(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式II：
【化１８】
0004402833.tif 000023
［式中、Ｒ１は炭素原子８〜２２個を有する直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、脂肪族アシル基であり、これは場合によりフェニルまたはシクロアルキル基１つ以上で中断されているか、または、フェニルまたはシクロアルキル基１つ以上に連結されることができ、そして、更に場合により酸素により中断されていることができる］の化合物のカルシウム塩。
【請求項２】
Ｒ１が、
１）フェニルまたはシクロアルキル基により中断されているか、または、フェニルまたはシクロアルキル基に連結されているアシル基；
２）下記：
【化１９】
0004402833.tif 000024
［式中、ｎは０〜２０の整数である］で表される基；
３）フェニルまたはシクロアルキル基により、そして、酸素により中断されているアシル基；
４）下記：
【化２０】
0004402833.tif 000025
［式中、ｎは０〜２０の整数である］で表される基；
５）炭素原子１２〜１５個を有する直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の脂肪族アシル基；
６）下記：
【化２１】
0004402833.tif 000026
で表される基；
７）下記：
【化２２】
0004402833.tif 000027
で表される基；
８）下記：
【化２３】
0004402833.tif 000028
で表される基；
９）下記：
【化２４】
0004402833.tif 000029
で表される基；
１０）下記：
【化２５】
0004402833.tif 000030
で表される基；
１１）下記：
【化２６】
0004402833.tif 000031
で表される基；
１２）下記：
【化２７】
0004402833.tif 000032
で表される基；または
１３）下記：
【化２８】
0004402833.tif 000033
で表される基
である請求項１記載のカルシウム塩。
【請求項３】
カルシウム塩が、
１）実験式Ｃ46+nＨ68+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ2（式中ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである）、
２）実験式Ｃ46+nＨ69+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ3（式中ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである）、
３）実験式Ｃ46+nＨ70+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ4（式中ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである）、
４）実験式Ｃ46+nＨ66+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ2（式中ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである）、
５）実験式Ｃ46+nＨ67+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ3（式中ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである）、
６）実験式Ｃ46+nＨ68+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ4（式中ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである）、
７）実験式Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ2（式中、Ｘはアニオンである）、
８）実験式Ｃ59Ｈ93Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ3（式中、Ｘはアニオンである）、
９）実験式Ｃ59Ｈ94Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ4（式中、Ｘはアニオンである）、
１０）実験式Ｃ46+nＨ68+2nＮ14Ｏ19Ｃａ（式中ｎは７〜２１の整数である）、
１１）実験式Ｃ46+nＨ66+2nＮ14Ｏ19Ｃａ（式中ｎは７〜２１の整数である）、または
１２）実験式Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ
を有する請求項１または２に記載のカルシウム塩。
【請求項４】
Ｘがハライドアニオンである請求項３に記載のカルシウム塩。
【請求項５】
極性溶媒中に請求項１〜４のいずれかに記載の式IIの化合物のナトリウムまたはアンモニウム塩を溶解すること、この溶液に同じ溶媒中に溶解したカルシウム塩を添加すること、次に得られた溶液をより極性の低い溶媒またはより極性の低い溶媒の混合物で処理すること、および沈殿として請求項１〜４のいずれかに記載のカルシウム塩を単離することを包含する請求項１〜４のいずれか１項に記載のカルシウム塩の製造方法。
【請求項６】
発酵溶液にキレート形成剤１種以上およびアスパラギンを添加することを包含する、Actinoplanes種の発酵による請求項１に記載の式IIの化合物の製造方法であって、ここでＲ１は
【化２９】
0004402833.tif 000034
