(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像装置により細胞群の画像を撮像して画像を情報処理装置に取り込み、情報処理装置において、得られた画像に基づいて細胞についての計測を行う細胞計測方法において、
細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、
前記細胞収容空間に細胞群を配置し、
前記細胞収容空間の液体に特定の物質を供給して、当該細胞収容空間の一端から他端に向かって液体中に特定物質の濃度勾配を形成させ、
前記細胞収容空間内の細胞群を撮像装置により撮像して、情報処理装置に取り込み、
得られた画像から細胞特徴量と特定物質の濃度との対応関係を示す情報を生成すること
を特徴とする細胞計測方法。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞計測方法であって、
濃度勾配は、蛍光物質が形成する濃度勾配を蛍光観察によって測定すること
を特徴とする細胞計測方法。
【請求項３】
請求項１および２のいずれか一項に記載の細胞計測方法であって、
細胞特徴量が、細胞の脱顆粒、運動速度、運動方向特異性、大きさ、平均直径、面積、コントラスト、形態変化、細胞内分子の局在変化、および、遺伝子発現のいずれかであることを特徴とする細胞計測方法。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞計測方法であって、
細胞特徴量は、画像より輪郭を求めて、閉形状のものを１個の細胞として識別することによって、その識別された細胞から得られる特徴量であることを特徴とする細胞計測方法。
【請求項５】
撮像装置により細胞群の画像を撮像して画像を情報処理装置に取り込み、情報処理装置において、得られた画像に基づいて細胞についての計測を行う細胞計測方法において、
細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、
前記細胞収容空間に細胞群を配置し、
前記細胞収容空間の液体に特定の物質を供給して、当該細胞収容空間の一端から他端に向かって液体中に特定物質の濃度勾配を形成させ、
前記細胞収容空間内の細胞群を撮像装置により撮像して、情報処理装置に取り込み、
情報処理装置において、
得られた画像について、前記濃度勾配に沿って複数の領域に区画し、各領域における画像から特徴量を抽出し、
前記抽出された特徴量と濃度勾配との対応関係を示す情報を生成すること
を特徴とする細胞計測方法。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞計測方法おいて、
前記特徴量は、細胞の画像が示すコントラストの違いによって抽出されるものであること、を特徴とする細胞計測方法。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞計測方法において、
前記各領域における画像から、各領域に存在する細胞全体の個数に対する、当該領域において特定の性質を有する細胞の個数の割合を、特徴量として抽出すること、を特徴とする細胞計測方法。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞計測方法において、
前記特定の性質が、細胞の脱顆粒である細胞計測方法。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞計測方法において、
前記細胞がマスト細胞である細胞計測方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の細胞計測方法において、
前記各領域における画像から、各領域に存在する細胞全体の運動についての、平均値、中央値、分散および標準偏差のいずれかの指標を、特徴量として抽出すること、を特徴とする細胞計測方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞計測方法において、
前記特徴量として抽出されるものが細胞の運動速度についての指標である細胞計測方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の細胞計測方法において、
前記特徴量として抽出されるものが細胞の運動方向特異性についての指標である細胞計測方法。
【請求項１３】
細胞計測方法において、
観察時に、観察すべき細胞群を収容する細胞収容領域と、前記細胞収容領域を挟んで連通し、使用時に、それぞれに液体が入れられ、前記細胞収容領域を液体で満たす、第１液溜空間および第２液溜空間と、を有する細胞観察支援装置と、使用時に、前記細胞収容領域に収容されている細胞群の画像を取得し、取得した画像に基づいて、細胞に関する情報を収集する情報処理装置と、を用い、
前記観察すべき細胞群を配置し、
第１液溜空間および第２液溜空間と、前記細胞収容領域とに液体を満たし、かつ、
前記第１液溜空間の液体中に、前記細胞を刺激する細胞刺激物を添加した後、
前記撮像装置により、異なるタイミングで複数回、細胞群の画像を取得する処理と、
