(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する脂質生産菌の育種方法であって、
原種の脂質生産菌からウラシル要求性株を取得するウラシル要求性株取得工程、
および前記ウラシル要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子としてオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子を用いて、当該マーカー遺伝子を宿主の胞子に導入する遺伝子導入段階と、
上記宿主のウラシル要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する選抜段階とを有する形質転換工程を含むことを特徴とする脂質生産菌の育種方法。
【請求項２】
上記脂質生産菌は、モルティエレラ アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ ハイグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）またはモルティエレラ クラミドスポラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）であることを特徴とする請求の範囲１に記載の脂質生産菌の育種方法。
【請求項３】
上記遺伝子導入段階では、エレクトロポレーション法、または、パーティクルデリバリー法が用いられることを特徴とする請求の範囲１または２に記載の脂質生産菌の育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、脂質生産菌の育種方法に関するものであり、特に、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する脂質生産菌において、抗生物質による選抜を用いずに形質転換による育種を行う方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  従来から、微生物の代謝により有用な化合物を生産させる技術（広義の醗酵技術）が開発、実用化されている。具体的には、例えば、代謝によって脂質を大量に生産する能力を有する脂質生産菌を挙げることができる。代表的な脂質生産菌としては、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ（モルティエレラ  アルピナ）等のモルティエレラ属の菌類を挙げることができる。モルティエレラ属の菌類は、アラキドン酸をはじめとする高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生産することが知られており、工業的に特に有用な菌類である（例えば、特公平７−３４７５２（公告日：平成７（１９９５）年４月１９日、公開公報：特開昭６３−４４８９１、公開日：昭和６３（１９８８）年２月２５日）参照）。【０００３】  ところで、上記脂質生産菌等の微生物も含めて各種有用生物においては、育種、すなわち有用生物の遺伝的性質をより望ましい性質に改良する（品種改良する）ことがなされている。特に醗酵技術では、微生物による化合物の生産効率を向上し、当該化合物の製造コストを低減する等の観点から、育種は非常に重要なものとなっている。【０００４】  育種方法は、基本的には、遺伝的変異を含む集団を作出する工程（便宜上、集団作出工程と称する）と、当該集団からより望ましい性質を示す品種を選抜する工程（便宜上、選抜工程と称する）とからなっている。集団作出工程も選抜工程も育種しようとする有用生物の種類に応じて様々な方法を用いることができるが、上記脂質生産菌等の微生物では、集団作出工程において、主として（１）変異処理による方法と（２）形質転換による方法とが利用される。【０００５】  （１）変異処理による方法
変異処理により集団作出工程を行う場合、様々な手法で微生物に突然変異を生じさせて集団を作出するが、突然変異そのものは無作為に多くの種類が生じることになる。そのため、その後の選抜工程にて、目的の形質を示す品種（株）を取得できたとしても、目的の形質に関わる遺伝子以外の他の遺伝子に予想外の損傷が生じている可能性が否めない。例えば、上記脂質生産菌の場合では、生産される脂質の種類に変化が生じても、増殖や胞子形成能などが悪くなること等があり得る。したがって、変異処理による集団作出工程では、必ずしも生産性のよい株を得ることができるとは限らない。【０００６】  さらに、この方法では、上記のように、得られる集団を形成する個体には、無作為に多くの種類の突然変異が生じていることになる。それゆえ、その後の選抜工程において、目的の性質を示す突然変異体（株）を得るために、適切な選抜方法（スクリーニング方法）がない場合には、上記集団を形成する個体全てについて突然変異の種類を調べる必要があり、膨大な労力を必要とする。【０００７】  （２）形質転換による方法
これに対して、形質転換により集団作出工程を行う場合、育種しようとする有用生物を宿主として、目的の性質を獲得するために必要なＤＮＡ断片を導入（形質転換）することにより形質転換体の集団を得る。すなわち、目的に合わせた特定の遺伝子のみを発現制御した集団を作出することになる。そのため、その後の選抜工程では、得られた形質転換体の中からより望ましい品種（株）のみを選抜すればよいことになるので、スクリーニングが容易になるだけでなく、上記他の遺伝子に予想外の損傷が生じることも回避できる。したがって、育種にかける労力を著しく低減することができる。【０００８】  このように、育種における集団作出工程では、形質転換による方法が好ましく用いられている。例えば、モルティエレラ属の菌類が属する糸状菌の形質転換方法については、多くの技術が報告されている。【０００９】  具体的には、（ａ）下記文献１〜３等には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓやＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ等の糸状菌をパーティクルデリバリー法により形質転換する技術が開示されている。これら技術では、形質転換する宿主株としてウラシル要求性株を用いるとともに、それを相補する遺伝子をマーカー遺伝子として用い、形質転換株を選択している。【００１０】  また、（ｂ）上記Ｍ．ａｌｐｉｎａの形質転換方法としては、下記文献４に開示されている技術が知られている。この技術では、胞子をプロトプラスト化し、エレクトロポレーション法によって遺伝子を細胞内に導入している。また、形質転換体のスクリーニングには、マーカー遺伝子として大腸菌由来のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｈｐｔ）を用いている。これにより、ハイグロマイシン含有培地で生育できるものを形質転換体として選択することができる。
［文献１］Ｆｕｎｇａｒｏ  Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｍｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｅｔｔ．，２５，２９３−２９７，１９９５
［文献２］Ｈｅｒｚｏｇ  Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４５，３３３−３３７，１９９６
［文献３］Ａｒｍａｌｅｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１７，９７−１０３，１９９０
