(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式：
ＣＨ３−（ＣＨ２）１３−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ
で示される脂肪酸類似体又はその塩の、再狭窄の治療及び／又は予防用の医薬組成物を調製するための使用。
【請求項２】
哺乳動物における再狭窄の治療及び／又は予防のための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬組成物が、前記脂肪酸類似体又はその塩の治療的又は予防的に有効な濃度がその投与の期間に動物の血中に実質的に持続的に維持されるように投与されるものとして意図されていることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記医薬組成物が経口又は局所投与されるものとして意図されていることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記再狭窄が、処置性血管外傷により生じるものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記処置性血管外傷が移植片又は移植処置によるものであることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記処置性血管外傷が血管形成術によるものであることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記血管形成術が経皮的血管内冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）であることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記再狭窄が、処置性血管外傷、平滑筋細胞の病的増殖及び／又は血漿ホモシステインの濃度上昇により生じるものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
哺乳動物における再狭窄の予防及び／又は治療用の医薬組成物であって、該医薬組成物が、
化学式：
ＣＨ３−（ＣＨ２）１３−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ
で示される脂肪酸類似体又はその塩を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物が脂肪酸類似体と混和物の形で製剤学的に許容される担体又は賦形剤を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、再狭窄（二次性狭窄）の治療及び／又は予防に使用できる脂肪酸類似体又はその塩を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、処置性血管外傷により生じる疾患の治療等による再狭窄の治療及び／又は予防用の医薬組成物を調製するための脂肪酸類似体又はその塩の使用に関し、さらに詳しくは、本発明は平滑筋細胞増殖と関係した状態に関する。
【０００２】
（背景技術）
多くの病的状態が、平滑筋細胞増殖と関係があることがわかっている。そのような状態として、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、血栓症、心筋梗塞、卒中発作のほか、腸や子宮の平滑筋腫や平滑筋肉腫及び線維種の子宮類線維種など平滑筋腫瘍があげられる。
【０００３】
毎年、５０万件を超える介入性血管内処置が実施されている。そのような介入性処置は長い年月をかけて向上し続ける一方で、毎年行われる処置の３０〜５０％もの処置が、再狭窄、すなわち二次性狭窄の形成の結果として失敗している。したがって、再狭窄の減少が、血管形成術、動脈拡張術、及びステントやレーザー技術を利用した処置など介入性血管内処置の使用による心血管疾患の治療で実現される成功を増大させる最も重要な要因として、しばしば引用される。
【０００４】
バルーン血管形成術、例えば経皮的血管内冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）では、患者の脚又は腕の動脈に小切開を行い、ガイドカテーテルと呼ばれる長い中空の管を動脈内に挿入する。そして、細いガイドワイヤと収縮バルーンカテーテルをガイドカテーテル内に挿入し、Ｘ線による映像化を行って患者の血管に注意深く進める。収縮バルーンは、管腔狭窄部位に到達するまで進め、到達した時点で、医師は１回以上、約６０秒間、およそ４〜６ａｔｍの圧力にバルーンを膨張させる。膨張すると、バルーンはプラークを破砕し、完全に跳ね返る能力を超えて動脈壁の筋線維を伸張させる。この処置でプラークは除去されないが、プラークの破砕及び動脈壁の伸張が血管内腔を増大し、血流を増大させる。
【０００５】
