(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程ａ）〜ｅ）：
ａ）精製されるべき因子VIIIポリペプチドを含有する混合物を、疎水的引力によりＦVIIIポリペプチドと結合する免疫アフィニティーマトリックスに添加し；
ｂ）因子VIIIポリペプチドの脱離を引き起こす脱離溶液を用いて免疫アフィニティーマトリックスから因子VIIIポリペプチドを溶離させ（因子VIIIポリペプチドは溶離溶液中に遊離される）；
ｃ）溶離溶液よりも高いイオン強度を含む溶液で溶離溶液を希釈して、希釈された因子VIII溶液を得て；
ｄ）希釈された因子VIII溶液を、因子VIIIポリペプチドと結合しうるイオン交換カラムに通し、そのことにより因子VIIIポリペプチドを結合させる一方で、混入物質がイオン交換カラムを通過するようにし；次いで
ｅ）精製された因子VIIIポリペプチドをイオン交換カラムから溶離させる
ことを含む、因子VIIIポリペプチドを精製するための改良された方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の脱離溶液が塩を含まず、工程（ｃ）の希釈が７ないし２０ｍＭのＮａＣｌを含む溶液を用いて行われる請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の脱離溶液が塩を含まず、工程（ｃ）の希釈が１５ｍＭのＮａＣｌを含む溶液を用いて行われる請求項１の方法。
【請求項４】
脱離溶液が３倍ないし５倍に希釈される請求項３の方法。
【請求項５】
脱離溶液が３倍に希釈される請求項３の方法。
【請求項６】
工程ａ）〜ｅ）
ａ）精製されるべき因子VIIIポリペプチドを含有する混合物を、疎水的引力によりＦVIIIポリペプチドと結合する免疫アフィニティーマトリックスに添加し；
ｂ）因子VIIIポリペプチドの脱離を引き起こす脱離溶液（該脱離溶液は無極性薬剤を含む）を用いて免疫アフィニティーマトリックスから因子VIIIポリペプチドを溶離させ（因子VIIIポリペプチドは溶離溶液中に遊離される）；
ｃ）溶離溶液よりも低濃度の無極性薬剤を含む溶液で溶離溶液を希釈して、希釈された因子VIII溶液を得て；
ｄ）希釈された因子VIII溶液を、因子VIIIポリペプチドと結合しうるイオン交換カラムに通し、そのことにより因子VIIIポリペプチドを結合させる一方で、混入物質がイオン交換カラムを通過するようにし；次いで
ｅ）精製された因子VIIIポリペプチドをイオン交換カラムから溶離させる
ことを含む、因子VIIIポリペプチドを精製するための改良された方法。
【請求項７】
工程（ｂ）の脱離溶液が５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含み、工程（ｃ）の希釈が５０％（ｖ／ｖ）未満のエチレングリコールを含む溶液を用いて行われ、その結果、エチレングリコールの最終濃度が１７％（ｖ／ｖ）ないし３３％（ｖ／ｖ）となる請求項６の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）の脱離溶液が５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含み、工程（ｃ）の希釈がエチレングリコールを含まない溶液を用いて行われ、その結果、エチレングリコールの最終濃度が１７％（ｖ／ｖ）ないし３３％（ｖ／ｖ）となる請求項６の方法。
【請求項９】
溶離溶液が１．５倍ないし３倍に希釈される請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、前凝固剤蛋白（procoagulant proteins）を精製するための改良された方法、詳細には、因子VIIIおよび関連蛋白の組み換え生産に関する。
