(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２に示すアミノ酸配列からなる、癌抗原ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の癌抗原ペプチドを少なくとも１つ活性成分として含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項３】
前立腺癌が骨転移を伴う、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
請求項１記載の癌抗原ペプチドを少なくとも１つ活性成分として含む、転移性骨病変を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項５】
転移性骨病変が前立腺癌に付随する、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
HLA-A24抗原と請求項１記載の癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球。
【請求項７】
請求項６記載の細胞傷害性Tリンパ球を活性成分として含む、前立腺癌を処置するための医薬組成物。
【請求項８】
前立腺癌が骨転移を伴う、請求項７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト主要組織適合抗原HLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者において免疫原を有する副甲状腺ホルモン関連タンパク質由来抗原ペプチドの同定に関し、詳細には、前立腺癌を処置または予防するための特異的癌抗原、それを含む癌ワクチン、およびそのための治療学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、老齢男性において頻度の高い癌の１つである[1]。前立腺癌は骨に転移することが多く、骨転移を有する患者にはアンドロゲン遮断療法が適用されている。ホルモン療法はこのような患者における疾患進行を一時的に抑制できるが、ほとんどの場合、ホルモン不応性の前立腺癌への進展することが避けられない。従って、新たな治療方法の開発が求められている。
【０００３】
腫瘍免疫学の最近の進歩により、種々のタイプの癌患者においてヒト癌関連抗原をコードする遺伝子、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）によって認識されるそれらの抗原エピトープが同定されている[2 - 4]。これらの同定された癌抗原やそのペプチドは特異的免疫療法に応用されている[5 - 7]。前立腺癌の場合、正常な前立腺に発現している組織特異的な抗原も前立腺癌患者に対する特異的免疫療法のための標的分子となりうる。前立腺特異的抗原（PSA）または前立腺特異膜抗原（PSMA）を標的とする免疫療法はすでに実施されており、抗腫瘍効果が限られた症例であるが確認されている[8 - 12]。
【０００４】
副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrP)は、骨芽細胞の受容体に結合するオートクリンまたはパラクリン因子であり、骨の形成と再吸収を刺激する。PTHrPはN端側で副甲状腺ホルモン(PTH)と相同性を有しており、PTHと同じ受容体に結合できるため、PTHと同様の活性をもたらす[13]。PTHrPは、カルシウム輸送、ケラチン形成細胞の分化、平滑筋の弛緩や軟骨の発育など種々の生理学的役割を担っている[14]。副甲状腺細胞の場合は、高い細胞外カルシウム濃度が負のフィードバック調節を生じ、PTHの分泌と副甲状腺細胞の増殖とを抑制するが、PTHrPの場合は、分泌が持続し、骨再吸収の増悪を促進する[15]。従って、PTHrPは悪性腫瘍に付随する高カルシウム血症に関与すると考えられている[16]。さらに、前立腺癌はPTHrPを産生すると報告されている[17]。これらは、PTHrPが骨転移を伴う前立腺癌患者の免疫療法における格好の標的分子である可能性を示している。PTHrP 59-68 および PTHrP 165-173 ペプチドはHLA-A2陽性前立腺癌患者を特異的に免疫治療するための候補ペプチドであると報告されている[16, 17]。
本研究では、HLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者において免疫原性を有する新たなPTHrP由来ペプチドの同定を試みた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前立腺癌は特異的免疫療法を開発するうえで格好な標的と考えられる[25]。近年、本発明者らは、前立腺癌患者から前立腺癌反応性CTLを生じさせることのできる前立腺関連抗原由来のエピトープペプチドの同定を試みている[22, 23, 26]。しかし、前立腺癌患者を治療する際の主な障害は、骨組織に転移した前立腺癌に対する治療である。従って、本発明者らは、転移を有するHLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者を特異的免疫療法により処置するのに適している可能性ある抗原エピトープを同定するため実験を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本実験では、ヒト主要組織適合抗原(HLA)-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者において免疫原性を有するPTHrP-誘導ペプチドの同定を試みた。