(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール耐性酵母ＳＡＭ００１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７３）。
【請求項２】
請求項１記載のアルコール耐性酵母を用いて製造され、グルコース及びマルトース含量が協会７号を用いて同条件で得られた清酒よりも少ない清酒。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
酒類の製造における酵母に関する。
特に、従来のアルコール耐性酵母を用いた清酒製造において問題となっているリンゴ酸などの有機酸の多量生産が改良された酵母に関する。
【０００２】
【従来の技術】
清酒醪発酵においてアルコール濃度が１０％を越えると、酵母は自ら生成したアルコールによりダメージを受けるものが現れはじめ、アルコール濃度が１５％を越え２０％近くに達すると、死滅するものも観察され、このダメージを受けた酵母および死滅した酵母から種々の物質が漏出されると考えられている。この漏出された菌体内物質が製成される清酒に雑味を与えたり、製成された清酒の品質劣化速度を速くすることから、アルコールに耐性を持つ菌株の探索が盛んに行われてきた。例えば、菅野らは、酒造場から野生のアルコール耐性酵母を分離している（Ｊ．Ｂｒｅｗ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，６５，９０２（１９７０））。また、原らは、アルコールを含む麹エキス培地でアルコール耐性酵母を育種、分離し（Ｊ．  Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．  Ｊａｐａｎ，７１，３０１（１９７６））、この系統から日本醸造協会が頒布している協会１１号が誕生した。
【０００３】
また、菌体内物質の漏出に関する基礎的な研究も進められてきた。後藤と土肥は、米および麹には検出される量は含まれていないが酵母の液胞に多量に蓄積されるＳ−アデノシルメチオニン（以下、ＳＡＭと略す。）に注目し、ＳＡＭの菌体外への漏出が清酒醪発酵における酵母菌体内物質漏出の指標となりうることを報告している（Ｊ．Ｂｒｅｗ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，８７，２３０（１９９２））。また、アルコール耐性酵母を用いた清酒醪発酵では、ＳＡＭの漏出が少ないことが明らかにされている。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
現在、清酒製造に最も頻繁に用いられているアルコール耐性菌株は協会１１号であり、他の菌株は殆ど用いられていない。
しかも、協会１１号により製成される清酒は、協会７号や協会９号、協会７０１号などの一般に広く使われている酵母菌株により製成される清酒と比較するとリンゴ酸を非常に多く含み、一般の清酒と較べるとやや異なった香味であるなどの難点があり、協会１１号が清酒製造に用いられるのは限られた場合にしかすぎない。
【０００５】
原らは、前記のアルコール耐性酵母を育種、分離とは別に、菌体溶解酵素を用いたアルコール耐性酵母の育種、分離を行っているが、この結果においてもアルコール耐性の強い菌株にはリンゴ酸高生産が認められている（Ｊ．Ｂｒｅｗ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，７３，４０８（１９７８）。
そのため、菌体内物質の漏出が少ないというアルコール耐性酵母の利点を保持しながら一般の清酒の範疇の香味を有する清酒を製成する新たな性質を示すアルコール耐性酵母の出現が望まれ、より広い目的でのアルコール耐性酵母の使用が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、清酒醪発酵が完了した後も長期間にわたり静置を続けて高濃度アルコールが存在する条件下でアルコール耐性株を育種し、このなかから様々な方法で優れた性質を有するアルコール耐性株を探索した。
