(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉幹細胞を合成無血清培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによって間葉幹細胞から軟骨細胞を生産する方法であって、ここで該間葉幹細胞が密に近接するように凝縮された三次元細胞塊を形成し、そして前記合成無血清培地が（１）合成最小必須培地；（２）アスコルビン酸；（３）トランスフェリン；（４）インスリン；（５）少なくとも１種類のＴＧＦβ；および（６）グルコースを含み、前記グルコースが前記培地中に３ｇ／ｌ〜７ｇ／ｌの量で含まれることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が分離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が詰め込まれた細胞塊あるいは遠心細胞ペレットとして存在することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求の範囲第１項に記載の方法であって、ここで前記少なくとも１種類のＴＧＦ−βが、ＴＧＦ−β１であってデキサメタゾンと組み合わせられることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載の方法であって、ここで前記細胞が硬質多孔容器に置かれる工程をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求の範囲第５項に記載の方法であって、ここで前記硬質多孔容器がセラミックキューブであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求の範囲第１項に記載の方法であって、ここで前記グルコースが前記無血清培地中に４．５ｇ／ｌの量で存在することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記少なくとも１種類のＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
間葉幹細胞を合成無血清培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによって間葉幹細胞に軟骨形成を誘導する方法であって、ここで該間葉幹細胞が密に近接するように凝縮された三次元細胞塊を形成し、そして前記合成無血清培地が（１）合成最小必須培地；（２）アスコルビン酸；（３）トランスフェリン；（４）インスリン；（５）少なくとも１種類のＴＧＦ−β；および（６）グルコースを含み、前記グルコースが前記培地中に３ｇ／ｌ〜７ｇ／ｌの量で含まれることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求の範囲第９項に記載の方法であって、ここで前記間葉幹細胞が分離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求の範囲第９項に記載の方法であって、ここで前記間葉幹細胞が詰め込まれた細胞塊あるいは遠心細胞ペレットとして存在することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求の範囲第９項に記載の方法であって、ここで前記少なくとも１種類のＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１であって、デキサメタゾンと組み合わせられることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求の範囲第９項に記載の方法であって、ここで前記細胞が硬質多孔容器に置かれる工程をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１３項に記載の方法であって、ここで前記硬質多孔容器がセラミックキューブであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求の範囲第９項に記載の方法であって、ここで前記グルコースが前記無血清培地中に４．５ｇ／ｌの量で存在することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求の範囲第９項に記載の方法であって、ここで前記少なくとも１種類のＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
この発明は試験管内で培養された間葉始原細胞を特異的細胞系列経路に分化するように指向するための方法および組成物の分野に関し、とりわけヒトおよび他の種で病的状態の治療処置のための受容体あるいは宿主へのこれらの細胞の移植に先立つ、あるいはその移植の時点でそのような指向系列誘導に関する。
間葉幹細胞（ＭＳＣS）は脂肪、骨、軟骨、弾性、筋および線維などの結合組織を含む特殊な型の間葉あるいは結合組織に分化することのできる骨髄、血液、真皮、および骨膜に見出される形成多能芽細胞あるいは胚状細胞である。これらの細胞が入る特異的分化経路は機械的影響およびもしくは成長因子、サイトカインなどの内因性生物活性因子、およびもしくは宿主組織により確立された局所微環境条件からの各種の影響に依存する。これらの細胞は通常骨髄で非常に低い頻度で存在するけれども、組織培養でこれらの細胞の集団を分離し、精製し、また有糸分裂拡張するプロセスは、キャプラン他、合衆国特許第５，１９７，９８５号、第５，２２６，９１４号、および第５，４８６，３５９号、間葉幹細胞、整形外科研究ジャーナル、９巻：６４１−６５０ページ、１９９１年で報告されている。
出生前生体では、ＭＳＣSの特殊化結合組織細胞への分化は十分に確証されている。例えば胚ひな、マウスあるいはヒト肢芽間葉細胞は軟骨、骨および他の結合組織に分化する（キャプラン  ＡＩ，間葉幹細胞。整形外科研究ジャーナル９巻：６４１−６５０ページ、１９９１年。発達生物学協会３９回年次シンポジウム、Ｓ  サブテルニーおよびＵ  アボット編、３７６８ページ。ニューヨーク、アラン  Ｒ  リス  インコーポレイテッド、１９８１年、所収；エルマー他、奇形学、２４巻：２１５−２２３ページ、１９８１年；ハウシュカ  ＳＤ，発達生物学、３７巻：３４５−３６８ページ、１９７４年；サラーシュ他、発達生物学、８３巻、９−１９ページ、１９８１年；スウォラ他、発達生物学、１１６巻：３１−３８ページ、１９８６年）。加えて、クローンラット胎仔頭蓋冠細胞系も筋、脂肪、軟骨、および骨に分化することが示されている（五島他、臨床整形外科関連研究、２６９巻：２７４−２８３ページ、１９９１年）。