(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２から４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
脳APPに対するペプチダーゼ活性を有するタンパク質であって、下記（ａ）または（ｂ）より選択されるタンパク質。
（ａ）配列番号：２から４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１０アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、配列番号：２のＣ末端１４アミノ酸ペプチドを認識する抗体により認識されるタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む、請求項３に記載のDNA。
【請求項５】
請求項３または４に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の宿主細胞を培養し、該細胞内で発現した組み換えタンパク質を該細胞またはその培養上清から回収する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項９】
配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖の一部から成る、ヒト血漿CPBをコードするDNAとのクロスハイブリダイゼーションを生じない、少なくとも１５塩基の鎖長を有するプローブ若しくはプライマー。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該タンパク質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質と被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のタンパク質のペプチダーゼ活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で、請求項１または２に記載のタンパク質にその基質を接触させる工程、
（ｂ）該基質の切断を検出する工程、および
（ｃ）被検試料非存在下において検出した場合（対照）比較して、請求項１または２に記載のタンパク質により引き起こされる該基質の切断を増加または減少させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１２】
基質が脳APPである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のタンパク質を有効成分とする、Aβの生成調節剤。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のタンパク質を含有することを特徴とする、該タンパク質のペプチダーゼ活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のタンパク質の基質をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
基質が脳APPである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
被検者から調製された試料中における、脳におけるAβの蓄積を生じる疾患の検査のための指標の検出方法であって、該試料に含まれる請求項１または２に記載のタンパク質の量を請求項８に記載の抗体を用いて検出する工程、を含む方法。
【請求項１８】
試料が髄液または血清である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脳におけるAβの蓄積を生じる疾患が、老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血、頭部打撲からなる群より選択される疾患である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項８に記載の抗体を含む、脳におけるAβの蓄積を生じる疾患の検査薬。
【請求項２１】
Aβの蓄積を生じる疾患が、老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血、頭部打撲からなる群より選択される疾患である、請求項２０に記載の検査薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なカルボキシペプチダーゼおよびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関する。
背景技術
アルツハイマー病（ＡＤ）は脳皮質に生じる神経変性疾患であり、疾患の進行に伴って徐々にニューロンが消失することから最終的には痴呆に至る。主な神経病理学的所見は、脳萎縮、老人斑、神経原線維集積物およびアミロイドアンギオパシーである。アルツハイマー病と脳の正常老化のいずれにおいても、ニューロンの喪失と、老人斑および脳血管性アミロイドの主要かつ必須な構成要素であるＡβの異常沈着が空間的に特有な様式で出現し、この種の病変は記憶と認知にかかわる海馬や嗅内皮質（ｅｎｔｈｏｒｈｉｎａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）といった大脳皮質の特定領域に主に認められる。数々の所見から、いくつかの種類の家族性アルツハイマー病や関連疾患の原因はＡβの内部や周囲に生じたミスセンス変異であることが示唆される（Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ，Ｍ．−Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５３，８４４−８４６；Ｈａａｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１，１２９１−１２９６；Ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１１２０−１１２２）。別の種類の家族性アルツハイマー病の原因となる２つの遺伝子は、小胞体および／またはゴルジ複合体の内部で発現すると推定される類似した膜貫通タンパク質であるプレセニリン１および２をコードすることが同定されている（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７５４−７６０；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：９７０−９７７）。このようなタンパク質は、新たに合成されたβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）などのタンパク質の修飾およびプロセッシングに関与すると思われる。脳内に認められるＡβペプチドの中でも、Ａβ１−４２はアミロイド形成性が高く、神経細胞内での増加がアルツハイマー病の病態生理と直接関係している可能性がある（Ｈａｒｄｙ，Ｊ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０，１５４−１５９；Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｃ．Ｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８９，６７７−６７８；Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ｓ．Ｇ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３７，２８７−２８８）。最近、Ａβ１−４２は小胞体で、Ａβ１−４０はトランスゴルジネットワークで産生されるというように、Ａβが産生される神経細胞内の特定の部位が同定されている（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３，１０１６−１０２０；Ｃｏｏｋ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３，１０２１−１０２３）。以上の所見は、ＡＰＰおよびＡβペプチドの修飾、プロセッシングまたは輸送における何らかの障害が、アルツハイマー病の病態生理に本質的に関係していることを強く示唆する。稀な家族性アルツハイマー病の症例では原因遺伝子およびタンパク質がいくつか同定されているが、アルツハイマー病患者の大半（９５％を超える）は孤発性であり、疾患過程の原因となる遺伝子やタンパク質はまだ同定されていない。個々のアルツハイマー病患者の主な原因が何であれ、アルツハイマー病の進行は脳内Ａβの蓄積および凝集をもたらし、���れは最終的にはおそらくＣａ２＋イオンチャネルの形成、ミクログリアによるフリーラジカルの生成および／またはアポトーシス機構を介して神経死を誘発する（Ｌｏｏ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７９５１−７９５５；Ａｒｉｓｐｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５６７−５７１）。
Ａβ分子種が生成されるタンパク質分解過程は未だ明らかになっていない。α、βまたはγ−セクレターゼ活性を有するプロテアーゼの候補は種々の種および臓器から同定されているが、その大半は合成基質を用いた活性のアッセイによって調製されたものであり、このような候補プロテアーゼの中で天然型ＡＰＰ基質に対する活性を持つものはわずかに過ぎない。家族性アルツハイマー病の原因となる同定された遺伝子のいずれかをトランスジェニックマウスで誘導させ、ヒト脳内で認められる神経病理学的所見を得ようとの試みは成功していない。線維状Ａβのマイクロインジェクションを行ったサル脳に関する最近の所見からは、特に高等霊長類では、Ａβのｉｎ  ｖｉｖｏ神経毒性が加齢脳で一種の病理反応を起こすことが示唆されている（Ｇｅｕｌａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，４，８２７−８３１）。以上の所見から、ＡβおよびＡβ含有ペプチドが、種および組織に特異的な様式で生成されることが示唆されるが、その分子メカニズムは明らかにされていない。
発明の開示
本発明は、脳で発現し、脳ＡＰＰに対するペプチダーゼ活性を有する新規なカルボキシペプチダーゼ、およびその遺伝子、並びにそれらの製造方法および用途を提供することを課題とする。
本発明者らは以前、家族性アルツハイマー病患者に由来するリンパ芽球細胞におけるＡＰＰおよびＡβ含有ペプチドのプロセッシングを解析した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１７，２１−２７；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｒ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２５，１０５５−１０６２）。家族性アルツハイマー病細胞の培地には、合成基質に対するβ−セクレターゼ様活性を示す６８ｋＤａのセリンプロテアーゼが認められた（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，３９４１−３９４８）。このプロテアーゼは、リンパ芽球細胞（ＬＡＰＰ）から調製した天然型ＡＰＰおよびそのＡβ含有断片を、Ａβ−Ｎ末端の近傍部位で切断した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１９５，１７１−１７４）。しかし、このセリンプロテアーゼの活性を、正常ヒト脳から調製した天然型脳ＡＰＰを基質に用いて測定したところ、該プロテアーゼは天然型脳ＡＰＰを分解しないことが判明した。このことから本発明者らは、基質としての天然型ＡＰＰには組織特異性があり、脳において発現しているプロテアーゼを、天然型脳ＡＰＰの切断活性を指標に検索することで、天然型脳ＡＰＰを基質とする新規なプロテアーゼを同定できるはずだと考えた。
そこで、本発明者らは、ヒト海馬のホモジネート分画物を天然型脳ＡＰＰのタンパク質分解活性に関して検索し、活性画分を分析することにより、脳ＡＰＰを複数の部位で切断してＡβ含有ペプチドを生成する活性を有する４０ｋＤａのタンパク質を分離することに成功した。このタンパク質を解析したところ、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）ファミリーに属する新規プロテアーゼであることが判明した。このプロテアーゼ（脳カルボキシペプチダーゼＢ；脳ＣＰＢ）は血漿ＣＰＢが選択的スプライシングを受けたアイソフォームではなく、Ｃ末端１４アミノ酸などの特定の特徴を有していた。ヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡプローブを用いたノーザン解析およびヒト脳ＣＰＢ特異的抗体を用いたウエスタン解析から、このプロテアーゼが脳特異的に発現していることが判明した。免疫組織化学試験では、このプロテアーゼが正常脳の神経細胞体、特に海馬錐体ニューロンと上衣−脈絡叢細胞、およびミクログリアの内部で発現されていることが示された。また、髄液および血液中にも微量ながら存在していた。孤発性アルツハイマー病患者の脳では、神経における発現の低下と、細胞外沈着を伴うプロテアーゼ免疫反応性のミクログリアのクラスターが検出された。さらに、抗ＡβＮ端抗体を利用したウェスタン解析から、ヒト脳ＣＰＢが、ＡβペプチドをそのＣ末端から分解するエキソペプチターゼ活性を有することが判明した。
以上の所見は、本発明者等により単離された脳ＣＰＢがＡＰＰプロセッシングにおいて生理的機能を果たしており、アルツハイマー病の病態生理にも重要であることを示唆している。従って、本発明者等により単離された脳ＣＰＢは、それ自体アルツハイマー病の予防、治療のための薬剤として、また、該予防や治療のための薬剤のスクリーニングへの利用が可能である。さらに本発明者等により単離された脳ＣＰＢは、アルツハイマー病の検査への利用も可能である。
また、本発明者等により単離された脳ＣＰＢやその活性を調節しうる化合物は、上記したアルツハイマー病に限られず、広くＡβの蓄積を生じる疾患の予防、治療、診断への応用が可能であると考えられる。
従って、本発明は、
（１）  配列番号：２から４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）  脳ＡＰＰに対するペプチダーゼ活性を有するタンパク質であって、下記（ａ）または（ｂ）より選択されるタンパク質、
（ａ）配列番号：２から４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、
