(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外に取り出した哺乳動物の細胞へ物質を輸送するメソ多孔性ケイ素を使用することを含む該細胞へ物質を移送する方法。
【請求項２】
再吸収性又は生物浸食性のメソ多孔性ケイ素を使用することを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも一部の領域にメソ多孔性ケイ素を含む顕微針を使用することを含む、請求項１又は請求項２のいずれかの方法。
【請求項４】
少なくとも針のチップにメソ多孔性ケイ素を有することを含む、請求項３の方法。
【請求項５】
少なくとも顕微針の長さの部分が(i)メソ多孔性ケイ素の被覆を有するか又は(ii)実質的に完全にメソ多孔性ケイ素で製造された顕微針を使用することを含む、先の請求項１ないし請求項４のいずれかの方法。
【請求項６】
少なくとも一部にメソ多孔性ケイ素を含む顕微針の配列を使用することを含む、先の請求項１ないし請求項５のいずれかの方法。
【請求項７】
顕微針が中空でかつメソ多孔性ケイ素を含み、物質が該中空部に供給され又は該中空部を通って移送される顕微針又は顕微針の配列を使用することを含む、先の請求項１ないし請求項６のいずれかの方法。
【請求項８】
配列が支持体から伸びる複数の針を含み、該針が実質的に完全に、又は少なくとも一部にメソ多孔性ケイ素を含み、かつそれぞれの針がその基部からそのチップまで流体を輸送するのに適した流体移送手段を有し、かつ流体供給手段が流体輸送手段と結合しかつ該針の基部に注入すべき流体を供給する、顕微針の配列を使用する、先の請求項１ないし請求項７のいずれかの方法。
【請求項９】
針が中央の内腔を有さずかつ微小孔開け装置を有し、メソ多孔性ケイ素が該針に備えられており、該メソ多孔性ケイ素が輸送されるべき物質を保持している、請求項３ないし請求項８のいずれかの方法。
【請求項１０】
貯蔵装置又は溝から針の表面に設けた物質送達領域まで伸びる孔のネットワークを一の針又は複数の針に備えたことを含む、請求項１ないし請求項９のいずれかの方法。
【請求項１１】
孔のネットワークがメソポアのネットワークである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
メソ多孔性ケイ素の微粒子銃用小球を使用することを含む、請求項１又は請求項２のいずれかの方法。
【請求項１３】
物質が結合したメソ多孔性ケイ素を使用すること、及び他の物質と共−沈殿するのに適した形でメソ多孔性ケイ素を提供して細胞に取り込まれる共−沈殿物を形成することを含む請求項１又は請求項２の方法。
【請求項１４】
共−沈殿物としてリン酸カルシウムを使用することを含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
少なくとも一部にメソ多孔性ケイ素を含む電気的に生物活性な電極を使用すること、及びエレクトロポレーシスを使用して物質を細胞へ輸送することを含む、請求項１又は請求項２のいずれかの方法。
【請求項１６】
細胞が電極に接着する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
物質がＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの断片、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの構成物を含む、先の請求項１ないし請求項１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
多孔性ケイ素を含む顕微針又は微小孔開け装置。
【請求項１９】
ダクトを有する請求項１８の顕微針。
【請求項２０】
ダクトが針の基部領域から針のチップまで伸びる、請求項１９の顕微針。
【請求項２１】
少なくとも針の一部が実質的に完全に多孔性ケイ素で製造されている、請求項１８ないし請求項２０のいずれか一の顕微針。
【請求項２２】
少なくとも針の一部が多孔性ケイ素の表面層を含む、請求項１８ないし請求項２１のいずれかの顕微針。
【請求項２３】
孔又は細管のネットワークを備えている、請求項１８ないし請求項２２のいずれか一の顕微針。
【請求項２４】
細胞に輸送するのに適した物質をさらに含む、請求項１８ないし請求項２３のいずれか一の顕微針又は微小孔開け装置を有する針の配列。
【請求項２５】
物質が多孔性ケイ素によって針に担持されるか又は保持される、請求項２４の針。
【請求項２６】
