(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示される２１塩基から成るオリゴヌクレオチドであるフォワード側プライマーと、配列番号４に示される２０塩基から成るオリゴヌクレオチドであるリバース側プライマーと、配列番号６で示される２８塩基から成るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものであるプローブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定方法。
【請求項２】
前記レポーター蛍光色素はフルオレッセイン系蛍光色素であり、前記クエンチャー蛍光色素はローダミン系蛍光色素である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＢ型肝炎ウイルス（本願明細書において「ＨＢＶ」という）の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、血清等の試料中のＨＢＶの検出は分岐ＤＮＡプローブ法により行われている。この方法は、ＨＢＶＤＮＡを相補的な配列を持つ合成ＤＮＡでプレートに捕捉し、さらに枝分かれしたＤＮＡ鎖を有する合成ＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）をシグナル増幅に用い、化学発光で検出する定量測定法である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＢＶのウイルス量を定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上で重要である。しかしながら、上記の分岐ＤＮＡプローブ法では検出感度が不足している。ＨＢＶＤＮＡの測定は、高感度でかつ短時間で多数の検体を処理できる系が必要であり、これが可能となれば非常に有利である。
【０００４】
本願共同出願人は、先にＨＢＶ遺伝子をいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemistry; 特表平６−５０００２１号公報）により測定する方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブを発明し、特許出願した(特願平９−２８２６１２号）。しかしながら、特願平９−２８２６１２号に記載された方法では、沖縄地方の患者由来の検体で、ＨＢＶを検出できない場合があることが判明した。
【０００５】
従って、本発明の目的は、沖縄地方の患者由来の検体であっても、ＨＢＶを高感度で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、沖縄地方の患者由来の検体であっても、特定のプライマー及びプローブを用いたリアルタイム検出ＰＣＲ法により、ＨＢＶを高感度で正確に、かつ、簡便に測定することができることを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号２に示される２１塩基から成るオリゴヌクレオチドであるフォワード側プライマーと、配列番号４に示される２０塩基から成るオリゴヌクレオチドであるリバース側プライマーと、配列番号６で示される２８塩基から成るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものであるプローブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるフォワード側プライマーは、ＨＢＶ遺伝子のＳ領域中の領域を増幅するためのフォワード側プライマーであり、配列表の配列番号２に示される２１塩基から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号２で示される塩基配列は、ＨＢＶゲノムＳ領域の第４０６番目のヌクレオチド（以下、「４０６ｎｔ」のように記載）〜４２６ｎｔに相当するものである。なお、沖縄地方の患者由来のＨＢＶ変異株のゲノムの全塩基配列は公知であり、J. Gen. Virol., Vol. 69, pp.2575-2583, 1988に記載されている。
【０００９】
本発明で用いられるリバース側プライマーは、ＨＢＶ遺伝子のＳ領域中の領域を増幅するためのリバース側プライマーであり、配列表の配列番号４に示される２０塩基から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号４で示される塩基配列は、ＨＢＶゲノムのＳ領域の６０８ｎｔ〜６２７ｎｔにハイブリダイズするものである。
【００１０】
本発明で用いられるプローブは、オリゴヌクレオチドに後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合したものである。本発明で用いられるプローブは、増幅されたＨＢＶ遺伝子のＳ領域中の領域を検出するためのものであり、そのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番号６で示される２８塩基から成る。なお、配列番号６で示される塩基配列はＨＢＶゲノムのＳ領域の４６１ｎｔ〜４８８ｎｔに相当するものである。
【００１１】
前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。レポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているのでそれを用いることができる。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましくは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNoble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254に記載されている。