（３）  （１）または（２）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（４）  配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む、（３）に記載のＤＮＡ、
（５）  （３）または（４）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
（６）  （５）に記載のベクターを保持する宿主細胞、
（７）  （６）に記載の宿主細胞を培養し、該細胞内で発現した組み換えタンパク質を該細胞またはその培養上清から回収する工程を含む、（１）または（２）に記載のタンパク質の製造方法、
（８）  （１）または（２）に記載のタンパク質に対する抗体、
（９）  （１）または（２）に記載のタンパク質の部分ペプチド、
（１０）  配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド、
（１１）  （１）または（２）に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該タンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１２）  （１）または（２）に記載のタンパク質に結合する化合物、
（１３）  （１１に記載の方法により単離されうる、（１２）に記載の化合物、
（１４）  （１）または（２）に記載のタンパク質のペプチダーゼ活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で、（１）または（２）に記載のタンパク質にその基質を接触させる工程、
（ｂ）該基質の切断を検出する工程、および
（ｃ）被検試料非存在下において検出した場合（対照）比較して、（１）または（２）に記載のタンパク質により引き起こされる該基質の切断を増加または減少させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１５）  基質が脳ＡＰＰである、（１４）に記載の方法、
（１６）  （１）または（２）に記載のタンパク質のペプチダーゼ活性を促進または阻害する活性を有する化合物、
（１７）  （１４）または（１５）に記載の方法により単離されうる、（１６）に記載の化合物、
（１８）  （１）または（２）に記載のタンパク質を有効成分とする、Ａβの生成調節剤、
（１９）  （１）または（２）に記載のタンパク質を有効成分とする、脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患の治療薬、
（２０）  脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患が、老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血、頭部打撲からなる群より選択される、（１９）に記載の治療薬、
（２１）  （１２）、（１３）、（１６）または（１７）に記載の化合物を有効成分とする、Ａβ生成調節剤、
（２２）  （１２）、（１３）、（１６）または（１７）に記載の化合物を有効成分とする、脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患の治療薬、
（２３）  脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患が老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血、頭部打撲からなる群より選択される、（２２）に記載の治療薬、
（２４）  （１）または（２）に記載のタンパク質を含有することを特徴とする、該タンパク質のペプチダーゼ活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット、
（２５）  （１）または（２）に記載のタンパク質の基質をさらに含む、（２４）に記載のキット、
（２６）  基質が脳ＡＰＰである、（２５）に記載の方法、
（２７）  脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患の検査方法であって、
（ａ）被検者から試料を調製する工程、
（ｂ）該試料に含まれる（１）または（２）に記載のタンパク質の量を（８）に記載の抗体を用いて検出する工程、を含む方法、
（２８）  試料が髄液または血清である、（２７）に記載の方法、
（２９）  脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患が、老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血、頭部打撲からなる群より選択される疾患である、（２７）または（２８）に記載の方法、
（３０）  （８）に記載の抗体を含む、脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患の検査薬、
（３１）  Ａβの蓄積を生じる疾患が、老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血、頭部打撲からなる群より選択される疾患である、（３０）に記載の検査薬、を提供するものである。
本発明は、脳で発現し、脳ＡＰＰに対するペプチダーゼ活性を有する新規な脳カルボキシペプチダーゼＢ（脳ＣＰＢ）タンパク質に関する。本発明のタンパク質に含まれるヒト脳ＣＰＢタンパク質は、ヒト海馬の抽出物から、脳ＡＰＰの分解活性を指標にして単離された。また、ヒト脳ＣＰＢタンパク質をコードする遺伝子は、ヒト脳ＣＰＢタンパク質に対する抗体を用いた免疫学的スクリーニング、およびヒト脳ＣＰＢタンパク質の部分アミノ酸配列を基に合成したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥによりクローニングされた。本発明者等により単離されたヒト脳ＣＰＢをコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１、該ｃＤＮＡによりコードされるヒト脳ＣＰＢタンパク質（プレプロ体）のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。本発明のヒト脳ＣＰＢは、プレプロタンパク質として合成されたのち、シグナル配列が切り離されてプロタンパク質が生成し、さらに活性化ペプチドが切り離されて成熟体タンパク質が生成すると考えられる。本発明のヒト脳ＣＰＢのプロタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に、成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。本発明において「脳ＡＰＰとは」、脳で発現するＡＰＰ分子種を指す。ヒト脳ＡＰＰの分子種としては、例えば、ＡＰＰ６９５（Ｋａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５，７３３−７３６）やＡｐｐｉｃａｎ（Ｓｈｉｏｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１３８１９−１３８２２）が挙げられるが、これらに制限されない。
ヒト脳ＣＰＢは、ヒト脳から調製されたＡＰＰを複数の部位で切断してＡβ含有ペプチドを生成する活性を有する。ヒト脳ＣＰＢは、４０ｋＤａのプレプロタンパク質として合成され、そこから３０ｋＤａの成熟タンパク質が生成すると考えられる。アミノ酸配列の特徴から、このタンパク質は、ＣＰＢファミリーに属する新規プロテアーゼ（脳カルボキシペプチダーゼＢ；脳ＣＰＢ）であることが判明した。このプロテアーゼは、既知のＣＰＢファミリーに属するヒト血漿ＣＰＢ（ＨＰＣＰＢ）と高い相同性を有していたが、特異的なＣ末端１４アミノ酸を有するなどの特定の特徴を有していたことから、血漿ＣＰＢが選択的スプライシングを受けたアイソフォームではなく、独立の遺伝子であると推定された。
ヒト脳ＣＰＢ（ＨＢＣＰＢ）は、ノーザン解析では、ヒト臓器のうち、脳のみで発現が認められた。また、ヒト脳ＣＰＢのＣ末端１４アミノ酸に対する抗体（抗Ｃ１４抗体）は、神経細胞体および一部のミクログリアにおいてシグナルが検出されたが（図７）、ヒト血漿ＣＰＢ（ＨＰＣＰＢ）が合成される肝臓では検出されなかった。さらに、脳ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析では、プロセッシングを受けた形態のプレプロヒト脳ＣＰＢに特有な１０７７ｂｐのバンドのみが検出された（図４Ｃ）。さらに、抗プレプロヒト脳ＣＰＢ抗体を用いて行った免疫学的スクリーニングでは、ほとんど同一の制限酵素パターンを有する３つのｃＤＮＡクローンが得られたが、このことはヒト脳ＣＰＢがヒト脳で発現される唯一のカルボキシペプチダーゼＢアイソフォームであることを意味している。
正常脳に関する免疫組織化学分析では、ヒト脳ＣＰＢが種々の神経細胞体、特に海馬錐体ニューロンと上衣−脈絡叢細胞、およびミクログリアの内部で発現されているが、アストロサイトでは発現されないことが示された。また、アルツハイマー病患者の脳では、ヒト脳ＣＰＢはグリア浸潤を一部は含み、一部は含まない実質沈着としてミクログリアのクラスターの一部で検出された。また、５例のアルツハイマー病患者の脳からの老人斑では、このプロテアーゼに対する免疫反応を示す呈色が一部に認められ、その頻度はそれぞれの脳のすべての斑のうち１０〜６０％の範囲であった。さらに、海馬実質では、ヒト脳ＣＰＢおよびＣ１４に対する免疫反応性を示す円形で均質な沈着が５例のアルツハイマー病患者の脳のすべてに共通して認められ、これはアミロイド体とは明らかに異なっていた（図９Ｇ）。ミクログリア浸潤の亢進は、加齢脳およびアルツハイマー病患者の脳に共通する所見である。老人斑形成との関連からみたミクログリアの意義は明らかではないが、Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，５３５−５４２）は、Ａβ沈着の極めて近傍に位置する活性化ミクログリアの小胞体内にＡβ線維が存在することを報告しており、このことは活性化されたミクログリアがＡβペプチドの合成とともにプロセッシングも行っていることを示唆する。中胚葉に由来するミクログリア内のＡＰＰアイソフォームにはＬＡＰＰ、およびＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害性ドメインを有するＡＰＰがあるが、これはいずれもニューロンでは発現されない。別の可能性としては、ミクログリアが初期の斑形成には関与せず、食細胞活動によってＡβペプチドのプロセッシングを行うことも考えられる（Ｆｒａｃｋｏｗｉａｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，８４，２２５−２３３）。脈絡叢細胞は脳脊髄液（ＣＳＦ）を分泌し、上衣細胞は分泌、吸収および輸送の機能を果たして脳とＣＳＦとの間の障壁になると推測されている（Ｄｅｌ  Ｂｉｇｉｏ，Ｍ．Ｒ．（１９９５）Ｇｌｉａ，１４，１−１３）。これらの細胞内で上記抗Ｃ１４抗体に対する免疫反応性が発現することから、ＡＰＰの適切なアイソフォームのような脳細胞内で合成されるペプチドのプロセッシングにはヒト脳ＣＰＢが必要なことが示唆される。生理的条件下でニューロン内の標的基質がＣＳＦ中に放出される前にプロテアーゼと遭遇する機会は、神経細胞体および上衣細胞内の少なくとも２つ存在していると考えられる。アルツハイマー病では、ミクログリア活性化の亢進に加えて細胞外間質にヒト脳ＣＰＢが存在することから病態生理学的異常を呈するものと考えられる。
また、Ａβペプチドがヒト脳ＣＰＢの基質であることが実験的に確認された。
以上のような所見から、本発明の脳ＣＰＢタンパク質は、脳ＡＰＰの分解によるＡβの生成およびアルツハイマー病の発症に深く関与していると考えられる。
すなわち、本発明の脳ＣＰＢタンパク質を含むプロテアーゼの作用バランスの失調が、Ａβの異常蓄積をもたらしていることが示唆される。
本発明のヒト脳ＣＰＢは、脳内に蓄積している自己凝集性の高いβアミロイドペプチド（特にβアミロイド１−４２）の代謝・低下作用により神経細胞死を減少させる機能をもち得る。
本発明の脳ＣＰＢタンパク質は、Ａβの生成の分子メカニズムを解明する研究対象としての利用の他、それ自体医薬品として利用することができる。例えば、アルツハイマー病患者の脳脊髄液中への持続注入し、髄液中でのヒト脳ＣＰＢ濃度を上昇させることにより、上衣細胞を介して神経細胞への取り込みを促し、減少・枯渇しているヒト脳ＣＰＢを補い、Ａβ代謝を改善させることが可能であると考えられる。
また、本発明の脳ＣＰＢは、医薬品として有用な本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングのためのツールとして利用することができる。さらに、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質の活性を制御する化合物は、脳におけるＡβペプチドの蓄積を来す病態を含む種々の疾患における予防や治療のための医薬として、また、それら疾患の検査や診断のための薬剤として有用である。このような疾患としては、例えば、老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血（オランダ型等）、頭部打撲（ボクサー脳）などが挙げられる。
本発明においては、脳ＡＰＰに対するペプチダーゼ活性を有する限り、天然型ヒト脳ＣＰＢタンパク質（配列番号：２、３、４）と構造的に類似したタンパク質も含まれる。このような構造的に類似したタンパク質には、天然型ヒト脳ＣＰＢタンパク質の変異体や他の生物由来の脳ＣＰＢタンパク質が含まれる。
このようなタンパク質は、当業者であれば、例えば、公知の変異導入法を用いて調製することができる。当業者に公知のタンパク質中のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４８８；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４，３６７）、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２，９４４１；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４，３５０）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｕａｌ  Ａｍｂｅｒ（ＯＤＡ）法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １００，４６８）などが挙げられる。タンパク質におけるアミノ酸の改変は、人為的に行うのであれば、通常、３０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このように脳ＡＰＰに対するペプチダーゼ活性を有する限り、人為的なまたは自然界におけるアミノ酸の置換、欠失、付加、および／または挿入により天然型ヒト脳ＣＰＢタンパク質（配列番号：２、３、４）に対してアミノ酸配列が異なるタンパク質も、本発明に含まれる。