様々な探索を試みていたところ、醪発酵においてＳＡＭ漏出が少ないという基準で選択した菌株のなかに、ＹＮＢＧ寒天培地（ディフコ社製イースト・ナイトロジェン・ベース０．６７％、グルコース２％、寒天２％）から麹エキス寒天培地に継代した場合は良好に生育するが、ＹＰＤ寒天培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％、寒天２％）に継代した場合やＹＮＢＧ寒天培地に継代した場合では生育が不良な菌株が存在することを見出した。さらに、これらの菌株が製成する清酒について調べたところ、リンゴ酸などの有機酸生成に問題のない良好な清酒を製成する菌株が多く存在することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、ＹＮＢＧ培地に継代後ＹＰＤ培地及びＹＮＢＧ培地に継代すると生育が不良であるという新しいタイプのアルコール耐性酵母菌株を提供するものであり、本発明の菌株は、アルコール耐性株でありながら、リンゴ酸などの有機酸含量が一般の清酒と同等である良好な清酒を製成することができるものである。
【０００８】
本発明の酵母は、醪発酵が完了した後も長期間にわたり静置を続けたものから分離した酵母菌株から探索することにより取得することができる。ここで、醪の調製に用いる酵母は、協会７号、９号または７０１号など通常の清酒製造に用いられているサッカロミセス・セレビシエに属する酵母菌株をはじめ様々な酵母を用いることができ、また、酵母を変異剤、紫外線、放射線などで変異処理したものを用いても良いが、変異処理をせずに自然誘発で起きる変異により目的の菌株を得ることができる。
【０００９】
醪の調製は、通常の清酒製造に用いられている米、麹及び水を用いればよく、必要に応じて乳酸や酵素剤などを加えてもよい。また、醪の調製方法は、従来の醪発酵の方法を適宜用いればよく、好ましくは、１０〜２０℃の温度で留後８〜２０日にアルコール濃度が１８％を越える発酵条件で行うのがよい。また、発酵が完了した醪の静置は、１０〜２０℃の温度で３０日以上続けるのが好ましく、長期間静置した後の醪の酵母を用いて再度醪発酵を行い、再度長期間静置してもよい。
【００１０】
発酵が完了した後も長期間にわたり静置を続けた醪からの酵母菌株の分離は、一般の方法を用いればよいが、好ましくは、醪を生理食塩水で希釈したものを麹エキス寒天培地に塗布し、１５〜３０℃で静置培養してコロニーを形成させ、コロニーから麹エキス寒天培地のスラントに植え継ぐのがよい。
【００１１】
分離した菌株のなかからＳＡＭ漏出が少ない菌株を選択するには、各分離菌株及び親株を用いて醪発酵の小仕込を行い、それぞれの醪上清のＳＡＭ濃度とアルコール濃度の経時変化を測定し、アルコール濃度が１８％に到達したときの醪上清ＳＡＭ濃度を親株のものと比較してＳＡＭ漏出が少ないかを判定することにより行うことができる。このとき、ＳＡＭ濃度の測定は、たとえば、後藤と土肥の方法（Ｊ．Ｂｒｅｗ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，８７，２３０（１９９２））で行うことができ、また、アルコール濃度の測定は、たとえば、国税庁所定分析法注解に記載の方法に従って行うことができる。
【００１２】
次に、上記で得られたＳＡＭ漏出が少ない菌株の中から、ＹＰＤ寒天培地及びＹＮＢＧ寒天培地では生育が不良である菌株の選択するには、上記のＳＡＭ漏出が少ないと判定された菌株をまずＹＮＢＧ寒天培地のスラントに植え継ぎ、次にこのスラントから麹エキス寒天培地、ＹＰＤ寒天培地及びＹＮＢＧ寒天培地に各々移植し、この３種の寒天培地を３０℃で３日間静置して、目視により生育状態を判定することにより、麹エキス寒天培地では生育が良好であるがＹＰＤ寒天培地及びＹＮＢＧ寒天培地では生育が不良なものを取得することができる。ここで言う麹エキス培地とは、麹米に２倍重量の水を加え、５０℃で１晩静置して麹菌の酵素により米の糖化を進めたものをろ過して得た液体から調製した培地である。麹米とは、麹室で、蒸した米を４０℃付近まで放冷したところに麹菌を振りかけて、米に麹菌を増殖させたものであり、米の澱粉を糖化する酵素が含まれている。また、生育の良、不良の判断は、接種面一面に菌体が増産する場合は良好、接種面に点々と小さな菌体の塊のみしか形成されない場合は不良と判断すればよい。
【００１３】
このようにして、醪発酵においてＳＡＭ漏出が少なく、かつ、ＹＮＢＧ寒天培地に継代するとＹＰＤ寒天培地及びＹＮＢＧ寒天培地では生育が不良である性質を持つ酵母菌株を取得することができる。このようにして得られた本発明の菌株は、通常の清酒醪発酵においてアルコール濃度が１８％に到達したときの醪上清ＳＡＭ濃度が協会７号の５０％以下であり、また、アルコール濃度が１８％に到達したときのメチレンブルー染色による酵母の死滅率は１０％以下であった。
