(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのＣＴＧＦに反応性を有する、国際寄託番号FERM BP-6599で識別される融合細胞から産生されるヒトモノクローナル抗体またはF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、ｓFv、dsFv及びdAbからなる群から選ばれる該モノクローナル抗体の一部。
【請求項２】
ヒトのＣＴＧＦに反応性を有する、国際寄託番号FERM BP-6600で識別される融合細胞から産生されるヒトモノクローナル抗体またはF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、ｓFv、dsFv及びdAbからなる群から選ばれる該モノクローナル抗体の一部。
【請求項３】
国際寄託番号FERM BP-6599で識別される融合細胞。
【請求項４】
国際寄託番号FERM BP-6600で識別される融合細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物の結合組織増殖因子（Connective Tissue Growth Factor、ＣＴＧＦ）に反応性を有するモノクローナル抗体若しくはその一部、該モノクローナル抗体を産生する細胞、該モノクローナル抗体若しくはその一部を固定化してなる抗体固定化不溶性担体、該モノクローナル抗体を標識物質で標識してなる標識抗体、哺乳動物のＣＴＧＦの検出、定量、分離または精製に用いられるキット、哺乳動物のＣＴＧＦを検出、定量、分離または精製する方法、該モノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物、ヒトＣＴＧＦ遺伝子導入トランスジェニックマウス、ラットのＣＴＧＦポリペプチド、ラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ、及びラットのＣＴＧＦに反応性を有する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組織傷害における組織の再生は、傷害部位に移入したマクロファージ等の貪食細胞等による不用の組織片や細胞片あるいは細菌等の除去、血管系の復元、並びにそれに続く新しい組織との置換を経て行われる。この組織の再生、修復の過程においては、該再生・修復の過程で出現するマクロファージや好中球が産生するトランスフォーミング増殖因子β（Transforming Growth Factor β (TGF-β)）が最初の調節因子として働くことが明らかとなってきている。
ＴＧＦ−βの機能は多彩であり、間葉細胞の増殖誘導、血管内皮細胞及び上皮細胞の増殖抑制だけでなく、結合組織細胞からの細胞外マトリックス（Extracellular Matrix (ECM)）の産生を調節する機能を有することが知られている。
【０００３】
前記ＴＧＦ−βで刺激し増殖誘導が見られる間葉細胞の培養上清においては、血小板由来増殖因子（Platelet-derived Growth Factor (PDGF)）や結合組織成長因子（Connective Tissue Growth Factor (CTGF)；Ｈｃｓ２４とも呼ぶ）の産生の増加が観察されることから、ＴＧＦ−βによる細胞増殖誘導活性は、それらの他の制御因子により間接的に発揮されるものであると考えられている。
【０００４】
ＣＴＧＦについては、ヒト及びマウスのＣＴＧＦが既に同定されており（なお、ラットのＣＴＧＦの同定については、未だ何ら報告されていない。）、それらの物理化学的及び生物学的性状の解析が進められてきている（［ヒトＣＴＧＦ］J. Cell Biology, Vol.114, No.6, p.1285-1294, 1991；Int. J. Biochem. Cell Biol., Vol.29, No.1, p.153-161, 1997；Circulation, Vol.95, No.4, p.831-839, 1997；Cell Growth Differ., Vol.7, No.4, p.469-480, 1996；J. Invest. Dermatol., Vol.106, No.4, p.729-733, 1996；J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.2, p.280-284, 1995；J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.1, p.128-132, 1995；及び国際特許出願公開WO96/38172号公報。［マウスＣＴＧＦ（Fisp12）］特開平5-255397号公報、Cell Growth Differ., Vol.2, No.5, p.225-233, 1991；FEBS Letters, Vol.327, No.2, p.125-130, 1993；及びDNA Cell Biol., Vol.10, No.4, p.293-300, 1991）。
【０００５】
ＣＴＧＦは、分子量約３８ｋＤを有するシステイン残基に富んだ分泌型糖タンパクであり、その生合成及び分泌はＴＧＦ−βより誘導されることが明らかにされている。ＣＴＧＦは、ＴＧＦ−βによる産生誘導を受ける点、ＰＤＧＦ受容体に結合する点、間葉細胞系の増殖を誘導する点、線維芽細胞や上皮細胞から産生されるという点等でＰＤＧＦと類似の性質を有するが、アミノ酸配列相同性はほとんど有さない全く異なる分子である（The Journal of Cell Biology, Vol.114, No.6, p.1287-1294, 1991及びMolecular Biology of the Cell, Vol.4, p.637-645, 1993）。
また、最近の研究により、ヒト及びマウス繊維芽細胞の培養上清中、並びにブタの子宮由来分泌液中には、３８ｋＤａのＣＴＧＦの分解物と考えられる生物学的に活性な分子量約１０乃至１２ｋＤａの低分子量ＣＴＧＦが同定されている（Growth Factors, Vol.15, No.3, p.199-213, 1998；J. Biol. Chem., Vol.272, No.32, p.20275-20282, 1997）。
【０００６】
ＣＴＧＦの生理学的機能及び疾患との関連性についての詳細は未だ完全に明らかにされてはいないものの、ＣＴＧＦのＴＧＦβによる産生誘導、種々の疾患患者の組織及び細胞におけるＣＴＧＦのｍＲＮＡの有意な発現（Int. J. Biochem. Cell. Biol., Vol.29, No.1, p.153-161, 1997；Circulation, Vol.95, No.4, p.831-839, 1997；J. Invest. Dermatol., Vol.106, No.4, p.729-733, 1996；J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.2, p.128-132, 1995；J. Cell Physiol., Vol.165, No.3, p.556-565, 1995及びKidney Int., Vol.48, No.2, p.5001-5009, 1995など）、並びにＣＴＧＦの血管内皮細胞の遊走及び増殖の促進に関する知見（J. Cell. Biol., Vol.114, No.6, p.1285-1294, 1991；Exp. Cell Res., Vol.233, p.63-77, 1997；歯科基礎医学会誌、第３８巻、増刊、第463頁、PD0187、1996及び第６９回日本生化学会要旨、第683頁、1P0535、1996など）等から、ＣＴＧＦが種々疾患の発症及び／または進行に関与する可能性が示唆され初めてきている。
【０００７】
具体的疾患の特定については、今後の研究展開及び研究結果を待たなければならないが、ＣＴＧＦは、例えば、癌、動脈硬化症、皮膚疾患（例えば、乾癬、強皮症、アトピー、ケロイド）、腎疾患、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ）、各種線維症（動脈硬化、肝硬変、関節炎、強皮症、ケロイド、腎線維化、及び肺線維症等で見られる組織線維化）等の幅広い範囲の疾患の発症及び／または進行に関与するのではないかと推測される。
【０００８】
このような各種疾患とＣＴＧＦとの係わりの解明においては、種々の疾患に罹患している患者及び疾患哺乳動物の体液（血清など）中に含まれるＣＴＧＦ及び／またはその断片を検出及び定量し、その値を、正常な生体（健常人、正常マウス、正常ラット、及び正常ウサギ等の哺乳動物）における測定値と比較することが、有効な一般的な手段である。
ＣＴＧＦのような分泌性タンパクの検出あるいは定量には、検出しようとする分泌性タンパクに対する抗体（特には、モノクローナル抗体）を用いた抗原抗体反応に基づく免疫学的測定方法、具体的には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）あるいはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）等のイムノアッセイが、最も簡便で有用な方法として汎用されている。
【０００９】
同様に、ＣＴＧＦの検出及び定量においても、このようなイムノアッセイによる検出方法及び定量方法、該定量方法の確立に必要とされるＣＴＧＦに対するモノクローナル抗体の作製、開発が必要となる。しかしながら、ＣＴＧＦに対する抗体については、抗血清の作製についての報告はあるものの（Exp. Cell Res., Vol.233, p.63-77, 1997；Cell Growth Differ., Vol.8, No.1, p.61-68, 1997；及び第６９回日本生化学会要旨、第683頁、1P0534、1996）、モノクローナル抗体、とりわけＣＴＧＦに対する高い親和性及び／またはＣＴＧＦの活性を中和する能力を有する機能的なモノクローナル抗体については未だ報告されておらず、イムノアッセイによるＣＴＧＦの定量系も全く提供されていない。
また、前記のようなＣＴＧＦの活性を中和する能力を有するモノクローナル抗体は、そのようなイムノアッセイにおける構成要素としてだけでなく、前述のようなＣＴＧＦの分泌に起因する各種疾患の治療及び／または予防における抗体医薬品として有用であるが、該抗体医薬品として使用可能なモノクローナル抗体についても、全く報告されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、前記のような種々疾患の発症及び／または進行に関連する可能性を有するＣＴＧＦの生物学的機能及び該ＣＴＧＦと各種疾患との因果関係の解明、並びにＣＴＧＦに起因する疾患の治療及び予防における医薬品の有効成分として使用可能な、ヒト、マウス、ラット及びウサギ等の各種哺乳動物のＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体の開発が望まれている。特に、ＣＴＧＦの機能及びＣＴＧＦと各種疾患との関係の解明において必要な手段であるＣＴＧＦのイムノアッセイにおいて用いられるモノクローナル抗体としては、該ＣＴＧＦに対する所望の親和性、ＣＴＧＦの生物学的活性を中和する能力、及び／または種々の哺乳動物に対する所望の交叉反応性（cross reactivity）を有するモノクローナル抗体の開発が求められている。
さらに、該種々疾患に罹患している患者の治療及び／または予防に用いられるモノクローナル抗体としては、該中和活性に加え、該患者に対する抗原性を低減または消失させたモノクローナル抗体の開発が求められている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述のような社会的ニーズを満たすために、各種哺乳動物のＣＴＧＦに対するモノクローナル抗体に関して鋭意研究した結果、種々の哺乳動物に由来するＣＴＧＦを免疫原として用いることにより、抗原特異性、抗原親和性、中和活性、及び交叉反応性等の性質の点で、各々異なる特性を有する種々の哺乳動物のＣＴＧＦに対する種々のモノクローナル抗体を作製することに成功した。
また、遺伝子組換え技術を用いてヒトの抗体を産生するように作製したトランスジェニックマウスをヒトのＣＴＧＦで免疫することによって、ヒトＣＴＧＦに対する種々のヒトモノクローナル抗体を作製することに世界に先んじて初めて成功した。
【００１２】
さらに、前者の種々のモノクローナル抗体を用いて構築した種々のイムノアッセイ系により、種々哺乳動物（ヒト、マウス、ラット及びウサギ等）の体液（血清等）中のＣＴＧＦを、インタクトな状態で簡便かつ高感度で定量できることを見出し本発明を完成するに到った。
また、後者のヒト抗体が、ヒトＣＴＧＦの活性を有意に中和するのみならず、例えば、組織繊維症（例えば、腎繊維症など）の治療効果を有することを見出し、本願発明を完成するに到った。これらのヒト抗体は、マウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副作用）であったヒトに対する抗原性を全く有しないことから、抗体の医薬品としての価値を劇的に増大させるものである。
【００１３】
即ち、本発明は、患者の治療及び予防における医薬品として、またヒト、マウス及びラット等の各種哺乳動物の体液中に含まれるＣＴＧＦを検出及び定量するためのイムノアッセイにおける構成要素として有用な種々の特性を有する各種哺乳動物に対するモノクローナル抗体を、本発明の分野において初めて提供するものである。
さらに、本発明は、そのようなＣＴＧＦに対する種々のモノクローナル抗体を用いることによるＣＴＧＦのイムノアッセイ方法及びアッセイキットを初めて提供するものである。
【００１４】
本発明のヒトＣＴＧＦに対するモノクローナル抗体は、ヒトに対する抗原性を惹起することなく、ＣＴＧＦに起因する種々の疾患の治療及び予防するための医薬品として極めて有用である。
また、本発明のモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、ヒトは勿論、種々哺乳動物（ヒト、マウス、ラット及びウサギなど）の正常な生体並びに疾患に罹患している生体の体液中に存在するＣＴＧＦを、インタクト（intact）な状態で簡便かつ高感度で検出及び定量できる。
【００１５】
即ち、本発明の下記のとおりの発明である。
（１）  下記の（ａ）乃至（ｇ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）ヒト、マウス及びラットの結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）のいずれにも反応性を有する；
（ｂ）ヒト及びマウスのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且つラットのＣＴＧＦに反応性を有しない；
（ｃ）マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且つヒトのＣＴＧＦに反応性を有しない；
（ｄ）ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）とヒトのＣＴＧＦとの結合、または該細胞株293-TとマウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する；
（ｅ）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570）、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）またはヒト肺由来繊維芽細胞のいずれかとヒトのＣＴＧＦとの結合を阻害する；
（ｆ）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激によるラット腎臓由来線維芽NRK-49F（ATCC CRL-1570）の細胞増殖を阻害する；または
（ｇ）ヒドロシキプロリンの生成が上昇的傾向を示している腎臓における該ヒドロキシプロリンの上昇を抑制する。
（２）  モノクローナル抗体が、下記の（ａ）乃至（ｃ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴とする前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）ヒトのＣＴＧＦまたはその一部をマウスに免疫して得られるモノクローナル抗体またはその一部であって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有する；
（ｂ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をハムスターに免疫して得られるモノクローナル抗体またはその一部であって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有する；または
（ｃ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をラットに免疫して得られるモノクローナル抗体またはその一部であって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有する。
（３）  モノクローナル抗体が、下記の（ａ）乃至（ｃ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴とする前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）ヒトのＣＴＧＦまたはその一部をマウスに免疫して得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且つヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）とヒトのＣＴＧＦとの結合を阻害する；
（ｂ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をラットに免疫して得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且つヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）とマウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する；または
（ｃ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をハムスターに免疫して得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且つヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）とマウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する
（４）  該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM BP-6208で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一部。
（５）  該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM BP-6208で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一部。
（６）  該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM BP-6209で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一部。
（７）  該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM BP-6209で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一部。
（８）  ヒト、マウス、またはラットのＣＴＧＦのいずれかに反応性を有するヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（９）  ヒトモノクローナル抗体が、ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（８）に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（１０）  下記の（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに記載の性質を有するヒトのＣＴＧＦに反応性を有するヒトモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）とヒトのＣＴＧＦとの結合を阻害する；
（ｂ）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570）、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）またはヒト肺由来繊維芽細胞のいずれかとヒトのＣＴＧＦとの結合を阻害する；
（ｃ）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激によるラット腎臓由来線維芽NRK-49F（ATCC CRL-1570）の細胞増殖を阻害する；または
（ｄ）ヒドロシキプロリンの生成が上昇的傾向を示している腎臓における該ヒドロキシプロリンの上昇を抑制する。
（１１）  ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（８）乃至前記（１０）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（１２）  ヒトモノクローナル抗体が、ヒトのＣＴＧＦを、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られるモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１１）に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（１３）  トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トランスジェニックマウスであることを特徴とする前記（８）乃至前記（１２）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（１４）  該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DP-5、DP-38、DP-65及びDP-75からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セグメントに由来することを特徴とする前記（８）乃至前記（１３）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（１５）  該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DPK1、DPK9、DPK12及びDPK24からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セグメントに由来することを特徴とする前記（８）乃至前記（１３）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（１６）  該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DP-5、DP-38、DP-65及びDP-75からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セグメントに由来し、且つ該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DPK1、DPK9、DPK12及びDPK24からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セグメントに由来することを特徴とする前記（８）乃至前記（１５）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
（１７）  該ヒトモノクローナルの重鎖可変領域が、下記（ａ）乃至（ｊ）のいずれかのアミノ酸配列を含むアミノ酸を有することを特徴とする前記（９）に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１８番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１２に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１２に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号１４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１７番目のアミノ酸配列；または
（ｊ）配列番号１４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（１８）  該ヒトモノクローナルの軽鎖可変領域が、下記（ａ）乃至（ｊ）のいずれかのアミノ酸配列を含むアミノ酸を有することを特徴とする前記（９）に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１２１番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至１２１番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２３乃至１１７番目のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２３乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２２に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１７乃至１１１番目のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２２に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１７乃至１１１番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２３乃至１１８番目のアミノ酸配列；または
（ｊ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２３乃至１１８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（１９）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6535で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体またはその一部。
（２０）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6535で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその一部。
（２１）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6598で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体またはその一部。
（２２）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6598で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその一部。
（２３）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6599で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体またはその一部。
（２４）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6599で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその一部。
（２５）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6600で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体またはその一部。
（２６）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6600で識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその一部。
（２７）  ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体またはその一部であって、該モノクローナル抗体が、該モノクローナル抗体をヒトのＣＴＧＦに反応性を有する前記（１７）若しくは前記（１８）に記載のいずれかのモノクローナル抗体とヒトのＣＴＧＦからなる抗原抗体複合体に反応させた時、該抗原抗体複合体に反応性を有しないことを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
（２８）  該モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（２７）に記載のモノクローナル抗体またはその一部。
（２９）  ラットのＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体またはその一部。
（３０）  可変領域が前記（２）乃至前記（７）、前記（２７）または前記（２９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒトのＣＴＧＦに反応性を有する組換えキメラモノクローナル抗体。
（３１）  超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が前記（２）乃至前記（７）、前記（２７）または前記（２９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体由来の相補性決定領域であり、超可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の枠組領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒトのＣＴＧＦに反応性を有する組換えヒト型モノクローナル抗体。
（３２）  前記（１）乃至前記（２９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生する細胞。
（３３）  前記（３０）または前記（３１）に記載の組換えモノクローナル抗体を産生する細胞。
（３４）  該細胞が、該モノクローナル抗体を産生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする前記（３２）に記載の細胞。
（３５）  該細胞が、該モノクローナル抗体の重鎖をコードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記（３２）または前記（３３）に記載の細胞。
（３６）  該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6535で識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３４）に記載の融合細胞。
（３７）  該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6598で識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３４）に記載の融合細胞。