置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましいと考えられる。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
また、脳ＡＰＰに対するペプチダーゼ活性を有する、ヒト脳ＣＰＢタンパク質と構造的に類似したタンパク質の調製は、公知のハイブリダイゼーション技術（２．９  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ２．９．１−２．９．１０（Ｓｅｌｄｅｎ，Ｒ．Ｆ．），４．９  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ４．９．１−４．９．８（Ｓｅｌｄｅｎ，Ｒ．Ｆ．），６．３  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ６．３．１−６．３．６（Ｓｔｒａｕｓ，Ｗ．Ｍ．），６．４  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ６．４．１−６．４．５（Ｄｕｂｙ，Ａ，），ｉｎ’Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ’（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７））やポリメラーゼ連鎖反応技術（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ  ３−１２（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．），Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  １３−２０（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．），Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ２１−２７（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｅ．Ｓ．），ＲＡＣＥ：Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ  ２８−３８（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．），Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３９−４５（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｔ），ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ４６−５３（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｃ．ａｎｄ  Ｃａｓｋｅｙ，Ｔ．），ｉｎ’ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０））を利用して行うことができる。即ち、当業者においては、「ヒト脳ＣＰＢ」ｃＤＮＡ配列（配列番号：１）若しくはその一部をプローブとして、また、「ヒト脳ＣＰＢ」ｃＤＮＡ（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の他の生物から「ヒト脳ＣＰＢ」ｃＤＮＡと相同性の高いＤＮＡを単離し、さらに単離したＤＮＡから「ヒト脳ＣＰＢ」タンパク質と構造的に類似したタンパク質を得ることが常套手段となっている。
本発明においては、脳ＡＰＰに対するペプチダーゼ活性を有する限り、「ヒト脳ＣＰＢ」ｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質を包含する。このようなタンパク質を単離する他の生物としては、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌなどが挙げられるが、これらに制限されない。このようなタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するには、例えば、これら生物の脳、例えば、海馬が材料として適していると考えられる。
ヒト以外の生物に由来する「脳ＣＰＢ」タンパク質をコードするＤＮＡは、通常、「ヒト脳ＣＰＢ」と高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルで少なくとも４０％以上、好ましくは５５％以上、さらに好ましくは７０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上）の配列の同一性を指す。配列の相同性は、日本データバンク：ＤＤＢＪ（国立遺伝学研究所）のホモロジーサーチプログラム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等により決定することができる。
ヒト「脳ＣＰＢ」タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。例えば３２Ｐラベルしたプローブを用いて脳ｃＤＮＡライブラリーから単離する場合の一例を示せば、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、５５℃，２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの低ストリンジェントな条件で行う。より好ましくは、５５℃，０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの中程度のストリンジェントの条件で行う。さらに好ましくは６８℃，０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの高ストリンジェントな条件で行う。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。他組織から単離する場合には、類似のＣＰＢが発現している可能性が考えられるため、高ストリンジェントな条件で洗浄を行うことが好ましい。
本発明のタンパク質は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、「脳ＣＰＢ」タンパク質が発現していると考えられる組織（例えば、海馬など）の抽出液に対し、後述する「脳ＣＰＢ」タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。また、実施例に記載したように、ベンズアミジン−セファロースカラムに結合した画分を回収し、調製用ＰＡＧＥなどを適宜組み合わせることによって調製することができる。一方、組換えタンパク質は、後述するように「脳ＣＰＢ」タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養し、これらタンパク質を発現させ回収することにより調製することが可能である。
本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のタンパク質のうち、活性化ペプチドと成熟タンパク質との境界部分を含むペプチドが挙げられる。このようなペプチドは、プロタンパク質から成熟タンパク質が切り出される反応を媒介するプロテアーゼに作用し、本発明のタンパク質の成熟体の生成と拮抗すると考えられる。また、本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、本発明のタンパク質の基質との結合部位に相当するペプチドが挙げられる。このような部分ペプチドは、生体投与することで、本発明のタンパク質の阻害剤等としての利用が考えられる。これら部分ペプチドは、本発明のタンパク質を介したシグナル伝達の阻害剤や活性化剤として有用である。また、本発明の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のタンパク質（例えば、配列番号２、３、４）のＣ末端領域の部分ペプチドが挙げられ、該ペプチドは抗体の調製に利用することができる。また、本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、活性化ペプチドが挙げられる。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列を有する部分ポリペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは少なくとも８アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも９アミノ酸の鎖長を有すると考えられる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することがきでる。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、これらタンパク質をコードしうるものであれば特に制限はなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば、配列番号：１に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、本発明のタンパク質が発現している組織（例えば海馬など）由来のｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織（例えば海馬など）由来のｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：１に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、ゲノムＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。一方、合成ＤＮＡは、例えば、配列番号：１に記載のｃＤＮＡの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、ＤＮＡリガーゼで結合させることにより調製することができる。
これらＤＮＡは、組換えタンパク質の生産に有用である。即ち、本発明のタンパク質は、それをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１に記載のＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を該形質転換体またはその培養上清から生成することにより、組換えタンパク質として調製することが可能である。
例えば、大腸菌を宿主として組換えタンパク質を発現させる場合には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより発現が誘導され、種々のタグを付加することが可能なｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、本発明のタンパク質をセルロース結合ドメインとの融合タンパク質として発現させ、セルロース担体でアフィニティー精製することが可能なｐＥＴ  ＣＢＤ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３４ｂ−３８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、本発明のタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂにより精製することが可能なＧＳＴ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などを用いることができる。また、本発明のタンパク質を発現させるための宿主には制限はなく、公知のベクター系を用いて酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などで発現させることが可能である。神経細胞（ニューロン）での発現の目的から、例えば、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｖｉｒｕｓ（ＳＦＶ）ベクターを用いるシステム（Ｔｉｅｎａｒｉ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：５２１８−５２２９（１９９６）等）を用いることができる。
宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合タンパク質の形で発現させた場合には、ニッケルカラムやグルタチオンセファロースカラム等により精製することができる。また、本発明のタンパク質を融合タンパク質として発現させた場合には、その境界部位にスロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）やＦａｃｔｏｒ  Ｘａ等の切断部位を挿入しておくことにより、本発明のタンパク質部分を回収することが可能である。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはそのアンチセンスＤＮＡ等は、また、本発明のタンパク質の異常（発現異常や機能異常）に起因する疾患の遺伝子治療に応用することも可能である。遺伝子治療に用いるためのベクターとしては、ベクターから治療上有効な発現が得られる限り制限はないが、例えば、アデノウイルスベクターやセムリキ森林ウイルスベクターが挙げられる（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，３５０４−３５０７；Ｂａｒｋａｔｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５５，３３３−３４１）。
例えば、プレプロヒト脳ＣＰＢ−ｃＤＮＡをセムリキ森林ウイルスベクター（ｐＳＦＶ−１）にフレームを合わせて組み込んだベクターを作成後、ヘルパーウイルスを用いて遺伝子組み換えウイルスを完成させ、全身状態やウイルス抗体値等により治療に適切な患者を選択し、該患者に対して遺伝子治療を行うことが考えられる。
