(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを組み込んで得られる組み換え体ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載の組み換え体ＤＮＡを保持する微生物。
【請求項４】
請求項３に記載の微生物をインドールの存在下に培養することにより、７−ヒドロキシインドールを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする７−ヒドロキシインドールの製造方法。
【請求項５】
前記微生物がエッシェリヒア属に属する微生物である請求項４に記載の７−ヒドロキシインドールの製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡを保持し、インドールの７位を水酸化する酵素を産生する微生物をインドールの存在下に培養することにより、７−ヒドロキシインドールを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする７−ヒドロキシインドールの製造方法。
【請求項７】
前記微生物がキサントモナス属に属する微生物である請求項６に記載の７−ヒドロキシインドールの製造方法。
【請求項８】
前記微生物がキサントモナス・マルトヒィリア  Ｍｅｒ−Ｈ１０８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３５９）である請求項６に記載の７−ヒドロキシインドールの製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡを保持し、インドールの７位を水酸化する酵素を産生する微生物をインドールおよびＬ−セリンの存在下に培養することにより、７−ヒドロキシトリプトファンを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする７−ヒドロキシトリプトファンの製造方法。
【請求項１０】
前記微生物がキサントモナス属に属する微生物である請求項９に記載の７−ヒドロキシトリプトファンの製造方法。
【請求項１１】
前記微生物がキサントモナス・マルトヒィリア  Ｍｅｒ−Ｈ１０８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３５９）である請求項９に記載の７−ヒドロキシトリプトファンの製造方法。
【請求項１２】
キサントモナス・マルトヒィリア  Ｍｅｒ−Ｈ１０８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３５９）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インドールの７位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチド、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを組み込んで得られる組み換え体ＤＮＡ、前記組み換え体ＤＮＡを保持する微生物、インドールの７位を水酸化する酵素を産生する微生物または前記組み換え体ＤＮＡを保持する微生物を用いた医薬、染料及び試薬の原料として有用な７−ヒドロキシインドール及び７−ヒドロキシトリプトファンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、７−ヒドロキシインドールは合成法によって製造されているが、数工程を要し製造コストがかかっている。また、微生物変換法による製造方法としては３−ヒドロキシ−２−アミノ−安息香酸を遺伝子操作した大腸菌に添加してトリプトファン−アントラニル酸サイクルを用いて製造する方法（WO 9534657）が知られているが、インドールの７位を微生物あるいは酵素を用いて水酸化することによる製造法は知られていない。一方、７−ヒドロキシトリプトファンの製造法としては合成法の他に微生物変換法として、先に述べた微生物変換法の他に合成法によって製造された７−ヒドロキシインドールを微生物によって７−ヒドロキシトリプトファンに変換する方法（特開昭49-20392）が知られているが、微生物を用いてインドールから７−ヒドロキシトリプトファンを直接製造する方法は知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、医薬、染料及び試薬の原料として重要視されている７−ヒドロキシインドールおよび７−ヒドロキシトリプトファンを安価に製造するために、インドールの７位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチド群およびそれらポリペプチドをコードする遺伝子を提供すると共に、その遺伝子を保持する微生物を用いた７−ヒドロキシインドールおよび７−ヒドロキシトリプトファンの製造法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題に鑑みて、インドールの７位を水酸化する微生物の探索を行ない、土壌から分離されたキサントモナス属に属する微生物が培地に添加したインドールの７位を水酸化して７−ヒドロキシインドールを生産する能力を有していることを発見し、さらに７−ヒドロキシトリプトファンをも生産することを発見した。