(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆（チョングッチャン）より分離培養されて、α−グルコシターゼ阻害剤の生産に用いるバチルスサブチルスＤＣ−１５菌株[受託番号：ＫＣＴＣ１０７６３ＢＰ]。
【請求項２】
納豆（チョングッチャン）試料を蒸留水に懸濁させて、常温水槽で熱処理する段階と；
前記熱処理された懸濁液を寒天が含まれたＬＢ平板培地に塗抹した後に、培養機で培養してコロニーを形成する菌体を分離する段階と；
前記分離された菌株をＬＢ液体培地に接種及び培養する段階と；
培養液を遠心分離した後、上澄み液からα−グルコシターゼ阻害活性を測定して、阻害活性が最も高い菌株を選び出す段階と；
を含むことを特徴とする、バチルスサブチルスＤＣ−１５菌株[受託番号：ＫＣＴＣ１０７６３ＢＰ]の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の菌株の培養液を遠心分離する段階と；
前記遠心分離により得られた上澄み液からα−グルコシターゼ阻害剤を収得する段階と；
を含むことを特徴とする、α−グルコシターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項４】
前記遠心分離は、５０００ｇ〜７０００ｇで５分〜１５分間行うことを特徴とする、請求項３に記載のα−グルコシターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載の菌株を利用した、機能性食品の製造方法。
【請求項６】
前記機能性食品は、納豆（チョングッチャン）であることを特徴とする、請求項５に記載の機能性食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−グルコシターゼの阻害剤を多量生産する新しい菌株とその製造方法｛Ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｈａｖｉｎｇ  ｈｉｇｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ  ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｉｎ｝及びその利用に関し、具体的には、納豆より分離培養され、α−グルコシターゼの阻害剤を多量に生産するバチルスサブチルスＤＣ−１５菌株、その製造方法、上記の菌株を利用したα−グルコシターゼを含める薬学的組成物、機能性食品および美容組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
α−グルコシターゼの阻害剤は、α−グルコシターゼによるオリゴ糖の分解を阻害する物質で一部の植物や微生物に分布している。微生物起源のα−グルコシターゼの阻害剤としては、Ａｃｔｉｏｎｐｌａｎｅｓ菌株起源のシュドオリゴ糖（ｐｓｅｕｄｏ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ），ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中の細菌が生産する１−デオキシノジリマイシン（１−ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）などが知られており、これらの誘導体は血糖降下用の医学品として開発され市販されている。
【０００３】
現在、数多くのα−グルコシターゼの阻害剤が臨床実験中であり、すでに薬剤として市販されている（Ｋｍｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２；  Ｒｈｉｎｅｈａｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ，  １９８８）。市販されている代表的な血糖降下用α−グルコシターゼの阻害剤としては、バイエル（Ｂａｙｅｒ）社のアクティノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）菌株が発酵して生産する二次代謝産物であるシュドオリゴ糖で１９７２年に発見された物質のアカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ）（Ｒｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）を主成分とするグルコベイ（Ｇｌｕｃｏｂａｙ）、１９７８年にストレプトマイセスの中の菌株より分離された１−デオキシノジリマイシン（Ａｓａｎｏ，  １９９４）の誘導体であるミグリトル（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）とエミグリテイト（ｅｍｉｇｌｉｔａｔｅ）の中ではミグリトル（ＤｅＢｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３）、またタケダ（Ｔａｋｅｄａ）社のバリオラニン（ｖａｌｉｏｌａｎｉｎ）などがある。