(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬理学的活性成分の同定方法であって、
a) 少なくとも１個の遺伝子調節要素の制御下で存在する転写されるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ鋳型を準備し、少なくとも１種類の標識ヌクレオチド、核抽出物、および試験される活性成分と混合し、転写反応を実施し、
b)  転写の後に、混合物中のタンパク質を単離しおよび／または分解し、
c)  標識された転写体を固体支持体に結合させ、
d)  過剰の標識ヌクレオチドを除き、
e)  標識された転写体を定量する
ことを含んでなる無細胞下でのインビトロ転写法を含んでなり、
ＤＮＡ鋳型が、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃII、ＢａｍＨＩ、ＳｗａＩおよびＳｍａＩの単一開裂部位、酵母Ｇａｌ４タンパク質の５つの結合部位、ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ制限部位の間のプラスミドｐＵＣ１９にクローン化されたヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡＴＡ」ボックス、ＢａｍＨＩおよびＳｗａＩ制限部位の間のプラスミドｐＵＣ１９にクローン化されたＭＬプロモーター（アデノウイルスメジャーレイトプロモーター）のＩＮＲ（イニシエーター）領域、およびＳｗａＩおよびＳｍａＩ制限部位の間のプラスミドｐＵＣ１９にクローン化された長さが８００ヌクレオチド（塩基対）のＧ欠如配列を含んでなる、方法。
【請求項２】
ＤＮＡ鋳型が配列番号：１の配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡ鋳型が受託番号ＤＳＭ第１１４５０号として寄託されている万能レポータープラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃII、ＢａｍＨＩ、ＳｗａＩおよびＳｍａＩの単一開裂部位、酵母Ｇａｌ４タンパク質の５つの結合部位、ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ制限部位の間のプラスミドｐＵＣ１９にクローン化されたヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡＴＡ」ボックス、ＢａｍＨＩおよびＳｗａＩ制限部位の間のプラスミドｐＵＣ１９にクローン化されたＭＬプロモーター（アデノウイルスメジャーレイトプロモーター）のＩＮＲ（イニシエーター）領域、およびＳｗａＩおよびＳｍａＩ制限部位の間のプラスミドｐＵＣ１９にクローン化された長さが８００ヌクレオチド（塩基対）のＧ欠如配列を含んでなる、ＤＮＡ鋳型。
【請求項５】
配列番号：１の配列を含んでなる、請求項４に記載のＤＮＡ鋳型。
【請求項６】
ＤＳＭ第１１４５０号として寄託されている、請求項４に記載のＤＮＡ鋳型。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、自動化することができ、遺伝子活性に選択的効果を有する特異的な化学的リード構造（lead structure）を見出だすための効率的かつ経済的な大量スクリーニングに適しているウイルスおよび細胞遺伝子の転写のインビトロ分析法に関する。
【０００２】
背景技術
活性物質を合理的にデザインするだけでは、活性物質の探索に成功することはできないことが明かになってから、生物活性成分を目的とした天然物のスクリーニングが著しく増加した。例えば、研究は化学物質のライブラリーおよび結合ライブラリーだけでなく、物質の起源としての天然物の伝統的抽出物にも集中している。これは、主としてこれらの抽出物が含む物質の多様性による。モデル分析法は、微生物発酵の抽出物は約５００種類の化合物を含んでおり、これらはその構造において著しく異なっている。その多様性に関して、それらは化学的および結合物質ライブラリーよりはるかに勝っている。
【０００３】
様々なしかも十分には検討されていない可能性のある天然物の薬理学的開発を制限する要因は、候補の活性物質を試験することができる適用可能で意義のある方法が多数あることである。特に、特異性の高い薬理活性物質であって、その適用が副作用をほとんど生じないものを同定するのに用いることができる方法が必要とされる。
【０００４】
下記の方法は、物質を遺伝情報のまさに第一段階に関与するその可能性、すなわち遺伝子転写の制御について試験する方法に基づいている。このような方法は、転写について直接または間接的、正または負の効果を有する物質を同定しようとするものである。
【０００５】
遺伝子の転写力は、この遺伝子の遺伝子調節要素、特にプロモーター、エンハンサー、サイレンサーによって測定される。遺伝子調節要素の作用は、転写因子および補因子によって介在されかつ転換される。これらの転写因子は遺伝子の転写速度に対して負のあるいは正の効果を有することができるので、転写力に寄与する。一方、多数の転写因子が、シグナル形質導入、細胞サイクル制御、分化および制御された細胞死（アポトーシス）などの多数の細胞工程中の重要な「分子スイッチ」として同定されている。
【０００６】
細胞が受け取る、遺伝子の転写力に影響を与えるシグナルの大半は、膜貫通タンパク質によって「登録」され、シグナル伝達連鎖によって細胞内に伝達され、転写因子によって転換される。外部シグナルを受け取るタンパク質の例は、ｃＡＭＰ結合タンパク質、成長シグナルのセンサー（例えば血清応答因子、ＳＲＦ）、ホルモンレセプターまたは転写因子であってサイトカイン発現に関与するいわゆるＳＴＡＴタンパク質（シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化因子）である。
【０００７】
一方、遺伝子の転写力に直接または間接的効果を有する多数の物質が知られている。このような物質は、とりわけ医薬品の薬理活性物質として用いられるが、これらの物質の作用は特異的でないことが多い。したがって、このような医薬品を服用すると、望ましくない副作用が伴う。
【０００８】
例えば、免疫疾患は、サイクロスポリンおよびステロイド誘導体を活性物質として含んでなる医薬品で治療される。サイクロスポリンＡはサイクロフィリンと複合体を形成する。後者は遍在ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害し、カルシニューリンは各種の代謝経路によりタンパク質を脱リン酸化する。カルシニューリンは、例えば転写因子のサブユニットＮＦＡＴのサイトゾルから核への輸送を調節する(Liu, J. (1993) Immunology Today 14, 290-295) 。ＮＦＡＴ（活性化したＴ細胞の核因子）は、ある種の免疫関連遺伝子の活性化に関与する。サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、ＮＦＡＴ（活性化したＴ細胞の核因子）に対するその効果によりこれらの遺伝子の発現を間接的に調節する。しかしながら、サイクロスポリンＡは間接的にのみ、すなわち遍在カルシニューリンを介してＮＦＡＴ活性を調節するので、サイクロスポリンＡは他の代謝経路を介して血管収縮薬、および腎および神経毒としても作用する。ＮＦＡＴを特異的に、場合によっては直接的に阻害することができる薬理活性物質が知られていたならば、この活性物質を含む医薬品は、恐らく副作用をほとんど起こさないであろう。
【０００９】
所望な効果の他に、強力な副作用も伴う薬理活性物質としては、糖質コルチコイドも挙げられる。糖質コルチコイドは、アレルギー、リウマチ、炎症、および過剰反応性の免疫系によって引き起こされる他の疾患の標準的治療に長年に亙って用いられてきた。それらは、とりわけ細胞ＮＦｋＢインヒビター、すなわちＩｋＢタンパク質の形成を刺激することによって細胞型特異的転写因子ＮｆｋＢの活性化を阻害する(Scheinmann, R.I., Cogswell, P.C., Lofquist, A.K. & Baldwin Jr.,A.S. (1995) Science 270, 283-286; Auphan, N., DiDonato, J.A., Rosette, C., Helmberg, A. & Karin M. (1995) Science 270, 286-290) 。次いで、ＩｋＢは、活性なＮＦｋＢ二量体の核への移行、したがって重要な免疫学的標的遺伝子の活性化を妨げる。ＣｓＡについて言われていることと同様に、糖質コルチコイドの遺伝子発現に対する効果は、糖質コルチコイドがＮＦｋＢだけでなく他のタンパク質にも作用するので比較的非特異的である。
【００１０】
これらの例から、その作用の概略ができるだけ特異的である薬理活性物質が強く求められていることは明かである。このような特性を有する新規な化学的リード構造を見出だすには、多数の物質をその特異活性について試験しなければならない。
【００１１】
同一の遺伝的構築を行っても、個々の細胞は常に、細胞の型および／またはある種の疾患または欠損、およびこれらの細胞が発生し、分化するそれぞれの程度によって、特異的タンパク質だけを発現する。細胞のこの個性の基礎は、遺伝子調節タンパク質の特異的レパートリー、例えば細胞型特異的で発生特異的構築であると考えられる。この構築は別個の遺伝子の調和して制御された転写を調節するある種の転写因子および補因子（アクセサリータンパク質）を提供すると考えられる。
【００１２】
したがって特異的な薬理活性物質は、画定された型の細胞での病理学的に関連した遺伝子の転写を選択的に活性化または阻害すべきである。このような活性物質を同定するには、個々の遺伝子の転写に対する、すなわち転写調節に関与するタンパク質および遺伝子調節要素に対する候補の活性物質の効果を画定条件下で直接測定することができる転写法が必要である。多数の候補の活性物質を試験しなければならないので、他の前提条件は、この方法が簡単に行うことができかつこれを自動化することができることである。