このような処置を伴う再狭窄は、血小板凝集や癒着、平滑筋細胞増殖、血管内腔の狭窄、血管拡張の制限、及び血圧の上昇により特徴づけられる。動脈の内膜層内の平滑筋細胞は、これらの処置の約２〜３日以内に増殖周期に入り、その後数日間に増殖することが報告されている（内膜増殖症）。
【０００６】
試験管内で平滑筋増殖を抑制することが報告されている化合物は、生体内で使用すると、望ましくない薬学的副作用を示すことがある。ヘパリンはそのような化合物の例であり、試験管内では平滑筋細胞増殖を阻害するが、生体内で使用すると、凝集を阻害する潜在的な有害な副作用を示すことが報告されている。
【０００７】
上記から明らかなように、平滑筋細胞の移動や増殖を効果的に治療する阻害剤の使用には解決すべき問題が多い。例えば、血管手術時に行われる血管への外傷性損傷後の血管平滑筋の増殖や移動による狭窄、再狭窄又は関連障害を阻害するための新規な組成物又は方法を開発することは、きわめて有利であろう。
【０００８】
修飾脂肪酸による治療は、これらの疾患を治療する新しい方法を代表するものである。
【０００９】
欧州特許明細書第０３４５０３８号及び国際出願番号ＰＣＴ／ＮＯ９５／００１９５は、高脂血症状態の治療用の非−β−易酸化脂肪酸類似体の使用を記載している。
【００１０】
さらに、われわれは現在、肥満、高血圧及び脂肪肝に対する効果を有する新規な脂肪酸類似体を合成、特徴づけた。
【００１１】
本発明に関連して本明細書で開示する化合物による飼養実験における結果は、これらの化合物が脂肪組織量及び体重を低下させ、そのため肥満や過体重の治療に有力な薬剤であることを示している。これらの結果は、出願人の同時係属出願ＰＣＴ／ＮＯ９９／００１３５に記述され、請求の範囲に記載されている。
【００１２】
われわれは、本発明に関連して本明細書で開示する化合物が有力な抗糖尿病化合物であり、グルコース及びインスリンに対する十分な効果を有することも見出した。これらの結果は、出願人の同時係属出願ＰＣＴ／ＮＯ９９／００１３６に記述され、請求の範囲に記載されている。
【００１３】
われわれは、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物が二次性狭窄の形成を阻害することを明らかにしており、したがって本出願は再狭窄の予防及び／又は治療用の医薬組成物の調製にこの化合物を使用することに関する。さらに、われわれは、この化合物が平滑筋細胞の増殖及び移動を阻害し、血漿ホモシステインの濃度を低下させることを明らかにした。このため、この化合物は一次性狭窄に対する予防及び／又は治療効果を有することも予想される。さらに、本発明は、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、血栓、心筋梗塞、卒中発作及び平滑筋細胞腫瘍、並びに処置性血管外傷により生じる疾患の治療及び／又は予防に有用となることが予想される。
【００１４】
本発明に関連して本明細書で開示する化合物は、天然脂肪酸の小修飾により特徴づけられる。イオウ、セレン又は酸素が好ましくは、脂肪酸の背骨における炭素の１個又はそれ以上に置換される。式Ｉで定義された化合物は、それらに生物学的効果の独特な組合せを与える特性を有する。
【００１５】
テトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）は最も徹底的に研究され、われわれは、さまざまな試験動物におけるいくつかの有利な効果を見出している。
【００１６】
それぞれの試験では、ＴＴＡが天然脂肪酸ときわめて類似した特性を有し、ＴＴＡがミトコンドリアβ−酸化系により酸化されない点が主な違いであることがわかった。しかし、本発明に関連して本明細書で開示する化合物の存在により、他の（非置換脂肪酸）β−酸化が増大することがわかっている。
【００１７】
ＴＴＡのラットに対する１２週間の投与により、モノ不飽和脂肪酸（主にオレイン酸）の肝及び血漿含有量はほぼ２倍になったが、ポリ飽和脂肪酸（主にリノール酸及びＤＨＡ）は減少した。このため、本発明に関連して本明細書で開示する化合物は、さまざまな組織における脂質の組成を変化させるものである。また、本発明に関連して本明細書で開示する化合物は脂肪含有量を変化させることがわかっており、本発明に関連して本明細書で開示する化合物が脂肪分布を変化させることも予想される。
【００１８】
ラット、マウス、ウサギ及びイヌなど動物に対する中等度の用量の投与により、治療日内に血漿コレステロール濃度とトリアシルグリセロール濃度の両方が低下した。われわれは、ＴＴＡの同じ効果も見出し、本発明に関連して本明細書で開示する位置５又は７で置換したイオウを含む化合物はβ−酸化を増大することがわかり、これらの脂肪酸類似体がトリグリセリド及びコレステロールの血漿濃度を低下させることも予想される。ＴＴＡ及びＴＳＡは、この点で、ＥＰＡのようなポリ不飽和脂肪酸よりもはるかに有力である。
【００１９】
