(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノプロテインＰおよび／またはセレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列からなる細胞障害抑制活性を示すペプチドを主要構成成分とする、運動失調を主たる病態とする神経変性疾患（虚血・再潅流または老化に起因する神経変性疾患を除く）治療剤。
【請求項２】
次式：Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（式中、Xaaはセレノシステインを表す)（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを主要構成成分とする、運動失調を主たる病態とする神経変性疾患（虚血・再潅流または老化に起因する神経変性疾患を除く）治療剤。
【請求項３】
神経変性疾患が脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）である、請求項１ に記載の神経変性疾患治療剤。
【請求項４】
神経変性疾患が脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）である、請求項２に記載の神経変性疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は医療用医薬品の分野に関し、血漿蛋白質の新たな用途に関する。さらに詳細には、運動失調症等をもたらす神経変性疾患に対する医薬品に関し、血漿蛋白質の一種であるセレノプロテインＰを、好適には当該セレノプロテインＰのＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群を主たる有効成分として含有する神経変性疾患治療剤に関する。
背景技術
神経変性疾患は、運動機能の低下（運動失調）等をもたらすことが知られている。神経変性疾患の例としてはアルツハイマー老年痴呆症、若年性アルツハイマー痴呆症、ピック病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、進行性核上麻痺、難治性てんかんなどが一般に知られている。
運動失調をきたす神経中枢性障害を部位別に分類列挙すると、大脳（前頭葉）性、小脳性、前庭（迷路）性および脊髄性の運動失調症がある。大脳性運動失調症では大脳皮質、殊に前頭葉性の障害が考えられ、脳血管障害性病変、脳萎縮、外傷、腫瘍、ピック病をはじめ慢性硬膜下血腫などでしばしば問題となる。また、失調性歩行のほか精神機能の低下を示す。小脳性運動失調症は、小脳障害すなわち小脳腫瘍、血管性障害、変性性疾患、小脳萎縮、奇形などに伴う重要な症状で、小脳虫部の損傷では主として体幹性失調をきたし、起立歩行の障害・蹣跚歩行、大歩行を示し、一般に姿勢、体位保持が困難で平衡バランス障害をきたす。
それに反し、小脳半球性障害では四肢筋トーヌスの異常、筋緊張の低下を示し、患側方向への偏位歩行、協調運動不能、誤示（指−指、指−鼻試験）、運動測定障害、ホームズ・スチュアート現象のほか、企図振戦や小脳性言語（断続性・爆発性）を伴う。前庭（迷路）性失調症では、前庭機能障害に由来し、原因としてその多くは耳科的、内耳性障害性疾患の存在あるいは後遺症としてみられる。例えば、メニエール病、突発性難聴、ストレプトマイシンやカナマイシンなどの薬物中毒による平衡神経の障害、外傷、梅毒、音響外傷、耳硬化症、内耳炎（およびその続発症）が挙げられる。脊髄性運動失調症は、別名、後索性運動失調症と呼称するごとく、脊髄後索障害により深部感覚の障害すなわち、位置覚、関節覚、握覚の障害により失調をきたすものである。フリードライヒ運動失調症、亜急性脊髄連合変性症、脊髄癆などで特徴的にみられる。
例えば、運動失調症を主症状とする疾患として脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）が知られているが、これは、原因不明の神経変性疾患の総称である。臨床的には小脳性ないしは後索性の運動失調を主症状とする。運動失調症状が徐々に出現し、緩徐に進行する経過をとる。運動失調、体幹運動失調、協調運動障害のみ呈する場合もあるが、それ以外の症状を呈する場合が少なくなく、他の症状として、小脳性言語障害、例えば筋固縮や無動などのパーキンソニズムを中心とする錐体外路徴候、腱反射亢進や時に病的反射を見る錐体路徴候、眼振や不髄意運動（末梢神経症状）、起立性低血圧や排尿障害を中心とする自律神経症状、頻度は少ないが病型によっては認められる知能障害などを示すものがある。従って、ＳＣＤは運動失調症状を呈する神経変性症疾患を代表していると位置づけることができる。