次に、本発明者らは該微生物からインドールの７位の水酸化に関与する遺伝子のクローニングを試み、その遺伝子群のクローニングに成功し本発明を完成するに至った。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドとしては、インドールの７位を水酸化する活性を有するポリペプチドであればいずれも用いることができ、例えば、配列番号１で示される塩基配列中、(1)2602番目から2796番目の配列を有するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、(2)2825番目から3829番目の配列を有するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、(3)3847番目から4116番目の配列を有するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、(4)4145番目から5704番目の配列を有するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、(5)5740番目から6099番目の配列を有するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、(6)6126番目から7181番目の配列を有するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、(7)7190番目から7528番目の配列を有するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは(1)〜(7)で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド群のアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつインドールの７位を水酸化する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
【０００６】
本発明には(1)前記配列番号１で示されるＤＮＡおよびそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡのほか、前記配列番号１で示される塩基配列中、(2)2602番目から2796番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、(3)2825番目から3829番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、(4)3847番目から4116番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、(5)4145番目から5704番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、(6)5740番目から6099番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、(7)6126番目から7181番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、(8)7190番目から7528番目の配列を有するＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、(9)配列番号２で示されるＤＮＡまたはそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。
【０００７】
また本発明には、前記(1)〜(9)のＤＮＡの少なくとも１種、および２種以上８種までのＤＮＡの任意の組み合わせを組み込んで得られる組み換え体ＤＮＡ、前記組み換え体ＤＮＡを保持する微生物、および前記(1)〜(7）の少なくとも１種、２種〜７種の任意の組み合わせ、およびこれらの全てを含むポリペプチド（ポリペプチド群）を発現させるための条件下で前記の微生物を培養し、その培養液もしくは培養液から分離した細胞を含む液にインドールもしくはインドールの誘導体を添加して反応させることによって、７−ヒドロキシインドールもしくは７−ヒドロキシトリプトファンを生産蓄積せしめ、これらを採取することを特徴とする７−ヒドロキシインドールまたは７−ヒドロキシトリプトファンの製造方法が含まれる。
【０００８】
