(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラジエノライドの生合成に関与し、ポリケチド合成酵素、6位水酸化酵素、7位アシル化酵素および18,19位エポキシ化酵素から選ばれる少なくとも１種であるポリペプチドをコードする少なくとも１個の領域を含んでなる単離された純粋なDNAであって、以下の(1)項から(4)項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも1個の塩基配列を含んでなるDNA。
(1)以下の(a)項から(h)項までのいずれかの項で定義された塩基配列、
(a) 配列番号１の塩基8340から塩基27935までの連続した塩基配列
(b) 配列番号１の塩基28021から塩基49098までの連続した塩基配列
(c) 配列番号１の塩基49134から塩基60269までの連続した塩基配列
(d) 配列番号１の塩基60269から塩基65692までの連続した塩基配列
(e) 配列番号１の塩基65707から塩基66903までの連続した塩基配列
(f) 配列番号１の塩基68160から塩基66970までの連続した塩基配列
(g) 配列番号１の塩基69568から塩基68270までの連続した塩基配列
(h) 配列番号１の塩基1から塩基74342までの連続した塩基配列
(2)(1)項において定義されたいずれかの塩基配列との相同性が90％以上である塩基配列
(3)(1)項または(2)項で定義されたいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列
(4)遺伝暗号の縮重のため、(1)項において定義された塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、(1)項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項２】
プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードする全ての領域を含んでなることを特徴とする、請求項１記載のDNA。
【請求項３】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物に由来することを特徴とする、請求項１又は２記載のDNA。
【請求項４】
以下の(a)項から(h)項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも1個の塩基配列を含んでなる、請求項１記載のDNA。
(a) 配列番号１の塩基8340から塩基27935までの連続した塩基配列
(b) 配列番号１の塩基28021から塩基49098までの連続した塩基配列
(c) 配列番号１の塩基49134から塩基60269までの連続した塩基配列
(d) 配列番号１の塩基60269から塩基65692までの連続した塩基配列
(e) 配列番号１の塩基65707から塩基66903までの連続した塩基配列
(f) 配列番号１の塩基68160から塩基66970までの連続した塩基配列
(g) 配列番号１の塩基69568から塩基68270までの連続した塩基配列
(h) 配列番号１の塩基1から塩基74342までの連続した塩基配列
【請求項５】
請求項１から４までのいずれかの請求項に記載されたDNAによりコードされるポリペプチド。
【請求項６】
ポリケチド合成酵素活性を有することを特徴とする、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２、３、４または５記載のアミノ酸配列またはその部分配列からなることを特徴とする、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
６位水酸化酵素活性を有することを特徴とする、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号６記載のアミノ酸配列またはその部分配列からなることを特徴とする、請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
18,19位エポキシ化酵素活性を有することを特徴とする、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号８記載のアミノ酸配列またはその部分配列からなることを特徴とする、請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
7位アシル化酵素活性を有することを特徴とする、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号７記載のアミノ酸配列またはその部分配列からなることを特徴とする、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１から４までのいずれかの請求項に記載されたDNAを担持する自律複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
【請求項１５】
請求項１から４までのいずれかの請求項に記載されたDNAを保持する形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５記載の形質転換体を培地で培養し、その培養液からプラジエノライドを採取することを特徴とする、プラジエノライドの製造方法。
【請求項１７】
プラジエノライドがプラジエノライドBである、請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
式（ＶＩ）
0004599357.tif 000022
[式中、ＲNは、低級アルキル基または環状の低級アルキル基を示し、nは、１または２を示す]で表されるプラジエノライドD誘導体の製造方法であって、
（１）請求項１６または請求項１７に記載の製造方法によって式（Ｉ）
0004599357.tif 000023
の化合物（プラジエノライドB）を製造し、次いでその１６位に水酸基を導入して、
式（ＩＩ）
0004599357.tif 000024
の化合物（プラジエノライドD）に変換する工程、
（２）式（ＩＩ）の化合物の３、６、１６及び／または２１位の水酸基に適宜保護基を導入して、式（ＩＩＩ）
0004599357.tif 000025
の化合物[式中、Ｒ3A、Ｒ6A、Ｒ16AおよびＲ21Aは、水素原子または水酸基の保護基を示す（ただし、Ｒ3A、Ｒ6A、Ｒ16AおよびＲ21Aは、同時に水素原子を示さない）]に変換する工程、
（３）式（ＩＩＩ）の化合物の７位のアセチル基を脱離させることにより、
式（ＩＶ）
0004599357.tif 000026
の化合物[式中、Ｒ3A、Ｒ6A、Ｒ16AおよびＲ21Aは、前記の意味を有する]に変換する工程、
（４）式（ＩＶ）の化合物の７位に置換基を導入して、式（Ｖ）
0004599357.tif 000027
の化合物[式中、ＲN、Ｒ3A、Ｒ6A、Ｒ16AおよびＲ21Aは、前記の意味を有する]に変換する工程
および（５）式（Ｖ）の化合物の保護基を脱離させる工程を含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、マクロライド系化合物プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡおよびそれらの改変体に関する。さらには、それらＤＮＡおよびそれらの改変体の一部または全体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いたマクロライド系化合物プラジエノライドの製造方法に関する。
【背景技術】  放線菌の生産する様々な代謝産物のなかには生理活性物質として重要な物質が見出されている。とりわけ構造上ポリケチドを母核にもつ化合物（以下、ポリケチド化合物という）が多く見出されている。例えば、抗菌性物質として知られるエリスロマイシン、ジョサマイシン、タイロシン、ミデカマイシン、マイシナマイシン、抗真菌性物質として知られるナイスタチン、アンフォテリシン、殺虫性物質として知られるミルベマイシン、エバーメクチン、免疫抑制物質として知られるタクロリムス、ラパマイシンおよび抗腫瘍性物質として知られるダウノマイシン、アドリアマイシン、アクラシノマイシンなどのように種々の生物活性を有する化合物が知られている。
そのような化合物の１つとしてプラジエノライドと命名された優れた抗腫瘍活性を示す一群のマクロライド系化合物がある。プラジエノライドは、放線菌ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株の培養物から見出された化合物群の総称であり、下記式（Ｉ）で示される１１１０７Ｂ（プラジエノライドＢ）をはじめとして５０種以上の類縁体が知られている（ＷＯ０２／０６０８９０）。
0004599357.tif 000002
一方、ポリケチド化合物の生合成機構についても多くのことが知られている。上記の多種多様なポリケチド化合物は共通な生合成機構を共有していると言われており、その機構は脂肪酸の生合成と極めて類似している。即ち、ポリケチド化合物の合成は酢酸やプロピオン酸などの低級脂肪酸が連続的に縮合し、次いで伸張したアシル基のβ位のカルボニル基を脂肪酸合成と同様な方法で様々にケトン還元、脱水あるいはエノイル還元する工程により生合成される。これら多くのポリケチド化合物の種々の反復的な合成工程はそれぞれの反応触媒活性に必要な別々の活性部位（ドメイン）を有する高分子の多機能酵素複合体によって調節されると言われている。ポリケチド生合成の一般的な反応様式は、例えば、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，２４（１９９０）３７−６６およびＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７（１９９３）８７４−９１２に概説されている。
ポリケチド合成酵素をコードしているＤＮＡ配列は一般にポリケチド骨格合成に必要なすべての活性をコードしており、縮合工程と縮合後の修飾工程を含む反復単位、即ちモジュールに構成されていることが明らかにされている。各々の触媒活性は、各縮合工程に含まれる特定のカルボン酸構成単位に対する特異性に関与するかあるいは達成される特定の縮合後の修飾機能を規定する異なる部位が関与している。例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８）１２１１１−１２１１６にはストレプトマイセス・ベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＡＴＣＣ１５４３９のピクロマイシン生合成に関わるポリケチド合成酵素をコードする遺伝子について記載されている。またＷＯ９３／１３６６３にはサッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）のエリスロマイシンポリケチド合成酵素をコードする遺伝子の構成が記載されている。この遺伝子は６つのモジュールから構成されており、各モジュールが１つの縮合工程を行う。即ち、アシル側鎖伸長の正確な配列と伸長している鎖の修飾は各モジュールに存在する遺伝子情報によって決定される。
また、多種多様なポリケチド化合物は、ポリケチド合成酵素によりポリケチド骨格の合成が行われた後、水酸化、エポキシ化、メチル化などの修飾反応を触媒する酵素（以下、修飾酵素ということがある）により、しばしば修飾を受けて最終的な代謝産物に変換される。これらの生産に関与する遺伝子群、すなわち最終的な代謝産物を生合成するために必要な酵素のほか、生産調節に必要な調節因子などをコードする遺伝子（以下、これらの生合成に関与する遺伝子群を総称して単に「生合成遺伝子」と称することがある）は、一般に生産菌のゲノムまたはプラスミド上のＤＮＡ領域にクラスターを形成して配置されていることが明らかにされている。
ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列情報が決定されれば、その情報を基にして、ドメインを改変することにより、炭素鎖の大きさ、縮合過程のβ位炭素の官能基を変化させることが可能となってくる。例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）７１１９−７１２３には、エリスロマイシンのポリケチド合成酵素遺伝子内の特定ドメインを選択的に不活化することにより、エリスロマイシンの新規誘導体を生じさせることができると記載されている。さらに、各モジュールのドメインを他のものと組み換えることにより、予測可能な新規の化合物を生産させることが可能となってくる。例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（１９９９）１８４６−１８５１には、エリスロマイシンのポリケチド合成酵素遺伝子内のドメインをいくつか組み換えることで多種の新規化合物ができることが記載されている。
また、修飾酵素をコードする遺伝子（以下、修飾酵素遺伝子ということがある）を含んだ生合成遺伝子クラスターの塩基配列が決定されれば、その情報を基にして、修飾酵素遺伝子を選択的に改変することにより、予測可能な新規の化合物を生産させることが可能となってくる。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２（１９９１）１１４−１１６には、エリスロマイシンのポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に存在する水酸化酵素遺伝子ｅｒｙＦを欠損させることで新たな誘導体６−デオキシエリスオノリドＢができることが記載されている。
さらに修飾酵素遺伝子の発現を活性化することで不要な副産物を減少させ、単一の目的成分を生産させることも可能となる場合がある。遺伝子発現の活性化には一般的にはプロモーターを置換することによる転写活性化、マルチコピーベクターを用いた遺伝子コピー数の増加、変異導入による遺伝子産物機能の向上などによる方法が知られている。また調節遺伝子を同様な方法で活性化させたり、逆に不活性化させたりすることで生産性を高めることが可能となる場合がある。
さらに、これら生合成遺伝子クラスターをコードする遺伝子を取得し、適当な方法を用いて異種菌株に導入することで、異種菌株による目的ポリケチド化合物の生産ができる場合がある。この時用いる異種菌株は、微生物、特に短期間の培養が可能な大腸菌などを使うと有利である。例えばＳｃｉｅｎｃｅ  ２９１（２００１）１７９０−１７９２には、大腸菌にポリケチド合成酵素遺伝子を組み込むことにより、エリスロマイシン前駆体である目的の６−デオキシエリスオノリドＢを効率よく生産できることが記載されている。
【発明の開示】
本発明の課題は、マクロライド系化合物プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡおよびそれらの改変体を提供することである。さらには、それらＤＮＡおよびそれらの改変体の一部または全体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いたマクロライド系化合物プラジエノライドの製造方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するため、コロニーハイブリダイゼーション法に従って、一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域（ｋｅｔｏ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）において保存されていると言われている配列に基づいて調製したプローブを用い、マクロライド系化合物プラジエノライド生産菌であるストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株（以下、Ｍｅｒ−１１１０７株ということがある）から目的のＤＮＡの取得を試みたが、多数のコスミドが選択され目的のＤＮＡを直ちに同定することはできなかった。
