(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８個の可変ドメインを有する、多量体である四価のＦv 抗体構築物であって、ここで単鎖Ｆv 抗体構築物が別の単鎖Ｆv 構築物で折り畳まれ、かつ各単鎖Ｆv 構築物が、ペプチドリンカー１、２および３によって互いに連結されている４個の可変ドメインを有し、ここでペプチドリンカー１および３が０〜１０個のアミノ酸を有し、中央のペプチドリンカー２が１０個までのアミノ酸の長さを有する、Ｆv 抗体構築物。
【請求項２】
ペプチドリンカー１および３がアミノ酸配列ＧＧを有してなるものである、請求項１記載のＦv 抗体構築物。
【請求項３】
ペプチドリンカー２が３〜１０個のアミノ酸を有してなるものである、請求項１または２記載のＦv 抗体構築物。
【請求項４】
ペプチドリンカー２がアミノ酸配列ＧＧＰＧＳを含有してなるものである、請求項３記載のＦv 抗体構築物。
【請求項５】
Ｆv 抗体構築物が二重特異性である、請求項１〜４いずれか記載のＦv 抗体構築物。
【請求項６】
Ｆv 抗体構築物が単一特異性である、請求項１〜４いずれか１つに記載のＦv 抗体構築物。
【請求項７】
Ｆv 抗体構築物が、CD3およびCD19からなる群より選択される抗原に対して特異的である、請求項１〜６いずれか記載のＦv 抗体構築物。
【請求項８】
ペプチドリンカーが可変ドメインを互いに連結し、得られるＤＮＡ分子が発現プラスミド中に発現されるように、ペプチドリンカー１、２および３をコードするＤＮＡが、単鎖Ｆv 構築物の４個の可変ドメインをコードするＤＮＡと連結されているものである、請求項１〜７いずれか１つに記載の多量体である四価のＦv 抗体構築物の産生方法。
【請求項９】
請求項１〜７いずれか１つに記載の多量体である四価のＦv 抗体構築物をコードする発現プラスミド。
【請求項１０】
ＤＳＭ  １２１４９としてＤＳＭＺに寄託された、請求項９記載の発現プラスミド。
【請求項１１】
ＤＳＭ  １２１５１としてＤＳＭＺに寄託された、請求項９記載の発現プラスミド。
【請求項１２】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７記載のＦｖ抗体構築物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、多価ＦV 抗体構築物、それらをコードする発現プラスミド、およびＦV 抗体構築物の産生方法ならびにそれらの使用に関する。
【０００２】
天然の抗体は、ダイマーであり、それゆえ、二価と呼ばれる。それらは、４個の可変ドメイン、すなわち２個のＶH ドメインおよび２個のＶL ドメインを有する。可変ドメインは、抗原に対する結合部位として働き、結合部位は、ＶH ドメインおよびＶL ドメインから形成される。天然の抗体は、各々１つの抗原を認識し、その結果、それらはまた、単一特異性と呼ばれる。さらに、それらはまた、天然の抗体に安定性を付加する定常ドメインを有する。他方で、それらはまた、種々の動物種の天然の抗体が相互に投与される場合に生じる所望されない免疫応答に対して同時応答である。
【０００３】
かかる免疫応答を回避するために、定常ドメインを欠失する抗体が構築される。詳細には、これらは、可変ドメインのみを含む抗体である。かかる抗体は、ＦV 抗体構築物と称される。それらは、互いにペアとなる単鎖モノマーの形態でしばしば入手可能である。
【０００４】
しかし、このことは、ＦV 抗体構築物がわずかな安定性しか有さないことを示した。それゆえ、治療目的に関するそれらの有用性は、強固に限定されている。
【０００５】
従って、本発明の目的は、所望されない免疫応答が回避され得る抗体を提供することである。さらに、この抗体は、抗体を治療使用に有用であるようにする安定性を有するだろう。
【０００６】
本発明により、このことは請求の範囲に規定される主題によって達成される。
【０００７】
それゆえ、本発明の主題は、大きな安定性を有する多価ＦV 抗体構築物に関する。かかる構築物は診断および治療目的に適切である。
【０００８】
本発明は、４個の可変ドメインが３個のペプチドリンカーによって互いに連結さている単鎖ダイマーの形態でＦV 抗体構築物が存在する場合、ＦV 抗体構築物の安定性が増大するという出願人の見識に基づく。出願人はまた、中央のペプチドリンカーが約１０〜３０個のアミノ酸の長さを有する場合に、ＦV 抗体構築物が、それ自身で折り畳まれることを認識していた。出願人はまた、多量体、すなわち、多価のＦV 抗体構築物が得られるように、中央のペプチドリンカーが、約１０個のアミノ酸までの長さを有する場合、他のＦV 抗体構築物で折り畳まれることを認識していた。出願人はまた、ＦV 抗体構築物が多重特異性であり得ることを理解した。
【０００９】
本発明により、出願人の見識は、ペプチドリンカー１、２および３によって互いに連結されている少なくとも４個の可変ドメインを含有してなる多価ＦV 抗体構築物を提供するために利用される。
【００１０】
表現「ＦV 抗体構築物」とは、可変ドメインを有するが定常ドメインを有さない抗体をいう。
【００１１】
