(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（Ａ）を有するポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法。
工程（Ａ）：下記式(２)で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、水溶液がｐＨ７．１〜１３のアルカリ性を示すアルカリ金属の炭酸塩、リン酸塩または酢酸塩であって窒素を含まない固体塩の存在下、有機溶媒中にて反応させる工程。
【化１】
0004540287.tif 000015
（式（２）中、Ｒ3Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。Ｚは活性付与基である。）
【化２】
0004540287.tif 000016
（式（３）中、Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯはそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、ｋは１〜６である。）
【請求項２】
Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯが炭素数１２〜２０のアシル基である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ｐが０、Ｙがメチル基である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
工程（Ａ）で使用する固体塩が炭酸ナトリウムであり、有機溶媒がトルエンまたはクロロホルムである請求項１ないし３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｂ）を有する請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｂ）：酢酸エチルまたはアセトンを用いて式（３）で示される未反応のリン脂質を除去する工程。
【請求項６】
工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｃ）を有する請求項１ないし５のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｃ）：溶媒として酢酸エチルおよび／またはアセトンを用いて再結晶を行う工程。
【請求項７】
工程（Ｃ）において、さらに炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を溶媒として使用する請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）の後に行われる請求項６または７記載の製造方法。
【請求項９】
工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｄ）を有する請求項１ないし８のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｄ）：吸着剤を用いて精製を行う工程。
【請求項１０】
工程（Ｄ）で使用する吸着剤が、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウム若しくはケイ素を含有する吸着剤、または活性炭である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
工程（Ｄ）は、工程（Ｂ）の後に行われる請求項９または１０記載の製造方法。
【請求項１２】
ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が、モノアシルリン脂質体の含有量が３重量％以下であり、かつ窒素原子を有する塩基の含有量が０．０２重量％以下である下記式（１）で示される化合物である請求項１ないし１１のいずれかに記載の製造方法。
【化３】
0004540287.tif 000017
（式（１）中、Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯはそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、ｋは１〜６、Ｒ3Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｍは水素原子、ナトリウムまたはカリウム、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
【請求項１３】
モノアシルリン脂質体の含有量が２重量％以下である請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
ｐが０、Ｙがメチル基であり、モノアシルリン脂質体の含有量が０．５重量％以下である請求項１２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規かつ有用なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法に関し、特に生理活性物質の化学修飾や乳化、あるいはリポソームなどドラッグデリバリーシステムに使用可能なポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、抗癌剤等のリポソーム製剤の研究が広く行われてきており、その血中滞留性を向上する目的でリポソームの水溶性高分子修飾が盛んに行われている。その一つとして、リポソーム修飾ポリエチレンオキシド修飾リン脂質が用いられている。これらは医薬用途で使用するため、限りなく不純物が少ないか、または不純物が存在しないことが好ましい。
【０００３】
リポソーム修飾ポリエチレンオキシド修飾リン脂質の合成反応においては、例えばトリエチルアミンなどの窒素を含有する塩基を触媒として使用していることが多い。この場合、反応後に過剰に存在する塩基を除去するため、系中を酸性にする必要があった。この工程中、リポソーム修飾ポリエチレンオキシド修飾リン脂質の劣化が起こり、高純度品を得ることが困難であった。
また、トリエチルアミンなどの窒素を含有する塩基はアンモニア臭や独特の臭気を有していることが多い。作業環境上このような塩基は使用しないことが望ましい。
【０００４】
ポリエチレンオキシド修飾リン脂質の合成法について、M.C.Woodle（Biochimica et Biophysica Acta, 1105, 193-200(1992)らやS.Zalipsky（Bioconjugate Chem,4,296-299(1994)）らが報告している。具体的には、有機溶媒中、ポリエチレングリコールの末端を１，１’−カルボニルジイミダゾールやジスクシンイミジルカーボネートを用いて活性化した後、トリエチルアミン等の塩基存在下でリン脂質と反応させ、その後逆相シリカゲルクロマトグラフィーや透析などにより精製し、ポリエチレンオキシド修飾リン脂質を得る方法である。
この方法でも同様に反応直後、過剰に存在するトリエチルアミン等の塩基を除去するために系中を酸性にしている。このとき、モノアシルリン脂質（一般的にはリゾリン脂質と言われる）が生成する。これは生体毒性が強く、医薬用途、例えばドラッグデリバリーシステムとして利用される際に問題となる。
また、合成後の精製工程で逆相シリカゲルクロマトグラフィーや透析を行うと、カラムからの溶出時に製品の劣化や（前述のモノアシルリン脂質の生成など）、透析中に製品が加水分解を起こすなどといったことが生じる。したがって、高純度品を得ることが困難であり、工業的に見ても問題である。
【０００５】
以上のように従来の方法では、トリエチルアミン等の塩基が含まれていたり、またそれを除去しようとするとリゾリン脂質が含有されてしまったりと高純度製品を得ることは困難であった。また、従来の方法では、製品収率の悪さや、使用溶媒量が多量である点からも製品の工業的生産への展開は困難である。
そのため、トリエチルアミンなどの窒素原子を有する塩基やモノアシルリン脂質等の不純物を含まない、純度の高いポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の簡便な合成法が望まれている。
【０００６】
またリン脂質は、乳化剤としても保湿剤としても優れた効果を有するため、医薬品のみならず化粧品に配合することは数多く検討されてきた。化粧品分野においては、リポソームとして、また他の界面活性剤の添加によりその利用が検討されてきた。しかし乳液および化粧水等への応用は溶解度の問題により添加量を上げると溶解しない等の問題があり困難であった。そのため本発明の界面活性剤以外の界面活性剤の添加量を多くしなければならなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、窒素原子を有する塩基やモノアシルリン脂質等の不純物含有量が少ない、高純度であるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、リン脂質の効果を有し、水溶液にも可溶であるため、界面活性剤として使用できるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法である。
（１）  下記工程（Ａ）を有するポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法。
工程（Ａ）：下記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と、下記式（３）で示されるリン脂質とを、水溶液がｐＨ７．１〜１３のアルカリ性を示すアルカリ金属の炭酸塩、リン酸塩または酢酸塩であって窒素を含まない固体塩の存在下、有機溶媒中にて反応させる工程。
【化４】
0004540287.tif 000002
（式（２）中、Ｒ3Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。Ｚは活性付与基である。）
【化５】
0004540287.tif 000003
（式（３）中、Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯはそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、ｋは１〜６である。）