そこで、ポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に修飾酵素遺伝子が存在する可能性が高いことに着目し、公知の放線菌から修飾酵素の１つである水酸化酵素（シトクロムＰ４５０酵素）の遺伝子断片をＰＣＲ法にて取得し、これをプローブとすることによりポリケチド合成酵素領域の配列に基づいて取得された多数のコスミドから目的のＤＮＡを含むいくつかのコスミドを選択した。
一方、Ｍｅｒ−１１１０７株は、多種類のプラジエノライド類縁体を生産する能力を有することから多数の修飾酵素の存在が推定される。本発明者らは、選択されたコスミド中に存在する水酸化酵素が、これら多くの修飾酵素のうちの６位水酸化酵素であることを見出し、さらにＭｅｒ−１１１０７株固有の性質であるプロトプラストになりにくい、あるいは常用される薬剤マーカーに耐性を有する等の遺伝子工学を適用するためには不利になる性質を克服することにより、初めて目的のＤＮＡを取得、同定することに成功した。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２０］に関する。
［１］  プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１個の領域を含んでなる単離された純粋なＤＮＡ。
［２］  プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードする全ての領域を含んでなることを特徴とする、［１］記載のＤＮＡ。
［３］  プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドが、ポリケチド合成酵素、６位水酸化酵素、７位アシル化酵素、１８，１９位エポキシ化酵素および転写調節因子から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、［１］または［２］記載のＤＮＡ。
［４］  ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来することを特徴とする、［１］から［３］までのいずれかに記載のＤＮＡ。
［５］  以下の（１）項から（５）項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも１個の塩基配列を含んでなる、［１］記載のＤＮＡ。
（１）  以下の（ａ）項から（ｉ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列、
（ａ）配列番号１の塩基８３４０から塩基２７９３５までの連続した塩基配列
（ｂ）配列番号１の塩基２８０２１から塩基４９０９８までの連続した塩基配列
（ｃ）配列番号１の塩基４９１３４から塩基６０２６９までの連続した塩基配列
（ｄ）配列番号１の塩基６０２６９から塩基６５６９２までの連続した塩基配列
（ｅ）配列番号１の塩基６５７０７から塩基６６９０３までの連続した塩基配列
（ｆ）配列番号１の塩基６８１６０から塩基６６９７０までの連続した塩基配列
（ｇ）配列番号１の塩基６９５６８から塩基６８２７０までの連続した塩基配列
（ｈ）配列番号１の塩基７２７２５から塩基７００２０までの連続した塩基配列
（ｉ）配列番号１の塩基１から塩基７４３４２までの連続した塩基配列
（２）  （１）項において定義されたいずれかの塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが有する塩基配列
（３）  （１）項において定義されたいずれかの塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列
（４）  （１）項から（３）項までのいずれかの項で定義されたいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列
（５）  遺伝暗号の縮重のため、（１）項において定義された塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、（１）項から（３）項までのいずれかの項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列
［６］  以下の（ａ）項から（ｉ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも１個の塩基配列を含んでなる、［１］記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基８３４０から塩基２７９３５までの連続した塩基配列
（ｂ）配列番号１の塩基２８０２１から塩基４９０９８までの連続した塩基配列
（ｃ）配列番号１の塩基４９１３４から塩基６０２６９までの連続した塩基配列
（ｄ）配列番号１の塩基６０２６９から塩基６５６９２までの連続した塩基配列
（ｅ）配列番号１の塩基６５７０７から塩基６６９０３までの連続した塩基配列
（ｆ）配列番号１の塩基６８１６０から塩基６６９７０までの連続した塩基配列
（ｇ）配列番号１の塩基６９５６８から塩基６８２７０までの連続した塩基配列
（ｈ）配列番号１の塩基７２７２５から塩基７００２０までの連続した塩基配列
（ｉ）配列番号１の塩基１から塩基７４３４２までの連続した塩基配列
［７］  ［１］から［６］までのいずれかの項に記載されたＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
［８］  ポリケチド合成酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［９］  配列番号２、３、４または５記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［８］記載のポリペプチド。
［１０］  ６位水酸化酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１１］  配列番号６記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１０］記載のポリペプチド。
［１２］  １８，１９位エポキシ化酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１３］  配列番号８記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１２］記載のポリペプチド。
［１４］  転写調節因子活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１５］  配列番号９記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１４］記載のポリペプチド。
［１６］  ７位アシル化酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１７］  配列番号７記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１６］記載のポリペプチド。
［１８］  ［１］から［６］までのいずれかの項に記載されたＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
［１９］  ［１］から［６］までのいずれかの項に記載されたＤＮＡを保持する形質転換体。
［２０］  ［１９］記載の形質転換体を培地で培養し、その培養液かプラジエノライドを採取することを特徴とする、プラジエノライドの製造方法。
［２１］  プラジエノライドがプラジエノライドＢである、［２０］記載の製造方法。
［２２］  式（ＶＩ）
0004599357.tif 000003
［式中、ＲＮは、低級アルキル基または環状の低級アルキル基を示し、ｎは、１または２を示す］で表されるプラジエノライドＤ誘導体を製造方法であって、
（１）［２０］または［２２］に記載の製造方法によって得られる式（Ｉ）
0004599357.tif 000004
の化合物（プラジエノライドＢ）の１６位に水酸基を導入して、
式（ＩＩ）
0004599357.tif 000005
の化合物（プラジエノライドＤ）に変換する工程、
（２）式（ＩＩ）の化合物の３、６、１６及び／または２１位の水酸基に適宜保護基を導入して、式（ＩＩＩ）
0004599357.tif 000006
の化合物［式中、Ｒ３Ａ、Ｒ６Ａ、Ｒ１６ＡおよびＲ２１Ａは、水素原子または水酸基の保護基を示す（ただし、Ｒ３Ａ、Ｒ６Ａ、Ｒ１６ＡおよびＲ２１Ａは、同時に水素原子を示さない）］に変換する工程、
（３）式（ＩＩＩ）の化合物の７位のアセチル基を脱離させることにより、式（ＩＶ）
0004599357.tif 000007
の化合物［式中、Ｒ３Ａ、Ｒ６Ａ、Ｒ１６ＡおよびＲ２１Ａは、前記の意味を有する］に変換する工程、
（４）式（ＩＶ）の化合物の７位に置換基を導入して、式（Ｖ）
0004599357.tif 000008
の化合物［式中、ＲＮ、Ｒ３Ａ、Ｒ６Ａ、Ｒ１６ＡおよびＲ２１Ａは、前記の意味を有する］に変換する工程
および（５）式（Ｖ）の化合物の保護基を脱離させる工程を含む製造方法。
発明の詳細な説明
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
なお、本発明書において、「低級アルキル基」とは、炭素数１ないし６個のアルキル基を意味し、具体的には、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等が挙げられ、特に、メチル基、エチル基、イソプロピル基等が好ましい。
「環状の低級アルキル基」とは、炭素数３ないし６個のアルキル基を意味し、具体的には、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロヘキシル等が挙げられ、特に、シクロプロピル基、シクロブチル基等が好ましい。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、上記（ａ）項から（ｉ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
「ＤＮＡの改変体」とは、構成塩基の削除、変換、付加、挿入などにより修飾されたもの、あるいはその誘導体を意味する。
「相同性」とは、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの百分率を意味する。すなわち、相同性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）４０３−４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。
「類縁体」とは、化学構造を特徴づける主骨格が同じで、修飾の様式や側鎖の形状などが異なる化合物を意味する。
本発明においては、マクロライド系化合物プラジエノライドを生産する能力を有する微生物の培養菌体から、プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することができる。このような微生物としては、プラジエノライドを生産する能力を有するものであれば種および株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい微生物として土壌から分離されたストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株を挙げることができる。本菌株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１４４として平成１２年１２月１９日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３号在の工業技術院生命工学工業技術研究所（その後、日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に組織変更した）に寄託され、さらに平成１３年１１月２７日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行攻法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、これを国際寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８１２に移管された。なお、本菌株の菌学的性状は次のとおりである。
（１）形態
基生菌糸より螺旋状（Ｓｐｉｒａｌｅｓ）の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に１０〜２０個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは０．７×１．０μｍ位で、胞子の表面は平滑（ｓｍｏｏｔｈ）を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。
（２）各種培地における生育状態
各種培地上で２８℃、２週間培養後の培養性状を以下に示す。色調の記載はトレズナーのカラー・ホイールズ（ＴｒｅｓｎｅｒのＣｏｌｏｒ  ｗｈｅｅｌｓ）の色標名と括弧内に示す符号で表示する。
１）  イースト・麦芽寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色の胞子（Ｌｉｇｈｔ  ｇｒａｙ；ｄ）が見られる。培養裏面はＬｉｇｈｔ  ｍｅｌｏｎ  ｙｅｌｌｏｗ（３ｅａ）である。溶解性色素は産生しない。
２）  オートミール寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を僅かに着生し、灰色の胞子（Ｇｒａｙ；ｇ）が見られる。培養裏面はＮｕｄｅ  ｔａｎ（４ｇｃ）またはＰｕｔｔｙ（１  １／２  ｅｃ）である。溶解性色素は産生しない。
３）  スターチ・無機塩寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色の胞子（Ｇｒａｙ；ｅ）が見られる。培養裏面はＦａｗｎ（４ｉｇ）またはＧｒａｙ（ｇ）である。溶解性色素は産生しない。
４）  グリセリン・アスパラギン寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、白色の胞子（Ｗｈｉｔｅ；ａ）が見られる。培養裏面はＰｅａｒｌ  ｐｉｎｋ（３ｃａ）である。溶解性色素は産生しない。
５）  ペプトン・イースト・鉄寒天培地
生育は悪く、その表面に気中菌糸を着生しない。培養裏面はＬｉｇｈｔ  ｍｅｌｏｎ  ｙｅｌｌｏｗ（３ｅａ）である。溶解性色素は産生しない。
６）  チロシン寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、白色の胞子（Ｗｈｉｔｅ；ａ）が見られる。培養裏面はＰｅａｒｌ  ｐｉｎｋ（３ｃａ）である。溶解性色素は産生しない。
（３）各種炭素源の同化性
プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、２８℃、培養２週間後の生育状況を以下に示す。
