(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の端部、第２の端部、内面および外面を有する第１のチャンバーであって、少なくとも１つの生育基質手段が第１のチャンバーの内面内に配置されて細胞付着を可能にする、
第１の端部、第２の端部、内面および外面を有する第２のチャンバーであって、培養培地が第２のチャンバーの内面内に配置され、第２のチャンバーは、第２のチャンバーの体積および第１のチャンバーに入る培養培地の量を調整する体積調整手段をさらに含む、および
体積調整手段を制御して第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間で培養培地を移動するための制御手段であって、第２のチャンバー内の培養培地の体積が最小のときに、生育基質手段が培養培地中に浸漬され、第２のチャンバー内の培養培地の体積が最大のときに、生育基質手段が生育基質手段の表面で維持された薄い生育培地を介して第１のチャンバーのガス環境にさらされる、
を含む、細胞培養装置。
【請求項２】
第１のチャンバーが少なくとも１つの開口をさらに含み、開口が、培養培地および細胞を受け、かつ除去し、細胞培養装置と細胞培養装置の外部環境との間の空気交換を可能にするように構成される、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項３】
開口が閉鎖手段を受けるように構成される、請求項２記載の細胞培養装置。
【請求項４】
閉鎖手段が少なくとも１つのエアフィルターを有して、ガス交換を可能にし、かつ細胞培養装置内の汚染を最少にする、請求項３記載の細胞培養装置。
【請求項５】
細胞培養装置が、第１のチャンバーの第２の端部と第２のチャンバーの第１の端部との間に配置される少なくとも１つの膜または連通手段をさらに含み、膜または連通手段が、生育基質手段を受け、かつ／または支持するように構成される、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項６】
細胞が真核細胞および原核細胞からなる群から選択される、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項７】
体積調節手段が、圧縮または減圧されるように構成されたベローであって、ベローが最大限まで圧縮されると、第２のチャンバー内の培養培地の体積が最小となり、ベローが最大限まで減圧されると、第２のチャンバー内の培養培地の体積が最大となるように、第２のチャンバー内の培養培地の体積を調節する、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項８】
体積調節手段がバルーンであって、バルーンが最大限まで膨張すると、第２のチャンバー内の体積が最小となり、バルーンが最大限まで収縮すると、第２のチャンバー内の体積が最大となるように、第２のチャンバーの体積を調節するために、バルーンが膨張または収縮するように構成される、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項９】
体積調整手段がピストンであり、ピストンを押し上げ、または引き下げて第２のチャンバー内の体積を調節することができる、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
連通手段が多孔性であって、生育基質手段を通過させることなく、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間を培養培地が自由に流れることができるようにし、連通手段がさらに生育基質手段を閉じ込める、請求項５記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
生育基質手段が、荒充填マトリックスの形態の多孔性の生育基質手段であって、かつ、織布基質、不織布基質、多孔性基質、セラミック基質、多孔性基質、生分解性基質、中空繊維基質、半透過性膜および半透過性繊維からなる群から選択された材料から作製される、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
多孔性基質が、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、半透過性ペレット、マクロペレット、半透過性膜および半透過性中空繊維からなる群から選択される、請求項１１記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
生育基質手段が、マトリックスとしてさらに荒充填され、かつ、酸素化装置、スタティックミキサーおよびデプスフィルターとして働く、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
第２のチャンバーが、第２のチャンバーが圧縮されるときに、細胞が培養培地中に浸漬することができるが、第２のチャンバーが減圧されるときには、細胞を培養培地から出現させて薄い生育培地を通してガス環境にさらして酸素化を提供することができるように、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間で培養培地を移動するために、第２のチャンバーの圧縮可能な部品を圧縮かつ減圧するための駆動手段とをさらに含む、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
駆動手段が油圧シリンダーである、請求項１４記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
駆動手段が空気圧シリンダーである、請求項１４記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
駆動手段がスクリュージャッキである、請求項１４記載の細胞培養装置。
【請求項１８】
駆動手段が空気圧縮機である、請求項１４記載の細胞培養装置。
【請求項１９】
第２のチャンバーが、第１のチャンバーの上に、第１のチャンバーの下に、第１のチャンバーと並んで、または第１のチャンバーを囲んで配置され、相互接続されて第２の開口を画定する、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項２０】
請求項１記載の細胞培養装置を使用して細胞を培養するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
微生物、細胞および／または組織の培養の最大の障害の１つは、使用する装置がかさばり、高価であり、使い捨てが不可能で、滅菌および滅菌状態の維持が困難であるため、汚染の可能性が高まり、微生物や細胞に損傷を与えることなく、かつ／または細胞死を生じさせることなく、微生物、細胞および／または組織に栄養分を与えることが不可能である点である。本発明は、一般に、微生物および細胞を試験管内で培養し、かつ微生物により生成された生成物および／または細胞生成物を採取することを教示している。より詳細には、本発明は、蛋白質等の、微生物により生成された生成物および／または細胞生成物の生成を効率的に最大にし、かつこれらの生成物を採取するための新規な装置および／または方法を特許請求し開示する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、「Ｃｅｌｌ−Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ（細胞培養装置）」という名称の２００２年１月３１日出願の仮出願第６０／３５２，５４２号の優先権を主張する。この仮出願を、仮出願中で引用された文献および引用文献中で引用または参照された文献と共に、参照により本明細書中に組み込む。本明細書中で引用される出願および特許の各々、出願および特許（各発行特許の手続き中の「出願引用文献」を含む）の各々で引用された各文献または参照、これらの出願および特許に対応し、かつ／またはこれらの出願および特許の優先権を主張するＰＣＴ出願および外国出願または特許の各々、ならびに出願引用文献の各々で引用または参照された文献の各々が、参照により本明細書中に明白に組み込まれる。一般には、本明細書中で文献または参照が引用され、これらの文献または参照（「本明細書中で引用された参照」）の各々、および本明細書中で引用された参照の各々で引用された各文献または参照（製造者の仕様書、指示書等を含む）を、参照により本明細書中に明白に組み込む。また、１９９９年７月１日出願の米国出願第０９／３４６，１０１号（現米国特許第６，３２３，０２２Ｂ１号）も参照し、これを参照により本明細書中に組み込む。
【０００３】
長年にわたって、細菌、酵母、およびカビを生育させるための大規模な細胞培養プロセスが広範囲で開発されている。細菌、酵母、およびカビはすべて一般に頑強な細胞壁および／または細胞外物質を有するため、より弾力性がある。これらの微生物細胞の構造上の弾力性は、この種の細胞のための非常に効率的な細胞培養プロセスを開発する速さに寄与する重要な要因である。例えば、生存能力のある培養物を終始維持しながら、激しい撹拌、培養物撹拌、およびガス散布技術を使用して生育中に良好なエアレーションを達成することにより、細菌細胞を大量の液体培地中で生育させることができる。あるいは、細菌をバイオフィルムとして生育させることができるが、生育面が必要となる。
【０００４】
これに対して、真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞および／または組織等の細胞を培養する技術は、非常に難しく複雑である。これは、これらの細胞が、微生物細胞よりも損傷を受けやすく、維持するのが複雑で難しい生育中の栄養分需要量および酸素需要量を有するためである。さらに、動物細胞および／または哺乳動物細胞は、微生物細胞であれば容易に耐えることのできる、空気、または酸素、窒素、および二酸化炭素を含む混合物等のガス混合物の流入により発生し得る過度の乱流および／または剪断力に耐えることができない。加えて、動物細胞をガスに直接さらすことはできない。大部分の動物細胞は培養培地中の溶存酸素しか使用することができない。動物細胞および哺乳動物細胞は、微生物細胞よりも空気およびガスの流入による損傷を受けやすいので、細胞死の確率が高くなる。大規模な培養のためのバイオリアクターは、圧縮器（ｉｍｐｅｌｌｅｒ）等の内部可動部品を有することが多く、この圧縮器は非常に高い流体剪断力を細胞に加えて細胞に損傷を与え、時には細胞死を生じさせるため、培養物の生存能力が低下し、その結果、蛋白質および／または細胞副生成物の生成が減少する。同様に、他のタイプの機械部品、激しい空気動、または急な流体動を機構として使用して、細胞の浮遊および／または適切なエアレーションを達成するバイオリアクターは、細胞に損傷を与えやすく、かつ細胞および組織の生育を妨げやすいため、蛋白質等の細胞副生成物の生成がさらに減少する。
【０００５】
バイオリアクターの主な機能は、多数の細胞を生育させて、限定されないが、細胞により生育培地中に分泌される蛋白質または抗体を含む、最小量の活性物質を精製する研究を目的とするものである。バイオリアクターの別の機能は、細胞および／または組織により生成される活性蛋白質を大量生成するための、商業目的での拡大実験用細胞培養プロセスである。真核細胞および／または原核細胞および／または動物細胞および／または哺乳動物細胞を実験室で大量に培養する必要があることから、バイオリアクターおよび培養装置は、研究、ならびに活性蛋白質および／または抗体および／または細胞副生成物を生成するための細胞の生成において重要なツールとなっている。
【０００６】
培養物中で細胞を大規模および小規模に生育させる多くの方法が当業界で公知である。小規模細胞培養のために、長年にわたって多くの容器が開発されている。例えば、培養皿は培養容器の１つのタイプである。一般に、培養皿は、生育培地を含む底皿と、取外し可能なカバーとからなる。取外し可能なカバーは培養物に近づくには都合がよいが、培養プロセス中にカバーを繰返し取り外すことにより、細胞が微生物によってしばしば容易に汚染される。実際に、汚染は細胞および組織の培養技術の成功に対する主な難題の１つである。
【０００７】
培養皿の汚染を克服するために、培養フラスコが開発された。一般に、培養フラスコは、培養チャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）と、フラスコの一端部に配置された小さい管状開口と、対応する閉鎖部を有する。この設計は、細胞が塵、細菌、酵母、および他の汚染物質にさらされるのを最小限にしようとするものである。例えば、培養フラスコを教示する特許が、Ｃａｒｖｅｒの米国特許第４，３３４，０２８号、Ａｋａｍｉｎｅの米国特許第４，８５１，３５１号、Ｄｅｇｒａｓｓｉの米国特許第５，３９８，８３７号に見られる。培養フラスコは培養皿を超える改良であるが、汚染の問題を完全に救済するものではない。加えて、培養皿も培養フラスコも細胞に対して適切なエアレーションを提供することができない。さらに、培養皿内と同様に、培養フラスコ内で使用可能な生育面積が不十分であるため、本技術を使用して培養プロセスを拡大するには限界がある。
【０００８】
細胞および組織培養に使用するために開発された別の技術はローラボトルである。ローラボトルは、長年にわたって当業界で広く使用されている。ローラボトルは、細胞付着および生育のためのより大きな表面積等の、皿およびフラスコを越えるいくつかの利点をもたらすが、依然として、すべての欠陥、特に拡大に関する欠陥を救済することはできない。集合的に、これらの欠点は、限定されないが、ガスヘッドスペースおよび多量の乱流渦に関連する、制御不可能な大きな流体剪断力を含む。ローラボトルに固有の高剪断力環境の結果として、より大きな三次元構造の組織培養が事実上不可能となる。剪断力により損傷を受けない、かつ／またはローラボトルの壁に付着したままとどまることが可能な細胞タイプしか培養物中に長期間維持することができない。従って、高い剪断力環境および起こり得る汚染という難題が常にあるため、確立された細胞系の長期維持は、ローラボトルについては困難であることがわかる。ローラボトルに向けた特許の例として、Ｍｕｓｓｉ他の米国特許第５，５２７，７０５号、およびＳｅｒｋｅｓの米国特許第４，９６２，０３３号がある。
【０００９】
さらに、ローラボトルの表面積は培養フラスコおよび培養皿と比べて大きいが、細胞付着面が培養フラスコおよび培養皿よりも必ずしも好ましいものではないため、特に細胞培養物の生育の拡大には不十分であると考えられることが多い。各ローラボトルにさらに大きな表面積を提供することによりローラボトルに改良を行う努力がなされている。例えば、Ｓｅｒｋｅｓの米国特許第５，０１０，０１３号は、細胞付着のための表面積を増加したローラボトルについて説明している。Ｓｅｒｋｅｓは、ローラボトルの内部表面積に加えられた波形チャネルを使用して、細胞付着能力を高めることに関する。しかし、一般的なローラボトルが細胞を培養するために提供する表面積は、約８５０〜１７００ｃｍ2しかなく、生成の拡大には依然として多数のローラボトルが必要である。多数のローラボトルを使用する培養の自動化によって時間および労力を節約することができるが、一般に、このような操作は費用がかかり、限定的である。
【００１０】
