(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）サイクリンＤ１遺伝子産物のための挿入遺伝子構築物（ここで、該サイクリンＤ１遺伝子産物は、該挿入前の細胞におけるサイクリンＤ１遺伝子産物の発現レベルよりも高レベルで、細胞内において機能的に発現される）と、
（ｂ）関心のあるタンパク質のための挿入遺伝子構築物（ここで、関心のあるタンパク質は、該挿入前の細胞における関心のあるタンパク質の発現レベルよりも高レベルで、細胞内において発現される）とを含んでなるＣＨＯ細胞であって、該関心のあるタンパク質は、（ｂ）の挿入遺伝子構築物を含むが（ａ）の挿入遺伝子構築物を含まない細胞において得られる該タンパク質の発現レベルよりも高いレベルで発現され、該ＣＨＯ細胞は無血清培地に順応している、ＣＨＯ細胞。
【請求項２】
前記ＣＨＯ細胞がｄｈｆｒ（−）表現型を保有する細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
該サイクリンＤ１遺伝子産物が哺乳類サイクリンＤ１を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
該サイクリンＤ１遺伝子産物がヒトサイクリンＤ１を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記の関心のあるタンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）−関連タンパク質、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）−関連タンパク質又はレプチン−関連タンパク質である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記の関心のあるタンパク質が、ＥＰＯ、新規赤血球造血刺激タンパク質（Novel  Erythropoiesis Stimulation Protein ; ＮＥＳＰ）、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｆｃ、レプチン又はＦｃ−レプチンである、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
関心のあるタンパク質の製造方法であって、
（ａ）（１）サイクリンＤ１遺伝子産物のための挿入遺伝子構築物（ここで、該サイクリンＤ１遺伝子産物は、該挿入前の細胞におけるサイクリンＤ１遺伝子産物の発現レベルよりも高レベルで、細胞内において機能的に発現される）と、
（２）関心のあるタンパク質のための挿入遺伝子構築物（ここで、関心のあるタンパク質は、該挿入前の細胞における関心のあるタンパク質の発現レベルよりも高レベルで、細胞内において機能的に発現される）
とを含んでなる無血清培地順応ＣＨＯ細胞を作製し、ここで、該関心のあるタンパク質は、（２）の挿入遺伝子構築物を含むが（１）の挿入遺伝子構築物を含まない細胞において得られる該タンパク質の発現レベルよりも高いレベルで発現され、
（ｂ）前記の関心のあるタンパク質の発現と該サイクリンＤ１遺伝子産物の機能的発現を可能にする条件下で該細胞を培養し、
（ｃ）前記の関心のあるタンパク質を単離することを含んでなる製造方法。
【請求項８】
前記ＣＨＯ細胞がｄｈｆｒ（−）表現型を保有する細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該サイクリンＤ１遺伝子産物が哺乳類サイクリンＤ１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
該サイクリンＤ１遺伝子産物がヒトサイクリンＤ１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記の関心のあるタンパク質がＥＰＯ−関連タンパク質、ＯＰＧ−関連タンパク質又はレプチン−関連タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記の関心のあるタンパク質がＥＰＯ、ＮＥＳＰ、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｆｃ、レプチン又はＦｃ−レプチンである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
哺乳動物の細胞周期の進行は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）の秩序だった活性化により駆動される。活性なCDKは、触媒サブユニット、およびサイクリンと称される調節サブユニットから構成される。CDK活性は、サイクリンとCDKインヒビター（CKI）との相互作用を介して、および翻訳後修飾（例えば、リン酸化）により調節される。
【０００２】
細胞周期段階間の移行は、定められたチェックポイントにおいて種々のサイクリンサブユニットにより調節される（例えば、G1/S移行はG1サイクリンにより、S期を通過する進行はSサイクリンにより、そして分裂期への進入はG2または分裂サイクリンにより調節される）。G1後期の限定点（R）において、細胞はS期に進入するように委ねられ、その後は、細胞分裂を完了させるためにはマイトジェン増殖因子はもはや要求されない。
【０００３】
サイクリンDおよびEはG1期中に順次合成され、これがS期への進入のための律速段階となるため、それらはG1サイクリンとみなすことができる。少なくとも3種の哺乳類遺伝子がD型サイクリン（D1、D2およびD3）をコードしている。D型サイクリンは、分裂刺激に対する遅延初期応答の一部として進行的に誘導され、それらは細胞系譜に特異的に発現される。D型サイクリンとCDK4およびCDK6との集合はマイトジェンにより翻訳後に調節される。集合したら、サイクリンD結合型CDKは、触媒活性を獲得するためにはCDK活性化キナーゼ（CAK）によりリン酸化される必要がある。
【０００４】
サイクリンD遺伝子は、A型、B型またはE型サイクリンとは異なる進化樹分枝上に存在し、D型サイクリンは、他のサイクリンとは異なるいくつかの特性を有する。該サイクリンは短寿命（t1/2<25分）のタンパク質である。G1期中の増殖因子の消失は、サイクリンDの安定した蓄積を妨げ、これは、増殖因子枯渇細胞がR点を越えて進行しないことと相関している。このように、サイクリンA、BおよびEの周期的発現とは異なり、サイクリンDの発現は細胞外シグナルにより調節される。
