(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各マイクロウェル（２７）が導電性ポリマーと結合した試薬を受け止めるように企画され、各マイクロウェルは、前記試薬が、当該試薬と結合した導電性ポリマーによってその上に固定される受容電極（２２、２３、２４）を備え、各マイクロウェルは対電極を備え、当該対電極が、マイクロウェルの容量において、対電極と受容電極の間に電場を適用できるように設定された複数のマイクロウェル、
第一の電位に対して全ての受容電極を同時連結する手段、
第二の電位に対して全ての対電極を同時連結する手段
を含み、前記電場をセットアップすることができる、化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムであって、
更に能動的基板（２１）を含み、該基板の一面が、受容電極（２２、２３、２４）を含み、マイクロウェル（２７）を構成する絶縁物質からなる第一層（２５）で被覆されており、該マイクロウェルの底部が受容電極に相当し、絶縁物質からなる第一層が対電極（２９）を形成する導電層を支持し、マルチプレクシング手段が、全ての受容電極を同時に連結するために設けられているマイクロシステムにおいて、
ａ）試薬を導電性ポリマーモノマーと結合させる工程、
ｂ）前記導電性ポリマーモノマーと結合した前記試薬の混合物を含む電解質キャリアー溶液を、前記複数のマイクロウェルの少なくとも一のマイクロウェルに添加する工程、
ｃ）電解質溶液が添加されたマイクロウェルにおいて、前記試薬を備えた導電性ポリマーを共重合および受容電極上に固定化すべく、前記受容電極と前記対電極との間に電場を適用する工程、
ｄ）前記ｃ）工程の後の、前記マイクロウェルをすすいで、残りのキャリアー溶液を除く工程を含む、化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムの製造方法。
【請求項２】
各マイクロウェル（７）が導電性ポリマーと結合した試薬（１４ａ、１５ａ、１６ａ）を受け止めるように企画され、各マイクロウェルは、前記試薬が、当該試薬と結合した導電性ポリマーによってその上に固定される受容電極（９ａ）を備え、各マイクロウェルは対電極を備え、当該対電極が、マイクロウェルの容量において、対電極と受容電極の間に電場を適用できるように設定された複数のマイクロウェル、
第一の電位に対して全ての受容電極を同時連結する手段、
第二の電位に対して全ての対電極を同時連結する手段
を含み、前記電場をセットアップすることができる、化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムであって、
更に受動的基板（１）を含み、該基板の一面が、それ自体絶縁物質からなる第一層（５）で被覆された第一の導電層（３）で被覆され、前記絶縁物質からなる第一層が、前記受容電極を形成する第一の導電層を露呈するマイクロウェル（７）を構成し、前記絶縁物質からなる第一層が対電極を形成する第二の導電層（９）を支持し、マルチプレクシング手段が、全ての受容電極を同時に連結するために設けられているマイクロシステムにおいて、
ａ）試薬を導電性ポリマーモノマーと結合させる工程、
ｂ）前記導電性ポリマーモノマーと結合した前記試薬の混合物を含む電解質キャリアー溶液（１４、１５、１６）を、前記複数のマイクロウェルの少なくとも一のマイクロウェルに添加する工程、
ｃ）電解質溶液が添加されたマイクロウェルにおいて、前記試薬を備えた導電性ポリマーを共重合および受容電極上に固定化すべく、前記受容電極と前記対電極との間に電場を適用する工程、
ｄ）前記ｃ）工程の後の、前記マイクロウェルをすすいで、残りのキャリアー溶液を除く工程を含む、化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムの製造方法。
【請求項３】
絶縁物質からなる第二層（３８）が、対電極（３２）を形成する導電層を被覆して、それを埋め込むことを特徴とする、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
絶縁物質からなる第二層（３８）が、参照擬似電極（４４）として用いられる導電層を支持することを特徴とする、請求項３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
通常のエレクトロニクスは、いくつかの機能が組み込まれた複雑なシステムにおけるリンクとして用いられている。前記システムまたはマイクロシステムは、物理的センサーアプリケーションから“バイオ”チップの最近の発達までにわたる。
【０００３】
第一の場合では、物理現象を測定できる敏感なセルが、情報を処理および使用できる集積回路と結合されている。これは、自動車産業におけるエアバッグのケースである。
