(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のｉ〜iｘ型から選択されるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）株の多型の右端ジャンクション（MREJ）型を含む少なくとも４種のMRSA株の有無を検出するための方法であって、
(a)前記株の有無について分析すべき事前に獲得しておいた試料を用意する、ここで各MSRA株は染色体DNAに挿入されるmecA遺伝子を含むブドウ球菌カセット染色体mec(SCCmec)要素を含むため、SCCmec要素の右端と当該右端に隣接する染色体DNAの双方に由来する配列を含むｉ〜iｘ型から選択される多形の右端ジャンクション（MREJ）領域が生成される、
(b)前記試料を、一緒になって前記少なくとも４種のMRSA株とハイブリダイズすることのできる複数のプライマー対と接触させる、ここで各プライマー対は第１プライマーと第２プライマーを含み、ここで
(i)当該第１プライマーはｉ〜iｘ型から選択されるMREJ型配列のSCCmec挿入体右端に特異的にハイブリダイズし、ここで当該SCCmec挿入体の右端は前記染色体DNAに挿入される前記SCCmec挿入体の組込み部位に隣接する；そして
(ii)当該第２プライマーは黄色ブドウ球菌の染色体配列にハイブリダイズする；そして
前記各プライマー対はi〜iｘ型から選択されるMREJ型配列に対応するアンプリコンの生成を可能にする
(c)(b)の混合物について増幅反応を行うことで、前記SCCmec挿入体が前記試料に存在しているとして、１又は複数の前記アンプリコンを生成する；そして
(d)前記１又は複数のアンプリコンの有無を検出する；
ステップを含んで成り、
ここで前記複数のプライマー対における前記第１プライマーは以下の群から選択されるMREJ核酸配列のSCCmec挿入体右端配列に特異的にハイブリダイズする、方法：
i. MREJ i型については配列番号 1, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 41, 199 ;
ii. MREJ ii型については配列番号 2, 17, 18, 19, 26, 40, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 197 ;
iii. MREJ iii型については配列番号 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 104, 184, 198
iv. MREJ iv型については配列番号 42, 43, 44, 45, 46, 51 ;
v. MREJ v型については配列番号 47, 48, 49, 50 ;
vi. MREJ vi型については配列番号 171 ;
vii. MREJ vii型については配列番号 165, 166 ;
viii. MREJ viii型については配列番号 167 ;
ix. MREJ ix型については配列番号 168。
【請求項２】
前記ブドウ球菌の染色体配列がorfX、配列番号 172、配列番号 231及びその相補体から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項３】
前記ブドウ球菌の染色体配列がorfXである、請求項３記載の方法。
【請求項４】
前記検出すべき少なくとも４種のMRSA株の検出がMREJ型ivの検出を含み、そしてプローブの使用をさらに含んで成り、ここで
(a)前記第一プライマーの少なくとも１つが、MREJのiv型配列のSCCmec挿入体の右端にハイブリダイズする、配列番号 79, 77, 145, 147, 68の群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、そして
(b)前記第二プライマーの少なくとも１つが、黄色ブドウ球菌染色体DNAにハイブリダイズする配列番号 64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89の群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、そして
(c)前記プローブの少なくとも１つが、(a)及び(b)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
MREJのiv型を含むMRSA株の検出のため、配列番号64と79からなるプライマー対を使用することを含んでなる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ(d)における検出が、配列番号32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるプローブを使用して行う、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが配列番号 84, 163, 164からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の第１及び第２プライマー又は請求項４〜７のいずれか１項記載のプローブが、以下のMREJ型の有無を決定するためのオリゴヌクレオチドである、 請求項１〜７のいずれか１項記載の方法：
A)  MREJ i型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号 66, 100, 101, 105, 52, 53, 54, 55, 56, 57から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89 から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
B)  MREJ ii型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号66, 97, 99, 1OO, 101, 106, 117, 118, 124, 125, 52, 53, 54, 55, 56, 57から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
C)  MREJ iii型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号67, 98, 102, 107, 108から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 58, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
D)  MREJ iv型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号79, 77, 145, 147から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 68, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
E)  MREJ v型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号65, 80, 146, 154, 155から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
F)  MREJ vi型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号202, 203, 204から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, l03, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
G)  MREJ vii型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号112, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 150, 151, 153から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
H)  MREJ viii型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号115, 116, 187, 188, 207, 208から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62
126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
I)  MREJ ix型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号109, 148, 149, 205, 206から成る群から選択される核酸配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164, 85, 86, 87, 88, 89から成る群から選択される核酸配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ。
【請求項９】
以下の配列番号の群から選択される少なくとも１つのプライマー対の使用を含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法：
a)  MREJ i型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/66, 64/100, 64/1O1; 59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57 ;
b)   MREJ ii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/101, 59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57 ;
c)   MREJ iii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/67, 64/98, 64/102 ; 59/58, 60/58, 61/58, 62/58, 63/58 ;
d)   MREJ iv型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/79 ;
e)   MREJ v型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/80 ;
f)   MREJ vi型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/204 ;
g)   MREJ vii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/112, 64/113 ;
h)   MREJ viii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/115, 64/116 ;
i)   MREJ ix型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/109, 64/116。
【請求項１０】
MREJ ｉ〜ix型を含んでなる少なくとも１つのMRSA株の有無の決定のための配列番号： 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164及びそれらの相補体の群から選択されるヌクレオチド配列からなる少なくとも１つのプローブの使用を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記第一プライマー、第二プライマー又は前記プローブが以下のMREJ型の有無を決定するためのオリゴヌクレオチドである、請求項８〜10のいずれか１項記載の方法：
A)  MREJ i及びii型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号 66のヌクレオチド配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 84, 163, 164から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
B)  MREJ iii型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号 67のヌクレオチド配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 84, 163, 164から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
C)  MREJ v型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号 80のヌクレオチド配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 84, 163, 164から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ；
D)  MREJ vii型、ここで前記オリゴヌクレオチドは以下のいずれか１つである：
(i)配列番号 112のヌクレオチド配列を含む第一プライマー；
(ii)配列番号64, 84, 163, 164から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む第二プライマー；又は
(iii)(i)及び(ii)に示す配列番号のいずれかから成る群から選択される核酸配列を含むプローブ。
【請求項１２】
試料中の少なくとも４種のMRSA株の有無を決定するための方法であって、前記MRSAの株は異なるMREJ株を含み、当該方法は
a)請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法を再現し、そして
b)前記試料中の前記少なくとも４種のMRSA株の有無の指標として各アンプリコンを別々に検出する、
ステップを含んでなる方法。
【請求項１３】
前記MRJEの型がMRJE型iv, MRJE型i, MRJE型ii及びMRJE型iiiである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記MRJEの型がMRJE型iv, MRJE型i, MRJE型ii, MRJE型iii及びMRJE型viiである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
前記MRJEの型がMRJE型iv, MRJE型i, MRJE型ii, MRJE型iii, MRJE型v, MRJE型vi, MRJE型vii, MRJE型viii及びMRJE型ixである、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
検出すべき前記少なくとも４種のMRSA株がMREJ型ivの検出を含んでなり、ここで
前記第１プライマーは配列番号 79及び145の群から選択されるヌクレオチド配列からなるMREJ型ivの配列のSCCmec挿入体の右端にハイブリダイズし、そして
前記第２プライマーは配列番号 64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 85, 86, 87, 88からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる黄色ブドウ球菌染色体配列にハイブリダイズする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164からなる群から選択される少なくとも１つのプローブの使用をさらに含んでなる、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記MREJ型ivの配列のSCCmec挿入体の右端にハイブリダイズする第１プライマーが配列番号 79及び145の群から選択されるヌクレオチド配列からなり、そして前記ブドウ球菌染色体配列にハイブリダイズする第２プライマーが配列番号 64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103, 130, 132, 158, 159, 59, 62, 126, 127, 128, 129, 131, 200, 201, 60, 61, 63, 85, 86, 87, 88からなる、請求項16又は17記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のプライマー対の前記第１プライマーが、
(i) MREJ型ivの検出については配列番号79, 
(ii)  MREJ型vの検出については配列番号80,
(iii) MREJ型viの検出については配列番号204,
(iv) MREJ型viiの検出については配列番号112,
(v) MREJ型viiiの検出については配列番号115,
(vi) MREJ型ixの検出については配列番号109からなる群から選択され、
そして前記複数のプライマー対の前記第２プライマーが配列番号64である、請求項１〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ(d)における検出が、配列番号32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるプローブを使用して行う、請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブが配列番号 84, 163, 164からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも４組のプライマー対の使用をさらに含んで成り、ここで当該４組のプライマー対の各々は異なるMREJの型を含むMRSA株に特異的であり、ここで前記少なくとも４組のプライマー対が下記の群から選択される、請求項１〜21のいずれか１項に記載の方法：
a)  MREJ i型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/66, 64/100, 64/1O1; 59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57 ;
b)  MREJ ii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/101, 59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57 ;
c)  MREJ iii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/67, 64/98, 64/102 ; 59/58, 60/58, 61/58, 62/58, 63/58 ;
d)   MREJ iv型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/79 ;
e)   MREJ v型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/80 ;
f)   MREJ vi型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/204 ;
g)   MREJ vii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/112, 64/113 ;
