(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法であって、ハイブリダイゼーション温度を経時的に昇温もしくは経時的に降温させながらＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせ、ＤＮＡチップに、レーザーシートにした光源をＤＮＡチップの平面方向から照射して、２本鎖となった塩基配列を検出することを特徴とするＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一度に定量性の高いハイブリダイゼーションを行うことができる方法及び該方法を実施するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップは、１〜２ｃｍ2ほどの固体表面に数百〜数十万のＤＮＡプローブをアレイ状に配列したものであり、ＤＮＡの検出やスクリーニング等を迅速かつ低コストで行うことができる。これを用いれば、サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを瞬時に判別することができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＤＮＡチップ上の塩基配列は、２５塩基程度と比較的短く、１つの基板に多種類のＤＮＡが存在し、それらはそれぞれ異なる塩基配列を有し、また異なる最適ハイブリダイゼーション温度を有するため、特異性に問題が生じる場合が多い。
【０００４】
したがって、本発明は、ＤＮＡチップを用いて、一度に定量性の高いハイブリダイゼーションを行うことができる方法及び該方法を実施するための装置を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ハイブリダイゼーションの特異性は温度が重要な因子となることに着目した。そして、同一配列を有する複数の塩基配列をＤＮＡチップ上に一列に配置し、その配列方向に温度勾配を設ける手段、又はＤＮＡチップ上の塩基配列に対して経時的に温度を変化させる手段を用いれば、一度に定量性の高いハイブリダイゼーションを行うことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明の第一参考例は、同一の配列を有する複数個の塩基配列が１列に固定化されたＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法であって、同一の塩基配列が固定化されている方向に温度勾配を設け、検出すべき塩基配列を標識した後ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせ、次いで緩衝液で洗浄した後、１列に固定化された各塩基配列の標識の強度を比較することによって該検出すべき塩基配列の核酸量を定量することを特徴とするＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法を提供するものである。
【０００７】
ハイブリダイゼーションは、特異性（選択性）を重視すれば高温で行うことが好ましいが、強度（ハイブリダイゼーション強度）が低くなるという問題がある。一方、低温で行えば強度は高くなるが、特異性が低くなるという問題がある。したがって、できるだけ低温で、かつ目的の塩基配列とのみハイブリダイズする条件でハイブリダイゼーションを行うことが好ましいが、従来のＤＮＡチップを用いた場合、かかる条件を見出すことが困難であった。
上記のように、同一の塩基配列が固定化されている方向に温度勾配を設ける手段をとれば、各塩基配列の強度を容易に検出することができ、目的とする塩基配列の核酸量を特異的に定量することができる。
【０００８】
本発明の第二参考例は、ＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法であって、検出すべき塩基配列を標識した後ＤＮＡチップ上で低温でハイブリダイゼーションさせ、次いで緩衝液を経時的に昇温させながら該緩衝液で洗浄し、昇温過程における各塩基配列の標識の強度をモニタリングすることによって該検出すべき塩基配列の核酸量を定量することを特徴とするＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法を提供するものである。
かかる方法は、ＤＮＡチップに固定化された各塩基配列を経時的に昇温させるものである。低温でハイブリダイゼーションさせると、目的とする塩基配列以外の配列ともハイブリダイズし得る。次いで経時的に昇温させた緩衝液で洗浄していけば、ミスマッチが大きいものほどハイブリダイゼーション強度が低下していく。したがって、かかる手段を用いれば、各塩基配列に特徴的な温度特性パターンを得ることができる。また本方法を用いることにより標識の強度のバラツキが最も大きくなる温度を容易に検出することができる。かかる温度が特異性が最も高いと考えられるから、それらの強度を比較することによってその塩基配列の核酸量を容易に定量することができる。
【０００９】
本発明の第三参考例は、緩衝液貯蔵容器と、該緩衝液の加熱手段と、該緩衝液をＤＮＡチップ上を流すための流路と、標識の強度を測定する手段と、を有することを特徴とする上記塩基配列決定又は核酸定量方法に用いるための装置を提供するものである。
かかる装置を用いれば、ＤＮＡチップに固定化された各塩基配列の昇温、降温を容易に行うことができ、一度に定量性の高いハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１０】