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチドに関する。該ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは本明細書において上記したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。このようなポリヌクレオチドには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的なＤＮＡと特異的にハイブリダイズし得るプローブやプライマー、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡあるいはその配列の一部を含むオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子やｃＤＮＡのクローニング、あるいＰＣＲによる増幅に利用できる。さらに、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、１本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）などの方法により、遺伝子あるいはｃＤＮＡの多型あるいは異常の検出（遺伝子診断など）に利用できる。
また、本発明は、本発明のタンパク質に結合する抗体に関する。本発明のタンパク質に対する抗体は、公知の方法により作製することが可能である（Ｓｃｈｅｉｄｔｍａｎｎ  Ｋ．Ｈ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｉｎ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．９３−１１５）。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、海馬組織より調製した天然由来の本発明のタンパク質または組換えタンパク質を、アジュバントと共に、ウサギ、モルモット、ヤギ等の動物に免疫する。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。抗原として、本発明のタンパク質の部分ペプチドを用いることも可能である。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。
これにより調製された抗体は、本発明のタンパク質のアフィニティー精製のために用いられる他、例えば、本発明のタンパク質の発現異常や構造異常に起因する疾患の検査や診断、本発明のタンパク質の発現量の検出などに利用することが可能である。
実施例に示されたように、アルツハイマー病において、本発明のタンパク質の発現の低下、および間質への沈着が認められる。本発明のタンパク質は、髄液および血清中に検出されることから、これらの試料に含まれる本発明のタンパク質の検出により、脳においてＡβの蓄積を生じる疾患の検査・診断を行なうことが可能である。このような病態診断薬として、本発明のタンパク質に対する抗体は有用である。
本発明の抗体を用いる脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患の検査は、（ａ）被検者から試料を調製する工程、（ｂ）該試料に含まれる本発明のタンパク質の量を該タンパク質に対する抗体を用いて検出する工程、を含む方法により実施することができる。本発明の検査の対象となる疾患としては、脳におけるＡβの蓄積を生じる疾患であれば制限はなく、例えば、老人性痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、遺伝性脳出血、頭部打撲が挙げられる。検査のために被験者から調製する試料としては、髄液または血清が好適である。
試料中に含まれる本発明のタンパク質は、例えば、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等の方法で検出することが可能である。検出に用いられる抗体としては、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体を検査薬として用いる場合、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）を用い、担体（例えば牛血清アルブミンまたはゼラチンなど）、防腐剤（アジ化ナトリウム）等を必要に応じて混合してもよい。
この検出の結果、健常者と比較して、被検者試料中の抗体反応性タンパク質量の増加もしくは減少、抗体反応性タンパク質の分子量の異常、および／または各分子量のタンパク質の量比の異常が認められれば、該被検者は、上記疾患にかかっているか、または上記疾患のおそれがある判定される。この検査は簡便であり被検者への負担も少ないことから、ＣＮＳの病態を検査・診断するための優れた方法である。
また、本発明の抗体を抗体治療に用いることも考えられる。抗体治療に用いる場合、ヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。このような抗体は、公知の方法により調製することができる（Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３，１３７−１４５）。
本発明は、また、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング法は、（ａ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、および（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに用いる被検試料としては、これらに制限されないが、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、修飾ペプチド、天然化合物などが挙げられる。スクリーニングに用いる被検試料は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
本発明のタンパク質と結合するタンパク質のスクリーニングは、例えば、本発明のタンパク質のＣ末端１４アミノ酸（Ｃ１４）のオリゴペプチド等を固定したアフィニティーカラムに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞の培養上清もしくは細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングを実施することが可能である。また、本発明のタンパク質と結合するタンパク質やその遺伝子のスクリーニングは、例えば、ウエストウエスタンブロッテイング法（Ｔａｒａｓｓｉｓｈｉｎ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．Ｃ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）６２，３８−４０；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．Ｃ．（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．７９，１６７１−１６７５）やｔｗｏハイブリッドシステム（Ｖｉｄａｌ，Ｍ．（１９９７）Ｔｈｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ”Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ”（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｏ．Ｋ．（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖ．５９，９４；Ｖｉｄａｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１０３２１）を利用して行うことも可能である。コンビナトリアルケミストリー技術（Ｍｙｅｒｓ，Ｐ．Ｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，７０１−７０７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．（１９９７）Ｑ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４１，１６３−１６９）等によるハイスループットを用いたスクリーニング（Ｃｅｒｒｅｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６，１９２−１９７；Ｋｅｎｎｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．５１，２４５−２６９；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ，Ｐ．Ａ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，６２４−６３１）により本発明のタンパク質に結合する化合物を単離する方法も当業者に周知の技術である。
また、本発明は、本発明のタンパク質のペプチダーゼ活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。この方法は、本発明のタンパク質によるその基質の切断活性を指標とする方法であり、具体的には、（ａ）被検試料の存在下で、本発明のタンパク質にその基質を接触させる工程、（ｂ）該基質の切断を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下において検出した場合（対照）比較して、本発明のタンパク質により引き起こされる該基質の切断を増加または減少させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法である。
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、タンパク質、天然または合成ペプチド、天然化合物、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明のタンパク質との結合活性を指標とした上記のスクリーニングにより単離された化合物を被検試料として用いることも可能である。スクリーニングに用いる本発明のタンパク質としては、天然のタンパク質でも組換えタンパク質でもよい。
基質としては、脳ＡＰＰが好適である。天然型脳ＡＰＰは、実施例に記載の方法で調製することが可能である。また、本発明のタンパク質が切断活性を示しうる限り、脳ＡＰＰの部分ペプチドや、他のＡＰＰアイソフォームやＡＰＰ類似ポリペプチド、基質の切断部位を含むように合成されたオリゴペプチドを用いてもよい。
基質の切断は、例えば基質と本発明のタンパク質をインキュベート後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、基質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出することが可能である。または、基質として合成オリゴペプチドを用いる場合は、あらかじめＮ端またはＣ端等を標識しておき、Ｔｒｉｓ−ｔｒｉｃｉｎｅ型ＰＡＧＥまたは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などにより検出することもできる。または、基質ペプチドの一端をマイクロプレート等の支持体に固定化し、他端を標識しておけば、基質の切断をより簡便に検出することが可能である。
被検試料非存在下と比較して、被検試料存在下において、本発明のタンパク質による基質の切断が促進されれば、その化合物は、本発明のタンパク質による基質の切断活性を促進する化合物と判定される。逆に被検試料存在下において、本発明のタンパク質による基質の切断が阻害されれば、その化合物は、本発明のタンパク質による基質の切断活性を阻害する化合物と判定される。本発明において「基質の切断活性を阻害する」とは、切断活性を完全に阻害する場合および部分的に阻害する場合を含む。
なお、本発明のタンパク質による基質の切断部位を決定するには、例えば、まず、本発明のタンパク質と脳ＡＰＰとをインキュベートし、切断された脳ＡＰＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＡＰＰのドメイン特異的抗体（例えばＡβについてはＡβ１−１７抗体、Ａβ１７−２４抗体、Ａβ１−４０Ｃ端抗体、Ａβ１−４２Ｃ端抗体等）を用いてウェスタンブロッティングを行い、切断部位を推定する。次に、よりスケールアップした系で本発明のタンパク質により切断された基質断片を精製し、Ｎ端またはＣ端のアミノ酸シーケンシングを行うことにより、切断部位を同定することができる。または、基質として合成オリゴペプチド（例えばＡβ１−４２等）を用い、本発明のタンパク質とインキュベート後、Ｃ端から分解された遊離アミノ酸をアミノ酸分析器により定性・定量的に測定し、切断部位を推定することができる。
本発明のタンパク質や本発明のスクリーニング方法により単離される化合物は、例えば、Ａβの生成を調節するための薬剤として、また、本発明のタンパク質が関与する脳疾患（例えば、アルツハイマー病などのＡβの蓄積を生じる疾患）の予防薬や治療薬への応用が考えられる。
本発明のタンパク質や本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を医薬として用いる場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
また、本発明は、本発明のタンパク質を含有することを特徴とする、該タンパク質のペプチダーゼ活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キットに関する。本発明のキットにおける本発明のタンパク質は、例えば、精製または粗精製タンパク質、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞外に発現した形態、または支持体に結合した形態であってもよい。本発明のキットの他の要素としては、上記タンパク質標品以外に基質を含むことが好ましい。基質としては、本発明のタンパク質が切断活性を示しうる限り制限はないが、脳ＡＰＰが好適である。天然型脳ＡＰＰは、実施例に記載の方法で調製することが可能である。また、脳ＡＰＰの部分ペプチドや、他のＡＰＰアイソフォームやＡＰＰ類似ポリペプチド、基質の切断部位を含むように合成されたオリゴペプチドを基質として含んでもよい。基質は標識されていてもよい。さらに、本発明のタンパク質と基質との反応のための緩衝液、洗浄液、基質の切断を検出するための試薬などが含まれていてもよい。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  海馬ホモジネートからの４０ｋＤａプロテアーゼの調製、およびＡＰＰタンパク質分解の解析