h)   MREJ viii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/115, 64/116 ;
i)   MREJ ix型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/109, 64/116。
【請求項２３】
前記プライマーおよび／またはプローブが同じ物理的エンクロージャ内で一緒に使用される、請求項１〜22のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記プライマーおよび／またはプローブが全て共通のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするように選定される、請求項１〜23のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
リアルタイムPCRを使用する、請求項１〜24のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
マルチプレックスPCRを使用する、請求項１〜25のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜26のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記キットが一緒に前記少なくとも４種のMRSA株にハイブリダイズできる複数のプライマー対を含んでなり、各プライマー対は：
a)型ｉ〜ixから選択されるMREJ核酸のSCCmec挿入体の右端に特異的にハイブリダイズする第１プライマー、ここで当該SCCmec挿入体の右端は染色体DNAに入る当該SCCmec挿入体の組込み部位に隣接する；及び
b) ブドウ球菌染色体DNAの特異的な配列に特異的にハイブリダイズする第２プライマー；
を含んで成り、それにより、前記MRSA株が試料中に存在しているなら、１又は不k数のアンプリコンを生成し、
ここで前記第１プライマーは以下の群から選択されるMREJ核酸配列のSCCmec挿入体の右端配列に特異的にハイブリダイズする、キット：
i. MREJ i型については配列番号 1, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 41, 199 ;
ii. MREJ ii型については配列番号 2, 17, 18, 19, 26, 40, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 197 ;
iii. MREJ iii型については配列番号 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 104, 184, 198
iv. MREJ iv型については配列番号 42, 43, 44, 45, 46, 51 ;
v. MREJ v型については配列番号 47, 48, 49, 50 ;
vi. MREJ vi型については配列番号 171 ;
vii. MREJ vii型については配列番号 165, 166 ;
viii. MREJ viii型については配列番号 167 ;
ix. MREJ ix型については配列番号 168。
【請求項２８】
前記ブドウ球菌の特異的な配列がorfXである、請求項27記載のキット。
【請求項２９】
前記プライマー対のいずれかにおいて、前記a)における第１プライマーが配列番号 79, 77, 145, 147及び68からなる群から選択される核酸からなる、請求項27又は28記載のキット。
【請求項３０】
前記プライマー対の１組が配列番号79からなる第１プライマー及び配列番号64からなる第２プライマーからなる、請求項29記載のキット。
【請求項３１】
配列番号32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164からなる群から選択される配列からなる少なくとも１つのプローブの使用をさらに含んでなる、請求項30記載のキット。
【請求項３２】
配列番号64及び79からなるプライマー対を含んでなる、請求項27〜31のいずれか１項記載のキット。
【請求項３３】
少なくとも４組のプライマー対の使用をさらに含んで成り、ここで当該４組のプライマー対の各々は異なるMREJの型を含むMRSA株に特異的であり、ここで前記少なくとも４組のプライマー対が下記の群から選択される、請求項27〜31のいずれか１項に記載のキット：
a)  MREJ i型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/66, 64/100, 64/1O1, 59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57 ;
b)  MREJ ii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/101, 59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57 ;
c)  MREJ iii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/67, 64/98, 64/102, 59/58, 60/58, 61/58, 62/58, 63/58 ;
d)   MREJ iv型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/79 ;
e)   MREJ v型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/80 ;
f)   MREJ vi型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/204 ;
g)   MREJ vii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/112, 64/113 ;
h)   MREJ viii型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/115, 64/116 ;
i)   MREJ ix型を含んでなるMRSA株の有無の決定については64/109, 64/116。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の臨床的意義
コアグラーゼ陽性の種である黄色ブドウ球菌は、人間の日和見病原体としてよく知られている。黄色ブドウ球菌(S. aureus)により引き起こされる院内感染は疾患と死亡の主要な原因である。黄色ブドウ球菌により引き起こされる最も一般的な伝染病のうちのいくつかは、皮膚が関係しており、これらは様々な部位のフルンケルまたは腫脹、蜂巣炎、とびひおよび手術後の創傷感染を含む。黄色ブドウ球菌により引き起こされるいくつかのより重症の伝染病は、菌血症、肺炎、骨髄炎、急性心内膜炎、心筋炎、心膜炎、脳炎、髄膜炎、熱傷様皮膚症候群および様々な膿瘍である。ブドウ球菌腸毒素により仲介される食中毒は、黄色ブドウ球菌に関係する別の重要な症候群である。毒素ショック症候群(コミュニティー後天性疾患)も、毒素産生の黄色ブドウ球菌による伝染あるいはコロニー形成に起因すると考えられている(Murrayら編、 1999, 「臨床微生物学のマニュアル（Manual of Clinical Mlcrobiology）」、第７版、ASM Press, ワシントンD.C.)。
【背景技術】
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は、病院における大きな臨床・疫学の問題として1980年代に出現した。MRSAは、黄色ブドウ球菌感染症を治療するための最も一般に用いられている抗生物質であるペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム（carbapenems）、およびモノバクタムを含む、すべてのβ−ラクタムに耐性がある。MRSA感染症は、より毒性でより高価な抗生物質によってのみ治療することができ、これは通常、最終的防御法として使用されている。MRSAは、人を介して患者から患者まで容易に広がることができるため、世界中の病院は、MRSAを制御する問題に直面している。従って、その伝搬を減少させ感染した患者の診断および治療を改善するために、MRSAの検出および／または同定のための迅速かつ簡便なスクリーニング試験または検出試験を開発する必要がある。
【０００３】
黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性は、スルヌメラリ（surnumerary）β−ラクタム耐性ペニシリン結合タンパク質（PBP）をコードする、他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（CNS）からのDNAの獲得によるものであり、これは、細胞がβ−ラクタム抗体に暴露されると、正常なPBPの生合成機能を引き継ぐという点でユニークである。黄色ブドウ球菌は通常４つのPBPを含有し、このうちPBP1、2、および3が必須である。MRSA中の低親和性PBP（PBP2a（またはPBP2'）と呼ぶ）は、染色体mecA遺伝子によりコードされ、β−ラクタム耐性トランスペプチダーゼとして機能する。mecA遺伝子は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌では欠如しているが、他のブドウ球菌種には広く分布しており、高度に保存されている（Ubukataら、1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34:170-172）。
【０００４】
黄色ブドウ球菌N315株（1982年に日本で単離された）からのmecA遺伝子の周りのDNA領域のヌクレオチド配列測定により、Hiramatsuらは、mecA遺伝子が新規遺伝要素（ブドウ球菌カセット染色体mec（Sccmec）と呼ぶ）により運搬され、染色体中に挿入されることを見つけた。SCCmecは、末端逆転配列および直接繰り返し配列（部位特異的リコンビナーゼ遺伝子のセット（ccrAとccrB））とmecA遺伝子複合体の存在が特徴である（Itoら、1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458；Katayamaら、2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1549-1555）。この要素は、黄色ブドウ球菌N315株から正確に切断され、特異的な黄色ブドウ球菌染色体部位に同じ配向で、ccrAとccrBを含むリコンビナーゼ遺伝子のユニークなセットの機能を介して取り込まれる。SCCmecに類似の構造的特徴を共有する２つの新規遺伝子要素が、MRSA NCTC10442株（1961年にイングランドで単離された最初のMRSA株）および85/2082株（1985年にニュージーランドで単離された株）からのmecA遺伝子の周りのDNA領域のクローニングと配列決定により見つかった。この３つのSCCmecは、株の単離の年に基づきＩ型（NCTC10442）、II型（N315）、およびIII型（85/2082）と呼ばれる（Itoら、2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336）（図１）。Hiramatsuらは、SCCmec DNAが、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）染色体の特異的部位に組み込まれることを見つけた。彼らは、SCCmec DNAの左右の境界の周りの領域のヌクレオチド配列（すなわち、それぞれattLとattR）ならびにSCCmec DNA組み込み部位の周りの領域のヌクレオチド配列（すなわち、SCCmec DNAの細菌染色体結合部位であるattBscc）を性状解析した。attBscc部位は、新規読みとり枠（ORF）（orfX）の3'末端に位置していた。orfXは、機能は不明であるがいくつかのすでに同定されているポリペプチドと同一性を共有する159アミノ酸ポリペプチドをコードする可能性がある（Itoら、1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458）。最近、新しい型のSCCmec（IV型）が、Hiramatsuら（Maら、2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152）とOliveriraら（Oliveiraら、2001, Microb. Drug Resist. 7:349-360）の両方により開示された。Hiramatsuら（Maら、2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152）が公表した黄色ブドウ球菌CA05と8/6-3P株からの新しいIV型SCCmecの右端の配列は、黄色ブドウ球菌N315株（Itoら、2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336）のII型SCCmecのものと、2000ヌクレオチドにわたってほとんど同一であった。SCCmec IV型の右端の配列はどれも、Oliveriraら（Oliveiraら、2001, Microb. Drug Resist. 7:349-360）が開示した黄色ブドウ球菌HDE288株とPL72株からは得られなかった。
【０００５】
mecA遺伝子と黄色ブドウ球菌特異的染色体配列の検出に基づく、MRSAを検出し同定するために使用された以前の方法（Saitoら、1995, J. Clin. Microbiol. 33:2498-2500；Ubukataら、1992, J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733；Murakamiら、1991, J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244；Hiramatsuら、1992, Microbiol. Immunol. 36:445-453）は、mecA遺伝子が黄色ブドウ球菌とCNS種に広く分布している（Suzukiら、1992, Antimicrob. Agents Chemother. 36:429-434）ため、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（CNS）からのMRSAの区別において問題につきあたった。Hiramatsuら（米国特許第6,156,507号）は、SCCmec DNAの３つの型の右端に特異的にハイブリダイズすることができるプライマーを、SCCmec組み込み部位の右側のヌクレオチド配列に対応する黄色ブドウ球菌染色体に特異的なプライマーと組合せて使用して、MRSAに特異的なPCR測定法を開示した。他のブドウ球菌種（例えば、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）およびスタフィロコッカス・ヘモリチカス（S. haemolyticus））のSCCmec組み込み部位の周りのヌクレオチド配列は、黄色ブドウ球菌中のものとは異なるため、このPCR測定法は、MRSAの検出に特異的であった。このPCR測定法はまた、SCCmec DNAのMREP型判定（「mec右端多型」を意味する）の情報を与えた（Itoら、2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336；Hiramatsuら、1996, J. Infect. Chemother. 2:117-129）。この型判定法は、SCCmecの３つの型の間の組み込み部位に隣接するSCCmec DNAの右端の多型を利用する。III型はユニークなヌクレオチド配列を有し、II型は、SCCmec Ｉ型の右端に102ヌクレオチドが挿入されている。Hiramatsuら（Itoら、2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336；Hiramatsuら、1996, J. Infect. Chemother. 2:117-129）が開示したMREP型判定法は、SCCmec Ｉ型をMREP ｉ型とし、SCCmec II型をMREP ii型とし、SCCmec III型をMREP iii型と規定する。Hiramatsuら（Maら、2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152）が開示した新しいSCCmec IV型とSCCmec II型は、右端に同じヌクレオチド配列を示すため、MREP型判定法は、これらの２つのSCCmec型と区別できないことに注意されたい。
【０００６】
最適のプライマー組合せ（本発明の配列番号56、58および60に対応する米国特許第6,156,507号のそれぞれ配列番号22、24、28）としてHiramatsuらが記載したプライマーセットは、種々のMRSAとMSSA株をPCRにより試験するために、本発明で使用されている（図１と表１）。試験した39個のMRSA株のうち20個は、HiramatsuらのマルチプレックスPCRアッセイ（表２と３）により増幅されなかった。Hiramatsuの方法は確かに、試験した39個のMRSA株の50％未満の検出に成功しただけである。この知見は、いくつかのMRSA株が、Hiramatsuらが同定したものとは異なるSCCmec右端ジャンクションの配列を右端で有することを示す。従ってHiramatsuらが開発した系は、すべてのMRSAを検出することができない。本発明は、Hiramatsuらの測定法を改良するための、より多くのMRSA株を検出するのに必要なSCCmec右端ジャンクション配列データの作成に関する。世界中のほとんどのMRSA株の検出のためのより普遍的なプローブとプライマーを開発する必要がある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、すべてのMRSA株からの核酸の存在および／または量を測定するためのプローブおよび／または増幅プライマーを使用する特異的で普遍的な高感度法を提供することである。
【０００８】
MRSA株IV〜Ｘ型である株のうち少なくとも50％の普遍性が本発明の目的である。
【０００９】
従って本発明において、試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）株の存在を検出するための方法であって、MRSA株は、mecA遺伝子を含有するSCCmec挿入体の存在のために耐性であり、該SCCmecは、細菌の核酸中に挿入され、従って多型の右端ジャンクション（MREJ）を生成し、該方法は、試料の核酸に複数のプローブおよび／またはプライマーをアニーリングさせる工程を含み：
(i) プライマーおよび／またはプローブはMRSA株に特異的であり、多型MREJ核酸とアニーリングすることができ、多型MREJはMREJ ｉ〜ｘ型を含み；そして
(ii) プライマーおよび／またはプローブは一緒に、MREJ ｉ〜ｘ型から選択される少なくとも４つのMREJ型とアニーリングすることができる、
ことを特徴とする方法が提供される。
【００１０】
具体例において、プライマーおよび／またはプローブはすべて、通常のアニーリング条件下でアニーリングするように選択され、さらに詳しくはこれらは、一緒に同じ物理的エンクロージャ内に置かれる。
【００１１】