【０００５】
げっ歯類またはヒト繊維芽細胞内でのヒトサイクリンD1およびEの過剰発現はG1期を短縮し、細胞サイズを減少させ、G1期からS期への移行のための血清要求性を低下させる（Resnitzkyら, MCB 14, 1669-79 (1994); Quelleら, Genes & Development 7, 1559-71 (1993); Ohtsubo & Roberts, Science 259, 1908-12 (1992)）。これらの結果は、Dサイクリンが、サイクリンEにより生理的に調節される機能を無効にしたり、その逆も生じうることを示唆している。しかしながら、サイクリンDまたはEの過剰発現は繊維芽細胞のトランスフォーメーションにつながらない。すなわち、細胞は依然として血清依存性であり、接触阻止を受け、半固体培地内でコロニーを形成する能力を有さない。また、サイクリンD1の過剰発現は内在性遺伝子の増幅を増強することが判明しており、このことは、それが腫瘍発生中のゲノム不安定性において何らかの役割を果たしていることを示唆している（Zhouら, Cancer Res. 56: 36-9 (1996)）。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、真核細胞であって、
（a）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルで該細胞内で機能的に発現されるサイクリンD遺伝子産物と、
（b）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルで該細胞内で発現される関心のあるタンパク質とを含んでなる真核細胞に関する。
【０００７】
本発明はまた、関心のあるタンパク質の製造方法であって、
（A）真核細胞を作製し（該真核細胞は、
（1）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルのサイクリンD遺伝子産物と、
（2）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルの関心のあるタンパク質とを発現する）、
（B）前記の関心のあるタンパク質の発現と該サイクリンD遺伝子産物の機能的発現とを可能にする条件下で該細胞を培養し、
（C）前記の関心のあるタンパク質を単離することを含んでなる製造方法に関する。
【０００８】
本発明の細胞は、好ましくは、哺乳類細胞であり、CHOが最も好ましい。該サイクリンD遺伝子産物は、好ましくは、哺乳類のものであり、ヒト由来のものが最も好ましい。該サイクリンD遺伝子または関心のあるタンパク質をコードする遺伝子（またはそれらの両方）は、細胞内の発現ベクター内に含まれていてもよく、あるいは細胞ゲノム内に組込まれていてもよい。
【０００９】
関心のある多数のタンパク質を本発明において使用することができる。特に、EPO、OPG、レプチンおよびNESPならびにそれらの誘導体を使用することができる。
【００１０】
（発明の詳細な記載）
本明細書全体で用いる用語に関しては、特定の場合において限定されない限り、以下の定義が適用される。
【００１１】
核酸の「挿入」なる語は、核酸が外的方法（例えば、トランスフェクション）により細胞または生物内に導入されることを意味する。挿入される核酸は、細胞ゲノムにとって外来性の又は該細胞ゲノム内に既に存在する配列を有していてもよい。後者の場合、該挿入核酸は、該挿入核酸にコードされるタンパク質の、より高度な又は差次的に調節される発現を可能にする。
【００１２】
「EPO関連タンパク質」は、組換えDNA法および他の方法により製造されうるエリトロポエチンならびにその誘導体および類似体を意味する。そのような誘導体には、末端トランケート化、中間部のアミノ酸の除去（例えば、結合するDNAの制限酵素処理および再連結によるもの）、アミノ酸の置換などを有するタンパク質が含まれる。そのような誘導体には、融合タンパク質（例えば、Fc領域を有するもの）も含まれる。エリトロポエチン誘導体の代表例は、国際特許出願WO91/05867、94/09257、88/03808および86/07594（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００１３】
「レプチン関連タンパク質」なる語は、組換えDNA法および他の方法により製造されうるレプチン（好ましくは、ヒトレプチン）およびその誘導体を意味する。そのような誘導体には、末端トランケート化、中間部のアミノ酸の除去、アミノ酸の置換などを有するタンパク質が含まれる。また、この定義には、レプチンを含む融合タンパク質（例えば、レプチンとFcフラグメントとを含む融合タンパク質）も含まれる。適当なレプチン誘導体は、特許出願WO96/40912（1996年12月19日付け出願）、WO96/05309（1996年2月22日付け出願）、WO97/06816（1997年2月27日付け出願）およびWO97/18833（1997年5月29日付け出願）（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００１４】
「OPG関連タンパク質」なる語は、組換えDNA法および他の方法により製造されうるOPGおよびその誘導体を意味する。そのような誘導体には、末端トランケート化、中間部のアミノ酸の除去（例えば、結合するDNAの制限酵素処理および再連結によるもの）、アミノ酸の置換などを有するタンパク質が含まれる。そのような誘導体には、融合タンパク質（例えば、Fc領域を有するもの）も含まれる。OPG誘導体の代表例は、国際特許出願WO97/23614（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００１５】
製造方法
遺伝子構築物
本発明で使用する核酸は、組換え核酸法により製造することができる。例えば、Nellesら, J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987)の組換えDNA法を参照されたい。
【００１６】