本発明は、ＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法であって、ハイブリダイゼーション温度を経時的に昇温もしくは降温させながらＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせ、ＤＮＡチップに、レーザーシートにした光源をＤＮＡチップの平面方向から照射して、２本鎖となった塩基配列を検出することを特徴とするＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法を提供するものである。
検出すべき塩基配列は、ＤＮＡチップに固定化された塩基配列とハイブリダイズすることによって２本鎖となり、ＤＮＡチップに固定される。１本鎖の場合は、ハイブリダイゼーション溶液中を浮遊しており、ＤＮＡチップに固定されることはない。、したがって、レーザーシートにした光源をＤＮＡチップにＤＮＡチップの平面方向から照射すれば、２本鎖のみを検出することができ、その塩基配列の核酸量を容易に定量することができる。
【００１１】
本発明の第四参考例は、ＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法であって、ハイブリダイゼーション温度を経時的に昇温もしくは降温させながら、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせ、２本鎖となった塩基配列のみを電気化学的手段を用いて検出することを特徴とするＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法を提供するものである。
電気化学的手段を用いることによって、２本鎖となった塩基配列のみを高精度で検出することができる。
【００１２】
本発明の第五参考例は、ＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法であって、ハイブリダイゼーション温度を高温から経時的に降温させながら、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせ、２本鎖のみを特異的に検出する試薬をハイブリダイゼーション溶液に加え、２本鎖となった塩基配列を検出することを特徴とするＤＮＡチップを用いた塩基配列決定又は核酸定量方法を提供するものである。
かかる方法は、２本鎖のみを特異的に検出する試薬を用いるものである。２本鎖のみを特異的に検出する試薬を用いれば、第四発明の場合と異なり、光をＤＮＡチップの上面方向から照射した場合であっても、２本鎖塩基配列を検出することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の第一参考例は、まず同一の配列を有する塩基配列を複数個、ＤＮＡチップ上に一列に固定化する。このように一列に固定化された塩基配列を複数種類ＤＮＡチップ上に固定化する。次いで、同一の塩基配列が固定化されている方向に温度勾配を設ける。温度勾配は、ＤＮＡチップ上の異なる塩基配列の最適ハイブリダイゼーション温度の近似性を考慮して適宜設定することができる。また、異なる塩基配列の最適ハイブリダイゼーション温度が近似している場合は、各塩基配列の温度間隔は小さくとることが好ましい。
【００１４】
温度勾配の設定は、以下の方法で行うことが好ましい。まず、ＤＮＡチップを、同一配列の方向を垂直方向に固定する。同一配列の方向を水平方向に固定すると、温度が拡散する速度が物質が拡散する速度より速いため、ハイブリダイゼーションを十分に行うことができない。そして、上部に加熱部、下部に冷却部のいずれか一方又は両方を設ける。これにより、垂直方向に温度勾配を形成させることができる。
【００１５】
次いで、検出すべき塩基配列を標識した後、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせる。標識の方法としては、例えば蛍光試薬を用いる方法、放射性同位元素を用いる方法等が挙げられるが、このうち蛍光試薬を用いる方法が好ましい。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液をＤＮＡチップ上に添加すればよい。反応時間は、ハイブリダイズさせる配列の長さ等に応じて適宜設定することができる。次いで緩衝液を用いて洗浄を行い、バックグラウンドを除去する。
【００１６】
このようにして得られたＤＮＡチップ上においては、一列に配列された同一の塩基配列のうち、最適ハイブリダイゼーション温度に保持された部分が特異的且つ最大の標識強度を有するため，該塩基配列の核酸量を高い精度で定量することが出来る。
【００１７】
本発明の第二参考例は、まず検出すべき塩基配列を標識した後、ＤＮＡチップ上で低温でハイブリダイゼーションさせる。標識の方法は、上記と同様である。ここで、「低温で」とは、検出すべき塩基配列がＤＮＡチップ上のすべての塩基配列とハイブリダイゼーションすることができる程度の温度を意味する。すなわち、第二発明においては、検出すべき塩基配列を、ＤＮＡチップ上のすべての塩基配列とハイブリダイゼーションさせる。これは、低温では、相補性の低い塩基配列であってもハイブリダイズすることを利用したものである。
【００１８】
