(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおいてアンドロゲン非依存性前立腺癌を処置するための薬学的組成物であって、モノクローナル抗体２Ｃ４（ＡＴＣＣ  ＨＢ１２６９７）またはそのヒト化形態、あるいは該モノクローナル抗体のフラグメントまたはそのヒト化形態を含み、該フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｖフラグメント、ジアボディ、直鎖状抗体およびｓｃＦｖからなる群より選択される、薬学的組成物。
【請求項２】
ヒトにおいてアンドロゲン非依存性前立腺癌を処置するための薬学的組成物であって、配列番号３で示される可変軽鎖（ＶＬ）ドメインおよび配列番号４で示される可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含むモノクローナル抗体、あるいは該抗体のフラグメントを含有し、該フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｖフラグメント、ジアボディ、直鎖状抗体およびｓｃＦｖからなる群より選択される、薬学的組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の薬学的組成物であって、配列番号３で示される可変軽鎖（ＶＬ）ドメインおよび配列番号４で示される可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体、あるいは該抗体のフラグメントを含む、薬学的組成物であって、ここで、該抗体が、インタクトなＩｇＧ抗体である、薬学的組成物。
【請求項４】
前記抗体が、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のＴＧＦ−α活性化をブロックする、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記抗体が、ＥｒｂＢへテロオリゴマーの形成をブロックする、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抗体が、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体およびｓｃＦｖからなる群より選択される抗体フラグメントである、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメントである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
化学療法剤をさらに含有する、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記化学療法剤が、タキサンである、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記薬学的組成物の投与が、前記ヒトにおいて、増加した前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を生じる、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記薬学的組成物の投与が、前記ヒトにおいて、増加した前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を生じる、請求項８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗ＥｒｂＢ２抗体での前立腺癌の処置に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＥｒｂＢファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、細胞の増殖、分化および生存の重要なメディエーターである。このレセプターファミリーは、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５neu）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む、４つの異なったメンバーを含む。
【０００３】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒトの悪性腫瘍において原因として関連付けられている。特に、ＥＧＦＲの増加した発現は、乳癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頸部癌および胃癌ならびに神経膠芽細胞腫において観察されている。増加したＥＧＦＲレセプター発現はしばしば、自己分泌刺激経路によるレセプター活性化を生じる、同じ腫瘍細胞による、ＥＧＦＲリガンドであるトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）の増加した産生と関連している。Ｂａｓｅｌｇａ  ａｎｄ  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６４：１２７−１５４（１９９４）。ＥＧＦＲまたはそのリガンドであるＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対して指向されるモノクローナル抗体は、このような悪性疾患の処置において治療剤として評価された。例えば、Ｂａｓｅｌｇａ  ａｎｄ  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ．，前出；Ｍａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４：１００２−１００７（１９８４）；およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１８９７−１９０５（１９９５）を参照のこと。
【０００４】
ＥｒｂＢファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５neuは最初に、化学的に処置されたラットの神経膠細胞腫からのトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。活性化された形態のｎｅｕプロトオンコジーンは、コードされるタンパク質の膜貫通領域における点変異（バリンからグルタミン酸へ）から生じる。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳癌および卵巣癌において観察され、そして乏しい予後に関連する（Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７−１８２（１９８７）；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７−７１２（１９８９）；および米国特許第４，９６８，６０３号）。今日までに、ｎｅｕプロトオンコジーンにおける点変異と類似した点変異はヒト腫瘍について報告されていない。ＥｒｂＢ２の過剰発現（頻繁であるが均質ではない。遺伝子増幅に起因）もまた、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌を含めて、他の癌において観察されている。とりわけ、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７４（１９８５）；Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：１：７６５−７６７（１９８６）；Ｆｕｋｕｓｈｉｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：９５５−９５８（１９８６）；Ｇｅｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，３：２１−３１（１９８８）；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：８１−８８（１９８９）；Ｙｏｎｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：１０３４（１９９１）；Ｂｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，３８：３６４（１９９０）；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：４２１−４２５（１９９０）；Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：５１８４（１９９０）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：６６０５（１９８９）；Ｚｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３：３５４−３５７（１９９０）；Ａａｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５８−３６３（１９８８）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｉｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：４６−５２（１９９１）；およびＭｃＣａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，６５：８８−９２（１９９０）を参照のこと。ＥｒｂＢ２は、前立腺癌において過剰発現され得る（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．９９：１８５−１８９（１９９６）；Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：８２７−８３３（１９９７）；Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ７９：２１６２−２１７０（１９９７）；およびＳａｄａｓｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１２６−１３１（１９９３））。ラットｐ１８５neuおよびヒトＥｒｂＢ２タンパク質産物に対して指向される抗体は、記載されている。Ｄｒｅｂｉｎおよび共同実験者は、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５neuに対して抗体を惹起させた。例えば、Ｄｒｅｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：６９５−７０６（１９８５）；Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１９８：２７７−２９０（１９９１）；およびＷＯ９４／２２４７８を参照��こと。Ｄｒｅｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：２７３−２７７（１９８８）は、ｐ１８５neuの２つの異なる領域と反応性の抗体の混合物が、ヌードマウス中に移植した、ｎｅｕで形質転換したＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対して相乗的な抗腫瘍効果をもたらすことを報告する。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号もまた参照のこと。
【０００５】
Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５−１１７２（１９８９）は、ヒト乳腫瘤細胞株ＳＫＢＲ３を用いて特徴付けされた抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルの作製を記載する。抗体に対する曝露後のＳＫＢＲ３細胞の相対的細胞増殖は、７２時間後に、単層のクリスタルバイオレット染色によって決定された。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６％阻害した、４Ｄ５と呼ばれる抗体を用いて最大阻害が得られた。このパネルにおける他の抗体は、このアッセイにおいてより低い程度まで細胞増殖を減少させた。抗体４Ｄ５はさらに、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳房腫瘤細胞株を、ＴＮＦ−αの細胞傷害性効果に対して感作することが見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号もまた参照のこと。Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．に考察される抗ＥｒｂＢ２抗体は、Ｆｅｎｄｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０）；Ｋｏｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２６（３）：５９Ａ（１９９０）；Ｓａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １：７２−８２（１９９１）；Ｓｈｅｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（３）：１１７−１２７（１９９１）；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（２）：９７９−９８６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５−２６３（１９９３）；Ｐｉｅｔｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９−１８３８（１９９４）；Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：５３０１−５３０９（１９９４）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３００−５（１９９１）；Ｄ’ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７２０２−７２０６（１９９４）；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６）；およびＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７）においてさらに特徴付けられる。
【０００６】
組換えヒト化版のマウス抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に多量の抗癌治療を受けた、ＥｒｂＢ２を過剰発現する転移性乳癌を有する患者において臨床的に活性である（Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７−７４４（１９９６））。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎから１９９８年９月２５日に、腫瘍がＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の処置についての販売認可を受けた。
【０００７】
種々の特性を有する他の抗ＥｒｂＢ２抗体が以下に記載される：Ｔａｇｌｉａｂｕｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３−９３７（１９９１）；ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３−５４８（１９８９）；Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１−５３６９（１９９１）；Ｂａｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０−３６２（１９９０）；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ８８：８６９１−８６９５（１９９１）；Ｂａｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０−２５８９（１９９２）；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１−４０８（１９９３）；ＷＯ９４／００１３６；Ｋａｓｐｒｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１−２７７６（１９９２）；Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０（１９９１）；Ｓｈａｗｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７−１３７３（１９９４）；Ａｒｔｅａｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８−３７６５（１９９４）；Ｈａｒｗｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０−１５１６７（１９９２）；米国特許第５，７８３，１８６号；およびＫｌａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７）。
【０００８】
相同性スクリーニングによって、ＥｒｂＢレセプターファミリーの２つの他のメンバー（ＥｒｂＢ３（米国特許第５，１８３，８８４号および同第５，４８０，９６８号、ならびにＫｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３−９１９７（１９８９））およびＥｒｂＢ４（ＥＰ特許出願番号５９９，２７４号；Ｐｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１７４６−１７５０（１９９３）；およびＰｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７３−４７５（１９９３））が同定された。これらのレセプターは両方とも、少なくともいくつかの乳癌細胞株に対して発現の増加を提示する。
【０００９】
ＥｒｂＢレセプターは一般に、細胞において種々の組み合わせで見出され、そしてヘテロダイマー形成は、種々のＥｒｂＢリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Ｅａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３５：１１５−１３２（１９９５））。ＥＧＦＲは、以下の６つの異なるリガンドによって結合される：上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−ａ）、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）およびエピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５−２５７（１９９４））。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヒレグリンタンパク質のファミリーは、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４についてのリガンドである。ヒレグリンファミリーは、αヒレグリン、βヒレグリンおよびγヒレグリン（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；米国特許第５，６４１，８６９；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７））；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア増殖因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；ならびに感覚ニューロンおよび運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）を含む。概説について、Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５−２５７（１９９４）；Ｌｅｍｋｅ，Ｇ．Ｍｏｌｅｃ．＆  Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７−２６２（１９９６）およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．４７：５１−８５（１９９５）を参照のこと。近年、３つのさらなるＥｒｂＢリガンドが同定された；ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のいずれかに結合することが報告されている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８７  ５０９−５１２（１９９７）、ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）；ならびにＣａｒｒａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２−５１６（１９９７））；ＥｒｂＢ４に結合するニューレグリン−３（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ９４（１８）：９５６２−７（１９９７））；ならびにＥｒｂＢ４に結合するニューレグリン−４（Ｈａｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２６８１−２６８９（１９９９））。ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリンおよびエピレグリンもまたＥｒｂＢ４に結合する。
【００１０】
ＥＧＦおよびＴＧＦａはＥｒｂＢ２に結合しないとはいえ、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２を刺激してヘテロダイマーを形成し、これは、ＥＧＦＲを活性化し、そしてヘテロダイマーにおけるＥｒｂＢ２のトランスリン酸化をもたらす。ダイマー形成および／またはトランスリン酸化は、ＥｒｂＢ２チロシンキナーゼを活性化するようである。Ｅａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，前出を参照のこと。同様に、ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ２と同時発現された場合、活性なシグナル伝達複合体が形成され、そしてＥｒｂＢ２に対して指向された抗体はこの複合体を破壊し得る（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４））。さらに、ＥｒｂＢ３のヒレグリン（ＨＲＧ）親和性は、ＥｒｂＢ２と同時に発現された場合、より高い親和性状態へと上昇する。ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３タンパク質複合体に関して、Ｌｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１３２９−１３４０（１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１４３１−１４３５（１９９５）；およびＬｅｗｉｓ  ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：１４５７−１４６５（１９９６）もまた参照のこと。ＥｒｂＢ４は、ＥｒｂＢ３と同様に、ＥｒｂＢ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（Ｃａｒｒａｗａｙ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ  ７８：５−８（１９９４））。
【００１１】
（発明の要旨）
第１の局面では、本発明は、ヒトにおける前立腺癌（例えば、アンドロゲン非依存性前立腺癌）を処置する方法に提供し、この方法は、ＥｒｂＢ２に結合してＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする、治療有効量の抗体をヒトに投与する工程を包含する。好ましくは、この抗体は、ＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体２Ｃ４の結合をブロックするおよび／またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のＴＧＦ−α活性化をブロックする。
【００１２】
本発明はさらに、ヒトにおける前立腺癌を処置する方法を提供し、この方法は、治療有効量の化学療法剤（例えば、タキサン（ｔａｘａｎｅ））およびＥｒｂＢ２に結合してＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする治療有効量の抗体をヒトに投与する工程を包含する。
【００１３】
別の局面では、本発明は、容器およびその中に含まれる組成物を備える製品に関し、ここでは、この組成物は、ＥｒｂＢ２に結合してＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体を含み、そしてこの容器はさらに、この組成物が前立腺癌を処置するために用いられ得ることを示すパッケージ挿入物を含む。
【００１４】
さらに、本発明は、ヒトにおけるアンドロゲン依存性前立腺癌を処置する方法に関し、この方法は、ＥｒｂＢ２に結合する治療有効量の抗体をヒトに投与する工程を包含する。この方法は必要に応じて、ヒトにおける前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）指数の増加をもたらす。１つの実施形態では、この抗体は、ＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する抗体（例えば、モノクローナル抗体４Ｄ５（例えば、ヒト化４Ｄ５））である。別の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体２Ｃ４（例えば、ヒト化２Ｃ４）のような、ＥｒｂＢ２レセプターのリガンド活性化をブロックする抗体である。この方法は必要に応じて、化学療法剤（好ましくは、タキサン）をヒトに投与する工程をさらに包含する。
【００１５】
本発明は、さらなる局面において、容器およびその中に含まれる組成物を備える製品を提供し、ここで、この組成物は、ＥｒｂＢ２に結合する抗体を含み、そしてこの容器はさらに、この組成物がアンドロゲン依存性前立腺癌を処置するために用いられ得ることを示すパッケージ挿入物を含む。このパッケージ挿入物は必要に応じてさらに、患者を化学療法剤（例えば、タキサン）を用いて処置することを示す。
【００１６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
「ＥｒｂＢレセプター」は、ＥｒｂＢレセプターファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、そしてこれには、ＥＧＦＲレセプター、ＥｒｂＢ２レセプター、ＥｒｂＢ３レセプターおよびＥｒｂＢ４レセプターならびに将来同定されるであろうこのファミリーのほかのメンバーが含まれる。ＥｒｂＢレセプターは、一般に細胞外ドメインを含み、これは、ＥｒｂＢリガンド；新油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびいくつかのチロシン残基（これはリン酸化され得る）を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを結合し得る。ＥｒｂＢレセプターは、「ネイティブ配列」のＥｒｂＢレセプターまたはその「アミノ酸配列改変体」であり得る。好ましくは、ＥｒｂＢレセプターは、ネイティブ配列のヒトＥｒｂＢレセプターである。
【００１７】
用語「ＥｒｂＢ１」、「上皮増殖因子レセプター」および「ＥＧＦＲ」は、本明細書中で互換可能に使用され、そして例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：８８１−９１４（１９８７）に開示されるようなＥＧＦＲをいい、これは、天然に存在するその変異体形態（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：４２０７−４２１１（１９９０）におけるような欠損変異体ＥＧＦＲ）を含む。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子をいう。
【００１８】
表現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は、本明細書中で互換可能に使用され、そして例えば、Ｓｅｍｂａら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７−６５０１（１９８５）およびＹａｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４（１９８６）に記載されるヒトＨＥＲ２タンパク質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３）をいう。用語「ｅｒｂＢ２」は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子をいい、そして「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５neuをコードする遺伝子をいう。好ましいＥｒｂＢ２は、ネイティブ配列のヒトＥｒｂＢ２である。
【００１９】
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８４４号および同第５，４８０，９６８ならびにＫｒａｕｓら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３−９１９７（１９８９）に開示されるようなレセプターポリペプチドをいう。
【００２０】
本明細書中の用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、例えば、欧州特許出願第５９９，２７４号；Ｐｌｏｗｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１７４６−１７５０（１９９３）；およびＰｌｏｗｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６６  ４７３−４７５（１９９３）に開示されるようなレセプターポリペプチドをいい、これは、例えば、Ｗ０９９／１９４８８（１９９９年４月２２日公開）に開示されるようなそのアイソフォームを含む。
【００２１】
「ＥｒｂＢリガンド」は、ＥｒｂＢレセプターに結合し、そして／またはＥｒｂＢレセプターを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書中の特定の目的のＥｒｂＢリガンドは、以下のようなネイティブ配列ヒトＥｒｂＢリガンドである：上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｓａｖａｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：７６１２−７６２１（１９７２））；トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）（Ｍａｒｑｕａｒｄｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１０７９−１０８２（１９８４））；シュワン細胞腫またはケラチノサイトオートクライン増殖因子としても公知であるアンフィレグリン（Ｓｈｏｙａｂら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１０７４−１０７６（１９８９）；Ｋｉｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：２５７−２６０（１９９０）；およびＣｏｏｋら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５４７−２５５７（１９９１））；βセルリン（Ｓｈｉｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６０４−１６０７（１９９３）；およびＳａｓａｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：１１７３（１９９３））；ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：９３６−９３９（１９９１））；エピレグリン（Ｔｏｙｏｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７４９５−７５００（１９９５）；およびＫｏｍｕｒａｓａｋｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：２８４１−２８４８（１９９７））；ヘレグリン（以下を参照のこと）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Ｃａｒｒａｗａｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２−５１６（１９９７））；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：９５６２−９５６７（１９９７））；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Ｈａｒａｒｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２６８１−２６８９（１９９９））；またはクリプト（ｃｒｉｐｔｏ）（ＣＲ−１）（Ｋａｎｎａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）３３３０−３３３５（１９９７））。ＥＧＦＲと結合するＥｒｂＢリガンドとしては、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、βセルリン、ＨＢ−ＥＧＦおよびエピレグリンが挙げられる。ＥｒｂＢ３と結合するＥｒｂＢリガンドとしては、ヘレグリンが挙げられる。ＥｒｂＢ４と結合し得るＥｒｂＢリガンドとしては、βセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４およびヘレグリンが挙げられる。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはＭａｒｃｈｉｏｎｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２−３１８（１９９３）において開示されるようなヘレグリン遺伝子産物によりコードされるポリペプチドをいう。ヘレグリンの例としては、以下が挙げられる：ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２およびヘレグリン−β３（Ｈｏｌｍｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Ｐｅｌｅｓら，Ｃｅｌｌ  ６９：２０５−２１６（１９９２））；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Ｆａｌｌｓら，Ｃｅｌｌ  ７２：８０１−８１５（１９９３））；グリア増殖因子（ＧＧＦ）（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２−３１８（１９９３））；感覚および運動ニューロン由来因子（ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＭＤＦ）（Ｈｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４５２３−１４５３２（１９９５））；γ−ヘレグリン（Ｓｃｈａｅｆｅｒら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７））。この用語は、そのＥＧＦ様ドメインフラグメント（例えば、ＨＲＧβ１117-224）のような、ネイティブ配列のＨＲＧポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントおよび／またはアミノ酸配列改変体を含む。
