(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
濃縮ＰＵＦＡ−トリグリセライド混合物の製造方法において、
（ｉ）該混合物に基づいてトリグリセライド含量が８５重量％以上で、全ＰＵＦＡ含量がＴＦＡの３９重量％以上の天然ＰＵＦＡオイルを、有機溶媒又は有機溶媒混合物中に溶解させること、この場合、該天然オイルは該溶媒又は溶媒混合物に基づいて１−１０重量％で使用されること、
（ｉｉ）該混合物を−５０℃〜−１００℃の温度に５分間以上保持すること、
（ｉｉｉ）該混合物を、濃縮ＰＵＦＡ−トリグリセライド混合物（主生成物）を示す浮上物と、沈降物相（副生物）とに分離すること、
（ｉｖ）該溶媒又は溶媒混合物を、該沈降物相を分離した後、該主生成物から除去すること、
を特徴とする前記方法であって、
該有機溶媒又は溶媒混合物がエタノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、イソプロパノール、メタノールからなる群の中から選ばれるものであり、
該ＰＵＦＡが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である製造方法。
【請求項２】
該段階（ｉｉ）の時間が５分〜１２０分である請求項１の方法。
【請求項３】
該段階（ｉｉ）の温度が−８５℃〜−１００℃である請求項１又は２の方法。
【請求項４】
該段階（ｉｉｉ）の分離を、遠心分離により、１０００ｇ以上で２〜６０分間行う請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
該段階（ｉｉｉ）の分離を、濾過分離により、ドライアイス上で−６０℃以下の温度で実施する請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項６】
該ＰＵＦＡオイルが、微生物からの天然ＰＵＦＡオイル、魚油及び植物油からなる群の中から選ばれる混合物である請求項１〜５のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然のＰＵＦＡ豊富なＰＵＦＡトリグリセライド混合物（ＰＵＦＡ＝ポリ不飽和脂肪酸であり、その複数はＰＵＦＡｓで表す）に関し、最小ＰＵＦＡ含量がＴＦＡ（全脂肪酸）の＞５５重量％を持ち、これらの大部分がトリグリセライドからなる。これらはＰＵＦＡ含量がＴＦＡの＞３９重量％を持つ天然のＰＵＦＡ油から一種またはそれ以上の有機溶剤中で冷凍させることで得られる。
【背景技術】
【０００２】
ポリ不飽和脂肪酸は人間生命体に対して必須の脂肪酸である。ＰＵＨＡｓは二つの大きな群に細分割される。リノレン酸（１８：２）から出発して生成されるω−６ＰＵＦＡｓの群に加えてα−リノレン酸（１８：３）から出発して作られるα−３ＰＵＦＡｓの群がある。ＰＵＦＡｓは細胞膜、網膜および髄膜の重要な構築ブロックであり、重要なホルモン例えばプロスタグランジン、スロンボキサンおよびロイコトリエンの前駆体である。
栄養的に重要なＰＵＦＡｓの例を表１に示す。
【０００３】
【表１】
0004537707.tif 000002
【０００４】
構築ブロックとしてのそれらの機能に加えて、最近ではＰＵＦＡｓが人間生命体または身体失調に関して直接に多くの有益な効果を有することが判った。
臨床的研究の大部分はＰＵＦＡｓが例えば癌、リューマチ性関節炎、高血圧および神経性皮膚炎ならびに他の失調症の場合に治療や軽減のために重要な貢献をすることが判った。これらの結果はＰＵＦＡｓの毎日の摂取量を規定する国際的研究機関や権威筋の推奨に対して最初に応答するものである。
ＰＵＦＡｓはＣ−Ｃ二重結合を＞Ｃ９の位置で炭素鎖に導入できるであろう酵素系を欠如するため（Δ１２−デサチュラーゼの欠如）ＰＵＦＡｓは人類によっては合成できない。前駆体の脂肪酸（例えばα−リノレン酸）がダイエットにより補給されるまでは人類はポリ不飽和脂肪酸を合成することは出来なかった。然しながらこの量がポリ不飽和脂肪酸の要求を補足するのに充分かどうかは議論の余地がある。
必須脂肪酸の大部分がダイエットを通じて消費される。特に植物油はω−６脂肪酸（例えばクロフサスグリはＧＬＡすなわちγ−リノレン酸を含む）に富むが、これらの脂肪酸は此処では単に鎖長がＣ１８までのものとして存在する。
【０００５】
魚油はω−３脂肪酸を含有する（例えば鮭油はＴＦＡの１８重量％までのＥＰＡとＴＦＡの１２重量％のＤＨＡを含有する）。然しながら一般に所望のＰＵＦＡの含量は低く混合物中に存在し、その場合に拮抗作用を持つＰＵＦＡｓも同様に存在できる。特に幼児栄養の場合にＥＰＡはその出血阻止や成長阻止作用のため望ましくない（Ｍ．  Ｈａｍｏｓｈ，  （１９９８）  Ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ：  Ｗｈｏ  ｎｅｅｄｓ  ｔｈｅｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．，  ２６（２），  ２６〜１０３）。トリグリセライド組成物のためで魚油からの高濃度ＰＵＦＡトリグリセライドに自然の制限がある。魚油からのＥＰＡおよびＤＨＡの典型的な全含量はＴＦＡの約１０〜２５％である。異種で多数の脂肪酸およびこのため同様な種々のトリグリセライド種のために得られる最大のＰＵＦＡ濃度はせいぜいＴＦＡの３０重量％である。