１）  Ｌ−アラビノース      ±
２）  Ｄ−キシロース        ±
３）  Ｄ−グルコース        ＋
４）  Ｄ−フルクトース      ＋
５）  シュークロース        ＋
６）  イノシトール          ＋
７）  Ｌ−ラムノース        −
８）  Ｄ−マンニトール      ＋
９）  ラフィノース          ＋
（＋は同化する、±は多少同化する、−は殆ど同化しない。）
（４）生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
１）生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：１２℃〜３７℃
２）最適温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：２１℃〜３３℃
３）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）：陰性
４）ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陰性
５）ミルクのペプトン化（スキムミルク培地）：陰性
６）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地）：陽性
７）メラニン様色素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陰性
（チロシン培地）：陰性
８）硫化水素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陰性
９）硝酸塩の還元（０．１％硝酸カリ含有ブロス）：陰性
１０）食塩の耐性（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：食塩含有量４％以下で生育
（５）菌体成分
本菌の細胞壁からＬＬ−ジアミノピメリン酸およびグリシンが検出された。
本発明者らはモレキュラ・クローニング第２版に記載されたコロニーハイブリダイゼーション法に従って、上記微生物から本発明のＤＮＡの取得を試みた。まずＭｅｒ−１１１０７株のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで部分分解したものを、大腸菌内で複製可能なコスミドベクターを制限酵素、例えばＢａｍＨＩで分解したものと連結して得た組換えＤＮＡを大腸菌に組込み形質導入株を得た。一方、Ｍｅｒ−１１１０７株から取得したＤＮＡを鋳型とし、一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域（ｋｅｔｏ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）において保存されていると言われている配列情報と、ピクロマイシン生産菌のケト合成酵素領域の配列情報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８）１２１１１−１２１１６）とを参考に設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅されたＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡをプローブとして先に調製した形質導入株をスクリーニングしたが、多数の陽性クローン（コスミド）が取得され、目的のＤＮＡをもつ形質導入株を直ちに同定することはできなかった。
そこでポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に修飾酵素遺伝子が存在する可能性が高いことに着目し、公知の放線菌２株から２種類の水酸化酵素（シトクロムＰ４５０酵素）遺伝子の断片をＰＣＲ法にて取得し、これをプローブとして、先に得られた多数の形質導入株をスクリーニングし、プローブと結合する１種類の形質導入株を選択した。そして選択されたコスミド中に存在する水酸化酵素遺伝子と結合するＤＮＡを取得し、配列を決定した。さらにこれを大腸菌に導入し、形質転換された大腸菌がプラジエノライドＢの６位デオキシ体である、下記式で表されるＭＥ−２６５をプラジエノライドＢに変換する能力をもつことを見出し、このＤＮＡが、６位水酸化酵素をコードするＤＮＡであることを確認した。
0004599357.tif 000009
こうしてプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡの一部が判明したので、この６位水酸化酵素をコードするシトクロムＰ４５０遺伝子をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、先に取得した多数の陽性クローン（コスミド）からシトクロムＰ４５０遺伝子に隣接するプラジエノライド生合成遺伝子クラスターを含むコスミドを選択し整列化した。
次いで得られたいくつかのコスミドのうち、ポリケチド合成領域を含むと考えられるコスミドを用いて遺伝子破壊株を作成し、その破壊株がプラジエノライド生産能を失うことを確認することにより、取得したＤＮＡの機能を確認することにした。まず、ポリケチド合成領域と考えられる領域の一部を欠失させたコスミドを作成し、汎用される手法を用いてＭｅｒ−１１１０７株の相同組換えを行い遺伝子破壊株を取得することを試みたが、いくつかの問題点が明らかになった。その１つは、Ｍｅｒ−１１１０７株が汎用されるリゾチーム処理ではプロトプラストにならないので、放線菌にプラスミドを形質転換させる方法として汎用されるプロトプラストＰＥＧ法が適用できないということである。
そこで本発明者らは、形質転換させる方法としてプロトプラストＰＥＧ法の代りに対数増殖期前期の大腸菌と適量の放線菌胞子とを混合してＤＮＡを受渡す接合法を試みたが、Ｍｅｒ−１１１０７株は胞子を形成しにくい性質をもっていたため、さらに検討を加え、胞子菌体の放線菌の代りに対数増殖期前期まで培養した菌糸を用いることによりようやく形質転換することができた。
もう１つの問題点はＭｅｒ−１１１０７株が元々チオストレプトンにある程度の耐性をもっているため、放線菌の形質転換で汎用されるチオストレプトン耐性遺伝子をマーカーとして利用できないということである。そのため形質転換の手法を再度検討し、マーカーとしてアミノグリコシドリン酸化酵素遺伝子（アミノグリコシド耐性遺伝子）、選択培地としてリボスタマイシン含有培地をそれぞれ用いることにより、Ｍｅｒ−１１１０７株の形質転換株を効率的に選択できることを見出した。そしてこの方法を用いてポリケチド合成領域と考えられるＤＮＡを破壊した遺伝子破壊株を作成し、その破壊株がプラジエノライド生産能を失うことを確認した。
こうして先に得られたコスミドに含まれる遺伝子がプラジエノライドの生合成に関連していることが確認されたので、次に各コスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。まず、各コスミドを塩化セシウム法を用いて単離後、約１ｋｂに剪断しサブクローン化した。次いで得られたサブクローンに対し、それぞれの断片の塩基配列を決定し、プラジエノライドの合成に関連するＤＮＡを含む約７５ｋｂの塩基配列を決定した（配列番号１参照）。
この配列番号１で示されるＤＮＡには、ｐｌｄＡ  Ｉ（塩基８３４０〜２７９３５）、ｐｌｄＡ  ＩＩ（塩基２８０２１〜４９０９８）、ｐｌｄＡ  ＩＩＩ（塩基４９１３４〜６０２６９）、ｐｌｄＡ  ＩＶ（塩基６０２６９〜６５６９２）、ｐｌｄＢ（塩基６５７０７〜６６９０３）、ｐｌｄＣ（塩基６８１６０〜６６９７０）、ｐｌｄＤ（塩基６９５６８〜６８２７０）およびｐｌｄＲ（塩基７２７２５〜７００２０）の８つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれていた。またこれらの配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２〜９に示すとおりである。
こうして得られたＭｅｒ−１１１０７株のプラジエノライド生合成に関与するＤＮＡのうち、ｐｌｄＡ  Ｉ、ｐｌｄＡ  ＩＩ、ｐｌｄＡ  ＩＩＩおよびｐｌｄＡ  ＩＶには、既に明らかにされている他のポリケチド生合成遺伝子と同様にモジュールと呼ばれる１またはそれ以上の反復単位をそれぞれ含むいくつかの転写解読枠があった。そして各モジュールは後述するとおりポリケチド合成の縮合反応に関与するアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素（ＫＳ）、アシル転移酵素（ＡＴ）と、β位カルボニル基修飾反応に関与するケトアシル還元酵素（ＫＲ）、脱水酵素（ＤＨ）およびエノイル還元酵素（ＥＲ）から選択されるドメインの全てあるいはいくつかをコードしており最後のモジュールにはポリケチド鎖をポリケチド合成酵素から切り離すチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインが存在していた。
図１に、Ｍｅｒ−１１１０７株におけるプラジエノライドの生合成経路を示した。開始モジュール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ）は他のモジュールと違って活性中心のシステインがグルタミンに置換されていることより、ＰｌｄＡ  Ｉは初発反応に関与していることがわかる。またモジュール１０にはチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインがあることより、ＰｌｄＡ  ＩＶはポリケチドの最後の反応に関与していることがわかる。こうしてポリケチドの基本骨格が形成された後、さらに、ｐｌｄＢ、ｐｌｄＣおよびｐｌｄＤがコードしている酵素群（ＰｌｄＢ、ＰｌｄＣおよびＰｌｄＤ）により修飾を受け、プラジエノライドが生合成されると思われる。なお、ｐｌｄＲはエバーメクチン生合成における転写調節因子をコードする遺伝子ａｖｅＲとの相同性が高く、プラジエノライド生合成に関与するＤＮＡの転写調節因子をコードしていると思われる。
こうして明らかになったプラジエノライド生合成に関与するＤＮＡのモジュールおよび対応するドメインは以下のとおりである。
ＯＲＦ  ｐｌｄＡ  Ｉ（配列番号１の塩基８３４０〜２７９３５）は、開始モジュール、モジュール１、モジュール２およびモジュール３をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２に記載したアミノ酸配列で示される。
開始モジュール（塩基８３４０〜１１３８４）
ＫＳｓ：塩基８３５８〜９６２０
ＡＴｓ：塩基９７０２〜１０７８１
ＡＣＰｓ：塩基１１１４８〜１１３２７
モジュール１（塩基１１３８５〜１６０７０）
ＫＳ１：塩基１１３８５〜１２６５０
ＡＴ１：塩基１２７４７〜１３８２９
ＫＲ１：塩基１４９４０〜１５８０３
ＡＣＰ１：塩基１５８２５〜１６００７
モジュール２（塩基１６０７１〜２１４３１）
ＫＳ２：塩基１６０７１〜１７３３６
ＡＴ２：塩基１７４４５〜１８５３６
ＤＨ２：塩基１８７１７〜１９４１８
ＫＲ２：塩基２０２９８〜２１１６７
ＡＣＰ２：塩基２１１８９〜２１３７１
モジュール３（塩基２１４３２〜２７９３５）
ＫＳ３：塩基２１４３２〜２２６９５
ＡＴ３：塩基２２８００〜２３８８０
ＤＨ３：塩基２４０６６〜２４７７９
ＥＲ３：塩基２５６５９〜２６５８８
ＫＲ３：塩基２６６１０〜２７４７６
ＡＣＰ３：塩基２７４９８〜２７６８０
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＳｓ：アミノ酸７〜４２７
ＡＴｓ：アミノ酸４５５〜８１４
ＡＣＰｓ：アミノ酸９３７〜９９６
ＫＳ１：アミノ酸１０１６〜１４３７
ＡＴ１：アミノ酸１４７０〜１８３０
ＫＲ１：アミノ酸２２０１〜２４８８
ＡＣＰ１：アミノ酸２４９６〜２５５６
ＫＳ２：アミノ酸２５７８〜２９９９
ＡＴ２：アミノ酸３０３６〜３３９９
ＤＨ２：アミノ酸３４６０〜３６９３
ＫＲ２：アミノ酸３９８７〜４２７６
ＡＣＰ２：アミノ酸４２８４〜４３４４
ＫＳ３：アミノ酸４３６５〜４７８６
ＡＴ３：アミノ酸４８２１〜５１８１
ＤＨ３：アミノ酸５２４３〜５４８０
ＥＲ３：アミノ酸５７７４〜６０８３
ＫＲ３：アミノ酸６０９１〜６３７９
ＡＣＰ３：アミノ酸６３８７〜６４４７
ＯＲＦ  ｐｌｄＡ  ＩＩ（配列番号１の塩基２８０２１〜４９０９８）は、モジュール４、モジュール５、モジュール６およびモジュール７をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号３に記載したアミノ酸配列で示される。
モジュール４（塩基２８０２１〜３３５４０）
ＫＳ４：塩基２８１３２〜２９３９７
ＡＴ４：塩基２９５３０〜３０６２７
ＤＨ４：塩基３０８６５〜３１５６６
ＫＲ４：塩基３２４１３〜３３２７６
ＡＣＰ４：塩基３３２９８〜３３４８０
モジュール５（塩基３３５４１〜３９００３）
ＫＳ５：塩基３３５４１〜３４８０６
ＡＴ５：塩基３４９１２〜３５９９４
ＤＨ５：塩基３６１７５〜３６８７６
ＫＲ５：塩基３７７５５〜３８６２５
ＡＣＰ５：塩基３８６４７〜３８８２９
モジュール６（塩基３９００４〜４３６８６）
ＫＳ６：塩基３９００４〜４０２６９
ＡＴ６：塩基４０３７２〜４１４５４
ＫＲ６：塩基４２５５０〜４３４０７
ＡＣＰ６：塩基４３４２９〜４３６１１
モジュール７（塩基４３６８７〜４９０９８）
ＫＳ７：塩基４３６８７〜４４９５２
ＡＴ７：塩基４５０３１〜４６１２８
ＤＨ７：塩基４６３０３〜４７０２２
ＫＲ７：塩基４７８８１〜４８７４４
ＡＣＰ７：塩基４８７６６〜４８９４８
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＳ４：アミノ酸３８〜４５９
ＡＴ４：アミノ酸５０４〜８６９
ＤＨ４：アミノ酸９４９〜１１８２
ＫＲ４：アミノ酸１４６５〜１７５２
ＡＣＰ４：アミノ酸１７６０〜１８２０
ＫＳ５：アミノ酸１８４１〜２２６２
ＡＴ５：アミノ酸２２９８〜２６５８
ＤＨ５：アミノ酸２７１９〜２９５２
ＫＲ５：アミノ酸３２４６〜３５３５
ＡＣＰ５：アミノ酸３５４３〜３６０３
ＫＳ６：アミノ酸３６６２〜４０８３
ＡＴ６：アミノ酸４１１８〜４４７８
ＫＲ６：アミノ酸４８４４〜５１２９
ＡＣＰ６：アミノ酸５１３７〜５１９７
ＫＳ７：アミノ酸５２２３〜５６４４
ＡＴ７：アミノ酸５６７１〜６０３６
ＤＨ７：アミノ酸６０９５〜６３３４
ＫＲ７：アミノ酸６６２１〜６９０８
ＡＣＰ７：アミノ酸６９１６〜６９７６
ＯＲＦ  ｐｌｄＡ  ＩＩＩ（配列番号１の塩基４９１３４〜６０２６９）は、モジュール８およびモジュール９をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号４に記載したアミノ酸配列で示される。
モジュール８（塩基４９１３４〜５３８８５）
ＫＳ８：塩基４９２３５〜５０５０１
ＡＴ８：塩基５０５８０〜５１６５６
ＫＲ８：塩基５２７５２〜５３６２１
ＡＣＰ８：塩基５３６４２〜５３８２５
モジュール９（塩基５３８８６〜６０２６９）
ＫＳ９：塩基５３８８６〜５５１５１
ＡＴ９：塩基５５２４５〜５６３４２
ＤＨ９：塩基５６５１４〜５７２３０
ＥＲ９：塩基５８０２９〜５８９２５
ＫＲ９：塩基５８９４７〜５９８０４
ＡＣＰ９：塩基５９８２６〜６０００８
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＳ８：アミノ酸３５〜４５６
ＡＴ８：アミノ酸４８３〜８４１
ＫＲ８：アミノ酸１２０７〜１４９６
ＡＣＰ８：アミノ酸１５０４〜１５６４