少なくとも10ヌクレオチドの長さを有し、配列番号 1, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 41, 199 ; 2, 17, 18, 19, 26, 40, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 197 ; 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 104, 184, 198 で定義される、MREJ  i〜iii型とアニーリングすることができ、および配列番号 42, 43, 44, 45, 46, 51 ; 47, 48, 49, 50 ; 171 ; 165, 166 ; 167 ; 168を有する、MREJ  iv〜ix型の１つ以上と、アニーリングすることができるプライマーおよび／またはプローブを使用して、具体的な方法が開発された。配列決定されたすべてのMREJに完全に対応できるために、プライマーおよび／またはプローブは一緒に、MREJ ｉ〜ix型の該配列番号にアニーリングすることができる。
【００１２】
以下の配列を有する以下の特異的プライマーおよび／またはプローブが設計されている：
MREJ ｉ型の検出用に、
66, 100, 101, 105, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 64, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
70, 103, 130, 132, 158, 159, 59,
62, 126, 127, 128, 129, 131, 200,
201, 60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ ii型の検出用に、
66, 97, 99, 1OO, 101, 106, 117,
118, 124, 125, 52, 53, 54, 55, 56, 57
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70,
103, 130, 132, 158, 159
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ iii型の検出用に、
67, 98, 102, 107, 108
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70,
103, 130, 132, 158, 159
58,
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ iv型の検出用に、
79, 77, 145, 147
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70,
103, 130, 132, 158, 159
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
68
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ v型の検出用に、
65, 80, 146, 154, 155
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
70, 103, 130, 132, 158, 159
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ vi型の検出用に、
202, 203, 204
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70,
l03, 130, 132, 158, 159
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ vii型の検出用に、
112, 113, 114, 119, 120, 121, 122
123, 150, 151, 153
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70, 103,
130, 132, 158, 159
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ viii型の検出用に、
115, 116, 187, 188, 207, 208
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 70,
103, 130, 132, 158, 159
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89
MREJ ix型の検出用に、
109, 148, 149, 205, 206
64, 71, 72, 73, 74, 75, 76
70, 103, 130, 132, 158, 159
59, 62
126, 127
128, 129, 131, 200, 201
60, 61, 63
32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164
85, 86, 87, 88, 89。
【００１３】
これらのうち、以下の配列を有する以下のプライマー対が使用される：
i型MREJの検出用に、
64/66, 64/100, 64/1O1; 59/52,
59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57,
60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56
60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55
61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54
62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53
63/54, 63/55, 63/56, 63/57
ii型MREJの検出用に、
64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/1O1
59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56,
59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55,
60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54,
61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53,
62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52
63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57
iii型MREJの検出用に、
64/67, 64/98, 64/102 ; 59/58,
60/58, 61/58, 62/58, 63/58
iv型MREJの検出用に、
64/79
v型MREJの検出用に、
64/80
vi型MREJの検出用に、
64/204
vii型MREJの検出用に、
64/112, 64/113
viii型MREJの検出用に、
64/115, 64/116
ix型MREJの検出用に、
64/109。
【００１４】
同様に、これらのうち以下の配列を有する以下のプローブが使用される：MREJ ｉ〜ix型の検出用に配列番号： 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164。
【００１５】
最も好適な例の方法において、以下のヌクレオチド配列を有する以下のプライマーおよび／またはプローブが一緒に使用される。好適な組合せは以下を使用する：
i) MREJ i型の検出用に配列番号： 64, 66, 84, 163, 164
ii) MREJ ii型の検出用に配列番号： 64, 66, 84, 163, 164
iii) MREJ iii型の検出用に配列番号： 64, 67, 84, 163, 164
iv) MREJ iv型の検出用に配列番号： 64, 79, 84, 163, 164
v) MREJ v型の検出用に配列番号： 64, 80, 84, 163, 164
vi) MREJ vii型の検出用に配列番号： 64, 112, 84, 163, 164。
【００１６】
これらのすべてのプローブとプライマーは、同じ物理的エンクロージャ内で使用することができる。
【００１７】
本発明の別の目的は、MRSA株のMREJを型判定する方法であって、確定したMREJ型に特異的なプライマーおよび／またはプローブを用いて上記方法を再現し、確定したMREJ型の存在の指標としてアニーリングされたプローブまたはプライマーを検出する工程を含む方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、以下の配列番号から選択される核酸を提供する：
i) MREJ iv型の配列用に配列番号： 42, 43, 44, 45, 46, 51；
ii) MREJ v型の配列用に配列番号： 47, 48, 49, 50；
iii) MREJ vi型の配列用に配列番号： 171；
iv) MREJ vii型の配列用に配列番号： 165, 166；
v) MREJ viii型の配列用に配列番号： 167；
vi) MREJ ix型の配列用に配列番号： 168。
【００１９】
これらのヌクレオチドの任意のものにハイブリダイズし、iv〜ixから選択される型の１つ以上のMREJにハイブリダイズする少なくとも10ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドもまた、本発明の目的である。これらのうち、以下の配列番号を有するプライマー対（またはプローブ）もまた本発明の範囲内である：
i型MREJの検出用に、
64/66, 64/100, 64/1O1; 59/52,
59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57,
60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56
60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55
61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54
62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53
63/54, 63/55, 63/56, 63/57
ii型MREJの検出用に、
64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/1O1
59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56,
59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55,
60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54,
61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53,
62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52
63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57
iii型MREJの検出用に、
64/67, 64/98, 64/102 ; 59/58,
60/58, 61/58, 62/58, 63/58
iv型MREJの検出用に、
64/79
v型MREJの検出用に、
64/80
vi型MREJの検出用に、
64/204
vii型MREJの検出用に、
64/112, 64/113
viii型MREJの検出用に、
64/115, 64/116
ix型MREJの検出用に、
64/109。
【００２０】
さらに、配列番号 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164の任意の１つで定義されるヌクレオチド配列を有する内部プローブもまた、本発明の範囲内である。iv〜ixから選択される型の１つ以上のMREJならびに上記核酸とアニーリングまたはハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを含む、ｉ〜iiiから選択される型の１つ以上のMREJにハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを含むかまたは含まない、組成物はさらに、本発明の目的である。好適な組成物は、以下の配列番号で定義されるヌクレオチド配列を有するプライマー：
i型MREJの検出用に、
64/66, 64/100, 64/1O1; 59/52,
59/53, 59/54, 59/55, 59/56, 59/57,
60/52, 60/53, 60/54, 60/55, 60/56
60/57, 61/52, 61/53, 61/54, 61/55
61/56, 61/57, 62/52, 62/53, 62/54
62/55, 62/56, 62/57, 63/52, 63/53
63/54, 63/55, 63/56, 63/57
ii型MREJの検出用に、
64/66, 64/97, 64/99, 64/100, 64/1O1
59/52, 59/53, 59/54, 59/55, 59/56,
59/57, 60/52, 60/53, 60/54, 60/55,
60/56, 60/57, 61/52, 61/53, 61/54,
61/55, 61/56, 61/57, 62/52, 62/53,
62/54, 62/55, 62/56, 62/57, 63/52
63/53, 63/54, 63/55, 63/56, 63/57
iii型MREJの検出用に、
64/67, 64/98, 64/102 ; 59/58,
60/58, 61/58, 62/58, 63/58
iv型MREJの検出用に、
64/79
v型MREJの検出用に、
64/80
vi型MREJの検出用に、
64/204
vii型MREJの検出用に、
64/112, 64/113
viii型MREJの検出用に、
64/115, 64/116
ix型MREJの検出用に、
64/109、
または、配列番号 32, 83, 84, 160, 161, 162, 163, 164であるプローブ、またはこの両方を含むであろう。
発明の詳細な説明
ここで、各MRSA核酸またはその変種もしくは一部は、普遍的であるように開発された該プライマーまたはプローブとハイブリダイズ可能な選択された標的領域を含む方法が提供され；
ここで、各核酸またはその変種もしくは一部は、該プライマーまたはプローブとハイブリダイズ可能な選択された標的領域を含み；
該方法は、試料にプローブまたはプライマーを接触させる工程、およびMRSAの存在および／または量の指標としてハイブリダイズしたプローブまたは増幅産物の存在および／または量を検出する工程を含む。
【００２１】
この方法では、SCCmec右端とSCCmec組み込み部位の右の染色体DNAからの配列を含む、SCCmec染色体右端ジャンクション（以後、「mec右端ジャンクション」を意味するMREJと呼ぶ）のDNA断片の配列は、そこからプライマーおよび／またはプローブが得られる親配列として使用される。MREJ配列は、我々の専有の配列ならびに公のデータおよび米国特許第6,156,507号から得られる配列を含み、標的のMRSA核酸を感度良く、特異的に、普遍的に、および迅速に検出する能力について選択された。
【００２２】
我々の占有のDNA断片およびオリゴヌクレオチド（プライマーとプローブ）はまた、本発明の別の目的である。
【００２３】
MRSAの検出のための増幅プライマーまたはプローブを含む診断キットのような組成物もまた、本発明の目的である。
【００２４】
上記方法とキットにおいて、プローブおよびプライマーは核酸に限定されず、特に限定されないが、核酸の類似体を含む。プローブおよびプライマーにより構成される診断試薬は、任意の適切な型で存在してもよい（固体支持体に結合、液体、凍結乾燥型など）。
【００２５】
上記方法とキットにおいて、増幅反応は特に限定されないが：a) ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、b) リガーゼ連鎖反応（LCR）、c) 核酸配列ベースの増幅（NASBA）、d) 自立式の配列複製（3SR）、e) 鎖置換増幅（SDA）、f) 分岐DNAシグナル増幅（bDNA）、g) 転写介在増幅（TMA）、h) サイクリングプローブ技術（CPT）、i) ネステッド（nested）PCR、j) マルチプレックスPCR、k) 固層増幅（SPA）、l) ヌクレアーゼ依存性シグナル増幅（NDSA）、m) ロリングサークル増幅技術（RCA）、n) 固定（anchored）鎖置換増幅、o) 固層（固定化）ロリングサークル増幅がある。
【００２６】
上記方法とキットにおいて、標的遺伝子の核酸の検出は、リアルタイムまたは増幅後技術を含む。これらの検出技術には、特に限定されないが、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく方法、例えばプローブの隣接ハイブリダイゼーション（プローブ−プローブおよびプローブ−プライマー法を含む）、TaqManプローブ、分子ビーコンプローブ（molecular beacon probe）、Scorpionプローブ、ナノ粒子プローブおよびAmplifluorプローブがある。他の検出法には、免疫学的方法を介する標的遺伝子核酸検出、フィルター、チップまたは任意の他の固体支持体上の固層ハイブリダイゼーション法がある。これらの系においてハイブリダイゼーションは、蛍光、化学発光、電位差測定、質量スペクトル法、プラズマ共鳴、偏光測定、比色法、フローサイトメトリーまたはスキャン法により追跡することができる。ジデオキシ停止またはハイブリダイゼーションによる配列決定（例えば、DNAチップを使用する配列決定）を含むヌクレオチド配列決定法は、標的遺伝子の核酸を検出しかつ性状解析するための別の方法である。
【００２７】
好適な実施態様においてPCRプロトコールが、核酸増幅のために使用される。
【００２８】
異なるMREJ型を有する複数のMREJ株候補を検出する方法は、別個の反応と物理的エンクロージャで、１回に１つの型だけ行われる。あるいは、別の物理的エンクロージャまたは同じ物理的エンクロージャで異なる型について同時に行われる。後者のシナリオでは、オリゴヌクレオチドがすべて、共通の条件下で標的領域にアニーリングすることができることを必要とするマルチプレックスPCR反応が行なわれるであろう。多くのプローブまたはプライマーは、確定したMREJ型に特異的なため、MRSA株を型判定することは可能である。２つ以上の型と一緒にアニーリングするオリゴヌクレオチドの混合物が、単一の物理的エンクロージャまたは容器中で使用される時、型を互いに区別するために異なる標識物が使用されるであろう。
【００２９】
我々は、MRSAを検出し同定するためのDNAベースの検査またはキットを開発することを目的としている。orfX遺伝子およびいくつかのSCCmec DNA断片の配列は公のデータベースから入手でき、MRSAの検出のためにDNAベースの検査を開発するのに使用されているが、本発明の目的であるMRSA検出と同定の改良を可能にする新しい配列データは、これまで性状解析されていないか、または組み込み部位に隣接するSCCmecの右端に位置することは証明されていない（表４）。これらの新規配列は、Hiramatsuら（米国特許第6,156,507号）が開発したMRSA特異的PCR測定法では予測されていないかまたは検出されていない。これらの配列は、世界中のすべての主要な流行性クローンを含むより多くのMRSA株の検出と同定のための普遍的なプライマーとプローブの設計を可能にするため、MRSAの診断のための現在のDNAベースの検査の改良を可能にするであろう。
