(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸球塩基性タンパク質を吸収させたろ紙を、
（ａ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有する緩衝液、
（ｂ）界面活性剤０．００１％以上を含有する緩衝液、又は
（ｃ）ｐＨ１０〜１３の緩衝液
と接触させることを特徴とする、前記ろ紙から前記好酸球塩基性タンパク質を抽出する方法。
【請求項２】
前記塩が、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩からなる群から選んだ塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
好酸球塩基性タンパク質を含有する可能性のある被検試料を、ろ紙に吸収させた後、前記ろ紙を、
（ａ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有する緩衝液、
（ｂ）界面活性剤０．００１％以上を含有する緩衝液、又は
（ｃ）ｐＨ１０〜１３の緩衝液
と接触させることにより抽出液を得、得られた抽出液を前記好酸球塩基性タンパク質用の分析手段により分析することを特徴とする、被検試料中の好酸球塩基性タンパク質を分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質の抽出方法及び分析方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
好酸球塩基性タンパク質（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＥＣＰと略称することがある）は、体内に存在する好酸球中に含まれる主要なタンパク質の１つであり、１型アレルギー性炎症反応に関連するタンパク質と考えられている。
好酸球は、１型アレルギーの遅発相反応において、ＥＣＰをはじめとして、好酸球パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）、好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）、及びメジャーベイシックタンパク質（ＭＢＰ）などのタンパク質を放出することにより、組織障害又は炎症を惹起する。従って、ＥＣＰ濃度の測定は、１型アレルギーに由来する炎症の指標になるとされている。血中に含まれるＥＣＰ量は、多くの研究者によって測定されており、その測定の臨床的意義について多くの報告がある（Ｐ．Ｖｅｎｇｅら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ，２９，ｐ１１７２−１１８６，１９９９）。また、ＥＣＰのアイソマーも公知である（ＷＯ９７／４６８８５号公報）。
【０００３】
ＥＣＰは血中のみならず、鼻汁、涙液、尿、又は便などにも存在する。特に、鼻汁中ＥＣＰ又は涙液中ＥＣＰは、好酸球に由来する局所のアレルギー性炎症の程度をよく反映すると言われており、これらの点に関する多くの報告が見られる。鼻汁中ＥＣＰは、鼻アレルギー患者で健常者に比べ有意に高値を示すと報告されている。また、涙液中ＥＣＰは、アレルギー性結膜炎、春季カタル、又は巨大乳頭性結膜炎などのアレルギー性疾患の鑑別に有用とする報告が多数見られる（例えば、雑賀寿和ら，アレルギーの臨床，１０，ｐ４０４−４０８，１９９０）。
【０００４】
血中のＥＣＰ測定に際しては、患者から血液を採取して血清又は血漿を分離することにより測定用サンプルを得ることが容易である。しかしながら、鼻汁又は涙液などの外分泌液などについては、測定用サンプルを定量的に得ることは難しい。
涙液又は鼻汁などの外分泌液中のＥＣＰ測定法についていくつかの報告がある。鼻汁の採取方法としては、分泌液そのものを採取する方法、あるいは、鼻腔洗浄液などで鼻腔を洗浄した後、新たに分泌された鼻汁のみを採取する方法等が試みられている（Ｄ．Ｗａｎｇら，Ｅｕｒ．Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．，２５２，ｐＳ４０−Ｓ４３，１９９５）。しかしながら、これらの方法は、研究目的では可能であったとしても、実際に臨床現場では手間がかかりすぎ、また、患者の負担も大きいため、実用化されるには到っていない。
【０００５】
また、涙液を充分量採取することは更に難しい。通常は、キャピラリー等を用いて非常にわずかの量（２μＬ程度）を採取することになるが、これは高度なテクニックを必要とし、同時に患者の恐怖心を惹起し、場合によっては眼を傷つけてしまうことすらあった。また、研究目的では、眼組織を採取する為に、金属器具等による擦過により組織を削りとる方法があるが、これもまた、患者に多大な苦痛と恐怖心を与える為、研究目的以外には用いられなかった。従って、涙液中のＥＣＰ測定もまた、臨床的有用性は認識されていながら、実用化されるには到っていない。