該核酸は、ゲノムDNA、サブゲノムDNA、cDNA、合成DNAおよびそれらの組合せを含む種々の起源に由来するものであってもよい。ゲノムDNAおよびcDNAは、多数の方法により得ることができる。所望の配列をコードする細胞を単離し、ゲノムDNAを断片化し（例えば、1以上の制限エンドヌクレアーゼでの処理によるもの）、得られた断片をクローニングし、所望の配列に相補的なプローブで同定し、所望の活性をコードする配列の存在に関してスクリーニングすることができる。cDNAの場合には、該cDNAをクローニングし、得られたクローンを、所望の領域をコードするcDNAに関するプローブでスクリーニングする。所望のクローンを単離したら、ゲノムDNAの場合と実質的に同じ方法により該cDNAを操作することができる。
【００１７】
該遺伝子構築物は、関心のあるタンパク質のコード配列に加えて多数の調節領域を含有すべきである。発現のためには、適当な宿主に認識される転写および翻訳シグナルが必要である。また、該コード配列は、宿主細胞に和合性のプロモーターに結合しているべきである。該プロモーターは、発現の更なる制御を可能にする誘導プロモーター、または構成的プロモーターであってもよい。多数の適当なプロモーターが当技術分野において公知である。
【００１８】
あるいは、ゲノムDNA由来のプロモーター領域を該コード配列と共に得ることができる。該コード領域に結合した転写調節および翻訳開始シグナルを宿主細胞が認識する限り、該コード配列に隣接した5'領域を保有させ、転写および翻訳調節のために使用することができる。この領域は、典型的には、転写および翻訳の開始に関連した配列、例えば、TATAボックス、キャップ形成配列、CAAT配列などを含むであろう。典型的には、この領域は、少なくとも約150塩基対長、より典型的には約200bpであり、約1〜2kbを超えることはめったにない。
【００１９】
また、該非コード3'領域（特に、その転写終結調節配列、例えば、終結シグナルおよびポリアデニル化領域）が保有されていてもよい。さらに、該非コード3'領域はまた、エンハンサーを含有していてもよい。該転写終結シグナルが宿主細胞内で十分に機能的でない場合には、その代わりに、異なる遺伝子に由来する機能的3'領域を使用することができる。そのような代わりに使用される3'領域の選択は、発現用に選択される細胞系に左右されるであろう。
【００２０】
宿主の性質に応じて、多種多様な転写および翻訳調節配列を使用することができる。該転写および翻訳調節配列は、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど）に由来するものであってもよい。ただし、これは、該調節シグナルが、宿主内で高レベルの発現を示す遺伝子に由来する場合に限られる。あるいは、哺乳類発現産物（例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシンなど）に由来するプロモーターを使用することができる。抑制または活性を可能にする転写開始調節シグナルは、該遺伝子の発現がモジュレーションされうるように選択することができる。そのような1つの制御可能なモジュレーション技術としては、温度変化による発現の抑制または開始を可能にする温度感受性の調節シグナルの使用が挙げられる。もう1つの制御可能なモジュレーション技術としては、ある種の化学物質に対して感受性である調節シグナルの使用が挙げられる。
【００２１】
該構築物は、宿主細胞に対して内因性の核酸配列を、該細胞に対して内因性であっても内因性でなくてもよいプロモーター、エンハンサーおよび他の調節領域と共に含んでいてもよい。そのような構築物は、該内因性配列の発現の増強（例えば、構成的プロモーターとの作動的共役によるもの）または制御（例えば、調節シグナルとの作動的共役によるもの）を可能にする。
【００２２】
該遺伝子構築物を得るために、当技術分野で公知の通常の技術に従いDNA断片を連結することができる。そのような技術には、付着末端断片を平滑末端に（またはその逆）変換するための制限酵素の使用、付着末端を埋めて平滑末端を得るためのポリメラーゼおよびヌクレオチドの使用、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼの使用、および断片を連結するためのリガーゼの使用が含まれる。
【００２３】
該構築物は、該構築物が宿主ゲノム内に組込まれる（例えば、相同組換えによるもの）ことになる場合の選択を可能にする遺伝子と共に、形質転換により細胞内に導入することができる。通常、該構築物は、宿主細胞により認識される複製系を有するベクターの一部である。
【００２４】
発現ベクター
本発明の分子を製造するための発現ベクターには、プラスミドまたは他のベクターが含まれる。一般に、そのようなベクターは、種々の細胞型における発現を可能にする制御配列を含有する。所望のコード配列および制御配列を含有する適当な発現ベクターは、当技術分野において公知の組換えDNA技術を用いて構築することができ、それらの多くは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００２５】
本発明において意図される発現ベクターは、少なくとも、関心のあるタンパク質をコードする核酸またはサイクリンD遺伝子産物の複製および発現を指令しうる。1つのクラスのベクターは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはSV40）に由来する自律複製性染色体外プラスミドを与えるDNA要素を用いるものである。もう1つのクラスのベクターは、宿主細胞染色体内への所望の遺伝子配列の組込みに基づくものである。
【００２６】
本発明において有用な発現ベクターは、典型的には、複製起点、発現されるDNA配列の5'側（すなわち上流）に位置するプロモーター、および転写終結配列を含有する。適当な複製起点には、例えば、ColE1、pSC101、M13、SV40およびEBV複製起点が含まれる。適当な終結配列には、例えば、ウシ成長ホルモン、SV40、lacZおよびAcMNPV多角体ポリアデニル化シグナルが含まれる。適当なプロモーターには、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、lacZプロモーター、gal 10プロモーターおよびAcMNPV多角体プロモーターが含まれる。また、該プロモーター配列は、発現のモジュレーション（例えば、増殖培地内の栄養素または他の誘導物質の存在または不存在によるもの）を可能にするように誘導可能なものであってもよい。一例として、バクテリオファージラムダpla5から得られるlacオペロン（これはIPTGにより誘導されうる）が挙げられる。