流体剪断力および表面積の制限の問題に加えて、細胞および組織培養技術に固有の主要な問題は、生育している培養物中で十分な酸素化を達成し、かつ維持することである。原核細胞や、動物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、およびカビを含む真核細胞がすべて、１つの主な律速段階の酸素物質移動を有することが当業界で公知である。
【００１１】
酸素代謝は、酵母等の種々の真核細胞微生物の一部の発酵性の代謝を除いて、大部分の原核細胞および真核細胞の代謝機能に必須のものである。詳細には、哺乳動物細胞および動物細胞培養技術では、急速な細胞分裂の初期段階中に酸素フラックスが特に重要となる。細胞が浮遊するときには細胞ごとの酸素の使用が増加し、細胞が集合、分化するにつれて酸素の必要量が減少する。哺乳動物細胞および動物細胞には、付着依存性であって生育する表面を必要とするものもあれば、非付着依存性であって細胞のタイプに関係なく液体環境中で生育できるものもある。しかし、これらの細胞はすべて培地中の溶存酸素を必要とする。それにもかかわらず、付着依存性細胞および非付着依存性細胞を含む細胞培養の後段階中に、単位体積当たりの細胞数が増加するにつれて、大量の酸素物質移動の必要量が再び増加する。
【００１２】
従来から、少なくとも非付着依存性細胞では、機械撹拌方法および培養物へのガス散布により酸素必要量の増加に対応している。しかし、前記したように、撹拌およびガスの散布により細胞が損傷を受け、これにより培養物の生存能力、ならびに細胞および／または組織培養の全体の効率および生産性が低下する。さらに、細胞および組織培養物をガスと共に直接散布することにより、細胞の生存能力に有害な泡生成物が生じる可能性がある。
【００１３】
細胞培養中の酸素化の問題を解決する試みが当業界でなされている。例えば、Ｗｏｌｆ他の米国特許第５，１５３，１３１号（「Ｗｏｌｆ」）は混合ブレードのないバイオリアクター容器に関する。代わりに、スクリーン全体にわたる支持板部材を通る空気入口通路を通り、かつ容器ハウジングの二面間に押し込まれた平坦なディスク状透過性膜を通って空気が移動する。その後、ハウジングの二面間の濃度勾配により、酸素は膜全体に拡散して培養チャンバー内に入る。
【００１４】
しかし、Ｗｏｌｆのバイオリアクターには多くの欠点がある。特に、酸素がディスク状の膜全体に拡散できる速度が、培養チャンバーの大きさを制限する重要な制限となっている。平坦なディスク膜の別の欠点は、培養物チャンバー内で混合を行うために曲がるように設計されていることにより、細胞死が生じる可能性がある点である。混合効果は、培養培地全体に空気を分配するのに重要であると説明されている特徴であるが、チャンバー内で剪断力が生じやすく、細胞にとって有害となる可能性があり、従って、より大きな細胞構造体の生育を維持するために十分なガス交換を行うことは、バイオリアクターまたは培養容器を設計するときの重要かつ実際的な制限となる。
【００１５】
前記した欠陥を克服する試みを示す一例として、ガス透過材料からリアクターを構成することが挙げられる。例えば、「Ｇａｓ  Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｏｆ  Ｕｓｅ（ガス透過バイオリアクターおよび使用方法）」という名称のＳｃｈｗａｒｚ他の米国特許第５，７０２，９４１号（「Ｓｃｈｗａｒｚ」）は、水平に回転する容器に関し、この容器は少なくとも一部がガス透過材料から構成される。容器壁を構成するガス透過材料を通して、培養培地とのガス交換が直接生じるようになっている。
【００１６】
しかし、Ｓｃｈｗａｒｚは、ガス交換がガス透過表面積の量に依存するため、容器の大きさの範囲が限定されていることを開示している。Ｓｃｈｗａｒｚは、容器の表面積が増加するにつれて、培養培地の体積および量も増加することを強調している。従って、Ｓｃｈｗａｒｚに記載された容器の好ましい寸法は、直径１〜６インチ（２．５４〜１５．２４センチメートル）に限定され、幅は、Ｓｃｈｗａｒｚによれば、好ましくは１／４〜１インチ（０．６３５〜２．５４センチメートル）に限定される。このような大きさの限定は、三次元細胞の集合体および組織の生育、および／または拡大生成に適していない。
【００１７】
同様に、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｖｅｓｓｅｌ  Ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（細胞培養のための培養容器）」という名称のＦａｌｋｅｎｂｅｒｇ他の米国特許第５，４４９，６１７号（Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇ）は、水平回転する容器に関する。容器は、透析膜により、細胞培養チャンバーと栄養分培地リザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）とに分割される。ガス透過材料を容器壁内で使用して、細胞培養チャンバー内でのガス交換を可能にする。しかし、容器は栄養分培地で完全に満たされるわけではなく、両チャンバーの流体培地上方に大量の空気が維持される。しかし、Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇの容器は、細胞培養チャンバー内の乱流を最小限にするように設計されておらず、むしろ混合は透析膜を濡れた状態に維持するのに必須のステップであると述べられている。さらに、Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇは、容器を使用してあらゆる種類の細胞集合体または組織を生育させることについて考慮していない。
【００１８】
酸素化の問題を克服する試みは他にもある。例えば、「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄＡｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ  ＡｎｃｈｏｒａｇｅＤｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  Ｃｅｌｌｓ（付着依存性単層細胞を培養するための方法および装置）」という名称のＬｉａｕ他の米国特許第５，７６６，９４９号（「Ｌｉａｕ」）は、細胞の酸素化を向上させる試みとして、培養培地が生育基質に対して上下に揺動する細胞培養システムについて記載している。
【００１９】
しかし、Ｌｉａｕには多くの欠点がある。このシステムの１つの欠点は、Ｌｉａｕの装置の複雑さである。Ｌｉａｕのシステムは、２つの外部貯蔵タンクと、一連の垂直な基質板を保持する別個の生育チャンバーとを必要とする。１つの貯蔵タンクから培養チャンバーを通して別の貯蔵タンクへ、その後再び第１の貯蔵タンクへと生育培地を循環させるために、複数の蠕動ポンプが必要となる。培養チャンバーに外付けするＬｉａｕの装置の部品、例えば外部管、貯蔵タンク、およびポンプの複雑さおよび依存により、汚染物質が導入されやすい。さらに、装置および装置の大きさに対してかなり大量の部品があるため、滅菌が難しく労力がかかる。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
Ｌｉａｕの別の問題は、システムを通る培養培地の流れにより、細胞を基質板から容易に分裂させ除去する流体剪断力が発生し、これにより細胞の生存能力が低下することである。さらに、垂直な基質板は細胞付着を妨げる。これは、基質板に直接付着できない細胞が単に落下して板の底部に蓄積し、最終的にこれらの細胞の大部分が死に至るためである。従って、この培養は生存能力が低く、これに対応して蛋白質生成も減少し、システムを連続して再開する必要があるため、非常に効率が悪く逆効果である。さらに、システムが複雑であるため、分泌蛋白質また細胞生成物の採取が煩雑で時間のかかるものとなる。最後に、生育基質板に対して生育培地を低くすると、細胞が空気、すなわちガス環境に直接さらされ、これにより細胞死に至る。バイオテクノロジー研究、製薬研究、患者のケア、学問的研究における細胞および組織培養技術の重要性を考慮し、かつ前記した従来技術の欠陥、障害、および制限を考慮して、本発明は、細胞および組織を培養するための方法および装置を教示かつ開示することにより、従来技術の障害を克服し、かつ欠陥を救済する。この方法および装置は、細胞および組織を培養するための新規な方法および装置についての長年の切実な要求を満たしており、より確実で、複雑でなく、より効率的で、煩雑でなく、安価で、労働集約的ではなく、細胞の生存能力を高めることができ、かつ細胞から生成される細胞副生成物をより多く生成することができる。本発明による装置によって汚染が減少し、従って細胞の寿命が延びる。
【００２１】
本発明の目的は、限定されないが、細胞培養物を調製し、生育させ、かつ維持するための新規な方法および装置を提供すること、細胞を生育させ、かつ／または組織培養物を調製するための新規な方法および装置を提供すること、器官培養物を調製し、かつ生育させるための新規な方法および装置を提供すること、酸素および栄養分が十分な環境で、最少の汚染で細胞を培養するための新規な方法および装置を提供すること、ガスの注入により生じる気泡および／または剪断力に細胞が直接さらされることなく、細胞との栄養分および酸素の交換を向上させる多孔性生育基質を使用して細胞を培養するための新規な方法および装置を提供すること、細胞付着を最大にし、空気／培地接触のための表面積を増大させ、本発明の装置の培地が上昇するときにスタティックミキサー（ｓｔａｔｉｃ  ｍｉｘｅｒ）として働く生育基質手段を提供すること、細胞を生育培地中に間欠的に浸漬し出現させることにより細胞を培養するための新規な方法および装置を提供すること、最少の汚染で細胞を培養するための方法および装置を提供すること、細胞培養中の細胞死を最少にし、これにより細胞生成物の生成を増加させるための方法および装置を提供すること、流体剪断力が大幅に減少し、または完全になくなって、細胞死を減少させ、かつ最少にする、細胞を培養するための方法および装置を提供すること、培養培地の酸素化を達成するのにガス散布が不要である、細胞を培養するための方法および装置を提供すること、生育培地の移動により、除去された細胞を再分配し、かつ細胞付着の増加を促進させる、細胞を培養するための方法および装置を提供すること、細胞生成物の生成を最大にするために、生育培養培地および酸素化により細胞に連続して栄養分を与えるための方法および装置を提供すること、細胞付着のための表面積を増加させること、分泌蛋白質、および細胞培養物および／または組織培養物からの他の細胞生成物を効率的に調製し、かつ採取するための方法および装置を提供すること、および培養物の長年にわたる生存能力を向上させる、細胞を培養するための方法および装置を提供することを含む。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞および／または組織を培養するため、かつ生成された細胞生成物を採取するための、確実で、単純で、安価な、おそらくは使い捨ての、効率的な方法および装置を提供する。より詳細には、本発明は、原核細胞、真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞等の対象とする細胞を効率的に培養するための新規な方法および装置について教示かつ開示しており、この方法および装置により、細胞をガスに直接さらすことなく酸素と栄養分の両方が細胞に連続して供給され、従って細胞の損傷、さらには細胞死が減少する。さらに、本発明の方法および装置は、汚染を減少させ、ガス供給により生じる剪断力に細胞が直接さらされることのないようにし、気泡およびガスにより生じる有害な影響が細胞に及ぶのを防止する。本発明による装置は、自動または手動とすることができる。さらに、本発明は蛋白質、および／または抗体、および／または細胞もしくは組織培養物からの細胞生成物および／または組織生成物等の分泌細胞生成物をより簡単かつ便利に生成し、かつ採取するための方法および装置を提供する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、細胞培養装置は、細胞付着および生育のための生育基質手段を含む第１のチャンバーを含み、生育基質手段はガス環境内の第１のチャンバー内に配置される。本発明による新規な生育基質手段は、細胞プレーティング中に細胞を捕捉するデプスフィルター（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）として機能し、空気／培地接触のための表面積を最大にし、スタティックミキサーとして働く。また、装置は、好ましくは透過性、より好ましくは多孔性の膜をオプションとして通して第１のチャンバーに接続された第２のチャンバーを含み、第１のチャンバーは第２のチャンバーの上に、第２の生育チャンバーの下に、かつ／または第２のチャンバーと並んで、かつ／または第２のチャンバーを囲んで配置することができ、従って、培養培地が第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間を自由に移動するのが促進される。
【００２４】
本発明の装置は、除去された細胞を生育基質手段上に戻すように静かに再分配することにより細胞付着を最大にするために、培養培地を混合することにより空気／培地接触を促進するために、かつ、細胞に損傷を与えることなく、または細胞を死なせることなくすべての細胞に栄養分およびガスを確実に等しく分配するために、１つのチャンバーから別のチャンバーへ、かつ別のチャンバーから１つのチャンバーへ培養培地を移動するための駆動手段を含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、細胞培養装置は、細胞付着および細胞生育を可能にする生育基質手段を含み、かつ／または支持することができる第１のチャンバーを含み、生育基質手段はガス環境を有する第１のチャンバー内に配置される。本発明による装置は、オプションとして、第１のチャンバーに接続され、かつ細胞培養培地を保持するように構成された第２のチャンバーを含み、第２のチャンバーは、第２のチャンバーの培養培地レベルが最小レベルのときに、細胞培養培地が第１のチャンバーへほぼ移動し、第２のチャンバーの培養培地レベルが最大レベルのときに、細胞培養培地がほぼ第２のチャンバーに戻るように、第２のチャンバー内の培養培地レベルを調節するための体積調節および／または体積調整手段を含む。体積調節手段は、限定されないが、ベロー（ｂｅｌｌｏｗ）、ピストン、バルーン、空気管を持つフローティングバッグ、空気圧、および／または１つのチャンバーから別のチャンバーへ培地を移動することのできる他の手段等の圧縮チャンバーを含むことができる。
【００２６】
