(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンを含有してなる肝硬変予防・治療剤。
【請求項２】
アディポネクチンを含有してなる、活性化肝星細胞に起因する請求項１記載の肝硬変予防・治療剤。
【請求項３】
アディポネクチンを含有してなる、活性化肝星細胞に起因する肝線維化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアディポネクチンを含有してなる肝線維化抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝臓は再生力の非常に強い臓器として知られている。しかし、慢性肝疾患においては持続的な肝細胞壊死後の再生過程において線維化が起こり、正常な肝細胞の再生を妨げている。その理由として、肝線維化に関わる細胞外マトリックス増加による類洞内血流の低下や、線維により肝再生の場がなくなることなどがあげられている。
肝線維化に関わる細胞外マトリックス産生は主に活性化肝星細胞ＨＳＣ（Hepatic Stellate Cell）で行われている。ＨＳＣはＴＧＦ( Transforming Growth Factor)-β、ＰＤＧＦ(Platelet Derived Growth Factor)などのサイトカインや酸化ストレスなどにより活性化されると、α− 平滑筋アクチン（αＳＭＡ）を発現し筋細胞としての性格も獲得して筋線維芽様細胞へと形質変換する。更に活性化したＨＳＣではＴＧＦβの受容体の発現が亢進し、オートクリン機序により細胞外マトリックス蛋白の産生が亢進する。また、ＴＧＦβは肝細胞の増殖抑制作用をも持ち合わせている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは何らかの方法でＴＧＦβおよびＰＤＧＦのＨＳＣに対する働きを阻害することができれば、肝線維化を抑制し、肝障害後の肝再生を正常に導くことができると考えた。本発明は、肝線維化を抑制し、線維化された肝臓を正常化する医薬を提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
アディポネクチンは、１９９６年、前田らによりヒト脂肪組織から新たに分離された動物脂肪組織特異的タンパク質であり、そのアミノ酸配列も明らかにされている。（ Maeda K, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 221:286(1996) )。
これとほぼ同時期に他の研究グループにより、マウス３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞からクローニングされたＡＣＲＰ３０と呼ばれる物質（ Scherer PE et al. J. Biol. Chem. 270:26746〜26749(1995) )はアディポネクチンと同一物質と考えられている。
このアディポネクチンは、脂肪組織のみならず、血中にも多量存在しており、正常ヒト血中には５〜１０μｇ／ｍｌという高濃度で存在している（ Arita Y et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:79〜83(1999) )。
また、このアディポネクチンは肥満が進むにつれてパラドキシカルに血中濃度が低下する。
【０００５】
このアディポネクチンの作用については、これまでにいくつかの研究グループにより血管平滑筋の増殖ならびに細胞遊走の抑制、抗動脈硬化作用のあることや、単球、マクロファージの活性化抑制、抗炎症作用などが判明しているが、その作用の全容については未だ明らかではない。
本発明らは、このアディポネクチンの作用について、種々検討を重ねるうち、これまで知られていなかった肝星細胞の活性化の抑制、細胞外マトリックス産生の抑制、肝星細胞増殖の抑制、肝細胞増殖促進などの作用を有していることを知った。これらの新知見を基に更に研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
（１）アディポネクチンを含有してなる肝硬変予防・治療剤、
（２）アディポネクチンを含有してなる、活性化肝星細胞に起因する（１）記載の肝硬変予防・治療剤、
（３）アディポネクチンを含有してなる、活性化肝星細胞に起因する肝線維化抑制剤、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
既に述べたように、アディポネクチンはヒトを含む動物の脂肪組織で産生され、血中にも多量存在するタンパク質である。
ヒト・アディポネクチンについては、これをコードするｃＤＮＡから遺伝子組換え法により高純度に精製されたものが得られている。（Arita, Y. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 79〜83(1999) ）。
マウス由来のＡＣＲＰ３０も、前述のとおり組み換え遺伝子の手技により高純度のものが得られており、市場で入手可能である。
本発明の肝線維化抑制剤を投与する対象の患者は、慢性肝臓疾患、特に慢性肝炎などにより、肝臓に線維化が起こっている患者あるいはその危険性のある患者である。そして、これらの患者に対して本発明の肝線維化抑制剤を投与することにより、肝線維化を阻止又は予防することができ、正常肝細胞の再生が促進される。
【０００８】
本発明の肝線維化抑制剤は、全身的または局所的に投与することができる。全身的としては静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射などの非経口法の他、経口投与等が挙げられ、いわゆる遺伝子治療も可能である。
本発明の医薬の製剤形態としては、注射剤などの液剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、坐剤などの固形剤などが挙げられる。
