(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）バイオ人工臓器用モジュールと、
（Ｂ）動物細胞と、
を備えてなり、該（Ａ）バイオ人工臓器用モジュールが（ｃ）細胞固定基材を備え、該動物細胞（Ｂ）が、該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内の（ｃ）細胞固定基材に固定化されたものであり、かつ該動物細胞（Ｂ）が、該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内に固定化された動物由来の可逆性不死化細胞を該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内で増殖させ、その後、該細胞から可逆性不死化遺伝子を該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内で切り出して生じた細胞である、バイオ人工臓器。
【請求項２】
該可逆性不死化細胞が可逆性不死化ヒト細胞である、請求項１記載のバイオ人工臓器。
【請求項３】
該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）が、
（ａ）体液導入口、体液導出口および少なくとも１つの細胞導入口を有するチャンバーと、
（ｂ）半透性を有する分離膜と、
（ｃ）細胞固定基材と、
を少なくとも備えてなり、かつ、
（１）該分離膜（ｂ）および該細胞固定基材（ｃ）が該チャンバー（ａ）内に収容され、
（２）該分離膜（ｂ）が、該チャンバー（ａ）内に空間（Ｉ）および（II）が形成されるように配置され、
（３）該空間（Ｉ）が、該体液導入口および該体液導出口と連通し、かつ該体液導入口から導入される体液が該体液導出口から導出されるような体液の流路を形成し、
（４）該空間（II）が、該細胞導入口と連通し、かつ該細胞固定基材（ｃ）を収容する、
構造を有する、請求項１または２記載のバイオ人工臓器。
【請求項４】
該分離膜（ｂ）が中空糸膜であり、該中空糸膜の内部に該空間（Ｉ）が形成され、かつ、該中空糸膜の外部に該空間（II）が形成されている、請求項３記載のバイオ人工臓器。
【請求項５】
該細胞固定基材（ｃ）が、少なくとも表面部がポリアミノ酸ウレタンで構成される繊維を含む、請求項１〜４いずれか記載のバイオ人工臓器。
【請求項６】
（ａ）体液導入口、体液導出口および少なくとも１つの細胞導入口を有するチャンバーと、
（ｂ）半透性を有する分離膜と、
（ｃ）細胞固定基材と、
を少なくとも備えてなり、かつ、
（１）該分離膜（ｂ）および該細胞固定基材（ｃ）が該チャンバー（ａ）内に収容され、
（２）該分離膜（ｂ）が、該チャンバー（ａ）内に空間（Ｉ）および（II）が形成されるように配置され、
（３）該空間（Ｉ）が、該体液導入口および該体液導出口と連通し、かつ該体液導入口から導入される体液が該体液導出口から導出されるような体液の流路を形成し、
（４）該空間（II）が、該細胞導入口と連通し、かつ該細胞固定基材（ｃ）を収容する、
構造を有するバイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内に、動物由来の可逆性不死化細胞を該細胞導入口から導入して該細胞固定基材（ｃ）に固定化し、増殖させ、ついで、該可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子を該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内で切り出すことを特徴とする、バイオ人工臓器の製造方法。
【請求項７】
該分離膜（ｂ）が中空糸膜であり、該中空糸膜の内部に該空間（Ｉ）が形成され、かつ、該中空糸膜の外部に該空間（II）が形成されている、請求項６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞が充填されたバイオ人工臓器およびバイオ人工臓器の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人工材料と生きている細胞とを組み合わせ、それらの長所を活かしたバイオ人工臓器が研究されている。例えば、肝細胞と人工材料とを組み合わせたバイオ人工肝臓（例えば、非特許文献１参照）、膵細胞と人工材料とを組み合わせたバイオ人工膵臓（例えば、特許文献２参照）、腎細胞と人工材料とを組み合わせたバイオ人工腎臓（例えば、非特許文献２参照）などが知られている。
【０００３】
例えば、肝不全の治療においては、血漿分離器を用いる血漿交換法や、血漿分離器とビリルビン吸着器を用いる血漿吸着法などが行われてきた。しかしながら、血漿分離膜や吸着材のような人工材料だけを用いた従来の血液浄化法では患者の救命率は低く、バイオ人工肝臓に対する期待が集まっている。
【０００４】
バイオ人工臓器は、細胞がバイオ人工臓器用モジュールに充填されて使用されるが、従来、充填される細胞は、モジュール外で増殖させた後、その細胞を回収してモジュールに充填し、バイオ人工臓器として使用されるのが一般的であった。
【０００５】
バイオ人工臓器に充填される細胞として、従来種々の細胞が検討されてきた。例えば、バイオ人工肝臓の場合、初代ブタ肝細胞（例えば、非特許文献１参照）、肝癌由来のヒト肝細胞（例えば、非特許文献３、特許文献１参照）、可逆性不死化ヒト肝細胞（例えば、非特許文献４参照）、可逆性不死化ヒト肝細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出して生じた細胞（例えば、特許文献３参照）などが知られている。
【０００６】
初代ブタ肝細胞の場合、ブタの新鮮な肝臓を摘出した後、コラゲナーゼやトリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いて細胞に分離し、モジュールに充填される。
【０００７】