HLA-A24結合モチーフを有する４つの異なるPTHrPペプチドのうちPTHrP 36-44 および PTHrP 102-111ペプチドが、HLA-A2結合モチーフを有する７つの異なるPTHrPペプチドのうちPTHrP 42-51 および PTHrP 59-67ペプチドが、それぞれのHLA陽性前立腺癌患者の末梢血単核細胞（PBMC）からペプチド特異的な細胞傷害性Tリンパ球を効率的に誘導した。ペプチドで刺激したPBMCは前立腺癌細胞に対してHLA-A24またはHLA-A2拘束性に細胞傷害活性を示した。抗体およびコールド標的細胞を用いた実験により、それらの細胞傷害活性はPTHrPペプチド特異的なCD8陽性T細胞に依存していることが判明した。HLA-A24分子に結合するPTHrP 102-111 またはPTHrP 110-119ペプチド、およびHLA-A2分子に結合するPTHrP 42-51ペプチドに反応する免疫グロブリンG(IgG)は前立腺癌患者の血漿中において高頻度に検出でき、このことは、PTHrP 102-111およびPTHrP 42-51ペプチドが癌患者の細胞性および液性の両方の免疫応答に認識されることを示している。これらの結果は、本発明のペプチドが、転移を伴うHLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者に対する特異的な免疫療法のための有望な標的分子でありうることを示す。
【発明の効果】
【０００７】
本発明において、HLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者において前立腺癌特異的なCTLを産生させる可能性ある新たなPTHrPペプチドが同定され、それによりPTHrPを標的とするペプチドワクチンを作成できる可能性が広がった。本発明者らは、PTHrP 36-44およびPTHrP 102-111ペプチドの両者がHLA-A24陽性前立腺癌患者において、また、PTHrP 42-51 および PTHrP 59-67ペプチドがHLA-A2陽性前立腺癌患者において、それぞれ前立腺癌反応性CTLを誘導する可能性があることを示した。HLA-A24陽性前立腺癌患者由来のPBMCは、PTHrP 36-44ペプチドまたはPTHrP 102-110ペプチドで刺激するとそれぞれ、10人の患者のうち７または6人においてペプチド特異的なIFN-γ産生を示した。HLA-A2結合性PTHrP 42-51ペプチドおよびPTHrP 59-67ペプチドは、10人の患者のうち５または４人においてペプチド特異的なIFN-γ産生を誘導した。さらに重要なことは、これらのPTHrPペプチドで刺激されたPBMCはHLA-A24またはHLA-A2拘束性に前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示したことである。これらの結果は、上記のPTHrPペプチドが免疫原性を有しており、転移を伴うHLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者の特異的な免疫療法に有用である可能性を示している。
【０００８】
これらペプチドはさらに、HLA-A24またはHLA-A2陽性健常ドナーのPBMCからペプチド特異的かつ腫瘍反応性のCTLを誘導した。この結果は、HLA-A2陽性健常ドナーのPBMCからPTHrPペプチド特異的CTLが誘導されることを示した既報[17]と整合している。これらペプチドとPTHとは相同性が低いことから、PTHrP ペプチドとPTHとの間の交差反応の可能性は除外できると考えられる。PTHrPはケラチン生成細胞、子宮および授乳期の乳腺において散発的に低レベルで検出される[27]。腫瘍免疫の最近の進歩により、ヒト癌細胞における自己抗原が免疫系に認識される主な腫瘍抗原であることが示された[2-4]。変異していない自己抗原に反応するCTL前駆体が特定の健常ドナーおよび癌患者の両者の末梢血に循環している可能性がある。
【０００９】
ここでは、本発明者らは、クラスI結合性腫瘍ペプチドに対する抗体が特定の癌患者や健常ドナーに既に観察されていることから[20, 21]、PTHrPペプチドに対するIgGがHLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者由来の血漿中において検出可能か否かを調べた。本発明者らは以前、前立腺関連抗原から誘導されたペプチドに反応するIgGが健常ドナーと前立腺癌患者に頻繁に検出されることを報告している[22-24]。本発明では、HLA-A24分子結合性ペプチドではPTHrP 102-111ペプチドまたはPTHrP 110-119ペプチドのいずれかに反応するIgGが、HLA-A2分子結合性ペプチドではPTHrP 42-51ペプチドに対するIgGが、健常ドナーおよび前立腺癌患者に頻繁に検出された。このことは、PTHrP 102-111およびPTHrP 42-51ペプチドが細胞性および液性免疫系の両者に認識されていることを意味する。抗腫瘍免疫応答においてペプチド特異的IgGが果たす役割は明確ではないが、本発明者らの臨床試験では、ペプチドワクチンにより投与したペプチドに反応するIgGを頻繁に誘導させることを観察している[28, 29]。