ヒトに非経口的に投与するために製造される組成物としては、注射剤、坐剤などが挙げられる。組成物が注射剤として製造される場合、たとえば溶剤（注射用蒸留水など）、安定化剤（エデト酸ナトリウムなど）、等張化剤（塩化ナトリウム、グリセリン、マンニトールなど）、ｐＨ調整剤（塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウムなど）、懸濁化剤（メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウムなど）を用いることができ、坐剤として製造される場合、たとえば坐剤基剤（カカオ脂、マクロゴールなど）などを適宜に選択して使用することができる。
【０００９】
ヒトに経口的に投与される組成物としては、たとえば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤および液剤などが挙げられる。組成物が粉末、顆粒、錠剤などとして製造される場合、固形組成物を製造するのに好適な任意の製薬担体、たとえば賦形剤（デンプン、トウモロコシデンプン、ブドウ糖、果糖、白糖など）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（デンプン、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプン、アラビアゴムなど）などを用いることができ、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなど）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロースなど）などで剤皮を施してもよい。さらに、持続性製剤（ＤＤＳ製剤）ためのコーティング剤として、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、ブルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合）などが用いられる。カプセル剤とする場合には、適当な賦形剤、例えば流動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、軽質無水ケイ酸など、また加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖などの他、上記崩壊剤などを適宜添加したものを均等に混和または、粒状、若しくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチンなど）にグリセリンまたはソルビトールなど加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤〔二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、エチル、プロピルエステル）など〕などを加えることができる。カプセル剤は通常のカプセルの他、腸溶コーティングカプセル、胃内抵抗性カプセル、放出制御カプセルとすることもできる。腸溶性カプセルとする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングしたリポソームを通常のカプセルに充填または、カプセル自身を腸溶性コーティング剤でコーティング、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形することができる。また、組成物がシロップや液剤として製造される場合、たとえば安定剤（エデト酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロースなど）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖など）、芳香剤などを適宜に選択して使用することができる。
【００１０】
投与量は、疾病の種類、患者の性別、年齢、疾病の程度、投与形態、投与ルート等により異なってくるが、静脈注射の場合、肝硬変を患っている成人一人当たり、一日１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは，３〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【００１１】
【実施例】
以下に試験例、実施例などを挙げて、本発明を更に具体的に説明する。
試験例１
１．材料と方法
ラット肝星細胞（ＲＨＳＣ）の分離
８週令の雄のＳＤ系ラットをネンブタールで麻酔した後開腹し、門脈にカニュレーションした。まずＣａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないハンクス（Ｈａｎｋｓ）液による灌流、つづいてコラゲナーゼ溶液による灌流によって肝を消化し、低速の遠心分離およびメッシュにて肝細胞を除いた非実質細胞浮遊液を得た。続いてエルトリエーションローター（３２５０回転／分、１８ｍｌ／分）を用いて肝星細胞を分離した。得られた肝星細胞をプラステックデッシュにまいた後、トリプシン／ＥＤＴＡ法で継代していき、３から５代継代培養したものを以下の実験に用いた。
培地は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で、抗生剤として２５ｍｇ／ｌのセファメジンと３０ｍｇ／ｌのカナマイシンを用いた。
【００１２】
２．ＲＨＳＣのＤＮＡ合成抑制作用
細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みにより評価した。即ち、９６ウェルのβプレートに９ｘ１０３個／ウェル ずつ４代継代したＲＨＳＣをまき、翌日細胞が接着していることを確認後、ＰＢＳで２回洗い、無血清 の培地に変えた。４８時間後アディポネクチン（ＡＣＲＰ３０）を０、３、１０、３０μｇ／ｍｌの各濃度でＰＤＧＦ１０ｎｇ／ｍｌを添加、無添加のメディウムで各々６ウェルずつ１８時間刺激した。その後各ウェルに５時間１．０μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンを入れてパルスした後カウントした。結果は１ウェルの３０秒あたりのカウントで表記した〔図１〕。
〔図１〕から明らかなように，ＡＣＲＰ３０は、ＰＤＧＦによるＤＮＡ合成を濃度依存性に抑制した。
【００１３】
