(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌属類の舞茸の菌糸体及び／又は子実体から抽出したβ−１,６結合の分岐鎖を有するβ−１,３グルカン及びβ−１,３結合の分岐鎖を有するβ−１,６グルカンのリン酸化物を含むレトロウイルス感染症用薬剤。
【請求項２】
グルカンの水酸基の５％以上がリン酸化されている請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
グルカンが蛋白質を１％以下含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はレトロウイルス等に起因する感染症（特に後天性免疫症候群）及び人免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に起因する後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）の新規治療薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、我々が直面している難病の一つであるＡＩＤＳはレトロウイルスに属しているヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に起因する事が解明されている。
【０００３】
ＷＨＯ（世界保健機構）によると、１９９２年末の時点においてＨＩＶ感染者は１０００万人であり、ＡＩＤＳウイルス感染患者は６１万人である。また、我が国においても、１９９２年の時点でＨＩＶ感染者が２６０１人確認されており、その内発症にいたらないが、ＡＩＤＳウイルスの感染者数は５５４人となっている。しかし、ＡＩＤＳの治療法は全く不明であり、また、本症ウイルスとして現在ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２型の２例が発見されているが、このウイルスが極端に変異しやすいことによりワクチン開発，治療薬の開発の実現は非常に困難である。そこで抗ＨＩＶ剤によるＡＩＤＳの効果的な治療および予防が要求されている状況である。
【０００４】
抗ＨＩＶ剤として実用化されている薬剤には、ＡＺＴ（アジトチミジン）がある（Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，４３０，１９８７）。これはＨＩＶの逆転写酵素の阻害効果に基づく抗ＨＩＶ剤であるが、この薬剤は治療に際し生体に強い副作用を示し、患者の造血機能を阻害し、多くの患者に極度の貧血作用を発症させることが知られている。
【０００５】
また澱粉やデキストラン等のα−グリコシド結合を有する多糖体は生理活性能が分子量に依存するが、体内酵素によって分解される活性が低下する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は抗エイズウイルス活性を有し、体内酵素によって分解されにくい新規リン酸化グルカンを得ることである。
【０００７】
本発明の別の目的は副作用が著しく減少しかつ体内酵素によって分解されにくい、レトロウイルス感染症用薬剤を得ることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記目的を達成するために鋭意検討した結果、舞茸に含まれ、体内酵素によって分解されにくいβ−１，３グルカン及びβ−１，６グルカンのリン酸化物は強い抗エイズウイルス活性を有し、しかもその副作用は著しく少ないことを知見し、本願発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は担子菌属類の舞茸の菌糸体及び／又は子実体から抽出したβ−１，６結合の分岐鎖を有するβ−１，３グルカン及び／又はβ−１，３結合の分岐鎖を有するβ−１，６グルカンのリン酸化物、及びこれを含むレトロウイルス感染症用薬剤である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のグルカンリン酸化物は、舞茸から例えば熱水により抽出したグルカンをリン酸化することによって得ることができる。リン酸化する前に、グルカン抽出物を更に精製（例えば、遠心分離、沈殿化、酸処理、アルカリ処理、ゲル濾過、カラム吸着処理、透析等）することが好ましい。
