(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−オキソグルタル酸に対して耐性を示し、有機酸を高生産する新規酵母。
【請求項２】
２−オキソグルタル酸に対して耐性を示し、有機酸を高生産する新規酵母がサッカロミセス・セレビシエに属することを特徴とする請求項１に記載の新規酵母。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の新規酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法。
【請求項４】
汲水の全部あるいは一部に清酒を使用する清酒の製造方法において、請求項１又は２に記載の新規酵母を用いることを特徴とする清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クエン酸シンターゼの阻害剤に耐性を示す新規酵母及び該新規酵母を用いる酒類、食品の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機酸を多く生成する酵母について、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるジメチルサクシネートの感受性酵母（特開平３−１７５９７５号公報）、爽快な酸味を生成する泡なし清酒酵母（特開平５−３１７０３６号公報）、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるテノイルトリフルオロアセトン又はオキシカルボキシン耐性酵母（特開平６−１２１６７０号公報）が知られている。
また、有機酸及び香気成分を多く生成する酵母について、シクロヘキシミド耐性酵母（日本醸造協会誌、第８８巻、第８号、第６４５〜６４７頁、１９９３年）、メタ亜硫酸カリウムに対して馴養により取得した酵母（特開平７−２０３９５１号公報）、シクロヘキシミド耐性酵母にカプロン酸エチル高生産性を付与した多酸性酵母（日本醸造協会誌、第９０巻、第１０号、第７５１〜７５８頁、１９９５年）、アコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質耐性又は基質感受性酵母（特開平１１−４６７５７号）が知られている。
一方、清酒製造工程において汲水の全部あるいは一部に清酒を使用し、清酒醪を十分増殖させた酵母によりアルコール発酵させる清酒醸造法があり、甘口、濃厚芳じゅんな酒質の清酒が得られる（特公昭５３−１９６７８号公報）。この甘口、濃厚芳じゅんな清酒の製造には、甘味とのバランスから多酸性清酒酵母を用いることが良いとされており、有機酸含量が多く、香気が優れ、甘味と酸味のバランスが良い酒質の清酒を製造できる酵母が求められている。しかしながら、従来の多酸性酵母でそのようなバランスの良い酒質の清酒を得る事は容易ではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記した従来技術にかんがみ、有機酸及び香気成分を更に高生産する新規酵母、及び該新規酵母を用いる酒類・食品の製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は２−オキソグルタル酸に対して耐性を示し、有機酸を高生産する新規酵母に関し、第２の発明は、第１の発明の新規酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法に関する。
【０００５】
本発明者らは、有機酸を高生産し、その酸組成にも特徴を有する酵母の取得を目的に、ＴＣＡサイクルに関与する酵素であるクエン酸シンターゼの阻害剤に耐性を示す酵母は、ＴＣＡサイクルによる有機酸生合成のバランスが変化し、有機酸を高生産するのではないかと考えた。本発明においては、クエン酸シンターゼの阻害剤の一つである２−オキソグルタル酸〔丸尾文治、田宮信雄  監修、酵素ハンドブック、第６６６〜６６７頁、１９８３年３月１日、初版、（株）朝倉書店発行〕を含む培地プレートに生育してくる耐性株を分離し、麹汁培養試験を実施して、有機酸を高生産し、酸度が高い株を見出した。更に清酒小仕込試験を実施し、有機酸、特に、リンゴ酸及び／又はコハク酸、並びに高級アルコールを高生産し、アセトアルデヒド及び／又は酢酸エチルを低生産する新規酵母株を得た。また、該新規酵母株を用いて酒類・食品の製造を行い、成分分析及び官能検査により、爽快で口当りの良い従来にない酸味の強い、又は非常に濃厚芳じゅんでかつ甘味と酸味のバランスの良い酒類・食品が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
【０００７】
本発明における親株としては、酵母であればよく特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシエに属する酵母（清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母又はパン酵母等）が酒類・食品の製造には好適である。
また、親株としては、変異処理株の他に野生株、馴養株、交雑株、細胞融合株及びプラスミド等による形質転換株をも含む。変異処理方法としては、酵母に公知の変異誘導方法、例えば、紫外線、放射線を照射させる方法、又はＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等の薬剤を適宜用いることにより行えばよく、有効な変異処理としてはエチルメタンスルホネート処理が好ましい。
【０００８】