また、肝癌由来のヒト肝細胞、可逆性不死化ヒト肝細胞、可逆性不死化ヒト肝細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出して生じた細胞の場合も、上記と同様に、タンパク質分解酵素を用いて細胞を培養皿から剥離させ、回収された細胞がモジュールに充填される。ここで、可逆性不死化ヒト肝細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出して生じた細胞では、培地を入れた培養皿等に可逆性不死化ヒト肝細胞を播種し、インキュベーター等の中で培養して増殖させた後、可逆性不死化遺伝子を切り出し、次いで剥離・モジュール内充填が行われる。なお、肝癌由来のヒト肝細胞の場合には、モジュール中に充填後、インキュベートしたものを人工肝臓として使用する試みがなされている。
【特許文献１】特表平５−５０８３１２号公報
【特許文献２】特開平７−２４６２１１号公報
【特許文献３】特許第３４５４８１８号公報
【非特許文献１】デメトリオウ（Ａ．Ａ．Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ）ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、第２３９巻、第６６０頁〜第６７０頁（２００４年）
【非特許文献２】ヒュームズ（Ｈ．Ｄ．Ｈｕｍｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１７巻，第４５１頁〜第４５５頁（１９９９年）
【非特許文献３】サスマン（Ｎ．Ｌ．Ｓｕｓｓｍａｎ）ら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ、第１８巻、第３９０頁〜第３９６頁（１９９４年）
【非特許文献４】コバヤシ（Ｎ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら、Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、第６巻、第２３６頁〜第２４４頁（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、一般的に採用されているバイオ人工臓器の製造方法では、タンパク質分解酵素を用いた細胞回収時に一部の細胞の死滅を避けることができないため、モジュール内に充填された細胞の生存率を高くすることができない。このことは、得られたバイオ人工臓器の機能を高める上で障害となる。一方、肝癌由来の肝細胞をモジュール中でインキュベートして製造されたバイオ人工肝臓では、モジュール内の細胞の生存率が高まるものの、不死化細胞が充填されたバイオ人工臓器は安全性に対する懸念を払拭することができない。
本発明は、１つの側面では、バイオ人工臓器として使用する際に、高い細胞生存率を示すこと、バイオ人工臓器として使用する際に、細胞の機能を高度に維持していること、バイオ人工臓器としての機能を十分に発揮すること等の少なくとも１つを解決し、かつ安全性の高いバイオ人工臓器を提供することにある。また、本発明は、他の側面では、製造時における細胞の損失を実質的に伴わないこと、製造時における細胞の機能の低下を実質的に伴わないこと、容易に製造できること、バイオ人工臓器中において、機能するに十分な細胞を維持すること、製造に要する時間を実質的に短縮できること等の少なくとも１つを解決する、安全性の高いバイオ人工臓器の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
[１]  （Ａ）バイオ人工臓器用モジュールと、
（Ｂ）動物細胞と、
を備えてなり、該（Ａ）バイオ人工臓器用モジュールが（ｃ）細胞固定基材を備え、該動物細胞（Ｂ）が、該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内の（ｃ）細胞固定基材に固定化されたものであり、かつ該動物細胞（Ｂ）が、該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内に固定化された動物由来の可逆性不死化細胞を該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内で増殖させ、その後、該細胞から可逆性不死化遺伝子を該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内で切り出して生じた細胞である、バイオ人工臓器、及び
[２]  （ａ）体液導入口、体液導出口および少なくとも１つの細胞導入口を有するチャンバーと、
（ｂ）半透性を有する分離膜と、
（ｃ）細胞固定基材と、
を少なくとも備えてなり、かつ、
（１）該分離膜（ｂ）および該細胞固定基材（ｃ）が該チャンバー（ａ）内に収容され、
（２）該分離膜（ｂ）が、該チャンバー（ａ）内に空間（Ｉ）および（II）が形成されるように配置され、
（３）該空間（Ｉ）が、該体液導入口および該体液導出口と連通し、かつ該体液導入口から導入される体液が該体液導出口から導出されるような体液の流路を形成し、
（４）該空間（II）が、該細胞導入口と連通し、かつ該細胞固定基材（ｃ）を収容する、
