(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板減少症を有するか、またはその危機にある哺乳動物を処置するための医薬品の製造のためのトロンボポエチン（ＴＰＯ）の使用であって、該医薬品が、ｍｐｌに結合する特性を有し、血小板新生活性を示すＴＰＯの治療有効量の１回もしくは２〜６回の用量からなるＴＰＯの投与のためのものであり、
用量は血小板減少症を引き起こす医療手順または哺乳動物に血小板減少症の危機をもたらす医療手順の処置周期のＴ0プラスマイナス１０時間に哺乳動物に投与され、ここでＴ0およびＴFはそれぞれ最初の処置時間および最後の処置時間であり
処置周期は処置期および回復期を含み、回復期は処置期に続き、
処置期は、その間に哺乳動物において血小板減少症を引き起こすかまたは哺乳動物に血小板減少症の危機をもたらす医療手順が行われる連続した１〜１０日を含み、
回復期は、その間に血小板減少症を引き起こすかまたは哺乳動物に血小板減少症の危機をもたらす医療手順が行われない連続した１４日以上６０日以下を含み、
トロンボポエチンが：
（ａ）配列番号２４、
（ｂ）配列番号２３、
（ｃ）ｈＴＰＯ（７−１５１）、
（ｄ）配列番号２４との９５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号２３との９５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｆ）ｈＴＰＯ（７−１５１）との９５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号２４を含むキメラポリペプチド、
（ｈ）配列番号２３を含むキメラポリペプチド、
（ｉ）ｈＴＰＯ（７−１５１）を含むキメラポリペプチド、
（ｊ）配列番号２４との９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含むキメラポリペプチド、
（ｋ）配列番号２３との９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含むキメラポリペプチド、
（ｌ）ｈＴＰＯ（７−１５１）との９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含むキメラポリペプチド、
であり、ここでｈＴＰＯ（７−１５１）が、Ｃｙｓ7（これを含んで）からＣｙｓ151（これを含んで）までのヒトトロンボポエチン（ｈＭＬ）のアミノ酸配列である、
使用。
【請求項２】
Ｔ0＝ＴFである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
処置周期が、放射線および／または化学療法剤の複数回の処置を含む、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
処置周期が、２〜１０回の処置を含む、請求項３記載の使用。
【請求項５】
処置がＴＰＯの用量を処置時間と同時に投与することを更に含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
哺乳動物に、複数回の処置周期を与える、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
哺乳動物に、２〜６回の処置周期を与える、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ＴＰＯを、１回の治療有効日用量で投与する、請求項１記載の使用。
【請求項９】
該処置が、サイトカイン、コロニー刺激因子およびインターロイキンよりなる群から選ばれる治療有効量の薬剤を同時投与することを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
薬剤が、ＫＬ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１１よりなる群から選ばれる、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
用量を、担体または賦形剤とともに投与する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
担体または賦形剤が、キレート化剤を含有する、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
キレート化剤が、ＥＤＴＡである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ＴＰＯがＰＥＧ化されている、請求項１〜１３のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
ＰＥＧ化ポリペプチドが、ポリエチレングリコールで製造される、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
ＴＰＯが、
ａ）哺乳動物から単離されたＴＰＯポリペプチド；
ｂ）組換え手段によって製造されたＴＰＯポリペプチド；および
ｃ）合成的手段によって製造されたＴＰＯポリペプチド
よりなる群から選ばれる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
ＴＰＯが、
ａ）ヒトポリペプチド；および
ｂ）ヒトにおいて非免疫原性であるポリペプチド
よりなる群から選ばれる、請求項１〜１６のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
ＴＰＯが、式：
Ｘ−ｈＴＰＯ（７−１５１）−Ｙ
［式中、ｈＴＰＯ（７−１５１）は、Ｃｙｓ7（これを含んで）からＣｙｓ151（これを含んで）までのヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）のアミノ酸配列であり；
Ｘは、
ｉ）Ｃｙｓ7のアミノ基；
ｉｉ）成熟ヒトＴＰＯにおいて見出される順での成熟ヒトＴＰＯの１個以上のアミノ末端アミノ酸残基；
ｉｉｉ）因子Ｘａ；または
ｉｖ）トロンビンを表し；
Ｙは、
ｉ）Ｃｙｓ151のカルボキシル末端基、または
ｉｉ）成熟ヒトＴＰＯにおいて見出される順での成熟ヒトＴＰＯの１個以上のカルボキシル末端アミノ酸残基を表す］
で示される、請求項１〜１７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
ＴＰＯが、ヒトＴＰＯである、請求項１記載の使用。
【請求項２０】
ＴＰＯが、配列番号２４で示されるヒトＴＰＯ（１５３）である、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
ＴＰＯが、配列番号２３で示されるヒトＴＰＯ（３３２）である、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
ＴＰＯが、配列番号２３のアミノ酸配列からなる組換えヒトトロンボポエチンであるｒｈＴＰＯ332である、請求項１９記載の使用。
【請求項２３】
ＴＰＯを静脈内に投与する、請求項１〜２２のいずれか１項記載の使用。
【請求項２４】
ＴＰＯを皮下に投与する、請求項１〜２２のいずれか１項記載の使用。
【請求項２５】
ＴＰＯを吸入によって投与する、請求項１〜２２のいずれか１項記載の使用。
【請求項２６】
用量が、処置周期の間、３５ｘ１０-12モルまたはそれ以上の哺乳動物における血中ＴＰＯレベルを維持するのに充分である、請求項１〜２５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２７】
用量が、処置周期の間、１００ｘ１０-12モルまたはそれ以上の血中ＴＰＯレベルを維持するのに充分である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
用量が、処置周期の間、３５ｘ１０-12モル〜３，５００ｘ１０-12モルの血中ＴＰＯレベルを維持するのに充分である、請求項１〜２５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２９】
用量が、体重１kgあたり０．１〜１０μgの範囲にわたる、請求項１〜２５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３０】
用量が、体重１kgあたり１〜５μgの範囲にわたる、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
用量が、エーロゾル中５〜１，０００μg/kgである、請求項２５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、トロンボポエチン、およびその生物学的活性誘導体やイソ型を用いる、血小板減少症を包含する免疫および／または造血疾患を治療する新たな方法に関する。この使用は、サイトカイン、特にコロニー刺激因子またはインターロイキンと一緒の、そのような材料の同時投与を企図する。該使用は、血小板減少症を有するか、またはその危機にある哺乳動物を、そのような治療が必要な該哺乳動物に治療有効量の該材料を投与することによって、治療する方法を包含し、かつそれに包含される。
発明の背景
造血系は、すべての哺乳動物に必要であることが既知である、高度に分化した成熟血球を産生する。これらの成熟した細胞は、酸素や二酸化炭素を輸送するよう分化した、赤血球、細胞性および体液性免疫応答を担う、ＴおよびＢリンパ球、血栓を形成するよう分化した、血小板すなわちトロンボサイト、ならびに感染と戦うためのスキャベンジャーや補助細胞として分化した、顆粒球およびマクロファージを包含する。これらの分化した成熟血球はすべて、最初は骨髄で発見された、多能性幹細胞と呼ばれる共通するただ一つの原始細胞型に由来する。
高度に分化した成熟血球は、哺乳動物の生涯を通じて絶えず大量に産生されなければならない。これらの分化した血球の大多数は、数時間ないし数週間のみ機能的に活性であり続けるにすぎない運命にある。そのため、これら成熟血球、原始幹細胞それ自身はもとより、いかなる中間体または系列、すなわち原始細胞と成熟細胞とを結ぶ方向づけられた前駆細胞系統の絶え間ない更新が、哺乳動物の継続的生活のための正常な定常状態の血球の必要性を維持するために必要である。
造血系の核心には、多能性幹細胞がある。これらの細胞は、比較的数が少なく、娘幹細胞を生じる増殖によって自己再生を果たすか、または一連の分化の段階の間に、次第に成熟する系列限定前駆細胞へと形質転換して、最終的には、高度に分化した成熟血球を形成する。
正常な造血細胞系を裏付ける原理は、多能性が失われ、系列限定および成熟が獲得されるにつれて、自己再生の能力が減退することにあると思われる。したがって、一連の造血細胞の一端には、様々なすべての系列特異的な方向づけられた前駆細胞へと自己再生かつ分化する能力を保有する、多能性幹細胞がある。一連の細胞の他端には、自己再生の能力は失ったが、成熟した機能的活性を獲得した、高度に系列限定された前駆細胞およびその子孫がある。
幹細胞、および系列限定された前駆細胞の増殖や発達は、様々な造血成長因子またはサイトカインによって注意深く制御されている。そのため、造血成長因子は、一つまたはそれ以上の系列の増殖や分化を左右するか、ただ一つの前駆細胞系に影響することが他の成長因子と重複するか、または他の因子と共同して作用するような可能性がある。
前記から、血球またはその始原のいずれの生存、増殖、分化または成熟にも影響する、新規な造血成長因子は、疾病、または放射線もしくは化学療法によって生じた減衰した造血系の再確立に、特に助けとなるのに役立つことが認識されると思われる。
血小板は、血液凝固機構の決定的要素である。血小板減少症と呼ばれる、血小板の循環レベルの低下は、様々な臨床的状態や疾患の際に発生かつ発現する。臨床的な血小板減少症は、一般的には、血小板数が１リットルあたり約１５０ｘ１０9未満である状態として定義される。血小板減少症の主な原因は、血小板の寿命に基づいて三つの範疇、すなわち（１）骨髄による血小板生産の欠陥、例えば化学および放射線療法に起因する血小板減少症；（２）脾臓における血小板の隔離（脾腫）；および（３）末梢循環における血小板の破壊の増強、例えば自己免疫疾患に起因する血小板減少症に大別することができる。加えて、急速に投与される大量の貧血小板血液生成物を受ける患者では、希釈率のために血小板減少症が発生し得る。より詳しい血小板減少症の説明とその原因とは、Schafner,“Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Disfunction”, Internal Medicine, John J. Hutton et al., Eds., Little, Brown & Co., Boston/Tronto/London, Third Ed.（1990）はもとより、国際特許願第PCT/US94/14553号（国際公開第WO95/18858号）公報に見出し得る。
血小板減少症の患者に対する治療方策は、臨床状態の重篤度や緊急度によって決められる。治療は、ＨＩＶ付随および非ＨＩＶ関連血小板減少症について同様であり、異なる数多くの治療方策が用いられているが、治療法は、臨床的に議論の余地が残されたままである。
前記から、血小板減少症を治療する一方法は、巨核球またはその前駆細胞の血小板生産形態への分化および成熟を加速できる薬剤を得ることであると認識されると思われる。かなりの努力が、そのような薬剤を特定することに払われている。なべて引用されるものの一つが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、すなわち本願の主題である。現時点で文献中に一般的に見出される、ＴＰＯに対する別名は、血小板新生刺激因子（ＴＳＦ）；巨核球コロニー刺激因子（ＭＫ−ＣＳＦ）、巨核球成長および発達因子（ＭＧＤＦ）、巨核球刺激因子、巨核球相乗因子、およびｍｐｌリガンドを包含する。
引用された国際特許願第PCT/US94/14553号公報は、巨核球の成熟血小板生産形態への増殖、成熟および／または分化を刺激できることが判明している、「ＭＰＬリガンド（ＭＬ）」、すなわちより一般的には「トロンボポエチン（ＴＰＯ）」と名付けられた、単離された哺乳動物の、巨核球新生性増殖および成熟促進タンパク質の同定、単離、生産および利用を記載している。
関心は、国際特許願第WO95/26746号、第WO95/21919号および第WO95/21920号公報にも向けられている。
国際特許第PCT/US94/14553号出願は、ＴＰＯの関連する実施態様の、造血疾患、特に血小板減少症を有するか、またはその危機にある哺乳動物を治療する方法であって、治療有効量の材料ＴＰＯを該哺乳動物に投与することを含む方法を包含する様々な側面を包含する。場合により、ＴＰＯは、そのようなものとしてか、またはサイトカイン、特にコロニー刺激因子もしくはインターロイキンと組み合わせて投与される。該国際特許願に開示された目的のためには、ＴＰＯは、ＴＰＯ自体、または血小板減少症の治療のための、完全なＴＰＯと共通する少なくとも一つの生物学的特性を共有するフラグメントをはじめとする、その様々な変異体、誘導体もしくはそのイソ型を包含するとして広義に定義されている。該特許願に記載のとおりに役立つ様々な材料ＴＰＯの定義に関連して用いられるとき、「生物学的特性」とは、材料ＴＰＯが直接もしくは間接的に生起もしくは発揮する造血新生活性、またはin vivoエフェクターまたは抗原の機能もしくは活性を意味する。
トロンボポエチンという材料の治療的用途に関しては、国際特許願第PCT/US94/14553号公報に記載されたとおり、材料ＴＰＯは、製薬上許容され得る担体との混合物での、いくつかの投与様式のいずれかを介する投与についてそこに記載されている。日次投与方式は、約０．１〜１００μg/体重kg、好ましくは約０．１〜５０μg/体重kgにわたり、好ましくは処置用量で１日あたり約１〜５μg/kgにわたる、として記載されている。該特許願の教示の範囲内の含意は、減少した血小板数の予測的な、または現実の状態の後の数日から何日にもわたる期間、そのような用量を投与するという投与方式である。
臨床的に投与されたトロンボポエチンの刊行された臨床的研究は、血小板減少症を特徴とする状態に対する、１０日の期間にわたる１日１回０．０３〜５．０μg/体重kgという用量でのトロンボポエチンの皮下投与からなる用量および投与方式を示している。抄録番号１９７７、Blood 86（1995）を参照されたい。また抄録番号１０１２、１０１４および１９７８、Blood 86（1995）も参照されたい。
ＰＥＧ化した（ＰＥＧ）マウスの巨核球成長および発達因子（ｍＭＧＤＦ）のマウスへの１回注入は、巨核球の頻度、大きさおよび倍数化の刺激を生じるのに充分である。ＰＥＧ−ｍＭＧＤＦは、１回静脈内注射としての２５μg/kgの用量でマウスに投与された［Blood, Feb. 1, 1997, 89（3）: 823-33］。正常マウスでの造血に対するＰＥＧ−ｍＭＧＤＦのin vivoでの効果が、Stem Cells, No. 1996, 14（6）: 651-60に報告されている。Blood, Jul. 15, 1996, 88（2）: 511-21およびBlood, Jun. 15, 1996, 87（12）: 5006-15も参照されたい。
サルでの骨髄抑制化学療法で誘導された血小板減少症に対するｒｈＴＰＯの効果が、Brit. J. Haematol., Sept. 1996, 94（4）: 722-8に報告されている。０日目にニムスチンで処置した後、サルにｒｈＴＰＯを、０．０４、０．２または１．０μg/kg/日の用量で静脈内投与した。ニムスチン処置後のｒｈＴＰＯの投与は、血小板減少症の重篤度を低下させ、用量依存性の様式で血小板回復の速度を加速した。ヒトの進行した癌の患者でのＰＥＧ−ｒｈＭＧＤＦの効果は、Lancet, Nov. 9, 1996, 348（9037）: 1279-81に報告されている。この研究でＰＥＧ−ｒｈＭＧＤＦは、化学療法の前に、皮下注射によって０．０３、０．１、０．３または１．０μg/体重kgの用量で与えられた。更に、肺癌に対する化学療法後の血小板数に対するＰＥＧ−ｒｈＭＧＤＦの効果が、New Engl. J. Med., Feb. 6, 1997, 336（6）: 404-9に報告されており、ヘプスルファム処置による激しい骨髄抑制を受けているアカゲザルへのこの化合物の皮下注射の効果は、Blood, Jan. 1, 1997, 89（1）: 15565に報告されている。
同様に、エリトロポエチンに対して与えられた名称である、エポエチンアルファ（Amgen, Inc.がEPOGENとして上市した）という化合物は、赤血球生産の刺激のために指示される糖タンパク質であり、何週間もの期間、週３回に１５０〜３００単位/kgの範囲にわたる出発用量からなる投与量および投与方式で、どのようにも理解される貧血に罹患した患者における赤血球の増殖を刺激するために指示される。
Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、骨髄前駆細胞の循環と増殖の増大とを誘導するサイトカインである。これらのサイトカインの薬物動態は研究されており、化学療法に併用されるときのこれらの薬物のそれぞれについて、異なる投与方式が提唱されている。
Amgen, Inc.がNEUPOGENとして上市するフィルグラスチムは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。その指示される投与方式は、化学療法後の２週間に毎日５〜１０μg/kgの皮下投与である。Ｇ−ＣＳＦは、化学療法前の投与については禁忌されている。Ｇ−ＣＳＦを化学療法後、および化学療法の前後に投与する臨床試験は、事前投与は、骨髄に対する化学療法剤の毒性効果を悪化させることを示している［J. Nat. Canc. Inst., 1996, vol.88, No.19およびExp. Hemat., 1994, 22: 100-102］。
ＧＭ−ＣＳＦも、化学療法との併用が臨床的に研究されている。Ｇ−ＣＳＦとは対照的に、ＧＭ−ＣＳＦは、比較的短い有効半減期を有する。ＧＭ−ＣＳＦの投与後は、造血前駆細胞の増殖活性の急速な上昇が生じる。しかし、投与の中断後７２時間以内に、負のフィードバックが確立されて、骨髄の増殖活性の基本的水準未満の値までの低下を招く。ＧＭ−ＣＳＦの短い半減期は、このサイトカインを化学療法以前に投与することを可能にしている［Cancer, 1993, vol.72, No.10］。
赤血球または他の前駆血球を増殖させて、血小板減少症の効果を覆す材料を投与する際の、慣用の投与方式は、血小板減少症を招く化学療法後のそのような治療法を要する患者への、治療有効量の生物学的材料の何日間にもわたる毎日の連続投与である。ＧＭ−ＣＳＦは、化学療法の前に投与したときは、限定された有効性を有し得るが、Ｇ−ＣＳＦは、化学療法の前に投与したときは、患者の血小板減少症を悪化させる。造血前駆細胞の循環および増殖を開始させる、比較的長い半減期を有するサイトカインの、放射線または化学療法剤による処置の前の投与は、これらの細胞削減性処置が、悪性細胞ばかりでなく、増殖中の前駆細胞も殺すことから、一般的には禁忌されている。
血小板減少症を有するか、または医療手順、例えば放射線および／または化学療法の結果として血小板減少症の危機にある患者の治療のもう一つの方策は、造血性自己移植による患者の救済である。この方策では、血小板減少症を誘導するような医療処置の前に、末梢血の造血前駆細胞を動員する化合物を、患者に投与する。動員された前駆細胞は、公知の白血球除去血輸血の手順によって採集し、次いで、患者の造血性自己細胞を骨髄に再確立するために、血小板減少症の発症後の患者へと再移植する。不幸にも、動員を受ける多くの患者は、採集の時点で前駆細胞が非常に少数であり、複数回の白血球除去血輸血を必要とするが、これは、患者には苦痛かつ面倒である。そのため、前駆細胞を動員し、それによって白血球除去血輸血の回数を削減する手順を改良する方法が、非常に望ましい。
医師と、同様に患者に簡便であるためには、これに代わる、好都合であり、かつ血小板減少症の外見を一変させるのに治療上同等またはそれ以上に優れた、サイトカイン材料の投与量／投与を開発するという目的が存在する。
発明の要約
したがって、本発明の一つの目的は、血小板減少症からの改良された回復を提供し、サイトカインを投与する既存の方法についての上記の欠陥を克服するトロンボポエチンの投与方法を提供することである。
もう一つの目的は、放射線および／または化学療法の処置を受ける哺乳動物もしくは患者にトロンボポエチンを投与する方法であって、そのような処置に付随する血小板減少症を最小限度にし、哺乳動物における血小板輸注の必要性を軽減する方法を提供することである。
下記の例示的実施態様の説明の途上で明らかになると思われる、これらおよびその他の目的は、本発明の方法によって達成されている。
本発明は、生物学的に活性である材料のトロンボポエチンが、血小板減少症を有するか、またはそれに対する処置を要する患者に、毎日１回もしくは少数回の用量の治療有効量を投与することによって、治療効果を生じさせることができるという、予想外かつ驚くべきな発見に基づく。この発見は、材料のトロンボポエチンが、造血細胞系列の後期の前駆細胞に作用すると考えられるＧ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦとは対照的に、初期の骨髄幹細胞および巨核球前駆細胞に対する成長因子であり、かつそれらに直接作用すると考えられるという発見に基づく。本発明の材料は、幹細胞の巨核球に分化を生じること、および投与後の血小板数を上昇させることができる。それらは、骨髄造血細胞の増殖および分化を誘導し、成熟巨核球の数を増加させて、循環する血小板数の増加を生じる。
すなわち、本発明は、血小板減少症を有するか、またはその危機にある哺乳動物を治療する方法であって、そのような治療を要する哺乳動物に、毎日１回もしくは少数回の用量の治療有効量のトロンボポエチンを投与することを含む方法を対象とする。一面では、本発明は、そのような哺乳動物への治療有効量のトロンボポエチンの１回の投与を対象とする。