本発明を実施するに当たって好適な微生物としては、例えばキサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株を挙げることができる。本菌株は藤沢市の畑の土壌から分離した菌株で、その形態は幅0.4μｍの長桿菌で極鞭毛による運動性があり、酵母エキス 0.1％、ペプトン 0.1％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、グルコース 0.1％、寒天２％からなる寒天培地（加熱殺菌前にｐＨ 6.8に調整）上で好気的に成育し３１℃で１日培養すると0.5ｍｍ以下の点状で淡黄色の扁平状のコロニーを形成するグラム染色陰性の細菌である。これらの性質からバージェイズマニュアル・オブ・システマチックバクテリオロジーに基づき本菌株をキサントモナス属のマルトヒィリアと同定し、キサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８と命名した。ただし、本発明に使用できる菌株は本菌株に限定されるものではなく、その目的を達成できる菌株であればすべて使用できる。なお、本菌株Ｍｅｒ−Ｈ１０８は、工業技術院生命工学工業技術研究所にキサントモナス・マルトヒィリアＨ１０８として寄託されている（受託番号FERM P-17359）。
【０００９】
次にキサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株からのインドールの７位水酸化に関る遺伝子のクローニングについて詳細に説明する。
１）非変換株の取得
キサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株をインドール１００μｇ／ｍｌを含む分離培地（Yeast Extract (Difco) 0.1％，Bacto Peptone (Difco) 0.1％，ＫＨ2ＰＯ4 0.1％，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01％，ｐＨ 6.8）５０ｍｌに斜面培地から一白金耳植菌し、２８℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその培養液５００μｌを分離培地５０ｍｌに植菌し、２８℃で６時間振盪培養した。この培養液から菌体を5000×ｇ、１０分間の遠心分離で集菌し、0.1Ｍリン酸バッファー（ｐＨ 7.0）で一回洗浄し、0.1Ｍリン酸バッファー（ｐＨ 7.0）５ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液にＮＴＧを終濃度１ｍｇ／ｍｌ加え、２８℃で３０分間振盪培養した。この培養液から集菌した菌体を0.1Ｍリン酸バッファー（ｐＨ 7.0）で一回洗浄し、全量を分離培地５０ｍｌに植菌し、２８℃で一晩振盪培養した。この培養液を５００μｌずつ分注し、−７０℃で凍結保存したものを変異株保存液とした。
【００１０】
この変異株保存液を滅菌水で1000倍希釈し、８ｃｍシャーレのインドール１００μｇ／ｍｌを含む分離寒天培地（Yeast Extract (Difco) 0.1％，Bacto Peptone (Difco) 0.1％，ＫＨ2ＰＯ4 0.1％，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01％，寒天1.5％，ｐＨ 6.8）に１００μｌずつ塗布し、２８℃で一週間培養した。生えてきたコロニーのうち白色を呈しているコロニーを分離培地１ｍｌに植菌し、２８℃で二日間振盪培養した。この培養液２０μｌをシリカゲルＴＬＣプレートの各レーンにスポットし乾燥させた。このプレートをクロロホルム：ジエチルエーテル（３：２）からなる溶媒系で展開し、Ehrlich発色して各レーン毎に７−ヒドロキシインドールの有無を調べた。このようにして変異株の中からインドールを全く７−ヒドロキシインドールに変換しない１８−９変異株を分離した。この変異株は工業技術院生命工学工業技術研究所にキサントモナス・マルトヒィリア・ミュータント１８−９として寄託されている（受託番号FERM P-17420）。
【００１１】
２）ホスト−ベクター系、形質転換系の構築
キサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株を分離培地３ｍｌに植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。これを種菌としてその培養液１００μｌを分離培地５０ｍｌに植菌し、３２℃で５時間振盪培養した。この培養液から菌体を5000×ｇ、１０分間の遠心分離で集菌し、１０％グリセロール溶液で一回洗浄し、１０％グリセロール溶液２００μｌに懸濁したものをエレクトロセルとした。このエレクトロセルにブロード・ホスト・レインジ・ベクター（Broad Host Range Vector）ｐＢＢＲ１２２（Mo Bi Tec社）２００μｇ／ｍｌ ＴＥ溶液１μｌを加えた。これを0.2ｃｍのエレクトロキュベット（Electrocuvette）（BIORAD社）に入れ、ジーンパルサー（Gene Pulser）II（BIORAD社）を用い2.5ＫＶ、２００Ω、２５μＦの条件で一回電気パルスをかけた。このセルをファルコン（Falcon）チューブに入れ、氷冷した分離培地１ｍｌを加え、３２℃で２時間振盪培養した。この培養液をカナマイシン硫酸塩２０μｇ／ｍｌを含む分離寒天培地に塗布し、３２℃で三日間培養した。1.0×１０4個の形質転換株を得た。
