(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＩ）の化合物（式中Ｒはアルカリ金属、またはアンモニアイオンを意味する）から、式（Ｉ）：
【化１】
0004531315.tif 000006
の化合物を調製するための微生物工程に関し、
前記工程は、好気性条件下で、式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）を液内培養し、生物変換の過程において形成された式（Ｉ）の化合物を分離することによるものであって、以下のステップ：
ａ）式（ＩＩ）（式中Ｒは上記で定義）の化合物を６β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ株を、２５〜３２℃にて、利用可能な炭素‐および窒素供給源および無機塩を含む栄養培地上で培養すること、その後
ｂ）増殖した培養液中に変換すべき基質を添加すること、次いで
ｃ）生物変換が完了するまで前記基質をヒドロキシル化させること、次いで
ｄ）培養培地から式（Ｉ）の化合物を分離すること
を含む微生物工程。
【請求項２】
さらに、前記ステップｄ）で得られた式（Ｉ）の化合物を精製することを含む、請求項１に記載の工程。
【請求項３】
番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２６８のもとで、ハンガリー、ブタペストのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたミクロモノスポラｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）ＩＤＲ−Ｐ３株、または一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項１または２に記載の工程。
【請求項４】
番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７１のもとで、ハンガリー、ブタペストのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたミクロモノスポラ プルプレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＩＤＲ−Ｐ４株、または一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項１または２に記載の工程。
【請求項５】
番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７２のもとで、ハンガリー、ブタペストのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたミクロモノスポラ エキノスポラｓｓｐ．エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｓｐ． ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＩＤＲ−Ｐ５株、または一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項１または２に記載の工程。
【請求項６】
番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７３のもとで、ハンガリー、ブタペストのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたミクロモノスポラ メガロミセア ｓｓｐ．ニグラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ ｓｓｐ．ｎｉｇｒａ）ＩＤＲ−Ｐ６株、または一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項１または２に記載の工程。
【請求項７】
番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７４のもとで、ハンガリー、ブタペストのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたミクロモノスポラ ロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）ＩＤＲ−Ｐ７株、または一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化できるこれの変異体株を適用する、請求項１または２に記載の工程。
【請求項８】
前記式（Ｉ）の化合物を培養液から分離する工程であって、この化合物を陰イオン交換樹脂上で吸着させ、または水と混じらない有機溶媒で抽出し、続いて中間物としてのこのラクトン誘導体またはこの二級アミン塩を調製し、或いは発酵液の有機溶媒抽出液から得られたアルカリ水溶抽出液を非イオン吸着樹脂上のクロマトグラフィーを用いて精製することにより行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はプラバスタチンの調製のための新規な微生物工程に関する。
【０００２】
（背景技術）
さらにとりわけ、本発明は、一般式（ＩＩ）の化合物（式中Ｒはアルカリ金属またはアンモニウムイオンを表す）から、式（Ｉ）
【０００３】
【化２】
0004531315.tif 000002
【０００４】
のプラバスタチンを調製するための微生物工程に関し、前記微生物は、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属からの原核生物であり、６β位にて前記一般式（ＩＩ）の化合物をヒドロキシル化できるものである。
【０００５】
高コレステロール血症は、アテローム性動脈硬化症疾患、とりわけ冠状心臓疾患に対する主要なリスク因子として認識されてきた。過去２０年間、コレステロール生合成における主要律速酵素として３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ  リダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ  ＥＣ．１．１．１．３４）が多数研究されてきた。異なる真菌種の選択株によって生合成されたメビノリンおよび関連する化合物が、この酵素の競合的阻害剤として明らかになった（Ｅｎｄｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ２９，１３４６−１３４８（１９７６）；Ｅｎｄｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．７２，３２３−３２６（１９７６）；Ｋｕｏ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８，１９９１−１９９８（１９８３））。
【０００６】
プラバスタチンもまた、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤のファミリーの一員である。最初に、プラバスタチンは、コンパクチンの代謝研究の過程で、イヌにおけるコンパクチンの主要な尿代謝物として（Ｔａｎａｋａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，未発行）発見された（Ａｒａｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｎｋｙｏ  Ｋｅｎｋｙｕｓｈｏ  Ｎｅｍｐｏ，４０，１−３８（１９８８））。
