(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブグループBからの血清型に基づく組換えアデノウイルスを補足し得るパッケージング細胞系であって、アデノウイルスのE1コード配列によって形質転換されているヒト細胞から導かれ、E1B-55Kタンパク質をコードする配列がサブグループBからのものであり、サブグループCのアデノウイルスに由来するE1Aタンパク質のコード領域を備える、細胞系。
【請求項２】
前記ヒト細胞が、一次のもの、二倍体の細胞、又はその誘導体である、請求項1記載のパッケージング細胞系。
【請求項３】
前記サブグループBのアデノウイルスが血清型35である、請求項1又は2記載のパッケージング細胞系。
【請求項４】
前記E1コード配列が、動作可能に、コード化タンパク質の転写及び翻訳を可能にする調節配列に連結される、請求項1〜3の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項５】
前記アデノウイルスE1コード配列が、動作可能に1つのDNA分子上に連結されるか、又は2つの別々のDNA分子上に配置されるかそのどちらもである、請求項1〜4の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項６】
一次のヒト細胞が、一次の網膜芽細胞、一次の胚腎臓細胞及び一次の羊膜細胞からなる群より選ばれている、請求項1〜5の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項７】
前記サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35である、請求項1〜6の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項８】
前記E1コード配列が、E1Aタンパク質のコード領域、及びE1B-55Kタンパク質の停止コドンに至るまで及びこれを含むE1Bコード配列に連結するE1Bプロモータ配列を備える、請求項7記載のパッケージング細胞系。
【請求項９】
前記サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35であり、及びE1コード配列がAd35野生型配列のヌクレオチド468から3400までを備える、請求項1〜6の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項１０】
サブグループBからの血清型に基づく組換えアデノウイルスを補足し得るパッケージング細胞系であって、非サブグループBアデノウイルスからのE1Aコード配列及び少なくとも1部分のE1B-21Kコード配列を備え、及び更にサブグループBのアデノウイルスからのE1B-55Kコード配列を備えるキメラのアデノウイルスE1構築物によって形質転換されている細胞から導かれ、及びサブグループCのアデノウイルスに由来するE1Aタンパク質のコード領域を備える、細胞系。
【請求項１１】
E1B-55Kコード配列がE1B-21Kコード配列と重複せず、サブグループBのアデノウイルスからのものである、請求項10記載のパッケージング細胞系。
【請求項１２】
サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35である、請求項8又は9記載のパッケージング細胞系。
【請求項１３】
前記アデノウイルスE1コード配列が、動作可能に、コード化タンパク質の転写及び翻訳を可能にする調節配列に連結される、請求項8〜10の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項１４】
前記細胞が、一次のもの、二倍体のヒト細胞、又はその誘導体である、請求項10〜13の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項１５】
一次のヒト細胞が、一次の網膜芽細胞、一次の胚腎臓細胞及び一次の羊膜細胞からなる群より選ばれている、請求項14記載のパッケージング細胞系。
【請求項１６】
サブグループBからの血清型に基づく組換えアデノウイルスを捕捉し得るパッケージング細胞系であって、非サブグループBアデノウイルスのE1コード配列によって形質転換されている細胞から導かれ、及び更にサブグループBのアデノウイルスのE1B-55Kコード配列で前記細胞のゲノム中に統合されるものを備え、サブグループCのアデノウイルスに由来するE1Aタンパク質のコード領域を備える、細胞系。
【請求項１７】
前記サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35である、請求項16記載のパッケージング細胞系。
【請求項１８】
前記E1コード配列が、動作可能に、コード化タンパク質の転写及び翻訳を可能にする調節配列に連結される、請求項16又は17記載のパッケージング細胞系。
【請求項１９】
前記E1B-55Kコード配列が、E1Bプロモータにより駆動され、及び異種ポリアデニル化信号により終止される、請求項16〜18の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項２０】
前記E1B-55Kコード配列が異種プロモータにより駆動される、請求項16〜18の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項２１】
前記アデノウイルスE1コード配列が、動作可能に1つのDNA分子上に連結されるか、又は2つの別々のDNA分子上に配置されるかそのどちらもである、請求項16〜20の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項２２】
前記細胞が、一次のもの、二倍体のヒト細胞、又はその誘導体である、請求項16〜21の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項２３】
一次のヒト細胞が、一次の網膜芽細胞、一次の胚腎臓細胞及び一次の羊膜細胞からなる群より選ばれている、請求項22記載のパッケージング細胞系。
【請求項２４】
前記細胞がサブグループCのアデノウイルスE1コード配列によって形質転換され、PER.C6細胞(ECACC受託番号96022940)、293細胞、911細胞、又はA549細胞、又は何れかのこれらの細胞の誘導体である、請求項22記載のパッケージング細胞系。
【請求項２５】
サブグループBのアデノウイルスの前記E1配列が、関連組換えウイルスベクタに存在する配列と重複する配列を含まない、請求項1〜24の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項２６】
前記非サブグループBアデノウイルスがアデノウイルス血清型5である、請求項10〜25の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
【請求項２７】
サブグループBの血清型に基づく組換えアデノウイルスを補足するための方法であって、請求項1〜26の何れか1項記載のパッケージング細胞系を、前記組換えアデノウイルスをコード化する核酸と共に提供する工程、及び前記細胞系を培養し補足を可能にさせる工程を含む、方法。
【請求項２８】
さらに、補足した組換えアデノウイルスを収集する工程を含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記組換えアデノウイルスが血清型35に基づく、請求項27又は28記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は一般的にはバイオテクノロジーの分野に関し、特にはアデノウイルス基相補細胞株に関する。
【０００２】
（従来の技術）
典型的には、ベクターおよびパッケージング細胞は、必要な素子を全て保持し、かつ組換えにより複製能力ウイルスに至るオーバーラップ素子を保持しないために、互いに適応性が必要である。したがって、パッケージング構成物の適正な転写に必要な配列は、例えば他のヒトアデノウイルス（Ａｄ）血清型、非ヒトアデノウイルス、非制限的にＳＶ４０、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等の他のウイルスから誘導される、または哺乳動物等のより高度な真核生物から誘導される異種調節配列である。一般に、これらの配列はプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化配列を含む。
【０００３】
ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）は、パッケージング構造体とアデノウイルスベクター間の配列オーバーラップが欠けている細胞株の一例である（Fallaux 等、1998年）。Ａｄ５およびＡｄ２等のサブグループＣアデノウイルスに基づく組換えウイルスはこれらのパッケージング細胞上で効率的に増殖できる。サブグループＢのような他の血清型からのアデノウイルスの産生および増殖はＰＥＲ．Ｃ６細胞についてより困難であることがわかった。しかし、欧州特許出願第００２０１７３８．２に記載されているように、サブグループＢウイルスＡｄ３５に基づく組換えウイルスはＡｄ３５初期領域−１配列（Ａｄ３５−Ｅ１）を含有する発現構造体の同時トランスフェクションにより作ることができる。さらに、Ｅ１Ａ配列について除去されたＡｄ基ウイルスはＰＥＲ．Ｃ６細胞上で効率的に複製することが示された。したがって、Ａｄ５相補Ａｄ３５−Ｅ１Ａ機能のＥ１Ａ蛋白質、Ａｄ３５のＥ１Ｂ機能の少なくとも１部は必要である。Ｅ１Ｂ機能におけるこの血清型特異性は最近Ａｄ７組換えウイルスについても記載されている。サブグループＢウイルスＡｄ７由来の組換えアデノウイルスを産生するための試みにおいて、Abrahamsen等(1997年)は野生型（ｗｔ）Ａｄ７の混入なく２９３細胞においてＥ１除去ウイルスを産生することができなかった。２９３−ＯＲＦ６細胞におけるプラーク精製（Brough等、1996年）の後、採取されるウイルスは非異種組換えによりＡｄ７Ｅ１Ｂを取り込むことが示された。したがって、Ａｄ７組換えウイルスの効率的な増殖はＡｄ７−Ｅ１Ｂ発現およびＡｄ５−Ｅ４−ＯＲＦ６発現の存在下においてのみ可能であることがわかった。Ｅ１Ｂ蛋白質は細胞およびウイルス蛋白質と相互作用することが知られている（Bridge 等、1993; White,1995年）。ウイルス蛋白質のｍＲＮＡ輸出を増加するためにおよび殆どの細胞ｍＲＮＡの輸出を阻害するために必要である、Ｅ１Ｂ５５Ｋ蛋白質およびＥ４−ＯＲＦ６間に形成される複合体は重要でありかつ場合によって血清型特異性である可能性がある。
【０００４】
（発明の説明）
本発明は、アデノウイルス型３５のような、サブグループＢからの血清型等の、サブグループＣウイルス以外の血清型に基づく組換えアデノウイルスに相補できる新規なパッケージング細胞株を提供する。
本発明は、一観点において、サブグループＢの血清型、好ましくは血清型３５に基づく組換えアデノウイルスに相補できるパッケージング細胞株を提供する。
「アデノウイルスに基づくまたはアデノウイルスに由来する」の用語は、その血清型において見いだされる核酸に対応する核酸を利用することを意味する。利用された核酸はＰＣＲクローニングまたは業界に知られた他の方法で誘導される。
【０００５】
本発明の一観点において、新規なパッケージング細胞は、非制限的に、一次ヒト網膜芽細胞、一次ヒト胎児性腎臓細胞または一次ヒト羊膜細胞等の一次二倍体ヒト細胞から誘導される。一次細胞またはアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子のみを用いたその誘導体のトランスフェクションは、無制限な増殖（不死化）を誘導できるが、完全な形質転換には至らない。しかし、殆どの場合、Ｅ１Ａの発現はプログラム化細胞死（アポトーシス）を誘導し、場合によって、不死化が得られる（Jochemsen等、1987年）。Ｅ１Ｂ遺伝子の同時発現はアポトーシスの誘導を防止するために、および完全な形態学的形質転換を生じるために必要である（White,1995年）。したがって、本発明の一観点では、一次ヒト細胞またはその誘導体は、サブグループＣ以外のサブグループ、好ましくはサブグループＢ、より好ましくはアデノウイルス３５型の、アデノウイルスＥ１蛋白質の発現により形質転換される。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ蛋白質の結合活性は細胞の無制限な成長を樹立し、組換えアデノウイルスの相補を可能にする。
【０００６】
アデノウイルスＥ１遺伝子による一次細胞の完全な形態学的形質転換はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域によりコード化された蛋白質の結合活性の結果である。溶菌感染および形質転換における種々のＥ１蛋白質の役割は広範に研究された（Zantema およびvan der Eb, 1995年; White, 1995年, 1996年）。アデノウイルスＥ１Ａ蛋白質は一次細胞の形質転換に対して重要である。Ｅ１Ａ蛋白質は転写の調節に伴われる多くの細胞蛋白質との直接的な相互作用を介してこの効果を及ぼす。これらは蛋白質のｐＲＢファミリー、ｐ３００／ＣＢＰおよびＴＡＴＡ結合蛋白質を含む。さらに、Ｅ１Ａは細胞におけるｐ５３蛋白質のレベルを高める。アデノウイルスＥ１Ｂ活性の不存在下で、ｐ５３レベルの上昇はアポトーシスを誘導する。Ｅ１Ｂ領域によりコード化された両蛋白質は、異なるメカニズムではあるが、アポトーシスの誘導を阻害する。Ｅ１Ｂ−２１Ｋは、アポトーシス経路の下流のエフェクター蛋白質との相互作用によりＢｃｌ−２に類似の方法でアポトーシスを阻害すると思われる（Han等, 1006年）が、Ｅ１Ｂ−５５Ｋはｐ５３との直接的な相互作用を介して機能する。ｐ５３を不活性化する能力における分子メカニズムが異なり、このメカニズムにより、Ａｄ２および５（サブグループＣ）およびＡｄ１２（サブグループＡ）のＥ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質が機能する。Ａｄ５  Ｅ１Ｂ−５５Ｋはｐ５３に強く結合し、この複合体は細胞質に局在化するが、Ａｄ１２  Ｅ１Ｂ−５５Ｋはｐ５３に弱く結合し、両蛋白質は核に局在化する（Zantema等,1985年; Grand等, 1999年）。しかし、両蛋白質はｐ５３により、他の遺伝子のトランス活性化を阻害する（Yew およびBerk,1992年）。
【０００７】
げっ歯類細胞において、Ｅ１Ｂ−２１Ｋまたは５５Ｋのいずれかと共にＥ１Ａの活性は完全は形質転換に対して十分であり、両Ｅ１Ｂ蛋白質一緒での発現は２倍の効率である（Rao等、1992年）。しかし、ヒト細胞では、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質の活性はより重要であると考えられ、Ｅ１Ｂ−５５Ｋが形質転換細胞の樹立に対して必須であることが観察された（Gallimore,1986年）。
本発明の実施例６はｐＩＧ２７０の産生を説明する。この構成では、Ａｄ３５−Ｅ１遺伝子はｈＰＧＫプロモーターから発現され、転写はＨＢＶｐＡにより終了する。ｈＰＧＫプロモーターはSinger-Sam等(1984年)により記載されたプロモーター配列のＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを構成する。ＨＢＶｐＡはＢ型肝炎ウイルスゲノムのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに位置する（Simonsen およびLevinson, 1983年; Genbank HBV-AF090841)。前記のとおり、本発明に記載したＥ１発現構造体のポリアデニル化配列およびプロモーターは本発明の範囲から外れることなく、他の給源から誘導できる。さらに、上記ｈＰＧＫおよびＨＢＶｐＡ配列の他の機能フラグメントも使用できる。
【０００８】
ｐＩＧ２７０の機能性は一次ベイビーラット腎臓細胞（ＢＲＫ）の形質転換により示された。等価なＡｄ５−Ｅ１発現構築物との比較により、Ａｄ３５−Ｅ１遺伝子がこれらの細胞を形質転換するには効率的ではないことがわかった。同様のことが、Ａｄ１２のＥ１遺伝子についてもわかった（Bernards等, 1982年）。
異なるサブグループからのアデノウイルスに対して観察されたＥ１配列の形質転換効率における相違をＥ１蛋白質が決定することは不明確である。Ａｄ１２の場合、キメラＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子についての感染の研究は、ＢＲＫ細胞の形質転換効率がＥ１Ａ蛋白質により決定されることを示唆した（Bernards等, 1982年）。Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質がＥ１除去アデノウイルスの相補性に対して必要な血清型特異性機能を有することを下記に示す。これらの機能がｍＲＮＡ分布および別の後期ウイルス機能の調節に関係する場合、これらが形質転換効率に含まれることは考えにくい。
【０００９】
挿入変異体を使用したＡｄ２またはＡｄ５  Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質における機能ドメインの解析により、ウイルス複製、後期蛋白質合成およびホスト蛋白質シャット−オフに関する機能が特異ドメインに限定されず、蛋白質に沿って分布することがわかった（Yew等, 1990年）。同じセットの変異体を使用して、ｐ５３およびＥ４−Ｏｒｆ６との相互作用に対して重要なドメインがより制限されることがわかった。普通の結合領域（アミノ酸２６２から３２６）に加えて、ｐ５３結合はａａ１８０における変異により影響され、Ｅ４−Ｏｒｆ６結合はａａ１４３における変異により影響された（Yew およびBerk, 1992年; Rubenwolf等, 1997）。
これらの結果は全体として、形質転換（ｐ５３結合）および後期蛋白質合成（Ｏｒｆ６結合）に関係するＥ１Ｂ−５５Ｋ機能を分離することが困難であることを示す。
【００１０】
本発明は新規なＥ１構造体を開示し、この構造体は一方の血清型の高効率形質転換を他方の血清型の血清型特異性相補機能とを結び付ける。これらの新規な構造体を使用して一次ヒト胎児性網膜芽細胞およびヒト羊膜細胞を形質転換する。
本発明の別の観点において、形質転換Ｅ１配列を異なる血清型から誘導する。欧州特許出願第００２０１７３８．２に記載したように、Ａｄ３５  Ｅ１配列はベイビーラット腎臓（ＢＲＫ）細胞を、Ａｄ５  Ｅ１配列に関して見られるよりも低効率ではあるが、形質転換可能である。このことは、Ａｄ１２からのＥ１配列に対しても観察された（Bernards等, 1982年）。したがって、本発明のこの観点では、一次二倍体ヒト細胞またはその誘導体はキメラＥ１構造体で形質転換され、この構造体は一次ヒト細胞またはその誘導体の効率的な形質転換を可能にする血清型のＥ１配列の部分と、別の血清型のＥ１除去ウイルスの効率的な増殖を可能にする血清型特異的Ｅ１Ｂ機能を提供する別の血清型のＥ１配列の部分からなる。本発明のこの観点の好ましい態様では、Ｅ１Ａ領域は、非制限的にＡｄ５等の、サブグループＣアデノウイルスから誘導され、Ｅ１Ｂコード配列は代替的なアデノウイルス、特にサブグループＢのアデノウイルス、特にアデノウイルス３５型から誘導される。また、Ｅ１Ｂ−２１Ｋコード配列はサブグループＣおよびサブグループＢコード配列両方で構成されるキメラである。好ましくは、Ｅ１Ｂ−２１Ｋの全てまたは殆どがサブグループＣコード配列で構成される。より好ましい態様では、Ｅ１Ａコード配列およびＥ１Ｂ−２１Ｋコード配列は非制限的にＡｄ５等のサブグループＣアデノウイルスから誘導される。ある態様では、細胞はさらにＥ１Ｂ−５５Ｋコード配列で構成され、好ましくは、これは、サブグループＢのアデノウイルス、特にアデノウイルス型３５から誘導された２１Ｋコード配列と重複しない。さらに好ましい態様では、全Ｅ１コード配列は、代替的なアデノウイルスサブグループ、特にアデノウイルスサブグループＢ、特にアデノウイルス型３５の血清特異的相補に必要なＥ１Ｂ−５５Ｋコード配列の少なくとも１一部を除いて、非制限的にＡｄ５等の、サブグループＣアデノウイルスから誘導される。本発明はパッケージング細胞株をも提供する。ここで、一次ニ倍体ヒト細胞またはその誘導体はキメラアデノウイルスＥ１構造体を用いて形質転換され、この構造体は一次ヒト細胞およびその誘導体の効率的な形質転換可能な第１アデノウイルス血清型の第１アデノウイルスＥ１コード配列の一部；および第２アデノウイルス血清型の第２アデノウイルスＥ１コード配列の一部であって、この第２アデノウイルスＥ１配列は第２アデノウイルス血清型の組換えアデノウイルスＥ１除去ウイルスの効率的な増殖を可能にする血清型特異的アデノウイルスＥ１Ｂ機能を提供する第２アデノウイルスＥ１配列の一部で構成される。好ましくは、この第１アデノウイルス血清型はサブグループＣアデノウイルスであり、第２アデノウイルス血清型はサブグループＢアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス型３５である。ある態様では、本発明のパッキング細胞株はウシアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋで構成される。このようなウシＥ１Ｂ−５５Ｋ発現細胞株は高収量で相補ウシ組換えアデノウイルスを得るために特に適している。
【００１１】
一次二倍体ヒト細胞またはその誘導体は、一つのＤＮＡ分子に操作可能に結合したか、または２つの別々のＤＮＡ分子に位置するアデノウイルスＥ１配列により形質転換される。後者の場合、一方のＤＮＡ分子は効率的な形質転換を可能にする血清型のＥ１配列の少なくとも一部を運び、別のＤＮＡ分子は血清型特異的相補性に必要な配列の少なくとも一部を運ぶ。さらに、効率的な形質転換を可能にする血清型のＥ１配列および血清型特異的相補に必要な別の血清型のＥ１配列で構成されるハイブリド構造体が提供される。血清型特異的相補性を提供する配列は形質転換に寄与する活性をさらに有していてもよい。好ましくは、効率的形質転換を可能にする配列はＥ１Ａで構成される。好ましくは、この配列および血清型特異的相補性に必要な配列はＥ１Ｂ配列で構成される。より好ましくは、効率的形質転換を可能にする前記配列はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ−２１Ｋ配列で構成され、血清特異的相補性に必要な配列はＥ１Ｂ−５５Ｋ配列で構成される。このようなハイブリド構造体により形質転換された細胞をも提供する。このような細胞は前記別の血清型の組換えＥ１除去アデノウイルスの増殖に好ましく使用される。勿論、別の構造体上にあるＥ１配列の両方の機能を提供することも可能である。全観点から、配列はコード化蛋白質の転写および翻訳可能な調節配列に操作可能的に結合する。好ましくは、本発明のパッケージング細胞はサブグループＢのアデノウイルスの少なくともＥ４−ｏｒｆ６、特にアデノウイルス血清型３５をコード化するＤＮＡで構成される。好ましくは、細胞は増殖／相補あるいは産生されるべき組換えベクターと同じ血清型のＥ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４−ｏｒｆ６で構成される。