ＳＣＤにおける主要病変部位による分類では、１）小脳型（小脳皮質に病変を有するＨｏｌｍｅｓ型など）、２）脊髄小脳型（Ｍｅｎｚｅｌ型オリーブ・橋・小脳萎縮症など）、３）脊髄型（フリードライヒ運動失調症、遺伝性痙性失調症など）に分けられている。運動失調症調査研究班による臨床統計によると、１９９０年の段階で本邦の脊髄小脳変性症の頻度は１０万人当たり約７〜１０人程度であり、そのうち約６０％は弧発性すなわち非遺伝性症例であり、４０％が遺伝性症例であるという。弧発性の中でその多くはオリーブ橋小脳萎縮症であり、したがって全脊髄小脳変性症の中でそれが最も多いことになる。一方、遺伝性症例の中では、従来はＭｅｎｚｅｌ型遺伝性運動失調症とされる病型が多かったが、最近の遺伝子診断が確実に行われるようになり、マシャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）が最も多いことがわかってきた。一方、オリーブ橋小脳萎縮症など弧発性の病型の病因は全く不明である。このように、遺伝子から病因を解明していく研究が盛んになっているが、小脳あるいは小脳と関連した神経細胞群が選択的に死に至る理由はまだ明らかになっていない。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
脊髄小脳変性症の運動失調症状に対する唯一の薬剤が、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＴＲＨ）酒石酸塩の静脈または筋肉内投与製剤（ヒルトニン）である。作用メカニズムはほとんど解明されていないが、初期や軽症の場合、歩行失調、構音障害、運動速度などが改善する場合もあるとされている。しかしながら、その効果は１時間程度といわれ、治療効果は余り高いとはいえない。また、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の分泌促進作用もあるので、その副作用が懸念されている。最近、ＴＳＨの分泌促進作用を抑えたＴＲＨ−Ｔ誘導体経口製剤（セレジスト）が開発されたが、ローリングマウスナゴヤ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｍｏｕｓｅ  Ｎａｇｏｙａ）を用いた実験では、腹腔内投与でＴＲＨが１時間程度、ＴＲＨ改変体が３時間程度と有効時間が３倍に延長されたに過ぎず、２〜３週間連日投与し、２〜３週間の休薬期間を取る基本的な投与パターンはあまり変わっていない。それ以外は対症療法が主体になり、例えば、手の震えなどのパーキンソニズムにはパーキンソン病治療薬、起立性低血圧などの自律神経症状には自律神経調整薬が使用されている。このような現状は、前述の運動失調症状を呈する様々な疾患でも同様で、運動失調症状を改善する有効な治療薬はほとんど知られていない。従って、運動失調等を主たる病態とする神経変性疾患に対してより効果の高い新規な神経変性疾患治療剤が切望されている。
（その解決方法）
上述の状況の下、本願発明者らは先に、血液成分由来の蛋白質であるセレノプロテインＰに、そしてより好適な態様として当該セレノプロテインＰのＣ末端側ペプチドに、従来報告されていなかった細胞死抑制活性が認められることを見出し、この知見を基に特許出願した（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０６３２２）。さらに、本願発明者らは、新たな神経変性疾患治療剤を提供すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに従来試みられることのなかった前記セレノプロテインＰまたはそのＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群が、モデル動物での実際の生体内投与によって、神経変性疾患治療剤としてヒトその他の動物に充分に適用できる事実を見出し、この知見に基づいて本願発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明は、セレノプロテインＰおよび／または当該蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群を主要構成成分とする神経変性疾患治療剤に関する。
本願発明の好ましい態様において、前記蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群は、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有する細胞障害抑制活性を示すペプチドまたは当該ペプチド群である。
