(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
Ｒ１−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅn−Ｒ２ （Ｉ）
〔式中、Ｒ１はアリルオキシカルボニル又はアリルアミノカルボニルであり；
Ａは（Ｌ）−４−アミジノフェニルアラニンの残基であり；
Ｂは（Ｌ）−グルタミン酸の残基又はその薬学的に許容しうる塩であり；
ＤはＡｒｇ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ［−Ｃ(＝ＮＨ)−ＮＨ2］、Ｄａｂ［−Ｃ(＝ＮＨ)−ＮＨ2］、Ｏｒｎ［−Ｃ(＝ＮＨ)−ＣＨ3］、Ｄａｂ［−Ｃ(＝ＮＨ)−ＣＨ3］、Ｄａｐ［−Ｃ(＝ＮＨ)−ＣＨ3］、Ｄａｂ（Ａｌｌｏｃ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｍｅ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ａｒｇ（ＮＯ2）、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、２−Ａｂｕ、Ａｌａ（３−ＣＮ）、Ａｌａ［３−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、２−Ａｂｕ（４−ＣＮ）および２−Ａｂｕ［４−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］からなる群より選択される基であり；
ＥはＣｈａ、Ｃｈｇ及びＰｈｅ[４−Ｃ（−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−）−Ｐｈ]からなる群から選択される残基であり、
ｎは０または１であり；
Ｒ２は、ＮＲ２１Ｒ２２であり、ここで、
Ｒ２１は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル又はフェニル（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであり、
Ｒ２２は、水素、またはそれぞれ置換されていない、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、ジアルキルアミノ、アルキルオキシ、メチレンジオキシ、１，２−エチレンジオキシ、アルキルスルホニル及びアミノスルホニルからなる群から独立して選ばれる置換基であり、ここで置換基ジアルキルアミノ、アルキルオキシ及びアルキルスルホニルにおけるアルキル基はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチルからなる群から選ばれる、で置換されている、（Ｃ１−Ｃ１２）−アルキル、１又は２の（Ｃ６−Ｃ１２）−アリール基により置換されている（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、ピリジル基により置換されている（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、テトラヒドロフラニル基により置換されている（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、シクロヘキシル−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフチル及びフルオレニルからなる群から選ばれる；〕
の化合物、またはその製薬上許容しうる塩。
【請求項２】
Ｒ２はＮＨＲ２２であり、
Ｒ２２は水素、またはそれぞれ未置換またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ヒドロキシ、メトキシ、メチレンジオキシ、ニトロ、シアノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニルおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される置換基であり、ここで置換基ジアルキルアミノ及びアルキルスルホニルにおけるアルキル基はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチルからなる群から選ばれる、で置換されるベンジル、ナフチルメチル、ピリジルメチル、フェニルエチル、ナフチルエチル、ピリジルエチル、フェニルプロピル、ナフチルプロピル、ピリジルプロピル、フルオレニル、ジフェニルメチル、ジフェニルエチルおよびジフェニルプロピルからなる群より選択される基である、請求項１記載の式Ｉの化合物、またはその製薬上許容しうる塩。
【請求項３】
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｈａ−ＮＨ2、
アリルアミノカルボニル−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｈｇ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ［３−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｂ−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ−(ＣＨ2)2−ＣＨ(Ｐｈ)2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｂ−ＮＨ−(ＣＨ2)2−Ｐｈ、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ2−Ｃｈｘ、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｂ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−２−Ａｂｕ（４−ＣＮ）−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（３−ＣＮ）−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１−ナフチルメチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１−（１−ナフチル）エチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２−ナフチルメチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−３,４−ジクロロベンジルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２−（３−クロロフェニル）エチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（ＮＯ2）−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｐｈｇ−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−９−フルオレニルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−３,５−ビストリフルオロメチルベンジルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−Ｐｈｅ［４−Ｃ（−Ｓ−(ＣＨ2)2−Ｓ−）−Ｐｈ］−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）−Ｃｈａ−ＮＨ2、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−３,４−メチレンジオキシベンジルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２−(２−ナフチル)エチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２−(１−ナフチル)エチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２−(２−ピリジル)エチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２,２−ジフェニルエチルアミド、
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２,４−ジフルオロベンジルアミド、または
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−４−ジメチルアミノベンジルアミド
である請求項１又は２記載の式Ｉの化合物またはその製薬上許容しうる塩。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかの項記載の化合物またはその製薬上許容しうる塩を有効成分とする医薬。
【請求項５】
有効量の請求項１〜３の何れかの項記載の化合物またはその製薬上許容しうる塩および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜３の何れかの項記載の化合物またはその製薬上許容しうる塩を有効成分とするVIIａ因子阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜３の何れかの項記載の化合物またはその製薬上許容しうる塩を有効成分とする血餅形成、血栓塞栓症または血管再狭窄症の阻止または軽減剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は活性化血液凝固VIIａ因子（ＦVIIａ）の可逆阻害を通して強力な抗血栓症作用を有する新規化合物、それらの製造、それらの使用、およびそれらを含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
血栓の形成は通常、血液凝固カスケード反応を開始する組織損傷の結果であり、創傷の治癒において血液の流れを遅らせたり、妨げたりする。アテローム性動脈硬化症および炎症のような組織損傷と直接関係のない他の因子もまた血液凝固カスケード反応を開始したり、病的状態をもたらしうる。
【０００３】
血液凝固は血漿チモーゲンが限定加水分解により連続的に活性化される継続的増幅機構の酵素活性化反応を含む複雑な過程である。機構的に、血液凝固カスケード反応は内因系および外因系の経路に分かれて、Ｘ因子の活性化で一点に集まり、その後のトロンビン生成は共通の経路により進行する（スキーム１参照）。
【化１】
0004537581.tif 000002
【０００４】
現存の証拠は内因系の系路がフィブリン生成の維持および成長において重要な役割を果たし、外因系の系路が血液凝固の初期段階で決定的であることを示唆している（H. ColeのAust. J. Med. Sci, 16, 87(1995年)；G.J. Brozeの「血液凝固およびフィブリン溶解」、６、補足１、Ｓ７〜Ｓ１３（１９９５年))。一般に、血液凝固は組織因子（ＴＦ）／VIIａ因子複合体の生成により物理的に開始すると理解されている。いったん生成すると、この複合体はIXおよびＸ因子を活性化することにより迅速に血液凝固を開始する。新しく生成した活性化Ｘ因子、すなわちＸａ因子は次にＶａ因子およびリン脂質と１対１複合体を生成して、その前駆体プロトロンビンからのトロンビンの活性化により可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変換するのに関与するプロトロンビナーゼ複合体を生成する。時間が経つにつれて、VIIａ因子／組織因子複合体（外因系の系路）の活性はKunitz型プロテアーゼ阻害タンパク質ＴＦＰＩにより抑制され、それはＸａ因子と複合体を生成するとVIIａ因子／組織因子のタンパク質分解活性を直接阻害することができる。抑制された外因系の存在下で凝固過程を維持するために、内因系の系路のトロンビンが関与する活性により追加のＸａ因子が生成する。このように、トロンビンは２つの自己触媒的役割をはたす、すなわちそれ自体の生成とフィブリノーゲンのフィブリンへの変換に関与する。
【０００５】
トロンビン生成の自己触媒作用は抑制されない出血に対する重要な保護手段であり、所定の閾値のプロトロンビナーゼが存在すると確実に血液凝固が行なわれる。血餅を形成する能力は生命の維持に絶対必要である。しかしながら、特定の疾患状態では、循環系での血餅形成そのものが病因である。にも関わらず、このような疾患状態では生命を脅かす出血が後から起こるため、血餅形成系を完全に阻害することは望ましくない。したがって、トロンビンを直接阻害することなくVIIａ因子を阻害することにより血液凝固を阻害する薬剤を開発することが最も望ましい。
【０００６】
多くの臨床応用において、血管内の血餅形成を予防する、またはある抗凝固処置を行なう必要が大いにある。現在入手できる薬剤は多くの特定の臨床応用において不十分なものである。例えば、全股関節置換術を受けた患者のほぼ５０％が深静脈血栓症（ＤＶＴ）を発生する。現在認められている治療法は固定投与量の低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）および変動投与量のヘパリンである。これらの薬物療法でさえ、１０％〜２０％の患者がＤＶＴを発生し、５％〜１０％が出血を併発する。
【０００７】
より良い抗凝血剤が必要とされる他の臨床状況は経内腔冠状動脈血管形成術を受ける患者および心筋梗塞の恐れのある、または次第に強くなる狭心症にかかっている患者と関係がある。ヘパリンおよびアスピリンを投与することからなる、現在の慣用的に受け入れられている治療法は処置後２４時間以内に突然起こる血管閉鎖の割合が６％〜８％である。また、ヘパリンを使用する輸血療法が必要な出血を併発する割合は約７％である。さらに、血管閉鎖を遅らせることが有意であっても、処置終了後のヘパリン投与は価値が小さく、そして有害でさえありうる。