（３８）  該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6599で識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３４）に記載の融合細胞。
（３９）  該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6600で識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３４）に記載の融合細胞。
（４０）  該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6208で識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３４）に記載の融合細胞。
（４１）  該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6209で識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３４）に記載の融合細胞。
（４２）  前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体が固定化されていることを特徴とする抗体固定化不溶性担体。
（４３）  不溶性担体が、プレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター及びメンブレンからなる群から選ばれる不溶性担体であることを特徴とする前記（４２）に記載の抗体固定化不溶性担体。
（４４）  不溶性担体が、フィルター若しくはメンブレン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる不溶性担体であることを特徴とする前記（４２）に記載の抗体固定化不溶性担体。
（４５）  前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識抗体。
（４６）  標識物質が、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、または放射性同位体であることを特徴とする前記（４５）に記載の標識抗体。
（４７）  前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、前記（４２）若しくは前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体、及び前記（４５）若しくは前記（４６）に記載の標識抗体からなる群から選ばれる少なくともいずれか１つのモノクローナル抗体、抗体固定化不溶性担体または標識抗体を含んでなることを特徴とする哺乳動物のＣＴＧＦの検出または定量に用いられるキット。
（４８）  前記（４２）若しくは前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体、及び前記（４５）若しくは前記（４６）に記載の標識抗体を含んでなることを特徴とする前記（４７）に記載の哺乳動物のＣＴＧＦの検出または定量に用いられるキット。
（４９）  前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、前記（４２）若しくは前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体、及び前記（４５）若しくは前記（４６）に記載の標識抗体からなる群から選ばれる少なくともいずれか１つのモノクローナル抗体、抗体固定化不溶性担体、または標識抗体を用いることを特徴とするイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する方法。
（５０）  少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する前記（４９）に記載の方法：
（ａ）前記（４２）または前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体に、試料を反応せしめる工程；及び
（ｂ）該抗体固定化不溶性担体と該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複合体に、前記（４５）または前記（４６）に記載の標識抗体を反応せしめる工程。
（５１）  少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する前記（４９）に記載の方法：
（ａ）前記（４５）または前記（４６）に記載の標識抗体と、試料を反応せしめる工程；及び
（ｂ）該標識抗体と試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複合体に、前記（４２）または前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体を反応せしめる工程。
（５２）  少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する前記（４９）に記載の方法：
（ａ）前記（４２）若しくは前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体、前記（４５）若しくは前記（４６）に記載の標識抗体、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
（５３）  少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する前記（４９）に記載の方法：
（ａ）前記（４２）または前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体に、試料、並びに単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質を反応せしめる工程。
（５４）  少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する前記（４９）に記載の方法：
（ａ）試料、並びに単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質との混合物に、前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を反応せしめる工程；及び
（ｂ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノクローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
（５５）  少なくとも下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する前記（４９）に記載の方法：
（ａ）試料に、前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を反応せしめる工程；
（ｂ）（ａ）の工程を行った反応系に、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質を反応せしめる工程；及び
（ｃ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノクローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
（５６）  前記（４２）または前記（４４）に記載の抗体固定化不溶性担体を含んでなる哺乳動物のＣＴＧＦの分離または精製に用いられるキット。
（５７）  前記（４２）または前記（４４）に記載の抗体固定化不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることを特徴とする哺乳動物のＣＴＧＦを分離または精製する方法。
（５８）  アフィニティクロマトグラフィーがアフィニティーカラムクロマトグラフィーである前記（５７）に記載の哺乳動物のＣＴＧＦの精製方法。
（５９）  ヒトのＣＴＧＦをコードするＤＮＡが、内在性遺伝子座に組み込まれていることを特徴とするトランスジェニックマウス。
（６０）  配列番号２に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するラットのＣＴＧＦ。
（６１）  配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ。
（６２）  ＤＮＡが、配列番号１に記載される塩基配列中の塩基番号213乃至1256迄の塩基配列を含むことを特徴とする前記（６１）に記載のＤＮＡ。
（６３）  前記（２）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。
（６４）  前記（９）乃至前記（１８）または前記（２８）のいずれかに記載されるヒトモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的に許容され得る担体とを含んでなる医薬組成物。
（６５）  前記（１４）乃至前記（１８）または前記（２８）のいずれかに記載されるヒトモノクローナル抗体若しくはその一部を含んでなる医薬組成物。
（６６）  該医薬組成物が、ＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を有する細胞の増殖を抑制するために用いられることを特徴とする前記（６３）乃至前記（６５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６７）  該医薬組成物が、ＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を有する細胞の増殖を伴う疾患を治療または予防するための前記（６３）乃至前記（６５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６８）  該細胞の増殖が、脳、頚部、肺、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、胃、大腸、小腸、十二指腸、骨髄、子宮、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、口腔、舌、及び血管からなる群から選ばれる組織における細胞の増殖であることを特徴とする前記（６６）または前記（６７）に記載の医薬組成物。
（６９）  該組織が、肺、肝臓、腎臓、または皮膚であることを特徴とする前記（６８）に記載の医薬組成物。
（７０）  該組織が、腎臓であることを特徴とする前記（６９）に記載の医薬組成物。
（７１）  該疾患が、さらに組織の繊維化を伴う疾患であることを特徴とする前記（６７）に記載の医薬組成物。
（７２）  該組織の繊維化が、肺、肝臓、腎臓または皮膚における繊維化であることを特徴とする前記（７１）に記載の医薬組成物。
（７３）  該組織の繊維化が、腎臓における繊維化であることを特徴とする前記（７２）に記載の医薬組成物。
（７４）  ＣＴＧＦ阻害剤またはＣＴＧＦ産生阻害剤、並びに薬学的に許容され得る担体とを含んでなり、腎臓における疾患を治療または予防するための医薬組成物。
（７５）  該阻害剤が、ＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（７４）に記載の医薬組成物。
（７６）  該阻害剤が、前記（９）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（７４）に記載の医薬組成物。
（７７）  該阻害剤が、前記（１４）乃至前記（１８）または前記（２８）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（７６）に記載の医薬組成物。
（７８）  該疾患が、組織の繊維化と伴う疾患であることを特徴とする前記（７４）乃至前記（７７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７９）  ＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を有する細胞のＣＴＧＦの刺激による増殖を抑制する能力を有する物質、及び薬学的に許容され得る担体とを含んでなり、腎臓における該細胞の増殖を抑制するための医薬組成物。
（８０）  該物質が、ＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（７９）に記載の医薬組成物。
（８１）  該阻害剤が、前記（９）乃至前記（３１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（７９）に記載の医薬組成物。
（８２）  該阻害剤が、前記（１４）乃至前記（１８）または前記（２８）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（８１）に記載の医薬組成物。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等を意味し、好ましくは、ヒト、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスであり、特に好ましくは、ヒト、ラット、ハムスターまたはマウスである。
本発明で用いられる「ヒト以外の哺乳動物」及び「非ヒト哺乳動物」なる用語は各々同義であり、前述に定義した哺乳動物におけるヒト以外のあらゆる哺乳動物を意味する。
【００１７】
本発明において用いられる「アミノ酸」とは、自然界に存在するあらゆるアミノ酸を意味し、好ましくは、アミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの三文字表記法または一文字表記法に従って各々下記のように表されるアミノ酸を意味する。
グリシン（Gly／G）、アラニン（Ala／A）、バリン（Val／V）、ロイシン（Leu／L）、イソロイシン（Ile／I）、セリン（Ser／S）、スレオニン（Thr／T）、アスパラギン酸（Asp／D）、グルタミン酸（Glu／E）、アスパラギン（Asn／N）、グルタミン（Glu／Q）、リジン（Lys／K）、アルギニン（Arg／R）、システイン（Cys／C）、メチオニン（Met／M）、フェニルアラニン（Phe／F）、チロシン（Tyr／Y）、トリプトファン（Trp／W）、ヒスチジン（His／H）、プロリン（Pro／P）。
【００１８】
本発明でいう「結合組織増殖因子（Connective Tissue Growth Factor (CTGF)）」とは、前記哺乳動物のＣＴＧＦであり、例えば、前述に記載したとおりの既報に報告される構造及び機能を有するヒト及びマウスのＣＴＧＦを包含する（例えば、The Journal of Cell Biology, Vol.114, No.6, p.1287-1294, 1991、Molecular Biology of the Cell, Vol.4, p.637-645, 1993、及びBiochem. Biophys. Res. Comm., Vol.234, p.206-210, 1997など）。また、本願発明の１つであるラットのＣＴＧＦも包含することは言うまでもない。
【００１９】
また、本発明で言う結合組織増殖因子には、当該文献に記載された分子量約38kDaのＣＴＧＦ（例えば、ヒトＣＴＧＦ）はもちろんのこと、当該分子量約38kDaの全長ＣＴＧＦ（例えば、ヒトＣＴＧＦ）の分解物と考えられる分子量約10乃至12kDaの低分子量CTGF蛋白をも包含する（Growth Factors, Vol.15, No.3, p.199-213, 1998；J. Biol. Chem., Vol.272, No.32, p.20275-20282, 1997）。この低分子量CTGFの構造は未だ明らかにされていないものの、ヒトＣＴＧＦにあっては、349アミノ酸からなる全長ヒトＣＴＧＦの246番目のロイシン（Leu246）と247番目のグルタミン酸（Glu247）の間で切断されることにより生ずると考えられる103個のアミノ酸からなるＣ末端蛋白（分子量：約11,800Da）、あるいは、同全長ヒトＣＴＧＦの247番目のグルタミン酸（Glu247）と248番目のグルタミン酸（Glu248）との間で切断されることにより生ずると考えられる102個のアミノ酸からなるＣ末端蛋白（分子量：約11,671Da）である可能性を有する。
さらに、後述する本願発明に係る「モノクローナル抗体」が天然型のタンパク一次構造（アミノ酸配列）を有するＣＴＧＦ（特には、ヒトＣＴＧＦ）またはその一部に反応性を有する限り、本発明でいう該ＣＴＧＦには、該天然型のタンパクまたはその一部のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＣＴＧＦも包含する。
【００２０】
本発明において使用される、「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」なる用語は、天然型のＣＴＧＦと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を有するタンパク、並びに該アミノ酸配列に、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するタンパクをも包含することを意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数の組み合わせの場合であってもよい。
本発明におけるＣＴＧＦは、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
【００２１】
また、本発明におけるＣＴＧＦには、該ＣＴＧＦの「一部」も包含される。ここで「ＣＴＧＦの一部」とは、前記に定義したＣＴＧＦ（前述の分子量約10乃至12ｋDaの低分子量ＣＴＧＦを含む）のアミノ酸配列中の任意の部分配列を含むポリペプチドを意味し、具体的には５乃至１００アミノ酸残基を有するＣＴＧＦペプチドフラグメント（例えば、Ｃ末端側）、より具体的には５乃至５０アミノ酸残基を有するＣＴＧＦペプチドフラグメント、さらに具体的には５乃至３０アミノ酸残基を有するペプチドフラグメントが包含される。好ましくは、ＣＴＧＦがその受容体と結合若しくは相互作用する部位（受容体結合部位など）またはＣＴＧＦがその生物学的機能を発揮するために必要な部位（活性部位など）を含むＣＴＧＦの部分構造である。
これらのポリペプチド（部分構造、フラグメント）は、後述する当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したＣＴＧＦをタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
【００２２】
本発明における「モノクローナル抗体」とは、哺乳動物の結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）またはその一部に反応性を有するモノクローナル抗体である。具体的には、前記発明（１）乃至前記発明（３１）のいずれかに記載される特徴を有するモノクローナル抗体である。さらに具体的には、後述の実施例並びに図面に記載されるような様々な特性及び産業上の有用性を有する各種のモノクローナル抗体である。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体における好ましい態様としては、例えば、下記（イ）乃至（ニ）のモノクローナル抗体が挙げられる。
（イ）  前記（１）に記載のモノクローナル抗体における（ｄ）乃至（ｇ）のいずれかの性質を有するモノクローナル抗体。
（ロ）  前記（２）に記載のモノクローナル抗体。
（ハ）  前記（４）乃至前記（７）のいずれかに記載されるモノクローナル抗体。
（ニ）  前記（９）乃至前記（３１）のいずれかに記載されるモノクローナル抗体。
本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬品としての適用の目的における使用においては、上記（イ）乃至（ニ）に記載のモノクローナル抗体に包含されるヒトモノクローナル抗体が好ましい。
本態様において、本願発明の別の主題である哺乳動物のＣＴＧＦの定量、検出、分離または精製の目的における使用においては、上記（イ）乃至（ニ）に記載のいずれのモノクローナル抗体をも使用し得る。
【００２４】
本願発明のモノクローナル抗体のさらに好ましい態様としては、例えば、下記（ホ）または（ヘ）のモノクローナル抗体が挙げられる。
（ホ）  前記（１）に記載のモノクローナル抗体における（ｄ）乃至（ｇ）のいずれかの性質を有するモノクローナル抗体。
（ヘ）  前記（４）乃至前記（７）のいずれかに記載されるモノクローナル抗体。
ト）  前記（１０）、前記（１４）乃至前記（２８）のいずれかに記載されるモノクローナル抗体。
本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬品としての適用の目的における使用においては、上記（ホ）乃至（ヘ）に記載のモノクローナル抗体に包含されるヒトモノクローナル抗体が好ましい。
本態様において、本願発明の別の主題である哺乳動物のＣＴＧＦの定量、検出、分離または精製の目的における使用においては、上記（ホ）乃至（ヘ）に記載のいずれのモノクローナル抗体をも使用し得る。
【００２５】
本願発明のモノクローナル抗体の特に好ましい態様としては、例えば、下記（ト）または（チ）のモノクローナル抗体を挙げることができる。
（ト）  前記（ニ）乃至（ト）に記載のモノクローナル抗体。
（チ）  前記（１４）乃至（２６）または前記（２８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬品としての適用の目的における使用においては、上記（チ）に記載のモノクローナル抗体が好ましい。
本態様において、本願発明の別の主題である哺乳動物のＣＴＧＦの定量、検出、分離または精製の目的における使用においては、上記（ト）乃至（チ）に記載のいずれのモノクローナル抗体をも使用し得る。
【００２６】
本願発明のモノクローナル抗体のとりわけ好ましい態様としては、例えば、下記（リ）乃至（カ）のモノクローナル抗体を挙げることができる。
（リ）  前記（４）または（６）に記載のモノクローナル抗体。
（ヌ）  前記（１４）乃至前記（１６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（ル）  前記（１７）に記載のモノクローナル抗体における（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）または（ｉ）に記載の特徴を有するモノクローナル抗体。
（ヲ）  前記（１８）に記載のモノクローナル抗体における（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）または（ｉ）に記載の特徴を有するモノクローナル抗体。
（ワ）  前記（１９）、前記（２１）、前記（２３）または前記（２５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（カ）  前記（２８）に記載のモノクローナル抗体。
本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬品としての適用の目的における使用においては、上記（ヌ）乃至（カ）のいずれかに記載のモノクローナル抗体が好ましい。
本態様において、本願発明の別の主題である哺乳動物のＣＴＧＦの定量、検出、分離または精製の目的における使用においては、上記（リ）乃至（カ）に記載のいずれのモノクローナル抗体をも使用し得るが、特には上記（リ）に記載のモノクローナル抗体が好ましい。
【００２７】
本発明の「モノクローナル抗体」は、前記に定義した結合組織増殖因子（天然体、組換え体、合成物、細胞培養上清を含む）若しくはその一部を抗原（免疫源）として用い、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体及びヒト型抗体（CDR-grafted抗体）、並びに例えば、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体も包含する。
さらには。後述する本発明の「組換えモノクローナル抗体を産生する細胞」から産生されるような、遺伝子組換えモノクローナル抗体も本発明のモノクローナル抗体に包含される。
またモノクローナル抗体の場合には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ（IgA1、IgA2）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、好ましくはIgG2またはIgG4）またはＩｇＭであり、さらに好ましくはＩｇＧである。。
【００２８】
本発明で言うポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物（後述するヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から融合細胞（ハイブリドーマ）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
また、後述する本発明の「組換えモノクローナル抗体を産生する細胞」によっても製造できる。
【００２９】
モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。
即ち、前述の結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ；天然体、組換え体、合成物、細胞培養上清を含む）若しくはその一部を免疫原として、該免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、非ヒト哺乳動物、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ、好ましくはマウス、ラットあるいはハムスター（後述するヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。
【００３０】
モノクローナル抗体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。
【００３１】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（ATCC No. CRL-1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（ＮＳ−１）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/O,Sp2）、PAI、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することができる。
モノクローナル抗体を産生する細胞（例えば、ハイブリドーマ）のスクリーニングは、該細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００３２】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
また、該ハイブリドーマあるいは後述する本発明の「組換えモノクローナル抗体を産生する細胞」からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、トランスジェニック動物作製技術を用いて当該遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、当該トランスジェニック動物のミルク中から当該抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（日系サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至８４頁）。
該細胞をインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００３３】
基本培地としては、例えば、Ham'F12培地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、RPMI1640培地、ASF104培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体には、該抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／または軽鎖からなるモノクローナル抗体も包含されるが、ここで、「数個のアミノ酸」とは、複数個のアミノ酸を意味し、具体的には１乃至１０個のアミノ酸であり、好ましくは１乃至５個のアミノ酸である。
本発明のモノクローナル抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Site specific mutagenesis ）を用いて常法により導入することができる（Proc. Natl. Acsd. Sci. USA, Vol.81, p.5662-5666, 1984）。
【００３５】
本発明における「ヒトモノクローナル抗体」とは、前記に定義したような哺乳動物のＣＴＧＦ（好ましくはヒトのＣＴＧＦ）に反応性を有するヒトモノクローナル抗体である。例えば、後述の実施例及び図面に記載されるような様々な特性を有する各種のヒトモノクローナル抗体を挙げることができる。
具体的には、イムノグロブリンを構成する重鎖（Ｈ鎖）の可変領域（Variable region）及びＨ鎖の定常領域（Constant Region）並びに軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するヒトイムノグロブリンである。Ｌ鎖としては、ヒトκ鎖またはヒトλ鎖が挙げられる。
【００３６】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、例えば、既報の方法に従って製造することができる「ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウス」に代表されるような「ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物」を、前記に定義した哺乳動物のＣＴＧＦで免疫することによって製造することができる。当該非ヒト哺乳動物への免疫及び抗体産生融合細胞（ハイブリドーマ）の製造及びスクリーニング、並びに当該ヒトモノクローナル抗体の大量調製は、前述の一般的な方法を用いて実施することができる（Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；及び特表平６−５００２３３号公報など）。
該ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、具体的には、例えば下記の工程からなる手法を用いることにより作製できる。他のヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物も同様にして製造することができる。
【００３７】
（１）マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することにより該マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺伝子が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作製する工程。
（２）マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することにより該マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子（特にκ鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作製する工程。
（３）酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome, YAC）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
（４）YAC等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
