(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白癬菌が感染したモルモット体部皮膚に、無機塩水溶液、低級アルコール及び多価アルコールから選ばれる成分を塗布し、その後のモルモットの掻き行動を測定することを特徴とする白癬菌感染由来の痒み評価方法。
【請求項２】
白癬菌が感染したモルモット体部皮膚に、被験薬物並びに無機塩水溶液、低級アルコール及び多価アルコールから選ばれる成分を塗布し、その後のモルモットの掻き行動を特定することを特徴とする、白癬菌感染由来の痒みに対する鎮痒効果を有する薬物のスクリーニング方法。
【請求項３】
白癬菌がトリコフィトン  メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）、ミクロスポルム  カニス（Microsporum canis）、トリコフィトン  ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン  バルコサム（Trichophyton verrucosum）、トリコフィトン  エキナム（Trichophyton equinum）及びエピデルモフィトン  フロコサム（Epidermophyton floccosum）から選ばれるものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
塗布する成分が、生理食塩水、エタノール及びポリエチレングリコールから選ばれる成分である請求項第１〜３のいずれか１項載の方法。
【請求項５】
体部皮膚が背部皮膚である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
掻き行動の測定が、頭部および後脚のストローク数の計測である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト白癬菌感染由来の痒みの評価方法及び鎮痒効果を有する薬物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
汗疱状白癬（水虫）の痒みを抑制するために、市販の水虫治療薬には鎮痒剤として、クロタミトン（CRT）や塩酸ジフェンヒドラミン（DPH）が配合されているが、これらは水虫の痒みに最適な鎮痒剤とは言い難い。その理由はこれらの鎮痒剤が、水虫に特定した痒みの治療薬として開発されていないことから、水虫患者に投与しても長時間の痒み抑制効果が得られず、鎮痒薬を頻繁に投与しなければならないのが現状である。
【０００３】
倉石らはマウスの背部に痒みを起こさせる起痒物質であるコンパンド４８／８０（Compound 48/80）およびサブスタンスＰ（substance  Ｐ）を皮膚に投与して起こるマウスの掻き行動をもとに痒みを評価している（ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー(European Journal of Pharmacology) 第２７５巻（１９９５）２２９−２３３頁）。その他、痒みを引き起こす起痒物質も多数報告されているが、未だそのほとんどが機序も明らかではない。ステロイド剤であるプレドニゾロンはアレルギー反応とマウスの引っ掻き行動を抑制するが、コンパンド４８／８０による引っ掻き行動を抑制しないことも知られている。
【０００４】
このように痒みの本体は複雑であり、また痒感はあくまで自覚的なものであるため、客観的な評価が難しい。痒みの原因は多様であり、水虫の痒みがどの実験モデルにより評価可能なのかについては未だ明らかにはされておらず、したがって、これらの動物による評価モデルもなく、そのため鎮痒効果を有する薬物の探索評価系も確立されていない状況である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、白癬菌感染由来の痒み評価方法及び鎮痒効果を有する薬物のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、水虫の原因菌である白癬菌が起こす痒みを評価するモデルとして、抗真菌剤の抗菌活性を評価するモデルとして古くから用いられているモルモット白癬菌感染モデル（以下、「モルモット白癬菌感染モデル」と称する）の掻き行動を計測したところ、白癬菌の感染に由来する痒みに対する掻き行動を行うことが判明した。しかしながら、その掻き行動は個体差が大きく、安定した評価ができなかった。そこで、白癬菌の感染部位に、それ自体起痒効果を有さない無機塩水溶液、アルコール類などを塗布すれば、全く意外にも掻き行動が顕著に増幅され、痒み評価実験系の信頼性が向上し、評価時間が著しく短縮されること、さらにこの実験系に被験薬物の投与を組み合せれば鎮痒効果を有する薬物のスクリーニングが定量的にできることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、白癬菌が感染したモルモット体部皮膚に、無機塩水溶液、低級アルコール及び多価アルコールから選ばれる成分を塗布し、その後のモルモットの掻き行動を測定することを特徴とする白癬菌感染由来の痒み評価方法を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、白癬菌が感染したモルモット体部皮膚に、被験薬物並びに無機塩水溶液、低級アルコール及び多価アルコールから選ばれる成分を塗布し、その後のモルモットの掻き行動を特定することを特徴とする、白癬菌感染由来の痒みに対する鎮痒効果を有する薬物のスクリーニング方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