【００２３】
本明細書中の「ＥｒｂＢヘテロオリゴマー」は、少なくとも２つの異なるＥｒｂＢレセプターを含む非共有結合したオリゴマーをいう。このような複合体は、２つ以上のＥｒｂＢレセプターを発現する細胞がＥｒｂＢリガンドに曝される場合に形成し得、そして例えば、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）に記載されるように、免疫沈降により単離され得、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され得る。このようなＥｒｂＢヘテロオリゴマーの例としては、ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ３−ＥｒｂＢ４複合体が挙げられる。さらに、ＥｒｂＢヘテロオリゴマーは、異なるＥｒｂＢレセプター（例えば、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４またはＥＧＦＲ）と組み合わされた２つ以上のＥｒｂＢ２レセプターを含み得る。サイトカインレセプターサブユニットのような他のタンパク質（例えば、ｇｐｌ３０）がヘテロオリゴマーに含まれ得る。
【００２４】
「ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化」は、目的のＥｒｂＢレセプターを含むＥｒｂＢヘテロオリゴマーに結合するＥｒｂＢリガンドにより媒介されるシグナル伝達（例えば、ＥｒｂＢレセプターまたは基質ポリペプチド中のチロシン残基をリン酸化するＥｒｂＢレセプターの細胞内キナーゼドメインにより引き起こされるシグナル伝達）を意味する。一般に、これは、ヘテロオリゴマー中の１つ以上のＥｒｂＢレセプターのキナーゼドメインを活性化し、そしてこれにより１つ以上のＥｒｂＢレセプター中のチロシン残基のリン酸化および／またはさらなる基質ポリペプチド中のチロシン残基のリン酸化を生じる、ＥｒｂＢリガンドのＥｒｂＢヘテロオリゴマーへの結合を含む。ＥｒｂＢレセプターの活性化は、種々のチロシンリン酸化アッセイを使用して定量され得る。
【００２５】
「ネイティブ配列」ポリペプチドは、天然に由来するポリペプチド（例えば、ＥｒｂＢレセプターまたはＥｒｂＢリガンド）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このようなネイティブ配列ポリペプチドは、天然から単離され得るかまたは組換えもしくは合成手段により生成され得る。従って、ネイティブ配列ポリペプチドは、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチドまたは任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。
【００２６】
用語「アミノ酸配列改変体」は、ネイティブ配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。通常は、アミノ酸配列改変体は、ネイティブＥｒｂＢリガンドの少なくとも１つのレセプター結合ドメインまたはネイティブＥｒｂＢレセプターの少なくとも１つのリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％の相同性を有し、そして好ましくは、これらは、このようなレセプターまたはリガンド結合ドメインと少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％相同である。アミノ酸配列改変体は、ネイティブアミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の部分において、置換、欠失および／または挿入を有する
「相同性」は、配列を整列させそして（必要ならば、相同性の最大パーセントを達成するために）ギャップを導入した後に同一である、アミノ酸配列改変体中の残基の割合として定義される。この整列化のための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。１つのこのようなコンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．により著された「Ａｌｉｇｎ  ２」であり、これは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ  ２０５５９にユーザー説明書と共に提出された（１９９１年１２月１０日）。
【００２７】
本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメント（これらのフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り）を包含する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に存在する可能性のある変異体を除いて同一である）から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、これらが抗原上の単一の決定基に対する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体により混入されずに合成され得る点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法にこの抗体の産生を必要とするとはみなされない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）により作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００２９】
本明細書中のモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体およびそのような抗体のフラグメント（これらが、所望の生物学的活性を示す限り）を含み、ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、その鎖の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに由来する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書中の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。
【００３０】
「抗体フラグメント」は、好ましくは抗原結合領域またはその可変領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’ フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、およびＦｖフラグメント；ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００３１】
「インタクトな」抗体は、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣL）および重鎖定常ドメイン（ＣH１、ＣH２およびＣH３）を含む抗体である。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列改変体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００３２】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはＦｃ領域のアミノ酸配列改変体）に起因する抗体の生物学的活性をいう。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。
【００３３】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は、異なる「クラス」に分類され得る。５つの主なクラスのインタクトな抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が存在し、そしてそれらのいくつかは、さらに「サブクラス」（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）に分類され得る。それらの異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、各々、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、公知である。
【００３４】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識しそして引き続きその標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応をいう。ＡＤＣＣの媒介についての主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施され得る。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ（例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）において開示されるような動物モデルにおいて）で評価され得る
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現しそしてエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、ネイティブその供給源から（例えば、本明細書中に記載されるように血液またはＰＢＭＣから）単離され得る。
【００３５】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γレセプター）を結合するＦｃＲであり、そしてこれらとしては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプター（これらのレセプターの対立遺伝子改変体および選択的スプライシングされた形態を含む）が挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターとしては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が挙げられ、これらは、そのレセプターの細胞質ドメイン中で主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプター（ＦｃγＲＩＩＡ）は、その細胞質ドメイン中に免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害レセプター（ＦｃγＲＩＩＢ）は、その細胞質ドメイン中に免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）中の総説Ｍ．を参照のこと）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説される。他のＦｃＲ（将来同定されるＦｃＲを含む）が、本明細書中の「ＦｃＲ」により包含される。この用語はまた、胎児への母性ＩｇＧの移行を担う新生児レセプター（ＦｃＲｎ）を含む（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｒｉｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００３６】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力をいう。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化された分子（例えば、抗体）への、補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）の結合により開始される。補体活性を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われ得る。
【００３７】
「ネイティブ抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔の空いた鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、それに続く一方の末端において、可変ドメイン（ＶH）と多くの定常ドメインの前有する。各軽鎖は、一方の末端において可変ドメイン（ＶL）を、そしてそのもう一方の末端において定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと共に整列され、そして軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界を形成すると考えられる。
【００３８】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で広範にわたり配列が異なり、そして各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用されるという事実をいう。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインの全体にわたり均等に分布しない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。各々４つのネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ＦＲを含み、れらのＦＲは、大部分がβシート構造をとり、３つの超可変領域に連結され、これらの超可変領域は、βシート構造に連結するするループを形成し、そして場合によっては、このβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって互いに近位に保持され、そして、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与）を示す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、残基５０−５６（Ｌ２）および残基８９−９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１−３５（Ｈｌ）、残基５０−６５（Ｈ２）および残基９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））ならびに／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌｌ）、残基５０−５２（Ｌ２）および残基９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｈ１）、残基５３−５５（Ｈ２）および残基９６−１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で規定するように、超可変領域の残基以外の可変ドメインの残基である。
【００４０】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント（各々、単一の抗原結合部位を有する）および残りの「Ｆｃ」フラグメント（この名前は、その容易に結晶化する能力を反映する）を生成する。パパイン処理は、２つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）2のフラグメントを生じ、そしてこれは、依然として抗原を架橋し得る。
【００４１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む、最小の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有結合した、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域は、ＶH−ＶL二量体の表面上の抗原結合部位を規定するために相互作用する。集団的に、この６つの可変領域は、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００４２】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、その定常ドメインのシステイン残基は、少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書中の名称である。Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメントは、本来、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた公知である。
【００４３】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に区別される型（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）のうちの１つに割り当てられ得る。
【００４４】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶHおよびＶLドメインを含み、ここでこれらのドメインは、一本のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶHドメインとＶLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｎｌａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６９−３１５頁（１９９４）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。抗ＥｒｂＢ２抗体ｓｃＦｖフラグメントは、Ｗ０９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号に記載される。
【００４５】
用語「ジアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶH−ＶL）中に可変軽鎖ドメイン（ＶL）に連結されている可変重鎖ドメイン（ＶH）を含む。同じ鎖上のこの２つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用して、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を作製する。ジアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載される。
【００４６】
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒトげっ歯類）（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで超可変ループは、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、そしてＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００４７】
ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体としては、米国特許第５，８２１，３３７号（本明細書中に参考として明確に援用される）の表３に記載されるような、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；本明細書以下に記載されるような、ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）およびヒト化２Ｃ４が挙げられる。
【００４８】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から同定されそして分離および／または回収された抗体である。その天然の環境の混入物成分は、その抗体についての診断的または治療的用途を干渉する物質であり、そしてこれらとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって測定した場合に、９５重量％を超える抗体にまで、そして最も好ましくは、９９重量％を超えるまでに精製されるか、（２）スピニングカップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ）配列決定装置の使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るに十分な程度に精製されるか、または（３）クーマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用する、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一なまでに精製される。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュでのその抗体を含む。なぜなら、その抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在していないからである。しかし、通常には、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００４９】
目的の抗原（例えば、ＥｒｂＢ２抗原）を「結合する」抗体は、その抗体が、その抗原を発現する細胞を標的化する際の治療薬剤として有用であるような十分な親和性で、その抗原を結合し得る抗体である。抗体が、ＥｒｂＢ２を結合する抗体である場合、この抗体は、通常、他のＥｒｂＢレセプターとは対照的に、ＥｒｂＢ２を優先的に結合し、そしてＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のような他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体であり得る。このような実施形態において、この抗体がこれらの非ＥｒｂＢ２タンパク質へ結合（例えば、内因性レセプターへの細胞表面結合）する程度は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析または放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって測定した場合に、１０％未満である。時には、この抗ＥｒｂＢ２抗体は、ラットｎｅｕタンパク質（Ｓｃｈｅｃｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１３（１９８４）およびＤｒｅｂｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５４５−５４８（１９８４）に記載のような）と有意に交差反応しない。
【００５０】
ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化を「ブロックする」抗体は、本明細書中上記で定義されたような活性化を減少するかまたは妨げる抗体であり、ここで、この抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも実質的により効果的に（例えば、モノクローナル抗体７Ｆ３または２Ｃ４あるいはそれらのＦａｂフラグメント
とほぼ同じぐらい効果的に、そして好ましくは、モノクローナル抗体２Ｃ４またはそのＦａｂフラグメントとほぼ同じくらい効果的に）ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックし得る。例えば、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体は、ＥｒｂＢヘテロオリゴマーの形成のブロックにおいて、４Ｄ５よりも約５０％〜１００％より効果的である抗体であり得る。ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化のブロックは、任意の手段、例えば、以下を干渉することによって生じ得る：ＥｒｂＢレセプターへリガンド結合、ＥｒＢ複合体形成、ＥｒｂＢ複合体におけるＥｒｂＢレセプターのチロシンキナーゼ活性および／あるいはＥｒｂＢレセプター中のまたはＥｒｂＢレセプターによるチロシンキナーゼ残基のリン酸化。ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体の例としては、モノクローナル抗体２Ｃ４および７Ｆ３（これらは、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロオリゴマーおよびＥｒＢ２／ＥｒｂＢ４ヘテロオリゴマーのＨＲＧ活性化；ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２ヘテロオリゴマーのＥＧＦ活性化、ＴＧＦ−α活性化、アンフィレグリン活性化、ＨＢ−ＥＧＦ活性化および／またはエピレグリン活性化をブロックする）；ならびにＬ２６抗体、Ｌ９６抗体およびＬ２８８抗体（Ｋｌａｐｐｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７））（これらは、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を発現するＴ４７Ｄ細胞へのＥＧＦ結合およびＮＤＦ結合をブロックする）が挙げられる。
【００５１】
示された抗体（例えば、この示されたモノクローナル抗体２Ｃ４）の「生物学的特性」を有する抗体は、同じ抗原（例えば、ＥｒｂＢ２）に結合する他の抗体とその抗体とを区別する、このような示された抗体の１以上の生物学的特性を保持する抗体である。例えば、２Ｃ４の生物学的特性を有する抗体は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４を含むＥｒｂＢヘテロオリゴマーのＨＲＧ活性化をブロックし得るか；ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２を含むＥｒｂＢレセプターのＥＧＦ活性化、ＴＧＦ−α活性化、アンフィレグリン活性化、ＨＢ−ＥＧＦ活性化および／またはエピレグリン活性化をブロックし得るか；ＭＡＰＫのＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよび／またはＨＲＧ媒介活性化をブロックし得るか；そして／または２Ｃ４によって結合されるエピトープ（例えば、モノクローナル抗体２Ｃ４のＥｒｂＢ２への結合をブロックする）と同じ、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中のエピトープを結合し得る。
【００５２】
他に示されない限り、用語「モノクローナル抗体２Ｃ４」とは、以下の実施例のマウス２Ｃ４抗体の、またはそれに由来する、抗原結合残基を有する抗体をいう。例えば、モノクローナル抗体２Ｃ４は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４またはその改変体（例えば、ヒト化２Ｃ４）であり得、その改変体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の抗原結合アミノ酸残基を保持する。ヒト化２Ｃ４抗体の例を、以下の実施例３に提供する。他に示されない限り、本明細書中で使用される場合、用語「ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４」は、ヒト軽鎖および重鎖ＩｇＧ１（非Ａアロタイプ）定常領域配列と融合された、それぞれ配列番号３および配列番号４の可変軽鎖（ＶL）配列および可変重鎖（ＶH）配列を含む抗体をいい、これは、必要に応じて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって発現される。
【００５３】
他に示されない限り、用語「モノクローナル抗体４Ｄ５」とは、マウス４Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）の、またはそれに由来する、抗原結合残基を有する抗体をいう。例えば、モノクローナル抗体４Ｄ５は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５またはその改変体（例えば、ヒト化４Ｄ５）であり得、その改変体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５の抗原結合アミノ酸残基を保持する。例示的なヒト化４Ｄ５抗体としては、米国特許第５，８２１，３３７号に記載のような、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））が挙げられ、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））が好ましいヒト化４Ｄ５抗体である。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「増殖阻害薬剤」とは、インビトロまたはインビボで、細胞（特に、ＥｒｂＢ発現癌細胞）の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。従って、増殖阻害薬剤は、Ｓ期にあるＥｒｂＢ発現細胞の割合を有意に減少させる薬剤であり得る。増殖阻害薬剤の例としては、（Ｓ期以外で）細胞周期進行をブロックする薬剤（例えば、Ｇ１阻止およびＭ期阻止を誘導する薬剤）が挙げられる。古典的なＭ期ブロッカーとしては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、およびトポＩＩインヒビター（ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシン）が挙げられる。Ｇ１を阻止する薬剤はまた、Ｓ期阻止をももたらし、例えば、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、タモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシルおよびａｒａ−Ｃ）が挙げられる。さらなる情報は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編、第１章、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）（特に、１３頁）に見い出され得る。
【００５５】
「増殖阻害」抗体の例としては、ＥｒｂＢ２に結合する抗体またはＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する抗体である。好ましい増殖阻害抗ＥｒｂＢ２抗体は、細胞培養物中のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の増殖を、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、２０％よりも高く、好ましくは、５０％よりも高く（例えば、約５０％〜約１００％）阻害する。ここでは、この増殖阻害を、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の抗体への曝露後６日で測定する（米国特許第５，６７７，１７１号（１９９７年１０月１４日公布）を参照のこと）。このＳＫ−ＢＲ−３細胞増殖阻害アッセイは、この特許および本明細書以下により詳細に記載される。
【００５６】
「細胞死を誘導する」抗体は、生存細胞を生育不能にさせる抗体である。この細胞は、一般に、ＥｒｂＢ２レセプターを発現する細胞であり、特に、この細胞は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する。好ましくは、細胞は、癌細胞（例えば、乳房細胞、卵巣細胞、胃細胞、子宮内膜細胞、唾液腺細胞、肺細胞、腎臓細胞、結腸細胞、甲状腺細胞、膵臓細胞または膀胱細胞）である。インビトロでは、細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。インビトロでの細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を区別するために、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され得る。従って、細胞死についてのアッセイは、熱不活化血清を使用して（すなわち、補体の非存在下で）かつ免疫エフェクター細胞の非存在下で行われ得る。抗体が細胞死を誘導し得るか否かを決定するために、膜の完全性の損失（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１（１９９５）を参照のこと）または７ＡＡＤの取り込みによって評価されるような）が、非処理細胞と比較して評価され得る。好ましい細胞死誘導抗体は、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取り込みアッセイにおいて、ＰＩ取り込みを誘導する抗体である（以下を参照のこと）。