神経疾患以外の疾患で死亡した患者５例（５５〜８２歳）および孤発性アルツハイマー病で死亡した５例（６０〜８４歳）の合計１０例の脳標本を剖検時に死後５時間以内に採取した。側頭葉切片を作製し、液体窒素中にて凍結し、−１１０℃で保存した。ホモジネートの調製には、凍結標本から海馬領域（約４ｇ）を摘出し、続いて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／２ｍＭ  フェニルメタンスルホニルフルオリドからなる滅菌ホモジナイズ用緩衝液１５ｍｌ中にて解凍し、その後、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーにて氷上でホモジナイズした。ホモジネートは３９，０００ｇ、３０分間で遠心分離を行った。上清を４０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、沈殿物を氷冷したホモジナイズ用緩衝液に対して透析した。この透析物を海馬ホモジネートとして用いた。天然型脳ＡＰＰは、記載されている通り（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１７，２１−２７）に、抗ｃＡＰＰ抗体（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７５，３６１−３６５）を用いたホモジネートの免疫沈降によって調製した。海馬ホモジネート（１回の調製当たり約１０ｍｇ）を、平衡化緩衝液として２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて、広範囲のセリンプロテアーゼを捕捉するベンズアミジン−セファロースＴＭ６Ｂアフィニティカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）によるクロマトグラフにかけた。通過画分を回収した後、溶出物の２８０ｎｍでの光学濃度がベースライン値に達するまでカラムを平衡化緩衝液で激しく洗浄した。カラムと結合した画分を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および０．２Ｍ  ＮａＣｌからなる溶出緩衝液を用いて回収し、次いで氷冷した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した上で凍結乾燥した。クーマシーブリリアントブルー染色による全結合画分の未変性ＰＡＧＥプロフィールを図１Ａに示す。
タンパク質分解活性を損なわずに結合画分を分離するため、ＳＤＳを用いずに未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。未変性ＰＡＧＥには、液相回収装置（ＢｉｏｐｈｏｒｅｓｉｓＴＭ  ３、Ａｔｔｏ、Ｊａｐａｎ）を備えた調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置およびＴｒｉｓ−グリシン緩衝系を用いた（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．（１９８９）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，ｐｐ．１０．２．１−１０．２．９）。約３ｍｇの結合画分を未変性ＰＡＧＥにより分子量２０〜１００ｋＤａの範囲の６１画分に分離した。各画分の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色によって可視化した（図１Ｂ）。
各画分を天然型脳ＡＰＰ分解活性に関して分析するため、まず、１ｍＭ  Ｚｎ２＋の存在下にて、ヒト海馬から調製した約０．１ｐｍｏｌの天然型脳ＡＰＰを各画分（約０．０５ｐｍｏｌ）とともに３７℃で３時間インキュベートした。続いて、目的とするタンパク質分解活性を得るため、各反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のウェルに並べて泳動し、抗Ａβ１／１４抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いたウエスタンブロット解析を以下のようにして行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分離後にタンパク質をゲルからＨｙｂｏｎｄ  Ｃニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）にブロットし、その後で５％ウシ血清アルブミンを含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中に膜を１時間浸漬することにより、非特異的結合をブロックした。次に上記の緩衝液を３回交換しながら膜を４５分間洗浄し、引き続いてＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で適度に希釈した一次抗体（抗Ａβ１／１４抗体）とともに４℃で１６時間インキュベートした。これを上記の通りに再び洗浄した後、１：２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体とともに膜を室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＥＣＬ化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）を用いて、シグナルをＸ線フィルムで検出した。
解析した６１画分のうち、分子量約４０ｋＤａを含む画分１９と分子量約３０ｋＤａを含む画分１１に同程度のタンパク質分解活性が認められた。解析の結果、画分１９のタンパク質成分には均質性がなく、画分１１の成分は均質であったが室温では３０分以内に活性が消失し、−２０℃での長期保存（２週間）によっても活性が消失した。このため、タンパク質分解活性を有する分子量４０ｋＤａを含む画分１９をさらに精製することにした。
合計５回の調製用電気泳動により充分量の画分１９を回収した（図１Ｂ）。画分１９（約８μｇ）を均質化するため、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を平衡化緩衝液とする１ｍＭ  Ｍｏｎｏ  Ｓイオン交換カラムにかけた。洗浄後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．２Ｍ  ＮａＣｌを溶出緩衝液として結合画分を回収した。この結果、画分１９からは４０ｋＤａタンパク質分解活性がカラム中に捕捉され、溶出によって回収されたが、共に挙動していた他のタンパク質はそのまま通過した（図１Ｃ）。続いてこれに上記の通りに透析および凍結乾燥を行い、ヒト脳ＣＰＢ（ＨＢＣＰＢ）標品を得た。ベンズアミジン−セファロースカラムに結合した画分（約１５ｍｇ）からのヒト脳ＣＰＢの回収量は２μｇであった（約５ｐｍｏｌ）。
単離した４０ｋＤａプロテアーゼのタンパク質分解活性を解析するため、１ｍＭ  Ｚｎ２＋の存在下にて３７℃で３時間、脳ＡＰＰ基質（約０．１ｐｍｏｌ）を４０ｋＤａプロテアーゼ（０．００５〜０．１ｐｍｏｌ）と共にインキュベートし、反応産物の解析は抗Ａβ１／１４抗体を用いたウエスタンブロッティングによって解析した（図２）。以上の反応条件下で４０ｋＤａタンパク質は天然型脳ＡＰＰを分解し、５．５ｋＤａ断片を主成分とする３〜１１ｋＤａのＡβ含有ペプチドを生成した（図２、レーン５および６）。同様の反応を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、または１ｍＭジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＢｉｏＰｕｒ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下で行ったところ、ＥＤＴＡ（図２、レーン２）およびジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害因子（図２、レーン４）によって反応は完全に阻害された。コンドロイチナーゼＡＢＣ処理の効果を検証するため、まずコンドロイチナーゼＡＢＣの酵素活性を阻害するＺｎ２＋を含まない条件下において、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中にて０．１ｐｍｏｌの天然型脳ＡＰＰ（を０．５ｐｍｏｌのプロテアーゼ非含有コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）とともに３７℃で３時間インキュベートし、その後、反応混合物を６５℃で１５分間インキュベートして酵素を変性させた後、上記と同様にタンパク質分解反応を行った。その結果、反応はほぼ完全に阻害されることが判明した（図２、レーン３）。また、ＡＰＰの細胞質ドメインの一部に対応するオリゴペプチドＮＨ２−ＴＰＥＥＲＨＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥ−ＣＯＯＨ（配列番号：５）（ＡＰＰ６９５の６６８〜６９１番目のアミノ酸）に対して産生させた抗ＡＰＰ−ＣＴ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行ったところ、５．５ｋＤａ断片が主要な切断産物として検出された（図２、レーン８）。また、抗４０ｋＤａプロテアーゼ抗体あるいは抗Ｃ１４抗体の存在下（反応混合液の１／５０の容量）では、このプロテオリシスは完全に阻害された（図２、レーン９および１０）。
抗Ａβ１／１４抗体、抗ＡＰＰ−ＣＴ抗体のいずれを用いても脳ＡＰＰからの主要な分解産物として５．５ｋＤａ断片が検出された（図２）ことは、この断片がＡβのＮ末端の近傍と、膜貫通部分の近傍にあるＡＰＰ細胞質ドメインにおける切断によって生成され、ほぼ完全なＡβにわたっていることを示唆している。ヒト脳ＣＰＢにはＡβの１５〜１７番目のアミノ酸残基を切断するαセクレターゼ様活性はなく、このため抗ＡＰＰ−ＣＴドメインを有するＣ末端ＡＰＰ断片はないと考えられる。
［実施例２］  ４０ｋＤａプロテアーゼをコードするｃＤＮＡの分子クローニングおよび構造解析
Ｎ末端アミノ酸配列決定に基づいて合成したオリゴヌクレオチドによる海馬ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによってｃＤＮＡクローンを単離するために、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａタンパク質のそれぞれをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＳＱフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上に固定し、続いてエドマン分解を行った。４０ｋＤａタンパク質のミクロシークエンシング分析は成功しなかったが、これはＮ末端がブロックされていたためと考えられる。３０ｋＤａタンパク質のシークエンシングの結果を表１に示す。表は、各サイクルにおける各アミノ酸残基の収量をｐｍｏｌ単位で示した。最も多量に回収されたアミノ酸に下線を施した。各アミノ酸残基は以下の通りに略記した。Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｎ：アスパラギン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｑ：グルタミン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ａ：アラニン、Ｙ：チロシン、Ｒ：アルギニン、Ｐ：プロリン、Ｍ：メチオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン、Ｋ：リジン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｉ：イソロイシン、Ｌ：ロイシン。
0004579422.tif 000002
その結果、３０ｋＤａタンパク質は成熟型ヒト血漿ＣＰＢのＮ末端配列と同一であることが明らかになった。３０ｋＤａタンパク質の実体を解明し、４０ｋＤａタンパク質と３０ｋＤａタンパク質との関連を明らかにするために、アミノ酸配列決定の結果を用いた海馬ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析およびヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングという２つの方法によって、４０ｋＤａタンパク質をコードするｃＤＮＡの分子クローニングを行った。
まず、ｑｕｉｃｋＰｒｅｐＴＭ  ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）を用いて、２例の脳の凍結海馬ブロックからポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｐｏｌｙ（Ａ）−ｒｉｃｈ  ＲＮＡ）を調製した。ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．（１９８３）Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６９）に従ってヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを作製した。第１ストランドのｃＤＮＡは、合成オリゴ（ｄＴ）をプライマーとしてクローン化Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＦＰＬＣ−ｐｕｒｅＴＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ  １．５μｇから合成した。続いて、クローン化大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）の存在下でクローン化大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、第１ストランドのＤＮＡから第２ストランドのｃＤＮＡを合成した。Ｔ４ファージポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）によって２本鎖ｃＤＮＡを平滑末端化し、大腸菌ＥｃｏＲＩメチラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を用いてそのＥｃｏＲＩ部位を修飾した後に、ＥｃｏＲＩリンカーを連結した。ＤＮＡライゲーションキット（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を用いてλｇｔ１１ファージベクターのＥｃｏＲＩアームとｃＤＮＡとの連結を行い、続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングを行った（ＰｈａｇｅＭａｋｅｒＴＭ、Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）。宿主菌として大腸菌Ｙ１０９０ｒ−を用いた場合、このライブラリーの効率は９．０×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ  １μｇであった。