３．ＲＨＳＣ増殖抑制作用
１２ウェルのβプレートに４代継代したＲＨＳＣを２ｘ１０４個／ウェルずつまいた。翌日細胞が接着していることを確認後、２回ＰＢＳで洗浄し、無血清培地に変えた。４８時間後コントロール（ＰＤＧＦ（−）、ＡＣＲＰ３０（−））、ＰＤＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ添加でＡＣＲＰ３０を０、１０、３０μｇ／ｍｌの各濃度で添加し、各々３ウェルずつ刺激した。初日、２日目、４日目、６日目でトリプシン／ＥＤＴＡ法で細胞を剥がし、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。
結果は０日目の細胞数の平均値を１００％とし、パーセント表示した〔図２〕。
〔図２〕から明らかなように，ＡＣＲＰ３０は、濃度依存性にＰＤＧＦによるＲＨＳＣ細胞数の増殖を抑制した。
【００１４】
４．肝星細胞遊走能抑制作用
遊走能は２４ウェルβプレートと８μｍ−ポアサイズのセルカルチァーインサート（ケモタキセル、クラボウ）を用いて行った。ディッシュとセルカルチァーインサートは前もってコラーゲンＩで１時間コートしておいた。２枚の１０ｃｍディッシュでサブコンフルエントなＲＨＳＣを２回ＰＢＳで洗った後、無血清培地に変え、４８時間培養した。その後２回ＰＢＳで洗い、３０分間ＡＣＲＰ３０を３０μｇ／ｍｌ入れたものと、入れないものでインキユベートし、トリプシン／ＥＤＴＡ法で細胞を剥がした。細胞は無血清のＤＭＥＭ中に混ぜた。インサートを各種メディウムを入れた２４ウェルβ−プレートに静かにおいた。メディウムは全て無血清でＰＤＧＦ、ＡＣＲＰ３０の入っていないもの、ＰＤＧＦ１０ｎｇ／ｍｌとＡＣＲＰ３０を３０μｇ／ｍｌ入れたもので各３つのインサートを準備した。各インサート中には４ｘ１０４個ずつＲＨＳＣを撒いた。その後３７℃で５時間インキュベートし、インサートの裏側に出てきたＲＨＳＣをメイギムザ染色で染め、２００倍の視野で測定し、細胞をカウントした。結果はコントロールの細胞数の平均値を１００％とし、パーセント表示した〔図３〕。
〔図３〕から明らかなように、ＡＣＲＰ３０は、ＰＤＦＧによる刺激のないコントロールと同程度までＨＳＣの遊走を抑制した。
【００１５】
５．ＴＧＦβ刺激に対するＡＣＲＰ３０の効果
６ウェルβプレートにＲＨＳＣを撒き、サブコンフルエントの状態で２回ＰＢＳで洗った後、無血清のＤＭＥＭに変えた。４８時間培養しコントロール（ＴＧＦβ、ＡＣＲＰ３０ともなし）、ＴＧＦβ５０ｐｇ／ｍｌ、ＴＧＦβ５０ｐｇ／ｍｌ＋ＡＣＲＰ３０  ３０μｇ／ｍｌの各種メディウムで２４時間培養した。その後トリゾール法により各ウェルのＲＨＳＣからＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは吸光度計にて濃度を測定し、各１μｇずつをテンプレートにしてＲＴにてｃＤＮＡを作成した。そのうち０．５μｌをテンプレートにしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、サイバーグリーンを用いて染めた。ＰＣＲはＴＧＦβ、ＴＧＦβタイプIIレセプター、コラーゲンＩα１の各プライマーでそれぞれ増幅がリニアになるサイクル数で行った（ＴＧＦβ  ２５サイクル、ＴＧＦβタイプIIレセプター２４サイクル、コラーゲンＩα１  ２３サイクル）。泳動したゲルのバンドは蛍光イメージスキャナーにてコンピューターに取り込み Image Quant ソフトウエアにより定量した。
統計学分析はグループ間の比較にはKruskal-Wallisテストを用い、ペア間の比較にはScheffe テストを行った。統計学的優位差はＰ値が０．０５未満とした。
【００１６】
〔図４〕から明らかな様に、ＡＣＲＰ３０はＴＧＦβのオートクリン機序によるＴＧＦβｍＲＮＡの発現を顕著に抑制し得た。〔図５〕から明らかなようにＴＧＦβタイプIIレセプターの発現も抑制した。このことからＡＣＲＰ３０によりＴＧＦβのシグナル抑制効果があることが証明された。また、〔図６〕に示されるように、ＴＧＦβによりその発現が増加するコラーゲンＩα１遺伝子の発現もＡＣＲＰ３０により抑制された。
【００１７】
実施例１
製剤例１  注射剤
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これを２ｍＬのガラスアンプルに分注し、密封する。
製剤例２  錠剤（腸溶錠）
アディポネクチン                        ０．８ｇ
トウモロコシデンプン                      １２ｇ
乳糖                                  ２７．２ｇ
ステアリン酸マグネシウム                ０．４ｇ
アディポネクチン、乳糖およびトウモロコシデンプンを加えてよく混和し、湿性錠剤調製法に準じて打錠用顆粒とする。ステアリン酸マグネシウムを加えて打錠し、錠剤４００錠とする。錠剤は、腸溶性コーティング剤（メタアクリル酸コポリマー）でコーティングする。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の肝線維化抑制剤は、活性化された肝星細胞による線維化を抑制するのみならず、正常肝細胞の再生増殖を促進させるので、慢性肝炎等により肝臓の線維化が起こっている患者又は線維化が予想される患者に投与することにより、その線維化を予防・治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＣＲＰ３０によるＲＨＳＣのＤＮＡ合成抑制作用を示す。
【図２】ＡＣＲＰ３０によるＲＨＳＣの増殖抑制作用を示す。
【図３】ＡＣＲＰ３０によるＲＨＳＣの遊走抑制作用を示す。
【図４】ＡＣＲＰ３０によるＴＧＦβｍＲＮＡ発現抑制作用を示す。
【図５】ＡＣＲＰ３０によるＴＧＦβタイプIIレセプター発現抑制作用を示す。
【図６】ＡＣＲＰ３０によるコラーゲンＩα１遺伝子発現抑制作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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