(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列からなる領域を含有することを特徴とする、果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列に結合する果実特異的発現に関与する転写因子で制御される、請求項１記載の果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列からなる領域を含有することを特徴とする、果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２で示される塩基配列に結合する果実特異的発現に関与する転写因子で制御される、請求項３記載の果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号３で示される塩基配列からなる領域を含有することを特徴とする、果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３で示される塩基配列に結合する果実特異的発現に関与する転写因子で制御される、請求項５記載の果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号７で示される塩基配列からなる領域を含有することを特徴とする、果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号７で示される塩基配列に結合する果実特異的発現に関与する転写因子で制御される、請求項７記載の果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ。
【請求項９】
植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを有し、請求項１又は２記載のＤＮＡを含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項１０】
植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを有し、請求項３又は４記載のＤＮＡを含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項１１】
植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを有し、請求項５又は６記載のＤＮＡを含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項１２】
植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを有し、請求項７又は８記載のＤＮＡを含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項１３】
請求項９、１０、１１又は１２記載のプラスミドにより、目的の構造遺伝子がコードする蛋白質またはアンチセンスＲＮＡを果実特異的に発現することを特徴とする植物細胞。
【請求項１４】
請求項９、１０、１１又は１２記載のプラスミドにより、目的の構造遺伝子がコードする蛋白質またはアンチセンスＲＮＡを果実特異的に発現することを特徴とする植物体。
【請求項１５】
請求項９、１０、１１又は１２記載のプラスミドを含有する微生物。
【請求項１６】
配列番号３の１０９３〜１１８１番目の塩基配列からなるＤＮＡを含有することを特徴とする、果実特異的発現プロモーターであるＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号３の９６８〜１１８１番目の塩基配列からなるＤＮＡを含有することを特徴とする、果実特異的発現プロモーターであるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物果実における遺伝子発現及び制御のためのＤＮＡ配列とその利用等に関する。さらに具体的には、植物果実における遺伝子発現を特異的に制御するためのＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むプラスミド、そのプラスミドにより形質転換されてなる植物細胞、植物体及び微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ある種のプロモーター配列の下流に植物で発現可能な蛋白質をコードする遺伝子を結合したＤＮＡを導入して形質転換植物を作出し、その目的蛋白質を発現させる方法が知られており、その代表的なプロモーターとしては、目的蛋白質を植物の組織非特異的に発現させることができるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターがある。また植物での蛋白質発現系としてはテトラサイクリンにより誘導可能なＴｎ１０  Ｔｅｔリプレッサーを利用した系（ＴｈｅＰｌａｎｔ  Ｊ．（２），３９７，１９９２）やステロイドホルモンにより誘導可能なラットグルココルチコイドレセプターを利用した系（Ｔｈｅ  ＰｌａｎｔＪ．（１１），６０５，１９９７）など外来の化学物質に反応する誘導可能な遺伝子プロモーターも報告されている。植物遺伝子の組織特異的発現に関与する塩基配列については、種子特異的発現遺伝子に関与するＲＹコア配列と呼ばれるＣＡＴＧＣＡＴが知られている（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（９８），３８７，１９９２）。また、キイチゴｄｒｕ１プロモーターにより所望蛋白質をキイチゴ果実に発現することができるとの開示もある（特表２０００−５０３８４８号公報）。