［文献４］Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，４６５５−４６６１，２０００
しかしながら、上述した形質転換を利用した技術では、ＰＵＦＡを生産する脂質生産菌の育種を有効かつ効率的に行うことが困難であるという課題を生じている。【００１１】  具体的には、上記（ａ）糸状菌をパーティクルデリバリー法により形質転換する技術を用いる場合、形質転換の対象となる上記Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓやＮ．ｃｒａｓｓａ等の糸状菌類は、脂質生産性が低いため、ＰＵＦＡ等の脂質を工業的に生産させる用途には適していない。【００１２】  これに対して、上記（ｂ）文献４に開示されている技術では、工業的にも利用可能な脂質生産菌として知られているＭ．ａｌｐｉｎａを形質転換する技術である。そのため、上記（ａ）の技術に比べると工業的には優れていると考えられる。【００１３】  ところが、Ｍ．ａｌｐｉｎａに代表されるモルティエレラ属の菌類は全てハイグロマイシン感受性ではない。したがって、この技術を用いて育種を行う場合、宿主となるモルティエレラ属の菌がハイグロマイシン耐性である場合、ハイグロマイシン耐性をマーカーとして用いることができない。【００１４】  ＰＵＦＡの多くは必須脂肪酸であり、生体内で複雑な生理機能に関与するため、近年重要な栄養素として注目されている。それゆえ、より一層効率的にＰＵＦＡを生産する醗酵技術が求められているが、そのためには、脂質生産菌として信頼性の高いモルティエレラ属の菌類を効率的かつ有効に育種する技術が必要となる。【００１５】  本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗生物質によらず、モルティエレラ属に属する脂質生産菌の育種を有効かつ効率的に行うことができる育種方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１６】  本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、脂質生産菌であるモルティエレラ属の菌類の栄養要求性株を取得し、それを相補する遺伝子をマーカー遺伝子として形質転換できる系を確立できれば、モルティエレラ属の菌類全ての株において、効率的かつ有効な形質転換が可能となるとともに、この系を利用すれば、セルフクローニングも可能となり、育種をより一層効率的かつ有効に行い得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】  本発明にかかる脂質生産菌の育種方法は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する脂質生産菌の育種方法であって、上記脂質生産菌の栄養要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子として上記栄養要求性を相補する遺伝子を用いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入する遺伝子導入段階と、上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する選抜段階とを有する形質転換工程を含むことを特徴としている。
【００１８】  上記育種方法においては、上記脂質生産菌は、モルティエレラ  アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ  ハイグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）またはモルティエレラ  クラミドスポラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）であることが好ましく、上記栄養要求性株がウラシル要求性株であることが好ましく、上記マーカー遺伝子として、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子またはオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子が用いられることが好ましい。
【００１９】  また、上記育種方法においては、上記遺伝子導入段階では、エレクトロポレーション法、または、パーティクルデリバリー法を用いることができる。
【００２０】  さらに、上記育種方法においては、原種の脂質生産菌から栄養要求性株を取得する栄養要求性株取得工程を含んでいてもよい。
【００２１】  本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】  本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。【００２３】  本発明では、育種における遺伝的変異を含む集団を作出する工程（集団作出工程）として、栄養要求性をマーカーとした形質転換工程を実施する。具体的には、脂質生産菌であるモルティエレラ属の菌類の栄養要求性株を取得し、これを宿主として、上記栄養要求性を相補する遺伝子を導入（形質転換）する。その後、上記集団から上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する。【００２４】  以下、本発明の対象となるモルティエレラ属の菌類、本発明にかかる育種方法、およびその利用について、それぞれ詳細に説明する。【００２５】  （１）モルティエレラ属の菌類
本発明にかかる育種方法の対象となるモルティエレラ属の菌類としては、特に限定されるものではなく、モルティエレラ属に分類される各種糸状菌を挙げることができる。モルティエレラ属は、ＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａとＭｉｃｒｏｍｕｃｏｒとの２亜属に分けられる。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ亜属の菌は全て、アラキドン酸等の炭素数２０の脂肪酸を生産するが、Ｍｉｃｒｏｍｕｃｏｒ亜属は炭素数１８以下の脂肪酸しか生産しない。本発明の対象となるモルティエレラ属の菌類は上記２亜属の何れであってもよい。【００２６】  モルティエレラ属の菌類としては、具体的には、Ｍ．ａｌｐｉｎａ，Ｍ．ｅｌｏｎｇａｔａ，Ｍ．ｅｘｉｇｕａ，Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ，Ｍ．ｉｓａｂｅｌｉｎａ，Ｍ．ｔｕｒｆｉｃｏｌａ，Ｍ．ｇａｍｓｉｉ，Ｍ．ｃｏｇｉｔａｎｓ，Ｍ．ｃａｐｉｔａｔａ，Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ，Ｍ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ等が知られているが、もちろんこれらに限定されるものではない。中でも、本発明では、脂質生産菌として広く用いられているＭ．ａｌｐｉｎａ（モルティエレラ  アルピナ）を好ましく用いることができる。Ｍ．ａｌｐｉｎａは、アラキドン酸（ＡＲＡ）を始めとしたＰＵＦＡを菌体内に蓄積する株が知られており、ＰＵＦＡの生合成研究用だけではなくＰＵＦＡを生産する工業用にも広く用いられている。【００２７】  上記Ｍ．ａｌｐｉｎａを含むモルティエレラ属の菌類の入手方法は特に限定されるものではなく、財団法人醗酵研究所やＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）等の微生物等寄託機関から入手すればよい。あるいは、特許出願されている株の場合であれば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターから入手することができる。また、自然環境からモルティエレラ属に属する未知の株を、公知のスクリーニング方法により取得して用いてもよい。【００２８】  （２）本発明にかかる脂質生産菌の育種方法