（５）前記（１）乃至（４）のノックアウトマウス及びトランスジェニックマウスを任意の順序で交配することにより、マウス内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及びマウス内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能的に不活性化され、且つヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域及ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所望の領域がともにマウス染色体上に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
【００３８】
前記ノックアウトマウスは、マウス内在性イムノグロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で相同組換えにより置換することにより該遺伝子座が再構成（リアレンジメント）できないように不活性化することにより作製できる。該相同組換えを用いた不活性化には、例えば、ポジティブ・ネガティブ・セレクション（Positive Negative Selection; PNS）と呼称される方法を用いることができる（日経サイエンス, ５月号, p.52-62, 1994）。
イムノグロブリン重鎖遺伝子座の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成できる。またイムノグロブリン軽鎖（例えばκ鎖）に機能的不活性化は、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
【００３９】
トランスジェニックマウスは、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年を参照）に従って作製することが可能である。具体的には、例えば、正常マウス胚盤胞（blastcyst）に由来するHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞（embryonic stem cell）を、該ヒトイムノグロブリン重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子またはその一部並びにHPRT遺伝子が挿入されたYACベクターを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合する。該外来性遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をHATセレクション法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 1980；米国特許第4,873,191号公報）。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得る。該ヘテロ（heterogeneic）トランスジェニックマウス同士を交配することにより、メンデルの法則に従って、ホモ（homogeneic）トランスジェニックマウスが得られる。
【００４０】
本発明における「キメラモノクローナル抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その可変領域が、非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスターなど）のイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換えキメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。
【００４１】
本発明におけるキメラモノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１０号、１９８８年及び特公平３−７３２８０号公報等を参照しながら作製することができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶH遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣH遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶL遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣL遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。
【００４２】
具体的には、まず、マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばEcoRI、HindIII等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例えば0.7%アガロースゲル使用）サザンブロット法を行う。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、0.25M HCl溶液に１５分間浸す。次いで、0.4NのNaOH溶液に１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して２×SSCで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５℃、３時間）を行う。ベイキング終了後に、該フィルターを0.1×SSC／0.1%SDS溶液に入れ、６５℃で３０分間処理する。次いで、３×SSC／0.1%SDS溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４時間処理する。
【００４３】
次に、この中に32Ｐ標識したプローブＤＮＡ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×SSC−0.1%SDS溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、２×SSCを少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行う。
上記サザンブロット法により、マウスモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定したＤＮＡ断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、ファージベクター（例えば、Charon 4A、Charon 28、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該ファージベクターで大腸菌（例えば、LE392、NM539等)を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。そのゲノムライブラリーを適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ鎖（κ）Ｊ遺伝子等）を用いて、例えばベントンデイビス法（サイエンス(Science)、第１９６巻、第１８０〜第１８２頁、１９７７年）に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あるいはＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。得られたクローンの制限酵素地図を作製し、塩基配列を決定し、目的とする再配列されたＶH(VDJ)遺伝子あるいはＶL(VJ)遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。
【００４４】
一方、キメラ化に用いるヒトＣH遺伝子及びヒトＣL遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ1とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣH遺伝子であるＣγ1遺伝子とＣL遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用してヒトＣγ1遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウスＣγ1遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって得ることができる。
【００４５】
具体的には、例えば、クローンIg146（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７５巻、第４７０９〜第４７１３頁、１９７８年）からの３ｋｂのHindIII−BamHI断片とクローンMEP10（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７８巻、第４７４〜第４７８頁、１９８１年）からの6.8kbのEcoRI断片をプローブとして用い、ヒトのラムダCharon 4AのHaeIII−AluIゲノムライブラリー（セル(Cell)、第１５巻、第１１５７〜第１１７４頁、１９７８年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハンサー領域を保持しているＤＮＡ断片を単離する。また、ヒトＣγ1遺伝子は、例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡをHindIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、5.9Kbのバンドをλ778に挿入し、前記のプローブを用いて単離する。
【００４６】
このようにして単離されたマウスＶH遺伝子とマウスＶL遺伝子、及びヒトＣH遺伝子とヒトＣL遺伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域などを考慮しながらマウスＶH遺伝子の下流にヒトＣH遺伝子を、またマウスＶL遺伝子の下流にヒトＣL遺伝子を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例えばpSV2gptあるいはpSV2neo等の発現ベクターに常法に従って組み込む。この際、マウスＶH遺伝子／ヒトＣH遺伝子とマウスＶL遺伝子／ヒトＣL遺伝子のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置することもできる。
【００４７】
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現ベクターを、例えばP3X63・Ag8・653細胞あるいはSP210細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞にプロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞を取得する。
このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得する。
【００４８】
本発明における「ヒト型モノクローナル抗体（CDR-grafted抗体）」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスターなど）のモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト型モノクローナル抗体を意味する。
【００４９】
ここで、超可変領域の相補性決定領域とは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Complementarity-determining residue；CDR1、CDR2、CDR3）を指し、また可変領域の枠組領域とは、該３つ相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Framework；FR1、FR2、FR3、FR4）を指す。
換言すれば、非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明におけるヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域についても限定されるものではない。
【００５０】
本発明におけるヒト型モノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換えヒト型モノクローナル抗体は、特表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６８９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製することができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。
【００５１】
単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナル抗体を得る。
【００５２】
本発明における「モノクローナル抗体」には、該モノクローナル抗体の「一部」も包含される。該「モノクローナル抗体の一部」とは、前述の本発明におけるモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはF(ab')2、Fab'、Fab、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilised Fv）あるいはｄＡｂ（single domain antibody）である（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ(Exp. Opin. Ther. Patents)，第６巻，第５号，第441〜456頁，1996年）。
【００５３】
ここで、「F(ab')2」及び「Fab'」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領域）とＣL（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶH（Ｈ鎖可変領域）とＣHγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Fab'という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのFab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')2という。
【００５４】
本発明の「モノクローナル抗体を産生する細胞」あるいは「組換えモノクローナル抗体を産生する細胞」とは、前述した本発明のモノクローナル抗体を産生する任意の細胞を意味する。具体的には、例えば、下記（１）乃至（３）のいずれかに記載される細胞を挙げることができる。
（１）前記で定義した哺乳動物のＣＴＧＦ（好ましくはヒトのＣＴＧＦ）若しくはその一部または該ＣＴＧＦを分泌する細胞等で、前述のヒト以外の哺乳動物または前述のヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウス（若しくは他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物）を免疫することにより得られ、該ＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体を産生する該動物から採取され得るモノクローナル抗体産生Ｂ細胞。
（２）そのようにして得られた抗体産生Ｂ細胞を哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合して得られる前述の融合細胞（ハイブリドーマ）。
（３）該モノクローナル抗体産生Ｂ細胞またはモノクローナル抗体産生融合細胞（ハイブリドーマ）から単離される該モノクローナル抗体をコードする遺伝子（重鎖をコードする遺伝子若しくは軽鎖をコードする遺伝子のいずれか一方、または両方の遺伝子）で、該Ｂ細胞及びハイブリドーマ以外の細胞（例えば、CHO（Chinese hamster ovarian）細胞）、BHK（Baby hamster kydney）細胞など）を形質転換して得られるモノクローナル抗体産生形質転換細胞（遺伝子組換え細胞）。
ここで、前記（３）に記載のモノクローナル抗体産生形質転換細胞（遺伝子組換え細胞）は、即ち、前記（１）のＢ細胞または（２）のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の遺伝子組換え体を産生する遺伝子組換え細胞を意味する。これらの抗体産生形質転換細胞は、前述のキメラモノクローナル抗体及びヒト型モノクローナル抗体の製造において用いられる一般的遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。
【００５５】
本発明における「実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体」とは、当該モノクローナル抗体の生物学的性質が、他のモノクローナル抗体の生物学的性質と比較した場合に、少なくとも下記の点で有意な差を有しないことを意味する。
（１）当該モノクローナル抗体を作製するために、非ヒト哺乳動物の免疫に用いた特定の動物由来のＣＴＧＦに対する反応性。
（２）当該特定の動物種のＣＴＧＦに対応する他の動物種のＣＴＧＦに対する反応性（所謂、交叉反応性）。
（３）後述の実施例に記載される種々の試験により求められる特性。
【００５６】
本発明における「哺乳動物由来の抗血清」とは、該本発明のモノクローナル抗体またはその一部に反応性を有する抗体を含む血清を意味する。該抗血清は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ブタあるいはウシ等の哺乳動物、好ましくはラット、モルモット、ウサギあるいはヤギに、前記本発明のモノクローナル抗体あるいはその一部を、前述モノクローナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫して製造することができる。
【００５７】
本発明における「不溶性担体」とは、本発明のモノクローナル抗体若しくはその一部（抗体フラグメント）、または試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＴＧＦを物理学的吸着あるいは化学的結合等によって坦持させるための支持体を意味する。
例えば、下記（Ａ）並びに（Ｂ）などを挙げることができる。
（Ａ）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプラスチックや、ガラス等に代表されるような水に不溶性の物質からなるプレート、試験管若しくはチューブ等の内容積を有するもの、ビーズ（特には、マイクロビーズ）、ボール、フィルター、あるいはメンブレン等。
（Ｂ）セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体を挙げることができる。
【００５８】
本発明の「抗体固定化不溶性担体」とは、前記のような不溶性担体上に、本発明のモノクローナル抗体（または該抗体の一部、即ち抗体フラグメント）が、物理的吸着あるいは化学的結合等によって坦持された状態にある不溶性担体を意味する。これらの抗体固定化不溶性担体は、試料（例えば、血清や血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＴＧＦを検出、定量、分離または精製するために用いることができる。
該検出または定量の目的においては、前記（Ａ）に例示した不溶性担体を用いることができ、とりわけ定量に用いる不溶性担体としては、操作の簡便性及び多数検体の同時処理の観点を考慮すると、例えば９６穴マイクロタイタープレートあるいは４８穴マイクロタイタープレート等の多数のウェル（Well、穴）を有するプラスチック等で作製されたマルチウェルマイクロタイタープレートを用いるのが好ましい。また、該分離または精製の目的においては、前記（Ａ）に例示したフィルター若しくはメンブレンまたは前記（Ｂ）に例示した不溶性担体を用いることができる。
【００５９】
本発明における「単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質」とは、それらを、前述のようなモノクローナル抗体若しくはその一部（抗体フラグメント）、あるいはＣＴＧＦの標準物質に物理化学的結合等により結合させることによりそれらの存在を検出可能にするために用いられる物質を意味する。
具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等であり、さらに具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ若しくは131Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質が挙げられる。
【００６０】
ここで、放射性同位体及び蛍光物質は、単独で検出可能なシグナルをもたらすことができる。一方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらす。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、基質として過酸化水素を用いる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的であるが、この限りではない。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
【００６１】
本発明における「標識抗体」及び「標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質」とは、各々前記のような種々標準物質で標識されたモノクローナル抗体（または抗体フラグメント）及びＣＴＧＦを意味する。これらの標識抗体及び標識標準物質は、試料（例えば、血清や血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＴＧＦを検出、定量、分離または精製するために用いることができる。本発明においては、上記のいずれの標識物質をも使用可能であるが、検出感度あるいは定量感度の高さ及び操作の利便性の点を考慮すると、ペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンで標識するのが好ましい。
【００６２】
ここで「ＣＴＧＦの標準物質」とは、試料中に含まれる濃度（含量）未知のＣＴＧＦと対照的に、あらかじめ単離されているＣＴＧＦを意味し、アッセイの目的に応じて自由にその濃度をコントロールすることができる標品（スタンダード）を意味する。該標準物質は、例えば、検量線の作成に用いることができる。
【００６３】
本発明における「イムノアッセイ」とは、抗原抗体反応の原理に基づき、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原の検出あるいは定量を行う方法を意味し、本発明においては、該抗原抗体反応における抗体が、本発明の哺乳動物のＣＴＧＦに反応性を有する前記のようなモノクローナル抗体（若しくはその抗体のフラグメント）、前記のような抗体固定化不溶性担体（若しくは抗体フラグメント固定化不溶性担体）、または前記のような標識抗体（若しくは標識抗体フラグメント）から選ばれる一つ以上の該モノクローナル抗体（または抗体フラグメント）をであること、及び抗原が哺乳動物のＣＴＧＦであること以外は、これまでに知られているイムノアッセイをも適用することができる。
【００６４】
具体的には、酵素免疫測定法（第３版、石川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載されているような、例えば、一抗体固相法、二抗体液相法、二抗体固相法、サンドイッチ法、ＥＭＩＴ法（Enzyme multiplied immunoassay technique）、エンザイムチャネリングアッセイ（Enzyme channeling immunoassay）、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ（Enzyme modulator mediated enzyme immunoassay、ＥＭＭＩＡ）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（Enzyme inhibitor immunoassay）、イムノエンザイムメトリックアッセイ（Immunoenzymometric assay）、酵素活性増強イムノアッセイ（Enzyme enhanced immunoassay）あるいはプロキシマールリンケージイムノアッセイ（Proximal linkage immunoassay）等、さらには、特公平２−３９７４７号公報に記載されているようなワンポット法を挙げることができる。
【００６５】
本発明においては、このようなイムノアッセイを、目的に応じて適宜選択して用いることができるが、操作上の簡便性及び／または経済的な利便性、とりわけ臨床上での汎用性の点を考慮すると、サンドイッチ法、ワンポット法、一抗体固相法または二抗体液相法を用いるのが好ましく、より好ましくは、サンドイッチ法またはワンポット法である。特に好ましくは、本発明のモノクローナル抗体を、９６穴マイクロプレートに代表されるような多数のウェルを有するマルチウェルマイクロプレートに固定化した抗体固定化不溶性担体と、酵素あるいはビオチンにより標識された標識抗体とを用いるサンドイッチ法、あるいは本発明のモノクローナル抗体を、マイクロビーズ等のビーズまたは微小なボールに固定化した抗体固定化不溶性担体と、酵素あるいはビオチンにより標識された標識抗体とを用いるワンポット法である。
【００６６】
特に好ましい態様において具体的な一例を挙げるならば、図１に記載のモノクローナル抗体である「8-64-6」または「13-51-2」をマイクロプレートまたはマイクロビーズに固定化した抗体固定化不溶性担体と、図１に記載されるモノクローナル抗体である「8-86-2」を酵素またはビオチンで標識した標識抗体との組合わせによるサンドイッチ法またはワンポット法である。
「8-64-6」を固定化した抗体固定化不溶性担体と、「8-86-2」を酵素またはビオチンで標識した標識抗体との組合わせによるイムノアッセイでは、ヒト及びマウスのＣＴＧＦを高感度で検出、定量することができる。また、「13-51-2」を固定化した抗体固定化不溶性担体と、「8-86-2」を酵素またはビオチンで標識した標識抗体との組合わせによるイムノアッセイでは、ラット（本願において初めて開示される）及びマウスのＣＴＧＦを高感度で検出、定量することができる。
【００６７】
以下に、サンドイッチ法、ワンポット法、一抗体固相法及び二抗体液相法について詳述する。
サンドイッチ法は、前述の本発明の前記（５０）で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体に、試料を反応せしめる工程；及び
（ｂ）該抗体固定化不溶性担体と該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複合体に、本発明の標識抗体を反応せしめる工程。
【００６８】
本発明に即して、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロプレートに固定化した「抗体固定化マイクロプレート」を用い、また「標識抗体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンで標識した「標識抗体」を用いて、ヒトまたはマウスのＣＴＧＦを定量する方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。
また、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記載のモノクローナル抗体「13-51-2」をマイクロプレートに固定化した「抗体固定化マイクロプレート」を用い、また「標識抗体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンで標識した「標識抗体」を用いて下記と同様に操作することによって、マウスのＣＴＧＦだけでなくラット（本願において初めて開示される）のＣＴＧＦも定量することができる。
【００６９】
（工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロプレートに固定化し、抗体固定化マイクロプレートを作製する工程；
（工程２）該抗体固定化マイクロプレートにヒトまたはマウスの血清等の試料を加え、該マイクロプレート上に固定化されているモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程；
（工程３）該マイクロプレートを洗浄し未反応の試料を該マイクロプレートから取り除く工程；
（工程４）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識抗体を作製する工程；
（工程５）工程３で洗浄されたマイクロプレートに、該標識抗体を加え、該マイクロプレート上に固定化されたモノクローナル抗体と試料中に含まれるヒトまたはマウスのＣＴＧＦとが反応して形成される抗原抗体複合体に該標識抗体を反応させる工程；
【００７０】
（工程６）マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識抗体を、該マイクロプレートから取り除く工程；
（工程７）工程６で洗浄されたマイクロプレートに、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存して種々の基質（但し、工程５でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程５でビオチンで標識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを反応させる工程；
（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程９）マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００７１】
ワンポット法は、前述の本発明の（５０）、（５１）または（５２）で各々述べた方法である。
即ち、第１は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体に、試料を反応せしめる工程；及び
（ｂ）該抗体固定化不溶性担体と該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複合体に、本発明の標識抗体を反応せしめる工程。
【００７２】
第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の標識抗体と、試料を反応せしめる工程；及び
（ｂ）該標識抗体と試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複合体に、本発明の抗体固定化不溶性担体を反応せしめる工程。
【００７３】
第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体、本発明の標識抗体、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
本発明に即して、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロビーズに固定化した「抗体固定化マイクロビーズ」を用い、また「標識抗体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンで標識した「標識抗体」を用いて、ヒトまたはマウスのＣＴＧＦを定量する方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。
【００７４】