「モルモット白癬菌感染モデル」は抗真菌作用を評価する実験動物モデルとして公知であり、広く用いられているが、痒みの評価系モデルとしては未だ使われたことはない（真菌誌  第３８巻第１号３３〜３７頁）。本モデルはモルモット又はヘアレスモルモットの背部皮膚又は脚部に好獣性の白癬菌を感染させたものであり、抗真菌活性を観察するのが目的で広く利用されている。この評価系は抗真菌作用を観察するのが目的であるため、被験動物が薬物をなめたり、患部を損傷するなど、薬剤の評価を阻害する要因を排除するために、患部をガーゼで固定したり、なめることを抑制する目的で、モルモットは首にネックレス（襟巻き）等の拘束具を装着したりしていたため、痒みに関する評価には用いられていなかった。
【００１０】
「モルモット白癬菌感染モデル」は公知のモデル動物であり、各種文献に記載された方法により作製可能である (アンチミクロバイアル  エージェンツ  アンド  ケモセラピー(Antimicrob. Agents Chemother.),第４２巻, ９６７−９７０頁,１９９７）。より具体的には、以下の方法によって作製できる。
【００１１】
モルモット体部の皮膚角質部分の体毛をバリカン、剃刀、脱毛ワックス等により刈毛し、抜毛したモルモットの角層部分を紙ヤスリ等で擦るか、乱切して軽微な外傷をおこすか、あるいは、ガムテープやセロファンテープを貼り付けて勢いよく剥がす操作により角層を剥離した後に、ガーゼをあらかじめ培養しておいた白癬菌の胞子液に浸し、感染部位にガーゼを貼着し、その上から絆創膏又は包帯で完全に覆い、３〜７日間密着させて、感染させる。感染部位は背部、腹部、脚部等いずれでも可能であるが、痒み評価実験には背部がもっとも好ましい。
【００１２】
使用する白癬菌としてはトリコフィトン  メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）、ミクロスポルム  カニス（Microsporum canis）、トリコフィトン  ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン  バルコサム（Trichophyton verrucosum）、トリコフィトン  エキナム（Trichophyton equinum）及びエピデルモフィトン  フロコサム（Epidermophyton floccosum）が利用できる。ヒトの白癬の病原菌は必ずしも動物に対して病原性を持つわけでなく、ヒトの白癬の病原菌として最も多く分離されるトリコフィトン  ルブルム（Trichophyton rubrum）は好ヒト性で動物に対する病原性がほとんどの株で弱く、安定した病変を得ることが困難であるため、あまり好ましくなく、ヒトの白癬の病原菌としてトリコフィトン  ルブルムに次いで多く分離される好獣性の白癬菌でもあるトリコフィトン  メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）あるいはミクロスポルム  カニス（Microsporum canis）が被験動物に対して再現性良く感染をおこすため、特に好ましい。
【００１３】
本発明に用いられるモルモットとしては公知の「モルモット白癬菌感染モデル」として使用できるモルモットであればよく、すなわち、ハートレー系モルモットまたはヘアレスモルモットが好ましい。これらは日本チャールズ・リバー株式会社等から供給されており、容易に入手可能である。雌雄はいずれでもよく、雄性が一般的に使用される。体重は適切な週齢（４〜６週齢）や扱い易さの点から、通常３００―３５０ｇのものを使用する。これらモルモットは通常の環境で飼育したものでよく、通常、２３±１℃、湿度５０％で飼育したものを、入荷後１週間の検疫期間を経てから実験終了まで、１ケージ１匹の単独飼育で行う。
【００１４】
このようにして作製した「モルモット白癬菌感染モデル」は白癬菌による感染が進むにつれ、痒みが発現し、痒みを回避するため、患部を引っ掻く等の掻き行動を示す。しかしながら、その掻き行動は、散発的であり、個体差が大きく、評価に耐えるデータの集積には観察時間も長時間必要であるため、定量的な評価、スクリーニング方法としては利用できない。これに対し、感染部位に無機塩水溶液、低級アルコール及び／又は多価アルコールを塗布すれば、掻き行動回数が数十倍増加し、個体間のバラツキが著しく減少することから、短時間の観察で有意差検定においても信頼性の高い評価ができる。これらの塗布成分は、従来公知の起痒物質とは異なり、それ自体を正常動物に塗布しても掻き行動をおこさせる作用を有さない。