【００１２】
３）プラスミドｐＣＦ７０４の構築
末端にＥｃｏＲＩサイトとＮｃｏＩサイトを付着したプライマーを合成（ファルマシア社）し、Ｔａｑポリメラーゼ（Taq polymerase）（ファルマシア社）とＰＣＲサーマルサイクラー（Thermal Cycler）PERSONAL（TaKaRa社）を用い、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトとその周辺領域９５ｂｐを増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｃｏＩで消化し、ｐＢＢＲ１２２のＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩサイトにライゲーション・キット・ヴァージョン２（Ligation Kit version ２）（TaKaRa社）を用いて連結反応した。この反応液でＥ.ｃｏｌｉコンピテント細胞ＪＭ１０９（TaKaRa社）を形質転換して得た形質転換株からプラスミドｐＣＦ７０４をキアーゲン・プラスミド・ミディ・キット（QIAGEN Plasmid Midi Kit）を用いて調製した。
【００１３】
４）プラスミドｐＩＺ３１１の構築
キサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株のゲノムＤＮＡをキアーゲン・ブラッド・アンド・セル・カルチャーＤＮＡキット（QIAGEN Blood and Cell Culture DNA Kit）に従って抽出精製した。このゲノムＤＮＡを制限酵素SauIIIAIで部分分解し、その４〜８Ｋｂｐ断片をアガロースゲルから切り出し、ウルトラフリーＣ３ユニット0.45μｍ（ミリポア社）を用いてＤＮＡを回収精製しＴＥ溶液に溶解したものをインサートＤＮＡ溶液とした。一方、ｐＣＦ７０４を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。これとインサートＤＮＡ溶液とをライゲーション・キット・ヴァ−ジョン２（Ligation Kit version ２）（TaKaRa社）を用いて連結反応したものをＤＮＡライブラリーとした。
【００１４】
このＤＮＡライブラリーを１８−９変異株のエレクトロセルに加え、電気パルスをかけた。このセルをファルコン（Falcon）チューブに入れ、氷冷した分離培地１ｍｌを加え、３２℃で２時間振盪培養した。この培養液全量をカナマイシン硫酸塩２０μｇ／ｍｌとインドール１００μｇ／ｍｌとを含む８ｃｍシャーレの分離寒天培地に１００μｌずつ塗布し、３２℃で３週間培養した。生えてきたコロニーのうち赤色を呈しているコロニーをカナマイシン２０μｇ／ｍｌとインドール１００μｇ／ｍｌとを含む８ｃｍシャーレの分離寒天培地に塗布し、３２℃で５日間培養した。生えてきた菌体を寒天ごとコルクボーラーでくりぬき、メタノール抽出し、ＨＰＬＣ分析（移動相：５０％ＣＨ3ＣＮ、流速：0.5ｍＬ／分、検出波長：２８０ｎｍ、カラム温度：３５℃、カラム：YMC-Pack ODS A-312 S-5 120A、６×１５０ｍｍ）で７−ヒドロキシインドールを検出し、インサートＤＮＡがインドールの７位水酸化活性変異を相補していることを確認した。この相補株からキアーゲン・プラスミド・ミディ・キット（QIAGEN Plasmid Midi Kit）を用いてプラスミドを調製し、さらにこのプラスミドでＥ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、再度調製したプラスミドをｐＩＺ３１１とした。ｐＩＺ３１１には約9.5ＫｂｐのインサートＤＮＡが挿入されていた。ｐＩＺ３１１で形質転換したキサントモナス・マルトヒィリア・Ｈ１０８は工業技術院生命工学工業技術研究所にキサントモナス・マルトヒィリア・Ｈ１０８（ｐＩＺ３１１）として寄託されている（受託番号FERM P-17421）。
【００１５】
ｐＩＺ３１１で形質転換したＥ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９をカナマイシン硫酸塩２０μｇ／ｍｌを含むＬ培地（Polypepton 1.0％，Yeast extract 0.5％，ＮａＣｌ 0.5％，Glucose 0.1％，ｐＨ 7.2）に植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。この培養上清をＨＰＬＣ分析したところ、７−ヒドキシインドールが約２０μｇ／ｍｌ検出された。これは導入したキサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株由来のインドールの７位水酸化に関る遺伝子がＥ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９で発現し、その活性を維持し、Ｅ.ｃｏｌｉのトリプトファン合成あるいは分解経路により生成されるインドールの７位の水酸化を行なっているものと考えられる。このことはクローニングしたｐＩＺ３１１上にインドールの７位水酸化に関る遺伝子が存在することを示している。