また、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記載のモノクローナル抗体「13-51-2」をマイクロビーズに固定化した「抗体固定化マイクロビーズ」を用い、また「標識抗体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンで標識した「標識抗体」を用いて下記と同様に操作することによって、マウスのＣＴＧＦだけでなくラット（本願において初めて開示される）のＣＴＧＦも定量することができる。
【００７５】
第１の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロビーズに固定化し、抗体固定化マイクロビーズを作製する工程；
（工程２）試験管、マイクロプレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに該抗体固定化マイクロビーズとヒトまたはマウスの血清等の試料を加え、該マイクロビーズ上に固定化されたモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程；
（工程３）容器中の内溶液を除去し、ビーズを洗浄する工程；
（工程４）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識抗体を作製する工程；
（工程５）工程３で洗浄されたビーズを含有する容器に該標識抗体を加え、該ビーズ上に固定化されたモノクローナル抗体と試料中に含まれるヒトまたはマウスのＣＴＧＦとが反応して形成される抗原抗体複合体に該標識抗体を反応させる工程；
【００７６】
（工程６）容器中の内溶液の除去し、ビーズを洗浄することにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；
（工程７）工程６で洗浄されたビーズを含む容器に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存して種々の基質（但し、工程５でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程５でビオチンで標識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを反応させる工程；
（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程９）工程７または工程８の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００７７】
第２の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識抗体を作製する工程；
（工程２）試験管、マイクロプレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに該標識抗体とヒトまたはマウスの血清等の試料を加え、該標識抗体と試料とを反応させる工程；
（工程３）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロビーズに固定化し、抗体固定化マイクロビーズを作製する工程；
（工程４）工程２の反応系に、該ビーズを加え、標識抗体と試料中に含まれるヒトまたはマウスのＣＴＧＦとが反応して形成される抗原抗体複合体と、該ビーズ上に固定化されたモノクローナル抗体とを反応させる工程；
（工程５）容器中の内溶液の除去し、ビーズを洗浄することにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；
【００７８】
（工程６）工程５で洗浄されたビーズを含む容器に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存して種々の基質（但し、工程２でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程２でビオチンで標識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを反応させる工程；
（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程８）工程６または工程７の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００７９】
第３の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロビーズに固定化し、抗体固定化マイクロビーズを作製する工程；
（工程２）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識抗体を作製する工程；
（工程３）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに、工程１で作製された抗体固定化マイクロビーズ、工程２で作製された標識抗体、及びヒトまたはマウスの血清等の試料を加え、該ビーズ上に固定化されたモノクローナル抗体、標識抗体、及び試料を同時に反応させる工程；
（工程４）容器中の内溶液を除去し、該ビーズを洗浄することにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；
【００８０】
（工程５）工程４で洗浄されたビーズを含む容器に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存して種々の基質（但し、工程３でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程３でビオチンで標識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを反応させる工程；
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）工程５または工程６の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００８１】
一抗体固相法は、前述の本発明の（５３）で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体に、試料、並びに単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質を反応せしめる工程。
【００８２】
本発明に即して、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロプレートに固定化した「抗体固定化マイクロプレート」を用い、また「標識物質」として、特に一般的であるペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンを用いて、ヒトまたはマウスのＣＴＧＦを定量する方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。
また、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記載のモノクローナル抗体「13-51-2」をマイクロプレートに固定化した「抗体固定化マイクロプレート」を用い、また「標識物質」として、特に一般的であるペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンを用いて下記と同様に操作することによって、マウスのＣＴＧＦだけでなくラット（本願において初めて開示される）のＣＴＧＦも定量することができる。
【００８３】
（工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロプレートに固定化し、抗体固定化マイクロプレートを作製する工程；
（工程２）ヒトまたはマウスのＣＴＧＦの標準物質をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識ＣＴＧＦ標準物質を作製する工程；
（工程３）該マイクロプレートにヒトまたはマウスの血清等の試料及び該標識ＣＴＧＦ標準物質を加え、該試料と標識標準物質とを、該マイクロプレート上に固定化されたモノクローナル抗体と競合的に反応させる工程；
（工程４）マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識標準物質を、マイクロプレートから取り除く工程；
【００８４】
（工程５）工程４で洗浄されたマイクロプレートに、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存して種々の基質（但し、工程３でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した標識標準物質を用いた場合）またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程３でビオチンで標識した標識標準物質を用いた場合）を加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識標準物質上の標識物質とを反応させる工程；
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００８５】
二抗体液相法は、前述の本発明の（５４）及び（５５）に記載した方法である。
即ち、第一は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）試料、並びに単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質との混合物に、本発明のモノクローナル抗体を反応せしめる工程；及び
（ｂ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノクローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
【００８６】
第２は、少なくとも下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）試料に、本発明のモノクローナル抗体を反応せしめる工程；
（ｂ）（ａ）の工程を行った反応系に、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質を反応せしめる工程；及び
（ｃ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノクローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
【００８７】
本発明に即して、「モノクローナル抗体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」または「8-86-2」を用い、また「標識物質」として、特に一般的であるペルオキシダーゼ等の酵素またはビオチンを用いて、ヒトまたはマウスのＣＴＧＦを定量する方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。
また、「モノクローナル抗体」として図１に記載のモノクローナル抗体「13-51-2」を用い、また「標識物質」としてペルオキシダーゼ等の酵素またはビオチンを用いて下記と同様に操作することによって、マウスのＣＴＧＦだけでなくラット（本願において初めて開示される）のＣＴＧＦも定量することができる。
【００８８】
第１の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒトまたはマウスのＣＴＧＦの標準物質をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識ＣＴＧＦ標準物質を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に、マウスまたはヒトの血清等の試料と工程１で作製された標識ＣＴＧＦ標準物質との混合物を加え、次いで本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」または「8-86-2」を加え、該試料と標識ＣＴＧＦ標準物質とを競合的に該モノクローナル抗体と反応させる工程；
（工程３）ヤギ抗マウスγグロブリン血清等のようなマウス由来のモノクローナル抗体に反応性を有するマウス以外の動物由来の抗血清を加え、工程２において形成される試料中に含まれる哺乳動物ＣＴＧＦ若しくは標識ＣＴＧＦ標準物質と該モノクローナル抗体との抗原抗体複合体に該抗血清を反応させ、該複合体と抗血清とからなる複合凝集物を凝集沈殿させる工程；
（工程４）工程３の反応系を遠心分離して凝集沈殿した複合体を分離する工程；
【００８９】
（工程５）工程４で分離された複合凝集物に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存して種々の基質（但し、工程２でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した標識標準物質を用いた場合）またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程２でビオチンで標識した標識標準物質を用いた場合）を加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識標準物質上の標識物質とを反応させる工程；
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）工程５乃至工程６の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００９０】
第２の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒトまたはマウスのＣＴＧＦの標準物質をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識ＣＴＧＦ標準物質を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器にヒトまたはマウスの血清等の試料を加え、次いで本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」または「8-86-2」を加え、該試料と該モノクローナル抗体とを反応させる工程；
（工程３）工程２の反応系に、工程１で作製した標識ＣＴＧＦ標準物質を加え、該標識ＣＴＧＦ標準物質と、工程２で試料と未反応であった残余のモノクローナル抗体とを反応させる工程；
（工程４）ヤギ抗マウスγグロブリン血清等のようなマウス由来のモノクローナル抗体に反応性を有するマウス以外の動物由来の抗血清を加え、工程２において形成される試料中に含まれる哺乳動物ＣＴＧＦと該モノクローナル抗体との抗原抗体複合体、及び／または工程３において形成される標識ＣＴＧＦ標準物質と該モノクローナル抗体との抗原抗体複合体に、該抗血清を反応させ、該複合体と抗血清とからなる複合凝集物を凝集沈殿させる工程；
（工程５）工程４の反応系を遠心分離して凝集沈殿した複合体を分離する工程；
【００９１】
（工程６）工程５で分離された複合凝集物に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存して種々の基質（但し、工程３でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した標識標準物質を用いた場合）またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程３でビオチンで標識した標識標準物質を用いた場合）を加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識標準物質上の標識物質とを反応させる工程；
（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合には、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程８）工程６乃至工程７の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００９２】
本発明における「アフィニティークロマトグラフィー」とは、抗原と抗体、酵素と基質、あるいは受容体とリガンドといった物質間の相互作用（親和性）を利用することにより試料（例えば、血清及び血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる目的物質を分離または精製する方法を意味する。
本発明発明の方法は、抗原抗体反応、即ち、抗原としての哺乳動物のＣＴＧＦと、哺乳動物のＣＴＧＦに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体との親和性を利用することにより、試料（例えば、血清及び血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＴＧＦを分離または精製する方法を意味する。
【００９３】
具体的には、（１）前述のような不溶性担体であるフィルターあるいはメンブレン等に哺乳動物のＣＴＧＦに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体（あるいは抗体フラグメント）を固定化した後、該フィルターあるいはメンブレンに試料を接触させることにより該試料中に含まれるＣＴＧＦを分離する方法、及び（２）前述のようなセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のような不溶性担体上に本発明の哺乳動物のＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体（あるいは抗体フラグメント）を常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラム（例えば、円柱状カラム）に、試料（例えば、血清若しくは血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）を通じて溶出させることにより、該試料中に含まれるＣＴＧＦを分離あるいは精製する方法である。後者（２）の方法を特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーという。
【００９４】
該アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる前記不溶性担体としては、本発明のモノクローナル抗体（あるいは抗体フラグメント）を固定化でき得るものであればどのような不溶性担体でも使用できるが、例えば、市販品である、ファルマシア(Pharmacia)社製のSepharose 2B、Sepharose 4B、Sepharose 6B、CNBr-activated Sepharose 4B、AH-Sepharose 4B、CH-Sepharose 4B、Activated CH-Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B、Activated thiol-Sepharose 4B、Sephadex、CM-Sephadex、ECH-Sepharose 4B、EAH-Sepharose 4B、NHS-activated SepharoseあるいはThiopropyl Sepharose 6B等、バイオラッド(Bio-Rad)社製のBio-Gel A、Cellex、Cellex AE、Cellex-CM、Cellex PAB、Bio-Gel P、Hydrazide Bio-Gel P、Aminoethyl Bio-Gel P、Bio-Gel CM、Affi-Gel 10、Affi-Gel 15、Affi-Prep 10、Affi-Gel Hz、Affi-Prep Hz、Affi-Gel 102、CM Bio-Gel A、Affi-Gel heparin、Affi-Gel 501あるいはAffi-Gel 601等、和光純薬工業社製のクロマゲルＡ、クロマゲルＰ、エンザフィックス P-HZ、エンザフィックスP-SHあるいはエンザフィックスP-AB等、セルバ(Serva)社製のAE-Cellurose、CM-CelluroseあるいはPAB Cellurose等を挙げることができる。
【００９５】
本発明における「医薬組成物」は、有効成分としての本発明のモノクローナル抗体若しくはその一部、後述の「ＣＴＧＦ阻害剤」、「ＣＴＧＦ産生抑制剤」または「ＣＴＧＦの刺激の刺激により増殖する能力を有する細胞のＣＴＧＦの刺激による増殖を抑制する能力を有する物質」のいずれかと「薬学的に許容され得る担体」とからなる医薬品として有用な組成物である。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００９６】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（前記タンパクや抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg（あるいは10μgから500mg）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に0.1μg抗体／ml担体〜10mg抗体／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。
【００９７】
このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μg〜100mgの割合で、好ましくは50μg〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、生体の種々の組織に由来するＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を有する細胞（例えば、種々の繊維芽細胞、種々の血管内皮細胞、種々の細胞など）の増殖を抑制するために有用である。該組織としては、例えば、脳、頚部、肺、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、胃、大腸、小腸、十二指腸、骨髄、子宮、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、口腔、舌、及び血管が挙げられる。好ましくは、肺、肝臓、腎臓または皮膚を挙げることができる。
上述したとおり、本発明の医薬組成物は、上記のようなＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を有する細胞の増殖を抑制できることから、本発明の医薬組成物は、また、上記のような種々の組織における該細胞の増殖を伴う種々の疾患の治療または予防のための医薬品として有用である。当該疾患における細胞増殖を伴う組織としては、例えば、脳、頚部、肺、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、胃、大腸、小腸、十二指腸、骨髄、子宮、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、口腔、舌、及び血管が挙げられる。好ましくは、肺、肝臓、腎臓または皮膚を挙げることができる。
【００９９】
該疾患としては、例えば、種々組織における繊維症（腎繊維症、肺繊維症、肝臓における繊維症、皮膚における繊維症など）、腎臓疾患（例えば、腎繊維症、腎炎、腎不全など）、肺における疾患（例えば、肺繊維症、肺炎など）、皮膚疾患（例えば、乾癬、強皮症、アトピー、ケロイドなど）、肝臓疾患（例えば、肝臓での繊維症、肝炎、肝硬変など）、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ）、種々の癌、あるいは動脈硬化症等の治療または予防への適用が可能である。
好ましくは、腎臓疾患（例えば、腎繊維症、腎炎、腎不全など）、肺における疾患（例えば、肺繊維症、肺炎など）、皮膚疾患（例えば、乾癬、強皮症、アトピー、ケロイドなど）、あるいは肝臓疾患（例えば、肝臓での繊維症、肝炎、肝硬変など）を挙げることができる。
さらに好ましくは、腎臓疾患（例えば、腎繊維症、腎炎、腎不全など）をあげることができる。
【０１００】
また、本発明の医薬組成物には、「ＣＴＧＦ阻害剤」、「ＣＴＧＦ産生阻害剤」、あるいは「ＣＴＧＦの刺激の刺激により増殖する能力を有する細胞のＣＴＧＦの刺激による増殖を抑制する能力を有する物質」を含んでなる医薬組成物も包含される。
ここで、該「ＣＴＧＦ阻害剤」、該「ＣＴＧＦ産生阻害剤」あるいは該「物質」とは、ＣＴＧＦの生物学的機能を抑制または阻害する活性を有する物質または各種細胞からのＣＴＧＦの産生を抑制若しくは阻害する活性を有する物質を意味する。例えば下記のいずれかの活性を有する物質を挙げることができる。
（１）ヒト腎臓由来繊維芽細胞（例えば、細胞株293-T（ATCC CRL-1573））とヒトのＣＴＧＦとの結合、または該細胞とマウスのＣＴＧＦとの結合を抑制若しくは阻害する。
（２）ラット腎臓由来繊維芽細胞株（例えば、細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570））、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）またはヒト肺由来繊維芽細胞のいずれかとヒトのＣＴＧＦとの結合を抑制若しくは阻害する。
（３）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激によるラット腎臓由来繊維芽細胞株（例えば、細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570））の細胞増殖を抑制若しくは阻害する。
（４）ヒドロキシプロリンの生成が上昇傾向を示している腎臓における該ヒドロキシプロリンの生成の上昇を抑制若しくは阻害する。
【０１０１】
上述の「物質」は具体的には、例えば下記のような物質を挙げることができる。
（ａ）前述した本発明のモノクローナル抗体（天然由来の抗体若しくは組換え抗体に限らない。）または該抗体の一部。
（ｂ）アンチセンスＤＮＡ。
（ｃ）アンチセンスＲＮＡ。
（ｄ）上記（ａ）乃至（ｃ）以外の低分子化学物質（化学的合成物または天然物）。
【０１０２】
本発明におけるアンチセンスＤＮＡとは、哺乳動物（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコードするＤＮＡの塩基配列中の部分塩基配列を含むＤＮＡ若しくは該ＤＮＡの一部が化学修飾されているＤＮＡ、または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ若しくは該ＤＮＡの一部が化学修飾されているＤＮＡをあげることができる。
【０１０３】
ここで、「部分塩基配列」とは、哺乳動物（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコードするＤＮＡの塩基配列中に含まれる任意の部位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味する。
該ＤＮＡは、該タンパクコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズすることにより、該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写あるいは該ｍＲＮＡのタンパクへの翻訳を阻害することにより、ＣＴＧＦタンパクの産生を阻害することができる。
【０１０４】
該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。
また、このＤＮＡをアンチセンス医薬として用いる場合には、該ＤＮＡが患者の体内に投与された場合の血中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の増大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該ＤＮＡの塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、3’及び／または5’末端等の化学修飾が挙げられる。
【０１０５】
リン酸結合の修飾としては、１以上の該結合を、ホスホジエステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合（S-オリゴ）、メチルホスホネート結合（MP-オリゴ）、ホスホロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチオエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、2'-フルオロリボースあるいは2'-O-メチルリボースへなどへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾としては、5-プロピニルウラシルまたは2-アミノアデニンなどへの変更が挙げられる。
【０１０６】
本発明におけるアンチセンスＲＮＡとは、哺乳動物（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコードするＲＮＡの塩基配列中の部分塩基配列を含むＲＮＡ若しくは該ＲＮＡの一部が化学修飾されているＲＮＡ、または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を含むＲＮＡ若しくは該ＲＮＡの一部が化学修飾されているＲＮＡをあげることができる。
【０１０７】
ここで、「部分塩基配列」とは、哺乳動物（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコードするＲＮＡの塩基配列中に含まれる任意の部位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味する。
該ＲＮＡは、該タンパクコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズすることにより、該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写あるいは該ｍＲＮＡのタンパクへの翻訳を阻害することにより、ＣＴＧＦタンパクの産生を阻害することができる。
【０１０８】
該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。
また、このＲＮＡをアンチセンス医薬として用いる場合には、該ＲＮＡが患者の体内に投与された場合の血中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の増大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該ＲＮＡの塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、3’及び／または5’末端等の化学修飾が挙げられる。
【０１０９】
リン酸結合の修飾としては、１以上の該結合を、ホスホジエステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合（S-オリゴ）、メチルホスホネート結合（MP-オリゴ）、ホスホロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチオエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、2'-フルオロリボースあるいは2'-O-メチルリボースへなどへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾としては、5-プロピニルウラシルまたは2-アミノアデニンなどへの変更が挙げられる。
【０１１０】
また、本発明の医薬組成物の種々疾患症状の治療効果については、常法に従って、既知の疾患モデル動物に投与することにより試験、検討することができる。
例えば、組織繊維症の一つであり、また腎臓疾患の１つでもある腎繊維症の治療効果の検討の場合には、マウスの一方の尿管を結紮し腎臓の血液等のろ過機能を停止させることにより腎機能不全を惹起させたモデルマウス（UUOモデル、Unilateral ureteral obstruction）に、本発明の医薬組成物を投与し、該腎機能不全により惹起される腎炎及び腎繊維症の発症の指標であるヒドロキシプロリンの生成の上昇を抑制する程度を測定する方法を用いることができる。該ヒドロキシプロリンの濃度の低減は、該医薬組成物が該腎臓疾患の治療に有効であることを示すものである。
【０１１１】
