(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの上皮気道（ＨＡＥ）細胞表面受容体に結合できるペプチドを含む 非ウイルス性トランスフェクション複合体であって、該ペプチドは、
ａ）Ｘ１ＳＭ［配列番号１］；
ｂ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ［配列番号１６］；および
ｃ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ［配列番号１８］
（式中、Ｘ１はＫまたＲから選ばれるアミノ酸残基、Ｘ４はＥまたＱから選ばれるアミノ酸残基、そしてＸ５はＰまたはＱである）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有するものであり、該非ウイルス性トランフェクション複合体は、
（i）核酸、
（ii）脂質成分、
（iii）ポリカチオン性核酸結合性成分、および
（iv）ヒトの上皮気道（ＨＡＥ）細胞表面受容体に結合できるペプチドを含む、細胞表面受容体結合性成分を含む、非ウイルス性トランスフェクション複合体。
【請求項２】
ペプチドが、ａ）Ｘ１ＳＭ［配列番号１］；
（式中、Ｘ１はＫまたＲから選ばれるアミノ酸残基である）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有する、請求項１に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項３】
Ｘ４がＥである請求項１に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項４】
Ｘ５がＰである請求項１に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項５】
ペプチドが、配列ＬＱＨＫＳＭＰ（配列番号４）を含む請求項１または２に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項６】
ペプチドが、配列ＬＰＨＫＳＭＰ（配列番号５）を含む、請求項１、２または４のいずれかに記載の トランスフェクション複合体。
【請求項７】
ペプチドが、配列ＶＫＳＭＶＴＨ（配列番号６）を含む、請求項１または２に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項８】
ペプチドが、配列ＳＥＲＳＭＮＦ（配列番号７）を含む、請求項１、２または３のいずれかに記載の トランスフェクション複合体。
【請求項９】
ペプチドが、配列ＳＱＲＳＭＮＦ（配列番号３６）を含む、請求項１に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１０】
１２までのアミノ酸を有する請求項１〜９のいずれかに記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１１】
７のアミノ酸を有する請求項１〜９のいずれかに記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１２】
ペプチドが、ポリカチオン性核酸結合性成分に結合している請求項１〜１１のいずれかに記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１３】
ポリカチオン性核酸結合性成分がポリエチレンイミンである請求項１２に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１４】
ペプチドがジサルファイド結合を介してポリエチレンイミンに結合している請求項１３に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１５】
ポリカチオン性核酸結合性成分が３〜１９のリシン部分を有するオリゴリシン分子である請求項１２に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１６】
ペプチドがスペーサー要素を介してポリカチオン性核酸結合性成分に結合している請求項１２〜１５のいずれかに記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１７】
スペーサー要素がＧＧまたはＧＡであるか、ジペプチドスペーサーＧＧ（グリシン−グリシン）およびＧＡ（グリシン−アラニン）より長く、および／またはより疎水的である請求項１６に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１８】
スペーサー要素が式ＧＡを有する請求項１６または１７に記載の トランスフェクション複合体。
【請求項１９】
式Ａ−Ｂ−Ｃのペプチド誘導体を含む トランスフェクション複合体であって、
Ａはポリカチオン性核酸結合性成分であり、
Ｂはスペーサー要素であり、そして
Ｃはヒトの上皮気道（ＨＡＥ）細胞表面受容体に結合できるペプチドであって、
ａ）Ｘ１ＳＭ［配列番号１］；
ｂ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ［配列番号１６］；および
ｃ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ［配列番号１８］，
（式中、Ｘ１はＫまたＲから選ばれるアミノ酸残基、Ｘ４はＥまたＱから選ばれるアミノ酸残基、そしてＸ５はＰまたはＱである）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有するペプチドである
トランスフェクション複合体。
【請求項２０】
核酸成分が、遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、またはアンチセンス治療のための標的である遺伝子であるか、関連する、請求項１に記載の複合体。
【請求項２１】
核酸の転写および／または翻訳調節分子が提供され、核酸が場合によりファージまたはベクター中に包まれる、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
核酸成分がＤＮＡである請求項２０または２１に記載の複合体。
【請求項２３】
核酸成分がＲＮＡである請求項２０または２１に記載の複合体。
【請求項２４】
核酸結合性成分が３〜１００のカチオン性モノマーを有する請求項２０〜２３のいずれかに記載の複合体。
【請求項２５】
ポリカチオン性核酸結合性成分がオリゴリシンである請求項２０〜２４のいずれかに記載の複合体。
【請求項２６】
オリゴリシンが、１０〜２０、特に１６のリシン残基を有する請求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】
ポリカチオン性核酸結合性成分がポリエチレンイミンである請求項２０〜２４のいずれかに記載の複合体。
【請求項２８】
脂質成分がカチオン性リポソームであるか、またはそれを形成できる請求項２０〜２７のいずれかに記載の複合体。
【請求項２９】
脂質成分が、カチオン性脂質および膜脱安定性またはフソジェニック（fusogenic）性を有する脂質から選択される１以上の脂質であるか、またはそれを含む請求項２０〜２８のいずれかに記載の複合体。
【請求項３０】
脂質成分が、中性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、または同様の膜脱安定化またはフソジェニック性を有する脂質であるか、またはそれを含む請求項２９に記載の複合体。
【請求項３１】
脂質成分が、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）または同様のカチオン性の性質を有する脂質であるか、またはそれを含む請求項２９または３０に記載の複合体。
【請求項３２】
脂質成分が、ＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡの混合物、特にそれらの等モル混合物であるか、またはそれを含む請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
脂質成分としてＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡの等モル混合物、細胞表面受容体結合性成分として請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチド、ポリカチオン性核酸結合性成分として［Ｋ］１６を含む請求項３２に記載の複合体。
【請求項３４】
脂質成分：細胞表面受容体結合性成分／ポリカチオン性核酸結合性成分：核酸の比が、重量で０.７５：４：１、またモルベースで０.５nmol：１.２５nmol：０.２５nmolである請求項３２または３３に記載の複合体。
【請求項３５】
脂質成分が、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミジンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオライドアセテート（ＤＯＳＰＡ）またＤＯＳＰＡの性質に類似の性質を有する脂質であるか、またはそれを含む請求項２９〜３２のいずれかに記載の複合体。
【請求項３６】
脂質成分が、ＤＯＰＥとＤＯＳＰＡの混合物、特に３重量部のＤＯＳＰＡに対して１重量部のＤＯＰＥの混合物であるか、またはそれを含む請求項３５に記載の複合体。
【請求項３７】
脂質成分としてＤＯＰＥとＤＯＳＰＡの混合物、細胞表面受容体結合性成分として請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、およびポリカチオン性核酸結合性成分として［Ｋ］１６を含む請求項３６に記載の複合体。
【請求項３８】
脂質成分：ポリカチオン性核酸結合性成分：核酸の比が重量で１２：４：１である請求項３７に記載の複合体。
【請求項３９】
成分（i）、(ii)、(iii)および(iv)を混合することを含む請求項２０〜３８のいずれかに記載の複合体の製造方法。
【請求項４０】
成分を次の順序：脂質成分、細胞表面受容体結合性成分／ポリカチオン性核酸結合性成分、核酸で混合する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３９または請求項４０に記載の方法により得ることができる、請求項２０〜３８のいずれかに記載の複合体。
【請求項４２】
（i）核酸、
（iii）ポリカチオン性核酸結合性成分、および
（iv）ヒトの上皮気道（ＨＡＥ）細胞表面受容体に結合できるペプチドを含む細胞表面受容体結合性成分、
を含み、
該ペプチドは、
ａ）Ｘ１ＳＭ［配列番号１］；
ｂ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ［配列番号１６］；および
ｃ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ［配列番号１８］，
（式中、Ｘ１はＫまたＲから選ばれるアミノ酸残基、Ｘ４はＥまたＱから選ばれるアミノ酸残基、そしてＸ５はＰまたはＱである）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有する、非ウイルス性トランスフェクション複合体。
【請求項４３】
核酸成分が請求項２０〜２３のいずれかに記載した通りである、請求項４２に記載の複合体。