（２）  Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯが炭素数１２〜２０のアシル基である上記（１）記載の製造方法。
（３）  ｐが０、Ｙがメチル基である上記（１）または（２）記載の製造方法。
（４）  工程（Ａ）で使用する固体塩が炭酸ナトリウムであり、有機溶媒がトルエンまたはクロロホルムである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）  工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｂ）を有する（１）ないし（４）のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｂ）：酢酸エチルまたはアセトンを用いて式（３）で示される未反応のリン脂質を除去する工程。
（６）  工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｃ）を有する上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｃ）：溶媒として酢酸エチルおよび／またはアセトンを用いて再結晶を行う工程。
（７）  工程（Ｃ）において、さらに炭素数５〜８の脂肪族炭化水素およびエーテルからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を溶媒として使用する上記（６）記載の製造方法。
（８）  工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）の後に行われる上記（６）または（７）記載の製造方法。
（９）  工程（Ａ）の後に、下記工程（Ｄ）を有する上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｄ）：吸着剤を用いて精製を行う工程。
（１０）  工程（Ｄ）で使用する吸着剤が、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウム若しくはケイ素を含有する吸着剤、または活性炭である上記（９）記載の製造方法。
（１１）  工程（Ｄ）は、工程（Ｂ）の後に行われる上記（９）または（１０）記載の製造方法。
（１２）  ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が、モノアシルリン脂質体の含有量が３重量％以下であり、かつ窒素原子を有する塩基の含有量が０．０２重量％以下である下記式（１）で示される化合物である上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の製造方法。
【化６】
0004540287.tif 000004
（式（１）中、Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯはそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアシル基、ｋは１〜６、Ｒ3Ｏは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜８００の数である。Ｍは水素原子、ナトリウムまたはカリウム、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）、ｐは０または１である。ｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。ｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基である。）
（１３）  モノアシルリン脂質体の含有量が２重量％以下である上記（１２）記載の製造方法。
（１４）  ｐが０、Ｙがメチル基であり、モノアシルリン脂質体の含有量が０．５重量％以下である上記（１２）記載の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質において、Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯは炭素数４〜２４、好ましくは１２〜２０のアシル基である。このアシル基は通常脂肪酸に由来する。Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯの具体的なものとしては、例えば酪酸、イソ酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸などの飽和および不飽和の直鎖または分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。Ｒ1ＣＯおよびＲ2ＣＯは互いに同じであっても異なっていてもよい。
【００１０】
前記式（１）においてＲ3Ｏで表されるオキシアルキレン基は炭素数２〜４、好ましくは２または３のオキシアルキレン基である。Ｒ3Ｏとしては、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基などが挙げられる。これらの中ではオキシエチレン基、オキシプロピレン基が好ましく、特にオキシエチレン基が好ましい。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよく、その組み合わせ方に制限はない。またブロック状であってもランダム状であってもよい。
【００１１】
前記式（１）においてｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、１０〜８００、好ましくは２０〜５００の数である。ｎが１０以上であると、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用した場合にデリバリー効果が高くなる。またｎが８００以下であると、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を製造する際、原料である前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物の粘度がさほど上昇しないので作業性がよいものとなる。
【００１２】
前記式（１）においてＭは水素原子、ナトリウムまたはカリウムである。前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、これらの混合物であってもよい。
リン酸基部分と塩を形成するナトリウムまたはカリウムは、通常薬剤等の調製に用いる生理食塩緩衝液中に含まれるものであり、さらに生体内にも存在するものである。したがって、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をドラッグデリバリーシステムに使用しても体内での毒性等の問題も少ない。Ｍがナトリウムまたはカリウム以外の金属イオン、例えばカルシウムまたはマグネシウム等の二価金属イオンの場合は、リン脂質２分子が会合した構造等をとるため、好ましくない。
【００１３】
前記式（１）においてｋは１〜６の整数であり、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２である。
前記式（１）においてＸは炭素数１〜３の２価の炭化水素基または−Ｃ(＝Ｏ)(ＣＨ2)ｑ−（ここでｑは１〜４）である。炭化水素基の具体的なものとしては−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−(ＣＨ2)3−、−ＣＨ(ＣＨ3)ＣＨ2−などが挙げられる。ｐは０または１である。
【００１４】
前記式（１）においてｐが０の場合、Ｙは水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、好ましくはアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられる。これの中ではメチル基が好ましい。
またｐが１の場合、Ｙは水素原子、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基またはチオール基であり、好ましくはアミノ基である。
Ｘｐ−Ｙとしてはメチル基、エチル基、プロピル基およびアミノメチル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００１５】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシルリン脂質体や触媒に由来する残留物である窒素原子を有する塩基などの不純物の含有量が少ない。
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質中に存在するモノアシルリン脂質体の含有量は３重量％以下、好ましくは２重量％以下、より好ましくは０．５重量％以下である。
【００１６】
また、窒素原子を有する塩基の含有量については０．０２重量％以下であり、より好ましくは０．０１重量％以下であり、さらに好ましくは実質的に含有されない。
窒素原子を有する塩基は、触媒に由来する残留物であり、例えばトリエチルアミンなどの塩基に由来するものであり、窒素原子を少なくとも１個有している。窒素原子を有する塩基として例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジメチルアミノピリジン、イミダゾール、ジエチルアミン、ジイソブチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミン、ジ−２−エチルヘキシルアミンなどが挙げられる。これらの中でも、特にトリエチルアミンが毒性の面で少ないことが望まれている。なお前記式（３）で示されるリン脂質は窒素原子を有しているが、分子内で中和されているため、窒素原子を有する塩基には該当しない。
【００１７】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は生体毒性が強いとされているモノアシルリン脂質の含有量が少なく、トリエチルアミンなどの窒素原子を有する不純物の含有量が少ないので、生体に対する安全性が高い。
また、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は生体内にも存在するナトリウムイオンまたはカリウムイオンの一価の金属陽イオンを含有しているので、生体に対する安全性が高い。