【０００４】
第二の場合では、集積回路が、生物学的媒体において使用されるような仕上げを受ける。これは、例えば、組み込まれたグルコース測定ユニットまたは血圧プローブのケースである。
【０００５】
いずれのケースにおいても、通常のマイクロエレクトロニクスの分野とセンサーまたは生物学者の分野との間の接点が、前記マイクロシステムの重要な要素である。
【０００６】
化学的または生物学的分析は、マイクロテクノロジーの使用に関連した小型化革命にある。多数のテストが、数ｍｍ2の基板上に集められるのであれば、コストが低減し、かつては例外的であった分析が標準的に実施できる。
【０００７】
非常に多数のポイントを用いて化学的または生物学的分析を実施できるシステムに対する要求は、現在、薬学におけるスクリーニングおよび生物学におけるＤＮＡテストとして現れてきている。
【０００８】
第一のケースでは、同一の試薬で満たされた多数のウェルを含む基板の上で、連続的に各ウェルに選択的に添加された種々の分子の効果について測定する必要がある。第二のケースでは、各ウェルは、異なるＤＮＡプローブで満たされ、ゲノム配列が検出されるアナライトが、全てのウェルと、分析時に接触させられる。分析化学では、化学反応ウェルの小型化に対して強い要求がある。
【０００９】
ウェルの製造、前記ウェルに液体を添加すること、結果の読みとり、および取得システムに関しては、研究開発が重要である。
【００１０】
生物学的分析の分野、またはより一般的に、新たな分子に対する薬学的試験の分野では、サイズの低減は、経済的観点から極めて興味のある試験ツールである。特に、分析マイクロシステムは、種々の試薬が最初に固定され、次いで、分析下で溶液の存在下に置かれる基板に関連する構造、および得られた反応性を測定するために用いられる方法になぞられる。所望であれば、得られた情報のマイクロシステム自身における処理が設けられてもよい。
【００１１】
種々の試薬を基板に固定するための種々の技術がある。
【００１２】
第一の技術は、活性化部位からなり、後に試薬が添加され、種々の化学分子を用いて固定される。この技術は、本質的に、ガラス基板上に用いられる。これらの試薬は、マイクロピペッティングにより、あるいは、インクジェットタイプ技術を用いて添加される。化学的に、基板と試薬との間の接点を確実なものとするために、基板が金で予め被覆される場合には、シラン、リシン、チオールのような物質が用いられてもよい。この化学は、特に、数千の異なる部位を含むことができる基板における再現性を調節するために複雑である。この技術の代表的な例は、米国特許第５４７４７９６号である。これは、表面構造に関する。すなわち、試薬が親水性領域と疎水性領域とを有する基板上に固定される。この理由から、この得られたマトリックスは、非常に規則的である。
【００１３】
ＤＮＡチップ（試薬はＤＮＡプローブ、特に約２０塩基のオリゴヌクレオチドである）の分野に適用された第二の技術によれば、各部位に塩基単位でプローブを構築することが提案された。in situでの合成をもたらす連続マスキングの使用が知られており、各部位は、光防護化塩基で被覆される。フォトマスキングは、その部位から保護を除き、化学的にさらなる光防護化塩基を結合することを可能にする。この操作が、各部位において、所望のプローブが得られるまで繰り返される。現在、一つの基板に数万の種々のプローブを構築することが可能である。この技術は優れたものであるが、多数の塩基を有するプローブを得るためには用いることができない（限界は約２０）。また、感光性ラジカルではなく化学的に敏感なラジカルを用いて、最初から保護化塩基を固定することも可能である。この場合、ピペッティングまたはインクジェットタイプ技術により、存在している塩基から保護を取り除き、さらなる塩基を結合するために選択された部位に局所的に移動する必要がある。
【００１４】
第三の技術は、選択された反応種を保有する導電性ポリマーの電気的に極性化された部位における電気的添加に関する。これについては、Juan-C. VIDALらにより、Biosensors and Biolelectronics, vol.13, No.3-4, 371-382頁, 1998に記載された論文“Electropolymerization of pyrrole and immobilization of glucose oxidase in a flow system: influence of the operating conditions on analytical performance”を参照。この基板は、外側に電気的に連結され、添加される化学種を含むタンクに浸される。選択された部位が極性化され、共重合が行われる（１Ｖ未満の電圧で少なくとも１分）。続いて、別の試薬を有する別の溶液が用いられ、別の部位が基板表面で極性化される。この方法を用いて、基板の種々の領域に種々の試薬が固定され、かくしてマルチポイント分析を可能とする。