そして、臨床実験の段階まで至った物質としては、ポリペプチドであるテンダミステト（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）、単糖類であるエミグリテイト（ｅｍｉｇｌｉｔａｔｅ）などがある。これらのα−グルコシターゼの阻害剤は、微生物の培養液より多く分離されているが、特に、アクティノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アンプラリエラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）及びストレプトポランジウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｏｒａｎｇｉｕｍ）の中の菌とアスペルジラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびクラドソリウム（Ｃｌａｄｏｓｏｒｉｕｍ）の中にある黴菌のα−グルコシターゼの阻害剤生産が報告されている。
【０００４】
大部分のα−グルコシターゼの阻害剤は炭水化物誘導体で、活性部分に置換されたツクロヘクセン輪と、４，６−Ｄ−デオキシ−４−アミノ−Ｄ−グルコース構造を持っており、この構造のアミノ基とα−グルコシターゼのヒドロキシル基が酸素結合により加水分解活性を現す事を阻害する（Ｈｅｉｋｅｒ，  １９８２）。
【０００５】
これ以外に多様な起源のポリペノル類がα−グルコシターゼだけに特異的ではないが、効果的にα−グルコシターゼの活性を阻害し、伴って血糖上昇抑制に効果があるという報告もある（Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｈｏｎｄａ，  １９９０；  Ｈｏｎｄａ  ａｎｄ  Ｈａｒａ，  １９９３；  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  １９９３）。
【０００６】
このα−グルコシターゼの活性を阻害することにより、血糖降下及び肥満治療のような効果を得るための多様な抑制剤が開発されていて、このような抑制剤を経済的に大量生産するための必要性は次第に増大していく状況である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、α−グルコシターゼの阻害剤を大量生産する新しい菌株を提供し、このような菌株を利用して多様な薬品、食品及び美容組成物などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の第１の観点によれば、納豆（チョングッチャン）より分離培養されて、α−グルコシターゼの阻害剤を大量に生産するバチルスサブチルスＤＣ−１５菌株[受託番号：ＫＣＴＣ１０７６３ＢＰ]が提供される。
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明の第２の観点によれば、納豆試料を蒸留水に混ぜて、常温水槽で熱処理する段階と；上記の熱処理された液を寒天が含まれたＬＢ平板の培地に塗りつけて、培養機で培養しコロニーを形成する菌体を分離する段階と；上記の分離された菌株をＬＢ液体の培地に接種及び培養する段階と；上記の培養液を遠心分離させた後、上澄み液よりα−グルコシターゼの阻害活性を測定して、阻害活性が一番高い菌株を選ぶ段階と；を含むバチルスサブチルスＤＣ−１５（ＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰ）菌株の製造方法が提供される。
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明の第３の観点によれば、本発明によるバチルスサブチルスＤＣ−１５（ＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰ）菌株を利用したα−グルコシターゼの阻害剤製造方法が提供される。
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明の第４の観点によれば、本発明によるバチルスサブチルスＤＣ−１５（ＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰ）菌株を利用した機能性食品の製造方法が提供される。
【００１４】
上記課題を解決するために、本発明の第７の観点によれば、本発明による方法に基づいて製造されたα−グルコシターゼの阻害剤を含める美容組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。
【００１７】
本発明者らは、韓国伝統の大豆発酵食品である納豆（チョングッチャン）より分離された新しい菌株バチルスサブチルスＤＣ−１５がα−グルコシターゼの阻害剤を大量に生産する能力の保有を確認し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
具体的に、本発明は、稲わらを利用した韓国伝統の大豆発酵食品である納豆（チョング