【０００２】
発明の背景
血友病は、数百年にわたり知られている遺伝病であるが、種々の形態（血友病Ａおよび血友病Ｂ）に分類できるようになったのはこの数十年においてである。血友病Ａは、生物学的に活性のある凝固因子VIII（通常は血漿に存在する）の非常に低下したレベルまたは不存在により引き起こされる。
最近まで、治療因子VIII濃縮物が血漿を分画することにより製造されていた。しかしながら、近年、ヒト凝固コファクターである、因子VIII：Ｃ（ＦVIII）をコードするＤＮＡ配列（例えば、Toole et al, 1984, Nature 312: 312-317; Wood et al, 1984, Nature 312: 330-337; Vehar et al, 1984, Nature 312: 337-342参照）ならびにそれらを発現させて組み換えＦVIIIを製造する方法（例えば、Toole,米国特許第４７５７００６号；WO87/04187、WO88/08035およびWO88/03558参照）が当該分野において知られるようになった。ＦVIII蛋白の活性変異体およびアナログ、ならびにそれらをコードするＤＮＡ配列も報告されている（例えば、Toole,米国特許第４８６８１１２号；EP 0 786 474; WO86/06101およびWO87/07144参照）。一般的には、Ｂドメインの一部または全部が消失するように、そして／あるいは特定アミノ酸位置が修飾されるように（例えば、通常にはプロテアーゼ感受性である部位が、例えばスロンビンまたは活性化プロテインＣによる蛋白分解に耐性を有するように）、かかる変異体およびアナログは修飾されている。他のアナログは、１個またはそれ以上のリジンおよび／またはチロシン残基における修飾を含む。
【０００３】
驚くべきことに、ＢドメインがＦVIIIの前凝固剤活性に必須であり、ＦVIIIをコードするＤＮＡ（Ｂドメインの一部または全部をコードするヌクレオチド領域が欠けている）により活性前凝固剤蛋白が発現され分泌されうることが見出された。これらの変異体の活性蛋白が産生され分泌されるのみならず、全長ＤＮＡにより発現される場合よりも高レベルで培地中に蓄積する。培地中の活性前凝固剤ＦVIII蛋白の低下したレベルは、少なくとも一部には、いくつかの要因によるものとされている（例えば、WO87/04187、WO88/08035およびWO88/03558参照）。Toole et al., Exploration of Structure-Function Relationships in Human Factor VIII by Site-directed Mutagenesis, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 51: 543 (1986)において、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせにより組み換えＦVIIIを精製できることが報告された。米国特許第５４７０９５４号には、ＦVIIIを免疫アフィニティー精製から直接イオン交換カラムに通す類似方法が記載されている。当該文献において、溶離されるポリペプチド溶液のイオン強度を変化させることにより、モノクローナル抗体がＦVIIIポリペプチドおよび副精製物に結合したままである機会が増加すると述べられている。
【０００４】
発明の概要
本発明において、モノクローナル抗体カラムからの溶離物を希釈すると、収率の一定の向上が見られ、そして／あるいは精製されるべきＦVIII蛋白に対するモノクローナル抗体の混入が減少することが見出された。したがって、本発明は、ＦVIIIおよびその変異体を包含する前凝固剤蛋白を精製するための改良された方法を提供するものであり、ＦVIIIおよびその変異体を包含する前凝固剤蛋白を組換え法により高収率および／またはより均一な形態で製造することができる。