【００５７】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、以下によって決定されるような、プログラムされた細胞死を誘導する抗体である：アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成。この細胞は、通常、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は、腫瘍細胞（例えば、乳房細胞、卵巣細胞、胃細胞、子宮内膜細胞、唾液腺細胞、肺細胞、腎臓細胞、結腸細胞、甲状腺細胞、膵臓細胞または膀胱細胞）である。インビトロでは、細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。種々の方法が、アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）トランスロケーションが、アネキシン結合によって測定され得；ＤＮＡのフラグメント化が、ＤＮＡのラダー形成によって評価され得；そしてＤＮＡのフラグメント化に伴う核／クロマチンの圧縮が、低二倍体細胞の任意の増加によって評価され得る。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイにおいて、非処理細胞と比較して、約２〜５０倍、好ましくは、約５〜５０倍、そして最も好ましくは、約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘導を生じる抗体である（以下を参照のこと）。時には、このプロアポトーシス抗体は、ＥｒｂＢレセプターのＥｒｂＢリガンド活性化をさらにブロックする抗体（例えば、７Ｅ３抗体）であり；すなわち、この抗体は、モノクローナル抗体２Ｃ４と生物学的特性を共有する。別の状況において、この抗体は、ＥｒｂＢレセプターのＥｒｂＢリガンド活性化を有意にブロックしない抗体（例えば、７Ｃ２）である。さらに、この抗体は、アポトーシスの誘導の間に、Ｓ期にある細胞の割合の大きな減少を誘導しない、７Ｃ２のような抗体（例えば、コントロールと比較して、これらの細胞の割合の約０〜１０％の減少のみを誘導する抗体）であり得る。
【００５８】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、慣用的な交差ブロック（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されるアッセイ）を行い得る。あるいは、エピトープマッピングを行って、抗体がＥｒｂＢ２の２Ｃ４エピトープ（例えば、包括的には、ＥｒｂＢ２のおよそ残基２２〜およそ残基５８４の領域における任意の１以上の残基；図１Ａ〜Ｂを参照のこと）に結合するか否かを評価し得る。
【００５９】
「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープは、ＥｒｂＢ２の膜貫通ドメインに近接する。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、慣用的な交差ブロックアッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されるアッセイ）を行い得る。あるいは、エピトープマッピングを行って、抗体がＥｒｂＢ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、包括的には、およそ残基５２９〜およそ残基６２５の領域における任意の１以上の残基；図１Ａ〜Ｂを参照のこと）に結合するか否かを評価し得る。
【００６０】
「エピトープ３Ｈ４」は、抗体３Ｈ４が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープは、包括的には、ＥｒｂＢ２細胞外ドメインのアミノ酸配列中のおよそ残基５４１〜およそ残基５９９の領域における残基を含む；図１Ａ〜Ｂを参照のこと。
【００６１】
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２抗体および／または７Ｆ３抗体（各々、ＡＴＣＣに寄託されている。以下を参照のこと）が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメインのＮ末端の領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、慣用的な交差ブロックアッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されるアッセイ）を行い得る。あるいは、エピトープマッピングを行って、抗体がＥｒｂＢ２上の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ（例えば、包括的には、ＥｒｂＢ２のおよそ残基２２〜およそ残基５３の領域における任意の１以上の残基；図１Ａ〜Ｂを参照のこと）に結合するか否かを確認し得る。
【００６２】
「処置」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置が必要なものとは、既に障害を有するもの、ならびに障害が予防されるべきものを含む。それゆえ、本明細書中の処置されるべき哺乳動物は、障害を有するとして診断されたかもしれないし、あるいは障害に対する素因があるか、または感受性であるかもしれない。
【００６３】
処置の目的のための「哺乳動物」とは、哺乳動物（ヒト、家庭内動物および家畜動物、動物園の動物、スポーツ用動物またはペット動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）を含む）として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００６４】
用語「治療的有効量」とは、哺乳動物における疾患または障害を処置するために有効な薬物の量をいう。癌の場合において、この薬物の治療的有効量は、癌細胞の数を減少し得るか；腫瘍サイズを減少し得るか；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し得るか；腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度緩やかにし得、そして好ましくは、停止させ得る）か；腫瘍増殖をある程度阻害し得る；そして／または癌に関連する１以上の症状をある程度軽減し得る。薬物が増殖を妨げ得るかそして／または既存の癌細胞殺傷し得る程度まで、薬物は、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。癌治療のために、効力は、例えば、疾患進行に対する時間（ＴＴＰ）の評価および／または応答速度（ＲＲ）の決定によって測定され得る。
【００６５】
用語「癌」および「癌性」とは、調節されない細胞増殖によって代表的に特徴付けられる、哺乳動物の生理学的状態を言及または記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例としては、扁平細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【００６６】
「ＥｒｂＢを発現する癌」は、その細胞表面に存在するＥｒｂＢタンパク質を有する細胞を含む癌である。「ＥｒｂＢ２を発現する癌」は、その細胞表面に十分なレベルのＥｒｂＢ２を産生する癌であり、その結果、抗ＥｒｂＢ−２抗体が、それに結合し得、そしてこの癌に対する治療効果を有する。
【００６７】
ＥｒｂＢレセプターの「過剰な活性化によって特徴付けられる」癌は、癌細胞におけるＥｒｂＢレセプター活性化の程度が、同じ組織型の非癌性細胞におけるＥｒｂＢレセプターの活性化のレベルを有意に超える癌である。このような過剰な活性化は、ＥｒｂＢレセプターの過剰発現および／または癌細胞中のＥｒｂＢレセプターの活性化に利用可能な正常レベルを超えるＥｒｂＢリガンドから生じ得る。このような過剰な活性化は、癌細胞の悪性疾患状態を引き起こし得るか、そして／またはこのような状態から引き起こされ得る。いくつかの実施形態において、この癌を診断アッセイまたは予後アッセイに供し、ＥｒｂＢレセプターのこのような過剰な活性化を生じるＥｒｂＢレセプターの増幅および／または過剰発現が生じているか否かを決定する。あるいは、またはさらに、この癌を診断アッセイまたは予後アッセイに供し、そのレセプターの過剰な活性化に寄与するＥｒｂＢリガンドの増幅および／または過剰発現が、この癌において生じているか否かを決定し得る。このような癌のサブセットにおいて、このレセプターの過剰な活性化は、オートクライン刺激経路から生じ得る。
【００６８】
「オートクライン」刺激経路において、ＥｒｂＢリガンドおよびその同族のＥｒｂＢレセプターの両方を産生する癌細胞によって、自己刺激が生じる。例えば、この癌は、ＥＧＦＲを発現または過剰発現し得、そしてまたＥＧＦＲリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αまたはＨＢ−ＥＧＦ）を発現または過剰発現し得る。別の実施形態において、この癌は、ＥｒｂＢ２を発現または過剰発現し得、そしてまたヘレグリン（例えば、γ−ＨＲＧ）を発現または過剰発現し得る。
【００６９】
ＥｒｂＢレセプターを「過剰発現する」癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に有意により高いレベルのＥｒｂＢレセプター（例えば、ＥｒｂＢ２）を有する癌である。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、あるいは転写または翻訳の増加によって引き起こされ得る。ＥｒｂＢレセプターの過剰発現は、細胞の表面上に存在するＥｒｂＢタンパク質のレベルの増加を評価することによる（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによる）、診断アッセイまたは予後アッセイにおいて決定され得る。あるいは、またはさらに、例えば、以下によって、細胞中のＥｒｂＢコード核酸のレベルを測定し得る：蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））。また、生物学的流体（例えば、血清）中の流出（ｓｈｅｄ）抗原（例えば、ＥｒｂＢ細胞外ドメイン）を測定することによって、ＥｒｂＢレセプター過剰発現を研究し得る（例えば、米国特許第４，９３３，２９４号（１９９０年６月１２日公布）；ＷＯ９１／０５２６４（１９９１年４月１８日公開）；米国特許第５，４０１，６３８号（１９９５年３月２８日公布）；およびＳｉａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３−８０（１９９０）を参照のこと）。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイが、当業者に利用可能である。例えば、患者の体内の細胞に抗体（必要に応じて、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）で標識する）を曝露させ得、そしてこの抗体の患者の細胞への結合を、例えば、放射活性の外部スキャニングによって、またはこの抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することによって、評価し得る。
【００７０】
逆に、「ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現によって特徴付けられない」癌は、診断アッセイにおいて、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、正常レベルよりも高いレベルのＥｒｂＢ２レセプターを発現しない癌である。
【００７１】
ＥｒｂＢリガンドを「過剰発現する」癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、有意により高いレベルのＥｒｂＢリガンドを産生する癌である。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、あるいは転写または翻訳の増加によって引き起こされ得る。ＥｒｂＢリガンドの過剰発現は、患者中（例えば、腫瘍生検中）のリガンド（または、それをコードする核酸）のレベルを評価することによって、あるいは、種々の診断アッセイ（例えば、ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、サザンブロッティング、ＰＣＲまたは上記に記載のインビボアッセイ）によって、診断的に決定され得る。
【００７２】
「ホルモン非依存性」の癌は、その増殖がその癌における細胞によって発現されるレセプターに結合するホルモンの存在に依存しない癌である。このような癌は、腫瘍中または腫瘍近辺のホルモン濃度を減少させる薬理学的または外科的ストラテジーの投与に際して、臨床的退行を生じない。ホルモン非依存性の癌の例としては、アンドロゲン非依存性前立腺癌、エストロゲン非依存性乳癌、子宮内膜癌および卵巣癌が挙げられる。このような癌は、ホルモン依存性腫瘍として始まり得、そして抗ホルモン療法後にホルモン感受性状態からホルモン不応性腫瘍に進行し得る。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害するかまたは妨げ、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、以下を含むことが意図される：放射性同位体（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、およびトキシン（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子トキシンまたは酵素的に活性なトキシン（そのフラグメントおよび／または改変体を含む）。
【００７４】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮTM）；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレデパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチェアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カラミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補助剤（例えば、フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラムブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキサー��；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）およびドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｅｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ロイコボリン（ＬＶ）、ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；ならびにそれらのいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体。この定義にはまた、以下のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するよう作用する抗ホルモン剤が含まれる：抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ））；ならびに抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリドおよびゴセレリン）；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体。
【００７５】
用語「サイトカイン」は、細胞間伝達物質として別の細胞に対して作用する、１つの細胞集団により放出されるタンパク質についての一般的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、以下が含まれる；成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体化ホルモン（ＬＨ））；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ミューラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板増殖因子；トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子。本明細書中で使用される場合、用語サイトカインは、天然の供給源に由来するタンパク質または組換え細胞培養物に由来するタンパク質およびネイティブ配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＥＧＦＲ標的薬物」とは、ＥＧＦＲレセプターに結合し、そして必要に応じてＥＧＦＲレセプター活性化を阻害する治療剤をいう。そのような因子（ａｇｅｎｔ）の例としては、ＥＧＦＲと結合する抗体および低分子が挙げられる。ＥＧＦＲと結合する抗体の例としては、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ  ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、参照のこと）およびその改変体（例えば、キメラ化２２５（Ｃ２２５）および、新形態化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．を参照のこと）；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されるような、ＥＧＦＲと結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；およびＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Ａｂｇｅｎｉｘを参照のこと）が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞傷害剤と結合体化され得、それにより免疫結合体を生成する（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨを参照のこと）。ＥＧＦＲと結合する低分子の例としては、ＺＤ１８３９（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＣＰ−３５８７７４（ＯＳＩ／Ｐｆｉｚｅｒ）およびＡＧ１４７８が挙げられる。
【００７７】
「抗脈管形成剤」とは、血管の発生をある程度までブロックまたは妨げる化合物をいう。抗脈管形成因子は、例えば、新脈管形成の促進に関与する増殖因子または増殖因子レセプターと結合する低分子または抗体であり得る。本明細書中の好ましい抗脈管形成因子は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合する抗体である。
【００７８】
本出願において使用される用語「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対して細胞傷害性が小さく、なおかつ酵素学的に活性化され得るか、またはより活性な親形態（ｐａｒｅｎｔ  ｆｏｒｍ）に転換され得る、薬学的に活性である物質の前駆体形態または誘導体形態をいう。例えば、Ｗｉｌｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、３７５−３８２頁、第６１５回  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄら、（編）、２４７−２６７頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変化プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム−含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性な細胞傷害性の無い薬物へ転換され得る５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグ。本発明における使用のためのプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例は、上記のそれらの化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞であり、これは、薬物（例えば、本明細書中に開示される抗ＥｒｂＢ２抗体および、必要に応じて化学療法剤）を哺乳動物に送達するために有用である。リポソームの成分は、一般的に二重層形成体（これは生体膜の脂質配置に類似する）の中に配置される。
【００８０】
用語「パッケージインサート」は、治療生成物の市販のパッケージ内に慣習的に備えられる説明書のことをいうために使用され、これは効能、用法、投薬量、投与、禁忌および／またはそのような治療生成物の使用に関する警告についての情報を含む。
【００８１】
「心臓保護剤」は、患者への薬物（例えば、アントラサクリン抗生物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体）の投与に関連する心筋機能不全（すなわち、心筋症および／またはうっ血性心不全）を予防または減少させる化合物または組成物である。心臓保護剤は、例えば、フリーラジカル媒介性心臓毒性効果をブロックまたは減少し得、そして／または酸化的ストレス障害を予防もしくは減少し得る。この定義によって包含される心臓保護剤の例としては、以下が挙げられる：鉄キレート化剤デキスラゾキサン（ＩＣＲＦ−１８７）（Ｓｅｉｆｅｒｔら、Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２８：１０６３−１０７２（１９９４））；脂質低下剤および／または抗酸化剤（例えば、プロブコール（Ｓｉｎｇａｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２７：１０５５−１０６３（１９９５））；アミホスチン（アミノチオール２−[（３−アミノプロピル）アミノ]エタンチオール二水素リン酸エステル（これはまた、ＷＲ−２７２１と呼ばれる）およびその脱リン酸化された細胞取り込み形態（これは、ＷＲ−１０６５と呼ばれる）ならびにＳ−３−（３−メチルアミノプロピルアミノ）プロピルホスホロチオ酸（ＷＲ−１５１３２７）、Ｇｒｅｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：７３８−７４１（１９９４）を参照のこと；ジゴキシン（Ｂｒｉｓｔｏｗ，Ｍ．Ｒ．：Ｂｒｉｓｔｏｗ  ＭＲ、編、Ｄｒｕｇ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  １９１−２１５（１９８０）；βブロッカー（例えば、メトプロロール（Ｈｊａｌｍａｒｓｏｎら、Ｄｒｕｇｓ  ４７：補遺４：３１−９（１９９４）；およびＳｈａｄｄｙら、Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１２９：１９７−９（１９９５））；ビタミンＥ；アスコルビン酸（ビタミンＣ）；フリーラジカルスカベンジャー（例えば、オレアノール酸、ウルソル酸およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）；スピントラッピング（ｓｐｉｎ  ｔｒａｐｐｉｎｇ）化合物（例えば、α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）；（Ｐａｒａｃｈｉｎｉら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１６０７−１６１２（１９９３））；セレノ有機化合物（例えば、Ｐ２５１（Ｅｌｂｅｓｅｎ）など。
【００８２】
（ＩＩ．抗ＥｒｂＢ２抗体の産生）
本発明に従って使用される抗体の産生のための例示的技術に関する記載が続く。抗体の産生のために使用されるべきＥｒｂＢ２抗原は、例えば、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインの可溶性形態またはその一部であり得、これらは所望のエピトープを含む。あるいは、細胞表面にＥｒｂＢ２を発現する細胞（例えば、ＥｒｂＢ２を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；または癌細胞株（例えば、ＳＫＢＲ３細胞、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１−８６９５（１９９１））を使用して、抗体を産生し得る。抗体を産生するために有用なＥｒｂＢ２の他の形態は、当業者に明らかである。
【００８３】
（（ｉ）ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において惹起される。関連抗原を、二官能剤または誘導化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、ＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）を使用して、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）と結合体化させることは有用である。
【００８４】
動物を、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質もしくは結合体（それぞれウサギまたはマウスに対して）を３容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせて、そして複数の部位にその溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫化する。一ヶ月後、その動物を、フロイント完全アジュバント中の初めの量のペプチドまたは結合体の１／５〜１／１０の量で複数の部位での皮下注射によりブーストする。７日〜１４日後、その動物から採血し、そしてその血清を抗体力価についてアッセイする。動物を、その力価がプラトーになるまでブーストする。好ましくは、その動物を、同じ抗原の結合体（ただし、異なるタンパク質と結合および／または異なる架橋試薬により結合させた）でブーストする。結合体はまた、タンパク質融合物として組換え細胞培養において作製され得る。また、凝集剤（ａｇｇｒｅｇａｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ミョウバン）を適切に使用して、免疫応答を増強させる。
【００８５】
（（ｉｉ）モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体を、実質的に均一な抗体（すなわち、個々の抗体は、可能性として自然に発生する変異（微量に存在し得る）を除いて同一である集団を構成する）の集団から入手する。従って、変更因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物でない場合の抗体の特徴を示す。
【００８６】
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【００８７】
ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター）は、本明細書中上記のように免疫化されて、免疫化のために使用されるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球を、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用してミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００８８】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中に播種され、そして増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐ。
【００８９】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により抗体の安定な高レベルの産生を支持し、そして培地（例えば、ＨＡＴ培地）に対して感受性である細胞である。とりわけ好ましいミエローマ細胞株は、マウスミエローマ細胞株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するミエローマ細胞株、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡより入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞）である。ヒトミエローマ細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００９０】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に指向されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
【００９１】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定され得る。
【００９２】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈手順によりサブクローン化され得、そして標準的な方法により増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、このハイブリドーマ細胞は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【００９３】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の抗体精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって培養培地、腹水または血清から適切に分離される。
【００９４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されて、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役に立つ。一旦単離されると、そのＤＮＡは、発現ベクターの中に配置され得、次いでその発現ベクターは、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を獲得するために、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の状況では抗体タンパク質を産生しないミエローマ細胞）にトランスフェクトされる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文としては、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【００９５】
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用する、マウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。引き続く出版物は、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２））ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしての組み合わせ感染およびインビボ組換えによる高い親和性の（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生を記載している（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替技術である。
【００９６】
ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインをコードする配列に置換することによってか（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４）、または免疫グロブリンコード配列を非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全てまたは一部に共有結合させることによって改変され得る。
【００９７】
代表的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製するために、抗体の定常ドメインに対して置換されるか、またはそれらは、抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換される。
【００９８】
（（ｉｉｉ）ヒト化抗体）
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において記載されてきた。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその抗体に導入された一つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基として言及される。この残基は、代表的に「輸入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、超可変領域配列をヒト抗体のその対応配列に置換することによって、本質的にはＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２１−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って実施され得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここでインタクトなヒト可変ドメインは、非ヒト種由来の対応配列によって、実質的にあまり置換されていない。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかの超可変領域残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯動物抗体の類似部位に由来する残基によって置換されている、ヒト抗体である。
【００９９】
ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従って、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯動物の配列の最も類似しているヒト配列が、ヒト化抗体のためにヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖および重鎖の特定小群の全ての抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１００】
