(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−６レセプターに対する抗体を含んでなる、筋蛋白分解抑制剤。
【請求項２】
インターロイキン−６レセプターに対する抗体が、インターロイキン−６の生物学的活性を阻害する抗体であることを特徴とする、請求項１の筋蛋白分解抑制剤。
【請求項３】
インターロイキン−６レセプターに対する抗体がヒトインターロイキン−６レセプターを認識することを特徴とする、請求項１の筋蛋白分解抑制剤。
【請求項４】
インターロイキン−６レセプターに対する抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１ないし３の筋蛋白分解抑制剤。
【請求項５】
インターロイキン−６レセプターに対する抗体がMR16-1抗体であることを特徴とする請求項４の筋蛋白分解抑制剤。
【請求項６】
インターロイキン−６レセプターに対する抗体がPM-1抗体であることを特徴とする請求項４の筋蛋白分解抑制剤。
【請求項７】
インターロイキン−６レセプターに対する抗体がヒト型化PM-1抗体であることを特徴とする請求項４の筋蛋白分解抑制剤。
【請求項８】
筋蛋白分解が、癌悪液質、敗血症、重度外傷または筋ジストロフィーの際に生ずることを特徴とする請求項１ないし７の筋蛋白分解抑制剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はインターロイキン−６レセプター（IL-6R）に対する抗体（抗IL-6R抗体）を含んで成る、筋蛋白分解抑制剤に関する。
背景技術
IL-6は、Ｂ細胞刺激因子２あるいはインターフェロンβ２と呼称された、サイトカインである。IL-6は、Ｂリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Hirano,T.ら、Nature 324,73-76,1986）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼすことが明らかとなった（Akira,S.ら、Adv.in Immunology 54,1-78,1993）。
IL-6は多機能性を有するサイトカインで、免疫、血液、急性期反応等の様々な段階で作用し〔Taga,T.ら、Critical Reviews in Immunol.1992;11:265-280.〕、多発性骨髄種の増殖因子として作用するに加え種々の疾患、例えば、リウマチ〔Hirano,T.ら、Eur J Immunol.1988;18:1797-1801;Houssiau,F.A.らArth Rheum.1988;31:784-788.〕Castleman’s disease〔Yoshizaki,K.らBlood 1989;74:1360-1367;Brant,S.J.らJ Clin Invest.1990;86:592-599.〕のようなプラズマサイト−シスがみられる病気、あるいはメサンギウム細胞増殖性腎炎〔Ohta,K.らClin Nephrol.（Germany）1992;38:185-189;Fukatsu,A.らLab Invest.1991;65:61-66;Horii,Y.らJ Immunol.1989;143:3949-3955.〕、腫瘍増殖に伴う悪液質〔Strassmann,G.らJ Clin Invest.1992;89:1681-1684.〕などにも関与することが報告されている。
遺伝子操作によってヒトIL-6（hIL-6）を過剰発現させたH-2Ld hIL-6トランスジェニックマウス（IL-6 Tgm）ではIgG1プラズマサイト−シス、メサンギウム増殖性腎炎、貧血、血小板減少症、自己抗体の出現などが観察され〔宮井達也ら：第21回日本免疫学会発表「H-2Ld hIL-6トランスジェニックマウスの加齢に伴う血液および血清学的変化」：1991〕、IL-6の多彩な疾患に対する関与が示唆された。
また、in vitroにおいて筋芽細胞に対しIL-6が筋蛋白分解促進作用を有することが、知られている（Ebisui,T.らClinical Science,1995;89:431-439.）。
しかしながら、インターロイキン−６レセプターに対する抗体が、筋蛋白質の分解を抑制することにおいて有効であることはこれまで知られておらず、また、そのような試みもなされていなかった。
発明の開示
本発明は、筋蛋白質の分解を抑制する薬剤を提供しようとするものである。より詳しくは、IL-6レセプター抗体を含んで成る、筋蛋白分解抑制剤を提供するものである。
癌悪液質、敗血症、重度外傷または筋ジストロフィー等に罹患すると、骨格筋蛋白の分解が進み、筋重量の低下が認められる。これまで、これらの疾患時の筋蛋白分解抑制剤としては、対症療法的な処置がとられているにすぎず、根本的な治療法は確立されていなかった。
本発明者らは、骨格筋蛋白の分解におけるIL-6レセプター抗体の及ぼす効果について鋭意検討を重ねた結果、IL-6レセプター抗体が筋蛋白分解を促進する蛋白分解酵素系の発現およびその活性を抑制することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、IL-6レセプター抗体を含んで成る、筋蛋白分解抑制剤に関する。
【図面の簡単な説明】
図１はコントロールマウスから得られた腓腹筋組織片におけるカテプシンＢの免疫組織染色像（400倍）を示す写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