本発明にかかる育種方法は、上記集団作出工程において形質転換を用いる形質転換工程を含むものであればよいが、より好ましくは、栄養要求性株取得工程を含んでいる。もちろん他の工程を含んでいてもよい。以下、各工程について詳細に説明する。【００２９】  ＜栄養要求性株取得工程＞
栄養要求性株取得工程は、原種のモルティエレラ属の菌から栄養要求性株（栄養要求性変異株）を取得する工程であれば特に限定されるものではなく、栄養要求性株を取得するための公知の技術を用いることができる。特に、栄養要求性に関わる遺伝子が明らかであれば（例えば、全ゲノム解読による場合等）、その遺伝子を潰すことで容易に栄養要求性株を取得することが可能となるため、好ましい。【００３０】  栄養要求性株の具体的な種類は特に限定されるものではなく、例えば、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求性株；ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性株；ビタミン要求性株；等を挙げることができる。本発明では、例えば、後述する実施例で説明するように、ウラシル要求性株を用いている。ウラシル要求性株の場合、特に、モルティエレラ属の菌においては５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）耐性というポジティブセレクションをマーカーとしてスクリーニングをかけることができるという利点がある。【００３１】  したがって、栄養要求性株取得工程では、特定の栄養素を欠失した合成培地により成育できない株を取得するだけでもよいが、変異遺伝子を限定するスクリーニングをかけた上で株を取得してもよい。例えば、ウラシル要求性株の取得においては、上記５−ＦＯＡを用いてスクリーニングをかければ、ＵＲＡ３遺伝子またはＵＲＡ５遺伝子に変異が生じたウラシル要求性株を取得することができる。同様に、リジン要求性株の取得においては、アミノアジピン酸を用いてスクリーニングをかければ、ＬＹＳ２遺伝子またはＬＹＳ５遺伝子に変異が生じたリジン要求性株を取得することができる。このように、変異遺伝子を限定した栄養要求性株を取得すれば、後段の形質転換工程に用いるマーカー遺伝子を明確に特定することができるため好ましい。【００３２】  ＜形質転換工程１・遺伝子導入段階＞
形質転換工程は、上述したように、育種における集団作出工程において形質転換を用いる工程であり、遺伝子導入段階と選抜段階との二段階を少なくとも経る工程である。もちろん、必要に応じてこれら以外の段階を経てもよい。【００３３】  本発明における遺伝子導入段階は、モルティエレラ属の菌類（脂質生産菌）の栄養要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子として上記栄養要求性を相補する遺伝子を用いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入する段階であれば特に限定されるものではない。【００３４】  上記マーカー遺伝子としては、栄養要求性株の変異（栄養要求性変異）を相補する遺伝子であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ロイシン要求性株の場合にはｌｅｕ２遺伝子、ヒスチジン要求性株の場合にはｈｉｓ３遺伝子、リジン要求性株の場合にはｌｙｓ２遺伝子、トリプトファン要求性株の場合にはｔｒｐ１遺伝子、ウラシル要求性株の場合には、ｕｒａ３遺伝子またはｕｒａ５遺伝子、アデニン要求性株の場合にはａｄｅ２遺伝子等を挙げることができる。本発明では、例えば、後述する実施例で説明するように、宿主をウラシル要求性株として、マーカー遺伝子として、ｕｒａ５遺伝子を用いている。【００３５】  上記各マーカー遺伝子の取得方法も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて酵母等の異種の（微）生物から取得してもよいし、市販のマーカー遺伝子を利用してもよい。また、本発明では、セルフクローニングが可能であるため、宿主であるモルティエレラ属の菌からマーカー遺伝子を取得してもよい。例えば、後述する実施例では、３種の酵母におけるｕｒａ５遺伝子の塩基配列を利用して、宿主であるＭ．ａｌｐｉｎａからｕｒａ５遺伝子を取得している。【００３６】  上記遺伝子導入段階で用いられる遺伝子導入方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、エレクトロポレーション法、パーティクルデリバリー法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。モルティエレラ属の菌類では、エレクトロポレーション法を用いる場合、菌体をプロトプラスト化しておくことが好ましい。なお、上記パーティクルデリバリー法の具体的な一例としては、パーティクルガン法を挙げることができるが、もちろんこれに限定されるものではない。【００３７】  上記マーカー遺伝子は、発現可能な状態となるようにモルティエレラ属の菌体内に導入されればよいため、その具体的な構成は限定されるものではない。本発明では、少なくともプロモーターをつなげてなる発現カセットが構築され、さらにこの発現カセットに染色体と組み換える領域（組換え領域と称する）がつなげられた遺伝子構築物として構築されていればよい。したがって、上記遺伝子構築物は、ベクター中に挿入された上で、上記宿主に導入されてもよいし、上記遺伝子構築物そのままで導入されてもよい。【００３８】  上記遺伝子構築物に含まれるマーカー遺伝子の発現カセットは、マーカー遺伝子の上流に少なくともプロモーターが連結された構成であればよいが、さらにマーカー遺伝子の下流にターミネーターが連結された構成であることが好ましい。また、上記遺伝子構築物には、上記マーカー遺伝子の発現カセットおよび組換え領域以外に、種々の遺伝子を発現させる発現カセットを導入可能とするために、マルチクローニングサイトが含まれていてもよい。さらに、上記遺伝子構築物には、上記マーカー遺伝子の発現カセット（プロモーター、マーカー遺伝子、ターミネーター）や組換え領域、あるいはマルチクローニングサイト以外のＤＮＡ断片が含まれていてもよく、上記遺伝子構築物のより具体的な構成は特に限定されるものではない。【００３９】  上記各ＤＮＡ断片の具体的な種類も特に限定されるものではない。例えば、プロモーターの場合、マーカー遺伝子を有効に発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。後述する実施例では、ｈｉｓＨ４．１プロモーターを用いているがもちろんこれに限定されるものではない。同様に、ターミネーターの場合も、転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであればよい。後述する実施例では、ｔｒｐＣターミネーターを用いているがもちろんこれに限定されるものではない。さらに、組換え領域の場合、モルティエレラ属の菌体内に導入されるマーカー遺伝子を、染色体内に組み込まれて存在させるＤＮＡセグメントであれば特に限定されるものではない。後述する実施例では、１８ＳリボソームＤＮＡ（１８Ｓｒ）を用いている。【００４０】  上記遺伝子構築物をベクターに組み込んで発現ベクターとする場合も特に限定されるものではなく、一般的な組換え発現ベクターとなっておればよい。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。通常、プラスミドを好ましく用いることができる。【００４１】  ＜形質転換工程２・選抜段階＞