出生後生体でのＭＳＣSの存在は、後胚細胞のいくつかの中胚葉表現型への分化を示す目的では広く研究されてはこなかった。行われた数少ない研究は骨髄細胞の拡散チャンバーへの入れこおよび生体内移植に続く骨髄細胞による骨および軟骨の形成を伴う（アシュトン他、臨床整形外科研究、１５１巻：２９４−３０７ページ、１９８０年；ブルーダー他、骨無機物、１１巻：１４１−１５１、１９９０年）。最近、ひな骨膜からの細胞が分離され、培養で拡張され、また試験管内で高密度条件の下で軟骨および骨に分化することを示した（中原他、実験細胞研究、１９５巻：４９２−５０３ページ、１９９１年）。ラット骨髄誘導間葉細胞は生体内で移植された時、骨芽細胞および軟骨細胞に分化する能力を持つことを示した（デニス他、細胞移植、１巻：２３３２ページ、１９９１年；五島他、臨床整形外科関連研究、２６９巻：２７４−２８３ページ、１９９１年）。培養での軟骨細胞の表現型が解糖およびクエン酸サイクルに利用できる糖類の濃度により影響されることが報告された（Ｐ．オット、「関節軟骨の基本細胞代謝．マノメーターによる研究」リューマチ学ジャーナル、５０巻：３０４−１２ページ、１９９１年；およびＪ．Ｍ．レーン、Ｃ．Ｔ．ブライトン、ならびにＰ．Ｊ．メンコヴィッチ、「関節軟骨における嫌気性および好気性代謝」リューマチ学ジャーナル、４巻：３３４−４２ページ、１９７７年）。
最近のものではジョンストン他（整形外科研究協会会報、４２巻：６５ページ、１９９６年）骨髄誘導間葉細胞の試験管内軟骨形成。整形外科研究協会会報２１巻：６５ページ、１９９６年はラビットＭＳＣSが試験管内で軟骨状表現型を発達させる培養条件を記述している。細胞は血清なしであるが、デキサメタゾン、ＩＴＳ、およびアスコルビン酸−リン酸塩の存在下で最小培養条件で成長する。細胞が低速で回転されると、それは層を形成しその層は１−２日間ではっきりとしないペレットに発達した。数週の間に、細胞はヒト細胞で使用される最初の観察対象であるII型コラーゲンの合成を開始し分泌するであろう。
滑膜関節の関節面への損傷は、外傷から、変形状関節症などの疾患から、また老齢化の結果として起こり得る。損傷関節の社会的経済的コストは大きく、また関節機能を回復できる有効な治療法が歓迎されるであろう。関節軟骨は関節軟骨細胞に分化した間葉細胞による出生前および出生後の成長の間に創り出され維持される。個体は成熟するにつれて主要な滑膜欠損を修復する能力を失うが、何故ならそれらの関節は関節軟骨を再生する適切に分化した細胞の十分な数を欠くためである。かくして損傷関節面が適切な細胞外基質を再構築するとみられる自己由来細胞を移植することにより損傷関節面が修復されるという仮説に多くの関心がこれまで寄せられてきた。培養軟骨細胞を膝に導入することに伴う一つの研究が非常に有望であるものとして現れた。最近のエッセーで整形外科医ジョーゼフ・バックウォルターが指摘しているように、これおよび類似の努力が不確かな長期にわたる成功と出会っている（Ｊ．Ａ．バックウォルター．「関節軟骨の再生：何故突然関心を呼んだのか？」今日の整形外科学、１９９６年４月１２日）。
かくして、軟骨再生治療に関して絶えざる必要性と機会が存在する。
発明の概要
今日まで、大量のｈＭＳＣSの均一に軟骨細胞系列への投入を起こさせることは可能ではなかった。ここで記載される組成物はこの目標を達成する。かくして、この発明は一つの技術の発展、つまり広範囲に及びまたかなりの潜在的有用性を持つ関節軟骨の自己由来ＭＳＣSベース修復において、一つの重要な段階を体現する。
この発明に従って、発明者により観察されてきたものは、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣS）であり、クエン酸サイクルによりＡＴＰの生産に寄与する単糖類あるいは他の因子の上昇した水準を持つある種の軟骨誘導培地組成物と試験管内で接触させると、ｈＭＳＣSは生活力を維持しまた著しく改良された投入および分化に誘導され得ることであった。望ましい実施例において、ｈＭＳＣSは三次元形態、例えば細胞ペレットなどに会合する。三次元形態はこの発明の試験管内軟骨形成に寄与し、また細胞は望ましくは、例えばパックされあるいはペレット化された細胞塊として一緒に濃縮される。この試験管内プロセスは試験管内で起こるものを反復するものと考えられ、また軟骨形成プロセスで重要である分子事象を定義するために使用することができる。
かくして一つの見地において、この発明はヒト間葉前駆細胞の試験管内軟骨形成およびそれからのヒト軟骨細胞の試験管内形成のための一つの組成物を提供し、この組成物は（選択肢として三次元形態での）分離ヒト間葉幹細胞および、そこで接触する少くとも約３ｇ／リットル（ｇ／ｌ）から、望ましくは約３ｇ／ｌ乃至約７ｇ／ｌの単糖類濃度を持つ培地での少くとも１個の軟骨誘導剤を含む。間葉幹細胞は望ましくは合成無血清環境で分離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であり、三次元細胞塊、例えばパック細胞あるいは遠心細胞ペレットの形態で密に近接するように凝縮することができる。
この発明のも一つの見地において、ＴＧＦ−β３がこれまでに使用されたもの、例えば（ｉ）デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、（ii）骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、ＴＧＦ−β１、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子などの形質転換成長因子−β上科の他のメンバー、（iii）Ｉ型コラーゲンなどのコラーゲン細胞外基質の成分、あるいは（iv）レチノイン酸などのビタミンＡ類似体、などよりももっと有効な軟骨誘導剤である。ＴＧＦ−β３はＭＳＣSの分化を支配的に軟骨細胞に誘導するのに有効な量で培地に含まれる。このような濃度は少くとも約５ｎｇ／ｍｌの培地であり、望ましくは５−１５ｎｇ／ｍｌの培地である。
この発明はまた間葉幹細胞を前に記載の改良培地、とりわけ軟骨形成分化を誘導するのにこれまでに使用されたもの以上の高いグルコースあるいはラクトース濃度を持つ培地に試験管内で軟骨誘導剤と接触させることにより間葉幹細胞から軟骨細胞を生産するプロセスを提供する。
この発明は更に間葉幹細胞を試験管内でこの発明の組成物と接触させることにより間葉幹細胞に軟骨形成を誘導するプロセスを提供する。