構造を有するバイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内に、動物由来の可逆性不死化細胞を該細胞導入口から導入して該細胞固定基材（ｃ）に固定化し、増殖させ、ついで、該可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子を該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内で切り出すことを特徴とする、バイオ人工臓器の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のバイオ人工臓器によれば、バイオ人工臓器として使用する際に、高い細胞生存率を示し、細胞の機能を高度に維持するため、治療等の用途において、細胞の機能を十分に効率よく発揮させることができ、バイオ人工臓器としての機能を十分に発揮し、かつ安全性が高いという優れた効果を奏する。また、本発明のバイオ人工臓器の製造方法によれば、製造時における細胞の損失、細胞の機能の低下等を実質的に伴わず、バイオ人工臓器中において、機能を発揮するに十分な細胞数を保持することができ、容易に、かつ製造に要する時間を実質的に短縮して、前記バイオ人工臓器を製造することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、１つの側面では、（Ａ）バイオ人工臓器用モジュールと、（Ｂ）動物細胞とを備え、該動物細胞（Ｂ）が、該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内に固定化されたものであり、かつ該動物細胞（Ｂ）が、該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内に固定化された動物由来の可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子を該バイオ人工臓器用モジュール（Ａ）内で切り出して生じた細胞である、バイオ人工臓器に関する。
【００１２】
本発明のバイオ人工臓器は、バイオ人工臓器用モジュール内に固定化された動物細胞であって、かつ該バイオ人工臓器用モジュール内に固定化された動物由来の可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出して生じた細胞が用いられていることに１つの大きな特徴がある。
【００１３】
したがって、本発明のバイオ人工臓器によれば、製造時において、バイオ人工臓器用モジュール内で細胞を十分に増殖させることができるため、人工臓器として使用するに十分な細胞数を維持することができる。
【００１４】
また、本発明のバイオ人工臓器によれば、前記動物細胞が用いられているため、バイオ人工臓器用モジュール内で可逆性不死化細胞を十分に増殖させた後、可逆性不死化遺伝子を切り出すことにより製造されうる。したがって、本発明のバイオ人工臓器によれば、増殖した細胞を人工臓器に用いるための容器に充填する操作を使用直前に行なう必要がないという優れた効果を発揮する。さらには、本発明のバイオ人工臓器によれば、動物細胞の増殖完了後、トリプシン、コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素による該細胞の処理を実質的に行なう必要がないという優れた効果を発揮する。したがって、本発明のバイオ人工臓器は、治療等の用途において、利便性が高く、かつ人工臓器として使用するに十分な量の細胞を保持できる。
【００１５】
また、本発明のバイオ人工臓器は、製造時において、動物細胞の増殖完了後、トリプシン、コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素による該細胞の処理を実質的に行なう必要がないため、細胞の損失を実質的に生じないという優れた効果を発揮する。そのため、本発明のバイオ人工臓器によれば、治療等の用途において、人工臓器として使用するに適した細胞の機能を十分に発揮させることができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
すなわち、本発明のバイオ人工臓器においては、前記動物細胞は、好ましくは、該バイオ人工臓器用モジュール内で増殖した可逆性不死化細胞を含むことが望ましい。
【００１７】
本発明は、可逆性不死化細胞をバイオ人工臓器用モジュールに充填した後、該モジュール内で該可逆性不死化細胞を増殖させる操作および増殖した該可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出す操作を行い、それにより得られる「可逆性不死化遺伝子が切り出された細胞」を保持したモジュールを用いるバイオ人工臓器が、バイオ人工臓器として使用する時の細胞の生存率と機能が高く維持されているという本発明者の知見に基づく。
【００１８】
本発明でいう「バイオ人工臓器」とは、例えば、血液や血漿中の有害物質を代謝、解毒するもの、アルブミン、血液凝固因子等を産生、供給するもの、インスリン等の生理活性物質を産生、供給するもの等であればよく、バイオ人工肝臓、バイオ人工腎臓、バイオ人工膵臓、バイオ人工免疫系、バイオ人工内分泌システム等が挙げられる。
【００１９】
本発明でいう「可逆性不死化細胞」とは、不死化を引き起こしうる因子をコードする核酸（以下、「可逆性不死化遺伝子」ともいう）を、人為的に除去可能に保持または該核酸の発現産物による機能を欠損可能に保持する細胞をいう。より具体的には、前記「可逆性不死化細胞」は、例えば、遺伝子工学技術を利用し正常細胞に一時的に前記可逆性不死化遺伝子を導入することにより増殖が可能な細胞を構築し、その後、組み込まれた可逆性不死化遺伝子を特異的に切り出すことで正常細胞に戻すことが可能な細胞をいう。
【００２０】
本明細書において、前記「可逆性不死化遺伝子」とは、細胞の分裂、増殖を促進する作用を示す遺伝子をいう。前記可逆性不死化遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、シミアンウイルス４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子（ＳＶ４０Ｔａｇ）、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）などを使用することができる。なかでも、前記ｈＴＥＲＴは、ヒトの血液、皮膚、腸管粘膜、子宮粘膜等のヒトの一生において再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞において通常に発現している遺伝子であり、好適に用いられる。
【００２１】
前記可逆性不死化細胞は、バイオ人工臓器をヒトに対して用いる場合には、可逆性不死化ヒト細胞が好ましい。