【００１１】
リン酸化は、リン酸塩を用いて行なうことができる。本発明のグルカンリン酸化物においては、舞茸から抽出したグルカンの水酸基のうち５％以上、好ましくは１０％以上、特に好ましくは１５％以上がリン酸化されている。
【００１２】
本発明のグルカンリン酸化物はβ−１，６結合を主鎖として有し、更に高頻度のβ−１，３分枝鎖を有するグルカン及びβ−１，３結合を主鎖として有し、更に高頻度のβ−１，６分岐鎖を有するグルカンのリン酸化物である。このグルカンリン酸化物の分子量は１６〜２５万、好ましくは１８〜２３万、更に好ましくは２０〜２２万である。
【００１３】
本発明のグルカンリン酸化物はせいぜい１重量％の蛋白質を含むこと又は蛋白質を全く含まないことが好ましい。舞茸の熱水抽出物中のグルカンには例えば２０〜２５％の蛋白質が含まれており、この蛋白質は、例えばゲル濾過、カラム吸着処理、透析等により除去することができる。
【００１４】
本発明のグルカンリン酸化物は、ヒトＴ細胞由来株（ＭＴ−４）を用いた試験管内における抗ＨＩＶ活性試験により、ＨＩＶの増殖を完全に抑制することが分かった。最小有効濃度は１６μｇ／ｍｌであり、従来最も有効であるといわれている硫酸デキストランの最小有効濃度と同等であると判断できる。リン酸化前の舞茸グルカンの最小有効濃度が１２５μｇ／ｍｌであるから、リン酸化による活性の増大は格別顕著である。
【００１５】
本発明のグルカンリン酸化物は、実施例に示すように、ＨＩＶ−１に対して抗ウイルス活性を示すが、ＨＩＶ−２に対しても同様の活性を有している。
【００１６】
舞茸グルカンの非リン酸化物がヘルパーＴ細胞（Ｔ４細胞）の活性を賦活化することが分っていることから、本発明のグルカンリン酸化物はＨＩＶによるＴ４細胞の変性を著しく軽減することにより、抗ＨＩＶ作用を示すと考えられる。
【００１７】
本発明のレトロウイルス感染症用薬剤は、上記のグルカンリン酸化物を活性物質として含む。本発明の薬剤は活性物質の他に、製薬上許容可能な希釈剤、賦形剤等の慣用的な添加剤を含み得る。添加剤としては水、溶剤、デンプン、乳糖、油脂類等があげられる。
【００１８】
本発明の薬剤は経口、非経口、局所投与等の任意のルートで投与が可能であるが、静脈投与が好ましい。
【００１９】
本発明の薬剤は溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、粉末、カプセル等の任意の形態とし得るが、液状形態が好ましい。
【００２０】
本発明の薬剤は、活性物質量として、１日当り体積１ｋｇ当り２５〜４００ｍｇ、好ましくは５０〜２００ｍｇ投与するが、この値は患者の年齢、性別、症状等によって変化し得る。
【００２１】
本発明の薬剤はレトロウイルス（特にＨＩＶウイルス）に起因する感染症（特にＡＩＤＳ）の治療及び発症の抑制に効果的に使用し得る。
【００２２】
本発明の薬剤は製薬上問題となるような急性毒性は有していない。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これにより本発明が限定されるものではない。
【００２４】
舞茸グルカンの抽出及び精製
舞茸の子実体あるいは菌糸体を粉砕し２００〜５００ｇの乾燥粉末を得た後、これに２Ｌ〜５Ｌの蒸留水を加え、１００℃で５〜７時間の煮沸熱水抽出、あるいは１．２気圧で１時間加熱処理し、冷却後遠心分離法、または濾過法によって得た澄液に等量のアルコールを加え、４℃、１８〜２４時間インキュベーションした後、９〜２５ｇの沈殿物を得た。これを３０％及び５０％の酢酸で処理し、酸可溶物を除去し２〜５ｇの酸不溶物を得た。これに５〜７％のＮａＯＨを加えアルカリ可溶物を収集し、これに４倍の純アルコールを加えて沈殿物を得た。
【００２５】
この沈殿物にクロロホルム−アルコール混合液（２：１）を加え、蛋白質を除去した後アルコールを４倍量加え混和後、４℃で１８〜２４時間インキュベーションし、遠心分離法により約０．７ｇ〜１．７ｇの沈殿物を得た。
【００２６】