抗体が、抗原に対する高い親和性の保持および他の有利な生物学的特性を有
するようにヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、そして当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンホメーション構造を例示し、そして表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の綿密な調査は、候補免疫グロブリン配列の機能決定（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）する際に、残基の適切な役割を分析すること（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析）を可能にする。この方法において、ＦＲ残基は、レシピエントおよび輸入の配列から選択されて、そして組み合わせられ得、その結果、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原に対する増大した親和性）が達成される。一般的に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼす際に、直接的かつ最も実質的に関与する。
【０１０１】
以下の実施例３は、ＥｒｂＢ２と結合し、そしてＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする例示的なヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体の作製を記載している。本明細書中の特定の目的のヒト化抗体は、本質的に、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（またはそのＦａｂフラグメント）と同じぐらい効果的にＭＡＰＫのＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよび／またはＨＲＧ媒介性の活性化をブロックし、そして／または本質的にマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（またはそのＦａｂフラグメント）と同じぐらい効果的にＥｒｂＢ２と結合する。本明細書中のヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメイン内に組み込まれた非ヒト超可変領域残基を含み、そして６９Ｈ、７１Ｈ、および７３Ｈ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載される可変ドメイン番号付けシステムを利用する）からなる群から選択される位置におけるフレームワーク領域（ＦＲ）置換をさらに含み得る。一つの実施形態において、ヒト化抗体は、６９Ｈ位、７１Ｈ位、および７３Ｈ位のうちの２箇所または全ての箇所におけるＦＲ置換を含む。
【０１０２】
本明細書中の目的の例示的ヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（ここで、Ｘは、好ましくはＤまたはＳである）（配列番号７）、ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号８）；および／またはＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号９）を含み、必要に応じて、それらのＣＤＲ残基のアミノ酸改変を含む（例えば、その改変は、本質的にその抗体の親和性を維持するか、または改善する）。例えば、目的の抗体改変体は、上記可変重鎖ＣＤＲ配列においておよそ１個〜およそ７個またはおよそ５個のアミノ酸置換を有し得る。そのような抗体改変体は、親和性変異（例えば、以下に記載されるような）によって調製され得る。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号４における可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
ヒト化抗体は、例えば、前の段落におけるそれらの可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に加えて、可変軽鎖ドメイン相補性決定残基ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号１０）、ＳＡＳＹＸ1Ｘ2Ｘ3（ここで、Ｘ1は好ましくはＲまたはＬであり；Ｘ2は好ましくはＹまたはＥであり；そしてＸ3は好ましくはＴまたはＳである）（配列番号１１）；およびＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号１２）を含み得る。そのようなヒト化抗体は、必要に応じて上記ＣＤＲ残基のアミノ酸改変（例えば、その改変は、その抗体の親和性を本質的に維持または改善する）を含む。例えば、目的の抗体改変体は、上記可変軽鎖ＣＤＲ配列においておよそ１個〜およそ７個もしくはおよそ５個のアミノ酸置換を有し得る。そのような抗体改変体は、親和性変異（例えば、以下に記載されるような）によって調製され得る。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号３における可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
本出願はまた、ＥｒｂＢ２に結合し、そしてＥｒｂＢ２レセプターのリガンド活性化をブロックする抗体であるアフィニティ成熟抗体を意図する。親抗体は、例えば、配列番号３および４の可変軽鎖および／または重鎖配列をそれぞれ含む（すなわち、改変体５７４）、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。アフィニティ成熟抗体は、好ましくは、マウス２Ｃ４または改変体５７４の親和性よりも優れた親和性（例えば、ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡを使用して評価した場合において、例えば、およそ２倍もしくはおよそ４倍〜およそ１００倍もしくは１０００倍の改善された親和性）によってＥｒｂＢ２レセプターに結合する。置換のための例示的な可変重鎖ＣＤＲ残基としては、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、または２つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２、３、４、５、６または７個）が挙げられる。変更のための可変軽鎖ＣＤＲ残基の例としては、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７または２つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２〜３、４、５またはおよそ１０個まで）が挙げられる。
【０１０５】
ヒト化抗体またはアフィニティ成熟抗体の種々の形態が意図される。例えば、ヒト化抗体またはアフィニティ成熟抗体は、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）であり得、これは、免疫結合体を作製するために必要に応じて一つ以上の細胞傷害剤と結合される。あるいは、ヒト化抗体またはアフィニティ成熟抗体は、インタクトな抗体（例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体）であり得る。
【０１０６】
（ｉｖ：ヒト抗体）
ヒト化の代替として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、トランスジェニック動物（例えば、マウス）であって、免疫の際に内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の充分なレパートリーを生成し得るものを作製することが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合部（ＪH）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全阻害を生じることが記載されている。そのような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子のアレイの移入は、抗原攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に際しヒト抗体の産生を生じる。例えば、以下を参照のこと：Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号および同第５，５４５，８０７号。
【０１０７】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、免疫していないドナーから免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリー由来のヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで生成し得る。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）の主要コートタンパク質遺伝子またはマイナーなコートタンパク質遺伝子のいずれか中にインフレームでクローニングされ、そしてファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、その抗体の機能的特性に基づく選択もまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。従って、そのファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行われ得る；それらの概説については以下を参照のこと：Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイのために使用し得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の多岐のアレイを単離した。免疫していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、そして多岐のアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、以下に記載される技術に本質的に従って単離され得る：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）。また、以下を参照のこと：米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号。
【０１０８】
上記のように、ヒト抗体はまた、インビトロで活性化したＢ細胞から生成され得る（以下を参照のこと：米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号）。
【０１０９】
ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体は、以下に記載される：米国特許第５，７７２，９９７号（１９９８年６月３０日発行）およびＷＯ  ９７／００２７１（１９９７年１月３日公開）。
【０１１０】
（ｖ）抗体フラグメント
種々の技術が抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、以下を参照のこと：Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。しかし、これらのフラグメントは、今や、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、その抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、化学的に結合されて、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明白である。他の実施形態において、えり抜きの抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。以下を参照のこと：ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号。この抗体フラグメントはまた、「線状抗体」（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり得る（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるとおり）。そのような線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性であり得る。
【０１１１】
（ｖｉ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープについての結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体は、ＥｒｂＢ２結合部位と、ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３および／またはＥｒｂＢ４についての結合部位とを組合せ得る。あるいは、抗ＥｒｂＢ２アームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）のような白血球上のトリガー分子に結合するアームと組み合わされて、またはＩｇＧについてのＦｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）））、細胞防御機構をＥｒｂＢ２発現細胞へと集中させ得る。二重特異性抗体はまた、ＥｒｂＢ２を発現する細胞に対して細胞傷害性因子を局在化させるために使用され得る。これらの抗体は、ＥｒｂＢ２結合アーム、および細胞傷害性因子に結合するアーム（例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）を有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異性抗体）として調製され得る。
【０１１２】
ＷＯ  ９６／１６６７３は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、そして米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示する。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、Ｗ０９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示する。
【０１１３】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここでは、その２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな配列のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ））は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。このうち、たった１つが正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製（これは、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によってなされる）は、かなり煩雑であり、そしてその産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１１４】
異なるアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原組合せ部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合物は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを伴い、少なくともヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３の領域の部分を含む。これらの融合物の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む、第一の重鎖不変領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。これは、その構築において使用される不等の比率の３つのポリペプチド鎖が最適な収率を提供するときの実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相対比率を調整するにおいてかなりの柔軟性を提供する。しかし、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖についてコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することは、等価な比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率を生じるときまたはその比率が特に重要ではない場合に可能である。
【０１１５】
このアプローチの好ましい実施形態において、その二重特異性抗体は、一方のアームにおいて第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称性の構造は、所望ではない免疫グロブリン鎖組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。なぜなら、二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチは、ＷＯ  ９４／０４６９０に開示される。例えば、二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１１６】
米国特許第５，７３１，１６８号において記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大化するように操作され得る。この好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣH３ドメインの少なくとも１対を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面からの１つ以上の低アミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置き換えられる。その大きな側鎖と同一または類似のサイズの補償性の「溝」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって第二の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモダイマーのような他の所望されない最終産物よりもヘテロダイマーの収率を増加するための機構を提供する。
【０１１７】
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロ結合体」抗体を包含する。例えば、ヘテロ結合体における抗体のうちの一方は、アビジンと結合され得、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、所望されない細胞に免疫系を標的化させることが提唱された（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染の処置について提唱された（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３およびＥＰ  ０３０８９）。ヘテロ結合体抗体は、任意の従来の架橋方法を用いて作製され得る。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、そして米国特許第４，６７６，９８０号において、多数の架橋技術とともに開示される。
【０１１８】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための技術もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的結合を用いて調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクト抗体がタンパク質分解的に開裂してＦ（ａｂ’）2フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤砒素ナトリウムの存在下で還元されて、ビジナルなジチオールが安定化され、そして分子間のジスルフィド形成が妨害される。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体へと変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つは、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールへと再変換され、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１１９】
最近の進展により、Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接の回収を容易にした。これは、化学的に結合されて、二重特異性抗体を形成し得る。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2分子の産生を記載する。各々のＦａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別個に分泌され、そしてインビトロでの指向された化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の分解性活性をトリガーし得る。
【０１２０】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製および単離するための種々の技術もまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎのタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。その抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成させ、そして次いで再度酸化されて抗体へテロダイマーを形成させた。この方法はまた、抗体ホモダイマーの生成のためにも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載された「ジアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供した。このフラグメントは、リンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶL）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。このリンカーは、同じ鎖の上の２つのドメインの間を対合させるには短すぎる。従って、１つのフラグメントのＶHおよびＶLのドメインは、別のフラグメントの相補的ＶLおよびＶHのドメインと対合されるように強制され、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって作製するための別の戦略もまた、報告されている。以下を参照のこと：Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）。
【０１２１】
２つを超える価数を伴う抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１２２】
（ｖｉｉ）他のアミノ酸配列改変
本明細書において記載される抗ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが好ましくあり得る。抗ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を抗ＥｒｂＢ２抗体核酸に導入することによるか、またはペプチド合成により調製される。そのような改変としては、例えば、抗ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換を包含する。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終構築物に達するように作製されるがただし、その最終構築物は所望の特性を有する。そのアミノ酸変化はまた、抗ＥｒｂＢ２抗体の翻訳後プロセシングを変更してもよい（例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化）。
【０１２３】
変異誘発についての好ましい位置である、抗ＥｒｂＢ２抗体の特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載される。本明細書において、標的残基の残基または基（例えば、荷電された残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ）が同定され、そして中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換され、ＥｒｂＢ２抗原とアミノ酸との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置は、さらにまたは他の改変体を置換の部位またはそれにわたって導入することによって再度調整される。従って、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位が予め決定されるものの、その変異自体の性質は、予め決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が、標的コドンまたは領域に施され、そして発現された抗ＥｒｂＢ２抗体改変体が、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１２４】
アミノ酸配列挿入としては、１つの残基から百以上の残基を有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端の挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗ＥｒｂＢ２抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに対して融合された抗体が挙げられる。抗ＥｒｂＢ２抗体分子の他の挿入改変体としては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）に対して抗ＥｒｂＢ２抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合物または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドが挙げられる。
【０１２５】
改変体の別の型は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、異なる残基によって置換された抗ＥｒｂＢ２抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発のために最も関心ある部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変もまた企図される。保存置換は、「好ましい置換」の見出しの以下の表１に示される。そのような置換が生物学的活性における変化を生じる場合、より実質的な変異（「例示的置換」と表１において称するか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される）は、導入され得そしてその産物がスクリーニングされ得る。
【０１２６】
【表１】
0004579471.tif 000002
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはへリックスコンホメーション）、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性）、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、を維持することに対するそれらの効果において有意に異なる特性を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいて以下のような群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；  （２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを他のクラスのものに交換することを包含する。
【０１２７】
抗ＥｒｂＢ２抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基はまた、一般にセリンに置換されて、その分子の酸化に対する安定性を改善し得、そして異常な架橋を妨害し得る。逆に、システイン結合は、その抗体に付加されて、その安定性（特に、その抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）を改善し得る。
【０１２８】
特に好ましい型の置換改変体は、親の抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを包含する。一般に、さらなる開発のために選択された得られた改変体は、それらが生成される親の抗体に比較して改善された生物学的特性を有する。そのような置換改変体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を包含する。手短には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６から７の部位）を変異させてすべての可能なアミノ置換を各部位に生成する。このように生成された抗体改変体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合物としてディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされた改変体は、本明細書において開示されるように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変について候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。あるいはまたはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＥｒｂＢ２との間の接触点を同定することも有利であり得る。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書において説明される技術に従う置換のための候補である。一旦そのような改変体が生成されると、改変体のパネルが、本明細書において記載されるスクリーニングに供され、そして１つ以上の関連するアッセイにおいて優越した特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択し得る。
【０１２９】
その抗体の別の形態のアミノ酸改変体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変化させる。変化させることは、抗体で見出される１つ以上の炭水化物部位を除去することおよび／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を加えることを意味する。
【０１３０】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結のどちらかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部位を取りつけることをいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に炭水化物部位を酵素的に取りつけるための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のどちらかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作成する。Ｏ連結のグリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトースまたはキシロースの糖の１つを、ヒドロキシアミノ酸（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得るが、最も一般的にはセリンまたはトレオニン）への付着をいう。
【０１３１】
グリコシル化部位の抗体への付加は、好都合なことに、上記記載の１つ以上のトリペプチド配列を含むように、アミノ酸配列を変化させることにより達成される（Ｎ連結グリコシル化部位について）。この変化はまた、元の抗体の配列に、１つ以上のセリンまたはトレオニン残基を加えることによるか、または置換することによって、行なわれ得る（Ｏ連結グリコシル化部位について）。
【０１３２】
抗ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、天然の供給源（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）からの単離、またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位指向性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および初期調製の改変体または抗ＥＲｂＢ２抗体の非改変体バージョンのカセット変異誘発による調製が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３３】