【００１２】
本発明の別の観点では、ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０；Fallaux等、1998年)から誘導され、かつゲノムに組み込まれるＡｄ３５−Ｅ１配列を含む新規なパッケージング細胞を開示する。これらのＡｄ３５−Ｅ１配列は機能発現カセットに存在するが、好ましくは、組換えウイルスベクターに存在する配列を重複する配列を含まない。好ましくは、機能発現カセットはＡｄ３５−Ｅ１配列に機能的に結合した異種プロモータおよびポリアデニル化信号からなる。特に、Ａｄ３５−Ｅ１コード配列はヒトホスホグリセラート遺伝子プロモータ（ｈＰＧＫ）およびＢ型肝炎ウイルスポリアデニル化信号（ＨＢＶ−ｐＡ）に機能的に結合する。好ましくは、Ａｄ３５−Ｅ１コード配列はＥ１Ｂ５５Ｋ蛋白質の停止コドンまでおよびこれを含むＥ１Ｂコード配列に結合したＥ１Ａ蛋白質およびＥ１Ｂプロモータ配列のコード領域を有する。さらに好ましくは、Ａｄ３５−Ｅ１配列はＡｄ３５ｗｔ配列のヌクレオチド４６８からヌクレオチド３４００までを有する。トランスフェクション細胞に対する選択を可能にするために、非限定的に、ネオ遺伝子等の優性選択マーカーは発現ベクターに取り込まれる必要があり、あるいはＡｄ３５発現ベクターは選択マーカーの発現を媒介する分離発現ベクターと共トランスフェクションされる。両方のケースにおいて、選択マーカーは細胞ゲモムに組み込まれる。２９３（Graham等、1977年）および９１１（Fallaux等、1996年）等の他のＡｄ３５−Ｅ１形質転換細胞株またはＡｄ５４９細胞等の樹立ニト細胞株は本発明の範囲から逸脱することなく、使用可能である。
【００１３】
本発明の別の観点では、ＰＥＲ．Ｃ６誘導細胞は機能Ａｄ３５−Ｅ１Ｂｈａｉｒｅｔｕを発現する。ある態様では、Ａｄ３５−Ｅ１Ｂコード配列はＥ１Ｂプロモータにより駆動され、非制限的に、ＨＢＶｐＡ等の異種ポリアデニル化信号により終了される。好ましい態様では、Ａｄ３５−Ｅ１Ｂコード配列は非制限的に、ｈＰＧＫプロモータまたは延長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモータ等の異種プロモータにより駆動され、非制限的に、ＨＢＶｐＡ等の異種ｐＡ信号により終了される。これらのＡｄ３５−Ｅ１Ｂ配列は野生型（ｗｔ）Ａｄ３５配列のヌクレオチド１６１１と３４００の間に位置するＥ１Ｂ２１ＫおよびＥ１Ｂ５５Ｋ蛋白質のコード領域を有する。より好ましくは、Ａｄ３５−Ｅ１Ｂ配列はｗｔＡｄ３５配列のヌクレオチド１５５０から３４００までを有する。さらに好ましい態様では、Ｅ１Ｂ配列はｗｔＡｄ３５配列のヌクレオチド１９１６および３４００間に位置するＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子のコード配列を有する。さらに好ましい態様では、本発明のパッケージング細胞株または細胞株はＥ１Ｂ２１Ｋに対する機能コード配列が欠けている。このような細胞株は一般にはＥ１Ｂ２１Ｋ正細胞株より非常に多い組換えアデノウイルスを産生する。
【００１４】
さらに、本発明は、組換えアデノウイルスを相補するための方法であって、前記組換えアデノウイルスを有する、本発明のパッケージング細胞株または細胞株を提供することおよび相補可能な前記細胞を培養することを有する方法を提供する。好ましい態様では、前記方法は、さらに、相補組換えアデノウイルスをハーベストすることを有する。好ましくは、前記組換えアデノウイルスはアデノウイルスサブグループＢから誘導される。より好ましくは、前記組換えアデノウイルスはアデノウイルス３５血清型から誘導される。
【００１５】
別の観点において、本発明は、本発明の方法により得られた、あるいは本発明のパッケージング細胞を用いた、組換えアデノウイルスを提供する。本質的に汚染のない野生型アデノウイルスまたは複製コンピテント細胞細胞を得ることができる。このような組換えアデノウイルス調製は例えば遺伝子治療場面に対するインビボにおける体細胞組織への治療配列の投与に非常に適している。少なくとも一つのＥ１領域蛋白質をコード化する核酸の欠如を有する組換えアデノウイルスが好ましい。好ましくは、このようなアデノウイルスはさらに少なくとも一つのＥ３領域蛋白質をコード化する核酸の欠如を有する。好ましくは、このようなアデノウイルスは少なくとも一つのＥ４領域蛋白質をコード化する核酸の欠如をさらに有する。好ましくは、このようなアデノウイルスは少なくともＥ４−Ｏｒｆ６蛋白質をコード化する核酸の欠如をさらに有する。この理由のために、本発明は薬剤の調製用に、本発明の組換えアデノウイルスの使用を提供する。
【００１６】
Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質とは、Ａｄ５のＥ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質により提供された、アデノウイルス血清型の同様の機能を有するアデノウイルス血清型のＥ１Ｂ領域によりコード化された蛋白質を意味する。
Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質とは、Ａｄ５のＥ１Ｂ−１９Ｋ蛋白質により提供された、アデノウイルス血清型の同様の機能を有するアデノウイルス血清型のＥ１Ｂ領域によりコード化された蛋白質を意味する。同じ技術用語をこれらの蛋白質をコード化する配列に対して適用する。Ａｄ３５−Ｅ１配列をいう場合、特定のヌクレオチドからヌクレオチド３４００までとは、ヌクレオチド３４００までとヌクレオチド３４００を含むことを意味する。
【００１７】
本発明の細胞株対象物は、他のもののなかで、遺伝子治療およびワクチン接種用に設計された組換えアデノウイルスの産生に有益である。また、ヒト起源の細胞から誘導された細胞株は非制限的に、ヒト成長因子、ヒト抗体等のヒト組換え治療蛋白質の産生にも有益である。さらに、細胞株は、非制限的にインフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス等のアデノウイルス以外のヒトウイルスの産生に有益である。
一次、二倍体ヒト細胞の好ましい誘導体は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６００２２９４０）である。
【００１８】
本発明で言及したアデノウイルスＥ１蛋白質と本質的に類似機能を有する蛋白質を提供することは当業者には可能である。例えば、機能部分は提供され、および／または誘導体は量はともかく、本質的に類似機能を備えることができる。
このような部分および誘導体は、類似の形質転換／相補性および／または血清型特異性機能が量はともかく本質的に提供される限り、本発明の範囲内であると考えられる。
【００１９】
（実施例）
実施例１
ヒト血清における活性の不活化を検出ための高処理能力アッセイ
全アデノウイルス血清型に対する中和抗体の存在下で多量のヒト血清をスクリーニング可能とするために、自動化９６ウェルアッセイを展開した。
ヒト血清
１００個体のパネルを選択した。ボランティア（５０％が男性、５０％が女性）は人種制限のない、２０才から６０才の健康体であった。全ボランティアはインフォームドコンセントの書類にサインした。アデノウイルス研究に職業的に関与している人々は排除した。
【００２０】
約６０ｍｌの血液を乾燥試験管に入れた。採取後２時間以内に、血液を２５００ｒｐｍ／１０ｍｉｎで遠心分離した。
約３０ｍｌの血清をポリプロピレン管に移し、−２０℃で次の使用まで凍結貯蔵した。
血清を解凍して５６℃下１０分間で熱不活化し、分取して凍結／解凍の繰り返しサイクルを防止した。一部を使用して、約７０の９６ウェルプレートを満たすのに充分な量の培地（ＤＭＥＮ，ギブコ  ＢＲＬ）中で５段階の２倍希釈を行った。未希釈および希釈血清アリコートを深いウェルプレート（９６ウェル形式）にピペットで取り、プログラムプレートメイトを使用して９６ウェルプレートに１００μｌのアリコートで分配した。このように前記プレートにデュプロ（１００μｌ／ウェル）で８つの異なる血清を下図（数１）にしたがって入れた。
【００２１】
【数１】
0004402881.tif 000002
カラム１と６のＳ１／２〜Ｓ８／２は１ｘ希釈血清を表し、Ｓｘ／４、Ｓｎ／８、Ｓｘ／１６、およびＳｘ／３２は連続２倍希釈を表す。また、最後のプレートは負コントロールとして１００μｌの胎性ウシ血清を入れた４つのウェルを有する。プレートを−２０℃で次の使用まで保存した。
【００２２】
ヒトアデノウイルスストックの調製
全既知ヒトアデノウイルスのプロトコルをＰＥＲ．Ｃ６細胞（Fallaux等、1998年）を蒔いたＴ２５フラスコで培養し、充分なＣＰＥについてハーベストした。凍結／解凍後、１−２ｍｌの粗ライゼートを使用してＰＥＲ．Ｃ６のＴ８０フラスコに接種し、ウイルスを充分なＣＰＥでハーベストした。接種およびＣＰＥ発生間の時間枠ならびにウイルス量には血清型間で異なる新規な培養物を再感染する必要があった。アデノウイルスストックを凍結／解凍により調製し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を有する３−４のＴ１７５ｃｍ２の３層フラスコに接種した。ＣＰＥ発生の際、フラスコをタッピングすることにより細胞をハーベストした。ペレットとウイルスを単離し、下記の２段階ＣｓＣｌ勾配により精製した。細胞ペレットを５０ｍｌの１０ｍＭＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、−２０℃で凍結した。３７℃解凍後、５．６ｍｌのデオキシコール酸ナトリウム（５％ｗ／ｖ）を添加した。溶液をゆるやかに混合し、５−１５分間３７℃で培養し、細胞を完全に溶解した。溶液を均質化した後、１８７５μｌの１ＭＭｇＣｌ２を添加した。３７５μｌのデオキシリボヌクレアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）の添加後、溶液を３０分間３７℃で培養した。細胞残渣を破壊することなく、室温で３０分間１８８０ｘｇで遠心分離した。次に、上清を蛋白質からＦＲＥＯＮ（３ｘ）を用いて抽出により精製した。透明な上清を１Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝塩化セシウムブロック勾配（範囲：１．２／１．４ｇ／ｍｌ）に入れ、１０℃下２．５時間２１００ｒｐｍで遠心分離した。ウイルスバンドを単離し、その後、第２精製を１Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝を使用して継続し、塩化セシウムの１．３３ｇ／ｍｌの勾配を実施した。その後、ウイルスを１０℃で５５０００ｒｐｍで１７時間遠心分離した。ウイルスバンド単離し、スクロース（５０％ｗ／ｖ）を添加して最終濃度１％にした。過剰の塩化セシウムを、ＣａＣｌ２（０．９ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）おおよび増加濃度のスクロース（１、２、５％）で補充された１．５リットルＰＢＳに対する透析スライド（Slide-a-lizer、カットオフ１００００ｋＤａ，Pierce、ＵＳＡ）中における透析（３回１時間室温下にて）により除去した。透析後、スライド−ア−ライザーからウイルスを除去し、この後、２５および１００μｌの部分に分取し、ウイルスを−８５℃で貯蔵した。
【００２３】
１ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を決定するために、５０μｌのウイルスバッチをShabram等(1997年)に説明された高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で展開する。ウイルスを、０〜６００ｍＭの範囲のＮａＣｌ勾配を使用して溶出した。表１に示すように、ウイルスが溶出されるＮａＣｌ濃度は血清型によって有意に異なる。
殆どのヒトアデノウイルスは僅かな例外はあるが、ＰＥＲ．Ｃ６で良好に複製された。アデノウイルス８型および４０型を９１１−Ｅ４細胞（Ｈｅ等、1998年）で成長させた。精製ストックは５×１０１０および５×１０１２ウイルス粒子／ｍｌの間で含む（ＶＰ／ｍｌ；参照表１）。
【００２４】
精製ヒトアデノウイルスストックの滴定
中和化アッセイの長さである、５日間で完全なＣＰＥを得るために必要なウイルス量を決定するためにＰＥＲ．Ｃ６でアデノウイルスを滴定した。１００μｌ培地を９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。予め１０４、１０５、１０６または１０７倍に希釈した２５μｌのアデノウイルスストック９６ウェルプレートのカラム２に添加し、ピペットで上下１０回混合した。その後、２５μｌをカラム２からカラム３に運び再び混合した。この操作をカラム１１まで繰り返した。この後、２５μｌをカラム１１から廃棄した。このように、５の段階における連続希釈を予め希釈したストックから開始して得た。この後、３×１０４ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）を１００μｌ体積で添加し、プレートを３７℃下、５日または６日間５％ＣＯ２で培養した。ＣＰＥを顕微鏡でモニターした。Reed−Muench法を使用して、細胞培地阻害量５０％（ＣＣＩＤ５０）を計算した。
【００２５】
並行して、同一のプレートを用意してＭＴＴアッセイ（プロメガ）を使用して分析した。このアッセイでは、生細胞は比色染色により定量化した。２０μｌＭＴＴ（ＰＢＳ中７．５ｍｇｒ／ｍｌ）をウェルに添加し、３７℃下２時間５％ＣＯ２で培養した。上清を除去し１００μリットルの２０：１イソプロパノール／トリトン−Ｘ１００溶液をウェルに添加した。プレートを９６ウェルシェイカーに３−５分間載せ、沈殿した染色を可溶化した。吸光度を５４０ｎｍおよび６９０ｎｍ（バックグラウンド）で測定した。このアッセイにより、進行中ＣＰＥまたは完全ＣＰＥを有するウェルを識別できる。
【００２６】
中和化アッセイ
希釈ヒト血清サンプルを有する９６ウェルプレートを３７℃下、５５ＣＯ２で解凍した。２００ＣＣＩＤ５０／５０μｌに希釈したアデノウイルスストックを調製し、５０μｌアリコートを、血清を有するプレートのカラム１〜１１に添加した。プレートを１時間３７℃下５％ＣＯ２で培養した。その後、６×１０５／ｍｌにて５０μｌＰＥＲ．Ｃ６細胞を全ウェルに分注し、１日３７℃下５％ＣＯ２で培養した。血清の毒性効果を避けるために、上清を新しいピペットチップを使用して各列について除去し、２００μｌの新しい培地を全ウェルに添加した。プレートを更に４日間３７℃下５％ＣＯ２で培養した。さらに、並行したコントロールプレートをラビットで発生し、例ＡおよびＢにおける試験されるべき各血清型に対して特異的である希釈した正コントロール血清および列ＣおよびＤの負コントロール血清（ＦＣＳ）を有するデュプロにて用意した。また、列Ｅ−Ｈのそれぞれにおいて、試験されるべき各ウイルスの２００ＣＣＩＤ５０で開始する５回希釈の段階を有する上記方法で滴定を行った。５日に、コントロールプレートの一つを顕微鏡的にＭＴＴアッセイを用いて分析した。実験力価を顕微鏡的に観察したコントロール滴定プレートから計算した。ＣＰＥが完全であることがわかった場合、すなわち、ＭＴＴにより分析されたコントロール滴定実験における第１希釈が明確な細胞子を示す場合、全アッセイプレートを処理した。そうでない場合は、充分なＣＰＥが見られるまで、アッセイを１日またはそれ以上進めることができ、その後全プレートを処理した。殆どの場合、アッセイを５日で終了した。Ａｄ１、５、３３、３９、４２および４３について、アッセイを６日間放置し、Ａｄ２については８日放置した。
【００２７】
最高血清濃度で血清がないコントロールに比べて４０％の最大保護が見られた場合、血清サンプルを「非中和化」と見なす。
１００人の健康なボランティアから得た血清に対する４４のプロトタイプアデノウイルスの分析結果を図１に示す。予想通り、Ａｄ２およびＡｄ５に対する中和化抗体を含む血清サンプルのパーセントは非常に高かった。このことは、番号のより小さいアデノウイルスの殆どに対しても真実であった。驚くべきことに、血清サンプルはＡｄ３５に対する中和化抗体を含まなかった。さらに、血清型２６、３４および４８に対する中和化抗体力価を有する個々の数は非常に低かった。
したがって、Ａｄ３５に基づく組換えＥ１欠損アデノウイルスすなわち上記他の血清型の一つは抗体中和化によるウイルスの一掃についてＡｄ５に基づく組換えベクタに比較して重要な利点を有する。
また、対応するＡｄ３５のキャプシド蛋白質（の一部）または他の血清型により置換されるホストの免疫応答に含まれるキャプシド蛋白質（の一部）を有するＡｄ５基ベクタはヒト血清の大部分により中和化されないか、非常に少ない。
【００２８】
表１に示されるように、１ｍｌあたりのウイルス粒子および実験における各ウイルスに対して得たＣＣＩＤ５０から計算したＶＰ／ＣＣＩＤ５０比は高度に可変であり、０．４〜５ｌｏｇの範囲であった。これはおそらく、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の異なる感染効率およびウイルスの複製効率に於ける相違により引き起こされる。さらに、バッチ品質に於ける相違が役割を演じているかもしれない。高ＶＰ／ＣＣＩＤ５０比は、５日でＣＰＥを得るためにウェルにより多くのウイルスを入れることを意味する。結果として、より多くの（不活性な）ウイルス粒子が抗体を遮蔽可能なので、中和研究の結果について先入観を持たれる可能性がある。この現象が生じたかどうかを確認するために、ＶＰ／ＣＣＩＤ５０比をアッセイ（図２）で正であることがわかった血清サンプルのパーセントに対してプロットした。グラフはアッセイにおけるウイルス量と血清における中和化の間に逆相関がないことを明確に示す。
【００２９】
実施例２
Ａｄ３５に対する中和化活性（ＮＡ）の普及は異なる地理的位置からのヒト血清において低い
実施例１において、ベルギーのある場所からのヒト血清における中和化活性（ＮＡ）の分析を説明した。試験した４４のアデノウイルス血清型のパネルのうち一血清型つまりＡｄ３５はアッセイした１００の血清のいずれにおいても中和されなかった。さらに、いくつかの型つまりＡｄ２６、Ａｄ３４，およびＡｄ４８は試験した血清のうち８％以下において中和されることがわかった。さらに、この分析は先に試験していないアデノウイルスの他の血清型に拡張し、第１スクリーンからの血清型の選択を使用して、異なる地理的位置からの血清にも拡張した。
【００３０】
これまで、アデノウイルスを増殖し、精製し、実施例１に記載したＣＰＥ阻害アッセイにおける中和化に対して試験した。実施例１におけると同じバッチからの血清を使用して、アデノウイルス血清型７Ｂ、１１、１４、１８、および４４／１８７６を中和化に対して試験した。これらのウイルスが血清のそれぞれ５９、１３、３０、９８および５４％で中和されることがわかった。しがたって、この血清のうちＡｄ１１は比較的低い頻度で中和される。
【００３１】
ヒト組織からのアデノウイルス血清型の単離の頻度およびアデノウイルス血清型へのＮＡの普及が異なる地理的位置について異なることが知られているので、我々は異なる場所からの血清に対するアデノウイルス血清型の選択をさらに試験した。ヒト血清を、付加的に欧州（イギリスのブリストルおよびオランダのライデン）の二カ所から、および合衆国（カリフォルニアのスタンフォードおよびニューヨークのグレートネック）の二カ所から得た。第１スクリーンにおいて２０％以下の血清にて中和されることがわかったアデノウイルスおよびＡｄ２，Ａｄ５，Ａｄ２７，Ａｄ３０，Ａｄ３８，Ａｄ４３をイギリスからの血清における中和化に対して試験した。これらの実験の結果を図３に示す。アデノウイルス血清型２および５を高パーセントのヒト血清において再び中和化した。さらに、第１スクリーンにおける低パーセントの血清において中和された血清型の幾つかはイギリスからのより高パーセントの血清、例えばＡｄ２６（７％対３０％）、Ａｄ２８（１３％対５０％）、Ａｄ３４（５％対２７％）、およびＡｄ４８（８％対３２％）において中和される。第１スクリーンにおける比較的低パーセントの血清において見いだされたＡｄ１１およびＡｄ４９に対する中和化活性はこの第２スクリーン（それぞれ１３％対５％および２０％対１１％）におけるさらにより低パーセントの血清において見いだされた。第１スクリーンにおける血清において中和されなかった血清型Ａｄ３５はイギリスからの低パーセント（８％）の血清において中和されることが今回わかった。イギリスからのヒト血清におけるＮＡの普及は血清型Ａｄ１１およびＡｄ３５に対して最低である。
【００３２】
更なる分析のために、合衆国（カリフォルニアのスタンフォードおよびニューヨークのグレートネック）の二カ所からおよびオランダ（ライデン）から血清を得た。図４はこれらの血清について得たデータおよび先のデータの外観を示す。Ａｄ５，Ａｄ１１、およびＡｄ３５を除く全血清について全ウイルスを試験したわけではない。ヒト血清のこの包括的なスクリーンからの全結論は、Ａｄ３５に対する中和活性の普及が西の国々にわたる全血清型のうちで最低である、ということである：すなわち、平均７％のヒト血清が中和活性を有する（５つの異なる場所）。別のＢグループアデノウイルスであるＡｄ１１も低パーセントのヒト血清において中和される（５つの異なる場所からの血清において平均１１％）。アデノウイルス型５は５つの異なる場所から得たヒト血清の５６％において中和される。全血清を試験したわけではないが、Ｄグループ血清型４９も比較的低い頻度で中和される（平均１４％）。
【００３３】
本願発明に記載の中和化実験において、血清を含まないコントロールに対して、最高血清濃度のウェル中でＣＰＥの最大保護が４０％である場合に血清は非中和化であると判定される。この保護は以下のようにして計算される：
【数２】
0004402881.tif 000003
【００３４】