次に、単離した４０ｋＤａタンパク質に対するポリクローナル抗体（１：１５００に希釈）（後述）を用いて、上記のλｇｔ１１ヒト海馬ライブラリーの免疫学的スクリーニングを行った（ＳｔＪｏｈｎ，Ｔ．Ｐ．（１９８９）Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，Ｊｏｈｎ  ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，ｐｐ．６．７．１−６．７−５）。３×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のファージクローンのスクリーニングにより３つの陽性クローンが分離された。制限エンドヌクレアーゼによる消化プロフィールはいずれのＤＮＡも極めて類似していたため、最も長い挿入断片を持つクローンの構造を解析した。塩基配列決定はＰＲＩＳＭＴＭ自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
この結果同定された１５４４ｂｐ長のｃＤＮＡ（配列番号：１）には、３６０個のアミノ酸残基（配列番号：２）をコードすると予想される１０８３ｂｐ長の読み枠が１つ存在する（図３）。コンピュータを用いたホモロジー解析により、このｃＤＮＡはヒト血漿ＣＰＢ（ＨＰＣＰＢ）（Ｅａｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２１８３３−２１８３８）と高い相同性があることが示された。相同性を有する他のタンパク質としては、組織型ＣＰＢ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２５７５−２５８１）および肥満細胞ＣＰＢ（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３，１６３０−１６３６）が同定された。プレプロヒト血漿ＣＰＢと、同定されたヒト脳プロテアーゼ（プレプロヒト脳ＣＰＢ）の構造の比較では、後者（プレプロヒト脳ＣＰＢ）も、成熟型酵素（ヒト脳ＣＰＢ）では２４６アミノ酸、ヒト血漿ＣＰＢでは３１７アミノ酸）の前にシグナルペプチド（２２アミノ酸）および活性化ペプチド（９２アミノ酸）が存在するという共通のＣＰ構造を持つことが示された（図４Ａ）。両者の差は成熟型酵素の配列にある。第１に、成熟型血漿酵素の中央部にある３７個のアミノ酸残基は、プレプロヒト血漿ＣＰＢの１９８〜３３４番目のアミノ酸残基（プレプロヒト血漿ＣＰＢ  ｃＤＮＡの６３３〜７４３番目のヌクレオチド残基）に対応するが、これはヒト脳ＣＰＢには存在しない。第２に、プレプロヒト血漿ＣＰＢ  ｃＤＮＡの１１９０〜１２４１番目の残基に対応するヌクレオチドが存在しないために４０個のアミノ酸残基（プレプロヒト血漿ＣＰＢの３８４〜４２３番目のアミノ酸残基）の欠失がもたらされ、フレームシフトによってプレプロヒト脳ＣＰＢのＣ末端に特有な１４個のアミノ酸残基が生じる。前者の変化は最終的にはインフレーム欠失をもたらし、後者は別の欠失を引き起こし、そのためにプレプロヒト血漿ＣＰＢ  ｍＲＮＡの３’非コード領域（４アミノ酸）および異なる停止コドンを含む異なるフレームの翻訳に起因するアミノ酸の変異が生じる。
ヒト脳ＣＰＢに特有なＣ末端１４アミノ酸残基（Ｃ１４）に相同なペプチド配列の有無をペプチドおよびタンパク質に関する最新のデータベースで検索した（図４Ｂ）。最も相同性の高かったペプチドは、種々の植物種の葉緑体ＡＴＰ合成酵素γサブユニットのドメイン中に認められた（Ｉｎｏｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，７３３３−７３３８）。Ｃ１４ペプチドと葉緑体の光依存的調節ドメインのＮ末端領域に位置するこれらの植物ペプチドとの間の相同性は極めて高い（８５％を上回った）。９個の同一アミノ酸に加えて、アミノ酸の４番目（プロリン）、５番目（バリン）および１３番目（ロイシン）はそれぞれ機能的に同一な（中性かつ疎水性）アミノ酸であるバリン、トレオニンおよびプロリンによって置換されている。
次に、３０ｋＤａタンパク質をコードするｃＤＮＡを得るため、免疫学的スクリーニングとは独立に、ＲＴ−ＰＣＲ法および３’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）系（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ＵＳＡ）を用いて脳ＣＰＢのｃＤＮＡの単離を試みた。テンプレートとしては、上記ライブラリー作製に用いたものとは異なり、３例の正常脳から調製した海馬ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡはアミノ酸配列決定結果（表１）に基づいて合成したセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＣＴＣＣＧＣＡＴＣＧＴＡＣＴＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＴＣＡＣ−３’／配列番号：６）を用い、アンチセンスプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を有するアダプタープライマーを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ＵＳＡ）により合成した。その結果、ＲＴ−ＰＣＲ産物として１０７７ｂｐの単一のバンドのみが検出された（図４Ｃ、レーン１）。ＨＰＬＣによる精製後にＰＣＲ産物のシークエンス解析を行った。塩基配列決定はＰＲＩＳＭＴＭ自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。
その結果、この配列は成熟型ヒト脳ＣＰＢに対応する、プレプロヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡのヌクレオチド３６０〜１４３６と同一であった。すなわち、２種のクローニング手順により得られたいずれのｃＤＮＡも、海馬内の同一のｍＲＮＡに由来することが示された。また、この結果から、３０ｋＤａのタンパク質は、４０ｋＤａのタンパク質と同一の遺伝子にコードされており、４０ｋＤａタンパク質のＮ末部分が切り出されて、３０ｋＤａのヒト脳ＣＰＢ成熟タンパク質が生成するものと考えられる。
［実施例３］  各種組織におけるノーザンブロット解析
種々の臓器からのＲＮＡ試料を用いて、プレプロヒト脳ＣＰＢ  ｍＲＮＡまたはそのホモログの発現を解析した。まず、正常剖検標本から調製したヒトの脳（海馬）、心臓、膵臓、腎臓、肝臓および脾臓に由来するポリ（Ａ）＋ＲＮＡ  １μｇを、ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．６％ホルムアルデヒドを含む）中で１％アガロースゲルにて電気泳動した。電気泳動後にキャピラリーブロット法によってゲルからナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）に転写し、ベーキングによって固定した。続いてブロットをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）中にて６８℃で１時間ハイブリダイズさせた。
プローブは、５’−ＧＧＴＴＣＡＴＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＡＴＧＴ−３’（配列番号：７）をセンスプライマー（ｃＤＮＡのヌクレオチド５９６〜６１８に対応）、５’−ＴＣＡＧＧＧＧＣＡＴＴＡＡＡＣＡＴＴＣＣＴＡＡＴ−３’（配列番号：８）をアンチセンスプライマー（ｃＤＮＡのヌクレオチド１１３５〜１１１２に対応）として用い、Ｔａｋａｒａ  ＴａｑＴＭ組み換えＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を用いたＰＣＲによって増幅したプレプロヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡのＣ末端部分５３８ｂｐを用いた（図４Ｃ、レーン２）。ヒトβ−アクチンｃＤＮＡプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を対照として用いた。以上のプローブには、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰによる放射標識を行った。ブロットを２×ＳＳＣ中、続いて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中にて室温で２０分ずつ各２回洗浄し、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃、４０分間の洗浄を２回行った。
プレプロヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡのＤＮＡ配列がプレプロヒト血漿ＣＰＢ  ｃＤＮＡと非常に相同性が高いことから予想された通り（図４Ａ）、ヒト肝臓ではこのプローブにより１．８ｋｂバンドの大量発現が認められた（図５、レーン６）。これに対して、ヒト脳ＲＮＡでは１．５ｋｂバンドの発現がはるかに低い強度で検出された（図５、レーン１）。心臓、胎盤、膵臓、腎臓および脾臓由来のＲＮＡ試料は、このプローブに反応するシグナルを発現しなかった（図５、レーン２、３、４、５および７）。脳および肝臓におけるｍＲＮＡシグナルのサイズの差は、プレプロヒト脳ＣＰＢおよびプレプロヒト血漿ＣＰＢのｃＤＮＡのコード領域のサイズの差とよく一致していた。また、この結果は、膵臓内で大量に発現される組織型ＣＰをこのプローブが分離することを示している。
［実施例４］  ４０ｋＤａプロテアーゼおよびプロテアーゼのＣ末端１４アミノ酸ペプチドに対するポリクローナル抗体の調製、ならびにウエスタンブロット解析
ベンズアミジン−セファロースカラムに結合した画分を調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、液相回収装置中に回収して、ニュージーランドホワイトウサギ２匹を免疫するのに十分な量（２ｍｇ）の４０ｋＤａプロテアーゼを調製した。４０ｋＤａのタンパク質が均質なものとして分離されたことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールから明らかである（図６Ａ）。未変性ＰＡＧＥの場合とは異なり、最初の分離段階がＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合には、変性した４０ｋＤａタンパク質を均質化するためのイオン交換クロマトグラフィーによる分離をさらに行う必要はなかった。調製された４０ｋＤａのプロテアーゼタンパク質を抗原として用いて、ウサギに抗プレプロヒト脳ＣＰＢポリクローナル抗体を産生させた。抗血清を得、ＩｇＧ画分をＥＺ  Ｐｒｅｐ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。抗原に対する特異性を抗体価で検討したところ、プレイミューン血清（対照抗体）と比較して２０００倍の感度を有することが示された。これとは別に、このプロテアーゼに特有なＣ末端１４アミノ酸残基に対応するオリゴペプチドＮＨ２−ＳＮＰＰＶＥＫＬＬＰＬＳＬＫ−ＣＯＯＨ（配列番号：９）に対して、抗Ｃ１４抗体を産生させた。このオリゴペプチドは、３−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシミドエステル（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）と結合させてからウサギの免疫化に用いた。得られた抗血清を、オリゴペプチドを結合させたセファロースＣＬ−４Ｂカラムにてアフィニティ精製した。この特異性を抗体価で検討したところ、プレイミューン血清（対照抗体）と比較してオリゴペプチドに対して１５００倍の感度を有することが示された。
未変性ＰＡＧＥによって分離した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗原として用いて、実施例１と同様のウエスタンブロット解析によって上記の抗体の特異性を検討した（図６Ｂ）。その結果、抗プレプロヒト脳ＣＰＢポリクローナル抗体は、単一の４０ｋＤａバンドを検出し、そのバンド強度はタンパク質分解活性が最初に認められた画分１９（図１Ｂ）で最も高かった。種々の脳試料から得た海馬ホモジネートの解析では、この抗体によって４０ｋＤａおよび３０ｋＤａのバンドが検出された（図６Ｃ、レーン１〜４）。この結果は、分子量４０ｋＤａおよび３０ｋＤａに対応する２つの未変性ＰＡＧＥ画分にＡＰＰ分解活性があり、３０ｋＤａタンパク質が成熟型プレプロヒト脳ＣＰＢであるとの所見と関連している。抗Ｃ１４抗体を用いたウエスタンブロット解析では、脳試料に関しては本質的に同じ結果が得られたが（図６Ｃ、レーン５〜７）、ヒト肝臓ホモジネート中には免疫反応性バンドは全く検出されなかった。これは、抗Ｃ１４抗体がヒト脳内のヒト脳ＣＰＢを認識することを意味している。
正常人およびアルツハイマー病患者の髄液および抹消血清をサンプルとし、抗Ｃ１４抗体を用いたウェスタン法により解析したところ、いずれのサンプルにも抗Ｃ１４抗体の免疫反応性が検出された。また、抹消血清中では、加齢に伴い免疫反応性が増加する傾向が認められた。
［実施例５］  免疫組織化学分析
実施例４で作製した、ヒト脳ＣＰＢ（ＨＢＣＰＢ）を特異的に認識する抗体を用いて、以下の免疫組織化学分析を行った。剖検直後に、免疫組織化学試験に用いるための標本を１０％ホルムアルデヒド中に１週間以上保存することによって固定して、５μｍ厚のパラフィン切片を作製した。免疫組織化学分析はアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）法によって行った。脱パラフィン処理後、３％過酸化水素中に５分間浸漬することによって内因性ペルオキシダーゼの失活を行い、切片をクエン酸ナトリウム緩衝液中に浸し、続いてリン酸緩衝生理食塩水中に浸漬した。次いでこれを１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で１：１００に希釈した目的の一次抗体とともにモイストチェンバーにて４℃で一晩インキュベートした。反応産物を３，３’−ジアミノベンジジンによって可視化し、顕微鏡で観察した。対照標本では、一次抗体として免疫前血清を用いた。