再吸収可能か若しくは生物学的に吸収可能な、又は少なくとも一部が再吸収可能か若しくは生物学的に吸収可能な、請求項１８ないし請求項２５のいずれか一の針。
【請求項２７】
顕微針が請求項１８ないし請求項２６のいずれかである、支持体から伸びる顕微針の配列。
【請求項２８】
少なくとも一部にメソ多孔性ケイ素を含み、かつ細胞へ移送される材料を含む、材料を哺乳動物の細胞へ移送するための細胞に入る担体。
【請求項２９】
顕微針若しくは微小孔開け装置又は微粒子銃用小球を含む、材料を哺乳動物の細胞へ移送するための細胞に入る担体であって、該顕微針又は微小孔開け装置は少なくとも一部に多孔性ケイ素及び細胞へ移送される材料を含み、該微粒子銃用小球は少なくとも一部に多孔性ケイ素及び細胞へ移送される材料を含む、担体。
【請求項３０】
メソ多孔性ケイ素が再吸収可能である、請求項２８の担体。
【請求項３１】
ケイ素が再吸収可能である、請求項２９の担体。
【請求項３２】
メソ多孔性ケイ素を含む微粒子銃用の小球を含む、請求項２８又は請求項３０の担体。
【請求項３３】
多孔性ケイ素を含む微粒子銃用の小球を含む、請求項２９又は請求項３１の担体。
【請求項３４】
微粒子銃用の小球が実質的に完全にメソ多孔性ケイ素で製造されている、請求項３２に記載の担体。
【請求項３５】
微粒子銃用の小球が実質的に完全に多孔性ケイ素で製造されている、請求項３３に記載の担体。
【請求項３６】
多孔性ケイ素がメソポアのケイ素である、請求項３３又は３５の担体。
【請求項３７】
細胞へ取り込まれる共−沈殿物質と使用時に共−沈殿する物質を担体が含む、請求項３０ないし請求項３３のいずれか１項の担体。
【請求項３８】
導電性の生物活性な多孔性ケイ素電極を含む、請求項３０ないし請求項３３のいずれか１項の担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、材料を細胞へ移送する手段に関し、顕微針の配列にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子操作のために細胞へ移送すべき材料、例えば核酸又は核酸の構成物、例えばベクター又はプラスミド等を細胞へ移送する必要がある場合が多数ある。さらに、化学物質、例えばヌクレオチド又はストレイン（strain）、及び細胞の生理機能に作用する化学物質を細胞へ移送する必要もある。細胞へ材料を運搬するための化学的、機械的方法が多数開発されてきた。これらの技術には以下のものがある：
１．直接的なマイクロインジェクション−針を細胞へ挿入し、針を通して材料を注入する；
２．エレクトロポレーション−高電圧の衝撃を適用していくつかの分子が細胞膜を透過するようにする；
３．微粒子銃−タングステン又は金の粒子を導入することが望ましい物質で被覆して細胞へ射出する；
４．リン酸カルシウム共沈殿−細胞がリン酸カルシウムを吸収し、ＤＮＡ／他の材料がリン酸カルシウムと共沈殿する場合はそれも細胞に取り込まれる；
５．仲介トランスフォーメーション（リポソーム、ウイルス又は細菌のベクターを介して）；及び
６．プロトプラストトランスフォーメーション。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、細胞へ物質を移送する場合に補助する新規な材料を使用することである。
本発明の他の目的は、少量の物質を提供する改良方法を提供することである。
直接的なマイクロインジェクションは、顕微針によってＤＮＡを直接個々の細胞の核に挿入することである。１０−８〜１０−７μlの材料、典型的にはＤＮＡ断片の溶液を細胞核に注入するのに、マイクロマニュピレーターに結合したガラスの微量ピペットを使用する。“ヒット（Hits）”は操作者にかなりの専門技術があればほとんど信頼することができるが、この技術は面倒でかつ多数の細胞に適用することができない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
第一の観点に従うと、本発明は物質を細胞へ移送する方法を含む。
好ましくは再吸収性又は生体浸食性の多孔性ケイ素を使用する。
ある態様では、少なくともある領域が多孔性ケイ素を含む顕微針を使用し又は該顕微針の配列を使用する。
第二の観点に従うと、本発明は多孔性ケイ素を含む顕微針（又は顕微針の配列）を含む。
第三の観点に従うと、本発明は、材料を細胞へ移送する担体を含み、該担体は少なくとも一部に多孔性ケイ素及び細胞へ移送すべき材料を含んでいる。
好ましくは多孔性ケイ素は再吸収可能である。担体は多孔性ケイ素の微粒子銃用小球（biolistic bullet）を含むことができる。担体は、細胞に取り込まれる共−沈殿性の物質と使用時に共−沈殿する物質を含むことができる。担体は、電気伝導性で生物活性の多孔性ケイ素電極を含むことができる。
