(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０４７７．４９２Ｐａ〜４４０２３．０４４Ｐａの減圧下、ピペリジンまたはプロピオン酸ピペリジニウムおよび過剰のプロピオン酸の存在下、式（ＩＩ）：
0004537499.tif 000007
で示される化合物またはその酸もしくは塩基付加塩を式（ＩＩＩ）：
0004537499.tif 000008
［式中、Ｒ’は、Ｃ1-4アルキルである］
で示される化合物と反応させ、次いで、塩基を用いてＲ’エステルを加水分解し、医薬上許容される塩を形成することを特徴とする式（Ｉ）：
0004537499.tif 000009
で示される化合物、エプロサルタンまたはその医薬上許容される塩の製造方法。
【請求項２】
式（ＩＩ）で示される化合物が
0004537499.tif 000010
である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩がメタンスルホン酸塩である請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
触媒がプロピオン酸ピペリジニウムおよび過剰のプロピオン酸である請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
圧力が３７２５０．２６８Ｐａに減圧されている請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
３０４７７．４９２Ｐａ〜４４０２３．０４４Ｐａの減圧下、ピペリジンまたはプロピオン酸ピペリジニウムおよび過剰のプロピオン酸の存在下、式（ＩＶ）：
0004537499.tif 000011
で示される化合物またはその酸もしくは塩基付加塩を式（ＩＩＩ）：
0004537499.tif 000012
［式中、Ｒ’は、Ｃ1-4アルキルである］
で示される化合物と反応させ、次いで、塩基を用いてＲ’エステルを加水分解し、医薬上許容される塩を形成することを特徴とする式（Ｉ）：
0004537499.tif 000013
で示される化合物、エプロサルタンまたはその医薬上許容される塩の製造方法。
【請求項７】
式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩がメタンスルホン酸塩である請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
圧力が３７２５０．２６８Ｐａに減圧されている請求項６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、エプロサルタン（eprosartan）の製造方法に関する。この化合物は、高血圧症、うっ血性心不全および腎不全の治療に有用なアンギオテンシンII受容体拮抗薬として、米国特許第5,185,351号に記載されている。
発明の背景
米国特許第5,185,351号には、イミダゾール化合物の製造方法が記載されている。この特許明細書に記載されている方法の１つは、アルデヒドと、マロン酸の置換半酸半エステル誘導体との反応である。この方法はその特許請求の範囲に記載されているイミダゾールを生成するが、エプロサルタンのような化合物を商業的規模で製造する場合にはこの方法を改良する必要があった。
４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸または４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物（PCT出願WO 95/32189）を（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルと反応させて、高収率および高純度で効率的にエプロサルタンを生成することによりエプロサルタンが製造できることが判明した。この方法の効率ならびにイミダゾール生成物の質および収率は、治療用として大規模に該生成物を製造する場合に特に重要である。
発明の説明
本発明は、式（Ｉ）：
0004537499.tif 000002
で示される（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸であるエプロサルタンまたはその医薬上許容される塩の製造方法を提供するものである。この方法は、
減圧下、過剰のプロピオン酸中のピペリジンまたはプロピオン酸ピペリジニウムのような触媒の存在下、式（ＩＩ）：
0004537499.tif 000003
で示される化合物またはその酸もしくは塩基付加塩を式（ＩＩＩ）：
0004537499.tif 000004
［式中、Ｒ’は、Ｃ1-4アルキルである］
で示される化合物と反応させ、次いで、Ｒ’エステルを加水分解し、所望により医薬上許容される塩を形成する工程からなる。
別法としては、式（Ｉ）で示される化合物は、減圧下、過剰のプロピオン酸中のピペリジンまたはプロピオン酸ピペリジニウムのような触媒の存在下、式（ＩＶ）：
0004537499.tif 000005
で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物と反応させ、次いで、Ｒ’エステルを加水分解し、所望により、医薬上許容される塩を形成することにより製造できる。
式（Ｉ）および（ＩＩ）で示される化合物の酸付加塩は、当該技術分野で知られている方法により、適当な無機または有機酸を用いて形成する。適当な酸の代表例は、マレイン酸、フマル酸、酢酸、コハク酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸またはメタンスルホン酸である。好ましくは、式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される酸付加塩は、メタンスルホン酸付加塩である。
式（Ｉ）および（ＩＩ）で示される化合物の塩基付加塩は、当該技術分野で知られている方法により、適当な無機または有機塩基を用いて形成する。陽イオン塩は、親化合物を、適当な陽イオンを含むヒドロキシド、カーボネートもしくはアルコキシドのような過剰のアルカリ試薬で、または、適当な有機アミンで処理することにより製造する。陽イオンの代表例は、Ｌｉ+、Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++およびＮＨ4+である。式（ＩＩ）で示される化合物の好ましい塩形態は、