本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物を用いた実験データは意外にも、血管形成術後の二次性狭窄（再狭窄）の形成が、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物を経口又は局所のいずれかで投与した各種動物モデルにおいて、顕著に減少又は阻害されることを示した。これは実験の部の実施例３及び４で明らかに示されているが、血管形成処置後の数週間に、動脈径がＴＴＡ投与動物では維持される一方で、対照動物では血管径が顕著に減少することを示している。これらの生体内の結果は、二次性狭窄形成の予防用のこの化合物の可能性を示している。
【００２０】
ＰＴＣＡ後の再狭窄形成の作用機序は完全には理解されていないが、再狭窄性病変は血管の内膜層における平滑筋細胞の過増殖を示すことが明らかにされている。
【００２１】
われわれは、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物が平滑筋細胞の増殖及び移動を減少させることを明らかにした。平滑筋細胞増殖の増大は、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、血栓、心筋梗塞、卒中発作とも関係があった。
【００２２】
正常血管は内皮細胞の層に沿って並んでいる。内皮細胞は、酸化窒素、プロスタグランジンＩ２及びプロスタシクリンを血管壁に放出する（壁内放出）とともに血流内に放出する（管内放出）。これらの因子は血管の正常状態を維持し（血管弛緩）、血管内表面上の血塊形成を阻害し（血小板癒着及び凝集）、単球密着及び化学走性を阻害し、平滑筋の遊走及び増殖を阻害する。この過程の結果、血管拡張及び血栓溶解が生じ、血流が維持される。しかし、内皮細胞が機能不全であったり、損傷を受けた場合は、酸化窒素及びプロスタシクリンの放出が障害される。血小板凝集及び癒着は抵抗なく生じることがあり、平滑筋細胞に対して直接作用する血小板由来産物が血管収縮を引き起こす。最終的な結果は、血栓症や血管痙攣をきわめて受けやすい血管である。
【００２３】
アテローム性動脈硬化は、さまざまな原因により何年間にもわたって血管内に形成することがある。それによって生じる病変、すなわちプラークはしだいに血管を塞ぎ、生命維持に必要な器官への血流を妨げる。
【００２４】
記載された血管収縮性の生理学的機序は末梢動脈と冠状動脈の両方で生じるが、その過程の結果は冠状動脈においてより生命を脅かす。心臓の動脈である冠状動脈は、心筋に酸化動脈血を灌流させる。また、必須栄養素を供給し、代謝廃棄やガス交換を可能にする。これらの動脈は、患者の一生を通じて連続的血流の絶え間ない供給需要にさらされている。内皮損傷による重篤な近位冠動脈狭窄は、周期性冠流減少（“ＣＦＲ’ｓ”）を誘発する。これらは損傷動脈における血流の周期的又は断続的な減少である。ＣＦＲ’ｓのエピソードは、不安定狭心症、急性心筋梗塞及び突然死を含む臨床的急性虚血性心疾患と関係がある。一般的な病態生理学的な関係は、血管痙攣及び／又は血栓形成を有する内皮損傷である。
【００２５】
このため、平滑筋細胞に対するその作用による本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物は、上記の疾患群に対する好ましい効果を有することが予想される。
【００２６】
すでに示したように、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物は脂質低下効果を示すため、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物の投与は、動脈関連疾患の治療又は予防のための選択化合物である。これらの化合物は毒性が低く、例えば一次性狭窄の形成を予防するために、その必要がある哺乳動物に対し投与される予防剤としてきわめて適している。
【００２７】
われわれは、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物がホモシステインの血漿濃度を減少させることも明らかにした。ホモシステインの濃度上昇は、アテローム性動脈硬化症の危険因子であり、またその進展と関連があると考えられている。このため、ＴＴＡのこのホモシステイン低下効果に基づき、本発明は一次性狭窄の形成に対する阻害効果を有することが予想される。
【００２８】
（発明の開示）
本発明は、非細胞毒性濃度での修飾脂肪酸類似体が、再狭窄の治療及び／又は予防用に使用できることを開示する。
【００２９】
われわれは、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物が平滑筋細胞の増殖及び移動を減少させることも明らかにしたが、平滑筋細胞の増殖はアテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、血栓症、心筋梗塞、卒中発作及び平滑筋細胞腫瘍などの疾患における病理学的要因であることが知られており、そのような疾患を、化学式：ＣＨ３−（ＣＨ２）１３−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨで示される脂肪酸類似体又はその塩を医薬組成物の調製において使用することによって治療及び／又は予防することが本発明の一部でもある。また、式（Ｉ）の化合物を医薬組成物の調製において使用することによって治療及び／又は予防することができることも予想される。