【００２７】
また、該発現ベクターは、所望の産物の最適な発現のための他の調節配列を含んでいてもよい。そのような配列には、発現産物の安定性をもたらす安定性リーダー配列、発現産物の分泌をもたらす分泌リーダー配列、該DNA配列の発現をアップレギュレーションするエンハンサー、および制限エンドヌクレアーゼによる切断のための部位を付与する制限酵素認識配列が含まれる。これらの物質のすべては当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。例えば、Okayama, Mol. Cell Biol., 3, 280 (1983)を参照されたい。
【００２８】
適当な発現ベクターはまた、形質転換宿主細胞の表現型選択を可能にするマーカー配列を含んでいてもよい。そのようなマーカーは、栄養要求宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質耐性）などを付与しうる。該選択マーカー遺伝子は、発現されるコード配列に直接結合していても、あるいはコトランスフェクションにより同一細胞内に導入されてもよい。選択マーカーの具体例には、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン耐性などに関する遺伝子が含まれる。
【００２９】
使用する実際の発現ベクターの特性は、使用する宿主細胞に適合するものでなければならない。例えば、哺乳類宿主の場合には、発現ベクターは、哺乳類細胞のゲノムから単離されたプロモーター（例えば、マウスメタロチオニンプロモーター）またはこれらの細胞内で増殖するウイルスから単離されたプロモーター（例えば、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有していてもよい。
【００３０】
本発明のコード配列を挿入することができる商業的に入手可能な適当な発現ベクターには、哺乳類発現ベクターpcDNA IまたはpcDNA I/Neo（これが好ましい）、バキュロウイルス発現ベクターpBlueBac、原核性発現ベクターpcDNA IIおよび酵母発現ベクターpYes2（これらはすべて、Invitrogen Corp, San Diego, Calif.から入手可能である）。
【００３１】
宿主細胞
本発明はまた、関心のあるタンパク質およびサイクリンD遺伝子産物のDNA配列を含む発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。適当な宿主細胞としては、真核細胞、例えば、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）、昆虫細胞、COS-7細胞、ヒト繊維芽細胞およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞が挙げられる。宿主細胞として有用でありうる哺乳類細胞には、繊維芽細胞由来の細胞（例えば、VEROまたはCHO-K1）またはリンパ系由来の細胞（例えば、SP2/0-AG14またはP3x63Sg8）またはそれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳類宿主細胞はCHO細胞である。
【００３２】
骨髄腫またはリンパ腫細胞などの不死化細胞も、適当な宿主細胞である。これらの細胞は、培養フラスコ中の適当な栄養培地内で増殖させたり、あるいは同系宿主（例えば、マウスまたはラット）または免疫不全宿主もしくは宿主部位（例えば、ヌードマウスまたはハムスター嚢）内に注射することができる。特に、腹水の産生およびキメラ分子の収穫のために腹腔内に該細胞を導入することができる。あるいは、該細胞を皮下注射し、抗体を該宿主の血液から集めることができる。該細胞は、ハイブリドーマ細胞と同様に使用することができる。Diamondら, N. Eng. J. Med., 304, 1344 (1981); Monoclonal Antibodies: Hybridomas-A New Dimension in Biologic Analysis（Kennattら編）Plenum (1980)を参照されたい。
【００３３】
発現ベクターは、当技術分野で公知の種々の方法により宿主細胞内に導入することができる。例えば、宿主細胞内への発現ベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法により行うことができる。しかし、宿主細胞内に発現ベクターを導入するための他の方法（例えば、エレクトロポレーション、リポソーム融合、核注入、およびウイルスまたはファージの感染）も用いることができる。
【００３４】
発現ベクターを含有する宿主細胞は、以下の6つの一般的アプローチの1以上により同定することができる：（a）DNA-DNAハイブリダイゼーション、（b）マーカー遺伝子機能の存在または不存在、（c）宿主細胞内の遺伝子構築物をコードするmRNA転写産物の産生により測定される転写レベルの評価、（d）遺伝子産物の免疫学的検出、（e）酵素アッセイ、および（f）PCR。これらの方法は当技術分野でよく知られており、例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,744,314号を参照されたい。
【００３５】
また、本発明の発現ベクターおよびDNA分子を配列決定することも可能である。種々の配列決定方法が当技術分野で公知である。例えば、Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-7 (1977)に記載のジデオキシターミネーション法、およびProc. Natl. Acad. Sci USA 74, 560-4 (1977)に記載のマキサム・ギルバート法を参照されたい。
【００３６】
発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入したら、関心のあるタンパク質の大量発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することができる。関心のあるタンパク質は、通常の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動など）に従い単離し精製することができる。好ましい方法はアフィニティークロマトグラフィーである。
