(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
0004547515.tif 000008
（式中、Ｇはビニル基、アリル基またはプロパルギル基、Ｂはプリン塩基またはピリミジン塩基、Ｘは炭素数１〜８のアルキレン基、Ｙは水酸基または水素を示す）の構造を有することを特徴とするヌクレオシド誘導体。
【請求項２】
Ｂがアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンである請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
【請求項３】
Ｇがビニル基である請求項１または２記載のヌクレオシド誘導体。
【請求項４】
下記一般式（２）
【化２】
0004547515.tif 000009
（式中、Ｇ’は
【化３】
0004547515.tif 000010
、Ｂはプリン塩基またはピリミジン塩基、Ｘは炭素数１〜８のアルキレン基、Ｙは水酸基または水素、ｎは正の整数を示す）の構造を含み、数平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であるヌクレオシド含有ポリマー。
【請求項５】
Ｂがアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンである請求項４記載のヌクレオシド含有ポリマー。
【請求項６】
Ｇ’が
【化４】
0004547515.tif 000011
である請求項４または５記載のヌクレオシド含有ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヌクレオシドのリボースまたはデオキシリボース残基の特定の水酸基に重合性置換基を配したヌクレオシド誘導体、その製造法およびヌクレオシド含有ポリマーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドを合成高分子に組み込んだポリマーは新しい機能性材料として期待されてきている。これまでに報告されている核酸塩基を含むポリマーとしては明石らがアデニンをシリカゲルやポリアクリルアミドに固定化したポリマーを合成し、アフィニティーゲル電気泳動やクロマトグラフィーへの応用を報告している（M. Akashi, et al., Chem. Lett., 1093-1096, 1988; E. Yashima et al., J. Chromatogr, 654, 159-166, 1993 ）。青木らはウラシルの６位にアクリロイルメチル基を導入し、ウラシル基含有ポリマーの合成とそのポリマーの温度応答性を報告している（T. Aoki et al., Polym. Preprints, Japan, 46, 3166-3167, 1997）。また、竹本らはアデニン、ウラシルなどの核酸塩基を含んだポリマーを合成し、溶液中でのポリマー間の相互作用を解析している（Y. Inaki et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 3201-3217, 1986; K. Kondo et al., Makromol. Chem. Rapid Commun., 1, 303-306, 1980 ）。
【０００３】
上記のように核酸塩基を含有するポリマーについては多くの報告が見られるが、これらの多くは核酸塩基がプリン環の場合は９位の窒素に、ピリミジン環の場合は１位の窒素に重合性置換基を導入したものであり、核酸塩基の機能を引き出すためには重合性置換基との間のスぺーサー部分を長くするか、または糖残基を有しているヌクレオシドの糖部分の水酸基に重合性置換基を導入することが望ましい。
【０００４】
ヌクレオシドを含有するポリマーについての報告は少ないが、最近、畑中らはウリジンのリボース残基の５位の水酸基に重合性置換基を配したウリジンを含有するポリマーを合成している。畑中らはそのウリジン含有ポリマーの糖転移酵素に対する阻害作用を調べ、阻害活性がモノマーに比べて高分子効果により飛躍的に高まることを報告している（K. Hatanaka et al., J. Carbohydr. Chem., 16, 667-672, 1997）。この場合、ポリマーは化学合成で調製されており、しかも、その主鎖がポリスチレンからなっているため水溶性が低く、かつ立体的に大きな芳香環を有しているので、阻害剤として用いるには必ずしも満足のいくものではなかった。
【０００５】
ヌクレオシドの糖部分に置換基を導入する方法としては、化学合成では反応工程が多く、かつ各生成物の単離精製も煩雑であるため、酵素合成が有効である。
Rivaらは、バチルス属由来のプロテアーゼを用いて、アデノシンやウリジンのリボース残基に一段階でエステル交換反応により脂肪酸エステルを導入できることを報告している（S. Riva et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 584-589, 1988 ）。しかし、アデノシンではリボース残基の３位と５位に置換反応が進行するので、混合物が得られる。また、ウリジンの場合は２，３，５位の置換体の混合物が得られる。
さらに、特表平７−５０３７５７にはジアジピン酸を用いてアデノシンの５’位にビニルアジポイル基を導入することが開示されているが、その収率は４％と非常に低い。