0004537499.tif 000006
である。
本明細書で用いる場合、Ｃ1-4アルキルは、分枝したまたは分枝しない炭素原子１−４個のアルキル基を意味する。Ｃ1-4アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルが挙げられる。好ましいＲ’のＣ1-4アルキル基は、エチルである。
典型的には、当該製造方法は、減圧下、例えば、約９−１３ｉｎＨｇ（水銀柱インチ）、好ましくは１１ｉｎＨｇに減圧した内圧下、適当な温度で、例えば、約７５℃〜約１００℃の温度で、好ましくは、８０℃−８５℃の温度で、触媒の存在下、例えば、プロピオン酸ピペリジニウムおよび過剰のプロピオン酸の存在下、トルエンのような適当な溶媒中、４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸または４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物を（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルと化合させることにより行う。式（Ｉ）で示される化合物のエステル前駆体を水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム水溶液のような塩基を用いて対応する式（Ｉ）で示されるカルボン酸に加水分解する。次いで、医薬上許容される塩を上記に従って製造してもよい。
別法としては、４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸または４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物および（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルを、減圧下、触媒としてピペリジンの存在下、トルエン中で還流させながら加熱して反応させ、得られた中間体エチルエステル（（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸エチル）を加水分解して、（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸を得る。この製造方法において、４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸または４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物、（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルおよびトルエンをガラス内張スチール容器に入れ、まず、５５−６０℃に加熱して均質溶液を得る。触媒（ピペリジン６６モル％）を添加し、減圧下、反応を加熱還流（７０−７５℃）する。該還流条件を２０−３５時間維持し、（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルをさらに添加する。反応が完了した後、該容器に水および水酸化ナトリウム水溶液を添加し、反応混合物を、大気条件下、１−３時間、還流させながら加熱する。反応は、（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸エチルのレベルが２．０％未満になった場合に完了したとみなす。反応を４５−５０℃に冷却し、水性相および有機相を分離する。トルエン相を廃棄する。水性相にエタノールを添加し、温度を５０−５５℃に維持しつつ、溶液を塩酸水溶液で、ｐＨが５．０〜５．４になるまで酸性化する。生成物スラリーを冷却し、１０−１５℃で２時間攪拌する。生成物を遠心分離により単離し、洗浄し、貯蔵する。次いで、医薬上許容される塩を上記に従って製造してもよい。
ピペリジンで触媒した、４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸または４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物および（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルの反応は、トルエン以外の溶媒（および／または溶媒系）中でも成功裏に行うことができる；これらの溶媒としては、シクロヘキサン、シクロヘキサン：ジクロロエタン（１２：５または１：１）、シクロヘキサン：ピリジン（１２：５）およびシクロヘキサン：酢酸エチル：ピリジン（８：３：１）が挙げられる。
ピペリジンのほかに、減圧下、トルエン中での４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸または４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物および（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルの反応を成功裏に促進させる他の触媒としては、モルホリン、１−メチルピペラジンおよびピロリジンが挙げられる。
本発明を以下の実施例により説明する。該実施例は、上記した、かつ、下記請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１
（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）−メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸（エプロサルタン）の製造
試薬および溶媒
１．４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物  １２．０３ｋｇ  ２８．８２モル