【０００６】
このような問題を解決する手段として、涙液や鼻汁をいったんろ紙などの吸湿性の素材に吸収させ、これから抽出することによりＥＣＰ測定のサンプルとすることが考えられる（鈴木康意ら，アレルギーの臨床，１０，ｐ４０９−４１１，１９９０）。この方法は、患者に負担をかけずにサンプリングできる良い方法であるが、前記文献に記載されているように、ＥＣＰの測定値に関して安定した回収率が得られず、実用化されるに到らなかった。この原因としては、一度吸湿し乾燥させた吸湿性担体からＥＣＰを抽出する場合、一般に用いられる生理食塩水やそれに相当する塩濃度の緩衝液では充分な抽出が行われないことが挙げられる。
このように、眼や鼻のアレルギー症状を客観的に評価又は数値化する為に、涙液や鼻汁を採取し、ＥＣＰを測定することは日常の臨床の場では困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、被検試料（例えば、涙液又は鼻汁など）などを吸収させた吸湿性担体からタンパク質（例えば、ＥＣＰ）を高回収率で抽出する方法、及び被検試料中のタンパク質（例えば、ＥＣＰ）を簡便に定量性良く分析する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、タンパク質を吸収させた吸湿性担体を、
（ａ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有する緩衝液、
（ｂ）界面活性剤０．００１％以上を含有する緩衝液、又は
（ｃ）ｐＨ１０〜１３の緩衝液
と接触させることを特徴とする、前記吸湿性担体から前記タンパク質を抽出する方法によって解決することができる。
また、本発明は、分析対象タンパク質を含有する可能性のある被検試料を、吸湿性担体に吸収させた後、前記吸湿性担体を、
（ａ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有する緩衝液、
（ｂ）界面活性剤０．００１％以上を含有する緩衝液、又は
（ｃ）ｐＨ１０〜１３の緩衝液
と接触させることにより抽出液を得、得られた抽出液を前記分析対象タンパク質用の分析手段により分析することを特徴とする、被検試料中のタンパク質を分析する方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抽出方法では、タンパク質を吸収させた吸湿性担体を、特定の抽出用液と接触させることにより、前記吸湿性担体から前記タンパク質を抽出する。
前記タンパク質は、吸湿性担体から通常の抽出用液（例えば、生理的食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水など）で充分に抽出されないタンパク質である限り、特に限定されるものではないが、例えば、好酸球塩基性タンパク質（ＥＣＰ）又はアポリポタンパク質Ａ−Ｉを挙げることができ、ＥＣＰであることが好ましい。
【００１０】
本発明の抽出方法において用いる前記吸湿性担体は、前記タンパク質（特にはＥＣＰ）を含有する可能性のある被検試料［特には、生体試料、例えば、外分泌液（例えば、涙液又は鼻汁）］を吸収することのできる担体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、ろ紙（セルロース）、布帛（例えば、織物、編物、又は不織布）、又はセルロース誘導体の膜（例えば、ニトロセルロース膜）などを挙げることができる。安価で、且つ入手が容易なことから、ろ紙（セルロース）が最も一般的である。また、被検試料の吸収量を定量的にコントロールすることができる点で、前記吸湿性担体として、目盛を付けた吸湿性担体、例えば、シルメル試験紙（昭和薬品化工株式会社製造，株式会社メニコン発売）を用いることが好ましい。
【００１１】
ＥＣＰを含有する可能性のある被検試料を吸収させた吸湿性担体は、湿潤状態のまま、以下に説明する抽出用液を用いた抽出処理に用いることもできるし、あるいは、一度、乾燥させた後、乾燥状態のまま、以下の抽出処理に用いることもできる。
例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、サイロキシン（甲状腺ホルモン、Ｔ４）、又は１７αヒドロキシプロゲステロン（ステロイドホルモン）などの測定では、多量のサンプルを一度に採取することが困難な新生児などにおいて、複数回に分けて血液をろ紙に吸収させることがよく行なわれている。本発明の抽出方法においても同様に、被検試料を吸収させた吸湿性担体を一度、乾燥させた後、乾燥状態で保存しておき、以下の抽出処理に用いることができる。