【００３０】
本明細書では、本発明に関連して、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３−［ＣＨ２］ｍ−［ｘｉ−ＣＨ２］ｎ−ＣＯＯＲ
（式中、ｎは１乃至１２の整数であり、
ｍは０乃至２３の整数であり、
ｉは奇数であり、ＣＯＯＲに対する位置を示し、
互いに独立したｘｉは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｓｅ及びＣＨ２を含む群から選択され、
Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、
少なくともｘｉの１つがＣＨ２ではないことを条件とする。）で示される脂肪酸類似体又はその塩の、再狭窄の治療及び／又は予防用の医薬組成物を調製するための使用が提案される。該脂肪酸類似体は、プロドラッグ若しくは複合体の形態で提供され得る。また、前記脂肪酸類似体又はその塩は一次性狭窄の治療及び／又は予防用の医薬組成物を調製するために使用することもできる。
【００３１】
特に、前記再狭窄は、例えば、処置性血管外傷により生じる疾患及び／又は平滑筋細胞の病的増殖及び／又は血漿ホモシステインの濃度上昇の治療及び／又は予防により予防される。
【００３２】
本発明に関連する実施例は、疾患がアテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、血栓、心筋梗塞、卒中発作、血管痴呆及び平滑筋細胞新生物含む群から選択される場合の、化学式：ＣＨ３−（ＣＨ２）１３−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨで示される脂肪酸類似体又はその塩の使用に関する。
【００３３】
本発明に関連して本明細書で開示する１つの実施例は、ｍ≧１３である一般式Ｉの化合物の使用である。
【００３４】
本発明に関連して本明細書で開示する現在好ましい実施例は、ｘｉ＝３がＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｓｅからなる群から選択され、ｘｉ＝5-25がＣＨ２である式Ｉの化合物である。
【００３５】
本発明に関連して本明細書で開示する実施例として、テトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）及びテトラデシルセレノ酢酸（ＴＳＡ）、すなわち、ｘｉ＝３がそれぞれイオウ及びセレンであることが現在、好ましい化合物である。
【００３６】
さらに、本発明に関連して本明細書で開示する医薬組成物を調製するために使用される脂肪酸類似体又はその塩（あるいはプロドラッグ若しくは複合体）は、哺乳動物における一次性又は二次性狭窄の予防的又は治療的処置のための方法に利用可能である。その方法は、一般に、その必要がある哺乳動物に対し、一般式（Ｉ）：
ＣＨ３−［ＣＨ２］ｍ−［ｘｉ−ＣＨ２］ｎ−ＣＯＯＲ
（式中、ｎは１乃至１２の整数であり、
ｍは０乃至２３の整数であり、
ｉは奇数であり、ＣＯＯＲに対する位置を示し、
互いに独立したｘｉは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｓｅ及びＣＨ２を含む群から選択され、
Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、
少なくともｘｉの１つがＣＨ２ではないことを条件とする。）で示される脂肪酸類似体、又はその塩、プロドラッグ若しくは複合体の有効量を投与するステップを含む。
【００３７】
治療は、そのような治療の必要がある患者に対し、その投与の期間にわたって血中で実質的に持続的に維持される有効な濃度を投与することを含む。
【００３８】
さらに、本発明は、再狭窄の予防及び／又は治療用の医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、一次性狭窄及び／又は二次性狭窄の治療及び／又は予防に使用可能である。医薬組成物は、脂肪酸類似体と混合して、製剤学的に許容される担体又は賦形剤を含むことが好ましい。
【００３９】
本発明は、哺乳動物における再狭窄の予防及び／又は治療用の医薬組成物であって、該医薬組成物が、化学式：ＣＨ３−（ＣＨ２）１３−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨで示される脂肪酸類似体又はその塩を含む医薬組成物にも関する。
【００４０】
定義
一次性狭窄
狭窄という用語は、管の狭小を指し、特に心血管の１つの狭小化を指す。一次性狭窄は、例えばアテローム性動脈硬化症など疾患状態による狭窄の形成を指す。
【００４１】
二次再狭窄（再狭窄）