このように生体に対する安全性が高いため、界面活性剤、特に生体用の界面活性剤として利用することができる。その中でも、生理活性物質用の界面活性剤として好適に使用することができる。
【００１８】
本発明の界面活性剤は本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む界面活性剤である。通常、界面活性剤を含む組成物等の全組成に対して、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を０．０１〜３０重量％配合して使用することがが望ましく、好ましくは０．１〜５重量％配合して使用することが望ましい。なお、界面活性剤の使用量は、界面活性剤の使用目的や組成の違い等により適宜選択される。
【００１９】
本発明の界面活性剤は、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を１種または２種以上併用してもよく、または他の界面活性剤と併用してもよい。
本発明の界面活性剤は、１）水に不溶または難溶の対象物質を水、緩衝液などの分散媒に乳化させる乳化剤、２）水に不溶または難溶の対象物質を水、緩衝液などの分散媒に溶解させる可溶化剤、３）水に不溶または難溶の対象物質を水、緩衝液などの分散媒に分散させる分散剤、４）対象物質に親水性基および疎水性基を導入する両親媒性化学修飾剤などとして好適に用いることができる。
【００２０】
本発明の界面活性剤を用いて、乳化液、可溶化液または分散液を得ることができる。
本発明の界面活性剤を乳化剤、可溶化剤または分散剤として用いる場合、乳化剤、可溶化剤または分散剤は、本発明の界面活性剤のみを用いてもよく、また乳化、可溶化または分散に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
【００２１】
可溶化液または分散液の形態は限定されず、水または緩衝液などの分散媒に生理活性物質等を溶解させた溶解液、水または緩衝液などの分散媒に生理活性物質等を分散させた分散液等があげられる。
乳化液または可溶化液の形態は限定されず、本発明の界面活性剤によって形成されたミセル溶液、すなわちミセルの内部に親油性の生理活性物質を含有したミセル溶液、あるいは水または緩衝液などの分散媒に本発明の界面活性剤と親油性の生理活性物質等による分散粒子が、コロイド粒子またはそれ以上の大きな粒子として存在するエマルション溶液等があげられる。ミセル溶液としては、分散粒子径が１０〜３００ｎｍであるものを特に高分子ミセル溶液としてあげられる。エマルション溶液は、油相に生理活性物質を配合した水中油滴（Ｏ／Ｗ）型または水相に生理活性物質を配合した多層水中油滴（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型でもよい。
【００２２】
本発明の界面活性剤は、ポリオキシアルキレン基に由来する親水性と、アシル基に由来する疎水性とを有しているので乳化剤または可溶化剤として使用することができ、保存安定性にも優れている。さらに、生体細胞構成成分と同等のリン脂質および毒性の低いポリオキシアルキレン基からなるとともに、生体毒性があると言われているモノアシルリン脂質の含有量が少ないのでより安全性が高い。このようなポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む乳化剤または可溶化剤を使用することにより、例えば安全性の高い生理活性物質の乳化液または可溶化液を得ることができる。
【００２３】
乳化、可溶化または分散する対象物質としては、生理活性物質、脂溶性物質などが挙げられる。
生理活性物質としては具体的には、酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質またはホルモンなどが挙げられる。
脂溶性物質としてはリン脂質等の脂質、タキソールなどの脂溶性薬剤、あるいは通常油相に用いられる高級アルコール、エステル油、トリグリセリン、トコフェロールおよび高級脂肪酸等が挙げられる。
本発明の界面活性剤は、本発明の目的が損なわれない範囲において、グリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコール、脂肪酸エステル、防腐剤、抗酸化剤等の公知の他の成分を含有することができる。
【００２４】
本発明のポリオキシアルキレン鎖を含有する高分子界面活性剤を使用して、粒径１０〜３００ｎｍの微粒子がミセルとして存在する高分子ミセル溶液を得ることができる。
高分子ミセルとしては、前記式（１）で示される高分子界面活性剤のみを用いてもよく、また他の公知の成分を含んでいてもよい。後述するように前記式（１）における反応性基Ｙを介して他の公知の高分子を結合させた高分子界面活性剤を用いてもよい。高分子ミセル溶液中に含有される高分子ミセルは脂溶性薬剤の可溶化などに用いることができる。
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、上記記載のように生体細胞構成成分に近く、さらに高分子のポリアルキレンオキシド鎖を含有するため、調製された高分子ミセル溶液は、従来の界面活性剤を使用して得られるミセル溶液に比べて、水和層を有することにより安定性が高く、生体に対する毒性も低い。
【００２５】
高分子ミセルは、対象物質を０．０５〜２重量％、本発明の界面活性剤を全量に対して０．２〜８重量％配合したものが好ましい。
得られた高分子ミセルの動的光散乱測定による重量平均粒径は１０〜３００ｎｍ、好ましくは２０〜１００ｎｍである。
【００２６】
乳化液の調製は、水に対して乳化させる対象物質と本発明の界面活性剤を３０〜９０℃、好ましくは４５〜８５℃、より好ましくは６０〜８０℃に加温して混練りし、それに水または緩衝液などの水相を徐々に添加して混合し乳化液を得ることができる。水相には必要に応じて、公知の水溶性物質を溶解させておくこともできる。
乳化液の調製は上記のように油相と水相を分けて混合してもよいし、すべての成分をホモジナイザー、ソニケーター等で混合してもよい。通常対象物質は、全量に対して０．０１〜３０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、本発明の界面活性剤は全量に対して０．１〜４０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％配合して用いるのがよい。
【００２７】
可溶化液の調製は、水に対して溶解させる対象物質と本発明の界面活性剤を通常室温〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃において混合し、それに水または緩衝液などの水相を徐々に添加して混合し均一な可溶化液を得る。水相には必要に応じて、公知の水溶性物質を溶解させておくこともできる。
混合については、ホモジナイザーおよびソニケーター等を用いることができる。通常対象物質は、全量に対して０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％、本発明の界面活性剤は全量に対して０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％配合して用いるのがよい。
【００２８】
前記式（１）のＹが水素原子以外の反応性官能基である場合、本発明の界面活性剤を生理活性物質の両親媒性化学修飾剤として用いることができる。
両親媒性化学修飾剤は本発明の界面活性剤を１種または２種以上を含んでもよく、さらに生理活性物質の化学修飾に用いられている公知の他の成分を含んでいてもよい。
化学修飾される生理活性物質はアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有するものであれば特に限定されない。例えば酵素、抗体、その他のオリゴおよびポリペプチド、タンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等が挙げられる。
【００２９】
本発明の界面活性剤を生理活性物質の両親媒性化学修飾剤として使用する場合、前記式（１）のＹとしてはアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基およびチオール基が好ましい。アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基およびチオール基を有する場合、生理活性物質中に存在する官能基と容易に反応させることができる。例えば、Ｙがカルボキシル基の場合、生理活性物質中のアミノ基とＣＯＮＨ結合を形成させることにより、生理活性物質にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質骨格を導入することができる。
【００３０】
生理活性物質の両親媒性化学修飾剤を、可溶化液、乳化液、分散液、高分子ミセル溶液として用いることができる。例えば脂溶性薬物を本発明ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を用いて前記方法により高分子ミセル溶液を調製し、さらに前記式（１）のＹがカルボキシル基等の反応性官能基である揚合、抗体タンパク質のアミノ基と反応させて結合させることにより標的部位への投与を可能にした高分子ミセル製剤を得ることができる。
【００３１】
本発明の両親媒性化学修飾剤を用いて化学修飾された生理活性物質をリポソーム成分として用いることができる。この場合、生理活性物質をリポソーム表面に存在させることができる。例えば生理活性物質が抗体のタンパク質の場合には生理活性物質を標的細胞のリガンドとして用いることができるので、リポソームを標的細胞へ集中して輸送することができる。
生理活性物質の両親媒性化学修飾剤として用いる場合、可溶化液、乳化液、分散液、高分子ミセル溶液およびリポソーム溶液として用いることができる。
【００３２】
本発明のリポソームは、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含むリポソーム形成剤からなるリポソームである。またリポソーム膜の形成に用いられている公知の他の脂質を成分として含んでいてもよい。
通常は、リン脂質１モルに対して本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を０．００２〜０．２モル、好ましくは０．０１〜０．１モル配合して使用することが望ましい。ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はリポソームの全組成に対しては０．１〜２０重量％配合して使用することが好ましい。