本願発明のさらに好ましい態様において、前記蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群は、次式：Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ（式中、Ｘａａはセレノシステインを表す）（配列番号１）で表されるアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記いずれかのアミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群である。
発明を実施するための最良の形態
セレノプロテインＰは１９７７年にグルタチオンペロキシダーゼ
（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）とは異なるセレン含有タンパク質として確認され、１９８２年にセレンがセレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）の形態で取り込まれていることが明らかにされた。さらに、１９９１年にセレノプロテインＰのｃＤＮＡのクローニングにより全長のアミノ酸配列が明らかにされ、その結果、当該蛋白質は最大１０個のセレノシステインを含む可能性等が示された（Ｈｉｌｌ  Ｋ．Ｅ．およびＢｕｒｋ  Ｒ．Ｆ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．，１０，ｐ．１９８−２０８（１９９７））。セレノプロテインＰの機能はほとんど不明であったが、最近、インビトロの系でｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅやｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅの還元活性、神経細胞のｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒとしての作用が見出された。
具体的な事例として、神経変性疾患に分類されている脊髄小脳変性症のモデルマウスであるローリングマウスナゴヤを用いたセレノプロテインＰの腹腔内投与実験において、セレノプロテインＰ投与群に転倒指数（転倒回数／自発運動）の減少効果が認められ、運動失調症の改善作用があることが判明した。これらのことから、セレノプロテインＰが運動失調症を主たる病態とする神経変性疾患に対する治療効果を有していることが示された。
本願発明は、セレノプロテインＰの前記知見に基づく新たな薬効に関するものであり、本願発明の神経変性疾患治療剤の本態はセレノプロテインＰである。さらに詳細には、セレノプロテインＰの中のセレンを含むセレノシステインに特徴があり、このアミノ酸が運動失調改善作用の中心アミノ酸であると思われる。本願発明者らは、すでに、血液成分由来の蛋白質であるセレノプロテインＰのＣ末端側ペプチド断片に従来報告されていなかった細胞死抑制活性が認められることを見出し、特許出願している。この活性にも、含有されるセレノシステインが関与していることが明らかである。従って、セレノシステインを含み細胞死抑制活性を持つ蛋白質および／またはペプチド群は、神経変性疾患治療剤の候補となりうる。
そもそも、本願発明に関係するセレンは、微量必須元素の一つであり、それが欠乏した場合には心筋症などを伴う重篤な欠乏症が知られている。また、無血清培養の培地に亜セレン酸ナトリウムの添加が必須であることから、セレンが細胞レベルでの生存維持・増殖に必須であることが示されている。しかしながら、セレン化合物が毒物指定されていることから理解されるように、有効量と危険量の幅、つまり安全域の濃度幅が狭く、適量以上のセレン化合物は一般的には細胞にとって毒性を示し、逆に細胞死を誘導する。例えば、セレンの急性中毒症状として、顔面蒼白、神経症状、神経障害、皮膚炎、胃腸障害などが知られている。また、細胞培養にセレノシステインの２量体であるセレノシスチンを添加すると、単独ではかなり強い毒性を示す。
これに対して、本願発明の好適な態様であるセレノプロテインＰ、セレノプロテインＰのＣ末端側断片は、その構造中に９〜１０個のセレノシステインを含むにも拘わらず、強い毒性は観察されなかった。このことから、本願発明の薬効作用を示すセレノプロテインＰの特徴として、セレノシステインを含み、なおかつ毒性が減弱していることが重要と思われる。実際に、セレノプロテインＰアミノ酸配列由来の４〜１４アミノ酸のセレノシステインを含有した合成ペプチドにおいてもセレノシスチンが毒性を示す濃度において毒性を示すことはなかった。本願発明のペプチドまたは当該ペプチド群は、毒性の低減というセレン化合物に対する命題を克服するのみならず、予期し得ない運動失調改善作用をもたらすことを可能とするものである。