《二次性狭窄》又は《再狭窄》という用語は、矯正手術後の狭窄の再発、すなわち、以前の狭小化の除去又は削減のあとの構造物（通常、冠状動脈）の狭小化を指す。
【００４２】
処置性血管外傷
処置性血管外傷という用語は、血管形成術、動脈拡張術、ステント（例えば、血管における）の配置、血栓摘出術及び移植術など血管の外科的処置による生じる状態を指す。
【００４３】
増殖
本明細書中で使用されるように、《増殖》という用語は、すなわち細胞の有糸分裂による細胞数の増加を意味する。
【００４４】
本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物の投与
医薬品として、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物は、非経口、鼻腔内、経口を含む適切な方法により、又は皮膚を通じた吸収により動物に直接投与しうる。それらは局所的又は全身的に投与することができる。各薬剤の特殊な投与経路は、例えば、動物の病歴によって決まることになる。
【００４５】
非経口の例として、皮下、筋内、静脈内、動脈内、及び腹腔内投与があげられる。
【００４６】
一般的な提案として、用量あたり非経口投与されるそれぞれの化合物の製剤学的に有効な総量は、患者の体重の約５ｍｇ／ｋｇ／日乃至１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であることが好ましいが、上記の通り、これは相当の治療的裁量に左右される。ＴＴＡについては、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量が好ましく、ＴＳＡの投与量は１０乃至１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となりうることが予想される。
【００４７】
連続的に投与される場合は、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物はそれぞれ典型的に、１日１〜４回の注射により、又は例えばミニポンプを用いた連続皮下注入により投与される。静脈内バッグ溶液を使用してもよい。適切な用量を選択するうえでの重要な因子は、総体重の減少又は除脂肪量に対する脂肪量の比、又は医師が適切と考えた対照若しくは肥満の予防又は肥満関連状態の予防を測定するための他の基準により得られた結果である。
【００４８】
非経口投与については、１実施例において、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物は一般に、それぞれ所望の純度で、製剤学的に許容される担体、すなわち、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、他の組成物の成分と合致する単位注射可能剤形（溶液、懸濁液、又は乳剤）と混合することで調製される。
【００４９】
一般に、組成物は、化合物を液体の担体若しくは微細に分割した固体の担体又はその両方とそれぞれ均一にかつ密接に接触させることで調製される。次に、必要であれば、製品は所望の組成物の形にされる。好ましくは、担体は非経口担体であり、さらに好ましくは、レシピエントの血液と等張性の溶液である。そのような担体賦形剤の例として、水、食塩水、リンゲル液、及びデキストロース液があげられる。固定油やオレイン酸エチルなど非水賦形剤のほか、リポソームもここでは有用である。
【００５０】
担体は、等張性や化学的安定性を強化する物質など少量の添加剤を適切に含有しうる。そのような材料は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対し非毒性であり、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、及び他の有機酸又はその塩など緩衝剤；アスコルビン酸など抗酸化剤；免疫グロビリン；ポリビニルピロリドンなど親水性ポリマー；グリセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニンなどアミノ酸；単糖類、二糖類、及びセルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキシトリンを含め他の炭水化物；ＥＤＴＡなどキレート剤；マニトール又はソルビトールなど糖アルコール；ナトリウムなど対イオン；及び／又はポリソルベート、ポロクサマー、若しくはＰＥＧなど非イオン界面活性剤を含む。
【００５１】
経口医薬組成物については、例えば水、ゼラチン、ガム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、油、ポリアルケングリコール、石油ゼリー等などの担体材料を使用しうる。そのような医薬製剤は単位剤形であることができ、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等など他の治療に有益な物質又は従来の医薬佐剤をさらに含有しうる。この医薬製剤は、錠剤、カプセル剤、糖衣錠、アンプル剤等など従来の液剤、乾燥アンプル剤など従来の剤形、及び坐剤等でありうる。
