(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検査溶液を展開するための展開層と、
前記展開層の一部に、試薬を固定化することにより形成された試薬固定化部と、
前記展開層の他の一部に、前記被検査溶液の展開により溶出可能な標識試薬を保持することにより形成された標識試薬保持部とを備え、
クロマトグラフィーを利用して被検査溶液を測定するバイオセンサ、を用いた測定方法において、
前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量を測定することにより、被検査溶液中の測定成分を定性もしくは定量するとともに、
前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されなかった残量を測定する、
ことを特徴とするクロマトグラフィー測定方法。
【請求項２】
請求項１記載のクロマトグラフィー測定方法において、
前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されなかった残量に基づき、前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量の測定値について補正を行う、
ことを特徴とするクロマトグラフィー測定方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載のクロマトグラフィー測定方法において、
前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されない残量の測定は、
光学的な検出器を用いる、
ことを特徴とするクロマトグラフィー測定方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー測定方法において、
前記標識試薬成分の溶出量の測定は、
前記試薬固定化部以外の部分において行う、
ことを特徴とするクロマトグラフィー測定方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー測定方法において、
前記標識試薬成分の溶出量の測定は、
前記試薬固定化部において前記標識試薬の結合量を測定するよりも前に行う、
ことを特徴とするクロマトグラフィー測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマトグラフィー測定方法に関するものであり、特に、クロマトグラフィー（以下、クロマトと略す）を利用したバイオセンサにより、被検査溶液の測定を行う方法の改良を図ったものに関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは、抗体、酵素等の持つ特異的反応を利用したもので、体液等の被検査溶液中の測定成分を検出することにより、臨床分野等に向けての応用が可能となるものである。
従来、クロマトグラフィーを利用して、被検査溶液（試料）中の測定成分を定性もしくは定量的に測定できるバイオセンサの代表例として、イムノ（免疫）クロマトセンサがある。このイムノクロマトセンサは、被検査溶液を展開する展開層を備え、前記展開層はその一部に試薬が固定化された試薬部分と、他の一部に被検査溶液展開により溶出可能な標識試薬が乾燥状態で保持された標識試薬部分とを含み、被検査溶液を展開した時に前記試薬固定化部分において結合が生じ、その結合量を測定することにより、被検査溶液中の測定成分を測定できるものである。
【０００３】
イムノクロマトセンサの一般例としては、被検査溶液を添加する被検査溶液添加部分を備え、複数の展開層で構成され、前記展開層の一部である試薬固定化部分には抗体が固定化されている。さらに、抗体が固定化されている部分よりも上流側に、標識された抗体が被検査溶液により溶出可能な乾燥状態で保持されている。
【０００４】
このようなセンサに被検査溶液を必要量添加すると、被検査溶液が多孔質材料中を浸透し測定が開始される。測定結果は前記抗体固定化部において結合した標識抗体により検出される。標識物の一般例として金コロイド粒子があり、前記抗体固定化部分で生じた結合が金コロイド粒子により目視可能となり、目視により測定結果が得られる。即ち、被検査溶液に含まれる抗原（測定成分）の濃度に応じて抗体固定化部分の呈色度（色の濃さ）が変化するので、検査者がこれを目視することで、測定が可能となる。
【０００５】
なお、ここでは、抗原抗体反応のサンドイッチ反応を測定原理とした場合を述べたが、その他競合反応を測定原理としても同様に、抗体固定化部における標識試薬の結合状態で測定結果が得られる。
【０００６】