【００３３】
本発明のリポソーム形成剤を用いて得られるリポソームは、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質と他の脂質を用いて製造することができる。
他の脂質としては、リン脂質、ステロール類、その炭素数８〜２２の飽和または不飽和のアシル基を有する化合物などが挙げられる。他の脂質はホスファチジルコリンを含むリン脂質単独であってもよいし、それ以外の脂質との混合脂質であってもよい。
【００３４】
リン脂質とは、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質を意味し、ステロール類とは、コレステロール、ジヒドロコレステロール、エルゴステロール、ラノステロールなどを意味する。
グリセロリン脂質としては、炭素数４〜２４、好ましくは１２〜２０の飽和または不飽和の直鎖または分岐のアシル基を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンが挙げられる。また卵黄レシチンおよび大豆レシチンのように天然物由来の混合脂質体としても用いることができる。
【００３５】
炭素数４〜２４のアシル基は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸等のカルボン酸由来のアシル基が挙げられる。
他の脂質は、具体的には例えば下記に示す組成比の混合脂質からなるものでもよい
ホスファチジルコリン／コレステロール／ホスファチジルグリセロールが２０〜９０／１０〜６０／２〜４０モル％、好ましくは３０〜６０／２０〜５０／１５〜２５モル％である。
【００３６】
本発明のリポソーム形成剤から得られるリポソームは、公知の方法で製造することができる。
例えば一般的なＢａｎｇａｈｍ法として、原料の脂質を溶解可能な有機溶媒に溶解し、エバポレーター等を用いて溶媒を除去して脂質薄膜を形成し、相点移転以上の温度で水和乳化後、超音波処理にてリポソーム溶液を得ることができる。また、上記原料の脂質を水和し、ホモジナイザー等を用いて相転移点以上の温度で乳化後、ポリカーボネートのメンブランを用いて加圧ろ過する方法（Hope M.J. et al, Biochimica et Biophysica Acta, 812, 55 (1985)）にてリポソーム溶液を得ることができる。また得られたリポソームはマルチラメラリポソームでも、シングルラメラリポソームでも適当な粒径に調節してもよい。好ましくは粒径６０〜３０ｎｍ、より好ましくは９０〜２００ｎｍのシングルラメラリポソームである。
【００３７】
本発明のリポソーム形成剤は、本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含んでいるので、リポソーム溶液として保存安定性に優れるとともに、生体毒性が強いモノアシルリン脂質の含有量が少なく、しかもトリエチルアミンなどの窒素を含有する不純物の含有量が少ないので生体にとって安全である。このため本発明のリポソーム形成剤を使用することにより、安全性の高いドラッグデリバリーシステムとして利用することができるリポソームを得ることができる。
【００３８】
リポソーム溶液として保存安定性に優れる理由としては、次のことが推測される。モノアシルリン脂質はジアシルリン脂質に比べて疎水性が低いので、リポソーム表面から脱離しやすい。このためモノアシルリン脂質の含有量が多い従来のリポソームはモノアシルリン脂質がリポソーム表面から脱離してリポソーム表面の水和層が減少するので、リポソーム粒子の凝集が起こり相分離を起こして不安定となりやすい。これに対して本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシル体含有量が少ないので、リポソーム表面からのリン脂質の脱離が起こりにくい。このためリポソーム溶液の保存安定性に優れたものとなる。
【００３９】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の合成法では、触媒としてトリエチルアミンなどの窒素を含有する塩基を使用していない。したがって、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質中には触媒に由来する有害な塩基が残存することなく、生体に安全で、かつ純度の高い、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を得ることができる。
【００４０】
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は次の工程（Ａ）により容易に製造することができる。
工程（Ａ）：前記式(２)で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と前記式（３）で示されるリン脂質を、水溶液がアルカリ性を示すアルカリ金属塩であって窒素を含まない固体塩の存在下、有機溶媒中にて反応させる工程。
【００４１】
工程（Ａ）で使用する前記式（２）で示される活性化ポリアルキレンオキシド化合物および前記式（３）で示されるリン脂質において、Ｒ1ＣＯ、Ｒ2ＣＯ、Ｒ3Ｏ、ｋ、ｎ、Ｘ、ｐおよびＹは前記式（１）で説明したものと同じである。
【００４２】
前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物において、Ｚは活性付与基であって、ポリアルキレンオキシド化合物に前記式（３）で示されるリン脂質との反応活性を付与する基であり、電子吸引性基、その他の基が含まれる。このような基として、具体的には、イミダゾール基、４−ニトロフェニルオキシ基、ベンゾトリアゾール基、塩素、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、カルボニロキシ−Ｎ−２−ピロリジノン基、カルボニル−２−オキシピリミジン基、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基、ペンタフルオロベンゾイル基などが挙げられる。この中でも、イミダゾール基、４−ニトロフェニルオキシ基、ベンゾトリアゾール基、塩素、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基が好ましく、特に４−ニトロフェニルオキシ基が特に好ましい。
【００４３】
前記式（３）で示されるリン脂質は天然リン脂質でも合成リン脂質でもよい。具体例として、例えば大豆および大豆水添ホスファチジルエタノールアミン、卵黄および卵黄水添ホスファチジルエタノールアミン等の天然および合成ホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。前記式（３）で示されるリン脂質としては、ｋが２であるホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００４４】
工程（Ａ）で使用する固体塩は、水溶液がアルカリ性を示すアルカリ金属塩であって窒素を含まない固体塩である。固体塩としては、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と、前記式（３）のリン脂質のアミノ基とを結合させることができ、水に溶解して水溶液にした場合のｐＨが７．１〜１３、好ましくは７．１〜１１のアルカリ性を示すアルカリ金属の炭酸塩、リン酸塩または酢酸塩である。固体塩としてはナトリウムまたはカリウムを含む固体塩であることが好ましい。具体的には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどである。この中でも好ましくは、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムであり、特に炭酸ナトリウムが好ましい。
固体塩の使用量は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の０．１〜１０００倍モルであることが好ましい。１０００倍モル以下であると攪拌が容易であるので好ましい。固体塩の使用量は特に、１〜５００倍モルであるのが望ましい。
【００４５】
使用する前記式（２）のポリアルキレンオキシド化合物の活性化体と前記式（３）のリン脂質の仕込み量は、モル比が１：１ないしリン脂質が過剰となるように設定することが望ましい。具体的には、ポリアルキレンオキシド化合物の活性化体とリン脂質のモル比が１：１〜１：５、好ましくは１：１．１〜１：２、さらに好ましくは１：１が望ましい。
リン脂質が過剰となる場合、後に述べる工程において生成物から除去することが可能である。一方、ポリアルキレンオキシド化合物が過剰となる場合、反応終了後に未反応のポリアルキレンオキシド化合物が残存する。この場合、ポリアルキレンオキシド化合物の分子量が約１００〜約３０００の場合は残存するポリアルキレンオキシド化合物を再結晶や晶析等の方法により除去することができる。ただしポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の収率が低下する場合がある。一方、ポリアルキレンオキシド化合物の分子量が約３０００以上の場合、残存するポリアルキレンオキシド化合物の除去は困難であることが多く、高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を得るのが難しくなるので、前記モル比が好ましい。
【００４６】
本発明の製造方法は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、上記のように前記固体塩の存在下に反応させることができる。ただし、場合によっては本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は、リン脂質の活性化体と、ポリアルキレンオキシド化合物を反応させて得ることもできる。
【００４７】
工程（Ａ）の反応に使用する有機溶媒は、出発原料および反応生成物と反応しないか、ほとんど反応しないものであれば特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼンおよびトルエンなどの非プロトン性溶媒などが挙げられる。これらの中ではトルエン、クロロホルムが好ましい。エタノールなどの水酸基を有する有機溶媒は、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の活性化体の末端活性基と反応するので好ましくない。ジクロロメタン等でも反応性には問題はないが、低沸点であるため作業上好ましくない。