【００１３】
最初の無細胞転写法はWeilらによって報告された(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18, 469-484)。この方法では、細胞核からの濃縮抽出物（いわゆるＳ１００抽出物）(Weil, P.A., Segall, J., Harris, B.Ng, S.Y., Roeder, R.G. (1979) J. Biol. Chem. 254, 6163-6173) 、および精製したＲＮＡポリメラーゼIIをインビトロ転写に用いた。外来ＲＮＡポリメラーゼIIなしでは、これらの濃縮したがこれ以上精製しない核抽出物は転写はできなかった(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18, 469-484; Digman, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101, 582-598) 。
【００１４】
このような核抽出物から出発して、数個の精製段階を用いて転写因子を単離する方法が続いて開発された。これらの方法は、とりわけ核タンパク質を結合する材料、例えばホスホセルロースカラム上でのクロマトグラフィによって核抽出物を精製する精製段階を含んでいる。数段階を含むこれらの複雑な方法の範囲内では、Dignamらの文献は精製段階の一つに市販のP11 System（商標名）(Whatman, メイドストーン, 英国）の使用を記載した最初のものであった(Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101, 582-598) 。
【００１５】
数段階を含むこれらの精製法は増々良好に適用されて、細胞核の抽出物から個々の転写因子を複雑な工程によって単離することができるほどになった。更に、個々の因子またはそれらのサブユニットは、例えばＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥα、ＴＦＩＩＥβおよびＴＦＩＩＦのような組換体の形態でも入手可能である(Zawel, L. and Reinberg, D. (1995) Annu Rev. Biochem. 64, 533-561)。
【００１６】
したがって、現在では既に、組換えおよび天然の精製因子の混合物からなる転写系が存在している。しかしながら、このような転写系は技術的観点からは複雑すぎ、高い試料処理量を有するスクリーニング法には高価すぎる。対照的に、他の転写系、例えば組換体または精製因子の代わりに細胞核からの抽出物を用いる系では、多数の二次反応が認められる。不十分にまたは精製されていない核抽出物（粗製抽出物）では、インビトロでの転写に悪影響を及ぼすので主として核酸およびＤＮＡ結合タンパク質、例えばヒストンのようなリプレッサーである。粗製抽出物に見られる核酸の中で、悪影響を及ぼすのは、特にｔ−ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。ｔ−ＲＮＡについての遺伝子はｍＲＮＡの遺伝子よりも約１００倍強く転写されるので、これらのｔ−ＲＮＡコード配列は非特異的転写体が過剰となる。したがって、特異的転写体を検出できるようにするには、非特異的転写体は複雑な精製段階によって除去しなければならない。
【００１７】
インビトロ転写の結果を定量分析するため、転写を行うＤＮＡ配列がグアニン塩基（いわゆるＧ欠如配列またはＧ欠如カセット）を欠いているベクターであって、適当ならば、Ｇ欠如配列には多数のグアニンを含む配列の断片が続くことができるものを開発した。これらのベクターを用いることにより、ＧＴＰの非存在下で転写を行うことができる。したがって、Ｇ欠如配列だけが転写されるが、Ｇを含む他の配列は転写されない。これにより、更に長さが（実質的に）均一な特異的転写体が得られる。Sawadogo and Roeder は、４００ヌクレオチドの長さの配列がＭＬ（アデノウイルス・メジャー・レイト）プロモーターによって制御されている転写にベクターの使用を最初に報告した。このベクターにより、長さが約４００ヌクレオチドの転写体が得られる(Sawadogo, M. and Roeder, R.G. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4394-4398) 。
【００１８】
これらのベクターにより非特異的転写体の数は著しく少なくなった。これがそれ以来幾度も転写反応におけるこれらのベクターの使用が報告されてきた理由である(Goppelt, A., Stelzer, G., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1996) EMBO J. 15, 3105-3115; Kretzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell 78, 525-534; Meisterernst, M., Roy, A.L., Lieu, H.M. and Roeder, R.G. (1991) Cell 66, 981-993)。
【００１９】
しかしながら、今日までのところは、用いられたベクターはＧ欠如配列の長さが４００ヌクレオチドを越えない様なものに限られていた。
【００２０】
上記の転写法の結果の定性および定量分析を行うため、転写は放射能標識したヌクレオチドの存在下で行われており、放射能標識した転写体を最初にフェノール化して沈澱した後、ゲル上で分離するのである。これは、間違って開始されたまたは間違って停止した転写体および非特異的に標識した核酸（例えば、プラスミドによって生じた転写体またはｔＲＮＡ）だけでなく、過剰のヌクレオチドも特異的転写体から除かれる。過剰の放射能標識したヌクレオチド対放射能標識した転写体の活性の比は好ましくない条件下では約１０，０００：１であり、標識した転写体は約１０，０００倍に濃縮しなければならない。この特異的転写体の濃度は沈澱段階によって達成され、分離は電気泳動によって達成される。しかしながら、これらの濃縮段階は自動化大量スクリーニングには向いていない。これが、代替法を開発して、転写結果の定量分析が可能な程度に標識したヌクレオチドを取り出せるようにしなければならない理由である。
【００２１】
転写は、反応溶液を例えばＤＥＡＥ−セルロース膜のような膜に適用することによっても観察することができる。放射能標識した転写体は、膜上に直接検出することができる。しかしながら、現在までのところは、膜の使用は、精製したＲＮＡポリメラーゼII (Roeder, R.G. (1974) J. Biol. Chem. 249, 241-248)および精製した基本転写因子(Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Horikoshi, M., Roeder, R.G. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9163-9167) の存在下で行われているインビトロ転写から転写体を検出するのに成功しただけであった。細胞核からの濃縮し、適当ならば、予備精製した抽出物によって得られる転写体がこの方法で検出することができることは指摘されていない。
【００２２】
活性物質をスクリーニングするための遺伝子転写の開発は、ＷＯ９６／２６９５９号明細書に既に記載されている。この公報には、ヒトＮＦＡＴ（ｈＮＦＡＴ）の配列と、天然物の場合によっては自動化された大量スクリーニングにも用いられる転写分析法におけるそれらの使用の可能性が開示されている。以下に記載する転写法とは異なり、この転写分析法は転写反応を全く行わない純粋な結合分析法である。
【００２３】
米国特許第５，５６３，０３６号明細書には、転写因子の核酸への結合を阻害することができる物質のスクリーニングに用いることができるもう一つの結合分析法が記載されている。この分析法でも、転写は行われていない。
【００２４】
米国特許第５，５６３，０３９号明細書には、この場合には腫瘍壊死因子レセプター（ＴＲＡＤＤ）と関連しているタンパク質のある種のＤＮＡ配列への結合を阻害することができる物質を見出だすのにも用いられる結合分析法のもう一つの例が記載されている。
【００２５】
【発明の概要】
本発明の目的は、遺伝子、例えば細胞およびウイルス遺伝子の画定された反応条件下での転写の分析法であって、特に大量スクリーニングに再現性よくかつ普遍的に用いることができる簡単に実施される方法を提供することである。
【００２６】
本発明は、転写されるＤＮＡ配列であって、１以上の遺伝子調節要素により制御されている配列を含むＤＮＡ鋳型の無細胞のインビトロ転写の方法であって、
a)  好ましくは、転写因子および／または補因子によって補足することができ、または転写因子および／または補因子によって部分的にまたは完全に置換することができる細胞核由来の濃縮し、好ましくは、精製した抽出物と、少なくとも１種類の標識ヌクレオチドとを転写に用い、
b)  転写の後に、好ましくは、反応混合物中のタンパク質を単離しおよび／または分解し、
c)  標識された転写体を固体マトリックスに結合させ、
d)  過剰の標識ヌクレオチドを除き、
e)  標識した転写体を定量する
ことを特徴とする、方法に関する。
【００２７】
【発明の具体的説明】
