(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ６−シクロヘキシルアデノシン、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、Ｎ６−シクロヘキシル−２’−Ｏ−メチルアデノシン、２−［Ｐ−（２−カルボキシエチル）フェニルエチルアミノ］−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、２−フェニルアミノアデノシン、２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロナミド、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−モノリン酸、８−ブチルアミノアデノシン、エリスロ−９−（２−ハイドロキシ−３−ノニル）アデニン、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸、α、β−メチレンアデノシン−５’−トリリン酸、２−メチルチオアデノシン−５’−トリリン酸、若しくは、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸の１種又は２種以上を有効成分として含有する育毛剤。
【請求項２】
外用剤である請求項１記載の育毛剤。
【請求項３】
前記有効成分の含有量が製剤全体の０．０１〜５重量％である請求項１又は２記載の育毛剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、育毛剤に関し、特に各種の外用剤として使用可能であり、優れた有効性を示す新規な作用機構を有する育毛剤に関する。また、本発明は、育毛作用を有する物質のスクリーニング方法に関し、特に新規作用機構を有する育毛作用物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、 ヒト特に男性型脱毛を治療または予防する試みにおいて、多くの薬剤の使用が提案されてきた。 そのような薬剤としては、例えば、血管拡張剤、男性ホルモン受容体阻害剤、ステロイド−５α−レダクターゼ阻害剤、 ビタミン類、 免疫抑制剤等が挙げられる。 しかし、実際には、これらの薬剤の育毛剤としての有効性は十分満足できるものではないのが現状である。
【０００３】
また、これまで、ヒト特に男性型脱毛を治療または予防する試みにおいて、いくつかの育毛物質のスクリーニング方法が提案されてきた。例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等の小動物、特に適当な週齢のＣ３ＨマウスやＣ５７ＢＬマウス等の主として背部毛を剃り、試験物質を塗布して発毛の程度を観察する方法、マウスのヒゲ、ヒトの頭髪等を摘出し、得られた毛組織を器官培養し、試験物質を添加してその成長の程度を評価する方法、または毛組織をさらに細胞レベルにまで分画し、特に毛乳頭細胞または外毛根鞘細胞を個別にまたは共存培養した系に、試験物質を添加して増殖促進効果を試験する方法、適当な動物またはヒトでの血管拡張作用または血流促進効果を試験するもの等が試みられている。また、特に男性型脱毛においては、その発症に男性ホルモンが関与していることから、男性ホルモン受容体阻害試験や男性ホルモンであるテストステロンをジヒドロテストステロンに変換させる酵素であるステロイド−５α−レダクターゼ阻害試験等も応用されてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来の育毛剤と比較して発毛効果に優れた育毛剤を提供することにある。
【０００５】
また、本発明の他の目的は、従来の育毛剤とは異なる新規な作用機構を有する、優れた育毛剤を提供するためのスクリーニング方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの形態は、プリン受容体刺激作用を有する化合物、生体に適用後にプリン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する化合物、若しくは、プリン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物の１種又は２種以上を有効成分として含有する育毛剤である。
【０００７】
本発明において、「プリン受容体刺激作用」とは、プリン受容体を刺激して細胞に対して何らかの現象を発生させる作用を指し、通常は、そのような刺激はプリン受容体と、該プリン受容体に特異的に結合可能な物質との相互作用によってもたらされる。
【０００８】
また、本発明において「生体に適用後にプリン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する化合物」とは、皮膚、粘膜又は体内組織等への塗布又は投与等の後にプリン受容体刺激作用を有する化合物を分離して放出する機能を有する化合物であり、通常は、プリン受容体刺激作用を有する化合物に何らかの化学修飾が施された化合物である。前記化学修飾の例としては、具体的には、エステル化、アミド化等の操作が挙げられる。
【０００９】
ところで、プリン受容体はＰ１及びＰ２受容体に大別されている。Ｐ１受容体はアデノシンに対する親和性が高いことからアデノシン受容体とも称呼されており、Ｐ２受容体はＡＴＰに対する親和性が高いことから同様にＡＴＰ受容体とも称呼される。したがって、本発明のプリン受容体刺激作用を有する化合物にはアデノシン受容体及び／又はＡＴＰ受容体の刺激作用を有する化合物が含まれる。
【００１０】
本発明のアデノシン受容体刺激を有する化合物としては、アデノシン、Ｎ６−シクロヘキシルアデノシン、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、（Ｒ）−Ｎ６−フェニルイソプロピルアデノシン、（Ｓ）−Ｎ６−フェニルイソプロピルアデノシン、（Ｒ）−フェニル−イソプロピルアデノシン、Ｎ−［Ｒ−（２−ベンゾチアゾリル）チオ−２−プロピル］−２−クロロアデノシン、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ−(メチル−フェネチル）アデノシン、ミノプリニル−デオキシ−Ｎ−エチルリボフラヌロアミド、デフィブロチド、５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、２−クロロアデノシン、Ｎ−エチル−１’−デオキシ−１’−[６−アミノ−２−[１−（３−ヒドロキシ−３−フェニル）プロピニル]−９Ｈ−プリン−９−イル]−β−Ｄ−リボフラン−５’−ウロナミド、Ｎ６−２−（４−アミノフェニル）エチルアデノシン、５’−Ｎ−シクロプロピルカルボキサミドアデノシン、Ｎ６−（ｐ−スルホフェニル）アデノシン、１−デアザ−２−クロロ−−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、８−ブチルアデノシン、１−シクロプロピルイソグアノシン、６−シクロヘキシル−２’−Ｏ−メチルアデノシン、２−β−Ｄ−リボフラノシルオキサゾール−４−カルボキサミド、２−ヨード−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ６−シクロペンチル−２’−メチル−２−クロロアデノシン、Ｎ６−シクロヘキシル−２’−Ｏ−メチルデノシン、２−［Ｐ−（２−カルボキシエチル）フェニルエチルアミノ］−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、Ｎ６−[４−[[[４−[[[２−[[[（ｐ−イソチオシアナトフェニル）アミノ]チオカルボニル]アミノ]エチル]アミノ]カルボニル]メチル]アミノカルボニル]メチル]フェニル]アデノシン、Ｎ６−[４−[[[４−[[[２−[[[（ｍ−イソチオシアナトフェニル）アミノ]チオカルボニル]アミノ]エチル]アミノ]カルボニル]メチル]アミノカルボニル]メチル]フェニル]アデノシン、２−[（２−アミノエチルアミノ）カルボニルエチルフェニルエチルアミノ]−５’−エチルカルボキサミドアデノシン、２−ヘキシニル−５−メチルカルボキサミドアデノシン、２−シクロヘキシルメチリデンヒドラジノアデノシン、Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、Ｎ６−[２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（メチルフェニル）エチル]アデノシン、５’−（Ｎ−シクロプロピル）カルボキサミドアデノシン、Ｎ−[２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−フェニルエチル]アデノシン、Ｎ−（２−メチルベンジル）アデノシン、２−オクチニルアデノシン、２−フェニルアミノアデノシン、２−［２−（４−フルオロフェニル）エトキシ］アデノシン、２−［（シクロヘキシルメチレン）ヒドラジノ］アデノシン、２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロナミド、Ｎ６−（３−イソチオシアナートベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロナミド、２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジルアデノシン−５’−Ｎ−メチルカルボキサミド、ピナシジル、デフィブロチド（短鎖デオキシリボヌクレオチド）、アデノシン−５’−モノリン酸、アデノシン−５’−モノリン酸メチルエステル、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−モノリン酸、８−��チルアミノアデノシン又はこれらの過ヨウ素酸酸化物が好ましい。