第四の観点に従うと、本発明は、生細胞へ材料を移送するための移送媒体として多孔性ケイ素を使用することを含む。
【０００５】
【発明の実施の形態】
多孔性ケイ素は生体適合性であることが見出され、また、重大な有害作用を生じることなく哺乳動物の体内で腐食され、又は体内に再吸収され得ることが見出された。多孔性ケイ素を使用すると生物学的材料（又は細胞へ導入すべきすべての物質）を配置しかつ実質的に不動化することができ、かつ該物質は細胞中に入った場合には細胞ＤＮＡと結合できるように自由になるか又は作用を持つように放出される。
ＰＣＴ特許出願のＷＯ ９６／１０６３０号から、微細加工したバルクケイ素のとげ又はチップ（tips）の配列及びそれらを使用して多数の細胞の原形質膜に同時に孔を開けることが公知である。これは単一の針で単一の細胞に孔を開けるより効率的であり、単一の針を使用することは数百の細胞に材料を導入すべき必要がある場合には操作が面倒になる。ＷＯ ９６／１０６３０号のチップを洞察力を持って理解すれば、孔を開けた細胞に材料（例えばＤＮＡ）を移送する場合には、考えられるほど有効ではない。例えば該文献は、密接に配置したチップの間の表面張力を利用して細胞に導入すべき生物学的材料をチップの間の空間に保持すること及びそれをチップ（プローブ）と基体の間に捕捉することを提案している。
【０００６】
１９９３年に発行された米国特許第５，２６２，１２８号はある提案をしており、そこではリガ法（Liga Processes）を使用するケイ素針の配列を製造することを当業者に教示している。この文献はその出願時（及び発行時）に実施できないものであり、この理由から本発明の新規性に対して不利益とならないと考えられる。本出願がされた１９８９年及びそれが発行された１９９３年には、そこに述べられている技術を使用してそこに述べられている中央の内腔を有する非常に薄いケイ素の針を通常の専門知識を有する当業者は製造することができなかった。リガ法は中空の針をケイ素で製造するには適していなく、かつ傾斜を付けた構造とすることはできない。
米国特許第５，４５７，０４１号は、ギザギザのチップを有するケイ素から製造した固形の針の配列を開示している。
米国特許第５，５９１，１３９号は、シリコンウェハーの平板において製造したケイ素の顕微針を開示している。
【０００７】
１９９８年６月２２日にリリースされたことが明らかなウェブサイト上の論文www.gtri.gatech.edu/res-news/NEEDLES.htnl of Georgia Tech.は、ケイ素から固形の針の配列を製造することを述べており、未知のまだ特定されていない技術によって中空の針を製造する希望が表明されている。米国特許第４，９６９，４６８号は、神経と電気的に接触する固形の金属針を述べている。
他の観点に従うと本発明は、多孔性ケイ素から製造する細胞貫通体又は微小孔開け装置を含む。
細胞貫通体は、細胞中に導入すべき物質を多孔性ケイ素で担持するのに適している。
他の観点に従うと本発明は、多孔性ケイ素を少なくとも一部の領域に含む細胞貫通体又は微小孔開け装置を含む。好ましくは物質はＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの断片、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの構成物を含む。
【０００８】
細胞貫通体又は微小孔開け装置は好ましくは細胞に導入すべき物質を多孔性ケイ素で担持するのに適している。
多孔性ケイ素の領域は、チタンのような生物不活性物質を提供した場合の固定化に比べて物質（例えばＤＮＡ）を固定化するのに適している。多孔性ケイ素の領域は、細胞貫通体又は微小孔開け装置のチップにあることが好ましい。細胞貫通体又は微小孔開け装置は、中央の内腔を有しないチップ又はとげであることができ、又は中央の溝を有する針であることができる。細胞貫通体又は微小孔開け装置は、貯蔵器又は溝から細胞貫通体又は微小孔開け装置の表面に設けた物質送達領域へ広がる孔のネットワークを有することができる。
細胞貫通体又は微小孔開け装置は多孔性ケイ素の被覆を有することができ、又はその断面全体が多孔性であってもよく、少なくともそのチップ（又は他の物質送達領域がチップでない場合は該領域）において多孔性であることができる。使用時に細胞に貫通する細胞貫通体又は微小孔開け装置の実質的にすべての外部表面が多孔性ケイ素を含むことができる。細胞貫通体又は微小孔開け装置は多孔性ケイ素の被覆を有するバルクのケイ素のマイクロチップであることができる。