さらに、投与したペプチドに反応するIgGの誘導は、進行性肺癌の患者の生存率の改善と正に相関していた[30]。胃癌の患者にペプチドワクチンを投与すると、投与ペプチドに対する細胞性免疫応答のみならず液性応答を示す患者では生存率が改善することが観察された[31]。さらに、投与したペプチドに反応するIgGの誘導は、再発性婦人科癌の患者における臨床効果と相関していた[32]。また、進行HRPCの患者におけるPTHrP 102-111ペプチドに特異的なIgGレベルは、非進行前立腺癌患者におけるそれよりも低いことを観察している（未掲載）。PTHrP 102-111ペプチドをこのような患者にワクチン投与すると、ペプチド特異的なIgGが誘導され、臨床効果を導くと考えられる。さらなる研究により、抗腫瘍免疫応答におけるペプチド特異的なIgGの役割が明らかになるであろう。
【好ましい態様の説明】
【００１０】
即ち、本発明は、
（１）副甲状腺ホルモン関連タンパク質由来の部分ペプチドであり、HLA-A24またはHLA-A2抗原に結合でき、細胞傷害性Tリンパ球に認識されうる癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体；好ましくは液性免疫系にさらに認識される癌抗原ペプチド；具体的には、配列番号１または２、もしくは配列番号３または４に示すアミノ酸配列を含む癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体；
（２）上記（１）記載の癌抗原ペプチドおよび機能的に同等の性質を有するその誘導体を少なくとも１つ活性成分として含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物、好ましくは前立腺癌が骨転移を伴う医薬組成物；
（３）上記（１）記載の癌抗原ペプチドおよび機能的に同等の性質を有するその誘導体を少なくとも１つ活性成分として含む、転移性骨病変を処置または予防するための医薬組成物；好ましくは転移性骨病変が前立腺癌に付随する医薬組成物；
（４）HLA-A24またはHLA-A2抗原と上記（１）記載の癌抗原ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体との複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球；および
（５）上記（４）記載の細胞傷害性Tリンパ球を活性成分として含む、前立腺癌を処置するための医薬組成物；好ましくは前立腺癌が骨転移を伴う医薬組成物；に関する。
【００１１】
本発明において、「癌抗原ペプチド」なる用語は、副甲状腺ホルモン関連タンパク質の一部を含む部分ペプチドであって、HLA-A24またはHLA-A2抗原に結合でき、CTLに認識されうる部分ペプチドを意味する。「副甲状腺ホルモン関連タンパク質」なる用語はPTHrPと略称され、生体のすべての組織ではないがほとんどの組織から産生されているタンパク質ホルモンのファミリーである。PTHrPは種間において高度に保存されている単一遺伝子にコードされており、PTHrPのアミノ酸配列は文献(35)に記載されている。本発明の癌抗原ペプチドは、PTHrPの一部を含むペプチド候補物質を合成し、そのペプチド候補物質とHLA分子との複合体がCTLによって認識されるか否かを決定する検定を行うことで、同定できる。
【００１２】
ペプチドの合成は、ペプチド化学において通常使用される方法によって行うことができる。既知の方法としては、“Peptide Synthesis”, Interscience, New York, 1966; “The Proteins”, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; “Pepuchido-Gosei”, Maruzen Co. Ltd., 1975などの文献に記載されている方法が挙げられる。
本発明の癌抗原ペプチドは、以下の実施例に示す手法により同定できる。
本発明において、「機能的に同等の性質を有する癌抗原ペプチドの誘導体」とは、本発明の癌抗原ペプチドのアミノ酸配列において１つまたは数個の置換、欠失および／または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ癌抗原ペプチドとしての性質、すなわちHLA-A24分子またはHLA-A2分子に結合できCTLに認識されうる性質を備えた改変ペプチドを意味する。
【００１３】
本発明においては、HLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者において液性および細胞性免疫系の両者に効率的に認識されるPTHrPペプチドが好ましい。
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体は、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物に使用でき、好ましくは前立腺癌は骨転移を伴っており、さらに転移性骨病変を処置または予防するための医薬組成物に使用でき、好ましくは転移性骨病変は前立腺癌に付随する。これら発明は、前立腺癌が非常に骨転移しやすく、骨破壊や骨吸収に関わるPTHrPを産生するという事実、および本発明のPTHrPペプチドが前立腺癌反応性CTLを誘導できるという結果に基づく。