表現「多価ＦV 抗体構築物」とは、数個、少なくとも４個の可変ドメインを有するＦV 抗体をいう。これは、単鎖ＦV 抗体構築物が、４個の可変ドメインを生じるためにそれ自身で折り畳まれるか、または他の単鎖ＦV 抗体構築物で折り畳まれる場合に達成される。後者の場合、８個、１２個、１６個などの可変ドメインを有するＦV 抗体構築物が得られる。４個または８個の可変ドメインを有すること、すなわち、二価または四価であることが、ＦV 抗体構築物にとって好ましい（図１を参照のこと）。さらに、可変ドメインは、互いに等しくてもよいし、異なっていてもよく、その結果、抗体構築物は、１つまたは数個の抗原を認識する。抗体構築物は、好ましくは１つまたは２つの抗原を認識し、すなわち、それはそれぞれ単一特異性および二重特異性である。かかる抗原の例は、タンパク質ＣＤ１９およびＣＤ３である。
【００１２】
表現「ペプチドリンカー１、３」とは、ＦV 抗体構築物の可変ドメインを互いに連結するのに適合したペプチドリンカーをいう。ペプチドリンカーは、任意のアミノ酸を含み得、アミノ酸グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）およびプロリン（Ｐ）が好ましい。ペプチドリンカー１および３は、互いに等しくてもよいし、異なっていってもよい。さらに、ペプチドリンカーは、約０〜１０個のアミノ酸の長さを有し得る。前者の場合、ペプチドリンカーは、一方の可変ドメインのＣＯＯＨ残基からのペプチド結合および他方の可変ドメインのＮＨ2 残基からのペプチド結合のみである。ペプチドリンカーは、好ましくはアミノ酸配列ＧＧを含む。
【００１３】
表現「ペプチドリンカー２」とは、ＦV 抗体構築物の可変ドメインを互いに連結するのに適合したペプチドリンカーをいう。ペプチドリンカーは、任意のアミノ酸を含み得、アミノ酸グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）およびプロリン（Ｐ）が好ましい。ペプチドリンカーはまた、単鎖ＦV 抗体構築物が他の単鎖ＦV 抗体構築物で折り畳まれることを達成するために働く、約３〜１０個のアミノ酸の長さ、詳細には５個のアミノ酸、そして最も詳細には、アミノ酸配列ＧＧＰＧＳを有し得る。ペプチドリンカーはまた、単鎖ＦV 抗体構築物がそれ自身で折り畳まれることを達成するために働く、約１１〜２０個のアミノ酸の長さ、詳細には１５〜２０個のアミノ酸、そしてより詳細にはアミノ酸配列（Ｇ4 Ｓ）4 を有し得る。
【００１４】
本発明によるＦV 抗体構築物は、一般的な方法によって産生され得る。ペプチドリンカーが可変ドメインを互いに連結し、得られるＤＮＡ分子が、発現プラスミド中に発現されるように、ペプチドリンカー１、２および３をコードするＤＮＡが、ＦV 抗体構築物の４個の可変ドメインをコードするＤＮＡと連結されている方法が好ましい。実施例１〜６を参照されたい。表現「ＦV 抗体構築物」および「ペプチドリンカー」に関しては、上記説明および追加として、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８２を参照のこと。
【００１５】
本発明によるＦV 抗体構築物をコードするＤＮＡはまた、本発明の主題を表す。さらに、かかるＤＮＡを含む発現プラスミドはまた、本発明の主題を表す。好ましい発現プラスミドは、ｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬ、ｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬ、ｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＬＬ、ｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＳＬ、ｐＤＩＳＣ５−ＬＬおよびｐＤＩＳＣ６−ＳＬである。最初の４つは、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｅｎ）［Ｇｅｒｍａｎ−ｔｙｐｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ］に１９９８年４月３０日に、各々ＤＳＭ１２１５０、ＤＳＭ１２１４９、ＤＳＭ１２１５２およびＤＳＭ１２１５１という名称で寄託された。
【００１６】
本発明の別の主題は、
（ａ）本発明によるＦV 抗体構築物、および／または
（ｂ）本発明による発現プラスミド、および
（ｃ）従来の補助薬剤、例えば、緩衝液、溶媒および対照、
を含むキットに関する。
【００１７】
個々の成分の１つまたは数個の代表が示され得る。
【００１８】
本発明は、可変ドメインがペプチドリンカーによって互いに連結されている多価ＦV 抗体構築物を提供する。かかる抗体構築物は、それが所望されない免疫反応を導き得る部分を含まない点でそれ自身を区別する。さらに、それは大きな安定性を有する。それはまた、数個の抗原に同時に結合し得る。それゆえ、本発明によるＦV 抗体構築物は、診断目的用だけでなく治療目的用における使用に完全に適合する。かかる目的は、任意の疾患、詳細にはウイルス性、細菌性または腫瘍性の疾患に関して見られ得る。
【００１９】
本発明は、下記の実施例によって説明される。
【００２０】