図２はPBSを投与したIL-6トランスジェニックマウスの腓腹筋組織片のカテプシンＢの免疫組織染色像（400倍）を示す写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
図３は抗IL-6レセプター抗体を投与したIL-6トランスジェニックマウスの腓腹筋組織片のカテプシンＢの免疫組織染色像（400倍）を示す写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
図４はコントロールマウスから得られた腓腹筋組織片におけるカテプシンＬの免疫組織染色像（400倍）を示す写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
図５はPBSを投与したIL-6トランスジェニックマウスの腓腹筋組織片のカテプシンＬの免疫組織染色像（400倍）を示す写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
図６は抗IL-6レセプター抗体を投与したIL-6トランスジェニックマウスの腓腹筋組織片のカテプシンＬの免疫組織染色像（400倍）を示す写真であり、生物の形態を表わす図面代用写真である。
図７はコントロールマウス（Ａ）、PBSを投与したトランスジェニックマウス（Ｂ）およびIL-6レセプター抗体を投与したトランスジェニックマウス（Ｃ）の腓腹筋由来RNAに対し、ポリユビキチンのcDNAをプローブとしたノザンハイブリダイゼーションを示し、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
図８はコントロールマウス（Ａ）、PBSを投与したトランスジェニックマウス（Ｂ）およびIL-6レセプター抗体を投与したトランスジェニックマウス（Ｃ）の腓腹筋由来RNAに対し、モノユビキチンのcDNAをプローブとしたノザンハイブリダイゼーションを示し、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
図９は、実験17日目のマウスの腫瘍重量を含む体重を示すグラフである。
図10は、実験17日目のマウスの腫瘍重量を含まない体重（carcass weight）を示すグラフである。
図11は、実験17日目のマウスの腓腹筋重量を示すグラフである。
図12は、実験17日目のマウス腓腹筋のカテプシンＢ活性を示すグラフである。
図13は、実験17日目のマウスの腓腹筋のカテオウシンＢ＋Ｌ活性を示すグラフである。
具体的な説明
本発明の筋蛋白分解抑制剤は、IL-6により誘導または増強される蛋白分解酵素系の発現および活性を低下させることにより、骨格筋の分解を抑制し、筋重量の低下を防止するものである。ここに述べる蛋白分解酵素系とは、カテプシンＢまたはＬ、ユビキチン等のリソソーマル、非リソソーマル系の蛋白分解径路を指す。
本発明の筋蛋白分解抑制剤により、筋蛋白分解が抑制され、筋重量の低下が防止される疾患として、癌悪液質、敗血症、重度外傷または筋ジストロフィー等が挙げられる。
本発明で使用されるIL-6レセプター抗体は、IL-6によるシグナル伝達を遮断し、IL-6の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来および種類（モノクローナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。この抗体はIL-6Rと結合することにより、IL-6とIL-6Rの結合を阻害して、IL-6のシグナル伝達を遮断し、IL-6の生物学的活性を阻害する抗体である。
モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。
このようなIL-6レセプター抗体としては、特にMR16-1抗体（Tamura,T.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,11924-11928,1993）、PM-1抗体（Hirata,Y.ら、J.Immunol.143,2900-2906,1989）などが好ましい。
モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、IL-6Rを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
より具体的には、モノクローナル抗体を作成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗原としては、欧州特許出願公開番号EP325474号に開示されたヒトIL-6Rの遺伝子配列を用いることによって得られる。ヒトIL-6Rの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のIL-6Rタンパク質を精製し、この精製IL-6Rタンパク質を感作抗原として用いればよい。
また、マウス由来の前記感作抗原としては、日本特許出願公開番号特開平3-155795に開示されたマウスIL-6Rの遺伝子配列を用い、上記ヒトIL-6Rの遺伝子配列を用いたのと同様な方法にしたがえばよい。