【００３０】
上記の診断用キット、プライマーおよびプローブは、in vitroまたはin situ応用に使用されても、MRSAを検出および／または同定するのに使用することができる。試料には、特に限定されないが：任意の臨床試料、任意の環境試料、任意の微生物培養物、任意の微生物コロニー、任意の組織、および任意の細胞株がある。
【００３１】
診断用キット、プライマーおよびプローブが、単独でまたは微生物を検出および／または同定するのに適した任意の他の測定法（特に限定されないが、核酸検出に基づく任意の測定法、任意の免疫測定法、任意の酵素的測定法、任意の生化学的測定法、任意の溶菌的測定法、任意の血清学的測定法、任意の示唆培養培地、任意の増強培養培地、任意の培養培地、任意のと測定培地、任意の同定培養培地、任意の計数培養培地、任意の細胞染色、任意の培養物または特異的細胞株、および動物での任意の感染性測定法がある）と組合せて使用できることもまた、本発明の目的である。
【００３２】
後述の方法とキットにおいてオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅プライマーは、より大きな配列（すなわち、少なくとも100塩基対のDNA断片）から得られている。すべてのDNA配列は、我々の占有の配列または公のデータベースから得られている（表５、６、７、８および９）。
【００３３】
本発明に記載のものおよびMRSAの検出および／または同定に適したもの以外のオリゴヌクレオチド配列がまた、占有の断片配列または選択された公のデータベース配列からも得られることは、当業者には明らかである。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、より短くてもよいが、少なくとも10ヌクレオチドの長さであるかまたは選択されたものより長い；これらはまた、占有のDNA断片中または公のデータベースから選択される配列中の任意の別のところで選択してもよい；これらはまた、同じオリゴヌクレオチドの変種でもよい。標的DNAまたはその変種が特定のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするなら、または標的DNAまたは変種が、特定のオリゴヌクレオチドPCRプライマー対により増幅することができるなら、逆もまた真である；特定の標的DNAは、変種オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするか、または変種オリゴヌクレオチドPCRプライマーにより増幅される。あるいはオリゴヌクレオチドは、PCR以外の増幅法で使用される該DNA断片配列から設計される。従って、本発明の核心は、特異的かつ普遍的なオリゴヌクレオチドプローブおよび／または増幅プライマーの供給源として使用されるゲノムDNA配列を標的とすることによる、MRSAの検出および／または同定である。診断目的に適したオリゴヌクレオチドの選択と評価には多大な努力が必要であるが、当業者は、選択されたDNA断片から、診断目的に適した表５、６、７、８および９に記載のものとは異なるオリゴヌクレオチドを得ることができる。占有の断片または公のデータベース配列がその特異性と普遍性のために選択されると、これは、そのサブセットもまた特異的で普遍的となる可能性を上昇させる。
【００３４】
占有のDNA断片は、新しいプライマーを用いてMRSAを増幅することにより作成される配列のレパートリーとして得られている。これらのプライマーおよび核酸のレパートリーならびにヌクレオチド配列のレパートリーは、本発明のさらなる目的である（表４、５、６、７、８および９）。
【００３５】
従って請求項は本発明に従う。
MRSAの検出と同定のための配列
本発明の説明において「核酸」および「配列」という用語は同義で使用される。しかし「核酸」は化学物質であり、「配列」は「核酸」によりコードされる情報の断片である。核酸と配列の両方とも、本発明に関する事項について同様に貴重な情報源である。
オリゴヌクレオチドプライマーとプローブの設計と合成
設計の規則の一部として、すべてのオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーション用プローブとPCRによるDNA増幅用のプライマー）を、コンピューター解析により標準的プログラム（すなわち、GCG ウィスコンシンパッケージプログラム、プライマー解析ソフトウェアOligo（登録商標）6とMFOLD3.0）を使用して、ハイブリダイゼーションまたはPCR増幅についてその安定性を評価した。PCRプライマー対の適切性もまた、その合成前に、不要な特徴（例えば、長い連続した１つのヌクレオチド、および3'末端での高い比率のGまたはC残基）が無いことを証明して評価した（Persingら、1993, 「診断分子微生物学：原理と応用（Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications）」、アメリカ微生物学会（American Society for Microbiology）、ワシントンD.C.）。オリゴヌクレオチド増幅プライマーを、自動DNA合成機（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems））を使用して合成した。分子ビーコン設計は、Kramerら（http://www.molecular-beacons.org）が確立した基準を使用して評価した。
【００３６】
プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチド配列は、２本鎖DNAのいずれかの鎖から得られる。プライマーまたはプローブは、塩基Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ、または類似体からなり、１つ以上の選択されたヌクレオチド位置で縮重してもよい（Nicholsら、1994, Nature 369:492-493）。プライマーとプローブはまた、ロックト核酸（LNA）（Koskinetら、1998, Tetrahedron 54:3607-3630）、およびペプチド核酸（PNA）（Egholmら、1993, Nature 365:566-568）のようなヌクレオチド類似体からなるものでもよい。プライマーまたはプローブは、任意の適切な長さでよく、占有の断片からまたはMRSAの検出に適した選択されたデータベース配列からのDNA配列内の任意の位置で選択されてよい。
【００３７】
ある標的微生物遺伝子については変種が天然に存在し、これは進化中の遺伝子内の配列の変化によるとされている（Watsonら、1987, 「遺伝子の分子生物学（Molecular Biology of the Gene）第４版」、ザベンジャミン／カミングズ出版社（The Benjamin/Cummings Publishing Company）、Menlo Park、カリホルニア州；Lewin, 1989, 「遺伝子（Genes）IV」、ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク、ニューヨーク州）。例えば、同じ微生物種の異なる株が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション部位に単一のまたはそれ以上のヌクレオチド変化を有することがある。当業者は、特定の遺伝子について変種の核酸および／または配列が存在することは充分承知しており、配列変化の頻度は、ある遺伝子産物について進化中の選択的圧力に依存する。２つのPCRプライマーの間の領域についての変種配列の検出は、増幅産物を配列決定することにより証明される。プライマーハイブリダイゼーション部位での配列変化の存在を証明するためには、ハイブリダイゼーション部位の外に、PCRプライマーを使用してより大きなDNA標的を増幅しなければならない。この大きな断片の配列決定は、このプライマーハイブリダイゼーション部位での配列変化の検出を可能にするであろう。プローブのハイブリダイゼーション部位での変化を示すために、同様の方法が応用できるであろう。標的核酸および／または配列またはその一部の分岐は、増幅プライマーまたはプローブの感度および／または特異性および／または普遍性に大きな影響を与えないため、変種微生物DNAは本発明の範囲内にある。選択されたプライマーまたはプローブの変種はまた、変種標的DNAを増幅するかまたはこれにハイブリダイズするのに使用される。
DNA増幅
広く使用されているPCR法によるDNA増幅について、プライマー対は、我々の占有のDNA断片または公のデータベース配列から得られた。
【００３８】
PCRによるDNA増幅の間、微生物ゲノムからの熱変性標的DNAの各鎖に結合するそれぞれ２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、DNAの変性、プライマーのアニーリング、および各サイクルでの新しい標的の合成を可能にする連続的熱サイクルにより、標的DNAがインビトロで指数的に増幅される（Persingら、1993, 「診断分子微生物学：原理と応用（Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications）」、アメリカ微生物学会（American Society for Microbiology）、ワシントンD.C.）。
【００３９】
簡単に説明すると、標準的サーマルサイクラー（エムジェイリサーチ社（MJ Research Inc.）からのPTC-200、Watertown、マサチューセッツ州）のPCRプロトコールは以下の通りであった：細菌培養物または臨床試料から調製した処理した標準化細菌懸濁物またはゲノムDNAを、20μlのPCR反応混合物中で増幅した。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、2.5mM MgCl2、0.4μMの各プライマー、200μMの４つの各dNTP（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））、3.3μg/μlのウシ血清アルブミン（BSA）（シグマアルドリッチカナダ（Sigma Aldrich Canada）社、オークビル、オンタリオ、カナダ）、およびTaqStart（登録商標）抗体（ビーディーバイオサイエンシーズ（BD Biosciences）、パロアルト、カリホルニア州）と組合せた0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ（Promega）社、マジソン、ウィスコンシン州）を含有した。Taq DNAポリメラーゼに対する中和性モノクローナル抗体であるTaqStart（登録商標）抗体を、すべてのPCR反応物に加えて、増幅の特異性と感度を増強させた（Kelloggら、1994, Biotechniques 16:1134-1137）。細菌培養物または臨床試料の処理は、微生物細胞を溶解しPCRインヒビターを除去または中和するための迅速プロトコールである（同時係属出願US60/306,163号に記載されている）。精製したゲノムDNAからの増幅のために、試料を直接PCR増幅混合物に加えた。標的MREJ配列またはヒトゲノム中には存在しない配列から得られた内部対照を使用して、PCR反応の効率と有意なPCR阻害が無いことを証明した。
【００４０】
PCR測定法について行われるサイクル数は、必要な感度レベルに応じて変化する。例えば、臨床試料からの直接の微生物検出に必要な感度レベルは、微生物培養物からの検出よりも高い。従って、臨床試料からの直接検出のためには、より多くの熱サイクルを有するより高感度のPCR測定法がおそらく必要である。
【００４１】
核酸増幅の分野の当業者は、他の迅速な増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（LCR）、逆転写酵素PCR（RT-PCR）、転写介在増幅（TMA）、自立配列複製（3SR）、核酸配列ベースの増幅（NASBA）、鎖置換増幅（SDA）、分岐DNA（bDNA）、サイクリングプローブ技術（CPT）、固層増幅（SPA）、ロリングサークル増幅技術（RCA）、固層RCA、固定SDA、およびヌクレアーゼ依存性シグナル増幅（NDSA）のような他の迅速増幅法の存在を知っている（Leeら、1997, 「核酸増幅技術：疾患の診断への応用（Nucleic Acid Amplification Technologies: Application to Disease Diagnosis）」、イートンパブリッシング（Eaton Publishing）、ボストン、マサチューセッツ州；Persingら、1993, 「診断分子微生物学：原理と応用（Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications）」、アメリカ微生物学会（American Society for Microbiology）、ワシントンD.C.；Westinら、2000, Nat. Biotechnol. 18:199-204）。本発明の範囲は、PCRによる増幅の使用に限定されず、任意の核酸増幅法または核酸ベースの診断検査の感度および／または迅速性を上昇させるのに使用される任意の他の方法の使用を含む。本発明の範囲はまた、任意の核酸増幅および検出技術（例えば、リアルタイムまたは増幅後検出技術、検出と組合せた任意の増幅技術、任意のハイブリダイゼーション核酸チップまたはアレイ技術、任意の増幅チップ、または増幅とハイブリダイゼーションチップ技術の組合せを含む）の使用を含む。任意のヌクレオチド配列決定法による検出と同定もまた、本発明の範囲内である。
【００４２】
黄色ブドウ球菌MREJ DNA配列から得られ、任意の核酸増幅および／またはハイブリダイゼーション技術で使用される任意のオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。
Hiramatsuらにより開発されたMRSA検出法の評価
Hiramatsuら（Itoら、1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458；Katayamaら、2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1549-1555；Itoら、2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336、Maら、2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152）によると、MRSA株の中に４つの型のSCCmec DNAが見つかる。彼らは、SCCmec DNAが、MSSA染色体の特定の部位（orfXと呼ぶ）に組み込まれていることを見つけた。彼らは、SCCmec Ｉ、IIおよびIII型の右端にハイブリダイズするプライマー（本発明の配列番号52、53、54、55、56、57、58に対応する、米国特許第6,156,507号のそれぞれ配列番号18、19、20、21、22、23、24）ならびにSCCmec組み込み部位の右の黄色ブドウ球菌染色体に特異的なプライマー（本発明の配列番号59、60、61、62、63に対応する、米国特許第6,156,507号のそれぞれ配列番号25、28、27、26、29）（表１と図１）を含む、MRSA特異的マルチプレックスPCR測定法を開発した。最適なプライマー組合せとしてHiramatsuらが記載したプライマーセット（本発明の配列番号56、58および60に対応する、米国特許第6,156,507号の配列番号22、24および28）を、本発明において種々のMRSA、MSSA、メチシリン耐性CNS（MRCNS）およびメチシリン感受性CNS（MSCNS）株をPCRで試験するのに使用した（表２）。標準的サーマルサイクラー（エムジェイリサーチ社（MJ Research Inc.）からのPTC-200）を使用して行ったPCR測定法を使用して、以下のプロトコールを使用してこれらのプライマーの普遍性、特異性および感受性を試験した：１μlの処理した標準化細菌懸濁物または細菌から精製したゲノムDNAを、20μlのPCR反応混合物中で増幅した。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％ トリトンX-100、2.5mM MgCl2、0.4μMの各SCCmec- と黄色ブドウ球菌染色体特異的プライマー（本発明の配列番号56、58および60に対応する、米国特許第6,156,507号の配列番号22、24および28）、200μMの４つの各dNTP（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech）、3.3μg/μlのBSA（シグマ（Sigma））、およびTaqStart（登録商標）抗体（ビーディーバイオサイエンシーズ（BD Biosciences））と結合した0.5UのTaqポリメラーゼ（プロメガ（Promega）社）を含有した。
【００４３】
次に、標準的サーマルサイクラー（エムジェイリサーチ社（MJ Research Inc.）からのPTC-200）を使用して、PCR反応物を、94℃で３分、次に40サイクルの95℃で60秒の変性工程、55℃で60秒のアニーリング工程、および72℃で60秒の伸長工程、次に72℃で７分の末端伸長の熱サイクリングにかけた。PCR産物の検出は、0.25μg/mlの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（２％）中の電気泳動により行った。試験した39個のMRSA株のうちの20個は、Hiramatsuらが開発したPCR測定法で増幅されなかった（実施例１、表２と３）。
【００４４】
MRSAの迅速な診断検査を確立するために、本発明者らは、SCCmecのＩ型とII型（配列番号66、100および101）（別紙１）、SCCmec II型（配列番号97と99）、SCCmec III型（配列番号67、98および102）の右端に特異的な、および黄色ブドウ球菌染色体において、SCCmec 組み込み部位（配列番号64、70、71、72、73、74、75および76）（表５）の右に特異的な、新しいプライマーセットを開発した。短いアンプリコン（171〜278bp）を増幅するこれらのプライマーは、迅速PCR測定法での使用に適合する（表７）。これらのプライマーの設計は、Hiramatsuらが記載したorfXとSCCmec配列の複数の配列整列の解析に基づく（米国特許第6,156,507号）か、またはジーンバンク（GenBank）から入手できる（表10、別紙Ｉ）。これらのプライマーセットは、PCRにより、種々のMRSA、MSSA、MRCNSおよびMSCNS株を試験するのに使用した。３つすべてのSCCmec型（SCCmec II型のために、配列番号97と99、SCCmec Ｉ型とII型のために配列番号66、100および101、およびSCCmec III型のために配列番号67、98および102））を検出するために、いくつかの増幅プライマーが開発された。プライマーは、MRSA株に対するその特異性、PCRの分析感度、およびPCR産物の長さに従って選択された。SCCmec右端領域のために２つのプライマーのセットを選択した（SCCmec Ｉ型とII型に特異的な配列番号66；SCCmec III型に特異的な配列番号67）。SCCmec組み込み部位（ターゲティングorfX遺伝子）の右で黄色ブドウ球菌染色体上でアニーリングするように設計された８つの異なるプライマー（配列番号64、70、71、72、73、74、75および76）のうち、１つのみ（配列番号64）が、種々のMRSA、MSSA、MRCNSおよびMSCNS株を用いて試験に基づき、MRSAに特異的であった（表12）。従って、SCCmec Ｉ、IIおよびIII型を含有するMRSA株を特異的に増幅することができる最適なプライマーセット（配列番号64、66および67）を使用するPCR測定法が、開発された（図２、別紙Ｉ）。この新規プライマーセットを用いて開発されたPCR測定法は非常に高感度であった（すなわち、すべての３つのSCCmec型について２〜５コピーのゲノムの検出を可能にした）（表11）が、Hiramatsuらが開発した検査と同じ欠点（すなわち、普遍性の欠如）を有した。Hiramatsuらのプライマーにより増幅されなかった20個のMRSA株はまた、配列番号64、66および67（表３と12）を含むプライマーセットにより検出されなかった。明らかに、試験した株の中で少なくとも50％の普遍性を達成するための診断手段が必要である。