【００５２】
本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物による治療は、個別の患者に望まれるように、１日の食物又はカロリー摂取量の制限など、食事制限なしに行うこと、又は食事制限とともに受けさせることもできる。
【００５３】
本発明の好ましい実施例は、化合物の局所投与を含む。最近、動脈壁への部位特異的薬物送達が、ＰＴＣＡ後の血管狭窄を含め、血管疾患の治療の新しい方法となっている。これらの薬物送達システムとして、（１）二重バルーンカテーテル、多孔バルーンカテーテル、微多孔バルーンカテーテル、チャネルバルーンカテーテル、ステントカテーテル上のバルーン、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテル、イオン泳動バルーンカテーテル及びステント装置を含む部位特異的（冠状動脈）薬物送達；（２）薬物溶出ポリマーマトリックス及びイオン泳動パッチ装置を含む外科的埋め込みを必要とする、心周囲外膜及び心外膜薬物送達装置；及び（３）薬物溶出微粒子の壁内注入があげられる。
【００５４】
また、本発明の医薬組成物の調製に使用される化合物は、肥満を克服又は予防するために他の治療と組み合わせて適切に投与される。
【００５５】
本発明は、以下の実施例を参考にすることでさらに完全に理解される。しかし、実施例は、本発明の範囲を制限するものとして構成するものではない。
【００５６】
実験部
方法と結果
結果
実施例１  化合物の調製及び特徴づけ
ａ）新規な化合物の合成
可変位置における異種原子を有する脂肪酸を、下記の変法により３−置換類似体についての一般的な記載に従って合成した：
アルキル−Ｈａｌはアルカノイック−Ｈａｌで置換し、ＨＳ−ＣＨＣＯＯＲはアルキル−ＳＨで置換した。
【００５７】
0004465672.tif 000002
【００５８】
ｂ）３−置換脂肪酸類似体の合成
置換基ｘｉ＝３がイオウ原子又はセレンである化合物は、次の一般的手順に従って調製しうる：
ｘがイオウ原子である：
本発明に従って使用されるチオ置換化合物は以下に示される一般的手順により調製しうる：
基
アルキル−Ｈａｌ  ＋  ＨＳ−ＣＨ２ＣＯＯＲ  ＝＝＝＞  アルキル−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＲ
イオウ−化合物、すなわち、テトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）、（ＣＨ３−（ＣＨ２）13−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨは、欧州特許明細書第３４５０３８号に開示された通り調製した。
【００５９】
ｘがセレン原子である：
セレン置換化合物は、次の一般的手順により調製しうる：
１．アルキル−Ｈａｌ  ＋  ＫＳｅＣＮ  ⇒  アルキル−ＳｅＣＮ…
２．アルキル−ＳｅＣＮ  ＋  ＢＨ４−  ⇒  アルキル−Ｓｅ−
３．アルキル−Ｓｅ−  ＋  Ｏ２  ⇒  アルキル−Ｓｅ−Ｓｅ−アルキル
この化合物は、エタノール又はメタノールから注意深く結晶化することで精製された。
【００６０】
ＢＨ４−
４．アルキル−Ｓｅ−Ｓｅ−アルキル  ⇒  ２アルキル−Ｓｅ−
５．アルキル−Ｓｅ−  ＋  Ｈａｌ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ  ⇒  アルキル−Ｓｅ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ
例えば、アルキルがテトラデシルであるときの最終化合物、（ＣＨ３−（ＣＨ２）13−Ｓｅ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（テトラデシルセレノ酢酸（ＴＳＡ））は、ジエチルエーテル及びヘキサンからの結晶化により精製することができる。この産物は、ＮＭＲ、ＩＲ及び分子量測定法により完全に特徴づけられうる。
【００６１】
これらのイオウ及びセレン化合物の合成及び単離用の方法、及び式Ｉのｘが酸素（Ｏ）、イオウ−Ｉ−酸化物（ＳＯ）及び二酸化イオウ（ＳＯ２）である化合物は、欧州特許明細書第３４５０３８号及び国際特許出願ＷＯ９７／０３６６３号に記載されている。
【００６２】
実施例２
ＴＴＡの毒性試験
ＧＬＰガイドラインに従った薬物の２８日毒性試験が、英国、コーニングハズレトン（Corning Hazleton）（ヨーロッパ）により実施された。５００ｍｇ／ｋｇ／日までの用量レベルでＴＴＡの経口投与は一般に十分に忍容性であった。一部の脂質関連パラメータが高用量を投与した動物で低下した。これはＴＴＡの薬学的活性と一致している。
【００６３】
５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量レベルは、体重減少も誘発した。５０又は５００ｍｇ／日／ｋｇの用量レベルにおける毒性の証拠は認められなかった。