【０００８】
最も広く使用されている血餅形成阻害剤はヘパリン、関連する硫酸化多糖類、ＬＭＷＨおよびヘパリン硫酸である。これらの分子は血餅形成過程の天然調節物質、抗トロンビンとトロンビンおよびＸａ因子との結合を促進することにより抗血餅形成作用を発揮する。ヘパリンの阻害活性は主としてトロンビンに向けられており、それはＸａ因子より約１００倍速く失活する。ヒルジンおよびヒルログは臨床試験で現在使用されている他の２種のトロンビン特異的抗凝血剤である。しかしながら、トロンビンを阻害するこれらの抗凝血剤もまた出血を併発する。ヒヒおよびイヌによる前臨床試験は凝固カスケード反応の初期段階で関与する標的酵素、例えばＸａ因子またはVIIａ因子が直接トロンビン阻害剤で観察される副作用の出血をひき起こすことなく血餅形成を予防することを明らかにした（T. Yokoyama, A.B. Kelly, U.M. Marzec, S.R. Hanson, S. Kunitada, L.A. Harkerの「循環」, 92, 485〜491（1995年）；L.A. Harker, S.R. Hanson, A.B. KellyのThromb. Hemostas, 74, 464〜472（1995年）；C.R. Benedict, J. Ryan, J. Todd, K. Kuwabara, P. Tyburg, Jr., J. Cartwright, D. Sternの「血液」, 81, 2059〜2066（1993年))。
【０００９】
単クローン性抗体（国際特許出願番号ＷＯ ９２／０６７１１）およびクロロメチルケトン失活ＦVIIａのようなタンパク質（国際特許出願番号ＷＯ ９６／１２８００およびＷＯ ９７／４７６５１）を使用するVIIａ因子／ＴＦ触媒複合体の特異的阻害は急性の動脈損傷によりひき起こされる血栓形成または細菌性敗血症と関係がある血栓症合併症を抑制する極めて有効な手段である。また、VIIａ因子／ＴＦ活性の阻害がバロン血管形成術後の再発狭窄症を抑制することを示唆している実験的証拠もある（L.A. Harker, S.R. Hanson, J.N. Wilcox, A.B. Kellyの「止血」, 26, S1：76〜82(1996年))。出血試験はヒヒで行なわれており、VIIａ因子／ＴＦ複合体の阻害がトロンビン、血小板およびＸａ因子阻害を含む試験したどの抗凝血剤アプローチについても治療的有効性および出血の恐れに関して幅広い安全窓を有することを示している（L.A. Harker, S.R. Hanson, A.B. KellyのThromb. Hemostas., 74, 464〜472（1995年))。
【００１０】
特定のVIIａ因子阻害剤は医療分野で実質的価値のある応用性を有する。特に、VIIａ因子阻害剤は現在選択されている薬剤、すなわちヘパリンおよび関連する硫酸化多糖類が効果のない、または少ししか有効でない状況下で効果的である。したがって、有効であるが、望ましくない副作用をひき起こさない低分子量のVIIａ因子特異的血餅形成阻害剤が必要とされる。本発明はVIIａ因子活性を阻害する式Ｉの誘導体、さらに関連する利益を提供することによりこの必要性を満たす。
【００１１】
式Ｉの化合物は血餅形成酵素のVIIａ因子の阻害剤である。本発明はまた、式Ｉの化合物の製造法、VIIａ因子活性を阻害する方法、血餅形成を阻害する方法、VIIａ因子活性の阻害により治療または予防することができる疾患、例えば血栓症、再発狭窄症、梗塞および狭心症を含む血栓塞栓症性疾患の治療および予防における式Ｉの化合物の使用、並びにこのような疾患に適用することができる薬剤の製造における式Ｉの化合物の使用に関する。さらに、本発明は式Ｉの化合物を不活性担体と混合または会合して含有する組成物、特に式Ｉの化合物を薬学的に許容しうる担体物質または賦形剤および／または補助物質または添加剤を含有する医薬組成物に関する。
【００１２】
本発明は特異的にVIIａ因子活性を阻害する化合物を提供する。特に、本発明の対象は式Ｉ
Ｒ１−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅn−Ｒ２      （Ｉ）
［式中、Ｒ１は
Ｒ１３、
Ｒ１２Ｃ(Ｏ)、または
Ｎ−末端基がＲ１４Ｃ(Ｏ)、Ｒ１５Ｓ(Ｏ)2およびアミノ保護基からなる群より選択される置換基で置換されうる１〜３個のアミノ酸であり、ここで
Ｒ１２はそれぞれ置換されうるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニルからなる群より選択され、
Ｒ１３はアミノ保護基、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群より選択され、
Ｒ１４およびＲ１５は独立してアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群より選択され；
【００１３】
ＡはＡ１−Ａ２−Ａ３基であり、ここで
Ａ１はＮＨであり、
Ａ２はＣＨＲ９３であり、Ｒ９３は４−アミジノフェニルメチルであり、
Ａ３はＣ(Ｏ)であり；
ＢはＢ１−Ｂ２−Ｂ３基であり、ここで
Ｂ１はＮＲ９５であり、Ｒ９５は水素およびアルキルからなる群より選択され、
Ｂ２はＣＨＲ９７であり、Ｒ９７は２−位がヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニルおよびアリールアルキルオキシカルボニルからなる群より選択される置換基により置換されるエチルであり、
Ｂ３はＣ(Ｏ)であり；
ＤはＤ１−Ｄ２−Ｄ３基であり、ここで
Ｄ１はＮＨであり、
Ｄ２はＣＲ８１Ｒ８２であり、Ｒ８１およびＲ８２は独立して水素、それぞれ未置換または置換されたアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群より選択され、
Ｄ３はＣ(Ｏ)であり；
Ｅnは(Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３)nであり、ここで
ｎは０、１、２または３であり、
【００１４】
Ｅ１はＮＲ７０であり、Ｒ７０は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群より選択され、
Ｅ２はＣＲ７１Ｒ７２であり、Ｒ７１およびＲ７２は独立して水素、それぞれ未置換または置換されたアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群より選択され、
Ｅ３はＣ(Ｏ)であり；
Ｒ２はＮＲ２１Ｒ２２、ＯＲ２３およびＲ２４からなる群より選択され、ここでＲ２１、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は独立して水素、それぞれ未置換または置換されたアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルからなる群より選択され；
アルキルおよびヘテロアルキルは１〜１３個の炭素原子を含有し、ヘテロアルキル基の１個またはそれ以上の炭素原子はＮ、ＯおよびＳからなる群より選択されるヘテロ原子で置換され；
【００１５】
アルケニル、アルキニル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニルは２〜１３個の炭素原子を含有し、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基の１個またはそれ以上の炭素原子はＮ、ＯおよびＳからなる群より選択されるヘテロ原子で置換され；
アリールおよびヘテロアリールは５〜１３個の環炭素原子を含有し、ヘテロアリール基の１個またはそれ以上の炭素原子はＮ、ＯおよびＳからなる群より選択されるヘテロ原子で置換され；
ヘテロシクロアルキルは３〜８個の環炭素原子を含有し、そのうち１〜３個の炭素原子はＮ、ＯおよびＳからなる群より選択されるヘテロ原子で置換される)の化合物の何れかの立体異性体形態または任意の比率のその混合物、またはその薬学的に許容しうる塩である。
【００１６】
本発明はVIIａ因子活性を阻害するが、血液凝固過程に関与する他のプロテアーゼの活性を実質的に阻害しない化合物である式Ｉ
Ｒ１−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅn−Ｒ２      （Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅおよびｎは上記で定義された通りである）のペプチドを提供する。式Ｉの化合物において、例えばＡ、Ｂ、ＤまたはＥ基、あるいはＲ１が１、２または３個のアミノ酸を表わす場合はＲ１基に、アミノ酸またはその誘導体またはアミノ酸類似体または模擬体であり、このようなアミノ酸などのカルボキシ基間で形成されるアミド結合Ｃ(Ｏ)−Ｎを介して隣接する基とペプチド様に結合している構造単位が含まれる。ペプチド化学で一般的であるように、式Ｉに存在するアミノ酸あるいはＡ、Ｂ、ＤまたはＥのような基の二価基はそれぞれのアミノ酸から形式的に水素原子をアミノ基より、またヒドロキシ基をカルボキシ基より除去して得られる。
【００１７】
本明細書で使用される「アミノ酸」なる用語は幅広い意味で使用され、２０個の天然に存在するアミノ酸を意味し、それらは遺伝子コードから翻訳され、特に断りがなければＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸、並びにアミノ酸類似体のような化学的に修飾されたアミノ酸、ノルロイシンのような一般にタンパク質に取込まれない天然に存在するアミノ酸、およびアミノ酸の特性を示すことが当該技術分野で知られている化学的に合成された化合物を含むタンパク質の構成単位である。例えば、ペプチド化合物の配座制限について天然のＰｈｅまたはＰｒｏと同じであるフェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模擬体は「アミノ酸」の定義に包含され、当業者に知られている。本明細書において、このような類似体および模擬体はアミノ酸の「機能性等価物」と呼ばれる。他のアミノ酸およびアミノ酸類似体の例はRobertsおよびVellaccioによりリストされている（ペプチド：分析、合成、生物学；GrossおよびMeienhofer編、第５巻、第３４１頁、アカデミックプレス（１９８３年）；これは参照により本明細書に加入される）。
【００１８】
本明細書で使用されるアミノ酸、アミノ酸の類似体および模擬体の略語、並びに他の略語を表１に示す。
【００１９】
【表１】
0004537581.tif 000003
【００２０】
【表２】
0004537581.tif 000004
【００２１】
特に断りがなければ、上記で略書したアミノ酸はＬ−配置を有する。Ｄ−配置のアミノ酸は３文字表記を使用して前にＤを付けて表示される（例えばＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−ｐＡｐｈ）。例えばＰｈｅ(４−ＣＮ)およびＰｈｅ［４−Ｃ(−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−)−Ｐｈ］のような略語はフェニル基の４−位がそれぞれシアノ置換基または２−フェニル−１,３−ジチオラン−２−イル置換基を有するアミノ酸フェニルアラニンの残基を意味する。例えばＤａｐ［−Ｃ(＝ＮＨ)−ＮＨ2］のような略語は側鎖のアミノ基、すなわち３−位のアミノ基がアミジノ基−Ｃ(＝ＮＨ)−ＮＨ2（カルバムイミドイル基）で置換され、それによりプロピオン酸ユニットの３−位と結合したグアニジノ基−ＮＨ−Ｃ(＝ＮＨ)−ＮＨ2が得られるアミノ酸２,３−ジアミノプロピオン酸の残基を意味する。例えばＯｒｎ［−Ｃ(＝ＮＨ)−ＮＨ2］またはＣｙｓ(Ｍｅ)のような略語はそれぞれ側鎖のアミノ基がアミジノ基を有するアミノ酸オルニチンの残基、またはメルカプト基がメチル基を有するアミノ酸システインの残基を意味する。ＴＯＴＵ、ＨＡＴＵおよびＢＯＰなる用語はそれぞれＯ−［シアン（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、および１−ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味する。
【００２２】
本明細書において、VIIａ因子活性の阻害に関して使用される「特異的」なる用語は式Ｉの化合物が（同じ濃度の阻害剤を使用して）プラスミンおよびトロンビンなどの他の特定のプロテアーゼの活性を実質的に阻害することなくVIIａ因子活性を阻害することができることを意味する。このようなプロテアーゼは血液凝固およびフィブリン溶解カスケード反応に関与している。
【００２３】
本明細書で使用される「置換基」なる用語は本明細書で開示されたペプチド、ペプチド類似体、模擬体または有機化合物のペプチド主鎖または側鎖に置換される様々な化学基の何れかを意味する。置換基は当業者に知られている多種多様の部分を含有することができる（例えばGiannisおよびKolterのAngew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1244〜1267（1993年）を参照；これは参照により本明細書に加入される）。
【００２４】
本明細書で使用される「アルキル」なる用語は幅広い意味で使用され、約１〜１３個の炭素原子からなる直鎖状、分枝状または環状の飽和または不飽和炭素鎖を意味し、もちろん不飽和アルキル基は少なくとも２個の炭素原子、また環状アルキル基は少なくとも３個の炭素原子を含有する。不飽和基は１個以上の２重結合および／または３重結合を含有する。したがって、「アルキル」なる用語は例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ｔ−ブチル、１−メチルブチル、２,２−ジメチルブチル、２−メチルフェニル、２,２−ジメチルプロピル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル基、アルキレン基、環状炭素鎖、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチル基、並びに直鎖状または分枝状炭素鎖および環状炭素鎖の組み合わせ、例えばメチルシクロヘキシル−、シクロヘキシルメチル−、１−シクロヘキシルエチル−、２−シクロヘキシルエチル−、シクロペンチルメチル−、１−シクロペンチルエチル−、２−シクロペンチルエチル−、シクロプロピルメチル−、１−シクロプロピルエチル−、２−シクロプロピルエチルまたはシクロプロピルメチレン基を含む。したがって、アルキルはまた１個以上のアルキル置換基を有する環状アルキル基を含む。他のアルキルの例は下記の特定の不飽和基である。さらに、上記で定義されたようなアルキルは１個以上の同一または異なる置換基、例えば１、２、３または４個の置換基で置換することができ、それらの置換基は所望の適当な位置に存在することは理解されよう。