形質転換工程における選抜段階は、上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する段階であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を好適に用いることができる。すなわち、マーカーとなる栄養要求性に基づいて、合成培地中から特定の栄養素を除き、上記遺伝子導入段階の後に得られた形質転換体を合成培地で培養すればよい。これによって、容易かつ効率的に形質転換体をスクリーニングすることができる。【００４２】  このように、本発明では、形質転換工程において栄養要求性をマーカーとして用いている。栄養要求性マーカーは、操作の簡便さ、低いバックグラウンド、宿主としているモルティエレラ属の菌由来の遺伝子が利用できる等の利点がある。また、抗生物質耐性をマーカーとした場合と比較すると、食品開発に都合が良い等の利点もある。【００４３】  具体的には、例えば、背景技術で述べた前記文献４の技術、すなわちハイグロマイシン耐性をマーカーとする場合を例に挙げると、選抜された形質転換体を安定して成育させるためには、培地にハイグロマイシンを添加しておく必要がある。そのため、この形質転換体を用いて生産される脂質にハイグロマイシンが混入する可能性があるが、脂質を食品用途に用いる場合には、ハイグロマイシンの混入は避けるべきものである。【００４４】  ここで、例えば、栄養要求性がウラシル要求性株である場合を例に挙げれば、実生産においてウラシル欠損培地を用いて培養することで、ｕｒａ５遺伝子等の栄養要求性を相補する遺伝子が導入された菌体を選択しながら、脂質を生産することが可能となる。すなわち、栄養要求性をマーカーとすれば、ハイグロマイシンの混入を避けることができる上に、常にセレクションをかけた培養が可能となるという利点もある。それゆえ、本発明のように栄養要求性マーカーを用いることはより好ましい。【００４５】  ＜選抜工程＞
本発明にかかる脂質生産菌の育種方法では、上記形質転換工程において、栄養要求性をマーカーとして、様々な遺伝子を導入することで、様々な性質を示す株の集団を得ることが可能である。それゆえ、本発明では、上記形質転換工程の後に、得られた集団からより望ましい性質を示す品種を選抜する選抜工程を実施してもよい。なお、ここで言う「選抜工程」は、上記形質転換工程における「選抜段階」とは異なり、栄養要求性をマーカーとして形質転換株を選択するのではなく、得られた複数の形質転換株から、より好ましい性質を示す形質転換株を選択する工程を指す。【００４６】  選抜工程の具体的な手法は特に限定されるものではなく、育種の目的に応じて好ましい性質を示す形質転換株を選択できるような条件を設定し、公知の手法に基づいて好ましい形質転換株を選択すればよい。【００４７】  （３）本発明の利用
本発明にかかる脂質生産菌の育種方法は、上記のように、栄養要求性をマーカーとして、遺伝的変異を含む集団からより望ましい性質を示す品種を選抜（スクリーニング）するようになっている。それゆえ、モルティエレラ属に属する脂質生産菌を原種として、新規品種（新規株）を効率的かつ有効に生産することが可能となる。モルティエレラ属の菌は脂質生産菌として良く知られており、Ｍ．ａｌｐｉｎａのように信頼性の高いものも含まれているため、例えば、脂質生産性をより一層高めた株を容易かつ効率的に生産することが可能となる。【００４８】  また、本発明にかかる育種方法では、形質転換を行う脂質生産菌の遺伝子のみを用いて形質転換できるので、セルフクローニングが可能となる。それゆえ、本発明では、原種のモルティエレラ属の菌から適当なＤＮＡ断片を取得してこれを栄養要求性株に導入し、特定の遺伝子の発現調節（高発現、発現時期の調節、発現抑制など）することが可能となり、脂質生産量の増加、生産できる脂質の種類の改変、組成の改変等が可能な形質転換体すなわち新規株を得ることができる。もちろん本発明では、セルフクローニングではなく、他種由来のＤＮＡ断片を栄養要求性株に導入することができることはいうまでもない。【００４９】  本発明にかかる育種方法では、例えばセルフクローニングの場合、原種（宿主）のモルティエレラ属の菌から適当なＤＮＡ断片を取得する方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、ここで言う適当なＤＮＡ断片（例えば、導入したい遺伝子等）は、宿主となるモルティエレラ属の菌において、目的とするより望ましい性質を実現できるＤＮＡ断片、あるいは当該性質を実現できる可能性のあるＤＮＡ断片であれば特に限定されるものではない。【００５０】  このＤＮＡ断片は、上記ｕｒａ５遺伝子と同様に、少なくともプロモーターと、好ましくはターミネーターとも連結することで発現カセットが構築された上で、組換え発現ベクター中に挿入されていればよいが、これに限定されるものではない。後述する実施例では、上記ＤＮＡ断片として、ＧＬＥＬＯ遺伝子を用いているがもちろん本発明はこれに限定されるものではない。【００５１】  以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】  本実施例では、本発明にかかる育種方法の一例として、ウラシル要求性株を取得し、これを形質転換して選抜する具体例について説明する。【００５３】  （１）ウラシル要求性株の取得（栄養要求株取得工程）
Ｍ．ａｌｐｉｎａの胞子を形成させるために、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地（３％スクロース、０．２％ＮａＮＯ３、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＫＣｌ、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％寒天、ｐＨ６．０に調整）に本菌を植菌し、２８℃で約２週間培養した。これをＴｗｅｅｎ８０水溶液（１ｄｒｏｐ／１００ｍｌＨ２Ｏ）で懸濁し、ガラスフィルター（岩城硝子社製、商品番号：３Ｇ１）で菌糸を除去して胞子液を調製した。変異処理は１×１０８〜１０９個の胞子に対し、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＭＮＮＧ）を用いて、Ｊａｒｅｏｎｋｉｔｍｏｎｇｋｏｌらの方法（Ｓ．Ｊａｒｅｏｎｋｉｔｍｏｎｇｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．ＪＡＯＣＳ，６９，９３９−９４４，１９９２）にしたがって行った。【００５４】  変異処理した胞子を１．０ｍｇ／ｍｌの５−ＦＯＡと０．０５ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＧＹ培地（２％グルコース、１％酵母エキス、２％寒天、ｐＨ６．０に調整）に塗布し、２８℃で４日間培養することにより、５−ＦＯＡ耐性株を６株得た。これらの株に対してウラシル要求性の評価を行った。【００５５】  すなわち、ＳＣ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）５．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１．７ｇ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ、アデニン２０ｍｇ、チロシン３０ｍｇ、メチオニン１．０ｍｇ、アルギニン２．０ｍｇ、ヒスチジン２．０ｍｇ、リジン４．０ｍｇ、トリプトファン４．０ｍｇ、スレオニン５．０ｍｇ、イソロイシン６．０ｍｇ、ロイシン６．０ｍｇ、フェニルアラニン６．０ｍｇ／リットル）およびウラシル添加ＳＣ培地（ウラシル５０ｍｇ／リットル）における生育の比較を行った。【００５６】  その結果、６株の５−ＦＯＡ耐性株の全てが、ウラシルを含む培地では親株と同様に生育できたが、ウラシルを含まない培地では生育が悪く、そのうち２株はまったく生育できなかった。これらの株をそれぞれΔｕｒａ−１株、Δｕｒａ−２株と命名した。【００５７】  （２）酵素活性の測定