ＫＳ９：アミノ酸１５８５〜２００６
ＡＴ９：アミノ酸２０３８〜２４０３
ＤＨ９：アミノ酸２４６１〜２６９９
ＥＲ９：アミノ酸２９６６〜３２６４
ＫＲ９：アミノ酸３２７２〜３５５７
ＡＣＰ９：アミノ酸３５６５〜３６２５
ＯＲＦ  ｐｌｄＡ  ＩＶ（配列番号１の塩基６０２６９〜６５６９２）は、モジュール１０をコードし、対応するヌクレオチドは、配列番号５に記載したアミノ酸配列で示される。
モジュール１０（塩基６０２６９〜６５６９２）
ＫＳ１０：塩基６０４３１〜６１６９６
ＡＴ１０：塩基６１７８１〜６２８６９
ＫＲ１０：塩基６３７５２〜６４６０９
ＡＣＰ１０：塩基６４６３１〜６４８１３
ＴＥ１０：塩基６４８３２〜６５６９２
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＳ１０：アミノ酸５５〜４７６
ＡＴ１０：アミノ酸５０５〜８６７
ＫＲ１０：アミノ酸１１６２〜１４４７
ＡＣＰ１０：アミノ酸１４５５〜１５１５
ＴＥ１０：アミノ酸１５２２〜１８０８
ＯＲＦ  ｐｌｄＢ（配列番号１の塩基６５７０７〜６６９０３）は、プラジエノライドの６位水酸化酵素をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号６に記載したアミノ酸配列で示される。ＯＲＦ  ｐｌｄＣ（配列番号１の塩基６８１６０〜６６９７０）は、プラジエノライドの７位アシル化酵素をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号７に記載したアミノ酸配列で示される。ＯＲＦ  ｐｌｄＤ（配列番号１の塩基６９５６８〜６８２７０）は、プラジエノライドの１８，１９位エポキシ化酵素をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号８に記載したアミノ酸配列で示される。ＯＲＦ  ｐｌｄＲ（配列番号１の塩基７２７２５〜７００２０）は、プラジエノライドの生合成における転写調節因子をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号９に記載したアミノ酸配列で示される。
さらに本発明のＤＮＡには、前記ＤＮＡだけでなく、それらの改変体であって、前記ＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡも包含される。このような改変体のより具体的なものとして、配列番号１の塩基８３４０から塩基２７９３５までの連続した塩基配列、配列番号１の塩基２８０２１から塩基４９０９８までの連続した塩基配列、配列番号１の塩基４９１３４から塩基６０２６９までの連続した塩基配列、配列番号１の塩基６０２６９から塩基６５６９２までの連続した塩基配列、配列番号１の塩基６５７０７から塩基６６９０３までの連続した塩基配列、配列番号１の塩基６８１６０から塩基６６９７０までの連続した塩基配列、配列番号１の塩基６９５６８から塩基６８２７０までの連続した塩基配列または配列番号１の塩基７２７２５から塩基７００２０までの連続した塩基配列のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％の相同性を示すものである。
こうして、一旦塩基配列を確定することができればその情報をもとに公知の方法によって本発明のプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡを取得することもできる。
例えば、配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、モレキュラー・クローニング第２版記載の方法により消化されたＤＮＡを分離回収し、プローブまたはプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを調製する。プローブとして用いる場合には、得られたＤＮＡ断片をジゴキシゲニン等で標識することが好ましい。ジゴキシゲニンによる標識にはＤＩＧラベリング＆デテクションキット（ロシュダイアノスティック社）等を用いることがこのましい。
次いでプラジエノライドを生産する能力を有する微生物の菌体から、モレキュラー・クローニング第２版等に記載のゲノムクローニング法またはｃＤＮＡクローニング法を用いてライブラリーを作製する。得られたライブラリーから先に調製したプローブとハイブリダイゼーションするクローン（コロニー）を選抜し、モレキュラー・クローニング第２版に記載の方法に従い選抜されたクローンからプラスミドを抽出し、得られたプラスミドから目的のプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡを取得することができる。
この場合において、抽出されたプラスミドにプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡの部分断片しか存在しない場合には、抽出されたプラスミドを適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩで消化することにより、これらプラスミドの制限酵素地図を常法に従い作成する。次いでその制限酵素地図からいくつかのクローンに共通して存在する制限酵素断片を見出し、オーバーラップしている部分でクローン化断片をつなぎ合わせることでプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡ全体を含むＤＮＡを取得することができる。
あるいは、上記したライブラリーおよびプライマーを用いて、直接ＰＣＲ反応を行い、目的のＤＮＡを直接増幅することにより、プラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡを取得することもできる。
プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。具体的には、２本鎖プラスミドＤＮＡを種々の配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたサイクルシークエンス反応の鋳型として直接用いるか、あるいは、ＤＮＡ断片を細分化し、バクテリオファージＭ１３にランダムにそして各断片が一部重複したライブラリーまたはプラスミドベクターを用いＤＮＡ断片の末端部分から順次欠失を導入した重複ライブラリーを作製し、ついで個々の組み換えＤＮＡ断片をベクター配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡ配列を決定することができる。
また、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、例えば８９０５型ＤＮＡ合成装置（パーセティブ・バイオシステムズ社製）等のＤＮＡ合成装置を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。得られた塩基配列データの整理、編集および解析は既存のソフトウェア、例えばソフトウェア開発社製ＧｅｎｅｔｙｘＴＭを用いて行うことができる。
また本発明のポリペプチドは、例えばモレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法を用い、本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて製造することができる。本発明のＤＮＡまたはそれらの改変体を組み込む部位は、宿主微生物のプラスミド上または染色体上のいずれでもよい。このようなプラスミドは、前記ＤＮＡまたはそれらの改変体以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等を含んでいてもよい。さらに、プラスミドは、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型プラスミドであってもよい。
このように本発明のＤＮＡでコードされるポリペプチドを発現させるための宿主、プラスミド−ベクター系は、これらのＤＮＡが安定に保持、発現される系であればどのような系でもよいが、例えば元々プラジエノライドを生産する能力を有する放線菌あるいはその類縁株を宿主とするならば、自律複製型ベクターｐＩＪ６０２１（Ｇｅｎｅ  １６６，１３３−１３７（１９９５））や染色体組み込み型ベクターＫＣ５１５〔Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ｖｏｌ．９．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ｅｄ：  Ｑｕｅｅｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ  Ｄａｙ，Ｌ．Ｅ．）．ｐ．１１９−１５８．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｇｌａ．〕などが利用できる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。得られた無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、先に得られたポリペプチドのアミノ酸配列の情報を基に、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ−ブトキシカルボニル法（ｔ−Ｂｏｃ法）等の化学合成法により本発明のポリペプチドを製造することもできる。
また先に取得したプラジエノライド生合成遺伝子を含有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にプラジエノライドを生成蓄積させ、該培養物からプラジエノライドを採取することによりプラジエノライドを製造することができる。培養条件は、特に制限はないが宿主の通常の培養条件に準ずる。
また、プラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡの塩基配列情報を基に、モジュールを修飾することにより、ポリケチド基本骨格の炭素鎖の大きさおよび縮合過程のβ位炭素の官能基を変化させることができる。さらにポリケチド形成後の修飾酵素を選択的に不活化することにより、予測可能なプラジエノライドの特定成分を優先的に生産させることが可能である。例えば、主としてプラジエノライドＢを生産する菌株であるＭｅｒ−１１１０７株のｐｌｄＢを欠損変異することにより、プラジエノライドＢの６位デオキシ体である、ＭＥ−２６５を主に生産する菌株にすることが可能である。ｐｌｄＢを欠損変異する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により、相同組換えによる置換、あるいは変換を行う方法をあげることができる。
こうして取得された特定のプラジエノライドを優先的に生産することが可能となった菌株を用い、プラジエノライドＢの製造法に準じて、特定のプラジエノライドを製造することができる。
本発明により、マクロライド系化合物プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡを単離して、その塩基配列を決定することができる。さらにそのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて、プラジエノライドを効率よく生産することができる。さらに得られたＤＮＡの配列を修飾、変更することにより取り込まれるカルボン酸の種類、縮合後の修飾反応、骨格形成後の修飾反応、またそれらのあらゆる組み合わせを改変することにより新規または特定のプラジエノライドの生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｍｅｒ−１１１０７株におけるプラジエノライドの生合成経路を示した図である。
図２は、Ｍｅｒ−１１１０７株におけるプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡの各ＯＲＦとコスミドの対応関係を示した図である。
図３は、ｐＫＵ２５３の構造を示す図である。
【実施例】  以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。また下記の説明中、特に記載がない限り表示濃度は重量％である。
実施例１：Ｍｅｒ−１１１０７株の培養およびゲノムＤＮＡの取得
ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株の菌糸を２５ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈに接種し、２８℃、３日間振とう培養した。この結果得られた培養液から、Ｄ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄらの放線菌遺伝子実験書Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ，２０００）のＩｓｏｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｐ１６２〜１７０）記載の方法に従ってゲノムＤＮＡを調製した。
実施例２：Ｍｅｒ−１１１０７株のゲノムライブラリーの調製
滅菌精製水１６０μｌと、Ｍｅｒ−１１１０７株のゲノムＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）２００μｌと、１０倍濃度のＭ緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ジチオスレイトール，５００ｍＭ  ＮａＣｌ］４０μｌと制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（ｌｕｎｉｔ／μｌ）１μｌとを混合し、３７℃で３分インキュベートした。その後、５０μｌを取り出し、５０μｌのフェノール−クロロホルム混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１，容量比）で抽出し、水相を回収し、さらに５０μｌのクロロホルムで抽出し、再び水相を回収した。この液に５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と１５０μｌのエタノールを加えて、−８０℃に３０分置き、遠心することで沈殿してくるＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、９０μｌの滅菌精製水に溶解し、１０μｌの１０倍濃度ＢＡＰ緩衝液［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２］および５μｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（０．５ｕｎｉｔ／μｌ、宝酒造社）を加えて３７℃で３時間インキュベートした。この反応液を１００μｌのフェノール−クロロホルム混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１，容量比）で抽出し、水相を回収し、さらに１００μｌのクロロホルムで抽出し、再び水相を回収した。この液に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と３００μｌのエタノールを加えて、−８０℃に３０分置き、遠心することで沈殿してくるＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、２０μｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に溶解した。