【００２５】
好ましくは、「アルキル」なる用語は１〜６個の炭素原子からなる直鎖状または分枝状の飽和炭素鎖、２〜６個の炭素原子からなる直鎖状または分枝状の不飽和炭素鎖、あるいは３〜８個の炭素原子、特に３〜６個または４〜６個の環炭素原子からなる環状アルキル基を意味する。不飽和アルキル炭素鎖に関して、(Ｃ2−Ｃ6)−アルケニルおよび(Ｃ2−Ｃ6)−アルキニルが好ましい。不飽和アルキル基の例はビニル、プロパ−１−エニル、プロパ−２−エニル（＝アリル）、ブタ−２−エニル、ブテン−３−イル、３−メチルブタ−２−エニル、エチニル、プロパ−２−イニル、ブタ−２−イニルなどのようなアルケニルおよびアルキニル基である。
【００２６】
同様に、「アシル」なる用語は幅広い意味で使用され、カルボニル部分−Ｃ(Ｏ)−と結合しており、このカルボニル基を介して結合する約１〜１３個の炭素原子からなる直鎖状、分枝状または環状の飽和または不飽和炭素鎖、あるいは５〜１３個の環炭素原子を有するアリール基を意味する。アシル基はそれぞれカルボキシル基Ｃ(Ｏ)−ＯＨを含有する化合物から形式的にヒドロキシ基を除去することにより誘導されると考えられる。したがって、「アシル」なる用語は例えばホルミル、アセチル、ベンゾイルなどのような基を含む。アシル基の好ましい基には、好ましい数の炭素原子を有し、さらにそれを介して結合するカルボニル基を含有する上記の直鎖状、分枝状または環状の飽和または不飽和炭素鎖が含まれる。
【００２７】
「アリール」なる用語は約５〜１３個の環炭素原子、および共役したｐｉ電子系を有する少なくとも１個の“環”基を含有する芳香族基を意味する。好ましくは、「アリール」なる用語は６〜１０個の環炭素原子を有する芳香族基を意味する。アリールの例にはフェニル、ナフチル、例えば１−ナフチルおよび２−ナフチル、フルオレニル、ビフェニリル基、その類似体および誘導体が含まれ、これらはすべて場合により１個以上、例えば１、２、３または４個の同一または異なる置換基で置換することができ、その置換基は所望の適当な位置に存在する。例えば、一置換フェニル基は２−、３−または４−位で、二置換フェニル基は２,３−、２,４−、２,５−、２,６−、３,４−または３,５−位で置換される。
【００２８】
「アリールアルキル」なる用語は１個以上、例えば１または２個の同一または異なるアリール基で置換された、上記で定義されたようなアルキルを意味する。適当なアリールアルキル基にはベンジル、フェニルエチル、例えば１−フェニルエチルおよび２−フェニルエチル、ジフェニルメチル、ジフェニルエチル、例えば１,２−ジフェニルエチルおよび２,２−ジフェニルエチル、フェニルプロピル、例えば１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピルおよび３−フェニルプロピル、ジフェニルプロピル、例えば２,３−ジフェニルプロピルおよび３,３−ジフェニルプロピル、ナフチルメチル、ナフチルエチル、例えば１−ナフチルエチルおよび２−ナフチルエチル、ナフチルプロピル、例えば１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピルおよび３−ナフチルプロピル、１,２,３,４−テトラヒドロ−１−ナフチル、１,２,３,４−テトラヒドロ−２−ナフチルなどが含まれ、これらはすべて場合により置換されうる。
【００２９】
本明細書で使用される「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」、「ヘテロアリールアルキル」および「ヘテロアリール」なる用語はそれぞれ１個以上の炭素原子、例えば１、２または３個の炭素原子がＮ、ＯまたはＳのような同一または異なるヘテロ原子で置換されたアルキル、アリールアルキルおよびアリール基を意味する。さらに、「ヘテロシクロアルキル」なる用語は１個以上の環炭素原子がヘテロ原子で置換された環状アルキル基に関して使用される。好ましくは、「ヘテロシクロアルキル」なる用語は３〜８個の環炭素原子を有し、そのうち１、２または３個がＮ、ＯまたはＳのような同一または異なるヘテロ原子で置換された環状アルキル基を意味する。これらの基はすべて所望の適当な位置で結合することができ、例えば窒素ヘテロ環の場合は適当な環窒素原子である。適当なヘテロアリール基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基には例えば２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−チエニル、３−チエニル、インドリル、イミダゾリル、フリル、ピペロニル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチル、４−ピリジルメチル、１−（２−ピリジル）エチル、１−（３−ピリジル）エチル、１−（４−ピリジル）エチル、２−（２−ピリジル）エチル、２−（３−ピリジル）エチル、２−（４−ピリジル）エチル、ピコリル、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロフラン−２−イルメチル、モルホリニル、４−モルホリニル、２−（４−モルホリニル）エチル、ピペラジニル、２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチルなどが含まれ、これらはすべて場合により１個以上、例えば１、２、３または４個の同一または異なる置換基で置換することができる。
【００３０】
本発明のペプチドはＮ−末端および／またはＣ−末端で適当な試薬と反応させることにより、あるいはそれぞれアミノ保護基またはカルボキシ保護基を導入する（または存在させる）ことにより修飾することができる。ペプチドまたはペプチド類似体のＮ−末端はＮ−末端のアミノ基が例えばアシル基（例えばアセチル、シクロペンチルカルボニル、イソキノリルカルボニル、フロイル、トシル、ベンゾイル、ピラジンカルボニルまたは他のこのような基）により；イソシアネート、クロロホルメート、アルキル化剤と反応させることにより；または上記のような置換基により置換されうる他のこのような基を導入することにより置換されるように化学的に修飾することができる。本明細書において、「アミノ基」なる用語は幅広く使用され、ペプチドに存在する遊離アミノ基、例えば第１、第２または第３アミノ基を意味する。比較して、「Ｎ−末端」なる用語は慣用的に記載されたペプチドに存在する第１アミノ酸のα−アミノ基を意味する。
【００３１】
本発明のペプチドのＮ−末端はそれにアミノ保護基を結合させることにより保護することができる。本明細書において、「アミノ保護基」なる用語は幅広く使用され、例えば本発明のペプチドのＮ−末端に存在するα−アミノ基などの遊離アミノ基と反応することができる化学基を意味する。それと反応することにより、アミノ保護基は例えば合成工程中に、または最終化合物のエキソペプチダーゼ活性により起こるような望ましくない反応に対して反応性のアミノ基を保護する。アミノ基の修飾はまた、別の利点、例えば化合物の溶解度または活性の増加をもたらしうる。様々なアミノ保護基は本明細書で開示されているか、または当該技術分野で知られており、例えばアセチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル基またはベンゾイル基のようなアシル基、さらにそれ自体アミノ保護基により修飾することができるアミノアシル基である。他のアミノ保護基は例えば「ペプチド」、GrossおよびMeienhofer編、第３巻（アカデミックプレス社、１９８１年）；GreeneおよびWutsの「有機合成の保護基」、第２版、第３０９〜４０５頁（John Wiley & Sons, １９９１年）に記載されており、それぞれ参照により本明細書に加入される。本発明のペプチドまたはペプチド類似体のＮ−末端アミノ基のこのような修飾の生成物は「Ｎ−末端誘導体」と呼ぶ。
【００３２】
同様に、ペプチドのＣ−末端に存在するカルボキシ基のようなカルボキシ基はカルボキシ保護基を使用して化学的に修飾することができる。「カルボキシ基」および「Ｃ−末端」なる用語は上記で定義された「アミノ基」および「Ｎ−末端」なる用語と一致して使用される。ペプチドのＣ−末端に存在する基のようなカルボキシ基はＣ−末端カルボキシ基のアルコールまたはアルデヒドへの還元により、あるいはオーラル（oral）エステルの生成により、あるいはチアゾリルシクロヘキシルまたは他の基のような置換基でのカルボキシ基の置換により修飾することができる。オーラルエステルは当該技術分野でよく知られており、例えばメトキシメチル、エトキシメチル、イソプロポキシメチルなどのようなアルキルオキシメチル基；メトキシエチル、エトキシエチル、プロポキシエチル、イソプロポキシエチルなどのような１−((Ｃ1−Ｃ4)−アルキルオキシ）エチル基；５−メチル−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イルメチル、５−フェニル−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イルメチルなどのような２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イルメチル基；メチルチオメチル、エチルチオメチル、イソプロピルチオメチルなどのような((Ｃ1−Ｃ3)−アルキルチオ）メチル基；ピバロイルオキシメチルアセトキシメチルなどのようなアシルオキシメチル基；エトキシカルボニルメチル基；１−アセトキシエチルのような１−アシルオキシ−１−置換メチル基；３−フタリジルまたは５,６−ジメチルフタリジル基；１−（エトキシカルボニルオキシ）エチル基のような１−(((Ｃ1−Ｃ4)−アルキルオキシ)カルボニルオキシ)エチル基；および１−（メチルアミノカルボニルオキシ）エチル基のような１−(((Ｃ1−Ｃ4)−アルキルアミノ）カルボニルオキシ）エチル基である。
【００３３】
本発明のペプチドはそれにカルボキシ保護基を結合させることにより修飾することができる。カルボキシ保護基は当該技術分野でよく知られており、ペプチドと結合することによりカルボキシ基を望ましくない反応から保護する（例えば上記のGreeneおよびWutsの文献、第２２４〜２７６頁（１９９１年）を参照；これは参照により本明細書に加入される）。当業者ならば、ペプチドのＮ−末端アミノ基またはＣ−末端カルボキシ基に対して有効である上記のような修飾は例えば本発明のペプチドのアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖に存在する反応性アミノ基またはカルボキシ基に対しても有効であることは理解されよう。このような修飾を行なうための方法は本明細書で開示されているか、または当該技術分野で知られている。
【００３４】
本発明の化合物中のＬ−またはＤ−アミノ酸の選択は幾分ペプチドの所望の特性に依存する。例えば、１種以上のＤ−アミノ酸の組込みは試験管内または生体内での化合物の安定性を高めることができる。１種以上のＤ−アミノ酸の組込みは化合物の薬理活性を増加または減少することもできる。化合物を短時間だけ活性にすることが望ましい場合もある。このような場合、化合物中への１種以上のＬ−アミノ酸の組込みは個体の内因性ペプチダーゼによる生体内での化合物の消化を可能にし、それにより活性化合物に対する個体の露出が制限される。当業者は例えば個体の年令および健康状態を考慮することにより本発明の化合物の必要な望ましい特性を決定することができる。一般に、本発明はすべての立体異性体およびすべての比率の２種以上の立体異性体の混合物、例えば純粋なエナンチオマー、純粋なジアステレオマー、すべての比率の２種のエナンチオマーの混合物、例えばラセミ化合物、ジアステレオマー、シス異性体、トランス異性体、Ｅ異性体またはＺ異性体の混合物としての式Ｉの化合物に関する。本発明はまた、すべての互変異性体としての式Ｉの化合物に関する。さらに、本発明は式Ｉの化合物のプロドラッグ、例えば上記のようなカルボキシ基から得られるエステル、アミド、アルデヒドまたはアルコールあるいはアミノ基、イミノ基、グアニジノ基およびアミジノ基を含むアシル化可能な基から得られる(Ｃ1−Ｃ6)−アルキルカルボニル、(Ｃ1−Ｃ6)−アルキルオキシカルボニルまたはアリール−(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルオキシカルボニル誘導体のようなアシル誘導体に関し、また本発明は式Ｉの化合物の活性代謝物質に関する。
【００３５】
式Ｉの化合物において、Ｒ１基は好ましくはＲ１２Ｃ(Ｏ)である。Ｒ１２を表わす基はアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基であり、これらの基はすべて未置換であるか、または置換されている。好ましくは、Ｒ１２はアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであり、より好ましくはアルケニルオキシ、アルケニルアミノまたはアリールであり、これらの基はすべて未置換であるか、または置換されている。特に好ましくは、Ｒ１２はそれぞれ１個の２重結合を含有する(Ｃ2−Ｃ6)−アルケニルオキシまたは(Ｃ2−Ｃ6)−アルケニルアミノのようなアルケニルオキシまたはアルケニルアミノ、例えばアリルオキシまたはアリルアミノである。さらに、好ましくはＲ１２は(Ｃ2−Ｃ6)−アルケニルオキシである。Ｒ１２を表わす基は未置換であるか、または置換されている。Ｒ１２基が置換されている場合、それは好ましくはハロゲン、すなわちフッ素、塩素、臭素または沃素、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、アミノカルボニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルオキシ、アルキルカルボニルアミノおよびモノ−またはジアルキルアミノからなる群より選択される１個以上の同一の置換基で置換される。同様に、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５を表わす基は未置換であるか、または例えばＲ１２に存在しうる置換基により置換されており、Ｒ１４およびＲ１５は互いに独立して同一または異なる基である。
