(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0004405667.tif 000013
上式中：
Ｒ１およびＲ２は独立に：
水素；低級アルキル；ハロゲン；アシル；ニトロ；スルホ；
−ＣＨ＝ＮＲ４（ここでＲ４はグアニジノ、複素環基、もしくは−ＮＲ５Ｒ６（ここでＲ５もしくはＲ６は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、低級アルキル、アシル、アリール、複素環基、カルバモイルもしくは低級アルキルアミノカルボニルである）である）；
−ＮＲ５Ｒ６；
−ＣＨ（ＳＲ７）２（ここでＲ７は低級アルキルもしくは２つのＲ７が一緒になってアルキレンを表す）；
−（ＣＨ２）ｊＲ８［ここでｊは１−６であり、そしてＲ８はハロゲン；置換アリール；未置換アリール；置換ヘテロアリール；未置換ヘテロアリール；Ｎ３；
−ＣＯ２Ｒ９（ここでＲ９は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１（ここでＲ１０およびＲ１１は独立に水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、低級アルキルアミノカルボニルもしくは低級アルコキシカルボニルであるか、またはＲ１０およびＲ１１は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；
−ＯＲ１２（ここでＲ１２は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１３（ここでＲ１３は水素、ＮＲ１０Ｒ１１、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキルもしくは未置換アラルキルである）である）；
−ＮＲ１０Ｒ１１；
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１４（ここでＲ１４は水素、低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；または
−Ｓ（＝Ｏ）ｒＲ１５（ここでｒは０ないし２であり、そしてＲ１５は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、チアゾリニル、（ＣＨ２）ａＣＯ２Ｒ１６（ここでａは１もしくは２であり、そしてＲ１６は水素もしくは低級アルキルである）、または−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１である）；である］；
−ＯＲ１７（ここでＲ１７は水素、低級アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１８（ここでＲ１８は置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリールもしくは未置換アリールである）である）；
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｊＲ１９（ここでＲ１９は水素、ハロゲン、ＮＲ１０Ｒ１１、Ｎ３、ＳＲ１５もしくはＯＲ２０（ここでＲ２０は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキルもしくはＣ（＝Ｏ）Ｒ１４である）である）；
−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ｊＲ１９；
−（ＣＨ２）ｄＣＨＲ２１ＣＯ２Ｒ１６Ａ（ここでｄは０−５であり、そしてＲ２１は水素、ＣＯＮＲ１０Ｒ１１もしくはＣＯ２Ｒ１６Ａ（ここでＲ１６ＡはＲ１６と同義である）である）；
−（ＣＨ２）ｄＣＨＲ２１ＣＯＮＲ１０Ｒ１１；
−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｍＲ２２（ここでｍは０−４であり、そしてＲ２２は水素、低級アルキル、ＣＯ２Ｒ９、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、ＯＲ１２もしくはＮＲ１０Ｒ１１である）；
−ＣＨ＝Ｃ（ＣＯ２Ｒ１６Ａ）２；
−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ２）ｍＲ２２；
−ＳＯ２ＮＲ２３Ｒ２４（ここでＲ２３およびＲ２４は独立に水素、低級アルキル、もしくは隣接する窒素原子と複素環基を形成する基である）；
−ＯＣＯ２Ｒ１３Ａ（ここでＲ１３ＡはＲ１３と同義である）；あるいは
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１
であり；
Ｒ３は、水素；低級アルキル；カルバモイル；アミノ；テトラヒドロピラニル；ヒドロキシル；Ｃ（＝Ｏ）Ｈ；アラルキル；低級アルカノイル；もしくはＣＨ２ＣＨ２Ｒ２５（ここでＲ２５はハロゲン、アミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシルもしくはヒドロキシ置換された低級アルキルアミノである）であり；
Ｘは、水素；ホルミル；カルボキシル；低級アルコキシカルボニル；低級アルキルヒドラジノカルボニル；−ＣＮ；低級アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２６Ｒ２７（ここでＲ２６およびＲ２７は独立に水素、未置換低級アルキルもしくは未置換アリールであるか；またはＲ２６およびＲ２７は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；−ＣＨ（Ｒ３４）Ｗ（ここでＲ３４は水素もしくは低級アルキルであり、そしてＷは−Ｎ＝ＣＨＮ（アルキル）２；グアニジノ；Ｎ３；ＮＲ２８Ｒ２９（ここでＲ２８もしくはＲ２９は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、アリル、アルカノイル、アリールオキシカルボニル、未置換アルキルもしくはα−アミノ酸の残基、（その中でカルボキシル基のヒドロキシ基が排除される）である）；−ＣＯ２Ｒ９；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１；−Ｓ（＝Ｏ）ｒＲ３０（ここでＲ３０は置換もしくは未置換の低級アルキル、アリールもしくはヘテロアリールである）；あるいは−ＯＲ３１（ここでＲ３１は水素、置換もしくは未置換のアルキル、または置換もしくは未置換のアルカノイルである）である）；
−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ３２（ここでＲ３２はヒドロキシル、低級アルコキシ、アミノ、グアニジノ、ウレイド、イミダゾリルアミノ、カルバモイルアミノもしくはＮＲ２６ＡＲ２７Ａ（ここでＲ２６ＡはＲ２６と同義でありかつＲ２７ＡはＲ２７と同義である）である）；あるいは
−ＣＨ２Ｑ（ここでＱは
【化２】
0004405667.tif 000014
により表わされる糖残基であり、
上式中Ｖは水素、メチル、エチル、ベンジル、アセチルもしくはトリフルオロアセチルを表わす）
であり；
Ｙは、水素；−ＯＨ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３３（ここでＲ３３はアルキル、アリールもしくはアミノである）；−ＯＣＨ２Ｏ−アルキル；−Ｏ−アルキル；またはアラルキルオキシであるか；またはＸおよびＹは−Ｘ−Ｙ−として結合されて−ＣＨ２ＯＣＯ２−もしくは−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１６Ｂ）ＣＯ２−（ここでＲ１６ＢはＲ１６と同義である）を形成し；
Ａ１およびＡ２は水素であるか、もしくは双方は結合されてＯを表わすか；または
Ｂ１およびＢ２は水素であるか、もしくは双方は結合されてＯを表わす；
の化合物、あるいはその製薬学的に許容できる塩であるが；ただしＡ１、Ａ２もしくはＢ１、Ｂ２の少なくとも一方がＯを表わし；また、さらにただしＸおよびＹの双方が同時に水素ではない。
【請求項２】
Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２６Ｒ２７、カルボキシル、低級アルコキシカルボニル、ホルミル、低級アルキル、−ＣＨ２ＯＲ３１、−ＣＨ２ＮＲ２８Ｒ２９、もしくは−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ｒＲ３０である、請求項１の化合物。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２がＨである、請求項１の化合物。
【請求項４】
Ｒ３が水素である、請求項１の化合物。
【請求項５】
化合物が、化合物ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸＶおよびＸＸＶＩＩより成る群から選ばれる請求項１の化合物。
【化３】
0004405667.tif 000015
【化４】
0004405667.tif 000016
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項７】
チロシンキナーゼの活性を阻害する阻害剤であって、請求項１記載の化合物を有するものである、阻害剤。
【請求項８】
請求項７記載の阻害剤において、
前記チロシンキナーゼは、プロテインキナーゼＣである。
【請求項９】
請求項７記載の阻害剤において、
前記チロシンキナーゼは、ｔｒｋＡである。
【請求項１０】
第二のキナーゼによるチロシンキナーゼのホスリル化を阻害する阻害剤であって、
請求項１記載の化合物を有するものである、阻害剤。
【請求項１１】
コリン作動性ニューロンの機能を高める組成物であって、
請求項１記載の化合物を有するものである、組成物。
【請求項１２】
コリン作動性ニューロンの生存を高める組成物であって、