一方でＳｕｐｅｒＣｏｓコスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）１０μｇをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従い制限酵素ＸｂａＩで消化後、ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｏｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社）によりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行い、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化、精製後、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
このコスミドＤＮＡ溶液１μｌに、前述のＭｅｒ−１１１０７株ＤＮＡのＳａｕ３Ａ１部分分解物の溶液２．５μｌを加え、さらに滅菌精製水１．５μｌ、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを５μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを１０μｌ順次加えた後、２３℃で１０分インキュベートした。この反応液４μｌをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてラムダファージにパッケージングした。得られたパッケージング液（全量５００μｌ）について形質導入試験を実施して、コロニー形成能を検定した結果、３８０ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／μｌであった。
実施例３：各種プローブの調製
（１）ケト合成酵素コード領域を含むプローブの調製
一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域（ｋｅｔｏ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）において保存されている配列に基づいて、それぞれ、以下の配列番号１０および１１に示す塩基配列からなる２種のプライマー、即ち、ＫＳ−３ＦおよびＫＳ−４Ｒを合成した。
ＫＳ−３Ｆ：５’−ＧＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号１０）
ＫＳ−４Ｒ：５’−ＧＴＧＣＣＣＧＡＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＣＧＡ−３’（配列番号１１）
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
0004599357.tif 000010
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）      ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果増幅された９３０ｂ  ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、分離した９３０ｂ  ＤＮＡ断片を切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社）を用いてＤＮＡを回収精製した。さらに得られたＤＮＡ断片１０ｎｇを鋳型として反応サイクル数を２０サイクルとする以外は前述のＰＣＲと同じ反応条件でケト合成酵素コード領域を含む９３０ｂ  ＤＮＡ断片を再増幅した。このＤＮＡ断片をＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造社）を用いて濃縮精製して得られた５０μｌのＴＥ溶液をプローブ溶液とした。
（２）シトクロムＰ４５０遺伝子領域を含むプローブの調製
シトクロムＰ４５０遺伝子プローブを調製するために公知の２種のシトクロムＰ４５０遺伝子を放線菌から増幅した。すなわちストレプトマイセス  サーモトレランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＡＴＣＣ１１４１６由来ＯＲＦ−Ａ遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５８２−５８８，１９９５）を増幅するために、それぞれ、以下の配列番号１２および１３に示す塩基配列からなる２種のプライマー、即ち、ＣＢ−１ＦおよびＣＢ−２Ｒを合成した。
ＣＢ−１Ｆ：５’−ＡＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣ−３’（配列番号１２）
ＣＢ−２Ｒ：５’−ＴＣＡＧＡＧＡＣＧＧＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＧ−３’（配列番号１３）
一方でストレプトマイセス・ベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＡＴＣＣ１５４３９由来ｐｉｋＣ遺伝子（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：６６１−６６７，１９９８）を増幅するために、それぞれ、以下の配列番号１４および１５に示す塩基配列からなる２種のプライマー、即ち、ＰＫＣ−１ＦおよびＰＫＣ−２Ｒを合成した。
ＰＫＣ−１Ｆ：５’−ＧＴＧＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号１４）
ＰＫＣ−２Ｒ：５’−ＴＣＡＣＧＣＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣ−３’（配列番号１５）
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
0004599357.tif 000011
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）      ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果増幅された２種の１．２ｋｂ  ＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、各ＤＮＡ断片１０ｎｇ／μｌずつを含む等量混合溶液を調製してプローブ溶液とした。
実施例４：ケト合成酵素コード領域を含むプローブを用いたスクリーニング
実施例２で調製したＭｅｒ−１１１０７株のゲノムＤＮＡライブラリーのパッケージング液を使って大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を宿主とし、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従って形質導入した。形質導入操作後の菌液を１０枚のＬＢ−５０μｇ／ｍｌアンピシリン−１．５％寒天培地シャーレ（内径９０ｍｍ、高さ１５ｍｍ）に分注して広げ、３７℃で１８時間培養した。各シャーレに生育したコロニーをＨｙｂｏｎｄｏＮ＋フィルター（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に転写し、ＨｙｂｏｎｄｏＮ＋フィルターに添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、中和処理を行い、８０℃で２時間乾燥することでフィルター上にコロニー由来のＤＮＡを固定化した。
実施例３（１）にて調製したケト合成酵素領域を含む９３０ｂ  ＤＮＡ断片１００ｎｇをプローブにしてＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてゲノムＤＮＡライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは塩濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌで６５℃で２時間行った。プローブＤＮＡの標識、ハイブリダイゼーションおよび検出の条件についてはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍに添付されたマニュアルに記載された条件に従った。試験した約７，６００コロニーのうち、アルカリホスファターゼで標識したプローブと強くハイブリダイズした５９コロニーを分離した。このコロニーから派生した大腸菌クローンからコスミドを抽出精製した。
実施例５：シトクロムＰ４５０遺伝子領域を含むプローブを用いたプラジエノライド生合成遺伝子領域を有するコスミドクローンの選択確認
実施例４で得られた各コスミドのＤＮＡ溶液２μｌをＨｙｂｏｎｄｏＮ＋フィルター上にスポットし、添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、中和処理を行い、さらに８０℃で２時間乾燥することでフィルター上にＤＮＡを固定化した。このフィルターを用いて、実施例３にて記述したシトクロムＰ４５０遺伝子断片をプローブとして実施例４と同じ条件でハイブリダイゼーションを行った。この結果プローブと強くハイブリダイズしたコスミド１つを選択し、ｐＫＳ５８と命名した。
ｐＫＳ５８  ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後、ファージベクターＺａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＢａｍＨＩ−ＣＩＡＰ処理済（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にライゲーションし、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてラムダファージにパッケージングした。このファージ液を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に感染させて、プラークを形成させた。実施例３（２）で調製したシトクロムＰ４５０遺伝子プローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行うことで、約２ｋｂのシトクロムＰ４５０遺伝子を含むＤＮＡ断片をサブクローニングした。
このシトクロムＰ４５０遺伝子ＤＮＡ断片の配列を決定し、シトクロムＰ４５０コード領域とされるＮ−末端およびＣ−末端から、それぞれ、以下の配列番号１６および１７に示す塩基配列からなる２種のプライマー、即ち、ＰＤＬ５８−１ＦおよびＰＤＬ５８−２Ｒを合成した。
ＰＤＬ５８−１Ｆ：５’−ＧＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１６）
ＰＤＬ５８−２Ｒ：５’−ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１７）
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
0004599357.tif 000012
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）      ２０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果増幅された１．２ｋｂ  ＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで分解した。反応後ＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、分離した１．２ｋｂ  ＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡＧＥＮ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを回収精製した。このＤＮＡ断片をシトクロムＰ４５０遺伝子発現用プラスミドｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢ（特願２００２−１１０３１１号）のＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ部位へ挿入することでｐＰＤＬ９６を構築した。
このプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、Ｍ９ＣＧ培地（１．２８％  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％  ＮａＣｌ、０．１％  ＮＨ４Ｃｌ、１％カザミノ酸、０．４％グルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＣａＣｌ２、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）にて菌密度としてＯＤ６００（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ）が０．８に達するまで培養した。５−アミノレブリン酸およびＩＰＴＧをそれぞれ８０μｇ／ｍｌ、０．１ｍＭになるよう添加した後、２２℃で２５時間培養を継続し、シトクロムＰ４５０タンパク質を誘導させた。誘導後、菌体を集めてＣＶ緩衝液［５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭグルコース］５ｍｌに懸濁した。この液１ｍｌを試験管に取り、プラジエノライドＢの６位デオキシ体であるＭＥ−２６５のＤＭＳＯ溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加して２８℃で１５時間インキュベートした。この反応液に１ｍｌのアセトニトリルを加えて混合した後、遠心分離して上清を下記の条件にてＨＰＬＣで分析することでプラジエノライドＢへの変換を認めた。このことからｐＫＳ５８にプラジエノライド生合成遺伝子領域が含まれていることを確認した。
（ＨＰＬＣの分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相（容量％）：４５％〜５５％  メタノール（０〜５分）
５５％          メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％  メタノール（１３〜２１分）
４５％            メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍｌ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：ＭＥ−２６５；２０分、プラジエノライドＢ；１３分、
実施例６：シトクロムＰ４５０遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスターを含むコスミドの選定
実施例４で得られた、５９個のコスミドＤＮＡの中で、実施例５で得られたシトクロムＰ４５０遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスターを含むコスミドを選定した。