５−ＦＯＡ耐性かつウラシル要求性という表現系を示す場合、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｕｒａ３遺伝子にコードされる酵素でｕｒａ３ｐと略す）またはオロチジル酸ピロホスホリラーゼ（ｕｒａ５遺伝子にコードされる酵素でｕｒａ５ｐと略す）活性が欠失していることが考えられる。そこで、上記Δｕｒａ−１株およびΔｕｒａ−２株についてこれらの酵素活性を測定した。【００５８】  それぞれの株をウラシル添加ＧＹ培地で２８℃、４日間振とう培養した。菌体の無細胞抽出液の調製は、Ｗｙｎｎらの方法（Ｊ．Ｐ．Ｗｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６，２３２５−２３３１，２０００）を改良して行った。【００５９】  すなわち、０．０５ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＧＹ液体培地で２８℃、４日間培養した菌体を、５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．５）で懸濁した。その後、フレンチプレスを用い３５ＭＰａにて細胞を破砕し、遠心した。得られた上清を無細胞抽出液とした。さらに、１００，０００×ｇ、６０ｍｉｎの条件で超遠心することでオルガネラを除き、可溶性画分を得た。【００６０】  得られた可溶性画分を用いて、ｕｒａ３ｐ活性をＹｏｓｈｉｍｏｔｏらの方法（Ａ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ５１，７４−７９，ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ  １９７８）にしたがって測定した。同じく得られた可溶性画分を用いて、ｕｒａ５ｐ活性をＵｍｅｚｕらの方法（Ｋ．Ｕｍｅｚｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，２４９−２６２，１９７１）にしたがって測定した。その結果すなわちピリミジン生合成に関わる酵素活性の比較を表１に示す。表１の結果から明らかなように、これら２株はどちらも、ｕｒａ３ｐの活性は親株と同程度あったのに対し、ｕｒａ５ｐ活性は全く検出されなかった。【００６１】  さらに、別に調製した１０８〜１０９個の胞子に対して同様の変異処理を行ったところ、５株の５−ＦＯＡ耐性株が得られ、そのうちの３株は、ウラシルを含まない培地ではまったく生育できなかった。【００６２】
【表１】
0004537319.tif 000002
（３）Ｍ．ａｌｐｉｎａのゲノムＤＮＡの取得およびｃＤＮＡライブラリーの作製
Ｍ．ａｌｐｉｎａと、これを原種（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）として誘導したウラシル要求株（上記Δｕｒａ−１株およびΔｕｒａ−２株）をそれぞれＧＹ液体培地で２８℃、５日間培養し、得られた菌体からＳａｋｕｒａｄａｎｉらの方法（Ｅ．Ｓａｋｕｒａｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６０，２０８−２１６，１９９９）にしたがって、ゲノムＤＮＡを調製した。【００６３】  Ｍ．ａｌｐｉｎａの胞子を、液体培地（２％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０に調整）に植菌し、２８℃で４日間培養した。菌体を回収し、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法で全ＲＮＡを調製した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｒｏｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、全ＲＮＡからｍＲＮＡの精製を行い、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品名、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。【００６４】  （４）Ｍ．ａｌｐｉｎａからのｕｒａ５  ｃＤＮＡの取得
３種の酵母Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＳｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａにおけるｕｒａ５ｐのアミノ酸配列について、その相同性の極めて高い二つの領域である次のアミノ酸配列
領域１：ＦＧＰＡＹＫＧＩＰ（配列番号１参照）
領域２：ＫＥＡＫＤＨＧＥＧ（配列番号２参照）
に基づいて、次の塩基配列を有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを合成した。なお、下記のプライマーにおけるＩはイノシンを示している。また、配列表では、イノシンに相当する部位はｎで示している。
センスプライマー：５’−ＴＴＹＧＧＨＣＣＩＧＣＩＴＡＹＡＡＲＧＧＨＡＴＹＣＣ−３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＣＴＣＤＣＣＲＴＧＲＴＣＹＴＴＩＧＣＹＴＣＹＴＴ−３’（配列番号４）
次に、Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー（商品名、Ｂｉｏｍｅｔｒａ社製）によりＭ．ａｌｐｉｎａのゲノムＤＮＡを鋳型として、上記２つのプライマーで、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。このときのＰＣＲ条件は、９４℃で１ｍｉｎ、５２℃で１ｍｉｎ、および７２℃で２ｍｉｎを１サイクルとして３５サイクルの後に７２℃で１０ｍｉｎ伸長させる条件とした。【００６５】  その結果約１３０ｂｐＤＮＡ断片が得られ、このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このＤＮＡ断片は既知のｕｒａ５遺伝子と高い相同性を示した。このＤＮＡ断片をプローブとして、（３）で調製したＭ．ａｌｐｉｎａのｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることにより、Ｍ．ａｌｐｉｎａのｕｒａ５遺伝子のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＭＡＵＲＡ５を得た。【００６６】  なお、ｕｒａ５遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号５に示される塩基配列を有しており、このｕｒａ５遺伝子にコードされているｕｒａ５ｐは配列番号６に示されるアミノ酸配列を有している。【００６７】  （５）ｕｒａ５ゲノムＤＮＡのクローニング