（４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸  ６８．５７％）
２．（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステル  １５．２９ｋｇ
（８０．９％ｗ／ｗアッセイ）  ５４．１８モル
３．ピペリジン  ２．８５リットル  ２８．８２モル
４．プロピオン酸  ８．６０リットル  １１５．２８モル
５．トルエン  ５６．５リットル＋１９．０リットル＝７５．５リットル（合計）
６．水酸化ナトリウム  １６．７ｋｇ（５０％水溶液）  ２０８．７５モル
７．水  ６５．０リットル
８．エタノール  ４１．２ｋｇ
９．６Ｎ ＨＣｌ  ｐＨ５．０〜５．２に調節
１０．水  ７５．０リットル
製造方法
１．反応器にトルエン（５６．６リットル）を入れた。
２．該反応器に（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステル（１５．２９ｋｇ、８０．９％ｗ／ｗアッセイ）および４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の亜硫酸塩付加化合物（１２．０３ｋｇ、４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸６８．５７％）を入れ、攪拌し始めた。内圧を１１ｉｎＨｇに減圧し、１−２時間、加熱還流した（反応の内部温度を８０−８５℃に維持した）。ジャケット温度を１１０℃に設定した。ディーン−スタークトラップに水を回収した。
３．第二反応器にトルエン（１９．０リットル）、次いで、プロピオン酸（６．４５リットル、８６．４６モル）を入れた。室温で、得られた溶液をピペリジン（２．８５リットル、２８．８２モル）でゆっくりと処理した。得られた混合物を約３０分間攪拌した。
４．第一反応器を窒素で換気し、ジャケット温度を８０℃に下げた。第二反応器から第一反応器にトルエン中プロピオン酸ピペリジニウム−プロピオン酸溶液を移した。内圧を１１ｉｎＨｇに減圧し、加熱還流した（反応の内部温度を８０−８５℃に維持した）。ジャケット温度を１４０℃に設定した。ディーン−スタークトラップに水を回収した。
５．７．５時間後、溶液中に残ったアルデヒド（４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸）の量は約２０％であり、（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステルの残存量は約２０％であった。８．５時間目に、（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステル（１．５３ｋｇ、５．４２モル）をさらに添加した。
６．１３．５時間後、反応が完了し、反応を７０℃に冷却した（アルデヒドの残存量は、約５％であった）。水（６５．０リットル）および水酸化ナトリウム（１６．７ｋｇ；５０％ｗ／ｗ水溶液）を添加し、反応を還流させた。
７．反応を１時間還流させた。反応を、（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸エチルの存在についてアッセイした。少しでも存在する場合には、さらに１時間還流した。アッセイを繰り返した。
８．溶液を６０℃に冷却した。層を分離し、水層にエタノール（４１．２ｋｇ）を添加した。６Ｎ ＨＣｌで溶液のｐＨを５．２にゆっくりと調節した（温度６０℃）。生成物は、結晶化し始める（温度６０℃）。室温に冷却し、２時間攪拌した。生成物を濾過し、水３７．５リットルで２回洗浄した。
７．固体を真空乾燥した（９．４４ｋｇ、７７．２％）。
分析データ
ＨＰＬＣ
カラム  ゾルバックス（Ｚorbax）ＳＢ−Ｃ１８、３．５ｍｍ、７．５ｃｍ×４．６ｍｍ
カラム温度  ４０℃
流速  ２．０ｍＬ／分
試料調製  反応８ｍＬに窒素流を吹き込み、次いで、アセトニル：水（５０：５０）２ｍＬに溶解する。
注入体積  ２．０ｍＬ
検出波長  ２３５ｎｍ
移動相Ａ  ０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ＝６．７）
移動相Ｂ  ０．１Ｍ酢酸アンモニウム：アセトニトリル（５０：５０）
勾配プログラム  直線勾配で移動相Ａ１００％から移動相Ｂ１００％までで０から１０分まで、移動層Ｂ１００％で５分間、次いで、移動相Ａ１００％で５分間再平衡させる。
操作時間  １５分間
平衡化時間  ５分間
保持時間  ４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸  ４．８１分
（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸  ４．５８分
（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステル  ４．１３分
（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸エチル  ８．４３分
実施例２
（Ｅ）−α−［［２−ブチル−１−［（４−カルボキシフェニル）メチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチレン］−２−チオフェンプロパン酸（エプロサルタン）の製造
