(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその相同体からなるタンパク質をコードする、ＤＮＡであって、
前記相同体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、かつ、コードされるタンパク質がβ-1,3-グルカン結合能を有するものである、ＤＮＡ。
【請求項２】
ＤＮＡが、配列番号５に記載の塩基配列である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含んでなる、発現ベクター。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＤＮＡと、異種タンパク質をコードするＤＮＡとを含んでなる、発現ベクターであって、
前記異種タンパク質が、β-1,3-グルカナーゼを除く加水分解酵素である、発現ベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載の発現ベクターによって形質転換されてなる、形質転換細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換細胞を培養し、その細胞および／またはその培養物から、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその相同体からなるタンパク質を採取する工程を含んでなる、前記タンパク質の製造法であって、
ここで、前記相同体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、かつ、コードされるタンパク質がβ-1,3-グルカン結合能を有するものである、製造法。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換細胞を培養し、その細胞および／またはその培養物から、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその相同体からなるタンパク質と異種タンパク質とを含んでなる融合タンパク質を採取する工程を含んでなる、前記融合タンパク質の製造法であって、
ここで、前記相同体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、かつ、コードされるタンパク質がβ-1,3-グルカン結合能を有するものであり、かつ
前記異種タンパク質が、β-1,3-グルカナーゼを除く加水分解酵素である、製造法。
【請求項８】
配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその相同体からなる、タンパク質であって、
前記相同体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、かつ、コードされるタンパク質がβ-1,3-グルカン結合能を有するものである、タンパク質。
【請求項９】
配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその相同体からなるタンパク質と、異種タンパク質とを含んでなる、融合タンパク質であって、
前記相同体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、かつ、コードされるタンパク質がβ-1,3-グルカン結合能を有するものであり、かつ
前記異種タンパク質が、β-1,3-グルカナーゼを除く加水分解酵素である、融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、β-1,3-グルカンを加水分解する活性を有するβ-1,3-グルカナーゼの遺伝子、およびβ-1,3-グルカンへの結合能を有するβ-1,3-グルカン結合ペプチドの遺伝子に関する。
【０００２】
背景技術
β-1,3-グルカンは、コンブ属に多く含まれるラミナランまたはアルカリゲネス・ファエカリス（Alcaligenes faecalis）が生産するカードランの主構造として存在するものであり、あるいはコケ等の地衣類に多く含まれるリケナンや穀類の細胞壁に多く含まれるβ−グルカン中の部分構造として存在するものである。
【０００３】
これらβ-1,3-グルカンを含む多糖類を加水分解する酵素としては、次のような酵素が知られている。すなわち、β-1,3-グルカン中のβ-1,3-グルコシド結合またはβ-1,3;1,4-グルカン中のβ-1,3-グルコシド結合の還元基側に隣接するβ-1,4-グルコシド結合をendo型に加水分解するエンド-1,3(4)-β-Ｄ-グルカナーゼ (EC 3.2.1.6)、β-1,3-グルカンのβ-1,3-グルコシド結合をランダムに分解するエンド-1,3-β-Ｄ-グルカナーゼ (EC 3.2.1.39)、さらにβ-1,3;1,4-グルカン中のβ-1,3-グルコシド結合の還元基側に隣接するβ-1,4-グルコシド結合をendo型に加水分解するリケナーゼ(EC 3.2.1.73)が知られている。
【０００４】
これらの酵素は、産業界において既に使用されている。例えば、畜産分野では、大麦を含む飼料に添加して、家畜の増体や飼料要求率を改善させることを目的として、これらの酵素が既に使用されている。また、菓子・パン分野では、β−グルカンを含む原料を該酵素で処理することにより、ドウの物性改善や製品の食感を向上させることを目的として使用されている。さらに、醸造分野では、ビール製造において大麦の麦芽代用を進めるため、および酵母からのエキスの抽出効率を高めるために使用されており、あるいは、ビールやワイン製造時の原料抽出液や製品の濾過性を改善する目的で使用されている。また、β-1,3-グルカンからの特定のオリゴ糖の製造（特開平０９−２７１３９０号等）や、糸状菌や酵母の細胞壁を分解しプロトプラストを調製するためにもこれらの酵素が使用されている。
【０００５】
β-1,3-グルカナーゼは、多くの植物もしくは微生物によって生産されることが知られている。既に遺伝子配列が明らかとなっているものの例としては、EC 3.2.1.6に分類されるクロストリジウム・サーモセルラム（Clostridium thermocellum）により生産される酵素(遺伝子名 cgkA) 、EC 3.2.1.39に分類されるバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）により生産される酵素(遺伝子名 glcA)、ならびに、EC 3.2.1.73に分類され、かつ、多くのバチルス属、クロストリジウム・サーモセルラム（Clostridium thermocellusm）などにより生産される酵素(遺伝子名 licB)、もしくはフィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）、ロドサーマス・マリヌス（Rhodothermus marinus）などにより生産される酵素(遺伝子名 bglA)等が挙げられる。