【０００７】
コンパクチンのヒドロキシル化産物としてのプラバスタチンの主要な特徴的特性は、その組織選択性である。この薬物は、肝臓および腸においてステロール合成を強く阻害するが、しかし他の器官ではその阻害は弱い。プラバスタチンが他のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤よりも毒性が低いことが利点である。
【０００８】
コンパクチンの微生物的ヒドロキシル化が、多くの異なる真菌種に属するいくつかの種株によって、および他のストレプトマイシス  ロセオクロモジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）およびストレプトマイシス  カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）の中で、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）およびストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種に属する放線菌種の株によって、種々の程度で実施できることが報告されてきた（米国特許第５，１７９，０１３号、米国特許第４，４４８，９７９号、米国特許第４，３４６，２２７号、米国特許第４，５３７，８５９号、日本特許第５８，０１０，５７２号）。
【０００９】
コンパクチンからのプラバスタチンの産出のために真菌を用いる際の問題は、おそらくその抗真菌活性のために、これらの微生物が一般的に、液体培養培地中のより高い濃度のコンパクチンに対して耐性ではないことである（Ｓｅｒｉｚａｗａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３６，８８７−８９１（１９８３））。ストレプトマイシス  カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）において、シトクロームＰ４５０系が、コンパクチンのプラバスタチンへのヒドロキシル化に必要であることが示された（Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４，７０７−７１３（１９８９））。そのような酵素の使用によるヒドロキシル化能の遺伝的改善の難しさは、それが単一のタンパク質というよりもタンパク質の複合体であることにある。
【００１０】
本発明者らの検討は、先行特許明細書で公知であるものよりも、より高い収率で、そしてより高い基質濃度を適用することで、コンパクチンの酸性形態の塩からプラバスタチンを産出する可能性のある放線菌類株を発見することに焦点を当てた。
【００１１】
約６０００の放線菌類のスクリーニング（その大部分は本発明者らが単離したが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより認証された株も含む）を行い、５つのストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および５つのミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）をさらなる検討のために選択した。これらの菌は、コンパクチンの酸性形態のナトリウム塩をプラバスタチンへとヒドロキシル化できることが証明された。これらの１０の放線菌類株、このうち８株が本発明者らの研究室にて種レベルで分類学的に同定されたものであるが、は以下であった。
【００１２】
ストレプトマイセス  ビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）（Ｋａｍｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９１による）、株番号１／４３
ストレプトマイセス  ロカイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｃｈｅｉ）（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９４９；Ｗａｋｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，１９５３）、株番号１／４１
ストレプトマイセス  レジストマイシフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ）（Ｌｉｎｄｅｎｂｅｉｎ，１９５２）株番号１／４４
ストレプトマイセス  ｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）株番号１／２８
ストレプトマイセス  ラナトゥス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（Ｆｒｏｍｍｅｒ，１９５９）、株番号１／１６
ミクロモノスポラ  ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）株番号ＩＤＲ−Ｐ3
ミクロモノスポラ  プルプレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）（Ｌｕｅｄｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ，１９６４）株番号ＩＤＲ−Ｐ4
ミクロモノスポラ  エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）（Ｌｕｅｄｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ，１９６４）株番号ＩＤＲ−Ｐ5ミクロモノスポラ  メガロミセア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ）（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９６９）株番号ＩＤＲ−Ｐ6
ミクロモノスポラ  ロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｒｏｓａｒｉａ）（Ｈｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ，１９８６）株番号ＩＤＲ−Ｐ7
【００１３】
現在まで、文献で、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）のコンパクチンの酸性形態の塩をプラバスタチンに変換する能力におけるデータが存在しないので、本発明者らは、この特定の酵素的能力だけでなく、これらの上記で列記したミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）の株の分類学的位置をも徹底的に研究した。
【００１４】
遺伝的レベルでの株ＩＤＲ−Ｐ3 、−Ｐ4 、−Ｐ5 、−Ｐ6 および−Ｐ7 の分類学的位置