各回に取得した前記画像について、前記画像に表れる細胞収容領域を、前記第１の液溜空間側から前記第２の液溜空間側に沿って複数の区画に分け、それぞれの区画に含まれる細胞の総個数を計数すると共に、予め定めた特徴量が表れている特定の細胞を識別して、その個数を計数する処理と、
前記計数結果に基づいて、それぞれの区画について、それぞれの区画内で計数された総個数に対する、特徴量が表れている特定の細胞個数の割合を算出する処理と、
前記特徴量が表れている特定の細胞個数の割合に関する経時的変化を示す情報を生成する処理と、
指示に応じて、前記経時的変化を示す情報を出力する処理と、を行うことを特徴とする細胞計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞計測方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医薬の開発、検査技術の開発等のために、細胞について顕微鏡等を用いて観察し、種々の計測を行って、例えば、医薬の細胞への影響に関する情報等の各種情報を収集することが行われている。この種の観察、測定等を行う場合、効率を上げるため、細胞を収容して観察等を行うための微小区画である観察サイト（以下単にサイトという）が、複数、二次元的に配置された観察支援機器が用いられる。【０００３】
この種の観察支援機器を用いて細胞の観察、測定等を行う場合には、観察支援機器を顕微鏡のＸＹＺステージ上に載せ、ステージを対物レンズ系に対して二次元（ＸＹ）方向に相対移動させて、複数のサイトを、順次、顕微鏡の視野内に位置させ、一定時間間隔で同じ対象を撮影する経時的撮影（タイムラプス撮影）が行われる。このため、この種の顕微鏡を用いた光学測定器では、各サイトを顕微鏡の視野内に正確に位置させるように、ステージの相対移動を精密に制御している。このようなタイムラプス観察については、例えば、非特許文献としては、“Shiro Kanegasaki et al. , A novel optical assay system for the quantitative measurement of chemotaxis. Journal of Immunological Methods 282 (2003) 1 11”に記載されている。また、特許文献としては、“特開２００２−２７７７５４号公報”に記載されている。【０００４】
ところで、化合物に対する細胞の反応、応答性等を観察する場合においては、細胞の種類ごとの、反応性の差異を測定したり、細胞の条件を変えた場合での応答性の変異を測定したりすることが求められる。【０００５】
このような場合には、適切な濃度で実験をすることによって良好な測定結果を得ることができる。例えば、ある刺激に対する細胞の応答性を細胞の種類ごとに比較したい場合、細胞の条件を変えた際の細胞応答性の変化を比較したい場合、設定した濃度が高すぎたり低すぎたりすると細胞の種類ごとでの差異が分かりづらく、良好な実験結果が得られない。【０００６】
そのため、化合物に対する細胞の応答性を試験するにあたっては、化合物刺激の適切な濃度を設定する必要がある。その適切な濃度条件を設定するにあたり、濃度条件を複数設定して各々の濃度について個別に細胞反応の計測を行う必要がある。しかし、従来の技術では、そこまで配慮されていなかった。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、細胞に関する反応を計測する際に、幅広い濃度範囲での計測を一度に行うことができる技術を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、
撮像装置により細胞群の画像を撮像して画像を情報処理装置に取り込み、情報処理装置において、得られた画像に基づいて細胞についての計測を行う細胞計測方法において、
細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、
前記細胞収容空間に細胞群を配置し、
前記細胞収容空間の液体に特定の物質を供給して、当該細胞収容空間の一端から他端に向かって液体中に特定物質の濃度勾配を形成させ、
前記細胞収容空間内の細胞群を撮像装置により撮像して、情報処理装置に取り込み、
得られた画像から細胞特徴量と特定物質の濃度との対応関係を示す情報を生成すること
を特徴とする細胞計測方法が提供される。
【０００９】
本発明の第２の態様によれば、
撮像装置により細胞群の画像を撮像して画像を情報処理装置に取り込み、情報処理装置において、得られた画像に基づいて細胞についての計測を行う細胞計測方法において、
細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、
前記細胞収容空間に細胞群を配置し、
前記細胞収容空間の液体に特定の物質を供給して、当該細胞収容空間の一端から他端に向かって液体中に特定物質の濃度勾配を形成させ、
前記細胞収容空間内の細胞群を撮像装置により撮像して、情報処理装置に取り込み、
情報処理装置において、
得られた画像について、前記濃度勾配に沿って複数の領域に区画し、各領域における画像から特徴量を抽出し、
前記抽出された特徴量と濃度勾配との対応関係を示す情報を生成すること
を特徴とする細胞計測方法が提供される。
【００１０】