IL-6Rは細胞膜上に発現しているものの他に細胞膜より離脱している可能性のもの（sIL-6R）が抗原として使用できる。sIL-6Rは細胞膜に結合しているIL-6Rの主に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型IL-6Rと異なっている。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J.Immunol.123:1458,1978）,P3-U1（Current Topics in Micro-biology and Immunology 81:1-7,1978）,NS-1（Eur.J.Immunol.6:511-519,1976）,MPC-11（Cell,8:405-415,1976）:SP2/0（Nature,276:269-270,1978）,FO（J.Immunol.Meth.35:1-21,1980）,S194（J.Exp.Med.148:313-323,1978）,R210（Nature,277:131-133,1979）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Milsteinら、Methods Enzymol.73:3-46,1981）等に準じて行うことができる。より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、この他、その種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000−6000程度のPEG溶液を通常、30−60％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノブリテンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が行われる。
このようにして作成されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られる抗体産生細胞あるいはこれを細胞融合させて生ずるハイブリドーマから得られるものだけでなく、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを公知の細胞株、例えば、COS、CHO細胞に導入し、遺伝子組換技術を用いて産生させたモノクローナル抗体を用いることができる（例えば、Vandamme,A-Mら、Eur.J.Biochem.,192,767-775,1990参照）。
さらに、前記の方法により得られるモノクローナル抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニテイークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高純度に精製することができる。このようにして、作成されるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA,ELISA）、蛍光抗体法（Immunofluorescence Analysis）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度で認識することを確認することができる。
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものであってよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。
さらに、再構成（reshaped）したヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができる。
なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（FR）領域のアミノ酸を置換してもよい（Satoら、Cancer Res.53:1-6,1933）。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化PM-1（hPM-1）抗体が好ましく例示される（国際特許出願公開番号WO92-19759を参照）。
さらには抗原に結合し、IL-6の活性を阻害するかぎり抗体の断片、たとえばFabあるいはFv,Ｈ鎖とＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる。（例えば、Birdら、TIBTECH,9:132-137,1991;Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,5879-5883,1988を参照）。さらに、scFvを作成するために用いるＨ鎖およびＬ鎖のFvには、上記再構成された抗体のＶ領域を用いることができる。
本発明のIL-6レセプター抗体を含んで成る筋蛋白分解抑制剤は、IL-6のシグナル伝達を遮断し、筋蛋白の分解を呈する疾患に有効である限り、本発明において使用することができる。本発明の予防治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとることができる。
本発明の予防治療剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、およそ１−1000mg／患者の範囲で４回以下の分割用量を選択することができる。また、１−10mg／kg／週の用量で投与することができる。しかしながら、本発明の予防治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の予防治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製されたIL-6R抗体を溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、Tween80、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（HSA）などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