更にここで開示されるのは、ｈＭＳＣS誘導軟骨細胞の肥大性軟骨細胞への更なる分化と成熟を可能にし促進する試験管内培養条件である。これはとりわけ（ｉ）軟骨細胞成熟に伴う因子の研究、（ii）軟骨形成時に生じる遺伝子発現の変性の研究、（iii）成熟軟骨細胞により生産される因子の同定および研究、（iv）薬理物質の成熟軟骨細胞に対する作用の評価、（ｖ）変形性関節症などの関節疾病に共通の成熟軟骨細胞の基質−金属プロテイナーゼおよび他の分解性酵素への罹病性の決定、および（vi）関節疾病を改善する目的でｈＭＳＣSに導入された遺伝子の発現の研究、などにとって有用である。
肥大性分化を受けるｈＭＳＣSの能力は移植ｈＭＳＣSによる関節軟骨の全厚欠損部の修復に直接関連している。移植片は隣接する組織によりよく「固着」され、また肥大性軟骨、無機質化軟骨および骨が欠損部の深層域で移植材料を置換した時には修復はより永続的にされる。ここで提示された試験管内結果は、そのような置換が実行可能な臨床選択肢であるということの重要な徴候である。かくしてこの発明のこの見地の部分は、表現型が顕著となり軟骨芽細胞段階を越えた細胞の成熟を示すので、特異的表現型を促進する条件を確認することで軟骨分化プロセスを調節する、すなわち細胞を肥大性軟骨細胞に指向することにあった。
前記の方法では、間葉幹細胞は望ましくは合成無血清環境で分離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であり、三次元細胞塊、例えばパック細胞あるいは遠心細胞ペレットの形態で密に近接するように凝縮される。更に、接触はヒト間葉前駆細胞を合成無血清培地で培養することを含み、この培地は（１）合成最小必須培地、（２）アスコルビン酸塩あるいはその類似体、（３）鉄源、（４）インスリンあるいはインスリン状成長因子、および（５）少くとも１個の軟骨誘導剤あるいは因子を含む。前記の方法は更に望ましくは細胞が軟骨誘導組成物で培養されまたその後硬質多孔容器例えばセラミックキューブなどに置かれる段階を含む。
分離された非培養非相同ヒト間葉幹細胞調製物をこの発明の組成物および方法に使用することも可能である。ＭＳＣSは骨髄、血液（末梢血を含む）、骨膜および真皮、ならびに中胚葉起源を持つ他の組織などから密度勾配分画などにより非培養非相同調製物として分離することができる。これに関して、これらの間葉幹細胞が非常に微量で例えば骨髄に存在し、またこれらの量が（例えば比較的若い患者で約１／１０，０００細胞から、年配の患者で１／２，０００，０００細胞まで少なくなるように）年齢と共に大幅に減少するけれども、ヒト間葉幹細胞調製物は組織、とりわけ骨髄から分離することができ、骨髄にある他の型の細胞から事実上遊離していることが発見された。分離された分画調製物は細胞の少くとも約９０％、また望ましくは少くとも約９５％がヒト間葉幹細胞の細胞を含むであろうということが考えられる。
更に開示されているのは、ｈＭＳＣ誘導軟骨細胞の肥大性軟骨細胞への更なる分化および成熟を可能にし促進する試験管内培養条件である。これは軟骨細胞の成熟に伴う因子の研究、軟骨形成の間に生じる遺伝子発現の変更の研究、軟骨細胞の成熟により生じる因子の同定および研究、軟骨細胞の成熟に対する薬理物質の作用の評価、変形性関節症などの関節疾病に共通の成熟軟骨細胞の基質−金属プロテイナーゼおよび他の分解性酵素への感受性の決定、関節疾病を改善する目的でｈＭＳＣSに導入された遺伝子の発現の研究に有用であることを立証する。
前記の試験管内方法で軟骨形成の導入および軟骨細胞の生産で生じる事象の連続は胚肢形成における軟骨形成の連続と類似する。システムのすべての成分が定義されているために、このシステムは成長因子などの軟骨形成の進行への作用についての研究のための価値ある研究手段として使用することができる。更にそれは始原細胞からの哺乳類軟骨形成の分子制御の研究に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
この発明は各図面の簡単な説明を引用することによりこれから更に説明されるが、それはこの発明の範囲を制約するものでは決してない。
図１．ｈＭＳＣSのサイズの変化が細胞外基質成分の合成の範囲を反映する。各ペレットは２００，０００細胞のアリコートを１ｇ／ｌ（５．５ｍＭ）のグルコース（左側あるいは４．５ｇ／ｌ（２５ｍＭ）のグルコース（右側）を持つ１／２ｍｌの軟骨形成培地に移すことにより形成された。
図２Ａ．１ｇ／ｌグルコースを持つ軟骨形成培地で１週間培養後成長したｈＭＳＣSペレットの８μｍ切片。切片はII型コラーゲンの存在のために免疫染色され展開されたが、図２Ｂで示されるように高グルコースで成長したペレットに見られる褐色反応製品を明らかにしなかった。切片は同じくヘマトキシリンでも染色された。倍率、１２５Ｘ。
図２Ｂ．４．５ｇ／ｌグルコースを持つ軟骨形成培地で１週間培養後、成長したｈＭＳＣペレットの８μｍ切片。切片はII型コラーゲンの存在のために免疫染色され、褐色反応製品を明らかにするために展開されたが、それは高グルコースで成長したペレットのみに見られた。切片はまたヘマトキシリンで染色された。倍率、１２５Ｘ。
図３Ａ．低グルコース培地で２週間成長したｈＭＳＣペレットの薄層切片。免疫染色は低グルコース条件でのペレットが図３Ｂで示される高グルコース条件でのペレットよりもII型コラーゲンの累積が少なかったことを示す。倍率、１２５Ｘ。
図３Ｂ．高グルコース培地で２週間成長したｈＭＳＣペレットの薄層切片。免疫染色は高グルコース条件でのペレットが図３Ａで示される低グルコース条件でのペレットよりもII型コラーゲンの累積が多かったことを示す。倍率、１２５Ｘ。
図４Ａ．トルイジンブルーＯで成長の３週間後に染色されたｈＭＳＣペレットの薄層切片。軟骨細胞外基質の紫色「異染」染色特性は図４Ｂで示される高グルコースペレットの場合よりも際立ってはいない。倍率、１２５Ｘ。
図４Ｂ．トルイジンブルーＯで成長の３週間後に染色されたｈＭＳＣペレットの薄層断片。軟骨細胞外基質の紫色「異染」染色特性は図４Ａで示される低グルコースペレットの場合よりも際立っている。倍率、１２５Ｘ。
図５Ａ．２１日目のｈＭＳＣペレットの生活力染色。培養ペレットは２μＭのエチジウムホモ二量体染料で７２時間保温され、次いで固定され、切開され、また第２染料、ＤＡＰＩで事後染色された。非生活細胞の核はエチジウムホモ二量体をとり込み、従って赤色蛍光発光する。生活細胞は固定および切開の後とり込まれたＤＡＰＩで青色蛍光発光する。細胞死滅はここで見られるように低グルコースペレットの際立った特徴である。倍率、１２５Ｘ。
図５Ｂ．２１日目のｈＭＳＣペレットの生活力染色。培養ペレットは２μＭのエチジウムホモ二量体染料で７２時間保温され、次いで固定され、切開され、また第２染料、ＤＡＰＩで事後染色された。非生活細胞の核はエチジウムホモ二量体をとり込み、従って赤色蛍光発光する。生活細胞は固定および切開の後とり込まれたＤＡＰＩで青色蛍光発光する。細胞死滅は低グルコースペレットの際立った特徴であり、図５Ａと比較して高グルコース条件での培養により大きく減少する。倍率、１２５Ｘ。