実施例１：細菌における、二価、二重特異性および／または四価、二重特異性ＦV 抗体構築物の発現のためのプラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬおよびｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬの構築。
ヒトＣＤ１９に特異的であるハイブリドーマＨＤ３７（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９６、５１〜６２）およびヒトＣＤ３に特異的であるハイブリドーマＯＫＴ３（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０、４４５〜４５３）のそれぞれに由来するｓｃＦｖフラグメントをコードするプラスミドｐＨＯＧ−αＣＤ１９およびｐＨＯＧ−ｄｍＯＫＴ３を、単鎖ＦV 抗体構築物に対する発現プラスミドの構築のために使用した。抗ＣＤ１９のＶH ドメインのＰＣＲフラグメント１、それに続くＧｌｙＧｌｙリンカーをコードするセグメントを、プライマーＤＰ１、５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣ−ＴＴＡＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣ、およびＤＰ２、５’−ＡＧＣＡＣＡＣＧＡＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣを用いて作成した（図２を参照のこと）。ＰＣＲフラグメント１を、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶにより切断し、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ線状化プラスミドｐＨＯＧ−ｄｍＯＫＴ３と連結して、ベクターｐＨＯＧ１９−３を作成した。抗ＣＤ１９のＶL ドメインのＰＣＲフラグメント２、それに続くｃ−ｍｙｃエピトープおよびヘキサヒスチジニル尾部をコードするセグメントを、プライマーＤＰ３、５’−ＡＧＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣ−ＴＣＣＡおよびＤＰ４、５’−ＡＧＣＡＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧを用いて作成した。ＰＣＲフラグメント２を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩにより切断し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ線状化プラスミドｐＨＯＧ−ｄｍＯＫＴ３と連結して、ベクターｐＨＯＧ３−１９を得た（図２を参照のこと）。プラスミドｐＨＯＧ３−１９中のハイブリッドｓｃＦｖ−３−１９をコードする遺伝子を、プライマーＢｉ３ｓｋ、５’−ＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧ、および長い可動性（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）4 インターｓｃＦｖリンカーの生成のためのＬｉ−１、５’−ＴＡＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧ（ＰＣＲフラグメント３、図２を参照のこと）または短く強固なＧＧＰＧＳリンカーの生成のためのＬｉ−２、５’−ＴＡＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧ（ＰＣＲフラグメント４、図２を参照のこと）のいずれかを用いるＰＣＲによって増幅した。発現プラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬおよびｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬを、ｐＨＯＧ１９−３（ベクターフレームワークおよびＮｃｏＩ／ＰｖｕＩＩ切断ＰＣＲフラグメント３および４それぞれを含む）に由来するＮｃｏＩ／ＰｖｕＩＩ制限フラグメントを連結することによって構築した（図３、４を参照のこと）。二価および四価のＦV 抗体構築物の完全なヌクレオチドおよびタンパク質配列を、それぞれ図５および図６に示す。
【００２１】
実施例２：酵母における、二価、二重特異性および／または四価、二重特異性ＦV 抗体構築物の発現のためのプラスミドｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＬＬおよびｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＳＬの構築
（Ａ）ｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＳＬの構築