また、本発明の装置は、生育基質を培養培地中にほぼ浸漬して細胞に栄養分と溶存酸素とを提供するために、培養培地が第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間を間欠的に移動するのをさらに促進することにより、流体および／または液体体積調節手段を駆動かつ制御するための駆動手段を含むことができる。従って、培養培地レベルが最小のときに、生育基質手段上の細胞は、十分な酸素化を受けるために薄い空気／生育培地界面にさらされる。第２のチャンバーの培養培地の体積が最大のときには、細胞は細胞培地中の栄養分にさらされる。細胞を薄いガス／生育培地界面にさらすことにより、細胞と空気との間隔が、第１のチャンバー内の培養培地の量を調整することにより達成された薄膜により分離されるため、細胞を乾かすことなく、かつガス注入により発生する剪断力および／または気泡に細胞を直接さらすことなく、細胞の酸素化が効率的に行われ、従って細胞に損傷を与えたり、有害な影響を与えたりすることがない。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態は、原核細胞、真核細胞、および／または哺乳動物細胞等の細胞を培養するための方法である。本発明は、第１のチャンバーを設けるステップと、細胞を受けるための生育基質手段を配置して細胞付着を促進するステップと、第２のチャンバーを設けるステップと、第２のチャンバーを第１のチャンバーに接続するステップと、第２のチャンバー内に培養培地を設けるステップと、第２のチャンバーから第１のチャンバーへ、かつ第１のチャンバーから第２のチャンバーへ間欠的に培養培地を移動して、細胞に損傷を与えることなく、または細胞を死なせることなく十分な栄養分および酸素を細胞に提供するために、オプションとして第２のチャンバー内に流体および／または液体体積調節手段を設けるステップと、更なる細胞付着のために除去された細胞を再分配するステップと、ガス／生育培地界面を設けるステップと、新しい培養培地を補給するための機構を設けるステップと、培養培地中の細胞生成物を収集するステップとを含む、新規な方法を提供する。従って、本発明は、細胞付着を増加させることにより細胞生成物を増加させるだけでなく、生育する培養物を採取するために容易に手が届くようにし、かつ培養物の汚染を確実に最少にする。これは、本発明の装置が事前に滅菌され、または事前に滅菌することができ、かつ使い捨てであるため、装置を再使用するために再滅菌することにより生じる問題が防止されることによる。加えて、本発明は、間欠的に、しかし間接的に、薄い空気／生育培地界面を通して、細胞に酸素を与えることにより、細胞に損傷を与えることなく、かつ／または細胞を死なせることなく、細胞に十分な酸素化を提供するための新規な方法を提供する。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態では、前記実施形態の方法は、所望の分泌細胞生成物を含む生育培地を採取するステップをさらに含む。この方法は、細胞培養装置から生育培地を収集するステップと、生育培地中に含まれる分泌蛋白質を採取するステップと、第１のチャンバー内に、細胞培養物の生育を支持するのに十分な量だけ新しい生育培地を提供し、かつ補給するステップと、第２のチャンバー内の培養培地レベルが最小のときに、生育培地が第１のチャンバー内へ移動して生育基質が培養培地中にほぼ浸漬され、第２のチャンバー内の培養培地レベルが最大のときに、生育培地が第２のチャンバーに戻って生育基質が空気／生育培地界面を通して酸素化のためのガス環境にほぼさらされるように、第１のチャンバーから第２のチャンバーへ、かつ第２のチャンバーから第１のチャンバーへ生育培地を周期的かつ間欠的に移動するステップとをさらに含む。間欠的に、しかし間接的に、薄いガス／生育培地界面を介して、酸素を多量に含む環境に生育基質手段の細胞をさらすこと、および生育基質手段の細胞を生育培地中に浸漬することにより、細胞に損傷を与えることなく、かつ／または細胞を死なせることなく、バランスのとれた酸素化と栄養分とが細胞に提供される。
【００２９】
これらおよびその他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示され、詳細な説明から明らかになり、かつ詳細な説明に包含される。
【００３０】
以下の説明は、例として与えられたものであり、記載された特定の実施形態に本発明を限定するものではない。説明は、参照により本明細書中に組み込んだ添付図面と組み合わせて理解することができる。
【００３１】
これらおよびその他の実施形態は、以下の詳細な説明に記載され、詳細な説明から明らかになる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下の説明は、例として与えられたものであり、記載された特定の実施形態に本発明を限定するものではない。詳細な説明は、参照により本明細書中に組み込んだ添付図面と組み合わせて理解することができる。本発明の不要な限定を希望することなく、以下で本発明をある好ましい実施形態について説明する。本発明の実施形態を使用して、真核細胞および原核細胞、特に動物細胞および／または哺乳動物細胞等の細胞を培養することができる。本発明は、特に、少なくとも１つのチャンバーと、少なくとも１つの開口と、開口を閉鎖する少なくとも１つの閉鎖手段とを有する細胞培養装置を教示している。チャンバーは、例えば、特に、希望の細胞、生育培地、および細胞付着および生育のための表面積を提供する生育基質を含むことができる。好ましい実施形態では、生育基質手段は、デプスフィルターとして働くことが可能な荒充填マトリックスを形成して、細胞付着を最大にするために細胞プレーティング中に細胞を捕捉する。薄い空気／生育培地界面を設けることにより、生育基質手段は空気／培地の接触を最大にする。生育基質手段はスタティックミキサーとしても働くことができる。好ましくは、生育基質手段はあらゆる大きさおよび形状の多孔性基質であり、あらゆる材料から構成することができる。より詳細には、本発明による多孔性生育基質は、細胞を空気に直接接触させることなく、細胞付着、生育、静かな撹拌、静かな混合、および酸素化のための表面積を最大にする。本発明によるチャンバーシステムは、細胞を周期的かつ間欠的に栄養分および酸素にさらすことにより、細胞の生育を最大にする。本発明によるシステムは、細胞生成物を含む培養培地を収集し、かつ培養培地を補給するための容易な方法を提供する。本発明の細胞培養装置は、ガスの流入により発生する気泡、ガス泡または剪断力に細胞が直接さらされるのを防止し、従って細胞に対する有害な影響を回避する。
【００３３】
より詳細には、本発明は、細胞および／または組織を培養するため、かつ培養された細胞により生成された細胞生成物を採取するための、確実で、単純で、安価な、使い捨ての、滅菌された、効率的な方法および装置に向けたものである。より詳細には、本発明は、真核細胞、原核細胞、哺乳動物細胞、または動物細胞のいずれかの細胞を効率的に培養するための新規な方法および装置を提供し、細胞に損傷を与えることなく、細胞を確実に生育させるのに必要な酸素と栄養分の両方を容易に使用することができる。さらに、本発明の方法および装置は、あらゆるタイプの汚染の危険性をなくし、または大幅に減少させ、生育している培養物に剪断力が導入されないようにし、細胞がガス泡、気泡、およびガスに直接さらされるのを防止する。さらに、本発明の方法および装置は、最小限の労力および／または監視により自動または手動で実施することができる。さらに、本発明は、細胞または組織培養物からの蛋白質、抗体等の分泌細胞生成物を生成し、かつ採取するための、より容易かつ便利な手段のための方法および装置を提供する。
【００３４】
本発明の第１の実施形態では、細胞培養装置は少なくとも１つのチャンバーを含む。より詳細には、細胞培養装置は、細胞付着および生育のための生育基質手段を含むことのできる第１のチャンバーを含み、生育基質手段は第１のチャンバー内に配置され、この生育基質手段は、酸素を受け、または培養培地中に浸漬されて、細胞の生育および細胞生成物の生成を促進するために、間欠的かつ周期的に、しかし間接的に、薄いガス／生育培地界面を介してガス環境にさらすことができる。第１のチャンバーは少なくとも１つの膜、好ましくは２つの膜を含み、この膜は好ましくは多孔性、より好ましくは透過性であり、生育基質手段が２つの膜の間に配置されて、細胞の酸素および栄養分の取入れをさらに制御し、かつ調整する。この膜は培養培地を透過できるため、培養培地が１つのチャンバーから別のチャンバーへ静かに移動するための通路として働くこともできる。本発明の装置は、オプションとして、培養培地のリザーバーとして働き、かつ膜を通して第１のチャンバーに接続された第２のチャンバーを含む。体積調節手段として働く第２のチャンバーの一部を圧縮または減圧して培養培地を１つのチャンバーから別のチャンバーへ移動することができる。第１のチャンバーは、オプションとして、第２のチャンバーの上、第２のチャンバーの下、第２のチャンバーと並んで、または第２のチャンバーを囲んで配置することができる。加えて、本発明は、細胞を生育培地中に周期的かつ間欠的に浸漬するのを促進するため、必要な栄養分を提供し、生育培地から出現させるため、かつ薄いガス／生育培地界面を介して細胞をガス環境に間接的にさらして十分な酸素化を提供するために、オプションとして駆動手段を備え、体積調節手段、従って、１つのチャンバーから別のチャンバーへの培養培地の移動を制御する。細胞をガス環境に間接的にさらすことにより、細胞に損傷を与えることなく、かつ／または細胞を死なせることなく十分かつ効率的な酸素化が提供される。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、細胞培養装置は、細胞付着のための生育基質手段を保持し、かつ細胞の生育を促進するように構成された第１のチャンバーを有する。生育基質手段はガス環境を有する第１のチャンバー内に配置され、第２のチャンバーが第１のチャンバーに嵌合接続される。さらに、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間に膜が配置される。好ましくは、培養培地が１つのチャンバーから別のチャンバーへ移動するための通路を提供するために、膜はほぼ多孔性であり、さらに膜は生育基質手段を保持するように構成されている。第２のチャンバーは、培養培地を１つのチャンバーから別のチャンバーへ移動するための体積調整手段および／または液体調整手段を有する。従って、第２のチャンバー内の空気が最少のときに、培養培地が第２のチャンバー内にほぼ残り、第２のチャンバー内の空気量が最大のときに、細胞培養培地は第１のチャンバー内へほぼ移動する。さらに、第１のチャンバーから第２のチャンバーへ、かつ第２のチャンバーから第１のチャンバーへ培養培地を移動するために、体積調節手段を調整、調節、または制御するための駆動手段により、オプションとして体積調節手段に電力供給することができる。従って、第１のチャンバー内の生育基質手段は、第２のチャンバー内の培養培地の体積が最小のときに周期的かつ間欠的に培養培地中に浸漬され、薄いガス／生育培地界面を介してガス環境に間接的にさらされて、第２のチャンバー内の培養培地の体積が最大のときに十分な酸素化が提供される。薄いガス／生育培地界面を介して細胞をガス環境に間接的にさらすことにより、細胞が空気流に直接接触することがないため、細胞に損傷を与えることなく、かつ／または細胞を死なせることなく細胞の効率的な酸素化が提供される。
【００３６】
本発明の第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは、限定されないが、ポリプロピレン、プラスチック、または熱可塑性物質を含む材料から構成することができる。各チャンバーの容積は変えることができ、同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、各チャンバーの容積は約１０ミリリットル〜約５０００ミリリットル、さらに好ましくは約５０ミリリットル〜約２５００ミリリットル、最も好ましくは約１００ミリリットル〜約１０００ミリリットルである。
【００３７】
さらに別の実施形態では、細胞培養装置は、第１のチャンバーと第２のチャンバーとを隔てる少なくとも１つの膜をさらに含む。膜は透過性とすることができ、さらに多孔性として、生育基質手段を保持かつ／または支持するように構成することができ、プラットホームして働く。
【００３８】
透過性膜は、限定されないが、例えば半透過性繊維（ｆｉｂｅｒ）、半透過性ポリマー担体、金属、またはプラスチックを含む材料から構成することができる。透過性膜は、膜が生育基質の重量を支持し、保持し、または支えることができれば、どのような形状であってもよい。好ましい実施形態では、細胞培養を妨害することなく、かつ／またはスタティックミキシングが可能な細胞を除去することなく、一方のチャンバーから他方のチャンバーへの培養培地の出入りを可能にするために、膜は透過性および多孔性となっている。特に、第１の透過性膜と同一または同様の特性を有することのできるさらなる透過性膜を、生育基質手段の反対側に配置することができ、第１のチャンバーに対して同一の位置に生育基質手段をほぼ保持し、かつ維持して、生育基質手段が生育培地中に浸漬される間に生育基質手段が移動するのを防止する。本発明による生育基質手段は多孔性とすることができ、限定されないが、セラミック、ポリマー、織布基質、不織布基質、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、フルオロカーボンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリビニルアルコール、ガラス、シリカ、およびＤＥＡＥを含む材料から構成することができる。多孔性生育基質手段は、限定されないが、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）、マイクロペレット（ｍｉｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）、半透過性ペレット、マクロペレット（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｅｌｌｅｔ）、半透過性膜、または半透過性中空繊維を含む形状または大きさに構成することができる。本発明によるこれらの生育基質手段を使用することにより、細胞付着および空気／生育培地面の表面積が最大となる。
【００３９】
生育基質手段は、限定されないが、中空繊維、繊維束、細胞生育キューブ、および溝切りセラミック芯を含む形状とすることもできる。これらのタイプの生育基質手段のすべてが共有する多くの利点の１つは、細胞の生育および付着のための表面積が大幅に増大することである。本発明の生育基質手段は、前記したように、中空繊維、繊維束、細胞生育キューブ、および溝切りセラミック芯等のマイクロキャリアシステムに関連するすべての市販の基質システムを考慮している。本発明により考慮されたマイクロキャリアおよび関連する基質を、蛋白質および／または他の生物学的または化学的特徴により被覆して、細胞付着を向上させ、または特定タイプの細胞付着を選択的に向上させることができる。
【００４０】
マイクロキャリアシステムには、商業的に有利な生産速度かつ低い人件費で細胞生育を促進する可能性がある。本発明の細胞培養装置は、ローラボトルおよび他の公知のシステムとは異なり、小規模および大規模の両方の細胞複製および細胞生成を可能にするものである。加えて、マイクロキャリアバイオリアクターシステムは、付着依存性細胞の自動化された大規模培養に十分に適している。
【００４１】