【００２２】
前記可逆性不死化細胞は、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応を利用した技術により作製することができる。かかる技術により作製された可逆性不死化細胞としては、可逆性不死化ヒト細胞等が挙げられる。前記可逆性不死化ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、可逆性不死化ヒト肝細胞〔例えば、コバヤシ（Ｎ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８７巻、第１２５８頁〜第１２６２頁（２０００年）および特許第３４５４８１８号公報（特許文献３）に記載されたヒト不死化肝細胞株ＴＴＮＴ−１細胞（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４９８）〕、可逆性不死化ヒト肝臓星細胞〔例えば、ワタナベ（Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第７５巻、第１８７３頁〜第１８８０頁（２００３年）参照〕、可逆性不死化ヒト間葉系骨髄細胞〔例えば、特開２００３−１７４８７０号公報；芝良昭ら、化学工学論文集、第２７巻、第１３４頁〜第１３６頁参照〕等が挙げられる。また、本発明においては、バイオ人工臓器の使用目的等に応じて、適宜、前記Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応を利用した技術等により、適切な細胞を可逆的に不死化させ、得られた細胞を用いてもよい。
【００２３】
前記バイオ人工臓器用モジュールは、可逆性不死化細胞を充填した後、モジュール内で該細胞を増殖させ、さらにその後、該細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出す操作を行なうことができるものであればよく、
（ａ）体液導入口、体液導出口および少なくとも１つの細胞導入口を有するチャンバーと、
（ｂ）半透性を有する分離膜と、
（ｃ）細胞固定基材と、
を少なくとも備えたものであることが好ましい。
【００２４】
本発明でいう「体液」とは、バイオ人工臓器を適用される個体、例えば、治療される患者（患畜）の血液、血漿、血清を含む液体であり、血液を血漿分離器に供して得られる血漿であってもよい。
【００２５】
前記「体液導入口」、「体液導出口」、および「細胞導入口」の形状としては、特に制限はないが、好ましくは、例えば、栓、三方活栓等により封をされうる形状を有する。
【００２６】
前記「チャンバー」は、既存の高分子材料から作製されうるが、内部の細胞や体液の通過状況の観察を容易にする観点から、内部が観察可能な程度の透明性を有するのが好ましい。前記高分子材料としては、例えば、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。チャンバー（ａ）は、分離膜（ｂ）および細胞固定基材（ｃ）を収容することが好ましい。
【００２７】
本発明でいう「半透性を有する分離膜」とは、前記バイオ人工臓器用モジュール内の細胞を、通過させることがなく、一方で、バイオ人工臓器として必要な物質の透過性を有する「半透性」を示す膜であればよい。
【００２８】
前記分離膜は、バイオ人工臓器が、例えば、バイオ人工肝臓の場合、被代謝物質であるアンモニア等を透過させる性質等を有する分離膜であればよく、バイオ人工膵臓の場合、細胞から分泌されるインスリン等を透過させる性質等を有する分離膜であればよい。
【００２９】
前記分離膜の材料は、細胞の維持および機能の発現に適したものであればよく、例えば、再生セルロース、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体等が好適に使用できる。
【００３０】
前記分離膜は、ポリビリルピロリドン、ポリエチレングリコール等の親水性を付与する添加剤が添加されていてもよい。
【００３１】
また、前記分離膜の膜孔径は、バイオ人工臓器として必要な物質は分離膜を通過しうるが、細胞は分離膜を通過しない孔径であればよく、バイオ人工臓器の目的に応じて選択されるが、分離膜を介して患者（患畜）の血液、血漿等と細胞との間の物質交換を適切に行なう観点から、好ましくは、１ｎｍ以上、より好ましくは、５ｎｍ以上であり、分離膜を介する細胞の漏れを抑制する観点から、好ましくは、１μｍ以下、より好ましくは、４００ｎｍ以下である。
【００３２】
本発明において、前記分離膜の形態には特に制限はなく、平膜、中空糸膜等が使用できる。細胞の充填密度を高め、かつ小型のバイオ人工臓器を作製できる観点から、中空糸膜型の分離膜がより好ましい。
【００３３】
前記中空糸膜の膜厚は、特に限定されないが、中空糸膜の耐圧性能を十分に得る観点から、好ましくは、５μｍ以上、より好ましくは、１０μｍ以上であり、細胞の充填密度を高める観点から、好ましくは、３００μｍ以下、より好ましくは、１００μｍ以下である。
【００３４】
また、前記中空糸膜の内径は、特に限定されないが、中空糸膜内における体液等の流体の通過性の観点から、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上であり、中空糸膜内外への物質の透過及び拡散の観点から、好ましくは５００μｍ以下であり、より好ましくは２００μｍ以下である。
【００３５】
分離膜（ｂ）が体液導入口と体液導出口とを前記チャンバー（ａ）の内部において連結させるように配置されることにより、該チャンバー（ａ）内に空間（Ｉ）および（II）が形成されうる。かかる場合、空間（Ｉ）は、体液導入口から導入される体液が体液導出口から導出されるような体液の流路を形成し、空間（II）は、細胞導入口と連通し、かつ細胞固定基材（ｃ）を収容しうる。体液を偏流なく通過させ、空間（Ｉ）と（II）の間における物質交換の効率を良好にするという観点から、分離膜（ｂ）が中空糸膜である場合、該中空糸膜の内部に該空間（Ｉ）が形成され、かつ、該中空糸膜の外部に該空間（II）が形成されることが好ましい。