【００１６】
５）ｐＩＺ３１１インサート領域の遺伝子塩基配列の決定
ｐＩＺ３１１インサート領域についてABIPRISM 377 XL DNA Sequencer（Perkin Elmer社）を用いプライマーウォーキング法により塩基配列を決定した（配列番号１）。さらに配列番号１の配列について、Bibbらの方法（Gene，30，157 (1984)）に従ってオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を調べた結果、ＩｏｘＡ（配列番号１中、2602〜2796番）、ＩｏｘＢ（配列番号１中、2825〜3829番）、ＩｏｘＣ（配列番号１中、3847〜4116番）、ＩｏｘＤ（配列番号１中、4145〜5704番）、ＩｏｘＥ（配列番号１中、5740〜6099番）、ＩｏｘＦ（配列番号１中、6126〜7181番）、ＩｏｘＧ（配列番号１中、7190〜7528番）、ＩｏｘＨ（配列番号１中、7258〜8496番）、ＩｏｘＲ（配列番号１中、2287〜５８０番（逆向き））と名付けたＯＲＦおよびＩｏｘＩの一部（配列番号１中、8544〜9320番）が見出された。これら塩基配列によりコードされていると考えられるアミノ酸配列をも示した。またＩｏｘＲについては逆向きにコードされているのでSacI site 2730塩基から配列番号２に示した。なお、配列番号１中、2591〜2596、2815〜2820、3837〜3849、4134〜4139、5739〜5740、6114〜6118、7182〜7185、7551〜7555、8553〜8536にはシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列と思われる配列が存在している。
【００１７】
上記ＩｏｘＡ、ＩｏｘＢ、ＩｏｘＣ、ＩｏｘＤ、ＩｏｘＥ、ＩｏｘＦ、ＩｏｘＧ、ＩｏｘＨ、ＩｏｘＲおよびＩｏｘＩによりコードされていると考えられるアミノ酸配列についてFASTA searchをかけた結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
0004405627.tif 000002
【００１９】
表１から明らかなようにｐＩＺ３１１インサート領域は全体にわたり種々のフェノールヒドロキシラーゼ（Phenolhydroxylase）と相同性が高く、特にPseudomonas sp. Strain CF600のフェノールヒドロキシラーゼ（Phenolhydroxylase）との相同性が高い。
【００２０】
これらの結果から、インドール−７−ヒドロキシラーゼ活性に関与するＯＲＦはＩｏｘＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，ＧおよびＩｏｘＲであると考えられた。ＩｏｘＡの上流には種々のフェノールヒドロキシラーゼと同様にσ５４依存−２４／−１２タイププロモ−タ−のコンセンサス配列ＴＧＧＣ−Ｎ８−ＴＧＣＡが存在しており（配列番号１中、2548〜2563番）、転写調節タンパク質ＩｏｘＲ、ＤＮＡ結合タンパク質ＩＨＦ、およびσ５４によりＩｏｘオペロンの転写制御がなされているものと考えられる。
【００２１】
６）各種デレーションミュータントを用いたインドールの７位水酸化に必要な遺伝子（ＯＲＦ）領域の検討
(i)Ｉｏｘデレーションミュータント（deletion mutant）の作成
まず、種々のＯＲＦに沿って特異的な配列番号３〜４のセンスプライマー（Sense primer）と配列番号５〜７のアンチセンスプライマー（Antisense primer）（各々２８ｍｅｒ）を作製した（下線部は制限酵素ＸｂａＩの認識配列である。）。
【００２２】
ｉｏｘＲＲＦ：ＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＣ（配列番号３）、
ｉｏｘＡＦ：ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣ（配列番号４）、
ｃｏｍｐ．Ｒ：ＧＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＧＣＡＴＴＴＧＣＣＧ（配列番号５）
ｉｏｘＧＲ：ＧＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＧＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣ（配列番号６）、