酵母ピヒアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における、組換えタンパク質の発現および分泌のためのベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ、Ｌｅｅｋ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、開始物質として使用した。これは、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子分泌シグナルをコードする遺伝子、それに続いてポリリンカーを含む。このベクターの分泌は、ピヒアおよび大腸菌の両方において二機能性である優性選択マーカー、ＺｅｏｃｉｎTMに基づく。四価ＦV 抗体構築物（ｓｃＤｉａ−ＳＬ）をコードする遺伝子を、プライマー５−ＰＩＣ、５’−ＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣおよびｐＳＥＸＢｎ  ５’−ＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＣＧを用いてテンプレートｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬによってＰＣＲを用いて増幅した。得られるＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによって切断し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ線状化ｐＰＩＣＺαＡに連結した。発現プラスミドｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＳＬを得た。四価ＦV 抗体構築物のヌクレオチドおよびタンパク質配列を、図７に示す。
【００２２】
（Ｂ）ｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＬＬの構築
ｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＬＬの構築を、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ、Ｌｅｅｋ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬ（図３を参照のこと）に基づいて行った。プラスミドＤＮＡ  ｐＰＩＣＺαＡをＥｃｏＲＩによって切断した。突出した５’末端を大腸菌  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて埋めた。得られたＤＮＡをＸｂａＩによって切断し、ｐＰＩＣベクターを含む大きいフラグメントを単離した。同様に、ｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬのＤＮＡを、ＮｃｏＩにより切断し、クレノウフラグメントで処理した。ＸｂａＩを用いた切断の後に、二価ＦV 抗体をコードする遺伝子を含む小さなフラグメントを単離した。ｐＰＩＣ由来ベクターＤＮＡとのライゲーションにより、プラスミドｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＬＬを得た。二価ＦV 抗体構築物のヌクレオチドおよびタンパク質配列を図８に示す。
【００２３】
実施例３：細菌における、四価および／または二価ＦV 抗体構築物の発現
発現プラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬおよびｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬそれぞれで形質転換した大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１００ｍＭグルコースを有する２×ＹＴ培地（２×ＹＴGA）中で３７℃にて一晩培養した。２×ＹＴGAにおける一晩培養物の１：５０希釈物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でフラスコ培養物として培養した。培養物が０．８のＯＤ600 値に達したときに、細菌を１５００ｇで２０℃での１０分間の遠心分離によりペレット化し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．４Ｍショ糖を含有する同容量の新鮮な２×ＹＴ培地に再懸濁した。ＩＰＴＧを、０．１ｍＭの最終濃度まで添加し、増殖を室温（２０〜２２℃）で１８〜２０時間続けた。細胞を、５０００ｇで４℃での１０分間の遠心分離によって収集した。培養上清を保持し、氷上で保存した。可溶性の周辺質タンパク質を単離するために、ペレット化細菌を、最初の容量の５％の氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％ショ糖、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再懸濁した。時折撹拌しながらの氷上での１時間のインキュベーションの後に、スフェロプラストを、３０，０００ｇで４℃にて３０分間遠心分離し、可溶性周辺質抽出物を上清として得、不溶性周辺質物質を有するスフェロプラストをペレットとして得た。培養上清および可溶性周辺質抽出物を組み合わせ、さらなる遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、４０分間）によって明澄化した。