【０００３】
植物由来プロテアーゼであるククミシンはメロン果汁に大量に集積されることを特徴とする耐熱性アルカリセリンプロテアーゼであり（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（５３），１００９，１９８９）、ｃＤＮＡがクローニングされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（５２），３２７２５，１９９４）。しかしその果実特異的発現調節機構については未解明であった。
【０００４】
植物に異種ＤＮＡを導入してトランスジェニック植物を作出する技術を使用して、除草剤耐性遺伝子等を導入したトランスジェニック作物が既に食品用に利用されている。一方、トランスジェニック植物の別の利用法として、植物に有用蛋白質を生産させ、生産物の抽出利用を図る、いわゆる分子農業への展開は未だ産業として確立されたとはいえない。有用蛋白質、或いはそれを利用して変換させた有用物質を植物細胞または植物体に作らせた場合、植物組織非特異的にはもちろん、特異的であっても葉や茎、根の組織に発現させると生産物によってはその抽出効率や精製回収が問題となる可能性があり、制御しやすく生産効率の良いプロモーターが望まれている。果実は種子よりはるかに体積が大きい貯蔵器官であり特にメロン等のウリ科は比較的大きな果実を数多くつけることを特徴としている。その果実に有用蛋白質もしくは有用物質を蓄積、または望まれる性質を付与させる技術が完成した場合、非常に有用なものとなるであろう。植物の種子や葉、根特異的発現に関与する塩基配列についてはこれまでにいくつかの報告があるが、果実特異的発現に関与する塩基配列、特にメロンのプロモーター配列より特定し、利用する報告は見られない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、植物の果実において特異的に、目的とする遺伝子の発現を制御することができるＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むプラスミド、ならびに、そのプラスミドにより形質転換されてなる植物細胞、植物体および微生物を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、果実部において特異的に高発現している蛋白質をコードしているメロン由来ククミシン遺伝子上流域に、新規な果実特異的発現に関与する制御ＤＮＡ配列を特定し、植物体で部位特異的発現に機能することを見いだし本発明を完成させるに至った。
すなわち、第１の本発明は、果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ配列であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は、配列番号７で示される塩基配列からなる領域を含有することを特徴とするものである。第１の本発明のＤＮＡ配列は配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は、配列番号７で示される塩基配列に結合する果実特異的発現に関与する転写因子で制御されることが好ましい。
【０００７】
第２の本発明は、植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを有し、第１の本発明のＤＮＡ配列を含有するプラスミドである。
第３の本発明は、第２の本発明のプラスミドにより、目的の構造遺伝子がコードする蛋白質またはアンチセンスＲＮＡを果実特異的に発現する植物細胞、又は、植物である。
第４の本発明は、第２の本発明のプラスミドを含有する微生物である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
第１の本発明は、果実特異的発現制御単位であるＤＮＡ配列であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は、配列番号７で示される塩基配列からなる領域を含有することを特徴とするものであり、植物細胞内で機能可能な果実特異的発現制御ＤＮＡ配列である。
第１の本発明のＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号７のいずれかの配列を単独で含んでいても、２つ以上を含んでいてもよい。配列番号１若しくは配列番号７および／または配列番号２を含む具体的な領域としてはメロン遺伝子であって配列番号３の塩基配列を含む領域を挙げることができる。
第１の本発明のＤＮＡ配列は、メロンのククミシンプロモーター遺伝子に由来する領域を含む配列であり、果実特異的発現を制御することができるので、本発明のＤＮＡ配列を用いることにより果実に任意の性質を付与することができ、例えば、植物における貯蔵器官として有望である果実内で部位特異的に有用物質の生産等を行ったり、果実内で発現する特定の遺伝子の転写を抑制すること等が可能である。