【０００５】
本発明は、細胞培養物からＦVIII蛋白を精製するための改良された方法を提供する。該方法により、現在用いられている方法よりも高純度のＦVIII蛋白が得られる。１の具体例において、本発明方法は、免疫アフィニティーカラムからの溶離物を、溶離物溶液よりも高いイオン強度の溶液で希釈することを含む。もう１つの具体例において、本発明方法は、免疫アフィニティーカラムからの溶離物を、溶離物溶液中に含まれるよりも少量のエチレングリコールを含む溶液で希釈することを含む。
【０００６】
発明の詳細な説明
したがって、本発明は、工程ａ）〜ｅ）：
ａ）精製されるべき因子VIIIポリペプチドを含有する混合物を、疎水的引力によりＦVIIIポリペプチドと結合する免疫アフィニティーマトリックスに添加し；
ｂ）因子VIIIポリペプチドの脱離を引き起こす脱離溶液を用いて免疫アフィニティーマトリックスから因子VIIIポリペプチドを溶離させ（因子VIIIポリペプチドは溶離溶液中に遊離される）；
ｃ）溶離溶液よりも高いイオン強度を含む溶液で溶離溶液を希釈して、希釈された因子VIII溶液を得て；
ｄ）希釈された因子VIII溶液を、因子VIIIポリペプチドと結合しうるイオン交換カラムに通し、そのことにより因子VIIIポリペプチドを結合させる一方で、混入物質がイオン交換カラムを通過するようにし；次いで
ｅ）精製された因子VIIIポリペプチドをイオン交換カラムから溶離させる
ことを含む、因子VIIIポリペプチドを精製するための改良された方法を提供する。
【０００７】
工程（ｂ）の脱離溶液は塩を含んでいなくてもよく、あるいは非常に少量の塩を含んでいてもよい。好ましくは、約５ないし約２０ｍＭのＮａＣｌ、最も好ましくは約５ないし約１５ｍＭのＮａＣｌを含む溶液を用いて工程（ｃ）の希釈を行う。好ましくは、溶離溶液を塩含有溶液で約３倍ないし約５倍に、最も好ましくは約３倍に希釈する。
【０００８】
もう１つの具体例において、本発明は、工程ａ）〜ｅ）
ａ）精製されるべき因子VIIIポリペプチドを含有する混合物を、疎水的引力によりＦVIIIポリペプチドと結合する免疫アフィニティーマトリックスに添加し；
ｂ）因子VIIIポリペプチドの脱離を引き起こす脱離溶液（該脱離溶液は無極性薬剤を含む）を用いて免疫アフィニティーマトリックスから因子VIIIポリペプチドを溶離させ（因子VIIIポリペプチドは溶離溶液中に遊離される）；
ｃ）溶離溶液よりも低濃度の無極性薬剤を含む溶液で溶離溶液を希釈して、希釈された因子VIII溶液を得て；
ｄ）希釈された因子VIII溶液を、因子VIIIポリペプチドと結合しうるイオン交換カラムに通し、そのことにより因子VIIIポリペプチドを結合させる一方で、混入物質がイオン交換カラムを通過するようにし；次いで
ｅ）精製された因子VIIIポリペプチドをイオン交換カラムから溶離させる
ことを含む、因子VIIIポリペプチドを精製するための改良された方法を包含する。
【０００９】
好ましくは、工程（ｂ）の脱離溶液はエチレングリコールを含み、より好ましくは約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含むのもであり、約５０％（ｖ／ｖ）未満のエチレングリコールを含む溶液を用いて工程（ｃ）を行って、エチレングリコールの最終濃度が約１７％（ｖ／ｖ）ないし３３％（ｖ／ｖ）となるようにする。好ましい具体例において、工程（ｂ）の脱離溶液は５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含み、エチレングリコールを含まない溶液を用いて工程（ｃ）の希釈を行って、エチレングリコールの最終濃度が約１７ないし約３３％（ｖ／ｖ）となるように、最も好ましくは約３３％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールとなるようにする。好ましくは、溶離溶液を約１．５倍ないし約３倍に、最も好ましくは約１．５倍または２：３に希釈する。