【０００９】
細胞に導入すべき物質を溝／チップの間の空間に物質を保持する代わりに、該物質を細胞貫通体又は微小孔開け装置自体に保持することの利点は、材料が細胞に明確に導入されることであり、典型的には細胞に深く導入されることである。このことにより操作の成功率を増大させることができる（多くの場合、細胞にＤＮＡを導入すること及びＤＮＡ／断片の安定な取込は統計的に成功率が高くはなく−数パーセントが成功するだけであり、このことが多数の細胞に注入しなければならない理由となっている）。
材料をチップに固定するため／少なくともいくらかの材料がチップに存在することを確実にするために多孔性ケイ素を使用する代わりに、他の保持手段を使用することができる。例えば、多結晶ケイ素は粒界においていくつかの物質を保持することができる。保持手段は多孔性材料を含むことができる。
貫流型ゲノセンサー（genosensor）の分野では、ＤＮＡ断片を大きな多孔性ケイ素中で固定化することが公知である（Advances in Genosensor Research. K.L. Beattie外、Clin. Chem. 41, 700(1995)）。
【００１０】
多孔性ケイ素の利点は、その孔径及び空隙率を制御することによってその生物活性を変化させることが可能なことである。従って、特定の所望の分子又は物質を保持し／固定化する特製の孔をもつ多孔性チップを有する細胞貫通体又は微小孔開け装置を製造することが可能である。チップが細胞に入ったときに少なくともいくらかの材料が離脱できないほどには物質が固定化されないのは当然である。
ケイ素から小規模の装置を製造するための微細加工技術において、例えばエレクトロニクス工業において細胞貫通体又は微小孔開け装置用の材料の選択が存在するという大きな利点を多孔性ケイ素は有している。
ケイ素構造多孔体の製造方法は公知である（例えば米国特許第５，３４８，６１８号を参照されたい。この内容を本明細書に参考として取り込む）。
細胞貫通体又は微小孔開け装置の配列を提供することができる。本配列は好ましくはｎ×ｍの微小孔開け装置の二次元配列である。微小孔開け装置を好ましくは通常格子模様に配置するが、そうである必要はない。
【００１１】
完全に異なる目的−真空マイクロエレクトロニクスの適用において使用する電界放射カソードのためのマイクロチップの配列を有することも公知である。ここで、５mm角のケイ素チップは典型的には、選択した製造パラメーターに依存しつつ、チップの幅が５０mm〜１μmかつ高さが１０〜１００μmであるピラミッド状のマイクロチップを約５００個含む。洞察力をもってすれば、これらは多孔化するのに適しており、次いで物質を細胞に移送するための微小孔開け装置として使用することが理解できる。多孔性ケイ素のピラミッド状カソードも公知である−例えば、Field emission from pyramidal cathodes covered in porous silicon. P.R. Wilshaw外, J. Vac. Sci. Techn. B12,1 (1994)；Fabrication of Si field emitters by forming porous silicon. D. Kim外, J. Vac. Sci. Techn. B14, 1906 (1996)；及びPorous silicon field emission cathode development. J.R. Jessig外, J. Vac. Sci. Techn. B14, 1899 (1996)。しかしながら、これらはすべて異なる分野のものであり、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は細胞に導入すべき他のいずれの物質を保持した微小孔開け装置を、いずれも示していない。
【００１２】
第三の観点に従うと、本発明は、一又は複数の微小孔開け装置の射出機を製造すること及び該射出機のチップに又はその近くに物質保持装置を提供することを含む、微小孔開け装置を製造する方法を含む。
好ましくは本方法は、射出機の少なくとも一部を多孔性にすることを含む。好ましくは本方法は、射出機のチップを多孔性にすること又は該チップの実質的にすべての外延部分を多孔性にすること、又はチップに多孔性の被覆を提供することを含む。好ましくはチップはＨＦ陽極化（anodising）技術を使用して多孔性とする。
他の観点に従うと、本発明は、微小孔開け装置のチップ部分に材料を結合させ、かつ該微小孔開け装置で細胞に孔を開けることを含む、材料を細胞に移送する方法を含む。