【０００９】
第１の本発明のＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は、配列番号７で示される塩基配列に結合する果実特異的発現に関与する転写因子で制御されることが好ましい。
上記転写因子としては、例えば、配列番号７のＤＮＡ配列に結合する核蛋白質、ＧＡＴＡボックス結合蛋白質、Ｉ−ボックス結合蛋白質、Ｇ−ボックス結合蛋白質、及び、本明細書の実施例７に示されるゲルシフトアッセイでＧｂプローブに結合する蛋白質等を挙げることができる。
第１の本発明であるＤＮＡ配列が果実特異的発現を制御するプロモーターとして機能するには、上記ＤＮＡ配列に転写因子が結合することが必要である。このため、転写因子の投与によって、目的とする有用物質の発現等を制御することができる。
【００１０】
なお、第１の本発明において、それぞれの塩基配列の一部について機能を損なわない変異、置換、欠失等の操作を行ったものも本発明の範囲内であることは言うまでもない。
【００１１】
第１の本発明においては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は、配列番号７に含まれる塩基配列を他の植物で機能可能なプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターなど、に連結または挿入や置換することにより、植物で活性を持つプロモーターに制御される構造遺伝子にコードされる蛋白質を果実特異的に発現させることも可能である。
【００１２】
第１の本発明ＤＮＡ配列中にはエチレン応答エレメントやオーキシン応答エレメントなどこれまでに知られている明確な植物ホルモン応答エレメントが見いだされないが、未同定の植物ホルモンエレメント等と協力して働くことにより果実特異的発現がおこなわれても良い。
【００１３】
また、実施例４の表１に示すとおり、配列番号７の塩基番号１〜２０で表されるＤＮＡ配列には発現を抑制するエレメントとして働くＤＮＡ配列があることが示唆されるため、この部分のＤＮＡ配列を欠損或いは置換させる等の操作を加えることによっても果実特異的発現に明らかな影響がでることは容易に類推される。
【００１４】
第１の本発明において、上記果実としては、広く種子植物により得られる実を意味し特に限定されるものではないが、ウリ科植物が好適に用いられ、例えばメロン、スイカ、ウリ、キュウリ、カボチャ等を挙げることができる。なかでも、実が大きく多くの有用物質を貯蔵できる点から、メロンが好ましい。
【００１５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び、配列番号７に示す塩基配列はメロンのククミシンプロモーター配列に由来し、第１の発明のＤＮＡ配列は、常法に従い、メロンよりゲノムＤＮＡを抽出し、既知のククミシンの配列に基づき作製したプライマーを用いてＩＰＣＲ法を用うこと等により得ることができる。
【００１６】
第１の本発明の制御機能を有するＤＮＡ配列が植物体若しくは植物細胞で機能するかどうかの確認は、部位特異的発現を調べる場合、パーティクルガン法による植物体へのＤＮＡ導入法を行えば、一過性発現の形で十分信頼性のある確認が可能である。
【００１７】
第２の本発明は、植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを有し、第１の本発明のＤＮＡ配列を含有するプラスミドである。
【００１８】
上記構造遺伝子およびアンチセンスＲＮＡとしては特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
上記プロモーターとしては、植物細胞内で機能するものであれば特に限定されず、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、アグロバクテリウムのオクトピン合成遺伝子プロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。
上記ターミネーターとしては、植物細胞内で機能するものであれば特に限定されず、例えば、ＲｕＢｉｓＣＯの３Ｃ遺伝子、植物遺伝子由来のノパリン合成遺伝子のターミネーター、ニンニクウイルスＧＶ１，ＧＶ２遺伝子のターミネーター等を挙げることができる。
【００１９】
第２の本発明のプラスミドは、公知の種々のベクターを用い、常法に従い作製することができる。
上記ベクターとしては、プラスミド導入法がエレクトロポーレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、融合法等である場合、特に限定されず公知のベクターを使用することができ、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ等を挙げることができ、プラスミド導入法がアグロバクテリウム菌により植物細胞へ感染させる方法である場合、例えば、バイナリーベクターｐＢＩ１０１（クロンテック社製）、ｐＢＩ１２１（クロンテック社製）、ｐＢＩ２２１（クロンテック社製）等のベクターを挙げることができる。
これらのベクターに第１の本発明のＤＮＡ配列、植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを挿入することにより第２の本発明のプラスミドを得ることができる。