この実施態様のもう一面では、本発明は、少なくとも１周期の、そのような周期を要する放射線および／または化学療法剤を受ける、哺乳動物へのトロンボポエチンの投与に関する。代表的には、該哺乳動物は、腫瘍、悪性などを治療するためには一つ以上のそのような周期を要すると思われる。もう一面では、本発明は、血小板減少症患者における血小板輸注の回数を減らす方法を対象とする。更にもう一面では、本発明は、有効量のトロンボポエチンの毎日１回または少数回の用量の投与によって、前駆細胞を動員する方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
図１−５．０Gyのγ照射およびカルボプラチン（１．２mg）の併用によって汎血球減少症にさせた動物に、１、２、４または８日間０．１μgのｒｍＴＰＯ（３３５）を皮下注射した。それぞれ２８日の期間にわたり、パネルＡは、この処置方式への血小板の応答を示し、パネルＢおよびＣは、赤血球および白血球の応答を示す。パネルＢで示されたキーは、３パネルすべてに該当する。
図２−５．０Gyのγ照射およびカルボプラチン（１．２mg）の併用によって汎血球減少症にさせた動物に、実験開始の２４時間後に、様々なレベルでのｒｍＴＰＯ（３３５）の１回投与量を皮下注射した。それぞれ２８日の期間にわたり、パネルＡは、この処置方式への血小板の応答を示し、パネルＢおよびＣは、赤血球および白血球の応答を示す。パネルＢで示されたキーは、３パネルすべてに該当する。
図３−５．０Gyのγ照射およびカルボプラチン（１．２mg）の併用によって汎血球減少症にさせた動物に、皮下または静脈内で与えた、ｒｍＴＰＯ（３３５）の１回投与に応答する血小板（パネルＡ）および赤血球（パネルＢ）の応答の対数−直線表示。プロットされた細胞数は、実験開始後１４日目に測定したもの。
0004562815.tif 000002
は、基本的水準の０レベルである。
図４−５．０Gyのγ照射およびカルボプラチン（１．２mg）の併用によって汎血球減少症にさせた動物に、実験開始の２４時間後に、様々なレベルでのｒｍＴＰＯ（３３５）の１回投与量を静脈内注射した。それぞれ２８日の期間にわたり、パネルＡは、この処置方式への血小板の応答を示し、パネルＢおよびＣは、赤血球および白血球の応答を示す。パネルＢで示されたキーは、３パネルすべてに該当する。
図５−５．０Gyのγ照射およびカルボプラチン（１．２mg）の併用によって汎血球減少症にさせた動物に、実験開始の２４時間後に、分子量２０，０００または４０，０００のいずれかのポリエチレングリコール（ｐｅｇ）と結合させた、様々な形態のｒｍＴＰＯ（１５３）による１回投与量を皮下注射した。それぞれ２８日の期間にわたり、パネルＡは、この処置方式への血小板の応答を示し、パネルＢおよびＣは、赤血球および白血球の応答を示す。パネルＢで示されたキーは、３パネルすべてに該当する。
図６−５．０Gyのγ照射およびカルボプラチン（１．２mg）の併用によって汎血球減少症にさせた動物に、実験開始の２４時間後に、分子量４０，０００のポリエチレングリコール（ｐｅｇ）と結合させた、ｒｍＴＰＯ（３３５）またはｒｍＴＰＯ（１５３）のいずれかによる１回投与量を皮下注射した。それぞれ２８日の期間にわたり、パネルＡは、この処置方式への血小板の応答を示し、パネルＢおよびＣは、赤血球および白血球の応答を示す。パネルＢで示されたキーは、３パネルすべてに該当する。
図７−５．０Gyのγ照射およびカルボプラチン（１．２mg）の併用によって汎血球減少症にさせた動物に、実験開始の２４時間後に、分子量４０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させた、ｒｍＴＰＯ（３３５）またはｒｍＴＰＯ（１５３）のいずれかによる１回投与量を静脈内注射した。それぞれ２８日の期間にわたり、パネルＡは、この処置方式への血小板の応答を示し、パネルＢおよびＣは、赤血球および白血球の応答を示す。パネルＢで示されたキーは、３パネルすべてに該当する。
図８−図８は、６Gyを照射したマウスの、プラシーボを対照とする最下点の時間での血小板レベルを、図に示した各時点での１回腹腔内投与量（０．３μg）のＴＰＯの投与の時間的関数として示す。
図９−図９は、６Gyを照射したマウスの、プラシーボを対照とする最下点の時間での血小板レベルを、照射の２時間前（−２ｈ）での１回腹腔内投与量（３０μg）のＴＰＯの投与の時間的関数として示す。
図１０−放射線または化学療法に非常に似た細胞削減性処置の遅延形態をモデル化するために、それぞれ２４時間隔離した３Gyの同等な３分画のマウスに、全身照射（ＴＢＩ）を与えた。ＴＰＯは、異なる三様の投与方式；すなわち照射から＋２ｈでの３ｘ０．３μg、照射から＋２ｈでの０．９μg、および照射から−２ｈでの０．９μgで、０．９μgの総用量として与えた。得られた血小板レベルをプラシーボとの対比で示す。
図１１−本図は、図１０の投与方式に対する大腿骨の造血前駆細胞のデータを示す。
図１２−本図は、図１０の投与方式に対する脾臓の造血前駆細胞のデータを示す。
図１３−図１３は、０．３μgの３回の用量、または０．９μgの１回の用量のＴＰＯを追跡する薬物動態学的データを示す。
図１４−図１４は、実施例７、周期１（化学療法のみ）に関する研究分枝による用量レベルにわたって平均した血小板数中央値を示す。
図１５−図１５は、実施例７、周期２（化学療法およびｒｈＴＰＯ）に関する研究分枝による用量レベルにわたって平均した血小板数中央値を示す。
図１６−図１６は、実施例７、周期３（化学療法およびｒｈＴＰＯ）に関する研究分枝による用量レベルにわたって平均した血小板数中央値を示す。
図１７−図１７は、実施例７、周期４（化学療法およびｒｈＴＰＯ）に関する研究分枝による用量レベルにわたって平均した血小板数中央値を示す。
図１８−図１８は、実施例７の分枝Ｃ、周期２のためのｒｈＴＰＯ用量レベルによる血小板数中央値を示す。
図１９−図１９は、実施例７の分枝Ｄ、周期２のためのｒｈＴＰＯ用量レベルによる血小板数中央値を示す。
図２０−ｒｈＴＰＯの１回吸入に接触させたマウスの血小板数；実施例８を参照されたい。
図２１−ｒｈＴＰＯの複数回吸入に接触させたマウスの血小板数；実施例８を参照されたい。
図２２−ＴＰＯ／ＦＬ／ＫＬによるＣＤ３４+細胞の拡大。図２２には、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドを含む培養体中での８週間にわたるＣＤ３４+細胞の拡大を示す。１０6倍を越える拡大が観察される；実施例１４を参照されたい。
図２３−ＴＰＯ／ＫＬ／ＦＬによるＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞の拡大。図２３に示すとおり、ＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞の下位集団も拡大する。１週目には、この分集団は、培養体の僅か８％を構成するにすぎないが、８週までには、培養体の３３％を構成して、４倍の拡大を示す。これは、これらの拡大した培養体での原始前駆細胞集団の拡大と維持との双方を立証する。
図２４−ＴＰＯ／ＫＬ／ＦＬによる多系列活性の拡大。図２４には、拡大した培養体がin vitroで多系列コロニーを生じ得ることが示されている。生成されたコロニーの数は、培養体中のＣＤ３４+細胞の拡大に正比例する。これは、拡大した細胞は、それらの多能活性を維持していることを示す；実施例１４を参照されたい。
定義
本明細書に用いられる限りで、「血小板減少症を有するか、またはその危機にある哺乳動物」とは、血小板減少症、すなわち哺乳動物の集団中の正常な平均的個体についての血小板数を下回る血小板数を経験している、ヒトを包含する哺乳動物を意味する。ヒトでは、血小板減少症は、血小板数が、血液１リットルあたり約１５０ｘ１０9未満である状態として定義される。しかし、哺乳動物は、血小板減少症の危機にあるとも云えて、血小板減少症を生じることが公知である特定の処置の結果として、哺乳動物が血小板減少症の状態を経験し得ると予測できることを意味する。例えば、哺乳動物は、処置された哺乳動物に血小板減少症を誘導することが公知である、放射線および／または化学療法の処置を受けたならば、血小板減少症の危機にある。換言すれば、血小板減少症を誘導することが公知である処置の結果として、血小板減少症を経験する危機にあるか、またはその確立が高いということが、明確に予測可能であるということである。血小板減少症の危機にあるそのような哺乳動物は、本発明の方法で治療し得る。本発明の範囲内に包含されるのは、機能不全の肝臓、例えば肝硬変の結果として血小板減少症の危機にある哺乳動物、ならびに一般的には放射線および／または化学療法の処置の前に、前駆細胞の動員療法およびアフェレーシスを受けている哺乳動物である。
用語「サイトカイン」は、細胞間メジエーターとして他の細胞に作用する、一細胞集団が放出するタンパク質の総称的用語である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来からのポリペプチドホルモンである。サイトカインに包含されるのは、成長ホルモン、インスリン様成長因子、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンを包含するヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキシン、プロレラキシン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン、造血成長因子、肝成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、ミュラー阻害物質、マウスゴナドトロピン付随ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、ＮＧＦβのような神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびII、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロンα、βおよびγのようなインターフェロン（ＩＦＮ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＦＳ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＦＳ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）、ならびにＬＩＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンドおよびkitリガンド（ＫＬ）を包含するその他のポリペプチド因子である。本明細書に用いられる限りで、前記の用語は、天然の入手源または組換え細胞培養体からのタンパク質を包含するものとする。同様に、該用語は、例えば１個以上のアミノ酸が異なるか、または糖鎖形成の形式もしくは程度が異なる、生物学的に活性である等価体を包含するものとする。
トロンボポエチン（ＴＰＯ）と関連して用いられるときの用語「生物学的に活性である」とは、トロンボポエチン、すなわち血小板新生活性を示すか、または無形成性ブタ血漿から単離されたか、あるいは組換え細胞培養体で発現された、ｍｐｌリガンドのエフェクター機能を共有する、血小板新生性ポリペプチドを意味する。ｍｐｌの公知の主要なエフェクター機能は、ヒトｍｐｌＰをトランスフェクションしたＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの標識化ヌクレオチド（3Ｈ−チミジン）の取込みである。ｍｐｌリガンドまたはポリペプチドの本明細書での公知のもう一つのエフェクター機能は、マウス血小板のリバウンドアッセイで、循環血小板への35Ｓの取込みを刺激できることである。ｍｐｌリガンドの公知の更にもう一つのエフェクター機能は、in vitroでヒトの巨核球新生を刺激できることであって、これは、巨核球の糖タンパク質ＧＰIIbIIIaに特異的な放射能標識化モノクローナル抗体を用いることによって、定量し得る。
用語「ｍｐｌリガンド」、「ｍｐｌリガンドポリペプチド」、「ＭＬ」「トロンボポエチン」または「ＴＰＯ」は、本明細書では相互可換的に用いられ、サイトカイン受容体スーパーファミリーの一員であるｍｐｌに結合する特性を有し、ｍｐｌリガンドの生物学的特性を有するいかなるポリペプチドも包含する。例示的な生物学的特性は、ヒトｍｐｌをトランスフェクションしたＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの標識化ヌクレオチド（例えば3Ｈチミジン）の取込みを刺激できることである。もう一つの例示的な生物学的特性は、マウス血小板のリバウンドアッセイで、循環血小板への35Ｓの取込みを刺激できることである。この定義は、本明細書に記載の無形成性ブタ血漿のようなｍｐｌリガンド源、もしくはもう一つの入手源、例えば、ヒトを包含するもう一つの動物種から単離されたか、または組換えもしくは合成の方法によって調製されたペプチドを包含する。例は、ＴＰＯ（３３２）およびｒｈＴＰＯ332を包含する。やはりこの定義に包含されるのは、還元性条件下でのＳＤＳゲルによって決定した限りでの約３１，０００ダルトン（３１kD）、および非還元性条件下での２８，０００ダルトン（２８kD）の分子量を有する、国際公開特許第WO95/28907号公報に記載の血小板新生性リガンドである。用語「ＴＰＯ」は、変異体形態、例えばそのフラグメント、対立遺伝子、イソ型、類似体、キメラ、およびこれらの形態の混合物を包含する。簡便のため、これらのリガンドはすべて、すべての個別的リガンドおよびリガンド混合物を、この用語によって指すことを認識して、以下、単に「ＴＰＯ」と称することにする。
好ましくは、ＴＰＯは、哺乳動物において、血小板新生活性を有するか、または血清血小板数を増加させることができる化合物である。ＴＰＯは、好ましくは、内在血小板数を少なくとも１０％、より好ましくは５０％増加させることができ、最も好ましくはヒトの血小板数を血液１リットルあたり約１５０ｘ１０9を越えて上昇させることができる。本発明のＴＰＯは、好ましくは、高度に精製された、実質的に均質であるブタｍｐｌリガンドポリペプチドのアミノ酸配列との少なくとも７０％以上の配列全体の同一性、およびブタｍｐｌリガンドポリペプチドの「ＥＰＯドメイン」との少なくとも８０％以上の配列同一性を有する。これに代えて、本発明のＴＰＯは、成熟したヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）、またはその変異体、もしくは転写後修飾した形態、あるいは成熟したヒトｍｐｌリガンドとの約８０％の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。これに代えて、該ＴＰＯは、成熟したヒトｍｐｌリガンドのフラグメント、特にアミノ末端または「ＥＰＯドメイン」フラグメントであってもよい。好ましくは、該アミノ末端フラグメントは、第１および第４システイン残基間の実質的にすべてのヒトＭＬ配列を保持するが、該領域外には実質的な付加、欠失または置換を含んでよい。この実施態様によれば、該フラグメントのポリペプチドは、式：
Ｘ−ｈＴＰＯ（７−１５１）−Ｙ
で示し得る。
式中、ｈＴＰＯ（７−１５１）は、ヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）のアミノ酸配列の、両端を含めてＣｙｓ7からＣｙｓ151までを表し；Ｘは、Ｃｙｓ7のアミノ基、あるいは成熟ＴＰＯの１個以上のアミノ末端アミノ酸残基、またはそれに対するアミノ酸残基の伸長、例えばＭｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、もしくはリシンに対するアルギニンのような、そのアミノ酸の置換、または例えばタンパク質分解性切断部位を含むリーダー配列（例えば因子Ｘａもしくはトロンビン）を表し；Ｙは、Ｃｙｓ151のカルボキシル末端基、あるいは成熟ＴＰＯの１個以上のカルボキシル末端アミノ酸残基、またはそれへの延長を表す。
「ＴＰＯフラグメント」とは、天然に産する成熟した完全な長さのｍｐｌリガンドの一部、または１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基もしくは炭水化物単位が欠失したＴＰＯ配列を意味する。欠失したアミノ酸残基は、フラグメントが少なくとも一つの生物学的特性をｍｐｌリガンドと共有する限り、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、または内部を含むペプチドのどこに生じてもよい。ｍｐｌリガンドのフラグメントは、代表的には、無形成性ブタ血漿から単離したリガンド、またはヒトもしくはマウスのリガンドを包含する、哺乳動物から単離したｍｐｌ、特にそのＥＰＯドメインの配列と同一である、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０または４０アミノ酸残基の連続配列を有することになる。Ｎ末端フラグメントの代表例は、ＴＰＯ（１５３）、ｈＭＬ153またはＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）である。
ＴＰＯ等と関連して用いられる用語「ＴＰＯイソ型」および「ＴＰＯ配列イソ型」または用語「誘導体」は、本明細書に用いられる限りで、組換え細胞培養体、無形成性ブタ血漿またはヒトｍｐｌリガンドから単離されたＴＰＯとの１００％未満の配列同一性を有する、下記に定義したとおりの生物学的活性材料を意味する。通常は、生物学的に活性であるｍｐｌリガンドまたはＴＰＯイソ型は、無形成性ブタ血漿または成熟したマウスから単離したｍｐｌリガンド／ＴＰＯイソ型、ヒトのｍｐｌリガンドもしくはそのフラグメントとの約７０％以上、好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約８５％以上、はるかに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有することになる。
イソ型の一実施態様では、ＴＰＯは、式：
0004562815.tif 000003
を有してよく、ここで、
第３７位のＸａａは、Ｔｈｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
第４６位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＭｅｔであり；
第４７位のＸａａは、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
第１１２位のＸａａは、欠失しているか、またはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｒｐもしくはＭｅｔであり；
第１１３位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐもしくはＭｅｔであり；
第１１４位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐもしくはＭｅｔであり；
第１１５位のＸａａは、欠失しているか、またはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒもしくはＡｓｎであり；
第１２２位のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり；
第２００位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＡｒｇおよびＬｙｓまたはＨｉｓであって、
１〜１７９個のアミノ酸が、Ｃ末端から欠失していることができるが、Ｘａａで表したアミノ酸の少なくとも１個は、未変性ＴＰＯ（１−３３２）の対応するアミノ酸と異なることを条件とする。
この実施態様は、下記の式：
0004562815.tif 000004
を有するＴＰＯフラグメントも包含し、ここで、
第３７位のＸａａは、Ｔｈｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
第４６位のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＭｅｔであり；
第４７位のＸａａは、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
第１１２位のＸａａは、欠失しているか、またはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｒｐもしくはＭｅｔであり；
第１１３位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐもしくはＭｅｔであり；
第１１４位のＸａａは、欠失しているか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐもしくはＭｅｔであり；
第１１５位のＸａａは、欠失しているか、またはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒもしくはＡｓｎであり；
第１２２位のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐであるが；
Xaaで表したアミノ酸の少なくとも１個は、未変性ＴＰＯ（１−３３２）の対応するアミノ酸と異なることを条件とする。これらの変異体は、改良された生物学的様相、例えば上昇した増殖活性、および／もしくは減少した副作用、ならびに／または改良された物理的特性、例えば改良された半減期、安定性、および／もしくは再折りたたみ効率を有してよい。この実施態様のためのポリペプチドの製造は、WO96/23888号公報に記載されている。
ＴＰＯ「類似体」は、ＴＰＯのポリペプチドを、様々な非タンパク質性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの一つと、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号または第4,179,337号に説明された方式で結合することによる、ＴＰＯまたはｍｐｌリガンドの共有結合での修飾を包含する。前記重合体と共有結合で結合したＴＰＯポリペプチドは、本明細書では、ペギル化したＴＰＯと称する。
本明細書に用いられる限りで、「キメラポリペプチド」または「キメラ」は、第二の異種ポリペプチド、または一つ以上のそのフラグメントに融合もしくは結合した、完全な長さの親リガンド（ＴＰＯもしくはｍｐｌリガンド）、または一つ以上のそのフラグメントを含むポリペプチドである。キメラは、少なくとも一つの共通する生物学的特性をＴＰＯと共有することになる。第二のポリペプチドは、代表的には、サイトカイン、例えば上記のサイトカイン、免疫グロブリン、またはそれらのフラグメントであると思われる。二つのポリペプチドを直接結び合わせるか、またはリンカー、例えば、２〜５０個、一般的には２〜２０個のアミノ酸単位を有してよいペプチドリンカーを介して結び合わせてよい。具体的な例は、ＴＰＯ／Ｇ−ＣＳＦ、ＴＰＯ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ／ＩＬ−３、ＴＰＯ／ＩＬ−６等々を包含する。キメラタンパク質の製造は、当技術に周知の方法を用いて達成してよい。
「ｍｐｌリガンド」もしくは「単離ｍｐｌリガンド」または「ＴＰＯ」と結び付けて用いたときの用語「生物学的特性」とは、血小板新生活性を有すること、またはｍｐｌリガンドもしくは（その未変性の立体配置であると変性した形態であるとに関らず）ＴＰＯ、またはそれらのフラグメントが直接的もしくは間接的に生起するか、または果たすin vivoでのエフェクターもしくは抗原性の機能や活性を有することを意味する。エフェクター機能は、ｍｐｌ結合およびあらゆる結合の活性、ｍｐｌの作用または拮抗作用、特に複製、ＤＮＡ調節機能、その他のサイトカインの生物学的活性の調整、受容体（特にサイトカイン）の活性化、失活、アップまたはダウンレギュレーション、細胞の成長または分化などを包含する増殖シグナルの形質導入を包含する。抗原性機能とは、未変性ｍｐｌリガンドまたはＴＰＯに対して誘発した抗体と交差反応できる、エピトープまたは抗原部位の保有を意味する。ｍｐｌリガンドまたはＴＰＯのポリペプチドの主な抗原性機能は、無形成性ブタ血漿から単離した、ｍｐｌリガンドもしくはＴＰＯに対して誘発した抗体に、少なくとも約１０6Ｌ／モルの親和性で結合することである。通常、このペプチドは、少なくとも約１０7Ｌ／モルの親和性で結合する。最も好ましくは、抗原性的に活性であるｍｐｌリガンドまたはＴＰＯポリペプチドは、上記のエフェクター機能のうち一つを有するｍｐｌリガンドもしくはＴＰＯに対して誘発した抗体と結合するポリペプチドである。「生物学的特性」を定義するために用いた抗体は、組換え細胞培養体、またはフロイントの完全アジュバント中の無形成性ブタ血漿から単離したｍｐｌリガンドもしくはＴＰＯを配合し、該配合物を皮下注射し、ｍｐｌリガンドもしくはＴＰＯの抗体の力価がプラトーに達するまで、該配合物の腹腔内注射によって免疫応答を促進することによって誘発したウサギポリクローナル抗体である。