実施例
以下、参考例および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１． B6Ld-IL-6トランスジェニックマウスの作製
H-2Ldプロモーターと融合したヒトIL-6cDNAを含有する3.3kbのSph1-Xho1断片（Ld-IL-6）（Suematsuら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,7547,1989）を、Yamamuraら、J.Biochem.96,357,1984に記載されている方法に従って、C57BL/6J（B6）マウス（日本クレア）からの受精卵の前核にマイクロインジェクションにより注入した。
前記トランスジーンの導入を、プローブとしてヒトIL-6cDNAの32Ｐ−標識化TaqI-BanII断片を用いて、EcoRI−消化尾部DNAのサザンブロット分析によりスクリーニングした。TaqDNAポリメラーゼ及びヒトIL-6cDNAについて特異的な２種のプライマー、CHIL6P5（5’-ACCTCTTCAGAACGAATTGACAAA-3’）（配列番号：１）及びCHIL6P7i（5’-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGT-3’）（配列番号：２）を用いて、尾部DNAのPCR分析によりトランスジェニックマウスを同定することによりトランスシェーンを検出した。これらのトランスジェニックマウスにおいて、ヒトIL-6特異的ELISA（T.Matsudaら、Eur.J.Immunolo.18,951-956,1988）により測定した血清IL-6濃度は12週齢の後600pg／mlより高かった。
参考例２． ラット抗IL-6R抗体の調製
マウス可溶性IL-6R生産性CHO細胞をSaitoら、J.Immunol.147,168-173,1991に記載されているようにして調製した。この細胞を、５％ウシ胎児血清（FBS）を含有するαMEM中で37℃にて、空気中５％CO2の加湿雰囲気下で培養した。馴化（conditioned）培地を回収し、そしてマウスsIL-6R調製物として使用した。培地中のマウスsIL-6Rの濃度は、サンドイッチELISAにより、モノクローナル抗マウスIL-6R抗体RS15（Saitoら、J.Immunol.147,168-173,1991）及びラビットポリクローナル抗−マウスIL-6R抗体を用いて測定した。
マウスsIL-6RをマウスsIL-6R調製物から、モノクローナル抗マウスIL-6R抗体（RS12）を吸着させたアフィニテイーカラムにより精製した。フロインドの完全アジュバント中50μｇの精製マウスsIL-6RによりWisterラットを皮下注射免疫し、次に２週間後から１週間に１回、フロインドの不完全アジュバント中50μｇのマウスsIL-6Rにより４回皮下に追加免疫した。最後の追加免疫から１週間後、ラットに100μｌのリン酸緩衝液（PBS）中50μｇのマウスsIL-6Rを静脈内投与した。
３日後にラットより脾臓を摘出し、そしてポリエチレングリコール（ベーリンガーマンハイム）を用いて、ラットの脾細胞とマウスp3U1ミエローマ細胞とを10：１の比で融合処理した。96−ウエルプレート（Falcon3075）のウエル中37℃にて、10％FBSを含有するRPMI1640培地100μｌ中で一夜インキュベートした後、ヒトIL-6を含有するヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（HAT）含有培地100μｌを各ウエルに添加した。４日間にわたり毎日、培地の半分をHAT培地により置換した。
７日後、抗マウスsIL-6Rを産生するハイブリドーマをマウスsIL-6R−結合アッセイ（ELISA）により選択した。要約すれば、ハイブリドーマの培養上清100μｌを60分間、ラビットポリクローナル抗−ラットIgG抗体を１μｇ／mlでコートしたプレート中でインキュベートした。プレートを洗浄し、そして100μｇ／mlのマウスsIL-6Rと共にインキュベートした。洗浄後、ラビットポリクローナル抗−マウスIL-6R抗体を２μｇ／mlで加え、そしてプレートを洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ−結合ヤギポリクローナル抗−ラビットIgG抗体（Tago）と共に60分間インキュベートした。
最後に、洗浄後、プレートを、アルカリホスファターゼの基質（Sigma 104；ｐ−ニトロフェニルホスフェート）と共にインキュベートし、そして405nmにてプレートリーダー（東ソー）を用いて読み取った。マウスsIL-6Rを認識するハイブリドーマを限界希釈法により２回クローニングした。腹水の作製のため、BALB/c nu/nuマウスに0.5mlのプリスタンを２回注射し、そして３日後に３×106個の樹立されたハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。10〜20日後に腹水を集め、そして腹水からプロテインＧカラム（Oncogene Science）を用いてモノクローナル抗体MR16-1を精製した。