また、前記の例は目視による定性判定を必要とする場合を述べたが、判定の再現性の低さや個人差を改善したり、自動判定が必要とされる場合には、特開平８−３３４５１１号公報に示される、ＣＣＤを用いて呈色した試験片を撮像する方法がある。また、必要とされる測定結果が半定量もしくはそれよりも精度の高い判定が必要とされる場合には、特開平１０−２７４６２４号公報に示される、光学的な読みとり装置を用いて透過方式により読みとる方法や、特開平１０−２７４６５３号公報に示される、カメラ等で画像として取り込み、演算処理する方法がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した，センサ部の抗体固定化部における標識試薬結合量を検出することにより、被検査溶液内の目的とする測定対象物の測定がなされる方法では、前記標識試薬の溶出量が、前記センサの乾燥状態、センサ中の試薬の保存状況、センサ作製時の温度、湿度、作製時間、作製時からの経時変化等によるセンサ部における要因、または被検査溶液の性質における要因、または測定操作における誤操作、測定操作時の環境等測定操作における要因等により、変化する。
【０００８】
抗体固定化部分における標識試薬結合量は、前記標識試薬の溶出量が一定であればより正確、かつ均一な測定結果が得られるが、前記要因により溶出量が変化すると、目的とする測定対象物濃度が一定であったとしても、測定毎に抗体固定化部に結合する標識試薬量は変化する。
【０００９】
従って、例えば、定性の測定結果を求める測定を実施するとき、前記要因により標識試薬の溶出量に変化が生じた場合、特に測定限界高感度付近において、誤った結果を与えたり、極端に前記標識試薬溶出量が少ない場合には、誤った結果を与えることがある。
【００１０】
さらに、半定量性や定量性の測定が必要とされる測定を実施する場合、前記要因による標識試薬溶出量の変化によって、抗体固定化部の標識試薬結合量に変化が生じ、精度が低い測定結果しか得られない、という問題がある。
このため、上述の方法では、定性または半定量測定を実施するのが限界であり、定量測定を実現できるものではなかった。
【００１１】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より高精度な測定結果が得られ、定量測定においてもその精度を向上できるクロマトグラフィー測定方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため、本発明の請求項１記載のクロマトグラフィー測定方法は、被検査溶液を展開するための展開層と、前記展開層の一部に、試薬を固定化することにより形成された試薬固定化部と、前記展開層の他の一部に、被検査溶液展開により溶出可能な標識試薬を保持することにより形成された標識試薬保持部とを備え、クロマトグラフィーを利用して被検査溶液を測定するバイオセンサ、を用いた測定方法において、前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量を測定することにより、被検査溶液中の測定成分を定性もしくは定量するとともに、前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されなかった残量を測定する、ことを特徴とするものである。
【００１３】
本願の請求項１記載の発明は、上述のように、前記試薬固定化部における前記標識試薬結合量により測定対象物の検出をする場合において、その結合量に影響を及ぼす前記標識試薬成分の実質的な溶出量もしくは残量を測定することにより、測定操作における前記試薬固定化部への前記標識試薬成分結合量の妥当性（結合量データの信頼性）を知ることを可能とするものである。
【００１４】
また、本発明の請求項２記載のクロマトグラフィー測定方法は、請求項１記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されなかった残量に基づき、前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量の測定値について補正を行う、ことを特徴とするものである。
【００１５】
本願の請求項２記載の発明は、前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量が測定時において実質的に溶出した標識試薬の成分量により変化するため、上述のように、実質的な溶出量を測定し、その測定された溶出量により前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量の測定値について補正を行うことで、より高精度な測定を可能とするものである。
【００１６】
また、本発明の請求項３記載のクロマトグラフィー測定方法は、請求項１または請求項２記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されない残量の測定は、光学的な検出器を用いる、ものとしたものである。