【００２０】
さらに、第１の本発明の果実特異的発現を制御するＤＮＡ配列を有するプロモーターを使用して蛋白質を発現させる際、植物で発現可能な蛋白質をコードする遺伝子の上流に当該蛋白質を細胞外に分泌するために必要なシグナル配列、たとえばメロンのククミシン遺伝子が持つ分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列や他の遺伝子が持つ分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列、または当該蛋白質をコードする遺伝子の下流に細胞内での局在性を支配する局在化シグナルをコードするＤＮＡ配列を連結することにより、果実中または果汁中に当該蛋白質を積極的に分泌させることや１種類または複数の当該蛋白質による物質変換反応に起因する有用物質生産のために植物果実中において積極的に反応を行わせることも可能である。
さらに当該蛋白質以外に、果実の過熟に関与する蛋白質をコードする遺伝子のアンチセンスＲＮＡを発現させることで日持ちの改善等をコントロールすることも可能である。
【００２１】
第２の本発明のプラスミドには、形質転換された植物を容易に選別できるように、選別マーカー遺伝子を挿入してもよい。上記選別マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子を用いることができ、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールに対する耐性遺伝子等を挙げることができる。抗生物質耐性遺伝子がプラスミドに含有されていれば、抗生物質を含む培地中で生育する植物を選択することによって、形質転換された植物、すなわち、本発明のプラスミドが導入された形質転換植物を容易に選択することができる。
【００２２】
第２の本発明のプラスミドを用いて植物細胞又は植物体を形質転換することにより、その植物の果実で特異的に目的とする有用物質を生産したり、不要な物質の生産を抑制することができる。
果実特異的発現を目的として第１の本発明のＤＮＡ配列または第２の本発明のプラスミドを植物細胞または植物体に導入する方法は、アグロバクテリウム菌により植物細胞へ感染させる方法、電気導入（エレクトロポーレーション）法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ベクターを含有する小細胞、細胞、リソソーム等とプロトプラストとの融合法等の公知の方法があげられる。
【００２３】
第３の本発明は、第２の本発明のプラスミドにより、目的の構造遺伝子がコードする蛋白質またはアンチセンスＲＮＡを果実特異的に発現する植物細胞、又は、植物体である。
上記植物細胞又は植物体としては、果実をつけるものであれば特に限定されないが、ウリ科植物が好適に用いられ、例えばメロン、スイカ、ウリ、キュウリ、カボチャ等を挙げることができる。
【００２４】
第４の本発明は、第２の本発明のプラスミドを含有する微生物である。
上記微生物としては、例えば、アグロバクテリウム菌、大腸菌等を挙げることができる。
第２の本発明のプラスミドを含有するアグロバクテリウム菌を用いて、第３の本発明の植物細胞や植物体を作製することもできる。
アグロバクテリウム菌は植物に感染すると、該細菌内に保有しているプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を持っており、この性質を利用して、第１の本発明のＤＮＡ配列、植物で発現可能な構造遺伝子またはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、植物で機能可能なプロモーターとターミネーターとを植物に導入することができる。
第２の本発明のプラスミドが、ｖｉｒ領域を有していない場合、用いるアグロバクテリウム菌はｖｉｒ領域を有している他のプラスミドをも含有していることが必要である。
【００２５】
【実施例】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）メロンゲノムＤＮＡからのククミシン蛋白質プロモーターの単離
（１）メロンゲノムＤＮＡの調製
マスクメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ  ｃｖ．Ｔｅｒｅｓａ）幼植物体の葉１０ｇを小片にし、液体窒素中で磨砕した。これを２×ＣＴＡＢバッファー（２％  ＣＴＡＢ，１．４Ｍ  ＮａＣｌ，１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）に懸濁後５５℃，１０分間保温したのちクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）を加え３０分間室温にて穏やかに転倒混和した。１４０００×ｇ，１５分間遠心後、上層にはクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）を、中間層と下層には１×ＣＴＡＢバッファーをそれぞれ加え穏やかに転倒混和した後、遠心分離しそれぞれ上層を合わせ１０％  ＣＴＡＢ液（１０％  ＣＴＡＢ，０．７Ｍ  ＮａＣｌ）を１／１０容量加えて転倒混和した。