直径約０．４〜０．７μｍの分岐菌糸と比較して、これらのすべての株は、よく発達した菌糸体を産出した。気中菌糸体は存在しないか、または痕跡のみで現れる。運動能力のない胞子が別々に胞子柄上にうまれる。培養基菌糸体の菌糸はグラム陽性であり、抗酸性ではない。株番号ＩＤＲ  Ｐ3 〜Ｐ7 は好気性、化学有機栄養性で６．０以下のｐＨに感受性である。細胞壁はメソ‐ジアミノピメリン酸を含む。以上で列記した、鍵となる特性としての診断特性は、これらの単胞子放線菌類株がミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属の典型的な一員であることを明らかに示唆している。
【００１５】
ミクロモノスポラ  ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）株番号ＩＤＲ−Ｐ3 の分類学的説明
微小形態学的特性：培養基菌糸体は、発達した、直線というよりもより湾曲した、形態学的に分岐した糸状体からなる。胞子柄上の胞子は、直径およそ１．８μｍの単一の、球状であり、菌糸状糸状体に多少均一に分散している。胞子は無柄か、または単胞子柄の末端上にある。両方の培養液において、おそらく成熟胞子の放出がとても速いので、胞子は菌糸上で観察されなかった。
【００１６】
培養−マクロ形態学的特性：
チャペック‐スクロース寒天：中程度の増殖、コロニーは、点様黒色胞子形成領域に覆われた赤茶色である。
グルコース‐アスパラギン寒天：増殖は、点様で、高さがあり、赤茶色または黒色コロニーとして記録された。赤茶けた拡散性色素。
栄養寒天：並の増殖、高さのある赤茶けた茶色または黒色コロニー。培地中に赤茶けた外色素。
酵母抽出物‐麦芽抽出寒天（ＩＳＰ  Ｍｅｄ．２）：かなり増殖、高さのある、ひだのある茶色コロニーで、黒色胞子形成領域または「疑似気中菌糸体」（これは制限された白っぽい、または灰色がかったブルームとして現れる）によって部分的に覆われる。茶色がかった、または茶色がかった赤色の可溶性色素。
無機塩‐デンプン寒天（ＩＳＰ  Ｍｅｄ．４）：中程度の増殖、赤色がかった茶色の高さのあるひだ性のコロニー。明赤色がかった可溶性色素。
グリセロール‐アスパラギン寒天（ＩＳＰ  Ｍｅｄ．５）：痕跡のみの増殖、オフホワイトまたは明褐色着色な平坦コロニー。薄バラ色の可溶性色素。
炭素供給源利用：Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−マンニトール、ダルシトール、グリセロールおよびイノシトール上での良好な増殖およびその陽性利用。Ｌ−ラムノース、Ｄ−ラフィノースおよびイヌリンでの増殖は、陰性対照培地上よりもわずかによかった。
窒素供給源利用：酵母抽出物およびＮＺ−アミンでの良好な増殖、ＮａＮＯ3 は全く利用されなかったか若干しか利用されなかった。
【００１７】
他の生理学的−生化学的特性：セルロースおよびデンプンがヒドロキシル化され、牛乳が激しく消化された。硝酸塩還元試験は陰性である。炭酸カルシウム（ｐＨ５．８〜６．０）なしでのジャガイモ片上では増殖しなかった。メラノイド色素産出はなかった。
【００１８】
この株番号ＩＤＲ−Ｐ3 のミクロモノスポラ  ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）は、Ｌａｋｅ  Ｂａｌａｔｏｎ（ハンガリー）の泥試料より単離された。
【００１９】
体系的位置：ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属の間での本株の正確な分類学的位置を明らかにするために、さらなる相対的体系的検討が必要となる。特定の特性に基づけば、株ＩＤＰ−Ｐ3 がミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属内の新規の種を示しているとするのは不可能ではないように思われる。
【００２０】
ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）株ＩＤＲ−Ｐ4 、−Ｐ5 、−Ｐ6 および−Ｐ7 の差異的−分析的特徴の説明および同定
株ＩＤＲ−Ｐ4
以上で列記した分析的培地上において、一般的に良好な増殖、オレンジ色〜赤オレンジ色、赤色、時折黄色がかったまたはバラ色に着色したコロニー。可溶性色素および気中菌糸体は産出されない。単胞子の数は比較的少ない。これらは、胞子柄末端上に現れる。培養基菌糸体は、よく分岐した菌糸よりなる。気中菌糸体は存在しない。Ｄ−メルビオース、ラフィノース、マンニトール、グリセロール、ラクトース、Ｌ−ラムノース上では増殖せず、しかしＤ−アラビノース、グルコース、Ｄ−キシロース上ではよく増殖し、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−フルクトース上では若干増殖した。これらの従来の分析的特徴に基づき、本研究者らは、本株をミクロモノスポラ  プルプレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）（Ｌｕｅｄｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ，１９６４）の一員として同定した。
【００２１】
株ＩＤＲ−Ｐ5
本株は、成熟まで、主として単担胞子体および胞子柄に強く接着する球状暗茶色〜黒色胞子（直径０．８〜１．５μｍ）を産出する。本発明者らの電子顕微鏡観察に従うと、これらの胞子の表面上において、いぼ状の構造または成長（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔ．Ｂａｃ．のＶｏｌ．４、１９８９、ページ２４４８に従うと「短く太いとげ」）が観察され、これはミクロモノスポラ  エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）の胞子の特徴である。一方、本株の培養−形態学的および生理学的診断的特性もＭ．エキノスポラ（Ｍ．  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）のものととても類似している。標準の分析用培地上でよく発達したコロニーの色は、褐色−茶色または暗紫色である。胞子形成層は黒色または紫色がかった黒色であり、蝋状である。気中菌糸体は存在しない。メラニン色素は産出されない。牛乳は分解される。Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−グルコースおよびスクロース上でよく増殖するが、しかしＬ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−メリビオースおよびグリセロールでは増殖しない。本発明者らは、本株をミクロモノスポラ  エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）の典型的な一員として見なす。
【００２２】
株ＩＤＲ−Ｐ6