酵母に対するクエン酸シンターゼ阻害剤の最小生育阻害濃度については、親株として日本醸造協会７０１号株（以下、Ｋ−７０１と略記する）とクエン酸シンターゼの阻害剤として２−オキソグルタル酸を用いた下記の実験例１で詳しく述べる。
〔実験例１〕
Ｋ−７０１株をＳＤ液体培地〔イーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％〕５ｍｌで一夜振とう培養して、酵母培養液を得た。次に、２−オキソグルタル酸の濃度を０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭに調整したＳＤ平板培地に、前培養したＫ−７０１株を植菌した。植菌後、３０℃で３日間及び７日間培養後生育を観察して、生育の程度〔非常に生育した：（＋＋）、生育した：（＋）、生育しない：（−）〕を調べた。Ｋ−７０１株に対する２−オキソグルタル酸の最小生育阻害濃度の結果を表１に示す。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
表１の結果より、３日目及び７日目供にＫ−７０１株は、２０ｍＭの２−オキソグルタル酸ではコロニーを形成するが、２５ｍＭ以上の２−オキソグルタル酸ではコロニーを形成しない。したがって、本発明においてＫ−７０１株に対する２−オキソグルタル酸の最小生育阻害濃度は、２５ｍＭと決定した。
【００１１】
クエン酸シンターゼの阻害剤に耐性を示し、有機酸を高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母の取得について、親株としてＫ−７０１株、クエン酸シンターゼの阻害剤として２−オキソグルタル酸を用いた下記の検討例１で詳しく述べる。
〔検討例１〕
Ｋ−７０１株をＹＰＤ液体培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）５ｍｌで３０℃にて一夜振とう培養後、遠心分離で集菌し、滅菌水で洗浄した。洗浄菌体を４．３５ｍｌの０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０ｗ／ｖ％グルコース溶液を０．５ｍｌ添加してかくはんした後、エチルメタンスルホネートを０．１５ｍｌ添加して、３０℃にて１時間穏やかに振とうした。振とう後、そのうちの０．２ｍｌを９．８ｍｌの６ｗ／ｖ％チオ硫酸ナトリウム溶液に加えて、室温で１０〜１５分放置後、遠心分離で集菌し、１ｍｌの滅菌水に懸濁した。そして、該懸濁液０．１ｍｌ（４×１０7個／ｍｌ）を２５ｍＭ２−オキソグルタル酸含有ＳＤ平板培地１０枚に植菌した。３０℃、３日間培養後、数百コロニーの耐性株が出現した。その中で、大きいコロニーを形成する２−オキソグルタル酸耐性株４５株を選択し、麹汁培養試験を行い、親株であるＫ−７０１株よりも有機酸の高生産（一般に酵母の場合、滴定酸度が高いと有機酸含量の多いことが知られる）を目的に、滴定酸度が高い４３株を取得した。この４３株のうち、親株に比べて１．２倍以上の滴定酸度を示し有機酸を高生産した株が３１株あり、その中でも８株は、滴定酸度が１．４倍以上と高かった。
【００１２】
検討例１で得られた有機酸を高生産する滴定酸度が親株に比べて１．４倍以上と高い８株のうち、顕著に酸度が高い２ＯＧ−Ｒ４８株、及び２ＯＧ−Ｒ３９株の２株を用いた小仕込試験について、下記の検討例２及び検討例３で詳しく述べる。
〔検討例２〕
有機酸を高生産し顕著に滴定酸度が高い２ＯＧ−Ｒ４８株、及び２ＯＧ−Ｒ３９株の２株を用いて、表２に示す仕込配合で総米４００ｇの清酒小仕込試験を行った。
【００１３】
【表２】
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【００１４】
掛米は精米歩合７８ｗ／ｗ％の白米を使用した。麹は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の白米を使用して製造した。酵母は１０ｍｌ中に２×１０9個含むものを用いた。発酵温度は最高品温１５℃とし、仕込み後１８日目で上槽した。対照株は親株のＫ−７０１株を用いた。上槽液の分析結果を表３に示す。
【００１５】
【表３】
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【００１６】
この結果、２ＯＧ−Ｒ４８株は、親株のＫ−７０１株に比べて、酸度が高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸が約１．４倍高生産であり、不快臭であるアセトアルデヒド、酢酸エチル供に親株より低生産であった。
２ＯＧ−Ｒ３９株は、親株のＫ−７０１株に比べて、酸度が高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸及び旨味を呈するコハク酸が各々約２．７倍、約１．７倍高生産であり、不快臭であるアセトアルデヒド及び酢酸エチルが各々約０．６倍、約０．７倍低生産であった。また、高級アルコールであるｎ−プロパノール、イソブタノール及びイソアミルアルコールが親株に比べて各々約１．２倍、約１．８倍及び約１．３倍高生産であった。
【００１７】
〔検討例３〕
次に、有機酸を高生産し顕著に滴定酸度が高い２ＯＧ−Ｒ４８株、及び２ＯＧ−Ｒ３９株の２株を用いて、汲水の一部に清酒を使用する清酒醸造法（特公昭５３−１９６７８号公報）を行った。仕込配合を表４に示す。
【００１８】
【表４】
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【００１９】