腎疾患、例えば、微小糸球体異常（例えば、ネフローゼ型微小変化群（MCNS)）、巣状糸球体硬化症（FGS）、膜性糸球体腎炎（膜性腎症、MN)、IgA腎症、メサンギウム増殖性腎炎、溶連菌感染後急性糸球体腎炎（APSGN）、半月体形成性（管外性）腎炎、間質性腎炎、あるいは急性腎不全などについては、既報に詳述されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、p.34-46、1993、技術情報協会（発行））。
皮膚疾患、例えば、創傷、ケロイド、アトピー、皮膚炎、強皮症あるいは乾癬などについては、既報に詳述されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、p.229-235、1993、技術情報協会（発行））。
【０１１２】
肝臓疾患、例えば、肝炎（例えば、ウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型など）など）、肝硬変あるいは薬物肝障害などについては、既報に詳述されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、p.119-129及びp.349-358、1993、技術情報協会（発行））。
例えば、動脈硬化症及び再狭窄への効果の検討の場合には、ラット大動脈にバルーンカテーテルを挿入しPTCAを施し疑似的に作成した再狭窄モデルを使用することができる。
【０１１３】
例えば、腫瘍の増殖及び転移への効果の確認の場合には、Ｂａｌｂ／ｃマウス等の正常マウス、ヌードマウスもしくはＳＣＩＤマウス等のモデルマウス等の市販のマウスの例えば皮下、尾静脈、脾臓内、腎被膜下、腹腔内あるいは盲腸壁内等に、癌細胞を移植することにより作製した癌転移モデルを用いることができる。
【０１１４】
本発明の「ラットのＣＴＧＦ」（具体的には、配列番号２に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する）及び「ラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ」（具体的には、配列番号１に記載される塩基配列中の塩基番号213乃至1256迄の塩基配列を含むＤＮＡ）は、下記のような意味を以て定義されるとともに、下記に述べるような常法に従って製造することができる。
【０１１５】
なお、「実質的に同一」なる用語は前述のとおりの意味を有する。
本発明の「ラットのＣＴＧＦ」は、後述するような遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
本発明の「ＤＮＡ」は、本発明のラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡであって、本発明のラットのＣＴＧＦをコードし得るいかなる塩基配列をも包含する。
具体的には、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。好適な態様としては、配列番号１に記載される塩基配列中の塩基番号213乃至1256迄の塩基配列を含むＤＮＡ（例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）が挙げられる。
【０１１６】
本発明におけるラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ及びゲノミックＤＮＡのいずれをも包含する。
本発明においては、同一のアミノ酸をコードするコドンであればどのようなコドンから構成されるＤＮＡを含む。
また、本発明のＤＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
【０１１７】
本発明におけるラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡは、常法に従って、該ラットのＣＴＧＦをコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、該ｃＤＮＡ配列若しくはｍＲＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲにより調製する方法、または化学合成する方法等により取得することができる。
本発明のラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡは、そのようにして調製した該ラットのＣＴＧＦをコードする各々のＤＮＡを適切な制限酵素による切断（消化）し、得られたＤＮＡ断片を、必要に応じてリンカーＤＮＡあるいはタグ（Ｔａｇ）と共に、適切なＤＮＡポリメラーゼ等を用いて連結することにより調製することができる。
【０１１８】
該ラットのＣＴＧＦ（以下、目的蛋白という）をコードするｃＤＮＡをｍＲＮＡからクローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、目的蛋白を発現・産生する組織あるいは細胞（例えば、ラット線維芽細胞など）から目的蛋白をコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法（チャーグウィン（Chirgwin）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、第１８巻、第５２９４頁、１９７９年）、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤマらの方法（モレキュラーセルバイオロジー（Mol. Cell. Biol.）、第２巻、第１６１頁、１９８２年及び同誌 第３巻、第２８０頁、１９８３年）やホフマン（Hoffman）らの方法（ジーン（Gene）、第２５巻、第２６３頁、１９８３年）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０１１９】
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてｐＵＣ１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で目的蛋白をコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えばマニアティス（Maniatis）らの方法（モレキュラークローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、第1.53頁、１９８９年）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、ヒュン（Hyunh）らの方法（ＤＮＡクローニング、プラクティカルアプローチ（DNA Cloning, a practical approach）、第1巻、第49頁、１９８５年）などが挙げられる。簡便には、市販のクローニングキット（例えば、宝酒造社製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＨＢ１０１、ＤＨ５α、Ｙ１０９０、ＤＨ１０ＢまたはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。
【０１２０】
プラスミドを宿主に導入する方法としては、（モレキュラークローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、第1.74頁、１９８９年）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製、アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
上記の方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから、目的蛋白をコードするｃＤＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を組み合わせることによって行うことができる。
【０１２１】
例えば、別個に目的蛋白のアミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法（クランシュタイン（Crunstein）ら、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンス（Proc. Natl. Acid. Sci. USA）、第７２巻、第３９６１頁、１９７５年）またはプラークハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition , Cold Spring Harbor Laboratory、第2.108 頁、１９８９年）により、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方法、ＰＣＲプライマーを作製し目的蛋白の特定領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。
【０１２２】
また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λｇｔ１１等のファージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、目的蛋白に反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マキサム（Maxam）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第７４巻、第５６０頁、１９７７年）あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法（サンガー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第７４巻、第５４６ ３〜５４６７頁、１９７７年）によって決定することができる。目的蛋白をコードする遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【０１２３】
また、前述のような目的蛋白を発現する細胞に由来するゲノムＤＮＡから目的蛋白をコードするＤＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
該細胞を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クローンから目的蛋白をコードする遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
【０１２４】
目的蛋白をコードするＤＮＡのＰＣＲによる調製は、該目的蛋白の既知のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型として常法により調製することができる（「遺伝子増幅ＰＣＲ法・基礎と新しい展開」、共立出版株式会社発行、1992年など）。
また、化学的合成による目的蛋白をコードするＤＮＡの製造は、目的蛋白の塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができる。
【０１２５】
本発明のラットのＣＴＧＦは、上述に例示した方法を用いて調製したラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはイントロンを含むゲノミックＤＮＡ）を、各々適切な制限酵素で切断することにより、該ラットのＣＴＧＦコードするＤＮＡ断片を得、それらの断片を、必要に応じてリンカーＤＮＡあるいはタグ（Ｔａｇ）と共に、適切なＤＮＡポリメラーゼ等を用いて連結させて得たＤＮＡを用いて、慣用される遺伝子組換え技術を用いて、常法により組換え蛋白として調製することができる。
具体的には下記の例示されるとおりである。即ち、上述のようにして調製したＤＮＡを、下記に詳述するようなベクターに挿入して発現ベクターを作成し、該発現ベクターで後述するような宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る。該形質転換体を培養することにより、培養上清中に該目的蛋白を産生させる。培養上清中の該目的蛋白は、カラムクロマトグラフィー等を用いて容易に精製することができる。
【０１２６】
本発明は、また本発明のラットＣＴＧＦをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される（Cloning Vectors: A Laboratory Manual, エルスビュ−社、ニューヨーク、1985年）。
当該発現ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリアファージＤＮＡ）に本発明のラットＣＴＧＦをコードするＤＮＡを常法により連結することによって調製することができる。
用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH19、pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB110、pTP5、pC194などが例示される。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、インビトロゲン社製）が例示される。
【０１２７】
本発明のラットＣＴＧＦをコードするＤＮＡを発現させ該ラットＣＴＧＦを生産させる目的においては、プラスミドベクターが有用である。プラスミドベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で該ラットＣＴＧＦをコードする遺伝子を発現し、これらのポリペプチドを生産する機能を有するものであれば特に制限されない。例えば、pMAL C2、pcDNA3.1(-)、pEF-BOS（ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Research）、第１８巻、第５３２２頁、１９９０年等）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を挙げることができる。
【０１２８】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明のラットＣＴＧＦをコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、本発明のラットＣＴＧＦをコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
【０１２９】
細菌中で本発明のラットＣＴＧＦを発現させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペレーターおよびShine-Dalgarno(SD)配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどを含むものが例示される。
酵母中で本発明のラットＣＴＧＦを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。
また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ＳＶ−４０、レトロウイルスである。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
【０１３０】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ）が例示される。
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E.coliではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149、プラスミドpSV2bsr等があげられる。
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【０１３１】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
【０１３２】
本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のリストリクションサイトなど）を用いることができる。
本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
【０１３３】
本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には大腸菌（DH5α、DH10B、TB1、HB101、XL-2Blue等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、C127、Sp2/0、NS-1またはNIH3T3等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（BHKおよびCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびNamalwa等）などが例示される。
発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことができる。
【０１３４】
例えば、細菌（E.coli、Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第６９巻、第２１１０頁、１９７２年）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet.、第１６８巻、第１１１頁、１９７９年）やコンピテント法（ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（J. Mol. Biol.）、第５６巻、第２０９頁、１９７１年）によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばハイネン（Hinnen）らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第７５巻、第１９２７頁、１９７８年）やリチウム法（J. Bacteriol.、第１５３巻、第１６３頁、１９８３年）によって、動物細胞の場合は、例えばグラハム（Graham）の方法（バイロロジー（Virology）、第５２巻、第４５６頁、１９７３年）、昆虫細胞の場合は、例えばサマーズ（Summers）らの方法（Mol. Cell. Biol.、第３巻、第２１５６〜第２１６５頁、１９８３年）によってそれぞれ形質転換することができる。
【０１３５】
本発明のラットＣＴＧＦは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。
【０１３６】
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。
宿主がE.coliの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、Exp. Mol. Genet、Cold Spring Harbor Laboratory、第４３１頁、１９７２年）、ＹＴ培地等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
【０１３７】
宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkholder最小培（ボスチアン（Bostian）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７７巻、第４５０５頁、１９８０年）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（サイエンス（Science）、第１２２巻、第５０１頁、１９５２年）、ＤＭＥＭ培地（バイロロジー（Virology）、第８巻、第３９６頁、１９５９年）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. Am. Med. Assoc.、第１９９巻、第５１９頁、１９６７年）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Biol. Med.、第７３巻、第１頁、１９５０年）、HamF12培地等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【０１３８】
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８２巻、第８４０４頁、１９８５年）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
本発明のラットＣＴＧＦは、上述のような形質転換細胞（特に動物細胞または大腸菌）を培養することにより、培養上清中に分泌させることにより製造することができる。即ち、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って該本発明のラットＣＴＧＦを精製、単離する。
【０１３９】
単離、精製方法としては、例えばアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【０１４０】
一方、本発明のラットＣＴＧＦが培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明のラットＣＴＧＦを含有する膜画分を得る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。
そして、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。
【０１４１】
本発明における「トランスジェニックマウス」は、上述のような方法に従って調製できるヒトＣＴＧＦをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ）がマウスの内在性遺伝子座上にインテグレート（integrate）されているトランスジェニックマウスマウスであり、該トランスジェニックマウスは、体内にヒトＣＴＧＦを発現、分泌する。
【０１４２】
該トランスジェニックマウスは、前述したようなトランスジェニック動物の製造において通常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年を参照）に従って作製することが可能である。具体的には、例えば、正常マウス胚盤胞（blastcyst）のから取得したＥＳ細胞（embryonic stem cell）を、該ヒトＣＴＧＦをコードする遺伝子が発現可能なように挿入された発現ベクターで形質転換する。ヒトＣＴＧＦをコードする遺伝子が内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞を常法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（肺盤胞）にマイクロインジェクションする（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 1980；米国特許第4,873,191号公報）。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得る。該ヘテロ（heterogeneic）トランスジェニックマウス同士を交配することにより、メンデルの法則に従って、ホモ（homogeneic）トランスジェニックマウスが得られる。
【０１４３】
【実施例】
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
【０１４４】
実施例１  ヒトＣＴＧＦに対するポリクローナル抗体の調製
ヒトＣＴＧＦの第242乃至第252番目のアミノ酸配列（Cys-Glu-Ala-Asp-Leu-Glu-Glu-Asn-Ile-Lys）にあたるペプチドを、ペプチドシンセサイザー（Applied Biosystems社製）を用いて常法に従って合成した。免疫感作抗原としては、該ペプチドをフロインド完全アジュバント（Freuind's complete adjuvant）とともにエマルジョン化したものを用いた。該ペプチド（0.32mg/kg）を、ニュジーランドホワイトウサギ（ＮＺＷ、Simunek, Inc.製）の皮下に１日目（0.8mg）、１４日目（0.8mg）、３５日目（0.8mg）及び４９日目（0.8mg）という間隔及び量で投与した。該ペプチドを用いて、適宜、血清中の抗体価を測定した。次いで、常法により血清を取得し、該ペプチドをカップリングさせたアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより該血清から、ヒトＣＴＧＦに対するポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を精製した。ヒトＣＴＧＦに対する反応性を、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）及びウェスタンブロッティングにより確認した。
【０１４５】
実施例２  組換えヒトＣＴＧＦの調製
＜２−１＞ヒト腎臓由来線維芽細胞株２９３での一過性発現
ヒトＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて常法により調製した。
具体的には、ヒト軟骨腫細胞株ＨＣＳ２／８から調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ヒトＣＴＧＦのｃＤＮＡ（The Journal of Cell Biology, Vol.114, No.6, p.1287-1294, 1991）を基に設計したプライマーを用いて合成した。得られた翻訳領域を含むヒトＣＴＧＦのｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ3.1(-)（Invitrogen社製）に挿入し発現ベクターを作成し、エレクトロポレ−ションにより、該ベクターでヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）を形質転換した。形質転換細胞を、無血清培地ASF104（味の素社製）中で３日間培養し、組換えヒトＣＴＧＦを一過性に発現させた。ヒトＣＴＧＦの発現を、実施例１で調製したポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。
培養上清を回収し、硫酸アンモニウム沈澱法に供した後、ヘパリンカラムクロマトグラフィーに供し、0.3MのNaCl/PBSで洗浄した後、0.5MのNaCl/PBSで溶出し、部分精製ヒトＣＴＧＦ画分を得た。
【０１４６】
＜２−２＞ヒト上皮様細胞株Helaでの安定発現
実施例＜２−１＞と同様の方法により、ヒトＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて常法により調製した。得られた翻訳領域を含むヒトＣＴＧＦのｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ3.1(-)（Invitrogen社製）に挿入し発現ベクターを作成し、エレクトロポレ−ションにより、該ベクターでヒト上皮様細胞株Hela（ATCC CCL-2）を形質転換した。形質転換細胞を、Geneticin（0.8mg/ml；GIBCO-BRL社製）及び10%ウシ胎児血清（fetal calf serum）を含有するRPMI1640培地中で約２週間培養することにより、Geneticin耐性形質転換細胞クローンを選別した。選別された形質転換細胞を、無血清培地ASF104（味の素社製）中で培養し、組換えヒトＣＴＧＦをに発現させた。ヒトＣＴＧＦの発現を、実施例１で調製したポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。
培養上清を回収し、硫酸アンモニウム沈澱法に供した後、ヘパリンカラムクロマトグラフィーに供し、0.3MのNaCl/PBSで洗浄した後、0.5MのNaCl/PBSで溶出し、部分精製ヒトＣＴＧＦ画分を得た。
【０１４７】
実施例３  組換えマウスＣＴＧＦの調製
既報のマウスＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡ配列（特開平5-255397号公報、Cell Growth Differ., Vol.2, No.5, p.225-233, 1991；FEBS Letters, Vol.327, No.2, p.125-130, 1993；及びDNA Cell Biol., Vol.10, No.4, p.293-300, 1991を参照。）に基づき、実施例２と同様にして部分精製組換えマウスＣＴＧＦを調製した。
【０１４８】
実施例４  抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体並びに抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第６６〜第７４頁、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。
免疫原としてのヒトＣＴＧＦは、実施例２で２種類の方法を用いて調製した組換えヒトＣＴＧＦのいずれか、またはそれらの混合物を用いた。またマウスＣＴＧＦは、実施例３で調製した組換えマウスＣＴＧＦを用いた。
被免疫動物としては、▲１▼正常マウス（BALB/cマウス、雌、４〜５週齢、静岡研究動物センター（製））、▲２▼正常ラット（Wistarラット、雌、４〜５週齢、静岡研究動物センター（製））、▲３▼正常ハムスター（Armenianハムスター、雄、４〜５週齢、オリエンタル酵母（製））並びに▲４▼前述の方法を用いて製造したヒト抗体産生トランスジェニックマウス（Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年等に記載の方法に従って作製した。）を用いた。
特に断わりのない限り、いずれの動物を用いた場合のモノクローナル抗体の作製も同一の方法を用いた。また、細胞培養操作は、マルチウェルマイクロプレートを用いて行った。
【０１４９】
＜４−１＞  抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
前記の正常マウス及びヒト抗体産生トランスジェニックマウスの各々に、実施例２で調製した部分精製組換えヒトＣＴＧＦ（1μｇ/匹）を、完全フロインドアジュバント（Complete Freund's Adjuvant）とともにフッドパッド内注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から１週間毎に同組換えヒトＣＴＧＦをフッドパッド内注射により４回以上追加免疫し、さらに以下に述べるリンパ節細胞の取得の前々日にも同様にして最終免疫した。
各々の動物から採取したリンパ節細胞とマウスミエローマ細胞とを５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール4000またはポリエチレングリコール1500（GIBCO社製）を用いて細胞融合させることによりハイブリドーマを作製した。なお、正常マウスのリンパ節細胞の細胞融合は、マウスミエローマＰＡＩ（JCR No.B0113；Res. Disclosure Vol. 217, p.155, 1982）を用い、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのリンパ節細胞の細胞融合は、マウスミエローマP3/X63-AG8.653（ATCC No.: CRL-1580）を用いた。
ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Fetal Calf Serum、ＦＣＳ）とアミノプテリンを含有するＨＡＴ含有ASF104培地（味の素（製））中で培養することにより行った。
各々のハイブリドーマクローンの培養上清の、免疫原として用いた組換えヒトＣＴＧＦに対する反応性を、後述するＥＬＩＳＡにより測定することにより各々の動物種について多数の抗体産生ハイブリドーマを得た。
【０１５０】
正常マウス（マウス抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体）については、8-64-6、8-86-2、8-97-3、8-149-3及び15-38-1と命名したクローンを得た（図１）。