【００１２】
本発明の抽出方法では、抽出用液として、
（ａ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有する緩衝液、
（ｂ）界面活性剤０．００１％以上を含有する緩衝液、又は
（ｃ）ｐＨ１０〜１３の緩衝液
を用いる。
【００１３】
前記抽出用液（ａ）、すなわち、塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有する緩衝液における前記塩は、水に良く溶け、電解質となることができる塩である限り、特に限定されるものではないが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のハロゲン化塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、又はＮａＢｒなど）、硫酸塩、又はリン酸塩などを挙げることができる。前記抽出用液（ａ）は、これらの塩１種類のみを含有することもできるし、あるいは、塩２種類以上を含有することもできる。
【００１４】
前記抽出用液（ａ）における塩濃度は、含有される各塩濃度の合計が０．３ｍｏｌ／Ｌ以上である限り、特に限定されるものではなく、含有する塩の種類に応じて塩濃度を適宜決定することができる。例えば、塩としてＮａＣｌを用いる場合には、０．４ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。
また、前記抽出用液（ａ）における塩濃度の上限は、塩が緩衝液中に可溶な濃度である限り、特に限定されるものではないが、塩濃度は５ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
なお、前記抽出用液（ａ）における塩濃度は、生理的な塩濃度よりかなり濃い塩濃度である。例えば、生理食塩水の塩濃度は、０．１４ｍｏｌ／Ｌである。
【００１５】
前記抽出用液（ｂ）、すなわち、界面活性剤０．００１％を含有する緩衝液における前記界面活性剤は、特に限定されるものではないが、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０］、ポリオキシエチレン（４０）ソルビタンモノラウレート（トゥイーン４０）、又はオクトキシロール−９［トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００］などを挙げることができる。前記抽出用液（ｂ）は、これらの界面活性剤１種類のみを含有することもできるし、あるいは、界面活性剤２種類以上を含有することもできる。
【００１６】
前記抽出用液（ｂ）における界面活性剤の濃度は、含有される各界面活性剤の濃度の合計が０．００１％以上である限り、特に限定されるものではなく、含有する界面活性剤の種類に応じてその濃度を適宜決定することができる。例えば、界面活性剤としてトゥイーン２０を用いる場合には、０．０１％以上であることが好ましい。
また、前記抽出用液（ｂ）における界面活性剤濃度の上限は、粘性等の面で実際に取り扱いが可能な濃度である限り、特に限定されるものではないが、界面活性剤濃度は３．２％以下であることが好ましい。
【００１７】
本発明の抽出方法では、前記抽出液（ａ）〜（ｃ）のいずれかを用いることにより、高い回収率で、吸湿性担体からタンパク質（特にはＥＣＰ）を抽出することができる。
また、本発明の抽出方法では、高塩濃度、界面活性剤、及びｐＨ条件を組み合わせることにより、更に高い抽出率を達成することができる。このような組み合わせとしては、例えば、
（ｄ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上と界面活性剤０．００１％以上とを含有する緩衝液、
（ｅ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有し、ｐＨ１０〜１３の緩衝液、
（ｆ）界面活性剤０．００１％以上を含有し、ｐＨ１０〜１３の緩衝液、又は
（ｇ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上と界面活性剤０．００１％以上とを含有し、ｐＨ１０〜１３の緩衝液
を挙げることができ、抽出率の点で、前記抽出液（ｄ）又は（ｇ）が好ましい。
また、本発明の抽出方法では、抽出後の分析方法の条件に応じて、適切な抽出液（ａ）〜（ｇ）を適宜選択することができ、例えば、抽出後のタンパク質（特にはＥＣＰ）分析に際して連続して用いる場合には、前記抽出用液（ｄ）が好ましい。
【００１８】
本発明の分析方法は、
