡを抽出した後、３２Ｐ−標識されたアンチセンスリボプローブを、ｎｔ  ９１４３−９３５１を通るＮＳ５遺伝子の配列（上パネル）と交雑してノーザンブロットした電気泳動写真である。ＥｔＢｒ−染色された１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドをローディングコントロール（下パネル）とし、全長のゲノムウイルス  ＲＮＡ（１１ｋｂ）と１８Ｓ  ｒＲＮＡは、左側に示した。
【図６】ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩ由来の組換えされたＪＥＶ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＪＥＶ）に存在するＸｈｏＩ遺伝子マーカー（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ）の存在を示すダイアグラムと電気泳動写真である。Ａは、Ｘｈｏ  Ｉ切断後に期待されるＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮとＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮ  ＲＴ−ＰＣＲ切片の概略図である。図面は、ＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマー（矢印）、導入されたＸｈｏ  Ｉ位置（別表）、及びＲＴ−ＰＣＲ生成物の大きさ（２，５８０ｂｐ）と二つのＸｈｏ  Ｉ切断生成物（１，５０６ｂｐと１，０７４ｂｐ）を示す。Ｂでは、ＢＨＫ−２１細胞をｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩＭＢＮまたはｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ｇｍ／ＸｂａＩＭＢＮから転写した合成ＲＮＡに形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させる。ウイルスは２４時間回復させ、０．１  ＭＯＩでＢＨＫ−２１細胞に順次的に継代した。次段階の継代培養のための感染前に、ウイルスはＤＮａｓｅ  ＩとＲＮａｓｅ  Ａで反応させた。継代１及び３で得られたウイルスが含まれた培養上澄み液からウイルスＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲに利用する。前記ＰＣＲ生成物をＸｈｏ  Ｉ存在（＋）または欠如（−）下で反応させ、１％アガロースゲルに分離してＥｔＢｒで染色する。切断または切断されていないＰＣＲ生成物の予想大きさを左側に示し、レーンＭは、１−ｋｂ  ＤＮＡラダーマーカー（ｂｐで表示）を示す。
【図７】１８０世代の間に維持される感染性を有するＪＥＶ  ｃＤＮＡクローンｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩから転写された合成ＲＮＡの感染性程度を示すグラフである。ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＸｂａＩを有する二つの独立的クローン（塗りつぶした円と中空円）は、クロラムフェニコールを含む２ｘＹＴで３７℃で一晩中（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養する。一次培養は、９日間毎日１０６稀釈して増殖させ、一晩中培養するために新鮮な培養液を添加する。各継代は、約２０世代とし、現われ継代でＤＮＡプラスミドを精製し、Ｘｂａ  Ｉで線形化した後、ＭＢＮ処理し、これをＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを利用したランオフ転写の鋳型として利用する。その後、転写物は特異的感染度を測定するため、ＢＨＫ−２１細胞に形質転換させるのに使用する。
【図８】ＪＥＶ  ｃＤＮＡをベクターと使用して異形蛋白質を発現することを示すもので、Ａは、ＳＰ６  ＲＮＡ重合酵素を利用したランオフ転写に使用された本発明のｃＤＮＡ鋳型に対する概略図である。ここで、ＧＦＰまたはＬＵＣ遺伝子を含む脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム挿入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ）をウイルスゲノムの３’ＮＴＲの開始点に挿入し、ＳＰ６プロモーター転写を始め、Ｘｂａ  Ｉ切断とＭＢＮ処理（ＸｂａＩ／ＭＢＮ）によってランオフ位置を生成した。ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩＭＢＮで、太い線は、ｎｔ  ５５９６（別表）でウイルス翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を前もって終結させるＮＳ３遺伝子の中央にある８３−ヌクレオチド欠失（ｎｔ  ５５８０−５５６３）を示す。Ｂは、ＧＦＰ蛋白質の発現を示す共焦点顕微鏡写真で、ＢＨＫ−２１細胞をｍｏｃｋ−形質転換（Ｍｏｃｋ）させるかまたは２μｇの合成ＲＮＡと形質転換させたものである。ここで、合成ＲＮＡは、ｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩＭＢＮ鋳型（ＪＶＦＬｘ／ＧＦＰ／ＸｂａＩＭＢＮ）から転写されたものである。その後、３０時間反応させた後、固定して共焦点顕微鏡で観察した。Ｃは、ＬＵＣ蛋白質の発現を示すグラフで、ＢＨＫ−２１細胞（８ｘ１０６）をｍｏｃｋ−形質転換させるかまたはｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣ／ＸｂａＩＭＢＮ  （●）から転写された２μｇの合成ＲＮＡまたはｐＢＡＣＳＰ６／ＪＶＦＬｘ／ＬＵＣＲＥＰ−／ＸｂａＩＭＢＮ（○）鋳型から転写された２μｇの合成ＲＮＡと形質転換させた。その後、ウェル当たり６ｘ１０５  細胞の密度で６−ウェルプレートに塗抹する。細胞は、各々の始点で溶解させた後、ＬＵＣ活性を測定する。独立する三つの実験結果から得られた基準偏差をエラーバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）に示した。