である、上記製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１種のカルシウム塩を含有する細菌感染に対する医薬。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の１種またはそれ以上のカルシウム塩および製薬用補助剤を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はリポペプチド抗生物質のカルシウム塩、その製造方法およびその使用に関する。
欧州特許出願０ ６２９ ６３６Ａ１号は下記式Ｉ：
【化１２】
0004402833.tif 000002
［式中Ｒ1はＯＨまたはＮＨ2基であり、そしてＲ2は脂肪酸基（Ｒ−Ｃ(Ｏ)−）である］のリポペプチド抗生物質を開示している。
【０００２】
これらのリポペプチド抗生物質はその環外アミノ酸に関して異なっている２つの群に分けられ：アンフォマイシン型のリポペプチド抗生物質は環外アミノ酸アスパラギン酸（Ａｓｐ、式Ｉ中のＲ1はＯＨ基である）を特徴とし（R.C. Strong等、Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1970，42-45；M．Bodansy等、J. Am．Chem．Soc．95，2352-2357(1973)）、他方アスパラギン型のリポペプチド抗生物質は環外アミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ、式Ｉ中のＲ1はＮＨ2基である）を特色とする。アンフォマイシン型およびアスパラギン型のリポペプチド抗生物質は異なる脂肪酸基（式ＩのＲ2）を有する環外アミノ酸（AspまたはAsn）のα−アミノ基上の置換が相互に異なっている。
【０００３】
更にまた欧州特許出願０ ６８８ ７８９Ａ１号（米国特許５,６２９,２８８号）はアンフォマイシン型およびアスパラギン型のリポペプチド抗生物質の誘導体およびその薬学的に受容性の塩を開示している。式Ｉのリポペプチドの抗生物質の薬学的に受容性の塩として、欧州特許出願０６８８７８９Ａ１号（米国特許５,６２９,２８８号）は塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルホン酸のような無機および有機の酸、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ(ＯＨ)2、ジエタノールアミン、エチレンジアミンのような無機および有機の塩基、または、アルギニン、リジンおよびグルタミン酸のようなアミノ酸との塩を開示している。
【０００４】
アンフォマイシンのカルシウム塩も知られている（Kirk-Othmer，Encyclopedia of Chemical Technology，第４版、第３巻、Antibiotics to Batteries，John Wiley & Sons，p284）。これらは殆ど水に溶解せず、前進投与時の溶血性によるアンフォマイシンの毒性のために、局所投与用の抗生物質軟膏で使用されているのみである。
【０００５】
アスパラギン型（式Ｉ中Ｒ1がＮＨ2基である）のリポペプチド抗生物質およびその製造は欧州特許出願０ ６２９ ６３６Ａ１号において最初に記載されている。しかしながらそこで提案されている製造方法、即ちActinoplanes sp.，好ましくはActinoplanes friulensisの発酵（１９９０年６月１８日に、ブタペスト条約に基づき、寄託番号ＤＳＭ７３５８の下でDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH，DSMZ，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Brunswickに寄託されている）は、極めて異なる性質、特に異なる生理作用、例えば抗細菌作用、溶血性による毒性、また異なる物理化学的特性、例えば溶解度や安定性を有しており、培地から分離するのは困難なアンフォマイシン型およびアスパラギン型の多数の構造的に極めて似ているリポペプチドの混合物を与えるものである。従って、多くの可能なリポペプチドの成分の好ましくは１つのみの製造を本質的に可能にするような発酵方法を得ることは極めて好ましいことである。
【０００６】
本発明の目的は比較的高い安定性と良好な抗細菌活性を特色とし良好な水溶性と低毒性の結果、特に低溶血活性により、全身（非経腸）投与が可能であるアスパラギン型のリポペプチド抗生物質の塩を得ることである。
【０００７】
本発明の別の目的はアスパラギン型のリポペプチド抗生物質の塩の製造方法、特にアスパラギン型のリポペプチド抗生物質が好ましく製造できる酸前駆体の発酵による製造のための改良方法を得ることである。
本発明の最後の目的は所望の好都合な特性を有するアスパラギン型のリポペプチド抗生物質の塩を含有する医薬を得ることである。
【０００８】
今回我々は、アスパラギン型のリポペプチド抗生物質の場合、一部のリポペプチド（または相当する酸）の種々の塩が極めて異なる特性を有することを発見した。例えば、ナトリウム塩は原則として極めて良好な抗細菌活性を有し、水に易溶である。しかしながら、これらは特に高温では限られた時間のみしか保存できない。医薬および他の市販品の場合、安定性は例えば商品の取り扱いのために極めて重要であるため、リポペプチド抗生物質の安定な塩の形態が必要である。
【０００９】
アスパラギン型のリポペプチド抗生物質は酸性領域に等電点を有する両性化合物であるため、中性の塩を種々の塩基で製造できる。考えられるカチオンは１価または多価のイオン、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属および他の金属のイオンであるが、アンモニアとの、または有機の塩基、例えば、アミンとの塩も挙げられる。後者の例はリジンおよびリジルリジンの塩であり、これらは極めて受容性が高く、十分な活性を有する。
【００１０】
意外にも今回アンフォマイシン型のリポペプチド抗生物質（特にアンフォマイシン）のカルシウム塩とは異なり、アスパラギン型のリポペプチド抗生物質のカルシウム塩が活性および受容性を有するのみならず、水に易溶であり、特に、相当するナトリウム塩とは異なり、安定であることがわかった。