【００３６】
前記細胞固定基材（ｃ）は、空間（II）（例えば、中空糸膜外空間）に挿入することができ、表面に可逆性不死化細胞が接着して機能を果たすことができる細胞固定基材であればよく、細胞を高密度に培養できる観点から、繊維からなる細胞固定基材がより好ましい。前記細胞固定基材には、例えば、不織布や綿状の繊維集合体等が好適に使用できる。
【００３７】
なお、本発明の一態様において、前記「空間（II）」とは、前記チャンバー（ａ）内における中空糸膜の外側の空間でありうる。
【００３８】
細胞固定基材の材料としては、動物細胞、例えば、ヒト細胞が接着し、該細胞の増殖に適したものであればよく、例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリメチルメタクリレート、エチレン−ビニルアルコール共重合体等が挙げられる。
【００３９】
本発明で使用する細胞固定基材としては、少なくとも表面部がポリアミノ酸ウレタンで構成される繊維を含む細胞固定基材が、細胞との接着性の観点から、より好ましい。
【００４０】
本発明でいうポリアミノ酸ウレタンとは、ポリアミノ酸セグメントとポリウレタンセグメントとを有する共重合体をいい、より具体的には、アミノ酸ユニットが平均４個以上連続して結合されたポリアミノ酸とウレタンとの共重合体をいう（例えば、芝良昭ら、化学工学論文集、第２７巻、第１３４頁〜第１３６頁；特開２００１−１３６９６０号公報等を参照）。
【００４１】
なお、前記バイオ人工臓器用モジュールは、主として人体に使用されるものであるため、該モジュールの材料は、安全性（例えば、低溶出物、耐滅菌性等）、体液適合性、特に、体液、例えば、血液、血漿等と接触する部分における適合性等に優れたものであることが好ましい。
【００４２】
本発明のバイオ人工臓器は、製造の際、バイオ人工臓器用モジュール内で可逆性不死化細胞の増殖と、可逆性不死化遺伝子の切り出しとを行なうことができるため、大量の細胞を充填する必要があるバイオ人工肝臓に特に好適である。すなわち、細胞として可逆性不死化肝細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出して生じたヒト細胞を有する本発明のバイオ人工臓器、すなわち、バイオ人工肝臓は、生存率と機能が高く維持された前記ヒト細胞が大量に充填されたバイオ人工肝臓として得られ、肝不全の治療に好適である。
【００４３】
本発明のバイオ人工臓器は、体内に埋め込む体内用バイオ人工臓器として、あるいは体外に装着する体外用バイオ人工臓器として使用されうる。
【００４４】
なお、本発明によれば、前記バイオ人工臓器用モジュール内に、動物由来の可逆性不死化細胞を細胞導入口から導入して細胞固定基材に固定化し、増殖させ、ついで、該可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子を前記バイオ人工臓器用モジュール内で切り出すことを特徴とする、バイオ人工臓器の製造方法も提供される。
【００４５】
従来の多くの製造方法では、バイオ人工臓器を治療に使用する直前に、培養された細胞に対し前記タンパク質分解酵素を作用させて細胞と培養皿との間の接着や細胞同士の接着を切断するという操作と、それに引続く、取得された細胞をバイオ人工臓器用モジュール内に充填するという操作が必要である。一方、本発明の製造方法では、バイオ人工臓器を治療に使用する直前での切断操作および充填操作を、いずれも必要としないという優れた効果が奏される。また、本発明の製造方法によれば、増殖完了後の細胞に対する切断操作および充填操作がないため、切断操作および充填操作に伴う細胞の生存率および該細胞の機能低下等の、バイオ人工臓器中に維持される細胞に対する悪影響を解消または低減させることができるという優れた効果も発揮される。したがって、本発明の製造方法により得られたバイオ人工臓器によれば、治療等の用途において、人工臓器として使用される際にも、人工臓器として使用するに十分な高い生存率で細胞が維持され、人工臓器として使用するに適した高い細胞の機能を発現するという優れた効果が発揮される。
【００４６】
本発明の製造方法において、バイオ人工臓器用モジュールへの可逆性不死化細胞の導入は、例えば、前記細胞導入口から該可逆性不死化細胞を導入することにより行なわれうる。ここで、導入に際しては、前記可逆性不死化細胞は、バイオ人工臓器用モジュール内に均等に存在させる観点から、細胞同士が解離された状態で、培地等に懸濁されていることが望ましい。なお、細胞が導入されるバイオ人工臓器用モジュールとしては、通常、滅菌処理が施されたものが使用される。
【００４７】
前記可逆性不死化細胞を、バイオ人工臓器用モジュールに導入した後、前記細胞導入口は、栓、三方活栓等で封をすればよい。
【００４８】
前記バイオ人工臓器用モジュール内に導入された可逆性不死化細胞を、細胞の種類、細胞固定基材の種類等に応じた適切な固定化条件に付することにより、前記可逆性不死化細胞の細胞固定基材への固定化（または接着）を行うことができ、さらに、固定化された可逆性不死化細胞を、細胞の種類等に応じた適切な培養条件下に維持することにより、前記可逆性不死化細胞の増殖が行なわれうる。高い細胞機能を発現させる観点から、好ましくは、バイオ人工臓器用モジュール内において、可逆性不死化細胞が、数個〜数百個程度の細胞塊を形成した状態となるように増殖させることが望ましい。
【００４９】
前記固定化条件は、特に限定されないが、例えば、バイオ人工臓器用モジュールに細胞を充填した後、該モジュールを振盪しながら固定する方法、静置しながら固定する方法、これらを併用した方法などを採用することができる。なかでも、モジュール内に細胞を均一に充填した後、静置下に固定する方法が好ましい。固定に際しての温度、時間などの条件は特に限定されず、用いた細胞の特性などを考慮して適宜選択することができる。必ずしも限定されるものではないが、一般的に、温度は３７℃近傍が好ましく、時間は１０分間から１２時間が好ましい。また、必要に応じて、炭酸ガスを含む空気や栄養分を系内に供給してもよい。