組換え産物を、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した（最終濃度７０％飽和）。タンパク質沈殿物を、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、４０分）によって得、最初の容量の１０％の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶解させた。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を、Ｃｕ2+で荷電し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（開始緩衝液）で平衡化したキレートセファロースの５ｍｌカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて４℃で行った。カラムを通過させることによってサンプルをロードした。次いで、２０カラム容量の開始緩衝液で洗浄し、続いて溶出物の２８０ｎｍでの吸収が最小になるまで、５０ｍＭイミダゾールを有する開始緩衝液で洗浄した（約３０カラム容量）。吸収された物質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．０で溶出させた。
【００２４】
タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）タンパク質アッセイキットを用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ染料結合試験（１９７６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４）で測定した。精製された四価および二価のＦV 抗体構築物の濃度を、吸光係数ε1mg/ml＝１．９６および１．９３それぞれを用いて、Ａ280 値から決定した。
【００２５】
実施例４：酵母ピヒアパストリスにおける、四価および／または二価抗体構築物の発現
コンピテントなＰ．パストリスＧＳ１５５細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＳａｃＩで線状化したｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＬＬおよびｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＳＬそれぞれの１０μｇのプラスミドＤＮＡの存在下でエレクトロポレートした。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌ  ＺｅｏｃｉｎTMを含有するＹＰＤプレート上での３０℃で３日間について選択した。二価および／または四価ＦV 抗体構築物を分泌するクローンを、抗ｃ−ｍｙｃ−ｍＡｋ  ９Ｅ１０（ＩＣ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ、Ｉｓｍａｎｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたプレートスクリーニングによって選択した。
【００２６】
二価ＦV 抗体構築物および四価ＦV 抗体構築物それぞれの発現のために、クローンを、撹拌しながら、振盪フラスコ中のＹＰＤ培地中で３０℃にて２日間培養した。細胞を遠心分離し、メタノールを含有する同じ容量の培地中に再懸濁し、撹拌しながら、３０℃でさらに３日間インキュベートした。上清を遠心分離後に得た。組換え産物を、硫酸アンモニウム沈殿により単離し、続いて上記のようなＩＭＡＣを行った。
【００２７】
実施例５：四価ＦV 抗体構築物および二価ＦV 抗体構築物それぞれの特徴付け
（Ａ）サイズ排除クロマトグラフィー
ＦV 抗体構築物の分析用ゲル濾過を、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００−ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＰＢＳ中で行った。サンプル容量および流速は、それぞれ２００μｌ／分および０．５ｍｌ／分であった。カラムを高分子および低分子ゲル濾過キャリブレーションキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて較正した。
【００２８】
（Ｂ）フローサイトメトリー
ヒトＣＤ３+ ／ＣＤ１９- 急性Ｔ細胞白血病株ジャーカットおよびＣＤ１９+ ／ＣＤ３- Ｂ細胞株ＪＯＫ−１を、フローサイトメトリーのために使用した。１０％  ＦＣＳおよび０．１％  アジ化ナトリウムを補充した５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｅｇｇｅｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（完全培地と呼ぶ）中の５×１０5 の細胞を、１００μｌのＦV 抗体調製物とともに氷上で４５分間インキュベートした。完全培地を用いた洗浄の後に、細胞を同一の緩衝液中で１００μｌの１０μｇ／ｍｌ抗ｃ−ｍｙｃ−Ｍａｋ  ９Ｅ１０（ＩＣ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ）とともに氷上で４５分間インキュベートした。