「血小板新生活性」は、巨核球もしくは巨核球前駆細胞が、これらの細胞の血小板産生形態へと増殖、分化および／または成熟するのを促進することによって特徴づけられる生物学的活性として定義される。この活性は、in vivoでのマウス血小板リバウンド合成アッセイ、ヒト白血病巨核球芽細胞系（ＣＭＫ）についての抗血小板イムノアッセイ（抗ＧＰIIbIIIa）によって測定される限りでの血小板細胞表面抗原アッセイの誘導、および巨核球芽細胞系（ＤＡＭＩ）での倍数性の誘導を包含する様々なアッセイで測定してよい。
投与と関連しての用語「少数回」によって、短期間にわたる治療有効量の複数の用量の投与が意味される。少数回の用量は、１日２〜約６用量、好ましくは１日２〜４用量を包含してよい。したがって、本発明は、トロンボポエチンの治療有効量の僅か１回の投与を対象とする。ただ１回の投与は、治療有効量の同じ材料を、当技術が示唆かつ教示する慣用の複数回で多くの日数という投与方式で投与したときに実現されるのと同等の治療効果を生じることが見出されている。
本明細書に用いられる限りで、用語「処置周期」とは、哺乳動物もしくは患者を放射線および／または化学療法剤で処置し、一般的には、観察および回復の期間（回復期）が続く、放射線および／または化学療法剤の投与（処置期）の１クールを意味する。処置期は、哺乳動物または患者に対する不快感を最小化し、ほぼ処置前のレベルまでの好中球および血小板数の回復を可能にするために、通常選ばれる、ある期間によって好ましくは隔離され、放射線および／または化学療法剤の１回の投与、または複数回の投与を包含してよい。この期間は、一般的には、個々の放射線および／または化学療法剤に対する、哺乳動物または患者の許容度によって決定される。代表的な処置期は、１〜１０日、好ましくは１〜６日または１〜４日間経過してよく、この間に、放射線または化学療法剤を連続的すなわち分割して投与する。代表的な回復期は、５〜６０日、好ましくは１４〜２４日間経過してよく、この間に、哺乳動物または患者を観察し、評価し、処置から回復するのを可能にする。場合により、１を越える処置周期を与えてもよく、代表的には、個々の処置方式、および処置の目的に応じて２〜約６周期が与えられる。
好適実施態様の詳細な説明
ここに、ＴＰＯは、Ｇ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインの特性とは驚くほど異なり、ＴＰＯを放射線および／もしくは化学療法の前にか、かつ／またはそれと同時に投与するのを可能にする、薬物動態学的特性を有することが発見された。事前および／または同時のＴＰＯの投与は、血小板減少症の最下点の深さを少なくし、放射線および／または化学療法の処置を受ける患者における、血小板量の回復の時間を短縮することが見出された。ＴＰＯの特性におけるこの差は、造血系列の初期の前駆細胞に対するＴＰＯの効果に由来すると考えられる。この効果は、ＴＰＯの投与後の系列での、より多くの成熟細胞の出現の遅延を招いて、細胞削減性処置の際に、増殖細胞の僅かにすぎないか、または臨床的に有意でない損失で放射線および／または化学療法処置を与えるのを可能にするものと思われる。ＴＰＯのこれらの独自の特性の発見が、本発明の一部である。
この発見は、放射線および／または化学療法を受ける患者は、血小板輸注を必要とすることが多いことから、有意義である。頻繁な血小板輸注は、同種免疫化を招き得る。これは、ＨＬＡ適合供与者の必要性と、より頻繁な輸注とを招く。血小板輸注の規定は、重要で困難の多い医療上の問題である。そのような輸注の必要性および頻度を減らすことは、患者の看護を改良し、輸注に付随する併発症、例えば血液抗原不適合、適切な血小板供与者の不足、供与された材料の汚染、例えばウイルスなどによる汚染を軽減する。長期化した血小板減少症の存続を予防または短縮するいかなる処置も、重要な医療上の進歩を表す。本発明は、血小板減少症に罹患した患者の血小板輸注の必要性を軽減する。
本発明の方法は、放射線および／または化学療法の後の血小板力価の基本的水準レベルへの、また実質的に上昇したレベルへさえもの復帰を速める。上昇した血小板力価の生成は、その後の放射線および／または化学療法処置の周期に患者が備えるの役立つ。上昇した血小板レベルを有して処置のその後の周期に入る患者は、処置の細胞削減性効果に、より充分に耐えることができる。したがって、本発明は、本発明によるＴＰＯの無投与の方式に対する患者の許容度に比して、放射線および／または化学療法の方式に対する患者の許容度を高めるのに効果的である。
本発明の方法は、動員療法にも役立つ。動員療法では、末梢血前駆細胞を骨髄から動員して、好中球減少症および／または血小板減少症を軽減または排除する。本発明の方法では、ＴＰＯを１回または少数回の日次用量として投与して、末梢血前駆細胞を動員する。代表的には、哺乳動物は、例えば放射線および／もしくは化学療法または肝疾患の結果として、血小板減少症を有するか、またはその危機にあるヒトである。本発明によれば、放射線もしくは化学療法の処置の前にか、またはそれと同時に、ＴＰＯを患者に投与する。当然であるが、上記の事前または同時の投与と結合して、血小板の血中力価を回復させるためにＴＰＯを放射線または化学療法の後にも投与してよい。ＴＰＯは、他のサイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦなどとともに投与してもよい。本発明の方法によって動員される前駆細胞は、標準的な白血球除去血輸血によって捕集し、場合により凍結し、放射線および／または化学療法後に患者に再移植してよい。追加のサイトカインは、一般的には、ＴＰＯの量と同等の量で投与する。例えば、動員療法では、ＴＰＯを、約０．１〜１０μg/kgの量で、単独でか、または同等量の追加のサイトカインとともに投与してよいと思われる。異種骨髄移植のために、場合により、もう１種類の上記のサイトカインと併用して、ヒトの患者を包含する哺乳動物に、末梢血前駆細胞を動員する目的でＴＰＯを投与してよく、次いで、それらを白血球除去血輸血によって捕集し、場合により凍結し、血小板減少症を有するか、またはその危機にある哺乳動物に移植してよい。異種骨髄移植組織（前駆細胞）を供与する哺乳動物または患者と、移植組織の受容者とは、公知の手順に従って、組織型検査してよい。ＴＰＯおよび他のサイトカインは、一般的には、自己移植組織について上に考察した量で投与する。
加えて、放射線および／または化学療法の周期の反復は、累積する骨髄抑制を招き、それが、個々の化学療法剤の用量強度を、特に併用療法を用いたときに、限定することは周知である。商業的に入手できる骨髄成長因子、例えばＧ−ＣＳＦは、好中球減少症を軽減するのに役立っているが；累積性血小板減少症は、問題として存続している。本発明は、併用化学療法の際の好中球減少症を有意に軽減し、それによって、化学療法の際に患者が許容する処置周期の数を増加させる。非常に多くの処置周期、またはより強力な用量の化学療法剤は、癌致死率を改良する。
本発明の方法は、抗ＴＰＯ抗体の形成の可能性も低下させる。免疫原性は、当技術に公知の継続的日次投与に比して、１回の用量を包含する、より少ない頻度の投与のため、軽減または除去される。投与は、好ましくは静脈内である。しかし、静脈内投与を皮下投与と併用する混成投与方式も、本発明によって企図される。例えば、放射線および／または化学療法による処置の前または直後に、そのような処置に付随する血小板最下点を下げ、血小板力価の回復を加速するために、ＴＰＯの初期静脈内用量を投与するのが望ましい。ＴＰＯの初期用量の後、血小板レベルを維持するための処置後に１回またはそれ以上のＴＰＯの皮下用量を与えてよいと思われる。
ＴＰＯの非経口または皮下送達の代替策は、エーロゾル送達である。投与の肺からの経路は、投与の容易さ、および吸収のための肺の大表面積のために、静脈内または皮下に対する魅力的な代替策である。しかし、タンパク質の吸収に対する障壁は、手に負えそうもなく、吸収の機構は、不明確である。潜在的制約にも関らず、何種類かのタンパク質（例えばインスリン、ｈＧＨ、ＢＳＡおよびＬＨＲＨ）は、全身性循環を標的として、肺を経由して好成績で送達されている［Adjei et al., International J. Pharm., 61: 135-144, 1990; Colthorpe et al., Pharm. Res., 9: 764-768, 1992; Folkesson et al., Acta Physiologica Scandinavia, 139; 347-54, 1990; Patton et al., Biotech. Therapeut., 1; 213-228, 1989-90 ;およびNiven et al., Pharm. Res., 12: 1343-9, 1995を参照されたい］。下記の表は、肺を経由する送達について試験されているタンパク質を示す。
0004562815.tif 000005
本発明の興味深い実施態様では、ＴＰＯ、例えば組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）は、全身性循環を標的として、エーロゾル吸入を介して送達できることが発見された。ｒｈＴＰＯは、約８０kDの糖タンパク質である。治療血清濃度は、ｒｈＴＰＯを液体または粉末エーロゾルとして肺に送達することによって、達成することができる。ＴＰＯの溶液は、慣用の噴霧器を用いて噴霧化し、エーロゾルとして鼻または口を経由して、哺乳動物またはヒトの患者に投与してよい。ＴＰＯは、例えばスプレイドライによって、粉末へと乾燥し、慣用の乾燥粉末吸入器を用いて投与してもよい。より高用量のｒｈＴＰＯは、エーロゾルとして与えたとき、静脈内と比較して同様な治療効果を達成することが必要とされる。一般に、エーロゾルによる用量は、エーロゾル投与のためには静脈内投与と比較して、約１００倍高くなければならない。エーロゾル投与に適した用量範囲は、１日または複数日での、１回の吸入用量としてか、または複数回の吸入として、約５〜１，０００μg/kg、好ましくは５０〜７５０μg/kg、連日または非連日で、好ましくは２〜１０もしくは２〜６μg/kgである。
本発明の方法は、哺乳動物もしくはヒトの患者が、血小板減少症を有するか、またはその危機にある、いかなる放射線および／または化学療法の方式とともに用いてもよい。本方法は、慣用の量で用いられる、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ロイコボリンカルシウム、カルムスチン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、ロイプロリド、レバミゾール、ロイプロリドデポー、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メチルＣＣＮＵ（セムスチン）、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、チオグアニン、トリエチレン−チオホスホルアミド、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびそれらの組合せを包含するが、これらに限定されない、慣用の化学療法剤とともに用いてよい。これらの化合物は、場合により、適切であり、指示された場合には、メスナなどのような公知の尿路防護性化合物とともに与えてよい。メスナは、商業的に入手可能であり、化学療法剤代謝物、例えばイホスファミド代謝物による、尿道刺激や出血性膀胱炎を解消するために、常套的に与えられる。代表的には、化学療法剤は、哺乳動物もしくは患者への最小のか、または少なくとも許容され得る毒性で、腫瘍細胞の致死を最大化するよう、組み合せて与えられる。本発明の方法は、この毒性をさらに少なくする。本発明の方法を併用してよい、適切な非制限化学療法の方式を、慣用の略記を用い、該方式が考慮される具体的な腫瘍／癌腫を示して下記に列挙する。化学療法剤は、慣用の量で、かつ慣用の処置の時間および方式に従って投与してよい。例えば、“The Cerenex Handbook”, Robert S. Benjamin, Ed., Cerenex Pharmaceuticals, Research Triangle Park, N.C.（1993）;“Combination Cancer Chemotherapy Regimens”, Roger W. Anderson & William J. Dana, Eds., Laderly Laboratories（1991）を参照されたい。しかしながら、血小板減少症を誘導するいかなる細胞削減性の方式も、本発明の範囲内にあると考えられる。
乳癌
ＣＡＦ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、フルオロウラシル
ＣＦＭ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン
ＣＦＰＴ：シクロホスファミド、フルオロウラシル、プレドニゾロン、タモキシフェン
ＣＭＦ：シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル
ＣＭＦＰ：シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、プレドニゾロン
ＣＭＦＶＰ：シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンクリスチン、プレドニゾロン
ＦＡＣ：フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＩＭＦ：イホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、メスナ
ＶＡＴＨ：ビンブラスチン、ドキソルビシン、チオテパ、フルオキシメステロン
ＣＥＰ：シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチン
ＩＣＥ：イホスファミド、シクロホスファミド、エトポシド
ＡＣ：ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＦＬＡＣ：フルオロウラシル、ロイコボリンカルシウム、ドキソルビシン、シクロホスファミド
結腸癌
Ｆ−ＣＬ：フルオロウラシル、ロイコボリンカルシウム
ＦＬｅ：レバミゾール、フルオロウラシル
ＦＭＶ：フルオロウラシル、メチルＣＣＮＵ、ビンクリスチン
胃癌
ＦＡＭ：フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ
ＦＡＭＥ：フルオロウラシル、ドキソルビシン、メチルＣＣＮＵ
ＦＣＥ：フルオロウラシル、シスプラチン、エトポシド
生殖尿路癌
ＣＡＰ：シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＣＩＳＣＡ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン
ＣＶＥＢ：シスプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、ブレオマイシン
ＦＬ：フルタミド、酢酸リュープロリドまたはフルタミド、酢酸ロイプロミドデポー
Ｌ−ＶＡＭ：酢酸ロイプロリド、ビンブラスチン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ
ＭＶＡＣ：メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シスプラチン
ＶＡＢ：ビンブラスチン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、シクロホスファミド
ＶＢ：ビンブラスチン、メトトレキサート
ＶＢＰ：ビンブラスチン、ブレオマイシン、シスプラチン妊娠トロホブラスト病
ＤＭＣ：ダクチノマイシン、メトトレキサート、シクロホスファミド
頭部および頚部癌
ＣＦ：シスプラチン、フルオロウラシル
ＣＦＬ：シスプラチン、フルオロウラシル、ロイコボリンカルシウム
ＣＯＢ：シスプラチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン
ＭＡＰ：マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、シスプラチン
ＭＢＣ：メトトレキサート、ブレオマイシン、シスプラチン
ＭＦ：メトトレキサート、フルオロウラシル、ロイコボリンカルシウム
白血病
急性リンパ球性白血病（Ａ．Ｌ．Ｌ．）
ＤＶＰ：ダウノルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン
ＭＭ：メルカプトプリン、メトトレキサート
ＡＶＤＰ：アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ダウノルビシン、プレドニゾン
急性骨髄性白血病（Ａ．Ｍ．Ｌ．）
ＡＡ：シタラビン、ドキソルビシン
ＣＯＡＰ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、シタラビン、プレドニゾン
ＭＶ：ミトキサントロン、エトポシド
急性非リンパ性白血病（Ａ．Ｎ．Ｌ．Ｌ．）
ＤＣＴ：ダウノルビシン、シタラビン、チオグアニン
ＭＣ：ミトザントロン、シタラビン
ＣＤ：シタラビン、ダウノルビシン
ＴＣ：チオグアニン、シタラビン
慢性リンパ性白血病（Ｃ．Ｌ．Ｌ．）
ＣＶＰ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン
肺癌
小細胞
ＣＯＰＥ：シクロホスファミド、シスプラチン、エトポシド、ビンクリスチン
ＣＶ：シスプラチン、エトポシド
ＶＡＣ：ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＩＣＥ：イホスファミド、シクロホスファミド、エトポシド
ＣＥＰ：シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチン
非小細胞
ＢＡＣＯＮ：ブレオマイシン、ドキソルビシン、ロムスチン、ビンクリスチン、メクロレタミン
ＣＡＭＰ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキサート、プロカルバジン
ＣＡＰ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン
ＣＶ：シスプラチン、エトポシド
ＣＶＩ：シスプラチン、エトポシド、イホスファミド、メスナ
ＦＡＭ：フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ
ＦＯＭｉ／ＣＡＰ：フルオロウラシル、ビンクリスチン、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン
ＭＡＣＣ：メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ロムスチン
ＩＣＥ：イホスファミド、シクロホスファミド、エトポシド
ＣＥＰ：シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチン
リンパ腫
ホジキン
ＡＢＶＤ：ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、ダカルバジン
Ｂ−ＣＡＶｅ：ブレオマイシン、ロムスチン、ドキソルビシン、ビンブラスチン
Ｂ−ＤＯＰＡ：ブレオマイシン、ダカルバジン、ビンクリスチン、プレドニゾン、ドキソルビシン
ＣＶＰＰ：ロムスチン、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレドニゾン
ＭＯＰＰ：メクロレタミン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾン
ＭＶＰＰ：メクロレタミン、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレドニゾン
ＮＯＶＰ：ミトザントロン、ビンブラスチン、プレドニゾン、ビンクリスチン非ホジキン
ＡＳＨＡＰ：ドキソルビシン、シスプラチン、シタラビン、メチルプレドニゾロン
ＢＡＣＯＰ：ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン
ＣＨＯＰ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン
ＣＨＯＰ−Ｂｌｅｏ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン
ＣＯＭＬＡ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート、ロイコボリンカルシウム、シタラビン
ＣＯＰ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン
ＣＯＰＰ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾン
ＣＶＰ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン
Ｅ−ＳＨＡＰ：エトポシド、シスプラチン、シタバリン、メチルプレドニゾロン
ＩＭＶＰ−１６：イホスファミド、メスナ、メトトレキサート、エトポシド、
ｍ−ＢＡＣＯＤ：ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、メトトレキサート、ロイコボリンカルシウム
ｍ−ＢＡＣＯＳ：ドキソルビシン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ロイコボリンカルシウム
ＭＩＮＥ：メスナ、イホスファミド、ミトザントロン、エトポシド
ＯＰＥＮ：エトポシド、ミトザントロン、ビンクリスチン、プレドニゾン
Ｐｒｏ−ＭＡＣＥ：プレドニゾン、メトトレキサート、ロイコボリンカルシウム、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド
ＡＩ：ドキソルビシン、イホスファミド
ＡＣ：ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＩＣＥ：イホスファミド、シクロホスファミド、エトポシド
ＣＥＰ：シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチン
悪性黒色腫
ＢＨＤ：カルムスチン、ヒドロキシ尿素、ダカルバジン
ＤＴＩＣ−ＡＣＴＤ：ダカルバジン、ダクチノマイシン
ＶＢＣ：ビンブラスチン、ブレオマイシン、シスプラチン
ＶＤＰ：ビンブラスチン、ダカルバジン、シスプラチン
多発性骨髄腫
ＡＣ：ドキソルビシン、カルムスチン
ＢＣＰ：カルムスチン、シクロホスファミド、プレドニゾン
ＭｅＣＰ：メチルＣＣＮＵ、シクロホスファミド、プレドニゾン
ＭＰ：メルファラン、プレドニゾン
Ｍ−２：ビンクリスチン、カルムスチン、シクロホスファミド、メルファラン、プレドニゾン
ＶＡＤ：ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン
ＶＢＡＰ：ビンクリスチン、カルムスチン、ドキソルビシン、プレドニゾン
ＶＣＡＰ：ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾン
卵巣癌
上皮性
Ｃ：カルボプラチン
ＡＰ：ドキソルビシン、シスプラチン