次いで、緩衝液を経時的に昇温させながら該緩衝液でＤＮＡチップを洗浄する。緩衝液を加熱する方法としては、特に制限はないが、例えば緩衝液貯蔵容器を直接加熱する方法、緩衝液貯蔵容器からＤＮＡチップへのライン中で加熱する方法、あるいはＤＮＡチップやその周辺を直接加熱する方法等が挙げられる。経時的に昇温させるには、加熱手段の強度を経時的に上げればよい。昇温速度は、一定であることが好ましい。緩衝液でＤＮＡチップを洗浄することにより、バックグラウンドを除去する。
【００１９】
次いで、ＤＮＡチップ上の各塩基配列の経時的な標識強度の変化を測定する。ここで、低温では相補性の低い塩基配列でもハイブリダイゼーションするが、昇温するに従ってミスマッチの多い２本鎖から解離していく。そして、ある特定の温度で、ＤＮＡチップ上の各塩基配列の標識の強度のバラツキが最も大きくなる。この温度で特異性が最も大きくなると考えられるから、その温度での標識の強度から核酸量を定量する。
【００２０】
図１は、第二参考例を実施するための装置の一例を示したものである。図１において、該装置１は、緩衝液貯蔵容器２、緩衝液のＤＮＡチップ上へのライン３、ＤＮＡチップ上の流路５、光源６及び検出部７からなる。緩衝液は、緩衝液貯蔵容器２及び／又はＤＮＡチップ４へのライン３中で加熱される。緩衝液の温度は、低温から経時的に昇温させていく。低温でのハイブリダイゼーション終了後、経時的に昇温させながら、緩衝液を、ＤＮＡチップ上（緩衝液流路５）に送液する。洗浄によるバックグラウンドの除去後、光源６を用いて標識強度を検出部７によって測定する。
【００２１】
図２は、第二参考例を実施するための装置の他の一例を示したものである。緩衝液の加熱部８は、ＤＮＡチップの上部にある。緩衝液は、緩衝液流路５を通過する際に加熱部８によって加熱される。緩衝液の温度を低温から経時的に昇温させていくように、加熱部８における加熱強度を調整する。図２においては、標識強度測定装置として、光ファイバを用いて、光源６’、検出器７’が測定対象物に対して同一側にある装置を例示している。ただし、測定装置は、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、レーザーシートにした光源を、ＤＮＡチップに、ＤＮＡチップの平面方向から照射して、２本鎖となった塩基配列を検出、決定するものである。すなわち、ＤＮＡチップにＤＮＡチップの平面方向から照射することによって、ＤＮＡチップ上でハイブリダイズしたもののみを検出するものである。経時的に昇温もしくは降温させながらハイブリダイゼーションさせつつ、かかる方法での検出を行うことによって、バックグラウンドの洗浄、除去を行うことなく、一度に定量性の高いハイブリダイゼーションを迅速に行うことができる。
【００２３】
本発明の第四参考例は、まず経時的に昇温もしくは降温させながらＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせ、次いで、ＤＮＡチップ上で２本鎖となった塩基配列のみを電気化学的手段を用いて検出するものである。これにより、バックグラウンドの洗浄、除去を行うことなく、一度に定量性の高いハイブリダイゼーションを迅速に行うことができる。
【００２４】
電気化学的手段による検出法の一例を以下に示す。最近、２本鎖ＤＮＡ識別能が極めて高く、安定した電気化学的応答を示す新規リガンドＦＮＤ（ferrocenylnaphthalenediimide derivative）が開発された。これは、２本鎖ＤＮＡへ縫い込み型インターカレートすることにより、ＤＮＡ二重ラセンの主溝と副溝の両方にリガンド置換基が飛び出す構造を有している。これらの置換基部がかすがいとなってＤＮＡ二重ラセンを安定化させると同時に、リガンドをＤＮＡ二重ラセンから解離し難くする。しかし、１本鎖ＤＮＡに対してはこのような効果はないため、２本鎖ＤＮＡに対して極めて高い結合特異性を示す。
【００２５】
リガンドＦＮＤを用いたＤＮＡ検出システムの概念を図３に示す。まず、金電極にチオール化したＤＮＡプローブを結合させ、試料ＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションを行う。そして、リガンドを含む溶液で測定を行い、リガンドの酸化還元応答を電気化学的手法によって測定する。このことにより、目的遺伝子の２本鎖形成量が定量化される。電気化学的手法として、ディファレンシャルパルスボルタモグラフィー（ＤＰＶ）を用いることにより、４６０ｍＶ付近にリガンドの酸化に伴う電流が流れる。電極上でのリガンドの濃縮による電流値は、２本鎖の形成量に応じて増加する。
【００２６】
本発明の第五参考例は、まずハイブリダイゼーション温度を高温から経時的に降温させながらＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせる。次いで、２本鎖のみを特異的に検出する試薬をハイブリダイゼーション溶液に加え、２本鎖となった塩基配列を検出する。２本鎖のみを特異的に検出する試薬としては、例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（登録商標：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）が挙げられる。検出は、例えば２５４ｎｍのＵＶを照射することにより行うことができるが、この方法には限定されない。
【００２７】
次に参考実施例を示して本発明の参考例をさらに詳細に説明するが、本発明の参考例は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
参考実施例１