図６は肥大性形態を持つ細胞の領域に含まれる軟骨形成培養で実施例４で説明されたように調製されたｈＭＳＣSのペレットであることを示す。かくしてｈＭＳＣSは軟骨形成分化の培養条件の下で肥大を受けることができる。示されているように、ｈＭＳＣペレットは培養２１日後に不完全な軟骨形成分化を受けた。高グルコースＤＭＥＭは記述されているようにＴＧＦ−β３、デキサメタゾンおよび他の作用薬を補充された。切片はII型コラーゲンのために免疫染色された。不完全な褐色染色は、ペレットの部分のみが軟骨のこのマーカーを分泌した細胞を含んでいたことを示した。しかしこのII型コラーゲン正領域は大型裂孔内に細胞を含んでいた。このような形態はペレット培養内のｈＭＳＣSが肥大性分化を受けることができることを示唆している。最終倍率、１５０Ｘ。
図７Ａおよび７Ｂもまた図６で示されたものよりもずっと大きい肥大を示した細胞のペレットを示す。これらの図は２個の培地でのペレット培養でのｈＭＳＣSの連続処置が肥大性を誘導することを示す。軟骨形成培地での培養の１４日後、図７ＡのペレットはＴＧＦ−β３を欠いており、またデキサメタゾン１０-9Ｍ、チロキシン５０ｎＭ、およびβリン酸グリセロール２０ｍＭを含む培地に切替えられた。図７Ｂのペレットはもとの培地でそのままであった。２８日に、両方のペレットは収穫され、切開され、II型コラーゲンに対する抗体で染色された。II型コラーゲンは両方のペレットで際立っている。図７Ａのペレットの拡張裂孔内での広大な数の細胞は、ｈＭＳＣSの肥大性分化がこの２段階培養養生法で顕著な経路であったことを示していた。これとは逆に、図７Ｂのペレットは肥大性軟骨細胞が相対的に少なかった。最終倍率、６０Ｘ。
望ましい実施例の詳細な説明
この発明はこれからそれを支持する多くの実施例および例と関連してより詳細に説明されるであろう。
間葉幹細胞（ＭＳＣS）は骨髄、血液、真皮および骨膜で見出され、また脂肪、骨、軟骨、弾性、筋、および線維の各結合組織を含む特異な型の間葉あるいは結合組織に分化することのできる形成多能芽細胞あるいは胚状細胞である。これらの細胞が入る特異な分化経路は、機械的な影響およびもしくは成長因子、サイトカインなどのような内因性生物活性因子、およびもしくは宿主組織により確立された局所性微環境条件からの各種影響に依存する。これらの細胞は通常骨髄に非常に低い頻度で存在するけれども、組織培養でこれらの細胞の集団を分離し、精製し、また有糸分裂拡張させるプロセスはキャプラン他、合衆国特許番号第５，１９７，９８５号、第５，２２６，９１４号、および第５，４８６，３５９号、間葉幹細胞、整形外科研究ジャーナル９巻、６４１−６５０ページ、１９９１年で報告されている。
ヒト間葉幹細胞は多数の型の間葉細胞、とりわけ軟骨を生産することができる。この形質は、２個の他のものと共にこれらの細胞を関節面の修復のための自己由来細胞治療に使用するための魅力的な候補者にさせる。第一に、ヒト間葉幹細胞が骨髄吸引液から得られるという相対的な安心感がある。第二に、これらの細胞は培養で数千倍もの拡張を受ける能力を示した（Ｓ．Ｐ．ブルーダー、Ｎ．ジェイズウォール、およびＳ．Ｅ．ヘインズワース。「広範な継代培養および続く冷凍保存の間の精製ヒト間葉幹細胞の成長運動、自己再生および骨形成能」細胞生化学ジャーナル、１９９６年、印刷中）。
ここで説明されるのは、試験管内で一次および継代ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣS）の軟骨形成分化を誘導するのに使用されるこれまでの方法以上の改良である。この改良は培養軟骨細胞の再分化を促進するために発展された「ペレット培養」組織培養プロトコルで構築する（Ｗ．加藤、Ｍ．岩本、Ｔ．小池、Ｆ．鈴木、およびＹ．高野、「遠心管で成長するラビット軟骨細胞培養の端部分化および石灰化：トランスフォーミング成長因子βおよび血清因子による調節」全米科学アカデミー紀要、８５巻、９５５２−５６ページ、１９８８年；Ｒ．Ｔ．バロックおよびＡ．Ｈ．レッディ、「チロキシンは合成培地での分離軟骨細胞から得た柱状軟骨細胞の形態形成を調節する血清因子である」細胞生物学ジャーナル、１２６巻：１３１１−１８ページ、１９９４年；およびＣ．スー、Ｂ．Ｏ．オヤジョーバイ、Ａ．フレーザー、Ｌ．Ｄ．コザーチ、Ｒ．Ｇ．Ｇ．ラッセル、およびＡ．Ｐ．ホランダー、「ウシ鼻および関節軟骨細胞ペレット培養でのプロテオグリカンおよびII型コラーゲン代謝回転に対する成長因子およびインターロイキン−１αの作用」内分泌学、１３７巻：３５５７−６５ページ、１９９６年）。我々はまた我々の培養法の効用を証明する細胞生活力を評価する検定法も説明する。これらの改良は新規な治療薬剤使用法に関連する遺伝子の同定を含むｈＭＳＣSの分化に関連した更なる発見を可能にする。
ここで報告された実験において、「高グルコースＤＭＥＭ」（４．５ｇ／１．２５ｍＭ）に存在する量に対して「低グルコースＤＭＥＭ」（１ｇ／１．５ｍＭ）に存在する標準濃度から軟骨形成培地のグルコース濃度を増加すると、培養ｈＭＳＣSの分化を劇的に変えることを示す。軟骨形成に関する他の糖類の高濃度の作用も調査された。フルクトース３．５ｇ／ｌあるいはグルコース６ｇ／ｌの低グルコース培地への補充は高グルコース培地（４．５ｇ／ｌ、グルコース）でそうであったように試験管内軟骨形成分化に同じ改良をもたらす。
この発明は多くの用途と利点を持つ。このような利点の一つは自己由来宿主への戻し移植に先立ち、ＭＳＣ分化を指向し加速する能力にある。例えば、軟骨形成細胞になるように試験管内で指向されるＭＳＣSは、まず系列内に補給され次いで主要分化段階を通じて進まねばならないＭＳＣSよりもより速くまた均質に移植部位で軟骨基質を合成するであろう。このような細胞外処置もまた生物活性因子の精製ＭＳＣSへの均質で制御された適用を提供し、均質な系列委託および分化に導く。内因性生物活性因子の生体内利用は容易に保証され制御できるものではない。ここで開示される前処置段階はこれを回避する。加えて、移植に先立ちＭＳＣSを前処置することにより、外因性生物活性因子の全身あるいは局所投与に会合する潜在的に有害な副作用は回避される。この技術のも一つの用途は、移植の時点で細胞が存在する分化の段階に基づく組織再生に指向する能力にある。つまり、軟骨に関連して、移植の細胞の状態は形成される最終組織の型を制御する。
ここで使用されるように、「単糖」という用語は、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノースおよびＤ−ガラクトースなどのアルドース、またＤ−フルクトースなどのケトースである。