本発明の第３の態様によれば、
細胞計測方法において、
観察時に、観察すべき細胞群を収容する細胞収容領域と、前記細胞収容領域を挟んで連通し、使用時に、それぞれに液体が入れられ、前記細胞収容領域を液体で満たす、第１液溜空間および第２液溜空間と、を有する細胞観察支援装置と、使用時に、前記細胞収容領域に収容されている細胞群の画像を取得し、取得した画像に基づいて、細胞に関する情報を収集する情報処理装置と、を用い、
前記観察すべき細胞群を配置し、
第１液溜空間および第２液溜空間と、前記細胞収容領域とに液体を満たし、かつ、
前記第１液溜空間の液体中に、前記細胞を刺激する細胞刺激物を添加した後、
前記撮像装置により、異なるタイミングで複数回、細胞群の画像を取得する処理と、
各回に取得した前記画像について、前記画像に表れる細胞収容領域を、前記第１の液溜空間側から前記第２の液溜空間側に沿って複数の区画に分け、それぞれの区画に含まれる細胞の総個数を計数すると共に、予め定めた特徴量が表れている特定の細胞を識別して、その個数を計数する処理と、
前記計数結果に基づいて、それぞれの区画について、それぞれの区画内で計数された総個数に対する、特徴量が表れている特定の細胞個数の割合を算出する処理と、
前記特徴量が表れている特定の細胞個数の割合に関する経時的変化を示す情報を生成する処理と、
指示に応じて、前記経時的変化を示す情報を出力する処理と、を行うことを特徴とする細胞計測方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る細胞計測システムの原理を示す説明図である。
【００１２】
【図２】図２は、本発明の細胞計測を行う際に用いることができる細胞計測システムの構成の一例を示すブロック図である。
【００１３】
【図３】図３は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第１の例を示す断面図である。
【００１４】
【図４】図４は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第２の例を示す断面図である。
【００１５】
【図５】図５は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第３の例を示す断面図である。
【００１６】
【図６】図６は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第４の例を示す断面図である。
【００１７】
【図７】図７は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第５の例を示す断面図である。
【００１８】
【図８】図８は、添加後におけるFITC分子の拡散のようすを、蛍光観察により測定した結果を示すグラフである。
【００１９】
【図９】図９は、刺激物質により細胞が脱顆粒して、コントラストが変化するという特徴を捉える場合について示す説明図である。
【００２０】
【図１０】図１０は、得られた画像について、濃度勾配に沿って、画面を複数の領域に区画して、特徴量を抽出する方法を示す説明図である。
【００２１】
【図１１】図１１は、各地点（区画）で脱顆粒細胞の割合を計算したグラフである。
【００２２】
【図１２】図１２は、走化活性強度の指標として細胞運動の濃度勾配方向の速度を採用し、その値をチャネル上の各位置において計測した結果を示すグラフである。
【００２３】
【図１３】図１３は細胞の刺激に対する何らかの応答性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、発明を実施するための最良の形態について、図面を参照して説明する。先ず、本発明の原理について説明し、ついで、具体的な適用について説明する。【００２５】
本発明は、細胞が多数存在する平面上に濃度勾配を再現性よく形成させ、その濃度勾配上の各位置での細胞の応答を計測することにより、幅広い濃度範囲での計測を一度に行うことを可能とする。その結果、本発明により、最適な細胞刺激濃度を探索することに必要となる実験を削減することができて、実験の効率を高める。また、細胞を刺激する化学物質の濃度が位置によって連続的に設定されるため、最適な濃度での評価が可能となる。【００２６】
データの解析方法としては、次のような考え方が可能である。すなわち、後述するように、撮像された画面を短冊状に領域を区切り、各々の領域に含まれる細胞集団の特徴量を得た後、解析する。
（ａ）最適な濃度条件における細胞の薬剤応答性評価方法（最適条件の選定方法）
細胞の薬剤に対する反応性を測定する場合、その細胞及び薬剤に対して、適当な薬剤処理濃度を選定する必要がある。従来このような場合においては適当な濃度をいくつか選択して、その各々の濃度における細胞性質を独立に測定することにより、適当な濃度を選定していた。この場合、より適当な濃度を選択するためには、多数の濃度において実験を繰り返し、あるいは並行して行う必要があった。本技術では、細胞に対する薬剤の処理濃度が連続的に変化した際の、細胞性質の変化についての連続的なデータを取得することができる。【００２７】