第２の洗浄サイクルの後、細胞を、上記と同じ条件下で１００μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ−抗マウス−ＩｇＧ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）とともにインキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、死細胞を排除した完全培地中の１００μｌの１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に再懸濁した。染色細胞の比較蛍光を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて測定した。
【００２９】
（Ｃ）細胞傷害性試験
ＣＤ１９発現バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫細胞株ＲａｊｉおよびＮａｍａｌｗａを、標的細胞として使用した。細胞を、１０％熱不活化ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中で、３７℃で７．５％ＣＯ2 を有する加湿した雰囲気下でインキュベートした。細胞傷害性Ｔ細胞試験を、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸および０．０５ｍＭ  ２−ＭＥを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で行った。細胞傷害性活性を、標準的な［51Ｃｒ］放出試験を用いて評価した；２×１０6 標的細胞を２００μＣｉのＮａ［51Ｃｒ］Ｏ4 （Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｕｃｈｌｅｒ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で標識し、そして４回洗浄し、次いで２×１０5 ／ｍｌの濃度で培地中に再懸濁した。エフェクター細胞を５×１０6 ／ｍｌの濃度に調整した。１００μｌ中の漸増する量のＣＴＬを、５０μｌ中の１０4 標的細胞／ウェルまたは腔に対して滴定した。５０μｌの抗体を、各ウェルに添加した。全体の試験を３回調製し、３７℃で４時間インキュベートした。１００μｌの上清を収集し、ガンマカウンターにおいて［51Ｃｒ］放出について試験した（Ｃｏｂｒａ  Ａｕｔｏ  Ｇａｍｍａ；Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。最大放出を、１０％ＳＤＳ中での標的細胞のインキュベーションによって測定し、自然放出を培地単独中での細胞のインキュベーションによって測定した。特異的溶解（％）を、（実験の放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００として計算した。
【００３０】
実施例６：高細胞密度発酵による、細菌における二価、二重特異性および／または四価、二重特異性ＦV 抗体構築物の発現のためのプラスミドｐＤＩＳＣ５−ＬＬおよびｐＤＩＳＣＳ５−ＳＬの構築
組換え抗体のより大きな産生のためのｈｏｋ／ｓｏｋプラスミド非含有細胞自殺系およびＳｋｐ／ＯｍｐＨ周辺質因子をコードする遺伝子を含む発現ベクターを調製した。ｓｋｐ遺伝子を、プラスミドｐＧＡＨ３１７（ＨｏｌｃｋおよびＫｌｅｐｐｅ、１９８８、Ｇｅｎｅ  ６７、１１７〜１２４）を用いて、プライマーｓｋｐ−１、５’−ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＡＴＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  Ｇおよびｓｋｐ−２、５’−ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  Ｇを用いるＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲフラグメントを、ＡｆｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、ＡｆｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ線状化プラスミドｐＨＫＫ（Ｈｏｒｎら、１９９６、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６、５２４〜５３２）に挿入し、ベクターｐＳＫＫを得た。プラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬ中およびｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬ中に得られ、そしてｓｃＦｖ抗体構築物をコードする遺伝子を、プライマーｆｅ−１、５’−ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＣＣおよびｆｅ−２、５’−ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  Ｇによって増幅した。