ここで使用されるように、「軟骨誘導剤」あるいは「軟骨誘導因子」という用語は、いずれかの天然あるいは合成、有機あるいは無機化合物もしくは生化学化合物あるいは化合物の組合せもしくは混合物、あるいはいずれかの機械もしくは物理的装置、コンテナー、影響、あるいは効力を引用し、それは三次元形態にあるヒト間葉幹細胞に適用することができ、そのためその試験管内誘導あるいは軟骨細胞の生産に作用する。公知の軟骨誘導剤は、例えば、（ｉ）デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、（ii）トランスフォーミング成長因子−β上科のメンバー、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、ＴＧＦ−β１、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）など、（iii）Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、および（iv）レチノイン酸などのビタミンＡ類似体などである。
ここで使用されるように、「合成培地」という用語は、この発明の組成物がとりわけこの発明の方法に従って試験管内軟骨形成を受けることができ、また最小必須培地、アスコルビン酸塩あるいはその類似体、鉄源およびインスリンもしくはインスリン状成長因子を含むような維持、成長あるいは培養培地を引用する。
ここで使用されるように、「最小必須培地」という用語は、ヒト間葉幹細胞の生活力を試験管内で支持する公知の組成物のいずれかの無血清細胞動物細胞培養調製物あるいは培地である。その例は、イーグル基本培地、すなわちダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）のいずれか、イスコーブ修飾イーグル培地、アルファ修飾イーグル培地、またマッコイ５ＡならびにＢＧＪb（フィットン−ジャクソン修飾）などである。
ここで使用されるように、「鉄源」という用語は必ずしもそれに限定されないがトランスフェリン、硫酸第一鉄あるいはフェリチンを含む培地に還元、三価鉄形態の鉄を放出するいずれかの種を引用する。
ここで使用されるように、「インスリン」という用語は公知である各種インスリンのいずれかを引用する。インスリンは皮下投与に続く作用の敏速性、持続性および強度に従って３種のカテゴリーに分割される。すなわち前に言及したように、速やか、中間あるいは持続的である。結晶等軸インスリンは塩化亜鉛の存在下の沈殿により調製され、修飾形態は活性のパターンを変更するために発達された。プロタミン亜鉛インスリン（ＰＺＩ）はインスリンと亜鉛および塩基性タンパク質プロタミンの反応の結果であり、それは溶解し結晶等軸インスリンよりもっとゆるやかに吸収されるが着実な割合での吸収にはもっと信頼性の高いタンパク質複合体を形成する。イソファンは修飾結晶性プロタミン亜鉛インスリンであり、その作用はより少ない部分のプロタミン亜鉛インスリンと量のより多い等軸インスリンの混合物と比較することができる。延長され迅速なインスリン−亜鉛懸濁液もこの発明で使用するために考慮される。インスリンは、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、あるいは他の動物起源のものであり得るし、あるいは組換え製品であることもできる。
ヒトインスリンは今では組換えＤＮＡ技術による生産の結果として広く利用することができる。理論としては、それは精製ブタインスリンより僅かではあるが免疫原性が少なく、後者は代ってウシインスリンよりも免疫原性が少ない筈である。ウシインスリンは３個のアミノ酸残基でヒトインスリンと異なり、一方ブタはβ鎖のカルボキシル末端での１個のインスリンでヒトインスリンと異なる。しかし、高度に精製した時には、３個のインスリンすべては免疫応答を刺激する比較的低いが測定可能な能力を有する。
短期あるいは急速に作用するインスリンは中性ｐＨでの緩衝液に溶解された等軸結晶亜鉛インスリン（インスリン注射）の単なる溶液である。これらのものは作用の急速な発現を示すが持続性は最も短い。すなわちグルコース水準は２０−３０分で最低の状態に達し、約２−３時間で基線にまで戻る。
中間作用インスリンはそれが皮下に投与される時よりゆっくりと溶解するよう形成される。その作用持続性はかくしてより長くなる。もっとも頻繁に使用される２個の調製品は中性プロタミンハーゲドロン（ＮＰＨ）インスリン（イソファンインスリン懸濁液）およびレンテインスリン（インスリン亜鉛懸濁液）である。ＮＰＨインスリンはリン酸緩衝液内での亜鉛とプロタミンの複合体でのインスリン懸濁液である。レンテインスリンはインスリンの可溶性を最小化する酢酸塩緩衝液での結晶性（ウルトラレンテ）および無定形（セミレンテ）インスリンの混合物である。これらの調製物は類似の薬物動態プロファイルを有する。
ウルトラレンテインスリン（延伸インスリン亜鉛懸濁液）およびプロタミン亜鉛インスリン懸濁液は長期作用性インスリンである。これらは非常に緩やかな発現と延長（「平坦」）作用頂点を持つ。これらのインスリンは１日中低いインスリン基準濃度を提供するものと主張されている。
ここで使用されるように、インスリンという用語はまたインスリン類似体を含むものと見做される。吸収率を変更したインスリンの最近の発達は関心を惹いている。Ｂ９およびＢ２７の位置でそれぞれ置換されたアスパラギン酸インスリンおよびグルタミン酸インスリンは殆ど結晶化せず、「モノマー性インスリン」と名付けられている。このインスリンは皮下貯蔵所からより急速に吸収され、かくして食後の必要性に合致する。これに反して、他のインスリン類似体は注射の部位で結晶化する傾向があり、よりゆっくりと吸収される。性能を高められたインスリンがＢ１０の位置でヒスチジンをアスパラギン酸塩と置換することにより、またＢ鎖のカルボキシル末端残基の修飾により生産されている。
この発明の軟骨形成培地の成分の例は表１で示される。
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実施例１
高グルコース培地は軟骨形成分化の間に細胞外基質生産を増加する
ｈＭＳＣSが軟骨形成系列に分化する時、細胞代謝は変更され、また細胞の同化活性が変更される。この一つの現れは細胞外基質生産の増加である。軟骨細胞のユニークな性質の原因となり、また重量支持するのに役立ち、隣接する骨の間の組織を滑らかにさせるのはこの細胞外基質であり、変形性関節症に罹患するのはこの面である。細胞外基質は、細胞が軟骨細胞に発達するにつれて時間様式で発現されるタンパク質および硫酸化プロテオグリカンで構成される。タンパク質およびプロテオグリカンはアグレカン、軟骨オリゴマトリクスタンパク質（ＣＯＭＰ）、ヒアルロン酸、硫酸ケラタン、鎖状タンパク質およびII型コラーゲン同じく他のものを含む。これらの分子は細胞外で組立てられ、細胞体を取り囲む。