MR16-1により生産された抗体のIL-6に対する中和効果を、MH60.BSF2細胞（Matsudaら、Eur.J.Immunol.18:951-956,1988）による3Ｈ−チミジンの取り込みにより試験した。MH60.BSF2細胞を96−ウエルプレートに１×104細胞／200μｌ／ウエルの量で分配し、マウスIL-6（10pg／ml）とMR16-1又はRS12抗体とをウエルに加え、そして細胞を37℃にて５％CO2中で44時間培養した。次に、各ウエルに3Ｈ−チミジン（１mci／ウエル）を加え、４時間後に3Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。
実施例１
実験１．
前記のようにして作製したトランスジェニックマウスを、12時間−明／12時間−暗の光条件下で空調室中で個別にケージに入れ、そして日本クレアからの標準実験室餌CE-2を自由に摂取させることにより飼育した。対象として、正常C57BL/6Jマウスを上記と同一の条件下で飼育した。マウスを３群用意し、対照群として上記正常マウス６匹（Ｃ−１〜Ｃ−６＝雌性）を使用し、試験群として上記トランスジェニックマウス６匹（Ａ−１〜Ａ−４＝雌性；Ａ−５、Ａ−６＝雄性）を使用し、そして比較群として上記トランスジェニックマウス５匹（Ｐ−１〜Ｐ−４＝雌性；Ｐ５＝雄性）を使用した。
試験群には、４週齢まで飼育した後、５週齢において２mg／マウスとなるように参考例２に記載のIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体MR16-1を静脈内投与し、第６週齢〜第14週齢において、100μｇ／マウスとなるように上記マウスモノクローナル抗体MR16-1を週２回づつ皮下投与した。15週齢においてマウスの体重を測定した後マウスを解剖して腓腹筋及び肝臓を摘出して重量を測定し、腓腹筋については重量測定後液体窒素中で急速凍結した。比較群においては、抗体の代りに同体積のリン酸緩衝液（PBS）を投与したほかは試験群と同時に管理した。対照群には抗体及びPBSのいずれも投与しなかった。
結果は次の表１に示す通りであった。
0004540132.tif 000002
比較群は、対照群より体重が増加していたにも係わらず、腓腹筋重量が減少しており、筋萎縮が観察された。また、肝重量の増加も認められた。一方、試験群では、これらの変化は認められず、いずれの項目も対照群とほぼ同じ結果であった。
実験２．
実験１と同様の飼育管理を行った。対照群として前記の正常マウス６匹（Ｃ−１〜Ｃ−６＝雌性）、試験群として前記トランスジェニックマウス５匹（Ａ−１〜Ａ４＝雌性；Ａ５＝雄性）を使用し、そして比較群として前記トランスジェニックマウス５匹（Ｐ−１〜Ｐ−４＝雌性；Ｐ−５＝雄性）を使用した。実験１と同様にして16週齢に得られたマウス腓腹筋をホモジネーション溶液（250mMシュークロース、２mMEGTA、２mMEDTA、20mMTris-HCl、pH7.4）により２回洗浄し、さらに0.2％のTriton-X100を含有する上記ホモジネーション溶液１ml中でポリトロンホモジナイザーおよび超音波処理によりホモジナイズし、細胞溶解した。
得られたホモジネートを18,000Ｇにて15分間遠心分離した。上清を同じ量のグリセロールに対して希釈し、そして分析するまで−40℃にて貯蔵した。Barrettらの方法（Barrett,A.J.ら、Methods Enzymol.,80,535-561,1976）に従って、10μＭ Z-Arg-Arg-MCAを基質として用いてpH6.0にてカテプシンＢ活性を測定した。別途、ブランクサンプルを得るため、前記抽出物を１μＭのE-64（Ｌ−３−カルボキシ−トランス−２，３−エポキシプロピオニル−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン）（Protein Research Foundation,大阪）と共に37℃にて５分間インキュベートしてカテプシンＢ活性を阻害した。
カテプシンＢ＋Ｌ活性は、カテプシンＢの活性測定と同様にして、但し基質Z-Phe-Arg-AMCを用いて測定した。この基質はカテプシンＬによってのみならずカテプシンＢによっても加水分解されるので、その加水分解はカテプシンＢ＋Ｌ活性として示される。抽出物の蛋白質濃度は、Bradfordの方法（Bradford,M.M.,Anal.Biochem.72,248-254,1976）により測定した。
各動物について、上記の測定におけるAMCの生成速度（n mol AMC／ml・時）を蛋白質の濃度（mg／ml）で除すことにより比活性（n mol AMC／mg蛋白質・時）を算出した。その結果を表２及び表３に示す。
0004540132.tif 000003
0004540132.tif 000004
比較群では、カテプシンＢおよびカテプシンＢ+Ｌの比活性が著しく上昇していたが、試験群では対照群と同定度の活性しか認められなかった。
実験３．
実験１と同様にして飼育管理を行い、同様にして腓腹筋を得、該腓腹筋の４μｍの厚さの凍結横断切片を切り出し、そしてポリ−Ｌ−リジンをコートしたスライドガラス上に載置した。１つのスライドはヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。