さらに等量のＣＴＡＢ沈殿用バッファー（１％  ＣＴＡＢ，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え穏やかに転倒混和し遠心分離した。得られた沈殿に１Ｍ  ＮａＣｌ−ＴＥバッファー（１ＭＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え沈殿を溶解させた。これに等量のイソプロパノールを加え穏やかに転倒混和した後遠心分離により沈殿を得、７０％エタノールにて洗浄、乾燥したものをＴＥバッファーに溶解した。溶解後、終濃度５μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ，１０μｇ／ｍｌプロテナーゼＫを加え５０℃，３０分間保温したあと、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。上層に１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２），等量のイソプロパノールを加え遠心分離後沈殿を７０％エタノールで洗浄したものをＴＥバッファーに溶解しゲノムＤＮＡ溶液とした。
【００２７】
（２）ＩＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法）によるプロモーター領域のクローニング
調製したメロンゲノムＤＮＡ１μｇを含むＤＮＡ溶液を１０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩで３７℃，一夜処理した。エタノール沈殿により消化ＤＮＡ断片を回収後、１０ユニットのＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅで１５℃，１２時間反応させた。このＤＮＡに１０ｎｇのククミシンプライマー１（配列番号４）と１０ｎｇのククミシンプライマー２（配列番号５）を加え、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（終濃度各０．２ｍＭ），ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５μｌにて１００μｌ溶液とし、ザイモリアクター（ＡＴＴＯ社製，ｔｙｐｅ  ＡＢ−１８００）を用い９５℃，１０分間処理後，９４℃，１分，５５℃，２分，７２℃，３分を３０サイクル，最後に７２℃，７分のＰＣＲ反応を行った。反応終了後、増幅ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫを制限酵素ＳｍａＩで切断しその５’端に１塩基のＴを付加したものへ導入しプラスミドｐＭ１−Ｂ２−５を得た（図１）。挿入断片のＤＮＡシークエンスはＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ｍｏｄｅｌ  ４０００Ｌ；ＬＩ−ＣＯＲ，Ｉｎｃ．社製，ＮＥ，ＵＳＡ）により、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  ＥＸＣＥＬ  ＩＩ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＬＣ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて行った。その結果、配列番号３の約１．２ｋｂのククミシンプロモーター部位の塩基配列を決定した。
【００２８】
（実施例２）
単離した遺伝子のプロモーター配列を用いてその遺伝子の発現解析を行う場合、元来の遺伝子の転写開始点にできるだけ近い位置に活性測定が容易に実施できるレポーター遺伝子を連結した融合遺伝子を作製することが望ましい。そこで単離したククミシン遺伝子の転写開始点を決定した。
【００２９】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識したＥｘプライマー（配列番号６）を、受粉後１０日目のマスクメロン未熟果実果芯部より抽出したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  ２０μｇと４２℃、一晩ハイブリダイズさせた。その反応液を用い、１２．５ユニットのＡＭＶ  ＲＴ（ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ，ＩＮＣ社製）を添加、５５℃，１時間インキュベートし逆転写によるプライマー伸長反応を行った。続いて、そのエタノール沈殿産物をシークエンスゲル組成のポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果ククミシン遺伝子の転写開始点はただ一つ存在した（配列番号３に続くａ：アデニン）。
【００３０】
（実施例３）メロンプロモーター−ＧＵＳ融合遺伝子の作製