【０００６】
バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５（Bacillus circulans IAM165）株は、糸状菌の細胞壁を強力に分解する細菌として分離されている（Nature 181:917-918, Biochim. Biophys. Acta 73:267-275等）。この菌株は、EC 3.2.1.39に分類される、分子量が８９，４２，および２８kDaの３種のβ-1,3-グルカナーゼを生産することが知られている。
【０００７】
これらの中で、分子量が８９kDaのβ-1,3-グルカナーゼについては、その酵素化学的性質が明らかとされており（Appl. Environ. Microbiol. 58:520-524）、さらにその遺伝子配列も決定されている(Biosci. Biotech. Biochem. 56:1854-1858)。また、４２kDaおよび２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼについても、その酵素化学的特性が報告されている（Appl. Environ. Microbiol. 61:122-129）。この文献には、分子量４２kDaおよび２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼは、互いに、ｐＨ依存性や温度依存性等の酵素特性が非常に類似していることが示されている。さらに同文献には、分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼが、最も強力な糸状菌の細胞壁分解活性を有するものであることも記載されている。
【０００８】
しかしながら、前記菌株から生産されたβ-1,3-グルカナーゼには、生産性が著しく低いという問題点が指摘されていた。その原因は、プロテアーゼによる酵素タンパク質の部分消化であると推定されている。従って、プロテアーゼによる酵素蛋白の部分消化の問題の生じない前記酵素の生産手段が望まれていた。
【０００９】
一方、現在までに、多くのセルロース結合ペプチドが研究されている。そして、このようなセルロース結合ペプチドと、セルラーゼや他酵素もしくはタンパク質とを、遺伝子工学的手段を利用して融合させることによって、セルロースに結合性を有した酵素またはタンパク質が製造できるようになってきている。また、このような手法を用いることにより、セルラーゼの不溶性セルロース分解活性を増強させたり、あるいは、セルロースを担体とした固定化酵素が開発され産業上の利用が進んでいる。
【００１０】
しかしながら、β−グルカンに結合するペプチドについては、これまでほとんど知られていない。例外的に、例えば、白エビ（Comp Biochem Physiol B Biochem Mol. Biol 116:453-458）やザリガニの血漿(J Biol Chem 265:9327-9332)から見出されているもの等が知られているが、これらについても産業上の利用検討は成されていない。
【００１１】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株より分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼの遺伝子を取得し、大腸菌（E. coli MV1184）において発現させることに成功した（例えば大腸菌(E. coli MBL4055)）。大腸菌で発現させたものは、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株で発現させた分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼと同等の性能を有していた。また、分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼとの比較により、分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼは分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼがプロテアーゼによって部分消化されたものであることが確認された。そしてこの両酵素の比較から、分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼは分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼとβ-1,3-グルカンへの結合ペプチドより構成されることが明らかとなった。本発明は、これら知見に基づくものである。
【００１２】
従って、本発明は、分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼおよびβ-1,3-グルカン結合ペプチドとそれらの遺伝子の提供を目的としている。
そして、本発明による分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼは、配列番号１のアミノ酸番号１〜３８４に示されたアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質である。
また、本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質である。
また、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼの遺伝子は配列番号３に記載の遺伝子配列である。また、本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドの遺伝子は配列番号５に記載の遺伝子配列である。
【００１３】
本発明による分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼを大腸菌で発現させ得られたβ-1,3-グルカナーゼは、プロテアーゼで低分子化されることなく、すなわち不溶性β-1,3-グルカンに対し強く結合する特性を有したβ-1,3-グルカナーゼであることが確認された。