【０００６】
生触媒的な方法（リパーゼを用いる）を使用してトリグリセライド中のＰＵＦＡ濃度をＴＦＡ（オランダのＷｏｒｍｅｒｖｅｅｒにあるＬｏｄｅｒｓ  ＆  Ｃｒｏｃｋｌａａｎ社からのＭａｒｉｎｏｌ  Ｄ４０）の約４０重量％のＤＨＡの範囲まで増加することは可能である。然しながら天然油はこの方法で生産することは出来ない。
【０００７】
同様な探求はＰＵＦＡトリグリセライドまたは構造脂質の逆合成である。ここでリパーゼ（特定または非特定の）により高純度ＰＵＦＡトリグリセライドまたは構造脂質を純粋なＰＵＦＡｓから出発して生産する（Ｇ．  Ｇ．  Ｈａｒａｌｄｓｓｏｎ，  Ｂ．  Ｏ．  ＧｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎおよびＯ．  Ａｌｍａｒｓｓｏｎ  （１９９５）：  Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｌｉｐａｓｅ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５１（３），  ９４１−９５２，  Ｒ．  Ｉｒｉｍｅｓｃｕ，  Ｋ．Ｈａｔａ，Ｙ．  Ｉｗａｓａｋｉ  およびＴ．  Ｙａｍａｎｅ  （２００１）：  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｃｙｌ  ｄｏｎｏｒｓ  ｆｏｒ  ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３−Ｄｉｃａｐｒｙｌｏｙｌ−２−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ．  ＪＡＯＣＳ，  ７８（１），  ６５−６７，  Ｆ．−Ｃ．  Ｈｕｓｎｇ，  Ｙ．−Ｈ．  Ｊ  およびＪ．−Ｃ．  Ｃｈｉａｎｇ  （１９９９）：  γ−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｒｒａｇｅ  ｏｉｌ  ｖｉａ  Ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  ＪＡＯＣＳ，  ７６（７），  ８３３−８３７）。然しながら純粋なＰＵＦＡｓが高価なためこの方法は極めて合理的でないものにしている。またこれらの場合に天然油は最早存在しない。
従って天然のトリグリセライドの形態の比較的高度にＰＵＦＡが豊富な濃縮物（ＴＦＡの＞３０重量％のＥＰＡ＋ＤＨＡ）の生産は現在では達成されていない課題である（Ｈｅｒａｌｄｓｓｏｎ，  Ｇ．  ，  Ｇ．  （２０００）：  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｅｄ．  Ｕ．  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，  Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ）。
【０００８】
海産油から比較的高度に濃縮されたＰＵＦＡ−トリグリセライド混合物を生産することも困難である（Ｓ．−Ｂ．  Ｐａｒｋ，  Ｙ．  Ｅｎｄｏ，  Ｋ．  ＭａｒｕｙａｍａおよびＫ．  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  （２０００）：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ  ｏｉｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐａｓｅ，  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ６（３），  １９２−１９５）。複雑なクロマトグラフィー法またはショートパス蒸留によって高度にＰＵＦＡｓにより濃縮されたトリグリセライド留分を理論的には単離できるが多くの問題が起こる（Ｗ．  Ｍ．  Ｗｉｌｌｉｓ，  Ｒ．  Ｗ．  ＬｅｎｃｋｉおよびＡ．Ｇ．  Ｍａｒａｎｇｏｎｉ  （１９９８）：  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆａｔｓ  ａｎｄ  ｏｉｌｓ．  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，  ３８（８），  ６３９−６７４，  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｋ．およびＨ．  Ｋｉｓｈｉｍｉｒａ  （１９９６）：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＨＡ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ  ｏｉｌｓ  ｂｙ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ．  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６２（５），  ８４２−８４３）。これらの方法は高価であり、複雑である。しかも酸化に対して不安定なＰＵＦＡｓの熱負荷は望ましくなく生成物を分解に導く。従ってこれらの方法は最早天然でない油をもたらす。