軟骨形成分化を受けるペレット培養でのｈＭＳＣSは前に言及した細胞外基質プロテオグリカンを発現する。この開示において、グルコース４．５ｇ／ｌを含む培地がより大きな細胞生活力および示されるような細胞外基質成分のより大きな生産を産み出すことを我々は示す。図１において、細胞ペレットのサイズの増加は培地が「高グルコース」である時に明白である。ｈＭＳＣペレットのサイズの変化は細胞外基質の合成の範囲を反映する。各ペレットは２００，０００細胞のアリコートをグルコース１ｇ／ｌ（５．５ｍＭ）（左側）あるいはグルコース４．５ｇ．ｌ（２５ｍＭ）（右側）を持つ軟骨形成培地１／２ｍｌに移すことにより形成された。軟骨形成培地は、前述の濃度のグルコースを持つＤＭＥＭおよび以下の補充剤：デキサメタゾン１００ｎＭ、トランスフォーミング成長因子β１０ｎｇ／ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、アスコルビン酸−２−リン酸５μｇ／ｍｌ、およびプロリン４０μｇ／ｍｌよりなる。「ＩＴＳ＋」の１：９９希釈液はウシインスリン６．２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン６．２５μｇ／ｍｌ、亜セレン酸６．２５μｇ／ｍｌ、リノール酸５．３３μｇ／ｍｌ、およびウシ血清アルブミン１．２５ｍｇ／ｍｌを供給した。ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、およびアンホテリシンＢ２５０ｎｇ／ｍｌが濃縮抗生物質溶液の１：９９希釈液で供給された。
細胞および培地は１５ｍｌポリプロピレン円錐底部遠心管に挿入され、ゆっくり遠心分離（５００ｘｇ、５分）され、その後緩いキャップを持つ管は５％加湿ＣＯ2恒温器に３７℃で置かれた。続く１２時間にわたり、管底部にある細胞は約１ｍｍの直径を持つ球状ペレットに自己を再組織化した。
「ペレット培養物」は細胞に新鮮培地を供給することで維持された。１週に３回、培地は管から吸引され、新鮮培地０．５ｍｌが付加された。管はゆるやかに振動されペレットが自由に浮遊し管の側壁に付着しないようにされた。図１に関連して、ペレットは固定され、２週間の成長の後、食塩加リン酸緩衝液にパラホルムアルデヒド４％に６０分置かれ、包埋および凍結に先立ち撮影された。グルコース１ｇ／ｌを持つ軟骨形成培地でｈＭＳＣSにより形成されたペレットは直径０．８ｍｍである（左側）。グルコース４．５ｇ／ｌで培養されたペレットは１．６ｍｍの直径を持つ（右側）。グルコース４．５ｇ／ｌを含む培地でのｈＭＳＣのサイズの増加は細胞増殖の増加によるよりもむしろ、生産される大量の細胞外基質によるものである。最終倍率、４０Ｘ。異なった軟骨形成条件を検討するために、細胞ペレットは固定され、５−８ミクロンで切開され、組織染色および免疫組織染色を受けた。
図２で示されるように、軟骨に特徴的なII型コラーゲンの発現の開始は高グルコース培地４．５ｇ／ｌを含む軟骨形成培地で培養された細胞で１週と同じだけより進められた。例えば、ｈＭＳＣSは、グルコース１ｇ／ｌを持つ軟骨形成で培養の第１週後にこのタンパク質の発現の証拠を殆ど示さなかった（図２Ａ）。これとは逆に、II型コラーゲン合成の開始はグルコース４．５ｇ／ｌを持つ軟骨形成培地で成長するペレット内で容易に検出された（図２Ｂ）。２週時の点で、II型コラーゲンはグルコース１ｇ／ｌを持つ培地で成長するペレットの限定領域で存在した（図３Ａ）が、一方II型コラーゲン合成の証拠はグルコース４．５ｇ／ｌで成長したペレット全体で明らかに検出された（図３Ｂ）。
硫酸プロテオグリカンの高い濃度のものを持つ細胞外基質の形成はサフラニンＯ（示されていない）およびトルイジンブルーＯでの染色により示された。トルイジンブルーＯでの染色時に、軟骨性細胞外基質を持つペレットの切片はブルーの色よりも紫がかった色の異染色性を示し、これは軟骨で見出される前に言及されたような負に負荷された基質要素の存在を示している。グルコース１ｇ／ｌを持つ軟骨形成培地でのｈＭＳＣペレットが切開され染色された時に２週の培養後にこの紫がかった異染性染色の証拠を一方では示したが（図４Ａ）、この染色の範囲は培養がグルコース４．５ｇ／ｌを含んだ時により一層顕著であった（図４Ｂ）。
実施例２
高グルコースは軟骨形成の間にｈＭＳＣ生活力を増加する
グルコース４．５ｇ／ｌを含む培地で培養されたｈＭＳＣSの軟骨形成分化の改善に関しては可能な数多くの説明がある。しかし、この実施例は、この高グルコース培地がグルコース１ｇ／ｌを持つ培地がなすよりももっと大きな範囲で細胞生存を促進することを示す。高生活力はより大きな軟骨形成に帰着するが、それは単により大きな数の生活細胞が軟骨性細胞外基質成分を分泌できるからである。加えて、細胞生存のより大きな水準はもっと強壮な細胞集団を表しているように見え、ここでは各生存細胞はその近辺により多くの細胞外基質タンパク質、プロテオグリカン、および炭水化物を加えることに寄与する。軟骨が無血管の器官であるために、培養培地で糖類の比較的高い濃度というこの必要性は生体内での軟骨細胞の異常な代謝特性を表している。
ペレット培養におけるｈＭＳＣSの生活力は、器官培養における細胞の生存を検証するためにプール他により開発された色素排除試験を修飾することにより検定された（Ｃ．Ａ．プール、Ｎ．Ｈ．ブルックス、Ｒ．Ｔ．ギルバート、Ｂ．Ｗ．ボーモント、Ａ．クローザー、Ｌ．スコット、およびＭ．Ｊ．メリリーズ。「固定可能フルオロプローブ・５−クロロメチルフルオレセイン・ジアセテートおよびエチジウム・ホモ二量体−１を使用する結合組織体外移植組織での生活能および非生活能細胞の検出」結合組織研究、３３巻、２３３−２４１ページ、１９９６年）。ペレット収穫の７２時間前に、エチジウムホモ二量体色素（ＤＭＳＯ内での菌株１ｍＭ）が２μＭの最終濃度になるように培地に加えられた。ペレットは次いで標準保温条件に戻された。収穫に際し、ペレットは食塩加リン酸緩衝液で４×３０分すすがれ、次いで１時間パラホルムアルデヒド４％で固定され、凍結切片包埋液で包埋され、液体窒素浴で冷却され、また凍結切開された。８μｍ切片は水様装備および蛍光顕微鏡検査による観察に先立ち、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）５００ｎｇ／ｍｌで対比染色剤着色された。