【００１１】
従って上記した目的は、下記式II：
【化１３】
0004402833.tif 000003
［式中、Ｒ１は炭素原子８〜２２個を有する直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、脂肪族アシル基であり、これは場合によりフェニルまたはシクロアルキル基１つ以上で中断されているか、または、そのような基に連結されることができ、そして、更に場合により酸素により中断されていることができる］の化合物のカルシウム塩により達成される。
【００１２】
好ましくは、式IIのＲ１はフェニルまたはシクロアルキル基で中断されるか、このような基に連結しているアシル基、例えば、下記：
【化１４】
0004402833.tif 000004
［式中ｎは０〜２０の整数である］の基である。
【００１３】
更に好ましいものはＲ１がフェニルまたはシクロアルキル基により、そして、酸素により中断されているアシル基、好ましくはＲ１が下記：
【化１５】
0004402833.tif 000005
［式中ｎは０〜２０の整数である］の基であるという特色を有する式ＩＩの化合物のカルシウム塩である。
【００１４】
特に好ましいものは、Ｒ１が炭素原子１２〜１５個を有する直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の脂肪族アシル基であるという特色を有する式ＩＩの化合物のカルシウム塩であり、ここで式ＩＩのＲ１は好ましくは下記：
【化１６】
0004402833.tif 000006
で示される式の脂肪酸基である。
【００１５】
式IIの化合物のカルシウム塩は２つの形態、即ち、ジカルシウム塩またはモノカルシウム塩として存在することができる。
アニオンおよび脂肪酸置換基（式IIのＲ１)の数に応じて、ジカルシウム塩はより詳細には、
(ｉ)  例えば、飽和脂肪酸（式IIのＲ１）の場合は下記実験式：
(ｉａ)  Ｃ46+nＨ68+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ2、
(ｉｂ)  Ｃ46+nＨ69+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ3、または
(ｉｃ)  Ｃ46+nＨ70+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ4
［実験式中、ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである］により説明されるか、または、
(ii)  例えば、１不飽和脂肪酸（式IIのＲ１）の場合は下記実験式：
(iiａ)  Ｃ46+nＨ66+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ2、
(iiｂ)  Ｃ46+nＨ67+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ3、または
(iiｃ)  Ｃ46+nＨ68+2nＮ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ4
［実験式中、ｎは７〜２１の整数であり、Ｘはアニオンである］により記述される。
【００１６】
例えば、式II（３ｃ）および（３ｄ）の化合物の上記した好ましいカルシウム塩はより詳細には、２カルシウム塩が存在する場合はＸがアニオンである下記実験式：
(３ｃ，３ｄ／iiａ)  Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ2、
(３ｃ，３ｄ／iiｂ)  Ｃ59Ｈ93Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ3、および
(３ｃ，３ｄ／iiｃ)  Ｃ59Ｈ94Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ4
により記述される。
好ましくは全ての上記した実験式において、アニオンＸはハライドアニオン、Ｃｌ-、Ｂｒ-またはＩ-、特に好ましくはＣｌ-である。
【００１７】
脂肪酸置換基（式IIのＲ１）の如何に応じて、モノカルシウム塩は更により詳細には、例えば、飽和脂肪酸（式IIのＲ１）の場合は下記実験式：
(iii)  Ｃ46+nＨ68+2nＮ14Ｏ19Ｃａ
により、または、１不飽和脂肪酸（式IIのＲ１）の場合は下記実験式：
(iv)   Ｃ46+nＨ66+2nＮ14Ｏ19Ｃａ
［両実験式中、ｎは７〜２１の整数である］により記述される。
【００１８】
例えば、式II（３ｃ）および（３ｄ）の化合物の上記した好ましいカルシウム塩はより詳細には、モノカルシウム塩が存在する場合は下記実験式：
(３ｃ，３ｄ／iv)    Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ
により記述される。
【００１９】
上記した式II（３ｃ）および（３ｄ）の化合物の好ましいカルシウム塩において、一方の相当する酸、即ち式IIの相当する化合物は、例えば、実験式Ｃ59Ｈ94Ｎ14Ｏ19を有する。
【００２０】
上記した好ましいカルシウム塩（３ｄ）（式IIの相当する化合物）に相当する以下の酸Ａ１４３７−Ｄは下記式
【化１７】
0004402833.tif 000007
に示す構造を有する。
【００２１】
表１にＡ１４３７−Ｄナトリウム塩により例示した場合の1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲシグナルのアサインメントを示す。アミノ酸の表示は国際会議に従って略記し、Ｄａｂ＝２,３−ジアミノ酪酸、Ｍｅ−Ａｓｐ＝β−メチルアスパラギン酸、Ｐｉｐ＝ピペコール（pipecolic）酸、ＦＡ＝脂肪酸とした。アミノ酸は好ましくは以下の配置を有する。Ｐｉｐ−３：Ｄ；Ｍｅ−Ａｓｐ−４：Ｌ−スレオ；Ａｓｐ−５，−７：Ｌ；Ｄａｂ−２：Ｌ−スレオ；Ｄａｂ−９：Ｄ−エリスロ；Ｖａｌ−１０：Ｌ；Ｐｒｏ−１１：Ｌ；Ａｓｎ−１：Ｌ