付着依存性細胞生成システムにおいてマイクロキャリアを使用するには、細胞培養物を酸素化するための撹拌システムの使用可能性が必要となる。システム要素は互いに相互作用して、細胞を含むマイクロキャリアビードを栄養培地中に浮遊させておく。反対に、本発明では、細胞に十分な栄養分および酸素化を提供するための撹拌システムは不要である。これは１つのチャンバーから別のチャンバーへ培養培地を間欠的かつ周期的に移動することにより、混合が促進され、除去された細胞に対して生育基質手段に再度付着する第２の機会を与え、これにより細胞付着、従って、細胞生育の向上および細胞生成物の生成の増加が最大となる。
【００４２】
マイクロキャリアとして有用となるように、材料は細胞付着および生育を支持する表面化学物質を有する必要があり、細胞または合成された生成物にとって有毒なものであってはならない。理想的にはマイクロキャリアの直径を約７５〜２２５μｍとすべきであるが、これよりも大きいまたは小さい大きさ（米国特許第５，１１４，８５５号（１９９２年５月）、Ｊ．Ｖａｒａｎｉ，Ｓ．Ｊｏｓｅｐｈｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｈｉｌｌｅｇａｓ，“Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｐｌｏｉｄ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ（集合体のポリスチレンマイクロキャリアにおけるヒトの二倍体線維芽細胞の生育）”，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２：１１１−１１７（１９９６））が使用されている。
【００４３】
本発明は、ペレット形状の新規な生育基質手段を教示している。生育基質手段は、個々の必要に応じてどのような直径でも適切と考えられるが、約１ミリメートル〜約１００ミリメートルの直径を有する種々の大きさとすることができる。さらに、本発明では、有用と考えられるどのような形状であってもよい。本発明の好ましい実施形態では、生育基質手段は、マトリックスとして荒充填された凹凸形状のペレットである。
【００４４】
本発明によるペレットの理想的な濃度は１．０２〜１．０５ｇ／ｃｃであるが、異なる適用例にはこれよりも薄いまたは濃い材料がより適している。表面化学物質の差に加えて、ペレットは、構成する基質ごとに剛性、多孔性、吸収性等の特徴が異なる。全体の製造費が異なるのと同様に、処理特性、耐久性、保存期間、および滅菌の容易さがすべて基質ごとに異なる。商業上の可能性の点から、本発明はこれらの変形例のすべてに適応可能である。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態によれば、多孔性生育基質手段および／またはペレットが設けられる。多孔性生育基質手段を使用して、少なくとも３つの方法で細胞の生育および生存能力を向上させる。
【００４６】
第１に、多孔性ペレットを生育培地中に浸漬すると、混合装置よりも弱い半透過性ペレットマイクロキャリアを使用する場合のように、ペレットの多孔空間内に静かな撹拌が生じ得る。従って、多孔性生育基質ペレットは、生育培地の移動時に静かな撹拌環境を生じさせるため、スタティックミキサーとして働くことができる。理論に縛られることなく、この静かな撹拌作用は、栄養分を静かに混合かつ分配し、除去された細胞を再分配し、除去された細胞が生育面に再付着する可能性を高めることにより、細胞の生育を向上させる。除去された細胞、特に付着依存性細胞の再分配は、培養物の生存能力全体の向上を助けることができる。
【００４７】
第２に、多孔性ペレット生育基質を生育培地中に浸漬しない場合、多孔性基質の固有の構造により、細胞がガス環境に直接さらされるのを防止しながら、細胞に効率的に酸素化を提供することができる。従って、多孔性ペレット生育基質は細胞の効率的な酸素化装置として働く。細胞をガス環境に直接さらすことは、細胞生育にとって有害であり、さらに、損傷または特に動物細胞に当てはまる死が生じる可能性がある。生育基質手段が培養培地から出現すると、生育培地の一部または被覆が多孔性ペレットの表面に残り、これにより、生育培地の薄層内の基質手段上に埋め込まれた細胞、または基質手段上で生育する細胞を被覆する。これにより、酸素の効率的な拡散を考慮した薄いガス／生育培地界面が作られ、細胞が空気に直接さらされることなく効率的に酸素を取り込むことができるようになる。さらに、多孔性ペレット生育基質により、細胞生育のための、かつ細胞が空気／生育培地層に接触するための表面積が最大となる。
【００４８】
第３に、多孔性ペレット生育基質は、プレーティングおよび／または接種中に細胞を捕捉するデプスフィルターとして働き、これにより付着する細胞の数を増加させる。多孔性ペレット生育基質は、接種中に細胞を容易かつ効率的に分配することを考慮し、かつ多孔性ペレット生育基質手段の表面への細胞付着を確実に最大にする、荒充填床を形成することができる。
【００４９】
本発明に有用な空気は、限定されないが空気を含む、細胞生育に適したガスの適宜の混合物とすることができる。本発明の細胞培養装置の第１のチャンバーは少なくとも１つの開口を有することができ、この少なくとも１つの開口は細胞培養培地および細胞を受け、かつ除去するように構成され、細胞培養装置と外部環境との間の空気交換を考慮している。開口は閉鎖手段を受けるように構成されている。オプションとして、開口と閉鎖手段との間にフィルターを配置して、空気の供給を受け、汚染物質を最少にすることができる。開口はどのような形状および直径としてもよい。
【００５０】
閉鎖手段は、限定されないが、スクリューキャップまたはスナップキャップを含む形状とすることができる。さらに、閉鎖手段は、限定されないが、プラスチックを含む材料から構成することができる。好ましい実施形態では、閉鎖手段はエアフィルター（ａｉｒ  ｆｉｌｔｅｒ）を含むことができ、このエアフィルターは、微生物、細胞、ウィルス、または他の汚染物質が細胞培養装置に出入りすることができないようにする。滅菌エアフィルターは当業界で公知であり、例えばマサチューセッツ州、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている。
【００５１】
本発明の細胞は、真核細胞および／または原核細胞とすることができる。好ましい実施形態では、細胞は動物細胞、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。細胞は、例えば、昆虫細胞、例えばＳｆ−９、霊長類細胞、例えばベロ（Ｖｅｒｏ）、マウス、例えばＢＨＫまたはＣ−１２７、ハムスター、例えばＣＨＯ、真菌、例えばサッカロミセスまたはシゾサッカロミセス（Ｓｃｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヒト、例えば腫瘍、骨芽細胞、および間葉幹細胞を含む、あらゆるタイプの組換えまたは非組換え原核細胞または真核細胞とすることができる。原核細胞は、限定されないが、大腸菌および枯草菌を含む、好気性または嫌気性、グラム陽性菌またはグラム陰性菌、あるいは組換えまたは非組換えとすることができる。本発明による細胞培養装置においてあらゆる細胞を生育させることができる。特に、本発明に最適な細胞は、付着依存性または非付着依存性とすることができる。付着依存性細胞は生育する表面を必要とし、非付着依存性細胞は液体に浮遊した状態で生育することができる。すべてのタイプの細胞が十分な酸素、栄養分、および生育するための生育因子を必要とする。
【００５２】
さらに別の実施形態では、本発明は三次元組織培養物を生育させるための細胞培養装置を提供する。移植用の組織を培養するには、組織が食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を受ける前に複数の条件を満たす必要がある。このＦＤＡの要件は、限定されないが、組織構造体の生育のための疾患の一貫性および再現性を改善する機能性、および証明された滅菌性を含む。生体内の機能性を達成するために、設計される組織構造体は三次元でなければならない。再現性を持たせるために、細胞培養環境をヒトの生理機能に合わせて調整すべきである。生育構造体の無菌モニタによるデータを使用して、滅菌性を確認し、明細を確立することができる。
【００５３】
移植可能な組織は３つの重要な特徴、すなわち、１）機械的安定性および足場のための細胞外マトリックス、２）生存能力および機能を維持するための細胞間接触、３）生育および増殖のために細胞分集団を分離する三次元形状を有する。標準の組織培養手法（例えば、Ｔフラスコ、ペトリ皿、ローラボトル、撹拌ローラボトル）は器官機能に直接取って代わる移植可能な組織を一貫して発生させることができない。組織を発生させることができないのは、多次元の細胞間接触がないことや不要な細胞分集団の過生育に関連する場合が多い。本発明は、従来技術の制限および欠陥を克服する。例えば、従来技術のローラボトルおよび撹拌リアクターは、細胞の持続した三次元生育を妨げる。加えて、ウィルスの発生に関し、ローラボトルからのプラーク形成単位／細胞収量は１９５、マイクロキャリア／スピナフラスコからは１０９、本発明からは３１３である。生成量が２、３倍増加する。剪断により、損傷に強い細胞分集団のみが事前に選択される。本発明は、乱流およびそれに伴う剪断が加わるのを減少させ、最少にし、制御し、かつ細胞の特定集団が事前に選択されるのを防ぐ。
【００５４】
標準の細胞培養ローラボトルに固有の選択圧に加えて、正常な生育を妨げる従来技術の種々の技術的操作により導入された他の選択圧がある。詳細には、これらの技術的操作は培養物への給餌に関連する。
【００５５】
培養培地を交換、変更、または補給する必要があるときに、ローラボトルまたは撹拌タンクバイオリアクターに関連した複数の欠陥がある。これは「培地交換モード」と呼ばれる。詳細には、マイクロキャリアを使用して細胞の生育を支持する撹拌タンクバイオリアクターのための潅流または流加方法等の培地交換モードは、スピンフィルター（ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ）、傾斜した分離板、または交互する接線流れ装置等のさらに複雑な装置を必要とするため難しくなる可能性がある。さらに、公知の方法および装置に培地交換の潅流モードを適用すると、付着した細胞が洗い流される。本発明は、剪断応力を低下させ、細胞の除去を減少させるように設計された潅流モードを使用することにより、この欠点を救済する。
【００５６】
本発明の体積調節および／または体積調整手段は、限定されないが、ベロー、フローティングバッグ、ピストンアセンブリ、バルーン等の圧縮可能なチャンバーを含むことができる。さらに、圧縮可能なチャンバーに電力供給する本発明の駆動手段は自動または手動とすることができる。
【００５７】
体積調節および／または体積調整手段の機構についてさらに説明する。本発明で考慮される自動駆動手段は、コンピュータ等の電子装置により制御することができる。本発明の駆動手段の制御は、当業者に公知の自動化方法により制御することができ、例えばロボット工学を使用して本発明を自動化することができる。
【００５８】
体積調節手段がベロー等の圧縮可能なチャンバーである場合、ベローは圧縮または減圧されてベロー内の培養培地の量を調節する。例えば、ベローが最大限まで圧縮されると、内部に含まれる培養培地は最少となる。ベローが最大限まで減圧されると、内部に含まれる培養培地は最大となる。より詳細には、ベローが圧縮されると、圧縮チャンバーから第１のチャンバー内へ培養培地が同時に移動する。この第１のチャンバーでは、培養物の細胞にとって有害なレベルの剪断力を発生しないように生育基質手段が配置されている。培養培地を含むチャンバーは、生育基質手段を含むチャンバーの上に、チャンバーの下に、かつ／またはチャンバーと並んで、かつ／またはチャンバーを囲んで配置することができる。ベローの圧縮および減圧、従って、１つのチャンバーから別のチャンバーへの培養培地の移動を一定の間隔および／または不規則な間隔で発生させることができ、培養物の特定の細胞に最適レベルの酸素化を提供するように最適化することができる。酸素化の最適レベルは当業界で公知である。例えば、酸素濃度が高すぎると、特に高度に分化した細胞を持つ細胞の生育にとって有害であることが当業界で公知である。同様に、酸素濃度が低すぎると、細胞、特に動物細胞および哺乳動物細胞が代謝および生育に酸素を必要とするため、細胞の生育にとって有害であることも当業界で公知である。
【００５９】
本発明の第２の実施形態では、体積調節および／または体積調整手段は、第２のチャンバー内で培養培地の体積を調節し、かつ１つのチャンバーから別のチャンバーへ培養培地を移動するために膨張または収縮するように構成されたバルーンである。従って、バルーンが最大限まで膨張すると、第２のチャンバー内の培養培地は最少となる。バルーンが最大限まで収縮すると、第２のチャンバーの培養培地は最大となる。本発明により考慮されたバルーンは、例えば、ゴム、ラテックス、または膨張可能なプラスチックなどいかなる材料からも構成することができる。より詳細には、バルーンは培養培地を含むチャンバー内に配置されるので、バルーンが膨張すると、培養物の細胞にとって有害なレベルの剪断力を発生しないように、培養培地を含むチャンバーから生育基質手段を含むチャンバーへ培養培地が同時に移動する。あるいは、バルーンが収縮すると、生育基質手段を含むチャンバーから培養培地を含むチャンバーへ培養培地が同時に戻り、続いて、生育基質手段がガス環境にさらされ、細胞は、生育基質手段に埋め込まれているため、薄いガス／生育培地界面により被覆されて酸素を受ける。従って、本発明の細胞培養装置と共に使用される体積調節および／または体積調整手段のタイプにかかわらず、本発明の細胞培養物は、間欠的かつ周期的に培養培地に浸漬されて栄養分を受けるか、または薄いガス／液体界面を介してガス環境に間接的にさらされて酸素を受ける。バルーンの膨張および収縮は、一定の間隔および／または不規則な間隔で発生させることができ、培養物の特定の細胞に最適レベルの酸素化を提供するように最適化することができる。
【００６０】
本発明の第３の実施形態では、体積調節手段はピストンであり、ピストンの移動により、１つのチャンバーから別のチャンバーへ培養培地が同時に移動する。例えば、ピストンが最大限まで押されると、第２のチャンバー内の培養培地は最大の体積となり、ピストンが最大限まで引き出されると、第２のチャンバー内の培地は最小となる。
【００６１】
別の実施形態では、本発明による細胞培養装置は少なくとも１つのチャンバーを有する。装置はオプションとして２つのチャンバー、すなわち第１のチャンバーおよび第２のチャンバーを含むことができる。第１のチャンバーは第２のチャンバーの上に、第２のチャンバーの下に、第２のチャンバーと並んで、または第２のチャンバーを囲んで配置することができ、第２のチャンバーは第１のチャンバーの上に、第１のチャンバーの下に、第１のチャンバーと並んで、または第１のチャンバーを囲んで配置することができる。第１のチャンバーは、細胞付着および細胞生育を促進するための生育基質手段と、培養培地の移動を促進するための透過性かつ多孔性の少なくとも１つの膜、好ましくは２つの膜と、生育基質手段に酸素を提供するためのガス環境とを含むように構成することができる。生育基質手段は、オプションとして第１のチャンバーの内面に固定係合させ、かつ／または取り付け、かつ／または吊り下げることができる。第２のチャンバーは、培養培地と、第２のチャンバーから第１のチャンバーへ、かつ第１のチャンバーから第２のチャンバーへ培養培地を移動するための機構とを含むことができる。第２のチャンバーの移動機構には、最適レベルの酸素化および栄養分を培養物の細胞に提供するように、一定の間隔および／または不規則な間隔で自動かつ／または手動で電力供給することができる。第１のチャンバーは膜を介して第２のチャンバーへ接続される。好ましい実施形態では、生育基質手段は２つの多孔性膜間に配置される。