また、本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドと、セルラーゼ、その他の酵素またはタンパク質とを、遺伝子工学を利用して融合させ、β-1,3-グルカンに結合性を有した酵素またはタンパク質を製造することが可能となる。すなわち、本発明によれば、β-1,3-グルカン結合性を有する酵素またはタンパク質の製造法が提供される。
本発明に従って得られたβ-1,3-グルカナーゼ、β-1,3-グルカン結合ペプチド、またはβ-1,3-グルカン結合ペプチドを融合させた融合タンパク質は、β-1,3-グルカンへの良好な結合能を有する。従って、本発明による酵素は、畜産分野、菓子・パン分野、醸造分野、特定のオリゴ糖の製造、糸状菌や酵母の細胞壁を分解しプロトプラストを調製するため等、その他多くの産業分野で有利に使用することができる。
【００１４】
【発明の具体的説明】
β-1,3-グルカナーゼ
本発明によるβ-1,3-グルカナーゼは、配列番号１のアミノ酸番号１〜３８４に示されたアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質を有するものである。このグルカナーゼは、分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼに相当するものである。
また、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸番号１〜３８４に示されたアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなるものである。
ここで、「その相同体」とは、該配列番号１のアミノ酸番号１〜３８４に示されたアミノ酸配列において、１以上（好ましくは１もしくは数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ、依然としてβ-1,3-グルカナーゼ活性を有するタンパク質を意味する。従って、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡには、さらに、このアミノ酸配列の相同体をコードするＤＮＡも包含される。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、該β-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡの好ましい具体例としては、配列番号３に記載の塩基配列を含んでなるＤＮＡが提供される。
【００１６】
一般的に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して容易に決定することができる。よって、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択することができる。従って、本発明による「配列番号１のアミノ酸番号１〜３８４に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ」とは、配列番号３に示される塩基配列を有するものに加え、該配列番号１と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、かつ、縮重関係にあるコドンも塩基配列として有するものをも意味するものとする。また、配列番号１のアミノ酸番号１〜３８４に示されたアミノ酸配列の相同体をコードするＤＮＡについても同様である。
【００１７】
また、前記したように、今般、分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼは分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼとβ-1,3-グルカンへの結合ペプチドより構成されることが明らかとなった。すなわち、分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡは、β-1,3-グルカナーゼ活性を有する分子量２８kDaのタンパク質コード領域と、β-1,3-グルカンへの結合能を有することによりグルカナーゼ活性を促進している結合性ペプチドコード領域とから構成されている。よって、分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼを構成する配列番号１のアミノ酸番号１〜３８４に示されたアミノ酸配列の内、同アミノ酸番号１〜２３３に示されたアミノ酸配列は、分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼのコード領域に相当し、同アミノ酸番号２３４〜３８４に示されたアミノ酸配列は、β-1,3-グルカン結合ペプチドのコード領域に相当する。
【００１８】
従って、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼ、特に分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼは、配列番号１のアミノ酸番号１〜２３３に示されたアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質を有するものである。
また、本発明による分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸番号１〜２３３に示されたアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなるものである。
【００１９】
ここで、「その相同体」とは、該配列番号１のアミノ酸番号１〜２３３に示されたアミノ酸配列において、１以上（好ましくは１もしくは数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ、依然としてβ-1,3-グルカナーゼ活性を有するタンパク質を意味する。従って、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡには、さらに、このアミノ酸配列の相同体をコードするＤＮＡも包含される。
【００２０】