ｉｏｘＦＲ：ＧＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＴＧＣＧＣＴＴＧＡＡＣＡＧＣＧ（配列番号７）。
【００２３】
上記プライマーとTaKaRa LA Taq（TaKaRa製）を用い、ｐＩＺ３１１を鋳型としてＰＣＲ反応（反応条件：９６℃で３分間、その後９８℃で２０秒−６０℃で２０秒−６８℃で１０分間の２５サイクル）を行なった。アガロースゲル電気泳動にてＰＣＲ産物ができていることを確認し、反応溶液をキアクイック・ＰＣＲピュリフィケーション・キット（QIAquick PCR Purification Kit，QIAGE製）を用いて精製した。精製産物をＤＮＡライゲーション・キット・ヴァージョン２（Ligation Kit Ver.2，TaKaRa製）を用いて大腸菌ベクターｐＴ７−Ｂｌｕｅ（Novagen製）に連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（TaKaRa製）を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地（ポリヘプトン 1.0％，酵母エキス 0.5％，ＮａＣｌ 0.5％，グルコース 0.1％，寒天 1.5％）にプレーテイングを行なった。翌朝、コロニーができていることを確認し、ＬＢ培地（ポリペプトン 1.0％、酵母エキス 0.5％、ＮａＣｌ 0.5％、グルコース 0.1％）に接種後、プラスミドの抽出を行なった。制限酵素ＸｂａＩ（TaKaRa製）にて処理後、アガロースゲル電気泳動を行ない断片の有無を確認した。ｉｏｘＲＲＦプライマーとｃｏｍｐ．Ｒプライマーを用いてプラスミドｐＩＯＸＲＣｏｍｐ．を、ｉｏｘＲＲＦプライマーとｉｏｘＦＲプライマーを用いてプラスミドｐＩＯＸＲＦを、ｉｏｘＲＲＦプライマーとｉｏｘＧＲプライマーを用いてプラスミドｐＩＯＸＲＧを、ｉｏｘＡＦプライマーとｉｏｘＦＲプライマーを用いてプラスミドｐＩＯＸＡＦを、ｉｏｘＡＦプライマーとｉｏｘＧＲプライマーを用いてプラスミドｐＩＯＸＡＧを構築した。
【００２４】
(ii)デレーションミュータントの培養試験
常法によりプラスミドｐＩＯＸＲＣｏｍｐ．、ｐＩＯＸＲ、ｐＩＯＸＲＧ、ｐＩＯＸＡＦ、ｐＩＯＸＡＧで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換してそれぞれのクローンを得た。各クローンをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩震盪培養を行なった。培養液５００μｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地（５０ｍｌ／２５０ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコ）に植菌し、３７℃でロータリーシェーカー上で震盪培養を開始し、培養８時間目で終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにインドールとＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏをそれぞれ添加した。その後、経時的に培養液２ｍｌのサンプリングを行ない、培養液から遠心分離によって菌体を除きその上清中のインドールと７位水酸化インドールの定量をＨＰＬＣ（カラム：YMC-PackA-312ODS（4.6×１５０ｍｍ），移動相：５０％アセトニトリル，流速：0.5ｍｌ／ｍｉｎ，検出：２８０ｎｍ）を用いて行なった。その結果、それぞれの形質転換株の７位水酸化インドール蓄積量は、ｐＩＯＸＡＦ転換株で11.8μＭ、ｐＩＯＸＡＧ転換株で66.6μｍ、ｐＩＯＸＲＦ転換株で21.4μＭ、ｐＩＯＸＲＧ転換株で59.4μＭ、ｐＩＯＸＲＣｏｍｐ．転換株で９８μＭであった。このことからインドールの７位を水酸化するのに必要なＯＲＦはＩｏｘＡ、ＩｏｘＢ、ＩｏｘＣ、ＩｏｘＤ、ＩｏｘＥ、ＩｏｘＦであることが分かった。
【００２５】
以上の結果及び前記表１の結果から、配列番号１の塩基配列でコードされるポリペプチド群の予想される役割を図１に示す。
【００２６】
次に前記の方法にてクローニングされた遺伝子で形質転換された微生物もしくは該遺伝子を染色体上に有する微生物の培養方法および生産された７位水酸化インドールおよび７位水酸化トリプトファンの製造法について詳細に説明する。