【００３７】
もちろん、すべての発現ベクターおよびDNA調節配列が、本発明の核酸を発現するように同等に十分に機能するとは限らないと理解されるべきである。また、すべての宿主細胞が同一発現系で同等に十分に機能するとは限らない。しかしながら、当業者であれば、過度な実験を行うことなく且つ本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書に記載の指針を用いて発現ベクター、DNA調節配列および宿主細胞からの選択を行うことができる。
【００３８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の特定の実施形態を以下に詳細に説明する。これらの実施形態は典型例であり、本発明の広範な適用性を例示するものである。特に示さない限り、これらの実施形態は本発明の好ましい要素を含む。
【００３９】
材料および方法
プラスミド
ヒトサイクリンD1遺伝子（Genbank受託番号M64349）をpcDNA 3.1（Invitrogen）内にクローニングし、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター/エンハンサー下で構成的に発現させて、pcDNA3.1/サイクリンD1を得た。また、該ベクターは、G418の存在下での安定な哺乳類細胞系の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を保持する。
【００４０】
細胞培養
CHOd(SF)細胞を100mmディッシュ中の完全培地 [DMEM (Gibco/BRL)、5％ウシ胎仔血清 (JRH Biosciences)、1％ヒポキサンチン/チミジン (HT)(Gibco/BRL)および1％グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン (Gibco/BRL)]内で増殖させた。該細胞をトリプシン処理し、計数し、60mmプレート（Falcon）内に1x10e6細胞/ディッシュで播いた。AM-1 CHOd細胞をAmgen VM-soy培地内の浮遊攪拌培養内で増殖させた。細胞を計数し、遠心分離し、完全培地に再懸濁し、60mmプレート内に1x10e6細胞/ディッシュで播いた。細胞を一晩インキュベートした。トランスフェクションの3時間後、該培地上の培地を4mlの新鮮培地と交換した。
【００４１】
サイクリンD1のトランスフェクション
このトランスフェクションでは、サイクリンD1 cDNAインサートを含有するベクターpcDNA 3.1 neo（登録商標）（Invitrogen）を使用した。60mmプレートの細胞ごとに、5μgのpcDNA3.1/サイクリンD1（2mg/ml）および5μgのマウスゲノム担体DNA（Clontech）（100μg/ml）を172.5μlの無菌蒸留水に加えた。25マイクロリットルの2.5M CaCl2を該DNA溶液に加えて、最終容積を250μlとした。ベクター対照として、170.5μlの無菌水に5μgのpneoベクターDNA（1.126mg/ml）を5μgの担体DNAと共に加え、ついで25μlの2.5M CaCl2を加えた。模擬対照として、25μlの2.5M CaCl2を225μlの水に加えた。該DNA溶液を等容積（250μl）の2x HBS（280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM NaHPO42H2O、0.2mMデキストロース、50mM HEPES、pH7.05）に滴下し、その間じゅう、絶えず通気した。該DNA/HBS溶液を室温で30分間インキュベートした。該培地を該CHO細胞プレートから除去し、該DNA/HBS溶液（全容積500μl/ディッシュ）を滴下した。合計3個のプレートをpcDNA3.1/サイクリンD1で処理し、各細胞系ごとに該ベクターおよび模擬対照についてそれぞれ1個のプレートを処理した。該細胞を室温で30分間インキュベートし、ついで5mlの完全培地を各ディッシュに加えた。ついで該細胞を37℃で一晩インキュベートした。翌日、該培地を新鮮な培地と交換した。
【００４２】
CHO(SF)細胞は、該トランスフェクションの48時間後にコンフルエントに達した。該細胞をトリプシン処理し、8x100mmディッシュに対して1x60mmディッシュの割合で完全培地内で再プレーティングした。翌日、該培地を、1mg/mlゲネティシン（Geneticin）（G418）（Gibco/BRL）を含有する完全培地と交換した。AM-1 CHO細胞はトランスフェクションの72時間後にコンフルエントに達し、それを同様に再プレーティングした。該細胞上の培地を新鮮な完全培地 + G418で週2回交換した。G418選択培地の最初の添加の10日後、ガラスクローニングシリンダー（Bellco）を使用して、CHO(SF)およびAM-1 CHOサイクリンD1をトランスフェクトしたプレートからコロニーを単離した。細胞をトリプシン処理し、再び24ウェルプレート内に播いた。CHO(SF)細胞のトランスフェクション頻度（>100コロニー/プレート）は、AM-1 CHO細胞の場合（20〜30コロニー/プレート）よりはるかに高かった。CHO(SF)/サイクリンD1プレートからは合計72個のコロニーを単離し、AM-1 CHO/サイクリンD1プレートからは68個のコロニーを単離した。G418選択培地を含有する模擬対照ディッシュのいずれのセットにおいても、コロニーは存在しなかった。コロニーを拾った後、プレートの各セットからの残りの細胞をトリプシン処理し、100mmディッシュ中のプール培養（CHO(SF)/サイクリンD1は3個のプール、AM-1 CHO/サイクリンD1は2個のプール）内に集めた。
【００４３】