【００１４】
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体は少なくとも１つ、またはその２つもしくはそれ以上を患者に投与し、要すれば免疫調整物質や化学療法物質などの他の抗癌剤とともに投与する。癌抗原ペプチドまたはその誘導体を投与すれば、それらは抗原提示細胞のHLA-A24またはHLA-A2とともに提示され、提示されたHLA抗原複合体に対するCTLが増殖し、腫瘍細胞を破壊する。その結果、患者の癌が治療され、あるいは腫瘍の増殖または転移が予防される。
【００１５】
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体を活性成分として含む組成物は、細胞性および／または液性免疫を効率的に確立するためにアジュバントとともに投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与または静脈注射が挙げられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体の投与量は、例えば処置目的の疾患状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.1mg〜10.0mg、好ましくは 0.5mg〜5.0mg、より好ましくは1.0mg〜3.0mgであり、これを数日ごとに投与する。
【００１６】
本発明は、HLA-A24またはHLA-A2抗原と癌抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識するCTLを、さらに、そのCTLを活性成分として含む前立腺癌を処置するための医薬組成物をも提供する。本発明の組成物は好ましくは生理食塩水またはリン酸緩衝化食塩水（PBS）を含む。これらは例えば静脈内、皮下または皮内に投与することができる。
【実施例】
【００１７】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。データの統計学的有意差は両側スチューデントｔ検定により求めた。０．０５以下のｐ値を統計学的に有意であると判断した。
実施例１
HLA-A24陽性前立腺癌患者からペプチド特異的CTLを惹起させる候補物質の同定
1.1  患者
すべてのHLA-A24陽性前立腺癌患者およびHLA-A24陽性健常ドナーはインフォームドコンセントを得た後に本試験に供した。前立腺癌患者＃2、＃3、＃5、および＃9が骨転移を伴っていた。すべての被験者にはHIVに非感染であった。末梢血２０ｍｌを採取し、フィコール・コンレイ密度勾配遠心によりPBMCを調製した。癌患者および健常ドナーのPBMCにおけるHLA-A24分子の発現はフローサイトメトリーにより測定した。
【００１８】
1.2  細胞株
C1R-A24は、C1Rリンパ腫由来でHLA-A*2402分子を発現する亜細胞株である(Oiso M, Eura M, Katsura F, Takiguchi M, Sobao Y, Masuyama K, Nakashima M, Itoh K, Ishikawa T. A newly identified MAGE-3-derived epitope recognized by HLA-A24-restricted cytotoxici T lymphocytes. Int. J. Cancer 81: 387-394, 1999)。すべての細胞株は、10％ FCSを添加したRPMI-1640培地(Gibco BRL, Grand Island, NY)に維持させた。
【００１９】
1.3  ペプチド
４つのPTHrP由来ペプチド（以下の表１に列記）を、HLA-A24分子に対する結合親和性、すなわちHLA-A24結合モチーフに基づき準備した[18, 19]。すべてのペプチドは>90%純度であり、Biologica Co.（名古屋、日本）から入手した。HLA-A24結合モチーフを有する、インフルエンザ（Flu）ウイルス由来ペプチド（RFYIQMCYEL）、EBV由来ペプチド（(TYGPVFMCL）およびHIV由来ペプチド（RYLRQQLLGI）を対照として用いた。すべてのペプチドをDMSOに溶解し、用量10 mg/mlとした。
PTHrP 1-36ペプチドはプロペプチドであるが[35]、PTHrP 25-34ペプチドを含めた。PTHrP 36-44とPTHとでは３つアミノ酸が相違し、他の３つのPTHrPペプチドとPTHとではすべてのアミノ酸が相違していた。
【００２０】
1.4  PBMCにおけるペプチド特異的CTLの検定
PBMCにおけるペプチド特異的CTLを検定し、４つのPTHrPペプチドの免疫原性を調べるため、HLA-A24陽性健常ドナー10名およびHLA-A24陽性前立腺癌患者10名のPBMCを４つのPTHrPペプチドそれぞれを用いて刺激し、次いで対応するPTHrPペプチドまたはHIVペプチドいずれかで前もってパルスしておいたC1R-A24細胞に応答して産生されるIFN-γを調べた。Flu-およびEBV-由来ペプチドを対照として用いた。
【００２１】