主な分析用培地上で、中程度〜弱い増殖。長い分岐した糸状体（直径およそ０．６μｍ）および限定数の単独、球状、暗黒色胞子（直径０．６〜１．０μｍ）からなる褐色〜褐赤色コロニー。気中菌糸体は産出されない。特定の培地において、弱い赤みかかった、またはバラ色の可溶性色素が形成される。チロシン寒天上では、メラノイド色素は産出されなかった。基礎培地上では、以下の炭素供給源：Ｄ−キシロースおよびＤ−フルクトースが本株によって利用され、Ｄ−メリビオース、マンニトールおよびガラクトースは若干だけ利用され、しかしグリセロール、Ｌ−ラムノース、ラクトースおよびラフィノースでは増殖が観察されないか、散在性増殖しか観察されなかった（Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，２０３−２１５，１９８３も参照のこと）。株番号ＩＤＲ−Ｐ6 は、ミクロモノスポラ  メガロミセア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ）属（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，１９７２）と明らかに類似性を示しており、本発明者らは、これをこの種の一員と考察する。
【００２３】
株ＩＤＲ−Ｐ7
ベネット寒天、チャペックスクロース寒天、グルコース−アスパラギン寒天、栄養寒天、オートミール寒天、ジャガイモ−デキストロース寒天等上で、良好〜中程度の増殖。栄養菌糸体色素の色は、赤色がかった茶色〜紫色がかった茶色の範囲である。特定の培地上で、ワインレッド拡散性色素が形成される。コロニーの表面上に黒色のスポットがよく産出される。栄養菌糸（平均直径：０．５μｍ）が強く分岐している。胞子（直径１．４〜１．７μｍ）が単独で、無柄か、または短菌糸体上に存在し、菌糸の長さに沿って現れる。増殖および胞子形成は、Ｌｕｅｄｅｍａｎｎのオープンウェブ型である。本株によって、以下の化合物、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラムノース、スクロースおよびＤ−キシロースが培地中の炭素供給源としてのみ利用され、ズルシトール、グリセロール、Ｄ−メリビオースおよびＤ−ラフィノースは利用されない。本発明者らは、株番号ＩＤＲ−Ｐ7 を、ミクロモノスポラ  ロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｒｏｓａｒｉａ）（Ｈｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ，１９８６）の典型的な一員として同定した。
【００２４】
以上に示したミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）株は、下記の与えられた番号指定において、ハンガリー、ブタペストのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された。
【００２５】
0004531315.tif 000003
【００２６】
以上に基づき本発明は、一般式（ＩＩ）の化合物（式中Ｒはアルカリ金属、またはアンモニアイオンを意味する）から、式（Ｉ）：
【００２７】
【化３】
0004531315.tif 000004
【００２８】
のプラバスタチンを調製するための新規の微生物工程に関し、前記工程は、好気性条件下で、式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）を液内培養し、生物変換の過程において形成された式（Ｉ）の化合物を分離および精製することによるものであって、以下のステップ：
ａ）式（ＩＩ）（式中Ｒは上記で定義）の化合物を６β−ヒドロキシル化可能なミクロモノスポラ株を、利用可能な炭素‐および窒素供給源および無機塩を含む栄養培地上で培養すること、その後
ｂ）増殖した培養液中に変換すべき基質の添加すること、次いで
ｃ）生物変換が完了するまで前記基質をハイドロキシル化させること、次いで
ｄ）培養培地から式（Ｉ）の化合物を分離し、望むならばこれを精製すること
からなるものである。
【００２９】
本発明の範囲は、コンパクチンの酸性形態のナトリウム塩をプラバスタチンにヒドロキシル化することが可能な、ミクロモノスポラ属に属する種の野生型種および全ての変異体まで広がる。
【００３０】
本発明の好ましい実施様態によれば、プラバスタチンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＩＤＲ−Ｐ3 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２６８］、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  ＩＤＲ−Ｐ4 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２７１］、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａＩＤＲ−Ｐ4 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２７２］、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ  ＩＤＲ−Ｐ6 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２７３］、およびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｒｏｓａｒｉａ  ＩＤＲ−Ｐ7 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２７４］からなる群より選択したミクロモノスポラ株で産出される。
【００３１】
本発明の最も好ましい実施様態によれば、プラバスタチンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．株ＩＤＲ−Ｐ3 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２６８］で産出される。
【００３２】
本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕ発酵方法によって実施することができ、すなわち、ヒドロキシル化は活発に増殖しているミクロモノスポラ培養液の関与によって達成される。
【００３３】
ヒドロキシル化は、攪拌フラスコ培養等の攪拌或いは発酵器内の給気および攪拌を使用するで実施されて得て、そこで式（ＩＩ）の化合物が増殖している培養液に添加される。そのような場合、泡止め薬剤を使用してもよい。本株の培養液の適切な密度は、使用可能な炭素および窒素供給源、無機塩並びにトレース要素を含む好ましい培地の使用によって達成できた。
【００３４】
たとえば、グルコース、グリセロール、デキストリン、デンプン、ラムノース、キシロース、スクロースおよび可溶性デンプンが同化可能な炭素供給源として証明されており、一方で、ダイズミール、トウモロコシ浸透液、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、クエン酸アンモニウムおよび硫酸アンモニウムがよい窒素供給源として証明されている。炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどのような無機塩を培養培地に加えてよい。本選択株の増殖のために好適な培地は、実施例に記述した。
【００３５】
コンパクチンのプラバスタチンへの生物変換は、異なる発酵技術、たとえばバッチ培養、給餌バッチ培養によって実施することができる。好ましくは、攪拌した液体沈降培養液を使用する。好ましい温度は、約２５℃〜３７℃であり、最も好ましいのは２５℃〜３２℃である。