【請求項４４】
ポリカチオン性核酸結合性成分がポリエチレンイミンである請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項４５】
成分（i）、（iii）および（iv）を混合することを含む、請求項４２〜４４のいずれかに記載の複合体の製造方法。
【請求項４６】
成分を次の順序：細胞表面受容体結合性成分／ポリカチオン性核酸結合性成分、核酸、で混合する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載の方法によって得られる、請求項４２〜４４のいずれかに記載の複合体。
【請求項４８】
（i）核酸、
（ii）脂質成分、
（iii）ポリカチオン性核酸結合性成分、および
（iv）ヒトの上皮気道（ＨＡＥ）細胞表面受容体に結合できるペプチドを含む細胞表面受容体結合性成分
を含み、
該ペプチドは、
ａ）Ｘ１ＳＭ［配列番号１］；
ｂ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ［配列番号１６］；および
ｃ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ［配列番号１８］，
（式中、Ｘ１はＫまたＲから選ばれるアミノ酸残基、Ｘ４はＥまたＱから選ばれるアミノ酸残基、そしてＸ５はＰまたはＱである）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有するトランスフェクション複合体の製造において使用するためのキット。
【請求項４９】
（i）核酸、
（iii）ポリカチオン性核酸結合性成分、および
（iv）ヒトの上皮気道（ＨＡＥ）細胞表面受容体に結合できるペプチドを含む細胞表面受容体結合性成分
を含み、
該ペプチドは、
ａ）Ｘ１ＳＭ［配列番号１］；
ｂ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ［配列番号１６］；および
ｃ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ［配列番号１８］，
（式中、Ｘ１はＫまたＲから選ばれるアミノ酸残基、Ｘ４はＥまたＱから選ばれるアミノ酸残基、そしてＸ５はＰまたはＱである）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有するトランスフェクション複合体の製造において使用するためのキット。
【請求項５０】
ポリカチオン性核酸結合性成分が請求項２４〜２７のいずれかに定義した通りである請求項４８または４９に記載のキット。
【請求項５１】
脂質成分が、請求項２８〜３２、３５および３６のいずれかに定義した通りである請求項４８〜５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５２】
脂質成分としてＤＯＰＥとＤＯＴＭＡの等モル混合物、細胞表面受容体結合性成分として請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチド、ポリカチオン性核酸結合性成分として［Ｋ］１６を含む請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
脂質成分：組み合わされた細胞表面受容体結合性成分／ポリカチオン性核酸結合性成分の比が、重量で０.７５：４である請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
細胞表面受容体結合性成分およびポリカチオン性核酸結合性成分を含み、細胞表面受容体結合性成分が
ａ）Ｘ１ＳＭ［配列番号１］；
ｂ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ［配列番号１６］；および
ｃ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ［配列番号１８］，
（式中、Ｘ１はＫまたＲから選ばれるアミノ酸残基、Ｘ４はＥまたＱから選ばれるアミノ酸残基、そしてＸ５はＰまたはＱである）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有するペプチドである、請求項４８または４９に記載のキット。
【請求項５５】
細胞表面受容体結合性成分が請求項２〜１１のいずれかに定義したペプチドである請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
ポリカチオン性核酸結合性成分が請求項２４〜３３のいずれかに定義した通りである、請求項５４または５５に記載のキット。
【請求項５７】
核酸を請求項４８〜５３のいずれかに記載のキットの化合物の混合物とともに導入することを含む、請求項１に記載の複合体を製造する方法。
【請求項５８】
核酸を請求項５４〜５６のいずれかに記載のキットの化合物の混合物とともに導入することを含む請求項４２に記載の複合体の製造方法。
【請求項５９】
細胞を核酸でトランスフェクトする方法であって、細胞をインビトロで請求項１〜１９、２０〜３８、または４１〜４４のいずれかに記載の複合体と接触させる方法。
【請求項６０】
ヒトの上皮気道（ＨＡＥ）細胞表面受容体に結合できるペプチドであって、該ペプチドは、
ｂ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ［配列番号１６］；および
ｃ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ［配列番号１８］
（式中、Ｘ４はＥまたＱから選ばれるアミノ酸残基、そしてＸ５はＰまたはＱである）
から選択されるアミノ酸配列を含み、２０までのアミノ酸を有するペプチド。
【請求項６１】
請求項３〜５、８、および９〜１１のいずれかに更に定義した請求項６０に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は細胞をトランスフェクトする改良された方法における使用のためのペプチドに関する。
本明細書で用いる「トランスフェクション」という用語は、核酸を細胞に導入することを意味する。核酸はいかなる起源のものであってもよく、受け取る細胞は、原核細胞または真核細胞である。
【０００２】
遺伝子治療および遺伝子ワクチン接種接種は、アンチセンス治療と同様に様々な状態を治療および／または予防するための興味ある可能性を提供する技術である。そのような技術は、問題のＤＮＡを標的細胞に導入することが必要である。十分なＤＮＡを特定の標的細胞に導入する能力は、遺伝子治療、アンチセンス技術および遺伝子ワクチン接種接種の発展に１つの主な限定を残す。ウイルスおよび非ウイルスＤＮＡ運搬システムが提案されている。ある場合にはＲＮＡがＤＮＡの代りに用いられる。
【０００３】
受容体媒介遺伝子運搬は、生理学的細胞過程、受容体媒介エンドサイトシスを、ＤＮＡを内部化するために利用する遺伝子運搬の非ウイルス的方法である。例としては、インスリン受容体（例えば、Ｒosenkrontz  et  al.，Ｅxperimental  Ｃell  Ｒesearch  １９９，３２３−３２９（１９９２を参照）、アシアログリコプロテイン受容体（例えば、Ｗu＆Ｗu，Ｊournal  of  Ｂiological  Ｃhemistry  ２６２，４４２９−４４３２（１９８７），Ｃhowdhury  et  al.，Ｊournal  of  Ｂiological  Ｃhemistry  ２６８，１１２６５−１１２７１（１９９３）参照）、およびトランスフェリン受容体（例えば、Ｃiriel  et  al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ  ８８，８８５０−８８５４（１９９１）参照）に対して標的化されたベクターを含む。ベクターの更なる例は、神経芽細胞腫上の受容体を標的とするモノクローナル抗体（Ｙano等、２０００）、リポソームに共役した葉酸（Ｒeddy およびＬow  ２０００，Ｒeddy 等１９９９）、肝細胞を標的とするガラクトース（Ｈan等、１９９９、Ｂettinger等、１９９９）および肝細胞に対するアシアログリコプロテイン（Ｗu等、１９９１）等を含む。
【０００４】
受容体媒介非ウイルスベクターはウイルスベクターに比べいくつかの利点がある。特に、それらは病原性がない；それらは特定の細胞タイプに標的にした遺伝子運搬を可能にする；そしてそれらはパッケージすることができる核酸分子の大きさに限定がない。遺伝子発現は、複合体の核酸成分がエンドソームから細胞質に無傷で放出され、次に核膜を横切って核転写装置に近づく場合にのみ達成される。しかしながら、トランスフェクション効率は、核酸成分のエンドソーマル分解、核酸が核に入れないこと、および約１５０nmより大きいアグリゲートのクラスリンでコートしたベシクルからの排除のため、ウイルスベクターに比べ一般的に低い。
【０００５】
ベクターに対して標的にするリガンドの望ましい性質は、それらが細胞表面の受容体に高親和性および高特異性、並びに中くらいのベクターインターナリゼーションを有して結合することである。短いペプチドは標的リガンドとして特別の利点がある。何故なら、それらは高純度で合成するのに簡単であり、インビボ用途で重要なことは低免疫原性であるからである。
【０００６】
ＷＯ  ９８／５４３４７は、インテグリン結合性成分、ポリカチオン性核酸結合性成分、および脂質成分を含む混合物を開示し、
（i）核酸、特に問題の配列をコードする核酸、
（ii）インテグリン結合性成分、
（iii）ポリカチオン性核酸結合性成分、および
（iv）脂質成分
を含む複合体も開示する。その複合体は主にインテグリン媒介トランスフェクションベクターである。
【０００７】
インテグリンは、いくつかの異なるαおよびβサブユニットからなるヘテロダイマー性膜タンパク質スーパーファミリーである。それらは細胞外マトリックスへの細胞の付着、細胞−細胞相互作用およびシグナル伝達にとって重要である。インテグリン媒介インターナリゼーションは食作用様過程によって進み、直径１〜２μmの細菌細胞のインターナリゼーションを可能にする（Ｉsberg、１９９１）。従って、インテグリンに対する非ウイルスベクターの標的は、病原体による細胞の感染をまねる方法で細胞をトランスフェクトする可能性を有し、受容体媒介エンドサイト−シスにおけるクラスリン被覆小胞により起こすサイズ限定を回避する。
【０００８】
ＷＯ  ９８／５４３４７に記載された成分は静電的に会合して、ベクター複合体を形成すると考えられ、そのベクターはリポポリプレックス型である。ＷＯ  ９８／５４３４７のそのベクター複合体は、ある範囲の細胞系および初代培養の培養物を高効率で、インテグリン特異的に、そして低毒性でトランスフェクトすることが見出されている。例えば、管の平滑筋細胞は５０％の効率で、内皮細胞は３０％の効率で、造血細胞は１０％の効率でトランスフェクトされる。更にラット肺およびブタ肺の気管支上皮のインビボトランスフェクションはアデノウイルスベクターのそれに匹敵する効率が示された。
【０００９】
遺伝子移転を媒介するためにインテグリン受容体を用いるベクターは、インテグリン受容体が比較的広く行き渡っているので、体中の多数の様々なタイプの細胞を標的にするという利点を有する。ある環境では、例えばインビボ処理では、しかしながら、受取細胞をより特異的に標的化することが好ましいかもしれない。
【００１０】