本発明で使用する培地組成は、使用する微生物が良好に生育し、かつインドール誘導体の７位を水酸化する活性を発現するのに適当な炭素源、窒素源、無機塩及び天然有機栄養物等により成り立っている。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、ソルビトール、アルコール類、酢酸、澱粉等を単独に用いるかもしくは併用でき、その使用濃度は特に限定されず、おおよそ１〜１０％が適当である。窒素源としてはアンモニア、尿素、硫安、硝安、酢安等の化合物を一種または二種以上使用することができる。無機塩としては、燐酸一カリウム、燐酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などの塩類を使用することが出きる。さらに使用菌の生育促進効果を持つ有機栄養源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチーブリカー、カザミノ酸などが用いられ、さらにビタミン類、核酸類を少量培地に含有せしめることもできる。
【００２７】
インドールの７位を水酸化するためのインドールの添加時期は、菌体の生育の最初から及び生育後のいずれでもよく、また、培養液から菌体を回収し菌体を適当な水溶液に懸濁させた液中に添加してもよい。インドールは種々の濃度で用いることが出きるが、約0.1ｇ／リットルから１ｇ／リットルの濃度で用いることが望ましく、これを一括添加しても分割して添加してもよい。
培養は通気撹拌培養、振盪培養等の好気的条件下、あるいは静置培養でもよい。培養中のpHは中性ないし弱アルカリ性が好適であり、このためのｐＨ中和剤としては、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、塩酸等の公知のものが使用できる。培養温度は２０〜４０℃の範囲で使用菌の成育に最適な温度で培養できる。培養時間は使用菌株の相違、原料の添加方法、添加濃度等により差はあるが、おおよそ１〜４日で７−ヒドロキシインドール及び７−ヒドロキシトリプトファンが生成蓄積する。
【００２８】
生成蓄積した７−ヒドロキシインドール及び７−ヒドロキシトリプトファンは、それ自体公知の方法に準拠して単離・精製することができる。すなわち、疎水性の担体あるいはイオン吸着樹脂に吸着せしめ、有機溶媒あるいはアルカリ水、酸性水で溶出し、濃縮後、結晶化等によって回収される。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例によって本発明を詳細に説明する。
実施例１：
酵母エキス 0.1％、ペプトン 0.1％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、グルコース 0.1％、寒天２％からなる斜面寒天培地（加熱殺菌前にｐＨ 6.8に調整）上で成育したキサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株を一白金耳取り、酵母エキス 0.1％、ペプトン 0.1％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％からなる培地（加熱殺菌前にｐＨ 6.8に調整）５０ｍｌを含む２５０ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコに植菌し、２８℃で１９時間ロータリーシェーカー上で培養を行なった。この種母培養液１５ｍｌをインドール 0.01％、酵母エキス 0.1％、ペプトン 0.1％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％からなる培地（加熱殺菌前にｐＨ 6.8に調整）1.5リットルを含む３リットル容のジャーファメンターに植菌し２８℃で２１時間、通気撹拌培養（通気量0.75リットル／分、撹拌４００ｒｐｍ）を行ない、培養液中に７−ヒドロキシインドールを２５μｇ／ｍｌ生成蓄積させた。培養液から菌体を遠心分離によって除いた後、培養上清1.4リットルを水で充填したダイヤイオンＨＰ−２０カラム（樹脂は三菱化成製、７φ×１２ｃｍ）に通塔し、７−ヒドロキシインドールを樹脂に吸着させ１リットルの水で洗浄後、５００ｍｌのメタノールでカラムから７−ヒドロキシインドールを溶出させた。溶出液から７−ヒドロキシインドール溶出画分を集めてエバポレーターで減圧下に濃縮して水およびメタノールを留去し７−ヒドロキシインドールを結晶として２３ｍｇ得た。こうして得た７−ヒドロキシインドールについてＦＡＢ−ＭＳおよび1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００３０】
ＦＡＢ−ＭＳ（マトリックス；グリセリン）：ｍ／ｚ  １３３（Ｍ+）、
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）：δ 6.39 (1H, d, J=3.3Hz), 6.49 (1H, d, J=7.7Hz), 6.79 (1H, dd, J=7.7Hz, J=7.7Hz), 7.03 (1H, d, J=7.7Hz), 7.15 (1H, d, J=3.3Hz)。
【００３１】
実施例２：