【００４５】
MRSAのより普遍的な（すなわち、すべてのまたはほとんどのMRSA株を検出する能力）検出と同定法を確立するために、我々は、増幅しなかったこれらの20個のMRSA株中に存在するMREJの配列を決定した。この研究により、診断目的に使用できる７つの新規な明確なMREJ標的配列が、発見かつ同定された。これらの７つの新しいMREJ配列は、Hiramatsuらによる米国特許第6,156,507号に記載の系では予測も検出もできなかったであろう。すなわち本発明は、世界中のすべての主要な流行性MRSAクローンの検出を可能にするより普遍的な診断法を提供するため、MRSAの改良された検出および同定法である。
SCCmec Ｉ、II、およびIII型に特異的なプライマーでは増幅できないMRSA株からのMREJヌクレオチド配列の配列決定
20個のMRSA株からのDNAは、Hiramatsuらが開発したプライマーセット（本発明の配列番号56、58および60に対応する、米国特許第6,156,507号の配列番号22、24および28）（表２と３）でも、３つのSCCmec（Ｉ、II、およびIII）型配列（配列番号64、65および67）（表12）に基づく本発明で開発されたプライマーセットでも増幅できなかったため、MREJのヌクレオチド配列を、これらの20個のMRSA株の16個について決定した。
【００４６】
IS431のトランスポサーゼはしばしば、mec遺伝子座内の耐性遺伝子の挿入に関連付けられている。このトランスポサーゼをコードする遺伝子は、SCCmecの右のセグメント内で１つ以上のコピーでしばしば記載されている（Oliveiraら、2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1906-1910；Itoら、2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-36）。従って、表３に記載の20個のMRSA株のうちの16個について新規MREJを配列決定するための最初の試みとして、IS431のトランスポサーゼをコードする遺伝子の配列中でプライマーを設計（配列番号68）し、SCCmec組み込み部位の右にorfX特異的プライマー（配列番号70）と組合せた（表５と８）。これらのプライマーを選択するために使用したこの方法は、図３に例示される。
【００４７】
配列決定すべきMREJ断片を、以下の増幅プロトコールを使用して増幅した：１μlの処理した細菌懸濁物（または、精製したゲノムDNA調製物）を、39μlのPCR反応混合物を含有する４つのチューブ中に直接移した。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％ トリトンX-100、2.5mM MgCl2、１μMの２つの各プライマー（配列番号68と70）、200μMの４つの各dNTP、3.3μg/μlのBSA（シグマアルドリッチカナダ（Sigma Aldrich Canada）社）、およびTaqStart（登録商標）抗体（ビーディーバイオサイエンシーズ（BD Biosciences））と結合した0.5単位のTaqポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有した。PCR反応物を、標準的サーマルサイクラー（エムジェイリサーチ社（MJ Research Inc.）からのPTC-200）を使用して、以下のようにサイクリングにかけた：94℃で３分、次に40サイクルの95℃で5秒の変性工程、55℃で30秒のアニーリング工程、および72℃で２分の伸長工程。
【００４８】
次に、４つのPCR増幅した混合物をプールし、10μlの混合物を、0.25μg/mlの臭化エチジウムを含有する1.2％アガロースゲルの電気泳動により分離した。次に、アンプリコンを、アルファ−イマージャー（Alpha-Imager）（アルファイノテクコーポレーション（Alpha Innotech Corporation）、サンジエゴ、カリホルニア州）を用いて、254nmのUV光に暴露して視覚化した。アンプリコンサイズは、１kbの分子量ラダー（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、バーリントン、オンタリオ、カナダ）と比較して推定した。残存するPCR増幅した混合物（150μl、総量）もまた、1.2％アガロースゲルの電気泳動により分離した。次に、メチレンブルーで染色して、アンプリコンを視覚化した（Floresら、1992, Biotechniques, 13:203-205）。再度、アンプリコンサイズを、１kbの分子量ラダーと比較して推定した。表３に記載の20個から選択された16個の株のうち、６個を、配列番号68と70をプライマーとして使用して増幅した（CCRI-178、CCRI-8895、CCRI-8903、CCRI-1324、CCRI-1331およびCCRI-9504）。これらの６つのMRSA株について、1.2kbの増幅産物を得た。この特異的増幅産物に対応するバンドを、アガロースゲルから切り出し、QIAquick（登録商標）ゲル抽出キットを使用して精製した（キアゲン社（Quiagen Inc.）、チャッツワース（Chatsworth）、カリホルニア州）。次に、ゲル精製した断片を、直接配列決定プロトコールで使用した。MREJ増幅産物の両方の鎖を、ジデオキシ鎖停止配列決定法により、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）の自動DNAシーケンサーを使用して、Big Dye（登録商標） Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティ、カリホルニア州）を用いて配列決定した。配列決定反応は、同じプライマー（配列番号68と70）と、ゲル精製したアンプリコンの１反応当たり10ng／100bpを使用して行った。表３に記載の６つのMRSA株（CCRI-178、CCRI-8895、CCRI-8903、CCRI-1324、CCRI-1331およびCCRI-9504）からのMREJの配列決定により、それぞれ配列番号42、43、44、45、46および51が得られた（表４）。
【００４９】
決定された配列が、PCRアーチファクトの配列決定に帰因するエラーを含まないことを確認するために、我々は、２つの独立したPCR増幅から得られるゲル精製したMREJ増幅産物の２つの調製物を配列決定した。ほとんどの標的断片について、両方のアンプリコン調製物について決定された配列は同一であった。さらに、両方の鎖の配列は100％相補的であり、従って、決定された配列の高い正確性が確認された。上記方法を使用して決定されたMREJ配列は、配列リストと表４に記載されている。
【００５０】
アンプリコンが得られなかった株中のMREJを、IS431とorfXのトランスポサーゼ遺伝子に特異的なプライマーを含む方法を使用して配列決定するために、mecAとorfX配列を標的とするプライマーを使用する別の方法を使用して、より長い原子断片を増幅した。orfX配列（配列番号70）中の同じプライマーと組合せて使用される新しいPCRプライマー標的化mecA(配列番号69）（表８）。これらのプライマーを選択するために使用したこの方法を、図３に例示する。
【００５１】
以下の増幅プロトコールを使用した：精製したゲノムDNA（300μｇ）を、最終容量50μlのPCR反応混合物に移した。各PCR反応物は、１×ハーキュラーゼ（Herculase）緩衝液（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリホルニア州）、0.8μMの２つの各プライマー（配列番号69と70）、0.56mMの４つの各dNTP、５単位のハーキュラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））を含有した。PCR反応物を、標準的サーマルサイクラー（エムジェイリサーチ社（MJ Research Inc.）からのPTC-200）を使用して、以下のようにサイクリングにかけた：92℃で２分、次に35〜40サイクルの92℃で10秒の変性工程、55℃で30秒のアニーリング工程、および68℃で30分の伸長工程。
【００５２】
次に、10μlのPCR増幅した混合物を、0.25μg/mlの臭化エチジウムを含有する0.7％アガロースゲルの電気泳動により分離した。次に、アンプリコンを、上記したように視覚化した。アンプリコンサイズは、１kbの分子量ラダー（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））と比較して推定した。次に、２〜５個のチューブ中で、同じプロトコールを使用して、第２の増幅の試験試料として最初のPCR反応物３μlを用いて再増幅反応を行った。PCR増幅した混合物をプールし、また0.7％アガロースゲルの電気泳動により分離した。次にアンプリコンを、上記したようにメチレンブルーで染色して視覚化した。試験したすべての株についてこの増幅方法を使用して、約12kbの増幅産物が得られた。この特異的増幅産物に対応するバンドを、アガロースゲルから切り出し、上記したように精製した。次に、ゲル精製した断片を、上記したように配列決定プロトコールで直接使用した。配列決定反応は、同じ増幅プライマー（配列番号69と70）と、１反応当たり425〜495ngのゲル精製したアンプリコンを使用して行った。次に、内部配列決定プライマー（配列番号65、77および96）（表８）を使用して、アンプリコンのより大きな部分について両方の鎖で配列データが得られた。表３に記載の20個のMRSA株のうちの５個（CCRI-1331、CCRI-1263、CCRI-1377、CCRI-1311、およびCCRI-2025）を、この方法を使用して配列決定して、それぞれ配列番号46、47、48、49および50が得られた（表４）。作成したアンプリコンからmecA遺伝子内の配列もまた得られ、CCRI-2025、CCRI-1263、CCRI-1311、CCRI-1331およびCCRI-1377株から、それぞれ配列番号27、28、29、30および31が得られた（表４）。mecA遺伝子内の下流領域からのより長い配列はまた、後述するようにCCRI-2025、CCRI-1331およびCCRI-1377株から得られた。
【００５３】
orfX遺伝子のより長い配列を得るために、mecAとorfX配列（開始コドンの）を標的とするプライマーを使用して２つの他の方法を使用して、より長い染色体断片を増幅した。mecA遺伝子中の同じプライマー（配列番号69）と組合せて使用する新しいPCRプライマーを、orfX（配列番号132）中に設計した。これらのプライマーを選択するために使用した方法を図３に示す。８つの黄色ブドウ球菌株を、プライマー配列番号69と132を使用して増幅した（CCRI-9860、CCRI-9208、CCRI-9504、CCRI-1331、CCRI-9583、CCRI-9681、CCRI-2025およびCCRI-1377）。これらのプライマーを使用するために使用した方法を図３に示す。
【００５４】
以下の増幅プロトコールを使用した：精製したゲノムDNA（350〜500ng）を、50μlのPCR反応混合物に移した。各PCR反応物は、１×ハーキュラーゼ（Herculase）緩衝液（ストラタジーン（Stratagene））、0.8μMの２つの各プライマーセット（配列番号69と132）、0.56mMの４つの各dNTP、および１mMのMgCl2を有する7.5単位のハーキュラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））を含有した。PCR反応物を、上記したように熱サイクリングにかけた。
【００５５】
次に、５μlのPCR増幅混合物を、0.25μg/mlの臭化エチジウムを含有する0.8％アガロースゲルの電気泳動により分離した。次に、アンプリコンを、上記したように視覚化した。次に、１つの黄色ブドウ球菌株（CCRI-9583）について、４つのチューブでプライマー配列番号96と158（図３）を使用して、同じPCRプロトコールを使用して、第２の増幅の試験試料として最初のPCR反応物２μlを用いて再増幅を行った。PCR再増幅した混合物をプールし、また0.8％アガロースゲルの電気泳動により分離した。次にアンプリコンを、上記したようにメチレンブルーで染色して視覚化した。試験したすべての株についてこの増幅方法を使用して、約12〜20kbのバンドが得られた。この特異的増幅産物に対応するバンドを、アガロースゲルから切り出し、QIAquick（登録商標）ゲル抽出キットまたはQIAEX IIゲル抽出キットを使用して精製した（キアゲン社（Quiagen Inc.））。２つの株（CCRI-9683とCCRI-9589）をまた、プライマー配列番号132と150を用いて増幅して、1.5kbの増幅産物を得た。長いアンプリコン（12〜20kb）を0.6〜１μg／反応物を使用して配列決定し、短いアンプリコン（1.5kb）は、150ng／反応物を使用して配列決定した。配列決定反応は、各黄色ブドウ球菌株からの異なるプライマーセットを使用して行った：1) CCRI-9504株について配列番号68、70、132、145、146、147、156、157および158；2) CCRI-2025株について配列番号70、132、154および155；3) CCRI-9681株について配列番号70、132、148、149、158および159；4) CCRI-9860株について配列番号70、132、187および188；5) CCRI-9589株について配列番号70、132、150および159；6) CCRI-9583株について配列番号114、123、132、150および158；7) CCRI-1377株について配列番号70、132、154および155；8) CCRI-9208株について配列番号70、132、158および159；9) CCRI-1331株について配列番号68、70、132、145、146、147および158；および10) CCRI-9770株について配列番号126と127。
【００５６】
ある株（CCRI-9770）では、orfX遺伝子とorfSA0022遺伝子が、これらの遺伝子に特異的なプライマー（それぞれ配列番号132と159および配列番号128と129）を使用する増幅に基づき、完全にまたは部分的に欠如していることが証明された（表８）。次に、mecA遺伝子中の同じプライマー（配列番号69）と組合せて使用する新しいPCRプライマーを、orfSA0021（配列番号126）中に設計した。このプライマーセットを用いて、4.5kbの増幅産物が得られた。
【００５７】
アンプリコンの増幅、精製および配列決定は上記したように行った。
【００５８】
表３に記載の20個のMRSA株のうちの10個(CCRI-9504、CCRI-2025、CCRI-9208、CCRI-1331、CCRI-9681、CCRI-9860、CCRI-9770、CCRI-9589、CCRI-9583、およびCCRI-1377）についてmecAを含有するSCCmec領域の配列を得るために、mecA中の上記のプライマー（配列番号69）を、mecAの下流領域に記載のプライマー（配列番号118）と組合せ使用した（表８）。試験したすべての株について、２kbの増幅産物が得られた。ある株（CCRI-9583）について、上記したようにプライマー配列番号69と132を用いて作成したアンプリコンを用いて、プライマー配列番号96と118を用いる再増幅を行った。アンプリコンの増幅、再増幅、精製、および配列決定反応は、上記したように行った。配列決定反応は、上記の配列番号69と132または配列番号69と118を用いて作成したアンプリコンを用いて行った。各黄色ブドウ球菌株について異なるセットの配列決定プライマーを使用した：1) CCRI-9504、CCRI-2025、CCRI-1331、CCRI-9770およびCCRI-1377株について配列番号69、96、117、118、120、151、152；2) CCRI-9208、CCRI-9681およびCCRI-9589株について配列番号69、96、118、および120；3) CCRI-9860株について配列番号69、96、117、118、120、および152；および4) CCRI-9583株について配列番号96、117、118、119、120、151、および152。
【００５９】
次に、Hiramatsuの測定法では増幅できない20個の株のうちの16個について得られた配列（表４）を、公のデータベースから入手できる配列と比較した。すべての場合に、配列の部分は、orfX（配列番号42〜51、165〜168および171）またはmecAについて公に入手できる配列と、下流領域（配列番号27〜31、189〜193、195、197〜199および225）と、ほぼ100％の同一性を有した。しかし、断片のorfX部分（配列番号42〜51、165〜168および171）は、Hiramatsuら（配列番号３）が記載したMSSA  NCTC8325株のorfX遺伝子（配列番号３）とほぼ100％の同一性を共有するが、SCCmec自体の右端内のDNA配列は、Hiramatsuらが記載したＩ、II、IIIおよびIV型のものとは大きく異なることが証明された（表13、図４）。６個の異なる新規配列型が得られた。
【００６０】
Hiramatsuらは、SCCmec Ｉ型がMREP ｉ型に関連し、SCCmec II型とIV型がMREP ii型に関連し、SCCmec III型がMREP iii型に関連していることを証明した。種々のMRSA株からの我々のMREJ配列決定データにより、６つの新規MREP型（iv、ｖ、vi、vii、viiiおよびix）が発見された。明瞭なMREP型を含むMREJを、MREP番号付け方法に従って命名した。すなわち、MREP ｉ型はMREJ ｉ型内にあり、MREP ii型はMREJ ii型内にあり、MREP ix型までこのように続く。
【００６１】
CCRI-178、CCRI-8895、CCRI-8903、CCRI-1324、CCRI-1331およびCCRI-9504株から得られたSCCmecの右端内の配列（配列番号42、43、44、45、46および51）は互いにほとんど同一であり、IS431（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AF422691、ABO37671、AF411934）とほぼ100％の同一性を有した。しかし、我々の配列データは、組み込み部位に隣接するSCCmecの右端にこのIS431配列が存在することを初めて明らかにした。すなわち、６つのMRSA株からのSCCmecの右端の配列は、Hiramatsuら（Itoら、2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336；Maら、2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152）が記載した、NCTC10442からのSCCmec Ｉ型、N315株からのSCCmec II型、85/2082株からのSCCmec III型、およびCA05株と8/6-3P株からのSCCmec IV型のものとは異なっていたため、これらの新しい配列をMREP iv型と命名した（配列番号42〜46と51）。MREP iv型配列のSCCmec部分を用いるBLAST検索により、種々の既知のトランスポサーゼの部分をコードする配列との有意な整列が得られた。例えば、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AB037671と比較すると、配列番号51からのMREP iv型は、IS431の推定トランスポサーゼおよびその下流領域と98％の同一性を共有した；それぞれ７つのヌクレオチドの２つのギャップもまた、整列中に存在した。