得られた物質は、冷水に難溶な淡褐色粉末でアンスロン反応は陽性であり、Ｌｏｗｒｙ法により２０〜２５％の蛋白質が検出され、プロテオグルカンであることが確認された。この蛋白質をまず、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：ＣＬ−４Ｂ，２．５×４５ｃｍカラムを用いてゲル濾過し、分子量２００×１０4 の高分子糖蛋白質を得た。つぎに、この物質をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：ＣＬ−６Ｂ，２．０×４．５ｃｍカラムに吸着させ、ｐＨ７．２の１／１５Ｍリン酸緩衝液で溶出された物質を得、この物質をＳｅｐｈａｒｏｓｅ透析チューブを用いて４℃蒸留水に対して透析（１８〜２４時間）し、つぎにセファデックスＧ−２５：３×３７ｃｍカラムで脱塩を実施した。これを蒸発乾固させ、淡褐色無定形粉末状の物質を得た。この物質は、０．５〜０．７％の蛋白質を含む多糖体であった。
【００２７】
ついで、得られた多糖体の化学構造を明らかにした。
【００２８】
即ち、前記物質１ｍｇを計り、５％塩酸メタノール１ｍｌに溶解し、１００℃で５〜７時間封管分解する。その後、分解物にトルエン−エタノール（１：１）混合液を添加して減圧下で蒸発乾固する。これにトリメチル珪素化剤を添加して６５〜７５℃で５〜１５分間インキュベーションし、ついでＳＥ２０（シリコンゴムＧＥ）を充填剤とするガスクロマトグラフィー分析で分析したところ、グルコースのみが検出された。さらに、この物質をエクソ−β−１，３−グルカナーゼをｐＨ５．０でマッキュルビン緩衝液の下でインキュベートしたところ、４８時間後に構成グルコース残基の４０〜５０％が遊離した。これらの結果から、この物質はβ−１，３結合を有するグルカンであることが確認された。
【００２９】
さらに、確認された物質を箱守法により完全メチル化した後、この完全メチル化物を５％塩酸メタノールによってメタノリシスした。これをネオペンチルグリコールサクシネートを充填剤とするガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β−１，３結合に由来する２，４，６−トリ−０−メチル、β−１，６結合に由来する２，３，６−トリ−０−メチル、１，３，４結合に由来する２，４−ダイ−０−メチル及び非還元末端に由来する２，３，４，６−テトラ−０−メチルグルコース誘導体の存在が確認された。このことから、舞茸子実体を煮沸熱水抽出して得られた物質は、β−１，６結合を主鎖とし、これに高頻度のβ−１，３分枝鎖を有する化学的構成よりなる多糖蛋白質及びβ−１，６分枝鎖をもつβ−１，３多糖蛋白質から構成されるものと断定した。さらにリン酸化β−グルカンの分子量はManers法（Ｅｔ  Ａｌ. 1971）の改変法を用いて測定したところ約２０万であった。
【００３０】
リン酸化
β−グルカンのリン酸化はリン酸一ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ  ０．６ｇとリン酸二ナトリウム・１２Ｈ2 Ｏ  ０．８ｇを蒸留水１ｍｌに溶解したものに凍結乾燥後のβ−グルカンを１ｇを加え、混和後６０分間撹拌して行なった。ついで濾過後２４時間減圧乾燥し粉砕し、１５５℃で２時間インキュベートした。その後ＭｅＯＨ／Ｈ2 Ｏ＝１／１(Wt)で洗浄した。洗浄後濾過し２４時間減圧乾燥した。得られたリン酸化グルカンは水酸基の２０％がリン酸化されていた。
【００３１】
リン酸化β−グルカンの抗血液凝固作用
リン酸化β−グルカンの抗血液凝固作用の有無を検討するために、血漿中活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）の測定を行った。
【００３２】
方法：使用動物は体重３．５〜３．９Kgの日本白色在来種の雄性兎であった。兎耳静脈をメスで切り、３．８％クエン酸ナトリウム溶液１容に対し血液９容となるように採血し、３０００rpm で１０分間遠心分離し、その上清の血漿を分離して測定まで氷中に保存した。血漿９０μｌ、被検薬物（また対照薬物）１０μｌ、及びActine１００μｌを加え３７℃で２分間インキュベートした。インキュベート後、０．０２５Ｍ塩化カルシウム１００μｌを加え、同時に凝固時間の測定を開始した。
【００３３】
薬物：被検薬物のβ−グルカン及びβ−グルカンリン酸化物は、０．３％DMSOに溶解し、硫酸デキストラン（DS 500）は蒸留水に溶解した。
【００３４】
0004540133.tif 000002
リン酸化β−グルカンはＡＰＴＴを延長させなかった。即ち、リン酸化β−グルカンは抗血液凝固作用は無いと判断できる。
【００３５】