掛米は精米歩合７８ｗ／ｗ％の白米を使用した。麹は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の白米を使用して製造した。留添は醪の最終濃度が９％になるように清酒（アルコール濃度  １５．２ｖ／ｖ％）を６６０ｍｌ添加した。発酵温度は最高品温１５℃とし、仕込み後、醪中の酵母のメチレンブルー染色率が３０％に達した段階で上槽した。対照株は親株のＫ−７０１株を用いた。その上槽液の分析結果を表５に示す。
【００２０】
【表５】
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【００２１】
この結果、２ＯＧ−Ｒ４８株は、親株のＫ−７０１株に比べて、酸度が高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸が約１．５倍高生産であり、不快臭であるアセトアルデヒドが約０．８倍低生産であった。また、高級アルコールであるイソブタノールが約１．２倍高生産であった。
２ＯＧ−Ｒ３９株は、親株のＫ−７０１株に比べて、酸度が高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸及び旨味を呈するコハク酸が各々約１．６倍、約１．８倍高生産であり、不快臭であるアセトアルデヒド及び酢酸エチルが各々約０．６倍、約０．７倍低生産であった。また、高級アルコールであるｎ−プロパノール、イソブタノール及びイソアミルアルコールが親株に比べて各々約１．２倍、約１．７倍及び約１．３倍高生産であった。
【００２２】
以上、検討例２及び検討例３より、本発明で取得した有機酸高生産株は、親株の酵母に比べ、酸度が高く、有機酸組成のバランスに優れ、有機酸を高生産する、特に、嗜好的に好ましいリンゴ酸及び／又はコハク酸、並びに香気成分である高級アルコールを高生産し、更に不快臭であるアセトアルデヒド及び／又は酢酸エチルが低下した新規酵母である。
【００２３】
クエン酸シンターゼ阻害剤の使用量は、阻害剤の種類及び親株酵母の種類に応じて適当な濃度で使用すればよい。
【００２４】
本発明における酒類・食品の製造方法では、クエン酸シンターゼの阻害剤耐性を示し、有機酸を高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する酵母を用いることを特徴とし、製造方法は特に限定されるものではなく、一般的な製造方法を適宜用いることができる。
【００２５】
本発明の新規酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビールの酒類、又はパン等の食品を製造すれば、爽快な口当りや香気の良い酸味が向上した製品を製造することができる。これらの清酒、焼酎、ワイン、ビール又はパン等の原料は特に限定するものではなく、例えば、精白及び／又は未精白の粳米、糯米、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、ヒエ、アワ、コウリャン、ソバ、トウモロコシ、モロコシ、マイロ等の穀類が挙げられるが、一般的な原料を適宜用いることができる。また、本発明の新規酵母を１種類単独又は２種類以上併用して用いてもよく、更に該新規酵母にＫ−７０１株やＫ−７７株等の公知酵母を組合せて酒類・食品を製造できる。更に、該新規酵母又は該公知酵母を用いて製造した酒類・食品を混合して新規の酒類・食品も製造できる。
かくして、本発明により、親株であるＫ−７０１株を用いて、クエン酸シンターゼ阻害剤に対して耐性の形質を有する酵母を選択することによって、有機酸を高生産する、詳細には、酸度が高く、有機酸、特に、リンゴ酸及び／又はコハク酸、並びに高級アルコールを高生産し、アセトアルデヒド及び酢酸エチル低生産の酵母が提供された。
【００２６】
以上の特徴を有するクエン酸シンターゼの阻害剤耐性株として、２−オキソグルタル酸耐性株１株を代表的菌株として寄託した。
【００２７】
本発明の代表的菌株である２ＯＧ−Ｒ３９株は、Saccharomyces cerevisiae２ＯＧ−Ｒ３９と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１７４７０として寄託されている。
【００２８】
本発明の代表的菌株である２ＯＧ−Ｒ３９株は、Ｋ−７０１株の変異株であるが、それらの菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した後、顕微鏡で観察した。
ａ）形：卵円形
ｂ）大きさ：長さ４．７〜７．９μｍ、幅３．８〜５．５μｍ
２．胞子形成：あり
胞子形成用培地（酢酸カリウム２ｗ／ｖ％、グルコース０．０５ｗ／ｖ％及び寒天２ｗ／ｖ％）で３０℃、５日間培養した後、顕微鏡で観察した。
３．増殖の形態：出芽
４．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）をダーラム管入り試験管に分注して、当該菌株を接種し、３０℃で５日間培養して、その炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース    （＋）                  ガラクトース  （＋）
スクロース    （＋）                  マルトース    （＋）
ラクトース    （−）                  メリビオース  （−）
ラフィノース  （＋）
ｂ）糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により、３０℃で１４日間後の生育を観察した。
グルコース  （＋）                  ガラクトース  （＋）
スクロース  （＋）                  マルトース    （＋）