ＣＤＣ：カルボプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＣＨＡＤ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン、ヘキサメチルメラミン
ＣＨＡＰ：シクロホスファミド、ヘキサメチルメラミン、ドキソルビシン、シスプラチン
ＣＰ：シクロホスファミド、シスプラチン
ＰＡＣ：シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＡＣ：ドキソルビシン、シクロホスファミド
ＩＣＥ：イホスファミド、シクロホスファミド、エトポシド
ＣＥＰ：シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチン
生殖細胞
ＶＡＣ：ビンクリスチン、ダクチノマイシン、シクロホスファミド
子宮内膜癌
Ｃ：カルボプラチン
ＡＣ：ドキソルビシン、シクロホスファミド
膵臓癌
ＦＭＳ：フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ストレプトゾシン
ＳＤ：ストレプトゾシン、ドキソルビシン
小児腫瘍
Ａ．Ｌ．Ｌ．
ＤＶＰ：ダウノルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン
ＶＡＰ：ダウノルビシン、アスパラギナーゼ、プレドニゾン
ＣＴ：シタラビン、チオグアニン
ＤＣＰＭ：ダウノルビシン、シタラビン、プレドニゾン、メルカプトプリン
Ａ．Ｎ．Ｌ．Ｌ．
ＤＣ：ダウノルビシン、シタラビン
骨肉腫
ＡＣ：ドキソルビシン、シスプラチン
ＨＤＭＴＸ：メトトレキサート、ロイコボリンカルシウム
Ｔ−２：ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、シクロホスファミド
ホジキン病
ＡＣＯＰＰ：ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾン
ＭＯＰＰ：メクロレタミン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾン
軟組織肉腫
ＶＡＣ：ビンクリスチン、ダクチノマイシン、シクロホスファミド
肉腫
骨肉腫
ＡＣ：ドキソルビシン、シスプラチン
ＣＹＶＡＤＩＣ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダカルバジン
ＨＤＭＴＸ：メトトレキサート、ロイコボリンカルシウム
ＩＭＡＣ：イホスファミド、メスナ、ドキソルビシン、シスプラチン
軟組織
ＣＹＡＤＩＣ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、ダカルバジン
ＣＹＶＡＤＩＣ：シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダカルバジン
ＩＤ：イホスファミド、メスナ、ドキソルビシン
ＶＡＣ：ビンクリスチン、ダクチノマイシン、シクロホスファミド
ＡＩ：イホスファミド、ドキソルビシン
ＭＡＩＤ：メスナ、ドキソルビシン、イホスファミド、ダカルバジン
本発明の方法で治療してよい血小板減少症に特に関連して選ばれる方式は：
0004562815.tif 000006
本発明の１回または少数回の用量は、処置周期における放射線および／もしくは化学療法剤の最初の処置時間の前にか、処置周期における処置時間の間か、またはそれと同時にか、あるいは処置周期における放射線および／もしくは化学療法剤の１回またはそれ以上の個々の処置時間の後に、与えてよい。例えば、１周期は、放射線または化学療法剤の１回の処置時間を構成してよい。本発明では、ＴＰＯの１回または少数回の用量は、この処置時間の前、間または後に投与することになると思われる。これに代えて、周期は、放射線または化学療法剤の複数の処置時間、例えば２〜１０またはそれ以上の処置時間を構成してよい。ここでは、本発明は、いかなる１処置時間もの前、間もしくは後にか、または個々の処置時間のそれぞれの前、間もしくは後にＴＰＯを投与することを企図する。例えば、周期は、化学療法剤の３回の処置を構成してよい。本発明の方法では、ＴＰＯを、３回の処置時間のそれぞれの前に投与してよいか、または３回の処置時間のそれぞれの後に投与してよいと思われる。当然ながら、本発明は、周期における化学療法剤の最初の処置時間の前と、周期における最後の処置時間の後とのＴＰＯの１回の日次用量の投与も包含する。
好適実施態様では、哺乳動物に、放射線および／または化学療法剤の少なくとも一つの処置周期を与えるが、ここで、該処置周期は、放射線および／または化学療法剤を投与する最初の処置時間Ｔ0と、最後の処置時間ＴFとを有する。ＴＰＯの用量は、好ましくはＴ0プラスマイナス２４時間、より好ましくはＴ0プラスマイナス１０時間、さらに好ましくはＴ0プラスマイナス６時間および最も好ましくはＴ0プラスマイナス２時間に投与する。
代替実施態様では、用量は、Ｔ0にか、またはＴ0以前ではあるが、Ｔ0前７日以内に、好ましくはＴ0前１日以内に投与する。１回用量の周期については、Ｔ0＝ＴFである。もう一つの好適実施態様では、用量は、ＴF以前ではあるが、ＴF前７日以内に投与する。上記のとおり、ＴＰＯは、ＴF以後に投与してもよい。ＴＰＯの第二の用量を、ＴF以後に与えたとき、該用量は、ＴF後２４時間以内に投与する。哺乳動物または患者は、当然、複数回の処置周期、一般的には２〜６周期であるが、癌もしくは腫瘍の大きさを縮小するか、または完全に放射線治療をするのに医療上必要なだけ多くの周期を受けてよい。何らかの治療方式では、腫瘍は、放射線および／または化学療法の処置以前のその大きさに対して、大きさが減少し、次いで、外科手術を利用して、腫瘍の残存する悪性組織を除去する。本発明の方法は、これらの方式にも用いてよい。
本発明は、一般的にはＴＰＯの用量の投与後の、好ましくは１治療周期での最後のＴＰＯ用量の投与後の、治療有効量のサイトカイン、コロニー刺激因子およびインターロイキンの同時投与も包含する。サイトカインは、好ましくはＫＬ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９またはＩＬ−１１、特にＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦである。
本発明によれば、本発明の１回または少数回投与方式は、患者の体重１kgあたり約０．１〜５０μg、好ましくは約０．１〜１０μg、より好ましくは約１〜５μg、または好ましくは約１〜３μg程度での日用量の比率で効果的であることが見出された。１回用量では、約２±１．５μg/体重kgの総投与が好ましいと思われる。少数回用量では、１用量あたり約０．５〜１．５μg/体重kgの投与が好ましいと思われる。上記の用量は、好適な静脈内投与で予測される。皮下の経路を介しての投与では、投与される総量は、静脈内の経路を介して投与される量の約１〜３倍の範囲、好ましくは約２倍であると思われる。さらに、肺を経由する投与のための用量は、上記のより高い。個々の患者に対する具体的な治療有効用量は、慣用の方法によって決定し得る。
本発明の方法は、好ましくは、放射線および／または化学療法の処置周期の間、哺乳動物での３５ｘ１０-12モルまたはそれを越える血中ＴＰＯレベルを維持するのに充分なＴＰＯの用量も提供する。好ましくは、該用量は、処置周期の間、１００ｘ１０-12モル以上、より好ましくは約３５ｘ１０-12〜約３，５００ｘ１０-12モルの血中ＴＰＯレベルを維持するのに充分である。
最適な用量の比率および方式は、疾病の重篤度や種類、体重、性別、食餌、投与の時間や経路、他の投薬、および他の関連する臨床的因子を包含する、薬物の作用を変化させる公知の様々な因子を勘案する担当の医師によって決定されることになる。
患者へのトロンボポエチンの１回の日次投与は、血小板減少症の処置に治療上有効であることが判明しているが、少数回（毎日）の方式を用い得ることが認識できることが理解されると思われる。１回の用量は、治療応答の開始を刺激し、本明細書では、複数回の投与が企図されているが、１回または少数回の投与後の投与の終結は、治療応答とは無関係であることが見出されている。
本発明の生物学的に活性である材料のトロンボポエチンは、それによれば、鼻または肺経由、皮下、この静脈内を包含する様々な経路で投与することができる。いずれにしても、投与経路に応じて、本発明の生物学的活性材料のトロンボポエチンは、好ましくは、製薬上許容され得る適切な担体または賦形剤と組み合せて投与する。全身的に投与するときは、該治療組成物は、発熱因子を含んではならず、生理学的なpH等張性および安定性についての正当な考慮を有する、非経口的に許容され得る溶液として存在しなければならない。これらの条件は、一般的には、適切な当技術の習熟者には周知であり、かつ充分に受容される。
略述すると、本発明の材料の投与量配合物は、望みの程度の純度を有する化合物を生理学的に許容され得る担体、賦形剤および／または安定剤と混合することによって、貯蔵または投与のために製造する。そのような材料は、用いた用量および濃度では受容者に無害であり、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩その他の有機酸塩のような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；ポリアルギニンのような低分子量ペプチド、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリジノンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸もしくはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースもしくはデキストリンを包含する単糖類、二糖類その他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはTWEEN、PLURONICSもしくはポリエチレングリコールのような非イオン界面活性剤を含む。
本発明の生物学的活性トロンボポエチンの材料は、遊離酸もしくは塩基の形態としてか、または製薬上許容され得る塩として投与することができ、許容された製薬の実施に要求されるような、生理学的に許容され得る伝達体、担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤、香味料などと調合される。
注射用の滅菌組成物は、慣用の製薬または薬理学の慣例に従って配合することができる。例えば、水、またはゴマ油、ピーナツ油もしくは綿実油のような天然に産する植物油のような賦形剤、あるいはオレイン酸エチルなどのような合成脂肪性賦形剤中の活性物質の溶液もしくは懸濁液が望ましいと思われる。やはり、緩衝液、防腐剤、抗酸化剤などを、許容された製薬の実施に従って組み込むことができる。本発明の生物学的活性材料のトロンボポエチンは、上に特定された疾患、および血小板減少症を指標とする状態の治療の際に、単独で用いるか、または他のサイトカイン、ヘマトポエチン、インターロイキン、成長因子もしくは抗体との併用で投与してよい。すなわち、本発明の活性材料は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Kitリガンド、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＦＬＴ−３リガンド等々を包含する、血小板新生活性を有するその他のタンパク質またはペプチドと組み合せて用いてよい。
徐放性調剤の適切な例は、該ポリペプチドを含有する固体の疎水性重合体の、成形品、例えば薄膜またはマイクロカプセルの形態をなす、半透性マトリックスを包含する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル［例えばLanger et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277（1981）、およびLanger, Chem. Tec., 12: 98-105（1982）に記載のポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリラクチド（米国特許第3,779,919号明細書、ヨーロッパ特許第58,481号公報）、Ｌ−グルタミン酸塩とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体［Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556（1983）］、非分解性エチレン−酢酸ビニル［Langer et al.前掲］、LUPROM DEPOTJ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リロイプロリドからなる注射できる微小球）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ヨーロッパ特許第133,988号公報）を包含する。
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のような重合体が、１００日以上も分子の放出を可能にするのに対し、ある種のヒドロゲルは、より短い期間だけタンパク質を放出する。カプセルに封入したタンパク質は、長期間体内に存続するとき、３７℃での水分との接触の結果として、変性または凝集して、生物学的活性の喪失と免疫原性の潜在的変化とを招く。関与する機構に応じて、タンパク質安定化のための合理的な対策を考案することができる。例えば、凝集機構が、ジスルフィド交換による分子間のＳ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加物の使用、および特定の重合体マトリックス組成物の開発によって達成し得る。
徐放性血小板新生性タンパク質組成物は、リポソームによって捕捉された巨核球新生性タンパク質も包含する。巨核球新生性タンパク質を含有するリポソームは、それ自体は公知である方法によって製造される［ドイツ国特許第3,218,121号公報；Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3698（1985）; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034（1980）; ヨーロッパ特許第52,322号；第36,676号；第88,046号；第143,949号；第142,641号公報；特開昭（58）-118,008号公報；米国特許第4,485,045号および第4,544,545号明細書；ならびにヨーロッパ特許第102,324号公報］。通常、リポソームは、小型（約２００〜８００オングストローム）の単一膜形式のものであり、その中の脂質含量は、コレステロールとして約３０モル％より多く、選ばれた比率は、最適の巨核球新生性タンパク質療法のために調整される。
ＴＰＯまたはｍｐｌリガンドの共有結合による修飾の一形式は、様々な非タンパク質性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの一種とのＴＰＯポリペプチドの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；または第4,179,337号明細書に記載の方式での結合を含む。前記重合体と共有結合されたＴＰＯポリペプチドは、本明細書ではＰＥＧ化したＴＰＯと称する。
ｍｐｌに結合するのに最適な、かつ上に定義した免疫学的および／または生物学的活性を有する変異体を選ぶために、回収したＴＰＯ変異体の何らかのスクリーニングが必要になることが、認識されると思われる。組換え細胞培養体または血漿における（例えばタンパク質分解性の切断に対する）安定性、ｍｐｌの成員に対する高い親和性、酸化に対する安定性、高収率で分泌される能力などについて、スクリーニングすることができる。例えば、ＴＰＯポリペプチドの免疫学的特徴、例えば与えられた抗体との親和性の変化を、競争的形式のイムノアッセイによって測定する。酸化還元もしくは熱に対する安定性、疎水性、またはタンパク質分解性分解に対する感受性のような、タンパク質またはポリペプチドの特性のその他のあり得る修飾は、当技術に周知の方法によって検定される。
製造の方法
ヒトｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）遺伝子の単離
ＴＰＯ遺伝子のヒトゲノムＤＮＡクローンを、ｍｐｌリガンドをコードするヒトｃＤＮＡの３Ｎ半分に相当するフラグメントによる低い緊縮（lowstringency）条件下、または高い緊縮（high stringency）条件下で、８−Ｇｅｍ１２中のヒトゲノムライブラリーをｐＲ４５でスクリーニングすることによって単離した。３５kbに及ぶ二つの重複λクローンを単離した。ＴＰＯ遺伝子全体を含む二つの重複フラグメント（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）を、サブクローニングし、配列決定した。
ヒト遺伝子の構造は、ゲノムＤＮＡの７kb以内の６個のエキソンからなる。すべてのエキソン／イントロン結合部の境界は、哺乳動物の遺伝子で確定された共通モチーフに一致する［Shapiro, M.B. et al., Nucl. Acids. Res. 15: 7155（1987）］。第１および第２エキソンは、５Ｎの非翻訳配列、およびシグナルペプチドの初めの４アミノ酸を有する。分泌シグナルの残余、および成熟タンパク質の初めの２６アミノ酸は、第３エキソン内にコードされている。カルボキシルドメイン全体、ならびにエリスロポエチン様ドメインの３Ｎの非翻訳およびそれから５０個までのアミノ酸は、第６エキソン内にコードされている。ｈＭＬ−２（ｈＴＰＯ−２）内で観察される欠失に関与する４個のアミノ酸は、第６エキソンの５Ｎ末端にコードされている。
サザンブロットによるヒトゲノムＤＮＡの分析は、ＴＰＯの遺伝子が、単一コピーとして存在することを示す。遺伝子の染色体での位置は、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定し、染色体３ｑ２７〜２８にマッピングした。
２９３細胞からのＴＰＯの発現および精製
２９３細胞からのＭＬまたはＴＰＯの調製および精製を、実施例１に詳述する。略述すると、ＴＰＯの全読取り枠に相当するｃＤＮＡを、ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩを用いたＰＣＲによって得た。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドｐＲＫ５tkneo. ＯＲＦ（全読取り枠をコードするベクター）の制限部位ＣｌａＩとＸｂａＩとの間にクローニングした。
ＥＰＯ相同ドメインをコードする第二のベクターを、同様に、しかし異なるＰＣＲプライマーを用いて生成して、ｐＲＫ５−tkneoＥＰＯ−Ｄと呼ばれる最終構成体を得た。
これら２種類の構成体を、ＣａＰＯ4法によってヒト胚性腎臓細胞にトランスフェクションし、ネオマイシン耐性クローンを選別し、密集するまで増殖させた。順化培地でのこれらのクローンからのＭＬ153またはＭＬ332の発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖アッセイを用いて査定した。
ｒｈＭＬ332の精製を、実施例１に記載したとおりに実施した。略述すると、２９３−ｒｈＭＬ332の順化培地を、ＢＬＵＥセファロース（Pharmacia）カラムにかけ、次いで、２モルの尿素を含有する緩衝液で洗浄した。２モル尿素および１モルＮａＣｌを含有する緩衝液でカラムを溶離した。次いで、ＢＬＵＥセファロース溶出液のプールを、ＷＧＡセファロースのカラムに直接かけ、２モル尿素および１モルＮａＣｌを含有する緩衝液１０カラム容で洗浄し、０．５モルＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する同じ緩衝液で溶離した。ＷＧＡセファロースの溶出液を、Ｃ４−ＨＰＬＣカラム（Synchrom, Inc.）にかけ、プロパノールの不連続勾配で溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製２９３−ｆｈＭＬ332は、ゲルの６８〜８０kDaの領域に幅広いバンドとして移動する。
ｒｈＭＬ153の精製も、実施例１に記載したとおりに実施した。略述すると、２９３−ｒｈＭＬ153順化培地を、ｒｈＭＬ332について記載したとおりに、ＢＬＵＥセファロース上で分離した。ＢＬＵＥセファロースの溶出液を、上記のとおり、ｍｐｌ親和性カラムに直接かけた。ｍｐｌ親和性カラムから溶出したｒｈＭＬ153を、ｒｈＭＬ332に用いたのと同じ条件下で、Ｃ４−ＨＰＬＣカラムの操作を用いて均質にまで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製ｒｈＭＬ153は、１８，０００未満〜２２，０００の相対質量を有する２０の主要バンドと二つの副次バンドへと分離する。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からのＴＰＯの発現および精製
ＣＨＯ細胞をトランスフェクションするのに用いた発現ベクターを、pSVI5.ID.LL.MLORF（ＴＰＯ332の全長）およびpSVI5.ID.LL.MLEPO-D（断端したか、またはＴＰＯ153）と称する。
ＴＰＯの全読取り枠に相当するｃＤＮＡを、ＰＣＲによって得た。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドpSVI5.ID.LLの二つの制限部位（ＣｌａＩとＳａＩＩ）の間にクローニングして、ベクターpSVI5.ID.LL.MLORFを得た。ＥＰＯ相同ドメインに相当する第二の構成体を、同じ方法であるが、異なる逆プライマー（ＥＰＯＤ．sal）を用いて生成した。ＴＰＯのＥＰＯ相同ドメインをコードするベクターのための最終構成体を、pSVI5.ID.LL.MLEPO-Dと呼ぶ。
これら二つの構成体をＮｏｔＩで直線化し、電気穿孔法によってチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞、１９８９年３月１５日公開されたヨーロッパ特許第307,247号公報）にトランスフェクションした。記載のとおり［Andreason, G.L., J. Tissue Cult. Meth., 15: 56（1993）］１０、２５または５０mgのＤＮＡの存在下、ＢＲＬ電気穿孔装置内で（３５０Ｖ、３３０mF、低静電容量）１０7個の細胞を電気穿孔した。トランスフェクションの翌日、ＤＨＦＲ選別培地（グリシンなしの高グルコースＤＭＥＭ−Ｆ１２が５０：５０、２mM グルタミン、２〜５％透析ウシ胎児血清）中で細胞を分割した。１０〜１５日後、個々のコロニーを、９６穴プレートに移し、密集まで増殖させた。順化培地でのこれらのクローンからのＭＬ153またはＭＬ332の発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖アッセイを用いて査定した。
採集したＣＨＯ細胞培養液からのＴＰＯの精製および単離の方法は、実施例２に記載してある。略述すると、採集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、樹脂１リットルあたりＨＣＣＦ約１００Lという率でＢＬＵＥセファロース（Pharmacia）カラムにかける。次いで、カラムを緩衝液３〜５カラム容、次いで２．０モルの尿素を含有する緩衝液３〜５カラム容で洗浄する。次いで、２．０モル尿素と１．０モルＮａＣｌとをともに含有する緩衝液３〜５カラム容で、ＴＰＯを溶離する。
次いで、ＴＰＯを含有するＢＬＵＥセファロース溶出液のプールを、ＢＬＵＥセファロース中で平衡させたコムギ胚芽レクチンセファロースカラム（Pharmacia）に、樹脂１mlあたり８〜１６mlのＢＬＵＥセファロース溶出液の率でかける。次いで、カラムを、平衡緩衝液２〜３カラム容で洗浄する。次いで、ＴＰＯを、２．０モル尿素、および０．５モルＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する緩衝液２〜５カラム容で溶離する。