【００３６】
二価の４−アミジノフェニルアラニン残基−ＮＨ−ＣＨ［−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−（４−Ｃ(＝ＮＨ)−ＮＨ2)］−Ｃ(Ｏ)−である式Ｉの化合物中のＡ基は好ましくは(Ｌ)−４−アミジノフェニルアラニン残基（＝(Ｓ)−４−アミジノフェニルアラニン残基）である。二価のグルタミン酸残基−ＮＨ−ＣＨ［−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ(Ｏ)ＯＨ］−Ｃ(Ｏ)−またはその薬学的に許容しうる塩またはエステルであるＢ基は好ましくは(Ｌ)−グルタミン酸残基（＝(Ｓ)−グルタミン酸残基）またはその薬学的に許容しうる塩またはエステルである。
Ｒ９５は好ましくは水素または(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル、より好ましくは水素またはメチル、特に好ましくは水素である。
【００３７】
置換されたＲ８１およびＲ８２基は独立して、好ましくはそれぞれ保護基で置換されうるアミノ、アミノカルボニル、アミジノ、グアニジノ、アミノアルキル、ヒドロキシ、メルカプト；アセトイミド（−Ｃ(＝ＮＨ)−ＣＨ3）、ニトロおよびシアノからなる群より選択される１個以上、例えば１、２、３または４個の同一または異なる基を有する。ニトロ基に関して、本発明の式Ｉの化合物では好ましくは２個以下のニトロ基が存在する。列挙した基の適当な保護基は当業者に知られており、GreeneおよびWutsの「有機合成の保護基」、第２版（John Wiley & Sons, １９９１年）のような上記文献に記載されている；これは参照により本明細書に加入される。保護基の例は上記のアミノ保護基であり、例えばアミジノ基およびグアニジノ基の保護基でもあるｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルおよびアリルオキシカルボニル；グアニジノ基を保護するために使用することができるニトロ基；ヒドロキシ、メルカプトなどのような基を保護するために使用することができるベンジル、メチル、トリチルまたはアセチルアミノメチルのような基である。好ましくは、Ｒ８１およびＲ８２は水素、(Ｃ1−Ｃ6)−アルキルのようなアルキル、フェニルのようなアリール、フェニル−(Ｃ1−Ｃ2)−アルキルのようなアリールアルキル、およびヘテロアリール−(Ｃ1−Ｃ2)−アルキルのようなヘテロアリールアルキルからなる群より選択され、これらはすべて未置換であるか、または置換されており、ヘテロアリールは好ましくはＮ、ＯまたはＳのような１または２個の同一または異なる環ヘテロ原子を含有する単環式または二環式芳香環系の基である。より好ましくは、Ｒ８１は水素であり、Ｒ８２は上記で定義されたような未置換または置換された基である。
【００３８】
特に好ましくは、Ｄ基はＡｒｇ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｄａｂ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｌｙｓ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｌｙｓ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｏｒｎ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｄａｂ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｄａｂ（Ａｌｌｏｃ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｍｅ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ａｒｇ（ＮＯ2）、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｐｈｅ（４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2）、２−Ａｂｕ、Ａｌａ（３−ＣＮ）、Ａｌａ［３−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、２−Ａｂｕ（４−ＣＮ）および２−Ａｂｕ［４−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］からなる群より選択される基である。それから特に好ましいＤ基が選択されるサブグループはＡｒｇ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｄａｂ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｌｙｓ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ａｒｇ（ＮＯ2）、Ｔｒｐ、Ｐｈｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、２−Ａｂｕ、Ａｌａ（３−ＣＮ）、Ａｌａ［３−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、２−Ａｂｕ（４−ＣＮ）および２−Ａｂｕ［４−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］からなる群より形成される。
【００３９】
数字のｎは好ましくは０、１または２、より好ましくは０または１である。ｎが０である場合、Ｒ２基はＤ３を表わすカルボニル基と直接結合している。ｎが０でない場合、Ｒ２基は末端基Ｅ３を表わすカルボニル基と結合している。ｎが２または３である場合、Ｅ基はすべて同一または異なる基である。
【００４０】
置換されたＲ７１およびＲ７２基は独立して、好ましくはそれぞれさらに置換されうるアルキル、アルキルオキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、アルキルスルホニル、アルキルカルボニル、フェニルカルボニルおよび２−フェニル−１,３−ジチオラン−２−イルからなる群より選択される１個以上、例えば１、２、３または４個の同一または異なる基を有する。Ｒ７１およびＲ７２に存在しうる置換基のサブグループはそれぞれさらに置換されうるアルキル、アルキルオキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、アルキルスルホニルおよびアルキルカルボニルからなる群より形成される。好ましくは、Ｒ７１は水素であり、Ｒ７２は上記で定義されたような未置換または置換された基である。Ｒ７２は好ましくはアルキル、特にシクロアルキルアルキル、例えばシクロアルキル−(Ｃ1−Ｃ2)−アルキルのような環状アルキルを含む(Ｃ3−Ｃ8)−アルキル；アリール、特にフェニル；アリールアルキル、特にフェニル−(Ｃ1−Ｃ2)−アルキル；またはヘテロアリールアルキル、特にヘテロアリール−(Ｃ1−Ｃ2)−アルキルであり、これらの基はすべて未置換であるか、または置換されており、ヘテロアリールは好ましくはＮ、ＯおよびＳのような１または２個の同一または異なる環ヘテロ原子を含有する単環式の５員または６員の芳香環である。Ｅ基（複数可）は特に数字ｎが１である場合、好ましくは未置換の、またはフェニル基が置換されたＰｈｅ、ＣｈａおよびＣｈｇからなる群より選択される。特に好ましくは、ＥはＣｈａ、ＣｈｇおよびＰｈｅ［４−Ｃ（−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−）−Ｐｈ］からなる群より選択される。Ｅ基に存在するＲ７０基は好ましくは水素、アルキル、特に(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル、例えばメチル、あるいはアリールアルキル、特にフェニル−(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル、例えば未置換のまたはフェニル基が置換されたベンジルおよび２−フェニルエチルである。特に好ましくは、Ｒ７０は水素である。
【００４１】
置換されたＲ２１、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は独立して、好ましくはそれぞれさらに置換されうるハロゲン、特にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、ニトロ、シアノ、ジアルキルアミノ、アルキルオキシ、例えばメチルオキシ、アルキレンジオキシ、アルキルスルホニル、アミノスルホニルおよびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１個以上、例えば１、２、３または４個の同一または異なる基を有する。アルキレンジオキシの例はメチレンジオキシ（Ｏ−ＣＨ2Ｏ−Ｏ）または１,２−エチレンジオキシである。ジアルキルアミノの例はジメチルアミノ、ジエチルアミノまたはジブチルアミノであり、アルキルスルホニルの例はメチルスルホニル、エチルスルホニルまたはブチルスルホニルである。Ｒ２は好ましくはＲ２１およびＲ２２が上記で定義された通りであるＮＲ２１Ｒ２２である。Ｒ２１は好ましくは水素、(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル、あるいは未置換の、またはフェニル基が置換されたフェニル−(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルである。特に好ましくはＲ２１は水素であり、すなわち特に好ましくはＮＲ２１Ｒ２２はＮＨＲ２２であり、したがって特に好ましくはＲ２はＮＨＲ２２である。Ｒ２２は好ましくは水素、アルキル、特にシクロアルキルアルキル、例えばシクロアルキル−(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルのような環状アルキルを含む(Ｃ1−Ｃ12)−アルキル；アリール、特に(Ｃ6−Ｃ13)−アリール；アリールアルキル、特に１または２個の(Ｃ6−Ｃ12)−アリール基で置換された(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル；ヘテロアリールアルキル、特にＮ、ＯまたはＳのような１または２個の同一または異なるヘテロ原子を含有する単環式または二環式ヘテロアリール基で置換された(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル；およびヘテロシクロアルキルアルキル、特にＮ、ＯまたはＳのような１または２個の同一または異なるヘテロ原子を含有する単環式の４、５、６または７員のヘテロシクロアルキル基で置換された(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルからなる群より選択される基であり、これらの基はすべて未置換であるか、または上記のように置換されている。
【００４２】
特に好ましくは、Ｒ２２は水素、ベンジル、ナフチルメチル、ピリジルメチル、フェニルエチル、ナフチルエチル、ピリジルエチル、フェニルプロピル、ナフチルプロピル、ピリジルプロピル、フルオレニル、ジフェニルメチル、ジフェニルエチルおよびジフェニルプロピルからなる群より選択される基であり、これらの基は未置換であるか、または好ましくはそれぞれさらに置換されうるＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ヒドロキシ、メトキシ、メチレンジオキシ、ニトロ、シアノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニルおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される１個以上、例えば１、２、３または４個の同一または異なる置換基で置換されている。一連の特に好ましい式Ｉの化合物群は同時に数字ｎが０ではなく、Ｒ２がＮＨＲ２２であり、そしてＲ２２が水素ではない化合物により形成され、これらの化合物においてＤ基の好ましい表示はＡｓｎである。  好ましい式Ｉの化合物は１種以上の基または残基が好ましい表示である化合物であり、すべての好ましい表示の組み合わせは本発明の対象である。
【００４３】
本発明の好ましい化合物群は、
Ｒ１はＲ１２Ｃ(Ｏ)であり、Ｒ１２は上記で定義された通りであり、
Ａは上記で定義された通りであり、
Ｂは上記で定義された通りであり、好ましくはＢはＮＨ−ＣＨＲ９７−Ｃ(Ｏ)であり、ここでＲ９７は２−位がヒドロキシカルボニルまたはその塩または(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルオキシカルボニルのようなアルキルオキシカルボニルにより置換されるエチルであり、
ＤはＮＨ−ＣＨＲ８２−Ｃ(Ｏ)であり、Ｒ８２は上記で定義された通りであり、
Ｅnは（Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３)nであり、ここで
ｎは０、１または２であり、
Ｅ１はＮＨであり、