【００２２】
【表１】
0004402833.tif 000008
【００２３】
【表２】
0004402833.tif 000009
【００２４】
【表３】
0004402833.tif 000010
【００２５】
例えばＡ−１４３７−Ｄナトリウム塩からカルシウム塩（３ｄ）への変化において、抗生物質の物理的性質が基本的に変化することが観察できる。即ち、ナトリウムＤ線の波長における２０℃のナトリウム塩の比旋光度［α］は、例えばＣａＣｌ2のような可溶性カルシウム塩を水溶液に添加した場合は＋６から５２°を超えるまで上昇する。この非合理的な挙動から、分子のコンホーメーションに大きな変化があったと推定することは合理的であると考えられる。このコンホーメーションの変化はまたイオン性化合物で予測されるより遥かに低値であるＡ−１４３７−Ｄカルシウム塩（３Ｄ／iv）の低い導電性によっても裏付けられる。
【００２６】
式IIの化合物のカルシウム塩の製造のためにはいくつかの方法がある。１つは一部の溶液中でのカルシウム塩の溶解度に限度があることを利用する。Ｎａ+またはＮＨ4+塩は水またはメタノール中に極めて易溶であり、高級アルコールおよび他の極性有機溶媒中に易溶であるが、非水性溶媒中の相当するカルシウム塩の溶解度は顕著に低下する。
【００２７】
従って、上記した式IIの化合物のカルシウム塩の製造方法の特色は、式IIの化合物のナトリウムまたはアンモニウム塩を適当な有機溶媒に溶解し、この溶液にエタノール中に溶解したカルシウム塩を添加し、そして、式IIの化合物のカルシウム塩を沈殿として単離することである。好ましくは、適当な有機溶媒はエタノールである。エタノール中に溶解した添加すべきカルシウム塩とは、好ましくはハロゲン化カルシウム、ＣａＣｌ2、ＣａＢｒ2、ＣａＩ2または相当する水和物である。この方法において、式IIの化合物のジカルシウム塩が生じるのが好ましい。
【００２８】
例えば、（３ｄ／iiａ）実験式Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ2を有する、(３ｄ／iiｂ) 実験式Ｃ59Ｈ93Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ3を有する、または、(３ｄ／iiｃ) 実験式Ｃ59Ｈ94Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｘ4を有するカルシウム塩の製造のためには、Ａ１４３７Ｄ（(３ｄ)に相当する酸）のナトリウムまたはアンモニウム塩を適当な有機溶媒、例えばエタノールに溶解し、この溶液にエタノール中に溶解したカルシウム塩を添加するという方法を使用できる。有機溶媒に難溶性であるＡ１４３７Ｄカルシウム塩はここで沈殿の形態で析出する。エタノール中に易溶であり析出に適するカルシウム塩は、例えばＣａＣｌ2、ＣａＢｒ2、ＣａＩ2およびこれらの水和物である。この製造方法により、カルシウムカチオン以外に例えばハライドＣｌ-、Ｂｒ-およびＩ-の析出塩のアニオンを更に含有することのできる塩が得られる。析出するカルシウム塩の実験式は析出条件に応じて、例えば、Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2ハライド2、例えば、Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｃｌ2またはＣ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｉ2、または、Ｃ59Ｈ93Ｎ14Ｏ19Ｃａ2ハライド3、例えばＣ59Ｈ93Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｂｒ3または、Ｃ59Ｈ93Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｃｌ3と記載することができるが、他の混合塩も形成でき、とりわけＣ59Ｈ94Ｎ14Ｏ19Ｃａ2ハライド4の組成物もあり得る。これらの混合塩（Ａ１４３７カルシウム混合塩）は水溶性であり、従って細菌感染症の治療のため、または、防腐のため、あるいは、動物育種における生育促進のために適しているが、他の塩の製造のための中間体としても使用できる。
【００２９】
結晶化は式IIの化合物のカルシウム塩を生成、または、精製するための更に別の方法である。ここでは純水、ジメチルスルホキシド、純メタノール、および他の極性溶媒中に溶解する抗生物質カルシウム塩の性質を利用する。
従って、式IIの化合物のカルシウム塩、好ましくはモノカルシウム塩の製造方法の特色は、例えば上記した方法で得られる式IIの化合物のジカルシウム塩を極性溶媒に溶解し、得られた溶液をより極性の低い溶媒、または、より極性の低い溶媒の混合物で処理し、カルシウム塩、好ましくはモノカルシウム塩を沈殿として単離することである。
【００３０】
式IIの化合物のカルシウム塩、好ましくはモノカルシウム塩の製造のための更に別の方法の特色は、式IIの化合物のナトリウムまたはアンモニウム塩を極性溶媒に溶解し、この溶液に同じ極性溶媒に溶解したカルシウム塩を添加し、次に得られた溶液をより極性の低い溶媒、または、より極性の低い溶媒の混合物で処理し、そして、カルシウム塩、好ましくはモノカルシウム塩を沈殿として単離することである。
【００３１】
好ましくは、２つの代替法において、式IIの化合物のナトリウムまたはアンモニウム塩またはジカルシウム塩を水、ジメチルスルホキシド、およびメタノールよりなる群から選択される極性溶媒に溶解する。
好ましくは、得られた溶液を処理するより極性の低い溶媒はアルコール、アセトンおよびアセトニトリルよりなる群から選択される。
【００３２】
好ましくは、式IIの化合物のナトリウムまたはアンモニウム塩またはジカルシウム塩を水に溶解し、より極性の低い溶媒はメタノールである。
