(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）：
【化１】
0004585128.tif 000004
で表されるＤＮＡポリメラーゼα阻害剤。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼαが、哺乳類由来のものであることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な、ＤＮＡポリメラーゼα阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物が有するＤＮＡポリメラーゼは、分子量や生化学的な特徴、及びＤＮＡ合成における機能の違い等からα、β、γ、δ、ε、ζ、η及びθの８種類が存在することが知られている。これらの酵素は、各々の機能に応じて生体内で分業してＤＮＡ合成に関与していると考えられている。即ち、ＤＮＡポリメラーゼα、δ及びεは、核のＤＮＡ複製用で、γはミトコンドリアのＤＮＡ複製用、そしてβ、ζ、η及びθは、核ＤＮＡの修復に関与していると考えられており、また、βは、ＤＮＡ組換えにも関与していることが示唆されている。しかしながら、ＤＮＡ合成反応におけるＤＮＡポリメラーゼの占める生化学的な役割は未だ不明な点が多い。
【０００３】
一般に、酵素の役割を研究するために、酵素の阻害剤を用いる方法が有用である。酵素の阻害剤は、特定の酵素のみを選択的に阻害するものであれば、その生物学的機能をよりよく解明することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼαのみを選択的に阻害する酵素があれば、ＤＮＡポリメラーゼαを識別するための分子プローブとして利用することもできる。
【０００４】
しかしながら、従来、ＤＮＡポリメラーゼαの阻害剤として知られているアフィジコリン(aphidicolin)は、ＤＮＡポリメラーゼαの他に、δ及びεも阻害する。これらのＤＮＡポリメラーゼα、δ及びεは、何れもＤＮＡの複製に関与することが知られていることから、ＤＮＡポリメラーゼαの生物学的機能解明のためには、αのみを選択的に阻害する物質の開発が望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼαを選択的に阻害し得る化合物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、下記式（Ｉ）：
【化２】
0004585128.tif 000002
【０００７】
で表されるデヒドロアルテヌシン(dehydroaltenusin)が、ＤＮＡポリメラーゼαに対する阻害活性があることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
デヒドロアルテヌシンは、従来、ミオシンＬ鎖キナーゼ阻害活性を有することが知られているが（Thomasら、J. Chem. Soc. D. 8, 393 (1971)、Nakanishiら、Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1333-1335(1995)）、ＤＮＡポリメラーゼαの活性を阻害することは知られていなかった。
【０００９】
また、本発明者らは、デヒドロアルテヌシンは、ＤＮＡ複製に関与するポリメラーゼα、δ及びεのうち、δ及びεは阻害せず、αのみを選択的に阻害することも見出した。
【００１０】
さらに、本発明者らは、デヒドロアルテヌシンは、哺乳類のＤＮＡポリメラーゼαは阻害するが、魚等の他の脊椎動物や植物のＤＮＡポリメラーゼαは阻害しないことも見出した。魚と哺乳類のＤＮＡポリメラーゼは、それらのアミノ酸配列の相同性が高いにもかかわらず、デヒドロアルテヌシンが哺乳類のＤＮＡポリメラーゼを選択的に阻害することは、驚くべきことであった。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤について詳細に説明する。
【００１２】
本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤は、上記式（Ｉ）の構造を有する。式（Ｉ）の化合物の立体配置は、ＤＮＡポリメラーゼα阻害活性を有する限り特に制限はない。
【００１３】
本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤であるデヒドロアルテヌシンそれ自体は、既知の化合物である。
【００１４】
デヒドロアルテヌシンは、例えば、NakanishiらがBiosci. Biotech. Biochem., 59(7), 1333-1335(1995)に記載する方法によりPenicillium verruculosum IAM-13756の培養液から得ることもできるし、RosettらがBiochem. J., 78, 390(1957)に記載する方法によりAlternaria tenuisから抽出することもできる。
【００１５】
本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤は、ＤＮＡ複製に関与するポリメラーゼα、δ及びεのうち、δ及びεに対してはほとんど阻害活性を有しないのに対して、αにのみ極めて高い阻害活性を有する。
【００１６】
また、本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤は、哺乳類（例えば、マウス、仔ウシ）のＤＮＡポリメラーゼαに対する高い阻害活性を有する一方で、同じ脊椎動物であっても魚類（例えば、サケ）や、植物（例えば、カリフラワー）のＤＮＡポリメラーゼαに対してはほとんど阻害活性を有さず、既知のＤＮＡα阻害剤であるアフィジコリンと比較して、ＤＮＡポリメラーゼ群の酵素のうち、特に哺乳類のＤＮＡポリメラーゼαに対して極めて高い選択性を有する。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤の実施例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない
以下の例において、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、Mizushinaら（Biochim. Biophys. Acta in press、Biochem. Biophys. Res. Commun. 273, 784-788(2000))、Soら(Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27, 129-155(1992)）の方法に従い、鋳型−プライマーＤＮＡとしてｐｏｌｙ（ｄＡ）／オリゴ（ｄＴ）12〜18（Pharmacia社）を、ヌクレオチド基質として［3Ｈ］−ｄＴＴＰ(New England Nuclear社）を用いて測定した。
【００１８】
例１）デヒドロアルテヌシンの哺乳類ＤＮＡポリメラーゼα及びβ対する阻害活性の比較
仔ウシ胸腺から精製したＤＮＡポリメラーゼα、及びE. coli JMpβ5から精製した組み換えラットＤＮＡポリメラーゼβに対するデヒドロアルテヌシンの阻害活性を測定した。
【００１９】
各濃度のデヒドロアルテヌシンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を準備し、30秒間超音波処理した。得られた処理試料４μＬを、16μＬの各酵素溶液（１ｍＭのジチオスレイトール、５０％のグリセロール及び０．１ＭのＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に、最終濃度０．０５ユニットに調整）と混合し、１０分間０℃に維持した。これらの得られた混合物１６μＬを上記各酵素用の反応標準溶液に添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。デヒドロアルテヌシン非存在下の活性を１００％として、各濃度における残存阻害活性を求めた。
【００２０】
得られた阻害曲線を図１に示す。
【００２１】
図１から、デヒドロアルテヌシンは、ＤＮＡポリメラーゼαに対して０．６８μＭの濃度で５０％阻害活性を示し、４μＭでほぼ完全に阻害することが分かる。哺乳類ＤＮＡポリメラーゼαに対する従来の阻害剤であるアフィジコリンは、４０μＭで完全に阻害することから（Oguroら、Eur. J. Biochem. 97, 603-607(1979)）、本発明のデヒドロアルテヌシンのＤＮＡポリメラーゼαは、アフィジコリンのＤＮＡポリメラーゼαよりも阻害活性が約１０倍高いことが分かる。
【００２２】
例２）デヒドロアルテヌシンの他のＤＮＡポリメラーゼに対する阻害活性の比較
仔ウシＤＮＡポリメラーゼδ、ラットＤＮＡポリメラーゼβ、ヒトＤＮＡポリメラーゼε、チェリーサーモン(Oncorhynchus masou)ＤＮＡポリメラーゼα及びδ、カリフラワーＤＮＡポリメラーゼＩ及びIIに対する阻害活性を例１と同様に測定した。カリフラワーＤＮＡポリメラーゼＩ及びIIは、それぞれＤＮＡポリメラーゼα及びβと同様の生化学的性質を有するものである。
【００２３】
各々の酵素に対する阻害活性（ＩＣ50）を以下の表１に示す。
【００２４】
【表１】
0004585128.tif 000003
【００２５】
上記表１に示すように、本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤であるデヒドロアルテヌシンは、ＤＮＡポリメラーゼαに対して極めて強い阻害活性を示す一方で、他のＤＮＡポリメラーゼ（β、δ及びε）に対する阻害活性は非常に低い。
これらのことから、デヒドロアルテヌシンは、ＤＮＡポリメラーゼ群のうち、ＤＮＡポリメラーゼαに対する選択的阻害活性を有するといえる。
【００２６】
更に、本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤であるデヒドロアルテヌシンは、ＤＮＡポリメラーゼαのうちでもその由来が魚類や植物のような哺乳類以外のものに対しては阻害活性が非常に低い。
【００２７】
これらのことから、デヒドロアルテヌシンは、特に、哺乳類のＤＮＡポリメラーゼαに対して極めて高い選択的阻害活性を有するといえる。
【００２８】
デヒドロアルテヌシンの、仔ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼαに対する阻害機序を調べた。
【００２９】
１）測定例１
ＤＮＡ鋳型−プライマーＤＮＡ及びｄＴＴＰ基質について、それぞれLineweaver-Burkのプロットを求めた結果、デヒドロアルテヌシンはＤＮＡ鋳型に対して拮抗的に作用し、基質に対して非拮抗的に作用することを確認した。
【００３０】
２）測定例２
ＤＮＡ鋳型−プライマーＤＮＡ及びｄＴＴＰ基質について、デヒドロアルテヌシンの阻害定数を求めた結果、ＤＮＡ鋳型に対して０．２３μＭ、ｄＴＴＰ基質に対して０．１８μＭであった。
【００３１】
３）測定例３
仔ウシＤＮＡポリメラーゼαの４つのサブユニットのうちｐ１８０サブユニットからアミノ末端（１〜３２９）及びカルボキシル末端（１２８０〜１４６５）を切断したのコア領域（ｐ１１０）と一本鎖ＤＮＡ（Ｍ13  ＤＮＡ（Takara（宝酒造（株））を用いて、デヒドロアルテヌシンとの相互作用をゲルシフト分析により調べた。
【００３２】
その結果、１分子のデヒドロアルテヌシンは、１分子の一本鎖ＤＮＡと拮抗すること、及びデヒドロアルテヌシンは、ＤＮＡポリメラーゼαの最大サブユニットにあるＤＮＡ結合部位に直接結合することにより酵素活性を阻害することが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のデヒドロアルテヌシンのＤＮＡポリメラーゼαおよびβに対する阻害曲線を示すグラフである。
【図１】
0004585128.tif 000005