エフェクター機能（例えば、抗体の抗原依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を増強するために）に関して、本発明の抗体を改変することが所望され得る。このことは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。あるいはまたはさらに、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これにより、この領域の鎖間ジスルフィド結合形成を可能とする。従って、産生されたホモ二量体抗体は、内部移行能力を改善し得そして／または補体媒介細胞死滅および抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を増加させ得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二官能性の架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体が操作され得、そして、それによって、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１３４】
血清の半分の寿命である抗体を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に組み込み得る。本明細書に記載されているように、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」とは、インビボ血清の半分の寿命のＩｇＧ分子を増加させることを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０１３５】
（（ｖｉｉｉ）所望の特質を有する抗体についてのスクリーニング）
抗体を産生する技術は、上記に記載されている。所望のように、特定の生物学的特徴を有する抗体をさらに選択し得る。
【０１３６】
ＲｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体を同定するために、ＥｒｂＢリガンドが、ＥｒｂＢレセプターを発現する細胞に結合するのをブロックする抗体の能力（例えば、目的のＥｒｂＢレセプターがＥｒｂＢヘテロオリゴマーを形成する別のＥｒｂＢレセプターと結合体化する際の）が決定され得る。例えば、ＥｒｂＢヘテロオリゴマーのＥｒｂＢレセプターを天然に発現するかまたは発現するようにトランスフェクトされた細胞は、抗体とインキュベートされ、次いで標識されたＥｒｂＢリガンドに曝される。次いでリガンドが、ＥｒｂＢヘテロオリゴマー中のＥｒｂＢレセプターに結合するのをブロックする抗ＥｒｂＢ２抗体の能力が、評価され得る。
【０１３７】
例えば、抗ＥｒｂＢ２抗体によって、ＨＲＧがＭＣＦ７乳癌細胞株に結合するのを阻害することが、本質的には以下の実施例１に記載されるように、２４ウェルプレート形式で氷上の単層ＭＣＦ７培養物を使用して、行なわれ得る。抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体が、それぞれのウェルに加えられ得、そして３０分間インキュベートされ得る。125Ｉ標識されたｒＨＲＧβ１177-224（２５ｐｍ）が次いで加えられ得、そしてインキュベーションが４〜１６時間続けられ得る。用量応答曲線が調製され得、そしてＩＣ50値が、目的の抗体について計算された。１つの実施形態では、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体は、このアッセイにおいて、約５０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満の、ＨＲＧがＭＣＦ７細胞に結合するのを阻害するＩＣ50を有する。抗体が、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＨＲＧがＭＣＦ７細胞に結合するのを阻害することについてのＩＣ50は、例えば、約１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満であり得る。
【０１３８】
あるいは、またはさらに、ＥｒｂＢヘテロオリゴマーに存在するＥｒｂＢレセプターのＥｒｂＢリガンドが刺激するチロシンリン酸化をブロックする抗ＥｒｂＢ２抗体の能力が、評価され得る。例えば、内因的にＥｒｂＢレセプターを発現するかまたはそれらを発現するようにトランスフェクトされた細胞は、抗体と共にインキュベートされ、次いで、抗ホスホチロシンモノクローナル（これは、必要に応じて、検出可能な標識と結合体化する）を使用して、ＥｒｂＢリガンド依存チロシンリン酸化活性についてアッセイされる。米国特許第５，７６６，８６３号に記載されるこのキナーゼレセプター活性化アッセイはまた、ＥｒｂＢレセプター活性化を決定するためおよび抗体によるＥｒｂＢレセプターの活性をブロックするために利用可能である。
【０１３９】
１つの実施形態では、本質的には以下の実施例１に記載されるように、ＭＣＦ７細胞におけるＨＲＧ刺激によるｐ１８０チロシンリン酸化を阻害する抗体についてスクリーニングし得る。例えば、ＭＣＦ７細胞は、２４ウェルプレートにプレーティングされ得、そしてＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体が、それぞれのウェルに加えられ得、そして室温で３０分間インキュベートされ得る；次いで、ｒＨＲＧβ１177-244は、最終濃度の０．２ｎＭまでそれぞれのウェルに加えられ得、そしてそのインキュベーションは、８分間続けられ得る。培養液が、ぞれぞれのウェルから吸引され、そして反応は、１００μｌのＳＤＳサンプル緩衝液（５％  ＳＤＳ、２５ｍＭ  ＤＤＴおよび２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）を加えることによって停止され得る。それぞれのサンプル（２５μｌ）は、４〜１２％の勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動され得、次いで、ポリビニリデンジフルオリドメンブレンに、電気泳動的に転写され得る。抗ホスホチロシン（１μｇ／ｍｌ）免疫ブロットが現像され得、そして約１８０，０００のＭｒの優性の反応性バンドの強度は、反射率デンシトメトリーによって定量され得る。選択された抗体は、このアッセイにおいて、好ましくは有意にｐ１８０チロシンリン酸化の刺激をコントロールの約０〜３５％に阻害する。反射率デンシトメトリーによって決定される場合のｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激の阻害の用量応答曲線は、調製され得、そして目的の抗体についてのＩＣ50が計算され得る。１つの実施形態では、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体は、このアッセイにおいて、約５０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満のＨＲＧ刺激によるｐ１８０チロシンリン酸化を阻害するＩＣ50を有する。抗体が、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＨＲＧ刺激によるｐ１８０チロシンリン酸化の阻害についてのＩＣ50は、例えば、約１００ｎＭ未満、より好ましくは、５０ｎＭ未満であり得る。
【０１４０】
また、例えば、基本的にＳｃｈｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７）に記載されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞に対する抗体の増殖阻害的効果を評価し得る。このアッセイに従って、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞は、４日間、抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（１０μｌ／ｍＬ）で処理され得、そしてクリスタルバイオレットで染色され得る。抗ＥｒｂＢ２抗体とのインキュベーションは、モノクローナル抗体２Ｃ４によって示される効果と類似した、この細胞株に対する増殖阻害効果を示し得る。さらなる実施形態では、外因性ＨＲＧは、有意にこの阻害を覆さない。好ましくは、抗体は、外因性ＨＲＧの存在下および非存在下の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５より大きい程度（そして、必要に応じて、モノクローナル抗体７Ｆ３より大きい程度）、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の細胞増殖を阻害し得る。
【０１４１】
１つの実施形態では、目的の抗ＥｒｂＢ２抗体は、実施例２で記載されるような共免疫沈降実験で決定されるように、実質的にモノクローナル抗体４Ｄ５より効果的に、そして必要に応じて、実質的にモノクローナル抗体７Ｆ３より効果的に、ＭＣＦ７およびＳＫ−ＢＲ−３細胞の両方において、ＥｒｂＢ２の、ＥｒｂＢ３とのヘリグリン非依存性相互作用をブロックし得る。
【０１４２】
あるいは、またはさらに、ＥＧＦ、ＴＧＲ−αおよび／またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のＨＲＧ媒介性の活性化をブロックする抗体の能力を決定し得る（例えば、以下の実施例４に示されるように）。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）またはモノクローナル抗体４Ｄ５より大きい程度に、ＥＧＦ、ＴＧＲ−αおよび／またはＨＲＧ媒介性のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化をブロックする抗体が、選択され得る。さらに、目的の抗体は、ＥＧＦ、ＴＧＲ−αおよび／またはＨＲＧ媒介性のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を、モノクローナル抗体７Ｆ３より大きい程度ブロックし得る。
【０１４３】
増殖阻害抗ＥｒｂＢ２抗体を同定するために、ＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する抗体についてスクリーニングし得る。１つの実施形態では、選り抜きの増殖阻害抗体は、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、約２０〜１００％、そして好ましくは約５０〜１００％、細胞培養中のＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を阻害し得る。そのような抗体を同定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されているＳＫ−ＢＲ−３アッセイが、行われ得る。このアッセイに従って、ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、１０％ウシ胎児血清、グルタミンおよびペニシリン  ストレプトマイシンを補充した、Ｆ１２およびＤＭＥＭ培養液の１：１の混合物中で増殖された。このＳＫ−ＢＲ−３細胞は、３５ｍｍ細胞培養皿（２ｍｌ／３５ｍｍ皿）中に、２０，０００細胞がプレーティングされた。０．５〜３０μｇ／ｍｌのＥｒｂＢ２抗体が、１皿当りに加えられた。６日後、未処理の細胞に対する細胞の数が、電動ＣＯＵＬＴＥＲTM細胞カウンターを使用して、計算された。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を、約２０〜１００％または約５０〜１００％阻害するこれらの抗体は、増殖阻害抗体として選択され得る。
【０１４４】
細胞死を誘導する抗体を選択するために、例えば、ＰＩ、トリパンブルーまたは７ＡＡＤの取り込みによって示される膜完全性の喪失が、コントロールに対して相対的に評価され得る。好ましいアッセイは、ＢＴ４７４細胞を使用するＰＩ取り込みアッセイである。このアッセイに従って、ＢＴ４７４細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得ることができる）は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）：１０％熱不活性ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンが補充されたＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２（５０：５０）中で、培養された。（従って、アッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で行なわれる）。ＢＴ４７４細胞は、１００×２０ｍｍ皿中で１皿当り３×１０6の密度で播種され、そして一晩付着させた。培地が、次いで除去され、そして、新鮮な培地単独とか、または１０μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体を含む培地で置換された。細胞は、３日の期間インキュベートされた。それぞれの処理の後に、単層は、ＰＢＳで洗浄され、そしてトリプシン処理によって剥離される。次いで、細胞は、４℃で５分間１２００ｒｐｍで遠心分離され、ペレットは、３ｍｌの氷冷したＣａ2+結合緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2）中に再懸濁され、そして細胞凝集塊の除去のために、３５ｍｍストレーナーキャップの１２×７５チューブ（１チューブ当り１ｍｌ、１処理群当り３チューブ）にアリコートした。次いで、チューブは、ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を受け入れた。サンプルは、ＦＡＣＳＣＡＮTMフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲTMＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析され得る。ＰＩの取り込みによって決定される統計的に有意なレベルの細胞死を誘導するこれらの抗体は、細胞死誘導抗体として選択され得る。
【０１４５】
アポトーシスを誘導する抗体を選択するために、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイが利用可能である。ＢＴ４７４細胞は培養され、そして前の段落で議論されるように、シャーレに播種される。次いで、培地は、除去され、そして、新鮮な培地単独とか、または１０μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体を含む培地で置換された。３日間のインキュベート期間の後、単層は、ＰＢＳで洗浄され、そしてトリプシン処理によって剥離される。次いで、細胞死アッセイのために上記議論されたように、細胞は、遠心分離され、Ｃａ2+結合緩衝液中に再懸濁され、そしてチューブにアリコートされた。次いで、チューブは、標識化アネキシン（例えば、アネキシンＶ−ＦＴＩＣ）（１μｇ／ｍｌ）を受け入れる。サンプルは、ＦＡＣＳＣＡＮTMフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲTMＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析され得る。コントロールに対して、統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する、これらの抗体は、アポトーシス誘導抗体として選択される。
【０１４６】
アネキシン結合アッセイに加えて、ＢＴ４７４細胞を使用するＤＮＡ染色アッセイが利用できる。このアッセイを行なうために、前の２つの段落に記載されるように、目的の抗体で処理したＢＴ４７４細胞は、３７℃で２時間、９μｇ／ｍｌのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２TMと共にインキュベートされ、次いで、ＭＯＤＦＩＴＬＴTMソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ）を使用して、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥTMフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で分析された。未処理細胞（１００％未満のアポトーシス細胞）より２倍以上大きい（好ましくは３倍以上）アポトーシス細胞の割合の変化を誘導する抗体は、このアッセイを使用して、アポトーシス推進性の（Ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）抗体として選択され得る。
【０１４７】
目的の抗体によって結合されるＥｒｂＢ２上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、慣用的な交差ブロックアッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ，ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されるようなアッセイ）が行なわれ得る。あるいは、またはさらに、エピトープマッピングが、当該分野で公知の方法（例えば、本明細書中の図１Ａおよび１Ｂを参照のこと）によって行なわれ得る。
【０１４８】
（（ｉｘ）免疫結合体）
本発明はまた、細胞障害性薬剤（例えば、化学治療剤、毒素（例えば、小分子または細菌、真菌、植物または動物の起源由来の酵素学的に活性な毒素（そのフラグメントおよび／または変異体を含む））、または放射活性同位体（すなわち、放射性結合体））に関する。
【０１４９】
そのような免疫結合体の生成に有用な化学治療剤が、上記に記載されている。
【０１５０】
抗体および１つ以上の小分子毒素（例えば、カリーチアミシン（ａｍｉｃｉｎ）、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、およびＣＣ１０６５）の結合体もまた、本明細書中に意図される。
【０１５１】
本発明の１つの好ましい実施形態では、抗体は、１つ以上のメイタンシン分子（例えば、１つの抗体分子当り、約１〜約１０のメイタンシン分子）に結合する。例えば、メイタンシンは、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元され得るＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換され得、そして改変抗体（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））と反応してメイタンシノイド−抗体免疫結合体を生成し得る。
【０１５２】
別の目的の免疫結合体は、１つ以上のカリーチアミシン分子と結合体化する抗ＥｒｂＢ２抗体を含む。抗生物質のカリーチアミシンファミリーは、ピコモーラー以下の濃度で、二本鎖ＤＮＡの破壊を起こすことが可能である。使用され得るカリーチアミシンの構造アナログとしては、γ1I、α2I、α3I、Ｎ−アセチル−γ1I、ＰＳＡＧおよびθI1が挙げられるがそれらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）およびＬｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８））。
【０１５３】
使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、ヒマＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ，ＰＡＰＩＩ，およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｉｔａインヒビター、カーシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照のこと。
【０１５４】
本発明はさらに、抗体と核酸溶解活性（例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）のようなＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を有する化合物との間で形成される免疫結合体を意図する。
【０１５５】
種々の放射活性同位体は、放射性結合体化抗ＥｒｂＢ２抗体の精製のために利用可能である。例としては、Ａｔ211，Ｉ131，Ｉ125，Ｙ90，Ｒｅ186，Ｒｅ188，Ｓｍ153，Ｂｉ212，Ｐ32およびＬｕの放射性アイソトープが挙げられる。
【０１５６】
抗体および細胞障害性薬剤の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ））、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピン酸ＨＣＬ）、活性化エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベリン酸）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−ジアゾ化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して行なわれ得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように、調製され得る。炭素１４標識した１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合体化についての例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。そのリンカーは、細胞中の細胞障害性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））が使用され得る。
【０１５７】
あるいは、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって、抗ＥｒｂＢ２抗体および細胞障害性薬剤を含む融合タンパク質が、作製され得る。
【０１５８】
なお別の実施形態では、抗体は、標的化される前の腫瘍（ここで、抗体−レセプター結合体が患者に投与される）での利用のための「レセプター」（ストレプトアビジンなど）に結合体化され得、引き続き除去剤を使用して、未結合の結合体を循環より除去し、次いで、細胞障害製薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合体化される「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０１５９】
（（ｘ）抗体依存酵素媒介性プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ））
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学治療剤（ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと））を活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体を結合体化させることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０１６０】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分は、そのような方法で、プロドラッグに対して作用し得る任意の酵素を含み、その結果、プロドラッグをそのより活性な細胞障害性形態に変換する。
【０１６１】
本発明の方法において有用な酵素としては、リン酸含有プロドラッグを遊離ドラッグに変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；サルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒素性５−フルオロシトシンを抗癌剤５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；例えば、セラチア属プロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）などのプロテアーゼ（これらはペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用である）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニラーゼなどの炭水化物切断酵素；β−ラクタムで誘導した薬物を遊離薬物に変換するβ−ラクタマーゼ；そしてそれらのアミンの窒素が、それぞれフェノキシアセチル基またはフェノキシアセチル基を用いて誘導体化された薬物を、遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、酵素活性を有する抗体（また、当該分野で「アブザイム」として公知である）は、本発明のプロドラッグを、遊離活性薬物に変換するのに使用され得る（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。抗体−アブザイム結合体は、本明細書中に記載されるように、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のために調製され得る。
【０１６２】
本発明の酵素は、上記に議論されたヘテロ二官能性架橋試薬の使用のような当該分野で周知の技術によって、抗ＥｒｂＢ２抗体に共有結合され得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと）を使用して構築され得る。
【０１６３】
（（ｘｉ）他の抗体改変）
抗体の他の改変は、本明細書中に意図される。例えば、抗体は、種々の非タンパク様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー）の１つに連結され得る。抗体はまた、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中か、またはマクロエマルジョン中に、例えば、コアセルベーション技術によるかまたは界面のポリマー化（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタキシレート）マイクロカプセル）によって調製されたマイクロカプセル中に包括され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０）において開示される。
【０１６４】
本明細書中に開示された抗ＥｒｂＢ２抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含むリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２；３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日公開のＷＯ９７／３８７３１に記載されるような当該分野で公知の方法によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【０１６５】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含むリピド組成物を有する逆相エバポレーション法によって作成され得る。リポソームは、所望の半径を有するリポソームを得るために、規定の細孔のサイズのフィルターを通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂフラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、リポソームに結合体化され得る。化学治療剤は、必要に応じて、リポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１６６】
（ＩＩＩ．薬学的処方物）
本発明に従って使用される抗体の治療的処方物は、凍結乾燥した処方物または水性溶液の形態で、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と、所望の程度の純度を有する抗体を混合させることによって、貯蔵のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して毒性はなく、そして例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；例えば、メチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｒａｂｅｎ）またはプロピルパラベン（ｐｒｏｐｙｌ  ｐａｒａｂｅｎ）などのアルキルパラベン（ａｌｋｙｌ  ｐａｒａｂｅｎ）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮTM、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳTMまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。好ましい凍結乾燥された抗ＥｒｂＢ２抗体処方物は、ＷＯ９７／０４８０１に記載され、本明細書中に参考として明確に援用される。
【０１６７】
この処方物はまた、特定の兆候が処置されるために必要な１つを超える活性化合物を含み得、好ましくは、お互いに悪影響を与えない補完的な活性を有する化合物である。例えば、１つの処方物において、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（例えば、ＥｒｂＢ２上の異なったエピトープ）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体をさらに提供することが、所望であり得る。あるいは、またはさらに、組成物は、化学療法剤、細胞障害性薬剤、サイトカイン、増殖阻害薬剤、抗ホルモン剤、および／または心保護剤をさらに含み得る。そのような分子は、意図される目的のために効果的な量で、組み合わせて、適切に提供される。
【０１６８】
活性成分はまた、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面のポリマー化（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチン−ミクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））ミクロカプセル）によって調製されたミクロカプセルに捕捉され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０）において開示される。
【０１６９】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、例えば、フィルム、またはミクロカプセルなどの成形品の形態で存在する。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシメチル−メタキクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７３３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴTM（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注入可能な微粒子）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、そしてポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシル酪酸が挙げられる。
【０１７０】
インビボ投与で使用される処方物は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌ろか膜を介するかにより容易に達成される。
【０１７１】
（ＩＶ．抗ＥｒｂＢ２抗体での処置）
本発明に従って、抗ＥｒｂＢ２抗体は、前立腺癌（例えば、アンドロゲン独立性前立腺癌またはアンドロゲン依存性前立腺癌）を処置するために、使用される。処置される癌が、アンドロゲン独立性またはアンドロゲン依存性の前立腺癌である場合、アンドロゲン（例えば、アンドロステロンまたはテストステロン）および／または腫瘍中のそのコグネイトレセプターの発現は、例えば、上記に記載されるような利用可能な種々のアッセイのいずれかを使用して、評価し得る。あるいは、またはさらに、患者は、抗アンドロゲン治療にもはや応答しないという点で、アンドロゲン独立性前立腺癌を有すると診断され得、そしてアンドロゲン依存性前立腺癌を有すると診断され得、抗アンドロゲン療法に応答する患者であり得る。一般的に、その癌はＥｒｂＢ２発現細胞を含み、その結果、抗ＥｒｂＢ２抗体は、この細胞に結合し得る。その癌は、ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現によって特徴付けられ得るが、本出願は、ＥｒｂＢ２を過剰発現する癌ではないと考えられる癌の処置の方法をさらに提供する。癌におけるＥｒｂＢ２の発現を決定するために、種々の診断的／予防的アッセイが利用できる。１つの実施形態では、ＥｒｂＢ２の過剰発現は、ＩＨＣによって（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）を使用して）、分析され得る。腫瘍生検に由来するパラフィン埋包した組織切片は、ＩＨＣアッセイに供され得、そして以下のようなＥｒｂＢ２タンパク質染色強度基準に従い得る：
スコア０    染色は全く見られないかまたは膜染色が、１０％未満の腫瘍細胞で見出される。
スコア１＋  かすかな／かろうじて認知できる膜染色が、１０％を越える腫瘍細胞で検出される。その細胞は、それらの膜の一部のみが染色されている。
スコア２＋  弱から中程度の完全な膜染色が、１０％を越える腫瘍細胞で検出される。
スコア３＋  中程度から強い完全な膜染色が、１０％を越える腫瘍細胞で見出される。
【０１７２】
ＥｒｂＢ２過剰発現の評価のための、スコア０または１＋を有するこれらの腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現しないとして特徴付けられ得、これに対して、スコア２＋または３＋を有する腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現するとして特徴付けられ得る。
【０１７３】
あるいは、またはさらに、ＩＮＦＯＲＭTM（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚｏｎａによって販売される）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮTM（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のようなＦＩＳＨアッセイは、腫瘍におけるＥｒｂＢ２過剰発現の程度（もしあれば）を決定するために、ホルマリン固定された、パラフィン埋包の腫瘍組織で実行され得る。
【０１７４】