好都合には、メタノールとブタノールの混合物をより極性の低い溶媒混合物として両方の方法において添加する。
【００３３】
あるいは、式IIの化合物のカルシウム塩、好ましくはモノカルシウム塩は、メタノール中に式IIの化合物のナトリウムまたはアンモニウム塩を溶解し、この溶液に同じ溶媒中に溶解したカルシウム塩を添加し、次に得られた溶液を水または水とブタノールの混合物で処理し、そして、沈殿としてカルシウム塩、好ましくはモノカルシウム塩を単離することにより製造できる。
【００３４】
好ましくは、上記した全ての方法において、好ましく添加される溶解したカルシウム塩はＣａＣｌ2、ＣａＢｒ2、ＣａＩ2およびこれらの水和物よりなる群から選択されるハロゲン化カルシウムである。
【００３５】
例えばＡ１４３７−Ｄジカルシウム塩を高溶解性の溶媒中に濃縮された形態で溶解し、次に混和性ではあるが抗生物質塩の溶解性は低い試薬で処理する。後者の例はより極性の低い有機溶媒、例えばアルコール、アセトン、アセトニトリル等である。水とメタノールの混合物は特殊な例である。これらの純粋な溶媒はＡ１４３７−Ｄ Ｃａ塩を容易に溶解するが、両溶媒の混合物は顕著に乏しい溶媒特性を示す。即ち、Ａ１４３７−Ｄモノカルシウム塩（３ｄ／iv）はメタノール（水）を加えながら水から（メタノールから）晶出することができる。この方法により、カルシウム塩を製造または精製することができる。Ａ１４３７−Ｄモノカルシウム塩（３ｄ／iv）は水メタノール混合物中で容易にゲル化する。
【００３６】
このゲル生成は、結晶化速度がこれにより大きく遅延することから、結晶化のためには望ましくない。従って結晶化のためには、ゲル形成を抑制する手段を講じる必要がある。即ち、１つの方法は例えばブタノールのような適当な物質を少量添加することである。
【００３７】
式IIの化合物のカルシウム塩、好ましくはそのモノカルシウム塩、例えばＡ１４３７−Ｄモノカルシウム塩（３ｄ／iv）を製造するための別の方法は、支持体、例えば、吸着樹脂、逆相支持体、モレキュラーシーブおよびイオン交換剤の使用であり、これらに、ハロゲン化カルシウムで予め処理しておいた式IIの化合物のナトリウムまたはアンモニウム塩（例えば化合物Ａ１４３７−Ｄのナトリウムまたはアンモニウム塩）の水溶液、または、式IIの化合物のジカルシウム塩（例えばジカルシウム塩（３ｄ／iiａ）、（３ｄ／iiｂ）または（３ｄ／iiｃ））の水溶液を負荷し、その後、支持体を場合により適当な溶媒で洗浄し、最後に式IIの化合物のカルシウム塩、好ましくはモノカルシウム塩、例えば、Ａ１４３７−Ｄモノカルシウム塩（３Ｄ／iv）を適当な溶媒で溶離する。
【００３８】
吸着樹脂として使用するためには、例えば、Amberlite ＸＡＤ７（Rohm & Haas)、ＤＩＡＩＯＮ(R) ＨＰ２０ＳＳ（Mitsubushi Chem. Corp.），Poros(R)２０Ｒ２またはポリアミド６（Riedel-deHaen）が適当であり、逆相支持体を使用する場合は、LiChrosorb(R) ＲＰ−セレクトＢ（E．Merck）が適している。しかしながら例えば蛋白の精製のためには、疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において通常使用される支持体を使用することもできる。このような支持体は例えば、Phenyl Sepharose(R)またはTSKgel Phenyl Toyopearl(R)が挙げられる。更にまた、「サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー」またはゲル濾過クロマトグラフィーに使用されているようなモレキュラーシーブも適している。この方法は、式IIの化合物（例えばＡ１４３７−Ｄ）のカルシウムイオンに結合する傾向に基礎をおくものである。上記した支持体を使用する場合、式IIの化合物のアンモニウムまたはナトリウム塩のカルシウム塩との混合物を水中に調製し、この混合物をそれ自体知られた方法で支持体上で分離する。あるいは、適切なジカルシウム塩の水溶液を適用することも可能である。例えば、Ａ１４３７−Ｄのナトリウム塩および塩化カルシウムの水溶液を例えばＤＩＡＩＯＮ(R) ＨＰ２０ＳＳのような吸着樹脂に適用し、適用された樹脂を水で洗浄して過剰な塩を除去し、次にリポペプチドのカルシウム塩を含水または無水の溶媒を用いて、好ましくはメタノールを用いて支持体から溶離させる。このようにして得られた生成物は例えばＣ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａの元素組成（式IIの化合物のモノカルシウム塩（３ｄ／iv））を有する。
【００３９】
式IIの化合物のカルシウム塩を得るためにはイオン交換剤、好ましくはアニオン交換剤を使用することも可能である。この方法においては、例えば、式IIの化合物の何れかの所望の低イオン性の水溶液をｐＨ５〜ｐＨ９のアニオン交換剤に結合させ、結合した支持体を水洗した後、水溶性のカルシウム塩の漸増濃度を用いて式IIの化合物のモノカルシウム塩を溶離する。モノカルシウム塩を含有するカラム溶出液を、例えば逆浸透により脱塩して乾燥する。あるいは、モノカルシウム塩は他の方法、例えば結晶化により単離できる。
【００４０】
式IIの化合物、本発明のカルシウム塩の前駆体は、好都合には、ＥＰ ０ ６２９ ６３６Ａ１号に記載の通り、Actinoplanes sp．好ましくはActinoplanes friulensis（ＤＳＭ７３５８）の発酵により調製するか、または、ＥＰ ０ ６８８ ７８９Ａ１（ＵＳ５,６２９,２８８）に記載の通り、天然には存在しない酸基による式IIの酸基Ｒ１の置き換えにより誘導できる。このようにして得られた式IIの化合物を上記した通り反応させることによりそのカルシウム塩が得られる。
【００４１】
式IIの化合物を好ましくは微生物により生産する、式IIの化合物、即ち本発明のカルシウム塩の酸前駆体の発酵による製造のための改良された方法を与えるという上記した目的は、Actinoplanes sp．好ましくはActinoplanes friulensis ＤＳＭ７３５８の発酵において、発酵溶液に錯体形成剤、好ましくはキレート形成剤１種以上、および、アミノ酸アスパラギンを添加する場合に達成される。