実施例１に記載したように、血清は４×希釈から６４×希釈までの範囲を有する５つの異なる希釈に付される。したがって、ＮＡの低力価（すなわち、最高血清濃度中においてのみ中和される）および高力価（すなわち、最低血清濃度のウェル中でも中和される）間で区別する可能性がある。Ａｄ５に対する中和活性を有することを見いだしたわれわれのスクリーンで使用したヒト血清のうち、７０％が高力価を有するに至ったが、Ａｄ３５に対するＮＡ含有血清では、たったの１５％しか高力価をもたなかった。Ａｄ１１へのＮＡに対して正であった血清のうち、たったの８％しか高力価を示さなかった。Ａｄ４９については５％であった。したがって、Ａｄ３５、Ａｄ１１および４９へのＮＡに対する頻度はＡｄ５に比べてずっと低いのみならず、これらのウイルスに対するＮＡ含有血清のうち大多数が低力価である。したがって、Ａｄ１１、Ａｄ３５、またはＡｄ４９に基づくアデノウイルスベクタは、感染効率が中和活性により妨害される用途でまたはインビボで遺伝子治療ビヒクルまたはワクチン接種ベクタとして使用した場合Ａｄ基ベクタを超えて明らかな利点を有する。
以下の実施例において、安全なＲＣＡフリーのＡｄ３５基ベクタの生成に対するベクタ系の構築を説明する。
【００３５】
実施例３
ヒトアデノウイルス型３５の配列
Ａｄ３５ウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞で増殖し、ＤＮＡを以下にようにして単離した：つまり、１００μｌのウイルスストック（Ａｄ３５：３．２６×１０１２ＶＰ／ｍｌ）に、１０μｌの１０×ＤＮアーゼ緩衝液（１３０ｍＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５；１．２ＭのＣａＣｌ２；５０ｍＭのＭｇＣｌ２）を添加した。１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＤＮアーゼＩ（ロシュ  ダイアグノスティクス）の添加の後、混合物を１時間３７℃で培養した。２．５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ、３．２μｌの２０％ＳＤＳおよび１．５μｌのプロテイナーゼＫ（ロシュ  ダイアグノスティクス；２０ｍｇｒ／ｍｌ）の添加に続いて、サンプルを５０℃で１時間培養した。次に、ウイルス性ＤＮＡをジーンクリーンスピンキット（Ｂｉｏｌ０１Ｉｎｃ．）を使用して製造者に指示にしたがって培養した。ＤＮＡをスピンカラムから２５μｌの無菌ＭｉｌｌｉＱ水で溶出した。全配列を。Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，ドイツ）により生成した。全ウイルス性ＤＮＡを超音波処理により剪断した。剪断した平滑フラグメントをアガロースゲルでサイズフラクションし、１．８〜２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントに対応するゲルスライスを得た。ＤＮＡをＱＩＡクイックゲル抽出プロトコルによりゲルスライスから精製し、ｐＵＣ１９プラスミドクローニングベクタのショットガンライブラリにサブクローニングした。標的ＤＮＡ８（＋／−２）倍をカバーする９６ウェルプレートにあるクローンのアレイを使用して全配列を使用した。配列決定をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９７００サーモサイクラーでＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ケミストリーおよびＡｍｐｌｉＴａｇＦＳＤＮＡポリメラーゼを使用して実施し、続いてＱＩＡＧＥＮ  ＤｙｅＥｘ９６を使用して配列決定反応の精製を行った。その後、配列決定反応生成物をＡＢＩ３７７ＸＬ９６レーンシークエンサーでフラグメントの自動化分離および検出に付した。初期配列結果を使用して連続配列を生成し、隙間を標的ＤＮＡについてプライマーウォーキングによりまたはＰＣＲ生成物の直接配列決定により満たした。ウイルス末端はショットガンライブラリーにないことがわかった。おそらく、ウイルス性ＤＮＡのプロテイナーゼＫ消化後、ＩＴＲ配列に残りのｐＴＰのアミノ酸が結合したことにより、クローニングが困難なためである。付加的な配列はこれらの領域における配列の殆どを解決したウイルス性ＤＮＡ上にあるが、殆どの末端ヌクレオチドの明確な配列を得ることは困難であった。５’末端で得られた配列部分は５’−ＣＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）であり、３’末端で得られた配列部分は５’−ＡＧＧＴＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）であった。殆どのヒトアデノウイルスは末端配列５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）を有する。さらに、ｐＢｒ３２２への末端７ｋｂＡｄ３５ＥｃｏＲＩフラグメントをクローニングした後得たＡｄ３５ＤＮＡの３’端部を表すクローンが典型的なＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴ．．．配列を有することがわかった。したがって、Ａｄ３５は典型的な端部配列を持ち、ウイルス性ＤＮＡで直接配列決定する際に得られた相違がランオフ配列ランに関連するアーチフェクトおよびｐＴＰの残渣アミノ酸が存在するためである。
【００３６】
修正末端配列を有するＡｄ３５の全配列を図５に示す。オープンリーディングフレームの位置におけるＡｄ５（Ｇｅｎｂａｎｋ＃Ｍ７２３６０）およびＡｄ７（部分配列Ｇｅｎｂａｎｋ＃Ｘ０３０００）についての配列ホモロジーに基づいて、ウイルス組織は殆どのヒトアデノウイルスの一般的な組織と、特にサブグループＢウイルスと同一である。ゲノムの全長さは３４，７９４塩基対である。
【００３７】
実施例４
組換えＡｄ３５基ウイルスを生成するためのプラスミド基ベクタ系の構成
組換えアデノウイルスベクタを生成するための機能性プラスミド基ベクタ系は以下の成分から構成される。
１．
レフトＩＴＲおよびＡｄ３５から誘導されたパッケージング配列および異種発現カセットの挿入のための少なくとも１つの制限部位および欠損Ｅ１配列を含むアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドはｐＩＸプロモータを含むＥ１Ｂコード化領域からのＡｄ３５配列’および第２核酸分子を有するアダプタープラスミドの相同な組換えを媒介するのに充分なコード配列を含む。
２．
アダプタープラスミドに相同な配列、および組換えウイルスの複製およびパッケージングに必要なＡｄ３５配列、すなわちパッケージング細胞に存在しない初期、中期、後期遺伝子を含む第２核酸分子。
３．
Ａｄ３５のＥ１機能を相補可能な少なくとも機能性Ｅ１蛋白質を提供するパッケージング細胞。
パッケージング細胞を相補する際に組換えアデノウイルスを生成するための他の方法は当業界で知られており、発明から離れることなくＡｄ３５ウイルスに適用可能である。例として、上記のようなプラスミド基系の構成を以下に示す。
【００３８】
１）Ａｄ３５アダプタープラスミドの構成
アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ（国際特許出願ＷＯ９９／５５１３２に開示）を第１修飾して拡張したポリリンカを含み、かつプラスミドベクタ配列からのアデノウイルス挿入断片の均衡を可能にする３’端部におけるアデノウイルス配列およびレフトＩＴＲに隣接する便利なユニークな制限部位を含むアダプタープラスミドを得た。これらのプラスミドの構成は以下に詳細に説明する。
アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔをＳａｌＩで消化して、再連結を減少するためにシュリンプアルカリフォスファターゼで処理した。以下の２つのリン酸化およびアニール化オリゴから構成されるリンカーを消化した構成物に直接結合し、これによりＳａｌＩ制限部位をＰｉ−ＰｓｐＩ、ＳｗａＩおよびＰａｃＩにより置き換える。前記２つのオリゴ：ＥｘＳａｌＰａｃＦ５’−ＴＣＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ ）およびＥｘＳａｌＰａｃＲ５’−ＴＣＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＣＡＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ ）。この構築物をｐＡＤＡＰＴ＋ＥｘＳａｌＰａｃリンカーと表示する。さらに、ｐＡｄＡｐｔのレフトＩＴＲの一部を以下のプライマーを使用してＰＣＲにより増幅する：ＰＣＬＩＰＭＳＦ：５’−ＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＧＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ ）およびｐＣＬＩＰＢＳＲＧＩ：５’−ＧＣＧＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ ）。増幅したフラグメントをＭｕｎＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ（国際特許出願ＷＯ９９／５５１３２）にクローン化し、これをＥｃｏＲＩで部分的に消化し、精製後、ＢｓｒＧＩで消化し、これにより、レフトＩＴＲおよびパッケージング信号を再挿入した。制限酵素分析の後、構築物をＳｃａＩおよびＳｇｒＡＩで消化し、８００ｂｐフラグメントをゲルから単離し、ＳｃａＩ／ＳｇｒＡＩ消化ｐＡＤＡＰＴ＋ＥｘＳａｌＰａｃリンカーに結合した。得られた構築物、すなわち消化されたｐＩＰｓｐＳａｌＡｄａｐｔをＳａｌＩで消化し、リン酸化し、前記リン酸化ＥｘＳａｌＰａｃＦ／ＥｘＳａｌＰａｃＲ二重鎖リンカーに結合した。ＰａｃＩ部位がＩＴＲに最も近いクローンを制限分析により同定し、配列を配列分析により確認した。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔと呼ばれる新規なｐＡｄＡｐｔ構築物は、ＰａｃＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＢｓｔＢＩに対する認識配列を有する２つのＥｘＳａｌＰａｃリンカーを持っている。これらはアデノウイルスアダプター構築物のアデノウイルス部分を取り囲み、アデノウイルスヘルパーフラグメントを用いた同時トランスフェクションの前にプラスミドＤＮＡを直線化するために使用できる。
【００３９】
導入遺伝子クローニング順列をさらに増加するために、多くのポリリンカー変異株をｐＩＰｓｐＡｄａｐｔに基づいて構築した。この目的のために、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔをＥｃｏＲＩで先ず消化し、脱リン酸化した。以下の２つのリン酸化およびアニール化オリゴから構成されるリンカーをこの構成物に結合し、これによりＡｓｃＩ，ＳａｌＩ，ＥｃｏＲＶ，ＣｌａＩおよびＮｏｔＩに対する制限部位を作る：前記２つのオリゴ：エコリンカー＋：５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ ）およびエコリンカー：５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ ）。このリンカーの両配向を得て、配列を制限分析および配列分析により確認した。順序５’ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＡｇｅＩ，ＥｃｏＲＩ，ＡｓｃＩ，ＳａｌＩ，ＥｃｏＲＶ，ＣｌａＩ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ，ＨｐａＩ，ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩにおけるポリリンカーを含むプラスミドをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ１と呼び、順序ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＡｇｅＩ，ＮｏｔＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＶ，ＳａｌＩ，ＡｓｃＩ，ＥｃｏＲＩ，ＮｈｅＩ，ＨｐａＩ，ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩにおけるポリリンカーを含むプラスミドをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ２と呼ぶ。
【００４０】
他のセンスまたはアンチセンス構築物のクローニングを容易にするために、以下の２つのオリゴヌクレオチドから構成されるリンカーを消化し、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔのポリリンカーを逆転した：ＨｉｎｄＸｂａ＋５’−ＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）；ＨｉｎｄＸｂａ−５’−ＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）。このリンカーをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔに結合し、訂正した構築物を単離した。制限酵素分析および配列決定により確認した。この新規な構築物であるｐＩＰｓｐＡｄａｐｔＡをＥｃｏＲＩで消化し、前記エコリンカーをこの構築物に結合した。このリンカーの両配向を得て、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔＡ３と呼ぶ。これは順序ＸｂａＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｐａＩ，ＮｈｅＩ，ＥｃｏＲＩ，ＡｓｃＩ，ＳａｌＩ，ＥｃｏＲＶ，ＣｌａＩ，ＮｏｔＩ，ＡｇｅＩ，ＫｐｎＩ，およびＨｉｎｄＩＩＩにおけるポリリンカーを含む。全配列を制限酵素分析および配列決定により確認した。
【００４１】
Ａｄ３５に基づくアダプタープラスミドを以下ようにして構築した：
レフトＩＴＲおよびＡｄ３５ｗｔ配列ヌクレオチド１〜４６４（図５）に対応するパッケージング配列をＰＣＲによりｗｔＡｄ３５ＤＮＡで以下のプライマーを使用して増幅した：ｌプライマー３５Ｆ１：
２５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
プライマー３５Ｒ２：
５’−ＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＴＡＡＡＡＡＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
増幅によりＰａｃＩ部位を前記配列の５’端部およびＡｖｒＩＩ部位を３’端部に導入する。
増幅のために、白金Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＬＴＩ）を製造者の指示書にしたがって使用した。ただし、プライマーを０．６μＭにておよびＤＭＳＯを３％の最終濃度に添加した。増幅プログラムは以下のとおりである。９４℃で２分（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分）を３０サイクル行い、次に６８℃で１０分行った。
【００４２】
ＰＣＲ製品をＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）を使用して製造者の指示書にしたがって精製し，ＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩを使用して消化した。その後、この消化したフラグメントをゲルからジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１社）を使用して精製した。Ａｄ５基アダプタープラスミドｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ−３をＡｖｒＩＩで消化し、その後部分的にＰａｃＩで消化し、５７６２ｂｐフラグメントをＬＭＰアガロースゲルスライスにて単離し、同じ酵素で消化した上記ＰＣＲフラグメントを使用して結合した。得られたクローンをｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ３−Ａｄ３５ｌＩＴＲと表示する。
並行して、Ａｄ３５ＤＮＡの別のスライスを以下のプライマーを使用して増幅した：
３３５Ｆ３：５’−ＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
４３５Ｒ４：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＧＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
【００４３】
このフラグメントの配列は、ｗｔＡｄ３５（図５）のヌクレオチド３４０１〜４６６９に対応し、Ｅ１Ｂ５５ｋコード配列から直接３’から開始する１．３ｋｂの配列を含む。増幅と精製を、レフトＩＴＲ及びパッケージング配列を含むフラグメントについて上記のようにして実施した。その後、ＰＣＲフラグメントをＰａｃＩで消化し、ＳｍａＩおよびＰａｃＩで消化したｐＮＥＢ１９３ベクター（New England Biolabs）にサブクローン化した。得られたクローンの配列の完全性を配列分析により確認した。その後、ｐＮＥＢ／Ａｄ３５ｐＦ３Ｒ４をＢｇｌＩＩおよびＰａｃＩで消化し、Ａｄ３５をゲルからＱＩＡＥｘＩＩキット（Qiagen）を使用して単離した。ｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ３−Ａｄ３５ｌＩＴＲをＢｇｌＩＩで消化し、その後ＰａｃＩで部分的に消化した。３６２４ｂｐフラグメント（ベクター配列、Ａｄ３５ＩＴＲおよびパッケージング配列およびＣＭＶプロモータ、多重クローニング領域およびポリＡ信号含有）をもＱＩＡＥｘＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。両フラグメントを結合し、能力ＤＨ１０Ｂ細胞（ＬＴ１）に形質転換した。得られたクローンであるｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ３はｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ３から発現カセットを有するが、Ａｄ３５レフトＩＴＲおよびパッケージング配列およびＡｄ３５からのヌクレオチド３４０１から４６６９に対応する第２フラグメントを含む。反対の配向における多重クローニング部位を有するＡｄ３５アダプタープラスミドの第２バージョンを以下のようにして作った。
【００４４】
ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ１をＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、０．７ｋｂｐバンドはＣＭＶプロモータの一部を含有した。ＭＣＳおよびＳＶ４０ポリＡを単離し、ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１を生じるｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ３の対応部位に挿入した（図６）。
その後、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺおよびｐＡｄＡｐｔ３５．ＬｕｃアダプタープラスミドをｐｃＤＮＡ．ＬａｃＺ（ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化）およびｐＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃ（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化）からの導入遺伝子をｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１における対応部位に挿入することによって生成した。ｐｃＤＮＡ．ＬａｃＺおよびｐＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃの生成を国際特許出願ＷＯ９９／５５１３２に記載する。
【００４５】
２）コスミドｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲの構築
図７は、以下に詳細に記載する、ｂｐ３４０１〜３４７９４（ライトＩＴＲ端部）からのＡｄ３５配列を含有するコスミドクローンを構築するために採用した種々の段階を示す。
第１ＰＣＲフラグメント（ｐＩＸ−ＮｄｅＩ）を以下のプライマーセットを使用して生成した：
５３５Ｆ５：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
６３５Ｒ６：５’−ＣＧＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＡＣＡＧＡＡＣＡＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
ＤＮＡポリメラーゼＰｗｏ（ロシュ）を製造者の指示にしたがって使用した。ただし、両プライマーの最終濃度は０．６μＭであり、テンプレートとして５０ｎｇｒｗｔＡｄ３５ＤＮＡを使用した。増幅を以下のようにして行った：９４℃で２分；９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で１分４５秒を３０サイクル、そして６８℃で８分である。ＴＡクローニングベクターＰＣＲ２．１におけるクローニングを可能にするために、７２℃で１０分間１単位スーパーＴａｇポリメラーゼ（ＨＴバイオテクノロジーＬＴＤ）について最後のインキュベーションを行った。
３３７０ｂｐ増幅フラグメントは、５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位を有するｂｐ３４０１〜６７７２のＡｄ３５配列を含む。フラグメントをＰＣＲ生成キット（ＬＴ１）を使用して生成した。
【００４６】
第２ＰＣＲフラグメント（ＮｄｅＩ−ｒＩＴＲ）を以下のプライマーを使用して生成した：
７３５Ｆ７：５’−ＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＡＴＣ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
８３５Ｒ８：５’−ＣＧＧＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