【００６２】
CCRI-1263、CCRI-1377、CCRI-1311およびCCRI-2025株から得られた配列（配列番号47〜50）は、互いにほとんど同一であり、すべての３つのSCCmec型とMREP iv型とは異なり、従ってMREP ｖ型と命名した。BLASTを使用してジーンバンク（GenBank）配列と比較すると、MREP ｖ型配列は、最初の28ヌクレオチド以外は、公表された配列とは有意な相同性はなかった。この短いストレッチは、orfXの最後の11個のコードヌクレオチド、次に下流の17ヌクレオチド（SCCmecの右反転繰り返し配列（IR-R）を含む）に対応した。
【００６３】
CCRI-9208株から得られた配列もまた、すべての３つのSCCmec型とMREP iv型およびｖ型とは異なり、従ってMREP vi型と命名した（配列番号171）。BLASTを使用すると、MREP vi型はユニークであり、公表された配列とは有意な相同性はなかった。
【００６４】
CCRI-9583とCCRI-9589株から得られた配列もまた、すべての３つのSCCmec型とMREP iv〜vi型とは異なり、従ってMREP vii型と命名した（配列番号165と166）。BLASTを使用すると、MREP vii型はユニークであり、公表された配列とは有意な相同性はなかった。
【００６５】
CCRI-9860株から得られた配列もまた、すべての３つのSCCmec型とMREP iv〜vii型とは異なり、従ってMREP viii型と命名した（配列番号167）。CCRI-9681株から得られた配列もまた、すべての３つのSCCmec型とMREP iv〜viii型とは異なり、従ってMREP ix型と命名した（配列番号168）。MREP viii型とix型のSCCmec部分を用いたBLAST検索により、有意な整列が得られたが、各MREP型の最初の約150ヌクレオチドについてのみであった。例えば、MREP viii型の最初は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AB063173の部分と88％の同一性を有したが、配列の残りの部分については、公表された配列とは有意な相同性はなかった。同様に、MREP ix型の最初の約150ヌクレオチドは、AB063173の部分と97％の同一性を有したが、配列の残りの部分はユニークであった。MREP viii型とix型の短い相同性部分は、AB063173中で、orfX、SCCmecのIR-R、およびorfCM009の一部の最後の少なくとも14のコードヌクレオチドに対応する。似ている部分もあるが、MREP viii型とix型は互いに大きく異なり、表13に示すように、SCCmec部分の最初の500ヌクレオチドについては両方の間でわずかに55.2％の同一性しかない。
【００６６】
最後に、我々は、CCRI-9770株からは、SSCmec内で配列を得ることはできなかった。しかし「SCCmec Ｉ、II、およびIII型に特異的なプライマーでは増幅できないMRSA株からのMREJヌクレオチド配列の配列決定」に記載したように、この株は、染色体DNA中でSCCmec組み込み部位の右にorfXとorfSA0022遺伝子が部分的または完全に欠失しているようであり、これは、新しい右端ジャンクションであろう。従って我々は、この新規配列をMREP ｘ型（配列番号172）と命名した。将来の配列決定により、このいわゆるMREJ ｘ型が新規MREP ｘ型を含有するか、または増幅の欠如が、MREJの染色体部分の変化により引き起こされるのかが明らかになるであろう。
【００６７】
本発明で得られたすべてのSCCmecの右端の最初の500ヌクレオチド部分の配列を、GCGプログラムPileupとGapを使用して、SCCmec Ｉ、II、およびIII型と比較した。表13は、６つの新規配列のSCCmec右端と、SCCmec Ｉ、II、およびIII型のSCCmec右端の間のヌクレオチドレベルでの同一性を、GCGプログラムGapを使用して示す。SCCmec ＩおよびII型は、ほとんど79.2％の同一性（SCCmec II型中に存在する102bp挿入部分のみ異なる）を示した（図１、２および４）が、すべての他のMREP型は、40.9〜57.1％の同一性を示す。これにより、本発明で開示される新規MREP iv〜ix型の右端がなぜ、Hiramatsuらにより記載された系を用いて予測または検出できないかが開示される。
【００６８】
表３に記載の４つの株（CCRI-1312、CCRI-1325、CCRI-9773およびCCRI-9774）は配列決定しなかったが、PCRプライマーを使用して性状解析した。CCRI-1312とCCRI-1325株は、実施例４、５および６に記載の特異的増幅プライマーを使用して、MREP ｖ型を含有することが証明され、CCRI-9773とCCRI-9774株は、実施例７に記載の特異的増幅プライマーを使用して、MREP vii型を含有することが証明された。
【００６９】
本発明の記載のMRSA株中に存在するSCCmecの完全な配列を得るために、SCCmec組み込み部位の左（mecA遺伝子の上流）の黄色ブドウ球菌染色体を標的とするプライマーを開発した。入手できる公のデータベース配列に基づき、５つの異なるプライマーを設計した（配列番号85〜89）（表９）。これらのプライマーは、完全なSCCmecを配列決定するために黄色ブドウ球菌染色体特異的プライマーと一緒に使用するか、あるいはSCCmecの左端ジャンクションを配列決定するためにmecA特異的プライマー（配列番号81）と一緒に使用することができる。我々はまた、SCCmecの完全な配列を得るために、遺伝子座に沿って広がる既知のSCCmec配列に特異的ないくつかのプライマーを開発した（表９）。これらのプライマーは、SCCmec型を、本発明で開発されたMRSA株に割り当てることを可能にするであろう。
SCCmec／orfX配列からの増幅プライマーの選択
本発明者らにより決定されたかまたは公のデータベースから選択されたMREJ配列を使用して、MRSAの検出と同定のためのPCRプライマーを選択した。これらのPCRプライマーを選択するのに使用した方法は、種々のMREJ配列の複数の配列整列の解析に基づいていた。
【００７０】
上記の６つの新しいMREP iv〜ix型の配列データの解析により、新しいMREP型の配列に特異的なプライマー（配列番号79、80、109、112、113、115、116および204）が設計された（図２、表５、実施例３、４、５、６、７および８）。SCCmec Ｉ、II、およびIII型を検出するための３つのプライマー（配列番号64、66および67）と、黄色ブドウ球菌orfXに特異的なプライマー（配列番号64）とのマルチプレックス中で、MREP iv、ｖおよびvii型に特異的なプライマー（配列番号79、80および112）を使用した（実施例３、４、５、６および７）。MREP vi、viiiおよびix型に特異的なプライマー（配列番号204、115、116、および109）もまた設計し、これらの特異的標的に対して使用した（実施例８）。
増幅産物の検出
古典的には、PCR増幅産物の検出は、上記の標準的臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動により行われる。しかし、ルーチン診断にはより迅速でより実用的な、特異的増幅産物の検出のための他の方法が使用できることは明らかである。そのような方法の例は、同時係属特許出願WO01/23604 A2に記載されている。
【００７１】
アンプリコン検出もまた、増幅産物にハイブリダイズする種特異的内部DNAプローブを使用して、固体支持体または液体ハイブリダイゼーションにより行われる。そのようなプローブは、我々のレパートリーからの任意の配列から作成され、本発明の目的であるDNA増幅産物に特異的にハイブリダイズするように設計される。あるいは、アンプリコンは、配列決定により性状解析することができる。検出法と配列決定法の例については、同時係属特許出願WO01/23604 A2を参照されたい。
【００７２】
核酸増幅効率を改良するために、反応混合物の組成物を修飾してもよい（ChakrabartiとSchutt, 2002, Biotechniques, 32:866-874；Al-SoudとRadstrom, 2002, J. Clin. Microbiol., 38:4463-4470；Al-SoudとRadstrom, 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64:3748-3753；Wilson, 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63:3741-3751）。増幅反応混合物のそのような修飾には、種々のポリメラーゼの使用、または核酸増幅促進物質（例えば、アスベタイン、BSA、スルホキシド、タンパク質gp32、界面活性剤、陽イオン、塩化テトラメチルアンモニウムなど）の添加がある。
【００７３】
好適な実施態様において、PCR増幅のリアルタイム検出を、SmartCycler（登録商標）装置（セフェイド（Cepheid）、サニーデール、カリホルニア州）で分子ビーコンプローブを使用して追跡した。黄色ブドウ球菌のMREP ｉ〜ｖ型に特異的なプライマーとorfXに特異的なプライマー（配列番号64、66、67、79、および80）、およびPCR阻害を追跡するための内部対照とを含有するマルチプレックスPCR測定法を開発した。内部対照は、MREP iv型−およびorfX特異的プライマー（配列番号79と64）に相補的な配列を含有する。この測定法はまた、内部対照の増幅中に作成されたDNA断片内の配列に特異的なテトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（TET）で標識した分子ビーコンプローブを含有する。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％ トリトンX-100、3.45mM MgCl2、0.8μMの各MREP特異的プライマー（配列番号66と67）とorfX特異的プライマー（配列番号64）、0.4μMの各MREP特異的プライマー（配列番号79と80）、80コピーの内部対照、内部対照に特異的な0.2μMのTET標識分子ビーコンプローブ、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）で標識した0.2μMの分子ビーコンプローブ（配列番号84）、330μMの４つの各dNTP（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））、3.45μg/μlのBSA（シグマ（Sigma））、およびTaqStart（登録商標）抗体（ビーディーバイオサイエンシーズ（BD Biosciences））と結合した0.875単位のTaqポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有した。SmartCycler（登録商標）によるPCR増幅は、以下のように行った：95℃で３分の最初の変性、次に３工程（95℃で５秒の変性工程、60℃で15秒のアニーリング工程、および72℃で15秒の伸長工程）からなる48サイクル。各MREP型（ｉ〜ｖ）の１つのMRSA株からの精製したゲノムDNAを使用して行った感度試験は、検出限界２〜10ゲノムコピーを示した（実施例５）。このマルチプレックス測定法では、試験した26個のMRCNSまたは10個のMSCNSのいずれも陽性ではなかった。本発明に記載の新しいMREP vi、viii、ixおよびｘ型配列を有する８個のMRSA株（CCRI-9208、CCRI-9770、CCRI-9681、CCRI-9860、CCRI-9583、CCRI-9773、CCRI-9774、CCRI-9589）は、検出不可能なままであった（実施例５）。
【００７４】
好適な実施態様において、臨床試料から直接SmartCycler（登録商標）装置（セフェイド（Cepheid）、サニーデール、カリホルニア州）によるリアルタイムマルチプレックス検出PCR測定法を使用してMRSAの検出を評価した。モントリオール総合病院（モントリオール、ケベック、カナダ）でのMRSA病院監視プログラム中に、全部で142個の鼻腔スワブを採取した。スワブ試料は、採取の24時間以内にラバル大学感染症研究センター（Centre de Recherche en Infectiologie de l'Universite Laval）で試験した。受領後スワブをマンニトール寒天上に置き、次に同じスワブから、同時係属特許出願US60/306,163に記載の簡便かつ迅速試料調製プロトコールに従って鼻腔物質を調製した。標準的培養法により、MRSAの古典的同定を行った。
【００７５】
培養法に基づき、PCR測定法はMRSA陽性の34試料のうち33試料を検出した。培養と比較して、PCR測定法は８つの追加のMRSA陽性試料を検出し、感度97.1％で特異性92.6％であった（実施例６）。このマルチプレックスPCR測定法は、鼻腔試料からのMRSAキャリアの直接の特異的検出のための迅速で強力な方法であり、創傷、血液または血液培養物、CSFなどの任意の種類の臨床試料で使用することができる。
【００７６】
好適な実施態様において、MREP ｉ、ii、iii、iv、ｖおよびvi型と黄色ブドウ球菌のorfXに特異的なプライマー（配列番号66、67、79、80、および112）およびorfX配列のこの領域で同定された２つの配列多型の検出を可能にしたorfX配列に特異的な３つの分子ビーコンプローブを含有するマルチプレックスPCR測定法を開発した。MREP ｉ〜ｖ型の検出のためのマルチプレックス測定法で検出されなかった株のうちの４つは、このマルチプレックス測定法で検出でき、本発明の記載のMREP vi、viii、ixおよびｘ型を有する４つのMRSA株（CCRI-9208、CCRI-9770、CCRI-9681、CCRI-9860）は、検出不可能なままであった（実施例７）。MREP vi、viiiおよびix型に特異的なプライマー（配列番号204、115、116および109）もまた設計し、その特異的標的株を検出することが証明された（実施例８）。Hiramatsuらの教示から得られるプライマーとプローブは、表２のMRSA株のわずかに48.7％（39のうち19株）のみの検出を可能にし、本発明からのプライマーとプローブは、97.4％の株（39のうち38株）の検出を可能にする（実施例７と８を参照）。従って、我々の測定法は、表２に記載のMRSA株について50％以上の普遍性を有する。
ポリヌクレオチドプライマーとプローブの特異性、普遍性および感度試験
オリゴヌクレオチドプライマーとプローブの特異性を、DNAの増幅またはブドウ球菌種を用いるハイブリダイゼーションにより試験した。試験したすべてのブドウ球菌種は、感染症に関連する病原体または臨床試料から単離できる混入物質候補である可能性が高い。各標的DNAは、細胞を溶解するための標準的化学および／または物理的処理を使用して、微生物細胞から放出することができた（サムブルーク（Sambrook）ら、1989, 「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）第２版」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）か、またはGNOME（登録商標）DNAキット（オビオジーン（Obiogene）、カールスバド（Carlsbad）、カリホルニア州）を用いて精製したゲノムDNAを使用した。次に、DNAをプライマーセットで増幅した。特異的プライマーまたはプローブは、標的DNAにのみハイブリダイズした。
【００７７】
次に、標的MRSAからDNAを特異的に増幅することがわかったオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅によりその普遍性について試験した（すなわち、普遍性プライマーは、MRSAのほとんどまたはすべての分離株を効率的に増幅した）。最後に、標的微生物からの精製したゲノムDNAの10倍または２倍希釈物を使用して、PCR測定法の分析感度を決定した。ほとんどの測定法について、２〜10ゲノムコピーの範囲の感度レベルが得られた。PCR測定法の特異性、普遍性および分析感度を、細菌培養物を用いて直接に、または精製した細菌ゲノムDNAを用いて、試験した。
【００７８】
上記したようにSmartCycler（登録商標）プラットフォームを使用して、分子ビーコンプローブを試験した。分子ビーコンプローブは、黄色ブドウ球菌のMREJから増幅したDNAにハイブリダイズした時にのみ、特異的であると見なした。特異的であることがわかった分子ビーコンプローブは次に、種々のMRSA株からの細菌DNAへのハイブリダイゼーションにより、その普遍性について試験した（すなわち、普遍性プローブは、MRSAのほとんどまたはすべての分離株を効率的に検出した）。
細菌株
占有のSCCmec−染色体左端ジャンクション配列データサブレパートリーを作成するために、ならびに増幅およびハイブリダイゼーション測定法を試験するために使用した参照株は、(i) アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、(ii) ケベック公衆衛生試験所（Laboratoire de sante publique du Quebec） (LSPQ) (Ste-Anne de Bellevue, ケベック、カナダ）、(iii) 疾病管理センター（Centers for Disease Control and Prevention）（CDC）（アトランタ、ジョージア州）、(iv) パスツール研究所（パリ、フランス）、および(v) ハーモニーコレクション（Harmony Collection）（ロンドン、英国）から得られた（表14）。種々の地域からのMRSA、MSSA、MRCNSおよびMSCNSの臨床分離株もまた、本発明で使用した（表15）。我々のMRSA株の本体は、表現型試験により確認し、黄色ブドウ球菌特異的プライマーとmecA特異的プライマー（配列番号69と81）を使用するPCR分析により再確認した（Martineauら、2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:231-238）。
【００７９】
わかりやすくするために、以下は、本発明の実施例、表、図および別紙のリストである。
実施例の説明
実施例１：Hiramatsuらが開発したプライマーは、MREP i、ii、およびiii型に属するMRSA株のみを検出でき、一般的な新規MREP型を見逃す。
【００８０】
実施例２：本発明で開発されたMREP i、ii、およびiii型配列に特異的なプライマーを使用するMRSAの検出と同定。
【００８１】
実施例３：MREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくMRSAの検出と同定のための、標準的サーマルサイクラー上のマルチプレックスPCR測定法の開発。
【００８２】
実施例４：MREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくMRSAの検出と同定のための、SmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発。
【００８３】
実施例５：内部対照を含むMREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくMRSAの検出と同定のためのSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発。