Ｅ２はＣＨＲ７２であり、Ｒ７２基は互いに独立して同一または異なって上記で定義された通りであり、
Ｅ３はＣ(Ｏ)であり、そして
Ｒ２は上記で定義された通りである、何れかの立体異性体または任意の比率のその混合物としての式Ｉの化合物、その薬学的に許容しうる塩、アミドおよびエステルにより形成される。
【００４４】
特に好ましい化合物群は、
Ｒ１はアリルオキシカルボニルまたはアリルアミノカルボニルであり、
Ａは（Ｌ）−４−アミジノフェニルアラニンの残基であり、
Ｂは（Ｌ）−グルタミン酸または（Ｌ）−グルタミン酸の薬学的に許容しうる塩またはエステルの残基であり、
ＤはＡｒｇ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｄａｂ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｌｙｓ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、Ｌｙｓ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｏｒｎ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｄａｂ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］、Ｄａｂ（Ａｌｌｏｃ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｍｅ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ａｒｇ（ＮＯ2）、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｐｈｅ（４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2）、２−Ａｂｕ、Ａｌａ（３−ＣＮ）、Ａｌａ［３−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］、２−Ａｂｕ（４−ＣＮ）および２−Ａｂｕ［４−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］からなる群より選択される基であり、
ｎは０または１であり、
ＥはＣｈａ、ＣｈｇおよびＰｈｅ［４−Ｃ（−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−）−Ｐｈ］からなる群より選択される基であり、
Ｒ２はＮＨＲ２２であり、
Ｒ２２は水素、またはそれぞれ未置換またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ヒドロキシ、メトキシ、メチレンジオキシ、ニトロ、シアノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニルおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される１個またはそれ以上の同一または異なる置換基で置換されるベンジル、ナフチルメチル、ピリジルメチル、フェニルエチル、ナフチルエチル、ピリジルエチル、フェニルプロピル、ナフチルプロピル、ピリジルプロピル、フルオレニル、ジフェニルメチル、ジフェニルエチルおよびジフェニルプロピルからなる群より選択される基である、何れかの立体異性体または任意の比率のその混合物としての式Ｉの化合物、その薬学的に許容しうる塩、アミドおよびエステルにより形成される。
特定の本発明の化合物の例には下記の表２および実施例部分に記載した化合物、それらの薬学的に許容しうる塩、アミドおよびエステルが含まれる。
【００４５】
式Ｉの化合物は例えば固相法に従って、
ａ１）  式 Ｆｍｏｃ−Ｅn−ＯＨ（式中、ｎは１、２または３である）の化合物を樹脂、一般には固体支持体と結合した酸感受性リンカーと結合させ、保護基Ｆｍｏｃを除去し、式 Ｆｍｏｃ−Ｄ１−Ｄ２−Ｃ(Ｏ)ＯＨの化合物を得られた遊離アミノ基と結合させ、再び保護基Ｆｍｏｃを開裂除去するか、またはｎが０である式Ｉの化合物を製造する場合は式 Ｆｍｏｃ−Ｄ１−Ｄ２−Ｃ(Ｏ)ＯＨの化合物を樹脂、一般には固体支持体に結合した酸感受性リンカーと結合させ、保護基Ｆｍｏｃを開裂除去し、
ａ２）  式 Ｆｍｏｃ−Ｂ１−Ｂ２−Ｃ(Ｏ)ＯＨの化合物を工程ａ１）で得られた遊離アミノ基と結合させ、保護基Ｆｍｏｃを開裂除去し、
ａ３）  式 Ｒ１−Ａ１−Ａ２−Ｃ(Ｏ)ＯＨの化合物を工程ａ２）で得られた遊離アミノ基と結合させ、そして
ａ４）  トリフルオロ酢酸を使用して工程ａ１）〜ａ３）に従って得られた化合物を樹脂から分離する
ことからなる方法により製造することができる。
【００４６】
本法で使用される樹脂またはリンカーはそれぞれ樹脂またはリンカーと結合させる化合物のカルボキシ基がアミド基Ｃ(Ｏ)−ＮＨ2に変換されるようなタイプのもの、例えばクノールリンカーまたはリンクアミド樹脂である。数字ｎが２または３である化合物の製造もまた、次のようにしてＥn単位を段階的に構成することにより行なうことができる。工程ａ１）において、最初に式 Ｆｍｏｃ−Ｅn−ＯＨ（式中、ｎは２または３である）の化合物の代わりに式 Ｆｍｏｃ−Ｅn−ＯＨ（式中、ｎは１である）の化合物を樹脂に結合した酸感受性リンカーと結合させ、次に保護基Ｆｍｏｃを開裂除去し、第２の式 Ｆｍｏｃ−Ｅn−ＯＨ（式中、ｎは１である）の化合物を得られた遊離アミノ基と結合させる。ｎが３である化合物を製造する場合、保護基Ｆｍｏｃを除去し、第３の式 Ｆｍｏｃ−Ｅn−ＯＨ（式中、ｎは１である）の化合物を得られた遊離アミノ基と結合させる。最後に保護基Ｆｍｏｃを開裂除去し、工程ａ２）〜ａ４）を行なう。
【００４７】
他の式Ｉの化合物の製造法は、
ｂ１）  式 Ｆｍｏｃ−Ｂ１−ＣＨＲ９７−Ｃ(Ｏ)ＯＰＧ（式中、Ｒ９７は２−ヒドロキシカルボニルエチルであり、ＰＧは保護基である）の化合物の側鎖カルボン酸をアミノ官能化樹脂と結合した酸感受性ベンジルアルコール型のリンカーと結合させ、
ｂ２）  保護基ＰＧを除去し、
ｂ３）  式 Ｈ2Ｎ−Ｄ２−Ｄ３−Ｅn−Ｒ２（式中、ｎは０、１、２または３である）の化合物を工程ｂ２）で得られた遊離カルボン酸と結合させ、
ｂ４）  保護基Ｆｍｏｃを開裂除去し、
ｂ５）  式 Ｒ１−Ａ１−Ａ２−Ｃ(Ｏ)ＯＨの化合物を工程ｂ４）で得られた遊離アミノ基と結合させ、そして
ｂ６）  トリフルオロ酢酸を使用して工程ｂ１）〜ｂ５）に従って得られた化合物を樹脂から分離する
ことからなる。
【００４８】
上記の最初の工程の修飾と同様にして、本法で構造単位Ｈ2Ｎ−Ｄ２−Ｄ３−Ｅn−Ｒ２を樹脂上で段階的に構成することができる。本法と似ている別の方法に従って、最初にＤ基のＤ２基側鎖に存在する、すなわちＲ８１およびＲ８２基の一方に存在するカルボン酸基を樹脂に結合したリンカーと結合させることにより式Ｉの化合物を製造することもできる。式 Ｆｍｏｃ−Ｂ１−ＣＨＲ９７−Ｃ(Ｏ)ＯＰＧの上記化合物と同様に、このような化合物は例えば式 Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＲ８１Ｒ８２−Ｃ(Ｏ)ＯＰＧ（式中Ｒ８２は上記で定義された通りであるがＣ(Ｏ)ＯＨ基を含有し、そしてＲ８１は上記で定義された通りである）を有する。例えば、Ｒ８１が水素であり、Ｒ８２がヒドロキシカルボニルメチルである場合、式 Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＲ８１Ｒ８２−Ｃ(Ｏ)ＯＰＧの化合物は保護アスパラギン酸誘導体である。式ＩのＤ３基であるカルボニル基のＣ(Ｏ)ＯＰＧ基を脱保護した後、得られた遊離カルボン酸基をＨ2Ｎ−Ｅn−Ｒ２またはＨ−Ｒ２のような化合物と結合させる。次に、保護基Ｆｍｏｃを脱保護した後、得られたアミノ基を式 Ｆｍｏｃ−Ｂ１−Ｂ２−Ｃ(Ｏ)ＯＨの化合物と結合させ、そしてアミノ基を脱保護した後、その生成物を式 Ｒ１−Ａ１−Ａ２−Ｃ(Ｏ)ＯＨと結合させる。また、使用される樹脂またはリンカーは樹脂またはリンカーと結合させる化合物のカルボキシ基がアミド基Ｃ(Ｏ)−ＮＨ2に変換されるようなタイプのものである。例えば、アミド樹脂を使用して、樹脂と結合したアスパラギン酸単位を最終化合物のアスパラギン単位に変換することができる。
【００４９】
本発明の化合物は例えば自動合成器を使用して化学的に合成することができる（実施例１参照）。ペプチドのアミノ酸側鎖に存在する基のような反応性基、あるいはＮ−末端またはＣ−末端の反応性基の選択的修飾は増加した溶解度または高められた阻害作用のような望ましい特性を本発明の化合物に付与することができる。固相合成法が使用される場合、化合物の化学組成を操作することができ、発生期のペプチドを樹脂と結合させて、またはペプチドを樹脂から分離した後、例えばＮ−末端アシル化、例えばアセチル化化合物のようなＮ−末端誘導体を得る。また、Ｃ−末端カルボキシ基などの化合物のカルボキシ基に対しても同様の修飾を行なうことができ、例えばアミド化することができる。
【００５０】
本化合物はまた、従来の医化学または溶液相有機化学の方法に従って保護アミノ酸を標的分子と結合させ、当該技術分野で知られている標準法により脱保護して製造することができる。一般に、固相法または溶液相法により式Ｉの化合物を合成するのに適した反応、並びにカルボジイミド、ＴＯＴＵまたはＨＡＴＵのような適当なカップリング剤、または溶媒および反応温度のような実験条件は当業者によく知られており、本明細書で引用した文献などの標準的な文献に記載されている。また、下記で例示する。
【００５１】
合成した化合物は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ；実施例１参照）あるいは例えば化合物の大きさ、電荷または疎水性に基づく他の分離法のようなよく知られている方法を使用して精製することができる。同様に、アミノ酸配列分析法または質量分析法（ＭＳ）のようなよく知られている方法を使用して本発明の化合物の構造を決定することができる（実施例１参照）。
【００５２】
様々な配置の置換基を含有する種々の化合物はVIIａ因子に対して様々なレベルの阻害活性を示す。例えば、置換基の選択は化合物の結合親和性に影響を与える。これらの化合物を実施例に記載の手順に従って合成した。ペプチドの阻害活性試験は実施例２２に記載のアッセイを使用して行なった。このような方法を使用して当業者はその修飾化合物を含む本明細書で開示した化合物を合成することができ、また化合物のVIIａ因子阻害活性を測定することができる。本発明の組成物は均質組成物として、または様々な組み合わせの置換基を含有する化合物の混合物として提供することができる。置換基の選択により可能になった適応性は本発明の化合物および組成物の生物学的および物理化学的特性を大幅にコントロールする。
【００５３】
本発明はVII因子活性を特異的に阻害する化合物を提供する。このような化合物はVIIａ因子活性に対して好ましくは５００nM以下、より好ましくは５０nM以下のＫｉを有し、（同じ濃度の阻害剤を使用する）VIIａ因子の阻害に関して血液凝固およびフィブリン溶解カスケード反応に関与する他のプロテアーゼの活性を実質的に阻害しないこのような他のプロテアーゼの例はＸａ因子、トロンビンおよびプラスミンである。
次の表２に本発明を例示する式Ｉの選択化合物のVIIａ因子阻害活性を示す（Ｋｉを測定する方法については実施例２２を参照）。
【００５４】
【表３】
0004537581.tif 000005
【００５５】
【表４】
0004537581.tif 000006
【００５６】
【表５】
0004537581.tif 000007
【００５７】
上記化合物のトロンビン阻害活性はKi値で表わすことができ、それは一般に上記のVIIａ因子阻害活性より相当高く、例えばVIIａ因子阻害活性の約２００または約５００または約１０００倍高い。また、測定した上記化合物のＸａ因子阻害活性もKi値で表わすことができ、それは一般に上記のVIIａ因子阻害活性より相当高く、例えばVIIａ因子阻害活性の約１００倍高い。
これらの結果から、式Ｉの化合物はVIIａ因子阻害剤として有用であり、血液凝固およびフィブリン溶解のプロセスに関与するＸａ因子またはセリンプロテアーゼ例えばトロンビンの活性を実質的に阻害しないことがわかる。
【００５８】
本発明の化合物は抗凝血剤として有利に使用することができ、血液凝固を防止する血液試料と接触させることができる。例えば、有効量の本発明の化合物を取ったばかりの血液試料と接触させて血液試料の凝固を防止することができる。本明細書で本発明の化合物に関して使用される「有効量」なる用語はVIIａ因子活性を阻害する化合物の量を意味する。当業者ならば、本明細書で開示した方法（実施例２２参照）または当該技術分野で知られている方法を使用して本発明の化合物の有効量を決定することができることは理解されよう。本発明の化合物の開示した有用性を考慮して、当業者ならばヘパリンのような物質の代わりに本発明の化合物を使用できることも理解されよう。本発明の化合物のこのような使用は例えば他の抗凝血剤と比べてコストの節約をもたらす。
【００５９】
さらに、本発明の化合物は様々な臨床状態を治療するために、例えば心臓血管疾患、あるいは例えば感染または手術による合併症を治療するために個体に投与することができる。心臓血管疾患の例は血管形成術後の再発狭窄症、成人呼吸障害症候群、多臓器不全、卒中および散在性血管内血餅形成疾患である。手術に伴う関連する合併症の例は手術後に起こりうる深静脈および近静脈血栓症である。したがって、本発明の化合物は個体の望ましくない血液凝固を軽減または阻害するための医薬として有用である。
【００６０】
本発明の化合物はVIIａ因子活性を阻害するため、このような化合物は一般に個体の血餅形成を軽減または阻害するのに有用である。本明細書で使用される「個体」なる用語はVIIａ因子が血餅形成カスケード反応に関与するヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物を意味する。
【００６１】