好ましくは本方法は、材料をチップ部分に又はその近くに配置するのに多孔性ケイ素を使用することを含む。
【００１３】
さらなる観点に従うと、本発明は、微小孔開け装置のチップ部分に遺伝子材料を結合させ、該微小孔開け装置で細胞に孔を開けて細胞に遺伝子材料を入れることを含む細胞の遺伝子操作方法を含む。次いで遺伝子材料が細胞に安定的に取り込まれる。
他の観点に従うと、本発明は、支持体から伸びている複数の針を含む顕微針の配列を含み、該針のそれぞれは配列の基体からそのチップへ流体を輸送するのに適した流体を輸送する手段を有し、また流体輸送手段と結合し、かつ針の基体に注入すべき流体を供給するのに適した流体供給手段を有している。
好ましくは、顕微針の配列をケイ素から製造する。例えばシリコンウェハーからそれを微細加工することができる。
流体輸送手段は貯蔵装置を含むことができ、これを針の下に伸ばすことができる。支持体は下部部分、上部部分、及び上部部分と下部部分の間に伸びる溝又は貯蔵装置を有することができ、針を上部部分に配置し、流体輸送手段は貯蔵装置又は溝まで延びることができる。
【００１４】
流体輸送手段は、それぞれの針に内腔又は巨大孔を含むことができ、これは一般に針の中心に向けてその長手方向に延びている。そうでない場合又は付加的に、流体輸送手段は孔又は細管のネットワーク、例えば複数のメソポア（mesopores）を含むことができる。
針の配列を集積したケイ素のチップ上に置くことができ、配列はチップ上に配置したセンサーも有することができ、該センサーは好ましくはその場でのトランスフェクション工程の監視を可能にする。例えば、光エミッター／ディテクターをＤＮＡと結合した光放出マーカー（例えば蛍光体）と結合させて使用することができる。チップに配置した動力供給及び／又は操作回路、及び／又は制御回路を有することもできる。光放出装置及び光検出器の配列により、トランスフェクションの工程の監視が高度に空間的な解像度で可能となる。
【００１５】
他の観点に従うと、本発明は、顕微針又は顕微針の配列の製造方法を含み、該方法はバルクのケイ素ウェハーを取って針又は針の配列を製造し、また針の基体又はそれぞれの針からそのチップへ延びる流体移送手段を製造する方法を含む。
好ましくは、針の基体又はそれぞれの針からそのチップへ孔のネットワークを提供することを含む。孔は大きな孔又はメソポアであることができ、ある適用では微小孔であることができる（しかし大きな孔であることが好ましい）。
針又はそれぞれの針をフォトリソグラフィーの技術、例えば異方性エッチング及びフォトレジストリソグラフィーの技術を使用して製造することができる。
ケイ素物質は０．１〜１０Ωcmの範囲の抵抗性を有するｎ−型の物質であることができる。
針又は針の配列は例えば非−伝導性マスクを使用してプレーナー処理することができる。
【００１６】
プレーナー処理した配列を次いでチップだけを曝すように、例えば酸素プラズマ処理及びＨＦ浸漬してチップだけを曝すように処理する。プレーナー処理した配列も充填するすることができる。次いでチップを陽極処理してチップからウェハー裏面まで孔を形成することができる。チップの配列を配置したウェハーを次いで他の裏打ち材に結合することができ、チップを有するウェハーと裏打ち材の間に溝又は貯蔵器を形成するように成形することができる。
さらなる観点に従うと、本発明は、細胞に材料を輸送するための担体を含み、該担体は少なくとも一部に再吸収性の材料を含む。
好ましくは担体は再吸収性のケイ素、例えば多孔性ケイ素又は多結晶性ケイ素を含む。担体の全体又はその一部のみを再吸収性の材料で製造することができる。担体は生物活性ケイ素を含むことができる。（“再吸収性”という用語によって、生理学的な流体中においてその場で材料が腐食され／吸収され／浸食されるか又は消失することを意味する。“生物活性”という用語は、材料が生理学的な条件下（体液中の場合）でその表面上に沈殿するリン酸カルシウムの沈殿物を誘導し得ることを意味する。）。
【００１７】
担体が細胞中に保持される場合、それは吸着され／腐食され／浸食され又は再吸収されて、いずれは細胞にとってより刺激性の少ない／外来性でない物質となる。
再吸収性ケイ素／他の材料を微粒子銃の技術で使用することができる。例えば、細胞に材料を移送する担体は微粒子銃用小球であることができる。
細胞に材料を移送する担体は、多孔性ケイ素を含む微粒子銃用小球を含むことができる。