例えば二種類以上の細胞群がある場合において、その各細胞群の薬剤に対する反応性の差異を検討する場合、濃度勾配を用いる本技術により各々の細胞群について連続的な薬剤濃度での反応性データを一括して取得することができる。その一連の濃度条件の中から、各細胞群の性質の差異を評価する最もふさわしい濃度を選択し、その濃度において各細胞郡の薬剤応答性の比較を行うことができる。この手法により、多数の薬剤濃度で細胞応答性を評価する一連の検討実験が不要となり、簡便かつ確実に質の高いデータを取得することが可能となる。
（ｂ）細胞の薬剤応答性の特性を表す、関数もしくは値の取得
本手法により、細胞の薬剤に対する応答性を連続的に評価することができる。ここで取得される“一連の濃度-応答性関係データ”をもとに、細胞の薬剤応答性の特性を示す関数もしくは値を取得することが可能である。例えば、ある試験において、細胞の薬剤に対する反応性が、その薬剤濃度に対する特定の関数の形でよく表される場合、本試験で得られたデータをその関数に対して適宜フィッティングことにより、試験した細胞群における薬剤応答の濃度依存性を近似する関数を得ることができる。ここでいう特定の関数としては、シグモイド関数などが想定されるが、これに限らない。また、その関数から、極大点、極小点、変極点などの特徴的な点に対応する濃度を取得して、その値を当該細胞群の当該薬剤に対する反応性の特徴量として採用することもできる。【００２８】
次に、本発明の実施形態について図１を参照して説明する。図１に示すように、本実施形態では、複数の細胞が配置された空間に、細胞の反応を見るための特定の物質についての濃度勾配を形成する。そのため、観察部材１００により、細胞を収容する空間として細胞収容空間１１０が形成される。図１に示す細胞収容空間１１０は、原理の説明をするため、その構造を模式的に示す。具体的な構成については後述する。【００２９】
この細胞収容空間１１０に、細胞に無害な液体１２０を満たし、この中に、観察したい細胞２００を、複数個（細胞群）、分散させて配置する。この状態で、細胞の反応を見るための物質（以下、刺激物質という）１３０を、細胞収容空間１１０の一方から注入して、細胞収容空間１１０内に濃度勾配１３１を形成させる。この例では、化合物等の刺激物質１３０を溶解した溶液を注入し、細胞収容空間１１０に特定の刺激物質１３０の濃度勾配１３１が形成された状況において、各細胞２００の状態を、顕微鏡３１０を介して、ディジタルカメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）３２０により撮像する。なお、本実施形態では、細胞収容空間１１０をシリコンウェハ上にフォトリソグラフ技術を用いて複数個（例えば、１２個）形成する。そして、それぞれの細胞収容空間１１０における濃度勾配の各位置における細胞の応答性を計測する。この方法により、化合物の細胞に対する作用の比較を容易に行うことが可能となる。【００３０】
刺激物質に対する細胞の応答性は、濃度に応じて異なる。細胞が示す応答として、例えば、遺伝子発現、形態変化、生理活性物質の放出など、様々な細胞現象が考えられる。こられの応答として、細胞は、外部から観察できる何らかの特徴量を示す場合がある。本発明では、この性質を利用して、細胞群が示す特徴量を細胞群の画像を解析することにより抽出して、刺激物質に関する細胞の応答に関する情報を、取得する。本発明の場合、同じ画面内に、濃度勾配が形成される。このため、濃度を変えては、実験を繰り返すといった試行錯誤による手間を要しない。１回の実験で濃度の違いによる応答を観察することができる。【００３１】
細胞収容空間１１０は、具体的には、図３から図７に示すような、様々な形態の観察部材１００により実現することができる。この細胞収容空間１１０は、細胞群を平面上に、分散配置させて、外部から顕微鏡等を介して観察することができるようにするためのものである。そのため、扁平な構造となっている。厚さは、例えば、細胞の大きさ程度である。【００３２】
図３に示すものは、シリコンウェハ１１５に、フォトリソグラフ技術を用いて、細胞収容空間１１０となる扁平な彫り込みと、その一端側に位置し、細胞収容空間１１０に刺激物質を流入させるソース領域１１１、および、細胞収容空間１１０の他端側に位置し、細胞収容空間１１０から刺激物質を排出させるドレイン空間１１２となる彫り込みとが形成される。シリコンウェア１１５は、ガラス基盤１１７上に載せられる。これにより、シリコンウェハ１１５とガラス基盤１１７に挟まれる、彫り込まれた空間が、細胞収容空間１１０、ソース領域１１１およびドレイン領域１１２を構成する。細胞収容空間１１０は、細胞が重ならない程度の深さの扁平な空間（チャネル）となるように形成される。なお、ソース領域１１１およびドレイン領域１１２は、あくまでも、刺激物質の注入側と排出側とを便宜上名付けているにすぎない。対称的な観察部材の場合、ソース領域とドレイン領域とがいずれの側になっても差し支えない。【００３３】