PBMCにおけるペプチド特異的CTLを検出するための上記検定は、既報の方法に従って行った[34]。簡単に説明すると、U底型96ウエルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において、培養培地200μｌの容量にてPBMCs (1 X 105 細胞/ウエル)を10 μg/mlの各ペプチドとインキュベートした。この培養培地には45% RPMI-1640、45% AIM-V 培地 (Gibco BRL)、10% FCS、100 U/ml IL-2および0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 (Gibco, BRL)が含まれている。3日毎に、培養培地の半分を取り出し、対応するペプチドを含む新たな培地(20 μg/ml)と置き換えた。培養の15日目に、培養細胞を４つのウエルに分け、２つのウエルにはPTHrPペプチド-パルスC1R-A24細胞を、他の２つのウエルにはHIV-パルスC1R-A24細胞を用いた。18時間インキュベートした後、上清を採取し、ELISA（限界感度：10 pg/ml）によりIFN-γレベルを測定した。
検定は個々のペプチドで各4ウエル回行い、２つの結果の平均を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0004579581.tif 000002
【００２３】
有意な値（両側スチューデントｔ検定によりp<0.05）が得られた場合、ペプチド特異的CTLの誘導の成功を陽性と判断した。結果、PTHrP 36-44、PTHrP 102-111、PTHrP 25-34およびPTHrP 110-119ペプチドがHLA-A24陽性健常ドナー１０のうちそれぞれ6、5、2および3名においてペプチド特異的CTLを誘導した。これらのPTHrPペプチドはさらに、HLA-A24陽性前立腺癌患者10名のうちそれぞれ7、6、3および1名においてペプチド特異的CTLを誘導した。これらは、PTHrP 36-44およびPTHrP 102-111がともに、HLA-A24陽性前立腺癌患者においてペプチド特異的CTLを産生させるための候補ペプチドであることを示している。
【００２４】
実施例２
HLA-A24拘束性でありPTHrP 36-44 または PTHrP 102-111ペプチドに特異的な前立腺癌反応性CTLの誘導
2.1   HLA-A24発現前立腺癌細胞株
ペプチド刺激PBMCのHLA-A24拘束性および前立腺癌に対する細胞傷害活性を調べるため、LNCaP-A24と命名したHLA-A24分子を恒常的に発現したLNCaP細胞系株を作製した。LNCaPはHLA-A24陰性の前立腺癌細胞株である。HLA-A24分子を恒常的に発現するLNCaP細胞（LNCaP-A24と命名）を樹立させるため、HLA-A*2402 遺伝子を挿入したpcDNA3.1/Hygro ベクター (Invitrogen, CA) をLNCaP細胞株 (ATCC 番号: CRL-1740)に電気的穿孔法で導入し、用量170μg/ml (Invitrogen)のハイグロマイシンBを用いて選別を行った。すべての細胞株は、10% FCSを添加したRPMI-1640培地 (Gibco BRL, Grand Island, NY)にて維持させた。LNCaPはPTHrPを産生することが既に報告されている(17)。親LNCaP細胞株はHLA-A24分子の細胞表面発現に関して陰性であるが、LNCaP-A24細胞株はその細胞表面にHLA-A24分子を発現している。LNCaP および LNCaP-A24に関するフローサイトメトリー分析の結果を図１に示す。フローサイトメトリー分析はLNCaP および LNCaP-A24細胞に対して行った。これらの細胞を抗-HLA-A24モノクローナル抗体、次いでFITC結合抗-マウスIgGモノクローナル抗体を用いて染色した。点線は第一モノクローナル抗体を用いずに染色した結果である。
【００２５】
2.2  指示したペプチドによる前立腺癌反応性CTLの誘導
次いで、PTHrP 36-44 またはPTHrP 102-111ペプチドいずれかで刺激したPBMCがHLA-A24陽性健常ドナーおよび前立腺癌患者由来の癌患者反応性CTLを誘導できるか否かを調べた。HLA-A24陽性健常ドナーおよび前立腺癌患者由来のPBMCをこれらのPTHrPペプチドで繰り返し刺激した。その結果、健常ドナー#2、患者#1および患者#2由来のPTHrPペプチド刺激PBMCが、HIV ペプチド-パルスC1R-A24細胞に対するよりも、刺激に用いたPTHrPペプチドをパルスしたC1R-A24細胞に応答してIFN-γを高いレベルで産生することが示された(図2A)。詳細には、15日目に4つのウエルから培養細胞の半分を採取し、プールし、それをHIVペプチド (白抜き記号) および上記PTHrPペプチド (黒色記号)で前もって18時間パルスしておいたC1R-A24細胞とともに培養した。次いで、上清におけるIFN-γのレベルをELISAにより測定した。
【００２６】
2.3  ３つの標的に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性