従ってＰＵＦＡ濃縮物を製造するためには使用された天然油ではなく寧ろ例えば尿素析出により濃縮された脂肪酸またはエステル混合物である（Ｓ．Ｐ．  Ｊ．Ｎ．  ＳｅｎａｎｙａｋｅおよびＦ．  Ｓｈａｈｉｄｉ  （２０００）：  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  （ＤＨＡ）  ｆｒｏｍ  ａｌｇａｅｌ  ｏｉｌ  ｖｉａ  ｕｒｅａ  ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｌｉｐｉｄｓ，  ７，  ５１−６１，  Ｗ．  Ｍ．  Ｎ．  Ｒａｔｎａｙａｋｅ，  Ｂ．  Ｏｌｓｓｏｎ，  Ｄ．  ＭａｔｔｈｅｗｓおよびＲ．  Ｇ．  Ａｃｋｍａｎｎ  （１９８８）：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｍｅｇａ−３  ＰＵＦＡ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ  ｏｉｌ  ｖｉａ  ｕｒｅａ  ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ．  Ｆａｔ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  １０，  ３８１−３８６）。これらの場合に同様にして非常に純粋なＰＵＦＡ濃縮物が製造できる。然しながら尿素の析出はトリグリセライドのために好ましくない。さらにＦＤＡは尿素の析出中に生理学的に危険なカルバメート（発癌性の物質）の生成があると報じられている（Ｂ．  Ｊ．  Ｃａｎａｓ  （１９９９）：  「ｅｔｈｙｌ  ｃａｒｂａｍａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｕｒｅａ  ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ．  ＪＡＯＰＣＳ，  ７６（４），  ５３７）．」
【０００９】
他の作者は乾燥分別（溶剤無しで）または溶剤結晶化（特にアセトンで）のような方法によりＰＵＦＡ濃度の僅かの増加と乏しい収量を報告している。ＢｉｍｂｏおよびＣｒｏｗｔｈｅｒはＴＦＡの１０重量％からＴＦＡの１１重量％へのＤＨＡ濃度の増加を達成し、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．はＴＦＡの３０．４重量％からＴＦＡの３５．３重量％へのＤＨＡ／ＥＰＡ濃度の増大を達成することが出来た（Ａ．  Ｐ．  ＢｉｍｂｏおよびＪ．  Ｂ．  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  （１９９１）：  Ｆｉｓｈ  Ｏｉｌｓ：  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｅｙｏｎｄ  ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ．  Ｉｎｆｏｆｉｓｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ６，  ２０−２５，  Ｋ．−Ｔ．  Ｌｅｅ  およびＴ．  Ａ．  Ｆｏｇｌｉａ  （２００１）：  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｎｈａｄｅｎ  ｏｉｌ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｍｅｎｈａｄｅｎ  ｏｉｌ：  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．  ＪＡＯＣＳ，  ７８（３），  ２９７−３０３）。
【００１０】
トリグリセライド当たりＤＨＡまたはＥＰＡ１モルの名目的な量で酵素的な方法または再合成を使用しないでＰＵＦＡ濃度を油の３００ｍｇ／ｇ以上に増加することは出来ない。油の３００ｍｇ／ｇのＥＰＡまたはＤＨＡ濃度を達成することは簡単ではない（Ａｃｋｍａｎｎ，  Ｒ．  Ａ．  （１９８８）：  Ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｓｈ  ｏｉｌｓ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  ７，  １３９−１４５）。ここでＴＦＡの３２．６重量％よりも大きい主要ＰＵＦＡの含量は達成されないが、一般に高含量はエチルまたはメチルエステルの形でのみ提供される（Ｍｏｆｆａｔ，  Ｃ．  Ｆ．，  Ａ．  Ｓ．  ＭｃＧｉｌｌ，  Ｒ．  ＨａｒｄｙおよびＲ．  Ａ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  （１９９３）：  Ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｓｈ  ｏｉｌｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ，  ＪＡＯＣＳ，  ７０（２），  １３３−１３８）。ここで液体窒素で凍結し、次いでー６０℃で抽出する形態の複合方法を使用する。この方法は作者によれば高度に濃縮されたＰＵＦＡを製造する方法ではなく寧ろ固体のトリグリセライドを分離する方法と見られる。液体窒素は危険な物質であり、特に産業上簡単に使用できない。