５例の正常脳ではすべて、検討したニューロンの大半で抗プレプロヒト脳ＣＰＢおよび抗Ｃ１４免疫反応性がいずれも細胞質（神経細胞体）内で検出された（図７）。海馬錐体ニューロン（図７Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）および外側膝状体ニューロン（図７Ｅ、ＦおよびＧ）は特にこれらの抗体に関して均一に免疫反応性であった。舌下運動ニューロン、視床ニューロン、基底核などの他のニューロンにも免疫反応性が認められたが、海馬顆粒細胞はこれらの抗体では染色されなかった。神経細胞体に限局的なヒト脳ＣＰＢの発現は顆粒状かつユビキタスであり、抗Ｃ１４免疫反応性も顆粒状に発現された（図７ＤおよびＧ）。抗ヒトＣＤ６８抗体を用いた染色によって同定された海馬実質中のミクログリアの一部は、抗ヒト脳ＣＰＢおよび抗Ｃ１４免疫反応性をいずれも強く発現した。このようなミクログリアは細胞外基質内（図７Ｂ）、ニューロンと直接隣接した位置（図７Ｃ）または血管周囲（図７Ｅ）に位置する。抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体を用いた本発明者らの解析では、すべての正常脳に関して抗プレプロヒト脳ＣＰＢおよび抗Ｃ１４免疫反応性を同時発現するＧＦＡＰ陽性アストロサイトは認められなかった。ヒト脳ＣＰＢプロテアーゼを明瞭に発現した他の種類の細胞は、上衣細胞および脈絡叢細胞（図７ＨおよびＩ）であり、細胞質でのユビキタスな発現は顆粒状であった。
免疫蛍光共焦点レーザー顕微鏡検査により、ニューロンにおけるこのプロテアーゼの正確な細胞内局在を検討した（図８）。抗体としては、抗ヒトニューロフィラメント抗体（Ｓａｎｂｉｏ、ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ６８モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、抗ヒトＧＦＡＰモノクローナル抗体（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ＵＳＡ）、抗Ａβ１／４０抗体（ＵＳ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＵＳＡ）、抗プレプロヒト脳ＣＰＢ抗体およびＣ１４抗体を用い、ＭＲＣ−１０２４共焦点レーザー顕微鏡（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、ＵＳＡ）で観察した。この結果、海馬錐体ニューロン（図８Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＨおよびＩ）、外側膝状体ニューロン（図８Ｄ、Ｅ、およびＦ）ともに、免疫反応性は明瞭に細胞質（神経細胞体）内に典型的な顆粒状様式で存在しており、抗ヒト脳ＣＰＢ（図８Ａ〜Ｆ）および抗Ｃ１４（図８Ｇ〜Ｉ）抗体のいずれによっても検出された。Ａβペプチドとこのプロテアーゼの局在との関係を解析するために抗ヒトＡβ１／４０および抗Ｃ１４抗体を用いて海馬切片を解析した（図８Ｊ、ＫおよびＬ）。この２つの免疫反応性は錐体ニューロンの神経細胞体内に顆粒として共存していた。Ｃ１４免疫反応性はグリア（ミクログリアと思われる）内でも認められたが、Ａβ１／４０免疫反応性は主に神経細胞体に認められた。
５例の孤発性アルツハイマー病患者から得た脳組織も解析した。アルツハイマー病患者のニューロン、特に海馬錐体ニューロンでは、ヒト脳ＣＰＢは正常試料のようにユビキタスではなく、錐体ニューロンの一部では免疫反応性が全く認められなかった（図９ＡおよびＢ）。検討したすべてのアルツハイマー病患者の脳で海馬実質中に抗Ｃ１４免疫反応性の細胞外沈着が検出され、これにはグリア浸潤を伴う斑状沈着として認められるもの（図９Ｂ）と、細胞浸潤を伴わないより均一な沈着として認められるもの（図９Ｃ）があった。正常脳と比較して、アルツハイマー病患者の脳では抗プレプロヒト脳ＣＰＢおよび抗Ｃ１４抗体に対する免疫反応性を有するミクログリアの数が増加しており、海馬実質中に免疫細胞がクラスターとして認められた（図９Ｆ）。ミクログリアを特異的に認識する抗ＣＤ６８抗体またはＣ１４抗体を用いて連続切片を解析したところ、免疫反応性細胞はミクログリアであり、この細胞ではいずれの抗体でも免疫反応性を示す呈色が共存していた（図９ＤおよびＥ）。検討したすべてのアルツハイマー病患者で海馬内に老人斑が存在しており、図９Ｂに示す通り、抗Ｃ１４免疫反応性は老人斑の位置と共通していた。アミロイド体は検討したすべてのアルツハイマー病患者の脳組織中で検出されたが、抗Ｃ１４抗体に関する免疫反応性はいずれも発現しなかった（図９Ｇ）。アルツハイマー病患者の脳での上衣細胞および脈絡叢細胞の免疫反応性は正常脳と差が認められなかった。
［実施例６］  既知のＣＰＢファミリーとの比較検討
ＣＰＢの精製および特徴分析が最初になされて以来（Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｇｌａｄｎｅｒ，Ｊ．Ａ．（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３１，３７９−３９３）、ＣＰＢが明らかに同定されているのは膵臓のみであった（Ｐａｓｃｕａｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９，６０６−６１６；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２５７５−２５８１）。このプロテアーゼは以前には消化器官のみから分泌される消化酵素と考えられていた。比較的最近になって、ＣＰＢとその相同酵素は、肥満細胞分泌顆粒などの消化器以外の組織（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３，１６３０−１６３６；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９，２７３−２８２）や血漿中（Ｅａｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２１８３３−２１８３８）にも見いだされた。詳細な特徴が明らかにされている膵臓内のＣＰに基づくと、この酵素群には特徴および特異性が異なる成熟型酵素を生成する２つのプレプロＣＰ、すなわちＡ型（ＣＰＡ）およびＢ型（ＣＰＢ）が存在する（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｓ．（１９７６）Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｂ．Ｉｎ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｓ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６９−２２３）。トリプシンはシグナルペプチドおよび活性化ペプチドを除去することにより、ＣＰＡとＣＰＢの両方を活性化する。ヒト肥満細胞分泌顆粒内のＣＰの生化学的特徴は組織型ＣＰの特徴と類似しており、これらの３３〜４０ｋＤａのＺｎ−メタロペプチダーゼは中性からやや塩基性のｐＨで活性であり、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害因子、ＥＤＴＡ、フェナントロリンおよび８−ヒドロキシキノリンによって阻害され、免疫刺激を受けると肥満細胞から放出される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３，１６３０−１６３６）。
プレプロヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡの構造解析では、ヒト脳ＣＰＢはＨＰＣＰＢとの相同性が高く（７０％を上回る）、ヒト肥満細胞ヒト膵臓ＣＰＢとの相同性は中等度（ほぼ２５％）であった。ヒト血漿および肥満細胞のＣＰＢと同じく、ヒト脳ＣＰＢには活性化ドメインにアスパラギン結合オリゴサッカライドを生成するグリコシル化部位と推定される３つの部位が保存されている（図３）。これらのＣＰＢの間では、基質結合に関与するアミノ酸残基（Ａｒｇ−１８３、Ａｓｎ−２０４、Ａｒｇ−２０５、Ａｒｇ−２２０、Ｓｅｒ−２７４、Ｔｙｒ−２７５、Ｔｙｒ−３２６およびＡｓｐ−３３３）および亜鉛との結合に関与するアミノ酸残基（Ｈｉｓ−１８１、Ｇｌｕ−１８４およびＨｉｓ−２７３）は高度に保存されている。これらの２つのｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ構造はまだ決定されていないが、ｃＤＮＡ構造の比較から、ＨＰＣＰＢ遺伝子はヒト脳ＣＰＢ遺伝子の先祖遺伝子であることが示唆される。ヒト膵臓プレプロＣＰＢをコードする相同遺伝子の存在という観点から考えると（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９，２７３−２８２）、プレプロヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡのエキソン−イントロン境界を推定することができる。脳プロテアーゼ（ヒト脳ＣＰＢ）では発現されない３７個のアミノ酸に対応するＤＮＡはヒト膵臓遺伝子のエキソン７に対応する１つのエキソンによってコードされており、これは選択的スプライシング機構の結果である可能性が高い。プレプロＨＰＣＰＢのＣ末端部分に位置し、ヒト脳ＣＰＢ中には存在しない１８個のアミノ酸は、１つのエキソンのみによってコードされるわけではない。プレプロＨＰＣＰＢ  ｍＲＮＡのヌクレオチド１１９０〜１２４１に対応する５２ｂｐの欠失によってＨＰＣＰＢからの１８個のアミノ酸（３８５〜４０１アミノ酸残基）の除去およびヒト脳ＣＰＢのフレームシフトが起こり、ヒト脳ＣＰＢに特有のＣ末端１４アミノ酸残基を生じた。以上の所見は、プレプロヒト脳ＣＰＢ  ｍＲＮＡが、選択的ＲＮＡスプライシングに由来する組織特異的アイソフォームではなく、プレプロＨＰＣＰＢと同じ祖先遺伝子から最近になって進化した別の分子であることを示唆する。
成熟型ＣＰは一般に塩基性が強く、中性ｐＨでの実効電荷は全体で＋１０〜２０［（Ｌｙｓ＋Ａｒｇ）−（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）］である。構造解析ではヒト脳ＣＰＢは弱塩基性であり、実効電荷は＋７であることが示されたが、肝臓内で合成されるヒト脳ＣＰＢや肥満細胞ＣＰＢはいずれも強塩基性であり、実効電荷は＋１１〜１６である。これらの構造的特徴は、ヒト脳ＣＰＢも塩基性ＣＰＢファミリーのメンバーであり、このためＣ末端のアルギニンおよびリジン残基に対する特異性を有することを示唆する。
ＨＰＣＰＢの場合、予想される機能は血液凝固時の抗線溶作用であり、部分分解を受けたフィブリン上のプラスミノーゲン結合部位がこれによって除去されるために血漿凝血塊の溶解は遅延する（Ｓａｋｈａｒｏｖ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１４４７７−１４４８２）。さらに、脳、血漿および膵臓のＣＰＢのＣ末端部分の構造の比較から、基質結合部位である最もＣ末端の残基（プレプロＨＰＣＰＢの第３８５残基のグルタミン）を含む１８個のアミノ酸残基がヒト脳ＣＰＢには存在しないことが示された。ヒト脳ＣＰＢに特有のＣ末端１４アミノ酸は、同定された他のＣＰのいずれの部分とも相同性が認められなかった（図４Ｂ）。この配列と最も高い相同性が認められたペプチドは、種々の植物種に由来する植物葉緑体ＡＴＰ合成酵素γサブユニットの光依存性調節ドメインと隣接したＮ末端部に位置していた（図４Ｂ）。ＡＴＰ合成酵素は電子伝達鎖によって生じたプロトンの電気化学的勾配との共役により、ＡＴＰを合成する。このγサブユニットは葉緑体ゲノムではなく核にコードされており、ＡＴＰ合成酵素の光依存的調節に必須であると考えられている（Ｉｎｏｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，７３３３−７３３８）。ヒト脳ＣＰＢでＣ末端１４アミノ酸ペプチドが特有に発現されることの意義はまだ明らかではないが、ＡＴＰ合成酵素の重要なドメインと相同性があることから、ＡＴＰ依存性プロテアーゼおよびＡＴＰと結合してアセンブルする種々のタンパク質を含んでいる２６Ｓプロテアソームとの関連性が示唆される。
膵臓ＣＰは単量体として存在するだけでなく、タンパク質分解特性の異なる１つまたは２つのプロテアーゼとの二重または三重複合体としても存在する（Ｋｅｒｆｅｌｅｃｋ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５１，５１５−５１９）。例えば、ヒト膵臓プロＣＰＡは分泌顆粒内ではプロプロテイナーゼＥとの二重複合体である（Ｐａｓｃｕａｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９，６０６−６１６）。ウシ膵臓内のプロテアーゼはキモトリプシノーゲンＣ／プロプロテイナーゼＥとの三重複合体であり（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，２４６０−２４６５）、クジラ膵臓ではキモトリプシノーゲンＣとの二重複合体である（Ｙｏｎｅｄａ，Ｔ．（１９８０）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６７Ｂ，８１−８６）。この種のプロテアーゼが相補的なタンパク質分解特性を有する複合体を形成することには、消化作用を効率化する機能があると思われる。ヒト脳ＣＰＢの調製を通じて、プロプロテイナーゼＥとキモトリプシノーゲンＣはいずれも分子量やイオン交換クロマトグラフィーにおける親和度の点でヒト脳ＣＰＢとは異なったことから、ヒト脳ＣＰＢのエンドプロテアーゼ活性はヒト脳ＣＰＢとのプロテイナーゼ活性複合体によるものではない可能性が高い。タンパク質分解活性を持つ最終産物は、高感度銀染色によって可視化された単一の４０ｋＤａバンドであった。さらに、ヒト脳ＣＰＢの調製工程でヒトプロテイナーゼＥの自己溶解を誘発するＳＤＳ（Ｓｚｉｅｇｏｌｅｉｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５１，５９５−５９９）を用いておらず、このプロテイナーゼがヒト脳ＣＰＢとともに同時精製されたならば検出されたはずである。