【００１０】
通常には、本発明の因子VIIIポリペプチドは組換え法により製造されるが、血漿から精製してもよい。組換え型因子VIIIポリペプチドは天然型の全長因子VIIIポリペプチドであってもよく、あるいは因子VIIIのＢドメイン欠失変異体（VIII：ＳＱ変異体を包含）のごとき変異体であってもよい。
本発明において有用な免疫アフィニティーカラムは、因子VIIIポリペプチドに結合しうる１種またはそれ以上のモノクローナルまたはポリクローナル抗体が結合され、後で標準的な方法および試薬を用いて因子VIIIポリペプチドが遊離されうる工業的に許容されるカラムおよび樹脂であってよい。適当なモノクローナル抗体は、例えば、Fass et al., Blood, 59: 594-600 (1982)に開示されている。
エチレングリコール、ジオキサン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのごとき無極性薬剤、あるいは適当な低イオン強度溶液、あるいは低極性バッファー溶液は脱離物質として有用である。
好ましい具体例において、因子VIIIポリペプチドを含有する混合物は、Triton X-100、Tween 80を包含するポリオキシエチル界面活性剤のごとき界面活性剤および／または溶媒を含んでいてもよい。さらに、因子VIIIポリペプチド含有溶液はヒスチジンのごときバッファー物質を含んでいてもよい。
【００１１】
実施例１
組換え型因子VIII：ＳＱの調製
組換え型因子VIII：ＳＱ（ｒ−VIII ＳＱ）の製造を、本質的にはＷＯ−Ａ−９１０９１２２（実施例１〜３）に記載されたようにして行った。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系（ＤＧ４４ＮＹ）を、ｒ−VIII ＳＱ遺伝子を含む発現ベクターおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む発現ベクターとともにエレクトロポレーションした。ならし培地（ウシ胎児血清含有）を清澄化させ、次いで、十字流濾過により濃縮した。溶液をSP Sepharose Fast Flowカチオン交換樹脂に負荷した。ｒ−VIII ＳＱは静電気力により選択的に樹脂に結合する。
溶離溶液（０．８Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％（ｖ／ｖ）界面活性剤（オクトキシノール９）、０．１Ｍ ＮＨ4Ａｃ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、１Ｍソルビトール、ｐＨ６．３±０．２）を流すことによりイオン強度を上昇させてｒ−VIII ＳＱをカラムから溶離させ、単一ＵＶ吸収ピークを集める。次いで、ｒ−VIII ＳＱを、ＴＮＢＰ（トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート）および界面活性剤（オクトキシノール９、Triton X-100のごとき）を使用する溶媒／界面活性剤法を用いるウイルス不活性化工程に付す。
次に、リガンドが因子VIIIの重鎖に指向されたモノクローナル抗体（８Ａ４と命名されたｍＡｂ）である免疫アフィニティークロマトグラフィーゲルにｒ−VIII ＳＱを負荷した。洗浄後、０．０５Ｍヒスチジン、０．０５Ｍ ＣａＣｌ2および５０％エチレングルコールおよび０．０２％オクトキシノール９（Tween）を含有するバッファーｐＨ６．６で因子VIIIを溶離させた。ｍＡｂ溶離物をアニオン交換カラムQ SepharoseR FF（スェーデン、ウプサラのPharmacia ABにより販売されている）に負荷した。洗浄後、０．０５Ｍヒスチジン、４ｍＭ ＣａＣｌ2、０．４Ｍ ＮａＣｌを含有するＱ溶離バッファーｐＨ６．３でＦVIII ＳＱを溶離させた。