ッチャン）より分離された菌株バチルスサブチルスＤＣ−１５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ＤＣ−１５，  ＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰ）、上記の菌株の製造方法、上記の菌株より生産されるα−グルコシターゼの阻害剤、及び上記のα−グルコシターゼの阻害剤を含める薬学的組成物、機能性食品及び美容組成物に関するものである。
【００１９】
本発明によれば、簡単で経済的な方法によりα−グルコシターゼの阻害剤を大量に生産することが出来るうえ、生産されたα−グルコシターゼを利用して高付加価値の血糖降下、抗肥満機能性食品などの製品開発が可能になるのである。
【００２０】
本発明者らは、上記のような多様な機能と応用性を持っているα−グルコシターゼの阻害剤を生産する微生物を得るために、韓国各地で生産、市販されている様々な納豆（チョングッチャン）を収集して、α−グルコシターゼの阻害剤の生産性が優秀な菌株を探索、分離した。
【００２１】
上記の探索を行った結果、日本で市販中である大豆発酵食品の納豆１２種類より分離したバチルスからは生産されないα−グルコシターゼの阻害剤を大量生産する優秀なバチルス菌株を分離することが出来、これをバチルスサブチルスＤＣ−１５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ＤＣ−１５）と命名し、便宜上上記の菌株の名称をバチルス属ＤＣ−１５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＤＣ−１５）として２００５年１月１８日に韓国生命工学研究院の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ、大田広域市ユソン区オウン洞５２所在）にＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰの受託番号で寄託した。上記の分離された菌株は長い間食用として使われていて安全性が立証された納豆（チョングッチャン）から収得したのであり、従って上記の菌株が生産するα−グルコシターゼの阻害剤は適量、適正な方法で薬学的組成物、機能性食品及び美容組成物などに添加して使うことが出来るのである。
【００２２】
本発明はまた一実施形態として、上記の菌株を製造するための方法を提供し、これは納豆（チョングッチャン）の試料を蒸留水に懸濁して、常温水槽で熱処理する段階と；上記の熱処理された液を寒天が含まれたＬＢ平板の培地に塗りつけて、培養機で培養し、菌がコロニーを形成する菌体を分離する段階と；上記の分類された菌株をＬＢ液体の培地に接合及び培養する段階と；上記の培養液を遠心分離した後、上澄み液からα−グルコシターゼの阻害活性を測定し、阻害活性が一番高い菌株を選び抜く段階と；を含む。
【００２３】
上記の熱処理は、６０℃あるいは７０℃で２０分〜３０分程度行われ、熱処理された液の培養をするとき、培養機の温度は２０℃あるいは４０℃、培養の時間は１日〜３日である。
【００２４】
また、分離された菌株が接種されるＬＢ液体培地の容積は１ｍｌ〜１０ｍｌであるものが望ましい。そして接合後培養温度及び時間は各々２０℃〜４０℃及び２４時間〜７２時間であるのが望ましい。
【００２５】
上記の方法によって製造された菌株の形態学的及び生理学的な特性は次のようである。
【００２６】
すなわち、本発明による菌株はＬＢ寒天の平板培地で培養したとき、乳白色の粗い表面を持つ菌のコロニーを形成して、２５℃〜３０℃の好揮的な条件の中で菌体の成長が活発なグラムの良性菌として、５５℃以上の培養温度では菌体の成長が見られない特性がある。  
【００２７】
本発明はまた他の実施形態として、上記のように製造された菌株を利用したα−グルコシターゼの阻害剤の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明によるα−グルコシターゼの阻害剤の製造方法は、上記の菌株の培養液を遠心分離する段階と；上記の遠心分離より得られた上澄み液からα−グルコシターゼの阻害剤を収得する段階と；を含む。
【００２９】
上記の遠心分離の条件は、望ましくは、５，０００ｇ〜７，０００ｇで５分〜１５分間行われる。
【００３０】
本発明はまた他の実施形態として、上記のように製造された菌株を利用した機能性食品の製造方法を提供し、上記の機能性食品は納豆（チョングッチャン）が望ましい。
【００３１】
本発明による菌株を使用して納豆（チョングッチャン）を製造しようとする場合には、本発明による菌株をゆでた大豆に接種及び培養した後、通常的な納豆（チョングッチャン）製造方法に基づいてこれを製造することが出来る。
【００３２】
本発明によって製造された納豆（チョングッチャン）は、α−グルコシターゼの阻害剤の活性が非常に高い菌株を選別し製造されたので、その活性が従来の通常的な納豆（チョングッチャン）に比べて優れている。つまり、日本で市販中である大豆発酵食品の納豆１２種類からではα−グルコシターゼの阻害剤の活性が全く見られないし、韓国内で市販されている従来の通常的なチョングッチャンも低く、不均一である。一方、本発明による納豆（チョングッチャン）は顕著に異なるα−グルコシターゼの活性が見られる。これら従来の通常的な納豆（チョングッチャン）は、菌株の混合培養又はα−グルコシターゼ阻害剤の非活性菌株を利用した純粋培養によって製造される反面、本発明による納豆（チョングッチャン）はα−グルコシターゼ活性が特に高い菌株だけを選別し、純粋培養することに基づいて納豆（チョングッチャン）を製造されたからである。