ここで用いられるセレノプロテインＰに特段の制約はなく、所望の運動失調改善活性を有するものであれば如何なる分子形態のものをも包含する。すなわち、完全分子型セレノプロテインＰをはじめ種々の分子形態のものが対象となり得る。この中で、好適な態様はセレノプロテインＰのＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群であり、中でもＣ末端側１０３個（２６０位から３６２位まで）のアミノ酸配列、当該アミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列、または前記アミノ酸配列をその一部として含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群は、とりわけ好適な態様として推奨され得る。アミノ酸置換に関しては、とりわけＣｙｓがＳｅｒに置換された態様のものが望ましい。
本願発明において最も好適なペプチドは、次式：Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ（式中、Ｘａａはセレノシステインを表す）（配列番号１）で表されるアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記いずれかのアミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するものである。
本明細書において「当該ペプチド群」とは、セレノプロテインＰのアミノ酸配列に由来する少なくとも１個のセレノシステインを含む４〜１４個程度のアミノ酸配列または１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列を含むペプチドであって、糖鎖の有無、荷電の相違、断片化の多様性等に起因する微細構造の異なるペプチドの集合体を意味する。すなわち、本願発明のセレノプロテインＰおよびペプチド群は、セレノプロテインＰのアミノ酸配列に由来し、運動失調改善活性を有するものであればその分子形態に特段の制約はなく、これらには完全分子型のセレノプロテインＰをはじめこれに起因するＣ末端側ペプチド等が含まれる。このような本願発明のペプチドは、ペプチド合成機を用いて常法に従って調製することもできるし、また、本願発明のペプチドをリード物質として、化学合成物をデザインすることも可能である。
本願発明に使用されるセレノプロテインＰまたは当該蛋白質に由来するペプチドもしくはペプチド群を製造する方法は特に限定されるものではないが、例えばヒト血液より分離する方法、または遺伝子組換え技術により製造することができる。本願発明に使用される神経変性疾患治療剤の主要構成成分となるセレノプロテインＰまたは当該蛋白質に由来するペプチドもしくはペプチド群は、一般的な酵素類よりも熱、変性剤、幅広いｐＨ、血中のプロテアーゼに対して安定であるため、これを精製同定するに際しては、一つの態様として、血漿を出発原料とし種々のクロマトグラフィー工程、例えば、ヘパリンクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗体カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー等、適用可能な種々の担体を用いた分画方法の他、硫酸アンモニウム沈殿分画、分子量膜分画、等電点分画、電気泳動分画等、種々の分画法が利用可能である。これらの分画法を組み合わせることにより、所望のセレノプロテインＰまたはペプチドもしくはペプチド群を分画することが可能である。好ましくは、例えば当該ペプチドまたはペプチド群に対して、順に、ヘパリンクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿分画、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。
本願発明に使用される神経変性疾患治療剤の主要構成成分となるセレノプロテインＰまたは当該蛋白質に由来するペプチドもしくはペプチド群はまた、当該蛋白質に対する抗体を適当な担体に結合させ、これを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。かかるアフィニティークロマトグラフィーと上記陽イオン交換クロマトグラフィーとを用いた望ましい態様の例を調製例１に示す。
本願発明では、有効成分としての当該蛋白質またはペプチドもしくはペプチド群と公知の適当な賦形剤を組み合わせ、公知の方法で本願発明の神経変性疾患治療剤とすることができる。本願発明の神経変性疾患治療剤の有効投与量は、投与対象者の年齢、症状および重症度などにより変動し、最終的には医師の意図により変動する。薬効は投与方法には依存しないが、皮下、皮内、腹腔への投与、血管内への単回（ボーラス）投与あるいは点滴投与などが最適である。また、分子量の小さなペプチド群の場合は、経口投与や経皮投与なども可能である。