シリコンウェハ１１５の上面側には、液溜を構成する液溜構成部材１１６が設けられる。液溜構成部材１１６は、例えば、ステンレススチール等の金属で構成される。この液溜構成部材１１６により、第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂと、第２液溜空間１１４ａおよび第４液溜空間１１４ｂとが形成される。第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂは、ソース領域１１１に連通している。一方、第２液溜空間１１２および第４液溜空間１１４は、ドレイン領域１１２に連通している。このような構造であることにより、液体１２０は、細胞収容空間１１０を通じて、第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂと、第２液溜空間１１４ａおよび第４液溜空間１１４ｂとの間で行き来することができる。ただし、液体自体は、本実施形態では、流れを作らない方が観察には都合がよいため、液溜構成部材１１６の上方において、第１液溜空間１１３ａおよび第３液溜空間１１３ｂと、第２液溜空間１１４ａおよび第４液溜空間１１４ｂとを連通させる連通部１１８が設けてある。液体１２０を連通部１１８まで達するように入れることによって、液体１２０に圧力差による流れができることを抑制することができる。【００３４】
細胞、刺激物質等は、注射器などを用いて注入する。この際、注射針を、ソース領域１１１に達する状態とすることによって、細胞収容空間１１０に確実に注入することができる。【００３５】
図４に、図３に示す構成とほぼ同等の構成を有する観察部材１００を示す。この観察部材１００は、シリコンウェハ１１５において形成される彫り込み構造に相違がある他は、前述した図３に示すものと同様の構造を有し、同様に機能する。【００３６】
図５に示す観察部材は、前述した図３および図４に示す観察部材において設けられている第３液溜空間１１３ｂおよび第４液溜空間１１４ｂを持たない構造となっている。すなわち、第１液溜空間１１３と、第２液溜空間１１４と、ソース領域１１１と、細胞収容空間１１０と、ドレイン領域１１２と、を有する構造となっている。【００３７】
なお、図３および図４の観察部材１００において、第３液溜空間１１３ｂおよび第４液溜空間１１４ｂを設けている理由は、注入されている液体の揺れを吸収するためである。特に、ソース領域１１１から離れた位置で、刺激物質を、注射器などを用いて注入する場合に、刺激物質を押し出す際に生じる圧力の一部を逃がす働きを果たすためと考えられる。【００３８】
図６および図７に示す観察部材は、前述した図３から図５に示すものと異なるタイプのものである。すなわち、図６に示す観察部材と図７に示す観察部材とは、液溜空間の構成と、細胞収容空間１１０の構成の仕方において相違がある。第１液溜空間１１３は、開放されていて、液体の注入、細胞の注入、刺激物質の注入等を行う。一方、第２液溜空間１１４は、開放されていない。また、細胞収容空間１１０を構成する部材１１９として、シリコンではなく、ステンレススチールを直接用いている。このようにすることによって、観察部材の生産を簡単化して、製造原価を低下する効果がある。【００３９】
図６は、横置き型、すなわち、水平に置くタイプの例である。一方、図７に示す例は、縦置き型である。図７に示す例では、粘着性のある細胞の場合、ガラス基盤１１７に付着してしまうため、細胞が落下することはない。【００４０】
ここで、濃度勾配の形成方法について、説明する。【００４１】
前述した図５に示す観察部材の場合には、細胞収容空間（チャネル）１１０と、これによって連通する第１液溜空間１１３と、第２液溜空間１１４とによって構成される連通管構造について、内部に適当な液体を満たす。また、第１液溜空間１１３および第２液溜空間１１４のいずれかの管中に、濃度勾配を形成させる目的の物質を含む溶液を注入する。これにより、ソース領域１１１からドレイン領域１１２に向かって物質がチャネル１１０中に拡散する。なお、上部の連通部１１８間で液体１２０を満たすことによって、振動や傾きなどの影響でチャネル１１０内を液体が激しく移動することによる濃度勾配の乱れを大幅に軽減することができる。これによって安定的な濃度勾配を維持することが可能となる。【００４２】
図３および図４に示すように、第１液溜空間１１３ａに分岐路として第３液溜空間１１３ｂを設け、また、第２液溜空間１１４ａに分岐路として第４液溜空間１１４ｂを設けた観察部材を用いることもできる。これらの場合には、それぞれ、第１液溜空間１１３ａまたは第２液溜空間１１４ａから、目的の刺激物質１３０を含む液体を投入する。なお、第１液溜空間１１３ａ側から刺激物質１３０の液体を注入した場合、ソース領域１１１からチャネル１１０を経てドレイン領域に向けて刺激物質が拡散する。一方、第２液溜空間１１４ａ側から刺激物質の液体を投入した場合、図に示すドレイン領域１１２が、実質的にソース領域となり、反対側のソース領域１１１が実質的にドレイン領域となる。従って、ソース領域とドレイン領域とは、図３、図４および図５に示す観察部材の場合には、便宜上の名称である。【００４３】
なお、図６および図７に示す観察部材を用いて濃度勾配を形成することもできる。この場合には、開放されている第１液溜空間１１３から刺激物質１３０を含む液体を投入して、ソース領域１１１からチャネル１１０を経てドレインに向けて、刺激物質１３０の濃度勾配を形成される。【００４４】