【００１５】
ここで、無機塩水溶液としては、生体に存在する成分である弱酸性、中性、弱アルカリ性の無機塩類の水溶液、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類ハロゲン化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸水素ナトリウム水溶液およびこれらの１種以上の混合水溶液が好ましく、生体と等張な濃度で用いるのが好ましい。生理食塩水、リンゲル液が作製・入手が容易であり特に好ましい。
【００１６】
低級アルコールとしてはメタノール、エタノール等の炭素数１〜４のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。また多価アルコールとしてはグリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等が好ましい。このうち、平均分子量２００〜１０００のポリエチレングリコールが特に好ましい。また、低級アルコールと多価アルコールは、併用するのがより好ましい。
【００１７】
これらの成分の塗布量は１〜４mL程度で十分であり、滴下して、軽くぬり拡げるか、または綿にたっぷりしみこませて塗布するのが好ましい。
【００１８】
被験薬物のスクリーニングにあたっては、前記成分の塗布の直前、同時又は直後に被験薬物を感染部位に塗布するが、同時投与（塗布）が好ましい。同時投与するには、被験薬物が水溶性の場合には生理食塩水に溶解して塗布するのが好ましく、被験薬物が難水溶性又は非水溶性の場合には低級アルコール及び／又は多価アルコールに溶解して塗布するのが好ましい。
【００１９】
前記成分塗布直後から掻き行動を示すので、当該掻き行動を測定する。掻き行動には２通りあり、１つは切歯で感染部位を噛む、または歯をこすりつけることによって、痒みを解消する頭部スクロールである。そしてもう一つの行動は後脚ストロークによる掻き行動である。これら２通りの掻き行動のうち、本発明のモデル動物では、切歯による行動が測定回数の９０％以上を占めている。
【００２０】
前記成分の塗布後１０分間以内が掻き行動のピークであり、約１時間程度で、無塗布群と変わらない程度の時折突発的な掻き行動をするレベルに落ち着くため、前記成分を塗布後最大６０分、より好ましくは１０分間程度掻き行動回数をカウントすればよい。
【００２１】
モルモットはヒトの存在に非常に敏感で、モルモットから見えるところで観察すると、掻き行動を含むすべての行動を開始せず、評価結果に影響を与えるので、ビデオカメラ等で記録し、実験終了後、再生によって掻き行動を計測することが好ましい。
【００２２】
なお、本発明のモデル動物は、痒みの回避行動である、掻き行動の回数を測定することにより痒みを評価するので、掻き行動を抑制する、前記拘束具等は使用せず、モルモットが自由に行動できるようにしておく。
【００２３】
痒みの評価は、それぞれの動物が、被験薬物塗布以前には、白癬菌感染により潜在的に同等の痒みを保持していることを基本として成り立っており、これらに被験薬物を塗布した塗布群とそうでない無塗布群にランダムに分け、一定時間にそれぞれの群で観察された２つの掻き行動回数を総計して、その掻き行動回数の差を算出し、有意差検定を実施することで、痒みの度合いの違いを指標に評価できる。
【００２４】
【実施例】
以下、参考例及び実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２５】
参考例１（モルモット白癬菌感染モデルの作製）
＜感染菌液の調整＞
２５℃で７日間、トリコフィトン  メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）をポテト  デキストロース  カンテン(ＰＤＡ)培地（真菌増殖用培地）で培養することにより胞子を形成させた。この胞子を１％ツイーン８０含有滅菌生理食塩水中に浮遊させて、白血球計算盤を用いて顕微鏡で計測することにより、目標の胞子数である約１０7cells/mLになるように、同液で希釈することなどにより合わせ、感染菌液とした。
【００２６】
＜モルモットの感染＞
感染方法はNiwanoらの報告を改変して実施した (アンチミクロバイアル  エージェンツ  アンド  ケモセラピー（Antimicrob. Agents Chemother.),第４２巻,９６７−９７０頁,１９９７）。
麻酔下（ネンブタール、ダイナボット株式会社製、２０ｍｇ/ｋｇ、腹腔内投与）のモルモット背部毛をバリカンで刈り、さらに市販の除毛剤（製品名：フェザー除毛フォーム、＃ＨＲ−１５０）で除毛した。体部に付着した除毛剤を７０％エタノールまたは滅菌生理食塩水を浸した紙タオルで拭い取り、その後乾いた紙タオルで水分を取り、乾燥させた。次にサンドペーパー（＃２４０）を用いて背部角質部分を出血しないように浅く傷つけ、この部分を７０％エタノールで消毒し、自然乾燥させた。
【００２７】