酵母エキス 0.1％、ペプトン 0.1％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、グルコース 0.1％、寒天２％からなる斜面寒天培地（加熱殺菌前にｐＨ 6.8に調整）上で成育したキサントモナス・マルトヒィリアＭｅｒ−Ｈ１０８株を一白金耳取り、酵母エキス 0.1％、ペプトン 0.1％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％からなる培地（加熱殺菌前にｐＨ 6.8に調整）５０ｍｌを含む２５０ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコに植菌し、２８℃で１９時間ロータリーシェーカー上で培養を行なった。この種母培養液１５０ｍｌをインドール 0.01％、酵母エキス 0.1％、ペプトン 0.1％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、0.01％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏからなる培地（加熱殺菌前にｐＨ 6.8に調整）１５リットルを含む３０リットル容ジャーファメンターに植菌し、２８℃で通気撹拌培養（通気量 7.5リットル／分、撹拌２００ｒｐｍ）を行なった。培養１５時間目にＬ−セリンを7.5ｇ添加し２６時間まで培養を行ない、培養液中に７−ヒドロキシトリプトファンを９μｇ／ｍｌ生成蓄積させた。培養終了後、培養液から菌体を遠心分離によって除き、得られた培養上清１４リットルを強塩基性イオン交換樹脂ダイアイオンＰＡ３０６ｓカラム（樹脂は三菱化成製、７φ×１５ｃｍ）に通塔し、７−ヒドロキシトリプトファンを樹脂に吸着させ１リットルの水で洗浄後、２リットルの0.1Ｎ塩酸で７−ヒドロキシトリプトファンを溶出させた。溶出液から７−ヒドロキシトリプトファンの溶出画分を合わせて１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ 6.0にしてからエバポレーターで減圧下に濃縮後、凍結乾燥を行なって粗精製物を21.3ｇ得た。これを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ 6.8）１０ｍｌに溶かし、分取ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil PREP-ODS（２×２５ｃｍ、ガスクロ工業）、移動相：５％ ＭｅＯＨ ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ 6.8）、流速：7.0ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）にかけ保持時間34.6分の７−ヒドロキシトリプトファンのピークを分取した。分取した画分を脱塩するため移動相を水とした他は先と同じ条件の分取ＨＰＬＣで７−ヒドロキシトリプトファンのピークを分取し凍結乾燥して７−ヒドロキシトリプトファンをナトリウム塩として８６ｍｇ得た。こうして得た７−ヒドロキシトリプトファンのＦＡＢ−ＭＳおよび1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００３２】
ＦＡＢ−ＭＳ（マトリックス；ＮＢＡ）：ｍ／ｚ２２１（（Ｍ＋Ｈ）+）、
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.05 (1H, dd, J=9.5Hz, J=15.0Hz), 3.45 (1H, dd, J=3.3Hz, J=15.0Hz), 3.79 (1H, dd, J=4.0Hz, J=9.5Hz), 6.57 (1H, d, J=7.7Hz), 6.85 (1H, dd, J=7.7Hz, J=7.7Hz), 7.13 (1H, s), 7.19 (1H, d, J=7.7Hz)。
【００３３】
実施例３：
ｐＩＺ３１１で形質転換したＥ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９をカナマイシン硫酸塩２０μｇ／ｍｌを含むＬ培地（ポリペプトン 1.0％，酵母抽出液（Yeast extract）0.5％，ＮａＣｌ 0.5％,グルコース 0.1％，ｐＨ 7.2）に植菌し、３２℃で一晩振盪培養した。この培養液から菌体を遠心分離によって除いた後、培養上清をＨＰＬＣ（カラム：ＯＤＳ−Ａ（0.6×１５ｃｍ）、ＹＭＣ）、移動相：５０％アセトニトリル、流速：0.5ｍｌ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）にかけ保持時間 10.08分の７−ヒドロキシインドールのピークを検出した。７−ヒドロキシインドールが約２０μｇ／ｍｌ検出された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による遺伝子でコードされるポリペプチド群の予想される役割を示す。図中太線矢印はプライマーを示し、細線矢印は遺伝子の大きさと向きを示す。
【図１】
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