上記精製系を改良するために、いくつかのシリーズの実験を行って、（ａ）希釈；（ｂ）ＮａＣｌを添加して希釈；および（ｃ）エチレングリコールを減じてあるいは添加せずに希釈した場合のＦVIII回収率に対する影響を評価した。
【００１２】
Ｑ平衡化バッファー
イオン交換カラムに負荷する前にＱ−カラムを平衡化するために使用する溶液（モノクローナル抗体カラムの脱離バッファーと同じ）は、大体、下記成分からなっている：
０．０５Ｍヒスチジン
０．０５Ｍ塩化カルシウム
５０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール
０．０２％（ｖ／ｖ）オクトキシノール９または他の界面活性剤
ｐＨ６．６±０．２
【００１３】
シリーズ１：Ｑ平衡化バッファーでの希釈
免疫アフィニティー精製後、溶離物をＱ−平衡化バッファーで約３倍ないし約５倍に希釈した。３倍希釈において、ＦVIII活性の全回収率は許容できるものであり、溶離物中に検出されるネズミＩｇＧは非常に少なかった。高倍率の希釈ではＦVIII活性の損失が有意であった。
【００１４】
シリーズ２：ＮａＣｌ含有Ｑ平衡化バッファーでの希釈
免疫アフィニティー精製後、溶離物を、約７ないし２０ｍＭの範囲のＮａＣｌを含有するＱ−平衡化バッファーで約３倍ないし約５倍に希釈した。一般的には、希釈によって、イオン交換カラムに乗せる前の溶離物から回収されるネズミＩｇＧ量が有意に減少する。驚くべきことに、ＮａＣｌの添加によって、ＦVIII活性の回収率が増加した。この回収率の増加は、希釈により生じる損失を補填するに十分であった。約１０ないし１７ｍＭの範囲のＮａＣｌで３倍ないし５倍に希釈した場合に最良の結果が観察された。ＦVIIIの最良の回収率は、約１５ｍＭ ＮａＣｌで約３倍希釈した場合に得られた。約７ｍＭ未満のＮａＣｌまたは約２０ｍＭより多いＮａＣｌで希釈した場合、ＦVIII活性の最終回収率が低下した。
結論は、免疫アフィニティー溶離物を希釈するのに使用するＱ平衡化バッファーに約７ｍＭないし約２０ｍＭのＮａＣｌを添加することにより、ＮａＣｌ無しでの希釈に関連する回収率の低下が回復され、溶離物中に検出されるネズミ抗体が減少することによる有益な効果も生じるということである。最も好ましい具体例において、約１５ｍＭのＮａＣｌが添加されたＱ平衡化バッファーの添加により最適な結果が得られた。
【００１５】
シリーズ３および４：エチレングリコール減量または無添加Ｑ平衡化バッファーでの希釈
免疫アフィニティー精製後、溶離物を、エチレングリコール不含Ｑ平衡化バッファーで約１．５倍ないし約３倍に希釈して、Ｑ平衡化バッファー中の最終エチレングリコール濃度を約５０％（ｖ／ｖ）から約１７％（ｖ／ｖ）（エチレングリコール無しのバッファーで３倍希釈の場合）まで低下させる。エチレングリコール無しのバッファーで１．５倍希釈の場合、約３３％（ｖ／ｖ）の最終エチレングリコール濃度となった。エチレングリコール濃度の減少とともに、約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含有するＱ平衡化バッファーで希釈した場合と比較して蛋白の全回収率が増加した。
【００１６】
実施例２
１．０  導入