ガラス内張スチール反応容器に４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸、（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステル（アッセイした４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸に対して約１．９モル当量）およびトルエン（アッセイした４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸のグラム当たり約６．３ｇ）を入れ、５５−６０℃に加熱した。ピペリジン（４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸に対して約６６モル％）を添加する。次いで、内部温度を７０−７５℃に維持するように減圧下で水を共沸除去しつつ反応を加熱還流する。ＩＰＣ １により出発４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の消失について反応をモニターする。１２−３０時間後に出発４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の＞１０％が残存している場合、（２−チエニルメチル）プロパン二酸モノエチルエステル（４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸に対して添加につき０．１０当量）をさらに添加し、反応を続ける。ＩＰＣ １分析が、出発４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸の反応が実質的に完了したこと（＜１０％残存）を示した場合、溶液を約６０−６５℃に冷却する。冷却した溶液を脱イオン水（アッセイした４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸のグラム当たり６．８ｇ）および６．７Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（アッセイした４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸のグラム当たり溶液約２．０ｍｌ）で処理し、該混合物を約１．０−３．５時間還流させながら加熱する。ＩＰＣ ２により反応をアッセイして、生成物への完全な変換（＜２．０％）を確認する。次いで、該溶液を約５０℃に冷却し、層を分離する。水性相にエチルアルコール（アッセイした４−［（２−ｎ−ブチル−５−ホルミル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル］安息香酸のグラム当たり約５．０ｇ）を添加し、６Ｎ塩酸水溶液でｐＨを約５．０−５．４に調節する。得られた懸濁液を約１０−１５℃で約２時間攪拌して、沈殿を完了させた。遠心分離により生成物を単離し、水で２回洗浄し、湿ケーキをそのまま次工程に用いる。この段階での生成物の補正した単離収率は、典型的には約７０−８５％である。標準試料に対するＨＰＬＣによるｗ／ｗベースでの生成物の乾燥試料のアッセイは、典型的には、相対純度約９７−９９％を示す。
分析データ
ＩＰＣ １
ＨＰＬＣ（勾配）
装置：以下の装置またはその等価物を使用できる：
計器  ヒューレット・パッカード（Ｈewlett Ｐackard）、モデル（Ｍodel）１０５０
ポンプ装置  ターナリー（Ｔernary）、低圧混合勾配ポンプ、ＨＰ １０５０
インジェクター  オートサンプラー（Ａutosampler）、ＨＰ １０５０シリーズ（Ｓeries）
検出器  ＵＶ、可変波長、ＨＰ １０５０シリーズ
条件：
カラム  ゾルバックス ＳＢ−Ｃ１８、７．５ｃｍ×４．６ｍｍ、粒度３．５ミクロン、ロックランド・テクノロジズ・インコーポレイテッド（Ｒockland Ｔechnologies, Ｉnc.）製造
アメリカ合衆国販売元：エムエイシー−エムオーディ・アナリティカル・インコーポレイテッド（ＭＡＣ−ＭＯＤ Ａnalytical, Ｉnc.）
希釈溶媒  アセトニトリル：ＨＰＬＣ用水（１：５）
溶離液（有機）：ＨＰＬＣ用アセトニトリル
（水性）：０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ＝６．７）
移動相調製  移動相Ａ＝０．１Ｍ酢酸アンモニウム
移動相Ｂ＝０．１Ｍ酢酸アンモニウム：アセトニトリル（５０：５０）
検出波長  ２３５ｎｍ、０．１ＡＵＦＳ
流速  ２．０ｍｌ／分
温度  ４０℃
注入体積  ２０マイクロリットル
分析時間  ２０分間
再平衡化時間  ６分間
試料調製  反応混合物約３０ｍｇ（２滴）を２５ｍｌのメスフラスコに計り取り、窒素流下で乾燥させる。次いで、メスフラスコに希釈溶液を所定の容積に充填する。試料を１０分間超音波処理し、室温に冷却する。
勾配プログラム  １）初期溶媒組成物−移動相Ｂ０％
２）１０分で移動相Ｂ０％から１００％までの直線勾配
３）５分間、移動相Ｂ１００％で保持
４）５分で移動相Ｂ１００％から０％までの直線勾配
５）６分間、移動相Ｂ０％で再平衡化
ＩＰＣ ２
ＨＰＬＣ（勾配）
装置：以下の装置またはその等価物を使用できる：
計器  ヒューレット・パッカード、モデル１０５０
ポンプ装置  ターナリー、低圧混合勾配ポンプ、ＨＰ １０５０
インジェクター  オートサンプラー、ＨＰ １０５０シリーズ
検出器  ＵＶ、可変波長、ＨＰ １０５０シリーズ
条件：
カラム  スフェリソルブ（Ｓpherisorb）ＳＣＸ、５ｕｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ
希釈溶媒  アセトニトリル：ＨＰＬＣ用水（１：５）
溶離液（有機）：ＨＰＬＣ用アセトニトリル
（水性緩衝液Ａ）：リン酸でｐＨ２．５に調節した水１０００ｍＬに溶解したリン酸二水素アンモニウム１１．５ｇ
移動相調製  移動相Ａ＝緩衝液Ａ ２００ｍＬ、水７００ｍＬ、アセトニトリル１００ｍＬ
移動相Ｂ＝緩衝液Ａ ２００ｍＬ、水４５０ｍＬ、アセトニトリル３５０ｍＬ
検出波長  ２３５ｎｍ
流速  ２．０ｍｌ／分
温度  ６０℃
注入体積  １０マイクロリットル
分析時間  ２０分間
再平衡化時間  ５分間
試料調製  ＩＰＣ試料２０ｍＬを５０ｍＬのビーカーに移す。溶液が均質になるまで、攪拌し、必要に応じて、メタノール（１〜２ｍＬ）を添加する。パストゥールピペット（Ｐasteur-pipet）を用いて、ＩＰＣ試料４滴（５０ｕＬ）を２５ｍＬのメスフラスコに移す。移動相Ｂ ２０ｍＬで希釈し、１分間超音波処理する。
勾配プログラム  １）０から３分までの溶媒組成物：移動相Ｂ０％
２）１分で移動相Ｂ０％から１００％までの直線勾配
３）１６分間、移動相Ｂ１００％で保持
４）５分で移動相Ｂ１００％から０％までの直線勾配
５）５分間、移動相Ｂ０％で再平衡化。
本発明は、上記具体例に限定されるものではなく、上記具体例および下記請求の範囲内に含まれる全ての変更を包含するものと解すべきである。