【００６４】
変異誘発活性の試験が、英国のコバンスラボラトリーズリミテッドにより実施された。ＴＴＡ及びＴＳＡは、サルモネラ・ティフィムリウム及びエシェリキア・コリの菌株における変異を誘発することはないと結論された。さらに、ＴＴＡは、マウスリンパ腫細胞及びＬ５１７８Ｙで試験すると、変異誘発性ではなかった。
【００６５】
Ｓ．ティフィムリウム及びＥ．コリで試験した化合物の濃度は、３〜１０００ｍｇ／プレート（ＴＴＡ）及び２〜５０００ｍｇ／プレート（ＴＳＡ）であった。マウスリンパ腫細胞、Ｌ５１７８Ｙにおける濃度は、２．５〜５０ｍｇ／ｍｌであった。
【００６６】
ＴＳＡ及びＴＴＡはこれらの試験で変異原生ではないことがわかった。ＴＳＡ及びＴＴＡは、培養されたチャイニーズハムスター卵巣細胞における染色体異常について試験され、試験用量（１２〜１４０ｍｇ／ｍｌ）で異常は誘発されなかった。
【００６７】
したがって、医薬組成物の調製に使用される前記化合物は、この点で医薬化合物として潜在的に有用である。
【００６８】
実施例３
ＴＴＡを経口投与したウサギにおける再狭窄の予防
いずれかの性のチンチラ（Ｃｈｂｂ：ＣＨ）ウサギ１４匹を、１日１回ＴＴＡ脂肪酸８００ｍｇの補給剤投与（平均体重３．６±０．０９ｋｇ）又はプラセボ投与（平均体重３．５±０．４７ｋｇ）のいずれかに無作為化した。
【００６９】
動物を毎日の飼料ペレットと混合した経口補給剤として投与したＴＴＡで前処置し、３週間、組織中に脂肪酸類似体の蓄積を確保した。
【００７０】
動物の治療及び使用に関する地域倫理委員会が実験プロトコールを承認した。
【００７１】
ＴＴＡは方法の部に記載した通りに合成した。他のすべての薬物は一般の販売元からのものであり、試薬水準のものとした。
【００７２】
血管形成処置
０．５ｍｌフェンタニール（０．３１５ｍｇ／ｍｌ）及びフルアニゾン（１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標））の筋内による前投薬後、ジアゼパム４ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与によりウサギを麻酔し、通常は処置時に１回必要なＨｙｐｎｏｒｍ（登録商標）とジアゼパムの１：１の混合液０．３〜０．４ｍｌを追加して維持した。
【００７３】
リグノカイン（Ｘｙｌｏｃａｉｎｅ（登録商標））及び外科的静脈切開による皮膚の局所浸潤後、６Ｆシースで右頸動脈内挿管した。ヘパリンの１００Ｕ／ｋｇボーラスを動脈内投与した。血管形成前、造影剤としてイオキサグル酸（Ｈｅｘａｂｒｉｘ（登録商標））３ｍｌをＢｅｒｍａｎ（登録商標）カテーテルを介して注入することで頭部前面像における血管造影法を行った。
【００７４】
２．５ｍｍの血管形成バルーンカテーテル（Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標））を各腸骨静脈の近位部に位置決めし、各動脈の同じ部位で、それぞれ３０秒間８及び１２大気で２回のバルーン膨張によるバルーン血管形成を行い、動脈を拡張した。２０ｍｍの長さのバルーンの中央部のバルーンマーカーを腸骨−仙骨関節上に配置し、バルーンが確実に同一部位に位置決めされるようにした。膨張は圧力マノメータ（Ｅｎｃｏｒｅ（登録商標）２６膨張装置、Ｓｃｈｉｍｅｄ、ボストンサイエンチフィックコーポレーション）を用いて行った。
【００７５】
最初の血管形成と同じ頭部前面像で別の血管造影法を行い、動脈の開存性を確認した。頸動脈を結紮し、結紮糸で皮膚を閉鎖した。ブプレノフィン０．３ｍｇ（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標））及びペニシリンを最初の数日、１日１回皮下投与した。
【００７６】
１０週間後、上記と同じ処置に従い、造影剤としてイオキサグル酸（Ｈｅｘａｂｒｉｘ（登録商標））を用いて、同じ頭部前面像におけるフォローアップ血管造影法を行った。今度はシースを左頸動脈に挿入した。血管内超音波を行って、壁の厚さ及び内腔径を測定した。血管造影後、開腹術を行い、腹壁大動脈に１８Ｇ注入針で挿管した。シースを介して過量のペントバルビタールを左頸動脈内に投与することで動物を安楽死させた。流出として下大静脈のカニューレを用いて、１５分間にわたって圧力１００ｍｍＨｇで遠位大動脈内に２％グルタルアルデヒドを注入することで腸骨動脈を灌流固定した。
【００７７】
定量的血管造影法
ベースライン血管造影（拡張前後）、及びフォローアップ血管造影からの最大不透明のフレームを、その後の定量分析用に保存した。拡張前後の動脈径及びバルーンと動脈の比を測定した。最小内腔径、基準径及び狭窄を判定した。測定はすべて、ディジタル電子カリパス（サンドヒル、モデルＥＣ−１）により行った（１２）。腹上に配置し、８大気で膨張させたバルーン血管造影カテーテル（Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）２．５ｍｍ）（定格バルーン径２．５ｍｍ）を径測定用に用いた。結果は表２に示されている。