（１）分析対象タンパク質を含有する可能性のある被検試料を、吸湿性担体に吸収させる工程（以下、吸収工程と称する）、
（２）前記吸収工程で得られた吸湿性担体を、
（ａ）塩０．３ｍｏｌ／Ｌ以上を含有する緩衝液、
（ｂ）界面活性剤０．００１％以上を含有する緩衝液、又は
（ｃ）ｐＨ１０〜１３の緩衝液
と接触させることにより抽出液を得る工程（以下、抽出工程と称する）、及び
（３）前記抽出工程で得られた緩衝液を、前記分析対象タンパク質用の分析手段により分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含む。
【００１９】
本発明の分析方法を適用することのできる被検試料は、分析対象タンパク質（例えば、ＥＣＰ又はアポリポタンパク質Ａ−Ｉ）を含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生体試料、より具体的には、外分泌液、例えば、涙液（特には、結膜と眼球表面との間の涙液）若しくは鼻汁、粘膜組織、唾液、又はリンパ液などを挙げることができる。
【００２０】
本発明の分析方法における吸収工程では、使用する吸湿性担体及び採取する被検試料に応じて、それ自体公知の方法により、吸湿性担体に被検試料を吸収させることができる。例えば、吸湿性担体として、シルメル試験紙（昭和薬品化工株式会社製造，株式会社メニコン発売）を用いる場合には、例えば、その先端を結膜と眼球との間に挟み、数分間目を閉じることで、吸湿性担体を湿潤させ、その湿潤長を計測し、一定長で切断することで涙液量を一定化して採取することが可能である。鼻汁採取に関しても、シルメル紙を鼻腔深部に挿入する以外はほぼ同様の手法が可能である。
【００２１】
本発明の分析方法における抽出工程は、先述の本発明の抽出方法と全く同様にして実施することができる。すなわち、本発明の分析方法における抽出工程においては、本発明の抽出方法で用いることのできる抽出用液を用いることにより、分析対象タンパク質を含有する可能性のある抽出液を得ることができる。
【００２２】
本発明の分析方法における分析工程では、分析対象タンパク質の種類に応じて、そのタンパク質に関する公知の分析手段を用いることにより、前記抽出液の分析を実施することができる。例えば、分析対象タンパク質がＥＣＰである場合には、例えば、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、化学発光エンザイムイムノアッセイ（ＣＬＥＩＡ）、ラテックス凝集法、又はイムノクロマトグラフィーなどを用いることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
本実施例では、異なる塩濃度におけるＥＣＰの抽出率について検討した。
ＥＣＰ陽性血清１０μＬをシルメル試験紙（昭和薬品化工株式会社製造，株式会社メニコン発売）の一方の端部に滴下し、２５℃で一昼夜自然乾燥させた。陽性血清が染み込んだ長さは、前記端部から１０〜２０ｍｍであったので、前記端部から２０ｍｍのところで切断し、塩濃度の異なる以下の各種抽出用液を用いて、以下の手順で抽出を行なった。
【００２４】
前記抽出用液としては、異なる塩濃度（すなわち、０ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｏｌ／Ｌ、０．６ｍｏｌ／Ｌ、０．８ｍｏｌ／Ｌ、１．０ｍｏｌ／Ｌ、１．２ｍｏｌ／Ｌ、１．５ｍｏｌ／Ｌ、３ｍｏｌ／Ｌ、及び５ｍｏｌ／Ｌ）の塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２種類を使用した。ＥＣＰ陽性血清を滴下し、自然乾燥させた前記シルメル紙断片（長さ＝約２０ｍｍ）を１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブ（エッペンドルフ社）に挿入した後、塩濃度の異なる前記１２種類の抽出用液をそれぞれ２００μＬずつ分注し、室温２５℃で４時間静置した。なお、エッペンチューブを横に傾けることにより、前記シルメル紙の全体が抽出用液に浸るようにした。
【００２５】
４時間静置した後、遠心操作を行ない、抽出液１８０μＬをサンプリングし、微量透析装置を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）に対して透析した。透析後、液量を２００μＬに調整し、ＥＣＰ測定キット〈米国ＤＰＣ社製〉を用いて、各抽出液中に含まれるＥＣＰ量（単位＝ｎｇ／ｍＬ）を測定した。
結果を表１及び図１に示す。表１及び図１に示すように、０．３〜５ｍｏｌ／Ｌの塩濃度において良好な抽出率が得られた。
【００２６】
0004592981.tif 000002
【００２７】