上記ペプチド刺激細胞がPTHrPペプチド-パルスC1R-A24細胞に応答してIFN-γを産生できることを確認した後、これらペプチド刺激PBMCを３つの標的であるLNCaP細胞 (HLA-A24陰性)、LNCaP-A24細胞 (HLA-A24陽性)およびPHA-芽球様T細胞 (HLA-A24陽性)に対する細胞傷害活性について試験した。詳細には、PTHrPペプチドによりインビトロ刺激した後、ペプチド刺激PBMCを100 U/ml IL-2とともにさらに約10日間培養し、細胞傷害活性検定を行うために充分な数の細胞を得た。次いで、得られた細胞を、6時間  51Cr放出検定によりLNCaP細胞、LNCaP-A24細胞およびPHA-芽球様T細胞に対する細胞傷害活性について試験した。96丸底ウエルプレートにおいて指示したエフェクター/標的比率において１ウエル当たり2000個の51Cr標識細胞をエフェクター細胞とともに培養した。この結果も図２Aに示す。健常ドナー#2、患者#1および患者#2由来のPTHrPペプチド刺激PBMCが、LNCaPおよびHLA-A24陽性PHA-誘導T芽球様細胞に対するよりもLNCaP-A24細胞株に対して高い細胞傷害活性レベルを有することが示された。
【００２７】
2.4   PTHrPペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性の抗体による阻害
次いで、いくつかの実験として、抗-HLAクラスI (W6/32: マウスIgG2a)、抗-HLA-DR (L243: マウスIgG2a)、抗-CD4 (NU-TH/I: マウスIgG1)、抗-CD8 (NU-TS/C: マウスIgG2a)、または抗-CD14 (H14: マウスIgG2a)抗体のいずれかを20 μg/mlで、検定の開始時にウエルに加えた。その結果、LNCaP-A24に対する細胞傷害活性が抗-HLAクラスIおよび抗-CD8モノクローナル抗体の添加により有意に阻害されたが、他の抗-HLAクラスII、抗-CD4または抗-CD14モノクローナル抗体の添加では阻害されないことが分かった（図２B）。
【００２８】
2.5  PTHrPペプチド刺激PBMCの特異性
さらに、PTHrPペプチド刺激PBMCの特異性をコールド標的細胞を用いた実験により確かめた。簡単に説明すると、2 X 104 コールド標的細胞を含有する96丸底ウエルプレートにおいて、51Cr-標識標的細胞 (2 X 103 細胞/ウエル)をペプチド刺激PBMC (4 X 104 細胞/ウエル)とともに培養した。HIVペプチドまたは対応するPTHrPペプチドのいずれかで前もってパルスしておいたC1R-A24細胞をコールド標的として使用した。LNCaP-A24細胞株に対する細胞傷害活性は、対応するPTHrPペプチド-パルスC1R-A24細胞をコールド標的として添加することにより有意に抑制されたが、この抑制は、HIVペプチド-パルスC1R-A24細胞を添加しても認められなかった(図2C)。
これらの結果は、PTHrP 36-44 および PTHrP 102-111ペプチドの両者がHLA-A24陽性前立腺癌患者において前立腺癌反応性CTLを誘導する可能性があることを、さらに、それらの前立腺癌に対する細胞傷害活性がPTHrPペプチド特異的なCD8陽性T細胞に依存していることを示している。
【００２９】
実施例３
HLA-A24分子結合性PTHrPペプチドに対するIgG反応性の検出
本発明者らはすでに、CTLエピトープペプチドに反応するIgGが健常ドナーと種々の型の癌患者において検出されることを報告した[20, 21]。前立腺関連抗原に反応するIgGも健常ドナーおよび前立腺癌患者において検出されている[22-24]。従って、ここにおいて、上記４つのPTHrP-由来ペプチドに反応するIgGが癌患者および健常ドナーの血漿中に検出されるか否かを調べた。
【００３０】
既報[20, 21]のようにして、血漿中のペプチド特異的IgGレベルをELISAにより測定した。簡単に説明すると、ペプチド（20 μｇ/ウエル）固定化プレートをBlock Ace (雪印, 東京, 日本)によりブロックし、0.05% Tween20-PBSで洗浄し、次いで0.05% Tween20-Block Aceで希釈した血漿試料を100μｌ/ウエルでプレートに加えた。３７℃で2時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、1:1000に希釈したウサギ抗-ヒトIgG (γ-鎖特異的) (DAKO, Glostrup, デンマーク)とともにさらに2時間インキュベートした。得られたプレートを洗浄し後、1:100に希釈したヤギ抗-ウサギIgG-結合ペルオキシダーゼ(EnVision, DAKO)１００μｌを各ウエルに加え、次いで室温にて40分間インキュベートした。プレートを1回洗浄し、100μｌ/ウエルでテトラメチルベンジジン基質溶液(KPL, Guildford, UK)を加えた後、1Mリン酸を加えて反応を停止させた。値は吸光度(OD)単位/mlで示し、HIVペプチドに対する応答を差し引いた。対応するPTHrPペプチドに反応するIgGは、1:100希釈血漿におけるODの差異が0.05を超えた場合に陽性を判断した。PTHrP102-111 または PTHrP 109-119ペプチドのいずれかに反応するIgGは10人の健常ドナーのうち8人に、そして10人の前立腺癌患者のうち7人に検出される結果が以下の表２に示すように得られた。結果は図３Aにも示している。
【００３１】
示したPTHrPペプチドに対するIgGの特異性を確認するため、健常ドナー#1および患者#6のいずれか由来の血漿試料100μｌを、対応するPTHrPペプチドまたは無関係のPTHrPペプチドのいずれかで前もってコートしておいたプレート中で培養した。次いで、得られた上清におけるPTHrP 102-111ペプチドまたはPTHrP 110-119ペプチドに反応するIgGレベルをELISAにより測定した。