５９個のコスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化し、得られた各々のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、エバーメクチンアグリコン合成酵素遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（１９９９）９５０９−９５１４、特開平２０００−２４５４５７号公報またはＷＯ  ００／５０６０５パンフレット参照）のＫＳドメインのＤＮＡ（ａｖｅＡ２のＫＳ６ｄｏｍａｉｎ）、ＡＴドメインのＤＮＡ（ａｖｅＡ１のＡＴ２  ｄｏｍａｉｎ）、および実施例５で得られたシトクロムＰ４５０遺伝子をプローブに用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。
制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡの電気泳動パターンと、各プローブでのハイブリダイズしたバンドパターンの結果から、まず、同じ長さでハイブリダイズしたＤＮＡ断片を持つコスミドをグループ化した。そのうち、ほぼ同等のパターンを示したコスミドについては１つを残して削除し、残ったものでバンドパターンが部分一致するものについて整列化した。そして、実施例５で得られたシトクロムＰ４５０遺伝子を含むコスミドｐＫＳ５８を中心とし、シトクロムＰ４５０遺伝子側からポリケチド合成酵素遺伝子を含む側に隣接するコスミドとしてｐＫＳ５６，ｐＫＳ５４を選出し、さらにｐＫＳ５４に隣接するコスミドとしてｐＫＳ３５を選出した。また、コスミドｐＫＳ５８とシトクロムＰ４５０遺伝子側からポリケチド合成酵素遺伝子を含まない側に隣接するコスミドとしてｐＫＳ２３を選出した。その結果、図２に示すようにプラジエノライド生合成遺伝子クラスターを包括するコスミドクローンとしてｐＫＳ２３，ｐＫＳ５８，ｐＫＳ５６，ｐＫＳ５４，ｐＫＳ３５が選定された。
実施例７：プラジエノライド生合成遺伝子クラスター破壊株の作製
実施例６で選定されたコスミドのうち、ポリケチド合成領域を含むと考えられるｐＫＳ５６のＤＮＡを用いた生合成遺伝子破壊株の作製を行った。
ｐＫＳ５６のコスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、２ｋｂのスペクチノマイシン耐性遺伝子（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ３”−ａｄｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下ａａｄＡと略記するときがある）ＢａｍＨＩ消化断片とＮＥＢ  ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて連結した。こうして、ＢａｍＨＩによりｐＫＳ５６のコスミドＤＮＡ内の３０ｋｂ（図２のＡ部位：配列番号１のヌクレオチド番号３１１９４−６１３７４）が欠失し、２ｋｂのスペクチノマイシン耐性遺伝子と組み換わったコスミドｐ５６ａａｄＡを得た。なお、ａａｄＡは、プラスミドｐＨＰ４５ｏｍｅｇａ（Ｇｅｎｅ  １９０，３１５−３１７（１９９７））を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して作成したものである。
得られたコスミドｐ５６ａａｄＡをＭｅｒ−１１１０７株に組み込むために、シャトルベクターｐＫＵ２５３を用いた。ｐ５６ａａｄＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により、各々コスミドベクター部分を含まない１４ｋｂを分離して、ジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１社）を用いて精製した。得られた１４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、シャトルベクターｐＫＵ２５３をＥｃｏＲＩで消化したものとＮＥＢ  ｑｕｉｃｋｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて連結し、ｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡを得た。なお、ｐＫＵ２５３は、図３に示すとおり、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のプラスミドＳＣＰ２（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２６，４２７−４４２，１９８１）をベースに大腸菌のプラスミドｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３（１），１０３−１１９，１９８５）を繋ぎ、アミノグリコシド耐性遺伝子ａｐｈＩＩ（Ｇｅｎｅ，１９（３），３２７−３３６，１９８２）と接合遺伝子のｏｒｉＴ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５３２０−５３２３，１９８７）を入れて作成したものである。
得られたｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡ株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡ株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍｌに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。
得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡ株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡ形質転換株を得た。
得られたｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡ形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。なお、プラスミドベクターｐＫＵ２５３はＭｅｒ−１１１０７株中での複製効率が悪く、薬剤耐性マーカー（リボスタマイシン）を含まない培地で培養すると、Ｍｅｒ−１１１０７株はｐＫＵ２５３を保持できない。
ｐＫＵ２５３−５６ａａｄＡ形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。スペクチノマイシンを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。
培養後、スペクチノマイシン耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択し、ゲノムＤＮＡ上の目的とする生合成遺伝子とみられる領域にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されたことをサザンハイブリダイゼーション法で確認した。得られた菌株をＭｅｒ−１１１０７−５６：：ａａｄＡ株とした。
実施例８：プラジエノライド生合成遺伝子クラスター破壊株のプラジエノライド生産性試験
実施例７で得られたＭｅｒ−１１１０７−５６：：ａａｄＡ株とコントロールとして親株のＭｅｒ−１１１０７株とその形質転換株のＭｅｒ−１１１０７／ｐＫＵ２５３株の計３株について、プラジエノライドＢの生産性を試験した。
実施例７で得られたＭｅｒ−１１１０７−５６：：ａａｄＡ株と、Ｍｅｒ−１１１０７株およびＭｅｒ−１１１０７／ｐＫＵ２５３株の各々の凍結種母２００μｌを、種母培地（溶性でんぷん２％、エスサンミート２％、酵母エキス０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３０．３％  ｐＨ無調整）２０ｍｌに植菌し、２５℃で２日間培養した。
得られた種母培養液の３００μｌを、本培養培地（スタビローズ５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、β−シクロデキストリン２％、ＣａＣＯ３０．１％ｐＨ７．５）３０ｍｌに植菌し、２５℃で４日間および５日間培養した。
培養終了後、得られた培養液に対して９倍量のアセトニトリルを加えて抽出した。得られた抽出液についてＨＰＬＣにてプラジエノライドＢ量を測定した。測定結果を表１に示す。
また、ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相（容量％）：４５％〜５５％  メタノール（０〜５分）
５５％          メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％  メタノール（１３〜２１分）
４５％          メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍｌ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：プラジエノライドＢ  １３分
【表１】
0004599357.tif 000013
この結果、図２におけるＡ部位を欠損したＭｅｒ−１１１０７−５６：：ａａｄＡ株はプラジエノライドＢを全く作らない株であることが確認された。このことより、Ａ部位中の遺伝子がプラジエノライドの生合成に関連していることが示された。
実施例９：プラジエノライド生合成遺伝子クラスターの塩基配列の決定
プラジエノライド生合成遺伝子をコードする一群のＤＮＡの塩基配列を決定した。実施例８より図２のＡ部位の欠損株はプラジエノライドＢを生産できないことから、Ａ部位中の遺伝子がプラジエノライドの生合成に関連している。よって実施例６で選出したｐＫＳ３５、ｐＫＳ５４、ｐＫＳ５８およびｐＫＳ２３の４つのコスミドについて、これらコスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
各コスミドを、塩化セシウム法を用いて単離後、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を用いて約１ｋｂに剪断し、ＢＫＬ  Ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて、サブクローン化した。
得られたサブクローンに対し、蛍光標識プライマーを用いたサイクルシークエンス反応（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を行い、それぞれの断片の塩基配列を決定（ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００：ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）することにより、プラジエノライドの合成に関連するＤＮＡを含む約７５ｋｂの塩基配列を決定した（配列番号１参照）。
このＤＮＡ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、以下の８つのＯＲＦが含まれていた。
ｐｌｄＡ  Ｉ：塩基８３４０〜２７９３５
ｐｌｄＡ  ＩＩ：塩基２８０２１〜４９０９８
ｐｌｄＡ  ＩＩＩ：塩基４９１３４〜６０２６９
ｐｌｄＡ  ＩＶ：塩基６０２６９〜６５６９２
ｐｌｄＢ：塩基６５７０７〜６６９０３
ｐｌｄＣ：塩基６８１６０〜６６９７０
ｐｌｄＤ：塩基６９５６８〜６８２７０
ｐｌｄＲ：塩基７２７２５〜７００２０
各ＯＲＦとコスミドの対応関係を図２に示す。
実施例１０：プラジエノライドの６位水酸化酵素遺伝子（ｐｌｄＢ）破壊株の作製
実施例９で決定されたプラジエノライドの生合成に関連するＤＮＡを含む約７５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）より、図１に示された生合成経路でプラジエノライドが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちのシトクロムＰ４５０遺伝子ｐｌｄＢのみを破壊することで、プラジエノライドＢの６位デオキシ体であるＭＥ−２６５のみを生産する株を取得可能と考え、以下の方法でｐｌｄＢ破壊株を作製した。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、それぞれ、以下の配列番号１８、１９、２０および２１に示す塩基配列からなる４種のプライマー、即ち、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ、ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦおよびｐｌｄＢ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを合成した。
ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴＡＣＣＴＣＴＡＣＧＡＧＴＡ−３’（配列番号１８）
ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＧ−３’（配列番号１９）
ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３Ｆ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴ−３’（配列番号２０）
ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＴ−３’（配列番号２１）
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
0004599357.tif 000014
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）      ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２ＦとｐｌｄＢ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６４７５６から塩基６６３０２を含む１．５７ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｌ１）が増幅され、ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦとｐｌｄＢ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６６８４９から塩基６８３６８を含む１．５４ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｒ１）が増幅された。ＤＮＡ断片Ｌ１及びＲ１をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片Ｌ１及びＲ１と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した２．３ｋｂのハイグロマイシシＢ耐性遺伝子（ｐＨＰ４５ｏｍｅｇａｈｙｇ：Ｇｅｎｅ  １９０，３１５−３１７，１９９７由来。以下ｈｙｇと略記することがある）、及び制限酵素ＢａｍＨＩで消化したシャトルベクターｐＫＵ２５３（図３参照）、の計４者をＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（宝酒造社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片Ｌ１とＲ１の間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入された形の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＫＵ２５３に挿入された約２１．４ｋｂのプラスミドｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１が構築された。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１を、接合大腸菌Ｓ１７−１へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍｌに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。