個体の血餅形成は治療的に有効な量の本発明の化合物を個体に投与することにより軽減または阻害することができる。本明細書で使用される「治療的に有効な量」なる用語は個体のVIIａ因子活性を阻害するため個体に投与する必要のある化合物の量を意味する。さらに詳しくは、治療的に有効な量の本発明の化合物はプロトロンビナーゼ複合体中で、または可溶性サブユニットとして直接的に、あるいはプロトロンビナーゼ複合体へのVIIａ因子の組込みを阻害することにより間接的にVIIａ因子触媒活性を阻害する。好ましい化合物は５００nM以下のKiで、より好ましい化合物は５０nM以下のKiでVIIａ因子活性を阻害する。治療的に有効な量は例えば実施例２２に記載の、または当該技術分野で知られている方法を使用して決定することができる。
【００６２】
本発明の治療法の実施において、治療的に有効な量の医薬組成物を個体に投与するための用量は例えば疾患の性質または程度、投与スケジュール、個体の年令および身体的特徴を含む様々な要因に応じて変動する。適当な投与量は医療分野でよく知られている臨床アプローチを使用して確定することができる。したがって、本発明はVIIａ因子を式 Ｒ１−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅn−Ｒ２の化合物と接触させることによりVIIａ因子活性を特異的に阻害する方法を提供する。さらに、本発明は治療的に有効な量の本発明の化合物を投与することにより個体の血餅形成を軽減または阻害する方法を提供する。
【００６３】
本発明の化合物は一般に１種またはそれ以上の式Ｉの化合物および薬学的に許容しうる担体を含有する組成物として個体に投与される。「薬学的に許容しうる担体」なる用語は個体にとって非毒性である、または適当な取り締まり機関により決定されたような許容毒性を有する媒質または組成物を意味する。本明細書で使用される「薬学的に許容しうる担体」なる用語はコーンスターチ、ラクトース、脂肪、ロウなどのような固体担体物質；例えばリン酸塩緩衝剤で処理した生理的食塩水；水のような液体；油／水型または水／油型乳濁液のような乳濁液；および／または通常の添加剤、例えば種々の湿潤剤からなる標準的な薬用担体を含む。適当な薬用担体およびそれらの配合はMartinの「レミントンの医薬サイエンス」、第１５版（Mack出版社、１９７５年）に記載されており、これは参照により本明細書に加入される。このような組成物は一般に治療的に有効な量の本発明の化合物を個体に投与するための最適投与量となるような適当量の担体と一緒に含有する。したがって、特許請求した化合物はVIIａ因子活性および個体の血餅形成を阻害するための医薬として有用である。
【００６４】
本発明の医薬組成物または薬剤は例えば丸剤、錠剤、ラッカー仕上げ錠剤、コーチング錠、顆粒剤、硬質および軟質ゼラチンカプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤またはエアゾル剤の形態で経口的に投与することができる。しかしながら、投与は例えば座剤の形態で経腸的に；あるいは例えば注射剤、注入剤、マイクロカプセル剤、移植錠またはロッド剤の形態で非経口的に、例えば静脈内的に、筋肉内的に、または皮下的に；あるいは例えば軟膏剤、液剤またはチンキ剤の形態で経皮的に；あるいは他の方法により、例えばエアゾル剤または鼻内噴霧剤の形態で行なうこともできる。医薬組成物の投与単位における式Ｉの活性成分またはその薬学的に許容しうる塩または誘導体の量は通常約０.５mg〜約１０００mg、好ましくは約１mg〜約５００mgであるが、医薬組成物の種類に応じてその量は高めになる。投与する式Ｉの化合物の１日量は１回で、あるいは数回、例えば２、３または４回に分けて投与することができる。
【００６５】
薬学的に許容しうる担体はまた、例えばその薬理的作用を高める式ＩのVIIａ因子阻害剤の他の媒質、化合物または修飾化合物を含む。薬学的に許容しうる媒質は例えば薬学的に許容しうる塩である。式Ｉの化合物の酸付加塩は例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸または過塩素酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、マレイン酸、リンゴ酸、ギ酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸のような有機カルボン酸、あるいはメタンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸のような有機スルホン酸を用いて製造することができる。式Ｉの化合物の酸基、例えばカルボン酸基はそのカチオンがナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリおよびアルカリ土類金属に基づく金属塩として、あるいは第４アンモニウム塩およびアミンとの酸付加塩を含む非毒性アンモニウム塩、例えばアンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム塩として存在することができる。
【００６６】
化合物の薬理的作用を高める修飾の例はアルキル基が直鎖または分枝鎖である(Ｃ1−Ｃ6)−アルキルエステル、好ましくは(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルエステルの生成のようなエステル化である。他の許容しうるエステルには、例えば(Ｃ5−Ｃ7)−シクロアルキルエステル、およびベンジルエステルのようなアリールアルキルエステルが含まれる。このようなエステルはペプチド化学分野でよく知られている慣用の方法を使用して本明細書で開示した化合物から製造することができる。
【００６７】
薬学的に許容しうる修飾はまた、例えばペプチドアミドの生成を含む。本発明の化合物について行なうことができるこのようなアミド修飾は例えば第１(Ｃ1−Ｃ6)−アルキルアミンおよび第２ジ−(Ｃ1−Ｃ6)−アルキルアミン（ここでアルキル基は直鎖または分枝鎖であり、またアリールアミンは様々な置換基を有する）から誘導されるものを含む。第２アミンの場合、そのアミンはアミド窒素原子の他に未置換のまたは置換された窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含有することができる５または６員の複素環の形態であってもよい。このようなアミドを製造するための方法は当該技術分野でよく知られている。
【００６８】
本発明の他の態様において、本発明の化合物はアッセイでVIIａ因子の存在を確認するために、またはVIIａ因子を実質的に純粋な形態で単離するために使用することができる。好ましくは、本発明の化合物は例えば放射性同位体で標識され、その標識化合物は特定の標識を検出するのに有用な常法を使用して検出される。さらに、本発明の化合物は生体内、試験管内または生体外でVIIａ因子活性の位置または量を検出するプローブとして有利に使用することができる。
【００６９】
本発明の様々な態様の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾が本発明の範囲内に含まれることは理解されよう。したがって、次の実施例は本発明を詳しく説明するものであって、制限するものではない。
【００７０】
【実施例】
実施例１
ペプチド合成法および一般合成法
合成に使用される出発物質はAldrich、Sigma、Fluka、Nova BiochemおよびAdvanced Chemtechのような化学薬品製造会社から入手した。合成中、使用したアミノ酸誘導体の官能基をブロッキング基により保護して結合工程の間の副反応を防止した。適当な保護基の例およびそれらの使用は上記の「ペプチド」(1981年)並びに同第９巻、UdenfriendおよびMeienhofer編(1987年)に記載されている(これは参照により本明細書に加入される)。
【００７１】
一般固相ペプチド合成法を使用して本発明の化合物を製造した。このような方法は例えばStewardおよびYoungの「固相ペプチド合成」(Freeman & Co., サンフランシスコ(1969年))に記載されている(これは参照により本明細書に加入される)。
【００７２】
特に断りがなければ、ペプチドはTentaGel S NH2樹脂(Rapp Polymere, ドイツ)で合成した。酸感受性リンカーｐ−[(Ｒ,Ｓ)−α−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシホルムアミド］−２,４−ジメトキシベンジル]フェノキシ酢酸(クノールリンカー)を固体支持体に結合させた(BernatowiczらのTetr. Lett. 30, 4645(1989年)；これは参照により本明細書に加入される)。別法として、ペプチドを酸感受性リンカーで修飾された１％ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレン樹脂(リンク樹脂)で合成した(リンク、Tetr. Lett. 28, 3787(1987年)；Sieber, Tetr. Lett. 28, 2107(1987年)；それぞれ参照により本明細書に加入する)。最初に式 Ｆｍｏｃ−Ｂ１−ＣＨＲ９７−Ｃ(Ｏ)ＯＰＧの化合物の側鎖カルボン酸を樹脂と結合させることによりペプチドを合成する場合、ＨＭＰＡリンカーの結合により修飾されたTentaGel S NH2樹脂を使用した。結合は１当量のＨＯＢｔの存在下でＮ,Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用して行なった（但し、Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨの場合は２当量のＨＯＢｔを使用した)。すべての結合を室温（ＲＴ）においてＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはＤＭＦ／ＤＭＳＯ（１／１混合物）中で行なった。結合の終了をニンヒドリン試験により監視した。最初の結合が不完全な場合は再び（２回目）結合を行なった。
【００７３】
Ｆｍｏｃ基の脱保護はＤＭＦ中で５０％ピペリジンを使用して２＋１０分間行なった。分離したＦｍｏｃの量を脱保護後の溶液の３００nmにおける吸光度、洗浄液の容量および合成に使用した樹脂の重量から測定した。
【００７４】
各結合の作業サイクルは次の通りである：
【表６】
0004537581.tif 000008
【００７５】
樹脂上でペプチド合成を終了した後、必要に応じて最終のＦｍｏｃ脱保護を行なった。特に断りがなければ、次にペプチド樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで連続して洗浄し、ペプチドをＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）混合物により１.５時間分離および脱保護した。樹脂をＤＣＭで洗浄し、ＤＣＭ洗浄液をＴＦＡ分離物と合一した。溶液を蒸発させ、無水ジエチルエーテルにより沈殿した生成物および固体沈殿物をろ過または遠心分離により単離し、ＫＯＨ固体のペレット上で真空乾燥した。固体を水およびアセトニトリルの混合物に再溶解し、凍結乾燥した。
【００７６】
乾燥ペプチドを適当なグラジエントの０.１％ＴＦＡ水溶液およびアセトニトリル（ＡＣＮ）を使用するＨＰＬＣ精製に付した。目的の合成生成物を含有するピークフラクションを集めた後、ペプチド溶液を凍結乾燥し、ペプチドをエレクトロスプレー質量スペクトル（ＭＳ）および／またはＮＭＲおよび／またはアミノ酸分析を含む確認工程に付して目的化合物が合成されたことを確認した。
【００７７】
ＨＰＬＣ分析の場合、生成物の試料を２３０nmおよび１ml／分の流量でBeckman ＨＰＬＣシステム（Gold Nouveauソフトウエアを用いたデータステーションにより制御された１２６溶媒供給システム、１６６プログラム可能な検出モジュール５０７ｅオートサンプラーからなる）およびＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＭ ４.６×２５０mmカラムを使用して分析した。
【００７８】
生成物精製の場合、凍結乾燥した粗製ペプチドの試料を１０％〜５０％ＡＣＮを含有する０.１％ＴＦＡ水溶液の混合物に溶解した。ペプチド溶液は通常、０.４５μm“ＡＣＲＯＤＩＳＣ”１３ ＣＲ ＰＴＦＥ（Gelman Sciences；Ann Arbor MI）ろ過器に接続したシリンジを通してろ過した。適当な量のろ過ペプチド溶液を半分取用Ｃ１８カラム（VydacプロテインおよびペプチドＣ１８，２１８ＴＰ１０２２（２２×２５０mm）；分離グループ；Hesperia CA，またはＹＭＣ ＯＤＳ−Ａカラム（２０×２５０mm），ＹＭＣ，ウィルミントン，ＮＣ）に注入した。Beckman“システムゴールド”ＨＰＬＣ（“システムゴールド”ソフトウエアにより制御されたBeckman, システムゴールド，プログラム可能な溶媒モジュール１２６およびプログラム可能な検出モジュール１６６）を使用し、溶離剤としての０.１％ ＴＦＡ緩衝液およびＡＣＮ（ＨＰＬＣグレード）のグラジエントまたはイソクラチック混合物の流量を維持した。ペプチドの溶離を２３０nmでのＵＶ検出により監視した。ＭＳを使用して合成する化合物に相当するピークを確認した後、化合物を集め、凍結乾燥し、生物学的に試験した。ＥＳ＋モードでＶＧプラットフォーム（Fisons Instrument）測定器を使用してＭＳを測定した。ＮＭＲでは、典型的に試料をBruker Avance DPX 300測定器を使用してＤＭＳＯ−ｄ6（Aldrich）中で測定した。
【００７９】
実施例２
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨの合成
同じ手順をＡｌｌｏｃ−Ｄ−ｐＡｐｈ−ＯＨに適用することができる。
Ａｌｌｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＮ）−ＯＨ