約１０7cells/mLに調製したトリコフィトン  メンタグロファイテス（T. mentagrophytes）胞子液を、ガーゼ長35mm x幅 250mmを１／３〜１／５長に切断した救急絆創膏（ビッグバンＧ、ニチバン株式会社製）のガーゼ部分に、十分吸い込む量（通常、１／３長で２mL）浸し、処理した背部に貼付し、さらにその上から包帯型絆創膏（エラストポア、ニチバン株式会社製[50mm幅のロール状[長さ５ｍ]粘着型包帯]）でビッグバンＧ貼付部分を完全に覆い、感染部に胞子液を長時間密着させることにより感染させ、そのまま３〜７日間放置させた後に絆創膏を除去し、その３〜５日後に実験に供した。
【００２８】
また非感染群は胞子液の代わりに滅菌生理食塩水を用いて、同様の塗布を行い、実験に供した。  感染の成立は、感染部位の炎症度合いの観察と、感染部位の皮膚を手術用ハサミで剥離し、約１０個の切片におよそ均等に分け、ＰＤＡ培地（100μg/mL塩酸テトラサイクリン含有）で作製したシャーレ平板培地表面上に剥離皮膚切片の皮膚表面を上向きにして密着するように配置し、２５℃で７日間培養後にトリコフィトン  メンタグロファイテス(T. mentagrophytes)が増殖した切片数と試験した総切片数の比率から確認した。
【００２９】
参考例２
包帯絆創膏を５日目に除去した参考例１のモルモット３匹を用い、実験開始後１０分間の掻き回数を測定した。測定は各動物をデジタルビデオカメラで撮影し、実験終了後、映像を観察することにより掻き行動をカウントした。掻き行動は切歯で感染部位を噛む、または歯をこすりつけることによって、痒みを解消する頭部スクロール及び後脚ストロークによる掻き行動をそれぞれ１回としてカウントした。
【００３０】
【表１】
0004452417.tif 000002
【００３１】
結果：
２匹にそれぞれ２回及び７回の頭部スクロールを計測した。
以上の結果から、１０分程度の短い時間では掻き行動回数も少なく、又データのバラツキも大きいことがわかった。
【００３２】
実施例１
包帯絆創膏を５日目に除去した参考例１のモルモット６匹を無作為に２群（各Ｎ＝３）に分けて、１群には生理食塩水２ｍｌを塗布し、もう１群には生理食塩水に塩酸ジフェンヒドラミンを溶解させ１％（ｗ／ｖ）とした溶液２ｍｌを塗布した。塗布１０分後までの掻き行動回数を参考例１と同様にビデオカメラにて撮影し、実験終了後、映像を観察することにより掻き行動をカウントした。
【００３３】
【表２】
0004452417.tif 000003
【００３４】
生理食塩水塗布群では、無処置群の掻き行動回数（表２）と比較して、約１６０倍に掻き行動回数が増加した。この時の1% DPH塗布群の平均掻き行動回数は、３５．３回であり、ＤＰＨが痒みを抑制していることを示している。
【００３５】
以上の結果から、上記白癬菌感染モルモットモデルは、感染によって潜在的に保持している痒みが、生理食塩水を塗布することにより、劇的に惹起されることが明らかとなった。
【００３６】
実施例２
包帯絆創膏を５日目に除去した参考例１のモルモット１５匹を無作為に下記４群（１群３〜４匹）に分け実施例１と同様に各成分塗布後、１０分間の掻き行動回数をカウントした。有意差検定はすべてStudentのt-検定（等分散を仮定した２標本による検定）で計算し、P(T<=t)両値を採用した。
【００３７】
１．無処置群
２．陽性対照群
（無水エタノール-ポリエチレングリコール４００［３０：７０（ｖ／ｖ）］混液を塗布）
３．５％ＣＲＴ塗布群
（無水エタノール-ポリエチレングリコール４００［３０：７０（ｖ／ｖ）］混液にクロタミトン（ＣＲＴ）を臨床投与量である５％（ｖ／ｖ）溶解した液を２ｍｌ塗布）
４．１％ＤＰＨ塗布群
（無水エタノール-ポリエチレングリコール４００［３０：７０（ｖ／ｖ）］混液に塩酸ジフェンヒドラミン（ＤＰＨ）を臨床投与量である１％（ｗ／ｖ）溶解させた液を２ｍｌ塗布）
【００３８】
結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
0004452417.tif 000004
【００４０】
陽性対照群
無処置群との有意差検定結果：ｐ＜０．０５で有意差有り
５％ＣＲＴ塗布群
無処置群との有意差検定結果：ｐ＝０．５０で有意差無し
陽性対照群との有意差検定結果：ｐ＜０．０５で有意差有り
１％ＤＰＨ塗布群
無処置群との有意差検定結果：ｐ＝０．４７で有意差無し
陽性対照群との有意差検定結果：ｐ＜０．０５で有意差あり
【００４１】
陽性対照群である無水エタノール-ポリエチレングリコール４００［３０：７０（ｖ／ｖ）］混液投与群が無処置群に対し３０倍掻き行動回数を増加させた。ＣＲＴおよびＤＰＨは共に塗布直後から鎮痒作用が発現し、陽性対照群と比較して約１２％まで掻き行動回数を抑制し、有意な差のある結果であった。しかしながら、無処置群との比較では、掻き行動回数において有意な差は認められなかった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の、白癬菌感染由来の痒み測定動物実験モデルを使用することにより、現在市販されている水虫治療薬よりも優れた鎮痒効果（症状の改善）を有する薬物を開発する際に、ヒトの痒みと同一と考えられる試験系で、短期間で数多くの薬物の薬効評価試験を実施することが可能となった。