従って、糖部分の特定の水酸基にいかに選択的に重合性の置換基を導入するかが問題となる。我々は水酸基を保護せず特定の水酸基のみを選択的にエステル化する合成に関して、これまでに糖の一級水酸基を修飾する方法について開発を行ってきた（特許第２７５７２５２号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヌクレオシドの特定の水酸基に対して重合性置換基が結合した構造のヌクレオシド誘導体、その製造法およびヌクレオシド含有ポリマーを提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を進めた結果、ヌクレオシドの糖部分の特定の水酸基の選択的エステル化は、有機溶媒中、加水分解酵素の存在下で行うことにより効率よく進行することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の通りである。
［１］下記一般式（１）
【０００９】
【化５】
0004547515.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｇは重合性置換基、Ｂはプリン塩基またはピリミジン塩基、Ｘはアルキレン基、Ｙは水酸基または水素を示す）の構造を有することを特徴とするヌクレオシド誘導体。
［２］Ｂがアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンである［１］記載のヌクレオシド誘導体。
［３］Ｇがビニル基である［１］または［２］記載のヌクレオシド誘導体。
［４］加水分解酵素の存在下、有機溶媒中でヌクレオシドと重合性置換基を有する脂肪族ジカルボン酸ジエステルとを反応させることを特徴とするヌクレオシド誘導体の製造方法。
［５］下記一般式（２）
【００１１】
【化６】
0004547515.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｇ’は
【００１３】
【化７】
0004547515.tif 000004
【００１４】
、Ｂはプリン塩基またはピリミジン塩基、Ｘはアルキレン基、Ｙは水酸基または水素、ｎは正の整数を示す）の構造を含み、数平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であるヌクレオシド含有ポリマー。
［６］Ｂがアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンである［５］記載のヌクレオシド含有ポリマー。
［７］Ｇ’が
【００１５】
【化８】
0004547515.tif 000005
【００１６】
である［５］または［６］記載のヌクレオシド含有ポリマー。
［８］［５］〜［７］のいずれかに記載のヌクレオシド含有ポリマーを含むことを特徴とする温度応答性材料。
【００１７】
【発明の実施の形態】
一般式（１）で表される本発明のヌクレオシド誘導体中のＢは、「プリン塩基またはピリミジン塩基」であって、ヌクレオシドを構成する塩基であり、例えばアデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、ヒポキサンチン、キサンチンなどが挙げられ、好適にはアデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシンが挙げられる。
【００１８】
上記ヌクレオシド誘導体中のＸは、「アルキレン基」であって、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン基などが挙げられ、好ましくは炭素数１〜８のアルキレン基、より好ましくは炭素数４のブチレン基である。
【００１９】
上記ヌクレオシド誘導体中のＧは、「重合性置換基」であって、例えばビニル基、アリル基、プロパルギル基などが挙げられ、好ましくはビニル基が挙げられる。
【００２０】
本発明のヌクレオシド誘導体の製造方法は、加水分解酵素の存在下、有機溶媒中でヌクレオシドと重合性置換基を有する脂肪族ジカルボン酸ジエステルとを反応させて、加水分解酵素の働きにより重合性置換基を有する脂肪族ジカルボン酸ジエステルのエステル交換反応によってヌクレオシドの糖部分の特定の水酸基（例えば３位または５位）を選択的にエステル化する方法である。
【００２１】
上記方法に用いる加水分解酵素としては、従来公知のもの、例えば細菌類、放線菌類、菌類などの微生物または動植物に由来する、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼなどが挙げられ、好ましくはアルカリゲネス属由来のリパーゼ、放線菌由来のアルカリ性プロテアーゼ、バチルス属由来のアルカリ性プロテアーゼなどが挙げられ、特に好ましくは放線菌由来のアルカリ性プロテアーゼ、さらに好ましくはストレプトマイセス  ｓｐ．属由来のアルカリ性プロテアーゼが挙げられる。
【００２２】
上記方法に使用するヌクレオシドとしては、先に規定した「プリン塩基またはピリミジン塩基」を有するヌクレオシドが挙げられ、好適にはアデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシンを含有するヌクレオシドが挙げられる。
【００２３】
「重合性置換基を有する脂肪族ジカルボン酸ジエステル」とは、重合性置換基を有するアルコールと脂肪族ジカルボン酸とのジエステルである。好ましい「重合性置換基を有する脂肪族ジカルボン酸ジエステル」の具体例としては、例えばマロン酸ジビニル、コハク酸ジビニル、グルタル酸ジビニル、アジピン酸ジビニル、ピメリン酸ジビニル、スベリン酸ジビニル、アゼライン酸ジビニル、セバシン酸ジビニルなどが挙げられ、好適にはアジピン酸ジビニルが挙げられる。