５.７ｇ（３０ミリモル）のＨ−Ｐｈｅ（４−ＣＮ）−ＯＨを１００mlの１Ｍ ＮａＯＨに溶解し、氷冷しながら２Ｍ ＮａＯＨを加えてpH＝１０にした。激しく攪拌しながらアリルクロロホルメート（７.５ml）をゆっくりと加えた（２Ｍ ＮａＯＨによりpHを１０に維持した）。反応混合物を０℃で１５分間、室温で３０分間攪拌し、ＨＣｌで酸性にしてpH＝２にし、酢酸エチルで抽出（３回）し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発させた。残留物を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶して白色の固体を得た。収量：７.０ｇ（８５％）。
【００８０】
Ａｌｌｏｃ−Ｐｈｅ［４−Ｃ(＝Ｓ)−ＮＨ2］−ＯＨ
２.７４ｇのＡｌｌｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＮ）−ＯＨをピリジン（５０ml）およびトリエチルアミン（２０ml）の混合物に溶解し、Ｈ2Ｓを３０分間通した。反応混合物を室温で一晩保持した。高真空下で乾燥して３.２１ｇの泡状固体の粗製チオアミドを得、それを直接メチルチオイミデートに変換した。
Ａｌｌｏｃ−Ｐｈｅ［４−Ｃ(＝ＮＨ)−ＳＣＨ3］−ＯＨ・ＨＩ
１ｇのＡｌｌｏｃ−Ｐｈｅ［４−Ｃ(＝Ｓ)−ＮＨ2］−ＯＨをアセトン（５０ml）に溶解し、沃化メチル（５ml）を加えた。反応混合物を室温で一晩保持し、揮発性溶媒を蒸発（速い、最高３５℃）させ、残留物をジエチルエーテルで処理した。０℃で１時間後、エーテルをデカントし、生成物をジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。黄色の泡状固体を得、それを直接アミジンに変換した。
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨ
すべての上記Ａｌｌｏｃ−Ｐｈｅ（４−Ｃ(＝ＮＨ)−ＳＣＨ3）−ＯＨ・ＨＩを３００μlの酢酸と一緒に５０mlのメタノールに溶解し、０.５ｇの酢酸アンモニウムを加えた。混合物を５５℃で３時間加熱し、蒸発させ、１０mlのアセトンを加えた。０℃で２時間後、固体生成物をろ過し、少量の冷アセトン、少量の冷メタノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥して黄色がかった固体を得た。収量：０.５３ｇ。
【００８１】
実施例３
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
１ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により３時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値７２９.１、計算値７２９.４。
【００８２】
実施例４
アリル−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＮ）。Ｎ−末端Ｆｍｏｃの脱保護後、樹脂を３mlのＤＭＦ中における１ミリモルのアリルイソシアネートの溶液で２時間処理した。次に、樹脂をＤＭＦおよびトリエチルアミン／ピリジン（１／２）で洗浄し、ピリジン／トリエチルアミン中の飽和Ｈ2Ｓ溶液で一晩処理した。樹脂をアセトンで洗浄し、チオアミド樹脂を沃化メチル（アセトン中の１０％沃化メチル溶液；３ml）と６時間反応させた。メチルチオイミデート樹脂をアセトン、メタノールで洗浄し、５５℃において３mlのメタノール中における０.２ｇの酢酸アンモニウムおよび１００μlの酢酸の溶液で３時間処理した。樹脂をメタノール、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により３時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製物質を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値７２８.３、計算値７２８.４。
【００８３】
実施例５
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｈｇ−ＮＨ2の合成
１ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により３時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値７１５.８、計算値７１５.４。
【００８４】
実施例６
Ａｌｌｏｃ−Ｄ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
１ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−Ｄ−ｐＡｐｈ−ＯＨ（実施例２のＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨと同じ手順に従って合成した）。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により３時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値７２９.２、計算値７２９.４。
【００８５】
実施例７
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（４−グアニジノ）−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.２５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２３ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ−Ｃ(＝ＮＢｏｃ)−ＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値７７７.１、計算値７７７.４。
【００８６】
実施例８
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.２５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２３ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ［−Ｃ（＝Ｎ−Ｂｏｃ）−ＮＨ−Ｂｏｃ］−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値７２９.１、計算値７２９.４。
【００８７】
実施例９
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｐ［−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ3］−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.２５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ。Ｎ−末端Ｆｍｏｃ−保護基を結合させ、樹脂をＤＭＦ／ＮＭＭ／ＡｃＯＨ（５／０.５／１）混合物で洗浄し、そしてアルゴン流下で絶えず混合しながら１００mgのＰｄ(Ｐ(Ｐｈ)3)4を３時間にわたって加えることによりＡｌｌｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、４mlのエタノール／ＤＭＳＯ（３／１）中における１５０mgの２−メチルナフチルアセトチオイミデートの溶液で１時間処理した。ＤＭＦで洗浄した後、Ｆｍｏｃ基を脱保護（１＋５分）し、Ｎ−末端のＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨを結合させた。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値７００.１、計算値７００.４。
【００８８】
実施例１０
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ［３−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.２５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−ＣＮ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＮ）−ＯＨ。ピリジンおよびトリエチルアミンの混合物（２／１）をＨ2Ｓ（室温、１５〜３０分）で飽和させ、この溶液をピリジン／トリエチルアミン（２／１）で予め洗浄した樹脂に加えた。一晩放置した後、樹脂をアセトンで洗浄し、アセトン中の２０％沃化メチル溶液で一晩処理した。次に、樹脂をアセトンおよびメタノールで洗浄した。５％酢酸を含有するメタノール中における１０当量の酢酸アンモニウムの溶液と一緒に樹脂を加熱（水浴、５５℃、３時間）することにより、樹脂と結合したメチルチオイミデートをアミジンに変換した。この最終変換後、樹脂をメタノール、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値６８５.９、計算値６８６.４。
【００８９】
実施例１１
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.１２５ｇのリンク樹脂（置換度０.７８ミリモル／ｇ）に、Ｆｍｏｃ−脱保護後、実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値６８６.９、計算値６８７.３。
【００９０】
実施例１２
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｂ−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.２５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値６７３.２、計算値６７３.４。
【００９１】
実施例１３
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ［３−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2］−ＮＨ2の合成
０.２５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−ＣＮ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＮ）−ＯＨ。ピリジンおよびトリエチルアミンの混合物（２／１）をＨ2Ｓ（室温、１５〜３０分）で飽和させ、この溶液をピリジン／トリエチルアミン（２／１）で予め洗浄した樹脂に加えた。一晩放置した後、樹脂をアセトンで洗浄し、アセトン中の２０％沃化メチル溶液で一晩処理した。次に、樹脂をアセトンおよびメタノールで洗浄した。５％酢酸を含有するメタノール中における１０当量の酢酸アンモニウムの溶液と一緒に樹脂を加熱（水浴、５５℃、３時間）することにより、樹脂と結合したメチルチオイミデートをアミジンに変換した。この最終変換後、樹脂をメタノール、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値５３３.３、計算値５３３.２。
【００９２】
実施例１４
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｈａ−ＮＨ2の合成
０.１５０ｇのリンク樹脂（置換度０.７８ミリモル／ｇ）に、Ｆｍｏｃ−脱保護後、実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値６３０.１、計算値６３０.３。
【００９３】
実施例１５
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−（Ｐｈ−ＣＨ2−ＣＨ2−）Ｇｌｙ−ＮＨ2の合成
Ｎ−置換グリシンの場合、Zuckermannらの方法（J. Am. Chem. Soc. 114, 10646（1992年）；これは参照により本明細書に加入される）を使用した。０.１ｇのリンク樹脂（置換度０.７８ミリモル／ｇ）に、Ｆｍｏｃ−脱保護後、ブロモ酢酸をＤＣＭ／ＤＭＦ中の対称無水物によって結合させた。１０分後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、結合をもう１回行なった。ＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した後、樹脂をＤＭＳＯ中における２−フェニルエチルアミンの１Ｍ溶液で一晩処理した。ＤＭＦで洗浄した後、リンカーと結合した（Ｐｈ−ＣＨ2−ＣＨ2−）ＮＨ−ＣＨ2−Ｃ(Ｏ)基を有する樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨの対称無水物と反応させた。Ｆｍｏｃ−脱保護後、実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値６９４.９、計算値６９５.３。
【００９４】
実施例１６
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ(Ｐｈ)2の合成
Ｈ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ(Ｐｈ)2・ＨＣｌ
０.６２ｇ（２ミリモル）のＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨを１０mlのＤＣＭに溶解し、２ミリモルのトリエチルアミンを加え、溶液を０℃まで冷却した。攪拌しながら、２ミリモルのイソブチルクロロホルメートをゆっくりと加えた。冷却浴を取り外し、溶液を１５分間攪拌し、２mlのＤＭＦ中の２.５ミリモルの３,３−ジフェニルプロピルアミンを加え、室温で１時間攪拌した。溶液を蒸発させ、酢酸エチルに溶解し、そして０.５Ｍ ＫＨＳＯ4溶液、飽和ＮａＨＣＯ3溶液およびブラインで抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発させた。油状生成物を１０mlのＤＣＭに溶解し、ジオキサン中の４Ｍ塩酸溶液（１０ml）を加えた。１０分後、溶媒を蒸発させ、生成物の塩酸塩をジエチルエーテルで沈殿させ、ろ過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥して白色の固体を得た。ＭＳ分析：(Ｍ＋Ｈ)+：実測値４０３.１、計算値４０３.２。