【００８４】
実施例６：臨床試料から直接MRSAを検出するための、MREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックス測定法を使用するMRSAの検出。
【００８５】
実施例７：MREP ｉ、ii、iii、iv、ｖ、viおよびvii型配列に基づくMRSAの検出と同定のためのSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発。
【００８６】
実施例８：MREP vi、viiiおよびix型配列に基づくMRSAの検出と同定のためのSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発。
表の説明
表１は、米国特許第6,156,507号でHiramatsuらが開発したすべてのPCRプライマーについての情報を提供する。
【００８７】
表２は、標準的サーマルサイクラー上で、米国特許第6,156,507号でHiramatsuらが開発したプライマーを使用する、SCCmec−orfX右端ジャンクションの検出のための結果（普遍性と特異性）のまとめである。
【００８８】
表３は、SCCmec−orfX右端ジャンクション配列のＩ、II、およびIII型を標的とするプライマーを使用しては増幅されないMRSA株のリストである。
【００８９】
表４は、本発明で開示した新規配列のリストである。
【００９０】
表５は、本発明で開発したすべてのプライマーについての情報を提供する。
【００９１】
表６は、本発明で開発した分子ビーコンプローブのリストである。
【００９２】
表７は、米国特許第6,156,507号でHiramatsuらが記載したかまたは本発明で開発した異なるプライマー対のアンプリコンサイズを示す。
【００９３】
表８は、SCCmec−染色体右端ジャンクションを配列決定するために本発明で開発されたプライマーについての情報を提供する。
【００９４】
表９は、完全なSCCmecを得るために本発明で開発したプライマーについての情報を提供する。
【００９５】
表10は、プライマーとプローブを設計するために本発明で使用される公のデータベース（ジーンバンク（GenBank）、ゲノム計画または米国特許第6,156,507号）から入手できる配列のリストである。
【００９６】
表11は、SCCmec−orfX右端ジャンクション配列のＩ、II、およびIII型を標的とするプライマーを使用して本発明で開発された、および標準的サーマルサイクラーを使用して行われるPCR測定法の分析感度を与える。
【００９７】
表12は、SCCmec−orfX右端ジャンクション配列のＩ、II、およびIII型を標的とするプライマーを使用して本発明で開発された、および標準的サーマルサイクラーを使用して行われた、MRSAの検出のための結果（普遍性と特異性）のまとめである。
【００９８】
表13は、MREPの９つの型の間のSCCmec右端の最初の500ヌクレオチドの間の配列同一性の比較を示す。
【００９９】
表14は、本発明で開発されたPCR測定法を評価するために使用したMRSA、MSSA、MRCNSおよびMSCNSの参照株についての情報を提供する。
【０１００】
表15は、本発明に記載されたPCR測定法を評価するために使用したMRSA、MSSA、MRCNSおよびMSCNSの臨床株の起源についての情報を提供する。
【０１０１】
表16は、５つの型のMREP配列を標的とするプライマーを使用して本発明で開発した、および標準的サーマルサイクラー上で行った、PCR測定法の分析感度を示す。
【０１０２】
表17は、５つの型のMREP配列を標的とするプライマーを使用して本発明で開発した、および標準的サーマルサイクラー上で行った、PCR測定法についての結果（普遍性と特異性）のまとめである。
【０１０３】
表18は、５つの型のMREPの検出のためのSmartCycler（登録商標）プラットフォームを使用する本発明で開発したPCR測定法の分析感度を示す。
【０１０４】
表19は、５つの型のMREP配列を標的とするプライマーと分子ビーコンプローブを使用して本発明で開発した、およびSmartCycler（登録商標）プラットフォーム上で行った、PCR測定法の結果（普遍性と特異性）のまとめを示す。
【０１０５】
表20は、６つの型のMREPの検出のためのSmartCycler（登録商標）プラットフォームを使用する本発明で開発したPCR測定法の分析感度を示す。
【０１０６】
表21は、６つの型のMREP配列を標的とするプライマーと分子ビーコンプローブを使用する本発明で開発した、およびSmartCycler（登録商標）プラットフォーム上で行った、PCR測定法の結果（普遍性と特異性）のまとめを示す。
図の凡例
図１．Ｉ、II、およびIII型 SCCmecorfX右端ジャンクションの略図とMRSAの検出と同定のためにHiramatsuらが記載したプライマー（配列番号52〜63）の位置。アンプリコンサイズを図７に示す。
【０１０７】
図２．MREP ｉ、ii、iii、iv、ｖ、vi、vii、viiiおよびixの略図と、本発明で開発されたすべてのMREP型を標的とするプライマーと分子ビーコン（配列番号20、64、66、67、79、80、84、112、115、116、84、163および164）の位置。アンプリコンサイズを図７に示す。
【０１０８】
図３．SCCmec−染色体右端ジャンクションの略図とMREP iv、ｖ、vi、vii、viii、ixおよびｘの配列決定のために本発明で開発されたプライマー（配列番号65、68、69、70、77、96、118、126、132、150および158）の局在化。
【０１０９】
図４．９つのMREP型（ｉ、ii、iii、iv、ｖ、vi、vii、viiiおよびix型についての、それぞれ配列番号１、２、104、51、50、171、165、167および168の部分により示される）の代表的な複数の配列整列。
別紙の説明
別紙は、プライマーと内部プローブの選択のために使用した方法を示す。
【０１１０】
別紙Ｉは、SCCmecとSCCmec ＩおよびII型に特異的なorfX配列からのプライマーの選択のための方法を例示する。
【０１１１】
別紙IIは、SCCmec−orfX右端ジャンクションのリアルタイム検出のための特異的分子ビーコンプローブの選択方法を例示する。
【０１１２】
これらの別紙に示すように、選択された増幅プライマーは、イノシンおよび／または塩基のあいまいさがあってもよい。イノシンは、４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかに特異的に結合することができるヌクレオチド類似体である。あるいは、ミスマッチの部位で４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴの２つ以上を有するオリゴヌクレオチド混合物からなる縮重オリゴヌクレオチドを使用した。増幅プライマーへのイノシンおよび／または縮重の含有は、ミスマッチ耐性を可能にし、こうして、標的ヌクレオチド配列のより広いアレイの増幅を可能にする（DieffenbachとDveksler、1995, 「PCRプライマー：実験室マニュアル（PCR Primer: A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、プレインビュー（Plainview）、ニューヨーク）。
実施例
実施例１：
Hiramatsuらが開発したプライマーは、MREP ｉ、ii、およびiii型に属するMRSA株のみを検出でき、一般的な新規MREP型を見逃す
図１に示すように、Hiramatsuらは、Ｉ、II、およびIII型のSCCmec DNAの右端に特異的にハイブリダイズすることができる種々のプライマーを開発した。彼らはMRSA検出のために、これらのプライマーを、SCCmec組み込み部位の右に位置する黄色ブドウ球菌染色体領域に特異的なプライマーと組合せた。このプライマーセット（本発明の配列番号56、58および60に対応する米国特許第6,156,507号の配列番号22、24および28）は、Hiramatsuらにより、MRSAの検出のための最も特異的かつ普遍的であることが証明された。このプライマーセットは、SCCmec Ｉ型について1.5kbの、SCCmec II型について1.6kbの、そしてSCCmec III型について1.0kbの増幅産物を与える（表７）。このマルチプレックスPCR測定法の普遍性と特異性を、39個のMRSA株、41個のMSSA株、９個のMRCNS株および11個のMSCNS株について試験した（表２）。細菌から精製した細菌ゲノムDNA調製物の処理した標準化細菌懸濁液の１μlを、20μlのPCR反応混合物中で増幅した。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％トリトンX-100、2.5mM MgCl2、各0.4μMのSCCmecおよびorfX特異的プライマー（配列番号56、58および60）、200μMの４つの各dNTP（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））、3.3μg/μlのBSA（シグマ（Sigma））、およびTaqStart（登録商標）抗体（ビーディーバイオサイエンシーズ（BD Biosciences））と組合せた0.5 UのTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有した。
【０１１３】
次に、標準的サーマルサイクラー（エムジェイリサーチ社（MJ Research Inc.）からのPTC-200）を使用して、PCR反応物を、94℃で３分、次に40サイクルの95℃で60秒の変性工程、55℃で60秒のアニーリング工程、および72℃で60秒の伸長工程、次に72℃で７分の末端伸長の熱サイクリングにかけた。PCR産物の検出は、0.25μg/mlの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（２％）中の電気泳動により行った。試験したMRCNSまたはMSCNS株のいずれも、SCCmec Ｉ、II、およびIII型を検出するこのプライマーセットでは検出されなかった。試験した39個のMRSA株のうちの20個は、このマルチプレックスPCR測定法で検出されなかった（表２と３）。これらの検出されなかったMRSA株の１つは、非常に伝染性の強いMRSAポルトガルクローン（CCRI-9504株：De Lencastreら、1994, Euro. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13:64-73）に対応し、別の１つは、非常に伝染性の強いMRSAカナダクローンCMRSA1（CCRI-9589株：Simorら、CCDR 1999, 25-12, june 15）に対応する。これらのデータは、Hiramatsuらが開発したプライマーセット（本発明の配列番号56、58および60に対応する米国特許第6,156,507号の配列番号22、24および28）が、MRSAの検出にとって普遍的ではないことを証明し、一部のMRSA株が、SCCmec右端ジャンクションに、Hiramatsuらが同定したものとは異なる配列を有することを示唆する。MRSA中には、SCCmecの右端に他の型のSCCmec配列または他の配列が見つかる。この測定法の限界は、13個のMSSA株の非特異的検出であることである（表２）。
実施例２：
本発明で開発されたMREP i、ii、およびiii型配列に特異的なプライマーを使用するMRSAの検出と同定
Hiramatsuらが記載したかまたはジーンバンク（GenBank）から入手できるorfXとSCCmec配列の複数の配列整列の分析に基づき、MRSA株からSCCmec−orfX右端ジャンクションのＩ、II、およびIII型の短いセグメントを増幅でき、MRCNSから区別することができる（別紙Ｉと図２）プライマーセット（配列番号64、66、67）を設計した。選択したプライマーセットは、SCCmec Ｉ型について176bpの、SCCmec II型について278bpの、そしてSCCmec III型について223bpの増幅産物を与える。これらのプライマーをマルチプレックスPCRで使用して、208個のMRSA株、252個のMSSA株、41個のMRCNS株および21個のMRCNS株を使用してその普遍的と特異性を試験した（表12）。PCR増幅と検出は、実施例１に記載のように行った。次に、標準的サーマルサイクラー（エムジェイリサーチ社（MJ Research Inc.）からのPTC-200）を使用して、PCR反応物を熱サイクリング（94℃で３分の後に、40サイクルの95℃で１秒の変性工程、60℃で30秒のアニーリング工程、および72℃で２分の伸長工程）にかけた。PCR産物の検出は、実施例１に記載のように行った。
【０１１４】
試験したMRCNSまたはMSCNS株のいずれも、このプライマーセットでは検出されなかった（表12）。しかし、Hiramatsuらが開発したプライマーセット（配列番号56、58および60）では検出されなかった20個のMRSA株は、本発明で開発したプライマーでも検出されなかった（表３と12）。これらのデータは、一部のMRSA株が、SCCmec−染色体右端ジャンクションに、Hiramatsuらが同定したものとは異なる配列を有することも証明する。再度、Hiramatsuプライマーで観察されたように、13個のMSSA株も非特異的に検出された（表12）。これらの明らかなMSSA株は、mec遺伝子座内の最近の欠失の結果かも知れないため、この知見の臨床的意義はまだ確立していない（Deplanoら、2000, J. Antimicrob. Chemotherapy, 46:617-619；Inglisら、1990, J. Gen. Micorobiol., 136:2231-2239；Inglisら、1993, J. Infect. Dis., 167:323-328；Lawrenceら、1996, J. Hosp. Infect., 33:49-53；Wadaら、1991, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:1319-1326）。
実施例３：
MREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくMRSAの検出と同定のための、標準的サーマルサイクラー上のマルチプレックスPCR測定法の開発
本発明に記載の２つの新しいMREP ivとｖ型配列データの分析により、２つの新しいプライマー（配列番号79と80）が設計され、実施例２に記載の３つのプライマー配列番号64、66、67とのマルチプレックスで使用した。PCR増幅とPCR産物の検出は、実施例２に記載のように行った。各MREP型の種々のMRSA株から精製したゲノムDNAの２倍または10倍希釈物を使用して行った感度試験は、５〜10ゲノムコピーの検出限界を示した（表16）。特異性試験は、0.1ngの精製したゲノムDNAまたは１μlの標準化細菌懸濁液を使用して行った。試験したすべてのMRCNSまたはMSCNS株は、このマルチプレックス測定法で陰性であった（表17）。実施例１と２に記載のマルチプレックスPCRで検出されなかった20個のMRSA株のうちの12個が、このマルチプレックス測定法で検出された。再度、Hiramatsuプライマーで観察されたように、13個のMSSA株も非特異的に検出された（表12）。本発明に記載の新しいMREP vi、vii、viii、ixおよびｘ型配列を有する８個のMRSA株（CCRI-9208、CCRI-9583、CCRI-9773、CCRI-9774、CCRI-9589、CCRI-9860、CCRI-9681、CCRI-9770）は、検出不可能なままであった。
実施例４：
MREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくMRSAの検出と同定のための、SmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発
プライマー（配列番号64、66、67、79および80）を含有する実施例３に記載のマルチプレックスPCR測定法を、SmartCycler（登録商標）プラットフォーム（セフェイド（Cepheid））に適合させた。orfX配列に特異的な分子ビーコンプローブを開発した（配列番号84、別紙II参照）。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％トリトンX-100、3.5mM MgCl2、各0.4μMのSCCmec特異的およびorfX特異的プライマー（配列番号64、66、67、79および80）、0.2μMのFAM標識分子ビーコンプローブ（配列番号84）、200μMの４つの各dNTP、3.3μg/μlのBSA、およびTaqStart（登録商標）抗体と組合せた0.5UのTaq DNAポリメラーゼを含有した。SmartCycler（登録商標）によるPCR増幅は、以下のように行った：94℃で３分の最初の変性、次に３工程（95℃で５秒の変性工程、59℃で15秒のアニーリング工程、および72℃で10秒の伸長工程）からなる45サイクル。各アニーリング工程の最後に、蛍光検出を行った。各MREP型のいくつかのMRSA株から精製したゲノムDNAを使用して行った感度試験は、検出限界２〜10ゲノムコピーを示した（表18）。このマルチプレックス測定法では、MRCNSまたはMSCNSのいずれも陽性ではなかった（表19）。再度、Hiramatsuプライマーで観察されたように、13個のMSSA株も非特異的に検出された。実施例１と２に記載のマルチプレックスPCRで検出されなかった20個のMRSA株のうちの12個は、このマルチプレックス測定法で検出された。実施例３に記載のように、本発明に記載の新しいMREP vi、vii、viii、ixおよびｘ型配列を有する８個のMRSA株は、検出不可能なままであった。
実施例５：
内部対照を含むMREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくMRSAの検出と同定のためのSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発
黄色ブドウ球菌のMREP ｉ〜ｖ型とorfXに特異的なプライマー（配列番号64、66、67、79および80）とorfX配列に特異的な分子ビーコンプローブ（配列番号84、別紙II参照）を含有する実施例４に記載のマルチプレックスPCR測定法を、PCR阻害を追跡するために内部対照を含むように最適化させた。この内部対照は、MREP iv型特異的およびorfX特異的プライマー（配列番号79と64）に相補的な配列を含有する。この測定法はまた、内部対照の増幅により作成されるアンプリコン内の配列に特異的なTET標識分子ビーコンプローブを含有する。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％トリトンX-100、3.45mM MgCl2、各0.8μMのMREP特異的プライマー（配列番号66と67）およびorfX特異的プライマー（配列番号64）、0.4μMのMREP特異的プライマー（配列番号79と80）、80コピーの内部対照、内部対照に特異的な0.2μMのTET標識分子ビーコンプローブ、0.2μMのFAM標識分子ビーコンプローブ（配列番号84）、330μMの４つの各dNTP（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））、3.45μg/μlのBSA（シグマ（Sigma））、およびTaqStart（登録商標）抗体（ビーディーバイオサイエンシーズ（BD Biosciences））と組合せた0.875 UのTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有した。SmartCycler（登録商標）によるPCR増幅は、以下のように行った：95℃で３分の最初の変性、次に３工程（95℃で５秒の変性工程、60℃で15秒のアニーリング工程、および72℃で15秒の伸長工程）からなる48サイクル。各MREP型（ｉ〜ｖ）のいくつかのMRSA株から精製したゲノムDNAを使用して行った感度試験は、検出限界２〜10ゲノムコピーを示した。このマルチプレックス測定法では、26個のMRCNSまたは10個のMSCNSのいずれも陽性ではなかった。再度、Hiramatsuプライマーで観察されたように、13個のMSSA株も非特異的に検出された。実施例３と４に記載のように、本発明に記載の新しいMREP vi〜ｘ型配列を有する８個のMRSA株は、検出不可能なままであった。