【００１１】
アデノシン受容体刺激作用を有する前記化合物又は生体に適用後にアデノシン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する化合物は、 下記［化３］：
【化３】
0004465779.tif 000002
［式中、ｎは０または１、Ｒ1〜Ｒ2はそれぞれ水素原子または炭素原子数１〜５のアシル基を示し、Ｒ3は水素原子または保護基を示す。］で示される化合物であってもよい。
【００１２】
アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する前記化合物としては、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の取り込み阻害剤が好ましい。ここで、「取り込み阻害剤」とは、対象となる化合物の細胞又は組織等への吸収、取り込みを阻害する作用を有する化合物を指す。前記取り込み阻害剤としては、ジピリダモール、ジラセップ、リドフラジン、ヘキソベンジン、カルボクロメン、クロモナール酸、シネパジド、ジアゼパム、パパベリン、６−（２’−ハイドロキシニトロベンジル）チオグアノシン、プロベントフィリンが好ましい。
【００１３】
また、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物は、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の不活性化阻害剤であってもよい。ここで、「不活性化阻害剤」とは、対象となる化合物のある特性、機能又は作用の減少を阻害する作用を有する化合物を指す。したがって、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の不活性化阻害剤は、当該化合物のアデノシン受容体刺激作用の減少を妨げる機能を有する。アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の前記不活性化阻害剤としては、２’−デオキシコホルマイシン、エリスロ−９−（２−ハイドロキシ−３−ノニル）アデニンが好ましい。
【００１４】
本発明の別の形態は、ＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物の１種または２種以上を有効成分として含有する育毛剤である。
【００１５】
本発明のＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物としては、例えば、アデノシンジリン酸、アデノシントリリン酸及びこれらの誘導体が挙げられるが、その中ではアデノシン−５’−ジリン酸、アデノシン−５’−トリリン酸及びこれらの誘導体が好ましい。なお、アデノシン−５’−ジリン酸の誘導体又はアデノシン−５’−トリリン酸の誘導体としては、エステル誘導体が好ましい。
【００１６】
前記アデノシン−５’−ジリン酸誘導体及び前記アデノシン−５’−トリリン酸誘導体は、下記［化４］：
【化４】
0004465779.tif 000003
［式中、ｎは２または３、Ｒ1〜Ｒ2はそれぞれ水素原子または炭素原子数１〜５のアシル基を示し、Ｒ3は水素原子または保護基を示す。］で示される化合物であってもよい。
【００１７】
前記アデノシン−５’−ジリン酸誘導体としては、α、β−メチレンアデノシン−５’−ジリン酸、２−メチルチオアデノシン−５’−ジリン酸、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸が好ましい。
【００１８】
前記アデノシン−５’−トリリン酸誘導体としては、α、β−メチレンアデノシン−５’−トリリン酸、２−メチルチオアデノシン−５’−トリリン酸、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸が好ましい。
【００１９】
本発明の他の形態は、プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用を有する化合物の１種又は２種以上を有効成分として含有する育毛剤である。プリン受容体刺激作用を有する化合物はアデノシン、アデノシン誘導体またはアデノシン代謝物であってもよく、また、ＡＴＰ、ＡＴＰ誘導体またはＡＴＰ代謝物であってもよい。
【００２０】
細胞から放出されるアデノシン誘導体またはアデノシン代謝物は、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェート、またはアデノシントリホスフェートでありうる。
【００２１】
プリン受容体刺激作用を有する化合物、特に、アデノシン、アデノシン誘導体またはアデノシン代謝物、を細胞から放出させる作用を有する化合物は細胞に存在するＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を有する化合物とすることができる。
【００２２】
ＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を有する化合物は、スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物とすることができる。
【００２３】
スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物は、メグリチニド、ニコランジル、レボクロマカリム、クロマカリム、ピナシジル、ジアゾキサイド、ジソピラミド、チリソロール、アプリカム、ビマカリム、ＭｇＡＴＰ、ＭｎＡＴＰ、ＣａＡＴＰ、ＺｎＡＴＰ、ＳｒＡＴＰ、ＭｇＡＤＰ、ＭｎＡＤＰ、ＣａＡＤＰ、ＺｎＡＤＰ、ＳｒＡＤＰ、ＭｇＡＭＰ、ＭｎＡＭＰ、ＣａＡＭＰ、ＺｎＡＭＰ、ＳｒＡＭＰ、アデニル-５-イルイミドジホスフェート、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンからなる群より選択される化合物であってよい。
【００２４】
スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物は、カルシウム、マンガン、マグネシウム、亜鉛、およびストロンチウムからなる群より選ばれる二価陽イオンを含む塩であってよい。
【００２５】
スルホニルウレア受容体への刺激作用を有する化合物は、下記式：
Ｒ−Ｓ−ＣｏＡ
[式中、Ｒは分岐しても良い炭素数１４〜３０のアシル基で、二重結合を０〜３個含む]で示される長鎖アシルコエンザイムＡであってよい。
【００２６】
上記の各化合物を有効成分として含有する本発明の育毛剤は、外用剤であることが好ましく、また、本発明の育毛剤において、当該有効成分の含有量は、製剤全体の０．０１〜５重量％であることが好ましい。
【００２７】
本発明の更なる他の形態は、ＡＢＣトランスポーター遺伝子とプリン誘導体に対する受容体遺伝子で形質転換させた細胞に対して被験物質を添加し、そのときの細胞内へのカルシウム流入量を指標とすることを特徴とする、育毛作用を有する物質のスクリーニング方法である。
【００２８】
上記ＡＢＣトランスポーター遺伝子は、スルホニルウレア受容体遺伝子とすることができる。
【００２９】
上記プリン誘導体に対する受容体遺伝子はアデノシン受容体遺伝子またはＡＴＰ受容体遺伝子とすることができる。
【００３０】
細胞内へのカルシウム流入量は蛍光カルシウム指示薬を用いた蛍光強度で測定することができる。
【００３１】
ＡＢＣトランスポーター遺伝子またはプリン誘導体に対する受容体遺伝子の形質転換を、宿主ベクター系による遺伝子組み換え技術によって行うことができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の育毛剤について記述する。
【００３３】
本発明者らは、優れた有効性を有する育毛成分について鋭意研究の結果、驚くべきことに、アデノシン受容体及びＡＴＰ受容体を含むプリン受容体への刺激作用が育毛効果と密接な関連を有していることを見出した。本発明は、この知見に基づくものであり、
Ａ．プリン受容体刺激作用を有する化合物、生体に適用後にプリン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する化合物、及び、プリン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物；及び
Ｂ．プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用を有する化合物、例えば、ＡＢＣトランスポーター刺激作用を有する化合物、特にスルホニルウレア受容体刺激作用を有する化合物；
を育毛成分として使用することを特徴とする。
【００３４】
以下、上記Ａ及びＢのタイプの化合物をそれぞれ含む育毛剤（以下、各々、プリン受容体直接刺激型、及び、プリン受容体間接刺激型と称する）について詳細に説明を行う。
【００３５】
１．プリン受容体直接刺激型育毛剤
既述したように、プリン受容体はアデノシン受容体及びＡＴＰ受容体に大別される。そこで、まずアデノシン受容体を特に刺激するタイプの化合物を含有する育毛剤について説明する。
【００３６】
アデノシン受容体は、薬理学的及び構造的な特徴をもとに、現在、Ａ１、Ａ２a、Ａ２ｂ、Ａ３の４種類のサブタイプに分類されている。そして、Ａ１受容体は抗けいれん効果、神経保護効果、行動抑制効果、睡眠効果等を、Ａ２（Ａ２ａ又はＡ２ｂ）受容体は行動抑制効果、睡眠効果等を、そしてＡ３受容体は肥満細胞の脱顆粒促進効果等の生理作用を有することが知られている。
【００３７】