得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１形質転換株を得た。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。ハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。
培養後、ハイグロマイシンＢ耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｐｌｄＢ遺伝子内の５４６ｂｐ（配列番号１の塩基６６３０３から塩基６６８４８）を欠失し、その間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入されたｐｌｄＢ破壊株であり、Ｍｅｒ−１１１０７ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株とした。
実施例１１：プラジエノライドの６位水酸化酵素遺伝子（ｐｌｄＢ）破壊株のプラジエノライド生産性試験
実施例１０で得られたＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株の凍結種母２００μｌを、種母培地（溶性でんぷん２％、エスサンミート２％、酵母エキス０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％  ｐＨ無調整）２０ｍｌに植菌し、２５℃で２日間培養した。
得られた種母培養液の３００μｌを、本培養培地（スタビローズ５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、β−シクロデキストリン２％、ＣａＣＯ３  ０．１％ｐＨ７．５）３０ｍｌに植菌し、２５℃で４日間および５日間培養した。
培養終了後、得られた培養液２０ｍｌに同量のアセトニトリルを加えて抽出した。その抽出液の一部を分取しアセトニトリルで５倍量に希釈し、下記の条件にてＨＰＬＣでプラジエノライドＢ及びＭＥ−２６５の量を測定した。測定結果を表２に示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相（容量％）：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％        メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％メタノール（１３〜１７分）
７０％        メタノール（１７〜３５分）
４５％        メタノール（３５〜４０分）
流速：１．２ｍｌ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：３５分
保持時間：ＭＥ−２６５；２２分、プラジエノライドＢ；１６分
【表２】
0004599357.tif 000015
実施例１２：ＭＥ−２６５の単離精製と構造確認
実施例１１で得られたアセトニトリル抽出液をろ過し、菌体を水１０ｍｌ、４０ｍｌで洗浄した。ろ液と洗浄液を一緒にして酢酸エチル１００ｍｌで抽出した。さらに水層に飽和食塩水５０ｍｌを加え、酢酸エチル５０ｍｌで再度抽出した。酢酸エチル層を合わせ飽和食塩水５０ｍｌで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を留去した後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフ、Ｍｅｒｃｋ社製Ａｒｔ．５７４４  展開溶媒  トルエン：アセトン＝２：１）により精製しＭＥ−２６５を２０．３ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  スペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：  δ  ｐｐｍ（積分，多重度，結合定数  Ｊ（Ｈｚ））：０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．１７−１．２１（１Ｈ，ｍ），１．２４−１．３６（２Ｈ，ｍ），１．４２−１．５２（３Ｈ，ｍ），１．６１−１．６６（３Ｈ，ｍ），１．７４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），１．８９−１．９６（１Ｈ，ｍ），２．００（３Ｈ，ｓ），２．４１−２．４７（１Ｈ，ｍ），２．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．９Ｈｚ），２．５１−２．５８（１Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．７，１３．９Ｈｚ），２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．１Ｈｚ），２．７２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，５．９Ｈｚ），３．５１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．４，８．４Ｈｚ），３．７５−３．８０（１Ｈ，ｍ），４．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１０．６Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．０Ｈｚ），５．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，１５．０Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１５．０Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），６．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６，１５．０Ｈｚ）
この結果、ｐｌｄＢ破壊株であるＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株はプラジエノライドＢを生産せずに、ＭＥ−２６５を生産していることが確認された。すなわち、上記方法により、ＭＥ−２６５を製造、取得することができた。
実施例１３：プラジエノライドの７位アシル化酵素遺伝子（ｐｌｄＣ）破壊株の作製
実施例９で決定されたプラジエノライドの生合成に関連するＤＮＡを含む約７５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）より、図１に示された生合成経路でプラジエノライドが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちの７位アシル化酵素遺伝子ｐｌｄＣのみを破壊することで、プラジエノライドの７位脱アシル体（プラジエノライドＢ１２）を生産する株を取得可能と考え、以下の方法でｐｌｄＣ破壊株を作製した。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、それぞれ、以下の配列番号１８、２２、２３および２４に示す塩基配列からなる４種のプライマー、即ち、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ、ｐｌｄＣ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ、ｐｌｄＣ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦおよびｐｌｄＣ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを合成した。
ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴＡＣＣＴＣＴＡＣＧＡＧＴＡ−３’（配列番号１８）
ｐｌｄＣ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＡ−３’（配列番号２２）
ｐｌｄＣ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３Ｆ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＣＣＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴ−３’（配列番号２３）
ｐｌｄＣ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号２４）
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
0004599357.tif 000016
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ４分）      ３０サイクル
６８℃  ５分
この反応の結果、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２ＦとｐｌｄＣ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６４７５６から塩基６７２２０を含む約２．５ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｌ２）が増幅され、ｐｌｄＣ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦとｐｌｄＣ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６８１０６から塩基７１１１２を含む約３．０ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｒ２）が増幅された。ＤＮＡ断片Ｌ２及びＲ２をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片Ｌ２及びＲ２と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した２．３ｋｂのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｐＨＰ４５ｏｍｅｇａｈｙｇ：Ｇｅｎｅ  １９０，３１５−３１７，１９９７由来。以下ｈｙｇと略記することがある）、及び制限酵素ＢａｍＨＩで消化したシャトルベクターｐＫＵ２５３（図３参照）、の計４者をＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（宝酒造社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片Ｌ２とＲ２の間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入された形の約７．８ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＫＵ２５３に挿入された約２３．８ｋｂのプラスミドｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２が構築された。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２を、接合大腸菌Ｓ１７−１へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍｌに植菌し、３６℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。
得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２形質転換株を得た。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。ｐＫＵ２５３−Ｌ２−ｈｙｇ−Ｒ２形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。ハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。
培養後、ハイグロマイシンＢ耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｐｌｄＣ遺伝子内の８８６ｂｐ（配列番号１の塩基６７２２１から塩基６８１０５）を欠失し、その間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入されたｐｌｄＣ破壊株であり、Ｍｅｒ−１１１０７ｐｌｄＣ：：ｈｙｇ株とした。
実施例１４：プラジエノライドの７位アシル化酵素遺伝子（ｐｌｄＣ）破壊株のプラジエノライド生産性試験
実施例１３で得られたＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＣ：：ｈｙｇ株の凍結種母２００μｌを、種母培地（溶性でんぷん２％、エスサンミート２％、酵母エキス０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３０．３％  ｐＨ無調整）２０ｍｌに植菌し、２５℃で２日間培養した。
得られた種母培養液の３００μｌを、本培養培地（スタビローズ５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、β−シクロデキストリン２％、ＣａＣＯ３  ０．１％ｐＨ７．５）３０ｍｌに植菌し、２５℃で４日間および５日間培養した。
培養終了後、得られた培養液２５ｍｌに同量のアセトニトリルを加えて抽出した。その抽出液の一部を分取しアセトニトリルで５倍量に希釈し、下記の条件にてＨＰＬＣでプラジエノライドＢ及びプラジエノライドＢ１２の量を測定した。測定結果を表３に示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相（容量％）：４５％〜５５％  メタノール（０〜５分）
５５％        メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％  メタノール（１３〜１７分）
７０％          メタノール（１７〜３５分）
４５％          メタノール（３５〜４０分）
流速：１．２ｍｌ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：３５分
保持時間：プラジエノライドＢ１２；１６分、プラジエノライドＢ；１２分
【表３】
0004599357.tif 000017
実施例１５：プラジエノライドＢ１２の単離精製と構造確認