また、一般的に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して容易に決定することができる。よって、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択することができる。従って、本発明による「配列番号１のアミノ酸番号１〜２３３に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ」とは、配列番号３中に示される塩基配列を有するものに加え、該配列番号１と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、かつ、縮重関係にあるコドンも塩基配列として有するものをも意味するものとする。また、配列番号１のアミノ酸番号１〜２３３に示されたアミノ酸配列の相同体をコードするＤＮＡについても同様である。
【００２１】
本発明による前記の各β-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡはいずれも、天然起源のものであっても、慣用の各種核酸合成法を利用することによって製造したものであってもよい。本発明によるこれらＤＮＡは、その塩基配列が決定されることから、その塩基配列全てを合成することにより製造したものであることもできる。また、天然起源のものを一部利用して、それを基にさらに合成を行って、製造したものであってもよい。
本発明の好ましい態様によれば、本発明によるこれらＤＮＡは、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株から、例えばＤＮＡクローニングのような各種遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。
【００２２】
β-1,3-グルカン結合ペプチド
本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質を有するものである。
また、本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列またはその相同体を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなるものである。
ここで、「その相同体」とは、該配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上（好ましくは１もしくは数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ、依然としてβ-1,3-グルカン結合能を有するタンパク質を意味する。従って、本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡには、さらに、このアミノ酸配列の相同体をコードするＤＮＡも包含される。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、該β-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡの好ましい具体例としては、配列番号５に記載の塩基配列を含んでなるＤＮＡが提供される。
【００２４】
一般的に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して容易に決定することができる。よって、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜することが可能である。従って、本発明による「配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ」とは、配列番号５に示される塩基配列を有するものに加え、配列番号４と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、かつ、縮重関係にあるコドンも塩基配列として有するものをも意味するものとする。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列の相同体をコードするＤＮＡについても同様である。
【００２５】
本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡは、天然起源のものであっても、慣用の各種核酸合成法を利用することによって製造したものであってもよい。本発明によるＤＮＡは、その塩基配列が決定されることから、その塩基配列全てを合成することにより製造したものであることもできる。また、天然起源のものを一部利用して、それを基にさらに合成を行って、製造したものであってもよい。
本発明の好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡは、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株から、例えばＤＮＡクローニングのような各種遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。
【００２６】
β-1,3-グルカナーゼおよびβ-1,3-グルカン結合ペプチドをコードする遺伝子の発現
本発明によるβ-1,3-グルカナーゼおよびβ-1,3-グルカン結合ペプチドは、それをコードするＤＮＡによって宿主細胞を形質転換させた形質転換細胞において、製造することができる。より具体的には、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼは、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ、特に発現ベクター、の形態とし、それを用いて宿主細胞の形質転換を行い、得られた形質転換体を培養することによって製造することができる。すなわち、本発明においては、該β-1,3-グルカナーゼ等の製造に際し、所謂宿主−ベクター系が使用される。なお、本発明においては、このような宿主−ベクター系を適用するにあたっては、この技術分野において慣用されている各種の発現ベクター作成法および形質転換法を使用することができる。
【００２７】
従って、本発明の別の態様によれば、形質転換細胞を培養し、その細胞および／またはその培養物からβ-1,3-グルカナーゼもしくはβ-1,3-グルカン結合ペプチドを採取する工程を含んでなる、β-1,3-グルカナーゼもしくはβ-1,3-グルカン結合ペプチドの製造法が提供される。
【００２８】