【００１７】
本願の請求項３記載の発明は、上述のように、光学的な検出器を用いることで、前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されない残量を、より正確に数値化することを可能とするものである。
【００１８】
また、本発明の請求項４記載のクロマトグラフィー測定方法は、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記標識試薬成分の溶出量の測定は、前記試薬固定化部以外の部分において行う、ことを特徴とするものである。
【００１９】
本願の請求項４記載の発明は、上述のように、前記測定対象物量に影響を受けない試薬固定化部以外の部分において、標識試薬成分の溶出量を測定することで、より正確な標識試薬成分の溶出量を測定し、測定の高精度化を可能とするものである。
【００２０】
また、本発明の請求項５記載のクロマトグラフィー測定方法は、請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記標識試薬成分の溶出量の測定は、前記試薬固定化部において前記標識試薬の結合量を測定するよりも前に行う、ことを特徴とするものである。
【００２１】
本願の請求項５記載の発明は、上述のように、前記試薬固定化部の標識試薬の結合量を測定するよりも前に、前記標識試薬成分の溶出量を測定することで、前記標識試薬成分の溶出量を、前記試薬固定化部において生じる結合の測定に、迅速に反映することを可能とするものである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
（実施の形態１）
この実施の形態１は、バイオセンサの抗体固定化部の標識試薬結合量の補正を行うことによって、より高精度な測定結果が得られるクロマトグラフィー測定方法の実現を図るものである。
【００２３】
以下に、本発明の実施の形態について、図１ないし図６を用いて説明する。
図１は、本発明の実施の形態１によるクロマトグラフィー測定方法を実施する際に使用する，バイオセンサ（イムノクロマトセンサ）の形態を示した図である。このイムノクロマトセンサは、被検査溶液を添加する被検査溶液添加部１、標識試薬保持部２と抗体固定化部４とを含む抗体固定化膜３、および、吸水部５で構成される。
【００２４】
被検査溶液添加部１は、被検査溶液を添加する部分であり、被検査溶液が湿潤可能な材料である不織布からなる。被検査溶液添加部１に用いる材料としては、不織布以外でも、被検査溶液が湿潤可能な材料であれば、ガラス繊維濾紙、メンブレンフィルタ等、任意の材料を用いて構成できる。
【００２５】
標識試薬保持部２は、抗体固定化膜３の一部分において、標識試薬を保持する部分である。この標識試薬は、金コロイド（標識物）により標識された抗体であり、被検査溶液の浸透により溶出可能なように、標識試薬保持部２に乾燥状態で保持されている。
【００２６】
また、ここでは標識物により標識される試薬として抗体を用いているが、抗体以外にも、抗原、ハプテン、タンパク質等でも同様に実施可能である。また、試薬の標識物としては、金コロイド以外にも、酵素、タンパク質、色素、蛍光色素、ラテックスなどの着色粒子等が選択可能である。
【００２７】
抗体固定化部４は、試薬固定化部に対応するものであり、抗体固定化膜３の他の一部分において、抗体を乾燥状態で固定して保持する部分である。この抗体は、被検査溶液によって溶出するのではなく、前記標識試薬保持部２の標識試薬と結合する性質を有するものである。そのため、前記抗体は、抗体固定化部４において前記標識試薬を結合捕捉することが可能である。
【００２８】
なお、本実施の形態１では、被検査溶液中の測定対象物を抗原としたサンドイッチ反応について例示したが、競合反応を用いる場合は、標識試薬保持部２に抗原を設置することにより同様に実施可能である。
【００２９】
抗体固定化膜３は、展開層に対応するものであり、標識試薬保持部２と抗体固定化部４とを含み、ニトロセルロースで構成される。抗体固定化膜３に用いられる材料は、ニトロセルロース以外にも、前記同様に被検査溶液が湿潤可能な材料であれば、同様に実施できる。
【００３０】
吸水部５は、抗体固定化膜３を通過した被検査溶液を吸収するものであり、ガラス繊維濾紙からなる。この吸水部５の材料としては、ガラス繊維濾紙以外でも、不織布、樹脂多孔質材料等、被検査溶液が湿潤可能な材料であれば任意の材料で構成可能である。
このように構成したバイオセンサに、被検査溶液を滴下することにより、被検査溶液に含まれる測定対象物を測定することができる。
【００３１】