高められた細胞標的化性を有する改良されたベクター複合体を提供するのが本発明の目的である。本発明は、従来のリガンドより細胞型選択性であるリガンドを有する合成の標的化非ウイスル性ベクター複合体の開発に基づいている。
【００１１】
標的化した非ウイルス性ベクターへの以前のアプローチは、細胞−細胞接着に関与する物質に対する抗体の使用を含んでいた。例えば、神経芽腫細胞上の受容体を標的にするモノクローナル抗体（Ｙano等、２０００）を含むベクターが知られている。標的化システムの更なる例が、肝細胞を標的にするためのガラクトース（Ｈan等、１９９９、Ｂettinger等、１９９９）および肝細胞についてのアシアログリコプロテイン（Ｗu等、１９９１）が提案されている。しかしながら、そのような方法は限られた環境でのみ有効である。例えば、抗体は広い利用性を有するが、製造するのに時間がかかり、その大きさを考えて小さい分子リガンドほどには器官へのインビボ投与に適していない。さらに、以前に記載された方法はリガンドが未だ利用できない細胞タイプに標的化することができない。
【００１２】
有効な標的ベクターの開発において、いくつかの異なる標的結合リガンドが利用可能であることが有用である。有効な標的化されたトランスフェクションは、良好な標的化だけではなく、ベクターＤＮＡの標的細胞の核への有効な移転を必要とする。リガンドが標的細胞を標的化し、結合することにおいて有効であったとしても、有効な遺伝子トランスフェクションは必ずしも起こらない。その理由は現在のところ明らかではない。従って、標的細胞に効果的に結合するリガンドが有効なトランスフェクションをもたらすかどうかに関してある程度の予測不可能性が残る。従って、有効なトランスフェクションリガンドが選択され得るいずれかの特別の細胞表面受容体についてリガンドの利用可能な「プール」を有することが望ましい。そのような選択は、例えばリポーター遺伝子を用いる遺伝子移転試験により、またはいずれかの他の適当な手段により起こり得る。
【００１３】
本発明はヒトの気道上皮（ＨＡＥ）細胞に結合する特異的なペプチド配列の同定に基づいている。ＨＡＥ細胞表面受容体結合性成分ペプチドモチーフの同定されたファミリーはＨＡＥ細胞への特異的結合を媒介する。
【００１４】
本発明は、
ａ）Ｘ１ＳＭ（配列番号１）；
ｂ）ＬＸ２ＨＫ（配列番号２）；
ｃ）ＰＳＧＸ３ＡＲＡ（配列番号９）；
ｄ）ＳＸ４ＲＳＭＮＦ（配列番号１６）；および
ｅ）ＬＸ５ＨＫＳＭＰ（配列番号１８），
から選択されるアミノ酸配列からなる、または含んでなるペプチドを提供する（式中、Ｘ１は塩基性アミノ酸残基であり、Ｘ２はＱまたはＰであり、Ｘ３はＡまたはＴであり、Ｘ４は酸性アミノ酸残基であり、Ｘ５はＰまたはＱである）。
【００１５】
好ましくは、本発明のペプチドは
ａ）Ｘ１ＳＭ（配列番号１）；
ｂ）ＬＸ２ＨＫ（配列番号２）；および
ｃ）ＰＳＧＡＡＲＡ（配列番号３）
から選択されるアミノ酸配列からなり、または含んでなる（式中、Ｘ１は塩基性アミノ酸残基であり、Ｘ２はＱまたはＰである）。
【００１６】
好ましくはＸ１はＫまたはＲである。好ましくはＸ２はＰである。好ましくはＸ３はＡである。好ましくはＸ４はＥまたはＱである（配合番号１７）。より好ましくはＸ４はＥである。好ましくはＸ５はＰである。
【００１７】
好ましくは、本発明のペプチドは、ＬＱＨＫＳＭＰ（配列番号４）、ＬＰＨＫＳＭＰ（配列番号５）、ＶＫＳＭＶＴＨ（配列番号６）、ＳＥＲＳＭＮＦ（配列番号７）、ＶＧＬＰＨＫＦ（配列番号８）、ＹＧＬＰＨＫＦ（配列番号１９）、ＰＳＧＡＡＲＡ（配列番号３）、ＳＱＲＳＭＮＦ（配列番号３６）およびＰＳＧＴＡＲＡ（配列番号３８）から選択される配列を含む。最も好ましくはペプチドはＬＱＨＫＳＭＰ（配列番号４）、およびＬＰＨＫＳＭＰ（配列番号５）を含む。
【００１８】
本発明のペプチドは、長さが２０までのアミノ酸であるか、より長くてもよい。本発明のペプチドは一般に、少なくとも５のアミノ酸を有するが、恐らくより少なくてもよい。一般に本発明のポリペプチドは６〜２０のアミノ酸のいずれかの数を有する。ペプチドは６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸を有する。一般に本発明のペプチドは１５以下のアミノ酸を有することが好ましい。例えば、本発明のペプチドは１２以下のアミノ酸を有し得る。好ましくは本発明のペプチドは１０以下のアミノ酸を有する。一般的に、本発明のペプチドは５以上のアミノ酸を有することが好ましい。例えば、本発明のペプチドは６以上のアミノ酸を有し得る。例えば、本発明のペプチドは７のアミノ酸を有する。上のアミノ酸配列ｃ）を含むペプチドの場合、最小のサイズは７アミノ酸である。
【００１９】
好ましくは本発明のペプチドはＸ１がＫもしくはＲであるか、またはＸ２がＱまたはＰであるものである。
【００２０】
本発明のペプチドは環状領域を含んでもよい。好ましくは、本発明のモチーフは、１以上のジサルファイド結合を形成することができる２以上のシステイン残基に隣接している。例えば、本発明のペプチドは「ペプチドＰ'」（ＣＬＰＨＫＳＭＰＣ）（配列番号１０）、または「ペプチドＱ'」（ＣＬＱＨＫＳＭＰＣ）（配列番号１１）であり得る。
【００２１】
本発明のペプチドはＨＡＥ細胞標的化非ウイルス性トランスフェクションベクター複合体に用途を見出す。それらは標的化されたウイルストランスフェクションベクターにおいても有用である。
【００２２】
ペプチドは好ましくはポリカチオン性核酸結合性成分に結合させる。ポリカチオン性核酸結合性成分は、核酸を結合するのに適したいずれかのポリカチオン性分子であり得る。
【００２３】
例えば、それはポリエチレンイミンであり得る。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、遺伝子運搬能力を有する非毒性の架橋したカチオン性ポリマーである（Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．，１９９５，９２，７２９７−７３０１）。例えばペプチドを、公知の方法を用いて（例えば、Ｇrene  Ｔherapy，１９９６，６，１３８−１４５）、ジサルファイド結合によってＰＥＩに結合する。ポリエチレンイミンはＦluka（８００ｋＤa）から、またはＳigma（５０ｋＤa）より入手可能であり、あるいはＰolyＰlusトランスフェクション（Ｉllkirch，Ｆrance）からトランスフェクション目的のためにあらかじめ希釈されている。典型的には、ＰＥＩはＤＮＡの９倍過剰であり（過剰比はＰＥＩ窒素：ＤＮＡリン酸として計算される）、pＨ＝５〜８の場合、最も有効である。そのようなパラメーターは当業者によく知られている方法で最適化し得る。
【００２４】
核酸結合性ポリカチオン性分子の他の例は、１以上のカチオン性アミノ酸を含むオリゴペプチドである。例えば、そのようなオリゴペプチドは５〜２５のリシン部分、好ましくは１０〜２０のリシン部分、例えば１６のリシン部分を有するオリゴリシン分子、オリゴヒスチジン分子、もしくはオリゴアルギニン分子、または全体で５〜２５の残基、好ましくは１０〜２０の残基、例えば１６の残基を有し、ヒスチジン、アルギニンおよびリシン残基のいずれかの組合せを含む混合オリゴマーであり得る。
【００２５】
ペプチドはスペーサーを介してポリカチオン性核酸結合性成分に結合してもよい。
【００２６】
スペーサー要素は一般にペプチドである。すなわち、それはアミノ酸残基を含む。アミノ酸は天然または非天然であり得る。それらはＬ−またはＤ−配置を有し得る。スペーサーは２以上のアミノ酸を有し得る。例えば、それは３以上のアミノ酸、例えば４以上の、例えば５以上の、例えば１０以上までのアミノ酸を含み得る。アミノ酸は同一でも異なってもよいが、多数のリシン残基（またはベクター複合体のポリカチオン性核酸結合性成分での使用に適した他のアミノ酸）の使用は、オリゴリシン配列は本発明のベクター複合体のポリカチオン性核酸結合性成分としての活性を有するので、スペーサーとし避けるべきである。
【００２７】
スペーサーは例えば、ジペプチド、グリシン−グリシン（ＧＧ）またはグリシン−アラニン（ＧＡ）であり得る。一般的にスペーサーはジペプチドスペーサーＧＧおよびＧＡより長く、そして／または疎水性であることが好ましい。
【００２８】
スペーサーはジペプチドＧＧおよびＧＡより疎水的でよい。例えば、グリシンおよびアラニンより疎水性のアミノ酸を用いてもよい。疎水性アミノ酸の例は周知であり、ε−アミノヘキサン酸を含む。
【００２９】
スペーサーはジペプチドＧＧおよびＧＡより長いか、またはより疎水性であり得、またはそれはより長く、そしてより疎水性であってもよい。後者のタイプのスペーサーの例はＸＳＸＧＡ（式中、Ｓ＝セリン、Ｇ＝グリシン、Ａ＝アラニン、Ｘ＝ε−アミノヘキサン酸である）である。このスペーサーは高度に疎水性である。
【００３０】
本発明は更に式Ａ−Ｂ−Ｃのペプチド誘導体を提供する。式中、Ａはポリカチオン性核酸結合性成分、Ｂはスペーサーエレメントであり、Ｃは上に記載したペプチドである。
【００３１】
ポリカチオン性核酸結合性成分Ａは上に記載したいずれかのポリカチオン性核酸結合性成分であり得る。スペーサーエレメントＢは上に記載したスペーサーエレメントのいずれでもよい。
【００３２】
本発明は更に、
（i）核酸、
（ii）脂質成分、
（iii）ポリカチオン性核酸結合性成分、および
（iv）上に記載したペプチドを含む細胞表面受容体結合性成分
を含む非ウイルス性トランスフェクション複合体を提供する。
【００３３】
細胞表面受容体結合性成分は本発明のペプチドに関し、上に記載した特徴を有し得る。
【００３４】
細胞表面受容体結合性成分ペプチドは、繊維状のファージ粒子上に示されるランダム７マー（７つのアミノ酸残基を有するペプチド）のペプチドライブラリー、およびランダム１２マー（１２のアミノ酸残基を有するペプチド）のペプチドライブラリーから選択により同定された。ランダム７マーライブラリーを用いて得られた結果はランダム１２マーペプチドライブラリーを用いて得た結果より良好であった。７および１２アミノ酸ライブラリーの挙動の差の理由は、現在のところ知られていない。ファージコートタンパク質により大きいアミノ酸を挿入することはファージの生存力を減少させ、そして／または更なるタンパク質合成の必要はＥ．coli 細菌に大きすぎる負担をかける。あるいは、または更に、１２マーライブラリーの不純物または欠陥もそのライブラリーを用いる実験の結果に悪い影響を与えたかもしれない。しかしながら、より小さいペプチド、例えばヘプタマーペプチドが好ましいようである。従って、本発明のペプチドは好ましくは４〜１１のアミノ酸、より好ましくは４〜１０のアミノ酸、例えば７アミノ酸を有する。
【００３５】
用いた７マーライブラリーは、ニューイングランド・バイオラボから入手したＣ７Ｃライブラリー（すなわち、システイン残基が隣接したランダムな７マーペプチド）であった。用いた１２マーライブラリーもニューイングランドラボから入手した。
【００３６】
上に示したように、本発明のＨＡＥ細胞受容体結合性ペプチドは、環化を可能にするためにシステイン残基の隣接した長さが７残基のランダムペプチド配列を含むファージディスプレーライブラリーからの選択により同定した。そのような選定過程は一般的に知られている。そのような過程によれば、ファージの懸濁液を標的細胞とインキュベートする。結合しないファージを次に洗い去り、次に結合したファージを、残った細胞を低pＨ緩衝液で洗うか、また細胞を溶菌することによって抽出する。次にＥ．coli を放出されたファージに感染させ、第１ラウンドファージの調製物を得る。そのサイクルを繰り返し、例えば３度行い、標的にするファージを富化するために、ストリンジェンシー条件を、選択の後のラウンドで、例えば洗浄工程の数を増加させ、溶出の前に低pＨ洗浄を導入し、培地ブロッカーでコートしたウェルで前選択することによって増加させ得る。