本明細書中で処置される前立腺癌は、ＥｒｂＢレセプター（例えば、ＥＧＦＲ）の過剰な活性化によって特徴付けられる癌であり得る。そのような過剰な活性化は、ＥｒｂＢレセプターまたはＥｒｂＢリガンドの過剰発現または増加した産生に起因し得る。本発明の１つの実施形態では、診断または予防アッセイは、患者の癌がＥｒｂＢレセプターの過剰な活性化によって特徴付けられるかどうかを決定するために、実施される。例えば、癌におけるＥｒｂＢ遺伝子増幅および／またはＥｒｂＢレセプターの過剰発現が、決定され得る。そのような増幅／過剰発現を決定するための種々のアッセイが、当該分野で利用可能であり、そしてＩＨＣ、ＦＩＳＨおよび上記記載の抗原アッセイが含まれる。あるいは、またはさらに、腫瘍におけるまたは腫瘍に関連したＥｒｂＢリガンド（ＴＧＦ−αなど）のレベルは、既知の手順に従って、決定され得る。そのようなアッセイは、試験されるサンプル中にタンパク質および／またはそれをコードする核酸を検出し得る。１つの実施形態では、腫瘍におけるＥｒｂＢリガンドレベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して決定され得る；例えば、Ｓｃｈｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：５４５−５５０（１９９５）を参照のこと。あるいは、またはさらに、試験されるサンプル中のＥｒｂＢリガンドをコードする核酸のレベルを評価し得る；例えば、ＦＩＳＨ、サザンブロッティング、またはＰＣＲ技術を介して評価し得る。
【０１７５】
さらに、ＥｒｂＢレセプターまたはＥｒｂＢリガンドの過剰発現または増幅は、インビボ診断アッセイ（例えば、検出される分子に結合する分子（抗体など）を投与することによって）を使用して評価され得、そして検出可能な標識（例えば、放射性同位体）で標識され、そして標識の位置決定のために、患者を外部走査する。
【０１７６】
特定の実施形態では、細胞障害性薬剤と結合体化した抗ＥｒｂＢ２抗体を含む免疫結合体が、患者に投与される。好ましくは、免疫結合体および／または免疫結合体が結合されるＥｒｂＢタンパク質は、細胞によって内部移行され、それが結合する癌細胞を殺す際に、増加した免疫結合体の治療効力を生じる。好ましい実施形態では、細胞障害性薬剤は、癌細胞の核酸を標的とするか、または干渉する。そのような細胞障害性薬剤の例としては、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、カリッシュアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【０１７７】
抗ＥｒｂＢ２抗体または免疫結合体は、既知の方法（静脈内投与（例えば、ボーラス投与）、または一定の期間にわたる継続的な注入（筋内経路、腹腔内経路、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）経路、皮下経路、関節内経路、滑液包内経路、髄腔内経路、経口経路、局所経路、または吸入経路などによる）に従って、ヒト患者に投与される。抗体の静脈内投与または皮下投与が好まれる。
【０１７８】
他の治療レジメンは、抗ＥｒｂＢ２抗体の投与と組み合わせられ得る。その組み合わせられた投与は、別々の処方物または単一の薬学的処方物を使用した同時投与およびどちらかの順序での連続投与を含み、ここで、好ましくは、両方（または全て）の活性薬剤が、それらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。
【０１７９】
１つの好ましい実施形態では、患者は、２つの異なった抗ＥｒｂＢ２抗体で処置される。例えば、患者は、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする第一の抗ＥｒｂＢ２抗体、またはモノクローナル抗体２Ｃ４の生物学的特徴を有する抗体、および増殖阻害性である第二の抗ＥｒｂＢ２抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、またはＥｒｂＢ２過剰発現細胞（例えば、７Ｃ２、７Ｆ３またはそのヒト化改変体）のアポトーシスを誘導する抗ＥｒｂＢ２抗体で処置され得る。好ましくは、そのような組み合わせ治療は、相乗的な治療効果を生じる。
【０１８０】
抗ＥｒｂＢ２抗体の投与を、別の腫瘍関連抗原に対する抗体の投与と組み合わせることがまた、所望であり得る。この場合、他の抗体は、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し得る。
【０１８１】
１つの実施形態では、本発明の処置は、抗ＥｒｂＢ２抗体および１つ以上の化学療法剤または増殖阻害剤の組み合わせ投与を含み、異なった化学療法剤のカクテルの同時投与を含む。好ましい化学療法剤は、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルなど）および／またはアントラサイクリン抗生物質を含む。そのような化学療法剤のための調製および投薬計画は、製造業者の指示に従って、または当業者によって経験的に決定されるように、使用され得る。そのような化学療法のための調製物および投薬計画はまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｈｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ編、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）に記載される。
【０１８２】
抗体は、そのような分子に既知の投薬で、抗ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストン（例えば、ＥＰ  ６１６  ８１２を参照のこと）などの抗プロゲステロン；またはフルタミドのような抗アンドロゲンと組み合わせられ得る。処理される癌が、アンドロゲン独立性の癌である場合、患者は、以前に抗アンドロゲン治療に供された可能性があり、そして癌が、アンドロゲン独立になった後、抗ＥｒｂＢ２抗体（および必要に応じて本明細書中に記載されるような他の薬剤）が患者に投与され得る。
【０１８３】
時々、心保護剤（その治療に関連した心筋機能障害を予防するまたは減少させるために）または１つ以上のサイトカインを患者に同時投与することはまた、有益であり得る。上記の治療レジメンに加えて、患者は、癌細胞の外科的除去および／または照射治療に供され得る。上記で同時投与される任意の薬剤の適切な投薬量は、現在使用される投薬量であり、そして薬剤および抗ＥｒｂＢ抗体の組み合わせ作用（相乗作用）に起因して、低減され得る。
【０１８４】
疾患の予防または処置のための抗体の適切な用量は、上記に定義されるように、処置される疾患の型、疾患の重篤度および経過、抗体が予防目的または治療目的のために投与されるのかどうか、以前の治療、患者の臨床履歴および抗体に対する応答、および担当医の自由裁量に依存する。抗体は、１回または一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の型および重篤度に依存して、抗体の約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回以上の別々の投与によるか、または継続的な注入のいずれにせよ、患者に対する投与の最初の候補投薬量である。典型的な１日毎の投薬量は、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得、上で述べられた因子に依存する。状態に依存して、数日またはそれ以上にわたる反復投与のために、疾患症状の所望の抑制が発生するまで、処置は持続される。好ましい投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの最初の負荷用量、続いて約２ｍｇ／ｋｇのＥｒｂＢ２抗体の１週間毎の維持用量を投与する工程を包含する。しかし、他の投薬量レジメンは、有用であり得る。この療法の経過は、慣例的な技術およびアッセイによって、容易にモニターされる。
【０１８５】
患者に対する抗体タンパク質の投与は別として、本出願は、遺伝子治療による抗体の投与を意図する。抗体をコードする核酸のそのような投与は、表現「治療的に有効量な抗体を投与する」によって、包含される。例えば、細胞内抗体を生成する遺伝子治療の使用に関する１９９６年、３月１４日公開のＷＯ９６／０７３２１を参照のこと。
【０１８６】
患者細胞に核酸（必要に応じて、ベクターに含まれる）を投与する２つの主要なアプローチが存在する；インビボおよびエキソビボ。インビボ送達のために、核酸は、患者に直接注入され、通常、抗体が必要とされる部位に注入される。エキソビボ処置では、患者の細胞は取り出され、核酸は単離された細胞に導入され、そして改変細胞が、患者に直接投与されるか、または例えば、患者に移植される多孔性膜内に被包されるかのいずれかである（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同５，２８３，１８７号を参照のこと）。核酸を生存可能な細胞に導入するために利用できる種々の技術が存在する。この技術は、その核酸が、インビトロで培養細胞へ、またはインビボで意図される宿主の細胞に移入されるかどうかに依存して、変動する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入のために適した技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が挙げられる。遺伝子のエキソビボ送達のために一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【０１８７】
現在好まれるインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなど）および脂質に依存した系（脂質媒介の遺伝子の移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）でのトランスフェクションを含む。いくつかの場合では、標的細胞を標的とする薬剤（細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞のレセプターのリガンドなど）を核酸供給源に提供することは望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に向性のあるカプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環の際に内部移行を経験するタンパク質の抗体、および細胞内局在化を標的とし、そして細胞内半減期を増強するタンパク質、を標的化するためおよび／または取り込みと容易にするために使用され得る。レセプター媒介のエンドサイトシス技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３４１０−３４１４（１９９０）によって記載される。現在既知の遺伝子マーキングプロトコルおよび遺伝子治療プロトコルの総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。またＷＯ９３／２５６７３およびそこに引用されている参考文献を参照のこと。
（Ｖ．製造品）
本発明の別の実施形態では、前立腺癌の処置に有用な物質を含む製造品が、提供される。製造品は、容器およびラベルまたは容器に対するパッケージ挿入物または容器に関連したパッケージ挿入物を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の物質から形成され得る。その容器は、状態の処置に効果的な組成物を保持し、そして滅菌アクセスポート（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下組織注射針によって貫通し得るストッパーを有するバイアルであり得る）を有し得る。その組成物中の少なくとも１つの活性剤は、抗ＥｒｂＢ２抗体である。そのラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が前立腺癌、アンドロゲン独立性前立腺癌、またはアンドロゲン依存性前立腺癌を処置するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）製造品に含まれる組成物を有する第一の容器（ここで、その組成物は、ＥｒｂＢ２に結合し、そしてＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する第一の抗体を含む）；および（ｂ）製造品に含まれる組成物を有する第二の容器（ここで、その組成物は、ＥｒｂＢ２に結合し、そしてＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化を阻害する第二の抗体を含む）、を含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、第一および第二の抗体組成物が、前立腺癌を処置するために使用され得ることを示すパッケージ挿入物をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、製造品は、薬学的に受容可能な緩衝液（注入のための静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液など）を含む第二（または第三）の容器をさらに含み得る。それは、商業的および利用者の観点から所望の他の物質をさらに含み得、これらの物質としては、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、およびシリンジが挙げられる。
【０１８８】
（ＶＩ．物質の寄託）
以下のハイブリドーマ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託された：
抗体名称      ＡＴＣＣ番号                    寄託日
７Ｃ２        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１５      １９９６年１０月１７日
７Ｆ３        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１        １９９６年１０月１７日
４Ｄ５        ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４６３      １９９０年  ５月２４日
２Ｃ４        ＡＴＣＣ  ＨＢ１２６９７        １９９９年  ４月  ８日
本発明のさらなる詳細は、以下の非制限的な実施例によって例示される。明細書中の全ての引用文献の開示は、本明細書中に参考として明確に援用される。
【０１８９】
（実施例１）
（モノクローナル抗体２Ｃ４の生成および特徴付け）
ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３および４Ｄ５を、Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０）に記載されるように、生成した。手短には、Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：７１５８−７１６３（１９８７）に記載されるように生成したＮＩＨ３Ｔ３／ＨＥＲ２−３400細胞（約１×１０5ＥｒｂＢ２分子／細胞を発現する）は、２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を用いて収集し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。マウスに、０、２、５および７週間で、０．５ｍｌ  ＰＢＳ中の１０7細胞の腹腔内注入を付与した。32Ｐ標識したＥｒｂＢ２で免疫沈降する抗血清を有するマウスは、９および１３週で、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）セファロースで精製したＥｒｂＢ２膜抽出物の腹腔内注入を付与した。続いて、０．１ｍｌのＥｒｂＢ２調製物の静脈内注入を行い、脾細胞を、マウス骨髄腫株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡおよび放射性免疫沈降によるＥｒｂＢ２結合についてスクリーニングした。
【０１９０】
モノクローナル抗体４Ｄ５、７Ｆ３および２Ｃ４によって結合されるＥｒｂＢ２エピトープを、競合的結合分析（Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０））によって決定した。交差ブロック研究を、蛍光を定量するためにＰＡＮＤＥＸTMスクリーン機械を使用して、インタクトな細胞の直接の蛍光によって、抗体に関して行なった。それぞれのモノクローナル抗体を、確立された手順（Ｗｏｆｓｙら、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｍｏｌｏｇｙ，ｐ．２８７，ＭｉｓｈｅｌおよびＳｃｈｉｉｇｉ（編）Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｗ．Ｊ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（１９８０））を使用して、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合された。ＮＩＨ  ３Ｔ３／ＨＥＲ２−３400細胞のコンフルエントな単層をトリプシン処理し、１回洗浄し、そして０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％ＮａＮ3を含むコールドなＰＢＳ中で、１．７５×１０6細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。最終濃度１％のラテックス粒子（ＩＤＣ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を、ＰＡＮＤＥＸTMプレート膜の塊状化を減少させるために加えた。細胞懸濁液２０μｌ、および精製されたモノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌ）２０μｌを、ＰＡＮＤＥＸTMプレートウェルに加え、そして氷上３０分間インキュベートした。２０μｌ中の所定のＦＩＴＣ標識のモノクローナル抗体の希釈液を、それぞれのウェルに加え、３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてその蛍光を、ＰＡＮＤＥＸTMによって定量した。モノクローナル抗体を、それぞれの抗体が無関係のモノクローナル抗体のコントロールと比較して、５０％以上他の抗体の結合をブロックすれば、エピトープを共有すると考えた。この実施例では、モノクローナル抗体４Ｄ５、７Ｆ３および２Ｃ４に、それぞれエピトープＩ、Ｇ／ＦおよびＦを割り当てた。
【０１９１】
モノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３および４Ｄ５の増殖阻害特徴を、乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（例えば、Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５−１１７２（１９８９）を参照のこと）を使用して評価した。手短には、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、０．２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリプシンを使用して剥離し、そして１ｍｌ当り４×１０5細胞の密度で、完全培地に懸濁した。１００μｌ（４×１０4細胞）のアリコートを、９６ウェル微量希釈溶液プレートにプレートし、細胞を接着させ、そして培地のみ１００μｌまたはモノクローナル抗体（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を含む培地１００μｌを、次いで、加えた。Ｓｕｇａｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９４３−９４５（１９８５）に記載されるように、７２時間後、プレートを、２回ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で洗浄し、クリスタルバイオレット（メタノール中０．５％）で染色し、相対的な細胞増殖を分析した。モノクローナル抗体２Ｃ４および７Ｆ３は、モノクローナル抗体４Ｄ５で達成された約５６％阻害と比較して、ＳＫ−ＢＲ−３相対的細胞増殖をそれぞれ約２０％および約３８％阻害した。
【０１９２】
モノクローナル抗体２Ｃ４、４Ｄ５、および７Ｆ３を、ＭＣＦ７細胞の全細胞溶解物由来の、分子量（Ｍr）が１８０，０００程度のタンパク質の、ＨＲＧにより刺激されるチロシンリン酸化をこれらが阻害する能力について、評価した（Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６））。ＭＣＦ７細胞は、公知の全てのＥｒｂＢレセプターを発現することが報告されているが、比較的低いレベルにおいてである。ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４は、ほぼ同じ分子サイズを有するので、全細胞溶解物がウェスタンブロット分析により評価される場合に、どのタンパク質がチロシンリン酸化されるかを区別することは、可能ではない。しかし、これらの細胞は、ＨＲＧチロシンリン酸化アッセイに関しては、理想的である。なぜなら、使用されるアッセイ条件下で、外因的に添加されるＨＲＧの非存在下では、これらは低レベルから検出不可能なレベルまでの、分子量が１８０，０００程度のチロシンリン酸化タンパク質を示すからである。
【０１９３】
ＭＣＦ７細胞を、２４ウェルプレートにプレートし、そしてＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした；次いで、ｒＨＲＧβ１177-244を、０．２ｎＭの最終濃度まで各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを８分間続けた。培地を注意深く各ウェルから吸引し、そして１００μｌのＳＤＳサンプル緩衝液（５％  ＳＤＳ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、および２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ  ６．８））の添加によって、反応を停止させた。各サンプル（２５μｌ）を、４〜１２％の勾配のゲル（Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動し、次いでポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移した。抗ホスホチロシン（４Ｇ１０、ＵＢＩ由来、１μｇ／ｍｌで使用）免疫ブロットを現像し、そして分子量約１８０，０００の優先的な反応性バンドの強度を、以前に記載されたように（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４６６１−１４６６５（１９９４））反射デンシトメトリー（ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって定量した。
【０１９４】
モノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３、および４Ｄ５は、分子量１８０，０００におけるＨＲＧ誘導チロシンリン酸化シグナルの発生を、有意に阻害した。ＨＲＧの非存在下では、これらの抗体のいずれも、分子量が１８０，０００程度のタンパク質のチロシンリン酸化を刺激し得なかった。また、これらの抗体は、ＥＧＦＲ（Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０））とも、ＥｒｂＢ３とも、ＥｒｂＢ４とも交差反応しない。抗体２Ｃ４および７Ｆ３は、コントロールの２５％未満まで、ｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激を有意に阻害した。モノクローナル抗体４Ｄ５は、約５０％までチロシンリン酸化のＨＲＧ刺激をブロックし得た。図２Ａは、反射デンシトメトリーにより決定した、ｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激の、２Ｃ４または７Ｆ３による阻害についての用量応答曲線を示す。４パラメータの当てはめを使用してのこれらの阻害曲線の評価により、２Ｃ４および７Ｆ３についてそれぞれ２．８±０．７ｎＭおよび２９．０±４．１ｎＭのＩＣ50を得た。
【０１９５】
抗ＥｒｂＢ２抗体による、ＭＣＦ７胸部腫瘍細胞株へのＨＲＧの結合の阻害を、２４ウェルプレートの形式で、氷上の単層培養物を用いて実施した（Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６））。抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体を、各ウェルに添加し、そして３０分間インキュベートした。125Ｉで標識したｒＨＲＧβ１177-224（２５ｐｍ）を添加し、そしてインキュベーションを４〜１６時間続けた。図２Ｂは、ＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧの結合の、２Ｃ４または７Ｆ３による阻害についての用量応答曲線を提供する。種々の濃度の２Ｃ４または７Ｆ３を、125Ｉで標識したｒＨＲＧβ１の存在下でＭＣＦ７細胞とともにインキュベートした。この阻害曲線を図２Ｂに示す。これらのデータの分析により、２Ｃ４および７Ｆ３についてそれぞれ２．４±０．３ｎＭおよび１９．０±７．３ｎＭのＩＣ50を得た。２Ｃ４および７Ｆ３についての最大約７４％の阻害は、チロシンリン酸化のデータと一致した。
【０１９６】
ＭＣＦ７細胞に対する抗ＥｒｂＢ２抗体の観察された効果が一般的な現象であるか否かを決定するために、ヒト腫瘍細胞株を、２Ｃ４または７Ｆ３とともにインキュベートし、そして125Ｉで標識したｒＨＲＧβ１の特異的な結合の程度を決定した（Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７  １４６５（１９９６））。この試験からの結果を、図３に示す。121Ｉで標識したｒＨＲＧβ１の結合は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（これは、ＥｒｂＢ２をほとんどまたは全く発現しないことが報告されている）を除く全ての細胞株において、２Ｃ４または７Ｆ３のいずれかによって有意に阻害され得た。残りの細胞株は、ＥｒｂＢ２を発現し、ＥｒｂＢ２発現のレベルは、これらの細胞株の間で広範に変動することが報告されている。実際に、試験した細胞株におけるＥｒｂＢ２発現の範囲は、２桁より大きく変動する。例えば、ＢＴ−２０、ＭＣＦ７、およびＣａｏｖ３は、約１０4のＥｒｂＢ２レセプター／細胞を発現し、一方でＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３は、約１０6のＥｒｂＢ２レセプター／細胞を発現する。これらの細胞におけるＥｒｂＢ２発現の広い範囲および上記データを考慮して、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４との間の相互作用自体が、形質膜の表面において起こる高親和性相互作用であることが、結論付けられた。
【０１９７】
外因性ｒＨＲＧβ１の存在下または非存在下での、モノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５の、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する増殖阻害の効果を評価した（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７））。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞におけるＥｒｂＢ２レベルは、正常な胸部上皮細胞において見出されるレベルより４〜６倍高く、そしてＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４レセプターは、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞において、構成的にチロシンリン酸化される。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞を、抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５（１０μｇ／ｍＬ）で、４日間処理した。クリスタルバイオレット染色アッセイにおいて、２Ｃ４とのインキュベーションは、この細胞株に対する強力な増殖阻害効果を示した（図４Ａ）。外因性ＨＲＧは、この阻害を有意には逆転させなかった。他方で、２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２過剰発現細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対して阻害効果を示さなかった（図４Ｂ）。モノクローナル抗体２Ｃ４は、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の細胞増殖を、外因性ＨＲＧの存在下と非存在下との両方において、モノクローナル抗体４Ｄ５より広い範囲まで阻害し得た。４Ｄ５による細胞増殖の阻害は、ＥｒｂＢ２発現レベルに依存する（Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５−２６３（１９９３））。６６％の最大阻害が、ＳＫ−ＢＲ−３細胞において検出され得た（図４Ｂ）。しかし、この効果は、外因性ＨＲＧによって克服され得た。
【０１９８】
（実施例２）
（ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３とのＨＲＧ依存性会合は、モノクローナル抗体２Ｃ４によりブロックされる）
ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ２に会合する能力を、免疫共沈実験において試験した。１．０×１０6のＭＣＦ７細胞またはＳＫ−ＢＲ−３細胞を、６ウェルの組織培養プレートに、５０：５０のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含む）（増殖培地）中で播種し、そして一晩付着させた。これらの細胞を、この実験を開始する前に、血清なしで、増殖培地中で２時間飢えさせた。
【０１９９】
これらの細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で軽く洗浄し、次いで１００ｎＭの適用された抗体（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含む０．２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＲＰＭＩ培地（結合緩衝液）中に希釈された）または結合緩衝液単独（コントロール）のいずれかとともに、インキュベートした。室温で１時間後に、最終濃度５ｎＭまで、ＨＲＧを半分のウェル（＋）に添加した。同じ容量の結合緩衝液を、他のウェル（−）に添加した。インキュベーションを、約１０分間続けた。
【０２００】
上清を吸引により除去し、そして細胞を、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１０ＴＵ／ｍｌアプロチニンを含む、ＲＰＭＩ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１．０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００TM、１．０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（溶解緩衝液）中に溶解した。この溶解物を遠心分離することによって、不溶性材料を除去した。
【０２０１】
ＥｒｂＢ２を、アフィニティーゲル（Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ  １０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に共有結合したモノクローナル抗体を使用して、免疫沈降した。この抗体（Ａｂ−３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、細胞質ドメインエピトープを認識する。免疫沈降を、約８．５μｇの固定した抗体を含む１０μｌのゲルスラリーを各溶解物に添加することにより実施し、そしてこれらのサンプルを、室温で２時間混合した。次いで、これらのゲルを、遠心分離により収集した。これらのゲルを、溶解緩衝液でバッチごとに３回洗浄して、結合していない材料を除去した。次いで、ＳＤＳサンプル緩衝液を添加し、そしてこれらのサンプルを、沸騰している水浴中で軽く加熱した。
【０２０２】
上清を、４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上で泳動し、そしてニトロセルロース膜上に、電気ブロットした。ＥｒｂＢ３の存在を、その細胞質ドメインエピトープに対するポリクローナル抗体（ｃ−１７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてブロットをプローブすることによって、評価した。これらのブロットを、化学発光基質（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して可視化した。
【０２０３】
図５Ａおよび５Ｂのコントロールのレーンに見られるように、ＭＣＦ７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞に関して、それぞれ、ＥｒｂＢ３は、これらの細胞がＨＲＧで刺激された場合にのみ、ＥｒｂＢ２の免疫沈降物に存在した。これらの細胞が最初にモノクローナル抗体２Ｃ４とともにインキュベートされた場合には、ＥｒｂＢ３シグナルは、ＭＣＦ７細胞においては消滅し（図５Ａ、レーン２Ｃ４＋）、そしてＳＫ−ＢＲ−３細胞においてはかなり減少した（図５Ｂ、レーン２Ｃ４＋）。図５Ａ〜Ｂに示すように、モノクローナル抗体２Ｃ４は、ＭＣＦ７細胞とＳＫ−ＢＲ−３細胞との両方において、ＥｒｂＢ３とＥｒｂＢ２とのヘレグリン依存性会合を、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）より、有意により効果的に、ブロックする。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）との予備インキュベーションは、ＭＣＦ７溶解物におけるＥｒｂＢ３シグナルを減少させたが、ＳＫ−ＢＲ−３溶解物から共沈したＥｒｂＢ３の量には、ほとんどまたは全く効果を有さなかった。ＥＧＦレセプターに対する抗体（Ａｂ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）での予備インキュベーションは、いずれの細胞株においても、ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ２と免疫共沈する能力に対して、効果を有さなかった。