本願発明の神経変性疾患治療剤の投与対象は、神経変性疾患全般に対して適用可能であるが、とりわけ運動失調（運動機能機能の低下）を主たる病態とする神経変性疾患に対して特に有効である。神経変性疾患治療剤として本願発明のセレノプロテインＰまたはこれに由来するペプチドもしくはペプチド群を主要構成成分として含有する薬剤を使用する場合、本薬剤を単独で投与することもできるし、他の治療薬剤との併用投与も効果を増大させるための有効な手段として期待できる。
以下、調製例および実施例に沿って本願発明をさらに詳細に説明するが、これらは本願発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、以下に示す調製例および実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製の試薬を使用した。
調製例１
（セレノプロテインＰに対する抗体結合担体（抗ＳｅＰ抗体カラム）を用いたセレノプロテインＰ断片の精製）
以下に記載するように、セレノプロテインＰの有する細胞死抑制活性を指標にセレノプロテインＰおよびセレノプロテインＰ断片を血漿から精製した。
血漿中のヘパリンセファロース結合画分を２Ｍ硫酸アンモニウムにより沈殿させ、その沈殿画分に対して５倍以上の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）により沈殿を溶解させた。この溶液に存在するセレノプロテインＰを、セレノプロテインＰ断片に対する抗体結合担体（抗ＳｅＰ抗体カラム）に結合させ、ＰＢＳで洗浄した。その後、４Ｍ尿素を含有する２０ｍＭクエン酸バッファーによりセレノプロテインＰを溶出し、２０ｍＭクエン酸バッファーで平衡化した陽イオン交換体（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ：ＢｉｏＲａｄ）に結合させた。これを塩化ナトリウムによる塩濃度勾配溶出を行い、細胞死抑制活性を示す画分を回収した。この時、全長のセレノプロテインＰも同時に得ることが可能であるが、蛋白あたりの細胞死抑制活性は明らかに弱い値を示した。本方法では、短時間の精製が可能であるため、蛋白あたりの細胞死抑制活性の強いセレノプロテインＰ断片を得ることができた。ここで得られた断片は、糖鎖の有無、分子間結合の有無、内部切断の有無などにより種々のサイズの分子種を含む混合画分であり、非還元電気泳動で１０〜３０ｋＤａのサイズを示すセレノプロテインＰ断片群であった。
調製例２
（ペプチド合成）
セレノシステインは、Ｆｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、ＭＢｚｌ（ｐ−Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）で保護したアミノ酸を合成し、ペプチド合成機を用いたＦｍｏｃ法により所望のペプチドを合成した。その後、脱保護を行ない、逆相ＨＰＬＣにより精製した。
本願発明者らは、細胞障害抑制活性を示すセレノプロテインＰ断片のアミノ酸配列：２６０Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｘａａ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ａｒｇ  Ｘａａ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｇｌｕ  Ｘａａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ３６２（式中、Ｘａａはセレノシステインを表す）（配列番号２）から還元状態で精製されたペプチド  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ（配列番号３）も細胞障害抑制活性を有することを確認した。そこで、この知見を基に以下の配列を有するペプチド断片を合成した。
0004402885.tif 000002
0004402885.tif 000003
（ペプチド１４のアミノ酸配列はペプチド６のＣ末端からＮ末端方向へのアミノ酸配列に対応する）
参考例
（細胞障害抑制活性）