【００１２】
本発明の方法では、上記フォワード側プライマーと、上記リバース側プライマーと、上記プローブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【００１３】
反応は、被検ＨＢＶのＤＮＡ、上記フォワード側プライマー、リバース側プライマー及び上記プローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む溶液を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加えることにより、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解することができるので好ましい。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被検試料としては、ＨＢＶを含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例えば血清等の体液である。ＨＢＶのＤＮＡの調製は、従来のＰＣＲの場合と同様に行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００１４】
反応では、まず、ＨＢＶのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡは、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、被検試料中にＨＢＶのＤＮＡが存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、レポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定することにより、被検試料中にＨＢＶのＤＮＡを検出することが可能である。
【００１５】
本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中のＨＢＶＤＮＡの量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調べることにより、被検試料中のＨＢＶＤＮＡの定量測定を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＨＢＶＤＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試料中のＨＢＶＤＮＡを定量測定することができる。すなわち、被検試料中のＨＢＶのＤＮＡ数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べることにより被検試料中のＨＢＶＤＮＡの量を定量測定することができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
(1)  プライマーの合成
配列番号２に示される２１塩基から成る２１ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード側プライマーとした。また、配列番号４に示される２０塩基から成る２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、リバース側プライマーとした。
【００１８】
(2)  プローブの調製
配列番号６に示される２８塩基から成る２８ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
【００１９】
(3)  標準濃度ＤＮＡの調製
沖縄地方の患者由来のＨＢＶ遺伝子を含むプラスミドを作製してＤＮＡを抽出し、分子量よりコピー数を算出し、102から109コピー／μｌまで１０倍希釈系列を作製した。
【００２０】
(4)  反応液の調製
上記プライマー、プローブ及びTaqMan PCR Core Reagent Kit（商品名、Perkin Elmer社製）を用いて、反応チューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を調製した。
【００２１】
【表１】
0004399048.tif 000002
【００２２】
(5)  リアルタイム検出ＰＣＲ
チューブ１本あたり、上記反応液を４５μｌ分注し、標準濃度ＤＮＡを５μｌ加え、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System（商品名、Perkin Elmer社製）にセットし、以下の条件で反応を行なった。ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定した。
【００２３】
キャリーオーバーＤＮＡのＵＮＧによる分解反応          ５０℃、２分間
ＵＮＧの失活、ＤＮＡポリメラーゼの活性化            ９５℃、１０分間
ＰＣＲ                    ９５℃、２０秒間
６０℃、１分間
このＰＣＲサイクルは５３回繰り返した。
【００２４】
(6)  結果
サイクル数を横軸に、蛍光強度の変化（ΔＲｎ）を縦軸にとってプロットした結果を図１に示す。図１中、各線の近傍には、試料中のＨＢＶのＤＮＡのコピー数（試料は上記のように５μｌ用いたので、上記濃度（コピー／μｌ）の５倍）の指数部分を示す。図１より、それぞれの被検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料中のＨＢＶのＤＮＡコピー数が大きいほど小さいことがわかる。また、上記リアルタイムＰＣＲにおいて、ＨＢＶのＤＮＡを含まない試料について行なったネガティブコントロールの３〜１５サイクルにおける蛍光強度の標準偏差の１０倍を閾値とし、この閾値を超えたサイクル数（すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた時のサイクル数）を求めた。ＤＮＡコピー数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットした図を図２に示す。図２に示すように、ＤＮＡコピー数の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間には直線関係があり（相関係数0.999)、上記サイクル数を測定することにより被検試料中のＨＢＶのＤＮＡを定量測定できることが明らかになった。