配列番号１〜７で表される７種類の塩基配列を、それぞれ複数個ずつＤＮＡチップ上に１列に配列し、その列方向が鉛直方向になるようにＤＮＡチップを固定する。海水１Ｌを０．２μｍヌクレポアフィルターでろ過し、フィルター上のバクテリアよりＲＮＡを抽出する。このＲＮＡを塩化マグネシウムで分解し、アルカリフォスファターゼで脱リン酸後、核酸のリボースを酸化してアルデヒド体とする。リザミンローダミンエチレンジアミンと反応させ、次いでシッフ塩基で還元した後、カラム精製し、３０〜５０ｍｅｒのラベル化ＲＮＡを調製する。
ラベル化ＲＮＡをこの上記チップに対してハイブリダイズさせる。ラベル化ＲＮＡ（１μｇ／μＬ）３μＬを、ハイブリダイゼーションバッファーに加えて３５μＬとする。ろ過精製後、９４℃で３分間加熱する。冷却後、３０μＬをスライドガラス上のＤＮＡチップに乗せ、カバーグラスを端の方から静かに乗せる。ＤＮＡチップの温度勾配は２０〜８０℃とし、６時間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、ウォッシングバッファーで洗浄し、蛍光シグナルを検出器によって検出し、解析を行う。
【００２９】
参考実施例２
上記で調製したラベル化ＲＮＡを２０℃で、ＤＮＡチップ上でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、洗浄バッファー（１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）中で２０℃から徐々に９５℃まで昇温し、その間、チップにハイブリダイズしているＤＮＡの蛍光をスキャンする。各々のプローブについて図４のような曲線（図４では６本）が得られる。各曲線が最も離れたとき（図４の垂直線部分）が最も特異性が高いと考えられるので、この温度について定量を行う。
【００３０】
【発明の効果】
本発明を用いれば、従来のＤＮＡチップにある特異性の低さの問題点が解消され、一度に定量性の高いハイブリダイゼーションを行うことができる。また、本発明、第四参考例および第五参考例を用いれば、バックグラウンドを洗浄、除去することなく迅速に定量性の高いハイブリダイゼーションを行うことができる
【００３１】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
<110>MITSUBISHI HEAVY INDUSTRIES,LTD
<120>Method of determining base sequence by DNA chip
<130>200101079
<160>7
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>Actinomycetes
<400>1
ggatgagccc gcggccta 18
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>α-Proteobacteria
<400>2
cgttcgytct gagccag 17
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Planktomycete
<400>3
ccaccgcttg tgtgagcccc 20
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>Cytophaga-Flavobacterium
<400>4
tggtccgtrt ctcagtac 18
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>Acinetobacter
<400>5
gctttagtgg cgcagctaac gcga 24
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>Vibrio
<400>6
tgatgtgggg gataaccat 19
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>Bacteria specific(standard)
<400>7
agagtttgat cctggctcag 20
【図面の簡単な説明】
【図１】  第二参考例を実施するための装置の一例を示したものである。
【図２】  第二参考例を実施するための装置の一例を示したものである。
【図３】  リガンドＦＮＤを用いたＤＮＡ検出システムの概念を示すものである。
【図４】  参考実施例２における、時間に対する蛍光強度の関係を示す図である。垂直線は、各曲線が最も離れる点（温度）を示している。図４においては、曲線は６本であるが、曲線の数はＤＮＡチップ上の塩基配列の数に等しい。
【符号の説明】
１：本発明の第二参考例の塩基配列決定又は核酸定量方法に用いる装置
２：緩衝液貯蔵容器
３：緩衝液のＤＮＡチップ上へのライン
４：ＤＮＡチップ
５：ＤＮＡチップ上の流路
６、６’：光源
７、７’：検出部
８：加熱部
９：ＤＮＡセンサー
１０：対極
１１：温度センサー
１２：ＤＮＡプローブ修飾電極
１３：参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ2）
１４：電界溶液
１５：恒温槽
【図１】
0004402321.tif 000002
【図２】
0004402321.tif 000003
【図３】
0004402321.tif 000004
【図４】
0004402321.tif 000005