【００１４】
本発明の菌株は、ＹＰＤ寒天培地及びＹＮＢＧ寒天培地で生育が不良である他、糖蜜培地（糖蜜１０％、硫酸アンモニウム０．５％、尿素１％、リン酸二水素一カリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０５％）を用いた通気撹拌培養での菌体の収量も協会７号の場合と較べると２０〜３０％にすぎなかった。これらのことから、具体的には物質を特定できないが麹エキスに含まれるものを本発明の菌株は要求すると考えられる。アルコール耐性酵母のなかでこのような栄養要求性を持つものは、これまでに知られておらず、本発明の菌株は新規タイプのアルコール耐性酵母であることが判明した。そこで、取得した菌株の内の１株をＳＡＭ００１と命名し、本株を受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７３として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００１５】
ＳＡＭ００１株は、協会７号を用いて前記の方法により得られた菌株であり、ＴＴＣ染色およびβ−アラニン培地での繁殖性は親株である協会７号と同じであった。
ＳＡＭ００１株のアルコール耐性能力の強さを調べるために、本株の親株である協会７号及びアルコール耐性株のなかで清酒製造に最も用いられている協会１１号と比較して、１６％アルコール存在下での生存能力、１０％アルコール存在下での増殖能力および１８％アルコール存在醪での発酵能力を測定した。その結果を表１に示す通り、ＳＡＭ００１株のアルコール耐性能力は協会１１号とは異なることが明らかになった。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
また、本発明には、本発明の酵母を用いて製造した酒類も含まれる。
本発明の酵母は、清酒をはじめ焼酎、ビール、ワインなど様々な酒類の製造に用いることが出来き、また、本発明の菌株を用いた酒類の製成は、従来の酒類の製造方法を適宜用いることにより可能である。
【００１８】
アルコール耐性株のなかで清酒製造に最も用いられている協会１１号により製成される清酒は、協会７号や協会９号、協会７０１号などの通常の清酒酵母により製成した清酒と比較するとリンゴ酸などが多量に含まれており有機酸組成が異なることが知られているが、本発明の菌株の製成する清酒について有機酸分析を行ったところ、リンゴ酸をはじめ種々の有機酸含量が親株（協会７号）のものと同等である菌株が多く存在した。
【００１９】
また、製成した清酒の清酒らしさを官能評価により判定したところ、総ての菌株のものが協会１１号により製成されたものより清酒らしさがあった。また、官能評価により香味の良さを判定したところ、親株のものよりも優れているものが多く存在した。このことから、従来の清酒の香味を持ち、良好な酒質の清酒を製成することが可能な菌株が多く含まれると推測された。
以下、具体例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
【００２０】
【実施例１】
協会７号酵母を１０ｍｌＹＰＤ培地に種菌し、３０℃で１日間静置培養した。この培養液を４００ｍｌ糖蜜培地に移植し、３０℃で３日間静置培養した。この培養液を集菌洗浄し、この酵母菌体を用い、表２に示す仕込配合で清酒醪発酵を行った。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
ここで、原料である米は日本晴（平成７年度産）を精米歩合７０％に精米して使用した。また、麹は常法により２日間麹室にて製麹し、酵素剤はスピターゼＭＫを用いた。仕込み方法は３日間に分け、初日を初添、１日置いて３日目に仲添、４日目に留添をし、１５℃で発酵させた。酵母は初添時に湿菌体重量で１ｇ添加した。
【００２３】
留後１７日に醪上清のアルコール濃度が１９．３％に達した。その後も１５℃で静置を続け、留後６０日の醪をサンプリングし、無菌生理食塩水で希釈した液を麹エキス寒天培地に塗布した。この寒天培地を３０℃で４日間静置培養し、コロニーを形成させ、各コロニーからアルコール耐性菌株探索の候補菌株のスラントを調製した。
【００２４】