【００４８】
工程（Ａ）の反応の反応温度は３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は１時間以上、好ましくは２〜１０時間とするのが望ましい。
【００４９】
このようにして前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と前記式（３）で示されるリン脂質とを反応させることにより、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が得られる。
【００５０】
なお工程（Ａ）において、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物の末端がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基、特にアミノ基の場合にはこれらの基を保護して反応に供するのが好ましい。例えば、アミノ基の場合にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基または９−フルオレニルメチルカルボニル基等の保護基を付け、カルボキシル基の場合にはメチル基等によりエステル化して保護し、またチオール基の場合にはＳ−ｔ−ブチルスルフィド基等の保護基を付けて保護するのが好ましい。
【００５１】
工程（Ａ）で得られた反応液から固体塩を濾過後、濾液を濃縮または貧溶媒に投入して結晶化するなどの方法により、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で得ることができる。濾過に使用する濾材は、被処理液の不溶物を除去することができるものであれば特に制限はなく、通常は保留粒子細孔径が１〜１０μｍで耐溶媒性を有する紙、ガラスなど各種の材質のフィルターを使用することができる。濾過方法には制限なく、例えば減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過などの方法を用いることができる。
また、工程（Ａ）で得られた濾液をｐＨ調整することにより、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を、前記式（１）のリン酸基部のＭが水素である水素タイプおよびＭがナトリウムやカリウムであるアルカリ塩タイプに変換することもできる。
【００５２】
得られたポリアルキレンオキシド修飾リン脂質またはポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を含む工程（Ａ）の溶液を、下記のような工程（Ｂ）〜（Ｄ）を経ることにより、さらに高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を得ることができる。なお、工程（Ｂ）〜（Ｄ）は、前記の濾過により工程（Ａ）の反応液から固体塩を除去した後に行うことが好ましい。
【００５３】
工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で得られた結晶を有機溶媒に溶解した時に不溶物として存在する前記式（３）で示される過剰のリン脂質、すなわち未反応のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンを除去する。
使用する有機溶媒としては、目的物であるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解するが、過剰に存在するリン脂質を溶解しない溶媒、またはリン脂質の溶解度が低い溶媒が好ましい。有機溶媒としては酢酸エチルまたはアセトンが好ましく、特にアセトンが好ましい。
工程（Ｂ）の溶解温度は０〜８０℃が好ましく、特に２０〜７０℃が好ましい。
有機溶媒の使用量は結晶に対して、１〜１００重量倍であり、好ましくは２〜５０重量倍である。
【００５４】
工程（Ｂ）の溶液から不溶物を濾過後、濾液を濃縮または貧溶媒に投入して結晶化するなどの方法により、前記式（１）で示される本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で得ることができる。
なお得られた濾液を冷却するだけでも結晶化を行うことはできるが、溶媒の種類によっては、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が十分に析出せず溶液中に残存し、収率が低下する可能性がある。
また、蒸留等により有機溶媒を除去して結晶化してもよい。有機溶媒を留去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が分解するなど望ましくない副反応が起こる可能性がある。
【００５５】
また、前述のように、工程（Ｂ）で得られた濾液をｐＨ調整することにより、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を水素タイプやアルカリ塩タイプに変換することもできる。
【００５６】
工程（Ｂ）は工程（Ａ）の後、または以下に述べる工程（Ｃ）、工程（Ｄ）の前のいずれに行ってもよいし、工程（Ｃ）および／または工程（Ｄ）の後に行ってもよい。
【００５７】
工程（Ｂ）で得られた結晶はそのまま本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、さらに精製に供してもよい。
【００５８】
本発明の方法において、工程（Ａ）の後に、以下に述べる工程（Ｃ）および／または（Ｄ）を行うことにより、工程（Ａ）中で原料である前記式（２）で示される活性化ポリアルキレンオキシド化合物の活性付与基Ｚより生成したＺ由来の化合物を除去することが好ましい。工程（Ｃ）、（Ｄ）は、それぞれ工程（Ａ）の後において、工程（Ｂ）の前または後であってもよく、工程（Ｃ）と工程（Ｄ）はどちらが先であってもよい。ただし、工程（Ｂ）の後に、工程（Ｃ）、（Ｄ）が行われることが好ましく、また工程（Ｃ）の後に工程（Ｄ）が行われることが好ましい。
【００５９】
工程（Ｃ）では、工程（Ａ）で得られた結晶を溶解し、冷却しまたは貧溶媒を加えてポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させることによりＺ由来の化合物を除去して精製を行う。
工程（Ｃ）で使用する溶媒は、工程（Ａ）で得られた結晶を溶解し、冷却によってポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶が析出する溶媒、または貧溶媒を加えることによりポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を結晶化させることのできる溶媒が好ましい。結晶が析出する際、目的物であるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は結晶化し、Ｚ由来の化合物は溶解したままであるような溶媒が特に好ましい。
工程（Ｃ）で使用する溶媒量は結晶に対して１〜１００重量倍であり、好ましくは２〜５０重量倍である。
【００６０】
工程（Ｃ）では、再結晶した後、冷却を行うか、または貧溶媒を用いて結晶化を行う。好ましくは、１０℃以下に冷却して行えば結晶化が十分に行われ、良好な収率で結晶が得られる。
溶媒を留去して結晶化してもよい。溶媒を留去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が分解するなど望ましくない副反応が起こる恐れがある。
【００６１】
工程（Ｃ）の具体的な方法としては、以下の方法を挙げることができる。
（i）酢酸エチル、アセトンから選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解後、冷却によってポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させる。
（ii）酢酸エチル、アセトンから選ばれる少なくとも１種の溶媒に溶解後、エーテルまたは炭素数５〜８の脂肪族炭化水素を用いてポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させる。
（iii）酢酸エチル、アセトンから選ばれる少なくとも１種の溶媒とエーテルまたは炭素数５〜８の脂肪族炭化水素の溶媒を組み合わせ、溶解した後、冷却することでポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の結晶を析出させる。
以上の方法の中でも、特に好ましくは、（i）の酢酸エチルを用いて溶解後、冷却し、結晶化させる方法が好ましい。
【００６２】
なお工程（Ｃ）で使用する前記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素には特に制限はない。例えば、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、３−メチルペンタン、ネオヘキサン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、３−エチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２，３，３−トリメチルブタン、オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチル−３−エチルペンタン、３−メチル−３−エチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３，３−テトラメチルブタンなどを挙げることができる。これらの中でヘキサンおよびヘプタンが好ましい。
【００６３】
工程（Ｃ）を行うにあたり、さらに純度を上げたい場合、同様に工程（Ｃ）を数回繰り返すことにより、さらに純度の優れたポリアルキレンオキサイド修飾リン脂質を得ることができる。
工程（Ｃ）により得られた結晶は、そのまま本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、さらに他の精製工程に供することもできる。
【００６４】
工程（Ｄ）では、結晶を溶媒に溶解後、吸着剤を添加して攪拌する等の方法によりＺ由来の化合物の除去行う。なお工程（Ｄ）は、工程（Ａ）で得られた反応液を濾過した濾液を用いても行うことができる。