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫにレポーター遺伝子としてｐＢＩ２２１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ）由来のβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）遺伝子とターミネーターとしてＲｕＢｉｓＣＯの３Ｃ遺伝子をつないで作製したプロモーター活性測定用ベクターであるｐＳＫＧＵＳ３Ｃを作製した（図２）。次にｐＭ１−Ｂ２−５プラスミドを鋳型として、ククミシンプロモーター配列上流部分を順次欠損させるよう設計された制限酵素ＸｂａＩ部位を持つプライマーと、転写開始点の１塩基上流で切断しＢａｍＨＩ部位を持たせたプライマーによりＰＣＲを実施し、得られた長さの異なる各ＤＮＡ断片をｐＳＫＧＵＳ３ＣのＧＵＳ遺伝子上流に存在する制限酵素部位ＸｂａＩとＢａｍＨＩの間へ挿入し、ククミシンプロモーター−ＧＵＳ融合遺伝子を作製した。プロモーター領域の塩基を表示する場合は一般的に転写開始点直前の塩基を−１とするため、配列番号３の塩基配列番号を３’端を−１、５’端を−１１８１とした場合、具体的にはククミシンプロモーターの−１１８１〜−１を持つｐ１１８１プラスミド、−８６５〜−１を持つｐ８６５プラスミド、−３７１〜−１を持つｐ３７１プラスミド、−２００〜−１を持つｐ２００プラスミド、−３１０〜−１を持つｐ３１０プラスミド、−２５４〜−１を持つｐ２５４プラスミド、−２３４〜−１を持つｐ２３４プラスミド、−２１４〜−１を持つｐ２１４プラスミド、−８９〜−１を持つｐ８９プラスミド、−２５４〜−２１５の下流にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの−９０〜−１部位を結合させたｐＫＧＸプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの−９０〜−１部位を持つｐＸプラスミドを作製した。ポジティブコントロールとしてはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの約８００ｂｐを持つｐＢＩ２２１を用いた（図３〜図６）。
【００３１】
（実施例４）ククミシンプロモーターの部位特異的発現
（１）パーティクルガンによる各器官へのＤＮＡ撃ち込み
マスクメロン未熟果実（直径約４．５ｃｍ）は厚さ約１〜２ｍｍの切片とし、葉、茎は適当な大きさに切断し直径９ｃｍのプラスチックシャーレに入れた。
直径１．６μｍの金粒子６０ｍｇに１ｍｌの７０％エタノールを加えて５分間ボルテックスし、１５分間静置した後５秒間遠心して上清を除いた。さらに１ｍｌの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静置、２秒間遠心の操作を３回繰り返した後、金粒子の終濃度が６０ｍｇ／ｍｌとなるよう５０％グリセロールを加えた。
【００３２】
調製した金粒子５０μｌを激しくボルテックスしながら実施例３で示されたｐ１１８１，ｐ８６５，ｐ３７１，ｐ２００，ｐＳＫＧＵＳ３Ｃ，ｐＢＩ２２１プラスミドの各溶液５μｌ（約１．２ｐｍｏｌｅ含有）を加えた後、さらに５０μｌの２．５Ｍ塩化カルシウム溶液、２０μｌの０．１Ｍスペルミジン溶液を加え激しく３分間ボルッテックスした。１分間静置、２秒間遠心により上清を除いた後、ペレットをエタノールに再懸濁した。ペレットはマイクロキャリアの中心にのせて乾燥させた。
【００３３】
各融合遺伝子を吸着させた金粒子を、１種類のＤＮＡあたりそれぞれ未熟果実、葉、茎のサンプルに２度撃ち込んだ。撃ち込みにはＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いた。
【００３４】
（２）器官でのＧＵＳ活性染色
撃ち込み終了後、シャーレを密封してアルミホイルで包み遮光し、２５℃、２４時間インキュベートした。さらに試料はＧＵＳ染色液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭヘキサシアノ酸鉄（ＩＩ）カリウム、０．５ｍＭヘキサシアノ酸鉄（ＩＩＩ）カリウム、１ｍＭ  Ｘ−Ｇｌｕｃ、２％  ＤＭＳＯ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に浸して密封し３７℃、暗所で一晩インキュベートした後、エタノール中で脱色し、各種ククミシンプロモーターによるＧＵＳ蛋白質のメロン未熟果実および成葉、茎における発現を染色により確認した。結果を表１に示した。
その結果、ＧＵＳ蛋白質の一過性発現が部位特異的に検出された。
【００３５】
【表１】
0004531931.tif 000002
【００３６】
（実施例５）ククミシンプロモーター中の果実特異的発現制御ＤＮＡ領域の特定
（１）用いたプラスミド
パーティクルガンによる各器官へのＤＮＡ撃ち込み方法は実施例４に同じく、用いたプラスミドの構造は実施例３に示す。
【００３７】
（２）抽出液の調製
実施例４の（１）で示した方法により調製したメロン未熟果実および成葉試料を液体窒素中で磨砕し、室温で融解させた後、２ｍＭ  ＤＦＰを含む１×ピッカジーン培養細胞溶解剤を加え磨砕し、遠心分離にて上清を抽出液サンプルとした。
【００３８】
（３）ＧＵＳ活性の測定
ＧＵＳ活性の定量のため、ｐＵＣ１９ベクターにカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターとＩＮＴ（イネＳＯＤ遺伝子の第１イントロン）、ＬＵＣ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子）を挿入したｐ３５Ｓ−ＩＮＴ−ＬＵＣ＋（図７）を同時に撃ち込み、測定したルシフェラーゼ活性を基準にしてＧＵＳ活性を標準化した。