ＸｂａＩ／ＡｆｌＩＩ−切断ＰＣＲフラグメントをｓｋｐ挿入物の前にｐＳＫＫ中に挿入し、発現プラスミドｐＤＩＳＣ５−ＬＬおよびｐＤＩＳＣ６−ＳＬそれぞれを得た。これらは、ｌａｃプロモーター／オペレーター系の調節下でトリ−シストロンオペロンを含む（図９、１０を参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明によるＦV 抗体構築物（Ａ）の遺伝学的機構および二価（Ｂ）または四価ＦV 抗体構築物（Ｃ）を形成するための模式図を示す。Ａｇ：抗原；Ｈｉｓ6 ：６個のＣ末端ヒスチジン残基；停止：停止コドン（ＴＡＡ）；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【図２】  図２は、プラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬおよびｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬの構築のための模式図を示す。ｃ−ｍｙｃ：抗体９Ｅ１によって認識されるエピトープをコードする配列、Ｈｉｓ6 ：６個のＣ末端のヒスチジン残基をコードする配列；ＰｅｌＢ：細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列（ＰｅｌＢリーダー）；ｒｂｓ：リボソーム結合部位；停止：停止コドン（ＴＡＡ）；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【図３】  図３は、発現プラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＬＬの図を示す。６×Ｈｉｓ：６個のＣ末端のヒスチジン残基をコードする配列；ｂｌａ：アンピシリン耐性を担うβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子；ｂｐ：塩基対；ｃ−ｍｙｃ：９Ｅ１０抗体によって認識されるエピトープをコードする配列；ＣｏｌＥ１：ＤＮＡ複製の起点；ｆ１−ＩＧ：バクテリオファージｆ１の遺伝子間領域；Ｌａｃ  Ｐ／Ｏ：ｗｔ  ｌａｃ−オペロンプロモーター／オペレーター；リンカー１：ＶH およびＶL ドメインに連結したＧｌｙＧｌｙジペプチドをコードする配列；リンカー２：ハイブリッドｓｃＦｖフラグメントを連結する（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）4 ポリペプチドをコードする配列；Ｐｅｌ−Ｂリーダー：細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；ｒｂｓ：リボソーム結合部位；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【図４】  図４は、発現プラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬの図を示す。６×Ｈｉｓ：６個のＣ末端ヒスチジン残基をコードする配列；ｂｌａ：アンピシリン耐性を担うβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子；ｂｐ：塩基対；ｃ−ｍｙｃ：９Ｅ１０抗体によって認識されるエピトープをコードする配列；ＣｏｌＥ１：ＤＮＡ複製の起点；ｆ１−ＩＧ：バクテリオファージｆ１の遺伝子間領域；ｌａｃ  Ｐ／Ｏ：ｗｔ  ｌａｃ−オペロンプロモーター／オペレーター：リンカー１：ＶH およびＶL ドメインを連結するＧｌｙＧｌｙジペプチドをコードする配列；リンカー３：ハイブリッドｓｃＦｖフラグメントを連結するＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＳｅｒオリゴペプチドをコードする配列；Ｐｅｌ−Ｂリーダー：細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；ｒｂｓ：リボソーム結合部位；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【図５】  図５は、発現プラスミドｐＤＩＳ３×１９−ＬＬによってコードされる二価ＦV 抗体構築物の核酸配列およびそれに由来するアミノ酸配列を示す。ｃ−ｍｙｃエピトープ：抗体９Ｅ１０によって認識されるエピトープをコードする配列；ＣＤＲ：相補性を決定する領域；フレームワーク：フレームワーク領域；Ｈｉｓ６尾部：６個のＣ末端のヒスチジン残基をコードする配列；ＰｅｌＢリーダー：細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；ＲＢＳ：リボソーム結合部位；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【図６】  図６は、発現プラスミドｐＤＩＳＣ３×１９−ＳＬによってコードされる四価ＦV 抗体構築物の核酸配列およびそれに由来するアミノ酸配列を示す。