【００１１】
微生物を使用するだけで魚油や植物油よりも高濃度のＰＵＦＡｓを有する天然のＰＵＦＡ油を生産することが可能である（Ｋ．  Ｄ．  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  （１９９９）：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｉｌｓ．  Ｉｎｆｏｒｍ，  １０（４），  ３０８−３１３）。例えばこれらの油はＴＦＡの４０重量％までのＤＨＡ、ＴＦＡの３０重量％のＧＬＡまたはＴＦＡの４０重量％のＡＲＡ含有することが出来る。
【００１２】
食品分野、医療分野および幼児栄養での使用には、トリグリセライドの形態でＰＵＦＡｓを摂取することが特に好適なことが判ったのでＰＵＦＡｓが高度に濃縮された天然のトリグリセライドの投与が望ましい（Ｇ．  Ｇ．  ＨａｒａｌｄｓｏｎおよびＡ．  Ｔｈｏｒｅｒｅｎｓｅｎ  （１９９９）：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎ−３  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｌｉｐａｓｅ．  ＪＡＯＣＳ，  ７６（１０），  １１４３−１１４９，  Ｋ．  Ｏｓａｄａ，  Ｋ．  ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＭ．  Ｈａｔａｎｏ  （１９９０）：  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｉｃｈ  ｏｉｌ  ｂｙ  ｌｉｐａｓｅ  ｔｏｙｏ．  Ｊ．  Ｊｐｎ．．  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １，  ５０−５２）。逆に遊離の脂肪酸を栄養に使用するのは好ましくない。ＰＵＦＡｓも同様に天然のトリグリセライド混合物の形態で人間の乳の中に存在するので、特にこれは幼児栄養に関係する（Ａ．  Ｒ．  Ｍｅｄｉｎａ，  Ｌ．  Ｅ．  Ｃｅｒｄａｎ，  Ａ．Ｇ．  Ｇｉｍｅｎｅｚ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｐａｅｚ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｉ．  ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＥ．  Ｍ．  Ｇｒｉｍａ  （１９９９）：  Ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  ｏｉｌｓ，  Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７０，  ３７９−３９１）。
【００１３】
さらに高度な油量（例えば魚油）を消費する必要があるので、毎日消費されるＰＵＦＡｓの量は問題である。高度の量の魚油を消費する場合は副作用が起こることがあるので、特にこれは高濃度のＰＵＦＡｓを消費する必要がある患者（例えば嚢胞性線維症の場合）に関することである（Ｙ．  ＫｏｓｕｇｉおよびＡ．  Ａｚｕｍａ  （１９９４）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐａｓｅ，  ＪＡＯＣＳ，  ７１（１２），  １３９７−１４０３）。個々のＰＵＦＡｓの特殊な作用を出来るだけ得るためには、濃縮されたまたは高度に純粋なＰＵＦＡｓを使用しなければならない。従って先行技術においてはＰＵＦＡｓで高度に濃縮された天然のトリグリセライドに強い要望があった（Ｈａｒａｌｄｓｓｏｎ，  Ｇ．，  Ｇ．  （２０００）：Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ＥＰＡ  ａｎｄ  ＤＨＡ  ｂｙ  ｌｉｐａｓｅ．  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｅｄ．  Ｕ．  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，  Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ）。
【００１４】