実施例１にて行ったような因子VIII：ＳＱの適当な下流精製プロセスは５つのクロマトグラフィー工程からなっていてもよい。該５つのクロマトグラフィー工程とは、カチオン交換（SP Sepharose FF）、免疫アフィニティー（mAb Sepharose FF）、アニオン交換（Q Sepharose FF）、疎水性相互作用（HIC, butyl Sepharose FF）、およびゲル浸透クロマトグラフィー（Superdex 200 pg）である。ｍＡｂカラムからの溶離物を直接Q-Sepharose FFカラムに通してもよい。Q-Sepharose FFカラムに対する一連の負荷条件はＰＰＤ（ストックホルムのＰ＆Ｕと協力）により試験され、（ｉ）Q-Sepharoseピークのプールにおける活性回収率ならびにマウスＩｇＧおよびＨＣＰレベルの低下に対する負荷条件の影響が研究され；（ｉｉ）アニオン交換樹脂への最適負荷条件が確定された。この研究の結果を本実施例においてまとめる。
【００１７】
２．０  実験手順
２．１  材料：
Q-Sepharose FF樹脂を７９ｘ５ｍｍ（内径）のPharmacia HRカラムに充填した。この研究におけるすべての使用バッファーは、確立された方法によりＣＴＳによって調製された。精製プロセスからのｍＡｂピークのプールを−８０℃に凍結した状態でストックホルムのＰ＆Ｕから得た（ＬｔＥ９２３）。ＣＯＢＡＳアッセイキットおよびmega標準物質をChromogenix AB, Swedenから購入した。
【００１８】
２．２  手順：
Q-Sepharoseスケールダウンしての操作：
先ず、カラムの体積の１０倍のバッファーを流速０．５ｍｌ／分で流してQ-Sepharose FFカラムを平衡化した。次いで、ｍＡｂピークプールを適当な希釈バッファーで希釈し、Q-Sepharose FFカラム上に流速０．２ｍｌ／分で負荷した。すべての実験において、負荷した全活性ユニットは樹脂ｍｌあたり４８３５０Ｕであり、それはＰＬＡにおいて特定された上限に近い。これらの実験を行うために使用したｍＡｂピークプールの活性は２８６０ＩＵ／ｍｌであった。３倍および５倍希釈の実験における負荷体積はそれぞれ７８．６ｍｌおよび１３１ｍｌであった。負荷後、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＣａＣｌ2、５０ｍＭヒスチジンを含有する、カラム体積の４０倍のバッファーｐＨ６．６を０．３２ｍｌ／分の流速で流してカラムを洗浄した（洗浄２）。次いで、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＣａＣｌ2、５０ｍＭヒスチジンを含有するバッファーｐＨ６．３を流速０．０５ｍｌ／分で流して結合蛋白を溶離させた。すべての実験において、洗浄２および溶離を０．０５ｍｌ／分の流速で行った。すべての実験において、洗浄２および溶離を逆方向で行った。種々の操作中にカラム流出物を集め、活性をアッセイした。２８０ｎｍの吸光度の上昇し始めてからカラム体積の１．６倍の体積のフラクションをプールし、ピークプールと命名した。負荷試料およびピークプール試料を、ＥＬＩＳＡ（P&U,Stockholm）を行うことによりマウスＩｇＧおよびＨＣＰレベルについてアッセイした。
【００１９】
再生：
アイオン交換カラムを再生し、次いで、２．０Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム（一塩基），ｐＨ３．０、次いで２．０Ｍ ＮａＣｌ、１００ｎＭリン酸ナトリウム（二塩基），ｐＨ１１．０（それぞれカラム体積の５倍）を流すことにより、スケールダウンして操作した。
【００２０】
安定性の経時変化についての研究
ｍＡｂピークプールを、（ｉ）ｍＡｂ溶離バッファー、および（ｉｉ）４０ｍＭ ＮａＣｌ含有ｍＡｂ溶離バッファーで異なる倍率で希釈し、室温でインキュベーションした。次いで、これらの試料中の活性を異なる時点においてアッセイした。
【００２１】
３．０  結果および議論
安定性の経時変化についての研究：