【００３７】
連続するラウンドのファージ増幅による選択の後、ＨＡＥ細胞に対して高親和性を有するファージは、プレートしたＨＡＥを用いる全細胞ＥＬＩＳＡによって更に選択され得ることが見出された。ＨＡＥ細胞と共にファージをインキュベートした後、細胞を洗浄し、保持されたファージは免疫染色法により検出し得る。細胞特異性は、標的細胞に結合するファージを、細胞をプレートしたウェルに結合したファージと、およびＮＩＨ繊維芽対照細胞に結合したファージと比較することにより評価する。
【００３８】
上に記載した全細胞ＥＬＩＳＡ（Ｅnzyme−Ｌinked  ＩmmnoＳorbent  Ａssay）を用いて、高親和性および高特異性結合ペプチドが同定された。高親和性ファージが結合する細胞を溶菌し、結合したファージ粒子を放出させた。ファージＤＮＡを単離し、配列決定した。
【００３９】
第１の実験において細胞溶菌溶出したＣ７Ｃファージから得たクローンのアミノ酸配列を表１ａに示す。
【表１】
0004430305.tif 000002
第２の実験において細胞溶解で溶出したＣ７Ｃファージから得たクローンのアミノ酸配列を表１ｂに示す。
【表２】
0004430305.tif 000003
【００４０】
第２の実験における第３ラウンドのＨＡＥ０−のパニングからの５６の配列決定したクローンを表１ｂに示した１４の配列により示し、いくつかの配列は多重ファージクローンにより示された。示された配列はファージにおいて２つのシステイン残基によりそれぞれ隣接され、それらの間のジサルファイド結合によりループ形成させられた。疑いを避けるために表１ａおよび１ｂ中のすべての配列は本発明の一部を形成する。
【００４１】
表１ａの（第１の実験）の陽性クローンアミノ酸配列に見出されたモチーフの分析を表２ａに示す。
【表３】
0004430305.tif 000004
＊  ＰＳＧＡＡＲＡはモチーフではなく、すでに同定したモチーフを含まない第１実験における繰返しクローンである。
【００４２】
表１ｂ（第２実験）の陽性のクローンアミノ酸配列に見出されるモチーフの分析を表２ｂに示す。
【表４】
0004430305.tif 000005
【００４３】
第１実験（表１ａ）で見出された配列を、ある範囲のファージ力価を用いてＥＬＩＺＡによるそれらの結合強度について比較し、順位をつけた（表３）。表３において、配列はＨＡＥ細胞に対する結合親和力の順序で順位をつけた。配列ＬＰＨＫＳＭＰ（「ペプチドＰ」）は最高の結合親和力を有していることが見出された。
【表５】
0004430305.tif 000006
【００４４】
表から、モチーフＫＳＭ／ＲＳＭおよびＬＸＨＫがいくつかのクローンに存在したことが見られ得る。これはこれらのモチーフがＨＡＥ細胞表面結合に重要であることを強く示唆する。どのＨＡＥ受容体に配列が結合するか現在のところ不明である。様々なモチーフが同じ受容体を標的にし、またはそれらは異なる受容体を標的にするかも知れない。
【００４５】
良好な結合は高親和性相互作用および／または細胞表面に多数存在する細胞表面受容体分子の結合を示す。ＬＸＨＫモチーフのＬＰＨＫバージョンはＬＱＨＫバージョンより良好な結合を提供し、ＸＳＭモチーフのＫＳＭバージョンはＲＳＭバージョンより良好な結合を提供する。ＬＸＨＫモチーフおよびＫＳＭモチーフはしばしば一緒に見出される。これは、共同的効果、多分２つの細胞表面レセプター分子へのモチーフ結合によるかも知れない。
【００４６】
本発明のペプチド配列はＨＡＥ細胞を用いて同定したが、それらの有用性はＨＡＥ細胞での使用に限定されない。ペプチドが結合する受容体は他の細胞タイプで発現し得る。本発明のペプチドが用いられる細胞タイプはいずれかの適当なスクリーニング過程により同定され得る。
【００４７】
本発明のベクター複合体のトランスフェクションの性質は、以下に示すようにＨＡＥ細胞トランスフェクションで研究された。
【００４８】
同定された配列を導入する非ウイルス性トランスフェクションベクター複合体を調製した。ペプチドを標準的な固相合成化学を用いて合成し、１６のリシンの尾を付加した。最もしばしば生ずるペプチドを合成のために選び、ＬＰＨＫＳＭＰペプチドをそれが３つのモチーフを有するので選んだ。各ペプチドに一文字名称を与えた。合成のために選んだペプチドを表４に示す。
【表６】
0004430305.tif 000007
【００４９】
ルシフェラーゼリポーター遺伝子ＤＮＡをトランスフェクションＤＮＡとして用いた。トランスフェクション複合体は、１）脂質、次に２）ペプチド、そして最後に３）ＤＮＡの順序で成分を混合することにより作り、その後希釈した。ベクター複合体懸濁液をＨＡＥ細胞および対照細胞に適用した。
【００５０】
ペプチドＱ（［Ｋ］１６−ＧＡＣＬＱＨＫＳＭＰＣＧ）（配列番号１２）を導入したベクター複合体およびペプチドＰ（［Ｋ］１６−ＧＡＣＬＰＨＫＳＭＰＣＧ）（配列番号１３）を導入したベクター複合体を合成し、ペプチドＰと同じアミノ酸組成を有するがランダム化された対照ペプチド（スクランブル対照）であるペプチドＳ（［Ｋ］１６−ＧＡＣＹＫＨＰＧＦＬＣＧ）（配列番号１４）を導入したベクター複合体ペプチド１２（［Ｋ］１６−ＸＳＸＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧ）（配列番号１５）、α５β１インテグリンに結合することが知られている標的ペプチドおよびペプチドＫ（［Ｋ］１６）結合する標的リガンドを有しないＤＮＡ結合部分と比較した。
【００５１】
ＨＡＥ細胞および３Ｔ３細胞のトランスフェクションは、２４時間前にプレートした２０，０００の細胞を含む９６ウェルプレートで行った。トランスフェクションベクター複合体において、ＤＮＡ電荷に対するペプチドの比（＋／−）は１．５：１，３：１および７：１を用いた。生理学的ｐＨではＤＮＡは陰電荷を有し、ポリカチオン性核酸結合性成分は陽電荷を有する。従って「電荷比」は複合体中の２つの成分の電荷の比である。脂質成分は、重量で、０．７５：１というＤＮＡに対する一定の割合で維持された。トランスフェクション実験の結果は図３に示される。
【００５２】
７：１の電荷比で、ペプチドＰを含むベクター複合体のトランスフェクション効率は、３：１の電荷比の次によいペプチド１２より５倍高かった。７：１の電荷比でペプチドＰはペプチドＳ（スクランブル対照）より１５０倍よく、トランスフェクション効率は受容体特異的であることを示す。ペプチドＰを含むベクター複合体は、ペプチドＫを含むものより９倍効率がよく、再び受容体特異性を示す。ペプチドＫを含むベクター複合体が、ペプチドＳを含むベクターコンプレックスより試験でよりよく挙動するという事実はペプチドＳにおけるスクランブルモチーフによる立体障害がある役割を果すことを示唆する。
【００５３】
ペプチドＰおよびペプチドＱの類似のＨＡＥ細胞表面結合性の性質にかかわらず（図２参照）、ペプチドＰはトランスフェクション試験でペプチドＱより顕著に良好に挙動する。この結果は結合性質のみではトランスフェクションの高効率を達成するのに十分でないことを示唆する。
【００５４】
本発明のベクター複合体における使用のためのＨＡＥ細胞表面受容体結合性ペプチド成分は、標準的な固相ペプチド合成方法を用いて合成し得る。
【００５５】
トランスフェクションに用いたペプチドにより結合された分子の同一性はＢＬＡＳＴサーチを行うことにより調査した（表５ａおよび５ｂ）。肺の上皮細胞の表面に存在する分子を結合し得る問題のいくつかの分子に対する相同性が見出された。本発明のペプチドと相同性を有する病原体ペプチドを表５ａに示し、一方本発明のペプチドと相同性を有する細胞接着分子を表５ｂに示す。
【表７】
0004430305.tif 000008
【表８】
0004430305.tif 000009
【００５６】
上皮性カドヘリンは細胞−細胞接着に関与し、β−カテニンと複合体を形成する分子である。ヒトヘルペスウイルスのグリコプロテインＢは細胞表面のヘパランサルフェートプロテオグリカンを結合する。セレクチンは細胞表面グリコプロテインと結合する。ラミニン、α５は上皮に見出される基底膜タンパク質である。ライノウイルスのカプシド結合タンパク質ＶＰ２はＩＣＡＭ−１または上部呼吸管のＬＤＬレセプターファミリー分子に結合する。Ｐ−グリコプロテインは細胞膜に局在化している分子ポンプ分子であり、凝固因子ＸＩＩは上皮細胞上のサイトケラチンに結合することが示されている。
【００５７】
本発明のいずれのモチーフまたはいずれのモチーフも天然に存在するタンパク質中にあるが、本発明のペプチドは天然に存在する完全長のタンパク質を含まない。一般に、本発明のペプチドは長さが１００以下のアミノ酸、好ましくは長さが５０以下のアミノ酸である。典型的にはそれらは上に述べた大きさを有する。
【００５８】
本発明のペプチドは、病原体および表４ａおよび表４ｂに示した細胞接着分子を含む状態の研究に用途を見出す。それらはこれらの状態の処置の開発に有用である。
【００５９】
核酸成分は天然源から得てもよく、又は組換的に、または化学合成により製造し得る。それは、例えば特異的な機能を有する分子、例えば核標的分子を含むよう改変してもよい。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種接種、またはアンチセンス治療での使用に適し得る。核酸は特定の遺伝子治療に対する標的である遺伝子であり得、または関連してもよく、遺伝子ワクチン接種として、またはアンチセンス治療剤として作用することができる分子であり得る。核酸は完全なコード配列であるかまたはそれに対応してもよく、コード配列の部分であってもよい。
【００６０】
或いは、核酸は商業的に有用な、例えば産業上または科学的に有用な、例えば酵素であるタンパク質をコードしていてもよい。それは医薬的に有用であり、治療的に予防的に薬剤またはワクチンとして用いることができるタンパク質、診断上有用な、例えばＥＬＩＳＡにおける使用のための抗原であるタンパク質をコードしてもよい。商業的に有用なタンパク質を製造することができる宿主細胞は時には「細胞工場」と呼ばれる。
【００６１】
適当な転写および翻訳コントロール因子が一般的に提供される。遺伝子治療の場合、核酸成分は一般にプラスミドまたはベクター中の核酸挿入の形で提供される。しかし、ある場合には、発現を達成するために核酸成分をベクターに導入する必要はない。例えば遺伝子ワクチン接種接種およびアンチセンス治療は裸の核酸を用いて達成される。
【００６２】
核酸は一般にＤＮＡであるが、ある場合には、例えばガンワクチン接種においてはＲＮＡを用い得る。核酸成分は以下でプラスミド成分または成分「Ｄ」と呼ぶかもしれない。
【００６３】
上に示したようにポリカチオン性核酸結合性成分はＤＮＡまたはＲＮＡに結合できるいずれのポリカチオンである。ポリカチオンは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する能力が保持されることを条件としていずれの数のカチオン性モノマーを有し得る。例えば、３〜１００のカチオン性モノマー、例えば１０〜２０、例えば１４〜１８、特に約１６のカチオン性モノマーが存在し得る。例えば１０〜２０のリシン残基、例えば１３〜１９、例えば１４〜１８、例えば１５〜１７の残基、特に１６残基（すなわち［Ｋ］１６，「Ｋ」はリシンを表す）を有するオリゴリリシン特に好ましい。