本実施の形態１は、バイオセンサを用いてクロマトグラフィー測定を行う際に、標識試薬成分の溶出量に変化が生じた場合においても、その溶出量もしくは残量を検知することで、測定操作の正確性を向上させることが可能になり、また、前記溶出量、もしくは残量を計測することにより、前記抗体固定化部４における前記標識試薬結合量に対して、標識試薬成分の溶出量に応じた補正を加えることで、実際の測定に関与した前記標識試薬成分量を反映させることが可能になり、より高精度なクロマトグラフィー測定方法を実現するものである。
【００３２】
図２は、被検査溶液添加部１に被検査溶液を添加した後のイムノクロマトセンサの状態を示している。
図２（ａ）は、被検査溶液を被検査溶液添加部１に添加して経過時間が比較的早い時点でのイムノクロマトセンサの状態を示し、図において、６は標識試薬溶出量を測定する領域を示している。
【００３３】
被検査溶液添加部１に添加された被検査溶液は、標識試薬保持部２の標識試薬を溶出しながら吸水部５に向かって浸透を開始するが、この時点では、被検査溶液により溶出された標識試薬は抗体固定化部４には到達していない。
【００３４】
図２（ｂ）は、抗体固定化部４において標識試薬結合量を測定する時点でのイムノクロマトセンサの状態を示し、図において、７は抗体固定化部４における標識試薬結合量の測定領域を示す。
この状態では、抗体固定化膜３を通過した被検査溶液は吸水部５に吸収され、抗体固定化部４に固定されている抗体は、被検査溶液中の測定対象物量に応じた反応が見られる。
【００３５】
図２（ｃ）は、前記図２（ｂ）と同時点でのイムノクロマトセンサの状態を示すものであり、図において、８は標識試薬溶出残量を測定する領域を示す。
本実施の形態１は、図２（ａ）の状態における標識試薬溶出量測定領域６で得られた測定値を用いて、図２（ｂ）の状態における標識試薬結合量測定領域７で得られた測定値を補正することで、より高精度な測定結果を得るものである。
【００３６】
このように、標識試薬成分の溶出量の測定を、前記抗体固定化部４以外の部分において行うのは、前記抗体固定化部４は、被検査溶液中の測定対象物量により前記標識試薬結合量が変化するため、測定開始後一定時間を区切って標識試薬を読みとろうとした場合、測定対象物の結合反応に起因するものか、前記結合反応に起因しないものかを判断できないからである。
【００３７】
また、標識試薬の溶出量の測定を、前記抗体固定化部４における前記標識試薬の結合量を測定するよりも前に（上流側で）行うのは、測定操作において被検査溶液を添加した後、被検査溶液は展開層を展開するが、前記抗体固定化部４を通過する前に、前記標識試薬成分を溶出させるため、測定部分である前記抗体固定化部４を、前記標識試薬が通過する前に、溶出量を前もって測定しておけば、前記抗体固定化部４における結合の測定に迅速に反映することが可能となるからである。
なお、この様な迅速な補正を行わなくても差し支えない場合は、標識試薬結合量測定領域７で標識試薬量を測定した後、その値に、図２（ｃ）の状態における標識試薬溶出残量測定領域８で得られた測定値を反映させる方法もある。
【００３８】
以下に、本実施の形態１による，バイオセンサを使用したクロマトグラフィー測定方法の具体例として、尿中のｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）の定量を例にとり、図１ないし図６を用いて、さらに詳細に説明する。なお、本実施の形態１の測定方法は、ｈＣＧの定量に限定されるものではない。
本実施の形態の試験片（バイオセンサ）として、ニトロセルロース膜中に抗ｈＣＧ−β抗体固定化ライン、及び抗ｈＣＧ−α抗体と金コロイドとの複合体の広いバンドを含む免疫クロマトグラフィー試験片を製造した。
【００３９】
上記試験片は、図１に示すように、抗ｈＣＧ−β抗体を固定化した抗体固定化部４と、それよりも前（上流側）にある抗ｈＣＧ−α抗体と金コロイドとの複合体が含有された標識試薬保持部２とを含むニトロセルロース膜からなる抗体固定化膜３と、不織布からなる被検査溶液添加部１と、ガラス繊維からなる吸水部５とで構成されるものである。
【００４０】
本実施の形態１は、ｈＧＣ溶液を、図１に示す上記試験片に添加し、反射型分光光度計（ＣＳ９３００；島津製作所）により、図３（ａ）に示すように、標識試薬溶出量測定領域６に光源１００から検査光を照射してその反射光を検出器２００で受光することで、標識試薬溶出量測定領域６の反射吸光度を測定し、次に、図３（ｂ）に示すように、標識試薬結合量測定領域７の反射吸光度を、図３（ａ）と同様に反射型分光光度計により測定し、さらに、標識試薬溶出量測定領域６の吸光度を用いて標識試薬結合量測定領域７の吸光度の補正を行うという、補正方法を使用したものである。
【００４１】
以下、Ａ.試験片の製造方法、Ｂ.被検査溶液の調製方法、Ｃ.補正方法の検討、について説明する。