【００３３】
また、上記のように製造されたα−グルコシターゼ阻害剤は、多様な医学品、食品及び化粧品などに添加させることが可能であり、従って本発明は上記のα−グルコシターゼ阻害剤を含める薬学的組成物、機能性食品及び美容組成物を提供する。
【００３４】
例えば、本発明によるα−グルコシターゼ阻害剤を含める薬学的組成物を製造する場合、薬剤学的に許容可能な多様な添加剤が含まれて、このような添加剤としては通常的な賦形剤、崩解剤、結合剤、活沢剤、懸濁化剤などの中で１種類又は２種類以上が選択的に使われることが出来る。例えば、本発明の組成物を錠剤又は硬質カプセルなどの固形剤の形で製造する場合、賦形剤として微結晶セルロース、乳糖、低置換ヒドロキシセルロースなどを使用することが出来る。崩解剤としては澱粉グリコル酸ナトリウム、無水リン酸水素カルシウムなどが使われることが出来る。結合剤としてはポリビニルピロリドン、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどが使用可能であり、活沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルクなどから選択して使うことが出来る。また、懸濁化剤としては薬剤学分野で通常的に使われている界面活性剤（例えばソルビタンエステル類、またはポリソルベート類など）の使用が可能である。
【００３５】
上記の薬学的組成物は、固形及び液状形態を含めた様々な形態の剤形として製剤化が出来、これらの剤形は錠剤、カプセル剤（硬質又は軟質）、液剤（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、懸濁剤、乳剤及びシロップ剤などを含む。
【００３６】
上記の薬学的組成物は経口又は非経口を含めた様々な投与方法によって投与出来る。投与量は年齢及び性別のような状態、疾病の軽重などに合わせて適当な量を調整し、投与することが出来る。このような投与量は臨床的に患者の治療又は予防に従事する者であればたやすく調整出来るのである。
【００３７】
本発明によるα−グルコシターゼ阻害剤は、様々な形態の機能性食品に添加することが出来て、このような機能性食品の非制限的な例えとしては、菓子類、ガム類、飲料などがある。また、本発明によるα−グルコシターゼ阻害剤は美容組成物の製造にも使うことが出来る。この場合、上記のことに従事する者であれば様々な種類の添加剤を適当な含量の範囲内で添加することは可能である。
【００３８】
本発明によるα−グルコシターゼ阻害剤を使用して機能性飲料又は美容組成物を製造する場合、本発明による納豆（チョングッチャン）の培養物を水で抽出して、これを遠心分離した後に上澄み液を濃縮して添加することによって製造される。
【００３９】
この場合、上記の納豆（チョングッチャン）培養物の抽出液の中にはα−グルコシターゼ阻害剤以外に水溶性ペプチド、ポリγ−グルタミン酸のような添加剤が含まれてα−グルコシターゼ阻害剤以外の機能性を与えることも出来る。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例を通してより具体的に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を例示的に説明する為であって、本発明の範囲が下記の実施例のみ限定されたのではない。
【００４１】
実施例１．  本発明による菌株の分離及び同定
（１．１  菌株の分離）
稲わらを媒体とする伝統的な大豆発酵法によって生産された伝統の大豆発酵食品２００種類の納豆（チョングッチャン）を全国各地から入手して、試料として使用した。各試料を減菌蒸留水に少量加えて混ぜた後、６０℃の常温水槽で２０分間熱処理し、バチルス菌が持つ内生胞子形成化過程を経た後、２％の懸濁液を寒天が含まれているＬＢ平板培地（１％トリプトン、０．２％砂糖、０．５％酵母抽出物及び０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に塗抹して、３０℃の培養機で２日間培養した。培養後、コロニーを形成する菌体を分離した。本発明によって得られたα−グルコシターゼ阻害剤の生産量を調整するために、分離された５ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３０℃の状態で４８時間の間培養した。上記の培養液を遠心分離して、上澄み液よりα−グルコシターゼ阻害活性を測定して、阻害活性が一番高い菌株を選び出した。
（１．２  分離された菌株の形態学的及び生化学的特性）
（１）分離された菌株の形態学的特性
上記の分離されたα−グルコシターゼ阻害剤の高生産活性菌株は、ＬＢ寒天平板培養地で乳白色のコロニーを形成して、菌体の縁はのこぎりの歯のような形をしていて、コロニーの表面はたくさんのしわを持つ外形として現れた。菌体の成長に及ぶ温度の影響は２５℃以上〜４０℃以下の範囲内で成長が良好であり、５０℃以上では菌体の成長が見られなかった。ＬＢ液体培地を利用した菌体成長の代数期のとき、顕微鏡で観察した結果、グラム陽性の短い棒のような形で、比較菌株であるバチルスサブチルスと似ていて、菌株の電子顕微鏡写真を図１に示した。菌株はグラム陽性であり、細胞の大きさは大体０．６〜０．７×１．５〜１．７μｍであった。