実施例１４で得られたアセトニトリル抽出液をろ過し、更に水１０ｍｌ及びアセトニトリル１０ｍｌにて洗浄した。ろ液を酢酸エチル４０ｍｌにて抽出し、有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣９１．４ｍｇをＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー、Ｍｅｒｃｋ社製Ａｒｔ．５７４４  展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１０：５０）にて精製し、プラジエノライドＢ１２（Ｒｆ＝０．４６，３．１ｍｇ）を得た。
１．分子量：４７８，ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５０１（Ｍ＋Ｎａ）＋，４７７（Ｍ−Ｈ）−
２．１Ｈ−ＮＭＲ  スペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：  δ  ｐｐｍ（積分，多重度，結合定数  Ｊ（Ｈｚ））：０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１６−１．２６（２Ｈ，ｍ），１．２７−１．３６（１Ｈ，ｍ），１．４１−１．６７（７Ｈ，ｍ），１．７４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），２．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１４．２Ｈｚ），２．４４−２．５８（２Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，１４．１Ｈｚ），２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．２Ｈｚ），２．７２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．３，６．０Ｈｚ），３．５１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．４，８．６Ｈｚ），３．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ），３．７２−３．７９（１Ｈ，ｍ），５．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，１５．１Ｈｚ），５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，１５．０Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１５．１Ｈｚ），６．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），６．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，１５．１Ｈｚ）
0004599357.tif 000018
この結果、ｐｌｄＣ破壊株であるＭｅｒ−１１１０７ｐｌｄＣ：：ｈｙｇ株は、プラジエノライドＢを生産せずにプラジエノライドＢ１２を生産していることが確認された。すなわち、上記方法によりプラジエノライドＢ１２を製造、取得することができた。
実施例１６：プラジエノライドの１８，１９位エポキシ化酵素遺伝子（ｐｌｄＤ）破壊株の作製
実施例９で決定されたプラジエノライドの生合成に関連するＤＮＡを含む約７５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）より、図１に示された生合成経路でプラジエノライドが生合成されることが明らかとなった。そこで、１８，１９位エポキシ化酵素遺伝子（ｐｌｄＤ）を破壊し、その下流の７位アシル化酵素遺伝子（ｐｌｄＣ）の発現を抑えることで、プラジエノライドの７位脱アシル、１８，１９位オレフィン体（プラジエノライドＺ）を生産する株を取得可能と考え、以下の方法でｐｌｄＤ破壊株を作製した。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、それぞれ、以下の配列番号２５、２６、２７および２８に示す塩基配列からなる４種のプライマー、即ち、ｐｌｄＤ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ、ｐｌｄＤ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ、ｐｌｄＤ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦおよびｐｌｄＤ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを合成した。
ｐｌｄＤ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣ−３’（配列番号２５）
ｐｌｄＤ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＴ−３’（配列番号２６）
ｐｌｄＤ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３Ｆ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴ−３’（配列番号２７）
ｐｌｄＤ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号２８）
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
0004599357.tif 000019
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ４分）      ３０サイクル
６８℃  ５分
この反応の結果、ｐｌｄＤ−Ｌ−Ｂｇｌ２ＦとｐｌｄＤ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６５７００から塩基６８３６８を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｌ３）が増幅され、ｐｌｄＤ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦとｐｌｄＤ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６９５１４から塩基７１９５１を含む約２．４ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｒ３）が増幅された。ＤＮＡ断片Ｌ３及びＲ３をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片Ｌ３及びＲ３と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した２．３ｋｂのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｐＨＰ４５ｏｍｅｇａｈｙｇ：Ｇｅｎｅ  １９０，３１５−３１７，１９９７由来。以下ｈｙｇと略記することがある）、及び制限酵素ＢａｍＨＩで消化したシャトルベクターｐＫＵ２５３（図３参照）、の計４者をＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（宝酒造社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片Ｌ３とＲ３の間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入された形の約７．４ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＫＵ２５３に挿入された約２３．４ｋｂのプラスミドｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３が構築された。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３を、接合大腸菌Ｓ１７−１へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍｌに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。
得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３形質転換株を得た。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。ｐＫＵ２５３−Ｌ３−ｈｙｇ−Ｒ３形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。ハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。
培養後、ハイグロマイシンＢ耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｐｌｄＤ遺伝子内の１１４６ｂｐ（配列番号１の塩基６８３６９から塩基６９５１３）を欠失し、その間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入されたｐｌｄＤ破壊株であり、Ｍｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＤＣ：：ｈｙｇ株とした。
実施例１７：プラジエノライドの１８，１９位エポキシ化酵素遺伝子（ｐｌｄＤ）破壊株のプラジエノライド生産性試験
実施例１６で得られたＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＤＣ：：ｈｙｇ株の凍結種母２００μｌを、種母培地（溶性でんぷん２％、エスサンミート２％、酵母エキス０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３０．３％  ｐＨ無調整）２０ｍｌに植菌し、２５℃で２日間培養した。
得られた種母培養液の３００μｌを、本培養培地（スタビローズ５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、β−シクロデキストリン２％、ＣａＣＯ３０．１％ｐＨ７．５）３０ｍｌに植菌し、２５℃で４日間および５日間培養した。
培養終了後、得られた培養液２０ｍｌに同量のアセトニトリルを加えて抽出した。その抽出液の一部を分取しアセトニトリルで５倍量に希釈し、下記の条件にてＨＰＬＣでプラジエノライドＢ及びプラジエノライドＺの量を測定した。測定結果を表４に示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相（容量％）：４５％〜５５％  メタノール（０〜５分）
５５％          メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％  メタノール（１３〜１７分）
７０％          メタノール（１７〜３５分）
４５％          メタノール（３５〜４０分）
流速：１．２ｍｌ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：３５分
保持時間：プラジエノライドＺ；２０分、プラジエノライドＢ；１２分
【表４】
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実施例１８：プラジエノライドＺの単離精製と構造確認
実施例１７で得られたアセトニトリル抽出液をろ過し、更に水１０ｍｌ及び酢酸エチル１０ｍｌにて洗浄した。ろ液に飽和食塩水４０ｍｌ及び酢酸エチル９０ｍｌを加え抽出し、飽和食塩水５０ｍｌにて洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー、Ｍｅｒｃｋ社製Ａｒｔ．５７４４  展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１０：５０）にて精製し、プラジエノライドＺ（Ｒｆ＝０．５９，２２．８ｍｇ）を得た。
１．分子量：４６２，ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８５（Ｍ＋Ｎａ）＋，４６１（Ｍ−Ｈ）−
２．１Ｈ−ＮＭＲ  スペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：  δ  ｐｐｍ（積分，多重度，結合定数  Ｊ（Ｈｚ））：０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．０１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１７−１．３７（３Ｈ，ｍ），１．４９−１．６７（４Ｈ，ｍ），１．７３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），２．０４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８，６．８Ｈｚ），２．０７−２．１５（１Ｈ，ｍ），２．２３−２．３１（１Ｈ，ｍ），２，４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．３，１４．１Ｈｚ），２．５０−２．５９（１Ｈ，ｍ），２．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４，１４．１Ｈｚ），３．１６−３．２２（１Ｈ，ｍ），３．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ），３．７２−３．７９（１Ｈ，ｍ），５．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），５．１７−５．４３（３Ｈ，ｍ），５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，１５．０Ｈｚ），５．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，１５．１Ｈｚ），６．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），６．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，１５．１Ｈｚ）
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この結果、ｐｌｄＤ破壊株であるＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＤＣ：：ｈｙｇ株は、プラジエノライドＢを生産せずにプラジエノライドＺを生産していることが確認された。すなわち、上記方法によりプラジエノライドＺを製造、取得することができた。
【図１】
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【図２】
0004599357.tif 000029
【図３】
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【配列表】
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