【００２４】
上記方法に使用する有機溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、アセトン、テトラヒドロフラン、ブタノールなどが挙げられ、より好ましくはＤＭＦおよびＤＭＳＯとＤＭＦとの混合溶媒（１：１０〜１：１）が挙げられる。
【００２５】
反応溶媒中のヌクレオシドの濃度は１〜４０重量％、好ましくは１０〜２０重量％である。重合性置換基を有する脂肪族ジカルボン酸ジエステルの使用割合は、例えば脂肪族ジカルボン酸ジビニルエステルの場合、ヌクレオシド１当量当たり１〜１０当量、好ましくは１〜５当量である。また、酵素の使用割合は、反応溶媒に対して０．１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。
【００２６】
上記方法の反応温度としては１０〜１００℃、好ましくは３０〜５０℃であり、反応時間としては１〜１６８時間、好ましくは７２〜９６時間である。
【００２７】
上記ヌクレオシド誘導体は、通常の重合方法、例えば溶液重合、乳化重合、懸濁重合などの方法により重合して、ヌクレオシド含有ポリマーとなる。例えば、ＤＭＳＯなどの溶媒中で、アゾビスイソブチロニトリルの存在下、５５℃で２４時間、脱気封管または窒素ガスのバブリング下という条件によって重合することができる。重合は、ヌクレオシド誘導体単独で行ってもよく、または他の重合性モノマーと共重合させてもよい。
【００２８】
好ましいヌクレオシド含有ポリマーとしては、重合性置換基Ｇがビニル基、アリル基またはプロパルギル基であるヌクレオシド誘導体が、単独または他の重合性モノマーと共に重合したものであって、一般式（２）で示される構造を含むものが挙げられる。
【００２９】
一般式（２）中のｎは１〜２，０００、好ましくは４〜２００の正の整数である。
【００３０】
上記ヌクレオシド含有ポリマーの数平均分子量は、１，０００〜１，０００，０００、好ましくは２，０００〜１００，０００であり、量平均分子量は１，０００〜１，０００，０００、好ましくは２，０００〜１００，０００である。
【００３１】
上記ヌクレオシド含有ポリマーのなかでも、一般式（２）において、Ｇ’が
【００３２】
【化９】
0004547515.tif 000006
【００３３】
であるものが特に好ましい。
【００３４】
上記ヌクレオシド含有ポリマーにおいて、ヌクレオシド誘導体と共重合させる他の重合性モノマーとしては、アクリロイル基、メタクリロイル基、アリル基、ビニルエステル基などのエテニル構造を有するものか、またはプロパルギル基などのエチニル構造を有するものであればよく、いずれのものでも利用できるが、好ましくはビニルエステル基を有するものが挙げられる。また、共重合させる他の重合性モノマーの量は、使用する重合性モノマーによって適宜選択されるが、例えばヌクレオシド誘導体１当量当たり０．０１〜１００当量、好ましくは０．１〜１０当量である。
【００３５】
上記ヌクレオシド含有ポリマーは、ポリビニルアルコールなどの主鎖にヌクレオシドが分岐した構造を分子内に有するので、分子間や分子内で水素結合性を有しており、後記実施例の淡色効果（Hypochromicity）にみられるように温度応答性を有する。また、主鎖がポリビニルアルコールなどであることにより、主鎖がポリスチレンなどである場合に生じる低い水溶性の問題、および立体的な障害の問題は小さい。従って、高分子分野やメディカル分野などの種々の分野で用いられる機能性材料、例えば温度応答性材料、分離膜、イオン透過膜、センサー、スイッチ、ドラッグデリバリーシステム、生体適合材料などに適用できる。
【００３６】
【実施例】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３７】
ヌクレオシド誘導体の酵素合成
実施例１
アデノシン（４．２ｇ）及びアジピン酸ジビニル（１２ｇ）を含むＤＭＦ：ＤＭＳＯ（４：１）の混合溶媒（６２ｍｌ）に、放線菌由来のアルカリ性プロテアーゼ（商品名：ＡＬＰ−１０１、東洋紡績株式会社製）（３１０ｍｇ）を加えて懸濁した。この酵素反応液を３０℃にて１３０ｒｐｍで１４日間攪拌した。また、反応液のＴＬＣ分析から生成物は１種であった。反応液を濾過して酵素を除き、減圧下で濃縮後、シリカゲル（Ｋｉｓｅｌｇｅｌ−６０、メルク製）を充填したカラム（内径：５ｃｍ、長さ：５０ｃｍ）に負荷し、クロロホルム：メタノール（１０：１）の混合溶媒で溶出して生成物を分離した。反応液のＨＰＬＣ分析（カラム：ＴＯＳＯＨ  Amide-80、溶媒；アセトニトリル：水＝１０：１、示差屈折計検出）よりアデノシンのエステル体への変換を確認し、アデノシン−３’−Ｏ−ビニルアジぺートを粉末状結晶（２．７ｇ）として得た。
融点１４９−１５０℃。
IR(KBr): 1735, 1750 cm-1(C=O), 1650 cm-1(vinyl),
13C-NMR(DMSO-d6 ):δ23.47, 23.74, 32.65, 32.74(-CH2 -), 61.64(C-5'), 71.76(C-2'), 73.37(C-3'), 83.70(C-4'), 87.82(C-1'), 152.49(C-2), 149.06(C-4), 119.43(C-5), 156.28(C-6), 139.95(C-8), 98.03, 141.26(C=C), 170.31, 172.06(C=O).