ハイブリドーマクローン8-86-2及び8-64-6は共に、平成９年１２月１８日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目1番3号）に国際寄託した（クローン8-86-2：国際寄託番号FERM BP-6208；クローン8-64-6：国際寄託番号FERM BP-6209）。
ヒト抗体産生トランスジェニックマウス（ヒト抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体）については、A4.3、A11.1、A15.1、A29.6、B13.7、B22.2、B29.6、B35.1、C2.1、C26.11、C59.1、C114.4、M32.2、M33.3、M84.4、M107.2、M122、M124,6、M194.2、M244、M255、M268.1、M288.5、M291.2、M295.2、M315、M320.2、N45.2、N50.1及びN60.1と命名したクローンを得た（図１及び図２）。
【０１５１】
ハイブリドーマクローンA11.1は、平成１０年９月２５日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目1番3号）に国際寄託した（国際寄託番号FERM BP-6535）。
また、ハイブリドーマクローンB22.2、M84.4及びM320.2は共に、平成１０年１２月１５日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目1番3号）に国際寄託した（クローンB22.2：国際寄託番号FERM BP-6598；  クローンM84.4：国際寄託番号FERM BP-6599；  クローンM320.2：国際寄託番号FERM BP-6600）。
なお、上記に示したとおり、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに当該実施例における試験結果として示した図面または表中においては、本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを、記号を用いて命名した。
当該記号中のピリオド記号より前に記載したアルファベットと数字は合わせて親クローンの名前を表す。また、上記各々の親クローンからサブクローニングされたハイブリドーマクローンは、その親クローン名の直後のピリオド記号の次にさらなる番号を付加することによって命名した。
なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに当該実施例における試験結果として示した図面または表中においては、当該サブクローニングによる番号を省略して記載する場合があるが、それらのいずれも図１または図2に記載したクローンと同一の細胞である。
【０１５２】
＜４−２＞  抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
前記の正常ラット及び正常ハムスターに、実施例３で調製した部分精製組換えマウスＣＴＧＦ（2μｇ/匹）を、完全フロインドアジュバント（Complete Freund's Adjuvant）とともにフッドパッド内注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から一週間毎に４回以上同組換えマウスＣＴＧＦをフッドパッド内注射により追加免疫し、さらに以下に述べるリンパ節細胞の取得の前々日にも同様にして最終免疫した。
各々の免疫感作動物の膝窩リンパ節細胞を常法に従って外科手術により採取した。
各々の動物から採取したリンパ節細胞とマウスミエローマ細胞ＰＡＩ（JCR No.B0113；Res. Disclosure Vol. 217, p.155, 1982）とを５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール4000またはポリエチレングリコール1500（GIBCO社製）を用いて細胞融合させることによりハイブリドーマを作製した。
ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Fetal Calf Serum、ＦＣＳ）とアミノプテリンを含有するHAT含有ASF104培地（味の素（製））中で培養することにより行った。
【０１５３】
各々のハイブリドーマクローンの培養上清の、免疫原として用いた組換えマウスＣＴＧＦに対する反応性を、後述するＥＬＩＳＡにより測定することにより各々の動物種について多数の抗体産生ハイブリドーマを得た。
正常ラット（ラット抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体）については、13-51-2、17-132、23-96、24-53、24-67、25-91、25-101、25-256、25-338、25-410及び25-463と命名したクローンを得た（図１）。
正常ハムスター（ハムスター抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体）については、2-228-1と命名したクローンを得た（図１）。
【０１５４】
＜４−３＞  モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのELISAによるスクリーニング
実施例＜４−１＞及び＜４−２＞で行ったELISAは、下記のとおりである。
実施例２で調製した組換えヒトＣＴＧＦ（0.2μｇ/ウェル）または実施例３で調製した組換えマウスＣＴＧＦ（0.2μｇ/ウェル）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（コーニング（Corning）社製）の各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、組換えヒトＣＴＧＦまたは組換えマウスＣＴＧＦをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルに、ブロッキング試薬（200μｌ、３％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）を加え室温で２時間インキュベートし、ＣＴＧＦが結合していない部位をブロックした。各ウェルを、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液200μlで３回洗浄した。このようにして、各ウェルを組換えヒトＣＴＧＦまたは組換えマウスＣＴＧＦでコーティングしたマイクロプレートを作製した。
各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（100μl）を加え、４０分間反応させた後、各ウェルを、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液200μlで３回洗浄した。
【０１５５】
次いで、正常マウス由来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加えたウェルにはビオチンで標識したヒツジ抗マウスイムノグロブリン抗体（50μl、アマシャム社製）を、正常ラット由来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加えたウェルにはビオチンで標識したヒツジ抗ラットイムノグロブリン抗体（50μl、アマシャム社製）を、正常ハムスター由来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加えたウェルにはビオチンで標識したヤギ抗ハムスターイムノグロブリン抗体（50μl、Cedarlane社製）を、またヒト抗体産生トランスジェニックマウス由来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加えたウェルにはビオチンで標識したヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体（50μl、アメリカンコーレックス社製）を加え、室温下で１時間インキュベートした。
【０１５６】
マイクロプレートを、0.1%Tween20を含有するリン酸緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミン（BSA、1mg/ml）を含有する0.5MのNaClと20mMのHEPESからなる溶液（pH7.0）で1000倍に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Streptoavidin-β-galactosidase、50μl、Gibco BRL社製））を各ウェルに加え、室温下で３０分間インキュベートした。
次いで、マイクロプレートを、0.1%Tween20を含有するリン酸緩衝液で洗浄後、1mg/mlのBSAを含有する100mMのNaCl、1mMのMgCl2及び10mMのリン酸緩衝液からなる溶液（pH7.0）で希釈した１％の４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside、50μl、シグマ（Sigma）社製）を各ウェルに加え、室温下で１０分間インキュベートした。各ウェルに、1MのNa2CO3（100μl）を加え、反応を止めた。波長460nm（励起：355nm）での蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II microplate fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories Inc.）（製））で測定した。
【０１５７】
＜４−４＞  モノクローナル抗体の大量調製
ＩＣＲヌードマウス（雌、７〜８週齢、チャールズリバー社製）に、前記の各々のハイブリドーマクローン（各々１０6〜１０7個／0.5ml／マウス）を、腹腔内注射した。１０〜２０日後、マウスを麻酔下で開腹し、常法により採取した腹水から各々のモノクローナル抗体を大量に調製した。
【０１５８】
＜４−５＞  モノクローナル抗体の精製
前記＜４−４＞で取得した各々のモノクローナル抗体腹水を遠心して得た遠心上清を、0.06Mの酢酸緩衝液（pH4.0）で３倍に希釈し、１Ｎの塩酸を加えｐＨを4.8に調整した。次いで、カプリル酸（Caprylic acid、和光純薬工業製）を、腹水１ｍｌに対して0.033mlになるように室温下で撹拌しながら少しずつ加え、撹拌しながら３０分間反応させた。次いで、遠心分離（10,000rpm、２０分間）し、抗体以外の蛋白を沈殿させた。遠心上清を回収し、フィルター（ミリポア社製）で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液を、リン酸緩衝液で透析（２時間）した。
透析後、硫酸アンモニウム（26.2g/100ml）を撹拌しながら少しずつ加え、撹拌しながら４℃で120分間反応させた。次いで、遠心分離（10,000ｒｐｍ、２０分間）して、沈殿物を回収した。回収した沈殿物に、リン酸緩衝液を加え、リン酸緩衝液で透析（４℃、２４時間）し、各々の精製モノクローナル抗体を得た。
【０１５９】
＜４−６＞  アイソタイプの決定
マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイプ決定用キット（アマシャム社製）を用い、該キットに添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、前述の正常マウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体（8-64-6、8-86-2、8-97-3、8-149-3及び15-38-1）の各々のアイソタイプを決定した。いずれもＩｇＧ１／κであることが確認された（図１）。
ヒトモノクロ−ナル抗体アイソタイプ決定用キット（アメリカン・コーレックス社製）を用い、該キットに添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、前述のヒト抗体産生トランスジェニックマウス由来のヒト抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体（A4.3、A11.1、A15.1、A29.6、B13.7、B22.2、B29.6、B35.1、C2.1、C26.11、C59.1、C114.4、M32.2、M33.3、M84.4、M107.2、M122、M124,6、M194.2、M244、M255、M268.1、M288.5、M291.2、M295.2、M315、M320.2、N45.2、N50.1及びN60.1）の各々のアイソタイプを決定した。いずれもＩｇＧ２／κであることが確認された（図１及び図２）。
【０１６０】
＜４−７＞  アフィニティーカラムの作製
ＮＨＳ活性化ハイトラップカラム（HiTrap-NHS-activated Sepharose HP、5ml、ファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のプロトコールに従ってアフィニティーカラムを作製した。具体的には、下記のとおりである。
0.5MのNaClを含有する0.2Mの炭酸水素ナトリウム溶液（pH8.3）中に溶解した実施例＜４−５＞で調製したモノクローナル抗体8-86-2（10mg／mlセファロース）を、ＮＨＳ活性化ハイトラップカラムに注入した。２０℃で４５分間反応させ、モノクローナル抗体8-86-2をＮＨＳ活性化セファロースに固定化した。
モノクローナル抗体8-86-2は、ヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦのいずれにも高い反応性を有するため、この抗体を用いたアフィニティーカラムを作製することにより、ヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦのいずれも精製することが可能である。
【０１６１】
＜４−８＞  アフィニティークロマトグラフィーによる哺乳動物ＣＴＧＦの精製ヒトＣＴＧＦを発現する形質転換Hela細胞（実施例＜２−２＞）、マウスＣＴＧＦを発現する形質転換Hela細胞（実施例３）及びラットＣＴＧＦを発現する形質転換Hela細胞（実施例＜１１−２＞）の各々の培養上清を回収し、ヘパリンカラムクロマトグラフィーに供し、0.3MのNaCl/PBSで洗浄した後、0.7MのNaCl/PBSで溶出し、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦ各々の粗精製画分を得た。
各々の粗精製物を、実施例＜４−７＞で作製した抗ＣＴＧＦ抗体8-86-2を固定化したアフィニティーカラムに加え、リン酸緩衝液で洗浄した後、0.1Mのグリシン緩衝液（pH2.5）で溶出し、0.75MのTris緩衝液（pH9.0）で中和した。集めた溶出物をリン酸緩衝液で透析し、高純度精製された組換えヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦを得た。
各々の精製組換えＣＴＧＦを、10乃至20%の濃度勾配のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。分離したバンドを銀染色した結果、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれについても約38kDa付近にバンドが検出された（図３）。
【０１６２】
＜４−９＞  精製ＣＴＧＦの細胞増殖促進活性の試験
実施例＜４−８＞で精製した各種組換えＣＴＧＦが生物活性を保持しているか否かを確認するため、各々の精製ＣＴＧＦの細胞増殖促進活性を調べた。
９６マイクロプレートを用いて、ラット腎臓線維芽細胞NRK-49F（ATCC CRL-1570；２×１０3／ウェル）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭ培地中で３日間培養した。培養上清を取り除き、ＤＭＥＭ培地で１回洗浄後、ＤＭＥＭ培地中で１日培養した。次いで、各々の培養系に各種濃度（100、50、25、12.5、6.3及び3.1ng/ml）の精製組換えＣＴＧＦを添加して２日間培養した後、［3H]-Thymidine（3.7kBq/ウェル）を添加してさらに６時間培養した。細胞を回収（ハーベスト）して、細胞内に取り込まれた［3H]-Thymidineの量を液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）にて測定した。なお、対照として、ＣＴＧＦを添加せず同様にして培養した場合の［3H]-Thymidineの取込みを測定した。
結果を図４に示す。ヒト、マウス及びラットのいずれの精製組換えＣＴＧＦも、濃度依存的な細胞増殖促進活性を示し、いずれの組換えＣＴＧＦも生物学的機能を保持していることが示された。
【０１６３】
＜４−１０＞  交叉反応性
前述のようにして調製した種々の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体（10μg/ml)及び抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体（10μg/ml)のヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦの各々に対する反応性を、実施例＜４−３＞に述べたELISAと同様にして調べた。
なお、本試験では、実施例＜４−７＞で作製したアフィニティーカラムを用いて精製したヒト、マウス及びラットの精製組換えＣＴＧＦの各々を、（Ａ）100、30及び10ng/well、または（Ｂ）100、10及び1ng/wellの濃度でコーティングしたマクロプレートを用いた。
なお、（Ｂ）の試験においては、陰性対照試験として、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、ＫＬＨ(keyhole limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫して調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用いて、前記と同様にして試験を行った。
濃度（Ａ）での試験結果を図５乃至図７に、また濃度（Ｂ）での試験結果を図８乃至図１０に示す。
また、図５乃至図１０に示した結果を、図１及び図２の「交叉反応性」の欄に簡略化して示した。
図１の「交叉反応性」の欄においては、左から順に、コーティング濃度が、１００、３０及び１０ｎｇ／wellでの結果を示す。各濃度における反応性は、蛍光強度が1000以上の場合は「○」を、500以上1000未満の場合は「△」を、また500未満の場合は「×」を付した。
図２の「交叉反応性」の欄においては、左から順に、コーティング濃度が、100、10及び１ng/wellでの結果を示す。各濃度における反応性は、蛍光強度が1000以上の場合は「○」を、500以上1000未満の場合は「△」を、また500未満の場合は「×」を付した。
本発明のモノクローナル抗体は、様々な交叉反応性の特徴を有することが示された。
【０１６４】
＜４−１１＞  ＣＴＧＦと種々細胞との結合の阻害活性
最近の研究によりＣＴＧＦが細胞接着に関与することが明らかになっている（Exp. Cell. Res., Vol.233, p.63-77, 1997）。そこで、前記のようにして調製した種々のモノクローナル抗体がＣＴＧＦの機能を阻害する活性（中和活性）を有するか否かを、ＣＴＧＦが媒介する細胞接着作用に対する阻害効果を指標に調べた。試験は下記<4-11-1>乃至<4-11-3>に記載する３種類の方法を用いた。
【０１６５】
<4-11-1>  ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-Tとの結合の阻害
実施例＜４−３＞と同様にして作製した組換えヒトＣＴＧＦ固定化マイクロプレート（コ−ティング濃度：0.5μg/well）の各ウェルに、前記のようにして調製したヒトＣＴＧＦに反応性を有する各種のモノクローナル抗体（0.5μg/well）を加えた。また、実施例＜４−３＞と同様にして作製した組換えマウスＣＴＧＦ固定化マイクロプレート（コ−ティング濃度：0.5μg/well）の各ウェルに、前記のようにして調製したマウスＣＴＧＦに反応性を有する各種のモノクローナル抗体（0.5μg/well）を加えた。
【０１６６】
各プレートの上清を除いた後、各ウェルにBCECF（2',7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein tetraacetoxymethyl ester、モレキュラープローブ社）で標識したヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）（５×１０4／ウェル）を加え、４℃で１時間静置した。
浮遊細胞を除去し、１％NP-40含有リン酸緩衝液（100μl）を加えて、プレートに接着している細胞を可溶化した。細胞溶解により培養上清中に放出されるBCECFの蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II microplate fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories Inc.）（製））を用いて測定した。
なお、対照試験として、いずれの抗体も加えないで上記と同様にして試験を行った。
結果を図１１に示す。また、図１１の結果を図１の「293細胞の結合阻害活性」の欄に簡略化して示した。図１の当該欄においては、「○」は有意差をもって細胞の接着を阻害する活性を示したこと示し、また「×」印は、該活性を示さなかったことを示す。
【０１６７】
<4-11-2>  ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49Fとの結合の阻害
実施例＜４−３＞と同様にして作製した組換えヒトＣＴＧＦ固定化マイクロプレート（コ−ティング濃度：１μg/well）の各ウェルに、前記のようにして調製したヒトＣＴＧＦに反応性を有する各種のヒトモノクローナル抗体（最終濃度：20、６または２μg/ml）を加えた。
次いで、各ウェルにBCECF（2',7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein tetraacetoxymethyl ester、モレキュラープローブ社）で標識したラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570）（１×１０4／ウェル）を加え、４℃で１時間静置した。
浮遊細胞を除去し、１％NP-40含有リン酸緩衝液（100μl）を加えて、プレートに接着している細胞を可溶化した。細胞溶解により培養上清中に放出されるBCECFの蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II microplate fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories Inc.）（製））を用いて測定した。
なお、対照試験として、いずれの抗体も加えないで上記と同様にして試験を行った。陰性対照試験として、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、ＫＬＨ(keyhole limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫して調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用いて、前記と同様にして試験を行った。
また、別の対照試験として、ＣＴＧＦをコーティングしないマイクロプレートウェルを用いて、且ついずれの抗体も加えないで前記と同様にして試験を行った。
結果を図１２に示す。なお、結果は、求められた蛍光強度の値を基に、細胞の結合率（％）に換算して示した。
また、図１２の結果を図２の「NRK-49F細胞の結合阻害活性」の欄に簡略化して示した。図２の当該欄における「○」印は、有意差をもって細胞の接着を阻害したことを示し、「×」印は、当該阻害活性が弱いかまたは阻害活性を示さなかったことを示す。
【０１６８】
<4-11-3>  種々細胞との結合の阻害
実施例＜４−３＞と同様にして作製した組換えヒトＣＴＧＦ固定化マイクロプレート（コ−ティング濃度：１μg/well）の各ウェルに、前記のようにして調製したヒトＣＴＧＦに反応性を有する各種のヒトモノクローナル抗体（最終濃度：20μg/ml）を加えた。
６０分静置後、各プレートの上清を除いた後、各ウェルにBCECF（2',7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein tetraacetoxymethyl ester、モレキュラープローブ社）で標識した下記細胞（各々１×１０4／ウェル）を加え、４℃で１時間静置した。細胞は下記を用いた。
（１）ヒト肺由来繊維芽細胞（NHLF2837；Clonetics製）。
（２）ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）。
（３）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570）。
浮遊細胞を除去し、１％NP-40含有リン酸緩衝液（100μl）を加えて、プレートに接着している細胞を可溶化した。細胞溶解により培養上清中に放出されるBCECFの蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II microplate fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories Inc.）（製））を用いて測定した。
なお、対照試験として、いずれの抗体も加えないで上記と同様にして試験を行った。陰性対照試験として、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、ＫＬＨ(keyhole limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫して調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用いて、前記と同様にして試験を行った。
また、別の対照試験として、ＣＴＧＦをコーティングしないマイクロプレートウェルを用いて、且ついずれの抗体も加えないで前記と同様にして試験を行った。
結果を図１３に示す。なお、結果は、求められた蛍光強度の値を基に、細胞の結合率（％）に換算して示した。
【０１６９】
＜４−１２＞  ウサギ組織への交叉反応性
高脂血症モデルウサギWHHL（オリエンタル酵母社製）の動脈硬化巣を外科的手術により採取し、常法により動脈硬化症部位の動脈の凍結切片を調製した。
各切片を、下記に述べるようにベクタステインエリート（Vectastain Elite）ＡＢＣキット（フナコシ株式会社製）を用いて染色した。
該切片をアセトンで１〜２分間固定し、乾燥後、希釈血清（PBS（10ml）／血清（150μl））で３０分間湿潤させた。各切片をＰＢＳで洗浄後、１次抗体として前述のようにして調製した正常マウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体（クローン：8-86-2及び8-149-3）、正常ラット由来の抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体（クローン：13-51-2）またはヒト抗体産生トランスジェニックマウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体（クローン：A4.3、A11.1、A29.6、B29.6、B35.1、C26.11及びC114.4）（各々１０μｇ／ｍｌあるいはハイブリドーマ培養上清）を加え、４０分間静置した。
【０１７０】
次いで、PBSで洗浄し、ビオチン化二次抗体溶液（100μｌ）を加え、３０分間静置した。なお、一次抗体として正常マウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体を用いた場合は、ビオチン標識ウマ抗マウスイムノグロブリン抗体を、一次抗体として正常ラット由来の抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体を用いた場合は、ビオチン標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン抗体を、また一次抗体としてヒト抗体産生トランスジェニックマウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体を用いた場合にはビオチン標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いた。
各切片を、メタノ−ル中に溶解した３％過酸化水素溶液中で１０分間静置し、ＰＢＳで洗浄した後、100μlのアビジン−ペルオキシダ−ゼ溶液（PBS（5ml）／ペルオキシダ−ゼ標識アビジンＤＨ（100μl）／ビオチン化過酸化水素Ｈ（100μl））を加え３０分間静置した。
【０１７１】
ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＢ溶液（水（5ml）／緩衝溶液（100μl）／ＤＡＢ（ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）溶液（200μl）／過酸化水素溶液（100μl））を加え、２〜１０分間静置した。
冷水で５分間洗浄した後、ギムザ（Giemsa）染色法に供し封入処理を行った。
なお、１次抗体として、ＣＴＧＦに対する反応性を有さず、且つアイソタイプの一致したモノクローナル抗体を用いて前記と同様に染色したものを対照とした。染色、封入された各組織切片を100及び200倍の倍率にて顕鏡し、結果を図１４に示した。また、図１４の結果を図１の「WHHLウサギの動脈硬化巣組織への反応性」の欄に簡略化して示した。図１の当該欄においては、組織切片が染色された場合は「○」を、組織切片の染色が弱いかまたは染色されなかった場合は「×」を付した。
ヒト抗体産生トランスジェニックマウス由来の抗ヒトＣＴＧＦヒトモノクローナル抗体であるクローンA4.3、A11.1、A29.6、C26.11及びC114.4、並びに正常ラット由来の抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体であるクローン13-51-2は、ウサギの動脈硬化巣組織に反応性を示した。
【０１７２】
＜４−１３＞  ＣＴＧＦ刺激による細胞増殖の阻害活性
前記実施例＜４−９＞の試験で示されたように、ＣＴＧＦは、各種細胞（例えば、腎臓や肺等の種々組織に由来する繊維芽細胞、各種腫瘍細胞、及び血管内皮細胞など）の細胞増殖を誘導する。
本試験では、本発明のモノクローナル抗体の、そのようなＣＴＧＦの刺激による細胞増殖に対する阻害効果を下記のようにして調べた。
【０１７３】
<4-13-1>  ＣＴＧＦを含む細胞培養液の調製
ヒト胎児皮膚由来繊維芽細胞（Neonatal human dermal fibroblast, NHDF；Becton Dickinson製）をシャーレで培養し、ウシ胎児血清（FCS）を含まないDMEM培養液で２回洗浄後、ヒトTGF-β（Transforming growth factor；１ng/ml，R&D Systems製）を含有するDMEM培地を加えさらに１日培養した。
培養上清を回収し、ヘパリンカラム（HiTrap、Pharmacia Biotech製）に添加した。カラムを0.2MのNaCl/PBSで洗浄後、0.6MのNaCl/PBSでカラムにトラップされた因子を溶出させた。溶出液をPBSで透析し、以下の細胞増殖アッセイに用いた。
ＣＴＧＦはヘパリン結合性であることから、ヘパリンカラムを用いることによりＣＴＧＦを部分精製することができる。実施例１で調製したヒトＣＴＧＦに対するウサギポリクローナル抗体を用いて、常法に従ってウェスタンブロッティングを行い、上記で得たサンプル中にＣＴＧＦが含まれていることを確認した。
なお、対照試験には、ヒトCTGFで免疫する前に取得したウサギ（実施例１に同じ）の血清を用いた。
結果を図２４に示す。
【０１７４】