小球は細胞に導入すべき物質を含むことができ、小球に吸着させてもよい。小球を材料（例えばＤＮＡ材料）に浸漬することができる。それを材料で実質的に飽和させてもよい。小球はサブミクロンのケイ素粒子を含むことができる。ケイ素粒子をステインエッチング（stain etching）技術で多孔性にすることができる。粒子は好ましくはメソ多孔性である。
【００１８】
再吸収性の微粒子銃用小球は、金又はタングステンの微粒子銃用小球がするようには、細胞中で粒子を後に残さない。小球は工程のすべてで多孔性である必要はなく−多孔性被覆を有していてもよい。再吸収性小球は多孔性ケイ素で製造する必要は必ずしもなく、又はケイ素である必要すらないが、多孔性ケイ素は特に適した材料であるとされてきた。
他の観点に従うと、本発明は、材料を細胞中に運ぶ担体を撃つ工程を含む、細胞に該材料を移送する方法を提供する。
好ましくは、担体は本明細書で先に定義したような担体である。好ましくは、加圧ガス、例えばヘリウムで細胞に小球を撃ち込む。
生物学的な微粒子銃の工程を、それ以外の標準的な技術が利用できない場合には使用することが多い。再吸収性の浸漬した材料、例えば多孔性ケイ素には、耐腐食性のバルクの金属材料に対して、生物適合性であるという利点がある。
【００１９】
さらなる観点に従うと、本発明は、担体を少なくとも部分的に多孔性にする工程及び細胞へ移送すべき材料を担体に導入する工程を含む、細胞へ材料を移送するための担体を製造する方法を提供する。
好ましくは担体はケイ素の小球を含み、より好ましくはサブミクロンのケイ素粒子を含み、該粒子はステインエッチング技術によって好ましくはメソ多孔性とすることが可能である。小球は細胞に導入すべき材料を有することができ、小球に吸着させてもよく又は小球を材料で浸漬してもよい。
担体はサブミクロンの粒子であることができ、担体を凝集部位として使用して細胞に移送すべき材料を（沈殿物質と共に）共−沈殿させることができる。
細胞に材料を移送するための担体は生物活性ケイ素を含むことができる。担体は、細胞によって取り込まれる物質と共−沈殿するのに適した形にある細胞に移送すべき物質をそれと結合させてもよい。共−沈殿物はリン酸カルシウム沈殿物であることができる。
【００２０】
他の観点に従うと、本発明は、材料をケイ素粒子と結合させること、粒子上にリン酸カルシウムを沈殿させてリン酸カルシウム／ケイ素粒子結合粒子を形成すること、及び細胞がリン酸カルシウム／ケイ素粒子結合物を取り込むように準備することを含む、細胞に材料を導入する方法を含む。
エレクトロポレーションの技術においては、非常に高い電圧の短い電気的衝撃に細胞を曝して細胞膜を透過性にすることができる。空隙率が低い生物活性ケイ素は導電性であり、微小電極の配列上で成長する接着性の哺乳動物細胞のための密接な結合マトリックスに適するものとして開発されている。生物活性ケイ素、例えば多孔性ケイ素又は多結晶性ケイ素をエレクトロポレーション装置の一方又は両方の電極とすることにより、ＤＮＡのよりよい取込が生じることが予想される。
さらなる観点に従うと、本発明は、導電性の生物活性ケイ素電極を提供することを含む、エレクトロポレーションの方法を含む。
【００２１】
好ましくは、方法は細胞を電極上で成長させることを含む。方法は生物活性ケイ素電極の配列を提供することを含むことができ、電極の上で細胞が成長できる。一つ又は複数の電極は多孔性ケイ素で被覆してもよく、又はその断面の全体が多孔性ケイ素であってもよく、少なくともその高さの領域が多孔性ケイ素であってもよい。
さらなる観点に従うと、本発明は生物活性電極を含むエレクトロポレーション装置を含む。好ましくは、電極は生物活性ケイ素であり、最も好ましくは多孔性ケイ素である。電極又は微小電極の配列を提供することができる。
本発明は、材料を細胞に導入するための装置の製造において、生物活性ケイ素、好ましくは多孔性ケイ素を使用することに存在していてもよい。
生物活性のある材料は、生体内で特定の生物学的反応を誘導し、その結果生きている組織と該材料との間に結合を形成する一群の材料であることを明確にすることが有用であろう。生物活性材料は表面反応性のある生物材料であるということも可能である。再吸収可能な材料は、生体内で時間がたつに従って次第に消失し又は分解するように設計されている材料であり、このような材料は組織と置換することが可能であっても、又は可能でなくてもよい。生体に再吸収可能な材料は、生体内で腐食し、細胞に吸収される可能性のある材料であるか、又は吸収される可能性のない材料である。生物学的に不活性な材料は、生体内で局所的な全体の生物学的反応を誘導しない材料である。
【００２２】
本発明の態様を図面を参照して実施例によって説明する。