請求項１記載の化合物を有するものである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は１９９７年１２月３１日に出願された仮出願番号第６０／０７０，２６３号の利益を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は製薬化学である。
【０００３】
（発明の背景）
Ｋ−２５２ａは、その立体化学が下（式Ｉ）すなわち
【０００４】
【化５】
0004405667.tif 000002
【０００５】
に示されるインドロカルバゾールである。
【０００６】
Ｋ−２５２ａは細胞機能の調節においてある役割を演じるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を阻害する。Ｋ−２５２ａは、多様な活性、例えば、平滑筋収縮を阻害すること（Ｊａｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３（ｓｕｐｐｌ．）：２８４、１９８７）、セロトニン分泌を阻害すること（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４４：３５、１９８７）、軸索の伸長を阻害すること（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７１５、１９８８）、ヒスタミン放出を阻害すること（Ａｌｌｅｒｇｙ  ４３：１００、１９８８）、平滑筋ＭＬＣＫを阻害すること（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６２１５、１９８８）、抗炎症作用（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｕｎｇ．８０：４２３、１９９２）および細胞の生存の促進（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：１５０２、１９９５）を有する。Ｋ−２５２ａはまたＩＬ−２産生も阻害する（Ｅｘｐｅｒ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９３：１７５−１８２、１９９１）。Ｋ２５２ａの天然の（＋）異性体およびその鏡像異性の（−）異性体（糖部分の全３個のキラル炭素が反転される）の全合成が達成されている（ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１０４１３、１９９５；およびＷＯ  ９７／０７０８１）。
【０００７】
（発明の要約）
われわれは、Ｋ−２５２ａのある３’−エピマー誘導体が生物学的に活性であることを発見した。これらの化合物は以下の一般式（式ＩＩ）すなわち
【０００８】
【化６】
0004405667.tif 000003
【０００９】
上式中：
Ｒ1およびＲ2は独立に：
水素；低級アルキル；ハロゲン；アシル；ニトロ；スルホ；
−ＣＨ＝ＮＲ4（ここでＲ4はグアニジノ、複素環基、もしくは−ＮＲ5Ｒ6（ここでＲ5もしくはＲ6は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、低級アルキル、アシル、アリール、複素環基、カルバモイルもしくは低級アルキルアミノカルボニルである）である）；
−ＮＲ5Ｒ6；
−ＣＨ（ＳＲ7）2（ここでＲ7は低級アルキルもしくは２つのＲ7が一緒になってアルキレンを表す）；
−（ＣＨ2）jＲ8［ここでｊは１−６であり、そしてＲ8はハロゲン；置換アリール；未置換アリール；置換ヘテロアリール；未置換ヘテロアリール；Ｎ3；
−ＣＯ2Ｒ9（ここでＲ9は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11（ここでＲ10およびＲ11は独立に水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、低級アルキルアミノカルボニルもしくは低級アルコキシカルボニルであるか、またはＲ10およびＲ11は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；
−ＯＲ12（ここでＲ12は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ13（ここでＲ13は水素、ＮＲ10Ｒ11、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキルもしくは未置換アラルキルである）である）；
−ＮＲ10Ｒ11；あるいは
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ14（ここでＲ14は水素、低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；または
−Ｓ（＝Ｏ）rＲ15（ここでｒは０ないし２であり、そしてＲ15は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、チアゾリニル、（ＣＨ2）aＣＯ2Ｒ16（ここでａは１もしくは２であり、そしてＲ16は水素もしくは低級アルキルである）、または−（ＣＨ2）aＣ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11である）；
である］；
−ＯＲ17（ここでＲ17は水素、低級アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ18（ここでＲ18は置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリールもしくは未置換アリールである）である）；
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ2）jＲ19（ここでＲ19は水素、ハロゲン、ＮＲ10Ｒ11、Ｎ3、ＳＲ15もしくはＯＲ20（ここでＲ20は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキルもしくはＣ（＝Ｏ）Ｒ14である）である）；
−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）jＲ19；
−（ＣＨ2）dＣＨＲ21ＣＯ2Ｒ16A（ここでｄは０−５であり、そしてＲ21は水素、ＣＯＮＲ10Ｒ11もしくはＣＯ2Ｒ16A（ここでＲ16AはＲ16と同義である）である）；
−（ＣＨ2）dＣＨＲ21ＣＯＮＲ10Ｒ11；
−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）mＲ22（ここでｍは０−４であり、そしてＲ22は水素、低級アルキル、ＣＯ2Ｒ9、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、ＯＲ12もしくはＮＲ10Ｒ11である）；
−ＣＨ＝Ｃ（ＣＯ2Ｒ16A）2；
−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）mＲ22；
−ＳＯ2ＮＲ23Ｒ24（ここでＲ23およびＲ24は独立に水素、低級アルキル、もしくは隣接する窒素原子と複素環基を形成する基である）；
−ＯＣＯ2Ｒ13A（ここでＲ13AはＲ13と同義である）；あるいは
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11
であり；
Ｒ3は、水素；低級アルキル；カルバモイル；アミノ；テトラヒドロピラニル；ヒドロキシル；Ｃ（＝Ｏ）Ｈ；アラルキル；低級アルカノイル；もしくはＣＨ2ＣＨ2Ｒ25（ここでＲ25はハロゲン、アミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシルもしくはヒドロキシ置換された低級アルキルアミノである）であり；
Ｘは、水素；ホルミル；カルボキシル；低級アルコキシカルボニル；低級アルキルヒドラジノカルボニル；−ＣＮ；低級アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ26Ｒ27（ここでＲ26およびＲ27は独立に水素、未置換低級アルキルもしくは未置換アリールであるか；またはＲ26およびＲ27は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；−ＣＨ（Ｒ34）Ｗ（ここでＲ34は水素もしくは低級アルキルであり、そしてＷは−Ｎ＝ＣＨＮ（アルキル）2；グアニジノ；Ｎ3；ＮＲ28Ｒ29（ここでＲ28もしくはＲ29は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、アリル、アルカノイル、アリールオキシカルボニル、未置換アルキルもしくはα−アミノ酸の残基（その中でカルボキシル基のヒドロキシ基が排除される）である）；−ＣＯ2Ｒ9；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11；−Ｓ（＝Ｏ）rＲ30（ここでＲ30は置換もしくは未置換の低級アルキル、アリールもしくはヘテロアリールである）；あるいは−ＯＲ31（ここでＲ31は水素、置換もしくは未置換のアルキル、または置換もしくは未置換のアルカノイルである）である）；
−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ32（ここでＲ32はヒドロキシル、低級アルコキシ、アミノ、グアニジノ、ウレイド、イミダゾリルアミノ、カルバモイルアミノもしくはＮＲ26AＲ27A（ここでＲ26AはＲ26と同義でありかつＲ27AはＲ27と同義である）である）；あるいは
−ＣＨ2Ｑ（ここでＱは
【００１０】
【化７】
0004405667.tif 000004
【００１１】
により表わされる糖残基であり、
上式中Ｖは水素、メチル、エチル、ベンジル、アセチルもしくはトリフルオロアセチルを表わす）
であり；