Ａ．クロマトグラフィー試験片の調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調製をした抗ｈＣＧ−β抗体溶液を準備した。この抗体溶液を溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に検出用の抗体固定化ライン（抗体固定化部４）が得られた。このニトロセルロース膜を乾燥した後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にてさらに１０分間緩やかに振り、膜の洗浄を行った。２度洗浄を行った後に、膜を洗浄液から取り出して、室温で乾燥させた。
【００４２】
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸溶液を加えることによって調製した。還流を３０分間続けた後に、冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ｈＣＧ−α抗体を加えて数分間攪拌した後に、１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液ｐＨ９を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、当初の金コロイド溶液量の１０分の１に調製して、４℃で貯蔵した。
【００４３】
前記標識抗体溶液を溶液吐出装置にセットして、抗ｈＣＧ−β抗体が固定化乾燥膜上の抗体固定化部分から離れた位置に塗布した後に、膜を乾燥させた。これによって、抗体固定化膜３上に標識抗体保持部（標識試薬保持部２）が得られた。
こうして調製された、抗体固定化ライン，標識抗体保持部を含む抗体固定化膜を、反応層担体支持体上に貼付け、不織布を被検査溶液添加部１として、またガラス繊維ろ紙を吸水部５として、付け加えてから０．５ｃｍ幅の細片に切断して、試験片を作製した。
【００４４】
Ｂ．被検査溶液の調製
ヒト尿中に既知濃度のｈＣＧ溶液を加えることにより、さまざまな既知濃度のｈＣＧ溶液を調製した。
【００４５】
Ｃ．補正方法の検討
以下に、測定時間を５分とし、標識試薬溶出量測定時間を、１分後、３分後とした場合の、反射吸光度を使用した補正方法について説明する。
補正を行なうには、予めデバイス（試験片）固有の係数を求めていることが必要である。まず、作製したデバイスの係数を求めるために、ｈＣＧ濃度１０００ＩＵ／ｌを含有する尿を調製し、試験片（試験片数Ｎ＝１０）の被検査溶液添加部１に２００μｌ以上添加する。前記被検査溶液添加時をスタート時間として、開始後１分後、３分後における、標識試薬溶出量測定領域６の反射吸光度を反射型分光光度計（ＣＳ９３００；島津製作所製）を用いて計測した。その後、５分後における標識試薬結合量測定領域７の呈色状況を前記同様反射型分光光度計を用いて計測した。標識試薬溶出量測定領域６の１分後における吸光度を吸光度ＡT、３分後における反射吸光度を吸光度ＢT、標識試薬結合量測定領域７の計測結果を吸光度ＣTとして、その測定結果をプロットし、以下に示す関係式（１）を導き出した。この測定結果は、図４（ｂ）に示されるものである。
【００４６】
Ｙ＝１．１２Ｘ＋Ｄ  （但し、Ｘ＝ＡT＋ＢTである。）          …（１）
ここで、Ｙは標識試薬結合量測定領域７の吸光度であり、図４では縦軸である。また、Ｘは標識試薬溶出量測定領域６の吸光度の和を示し、図４では横軸である。また、Ｄは定数である。
次に、標識試薬溶出量測定領域６の測定結果の中心値を求める。本実施の形態１の例では全測定の中心値は０．２９であった。
【００４７】
この様にして、デバイス（バイオセンサ）固有の係数、Ｅ＝１．１２、Ｆ＝０．２９を得た。このデバイス固有の係数Ｅは標識試薬溶出量測定領域６と標識試薬結合量測定領域７における吸光度の関係式の傾きであり、またＦは標識試薬溶出量測定領域６で得られた吸光度の中心値である。
【００４８】
以下、ヒト尿中に既知濃度のｈＣＧ溶液を加えることにより、１００、１０００、１００００ＩＵ／ｌのｈＣＧを含有する尿を調製し、該３種類の濃度既知の被検査溶液を用いて、本実施の形態１のクロマトグラフィー測定方法で測定を行い、補正前の測定値と補正後の測定値とを比較する。まず、各ｈＣＧ濃度の尿に対して試験片上の被検査溶液添加部１に前記ｈＣＧを含む尿を２００μｌ以上添加して、吸水部５方向へと展開させ、測定を開始する。被検査溶液添加時をスタート時間として、開始後１分後、３分後における、標識試薬溶出量測定領域６の反射吸光度を反射型分光光度計（ＣＳ９３００；島津製作所製）を用いて計測した。その後、５分後における標識試薬結合量測定領域７の呈色状況を前記同様反射型分光光度計を用いて計測した。標識試薬溶出量測定領域６の１分後における吸光度を吸光度ＡT、３分後における反射吸光度を吸光度ＢT、標識試薬結合量測定領域７の計測結果を吸光度ＣTとする。