ｍＡｂピークプールを、ｍＡｂ溶離バッファーで２倍、３倍および５倍に希釈し、室温でインキュベーションした。これらの試料の活性低下を時間の関数としてモニターした。２４時間であまり大きくない活性の低下（２０％）が観察された。４時間経過後において活性低下は無視でき、８時間経過後において活性低下は１０％未満であった。さらに、活性パーセンテージの低下が観察されたが、ｍＡｂピークプールの希釈の程度とは無関係であり、それゆえ、ｍＡｂ溶離バッファー中のＦVIII濃度とは無関係であった。４０ｍＭ ＮａＣｌを含むｍＡｂ溶離バッファーでｍＡｂピークプールを希釈した場合にも同様の結果が得られた。
【００２２】
Q-Sepharoseスケールダウン実験：
ｍＡｂ溶離バッファーでｍＡｂピークプールを３倍および５倍に希釈して行ったQ-Sepharose FFのスケールダウン操作から得た結果を表１に示す。
【表１】
0004405668.tif 000002
いずれの場合にも素通しでの損失は負荷量の約３．５％であり、洗浄試料およびピーク前試料の活性損失は合わせて１％未満であった。３倍および５倍希釈実験におけるカラムの１．６倍の体積（１．６ｃｖ）のピークプール中の活性はそれぞれ負荷量の５７．５％および４１．３％であり、ピーク後はそれぞれ負荷活性の３．９％および２．５％となった。溶離物をさらに修飾しないでｍＡｂピークプールをカラムに負荷する製造的操作における対応値は、素通し中で５％、ピークプール中で７０±９％である。
これらの結果は、Q-Sepharose FFカラムを通した場合の収率は、カラムへの負荷前のｍＡｂピークプールの希釈の程度に影響され、希釈倍率の増加とともに低下することを明確に示す。しかしながら、安定性の経時変化の研究から、ＦVIII：ＳＱの溶液中での安定性は希釈により影響を受けないことが明らかである。一定数の活性ユニットをカラムに負荷した場合、希釈倍率の増大にともなって操作時間が長くなる。安定性の経時変化のデータにより示唆されるように、収率の低下は負荷する際に高倍率で希釈した場合に起こりうる。それにもかかわらず、スケールダウン操作により実験的に得られた活性値は、安定性の経時変化のデータにより支持されるよりも有意に低かった。１の可能な説明は、希釈条件下でのQ-Sepharose上へのFVIII:SQの吸着は樹脂とのより強力な相互作用を誘発し、蛋白に変性作用を及ぼし、それゆえ溶離した場合に回収率が低くなるというものである。高倍率希釈の場合の回収率は、負荷中の「ＦVIII−樹脂相互作用」を弱めることにより改善されうるであろう。この仮説を検証するために、ＮａＣｌ含有ｍＡｂ溶離バッファーでｍＡｂピークプールを希釈して引き続き実験を行った。
【００２３】
ＮａＣｌ含有ｍＡｂ溶離バッファーでの希釈：
種々の濃度のＮａＣｌ含有するｍＡｂ溶離バッファーで希釈したｍＡｂピークプールを用いて行ったQ-Sepharoseスケールダウン実験から得た結果を表２に示す。
【表２】
0004405668.tif 000003
【００２４】
５倍希釈実験：
「ＦVIII−樹脂相互作用」を弱める条件下での希釈ｍＡｂプールの負荷により、Q-Sepharoseカラムを通した場合の全活性回収率が有意に増加した。この活性の大きな増加は、負荷時に１０ｍＭおよび１５ｍＭのＮａＣｌを用いた操作で得たピークプールにおいて見られ、最大ピーク活性回収率となる最適ＮａＣｌ濃度が存在することが示唆される。
約７ないし２０ｍＭの範囲のＮａＣｌにおいて、素通し中の活性損失は６．５ないし８．５％の間であった。これらの値は、ＮａＣｌ不存在下で５倍希釈した場合の操作において見られた値の２倍である。すべての場合において、洗浄およびピーク前の活性損失を一緒にしたものは２％未満であった。ピークプール後における活性損失はＮａＣｌ濃度とともに増大し、２０ｍＭのＮａＣｌ濃度において２０％となった。負荷中に蛋白がカラムをさらに下って移動し、その結果、流れを逆転させた場合に溶離に時間がかかったことから、このことが予想される。