この方法は、実際の転写反応(a) 、特異的転写体の単離(b, c, d) 、および特異的転写体の検出(e) を包含している。この方法は、特異的転写体の単離の具体的態様であって、上記のb, cおよびd の順序だけが可能なものである態様を包含している。特異的転写体の単離順序は、適当ならば、c, d, b またはd, b, c とすることもできる。また、本発明の具体的態様は個々の単離段階を省くこともできる。例えば、転写法は、段階a, c, d およびe 、または段階a, cおよびe のみ、またはa, b, c およびe のみ、またはa, b, d およびe のみ、またはa, bおよびe のみ、またはa, dおよびe のみを含んでなることができる。
【００２８】
総ての工程段階、すなわち実際の転写反応（転写）および特異的転写体の単離および検出を自動化し、特定の反応条件下で得られる特異的転写体の量、したがって転写速度を簡単かつ信頼性よく定量することができることが本発明の方法の特別の特徴である。
【００２９】
転写速度は、特定の遺伝子が単位時間当たりで幾度転写されるか、または上記転写法において、転写されるＤＮＡ配列が単位時間当たりで幾度転写されるかを示す。転写速度を測定するには、画定された単位時間後に得られる放射能標識した量を測定する。
【００３０】
この方法の特徴は、転写が活性化因子および／またはインヒビターの存在下、すなわち転写に正または負の効果を有する成分の存在下で行うことである。例えば、転写することができる細胞核からの抽出物を基本転写に用いることができる。この基本転写系は、活性化因子および／またはインヒビターを補足することができる。基本転写と比較して、転写阻害では転写速度が減少し、したがって特異的転写体／単位時間の量が低下するが、転写活性化では転写速度が増加し、したがって特異的転写体／単位時間の量が増加する。
【００３１】
遺伝子の転写は、幾つかの段階、予備開始複合体（ＰＩＣ）の形成、ＰＩＣの活性化、開始、プロモータークリアランス、伸張および停止、に分けることができる。真核生物では、転写の開始には、ＲＮＡポリメラーゼ（タンパク質コード遺伝子の転写のためのもの、ＲＮＡポリメラーゼII）およびＲＮＡポリメラーゼIIをＤＮＡと特異的相互作用させるＤＮＡ結合タンパク質が必要である。これらのＤＮＡ結合タンパク質は転写因子と呼ばれており、一般的転写因子は本質的にプロモーターとの相互作用に関与しており、特異的転写因子はプロモーターの下流または上流に位置する遺伝子調節要素の作用に介在している。
【００３２】
一般的転写因子ＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦおよびＴＦIIＨは、真核生物の遺伝子の転写で役割を担っている。遺伝子の低い基本活性に関与する転写することができるタンパク質画分は、プロモーターによって、これらの一般的転写因子の総てまたは大半およびＲＮＡポリメラーゼII（ＲＮＡ  ＰｏｌII）を含んでいる。ＭＬプロモーターの基本活性は、例えばＴＢＰ（ＴＦIIＤのＴＡＴＡ結合サブユニット）、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦ、ＴＦIIＨおよびＲＮＡ  ＰｏｌIIによって達成される。このような基本活性を引き起こすタンパク質画分は、基本転写系と呼ばれている。本発明の目的には、この用語は細胞核からの濃縮して、適当ならば、精製した抽出物についても用いられる。基本転写系によって行われる転写は、基本転写と呼ばれる。インビトロでの無細胞転写を行うには、少なくとも、１個の基本転写系、ヌクレオチド、および転写を行うＤＮＡ鋳型が必要である。
【００３３】
活性化した転写は、一般的転写因子の他に、かつ基本転写系の他に、特異的転写因子および補因子（アクセサリータンパク質）を必要とする(Kaiser, K., Stelzer, G. and Meisterernst, M. (1995) EMBO J. 14, 3520-3527) 。特異的転写因子は極めて低い特異的遺伝子の基本転写力を増加させることができ、転写開始の頻度を支配することができる。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は遺伝子が転写される頻度（転写速度）に深く関わっている。ＤＮＡに直接結合しないが転写因子またはＲＮＡポリメラーゼIIの活性にタンパク質−タンパク質相互作用を介して影響を与える他のタンパク質、例えば補因子も、この調節過程に役割を演じている。
【００３４】
本発明の方法の１態様は、細胞核からの濃縮した抽出物（細胞からの核抽出物、核抽出物）を基本転写に用いることである。このパラメーターに関して、この方法を普遍的に用いることができ、これは使用した細胞および使用した真核生物種にも適用される。
【００３５】
例えば、ヒトまたは動物細胞に由来する細胞系から濃縮した核抽出物を得ることができる。特に好適な細胞は、発酵装置で大量に成育させ、増殖させることができる細胞、例えばHeLa細胞である。更に、選択した細胞型の細胞核からの抽出物、特に転写因子および／または補因子との細胞型特異的、細胞サイクル特異的、発生特異的、分化特異的または疾患特異的組立てなどによって識別されるものを用いることができる。特に、疾患の起源に重要な役割を演じている細胞型、例えば免疫系の細胞（例えば、ＢおよびＴ細胞）を用いることができる。
【００３６】
この方法の特別な利点は、組織または腫瘍細胞からの核抽出物を単離して用いることもできることである。これは、適当な細胞系を用いることができない場合には特に遊離である。特に、核抽出物は、動物またはヒトの臍帯、動物またはヒトの移植廃棄生成物、動物またはヒトの生験材料、または動物またはヒトの腫瘍組織（例えば、外科手術中に除かれた組織）、または動物またはヒトの胎盤などの容易に入手できる組織から単離して、この方法に用いることができる。
【００３７】
この方法の１態様は、濃縮した核抽出物を、新鮮なまたは凍結した細胞の細胞核から、または新鮮なまたは凍結した細胞核から、例えばDignam et al. が報告した方法によってタンパク質を濃縮するための既知の方法によって調製されることである(Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101, 582-598; Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acid Res. 11, 1475-1489)。この方法の特別な態様は、濃縮した核抽出物を調製するため、細胞核のホモゲナイゼーションの後に、ホモゲネートの透析を含んでなる方法を用いることである。
【００３８】
本発明の方法の重要な態様の特徴は、細胞核からの濃縮抽出物を１以上の精製段階、特に単一精製段階によって、転写することができる、すなわちこの方法を行うときに特異的転写体が得られる程度まで精製することである。例えば、抽出物をクロマトグラフィによって精製することができる。精製は、例えば核タンパク質結合材料、例えばホスホセルロース、ＤＥＡＥ−セルロース、またはヘパリン−セファロース上で行うことができる。あるいは、カチオン−および／またはアニオン−交換カラムまたは特異的アフィニティカラム、例えば抗体またはオリゴヌクレオチドがカラム材料に結合されるものを、精製に用いることもできる。
【００３９】
本発明の方法の特別な態様の特徴は、濃縮した核抽出物がホスホセルロースカルビル、特にP11 カラム（商標名）（P11 系、Whatman 、メイドストーン、英国）上で精製されることである。この方法のもう一つの特別な態様の特徴は、濃縮した核抽出物が単一のP11 カラム（商標名）、またはＤＥＡＥ−セルロースまたはヘパリン−セファロースを含むカラム材料を有する単一カラム上で単一段階だけによって精製されることである。
【００４０】
P11 （商標名）精製の具体的態様では、他成分の他に０．０５〜０．１５Ｍ、好ましくは０．１ＭのＫＣｌを含んでなる緩衝液の存在下で、核抽出物を最初にホスホセルロースに結合する。ロード（load）したカラムを適当な緩衝液、好ましくは０．０５〜０．１５ＭのＫＣｌ、好ましくは０．１Ｍ  ＫＣｌを含んでなる緩衝液で洗浄すると、非特異的および妨害成分がカラムから洗い出される。転写することができる成分は、好ましくは２画分でカラムから溶出され、最初に例えば０．４〜０．６Ｍ  ＫＣｌ、好ましくは０．５Ｍ  ＫＣｌを含んでなる緩衝液を用いて、次いで例えば０．７〜１Ｍ  ＫＣｌ、好ましくは０．８５Ｍ  ＫＣｌを含んでなる緩衝液を用いて溶出される。
【００４１】
本発明の方法の具体的態様は、外来ＲＮＡポリメラーゼIIの存在下にて濃縮して、適当ならば、精製した核抽出物によって転写を行うことである。用いられるＲＮＡポリメラーゼは、好ましくは真核生物のII型のＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼII）、特に動物またはヒトＲＮＡポリメラーゼIIである。
【００４２】
本発明の方法のもう一つの態様の特徴は、濃縮して、適当ならば精製した核抽出物に、タンパク質、例えば転写因子および／または補因子（アクセサリータンパク質）を補足し、または完全にまたは部分的に置換することである。例えば、これらのタンパク質は細胞核から単離することができ、または組換え技術によって調製することができる。
【００４３】
本発明の方法の具体的態様は、核抽出物を転写因子および／または補因子だけを補足することである。他の極端な場合には、この方法の特徴は、転写を行うことができるタンパク質画分（基本転写系）が単離されたまたは組換え技術によって調製された転写因子および／または補因子と、ＲＮＡポリメラーゼだけからなっていることである。
【００４４】
用いることができる転写因子は、例えば一般的および／または特異的転写因子またはその部分であって、適当ならば、融合タンパク質の形態をしている。
【００４５】
用いることができる一般転写因子は、例えばＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦ、ＴＦIIＨ、ＴＦIIＪおよびＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）である。