【００７８】
0004465672.tif 000003
【００７９】
表に示された結果は、拡張処置後の動脈が対照群と投与群で等しいことを明らかに示している。しかし、６週間後のフォローアップ時の結果は、ＴＴＡが動脈径の減少を阻害したため、ＴＴＡが再狭窄形成を予防又は減少させうることを示す。
【００８０】
実施例４
ミニブタにおける再狭窄の予防
−ＴＴＡの局所投与
ＰＴＣＡと共に薬剤の局所適用を可能にするさまざまな局所薬物送達システムが開発されている。本試験では、トランスポート（Transport）（登録商標）多孔血管形成バルーンカテーテルを介して、ミニブタ２０匹をプラセボ又は脂肪酸類似体テトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）による活性治療に無作為化した。このカテーテルはバルーンを取り巻くスリーブを有し、薬物は多孔を有するスリーブに接続した分離内腔を通じて送達される。
【００８１】
特大のバルーンを用いた冠バルーン血管形成損傷をＬＡＤ又はＬＣｘに行った後、活性薬０．５ｍｌ（０．３３ｍｇ／ｍｌＴＴＡ）／プラセボのボーラスを３回送達した。前節に示した定量的血管造影を損傷前後及び４週間フォローアップ後に行った。その後、ブタを屠殺し、グルタルアルデヒドで灌流固定するとともに、コンピュータ面積測定による組織学用に血管を調製した。標識１−１４Ｃ−ＴＴＡを余分のブタ２匹に局所投与し、４週間後及び６週間後に冠状動脈における活性薬の存在を確認した。
【００８２】
前後及びフォローアップ時（バルーン損傷後６週間）の内腔径（ｍｍ）を表２に示す。
【００８３】
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【００８４】
結果は、それぞれ対照動物及びＴＴＡ投与動物のバルーン損傷後６週間の腸骨動脈を示す添付の図１及び２において視覚化もされている。
【００８５】
0004465672.tif 000005
【００８６】
組織学：
腸骨動脈の拡張セグメントを、解剖学的特徴として腸骨−仙骨関節を用いて、Ｘ線透視法により局在し、ブロックで切開した。連続切片を処理し、セグメントをパラフィンで包埋した。ヘマトキシリン−エオキシン及びヴァーヘフ−ファンギーソン染色法で断面を染色した。全切片を内膜増殖、内部弾性内腔の中断、内腔及び内膜血栓の存在のほか、血管面積について評価した（データは示さず）。
【００８７】
実施例５
平滑筋細胞増殖の減少
再狭窄病変は血管の内膜層における平滑筋細胞の過増殖を示すとみられるため、われわれは培養筋細胞に対するＴＴＡの効果を試験した。
【００８８】
ＳＭＣはアメリカ型培養コレクションから入手可能なヒト平滑筋細胞である（１９９９−ＣＲＬ型）。ＳＭＣ細胞をハムス（Ham's）Ｆ１２Ｋ培地中の瓶（７５ｃｍ２）で培養した。インキュベーションの２４時間後、脂肪酸及びＢＳＡをモル比１：２：５で培地に添加、すなわち、パルミチン酸及びＴＴＡの最終濃度を１００μＭとした。３日及び６日後、細胞をトリプシン化し、血算板付き光学顕微鏡（ライツヴェツラー（Leitz Wetzler）を用いて細胞数を測定した。
【００８９】
図３は平滑筋細胞に対するＴＴＡの阻害効果を示す。
【００９０】
平滑筋細胞増殖の阻害は、ＴＴＡの再狭窄予防効果のいくつかの機序のひとつとみられる。
【００９１】
実施例６
ＴＴＡは血漿ホモシステインの濃度を減少させる
ホモシステインの濃度上昇、すなわち高ホモシステイン血症は動脈疾患と関係があることが提案されているため、われわれは、１０日間、１日あたり３００ｍｇＴＴＡ／ｋｇ体重を投与した雄ウィスターラットからの血漿試料中のホメシステイン濃度を測定した。
【００９２】
完全に自動化した蛍光アッセイにより総血漿ホモシステインを測定した。３０μｌの血漿を３０μｌのＮａＢＨ４／ＤＭＳＯ溶液で還元した（６ｍｏｌ／Ｌ）。１．５分後、アセトニトリル中の２０μｌの蛍光試薬モノブロビマン（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加し、３分間反応させた。そして、強力イオン交換カラム、さらにシクロヘキシルシリカカラム内に変化するカラムによるＨＰＬＣで２０μｌの試料を直ちに分析した。ＳＣＸカラムを同等に溶離し、２０ｎｍｏｌ／Ｌギ酸緩衝液中でＣＨカラムを直線メタノールグラジエント法により溶離した（５分で１７〜３５％）。ホモシステインは保持時間４．５分で溶離した。結果を表４に示す。
【００９３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  バルーン損傷後６週間での対照動物の腸骨動脈を示す図である。
【図２】  バルーン損傷後６週間でＴＴＡを投与した動物からの腸骨動脈を示す図である。
【図３】  平滑筋細胞の増殖に対するＴＴＡの抑制効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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