アデノシン受容体は生体中において様々な臓器に分布しており、細胞機能及び生理機能の調節に関与しているものと考えられている。例えば、心臓の血管平滑筋に分布するアデノシン受容体は、血中のアデノシン受容体刺激作用を有する化合物との結合により、血管を拡張し、冠血管の血流量を増大させることが知られている。また、近年、細胞上に存在するアデノシン受容体の刺激が細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる等の現象を発生させることが明らかとなっている。
【００３８】
本発明者らは、アデノシン受容体刺激作用がもたらす様々な現象が細胞組織の他の機能の調節に重要な役割を有する可能性について様々な側面から研究を重ねた結果、アデノシン受容体刺激作用が毛髪の生育に関して深く関与していることを突き止め、この知見に基づき、高い育毛効果を有する新規な育毛剤を開発した。
【００３９】
すなわち、本発明の育毛剤の１つの形態は、アデノシン受容体刺激作用に基づくものである。
【００４０】
この育毛剤の有効成分としては、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の１種又は２種以上の他に、生体に適用後にアデノシン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する化合物、若しくは、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物の１種又は２種以上が挙げられる。これらの化合物は単独で使用されてもよく、また、複数の種類が混合されて使用されてもよい。
【００４１】
アデノシン受容体刺激作用を有する前記化合物は、アデノシン受容体を刺激する作用を有するものであれば特に限定されるものではないが、アデノシン受容体との結合性の点では、アデノシン、Ｎ６−シクロヘキシルアデノシン、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、（Ｒ）−Ｎ６−フェニルイソプロピルアデノシン、（Ｓ）−Ｎ６−フェニルイソプロピルアデノシン、（Ｒ）−フェニル−イソプロピルアデノシン、Ｎ−［Ｒ−（２−ベンゾチアゾリル）チオ−２−プロピル］−２−クロロアデノシン、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ６−[４−[[[４−[[[２−[[[（ｐ−イソチオシアナトフェニル）アミノ]チオカルボニル]アミノ]エチル]アミノ]カルボニル]メチル]アミノカルボニル]メチル]フェニル]アデノシン、Ｎ６−[４−[[[４−[[[２−[[[（ｍ−イソチオシアナトフェニル）アミノ]チオカルボニル]アミノ]エチル]アミノ]カルボニル]メチル]アミノカルボニル]メチル]フェニル]アデノシン、Ｎ−(メチル−フェネチル）アデノシン、ミノプリニル−デオキシ−Ｎ−エチルリボフラヌロアミド、５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、２−クロロアデノシン、Ｎ−エチル−１’−デオキシ−１’−[６−アミノ−２−[１−（３−ヒドロキシ−３−フェニル）プロピニル]−９Ｈ−プリン−９−イル]−β−Ｄ−リボフラン−５’−ウロナミド、Ｎ６−２−（４−アミノフェニル）エチルアデノシン、５’−Ｎ−シクロプロピルカルボキサミドアデノシン、Ｎ６−（ｐ−スルホフェニル）アデノシン、１−デアザ−２−クロロ−−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、８−ブチルアデノシン、１−シクロプロピルイソグアノシン、６−シクロヘキシル−２’−Ｏ−メチルアデノシン、２−β−Ｄ−リボフラノシルオキサゾール−４−カルボキサミド、２−ヨード−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ６−シクロペンチル−２’−メチル−２−クロロアデノシン、Ｎ６−シクロヘキシル−２’−Ｏ−メチルデノシン、２−［Ｐ−（２−カルボキシエチル）フェニルエチルアミノ］−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、２−[（２−アミノエチルアミノ）カルボニルエチルフェニルエチルアミノ]−５’−エチルカルボキサミドアデノシン、２−ヘキシニル−５−メチルカルボキサミドアデノシン、２−シクロヘキシルメチリデンヒドラジノアデノシン、Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、５’−（Ｎ−シクロプロピル）カルボキサミドアデノシン、Ｎ−[２−（３，５−ジメトキシフェニル）フェニルエチル]アデノシン、Ｎ−（２−メチルベンジル）アデノシン、２−オクチニルアデノシン、２−フェニルアミノアデノシン、２−［２−（４−フルオロフェニル）エトキシ］アデノシン、２−［（シクロヘキシルメチレン）ヒドラジノ］アデノシン、２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロナミド、Ｎ６−（３−イソチオシアナートベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロナミド、２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジルアデノシン−５’−Ｎ−メチルカルボキサミド、デフィブロチド（短鎖デオキシリボヌクレオチド）、ピナシジル、アデノシン−５’−モノリン酸、アデノシン−５’−モノリン酸メチルエステル、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−モノリン酸、���−ブチルアミノアデノシン又はこれらの過ヨウ素酸酸化物が好ましく、また、育毛効果の面では、Ａ１及びＡ２タイプのアデノシン受容体への刺激作用が高い化合物がより好ましい。
【００４２】
また、育毛効果の点では、アデノシン受容体刺激作用を有する前記化合物又は生体に適用後にアデノシン受容体刺激作用を有する化合物を遊離する前記化合物は、上記［化３］に示される構造を有する化合物であることが好ましく、その場合は、Ｒ1〜Ｒ2はそれぞれ水素原子又は炭素原子数１〜５のアシル基、Ｒ3は水素原子又は保護基とされることが好ましい。
【００４３】
ところで、アデノシンをはじめとするアデノシン受容体刺激作用を有する化合物は、生体の様々な組織においてその生成と代謝が行われている。したがって、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物にも、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物と同様の効果が存在する。本発明の育毛剤に配合されるアデノシン受容体刺激作用を有する化合物の当該作用を増強する化合物としては、具体的には、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の取り込み阻害剤及び不活性化阻害剤が好ましい。なお、前記不活性化剤としては、アデノシン受容体刺激作用を有する化合物の酵素による代謝を阻害する化合物を挙げることができ、例えば、アデノシンを生体内で不活性なイノシンに代謝するアデノシンデアミナーゼの阻害剤を使用してもよい。
【００４４】
前記取り込み阻害剤としては、取り込み阻害効果の点で、がジピリダモール、ジラセップ、リドフラジン、ヘキソベンジン、カルボクロメン、クロモナール酸、シネパジド、ジアゼパム、パパベリン、６−（２’−ハイドロキシニトロベンジル）チオグアノシン、プロベントフィリンが好ましく、また、前記不活性化阻害剤としては、その効果の点で、２’−デオキシコホルマイシン、エリスロ−９−（２−ハイドロキシ−３−ノニル）アデニンが好ましい。
【００４５】
次に、ＡＴＰ受容体を特に刺激するタイプの化合物を含有する育毛剤について説明する。
【００４６】
ＡＴＰ受容体には、リガンドの刺激を細胞内に伝達する方法としてイオンの細胞膜透過を利用するものとＧＴＰ結合蛋白を介するものの２種類があるとされており、Ｐ２Ｘ型及びＰ２Ｙ型（それぞれ７つのサブタイプを有する）と称呼されている。
【００４７】
ＡＴＰ受容体は生体中では様々な臓器に分布しており、情報伝達や機能調節に関与しているものと考えられている。例えば、神経系ではシナプス変調作用、大動脈では血圧調節を担っているものと考えられている。しかし、いまだその分布の詳細や機能については明確にされていないのが現状である。アデノシン及びＡＴＰ（アデノシントリリン酸）はいずれもプリン環を有することから、プリン受容体の概念には、アデノシン受容体及びＡＴＰ（アデノシントリリン酸）受容体が含まれる。
【００４８】
ところで、近年、細胞上に存在するＡＴＰ受容体の刺激が細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇を引き起こすこと等が明らかとなってきている。本発明者らは、ＡＴＰ受容体刺激作用が細胞組織の他の機能の調節に重要な役割を有する可能性について、様々な側面から研究を重ねた結果、ＡＴＰ受容体刺激作用が毛髪の生育に関して深く関与していることを突き止め、この知見に基づき、高い育毛効果を有する新規な育毛剤を開発した。
【００４９】
すなわち、本発明の育毛剤の他の形態は、アデノシン受容体以外のプリン受容体、すなわちＡＴＰ受容体への刺激作用に基づくものである。
【００５０】
このタイプの育毛剤の有効成分としては、ＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物の１種又は２種以上が挙げられる。これらの化合物は単独で使用されてもよく、また、複数の種類が混合されて使用されてもよい。
【００５１】