【００４６】
用いることができる特異的転写因子は、例えばＮＦｋＢ、ＡＰ１、ＮＦＡＴ、ＧＡＴＡ３、ＴＣＦ／Ｌｅｆ、ＣＢＦ、Ｔａｔ、ｆｏｓ／ｊｕｎ類、Ｏｃｔ類の一員（Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２）、およびそれらと相互作用する因子、例えばＥｔｓ類のＢｏｂｌ、ＯＣＡ−ＢまたはＯＢＦ、ＡＴＦ／ＣＲＥＢタンパク質類の活性化因子、核レセプター、例えばＰＰＡＲα、または転写因子の相当する細胞型特異的イソ形態である(Kel, O.V., Romaschenko, A.G., Kel, A.E., Wingender, E., Kolachenov, N.A. (1995) Nucl. Acids. Res. 20, 3-16 ）。
【００４７】
特異的転写因子の他の例は、下記のようなものがある。
1.  原癌遺伝子（proto-oncogene）、例えばｊｕｎ、ｆｏｓ、ｅｔｓ、ｍｙｃ、ｂｃｌ−イソ形態、およびｅｒｂ、
2.  ホルモンレセプター、例えば（ｅｒｂ）、糖質コルチコイドレセプター、エストロゲンレセプター、レチン酸レセプター、ビタミンＤレセプター、または
3.  腫瘍抑制因子、例えばｐ５３、ＮＦ１、ＷＴ１、ＲＢ
4.  ウイルス病原体、例えば単純ヘルペスウイルスのタンパク質、例えばパピローマウイルスのＶＰ１６またはＩＣＰ４、例えばアデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ６またはＥ７、例えばサイトメガロウイルスのＥ１ＡまたはＥ２Ａ、例えばＢ型肝炎ウイルスのＩＥ８６、例えばＨＩＶウイルスのｐＸ、例えばＴａｔまたはＲｅｖ、
5.  細胞型特異的および／または組織特異的因子、例えば筋形成因子、Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｐｕ−１、ＯＣＡ−ＢまたはＨＮＦ、またはＴ細胞特異的因子、例えばＥｔｓ−１、ＧＡＴＡ３、ＴＣＦ／Ｌｅｆ、ＣＢＦ、
6.  ＳＴＡＴタンパク質（転写のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子）、例えばサイトカインによって活性化される転写因子、例えばＩＬ−１、Ｓｔａｔ、ＩＬ−２Ｓｔａｔ、ＩＬ−３Ｓｔａｔ、ＩＬ−４、ＩＬ−５Ｓｔａｔ、ＩＬ−６Ｓｔａｔ、ＩＬ−７Ｓｔａｔ、ＩＬ−８Ｓｔａｔ、ＩＬ−９Ｓｔａｔ、ＩＬ−１０Ｓｔａｔ、ＩＬ−１１Ｓｔａｔ、ＩＬ−１２Ｓｔａｔ（「Ｓｔａｔ」は作用を媒介するタンパク質を意味する）、または
7.  セカンドメッセンジャー形質導入カスケード、例えばＣＲＥＢまたはａｂｌ、
8.  核レセプター、例えばセカンドメッセンジャーレセプター（例えば、ｃＡＭＰまたはＩＰ３レセプター、Ｃａ2+依存性レセプター）、レチン酸レセプター、糖質コルチコイドレセプター、またはステロイドレセプター、
9.  遺伝子特異的転写因子、またはインヒビター、例えばＩＬ−２遺伝子の特異的活性化因子、例えばＮＦｋＢ、ＡＰ１またはＮＦＡＴ、
10. 発生特異的、細胞サイクル特異的および分化依存発現転写因子。
【００４８】
補因子は、タンパク質−タンパク質相互作用および／またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用により転写において直接または間接的役割を果たしている。幾つかの補因子は、基本転写系に既に存在しており、他のものは、活性化した転写系だけに存在している。補因子は転写速度に正または負の効果を有することができる。用いることができる補因子は、例えば下記のようなものである。
ＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）例えば、ＴＡＦII３０、ＴＡＦII４０、ＴＡＦII５５、ＴＡＦII６０、ＴＡＦII１１０、ＴＡＦII１５０、ＴＡＦII２５０（Verrijzer, C.P. and Tjian, R. (1996) Trends Biochem. Sci. 21, 338-342;ＴＡＦはＴＢＰと共にＴＦIIＤ複合体を形成し、ＴＦIIＤＩおけるＴＡＦの組成をかなり変化させることが可能である）、
メディエーター、すなわちＲＮＡポリメラーゼIIと関連している補因子、例えばＣＴＤ（カルボキシ末端ドメイン）相互作用性タンパク質、および／またはＲＮＡポリメラーゼIIのリプレッサーおよび／または活性化因子、特にＲＡＰ３０、ＲＡＰ７４、ＲＡＰ３８、ＳＲ７（ＲＮＡポリメラーゼＢのサプレッサー、ＳＲＢ）、サイクリンまたはキナーゼ（例えばＣＫII）、
一般的補因子、
ＵＳＡ（上流刺激活性）画分に含まれる補因子(Kaiser, K. and Meisterernst, M. (1996) Trends Biochem. Sci., 342-345)、
正の補因子、例えばＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ４（ｐ１５）、ＰＣ５、ＰＣ６、Ｄｒ２（Ｄリプレッサー２）／ＰＣ３、ＡＣＦ（活性化補因子）ＣｏｆＡ（補因子Ａ）、ＨＭＧ−タンパク質（クロマチン関連高速移動群タンパク質）、
負の補因子、例えばＮＣ１、ＮＣ２、および／または
特異的補因子。
【００４９】
本発明の方法の特徴は、１個以上の遺伝子調節要素および転写を行うＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ鋳型を転写に用いることである。
【００５０】
本発明の主題は、無細胞のインビトロでの転写の上記方法に用いることができるＤＮＡ鋳型である。このＤＮＡ鋳型は、１個以上の遺伝子調節要素と転写を行うＤＮＡ配列を含んでなる。ＤＮＡ鋳型は、更に、他の配列断片も含むことができる。
【００５１】
遺伝子調節要素は、既知の遺伝子調節要素または検討を行う遺伝子調節要素、または１種類以上の既知の遺伝子調節要素と１種類以上の検討を行う遺伝子調節要素の構築物であることができる。
【００５２】
遺伝子調節要素は、遺伝子調節に関与する任意のＤＮＡ配列またはその断片を含んでなることができる。遺伝子調節要素に関して、ＤＮＡ鋳型、または方法は普遍的であり、遺伝子調節要素は、好ましくは真核生物遺伝子に由来するか、または後者に対応している。遺伝子調節要素は、細胞またはウイルス遺伝子調節要素または合成遺伝子調節要素であることができる。遺伝子調節要素は、好ましくは、とりわけＤＮＡ結合タンパク質の結合部位を表すＤＮＡ配列（タンパク質結合ＤＮＡ配列、例えば転写因子または融合タンパク質の結合部位）を含んでなる。遺伝子調節要素は１個のプロモーター（プロモーター配列）および／または１種類以上のエンハンサー（エンハンサー配列）および／または１種類以上のサイレンサー（サイレンサー配列）を含んでなることができる。好ましくは、遺伝子調節要素は、天然および／または人工的に配置されたプロモーター、エンハンサーおよび／またはサイレンサー配列またはその部分を含んでなることができる。
【００５３】
プロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび／またはイニシエーター領域（ＩＮＲ）（転写の開始）を含んでなることができる。プロモーターは「ＧＣ」ボックスおよび／または「ＧＡＡＴ」ボックスを含んでなることができる。
【００５４】
ＤＮＡ鋳型の具体的態様では、遺伝子調節要素はモデルプロモーターである。
【００５５】
モデルプロモーターは、プロモーターおよび追加のタンパク質結合ＤＮＡ配列、および適当ならば、他の遺伝子調節要素を含んでなる。モデルプロモーターは、好ましくは「ＴＡＴＡ」ボックスおよびイニシエーター領域を含んでなる。具体的態様では、モデルプロモーターはヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡＴＡ」ボックスおよびＭＬプロモーターのイニシエーター領域を含んでなる。これらの２個の基本プロモーター要素により、インビトロでの基本転写を行うことができる。更に、この特異的モデルプロモーターは、酵母Ｇａｌ４タンパク質についての５個の結合部位を有する。モデルプロモーターは、所望により、例えば分子生物学の方法により、例えばモデルプロモーターに例えば試験される遺伝子調節要素を補足し、および／またはモデルプロモーターの個々の区分を他の遺伝子調節要素、例えば試験される遺伝子調節要素によって置換することによって変更することができる。
【００５６】
モデルプロモーターの操作を行うには、これが制限エンドヌクレアーゼの１個以上の以上開裂部位を含むのが好ましい。モデルプロモーターの具体的態様では、制限エンドヌクレアーゼの少なくとも１個の以上開裂部位は、「ＴＡＴＡ」ボックスとＧａｌ４結合部位との間に位置している。
【００５７】
既に存在しているタンパク質結合配列の他に（例えば、Ｇａｌ４配列の他に）他のタンパク質結合配列をモデルプロモーターに組み込むことができる。これは、例えば検討（試験）を行う他の転写因子、例えば特異的転写因子を、既に検討してしまった転写系の他に加える場合には特に興味深い。
【００５８】
本発明の方法の特徴は、融合タンパク質を、転写活性化因子および／またはインヒビターとして、モデルプロモーターと組み合わせて用いることもできる。このような融合タンパク質は、例えば酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのようなＤＮＡ結合ドメイン、および例えばＨＳＶ活性化因子ＶＰ１６の活性化ドメインのような特異的活性化ドメインとを含んでなることができる。融合タンパク質により、画定された活性化因子および／またはインヒビター、またはそれらの部分、例えばそれらの活性化または阻害ドメインをそれぞれ検討を行う遺伝子調節要素のバックグラウンドなしに分析することができる。例えば、これは、ＤＮＡ結合ドメインが、用いられる転写系（例えば、濃縮した核抽出物）が欠けているＤＮＡ結合タンパク質に由来する場合に、可能である。例えば、酵母のＧａｌ４結合ドメインとの融合タンパク質として存在する転写因子の活性化因子（ドメイン）は、哺乳類細胞からの濃縮した核抽出物をこの方法で用いるときには、哺乳類細胞からの核抽出物はＧａｌ４を含まないので、バックグラウンドなしに分析することができる。