濃度勾配がどのように形成されるかについて、図８を参照して説明する。図４に示す観察部材に液体を満たし、これに、特定の刺激物質１３０を投入した場合の、拡散がどのように起きているかについて、図８に示す。この実験では、第１液溜空間１１３ａに、蛍光物質であるFITCを添加した。図８に示すものは、添加後におけるFITC分子の拡散のようすを、蛍光観察により測定した結果である。グラフ横軸はチャネル上の位置を表し、縦軸は蛍光強度を示す。ここではFITC分子投入後、１分、３分、６分、９分および１５分後のFITC分子の濃度勾配を表している。３分後から、ほぼ直線的な濃度勾配が形成され、維持されていることがわかる。【００４５】
図２に、本細胞計測システムの構成の一例を示す。図２に示す細胞計測システムは、細胞収容空間１１０に収容されている細胞の撮像を行うための撮像装置と、撮像された画像について処理し、目的とする情報を得るための画像処理を行う情報処理装置とを備える。【００４６】
撮像装置は、本実施形態では、顕微鏡３１０、ＣＣＤカメラ３２０、ステージ３１６、ステージ駆動装置３１５、および、情報処理装置３５０により構成される。一方、情報処理装置は、入力装置３３０および表示装置３４０と、コンピュータ３５０とを有する。【００４７】
コンピュータ３５０は、中央演算ユニット（ＣＰＵ）３５１と、メモリ３５２と、補助記憶装置３５３とを有する。補助記憶装置３５３には、当該ＣＰＵ３５１の動作プログラム３６０と、データ３７０とが格納される。プログラム３６０としては、図示していないＯＳの他、細胞計測システムにおける計測動作を制御する撮像シーケンス３６１と、ステージを制御するステージ制御３５２と、撮像を制御する撮像制御３６３と、得られた画像データの解析を行うデータ解析３６４とが含まれる。これらのプログラムは、記憶媒体、ネットワークなどから補助記憶装置３５３にインストールされたものである。データとしては、画像データ３７１が代表的なものである。【００４８】
細胞についての撮像は、前述した観察部材により観察用細胞群を用意しておき、コンピュータ３５０の制御により、測定を行う。測定は、予め定めた撮像シーケンス３６１に従って行う。すなわち、コンピュータ３５０は、ステージ制御プログラム３６２により、ステージ駆動装置３１５を駆動制御して、観察部材の複数箇所、例えば、１２箇所を、１分おき等の一定のタイミングで、撮像するように位置決めを行う。撮像シーケンス３６１は、ＸＹステージ３１６による位置決めと共に、撮像制御プログラム３６３により、一定タイミングで、細胞収容空間１１０における細胞群の撮像を行うようＣＣＤカメラ３２０に指示する。そして、予め定めたタイミングで、ＣＣＤカメラ３２０が撮像した画像をメモリ３５２に取り込む。【００４９】
取り込んだ画像データについて、データ解析プログラム６４により解析処理を行う。まず、撮像データを、撮像条件と共に、補助記憶装置３５３に格納する。【００５０】
この後、得られた画像について、指定された処理を行う。撮像された画像から特徴量を抽出するには、種々の方法が可能である。例えば、得られた画像について、濃度勾配に沿って、画面を複数の領域に区画し、区画毎に、それらに含まれる細胞群が示す特徴量の抽出を行う。区画は、例えば、図１０に示すように、長方形状に定められる。この区画の大きさは、適宜定めることができる。例えば、表示装置３４０条に表示されている画面上に、入力装置を用いて、枠指定を行うことにより、コンピュータ３５０に区画を認識させる方法がある。また、区画数を指示することによって、画面を指示された区画数に均等割して、区画を定める構成とすることも可能である。いずれの場合でも、コンピュータ３５０が認識している区画を人に示すため、長方形の枠を表示画面上に表示することができる。図１０は、表示を行っている例である。【００５１】
なお、図１０においては、説明の便宜上、区画を示す枠の左側に１から４の数字を付記してある。図１０では、画面上方をソース側とし、下方側をドレイン側として表示している。従って、図１０に示す例の場合、上から順に降られている数値は、濃度の濃い順を表しているともいえる。【００５２】
ここで、細胞群が示す特徴量としては、例えば、次のようなものが挙げられる。もちろん、これらに限定されるものではない。
（ａ）各領域に存在する細胞全体の個数に対する、当該領域において特定の性質を有する細胞の個数の割合
（ａ１）特定の性質が、細胞の脱顆粒である場合
（ａ２）ａ１で、さらに細胞がマスト細胞である場合
（ｂ）細胞のある特徴量の平均値、中央値、分散、標準偏差など
（ｂ１）細胞のある特徴量が、細胞の運動速度である場合
（ｂ２）細胞のある特徴量が、細胞の運動方向特異性である場合
特徴量の抽出は、図１０に示すように、区画に含まれる細胞の画像のコントラストを用いて、細胞が膨張ないし破裂したかを調べることにより行う。この他に、大きさ、例えば、平均直径、面積等について、予め定めた閾値と比較して、閾値を超えたかを調べることにより、判断する構成とすることもできる。ここでは、図９に示すように、刺激物質により細胞が脱顆粒して、コントラストが変化するという特徴を捉える場合について説明する。【００５３】