【００３９】
ＧＵＳ活性は（１）で用意した抽出液に、終濃度１ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを加え３７℃で３０分間インキュベートした。さらに４倍量の０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加えた後、Ｆ−３０１０蛍光分光光度計（日立製作所社製）にて励起波長３６５ｎｍ、測定波長４５５ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。別に４−メチルウンベリフェロンを用いた回帰直線を作製しておき、測定した蛍光強度をＧＵＳ活性に換算した（ｐｍｏｌｅ  ４−ＭＵ／ｍｉｎ）。
【００４０】
ルシフェラーゼ活性は、（１）で用意した抽出液にピッカジーン発光キットＰＧＬ１００（東洋インキ社製）のピッカジーン発光試薬を加え室温３０秒間放置した後、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ−５１００，アロカ社製）にて発光量を計測した。別にキット付随のホタルルシフェラーゼ酵素溶液を用いた回帰直線を作製しておき、測定した発光量をルシフェラーゼ酵素量（ｇ）に換算しルシフェラーゼ活性とした。
【００４１】
得られたＧＵＳ活性は対応するルシフェラーゼ活性で除して標準化した。メロンの果実試料、葉試料それぞれについて、１種類の融合遺伝子に由来する３点の標準化ＧＵＳ活性から平均値と標準偏差を求めた。さらにポジティブコントロールであるｐＢＩ２２１を撃ち込んだ際の標準化ＧＵＳ活性の平均値に対する百分率として換算し、相対ＧＵＳ活性とした。結果を表２に示した。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
（実施例６）他種プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター）を使った果実特異的発現
（１）用いたプラスミド
パーティクルガンによる各器官へのＤＮＡ撃ち込み方法は実施例４に同じく、用いたプラスミドの構造は実施例３に示したとおりである。
【００４４】
（２）抽出液の調製
実施例４の（１）で示した方法により調製したメロン未熟果実および成葉試料を液体窒素中で磨砕し、室温で融解させた後、２ｍＭ  ＤＦＰを含む１×ピッカジーン培養細胞溶解剤を加え磨砕し、遠心分離にて上清を抽出液サンプルとした。
【００４５】
（３）ＧＵＳ活性の測定
実施例５の方法に準じて、果実特異的発現制御ＤＮＡ配列を導入したカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターのメロン果実におけるＧＵＳ相対活性を測定した。結果を表３に示した。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
（実施例７）ゲルシフトアッセイによる特異的発現にポジティブに作用する配列とネガティブに作用する配列の同定
（１）プリンスメロンからの核蛋白質抽出
プリンスメロンの未熟果実を薄く切断して種子を除き、ナイフで果芯部だけを取りだして氷冷した（約３２０ｇ）。葉は適当な大きさに切断して用いた。ミキサーに氷冷した核破砕バッファー（１Ｍヘキシレングリコール、１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ ２−メルカプトエタノール，２ｍＭ  ＤＦＰ，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を５００ｍｌ加え粉砕した後、５０μｍナイロンメッシュでろ過し、ろ液を２，０００×ｇ，４℃，１０分遠心しペレットを得た。これを８０ｍｌの氷冷した核洗浄バッファー（０．５Ｍへキシレングリコール，１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，１ｍＭＤＦＰ，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に懸濁し３，０００×ｇ，４℃，５分遠心でペレットを回収した。ペレットは２０ｍｌの氷冷した核溶解バッファー（１１０ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，１ｍＭ  ＤＴＴ，５μｇ／ｍｌアンチパイン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、５μｇ／ｍｌキモスタチン）に懸濁し、撹拌しながら２ｍｌの４Ｍ硫酸アンモニウム溶液を滴下した。３０分間おだやかに振とう培養した後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｗ／Ｔｉ６０ローターで１００，０００×ｇ，４℃，９０分間遠心した。上清１ｍｌあたり０．２５ｇの細粒状硫酸アンモニウムを少量ずつ加えて溶解させ、０℃，一夜静置した後１０，０００×ｇ，４℃，１５分間遠心しペレットを得た。ペレットを氷冷した０．