【００３８】
ヌクレオシドポリマーの合成
実施例２
アデノシン−３’−Ｏ−ビニルアジペート（０．４ｇ）を蒸留したＤＭＳＯ（０．８ｍｌ）に溶かし、アゾビスイソブチロニトリル（４ｍｇ）を添加し、脱気封管後、５５℃で２４時間反応した。反応液をエタノール中に流し込みポリマーを得た。収量0.04 g、ＧＰＣ分析から得られた分子量Ｍｗ 10,000 、Ｍｎ 6,300、Ｍｗ/ Ｍｎ 1.6。
【００３９】
ポリマーの淡色効果の測定
実施例３
測定方法はTakemotoらの報告に従って行った。即ち、ポリ（アデノシン−３’−Ｏ−ビニルアジペート）（５ｍｇ）にＤＭＳＯ（１５ｍｌ）を加え、室温で２日間攪拌した。それにエチレングリコール（ＥＧ）（２０ｍｌ）を添加した。その溶液をＤＭＳＯ/ ＥＧ(3/2) で９倍希釈し、２５〜８０℃の温度でそれぞれ２日間静置し、温度制御装置がついている分光光度計を用いて各インキュベーション温度で吸光度（Ａ２６０）を測定した。アデノシン−３’−Ｏ−ビニルアジペートも同様に処理して吸光度を測定した。
その結果、低温ではポリマーはモノマーに比べて低い吸光度を示し、温度の上昇と共にその差が減少し、８０℃では同じ吸光度となった。各温度でインキュベーションした溶液を２５℃で一晩静置後、その吸光度を測定したところ、モノマーはどの温度においても元の吸光度に戻り、またポリマーにおいても吸光度が元の値に回復する傾向が見られた。
【００４０】
測定した吸光度より以下の式を用いて淡色効果（％）を求めた。その結果を図１に示す。
【００４１】
【数１】
0004547515.tif 000007
【００４２】
（式中、Ｘはアデノシン−３’−Ｏ−ビニルアジペートの吸光度、Ｙはポリ（アデノシン−３’−Ｏ−ビニルアジペート）の吸光度を示す）。
２５℃では１０％吸光度が減少しているのに対し、インキュベーション温度の上昇と共にその減少が小さくなり、８０℃ではほぼ０になった。このことは、このポリマーは低温下では分子間水素結合により凝集した構造をとっているのに対し、高温下では水素結合がほとんどなくなりランダムコイル状となっていることを示唆している。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のヌクレオシド誘導体は、リボースまたはデオキシリボースの特定の水酸基に炭素鎖を介して重合性置換基を結合させた構造のものであり、重合性置換基による重合性を有するものである。
本発明の方法によれば、ヌクレオシドの糖部分の特定の水酸基（例えば３位または５位）が重合性置換基を有する脂肪族ジカルボン酸ジエステルによって選択的にエステル化されたヌクレオシド誘導体を一段階の反応工程で得ることができる。得られるヌクレオシド誘導体は、ほぼ単一物であって単離精製が容易である。
本発明のヌクレオシド誘導体は、その重合性置換基の重合性を利用して、その単独重合体や共重合体を得るための重合性モノマーとして利用することができる。また、その単独重合体および共重合体（ヌクレオシド含有ポリマー）は、ポリビニルアルコールなどの主鎖にヌクレオシドが分岐した構造であることにより、分子間や分子内で水素結合性を有しているので、温度応答性を有する。また、主鎖がポリビニルアルコールなどであることにより、主鎖がポリスチレンである場合に生じる低い水溶性の問題、および立体的な障害の問題は小さい。従って、高分子分野やメディカル分野などの種々の分野で用いられる機能性材料として有利に適用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】アデノシン含有ポリマーの淡色効果を示すグラフである。
【図１】
0004547515.tif 000012