次いで、ＴＰＯを含有するコムギ胚芽レクチン溶離液を、酸性化し、０．０４％の最終濃度までＣ12Ｅ8を加える。得られたプールを、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ12Ｅ8中で平衡させたＣ４逆相カラムに、樹脂１mlあたり約０．２〜０．５mgのタンパク質の容量でかける。
タンパク質は、０．１％ＴＦＡおよび０．０４％Ｃ12Ｅ8を含有するアセトニトリルの二段階線形勾配で溶離し、プールは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて作成する。
次いで、Ｃ４プールを、１０，０００〜３０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するＡＭＩＣＯＮ−ＹＭまたは類似の限外濾過膜上で、緩衝液約６容に対して希釈かつダイア濾過する。そうして、得られたダイア濾液は、直接処理するか、または限外濾過によってさらに濃縮してよい。ダイア濾液／濃縮液は、通常、０．０１％のTWEEN-80の最終濃度に調整する。
次いで、算出カラム容の２〜５％と等価のダイア濾液／濃縮液の全部または一部を、０．０１％TWEEN-80を含有する緩衝液中で平衡させたSEPHACRYL S-300HRカラム（Pharmacia）にかけ、クロマトグラフィーに付す。次いで、凝集体およびタンパク質分解性分解生成物を含まないＴＰＯ含有画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいてプールする。得られたプールを濾過し、２〜８℃で貯蔵する。
微生物中での形質転換、およびＴＰＯ合成の誘導、ならびにそこに製造されたＴＰＯの単離、精製および再折りたたみ
E. ColiのＴＰＯ発現ベクターの構築を、実施例３に詳述する。略述すると、プラスミドｐＭＰ２１、ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐＭＰ５７およびｐＭＰ２０２を、すべて、異なる構成体間で変動する小リーダーの下流で、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するように設計した。リーダーは、主として、高レベルの翻訳開始、および迅速な精製を与える。プラスミドｐＭＰ２１０−１、−Ｔ８、−２１、−２２、−２４、−２５は、開始メチオニンの下流で、ＴＰＯの初めの１５３アミノ酸を発現するように設計し、ＴＰＯの最初の６アミノ酸に対するコドン使用法のみが異なるにすぎないが、プラスミドｐＭＰ２５１は、ｐＭＰ２１０−１の誘導体であって、ＴＰＯのカルボキシル末端が２アミノ酸だけ延長されている。上記のプラスミドはすべて、トリプトファンプロモーターで誘導すると、ＴＰＯの高レベルの細胞内発現をE. coliで生じると思われる［Yansure, D.G. et al., Methods in Enzymology, 185: 54-60（Goeddel, D.V., Ed.）Academic Press, San Diego（1990）］。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は、上記のＴＰＯ細胞内発現プラスミドの構築の中間体である。上記のＴＰＯ発現プラスミドを用いて、実施例３に記載のＣａＣｌ2熱ショック法［Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162（1970）］その他の手順を用いて、E. coliを形質転換した。略述すると、形質転換した細胞を、培養体の光学密度（６００nm）が約２〜３に達するまで、初めに３７℃で増殖させた。次いで、培養液を希釈し、通気による増殖後に、酸を加えた。次いで、培養体を、更に１５時間の通気しながら増殖させ続け、その後、遠心分離によって細胞を回収した。
生物学的に活性であり、再折りたたまれたヒトＴＰＯ、またはそのフラグメントの生成について下に示した単離、精製および再生手順は、実施例４に記載し、ＮおよびＣ末端延長形態を包含する、いかなるＴＰＯ変異体の回収にも適用することができる。再折りたたみまたは合成ＴＰＯに適したその他の手順は、E. coli中で不溶形態で発現させた様々な組換えタンパク質に対する、回復および再折りたたみの方法の全般的説明のための、下記の特許中に見出すことができる：Builder et al., 米国特許第4,511,502号；Jones et al., 同第4,512,922号；Olson, 同第4,518,526号；およびBuilder et al., 同第4,620,948号明細書。
血小板新生活性の測定の方法
血小板新生活性は、Ｂａ／Ｆ３ｍｐｌリガンドアッセイを包含する様々なアッセイで測定してよい。in vivoマウス血小板リバウンド合成アッセイ、ヒト白血病巨核球芽細胞系（ＣＭＫ）に対する抗血小板免疫アッセイ（抗ＧＰIIbIIIa）で測定する限りでの、血小板細胞表面抗原の誘導アッセイ［Sato et al., Brit. J. Heamatol., 72: 184-190（1989）を参照されたい］、および巨核球芽細胞系（ＤＡＭＩ）での倍数化の誘導［Ogura et al., Blood, 72（1）: 49-60（1988）を参照されたい］。未成熟の、大半がＤＮＡを合成しない細胞からの、形態学的に特定できる巨核球への巨核球の成熟は、細胞質の細胞小器官の出現、膜抗原（ＧＰIIbIIIa）の獲得、背景に記載したような血小板の核内複製および放出を包含する過程を伴う。巨核球成熟の系列特異的プロモーター（すなわちｍｐｌリガンド）は、血小板の放出、および血小板減少症の緩和へと導く、未成熟巨核球でのこれらの変化の少なくともいくつかを誘導することが期待されると思われる。したがって、未成熟巨核球細胞系統、すなわちＣＭＫおよびＤＡＭＩ細胞での、これらのパラメータの出現を測定するように、アッセイを設計した。ＣＭＫアッセイは、特異的な血小板マーカーであるＧＰIIbIIIaの出現と、血小板の放散とを測定する。ＤＡＭＩアッセイは、倍数性の増加が成熟巨核球の顕著な特徴であることから、核内複製を測定する。認め得る巨核球は、２Ｎ、４Ｎ、８Ｎ、１６Ｎ、３２Ｎなどの倍数値を有する。最後に、in vivoマウス血小板リバウンドアッセイは、試験化合物（ここではｍｐｌリガンド）の投与が血小板数の増加を招くことの立証に役立つ。
ＴＰＯ活性を測定するために、二つの追加のin vivoアッセイを開発した。第一は、キナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）ＥＬＩＳＡであって、ＣＨＯ細胞をｍｐｌ−Ｒｓｅキメラでトランスフェクションし、キメラのｍｐｌ部分をｍｐｌリガンドと接触させた後に、Ｒｓｅのチロシンリン酸化をＥＬＩＳＡによって測定する。第二は、受容体依拠ＥＬＩＳＡであって、ウサギの抗ヒトＩｇＧで被覆したＥＬＩＳＡプレートが、検定しようとするｍｐｌリガンドと結合するヒトキメラ受容体ｍｐｌ−ＩｇＧを捕捉する。結合したｍｐｌリガンドを検出するには、ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ155）に対するビオチニル化したウサギポリクローナル抗体を用い、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて測定する。
材料トロンボポエチンの治療的用途
生物学的に活性である血小板新生タンパク質（ＴＰＯ）は、産生の欠陥、隔離、または血小板の破壊の増大による、血小板減少症に罹患した患者での巨核球新生または血小板新生活性を刺激するために、滅菌製剤または配合物として役立ち得る。血小板減少症に付随する骨髄の発育不全（例えば、化学療法または骨髄移植組織後の無形成性貧血）はもとより、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、免疫血小板減少症（ＨＩＶ誘導ＩＴＰおよび非ＨＩＶ誘導ＩＴＰを包含）、慢性特発性血小板減少症、先天性血小板減少症、骨髄形成異常症および血栓性血小板減少症も、本発明の化合物で効果的に治療し得る。加えて、これらの巨核球新生タンパク質は、骨髄増殖性の血小板疾患はもとより、炎症性状態からの、および鉄分の欠乏での血小板増加症を治療するのにも役立ち得る。
本発明の方法は、血小板減少症を生じるのに充分な電離性放射線に被曝した哺乳動物またはヒトの患者、例えば、チェルノブイリで発生した周知の事故のような、核事故に被曝した人間を治療するのにも役立つ。ＴＰＯは、患者に充分許容され、これが、核事故後数時間以内の、放射線に作用されたすべての人間へのＴＰＯの迅速な投与を正当化し得る。より詳しく下記に述べるとおり、前駆細胞のＴＰＯ応答性は、放射線および／または化学療法への人間の暴露の直後には、非常に大きいと思われる。本発明の方法は、電離性放射線に被曝すると予測されるような人間に、予防的にＴＰＯを投与することによって、放射線防護手順としても用いてよい。例えば、重大な核事故の場合、緊急作業員は、高度に汚染された部域への進入を必要とすることがある。予防的容量のＴＰＯの、本発明の投与方法による被曝前の投与は、作業員が、放射線への被曝によって誘導される血小板減少症の程度を軽減するために、高レベルの初期多系列前駆細胞を有するのを確保することになる。
本発明の血小板新生タンパク質（ＴＰＯ）の好適な用途は、白血病または充実性腫瘍の治療のための骨髄毒性化学療法、自己または同種骨髄移植組織に対する骨髄除去性化学療法、骨髄形成異常症、特発性無形成性貧血、先天性血小板減少症および免疫血小板減少症にある。
本発明の血小板新生タンパク質で有用に治療される、更に別の疾患は、薬物、中毒、または人工的表面での活性化に起因する、血小板の欠陥もしくは損傷を包含する。これらの場合、「放散している」か、または新たな「未損傷の」血小板を刺激するために、本化合物を用いてよい。
実施例
実施例１：２９３細胞からのＴＰＯの発現および精製
２９３細胞発現ベクターの調製
ＴＰＯ全読取り枠に相当するｃＤＮＡを、下記のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって得た：
0004562815.tif 000007
ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）の存在下での反応のためのテンプレートとしては、ｐｒｋ５−Ｈｍｐｌを用いた。初期変性は、９４℃で７分間、その後２５サイクルの増幅（９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間）であった。最終的な延長は、７２℃で１５分間であった。ＰＣＲ産物を精製し、チミジンキナーゼ促進の制御下でネオマイシン耐性遺伝子を発現するよう改質した、ｐＲＫ５から誘導したベクターである、プラスミドｐＲＫ５tkneoの制限部位ＣｌａＩとＸｂａＩとの間にクローニングして、ベクターｐＲＫ５tkneo. ＯＲＦを得た。ｅｐｏ相同ドメインに相当する第二の構成体を、同じ方法であるが、前進プライマーとしてCla.FL.Fと、下記の逆行プライマーとを用いて生成した：
0004562815.tif 000008
最終構成体をｐＲＫ５−tkneoＥＰＯ−Ｄと呼ぶ。両構成体の配列を確認した。
ヒト胚性腎臓細胞のトランスフェクション
これら２種類の構成体を、ＣＡＰＯ4法によってヒト胚性腎臓細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、ネオマイシン耐性クローンの選別を、０．４mg/mlのＧ４１８の存在下で開始した。１０〜１５日後、個々のクローンを９６穴プレートに移し、密集まで増殖させた。これらのクローンからの順化培地でのＭＬ153またはＭＬ332の発現（ＴＰＯ１５３またはＴＰＯ３３２）を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖アッセイを用いて査定した。
ｒｈＭＬ332の精製
３９２−ｒｈＭＬ332順化培地を、１０mM リン酸ナトリウム、pH７．４（緩衝液Ａ）中で平衡させたＢＬＵＥセファロース（Pharmacia）カラムにかけた。次いで、カラムを緩衝液Ａおよび２M 尿素含有緩衝液Ａ、それぞれ１０カラム容で洗浄した。次いで、カラムを、２M 尿素および１M ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで溶離した。次いで、ＢＬＵＥセファロース溶出プールを、緩衝液Ａ中で平衡させたＷＧＡセファロースカラムに直接かけた。次いで、ＷＧＡセファロースのカラムを、２M 尿素および１M ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ１０カラム容で洗浄し、０．５M Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する同じ緩衝液で溶離した。ＷＧＡセファロースの溶出液を、０．１％ＴＦＡ中で平衡させたＣ４−ＨＰＬＣカラム（Synchrom, Inc.）にかけた。Ｃ４−ＨＰＬＣカラムを、プロパノールの不連続勾配（０〜２５％、２５〜３５％、３５〜７０％）で溶離した。ｒｈＭＬ332は、勾配の２８〜３０％プロパノールの領域で溶出することが判明した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製ｒｈＭＬ332は、ゲルの６８−８−kDaの領域に幅広いバンドとして移動した。
ｒｈＭＬ153の精製
３９２−ｒｈＭＬ153順化培地を、ｒｈＭＬ332について記載したとおりに、ＢＬＵＥセファロース上で分離した。ＢＬＵＥセファロースの溶出液を、上記のとおり、ｍｐｌ親和性カラムに直接かけた。ｍｐｌ親和性カラムから溶出したｒｈＭＬ153を、ｒｈＭＬ332について記載したのと同じ条件下で、Ｃ４−ＨＰＬＣカラムの操作を用いて均質にまで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製ｒｈＭＬ153は、１８，０００未満〜２１，０００の相対質量を有する二つの主要バンドと二つの副次バンドへと分離した。
実施例２：ＣＨＯからのＴＰＯの発現および精製
１．ＣＨＯ発現ベクターの説明
下記の電気穿孔のプロトコルに用いた発現ベクターは、
pSVI5.ID.LL.MLORF（全長すなわちｈＴＰＯ332）、および
pSVI5.ID.LL.MLEPO-D（断端すなわちｈＴＰＯ153）と称する。
２．ＣＨＯ発現ベクターの調製
ｈＴＰＯの全読取り枠に相当するｃＤＮＡを、下表のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって得た。
ＣＨＯ発現ベクターのＰＣＲプライマー
0004562815.tif 000009
ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）の存在下での反応のためのテンプレートとしては、ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩを用いた。初期変性は、９４℃で７分間、その後２５サイクルの増幅（９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間）であった。最終的な延長は、７２℃で１５分間であった。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドpSV15.ID.LLの制限部位ClaIとSalIとの間にクローニングして、ベクターpSV15.ID.LL.MLORFを得た。ＥＰＯ相同ドメインに相当する第二の構成体を、同じ方法であるが、前進プライマーとしてCla.FL.F2と、下記の逆行プライマーとを用いて生成した：EPOD.Sal5’AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC3′（SEQ ID NO:6）。最終構成体をpSV15.ID.LL.MLEPO-Dと呼ぶ。両構成体の配列を確認した。
本質的には、全長および断端リガンドに対するコーディング配列を、ＣＨＯ発現ベクターpSV15.ID.LLの多重クローニング部位に導入した。このベクターは、ＳＶ４０の初期プロモーター／エンハンサー領域、マウスＤＨＦＲｃＤＮＡを含む修飾されたスプライス単位、問題の遺伝子（この場合は記載のＴＰＯ配列）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび複製起点、ならびに細菌でのプラスミド選別および増幅のためのβラクタマーゼ遺伝子を有する。
３．組換えヒトＴＰＯ332およびＴＰＯ153を発現する安定的ＣＨＯ細胞系を確立するための方法論
ａ．ＣＨＯ親細胞系の説明
本明細書に記載のＴＰＯ分子の発現に用いた宿主ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系は、ＣＨＯ−ＤＰ１２として公知である（１９８９年３月１５日公開されたヨーロッパ特許第307,247号公報を参照されたい）。この哺乳動物細胞系を、プレプロインスリンを発現するベクターでの親系（L. Chasin博士の許可により、Stanford UniversityのFrank Lee博士から入手したＣＨＯ−Ｋ１  ＤＵＸ−Ｂ１１（ＤＨＦＲ−））のトランスフェクションからクローン選別して、インスリン要求度の低いクローンを得た。これらの細胞もＤＨＦＲマイナスであり、クローンは、ＤＨＦＲｃＤＮＡベクター配列の存在について、ヌクレオシド補給物質（グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジン）を欠く培地での成長によって選別することができる。ＣＨＯ細胞系を安定的に発現するこの選別系を、一般的に用いる。
ｂ．トランスフェクション方法（電気穿孔）
線状にした、それぞれpSVI5.ID.LL.MLORFまたはpSVI5.ID.LL.MLEPO-Dプラスミドを、電気穿孔［例えばAndreason, G.L., J. Tiss. Cult. Meth., 15, 56（1993）を参照されたい］によってＤＰ１２細胞にトランスフェクションすることによって、ＴＰＯ332およびＴＰＯ153発現細胞系を生成した。標準的な分子生物学の方法によって、酵素ＮＯＴＩで１０μg、２５μgおよび５０μgのベクターを切断する各プラスミドについて、３種類の制限酵素反応混合物を構成した。この制限部位は、ベクターの線状化領域３′内でＴＰＯリガンド転写単位の外側に一度だけ見出されるにすぎない。１００μlの反応を、３７℃での終夜培養で実施した。翌日、混合物をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回抽出し、約１時間ドライアイス上にエタノール沈澱させた。次いで、１５分の微量遠心分離によって沈澱を捕集し、乾燥した。線状化したＤＮＡを、標準的抗生物質および２mM グルタミンを補充したＨａｍのＤＭＥＭ−Ｆ１２の１：１培地５０μlに再懸濁させた。
ＤＰ１２細胞を増殖する懸濁液を回集し、ＤＮＡの再懸濁について記載した培地中で１回洗浄し、最後に、同じ培地に７５０μlあたり１０7個の細胞の濃度で再懸濁させた。細胞のアリコート（７５０μl）、および線状化したＤＮＡ混合物のそれぞれを、室温で１時間まとめて温置し、次いで、ＢＲＬ電気穿孔チャンバーに移した。次いで、各反応混合物を、標準的ＢＲＬ電気穿孔装置内で、３３０μFおよび低静電容量に設定して３５０Vで電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞を、装置内に５分間、次いで氷上に更に１０分の温置期間留めた。電気穿孔した細胞を、ＣＨＯ細胞用の標準的完全成長培地（１ｘＧＨＴ、２mM グルタミンおよび５％ウシ胎児血清を補充した、グリシン抜きの高グルコースＤＭＥＭ−Ｆ１２が５０：５０）５mlを有する６０mm細胞培養皿に移し、５％ＣＯ2の細胞培養インキュベーター内で終夜増殖させた。
ｃ．選別およびスクリーニングの方法
翌日、標準的方法によって、細胞をトリプシン処理して剥離し、ＤＨＦＲ選別培地（２％または５％透析ウシ胎児血清のいずれかを補充した、グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く、上記のＨａｍのＤＭＥＭ−Ｆ１２が１：１の培地）を有する１５０mm組織培養更に移した。次いで、６０mmの皿の各々からの細胞を、５／１５０mmの皿に再プレートした。次いで、クローンが出現し始め、９６穴の皿に移すのに従える大きさに達するまで、３７℃／１５％ＣＯ2で１０〜１５日間（１回培地を交換して）細胞を培養した。４〜５日の期間にわたり、５０mlに設定したピペットマンの滅菌黄色チップを用いて、細胞系を９６穴の皿に移した。細胞を集密するまで（通常３〜５日）増殖させ、次いで、トレーをトリプシン処理し、初めのトレーの２コピーを複製した。これらのコピーのうちの二つを、各ウェルの細胞をＤＭＳＯ中の１０％ＦＣＳ５０μlに希釈して、フリーザー内に短期間貯蔵した。第三のトレーの密集ウェルからの５日目の無血清順化培地のサンプルを、ＴＰＯ発現について、Ｂａ／Ｆ細胞依拠活性アッセイによって検定した。このアッセイに基づく最高の発現クローンを、貯蔵物から復活させ、二つの集密１５０mmＴ型フラスコに規模拡大して、懸濁液に適応させるための細胞培養群に移し、再検定し、蓄積した。
ｄ．増幅のプロトコル
続いて、上記の選別からの最高力価の細胞系のいくつかを、標準的メトトレキサート増幅方式に付して、より高い力価のクローンを生成した。ＣＨＯ細胞クローンを拡大し、メトトレキサートの４様の濃度（すなわち５０nM、１００nM、２００nMおよび４００nM）で、２または３様の細胞数（１皿あたり１０5、５ｘ１０5および１０6個の細胞）で１０cmの皿にプレートした。次いで、これらの培養体を、クローンが確立され、その後のアッセイのために９６穴皿に移すのに従えるようになるまで、３７℃／５％ＣＯ2で培養する。この選別からのいくつかの高力価クローンを、より高濃度のメトトレキサート（すなわち６００nM、８００nM、１，０００nMおよび１，２００nM）に付し、前記と同様に耐性クローンを確立させ、次いで、９６穴の皿に写し、検定した。
４．組換えヒトＴＰＯ332およびＴＰＯ153を発現する安定的ＣＨＯ細胞系の培養
蓄積した細胞を解凍し、無血清または含血清培地のいずれかでの標準的細胞増殖法によって、細胞集団を拡大する。充分な細胞密度までの拡大の後、細胞を洗浄して、消費された細胞培養液を除去する。次いで、細胞を、２５〜４０℃、中性pH、溶解Ｏ2含量が少なくとも５％の、バッチ、供給バッチまたは連続培養を包含するいずれかの標準的方法によって培養して、構成的に分泌されたＴＰＯを蓄積させる。次いで、遠心分離のような機械的手段によって、細胞培養液を細胞から分離する。
５．ＣＨＯ培養液からの組換えヒトＴＰＯの精製
回集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、０．１５M ＮａＣｌ中で平衡させたＢＬＵＥセファロース６FASTFLOWカラム（Pharmacia）に、樹脂１リットルあたりＨＣＣＦ約１００Lの比率で、約３００ml/時/cm2の連続的流速で直接かける。次いで、平衡緩衝液３〜５カラム容、次いで３〜５カラム容の０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、２．０M 尿素で、カラムを洗浄する。次いで、３〜５カラム容の０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、２．０M 尿素、１．０M ＮａＣｌで、ＴＰＯを溶出させる。次いで、ＴＰＯを含有するＢＬＵＥセファロースのプールを、０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、２．０M 尿素および１．０M ＮａＣｌで平衡させたコムギ胚芽レクチンセファロース６ＭＢカラム（Pharmacia）に、樹脂１mlあたりＢＬＵＥセファロースプール８〜１６mlの比率で、約５０ml/時/cm2の流速でかける。次いで、カラムを、２〜３カラム容の平衡緩衝液で洗浄する。次いで、２〜５カラム容の０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、２．０M 尿素、０．５M Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで、ＴＰＯを溶出させる。