上記ｕｒａ５遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号５）を基に、次に示すプライマーＣＲＯＮ１およびＣＲＯＮ２
プライマーＣＲＯＮ１：ＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＧＴＣＣ（配列番号７）
プライマーＣＲＯＮ２：ＧＡＧＴＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣ（配列番号８）
を合成し、Ｍ．ａｌｐｉｎａのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりｕｒａ５ゲノムＤＮＡをクローニングした。このときのＰＣＲ条件は、９４℃で１ｍｉｎ、５５℃で１ｍｉｎ、および７２℃で２ｍｉｎを１サイクルとして３０サイクルの後に７２℃で１０ｍｉｎ伸長させる条件とした。その結果、ｕｒａ５ゲノム遺伝子上にはイントロンは存在しないことが明らかになった。【００６８】  （６）栄養要求性株における変異部位の特定
上記プライマーＣＲＯＮ１およびＣＲＯＮ２を用い、ウラシル要求性株であるΔｕｒａ−１株およびΔｕｒａ−２株のゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれの株のｕｒａ５ゲノム遺伝子をクローニングした。なお、このときのＰＣＲ条件は、９４℃で１ｍｉｎ、５５℃で１ｍｉｎ、および７２℃で２ｍｉｎを１サイクルとして３０サイクルの後に７２℃で１０ｍｉｎ伸長させる条件とした。その結果、Δｕｒａ−１株では，開始コドンから数えて９３番目の塩基に１塩基のアデニンの挿入があり、ＯＲＦ内でフレームシフトを起こしていた。一方、Δｕｒａ−２株では、３９８番目のグアニンがアデニンに置換されており、モチーフ配列内の１３３番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されていた。これら変異の結果、上記２株はｕｒａ５ｐ活性を失ったことが示唆された。【００６９】  （７）組換え発現ベクター：ｐＤｕｒａ５の構築
プラスミドｐＤ４（Ｄ．Ｂ．Ａｒｃｈｅｒ氏より分譲、前記文献４参照）を制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑化したのち、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子であるｈｐｔｍｏｄ断片を除く５．４ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＰＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。（４）で得られた上記ｐＢＭＡＵＲＡ５を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、末端を平滑化した後、ｕｒａ５  ｃＤＮＡを含む約０．６５ｋｂｐの断片を精製した。これら２つの断片をｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（商品名、東洋紡社製）を用いて連結した。ｕｒａ５遺伝子の方向を確認し、ｕｒａ５遺伝子の５’上流側にｈｉｓＨ４．１プロモーター、３’下流側にｔｒｐＣターミネーターが連結されているものを選択し、プラスミドｐＤｕｒａ５とした。【００７０】  （８）ｐＤｕｒａ５による形質転換（形質転換工程）
形質転換株の選択培地にはＳＣ寒天培地を用いた。宿主となるΔｕｒａ−１株の胞子１０８個をＳＣ寒天培地に塗布した。上記ｐＤｕｒａ５はパーティクルデリバリー法により宿主に導入（形質転換）した。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅパーティクルデリバリーシステム（商品名、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）による遺伝子導入は、ヘリウム圧：７５９０ｋＰａ（１１００ｐｓｉ）、チャンバー内の真空：２８インチＨｇ、ターゲットとの距離３ｃｍ、タングステン粒子径１．１μｍの条件で行った。遺伝子導入後、２８℃で２〜３日間培養すると４個のコロニーが生育してきたので、これらを形質転換株として取得した。なお、便宜上、これらの形質転換株に対して＃１〜＃４の番号を付与した。【００７１】  形質転換株＃１〜＃４に遺伝子が導入されているか否かをＰＣＲにて確認した。すなわち、それぞれの形質転換株よりゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型として、次に示すプライマーＲＤＮＡ１およびＲＤＮＡ２
プライマーＲＤＮＡ１：ＡＣＡＧＧＴＡＣＡＣＴＴＧＴＴＴＡＧＡＧ（配列番号９）
プライマーＲＤＮＡ２：ＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧ（配列番号１０）
と、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。このときのＰＣＲ条件は、９４℃で１ｍｉｎ、５４℃で１ｍｉｎ、および７２℃で１ｍｉｎを１サイクルとして３５サイクルの後に、７２℃で１０ｍｉｎ伸長させる条件とした。なお、コントロールとして、Δｕｒａ−１株についても同様にしてＰＣＲにて確認した。【００７２】  その結果、宿主としたΔｕｒａ−１株では、ＤＮＡの増幅が見られなかったのに対し、形質転換株＃１〜＃４では何れも１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。このことから、上記＃１〜＃４の１８ＳｒＤＮＡ領域でプラスミドｐＤｕｒａ５と組換えが生じてｕｒａ５遺伝子が導入されていることが確認できた。【００７３】  さらに、上記形質転換株＃１〜＃４をＳＣ液体培地中で、２８℃４日間振とう培養し、ｕｒａ５ｐ酵素活性を測定した。その結果すなわちｕｒａ５ｐ酵素活性の比較を表２に示す。表２の結果から明らかなように、形質転換株＃１〜＃４では野生株（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）と同程度もしくは数倍の活性を回復しており、導入したｕｒａ５遺伝子が有効に機能していることが示された。【００７４】
【表２】
0004537319.tif 000003
さらに、Δｕｒａ−１株の胞子約１０８個に対して、同様の遺伝子導入操作を別途２回行い、２８℃で２〜３日間培養したところ、それぞれ、３個および４個のコロニーが生育しており、形質転換に再現性があることが確認された。
【実施例２】
【００７５】  本実施例では、上記実施例１において構築されたウラシル要求性株を利用した育種方法を用いて、新規な株であるＧＬＥＬＯ遺伝子導入株を創出する例について説明する。【００７６】  （１）ｐＤｕｒａ５ＧＬＥＬＯベクターの構築
γ−リノレン酸をジホモγ−リノレン酸とする脂肪酸鎖長酵素をコードするＧＬＥＬＯ遺伝子は、Ｊ．Ｍ．Ｐａｒｋｅｒ−Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７（１５），８２８４−８２８９，２０００に記載されている配列ＧＢのＩＤ：ＡＦ２０６６６２の塩基配列に基づいて、Ｍ．ａｌｐｉｎａのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより増幅することにより取得した。このとき、次に示すプライマーＭＡＧＬＥＬＯ１およびＭＡＧＬＥＬＯ２を用いた。