【０２０４】
（実施例３）
（ヒト化２Ｃ４抗体およびアフィニティー成熟した２Ｃ４抗体改変体）
マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変ドメインを、最初に、マウス／ヒトキメラＦａｂフラグメントの産生を可能にするベクターにクローニングした。全ＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＲＮＡ抽出キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って、ハイブリドーマ細胞から単離した。この可変ドメインを、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ゲルで精製し、そして以前に記載されたように（Ｃａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：４２８５（１９９２）；および米国特許第５，８２１，３３７号）、ヒトκ定常ドメインおよびヒトＣH１ドメインを含むｐＵＣ１１９に基づくプラスミドの誘導体に挿入した。得られたプラスミドを、Ｆａｂフラグメントの発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ株１６Ｃ９に形質転換した。培養物の増殖、タンパク質発現の誘導、およびＦａｂフラグメントの精製は、以前に記載されたとおりであった（Ｗｅｒｔｈｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９８６−４９９５（１９９６）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：４５９３−４５９９（１９９７））。精製したキメラ２Ｃ４  Ｆａｂフラグメントを、ＭＣＦ７細胞への125Ｉ−ＨＲＧの結合を阻害する能力、およびＭＣＦ７細胞においてｐ１８０チロシンリン酸化のｒＨＲＧ活性化を阻害する能力に関して、マウス親抗体２Ｃ４と比較した。図６Ａに示すように、キメラ２Ｃ４  Ｆａｂフラグメントは、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７への、高親和性ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３結合部位の形成の破壊において、非常に効果的である。インタクトなマウス２Ｃ４について計算した相対的なＩＣ50値は、４．０±０．４ｎＭであり、一方でＦａｂフラグメントについての値は、７．７±１．１ｎＭである。図６Ｂに示すように、一価のキメラ２Ｃ４  Ｆａｂフラグメントは、ＨＲＧ依存性ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３活性化を破壊する際に、非常に効果的である。インタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４について計算したＩＣ50値は、６．０±２ｎＭであり、一方でＦａｂフラグメントについての値は、１５．０±２ｎＭである。
【０２０５】
キメラクローンのＤＮＡ配列決定は、ＣＤＲ残基の同定を可能にした（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））（図７ＡおよびＢ）。オリゴヌクレオチド部位に指向された変異誘発を使用して、６つ全てのこれらのＣＤＲ領域を、以前に記載されたように（Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：４５９３−４５９９（１９９７））、プラスミドＶＸ４に含まれる完全ヒトフレームワーク（ＶLκサブグループＩおよびＶHサブグループＩＩＩ）に導入した。得られた「ＣＤＲ交換物」から、上記のようにタンパク質を発現させ、そして精製した。結合試験を実施して、これら２つのバージョンを比較した。簡単にいえば、ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰTMプレートを、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１ｍｌあたり１μｇのＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ；ＷＯ９０／１４３５７に記載されるように生成した）で、４℃で一晩コーティングし、次いでＥＬＩＳＡ希釈液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０、ＰＢＳ）で室温で１時間ブロックした。ＥＬＩＳＡ希釈液中のサンプルの系列希釈物を、プレート上で２時間インキュベートした。洗浄後、結合したＦａｂフラグメントを、ビオチン化マウス抗ヒトκ抗体（ＩＣＮ  ６３４７７１）、続いてストレプトアビジン結合体化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を基質として使用して、検出した。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。図８Ａに示すように、すべての結合が、ＣＤＲ交換ヒトＦａｂフラグメントの構築の際に、失われた。
【０２０６】
ヒト化Ｆａｂの結合を回復させるために、変異体を、テンプレートとしてＣＤＲ交換物由来のＤＮＡを使用して、構築した。コンピューターにより生成されるモデル（図９）を使用して、これらの変異体を設計し、ヒトフレームワーク領域の残基を、そのマウスの対応物に、変化がＣＤＲコンホメーションまたは抗体−抗原界面に影響を与え得る位置で、変化させた。変異体を、表２に示す。
【０２０７】
【表２】
0004579471.tif 000003
種々の変異体についての結合曲線を、図８Ａ〜Ｃに示す。ヒト化Ｆａｂバージョン５７４（ＡｒｇＨ７１Ｖａｌ、ＡｓｐＨ７３ＡｒｇおよびＩｌｅＨ６９Ｌｅｕの変化を有する）の結合は、元のキメラ２Ｃ４  Ｆａｂフラグメントの結合に回復されたようである。さらなるＦＲ残基および／またはＣＤＲ残基（例えば、Ｌ２、Ｌ５４、Ｌ５５、Ｌ５６、Ｈ３５および／またはＨ４８）は、ヒト化抗体の結合をさらに精製または増強するために、改変され得る（例えば、以下のように置換され得る：ＩｌｅＬ２Ｔｈｒ；ＡｒｇＬ５４Ｌｅｕ；ＴｙｒＬ５５Ｇｌｕ；ＴｈｒＬ５６Ｓｅｒ；ＡｓｐＨ３５Ｓｅｒ；およびＶａｌＨ４８Ｉ１ｅ）。代替的に、またはさらに、ヒト化抗体は、その親和性および／または他の生物学的活性をさらに改善または精製するために、アフィニティー成熟され得る（上記を参照のこと）。
【０２０８】
ヒト化２Ｃ４バージョン５７４を、ファージディスプレイ法を使用して、アフィニティー成熟させた。簡単にいえば、ヒト化２Ｃ４．５７４  Ｆａｂを、遺伝子ＩＩＩ融合としてファージディスプレイベクターにクローニングした。ファージ粒子が、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージでの感染によって誘導される場合には、この融合は、Ｆａｂがファージテール線維タンパク質である遺伝子ＩＩＩのＮ末端においてディスプレイされることを、可能にする（Ｂａｃａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８（１９９７））。
【０２０９】
個々のライブラリーを、上で同定した６つのＣＤＲの各々について、構築した。これらのライブラリーにおいて、コンピュータにより生成されたモデル（図９）を使用してＥｒｂＢ２への結合において潜在的に重要であると同定されたＣＤＲにおけるアミノ酸を、「ＮＮＳ」をコドンとして含むオリゴを使用して、無作為化した。次いで、これらのライブラリーを、ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰTMプレート上にコーティングされたＥｒｂＢ２  ＥＣＤに対して、０．２％ＴＷＥＥＮ  ２０（登録商標）を含むＰＢＳ中の３％乾燥ミルク（ＭＰＢＳＴ）を全てのブロッキング溶液の代わりに使用して、パニングした。２Ｃ４．５７４の親和性より高い親和性を有するファージを選択するために、パニングの３回目、４回目、および５回目において、可溶性ＥｒｂＢ２  ＥＣＤまたは可溶性Ｆａｂ  ２Ｃ４．５７４を、洗浄工程の間に、競争物として添加した。洗浄時間は、室温で１時間にわたった。
【０２１０】
５回のパニングの後に、個々のクローンを、ファージＥＬＩＳＡによって再度分析した。個々のクローンを、Ｃｏｓｔｅｒ  ９６ウェルＵ底組織培養プレートで増殖させ、そしてヘルパーファージの添加によって、ファージを導入した。一晩の増殖の後に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をペレット化し、そしてファージ含有上清を９６ウェルプレートに移し、ここで、これらのファージを、ＭＰＢＳＴを用いて室温で１時間ブロックした。ＥｒｂＢ２  ＥＣＤでコーティングしたＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰTMプレートもまた、上記のように、ＭＰＢＳＴでブロックした。ブロックしたファージを、プレート上で２時間インキュベートした。洗浄後、結合したファージを、ＭＰＢＳＴ中で１：５０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼと結合体化した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．２７−９４２１−０１）、次いで３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを基質として使用して検出した。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。
【０２１１】
最も高いシグナルを生じた、各ライブラリーからの４８のクローンを、ＤＮＡ配列決定した。配列が最も頻繁に起こったクローンを、可溶性Ｆａｂの発現を可能にする上記のベクターにサブクローニングした。これらのＦａｂをインキュベートし、タンパク質を精製し、そして精製したＦａｂを、結合について、ＥＬＩＳＡによって上記のように分析し、そして結合を、出発ヒト化２Ｃ４．５７４バージョンの結合と比較した。
【０２１２】
個々のＣＤＲにおいて目的の変異を同定した後、これらの種々の組み合わせであるさらなる変異を、上記のように構築し、そして試験した。５７４に対して改善された結合を生じた変異体を、表３に示す。
【０２１３】
【表３】
0004579471.tif 000004
*標準曲線の中央ＯＤを与えるために必要な変異体の量の、Ｅｒｂ２−ＥＣＤ  ＥＬＩＳＡにおける標準曲線の中央ＯＤを与えるために必要な５７４の量に対する比。１．０より小さな数は、その変異体が、５７４が結合するより良好にＥｒｂ２を結合することを示す。
【０２１４】
以下の変異体もまた構築し、そして現在評価中である：
【０２１５】
【表４】
0004579471.tif 000005
以下の変異体は、相同性走査により示唆され、現在構築中である：
【０２１６】
【表５】
0004579471.tif 000006
Ｈ３４における好ましいアミノ酸は、メチオニンである。この位置において酸化が見出された場合には、ロイシンへの変化がなされ得る。
【０２１７】
ａｓｎＨ５２およびａｓｎＨ５３は、結合のために非常に好ましいことがわかった。これらの残基をアラニンまたはアスパラギン酸に変化させることにより、結合が劇的に減少した。
【０２１８】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域でヒト化されたＦａｂバージョン５７４を含むインタクトな抗体を調製した（米国特許第５，８２１，３３７号を参照のこと）。このインタクトな抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される。
【０２１９】
（実施例４）
（モノクローナル抗体２Ｃ４は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、またはＨＲＧが媒介するＭＡＰＫの活性化をブロックする）
多くの増殖因子レセプターは、マイトジェン（分裂促進因子）活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）径路を通じてシグナル伝達する。これらの２重特異性キナーゼは、最終的にガン細胞の分割を誘発するシグナル伝達径路における重要な終点（エンドポイント）の１つである。モノクローナル抗体２Ｃ４またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）が、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、またはＨＲＧによるＭＡＰＫの活性化を阻害する能力を、以下の様式で評価した。
【０２２０】
血清含有培地を含む１２ウェルの細胞培養プレートに、ＭＣＦ７細胞（１０5細胞／ウェル）をプレーティングした。翌日、この細胞培地を取り除き、そして０．１％血清を含有する新鮮培地を、各ウェルに添加した。次いで、この手順を翌日、繰り返し、そしてアッセイの前に、培地を無血清結合緩衝液と交換した（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１６６７〜７４（１９９８）；およびＳｃｈａｅｆｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８５９〜６６（１９９９））。細胞を室温と平衡化させ、次いで、０．５ｍＬの２００ｎＭ  ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）またはモノクローナル抗体２Ｃ４とともに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１ｎＭ  ＥＧＦ、１ｎＭ  ＴＧＦ−α、または０．２ｎＭ  ＨＲＧを用いて１５分間処理した。細胞培地を吸引することにより、この反応を終わらせ、次いで０．２ｍＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（１％ＤＴＴ含有）を添加した。以前に記載（Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１６６７〜７４（１９９８））のように、抗活性ＭＡＰＫ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いるウエスタンブロットにより、ＭＡＰＫ活性化を評価した。
【０２２１】
図１０に示すように、モノクローナル抗体２Ｃ４は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＨＲＧにより媒介されるＭＡＰＫの活性化を、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）よりも大きい程度に、有意にブロックする。これらのデータは、モノクローナル抗体２Ｃ４が、ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ３のいずれかとの会合に用いられるＥｒｂＢ２の表面に結合し、従ってシグナル伝達レセプター複合体の形成を妨げることを示唆する。
【０２２２】
（実施例５）
（アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺ガンの増殖に対するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の影響）
アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性のヒト前立腺ガンの異種移植モデルにおけるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）単独療法、およびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）とパクリタキセルとの併用の影響を、ヒト前立腺ガンの前臨床モデルで研究した。アンドロゲン依存性のＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰのヒト前立腺ガン異種移植片モデル、ならびにＣＷＲ２２のアンドロゲン非依存性亜系統を用いた（Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０４２〜３０４６（１９９６）；Ｗａｉｎｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６０４９〜６０５２（１９９４）；およびＳｔｅａｒｎｓら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：５６〜５８（１９９８））。
【０２２３】
（材料および方法）
（動物研究）：４〜６週齢のヌード無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ雄性および雌性マウスをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから得て、そしてＳｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ研究所において加圧換気ケージ中で飼育した。雄性動物には、１×１０6のＬＮＣａＰ細胞、またはアンドロゲン依存性ＣＷＲ２２由来の細かく刻んだ腫瘍組織を皮下注射し、そして雌性マウスにはアンドロゲン非依存性亜系統であるＣＷＲ２２Ｒ、またはＣＷＲ２２ＳＡ１、ＣＷＲＳＡ４、ＣＷＲＳＡ６（再増殖のために腫瘍を選択することによって得た）を投与し、そしてアンドロゲン中止後に血清ＰＳＡが上昇した。全ての株を、以前に記載した（Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０４２〜３０４６（１９９６）；Ｗａｉｎｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６０４９〜６０５２（１９９４）；およびＳａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１５８４〜１５８９（１９９７））ように、再構成された基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と一緒に注射した
。血清テストステロンレベルを維持するため、雄性マウスに、１２．５ｍｇの徐放性テストステロンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を皮下に埋め込み、その後、腫瘍細胞を接種した。処置は、以下から構成された：３週間未満の間、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（ＰＢＳ中に含有）の２０ｍｇ／ｋｇを毎週２回腹腔内投与、および／またはパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）（滅菌生理食塩水中に含有）を皮下に低用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ、皮下、１週あたり５回を３週）または高用量（１２．５ｍｇ／ｋｇ、皮下、１週あたり５回を２週）。コントロールマウスにはビヒクルのみを与えた。腫瘍を３〜４日ごとにノギス（副尺付きカリパス）で測定し、そして腫瘍容積を以下の式によって算出した：ｐ／６×長直径×（短い方の直径）2。容積で少なくとも６５ｍｍ3の腫瘍が明白に樹立された動物を、処置群に指定した。
【０２２４】
（異種移植片のＥｒｂＢ２状態の決定）：ＤＡＫＯ  ＥｒｂＢ２キット（ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）、ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いた免疫組織化学により、ＥｒｂＢ２の発現について、異種移植片をアッセイした。このサンプルを、ＤＡＫＯキット標準物中の標準コントロールとの比較により盲検的にスコア付けした。このスコアは以下の通りであった：０（染色なし、または膜染色が腫瘍細胞の１０％未満）、１+（腫瘍細胞の１０％を超える弱い膜染色）、２+（細胞の１０％を超える、弱〜中度の完全膜染色）、または３+（細胞の１０％を超える、中度〜強度の完全膜染色）。０または１+のスコアをＥｒｂＢ２過剰発現が陰性とみなし、一方、２+または３-は、ＥｒｂＢ２過剰発現を示した。Ｏｎｃｏｒキット（ＩＮＦＯＲＭ（登録商標）ＥｒｂＢ２遺伝子検出システム、Ｏｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＦＩＳＨ分析を行った。各腫瘍において、最小１００の腫瘍細胞を、核ＥｒｂＢ２遺伝子コピー数について評価した（Ｒｏｓｓら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：８２７〜８３３（１９９７））。
【０２２５】
（血清ＰＳＡ値の決定）：背部尾静脈の表面切開によって、ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ血清分離管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中に収集した雄性マウス由来の血液サンプル（約５０ｍｌ）を、治療の前、そして処置の９日目および２１日目に採取した。次いで、Ｔａｎｄｅｍ−Ｒ  ＰＳＡ免疫放射定量測定アッセイ（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて血清からＰＳＡ値を決定した。
【０２２６】
（統計学的分析）処置群の腫瘍容積の間の２つの組の間の差異を並べ替え検定（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）を用いて経時的に比較した。この検定についてのヌル仮説は、その処置が腫瘍容積に対して経時的に、示差的効果を有さないというものである。この仮説を検定するために用いられた統計値は、全ての時点にわたって合計された平均腫瘍容積の間の差の二乗の合計であった。
【０２２７】
【数１】
0004579471.tif 000007
ＳＳ＿Ｄｅｖを用いて、各時点での処置群の間の平均差異を獲得した。この統計値は、２つの処理群の平均腫瘍量の軌跡を異ならせる量を反映する。
【０２２８】
（結果）
（前立腺異種移植片のＥｒｂＢ２免疫組織化学染色およびＥｒｂＢ２遺伝子コピー数）：アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性前立腺異種移植片のＥｒｂＢ２発現パターンを、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびＦＩＳＨにより試験した。親のアンドロゲン依存性ＣＷＲ２２腫瘍は、２+のＥｒｂＢ２染色を示し、そしてＬＮＣａＰ腫瘍は、３+のＥｒｂＢ２染色を示した。アンドロゲン非依存性亜系統のＣＷＲ２２は、ＥｒｂＢ２について、以下の染色を示した：２+（ＣＷＲＳＡ１）、３+（ＣＷＲＳＡ４）、２+（ＣＷＲＳＡ６）、および１+（ＣＷＲ２２Ｒ）の染色。全ての腫瘍は、ＦＩＳＨにより、２〜４のＥｒｂＢ２遺伝子コピー数（正常範囲）を有した。
【０２２９】
（樹立された前立腺ガン異種移植片に対するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の効果）：動物実験を実施し、十分に樹立されたアンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺ガン異種移植片において、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の効果を評価した。これらの実験には、ＣＷＲ２２、ＬＮＣａＰ、ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６のモデルを用いた。なぜなら、それらは再現性の増殖曲線を提供したからである。異種移植片が樹立された後、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を、毎週２回、２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。いずれのアンドロゲン非依存性腫瘍においても、コントロールに比較して、腫瘍増殖に対するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の効果は観察されなかった（ＣＷＲ２２Ｒ、ｐ＝０．６０、ｎ＝１０、図１１Ａ；ＣＷＲＳＡ６、ｐ＝０．６３、ｎ＝１０、図１１Ｂ）。マウス抗ＥｒｂＢ２抗体である４Ｄ５も、ＣＷＲ２２Ｒアンドロゲン非依存性株において腫瘍増殖に対する効果はなかった（ｐ＝０．２１、ｎ＝１０）。対照的に、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、アンドロゲン依存性異種移植片モデルＣＷＲ２２（６８％増殖阻害；ｐ＜０．０３，ｎ＝１２、図１１Ｃ）およびＬＮＣａＰ（８９％増殖阻害；ｐ＝０．００２、ｎ＝１２，図１１Ｄ）の両方において、有意な増殖阻害を示した。
【０２３０】
（樹立された腫瘍異種移植片に対する、ＴＡＸＯＬ（登録商標）と組合せた、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の効果）：パクリタキセルおよびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を動物に同時投与した場合、アンドロゲン依存性腫瘍およびアンドロゲン非依存性腫瘍の両方について、コントロールに対して腫瘍容積の著明な減少がある（ＣＷＲ２２  ９８％増殖阻害、ｐ＜０．０１、図１１Ｅ；ＣＷＲ２２Ｒ  ９２％増殖阻害、ｐ＜０．０１、図１１Ｇ；ＬＮＣａＰ  ９４％増殖阻害、ｐ＝０．００６、図１１Ｆ；ＣＷＲＳＡ６  ７７％増殖阻害、ｐ＜０．０１、図１１Ｈ）。アンドロゲン依存性異種移植片を有する動物における処置期間の終わりの時点で、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびパクリタキセルの組合せでは、各薬剤の単独に比較して、増殖阻害の増大が観察された（図１１Ｅ〜Ｈ）：ＣＷＲ２２群（平均腫瘍容積、各群でｎ＝６、パクリタキセル４０８ｍｍ3、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）５２０ｍｍ3、パクリタキセルおよびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）７６ｍｍ3；ｐ＜０．０３  パクリタキセル対パクリタキセル＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、およびＬＮＣａＰ群（平均腫瘍容積、各群でｎ＝６、パクリタキセル２３３ｍｍ3、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）１６３ｍｍ3、パクリタキセルおよびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）８２ｍｍ3；ｐ＜０．０３  パクリタキセル  対  パクリタキセル＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））。さらに、アンドロゲン非依存性異種移植片を有する動物における処置期間の終わりの時点で、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびパクリタキセルの組合せでは、各薬剤の単独に比較して、増殖阻害の増大が観察された（図１１Ｅ〜Ｈ）：ＣＷＲＳＡ６群（平均腫瘍容積、各群でｎ＝５、パクリタキセル１，４９６ｍｍ3、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）２，９４１ｍｍ3、パクリタキセルおよびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）６８７ｍｍ3；ｐ＜０．００１  パクリタキセル  対  パクリタキセル＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、およびＣＷＲ２２Ｒ群（平均腫瘍容積、各群でｎ＝５、パクリタキセル１，２７３ｍｍ3、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）３，８１１ｍｍ3、パクリタキセルおよびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）５９２ｍｍ3；ｐ＝０．０９５  パクリタキセル  対  パクリタキセル＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））。
【０２３１】
（アンドロゲン依存性異種移植片を有する処置動物におけるＰＳＡ指標に対するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の効果）：図１２ＡおよびＢに示すように、コントロールと比較して、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）処置したアンドロゲン依存性群において、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）係数（ＰＳＡ  ｎｇ／血清ｍｌ／腫瘍ｍｍ3）の有意な上昇があった（ＣＷＲ２２，１８６４％対−４％、ｐ＜０．０００１、図１２Ａ；ＬＮＣａＰ，２３２％対−６８％、ｐ＜０．０００１、図１２Ｂ）。処置前の値と比較した場合も、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびパクリタキセルでの併用処置後、ＰＳＡ指標の上昇があった。
【０２３２】
（結論）
これらの前立腺ガンモデル系において、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）単独では、アンドロゲン依存性腫瘍にしか臨床活性がなく、そしてパクリタキセルと組合せれば、アンドロゲン依存性腫瘍およびアンドロゲン非依存性腫瘍の両方において、増殖に対して少なくとも相加的な効果を有する。コントロール群においては一定を保っていたが、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）処置群においてはＰＳＡ指標が著明に増加したように、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）に対する反応は、ＰＳＡレベルと相関していなかった。
【０２３３】
（実施例６）
（アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性のヒト前立腺ガンの増殖に対するモノクローナル抗体２Ｃ４の効果）
ヒト前立腺ガンにおいて、ＥｒｂＢ２レセプターのリガンド活性化をブロックする抗体の効果を評価した。詳細には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、モノクローナル抗体２Ｃ４、パクリタキセルおよび２Ｃ４／パクリタキセル処置の組合せに対する異種移植片腫瘍の反応を、上記の実施例５に記載の、アンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２ならびにアンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６を用いて決定した。抗体およびパクリタキセルは、実施例５に記載のように投与した。
【０２３４】
治療に対するアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２の反応を図１３および１４に示す。結果は、平均腫瘍容積±ＳＥで示す。図１３に示す動物の腫瘍容積は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）が、モノクローナル抗体２Ｃ４がそうであるように、アンドロゲン依存性モデルにおいて臨床活性を有することを示す。モノクローナル抗体２Ｃ４およびＴＡＸＯＬ（登録商標）の組合せは、２Ｃ４またはＴＡＸＯＬ（登録商標）単独のいずれかと比較した場合、増殖阻害の増大を示す（図１４；ｐ＝０．００３）。
【０２３５】
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、モノクローナル抗体２Ｃ４、パクリタキセルまたは２Ｃ４／パクリタキセル処置の組み合わせを用いた治療に対するアンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６の反応を図、１５〜１８に示す。結果は、平均腫瘍容積±ＳＥで示す。図１５および１７に示す動物の腫瘍容積は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）が、これらのアンドロゲン非依存性モデルにおいて臨床活性が欠しいかまたは全くなく、一方、モノクローナル抗体２Ｃ４がこれらのモデルにおいて臨床活性を有することを示す。モノクローナル抗体２Ｃ４およびＴＡＸＯＬ（登録商標）の組合せは、２Ｃ４またはＴＡＸＯＬ（登録商標）単独のいずれかと比較した場合、増殖阻害の増大を示す（図１６および１８；ｐ＝０．００２）。
【０２３６】
ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４のＦａｂ’フラグメントを、ＷＯ９８／３７２００（本明細書において参考として明白に援用される）に記載のように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして２０ｋＤの分枝したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合体化した。マウス２Ｃ４抗体（２０ｍｇ／ｋｇ）、ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４（２０ｍｇ／ｋｇ）、およびペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｆａｂフラグメント（ＰＥＧ−Ｆａｂ；２０または４０ｍｇ／Ｋｇ）が、インビボにおいてアンドロゲン非依存性前立腺ガンを処置する能力を、上記のＣＷＲ２２Ｒ異種移植片を用いて評価した。全ての注射はＩＰ（腹腔内）に投与した（Ｎ＝５）。これらの研究の結果を図２３に示す。これらのデータは、ＣＷＲ２２Ｒモデルにおいて２Ｃ４で見られる腫瘍阻害が、インタクトな二価抗体を必要としないことを実証する。これらのＦａｂフラグメントは、Ｆｃを含まないので、ＡＤＣＣのような免疫学的機構は、除外してもよさそうである。これらの結果は、図６に示される結果（インビトロシステムおよび２Ｃ４  Ｆａｂのキメラバージョンを利用する）と一致する。２Ｃ４が一価フラグメントとして腫瘍増殖を阻害するという観察はまた、この阻害は、ＥｒｂＢ２が他のＥｒｂＢファミリーメンバーとヘテロ二量体化する能力をブロックする結果であり、従って下流のシグナル伝達事象の開始を阻害するという概念に対する証拠を与える。