図１は、５０μmのベース幅Ａ及び１００μmの高さＢ及び０．５μmのチップ幅Ｃを有するマイクロチップ１２の形態にある微小孔開け装置１２を示している。マイクロチップ１２は０．１μmの深さＤを有する多孔性ケイ素で被覆されている。
使用時に、多孔性ケイ素の被覆１４が、細胞に送達すべき物質（例えばＤＮＡ／ＲＮＡ）をチップ自体の上で固定化し、このことによりチップ上に固定化された物質が生きた細胞へ導入される機会が増加する。
多孔性ケイ素被覆の孔の大きさ及び空隙率を制御してマイクロチップ１２の生物活性を調整することができる。多孔性ケイ素の孔の大きさ及び空隙率を制御することにより、特定の分子をより多くまたはより少なく容易に離れさせることができる。マイクロチップを細胞の内部に所定の時間置いて、分子を多孔性ケイ素から分離させることができる。
図２は、ケイ素の支持体又は裏打ち体２４から延びるケイ素の顕微針２２の配列２０を示している。顕微針２２は多孔性ケイ素のマイクロチップ２６及び中央の内腔２８を有し、内腔はマイクロチップ２６と貯蔵器３０の間を結んでおり、該貯蔵器は顕微鏡針２２を有する上部構造体３２と裏打ち体の支持体２４とを区画している。裏打ち体２４はバルクのケイ素である。
【００２３】
図３は、図２の顕微針に類似するケイ素の顕微針３４の配列３３を示している。図２及び３に示された配列の間の主な相違は、図３に示される顕微針３４には中央の内腔２８がないことである。その代わり、図３に示されたケイ素の顕微針３４の配列３３にはメソ多孔性のネットワーク３６があり、これは顕微針のマイクロチップから貯蔵器３０’に伸びており、貯蔵器３０’とマイクロチップとの間の流体による結合を可能にしている。使用時には、細胞に送達すべき物質が、貯蔵器３０、３０’から中央の内腔２８又はメソ多孔体のネットワーク３６を通って多孔性ケイ素のマイクロチップ２２，３４へ供給される。
細胞に導入すべき材料をポンプで貯蔵器３０、３０’に送ることができ、ポンプで内腔２８又は多孔性のネットワークを通って外に出すことができる。このことは示されていないが矢印３９はポンプが液体を貯蔵器に送達することを示している。
【００２４】
最終構造におけるケイ素表面の全部又は一部を、生物学的システムと相互作用するように変性する方法で処理することができる。このことは表面上に多孔性ケイ素の層を形成することによって達成することができる。電気化学的な陽極化方法によるか、又はフッ化水素酸と硝酸の混合物のようなステインエッチング溶液に構造物を浸漬することによって、このような層を形成することができる。
図４は、ステインエッチングによってメソ多孔性になったサブミクロンのケイ素粒子を含む微粒子銃用小球４０を示している。
使用時に、細胞に導入すべき物質で小球４０を浸漬し、加圧ヘリウムを使用して細胞の中へ撃つ。多孔性ケイ素が再吸収性の材料であるので、これが入った細胞で完全に再吸収され、少なくとも部分的に再吸収され、従って細胞中に金属の粒子が残る金又はタングステンのような公知の微粒子銃用小球より外来物質の少ないものを含む。
【００２５】
図５は、細胞に導入すべき物質（例えばＤＮＡ／ＲＮＡ）で浸漬した多孔性ケイ素のコア５０及びコア５０の周囲に形成されたリン酸カルシウムの沈殿５２を示している。リン酸カルシウム５２はＤＮＡ／ＲＮＡと共に共−沈殿して、遺伝子材料／リン酸カルシウムの層が生物活性のケイ素のコア５０を取り巻いている。生物活性なケイ素のコアはリン酸カルシウムの過飽和を局所的に誘導する。生物活性なケイ素のコアを細胞の隣に／細胞の壁に接して配置すること、及び共−沈殿したＤＮＡ／Ｃａ(ＰＯ4)2をコアと接して、また細胞の壁に接して配置することができる。コアが食細胞に取り込まれるとそれは再吸収される。
コア５０はその上にＤＮＡ／ＲＮＡ／他の活性物質を有する必要はなく、それはＤＮＡ／Ｃａ(ＰＯ4)2の共−沈殿のための良好な核となる部位として作用することができるだけである。
リン酸カルシウムの共−沈殿ＤＮＡトランスフェクションのための核となる部位としてガラスビーズを使用することが公知である−例えばWatson及びLatchmanによる論文“Methods (San Diego) 1996 10(3), 289-291 (Eng.)を参照されたい。
【００２６】
微小多孔体は２nm又はそれより小さい直径の孔であり；メソ多孔体は２nm〜５０nmの直径を有し；また大きな多孔体は５０nm又はそれより大きい直径を有することが理解されよう。
図６に示されれているように、多孔性ケイ素、好ましくはメソ多孔性のケイ素を使用してエレクトロポレーション技術で細胞へ材料を導入する場合の効率を改良することが可能であることも実現している（大きな多孔性及び微小多孔性のケイ素も有用である）。