【実施例２】
本実施例では、異なる濃度の界面活性剤存在下におけるＥＣＰの抽出率について検討した。
抽出用液として、異なる濃度（すなわち、０％、０．００１％、０．０１％、０．１％、０．３２％、１％、及び３．２％）のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）７種類を使用したこと以外は、前記実施例１の操作を繰り返した。
結果を表２及び図２に示す。表２及び図２に示すように、０．００１〜３．２％のトゥイーン２０濃度において有意な抽出率の向上が見られた。
【００２８】
0004592981.tif 000003
【００２９】
【実施例３】
本実施例では、異なる濃度の界面活性剤存在下におけるＥＣＰの抽出率について検討した。
抽出用液として、異なるｐＨの緩衝液９種類［すなわち、０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０，ｐＨ６．０）２種類、０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０，ｐＨ８．０）２種類、０．１ＭのＴＡＰＳ緩衝液液（ｐＨ９．０）１種類、及び０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０，１１．０，１２．０，１３．０）４種類］を使用したこと以外は、前記実施例１の操作を繰り返した。
結果を表３及び図３に示す。表３及び図３に示すように、ｐＨ１０〜ｐＨ１３において有意な抽出率の向上が見られた。
【００３０】
0004592981.tif 000004
【００３１】
【実施例４】
抽出用液として、０．８ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．１％トゥイーン２０を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を使用したこと以外は、前記実施例１の操作を繰り返したところ、ＥＣＰ量として１４．０ｎｇ／ｍＬの測定値が得られた。
対照として、前記ＥＣＰ陽性検体を前記抽出用液で１００％抽出することができたと仮定した場合の稀釈率で稀釈した希釈液（すなわち、ＥＣＰ陽性検体２０μＬに前記抽出用液１８０μＬを加えた混合液）について、ＥＣＰ測定キット〈米国ＤＰＣ社製〉を用いてＥＣＰ量を測定したところ、１５．６ｎｇ／ｍＬであった。
これらの測定値から、前記抽出用液を用いた場合のＥＣＰの回収率は約９０％であることが判明した。
【００３２】
【実施例５】
アレルギー性結膜炎の患者１４例及び健常者９例について、各人の両眼からそれぞれ別々に、シルメル試験紙により涙液を採取し、乾燥させた（合計サンプル数＝４６）。シルメル試験紙の先端半円状の部分を切り取り、前記実施例４で使用した抽出用液１００μＬを用いて、以下、前記実施例１に記載の手順と同様にして、ＥＣＰ量を測定した。
【００３３】
結果を表４及び図４に示す。図４において、レーン１〜１８は健常者９例の結果を示し、レーン１９〜４６はアレルギー性結膜炎の患者１４例の結果を示す。なお、各レーンの内、奇数番号のレーンは左眼の結果を示し、偶数番号のレーンは右眼の結果を示す。例えば、レーン１及びレーン２は、それぞれ、同一健常者の左眼及び右眼の結果を示し、レーン３及びレーン４は、それぞれ、前記健常者とは別の同一健常者の左眼及び右眼の結果を示す。
表４及び図４に示すように、アレルギー性結膜炎患者の涙液から、健常者に比べ、有意に高いＥＣＰ値が得られた。
【００３４】
0004592981.tif 000005
【００３５】
【発明の効果】
本発明の抽出方法によれば、通常の抽出用液（例えば、生理的食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水など）では充分に抽出することができないタンパク質（特にはＥＣＰ）を、吸湿性担体から高回収率で抽出することができる。また、本発明の分析方法によれば、通常の抽出用液では充分に抽出することができないタンパク質（特にはＥＣＰ）であっても、簡便に定量性良く分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なる塩濃度におけるＥＣＰの抽出率を示すグラフである。
【図２】異なる界面活性剤濃度におけるＥＣＰの抽出率を示すグラフである。
【図３】異なるｐＨにおけるＥＣＰの抽出率を示すグラフである。
【図４】本発明の分析方法により測定した涙液中のＥＣＰ量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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