この育毛剤の有効成分は、ＡＴＰ受容体刺激作用を有するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、アデノシンジリン酸、アデノシントリリン酸又はそれらの誘導体を挙げることができる。生体における機能の点では、前記アデノシンジリン酸及び前記アデノシントリリン酸において、リン酸部分の結合位は、５’位の炭素が好ましい。したがって、上記した例の中では、アデノシン−５’−ジリン酸、アデノシン−５’−トリリン酸及びこれらの誘導体が好ましい。
【００５２】
また、育毛効果の面では、アデノシン−５’−ジリン酸の誘導体又はアデノシン−５’−トリリン酸の誘導体としてエステル誘導体が好ましい。なお、エステル誘導体としては、アデノシン部位の２’又は３’位の炭素に結合した酸素原子が、１〜１０、好適には１〜５の炭素原子を含むアシル基と共にエステルを形成していることが好ましい。
【００５３】
アデノシン−５’ジリン酸の誘導体及びアデノシン−５’−トリリン酸の誘導体は、具体的には、上記［化４］に示される化合物であってもよく、その場合は、Ｒ1〜Ｒ2はそれぞれ水素原子又は炭素原子数１〜５のアシル基、Ｒ3は水素原子または適当な保護基とされることが好ましい。
【００５４】
なお、育毛効果の点では、前記アデノシン−５’−ジリン酸誘導体は、α、β−メチレンアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体、２−メチルチオアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体、又は、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸エステル誘導体であることが好ましい。
【００５５】
同様に、育毛効果の点では、前記アデノシン−５’−トリリン酸エステル誘導体は、α、β−メチレンアデノシン−５’−トリリン酸エステル、２−メチルチオアデノシン−５’−トリリン酸、２’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸、又は、３’−ベンゾイルアデノシン−５’−トリリン酸であってもよい。
【００５６】
２．プリン受容体間接刺激型育毛剤
ＡＢＣトランスポーターは、細胞内のＡＴＰの細胞外への放出を引き起こす作用を有する類似タンパクの総称であり、タンパクとしては、いわゆるＡＢＣタンパクスーパーファミリーを構成する一部で、ＡＴＰバインディングカセット、ＡＴＰ結合タンパク、ＡＢＣ結合トランスポーターまたはＡＢＣタンパクとも呼ばれており、ＭＤＲ（Ｐ糖タンパク質、multidrug resistance protein）、ＭＲＰ（MDR-related protein）、ＣＦＴＲ（cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator）、ＳＵＲ（スルホニルウレア受容体）などが挙げられ、様々な細胞機能の発現やその調節に重要な役割を果たしていることが明らかになっている。
【００５７】
例えば膵臓のベータ細胞膜に存在するＡＢＣトランスポーターは、隣接するＡＴＰ依存性カリウムチャンネルの開閉をコントロールしてカリウムイオンの細胞外への放出とその後のカルシウムイオンの流入を調節し、細胞小胞内のインスリンの細胞外への分泌をコントロールしている。さらに、心筋のＡＢＣトランスポーターはミトコンドリアに存在し、同じくミトコンドリアに存在するＡＴＰ感受性カリウムチャンネルの機能を調節し、虚血再灌流時のプレコンディショニング効果（心筋保護効果）の発現に関与していることが明らかとなってきている。一方、ＡＢＣトランスポーターは心筋や血管平滑筋をはじめとして、生体の様々な組織に存在していることが知られるようになってきており、トランスポーターとしての役割、即ち細胞内のＡＴＰの細胞外への放出を引き起こす作用も様々な調節作用に関与していることが推察されている。また、膵臓のβ細胞、血管平滑筋及び心筋に存在するＡＢＣトランスポーターはスルホニルウレア受容体であることが明らかになっている。
【００５８】
スルホニルウレア受容体は、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルの制御因子として機能することが知られている（稲垣ら、「スルホニル尿素受容体」（生化学第６９巻第９号1067頁、１９９７年））。
【００５９】
本発明者らは、毛乳頭細胞にＡＢＣトランスポーターとＡＴＰ受容体またはアデノシン受容体が発現していることを見出した。そして、これらの受容体、すなわちプリン受容体の刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用を有する化合物、特にＡＢＣトランスポーターを刺激することによりその作用を発揮する化合物が、従来の育毛成分には見られなかった優れた有効性を示すことを見出した。プリン受容体刺激作用を有する化合物には、ＡＴＰ受容体及び／又はアデノシン受容体刺激作用を有する化合物が含まれ、具体的には、ＡＴＰ、ＡＴＰ誘導体又はＡＴＰ代謝物、及び／又は、アデノシン、アデノシン誘導体又はアデノシン代謝物が挙げられる。
【００６０】
プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用と育毛効果との関連性について、本発明者らは、図１に示すように、例えばスルホニルウレア受容体などのＡＢＣトランスポーターを刺激することにより、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）が細胞内から放出され、これがＡＴＰ受容体に作用するか、またはＡＴＰが分解して生成したアデノシンがアデノシン受容体に作用し、細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こし、毛成長速度や毛周期を調節する機構を司っているものと考えている。または、ミトコンドリアに存在するスルホニルウレア受容体の刺激がミトコンドリアに存在するＡＴＰ感受性カリウムチャンネルに作用し、これがＡＴＰ、アデノシン、それらの誘導体又は代謝物を細胞から放出させることも考えられる。
【００６１】
したがって、本発明の育毛剤の更なる他の形態は、プリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させる作用に基づくものである。具体的には、この育毛剤の有効成分としては、ＡＴＰ、アデノシン、それらの誘導体または代謝物を細胞から放出させる作用を有する化合物の１種又は２種以上が挙げられる。これらの化合物は単独で使用されてもよく、また、複数の種類が混合されて使用されてもよい。
【００６２】
プリン受容体刺激作用を有する化合物、例えばアデノシンおよびその誘導体または代謝物、を細胞から放出させる作用の具体例としては、例えば当該細胞に存在するＡＢＣトランスポーターを刺激することがあげられる。
【００６３】
本発明において、アデノシンおよびその誘導体または代謝物としては、アデノシン、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェートおよびアデノシントリホスフェートなどが挙げられる。
【００６４】
ＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を有する化合物としては、ＭＤＲ、ＭＲＰ、ＣＦＴＲ、スルホニルウレア受容体のいずれかへの刺激作用を有する化合物を用いることができるが、好ましくはスルホニルウレア受容体を刺激作用を有する化合物が挙げられる。
【００６５】
スルホニルウレア受容体を刺激作用を有する化合物としては、例えば、メグリチニド、ニコランジル、レボクロマカリム、クロマカリム、ピナシジル、ジアゾキサイド、ジソピラミド、チリソロール、アプリカム、ビマカリム、ＭｇＡＴＰ、ＭｎＡＴＰ、ＣａＡＴＰ、ＺｎＡＴＰ、ＳｒＡＴＰ、ＭｇＡＤＰ、ＭｎＡＤＰ、ＣａＡＤＰ、ＺｎＡＤＰ、ＳｒＡＤＰ、ＭｇＡＭＰ、ＭｎＡＭＰ、ＣａＡＭＰ、ＺｎＡＭＰ、ＳｒＡＭＰ、アデニル-５-イルイミドジホスフェート、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、カルシウム、マンガン、マグネシウム、亜鉛またはストロンチウムの二価陽イオンを含む塩、および下記式
Ｒ−Ｓ−ＣｏＡ
［式中、Ｒは分岐しても良い炭素数１４〜３０のアシル基で、二重結合を０〜３個含む］で示される長鎖アシルコエンザイムＡ、その中でも特にオレオイル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、オレイル−ＣｏＡ、ミリストイル−ＣｏＡ、ペンタデカノイル−ＣｏＡ、ステアリル−ＣｏＡが挙げられる。
【００６６】
これらの物質は、カリウムチャネルの開口剤として知られている（例えば、高橋ら、「Ｋチャネル開口薬」、医薬ジャーナル、vol.34, S-1, P.70-74 (1998)、および遠藤ら、「カリウムチャネル開口薬」、医薬ジャーナル、vol.35, S-1, P.112-119 (1999)参照）。スルホニルウレア受容体は、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルの制御因子として機能しており、カリウムチャネルの開口剤が、スルホニルウレア受容体に結合することはすでに知られている（例えば、Brayら、Jounal of Bailogical Chemistry, vol.267, p.11689 (1992)参照）。そして、スルホニルウレア受容体が、細胞内より細胞外へＡＴＰの放出に関与していることもすでに提唱されている（Awqatiら、Science vol.269, 805 (1995)参照）。
【００６７】