硫酸デキストランは濃度依存的にＡＰＴＴを延長させ、ＡＰＴＴを２倍延長させる濃度は、５．４μｇ／ｍｌであった。即ち、硫酸デキストランは抗血液凝固作用があると判断できる。
【００３６】
抗凝固作用を再度確認のため追試を実施した。追試には更に硫酸化β−グルカンを加えて試み、リン酸化β−グルカンの濃度を高濃度にして試験を実施した。
【００３７】
0004540133.tif 000003
リン酸化β−グルカンは高濃度においても抗血液凝固作用は見られなかった。
対照薬である硫酸化β−グルカンと硫酸デキストランは濃度依存的にＡＰＴＴを延長させ、ＡＰＴＴを２倍延長させる濃度は、それぞれ２８．８μｇ／ｍｌと６．４μｇ／ｍｌであった。
【００３８】
以上の結果より、現在ＨＩＶ患者に有用であると言われている硫酸デキストランよりもリン酸化β−グルカンの方がＨＩＶ患者には有用であることが示唆された。
【００３９】
抗ＨＩＶ活性の測定（ウイルスによる細胞変性抑制活性の試験）
国立予防衛生研究所エイズセンターエイズウイルス室で実施されている方法を用いた。
【００４０】
即ち、１次スクーリングとしてＭＴ−４細胞のＨＩＶ感染による細胞障害性の抑制を指標にしたマイクロプレート法を用い、ここで活性が認められた試料に関しては更に他の方法により抗ＨＩＶ活性の確認及び作用メカニズムの解析を行った。
【００４１】
マイクロプレート法
ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−III ＢStrain）及びＨＩＶ−２（ＨＩＶ「ＧＨ−１」）に対して高い感受性を持つＭＴ−４細胞（ＣＤ４抗原陽性・ＨＴＬＶ−１陽性細胞）は感染後３〜５日間でＣＰＥが出現し、ほとんどの細胞が死滅する。
【００４２】
顕微鏡下でＣＰＥを判定し、添加した試料によってこのＣＰＥの発現を抑制するかどうかを調べ、１次スクリーニングとした。
【００４３】
即ち、丸底９６ウエルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ）の左端８ウェルに所定の希釈した試料溶液２００ｍｌを加えた。試料の希釈は１０％Ｆｃｓ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で行った。残りのウエルには培地を１００ｍｌづつ入れておき、８連ピペットで左端のウェルから１００ｍｌを取り右隣のウェルに移しよく撹拌した。これを繰り返し試料の２倍段階希釈（１００ｍｌ／ウェル１２段階）とした。
【００４４】
次に対数増殖期にあるＭＴ−４細胞をプレート１枚あたり６００万個遠心分離にて集め、極く少量の培地に懸濁した。
【００４５】
この細胞浮遊液に遠心管内で１００ＴＣＩＤ  ５０／ｍｌとなるようにＨＩＶを加え３７℃で１時間吸着させた。
【００４６】
ＨＩＶは持続感染Ｍｏｌｔ−４／ＨＩＶ細胞の培養上清を２２μｍのミリポアフイルターで濾過し−８０℃で保存したもので、予めＭＴ−４細胞にたいする感染価を決定していたものを用いた。
【００４７】
３７℃で１時間吸着後プレート１枚あたり１０ｍｌの培地を加え１００μｌ／ウェルを試料希釈液に添加した。この時の細胞濃度は３０万個／ｍｌに設定した。
【００４８】
非感染細胞と試料無添加感染細胞を対照としておき、５％ＣＯ2 存在下、３７℃で培養した。
【００４９】
ＨＩＶ感染後３日目に検鏡で試料による細胞毒性を調べると共に感染時と同じ試料の２倍段階希釈のプレートを用意し、３日間培養したプレートから１／３〜１／５の細胞を取り出し移し替えた。感染後６日目に判定を行った。
【００５０】
判定は検鏡によりＨＩＶ感染によるＣＰＥの発現の有無を観察した。試料が細胞毒性を示さない濃度でＨＩＶ感染によるＣＰＥの発現を抑制した場合に効果が認められるものとした。
【００５１】
0004540133.tif 000004
【００５２】
【表１】
0004540133.tif 000005
【００５３】
【発明の効果】
舞茸由来リン酸化β−プロテオグルカン（リン酸化β−ｇｌｕｃａｎともいう）は強い抗ＨＩＶ活性を示した。培養後ウイルスによる細胞毒性の有無を確認した結果、対照群ではウイルスによる細胞変性が認められたが、リン酸化β−グルカン３１〜６３μｇ／ｍｌという少量を添加した場合においてもウイルスによる細胞変性が認められなかった。
【００５４】
本発明のグルカンリン酸化物はウイルスによる細胞変性の抑制活性即ち抗ＨＩＶ活性が著しく高い。