トランスフェクトされた細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、ついで6ウェルプレート内に再プレーティングした（1クローン/プール当たり2ウェル）。コンフルエントに達したら、各クローン/プール当たり1ウェルの細胞を250mlの1％ Triton溶解バッファー（1％ Triton X100、1mM NaVo3、50mM Tris/HCl pH8、100mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤）で細胞溶解した。ライセートを14Kで15分間遠心分離した。上清を集め、-20℃で保存した。ライセートをサイクリンD1の発現に関してウエスタンブロット法により分析した。25μlの各サンプル + 対照サンプル（親CHO(SF)およびAM-1 CHO系のもの）を5μlの5X PAGEゲルサンプルバッファーと混合し、3分間煮沸し、12％ Novex Tris-グリシンゲル上にローディングした。該ゲルを0.2μのニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schuell）上にエレクトロブロッティングした。該フィルターを抗サイクリンD1 Ab-3モノクローナル抗体（Calbiochem）でプローブし、Amersham ECL試薬を使用して現像した。結果は、該プール培養における及び該クローンのほとんどにおける種々の程度のサイクリンD1の過剰発現を示した。
【００４４】
それらの2つのAM-1 CHO/サイクリンD1プール培養およびそれらの2つの最高発現CHO(SF)/サイクリンD1プール培養を一緒にして、後続のトランスフェクションで用いる各細胞系に関する「マスタープール」とした。ヒポキサンチン/チミジンを含まない選択培地 [DMEM、5％透析ウシ胎仔血清（Hyclone）、非必須アミノ酸、グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン] 内で該細胞を増殖させることによりそれらがDHFR陰性表現型を保有していたか否かを判定するために、該マスタープール培養を試験した。この培地においては細胞の増殖は何ら検出されなかった。
【００４５】
EPOのトランスフェクション
CHO(SF)/サイクリンD1およびAM-1 CHO/サイクリンD1のマスタープール培養を、1mg/mlのG418で補足された完全CHOd培地内に維持した。これらの細胞を60mmプレート内に8x10e5細胞/ディッシュで播き、一晩培養した。前記プロトコールを用いて、pSW19（pDSRα2の近縁誘導体）/EPO標的DNA、pDSRα2ベクター対照DNA、およびニシン精子担体DNA（Gibco/BRL）で該細胞をトランスフェクトした。最終濃度5μg/ディッシュのpSW19/EPO DNAを使用した。トランスフェクションの24時間後、該細胞に新鮮な培地を与えた。トランスフェクションの72時間後、該細胞をトリプシン処理し、選択培地 + 1mg/ml G418内に1:8、1:10および1:20の比（60mmプレート対100mmプレート）で再プレーティングした。該細胞上の培地を、G418を含有する新鮮な培地で週2回交換した。再プレーティングの12日後、CHO(SF)/サイクリンD1/EPOでトランスフェクトされたプレートから48個のコロニーを単離した。残りの細胞をトリプシン処理し、2つのプール培養内に集めた。再プレーティングの15日後、AM-1 CHO/サイクリンD1/EPOでトランスフェクトされたプレートから48個のコロニーを単離し、残りの細胞を2つのプール内に集めた。該プールの100mmプレート培養または単離されたクローンからのコンフルエントな24ウェル培養からの無血清馴らし培地収穫物上で、ウエスタンブロット法によりEPOの発現を分析した。還元条件下でゲル泳動を行い、抗EPOモノクローナル抗体2D8でブロットをプローブした。
【００４６】
OPGのトランスフェクション
CHOd(SF)/サイクリンD1およびAM-1 CHOd/サイクリンD1マスタープールならびにCHOd(SF)親系内へのpSW19/OPG DNA構築物のトランスフェクションを、EPOのトランスフェクションと同様に行った。2つの別々のOPG-Fc(22-201)のトランスフェクションを全3個の宿主細胞系内に行った。合計124個のCHO(SF)、110個のCHO(SF)/cycDおよび147個のAM-1 CHO/cycDコロニーをOPG-Fc(22-201)のトランスフェクションから拾った。得られたクローンおよびプールにおいて、抗huIgG-Fc-HRP抗体（Pierce）またはアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗huOPGを使用するウエスタンブロット法により、OPGの発現を分析した。
【００４７】
DNAのヨウ化プロピジウム染色
細胞を100mmプレート内に播き、約50％コンフルエントになるまで増殖させた。該アッセイのためには、細胞が対数期になければならない。該細胞をトリプシン処理により収穫し、等容積のDMEM/FBSを含有する遠心管内にピペッティングした。該細胞懸濁液のアリコートを血球計算盤で計数した。細胞密度は約106〜107細胞/5mlであるべきである。該細胞を1000xgでの遠心分離によりペレット化し、氷冷PBSで2回洗浄した。該細胞は単個細胞懸濁（浮遊）液中になければならない。0.5mlのPBSを加え、該細胞懸濁液をボルテックスした。ついで、該細胞懸濁液を穏やかに混合しながら2mlの70％エタノールを該管の壁面に沿わせて滴下することにより、該細胞を固定した。最低限の固定時間は30分である（この段階で、該細胞懸濁液を染色および分析の前に4℃で約2週間保存することができる）。該細胞を該エタノール上清の除去のために遠心分離し、PBSで1回洗浄し、4℃で5分間再水和させる。該細胞を遠心分離し、該PBSを除去し、該ペレットを0.5mlのヨウ化プロピジウム溶液（Molecular Probes）（PBS中で調製した50μg/ml）に再懸濁した。DNアーゼを含まないRNアーゼ（10mg/ml）（Boehringer Mannheim）の10μlを加え、該細胞懸濁液を37℃で20分間インキュベートした。該サンプルを1mlのPBSで希釈し、1時間以内にFACSにより分析した。
【００４８】
遺伝子増幅