【図９】感染性組換えＪＥＶをコードする外来遺伝子の概略図及び特性を示し、組換えＪＥＶは、ＢＡＣで提供されるバイシストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎ）全長の感染性ＪＥＶ  ｃＤＮＡに基づく。Ａは、感染性組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡを製造する過程で、感染性ＪＥＶ  ｃＤＮＡの母鎖の構造（ｐＪＥＶ／ＦＬ）は、ユン等の文献（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）に示されている。ウイルスのＯＲＦは、ウイルスゲノムの５’と３’ＮＴＲの両末端の太い線と共に示した。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳによって誘導された追加的な発現ユニットを単一のＮｓｉ  Ｉ部位を使用して３’ＮＴＲの開始点に挿入する。現われたものは、ＳＰ６プロモーター転写開始部位（ＳＰ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とＸｂａ  Ｉ切断及びＭＢＮ処理（ＸｂａＩ／ＭＢＮ）によってできたランオフ位置を示す。Ｘは、関心ある外来遺伝子を示す。Ｂは、本発明で製造した感染性組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡの構造を示す。三つ共通に使用されるリポーター（ＥＧＦＰ，７６８  ｂｐ；ＬＵＣ，１６５３  ｂｐ；及びＬａｃＺ，３０１２  ｂｐ）または優性の選択的マーカーＰＡＣ（６００ｂｐ）を３’ＮＴＲの開始点に作っておいた。対照群として使用した複製完全ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ  ｃＤＮＡの場合、複製不完全ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣＲＥＰ−  ｃＤＮＡは、ＮＳ３遺伝子の中央にある８３−塩基の欠失（塗りつぶし箇所）を導入したものである。その結果、上記（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）のように、ｎｔ  ５５９６（＊）でウイルスの翻訳が未成熟終結された。ＣとＤは、感染性組換えＪＥＶを親ウイルスのそれと比較したものである。Ｃは、ＢＨＫ−２１細胞（８Ｘ１０６）は、ｍｏｃｋ−形質転換させるかまたは前記ＪＥＶ  ｃＤＮＡから転写された親ウイルスのＪＥＶ  ＲＮＡ  ２μｇまたは組換えＪＥＶ  ｃＤＮＡ  ２μｇと形質転換させた。ここで、トランスフェクトされた細胞をアガロースゲルで覆った後、５日後にクリスタルバイオレットで染色してプラークを視覚化した。Ｄでは、トランスフェクトされた細胞を（４Ｘ１０５）各時点で１Ｘ  サンプルローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）バッファーで溶解させた後、その蛋白質抽出物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離させた。ウイルスの蛋白質は、ＪＥＶ−特異的なマウス高度免疫血清（Ｙｕｎ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，第７７巻，６４５０−６４６５頁）で免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）させ、ウイルス蛋白質蓄積を示した。ウイルス蛋白質の位置（Ｅ及びＮＳ１）と切断−関連（ｃｌｅａｖａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ）中間体の位置は、左側に矢印で示した。分子量マーカーは、ｋＤａ単位で右側に示した。Ｖは、ＪＥＶ  ＣＮＵ／ＬＰ２−感染したＢＨＫ−２１細胞を、それから、Ｎは、未処置ＢＨＫ−２１細胞を示す。
【図１０】感染性ＪＥＶ  ｃＤＮＡをベクターに使用する優性選択的マーカー及びリポーター遺伝子の発現を示したものである。ＢＨＫ−２１細胞（８Ｘ１０６）を各プラスミドから転写された２μｇの母鎖または組換えＪＥＶ  ＲＮＡと形質転換させるかｍｏｃｋ−形質転換させた。各プラスミドは、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＥＧＦＰ（Ａ−Ｂ）、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬａｃＺ（Ｃ）、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣまたはｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣＲＥＰ−（Ｄ）及びｐＪＥＶ／ＦＬ／ＰＡＣ（Ｅ）である。Ａ、Ｂは、ＥＧＦＰの発現を示し、トランスフェクトされた細胞は、形質転換３６時間後に共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）分析（Ａ）及び流動細胞計測法（Ｂ）に使用した。−−は、ＪＥＶ／ＦＬ／ＥＧＦＰ  ＲＮＡ−トランスフェクトされた細胞を示し、・・・は、ｍｏｃｋ−トランスフェクトされた細胞を示す。