【００６２】
あるいは、本発明は、第１のチャンバー内に配置された、細胞を含む生育基質手段と、培養培地を含む第２のチャンバーとを備える細胞培養装置を提供する。生育基質手段および第２のチャンバーは、いずれも第１または遠位の端部および第２または近位の端部を有する。第２のチャンバーはほぼ遠位端で培養培地を含むように、かつほぼ近位端でガス環境を含むように構成される。細胞培養物チャンバーは、プラスチックまたはポリプロピレン等のいかなる材料からも構成することができる。第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは互いに嵌合し、またはオプションとして互いに一体化される。
【００６３】
本発明の第４の実施形態は、オプションとして多孔であり生育基質手段を上部に有する表面または膜に固定係合された体積調節または液体調整手段として、密閉されたフローティングバッグおよび／またはコンテナアセンブリを含み、フローティングバッグは内部に含まれた空気を使用して、生育基質手段を上下方向に移動し、従って同時に培養培地を移動する。例えば、フローティングバッグが空気で膨張すると、生育基質手段が上方に推進されて生育基質培地の浸漬から出て、薄いガス／液体界面を介してガス環境に間接的にさらされて酸素化を提供する。フローティングバッグが収縮すると、生育基質手段は下方に推進されて培養培地中に浸漬され、細胞が栄養分を受ける。フローティングバッグアセンブリはいかなる適宜の材料からも構成することができる。
【００６４】
本発明は、フローティングバッグアセンブリを自動または手動で膨張または収縮させて、生育基質手段に付着した細胞への酸素化および栄養分を促進するために、オプションとして、空気圧縮機等の駆動手段を備えることができる。
【００６５】
本発明の第６の実施形態は、内部に配置され吊り下げられた生育基質手段を有する第１のチャンバーを含み、第１のチャンバーが第１または近位の端部および第２または遠位の端部を有し、第１のチャンバーの遠位端が第１のチャンバーを囲む第２のチャンバーに対してほぼ開口する細胞培養装置を提供する。第２のチャンバーは第１または近位の端部と第２または遠位の端部とを有し、近位端がほぼ密閉される。空気が近位端を介して第２のチャンバーに汲み入れられるときに生育基質手段が培地中に浸漬され、空気が第２のチャンバーから引き出されるときに薄いガス／生育培地界面を介してガス環境に間接的にさらされる。空気圧縮機等の駆動手段により第２のチャンバーに空気を汲み入れ、または第２のチャンバーから空気を引き出すことができ、駆動手段には自動または手動で電力供給することができる。
【００６６】
本発明は、真核細胞および／または原核細胞、好ましくは動物細胞および哺乳動物細胞である培養物細胞に対する新規な方法であって、細胞培養装置の第１のチャンバー内に配置された生育基質手段上に生育培地および細胞浮遊物を分配するステップと、生育基質手段を支持する少なくとも１つの表面および／または膜を提供するステップであって、膜および／または表面が好ましくは多孔性であるステップと、第１のチャンバーの第１の端部に少なくとも１つの開口を設けて生育培地および細胞の付加および／または除去を可能にし、かつ開口を密閉するように構成された少なくとも１つの閉鎖手段を設けるステップとを含む方法を提供する。閉鎖手段は、オプションとして、フィルターを備え、空気交換を可能にし、汚染物質がチャンバー内に入るのを最小限にする。装置は、培養培地を受ける第２のチャンバーと、１つのチャンバーから別のチャンバーへ培養培地を移動する体積調節手段と、培養培地中に含まれる細胞により生成された細胞生成物を採取する方法とをさらに備える。
【００６７】
本発明の細胞培養装置は、透過性かつ／または多孔性であって第１のチャンバーを第２のチャンバーから分離するように構成された少なくとも１つの膜バリアをさらに含む。さらに、好ましい実施形態では、細胞を含むペレットを閉じ込めるために、生育基質手段の両側に膜がある。第２のチャンバーは培養培地を含むことができ、第１のチャンバーの上に、かつ／または第１のチャンバーの下に、かつ／または第１のチャンバーと並んで、かつ／または第１のチャンバーを囲んで配置することができ、従って第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間を生育培地が静かに流れ、または移動できるようになる。膜は半透過性繊維、半透過性ポリマー担体、金属、またはプラスチック等の材料から構成することができる。さらに、膜は生育基質を定位置に支持または保持し、かつ／または閉じ込めることができる。
【００６８】
本発明は、生育基質手段に細胞を接種し、かつ／またはプレーティングするステップをさらに含む。
【００６９】
さらに、本発明は、生育基質手段に付着した細胞を培養培地中に浸漬して細胞に栄養分を提供し、または生育基質手段に付着した細胞を薄いガス／生育培地界面を介してガス環境に間接的にさらして、細胞に損傷を与えることなく、かつ／または死なせることなく生育基質手段を培養培地から出現させることにより細胞を酸素化するために、細胞培養装置内の生育基質手段または培養培地を周期的かつ／または間欠的に移動する新規な方法を提供する。
【００７０】
本発明の更なる実施形態では、前記実施形態の方法が、分泌細胞生成物を含む生育培地を採取するステップをさらに含む。分泌細胞生成物は、限定されないが、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、抗体、およびウィルスを含むことができる。生育培地を採取するステップは、デカントすることにより、かつ／または従来の方法により、第１のチャンバー内に設けられた開口を通して細胞培養装置から生育培地を収集するステップと、生育培地中に含まれる分泌蛋白質を採取するステップとをさらに含む。当業界で公知の生育培地を採取する方法、例えば、培養物チャンバーから生育培地をデカントすること、および／または吸引することが本発明により考慮されている。使用済みの細胞培地の除去後に、本発明の方法は、採取後に新しい培養培地を十分な量だけ細胞培養装置に補給して、細胞培養物を育て、かつ細胞培養物に栄養分を与えるステップをさらに提供する。生育基質手段は再び周期的かつ間欠的に新しい培養培地中に浸漬され、前記したように第２のチャンバーの容積が最小から最大になるときに、薄いガス／生育培地界面を介して細胞がガス環境に間接的にさらされる。従って、細胞培養装置は、細胞が所望の細胞生成物を生成できなくなるまで永久的に実施することができる。本発明の細胞培養装置は単純な構成であるため、安価かつ使い捨て可能であり、従って、装置の滅菌に関連する問題が回避される。
【００７１】
例として図を参照するが、これらの図は本発明の範囲を限定するものではない。図１Ａおよび１Ｂは本発明の第１の実施形態の細胞培養装置を示す。第１のチャンバー１１０は生育基質手段１２０を含む。生育基質手段１２０は、セラミック、ポリマー、織布基質、不織布基質、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、フルオロカーボンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリビニルアルコール、ガラス、シリカ、およびＤＥＡＥを含む適宜の材料から構成することができる。オプションとして、生育基質手段１２０は多孔性とすることができる。生育基質手段１２０は細胞付着を考慮し、かつその上に含まれる細胞が、ガス環境に直接さらされることなく酸素化されることを考慮している。細胞、特に動物細胞および哺乳動物細胞を直接さらすことは有害であり、培養物の細胞死を生じさせ、かつ培養物の生存能力をなくす可能性がある。
【００７２】
生育基質手段１２０は、限定されないが、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、マイクロキャリア、半透過性ペレット、マクロペレット、半透過性膜、または半透過性中空繊維を含むいかなる形状または大きさとすることができる。
【００７３】
第１のチャンバー１１０は第２のチャンバー１３０に接続され、第１のチャンバー１１０は第２のチャンバー１３０に嵌合し、または第２のチャンバー１３０と一体化され、第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーは生育培地を含み、両チャンバーは少なくとも１つの連通開放路を有して流体および空気が１つのチャンバーから別のチャンバーへ流れ、かつ移動できるようにする。第１の実施形態では、第２のチャンバー１３０は、圧縮および減圧可能なベロー形状とすることのできる圧縮可能な部品を有する。第２のチャンバー１３０は生育培地または培養培地を含むことができる。図１Ａは、第２のチャンバー１３０内の圧縮可能な部品が非圧縮形状であり、従って第２のチャンバーに培養培地を充填した状態を示す。従って、生育基質手段１２０は、薄いガス／生育培地界面を介してガス環境に間接的にさらされて酸素化を受ける。図１Ｂは、第２のチャンバー１３０内の圧縮可能な部品が圧縮形状である場合を示す。第２のチャンバー１３０が圧縮形状のときに、生育培地は第１のチャンバー１１０内に移動し、生育基質手段１２０は生育培地中に浸漬される。これに対し、第２のチャンバー１３０が非圧縮形状のときには、生育培地は第２のチャンバー１３０に含まれ、生育基質手段１２０は生育培地中に浸漬されない。第１のチャンバー１１０には、細胞および培養培地を第１のチャンバー１１０内に充填し、または第１のチャンバー１１０から引き出すための少なくとも１つの開口１４０を設けることができる。開口１４０は閉鎖手段１５０を受けるように構成される。閉鎖手段１５０は少なくとも１つのエアフィルター１６０を含み、汚染を最少にするために、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００７４】
図２Ａおよび２Ｂは、本発明の第２の実施形態の細胞培養装置を示す。図を参照する。第１のチャンバー２１０は生育基質手段２２０を含む。生育基質手段２２０は、限定されないが、セラミック、ポリマー、織布基質、不織布基質、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、フルオロカーボンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリビニルアルコール、ガラス、シリカ、およびＤＥＡＥを含む材料から構成された荒充填マトリックスから形成することができる。第２の実施形態では、オプションとして、生育基質手段２２０は多孔性とすることができる。生育基質手段２２０は、その上に含まれる細胞が、ガス環境に直接さらされることなく酸素化されるようにする。細胞、特に動物細胞および／または哺乳動物細胞を直接さらすことは有害であり、培養物の細胞死を生じさせ、かつ培養物の生存能力をなくす可能性がある。
【００７５】
生育基質手段は、限定されないが、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、マイクロキャリア、半透過性ペレット、マクロペレット、半透過性膜、または半透過性中空繊維を含むいかなる形状または大きさのペレットから作製することができる。
【００７６】
第１のチャンバー２１０は第２のチャンバー２３０に接続され、第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーは生育培地および／または培養培地を含み、両チャンバーは界面で互いに対してほぼ開口して、流体およびガスの交換、ならびに移動を促進する。第２の実施形態では、第２のチャンバー２３０はバルーン２８０形状の圧縮可能な部品を体積調節手段として含むことができる。第２のチャンバー２３０は、オプションとして生育培地を含むことができる。図２Ａは、第２のチャンバー２３０内で収縮状態にあるバルーン２８０を示す。図２Ｂは、第２のチャンバー２３０内で膨張状態にあるバルーン２８０を示す。バルーン２８０は、例えば、ゴム、ラテックス、または弾性ポリマー等の材料から構成することができる。
【００７７】
図２Ｂに示すようにバルーン２８０が膨張状態にある場合、第２のチャンバー２３０の生育培養培地の体積は最小であり、生育培地は第１のチャンバー２１０内にほぼ押入されて、生育基質２２０を生育培地中に浸漬する。バルーン２８０が図２Ａに示すように収縮状態にある場合、第２のチャンバー２３０の生育培養培地の体積は最大であり、薄いガス／生育培地界面を介して生育基質２２０を第１のチャンバー２１０のガス環境に間接的にさらして酸素化を受ける。第１のチャンバー２１０には、生育基質手段上に細胞を充填し、プレーティングもしくは接種し、または生育基質手段上から引き出し、第１のチャンバー２１０内に培養培地を充填し、または第１のチャンバー２１０内から引き出し、かつ第１のチャンバー２１０の外部の環境と空気を交換するための少なくとも１つの開口２４０を設けることができる。開口２４０には閉鎖手段２５０が装着される。さらに閉鎖手段２５０には少なくとも１つのエアフィルター２６０が装着され、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００７８】
図３Ａおよび３Ｂは本発明の第３の実施形態の細胞培養装置を示す。第１のチャンバー３１０は生育基質手段３２０を含む。生育基質手段３２０は、セラミック、ポリマー、織布基質、不織布基質、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、フルオロカーボンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリビニルアルコール、ガラス、シリカ、およびＤＥＡＥ等のいかなる材料からも構成することができる。第３の実施形態では、オプションとして、生育基質手段３２０は多孔性とすることができ、または荒充填マトリックスを形成するためにペレットの寄せ集めから構成することができる。多孔性生育基質３２０は、その上に含まれる細胞が、ガス環境に直接さらされることなく酸素化されるようにする。細胞、特に動物細胞および／または哺乳動物細胞を直接さらすことは有害であり、培養物の細胞死を生じさせ、かつ培養物の生存能力をなくす可能性がある。
【００７９】
生育基質手段３２０は、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、マイクロキャリア、半透過性ペレット、マクロペレット、半透過性膜、または半透過性中空繊維等のいかなる形状または大きさとすることができる。
【００８０】