【０２３７】
アンドロゲン非依存性前立腺異種移植片であるＣＷＲ２２ＲおよびＭＳＫＰＣ６（Ａｇｕｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：４７６１〜４７６４（１９９９））において、ｒｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５を用いて用量反応研究を実施する。動物に以下の用量でＩＰ（腹腔内）投与した：コントロール；６ｍｇ／ｋｇの負荷（ローディング）用量、次いで毎週２回３ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇのローディング用量、次いで毎週２回１０ｍｇ／ｋｇ；または６０ｍｇ／ｋｇのローディング用量、次いで毎週２回３０ｍｇ／ｋｇ。これらの研究の結果を図２４および２５に示す。これらのデータは、２Ｃ４が用量依存性の様式で、アンドロゲン非依存性腫瘍異種移植片の増殖を抑制することを実証する。さらに、これらの結果により、腫瘍増殖のこの阻害が、２Ｃ４処置に起因し、そして実験のアーチファクトではないことがさらに確認される。
【０２３８】
実施例５および６における研究からの代表的な結果の要旨を図２１に示す。
【０２３９】
（実施例７）
（アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性のヒト前立腺ガンにおけるＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦのレベル）
本実施例では、ＣＷＲ２２細胞（アンドロゲン依存性）およびＣＷＲ２２Ｒ細胞（アンドロゲン非依存性）におけるＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡのレベルを評価した。
【０２４０】
（材料および方法）
（ｍＲＮＡ調製）：凍結腫瘍組織をＱｉａｇｅｎプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ番号７５１６３）に従って処理した。簡略には、ＰＴ−ＤＡ  ３０１２／２  ＴＳジェネレーターを装備したＢｒｉｎｋｍａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｐｔ−３０００）ホモジナイザーを用いて、１５秒パルス、次いで３０秒間停止を用いて、組織のホモジナイゼーションを達成した。この処理を３回繰り返し、そして抽出物をＱｉａｇｅｎカラムにロードし、そして製造業者の仕様書に従って洗浄した。カラムを１ｍＬのＲＮＡｓｅを含まない水で溶出し、そしてＲＮＡ含量を２６０ｎｍでの吸収により決定した。ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦは、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において発現されるので、これらの細胞由来の総ＲＮＡを、ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦ定量のための標準物質として用いた。
【０２４１】
（リアルタイムの定量的ＰＣＲ）：以前に記載のようなリアルタイム定量的ＰＣＲまたはＴａｑＭａｎ法（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６〜９９４（１９９６）；およびＨｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６〜９９４（１９９６））を用いて、ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡを定量した。この分析のために用いるプライマー／プローブのセットの配列を以下に示す：
【０２４２】
【化１】
0004579471.tif 000008
ここで、ＦおよびＲは、それぞれ正方向プライマーおよび逆方向プライマーであり、そしてＰは、蛍光標識されたプローブである。βアクチンをハウスキーピング遺伝子として用いた。βアクチンについてのプライマー／プローブセットは以下である：
βアクチン
【０２４３】
【化２】
0004579471.tif 000009
標準的な９６ウェルプレート形式においてＴａｑＭａｎ分析を実施した。ＴＧＦ−αについて０．６〜１５０ｎｇのｍＲＮＡを、そしてＨＢ−ＥＧＦ分析およびβアクチンについて９．４〜１５０ｎｇのｍＲＮＡを用いて、検量線を作成した。各稀釈は２連で行った。腫瘍サンプルについては、分析した全ての遺伝子について１００ｎｇを用いた。
【０２４４】
（結果）
図１９〜２０に示すように、アンドロゲン非依存性前立腺腫瘍株ＣＷＲ２２Ｒは、アンドロゲン依存性細胞株ＣＷＲ２２と比較して、有意により大きいレベルのＥＧＲＦリガンド（ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦ）を発現した。詳細には、ＴＧＦ−αは、ＣＷＲ２２腫瘍と比較して、ＣＷＲ２２Ｒ腫瘍において８〜９倍高いレベルで発現された。類似の様式で、ＨＢ−ＥＧＦは、ＣＷＲ２２に対してＣＷＲ２２Ｒにおいて、約１９倍高く発現された。
【０２４５】
（実施例８）
（アンドロゲン依存性異種移植片を有する動物における、ＰＳＡ指標に対する２Ｃ４またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の効果）
図２２に示すように、ＰＳＡ指標（ＰＳＡのｎｇ／血清ｍＬ／腫瘍ｍｍ3で定義される）を、２１日目に、処置の終わりの時点で、アンドロゲン依存性動物において測定した。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）で処置したアンドロゲン依存性動物において、ＰＳＡ指標の有意な増大があったが、コントロール動物は、ＰＳＡ指標の低下を示した（ＬＮＣａＰ：コントロール＝０．６（処置前値に対して）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）群＝２．３５（処置前値に対して２１日目）；ＣＷＲ２２：コントロール＝１．０（処置前値に対して）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）群＝１８（処置前値に対して２１日目））。相対的なＰＳＡ指標は、おそらく腫瘍サイズの増大をともなう壊死の増大に対して二次的に、ＬＮＣａＰ未処置群において低下した。対照的に、コントロールと比較して、処置した腫瘍のＰＳＡ指標に対して２Ｃ４の有意な効果はなかった。いかなる理論によっても拘束されることはないが、この現象についての可能な説明は、前立腺ガン細胞におけるＥｒｂＢ２活性化の程度に関連し得る。ＥｒｂＢ２活性化は、アンドロゲンレセプターシグナル伝達径路との干渉（クロストーク）により、アンドロゲン依存性増殖を生じ得る（Ｃｒａｆｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：２８０〜２８５（１９９９））。本発明者らのモデル系では、ＥｒｂＢ２に対するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の結合は、アンドロゲン非依存性の様式でＰＳＡの細胞性分泌の増大を導いた（Ａｇｕｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４７６１〜４７６４（１９９９））。この結果はＥｒｂＢ２とアンドロゲンレセプターシグナル伝達径路との間の干渉（クロストーク）という概念をさらに支持する。
【０２４６】
（実施例９）
（アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の異種移植片に対する７Ｃ２抗ＥｒｂＢ２抗体の効果）
ＥｒｂＢ２過剰発現細胞のアポトーシスを誘導するモノクローナル抗体７Ｃ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１５）の効果を、アンドロゲン依存性ＣＷＲ２２異種移植片におけるモノクローナル抗体２Ｃ４の効果と比較した。両方の抗体を１週あたり２回２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。図２６に示すように、２Ｃ４およびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）と同様、７Ｃ２はまた、アンドロゲン依存性前立腺ガンを処置する際に効果的である。アンドロゲン非依存性前立腺ガンに対する７Ｃ２の効果を、ＣＷＲ２２Ｒ異種移植片を用いても評価した。図２７は、このモデルにおいて、７Ｃ２単独では効果的でないが、ＴＡＸＯＬ（登録商標）と組合せれば効果的であったことを示す。
【０２４７】
（実施例１０）
（再発性または不応性の転移性前立腺ガンの治療）
ＲｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２に対する、全長の、ヒト化モノクローナル抗体（ＣＨＯ細胞において産生された）である。ＲｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４は、他のＥｒｂＢファミリーメンバーとＥｒｂＢ２との会合をブロックし、それによりＥｒｂ経路を通じた細胞内シグナル伝達を阻害する。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）と比較して、ｒｈｕＭＡｂ  ２０４は、ＥｒｂＢ２過剰発現腫瘍の増殖を阻害するだけでなく、ＥｒｂＢリガンド依存性シグナル伝達を必要とする腫瘍の増殖をもブロックする。
【０２４８】
ＲｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４は、ホルモン不応性（アンドロゲン非依存性）前立腺ガン患者の処置のための単一薬剤であると示される。有効性に関する主な終点（エンドポイント）としては、単一薬剤として使用した場合、最も有効なケア（ミトザントロン／プレドニゾン）と比較した全体的な生存、および安全性が挙げられる。第２の有効性の終点としては、以下が挙げられる：疾患進行の時間、反応率、クオリティーオブライフ（生活の質）、疼痛および／または反応の期間。ＲｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４は、疾患進行まで、それぞれ、２ｍｇ／ｋｇもしくは４ｍｇ／ｋｇ、毎週、または３週ごとに静脈（ＩＶ）投与される。この抗体は、複数用量の液体処方物（２０ｍＬ：２０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で充填）として供給される。
【０２４９】
ＲｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４はまた、ホルモン不応性（アンドロゲン非依存性）前立腺ガン患者の処置のために化学療法と組合せて指示される。有効性に関する主な終点としては、化学療法と比較した全体的な生存、および安全性が挙げられる。第２の有効性の終点としては、以下が挙げられる：疾患進行の時間、反応率、クオリティーオブライフ（生活の質）、疼痛および／または反応の期間。ＲｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４は、疾患進行まで、それぞれ、２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇ、毎週または３週ごとに静脈（ＩＶ）投与される。この抗体は、複数用量の液体処方物（２０ｍＬ：２０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で充填）として供給される。
【０２５０】
前立腺ガン（例えば、アンドロゲン非依存性前立腺ガン）を処置するために、抗ＥｒｂＢ２抗体（これは、ＥｒｂＢ２レセプターのリガンド活性化をブロックする）と組み合わせられ得る薬物の例としては、以下が挙げられる：ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター；抗脈管形成剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）；ＥＧＦＲ標的薬物（例えば、Ｃ２２５またはＺＤ１８３９）；別の抗ＥｒｂＢ２抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）のような増殖阻害性抗ＥＲｂＢ２抗体、または７Ｃ２もしくは７Ｆ３のようなアポトーシスを誘導する抗ＥｒｂＢ２抗体（そのヒト化改変体および／またはアフィニティー成熟改変体を含む））；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ）；抗アンドロゲン（フルタミドまたは酢酸シプロテロンなど）；ロイプロリド；スラミン；化学療法剤（例えば、ビンブラスチン、エストラムスチン、ミトキサントロン、リアゾロール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）（レチノイン酸代謝ブロック剤）、シクロフォスファミド、アントラサイクリン抗体（例えば、ドキソルビシン、タキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ））、またはメトトレキサート、あるいは上記の任意の組合せ（例えば、ビンブラスチン／エストラムスチンまたはシクロフォスファミド／ドキソルビシン／メトトレキサート）；プレドニゾン；ヒドロコルチゾン；あるいはそれらの組合せ。これらの種々の薬物について標準的用量（例えば、４０ｍｇ／ｍ2／週ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；６（ＡＵＣ）カルボプラチン；および２００ｍｇ／ｍ2パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））が、投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａおよび図１Ｂは、短縮変異体分析および部位特異的変異誘発（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（１０）：６１７９−６１９１（１９９３）；およびＲｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５（６）：１３９５−１４０６（１９９４））によって決定した場合の、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内の残基２２〜６４５（図１Ａに示す、シグナル配列を含む、アミノ酸配列；配列番号１３）のエピトープマッピングを示す。種々のＥｒｂＢ２−ＥＣＤ短縮化または点変異を、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてｃＤＮＡから調製した。ＥｒｂＢ２変異体は、哺乳動物発現プラスミドにおいてｇＤ融合タンパク質として発現された。この発現プラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーを、挿入されるｃＤＮＡの下流に位置するＳＶ４０終結シグナルおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと共に使用する。プラスミドＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞を、１％透析胎児ウシ血清および各々２５μＣｉの35Ｓメチオニンおよび35Ｓシステインを含む、メチオニンおよびシステインを含まない、低グルコースＤＭＥＭにおいて代謝的に一晩標識した。上清を収集し、そして抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体またはコントロール抗体のいずれかをこの上清に添加し、そして４℃にて２〜４時間インキュベートした。この複合体を沈澱させ、１０〜２０％のＴｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ勾配ゲルにアプライし、そして１００Ｖで電気泳動した。このゲルを膜に電気ブロットし、そしてオートラジオグラフィ−によって分析した。図１Ｂに示すように、抗ＥｒｂＢ２抗体７Ｃ２、７Ｆ３、２Ｃ４、７Ｄ３、３Ｅ８、４Ｄ５、２Ｈ１１および３Ｈ４は、種々のＥｒｂＢ２  ＥＣＤエピトープに結合する。
【図１Ｂ】  図１Ａおよび図１Ｂは、短縮変異体分析および部位特異的変異誘発（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（１０）：６１７９−６１９１（１９９３）；およびＲｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５（６）：１３９５−１４０６（１９９４））によって決定した場合の、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内の残基２２〜６４５（図１Ａに示す、シグナル配列を含む、アミノ酸配列；配列番号１３）のエピトープマッピングを示す。種々のＥｒｂＢ２−ＥＣＤ短縮化または点変異を、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてｃＤＮＡから調製した。ＥｒｂＢ２変異体は、哺乳動物発現プラスミドにおいてｇＤ融合タンパク質として発現された。この発現プラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーを、挿入されるｃＤＮＡの下流に位置するＳＶ４０終結シグナルおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと共に使用する。プラスミドＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞を、１％透析胎児ウシ血清および各々２５μＣｉの35Ｓメチオニンおよび35Ｓシステインを含む、メチオニンおよびシステインを含まない、低グルコースＤＭＥＭにおいて代謝的に一晩標識した。上清を収集し、そして抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体またはコントロール抗体のいずれかをこの上清に添加し、そして４℃にて２〜４時間インキュベートした。この複合体を沈澱させ、１０〜２０％のＴｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ勾配ゲルにアプライし、そして１００Ｖで電気泳動した。このゲルを膜に電気ブロットし、そしてオートラジオグラフィ−によって分析した。図１Ｂに示すように、抗ＥｒｂＢ２抗体７Ｃ２、７Ｆ３、２Ｃ４、７Ｄ３、３Ｅ８、４Ｄ５、２Ｈ１１および３Ｈ４は、種々のＥｒｂＢ２  ＥＣＤエピトープに結合する。
【図２】  図２Ａおよび図２Ｂは、ＭＣＦ７細胞のｒＨＲＧβ１活性化に対する抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体２Ｃ４および７Ｆ３の効果を示す。図２Ａは、チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激の２Ｃ４阻害または７Ｆ３阻害の用量応答曲線を示す。図２Ｂは、２Ｃ４または７Ｆ３による、ＭＣＦ−７細胞に対する125Ｉ標識ｒＨＲＧβ１177-244結合の阻害についての用量応答曲線を示す。
【図３】  図３は、抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体２Ｃ４または７Ｆ３による、ヒト腫瘍細胞株のパネルに対する特異的125Ｉ標識ｒＨＲＧβ１177-244結合の阻害を示す。モノクローナル抗体−コントロールは、ｒＨＲＧ結合をブロックしない、アイソタイプが一致したマウスモノクローナル抗体である。非特異的125Ｉ標識ｒＨＲＧβ１177-244結合を、１００ｎＭ  ｒＨＲＧβ１の存在下で行った並行インキュベーションから決定した。非特異的125Ｉ標識ｒＨＲＧβ１177-244結合についての値は、試験した全ての細胞株についての合計の１％未満であった。
【図４】  図４Ａおよび図４Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（図４Ａ）およびＳＫ−ＢＲ−３細胞（図４Ｂ）の増殖に対する、モノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５の効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を、９６ウェルプレートに播種し、そして２時間にわたって接着させた。実験を、１％血清を含む培地において行った。抗ＥｒｂＢ２抗体または培地単独を添加し、そしてこの細胞を３７℃にて２時間にわたってインキュベートした。続いて、ｒＨＲＧβ１（１ｎＭ）または培地単独を添加し、そしてこの細胞を４日間にわたってインキュベートした。単層を洗浄し、そして０．５％クリスタルバイオレットで染色／固定した。細胞増殖を決定するために、吸光度を５４０ｎｍで測定した。
【図５】  図５Ａおよび図５Ｂは、低／正常レベルのＥｒｂＢ２を発現するＭＣＦ７細胞（図５Ａ）中の、および高レベルのＥｒｂＢ２を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞（図５Ｂ）中の、ＥｒｂＢ３とのＥｒｂＢ２のヒレグリン（ＨＲＧ）依存性会合に対するモノクローナル抗体２Ｃ４、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗体または抗ＥＧＦＲ抗体の効果を示す；上記の実施例２を参照のこと。
【図６】  図６Ａおよび図６Ｂは、インタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（ｍｕ  ２Ｃ４）の活性とキメラ２Ｃ４  Ｆａｂフラグメントの活性とを比較する。図６Ａは、キメラ２Ｃ４  Ｆａｂまたはインタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４による、ＭＣＦ−７細胞に対する125Ｉ−ＨＲＧ結合の阻害を示す。ＭＣＦ７細胞を、２４ウェルプレート（１×１０5細胞／ウェル）中に播種し、そして２日間にわたって８５％のコンフルエンシーになるまで増殖させた。結合実験を、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６）に記載される通りに行った。図６Ｂは、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６）に記載される通りに行った、ＭＣＦ−７細胞におけるｐ１８０チロシンリン酸化のｒＨＲＧβ１活性化の阻害を示す。
【図７】  図７Ａおよび図７Ｂは、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖（ＶL）ドメイン（図７Ａ）および可変重鎖ドメイン（ＶH）（図７Ｂ）（それぞれ、配列番号１および２）；ヒト化Ｆａｂバージョン５７４のＶLドメインおよびＶHドメイン（それぞれ、配列番号３および４）、ならびにヒトのＶLコンセンサス骨格およびＶHコンセンサス骨格（ｈｕｍ  κ１、軽鎖κサブグロープＩ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖サブグループＩＩＩ）（それぞれ、配列番号５および６）のアミノ酸配列の整列を示す。星印は、ヒト化Ｆａｂ版５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化Ｆａｂ版５７４とヒト骨格との間の差を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、括弧内に存在する。
【図８Ａ】  図８Ａ〜図８Ｃは、実施例３においてＥＬＩＳＡによって決定した場合の、キメラＦａｂ  ２Ｃ４（Ｆａｂ．ｖ１）およびいくつかのヒト化２Ｃ４改変体の、ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合を示す。
【図８Ｂ】  図８Ａ〜図８Ｃは、実施例３においてＥＬＩＳＡによって決定した場合の、キメラＦａｂ  ２Ｃ４（Ｆａｂ．ｖ１）およびいくつかのヒト化２Ｃ４改変体の、ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合を示す。
【図８Ｃ】  図８Ａ〜図８Ｃは、実施例３においてＥＬＩＳＡによって決定した場合の、キメラＦａｂ  ２Ｃ４（Ｆａｂ．ｖ１）およびいくつかのヒト化２Ｃ４改変体の、ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合を示す。
【図９】  図９は、白いＣＤＲ骨格（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）を標示した、モノクローナル抗体２Ｃ４のＶLドメインおよびＶHドメインのリボンダイヤグラムである。ヒト化の間の変異誘発によって評価されるＶHの側鎖もまた示す（実施例３、表２を参照のこと）。
【図１０】  図１０は、マイトジェン活性タンパク質プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のＥＧＦ、ＴＧＦ−αまたはＨＲＧによって媒介される活性化に対する、モノクローナル抗体２Ｃ４またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の効果を示す。
【図１１Ａ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１１Ｂ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１１Ｃ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１１Ｄ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１１Ｅ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１１Ｆ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１１Ｇ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１１Ｈ】  図１１Ａ〜図１１Ｈは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、黒四角）、コントロール（Ｃ、白丸）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｔ、黒三角）および組み合わせＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｈ／Ｔ、白菱形）処置に対する異種移植片腫瘍の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびコントロールに対する、アンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２ＲおよびＣＷＲＳＡ６（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）ならびにアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２およびＬＮＣａＰ（それぞれ、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の応答を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびにコントロールに対する腫瘍の応答を図１１Ｅ（ＣＷＲ２２）；図１１Ｆ（ＬＮＣａＰ）；図１１Ｇ（ＣＷＲ２２Ｒ）；および図１１Ｈ（ＣＷＲＳＡ６）に示す。結果を、平均腫瘍容積＋／−ＳＥとして示す。
【図１２】  図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）で処置した、アンドロゲン依存性前立腺癌異種移植片を有する動物の相対的前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）指数応答を示す。図１２Ａでは、ＰＳＡ指数を、処置の前ならびに処置開始後９日目および２１日目のＬＮＣａＰ異種移植片モデルにおいて測定し、そして処置前の値に対して表した。図１２Ｂでは、ＰＳＡ指数を処置の前ならびに処置開始後９日目および２１日目のＣＷＲ２２異種移植片モデルにおいて測定し、そして処置前の値に対して表した。値を、平均相対ＰＳＡ＋／−ＳＥとして示す。
【図１３】  図１３は、コントロール抗体（Ｃ、黒三角）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、白丸）またはモノクローナル抗体２Ｃ４（２、黒四角）を用いた治療に対するアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２の応答を示す。２Ｃ４の投与を＊によって示し；ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の投与を＋によって示す。
【図１４】  図１４は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）単独（Ｔ、白丸）、モノクローナル抗体２Ｃ４単独（２、黒四角）またはモノクローナル抗体２Ｃ４とＴＡＸＯＬ（登録商標）との組み合わせ（２／Ｔ、黒三角）での治療に対するアンドロゲン依存性腫瘍ＣＷＲ２２の応答を示す。２Ｃ４の投与を＊によって示し；ＴＡＸＯＬ（登録商標）（６．２５ｍｇ／ｋｇ）の投与を＋によって示す。
【図１５】  図１５は、コントロール抗体（Ｃ、黒三角）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、白丸）またはモノクローナル抗体２Ｃ４（２、黒四角）での治療に対するアンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２Ｒの応答を示す。モノクローナル抗体２Ｃ４の投与を＋によって示し；ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の投与を＋によって示す。
【図１６】  図１６は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）単独（Ｔ、白丸）、モノクローナル抗体２Ｃ４単独（２、黒四角）またはモノクローナル抗体２Ｃ４とＴＡＸＯＬ（登録商標）との組み合わせ（２／Ｔ、黒三角）での治療に対するアンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲ２２Ｒの応答を示す。２Ｃ４の投与を＊によって示し；ＴＡＸＯＬ（登録商標）（６．２５ｍｇ／ｋｇ）の投与を＋によって示す。
【図１７】  図１７は、コントロール抗体（Ｃ、黒三角）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｈ、白丸）またはモノクローナル抗体２Ｃ４（２、黒四角）での治療に対するアンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲＳＡ６の応答を示す。モノクローナル抗体２Ｃ４の投与を＋によって示し；ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の投与を＋によって示す。
【図１８】  図１８は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）単独（Ｔ、白丸）、モノクローナル抗体２Ｃ４単独（２、黒四角）またはモノクローナル抗体２Ｃ４とＴＡＸＯＬ（登録商標）との組み合わせ（２／Ｔ、黒三角）での治療に対するアンドロゲン非依存性腫瘍ＣＷＲＳＡ６の応答を示す。２Ｃ４の投与を＊によって示し；ＴＡＸＯＬ（６．２５ｍｇ／ｋｇ）の投与を＋によって示す。
【図１９】  図１９は、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲによって決定した場合の、ＣＷＲ２２Ｒ細胞またはＣＷＲ２２細胞による相対ＴＧＦ−α  ｍＲＮＡ発現を示す。
【図２０】  図２０は、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲによって決定した場合の、ＣＷＲ２２Ｒ細胞またはＣＷＲ２２細胞による相対ＨＢ−ＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現を示す。
【図２１】  図２１は、前立腺癌異種移植片の増殖に対する抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体処置の効果を示す。腫瘍の増殖は、コントロール動物を屠殺した場合、各実験の最後に、コントロール腫瘍に対して正規化された。ＣＷＲ２２について示した値は、触知可能な腫瘍の形成後の２３日目に；ＬＮＣａＰについては、５１日目に；ＣＷＲ２２Ｒについては、２２日目に；ＣＷＲ２２ＳＡ６については、３３日目に対応する。
【図２２】  図２２は、ＰＳＡ指数に対する抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体処置の効果を示す。ＰＳＡ指数は、腫瘍容積に対して正規化された血清ＰＳＡの量として同定される。
【図２３】  図２３は、組換えヒト化モノクローナル抗体（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４）、そのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｆａｂフラグメントおよびマウス２Ｃ４の活性を、ＣＷＲ２２Ｒアンドロゲン非依存性前立腺異種移植片に対して評価する。
【図２４】  図２４は、ＣＷＲ２２Ｒアンドロゲン非依存性前立腺異種移植片に対するｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４の用量応答を示す。
【図２５】  図２５は、ＭＳＫＰＣ６アンドロゲン非依存性前立腺異種移植片に対するｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４の用量応答を示す。
【図２６】  図２６は、アンドロゲン依存性前立腺異種移植片（ＣＷＲ２２）における２Ｃ４および７Ｃ２の用量応答を示す。
【図２７】  図２７は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）ならびに抗ＥｒｂＢ２抗体２Ｃ４および７Ｃ２で処置したＣＷＲ２２Ｒ異種移植片における腫瘍容積を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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