Ｙは、水素；−ＯＨ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ33（ここでＲ33はアルキル、アリールもしくはアミノである）；−ＯＣＨ2Ｏ−アルキル；−Ｏ−アルキル；またはアラルキルオキシであるか；またはＸおよびＹは−Ｘ−Ｙ−として結合されて−ＣＨ2ＯＣＯ2−もしくは−ＣＨ2Ｎ（Ｒ16B）ＣＯ2−（ここでＲ16BはＲ16と同義である）を形成し；
Ａ1およびＡ2は水素であるか、もしくは双方は結合されてＯを表わすか；またはＢ1およびＢ2は水素であるか、もしくは双方は結合されてＯを表わす；
あるいその製薬学的に許容できる塩を有するが；ただしＡ1、Ａ2もしくはＢ1、Ｂ2の少なくとも一方がＯを表わし；また、さらにただしＸおよびＹの双方が同時に水素ではない。
【００１２】
好ましくは、Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ26Ｒ27、カルボキシル、低級アルコキシカルボニル、ホルミル、低級アルキル、−ＣＨ2ＯＲ31、−ＣＨ2ＮＲ28Ｒ29、もしくは−ＣＨ2Ｓ（Ｏ）rＲ30である。好ましくは、Ｒ1およびＲ2はＨである。好ましくは、Ｒ3は水素もしくは保護基である。特に好ましいのは、下に示される化合物ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸＶおよびＸＸＶＩＩである。
【００１３】
【化８】
0004405667.tif 000005
【００１４】
【化９】
0004405667.tif 000006
【００１５】
本発明のいくつかの態様において、Ｋ−２５２ａの３’−エピマー誘導体は製薬学的組成物に処方される。
【００１６】
本発明はまた、チロシンキナーゼ、たとえばプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性の阻害方法も提供する。当該方法はチロシンキナーゼを請求項１の化合物と接触させることを包含する。チロシンキナーゼはインビボもしくはインビトロであり得る。
【００１７】
本発明はまた、第二のキナーゼによるチロシンキナーゼのホスホリル化の阻害方法も提供する。当該方法は第二のキナーゼを請求項１の化合物と接触させることを包含する。チロシンキナーゼはインビボもしくはインビトロであり得る。
【００１８】
本発明はまた、コリン作動性ニューロンの機能を高める方法も提供する。当該方法はコリン作動性ニューロンを請求項１の化合物と接触させることを包含する。コリン作動性ニューロンはインビボもしくはインビトロであり得る。
【００１９】
本発明はまた、コリン作動性ニューロンの生存を高める方法も提供する。当該方法はコリン作動性ニューロンを請求項１の化合物と接触させることを包含する。コリン作動性ニューロンはインビボもしくはインビトロであり得る。
【００２０】
別に定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および学術的用語は、本発明が属する技術分野の通常の技能を有する者により普遍的に理解されているのと同一の意味を有する。対立する場合は、定義を包含する本出願が支配する(control)。本明細書で挙げられる全部の刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は引用により組み込まれる。
【００２１】
本明細書に記述されるものに類似もしくは同等な方法および材料が本発明の実施もしくは試験で使用され得るとは言え、好ましい方法および材料が下に記述される。該材料、方法および実施例は具体的に説明することを意図するにすぎず、制限することを意図するものでない。本発明の他の特徴および利点が詳述される記述および請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２２】
本発明のＫ−２５２ａの３'−エピマー誘導体は、チロシンキナーゼ活性の阻害、例えばＰＫＣもしくはｔｒｋチロシンキナーゼの阻害（この阻害は癌を包含する疾患の治療に有用でありうる）を包含する薬理学的活性を示す。本発明の化合物は栄養因子応答性細胞、例えばコリン作動性ニューロンの機能および／もしくは生存を高めるのに有用である。ニューロンに対する影響は以下、すなわち（１）培養された脊髄のコリンアセチルトランスフェラーゼ（「ＣｈＡＴ」）アッセイ；および（２）培養された基底前脳ニューロン（「ＢＦＮ」）のＣｈＡＴ活性アッセイを初めとするアッセイで立証され得る。
【００２３】
ＣｈＡＴはアセチルコリンにつながる生合成経路中の酵素である。コリン作動性ニューロンに関連するＣｈＡＴ活性はそのニューロンが機能性であることを示す。ニューロンの生存はニューロンによる色素、例えばカルセインＡＭの取り込みおよび酵素的変換を測定することによりアッセイされ得る。
【００２４】
多様な神経学的障害は、傷害されている、機能的に損なわれている（fanctionally comprised）、軸索変性を受けている、死につつあるかもしくは死亡の危険にさらされているニューロン細胞を特徴とする。これらの障害は：アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症のような運動ニューロンの障害、パーキンソン病；卒中もしくは虚血のような脳血管障害、ハンチントン病、ＡＩＤＳ痴呆、癲癇、多発性硬化症、末梢ニューロパシー、興奮性アミノ酸により誘発される障害、および脳もしくは脊髄の震盪性もしくは浸透性傷害を伴う障害を包含する。
【００２５】
栄養因子応答性細胞の栄養因子誘発活性を高めるため、本発明の化合物は、哺乳動物、例えばヒトでのニューロン系統の細胞の機能および／もしくは生存を高める治療薬として使用され得る。とりわけ、それらは、低下されたＣｈＡＴ活性もしくは脊髄の運動ニューロンに対する傷害を伴う障害の治療で有用である。
化学合成
本発明の化合物は後述されるとおり製造され得る（図１−７）。当該化合物は適当に保護されたＫ−２５２ａ誘導体を用いて出発することにより製造され得る。Ｋ−２５２ａは例えばアセテートもしくはシリル誘導体としてラクタムのアミドの窒素を保護され得る。
【００２６】
チオノカーボネートＩＶａ（図１）が、米国特許第４，９２３，９８６号に記述されるような手順を使用してジオールＩＩＩａから製造され得る。トリメチルホスファイトでのＩＶａの処理は環外アルケンＶを与える。アルケンＶはヒドロホウ素化条件を使用して（Ｓ）−メタノール誘導体ＶＩに転化され得るか、もしくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中、四酸化オスミウムを使用して（Ｒ）−ジオールＶＩＩに転化され得る。化合物ＶＩＩにおいて、糖の３’位置の配置は、米国特許第４，９２３，９８６号中に（Ｓ）−ジオールＩＩＩとして報告された配置と反対である。
【００２７】
（Ｒ）−エポキシドＩＸａ（図２）は、（Ｒ）−ジオールＶＩＩをトシル中間体ＶＩＩＩに転化すること、次いで水素化ナトリウムもしくは水酸化ナトリウムのような塩基での処理により製造され得る。水素化トリエチルホウ素リチウムのような水素化物還元剤での（Ｒ）−エポキシドＩＸａの処理は、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基の脱保護後に第三級（Ｓ）−アルコールＸを与える。化合物ＶＩ、ＶＩＩもしくはＸのようなキラルなアルコール誘導体が、慣習的技術を使用して塩基およびハロゲン化物もしくはトシル化物との反応によりエーテル誘導体にさらに転化され得る。アルコール誘導体は、酸の塩化物もしくは酸無水物での処理によりエステル誘導体、または既知の手順による適当なイソシアナートとの反応によりカルバメートにもまた転化され得る。例えば化合物ＶＩもしくはＶＩＩのハロゲン化物もしくはスルホネートの誘導体は多様なＯ、Ｓ、ＮもしくはＣ求核体で置き換えられて適当な誘導体を生じ得る。
【００２８】
３’−（Ｒ）−Ｋ−２５２ａＸＩＶの製造（図３）はケトンＸＩで開始する。化合物ＸＩＶは３’の糖の位置でのみ天然のＫ−２５２ａ異性体と異なる。シアン化物塩（ＮａＣＮ、ＫＣＮ、シアン化テトラブチルアンモニウムもしくはＴＭＳＣＮ）でのケトンＸＩａの処理はシアノヒドリンＸＩＩおよびＸＩＩＩの混合物を与える。シアノヒドリン異性体の混合物はクロマトグラフィーにより分離され得るか、またはメタノール中ＨＣｌを使用してエステルＸＩＶもしくはアミドＸＶに直接転化され得る。３’−エピ−Ｋ−２５２ａＸＩＶは天然のＫ−２５２ａについて使用されるような手順を使用してヒドロキシ酸ＸＶＩに加水分解され得る。例えばＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３９：１０７２、１９８６を参照。酸ＸＶＩはＫ−２５２ａについて記述される類似の手順を使用して多様なエステルもしくはアミド誘導体に転化され得る。例えば、米国特許第４，９２３，９８６；５，４６１，１４６；および５，６５４，４２７号を参照。アミドＸＶは、天然のＫ−２５２ａの転化について記述される手順を使用して、対応するメチルアミン誘導体ＸＶＩＩに還元され得、そして、ＸＶＩＩが多数のメチルアミドおよびメチル尿素誘導体を製造するのに使用され得る。例えば、米国特許第４，９２３，９８６；５，４６１，１４６；および５，６５４，４２７号を参照。３’−エピ−Ｋ−２５２ａはアルデヒドＸＶＩＩＩに還元され得、そして多様なアミン、ヒドラジンもしくはヒドロキシルアミンと縮合されて対応する類縁体を生じ得る。アルデヒドＸＶＩＩＩが多様な金属アルキル、アリールアルキル、アリールもしくはヘテロアリールアルキル試薬、例えば、Ｌｉ、Ｍｇ、ＺｎもしくはＣｕ試薬で処理されて対応するアルコール付加生成物を生じうる。アルデヒドＸＶＩＩＩは、ホスホニウムイリド（Ｑｕａｒｔ  Ｒｅｖ．１７：４０６、１９６３；Ａｎｇｅｗ  Ｉｎｔ．１６：４２３、１９７７）、ホスホネート（ホーナー−ワズワース−エモンズ（Ｈｏｒｎｅｒ−Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ−Ｅｍｍｏｎｓ）試薬：Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．９１：６１、１９５８；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３：１７３３、１９６１；Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔ．２５：７３；１９７７）、シラン（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３３：７８０、１９６８；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３８４、１９８４）、テルル試薬（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８：８０１、１９８７）もしくはボロン試薬（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：６３５、１９８３）での処理、次いで例えば触媒的水素化によるアルケンの還元により、官能化された(functionalized)オレフィンおよびそれらの還元された生成物に転化されうる。アルデヒドＸＶＩＩＩから生じるアルケンがエポキシドに転化され得、そして例えばエポキシドＩＸについて記述されるように求核剤で処理され得る。