【００２５】
実施例２、比較例１、２
沖縄地方のＢ型肝炎患者の血清各１００μｌにスマイテストEX-R&D(商品名、住友金属工業社製ＤＮＡ抽出試薬）の酵素溶液１５μｌ、強沈剤溶液５μｌ、検体希釈液４８０μｌを加え撹拌し、５５℃で３０分間反応した。次に蛋白溶解液４００μｌを加え撹拌後５５℃で１５分間反応した。同チューブにイソプロパノール８００μｌを加えて撹拌し、４℃で３０分間静置後、12000 x gで１０分間遠心した。次いで、５００μｌの７０％エタノールで２回洗浄後乾燥し、１０μｌの滅菌蒸留水で溶解し、測定まで−８０℃で保存した。
【００２６】
得られたＨＢＶ陽性患者血清由来ＤＮＡ溶液を上記標準濃度ＤＮＡに代えて用いたことを除き、実施例１と同じ操作を行った（実施例２）。一方、比較のため、配列番号７に示すオリゴヌクレオチド（ＨＢＶのＳ領域の１６６ｎｔ〜１８６ｎｔに相当）をフォワード側プライマーとして用い、配列番号８に示すオリゴヌクレオチド（ＨＢＶのＳ領域の３２１ｎｔ〜３３９ｎｔとハイブリダイズ）をリバース側プライマーとして用い、配列番号９に示すオリゴヌクレオチド（ＨＢＶのＳ領域の２４２ｎｔ〜２６７ｎｔに相当）の５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合したものをプローブとして用いることを除き同じ操作を行った（比較例１）。各プライマーの組合せを用いて別途作成しておいた検量線に基づき、各検体中のＨＢＶＤＮＡのコピー数を求めた。さらに、比較のため、ＴＭＡ (Transcription Mediated Amplification)法に基づく市販品を用い、市販品の使用説明書に従って同じ検体について測定を行った(比較例２)。結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
0004399048.tif 000003
LGE: Log genome equivalent
(6.0 LGE/mlは１０6コピー/mlに相当）
【００２８】
表２に示されるように、沖縄地方の患者由来の検体を用いた場合、比較例１の方法ではいずれの場合もＨＢＶを検出できなかったが、本発明の方法によれば、１８検体中、１４検体でＨＢＶのコピー数が測定された。また、比較例２の方法では、１８検体中１３検体でコピー数が測定されず、測定された５検体についてもいずれも本発明の方法の方が測定されたコピー数が多かった。なお、本発明の方法でコピー数が測定されなかった検体は、比較例１及び比較例２のいずれの方法でもコピー数が測定されなかった。これらの結果から、本発明の方法が、比較例１及び比較例２の方法に比較して、沖縄地方の患者由来のＨＢＶをより高感度に測定することができることがわかる。
【００２９】
比較例３
従来の分岐ＤＮＡプローブ法（クォンティプレックスＨＢＶ−ＤＮＡ（商品名）カイロン社製）により、実施例１と同様な標準濃度ＤＮＡ（ただし濃度域はより広い）を用いてＨＢＶＤＮＡの測定を行った。一方、実施例１の方法によりＨＢＶＤＮＡの測定を行った。
【００３０】
各方法により得られた測定値の相関関係を図３に示す。図３では、横軸に従来の分岐ＤＮＡ法により測定した測定値、縦軸に本発明の実施例１の方法により測定した測定値をプロットしてある。なお、図中、例えば「1.0E+06」は１０6を示す。図３に示されるように、従来法では測定限界が１０6コピーであるのに対し、本発明の方法では１００コピーまで測定可能である。また、１０6コピー以上の場合には、本発明の方法による測定結果は、従来法による測定結果と良く相関しており、本発明の方法により精度良く測定できることがわかる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、沖縄地方の患者由来のＨＢＶを高感度で正確に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
【００３２】
【配列表】
0004399048.tif 000004
【００３３】
0004399048.tif 000005
【００３４】
0004399048.tif 000006
【００３５】
0004399048.tif 000007
【００３６】
0004399048.tif 000008
【００３７】
0004399048.tif 000009
【００３８】
0004399048.tif 000010
【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
0004399048.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例の方法により、各種被検試料中のＨＢＶのＤＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイクル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
【図２】図１に示す結果について、ＨＢＶのＤＮＡのコピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサイクル数との関係を示す図である。
【図３】本発明の方法及び従来の分岐ＤＮＡプローブ法により測定したＨＢＶのＤＮＡのコピー数の相関関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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