【００３２】
他方、PTHrP 36-44ペプチドに反応するIgGが10人の健常ドナーのうち３人に、そして10人の前立腺癌患者のうち１人にそれぞれ検出された。PTHrP 25-34に反応するIgGは健常ドナー、癌患者いずれにも検出されなかった。PTHrPペプチド特異的IgGのレベルは、対応するPTHrPペプチドコートウエル中で血漿を培養することにより減少した（図３B）。このペプチド特異的な吸収は、本検定システムが信頼できることを示している。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
実施例４
HLA-A2陽性前立腺癌患者からペプチド特異的CTLを誘導できる候補物質の同定
4.1  患者、細胞株、およびペプチド
実施例１と同様にして、HLA-A2陽性前立腺癌患者においてペプチド特異的CTLを誘導できるPTHrP由来ペプチドを同定した。癌患者＃1、＃3および＃10が骨転移を伴っていた。標的細胞としてHLA-A0201*分子を発現するリンパ腫由来細胞株であるT2細胞（ATCC寄託番号：CRL-1992）を用いた。HLA-A2結合モチーフを有する７つのPTHrP由来ペプチドを準備した（表３に列記）。PTHrP 59-68およびPTHrP 165-173はHLA-A0201*健常ドナーから特異的CTLを誘導することが以前に報告されているが[17]、本発明においては推定結合スコアーが１未満であった（表３）。PTHと共有するアミノ酸の数を以下に示す：PTHrP 42-51（5）、PTHrP 143-51（4）、PTHrP 51-60（2）、PTHrP 59-67（1）、PTHrP 103-111（0）。
【００３５】
4.2  PBMCにおけるペプチド特異的CTLの検定
HLA-A2陽性健常ドナー10名およびHLA-A2陽性前立腺癌患者10名において、これらペプチドの特異的CTL誘導能を検討した結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
0004579581.tif 000004
【００３７】
PTHrP 42-51およびPTHrP 59-67ペプチドが、HLA-A2陽性健常ドナー10名のうちそれぞれ7名および4名においてペプチド特異的CTLを誘導した。既報のPTHrP 59-68ぺプチドはPTHrP 59-67ペプチドと１アミノ酸しか相違しないが、PTHrP 59-68ぺプチドはHLA-A2陽性健常ドナー由来のPBMCにおいてペプチド特異的CTLを誘導しなかった。既報のPTHrP 165-173ぺプチドは、HLA-A2陽性健常ドナー10名のうち4名においてペプチド特異的CTLを誘導した。PTHrP 42-51およびPTHrP 59-67ペプチドは、HLA-A2陽性前立腺癌患者10名のうちそれぞれ5名および4名においてペプチド特異的CTLを誘導した。既報のPTHrP 59-68およびPTHrP 165-173ぺプチドは、HLA-A2陽性前立腺癌患者10名のうちそれぞれ5名および3名においてペプチド特異的CTLを誘導した。
【００３８】
PTHrP 59-68ペプチドとPTHrP 59-67ペプチドでは、ペプチド特異的CTLが誘導される患者がほとんど異なっている（表３）。これらの結果は、本発明のPTHrP 42-51およびPTHrP 59-67ぺプチドが、HLA-A2陽性前立腺癌患者においてペプチド特異的CTLを誘導するのに有用な新規の候補ペプチドであることを示している。
【００３９】
実施例５
HLA-A2拘束性でありPTHrP 42-51 または PTHrP 59-67ペプチドに特異的な前立腺癌反応性CTLの誘導
実施例２と同様にして、HLA-A2陽性健常ドナーおよびHLA-A2陽性前立腺癌患者由来PBMCにおいて、PTHrP 42-51およびPTHrP 59-67ぺプチドが癌細胞反応性CTLを誘導できるかについて調べた。HLA-A2発現前立腺細胞株は、HLA-A2陰性前立腺癌細胞株であるPC93細胞（Dr. K. Ohnishi, Department of Urology, Kyoto University, Japanにより樹立）にHLA-A*0201分子を恒常的に発現させることにより作製した（PC93-A2細胞）。本細胞株のHLA-A*0201分子の発現は以前に報告されている[24]。またPC93細胞は、2.2pmol/l（1×106 細胞/ml、24時間）のレベルのPTHrPを産生した。
【００４０】
PTHrP 42-51およびPTHrP 59-67ぺプチドで刺激したPBMCが、対応ペプチドでパルスしたT2細胞に反応してIFN-γを産生できることを確認した（図４A）。これらペプチド刺激PBMCの、PC93細胞、PC93-A2細胞、およびPHA芽球様T細胞に対する細胞傷害活性を図4Bに示す。図５には、これらのペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性を（A）ブロッキング抗体、および（B）コールド阻害アッセイを用いて検討した結果を示す。これらの結果は、PTHrP 42-51およびPTHrP 59-67ぺプチドが、HLA-A2陽性前立腺癌患者において前立腺癌反応性CTLを誘導し得ること、およびその細胞傷害活性がペプチド特異的なCD8陽性細胞に依存することを示唆している。
【００４１】
実施例６
HLA-A2結合性PTHrPペプチドに反応するIgGの検出