【００２９】
エポキシドＩＸ（図４）は多様な求核剤で処理されて構造ＸＩＸの第三級アルコールを形成し得る。求核剤は置換され得る。アルコールのエポキシドおよび三級の３’−エピ−ＯＨ配置を製造するための代替の一方法（図５）は、ケトンＸＩを、例えばアルデヒドＸＶＩＩＩについて記述されるような慣習的オレフィン化反応を使用して構造ＸＸのオレフィンに転化することである。
【００３０】
構造ＸＸＩのエポキシドは既知の方法を使用して不斉で製造され得る。例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２：１３６３、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ８９、１９８６；１９６７；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３６９２、１９９５；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：２８０１、１９９０；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：６９３７、１９９４；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：７６１５、１９９３を参照。エポキシドＩＸで使用されるものに類似の様式での求核的エポキシド開環は３’−エピ配置にＯＨ基をもつ置換第三級アルコールを与える。
【００３１】
既知の（Ｒ）−アルコールＸＸＶＩ（図６）は第二級アルコールの反転のための慣習的方法を使用して（Ｓ）−アルコールＸＸＶＩＩに転化され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：６１４５、１９９６；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９５、３３６を参照。あるいは、ＸＸＶＩＩは水素化トリエチルホウ素リチウムのような水素化物試薬でのエポキシドＸＸＩＶの処理により製造され得る。ケトンＸＩ（図６）はトリフラートＸＸＩＩに転化され得、次いで水素化トリブチルスズで処理されてアルケンＸＸＩＩＩを与え得る。
【００３２】
Ｒ1およびＲ2の位置に置換基をもつＫ−２５２ａ誘導体を製造するのに使用される既知の方法が、３’−エピ−Ｋ−２５２ａ上で対応するＲ1およびＲ2の位置に置換基を得るのに使用され得る。例えば、米国特許第４，９２３，９８６；５，４６１，１４６：および５，６５４，４２７号を参照。例えば、１等量のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）でのＸＩＶの処理（図７）はＲ1がＢｒである誘導体ＸＸＶを生じる。２等量のＮＢＳはＲ1およびＲ2双方がＢｒである誘導体を与えるとみられる。
【００３３】
（Ｓ）−メタノールＶＩのアルデヒドもしくはカルボン酸誘導体への酸化は、適切な酸化試薬（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、アメリカ化学会モノグラフ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ）１８６、ＡＣＳ  ワシントンＤＣ  １９９０に記述されるような）を使用して達成され得る。このアルデヒドもしくはカルボン酸誘導体は記述された手順を使用して誘導体ＸＶＩおよびＸＶＩＩＩを製造するためにさらに転換され得る（図３）。
製薬学的組成物
本発明のある化合物は、単一の有効成分としてもしくは他の治療剤とともに、哺乳動物、例えばヒト患者に投与され得る。本発明の化合物は、製薬学的に許容できる賦形剤および担体との混合状態により製薬学的組成物に処方され得る。こうした組成物は、いずれかの投与経路、例えば、非経口、経口、鼻もしくは局所のために処方され得る。当該組成物は、慣習的方法による製造の後に単位投与剤形で投与され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マック  パブリッシング  カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）、フィラデルフィア州イーストン）を参照。有効成分の量および濃度は変動し得る。濃度は、有効成分の総投薬量、使用される化合物の化学的特徴（例えば疎水性）、投与経路、患者の年齢、患者の体重、および治療されている病態のような因子に依存する。
【００３４】
本発明の化合物は、非経口投与のために例えば０．１ないし１０ｗ／ｖ％の化合物を含有する生理学的緩衝溶液中で提供され得る。典型的な用量範囲は１日あたり約１μｇ／ｋｇから約１ｇ／ｋｇ体重までであり；好ましい用量範囲は１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重まで、そして好ましくは１日あたり約０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇ１回ないし４回である。
【００３５】
本発明はＫ−２５２ａの３’−エピマー誘導体の製薬学的に許容できる塩を包含する。製薬学的に許容できる塩は、製薬学的に許容できる酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、およびアミノ酸付加塩を包含する。酸付加塩は、塩酸塩、硫酸塩およびリン酸塩のような無機酸付加塩、ならびに酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩および乳酸塩のような有機酸付加塩を包含する。金属塩の例は、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩ならびに亜鉛塩である。アンモニウム塩の例はアンモニウム塩およびテトラメチルチルアンモニウム塩である。有機アミン付加塩の例はモルホリンおよびピペリジンとの塩である。アミノ酸付加塩の例は、グリシン、フェニルアラニン、グルタミン酸およびリシンとの塩である。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「低級アルキル」は１ないし６個の炭素を含むアルキル基を意味する。本明細書で使用されるところの「アリール」（単独でもしくはアリールカルボニルおよびアリールアミノカルボニルのような用語中で）は、単一の環もしくは２個の縮合環中に６ないし１２個の炭素原子を有する基を意味する。アリール基の例はフェニル、ビフェニルおよびナフチルである。ヘテロアリール基は最低１個のヘテロ原子を含有する。好ましくは、ヘテロ原子はＯ、ＳもしくはＮである。ヘテロアリール基の例は、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾイミダゾリル、チアゾリルおよびベンゾチアゾリルである。置換アルキル基は１ないし３個の独立に選択される置換基を有する。アルキル基の好ましい置換基は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、置換もしくは未置換のアリールアルコキシ−低級アルコキシ、置換もしくは未置換のヘテロアリールアルコキシ−低級アルコキシ、ハロゲン、カルボキシル、低級アルコキシカルボニル、ニトロ、アミノ、モノもしくはジ−低級アルキルアミノ、ジオキソラン、ジオキサン、ジチオランおよびジチオンである。置換アリール、ヘテロアリールもしくはアリールアルキル基は１ないし３個の独立に選択される置換基を有する。好ましい置換基は、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、ニトロ、アミノ、モノもしくはジ低級アルキルアミノおよびハロゲンである。
【００３７】
本明細書で使用されるところの「コリン作動性ニューロン」は、神経伝達物質としてアセチルコリンを使用するニューロンを意味する。コリン作動性ニューロンの例は、基底前脳ニューロン、線条体ニューロンおよび脊髄ニューロンである。本明細書で使用されるところの「感覚ニューロン」は、温度もしくは動きのような環境の刺激に応答するニューロンを意味する。感覚ニューロンは、皮膚、筋および関節を包含する構造で見出される。後根神経節ニューロンは感覚ニューロンの一例である。本明細書で使用されるところの「栄養因子応答性細胞」はそれに栄養因子が結合する細胞を意味する。栄養因子応答性細胞は、コリン作動性ニューロン、感覚ニューロン、単球および腫瘍細胞を包含する。
【００３８】