【００５０】
前記培養条件は、特に限定されないが、可逆性不死化ヒト細胞の場合、例えば、３７℃で、５容積％の炭酸ガスを含む空気中、培養する際に必要な栄養分を含む培地で行なうこと等が挙げられる。
【００５１】
可逆性不死化細胞からの可逆性不死化遺伝子の切り出しは、例えば、前記Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応を用いる技術等により行なわれうる。また、かかる可逆性不死化細胞からの可逆性不死化遺伝子の切り出しは、例えば、一対のＬｏｘＰ配列の間に、可逆性不死化遺伝子とともに、マーカーとなるタンパク質をコードする核酸、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸を挿入した系を用いることにより、マーカーとなるタンパク質が発現しないことを指標として確認されうる。
【００５２】
また、本発明のバイオ人工臓器の評価は、例えば、バイオ人工肝臓の場合、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では培地をバイオ人工肝臓に循環させ、あるいは、動物実験や臨床試験では動物または患者の血液や血漿をバイオ人工肝臓に循環させ、これらの循環中において、アンモニアの代謝、尿素の合成、リドカインの代謝、アルブミンの合成等を経時的に測定すること等により行なわれうる。
【００５３】
本発明のバイオ人工臓器の形態の一例（態様１）としては、血液等の流路が半透性の中空糸膜の中空部で形成され、該中空糸膜の外周側の領域に、不織布等の細胞固定基材が配置されており、該中空糸膜と細胞固定基材とがチャンバーに収容されたバイオ人工臓器が挙げられる。前記態様１のバイオ人工臓器において、前記中空糸膜の一端は、血液等の体液を導入するための体液導入口に、他端は、処理後の血液等の処理後の体液を導出するための体液導出口に接続されている。また、前記チャンバーには、細胞収容部を占める前記細胞固定基材へ可逆性不死化細胞を播種するための細胞導入口が少なくとも１つ、好ましくは２つ設けられている。
【００５４】
例えば、態様１の具体例としては、図１に示されるバイオ人工臓器等が挙げられる。以下、説明の容易性の観点から、図１のバイオ人工臓器を例に挙げて説明する。
【００５５】
図１のバイオ人工臓器は、バイオ人工臓器用モジュールと該バイオ人工臓器用モジュール内に固定化された動物細胞７からなる。ここで、該動物細胞７は、該バイオ人工臓器用モジュール内に固定化された動物由来の可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子を該バイオ人工臓器用モジュール内で切り出して生じた細胞である。一方、該バイオ人工臓器用モジュールは、
体液導入口２、体液導出口３および少なくとも１つの細胞導入口５を有するチャンバー６と、
半透性を有する分離膜（例えば、中空糸膜）１と、
細胞固定基材４と、
を少なくとも備えてなり、かつ、
該分離膜１および該細胞固定基材４が該チャンバー６内に収容され、
該分離膜１が、該チャンバー６内に空間（Ｉ）および（II）が形成されるように配置され、
該空間（Ｉ）が、該体液導入口２および該体液導出口３と連通し、かつ該体液導入口２から導入される体液が該体液導出口３から導出されるような体液の流路を形成し、
該空間（II）が、該細胞導入口５と連通し、かつ該細胞固定基材４（細胞収容部）を収容する、
構造を有するものである。ここで、前記細胞導入口５は、該チャンバー６の外側から該細胞固定基材４への細胞の移動が可能なように配置されたものである。前記体液導入口２および体液導出口３と、分離膜１とは、例えば、ポリウレタンにより連結される。
【００５６】
以下、本発明を実施例等により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
〔可逆性不死化細胞の調製例〕
ヒト不死化肝細胞株ＴＴＮＴ−１細胞（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４９８）（岡山大学大学院医歯学総合研究科消化器腫瘍外科学  小林直哉博士より供与された）を用いた。最終濃度１０ｗｔ％  ウシ胎仔血清（三光純薬）、最終濃度１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン〔ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（商品名：Ｐ０７１、シグマ社製）〕を含有するグルコース濃度４５０ｍｇ／ｄＬのＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）（商品名：Ｄ５７９０、シグマ社製）を、ローラーボトル型培養器（カタログ番号：４８０８５３、コーニング社製、培養面積１７００ｃｍ２）に入れた。前記ローラーボトル型培養器に、前記ＴＴＮＴ−１細胞  ３．０×１０７個を播種し、３７℃、炭酸ガス濃度５％のインキュベーター中で、７２時間培養した。培養後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（商品名：Ｔ４０４９、シグマ社製）により細胞を培養容器から剥離し、３００×ｇ、５分間の遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞を、ＤＭＥＭ培地（液体）に分散させ、３００×ｇ、５分間の遠心分離により沈殿の操作を行ない、トリプシンを除去した。得られたＴＴＮＴ−１細胞を、ＤＭＥＭ培地  ２０ｍｌに懸濁し、ＴＴＮＴ−１細胞懸濁液を得た。
【００５８】
〔バイオ人工臓器用モジュールの作製〕