次いで、コムギ胚芽レクチンプールを、０．０４％Ｃ12Ｅ8および（ＴＦＡ）０．１％のトリフルオロ酢酸最終濃度に調整する。得られたプールを、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ12Ｅ8で平衡させたＣ４逆相カラム（Vydac ２１４ＴＰ１０２２）に、樹脂１mlあたりタンパク質０．２〜０．５mgの容量、１５７ml/時/cm2の流速でかける。
０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ12Ｅ8を含有するアセトニトリルの二段階線形勾配中で、タンパク質を溶出させる。第一段階は、１５分間の０〜３０％のアセトニトリルの線形勾配からなり、第二段階は、６０分間の３０〜６０％のアセトニトリルの線形勾配からなる。ＴＰＯは、約５０％のアセトニトリルで溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、プールを作成する。
次いで、Ｃ４プールを、２容の０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、０．１５M ＮａＣｌで希釈し、１０，０００〜３０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するＡＭＩＣＯＮ  ＹＭまたは類似の限外濾過膜上で、約６容の０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、０．１５M ＮａＣｌに対してダイア濾過する。そうして、得られたダイア濾液は、直接処理するか、または限外濾過によってさらに濃縮してよい。ダイア濾液／濃縮液は、０．０１％のTWEEN-80の最終濃度に調整する。
次いで、算出カラム容の２〜５％と等価のダイア濾液／濃縮液の全部または一部を、０．０１M リン酸Ｎａ、pH７．４、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１％TWEEN-80で平衡させたSEPHACRYLＳ−３００ＨＲカラム（Pharmacia）にかけ、約１７ml/時/cm2の流速でクロマトグラフィーに付す。凝集体およびタンパク質分解性分解生成物を含まないＴＰＯ含有分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいてプールする。得られたプールを０．２２μmフィルター、ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶなどで濾過し、２〜８℃で貯蔵する。
実施例３：E. coli中での形質転換、およびＴＰＯタンパク質合成の誘導
１．大腸菌ＴＰＯ発現ベクターの構築
プラスミドｐＭＰ２１、ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐＭＰ５７およびｐＭＰ２０２を、すべて、異なる構成体間で変動する小さなリーダーの下流で、ＴＰＯの初めの１５５アミノ酸を発現するように設計した。リーダーは、主として、高レベルの翻訳開始、および迅速な精製を与える。プラスミドｐＭＰ２１０−１、−Ｔ８、−２１、−２２、−２４、−２５は、開始メチオニンの下流で、ＴＰＯの初めの１５３アミノ酸を発現するように設計し、ＴＰＯの初めの６アミノ酸に対するコドン使用法のみが異なるにすぎないが、プラスミドｐＭＰ２５１は、ｐＭＰ２１０−１の誘導体であって、ＴＰＯのカルボキシル末端が２アミノ酸だけ延長されている。上記のプラスミドはすべて、トリプトファンプロモーターで誘導すると、ＴＰＯの高レベルの細胞内発現をE. coliで生じることになる［Yansura, D.G. et al., Methods in Enzymology, 185: 54-60（Goeddel, D.V., Ed.）Academic Press, San Diego（1990）］。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は、上記のＴＰＯ細胞内発現プラスミドの構築の中間体である。
（ａ）プラスミドｐＭＰ１
プラスミドｐＭＰ１は、ＴＰＯの初めの１５５アミノ酸に対する分泌ベクターであり、ＤＮＡの５フラグメントをともに結合することによって構成した。その第一のものは、小さいＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを除去した、ベクターｐＰｈｏ２１であった。ｐＰｈｏ２１は、ｐｈＧＨ１［Chang, C.N. et al., Gene 55: 189-196（1987）］の誘導体であって、ヒト成長ホルモン遺伝子が、E. coli phoA遺伝子と置き換えられ、MluI制限部位が、STIIシグナル配列のコーディング配列の第２０〜２１アミノ酸に組み込まれている。
次の二つのフラグメント、すなわちＴＰＯの第１９〜１０３アミノ酸をコードするｐＲＫ５−ｈｍｐｌからのＤＮＡの２５８塩基対のＨｉｎｆＩ−ＰｓｔＩ片、および第１〜１８アミノ酸をコードする下記の合成ＤＮＡ：
0004562815.tif 000010
は、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼで予め結合し、次いでＰｓｔＩで切断した。第四は、ＴＰＯの第１０４〜１５５アミノ酸をコードするｐＲＫｓｈｍｐＩＩからのＤＮＡの１５２塩基対のＰｓｔＩ−ＨａｅＩＩＩフラグメントであった。最後は、λを含むｐｄｈ１０８から前記の転写ターミネーター［Scholtissek, S. et al., NAR 15: 3185（1987）］までの４１２塩基対のＳｔｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントであった。
（ｂ）プラスミドｐＭＰ２１
プラスミドｐＭＰ２１は、ＳＴＩＩシグナル配列の一部を含む１３アミノ酸のリーダーを援用して、ＴＰＯの初めの１５５アミノ酸を発現するよう設計する。それは、三つの（３）ＤＮＡフラグメントをともに結合することによって構成したもので、その第一は、小さいＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを除去した、ベクターｐＶＥＧ３１であった。ベクターｐＶＥＧ３１は、pHGH207-1［de Boer, H.A. et al., in Promoter Structure and Function（Rodriguez, R.L. & Chamberlain, M.J., Ed.）, 462, Praeger, New York（1982）］の誘導体であって、ヒト成長ホルモン遺伝子を血管内皮成長因子の遺伝子と置き換えてある（この同一のベクターフラグメントは、この後者のプラスミドから得ることができる）。
結合の第二の部分は、下記の配列：
0004562815.tif 000011
を有する合成ＤＮＡ二重らせん体であった。
最後の１片は、ＴＰＯの１５５アミノ酸をコードするｐＭＰ１からの１，０７２塩基対のＭｌｕＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。
（ｃ）プラスミドｐＭＰ１５１
プラスミドｐＭＰ１５１は、ＳＴＩＩシグナル配列の７アミノ酸、８ヒスチジン、および因子Ｘａ切断部位を含むリーダーの下流で、ＴＰＯの初めの１５５アミノ酸を発現するように設計する。ｐＭＰ１５１は、三つのＤＮＡをともに結合することによって構成したが、その第一は、小さいＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを除去した、前記のベクターｐＶＥＧ３１であった。第二は、下記の配列：
0004562815.tif 000012
を有する合成ＤＮＡ二重らせん体であった。
最後は、ＴＰＯの１５４アミノ酸をコードするｐＭＰ１１からの１，０６４塩基対のＢｇＬＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。プラスミドｐＭＰ１１は、ＳＴＩＩシグナル配列の少数のコドンの変化以外はｐＭＰ１と同一である（このフラグメントは、ｐＭＰ１から得られる）。
（ｄ）プラスミドｐＭＰ２０２
プラスミドｐＭＰ２０２は、リーダー中の因子Ｘａ切断部位がトロンビン切断部位に置き換わっていることを除けば、発現ベクターｐＭＰ１５１に非常に似ている。図３６に示したとおり、ｐＭＰ２０２は、三つのＤＮＡフラグメントをまとめて結合することによって構成した。その第一は、小さいＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを除去した、前記のベクターｐＶＥＧ３１であった。第二は、下記の配列：
0004562815.tif 000013
を有する合成ＤＮＡ二重らせん体であった。
最後の１片は、前記のプラスミドｐＭＰ１１からの１，０６４塩基対のＢｇｌＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。
（ｅ）プラスミドｐＭＰ１７２
プラスミドｐＭＰ１７２は、ＴＰＯの初めの１５３アミノ酸に対する分泌ベクターであり、ｐＭＰ２１０を構成するための中間体である。ｐＭＰ１７２は、三つのＤＮＡをまとめて結合することによって調製したが、その第一は、小さいＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩセクションを除去した、ベクターｐＬＳ３２１ａｍＢであった。第二は、前記のプラスミドｐＭＰ１１からの９４６塩基対のＥｃｏＲＩ−ＨｇａＩフラグメントであった。最後の１片は、下記の配列：
0004562815.tif 000014
を有する合成ＤＮＡ二重らせん体であった。
（ｆ）プラスミドｐＭＰ２１０
プラスミドｐＭＰ２１０は、翻訳開始メチオニンの後のＴＰＯの初めの１５３アミノ酸を発現するように設計した。このプラスミドは、実際には、ＴＰＯの初めの６コドンが各コドンの第３位でランダム化された、プラスミドのバンクとして作成し、三つのＤＮＡフラグメントの結合によって構成した。その第一は、小さいＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを除去した、前記のベクターｐＶＥＧ３１であった。第二は、初めにＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ）で処理し、次いで、ＸｂａＩおよびＨｉｎＩで消化した、下記に示す配列：
0004562815.tif 000015
を有する合成ＤＮＡ二重らせん体であり、ＴＰＯの開始メチオニン、およびランダム化された初めの６コドンをコードしていた。
第三は、ＴＰＯの第１９〜１５３アミノ酸をコードするｐＭＰ１７２からの８９０塩基対のＨｉｎｆＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。
約３，７００クローンからなるプラスミドｐＭＰ２１０のバンクを、高テトラサイクリン（５０μg/ml）ＬＢプレート上に再び形質転換して、高翻訳開始クローンを選別した［Yansura, D.G. et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4: 151-158（1992）］。高テトラサイクリンプレートに現出した８コロニーのうち、ＴＰＯ発現に関して最良の５コロニーを、ＤＮＡ配列決定に付した。
（ｇ）プラスミドｐＭＰ４１
プラスミドｐＭＰ４１は、因子Ｘａ切断部位が後続するＳＴＩＩシグナル配列の７アミノ酸からなるリーダーに融合させた、ＴＰＯの初めの１５５アミノ酸を発現するよう設計した。このプラスミドは、ＤＮＡの３片をともに結合することによって構成したが、その第一は、小さいＸｂａＩ−Ｓｐｈ１フラグメントを除去した、前記のベクターｐＶＥＧ３１であった。第二は、下記：
0004562815.tif 000016
の合成ＤＮＡ二重らせん体であった。
結合の最後の１片は、前記のプラスミドｐＭＰ１１からの１，０６４塩基対のＢｇｌＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。
（ｈ）プラスミドｐＭＰ５７
プラスミドｐＭＰ５７は、ＳｔｌＩシグナル配列の９アミノ酸と、二塩基部位Ｌｙｓ−Ａｒｇとからなるリーダーの下流で、ＴＰＯの初めの１５５アミノ酸を発現する。この二塩基部位は、リーダーをプロテアーゼＡｒｇＣで除去する手段を与える。このプラスミドは、三つのＤＮＡ片をともに結合することによって構成した。その第一は、小さいＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを除去した、前記のベクターｐＶＥＧ３１であった。第二は、下記：
0004562815.tif 000017
の合成ＤＮＡ二重らせん体であった。
結合の最後の部分は、前記のプラスミドｐＭＰ１１からの１，０６４塩基対のＢｇｉＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。
（ｉ）プラスミドｐＭＰ２５１
プラスミドｐＭＰ２５１は、ｐＭＰ２１０−１の誘導体であって、ＴＰＯの追加の２アミノ酸が、カルボキシル末端に含まれている。このプラスミドは、ＤＮＡの２片をともに結合することによって構成したが、その第一は、小さいＸｂａＩ−ＡｐａＩフラグメントを除去した、前記のｐＭＰ２１であった。結合の第二の部分は、ｐＭＰ２１０−１からの３１６塩基対のＸｂａＩ−ＡｐａＩフラグメントであった。
２．ＴＰＯ発現ベクターによる大腸菌の形質転換および誘導
上記のＴＰＯ発現プラスミドを用いて、E. coli４４Ｃ６株（w3110 tonA Δ rpoHts lonΔ cipΔ galE）を、ＣａＣｌ2熱ショック法［Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162（1970）］を用いて形質転換した。形質転換した細胞を、５０pg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ培地で、培養体の光学密度（６００nm）が約２〜３に達するまで、初めに３７℃で増殖させた。次いで、ＬＢ培養体を、０．４９％（w/v）カザアミノ酸、および５０pg/mlのカルベニシリンを含有するＭ９培地中で２０倍に希釈した。３０℃で１時間の通気による増殖後に、インドール−３−アクリル酸を５０llg/mlの最終濃度まで加えた。次いで、培養体を、３０℃で更に１５時間の通気によって増殖させ続け、その時点で、遠心分離によって細胞を採集した。
実施例４：大腸菌での生物学的活性ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）の生産
生物学的に活性である、再び折りたたまれたＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）の生産のための下記の手順は、ＮおよびＣ末端延長形態を包含する、他のＴＰＯ変異体の回収についても、同様にして適用することができる。
１．不溶性ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）の回収
プラスミドｐＭＰ２１０−１によってコードされる、ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）を発現するE. coli細胞を、上記のとおり発酵させた。代表的には、約１００gの細胞を、細胞破壊緩衝液（１０mM トリス、５mMＥＤＴＡ、pH８）１（１０容）にPolytronホモジナイザーで再懸濁させ、細胞を５，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。洗浄した細胞ペレットを、再び、細胞破壊緩衝液１LにPolytronホモジナイザーで再懸濁させ、細胞懸濁液を、LH CELL DISRUPTER（LH Inceltech, Inc.）またはMICROFLUIDIZER（Microfluidics International）に、製造者の教示に従って通す。懸濁液を５，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、再懸濁させ、２回目の遠心分離を施して、洗浄した屈折性実体のペレットとした。洗浄したペレットは、直ちに用いるか、または−７０℃で凍結貯蔵した。
２．単量体ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）の可溶化および精製
ＴＰＯタンパク質の可溶化。高濃度の尿素（６〜８M）も役立つが、一般的には、グアニジンに比して、より低い収率を招く。可溶化の後、溶液を３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離して、変性した単量体ＴＰＯタンパク質を含有する清澄な上清を生成した。次いで、上清を、ＳＵＰＥＲＤＥＸ２００ゲル濾過カラム（Pharmacia、２．６ｘ６０cm）でのクロマトグラフィーに２ml/分の流速でかけ、１６０および２００ml間で溶出する単量体の変性ＴＰＯタンパク質を含有する、１０mMＤＴＴ画分とともに、２０mM リン酸Ｎａ、pH６．０で溶出するタンパク質をプールした。ＴＰＯタンパク質を、半調製的Ｃ４逆相カラム（２×２０cmＶＹＤＡＣ）でさらに精製した。サンプルを、３０％アセトニトリルを有する０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）平衡させたカラムに、５ml/分でかけた。アセトニトリルの線形勾配（６０分で３０〜６０％）で、タンパク質を溶出させた。変形した、精製タンパク質を、約５０％アセトニトリルで溶出した。この材料を再折りたたみに用いて、生物学的活性ＴＰＯ変異体を得た。
３．生物学的活性ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）の生成
０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル４０ml中の変形し、変性した単量体のＴＰＯタンパク質約２０ｇを、場合により下記の試薬を含有する再生緩衝液３６０mlに希釈した：
５０mM トリス、
０．３M ＮａＣｌ、
５mM ＥＤＴＡ、
２％ＣＨＡＰＳ界面活性剤、
２５％グリセリン、
５mMの酸化したグルタチオン、
１mMの還元したグルタチオン、
pH８．３に調整。
混合した後、再折りたたみ緩衝液を、４℃で１２〜４８時間静かに攪拌して、適正なジスルフィド形態のＴＰＯ（下記を参照されたい）の最高再折りたたみ収率を発揮させる。次いで、溶液をＴＦＡで酸性化して、０．２％の最終濃度とし、０．４５または０．２２μmフィルターを通じて濾過し、１１０容のアセトニトリルを加えた。次いで、この溶液を、Ｃ４逆相カラムに直接圧送かつ精製し、再折りたたまれたＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）を、上記と同じ勾配プログラムで溶出させた。これらの条件下で、再折りたたまれた生物学的活性ＴＰＯは、約４５％のアセトニトリルに溶出された。ＴＰＯの不適正なジスルフィド結合バージョンは、より早期に溶出される。最終的な精製ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）は、ＳＤＳゲル、および分析的Ｃ４逆相クロマトグラフィーによって査定した限りで、９５％を上回る純度である。動物実験のためには、Ｃ４精製材料を、生理学的に適合する緩衝液へと透析した。１５０mMＮａＣｌ、および０．０１％TWEEN-80を含有する等張緩衝液（１０mM リン酸Ｎａ、pH５．５、１０mM コハク酸Ｎａ、pH５．５、または１０mM リン酸Ｎａ、pH７．４）を用いた。
Ｂａ／Ｆ３アッセイでのＴＰＯの高い効力（半値最大刺激は、約３pg/mlで達成される）のため、生物学的活性材料は、異なる多くの緩衝液、界面活性剤および酸化還元条件を用いて得ることができる。しかし、ほとんどの条件下で、適正に折りたたまれた少量（＜１０％）の材料のみが得られるにすぎない。商業的な製造法のためには、少なくとも１０％、より好ましくは３０〜５０％、最も好ましくは＞５０％の折りたたみ収率を有するのが望ましい。異なる多くの界面活性剤（トリトンＸ−１００、ドデシル−β−マルトシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、ＳＡＲＫＯＳＹＬ、TWEEN 20やTWEEN-80、ZWITTERGNT ３〜１４など）を、高い再生収率を裏付ける効率について査定した。これらの界面活性剤のうち、ＣＨＡＰＳ族（ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯ）のみが、タンパク質凝集および不適正ジスルフィド形成に限定する再折りたたみ反応に役立つことが判明したにすぎない。１％を越えるレベルのＣＨＡＰＳが、最も有用であった。最良の収率には、０．１〜０．５Mの最適レベルとともに、塩化ナトリウムが必要とされた。ＥＤＴＡ（１〜５mM）の存在は、いくつかの調製品で観察された金属で触媒される酸化（および凝集）の量を限定する。１５％を越えるグリセリン濃度は、最適の再折りたたみ条件を生じる。最高収率のためには、酸化および還元グルタチオン、または酸化および還元システインの双方を、酸化還元試薬対として有することが不可欠である。一般に、酸化された試薬のモル比が、酸化還元対の還元された試薬である成員に等しいか、またはそれより過剰であるときに、より高い収率が観察され、７．５と約９の間のpH値が、これらのＴＰＯ変異体の再折りたたみに最適であった。有機溶媒（例えばエタノール、アセトニトリル、メタノール）は、１０〜１５％またはそれ以下の濃度で許容された。より高レベルの有機溶媒は、不適正に折りたたまれた形態の量を増加させた。トリスおよびリン酸緩衝液は、一般的には、有用であった。４℃での温置も、より高レベルの適正に折りたたまれたＴＰＯを生じた。
最初のＣ４段階を通じて精製したＴＰＯの調製品については、４０〜６０％の再折りたたみ収率（再折りたたみ反応に用いられた変形し、変性したＴＰＯの量に対して）が代表的である。活性材料は、より純粋でない調製品（例えば、Superdex 200カラムの直後、または最初の屈折体の抽出後のそれ）のときに得ることができたが、大規模の沈澱と、ＴＰＯ再折りたたみ工程の際の非ＴＰＯタンパク質の干渉とのため、収率は比較的少ない。
ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）は、４個のシステイン残基を有するため、このタンパク質の異なる３種類のジスルフィドバージョン：
バージョン１：第１と４および第２と３システイン残基間のジスルフィド
バージョン２：第１と２および第３と４システイン残基間のジスルフィド
バージョン３：第１と３および第２と４システイン残基間のジスルフィド
を生成することが可能である。再折りたたみ条件を決定する最初の探索の際に、ＴＰＯタンパク質を含有する異なるいくつかのピークが、Ｃ４逆相クロマトグラフィーによって分離された。これらのピークの一つだけが、Ｂａ／Ｆ３アッセイを用いて決定した限りで、有意な生物学的活性を有した。次いで、このバージョンを優先的に生じるよう、再折りたたみ条件を最適化した。これらの条件下で、誤って折りたたまれたバージョンは、得られた全単量体ＴＰＯの１０〜２０％未満である。
生物学的活性ＴＰＯに関するジスルフィドパターンは、質量分析法およびタンパク質配列決定によって１と４および２と３であると決定されている（すなわちバージョン１）。Ｃ４で分離した様々なピークのアリコート（５〜１０ナノモル）を、トリプシンで消化した（１：２５モル比のトリプシン対タンパク質）。消化混合物を、ＤＴＴによる還元の前後で、マトリックス支援レーザー脱離質量分析法によって分析した。還元後は、ＴＰＯの、より大きいトリプシンペプチドの大部分に相当する質量が検出された。未還元サンプルでは、これらの質量のいくらかが存在せず、新たな質量が観察された。新たなピークの質量は、基本的には、ジスルフィド対に関与する個々のトリプシンペプチドの合計に相当した。したがって、再折りたたまれた、組換えによる生物学的活性ＴＰＯのジスルフィドパターンは、疑いもなく、１と４および２と３によるとすることが可能になった。これは、関連分子であるエリスロポエチンの公知のジスルフィドパターンと一致する。
Ｄ．組換えによる再生ＴＰＯ（Ｍｅｔ１−１５３）の生物学的活性