第１のチャンバー３１０は第２のチャンバー３３０に接続され、第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーは生育培地を含み、両チャンバーは界面で互いに対してほぼ開口する。第３の実施形態では、第２のチャンバー３３０はピストン３８０を体積調節手段として含むことができる。ピストンは押し上げられ、または引き下げられて第２のチャンバー３３０内の培養培地を第１のチャンバー３１０内または第１のチャンバー３１０外へ同時に移動し、これにより第２のチャンバー３３０内の生育培地の体積が調節される。図３Ａは引き下げ位置にあるピストン３８０を示し、ここでは第２のチャンバー３３０内の生育培養培地の体積が最大となっている。図３Ｂは押し上げ位置にあるピストン３８０を示し、ここでは第２のチャンバー３３０内の生育培養培地の体積が最小となっている。ピストン３８０は、ゴム、プラスチック、金属、合成材料、またはポリプロピレン等のいかなる材料から構成することもでき、従来の方法で操作することができる。
【００８１】
ピストン３８０が下方位置にある場合、生育培地は第２のチャンバー３３０内にほぼ残り、従って、生育基質３２０をさらし第１のチャンバー３１０内で酸素化する。ピストン３８０が上方位置にある場合、ピストンは生育培地を第１のチャンバー３１０内へ駆動して生育基質３２０を生育培地中に浸漬する。第１のチャンバー３１０は、オプションとして、細胞および培養培地を第１のチャンバー３１０内へ充填し、または第１のチャンバー３１０から引き出し、かつ第１のチャンバー３１０の外部環境と空気を交換するための少なくとも１つの開口３４０を有することができる。開口３４０には閉鎖手段３５０が装着される。閉鎖手段３５０には、オプションとして、少なくとも１つのフィルター３６０が装着され、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００８２】
図４は、少なくとも１つの半中空繊維生育基質手段４２０を含む第１のチャンバー４１０を有する、本発明の第４の実施形態の細胞培養装置を示す。半中空繊維生育基質手段４２０は、織布基質、不織布基質、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、フルオロカーボンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリビニルアルコール、ガラス、シリカ、およびＤＥＡＥ等のいかなる材料からも構成することができる。半中空繊維生育基質手段４２０は、内部に含まれる細胞が、ガス環境に直接さらされることなく酸素を受けるようにする。細胞、特に動物細胞および／または哺乳動物細胞を直接空気にさらすことは有害であり、培養物の細胞死を生じさせ、かつ培養物の生存能力をなくす可能性がある。
【００８３】
第１のチャンバー４１０は第２のチャンバー４３０に一体化または嵌合することができ、第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーは生育培養培地を含むことができ、両チャンバーは界面で互い対してほぼ開口する。好ましい本実施形態では、第２のチャンバー４３０はベロー形状とすることができ、図１Ａおよび１Ｂで前記したように、圧縮または減圧されて、第２のチャンバー４３０内に含まれる生育培養培地の体積を変化させることができる。
【００８４】
第２のチャンバー４３０の圧縮時（図示せず）には、生育培養培地は第１のチャンバー４１０内にほぼ移動し、半中空繊維生育基質４２０を生育培地中に浸漬して細胞に栄養分を与える。第２のチャンバー４３０の非圧縮時には、生育培地は第２のチャンバー４３０にほぼ戻り、かつ／または第２のチャンバー４３０内に残り、従って、半中空繊維生育基質４２０内および上で細胞に酸素化を提供する。第１のチャンバー４１０は、オプションとして、開口４４１を可逆的に密閉するための閉鎖手段４５１を受けるように構成された、細胞を半中空繊維基質４２０上へ充填するための少なくとも１つの開口４４１を含む。第１のチャンバー４１０には、培養培地を第１のチャンバー４１０内へ充填し、または第１のチャンバー４１０から引き出し、かつ外部環境と空気を交換するための第２の開口４４０を設けることもできる。開口４４０は第２の閉鎖手段４５０により可逆的に密閉される。閉鎖手段４５０は少なくとも１つのエアフィルター４６０を含んで、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００８５】
図５は、半透過性バッグ生育基質手段５２０を含む第１のチャンバー５１０を有する、本発明の第５の実施形態の細胞培養装置を示す。半透過性バッグ基質５２０は、織布基質、不織布基質、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、フルオロカーボンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリビニルアルコール等のいかなる材料からも構成することができる。半透過性バッグ基質５２０は、内部に含まれる細胞が、薄いガス／生育培地界面を通して、ガス環境に直接さらされることなく十分に酸素化されるようにする。半透過性バッグまたはコンテナ基質５２０は、オプションとして、細胞を通過させることのないガス透過性とすることができる。
【００８６】
本実施形態の第１のチャンバー５１０は第２のチャンバー５３０に接続され、第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーは生育培養培地を含むことができ、両チャンバーは界面で互いに対してほぼ開口する。本実施形態では、第２のチャンバー５３０はベロー等の圧縮可能なチャンバーの形状とすることができ、圧縮または解除されて、第１のチャンバー５１０から第２のチャンバー５３０へ生育培養培地を移動することができる。
【００８７】
第２のチャンバー５３０の圧縮時には、生育培地は第１のチャンバー５１０内にほぼ移動し、かつ／または押入され、細胞に栄養分を与えるために、細胞を含む半透過性バッグ基質５２０が生育培地中に浸漬される。第２のチャンバー５３０の非圧縮時には、生育培地は第２のチャンバー５３０にほぼ戻り、かつ／または第２のチャンバー５３０内に残り、従って、半透過性バッグ基質５２０をさらして第１のチャンバー５１０内で酸素化する。第１のチャンバー５１０は、開口５４１を可逆的に密閉するための閉鎖手段５５１が装着された、細胞を半透過性バッグ基質５２０内へ充填するための少なくとも１つの開口５４１をさらに含む。第１のチャンバー５１０はさらに、培養培地を第１のチャンバー５１０内へ充填し、または第１のチャンバー５１０から引き出し、かつ外部環境と空気を交換するための第２の開口５４０を備えることができる。第２の開口５４０は第２の閉鎖手段５５０により可逆的に密閉される。閉鎖手段５５０には、オプションとして、少なくとも１つのエアフィルター５６０が装着され、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００８８】
図６Ａおよび６Ｂは、本発明の第６の実施形態の細胞培養装置を示す。培養チャンバー６１０は、フローティングバッグアセンブリ６２８およびエアチューブ６２７を制御することにより、生育培地上方に浮き、または生育培地中に浸漬する生育基質手段６２０を有する。図６Ａに示すようにフローティングバッグアセンブリ６２８に空気が充填されると、生育基質手段６２０はほぼ、しかし間接的に培養チャンバー６１０のガス環境にさらされ、内部に含まれる細胞は薄いガス／生育培地界面を介して酸素化される。図６Ｂに示すようにフローティングバッグ６２８がほぼ収縮すると、生育基質手段６２０は生育培地中にほぼ浸漬されて、その上に付着した細胞が栄養分を得ることができる。
【００８９】
培養チャンバー６１０は、オプションとして、生育培地を培養チャンバー６１０内へ充填し、培養チャンバー６１０から引き出し、かつ外部環境と空気を交換するための少なくとも１つの開口６４０を含むことができる。開口６４０は閉鎖手段６５０により可逆的に密閉される。閉鎖手段６５０は少なくとも１つのエアフィルター６６０をさらに含み、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００９０】
図７Ａおよび７Ｂは、本発明の第７の実施形態の細胞培養装置を示す。第１のチャンバー７１０は生育培地を含む。第２のチャンバー７３０は第１のチャンバー７１０に接続され、第１のチャンバー７１０の上部に配置される。第２のチャンバー７３０はケーブル７２９を通して生育基質手段７２０に接続される。基質手段７２０は、セラミック、ポリマー、織布基質、不織布基質、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、フルオロカーボンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリビニルアルコール、ガラス、シリカ、およびＤＥＡＥ等の材料から構成することができる。第７の実施形態では、オプションとして、生育基質手段７２０は多孔性とすることができる。多孔性生育基質手段は、その上に含まれる細胞が、ガス環境中の空気流または気泡の剪断力に直接さらされることなく酸素化されるようにする。細胞、特に動物細胞および／または哺乳動物細胞を直接さらすことは有害であり、培養物の細胞死を生じさせ、かつ培養物の生存能力をなくす可能性がある。
【００９１】
生育基質手段７２０は、限定されないが、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、マイクロキャリア、半透過性ペレット、マクロペレット、半透過性膜、または半透過性中空繊維を含むいかなる形状または大きさとすることができる。
【００９２】
第１のチャンバー７１０は第２のチャンバー７３０に接続され、第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーは生育培地を含み、両チャンバーは界面で直接連通することができる。第７の実施形態では、第２のチャンバー７３０はベロー等の圧縮可能なチャンバーの形状とすることができ、圧縮および減圧可能である。図７Ａは、減圧形状の第２のチャンバー７３０を示す。図７Ｂは圧縮形状の第２のチャンバー７３０を示す。第２のチャンバー７３０の圧縮時には、生育基質手段７２０は下降し、第１のチャンバー７１０内に含まれる生育培地中に浸漬されて、図７Ｂに示すように生育培地中にほぼ浸漬される。第２のチャンバー７３０の非圧縮時には、基質手段７２０は第１のチャンバー７１０に含まれる生育培養培地から出現して、生育基質手段７２０はほぼ、しかし間接的に、薄いガス／生育培地界面を介して第２のチャンバー７３０のガス環境にさらされて酸素を受ける。第２のチャンバー７３０は少なくとも１つの開口７４０をさらに含む。開口７４０は閉鎖手段７５０により可逆的に密閉される。閉鎖手段７５０は、少なくとも１つのエアフィルター７６０をさらに含み、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００９３】
図８は本発明の第８の実施形態の細胞培養装置を示す。装置は２つの培養チャンバー８１０、８１０’を示し、ここではチャンバー８１０がチャンバー８１０’の内側に配置され、チャンバー８１０’がチャンバー８１０を囲んでいる。チャンバー８１０は基質手段を含んで細胞を受け、底端部でほぼ開口して、チャンバー８１０’からの生育培養培地がチャンバー８１０からチャンバー８１０’へ、かつチャンバー８１０’からチャンバー８１０へ、チャンバー８１０の底部を通して自由に移動するようにする。チャンバー８１０’の底面は、流れを円滑化して生育基質手段８２０に付着できない細胞の蓄積をなくすように最適に設計された外形８２１’を有する。
【００９４】
チャンバー８１０は、細胞および／または培養培地をチャンバー８１０内へ充填し、またはチャンバー８１０から引き出すための少なくとも１つの開口８４０をさらに含む。開口８４０は閉鎖手段８５０により可逆的に密閉される。閉鎖手段８５０は少なくとも１つのエアフィルター８６０をさらに含み、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。チャンバー８１０’は少なくとも１つの開口８４０’をさらに含み、この開口８４０’には第２の閉鎖手段８５０’が装着される。閉鎖手段８５０’は少なくとも１つのエアフィルター８６０をさらに含み、細胞培養装置に流入または細胞培養装置から流出する空気を滅菌する。
【００９５】
チャンバー８１０内の生育培地レベルは、エアフィルター８６０’を通してチャンバー８１０’内に空気を汲み入れてチャンバー８１０’内の空気空間を変化させることにより制御される。この圧力は、生育培地をチャンバー８１０’からチャンバー８１０内へ駆動する。チャンバー８１０’内の空気が減少すると、生育基質手段８２０は生育培地中にほぼ浸漬される。チャンバー８１０’内の空気が増加すると、チャンバー８１０’内の真空により生育培地がチャンバー８１０’にほぼ戻り、これにより、生育基質手段８２０が、薄いガス／生育培地界面を介してチャンバー８１０のガス環境に間接的にさらされる。
【００９６】
図９Ａは、生育基質手段が生育培地中に浸漬されて栄養分の利用率が高い場合の本発明の生育基質手段１２０を示す。オプションとして多孔性生育基質を浸漬することにより、スタティックミキシングと呼ばれる現象が発生する。スタティックミキシングは生育培地、従って生育基質手段１２０内の栄養分の静かな混合であり、除去された細胞の再分配を助け、細胞を均一に再分配する。
【００９７】
図９Ｂは、生育培地レベルが基質手段１２０よりも低く、酸素利用率が高い場合の本発明の基質手段１２０を示す。図は、生育基質１２０を含むチャンバーから生育培地が除去されると、生育培地の薄層が多孔性生育基質の表面上に残ることを示す。この薄層は生育基質手段１２０上および／または内に含まれる細胞を保護して、細胞がガス環境内で空気流の剪断力に直接さらされることなく酸素化されるようにする。
【００９８】
図１０Ａおよび１０Ｂは本発明の第９の実施形態を示す。図１Ａおよび１Ｂの実施形態は、圧縮可能な第２のチャンバー１０３０の底部に取り付けられた１０１２で示す油圧シリンダーまたは空気圧シリンダー等の駆動装置と共に示される。図１０Ｂに示すように圧力シリンダー１０１２が上昇すると、または図１０Ａに示すように下降すると、第２のチャンバー１０３０は間欠的かつ周期的に圧縮され減圧される。第２のチャンバー１０３０の圧縮および減圧により、生育基質手段１０２０はチャンバー１０３０からチャンバー１０１０へ、かつチャンバー１０１０からチャンバー１０３０へ間欠的にかつ周期的に移動する。従って、培養培地中に生育基質１０２０を浸漬して栄養分を受け、または生育培地から出現させて生育基質１０２０上の細胞が酸素を受けるようにする。
【００９９】
図１１Ａおよび１１Ｂは本発明の第１０の実施形態を示す。図１Ａおよび１Ｂの実施形態は、圧縮可能な部品を有する第２のチャンバー１１３０の底部に取り付けられた１１１７で示すスクリュージャッキ等の体積調節機構と共に示される。図１１Ｂに示すようにスクリュージャッキ１１１７が上昇すると、または図１１Ａに示すように下降すると、第２のチャンバー１１３０は間欠的にかつ交互して圧縮され減圧される。第２のチャンバー１１３０の圧縮および減圧により、生育基質手段１１２０は生育培地中に周期的かつ間欠的に浸漬された後、薄いガス／生育培地界面を介してガス環境に間接的にさらされて酸素化される。
【０１００】