増幅をｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（ＬＴＩ）を用いて製造者の指示にしたがって行った。ただし、０．６μＭの両プライマーおよび３％ＤＭＳＯを使用し、テンプレートとして１０ｎｇｒ．のｗｔＡｄ３５ＤＮＡを使用した。使用したプログラムは以下の通りである：
９４℃で３分、および９４℃で３０秒、４０℃で４５秒、６８℃で２分４５秒を５サイクル、さらに９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分４５秒を２５サイクルである。ＴＡクローニングベクターＰＣＲ２．１におけるクローニングを可能にするために、１単位のスーパーＴａｑポリメラーゼについて最後のインキュベーションを１０分間７２℃で行った。ヌクレオチド３３１７８〜Ａｄ３５のライトＩＴＲの末端までの範囲の１．６ｋｂの増幅フラグメントをＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）を使用して精製した。
【００４７】
両方の精製ＰＣＲフラグメントをＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）のＰＣＲ２．１ベクターに結合し、ＳＴＢＬ−２コンピテント細胞（ＬＴＩ）に形質転換した。期待した挿入物を含有するクローンを配列決定して正しい増幅を確認した。次に、両方のフラグメントをベクターからＮｏｔＩおよびＮｄｅＩを用いて消化することにより切除し、ゲルからジーンクリーンキット（ＢＩＯ１０１社）を使用して精製した。コスミドベクターｐＷＥ１５（Clontech社）をＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化し、さらにゲルから精製した。これらの３つのフラグメントを結合してＳＴＢＬ２コンピテント細胞（ＬＴＩ）に形質転換した。その後、両方のＰＣＲフラグメントを含む正しいクローンをＮｄｅＩで消化し、一次フラグメントをゲルからジーンクリーンキットを使用して精製した。Ａｄ３５ｗｔＤＮＡをＮｄｅＩで消化し、２６．６ｋｂフラグメントをＬＭＰゲルからアガロース酵素（ロシュ社）を製造者の指示にしたがって使用して精製した。これらのフラグメントを一緒に結合して、λ１相パッケージング抽出物（ストラタジーン社）を使用して製造者のプロトコルにしたがってパッケージングした。ＳＴＢＬ−２細胞への感染の後、コロニーはプレート上で成長し、完全な挿入の存在について分析した。正しい配向に挿入され、かつ3つの酵素（ＮｃｏＩ，ＰｖｕＩＩ，およびＳｃａＩ）で独立して消化した後正しい制限パターンを有する大きいフラグメントを有する一つのクローンを選択した。このクローンをｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲとして表示する。これはｂｐ３４０１〜末端までのＡｄ３５配列を含有し、ＮｏｔＩ部位に隣接する（図８）。
【００４８】
３）ＰＥＲ．Ｃ６におけるＡｄ３５基組換えウイルスの生成
野生型Ａｄ３５ウイルスはＰＥＲ．Ｃ６パッケージング細胞上で非常に高い力価まで成長可能である。しかし、ＰＥＲ．Ｃ６に存在するＡｄ５−Ｅ１領域が能力Ｅ１−欠損Ａｄ３５組換えウイルスであるかどうかは不明である。これを試験するために、ＰＥＲ．Ｃ６を上記アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺおよび大きいバックボーンフラグメントｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲを用いて同時トランスフェクションした。先ず、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺをＰａｃＩで消化し、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲをＮｏｔＩで消化した。さらに生成することなく、４μｇｒの各構築物をＤＭＥＭ（ＬＴＩ）で混合し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクションした。これは、製造者の指示書にしたがってリポフェクトアミン（ＬＴＩ）を使用して先にＴ２５フラスコに５×１０６細胞の密度で蒔いた。正のコントロールとして、６μｇｒのＰａｃＩ消化ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ  ＤＮＡをＥ１領域を含むウイルス性ゲノムのレフト末端を含有するＡｄ３５ｗｔＤＮＡから単離した６．７ｋｂＮｈｅＩフラグメントで同時トランスフェクションした。次の日の、培地（１０％のＦＢＳおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＤＭＥＭ）を新しくし、細胞をさらにインキュベートした。トランスフェクション後２日で、細胞をトリプシン処理しＴ８０フラスコに移した。正のコントロールフラスコはトランスフェクション後５日でＣＰＥを示し、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ構築物は少なくともＡｄ３５−Ｅ１蛋白質の存在下で機能的であることを示した。Ａｄ３５ＬａｃＺアダプタープラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲについてのトランスフェクションはＣＰＥを生じなかった。これらの細胞を１０日で培地にハーベストし、凍結／解凍を１回行い、細胞からウイルスを放出した。４ｍｌのハーベスト材料をＰＥＲ．Ｃ６細胞（８０％の密集度）の入ったＴ８０フラスコに添加し、さらに５日間インキュベートした。このハーベスト／再感染を２回繰り返したがウイルス関連ＣＰＥの証拠はなかった。
【００４９】
この実験から、Ａｄ３５−Ｅ１蛋白質は、Ａｄ３５組換えウイルスを相補できないかあるいは充分ではないと思われる。しかし、アダプタープラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲバックボーンプラスミドの配列オーバーラップが効率的に再結合して組換えウイルスゲノムを生じるのに充分には大きくない可能性がある。正のコントロールトランスフェクションを６．７ｋｂレフト末端フラグメントで行い、配列オーバーラップは約３．５ｋｂであった。アダプタープラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲフラグメントは１．３ｋｂの配列オーバーラップを有する。１．３ｋｂの配列オーバーラップが効率的な相同の組換えに対して小さすぎるかどうかを確認するために、同時トランスフェクションを、前記と同じ手順を使用して、ＰａｃＩ消化ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲおよび３５Ｆ１および３５Ｒ４を使用して生成したＡｄ３５ｗｔＤＮＡのＰＣＲフラグメントについて行った。したがって、ＰＣＲフラグメントはｂｐ４６６９までのレフト末端配列を含み、したがって、アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺと同じｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲを有するオーバーラップ配列を有する。しかし、Ａｄ３５Ｅ１配列を有する。ＰＣＲカラム生成の後、ＤＮＡをＳａｌＩで消化し、潜在的な無傷なテンプレート配列を除去する。消化したＰＣＲ生成物単独でのトランスフェクションは負のコントロールとして役立つ。トランスフェクション後４日でＣＰＥがＰＣＲ生成物およびＡｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲフラグメントでトランスフェクションした細胞に生じた。これは負のコントロールにはない。この結果により、１．３ｋｂオーバーラップ配列はＡｄ３５Ｅ１蛋白質の存在下でウイルスを生成するために充分であることがわかる。これらの実験から、われわれは、Ａｄ３５．Ｅ１蛋白質の少なくとも１つの存在がＡｄ５相補細胞株においてプラスミドＤＮＡから組換えＡｄ３５基ベクターを生成するために必要であると結論した。
９
【００５０】
実施例５
１）Ａｄ３５．Ｅ１発現プラスミドの構築
ＰＥＲ．Ｃ６のＡｄ５−Ｅ１蛋白質はＡｄ３５組換えウイルスを効率的に相補することが不可能であるので、Ａｄ３５Ｅ１蛋白質をＡｄ５相補細胞（例えばＰＥＲ．Ｃ６）で発現させる必要がある。あるいは、Ａｄ３５Ｅ１蛋白質を発現する新規なパッケージング細胞株を、アデノウイルスＥ１蛋白質を発現しない樹立した細胞株または二倍体一次ヒト細胞から開始して作る必要がある。第１の可能性に対処するために、Ａｄ３５Ｅ１領域を下記の発現プラスミドにおいてクローン化した。
第１に、ｂｐ４６８からｂｐ３４００までのＡｄ３５Ｅ１領域を以下のプライマーセットを使用してｗｔＡｄ３５ＤＮＡから増幅した：
１３５Ｆ１１：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＡＣＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
２３５Ｆ１０：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
【００５１】
このＰＣＲにより、５’末端にＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位をおよび３’末端にＸｂａＩ部位を誘導する。
５ｎｇｒ．テンプレートＤＮＡにおける増幅を製造者の指示にしたがってＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）で行った。しかし、両方のプライマーの最終濃度は０．６μＭであった。プログラムは以下のようであった：９４℃で２分；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で２分を５サイクル；さらに、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で２分を２５サイクル；さらに７２℃で１０分である。ＰＣＲ生成物をＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）で精製し、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化した。その後、消化したＰＣＲフラグメントを発現ベクターｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏ（下記参照）に結合し、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化した。結合物を製造者の指示にしたがって能力ＳＴＢＬ−２細胞（ＬＴＩ）に形質転換し、コロニーをＲＳＶプロモータおよびＨＢＶポリＡ間のポリリンカーへのＡｄ３５Ｅ１配列の正しい挿入に対して分析した。
【００５２】
得られたクローンをｐＲＳＶ．Ａｄ３５−Ｅ１として表した（図９）。ｐＲＳＶ．Ａｄ３５−Ｅ１におけるＡｄ３５配列を配列分析により確認した。
ｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏを以下のようにして生成した：ｐＲｃ−ＲＳＶ（インビトロゲン）をＰｖｕＩＩで消化し、ＴＳＡＰ酵素で脱リン酸化し、３ｋｂベクターフラグメントを低融点アガロースにおいて単離した（ＬＭＰ）。プラスミドｐＰＧＫｎｅｏｐＡ（図１０、国際特許出願        ＷＯ９６／３５７９８）をＳｓｐＩで完全に消化し、プラスミドを直線化し、ＰｖｕＩＩを用いた部分的消化を容易にした。ＰｖｕＩＩを用いた部分的な消化の後、得られたフラグメントをＬＭＰアガロースゲル上で分離し、ＰＧＫプロモータ、ネオマイシン耐性遺伝子およびＨＢＶポリＡ含有２２４５ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントを単離した。単離した両方のフラグメントを結合して、ＰＧＫprom−ネオ−ＨＢＶポリＡカセットにより置換されたオリジナルＳＶ４０prom−ネオ−ＳＶ４０ポリＡ発現カセットを持つに至った発現ベクターｐＲＳＶ−ｐＮｅｏを得た（図１１）このプラスミドを、ＢＧＨｐＡをＨＢＶｐＡで置換するために、さらに以下のように修飾した：ｐＲＳＶｐＮｅｏをＳｃａＩで直線化し、さらにＸｂａＩで消化した。Ａｍｐ遺伝子の一部およびＲＳＶプロモーター配列およびポリリンカー配列を含有する１１４５ｂｐフラグメントをゲルからジーンクリーンキット（ＢｉｏＩｎｃ．１０１）を使用して単離した。次に、ｐＲＳＶｐＮｅｏをＳｃａＩで直線化し、さらにＥｃｏＲＩで部分的に消化し、ＰＧＨｎｅｏカセットおよびベクター配列を含む３７０４ｂｐフラグメントをゲルから上記のように単離した。その後、それぞれ５’および３’末端にてＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩに隣接したＨＢＶポリＡ配列含有第３フラグメントを以下のプライマーセットを使用してｐＲＳＶｐＮｅｏ上でＰＣＲ増幅により生成した。
３ＨＢＶ−Ｆ：５’−ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
４ＨＢＶ−Ｒ：５’−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
【００５３】
増幅をエロンガーゼ酵素（ＬＴＩ）を使用して製造者の指示にしたがって以下の条件で行った：９４℃で３０秒；その後、９４℃で４５秒；４２℃で１分、６８℃で１分を５サイクル；さらに９４℃で４５秒、６５℃で１分および６８℃で１分を３０サイクル；さらに６８℃で１０分である。その後、６２５ｂｐＰＣＲフラグメントを、ＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ゲルからジーンクリーンキットを使用して精製した。３つの単離したフラグメントを結合してＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し（ＬＴＩ），構築物ｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏを得た（図１２）。この構築物において、ＲＳＶ発現カセットおよびネオマイシン選択マーカーの転写調節領域を修飾してＣＭＶおよびＳＶ４０転写調節配列をしばしば含むアデノウイルスベクターとのオーバーラップを減少させる。
【００５４】
２）Ａｄ３５−Ｅ１発現構築物を使用した同時トランスフェクションされたＰＥＲ．Ｃ６細胞上のＡｄ３５組換えウイルスの生成
ＰＥＲ．Ｃ６細胞をＴ２５フラスコに５×１０６細胞の密度で蒔き、次の日、ＰａｃＩで消化した１μｇｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ
未消化の５μｇｐＲＳＶ．Ａｄ３５Ｅ１
ＮｏｔＩで消化した２μｇｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
を含有するＤＮＡ混合物を使用してトランスフェクションした。
トランスフェクションを、製造者の指示にしたがってリポフェクトアミンを使用して行った。トランスフェクション混合物を細胞に添加した後５時間で、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。２日後、細胞をＴ８０フラスコに入れ、さらに培養した。トランスフェクション後１週間で、１ｍｌの培地をＡ５４９細胞に添加し、次の日、細胞をＬａｃＺ発現に対して染色した。染色後２時間で青い細胞がはっきり見え、組換えＬａｃＺ発現ウイルスが生成されたことを示した。さらに、細胞を培養したが、ＣＰＥは明確には見られなかった。しかし、１２日後、細胞の塊が単層にて現れ、トランスフェクション後１８日で細胞が外れた。その後、細胞および培地をハーベストし、凍結／解凍を１回行い、１ｍｌの粗ライゼートを使用して６ウェルプレートでＰＥＲ．Ｃ６を感染した。感染後２日で、細胞をＬａｃＺ活性に対して染色した。２時間後、細胞の１５％が青く染色した。ｗｔの存在および／または能力ウイルスの複製を試験するために、Ａ５４９細胞をこれらのウイルスを使用して感染し、さらに培養した。ＣＰＥの徴候は見られず、能力ウイルス複製の不存在を示した。これらの実験から、組換えＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスを、Ａｄ３５−Ｅ１発現構築物で同時トランスフェクションしたＰＥＲ．Ｃ６細胞で作った。Ａｄ３５組換えウイルスはＡｄ５ウイルスに対する活性を中和化することを含むヒト血清における中和化を免れる。
【００５５】
その後、ＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスを使用してＡｄ５ウイルスに対する活性の中和化を含む血清の存在下における感染を調べた。精製したＡｄ５基ＬａｃＺウイルスはＮＡに対する正のコントロールとして役立った。これまで、ＰＥＲ．Ｃ６を２４ウェルプレートに２×１０５セル／ウェルの密度で蒔いた。次の日、Ａｄ５に対する高中和活性を有するヒト血清サンプルを５段階の５倍希釈における粗培地において希釈した。その後、０．５ｍｌの希釈血清を０．５ｍｌ培地中の４×１０６ウイルス粒子ＡｄＡｐｔ５．ＬａｃＺウイルスで混合し、３７℃で３０分インキュベーションした後その混合物の０．５ｍｌをＰＥＲ．Ｃ６に二重試験下にて添加した。ＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスについて、０．５ｍｌの希釈血清サンプルをＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスを含有する０．５ｍｌの粗ライゼートで混合し、インキュベーション後、この混合物の０．５ｍｌをデュプロにおけるＰＥＲ．Ｃ６細胞に添加した。血清無しで培地中でインキュベートしたウイルスサンプルを感染に対する正のコントロールとして使用した。３７℃における感染の２時間後、培地を添加し最終体積を１ｍｌにし、さらに細胞をインキュベートした。感染後２日で、細胞をＬａｃＺ活性に対して染色した。その結果を表ＩＩに示す。これらの結果から、ＡｄＡｐｔ５．ＬａｃＺウイルスが効率的に中和され、ＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスがヒト血清の存在に関係なく感染性のままであることが明らかである。これにより、組換えＡｄ３５基ウイルスはＡｄ５基ウイルスに対するＮＡを含有するヒト血清中での中和を免れることがわかる。
【００５６】
実施例６
Ｅ１欠損Ａｄ３５ウイルスを相補可能な細胞株の精製
ｐＩＧ１３５およびｐＩＧ２７０の精製
構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ（図１３）は，Ａｄ５配列のヌクレオチド４５９から３５１０（ジーンバンク寄託バンゴＭ７２３６０）に相当するＡｄ５のＥ１領域配列を含み、ヒトホスフォグリセレートキナーゼプロモータ（「ＰＧＫ」）およびヘパティティスＢウイルスポリＡ配列に操作により結合させることが可能である。この構築物の生成は国際特許出願ＷＯ９７／００３２６に記載されている。Ａｄ５のＥ１配列を以下のＡＤ３５の対応する配列により置換した。ｐＲＳＶ．Ａｄ３５−Ｅ１（実施例５に記載）をＥｃｏＲＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで消化し、Ａｄ３５Ｅ１配列に対応する３ｋｂフラグメントをゲルから単離した。構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢをＳｓｅ８３８７Ｉで完全に消化し、ＥｃｏＲＩで部分的に消化した。ベクター配列に相当する、Ａｄ５Ｅ１領域は無いがＰＧＫプロモータは残っている４．２ｋｂフラグメントを他のフラグメントからＬＭＰアガロースゲルで分離し、正しいバンドをゲルから切り取った。得られた両方のフラグメントを結合し、ｐＩＧ．Ａｄ３５−Ｅ１を得た。
【００５７】
このベクターをさらに修飾してｐＵＣ１１９ベクターバックボーンに存在するＬａｃＺ配列を除去した。ベクターをＢｓａＡＩおよびＢｓｔＸＩで消化し、大きいフラグメントをゲルから単離した。二重鎖オリゴを以下の２つのオリゴをアニーリングすることにより調製した：
１ＢＢ１：５’−ＧＴＧＣＣＴＡＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
２ＢＢ２：５’−ＧＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＡＣ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
【００５８】
オリゴとベクターフラグメントの結合により構築物ｐＩＧ１３５ができる（図１４）。オリゴの適正な挿入によりＢｓａＡＩおよびＢｓｔＸＩ部位が回復しユニークＡｖｒＩＩ部位が導入される。次に、我々はｐＩＧ１３５のＡｄ３５−Ｅ１発現カセットの３’末端におけるユニーク部位を導入した。構築物をＳａｐＩで消化し、３’突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により平滑にした。したがって、このように処理した直線プラスミドさらにＢｓｒＧＩで消化し、大きいベクター含有フラグメントをゲルから単離した。ＨＢＶポリＡ配列の３’末端を回復するために、およびユニーク部位を導入するために、ＰＣＲフラグメントを以下のプライマーを使用して生成した：
３２７０Ｆ；５’−ＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＴＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
４２７０Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
ＰＣＲをｐＩＧ．Ａｄ３５Ｅ１ＤＮＡに対してＰｗｏポリメラーゼ（ロシュ）を使用して製造者の指示にしたがって実施した。得られたＰＣＲ生成物をＢｓｒＧＩで消化し、Ｔｓａｐ酵素（ＬＴＩ）を使用して脱リン酸化した。後者はＳｓｒＧＩ部位における挿入断片二量化を回避するためである。ＰＣＲフラグメントおよびベクターフラグメントを結合して構築物ｐＩＧ２７０を得た（図１５）。
【００５９】
Ａｄ３５Ｅ１配列はラット一次細胞を形質転換可能である。