【００４２】
好ましくは、使用する錯体形成剤はクエン酸またはエチレンジアミン４酢酸塩（ＥＤＴＡ）である。
好都合には、ＥＤＴＡおよびクエン酸を発酵溶液に添加することも可能である。
【００４３】
Ｒ１が例えば式（３ａ）または好ましくは（３ｂ）の脂肪酸基である式IIの化合物の収量を上昇させるためには、発酵溶液に更にアミノ酸Ｌ−ロイシンを添加することができる。Ｒ１が例えば式（３ｃ）または好ましくは（３ｄ）の脂肪酸基である式IIの化合物の収量を上昇させるためには、発酵溶液に更にアミノ酸Ｌ−バリンを添加することができる。
【００４４】
従って、本発明はまた式IIの化合物のカルシウム塩の調製のための方法に関し、その特色は、第１の工程において、上記した式IIの化合物をActinoplanes sp.好ましくはActinoplanes friulensis（ＤＳＭ７３５８）の発酵により製造し、その際発酵溶液に複合体形成剤、好ましくはキレート形成剤１種以上およびアミノ酸アスパラギンを添加し、その後の工程において、上記したとおり式IIの化合物のカルシウム塩を沈殿、結晶化または支持体上の処理により得ることである。
本発明はまた、医薬として使用するための式IIの化合物のカルシウム塩に関する。
【００４５】
式IIの化合物のカルシウム塩は好ましくは細菌感染症に対抗する医薬の製造に特に適しており、上記したカルシウム塩（３ｃ）、特に（３ｄ）またはジカルシウム塩（３ｃ／iiａ）、（３ｃ／iiｂ）および（３ｃ／iiｃ）、特にジカルシウム塩（３ｄ／iiａ）、（３ｄ／iiｂ）または（３ｄ／iiｃ）が特に適しており、ジカルシウム塩（３ｄ／iiａ）が特に好ましい。式IIの化合物のモノカルシウム塩は細菌感染症に対する医薬の製造に特に適しており、実験式（３ｃ．３ｄ／iv）Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａを有するモノカルシウム塩（３ｃ）および、特に、（３ｄ）が好ましい。式IIの化合物の上記したカルシウム塩は好ましくはグラム陽性細菌、好ましくは、グリコペプチド耐性細菌による細菌感染症に対抗する医薬の製造に適している。
【００４６】
式IIの化合物のカルシウム塩少なくとも１つを含有する医薬は更に、慣用的な製薬用補助剤を含有することができる。
例えば式IIの化合物のジカルシウム塩、好ましくは塩化物３ｄ／iiａを等しい重量部のマンニトールを含有する水に溶解し、次に凍結乾燥して医薬を製造する。
【００４７】
式IIの化合物のカルシウム塩は、その溶解度および特性学的特徴の点において注射用溶液の形態で非経腸投与するために特に適している。従って、本発明はまた式IIの化合物のカルシウム塩１種以上、好ましくは（３ｄ／iv）実験式Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａを有するカルシウム塩、または、特に好ましくは、実験式Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｃｌ2を有するカルシウム塩３ｄ／iiａを含有する注射用溶液に関する。
注射用溶液の製造のためには、等しい重量部のマンニトールおよびカルシウム塩を含有する凍結乾燥物を適当に調製された水に溶解する。
【００４８】
【実施例】
以下の実施例において、式Ｉの化合物の酸型をＡ１４３７と称する。次の式は実施例において製造または使用したリポペプチドの一覧である。Ａ１４３７−Ａ、−Ｂおよび−Ｇと称した式Ｉの化合物はアンフォマイシン型（式ＩにおいてＲ１＝ＯＨ）のリポペプチドに属し、Ａ１４３７−Ｃ、−Ｄおよび−Ｈと称した化合物はアスパルギン型（式ＩにおいてＲ１＝ＮＨ2）のリポペプチドに属するか、式IIの化合物である。
【００４９】
【表４】
0004402833.tif 000011
【００５０】
ＥＰ ０ ６２９ ６３６号に記載の通り、Actinoplanes sp．特にActinoplanes Friulensis ＤＭＳ７３５８はアンフォマイシン型およびアスパラギン型の少なくとも８種の抗生物質活性を有する式Ｉの化合物を発酵により生成する。リポペプチドＡ１４３７−ＣおよびＡ１４３７−Ｄ（共に式IIの化合物）により例示されるとおり、これは、どの方法によりアスパラギン型のリポペプチドの収率を大幅に向上させることができるかを示すことを意図している。
【００５１】
Ａ１４３７−ＣおよびＡ１４３７−Ｄは環外アスパラギンを有する環状デカペプチドであり、Ｃペプチドの場合はＣ１３−脂肪酸で、Ｄ−ペプチドの場合はＣ１４−脂肪酸でアシル化される（上記式）。対応する脂肪酸の合成のスターターとなるアミノ酸バリンおよびロイシンを混合することにより、発酵をＣ−またはＤ−ペプチドの形成の方向に制御することができる。しかしながら、Ｃ−ペプチドと同時にいわゆるＡ−ペプチド（Ａ１４３７−Ａ）が、そして、Ｄ−ペプチドと同時に環外部位（アスパラギンではなくアスパラギン酸）のみがＣ−またはＤ−ペプチドと異なるＢ−ペプチド（Ａ１４３７−Ｂ）が形成する。原則として、これらのペプチドの力価はＣ−およびＤ−ペプチドの力価よりむしろ高値であり、最も好ましい場合においては、比は約１：１である。典型的には、浸透培養機内の収率はＤ−ペプチドが４０〜１５０mg／Ｌ、Ｂ−ペプチドが５０〜２５０mg／Ｌの範囲であった（実施例１）。３０Ｌと２００Ｌの鉄鋼製発酵器中では、典型的にはＢ−ペプチド８００〜１１００mg／Ｌ、Ｄ−ペプチド２０〜４０mg／Ｌを得ることができた（実施例２）。
【００５２】