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明される。当該実施例はいかなる様式でも本発明の範囲もしくは内容を制限するとして解釈されるべきでない。
【００３９】
実験実施例
チロシンキナーゼ活性の阻害
Ｋ−２５２ａのエピマー誘導体を、アンジェレ（Ａｎｇｅｌｅｓ）らにより記述された（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：４９−５５、１９９６）とおり、ＥＬＩＳＡを基礎としたアッセイを使用して、バキュロウイルスで発現されたヒトｔｒｋＡの細胞質ドメインのキナーゼ活性の阻害について試験した。９６穴マイクロタイタープレートを基質溶液（組換えヒトホスホリパーゼＣ−γ／グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質；ロティン（Ｒｏｔｉｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１：５５９−５６７、１９９２）で被覆した。阻害を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、４０μＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．１％ＢＳＡ、２％ＤＭＳＯおよび多様な濃度の阻害剤を含有する１００μｌのアッセイ混合物中で測定した。反応を、ｔｒｋＡキナーゼの添加により開始し、そして３７℃で１５分間進行させた。ホスホチロシンに対する抗体（ＵＢＩ）、次いで二次酵素結合抗体、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））をその後添加した。
【００４０】
結合された酵素の活性を増幅検出系（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）を使用して測定した。阻害データを、グラフパッド  プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）中のＳ字形の用量応答（変動する傾き）等式を使用して分析した。キナーゼ活性の５０％阻害を与えた濃度をＩＣ50と称した。結果を表１に要約する。
【００４１】
【表１】
0004405667.tif 000007
【００４２】
ＮＧＦで刺激されたｔｒｋのホスホリル化の阻害
選択されたＫ−２５２ａのエピマー誘導体によるｔｒｋのＮＧＦで刺激されたホスホリル化の阻害を、米国特許第５，５１６，７７１号に記述された手順から改変された手順を使用して測定した。ｔｒｋＡでトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を１００ｍｍ皿中で成長させた。コンフルエント以下の(subconfluent)細胞から、培地を化合物（１〜１００ｎＭ）もしくはＤＭＳＯ（対照に添加された）を含有する血清を含まない０．０５％ＢＳＡ−ＤＭＥＭで３７℃で１時間置き換えることにより血清を欠乏させた(serum-starved)。ＮＧＦ（ハルラン（Ｈａｒｌａｎ）／バイオプロダクツ  フォー  サイエンス（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））をその後１０ｎｇ／ｍｌの濃度で５分間細胞に添加した。細胞を、洗剤およびプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液中で溶解した。澄明にされた細胞ライセートを、ＢＣＡ法を使用してタンパク質に対して正規化し、そして抗ｔｒｋ抗体を用いて免疫沈降させた。
【００４３】
ポリクローナル抗ｔｒｋ抗体を、ｔｒｋのカルボキシ末端の１４アミノ酸（マーティン・ザンカ（Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  ９：２４−３３、１９８９）に対応するペプチドに対して調製した。免疫複合体を、プロテインＡセファロースビーズ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））上で収集し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、そしてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに移した。このメンブレンを抗ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）でイムノブロットし、次いでワサビペルオキシダーゼを結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））とともにインキュベーションした。ホスホリル化されたタンパク質をＥＣＬ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して可視化した。
【００４４】
ｔｒｋタンパク質のバンドの面積を測定し、そしてＮＧＦ刺激された対照に比較した。ｔｒｋタンパク質のバンド中の減少パーセントを基礎として、使用された阻害得点(scoring)系は以下のとおりであった。すなわち、０＝減少なし；１＝１〜２５％；２＝２６〜４９％；３＝５０〜７５％；４＝７６〜１００％。
【００４５】
ｔｒｋ阻害データ（表２）は、３’エピ−ＯＨ異性体が、対応する天然の異性体より全細胞調製物中でのｔｒｋを阻害することについて、より強力であることを示した。３’−エピ−Ｋ−２５２ａ（ＸＩＶ）は＜１０ｎＭのＩＣ50を示した一方、Ｋ−２５２ａはおよそ５０ｎＭのＩＣ50を示した。化合物Ｘは、＜５０ｎＭでｔｒｋＡの完全な阻害、また、細胞で＜１０ｎＭのＩＣ50を示した。天然の異性体ＸＸＩＸは１００ｎＭでも完全な阻害を示さなかった。ジオールＶＩＩは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞でのｔｒｋＡ阻害について天然の異性体ＩＩＩより大きな活性を示した。
【００４６】
【表２】
0004405667.tif 000008
【００４７】
ＶＥＧＦレセプターキナーゼ活性の阻害
Ｋ−２５２ａの３’−エピマー誘導体を、上述された手順を使用して、バキュロウイルスで発現されたＶＥＧＦレセプターキナーゼドメインのキナーゼ活性の阻害について試験した。５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、４０μＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．１％ＢＳＡ、２％ＤＭＳＯおよび多様な濃度の阻害剤より成るキナーゼ反応混合物を、ＰＬＣ−γ／ＧＳＴ被覆されたプレートに移した。ＶＥＧＦＲキナーゼを添加し、そして反応を３７℃で１５分間進行させた。ホスホリル化生成物を抗ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）により検出した。二次酵素結合抗体を使用して、抗体−ホスホリル化ＰＬＣ−γ／ＧＳＴ複合体を捕捉した。結合された酵素の活性を、増幅検出系（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）により測定した。阻害データを、グラフパッド  プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）中のＳ字形の用量応答（変動する傾き）等式を使用して分析した。結果を表３に要約する。
【００４８】
【表３】
0004405667.tif 000009
【００４９】
プロテインキナーゼＣ活性の阻害
プロテインキナーゼＣ活性を、ミリポア  マルチスクリーン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）ＴＣＡインプレート(in-plate)アッセイ（ピット（Ｐｉｔｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１：４７−５１、１９９６）を使用して測定した。アッセイを、９６穴マルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）−ＤＰプレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））中で実施した。各４０μｌのアッセイ混合物は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、８０ｍｇ／ｍｌホスファチジルセリン、３．２ｍｇ／ｍｌジオレイン、２００ｍｇ／ｍｌヒストンＨ−１（フルカ（Ｆｌｕｋａ））、５ｍＭ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ、１．５ｎｇプロテインキナーゼＣ（ＵＢＩ；ａ、ｂ、ｇのアイソザイムの混合物）、０．１％ＢＳＡ、２％ＤＭＳＯおよびＫ−２５２ａの３’−エピマー誘導体を含有した。反応を３７℃で１０分間進行させた。反応を氷冷５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でクエンチした。プレートを４℃で３０分間平衡化し、その後氷冷２５％ＴＣＡで洗浄した。シンチレーションカクテルをプレートに添加し、そして放射活性をワラック  マイクロベータ  １４５０プラス（Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  １４５０  ＰＬＵＳ）シンチレーション計数器を使用して測定した。ＩＣ50値を、データをグラフパッド  プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）中のＳ字形の用量応答（変動する傾き）等式に適合させることにより算出した。結果を表４に要約する。
【００５０】
【表４】
0004405667.tif 000010
【００５１】
脊髄のＣｈＡＴ活性の増強