ラクトース  （−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとしてウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色性：赤
ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：（−）
５．高泡の形成
清酒の小仕込みを行ったところ、高泡の形成は観察されなかった。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母であることを示すものである。また、β−アラニン培地、３５℃での生育が陰性、及び清酒の小仕込試験において、高泡の形成も認められないことから、該菌株はＫ−７０１株の変異株であることを示すものである。
【００２９】
６．薬剤に対する感受性
ジメチルサクシネート（１．５ｖ／ｖ％）を含むＹＭ培地（０．３ｗ／ｖ％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．５ｗ／ｖ％ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）を用いて、３０℃で７日間培養した。親株（Ｋ−７０１）と同様に生育してきた株を＋で表した。ジメチルサクシネートに対する感受性の結果を表６に示す。変異株は生育し、感受性を示さなかった。
【００３０】
【表６】
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【００３１】
７．薬剤に対する耐性
シクロヘキシミド（０．５μｇ／ｍｌ）含有ＹＭ培地、テノイルトリフルオロアセトン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、５０％オキシカルボキシンを含有する農薬プラントバックス〔３．２ｍｇ／ｍｌ：日本曹達（株）製〕含有ＹＮＢＣ培地（０．０．６７ｗ／ｖ％ディフコ社イーストニトロゲンベース、２％クエン酸、２ｗ／ｖ％寒天、ｐＨ６．０）、メタ亜硫酸カリウム（０．２ｍｇ／ｍｌ）含有ＳＤ培地、又は２−オキソグルタル酸（２５ｍＭ）含有ＳＤ培地を用いて３０℃で７日間培養した。親株（Ｋ−７０１）と同様に生育してこなかった株を−で示した。薬剤に対する耐性の結果を表７に示す。変異株は変異処理に用いた２−オキソグルタル酸以外の培地で生育せず耐性を示さなかった。
【００３２】
【表７】
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【００３３】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
本発明の新規酵母２ＯＧ−Ｒ３９株を用いて、汲水の一部に清酒を使用する清酒醸造法（特公昭５３−１９６７８号公報）を行った。総米２５ｋｇの仕込配合を表８に示す。なお、対照株として、多酸性酵母である日本醸造協会酵母Ｎｏ．７７株（以下Ｋ−７７と略記する）及び該新規酵母の親株であるＫ−７０１株を用いた。
【００３５】
【表８】
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【００３６】
掛米は精米歩合７８ｗ／ｗ％の白米を使用した。麹は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の白米を使用して製造した。留添は醪の最終濃度が９％になるように清酒（アルコール濃度  １４．３ｖ／ｖ％）を添加した。なお、留添の（）内は清酒の使用量である。発酵温度は最高品温１５℃とし、仕込み後、発酵が終了した段階で上槽した（Ｋ−７０１株及びＫ−７７株は２７日目、２ＯＧ−Ｒ３９株は３４日目に上槽した）。上槽液の分析結果を表９に示す。
【００３７】
【表９】
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【００３８】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で表した。
【００３９】
この結果、２ＯＧ−Ｒ３９株は、親株のＫ−７０１株に比べて、酸度が高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸及び旨味を呈するコハク酸が各々約２．４倍、約１．８倍高生産であり、不快臭であるアセトアルデヒド及び酢酸エチルが各々約０．８倍、約０．７倍低生産であった。また、高級アルコールであるイソブタノール及びイソアミルアルコールが親株に比べて各々の約１．６倍、約１．４倍高生産であった。
また、Ｋ−７７株は、リンゴ酸の有機酸中に占める割合が非常に大きく、２ＯＧ−Ｒ３９株は有機酸のバランスがとれていた。官能的にも、Ｋ−７７株は酸味や酢酸臭がきつく、またＫ−７０１株は甘味が多いのという評価に対して、２ＯＧ−Ｒ３９株はほどよい酸味を有するという評価が得られた。すなわち、香りがよく、ふくいくたる香りのする、甘味と酸味のバランスのとれた、しかも旨味も呈する、従来にない濃厚芳じゅんな酒質を有する清酒であった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、有機酸、詳細にはリンゴ酸及び／又はコハク酸、並びに香気成分を高生産する新規酵母を取得することができ、これらの酵母を使用することにより、従来の酒類、食品に比べ、酸味が強く、その有機酸組成で嗜好的に好ましいリンゴ酸及び／又はコハク酸含有量が増加した酒類、食品を製造できる。更に、濃厚芳じゅんでかつ甘味と酸味のバランスの良く、旨味も呈する酒質の清酒を製造できる。これらの特性を生かして、割り水しても味が薄くならず、幅のある爽やかな酸味を有する低アルコール酒類等の製造への応用も可能となる。