（２）分離された菌株の生化学的特性
バジスマニアルによるバチルス属菌株の分類学的特性分析方法（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ２００２）とＡＰＩ５０ＣＨＢキト（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社，  Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、本発明による菌株の生化学的特性などを調査した。本発明による菌株はグラム陽性の円筒形で、胞子細胞中央に形成されて、硝酸塩の還元力があって、インドルの生成をさせない。また、カゼインと澱粉を分解し、カタルラーゼを生産して好期的な条件のみで成長出来る。一方、グリセロール、Ｌ−アラビノス、Ｄ−ザイルロス、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、シュクロース、マルトースなどを利用できることが明らかになった。
【００４２】
本発明による菌株の詳細な形態学的及び生化学的特性を下記の表１に示した。
【００４３】
【表１】
0004465337.tif 000002
【００４４】
（３）分離された菌株の同定
本発明の菌株は、通常的なバチルス属菌株とは違い、α−グルコシターゼ阻害剤を大量生産する特性を見せる。従って、本発明の菌株をバチルスサブチルスに属する新菌株として分類し、‘バチルスサブチルスＤＣ−１５’（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ＤＣ−１５）と命名して、便宜上前期菌株の名称を‘バチルス属ＤＣ−１５’（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＤＣ−１５）として、２００５年１月１８日韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ，  大田広域市ユソン区オウン洞５２所在）に寄託して寄託番号ＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰを与えられた。
【００４５】
実施例２．  本発明による菌株を利用した納豆（チョングッチャン）の製造及び製造された納豆（チョングッチャン）のα−グルコシターゼ阻害剤活性測定
本発明の菌株をふやかしてゆでた大豆に接種した後、３０℃で７２時間の間培養した。培養中、酸素の円滑な供給のために一日２回の攪拌を実施した。培養が終わった後、これを加圧滅菌して、本発明の菌株によって生産されたα−グルコシターゼ及びプロターゼを実活させた後、納豆（チョングッチャン）１０ｇに１０倍量の５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加えてホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で細かく砕いた後、４℃で１０時間以上攪拌して抽出した。懸濁液を遠心分離して、上澄み液のα−グルコシターゼ阻害活性を測定した。α−グルコシターゼ阻害活性は下記のように測定した。つまり、１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）５０μｌ、所定濃度で希釈した豚の小腸起源のα−グルコシターゼ助酵素液５０μｌ、及びα−グルコシターゼ阻害剤５０μｌを混合して３７℃で３分間予備加温した後、基質である０．０７５％の麦芽糖溶液５００μｌを加えて反応をさせた。続いて３０分間反応後、沸騰した湯で５分間加熱し、反応を停止させて、十分に冷却した後、この中の１００μｌをブドウ糖定量用キッド溶液１ｍｌに添加し、３７℃で５分間放置した。そして、分光光度計で５００ｎｍでの、吸光度を測定することによって、α−グルコシターゼ阻害活性を測定出来た。このとき、阻害剤の代わりに水を入れたのを対照として下記の式にしたがって阻害率を計算した。
【００４６】
阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ  ×  １００
【００４７】
上記の式で、Ａは対照の吸光度であり、Ｂは阻害剤を入れた試料の吸光度である。
【００４８】
本発明による納豆（チョングッチャン）と国内及び日本で市販されている従来の通常的な納豆（チョングッチャン）１６種類を上記の方法を用いて抽出した後、３２００倍に希釈して、上記の方法でα−グルコシターゼ阻害率を測定した結果を下記の表２に示した。
【００４９】
【表２】
0004465337.tif 000003
【００５０】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明はかかる例に限定されないことは言うまでもない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明による菌株の電子顕微鏡の写真である
【図１】
0004465337.tif 000004