まず、細胞群の個数の計数を行う。すなわち、コントラストが大きいもの（例えば、図９に示す細胞２１２）と、小さいもの（図９に示す細胞２１１）とに分けて、それぞれ識別を行って、その個数を計数する。識別は、種々の手法があるが、例えば、輪郭を求めて、閉形状のものを１個として計数する。この際、例えば、輪郭線と周囲との明度差に基づいて、コントラストを調べる。または、画像について、コントラストの大小を、フィルタを使って分離し、分離された画像のそれぞれについて、輪郭線を求めて、細胞の個数を計数する。いずれによっても、コントラストの高い細胞の個数と、低い細胞の個数とを計数する。【００５４】
また、細胞個数の計数の代替として、細胞の領域が占める画面上の面積を計測することも可能である。例えば、コントラストを指標として細胞を識別する場合では、特定のコントラスト範囲に含まれる画面上の領域について面積を計数することにより、細胞個数の計数と同等な効果を得ることができる。例えば、特定のコントラストを有する細胞の割合を評価する場合、画面上を占める細胞の総面積に対する当該性質を有する細胞の面積の割合をもってして、細胞の総数に対する当該性質を有する細胞の割合として用いることができる。【００５５】
計数結果は、各区画について、全体の細胞個数に対する低コントラストの細胞の個数についての割合を求めることによって、例えば、刺激物質に対する脱顆粒率として把握することができる。さらに、異なるタイミングで複数回、撮像が行われる場合には、時間の経過と共に、濃度勾配の各濃度において、刺激物質に対する細胞の応答性を示す情報を生成することができる。図１０は、このようにして生成された情報に基づいて、細胞群が示す特徴量（ここでは脱顆粒した細胞の割合、すなわち、刺激物質の活性強度）を、各濃度について、その時間変化として表したものである。図１０に示す情報によれば、濃度に応じて活性度が異なること、および、応答性が時間の経過とともに変わることが読みとれる。
＜実施例＞
次に、実施例に基づいて、より具体的に説明する。【００５６】
マスト細胞は、ある化合物刺激に対応して、細胞内に保有する顆粒を細胞外に放出する脱顆粒と呼ばれる反応を起こす。脱顆粒に際しては細胞の形態やコントラストが変化するため、光学的装置により脱顆粒した細胞を区別することが可能である。ここではマスト細胞が分散した環境中に、マスト細胞刺激物質の濃度勾配を形成させ、各位置で脱顆粒を引き起こした細胞の割合を計算した。【００５７】
実験にあたっては細胞走化性測定用の器具であるTAXIScan (KK chamber)を用いた(参照：Kanegasaki S et al., (2003)J. Immunol. Methods 282, 1-11)。シリコンウェハで形成されたマイクロチャネルとガラス基盤との間隙（細胞収容空間１１０）に、ラット腹腔より採取したマスト細胞を導入し、マイクロチャネルの一方の端につながるソース領域１１１より、刺激物質としてマスト細胞刺激剤を投入した。ここで刺激剤としては、100μMのlysoPSと、2000,1000,200,80μg/mlのコンカナバリンAとを含む緩衝液を１マイクロリットル導入した。マスト細胞の脱顆粒は、チャネル中の細胞を顕微鏡で直接観察することによりモニターした。マスト細胞の脱顆粒は、図９に示すように形態の変化やコントラストの変化などを指標とすることによってモニターすることが可能である。また、コントラスト変化などを指標とすることにより、画像解析で自動的に脱顆粒の検出を行うことも可能である。【００５８】
刺激剤は、拡散により濃度勾配を形成するため、画面上の位置によって濃度が異なる。その各々の地点において個別に脱顆粒活性の強度を測定することにより、各地点の濃度での活性強度が分かる（図１０）。図１０の右に示した４つのグラフは、写真中の４つのエリアにおいて、脱顆粒した細胞の割合を、時間を追って計測したものである(横軸は時間(min)、縦軸は割合(%))。濃度勾配は拡散により形成され、ある程度時間を置くと脱顆粒細胞の割合が安定する。前述したように、図１０に示す例では、区画（１）が最も濃度が高く、区画（２）、区画（３）、区画（４）の順に、濃度が低くなるような濃度勾配を有する。【００５９】
図１０において、細胞収容空間１１０にマスト細胞を配置し、画面上方向より刺激剤を導入した写真（左：刺激前、右：刺激後）。画面上方の細胞が脱顆粒してコントラストが下がり、白くなっていることが確認される。なお、２１１が脱顆粒した細胞、２１２脱顆粒しなかった細胞を示す。【００６０】
各地点（区画）で脱顆粒細胞の割合を計算したグラフを図１１に示す。縦軸は脱顆粒した細胞の割合(%)、横軸は横軸は刺激剤の濃度(μg/ml)である。横軸における数字は、濃度勾配を形成したチャネル（細胞収容空間）上の区画を表す。１が最も濃度の高い点で、１から４の順で濃度が薄くなっていくように濃度勾配は形成されている。ここで、１から４の番号は、図１０において付した区画の番号（１）から（４）に対応している。なお、刺激剤に用いたコンカナバリンA濃度は、黒四角：2000μg/ml、白四角：1000μg/ml、×印：200μg/ml、白丸：80μg/mlである。グラフより、地点２や３において、刺激剤の濃度によって脱顆粒細胞の割合に差異がみられ、かつその値は刺激剤の濃度と相関している。【００６１】