発酵器中のＡ１４３７−Ｄの収率の低下の原因は一方では発酵器の研磨により培養液中に侵入する金属イオンの悪影響、および、アスパラギンの相対的欠乏をもたらすバイオマス生成の増大の可能性がある。これらの可能性をより詳細に調べるために、培養液にＥＤＴＡ（０.５mL）およびクエン酸（１０mM）をイオン捕獲剤として、そして、アスパラギン（０.５ｇ／Ｌ）を添加した。ここで、鉄鋼製の発酵器では、振とう器の培養収率を達成できたのみならず、意外にも、これを大きく上回り、Ｄ−ペプチド（Ａ１４３７−Ｄ）が主要成分となったことがわかった。例えば最大収率はＡ１４３７−Ｄが１.２ｇ／ｌ、Ａ１４３７−Ｂが２８０mg／Ｌであった（実施例２）。振とう培養においてはＡ１４３７−Ｄに優先的な選択性の変化と収率増大が観察された。振とう培養のＡ１４３７−Ｄの収率も、Ａ１４３７−Ｂの平均収率は同じままで、同様に１ｇ／Ｌまで上昇させることが可能であった（実施例１）。
【００５３】
実施例１
ＥＤＴＡおよびアスパラギンの添加による振とう培養のActinoplanes Friulensis ＤＭＳ７３５８によるＡ１４３７−Ｄの収率向上
下記組成：
【表５】
0004402833.tif 000012
の栄養溶液（ＮＬ１）１００mLの入った３００mL容の三角フラスコに液体窒素中−１９０℃で保存した菌糸体のアンプル（３mL充填容）を接種し、２４０rpm、２８℃で５日間振とうする。
【００５４】
下記の栄養溶液（ＮＬ２）５００mLの入った２Ｌ容の三角フラスコに上記フラスコから２５mLを接種する。
【表６】
0004402833.tif 000013
培養終了時の培養液のｐＨは７.０〜７.８となる。収率は典型的にはＡ１４３７−Ｄが２０〜１５５mg／Ｌ、Ａ１４３７−Ｂが６０〜２５０mg／Ｌである。
【００５５】
夫々の結果
【表７】
0004402833.tif 000014
０.５mMエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）および０.５ｇ／Ｌのアスパラギンを添加することにより、Ａ１４３７−Ｂの平均収率は同様のままで、Ａ１４３７−Ｄの収率を約１ｇ／Ｌに高めることができた。
【００５６】
夫々の結果
【表８】
0004402833.tif 000015
【００５７】
実施例２
ＥＤＴＡおよびアスパラギンの添加による２００Ｌ容発酵器中のActinoplanes Friulensis ＤＭＳ７３５８の発酵によるＡ１４３７−Ｄの収率向上
栄養溶液１が１００mL入った３００mL容の三角フラスコに−１９０℃で保存したアンプルの内容物を接種し、２４０rpm、２８℃で５日間振とうする。
このフラスコから２０mLを同じ栄養溶液５００mLの入った２Ｌ容の三角フラスコに植え継ぎ、これを同様に２８℃１２０rpmで５日間培養する。
これらのフラスコ８本の内容物を栄養溶液２が３０Ｌ入った４０Ｌ容の発酵器に植え継ぎ、０.８ｍ／secの攪拌速度で運転する。
培養終了時の培養液のｐＨは７.０〜７.８となる。
収率は典型的にはＡ１４３７−Ｄが２０〜４０mg／Ｌ、Ａ１４３７−Ｂが８００〜１０００mｇ／Ｌである。
【００５８】
夫々の結果
【表９】
0004402833.tif 000016
０.５mM ＥＤＴＡおよび０.５ｇ／Ｌのアスパラギンを添加することにより、Ａ１４３７−Ｂの濃度はかなり低下させながら、Ａ１４３７−Ｄの収率を１.２ｇ／Ｌまで高めることができた。
【００５９】
夫々の結果
【表１０】
0004402833.tif 000017
【００６０】
実施例３
振とう培養におけるActinoplanes Friulensis ＤＭＳ７３５８の発酵によるＡ１４３７−Ｄの収率
栄養溶液１が１００mL入った３００mL容の三角フラスコに−１９０℃で保存したアンプルの内容物を接種し、２４０rpm、２８℃で５日間振とうする。
このフラスコから２５mLを以下の栄養溶液（３Ｌ）５００mLの入った２Ｌ容の三角フラスコに接種する。
【００６１】
【表１１】
0004402833.tif 000018
培養終了時の培養液のｐＨは７.０〜７.８となる。収率は典型的には以下の通りである。
【００６２】
【表１２】
0004402833.tif 000019
【００６３】
実施例４
表２は４０℃で保存した後のＡ１４３７Ｄナトリウム塩とカルシウム混合塩Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｉ2の安定性を比較したものである。
【表１３】
0004402833.tif 000020
【００６４】
実施例５
Ａ１４３７ＤＣａ塩の抗細菌活性を表３に示す。化合物の数値は耐性および多剤耐性の病原体に対する活性に基づいたものであり、作用スペクトルは以下に記載する良好な受容性と組み合わさって抗生物質の薬学的価値を高めるものである。
【００６５】
【表１４】
0004402833.tif 000021
【００６６】
実施例６
Ａ１４３７−Ｄジカルシウムヨウ化物塩（Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｉ2）の製造
エタノール３mL中に溶解した０.８ｇのＣａＩ2×４Ｈ2Ｏを無水エタノール２７mL中のＡ１４３７Ｄナトリウム塩１.３５ｇの溶液にゆっくり添加する。白色の綿毛状の沈殿がここで徐々に付着し、これを３０分後に遠心分離により回収し、冷エタノール各々１０mLで３回洗浄し、次に真空下に乾燥する。Ａ１４３７Ｄジカルシウムのヨウ化物塩１.４ｇが得られる。ＨＰＬＣで測定したＡ１４３７Ｄ ７９％に加えて分析結果は５％Ｃａ、１５.４％ヨウ素、および＜０.２％ナトリウムを示し、Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｉ2の組成と合致する。
【００６７】
実施例７
Ａ１４３７Ｄカルシウム臭化物塩の製造
Ａ１４３７Ｄナトリウム塩１８ｇを無水エタノール３６０mL中に溶解し、無水エタノールに溶解したＣａＢｒ2 ７ｇで室温で処理する。白色の綿毛状の沈殿がここで徐々に付着し、これを１５分間８００００ｇで遠心分離して回収する。無水エタノール各々１８０mLで２回洗浄し、次に真空下に乾燥し、得られるＡ１４３７Ｄカルシウムの臭化物塩１８.８ｇは分析の結果、８０％Ａ１４３７Ｄ（ＨＰＣＬ、遊離の酸）、６％カルシウム、１５％臭素、および、＜０.１％ナトリウムである。