本発明によれば、さらに本発明によるβ-1,3-グルカナーゼをコードする遺伝子を含んだＤＮＡ、特に発現ベクター、が提供される。同様にして、本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドをコードする遺伝子を含んだＤＮＡ、特に発現ベクター、もまた提供される。
このようなＤＮＡ（特に発現ベクター）は、慣用のベクター系に、本発明によるβ-1,3-グルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。同様に、β-1,3-グルカン結合ペプチドをコードする遺伝子を含んだＤＮＡ（特に発現ベクター）も、慣用のベクター系に、本発明によるβ-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。さらに、これらのベクターは、それにコードされるＤＮＡ断片を反復した形式で含んでいても良い。
【００２９】
さらに、このβ-1,3-グルカン結合ペプチドは、β-1,3-グルカン結合ペプチドを有さないβ−グルコシダーゼや他のタンパク質と、ハイブリッドさせ、それらの融合タンパク質として発現させ、製造することもできる。このような融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合ペプチドを包含しているため、その融合タンパク質は、β-1,3-グルカンへの良好な結合能を有することとなる。このため、これら融合タンパク質（酵素）は、β-1,3-グルカンの分解効率を増強させることができ、あるいは、β-1,3-グルカンを担体とした固定化酵素等として使用することが出来る。
【００３０】
従って、本発明ではそのような融合タンパク質も提供される。すなわち、 本発明における融合タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそれらの相同体からなるタンパク質と、異種タンパク質とを含んでなるものである。
ここで、「異種タンパク質」とは、本発明のβ-1,3-グルカン結合ペプチドとハイブリッドして、β-1,3-グルカン結合能の強化された融合タンパク質を形成することができる各種タンパク質（好ましくは酵素）のことを意味する。このような異種タンパク質は、β-1,3-グルカンへの結合能を有さないものが普通であるが、特にそれらに限定されるものではない。このような異種タンパク質の具体例としては、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼに代表される加水分解酵素やその他の酵素類および分子量２８kDaのβ-1,3-グルカナーゼ等が挙げられる。
【００３１】
融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡと異種タンパク質をコードするＤＮＡとを用い、これらＤＮＡを融合させて、融合タンパク質をコードするＤＮＡを作成し、これを発現させて製造することができる。すなわち、このような融合タンパク質は、例えば、β-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡの5'側に適当な制限酵素認識部位をＰＣＲによって導入する。そして、目的とする酵素遺伝子のC-末端側に同一の制限酵素部位を導入する。これらを制限酵素で切断した後に再結合させることによって、容易に融合タンパク質をコードする遺伝子を構築することができる。
また、使用する異種タンパク質によっては、β-1,3-グルカン結合ペプチドと異種タンパク質とをそれぞれ別個に用意し、これら各サブユニットを結合させることによって、本発明の融合タンパク質を製造できる場合もある。
【００３２】
本発明においては、異種タンパク質をコードするＤＮＡとβ-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡとを融合させて、融合タンパク質をコードするＤＮＡ（すなわち融合ＤＮＡ）を有する、発現ベクターを製造することができる。そして、本発明では、このような発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させて、形質転換体を作成し、これを使用して、融合タンパク質を製造することができる。
すなわち、本発明では、β-1,3-グルカン結合ペプチドをコードするＤＮＡと異種タンパク質をコードするＤＮＡとを含んでなる発現ベクターが提供される。また、本発明では、そのような発現ベクターで形質転換された形質転換細胞も提供される。さらに、本発明では、前記形質転換細胞を培養し、その細胞および／またはその培養物から目的とする融合タンパク質を採取する工程、を含んでなる融合タンパク質の製造法も提供される。
【００３３】
本発明において使用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、宿主−ベクター系の確立されている慣用のベクター系、例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミドベクターなど、から選択することができる。より具体的には、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合にはλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ系やｐＵＣ系のプラスミド、枯草菌の場合にはｐＵＢ系のプラスミド、ならびに、酵母の場合にはＹＥｐ系やＹＣｐ系のベクター、等が挙げられる。
【００３４】
本発明において使用される発現ベクターは、プラスミドであるのが好ましい。本発明において使用されるプラスミドは、形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、このような選択マーカーとしては、例えば薬剤耐性マーカーや栄養要求マーカー遺伝子を使用することが出来る。これらの好ましい具体例としては、使用する宿主細胞が細菌の場合には、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などがあり、酵母の場合には、トリプトファン合成遺伝子(TRP1)、ウラシル合成遺伝子(URA3)、ロイシン合成遺伝子（LEU2）などが挙げられる。また、使用する宿主細胞がカビの場合には、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)、ビアラホス耐性遺伝子（Bar）、もしくは硝酸還元遺伝子（niaD）など、が上記の好ましい具体例として挙げられる。