図１１に示すグラフにおいて、区画（１）および（４）では刺激剤の濃度差がほとんどないが、区画（２）および（３）では濃度によって反応の違いが明瞭である。例えば、この細胞の、刺激強度に対する活性のばらつきを調べたり、試薬が細胞活性に与える阻害／促進活性を確認したりする実験にあたっては、区画（２）および（３）の領域に該当する刺激物濃度を採用することによって適切なデータを取ることができる。このように、濃度勾配を利用することにより、一度の試験において連続的に変化した濃度での細胞応答が観察できるため、最適な条件での比較が可能である。【００６２】
次に、他の実施例について説明する。ここでは、細胞の走化活性の濃度変化について述べる。【００６３】
細胞の走化活性の濃度変化についても、濃度勾配上の細胞位置を考慮することにより検討が可能である。細胞の走化性は細胞が特定の因子の濃度勾配を感知して、濃度の濃い方向へと移動する機能のことである。この走化活性は、特定の濃度で活性が最大となり、高い濃度や低い濃度域では活性が減少していく、ベルシェイプ型の活性を示すことが知られている。従来の方法では、濃度に対して活性がベルシェイプ型であることは、多数の濃度において実験を行うことにより確認することができる。濃度勾配環境中の各位置で濃度が異なることを利用すれば、容易に活性の濃度特性を知ることができる。このことを実験で示すにあたっては、細胞走化性測定用の器具であるTAXIScan (KK chamber)を用いた(方法と材料などについてはKanegasaki S et al., (2003)J. Immunol. Methods 282, 1-11を参照)。【００６４】
ここでは、Jurkat細胞を、細胞収容空間１１０中に導入し、そこにSDF-1aの濃度勾配を形成した際の細胞の運動を測定した。濃度勾配を作成する際に用いたSDF-1aの濃度は10及び1 nMの3種類で、各々につき１マイクロリットルを注入した。Jurkat細胞はSDF-1aの濃度勾配方向に走化性を示したので、走化活性強度の指標として細胞運動の濃度勾配方向の速度を採用し、その値をチャネル（細胞収容空間１１０）上の各位置において計測した。その結果を図１２に示す。グラフ横軸はチャネル上の位置、縦軸は走化活性（細胞移動速度の濃度勾配方向成分）を表す。濃度勾配はグラフ右方向より形成したため、右に行くほど濃度が高いことになる。縦軸は細胞運動の濃度勾配方向の速度（μm/sec）を表す。加えたSDF-1aの濃度が1 nMの際には、図１２（ｂ）に示すように、濃度が高いほど走化活性も高くなっている。10nMとした場合の結果をみると、図１２（ａ）チャネル上の途中地点に活性のピークがあり、そこより濃度が濃くなると走化活性は減少していくことが分かる。これにより確かに走化活性はベルシェイプであることが分かる。【００６５】
細胞の運動の計測は、例えば、図１０に示す画面を複数のメッシュに区画し、それぞれのメッシュ内での細胞の輪郭線の一部に注目し、その輪郭線の位置が、時間共に、どのように変位するかについて計測し、それらの変位のｘ成分、ｙ成分を平均することにより、平均的な変位方向と、撮像タイミングとから、平均的な速度を求めることができる。【００６６】
以上に述べたように、本発明では、細胞収容空間に細胞群を投入すると共に、細胞群について刺激物質を注入して、その刺激物質の濃度勾配を形成して、撮像し、得られた画像について、濃度勾配に沿った区画を設けて、画像処理に基づいて、各区画における細胞群が示す特徴量を抽出するものである。これまでのように、濃度毎に、時間経過毎に、何度も試行する必要があった計測を、一回の処理で行うことが可能となる。【００６７】
すなわち、細胞の種類ごとでの反応性の差異を測定したり、細胞の条件を変えた場合での応答性の変異を測定したりする場合には、適切な濃度で実験をすることによって良好な測定結果を得ることができる。例えば、ある刺激に対する細胞の応答性を細胞の種類ごとに比較したり、細胞の条件を変えた際の細胞応答性の変化を比較したりしたい場合、設定した濃度が高すぎたり低すぎたりすると細胞の種類ごとでの差異が分かりづらく、良好な実験結果が得られない。【００６８】
ここで、細胞の刺激に対する何らかの応答性が、図１３(a)のように表されるとする(横軸:濃度、縦軸:活性)。細胞が適当に分散した環境中に図１３(b)(横軸:位置、縦軸:濃度)に示すような濃度勾配を形成した場合、濃度勾配中の各位置における細胞応答性は図１３(c)(横軸:位置、縦軸:活性)のようになる。通常の実験では、多数の濃度を試験する場合、濃度を段階的にふって、各々の濃度における反応をみるため、試験される濃度が断続的となる。さらに、多数の濃度での反応を確認するためには、その数だけの試験を独立に行なう必要がある。濃度勾配を利用すると、連続的な濃度範囲の各濃度における細胞応答を、一つの独立な試験で確認することが可能となる。これにより独立な試験の個数が削減されて実験が簡便となる。【００６９】
なお、細胞の活性評価については、細胞の形態変化や運動性、あるいは蛍光プローブなどを用いた細胞内分子の局在変化、遺伝子発現など、顕微鏡上で評価可能なあらゆる生命現象が対象となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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