凍結は古くから知られている油が固体成分から分離される方法であり（ワックス、脂肪族アルコール、飽和トリグリセライド）（Ｗｏｌｆ  ＨａｍｍおよびＲｉｃｈａｒｄ  Ｊ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  （２０００）から：Ｅｄｉｂｌｅ  ｏｉｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ａｃｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、一定の融点を持つ油の製造方法（Ｓ．  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｔ．  Ｎｅｚｕ，  Ｈ．  Ａｒａｋａｗａ，  Ｔ．  ＩｔｏおよびＳ．  Ｍａｒｕｚｅｎｉ  （２００１）：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈａｒｐ−ｍｅｌｔｉｎｇ  ｈａｒｄ  ｐａｌｍ  ｍｉｄｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ａｓ  ｈａｒｄ  ｂｕｔｔｅｒ  ｉｎ  ｃｈｏｃｏｌａｔｅ，  ＪＡＯＣＳ，  ７８（５），  ４５５−４６０）である。実際、これは油脂から油を製造するための選択方法である。
【００１５】
Ｙｏｋｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）：  ＪＡＯＣＡ，  ６７（１１），  ８４６−８５１はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａで醗酵させることにより製造された油から出発してＧＬＡ濃度を増大するための凍結を記載している。然しながらＹｏｋｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．は本発明を使用して得ることが出来るＰＵＦＡ濃縮物は遥かに得ていない。ＴＦＡの１０．５重量％のＧＬＡ濃度しか得ていなかった（ＴＦＡ中のＧＬＡ初期濃度は５．７重量％）。この方法では食品衛生法では許可されていない数種の溶剤が使用されていた（石油エーテル）。
【００１６】
亜麻仁油はＴＦＡの６２重量％までのα−リノレン酸（１８：３）を含んでいる。他のＰＵＦＡ特にＤＨＡおよび（または）ＥＰＡがトリグリセライドの形態でこのような高濃度で存在する天然の組成物は知られていない。然しながら特にＤＨＡおよび（または）ＥＰＡのような他のＰＵＦＡｓは特に健康に有益である。これらのＰＵＦＡｓは３個よりも多いＣ−Ｃ二重結合を有する。
【００１７】
先行技術では従って高濃度で天然のＰＵＦＡトリグリセライドを含有する組成物に未だ極めて大きな要望がある。下記のようなＰＵＦＡｓに対して特に大きな要求がある。ステアリドン酸（ＳＡ），エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびアラキドン酸（ＡＲＡ）。特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）に対して非常に高い要求がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記の先行技術に鑑み、低濃度のＰＵＦＡ油から天然で高度に濃縮されたＰＵＦＡトリグリセライド混合物を製造する方法を提供することが本発明の目的であり、ここで組成物（ＰＵＦＡトリグリセライド混合物）はステアリドン酸（ＳＡ），エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびアラキドン酸（ＡＲＡ）。特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）が好適に製造される。本発明の方法により特に好適には高められた含量のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）を有する組成物が製造できることである。
特に、提供される組成物（ＰＵＦＡトリグリセライド混合物）は詳細には４個またはそれ以上のＣ−Ｃ二重結合を有するＰＵＦＡに濃縮された組成物である。
この場合トリグリセライドの天然の特性は残されるべきである。各場合に得られる全ＰＵＦＡ含量はＴＦＡの＞５５重量％とすべきである。好適にはここで得られるトリグリセライド混合物は食品分野または特に薬理学の用途に特に好適であるべきである。従って好適には１９９８年６月１３日付けのヨーロッパ連合の諮問指令（８８／３４４／ＥＥＣ）で食品分野のために明確に記載され許可された溶剤のみを使用されるべきである。然しながら他の溶剤もこの目的には好適であることもある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
これらの目的および明記していないが本明細書で検討した関連から問題無く誘導できる他の目的は本発明請求項１で記載した方法により達成できる。本発明の方法の適切な変更は請求項１に依存した請求項に記載されている。
本発明の目的は意外にも簡単に以下の事実により達成される。
（ｉ）ＴＦＡに対して＞８５重量％のトリグリセライド含量を持ちそして＞３９重量％のＰＵＦＡ含量を有するＰＵＦＡ油を有機溶剤または溶剤混合物に溶解し、
（ｉｉ）この混合物を一定の温度に一定時間放置し、
（ｉｉｉ）この混合物を濃縮されたＰＵＦＡ−トリグリセライド混合物を含有する上澄み液（主要生成物）と沈殿相（副生物）とに分離し、
（ｉｖ）高度に濃縮されたＰＵＦＡトリグリセライドを含有する主要生成物から再度溶剤を除去する、
【００２０】