エチジウムホモ二量体色素保温のこれらの条件下で、無傷原形質膜のない細胞のみがその核に色素の入場を許した。これらの核は４９０ｎｍ光で励起されると赤く蛍光発光する。青色に蛍光発光するＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を持つ固定切片の保温はこの第２色素の他のすべての核のＤＮＡへの挿入を可能にし、ここではらせん間結合部位はエチジウムホモ二量体で占められることはない。かくしてエチジウムホモ二量体保温および固定の時点で生活能である細胞の核は赤く輝き、一方エピ蛍光顕微鏡写真による観察下では生活能細胞は青く輝く。
エチジウム・ホモ二量体−処置ペレットの試験は非生活能細胞の赤色核がグルコース１ｇ／ｌで成長したペレットで顕著であることを明らかにする（図５Ａ）。これとは著しく対照的に、グルコース４．５ｇ／ｌで成長した同等のペレットは赤色核を殆ど含まない（図５Ｂ）。
実施例３
ＴＧＦ−β３はＭＳＣSにとって優れた軟骨形成剤である
ここで報告される実験は比較的大きな数のラビット（約１６匹）からのＭＳＣSの軟骨形成を各種の条件の下で調査したものである。
ＴＧＦ−β１は軟骨形成の有力なプロモーターであるとして長い間公知であった（加藤〔２〕による実施例検討を参照されたい。）。事実ＴＧＦ−β１は例えばオドリスコル〔３〕のそれのように数多くの研究で軟骨の修復を実行するために移植片で使用されてきており、そこでは間葉始原の組織（例えば骨膜および筋など）に軟骨形成を導入することが示されてきた。更にＴＧＦ−β１を骨軟骨移植片に使用する他の報告も存在する〔４，５〕。最近ブライアン・ジョンストンは、ＴＧＦ−β１が、ペレット培養で一次細胞に付加される時には、粘稠性の欠除という問題を克服し、より再生可能な結果に導いた。これは重要な発展であり、最初の発見を強化した。
ＴＧＦ−β３は子宮平滑筋腫細胞に際立った効果を持つものとして発見された〔６〕。平滑筋腫は低い有糸分裂指数で肥大性細胞による大量の細胞外基質の形成により特徴付けられる良性平滑筋腫瘍である。軟骨表現型を示す平滑筋腫の少くとも１件の報告事例がある。これらの観察に基づいて、我々は間葉幹細胞の軟骨形成分化に対するＴＧＦ−β３の作用を調査した。
ヒト骨髄誘導間葉幹細胞は密集になるまでＦＢＳ１０％の存在下で標準条件の下で培養された。細胞はトリプシン消化され、軟骨形成培地で２回洗浄され、ＴＧＦ−β１、１０ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−β３、１０ｎｇ／ｍｌのいずれかを含みあるいはそのいずれをも含まない軟骨形成培地で１５ｍｌポリプロピレン管内で２００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁された。細胞は層形成のため回転され、培地は３−４日毎に取り替えられ、細胞は７日、１４日および２１日に収穫された。凍結切片（８μｍ）はトルイジンブルーで染色された。それらはまた、免疫細胞化学プロトコルを用いる下記のもの：II型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、および軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）で染色された。
同じ供与体からの細胞がＴＧＦ−β１あるいはＴＧＦ−β３ありもしくはなしで軟骨形成培地で培養された。ゼロ日（すなわち層形成のために細胞を回転する前に）Ｉ型コラーゲンの発現が細胞に近接して観察されたが、II型コラーゲンおよびＣＯＭＰの染色はなかった。成長因子付加の不在下でペレット培養８日後に、ＣＯＭＰ発現は細胞外基質で豊富であったが、II型コラーゲンは明白でなかった。ＴＧＦ−β１の存在下で、II型コラーゲンの発現は同じくなかった。ＴＧＦ−β３の存在でペレットの小領域が無細胞となりある細胞はII型コラーゲンを発現した。１４日目に、II型コラーゲンの局所発現で見られるように、ＴＧＦ−β１の存在下でいくつかの軟骨形成分化の証拠があった。しかしＴＧＦ−β３の存在下で成長した時には、ペレットは劇的に異なった様相を示した。この場合ペレットは豊富な細胞外基質の存在のためにサイズがより大きくなった。細胞の大部分は肥大性であり、細胞が未だに未分化であった中心区域を除いて全体にII型コラーゲンの発現があった。ペレットの周辺を囲んで、細胞は軟骨膜に類似したII型の強度の染色を持つ細長い形状を採用した。
ＴＧＦ−β１の存在下で培養２１日後に、周辺は陰性であったがそれを除きペレット全体にわたり染色があった。ＴＧＦ−β３では、非常に強い染色、とりわけテリトリー間基質にそれが見られた。ＣＯＭＰでの染色も同様で、ただ周辺細胞染色は少なくテリトリー間染色は増加した。
これはＴＧＦ−β３が試験管内ヒトＭＳＣSの軟骨形成分化に劇的な作用を有し、また豊富な軟骨状細胞外基質の発達を刺激することを示す。培養２１日後、組織は関節軟骨に類似する形態を持つ。テリトリー間基質でのＣＯＭＰの特異的な発現は特に成熟軟骨を想起させる。加えてII型コラーゲンの豊富な発現は、これらの細胞が軟骨形成系列に分化したことを示唆している。その作用はＴＧＦ−β１に比べてＴＦＧ−β３の存在下でより際立っている。
実施例４
ペレット培養実験
ｈＭＳＣ付着培養
ヒト間葉幹細胞は（ブルーダー他、１９９７年）広範な継代培養および続く冷凍保存の間での精製ヒト間葉幹細胞の成長動態、自己再生および骨形成能。細胞生化学ジャーナル、６４巻：２７８−２９４ページ、１９９７年、に記載された通り分離され、培養拡張され、付着細胞として生育された。成長培地はダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）であり、グルコース１ｇ／ｌを含み、選択されたロットからの胎仔ウシ血清で補充されていた（レノン他、１９９６年）Ｓ．Ｅ．ヘインズワース、Ｓ．Ｐ．ブルーダー、Ｎ．ジェイズウォール、およびＡ．Ｉ．キャプラン。骨髄からのヒトおよび動物間葉始原細胞：最適選択および増殖のための血清の同定。試験管内細胞発展生物学−動物篇３２巻：６０２−６１１ページ：１９９６年。およびペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、ならびにアンホテリシンＢ２５０ｎｇ／ｍｌ）。細胞は５％炭酸ガス雰囲気で３７℃で成長した。細胞は約１３集団倍加に対応する継代１で使用された（ブルーダー他、１９９７年）。広範な継代培養および続く冷凍保存の間での精製ヒト間葉幹細胞の成長動態、自己再生および骨形成能。細胞生化学ジャーナル、６４巻：２７８−２９４ページ、１９９７年。
ｈＭＳＣペレット培養