【００６４】
さらに好ましいカチオン性ポリマーはポリエチレンイミンである（Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．１９９５，９２，７２９７−７３０１）。
【００６５】
ポリカチオン性ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性成分は細胞表面受容体結合性成分に有利に結合し、さもなくば付着してもよい。組合された細胞表面受容体結合性成分／ポリカチオン性ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性成分は以下で成分「Ｉ」と呼ぶ場合がある。例えばポリカチオン性ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性成分は、細胞表面受容体結合性成分に、例えばオリゴリシンの場合におけるペプチド結合によって、化学的に結合し得る。ポリカチオン性成分は細胞表面受容体結合性成分のいずれの位置にも結合し得る。細胞表面受容体結合性成分およびポリカチオン性ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性成分の好ましい組合せは、例えば上記のペプチドにペプチド結合により結合したオリゴリシン、特に［Ｋ］１６である。細胞表面受容体結合性成分とポリカチオン性ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性成分の更に好ましい組合せは、例えば上に記載したペプチドに共有結合により結合したポリエチレンイミンである。例えばそのような共有結合はジサルファイド結合またはスクシニミジルブリッヂである。
【００６６】
脂質成分はカチオン性リポソームであっても、またはそれを形成してもよい。脂質成分は、カチオン性脂質、膜脱安定性またはフソジェニックな性を有する脂質、特にカチオン性脂質、膜脱安定性性質の組合せから選択される１以上の脂質であっても、または含んでもよい。
【００６７】
好ましい脂質成分（「Ｌ」）は中性の脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（以下「ＤＯＰＥ」と呼ぶ）であっても、またはそれを含んでもよい。ＤＯＰＥは、時には「フソジェニック性」と呼ぶ膜脱安定性を有する（Ｆarhood等，１９９５）。他の脂質、例えば膜脱安定性を有する、特にＤＯＰＥのように膜脱安定性を有する中性脂質もＤＯＰＥの代りに、または同様に使用し得る。
【００６８】
少くとも１の長鎖アルキル基を有する他のリン脂質、例えばジ（長鎖アルキル鎖）ホスホリピッドを用い得る。そのリン脂質はホスファチジル基、例えばホスファチジルアルカノールアミン基、例えばホスファチジル−エタノールアミン基を含み得る。
【００６９】
更なる好ましい脂質は、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（以下「ＤＯＴＭＡ」と称する）てあるか、含み得る。ＤＯＴＭＡはカチオン性性質を有する。他のカチオン性脂質、特にＤＯＴＭＡと似た性質を有するカチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡに加えて、または代替物として用い得る。そのような脂質は、例えば３つの短鎖アルキル基、および１の長鎖アルキル基により置換された４級アンモニウム塩である。短鎖アルキル基は同じであっても異っていてもよく、メチルおよびエチルから選択され得る。少くとも１のそして３までの短鎖アルキル基はメチル基であり得る。長鎖アルキル鎖基は、直鎖または分枝鎖、例えばジ（長鎖アルキル）アルキル基を有してもよい。
【００７０】
他の好ましい脂質は、脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミジンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオライドアセテート（以下「ＤＯＳＰＡ」と称する）であるか、含む。類似の脂質、特にＤＯＳＰＡのそれと似た性質を有する脂質は、ＤＯＳＰＡに加えて、または代替物として使用し得る。そのような脂質は、例えばＤＯＳＰＡにおけるそれと異なる短い鎖のアルキル基を有する。
【００７１】
好ましい脂質成分はＤＯＰＥおよび１以上の他の成分、例えば上に記載したものを含む。ＤＯＰＥとＤＯＴＭＡの混合物を含む脂質成分が特に好ましい。そのような混合物はカチオン性リポソームを形成する。ＤＯＰＥとＤＯＴＭＡの等モル混合物が特に有効であることが見出されている。そのような混合物は「リポフェクチン」として一般的に知られ、「リポフェクチン」の名前で商業的に利用可能である。「リポフェクチン」という用語は、ＤＯＰＥとＤＯＴＭＡの等モル混合物を示すために一般的に用いる。リポフェクチンと類似の性質を有するカチオン性リポソームである脂質の他の混合物は用い得る。リポフェクチンは試験したすべての細胞タイプで有効であるので特に有用である。
【００７２】
更なる好ましい脂質成分はＤＯＰＥおよびＤＯＳＰＡの混合物を含む。そのよう混合物もリポソームを形成する。３：１のＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥの重量比のＤＯＰＥおよびＤＯＳＰＡの混合物は特に有効である。膜濾過水中のそのような混合物は「リポフェクタミン」の名前で商業的に利用可能である。ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＳＰＡを含む混合物、例えばリポフェクチンとリポフェタミンの混合を使用し得る。
【００７３】
他のカチオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム）およびＴｆｘ範囲の脂質（Ｐromoga）が使用可能である。ＤＯＴＡＰはＮ−［１−（２，３−ジオリルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェートである。Ｔｆｘ試薬は、合成カチオン性脂質［Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイルオキシ）−１，４−ブタンジアンモニウムアイオダイドおよびＤＯＰＥの混合物である。すべての試薬は同量のカチオン性脂質成分を含むか、異なるモル量のフソジェニック脂質ＤＯＰＥを含む。
【００７４】
しかしながら、リポフェクチンおよびリポフェクタミンは、本発明のＬＩＤベクター複合体における脂質成分としてＤＯＴＰＡおよびＴｆｘ試薬より顕著に有効であるようである。
【００７５】
推定の細胞表面受容体結合性成分、ポリカチオン性ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性成分、若しくは脂質成分、またはこれらのいずれかの組合せの有効性は以下に記載する方法を用いて容易に測定できる。
【００７６】
トランスフェクションベクターと同様に上に記載したトランスフェクション複合体を用いるトランスフェクションの有効性は、脂質成分：細胞表面受容体結合性成分：ＤＮＡまたはＲＮＡの比により影響される。トランスフェクトされるべきいずれかの個々のタイプの細胞に対するいずれかの選ばれた成分の組合せについては、最適の比は、異なる割合の成分を混合し、例えば本明細書に記載するようにその細胞タイプについてトランスフェクション割合を測定すれば簡単に測定できる。
【００７７】
リポフェクチンおよびリポフェクタミンは上述したシステムにおけるトランスフェクションを高めるのに特に有効であるようである。リポフェクチンは非常に少量のみが必要であるという利点を有する。生じ得る副作用はそれ故最小化される。脂質およびＤＮＡ成分の適当な重量比は０．７５：１であることがわかった。いずれかのあるトランスフェクション実験において、この比は当業界で知られる方法を用いて最適化され得る。
【００７８】
本発明のペプチドを導入するトランスフェクションベクター複合体によってトランスフェクトされ得る細胞は、例えば内皮および上皮細胞、例えば気管支および肺上皮を含む気道内皮のいずれかの部分および角膜内皮の細胞を含む。気道上皮はのう胞の繊維症および喘息に対する遺伝子治療の重要な標的である。
【００７９】
上に記載したトランスフェクションベクター複合体は、成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を混合することにより調製される。
【００８０】
成分はいかなる順序で混合してもよいが、脂質成分は最後に添加しないことが一般的に望ましい。組み合わせた細胞表面受容体結合性成分／ポリカチオン性ＤＮＡ結合性またＲＮＡ結合性成分が存在する場合には、次の順序で成分を混合することが一般的に好ましい：脂質成分；組み合わせた細胞表面受容体結合性／ポリカチオン性ＤＮＡ−結合性またはＲＮＡ結合性成分；ＤＮＡまたはＲＮＡ成分、例えば次の順序、リポフェクチン−オリゴリシン−ペプチド成分、ＤＮＡまたはＲＮＡ成分。
【００８１】
細胞表面受容体結合性成分、ポリカチオン性核酸結合性成分および脂質成分を含むトランスフェクション混合物を用いて、核酸を混合物に導入することにより、上記のように核酸を含むトランスフェクションベクターを調製してもよい。或いは、トランスフェクション混合物は、核酸成分の代りに、ポリカチオン性核酸結合性成分、例えばタンパク質に結合できるいずれかの他の成分を含むベクター複合体を製造するために用いてよい。
【００８２】
本発明のトランスフェション混合物の個々の成分は、それぞれトランスフェクションベクター複合体に関して上に記載した通りである。好ましい成分、好ましい成分の組合せ、好ましい成分の比および好ましい混合順序は、混合物およびベクター複合体の製造の両方に関して、トランスフェクションベクターに関して上に記載した通りである。
【００８３】
トランスフェクション混合物は好ましくは、脂質成分としてＤＯＰＥおよびＤＯＴＭＡ（リポフェクチン）の等モル混合物、組み合わせた細胞表面受容体結合性成分／核酸結合性成分として［Ｋ］１６−ペプチドを含む。リポフェクチン：オリゴリシン−ペプチドの好ましいモル比は０．７５：４である。
【００８４】
本発明は更に、
（ｉ）核酸、
（ｉｉｉ）ポリカチオン性核酸結合性成分、および
（ｉｖ）上に記したペプチドを含む細胞表面受容体結合性成分を含む非ウイルス性トランスフェクション複合体を提供する。
【００８５】
細胞表面受容体結合性成分は本発明のペプチドに関して上に記載した特徴を有し得る。核酸成分およびポリカチオン性核酸結合性成分は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む非ウイル性トランスフェクション複合体に関して上に記載した通りでよい。
【００８６】
推定の細胞表面受容体結合性成分およびポリカチオン性ＤＮＡ結合性およびＲＮＡ結合性成分は上に記載した方法を用いて容易に決定し得る。
【００８７】