多孔性ケイ素（又は他の生物活性材料、又は生物活性多結晶性ケイ素）電極６０、６１を使用することにより、エレクトロポレーションをうまく実施できる。電極が生物不活性である代わりに生物活性であるので、細胞（典型的には動物細胞）はそれに親和性を有しかつ細胞がその表面に集中する。
【００２７】
低空隙率（５０％以下、又は３０％以下、又は１０％以下）の生物活性ケイ素は導電性で、接着性の哺乳動物細胞６２のための適切な密着した複合体マトリックスであり、該細胞は微小電極６０、６１上で生育することができる。従って、生物活性な多孔性ケイ素電極上で哺乳動物の細胞が生育することができ、次いで細胞が生育する基板がエレクトロポレーション装置の一方又は両方の電極６０、６１であるエレクトロポレーションを使用して、ＤＮＡ（又は他の物質）を細胞へ導入することができる。このことは細胞を取り扱う上で有利であり、液状溶媒６３に細胞を分散しただけよりＤＮＡの導入の効率がよくなる。
哺乳動物の生体内で多孔性ケイ素が再吸収性／浸食性であるという事実は本発明者により立証されたことであり、このことは本発明の観点のいくつかを支持するものである。ケイ素を生物活性にすることができるという事実は、本発明の他の観点を支持する。
【００２８】
図７は、多孔性ケイ素のシートにおいて窒素の濃度を深さで表すＳＩＭＳ（二次イオン質量分析法）のプロットを示している。ＤＮＡは窒素が多く、多孔性ケイ素において高い窒素の値を検出することは、存在するＤＮＡの量の尺度である。プロット７０はシートの表面にＤＮＡを加えずに窒素を分析した“保存期間の長い”多孔性のケイ素シートを示している。窒素のバックグラウンドの値は、多孔性ケイ素のフィルムの型及びその“保存期間”−大気中での保存期間、に依存する。プロット７２は、多孔性ケイ素のシートに１滴の水を適用した後における多孔性ケイ素シートの分析を示している。１滴の水には１μl当たり１ngのＤＮＡが入っていた。シートを分析する前にＤＮＡ溶液の水滴を５０℃で乾燥した。プロット７４は同じ１μl当たり１ngのＤＮＡの水滴をシートに適用し、乾燥し、次いでシートを５０℃の脱イオン水で洗浄した場合の多孔性ケイ素における窒素の量を示している。
【００２９】
図から分かるように、プロット７０よりプロット７２のほうが遙かに多くの窒素があることが示されており、本試験でＤＮＡが検出できたことが示されている。プロット７４は洗浄工程がいくらかの、しかしすべてではないＤＮＡを除去したことを示しており、ＤＮＡは多孔性ケイ素の上で部分的に固定化された可能性があり、後で（洗浄工程で）放出されたことを示している。
図８は、同一の層について純水で処理した後の等価のＳＩＭＳプロットを示している。“保存期間の長い”多孔性のケイ素を大気中で保存して、亜酸化窒素及びアンモニア−一般的な痕跡量の汚染ガス−が原因である窒素のバックグラウンドレベルを得た。プロット８０は、保存期間の長いＤＮＡを有しない多孔性のケイ素を示し、プロット８２は保存期間の長い水滴の沈着物（ＤＮＡを含まない溶液）を有する多孔性ケイ素を示し、プロット８４は比較のために再度保存期間の長い１ng／μlのＤＮＡ溶液を加え５０℃で乾燥した多孔性ケイ素の分析を示している。
図７及び図８に示したＳＩＭＳデータは、多孔性ケイ素が可逆的にＤＮＡを結合することを示している。
本発明は、多孔性ケイ素（又は多分多結晶性ケイ素）を、材料を生きた細胞に輸送／移送するための無機ベクターとして使用することであると考えられる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】は部分的に多孔化したマイクロチップを示す。
【図２】はケイ素の顕微針の配列を示す。
【図３】はチップから下にある貯蔵器に延びる大きな多孔性のネットワークを有する図２に示したケイ素の顕微針の配列を示す。
【図４】はＤＮＡで浸漬した多孔性のケイ素の小球を示す。
【図５】はＤＮＡで浸漬しかつリン酸カルシウムで被覆した多孔性ケイ素のコアを示す。
【図６】端本発明のエレクトロポレーション技術を示す。
【図７】はＤＮＡの多孔性ケイ素に対する親和性を示すＳＩＭＳのプロットを示し、かつそれが多孔性ケイ素の表面から放出できることを示している。
【図８】はＤＮＡの多孔性ケイ素に対する親和性を示すＳＩＭＳのプロットを示し、かつそれが多孔性ケイ素の表面から放出できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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