【００１５】
この技術の興味ある改良は、基板自身に部位アドレス指定エレクトロニクスを組み込むことからなる。この処理に用いられた導電性ポリマーは、ポリアニリン、ポリピロールである。これについては、国際公開第９４／２２８８９号、仏国特許第２７４１号および仏国特許第２７４１４７６号を参照。この方法は、その部位にプローブを固定することが強力であり、再現性があり、かつよく調節可能であることから、関心が向けられる。これは、各部位が連続的に極性化され、基板が完全に被覆されるか、あるいは、各通過(passage)において試薬キャリアー溶液に浸される連続的技術である。しかしながら、部位の数が多くなる場合には、各部位基板の処理時間が極めて大きくなる。共重合時間が長いほど、すすぎまたは新たな電解質導入に必要な時間が長くなる。
【００１６】
これらの生物学的プローブ装置の使用は、インピーダンス電気測定、マイクロスケール、屈折率の変化を用いた光学的測定、放射能ラベル化、蛍光発光といった、非常に広い範囲の方法を用いることができる。このうちの最後の方法が、実施が容易であり良好な感度を示すことから広く用いられている。概略的に、これは、アナライトをテスト下で蛍光体(fluophor)と結合させることからなる。アナライトは、マイクロシステムに局所的に固定された試薬と接触させられる。あらゆる種類の反応／ペアリングが存在するのであれば、蛍光体を含有するアナライトがテスト領域に残る。洗浄後、蛍光を読みとることによって、キャリアー部位にペアリングが存在するか否かを調べることができる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術の問題を改善するために、本発明は、単一の電気重合工程(electropolymerisation)において、外側に電気的に連結した部位に導電性ポリマーのモノマーと結合した試薬を固定するために用いられる構造の使用を提案する。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
それゆえ、本発明は、化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムを製造する方法に関し、以下からなる工程を含む：
ａ）試薬を導電性ポリマーモノマーと結合させる工程、
ｂ）前記導電性ポリマーモノマーと結合した前記試薬の混合物を含む電解質キャリアー溶液を、基板上に形成されたマイクロウェルの少なくとも一つのマイクロウェルに添加する工程であって、各マイクロウェルは、受容電極(reception electrode)と対電極とを備え、電解質溶液は、受容電極と対電極との間の電気化学的回路を閉じるのに十分な量で添加され、
ｃ）電解質溶液が添加されたマイクロウェルにおいて、前記受容電極上に、前記試薬を有する導電性ポリマーを共重合および固定するために、受容電極と対電極との間に電場を適用する工程、
ｄ）かかる構造のマイクロウェルをすすいで、残りのキャリアー溶液を除く工程。
【００１９】
工程ａ）、ｂ）およびｃ）は、種々のマイクロウェルに種々の試薬を添加するのに必要な回数にわたり繰り返される。
【００２０】
また、本発明は、マイクロウェルを備えた構造からなる化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムにも関するもであって、各マイクロウェルは、導電性ポリマーと結合した試薬を受け止めるように企画され、各マイクロウェルは、受容電極を有し、この受容電極上に、試薬が、当該試薬と結合した導電性ポリマーによって固定され、各マイクロウェルは、対電極を有し、この対電極は、マイクロウェルの容量において、対電極と受容電極の間に電場を適用できるように設定され、
かかる構造は、第一の電位に対して全ての受容電極を同時連結する手段と、第二の電位に対して全ての対電極を同時連結する手段とを含み、前記電場をセットアップすることができる。
【００２１】
第一の態様によれば、この構造は受動的基板(passive substrate)を含み、その基板の一面は、それ自体絶縁物質からなる第一層で被覆された第一の導電層で被覆され、前記絶縁物質からなる第一被覆は、前記受容電極を形成する第一導電層を示すマイクロウェルを含み、前記絶縁物質からなる第一層は、通常の対電極を形成する第二の導電層を支持する。
【００２２】
第二の態様によれば、この構造は能動的基板(active substrate)を含み、その基板の一面は、受容電極を含み、マイクロウェルを含む絶縁物質の第一層で被覆されており、このマイクロウェルの底部は受容電極に対応し、絶縁物質からなる第一層は通常の対電極を形成する導電層を支持し、マルチプレクシング(multiplexing)手段が、全ての受容電極を同時に連結するために設けられている。