分離膜としてポリスルホン中空糸膜、細胞固定基材としてポリアミノ酸ウレタンで表面被覆されたポリテトラフルオロエチレン繊維からなる不織布シートを用いて図１と同様の形態を有するモジュールＡを作製した。ポリスルホン中空糸膜は、特開平６−１６５９２６号公報に記載の実施例２に記載の方法に従って作製されたものである。また、ポリアミノ酸ウレタンで表面被覆されたポリテトラフルオロエチレン繊維からなる不織布シートは、ポリテトラフルオロエチレン繊維製不織布シート〔（株）巴川製紙所、トミーファイレックＦ、Ｒ−１２５〕を用い、その繊維表面を特開２００１−１３６９６０号公報に記載の実施例１に記載の方法に従ってポリアミノ酸ウレタンで被覆することにより、作製されたものである。なお、モジュールＡ中の中空糸膜の本数は５００本、中空糸膜の有効長は１０ｃｍ、細胞固定基材の表面積は、１４０ｃｍ2 （１０ｃｍ×１４ｃｍ）とした。充填液として注射用蒸留水を該モジュールＡに満たし、該モジュールＡを、オートクレーブ滅菌器により１２１℃で２０分間滅菌処理した。滅菌後のモジュールＡを滅菌生理食塩水でプライミング処理し、細胞を充填可能な状態にした。
【００５９】
〔実施例１〕
モジュールＡにおける細胞導入口５より、前記調製例記載の方法により得られたＴＴＮＴ−１細胞縣濁液（細胞数：２．３×１０8個）を注入、充填し、細胞導入口５を三方活栓で封じた。なお、この細胞充填操作は、クリーンベンチ内で無菌的に行なった。体液導入口２と体液導出口３も装着した活栓により閉じ、その状態で３７℃のインキュベーター中で４時間静置し、ＴＴＮＴ−１細胞を細胞固定基材４に接着させた。その後、ＴＴＮＴ−１細胞を充填したモジュールＡにおける体液導入口２と体液導出口３にチューブ（商品名：ＪＭＳエキステンションチューブＥＴ−３、内径：３．５ｍｍ、ジェイ・エム・エス社製）をそれぞれ接続し、各チューブの先を、ＤＭＥＭ培地  ５００ｍＬを入れた容器に浸した。チューブの途中には、ペリスタポンプを設置し、培地をモジュールＡに循環できるようにした。
【００６０】
前記モジュールＡ、チューブ、ＤＭＥＭ培地を入れた容器およびペリスタポンプを、炭酸ガス濃度５％、温度３７℃のインキュベーターに入れ、流速２０ｍＬ／分で、モジュールＡにＤＭＥＭ培地を循環し、モジュールＡ内でのＴＴＮＴ−１細胞の増殖を行なった。
【００６１】
２４時間毎に前記容器の培地を交換し、培地の循環を継続した。なお、交換した培地中のグルコース濃度を、商品名：ＧＬＵ２  Ｌタイプワコー（和光純薬株式会社製）により測定し、細胞の増殖の指標とした。
【００６２】
４日後、ＴＴＮＴ−１細胞のゲノム中の可逆性不死化遺伝子（ｈＴＥＲＴ）を特異的に切り出すことができるアデノベクターＡｘＣＡＮＣｒｅ（理研ジーンバンク、ＲＤＢ  Ｎｏ．１７４８）  ＭＯＩ＝５０を、細胞導入口５から添加し、さらに同様のインキュベーションを３日間行ない、ＴＴＮＴ−１細胞のゲノムから可逆性不死化遺伝子を特異的に切り出した。なお、この３日間についても細胞数の指標としてグルコース消費量を測定した。また、ＴＴＮＴ−１細胞からの可逆性不死化遺伝子の切り出しは、細胞からの蛍光の消失により確認した。
【００６３】
その後、モジュールＡを分解し、細胞が接着した細胞固定基材４を取り出し、前記ＤＭＥＭ培地  ５０ｍＬ中に移した。取り出した細胞固定基材４の一部を培地中に移した後、トリパンブルー染色法により細胞固定基材４に接着している細胞の生存率を測定した。また取り出した細胞固定基材４の一部から、トリプシン溶液（シグマ社製）を用いて、細胞を回収し、回収した細胞数を顕微鏡にて観察することで細胞固定基材４に接着していた細胞数（「固定細胞数」）を測定した。
【００６４】
〔比較例１〕
前記調製例の方法により得られたＴＴＮＴ−１細胞懸濁液を、前記調製例と同様のローラーボトル型培養器中で実施例１と同様の炭酸ガス５％、温度３７℃のインキュベーション操作条件で、２４時間毎に培地を交換しながら、培養した。４日後、ローラーボトル型培養容器中にアデノベクターＡｘＣＡＮＣｒｅを添加して、さらに３日間培養を続け、ＴＴＮＴ−１細胞から可逆性不死化遺伝子を切り出した。その後、コラゲナーゼ（シグマ社製）で処理して細胞をローラーボトル型培養器から取り出し、可逆性不死化遺伝子が切除されたＴＴＮＴ−１細胞を得た。
【００６５】
得られた可逆性不死化遺伝子切除後のＴＴＮＴ−１細胞  ４．１×１０8個を、モジュールＡに注入して充填し、細胞導入口５を三方活栓で封じた。体液の導入口と導出口も装着した活栓により閉じ、その状態で３７℃のインキュベーター中で４時間静置して細胞固定基材に細胞を接着させた。その後、直ちにモジュールＡを分解して細胞が接着した細胞固定基材を取り出して培地中に移した後、実施例１と同様にして細胞生存率と固定細胞数を測定した。
【００６６】
〔比較例２〕
初代ブタ肝細胞を常法のコラゲナーゼ法により採取した。すなわち、麻酔下の体重１８ｋｇのブタに、門脈に挿入したカテーテルから、ＥＤＴＡ  ０．０２容積％溶液を注入して肝臓を潅流し、その後、コラゲナーゼ液（シグマ社製）  １０００ｍＬを肝臓に２０分間潅流して肝臓を消化した。その後、肝臓を摘出し、肝細胞を遊離させ、４℃のハンクス液  ５００ｍｌに分散させた。得られた分散液を、メッシュで濾過後、３００×ｇ、５分間遠心分離して上清を捨てた。沈殿した細胞にハンクス液  ５００ｍｌを添加して分散させ、３００×ｇ、５分間遠心分離して上清を捨てる操作を２回繰り返してコラゲナーゼを除去した。得られた初代ブタ肝細胞をハンクス液に分散させて初代ブタ肝細胞縣濁液を調製した。得られた初代ブタ肝細胞の生存率をトリパンブルー染色法で測定した。その結果、初代ブタ肝細胞の生存率は、８８％であった。
【００６７】
得られた初代ブタ肝細胞（細胞数：４×１０8個）をモジュールＡに充填し、３７℃で４時間静置して初代ブタ肝細胞を細胞固定基材に接着させた。その後、直ちにモジュールを分解して初代ブタ肝細胞が接着した細胞固定基材を取り出して培養液中に移した後、実施例１と同様にして細胞生存率と固定細胞数を測定した。
【００６８】
〔試験例１〕
実施例１、比較例１および比較例２におけるモジュールＡ内の細胞固定基材に固定化されていた細胞数および細胞生存率の結果を表１に示す。