新生ＷＡＧ／ＲＩＪラットを１週間の妊娠期間にて犠牲にし、腎臓を単離した。注意深く皮膜を除去した後、腎臓を３７℃でトリプシン／ＥＤＴＡ（ＬＴＩ）中多重ラウインドのインキュベーションにより壊して単細胞懸濁液にした。浮いた細胞を冷たい１％ＦＢＳ含有冷ＰＢＳに集めた。腎臓の殆どをトリプシン処理したとき、全細胞を１０％ＦＢＳで補充したＤＭＥＭ中に再懸濁し、滅菌チーズクロスを介して濾過した。一つの腎臓から得たあかちゃんラットの腎臓（ＢＲＫ）細胞を５つの皿（Greiner、６ｃｍ）にプレートした。７０〜８０％の密集度に達したとき、細胞を１または５μｇｒのＤＮＡ／皿を用いてＣａＰＯ４沈殿キット（ＬＴＩ）を使用して製造者の指示にしたがってトランスフェクションした。以下の構築物を別のトランスフェクションにおいて使用した：つまり、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ（Ａｄ５−Ｅ１領域発現）、ｐＲＳＶ．Ａｄ３５−Ｅ１，ｐＩＧ．Ａｄ３５−Ｅ１およびｐＩＧ２７０（Ａｄ３５−Ｅ１領域発現）。形質転換された細胞の細胞増殖巣が現れるまで細胞を３７℃でインキュベートした。表ＩＩＩは円状のまたは線状のＤＮＡを使用する幾つかのトランスフェクション実験から得られた細胞増殖巣の数を示す。予想通り、Ａｄ５−Ｅ１領域は効率的にＢＲＫ細胞を形質転換した。また、細胞増殖巣は低率ではあるが、Ａｄ３５−Ｅ１トランスフェクション細胞層においても現れた。Ａｄ３５形質転換細胞増殖巣は後の時点で現れた：つまり、Ａｄ５Ｅ１に対する７〜１０日に比べてトランスフェクション後、〜２週間である。これらの実験は、ＢグループウイルスＡｄ３５のＥ１遺伝子が一次げっ歯細胞を形質転換できることを明確に示す。このことはＡｄ３５−Ｅ１発現構築物の機能性を証明し、ＢグループウイルスＡｄ３およびＡｄ７の形質転換能の以前の発見を確認する（Dijkema,1979年）。細胞増殖巣における細胞が実際に形質転換されたかどうかを試験するために、細胞増殖巣を少し選んで、膨張（expand）させた。選択した７つの細胞増殖巣から少なくとも５つが樹立された細胞株として成長せることがわかった。
【００６０】
一次ヒト羊膜細胞由来新規なパッケージング細胞の生成
羊膜穿刺後に得た羊水を遠心し、細胞をＡｍｎｉｏＭａｘ培地（ＬＴＩ）中に再懸濁し、組織培養フラスコ中で、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。細胞が良好に成長しているとき（約１回の細胞分裂／２４時間）、培地を、ＡｍｍｉｏＭａｘ完全培地とＧｌｕｔａｍａｘＩ（最終濃度４ｍＭ、ＬＴＩ）およびグルコース（最終濃度４．５ｇｒ／Ｌ、ＬＴＩ）で補充したＤＭＥＭ低グルコース培地（ＬＴＩ）の１：１混合物および１０％ＦＢＳ（ＬＴＩ）で置き換えた。トランスフェクションのために、〜５×１０５細胞を１０ｃｍの組織培養皿にプレートした。後日、細胞を２０μｇｒのｐＩＧ２７０／皿でＣａＰＯ４形質転換キット（ＬＴＩ）を使用して製造者の指示にしたがってトランスフェクションし、細胞を、ＤＮＡ沈殿物と共に一晩インキュベートした。次の日、細胞を４回、ＰＢＳで洗浄し、沈殿物を除去し、さらに３週間以上形質転換した細胞巣が現れるまでインキュベートした。１週間に一度、培地を新しい培地で置き換えた。非制限的に、リポフェクトアミン（ＬＴＩ）またはＰＥＩ（ポリエチレンイミン、高分子量、無水、Ａｌｄｒｉｃｈ）等の他のトランスフェクション剤を使用した。これらの３種の薬品のうち、ＰＥＩが最良のトランスフェクション効率に一次ヒト羊膜細胞について達した：つまり、〜１％青細胞４８時間。ｐＡｄＡｄｔ３５．ＬａｃＺの次の形質転換。
【００６１】
細胞増殖巣を以下のように単離した。培地を除去し、ＰＢＳによって置き換え、その後、細胞増殖巣を、使い捨てフィルタチップのついた５０−２００μｌギルソンピペットを使用して細胞をやさしく擦って単離した。〜１０μｍｌＰＢＳに含まれる細胞を１５μｌトリプシン／ＥＤＴＡ（ＬＴＩ）を含む９６ウェルプレートに入れ、単細胞懸濁液をピペットで上下して得、室温で短くインキュベーションした。上記ＡｍｍｉｏＭａｘ完全培地と補充ＤＭＥＭの１：１混合物および１０％ＦＢＳを２００μｌ添加した後、細胞をさらにインキュベートした。成長し続けるクローンを膨張させ、特に、Ａｄ３５またはＡｄ１１から特異的なＢグループウイルス由来の、異なるサブグループのＥ１欠損アデノウイルスベクターの成長を補足する能力を分析した。
【００６２】
ＨＥＲ細胞からの新規なパッケージング細胞株の生成
ＨＥＲ細胞を単離し、１０％ＦＢＳ（ＬＴＩ）で補充したＤＭＥＭ培地で培養した。トランスフェクション前日、〜５×１０５細胞を６ｃｍ皿にプレートし、３７℃、１０ＣＯ２下で一晩培養した。トランスフェクションをＣａＰＯ４沈殿キット（ＬＴＩ）を使用して製造者の指示にしたがって実施した。各皿を８〜１０μｍｇｒのｐＩＧ２７０ＤＮＡで、円状プラスミドとしてまたは精製フラグメントとしてトランスフェクションした。精製フラグメントを得るために、ｐＩＧ２７０をＡｖｒＩＩおよびＸｂａＩで消化し、Ａｄ３５Ｅ１発現カセットに相当する４ｋｂフラグメントをゲルからアガラーゼ処理（ロシュ）により単離した。次の日、４つの皿から滅菌ＰＢＳを使用して沈殿物を注意深く洗い去る。新鮮な培地を添加し、トランスフェクションした細胞を、栄質転換細胞の細胞増殖巣が現れるまでさらに培養した。充分に大きい（＞１００細胞）細胞巣を選択し、上記のように９６ウェルに入れた。成長を続ける形質転換ＨＥＲ細胞のクローンを膨張させ、特に、Ａｄ３５またはＡｄ１１から特異的なＢグループウイルス由来の、異なるサブグループのＥ１欠損アデノウイルスベクターの成長を補足する能力を試験した。
【００６３】
ＰＥＲ．Ｃ６由来の新規なパッケージング細胞株
実施例５に記載したように、例えばｐＲＳＶ．Ａｄ３５．Ｅ１等のＡｄ３５−Ｅ１発現構築物の同時トランスフェクションによるＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＡｄ３５Ｅ１欠損ウイルスを生成、成長させることが可能である。しかし、この方法を使用する組換えアデノウイルスの大規模生成は面倒である。その理由は、各増幅段階について、Ａｄ３５Ｅ１構築物のトランスフェクションを必要とするからである。さらに、この方法はプラスミドとウイルスゲノム間の非同種組換えの危険を増加させ、複製能力ウイルスになるＥ１配列を結合した組換えウイルスの生成の機会が多い。これを避けるために、ＰＥＲ．Ｃ６のＡｄ３５−Ｅ１蛋白質の発現は、ゲノムの発現プラスミドの完全なコピーにより媒介される必要がある。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を既に形質転換しＡｄ３５−Ｅ１蛋白質を発現するので、余計なＡｄ３５−Ｅ１発現の添加は細胞に対して毒性を有するかもしれない。しかし、Ｅ１蛋白質で形質転換細胞を安定的にトランスフェクションすることは不可能ではない。その理由は、Ａｄ５−Ｅ１発現Ａ５４９細胞が生成されたからである。
【００６４】
サブグループＢウイルスＡｄ７由来の組換えアデノウイルスを生成する試みにおいて、Abrahamsen氏等（１９９７年）は、ｗｔＡｄ７の汚染無く、２９３細胞にＥ１欠損ウイルスを生成できなかった。２９３−ＯＲＦ６細胞（Brough氏等、１９９６年）についてプラーク精製後選択したウイルスを、非同種組換えによりＡｄ７Ｅ１Ｂ配列を結合したことを示した。したがって、Ａｄ７組換えウイルスの効率的な増殖はＡｄ７−Ｅ１Ｂ発現およびａｄ５−Ｅ４−ＯＲＦ６発現の存在下でのみ可能であることがわかった。Ｅ１Ｂ蛋白質は細胞およびウイルス蛋白質と相互作用することが知られている（Bridge等、１９９３年；White  １９９５年）。ウイルス蛋白質のｍＲＮＡ搬出を増加することおよび殆どの細胞ｍＲＮＡの搬出を阻害することが必要である、Ｅ１Ｂ５５Ｋ蛋白質およびＥ４−ＯＲＦ６間に形成された複合体は、重要であり、ある場合には血清型特異的である。上記の実験は、Ａｄ５のＥ１Ａ蛋白質がＡｄ７−Ｅ１Ａ欠損を相補できることおよびアデノウイルスパッケージング細胞のそれ自体におけるＡｄ７−Ｅ１Ｂ発現が安定な相補細胞株を生成するのに不十分であることを示す。Ａｄ３５−Ｅ１Ｂ蛋白質の一方または両方がＰＥＲ．Ｃ６における効率的なＡｄ３５ベクター増殖の制限因子であるかどうかを試験するために、我々はＥ１ＢプロモータおよびＥ１Ｂ配列を含まず、そのプロモータおよびＥ１Ａに対するコード化領域を欠くＡｄ３５アダプタープラスミドを生成した。ｗｔＡｄ３５ＤＮＡのレフト末端をプライマー３５Ｆ１および３５Ｒ４（両方とも実施例４に記載）を使用してＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いて製造者の指示にしたがって増幅した。４．６ｋｂＰＣＲ生成物をＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）を使用して精製し、ＳｎａＢＩおよびＡｐａＩ酵素を用いて消化した。その後、得られた４．４ｋｂフラグメントをゲルからＱＩＡＥｘＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次に、ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１（実施例４）をＳｎａＢＩおよびＡｐａＩで消化し、２．６ｋｂベクター含有フラグメントをゲルからジーンクリーンキット（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して単離した。単離した両方のフラグメントを結合してｐＢｒ／Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸを得た（図１６）。ＰＣＲ中の適正な増幅は以下の機能性試験により証明された：ＤＮＡをＢｓｔＢＩで消化し、Ａｄ３５挿入物をベクター配列から放し、このＤＮＡ４μｇを４μｇのＮｏｔＩ消化ｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（実施例４）でＰＥＲ．Ｃ６細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクション細胞をＴ８０フラスコに２日で継代し、２日後、再びＣＰＥは形成し、新規なｐＢｒ／Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸ構築物が機能性Ｅ１配列を含むことを示す。この後、ｐＢｒ／Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸ構築物をさらに以下のようにして修飾した。ＤＮＡをＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、５’ＨｉｎｄＩＩＩ突出を、クレノウ酵素を使用して満たした。消化ＤＮＡの再結合およびコンピテント細胞（ＬＴＩ）への形質転換により構築物ｐＢｒ／Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＤＥｌＡを得た（図１７）。後者の構築物はｂｐ４５０および１３４１（図５、ｗｔＡｄ３５���番号付け）間のＥ１Ａ配列を除き、レフト末端４．６ｋｂのＡｄ３５を含み、Ｅ１ＡプロモータおよびＥ１Ａコード配列の殆どを欠く。その後、ｐＢｒ／Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＤＥｌＡをＢｓｔＢＩで消化し、この構築物の２μｇを６μｍｇｒのＮｏｔＩ消化ｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（実施例４）でＰＥＲ．Ｃ６に同時トランスフェクションした。トランスフェクション後１週間で完全なＣＰＥがトランスフェクションフラスコに形成した。
【００６５】
この実験から、Ａｄ３５−Ｅ１Ａ蛋白質がＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＡｄ５−Ｅ１Ａ発現により機能的に相補されることおよびＡｄ３５−Ｅ１Ｂ蛋白質の少なくとも１つがＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＡｄ５−Ｅ１発現により相補されえないことがわかる。さらに、ＰＥＲ．Ｃ６におけるＡｄ３５−Ｅ１Ｂ蛋白質を発現することによりＡｄ３５−Ｅ１欠損ウイルスに対する相補細胞株を作ることが可能であることがわかる。ＰＥＲ．Ｃ６細胞のゲノムにおける完全なコピーからのＡｄ３５−Ｅ１Ｂ配列の安定な発現はＥ１Ｂプロモータにより駆動され、非制限的にＨＢＶｐＡ等の異種ポリアデニル化信号により終了されうる。異種ｐＡ信号はＥ１Ｂ挿入物と組換えベクター間のオーバーラップを避けることが必要である。その理由は、天然Ｅ１Ｂ終止はアデノウイルスベクターに存在する必要があるｐＩＸ転写単位に存在するからである。あるいは、Ｅ１Ｂ配列は非制限的にヒトＰＧＫプロモーター等の異種プロモーターにより、あるいは非制限的に７ｘｔｅｔＯプロモーター（Gossen およびBujard、1992年）等の誘導性プロモーターにより駆動されうる。さらに、これらの場合には、転写終止は異種pＡ配列、例えばＨＢＶｐＡにより媒介される。Ａｄ３５−Ｅ１Ｂ配列は、ｗｔＡ３５配列のヌクレオチド１６１１および３４００間に位置するＥ１Ｂ２１ＫおよびＥ１Ｂ５５Ｋ蛋白質のコード領域の一つを少なくとも含む。さらに、挿入物はｗｔＡｄ３５配列のヌクレオチド１５５０および１６１１間のＡｄ３５−Ｅ１Ｂ配列（の一部）をも含みうる。
【００６６】
実施例７
Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ−２１Ｋ遺伝子について欠損するＡｄ基ウイルスがＡｄ５相補細胞株で増殖する
Ｅ１Ａについて欠損し、完全なＥ１Ｂ領域を保持するＡｄ３５基ウイルスの生成については本発明の実施例６に記載している。このようなウイルスは、Ａｄ５相補細胞株ＰＥＲ．Ｃ６で生成かつ増殖可能である。Ｅ１Ｂ領域は２つの主な蛋白質２１Ｋおよび５５Ｋ（Ｂｏｓ等、１９８１年）に対する部分的にオーバーラップするコード配列を含む。生産的なｗｔアデノウイルス感染の間、２１Ｋおよび５５Ｋの両方はＥ１Ａ蛋白質のアポトーシス誘導効果に反作用する際に伴われるが、Ｅ１Ｂ５５Ｋ蛋白質はウイルス感染の後期段階の間付加的な機能を有すると考えられた。これらは、ウイルス性ｍＲＮＡの蓄積、後期ウイルス性遺伝子発現のコントロール、およびｍＲＮＡ移送のレベルにおける殆どのホストｍＲＮＡのショットガンを含む（Basiss等、１９８４年、Pilder等、１９８６年）。Ｅ１Ｂ−５５Ｋおよびアデノウイルス初期領域によりコード化されたＯＲＦ６蛋白質間に形成された複合体はこれらの機能の少なくとも一部を発揮する。
【００６７】
Ｅ１Ｂ蛋白質のいずれがＰＥＲ．Ｃ６パッケージング細胞でＡｄ３５−Ｅ１Ａ欠損組換えウイルスの増殖に必要であるかを分析するために、構築物ｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＥ１Ａ（参照：実施例６および図１７）におけるＥ１Ｂ領域をさらに欠いた。第１構築物であるｐＢｒ．Ａｄ３５Δ２１Ｋは完全なＥ１Ｂ−５５Ｋ配列を保持し、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ−２１Ｋについて欠いている。ｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＥ１ＡをＮｅｏＩおよびＢｓｐＥ１で消化し、５ＫＢベクターフラグメントをアガロースゲルからジーンクリーンキット（ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ．）を使用して製造者の指示にしたがって単離した。その後、ＰＣＲフラグメントをｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＥ１ＡをテンプレートＤＮＡとして以下のプライマーを使用して生成した：
１３５Ｄ２１：５’−ＴＴＡＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
２３５Ｂ３：５’−ＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
３ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を使用して製造者の推薦にしたがって反応混合物にＤＭＳＯ（最終濃度３％）を添加して増幅した。ＰＣＲプログラムは以下の通りである。９４℃で２分、その後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で４５秒を３０サイクル、最終段階は６８℃で８分であり、平滑末端を確実にした。
【００６８】
このＰＣＲはヌクレオチド１９０８〜２５２８（配列Ａｄ３５，図５）のＡｄ３５−Ｅ１Ｂ配列を増幅し、Ｅ１Ｂ−５５Ｋコード配列（プライマー３５Ｄ２１におけるボールド）の開始コドンにＮｃｏＩ部位を導入する。６２０ｂｐＰＣＲフラグメントをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、その後、ＮｃｏＩおよびＢｓｐＥ１を用いて消化し、上記アガロースゲルから精製し、上記ＮｃｏＩ／ＢｓｐＥ１消化ベクターフラグメントに結合し、ｐＢｒ．Ａｄ３５Δ２１Ｋ（図１８）を得た。
【００６９】
２１Ｋおよび５５Ｋ蛋白質のコード領域がオーバーラップしているので、２１Ｋを残して５５Ｋコード配列の一部を単に欠損できるのみである。ｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＥ１ＡをＢｇｌＩＩで消化し、ベクターフラグメントを再結合してｐＢｒ．Ａｄ３５Δ５５ｋ１（図１９）を得た。この欠損によりＥ１Ｂコード配列をヌクレオチド２２６１〜３３３０（図５のＡｄ３５配列）まで除去した。この構築物において、Ｎ末端１１５アミノ酸は保持され、停止コドンに至るまえに適正なリーディングフレームからの２１の付加的なアミノ酸に融合した。２１Ｋコード領域は構築物ｐＢｒ．Ａｄ３５Δ５５Ｋ１において無傷である。
【００７０】
Ｅ１Ａ、２１Ｋ、および５５Ｋ配列の殆どが欠損する第３構築物を以下のようにして生成した。ｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸ（図１６）をＳｎａＢＩおよびＭｆｅＩ（ＭｕｎＩのアイソシゾマー）で消化し、ＭｆｅＩ消化から得た５’突出を、クレノウ酵素を使用して満たした。４．４ｋｂベクターフラグメントをゲルから単離し、ジーンクリーンキット（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して製造者の指示にしたがって単離し、再結合し構築物ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ（図２０）を得た。この構築物では、ヌクレオチド４５３および２８０４間のＡｄ３５配列が削除され、Ｅ１Ｂ５５Ｋの３’末端の５９６ヌクレオチドが保持された。５５Ｋ配列のさらなる欠損を構築物ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＥ１Ａ．ΔＥ１Ｂにおいて、ＳｎａＢＩおよびＢｇｌＩＩでｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸを消化し、クレノウ処理してＢｇｌＩＩ結合性末端で満たし、再結合をすることにより行った。図２１は上記構築物を図で示す。
【００７１】
Ａｄ３５基ウイルスがこれらの構築物を伴って生成可能であるかどうかを試験するために、構築物の各々をＮｏｔＩ消化ｐＷＥ．Ａｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（実施例４参照）を使用してＰＥＲ．Ｃ６で同時トランスフェクションした。それぞれのフラグメントをプライマー３５Ｆ１および３５Ｒ４を使用してＰＣＲ増幅した（実施例４参照）。構築物のうち幾つかを充分多量に単離することが困難であったので、このＰＣＲ増幅を実施した。この方法で等しい品質の異なるアダプターフラグメントを確認した。増幅のために、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を製造者の指示にしたがって使用した。ただし、ＤＭＳＯ（最終濃度３％）をＰＣＲ混合物に添加した。各テンプレートに、〜５０ｎｇＤＮＡを使用した。ＰＣＲに対する条件は以下の通りである：つまり９４℃２分、その後９４℃３０秒、４８℃４５秒、７２℃４分を５サイクル、さらに、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃４分を２５サイクル、最後に６８℃８分である。
４ＰＣＲフラグメントをｐＢｒ．Ａｄ３５レフトＩＴＲ−ｐＩＸ，ｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＥ１Ａ，ｐＢｒ．Ａｄ３５Δ２１Ｋ，ｐＢｒ．Ａｄ３５Δ５５Ｋ１、ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭおよびｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＥ１ＡΔＥ１Ｂから生成した。全フラグメントについてＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し製造者の指示にしたがい、最終濃度はＥｔＢｒ染色アガロースゲルで、Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ  Ｓｔｉｌｌ  ＶｉｄｅｏシステムおよびＥａｇｌｅＳｉｇｈｔソフトウェア（ストラタジーン）を使用して、参考にＳｍａｒｔＬａｄｄｅｒ分子量マーカー（Eurogentec）を用いて見積った。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を２．５×１０６細胞の密度で、Ｔ２５培養フラスコ中に、１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）および１０ｍＭのＭｇＳＯ４含有ＤＭＥＭにおいてシードまき、加湿ストーブにおいて３７℃で培養した。次の日、３ｍｇのＰＣＲフラグメントの各々を５μｇｒのＮｏｔＩ消化ｐＷＥ．Ａｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲを用いてリポフェクトアミン（ギブコ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用し、製造者の指示にしたがって同時トランスフェクションした。トランスフェクション後２日で、全細胞をＴ８０フラスコに移し、さらに培養した。その後、培養物をＣＰＥの出現についてモニターした。実施例４および６に記載した先の実験の結果に合致して、ｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸおよびｐＢｒ．Ａｄ３５．レフトＩＴＲ−ｐＩＸΔＥ１Ａは、トランスフェクション後１週間の内に殆ど完全なＣＰＥを示した。異なるＥ１Ｂ欠損を有するフラグメントのうちｐＢｒ．Ａｄ３５Δ２１Ｋのみが上記２つのフラグメントとして同時にＣＰＥを示した。構築物ｐＢｒ．Ａｄ３５Δ５５Ｋ１、ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ，およびｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＥ１ＡＥ１Ｂは全くＣＰＥを得られず、さらに、凍結・解凍によるハーベストおよび粗ライゼートの新しいＰＥＲ．Ｃ６細胞への再感染の後も得られなかった。