【００４９】
図４は、被検査溶液中の測定対象物であるｈＣＧ各濃度における吸光度ＡTと吸光度ＢTの和と、吸光度ＣTの関係を示す図である。図４（ａ）はｈＣＧ濃度１００ＩＵ／ｌ、図４（ｂ）はｈＣＧ濃度１０００ＩＵ／ｌ、図４（ｃ）はｈＣＧ濃度１００００ＩＵ／ｌの場合の吸光度ＡTと吸光度ＢTの和と、吸光度ＣTの関係を示している。図４（ａ）ないし図４（ｃ）より、ｈＣＧ各濃度において吸光度ＡTと吸光度ＢTの和と、吸光度ＣTに相関があることがわかる。
【００５０】
次に、上記測定結果、及び前記デバイスの係数を使用して、以下の式（２）を用いて標識試薬結合量測定領域７の計測結果における吸光度ＣTの補正を行い、補正値ＣHを求める。
補正値ＣH＝ＣT×（１−（（ＡT＋ＢT）−Ｆ×Ｅ）            …（２）
ここでＣHは補正結果を示す。
【００５１】
図５は、各ｈＣＧ濃度における補正前の測定結果と補正後の測定結果との関係を示す図である。図５（ａ）は、補正前である図４の結果をｈＣＧ各濃度ごとにプロットしなおした図で、図５（ｂ）は、前記図４で示した測定結果に式２を用いて補正した後の測定結果をｈＣＧ各濃度ごとにプロットした図である。
補正前のｈＣＧ同一濃度内のＣＶ値（変動係数）はそれぞれ、１１．１％、１０．８％、１３．８％であるが、補正によりＣＶ値（変動係数）はそれぞれ、８．９％、４．１％、１．９％となり、全濃度領域とも大幅に測定値の精度が向上していることがわかる。
【００５２】
以上の，本実施の形態１における補正を実施することにより、測定値の精度が飛躍的に向上することが確認できた。
即ち、標識試薬成分の溶出量に変化が生じたとしても、ｈＣＧ濃度が同一であれば測定値は変動の影響をあまり受けなくなり、定量精度が大幅に向上したクロマトグラフィー測定方法を得ることができる。
【００５３】
このように、本実施の形態１によれば、センサの乾燥状態、センサの中の試薬成分の保存状況、センサ作製時の温度、湿度、作製時間等の外的状況、等のセンサ部における要因、または、被検査溶液の性質における要因、測定操作における誤操作、測定操作時の環境等、測定操作における要因等により、標識試薬成分の溶出量に変化が生じた場合においても、その溶出量もしくは残量を検知することで、測定操作の正確性を向上させることが可能になり、また、前記溶出量、もしくは残量を計測することにより、前記試薬固定化部分における前記標識試薬成分の結合量に対して、溶出量に応じた補正を加えることで、より高精度なクロマトグラフィ測定方法を提供できる。
【００５４】
なお、本実施の形態１では、図１に示すような試験片を用いた場合の補正方法の一例について説明したが、試験片の形状は図１のものに限定されるものではなく、適宜選択可能である。
また、前記デバイス固有の値Ｅ，Ｆは、標識試薬保持濃度、標識試薬保持面積、標識試薬保持量、標識試薬種類、流速、試料溶媒種、標識試薬保持領域と固定化試薬との位置等の要因で変化するものであり、必要に応じて適宜選択可能である。
【００５５】
さらに、本実施の形態１では、標識試薬溶出量計測を利用して補正を行うようにしたが、標識試薬の残量を計測して補正を行うようにしてもよく、この場合、図３と同様の反射型分光光度計により、先に標識試薬結合量測定領域７の反射吸光度を求め（図６（ａ）参照）、次に標識試料溶出残量測定領域８の反射吸光度を求めて（図６（ｂ）参照）、補正を行った後、上述の標識試薬溶出量計測の場合と同様にしてデバイス固有の値を算出し、これを用いて、式（２）により補正を行うようにすればよい。
その他、溶出量の計測方法、溶出量測定領域の場所、補正演算式などの選択など、必要に応じて適宜選択可能である。
【００５６】
【発明の効果】
以上のように、請求項１記載のクロマトグラフィー測定方法によれば、被検査溶液を展開する展開層と、前記展開層の一部に、試薬を固定化することにより形成された試薬固定化部と、前記展開層の他の一部に、前記被検査溶液の展開により溶出可能な標識試薬を保持することにより形成された標識試薬保持部とを備え、クロマトグラフィーを利用して被検査溶液を測定するバイオセンサ、を用いた測定方法において、前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量を測定することにより、被検査溶液中の測定成分を定性もしくは定量するとともに、前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されなかった残量を測定する、ようにしたので、前記試薬固定化部における前記標識試薬結合量により、被検査溶液内の測定対象物の検出をする場合において、その結合量に影響を及ぼす前記標識成分の実質的な溶出量もしくは残量を測定することにより、固定化における前記標識試薬成分結合量の妥当性（結合量データの信頼性）を知ることを可能にし、測定操作の正確性を向上させる効果があり、また、前記溶出量、もしくは残量を計測することにより、前記試薬固定化部分における前記標識試薬成分の結合量に対して、溶出量に応じた補正を加えることで、実際の測定に関与した前記標識試薬成分量を反映させることが可能になり、より高精度な，バイオセンサを用いたクロマトグラフィー測定方法が実現できるという効果が得られる。