再折りたたまれ、精製されたＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）は、in vitroとin vivoとの双方のアッセイで活性を有する。Ｂａ／Ｆ３アッセイでは、Ｂａ／Ｆ３細胞へのチミジン取込みの半値最大刺激は、３．３pg／ml（０．３pM）で達成された。ｍｐｌ受容体に基づくＥＬＩＳＡでは、半値最高活性は、１．９ng/ml（１２０pM）で生じた。正常な動物、および近致死Ｘ線によって生起した骨髄抑制動物では、ＴＰＯ（Ｍｅｔ-1１−１５３）は、新たな血小板の産生を刺激するのに非常に有効であった（活性は、３０ng/マウスという低い用量で認められた）。
実施例５：骨髄抑制（カルボプラチン／照射）マウスのデータ
動物
調べたすべての動物は、Genentech Inc.の研究用飼育および使用委員会によって承認された。実験開始の前に、すべての動物を、同定のために耳に標識し、基本的水準の全血球数（ＣＢＣ）を得た。メスＣ５７ＢＬ／６系マウス１０匹の群に、137Ｃｓ線源からの５．０Gyのガンマ線を照射した。６時間以内に、動物にカルボプラチン１．２mgを２００μlの腹腔内注射として与えた。
下記は、標準的マウスモデルに組換えマウストロンボポエチン（ｍＴＰＯ）を用いた、プロトコルおよび結果である。当業者は、このモデルがヒトにおける処置と相関することを理解すると思われる。ヒトトロンボポエチンは、同じマウスモデルで試験されており、種特異性のために、より低いレベルでではあるが、適切な活性を示すことが見出された。したがって、適切な効果を立証できるよう、この種に対する適正な相手であるマウスＴＰＯを用いて、下記のプロトコルを選んだ。やはり、マウスのプロトコルでのヒトＴＰＯの使用は、程度のみが異なるにすぎない、類似の結果を与えるものと思われる。
血液サンプルの調達
実験の前、および研究期間中の時点で、眼窩から４０μlの血液を採取し、直ちに希釈剤１０mlに希釈して、血液凝固を防止した。各血液サンプルからの全血球数（ＣＢＣ）を、SERRANO Baker System 9018血液分析装置で捕集の６０分以内に測定した。各用量群の動物の半数のみを、与えられた日に採血し、こうして、各動物は、交互の時点で採血した。
処置方式
実験１：血小板減少症にさせた動物における組換えマウストロンボポエチン（ｍＴＰＯ３３５ａａ）に対する応答を決定するために、０．１μg/日（ほぼ５μg/kg/日）で連続１、２、４または８日間、動物群を処置した。ｍＴＰＯ（３３５ａａ）による処置は、モデルの開始２４時間後に開始し、毎日１００μlの皮下注射として与えた。
実験２：このモデルでのｒｍＴＰＯ（３３５）に関する用量応答関係の性質を決定するために、モデルの開始２４時間後に、ｒｍＴＰＯ（３３５）の１回注射を動物に与えた。１回の１００μl皮下注射として、ｒｍＴＰＯ（３３５）０．０１、０．０３、０．１または０．３μgの一つを動物群に与えた。二つの投与経路を比較するために、同時実験は、同一用量のｒｍＴＰＯ（３３５）を、しかし静脈内の経路（側尾静脈）を介して与えた４動物群を用いた。
実験３：この一連の実験は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合した、ＰＥＧ化した様々な断端ｒｍＴＰＯ分子（ｒｍＴＰＯ（１５３））の薬効を比較するために実施した。
ｉ．この実験では、血小板減少症の動物に、下記のＰＥＧ化ｒｍＴＰＯ（１５３）分子：ＰＥＧなし、１回の２０K ＰＥＧ、または１回の４０K ＰＥＧを注射した（０．１μg皮下）。
ii．最後の実験では、血小板減少症にさせた動物に、０．１μgを皮下または静脈内のいずれかで与えることによって、１回の４０K ＰＥＧｒｍＴＰＯ（１５３）分子の投与の効果を比較した。ｒｍＴＰＯ（３３５）（０．１μg）を陽性対照として用いた。
結果
致死下の照射とカルボプラチンとの併用は、一貫した血小板減少症を１００％の動物に与える、再現可能な応答を招いた。血小板減少症の最下点は、１０日目に発生し、２１〜２８日目までに、血小板数は次第に回復した。この血小板減少症に伴って、顕著な貧血が、やや遅れて１４〜１７日目に、また２８日目までには対照赤血球数への回復が存在した。白血球数も、実験の経過の際に減少した。
実験１：モデルの開始２４時間後に与えた０．１μgのｒｍＴＰＯ（３３５）の１回の用量は、このマウスのモデルでの血小板数の回復を加速した。ｒｍＴＰＯ（３３５）のこの１回の投与は、１０日目の１９６ｘ１０3±３３ｘ１０3/μlから７日目の４３４ｘ１０3±７ｘ１０3/μlまで、応答の最下点を上昇させた。血小板数の減少の初めの速度は、不変のままであったが、回復期は、はるかに急速であって、血小板数は、１４日目までに正常に復帰して、対照群での２１日に対比される。回復速度のそれ以上の何らかの向上は、１日目および２日目に０．１μg/日を与えることによって認められたが、これは、下限に近かった。連続する４または８日間のｒｍＴＰＯ（３３５）の投与によっては、それ以上の向上は、全く認められなかった（図１ａ）。血小板数の回復の加速に加え、これらの動物に発症した貧血も、１日目に与えた１回の用量のｒｍＴＰＯ（３３５）によって緩和された。血小板数と同様に、ｒｍＴＰＯ（３３５）の２回以上の投与によっては、それ以上の進歩を得ることはできなかった（図１ｂ）。ｒｍＴＰＯ（３３５）は、血小板および赤血球数の低下を伴う白血球減少症に対しては、全く効果がなかった（図１ｃ）。
実験２：モデル開始の２４時間後に与えたｒｍＴＰＯ（３３５）の１回の皮下用量に対する応答は、用量依存性であった。試験した最低用量（０．０１μg）は、対照に比して、血小板回復に対する効果が皆無であった。しかし、０．０３μgを与えたとき、応答はほとんど最大である（図２ａ）。この極端に急勾配の用量応答曲線は、１４日目の血小板数を対数−直線プロットでプロットしたとき、より充分に認識される（図３ａ）。類似の急勾配の用量応答は、このモデルでの赤血球集団についても認められる（図３ｂ）。ｒｍＴＰＯ（３３５）の静脈内投与は、類似の用量依存性応答を示した。しかし、試験した最低用量（０．０１μg）は、静脈内に与えたときに効果的であり（図４ａ）、用量応答曲線が、左方に移動することを示唆した。効力のこの増大は、移動が強さの程度の半分未満であることから、小さい（図３ａ）。より重要であるのは、両投与経路とも、匹敵する最大値を有することである（図３ａ）。皮下および静脈内の投与経路も、貧血からの回復を用量依存性の様式で促進した（図２ａ、３ｂ、４ｂ）。しかし、皮下および静脈内のいずれの投与経路も、試験した用量範囲にわたっては、白血球減少症に対して効果がなかった（図２ｃ、４ｃ）。
実験３：
Ａ．１回の２０KのＰＥＧ、または１回の４０KのＰＥＧのいずれかによる、ｒｍＴＰＯ（１５３）のＰＥＧ化は、血小板回復に対して非ＰＥＧ化分子より多大な効果を有した。完全長の分子とは異なり、いずれのＰＥＧ化ｒｍＴＰＯ（１５３）も、血小板減少症の最下点を左右したが、モデルの開始２４時間後に、１回の０．１μg皮下用量として与えたとき、モデルの回復期を大きく加速した（図５ａ）。これは、１４日目には非常に明らかであって、このとき、血小板数は、対照、ＰＥＧなしのｒｍＴＰＯ（１５３）、ｒｍＴＰＯ（１５３）＋２０K ＰＥＧ、ｒｍＴＰＯ（１５３）＋４０K ＰＥＧについて、それぞれ、８０ｘ１０3±１５ｘ１０3/μl、２６８ｘ１０3±６７ｘ１０3/μl、６９７ｘ１０3±２９７ｘ１０3/μl、および８７８ｘ１０3±３１ｘ１０3/μlである（図５ａ）。同じ様相は、赤血球の応答でも明らかであった（図５ｂ）。これらのｒｍＴＰＯ（１５３）に基づく分子のいずれも、このモデルでの白血球減少症に対しては、いかなる効果もなかった（図５ｃ）。
Ｂ．ｒｍＴＰＯ（１５３）＋４０K ＰＥＧ（０．１μg）は、１回の静脈内または皮下注射のいずれかとして投与したとき、一致する応答を示した。この実験では、皮下の経路は、１０日目に最下点を僅かに上昇させ、１４日目までには血小板を対照レベルまで復帰させて、対照群での２８日目と対比される（図６ａ）。この薬物を静脈内に与えられた動物では、回復の最下点および率に対して類似の効果があった（図７ａ）この４０K ＰＥＧ化した断端ｒｍＴＰＯ（１５３）分子に対する応答は、皮下（図６ｂ）または静脈内（図７ｂ）のいずれかで与えたとき、血小板と赤血球との回復の双方でのｒｍＴＰＯ（３３５）に対する応答とほとんど同一である。他の実験のすべてと同じく、皮下または静脈内で与えたｒｍＴＰＯ（１５３）＋４０KＰＥＧは、白血球の循環レベルに対しては効果がなかった（図６ｃ、７ｃ）。平行する実験では、この分子の１０K ＰＥＧ化バージョンは、血小板または赤血球の集団のいずれでも、ｒｍＴＰＯ（１５３）に対する応答を変えなかった。
実施例６
下記は、細胞毒性である化学療法を受けているヒトの患者での、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ332）による１回用量療法を用いたプロトコルおよび結果である：
集中的な化学療法の予備臨床モデルは、ｒｈＴＰＯの１回用量は、血小板の最下点を上昇させ、重篤な血小板減少症の期間を短縮することを立証した。化学療法を受けている癌患者に、ｒｈＴＰＯの１回用量を投与する、二つの第Ｉ相研究の暫定的な結果を提示する。
患者および方法
両研究とも、２１日目、すなわち、０．３、０．６または１．２meg/kgの１回静脈内丸塊注射後の、ｒｈＴＰＯの安全性、および血小板応答を査定するための前化学療法期間（周期０）で開始した（各研究で１群あたり３患者）。そうして、患者には、選んだその後の周期での化学療法後に、同じ用量のｒｈＴＰＯを与えた。第一の研究集団は、進行した悪性の患者からなり、二つの連続する化学療法周期のそれぞれで、チオテパによるサルベージ化学療法（２８日ごとに６５mg/m2）の翌日にｒｈＴＰＯを投与した。第二の研究は、ＡＩ化学療法（ドキソルビシン９０mg/m2、２１日ごとに１０g/m2）での誘導処置を受ける、化学療法未経験の肉腫患者を包含した。周期０に続いて、この研究の患者は、最初の化学療法周期の間追跡し、第二以後の周期の間の化学療法の完了の翌日（５日目）に１回ｒｈＴＰＯ注射を与えた。
結果：
現在まで１４患者を治療している。ｒｈＴＰＯは、充分に許容されて、研究薬物に帰せられる重大な有害事象の報告は、皆無である。ｒｈＴＰＯに対する抗体は、観察されていない。周期０では、最低（０．３mcg/kg）の用量が毎週活性であり、下記に示すとおり、より高用量では活性が上昇する。
0004562815.tif 000018
周期０の間の最多血小板数は、中央値で１１日目に出現した（範囲：７〜１４）。ＷＢＣまたはＨＣＴでは、有意な変化は全く見出されなかった。骨髄のＦＡＣＳ分析は、０．６mcg/kg後の患者２／２ですべてのＣＤ３４＋のサブセットの増加を示した。これらの患者では、末梢血ＣＤ３４＋の増加も認められ、ＴＰＯは、幹細胞動員活性を有する可能性があることを示唆する。用量算出および化学療法後処置は、進行中である。
これらの第Ｉ期の研究は、相俟って、ｒｈＴＰＯの１回用量投与は、安全であり、かつ充分に許容されることを示唆する。０．３、０．６および１．２mcg/kgの用量レベルは、上昇する血小板新生活性を示す。より高い用量レベルでの患者の進行中の処置は、ｒｈＴＰＯの１回用量が、集中的な化学療法後の血小板減少症を軽減する薬効があるとの仮説を試験するものと思われる。
実施例７Ａ：アドリアマイシンおよびイホスファミドを投与されている肉腫の被験者における、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）の安全性、許容性、薬物動態および薬力学を決定する第Ｉ相研究
処置計画
これは、安全性を主な到達点とする、ｒｈＴＰＯの１回および複数回静脈内用量の、単一センター、公開ラベル、用量エスカレーション方式の研究であった。組織学的に診断された肉腫の患者に、ｒｈＴＰＯを投与して、その投与が、ドキソルビシンおよびイホスファミドの公知の血小板減少効果を防止し、遅延させ、軽減し、またはその持続期間を短縮するのに役立つか否かを決定した。
現在まで、７１名の患者が、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦとの併用での様々なｒｈＴＰＯ投与スケジュールの安全性および活性を対象とする、この研究に登録されている。研究は、癌の患者における安全性、活性および薬物動態を査定する、２１日間の前化学療法周期（周期０）で開始された。データは、０．３〜３．６mg/kgにわたるｒｈＴＰＯの１回および複数回静脈内用量に応答する、末梢血の血小板数、および骨髄巨核球の用量依存性増加を示し、こうして、ｒｈＴＰＯのすべてを化学療法の完了後に投与するｒｈＴＰＯ投与方式は、安全であったが、控えめな活性を示すにすぎなかった。正常の血小板数の一患者は、併発症のない、強度の静脈血栓症を足に発症したが、保存療法で消散し、中和抗体は観察されていない。被験者は、転移性であるか、または切除できない肉腫があった。
化学療法以前の１回用量のｒｈＴＰＯは、他の用量分枝または病歴対照の患者に比して、血小板最下点の深さおよび持続期間の面での利得を受けていて、この効果は、計画された化学療法の６周期を通して示されている（病歴対照の患者（ｎ＝１８）のうち、６周期をすべてうけたのは皆無であり、２名のみ５周期を受けたにすぎないことに留意されたい）。前化学療法用量は、充分に許容されている。化学療法を通じての用量投与が安全であり、より効果的であり得るため、このｒｈＴＰＯ用量投与方式を、プロトコルに組み込んでいる。
用量レベル
この研究では、ｒｈＴＰＯの５種類の用量レベル、および６種類の方式（分枝Ａ〜Ｆ）を評価した。用量レベル、および１用量レベルあたりの被験者数を下表に示す。
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予備臨床研究での１回または複数回の用量投与後の、血小板数におけるピーク上昇は、用量投与開始後数日以内に観察されている。したがって、ピーク血小板応答は、この研究での用量投与開始後７〜１４日以内に予測されると思われる。現在の臨床的経験は、これらの所見を裏付ける。
研究の設計
被験者を、上表に記載の用量群の一つに割り振った。分枝Ａ〜Ｆについての研究概要を下記に示す。周期１（第０、１、２および３）および追加の周期に、すべての被験者にドキソルビシンおよびオホスファミドを投与した。
この研究のためのｒｈＴＰＯ用量投与方式は、下記のとおりである：
分枝Ａ
周期０：０日目にｒｈＴＰＯ
周期１：：ｒｈＴＰＯなし
周期２＋：４日目にｒｈＴＰＯ
分枝Ｂ
周期０：０および３日目にｒｈＴＰＯ
周期１：：ｒｈＴＰＯなし
周期２＋：４および７日目にｒｈＴＰＯ
分枝Ｃ
周期１：ｒｈＴＰＯなし
周期２＋：４〜１０日目に、または最下点後の血小板数が3１００，０００/μlになるまで、毎日ｒｈＴＰＯ
分枝Ｄ
周期１：ｒｈＴＰＯなし
周期２＋：−１、４および７日目にｒｈＴＰＯ
分枝Ｅ
周期１：ｒｈＴＰＯなし
周期２＋：分枝Ｄの方式のとおりだが、Ｇ−ＣＳＦをＧＭ−ＣＳＦに置き換えてｒｈＴＰＯ
周期０：研究のこの時期は、１回および複数回の用量投与の安全性、薬物動態および薬力学を評価する。分枝Ａの被験者に、ｒｈＴＰＯの１回静脈内注射を与えた（０日目）。分枝Ｂの被験者には、０および３日目にｒｈＴＰＯの静脈内注射を与えた。
周期１：被験者に、ドキソルビシンおよびイホスファミドを与えた。周期１の間に投与されるｒｈＴＰＯは、皆無であった。これは、ｒｈＴＰＯによるその後の周期との、各被験者の応答の比較のための対照周期を与える。この対照周期は、また、ｒｈＴＰＯ用量投与の不在下での化学療法に関連する有害事象を明らかにする。
周期２＋：被験者には、ドキソルビシンおよびイホスファミドを投与した。分枝Ａの被験者には、ｒｈＴＰＯの１回静脈内注射を与えた（４日目）。分枝Ｂの被験者には、４および７日目にｒｈＴＰＯの静脈内注射を与えた。分枝Ｃの被験者には、４〜１０日目に、または最下点後の血小板数が１００，０００/μl以上になるまで、７日以内の間、毎日ｒｈＴＰＯの静脈内注射を与えた。分枝Ｄの被験者には、−１日目（化学療法の１日前）および４および７日目に、ｒｈＴＰＯの静脈内注射を与えた。
被験者の危険性を最小化しつつ、ヒトにおけるＧＭ−ＣＳＦとのｒｈＴＰＯのあり得る相乗作用関係を調べるために、分枝ＥではＧ−ＣＳＦをＧＭ−ＣＳＦに置き換えた。ＧＭ−ＣＳＦは、周期１および２、ならびに有益であると判明した場合にその後の周期で投与した。分枝Ｅの被験者には、分枝Ｄの方式に従ってｒｈＴＰＯを投与した。
0004562815.tif 000020
ドキソルビシン
ドキソルビシンは、商業的供給源から入手し、製造者の指針に従って貯蔵かつ投与した。ドキソルビシン（９０mg/m2の総量）は、各化学療法周期の初めの３日間、連続輸注として与えた（３日間（０〜２日目）に毎日３０mg/m2）。
イホスファミド
イホスファミドは、商業的供給源から入手し、製造者の指針に従って貯蔵かつ投与した。イホスファミド（１０g/m2の総量）は、各化学療法周期の初めの４日間、毎日４回の個別輸注として与えた（４日間（０〜３日目）に毎日３時間にわたり２．５g/m2）。
メスナ
メスナは、商業的供給源から入手し、製造者の指針に従って貯蔵かつ投与した。メスナ（５００mg/m2、またはイホスファミドの用量の２０％）は、各化学療法周期の０日目にイホスファミドの初期用量で３時間にわたり静脈内投与した。メスナの投与は、各化学療法周期の最後のイホスファミド投与の２４時間後まで（０〜４日目）、連続静脈内輸注として維持した（６g/m2の総量のために１，５００mg/m2/日）。
Ｇ−ＣＳＦ
Ｇ−ＣＳＦは、商業的供給源から入手し、製造者の指針に従って貯蔵かつ投与した。Ｇ−ＣＳＦ（５μg/kg）は、周期１の４日目から始めて、その後のいかなる化学療法周期にも毎日投与した。被験者には、Ｇ−ＣＳＦを自己投与するよう教えた。Ｇ−ＣＳＦの注射はすべて、午後８時までに投与しなければならなかった。ｒｈＴＰＯ投与と同じ日の注射は、ｒｈＴＰＯ投与後１２時間までに与えて、注射に関連するいかなる現象も明確にするのに役立てなければならなかった。Ｇ−ＣＳＦ投与は、絶対好中球計算値が、後最下点で、少なくとも２回の連続する測定で１，５００/μlを上回るまで、日次ベースで継続した。
ＧＭ−ＣＳＦ
ＧＭ−ＣＳＦは、商業的供給源から入手し、製造者の指針に従って貯蔵かつ投与した。ＧＭ−ＣＳＦ（２５０mg/m2）は、周期１の４日目から始めて、その後のいかなる化学療法周期にも毎日皮下投与した。被験者には、ＧＭ−ＣＳＦを自己投与するよう教えた。ＧＭ−ＣＳＦの注射はすべて、午後８時までに投与しなければならなかった。ｒｈＴＰＯ投与と同じ日の注射は、ｒｈＴＰＯ投与後１２時間までに与えて、注射に関連するいかなる現象も明確にするのに役立てなければならなかった。ＧＭ−ＣＳＦ投与は、後最下点の絶対好中球計算値が、少なくとも２回の連続する測定について１，５００/μlを上回るまで、日次ベースで継続した。
この研究の結果を、図１４〜１９に示す。
実施例７Ｂ：カルボプラチンを受けている、進行した婦人科の悪性の患者への皮下注射を経由して投与された組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）の第Ｉ相試験
この研究は、皮下に注されたｒｈＴＰＯの安全性と、隔日の時間割でのｒｈＴＰＯの用量投与の活性とを対象とした。研究は、癌の患者での安全性、活性および薬力学を査定するために、化学療法周期（周期０）前の２１日で開始した。現時点では、１６名の被験者がこの試験に登録されていた。データは、周期０での末梢血血小板数の用量依存性の増加を示すが、血小板の応答および薬物動態は、静脈内ｒｈＴＰＯの類似の用量と比較したとき、鈍化される。これまで、断端形態のｒｈＴＰＯ（エリスロポエチン様ドメイン）に対する２抗体が、観察された；一方は予め形成され、いずれもバイオアッセイでも、または臨床的にも中和性ではなかった。被験者は、再発性のか、または進行した婦人科新生物を有し、カルボプラチンを投与されていた。
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実施例８
動物：ＣＤ−１系メスマウス７６匹、体重＝１９．７〜２６．３g
エーロゾル接触：
マウスを経鼻のみの吸入（CH Technologies）でｒｈＴＰＯに接触させ、同時に、呼吸パターンを合計６０分の持続時間測定した（全身プレチスモグラフ）。ＰＡＲＩ−ＩＳ２ネビュライザーを用いて、２２psi（約１．５６kg/cm2）および５．１LPMの流速でｒｈＴＰＯをエーロゾル化した。フィルターサンプルを採取して、接触のそれぞれについてエーロゾル濃度を推計した。伝達体の対照群と、異なる３種類の濃度（０．０５、０．５および５．０mg/mlのｒｈＴＰＯ）を噴霧化した。投与群を、各群についてのマウス肺に蓄積した、kgあたりの推計量として表した。動物の半数は、１回だけ接触させた（１回接触）が、他の半数は、０、２および６日目の３回、ｒｈＴＰＯに接触させた。抗ｒｈＴＰＯ抗体を、最高用量群でのみ測定したにすぎないが、これらの抗体は、中和性でなかった。投与群を下表に示す。
投与群：
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データの終点：
血液学（血小板数）と血清抗ＴＰＯ抗体の測定とのために、血清および血液を、エーロゾル吸入後の−４、３、６、８、１０、１４、２１、３０および４３日目に採集した。
蓄積されたｒｈＴＰＯの肺での用量：
蓄積用量（μg/kg）＝室濃度（μg/ml）×分体積（ml/分）×接触時間（分）×蓄積画分／体重（kg）
ここで、室濃度＝０．０００８３９、０．００８３９または０．０８３９μg/ml
分体積＝３０ml/分
暴露時間＝６０分
蓄積画分＝０．１
体重＝０．０２３kg
蓄積用量＝６．４、６４または６４０μg/kg（０．０５、０．５または５mg/mlの溶液に対して）となる。ｒｈＴＰＯの１回吸入（用量）に接触したマウスの血小板数を、図２０に示す。ｒｈＴＰＯの複数回吸入（用量）に接触したマウスの血小板数を、図２１に示す。
実施例９
動物：ほぼ１２週齢のメス（Ｃ５７ＢＬｘＣＢＡ）Ｆ１（ＢＣＢＡ）系マウスをErasmus Universityの実験動物施設、Rotterdam、オランダ国で繁殖させ、ＳＰＦ条件下に保った。飼育箱、実験その他すべての条件は、オランダ国での法的規制に従って、倫理委員会によって承認された。
実験の設定：ＴＢＩは、相対する二つの137Ｃｓ線源（Gammacel／L 40, Atomic Energy of Canada, Ottawa、カナダ国）を用い、０．９２〜０．９４Gy/分の線量率で、１日目に与えた。用いた線量は、１回線量照射については６Gyであり、９Gyの総線量を、２４時間の間隔で与えた３Gyの３線量に分割した。各データ点について、３匹のマウスからなる群をと殺した。個々のマウスについて、すべてのパラメータを採集した。
試験薬物：ＣＨＯ細胞（Genentech Inc., South San Francisco, CA）が産生した組換え完全長マウスＴＰＯを、すべての実験を通して用い、ＰＢＳ／０．０１％TWEEN 20に希釈し、０．５mlの容量で腹腔内投与した。
ＴＰＯレベル：特性記述血漿ＴＰＯの薬物動態についてのデータは、前記のとおり、Genentech, Inc.で作成した。略述すると、マウスに、125Ｉ−ｒｍＴＰＯを、０．９μg/マウス（約４５μg/kg）の１回用量、または２４時間を隔てた０．３μg/マウス（約１５μg/kg）の３回用量のいずれかとともに注射した。用量投与の直後、およびその後間隔を置いて、クエン酸化血を捕集し（１時点あたりｎ＝３マウス）、２，９５０ｘｇで１０分間遠心分離し、血漿を採集し、ＴＣＡ沈降性放射能を決定した。薬物動態のパラメータは、ＴＣＡ沈降性cpm/mlを換算し、非線形最小平方回帰分析を用いて、一次吸収による二区画モデルに時間データ対濃度を当てはめた（ＷＩＮ−ＮＯＮＬＩＮ；Statistical Consultants, Lexington, KY）の値に、推計した。濃度時間曲線下の部域（ＡＵＣ）、最高濃度（Ｃmax）、末端半減期（ｔｌ／２）およびクリアランス（mL/時/kg）を、モデルに当てはめから得られた係数および指数を用いて算出した。
血液学的検査：エーテル麻酔の後、マウスを眼窩後穿刺によって採血し、頚部脱臼によってと殺した。血液をＥＤＴＡ管に捕集した。全血球計算値は、SYSMEX F-800血液学分析装置（東亜医療電子、神戸）を用いて測定した。分化白血球カウントは、メイグリュンワルトギムザ染色後に実施した。