トランスフェクションベクターとして上に記載したトランスフェクション複合体を用いるトランスフェクションの効率は、細胞表面受容体結合性成分：ポリカチオン性核酸結合性成分：ＤＮＡまたはＲＮＡの比によって影響される。トランスフェクトすべきいずれかの特定の型の細胞に対する、成分のいずれかの選ばれた組合せについて、最適の比は、異った割合の成分を混合し、例えば上記のようにその細胞タイプに対するトランスフェクション比を測定することによって簡単に決定できる。
【００８８】
本発明のペプチドを導入したトランスフェクションベクター複合体によりトランフェクトされる細胞は、例えば内皮および上皮細胞、例えば気管支および肺を含む気道の上皮のいずれかの部分および角膜内皮の細胞を含む。気道上皮はのう胞繊維症およびゼンソクに対する遺伝子治療の重要な標的である。
【００８９】
上に記載したトランスフェクションベクター複合体は成分：（ｉ），（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を混合することにより製造し得る。
【００９０】
成分はいずれの順序で混合してもよいが、成分を次の順序で混合することが一般的に好ましい：組合わされた細胞表面受容体結合性／ポリカチオン性ＤＮＡ−結合性またはＲＮＡ結合性成分：ＤＮＡまたはＲＮＡ成分，例えば以下の順序：ポリエチレンイミン−ペプチド成分；ＤＮＡまたはＲＮＡ成分。
【００９１】
細胞表面受容体結合性成分およびポリカチオン性核酸結合性成分を含むトランフェクション混合物を用いて、核酸を混合物に導入することにより例えば混合により上記のように核酸含有トランスフェクションベクター複合体を製造してもよい。或いは、トランフェクション混合物を、核酸の代りに、いずれかの他の成分、ヒトまたは非ヒト動物の治療的または予防的免疫化のための、またはヒトまたは非ヒト動物のアンチセンス治療のための、遺伝子の欠陥および／または欠如を含むベクター複合体の製造のために用い得る。
【００９２】
非ヒト動物は、例えば哺乳動物、鳥または魚であり、特に商業的に飼われる動物である。
【００９３】
ベクター複合体中の核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡは、例えば遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種接種またはアンチセンス治療についての意図された使用に適している。ＤＮＡまたはＲＮＡ、および従ってベクター複合体は意図する目的に有効な量を投与する。
【００９４】
上に記載した処置および使用は、それぞれのベクター複合体、薬剤または医薬を適当な方法で投与することにより行われ、例えば気道上皮の場合には投与は局所的でもよい。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は核酸を含む本発明の受容体を標的にしたベクター複合体を含むキットを提供する。
【００９６】
本発明は次のものを含むキットをも提供する：（ａ）細胞表面受容体結合性成分；（ｂ）ポリカチオン性核酸結合性成分；および（ｃ）脂質成分。そのようなキットは更に（ｄ）核酸を含み得る。そのような核酸は一本鎖または二本鎖であり得、プラスミドまたは人工染色体でもよい。核酸成分は核酸の発現に適したベクター複合体により提供され得、ベクター複合体は空か、核酸を含む。インビトロ目的には核酸はリポーター遺伝子でもよい。インビボの治療目的には核酸は補正または補充を行うに適したＤＮＡを含む。そのようなＤＮＡは、いずれかの適当な調節因子を含む遺伝子であり得、またはそれは相同性組換え配列を有する核酸である。ペプチド／ＤＮＡ／脂質／ポリカチオン性核酸結合性成分複合体は塩を含まない緩衝液（例えば水、または５％デキストローズ）中で特に安定であることが見出された。
【００９７】
本発明は以下のものを含むキットをも提供する：（ａ）細胞表面受容体結合性成分；および（ｂ）ポリカチオン性核酸結合性成分。そのようなキットは更に（ｄ）核酸を含み得る。そのような核酸は一本鎖または二本鎖であり得、プラスミドまたは人工染色体であり得る。核酸成分は核酸の発現に適したベクター複合体により提供され得、ベクター複合体は空であるか、または核酸を含む。インビトロ目的のためには核酸はリポーター遺伝子であり得る。インビボ治療目的のためには、核酸は補正または補充が行われるに適したＤＮＡを含み得る。そのようなＤＮＡはいずれかの適当な調節因子を含む遺伝子であるか、またはホモロガスな組換え配列を有する核酸であり得る。ペプチド／ＤＮＡ／ポリカチオン性核酸結合性成分の複合体は塩を含まない緩衝液（例えば水、または５％デキストローズ）中で特に安定である。
【００９８】
成分（ａ）〜（ｄ）のキットは、例えば細胞表面受容体を標的にするトランスフェクションベクター複合体、または上記の混合物に関して上に記載した通りである。
【００９９】
キットは一般に指示を含み、指示は好ましくは、成分の好ましい割合、および成分の使用または混合の好ましい順序を示す。キットは遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、またはアンチセンス治療に用い得る。或いはそれは宿主細胞を商業的に有用なタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトするため、すなわちいわゆる「細胞工場」を製造するため用い得る。
【０１００】
本発明のキットにおいて、好ましい成分を含むキットは、例えば本発明のベクター複合体に関して上に述べた通りである。
【０１０１】
ポリカチオン性核酸結合性成分は好ましくは上述のようにオリゴリシンである。脂質成分は好ましくはカチオン性リポソームを形成でき、好ましくはＤＯＰＥおよび／またはＤＯＴＭＡ、好ましくは等モルのそれらの混合物であるか、またはそれを含み、またはＤＯＳＰＡであるかＤＯＳＰＡを含み、例えばＤＯＰＥおよびＤＯＳＰＡの混合物、例えばＤＯＰＥ：ＤＯＳＰＡ＝１：３の重量比であるか、またはそれを含む。成分間の割合は、成分の混合順序と同様、好ましくは上述の通りである。
【０１０２】
遺伝子治療の標的はよく知られており、単一遺伝子障害、例えばのう胞繊維症、様々なガン、および感染、例えばウイルス感染、例えばＨＩＶを含む。例えばｐ５３遺伝子でのトランスフェクションはガン治療に大きい可能性を与える。遺伝子ワクチン接種の標的もよく知られており、天然源に由来するワクチンがヒト使用のためにあまりに危険であり、組換えワクチンが必しも有効でない、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびヘルペスシンプレックスウイルスについての病原体に対するワクチン接種を含む。アンチセンス治療の標的も知られている。遺伝子治療およびアンチセンス治療の更なる標的は、病気の遺伝的基礎についての知識が増加するにつれ、遺伝子ワクチン接種の更なる標的と同様に提案されつつある。本発明はトランスフェクション効率、したがって治療の効力を高める。
【０１０３】
本発明のベクター複合体は非常に大きいＤＮＡ分子、例えば１２５ｋｂより大きＤＮＡの細胞内輸送に有効であり得る。それは従来のベクターを用いて特に困難である。これは人工染色体の細胞への導入を可能にする。
【０１０４】
気道、例えば気管支上皮のトランスフェクションは、例えばのう胞繊維症、肺気腫、喘息、肺繊維症、肺高血圧および肺ガン等の呼吸病の遺伝子治療に有用性を証明する。
【０１０５】
のう胞性繊維症（ＣＦ）はコーカシア人における最も一般的な単遺伝子病である。病的状態は主に肺の病気と主に関連する。ＣＦはのう胞性繊維症膜貫通コンダクタンスレギュラータンパク質（ＣＦＴＲ）、塩素イオンの分泌を媒介する細胞膜チャンネル、をコードする遺伝子の変異により起される。ＣＦＴＲ遺伝子移転による気管支細胞の欠陥の是正は、生化学的な輸送の欠陥、したがって肺の病気を是正するであろう。現在までの臨床的な試みは勇気づけるデータを生み出しているが、より有効な非毒性のベクターの必要性を強調する。
【０１０６】
トランフェクションのレベルの向上は、本発明の方法を、いわゆる「細胞工場」と呼ばれる、所望のタンパク質を製造することができる宿主細胞の製造に特に適せしめる。長期間の製造のため、導入された核酸が宿主細胞のゲノムに導入されるか、またはさもなくば安定に維持されることが望ましい。それは容易に確めることができる。上に示したように、この方法で製造されるタンパク質の範囲は、科学的および産業的使用のための酵素、治療および予防における使用のためのタンパク質、ワクチンにおける使用のための免疫原および診断における使用のための抗原を含み、広い。
【０１０７】
従って、本発明は、病気についての組織モデルにおいて薬剤を試験する方法を提供し、組織モデルは、細胞を、核酸を含む本発明の受容体標的化ベクター複合体と接触させることにより、細胞を核酸でトランスフェクトすることにより得られるトランスジェニック細胞を含む。
【０１０８】
本発明は、高い効率のトランスフェクションの可能な受容体標的ベクター複合体の場合、特に有用である。好ましい態様においてベクター複合体は４つのモジュール要素を含む；オリゴリシン、特に［Ｋ］１６、ＤＮＡ結合性またはＲＮＡ結合性要素；高親和性細胞表面受容体結合性ペプチド、例えば本明細書に記載したペプチド；、場合によりプラスミド中の、そして場合によりウイルスプロモーターおよびエンハンシング要素により制御されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列；カチオン性リポソームＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（リポフェリン）。オリゴリシン−ペプチド／ＤＮＡまたはＲＮＡ複合体の、カチオン性リポソーム処方ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥとの組合せは強力な組合せである。或いは、ＤＯＰＥ／ＤＯＳＰＡ処方を、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ処方の代りに、或いは共に用いてもよい。複合体形成に関連する変数の最適化、およびＬＩＤベクター複合体によるトランスフェクションの様式が証明された。
【０１０９】
最適ＬＩＤトランスフェクション複合体の形成における最も重要な変数は３つの成分の比、およびそれらの混合の順序のようである。
【０１１０】
本発明は更に、非ウイルス性トランスフェクションベクター複合体における使用のため  の細胞表面受容体リガンドを同定する方法を提供し、その方法は以下の工程：
ａ）ファ  ージを問題の細胞と接触させ、非結合性のファージを洗浄して除去し、次に結合したフ  ァージ粒子を抽出することによって問題の細胞に対する結合親和性に従ってファージペ  プチドライブラリーからファージを選択し、
ｂ）必要なら工程（ａ）を繰り返し、そして好ましくは
ｃ）工程ａ）およびｂ）で得たファージから、問題の細胞に高親和力で結合するファージ  を全細胞ＥＬＩＳＡを用いて選択する、
工程を含む。
【０１１１】
好ましくは工程ａ）における洗浄のストリンジェンシーは、多数回の洗浄による低いｐＨでの洗浄による第１ラウンドの選択後、増加させる。
【０１１２】
次の非限定的実施例は本発明を説明する。
実施例
【０１１３】
材料および方法
実施例１
【０１１４】
ペプチドライブラリー
本研究で用いたペプチドライブラリー、Ｃ７Ｃ、はＮew  Ｅngland  Ｂiolabs  Ｉncから得た。ファージ生長、滴定および増幅過程は製造者のハンドブックに記載のように行った。そのライブラリーは長さで７残基のランダムなペプチド配列からなり、シスチン残基に隣接させ、空気中での酸化により環化を可能にした。そのライブラリーは少なくとも１×１０９の異なるアミノ酸配列を含むらしい。