ＣｈＡＴは、機能的コリン作動性ニューロンについての生化学的マーカーとして使用された。ＣｈＡＴ活性を使用して、コリン作動性ニューロンの生存および／もしくは機能に対するニューロトロフィン（例えばＮＧＦもしくはＮＴ−３）の効果を研究した。ＣｈＡＴアッセイはコリン作動性ニューロン内のＣｈＡＴレベルの調節の指標としてもまた使用されている。
【００５２】
Ｋ−２５２ａの３’−エピマー誘導体は、解離されたラット胚脊髄培養物アッセイでＣｈＡＴ活性を増大させた（表５）。化合物ＸＶＩＩは、細胞が対照の組織培養ウェルに付着するための２〜３時間のプレート培養期間の後に、ＣｈＡＴ活性を、対照培養物（Ｋ−２５２ａの３'−エピマー誘導体で処理されない）に対して１９５％まで増大させた。これらのアッセイでは、化合物を解離された脊髄培養物に直接添加した。ＣｈＡＴ活性を対照活性の少なくとも１２０％まで増大させた化合物を活性があるとみなした。増大されたＣｈＡＴ活性が、選択されたＫ−２５２ａの３'−エピマー誘導体の単回の適用後に観察された。結果を表５に要約する。
【００５３】
【表５】
0004405667.tif 000011
【００５４】
ラット胎児脊髄細胞を解離させ、そして実験を、本質的にスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０１：１６０８−１６２１、１９８５）およびグリックスマン（Ｇｌｉｃｋｓｍａｎ）ら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：２１０−２２１、１９９３）により記述されるとおりに実施した。解離された細胞を、慣習的トリプシン解離技術によりラット（胚第１４〜１５日）から切開された脊髄から調製した。細胞を、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補充された血清を含まないＮ２培地中でポリ−ｌ−オルニチン被覆されたプラスチック組織培養ウェル上で細胞６×１０５個／ｃｍ2でプレート培養した（ボッテンシュタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５１４−５１７、１９７９）。培養物を、５％ＣＯ2／９５％空気の加湿雰囲気中３７℃で４８時間インキュベーションした。ＣｈＡＴ活性を、マクマナマン（ＭｃＭａｎａｍａｎ）ら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２５：３１１−３２０、１９８８）およびグリックスマン（Ｇｌｉｃｋｓｍａｎ）ら（上記）に従ったフォンナム（Ｆｏｎｎｕｍ）の手順（フォンナム（Ｆｏｎｎｕｍ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２４：４０７−４０９、１９７５）の変法を使用して、２日後にインビトロで測定した。
ラット脊髄運動ニューロンを使用する生存アッセイ
選択されたＫ−２５２ａの３’−エピマー誘導体を、ラット脊髄運動ニューロンにおける生存増強活性についてアッセイした。化合物ＸＩＶは脊髄運動ニューロンの生存を有意に高めた（図８）。
【００５５】
脊髄を、胚齢（Ｅ）１４．５−１５のシュプラグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット胎児（チャールズ  リバー  ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マサチューセッツ州ウィルミントン）から切り出した。脊髄の腹側部分のみからの細胞を解離し、そして６．５％段階メトリザミド勾配上での遠心分離により運動ニューロンについてさらに濃縮し、そして低親和性ニューロトロフィンレセプター抗体（ＩｇＧ−１９２、ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））で染色することにより純度について分析した。細胞を、ポリ−ｌ−オルニチンおよびラミニン（それぞれ５μｇ／ｍｌ）で既に被覆された９６穴プレート上に、細胞６×１０4個／ｃｍ2の密度で、化学的に定義された血清を含まないＮ２培地（ボッテンシュタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）とサト（Ｓａｔｏ）、１９７９）中で植え付けた。生存の効果と付着を区別するため、３，９−ビス［（エチルチオ）メチル］−Ｋ−２５２ａ（金子（Ｋａｎｅｋｏ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ４０：１８６３−１８６９、１９９７）を、１〜３時間の初期付着期間の後に培養物に添加した。
【００５６】
ニューロンの生存を、蛍光定量的生存率アッセイ（ボジツコ・コイネ（Ｂｏｚｙｃｚｋｏ−Ｃｏｙｎｅ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．５０：２０５−２１６、１９９３）でカルセインＡＭ（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージーン）により４日後に評価した。培養培地を、ダルベッコのリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）で連続的に希釈した。６μＭの最終濃度のカルセインＡＭストックを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションし、次いでＤＰＢＳで連続的に希釈洗浄した。蛍光シグナルを、プレート読取り蛍光定量器（サイトフルオル（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）２３５０）（励起＝４８５ｎｍ；発光＝５３８ｎｍ）を使用して読み取った。各プレートについて、カルセインＡＭを受領するがしかし細胞を含有しないウェルから生じた平均の背景を全部の値から差し引いた。蛍光シグナルの直線性を、細胞密度の範囲での濃度およびインキュベーション時間について確かめた。ニューロンの顕微鏡での計数は相対的蛍光値と直接相関した。
化合物Ｖの製造
化合物ＩＶｂ（米国特許第４，９２３，９８６号）をトリメチルホスファイト（２ｍＬ）に溶解し、そして３時間還流下に加熱した。反応混合物を室温に冷却し、そして、クロロホルム−メタノール（２０：１）を使用してフラッシュシリカゲルカラムを通して洗い流してトリメチルホスファイトを除去した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；酢酸エチル：ヘキサン；１：１）により精製して化合物Ｖを淡黄色固形物（１５ｍｇ、９５％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ４０６（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．６２（ｓ、３Ｈ）、２．８５（ｄ、１Ｈ）、３．３７−３．４５（ｍ、１Ｈ）、４．９５（ｓ、１Ｈ）、５．００（ｓ、２Ｈ）、５．０９（ｓ、１Ｈ）、６．２９（ｓ、１Ｈ）、６．９０（ｄ、１Ｈ）、７．３３−７．５３（ｍ、５Ｈ）、７．９１（ｄ、１Ｈ）、９．４１（ｄ、１Ｈ）。
化合物ＶＩの製造
窒素下、０℃の化合物Ｖ（１６１ｍｇ、０．３９７ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（８ｍＬ）溶液に、ＢＨ3 ＴＨＦ（１．５９ｍＬの１Ｍ溶液、１．５９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、そしてその後一夜室温に温めた。混合物を０℃に再冷却し、そして１０％ＮａＯＨ（０．１ｍＬ）を気体の活発な発生を伴い添加した。過酸化水素（８０ｍＬ）をその後一滴ずつ添加した。０℃で３０分間攪拌した後に、反応を酢酸エチル（１５ｍＬ）で希釈し、そして水（３×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして淡緑色固形物まで真空中で濃縮した。生成物をクロマトグラフィー（シリカゲル：ヘキサン：酢酸エチル；１：１）により精製して化合物ＶＩを白色固形物（０．１２ｇ、７１％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ４２４（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．５４（ｓ、３Ｈ）、２．５１（ｍ、１Ｈ）、２．９９−３．０１（ｍ、２Ｈ）、３．４７（ｍ、１Ｈ）、３．８（ｍ、１Ｈ）、５．０４９（ｓ、２Ｈ）、６．２１（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、６．９８（ｍ、１Ｈ）、７．１３−７．４９（ｍ、６Ｈ）、７．９４−８．０２（ｍ、２Ｈ）、９．３４（ｄ、１Ｈ）。
化合物ＶＩＩの製造
室温で窒素下の化合物Ｖａ（ＴＢＤＭＳ−Ｖ）（３５０ｍｇ、０．６７３ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．４３５ｍＬ、５．３９ｍｍｏｌ）、次いで四酸化オスミウム（６．７３ｍＬ、０．６７３ｍｍｏｌ、ＣＣｌ4中０．１Ｍ）を添加した。反応混合物を室温で３６時間攪拌した。この時間の間に混合物は色を黄色から橙褐色まで変化させた。水性重亜硫酸ナトリウム（３０ｍＬ）を反応混合物に添加し、そして反応を３０分間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で濃縮して淡褐色薄膜を得た。混合物を、酢酸エチルを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物ＶＩＩａ（ＴＢＤＭＳ−ＶＩＩ）を黄色固形物（２８０ｍｇ、７６％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ５４４（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ０．５６（ｄ、６Ｈ）、１．０７９（ｓ、９Ｈ）、２．０４（ｄｄ、１Ｈ）、２．１２（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、２．４０（ｓ、３Ｈ）、２．８６（ｄｄ、１Ｈ）、３．５２（ｂｒｏａｄ  ｓ、３Ｈ）、４．９９（ｓ、２Ｈ）、６．９８（ｄｄ、１Ｈ）、７．３２（ｔ、１Ｈ）、７．３９−７．４６（ｍ、４Ｈ）、７．９７（ｄｄ、２Ｈ）、９．３５（ｄ、１Ｈ）。