【００７２】
これらの実験から、Ａｄ３５−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ（Ｅ１Ｂ−２１Ｋではなく）が、Ａｄ５相補細胞株におけるＡｄ３５基ウイルスの生成および増殖に必要であることが結論付けられる。したがって、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ２１Ｋ遺伝子の欠損を有し、かつＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子またはその機能性フラグメントを有するＡｄ３５基ウイルスは、Ａｄ５相補細胞株において成長できる。あるいは、Ａｄ３５基ウイルスは、完全なＥ１Ｂ領域またはＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子またはその機能性フラグメントを安定的に発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞で成長できる。Ａｄ３５Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子またはその機能性部分は、非制限的にヒトＰＧＫプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター等異種プロモーターから発現され、非制限的にＢ型肝炎ウイルスポリアデニル化配列（ＨＢＶｐＡ）、シミアンウイルス４０ポリアデニル化配列（ＳＶ４０ｐＡ）等の異種ポリアデニル化配列により終止する。非制限的な例として、Ｅ１ＢプロモーターおよびＨＢＶｐＡにより駆動されるＡｄ３５Ｅ１Ｂ領域を発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒトＰＧＫプロモーターおよびＨＢＶｐＡにより駆動されるＡｄ３５−Ｅ１Ｂ領域を発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞、およびヒトＰＧＫプロモーターおよびＨＢＶｐＡにより駆動されるＡｄ３５Ｅ１Ｂ−５５Ｋの機能性フラグメントを発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞を以下に記載する。
【００７３】
ｐＩＧ３５ＢＬおよびｐＩＧ３５ＢＳの生成
我々は２つの発現構築物であるｐＩＧ．３５ＢＳおよびｐＩＧ３５ＢＬについて説明する。両方とも、Ａｄ３５−Ｅ１Ｂ遺伝子およびネオマイシン選択マーカーを運ぶ。この２つの構築物はＥ１Ｂプロモーターを含有するフラグメントの長さが異なる。３５ＢＬでは、プロモーターフラグメントはより長く、Ｅ１Ａ領域（１０３ヌクレオチドコード配列およびｐＡ）の３’末端を含む。Ｅ１Ｂ領域はＨＢＶポリＡにより終止する。ネオマイシン耐性遺伝子はｈＰＧＫプロモーター／ＨＢＶｐＡカセットにより駆動される。
ｐＩＧ．３５ＢＬを以下のようにして作製した。構築物ｐＲＳＶ．Ａｄ３５Ｅ１（実施例５に記載、図９）をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、突出末端をクレノウ処理で満たした。７ｋｂのベクターフラグメントをゲル上のより小さいフラグメントから分離し、ジーンクリーンキット（ＢＩＯ１０１、Ｉｎｃ．）を使用して単離した。ＤＮＡの再結合および能力ＳＴＢＬ２細胞（ギブコ，ＬＴＩ）への形質転換の後、適正なクローンを単離した。ｐＩＧ．３５ＢＬ（図２２）はＥ１Ｂ−２１Ｋコード領域の開始部位の上流の２７３ヌクレオチドを含む。ｐＩＧ．３５ＢＳをｐＩＧ３５ＢＬと同じ方法で作った。ただし、ｐＲＳＶ．Ａｄ３５Ｅ１をＮｒｕＩおよびＨｐａＩ（両方の酵素は平滑末端を有する）で消化し、Ｅ１Ｂ−２１Ｋのコード領域の上流のより短いフラグメントを得た：つまり９７ヌクレオチド。
Ａｄ３５−Ｅ１Ｂ発現細胞を生成するために、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を１×１０６細胞／皿にて１０ｃｍの皿に蒔いた。２日後、細胞をＳｃａＩ線状構築物でトランスフェクションした。
４皿について２μｇＤＮＡを使用して１と４に関して製造者の指示にしたがってトランスフェクションした（合計１６皿、リポフェクトアミン（ギブコ、ＬＴＩ）、非担体ＤＮＡ使用）。次の日、トランスフェクション細胞にＧ４１８含有培地（０．７５ｍｇ／ｍｌ）を入れた。ＬａｃＺ発現構築物（２μｇ）を使用するコントロールトランスフェクション物を４８時間後に染色し、〜２５％のトランスフェクション効率を示した。選択培地の添加後４日で未トランスフェクション細胞は死に始め、さらに三日後クローンは行き始めた。１週間後、第１クローンを選択した。１μｇでのトランスフェクション物は最初より少ないか小さいクローンとなった（合計、〜２０クローン／皿、これに対して２μｇＤＮＡでのトランスフェクションについては＞５０クローン／皿）。２μｇのｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）を使用する正のコントロールトランスフェクションは〜５０クローンになった。
合計で１２０クローンを選択し、１０７について樹立に成功した（ｐＩＧ３５ＢＳから５５、ｐＩＧ３５ＢＬから５２）。
【００７４】
ｐＩＧ３５Ｂｎｅｏの生成
ｐＩＧ３５Ｂｎｅｏは、Ｅ１Ｂ遺伝子が異種プロモーター（ｈＰＧＫ）から発現され、かつネオマイシン耐性発現カセットをも含むＡｄ３５−Ｅ１Ｂ発現プラスミドである。同種配列における組換え事実のためにプラスミドが不安定になることを回避するため、ＲＳＶプロモーターはネオマイシン耐性遺伝子を駆動する。これを達成するために、構築物ｐＲＳＶｈｂｖ．Ｎｅｏ（実施例５に記載、図１２）をＳｃａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、突出末端をクレノウ酵素を使用して満たす。アンピシリン遺伝子の一部およびＲＳＶプロモーターを含有する１０７０ｂｐフラグメントをゲルからジーンクリーンキット（ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して単離した。次に、ｐＲＳＶｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏをＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、クレノウで平滑化し、ネオ遺伝子、ＨＢＶｐＡ、ベクターおよびアンピシリン遺伝子の一部を含有する３．２ｋｂフラグメントを上記のようにして単離した。その後、２つのフラグメントを結合してｐＲＳＶｎｅｏ４を得た（図２３）。さらに、構築物ｐＩＧ２７０（図１５、実施例６に記載）をＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで消化し、粘着末端をクレノウ酵素で平滑化した。フラグメント含有ベクターをゲルから上記のようにして単離し、再結合し、ｐＩＧ２７０ｄｅｌＥ１Ａを得た。この構築物をＡｖｒＩＩおよびＸｂａＩで消化し、突出末端クレノウ酵素を使用して満たした。ｈＰＧＫプロモーターおよびＡｄ３５．Ｅ１Ｂ配列含有２．９ｋｂフラグメントをゲルから上記のようにして単離した。次に、ｐＲＳＶｎｅｏ４をＢｇｌＩＩで消化し、クレノウ酵素で平滑化し、脱リン酸化し、ゲルから単離した。その後、平滑化ＡｖｒＩＩ／ＸｂａＩＡｄ３５．Ｅ１Ｂフラグメントを上記で調製したｐＲＳＶｎｅｏ４ベクターフラグメントに結合し、得られたクローンを分析した。同じ配向の両方の発現カセットを含む１つのクローンを選択し、ｐＩＧ３５Ｂｎｅｏとする（図２４）。このクローンの詳細な分析により、不完全なクレノウ反応のため余分なＢｇｌＩＩ部位がおそらく存在することがわかった（図２４のヌクレオチド２９４９におけるＢｇｌＩＩ部位）。
【００７５】
ｐＩＧ３５．５５Ｋの生成
構築物ｐＩＧ３５．５５ＫはｐＩＧ３５Ｂｎｅｏに類似している。しかし、Ａｄ３５．Ｅ１Ｂ−２１Ｋのコード領域が欠けている。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ−２１Ｋ配列の両方は以下のようにｐＩＧ２７０から先ず単離される：
構築物ｐＩＧ２７０をＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ酵素で処理し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造者の指示にしたがって精製した。その後、回収したＤＮＡをＡｇｅＩで消化し、〜５ｋｂベクターフラグメントを上記にようにゲルから単離した。次に、Ａｄ３５Ｅ１Ｂ−５５Ｋ配列をＰＣＲによりｐＩＧ２７０テンプレートＤＮＡで下記プライマーを使用して増幅する：
５３５Ｄ２１：５’−ＴＴＡＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
６３５Ｂ３：５’−ＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）
増幅に使用した条件は前記の通りである。ＰＣＲフラグメントはＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＮｃｏＩで消化した。突出末端を満たすためのクレノウ処理の後、さらにＤＮＡをＡｇｅＩで消化し、再びカラム精製する。このように処理したＰＣＲフラグメントを上記調製ＥｃｏＲＩ／ＡｇｅＩ消化ベクターフラグメントにクローン化し、ｐＩＧ２７０．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋを得た。ｐＩＧ３５．５５Ｋ（図２５）を得る最後の段階は、ｐＩＧ２７０．ΔＥ１Ａの代りにｐＩＧ２７０．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋで開始するｐＩＧ３５Ｂｎｅｏの生成に対する上記最後の段階に等しい。
【００７６】
その後、ｐＩＧ３５．５５ＫをＳｃａＩで線状化し、上記にようにＰＥＲ．Ｃ６細胞をトランスフェクションするために使用した。Ｇ４１８選択に対して耐性であるクローンを選択してＥ１欠損Ａｄ３５ウイルスの増殖を相補する能力について分析する。
【００７７】
実施例８
Ｅ１欠損Ａｄ３５基ベクターの生成および増殖に対する新規なパッケージング細胞株を一次ヒト細胞から誘導した。
アデノウイルスＥ１遺伝子による一次細胞の完全な形態学的形質転換はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域によりコード化された蛋白質の活性が結合した結果である。溶菌感染および形質転換における種々のＥ１蛋白質の役割は広範囲に研究された（Zentema およびvan der Eb,1995; White 1995、1996）。アデノウイルスＥ１Ａ蛋白質は一次細胞の形質転換に対して本質的である。Ｅ１Ａ蛋白質はこの効果を転写調節に含まれる多くの細胞蛋白質との直接的な相互作用を介して及ぼす。これらは蛋白質のｐＲＢファミリー、ｐ３００／ＣＢＰおよびＴＡＴＡ結合蛋白質を含む。さらに、このＥ１Ａは細胞中のｐ５３蛋白質レベルを上げる。アデノウイルスＥ１Ｂ活性が不存在の下では、ｐ５３レベルの上昇によりアポトーシスが誘発される。Ｅ１Ｂ領域によりコード化された両方の蛋白質は、メカニズムは異なるが、アポトーシスの誘発に対抗する。アポトーシス経路における下流のエフェクター蛋白質との相互作用を介してＢｃｌ−２に類似した方法で（Han等、1996年）、Ｅ１Ｂ−２１Ｋはアポトーシスを妨げるが、Ｅ１Ｂ５５Ｋはｐ５３との直接相互作用を介して機能すると思われる。重要なことは、Ａｄ２および５（サブグループＣ）およびＡｄ１２（サブグループＡ）のＥ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質がｐ５３を中和する能力において機能する分子メカニズムが異なり得ることである。Ａｄ５Ｅ１Ｂ−５５Ｋはｐ５３に強く結合するが、その複合体は細胞質に局在し、Ａｄ１２Ｅ１Ｂ−５５Ｋはｐ５３に弱く結合し、両蛋白質は核に局在する（Zantema等、1985年、Ｇrand等、１９９９年）。しかし、両蛋白質はｐ５３により他の遺伝子の転写促進を阻害する（Yew およびBerk、1992年）。
【００７８】
げっ歯類細胞において、Ｅ１Ａおよび、Ｅ１Ｂ−２１Ｋまたは５５Ｋの活性は完全な形質転換に対して充分であり、両方のＥ１Ｂ蛋白質の発現は２倍の効率である（Rao等、1992年)。しかし、Ｅ１Ｂ−５５Ｋが形質転換細胞の樹立に対して必須であるという観察から、ヒト細胞において、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質の活性はより重要であると思われる（Gallimore,1986）。実施例６はｐＩＧ２７０の生成を説明する。この構築物において、Ａｄ３５−Ｅ１遺伝子はｈＰＧＫプロモーターから発現され、転写はＨＢＶｐＡにより終止する。ｈＰＧＫプロモーターはＳｉｎｇｅｒ  Ｓａｍ等（１９８４年）により記載されたプロモーター配列のＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを構成する。ＨＢＶｐＡをＢ型肝炎ウイルスゲノムのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに位置する（Simonsenおよび Levinson 1983年; Genbank HBV-AF090841参照）。上記のように、本発明に記載したＥ１発現構築物のポリアデニル化配列およびプロモーターは本発明とかけ離れることなく、他の給源から誘導可能である。さらに、上記のｈＰＧＫおよびＨＢＶｐＡ配列の他の機能性フラグメントを使用することができる。
【００７９】
ｐＩＧ２７０の機能性は一次ベイビーラット腎臓細胞（ＢＲＫ）の形質転換により示された。等価なＡｄ５−Ｅ１発現構築物との比較により、Ａｄ３５−Ｅ１遺伝子がこれらの細胞を形質転換する際により低効率であることがわかった。同様のことがＡｄ１２のＥ１遺伝子に対してもわかった（Bernard等、1982年）。
Ｅ１蛋白質が異なるサブグループからのアデノウイルスに対して観察されたＥ１配列の形質転換効率における差を決定することは明確ではない。Ａｄ１２の場合は、キメラＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子についてのトランスフェクション研究によりＢＲＫ細胞の形質転換効率がＥ１Ａ蛋白質により決定された（Bernard等、1982年)。Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質がＥ１欠損アデノウイルスの相補に対して必要な血清型特異性機能を有することを以下に示す。これらの機能がｍＲＮＡ分布または別の後期ウイルス性機能の調節に関係する場合、これらは形質転換効率には含まれそうもない。
【００８０】
挿入変異体を使用するＡｄ２またはＡｄ５Ｅ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質における機能性ドメインの分析により、ウイルス性複製、後期蛋白質合成およびホスト蛋白質シャットオフに関する機能が特異的なドメインに閉じ込められず、蛋白質に沿って分布することがわかった（Yew等、１９９０年）。変異体の同じセットを使用して、ｐ５３およびＥ４−Ｏｒｆ６との相互作用に重要なドメインがより制限されることがわかった。普通の結合領域（アミノ酸２６２〜３２６）に加え、ｐ５３結合はａａ１８０における変異により影響され、ｅ４−Ｏｒｆ６結合はａａ１４３における変異により影響された（Yewおよび Berk、1992年、Rubenwolf等、1997年）。
【００８１】
これらの結果は、形質転換に関係するＥ１Ｂ−５５Ｋ機能（ｐ５３結合）と後期蛋白質合成（Ｏｒｆ６結合）を分離することが困難であることを示す。
本発明は、ある血清型の高効率な形質転換と別の血清型の血清型特異的相補機能を結合する新規なＥ１構築物を開示する。これらの新規な構築物を使用して一次ヒト胎児性網膜芽細胞およびヒト羊膜細胞を形質転換する。
【００８２】
ｐＩＧ５３５，ｐＩＧ６３５，およびｐＩＧ７３５の生成
構築物ｐＩＧ５３５はＡｄ３５Ｅ１Ｂ配列に結合したＥ１Ｂプロモーター配列およびＡｄ５Ｅ１Ａ領域を含む。ｐＩＧ２７０（図１５、実施例６参照）をＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで消化した。その後、５．３ｋｂベクターフラグメントをゲルからジーンクリーンキット（ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して製造者の指示にしたがって単離した。次に、構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ（図１３、実施例６参照）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、得られた８９０ｂｐフラグメントを上記のように単離した。第３フラグメントをｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢにおけるＰＣＲ増幅により以下のプライマーを使用して生成した：
１５Ｅ１Ａ−Ｆ：５’−ＧＡＧＡＣＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
２５Ｅ１Ｂ−Ｒ：５’−ＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＴＡＡＣ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）。
３以下のＰＣＲプログラムを使用した：９４℃２分、さらに、９４℃３０秒、６０℃３０秒および７２℃１分を３０サイクル、そして最後の段階として７２℃で１０分を行い、平滑末端を確実にした。
得られた４００ｂｐＰＣＲフラグメントをＸｂａＩおよびＮｃｏＩで消化した。上記のゲル単離の後、３つのフラグメントを結合し、ＳＴＢＬ−２バクテリアに形質転換した。全３フラグメントを正しい順序で含有する１つのコロニーを選択し、ｐＩＧ５３５（図２６）と表す。
【００８３】
構築物ｐＩＧ６３５は、２１Ｋ配列が本質的にＡｄ５からのものであり、２１Ｋ配列とオーバーラップしない限りＡｄ３５Ｅ１Ｂ−５５Ｋ配列に結合するような、Ａｄ５Ｅ１ＡおよびキメラＡｄ５−Ａｄ３５Ｅ１Ｂ領域を含む。第１に、ＡＡｄ５Ｅ１配列の一部はＰＣＲによりｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂをテンプレートとして使用し、かつ以下のプライマーを使用して増幅される：
４５ＡＫ：５’−ＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
５２１５５Ｒ：５’−ＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＧＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）。
増幅はＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を製造者の指示にしたがって用いて達成される。その後、２１０ｂｐフラグメントをプライマー配列からＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。
【００８４】
第２ＰＣＲフラグメントを上記ｐＩＧ２７０ＤＮＡから以下のプライマーを使用して増幅する：
６２１５５Ｆ：５’−ＣＣＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）および
７３５Ｆ１０：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧ−３’ （ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）。
１．３ｋｂ増幅フラグメントを上記のように精製し、１：１モル比で第１ＰＣＲフラグメントと混合する。その後、混合物をＰｗｏＤＮＡポリメラーゼおよび以下のプログラムを使用してプライマーを添加することなく、ＰＣＲ反応を先ず行う：９４℃で２分、その後９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒を５サイクル。次に、プライマー５ＡＫおよび３５Ｆ１０を０．６μＭ濃度で添加し、その後、最後のＰＣＲにより１．５ｋｂフラグメントに増幅する。温度を以下のように設定した：９４℃で２分、その後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で９０秒を３０サイクル、続いて最終段階を７２℃で１０分行い、平滑末端を確実にした。得られた生成物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して上記のように精製し、ＫｐｎＩおよびＳｂｆＩ（Ｓｓｅ８３８７Ｉのアイソシゾマー）で消化する。その後消化ＤＮＡをジーンクリーンキット（ＢＩＯＩｎｃ．１０１）を使用してゲルから単離する。構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢをＫｐｎＩおよびＳｂｆＩで消化し、ベクター含有フラグメントを上記のようにゲルから単離する。このフラグメントを上記調製最終ＰＣＲ生成物に結合し、この結合混合物をＳＴＢＬ−２細胞（ギブコ、ＬＴＩ）に製造者の指示にしたがって形質転換する。これにより構築物ｐＩＧ６３５（図２７）を得る。
【００８５】
構築物ｐＩＧ７３５において、Ａｄ５誘導配列およびＡｄ３５誘導配列間の境界は構築物ｐＩＧ６３５におけるよりより３’に位置する。先ず、ＢｓｐＥＩ部位が構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢのＡｄ５配列にアミノ酸配列を変化させることなく導入される。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢからのＡｄ５配列を以下のＰＣＲプライマーを使用して増幅する：