細胞障害抑制活性のアッセイ系に使用するＤａｍｉ細胞（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌ．７２，ｐ．１９６８−１９７７（１９８８）に記載）を用いて、アッセイ培地（５０％ＰＢＳ／ＳＡ／０．０３％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製））またはＳＡ／０．０５％脱脂肪酸ＢＳＡ（ＷＡＫＯ社）／４μＭの長鎖多価脂肪酸（アラキドン酸、リノール酸またはリノレン酸等）により２回洗浄して３×１０４細胞／ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ウェルのみ２００μｌ、段階希釈のためのウェルには１００μｌずつを９６ウエルプレートに分注した。サンプル添加ウェルにアッセイ試料として調製例２で合成したペプチド、およびセレノシスチン、セレノメチオニン、エブセレン、亜セレン酸ナトリウムについて同一濃度の溶液を調製し、それらを２μｌ添加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウェルに対して段階希釈した。そして、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し細胞の生死を判定した。
調製例２で得られた前記ペプチドについて、細胞障害抑制活性を測定したところ、セレノシステイン含有ペプチド（ペプチド３〜ペプチド１６）は基本的に細胞障害抑制活性を有することが確認できた。この中でもＣｙｓをＳｅｒに全て置換したペプチド６が最も低濃度で効果的に細胞障害を抑制した。また、他のセレン含有物質の毒性が認められる濃度でも、ペプチド結合を有するセレノシステインの毒性は認められなかった。表２参照。
0004402885.tif 000004
（上記アミノ酸配列中、Ｕはセレノシステインを表す）
実施例１
（セレノプロテインＰのローリングマウスナゴヤの運動失調に対する作用）
セレノプロテインＰの運動失調改善作用を確認するために、運動失調モデルとして確立されているローリングマウスナゴヤの転倒指数を指標とし検討した。群構成として、対照（生理食塩水）腹腔内（０．２５ｍＬ／ｈｅａｄ／週）投与群、セレノプロテインＰ（低用量）腹腔内（０．０５ｍｇ／ｈｅａｄ／週、０．２５ｍＬ／ｈｅａｄ／週）投与群、セレノプロテインＰ（高用量）腹腔内（０．５ｍｇ／ｈｅａｄ／週、０．２５ｍＬ／ｈｅａｄ／週）投与群の各１０匹ずつを設定し、週１回、３週間にわたって投与した。
試験動物は、ローリングマウスナゴヤ（１１３匹、５〜８月齢、体重：１９．１〜３６．２ｇ）を雌雄の区別なく使用した。群分けは、測定開始日前日の体重および測定開始前に事前に測定した転倒指数を指標として行った。自発運動量は、投与直前（投与前３０〜０分）、投与直後（投与後０〜３０分）、投与後１時間（投与後６０〜９０分）、投与後３時間（投与後１８０〜２１０分）、投与後７時間（投与後４２０〜４５０分）にそれぞれ３０分間毎に自発運動測定装置にて測定した。転倒回数は、自発運動量を測定した時間帯と同一時間帯において、自発運動測定装置の上に取り付けたビデオカメラにて撮影し、カウントした。転倒指数は、転倒回数（回／３０分）÷自発運動（回／３０分）にて算出した。その結果を図１〜図３に示す（＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１：投与前値との比較で有意（ｐａｉｒｅｄｔ−ｔｅｓｔ）、＊ｐ＜０．０５：同一時間帯の対照との比較で有意（Ｔｕｒｋｅｙ  ｔｅｓｔ））。
セレノプロテインＰの高用量投与（０．５ｍｇ／ｈｅａｄ）により、投与１週目、２週目および３週目の各時間帯の転倒指数は対照群と比較して低値で推移し、投与１週目の投与後６０〜９０分に有意な低下が認められた。さらに、投与前値との比較では、投与１週目の投与後４２０〜４５０分に、投与２週目の投与後６０〜９０分、投与後１８０〜２１０分および投与後４２０〜４５０分に、投与３週目の投与後６０〜９０分において、有意に転倒指数の低下が認められた。一方、セレノプロテインＰの低用量投与群（０．０５ｍｇ／ｈｅａｄ）においては、明らかな転倒指数の低下は認められなかった。
本願発明により、運動失調を主たる病態とする神経変性疾患に対する好適な神経変性疾患治療剤が提供される。
【配列表】
0004402885.tif 000005
0004402885.tif 000006
0004402885.tif 000007
0004402885.tif 000008
0004402885.tif 000009
0004402885.tif 000010
0004402885.tif 000011
0004402885.tif 000012
0004402885.tif 000013
【図面の簡単な説明】
図１はローリングマウスナゴヤにおけるセレノプロテインＰの投与１週目の転倒指数改善効果を示す図である。
図２はローリングマウスナゴヤにおけるセレノプロテインＰの投与２週目の転倒指数改善効果を示す図である。
図３はローリングマウスナゴヤにおけるセレノプロテインＰの投与３週目の転倒指数改善効果を示す図である。
【図１】
0004402885.tif 000014
【図２】
0004402885.tif 000015
【図３】
0004402885.tif 000016