【００５７】
０℃で窒素下のメタノール（２ｍＬ）を含有するフラスコに塩化アセチル（４滴）を添加した。メタノール（１ｍＬ）中の化合物ＶＩＩａ（４０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）をメタノール性ＨＣｌの溶液に一滴ずつ添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、その後一夜室温に温めた。溶媒を真空中で除去して化合物ＶＩＩを黄褐色固形物（２１ｍｇ、６６％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ４４０（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．０５２（ｄｄ、１Ｈ）、２．４３（ｓ、３Ｈ）、２．９０（ｄｄ、１Ｈ）、３．５７（ｓ、１Ｈ）、３．６１（ｓ、２Ｈ）、５．０４（ｓ、２Ｈ）、６．２８（ｓ、１Ｈ）、７．０２（ｄｄ、１Ｈ）、７．３３−７．５４（ｍ、６Ｈ）、７．９５（ｄ、１Ｈ）、８．０２（ｄ、１Ｈ）、９．３２（ｄ、１Ｈ）。
化合物Ｘの製造
０℃で窒素下の中間体ＶＩＩａ（図２；０．２３ｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（５７．９ｍｌ、０．４１５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２５．４ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）および塩化ｐ−トルエンスルホニル（７９．１ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌した。それをその後一夜室温にゆっくりと昇温した。反応混合物を、薄層クロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル、２：１）によりモニタリングする一方で１時間加温した。反応混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、そして水（３×１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で濃縮してトシル中間体ＶＩＩＩａを黄色薄膜として得た。反応混合物を、ヘキサン：酢酸エチル（２：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製して淡黄色薄膜（０．１６ｇ、５５％収率）を得た。ＭＳ（ＡＰＣＩ）：ｍ／ｅ  ７０８（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ０．５７（ｄ、６Ｈ）、１．０８（ｓ、９Ｈ）、２．０１（ｄｄ、１Ｈ）、２．３３（ｓ、３Ｈ）、２．４２（ｓ、３Ｈ）、３．８８（ｄｄ、１Ｈ）、３．８６（ｄｄ、２Ｈ）、４．９８（ｓ、２Ｈ）、６．９７（ｄｄ、１Ｈ）、７．１４（ｄ、２Ｈ）、７．２４−７．４９（ｍ、７Ｈ）、７．７５（ｄ、１Ｈ）、７．９１（ｄ、１Ｈ）、９．３５（ｄ、１Ｈ）。
【００５８】
０℃で窒素下の中間体ＶＩＩＩａ（０．１４ｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に水素化ナトリウム（１５．８ｍｇ、０．３９５ｍｍｏｌ）を添加した。気体の活発な発生が観察され、そして反応混合物が曇ったようになった。追加の水素化ナトリウム（２等量）を添加し、そしてフラスコの内容物をさらに２時間攪拌し、その後穏やかに４時間加温した。反応混合物をその後０℃に冷却し、そして水でクエンチした。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、そして水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で濃縮して化合物ＩＸａを黄色薄膜（１００．２ｍｇ、９５％収率）として得た。ＭＳ（ＡＰＣＩ）：ｍ／ｅ  ５３６（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ０．５６（ｄ、６Ｈ）、１．０８（ｓ、９Ｈ）、２．３２−２．３８（ｍ、４Ｈ）、２．５７（ｄ、２Ｈ）、３．０１（ｄｄ、１Ｈ）、４．９９（ｓ、２Ｈ）、７．０１（ｄ、１Ｈ）、７．３３−７．５６（ｍ、５Ｈ）、７．７３（ｄ、１Ｈ）、７．９４（ｄ、１Ｈ）、９．４６（ｄ、１Ｈ）。
【００５９】
０℃で窒素下の化合物ＩＸａ（１００ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、水素化トリエチルホウ素リチウム（０．３７ｍＬ（ＴＨＦ中１Ｍ溶液）、０．３７４ｍｍｏｌ）を、気体の発生を伴いながら一滴ずつ添加した。追加の水素化トリエチルホウ素リチウム（２等量）を０℃で添加し、そして反応を０℃で３０分間攪拌し、そしてその後室温に温めた。反応混合物を０℃に冷却し、そして水でクエンチし、酢酸エチルで希釈し、そして水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で濃縮した。反応混合物を、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｘａ（Ｒ＝ＴＢＤＭＳ）を淡黄色薄膜として得た。０℃で窒素下の化合物Ｘａの攪拌されたメタノール溶液に、メタノール中塩化アセチル（５滴）から作成された溶液を添加した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、その後一夜室温に温めた。溶媒を真空中で除去して黄色固形物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル；１：１）により精製して化合物Ｘ（３０ｍｇ、４２％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ４２４（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ１．３９（ｓ、３Ｈ）、２．２９（ｄｄ、１Ｈ）、２．３７（ｓ、３Ｈ）、２．９１（ｄｄ、１Ｈ）、５．０５（ｓ、２Ｈ）、６．１９（ｓ、１Ｈ）、６．９７（ｔ、１Ｈ）、７．３２−７．５０（ｍ、５Ｈ）、７．７８（ｄ、１Ｈ）、７．９５（ｄ、１Ｈ）、９．３３（ｄ、１Ｈ）。
化合物ＸＩＶおよびＸＶの製造
窒素下のケトンＸＩ（米国特許第４，９２３，９８６号）（図５；４５１ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）の攪拌されたＣＨ2Ｃｌ2−ジオキサン混合（６ｍＬ；５：１）溶液に、シアン化テトラブチルアンモニウム（７４０ｍｇ、２．７７ｍｍｏｌ）および酢酸（９５ｍＬ、１．６６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。黒ずんだ反応混合物を２４時間攪拌し、そしてその後真空中で濃縮した。黒ずんだ油状物を酢酸エチル（２０ｍＬ）およびジオキサン（２ｍＬ）に溶解し、そして水（３×１０ｍＬ）および塩水（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で褐色固形物まで濃縮した。ＨＰＬＣ分析は２種のシアノヒドリン中間体ＸＩＩａおよびＸＩＩＩｂの存在を示した。
【００６０】
メタノール（４ｍＬ）を含有するフラスコにＨＣｌ（ｇ）を１０分間添加した。段階１からの粗シアノヒドリン混合物（４５０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）のメタノール：ジオキサン（２：１、３ｍＬ）溶液を、０℃でメタノール溶液中のＨＣｌに添加した。反応混合物を封止し、そして０℃で２時間攪拌し、その後冷蔵庫中に４８時間置いた。フラスコを室温に温め、そして６ＮＨＣｌを慎重に添加した。混合物を３０分間攪拌し、そしてその後乾固まで濃縮した。残渣を５０％メタノール：水に溶解し、そして室温で一夜攪拌する一方で沈殿物が生じた。反応混合物を乾固まで濃縮した。残渣を、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物ＸＩＶを灰白色固形物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ４６８（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．４１６（ｓ、３Ｈ）、２．７７（ｄｄ、１Ｈ）、２．９１（ｓ、３Ｈ）、２．９５２（ｄｄ、１Ｈ）、４．９９（ｓ、２Ｈ）、７．１３（ｄｄ、１Ｈ）、７．３３（ｔ、１Ｈ）、７．４４（ｄｄ、２Ｈ）、７．６４（ｔ、２Ｈ）、７．９８（ｄ、１Ｈ）、９．１６（ｄ、１Ｈ）。カラムを酢酸エチルで溶出して、アミドＸＶを淡橙色生成物（１３ｍｇ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ  ４５３（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、３００ＭＨｚ）δ２．３３（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｍ、２Ｈ）、４．９４（ｓ、２Ｈ）、６．５８（ｓ、１Ｈ）、７．１９−７．６４（ｍ、６Ｈ）、７．８１（ｍ、３Ｈ）、７．９６（ｄ、１Ｈ）、８．５９（ｓ、１Ｈ）、９．１７（ｄ、１Ｈ）。
化合物ＸＸＩＩＩの製造