図１２Ａおよび１２Ｂは本発明の第１１の実施形態を示す。図１Ａおよび１Ｂの実施形態は、圧縮可能な第２のチャンバー１２３０の底部に取り付けられたシャフトドライバ１２１９、１２２０等の体積調節機構に接続されたモータまたはステップモータ１２１８等の駆動装置と共に示される。図１２Ｂに示すようにシャフトドライバが上昇すると、または図１２Ａに示すように下降すると、第２のチャンバー１２３０は周期的かつ間欠的に圧縮され減圧される。第２のチャンバー１２３０の圧縮および減圧により、第１のチャンバー１２１０の生育基質手段１２２０は生育培地中に周期的かつ間欠的に浸漬され、または生育培地から出現する。
【０１０１】
図１３Ａおよび１３Ｂは本発明の第１２の実施形態を示す。図２の実施形態は、空気圧縮機駆動装置と共に示される。バルブポート１３２２を開状態に維持することができる。弁ポート１３２４が開き、バルブポート１３２３が閉じると、エアポンプ１３２５により空気がバルーン１３８０内へ駆動されて、バルーン１３８０に空気が充填される。その結果、図１３Ｂに示すように、第２のチャンバー１３３０内の培養培地の体積が減少する。従って、生育培地が第２のチャンバー１３３０から第１のチャンバー１３１０内へ推進されて、生育基質１３２０が生育培地内にほぼ浸漬される。ソレノイドバルブポート１３２３、１３２４のスイッチを、例えばタイマーコントローラー１３２６により制御することができる。タイマーコントローラー１３２６は、ソレノイドバルブ１３２３、１３２４の開／閉状態を変える。バルブポート１３２４が閉じてバルブポート１３２３が開くと、バルーン内の空気が重力による培養培地の圧力によって押し出される。従って、生育培地は第１のチャンバー１３１０から第２のチャンバー１３３０へ流れ、生育培地１３２０を空気にさらす。バルーン１３８０が交互に膨張かつ収縮することにより、周期的かつ間欠的に生育基質１３２０が生育培地中に浸漬し、かつ生育基質１３２０が培養培地から出現し、薄いガス／生育培地界面を介して生育基質手段１３２０を間接的にガス環境にさらす。
【０１０２】
図１４は、本発明の第１３の実施形態を示す。図６に示す実施形態を空気圧縮機駆動手段と共に示す。基質手段１４２０は、フローティングバッグ２１４８およびエアチューブ１４２７内の空気量を制御することにより、生育培地上方に浮くことができ、または生育培地中に浸漬することができる。バルーン１４２８は生育基質手段１４２０の底部に取り付けられ、少なくとも１つのソレノイドバルブポートに接続されたエアポンプ３０等の駆動装置により空気が充填され、または空にされる。操作時には、バルブポート１４３３、１４３６は常に開いている。バルブポート１４３２、１４３７が開いてバルブポート１４３４、１４３５が閉じると、エアポンプ１４３０によりバルーン１４２８内へ空気が駆動され、バルーン１４２８を満たす。従って、生育基質手段１４２０は細胞を上方へ推進し、薄いガス／生育培地界面を介して第１のチャンバー１４１０のガス環境に細胞を間接的にさらす。ソレノイドバルブのスイッチングは、例えばタイマー１４３１により制御可能である。タイマー１４３１はソレノイドバルブポートの開／閉状態を変える。バルブポート１４３２、１４３７が閉じてバルブポート１４３４、１４３５が開くと、バルーン１４２８内の空気がエアポンプ１４３０により吸引される。その後、基質手段１４２０は培地中にほぼ浸漬される。
【０１０３】
図１５は本発明の第１４の実施形態を示す。図８に示す実施形態を空気圧縮機駆動装置と共に示す。バルブポート１５３３、１５３６が開く。ソレノイドバルブポートのバルブポート１５３４、１５３５が開くと、他のバルブポート１５３２、１５３７が閉じる。空気圧縮機１５３０により第１のチャンバー１５１０の内面に空気が押入される。従って、第１のチャンバー１５１０の生育培地レベルは空気圧により減少する。２つのチャンバー１５１０、１５１０’の下端部が互いに連通するので、培養チャンバー１５１０の培地レベルが低下するときに培養チャンバー１５１０’の培地レベルが上昇し、培養チャンバー１５１０’の培地レベルが低下するときに培養チャンバー１５１０の培地レベルが上昇する。ソレノイドバルブのスイッチをタイマー１５３１により制御することができる。タイマー１５３１はソレノイドバルブを開閉するように動作することができる。次に、バルブポート１５３２、１５３７が開き、バルブポート１５３４、１５３５が閉じ、バルブポート１５３３、１５３６は変わらず開いたままとなる。その後、外側培養チャンバー１５１０’内に空気が押入されて、培養チャンバー１５１０’内の生育培地レベルが低下する。これに対して、培養チャンバー１５１０の培地レベルは上昇する。この動作を繰り返すことにより、チャンバー１５１０、１５１０’内の培養培地が周期的かつ間欠的に１つのチャンバーから別のチャンバーへ移動し、生育培地基質１５２０が生育培地中に浸漬されて細胞が栄養分を受け、または生育培地から出現して細胞が薄いガス／生育培地界面を介して酸素化を受けるようにする。
【０１０４】
図１６は本発明の第１５の実施形態を示す。図１に示す実施形態は培地交換システムと共に示される。培地交換システムは２つの異なるモード、すなわち培地交換モードおよび生育モードで動作するようになっている。生育モードでは、バルブ１６４３、１６４４が閉じ、これによりコネクター１６４５、１６４６が閉じる。また、バルブおよび空気入口１６４７が開き、エアフィルター１６０（図示せず）を通して図１の実施形態との空気交換を可能にする。この状態では、生育培地は細胞培養装置に入ることも細胞培養装置から出ることもできない。細胞培養物により培地が使用され、かつ／または十分な分泌蛋白質が生成された後、使用済みの培地を収集して蛋白質を採取し、かつ使用済みの培地に新しい培地を補給することが望ましい。
【０１０５】
培地交換モードでは、バルブおよび空気入口１６４７が閉じている。さらに、バルブ１６４３が閉じている。第２のチャンバー１３０（例えばベロー）の圧縮と共に第１のチャンバー１１０の残りのガス圧を使用して、バルブ１６４４を開く。これはコネクター１６４６を通して貯蔵コンテナ１６４２内へ使用済み培地を放出することを考慮している。使用済み培地の放出後、バルブ１６４４が閉じる。次に、バルブ１６４３を開くことにより、吸引が形成されて、貯蔵コンテナ１６４１に含まれる新しい培地を、コネクター１６４５を通して第２のチャンバー１６３０内へ引き込む。この第２のチャンバー１３０の膨張により、新しい培地が貯蔵フラスコ１６４１からコネクター１６４５を通して細胞培養装置内へ引き込まれる。十分な量の新しい培地が送出されると、バルブ１６４３が閉じる。正常な生育モードを再び確立するために、バルブおよび空気入口１６４７が開く。すべてのバルブコントロールには、コンピュータ１６４８等の電子装置により電力供給することができる。プロセスは自動または手動で操作することができる。
【０１０６】
図１７Ａ、１７Ｂは本発明の第１６の実施形態を示す。図１に示す細胞培養装置を培地交換システムと共に示す。図１７Ａは手動で操作される第１６の実施形態を示す。図１７Ｂは自動で操作される第１６の実施形態を示す。
【０１０７】
細胞培養装置は２つの異なるモード、すなわち培地交換モードおよび生育モードで動作する。生育モードでは、ポンプ１７４３、１７４４がオフ位置にある。また、空気入口１７６０が開いて、エアフィルター１６０（図示せず）を通して図１に前記した実施形態との空気交換を可能にする。この状態では、新しい生育培地は細胞培養装置の第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーに入ることも第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーから出ることもできない。細胞培養物により培地が使用され、かつ／または十分な分泌蛋白質が生成された後、使用済みの培地が採取されて生成された蛋白質を取り出し、かつ収集された使用済みの培地を新しい培地と交換する。
【０１０８】
培地交換モードでは、空気入口１７６０を閉じることができる。ポンプ１７４４をオンにし、これにより第２のチャンバー１７３０の使用済み培地がコネクター管１７５０を通して汲み出され、貯蔵コンテナ１７４２に移送される。使用済み培地の放出後、ポンプ１７４４をオフにする。次に、ポンプ１７４３をオンにし、これにより貯蔵コンテナ１７４１内に含まれる新しい培地がコネクター管１７５１を通して細胞培養装置の第１のチャンバー１７１０に汲み入れられる。十分な量の新しい培地が送出されると、ポンプ１７４３がオフされる。正常な生育モードを再び確立するために、空気入口１７６０が開く。すべてのポンプコントロールには、コンピュータおよび／または電子装置１７４８により電力供給することができる。プロセスは自動または手動で操作することができる。
【０１０９】
図１８Ａ、１８Ｂは本発明の第１７の実施形態を示す。図１に示す細胞培養装置を本発明による培地交換システムと共に示す。図１８Ａは手動で操作される第１７の実施形態を示す。図１８Ｂは自動で操作される第１７の実施形態を示す。
【０１１０】
細胞培養装置は２つの異なるモード、すなわち培地交換モードおよび生育モードで動作する。生育モードでは、ポンプ１８４３、１８４４がオフ位置にある。また、空気入口１８６０が開いて、エアフィルター１６０（図示せず）を通して図１に示す細胞培養装置との空気交換を可能にする。この状態では、新しい生育培地は細胞培養装置の第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーに入ることも第１のチャンバーおよび／または第２のチャンバーから出ることもできない。培地が使用され、かつ／または十分な分泌蛋白質を含むと、使用済みの培地が採取されて蛋白質を取り出し、かつ使用済みの培地を新しい培地と交換する。
【０１１１】
培地交換モードでは、空気入口１８６０を閉じることができる。ポンプ１８４４をオンにすることにより、使用済み培地が細胞培養装置から汲み出されてポンプ１８４４のコネクターを通って貯蔵コンテナ１８４２内へ入る。使用済み培地の収集後、ポンプ１８４４をオフにする。次に、ポンプ１８４３をオンにして、コンテナ１８４１内に含まれる新しい培地を細胞培養装置に補給する。十分な量の新しい培地が送出された後、ポンプ１８４３をオフにする。正常な生育モードを再び確立するために、空気入口１８６０が開く。すべてのポンプコントロールには、オプションとして、電子装置１８４８またはコンピュータにより電力供給することができる。使用済み培地の収集および新しい培地の補給は自動または手動で実現することができる。
【０１１２】
図１９Ａおよび１９Ｂは本発明の第１８の実施形態を示す。本実施形態は少なくとも１つの生育チャンバーを含み、生育チャンバーは少なくとも１つの生育チャンバー壁１９９２により形成され、各チャンバーは第１の端部、第２の端部、内面、および外面を有して開口を画定する。本発明による細胞培養装置は、第１の生育チャンバーの上に、第１の生育チャンバーの下に、または第１の生育チャンバーと並んで配置された第２のチャンバーを有することができる。少なくとも１つの生育チャンバーを車輪または台１９９０上で支持することができ、本実施形態の細胞培養装置を床、テーブルまたは実験用ベンチトップ等の表面上で十分に支持することができる。各生育チャンバーは少なくとも１つの生育基質１９９１を有して少なくとも１つの細胞を受け、かつ細胞付着を可能にする。
【０１１３】
少なくとも１つの生育チャンバーは、生育培地およびガス環境を含んで、生育培地が生育チャンバーの第２の端部にほぼ含まれ、ガス環境が生育チャンバーの第１の端部に配置され、かつ／または含まれるように構成される。本実施形態は駆動手段１９９５を含み、生育チャンバーの第１の端部から第２の端部へ上下または左右方向に交互に生育基質を移動して、生育基質が周期的かつ間欠的に交互に生育培地中に浸漬され、かつ／または生育培地から出現し、細胞に最適な栄養分と酸素とを提供するようにする。駆動手段１９９５は、オプションとして第１の接続手段１９９４を含み、駆動手段１９９５を第２の接続手段１９９３に接合する。駆動手段１９９５は生育基質１９９１に接続されて、生育チャンバーの第１の端部から第２の端部へ生育基質手段を周期的かつ間欠的に交互に移動する手段、すなわち、細胞に適切な栄養分および酸素を提供するために、生育チャンバー内の生育基質を移動して交互に生育培地中に浸漬し、かつ生育基質から出現させる手段を提供する。本実施形態の駆動手段はリフトとすることができる。リフト機構は、上下または左右方向への生育基質手段の移動を促進する。
【０１１４】
オプションとして、第１８の実施形態の生育基質１９９１は多孔性とすることができる。多孔性生育基質手段は、その上に含まれる細胞が、ガス環境中の空気流または気泡の剪断力に直接さらされることなく酸素化されるようにする。細胞、特に動物細胞および／または哺乳動物細胞を直接空気にさらすことは有害であり、培養物の細胞死を生じさせ、かつ培養物の生存能力をなくす可能性がある。
【０１１５】
生育基質手段１９９１は、限定されないが、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、マイクロキャリア、半透過性ペレット、マクロペレット、半透過性膜、または半透過性中空繊維を含むいかなる形状または大きさとすることができる。オプションとして、多孔性膜のエンベロープを使用して生育基質手段、例えば多孔性ペレットまたはマイクロキャリアを含み、細胞培養培地の移動を可能にすることができる。さらに、剛性の支持構造を使用して生育基質手段を支持し、生育基質手段が培養培地の内外に移動するのを可能にすることができる。
【０１１６】
図２０Ａおよび２０Ｂは本発明の第１９の実施形態を示す。本実施形態は第１の生育チャンバーを含み、生育チャンバーは少なくとも１つの生育チャンバー壁２０９２により形成され、各チャンバーは第１の端部、第２の端部、内面、および外面を有して開口を画定する。本発明による細胞培養装置は、第１の生育チャンバーの上に、第１の生育チャンバーの下に、または第１の生育チャンバーと並んで配置された第２の生育チャンバーを有することができる。少なくとも１つの生育チャンバーは車輪または台２０９０上で支持することができ、本実施形態の細胞培養装置を床、テーブルまたは実験用ベンチトップ等の表面上で十分に支持することができる。各生育チャンバーは少なくとも１つの生育基質２０９１を有して少なくとも１つの細胞を受け、細胞付着を可能にする。
【０１１７】
少なくとも１つの生育チャンバーは、生育培地およびガス環境を含んで、生育培地が生育チャンバーの第２の端部にほぼ含まれ、ガス環境が生育チャンバーの第１の端部に配置され、かつ／または含まれるように構成される。本実施形態は駆動手段２０９５を含み、生育チャンバーの第１の端部から第２の端部へ上下または左右方向に交互に生育基質を移動して、生育基質が周期的かつ間欠的に交互に生育培地中に浸漬され、かつ／または生育培地から出現し、細胞に最適な栄養分と酸素とを提供するようにする。駆動手段２０９５は、オプションとして第１の接続手段２０９４を含み、駆動手段２０９５を接続手段２０９３に接合する。駆動手段２０９５は生育基質２０９１に接続されて、生育チャンバーの第１の端部および第２の端部側へ生育基質手段の位置決めを周期的かつ間欠的に交互に移動する手段、すなわち、細胞に適切な栄養分および酸素を提供するために、生育チャンバー内の生育基質を移動して交互に生育培地中に浸漬し、かつ生育基質から出現させる手段を提供する。本実施形態の駆動手段はスクリュージャッキ機構とすることができる。スクリュージャッキ機構は、上下または左右方向への生育基質手段の移動を促進する。
【０１１８】