ｃ−ｍｙｃエピトープ：９Ｅ１０抗体によって認識されるエピトープをコードする配列；ＣＤＲ：相補性を決定する領域；フレームワーク：フレームワーク領域；Ｈｉｓ６尾部：６個のＣ末端のヒスチジン残基をコードする配列；ＰｅｌＢリーダー：細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；ＲＢＳ：リボソーム結合部位；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【図７】  図７は、ピヒア発現プラスミドｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＳＬ中のα因子リーダー配列をコードする遺伝子と四価ＦV 抗体構築物をコードする遺伝子との間の連結のヌクレオチド配列および由来するアミノ酸配列を示す。α因子シグナル：サッカロミセスセレビシエ−α因子分泌シグナルのリーダーペプチド配列；ＶH ：重鎖の可変領域。菱形はシグナル切断部位を示す。
【図８】  図８は、ピヒア発現プラスミドｐＰＩＣ−ＤＩＳＣ−ＬＬ中のα因子リーダー配列をコードする遺伝子と二価ＦV 抗体構築物をコードする遺伝子との間の連結のヌクレオチド配列および由来するアミノ酸配列を示す。α因子シグナル：サッカロミセスセレビシエ−α因子分泌シグナルのリーダーペプチド配列；ＶH ：重鎖の可変領域。菱形はシグナル切断部位を示す。
【図９】  図９は、発現プラスミドｐＤＩＳＣ５−ＬＬの図を示す。６×Ｈｉｓ：６個のＣ末端ヒスチジン残基をコードする配列；ｂｌａ：アンピシリン耐性を担うβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子；ｂｐ：塩基対；ｃ−ｍｙｃ：９Ｅ１０抗体によって認識されるエピトープをコードする配列；ｈｏｋ−ｓｏｋ：プラスミド安定化ＤＮＡ部位；ＬａｃＩ：Ｌａｃリプレッサーをコードする遺伝子；ＬａｃＰ／Ｏ：ｗｔ  ｌａｃ−オペロン−プロモーター／オペレーター；ＬａｃＺ’：β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドをコードする遺伝子；リンカー１：ＶH およびＶL ドメインを連結するＧｌｙＧｌｙジペプチドをコードする配列；リンカー２：ハイブリッドｓｃＦｖフラグメントを連結する（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）4 ポリペプチドをコードする配列；Ｍ１３  ＩＧ：Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子間領域；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ：ＤＮＡ複製の起点；Ｐｅｌ−Ｂリーダー：細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；ｒｂｓ：大腸菌ｌａｃＺ遺伝子（ｌａｃＺ）、バクテリオファージＴ７遺伝子１０（Ｔ７ｇ１０）または大腸菌ｓｋｐ遺伝子（ｓｋｐ）に由来するリボソーム結合部位；ｓｋｐ：細菌の周辺質の因子Ｓｋｐ／ＯｍｐＨをコードする遺伝子；ｔＨＰ：強い転写ターミネーター；ｔＩＰＰ：転写ターミネーター；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【図１０】  図１０は、発現プラスミドｐＤＩＳＣ６−ＳＬの図を示す。６×Ｈｉｓ：６個のＣ末端のヒスチジン残基をコードする配列；ｂｌａ：アンピシリン耐性を担うβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子；ｂｐ：塩基対；ｃ−ｍｙｃ：９Ｅ１０抗体によって認識されるエピトープをコードする配列；ｈｏｋ−ｓｏｋ：プラスミド安定化ＤＮＡ部位；ＬａｃＩ：Ｌａｃリプレッサーをコードする遺伝子；ＬａｃＰ／Ｏ：ｗｔ  ｌａｃ−オペロン−プロモーター／オペレーター；ＬａｃＺ’：β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドをコードする遺伝子；リンカー１：ＶH およびＶL ドメインを連結するＧｌｙＧｌｙジペプチドをコードする配列；リンカー３：ハイブリッドｓｃＦｖフラグメントを連結するＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＳｅｒオリゴペプチドをコードする配列：Ｍ１３  ＩＧ：Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子間領域；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ：ＤＮＡ複製の起点；Ｐｅｌ−Ｂリーダー：細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；ｒｂｓ：大腸菌ｌａｃＺ遺伝子（ｌａｃＺ）、バクテリオファージＴ７遺伝子１０（Ｔ７ｇ１０）または大腸菌ｓｋｐ遺伝子（ｓｋｐ）に由来するリボソーム結合部位；ｓｋｐ：細菌の周辺質の因子Ｓｋｐ／ＯｍｐＨをコードする遺伝子；ｔＨＰ：強い転写ターミネーター；ｔＩＰＰ：転写ターミネーター；ＶH およびＶL ：重鎖および軽鎖の可変領域。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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