コロニーアッセイ：この研究には、無血清メチルセルロース培養を用いた。適切な数の骨髄細胞を、ＧＩＢＣＯ（Life Technologies LTD, Paisley、スコットランド）から入手した、アミノ酸のＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−プロリン（Sigma）、ビタミンＢ１２、ビオチン、ピルビン酸Ｎａ、グルコース、ＮａＨＣＯ3、ならびに抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ダルベッコのＭＥＭ）に、３００mOsm/Lのモル浸透圧で懸濁させた（∝−培地）。０．８％メチルセルロース（Methocel A4M Premium Grade, Dow Chemical Co., Barendrecht、オランダ国）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Fraction V, Sigma）、２ｘ１０-6モル/Lの鉄飽和ヒトトランスフェリン（Intergen Company N.Y., N.Y）、１０-7モル/LのＮ2ＳｅＯ3（Merck）、１０-4モル/Lのβ−メルカプトエタノール（Merck）、リノレイン酸（Merck）およびコレステロール（Sigma）を、前駆細胞コロニーの種類に応じて、両者について７．５ｘ１０-6モル/Lおよび１．５ｘ１０-5モル/Lの最終濃度で含有する∝−培地中の適切な数の細胞を培養し、１０-3g/Lのヌクレオシド（Sigmaから入手したシチジン、アデノシン、ウリジン、グアノシン、２′−デオキシシチジン、２′−デオキシアデノシン、チミジンおよび２′−デオキシグアノシン）を、１mlのアリコートとして、３５mm Falcon 1008ペトリ皿（Bercton Dickinson Labware）にプレートした。
基本的には前記に記載したとおり、妊娠マウス子宮抽出物（ＰＭＵＥ）から精製し、１００ng/mlマウス幹細胞因子（SCF、Immunex Corporation, Seattle, WAからの親切な寄贈）、および１０ng/mlマウスＩＬ−３（R&D, Minneapolis, MN）を補充した、飽和濃度のＭ−ＣＳＦによって顆粒球／マクロファージのコロニー形成を刺激した。培養の７日後に、ＧＭ−ＣＦＵコロニーを計数した。
フェニルヒドラジン処理したマウスの血清から精製した、１００ng/mlＤＣＦおよび４U/mlマウスエリスロポエチン（ＥＰＯ、Behringwerke, Marburg、ドイツ国）によって、ＢＦＵ−Ｅ増殖を刺激し、最適濃度まで滴定した。培養の１０日後に、コロニーを計数した。赤血球前駆細胞の培地は、２ｘ１０-4モル／Lの濃度のヘルミン（ウシ、Ｉ型、Sigma）も含有した。
巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）を、０．２５％寒天培養として培養した。１００ng/ml ＳＣＦ、１０ng/ml ＩＬ−３および１０ng/mlマウスＴＰＯ（Genentech, Inc., San Francisco, CA）によって、コロニー形成を刺激した。１０日後、コロニーを乾燥し、アセチルコリンエステラーゼ陽性細胞について染色し、計数した。培養体は、すべて、空気中の１０％ＣＯ2とともに充分に加湿した雰囲気中、３７℃で二重に増殖させた。コロニー数は、個々のマウスの骨髄サンプルの平均±標準偏差を表した。
脾臓コロニーアッセイ：このアッセイは、Till & McCullochが記載したとおりに実施した。略述すると、ＴＢＩの１日後のＨＨ中の５ｘ１０4のＢＭ細胞、または５ｘ１０5の脾臓細胞をマウスに注射した。１３日後、マウスをと殺し、脾臓を摘出し、Ｈ2Ｏ中のテリエスニツキー液（６４％エタノール、５％酢酸および２％ホルムアルデヒド）中で固定した。
統計学：標準偏差は、正規分布の仮定に基づいて算出し、かつ本文および図に示した。差の有意度は、STATVIEW（Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA）を用い、分散の片側解析と、その後の対応なしのスチューデントｔ検定とによって算出した。コロニーアッセイは、すべて、個々のマウスについて二重に実施した。コロニーアッセイの結果は、１群あたり少なくとも３匹のマウスについて、１大腿骨または脾臓あたりの平均±ＩＳＤとして表す。
実験の設定１：ＢＣＢＡＦ１系マウスを、時間０に、３Gyの全身照射に付した。図８に示したとおりの様々な時点でに０．３μgＴＰＯ／マウスを腹腔内にか、または−２時間に３０μgＴＰＯ／マウスを腹腔内に投与した。
図８は、プラシーボ対照における、最下点の時点での６Gy照射マウスの血小板レベルを、１回用量のＴＰＯの投与の時間の関数として示す。観察された動態に基づき、ＴＰＯ投与直後に到達したＴＰＯのピークレベルが、薬効に最も関連していたように思われる。これは、ＴＢＩの２時間前の非常に高用量のＴＰＯの投与によって、直接確認された（図９）。この効果は、赤血球、白血球（主として好中球）および血小板に対するＴＰＯの同等の効果が末梢血で示したとおり、多系列細胞に由来した。下記の表１を参照されたい。
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実験の設定２：ＢＣＢＡＦ１系マウスを、−２、−１、０日目の時点で、６Gyの全身照射に付し、０．９μgＴＰＯ／マウスを、図１０の説明中に示した様々な時点、すなわち第一画分のＴＢＩの２時間前、最終画分のＴＢＩの２時間後にか、または３画分の０．３μgのＴＰＯを、各画分のＴＢＩの２時間後に、腹腔内投与した。
長引かせた形態の細胞削減性処置を、より化学療法に似せて刺激するために、ＴＢＩを、それぞれ２４時間の間隔を置く３Gyの等しい３画分として与えた（実験の設定２）。ＴＰＯは、図１０の説明に示したとおり、０．９μgの総用量として投与した。血小板応答は、ＴＰＯのこの用量を、各画分のＴＢＩの２時間後に、等しい３画分の０．３μgＴＰＯとして投与したときに最適であった。類似の効果は、赤血球および白血球についても示された。表２は、この実験設定、すなわち第一画分のＴＢＩの２時間前の非常に高用量のＴＰＯも、等しく効果的であったことを示す。図１１および１２は、それぞれ、骨髄および脾臓の造血前駆細胞のデータを示し、ＴＰＯのための最も最適の用量スケジュール、すなわち、各画分のＴＢＩの２時間後に３ｘ０．３μgも、他の処置群に認められた大きい変動なしに、前駆細胞レベルを急速に正常化したことを立証する。
図１３は、０．３μgのＴＰＯの３回の用量、または０．９μgの１回の用量の後の薬物動態データを示す。関連するピークレベルは、腹腔内投与の約２時間後に生じた。効果的なレベルは、３０ng/血漿mlであった。しかし、最低有効ＴＰＯレベルは、力価測定実験によっては、依然として決定されていない。
データから、細胞削減性処置の際に高レベルのＴＰＯを維持することは、多系列の刺激、および末梢血血球の回復を招くことを認めることができる。
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ＴＰＯは、それぞれ２４時間で隔てられた等しい３分画での合計用量が９GyのＴＢＩに被曝したマウスでは、各ＴＢＩ分画の２時間後に腹腔内に投与するならば、非常に効果的であるように思われた。ＴＰＯの投与は、プラシーボ対照で観察された、血小板数の重大な減少を予防し、顆粒球の回復を刺激し、貧血の発症も充分に予防した。６Gyの１回ＴＢＩの実験と同様に、この効果は、複数の血球分化系列の前駆細胞の加速された再構成に媒介されるように思われた。これは、ＴＰＯの薬効が、ＴＢＩ後のある時間帯にＴＰＯによって刺激されることを要する、残留する免疫多系列細胞とは無関係であることを含意する。
本発明者らは、未成熟細胞が、簡単な短期間の定量的移植アッセイに関与するか否かについての疑問に取り組んだ。致死的に照射した受容者への骨髄の移植の後、１３日目の脾臓コロニーの数（ＣＦＵ−Ｓ−１３）は、数ヶ月間持続する、造血性再構築の初期の短期の波に付随する、比較的未成熟の再集合する幹細胞についての尺度である。このアッセイによって、未成熟前駆細胞に対するＴＰＯ処理の効果を、直接立証することができた。等しい３区画で９GyのＴＢＩに被曝したマウスでは、ＴＰＯ処理マウスの検出できるＣＦＵ−Ｓ−１３の数は、最後の分画のＴＢＩの２４時間後に、プラシーボ対照マウスに比して、ほぼ１４倍に増加した（表３）。類似の増加は、検査した３系列に属する前駆細胞の数でも観察された。これらの結果は、殆どの未成熟多系列細胞に対する、クローン生成アッセイによって検出できる、ＴＰＯの主要な効果の強力な指標であって、そのような未成熟細胞でのＴＰＯ受容体の存在と一致する。
ＴＰＯの最適薬効を達成するための小さい時間帯は、ＴＰＯレベルの一掃の緩慢な時期を考慮すると特殊であって、約２０時間の末端半減期を有し、投与後の最初の１２時間以内のすべての時点で、血漿中の分布による初期上昇以外は、ほぼ類似のレベルを招くと思われる。これによって、投与後の最初の数時間でのＴＰＯの高レベルが、決定的に重要であると思わざるを得ない。後者の仮説を、二つの方法で、すなわち、放射線の各画分後のＴＰＯ投与によって得られるのと同様に、薬効が到達され得るか否かを検証するための、薬物動態の測定と、ＴＢＩ前の非常に高い用量の投与とによって試験した。薬効データにに薬物動態データを重ね合わせることによって、有効レベルは、２０ng/mlより高く、腹腔内投与の約２時間後に生じると推論することができる。後者の所見から、本発明者らは、これらのマウスでは、ＴＢＩの約４時間後のＴＰＯの高いレベルは、未成熟標的細胞の刺激による、放射線で誘導される骨髄症候群を緩和することを必要とすると結論した。最初の放射線画分の２時間前の３０μgの腹腔内ＴＰＯという用量（初期分布に基づいて算出）の投与によって、これを直接試験した。結果は、実際に、分画したＴＢＩという方式の際のそのような非常に高レベルのＴＰＯは、血小板減少症を予防するのに決定的であることを立証した。ＴＢＩの最初の用量の前に３０μgで処理されたマウスにおける、ＴＢＩの最後の用量の１０日後の血小板数は、各ＴＢＩ画分の２時間後に、０．３μgのＴＰＯという最も効果的なスケジュールで処置したマウスのそれと、有意に異なることがなかった。類似の薬効は、６Gyという１回ＴＢＩ線量の２時間前の高用量のＴＰＯによって得られた。
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実施例１０：ｒｈＴＰＯを投与され、自己骨髄移植物（ＡＢＭＴ）を受けている患者の研究
骨髄採集物の採集の後、すべての患者に、シクロホスファミド１８０mg/kg、チオペタ９００mg/m2、±カルボプラチン６００mg/m2を投与した。未操作移植細胞の注入（０日目）後、患者は、１日目に、１日１回または１日３回のいずれかで、２１日目までか、または患者が≧５０K/μlを数えるかのいずれかまで、ｒｈＴＰＯ静脈内投与を開始した（下表を参照されたい）。ｒｈＴＰＯは、患者コホートに用量漸増方式で投与した。絶対好中球数が≧５００/μlとなるまで、すべての患者にＢ−ＣＳＦを投与した。＜２０K/μlの血小板数に対してか、または臨床的指示に応じて、血小板を輸注した。
血小板の回復を、≧２５，０００/mlの非担持血小板数の最初の日としてか（単純な定義）、またはより厳密には、≧２５，０００/mlであって、第二の計算値が先行値より大きいか、もしくはそれに等しい非輸注血小板数の、連続する≧２の日の初日として（安定的または上昇的定義）、定義した。好中球の回復は、絶対好中球数が≧５００/μlである、連続する２日の初日として定義した。患者は、同じ移植組織の方式を用いて自己骨髄移植組織を受けた、１５名の病歴対照と比較した。
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すべての用量レベルでのｒｈＴＰＯを、ｒｈＴＰＯを毎日投与した用量レベル５以外は、毎日３回投与した。
この研究では、中央値年齢が４９歳である患者３３名（２３〜５９歳）を登録した；すべて、安全性および血液学的応答については評価可能であった。患者７名に０．３μg/kgの用量レベルで；７名に０．６μg/kgで；７名に１．２μg/kgで；３名に２．４μg/kgで；そして６名に４．８μg/kgでｒｈＴＰＯを投与した（上表を参照されたい）。すべてのレベルが安全に許容され、ｒｈＴＰＯは、研究した薬物に関連するいかなる有害な事象も付随していない。化学療法関連の副作用は、予測したとおりに発生した。患者１名は、ヒトヘルペスウイルス６の感染による遅延した汎血球減少症を経験した。血小板減少症の期間中には、２例のみの出血性症状の発現、すなわち鼻出血および硬膜下血腫が、ともに血小板数が＜２５，０００/μlのときに観察されたにすぎない。ともに長期の続発症なしに消散された。注目される血栓症または静脈閉塞性疾患症状の発現は皆無であった。この研究の患者の群全体にわたって、血小板回復（安定的かつ上昇的定義）の中央値時間は、１７．５日であった。
要約すると、Ｇ−ＣＳＦと併用したｒｈＴＰＯは、骨髄解離性療法、および自己骨髄による救済を経験している患者では、安全であり、充分許容されるように思われる。
実施例１１：乳癌の患者における末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）動員の研究
患者を、評価可能な患者３名のコホートとして、トロンボポエチンに関連付けられる毒性が生じないならば、０．６、１．２または２．４μg/kgの静脈内投与のトロンボポエチン（ＴＰＯ）用量で、継時的コホートで用量を増加させつつ処置した。ＴＰＯに関連付けられる重大な毒性の発生は、皆無であった。最適な生物学的用量は、ＰＢＳＣ採集の際に処理された血液のＣＤ３４＋細胞/kg/Lを最大化するような最低用量であると考えられる。二次的終点は、ＣＶＰ後と、ＣＢＹ／ＰＢＰＣ移植組織後とでの、顆粒球および血小板の回復までの間隔である。
処置方式
ＣＶＰ：シクロホスファミド１．５mg/m2/日静脈内投与＋メスナ；エトポシド２５０mg/m2１日１〜３回；シスプラチン４０mg/m2１日１〜３回、その後１回用量のトロンボポエチン０．６〜２．４μg/kg静脈内投与１日４回、Ｇ−ＣＳＦ６μg/kg毎１２時間。
＞１．０のＷＢＣの回復に際し、３ｘＢＶの大容積アフェレーシスによるＰＢＰＣ採集、標的＞３ｘ１０6ＣＤ３４＋細胞/kg。
ＣＢＴ：シクロホスファミド２．０mg/m2静脈内投与、チオテパ２４０mg/m2/日、ＢＣＮＵ１５０mg/m2/日、−８、−７、−６日目、０日目に低温保存した細胞の再注入。
Ｇ−ＣＳＦ５μg/kg/日皮下投与、顆粒球の回復まで。
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トロンボポエチンは、ＰＢＰＣ動員のためのＣＶＰ化学療法後にＧ−ＣＳＦを与えたとき、充分許容された。
動員は、病歴対照に比して増強された。１回のアフェレーシスの中央値は、標的細胞用量に達するために必要とされた。移植組織後の造血回復は、迅速であった。
実施例１２：乳癌の患者のＰＢＰＣ研究
高危険度かつ応答性の第IV期乳癌の患者における、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）動員のためのＧ−ＣＳＦ１０μg/kg、その後のシスプラチン、ＶＰ−１６およびシクロホスファミド（Ｃｙ）による高用量化学療法（ＨＤＣＴ）と併用される、１回または反復的用量のトロンボポエチン（ＴＰＯ）の実行可能性および潜在的薬効を査定するために、第Ｉ相臨床試験を実施した。
ＨＤＣＴ処置概要は、下記のとおりであった：
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ＴＰＯの用量概要は、下記のとおりであった：
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動員は、群ＡでのＴＰＯおよびＧ−ＣＳＦ１０μg/kg（５μg/kgＢＩＤ）、群Ｂでの１０μg/kg１日１回、群ＣでのＧ−ＣＳＦ１０μg/kg（５μg/kgＢＩＤ）からなった。
アフェレーシスは、CS-3000 FenwallまたはＣＯＢＥスペクトル細胞分離装置を通じて、１０l未満の血液を処理することによって、実施した。ＰＢＰＣは、５％ＤＭＳＯを含有する溶液中に低温保存し、−１３０℃のフリーザーへの単純浸漬によって凍結した。群Ａ対Ｂ対Ｃの比較は、Kruskal-Wallis検定を用いて実施した。群Ａ対Ｂは、ウィルコクソン順位和検定を用いて比較した。ＰＢＰＣ、造血回復および輸注要件に関するデータは、中央値（範囲）として提示する。
血小板（ＰＬＴ）輸注は、≦２０，０００のＰＬＴ／μlに対してか、または臨床的指示に応じて与えた。血小板の非依存性を、最終血小板輸注後の日として定義する。１回アフェレーシス産物、およびプールした血小板産物を、１ＰＬＴ輸注として数える。
患者の特徴
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アフェレーシス要件の比較、ＣＤ３４+およびＭＮＣ収率
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造血回復および輸注要件
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試験した用量範囲のＴＰＯは、充分に許容される。Ｇ−ＣＳＦと併用したＴＰＯは、ＰＢＰＣ動員およびＣＤ３４+収率を増大させる。ＴＰＯと、Ｇ−ＣＳＦで動員されたＰＢＰＣとは、血小板と顆粒球との双方の回復を加速する。
実施例１３：その他の実施態様
本発明は、放射線または化学療法剤を、連続する複数の日に、例えば連続する４、５、６または７日に投与する処置周期を特定して企図しているが、ここで、ＴＰＯの用量は、処置周期の連続する日の初日の前、および／または連続する１もしくはそれ以上の日と同時に投与する。連続５日の処置周期に対しては、ＴＰＯは、−１日目と、２、４、６、８、１０、１２日目等々とにか、または−１日目と、４、６、８、１０、１２日目等々とに与え得ると思われる。もう一つの実施態様では、放射線または化学療法剤は、処置周期の交互の日、例えば１、３、５日目に与えることになる。この実施態様では、ＴＰＯは、−１日目と、２、４、６、８、１０日目等々に与え得ると思われる。
実施例１４
本発明によるＴＰＯのそれ以上の用途は、例えば哺乳動物の骨髄、末梢血または臍帯血から得た、前駆細胞のex vivoでの拡大を目的とする。そのような方式で拡大された前駆細胞は、化学療法または放射線の処置で治療されている患者に対する同種異系の幹細胞移植組織のために用いることができる。幹細胞活性について強化した前駆細胞集団は、ＣＤ３４+集団であり、この集団は、ＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞を選別することによって、更に強化することができる。この集団は、多系列造血コロニーをin vitroで、また多能造血生着をin vivoで生じる能力を有する。拡大のための前駆細胞は、フェレーシスによって末梢血から、また標準的手法によって骨髄吸引物から得ることができる。造血前駆細胞は、臍帯血からも得ることができる。そうして、ＣＤ３４+の表現型を有する造血幹細胞細胞は、免疫磁気強化カラムを用いて、血液または骨髄から単離してよい。次いで、単離した細胞を、成長因子のＴＰＯ、Ｆｌｔ−３およびｃ−ｋｉｔリガンド混合液を含有する細胞増殖培地で培養して、幹細胞集団の細胞数を拡大または増加させてよい。成長因子は、前駆幹細胞の増殖を刺激するのに充分な量で加える。好ましくは、成長因子は、それぞれ、約１０2〜約１０6幹細胞/mlを含有する成長培地に対して、約１０〜約１００ng/mlの量で加える。セルロースは、標準的培養手法、例えば、約５％のＣＯ2中、約３５〜４０℃で約１〜８週間培養する。培養体は、成長因子を含有する新鮮な培地と毎週交換する。成長培地は、他の慣用の栄養素、胎児血清などを標準的な量で含有してよい。そうして、拡大された細胞を、公知の手順に従って、同種異系幹細胞として投与する。
下表には、拡大８週後のＣＤ３４+培養体が、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨アッセイを用いてin vivoでのリンパ造血を生じ得ることが示されている。拡大された培養体からの細胞を注入された骨移植片では、これらの細胞は、リンパ様、骨髄様および前駆性造血区画に寄与する。これは、拡大された細胞が、それらのin vivo多能生着の能力を維持していることを示す。
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材料および方法
ヒト造血幹細胞集団の単離：造血前駆細胞集団は、ヒト骨髄から単離した。略述すると、単球画分を、非免疫磁気強化カラム（Miltenyi Biotech, Auburn, CA）を用いて、ＣＤ３４+細胞について濃縮した。純度は、ＦＡＣＳによって常套的に＞９０％であった。
懸濁培養アッセイ：造血幹細胞集団を、IMDM Gibco BRL（Grand Island, NY）＋１０％ウシ胎児血清（Gibco BRL）、１０-5Mの２−メルカプトエタノール、１０-6Mのヒドロコルチゾン、および２mMのＬ−グルタミン（Gibco BRL）中に２ｅ４細胞/mlで播種した。成長因子を下記の濃度で加えた：５０ng/mlのＦｌｔ−３リガンド（Immunex, Seattle, WA）、５０ng/mlのＴＰＯ（Genentech, S. San Francisco, CA）、および５０ng/mlのc-kitリガンド（R and D Systems）。培養体を、３７℃／５％ＣＯ2で７日間培養した。７日目に、すべてのウェルを採集し、すべての細胞を血球計算盤によって数えた。その後のプレーティングのために、２ｅ４細胞/mlを新鮮培地および成長因子に加え、更に７日間培養した。すべての条件は、二重にして実施した。
フローサイトメトリー分析：ＦＡＣ分析のためには、細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳに１ｅ６細胞/mlで再懸濁させ、マウス抗ヒトＣＤ３４ＦＩＴＣ、ＣＤ３８ＰＥ（Becton Dickenson）によって染色した。生細胞をヨウ化プロピジウム排除によって選別し、FACscan（Becton Dickenson）で分析した。
コロニーアッセイ：メチルセルロースコロニーアッセイを、「完全」骨髄用メチルセルロース培地（Stem Cell Technologies, Vancouver, B.C.）を用いて実施した。細胞を、メチルセルロース中に１，０００細胞/mlで播種し、４ｘ３５mm格子皿にプレートした。コロニーを数え、培養の１４日後に倒立位相差顕微鏡で視覚的に表現型を判定した。
ＳＣＩＤ−ｈｕマウス再構成アッセイ：ＣＢ−１７scid/scidマウスに、前記のとおり胎児骨髄を移植した。移植細胞と細胞とが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原について不対合となるように、マウスを用いた。マウスに、２５０ラドの全身γ照射を与えた後、３０，０００個の培養ヒト骨髄細胞を骨移植細胞に注入した。細胞の注入の８週後、骨移植細胞を採集し、ＦＩＴＣ複合抗ヒトＣＤ３４（前駆細胞）、抗ヒトＣＤ３３（骨髄）および抗ヒトＣＤ１９（リンパ）に対する供与者ＨＬＡの寄与について分析した。次いで、供与者ＨＬＡ陽性細胞をＦＡＣＳによって選別した。次いで、３０，０００個の供与者ＨＬＡ陽性細胞を、一次受容者と同様にして、二次受容者に注入した。注入の８週後、二次骨移植細胞を取り出し、ＣＤ３４、ＣＤ１９およびＣＤ３３の生着について分析した。
前記の説明は、本発明を実施するために用い得る、特定の方法を詳述している。そのような特定の方法を詳述して、当業者は、本発明の成果を用いる際に、同じ情報で到達する、代替的な信頼できる方法を考案する方法を充分に知るものと思われる。従って、前記が試験においていかに詳述されていると思われても、それがその範囲全体を限定するとして解釈してはならず；むしろ、本発明の範囲は、添付の請求の範囲の法律上の構成によってのみ、決定されなければならない。引用されたすべての文献は、ここに、参照によって明示的に組み込まれる。
配列表
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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