本発明の目的のためには「天然のトリグリセライド混合物」は常に本発明方法の生成物を意味する。本発明方法で使用される出発原料は常に天然のＰＵＦＡ油である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の目的のためにはＰＵＦＡ油は次のことを意味するものとする。（ＰＵＦＡ油の）組成物の全量に基づいて少なくとも８５重量％、好適には少なくとも９０重量％、特に好適には少なくとも９５重量％のトリグリセライド含量を有し、そして全脂肪酸（ＴＦＡ）に基づいて＞３９重量％全ＰＵＦＡ含量を有する組成物。本発明によれば用語油は濃度のため通常は油に割り当てられない例えばワックスおよび脂肪の混合物も包含する。例えばこれらのＰＵＦＡ油は微生物から生産され、あるいは魚油および植物油であっても良く、例えばＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ，  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ，  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ，  ＵｌｋｅｎｉａからのＤＨＡ油、ＭｏｒｔｌｉｅｒｅｌｌａおよびＰｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍからのＡＲＡ含有油、ｃｈｌｏｒｅｌｌａからのＥＰＡ含有油、遺伝子的に変性された油菜からのＧＬＡ油、さらに他の相当する組成物である。特に好適には本発明により生産された微生物油である。同様に高度に好ましいものは遺伝子的に変性された植物からの油である。さらに魚油および植物油も好適である。
従って本発明によればＰＵＦＡ油はトリグリセライドに加えて例えば少量のジグリセライドまたは遊離の脂肪酸そして自然物質から産出されたもの、ある環境下で遺伝子的に変性された物質もまた含有し、その結果常に少量の不純物が存在すると予想するべきである。本発明の目的のために天然でないと思われるＰＵＦＡ油は例えばリパ−ゼを使用した再合成により生産されたＰＵＦＡ油である。
従って本発明の目的のために天然は化学的または生触媒的な変性により生産されないことを意味する。
【００２２】
本発明の方法により、上記の方法に反してＴＦＡの＞５５重量％の全ＰＵＦＡ含量が常に得られる。同様にこの方法によればＴＦＡの＞６０重量％、好適にはＴＦＡの＞７０重量％、特に好適にはＴＦＡの＞８０重量％、そして非常に特に好適にはＴＦＡの＞９０重量％、の全ＰＵＦＡ含量を達成することができる。本発明によれば生成物は常に天然のトリグリセライド混合物として現れ、遊離の脂肪酸または他のエステルとして現れない。従ってこれらの天然のトリグリセライド混合物は本発明の好適な態様である。
【００２３】
特に好適なものは比較的高度に濃縮された混合物である。発明の目的のために全ＰＵＦＡ含量は以下に記載する群から選ばれた少なくとも２種のＰＵＦＡｓの濃縮物の合計を意味する。ステアリドン酸（ＳＡ），エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびさらにアラキドン酸（ＡＲＡ）。特に好適にはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）が混合物に存在することである。
従って組成物には明記していない他のＰＵＦＡｓも存在していることがある。然しながらこれらの他のＰＵＦＡｓは全ＰＵＦＡ含量の計算には入れない。
従って本発明により定義されるこの全ＰＵＦＡ含量は標的ＰＵＦＡ含量としても定義される。
【００２４】
本発明のさらに好適な例示態様はＴＦＡの＞５０重量％、好適にはＴＦＡの＞６０重量％、特に好適にはＴＦＡの＞７０重両％、非常に特に好適にはＴＦＡの＞８０重両％そして最高に好適にはＴＦＡの＞９０重量％の主要ＰＵＦＡ含量を持つ天然トリグリセライド混合物である。この主要ＰＵＦＡはステアリドン酸（ＳＡ），エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびアラキドン酸（ＡＲＡ）からなる群から選ばれ、特に好適なものはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）である。
【００２５】
本発明によれば好適には食品分野で許可された１９９８年６月１３日付けのヨーロッパ連合の諮問指令（８８／３４４／ＥＥＣ）に明記された溶剤を使用されるべきである。即ちプロパン、ブタン、ブチルアセテート、エチルアセテート、エタノール、二酸化炭素、アセトンおよび二窒素モノオキサイド、ヘキサン、メチルアセテート、エチルメチルケトン、さらにまたジクロロメタンである。得られた天然ＰＵＦＡトリグリセライド濃縮されたトリグリセライド混合物を食品分野で使用する場合には、健康に対する関心から他の溶剤は本発明には好ましくない。
【００２６】