プライマーＭＡＧＬＥＬＯ１：ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＴＣＣ（配列番号１１）
プライマーＭＡＧＬＥＬＯ２：ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣ（配列番号１２）
増幅したＧＬＥＬＯ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し約１ｋｂの断片を得た。また、ｐＤ４を制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し約７．７ｋｂの断片を得た。上記各断片をｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（商品名、東洋紡社製）を用いて連結し、プラスミドｐＤＧＬＥＬＯを得た。【００７７】  一方、ｐＤｕｒａ５をＥｃｏＲＩで部分消化し、２箇所あるＥｃｏＲＩサイトのうち１箇所のみで切断された約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。この断片をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｏｎｇ  Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）によって末端を平滑化した後、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（商品名、東洋紡社製）によりセルフライゲーションさせ、ヒストン４．１プロモーターの５’上流側となるサイトのみが残ったものを選択し、ｐＤｕｒａ５’とした。また、上記ｐＤＧＬＥＬＯをＥｃｏＲＩで消化して２．７ｋｂの断片を得て、これを上記ｐＤｕｒａ５’のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。その中から、ＧＬＥＬＯ発現カセットおよびｕｒａ５発現カセットが同じ方向に並んでいるプラスミドを選択し、これを組換え発現ベクターｐＤｕｒａ５ＧＬＥＬＯとした。【００７８】  （２）ｐＤｕｒａ５ＧＬＥＬＯによる形質転換（形質転換工程）
実施例１の（８）と同じ方法により、Δｕｒａ−１株を形質転換し、形質転換株を３株取得した。なお、便宜上、これらの形質転換株に対して＃５〜＃７の番号を付与した。【００７９】  これら形質転換株＃５〜＃７にｐＤｕｒａ５ＧＬＥＬＯが導入されているか否かを、実施例１の（８）と同じく、プライマーＲＤＮＡ１およびＲＤＮＡ２を用いてＰＣＲにて確認した。その結果、３株とも１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。このことから、これら３株の１８ＳｒＤＮＡ領域でｐＤｕｒａ５ＧＬＥＬＯと組換えが生じてｕｒａ５遺伝子が導入されていることが確認できた。【００８０】  （３）ＧＬＥＬＯ遺伝子の発現解析
実施例１で創出した２種類のｕｒａ５遺伝子導入株＃１・＃２と、上記（２）で取得したＧＬＥＬＯ遺伝子導入株＃５〜＃７（脂質分析を行ったものと同様の培養条件の菌体）から、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ランダムヘキサマーをプライマーとして逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡのうち１μｌ（１／２０量）を鋳型として、次に示すプライマーＭＡＧＬＥＬＯ５およびＭＡＧＬＥＬＯ６
プライマーＭＡＧＬＥＬＯ５：ＣＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡ（配列番号１３）
プライマーＭＡＧＬＥＬＯ６：ＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＡ（配列番号１４）
と、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。このときのＰＣＲ条件は、９４℃で１ｍｉｎ、５５℃で１ｍｉｎ、および７２℃で２ｍｉｎを１サイクルとして２０サイクルの後に、７２℃で１０ｍｉｎ伸長させる条件とした。【００８１】  得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、約３００ｂｐのフラグメントのバンドについて、その蛍光濃度を比較した。その結果、ｕｒａ５遺伝子導入株では２株ともバンドの蛍光濃度が非常に薄かったのに対して、ＧＬＥＬＯ遺伝子導入株は３株とも明確な濃度のバンドを確認することができた。一方、ＰＣＲを同様に３０サイクルで行った場合には、何れの株においても明確な濃度のバンドを検出することができた。このことから、ＧＬＥＬＯ遺伝子導入株では、ＧＬＥＬＯ遺伝子の発現量が増加していることが示唆された。【００８２】  （４）ＧＬＥＬＯ遺伝子導入株の脂質分析
実施例１で創出した２種類のｕｒａ５遺伝子導入株＃１・＃２と、上記（２）で取得したＧＬＥＬＯ遺伝子導入株＃５〜＃７の胞子を、それぞれ液体培地（５％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０に調整）に植菌し、２８℃で７日間振とう培養した。培養後、菌体を濾過により集めて乾燥し、秤量した。塩酸メタノール法により菌体内の脂肪酸残基をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去して得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。得られた結果、すなわち、上記各遺伝子導入株（形質転換体）を成育したときの乾燥菌体重量と、各株の菌体内における脂肪酸組成と総脂質生産量とを表３に示す。【００８３】  なお、表中の１６：０はパルミチン酸を示し、１８：０はステアリン酸を示し、１８：１がオレイン酸を示し、１８：２がリノール酸を示し、１８：３がγ−リノレン酸を示し、２０：３がジホモ−γ−リノレン酸を示し、２０：４がアラキドン酸を示し、２４：０がリグノセリン酸を示す。【００８４】
【表３】
0004537319.tif 000004
表３の結果から明らかなように、ＧＬＥＬＯ遺伝子を導入することにより、乾燥菌体重量が増加し、総脂肪酸中に占めるジホモ−γ−リノレン酸およびアラキドン酸の割合が増加するとともに、γ−リノレン酸の割合が減少した。また、総脂質生産量、総脂質含量も増加し、さらに、ジホモ−γ−リノレン酸およびアラキドン酸の生産量および含量も増加した。鎖長延長反応の生成物であるジホモ−γ−リノレン酸とその基質であるγ−リノレン酸との比（２０：３／１８：３比）、あるいは、ジホモ−γ−リノレン酸の代謝物であるアラキドン酸も合計したものとγ−リノレン酸との比（（２０：３＋２０：４）／１８：３比）は、ＧＬＥＬＯ遺伝子導入株において顕著に大きな値を示した。
【実施例３】
【００８５】  本実施例では、Ｍ．ａｌｐｉｎａ以外のモルティエレラ属の菌について、本発明にかかる育種方法を適用した具体例について説明する。【００８６】  （１）ウラシル要求性株の取得（栄養要求株取得工程）
Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａおよびＭ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａの胞子を形成させるために、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地（３％スクロース、０．２％ＮａＮＯ３、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＫＣｌ、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％寒天、ｐＨ６．０に調整）にこれらの菌をそれぞれ植菌し、２８℃で約２週間培養した。これをＴｗｅｅｎ８０水溶液（１ｄｒｏｐ／１００ｍｌ  Ｈ２Ｏ）で懸濁し、ガラスフィルター（岩城硝子社製、商品番号：３Ｇ１）で菌糸を除去して胞子液を調製した。変異処理は１×１０８〜１０９個の胞子に対し、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＭＮＮＧ）を用いてＪａｒｅｏｎｋｉｔｍｏｎｇｋｏｌらの方法（Ｓ．Ｊａｒｅｏｎｋｉｔｍｏｎｇｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．ＪＡＯＣＳ，６９，９３９−９４４，１９９２）にしたがって行った。【００８７】  変異処理した胞子を１．０ｍｇ／ｍｌの５−ＦＯＡと０．０５ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＧＹ培地（２％グルコース、１％酵母エキス、２％寒天、ｐＨ６．０に調整）に塗布し、２８℃で４日間培養して生育できる５−ＦＯＡ耐性株を、Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａから２株、Ｍ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａから１株得た。これらの株に対してウラシル要求性の評価を行った。【００８８】  すなわち、ＳＣ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）５．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１．７ｇ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ、アデニン２０ｍｇ、チロシン３０ｍｇ、メチオニン１．０ｍｇ、アルギニン２．０ｍｇ、ヒスチジン２．０ｍｇ、リジン４．０ｍｇ、トリプトファン４．０ｍｇ、スレオニン５．０ｍｇ、イソロイシン６．０ｍｇ、ロイシン６．０ｍｇ、フェニルアラニン６．０ｍｇ／リットル）およびウラシル添加ＳＣ培地（ウラシル５０ｍｇ／リットル）における生育の比較を行った。【００８９】  その結果、得られた５−ＦＯＡ耐性株すべてが、ウラシルを含む培地では親株と同様に生育できたが、ウラシルを含まない培地では生育が悪く、そのうちＭ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａの１株（ＭＨ−Δｕｒａ−１と命名）、Ｍ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａの１株（ＭＣ−Δｕｒａ−１と命名）はまったく生育できなかった。【００９０】  （２）酵素活性の測定
上記の２株をウラシル添加ＧＹ培地で２８℃、４日間振とう培養した。菌体の無細胞抽出液の調製は、Ｗｙｎｎらの方法（Ｊ．Ｐ．Ｗｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６，２３２５−２３３１，２０００）を改良して行った。【００９１】  すなわち、０．０５ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＧＹ液体培地で２８℃、４日間培養した菌体を、５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．５）で懸濁した。その後、フレンチプレスを用い３５ＭＰａにて細胞を破砕し、遠心した。得られた上清を無細胞抽出液とした。さらに、１００，０００×ｇ、６０ｍｉｎの条件で超遠心することでオルガネラを除き、可溶性画分を得た。【００９２】  得られた可溶性画分を用いて、オロチジル酸ピロホスホリラーゼ（ｕｒａ５ｐ）活性を、Ｕｍｅｚｕらの方法（Ｋ．Ｕｍｅｚｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，２４９−２６２，１９７１）にしたがって測定した。その結果、いずれの株でもｕｒａ５ｐ活性は検出限界以下であった。【００９３】  （３）ｐＤｕｒａ５による形質転換（形質転換工程）
Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ  ＭＨ−Δｕｒａ−１またはＭ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ  ＭＣ−Δｕｒａ−１をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地に植菌し、２８℃で２週間培養して胞子を形成させた。上記（１）に記載のとおり胞子を回収した。【００９４】  形質転換株の選択培地にはＳＣ寒天培地を用いた。ｐＤｕｒａ５はパーティクルデリバリー法により宿主に導入（形質転換）した。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅパーティクルデリバリーシステム（商品名、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）による遺伝子導入は、ヘリウム圧：７５９０ｋＰａ（１１００ｐｓｉ）、チャンバー内の真空：２８インチＨｇ、ターゲットとの距離３ｃｍ、タングステン粒子径１．１μｍの条件で行った。遺伝子導入後、２８℃で２〜３日間培養すると、それぞれ十数個のコロニーが生育してきたので、これらを形質転換株として取得した。【００９５】  なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【００９６】  本発明にかかる脂質生産菌の育種方法は、上記のように、上記脂質生産菌の栄養要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子として上記栄養要求性を相補する遺伝子を用いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入（遺伝子導入段階）し、上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜（選抜段階）する形質転換工程を含む構成である。それゆえ、モルティエレラ属に属する脂質生産菌を原種として、新規品種（新規株）を効率的かつ有効に生産することが可能となるという効果を奏する。また、本発明では、セルフクローニングが可能となるため、原種のモルティエレラ属の菌から適当なＤＮＡ断片を取得してこれを栄養要求性株に導入し、特定の遺伝子の発現調節（高発現、発現時期の調節、発現抑制など）することが可能となり、脂質生産量の増加、生産できる脂質の種類の改変、組成の改変等が可能な形質転換体すなわち新規株を得ることができるという効果を奏する。【００９７】  モルティエレラ属の菌は脂質生産菌としてよく知られており、Ｍ．ａｌｐｉｎａのように信頼性の高いものも含まれている。それゆえ、本発明を用いれば、例えば、脂質生産性をより一層高めた株を容易かつ効率的に生産することができる等の効果を奏する。【００９８】  したがって、本発明は、モルティエレラ属の菌類を利用する各種醗酵技術に関わる産業や、当該醗酵技術を用いた食品産業、医薬品産業等に利用することが可能である。
【配列表】
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