実施例３と同様にして、健常ドナー10人および癌患者10人の血漿中にPTHrP 42-51およびPTHrP 59-67ぺプチドに特異的なIgGが存在するかについて検討した。1：100希釈血清でのカットオフ値はOD0.054とした。結果は表4に示す。
【表４】
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【００４２】
PTHrP 42-51ペプチドに反応するIgGは、健常ドナー10人のうち8人において、および前立腺癌患者10人のうち7人において検出された。PTHrP 59-67ぺプチドに反応するIgGは、健常ドナー10人のうち2人において、および前立腺癌患者10人のうち2人において検出された。健常ドナー2人（HD＃１およびHD＃6）および癌患者2人（Pt＃1およびPt＃2）の代表的結果を図６Aに示す。IgGのペプチド特異性を対応ペプチドでの吸収によって検討した結果を図６Bに示す。以上の結果は、これらペプチド、特にPTHrP 42-51ペプチドが、癌患者において細胞性および液性免疫応答の両者を誘導することを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明者らは、HLA-A24または-HLAA2陽性前立腺癌患者において免疫原性である新たな４つのPTHrP由来ペプチドを同定した。HLA-A24アレルの頻度は全世界を通じて比較的高い[33]。また、白人の多くがHLA-A*0201陽性である。一方日本人においては、HLA-A2サブタイプは非常に変化に富んでいる。本発明のHLA-A2分子結合性PTHrP由来ペプチドはHLA-A*0201分子結合モチーフに基づいて調製し、かつT2細胞およびPC93-A2細胞もHLA-A*0201分子を発現していた。しかしながら本発明のペプチドは、表３に示されるように、HLA-A*0206、HLA-A*0207およびHLA-A*0210を含む他のHLA-A2サブタイプを有する患者においてもペプチド特異的CTLを誘導した。本発明の情報は、転移を伴うHLA-A24またはHLA-A2陽性前立腺癌患者に対するペプチドに基づく免疫療法により処置する可能性を開くものである。
【００４４】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】LNCaPおよびHLA-A24-発現LNCaP細胞株LNCaP-A24についてのフローサイトメトリー分析の結果である。点線は第1のモノクローナル抗体不存在下での染色である。
【図２】健常ドナー（HD）および癌患者（Pt）のPBMCからのHLA-A24拘束性前立腺癌反応性CTLの誘導を示す。(A)：図示したペプチドによる前立腺癌反応性CTLの誘導、およびLNCaP 細胞 (HLA-A24陰性)、LNCaP-A24 細胞 (HLA-A24陽性)およびPHA-芽球様T細胞 (HLA-A24陽性)に対するそれらの細胞傷害活性を示すグラフである。値は3回の検定の平均である。* P<0.05は統計学的に有意と考えられた。(B)：PTHrPペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性に対する抗体の阻害を示すグラフである。値は3回の検定の平均である。* P<0.05は統計学的に有意と考えられた。(C)：PTHrPペプチド刺激CTLの細胞傷害活性の阻害を示すグラフである。値は3回の検定の平均である。* P<0.05は統計学的に有意と考えられた。
【図３】健常ドナーおよび前立腺癌患者由来の血漿におけるPTHrPペプチドに対するIgG反応性を示す。(A)：6人の健常ドナーおよび６人の前立腺癌患者由来のペプチド特異的IgGの結果を吸光度 (OD)として示すグラフである。(B)：図示したPTHrPペプチドに対するIgGのペプチド特異的吸収を示すグラフである。
【図４】健常ドナーおよび癌患者のPBMCからのHLA-A2拘束性前立腺癌反応性CTLの誘導を示す。  （A）：図示したペプチドによるペプチド特異的CTLの誘導、および（B）：PC93細胞 (HLA-A2陰性)、PC93-A2 細胞 (HLA-A2陽性)およびPHA-芽球様T細胞 (HLA-A2陽性)に対するそれらの細胞傷害活性を示すグラフである。値は3回の検定の平均である。* P<0.05は統計学的に有意と考えられた。
【図５】(A)：PTHrPペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性に対する抗体の阻害を示すグラフである。値は3回の検定の平均である。* P<0.05は統計学的に有意と考えられた。(B)： PTHrPペプチド刺激CTLの細胞傷害活性の阻害を示すグラフである。コールド標的細胞としてペプチド-パルス非標識T2細胞を用いた。値は3回の検定の平均である。* P<0.05は統計学的に有意と考えられた。
【図６】健常ドナーおよび前立腺癌患者由来の血漿におけるPTHrPペプチドに対するIgG反応性を示す。(A)：健常ドナー2人および前立腺癌患者2人由来のペプチド特異的IgGの結果を吸光度 (OD)として示すグラフである。(B)：図示したPTHrPペプチドに対するIgGのペプチド特異的吸収を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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