【００３５】
さらに、本発明による発現ベクターとしてのＤＮＡは、β-1,3-グルカナーゼまたはβ-1,3-グルカン結合ペプチド遺伝子の発現に必要なＤＮＡ、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、もしくは転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号などを有しているのが好ましい。
【００３６】
本発明における発現ベクターにおいて利用できるプロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主内において機能することができるプロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン(lac)、トリプトファンオペロン(trp)等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH）、酸性フォスファターゼ遺伝子（PHO）、ガラクトース遺伝子（GAL）、もしくはグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(GPD)等のプロモーター、カビではα−アミラーゼ遺伝子（amy）、セロビオハイドロラーゼＩ遺伝子（CBHＩ）等のプロモーター、が好ましいものとして例示される。
【００３７】
本発明において使用可能な宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば何れのものも使用可能である。このような宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、やカビ等が挙げられる。
宿主細胞が枯草菌、酵母もしくはカビの場合には、分泌型ベクターを使用して、菌体外に、組換えβ-1,3-グルカナーゼ、β-1,3-グルカン結合ペプチド、および／またはβ-1,3-グルカン結合ペプチドを融合させた融合タンパク質、を分泌させてもよい。これは、酵素精製過程の容易さや菌体リサイクルの可能性等の観点からも有利であるからである。
【００３８】
本発明においては、形質転換体の生産する組換え酵素もしくはペプチド、すなわちβ-1,3-グルカナーゼ、β-1,3-グルカン結合ペプチドもしくは融合タンパク質は、次のようにして得ることができる。
【００３９】
酵素もしくはペプチドの抽出（もしくは粗精製）は、慣用されている各種抽出・粗精製法を適宜組み合わせて実施することができる。
具体的には、例えば、まず前記したようにして発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、適当な条件下で培養し、得られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離、により培養上清あるいは菌体を得る。このとき、特に形質転換体が分泌性である場合には、この培養上清を、そのままもしくは一定の濃縮（もしくは希釈）操作の後、後述の精製工程において用いて精製を行うことが出来る。また、通常の場合、もしくは菌体中に主に酵素もしくはペプチドが産生されている場合には、これを適当な緩衝液中に懸濁させ、凍結融解、超音波処理、酵素処理、もしくは、磨砕等により菌体を破砕し、遠心分離または濾過により、組換え酵素またはペプチドを含有する菌体抽出物を得ることができる。
【００４０】
これらの抽出方法は、精製しようとする酵素等の起源、細胞における存在部位、酵素等自体の性質、抽出処理を行おうとする菌体量等によって、適宜使い分けることができ、その操作条件も同様にして選択することができる。例えば、目的とするペプチドが、大腸菌中の細胞膜と外膜の間にあるペリプラズム領域に特に産生蓄積されているような場合には、内膜の構造を維持して外膜だけを破壊し、ペリプラズム領域中に存在する酵素等のみを優先的に抽出するような方法および操作条件を選択することも可能である。
【００４１】
酵素の精製は、慣用されている分離、精製法を適宜組み合わせて実施することができる。
このような方法としては、例えば、熱処理のような耐熱性の差を利用する方法、塩沈殿および溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、あるいは、等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、等が挙げられる。本発明においては、生産されるβ-1,3-グルカナーゼ、β-1,3-グルカン結合ペプチド、β-1,3-グルカン結合ペプチドを融合させたタンパク質はすべて、β-1,3-グルカンに強い親和性を有しているため、β-1,3-グルカンを使用したアフィニティークロマトグラフィーを用いるのが特に有効である。
【００４２】
用途に応じて、精製の程度を適宜選択することもできる。培養上清または菌体破砕物からの粗酵素のままのものを用いることもでき、また、各種精製工程で得られた精製酵素を使用することもできる。あるいは、各種精製手段を経てさらに単離精製された酵素を使用することもできる。
【００４３】
【実施例】
実施例１：β-1,3-グルカナーゼ遺伝子の翻訳領域の決定
バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株より常法に従って染色体ＤＮＡを得た。次にβ-1,3-グルカナーゼのＮ末シークエンス、およびβ-1,3-グルカナーゼの臭化シアン部分分解による断片のシークエンス、を行うことにより、アミノ酸配列を決定し、それに基づいて合成ＤＮＡを合成した。合成したプライマーにより染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株のβ-1,3-グルカナーゼ遺伝子を増幅させた。このＤＮＡをアガロース電気泳動で分画し、抽出・精製して、プローブ用ＤＮＡを得た。
【００４４】
