(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミニプラスミンをプローブとし、センダイウイルスを基質として被探索物質と反応させた後、反応液中のセンダイウイルスのフュージョンプロテイン１サブユニット（Ｆ１）およびフュージョンプロテイン２サブユニット（Ｆ２）の量を指標とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法。
【請求項２】
ミニプラスミンをプローブとし、インフルエンザウイルスを基質として被探索物質と反応させた後、反応液中のインフルエンザウイルスのヘムアグルチニン１サブユニット（ＨＡ１）およびヘムアグルチニン２サブユニット（ＨＡ２）の量を指標とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法。
【請求項３】
ミニプラスミンをプローブとし、センダイウイルスを基質として被探索物質と反応させた後、反応後のセンダイウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させたときの感染価を指標とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法。
【請求項４】
ミニプラスミンをプローブとし、インフルエンザウイルスを基質として被探索物質と反応させた後、反応後のインフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させたときの感染価を指標とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗インフルエンザウイルス作用を有する物質を探索する方法に関するものである。
背景技術
従来の抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の開発は大きく分けて３つの方向で検討されてきた。
第１は、ワクチンを抗インフルエンザウイルス作用を有する物質として開発する方法で、不活性化インフルエンザワクチンや生ワクチンが開発されてきた。
第２は、インフルエンザウイルスのイオンチャンネルＭ２蛋白を標的としたチャンネルブロッカーを抗インフルエンザウイルス作用を有する物質として探索し開発する方法である。
第３は、インフルエンザウイルスに対する感染細胞の膜上のレセプターはシアール酸であることが知られていることから、このシアール酸を標的とした抗インフルエンザウイルス作用を有する物質を探索し開発する方法である。
しかし、上記の従来の開発方法では、以下のような欠点があった。
第１のワクチンを抗インフルエンザウイルス作用を有する物質として開発する場合は、インフルエンザウイルスの外膜糖蛋白質が抗原として認識されることが多いが、インフルエンザウイルスの抗原は、毎年流行する度に変異によって異なるため、この方法で開発されたワクチンの効果が必ずしも期待できなかった。
第２のインフルエンザウイルスのイオンチャンネルＭ２蛋白を標的としたチャンネルブロッカーを抗インフルエンザウイルス作用を有する物質として探索し開発する方法では、例えば従来抗パーキンソン氏病薬の一つとしてその有効性が報告されているアマンタジンが探索されているが、Ｍ２蛋白をブロックするということが、同時に中枢神経系への作用も強く発生するという面も持ち合わせているため、現時点では使用に制限を生じ、全てのインフルエンザウイルスの疾患患者に用いるのは困難な物質である。つまり、この方法による抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法では、得られた物質による中枢神経に関する問題を必ずしも解決できる現状にはない。
第３のインフルエンザウイルスに対する感染細胞の膜上のレセプターであるシアール酸を標的とした抗インフルエンザウイルス作用を有する物質を探索し開発する方法は、その有効性が報告されているが、必ずしもその効果が十分に発揮されている現状にあるとは言えない。また、この探索方法は本発明とは全く別の作用点および作用機序に基づくものである。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題は、このような従来技術の欠点を解消し、かつ従来とは異なる作用に基づく抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索を効率的に行なうことのできる方法を提供することである。
このような状況下にあって、本発明者らは、ミニプラスミンとインフルエンザウイルス及びセンダイウイルスとの関係に関する研究を鋭意積み重ねる中で、特に急性、慢性炎症など、好中球の浸潤を伴う肺での主要なインフルエンザウイルス活性化酵素がミニプラスミンであり、つまり、ミニプラスミンがインフルエンザウイルスやセンダイウイルスの活性化に重大に関与していること、すなわち、インフルエンザウイルスやセンダイウイルスが人体においてその感染力を発揮するには、ミニプラスミンによる活性化体への構造変換作用が不可欠であるとの知見を得ることに成功した。
本発明者らは、以上の研究により知り得た知見を検討した結果、ミニプラスミンのインフルエンザウイルス活性化作用を阻止する物質、つまりミニプラスミン阻害物質を探索し、それを医薬品として実用化することが、抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索に有効であることを見出した。
すなわち、本発明は、ミニプラスミンをプローブとして用いることを特徴とする抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法に関するものである。