工程（Ｄ）で用いる溶剤は、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン、アセトンなどが好ましく、特に酢酸エチルが好ましい。
【００６５】
吸着剤を用いて処理する温度は１０〜８５℃、好ましくは４０〜７０℃、時間は１０分〜５時間、好ましくは３０分〜３時間とするのが望ましい。
工程（Ａ）で得られた結晶を加熱溶解し、吸着剤処理してもよいが、上記温度で結晶が溶解しない場合や溶液の粘度が高い場合が多いため、酢酸エチルなどの本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を溶解する溶媒に希釈して処理することが好ましい。処理する温度が１０℃未満ではポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が析出する場合があり、吸着剤を除去する場合にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質も一緒に除去されて収率が下がるので好ましくない。また、８５℃を超えると、微量の水分が存在する場合、吸着剤処理中にポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の加水分解等が起こる可能性がある。
吸着剤の使用量は処理する結晶１００重量部に対して０．１〜２００重量部、好ましくは１〜５０重量部とするのが望ましい。吸着剤量が０．１〜２００重量部であると、Ｚ由来の化合物を充分に効率よく除去することができる。
【００６６】
工程（Ｄ）で吸着剤処理を行い、濾過などの方法により吸着剤を除去した後、冷却を行うか、または貧溶媒を用いて結晶化させることができる。好ましくは、１０℃以下に冷却して行えば結晶化が十分に行われ、良好な収率で結晶が得られる。
吸着剤除去後、溶媒を留去して結晶化してもよいが、溶媒を留去する場合、８０℃以下で減圧下で行うことが望ましい。有機溶媒の留去温度が８０℃を越えると、前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質のアシル基が分解するなど望ましくない副反応が起こる恐れがある。
【００６７】
工程（Ｄ）で用いる吸着剤としては、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、アルミニウム若しくはケイ素を含有する吸着剤または活性炭であり、例えば水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化ケイ素等を含有する吸着剤、活性炭などが挙げられる。これらの化合物を含有する吸着剤の市販品としては、キョーワード２００、キョーワード３００、キョーワード５００、キョーワード６００、キョーワード７００、キョーワード１０００、キョーワード２０００（協和化学工業（株）製、商標）、トミックス−ＡＤ３００、トミックス−ＡＤ５００、トミックス−ＡＤ７００（冨田製薬（株）製、商標）などが挙げられる。吸着剤は１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合せて使用することもできる。
【００６８】
工程（Ｄ）において得られた結晶は、そのまま本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質とすることもできるし、工程（Ｄ）の濾液を結晶化させずに、さらに吸着剤処理を行うなどして、さらに精製することもできる。
【００６９】
上記のような製造方法により、副生するモノアシルリン脂質の含有量が少なく、かつ従来の製造方法では触媒として利用され、最終生成物中から完全に分離することが困難であり、このため最終生成物中に残留していた窒素原子を有する塩基などの不純物含有量が少ない、高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を容易に高収率で製造することができる。
【００７０】
【発明の効果】
本発明で製造されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質は新規かつ有用である。本発明で製造されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質はモノアシルリン脂質体や窒素原子を有する不純物の含有量が少なく、生体に対する安全性の高い高純度のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質であるので、界面活性剤、特に乳化剤、可溶化剤、高分子ミセル形成剤、分散剤、両親媒性化学修飾剤およびリポソーム形成剤などとして好適に利用することができる。さらにこれらの中でもリポソーム形成剤として好適に利用することができる。
本発明のポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法では、前記式（２）で示されるポリアルキレンオキシド化合物と、前記式（３）で示されるリン脂質とを、水に溶解したときに水溶液がｐＨ７．１〜１３のアルカリ性を示すアルカリ金属塩の炭酸塩、リン酸塩または酢酸塩であって窒素を含まない固体塩の存在下、有機溶媒中にて反応させるので、モノアシルリン脂質体の含有量が少なく、窒素原子を有する不純物含有量が少ないポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度かつ高収率で、容易に製造することができる。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明する。各例中、％は特別な言及がない限り、重量％である。
【００７２】
実施例１
（１）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（４））の合成
【００７３】
【化９】
0004540287.tif 000005
【００７４】
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、２０ｇ、１０ｍｍｏｌ）にトルエン（８０ｍＬ）を加え、１１０℃で還流し、１時間脱水した。50℃に冷却後、１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．９５ｇ、１２ｍｍｏｌ）を加え、２時間反応させることにより、活性化体を得た。次に、炭酸ナトリウム（４２．４ｇ、４００ｍｍｏｌ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１１．２２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、６５℃に昇温後、８時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（３００ｍL）を入れ、結晶化させた。結晶を濾過後（この結晶１ｇをサンプリングした。これを工程（Ａ）におけるサンプル▲１▼とする：以下、同様にサンプリングしたものをサンプル▲２▼〜▲６▼とする）、結晶にアセトン（８０ｍL）を加え、５０℃に加温した。グラスフィルターにて濾過し、不溶物を除去した。濾液にヘキサン（１６０ｍL）を加え、晶析させ、５℃まで冷却した。その後、結晶を濾過した（工程（Ｂ）におけるサンプル▲２▼）。
【００７５】
結晶に酢酸エチル（４００ｍL）を加え、６５℃で溶解し３０分攪拌後、５℃に冷却した。析出した結晶を濾過した（工程（Ｃ）におけるサンプル▲３▼）。同様に酢酸エチルでの工程をもう１回行った（工程（Ｃ）におけるサンプル▲４▼）。
結晶を酢酸エチル（４００ｍL）にて溶解し、吸着剤としてキョーワード＃２０００（５ｇ）、キョーワード＃７００（０．８ｇ）を加え、６５℃にて１時間攪拌した。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、結晶化させた（サンプル▲５▼）。結晶を濾過後、同様に、吸着剤処理を１回行った。ヘキサン（２００ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物１４．６ｇ（収率５２．２％）を得た（工程（Ｄ）におけるサンプル▲６▼）。最終的に得られた結晶の純度は９８．４％であった。
【００７６】
各段階における生成物の分析は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５容量比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。
同様に、展開溶媒としてクロロホルム、メタノール、水、アンモニア水の混合比が６５：２５：４：０．１の混合溶媒を用いてＴＬＣを行った。
前者は、不純物として、リゾ体、フリーのリン脂質、フリーのポリエチレングリコール誘導体、トリエチルアミンの定量ができ、後者は、ポリオキシエチレン修飾リン脂質中のリン酸部のトリエチルアミン塩中のトリエチルアミン量を定量できる。
これらの方法により純度を求めた結果を表１に示す。
【００７７】
一方、各工程での物質中に含まれるＺ由来の化合物量を測定するため、サンプル▲１▼〜▲６▼についても分析を行った。サンプル▲１▼〜▲６▼を減圧下で乾燥後、それぞれ５０ｍｇをサンプル管にとり、エタノールで全量を５ｇにし、溶解した。分光光度計にて、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）由来の２４８ｎｍの吸光度を測定した。それぞれのサンプルの測定値から、各工程での１，１’−カルボニルイミダゾール由来の化合物の除去率を求め、得られたそれぞれの除去率を表２に示す。
【００７８】
表２の結果より、各工程において、Ｚ由来の化合物が減少し、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が精製されていることが確認できた。なお最終的には０．０２％程度の１，１’−カルボニルジイミダゾール由来の化合物を含んでいることとなるが、この程度の値は、不純物含有量としては無視できる値である。
【００７９】
実施例２
（２）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（５））の合成
【００８０】
【化１０】
0004540287.tif 000006
【００８１】