−７８℃の窒素下のケトンＸＩａ（図６；Ｒ＝ＴＢＤＭＳ）（９５．４ｍｇ、０．１８３ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（５ｍＬ）溶液にジエチルアミドリチウム（０．１２ｍＬ、シクロヘキサン中１．５Ｍ溶液）を添加した。反応混合物を−７８℃で３０分間攪拌した。Ｎ−フェニルトリフルオロメタンスルホンイミド（７１．９ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１．５ｍＬ）溶液を反応混合物に一滴ずつ添加し、そして混合物を−７８℃で３０分間攪拌した。反応混合物を０℃に温め、１時間攪拌し、その後一夜室温に温めた。反応を塩化アンモニウム（飽和水性、２ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチルで希釈し、そして水で洗浄した。混合物を、ヘキサン：酢酸エチル（２：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物ＸＸＩＩａ（Ｒ＝ＴＢＤＭＳ）を灰白色固形物（６６ｍｇ、６１％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ６５４（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ０．５８（ｓ、６Ｈ）、１．１２（ｓ、９Ｈ）、２．６６（ｓ、３Ｈ）、５．０２（ｄｄ、２Ｈ）、６．１４（ｓ、１Ｈ）、７．３１−７．６２（ｍ、６Ｈ）、７．８３（ｄ、１Ｈ）、７．９８（ｄ、１Ｈ）、９．４４（ｄ、１Ｈ）。
【００６１】
段階１からの生成物（化合物ＸＸＩＩａ）（７５ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、塩化リチウム（１４．６ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．６ｍｇ、０．００２３ｍｍｏｌ）を添加した。水素化トリブチルスズ（３７ｍＬ、０．１３９ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加し、そして内容物を６０℃に加熱した。反応混合物を４時間加熱し、その時間の間に反応の色が黄色から赤黒色に変化した。反応を真空中で濃縮し、そしてヘキサン：酢酸エチル（２：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。２種の生成物、すなわちトリブチルスズが混じったＴＢＤＭＳで保護されたＸＸＩＩＩａ生成物（６０ｍｇ）および脱保護された生成物ＸＸＩＩＩ（１０ｍｇ、２２％）を単離した。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ  ３９２（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．６５（ｓ、３Ｈ）、４．９７８（ｓ、２Ｈ）、６．１９（ｄ、１Ｈ）、６．２８（ｄ、１Ｈ）、６．４１（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．６２（ｍ、５Ｈ）、７．６５−７．６９（ｍ、１Ｈ）、７．８７（ｄｄ、２Ｈ）、９．３９（ｄ、１Ｈ）。
【００６２】
化合物ＸＸＩＩＩは上述されたアッセイで以下のＩＣ50値を示した。すなわち、ｔｒｋＡキナーゼの阻害、４ｎＭ；ＶＥＧＦレセプターキナーゼの阻害、２５ｎＭ、およびプロテインキナーゼＣの阻害、＞１０００ｎＭ。
化合物ＸＸＶの製造
室温で窒素下の、化合物ＸＩＶ（３０．４ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１１．６ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応混合物は当初色が淡橙色であり、そして徐々に淡紫色になった。反応混合物を室温で一夜攪拌した。溶媒を真空中で除去し、そして、固形物を、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。化合物ＸＸＶを灰白色固形物（３１．２ｍｇ、８８％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ  ５４７（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．４２（ｓ、３Ｈ）、２，７７−２．８３（ｍ、１Ｈ）、２．８６（３Ｈ、ｓ）、３．１６６（ｄｄ、１Ｈ）、４．１０５（ｓ、１Ｈ）、５．０７（ｓ、２Ｈ）、６．３９（ｓ、１Ｈ）、７．０１（ｄｄ、１Ｈ）、７．９５（ｄ、１Ｈ）、７．５８（ｄ、１Ｈ）、７．３４−７．５７（ｍ、４Ｈ）、９．５０（ｓ、１Ｈ）。
化合物ＸＸＩＸの製造
【００６３】
【化１０】
0004405667.tif 000012
【００６４】
方法Ａ
０℃で窒素下の、エポキシドＸＸＶＩＩＩ（米国特許第４，９２３，９８６号、化合物Ｉ−２７）（９０．１ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に、水素化トリエチルホウ素リチウム（ＴＨＦ溶液中１Ｍの０．４５５ｍＬ、０．４５５ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、その後一夜室温に温めた。混合物を０℃に冷却し、そしてメタノールのゆっくりの添加によりクエンチした。攪拌を０℃で１５分間継続し、その後に反応混合物を室温に昇温した。溶媒を真空中で除去した。黄色油状物を生じた。この油状物を、酢酸エチル：ヘキサン（１：１）を使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。化合物ＸＸＩＸを白色固形物（７５ｍｇ、８３％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ  ４２４（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ１．６９（ｓ、３Ｈ）、１．９９（ｓ、３Ｈ）、２．８６（ｄｄ、１Ｈ）、３．０３（ｄｄ、１Ｈ）、４．３７（ｍ、３Ｈ）、４．９３（ｓ、２Ｈ）、６．４３（ｔ、１Ｈ）、６．９５（ｄ、１Ｈ）、７．０３（ｔ、１Ｈ）、７．１８（ｔ、１Ｈ）、７．４４（ｔ、１Ｈ）、７．７９（ｄ、１Ｈ）、７．９９（ｄ、１Ｈ）、８．６９（ｄ、１Ｈ）。
方法Ｂ
０℃で窒素下のケトンＸＩ（図３、Ｒ＝Ｈ）（２１２ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（６ｍＬ）溶液に、ヨウ化メチルマグネシウム（０．２７ｍＬ、０．８２ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、その後一夜室温に温めた。混合物をその後還流下に２４時間加熱し、その後室温に冷却した。反応を塩化アンモニウム（飽和水性）でクエンチし、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、そして水（３×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で黄色残渣まで濃縮した。生成物を、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物ＸＸＩＸを黄褐色固形物（０．１１ｇ、５０％収率）として得た。1Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析スペクトルのデータは方法Ａから得られた生成物のデータと一致した。
【００６５】
他の態様は請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  発明にかかる、既知のインドロカルバゾールＩＩＩａからの３’−エピマーであるインドロカルバゾールＶＩおよびＶＩＩの合成の略図である。
【図２】  発明にかかる、図１に示されるとおり製造された３’−エピマーであるインドロカルバゾールＶＩＩからの３’−エピマーであるインドロカルバゾールＸの合成を示す図面である。
【図３】  発明にかかる、中間体ケトンＸＩａからの３’−エピマーであるインドロカルバゾールＸＩＩａ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩの合成を示す図面である。
【図４】  発明にかかる、中間体エポキシドＩＸａからの３’−エピマーであるインドロカルバゾールＸＩＸの合成を示す図面である。
【図５】  発明にかかる、中間体ケトンＸＩからの３’−エピマーであるインドロカルバゾールＸＩＸの代替の合成を示す図面である。
【図６】  発明にかかる、中間体ケトンＸＩからのエピマーである３’−ヒドロキシインドロカルバゾールＸＸＶＩＩの合成、および、代替の既知の３’−ヒドロキシインドロカルバゾールＸＸＶＩのエピマー化によるエピマーである３’−ヒドロキシインドロカルバゾールＸＸＶＩＩの合成を示す図面である。
【図７】  発明にかかる、対応する３’−エピマーであるインドロカルバゾールＸＩＶからの環が臭素化された３’−エピマーであるインドロカルバゾールＸＸＶの合成を示す図面である。
【図８】  発明にかかる、運動ニューロンについて濃縮された培養物でのニューロンの生存に対する化合物ＸＩＶの効果を決定するための実験からのデータを要約するグラフである。細胞生存率（対照のパーセントとして）が細胞培養培地中の化合物ＸＩＶの濃度に対してプロットされる。
【図１】
0004405667.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４−５】
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【図６−７】
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【図８】
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