【０１１５】
ライブラリーからファージの選択
ＨＡＥ細胞を２４ウェルプレート中で集密まで増殖させた。用いたＨＡＥ細胞はカルホルニア大学、サンフランシスコのディエーター・グルエナート博士（現ベルモント大学）からの贈り物として得た１ＨＡＥｏ細胞であった。細胞をＴris緩衝食塩水、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）で２度洗浄した後、４℃で３０分間、ウェル当り２ｍｌの２％マーベル、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＴＢＳで細胞をブロックした。ブロッカーを除き、２×１０１１のファージを１ｍｌの２％マーベル、５％ＢＡＳ−ＴＢＳに加えた。そのファージを２時間振とうにより結合させた後、５回２％ＢＳＡ−ＴＢＳ洗浄し、４℃で５分振とうし、その後数秒間２％のＢＳＡ−ＴＢＳでさらに５回洗浄した。４℃で振とうしながら１０分間ウェルに４００μｌの７６ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ２．５を添加して溶出させた。溶出液を除去し、６００μｌの１Ｍ  Ｔris緩衝液ｐＨ７．５で中和し、溶出した画分として保持した。残った細胞を１ｍｌの３０ｍＭ  Ｔris緩衝液ｐＨ８．０，１ｍＭのＥＤＴＡで１時間氷上で溶菌した。細胞をプレートから捨て、溶出液をミクロ遠心管に移し、短く渦巻した。その溶出液は細胞関連画分として保持した。
【０１１６】
上に記載した方法を３回繰り返した。第２および第３ラウンドにおいて、選択のストリンジェンシーを前選択工程の導入により、プラスチックまたは培地中の成分に結合するファージを除去することにより、およびファージ結合後の洗滌の数を増加させることにより増加させた。各溶出液に存在するファージの数（プラーク形成単位，ＰＦＵで）を図１に示す。
【０１１７】
全細胞ＨＡＥ細胞ＥＬＩＳＡ
組織培養ＨＡＥ細胞へのファージの結合を、全細胞ＥＬＩＳＡにより研究した。１００ｍｌのＨanks  Ｂalanced  Ｓalt  Ｓolution（ＨＢＳＳ）中の約８×１０４ＨＡＥ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、細胞が付着するまで３７℃でインキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中でおだやかに洗い、３０分間ＨＢＳＳ中の０．５％ＢＳＡの添加によりブロッキングした。ブロッカー溶液中の１×１０１０のファージ粒子を各ウェルに加え、室温で４０分間結合させた。結合していないファージを、ＨＢＳＳで２回洗うことにより除き、結合したファージを３．７％パラホルムアルデヒド中で１０分インキュベートすることにより細胞に固定した。細胞をＰＢＳ中で洗い、ブロッキング緩衝液中で４５分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗った。結合したファージは、１時間ブロッキング緩衝液中で１：５０００に希釈した、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体の添加により検出した後、ＰＢＳで３回洗い、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）基質溶液でＥＬＩＳＡを発色させ、４０５ｎｍでのプレートリーディング分光光度計における吸光度を読んだ。実験を３Ｔ３細胞を用いて繰返し、空のウェルを用い、結合親和性を比較することでＨＡＥ細胞に選択的に結合するファージの同定を可能にした。選択したペプチドについての結果を図２に示す。
【０１１８】
高いＨＡＥ細胞親和力および特異性を示した１２のファージクローンのペプチドをコードするＤＮＡを配列決定し、ペプチド配列を推定した。推定した配列を表１に示す。３つの主要ペプチドモチーフ、ＫＳＭ／ＲＳＭ，ＬＸＨＫおよびＬＸＨＫＳＭＰを、１２配列および他の３つのモチーフのいずれをも含まない１の配列、ＰＳＧＡＡＲＡの間で同定した。その配列を比較し、ファージ力価の範囲を用いてＥＬＩＳＡによりそれらの結合力についてランクづけた（表３）。配列ＬＰＨＫＳＭＰ（ペプチドＰ）が最も高い結合アフィニティを有することが見出された。この配列および密接に関連したペプチドＬＱＨＫＳＭＰ（ペプチドＱ）および対照ペプチドＰのスクランブルバージョンをトランスフェクショク実験のため選択した。
【０１１９】
ペプチド合成
次のオリゴリシン−ペプチドをトランスフェクション実験のために製造した。
Peptide P： [K]16−GACLPHKSMPCG − HAE細胞に結合
Peptide Q： [K]16−GACLQHKSMPCG − HAE細胞に結合
Peptide S： [K]16−GACYKHPGFLCG − 非結合性対照
Peptede 12： [K]16−XSXGACRRETAWACG − α５β１インテグリンに結合
（Ｘ＝ε−アミノヘキサン酸）
K16：ＤＮＡ結合部分、標的リガンドなし
【０１２０】
オリコリシン−ペプチドは標準的な固相オリゴペプチド合成方法を用いて合成した。
【０１２１】
トランスフェクション実験
望ましい細胞結合の特徴を示すファージから同定したペプチドを標準的な固相ペプチド合成化学を用いて合成し、１６のリシンの尾を標準的な方法で付けた。標的ペプチドＰと同じアミノ酸組成よりなるがランダムな順序である、対照ペプチド（Ｓ）はリポポリプレックス製剤への導入のため合成した。ＨＡＥおよび３Ｔ３細胞のトランスフェクションは、２４時間前にプレートした２０，０００の細胞を含む９６ウェルプレート中で行った。トランスフェクション複合体中で、ＤＮＡ電荷に対するペプチドの割合（＋／−）は、１．５：１、３：１および７：１で用いた。脂質成分は、ＤＮＡに対して重量で一定割合０．７５：１に維持した。トランスフェクション複合体を作る前に、脂質成分を１５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ペプチドは０．１ｍｇ／ｍｌ、ＤＮＡは２０μｇ／ｍｌで調製した。すべての希釈はＯptiＭＥＭレデュースド血清組織培養培地（Ｌife  Ｔechnologies）で行った。トランスフェクション複合体を、成分を、１）脂質、次に２）ペプチド、そして最後に３）ＤＮＡの順序で混合することにより作り、次にα２５μｇＤＮＡ／２００μｌのＤＮＡ成分に対応する濃度までＯptiＭＥＭで希釈し、その容積を各ウェルに加えた。各群は６レプリケートで行った。そのベクター複合体懸濁液を次に調製の５分以内に細胞に適用した。トランスフェクションインキュベーションは３７℃で４時間行った。細胞を含まない抽出物中でのルシフェラーゼリポーター遺伝子検定を、Ｐromegaのキットを用いて、製造者のプロトコールに従って４８時間のインキュベーション後行った。光単位を各抽出以内のタンパク質濃度まで標準化した。トランスフェクション実験の結果を図３に示す。
【０１２２】
７：１の電荷比で、ペプチドＰを含む複合体のトランスフェクション効率は、次に良いペプチド、３：１の比のペプチドＤより５倍高かった。ペプチドＰは電荷比７：１でペプチドＳより１５０倍よく、トランスフェクション効率は受容体特異的であることを示す。ペプチドＰを含む複合体はＫ１０よりほとんど９倍高く、再び受容体特異性を示す。この結果は、ペプチドＳはペプチドＫ１６と同様にトランスフェクション複合体において１０分の１より小さいことを示唆する。これはペプチドＳにおけるスクランブルされたモチーフにより立体障害により説明し得る。
【０１２３】
ペプチドＰとＱの間のトランスフェクション挙動の違いは、ペプチドＱ（ＬＱＨＫＳＭＰ）は１つのアミノ酸残基だけＰから変化するので予想外であった。この結果は結合性質のみではペプチドのトランスフェクション能力を説明するのに十分でないことを示唆する。これらの結果は、ＬＩＤベクター複合体システムは本明細書に記載した他の特異的ペプチドに再標的化され、インビボおよびインビトロでの上皮細胞への標的化遺伝子運搬に有用であることをも示唆する。
実施例２
【０１２４】
実施例２は実施例１の類似の実験シリーズで、多くの条件の比較的小さい変化がある。
【０１２５】
細胞ライン
ヒト気道上皮細胞ライン（ＨＡＥｏ−）を、１０％胎児子牛血清（ＦＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン、並びにグルタミン酸を含むＥagleの最小必須培地（ＭＥＭ）ＨＥＰＥＳ改変（Ｓigma，Ｐoole）の中に保持した。マウス線維芽細胞ライン３７３およびヒト神経芽腫細胞ラインＩＭＲ３２を、グルタマックス−１を有し、ピルビン酸ナトリウムを有せず、４５００ｍｇ／Ｌグルコースを有し、ピリドキシン（Ｇibco  ＢＲＬ）、１０％ＦＣＳを有し、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤulbecco's  ＭＥＭ中で増殖させた。Ｎeuro−２Ａ細胞をグルタマックス−１（Ｇibco  ＢＲＬ）、１０％ＦＣＳ、ピルピン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸をＤulbecco's  ＭＥＭ中に保持した。
【０１２６】
単層のパニング細胞
ＨＡＥｏ−細胞を２４ウェルプレート中で集密まで増殖させた。細胞をＴＢＳ中で２度洗った後、細胞を４℃で３０分間ウェル当り２ｍｌの２％Ｍarrel，５％ＢＳＡ−ＴＢＳでブロックした。ブロッカーを除去し、２×１０１１のファージを１ｍｌの２％Ｍarvel、５％ＢＳＡ−ＴＢＳに加えた。ファージを４℃で２時間振とうしながら結合させた後、４℃で振とうしながら５分間２％ＢＳＡ−ＴＢＳで５回洗浄した後、２％ＢＳＡ−ＴＢＳでわずか数秒間さらに５回洗浄した。４００μｌの７６ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ２．５をウェルに加え、４℃で１０分間振とうすることによってファージを溶出させた。溶出液を除去し、残った細胞を１ｍｌの３０ｍＭ  Ｔris  ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡで１時間、氷上で溶菌した。細胞をプレートから捨て、溶出液をエッペンドルフに移し、短時間渦巻かせた。この溶出液を細胞関連画分として取っておいた。この溶出液からのファージを、プラーク形成単位（ＰＦＶ）として、ＮＥＢによるライブラリーで提供される文献に記載のように滴定した後、文献に記載のようにＥ．coli  ＥＲ２７３８細胞中でファージを増殖させた。パニングの第２ラウンドのために、前のラウンドからの増殖させたファージの２×１０１１をインプットファージとして用いた。しかしながら、単離された塑性でブロッキング分子結合性ファージの数を減少させるために、ファージを細胞のないブロックされたウェルに３０分間、４℃で添加する４つの前選択を行った後、ファージをＨＡＥｏ細胞に加えた。１ｍｌの７６ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ３．５を用いて４℃で１０分洗浄の添加による第２および第３ラウンドにおいて洗浄のストリンジェンシーも増加させた。第３ラウンドのために、第２ラウンドからの２×１０１１の増幅したファージを３０分間細胞を含まない５のブロックされたウェル中で前選択した後、４℃で１時間１ウェルで行った。ファージ結合および溶出は第２ラウンドについて記載した通りである。第３ラウンドの溶出液の滴定後、単一ウェルの単離プラークを取り、増幅させ、配列決定および全細胞ＥＬＩＳＡによるクローン結合キャラクタリゼーションのために精製した。