【００３６】
好ましいｐＨは約６．０〜９．０であり、最も好ましいのは約７．０〜８．５である。好ましい振とう条件は約２００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍであり、最も好ましくは約２５０ｒｐｍである。
【００３７】
本発明は、コンパクチン酸ナトリウム塩をプラバスタチンに変換するための方法を提供する。コンパクチン酸ナトリウム塩は、結果としてプラバスタチンを産出するであろう任意の濃度で本発明で使用できる。好ましくは、コンパクチン濃度は、０．１〜１０ｇ／リットルの間であり、より好ましくは約０．３〜３．０ｇ／リットルの間である。
【００３８】
本発明は、少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも約９０％で、ミクロモノスポラ  ｓｐｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）の株による、コンパクチンのプラバスタチンへの変換の任意のパーセンテージをカバーすることを意味している。
【００３９】
発酵の工程において、培養培地の組成は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法によって制御される。ＨＰＬＣ方法にしたがって、培地の試料はメタノールによって２倍に希釈し、遠心し、上清を解析のために使用する。解析に使用するＨＰＬＣ系のパラメータは以下である。ウォータース（Ｗａｔｅｒｓ）解析ＨＰＬＣ器具、カラムパッケージング：Ｗａｔｅｒｓ  Ｎｏｖａｐａｃｋ  Ｃ１８  ５μｍ、２３７ｎｍにて測定、注入容量  １０μｌ、流速０．６〜０．９ｍｌ／分直線勾配、勾配溶出を使用、溶出液、溶媒Ａ＝アセトニトリル−０．１ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 、水中にて（２５：７５）、溶媒Ｂ＝アセトニトリル−水（Ｈ3 ＰＯ4 にてｐＨ２）（７０：３０）。
勾配溶出のパラメータ
【００４０】
【表１】
0004531315.tif 000005
【００４１】
保持時間：プラバスタチン（Ｎａ塩）  １０．６分、コンパクチン（酸Ｎａ塩）１９．５分、プラバスタチン（ラクトン形態）  １７．３分、コンパクチン（ラクトン形態）  ２３．５分。
【００４２】
任意の公知の方法、たとえば抽出−再抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー、沈殿をプラバスタチンを単離するために使用できる。
【００４３】
培養液からの産物の回収に関して、生物変換の間に、プラバスタチンはその酸性形態で生成されることを考慮することは有効であり、したがって、陰イオン交換樹脂カラム上におけるその吸着によって培養液の濾液より単離することができる。産物の単離に関して、たとえばＤｏｗｅｘ  Ａｌ  ４００（ＯＨ- ）、Ｄｏｗｅｘ  １×２（ＯＨ- ）、Ｄｏｗｅｘ  ２×４（ＯＨ- ）、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲＡ  ９００  （ＯＨ- ）樹脂などの四級アンモニウム活性基を含むポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマーである強塩基陰イオン交換樹脂を使用することが都合がよい。イオン交換樹脂上に吸着した産物は、水性酢酸または塩化ナトリウム含有アセトン−水混合液によって、好ましくは１％塩化ナトリウム含有アセトン−水（１：１）混合液によってカラムより抽出できる。プラバスタチン含有画分をあわせ、溶出液中に存在するアセトンを吸引して除去する。濃縮物のｐＨを１５％硫酸にて３．５〜４．０の範囲内に調整し、水性化した水溶液を酢酸エチルにて抽出する。酢酸エチル抽出物より、プラバスタチンを１／１０および１／２０容量比の５％炭酸水素ナトリウムまたは弱アルカリ水（ｐＨ７．５〜８．０）で抽出できる。プラバスタチンが、非イオン性吸着樹脂上のカラムクロマトグラフィーによって、上記で得られたアルカリ水性抽出液より純粋な形態で回収できることが示された。有利な方法として、水相に溶解したすべての酢酸エチルをまずアルカリ水性溶出液より吸引蒸留にて除去し、次いで水性抽出液をＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０カラム上にのせる。このカラム上に吸着したプラバスタチンを、アセトン含量を徐々に増加させる水性アセトンで溶出して精製し、次いで単一成分としてプラバスタチンを含むクロマトグラフィー画分をあわせ、吸引下で濃縮する。濃縮物を木炭で浄化し、凍結乾燥し、次いでエタノール−酢酸エチル混合液より結晶化し、薬理学的適用に許容可能な純度のプラバスタチンを得る。
【００４４】
生物変換が終了した後、プラバスタチンを発酵培養液、または菌糸集団の分離の後に得た濾液のいずれかから抽出できる。後者は、濾過または遠心のいずれかによって取り出せるが、これはとりわけ全培養液抽出をおこなうための工業的スケールで都合がよい。抽出の前に、発酵培養液または培養液の濾液のいずれかのｐＨを、無機物酸、好ましくは希釈した硫酸にて３．５〜３．７に調整する。抽出を脂肪族アルコールを含む２〜４炭素原子を有する酢酸エステルにて、好ましくは酢酸エチルまたは酢酸イソブチルによっておこなう。酢酸エチル抽出物を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥させる。次いでラクトン誘導体をプラバスタチンより調製する。ラクトン環閉環を、室温にて乾燥酢酸エチル溶液中で連続攪拌の下、触媒量のトリフルオロ酢酸によいラクトン形成を誘導させて実施する。ラクトン環閉環を、薄層クロマトグラフィー解析（ＴＬＣ）にて確認する。ラクトン形成が終了した後、酢酸エチル溶液をまず５％水性炭酸水素ナトリウム溶液、次いで水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引下で蒸発させる。残余物を、溶出液として酢酸エチル−ｎ−ヘキサンの混合液を使用して（酢酸エチル含量を徐々に増加させる）、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製する。プラバスタチンは、当量の水酸化ナトリウムを用いて、アセトン中で室温での加水分解によりプラバスタチンラクトンより調製する。プラバスタチンナトリウム塩形成が完了したならば、プラバスタチンをアセトンにて沈殿させる。次いで沈殿物を濾過し、アセトンおよびｎ−ヘキサンにて洗浄し、吸引下乾燥させ、次いでエタノール−酢酸エチル混合液より結晶化する。
【００４５】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０ゲル上のクロマトグラフィーが、プラバスタチンを精製するために都合よく適用可能であることがわかった。この方法を適用することで、（ＨＰＬＣ測定）９９．５％の純度を超えるプラバスタチンを生成できる。
【００４６】