オプションとして、第１９の実施形態の生育基質２０９１は多孔性とすることができる。多孔性生育基質手段は、その上に含まれる細胞が、ガス環境中の空気流または気泡の剪断力に直接さらされることなく酸素化されるようにする。細胞、特に動物細胞および／または哺乳動物細胞を直接空気にさらすことは有害であり、培養物の細胞死を生じさせ、かつ培養物の生存能力をなくす可能性がある。
【０１１９】
生育基質手段２０９１は、限定されないが、ディスク、フレーク、ブロック、プレート、シート、ストリップ、ペレット、マイクロキャリア、半透過性ペレット、マクロペレット、半透過性膜、または半透過性中空繊維を含むいかなる形状または大きさとすることができる。オプションとして、多孔性膜のエンベロープを使用して生育基質手段、例えば多孔性ペレットまたはマイクロキャリアを含み、細胞培養培地の移動を可能にすることができる。さらに、剛性の支持構造を使用して生育基質手段を支持し、生育基質手段が培養培地の内外に移動するのを可能にすることができる。
【０１２０】
本発明について、例として好ましい実施形態に関して説明したが、本発明は開示された実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。反対に、本発明は、（当業者に明らかなように）本発明の種々の実施形態を包含するものである。従って、頭記の請求の範囲には、このような修正および類似の配置をすべて包含するように最も広い解釈を与えるべきである。
【０１２１】
本開示中、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は米国特許法による意味を持ち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができる。
【０１２２】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに説明される。これらの実施例も本発明の説明であり、本発明の限定とみなすべきではなく、本発明の精神または範囲から逸脱することなく多くの明らかな変形例が可能である。
【０１２３】
【実施例】
以下の実施例は、本発明による実施形態を説明するために示すものであり、限定のためではなく、本実施例が本発明を限定することもない。
【０１２４】
実施例１  細胞培養および生育中に分泌された蛋白質の分離
対象とする異種蛋白質をコード化する、安定統合された発現可能なＤＮＡを含む遺伝子組換え系のＣＨＯ細胞を使用して、本発明の細胞培養装置に含まれる半透過性マイクロキャリアの生育基質手段に接種する。本発明による細胞培養装置は、２つのチャンバー、すなわち第１のチャンバーと第２のチャンバーとを含む。第１のチャンバーは第２のチャンバー上にあり、第１のチャンバーは本発明による生育基質手段を含み、第２のチャンバーは圧縮可能なベローを有し、培養培地を含む。
【０１２５】
生育培地および接種物が付加されると、細胞培養装置は駆動手段上に配置されてベローを周期的かつ間欠的に圧縮し減圧する。ベローが駆動手段により自動的に圧縮されると、生育培地は第２のチャンバーから第１のチャンバー内へ推進されて、マイクロキャリア生育基質手段が生育培地中に浸漬される。ベローが駆動手段により減圧されると、生育培地は第１のチャンバーから第２のチャンバー内へ移動することにより、マイクロキャリア生育基質手段およびその上に含まれる細胞が、生育基質手段の表面で維持された薄いガス／生育培地界面を介して、第１のチャンバーのガス環境に間接的にさらされる。ガス環境は最適濃度の酸素を含む。
【０１２６】
さらに、生育培地が第２のチャンバーに戻るときに、マイクロキャリア基質手段は表面に少量の生育培地を保持するため、ガス環境にさらされることにより生じる損傷から細胞が保護される。ベローの圧縮および減圧は、生育培地が周期的かつ間欠的に移動して生育基質手段、従ってその上に含まれるに細胞に接触して、最大の栄養分を細胞に提供することを考慮したものである。さらに、細胞が第２のチャンバーから第１のチャンバー内へ周期的かつ間欠的に移動することにより、除去された細胞が再分配され、かつ再付着して、培養物の全体の生存能力および生成能力が増加する。
【０１２７】
対象とする異種蛋白質をコード化する、安定統合された発現可能なＤＮＡを含むＣＨＯ細胞は、本発明により生育され、細胞をガス環境に直接さらすことなく細胞に栄養分と酸素とを交互に供給するために、１つのチャンバーから別のチャンバーへ生育培地を周期的かつ間欠的に移動することにより、最適な細胞生育と異種蛋白質の生成および分泌とが達成される。対象とする異種蛋白質は生育培地中に分泌され、長時間にわたって濃度が蓄積される。
【０１２８】
最適レベルの細胞生育が達成されると、例えば生育培地のすべての栄養分がなくなると、細胞生育培地が細胞培養装置から除去されて新しい培地が補給される。細胞生成培地は対象とする組換え蛋白質を含み、これは当業界で公知の方法により精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】第２のチャンバーが第１のチャンバーの下方に配置され、オプションとして圧縮可能であって第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間で生育培地を移動する、本発明の第１の実施形態の細胞培養装置を示す図であり、圧縮可能な第２のチャンバーが圧縮されず、生育基質手段がガス／生育培地界面にさらされて酸素化される場合を示す図である。
【図１Ｂ】圧縮可能な第２のチャンバーが圧縮され、生育基質手段が生育培地中に浸漬されて細胞が栄養分を受ける、本発明の第１の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図２Ａ】膨張可能なバルーンが第２のチャンバー内に配置され、かつ／または位置決めされ、収縮して生育培地を第２のチャンバー内に残して、第１のチャンバーの生育基質手段が薄いガス／生育培地界面を介してガス環境に間接的にさらされるようにする、本発明の第２の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図２Ｂ】膨張可能なバルーンが膨張し、従って生育培地を第２のチャンバーから第１のチャンバー内へ流れさせ、または移動することにより、生育基質手段、従って細胞を生育培地中に浸漬する、本発明の第２の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図３Ａ】ピストンが第２のチャンバー内に配置され、かつ完全に引き出されて、生育培地を第２のチャンバー内に残すように維持して、第１のチャンバーの生育基質手段が薄いガス／生育培地界面を介してガス環境に間接的にさらされるようにし、従って細胞がガスおよび／または空気に直接さらされることがない、本発明の第３の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図３Ｂ】第２のチャンバー内のピストンが押し上げられて、生育培地を第２のチャンバーから第１のチャンバー内へ流れさせ、または移動し、細胞に栄養分を与えるために生育基質手段を生育培地中に浸漬する、本発明の第３の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図４】生育基質手段が中空繊維である、本発明の第４の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図５】生育基質手段が半透過性膜バッグ、および／またはコンテナ、および／またはキャリアである、本発明の第５の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図６Ａ】第２のチャンバー内に配置されたフローティングバッグ等の空気含有装置が膨張するときに、第１のチャンバーの生育基質手段が生育培地上方を浮遊し、薄いガス／液体界面を介してガス環境に間接的にさらされる、本発明の第６の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図６Ｂ】第２のチャンバー内に配置されたフローティングバッグ等の空気含有装置が収縮するときに、生育基質手段が生育培地中に浸漬される、本発明の第６の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図７Ａ】下側チャンバー内の生育培地の移動が、圧縮可能な上側チャンバーにより制御される、本発明の第７の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図７Ｂ】下側チャンバー内の基質手段が、上側の圧縮可能なチャンバーを圧縮することにより培地中に浸漬される、本発明の第７の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図８】第１のチャンバー内の培地レベルが第２のチャンバー内の空気圧により制御され、第２のチャンバーが第１のチャンバーに囲まれる、本発明の第８の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図９Ａ】圧縮可能な第２のチャンバーを圧縮することにより、生育基質が生育培地中に浸漬される、本発明の生育基質手段を示す図である。
【図９Ｂ】生育基質手段が薄いガス／生育培地界面を通してガス環境に間接的にさらされ、圧縮可能な第２のチャンバーを減圧することにより酸素利用率が高くなる、本発明の生育基質手段を示す図である。
【図１０Ａ】第２のチャンバーの移動がピストン機構により制御され、第２のチャンバーの非圧縮時には生育培地が第２のチャンバー内に残る、本発明の第１の実施形態の構成を組み込んだ第９の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図１０Ｂ】第２のチャンバーがピストン機構により圧縮される、本発明の第１の実施形態の構成を組み込んだ第９の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図１１Ａ】スクリュージャッキアセンブリが第２のチャンバーを減圧するための駆動手段として使用される、本発明の第１の実施形態を組み込んだ第１０の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図１１Ｂ】第２のチャンバーから第１のチャンバー内へ培養培地を移動するために、スクリュージャッキアセンブリを使用して第２のチャンバーを圧縮する、本発明の第１の実施形態を組み込んだ第１０の実施形態の細胞培養装置を示す図である。
【図１２Ａ】駆動手段を使用して、生育培地を含むチャンバーを減圧する、本発明の第１１の実施形態を示す図である。
【図１２Ｂ】第２のチャンバーから第１のチャンバー内へ生育培地を移動するために、駆動手段を使用して、生育培地を含む第２のチャンバーを圧縮する、本発明の第１１の実施形態を示す図である。
【図１３Ａ】本発明の図２Ａおよび２Ｂに記載したように、駆動手段がバルーンである、本発明の第１２の実施形態を示す図である。
【図１３Ｂ】本発明の第２の実施形態について膨張状態のバルーンを示す図２Ａおよび２Ｂに記載したように、培養培地の駆動手段がバルーンである、本発明の第１２の実施形態を示す図である。
【図１４】細胞培養装置のための異なる駆動手段を使用して体積調節手段を駆動し、１つのチャンバーから別のチャンバーへ生育培地を移動する、本発明の第１３の実施形態を示す図である。
【図１５】外側チャンバー内の圧力が内側チャンバー内の圧力よりも高く、生育培地がほぼ外側チャンバーから内側チャンバー内へ移動される、本発明の第６の実施形態の構成を組み込んだ、細胞培養装置のためのさらに別の駆動手段を使用する本発明の第１４の実施形態を示す図である。
【図１６】第１の実施形態の細胞培養装置を組み込み、さらに培養された細胞のために新しい培養培地を補給し、かつ細胞培養装置に含まれた使用済みの培養培地中で溶解された細胞生成物をコネクターおよび／または管を介して収集するために、本発明による細胞培養装置に接続された２つのリザーバーを含む、本発明の第１５の実施形態を示す図である。
【図１７Ａ】第１の実施形態の細胞培養装置を組み込み、さらに培養された細胞のために新しい培養培地を補給し、かつ細胞培養装置に含まれた使用済みの培養培地中で溶解された細胞生成物をポンプを介して収集するために、本発明による細胞培養装置に接続された２つのリザーバーを含む、本発明の第１６の実施形態を示す図である。
【図１７Ｂ】第１の実施形態の細胞培養装置を組み込み、さらに培養された細胞のために新しい培養培地を補給し、かつ細胞培養装置に含まれた使用済みの培養培地中で溶解された細胞生成物を、オプションとして電子装置システムまたはコンピュータにより制御されたポンプを介して収集するために、本発明による細胞培養装置に接続された２つのリザーバーを含む、本発明の第１６の実施形態を示す図である。
【図１８Ａ】第１の実施形態の細胞培養装置を組み込み、さらに培養された細胞のために新しい培養培地を補給し、かつ細胞培養装置に含まれた使用済みの培養培地中で溶解された細胞生成物をポンプを介して収集するために、本発明による細胞培養装置に接続された２つのリザーバーを含む、本発明の第１７の実施形態を示す図である。
【図１８Ｂ】第１の実施形態の細胞培養装置を組み込み、さらに培養された細胞のために新しい培養培地を補給し、かつ細胞培養装置に含まれた使用済みの培養培地中で溶解された細胞生成物を、コンピュータおよび／または電子システムにより制御されたポンプを介して収集するために、本発明による細胞培養装置に接続された２つのリザーバーをさらに含む、本発明の第１７の実施形態を示す図である。
【図１９Ａ】少なくとも１つの内部開放空間を画定する少なくとも１つの生育チャンバーを含み、リフト状の駆動手段に接続された可動生育基質をさらに含み、生育基質が生育培地中に浸漬される、本発明の第１８の実施形態を示す図である。
【図１９Ｂ】少なくとも１つの内部開放空間を画定する少なくとも１つの生育チャンバーを含み、リフト状の駆動手段に接続された可動生育基質をさらに含み、生育基質が上下方向または左右方向に自由に移動可能であり、かつ生育培地から生育チャンバーへ出現する、本発明の第１８の実施形態を示す図である。
【図２０Ａ】少なくとも１つの内部開放空間を画定する少なくとも１つの生育チャンバーを含み、スクリュージャッキ状の駆動手段に接続された可動生育基質をさらに含み、生育チャンバーの生育基質が生育培地中に浸漬される、本発明の第１９の実施形態を示す図である。
【図２０Ｂ】少なくとも１つの内部開放空間を画定する少なくとも１つの別個の生育チャンバーを含み、スクリュージャッキ状の駆動手段に接続された可動生育基質をさらに含み、生育培地から出現する各生育チャンバーの生育基質が上下方向または左右方向に自由に移動可能であり、かつ各生育チャンバー内の酸素量を最大にする、本発明の第１９の実施形態を示す図である。
【符号の説明】
１１０  第１のチャンバー
１２０  生育基質手段
１３０  第２のチャンバー
１４０  開口
１５０  閉鎖手段
１６０  エアフィルター
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
0004430317.tif 000004
【図２Ｂ】
0004430317.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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