Ｃは、ＬａｃＺの発現を示し、トランスフェクトされた細胞を形質転換３６時間後にＸ−ｇａｌ染色した。Ｄは、ＬＵＣの発現を示し、トランスフェクトされた細胞をウェル（ｗｅｌｌ）当たり４Ｘ１０５細胞の密度で、六つのウェルプレートに塗布（ｓｅｅｄ）した後、開始された始点で細胞溶解した後、ＬＵＣ分析した。実験は、３回反復し、平均値はエラーバー（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）で示した。●は、ＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ  ＲＮＡ−トランスフェクトされた細胞を示し、○は、ＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣＲＥＰ−  ＲＮＡ−形質転換された細胞を示し、−は、未処置細胞の背景ルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の水準を示す。Ｅは、ＰＡＣの発現を示し、形質転換された細胞を６−ウェルプレートに接取し、完全培地（１、３、５、及び７番プレート）または０．５％のアガロースを含めて覆われた培地（２、４、６、及び８番プレート）で培養する。培養２日後に、プレートは、１０μｇ／ｍｌピューロマイシン存在下に（５−８番プレート）または未存在下に（１−４番プレート）さらに３日間培養する。その後、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。
【図１１】ＪＥＶウイルスレプリコンの構造と特性を示したもので、Ａは、ＪＥＶウイルスレプリコンの構造を示す。太いボックスは、感染性ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣ  コンストラクトのゲノムに導入されたインフレーム欠失（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を示す。四つのコンストラクト、即ち、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣＣ／ＬＵＣ、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣ、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ／ＬＵＣ及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＥ／ＬＵＣは、ＪＥＶの各構造遺伝子内に一つのインフレームが欠失されている。ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣと違って、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣＣ／ＬＵＣは、Ｃ遺伝子の５’領域で開示された環形（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）配列モチーフに延長された欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有する。三つのコンストラクト、即ち、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ／ＬＵＣ、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔＥ／ＬＵＣ及びｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣは、二重（ｄｏｕｂｌｅ）インフレームが欠失している。一方、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣは、ウイルスの全ての構造蛋白質に三重（ｔｒｉｐｌｅ）インフレーム欠失を有している。また、作られたｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣは、Ｃ−蛋白質の３５Ｎ−末端と２４Ｃ−末端アミノ酸を暗号化し、その後にＮＳ１蛋白質のＮ−末端と残りのウイルスゲノムがすぐ後に付いて存在する。Ｂは、ＬＵＣの発現を示す。未処置ＢＨＫ−２１細胞を（８Ｘ１０６）各プラスミドから転写された２μｇの母鎖または組換えＪＥＶ  ＲＮＡに形質転換させた後、ウェル当たり４Ｘ１０５個の細胞密度で６−ウェルプレートに塗抹する。開始された時点で、細胞溶解後、ＬＵＣ分析（ａｓｓａｙ）を遂行する。実験は、３回反復し、平均値を示した。●黒色は、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣであり、◆黒色は、ｐＪＥＶ／ＦＬ／ＬＵＣＲＥＰ−であり、◆青色は、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣＣ／ＬＵＣであり、塗りつぶし四角（青色）は、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ／ＬＵＣであり、塗りつぶし三角（青色）は、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ／ＬＵＣであり、●青色は、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＥ／ＬＵＣであり、塗りつぶし四角（赤色）は、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ／ＬＵＣであり、塗りつぶし三角（赤色）は、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔＥ／ＬＵＣであり、●赤色は、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣであり、塗りつぶし四角（緑色）のものは、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣであり、●緑色のものは、ｐＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣである。−は、未処置細胞の背景ルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の水準を示す。Ｃは、ウイルス蛋白質の蓄積を示す。形質転換された細胞を（４Ｘ１０５）４８時間形質転換させた後、１Ｘサンプルローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）バッファーで溶解させ、その蛋白質抽出物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで溶解させる。蛋白質をニトロセルロース膜に移動させた後、ＪＥＶ−特異的なマウス高度免疫血清で免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）する。
【図１２】ＪＥＶウイルスレプリコンに対する包装（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）システムの製造に関するものである。Ａは、ＪＥＶ構造的蛋白質発現カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）は、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスに基づく発現ベクターを基礎とする。ｐＳｉｎＲｅｐ１９は、二重（ｄｏｕｂｌｅ）サブケノミックノンサイトパチック（ｎｏｎｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ）ＲＮＡベクターである。外部遺伝子とＰＡＣ遺伝子を矢印で示したように別途の下部ゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）プロモーターを利用して発現させる。ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅカセットは、ＪＥＶ  Ｃ、ｐｒＭ及びＥ遺伝子を暗号化する。ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−Ｅ−ＢｇｌＩＩカセットは、ＮＳ１のＮ末端５８残基が、ＪＥＶ  Ｃ、ｐｒＭ及びＥ遺伝子の後を引き継いで暗号化する。一方、ｐＳｉｎＲｅｐ１９／ＪＥＶ  Ｃ−ＮＳ１は、ＮＳ１遺伝子の残り断片を有する。ＭＣＳは、多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）を示す。Ｂは、三つのＪＥＶ構造的蛋白質発現カセットから発現されたＪＥＶ構造的蛋白質のウエスタンブロット分析写真である。ＢＨＫ−２１細胞を各ＪＥＶ構造的蛋白質発現カセットに形質転換させるかｍｏｃｋ−形質転換させ、溶解物を４８時間経過後に収得する。細胞溶解物の等価量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、ＪＥＶ特異的高度免疫血清でプローブする。電気泳動写真の右側は、ウイルス蛋白質ＥとＮＳ１の位置を示し、左側は、分子量  マーカーをｋＤａ単位で示す。Ｃは、（ｉ）ＪＥＶウイルスレプリコンＲＮＡとＪＥＶ構造的蛋白質発現ベクターＲＮＡのコトランスフェクションまたは（ｉｉ）ＪＥＶウイルスレプリコンＲＮＡをＪＥＶ構造的蛋白質発現ＰＣＬに形質転換して、いかにしてＪＥＶ  ＶＲＰｓが生じるかを示す概略図である。Ｄ乃至Ｅは、ＪＥＶ  ＶＲＰｓの生産を示す。Ｄは、ＪＥＶ  ＶＲＰｓの生成のための二つのアプローチ方法の中一つで、二つのＲＮＡベクター、即ち、ＪＥＶ構造的蛋白質発現ベクターＲＮＡと示されたＪＥＶウイルスレプリコンベクターＲＮＡを未処置のＢＨＫ−２１細胞にコトランスフェクションすることによって得られた結果を示す。Ｅは、ＪＥＶ  ＶＲＰｓの生成のための他のアプローチ方法で、開示されたＪＥＶウイルスレプリコンベクターＲＮＡに形質転換されたＪＥＶ  ＰＣＬから得られた結果を示す。ＪＥＶウイルスレプリコンＲＮＡは、次のように示す。□緑色は、ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＥＧＦＰであり、塗りつぶし四角（緑色）は、ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＥＧＦＰであり、□青色は、ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬａｃＺであり、塗りつぶし四角（青色）は、ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬａｃＺであり、塗りつぶし四角（黒色）は、ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ΔＣ＋ΔｐｒＭ＋ΔＥ／ＬＵＣであり、□黒色は、ＪＥＶ／Ｒｅｐ／ＮＳ１／ＬＵＣである。形質転換４８時間後に、上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収集し、これはＶＲＰの滴定及び個々のリポーター遺伝子の発現を調査するため、未処置のＢＨＫ−２１細胞を感染させるのに使用する。−は、未処置の細胞の背景ルミネセンスの水準を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【配列表】
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