実施例６：
臨床試料から直接MRSAを検出するための、MREP ｉ、ii、iii、ivおよびｖ型配列に基づくSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックス測定法を使用するMRSAの検出
実施例５に記載の測定法を、臨床試料から直接検出できるように適合させた。モントリオール総合病院（モントリオール、ケベック、カナダ）でのMRSA病院監視プログラム中に採取した全部で142個の鼻腔スワブを試験した。スワブ試料は、採取の24時間以内にラバル大学感染症研究センター（Centre de Recherche en Infectiologie de l'Universite Laval）で試験した。受領後スワブをマンニトール寒天上に置き、次に同じスワブから、同時係属特許出願US60/306,163に記載の簡便かつ迅速試料調製プロトコールに従って鼻腔物質を調製した。標準的培養法により、MRSAの古典的同定を行った。
【０１１５】
培養法に基づき、実施例５に記載のPCR測定法はMRSA陽性の34試料のうち33試料を検出した。培養と比較して、PCR測定法は８つの追加のMRSA陽性試料を検出し、感度97.1％で特異性92.6％であった。このマルチプレックスPCR測定法は、鼻腔試料からのMRSAキャリアの特異的検出のための迅速で強力な方法であり、創傷、血液または血液培養物、CSFなどの任意の種類の臨床試料で使用することができる。
実施例７：
MREP ｉ、ii、iii、iv、ｖ、viおよびvii型配列に基づくMRSAの検出と同定のためのSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発
本発明に記載の新しいMREP II型配列データ（配列番号165と166）の解析により、２つの新しいプライマー（配列番号112と113）を設計し、実施例２に記載の３つのプライマー配列番号64、66、67とのマルチプレックスで試験した。その感度に基づき、プライマー配列番号112をマルチプレックスでの使用のために選択した。配列番号173〜186の解析に基づき、orfX配列のこの領域で同定された２つの配列多型の検出を可能にしたorfX配列に特異的な３つの分子ビーコンプローブもまたマルチプレックスで使用した（配列番号84、163および164）。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％トリトンX-100、3.45mM MgCl2、各0.8μMのSCCmec特異的プライマー（配列番号66と67）およびorfX特異的プライマー（配列番号64）、各0.4μMのSCCmec特異的プライマー（配列番号79と80）、0.2μMのFAM標識分子ビーコンプローブ（配列番号84）、330μMの４つの各dNTP（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））、3.45μg/μlのBSA（シグマ（Sigma））、およびTaqStart（登録商標）抗体（BD biosciences）と組合せた0.875 UのTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有した。SmartCycler（登録商標）によるPCR増幅は、以下のように行った：95℃で３分の最初の変性、次に３工程（95℃で５秒の変性工程、60℃で15秒のアニーリング工程、および72℃で15秒の伸長工程）からなる48サイクル。各アニーリング工程の最後に、蛍光の検出を行った。各MREP型のいくつかのMRSA株から精製したゲノムDNAを使用して行った感度試験は、検出限界２ゲノムコピーを示した（表20）。このマルチプレックス測定法では、26個のMRCNSまたは８個のMSCNSのいずれも陽性ではなかった。再度、Hiramatsuプライマーで観察されたように、13個のMSSA株も非特異的に検出された（表21）。MREP ｉ〜ｖ型の検出のためのマルチプレックス測定法で検出されなかった株のうちの４つは、このマルチプレックス測定法で検出でき、本発明の記載のMREP vi、viii、ixおよびｘ型を有する４つのMRSA株（CCRI-9208、CCRI-9770、CCRI-9681、CCRI-9860）は、検出不可能なままであった。
実施例８：
MREP vi、viii、ix型配列に基づくMRSAの検出と同定のためのSmartCycler（登録商標）上のリアルタイムマルチプレックスPCR測定法の開発
本発明に記載の新しいMREP vi、viiiおよびix型配列データの解析により、MREP vi型に特異的な１つの新しいプライマー（配列番号201）、MREP viii型に特異的な１つの新しいプライマー（配列番号115）、MREP ix型に特異的な新しいプライマー（配列番号109）およびMREP viiiとix型の両方に特異的なプライマー（配列番号116）を設計した。各PCRプライマーは、orfX特異的プライマー（配列番号64）とともに使用し、その特異的標的株に対して試験した。各PCR反応物は、50mM KCl、10mM トリス塩酸（pH9.0）、0.1％トリトンX-100、3.45mM MgCl2、各0.4μMのSCCmec特異的およびorfX特異的プライマー、200μMの４つの各dNTP、3.4μg/μlのBSA、およびTaqStart（登録商標）抗体と組合せた0.875 UのTaq DNAポリメラーゼを含有した。PCR増幅は、実施例７に記載のように行った。各MRSA標的株から精製したゲノムDNAを使用して行った感度試験は、MREP viii型とixの同時検出について、最適なプライマー対組合せは配列番号64と115であることを示した。これらの新しいSCCmec特異的プライマーは、より普遍的なMRSA測定法を提供するために、前の実施例に記載のMREP ｉ、ii、iii、iv、ｖおよびvii型に特異的なプライマー（配列番号64、66、67、79および80）とのマルチプレックスで使用してもよい。
【０１１６】
結論として我々は、MRSA株の検出の普遍性を改良した。新しいMREJ iv〜ｘ型が同定された。これらの新しい型を代表する株の中で、Hiramatsuのプライマーおよび／またはプローブは、その50％未満の検出に成功したのみである。従って我々のプライマーとプローブは、MREJ iv〜ix型の代表として試験した株の100％を検出するように設計されたため、我々は少なくとも50％の普遍的な境界は充分越えている。従って、普遍性は分析される株と代表のプールに依存するが、我々は、この領域の多型を扱うプローブとプライマーを得るために右ジャンクション（MREJ）の配列を使用すると、ほぼ100％の普遍性が達成可能な目標であることを承知している。上記教示に従うと、どれだけ多くの未知の型のMREJが存在するかに依存して、我々は、すべての存在するMREJを配列決定して本診断手段と方法を正しく得るなら、50％（試験した株についてHiramatsuのプライマーより高い）〜100％の操作の余地がある。
【０１１７】
上記で本発明を説明したが、本発明の精神を逸脱することなく、その修飾が可能であることは容易に明らかである。これらの修飾は、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の範囲内にある。
表１．配列リスト中の米国特許第6,156,507号でHiramatsuらが報告したPCR増幅プライマー
【０１１８】
【表１】
0004579532.tif 000002
【０１１９】
a  位置はプライマーの5'末端のヌクレオチド位置を示す。
b  配列番号52〜57の番号は配列番号２であり；配列番号58の番号は配列番号４であり；配列番号59〜63の番号は配列番号３である。
ｃ  プライマーは標的配列の逆相補体である。
ｄ  orfSA0022は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AP003129からの読みとり枠を意味する（配列番号231）。
表２．MRSAの検出のためのHiramatsuらが記載した最適プライマーセット（本発明の配列番号56、58および60に対応する米国特許第6,156,507号の配列番号22、24および28）を使用して標準的サーマルサイクラー上で行った特異性と普遍性試験
【０１２０】
【表２】
0004579532.tif 000003
【０１２１】
表３．Hiramatsuらが開発したプライマー（本発明の配列番号56、58および60に対応するそれぞれ米国特許第6,156,507号の配列番号22、24および28）およびMREP i、ii、およびiii型を標的とする本発明で開発されたプライマー（配列番号64、66、67）により増幅されなかったMRSA株の起源
【０１２２】
【表３】
0004579532.tif 000004
【０１２３】
a  CCRIは、「感染症研究センターコレクション（Collection of the Centre de Recherche en Infectiologie）」を意味する。
b  ポルトガルクローン。
c  カナダクローンEMRSA1。
表４．本発明で開示された黄色ブドウ球菌MREJヌクレオチド配列
【０１２４】
【表４】
0004579532.tif 000005
【０１２５】
表４．本発明で開示された黄色ブドウ球菌MREJヌクレオチド配列（続き）
【０１２６】
【表５】
0004579532.tif 000006
【０１２７】
a  CCRIは、「感染症研究センターコレクション」を意味する。
b  orfSA0021とorfSA0022は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AP003129（配列番号231）からの読みとり枠を意味する。
表５．本発明で開発されたPCRプライマー
【０１２８】
【表６】
0004579532.tif 000007
【０１２９】
a  位置はプライマーの5'末端のヌクレオチド位置を示す。
b  プライマーは標的配列の逆相補体である。
表６．本発明で開発された分子ビーコンプローブ
【０１３０】
【表７】
0004579532.tif 000008
【０１３１】
a  位置は、配列番号３上の分子ビーコンループの5'末端のヌクレオチド位置を示す。
b  分子ビーコンループの配列は配列番号３の逆相補体である。
表７．本発明の目的である異なるプライマー対を用いて得られたアンプリコンの長さ
【０１３２】
【表８】
0004579532.tif 000009
【０１３３】
a  アンプリコンの長さは、プライマーセットで増幅されたMREP型について塩基対で示す。
b  米国特許第6,156,507号でHiramatsuらが記載したプライマーセット。
c  本発明で開発したプライマーセット。
d  orfSA0022は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AP003129（配列番号231）からの読みとり枠を意味する。
表８．本発明で開発された他のプライマー
【０１３４】
【表９】
0004579532.tif 000010
【０１３５】
a  位置はプライマーの5'末端のヌクレオチド位置を示す。
b  プライマーは標的配列の逆相補体である。
表９．本発明で開発された増幅および／または配列決定プライマー
【０１３６】
【表１０】
0004579532.tif 000011
【０１３７】
a  位置はプライマーの5'末端のヌクレオチド位置を示す。
b  プライマーは標的配列の逆相補体である。
c  プライマーは２つのミスマッチを含む。
d  orfSA0021とorfSA0022は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AP003129（配列番号231）からの読みとり枠を意味する。
表10．配列リスト中の公のデータベースから入手できる核酸および／または配列の起源
【０１３８】
【表１１】
0004579532.tif 000012
【０１３９】
a  MREJは、mec右端ジャンクションを意味し、SCCmec組み込み部位の右にSCCmec右端と染色体DNAを含む。
b  特に明記しない場合は、すべての配列は黄色ブドウ球菌株から得られた。
c  サンガー研究所（Sanger Institute）ゲノム計画（http://www.sanger.ac.uk）。
d  TIGRゲノム計画（http://www.tigr.org）。
表11．本発明で開発されたプライマーセット（配列番号64、66、67）を使用する標準的サーマルサイクラー上のMREP i、ii、およびiii型を標的とするMRSA特異的PCR測定法の分析感度
【０１４０】
【表１２】
0004579532.tif 000013
【０１４１】
a  CCRIは、「感染症研究センターコレクション」を意味する。
表12．MRSAの検出のために本発明で開発されたMREP i、ii、およびiii型を標的とするプライマーセット（配列番号64、66、67）を使用する標準的サーマルサイクラー上で行った特異性および普遍性試験
【０１４２】
【表１３】
0004579532.tif 000014
【０１４３】
表13．すべての９つの型のMREPa,bの間のSCCmec右端の最初の500ヌクレオチドの配列同一性パーセント
【０１４４】
【表１４】
0004579532.tif 000015
【０１４５】
a  「最初の500ヌクレオチド」とは、図４に示す黄色ブドウ球菌染色体中のSCCmecの組み込み部位から出発して、SCCmec右端内の500ヌクレオチドを意味する。
b  配列は、ｉ〜ix型についてそれぞれ配列番号１、２、104、51、50、171、165、167、および168から抽出された。
表14．MREJ配列を標的とするMRSA特異的PCR測定法の感度および／または特異性および／または普遍性を試験するために使用した参照株
【０１４６】
【表１５】
0004579532.tif 000016
【０１４７】
表14．MREJ配列を標的とするMRSA特異的PCR測定法の感度および／または特異性および／または普遍性を試験するために使用した参照株（続き）
【０１４８】
【表１６】
0004579532.tif 000017
【０１４９】
a  ATCCは「アメリカンタイプカルチャーコレクション」を意味する。
【０１５０】
LSPQは、「ケベック公衆衛生試験所」を意味する。
【０１５１】
CDCは、「疾病管理センター」を意味する。
表15．MREJ配列を標的とするMRSA特異的PCR測定法の感度および／または特異性および／または普遍性を試験するために使用した臨床分離株
【０１５２】
【表１７】
0004579532.tif 000018
【０１５３】
表16．MRSAの検出と同定のために本発明で開発したMREP i、ii、iii、ivおよびｖ型を標的とするプライマーセット（配列番号64、66、67、79および80）を使用する標準的サーマルサイクラー上で行った試験の分析感度
【０１５４】
【表１８】
0004579532.tif 000019
【０１５５】
a  CCRIは、「感染症研究センターコレクション」を意味する。
表17．MRSAの検出と同定のために本発明で開発したMREP i、ii、iii、ivおよびｖ型を標的とするプライマーセット（配列番号64、66、67、79および80）を使用する標準的サーマルサイクラー上で行った特異性および普遍性試験
【０１５６】
【表１９】
0004579532.tif 000020
【０１５７】
表18．MRSAの検出と同定のために本発明で開発したMREP i、ii、iii、ivおよびｖ型を標的とするプライマーセット（配列番号64、66、67、79および80）と分子ビーコンプローブ（配列番号84）を使用するSmartCycler（登録商標）上で行った試験の分析感度
【０１５８】
【表２０】
0004579532.tif 000021
【０１５９】
a  CCRIは、「感染症研究センターコレクション」を意味する。
表19．MRSAの検出のために本発明で開発したMREP i、ii、iii、ivおよびｖ型を標的とするプライマーセット（配列番号64、66、67、79および80）と分子ビーコンプローブ（配列番号84）を使用するSmartCycler（登録商標）上で行った特異性および普遍性試験
【０１６０】
【表２１】
0004579532.tif 000022
【０１６１】
表20．MRSAの検出と同定のために本発明で開発したMREP i、ii、iii、iv、ｖおよびvii型を標的とするプライマーセット（配列番号64、66、67、79および80）と分子ビーコンプローブ（配列番号84）を使用するSmartCycler（登録商標）上で行った試験の分析感度
【０１６２】
【表２２】
0004579532.tif 000023
【０１６３】
a  CCRIは、「感染症研究センターコレクション」を意味する。
表21．MRSAの検出と同定のために本発明で開発したMREP i、ii、iii、iv、viおよびvii型を標的とするプライマーセット（配列番号64、66、67、79および80）と分子ビーコンプローブ（配列番号84）を使用するSmartCycler（登録商標）上で行った特異性および普遍性試験
【０１６４】
【表２３】
0004579532.tif 000024
【０１６５】
別紙Ｉ：ｉおよびii型 MREPの特異的増幅プライマーの選択方法
【０１６６】
【表２４】
0004579532.tif 000025
【０１６７】
配列位置は配列番号２を意味する。
大文字のヌクレオチドは、選択された配列と同一であるかまたはそれらの配列に一致する。
ミスマッチは、小文字で示す。点は、記載の配列中のギャップを示す。
a  これらの配列は、配列番号17〜25の逆相補体である。
b  この配列は、選択されたプライマーの逆相補体である。
c  配列番号33と34は、CNS種から得られた。
別紙II：MREJのリアルタイム検出のための特異的分子ビーコンプローブの選択方法
【０１６８】
【表２５】
0004579532.tif 000026
【０１６９】
orfX配列と配列番号84とのヌクレオチドの差を小文字で示す。配列リスト中の他のエントリーは、同様の変化を示す。分子ビーコンプローブの幹は、明瞭化のために示していない。配列の位置は配列番号165を示す。
a  これらの配列は、配列番号33と34の逆相補体である。
b  配列33と34は、CNS種から得られた。
c  示した配列は、選択された分子ビーコンプローブの逆相補体である。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】MRSAの検出と同定のためのSCCmec−染色体右端ジャンクション中のHiramatsuら（米国特許第6,156,507号）が開発したプライマーの位置を例示する模式図である。
【図２】MRSAの検出と同定のためのSCCmec−orfX右端ジャンクション中の本発明で選択されたプライマーの位置を例示する模式図である。
【図３】新しいMREP型を配列決定するために本発明で選択したプライマーの位置を例示する模式図である。
【図４】９つのMREP型の配列整列を例示する。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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