【０１２７】
ファージ配列決定
ファージを小スケールのＰＥＧ生産物から精製し（供給者の方法を参照）、一本鎖ファージＤＮＡを、Ｂrian  Ｋ．Ｋay，Ｊill  ＷinterおよびＪohn  ＭcＣaffertyにより編集されたＰhage  display  of  Ｐeptides  and  Ｐroteinsに記載の方法を用いて配列決定のために調製した。簡単にいうと、タンパク質のコートを、フェノール・クロロホルム抽出により試料から除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿によりペレットにした。微量の塩を氷冷７０％エタノールでペレットから洗浄した後、ＤＮＡをＴＥ中に再懸濁した。
【０１２８】
ライブラリーで供給される−９６プライマー（5'-CCCTCATTAGCGTAACG-3'）を用いるＢig  Ｄyeターミネーターサイクル配列決定反応（ＡＢＩ）に５０〜１００ｎｇの精製したＤＮＡを用い、Ｂig  Ｄyeキットの指示に記載のようにエタノール沈殿によりローディングのために精製した。試料をＡＢＩ３７７シークエンサーにかけ、結果をＶectorＮＴＩプログラムを用いた分析した。
【０１２９】
全細胞ＥＬＩＳＡ
１００ｍｌのＨＢＳＳ中の約８×１０４ＨＡＥ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞が接着するまで、３７℃でインキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中でおだやかに洗浄した後、３０分間ＨＢＳＳ中の０．５％ＢＳＡの添加によりブロックした。ブロックカー中の１×１０１０ファージ粒子を各ウェルに添加し、室温で４０分結合させた。結合しなかったファージをＨＢＳＳで２度洗浄することにより除去し、結合ファージを３．７％のパラホルムアルデヒド中で１０分間インキュベートすることにより細胞に固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ブロッキング緩衝液中で４５分インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージは、ブロッキング緩衝液中で１時間、１：５０００に希釈したＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体の添加により検出した後、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＡＢＴＳ溶液でＥＬＩＳＡを発色させ、４０５ｎｍでの吸収を読んだ。
【０１３０】
環化したペプチドの［Ｋ]１６形（表６に示すように）を、Ａlta  Ｂiosciences，ＢirminghamおよびＴhe  Ｄepartment  of  Ｃhemistry，ＶＣＬにより、標準的な固相合成により合成した。
【表９】
0004430305.tif 000010
【０１３１】
疑問を避けるために表５の配列のすべては本明細書の一部を構成する。
【０１３２】
トランスフェクション
リポポリプレックス形成
次の成分を次の順序で加えることにより、試験管中で複合体を静電的に形成させた。５０μｌのリポフェクチン（Ｌife  Ｔechnologies  Ｌtd）をＯptiＭＥＭ中で３０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈、７０μｌのペプチド（複合体中のペプチド：ＤＮＡ電荷の最適化のためにＯptiＭＥＭ中でさまざまな濃度で）、５０μｌのルシフェラーゼリポータープラスミドｐＣＩＬｕｃを最後に加えたＯptimem中４０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。複合体を短くピペッティングすることに混合した後、Ｏptimem中で最終容積１．５７ｍｌまで希釈した。
【０１３３】
トランスフェクション
９６ウェルプレート中で一晩２×１０４細胞／ウェルでプレートした半集密ＨＡＥｏ細胞から培地を除去し、２００μｌの複合体（約０．２５ｎｇのプラスミドＤＮＡ）を各ウェルに加え、複合体を作り、細胞に加える最小の時間を残した。すべてのトランスフェクションはそれぞれ６ウェル中で行った。細胞を複合体と共に４時間インキュベートした後、４８時間正常培地で置換え、その後リポーター遺伝子発現をルシフェラーゼ検定（Ｐromega）により分析した。
【０１３４】
ルシフェラーゼ試験
細胞をＰＢＳで２度濯いだ後、１００μｌのリポーター溶解緩衝液（Ｐregma、ｄＨ２Ｏ中５中１に希釈）を細胞に２０分の間４℃で加えた後、凍結−解凍を行った。２０μｌの溶解物を白色プレートに移し、ルシフェラーゼを１００μｌの試薬の添加後、ルシルルミノメーターで測定した。
【０１３５】
各トランスフェクションウエル中に存在するタンパク質をＢio−Ｒadタンパク質試験試薬（Ｂradford  assayに基く）を用い、５中１に希釈した試薬２００μｌにルシフェラーゼテストから２０μｌを加え、室温で１０分インキュベートし、５９０ｎｍでの吸収を読むことにより計算した。ウェル当り存在する全タンパク質はＢＳＡ標準の範囲での比較から計算した。
【０１３６】
トランスフェクション実験の結果を図４に示す。ファージ由来ペプチドおよびそのスクランブル対照によるＨＡＥｏ細胞のトランスフェクションは１．５：１、３：１および７：１を含むペプチド：ＤＮＡ電荷比の範囲で行った。各ペプチドについて最高トランスフェクション効率（ＲＬＵとして測定）を与える比を図中に示した。対照はトランスフェクション複合体を有さない（ＯptiＭＥＭのみ）細胞、およびペプチド６、インテグリン結合ペプチドを有する細胞を含む。各結果は６の値の平均であり、誤差の棒は平均についての標準偏差である。
実施例３
【０１３７】
上述のトランスフェクション実験を、Ｎeuro−２Ａ細胞、ＩＭＲ３２細胞、ラビット外膜繊維芽細胞および３Ｔ３細胞を用いて繰り返した。これらの細胞ラインのトランスフェクションの分析のために、細胞を一晩サブ集密までプレートした後、上と同じ方法でトランスフェクトし、２４時間後のリポーター遺伝子の発現を分析した。結果を図５〜８に示す。
【０１３８】
ファージ由来ペプチドによるＮeuro−２Ａ細胞のトランスフェクションは、１．５：１、３：１および７：１を含むペプチド：ＤＮＡ電荷比の範囲で行った。各ペプチドについて最高のトランスフェクション効率（ＲＬＵ／ｍｇとして測定）を与える比を図５に示す。対照はトランスフェクション複合体を有さない（ＯptiＭＥＭのみ）ペプチド６、インテグリン結合ペプチド、ペプチドＳ、ペプチドＹのスランブルバージョンを含む細胞を含む。各結果６の値の平均であり、誤差の棒は平均についての標準偏差である。
【０１３９】
ファージ由来のペプチドによるＩＭＲ３２細胞のトランスフェクションは１．５：１、３：１および７：１を含むペプチド：ＤＮＡ電荷比の範囲で行った。各ペプチドについて最大のトランスフェクション効率（ＲＬＶ／ｍｇとして測定）を与える比を図６に示す。対照はトランスフェクション複合体を有さない（ＯptiＭＥＭのみ）細胞、細胞６、インテグリン結合ペプチド、ペプチドＳ、ペプチドＹのスクランブルバージョンを含む。各結果は６つの値の平均であり、誤差の棒は平均についての標準偏差である。
【０１４０】
ファージ由来ペプチドによるラビット外膜細胞のトランスフェクションは、１．５：１、３：１および７：１を含むペプチド：ＤＮＡ電荷比の範囲で行った。各ペプチドについて最高のトランスフェクション効率（ＲＬＵ／ｍｇとして測定）を与える割合は図７に示す。対照はトランスフェクション複合体を加えない（ＯptiＭＥＭのみ）ペプチド６、インテグリン結合ペプチド、ペプチドＳ、ペプチドＹのスクランブルバージョンを含む細胞を含む。各結果は６つの値の平均であり、誤差の棒は平均についての標準偏差である。
【０１４１】
ファージ由来のペプチドによる３Ｔ３細胞のトランスフェクションは、１．５：１、３：１および７：１を含むペプチド：ＤＮＡ電荷比の範囲で行った。各ペプチドについて最高のトランスフェクション効率（ＲＬＵ／ｍｇとして測定）を与える比を図８に示す。対照はトランスフェクション複合体を添加しない（ＯptiＭＥＭのみ）ペプチド６、インテグリン結合ペプチド、ペプチドＳ、ペプチドＹのスクランブルバージョンを含む細胞を含む。各結果は６つの値の平均であり、誤差の棒は平均についての標準偏差である。
【０１４２】
Ｎeuro２Ａ細胞、ＩＭＲ３２細胞、ラビット外膜繊維芽細胞のペプチドによるトランスフェクションは、ペプチド６によるトランスフェクションと同様の効率か又は低いことが図５、６および７からわかる。３Ｔ３細胞（図８）においてのみ、ペプチド６について見られる以上のトランスフェクション効率が、ペプチドＱおよびＥについてあり、ペプチド６について見られるものより約１．５倍の効率を示す。すべてのトランスフェクションはスクランブルペプチドのそれ以上の効率を示した。これらの結果は、ペプチドにより結合した分子は他の細胞タイプおよび他の種に存在するが、ＨＡＥｏ細胞に比べて別の形でまたは異なる密度で存在することを示唆するかも知れない。
【０１４３】
文献
【表１０】
0004430305.tif 000011
【表１１】
0004430305.tif 000012
【表１２】
0004430305.tif 000013
【表１３】
0004430305.tif 000014
【表１４】
0004430305.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】Ｃ７Ｃライブラリーおよび１２２−ペプチドライブラリー出発物質についての連続的な選択ラウンドにおけるＨＡＥ細胞に対するファージ結合の増加を示す。
【図２】全細胞ＥＬＩＳＡ試験における個々のファージクローンの結合特異性を示す。ＨＡＥ細胞に対する、３Ｔ３対照細胞に対する、およびＥＬＩＳＡプレートに対する結合親和性を示す。
【図３】本発明によるトランスフェクション複合体により達成されるＨＡＥ細胞のトランスフェクション効率の比を示す。
【図４】本発明によるトランスフェクション複合体およびスクランブル対照ペプチドにより達成されるＨＡＥ細胞のトランスフェクションの効率の比を示す。
【図５】本発明によるトランスフェクション複合体および対照ペプチド、対照ペプチド６により達成されるＮeuro−２Ａ細胞のトランスフェクションの効率の比を示す。
【図６】本発明のトランスフェクション複合体と対照ペプチド、対照ペプチド６により達成されたＩＭＲ３２細胞のトランスフェクション効率の比を示す。
【図７】本発明のトランスフェクション複合体およびコントロールペプチド、ペプチド６により達成されるラビット外膜細胞のトランスフェクションの効率の比を示す。
【図８】本発明のトランスフェクション複合体と対照ペプチド、ペプチド６により達成される３Ｔ３細胞のトランスフェクションの効率の比を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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