ここで得られた株の内の１株である本発明の菌株ＳＡＭ００１株、及び親株である協会７号を用いて上記の方法で培養し、集菌洗浄した酵母菌体を用いて表２に示す仕込配合で清酒醪発酵を行った。このときの醪上清のアルコール濃度およびＳＡＭ濃度を測定し、その結果をそれぞれ表３および表４に示す。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
【表４】
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【００２７】
表３に示す通り、本発明の菌株のアルコール生成速度は、醪発酵前半では親株よりもやや遅かったが醪発酵後半では親株よりも速く、アルコール生成量は醪発酵末期に親株のアルコール生成量を追い越した。また、表４に示す通り、本発明の菌株のＳＡＭ漏出量は親株と比較すると著しく少なく、アルコール濃度が１８％に到達したときのＳＡＭ濃度を基にＳＡＭ漏出量を比較したところ、本発明の菌株のＳＡＭ漏出量は親株の３１．６％であった。
【００２８】
ここで、ＳＡＭ濃度の測定は、後藤と土肥の高速液体クロマトグラフィーによる方法（Ｊ．Ｂｒｅｗ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，８７，２３０（１９９２））に準じて行った。すなわち、強カチオン交換樹脂カラムＣｈｅｍｏｃｏｐａｋ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １０ＳＡを用い、リン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）の０．０５Ｍから０．５Ｍのグラジエントで展開し、２６０ｎｍの吸光度で検出することにより行った。
【００２９】
【実施例２】
本発明の菌株ＳＡＭ００１株および親株である協会７号をＹＮＢＧ寒天培地に植え、３０℃で４日間静置培養してスラントを作製した。このスラントから麹エキス寒天培地及びＹＰＤ寒天培地並びにＹＮＢＧ寒天培地に移植し、３０℃で静置培養し、３日後に目視により生育状況を判定した。その結果を表５に示す。
【００３０】
【表５】
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【００３１】
表５に示す通り、親株である協会７号は総ての培地で生育良好であった。本発明の菌株は、麹エキス寒天培地では生育は良好であったが、ＹＰＤ寒天培地およびＹＮＢＧ寒天培地では親株である協会７号のものと比較すると寒天表面に形成される菌体の塊の厚みが薄く生育不良であると判定した。特に、ＹＮＢＧ寒天培地の生育においては、親株のものは、菌を接種した部分には一面に菌体が増殖しているのに対して、本発明の菌株のものは、点々と小さな菌体の塊があるのみであり、明らかに生育不良であることが観察された。
【００３２】
【実施例３】
本発明の菌株、親株及び協会１１号を麹エキス培地に種菌し、３０℃で１日間静置培養した。これらの培養液にアルコール濃度が１６％となるようにアルコールを加え、３０℃に４時間温置し、メチレンブルー染色で死滅率を測定した。この結果を表６に示す。
【００３３】
【表６】
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【００３４】
表６に示す通り、本発明の菌株の高アルコール濃度中での生存維持能力は、協会１１号ほどは強くなかったが、親株よりは強かった。
【００３５】
【実施例４】
本発明の菌株、親株及び協会１１号を麹エキス培地に種菌し、３０℃で１日間静置培養した。これらの培養液を１０％アルコール含有麹エキス培地に酵母密度が約１０4／ｍｌとなるように移植し、３０℃で２０時間静置培養し、トーマ血球板を用いて生菌数を測定して増殖倍率を求めた。この結果を表７に示す。
【００３６】
【表７】
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【００３７】
表７に示す通り、本発明の菌株の高アルコール濃度中での増殖速度は、親株および協会１１号よりも速かった。
【００３８】
【実施例５】
本発明の菌株を麹エキス培地１０ｍｌに４本種菌し、３０℃で１日間静置培養した。この培養液１本分を麹エキス培地５００ｍｌに移植し、３０℃で２日間静置培養し、合計２Ｌの培地に増殖させた本発明の菌株の菌液を調製した。
この菌液を水１００Ｌおよび乳酸１Ｌを入れた容器に加えた後に、麹米４５ｋｇ、次いで７０％精白米１０５ｋｇを加え、常法により速醸酒母を調製した。