軟骨形成はｈＭＳＣSを稠密三次元培養形態に切り替えることで促進され、そのため２５０，０００細胞が約１ｍｍ当初直径の球状ペレットを形成した。これらのペレットを形成するために、付着ｈＭＳＣSはトリプシン消化され、血清含有培地で洗浄され、次いで標準組織培養技術を使用して無血清軟骨形成培地で再懸濁された。この培地はオシリス・プロビジョナル・アプリケーション＃６４０１００−１２９に記載された通りであった〔トランスフォーミング成長因子ベーター３、１０ｎｇ／ｍｌ（ＴＧＦ−β３、オンコジーン・リサーチ・プロダクツ、マサチューセッツ、ケンブリッジ）、デキサメタゾン１００ｎＭ（シグマ、ミズーリ、セントルイス）、アスコルビン酸−２−リン酸５０μｇ／ｍｌ（和光薬品株式会社、日本、東京）、ピルビン酸ナトリウム１００μｇ／ｍｌ、プロリン４０μｇ／ｍｌ、およびウシインスリン６．２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン６．２５μｇ／ｍｌ、亜セレン酸６．２５μｇ／ｍｌ、リノール酸５．３３μｇ／ｍｌ、ウシ血清アルブミン１．２５ｍｇ／ｍｌ（ＩＴＳ−プラス，コラボレイティブ・バイオメディカル・プロダクツ、マサチューセッツ、ケンブリッジ）で補充された高グルコースＤＥＭＥＭ〕。
ｈＭＳＣSの軟骨形成ペレットは下記の方法で生産された。無血清軟骨形成培地０．５ｍｌに懸濁された２５０，０００細胞のアリコートが１５ｍｌ円錐形ポリプロピレン遠心管（ＶＷＲ）に分配された。細胞は５分６００ｘｇで遠心分離され、管の底部に残された。管はガス交換を可能にするためゆるめられたキャップ付きの恒温器に置かれた。沈殿細胞は２４時間以内に管の底部で球状ペレットを形成した。培地は週３回交換され、細胞は４週までこの方法で培養された。
肥大の誘導
肥大分化はペレットが標準軟骨形成条件の下で７日あるいは１４日培養された後に誘導された。その時点において、軟骨形成培地はチロキシン（シグマ）５０ｎｇ／ｍｌを含む成熟培地で置換された。肥大を更に誘導するために、デキサメタゾンの濃度は１０-9Ｍに下げられ（クアトロ他、１９９２年）、またβ−リン酸グリセロール２０ｍＭが加えられた（デュードンヌ他、１９９４年）。Ｃ．Ｍ．シーマインズ、Ｓ．Ｗ．ゴーエイ、Ｓ．ブーキセビッチ、Ｊ．Ｋ．ヌーランド、Ｔ．Ｋ．サンパス、Ｍ．ヘルダー、およびＥ．Ｈ．バーガー。骨形成タンパク質およびトランスフォーミング成長因子−ｂの培養された長骨原基痕跡での軟骨形成への逆作用。骨無機質研究ジャーナル９巻：７７１−７８０ページ、１９９４年。
他の予備実験は、Ｔ３およびチロキシンがいずれも肥大を誘導するのに有効であることを示している。レチノール酸およびその誘導体などの薬剤はまたこの方法で有効である。
ペレットの分析
細胞ペレットはＰＢＳ内でのパラホルムアルデヒド４％で１時間固定により収穫された。サンプルは次いでエタノール７０％に移され、エタノールおよびキシレンシリーズで脱水され、パラフィン包埋された。５μｍ切片は各ペレットの中心を通して切断された。
単一特異性抗体が軟骨形成分化の細胞外基質タンパク質特性を検出するために使用された。切片はｐＨ７．６のトリス−酢酸１００ｍＭ、ウシ血清アルブミン０．１％をコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学、アメリカ、メリーランド、アイジャムズビル）５０ｍＵ／ｍで３０分消化された。II型コラーゲンは２ｍｇ／ｍｌで使用されたマウスモノクローナル抗体Ｃ４Ｆ６で同定された（スリニバス他、１９９３年）。スリニバス、Ｇ．Ｒ．、Ｈ．Ｊ．バラック、およびＣ．Ｏ．チチェスター。II型コラーゲンおよびその臭化シアンペプチドの定量免疫検定。免疫学方法論ジャーナル１５９巻：５３−６２ページ、１９９３年。Ｘ型およびIX型コラーゲンはそれぞれペプシン消化後マウスモノクローナルＸ５３で同定された（カルテット、ドイツ連邦共和国、ベルリン）（ギルコンタイテ他、１９９６年）Ｓ．フリッシュホルツ、Ｐ．ラミ、Ｋ．ワグナー、Ｂ．スボボダ、Ｔ．アイグナーおよびＫ．フォン・デア・マルク．モノクローナル抗体を持つ正常胎児および成人変形性関節症軟骨におけるＸ型コラーゲンの免疫局在化。基質生物学１５巻：２３１−２３８、１９９６年、およびαＣＩＸ（Ｃ．Ｏ．チチェスター他、原稿作成中）コンドロイチナーゼ処置に先立ち切片は酢酸０．５Ｍ内でのペプシン（シグマ）２ｍｇ／ｍｌで１時間２２℃で保温された。
すべての免疫染色に対し、反応性が製造業者の使用説明書（カークガード・アンド・ペリー・ラブス、メリーランド、ゲイザーズバーグ）に基づきビオチン化ヤギ抗マウスあるいは抗ラビット抗体で切片を連続保温し、次いでストレプトアビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されて検出された。３，３′−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＨ2Ｏ2のペルオキシダーゼ反応製品として信号が開発された。
陰イオン硫酸プロテオグリカンはサフラニンＯ染色およびトルイジンブルー異染色性により検出された。これらの染色は軟骨基質の付着を特徴付ける（シーハンおよびフラプチャック、１９８０年）。シーハン、Ｄ．Ｃ．およびＢ．Ｂ．フラプチャック。組織化学の理論と実践、第２版、バッテル・プレス、オハイオ、コロンバス、４８１ページ、１９８０年。
実施例５
２種の培地でのペレット培養におけるｈＭＳＣSの連続処置は肥大を誘導する
軟骨形成分化を受けるヒトＭＳＣSは遺伝子発現の内部プログラムに起因するかもしくは環境条件に応答するかのいずれかで肥大細胞に成熟することができる。肥大を誘導するために、試験管内培養条件は軟骨形成分化の２週後に変更された。ＴＧＦ−β３の引出し（セーラ他、１９９７年）、ジョンソン、Ｅ．Ｈ．フィルバロフ、Ｊ．ラボード、Ｄ．Ｍ．シーハン、Ｒ．デリンク、およびＨ．Ｌ．モーゼス。マウス骨格組織の切形キナーゼ欠損ＴＧＦ−βII型レセプターの発現は末端軟骨細胞分化および変形性関節症を促進する。細胞生物学ジャーナル、１３９巻：５４１−５５２ページ。およびチロキシン５０ｎＭの追加（バロックおよびレッディ、１９９４年）。チロキシンは合成培地で分離軟骨細胞からの柱状軟骨の形態形成を調節する血清因子である。細胞生物学ジャーナル１２６巻：１３１１−１８ページ、１９９４年。培地に対し培養の２週追加後際立った肥大効果を与えた。肥大はこれらの条件がβ−リン酸グリセロール２０ｍＭの追加およびデキサメタゾン濃度の１０-9Ｍまでの減少を組合せた時にはより顕著であった。これらのペレットは広範な細胞周辺でのＥＣＭの堆積で囲まれた肥大細胞の領域を含んでいた（図２）。２８日間標準軟骨形成培地で維持されたペレットと比較すると、処置されたペレットはII型およびIX型コラーゲンの強い染色、ならびに抗体Ｘ５３で検出されたＸ型コラーゲンの付着で不均整ではあるが著しい増加を示していた（図２）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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