【００５９】
用いることができる遺伝子調節要素および検討を行う遺伝子調節要素は、画定されたヒトおよび／または動物および／またはウイルス遺伝子調節要素、特に病理学的に興味深い遺伝子の遺伝子調節要素である。例としては、接着分子、成長因子、ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、膜レセプター、セカンドメッセンジャーレセプター、ホルモンレセプター、例えばステロイドレセプター、メタロプロテアーゼ、イムノフィリン、ＮＯ−シンタ−ゼ、５−リポキシゲナーゼ、または免疫学的標的の遺伝子の遺伝子調節要素、例えばインターロイキンのようなサイトカインの遺伝子調節要素、例えばＣＤ４レセプターＴＣＲまたはＢＣＲ（ＴまたはＢ細胞レセプター）のＴまたはＢ細胞特異的発現遺伝子のプロモーター、例えばＴＮＦ（腫瘍壊死因子）のようなリンパ系特異的遺伝子のプロモーター、または例えばＨＴＬＶ−１またはＨＩＶ−１のようなＴ細胞特異的レトロウイルスの遺伝子調節要素が挙げられる。
【００６０】
モデルプロモーターの本発明の方法の特別な利点は、用いることができる遺伝子調節要素が「ＴＡＴＡ」ボックスを含むプロモーター、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）をコードする遺伝子のプロモーターだけでなく、「ＴＡＴＡ」ボックスを欠いているプロモーター、例えばＴ細胞レセプターのβ鎖をコードする遺伝子のプロモーターでもあることである。例えば、「ＴＡＴＡ」ボックスを欠いているプロモーターをモデルプロモーター中または万能レポータープラスミドｐＧＳ１００に組み込み、転写に用いることができる。
【００６１】
転写を行うＤＮＡ配列の特徴は、それがこの配列中に１以上の核塩基を欠いていることである。転写を行うＤＮＡ配列は、好ましくはグアニンまたはシトシンまたはチミンを含まず、すなわち配列がＧ欠如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列である。更に、この配列は２個以上の核塩基、例えばグアニンおよびチミン、またはグアニンおよびシトシン、またはシトシンおよびチミンを欠いていてもよい。
【００６２】
用いられるＧ欠如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列は、特にＧ欠如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列の長さが４００ヌクレオチドを上回り、好ましくは４００〜２０００ヌクレオチド以上であるものである。特に、約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、５０００以上のヌクレオチドの長さの配列が用いられる。特異的核塩基を欠いている配列の特に好ましい長さは、約８００、１２００、１６００または２０００ヌクレオチドの長さである。
【００６３】
ＤＮＡ鋳型は線形または環状ＤＮＡ配列であることができ、例えばＤＮＡ鋳型はポリメラーゼ連鎖反応またはプラスミドによって生成した線状配列であることができる。
【００６４】
１態様では、ＤＮＡ鋳型はプラスミドであり、ベクター、モデルプロモーター、および例えばＧ欠如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列である転写を行うＤＮＡ配列の総てまたは部分から構築される。
【００６５】
本発明の目的は、普遍的に利用可能なレポータープラスミド（万能レポータープラスミド）である。この万能レポータープラスミドは、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃII、ＢａｍＨＩ、ＳｗａＩの異常開裂部位、プラスミドｐＵＣ１９の一部、酵母Ｇａｌ４タンパク質の５つの結合部位、ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ制限部位の間のヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡＴＡ」ボックス、ＢＡＭＨＩおよびＳｗａＩ制限部位の間のＭＬプロモーター（アデノウイルスメジャーレイトプロモーター）ののＩＮＲ（イニシエーター）領域、および長さが約８００ヌクレオチド（塩基対）のＧ欠如配列を含んでいる。普遍的レポータープラスミド中のモデルプロモーターは合成プロモーターであって、５個の酵母Ｇａｌ４結合部位、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃII、ＢａｍｈｉおよびＳｗａＩの異常開裂部位、ヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１のＴＡＴＡボックス、およびＭＬプロモーターのＩＮＲを含んでいる。検討を行う任意の遺伝子調節要素は、このプロモーター領域に組み込むことができる。モデルプロモーターの一部または完全なモデルプロモーターを除いて、検討を行う遺伝子調節要素に置換してもよい。
【００６６】
万能レポータープラスミドの１態様は、ｐＧＳ１００と呼ばれている（図２）。
【００６７】
万能レポータープラスミドｐＧＳ１００の１態様では、合成プロモーターをヌクレオチド位置２１６８および２３３７の間の配列領域に配置する。アデノウイルスメジャーレイト（ＭＬ：major late）プロモーターのイニシエーター領域はヌクレオチド位置２３２２〜２３３７に配置され、ヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１プロモーターのＴＡＴＡボックスを有する領域はヌクレオチド位置２２８９〜２３１６に配置されている。酵母Ｇａｌ４タンパク質の５つの結合部位は、ヌクレオチド位置２１６８〜２２６０に配置されている。
【００６８】
万能レポータープラスミドｐＧＳ１００のもう一つの態様は、図４〜６のヌクレオチド配列（配列番号：１）によって示される。
【００６９】
万能レポータープラスミドｐＧＳ１００は、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 、マシェルオデール・ベグ１ｂ、Ｄ−３８１２４  ブラウンシュバイクに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき寄託された。受託番号はＤＳＭ第１１４５０である。
【００７０】
本発明の方法の特徴は、特異的転写体の検出を直接または間接的に妨害して、特異的転写体の明確な検出を不可能にするタンパク質を転写後に除去しおよび／または分解させることである。除去または分解は、特に簡単に行われる肯定段階、例えば反応を化学的および／または機械的および／または酵素学的工程段階によって停止し、適当ならば、転写体を同時に妨害タンパク質から取り除いて、過剰の標識したヌクレオチドを、この工程段階の後に洗浄段階などによって特異的転写体から除去することができるようにするものを含んでなる。
【００７１】
本発明の方法のこの態様の特徴は、例えば、転写反応の後にタンパク質をプロテアーゼによって分解することができることである。用いることができるプロテアーゼは、例えば亜鉛プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、およびカルボキシプロテアーゼである。特に、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＡ、パパインおよびペプシンを用いることができる。本発明の方法の特別な態様は、プロテイナーゼＫによる消化を転写の後に行うことである。
【００７２】
転写の程度、すなわち転写速度を測定することができるようにするには、特異的転写体の量を測定しなければならない。
【００７３】
本発明の方法の特徴は、転写を標識したヌクレオチドの存在下で行い、特異的転写体を標識することである。例えば、転写体は、適当な放射能標識し低ないヌクレオチドを転写に用いる場合には、非放射能標識体であることができる。用いることができるヌクレオチドの標識基は、例えばダンシル（＝Ｎ−ジメチル−１−アミノナフチル−５−スルホニル）誘導体、フルオレセイン誘導体またはクマリン誘導体のような蛍光基、またはアクリジン誘導体のような化学発光基である。上記の標識基により、特異的転写体を直接検出することができる。更に、転写体の間接検出に適する標識基を用いることも可能である。例としては、ＥＬＩＳＡなどにおける特異的抗ジゴキシゲニン抗体で検出することができるジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン系によって検出することができるビオチン、および官能基を含むリンカーアームであって、続いて検出可能なレポーター基と誘導体京成することができるものである。最後に述べた可能性の一例は、例えば転写の後に、アミノアルキルリンカーであって、化学発光試験においてと反応して検出することができるものである。
【００７４】
本発明の方法の特別な態様は、放射能標識したヌクレオチドの存在下で転写を行うことである。ヌクレオチドは、例えばリン（32Ｐまたは33Ｐ）、硫黄（35Ｓ）またはトリチウム（３Ｈ）で放射能標識することができる。
【００７５】