本発明者らの実験の過程において、以下の発明が認識された。一般式（ＩＩ）の化合物を６β−ヒドロキシル化可能であるミクロモノスポラｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＩＤＲ−Ｐ3 株の培養液または培養液濾液の有機溶媒抽出液から、好ましくは酢酸エチルまたは酢酸イソブチル抽出液から、プラバスタチンを二級アミンを用いて結晶性塩として沈殿させることができる。さらに、塩形成のために、アルキル−、シクロアルキル−、アラリキル−、またはアリール−置換基を含むさまざまな二級アミンが好ましいこともわかった。適切な無毒性二級アミン、たとえばジオクチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミンを選択した。有機二級アミン塩中間体、たとえばジベンジルアミン塩の単離を、抽出物のプラバスタチンの含量について１．５当量で、ジベンジルアミンを加えることで実施し、引き続きこの抽出物を吸引蒸留にて出発量の５％まで濃縮し、次いでさらなる量のベンジルアミンを０．２当量比で濃縮物に加える。この結晶性ジベンジルアミン塩を濃縮物より沈殿させる。この結晶性未精製産物を濾過し、吸引下で乾燥させ、メタノールまたはアセトン溶液中で木炭にて浄化する。次いで、浄化産物のアセトンからの再結晶により、クロマトグラフィー的に純粋なプラバスタチンジベンジルアミン塩中間体を得ることができる。
【００４７】
プラバスタチン有機二級アミン塩は、水酸化ナトリウムまたはナトリウムアルコキシド、好ましくはナトリウムエトキシドによってプラバスタチンに変換できる。
【００４８】
二級アミン塩中間体を介したプラバスタチンの単離は、任意の既に公知の単離手順よりもより簡単な手順である。手順の間、人工物は形成されず、そして生物変換の副産物から、さらに微生物のヒドロキシル化によって生合成された種々な代謝産物からのプラバスタチンの分離が都合よく解決されうる。
【００４９】
本発明による工程は、以下の実施例にて表される。
【００５０】
【実施例】
実施例１
胞子を、ミクロモノスポラ  ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＩＤＲ−Ｐ3 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２６８］株の７〜１０日齢の、可溶性デンプン寒天（ＳＭ）傾斜培養の表面より得て、５ｍｌの無菌蒸留水中に懸濁させた。次いでこの懸濁液を使用し、５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の１００ｍｌの無菌ＴＩ接種培地に接種させた。
【００５１】
ＳＭ培地の組成
可溶性デンプン            １０．０ｇ
Ｎａ2 ＨＰＯ4               １．１５ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4                 ０．２５ｇ
ＫＣｌ                      ０．２ｇ
ＭｇＳＯ4 ×７Ｈ2 Ｏ        ０．２ｇ
寒天                      １５．０ｇ
１０００ｍｌの蒸留水中
【００５２】
滅菌前にこの培地のｐＨを７．０に調整し、混合液を１２１℃にて２５分間滅菌した。
【００５３】
ＴＩ培地の組成
可溶性デンプン          ２０．０ｇ
酵母抽出物              １０．０ｇ
１０００ｍｌの水道水中
【００５４】
滅菌前にこの培地のｐＨを７．０に調整し、混合液を１２１℃にて２５分間滅菌した。
【００５５】
増殖培養液をロータリー振とう器（２５０ｒ．ｐ．ｍ．、振幅２．５ｃｍ）上で３日間、３２℃にて振動させ、次いでこれからの５ｍｌ分液を使用して、１２１℃にて２５分間滅菌した１００ｍｌのＴＴ培地をそれぞれ含んでいる５００ｍｌ用量の１０個のエルレンマイヤーフラスコに接種させた。
【００５６】
ＴＴ培地の組成
ジャガイモデンプン      ３０．０ｇ
ダイズミール            ３０．０ｇ
ＣａＣＯ3                 ５．０ｇ
ＣｏＣｌ2 ×６Ｈ2 Ｏ      ２．０ｍｇ
ヤシ油                    ２．０ｇ
１０００ｍｌの水道水中
【００５７】
加熱滅菌前に、ｐＨを７．０に調整した。
【００５８】
インキュベーションを３２℃にて７２時間実施し、５０ｍｇのコンパクチン酸ナトリウム塩を蒸留水中でそれぞれのフラスコに加え、培養を９６時間実施した。ＨＰＬＣにて測定したコンパクチン酸ナトリウム塩のプラバスタチンへの変換率は８２％であった。
【００５９】
発酵が終了した後、培養液をまとめ、４１０ｍｇのプラバスタチンを含んだ、得られた回収発酵液からのプラバスタチンの単離を以下のように実施した。発酵液を２５００ｒ．ｐ．ｍ．にて２０分間遠心した。液の上清および菌糸体集団を分離し、次いで後者を２５０ｍｌの水中に再懸濁させ、得られた懸濁液を１時間攪拌し、濾過した。合わせた遠心液および濾液のｐＨを１５％硫酸にて４．０に調整し、次いで酸性濾液を３×３００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、３００ｍｌの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引下で１００ｍｌの容量まで濃縮した。次いで、プラバスタチンラクトンを、連続攪拌下、室温にて、触媒量のトリフルオロ酢酸を加えることでプラバスタチンより調製した。プラバスタチンラクトンの形成をＴＬＣ法：（吸収剤にＫｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ245 ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ）アルミニウムホイル、展開溶媒にアセトン−ベンゼン−酢酸（５０：５０：１．５）混合液、検出にホスホノ−モリブデン酸薬剤）にて制御した。プラバスタチンのＲｆ値は０．７であった。ラクトン形成の完了後、酢酸エチルを２×２０ｍｌの５％水性炭酸水素ナトリウムにて洗浄し、次いで２０ｍｌの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにで乾燥させ、吸引下蒸発させた。０．５ｇの蒸発残余物を得、これを１０ｇのＫｉｅｓｅｋｇｅｌ  ６０  吸着剤含有カラム（カラムの直径：１．２ｃｍ、吸収ベッドの高さ：１７ｃｍ）上でクロマトグラフした。溶出のために、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合液を使用し、そこで酢酸エチル含量は徐々に増加させた。プラバスタチンラクトンは６０％酢酸エチル−４０％ｎ−ヘキサンの混合液でカラムより溶出された。プラバスタチンラクトン含有画分をあわせ、吸引下で蒸発させた。２３０ｍｇのプラバスタチンラクトンを含むこの得られた残余物を、５ｍｌのアセトン中に溶解し、次いで攪拌下、１１０モル％の水酸化ナトリウムを１Ｍ  エタノール性溶液中で加えた。溶液の攪拌を室温にて３０分間続けた。続いて、この溶液を２ｍｌ容量まで濃縮し、４ｍｌのアセトンをこの濃縮液に加えた。混合液を＋５℃にて一晩維持した。沈殿物を濾過し、２ｍｌのアセトン、続いて２ｍｌのｎ−ヘキサンで洗浄し、室温にて吸引下乾燥させた。得られた未精製プラバスタチンをエタノール中に溶解し、木炭にて浄化し、次いでエタノール−酢酸エチル混合液より結晶化した。この方法により１７０ｍｇのプラバスタチンを得た。
【００６０】
融解点  １７０−１７３℃（ｄｅｃｏｍｐ．）
[α]2D ＝＋１５６°（ｃ＝０，５、水中）。