５ＡＫ：上記を参照
Ｂｓｐ−Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ． ）。
増幅をＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を使用し製造者の指示にしがたって達成した。以下のＰＣＲプログラムを使用する：９４℃２分、その後９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル、その後、最終段階を７２℃１０分で行い、平滑末端を確実にした。得られた０．６ｋｂフラグメントを上記のように精製し、ＫｐｎＩおよびＳｂｆＩで消化し、上記ＫｐｎＩ／ＳｂｆＩ消化ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂベクターフラグメントに結合する。ＳＴＢＬ−２バクテリアの形質転換（Life Techn. Inc.）後のコロニーの選択により構築物ｐＩＧ．Ｅ１Δ５５Ｋを得る。その後、ｐＩＧ．Ｅ１Δ５５ＫをＳｂｆＩで、かつ部分的にＢｓｐＥＩで消化する。その後、６．４ｋｂＳｂｆＩ−部分的ＢｓｐＥＩ消化ベクターフラグメントをジーンクリーンキット（ｂｉｏ１０１Ｉｎｃ．）を使用してゲルから単離する。次に、ｐＩＧ２７０をＢｓｐＥ１およびＳｂｆＩで消化し、得られた９１５ｂｐフラグメントをゲルから上記にように単離する。その後、このフラグメントを上記調製ＳｂｆＩ／部分的ＢｓｐＥＩ消化ｐＩＧ．Ｅ１Δ５５Ｋベクターフラグメントに結合し、ＳＴＢＬ−２コンピテント細胞に形質転換する。これにより、構築物ｐＩＧ７３５（図２８）を得る。クローンを制限酵素消化により分析し、フラグメントの正しい結合を確実にするために配列決定した。構築物ｐＩＧ５３５，ｐＩＧ６３５およびｐＩＧ７３５を使用して相補細胞株を一次ヒト細胞から実施例６に記載されるように生成できる。
【００８６】
実施例９
Ｅ１欠損Ａｄ３５ウイルスに対するＰＥＲ．Ｃ６基相補細胞株
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を１０ｃｍ培養皿に３×１０６細胞／皿の密度でＦＢＳ（ギブコＢＲＬ）を１０％までかつ１０ｍＭのＭｇＣｌ２で補充したＤＭＥＭ（ギブコ、ＢＲＬ）中に蒔いた（４．９ストック溶液、シグマ）。２日後、９皿を１μｇのＳｃａＩ線状化ｐＩＧ３５．５５ＫＤＮＡ（実施例７参照）を用いてトランスフェクトし、９皿を１．５μｇのＳｃａＩ線状化ｐＩＧ３５．５５ＫＤＮＡを用いてトランスフェクトした。別々のコントロール皿を、トランスフェクション効率をモニターするために１または１．５μｇのＳｃａＩ線状化ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺを用いて、かつ、１または１．５μｇのＳｃａＩ線状化ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺでトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺはＣＭＶプロモーターにより誘導されたｎｌｓＬａｃＺ遺伝子（Bonnerot等、１９８７年）を有するｐｃＤＮＡ３−基プラスミド（インビトロゲン）である。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺもネオマイシン耐性発現カセットを含む。負のコントロールとして、１つの余分な皿を線状化ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした。構築物はネオマイシン耐性選択遺伝子を欠いている。全トランスフェクションをリポフェクトアミントランスフェクションキット（インビトロゲン／Life Technologies）で製造者の指示にしたがって、５ｍｌのリポフェクトアミンシラク／μｇＤＮＡを使用しておこなった。細胞を４時間トランスフェクション混合物でインキュベートし、その後培地をＰＥＲ．Ｃ６培養培地で置き換えた。次の日、培地を、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（ギブコＢＲＬ）含有培養培地で置換した。ただし、１または１．５μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした２つの皿は除く。これらの皿はトランスフェクション後２日のＬａｃＺ発現をモニターするために使用した。これらの培養物のＸｇａｌ染色後、トランスフェクション効率を１．５μｇＤＮＡでトランスフェクトした皿に僅かに青い細胞を伴い、約４０％と見積もった。残りのトランスフェクトした皿において選択培地を週に２回リフレッシュした。選択培地を最初に添加した後２週間以内に負のコントロール皿（１．５μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトされた）の殆どの細胞が死んだ。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺでトランスフェクトした皿において、細胞クローンは目視可能になった。ｐＩＧ３５．５５Ｋでトランスフェクトした細胞がＧ４１８により耐性であると考えられるので、トランスフェクション後３週、濃度を０．７５ｍｇ／ｍｌに上げた。３日後および７日後、合計１９６細胞クローンをｐＩＧ３５．５５Ｋでトランスフェクトした皿から選択し、９６ウェルプレートの別々のウェルに蒔いた。
【００８７】
１μｇのｐＩＧ３５．５５ＫＤＮＡでのトランスフェクションの２つの１０ｃｍの皿のコロニー選択後に残っている細胞をトリプシン処理し、プールし、膨張させ、プールＰＥＲ５５Ｋ（１．０）を得た。同様の操作を、１．５μｇトランスフェクションの２つの皿に対して行った。ＰＥＲ５５Ｋ（１．０）細胞プールを膨張させ、４つのＴ２５フラスコに３．５×１０６細胞／フラスコの密度でトランスフェクションのために蒔き、ウイルス生成を試験した。さらに、親のＰＥＲ．Ｃ６細胞を有する３つのＴ２５フラスコを同じ密度で蒔いた。ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰ（マーカー遺伝子として緑色の蛍光蛋白質を含有するアダプタープラスミド、実施例４参照）をＰａｃＩで消化し、プラスミドバックボーンからのアデノウイルス配列を遊離した。ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（実施例４参照）をＮｏｔＩで消化し、コスミドバックボーンからのアデノウイルス配列を遊離した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を有する２つのフラスコおよびＰＥＲ５５Ｋ（１．０）細胞を有する２つのフラスコを２μｇの消化ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰおよび６μｇ消化ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲでそれぞれトランスフェクトした。各細胞株の１つのフラスコを８μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトし、トランスフェクション効率をモニターした。ＰＥＲ５５Ｋ（１．０）細胞を有する残りのフラスコが負のコントロールとして役立ち、他のものとして処理されたが、トランスフェクション混合物を入れなかった。全トランスフェクションをリポフェクトアミン（インビトロゲン／Life Techn.）を用いて製造者に指示にしたがって８μｇのＤＮＡおよび４０μｌのリポフェクトアミン試薬の合計を各トランスフェクションに対して使用して行った。トランスフェクション混合物を４時間インキュベーションした後除去し、新鮮な培養培地を添加した。細胞を蒔いた後日トランスフェクションを行い、２日後、再びＴ２５フラスコ中の細胞をＴ８０フラスコに移した。ただし、ＬａｃＺコントロールトランスフェクションは除く。これらを穏やかな固定化の後、Ｘｇａｌ溶液で染色した。染色溶液を用いた５時間のインキュベーション後、青い細胞の割合を両方の細胞株に対して充分にトランスフェクションされたことを示す両方のフラスコにおいて約９０％にて見積もった。Ｔ８０フラスコへの継代後４日、トランスフェクトＰＥＲ５５Ｋ（１．０）培養物は約１００の現象／フラスコのＣＰＥ（ウイルス複製を示す、細胞変性効果）の開始を示した。未トランスフェクトＰＥＲ５５Ｋ（１．０）細胞はＣＰＥの証拠なく密集して成長した。トランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６培養物において、３つのＤＰＥの現象が密集した単層の細胞において目視可能であった。さらに３日後、トランスフェクトＰＥＲ５５Ｋ（１．０）培養物は全細胞は丸く塊中で離れた状態で充分なＣＰＥを示した。対照的に、ＰＥＲ．Ｃ６培養物において、ＣＰＥの幾つかの現象は進行しておらず、細胞は未だ単層であった。これにより、ＰＥＲ．Ｃ６におけるＥ１欠損Ａｄ３５基ウイルスの生成は非常に非能率的であるという初期の観察が確認される。また、未トランスフェクトＰＥＲ５５Ｋ（１．０）培養物は、予期したように、ＣＰＥのない密集した単層を示した。充分なＣＰＥを有するＰＥＲ５５Ｋ（１．０）フラスコにおける細胞および培地をハーベストし、２サイクルの凍結／解凍を行い、その後、細胞の破片を３０００ｒｐｍで１０分間テーブル遠心分離機により遠心分離により除去した。得られた粗ライゼートの一つを使用してＴ１７５フラスコ（１．５ｍｌ／フラスコ）におけるＰＥＲ５５Ｋ（１．０）細胞の新しい培養物を感染した。細胞および培地を４日後の充分なＣＰＥでハーベストした。これにより、感染性ウイルスが初期トランスフェクションにおいて形成されることがわかった。ＧＦＰ発現を、粗ライゼートで感染したＡ５４９細胞の蛍光顕微鏡検査により確認した。その後、粗ライゼートを使用して下記のように、個々のクローンにおけるこのＥ１欠損Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰウイルスの相補性を分析した。
【００８８】
ｐＩＧ３５．５５ＫトランスフェクトＰＥＲ．Ｃ６細胞から選択された上記クローンを膨張させ、Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰの複製に耐える能力について機能的に試験をした。このクローンを６ウェルプレートに２つの密度で蒔き、１日後、１５ｍｌの上記粗ライゼートで感染した。ＣＰＥを後日モニターした。この方法で試験した１４６のクローンのうち１９が２または３日で充分なＣＰＥをもたらし、６８が５または６日で充分はＣＰＥをもたらした。残りのクローンは単に部分的なＣＰＥであり、あるいは少しの非進行現象を示した。後者は負のコントロールとして伴われたＰＥＲ．Ｃ６細胞と区別不能であった。
【００８９】
これらの結果に基づき、２４クローンの選択を、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＧＦＰアダプタープラスミドおよび大きいｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲコスミドクローンのトランスフェクション後、組換えＥ１欠損ウイルスを生成する能力についてさらにスクリーンにかけておこなった。クローンをＴ２５フラスコにプレートし、上記リポフェクトアミンを使用して２μｇのアダプターおよび６μｇのバックボーンプラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後２日で、細胞をＴ８０フラスコに移し、培養物が過密になるのを防止した。２４クローンのうち５つがＴ８０への継代後３日で充分なＣＰＥを示し、別の１３クローンがその後充分なＣＰＥに進行した。残りの６クローンはＣＰＥをしめさないかあるいはほんの開始あった。比較すると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＥ１欠損Ａｄ５ベクターの通常の生成は、一般にＴ８０フラスコに移動した後４日か６日で充分なＣＰＥに至る。
【００９０】
これにより、新しいクローンはＥ１欠損アデノウイルスベクターを効率的に相補することがわかる。上記クローンのうち一つを使用して、種々の導入遺伝子を含むＥ１およびＥ１／Ｅ３欠損Ａｄ３５ウイルスの多重バッチを生成、製造した。上記トランスフェクションから得られ、種々のアダプタープラスミドを使用する粗ライゼートにおけるウイルスは新しい細胞株において精製されるプラークである。プラークを導入遺伝子活性について試験し、その後、４−８三重層フラスコにおいて中程度の規模生産に対して増幅した（３×１７５ｃｍ／フラスコ）。細胞を充分はＣＰＥでハーベストし、ウイルスを遊離し、実施例１において記載しアデノウイルスに対する通常の操作で精製した。しかし、細胞の塊を除去するためにフレオンを用いた抽出段階は遠心分離段階で置き換えた。このようにして、ＤＮアーゼＩを用いたインキュベーション後、細胞塊をコニカル５０ｍｌ管（Greiner）で８０００ｒｐｍで卓上遠心分離機（固定アングルローラーを具えたBeckman Coulter allegra 21R）において３０分４℃で遠心分離した。この段階を、上清が透明になるまで、新しい５０ｍｌ管で繰り返した（通常は１回）。ウイルス粒子の量はＨＰＬＣにより決定された（Shabram等、1997年）。表IVは、ＰＥＲ５５Ｋクローン＃１６細胞を入れた三重層フラスコにおけるＥ１およびＥ１／Ｅ３欠損Ａｄ３５ウイルスの中規模生産の下流処理後の収量を示す。精製ウイルス粒子量はＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＡｄ５基ベクターの収量で比較できる。
【００９１】
我々は、充分なＥ１欠損Ａｄ３５基ベクターを効率的に相補する多重細胞株を生成したと結論付けた。Ａｄ５相補細胞株におけるＡｄ３５Ｅ１Ｂ−５５Ｋ発現はＡｄ３５ベクターの複製を容易にする。
【００９２】
実施例１０
一次細胞からの新規な相補細胞株
実施例８は構築物ｐＩＧ５３５，ハイブリドＡｄＥ１Ａ−Ａｄ３５Ｅ１Ｂ発現プラスミドの生成を開示する。また、ｐＣＣ５３６ｓおよびｐＩＧ５３６はハイブリドＡｄ５−Ａｄ３５Ｅ１構築物であるがＥ１Ａ領域、Ｅ１ＢプロモーターおよびＡｄ５からのＥ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子の殆どおよびＡｄ３５からのＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子の殆どを有する。構築物ｐＣＣ５３６ｓおよびｐＩＧ５３６はＥ１Ｂ転写を終了する異種ポリアデニル化配列においてのみ異なる：ｐＩＧ５３６はＨＢＶｐＡ配列を有し、ｐＣＣ５３６ｓは合成ｐＡ配列を有する（ＳｐＡ）。ＳｐＡ配列はヒトＣ２相補遺伝子（Moreira等、1995年）の上流配列素子（ＵＳＥ）およびLevitt等(1989年)により記載された合成ｐＡ配列（ＳＰＡ）からなる。
合成ポリＡ配列は以下のオリゴを使用して構成される：
Ｃ２ＳＰＡ−１：５’−ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＧ−３’
Ｃ２ＳＰＡ−２：５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＣＴＧ−３’
【００９３】
オリゴヌクレオチドを１×アニーリング緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１０μＭの濃度でＰＣＲマシーンを使用して混合し、この溶液を９４℃５分加熱し、その後６５℃に０．５℃／秒で冷却し、６５℃で５分間インキュベーション後、さらに２０℃に０．０５℃／秒で冷却した。次に、１０μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰ，０．５μｌ、１ＭのＭｇＣｌ２および３μｌのクレノウフラグメント（New England Biolabs）を８７μｌのアニールサンプルに添加し、混合物を室温で３０分間インキュベートした。その後1μｌのアニール化およびクレノウ処理サンプルを以下のプライマーを使用して増幅した：
Ｃ２前：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＣ−３’
ＳＰＡ逆：５’−ＴＴＧＣＧＡＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣ−３’，製造者の指示にしたがってＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）使用し、ただし最終濃度３％にＤＭＳＯ（シグマ）を添加。ＰＣＲプログラムを９４℃２分、次に（９４℃３０秒、５５℃３０秒、および７２℃２０秒）の３０サイクルに設定した。その後、増幅ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＸｂａＩおよびＳｂｆＩで消化した。その後、この消化生成物を再びＰＣＲ精製キットで精製し、小さい消化末端を除去した。構築物ｐＩＧ２７０をもＸｂａＩおよびＳｂｆ（Ｓｓｅ８３８７Ｉのアイソシゾマー）で消化し、得られたフラグメント含有５．９ｋｂベクターをゲルからジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して単離した。その後、処理したベクターおよびＰＣＲ挿入断片を結合してｐＣＣ２７１（図２９）を得た。こうしてｐＣＣ２７１はＰＧＫプロモーター、Ａｄ３５Ｅ１領域（実施例３および図５のＡｄ３５配列からのヌクレオチド４６８〜３４００（これも含む））および合成ｐＡ（ＳｐＡ）を含む。その後、合成ｐＡ配列をも構築物ｐＩＧ５３５に以下のようにクローン化した。
【００９４】
ｐＩＧ５３５をＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩおよびＳｃａＩ（全酵素はＮＥＢ緩衝液３で消化したNew England Biolabsから）で消化し、キメラＡｄ５−Ａｄ３５Ｅ１領域に対応する３ｋｂ挿入断片をジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。構築物ｐＣＣ２７１をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化した。ＳｐＡおよびＰＧＫプロモーター含有３ｋｂベクターフラグメントを上記のようにして単離した。単離した両フラグメントを結合して、ＳＴＢＬ−２コンピテント細胞（Invitrogen／Life Technnoligies）に形質転換し、ｐＣＣ５３５s（図３０）を得た。ｐＣＣ５３５sはｐＩＧ５３５と同じＡｄ５−Ａｄ３５Ｅ１配列を含むが異なるｐＡ配列である。
【００９５】
ｐＣＣ５３６sの構築物に対して、サブクローンを新規なハイブリドＥ１Ｂ配列を使用して作製した。Ａｄ５Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ２１Ｋ配列を以下のプライマーを使用して増幅した：
５ＡＫ：５’―ＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＧＡＧ―３’および
２１５５Ｒ：５’−ＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＧＧ−３’
これはＤＮＡをテンプレートとしてＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を製造者の指示にしたがって使用するがさらに最終濃度を３％にＤＭＳＯを添加した、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ（参照：実施例６および図１３）を有する。プログラムは、以下のように設定した：９４℃２分、その後（９４℃３０秒、５８度３０秒、７２℃３０秒）の３０サイクル、最後に６８℃８分。これにより、Ａｄ５配列のヌクレオチド２０２２−２２３３に対応する２１０ｂｐフラグメントを得た。第２ＰＣＲをプライマーを使用してｐＣＣ２７１において行った：
２１５５Ｆ：５’−ＣＣＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣ―３’および
３５Ｆ１０：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧ−３’。
同じＰＣＲプログラムを使用したが９０秒に延長した。得られた１．３ｋｂフラグメントが３’末端にＳｂｆＩ部位を有するＡｄ３５配列のヌクレオチド２１１２〜３４００に対応する。留意することは、プライマー２１５５Ｆおよび２１５５Ｒが以下のように２つのフラグメントの組み立て可能に充分相補性であることである：
両方のＰＣＲフラグメントをゲルからＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して精製した。精製サンプルのアリコートを等モル比で混合し、上記のように下記のプログラム設定を使用してＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを使用しプライマー５ＡＫおよび３５Ｆ１０を使用する組み立てＰＣＲ増幅に対するテンプレートとして使用した：
９４℃２分、および（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃２分）を５サイクル、さらに、（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃９０秒）を２５サイクル。得られた１．５ｋｂフラグメントをゲルからＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ／Ａｍｐベクター（ストラタジーン）に結合し、ＤＨ５ａコンピテント細胞（Invitorgen／Life Technologies）に形質転換し、ｐＣＲ５３５Ｅ１Ｂ（図３１）を得た。この構築物を制限分析により確認し、配列決定し、目標配列の正しい増幅を確認した。
【００９６】