したがって、カリウムチャネルの開口剤として知られている上記物質は、スルホニルウレア受容体に結合して、これを刺激するものと考えられる。本発明は、これらの物質のスルホニルウレア受容体への結合によるスルホニルウレア刺激作用、すなわちＡＢＣトランスポーターへの刺激作用が、ＡＴＰ、アデノシン、それらの誘導体または代謝物等のプリン受容体刺激作用を有する化合物を細胞から放出させ、育毛効果を発揮させることに初めて着目したものである。
【００６８】
本発明の育毛剤は、外用剤であることが好ましく、１日１〜数回、適量を頭皮、皮膚上に塗布して使用することができる。また、本発明の育毛剤に含有される各有効成分の配合量は、好ましくは製剤全体中０．０１〜５重量％であり、より好ましくは０．１〜５重量％、特に好ましくは１〜５重量％である。 この配合量が０．０１重量％未満であると、育毛効果が十分でなく、５重量％を超えると、有効成分の製剤中での溶解安定性が低下することが多く、例えば低温保存時に結晶析出が認められるなど品質への悪影響が懸念されるため好ましくない。
【００６９】
本発明の育毛剤は、 外用剤として通常用いられる剤形、 例えばローション剤、 乳剤、 クリーム剤、トニック剤、軟膏剤、ゲル剤、エアゾール剤等として使用することができるが、外用剤として使用される剤形であればこれらに限定されるものではない。なお、エアゾール剤として使用する場合は、原液に対して上記のように配合量が設定される。
【００７０】
なお、本発明の育毛剤には、それぞれ、必要に応じ水、低級アルコール（メタノール、エタノール、変性エタノール、イソプロピルアルコール等）、溶解補助剤、界面活性剤、乳化安定剤、ゲル化剤、粘着剤、その他、所望する剤型を得るために通常使用される基剤成分を配合でき、使用目的に応じて、ミノキシジル、 塩化カルプロニウム等の血管拡張剤、スピロノラクトン、 フルタミド、 シプロテロンアセテート、オキセンドロン等の男性ホルモン受容体阻害剤、フィナステライド、 エピリステライド等のステロイド−５α−レダクターゼ阻害剤、グリチルレチン酸、アズレン等の抗炎症剤、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸デキサメサゾン等の副腎皮質ホルモン、尿素、サリチル酸等の角質溶解剤、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、マクロゴール、グリセリン、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類、グリセリルモノペンタデカノエート等の脂肪酸グリセリンエステル、 塩酸イソペンジル、塩酸ジフェンヒドラミン等の抗ヒスタミン剤、グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルペチルフェノール、第４級アンモニウム塩、ヒノキチオール、ピロクトンオラミン等の殺菌剤、ヒアルロン酸ナトリウム、グリセリン、コンドロイチン硫酸等の保湿剤、イチイ、ボタンビ、カンゾウ、オトギリソウ、附子、ビワ、カワラヨモギ、コンフリー、アシタバ、サフラン、サンシン、ローズマリー、セージ、モッコウ、セイモッコウ、ホップ、プラセンタなどの動植物の抽出物、酢酸レチノール、塩酸ピリドキシン、アスコルビン酸、硝酸チアミン、シアノコバラミン、ビオチン、酢酸トコフェノール等のビタミン類、ミリスチン酸イソプロピル、パルチミン酸イソプロピル、スクワラン、流動パラフィン、レシチン等の油分、ポリエキシエチレンソルビダン脂肪酸エステル、ソルビダン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリエキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤、ジブチルヒドロキシトルエン、イソプロピルガレート等の抗酸化剤、 エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤、メントール、カンフル等の清涼化剤、色素、香料、経皮吸収促進剤等の成分を本発明の効果を損なわない範囲で配合することができる。
【００７１】
また、適用対象又は必要とされる育毛効果の程度等にも依存するが、必要であれば、本発明の育毛剤は、上記Ａ及びＢのタイプの化合物の両方を含んでもよい。
【００７２】
次に、本発明の育毛物質のスクリーニング方法について記述する。
【００７３】
図１に関連して既に説明したとおり、毛乳頭細胞にはＡＢＣトランスポーターとＡＴＰ受容体又はアデノシン受容体が発現しており、これらは相互に密接に関連して育毛作用を示すものと思われる。特に、ＡＢＣトランスポーターに対する刺激作用を有する化合物については、このＡＢＣトランスポーターに対する刺激作用を介するＡＴＰ受容体またはアデノシン受容体の刺激により、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴って育毛効果を示すのではないかと考えられる。
【００７４】
そこで、毛乳頭細胞を用いて育毛剤のスクリーニングを実施したが、目的とする毛乳頭細胞は、増殖能が極めて悪く、スクリーニングに必要な細胞数を確保するには多量の毛組織が必要で、その実施には多大な労力と費用を要した。そのため、ＡＢＣトランスポーターを介してＡＴＰ受容体またはアデノシン受容体に作用して効果を示す物質を見出す簡便な方法の開発が望まれた。
【００７５】
そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、ＡＢＣトランスポーター遺伝子と、ＡＴＰ受容体遺伝子またはアデノシン受容体遺伝子を適当な宿主ベクター法による遺伝子組み替え技術によって遺伝子組み替え細胞とし、この細胞へのカルシウムの流入を測定することにより育毛物質をスクリーニングする方法を確立し、本発明を完成させた。
【００７６】
即ち、本発明の育毛物質のスクリーニング方法は、ＡＢＣトランスポーター遺伝子およびプリン誘導体に対する受容体遺伝子を宿主ベクター法によって発現させた細胞を使用し、細胞内へのカルシウムの流入を指標とすることを特徴とする。
【００７７】
上記したとおり、ＡＢＣトランスポーターは、細胞内のＡＴＰの細胞外への放出を引き起こす作用を有する類似タンパクの総称であり、タンパクとしては、いわゆるＡＢＣタンパクスーパーファミリーを構成する一部で、ＡＴＰバインディングカセット、ＡＴＰ結合タンパク、ＡＢＣ結合トランスポーターまたはＡＢＣタンパクとも呼ばれている。ＡＢＣトランスポーターとしては、例えば、ＭＤＲ（Ｐ糖タンパク質、multidrug resistance protein）、ＭＲＰ（MDR-related protein）、ＣＦＴＲ（cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator）、ＳＵＲ（スルホニルウレア受容体）などが挙げられる。中でも、本発明に用いられるＡＴＰ結合トランスポーター遺伝子としては特にスルホニルウレア受容体遺伝子（以下SUR遺伝子ともいう）が好ましい。
【００７８】
スルホニル受容体遺伝子は、すでに知られているSUR遺伝子配列の情報、例えばY.Tokuyamaら、Biochemical and Biophysical Research Communications, 220, p.532-538 (1996)に記載されたハムスターSUR遺伝子配列の情報を元に該配列から作成した適当なプローブを用いて、周知のPCR法やｃDNAライブラリーからのハイブリダイゼーション法などにより得られることができる。また、ラットのSURcDNA配列も知られている（GenBank Accession No.L40624）。ハムスターSUR遺伝子導入に関しては、Aguilar-Bryanら、Science, vol.268, p.423 (1995)に記載されている。ラット、マウスSURのアミノ酸配列については、稲垣ら、「スルホニル尿素受容体」（生化学第６９巻、第９号、1067頁、１９９７年）に記載されている。
【００７９】
上記アデノシン誘導体に対する受容体遺伝子としては、プリン受容体遺伝子またはアデノシン受容体遺伝子が挙げられる。
【００８０】
アデノシン受容体遺伝子としては、すでにヒトのcDNA遺伝子配列が知られている（GenBank Accession No.X68485）。あるいはスルホニル受容体遺伝子と同様に、周知のPCR法またはcDNAライブラリーからのハイブリダイゼーション法などにより得られることができる。
【００８１】
ＡＴＰ受容体遺伝子についても、ヒトのｃＤＮＡ遺伝子配列が知られている（GenBank Accession No.X83688）。
【００８２】
これらの遺伝子の種に関しては特に制限はなく、例えば、ヒト、ラット、マウス、ハムスター由来のものが挙げられる。
【００８３】
これらの遺伝子をクローン化する方法としては、例えば、Sambrookら, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 1989等に記載された一般的な方法を用いることができる。
【００８４】
上記ＡＢＣトランスポーター遺伝子またはプリン誘導体に対する受容体遺伝子としては、形質転換後に形質転換細胞内でＡＢＣトランスポーターまたはプリン誘導体に対する受容体として機能する範囲で、遺伝子配列の内部または末端の一部が、挿入、置換あるいは削除されたものも含む。
【００８５】
また、本発明に用いられる宿主としては導入した遺伝子が効率よく発現され、培養が容易なものであれば特に限定されないが、エシェリヒア属菌であるEscherichia coliの各種菌株、バチルス属菌種であるBacillus subtilisの各種菌株、酵母としてはSaccharomyces cerevisiaeの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＣ１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＮＲＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞等が好ましい。