この調製した酒母を用いて、表８に示す仕込配合で醸造を行った。
【００３９】
【表８】
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【００４０】
ここで、原料である米は日本晴（平成１０年度産）を精米歩合７０％に精米して使用し、、麹は常法により２日間麹室にて製麹した。仕込み方法は３日間に分け、初日を初添、１日置いて３日目に仲添、４日目に留添をし、１５℃で発酵させた。酒母は、調製した全量を初添時に加えた。
【００４１】
また、留１９日に３０％アルコールを８７６Ｌ添加し、留２０日に米１２０Ｋｇを汲み水２４０Ｌのなかで酵素剤スピターゼＭを用いて５５℃で１２時間の糖化をして１５℃まで冷却したものを四段として加えた。
留２１日に上槽し、アルコール濃度20.7％、日本酒度＋７．５，酸度1.7、アミノ酸度1.7の製成酒５６８１Ｌを得た。
【００４２】
親株を用いて同様な方法で醸造した製成酒は、アルコール濃度２０．４％、日本酒度＋５．０  ，酸度１．８、アミノ酸度１．５であり、日本酒度を比較すると本発明の菌株から製成した清酒は高く、本発明の菌株を用いて辛口タイプの清酒を製成できることが明らかになった。
【００４３】
また、本製成酒のグルコースおよびマルトース濃度を測定したところ、それぞれ１．８２％および０．３０％であった。親株を用いて同様な方法で醸造した清酒の２．２６％および０．４５％と較べると、本発明の菌株により製成される清酒の残存グルコースおよびマルトースは少なく、辛口タイプの清酒を製成するのに適していると考えられる。
【００４４】
また、上槽直前の醪中の酵母の死滅率をメチレンブルー染色法により観察したところ、１９．２％であり、親株を用いて同様な方法で醸造した場合の５８．３％と比較するとかなり低かった。また、アルコール濃度が１８％に達したときの死滅率は、１．４％であり、親株を用いて同様な方法で醸造した場合の１５．０％と比較するとかなり低かった。
【００４５】
アルコール濃度が１８％に到達したときの醪上清ＳＡＭ濃度は、４．６ｐｐｍであり、親株を用いて同様な方法で醸造した場合の１２．６ｐｐｍと比較するとかなり低かった。
本製成酒並びに親株及び協会１１号を用いて本製成酒と同様な方法で醸造した清酒の有機酸分析を行ったところ、表９に示す結果が得られた。
【００４６】
【表９】
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【００４７】
表９の結果から、協会１１号により製成される清酒には協会７号のものと較べるとリンゴ酸およびコハク酸が非常に多量に含まれるが、本発明の菌株により製成される清酒の有機酸組成は、親株である協会７号のものとあまり変わらないことが確認された。
【００４８】
【実施例６】
実施例５に記載の本発明の菌株、協会７号及び協会１１号により製成された清酒を用いて、１５名のパネルが清酒らしい香味を有しているかを官能評価した。評価方法は、協会７号により製成された清酒を基準とし、５：協会７号により製成された清酒よりも非常に清酒らしい、４：協会７号により製成された清酒よりもやや清酒らしい、３：協会７号により製成された清酒と同等、２：協会７号により製成された清酒と較べるとやや清酒らしくない、１：協会７号により製成された清酒と較べると全く清酒らしくない、の５段階評価で行い、表１０に示す結果が得られた。
【００４９】
【表１０】
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【００５０】
表１０に示す通り、本発明の菌株から製成された清酒は、協会１１号により製成された清酒よりも清酒らしい香味を有していた。
【００５１】
【実施例７】
実施例５に記載の本発明の菌株、協会７号および協会１１号により製成された清酒を用いて、１５名のパネルが良質の香味を有しているかを官能評価した。評価方法は、５：非常に良い、４：やや良い、３：普通、２：やや悪い、１：非常に悪い、の５段階評価で行い、表１１に示す結果が得られた。
【００５２】
【表１１】
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【００５３】
表１１に示す通り、本発明の菌株から製成された清酒は、協会７号により製成された清酒よりもやや香味が良く、協会１１号により製成された清酒よりも良質の香味を有していた。