<4-13-3>  精製CTGFによる細胞増殖促進活性
９６穴マイクロタータープレートにラット腎臓由来繊維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570、１×１０4個/well）を加え、１日培養した。次いで、プレートをFCSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、さらに１日培養した。次いで、前記<4-13-1>で調製したＣＴＧＦサンプル（0.6MのNaClによる溶出画分のDMEM培地による20倍希釈物）を各ウェルに加え１８時間培養した。次いで、各ウェルに、［3H]-Thymidine（3.7kBq/ウェル）を添加してさらに６時間培養した。細胞を回収（ハーベスト）して、細胞内に取り込まれた［3H]-Thymidineの量を液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）にて測定した。
なお、陽性対照試験として、精製CTGFの代りにPDGF（血小板由来増殖因子）を用いて上記と同様にして試験を行った。また、陰性対照試験として、ＣＴＧＦサンプルを添加せず上記と同様にして試験を行った。
結果を図２５に示す。
前記で得た精製CTGFがラット腎臓由来繊維芽細胞株NRK-49Fの増殖を濃度依存的に促進することが示された。
【０１７５】
<4-13-3>  細胞増殖の阻害活性
９６穴マイクロタータープレートにラット腎臓由来繊維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570、１×１０4個/well）を加え、１日培養した。次いで、プレートをFCSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、さらに１日培養した。次いで、前記<4-13-1>で調製したＣＴＧＦサンプル（0.6MのNaClによる溶出画分のDMEM培地による20倍希釈物）及び前記で調製した本発明の抗ヒトＣＴＧＦヒトモノクローナル抗体（最終濃度：20、２または0.2μg/ml）とを３０分間反応させた混合物を各ウェルに加え１８時間培養した。次いで、各ウェルに、［3H]-Thymidine（3.7kBq/ウェル）を添加してさらに６時間培養した。細胞を回収（ハーベスト）して、細胞内に取り込まれた［3H]-Thymidineの量を液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）にて測定した。
なお、陽性対照試験として、いずれの抗体も加えないで上記と同様にして試験を行った。また、陰性対照試験として、ＣＴＧＦサンプル及びいずれの抗体をも添加せず上記と同様にして試験を行った。
結果を図１５及び図１６に示す。
また、前記と同様の複数回の試験を行った結果（図１５及び図１６に示した本試験の結果を含む）を、図２の「NRK-49F細胞の増殖阻害活性」の欄に簡略化して示した。図２の当該欄における「○」は、有意差をもって細胞の増殖を阻害する活性を示したことを意味する。
本発明の抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体は、ヒト繊維芽細胞の増殖を有意に抑制または阻害することが示された。
【０１７６】
＜４−１４＞  エピトープマッピング
本発明の抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体が特異的に結合するヒトＣＴＧＦの構造中の部位（エピトープ）を解析する目的で下記の試験を行った。
本試験は、後述の実施例５に詳述する２種類のモノクローナル抗体を用いた本発明のサンドイッチELISAを用いて行った。具体的には下記の工程に従った。
（工程１）
後述の実施例<5-1>と同様にして図２に記載される各々の抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体（0.3μg/50μl/well）が固定化された抗体固定化マイクロプレートを作製した。
【０１７７】
（工程２）
後述の実施例<5-2>と同様にして下記Ａ乃至Ｄの各々の本発明のモノクローナル抗体を標識し、標識モノクローナル抗体を作製した。
［抗体Ａ］
ヒトCTGFに反応性を有するマウスモノクローナル抗体8-64-6（国際寄託番号  FERM BP-6209で識別されるハイブリドーマに由来する。）
［抗体Ｂ］
抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体A11.1（国際寄託番号  FERM BP-6535で識別されるハイブリドーマに由来する。）
［抗体Ｃ］
抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体C26.11（配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する重鎖、並びに配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる。）
［抗体Ｄ］
抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体C59.1（配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する重鎖、並びに配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する軽鎖とからなる。）
（工程３）
後述の実施例<5-3>と同様にしてELISAを行った。即ち、工程１で作製した抗体固定化マイクロプレートの各々に、前記実施例で調製した精製組換えヒトCTGF（15ng/well）を加えて抗原抗体反応を進めた後、工程２で調製した各々の標識モノクローナル抗体（0.1μl/50μl/well）を加えて反応させた。後述の実施例<5-3>に記載の同様の操作の後、各ウェルに反応停止液を加えて反応を停止させ、波長460nm（励起：355nm）での蛍光強度をフルオロメーターにより測定した。
【０１７８】
求められる蛍光強度の値は、マイクロプレートに固定化したモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）と標識されたモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）の異同に依存して、下記（１）乃至（３）のような結果になるものと考えられた。
（１）  マイクロプレートに固定化したモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）と標識されたモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）が同一であるならば、マイクロプレートに固定化したモノクローナル抗体とヒトCTGFとで形成される抗原抗体複合体に、後に加えた標識モノクローナル抗体が結合し得ないことから、工程３で測定される蛍光強度の値は極めてゼロに近いこととなる。
（２）  マイクロプレートに固定化したモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）と標識されたモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）が近い位置に存在するならば、マイクロプレートに固定化したモノクローナル抗体とヒトCTGFとで形成される抗原抗体複合体への、後に加えた標識モノクローナル抗体の結合が多少の立体障害を受けることから、工程３で測定される蛍光強度の値は低いこととなる。
（３）  マイクロプレートに固定化したモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）と標識されたモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）が異なるならば、マイクロプレートに固定化したモノクローナル抗体とヒトCTGFとで形成される抗原抗体複合体に、後に加えた標識モノクローナル抗体が結合し得えることから、工程３で測定される蛍光強度の値は有意に高い値となる。
【０１７９】
本試験の結果は、上記の推定に合致するものであった。結果を図２の「エピトープマッピング」の欄に示した。
なお、以下に図２における当該欄に示した各々のアルファベットの意味を例示的に示す。
「（Ａ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ａ」であることを意味する。
「（Ｂ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ｂ」であることを意味する。
「（Ｃ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ｃ」であることを意味する。
「（Ｄ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ｄ」であることを意味する。
「Ａ」：「抗体Ａ」のエピトープと同一またはほぼ同一のエピトープであることを意味する。
「Ｂ」：「抗体Ｂ」のエピトープと同一またはほぼ同一のエピトープであることを意味する。
「Ｃ」：「抗体Ｃ」のエピトープと同一またはほぼ同一のエピトープであることを意味する。
「Ｄ」：「抗体Ｄ」のエピトープと同一またはほぼ同一のエピトープであることを意味する。
「−」：「抗体Ａ」、「抗体Ｂ」、「抗体Ｃ」または「抗体Ｄ」のいずれ抗体のエピトープとも異なるエピトープであることを意味する。
「Ｂ／Ｃ」：「抗体Ｂ」のエピトープ及び／または「抗体Ｃ」のエピトープと同一またはほぼ同一のエピトープであることを意味する。
「Ａ-／Ｂ」：「抗体Ａ」のエピトープに近い位置のエピトープであり、且つ「抗体Ｂ」のエピトープと同一またはほぼ同一のエピトープであることを意味する。
上記以外の記載方法も、上記と同様な意味を有するものである。
【０１８０】
＜４−１５＞  腎臓疾患及び組織繊維症に対する治療効果
本発明の抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体の各種疾患に対する治療効果を当該疾患のマウスモデルを用いて調べた。
本試験で用いたマウスモデルは、下記の疾患あるいは病的状態のいずれにおいても見られる病理学的特徴の一部または臨床所見の一部を呈する疾患モデルであることから、本試験で得られる治療効果は、下記全ての疾患または病的状態の治療効果を代表するものである。
腎臓疾患（腎不全、腎炎、腎繊維症など）、各種組織繊維症（腎繊維症、肺繊維症、肝臓組織での繊維症、皮膚組織での繊維症など、関節リウマチに伴う滑膜組織での繊維症、各種癌に伴う繊維症）、皮膚疾患（強皮症、乾癬、アトピーなど）、肝臓疾患（肝硬変、肝臓組織での繊維症、肝炎など）、肺疾患（肺繊維症、肺炎など）、関節リウマチ、及び動脈硬化症など。
【０１８１】
<4-15-1>  疾患マウスモデルの作製
B6C3F1マウス（雄、７週齢、各群６匹、SLC製）を、ペントバルビタール（Pentobarbital、50mg/kg）による麻酔下で外科手術により左脇腹を開腹した。次いで、左腎から伸びる尿管の２箇所を縫合糸で結紮し、当該２箇所の結紮部位の間の尿管を切断した（UUO、Unilateral ureteral obstruction）。当該処置の後、開腹部を縫合した。この手術により、当該左腎は、正常な腎臓の最も重要な機能である血液等の体液のろ過機能を失い、種々の腎疾患に見られる様々な病理的症状を発現するようになる。
【０１８２】
<4-15-2>  抗CTGFモノクローナル抗体による治療効果
上記で作製した各々のモデルマウスに、リン酸緩衝液に溶解した抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体M84またはM320（前記実施例で調製、各々５mg/kg）を腹腔内投与した。当該抗体投与は、上記手術完了直後に初回投与し、さらに初回投与から３日おきに合計４回行った。最終投与の後（当該手術完了から１４日目）、各々のマウスから当該左腎を外科手術により摘出した。摘出した腎臓をアセトンで脱脂及び脱水した後、６N塩酸でタンパクを加水分解した。次いで、当該サンプルを温暖な条件下で窒素ガスを当て乾燥させたた後、精製水に溶解して定量用のサンプルとした。得られた腎臓組織サンプル中のヒドロキシプロリン（OH-Proline）の濃度を既報の方法に従って測定した（Analytical Biochemistry, Vol.55, ｐ.288-291, 1973；  Kidney Int., Vol.54, No.1, ｐ.99-109, 1998）。
該ヒドロキシプロリンの生成の上昇は、腎機能不全により惹起される腎炎及び腎繊維症の発症の指標であり、ヒドロキシプロリン濃度の低減は、該モノクローナル抗体が該腎臓疾患の治療に有効であることを示すものである。
【０１８３】
なお、前記と同様にして下記の対照実験を行った。
（１）上述のUUO（尿管結紮処置）を施したマウスにリン酸緩衝液のみ（いずれの抗体も含まない）を前記と同様にして腹腔内投与した。
（２）開腹のみ行いUUOを施さずに開腹部を縫合した正常マウスの場合。
（３）UUOを施さない正常マウスの場合。
（４）前記抗体の代わりに腎繊維症などの繊維症治療薬として臨床試験中のPirfenidone（Kidney Int., Vol.54, No.1, ｐ.99-109, 1998）（約500mg/kg）を餌に混入させて与えた場合（陽性対照試験）。
結果を、図１７に示した。
この結果、本発明のモノクローナル抗体が、腎臓疾患並びに組織繊維症に対して有意な抑制及び治療効果を有していることが示された。
また驚くべきことに、本発明のモノクローナル抗体による有効性は、極めて高用量で投与した陽性対照薬（例えば、50kgの患者への４回投与の場合に換算すると約100g）の有効性と同様であった。
【０１８４】
＜４−１６＞  抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体の遺伝子配列及びアミノ酸配列の決定及び解析
前記実施例で作製された種々のヒトCTGFに対するヒトモノクローナル抗体を構成する重鎖（Heavy Chain）の可変領域をコードするｃDNA配列、並びに軽鎖（Light Chain）の可変領域及び定常領域をコードするｃDNA配列を下記のようにして決定するとともに、該遺伝子の構造的特徴を解析した。本実施例における配列解析の手順を図１８に模式的に示した。
前記実施例で作製したヒトCTGFに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（クローン：A29、C26、C59、C114及びM295；  各々約5×107細胞）を培養後、遠心分離し、沈殿物を回収し、後述するPolyA+RNAの抽出時まで−80℃で保存した。
【０１８５】
各々のハイブリドーマからのPolyA+RNAの抽出、精製は、市販のFastTrack2.0kit(INVITROGEN製）を用いて次のようにしてした。前記各々の凍結細胞を、細胞溶解緩衝液（Lysis Buffer）に溶解し、POLYTRONにより細胞を破壊し、可溶化させた。該可溶化物を45℃でインキュベーションした後、Oligo(dT) celluloseを加え約1時間緩やかに振盪した。次いで、Oligo(dT) celluloseを洗浄後、PolyA+RNAをEllution Bufferで溶出させた。溶出したPolyA+RNAをエタノール沈殿させ、20μlのTris-EDTA緩衝液に溶解した。得られたPolyA+RNAの濃度を、260nmの波長での吸光度を測定することにより決定した。
【０１８６】
得られたPolyA+RNAを鋳型とし、市販のMarathon cDNA Amplification Kit（CLONTECH製）を用いたRACE-PCR法により常法によりcDNAを合成した（「遺伝子増幅PCR法・基礎と新しい展開」、1992年第２刷、共立出版株式会社発行、p.13-15）。即ち、各々のハイブリドーマから精製したPolyA+RNA（1乃至5μg）を鋳型として、1st strand cDNA及び2nd strand cDNAを順次合成した。該ｃDNAを、フェノール／クロロホルム／イソアミノアルコール並びにクロロホルムを用いて各々1回ずつ抽出に供した。次いで、cDNAをエタノール沈殿させ、アダプターDNA（配列番号25）に連結させた。得られたDNA反応物を1/250に希釈したものを鋳型とし、合成プライマーを用いて常法によりPCRを行い抗体重鎖及び抗体軽鎖を各々コードするｃDNAを調製した。抗体重鎖に係るPCRには、配列番号26に記載のプライマーを用いた。抗体軽鎖に係るPCRには、配列番号27に記載のプライマーを用いた。
【０１８７】
各々のPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分画し、DNAを回収した。得られた各々のｃDNAの塩基配列の決定を、市販のDyeTerminator Cycle Sequencing FS Kit（PE-Applied Biosystems製）及びPRISM377 DNA Sequencer（PE-Applied Biosystems製）を用いて行った。なお、本配列決定のためのSequencing Primerは、前述のPCRにおいて使用したプライマーを使用した。さらに、得られた配列から適切なSequencing Primerを作成しさらに反応を実施した。
前記の各々のハイブリドーマが産生するヒトCTGFに対するヒトモノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードするｃDNA配列、軽鎖（Light Chain）の可変領域をコードするｃDNA配列、並びに該各々のcDNA配列から演繹されるアミノ酸配列を下記のとおり配列表に示した。
【０１８８】
＜クローンA29＞
（重鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号５（シグナル配列：塩基番号１乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至363）
アミノ酸配列：配列番号６（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至120を含む）
（軽鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号15（シグナル配列：塩基番号１乃至60、Ｖ領域：塩基番号61乃至365）
アミノ酸配列：配列番号16（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至20、可変領域：アミノ酸番号21乃至120を含む）
【０１８９】
＜クローンC26＞
（重鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号７（シグナル配列：塩基番号１乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至357）
アミノ酸配列：配列番号８（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至118を含む）
（軽鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号17（シグナル配列：塩基番号１乃至60、Ｖ領域：塩基番号61乃至364）
アミノ酸配列：配列番号18（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至20、可変領域：アミノ酸番号21乃至121を含む）
【０１９０】
＜クローンC59＞
（重鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号９（シグナル配列：塩基番号１乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至350）
アミノ酸配列：配列番号10（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至116を含む）
（軽鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号19（シグナル配列：塩基番号１乃至66、Ｖ領域：塩基番号67乃至353）
アミノ酸配列：配列番号20（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至22、可変領域：アミノ酸番号23乃至117を含む）
【０１９１】
＜クローンC114＞
（重鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号11（シグナル配列：塩基番号１乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至350）
アミノ酸配列：配列番号12（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至116を含む）
（軽鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号21（シグナル配列：塩基番号１乃至47を含む、Ｖ領域：塩基番号48乃至335）
アミノ酸配列：配列番号22（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至16を含む、可変領域：アミノ酸番号17乃至111を含む）
【０１９２】
＜クローンM295＞
（重鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号13（シグナル配列：塩基番号１乃至58、Ｖ領域：塩基番号59乃至353）
アミノ酸配列：配列番号14（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至117を含む）
（軽鎖の可変領域）
ＤＮＡ配列  ：配列番号23（シグナル配列：塩基番号１乃至66、Ｖ領域：塩基番号67乃至356）
アミノ酸配列：配列番号24（シグナル配列：アミノ酸番号１乃至22、可変領域：アミノ酸番号23乃至118を含む）
【０１９３】
決定された各々のＤＮＡ配列を基に、遺伝子配列解析ソフトウェアーを用いて、Tomlinsonらにより作成されたヒトイムノグロブリンの可変領域遺伝子のライブラリーV BASE Sequence（Immunol. Today, Vol.16, No.5, p.237-242, 1995）を検索した。
その結果、上記ヒトモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々のＶ領域遺伝子は、各々下記のセグメントから構成されていることが分かった。
＜重鎖Ｖ領域遺伝子＞
クローンA29：    DP-38
クローンC26：    DP-75
クローンC59：    DP-5
クローンC114：    DP-5
クローンM295：    DP-65
＜軽鎖Ｖ領域遺伝子＞
クローンA29：    DPK24
クローンC26：    DPK12
クローンC59：    DPK1
クローンC114：    DPK1
クローンM295：    DPK9
なお、上記ヒトモノクローナル抗体の重鎖をコードするcDNA配列には、Ｖ領域と下流のＤ領域の間、並びにＤ領域とさらに下流のＪ領域の間にＮ領域（N-addition）を有しているものと考えられた。
【０１９４】
実施例５  ヒトＣＴＧＦ及びマウスＣＴＧＦの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系確立
＜５−１＞  抗体固定化マイクロプレートの作製
本実施例においてマイクロプレートに固定化するモノクローナル抗体は、前述のようにして調製した正常マウス由来のモノクローナル抗体8-64-6（国際寄託番号FERM BP-6209で識別されるハイブリドーマに由来する）を用いた。このモノクローナル抗体は、ヒトＣＴＧＦに高い反応性を有するとともに、マウスＣＴＧＦにも交叉反応性を示す。
モノクローナル抗体8-64-6をリン酸緩衝液で希釈し、１μg／50μl／ウェルの濃度で、ELISA用９６穴マイクロプレート（コーニング（Corning）社製）の各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、モノクローナル抗体8-64-6をマイクロプレートに吸着させた。
次いで、プレ−トをリン酸緩衝液で洗浄した後、各ウェルに３％のウシ血清アルブミン（BSA; Bovine serum albumin）を含有するリン酸緩衝液（200μl／ウェル）を加え、室温で２時間インキュベーションすることにより抗体が結合していない部位をブロックした。次いで、プレートをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
【０１９５】
＜５−２＞  標識モノクローナル抗体の作製
本実施例において標識されるモノクローナル抗体は、前述のようにして調製した正常マウス由来のモノクローナル抗体8-86-2（国際寄託番号FERM BP-6208で識別されるハイブリドーマに由来する）を用いた。このモノクローナル抗体は、ヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦのいずれにも高い反応性を有する。
モノクローナル抗体8-86-2（20mg／mlを１ml）を、0.1MのNaHCO3（pH8.2〜8.3）溶液で、透析（４℃、２４時間）した。次いで、ＮＨＳ−ビオチン（2mg／mlを100μｌ、ピアス社製）を加え、激しく撹拌した後、室温下で３０分インキュベートした。次いで、リン酸緩衝液で透析（４℃、２４時間）した。
【０１９６】
＜５−３＞  サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法の確立
本発明で確立されたヒトＣＴＧＦ及びマウスＣＴＧＦの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系は以下の通りである。
実施例＜５−１＞で作製した抗体固定化マイクロプレートの各ウェルに、測定試料（50μl／ウェル）を加え、室温で１時間インキュベートした。マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、各ウェルに、1% BSA、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で希釈した実施例＜５−２＞で作製したビオチン標識モノクローナル抗体（0.3μl／50μl／ウェル）を加え、室温下で１時間インキュベートした。
マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、0.5MのNaClと20mMのHEPESからなる溶液（BSA(１mg/ml)を含有、pH7.0）で1000倍に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Streptoavidin-β-galactosidase、５０μｌ、ギブコ（Gibco BRL）社製）を各ウェルに加え、室温下で３０分間インキュベートした。
【０１９７】
マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、100mMのNaCl、1mMのMgCl2及び10mMのリン酸緩衝液（Na及びKを含有）からなる溶液（BSA(1mg／ml))を含有、pH7.0）で希釈した１％の４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside、５０μｌ、シグマ（Sigma）社製）を各ウェルに加え、室温下で１０分間インキュベートした。
各ウェルに、1MのNa2CO3（100μl）を加え、反応を止めた。波長460nm（励起：355nm）での蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II microplate fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories Inc.）（製））で測定した。測定試料中のヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦ量は、下記実施例で作成した検量線から求めた。
【０１９８】
＜５−４＞  検量線の作成
実施例＜４−８＞で調製したアフィニティー精製した組換えヒトＣＴＧＦまたは組換えマウスＣＴＧＦをＣＴＧＦ標準物質（スタンダード）として用い、実施例＜５−３＞で確立したサンドイッチELISAを用いて検量線を作成した。結果を図１９に示す。
ヒトＣＴＧＦについては、極めて低濃度である３ng/ml〜1000ng/mlの濃度範囲で有意差を持った検量線が得られた。マウスＣＴＧＦについては、30ng/ml〜1000ng/mlの濃度範囲で有意差を持った検量線が得られた。しかしながら、実施例＜５−３＞で確立したサンドイッチELISA系では、ラットＣＴＧＦは定量できなかった。
【０１９９】
実施例６  マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系確立
＜６−１＞  抗体固定化マイクロプレートの作製
本実施例においてマイクロプレートに固定化するモノクローナル抗体は、前述のようにして調製した正常ラット由来のモノクローナル抗体13-51-2を用いた。このモノクローナル抗体は、マウスＣＴＧＦに高い反応性を有するとともに、ラットＣＴＧＦにも交叉反応性を示す。
モノクローナル抗体13-51-2をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、１μg／50μl／ウェルの濃度で、ELISA用９６穴マイクロプレート（コーニング（Corning）社製）の各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、モノクローナル抗体13-51-2をマイクロプレートに吸着させた。
次いで、プレ−トをリン酸緩衝液で洗浄した後、各ウェルに３％のウシ血清アルブミン（BSA; Bovine serum albumin）を含有するリン酸緩衝液（200μl／ウェル）を加え、室温で２時間インキュベーションすることにより抗体が結合していない部位をブロックした。次いで、プレートをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
【０２００】
＜６−２＞  標識モノクローナル抗体の作製
実施例＜５−２＞で作製したビオチン標識モノクローナル抗体、即ち、ヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦのいずれにも高い反応性を有するモノクローナル抗体8-86-2（国際寄託番号FERM BP-6208で識別されるハイブリドーマに由来する）をビオチンで標識した標識モノクローナル抗体を用いた。
【０２０１】
＜６−３＞  サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法の確立
本発明で確立されたマウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系は以下の通りである。
実施例＜６−１＞で作製した抗体固定化マイクロプレートの各ウェルに、測定試料（50μl／ウェル）を加え、室温で１時間インキュベートした。マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、各ウェルに、1% BSA、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で希釈した実施例＜６−２＞で作製したビオチン標識モノクローナル抗体（0.3μl／50μl／ウェル）を加え、室温下で１時間インキュベートした。
マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、0.5MのNaClと20mMのHEPESからなる溶液（BSA(１mg/ml)を含有、pH7.0）で1000倍に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Streptoavidin-β-galactosidase、５０μｌ、ギブコ（Gibco BRL）社製）を各ウェルに加え、室温下で３０分間インキュベートした。
【０２０２】
マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、100mMのNaCl、1mMのMgCl2及び10mMのリン酸緩衝液（Na及びKを含有）からなる溶液（BSA(1mg／ml))を含有、pH7.0）で希釈した１％の４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside、５０μｌ、シグマ（Sigma）社製）を各ウェルに加え、室温下で１０分間インキュベートした。
各ウェルに、1MのNa2CO3（100μl）を加え、反応を止めた。波長460nm（励起：355nm）での蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II microplate fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories Inc.）（製））で測定した。測定試料中のマウスＣＴＧＦまたはラットＣＴＧＦ量は、下記実施例で作成した検量線から求めた。
【０２０３】
＜６−４＞  検量線の作成
実施例＜４−８＞で調製したアフィニティー精製した組換えマウスＣＴＧＦまたは組換えラットＣＴＧＦをＣＴＧＦ標準物質（スタンダード）として用い、実施例＜６−３＞で確立したサンドイッチELISAを用いて検量線を作成した。結果を図２０に示す。
マウスＣＴＧＦについては、極めて低濃度である１ng/ml〜1000ng/mlの濃度範囲で有意差を持った検量線が得られた。ラットＣＴＧＦについては、10ng/ml〜1000ng/mlの濃度範囲で有意差を持った検量線が得られた。しかしながら、実施例＜６−３＞で確立したサンドイッチELISA系では、ヒトＣＴＧＦは定量できなかった。
【０２０４】
実施例７  各種疾患に罹患している患者の血清中のＣＴＧＦの定量
実施例＜５−３＞で確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法を用いて各種患者の血清中のＣＴＧＦを定量した。
【０２０５】
＜７−１＞胆道閉鎖症、リウマチ性血管炎、悪性慢性関節リウマチ、乾癬及びアトピー性皮膚炎
本試験で用いたヒト血清は、健常人（３３検体）、胆道閉鎖症に罹患し、外科手術を受けた患者の術後サンプル（＜第１群＞臨床所見は正常な患者（１７検体）、＜第２群＞症状進行中の患者（１４検体）、及び＜第３群＞肝臓移植を必要とする重症患者（８検体））、リウマチ性血管炎に罹患している患者（１０検体）、悪性慢性関節リウマチ（Malignant rheumatoid arthritis,MRA）に罹患している患者（１７検体）、乾癬に罹患に罹患している患者（２４検体）、及びアトピー性皮膚炎に罹患している患者（３４検体）の各々から採取した血清である。
結果を図２１（胆道閉鎖症）及び図２２（リウマチ性血管炎、悪性慢性関節リウマチ、乾癬及びアトピー性皮膚炎）に示す。
胆道閉鎖症患者では、ＣＴＧＦが第２群（症状進行期）で有意な発現することが明らかとなった。また、リウマチ性血管炎、悪性慢性関節リウマチでは、健常人に比べ有意に多くのＣＴＧＦを発現していることが明らかとなった。
【０２０６】
＜７−２＞  慢性関節リウマチ及び変形性関節症
本試験で用いたヒト血清は、慢性関節リウマチ（Rheumatoid arthritis,RA）に罹患に罹患している患者（３６名）及び変形性関節症（Osteoarthritis, OA）に罹患している患者（１９名）の各々から採取した関節液である。
結果を図２３に示す。
慢性関節リウマチ患者の関節液中のCTGF濃度は、変形性関節症のそれに比べ有意に高いことが明らかとなった。
この結果から、本発明のアッセイ系は、健常人のみならず種々の疾患患者でのＣＴＧＦの発現状態を高感度で定量することができ、その病状の進行程度を的確に把握するための臨床診断薬としての有用性を有していると言うことができる。
【０２０７】
実施例８  抗体フラグメントF(ab')2及びFabの調製
前述のようにして調製した各種モノクローナル抗体の抗体フラグメントF(ab')2及びFabは、下記のようにして調製する。
モノクローナル抗体（5mg/ml）を、20mMの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐH3.5）に加え、３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、不溶化ペプシン（１ｍｌ、ピアス社製）を加え、ローテーターで回転させながら３７℃で１２時間インキュベートする。反応液を回収し、遠心分離（3000rpm、１０分間）し、上清を回収する。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを、プロテインＡカラムキット（アマシャム社製）のプロトコールに従って以下のようにして行う。遠心沈殿物に結合緩衝液を加え、遠心分離（3000rpm、１０分間）し、上清を回収する。２回の遠心分離で回収した上清を集め、等量の結合緩衝液を加え、さらに１Ｎの水酸化ナトリウムを加えてpH8.9に調整する。該混合溶液を、該結合緩衝液で平衡化した該プロテインＡカラムに添加した後、該結合緩衝液（5ml）で２回洗浄し、溶出分画を回収する。得られた溶出分画を、5mMのリン酸緩衝液（２Ｌ、pH6.8）で透析（４℃、２４時間）する。
【０２０８】
さらなる精製のためヒドロキシアパタイトカラム（バイオラッド社製）を用いて、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行う。透析により得られる溶液を、該ヒドロキシアパタイトカラムに添加し、5mMのリン酸緩衝液を１５分間流した後、5mM〜0.4Mのリン酸緩衝液で直線濃度勾配溶出させる。溶出液をフラクションコレクターで分取し、280nmでの吸光度を測定し、F(ab')2を含む分画を回収する。得られた分画をリン酸緩衝液（２Ｌ）で透析（４℃、２４時間）し、モノクローナル抗体の精製F(ab')2を得る。
【０２０９】
実施例９  ヒトＣＴＧＦ発現トランスジェニックマウスの作製
実施例２で取得したヒトＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡを、ニワトリβアクチンプローモーターを有する発現ベクターpCAGGS（Gene, Vol.108, p.193-200, 1991）に、ＤＮＡ末端平滑化キット（タカラ社製）を用いて挿入し、プラスミドphCTGFを得た。エレクトロポレーション法により、phCTGFでヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）を形質転換した。実施例５で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡにより、得られた形質転換細胞が培養上清中にヒトＣＴＧＦを発現、分泌していることを確認した。
トランスジェニックマウス作製のために、phCTGFを制限酵素処理して直鎖状にした。
【０２１０】
仮親マウスには、白色ＩＣＲマウス（雌、日本エスエルシー社製）と精管結紮した白色ＩＣＲマウス（雄、日本エスエルシー社製）とを交配して得られたプラグ（または腟栓）を有する雌ＩＣＲマウスを用いた。また、ヒトＣＴＧＦ遺伝子を導入するための受精卵を得るための採卵用マウスは、PEAMEX（５ユニット、三共ゾーキ社製）及びプレグニール（５ユニット、オルガノン社製）を投与することにより過剰排卵させたBDF-1マウス（雌、日本エスエルシー社製）をBDF-1マウス（雄、日本エスエルシー社製）と交配させて作製した。交配後、BDF-1マウス（雌）から卵管部を摘出し、ヒアルロニダーゼ処理により受精卵のみを得、培地中で保存した。
【０２１１】
受精卵へのヒトＣＴＧＦ遺伝子の導入は、顕微鏡下でマニピュレーターを用いて常法により行った。受精卵を保定針で固定し、３７℃条件下、トリスＥＤＴＡ緩衝液で希釈したヒトＣＴＧＦの前記直鎖状遺伝子を含有する溶液を、ＤＮＡ導入針を用いて受精卵の雄性前核内に注入した。
遺伝子導入後、正常な状態を保持する受精卵のみを選別し、仮親マウス（白色ＩＣＲマウス）の卵巣内にある卵管采に、ヒトＣＴＧＦ遺伝子導入受精卵を挿入した。
仮親から生まれた子マウス（キメラマウス）の尾を切取りゲノム遺伝子を回収し、ＰＣＲによりマウスゲノム内にヒトＣＴＧＦ遺伝子が導入されていることを確認した。また、実施例５で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡにより、該マウスの血清中にヒトＣＴＧＦが発現、分泌されていることを確認した。次いで、このキメラマウスを正常マウスと交配させることによりヒトＣＴＧＦ高発現ヘテロトランスジェニックマウスを作製した。該ヘテロマウス同士を掛け合わせることによりホモマウスを作製した。
【０２１２】
実施例１１  ラットＣＴＧＦの調製
＜１１−１＞  ｃＤＮＡのクローニング
（１）ラットｃＤＮＡライブラリー及びプローブの作製
ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570、約1×106/ml）を遠心（2,000×g、５分間、４℃）して、沈殿した細胞をISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて懸濁させた後、クロロホルムで振とう抽出して上清を回収した。得られた上清にイソプロパノールを添加して室温で１０分間放置した後、遠心（12,000×g、10分間、4℃）し、RNAを沈殿させた。沈殿したRNAをエタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液に溶解した。得られた全RNAから、mRNA Purification Kit（Pharmacia社製）を用いてpoly(A)+RNAを精製した。
【０２１３】
poly(A)+RNA（５μｇ）を鋳型とし、Superscript l system for cDNA Synthesis Kit（GIBCO-BRL社製）を用いてcDNAを合成した。スクリーニングの効率を上げるため、NotI切断部位を有するoligo dTプライマー（GIBCO-BRL社製）を用いた。SalIアダプター付加した後NotI消化を行い、単一方向性を有するcDNAを得た。さらにｃＤＮＡサイズ分画カラム（cDNA size fractionation column、GIBCO-BRL社製）を用いてサイズ分画を行った。
実施例２で取得したヒト及びマウスCTGFをコードするcDNA塩基配列を比較しヒト・マウス間で相同性の高い領域を利用して5'プライマー（配列番号３）及び3'プライマー（配列番号４）を設計し、合成した。
【０２１４】
上記のようにして作製したcDNAライブラリーを鋳型とし、前記両プライマー及びEx Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行った。反応は、DNAサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）を用いて、プライマー終濃度が0.4μM及びMg2+濃度が1.5mMの条件下で、94℃で１分、55℃で１分及び72℃で１分の反応を１サイクルとして合計35サイクル行った。増幅されたDNAを、アガロースゲル電気泳動した後、QUIAEX DNA抽出キット（QUIAEX DNA Extraction Kit、QUIAGEN社製）を用いて精製した。
【０２１５】
回収したDNA断片をTAクローニングキット（Invitrogen社製）を用いてベクターpCRII（Invitrogen社製）に連結した後、オートリードシークエンシングキット（Auto Read Sequencing Kit、Pharmacia社製）及びA.L.F.DNAシークエンサー（Pharmacia社製）を用いてジデオキシ法により塩基配列を決定した。得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列を、実施例２及び実施例３で各々取得したヒト及びマウスのＣＴＧＦの塩基配列と比較した結果、当該ｃＤＮＡ断片はヒト及びマウスのＣＴＧＦのラットホモログ（ラットＣＴＧＦ）をコードする領域を含んでいることが確認された。
該ｃＤＮＡ断片（約0.8kb）を、ECLランダムプライムラベリングキット（ECL random prime labelling system、Amersham社製）を用いてFITC標識し、プラークハイブリダイゼーション用プローブとして使用した。
【０２１６】
（２）ｃＤＮＡライブラリーのベクターへの組み込み及びパッケージング
前記（１）で得られたｃＤＮＡ断片を、ベクターlZipLox NotI-SalI arm（GIBCO-BRL社製）に連結した。連結反応にはDNAライゲーションキット（DNA ligation Kit、宝酒造社製）を用いた。次いで、GIGA PACK II GOLD（Stratagene社製）を用いてインビトロパッケージングした後、得られたファージ粒子を用いて、大腸菌Y1090（GIBCO-BRL社製）を宿主として、組み換えファージを含有するプラークからなるｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【０２１７】
（３）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ラピッドハイブリダイゼーション緩衝液（Rapid hybridization buffer、Amersham社製）を用いたプラークハイブリダイゼーション法（マニアティス（Maniatis）ら、Molecular Cloning: A Labolatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）に従い、前記（２）で調製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを下記のようにして行った。
前記（２）で得られたライブラリー（1×104個プラーク）を寒天プレートに蒔き、ハイボンド-N ナイロンメンブラン（Hybond-N nylon menbrane、Amersham社製）を用いてレプリカを作製した。このレプリカと前記（１）で作製したFITC標識プローブを用いて、ラピッドハイブリダイゼーション緩衝液（Rapid hybridization buffer、Amersham社製）中でプラークハイブリダイゼーションを行った。１次スクリーニング及び２次スクリーニングを行い、１３個のポジティブ・クローンを得た。各クローンをシングルプラークで単離した後、GIBCO-BRL社のマニュアルに従ってインビボエクサイジョン（in vivo Excision）に供し、１３クローンをプラスミドDNAとして回収した。
【０２１８】
（４）塩基配列決定
１３個のクローンについてオートリードシークエンシングキット（Auto Read Sequencing Kit、Pharmacia社製）とA.L.F.DNAシークエンサー（Pharmacia社製）を用いてジデオキシ法により塩基配列を決定した。１３個のクローンはすべて同じ塩基配列を含んでいた。ヒト及びマウスCTGFのｃＤＮＡ配列と比較した結果、得られたクローンｒ３１１にはラットＣＴＧＦの全長をコードするｃＤＮＡ領域を含まれることが確認された。なお、得られらラットＣＴＧＦの全長ｃＤＮＡ配列（５’及び３’末端塩基配列を含む）を配列番号１に、またその配列から演繹されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０２１９】
＜１１−２＞  組換えラットＣＴＧＦの調製
実施例＜１１−１＞で取得したラットＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡを含むクローンｒ３１１をSalI-DraIで消化して、ラットＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を切りだした。該ＤＮＡ断片をプラスミドｐｃＤＮＡ3.1(-)（Invitrogen社製）に挿入し発現ベクターを作成した。エレクトロポレ−ションにより、該ベクターでヒト上皮様細胞株Hela（ATCC CCL-2）を形質転換した。形質転換細胞を、Geneticin（0.8mg/ml；GIBCO-BRL社製）及び10%ウシ胎児血清（fetal calf serum）を含有するRPMI1640培地中で約２週間培養することにより、Geneticin耐性形質転換細胞クローンを選別した。選別された形質転換細胞を、無血清培地ASF104（味の素社製）中培養し、組換えラットＣＴＧＦを発現させた。ラットＣＴＧＦの発現を、前記実施例４で調製したラットＣＴＧＦに交叉反応性を有するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。
培養培養上清を回収し、硫化アンモニウム沈澱法に供した後、ヘパリンカラムクロマトグラフィーに供し、0.3MのNaCl/PBSで洗浄した後、0.5MのNaCl/PBSで溶出し、部分精製ラットＣＴＧＦ画分を得た。
【０２２０】
【発明の効果】
本発明は、未だ提供されていない、ヒト、マウス、ラット及びウサギ等の種々の哺乳動物のＣＴＧＦに対して、抗原特異性、抗原親和性、中和活性、及び交叉反応性等の性質の点で、異なる特性を有する種々の哺乳動物由来の種々のモノクローナル抗体を提供するものである。特に、遺伝子組換え技術を用いてヒトの抗体を産生するように作製したトランスジェニックマウスを免疫動物として用いることにより、ヒトＣＴＧＦに対する種々のヒトモノクローナル抗体を世界に先んじて初めて提供するものである。
【０２２１】
本発明のモノクローナル抗体の内、ヒトＣＴＧＦに対するモノクローナル抗体及びその医薬組成物は、その発症がＣＴＧＦに起因することが予測される可能性を有するような種々の疾患症状、例えば、腎疾患（腎繊維症、腎炎、腎不全など）、肺疾患（例えば、肺線維症、肺炎など）、肝臓疾患（例えば、肝臓組織繊維症、肝硬変、肝炎など）、皮膚疾患（例えば、創傷、強皮症、、乾癬、ケロイドなど）、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、血管疾患（例えば、リウマチ性血管炎など）、各種癌で併発する組織繊維症、及び動脈硬化症（特にい、併発する組織繊維症）などの発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
特に、ヒトモノクローナル抗体及びその医薬組成物は、マウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副作用）であったヒトに対する抗原性を全く有しないことから、医薬品としての価値を劇的に増大させるものである。
【０２２２】
さらに、本発明の種々のモノクローナル抗体を用いることにより、種々哺乳動物（ヒト、マウス、ラット及びウサギ等）の体液（血清等）中のＣＴＧＦを、インタクトな状態で簡便かつ高感度で定量できる種々のイムノアッセイ系（方法及びキット）を提供することができる。また、該モノクローナル抗体を不溶性担体の固定化したアフィニティーカラムを作製することにより、種々の哺乳動物のＣＴＧＦを高純度で容易に精製することが可能となる。
【０２２３】
また、本発明のヒトＣＴＧＦを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物（タランスジェニックマウス等）は、ヒトＣＴＧＦの生理学的機能を解明するためのモデル動物として有用であるだけでなく、ヒトＣＴＧＦの機能を制御（阻害、抑制、活性化、刺激など）する可能性を種々の医薬（低分子化合物、抗体、アンチセンス、ヒトＣＴＧＦ以外のポリペプチドなど）をスクリーニングするためのツールといして極めて有用である。即ち、そのような薬剤を該トランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、該動物中でのヒトＣＴＧＦの発現の程度を、本発明のアッセイ系（サンドイイッチELISAなど）を用いて定量することにより、投与された薬剤のヒトＣＴＧＦに対する効果を評価することが可能である。
【０２２４】
【配列表】
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【０２２５】
「配列表フリーテキスト」
配列番号：３
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
配列番号：４
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
配列番号：２１
他の情報：開始コドン及びシグナル配列の一部が欠けている。
配列番号：２５
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したアダプター配列。
配列番号：２６
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
配列番号：２７
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
【０２２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体の特性を示す図。
【図２】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体の特性を示す図。
【図３】ヒト、マウス及びラットのいずれのＣＴＧＦにも反応性を有するモノクローナル抗体8-86-2を吸着させたアフィニティーカラムを用いて精製した組換えヒトＣＴＧＦ、組換えマウスＣＴＧＦ及び組換えラットＣＴＧＦのSDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の状態を示す図。
【図４】ヒト、マウス及びラットのいずれのＣＴＧＦにも反応性を有するモノクローナル抗体8-86-2を吸着させたアフィニティーカラムを用いて精製した組換えヒトＣＴＧＦ、組換えマウスＣＴＧＦ及び組換えラットＣＴＧＦの、ラット腎臓由来線維芽細胞NRK-49Fの細胞増殖促進活性を示す図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標としての［3Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示し、横軸は各々の組換えＣＴＧＦの濃度を示す。
【図５】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体のヒトＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のヒトＣＴＧＦにおけるELISAで試験したモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図６】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体のマウスＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のマウスＣＴＧＦにおけるELISAで試験したモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図７】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体のラットＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のラットＣＴＧＦにおけるELISAで試験したモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図８】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体のヒトＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のヒトＣＴＧＦにおけるELISAで試験したヒトモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図９】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体のマウスＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のマウスＣＴＧＦにおけるELISAで試験したヒトモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図１０】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体のラットＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のラットＣＴＧＦにおけるELISAで試験したヒトモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図１１】ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-TとヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦとの接着に対する、ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。縦軸は阻害活性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は試験した各種モノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図１２】ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49FとヒトＣＴＧＦの接着に対する、ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。縦軸は細胞結合率（％）を示し、横軸は試験した各種モノクローナル抗体のクローン名を示す。なお、加えた細胞の総数を100%とした。
【図１３】ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63またはヒト肺由来繊維芽細胞の各々とヒトＣＴＧＦの接着に対する、ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。縦軸は細胞結合率（％）を示し、横軸は試験した各種モノクローナル抗体のクローン名を示す。なお、加えた細胞の総数を100%とした。
【図１４】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体の動脈硬化症モデルウサギWHHLの動脈硬化巣組織切片への反応性を示す該組織の染色状態を示す図。分図（ａ）は対照試験での染色状態を示し、分図（ｂ）はモノクローナル抗体B35.1での試験での染色状態を示し、分図（ｃ）はモノクローナル抗体B29.6での試験での染色状態を示し、分図（ｄ）はモノクローナル抗体13-51-2での試験での染色状態を示し、分図（ｅ）はモノクローナル抗体A4.3での試験での染色状態を示し、分図（ｆ）はモノクローナル抗体C114.4での試験での染色状態を示し、分図（ｇ）はモノクローナル抗体A11.1での試験での染色状態を示し、分図（ｈ）はモノクローナル抗体A29.6での試験での染色状態を示し、また分図（ｉ）はモノクローナル抗体C26.11での試験での染色状態を示す。
【図１５】精製ヒトCTGFの刺激によるラット腎臓由来繊維芽細胞株NRK-49Fの細胞増殖に対する、ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標としての［3Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示し、横軸は各種濃度の精製ヒトＣＴＧＦを用いて試験したヒトモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図１６】精製ヒトCTGFの刺激によるラット腎臓由来繊維芽細胞株NRK-49Fの細胞増殖に対する、ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標としての［3Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示し、横軸は各種濃度の精製ヒトＣＴＧＦを用いて試験したヒトモノクローナル抗体のクローン名を示す。
【図１７】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル抗体の、腎臓疾患及び組織繊維症に対する治療効果を示す図。縦軸は、疾患症状の進行の指標となるヒドキシプロリンの濃度を示し、横軸は投与したヒトモノクローナル抗体のクローン名を示す。脚注のSham groupなる用語は、正常マウス（開腹のみ実施群）を意味し、またVehicle groupなる用語は、PBS投与群を意味する。
【図１８】抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするDNA配列の決定の手順を模式的に示す図。
【図１９】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用いたサンドイッチELISAにより定量した標準ヒトＣＴＧＦ、標準マウスＣＴＧＦ及び標準ラットＣＴＧＦの検量線を示す図。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標準ＣＴＧＦの濃度を示す。
【図２０】モノクローナル抗体13-51-2及び8-86-2を用いたサンドイッチELISAにより定量した標準ヒトＣＴＧＦ、標準マウスＣＴＧＦ及び標準ラットＣＴＧＦの検量線を示す図。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標準ＣＴＧＦの濃度を示す。
【図２１】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用いたサンドイッチELISAにより定量した胆道閉鎖症患者の各種血清検体中に含まれるＣＴＧＦ濃度を示す図。縦軸は定量値（ＣＴＧＦ含量）を示し、横軸は試験した検体群の種類を示す。なお、第１群（I）は臨床所見は正常な患者の検体であり、第２群（II）は症状進行中の患者の検体であり、また第３群（III）は肝臓移植を必要とする重症患者の検体である。
【図２２】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用いたサンドイッチELISAにより定量した各種患者の血清検体中に含まれるＣＴＧＦ濃度を示す図。縦軸は定量値（ＣＴＧＦ含量）を示し、横軸は試験した検体を採取した患者が罹患している疾患名を示す。
【図２３】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用いたサンドイッチELISAにより定量した慢性関節リウマチ患者及び変形性関節症患者の関節液検体中に含まれるＣＴＧＦ濃度を示す図。縦軸は定量値（ＣＴＧＦ含量）を示し、横軸は試験した検体を採取した患者が罹患している疾患名を示す。
【図２４】ウェスタンブロッティング試験によるヒト胎児皮膚由来繊維芽細胞から精製したヒトCTGFのSDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の状態を示す図。レーン１、２及び３は、各々0.2、0.6及び2.0MのNaClでの溶出画分をプレイミューン抗体（ヒトCTGFで免疫する前の正常ウサギの血清）を用いた場合の試験結果を示し、レーン４、５及び６は、各々0.2、0.6及び2.0MのNaClでの溶出画分をウサギ抗ヒトCTGFポリクローナル抗体を用いた場合の試験結果を示す。
【図２５】種々濃度の精製ヒトCTGFの、ラット腎臓由来繊維芽細胞株NRK-49Fの細胞増殖に対する細胞増殖促進活性を示す図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標としての［3Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示し、横軸は精製ヒトＣＴＧＦの濃度（希釈倍率）を示す。ＮＣは、精製CTGFを加えない場合の陰性対照（ネガティブコントロール）試験の結果を示す。  PDGFは、精製CTGFの代りにPDGF（血小板由来増殖因子）を用いた場合の陽性対照（ポジティブコントロール）試験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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