その後、ｐＣＲ５３５Ｅ１ＢをＮｏｔＩで消化し、突出端をクレノウフラグメントで平滑にした。その後、ＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、溶出ＤＮＡをＰｓｔＩで消化した。ｐＣＲ５３５Ｅ１ＢベクターからのキメラＥ１配列含有１．５ｋｂフラグメントをゲルからジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。このフラグメントをＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩで消化したベクターｐＣＣ５３５sに結合し、ＳＴＢＬ−２コンピテント細胞（Invitorgen／Life Technologies）に形質転換し、ｐＣＣ２１５５s（図３２）を得た。その後、ｐＣＣ５３６s構築物を完成するために、Ａｄ５−Ｅ１配列をｐＣＣ２１５５sサブクローンにクローン化した。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ａｄ５Ｅ１ＡおよびＡｄＥ１Ｂ２１Ｋ（Ａｄ５配列のヌクレオチド４５９〜２０４８）に対応する１．６ｋｂフラグメントをゲルからジーンクリーンキットを使用して単離した。ｐＣＣ２１５５sをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、フラグメント含有ベクターをもゲル精製した。両方のフラグメントを結合してＤＨ１０Ｂ電気コンピテント細胞（Invitorgen／Life Technologies）への形質転換によりｐＣＣ５３６s（図３３）を得た。ハイブリドＥ１Ｂ配列を図３８により詳細に示す。図３８Ａは野生型（ｗｔ）Ａｄ３５およびＡｄ５配列を有するｐＣＣ５３６s構築物におけるＥ１Ｂ−２１Ｋの蛋白質配列のアラインメントを示す。ｐＣＣ５３６sにおけるＥ１Ｂ−２１Ｋ蛋白質の殆どがＡｄ５から誘導される。ただし、Ａｄ３５Ｅ１Ｂ−２１Ｋに等しいＣ末端の６つのアミノ酸を除く。図３８ＢはＥ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質に対して同じアラインメントを示す。この場合、ｐＣＣ５３６sのＮ末端アミノ酸はＡｄ５にａａ６５まで等しい。残りはＡｄ３５Ｅ１Ｂ−５５Ｋに等しい。明らかに、種々のハイブリドＥ１Ｂ−５５Ｋ構築物を、本発明から逸脱することなく上記一般的方法にしたがって設計可能である。
【００９７】
構築物ｐＩＧ５３６を、フラグメントをＨＢＶｐＡ含有ｐＩＧ２７０（実施例６、図１５）からの対応フラグメントを有するｐＣｃ５３６sにおけるＳｐＡで置換することにより作製した。ｐＩＧ２７０をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩで消化し、１．８ｋｂ挿入断片をゲルからジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）を使用して単離した。ｐＣＣ５３６sを同じ酵素で消化し、フラグメント含有４．８ｋｂベクターをゲルから上記のようにして精製した。単離した両フラグメントを結合し、ＳＴＢＬ−２コンピテント細胞（Invitorgen／Life Technologies）に形質転換し、構築物ｐＩＧ５３６（図３４）を得た。
【００９８】
生成したＥ１構築物を実施例６で記載した一次ベイビーラット腎臓（ＢＲＫ）細胞において試験した。この結果（表Ｖ）により、Ａｄ５−Ｅ１遺伝子は一次ＢＲＫ細胞をＡｄ３５Ｅ１遺伝子よりさらに効率的に形質転換するという初期の観察を確認した。キメラＡｄ５−Ａｄ３５Ｅ１発現構築物、ｐＣＣ５３５sおよびｐＣＣ５３６sは完全なＡｄ３５Ｅ１構築物、ｐＩＧ２７０およびｐＣＣ２７１よりさらに多くの形質転換コロニーを製造した。さらに、ｐＣＣ５３５sにおける合成ポリアデニル化配列の使用により、ＨＢＶｐＡ変種ｐＩＧ５３５に比較して僅かに多い細胞増殖巣を得た。
【００９９】
ヒト胎児網膜芽細胞（ＨＥＲ）を１８週および２１週の中絶された胎児の眼から単離した。この眼をＰＢＳの入った６ｃｍの皿に入れ、外側組織を除いた。内側に至る切り込みを入れて網膜芽細胞を含有する眼の内側後ろにある灰色の細胞層をこすり取った。この層を２ｍｌのＰＢＳの入った１４ｍｌ管に入れ、組織を沈殿させ、その後、ＰＢＳを除去した。２ｍｌのトリプシン（０．２５％、ＥＤＴＡ無し，ギブコＢＲＬ）を添加し、５分間３７℃でインキュベートし、時折旋回した。組織片を沈殿させ、細胞の入った１ｍｌのトリプシンを新しい管に移した。この管に４ｍｌの培養培地（１０％ＦＣＳの入ったＤＭＥＭ）を入れ、管を氷上に貯蔵した。トリプシン中の残りの組織片を６ｃｍの皿に入れ、さらに小さい片に切断した。２ｍｌの新しいトリプシンを添加した後、これらを再び１４ｍｌ管で３７℃にて時折旋回してインキュベートした。その後、この混合物を培養培地中の第１に単離した細胞に添加し、合計を１０００ｒｐｍで卓上遠心分離機において遠心分離した。上清を除去し、細胞を１０ｍｌの培養培地に再懸濁した。単離ＨＥＲ細胞を２つの６ｃｍ皿に入れ、３７℃で１０％のＣＯ２下でインキュベートした。９０％の密集度の培養物を１：３に分割し、さらにインキュベートした。この手順を、トランスフェクションに使用するのに充分な皿を確保するまで繰り返し、さらに培養した。トランスフェクションを、製造者の指示にしたがって、ＣａＰＯ４同時トランスフェクションキット（Invitorgen／Life Technologies）を使用して、種々の継代数にて実施した。各皿（５０〜７０％の密集度）に対して、２０μｇのＤＮＡを使用した。初期トランスフェクションをｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢつまりＡｄ５−Ｅ１発現構築物、およびｐＩＧ５３５つまりハイブリドＡｄ５−Ｅ１Ａ／Ａｄ３５−Ｅ１Ｂ発現構築物を使用しておこなった。トランスフェクション後２〜３週間で形質転換細胞増殖塊がｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂトランスフェクション皿において見られるようになった。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂでトランスフェクトした皿において平均１５〜２０の細胞増殖塊／皿が見られた。３０を超えるクローンを選択して９６ウェルプレートに移した。密集細胞をより大きい培養プレートまたはフラスコに継代し、最終的に、Ｔ１７５フラスコから液体窒素中でアンプルに入れて生存可能な冷凍を施した。全選択クローンをこの方法で樹立した。ｐＩＧ５３５でトランスフェクトした皿ではずっと後になって、最初のものはトランスフェクション後約５週間で、形質転換細胞増殖塊が見られた。平均３〜４クローンを１皿当たりに見つけた。合計４６クローンを、トランスフェクション後７週間から３カ月で選択し、そのうち１４が生存可能で複数回継代可能であった。これらのうち、２つのクローン（クローン＃４５および＃７５）をＴ１７５フラスコまで成長し、液体窒素中アンプルにて生存可能に冷凍した。
【０１００】
一次ＨＥＲ細胞をも構築物ｐＣＣ５３５sおよびｐＣＣ５３６sでトランスフェクトした。ｐＣＣ５３５sのトランスフェクションにより平均２クローン／皿になり、合計５０クローンを選択した。これらの選択したクローンのうち、２つを樹立した。ｐＣＣ５３６sを用いたトランスフェクションから、少なくとも１つのクローンを樹立できた。
【０１０１】
上記実験により、一次ＨＥＲ細胞はハイブリドＡｄ５−Ａｄ３５Ｅ１配列で形質転換可能であることがわかる。形質転換効率は完全Ａｄ５Ｅ１領域で得たものより低かった。その後、我々は新しい細胞株が組換えＡｄ３５基Ｅ１欠損ベクターを相補できるかどうかを試験した。ｐＩＧ５３５トランスフェクションから得たクローン＃４５をＴ２５フラスコに７×１０６細胞／フラスコの密度で蒔き、Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰウイルス（実施例９参照）を用いて５および２５ウイルス粒子／細胞の多重感染にて感染させた。多重感染度２５および５に対してそれぞれ４および５日で充分なＣＰＥが見られた。Ａｄ５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰウイルスで感染したクローン＃４５細胞の比較並行培養として、多重感染度２５および５に対してそれぞれ７および８日で充分なＣＰＥを得た。初期感染効率はＡｄ５およびＡｄ３５ウイルスに対して比較し、〜８０％（多重感染度＝５）および〜９５％（多重感染度＝２５）の細胞は、感染後１日でＧＦＰウイルスで感染された。蛍光顕微鏡で測定された。クローン＃７５からの細胞を６ウェルプレートに２×１０６細胞／ウェルの密度で蒔き、多重感染度５（ＶＰ／細胞）にてＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰまたはＡｄ５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰで感染した。再び、初期感染効率を両ウイルスに対して比較した。Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰ感染の場合４日で充分なＣＰＥを観察したが、Ａｄ５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰ感染クローン＃７５細胞は７日で充分はＣＰＥを得た。Ａｄ３５およびＡｄ５組換えベクター間のＡｄ３５相補細胞における複製効率の違いは、ウイルスがプラスミドトランスフェクションにより生成された場合により明瞭である。
【０１０２】
クローン＃４５細胞をＴ２５フラスコに３．５×１０６細胞の密度で蒔き、上記にように、リポフェクトアミン試薬（Invitorgen／Life Technologies）を使用して製造者の指示にしたがって３日後にトランスフェクトした。ＰａｃＩで消化した２μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰアダプタープラスミドを、ＮｏｔＩで消化した６μｇのｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲまたはｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３バックボーンコスミドを使用して同時トランスフェクトした。ＰａｃＩを使用して消化した２μｇのｐＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰ（Ａｄ５アダプタープラスミド、国際特許出願ＷＯ００／７００７１に記載）をＰａｃＩで消化した６μｇのｐＷＥ．Ａｄ５．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐ（Ａｄ５バックボーンプラスミド、国際特許出願ＷＯ００／７００７１に記載）で同時トランスフェクトした。一つのＴ２５はトランスフェクトせず、負のコントロールをしてつかった。トランスフェクション後１日、蛍光顕微鏡でモニターし、全ｅＧＦＰトランスフェクションにおいて１０〜１５％で見積もった。トランスフェクション後３日で細胞をＴ８０フラスコに移し、さらに３７℃／１０％ＣＯ２でインキュベートした。再び３日後、ＣＰＥ現象を、ｐＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰおよびｐＷＥ．Ａｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲ＋または−Ｅ３でトランスフェクトした培養物において見えるようになった。Ｅ３欠損バックボーンを用いたトランスフェクションはより多くの緑色蛍光細胞およびＣＰＥ現象を有した。Ａｄ５プラスミドを用いたトランスフェクションは約２０％の緑色蛍光細胞を示したにすぎず、そのうち殆どは死に、ＣＰＥ現象は生じなかった。ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰおよびｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３でトランスフェクトした培養物は８０％のＣＰＥを明らかに示し、かつｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰおよびｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ構築物は進行ＣＰＥ現象を示したので、２日後、この違いはより大きくなった。Ａｄ５トランスフェクト培養物はなんの進行もしめさなかった。表ＶＩはこれらの結果を纏める。我々は上記の新規相補細胞株がＥ１欠損Ａｄ３５基ウイルスの複製を効率的に持続し、かつＥ１欠損Ａｄ５基ウイルスの生成および複製は効率がより劣ることを結論付ける。あきらかに、Ａｄ３５Ｅ１５５Ｋ蛋白質はＡｄ５−Ｅ４Ｏｒｆ６蛋白質との機能的複合体を形成しない。したがって、相補性に対する血清型特異性をもＡｄ３５パッケージング細胞における組換えＡｄ５ベクターに対して示される。
【０１０３】
実施例１１
ｐＷＥ．Ａｄ．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３の生成
ヒトアデノウイルスの初期領域−３は、アデノウイルス感染に対するホスト免疫応答と干渉する蛋白質に対する複数コード化領域を含む。アデノウイルスベクターをワクチンキャリヤとして使用する場合このような干渉は望ましくない。したがって、我々はＥ３領域を欠くＡｄ３５バックボーンコスミドを構築した。
【０１０４】
構築物ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎ（図３５、公開ＥＰ１０５４０６４Ａ１）をＳｔｕＩおよびＭｌｕＩで消化し、１７．３ｋｂベクターフラグメントを低融点（ＬＭＰ）ゲルからアガラーゼ酵素（ロシュ）を使用して製造者の指示にしたがって精製した。次に、ＰＣＲフラグメントを以下のプライマーを使用してｐＢｒ．Ａｄ３５．Ｐｒｎにおいて生成した：
３５Ｅ３前：５’―ＡＡＴＧＡＣＴＡＡＴＧＣＡＧＧＴＧＣＧＣ−３’および
３５Ｅ逆：５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＧＣＴＴＣＴＡＧ−３’。
増幅に対して、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を製造者の指示にしたがって使用し、以下のプログラムを使用した：９４℃で２分、（９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分）の３０サイクル、そして６８℃８分で最後のインキュベーション。８３３ｂｐＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＭｌｕＩおよびＳｔｕＩで消化した。消化ＤＮＡをゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。両方の単離フラグメントを結合し、ＤＨ５ａコンピテント細胞（Invitorgen／Life Technologies）に形質転換し、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３（図３６）を得た。プラスミドを制限分析およびＰＣＲ増幅挿入断片の配列決定により確認した。その後、Ｅ３欠損をｐＷＥ．Ａｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲコスミドバックボーンにクローン化した。ｐＷＥ．Ａｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（実施例４および図８を参照）をＰａｃＩで消化し、ＤＮＡをイソプロパノールを用いた沈殿により精製し、７０％ＥｔＯＨで洗浄した。ｍｉｌｌｉＱ水中での再懸濁後、ＤＮＡをＳｗａＩで消化し、２２．８ｋｂベクター含有フラグメントをＬＭＰゲルから上記アガラーゼ酵素を使用して精製した。
【０１０５】
構築物ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３をＰａｃＩおよびＳｗａＩで同じ方法で消化し、１６．６ｋｂフラグメントをアガラーゼ酵素を使用して単離した。両方の単離したフラグメントを０．５〜０．６μｇの各フラグメントを使用して結合した。その後、結合フラグメントをλ相パッケージング抽出物（ストラタジーン）を使用して製造者の指示にしたがってパッケージングし、ＳＴＢＬ−２細胞と混合した。バクテリアをＬＢ＋Ａｍｐプレートにプレートし、得られたコロニーを正しい構築物の存在について分析した。これにより、構築物ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３（図３７）を得た。Ｅ３欠損はＡｄ３５配列（実施例３）のヌクレオチド２７６４から３０３２０に拡張し、２．６ｋｂ領域に及ぶ。上記のようにＰＥＲ５５−クローン＃１６細胞（実施例９参照）におけるＮｏｔＩ消化ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３およびｐＩＰｅｐ−１消化ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰの構築物によりＧＦＰ発現Ａｄ３５基ウイルスをもたらす。これらのウイルスからのウイルス性ＤＮＡの単離に際し、ウイルスはＥ３領域のＰＣＲ増幅により、ウイルスが予想どおり２．６ｋｂのＥ３配列について欠いていることがわかった。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
表１の説明
中和実験に使用した全ヒトアデノウイルスを、実施例１に記載したように、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Fallaux 等、1998年）で生成し、ＣｓＣｌで精製した。ＨＰＬＣカラムから種々の血清型が溶出するＮａＣｌ濃度を示す。ウイルス粒子／ｍｌ（ＶＰ／ｍｌ）をＡｄ５標準から計算した。実験（ＣＣＩＤ５０）における力価を、中和実験と並行して実施した滴定により、実施例１で記載したように、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で定量した。ＣＣＩＤ５０はこの研究で使用された４４のウイルスについて示し、かつ５日後にウェルの５０％でＣＰＥを得るために必要なウイルスの希釈を示す。ＶＰ／ＣＣＩＤ５０の比をlog10で示し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞における種々のバッチの感染力の測定値である。
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
【表４】
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【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
リファレンス：
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【図面の簡単な説明】
【図１】  試験した各ヒト野生型アデノウイルスに対する中和に対して正の血清サンプルのパーセントを示す棒グラフ（参照：中和アッセイの説明に対する実施例）。
【図２】  ＶＰ／ＣＣＩＤ５０比および中和のパーセントの間に相関が無いことを示すグラフ。
【図３】  アデノウイルス血清型の選択に対する中和活性を示す血清サンプルのパーセントを示す棒グラフ。血清はベルギーおよびイギリスの健康なボランティアから得た。
【図４】  アデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８および４９に対する中和活性を示す血清サンプルのパーセントを示す棒グラフ。血清はヨーロッパおよび合衆国の５箇所から得た。
【図５】  ヒトアデノウイルス３５型の配列（Ａｄ３５の全配列）。
【図６】  ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１のマップ。
【図７】  構築物ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲに対して実施された工程の略図。
【図８】  ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲのマップ。
【図９】  ｐＲＳＶ．Ａｄ３５−Ｅ１のマップ。
【図１０】  ＰＧＫｎｅｏｐＡのマップ。
【図１１】  ｐＲＳＶｐＮｅｏのマップ。
【図１２】  ｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏのマップ。
【図１３】  ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂのマップ。
【図１４】  ｐＩＧ１３５のマップ。
【図１５】  ｐＩＧ２７０のマップ。
【図１６】  ｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌｅｆｔＩＴＲ−ｐＩＸのマップ。
【図１７】  ｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌｅｆｔＩＴＲ−ｐＩＸΔＥ１Ａのマップ。
【図１８】  ｐＢｒ．Ａｄ３５．Δ２１Ｋのマップ。
【図１９】  ｐＢｒ．Ａｄ３５．Δ５５Ｋ１のマップ。
【図２０】  ｐＢｒＡｄ３５ΔＳＭのマップ。
【図２１】  Ａｄ３５−Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ欠損構築物の略図。
【図２２】  ｐＩＧ．３５ＢＬのマップ。
【図２３】  ｐＲＳＶｎｅｏ４のマップ。
【図２４】  ｐＩＧ３５Ｂｎｅｏのマップ。
【図２５】  ｐＩＧ３５．５５Ｋのマップ。
【図２６】  ｐＩＧ５３５のマップ。
【図２７】  ｐＩＧ６３５のマップ。
【図２８】  ｐＩＧ７３５のマップ。
【図２９】  ｐＣＣ２７１のマップ。
【図３０】  ｐＣＣ５３５ｓのマップ。
【図３１】  ｐＣＲ５３５Ｅ１Ｂのマップ。
【図３２】  ｐＣＣ２１５５ｓのマップ。
【図３３】  ｐＣＣ５３６ｓのマップ。
【図３４】  ｐＩＧ５３６のマップ。
【図３５】  ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎのマップ。
【図３６】  ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３のマップ。
【図３７】  ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３。
【図３８Ａ】  ｗｔＡｄ５およびｗｔＡｄ３５配列を有するｐＣＣ５３６ｓにおけるＥ１Ｂ−２１Ｋ（Ａ）アミノ酸配列のアラインメント。
【図３８Ｂ】  ｗｔＡｄ５およびｗｔＡｄ３５配列を有するｐＣＣ５３６ｓにおけるＥ１Ｂ−５５Ｋ（Ｂ）アミノ酸配列のアラインメント。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８−Ａ】
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【図３８−Ｂ】
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