５ｍｌの核抽出バッファー（７０ｍＭ  ＫＣｌ，２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール、５μｇ／ｍｌアンチパイン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、５μｇ／ｍｌキモスタチン）に懸濁しＢｉｏ−Ｔｅｃｈ透析カップＭＷＣＯ  ８０００（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ社製）にて透析バッファー（７０ｍＭ  ＫＣｌ，２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５），１ｍＭメルカプトエタノール，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０％グリセロール）に対して４回バッファーを交換しながら２時間透析した。透析後、内液を１２，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心して得た上清を小分けして直ちに液体窒素中で凍結した後−８０℃保存し試験に供した。
【００４８】
（２）プローブ
Ｇプローブ（配列番号７），Ｈプローブ（配列番号８）、Ｇａプローブ（配列番号７の塩基番号１〜２０で表される塩基配列）、Ｇｂプローブ（配列番号１）、Ｇ５プローブ（配列番号７の塩基番号２７〜４０で表される塩基配列）をそれぞれ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ，Ｔ４キナーゼで末端ラベルした。
【００４９】
（３）ゲルシフトアッセイ
結合反応は５×バインディングバッファー（２００ｍＭ  ＫＣｌ，１２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５），５ｍＭメルカプトエタノール，０．５ｍＭＥＤＴＡ，５０％グリセロール）を３μｌ，１μｇ／μｌ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）・（ｄＩ−ｄＣ）（ファルマシア社製）、２μｌ，３００，０００ｃｐｍのラベルプローブ（上記（２）で調製）、１μｇ／μｌに調製したプリンスメロン果芯部または葉の核抽出液（上記（１）で調製）を３μｌ加え、滅菌水で全量１５μｌとして２５℃，１５分間インキュベートした。反応液は未変性３０％アクリルアミドゲルにて２０ｍＡ定電流で３０分間電気泳動したのち、ゲルを濾紙に移しゲルドライヤーにて乾燥させ、Ｘ線フィルムにて−８０℃，３時間感光させてフィルムを現像した。また、競合ゲルシフトアッセイの際は競合プローブとして未ラベルのプローブをラベルプローブの１００倍量加えて結合反応を行わせた。結果を表４に示した。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
その結果、果実特異的に強い核蛋白質の結合がＧプローブに見られた。ラベルしたＧａプローブおよびラベルしたＧｂプローブでも果実特異的に核蛋白質の結合が見られた。ＧＵＳ活性データよりＧａプローブ部分へは遺伝子発現にネガティブに、Ｇｂプローブ部分へは遺伝子発現にポジティブな作用をする核蛋白質がそれぞれ結合するものと考えられる。
【００５２】
また、同様にラベルしたＧｂプローブを用い、非標識のＧ５プローブを競合させるとほぼ完全に果実での特異的バンドが消失した。一方、Ｇ５プローブの塩基を１塩基づつ変異させたものを非標識プローブとして競合させると、Ｇ５プローブの３塩基目のＴをＣに変異させたもの、７塩基目のＡをＧに変異させたもので特異的バンドの消失が軽度となった。これはその部分の塩基が果実特異的発現に関与すると推測される転写因子の結合に、より重要な配列であることを示している。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡ配列を利用することにより、植物の果実において目的とする蛋白質を特異的に発現させることが可能になった。また、その結果、果実を収穫することにより有用蛋白質もしくは有用物質の分離精製が簡便化できる。
【００５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ククミシンプロモーター領域をインサートＤＮＡとして含むｐＭ１−Ｂ２−５プラスミドを示す図である。
【図２】プロモーター活性測定用ｐＳＫＧＵ３Ｃプラスミドを示す図である。
【図３】ｐＳＫＧＵ３ＣプラスミドのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入したククミシンプロモーター領域ＤＮＡ配列およびそれにより構築したプラスミドを示す図である。
【図４】ｐＫＧＸプラスミドを構築する際に、ｐＳＫＧＵ３ＣプラスミドのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入したＤＮＡ配列を示す図である。
【図５】ｐＸプラスミドを構築する際に、ｐＳＫＧＵ３ＣプラスミドのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入したＤＮＡ配列を示す図である。
【図６】ｐＢＩ２２１プラスミドを示す図である。
【図７】ｐ３５Ｓ−ＩＮＴ−ＬＵＣ＋プラスミドを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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