【００５７】
また、請求項２記載のクロマトグラフィー測定方法によれば、請求項１記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量に対し、前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されない残量に基づき、前記試薬固定化部における前記標識試薬の結合量の測定値について補正を行うようにしたので、実際の測定に関与した前記標識試薬成分量を反映させることが可能になり、より高精度な，バイオセンサを用いたクロマトグラフィー測定方法が実現できるという効果が得られる。
【００５８】
また、請求項３記載のクロマトグラフィー測定方法によれば、請求項１または請求項２記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記標識試薬成分の溶出量もしくは溶出されない残量の測定は、光学的な検出器を用いるものとしたので、前記標識試薬成分の溶出量をより正確に数値化することが可能となり、より高精度な，バイオセンサを用いたクロマトグラフィー測定方法が実現できるという効果が得られる。
【００５９】
また、請求項４記載のクロマトグラフィー測定方法によれば、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記標識試薬成分の溶出量の測定は、前記試薬固定化部以外の部分において行うものとしたので、測定対象物量に影響を受けない試薬固定化部以外の部分における標識試薬成分溶出量を測定することで、より正確な標識試薬溶出量を測定でき、より高精度な，バイオセンサを用いたクロマトグラフィー測定方法が実現できるという効果が得られる。
【００６０】
さらに、請求項５記載のクロマトグラフィー測定方法によれば、請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー測定方法において、前記標識試薬成分の溶出量の測定は、前記試薬固定化部において前記標識試薬の結合量を測定するよりも前に行うものとしたので、試薬固定化部分において生じる結合に関与する標識試薬成分をあらかじめ知ることができ、測定操作の正確性を高めるとともに、より迅速な判断を可能にし、より高精度な，バイオセンサを用いたクロマトグラフィー測定方法が実現できるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１によるクロマトグラフィー測定方法に使用する，バイオセンサの構成の一例を示す斜視図である。
【図２】本発明の実施の形態１によるクロマトグラフィー測定方法におけるバイオセンサの被検査溶液の展開状況を示す斜視図であり、図２（ａ）は測定初期状態を示す図であり、図２（ｂ），（ｃ）は反応測定状態を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態１によるクロマトグラフィー測定方法におけるバイオセンサの測定すべき領域の順序の一例を示す斜視図であり、図３（ａ）は最初に測定すべき領域を示す図であり、図３（ｂ）は次に測定すべき領域を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサにより測定したｈＣＧの各濃度における吸光度ＡT，ＢTの和と、吸光度ＣTとの関係を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサにより測定した各ｈＣＧ濃度における補正前の測定結果と補正後の測定結果の関係を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態１によるクロマトグラフィー測定方法におけるバイオセンサの測定すべき領域の順序の他の例を示す斜視図であり、図６（ａ）は最初に測定すべき領域を示す図であり、図６（ｂ）は次に測定すべき領域を示す図である。
【符号の説明】
１  被検査溶液添加部
２  標識試薬保持部
３  抗体固定化膜
４  抗体固定化部
５  吸水部
６  標識試薬溶出量測定領域
７  標識試薬結合量測定領域
８  標識試薬溶出残量測定領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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