他のスライドにおいては、0.3％（ｖ／ｖ）過酸化水素を含有する0.1％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド中で20分間、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした後、３％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清により20分間処理して非特異的結合をブロックした。これらの切片を、精製したラットカテプシンＢに対するラビット抗体（Kominami,E.ら、J.Biochem.98,87-93,1985）（２μｇ／ml）、及びラットカテプシンＬに対するラビット抗体（Banco,Y.ら、J.Biochem.100,35-42,1986）（10μｇ／ml）と共に４℃にて湿室中で一夜インキュベートした。
PBS中で洗浄した後、ビオチンを結合させたマウス抗−ラビット免疫グロブリン（Histofine SAB-POキット、ニチレイ株式会社）を添加し、そしてスライドを室温にて20分間インキュベートした。PBS中で十分に洗浄した後、パーオキシダーゼを結合したストレプトアビジンを添加し、そしてスライドを再度20分間インキュベートした。
免疫染色物を、0.05M Tris-HCl（pH7.6）中0.02％（ｗ／ｖ）の３，３′−ジアミノベンジジン及び0.03％（ｖ／ｖ）の過酸化水素により３分間反応させた後、発色させた。各染色試験において、正常ヤギ血清を用いる陰性対照を含めた。結果を図1〜6図に示す。IL-6トランスジェニックマウスでは、カテプシンＢおよびＬが強く染色された。一方、IL-6レセプター抗体を投与したトランスジェニックマウスでは、カテプシンＢおよびＬの発現が抑制された。
実験４．
実験１と同様の飼育管理を行った。対照群として前記正常マウス10匹を用い、そして試験群として前記トランスジェニックマウス10匹を用いた。腓腹筋から、Chirgwin,J.M.ら、Biochemistry 18,5291-5301,1979の方法によりチオシアン酸グアニジンを用いて全RNAを抽出し、そして260nmでの吸光度により定量した。
10μｇのRNAサンプルをフォルムアルデヒドを含む1.0％アガロースゲル中での電気泳動にかけ、そして20×標準食塩クエン酸塩溶液（SSC：0.15Ｍ Nacl及び15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）を用いて、RNAをハイボンドナイロンメンブレン（アマシャム）に一夜ブロットした。ゲル及びフィルター中のRNAをエチジウムブロマイドにより可視化し、UVトランスイルミネーションにより写真を撮ることにより等量のRNAが転写されたことを確認した。
ポリユビキチン（poly-Ub）をコードするcDNA及びモノユビキチン（mono-Ub）をコードするcDNA（Kanayama,H.ら、Cancer Res.,51,6677-6685,1991）を用いて、ランダムプライマー法により放射能ラベルされたプローブを調製した。前記のメンブレンを１時間プレハイブリダイズさせた後、Church緩衝液を用いて、前記プローブと一夜ハイブリダイズさせた。フィルターをコダックXAR-5フィルムに、強化スクリーンを用いて−80℃にて１〜３日間暴露し、そしてMCIDシステム（Lmaging Research Inc.,カナダ、オンタリオ）を用いてデンシトメーターによりフィルム上の像を定量した。この結果を図７および８図に示す。poly-Ubおよびmono-UbともにトランスジェニックマウスにてRNAの発現が増強しており、IL-6レセプター抗体を投与した群ではRNAの発現が抑制された。
実施例２
colon26担癌マウスにおけるIL-6レセプター抗体の筋蛋白分解抑制効果を検討した。マウスは６週齢の雄性BALB/cを用い、実験開始日にcolon26をマウスの側背部皮下に移植した。マウスIL-6レセプター抗体MR16-1（参考例２参照）は、実験開始日のcolon26移植後、４，６，８，10，12，14および16日目に0.5mg／マウスを皮下投与した（ｎ＝６）。この方法では、異種蛋白のラット抗体に対する中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認している。なお、担癌コントロール群（ｎ＝７）および非担癌コントロール群（ｎ＝７）共に、ラットIgG1（KH5）を同様のスケジュールで投与した。
実験開始17日に腫瘍重量を含む体重、腫瘍重量を含まない体重（carcass weight）、および腓腹筋重量を観察し、腓腹筋のカテプシンＢ活性およびカテプシンＢ＋Ｌ活性を測定した。なお、カテプシンＢ活性とカテプシンＢ＋Ｌ活性の測定は、前記実験２と同様に行った。
実験開始17日目の腫瘍重量を含む体重、腫瘍重量を含まない体重および腓腹筋重量を、各々、図９、図10及び図11に示す。IL-6レセプター抗体投与群では、腫瘍重量を含まない体重および腓腹筋重量の減少が抑制された（腫瘍重量を含まない体重については有意差なし）。
実験17日目にカテプシンＢ活性およびカテプシンＢ＋Ｌ活性を、各々、図12及び図13に示す。経時的に観察されるカテプシンＢ活性およびカテプシンＢ＋Ｌ活性の上昇は、IL-6レセプター抗体の投与により抑制された（カテプシンＢ活性については有意差なし）。
産業上の利用可能性
蛋白分解酵素系を介した骨格筋の分解には、IL-6が係わっている。IL-6レセプター抗体による筋蛋白分解抑制作用が認められたことから、本発明は、筋蛋白分解抑制剤としての有用性が示唆された。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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