このプローブＤＮＡをランダムプライマー法（ＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム山之内社製）で標識し、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株の染色体ＤＮＡを数種の制限酵素で切断した断片に対して、サザンハイブリダイゼーションを実施した。すなわち、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株の染色体ＤＮＡを数種の制限酵素で切断し、これらをゲル電気泳動法によりサイズに従い分画して、このゲル内のＤＮＡ断片をニトロセルロースフィルター上にブロッディングし、上記の標識したプローブとハイブリダイズさせた。標識プローブを検出することにより、β-1,3-グルカナーゼ遺伝子の翻訳領域を有する断片を特定したところ、この断片は、4kbのHindIII消化断片であった。次いで、この4kbのHindIII消化断片を用いて E. coli HB101を形質転換させた。この E. coli HB101は、形質転換されるとアンピシリン耐性株になるので、アンピシリンを含むパキマン−コンゴレッド培地上で培養すると、形質転換株のみが生育可能なため、形質転換株を選別できる。従って、上記の形質転換の後、パキマン−コンゴレッド培地で培養してハローを形成した大腸菌のみを分離し、これからプラスミド(pGM2)を回収した。このpGM2は、2.7および3.8kbの２種のHindIII消化断片を含んでいた。pGM２を種々の制限酵素で消化しpUC119にサブクローニングした。その結果、2kbのBamHＩ断片を有するpGM3が得られた。このプラスミドで形質転換したE. coli HB101は、パキマン−コンゴレッド培地でハローを形成したため、目的ＤＮＡを有していることが確認された。
【００４５】
得られたサブクローンからプラスミドＤＮＡを常法により調製し、ＤＮＡシークエンシングシステムモデル370Aおよび373A（パーキンエルマーアプライドバイオシステム社製）で塩基配列を決定した。配列番号２として記載した塩基配列が得られたが、この配列には分泌シグナル、ストップ、開始コドン等がさらにコードされていると考えられる。このため、この配列から、ＤＮＡ供与菌培養上清から精製した成熟型β-1,3-グルカナーゼを用いて決定したN-末端アミノ酸配列と分子量とから、成熟型酵素に対するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を推定した。そして、分泌シグナル、開始コドンを考慮して、β-1,3-グルカナーゼをコードする遺伝子領域を決定した。このようにして得られた塩基配列を配列番号３に記載した。また、対応するアミノ酸配列は配列番号１に記載した。
【００４６】
実施例２：バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株のβ-1,3-グルカナーゼ遺伝子の、大腸菌での発現
E. coli MBL4055（実施例１のpGM3を有する）をLB培地で培養した。なお、前記の株、即ち、Escherichia coli MBL4055株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５４３の受託番号のもと、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に１９９９年９月１日付けで寄託されている。菌体を超音波破砕機で破砕し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、４２kDaの分子量を示すタンパク質が存在し、そのタンパク質は、β-1,3-グルカナーゼ活性を示した。
この４２kDaのタンパク質は、大腸菌中のペリプラズムに生産されていた。そこで、リゾチーム処理を実施して、ペリプラズム成分を主に採取して、それから該タンパク質を回収した。得られたタンパク質は、352units/mgのβ-1,3-グルカナーゼ比活性を示した。この比活性値は、バチルス・サーキュランスＩＡＭ１６５株より抽出・精製して得られた分子量４２kDaのβ-1,3-グルカナーゼの比活性と同等の値であった。
【００４７】
実施例３：β-1,3-グルカン結合ペプチドの翻訳領域の決定
E. coli MBL4055（実施例１のpGM3を有する）をLB培地で培養した。得られた菌体を繰り返し凍結融解した後、超音波破砕して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後のタンパク質をラミナリン結合活性に基づいて染色した。その結果、成熟型β-1,3-グルカナーゼに相当する４２kDa、および２８kDaと１６kDaのタンパク質とが結合活性を示すことが認められた。これらのなかで、２８kDaタンパク質の結合活性は、他の２種類のタンパク質が有する結合活性よりも低かった。ラミナリン加水分解活性に基づいて、泳動後のタンパク質を染色したところ、４２kDaおよび２８kDaタンパク質がラミナリン加水分解活性を示した。１６kDaのタンパク質をDEAEカラムで精製してN-末端分析を行ったところ、そのN-末端配列は「Gln-Asp-Thr-Gly-Ala-Ser-Asn-Val-Ile-Ser」（QDTGASNVIS）（配列番号６）と一致した。すなわち、４２kDaの成熟型β-1,3-グルカナーゼが大腸菌のペリプラズムに蓄積する。蓄積した４２kDaの成熟型β-1,3-グルカナーゼは、末詳のプロテアーゼによって加水分解されて、２８kDaと１６kDaのタンパク質となる。２８kDaタンパク質はラミナリン加水分解活性を有し、１６kDaのタンパク質はラミナリン結合活性を有する。従って、１６kDaのタンパク質は、β-1,3-グルカナーゼに由来するβ-1,3-グルカン結合ペプチドであることが明らかとなった。
【００４８】
次いで、β-1,3-グルカン結合ペプチドの塩基配列決定を下記のように行った。即ち、先に決定した、１６kDaグルカン結合蛋白のＮ末端配列−QDTGASNVIS‥に相当する塩基配列caggacacgggtgcatcaaacgtgatcagt（配列番号７）を配列番号３に示したβ-1,3-グルカナーゼにより探した。その結果、配列番号３の７００番目から７２９番目の塩基配列に一致した。以上により配列番号３の７００番目から１１５２番目の配列をβ-1,3-グルカン結合ペプチドの塩基配列を決定した。この様にして決定されたβ-1,3-グルカン結合ペプチドの塩基配列を配列番号５に記載した。また。対応するアミノ酸配列は配列番号４に記載した。
【００４９】
【配列表】
0004431230.tif 000002
0004431230.tif 000003
0004431230.tif 000004
0004431230.tif 000005
0004431230.tif 000006
0004431230.tif 000007
0004431230.tif 000008