【００９５】
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ(Ｐｈ)2
０.５ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸を結合させた（３当量、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで１.５時間活性化した）。ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ／ＮＭＩを一晩使用して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−Ｏ−アリルを側鎖を通して樹脂に結合させた。アルゴン下で樹脂をＤＭＦ／ＡｃＯＨ／ＮＭＭ（１０／２／１）中のＰｄ(ＰＰｈ3)4と一緒に４時間振騰することによりアリル保護基を除去した。脱保護したカルボキシ基を１.５mlのＤＭＦ中における０.５ミリモルのＢＯＰ、０.５ミリモルのＨＯＢｔ、１.５ミリモルのＤＩＥＡおよび０.５ミリモルのＨ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ(Ｐｈ)2・ＨＣｌの溶液で２時間活性化した。Ｆｍｏｃ脱保護後、Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨを実施例１に記載の一般手順に従って結合させた。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／チオアニソール（９５／５）により１.５時間脱保護し、実施例１に記載のようにして処理した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値８０５.０、計算値８０５.４。
【００９６】
実施例１７
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ｄａｂ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｐｈの合成
０.２ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸を結合させた（２.５当量、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで４時間活性化した）。ＤＣＭ中のＣＢｒ4（５当量）／ＰＰｈ3（５当量）で樹脂を４時間処理することによりヒドロキシ基を臭素で置換した。臭素誘導体樹脂をＤＣＭ中の２Ｍフェニルエチルアミン溶液で一晩処理した。ＴＦＦＨ／ＤＩＥＡ（現場で生成したフッ化アシル）を使用してＦｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨを樹脂と結合させた。実施例１に記載の一般手順に従って、次の保護アミノ酸を結合させた：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨ。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（９９／１）で２時間脱保護した。ＴＦＡを蒸発させ、ペプチドをＨ２Ｏ／ＡＣＮに溶解し、凍結乾燥した。粗製化合物を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値６２４.２、計算値６２４.３。
【００９７】
実施例１８
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＮの合成
０.２ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸を結合させた（３当量、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで１.５時間活性化した）。ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ／ＮＭＩを一晩使用して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−Ｏ−アリルを側鎖を通して樹脂に結合させた。アルゴン下で樹脂をＤＭＦ／ＡｃＯＨ／ＮＭＭ（１０／２／１）中のＰｄ(ＰＰｈ3)4と一緒に４時間振騰することによりアリル保護基を除去した。脱保護したカルボキシ基をＤＩＣ（３当量）／ＨＯＢｔ（３当量）で１０分間活性化し、ＤＭＦ中の２−シアノエチルアミン（３当量）を樹脂に３時間加えた。Ｆｍｏｃ脱保護後、Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨを実施例１に記載の一般手順に従って結合させた。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（９９／１）で２時間脱保護した。ＴＦＡを蒸発させ、ペプチドをＨ2Ｏ／ＡＣＮに溶解し、凍結乾燥した。粗製物質を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値４７３.１、計算値４７３.２。
【００９８】
実施例１９
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ2−Ｃｈｘの合成
０.１ｇのTentaGel S NH2樹脂（置換度０.２６ミリモル／ｇ）に、クノールアミドリンカーを結合させた。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−Ｏ−アリルを側鎖を通してリンカーに結合させ、アリル保護基を実施例１８に記載のようにして除去した。脱保護したカルボキシ基をＤＩＣ（５当量）／ＨＯＢｔ（５当量）で活性化し、ＤＭＦ中のシクロヘキシルメチルアミン（５当量）を２.５時間加えた。Ｆｍｏｃ脱保護後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−ＯＨを実施例１に記載の一般手順に従って結合させた。ペプチドを分離し、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（９９／１）で２時間脱保護した。ＴＦＡを蒸発させ、ペプチドをＨ2Ｏ／ＡＣＮに溶解し、凍結乾燥した。粗製物質を実施例１に記載のようにＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＳにより特性決定した。(Ｍ＋Ｈ)+：実測値６２９.９、計算値６３０.３。
【００９９】
実施例２０
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｐｈの合成
２−（Ｓ）−［２−（Ｓ）−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ペンタン二酸５−ｔ−ブチルエステル１−メチルエステル塩酸塩
２０mlのＤＭＦ中の２−（Ｓ）−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオン酸塩酸塩（３.４８ｇ、１０.６ミリモル）および２−（Ｓ）−アミノ−ペンタン二酸５−ｔ−ブチルエステル１−メチルエステル塩酸塩（２.７ｇ、１０.６ミリモル）に−１５℃でＴＯＴＵ（３.８３ｇ、１１.６７ミリモル）およびＮ−エチルモルホリン（２.７ml、２１.２ミリモル）を加えた。混合物を１時間攪拌し、次に室温まで加温した。蒸発させた後、酢酸エチルを残留物に加え、有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液、硫酸水素カリウム水溶液および水で抽出した。有機層を蒸発させた。収量：２.８ｇ（５０％）。ＭＳ：ｍ／ｚ＝４９１.３(Ｍ＋Ｈ)+。
【０１００】
２−（Ｓ）−［２−（Ｓ）−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ペンタン二酸５−ｔ−ブチルエステル
１００mlの水および３０mlのＴＨＦ中の２−（Ｓ）−［２−（Ｓ）−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ペンタン二酸５−ｔ−ブチルエステル１−メチルエステル塩酸塩（３.０６ｇ、５.８ミリモル）に水酸化リチウム水和物（０.４９ｇ、１１.６ミリモル）を加えた。溶液を室温で１２時間攪拌し、蒸発させ、凍結乾燥した。残留物を溶離剤としてｎ−ブタノール／氷酢酸／水（１７／１／２）を使用するセファデックスＬＨ２０上のクロマトグラフィーにより精製した。純粋なフラクションを合一した。溶媒を蒸発させ、残留物を水に取り、水溶液を凍結乾燥した。収量：２.７ｇ（９７％）。ＭＳ：ｍ／ｚ＝４７７.４(Ｍ＋Ｈ)+。
【０１０１】
４−(Ｓ)−［２−(Ｓ)−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−４−（２−カルバモイル−１−(Ｓ)−（２−フェニルエチルカルバモイル）−エチルカルバモイル）−酪酸塩酸塩（Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｐｈ）
５mlのＤＭＦ中の２−（Ｓ）−［２−（Ｓ）−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ペンタン二酸５−ｔ−ブチルエステル（４８mg、０.１ミリモル）および２−（Ｓ）−アミノ−Ｎ１−フェニルエチル−スクシンアミド塩酸塩（２７mg、０.１ミリモル）に０℃でＨＡＴＵ（３９mg、０.１ミリモル）およびコリジン（２４.２mg、０.２ミリモル）を加えた。混合物を１時間攪拌し、次に室温まで加温した。蒸発させた後、残留物を溶離剤としてｎ−ブタノール／氷酢酸／水（１７／１／２）を使用するセファデックスＬＨ２０上のクロマトグラフィーにより精製した。純粋なフラクションを合一した。溶媒を蒸発させ、残留物を水に取り、水溶液を凍結乾燥した。収量：４５mg（６６％）。ＭＳ：ｍ／ｚ＝６３８.４(Ｍ＋Ｈ)+。
【０１０２】
実施例２１
Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＮＨ−(３−クロロベンジル)の合成
５mlのＤＭＦ中の２−（Ｓ）−［２−（Ｓ）−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ペンタン二酸５−ｔ−ブチルエステル（５０mg、０.１０５ミリモル）および２−（Ｓ）−アミノ−Ｎ１−（３−クロロベンジル）スクシンアミドトリフルオロ酢酸塩（６１mg、０.１６ミリモル）に０℃でＴＯＴＵ（３６mg、０.１１ミリモル）およびＮ−エチルモルホリン（５７μl、０.４ミリモル）を加えた。混合物を１時間攪拌し、次に室温まで加温した。蒸発させた後、残留物を溶離剤としてｎ−ブタノール／氷酢酸／水（１７／１／２）を使用するセファデックスＬＨ２０上のクロマトグラフィーにより精製した。純粋なフラクションを合一した。溶媒を蒸発させ、残留物を水に取り、水溶液を凍結乾燥した。４−（Ｓ）−［２−（Ｓ）−アリルオキシカルボニルアミノ−３−（４−カルバイミドイル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−４−（２−カルバモイル−１−（Ｓ）−（３−クロロベンジルカルバモイル）−エチルカルバモイル）−酪酸（Ａｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＮＨ−（３−クロロベンジル）またはＡｌｌｏｃ−ｐＡｐｈ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−３−クロロベンジルアミド）の収量：２８mg（４１％）。ＭＳ：ｍ／ｚ＝６５８.３(Ｍ＋Ｈ)+。
上記実施例と同様にして製造した別の実施例化合物を上記表２に記載した。
【０１０３】
実施例２２
ＦVIIａ阻害に関するKiの測定
本質的に前記のようにして色素形成試験を使用してVIIａ因子／組織因子活性に対する各化合物の阻害活性（Ki）を測定した（J.A. Ostrem, F. Al-Obeidi, P. Safar, A. Safarova, S.K. Stringer, M. Patek, M.T. Cross, J. Spoonamore, J.C. LoCascio, P. Kasireddy, D.S. Thorpe, N. Sepetov, M. Lebl, P. Wildgoose, P. Stropの「組合わせ化学による強力で特異的な新規Ｘａ因子阻害剤の発見」、生化学３７、１０５３−１０５９（１９９８年))。反応速度試験を２５℃において反応プレート読取り器（分子装置スペクトラマックス２５０）を使用して半領域マイクロタイタープレート（Costar社製）で行なった。典型的な試験液は２５μlのヒトVIIａ因子およびＴＦ（それぞれの最終濃度５nMおよび１０nM）を１０％ ＤＭＳＯ／ＴＢＳ−ＰＥＧ緩衝液（５０mMのトリス、１５mMのＮａＣｌ、５mMのＣａＣｌ2；０.０５％ ＰＥＧ ８ｋ、pH８.１５）中における４０μlの阻害剤希釈液と化合させたものである。予め１５分間インキュベートした後、３５μlの色素形成基質Ｓ−２２８８（Ｄ−ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Pharmacia Hepar社製、最終濃度５００μM）を加えて試験を開始した。見掛けの阻害定数を所定時間の直線部分、典型的には基質を試験液に加えた後１〜５分間の反応曲線の傾きから計算した。次に、各化合物についての真のKiを式Ki＝見掛けのKi／（１＋(Ｓ)／Km）を使用して基質濃度(Ｓ)およびKmを補正することにより求めた（I.H. Segalの「酵素速度論」、第１００−１２５頁（John Wiley & Sons, １９７５年))。