メトトレキセート（MTX）を該増殖培地に徐々に段階的に加えることにより、該細胞における遺伝子増幅を行った。低い3つの濃度（1nM、2.5nMおよび5nM）のメトトレキセート中、100mmプレート内で1:10の比で該細胞を継代培養した。該細胞の増殖をモニターし、最初にコンフルエントに達したプレートを、次のラウンドの増幅に使用した。該細胞が2以上のメトトレキセート濃度において同等に十分に増殖した場合には、最高の濃度を次のラウンドで用いた。48時間の無血清DMEM収穫物（4ml/プレート）を、ウエスタンブロットまたはEIAによるタンパク質発現レベルの分析に採用した。該細胞を、メトトレキセートを含む完全培地内で24時間回収し、ついで1:10の比で3つのより高い濃度のメトトレキセート中に継代培養した。MTXの濃度を10nMの増加量で100nMまで増加させた。一般に、該タンパク質発現レベルが100nMまでにピークに達しない場合には、最大発現レベルに達するまで100nMの増加量で増幅を継続する。最適濃度が決定したら、MTXの存在下で該細胞を維持した。
【００４９】
AM-1/D細胞系の作製
AM-1/D細胞系を、1987年10月27日付け発行の米国特許第4,703,008号およびUrlaubら(1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 77:4461（それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする）に記載のCHOd(-)細胞系から誘導した。VM-SOY培地内での継代（この場合、ウシ胎仔血清のレベルを次第に減少させて、最終的には0にした）により、該CHOd(-)細胞系を順応させた。得られた無血清順応細胞系AM-1は尚もdhfr(-)表現型を保有する。ヒトサイクリンD1を過剰発現するように該AM-1細胞系を操作した。
【００５０】
トランスフェクションのための標準的なリン酸カルシウム沈殿法により、pcDNA3.1/サイクリンD1をAM-1細胞系内にトランスフェクトした。G418での選択に際して、該コロニーをトリプシン処理し、2つのプールに集めた。ヒトサイクリンD1特異的抗体（抗サイクリンD1 Ab-3、Calbiochem）を使用する、該プールから調製された細胞ライセートのウエスタンブロット法（図1）により、ヒトサイクリンD1タンパク質の発現が示された。多数のコロニーをクローニングリングでランダムに拾い、該細胞ライセートを調製し、さらに分析した。予想したとおり、ヒトサイクリンD1の発現は該クローンによって様々であった。該クローンと比較すると、それらの2つのプールは、全体的に高レベルのヒトサイクリンD1タンパク質を示した（図1）。それらの2つのプールをマスタープール培養（AM-1/D）内に集めた（それは、後続のすべての実験で使用した親細胞系であった）。
【００５１】
AM-1/D細胞系内で発現されたヒトサイクリンD1は機能的である
本発明者らは、ヒトサイクリンD1が、細胞周期動力学のその改変により機能的に発現されることを確認した。例えば、図2および後記を参照されたい。
【００５２】
AM-1/DおよびAM-1細胞系由来の非同調細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、FACScan（Becton Dickinson）により分析した。図2A〜2Dは、相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示す。AM-1/D細胞（40.08％、40.14％）では、AM-1細胞（33.73％、32.25％）の場合より有意に多数の細胞がS期に存在した。このことは、CHO細胞系であるAM-1/D内でのヒトサイクリンD1の過剰発現が、細胞周期動力学を有意に改変するほどに機能的であることを示した。
【００５３】
実施例1
発現ベクターpDSRα2でヒトOPG（GenBank受託番号U94332）-Fc融合タンパク質を発現させるために、プラスミドpDSRα2/OPG-Fcを構築した。標準的なリン酸カルシウム沈殿法を用いて、pDSRα2/OPG-Fcの線状化DNAを、AM-1/D細胞および未修飾の元のAM-1細胞内に平行してトランスフェクトした。HT補足物を欠く選択培地内に細胞を2週間配置した後、各トランスフェクションからの44個のコロニーをランダムに拾った。
【００５４】
該コロニーを個々に24ウェルプレート内に移し、コンフルエントになるまで増殖させた。48時間後、無血清馴らし培地を集め、ヒトOPGに特異的な抗血清を使用するEIAにより分析した。図3は、これらの2つの細胞系に由来する種々のレベルのOPG-Fcを発現するクローンの数を示している。より高レベルの該組換えタンパク質を発現するAM-1/D細胞系由来クローンが、有意に、より多数存在すること、および20mg/ml以上のOPG-Fcを発現する最高発現クローンのすべてがAM-1/D細胞系に由来することが明らかである。
【００５５】
実施例2
プラスミドpDSRα2/hEpoを、ヒトEpo遺伝子を発現するように構築し、前記のリン酸カルシウム法に従いAM-1/D細胞内にトランスフェクトした。さらなる分析のために、48個のコロニーをランダムに拾った。該高発現クローンのうちの4個を馴らし培地のEIA分析により同定し、メトトレキセート増幅（1nMから開始した）に付した。図4は、増幅過程中のEPOの発現を示す。それらのクローンのうちの2つ（AM-1/Dクローン2およびAM-1/Dクローン33）は、MTXの濃度の増加と共に上昇するEPO産生を示し、これは、遺伝子増幅が成功したことを示している。これらのクローンを凍結-融解および徹底的な継代に際して試験したところ、Epoの発現の喪失は生じず、これは、これらのクローンにおけるEpo遺伝子発現の安定性を示している。
【００５６】
AM-1/サイクリンD CHO細胞内でのOPGの発現
2つのOPG構築物の発現をAM-1/サイクリンD CHO細胞および他のCHO細胞系において比較した。OPG(22-201)-FcをAM-1/サイクリンD CHO細胞および親CHO細胞系（無血清培地内での増殖に予め順応されているもの）[CHO(SF)]内にトランスフェクトした。OPG(22-194)・cys-FcをAM-1サイクリンD CHO細胞内およびその親AM-1 CHO細胞系内にトランスフェクトした。該トランスフェクションは、標準的なリン酸カルシウム法およびDHFR選択により行った。トランスフェクトされたコロニーを、ガラスクローニングシリンダーを使用して単離した。個々のコロニーをコンフルエントになるまで24ウェルプレート内で増殖させた。無血清馴らし培地収穫物を、OPGに対するポリクローナル抗血清を使用するウエスタンブロット法により分泌OPGに関して分析した。ウエスタンブロット法で最高レベルの発現を示すクローンからの馴らし培地サンプルを、ELISAにより更に分析した。本発明者らは、AM-1 CHO細胞またはAM-1/サイクリンD CHO細胞由来の46個のクローンにおいてOPG(22-194)-cys-Fcの発現レベルを比較した（図5）。本発明者らはまた、ウエスタンブロット法により予め決定された24個の最高発現クローンにおいてOPG(22-201)-Fcの発現を比較した（図6）。それぞれの場合において、AM-1/サイクリンD CHO細胞系由来のクローンは、CHO(SF)またはAM-1 CHO細胞由来のクローンより有意に高いレベルの発現を示している。