本発明により最適な溶剤は好適には下記からなる群から選ばれる。エタノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、イソプロパノール、メタノール。これらの中で特に好適なものは、ｎ−ヘキサン、エタノールおよびアセトンである。また非常に特に好適なものはこれらの溶剤の混合物である。ｎ−ヘキサン／エタノール混合物が（ここでこの混合物に基づいてこの２種の溶剤の容量百分率の比が、容量百分率の合計が常に値１００を達成する条件で）２０：８０から３０：７０までの範囲にあることが本発明によれば非常に高度に好ましいことが判った。さらにまた好適なことは、ｎ−ヘキサン／アセトンが（ここでこの混合物に基づいてこの２種の溶剤の容量百分率の比が、容量百分率の合計が常に値１００を達成する条件で）５：９５から２０：８０までの範囲にあることである。最高の結果は、ｎ−ヘキサン／エタノールが（ここでこの混合物に基づいてこの２種の溶剤の容量百分率の比が、容量百分率の合計が常に値１００を達成する条件で）５：９０から＜２０：＞８０までの範囲にあることで、その結果このような溶剤混合物は本発明で非常に特に好ましく使用される。最高に好適には、ｎ−ヘキサン／アセトン（１０：９０；でＶ：Ｖ）が使用される。
食品分野の指示が考慮に入れる必要が無い場合、例えば化粧品や薬理学的用途の場合には、本発明によれば他の溶剤もまた使用することができる。この場合好適にはＡＣＮや石油エーテルのような溶剤が中でも使用することができる。
【００２７】
上記の方法の段階（ｉｉ）の温度は使用する初期混合物によって大きく変えることができる。−３５〜−１００℃の範囲の温度が特に好適であることが判った。−５０〜−１００℃の範囲の温度がさらに好都合である。一般に特に低温であることが好都合であり、−８５〜−１００℃の範囲が特に好都合である。さらに低い温度が使用できることは明白であるがエネルギー費用が増大するので通常は不経済である。
本発明によれば段階（ｉｉ）は少なくとも５分間そして１８時間までの間実施することが出来る。特に好適には、段階（ｉｉ）は５〜１２０分間で実施されるが、さらに好適には１０〜１００分間、非常に特に好適には３０〜６０分間で実施される。
段階（ｉｉｉ）からの主要生成物と副生物の分離のためには、遠心分離、ろ過およびドライアイスろ過が使用できる。
【００２８】
液状油から固体脂肪区分を分離するためには、分離される相の異なる密度の違いを利用する慣用の分離法の全てを使用することが出来る。遠心分離に加えて例えば分離デカンター等を使用できる。３０００〜４０００Ｇで遠心分離を実施するのが好ましい。１０００〜２０００Ｇの値も同様に好適である。
【００２９】
濾過には例えば濾紙による濾過、膜濾過、圧力を伴うか伴わない膜フイルタープレスのような慣用の濾過方法を使用できる。
特に好適には濾過を真空を使用しないブルーリボンフイルターを通して実施する。適当な冷却を確実にするため濾過器をドライアイスでデザインし、同様に二酸化炭素を濾過される材料に加える。これは−６５℃へ冷却するのを確実にする。
全ての場合に適当な冷却を確実にするのが（油にもよるが）必要である。
溶剤を除去するには真空中で溶剤を分離する任意の方法例えば回転蒸発器、真空でない蒸発系または方法例えば不活性ガスで溶剤を吹き飛ばす方法が好適である。
本発明の別の点から見て、本発明により好適なＰＵＦＡｓは常に少なくとも４個のＣ−Ｃ二重結合、好適には少なくとも５個、特に好適には少なくとも６個のＣ−Ｃ二重結合を含有する。
【００３０】
本発明の好適な例示的な態様は、本発明の全ＰＵＦＡ含量がＴＦＡの＞５５重量％、好適にはＴＦＡの＞６０重量％、特に好適にはＴＦＡの＞７０重量％、非常に特に好適にはＴＦＡの＞８０重量％そして最高に好適には＞９０重量％である天然トリグリセライド混合物の使用を包含し、あるいはこれらの天然トリグリセライド混合物またはそれらの二次生成物またはＴＦＡの５５重量％、好適にはＴＦＡの＞６０重量％、特に好適にはＴＦＡの＞７０重量％、非常に特にＴＦＡの＞８０重量％、そして最高に好適にはＴＦＡの＞９０重量％である組成物を包含し、主要ＰＵＦＡのうち常にステアリドン酸（ＳＡ），エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびアラキドン酸（ＡＲＡ）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）からなる群から選ばれたＰＵＦＡｓを薬理学的製剤中の活性化合物として、あるいは機能的食品の成分として、あるいは化粧品製剤の成分として、あるいは例えば製パン製品のような食品添加物として使用される。
【００３１】
略語の表
ＡＬＡ          α−リノレン酸
ＡＲＡ          アラキドン酸
ＤＨＡ          ドコサヘキサエン酸
ＤＰＡ          ドコサペンタエン酸
ＥＰＡ          アイコサペンタエン酸
ＧＬＡ          γ−リノレン酸
ＰＵＦＡ        ポリ不飽和脂肪酸
ＳＡ            ステアリドン酸
ＴＦＡ          全脂肪酸
ｗ／ｗ          重量部／重量部
ｖ／ｖ          容量部／容量部
ＴＦＡの重量％  全脂肪酸に基づく重量百分率
【実施例】
【００３２】
以下に掲げる実施例は本発明を詳細に記載する。
【００３３】
例１（ＤＨＡ含量（主要ＰＵＦＡ含量）がＴＦＡの＞５５重量％と全ＰＵＦＡ含量がＴＦＡの５８）
重量％である天然トリグリセライド混合物の製造
Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国メリーランド州コロンビア市）から市販のＤＨＡＳＣＯを使用した。最初の混合物のＤＨＡ含量はＴＦＡの４５．１重量％であった（製造者規格：ＴＦＡの４２．８％）。