【００６９】
なお、実施例１の結果は、モジュールＡ内で可逆性不死化ヒト肝細胞の増殖と不死化遺伝子の切り出しを行なったバイオ人工肝臓について、バイオ人工臓器として使用する直前の細胞数と細胞生存率を示す。また、比較例１の結果は、モジュールＡの外で可逆性不死化遺伝子が切除された可逆性不死化ヒト肝細胞が充填されたバイオ人工臓器の使用直前の細胞数と細胞生存率に相当する。比較例２の結果は、初代ブタ肝細胞を充填したバイオ人工臓器の使用直前の細胞数と細胞生存率に相当する。
【００７０】
【表１】
0004599315.tif 000002
【００７１】
その結果、表１に示されるように、実施例１では、充填から７日後の細胞数は３．９×１０8個であった。初めに充填した細胞数が２．３×１０8個であったので、７日間で可逆性不死化ヒト肝細胞がモジュール中でほぼ１．７倍に増殖したことが示された。
【００７２】
実施例１の細胞生存率は、比較例１および比較例２の細胞生存率と比較して高く、モジュール内で可逆性不死化細胞を増殖させ、モジュール内で該可逆性不死化細胞のゲノム中の可逆性不死化遺伝子を切り出すことにより、細胞生存率の高い良好なバイオ人工臓器を提供できることを示す。すなわち、比較例１や比較例２のように、バイオ人工臓器として使用に供する数時間前にトリプシン処理やコラゲナーゼ処理を行うことがないため、実施例１のバイオ人工臓器においては細胞生存率が高く維持されていた。
【００７３】
〔実施例２〕
モジュールＡ内において、合計７日間のインキュベーションが終了するところまで実施例１と同様の操作を行ない、可逆性不死化遺伝子が切除されたＴＴＮＴ−１細胞をモジュールＡ内で調製したバイオ人工臓器Ａを作製した。
【００７４】
得られたバイオ人工臓器Ａに、塩化アンモニウムを添加してアンモニウムイオン濃度が５００μｇ／ｄＬになるように調製したＤＭＥＭ培地  ５００ｍＬを、炭酸ガス濃度５％、温度３７℃のインキュベーター中でペリスタポンプを用いて流速２０ｍＬ／分で２４時間循環させた。
【００７５】
２４時間循環前後の培地中のアンモニア濃度を臨床検査キットであるアンモニアテストワコー（和光純薬工業株式会社製、藤井・奥田法変法による比色法）を用いて測定し、バイオ人工臓器Ａのアンモニア処理機能を評価した。
【００７６】
また、循環後のバイオ人工臓器Ａを分解し細胞固定基材を取り出し、トリプシン溶液（シグマ社製）を用いて、可逆性不死化遺伝子が切除されたＴＴＮＴ−１細胞を回収し、細胞固定基材に接着していた細胞数（「固定細胞数」）を計測した。また、細胞固定基材に接着していなかったモジュール内の細胞数を併せて計測し、それと固定細胞数との和を、「モジュール内総細胞数」として記録した。
【００７７】
〔実施例３〕
ポリアミノ酸ウレタンでコーティングされていない細胞固定基材を使用したこと以外は実施例２と同様の操作を行い、バイオ人工臓器Ｂを作製した。バイオ人工臓器Ｂについて、実施例２と同様にアンモニア処理機能と細胞数（固定細胞数およびモジュール内総細胞数）を測定した。
【００７８】
〔比較例３〕
前記比較例１と同様に、ローラーボトル型培養器内においてＴＴＮＴ−１細胞の増殖と可逆性不死化遺伝子の切り出しを行ない、さらにトリプシン処理することにより、可逆性不死化遺伝子が切除された細胞を得た。得られた細胞をモジュールＡに充填し、４時間静置して細胞を細胞固定基材に接着させるところまで比較例１と同様に行ない、バイオ人工臓器Ｃを作製した。
【００７９】
バイオ人工臓器Ｃについて、実施例２と同様に、アンモニア処理機能の評価と細胞数（固定細胞数およびモジュール内総細胞数）の計測を行なった。
【００８０】
〔試験例２〕
実施例２、実施例３および比較例３のアンモニア処理機能の評価結果および計測された細胞数（固定細胞数およびモジュール内総細胞数）を表２に示す。
【００８１】
【表２】
0004599315.tif 000003
【００８２】
その結果、表２に示されるように、塩化アンモニウムを濃度が５００μｇ／ｄＬになるように添加した培地を実施例２のバイオ人工臓器Ａに２４時間循環したとき循環後の培地中のアンモニウムイオン濃度は、２４５μｇ／ｄＬに低下し、アンモニア濃度低下率は、５１％の優れた低下率を示した。
【００８３】
また、表２に示されるように、実施例３におけるバイオ人工臓器Ｂの場合もアンモニア濃度低下率は、３９％であり、実施例２のバイオ人工臓器Ａよりはやや劣るものの、優れたアンモニア処理機能を示した。
【００８４】
一方、比較例３のバイオ人工臓器Ｃでは、アンモニア低下率は、１１％にとどまり、十分なアンモニア処理機能を有していなかった。
【００８５】
これらの結果より、モジュール内で可逆性不死化ヒト肝細胞から可逆性不死化遺伝子を切除することにより作製されたバイオ人工臓器ＡおよびＢでは、使用直前にトリプシン処理する必要が無いため、該細胞の機能が高く維持されており、高いアンモニア処理機能を有していることが示された。また、表面部がポリアミノ酸ウレタンで構成される繊維を含む細胞固定基材を使用することにより、臓器としての機能において、より優れたバイオ人工臓器が作製され得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、例えば、肝不全患者の治療具として好適に使用することができるバイオ人工肝臓、糖尿病患者の治療具として好適に使用することができるバイオ人工膵臓等のバイオ人工臓器が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、本発明に従うバイオ人工臓器の一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００８８】
１．  分離膜（例えば、中空糸膜）
２．  体液導入口
３．  体液導出口
４．  細胞固定基材（細胞収容部）
５．  細胞導入口
６．  チャンバー
７．  動物細胞（動物由来の可逆性不死化細胞から可逆性不死化遺伝子が切り出されて生じた細胞）
【図１】
0004599315.tif 000004