【００８６】
ベクターとしては、調製が容易で効率よく導入できるものであれば特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミド（例：ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８など）、枯草菌由来のプラスミド（例：ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４など）、酵母由来のプラスミド（例：ｐＳＨ１９など）、さらにバクテリオファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が好ましい。さらに、該当遺伝子を発現させるために、遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用するプロモーターは、宿主に応じて選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、γＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用できる。
【００８７】
形質転換は、ＤＮＡが、染色体外要素として、あるいは染色体組み込みによりＤＮＡが複製可能となるように、ＤＮＡを生体内に導入することを意味する。
【００８８】
上記組み替えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法としては、各宿主細胞に対して一般に用いられる形質転換方法、例えば塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションなどが適用できる（Sambrookら, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 1989など）。
【００８９】
こうして得られた形質転換細胞を適当な選択培地で培養してスクリーニングに供する。このスクリーニングのための培養は、細胞をカバーグラス上で培養して供することが好ましい。例えば、形質転換細胞を細胞濃度３×１０7/ｍＬとなるように培地に懸濁し、適量をカバーグラス上に載せ、２４〜４８時間程度、約３７℃で培養する。
【００９０】
スクリーニングの方法としては、培養細胞に、被験物質溶液を添加し、細胞内へのカルシウムの流入量を測定することにより行う。
【００９１】
細胞内カルシウム濃度測定法としては、カルシウムキレート剤でありカルシウム結合量に応じてその蛍光特性が変化する周知の蛍光カルシウム指示薬、例えばｆｕｒａ−２、ｆｕｒａ−２−ＡＭ、ｉｎｄｏ−１、ｑｕｉｎ２、ｆｌｕｏ−３、ｒｈｏｄ−２などを用いることができるが、なかでもｆｕｒａ−２−ＡＭ（1-(2-(5'-カルボキシオキサゾール-2'-イル)-6-アミノベンゾフラン-5-オキシ)-2-(2'-アミノ-5'-メチルフェノキシ)-エタン-N,N,N',N'-テトラアセチックアシッドペンタアセトキシメチルエステル、和光純薬（東京））を使用した蛍光強度法を用いることが好ましい（唐木、実験医学、7（6）、626（1989））。
【００９２】
例えば、１〜２０μｇ／ｍｌのｆｕｒａ−２−ＡＭを２０〜４０分間ロードし、タイロード液（１３５ｍＭ ＮａＣｌ, ５．６ｍＭ ＫＣｌ, １．２ｍＭ ＭｇＳＯ4, ２．２ｍＭ ＣａＣｌ2, １０ｍＭグルコース, ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ([4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン]エタンスルホン酸)／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４））にて洗浄した後、細胞内カルシウム濃度の指標として３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの蛍光強度の比を求める。これには、例えばカバーガラスを循環定温チャンバー付蛍光測定装置（ＡＲＧＵＳ-50、浜松フォトニクス社、浜松）を用いることができる。
【００９３】
【実施例】
次に、製剤例及び試験例（実施例及び比較例）を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００９４】
育毛剤
製剤例１（外用ローション剤）：
0004465779.tif 000004
上記成分を撹拌し、均一に溶解させ外用ローション剤を調製した。
【００９５】
製剤例２ （外用クリーム剤）：
（成分）                                            配合量(W/W%)
アデノシン                                               １．０
中鎖脂肪酸トリグリセリド                               １８．０
ミリスチン酸イソプロピル                                 １．０
２−ヘキシルドデカノール                                 ４．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート     ５．０
ソルビタンモノステアレート                               ３．０
グリセリンモノステアレート                               ６．０
セタノール                                               １．０
ステアリルアルコール                                     ２．０
プロピレングリコール                                   １５．０
ｐ−アミノ安息香酸メチル                                 ０．０５
ｐ−アミノ安息香酸プロピル                               ０．０５
精製水                                             全１００ｇ
上記成分について、乳化剤の通常の製法に準じて外用クリーム剤を調製した。
【００９６】
製剤例３（外用ゲル剤）：
（成分）                                           配合量(W/W%)
Ｎ６−（Ｌ−２−フェニルイソプロピル）アデノシン       ０．５
ポリエチレングリコール（１０）モノステアレート         １．０
１，３−ブチレングリコール                             ７．０
カルボキシビニルポリマー                               １．５
ジイソプロパノールアミン                               適量
エタノール                                           ４０．０
精製水                                            全１００ｇ
上記成分について、ゲル剤の通常の製法に準じて外用ゲル剤を調製した。
【００９７】
製剤例４（エアゾール剤）：
（成分）                                         配合量(W/W%)
ピナシジル                                             ０．１
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート   １．０
グリセリン                                             ３．０
エタノール                                           ２０．０
精製水                                               １５．０
イソペンタン                                         １０．０
液化石油ガス                                           ３．０
ジメチルエーテル                                     ４８．０
上記成分について、エアゾール剤の通常の製法に準じて外用エアゾール剤を調製した。
【００９８】
試験例：
実施例１〜１５（表１及び表２）の育毛剤の発毛試験をＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒＪマウスを用い行った。試験法はマウスを１群１０匹とし、実施例１〜１５、比較例１及び２、並びに、無投与群の１７群に分け、マウスの背部をバリカンおよびカミソリにて剃毛し、それぞれのサンプルを１日１回、剃毛した背部８平方ｃｍ当たり１００μＬずつ塗布した。実施例１〜１５、比較例１及び２の育毛剤は製剤例１と同様に、表１及び表２に示す各成分を全体が均一な状態となるまで攪拌して調製した。実施例１〜１５の育毛剤及び比較例１、２の育毛剤の投与群、並びに無投与群の塗布面積に対する毛の再生面積（１５日後）を表３及び表４に示す。
【００９９】
【表１】
0004465779.tif 000005
【０１００】
【表２】