本発明の方法の特別な態様は、特異的転写体を、固相（固形マトリックス）に結合することによって、例えば、マイクロタイタープレートに結合することによって、または特異的転写体を特殊フィルター膜または他の固相に結合することによって、特に、好ましくはナイロンまたはニトロセルロース製の帯電膜または帯電フィルターに結合することによって、特に好ましくは、例えばジエチルアミノエチル基のような帯電基を含む膜、例えばＤＥＡＥ−セルロース膜に結合することによって、反応混合物から単離する。この態様の特徴は、固形マトリックスに結合した特異的転写体を、特異的転写体の明確な検出が可能な程度まで洗浄段階によって過剰の標識したヌクレオチドから取り出すことができることである。
【００７６】
変性ゲル上での転写体のフェノール化、沈澱およびその後の分離からなる通常の分離および検出と比較して、本発明の方法は、意外なことには、均一に明確に検出することができる特異的シグナルを生じる（例７および図３を参照）。
【００７７】
本発明の方法は、例えば活性化因子の存在下での特異的転写（活性化因子転写）またはインヒビターの存在下での特異的転写（インヒビター転写）によって誘発される特異的シグナルを発生するのに好適であり、このシグナルは、例えば活性化因子またはインヒビターの非存在下で基本転写によって誘発される基本シグナル強度とは少なくとも７倍、好ましくは８倍、特別の場合には９または１０倍だけ異なる（例７および図３を参照）。
【００７８】
本発明の方法の重要な態様は、薬理活性物質のスクリーニングに用いることができることである。候補の薬理活性物質をその活性（例えば、活性化または阻害特性）について試験するには、試験を行う活性物質の存在下で転写を行う。適当であれば、個々の成分、例えば濃縮した核抽出物を、試験を行う活性物質と共に予備インキュベーションすることができる。更に、試験を行う活性物質の特異性を、複数の転写反応混合物であって、それぞれの反応混合物が異なる成分を含んでなるものにおいて平行して試験を行う活性物質の存在下で転写を行うことによって特性決定することができる。
【００７９】
試験を行う活性物質の例は、天然物および／または化学的および結合性物質ライブラリーからの物質であることができる。天然物は、植物、動物、植物分泌物、動物分泌物、および特に真菌、酵母、細菌または藻類のような微生物から単離することができる。
【００８０】
本発明の方法のもう一つの特別な態様は、転写を、試験を行う活性物質、転写因子、補因子または細胞型特異的核抽出物の存在下で行い、平行な反応混合物は、試験を行う活性物質、転写因子、補因子または細胞型特異的核抽出物の非存在下で、他の点では同一条件下で行い、遺伝子調節要素（または遺伝子）および／または転写因子および／または補因子に対する試験を行う活性物質、転写因子、補因子または細胞型特異的核抽出物の活性（例えば、阻害、活性化）または効果を標識した転写体の量の差から決定する。
【００８１】
本発明の方法の特徴は、遺伝子調節に関与しておりかつ検討を行うタンパク質の効果を、同一条件下で平行して行った転写によって測定し、検討を行うタンパク質は２個の反応混合物の一方だけに含まれていることである。
【００８２】
本発明の方法の１態様の特徴は、
a)  少なくとも２つの転写を同一条件下で平行して行い、
但し
b)  転写反応混合物が、異なる量の試験される活性物質、および／または少なくとも１個の転写因子、および／または少なくとも１個の補因子、および／または濃縮した核抽出物を含んでなることだけが異なり、
c)  標識した転写体の生成量を、転写後のそれぞれの反応混合物について測定し、
d)  試験される活性物質、転写因子、補因子および／または濃縮核抽出物の遺伝子調節要素に対する活性および／または特異性を、標識した転写体の生成量の差から測定する
ことである。
【００８３】
この方法により、転写反応混合物が含んでいるそれぞれの個々の成分（例えば、核抽出物（すなわち特異的細胞型）に対する、または特異的転写因子に対する）の効果を標的特異的に試験することができる。例えば、検討を行う活性物質の画定された遺伝子調節要素に対する効果を解析することができる。ここで決定的なことは、転写の反応条件を正確に定義することができることである。
【００８４】
本発明の方法は、遺伝子調節要素、および転写因子および／または補因子および／または細胞型特異的核抽出物を選択することによって好適な反応条件を調節しまたは正確に設定することができるので、個々の因子の病理が的遺伝子発現に対して標的特異的に影響を与える方法を提供する。
【００８５】
この方法が特に有利な点は、画定された条件下で正または負の効果を発揮できる薬理活性物質、特に画定された（標的）遺伝子の転写を活性化しまたは阻害する活性物質であって、画定された遺伝子調節要素および／または画定された転写因子、補因子および／または細胞型特異的核抽出物（または細胞）に特異的効果を有する活性物質を同定することができることである。
【００８６】
本発明は、特異活性物質の同定法の使用に関する。例えば、この方法を用いて、試験する物質の特性決定を行うことができる。例えば、この方法を用いて、画定された条件下での試験する物質の特異性に関して特性決定することができる。この方法によって同定される薬理活性物質は、例えば遺伝子調節要素によって制御されているＤＮＡ配列の転写を阻害または活性化するものである。
【００８７】
本発明の方法のもう一つの特に有利な特徴は、総ての段階を簡単な方法で自動化できることである。例えば、供給ロボットモジュールに接続した試料採取ロボットBiomek 2000 （商標名）（Beckman,ミュンヘン）を用いることができる。次いで、固相に結合した転写体を手動でまたは自動的に、例えばコンベアベルトによって洗浄することができる。
【００８８】
本発明の特徴は、試料採取ロボット、例えばBiomek 2000 （商標名）が、タンパク質画分（例えば、核抽出物および他のタンパク質）、ＤＮＡ鋳型、転写緩衝剤、転写において検討される物質、ピペットチップ、マイクロタイタープレート、および膜のような個々の反応成分を備えていることである。個々の反応は、例えばマイクロタイタープレートのウェル中のこれらの成分からなり、総ての試料採取段階は自動的に行われる。この方法では、プレート当たり９６以上の異なる転写反応混合物を同時に、小試料量、特に１００μｌ未満、好ましくは１０〜５０μｌ、特に２０μｌと組み合わせて処理することができる。それぞれの転写には約１〜１．５時間かかるので、最良の可能なやり方でインキュベーション時間を用いると、この方法では１日当たり１０００以上までの転写を行うことができる。
【００８９】
転写は、例えば２０〜２５℃の温度で行うことができる。約３０℃で転写を行うのが特に好ましい。
【００９０】
試験を行う活性物質、転写因子補因子、および適当ならば、試験を行う濃縮した核抽出物は少量でしか用いることができないが、これらの物質はこれらの物質は多数の転写において各種の反応条件下で試験すべきであり、この方法は転写反応に要する試料量ができるだけ少ないという要件に合うものでなければならない。したがって、本発明の方法がナノリットルスケール、すなわち約５０〜５００ｎｌの反応容積で行うのにも適していることは、特に重要である。
【００９１】
転写法は普遍的に用いることができる。この方法は、転写、および／または補因子、および／または遺伝子転写の調節に直接または間接的役割を果たしている他のタンパク質（すなわち、標的としての特異的タンパク質）、および／または濃縮した核抽出物（すなわち、標的としての特異的核抽出物または特異的細胞型）の遺伝子調節要素（すなわち、標的としての特異的遺伝子）を同定し、特性決定するのに用いることができる。特に、この転写法は、病理学的に興味深い新規な遺伝子調節要素を同定したり、これらの要素の効果を相当する遺伝子調節要素に媒介する遺伝子調節タンパク質の指摘に用いることができる。
【００９２】
細胞分析法と比較して、上記の転写法は標的特異性が一層高い。細胞分析法とは対照的に、個々の成分の細胞への取り込みは、転写の効率に何んら影響しない。更に、上記の方法は簡単かつ速やかに行うことができる（例えば、個々の成分を調製して冷凍保管することができる）。この方法は、実質的にあらゆる細胞型およびあらゆる遺伝子に適用することができるので、標準化が簡単であり、普遍的に用いることができる。
【００９３】
この方法により、医薬品の調製に用いることができる薬理活性物質を同定できる。これらの転写法によって同定された活性物質は、既知の活性物質と比較して副作用がかなり低いものである。例えば、（自己）免疫疾患、代謝疾患、癌、循環器疾患、伝染病、リウマチ、糖尿病、退行性および精神疾患の治療のための医薬品の調製、特に慢性関節リウマチ、多発性硬化症、真性糖尿病、アレルギー、喘息、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤーコブ病、癲癇、精神分裂病、動脈硬化症、および結核の治療用の医薬品の調製に用いることができる。
【００９４】
更に、この普遍的な方法は、多数の他の可能な用途を提供する。例えば、この方法は、動物病理学および動物飼育に、穀物保護に、または植物育種にも同様に用いて、問題の生物からの関連基本転写系、および特異的遺伝子調節要素、転写因子および／または補因子および／または転写反応に直接または間接的に関与している他のタンパク質における特異的な薬理活性物質を見出だすことができる。
【００９５】
原則として、このインビトロ転写法は、酵母、真菌、細菌などの微生物の、または昆虫の遺伝子調節要素、転写の可能な系、転写因子および／または補因子を用いる場合には、これに対応して、材料および食品の保存に用いることができる物質の同定についても同様に用いることができる。
【００９６】
【実施例】
例１：  HeLa核抽出物の調製
HeLa細胞核から出発して、核抽出物を調製する。HeLa細胞核は、様々な会社から市販されている（例えば、「４℃」, Mons; Sigma 、ミュンヘン、Santa Cruz Biotechnology、ハイデルベルグ）。以下に記載する細胞核の加工は４℃（コールドルーム）で行う。緩衝液を、トリスで４℃でｐＨ７．３に相当する室温（ＲＴ）でｐＨ６．８に調整する。使用の前に、緩衝液ＤＴＴ（１Ｍ保存水溶液）で処理して最終濃度を５ｍＭとし、ＰＭＳＦ（２００ｍＭ保存溶液、ＤＭＳＯ中）で処理して最終濃度を１ｍＭとする。