【００２３】
絶縁物質からなる第二層が、対電極を形成する導電層を被覆して、それを埋め込んでもよい。第二の絶縁層は、参照擬似電極(reference pseudo-electrode)として用いられる導電層を支持してもよい。
【００２４】
図面を参照しながら以下の非限定的な実施例として示された記載を読むことにより、本発明をより明確に理解し、本発明の他の利点および特異性を理解できるだろう。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明に係るマイクロシステムを製造するために、二つのケースを考慮する。この構造は、受動的基板を含むことができる。すなわち、統合電子装置(integrated electronics)を含まない。この場合、この基板は、微小空洞が形成される、電気的絶縁を付与する材料の層でそれ自体被覆された導電性表面（例えば、金属）で被覆されてもよい。この場合、導電性表面の未被覆領域は、受容電極を形成する。
【００２６】
基板は、能動的であってもよく、その場合には、集積エレクトロニクス(integrated electronics)が異なる機能、すなわち局在部位加熱、局所ｐＨ測定、蛍光シグナル読み取り等について用いられてもよい。殆どの場合、この部位は、他から独立した部位においてアドレスで呼び出せるように維持しなければならない後の機能について短絡させることができない。これらの機能に必要とされるマルチプレクシングが、マイクロシステム製造処理中に用いられてもよい。集合的に試薬固定操作を実施する全ての部位をアドレスすることが可能である。次いで、各部位は個別にアドレスされてもよい。
【００２７】
図１Ａないし１Ｈは、横断部分断面図である。対電極が表面に配置され、かつ、基板が受動的である、本発明のマイクロシステムの第一の実施態様を例示する。
【００２８】
図１Ａは、ガラス、ケイ素またはプラスチックのような物質からなる平行六面体プレートからなる基板１を示す。このプレートの主要面に、０．１ないし１０μｍの厚みを有するクロム、金またはプラチナ等の金属層３が堆積されている。図１Ｂに示されているように、金属層３の上に、感光性ポリマーフィルム５、例えば、１ないし５０μｍの厚みのポリイミドフィルムが堆積されている。
【００２９】
マイクロウェル７は、ポリイミドフィルムのインソレーションとディベロップメントによって形成される（図１Ｃ参照）。これらは、有利に、斜側面を有するように形成される。形成されたマイクロウェルは、局所的に金属層３を検出する。新しい金属層９は、マイクロウェル７の内部を含むポリイミドフィルム上に均一に堆積される。この金属層９は、クロム、金またはプラチナからなり、０．１ないし１０μｍの厚みであってもよい。
【００３０】
図１Ｄに示されているように、マスキング樹脂１１の層が金属層９上に堆積され、金属層９において彫り込まれる領域が決められる。
【００３１】
金属層９は、アクセスできる部位で彫り込まれ、樹脂１１が取り除かれる。図１Ｅに示されている構造が得られる。各マイクロウェル７は、その底部に電極９ａを含み、全ての電極９ａは、金属層３の手段によって電気的に連結されている。通常の電極９ｂは、ポリマーフィルム５の上面を被覆する。
【００３２】
マイクロ流体技術（マイクロキャピラリー、ファウンテンペン、インクジェット型印刷ヘッド等）を用いて、試薬を含む溶液が各マイクロウェルに堆積される。図１Ｆは、モノマーと結合した特異的試薬およびシングルモノマーの混合物を含む電解液のドロップ１４、１５、１６を各マイクロウェル７に供給する、参照１３の下に図式的に示された分散システムを示す。
【００３３】
図１Ｇは、マイクロウェルにアレンジされた電解液のドロップ１４、１５、１６を示す。このマイクロウェルは、異なる溶液の混合を妨げる。電解液の量は、電極９ａと対電極９ｂとの間の電気化学的回路を閉じるような量である。
【００３４】
金属層３と対電極９ｂとの間につながれた電圧装置１７により供給された適切な電場を適用することにより、電極９ａ上への導電性ポリマーの共重合および固定化が得られる。
【００３５】
次いで、マイクロウェル７をすすいで、各マイクロウェル中に、試薬を含む導電性ポリマーによって電極９ａに固定された試薬１４ａ、１５ａ、１６ａを得る。
【００３６】
基板が能動的である場合、試薬の受容電極は、共通の導電層に連続的に連結されない。この場合、図２に示されているように、基板２１は、通常通りに互いから電気的に絶縁された受容電極２２、２３、２４が外側に設けられているが、マルチプレクシングシステムにより、電圧装置の端子の一方に集合的に連結されていてもよい。この構造の他の部分は、上記構造、すなわち、マイクロウェル２７が形成され、かつ、対電極２９を支持する感光性ポリマーフィルム２５と同じである。