0004465779.tif 000006
【０１０１】
【表３】
0004465779.tif 000007
【０１０２】
【表４】
0004465779.tif 000008
表１乃至表４の結果から明らかなように、本発明の育毛剤は毛の再生に関して高い効果を有する。
【０１０３】
製剤例５（外用ローション剤）：
（成分）                                            配合量(W/V%)
α、β−メチレンアデノシン−５’−トリリン酸             ０．５
プロピレングリコール                                   １０．０
エタノール                                             ５０．０
精製水                                             全１００ ｍｌ
上記成分を撹拌し、均一に溶解させ外用ローション剤を調製した。
【０１０４】
製剤例６（外用クリーム剤）：
（成分）                                            配合量(W/W%)
２−メチルチオアデノシン−５’−トリリン酸               １．０
中鎖脂肪酸トリグリセリド                               ２０．０
ミリスチン酸イソプロピル                                 １．０
２−ヘキシルドデカノール                                 ４．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート     ５．０
ソルビタンモノステアレート                               ３．０
グリセリンモノステアレート                               ６．０
セタノール                                               １．０
ステアリルアルコール                                     ２．０
プロピレングリコール                                   １５．０
ｐ−アミノ安息香酸メチル                                 ０．０５
ｐ−アミノ安息香酸プロピル                               ０．０５
精製水                                             全１００ｇ
上記成分について、乳化剤の通常の製法に準じて外用クリーム剤を調製した。
【０１０５】
製剤例７（外用ゲル剤）：
（成分）                                           配合量(W/W%)
２’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸             ５．０
ポリエチレングリコール（１０）モノステアレート         １．０
１，３−ブチレングリコール                             ７．０
カルボキシビニルポリマー                               １．５
ジイソプロパノールアミン                               適量
エタノール                                           ４０．０
精製水                                            全１００ｇ
上記成分について、ゲル剤の通常の製法に準じて外用ゲル剤を調製した。
【０１０６】
製剤例８（エアゾール剤）：
（成分）                                         配合量(W/W%)
３’−ベンゾイルアデノシン−５’−ジリン酸             ０．１
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート   １．０
グリセリン                                             ３．０
エタノール                                           ２０．０
精製水                                               １５．０
イソペンタン                                         １０．０
液化石油ガス                                           ３．０
ジメチルエーテル                                     ４８．０
上記成分について、エアゾール剤の通常の製法に準じて外用エアゾール剤を調製した。
【０１０７】
製剤例９（外用ローション剤）：
（成分）                                            配合量(W/V%)
アデノシン−５’−トリリン酸メチル                       ０．０１
プロピレングリコール                                   １０．０
エタノール                                             ５０．０
精製水                                             全１００ ｍｌ
【０１０８】
試験例：
実施例１６〜２２（表５）の育毛剤の発毛試験をＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒＪマウスを用い行った。試験法はマウスを１群１０匹とし、実施例１６〜２２の育毛剤投与群、比較例３の育毛剤投与群及び無投与群の９群に分け、マウスの背部をバリカンおよびカミソリにて剃毛し、それぞれのサンプルを１日１回、剃毛した背部８平方ｃｍ当たり１００μＬずつ塗布した。実施例１６〜２２及び比較例３の育毛剤は、製剤例５と同様に、表５に示す各成分を全体が均一な状態となるまで攪拌して調製した。実施例１６〜２２の育毛剤及び比較例３の育毛剤の投与群並びに無投与群の塗布面積に対する毛の再生面積（１５日後）を表６に示す。
【０１０９】
【表５】
0004465779.tif 000009
【０１１０】
【表６】
0004465779.tif 000010
表５及び表６の結果から明らかなように、本発明の育毛剤は毛の再生に関して高い効果を有する。また、本発明の化合物群の中では、アデノシン−５’−ジリン酸（実施例２１）又はアデノシン−５’−トリリン酸(実施例２２）と比べて、それらの誘導体の方がより高い育毛効果を有することが明らかとなった。
【０１１１】
製剤例１０（外用クリーム剤）
（成分）                                            配合量(W/W%)
クロマカリム                                             １．０
中鎖脂肪酸トリグリセリド                               １８．０
ミリスチン酸イソプロピル                                 １．０
２−ヘキシルドデカノール                                 ４．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート     ５．０
ソルビタンモノステアレート                               ３．０
グリセリンモノステアレート                               ６．０
セタノール                                               １．０
ステアリルアルコール                                     ２．０
プロピレングリコール                                   １５．０
ｐ−アミノ安息香酸メチル                                 ０．０５
ｐ−アミノ安息香酸プロピル                               ０．０５
精製水                                             全１００ｇ
上記成分について、乳化剤の製法に準じ、外用クリーム剤を調製した。
【０１１２】
製剤例１１（外用ゲル剤）
（成分）                                           配合量(W/W%)
ＭｇＡＴＰ                                             １．０
ポリエチレングリコール（１０）モノステアレート         １．０
１，３−ブチレングリコール                             ７．０
カルボキシビニルポリマー                               １．５
ジイソプロパノールアミン                               適量
エタノール                                           ４０．０
精製水                                            全１００ｇ
上記成分について、ゲル剤の製法に準じ、外用ゲル剤を調製した。
【０１１３】