【００２５】
３倍希釈：
５倍希釈の場合と同様に、ＮａＣｌ存在下で負荷した場合に全活性回収率および素通しにおける損失が高かった。ＮａＣｌ濃度１５ｍＭにおいて最大全活性回収率およびピーク活性回収率が得られた。しかしながら、この希釈レベルでは５倍希釈と同じような最適ＮａＣｌ濃度の存在は明らかでない。
【００２６】
マウスＩｇＧの結果：
３倍および５倍希釈した場合のピークプールおよびピークプール後のマウスＩｇＧのデータを表３に示す。
【表３】
0004405668.tif 000004
【００２７】
３倍希釈して操作した場合のピークプール中のＩｇＧ値は０．５ないし１．２ｎｇ／ＫＩＵであり、５倍希釈して操作した場合のピークプール中のＩｇＧ値は０．５ないし０．８ｎｇ／ＫＩＵであった。溶離物をさらに修飾しないでｍＡｂピークプールをカラムに負荷する製造的操作における対応値は平均２．３ｎｇ／ＫＩＵであった。よって、負荷前におけるｍＡｂ溶離バッファー（ＮａＣｌ含有または不含）でのｍＡｂピークプールの希釈により、Q-Sepharoseピークプール中のＩｇＧレベルが低下した。この効果は、単に希釈した場合のＩｇＧレベルを超えたものであり、ＩｇＧ−ＦVIII：ＳＱ複合体形成に関する一定の結合定数の結果であるかもしれない。かくして、ＩｇＧおよびＦVIII：ＳＱの濃度を低下させることは複合体濃度を低下させることとなり、それゆえ、イオン交換樹脂を通過するＩｇＧが大幅に除去される。３倍および５倍いずれの希釈実験においても、Q-Sepharoseピークプール中のＩｇＧ値と負荷時のＮａＣｌ濃度との間には相関関係が観察されなかった。よって、これらの実験に使用したＮａＣｌ濃度範囲において、ＮａＣｌの添加はマウスＩｇＧレベルのさらなる低下をもたらすとは思えない。
【００２８】
宿主細胞蛋白の結果：
３倍および５倍希釈実験における宿主蛋白のデータを表４に示す。
【表４】
0004405668.tif 000005
【００２９】
溶離物をさらに修飾しないでｍＡｂピークプールをカラムに負荷する製造的操作における対応値は平均２０ｎｇ／ＫＩＵであった。これらの結果は、ＮａＣｌ濃度の上昇とともにピークプール中のＨＣＰレベルが低下し、ＨＣＰレベルは希釈倍率とは無関係であることを示唆する。ＮａＣｌの添加は樹脂に対するＨＣＰの結合を弱め、それゆえ、Q-Sepharoseピークプール中のＨＣＰレベルを低下させる可能性がある。
【００３０】
４．０  結論
Q-Sepharoseカラムに負荷する前にｍＡｂピークプールをｍＡｂ溶離バッファーで希釈することは、この工程での収率を有意に低下させた。収率の低下は希釈の程度の増加関数である。しかしながら、ＦVIIIの溶液中での安定性はｍＡｂ溶離バッファーでの希釈の程度とは無関係であり、それゆえ、希釈条件下での負荷は強力な「ＦVIII−樹脂」相互作用を引き起こし、蛋白に対する変性効果を有することが示唆される。希釈バッファーへの塩化ナトリウムの添加は「ＦVIII−樹脂」相互作用を弱め、Q-Sepharoseカラムを通した場合の回収率を増大させる。しかしながら、ＮａＣｌ濃度の増大は素通しおよびピーク後の損失を増加させ、そのため、収率の低下が有意に補填される最適ＮａＣｌ濃度が存在する。３倍および５倍希釈で操作する場合の最適濃度は７ないし２０ｍＭと思われ、より詳細には約１５ｍＭである。
ｍＡｂ溶離バッファーでのｍＡｂピークプールの希釈はQ-Sepharoseピークプール中のＩｇＧおよびＨＣＰレベルも低下させた。実験したＮａＣｌ濃度範囲において、Q-Sepharoseピークプール中のＨＣＰレベルは負荷時のＮａＣｌ濃度の増大とともに低下した。全体として、ｍＡｂピークプールの希釈および７ないし２０ｍＭの濃度のＮａＣｌの添加の組み合わせにより、有意な収率の低下なしに精製が改善された。