反応器にポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、５０ｇ、２５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（５３ｇ、５００ｍｍｏｌ）およびトルエン（２００ｍL）を入れ、７５℃に加温した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（１２．６ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）を添加し、９時間反応させることにより、活性化体を得た。６５℃に冷却後、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（２８．１ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を入れ、７．５時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（５００ｍL）を入れ、５℃に冷却後、析出した結晶を濾過した。この結晶にアセトン（２００ｍL）を加え、５０℃に加温した後、グラスフィルターにて濾過し、不溶物を除去した（工程（Ｂ））。
【００８２】
濾液にヘキサン（５００ｍL）を加えた後、５℃まで冷却した。析出した結晶を濾過後、工程（Ｃ）へ供した。工程（Ｃ）では、酢酸エチル（７５０ｍL）を加えて６５℃にて溶解し、３０分攪拌後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した。同様に酢酸エチルを用いた工程（Ｃ）をもう１回行った。
結晶を酢酸エチル（７５０ｍL）にて溶解し、吸着剤としてキョーワード＃２０００（12ｇ）、キョーワード＃７００（1ｇ）を加え、６０℃で１時間攪拌した。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｄ））。同様に、工程（Ｄ）の吸着剤による処理を２回行った。
ヘキサン（３００ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物３８．２ｇ（収率５４．６％）を得た。純度は９９．５％であった。純度の結果を表１に示す。
【００８３】
実施例３
（３）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（６））の合成
【００８４】
【化１１】
0004540287.tif 000007
【００８５】
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量５０００、２０ｇ、４ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１７．０ｇ、１６０ｍｍｏｌ）およびトルエン（７５ｍL）を入れ、７５℃に加温した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（２．７ｇ、１３.２ｍｍｏｌ）を添加し、９時間反応させることにより、活性化体を得た。６５℃に冷却後、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（４．５ｇ、６ｍｍｏｌ）を入れ、６時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（２００ｍL）を入れ、析出した結晶を濾過した。結晶にアセトン（１５０ｍL）を加え、５０℃に加温した後、グラスフィルターにて不溶物を除去した（工程（Ｂ））。
【００８６】
ヘキサン（３００ｍL）を加え、晶析させた。濾過後、得られた結晶に酢酸エチル（４００ｍＬ）を加え、６５℃にて溶解し、３０分攪拌後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｃ））。さらに酢酸エチルを用いた工程（Ｃ）を２回行った。
結晶を酢酸エチル（３６０ｍL）にて溶解後、吸着剤としてキョーワード＃２０００（４ｇ）、キョーワード＃７００（０．２ｇ）を加え、６５℃で１時間攪拌した。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｄ））。同様に、工程（Ｄ）の吸着剤による処理を２回行った。
ヘキサン（９０ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物１５．２ｇ（収率６５．４％）を得た。純度は９８．４％であった。純度の結果を表１に示す。
【００８７】
実施例４
（４）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（下記に示す式（７））の合成
【００８８】
【化１２】
0004540287.tif 000008
【００８９】
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量５０００、２０ｇ、４ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（３３．９ｇ、３２０ｍｍｏｌ）およびトルエン（７５ｍＬ）を入れ、７５℃に加温した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（２．８２ｇ、１４ｍｍｏｌ）を添加し、９時間反応させることにより、活性化体を得た。６５℃に冷却後、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（３．２ｇ、６ｍｍｏｌ）を入れ、５時間反応させた。
炭酸ナトリウムを濾過後、濾液にヘキサン（２００ｍL）を入れ、５℃に冷却した。析出した結晶を濾過し、結晶を得た。結晶にアセトン（１５０ｍL）を加え、５０℃に加温した後、グラスフィルターにて不溶物を除去した（工程（Ｂ））。
【００９０】
濾液にヘキサン（３００ｍL）を加え、晶析させた。濾過後、得られた結晶に酢酸エチル（４００ｍＬ）を加え、６５℃にて溶解し、３０分攪拌した。５℃に冷却後、析出した結晶を濾過した（工程（Ｃ））。さらに酢酸エチルを用いた工程（Ｃ）を２回行った。
結晶を酢酸エチル（３６０ｍL）にて溶解し、吸着剤としてキョーワード＃２０００（４ｇ）、キョーワード＃７００（０．２ｇ）を加えた。吸着剤を濾過後、５℃に冷却し、析出した結晶を濾過した（工程（Ｄ））。同様に、工程（Ｄ）の吸着剤による処理を２回行った。
ヘキサン（９０ｍL）にて結晶洗浄後、濾過、乾燥し、目的化合物１５．２ｇ（収率６５．６％）を得た。純度は９８．５％であった。純度の結果を表１に示す。
【００９１】
比較例１
（１）ピリジルジチオプロピオノイルアミノ  ポリエチレングリコール  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ピリジルジチオプロピオノイルアミノ  ポリエチレングリコール  サクシンイミジルカーボネート（１ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍＬ）に溶解し、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（０．３６ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、次にトリエチルアミン（０．３３ｍＬ、２．３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４０℃で１０分間攪拌した。反応液を減圧下、エバポレーターにて濃縮後、アセトニトリル（５０ｍＬ）を加え、この溶液を４℃で一晩冷蔵した。次に、遠心分離を行い、透明な溶液を分離した。溶液をエバポレーターにて濃縮後、結晶を乾燥した。収量は１．１５ｇであった。収率は９０．８％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９２】
表３で示したフリートリエチルアミン含有量、およびフリー塩含有量は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）のスポットにおいては、５％までは定量が可能であるが、それ以上については定量性がない。そのため、５％を超えるものについては、＞５とした。
【００９３】
比較例２
（２）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、２０ｇ、１０ｍｍｏｌ）にベンゼン（７５ｍＬ）を加え、還流し、脱水した。カルボニルジイミダゾール（１．７８ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加え、２時間還流し、活性化体を得た。ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（７ｇ、９．３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．１ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）を加え、２０時間還流した。反応溶液をエバポレーターにて濃縮し粗生成物を得た。
この粗生成物をＣ−１８逆相シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。Ｃ−１８逆相シリカゲルは（Ｂｉｏ-Gel  Ａ-１．５m）を使用し、溶離液はエタノール／水＝４／１を用いた。収量は  ５．０ｇ、収率は１８％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９４】
比較例３
（３）モノメチルポリオキシエチレンカルバミル  １−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミンの合成
ポリオキシエチレンモノメチルエーテル（分子量２０００、５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム/トルエン＝５０／２（ｗｔ／ｗｔ）（２５ｍＬ）に溶解後、トリホスゲン（０．８９ｇ、３ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で３時間反応させた。この溶液に、ジエチルエーテル（７５ｍＬ）を加え、沈殿させた。この沈殿物を濾過後、乾燥し、モノメチルポリオキシエチレン  クロロホルメート（４．７ｇ、９１％）を得た。