製剤例１２（エアゾール剤）
（成分）                                         配合量(W/W%)
オレオイル−ＣｏＡ                                     ０．５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート   １．０
グリセリン                                             ３．０
エタノール                                           ２０．０
精製水                                               １５．０
イソペンタン                                         １０．０
液化石油ガス                                           ３．０
ジメチルエーテル                                     ４８．０
上記成分について、エアゾール剤の製法に準じ、外用エアゾール剤を調製した。
【０１１４】
実施例２３（外用ローション剤）
（成分）                                            配合量(W/V%)
ニコランジル                                             １．０
プロピレングリコール                                   ２０．０
エタノール                                             ５０．０
精製水                                             全１００ ｍｌ
上記成分を撹拌し、均一に溶解させ外用ローション剤を調製した。
【０１１５】
実施例２４−２８
表７に示すように、実施例２３におけるニコランジルを、ピナシジル（実施例２４）、クロマカリム（実施例２５）、ＭｎＡＴＰ（実施例２６）、メグロチニド（実施例２７）、Ｌ−アルギニン（実施例２８）に代えた以外は実施例２３と同様に外用ローション剤を調製した。
【０１１６】
比較例４
表７に示すように、実施例２３におけるニコランジルを除いた以外は実施例２３と同様に外用ローション剤を調製した。
【０１１７】
【表７】
0004465779.tif 000011
【０１１８】
試験例
実施例２３〜２８と比較例４の外用ローション剤を用いた発毛試験を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒＪマウスを用い、以下の通り行った。
試験法はマウスを１群１０匹とし、試料投与群および無投与群の８群に分け、マウスの背部をバリカンおよびカミソリにて剃毛し、それぞれのサンプルを１日１回、剃毛した背部８平方ｃｍ当たり１００μＬずつ塗布した。実施例２３〜２８の試料投与群、比較例４の試料投与群および無投与群の塗布面積に対する毛の再生面積（１５日後）を表８に示す。
【０１１９】
【表８】
0004465779.tif 000012
上記試験例より、本発明の育毛剤は、毛の再生に関して、高い効果を持つことが確認された。
【０１２０】
スクリーニング方法
＜目的遺伝子の細胞への形質転換＞
ＣＯＳ−１細胞（３×１０5個 ／直径３５ｍｍシャーレ）を１０％牛胎児血清を含んだダルベッコ変性ＭＥＭ培地にて５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で培養した。  別に、ヒトアデノシン受容体ｃＤＮＡ（GenBank Accession No.X68485、参考文献：C.A.Kollias-Bakerら、The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,281(2),761-768(1997)）とラットスルホニルウレア受容体ｃＤＮＡ（GenBank Accession No.L40624、参考文献：Y.Tokuyamaら、Biochemical and Biophysical Research Communications, 220, 532-538 (1996)）をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社、カリフォルニア、米国）とｐｃＤＮＡ３．１/Hygroベクター（インビトロジェン社、カリフォルニア、米国）に常法に従ってそれぞれ導入し、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＡＤおよびｐｃＤＮＡ３．１/Hygro raＳＵＲを得た。
【０１２１】
ｐｃＤＮＡ３．１ｈＡＤは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのEcoRI/NotI部位に、ヒトアデノシン受容体ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ/ＸｂａＩ断片（１．４ｋｂ）が挿入されたものである。
【０１２２】
ｐｃＤＮＡ３．１/Hygro raＳＵＲは、ｐｃＤＮＡ３．１/HygroベクターのHindIII/XbaI部位に、ラットスルホニルウレア受容体ｃＤＮＡの塩基番号２０８−５０８６のＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【０１２３】
こうして得られたｐｃＤＮＡ３．１ｈＡＤ（１μｇ）およびｐｃＤＮＡ３．１/Hygro raＳＵＲ（１μｇ）を、先に培養しておいたＣＯＳ−１細胞中に、リポフェクタミンとＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ試薬、Nobuya Inagakiら、Science, 270, 1166-1170 (1995)に記載された方法に準じて、トランスフェクトした。
【０１２４】
その後、細胞をさらに培養し、コンフルーエントに達したところでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、０．０５％トリプシンと０．５３ｍＭのＥＤＴＡ溶液で処理した。
【０１２５】
ネオマイシンおよびハイグロマイシン耐性を指標にして高発現細胞株を得た。
【０１２６】
スクリーニングには細胞をカバーグラス上で培養して供した。また、細胞内カルシウム濃度の測定には、ＦＵＲＡ−２を使用した蛍光強度法を用いた。すなわち５μｇ／ｍｌのｆｕｒａ−２ ａｍを３０分間ロードし、タイロード液にて洗浄した後、細胞内カルシウム濃度の指標として３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの蛍光強度の比を求めた。
【０１２７】
試験例
上記操作によって得られた細胞を用いて、以下の試験を行った。
【０１２８】
試験例１
スルホニルウレア受容体刺激剤として知られているニコランジルを用いて、本発明のスクリーニング法の有効性を確認した。その結果、図２に示す通り、ニコランジル２５、１００μＭ添加により細胞内カルシウム濃度が上昇するが、この作用はアデノシン受容体の阻害剤である８−スルホフェニルテオフィリン１μＭの前処理により抑制されることが確認された。
【０１２９】
試験例２
アデノシン受容体刺激剤としてアデノシン１．０および１０．０μＭを添加すると、図３に示す通り、細胞内カルシウム濃度は濃度依存的に上昇した。この作用はアデノシン受容体阻害剤である８−スルホフェニルテオフィリン１μＭの前処理により抑制された。
【０１３０】
試験例１および２の結果から、本発明の形質導入細胞では、スルホニルウレア受容体とアデノシン受容体が発現し、機能していることが確認できた。
【０１３１】
なお、カルシウム除去培地ではニコランジルおよびアデノシンの作用は認められなかった。このことから、細胞内カルシウム濃度の増大は、細胞外カルシウムの流入によるものであることは明らかである。本発明で得られた形質転換細胞は、増殖能も良好で、育毛剤のスクリーニングに容易に使用することができる。
【０１３２】
【発明の効果】
本発明により、従来の育毛剤よりも高い育毛効果を有する育毛剤を提供することが可能である。
【０１３３】
特に、本発明の育毛剤は、例えば、ＡＴＰ、ＡＴＰ誘導体、アデノシン、アデノシン誘導体等を細胞から放出させて、ＡＴＰ受容体及び／又はアデノシン受容体を刺激して、育毛効果を発揮するという新規な作用機構に基づいており、顕著な育毛効果を奏するものである。
【０１３４】
なお、ＡＴＰ受容体刺激作用を有する化合物を有効成分とする育毛剤では、当該化合物としてアデノシン−５’−ジリン酸誘導体又はアデノシン−５’−トリリン酸誘導体を用いた場合に、特に高い育毛効果を得ることができる。
【０１３５】
また、本発明により、ＡＢＣトランスポーターへの刺激作用を介するプリン受容体刺激作用、すなわちＡＴＰ受容体及び／又はアデノシン受容体刺激作用、により、育毛効果を発揮するという新規な作用機構を有する育毛作用物質のスクリーニングを、容易に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の育毛剤及び本発明の方法によってスクリーニングされる物質の、作用機構を示す説明図である。
【図２】本発明のスクリーニング方法の実施例の結果を示すグラフである。
【図３】本発明のスクリーニング方法の実施例の結果を示すグラフである。
【図１】
0004465779.tif 000013
【図２】
0004465779.tif 000014
【図３】
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