【００９７】
細胞核の加工は、下記の段階を含んでなる。
1.  氷上で細胞核を解凍し、ＮＰＶ容積（核ペレット容積）を測定する。
2.  ２個の異なるガラスビーカーに、それぞれの場合に１／２ＮＰＶ容積の０．０２Ｍ  ＫＣｌ緩衝液（低塩含量の緩衝液：２０ｍｌ  １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、２５０ｍｌ  １００％グリセロール、６．６７ｍｌ  ３Ｍ  ＫＣｌ、１．５ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌとする）、および１．２Ｍ  ＫＣｌ緩衝液（高塩含量の緩衝液：２０ｍｌ  １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、２５０ｍｌ  １００％グリセロール、４００ｍｌ  ３Ｍ  ＫＣｌ、１．５ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌとする）をそれぞれ加える。
それぞれの緩衝液を０．０００７×ＮＰＶ／２  β−メルカプトエタノールおよび０．００１×ＮＰＶ／２  ０．２Ｍ  ＰＭＳＦで処理する。
ペレットを１／２容積の０．０２Ｍ  ＫＣｌ緩衝液に再分散し、乳棒を用いて緩やかにホモゲナイズする（６×）。
3.  ホモゲネートをガラスビーカーに入れて、３０分間連続攪拌しながら１．２Ｍ  ＫＣｌ緩衝液を滴加して処理する。更に３０分間攪拌した後、抽出を終了する。遠心分離（Beckman 遠心分離機、SS34ローター、１４，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）を行い、ペレットおよび上清を別個に更に処理する。
4.  上清を緩衝液１（４０ｍｌ  １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌとする）中で、緩衝液２の伝導率に到達するまで（４０ｍｌ  １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、６６．７ｍｌ３Ｍ  ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０００ｍｌとする）透析を行う（４５〜５５分）。
5.  透析した上清を遠心分離する（Beckman 、SS34ローター、１８，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。HeLa核抽出物は上清中にある（HeLa核抽出物＝HeLaＮＥ）。この抽出物の一部を液体Ｎ２で凍結する。核抽出からのペレットをホモジナイザーに移して、１０ｍｌのＴＧＭＥ／５ｍＭ  ＤＴＴ（１リットルに対するＴＧＭＥ：２５０ｍｌ  １００％グリセロール、５０ｍｌトリスｐＨ７．３ＲＴ、５ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｌ  ５００ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ８．０）で処理し、乳棒で２０×（激しく）ホモゲナイズして、液体Ｎ２で凍結する（HeLa核ペレット）。
【００９８】
例２：  核抽出物の単離のためのホスホセルロースカラムの調製
1.  P11 カラム（商標名）材料を水で繰り返し洗浄する。膨潤した材料の容積を測定する。
2.  ０．５Ｎ  ＮａＯＨを５倍容積加え、５分間放置した後、直ちに折り畳みフィルターで吸引濾過する。
3.  水でｐＨ１１になるまで洗浄する。
4.  ０．５Ｎ  ＨＣｌを２５倍容積加える。５分間放置した後、直ちに吸引濾過する。
5.  水でｐＨ３になるまで洗浄する。
6.  １ＭトリスｐＨ７でｐＨが一定になるまで洗浄する。カラム材料を４℃で保管する。最も好ましくは、一晩平衡させる。
【００９９】
例３：  ホスホセルロースクロマトグラフィによる核抽出物のクロマトグラフィ精製
P11 カラム（商標名）材料の容量は１０ｍｇタンパク質／１ｍｌ材料である。クロマトグラフィは下記の方法で行う。
1.  P11 カラム（商標名）材料をカラムに充填し、緩衝液２（ＤＴＴおよびＰＭＳＦを新たに加えたもの、例１を参照）で平衡させる。カラムをポンプに取り付ける。
2.  核抽出物（緩衝液２中）を（１カラム容積（ＣＶ）／時で）ロードする。
3.  カラムを５ＣＶの緩衝液２で洗浄する（５〜１０ＣＶ／時）。
4.  緩衝液３（４０ｍｌ  １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、２００ｍｌ  ３Ｍ  ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出する。タンパク質がそれ以上溶出しなくなった後、更に２ＣＶの緩衝液３を流す。
5.  緩衝液４（４０ｍｌ  １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、３３３ｍｌ  ３Ｍ  ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出し、ピーク画分を集める。
6.  緩衝液５（４０ｍｌ  １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、５６７ｍｌ  ３Ｍ  ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出し、ピーク画分を集める。
7.  ２種類の溶出物のそれぞれを伝導率が一定になるまで緩衝液２に対して透析した後、一部を液体Ｎ２で冷凍する。
【０１００】
例４：  転写体を分離するためのポリアクリルアミドゲルを用いる標準的転写法
転写反応混合物（最終容積２０μｌ）は下記の成分からなることができる。
a)  予備精製した核抽出物の形態の、または組換え技術によって産生し、適当ならば、追加の特異的転写因子、活性化因子、インヒビター、または融合タンパク質を補足した一般的転写因子、
b)  ＤＮＡ鋳型（例えば検討を行う遺伝子調節要素を有するベクターｐＧＳ１００）、
c)  例えば検討を行う活性物質を含んでなる転写緩衝液、
d)  標識したおよび未標識ヌクレオチド。
【０１０１】
a)について、（例３の）緩衝液４の溶出物および緩衝液５の溶出物は、転写できる核抽出物に含まれている（総ての一般的転写因子）。緩衝液４の溶出物および緩衝液５の溶出物の最適量は、それぞれの個々の調製について決定しなければならない（反応混合物当たり約３μｌの緩衝液４の溶出物および２μｌの緩衝液５の溶出物）。
b)について、反応混合物に対して、ＤＮＡ鋳型（レポータープラスミド、例えばｐＧＳ１００中の遺伝子調節要素）１００ｎｇを通常用いる。
c)について、転写緩衝液（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＫＯＨｐＨ８．２、０．５μｌＢＳＡアセチル化体（保存溶液２０ｍｇ／ｍｌ）、約１０％グリセロール、約７０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）に、それぞれの場合に反応混合物当たり２０ＵのＲＮアーゼインヒビターを加えたもの。
d)について、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰをそれぞれの場合に１００μｍの最終濃度、ＣＴＰを５μＭの最終濃度、ｏ−ｍ−ＧＴＰを２０μＭの最終濃度、α−32Ｐ−ＣＴＰを約０．１２μＭの最終濃度、３０００Ｃｉ／ミリモル、１０ｍＣｉ／ｍｌ）。
【０１０２】
1.  転写緩衝液およびｄＮＴＰを導入し、ＤＮＡ鋳型を加える。
2.  転写活性化因子および緩衝液４溶出物および緩衝液５溶出物を加える。
3.  転写反応を行うため、３０℃で１時間インキュベーションする。
4.  停止混合物（７Ｍ尿素、１０ｍＭトリスｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＮａＯＨｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、３００ｍＭ  酢酸Ｎａ）４００μｌ、およびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）４００μｌを加える。混合して遠心分離する（SS34ローター、Beckman 遠心分離機、５分、１４，０００ｒｐｍ、ＲＴ）。上清を抜き取り、イソプロパノール４００μｌを加えた後、−２０℃で１時間インキュベーションする。
5.  遠心分離（SS34ローター、Beckman 遠心分離機、１４，０００ｒｐｍ、３０分、ＲＴ）して、ペレットを７０％エタノールで洗浄した後、Speedvacで乾燥する。
6.  ペレットをロード用緩衝液（９５５μｌの１００％ホルムアミド（脱イオン化）１０μｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌ、１ＭトリスｐＨ７を２０μｌ、それぞれの場合に０．００３％ブロモフェノールブルー／キシレンシアノール、Ｈ２Ｏを加えて１ｍｌとする）１０μｌに取り、５０℃で１５分間インキュベーションする。
7.  転写体を、１×ＴＢＥを有する５％強度の変性ポリアクリルアミドゲルを展開緩衝液として、分離する。６０ｍＡで２０分間予備展開する。ゲルをロードする。ゲルを６０ｍＡで約１時間展開する。
8.  ゲルを１０％酢酸で固定し、乾燥して、Phosphoimager （商標名）中でＸ線フィルターに暴露する。
【０１０３】
例５：  転写体を結合するためのフィルターを用いて自動化できる上記のインビトロ転写法のプロトコール
1.  転写緩衝液およびｄＮＴＰを導入して、ＤＮＡ鋳型を加える。