モノメチルポリオキシエチレン  クロロホルメート（４ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）および１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（１．６５ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３９ｍＬ、２．７６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３時間反応させた。
不溶物を濾過後、反応溶液をエバポレーターにて濃縮した。残渣に水（２０ｍＬ）を入れて溶解し、０．１Ｎ塩酸（５．０ｍＬ）を加えて水溶液を酸性にした。水溶液に塩化メチレン（２５ｍＬ）を加え、抽出した。同様に抽出を２回繰り返し、組み合わせた抽出液に硫酸ナトリウム（３０ｇ）を入れ、脱水した。硫酸ナトリウムを濾過後、エバポレーターにて濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的化合物１．５ｇを得た。収率は２８％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９５】
比較例４
（４）ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド  ポリオキシエチレンスクシニル  ホスファチジルエタノールアミンの合成
ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド  ポリオキシエチレン  サクシンイミジルカーボネート（１ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（６ｍＬ）に溶解した。ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（０．２９２ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１４４ｍＬ、１．０４ｍｍｏｌ）を入れ、４５℃で１０分間反応させた。
反応液に酢酸（０．０６ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）を加え、エバポレーターにて濃縮した。残渣に水（７．５ｍＬ）を加え、溶解後、エバポレーターにて少量のクロロホルムを留去した。反応液をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ  ＣＥ  透析チューブ（ＭＷＣＯ  ３０万）に入れ、５０ｍＭの生理食塩水（１５００ｍＬ×３）にて４℃で透析を行った（８−１６時間／１回透析）。さらに、イオン交換水にて透析後、０．２μｍの滅菌フィルターで濾過した。凍結乾燥後、目的物を得た。収量は０．５５ｇ、収率は４３．３％であった。純度の結果を表３に示す。
【００９６】
【表１】
0004540287.tif 000009
【００９７】
【表２】
0004540287.tif 000010
【００９８】
【表３】
0004540287.tif 000011
【００９９】
表１、表３の注
＊１  純度１：前記式（１）で示されるポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の純度。（単位％）
＊２  リゾ体含有量：モノアシルリン脂質体の含有量。（単位％）
＊３  フリーＰＥ含有量：未反応のリン脂質の含有量。（単位％）
＊４  フリーＰＥＧ誘導体含有量：ポリエチレングリコールおよび、その誘導体の含有量。（単位％）
＊５  フリートリエチルアミン含有量：トリエチルアミン含有量。（単位％）
＊６  フリー塩中のトリエチルアミンの含有量：リン酸トリエチルアミン塩中のトリエチルアミン含有量。（単位％）
【０１００】
表１、表３の結果から、実施例の製造方法は比較例に比べて、リゾ体やトリエチルアミンなどの不純物の含有量が少なく、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を高純度で製造することができることがわかる。
【０１０１】
実施例５
実施例３のモノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用して乳液を作製した。すなわち、表４の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
作製した乳液を４０℃で一か月保存した後、乳化状態を下記の基準により評価した。結果を表６に示す。
３：安定な状態
２：やや不均一な状態
１：クリーミングまたは分離している状態
【０１０４】
また、作製した直後の乳液を皮膚に塗布し、官能試験を行った。官能評価は５人の専門パネラーで行った。評価方法は、上腕部を洗浄した後に試料を塗布し、塗布直後および一晩経過後の皮膚刺激についての評価を下記３段階評価でそれぞれ行った。５人の合計点を表６に記す。
３：普通である。全く異常がない。
２：違和感がある。少し痒みを感じる。
１：痒みがある。皮膚に発赤を認める。
【０１０５】
実施例６
実施例２のモノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを使用してクリームを作製した。すなわち、表５の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、撹拌しながら水相部を同温度で添加した。
【０１０６】
【表５】
0004540287.tif 000013
【０１０７】
作製したクリームについて実施例５と同様の評価を行った。結果を表６に示す。
【０１０８】
比較例５および６
比較例３のモノメチルポリオキシエチレンカルバミル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて実施例５および実施例６と同様の試験を行った。結果を表６に示す。
【０１０９】
【表６】
0004540287.tif 000014
【０１１０】
実施例７
リポソーム溶液の安定性評価
ジパルミトイルホスファチジルコリン（１．９２ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）、コレステロール（０．４５ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）、実施例２で得たモノメチルポリオキシエチレン  カルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（０．４２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、クロロホルム５０ｍＬを加えて溶解し、ロータリーエバポレーターにて脱溶剤し、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成した。減圧下にて溶剤除去を十分に行い、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水液３０ｍＬを加えて分散し、さらに超音波洗浄器にて５分間処理を行いリポソーム溶液とした。
得られたリポソーム溶液を室温にて１か月間放置した。１か月後のリポソーム溶液の分散状態は、目視では変化が認められず、均一なリポソーム溶液であった。
【０１１１】
比較例７
比較例２で得たモノメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いて、実施例７と同様の評価を行った。その結果、リポソーム溶液は均一ではなく、脂質粒子が沈降していた。
【０１１２】
実施例８
カルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いたアスパラギナーゼの修飾
実施例３と同様にして得られたカルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（５ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）をクロロホルム５０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（０．１５ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加し、少量のクロロホルムに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２７ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加して室温にて２時間撹拌した。その後、濾過して不溶物を除去した溶液にジエチルエーテルを添加し、析出した結晶を濾過して得た。減圧にて溶剤を除去し、次の工程に用いた。
【０１１３】
アスパラギナーゼ０．１ｇをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水液５０ｍＬに溶解し、上記で得られたサクシンイミジルカルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを添加し、５℃で４時間撹拌した。この反応液を、ｐＨ７．４、４℃のリン酸緩衝生理食塩水液に対して透析して未反応物を除去し、その後凍結乾燥し、カルボキシメチルポリオキシエチレン  カルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンがアスパラギナーゼに結合した乾燥品を得ることができた。
【０１１４】
実施例９
カルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを用いた大豆水添ホスファチジルコリンの高分子ミセル溶液の調製
大豆水添ホスファチジルコリン（０．１ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と実施例３と同様にして得られたカルボキシメチルポリオキシエチレンカルバミルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１ｇ、１７ｍｍｏｌ）を蒸留水（５ｍＬ）に添加し攪拌混合した。均一な混合溶液に蒸留水（９５ｍＬ）を徐々に添加攪拌し、透明で均一な高分子ミセル溶液を得た。得られた溶液について粒度測定装置（NICOMP Model 370：野崎産業株式会社製）を用いて粒度分布を測定した。その結果平均粒径は３５ｎｍであった。
得られた高子ミセル溶液を室温にて１か月間放置した。１か月後の高分子ミセル溶液の状態は、目視では変化が認められず沈殿物のない均一な高分子ミセル溶液であった。