紫外線吸収スペクトル（２０μｇ／ｍｌ、メタノール中）：λｍａｘ＝２３１、２３７、２４５ｎｍ（ｌｏｇε＝４．２６３；４．３１１；４．１３６）。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νＯＨ  ３４１５、νＣＨ  ２９６５、νＣ＝０  １７３０、νＣＯＯ- １５７５ｃｍ-1。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2 Ｏ、δ、ｐｐｍ）：０．８６、ｄ、３Ｈ（２−ＣＨ3 ）；５．９２、ｄｄ、Ｊ＝１０．０および５．４Ｈｚ、１Ｈ（３−Ｈ）；５．９９、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ（４−Ｈ）；５．５２、ｂｒ、１Ｈ（５−Ｈ）；４．２４、ｍ、１Ｈ（６−Ｈ）；５．３４、ｂｒ、１Ｈ（８−Ｈ）；４．０６、ｍ、１Ｈ（β−Ｈ）、３．６５、ｍ、１Ｈ（δ−Ｈ）；１．０５、ｄ、３Ｈ（２’−ＣＨ3 ）；０．８２、ｔ、３Ｈ（４’−Ｈ3 ）。
【００６１】
13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2 Ｏ、δ、ｐｐｍ）：１５．３、ｑ（２−ＣＨ3 ）；１３９．５、ｄ（Ｃ−３）；１２９．５、ｄ（Ｃ−４）；１３８．１、ｓ（Ｃ−４ａ）；１２７．７、ｄ（Ｃ−５）；６６．６、ｄ（Ｃ−６）；７０．１、ｄ（Ｃ−８）；１８２．６、ｓ（ＣＯＯ- ）；７２．６、ｄ（Ｃ−β）；７３．０、ｄ（Ｃ−δ）；１８２．０、ｓ（Ｃ−１’）；１８．８、ｑ（２’−ＣＨ3 ）；１３．７、ｑ（Ｃ−４’）。
ポジティブＦＡＢ質量スペクトル（特性イオン）：［Ｍ＋Ｎａ］+ ４６９；［Ｍ＋Ｈ］+ ４４７。
ネガティブＦＡＢ質量スペクトル（特性イオン）：［Ｍ−Ｈ］- ４４５、［Ｍ−Ｎａ］- ４２３、ｍ／ｚ  １０１［２−メチル−ブチル酸−Ｈ］- 。
【００６２】
実施例２
それぞれ１００ｍｌのＭＴ１生物変換培地を含有する５００ｍｌ容量の１０個のエルレンマイヤーフラスコに、実施例１で記述したように調製した接種培養液を接種させ、次いで２８℃にて９６時間インキュベートし、５０ｍｇのコンパクチン酸ナトリウム塩をそれぞれのフラスコに蒸留水中で加え、次いでヒドロキシル化を、さらに５０〜５０ｍｇの基質を蒸留水中で培養液に加えて７２時間実施し、発酵を７２時間続けた。
【００６３】
ＭＴ１生物変換培地の組成
ジャガイモデンプン        １０．０ｇ
デキストロース            ２０．０ｇ
ダイズミール              １０．０ｇ
酵母抽出物                １０．０ｇ
ＣａＣＯ3                   ５．０ｇ
ヒマワリ油                  ２．０ｇ
１０００ｍｌの水道水中
【００６４】
滅菌前に生物変換培地のｐＨを７．０に調整した。この混合液を１２１℃にて２５分間滅菌した。
【００６５】
生物変換期間が終了した後、培養液を統合し、プラバスタチンを以下の手順に従って、回収液より単離した。ＨＰＬＣアッセイにしたがって７５０ｍｇのプラバスタチンが含まれる統合液を、２５００ｒ．ｐ．ｍ．にて２０分間遠心した。分離した菌糸体集団を１時間、２５０ｍｌの水で攪拌し、次いで濾過した。遠心した液および濾液を合わせ、得られた溶液のｐＨを、１５％硫酸にて３．５〜４．０値に調整し、次いでこの溶液を３×３００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。次いでプラバスタチン容量に対して計算した１５０モル％のジベンジルアミンを酢酸エチル抽出液に加えた。酢酸エチル抽出液を約３０ｍｌ容量まで蒸発させ、懸濁液を０〜５℃にて一晩維持した。沈殿したプラバスタチン酸ジベンジルアミン塩を濾過し、冷却酢酸エチルおよびｎ−ヘキサンを用いて濾紙上で洗浄し、最終的に吸引下で乾燥させた。１．１ｇの未精製プラバスタチン酸ジベンジルアミン塩を、６２〜６６℃の温度で、３３ｍｌのアセトン中に溶解させ、この溶液を３０分間、０．１ｇの木炭にて浄化した。次いで木炭を濾過によってこの溶液より除去した。浄化した溶液から沈殿した結晶を再び上記温度にて溶解させ、次いで溶液を＋５℃にて一晩維持した。沈殿物を濾過し、冷アセトンおよびｎ−ヘキサンで洗浄し、吸引下乾燥させた。得られたプラバスタチン酸ベンジルアミン塩（０．７ｇ）を１０ｍｌのエタノール中に懸濁させ、次いで１１０モル％の水酸化ナトリウムを、１Ｍ水溶液を供給することにて溶液に加えた。このアルカリ溶液の攪拌を室温にて３０分間続けた。ナトリウム塩の形成が完了した後、３０ｍｌの水を加え、溶液のｐＨを中性にし、次いでエタノールを吸引下蒸留した。水性濃縮液を、５０ｍｌのＤｉａｉｏｎ  ＨＰ  ２０樹脂（カラムの直径、１．５ｃｍ、樹脂ベッドの高さ、２８ｃｍ）で満たしたカラム上でクロマトグラムした。カラムをアセトン−脱イオン水混合液で溶出し、ここでアセトンの濃度を５％段階にて増加させた。プラバスタチンは、１５％アセトン含むアセトン−脱イオン水混合液にて溶出された。画分を、実施例１で示したＴＬＣ方法にて解析した。プラバスタチンのＲｆ値は０．５であった。プラバスタチンを含む画分をあわせ、アセトン含有物を吸引下で蒸発させた。水性残余物の凍結乾燥によって、クロマトグラフィー的に純粋なプラバスタチン３９０ｍｇが得られた。
【００６６】
実施例３
研究室発酵器中の４．５リットルのＴＴ／２培地を１２１℃にて４５分間滅菌し、実施例１で記述したように調製した５００ｍｌの接種攪拌培養液を接種させ、次いで３２℃にてインキュベートし、２５０ｌの滅菌空気／時間で空気にさらし、３００ｒ．ｐ．ｍ．にて平坦刃攪拌器にて攪拌した。インキュベーションを７２時間続け、２．５ｇのコンパクチン酸ナトリウム塩を本培養液に加えた。生物変換期間の４８時間後に、コンパクチン基質が発酵溶液より消費され、そこでさらに２．５ｇのコンパクチン酸ナトリウム塩を再び本培養液に加えた。コンパクチンの第二用量は２４時間以内に消費された。コンパクチン酸ナトリウム塩のプラバスタチンへの変換率は、本生物変換工程において約９０％であった。
【００６７】
ＴＴ／２生物変換培地の組成
グルコース        ７５．０ｇ
可溶性デンプン    ５０．０ｇ
ダイズミール      ５０．０ｇ
酵母抽出物        ５０．０ｇ
ペプトン            ５．０ｇ
ＮａＮＯ3         ２０．０ｇ
ＣａＣＯ3         ２５．０ｇ
４５００ｍｌの水道水中
【００６８】
実施例４
研究室発酵器内で、４．５リットルのＴＴ／１発酵培地を１２１℃にて４５分間滅菌し、実施例１で記述したように調製した接種攪拌培養液を５００ｍｌに接種し、次いで２８℃にてインキュベートし、２００ｌの蒸留空気／時間で空気にさらし、４００ｒ．ｐ．ｍにて平坦刃攪拌器にて攪拌した。
【００６９】
ＴＴ／１生物変換培地の組成
グルコース            １２５．０ｇ
ジャガイモデンプン      ２５．０ｇ
ダイズミール            ５０．０ｇ
酵母抽出物(Gistex)      ５０．０ｇ
ペプトン                ５０．０ｇ
ＣｏＣｌ2 ×６Ｈ2 Ｏ    １０．０ｍｇ
ヒマワリ油              １０．０ｇ
４５００ｍｌの水道水中
【００７０】
滅菌前に、生物変換培地のｐＨを７．０に調整した。
【００７１】