2.  緩衝液４溶出物および緩衝液５溶出物、および適当ならば、転写活性化因子または転写インヒビターを加える。
3.  混合物３０℃で１時間インキュベーションして、転写反応を行う。
4.  ５μｌのプロテイナーゼＫ混合物（１μｌプロテイナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）、１μｌ  １０％ＳＤＳ、０．５μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡｐＨ８、１μｌ  ５０ｍＭ  トリスｐＨ７．８、Ｈ２Ｏを加えて５μｌとする）を加える。
5.  ３０℃で１５分間インキュベーションする。
6.  ＤＥＡＥ膜NA45（商標名）(Schleicher und Schuell)を膜洗浄緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％ピロリン酸ナトリウム）で簡単に洗浄する。
7.  この反応混合物から膜に５μｌを採取し、５分間乾燥する。
8.  膜洗浄緩衝液（＋１％Triton）約１００ｍｌ中で膜を緩やかに４×１５分間振盪する。
9.  Whatmann 3 MM （商標名）濾紙(Whatmann 、メイドストーン、英国）に膜を移し、風乾し、フィルムで被覆して、フィルターをPhosphoimager （商標名）を用いてＸ線フィルムに暴露する。
【０１０４】
例６：  フィルターを用いる上記のインビトロ転写法に続いて、転写反応を３種類の異なるレポータープラスミドを用いて平行して行う。
手続は、例１〜３および５に記載した通りである。用いるレポータープラスミドはｐＭＲＧ５（ＨＩＶプロモーターのＴＡＴＡボックス、ＭＬプロモーターのイニシエーター領域、およびｐＵＣ１９中の長さが約４００ヌクレオチドの無Ｇカセット(Kretschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell. 78, 525-534) 、ｐＧＳ１００（図２）、およびｐＶβＭＬ（ｐＧＳ１００と同様に構築されているが、８００ｂｐのＧ欠如カセットの代わりに４００ｂｐだけのＧ欠如カセットを含む）である。それぞれの場合に、ＤＮＡ鋳型１００ｎｇ、およびP11 （商標名）画分（緩衝液４溶出物および緩衝液５溶出物）３μｌを転写反応に用いる。反応は、それぞれの場合に、活性化因子（Ｇａｌ４結合ドメインとポリグルタミン活性化ドメインとからなる融合タンパク質）を用いずにおよびを用いて平行して行う。結果を、図１に示した。
【０１０５】
図１には万能レポータープラスミドｐＧＳ１００（図２）を有する２種類の標準的プロモーターの比較が示されている。転写反応は例６に記載した通りに行った。
【０１０６】
図１のそれぞれの場合に比較したものは、基本(A) および活性化転写(B) であった。用いた活性化因子はＧａｌ４結合ドメイン（９４アミノ末端アミノ酸）およびポリグルタミン活性化ドメイン（１１グルタミン酸単位の合成ペプチド）からなる融合タンパク質であった。プロットしたデーターは、バックグラウンドを差し引いた後の（ホスホイメージャー(phosphoimager) によって得られる相対的単位での）絶対値である。ｐＧＳ１００をレポータープラスミドとして用いた転写反応では、両方とも高い絶対値を示し、合成プロモーターの構築が異なっているため、ｍＲＧ５より優れた活性が測定された。更に、４００ヌクレオチドを上回る長さのＧ欠如配列の正の効果は明らかである。
【０１０７】
図２に示される万能レポータープラスミドｐＧＳ１００は、ｐＵＣ１９において長さが約８００塩基対のＧ欠如領域のモデルプロモーター上流として合成プロモーター領域を含む。ＢａｍＨＩおよびＳｗａＩ制限部位内には、アデノウイルスメジャーレイト（ＭＬ）プロモーターのイニシエーター領域が配置されている。ＳａｃIIとＢａｍＨＩ制限部位の間には、ヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１プロモーターのＴＡＴＡボックスを有する領域が配置されている。これらの２個の基本プロモーター要素（イニシエーターおよびＴＡＴＡボックス）により、インビトロでの基本転写ができる。これらの候補標的遺伝子はスクリーニングに特に重要であることがあるので、検討を行う遺伝子の相当する領域について（相当する遺伝子調節要素）個々にそれらを交換することができる。標的遺伝子の任意の調節領域を、基本プロモーターのポリリンカー下流に導入することができる（特異的活性化）。あるいは、全プロモーター領域を交換することもできる。ポリリンカーの上流では（ＳａｃII〜ＰｓｔＩ）ｐＧＳ１００は、酵母Ｇａｌ４タンパク質の５個の結合部位を含んでいる。これにより、合成転写活性化因子、例えば任意の所望な活性化ドメイン（例えば、単純ヘルペストランスアクチベーターＶＰ１６）およびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる融合タンパク質を分析することもできる。無Ｇ配列はｐＧＳ１００の本質的単位である。
【０１０８】
例７：  標準的転写法で得られる放射能標識した転写体のシグナル強度（転写体の量、したがって転写強度の尺度として）と上記のインビトロ転写法で得られるシグナル強度との比較。
転写反応は、例１〜５に記載した通りに行い、平行反応混合物をフィルター分析法（例５）またはゲル分析法（例４）で分析する。それぞれの場合に、ｐＭＲＧ５  ２００ｎｇを反応のＤＮＡ鋳型として用いる。幾つかの転写反応を３０ｎｇのＧａｌ４−ＶＰ１６の存在下で行い、これを活性化因子として用いる。結果を図３に示した。
【０１０９】
図３は、様々な反応条件下で得られる（転写体の量、したがって転写強度の尺度としての）シグナル強度の比較を示している。転写反応は、例７に記載した通りに行う。
【０１１０】
異なる反応条件下での２種類の異なる方法で得られたシグナル強度の比較は、本明細書に記載のインビトロ転写法を用いる基本転写(II)だけでなく活性化転写(III) も測定することができることを示しており、シグナル強度は、通常の転写法を用いるときに得られるものと同様である。
【０１１１】
基本シグナル強度も測定することができるということは極めて重要であり、上記転写法は転写インヒビターのスクリーニングにも用いることができる。特異的ＲＮＡポリメラーゼIIインヒビターα−アマニチンにより、シグナル強度は約８分の１に減少する（比較III およびIV）。
【０１１２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】様々な長さのＧ欠如配列を有する各種の遺伝子調節要素およびレポータープラスミドを用いた転写反応の放射性カウントを示した図である。
A)  基本転写：  プロモーターを活性化せずに得られる放射性転写体の量（相対的単位）（基本的にシグナルの強さ）；B)  活性化転写：  Ｇａｌ４−ポリグルタミンでプロモーターを活性化して得られる放射性転写体の量（相対的単位）。I)  用いたレポータープラスミドはｐＭＲＧ５であった(Kretschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell 78, 525-534)。ｐＭＲＧ５の合成プロモーターはＨＩＶプロモーターのＴＡＴＡボックス、ＭＬプロモーターのイニシエーター、およびｐＵＣ１９における長さが約４００ヌクレオチドのＧ欠如配列を含む。II) 用いたレポータープラスミドはｐＶβＭＬであった。レポータープラスミドｐＶβＭＬの構築はレポータープラスミドｐＧＳ１００についてと同様であるが、８００ヌクレオチドの代わりに長さが４００ヌクレオチドだけのＧ欠如配列を含む。III)  用いたレポータープラスミドはｐＧＳ１００であり、これは約８００ヌクレオチドのＧ欠如配列を含む。
【図２】万能レポータープラスミドｐＧＳ１００を示した図である。
【図３】通常の標準的転写法と上記の無細胞のインビトロ転写法との効率を比較した図である。
A)  特異的転写体が、フェノール処理、エタノール沈澱、続いて変性ゲル電気泳動によりタンパク質および過剰のヌクレオチドを含まない、通常の標準的転写法、B)  タンパク質をプロテイナーゼＫで消化し、過剰のヌクレオチドを、ＤＥＡＥフィルターに結合している特異的転写体の洗浄によって除去した、インビトロ転写法。I)  転写に用いられる材料は、転写が可能でありかつP11 カラム（商標名）上で精製したHeLa細胞核からの抽出物であり、相当するＤＮＡ鋳型を持たない（コントロール実験）。II)   基本転写：  I の反応混合物に相当する反応混合物をＤＮＡ鋳型としてのレポータープラスミドｐＭＲＧ５で処理し、転写反応を行う。基本シグナル強度はこの方法で測定する。III)  活性化転写：  反応混合物IIに相当する反応混合物を更に転写活性化因子である、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６の活性化ドメインからなる融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＶＰ１６）で処理し、転写を行う。この方法で、活性化シグナル強度が得られる。IV)   III の転写反応混合物に相当する反応混合物をＲＮＡポリメラーゼIIインヒビターとしてのα−アマニチンで処理した（コントロール実験）。
【図４】レポータープラスミドｐＧＳ１００のヌクレオチド配列を示した図である。
【図５】レポータープラスミドｐＧＳ１００のヌクレオチド配列を示した図である。図４の続きである。
【図６】レポータープラスミドｐＧＳ１００のヌクレオチド配列を示した図である。図５の続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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