１．０ｇの油のｎ−ヘキサン／エタノール（２０：８０；ｖ／ｖ）（約２．５重量％）に溶解し、−８５℃で８時間凍結する。この混合物を次いで０℃で２分間６００ｒｐｍで遠心分離し、そして上澄み液をパスツール・ピペットを使用して取り出す。ロータリー蒸発器により除去した後３７７．１ｍｇの澄明な黄色油が得られた。さらに澄明な黄色油が残渣（６３２．７ｍｇ）として得られた。この生成物区分のＧＣ分析の結果、ＤＨＡ含量は５７．５％であり、残渣に対して３８．２％である。ＤＨＡ濃度力価は１．３である。
この油を一般に知られているエステル交換によりメチルエステルを生成させた後に分析し、次いでガスクロマトグラフィー分析する（ヒューレット・パッカードＧＣ６８９０，カラム：Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ  ＦＦＡＰ  パーマボンド０．１μｍ、（２５ｍ、０．２５ｍｍ）、スプリットモード（１０：１）、担持ガス：ヘリウム（一定流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）、燃焼ガスとしての水素（３０ｍｌ／ｍｉｎ）および酸素（３００ｍｌ／ｍｉｎ）によるＦＩＤ操作、メークアップ：ヘリウム２０ｍｌ、検出器および注入器温度：各場合とも２５５℃，ＧＣ炉温度プログラム：初期温度１６０℃、保持相１２分間等温、温度上昇率１０℃／ｍｉｎで最終温度２３０℃、この温度で５分間保持、注入容積１．０μｌ）。内部標準を反応バッチに加えることで定量分析を実施することができる。
【００３４】
例２（ＤＨＡ含量（主要ＰＵＦＡ含量）がＴＦＡの＞６０重量％と全ＰＵＦＡ含量がＴＦＡの７９．５重量％である天然トリグリセライド混合物の製造）
Ｙｏｋｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９８）  ４９，  ｐｐ．７２−７６に記載されたようにして製造された油を使用した。炭素源としてグリセロールを使用して培養を実施した。最初の混合物のＤＨＡ含量はＴＦＡの４７．０重量％であった。ＤＰＡ含量はＴＦＡの１３．４重量％であった。
１．０ｇの油のｎ−ヘキサン／アセトン（１０：９０；ｖ／ｖ）（約２．８重量％）に溶解し、−８５℃で３時間凍結する。この混合物を次いで０℃で２分間６００ｒｐｍで遠心分離し、そして上澄み液をパスツール・ピペットを使用して取り出す。ロータリー蒸発器により除去した後５３７．３ｍｇの澄明な黄色油が得られる。さらに混濁した黄色油が残渣（４７２．０ｍｇ）として生産される。この生成物区分のＧＣ分析の結果、ＤＨＡ含量はＴＦＡの６４．０重量％であり、残渣に対してＤＨＡ含量はＴＦＡの３４．３重量％である。生成物区分のＤＰＡ含量はＴＦＡの１５．５重量％である。ＤＨＡ濃度力価は１．３である。
【００３５】
例３（ＤＨＡ含量（主要ＰＵＦＡ含量）がＴＦＡの＞７０重量％と全ＰＵＦＡ含量がＴＦＡの８５．３重量％である天然トリグリセライド混合物の製造）
Ｙｏｋｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９８）  ４９，  ｐｐ．７２−７６に記載されたようにして製造された油を使用した。炭素源としてグリセロールを使用して培養を実施した。最初の混合物のＤＨＡ含量はＴＦＡの４６．４重量％であった。ＤＰＡ含量はＴＦＡの１１．３重量％であった。
３．８ｇの油のｎ−ヘキサン／エタノール（１０：９０；ｖ／ｖ）（約３．８重量％）に溶解し、−８５℃で８時間凍結する。この混合物を次いで０℃において２分間６００ｒｐｍで遠心分離し、そして上澄み液をパスツール・ピペットを使用して取り出す。ロータリー蒸発器により溶剤を除去した後１７４．９ｍｇの澄明な黄色油が得られる。さらに混濁した黄色油が残渣（３．６２ｇ）として生産される。この生成物区分のＧＣ分析の結果、ＤＨＡ含量はＴＦＡの７０．１重量％であり、残渣に対してＤＨＡ含量はＴＦＡの４４．４重量％である。生成物区分のＤＰＡ含量はＴＦＡの１５．２重量％である。ＤＨＡ濃度力価は１．５である。
【００３６】
例４（生成物濃度に対する溶剤の効果）
Ｙｏｋｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９８）  ４９，  ｐｐ．７２−７６に記載されたようにして製造された油を使用した。炭素源としてグリセロールを使用して培養を実施した。最初の混合物のＤＨＡ含量はＴＦＡの４７．０重量％であった。
この油１．０ｇを次の各溶剤：アセトン、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ヘキサン／エタノール（３０：７０；Ｖ：Ｖ）（溶剤に基づき約２．５重量％油）の４０ｍｌに溶解し、−８５℃で１７時間凍結する。この混合物を次いで０℃において２分間３６００Ｇで遠心分離し、そして上澄み液をパスツール・ピペットを使用して取り出す。溶剤を除去後に澄明な黄色油が得られる。さらに混濁した黄色油が残渣として生産される。この上澄み液の分析の結果は表に再現される。使用した溶剤は実験結果に大きな影響があることが明確に理解できる。この場合６０％濃度のＤＨＡ油を製造するためにはエタノール：ｎ−ヘキサン（７０：３０、Ｖ／Ｖ）の溶剤混合物が好適であり、また６８％濃度のＤＨＡ油を製造するためには純エタノールが溶剤として好適である。
【表２】
0004537707.tif 000003