【００６８】
実施例８
固相抽出法によるＡ１４３７Ｄ−モノカルシウム塩の製造
実施例７に従って製造したＡ１４３７Ｄカルシウムの臭化物塩１.１ｇを水に溶解し、ＭＣＩゲルＣＨＰ２０Ｐ、７５〜１５０μを充填した１６mL容の製造済みキャピラリーカラムに適用する。溶離は水中１０％メタノール（溶液Ａ）から９０％メタノール＋１０％ブタ(溶液Ｂ)の勾配溶離により、可能な限り急速に行う。まず不純物をカラムから洗い出し、次にＡ１４３７Ｄのモノカルシウム塩を純粋な溶液Ｂで溶離する。真空下に濃縮し、得られる０.８ｇのＡ１４３７Ｄモノカルシウム塩の組成は９６％Ａ１４３７Ｄ（ＨＰＣＬ）および３％カルシウムでありＣ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａの組成と合致する。
【００６９】
実施例９
Ａ１４３７Ｄカルシウムの臭化物塩の再沈殿
実施例７に従って製造したＡ１４３７Ｄカルシウムの臭化物塩１ｇを水１００mLに溶解し、メタノール−ブタノール（９：１）の混合物３６mLで処理する。最初は透明であった溶液が徐々に白濁するが、これを１２時間放置して完了させる。得られた沈殿を遠心分離により回収し、４０％の冷メタノール水溶液５０mLで洗浄し、真空下に乾燥する。モノカルシウム塩Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ ７２０mgが得られ、組成は３.１％カルシウム、＜１％臭素、および９５％Ａ１４３７Ｄモノカルシウム塩である。
【００７０】
実施例１０
メタノール沈殿によるＡ１４３７Ｄモノカルシウム塩Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａの製造
Ａ１４３７Ｄナトリウム塩１ｇを水３０mLに溶解し、水１０mL中のＣａＣｌ2 ２００mgの溶液で処理する。９０％メタノールと１０％ブタノールの混合物１４mlを透明な水溶液に添加し、１時間後、混合物を４℃で遠心分離する。沈殿を水性メタノール（４０％）各々３０mLで２回洗浄して得られるＡ１４３７Ｄモノカルシウム塩８１０mgの組成は、遊離の酸として計算すると、３.２％カルシウム、＜１％塩化物、および、９４.５％Ａ１４３７Ｄモノカルシウム塩である。
【００７１】
実施例１１
in vitroの溶血の測定
溶血作用を測定するために、新しく採取したヒト、アカゲザルおよびビーグルの静脈血を用いる。血液はヘパリン処理した試験管に採取し、２００μｌづつ１２本のポリエチレン試験管に分注する。１本を水２００μｌで処理し、１００％標準物質とし、もう１本を生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）２００μｌと混合する。生理食塩水中１６０、８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２.５、６.２５および３.１２５mg／ｌに希釈した溶液各々２００μｌを別の試験管に分注する。全ての試験管を慎重に揺らし、次に３時間３７℃でインキュベートする。次に１００％標準物質を蒸留水５mLで製造し、他の試験管は各々５mLの生理食塩水で製造し、７００ｇで５分間遠心分離する。
【００７２】
溶血は波長５４０nmにおいて分光光度計で上澄みの吸光度を測定することにより求める。完全な溶血を示す標準物質の吸光度を１００％とする。被験調製希釈液の吸光度および０％標準物質値を測定し、最大誘発溶血のパーセントとして表示する。表４はサル血液を用いて行ったＡ１４３７−Ｂ、Ａ１４３７−ＧをＡ１４３７−ＤＣａ塩と比較した溶血実験の結果を示す。
表４は抗生物質の濃度の関数としてのサル血液のin vitro溶血を例示する。
【００７３】
【表１５】
0004402833.tif 000022
【００７４】
実施例１２
ナトリウム塩からのＡ１４３７Ｄジカルシウム２塩化物塩の製造
Ａ１４３７Ｄナトリウム塩１５ｇを無水エタノール４００mLに完全に溶解し、無水エタノール１００mLに溶解したＣａＣｌ2（乾燥）２.５２（  ）で３０分間処理し、その間、ゆっくり攪拌し、次に２時間０℃で放置する。沈殿を遠心分離により除去し、エタノール２００mLで洗浄し、遠心分離により再度除去し、高真空下に乾燥する。収率は１６.５％である。最終生成物は遊離の酸として計算して、Ａ１４３７Ｄリポペプチド８０.５％、水４.５％、カルシウム５.１％、塩化物７.５％、および、ナトリウム２.１％を含有し、実験式Ｃ59Ｈ92Ｎ14Ｏ19Ｃａ2Ｃｌ2と合致し、不純物は約４.６％のＮａＣｌである。
【００７５】
実施例１３
ナトリウム塩からのＡ１４３７Ｄジカルシウム二塩化物の結晶化
純度９１.９％のＡ１４３７Ｄナトリウム塩２.５ｇを水１００mLに溶解し、ＣａＣｌ2（例えばAldrich Cat．No．38，314-8）１０ｇで処理する。この間白濁が起これば濾過または遠心分離により除去する。次に２時間掛けてエタノール３５mLを添加することにより結晶化を徐々に誘発し、結晶の形成は有機溶媒含有量１５％の時点で徐々に開始する。結晶化を加速するためには、溶媒含有量２０％の時点でバッチに結晶種を添加する。溶媒の添加が完了した後、結晶懸濁液を室温で２４時間放置し、時々攪拌して結晶の形成を加速する。結晶化を完了するためにバッチを＋１℃に一夜冷却し、次に吸引濾過する。針状結晶の緻密な羽毛状物よりなる結晶物を水中２５％エタノールの冷却混合物５mlで洗浄し、その後乾燥する。８１％の収率に相当するＡ１４３７Ｄジカルシウム二塩化物塩２２ｇが９７.９％純度で得られる。母液（有機固形分５ｇ、純度約６３％）を冷却しながら放置し、数日間で更にＡ１４３７Ｄのジカルシウム二塩化物塩が晶出する。
【００７６】
実施例１４
Ａ１４３７Ｄジカルシウム二塩化物の注射用溶液の製造
Ａ１４３７Ｄジカルシウム二塩化物１００mgおよび非発熱性マンニトール１００mgを滅菌水２mLに溶解し、凍結乾燥する。粉末状の凍結乾燥物全てを注射用水２mLに溶解し、滅菌アンプルに充填し、アンプルをセプタムで密封する。