【００５７】
無血清培地順応CHO細胞内でのNESPの発現
pDSR・2発現ベクター内に挿入されたNESP DNAを、標準的なリン酸カルシウム法により、3つの異なる無血清順応CHOd細胞系（CHOd(SF)、AM-1およびAM-1/サイクリンD）内にトランスフェクトした。クローンのトランスフェクション、選択および単離は、付着培養内の血清含有培地内で行った。まず、高レベルのNESPを発現するクローンを、EPOに対するモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法により同定した。発現の定量をEIAにより行った。各細胞系由来の最高発現クローンを、無血清培地内の懸濁培養内での増殖に関して試験した。また、付着培養内の血清含有培地内のメトトレキセートの濃度を徐々に増加させながら増殖させることにより、該クローンをDNA増幅に付した。増幅過程中のNESPの発現を、ウエスタンブロットおよびEIA分析によりモニターした。該増幅過程中の種々の段階で、該クローンを無血清懸濁培養内での増殖および発現に関して分析した。AM-1/サイクリンD CHO細胞系由来のクローンは、その他の2つの親CHO細胞系に由来するものより全体的に高レベルのNESP発現を示した（図7）。また、該クローンを等電点電気泳動により分析して、アイソフォームの分布を測定した。それらの種々のクローンにおける又は該親CHO細胞系由来の対照細胞系（61L）におけるアイソフォーム分布の有意な相違は認められなかった。
【００５８】
本明細書の全体にわたり使用されている略語は以下のとおりに定義される。
【００５９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、pcDNA3.1/サイクリンD1でトランスフェクトされヒトサイクリンD1特異的抗体で処理されたAM-1細胞のライセートのウエスタンブロットを示す（「材料および方法」を参照されたい）。このブロットは、AM-1/D細胞内でのヒトサイクリンD1の発現を示している。
【図２Ａ】  図２Ａは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムである。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存在したことを示している。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムである。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存在したことを示している。
【図２Ｃ】  図２Ｃは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムである。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存在したことを示している。
【図２Ｄ】  図２Ｄは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムである。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存在したことを示している。
【図３】  図３は、種々のレベルのOPG-Fcを発現するクローンの数を示すグラフである。前記実施例1に記載のとおりに、AM-1/D細胞をプラスミドpDSRα2/OPG-Fcでトランスフェクトした。このグラフは、最高発現クローンがAM-1/D細胞系に由来することを示している。
【図４】  図４は、増幅に用いたMTXの濃度に対してプロットされたEPOの発現を示すグラフである。前記実施例2に記載のとおりに、AM-1/D細胞をプラスミドpDSRα2/hEPOでトランスフェクトした。それらのうちの2個のクローンが、MTX濃度の上昇につれて上昇するEPO産生を示し、これは、遺伝子増幅が成功したことを示している。
【図５】  図５は、AM-1 CHO細胞またはAM-1/サイクリンD CHO細胞に由来する46個のクローンにおけるOPG(22-194)-cys-Fcの発現レベルの比較を示す。AM-1/サイクリンD CHO細胞系由来のクローンは、AM-1 CHO細胞由来のクローンより有意に高いOPG(22-194)-cys-Fc発現レベルを示している。
【図６】  図６は、ウエスタンブロット法により予め決定された24個の最高発現クローンにおけるOPG(22-201)-Fc発現の比較を示す。それぞれの場合において、AM-1/サイクリンD CHO細胞系由来のクローンは、CHO(SF)細胞由来のクローンより有意に高いOPG(22-201)-Fc発現レベルを示している。
【図７】  図７は、各親CHO細胞系由来の14個の最良クローンにおける、EIAにより測定された平均NESP発現を示す。馴らし培地サンプルを24ウェルプレートから集めた（第2日の収穫物）。サンプルをウエスタンブロット法により予備スクリーニングした。
【図８】  図８は、攪拌培養およびバイオリアクター培養の収穫物のIEFウエスタンブロットを示すものであり、攪拌培養およびバイオリアクター培養からの分泌NESPタンパク質のアイソフォーム分布が比較されている。攪拌収穫物は未増幅クローンからのものである。ローラーボトル馴らし培地から精製された標準NESPタンパク質は、所望の高分子量アイソフォームを示している。該馴らし培地収穫物は、すべてのアイソフォームを含有している。該ブロットは、すべてのサンプルにおける高アイソフォームの存在を示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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