培養を２８℃にて９６時間続けた。この時点で、２．５ｇのコンパクチン酸ナトリウム塩を、滅菌濾過水溶液中でこの培養液に加えた。発酵の５日目までに、コンパクチン酸ナトリウム塩が発酵培養液より完全に消費された。次いで、基質添加を毎日さらに３日間、２．５ｇ／日の割合で続けた。コンパクチン酸ナトリウム塩基質は、４日の間徐々に消費され、完全にプラバスタチンに変換された。発酵期間の最後の、１０ｇのコンパクチン基質からのＨＰＬＣ測定の結果により、９ｇのプラバスタチンが産出された。
【００７２】
生物変換が終了した後、１８００μｇ／ｍｌの濃度にて形成されたプラバスタチンを以下のように単離した。５リットルの培養液を２５００ｒ．ｐ．ｍ．にて２０分間遠心した。次いで２リットルの水を分離した胞子集団に加え、この懸濁液を１時間攪拌し、濾過した。これらの２つの濾液を統合し、５００ｍｌ／時間の流速にて、３００ｇ（５４０ｍｌ）のＤｏｗｅｘ  Ａｌ  ４００（ＯＨ- ）樹脂を含むカラム（カラムの直径、４ｃｍ、樹脂ベッドの高さ、４３ｃｍ）に通し、次いで樹脂ベッドを１リットルの脱イオン水にて洗浄した。その後、カラムを１０ｇの塩化ナトリウムを含む１リットルのアセトン−水（１：１）混合液にて、５０ｍｌ画分を回収して溶出した。画分を実施例１にて示したＴＬＣ方法にて解析した。産物を含む画分をあわせ、アセトンを吸引下で蒸発させた。この濃縮液のｐＨを、１５％硫酸にて３．５〜４．０値まで調整し、次いで３×２５０ｍｌの酢酸エチルで溶出した。４０ｍｌの脱イオン水を合わせた酢酸エチル抽出液に加え、ｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウムにて７．５〜８．０まで調整した。１５分攪拌後、水相および酢酸エチル相を分離し、次いで上述したように、酢酸エチル溶液を２×４０ｍｌの脱イオン水にて抽出した。次いでアルカリ水性溶液を合わせ、５０ｍｌ容量まで濃縮し、６００ｍｌのＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｏ．、Ｊａｐａｎ）非イオン吸着樹脂で満たしたカラム（カラムの直径、３．８ｃｍ、樹脂ベッドの高さ、５３ｃｍ）上でクロマトグラフした。カラムを６００ｍｌの脱イオン水にて洗浄し、次いでアセトン−脱イオン水混合液で溶出し、ここで、アセトンの濃度を５％段階で増加させ、５０ｍｌ画分を回収した。溶出液を実施例１で示したようにＴＬＣで解析した。プラバスタチンは、１５％のアセトンを含むアセトン−脱イオン水混合液にてカラムより溶出された。単一成分としてプラバスタチンを含む画分をあわせ、この溶液を吸引下で１５０ｍｌの容量まで濃縮した。続いて、０．６ｇの木炭をこの濃縮した水溶液に加え、プラバスタチンを室温にて１時間浄化した。次いで木炭を濾過し、濾液を凍結乾燥させた。得られた６．５ｇの凍結乾燥プラバスタチンを、エタノールと酢酸エチルの混合液より２回結晶化させた。沈殿物を濾過し、２０ｍｌの酢酸エチルおよび２０ｍｌのｎ−ヘキサンで洗浄し、室温にて吸引下乾燥させた。このようにしてクロマトグラム的に純粋なプラバスタチン４．６ｇが得られた。
【００７３】
実施例５
胞子懸濁液を、コンパクチン酸ナトリウム塩の６β−ヒドロキシル化に適用可能であるミクロモノスポラ  エキノスポラ  ｓｓｐ．エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ  ｓｓｐ．ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＩＤＲ−Ｐ5 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２７２］株の１０日齢の可溶性寒天斜面培養の表面より、実施例１で記述したように５ｍｌの無菌蒸留水を用いて調製し、得られた胞子懸濁液を使用して、５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で滅菌した１００ｍｌの接種培地に接種させた。培地ＴＩの組成は、実施例１に記載した。接種した培地をロータリー振とう器にて３日間、２８℃にて振とうし（２５０ｒ．ｐ．ｍ．、２．５ｃｍ振幅）、次いで増殖した培養液の５ｍｌ分液を、５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で１２１℃にて２５分間滅菌した１００−１００ｍｌの生物変換培地ＴＴ／１内に移した。培地ＴＴ／１の組成は実施例４に記述した。フラスコをロータリー振とう器上で３日間、２５℃で振とうし（２５０ｒ．ｐ．ｍ．、２５ｃｍ振幅）、次いで１０−１０ｍｇのコンパクチン基質（コンパクチン酸ナトリウム塩）を、滅菌濾過した水溶液中で、この培養液に加え、次いで発酵を１６８時間続けた。
【００７４】
生物変換の終わりに、発酵培養液のプラバスタチン含量をＨＰＬＣ法にて測定した。この時点で、平均プラバスタチン濃度は４０μｇ／ｍｌであった。
【００７５】
実施例６
発酵、基質添加および生物変換を、実施例５で記述したように、ミクロモノスポラ  メガロミセア  ｓｐｐ．ニグラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ  ｓｐｐ．ｎｉｇｒａ）の株ＩＤＲ−Ｐ6 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ００１２７３］にて実施した。発酵培養液のプラバスタチン含量をＨＰＬＣ法にて測定した。生物変換の終了時点で、この培養液のプラバスタチン含量は５０μｇ／ｍｌであった。
【００７６】
実施例７
実施例１で記述したように調製したミクロモノスポラ  プルプレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）の株ＩＤＲ−Ｐ4 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２７１］の接種培養液の５ｍｌの分液を使用し、５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に分配し、１２１℃にて２５分間滅菌した１００−１００ｍｌのＴＴ／１４培地にまいた。
【００７７】
ＴＴ／１４培地の組成
ジャガイモデンプン            ５．０ｇ
グルコース                  ２５．０ｇ
酵母抽出物（ＧＩＳＴＥＸ）  １５．０ｇ
ペプトン                    １５．０ｇ
ＣａＣＯ3                     １．０ｇ
１０００ｍｌの水道水中
【００７８】
滅菌前に生物変換培地のｐＨを７．０に調整した。
【００７９】
フラスコを３日間、ロータリー振とう器上で振とうした（２５０ｒ．ｐ．ｍ．、２．５ｃｍ振幅）。基質添加、生物変換およびプラバスタチン含量の測定を実施例５にて記述したように実施した。生物変換の終了時点で、発酵培養液のプラバスタチン含量は４０μｇ／ｍｌであった。
【００８０】
実施例８
発酵、基質添加および生物変換を、実施例１で記述したように、ミクロモノスポラ  ロサリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｒｏｓａｒｉａ）の株ＩＤＲ−Ｐ7 ［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ  ００１２７４］にて実施した。生物変換終了時点で、ＨＰＬＣ法により、３５０μｇ／ｍｌのプラバスタチンが発酵培養液中で測定された。