【００３７】
図３Ａないし３Ｃは、対電極が埋め込まれている別の態様の製造を図示している。電解液と受容電極との間の接触は、通常の導電層に連続的に連結された受容電極、または、互いから電気的に絶縁されているが、マルチプレクシングにより同時にアドレスされうる受容電極を用いて、上記のように実施される。例えば、図３Ａないし３Ｃは、受容電極が通常の導電層に連続的に連結される場合を例示している。この処理の第一の工程は、図１Ａおよび１Ｂに例示されているものと類似しており、この理由により図示されていない。
【００３８】
図３Ａは、金属層３３および感光性ポリマーフィルム３５で被覆された基板３１を示し、これは、写真平版を受け、かつ、彫り刻まれ、かくして、金属層３３をフィルム３５に形成されたホール３６のベース部に露呈している。
【００３９】
金属層、例えば、０．１ないし１０μｍの厚みのクロム、金またはプラチナが、この構造の最上面に堆積されている。この層は、写真平版を受け、かつ、彫り刻まれ、領域３２をフィルム３５上に残し、当該領域３２は、対電極を形成する（図３Ｂ参照）。
【００４０】
ポリマー３８の別の層が、堆積および彫り刻まれてマイクロウェルを構成する。彫り刻むことにより、ホール３６と同一中心であり、より大きな直径のホール３９が形成される。これらは、対電極３２をマイクロウェル３７にはみ出させる（図３Ｃ参照）。マイクロウェルの金属被覆されたベース３４は、マイクロシステムのための受容電極を形成する。
【００４１】
得られたこの構造は、上記のように処理されて、企図された試薬を受ける。この構造は、電極と対電極との間の改善された接触を与える。
【００４２】
記載された構造の変形は、参照として用いられる、表面上の第三の電極を含めることからなる。これは絶対参照（ゲル）または擬参照（例えば、Ｔｉ／ＴｉＯ2）から構成されてもよい。次いで、形成されたセルは、受容電極、対電極および参照電極を含む。この説明は、図４に示されている。図４は、基板４１（この例では受動的）、局所的に受容電極を供給する導電性表面４２、対電極４３および参照電極４４を示す。この金属表面は、当然に、転化させることができ、対電極が当該表面上に残され、参照電極が中間レベルに設けられてもよい。
【００４３】
本発明は、流体論理技術を用いた電解液の堆積の簡便性という利点を与える。これは、特に、モノマー共重合により、強く化学的中性な固定化方法を可能にする。共重合および固定化操作が集合的であることから、多数の試薬が容易に導入されうる。このモノマーは、化学的および生物学的物質の多数のタイプと組み合わせられてもよい（グルコースオキシダーゼ、抗原、ＤＮＡプローブ等）。
【００４４】
本発明により得られた溶液は、始めに記載した化学的処理を用いた核酸プローブのin situ合成に適合する。第一の塩基が電気的共重合により固定化され、その後の構成が化学的に実施される。ポリピロールは、その高度な化学的安定性から、この場合における良好な候補である。この固定化方法は、例えば、シラニゼーションによる固定化と比較して非常に強いことから、魅力的である。
【００４５】
また、この技術は、集団的な電気的共重合および固定化工程のための集積電子工学機能を用いることにより、能動的基板の使用に適合しているという利点を与える。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係る化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムを製造する処理の種々の工程を示す。
【図２】  本発明に係る、別の化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムを示す。
【図３】  本発明に係る化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムを製造する他の処理の種々の工程を示す。
【図４】  本発明に係る、他の化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステムを示す。
【符号の説明】
１  基板
３  金属層
５  感光性ポリマーフィルム
７  マイクロウェル
９  金属層
９ａ  受容電極
９ｂ  対電極
１４ａ、１５ａ、１６ａ  試薬
【図１】
0004562914.tif 000002
0004562914.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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