天然型ＡＰＰとコンドロイチナーゼで前処理したＡＰＰを用いた場合のタンパク質分解効率の差は、荷電効果がタンパク質分解に影響することを示唆する。中等度に陽性荷電したヒト脳ＣＰＢは、陰性荷電したコンドロイチン硫酸部分を含む天然型ＡＰＰを、それを含まないＡＰＰよりもはるかに効率的に捕捉すると考えられる。ヒト脳内でこれが成り立つとすれば、ＡＰＰファミリーに属する種々の分子が存在する。脳ＡＰＰの一部には、特有のプロテオグリカンの成分であるアピカンが含まれる（Ｓｈｉｏｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１３８１９−１３８２２）。このコアタンパク質はエキソン１５によってコードされる１８個のアミノ酸を欠失したＡＰＰ６９５であり、これにはグルコサミノグリカン結合のための認識シグナル（エキソン１４とエキソン１６との間のアミノ酸残基に生じる）と結合したコンドロイチン硫酸複合糖質が含まれる（Ｐａｎｇａｌｏｓら、１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１０３８８−１０３９１）。抗ｃＡＰＰ抗体を用いた天然型脳ＡＰＰの免疫沈降の段階で、ＡＰＰとの相同配列を持つＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２が共沈すると考えられる。実際、コンドロイチン硫酸はＡＰＰとの場合と同じようにＡＰＬＰ２の特定のアイソフォームと結合する（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１６５２２−１６５２５）。しかし、抗Ａβ１／１４抗体を解析に用いた場合には、Ａβの細胞外ドメインと相同な配列がこれらのタンパク質に存在しないことから、ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２に由来する断片は検出されなかった（Ｗａｓｃｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０７５８−１０７６２；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４４８１−４４８６）。このため、ＡＰＰおよび／またはアピカンや、現時点ではまだ同定されていないアイソフォームなどのＡＰＰアイソフォームを伴うプロテオグリカンに由来するＡβ含有ペプチドは、ヒト脳ＣＰＢの標的となりうる。脳ＡＰＰの分子的多様性も、基質−プロテアーゼ間の厳密な関係に関連しており、それによってアルツハイマー病の病態生理の組織および種特異性が生じていると考えられる。
［実施例７］  カルボキシペプチダーゼとしての蛋白分解作用
合成Ａβ１−４０およびＡβ１−４２（各０．１ｐＭ）を基質としてヒト脳カルボキシペプチダーゼＢ（０．０１ｐＭから０．２ｐＭまで）を３７℃で１６時間作用させると、用量依存的に低分子ペプチドを形成した。ウェスタンブロット解析において、Ａβ１−４０基質については抗Ａβ−Ｎ端抗体で低分子化ペプチド（数アミノ酸分がシフト）が確認できるが、これは抗Ａβ４０断片抗体では確認できない。一方、Ａβ１−４２基質についても抗Ａβ−Ｎ端抗体で低分子化ペプチド（数アミノ酸分がシフト）が確認できるが、これは抗Ａβ４２断片抗体では確認できない。これらの実験的事実はヒト脳型カルボキシペプチダーゼＢがニューロン内のＡβペプチドのＣ端側アミノ酸を分解する可能性、特に凝集性の高いＡβ１−４２を代謝してより毒性の低いＡβペプチドに変換する生理機能をもつ可能性を示唆する。
［実施例８］  神経外胚葉由来細胞におけるヒト脳ＣＰＢの発現
ヒトおよびラット由来の膵臓および精巣の組織切片についてヒト脳ＣＰＢに対する抗体（Ｃ端側１４アミノ酸に対する抗体：抗Ｃ１４モジュール抗体）を用いた免疫組織化学的解析により、いずれの種もランゲルハンス島β細胞（インスリン産生細胞）の細胞質、および精巣間質ライデイッヒ細胞細胞質（図１０）に著明な免疫染色性を認めた。
この結果から、ヒト脳ＣＰＢが、インスリンと同じくβ細胞で産生されβアミロイドと類似した特性をもつアミリンを代謝する機能を有することが示唆される。アミリンのインスリン作用における機能を考慮すれば、ヒト脳ＣＰＢが特定の糖尿病の病態生理に関連する可能性がある。
また、ヒト脳ＣＰＢは、ヒト精巣ライディッヒ細胞の細胞質における発現も認められた。この事からヒト脳ＣＰＢがこの内分泌細胞で産生される多くの蛋白性ホルモンの産生・分泌・分解等に関与している可能性がある。
産業上の利用の可能性
本発明の脳ＣＰＢタンパク質は、脳ＡＰＰを切断し、Ａβ含有ペプチドを生成する生理的活性を有している。また、ＡβペプチドをＣ末端から分解する生理的活性をも有している。従って、脳ＣＰＢタンパク質は、病的なＡＰＰ代謝やＡβ含有ペプチド生成を制御する治療薬となりうる他、Ａβペプチドの生成やそれに関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）の発症の分子メカニズムを解明するための有用なツールとなる。さらに、髄液や抹消血中にも微量発現する脳ＣＰＢは、ＡＰＰ・Ａβ代謝異常を検査・診断するためのＣＮＳの病態マーカーとしても有用である。脳ＣＰＢは、また、脳においてＡβの蓄積を生じる疾患の医薬品候補化合物のスクリーニングに利用することも可能である。即ち、本発明により、脳においてＡβの蓄積を生じる疾患の予防、治療や検査のための新規かつ有用な方法が提供された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト海馬ホモジネートのＡＰＰ分解活性を示す写真である。（Ａ）ベンズアミジン−セファロース６Ｂアフィニティカラムと結合した画分の未変性ＰＡＧＥプロフィール。クーマシーブリリアントブルー染色。左：分子量マーカーの移動位置をキロドルトン単位で示したもの。２２０ｋＤａ：ミオシン、９７ｋＤａ：ホスホリラーゼｂ、６７ｋＤａ：ウシ血清アルブミン、４６ｋＤａ：卵白アルブミン、３０ｋＤａ：脱炭酸酵素、２１ｋＤａ：トリプシン阻害因子。（Ｂ）調製用未変性ＰＡＧＥによって分画したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。平行ウェルには３つの連続した画分のうち１つずつを並べて泳動し、分離した後に銀染色によって可視化した。（Ｃ）未変性ＰＡＧＥによって分離した画分１９のＭｏｎｏ  Ｓイオン交換クロマトグラフィー。縦軸：２８０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）。横軸：画分をｍｌ単位で示したもの。矢印は溶出緩衝液を加えた画分の位置を示す。
図２は、精製した４０ｋＤａタンパク質の脳ＡＰＰ分解活性を示す写真である。約０．１ｐｍｏｌの天然型ＡＰＰ（レーン３を除く）またはコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣＤＲ−ＡＢＣ）で前処理したＡＰＰ（レーン３）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（レーン２）または１ｍＭジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害因子（ＣＰＩ）（レーン４）の存在下または非存在下で、４０ｋＤａプロテアーゼ（レーン２、３、４、６、７、８、９および１０では約０．０５ｐｍｏｌ、レーン５では約０．０１ｐｍｏｌ）で処理した。また抗４０ｋＤａプロテアーゼ抗体（レーン９）あるいは抗Ｃ１４抗体（レーン１０）に共存下（容量比で１／５０）でも解析した。Ｔｒｉｓ−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、レーン１から６までに対応するブロットには抗Ａβ１／１４抗体、レーン７および１０に対応するブロットには抗ＡＰＰ−ＣＴ抗体を用いて解析した。左：分子量マーカーの移動位置をキロドルトン単位で示したもの。４６ｋＤａ：卵白アルブミン、２１ｋＤａ：トリプシン阻害因子、１４ｋＤａ：α−ラクトアルブミン、６．５ｋＤａ：ミオグロビンＩＩ、３．４ｋＤａ：ミオグロビンＩ。矢印は５．５ｋＤａのＡβペプチドの移動位置を示す。
図３は、プレプロヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡの塩基配列および予想されるアミノ酸配列。左の数字はｃＤＮＡのヌクレオチド残基を示し、右の数字は予想されるアミノ酸残基を示す。矢尻は疎水性シグナル（２２アミノ酸残基）の切断部位、および活性化ペプチド（９２アミノ酸残基）がプレプロ酵素から放出されると予想される切断部位を示す。３０ｋＤａタンパク質（成熟型酵素）中に同定されたアミノ酸配列には下線を施した。停止コドンおよびポリアデニル化シグナルには二重下線を施した。Ｎ結合グリコシル化部位はアスパラギン残基の下に●印を付した。組織ＣＰＢおよびＨＰＣＰＢに関して、亜鉛結合にかかわると予想されるアミノ酸残基（円で囲んだアミノ酸残基）および基質結合にかかわると予想されるアミノ酸残基（四角で囲んだアミノ酸残基）を示した。以上の配列データはＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＢ０１１９６９として寄託されている。
図４は、プレプロヒト脳ＣＰＢの分子的特徴の決定。（Ａ）プレプロヒト脳ＣＰＢおよびプレプロＨＰＣＰＢの構造を比較した模式図。（Ｂ）ヒト脳ＣＰＢに特有なＣ末端１４アミノ酸残基をコンピューター検索による相同ペプチドとともに併置したもの。同一のアミノ酸を囲って示した。（Ｃ）ヒト脳ＣＰＢに関するヒト海馬ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析を示す写真。ＤＮＡ分子量マーカーの移動位置をｂｐ単位で示した。矢尻は合成ヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡ（左）の１０７７ｂｐバンドおよびヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡの３’末端部分に対応する５３８ｂｐバンド（右）の移動位置を示す。
図５は、種々の臓器由来のヒトｍＲＮＡのノーザンブロット解析を示す写真である。ヒト脳（海馬）（レーン１）、心臓（レーン２）、胎盤（レーン３）、膵臓（レーン４）、腎臓（レーン５）、肝臓（レーン６）および脾臓（レーン７）由来の全ＲＮＡ２０μｇから調製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、２回に分けて（ＡおよびＢ）変性アガロースゲルに並べて泳動した。（Ａ）３２Ｐで標識したプレプロヒト脳ＣＰＢ  ｃＤＮＡの５３８ｂｐ断片をプローブに用いたオートラジオグラム。（Ｂ）３２Ｐで標識したβ−アクチンｃＤＮＡプローブを用いたオートラジオグラム。左：ＲＮＡ分子量マーカーの移動位置をｋｂ単位で示したもの。矢尻は１．８ｋｂのプレプロＨＰＣＰＢ  ｍＲＮＡ、ならびに１．５ｋｂのプレプロヒト脳ＣＰＢ  ｍＲＮＡ（Ａ）および２．０ｋｂのヒトβ−アクチンｍＲＮＡ（Ｂ）の移動位置を示す。
図６は、プレプロＨＰＣＰＢに対するポリクローナル抗体の調製およびウエスタンブロット解析を示す写真である。（Ａ）ベンズアミジン−セファロースと結合した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィール。左：図１Ａと同じ分子量マーカーの移動位置。矢尻：４０ｋＤａプロテアーゼの移動位置。（Ｂ）未変性ＰＡＧＥによって分離した画分を抗体用いてウエスタンブロット解析した結果である。画分１７〜２１（レーン１〜５）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。左の数字および矢尻はＡと同じである。（Ｃ）抗プレプロヒト脳ＣＰＢ抗体（レーン１〜４）または抗Ｃ１４抗体（レーン５〜７）を用いた海馬ホモジネートのウエスタンブロット解析。左の数字および矢印はＡと同じである。矢尻は４０ｋＤａプロテアーゼ（大きな矢尻）および３０ｋＤａ成熟型（小さな矢尻）の移動位置を示す。
図７は、ヒト正常脳切片の免疫組織化学分析を示す写真である。用いた抗体は抗プレプロヒト脳ＣＰＢ抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＦおよびＩ）または抗Ｃ１４抗体（Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨ）である。（Ａ）海馬の全体像。錐体ニューロンはすべて免疫反応性を示す。倍率５倍。（Ｂ）海馬実質における錐体ニューロンおよび活性化ミクログリアでは細胞質に免疫反応性が認められる。倍率４００倍。（Ｃ）錐体ニューロンに接着した活性化ミクログリア。倍率６００倍。（Ｄ）錐体ニューロンの細胞体には顆粒状の抗Ｃ１４免疫反応性が認められる。倍率４００倍。（Ｅ）外側膝状体の血管周囲に位置する活性化ミクログリア。倍率４００倍。（Ｆ）および（Ｇ）外側膝状体ニューロンは抗ヒト脳ＣＰＢ（Ｆ）および抗Ｃ１４（Ｇ）免疫反応性を示す。倍率４００倍。（Ｈ）上衣細胞の細胞質における抗Ｃ１４免疫活性。倍率２００倍。（Ｉ）脈絡叢細胞の細胞質における抗プレプロヒト脳ＣＰＢ免疫反応性。倍率２００倍。
図８は、免疫蛍光共焦点レーザー顕微鏡観察を示す写真である。海馬の錐体ニューロン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）および外側膝状体ニューロン（Ｄ、ＥおよびＦ）の脳切片に、抗ニューロフィラメント抗体（ＦＩＴＣ、緑色）と抗プレプロヒト脳ＣＰＢ抗体（テキサスレッド、赤色）（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＨおよびＩ）、抗ニューロフィラメント抗体（ＦＩＴＣ）と抗Ｃ１４抗体（テキサスレッド）（Ｄ、ＥおよびＦ）、または抗Ａβ１／４０抗体（ＦＩＴＣ）と抗Ｃ１４抗体（テキサスレッド）（Ｊ、ＫおよびＬ）の組み合わせによる二重染色を施した。Ｃ、Ｆ、ＩおよびＬの顕微鏡写真では、２つの免疫反応性が融合した像（黄色）が認められる。倍率：２００倍（Ｊ、ＫおよびＬ）、４００倍（Ｊ、ＫおよびＬを除くすべて）。
図９は、孤発性アルツハイマー病患者の脳切片の免疫組織化学分析を示す写真である。（Ａ）：海馬の錐体ニューロン。一部のニューロンでは抗プレプロヒト脳ＣＰＢ免疫反応性の低下が認められる。倍率４００倍。（ＢおよびＣ）：海馬内にグリア浸潤を伴う（Ｂ）または伴わない（Ｃ）、抗Ｃ１４免疫反応性の細胞外沈着。倍率４００倍。（ＤおよびＥ）：抗ＣＤ６８抗体（Ｃ）および抗Ｃ１４抗体（Ｄ）で染色した２枚の連続切片。海馬内のＣＤ６８陽性ミクログリアの一部は抗Ｃ１４免疫反応性も呈する。倍率２００倍。（Ｆ）：活性化ミクログリアのクラスターは海馬内でプレプロヒト脳ＣＰＢ免疫反応性を示す。倍率２００倍。（Ｇ）：アミロイド体は抗Ｃ１４免疫反応性を発現しない。倍率２００倍。
図１０は、ラット精巣の免疫組織化学分析を示す写真である。間質のラディッヒ細胞の細胞質が抗Ｃ１４モジュール抗体（ヒト脳ＣＰＢのＣ末端部分を認識する）で濃く染色されている。上が２００倍、下が４００倍の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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