さらに本発明は、ミニプラスミンをプローブとし、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスを基質として被探索物質と反応させ、反応液中の基質ウイルスの外膜糖蛋白質前駆体のサブユニット量を指標とする抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法に関するものである。
さらにまた本発明は、ミニプラスミンをプローブとし、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスを基質として被探索物質と反応させ、反応後の基質ウイルスを犬の腎細胞（Ｍａｒｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ、以下「ＭＤＣＫ細胞」と略称する）に感染させたときの感染価を指標とする抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法に関するものである。
本発明者らは、炎症などの病的な状態のため好中球が多量に浸出した局所において主として形成されるミニプラスミンが、局所の細胞膜上に付着し存在すること、そしてその細胞がインフルエンザウイルスに感染していた場合、細胞内から新たに増殖し出芽してくる非感染型インフルエンザウイルスや非感染型センダイウイルスに対し、そのミニプラスミンが気道の細胞への感染が可能な感染型ウイルスに変換させる作用を有することを見出した。
本発明者らは、ミニプラスミンのこの特徴を利用することにより、ミニプラスミンに対する特異的阻害剤の探索方法が確立できれば、それにより見出された薬剤によって、種々の炎症反応に伴うインフルエンザウイルス感染の増悪の阻止が可能になると考えた。
さらに詳しくは、次の通りである。本発明者らは、ヒトの顆粒球由来のエラスターゼやブタの膵臓に由来するエラスターゼによって作られるミニプラスミンが、プラスミンに比較して、表１に示すように著しく疎水性が増加しているため、種々の細胞膜表面に付着しやすく、その結果、蛋白質の分解、つまりウイルスの感染型への変換に重大な関与をしていることを予測した。
一方、気道に感染して増殖するインフルエンザウイルスやセンダイウイルスは、感染するにあたり、インフルエンザウイルスではその外膜糖蛋白質前駆体であるヘムアグルチニン（ＨＡ）がヘムアグルチニン１サブユニット（ＨＡ１）とヘムアグルチニン２サブユニット（ＨＡ２）に、センダイウイルスではその外膜糖蛋白質前駆体であるフュージョンプロテイン（Ｆ０）がフュージョンプロテイン１サブユニット（Ｆ１）とフュージョンプロテイン２サブユニット（Ｆ２）に、宿主側のプロテアーゼによって切断されなくてはならない。なぜならば、外膜糖蛋白質前駆体の切断によってはじめてウイルスは膜融合能と細胞への感染性を示すようになるからである。
そこでこれら気道に感染する代表的なウイルスである、インフルエンザウイルスとセンダイウイルスを標的にして、ミニプラスミンがこれ等のウイルスの外膜糖蛋白質を限定的に分解して膜融合性と感染性の発現に関与するかを検討した。その結果、ミニプラスミンによってセンダイウイルスやインフルエンザウイルスの外膜糖蛋白質は限定分解され、非感染型ウイルスは感染化されて感染性を示すことが明かとなった。
以下に本発明の方法を説明する。
まず、ヒトミニプラスミンとその基質、例えばセンダイウイルスやインフルエンザウイルスが混入された反応系に、抗インフルエンザウイルス作用の有無を探索したい物質を投入し、反応を行なわせる。反応後、反応容器中より、基質としてインフルエンザウイルスを用いた場合は、その外膜糖蛋白質前駆体であるヘムアグルチニン（ＨＡ）の切断によって生じるヘムアグルチニン１（ＨＡ１）とヘムアグルチニン２（ＨＡ２）のサブユニットが存在するか否か、また基質にセンダイウイルスを用いた場合は、その外膜糖蛋白質前駆体（Ｆ０）の切断によって生じる（Ｆ１）と（Ｆ２）のサブユニットが存在するかを否かを分析する。
もし、それらサブユニットが存在した場合は、ヒトミニプラスミンの作用が発揮されたことを示すため、当該投入物質には抗インフルエンザウイルス作用を有さないことが証明され、反対にそれらのサブユニットが存在しない場合には、ヒトミニプラスミンの作用が阻害されたことを示すため、当該投入物質が抗インフルエンザウイルス作用を有することが証明されたことになる。
このようにして、抗インフルエンザウイルス作用を有する物質を探索することが可能となる。
なお、ヒトミニプラスミンの作用が阻害されたか否かを調べる方法としては、上記の他に、インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させたときの細胞への感染価（ＣＩＵ：Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）を用いる方法でも良い。具体的には、ヒトミニプラスミンとその基質であるインフルエンザウイルスが混入された反応系に、抗インフルエンザウイルス作用の有無を探索したい物質を投入し、反応を行なわせた後、反応溶液中より、インフルエンザウイルスを取り出し、ＭＤＣＫ細胞に感染させ、感染した細胞数を蛍光標識した抗インフルエンザ抗体で検出し、ＣＩＵを算出する。探索物質を添加してミニプラスミンによって活性化されたときのＣＩＵ値が、探索物質の投与群での無添加群に比べて低い値を示すときは、抗インフルエンザウイルス作用を示したことになる。このようなＣＩＵ値の評価により、当該投入物質が抗インフルエンザウイルス作用を有するか否かを探索することが可能である。
ところで、本発明方法における基質の選択方法であるが、表３に示したような人工基質を指標にしたミニプラスミン阻害物質の探索方法では、基質として蛋白や実際のウイルスを使用した探索方法と比べ、それぞれの基質の立体構造の違いのために異なった阻害効率を示すことが考えられる。従って、本発明では、実際のインフルエンザウイルスやセンダイウイルスを基質として用いることが好ましい。
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試験例
１．ヒトミニプラスミンの構造
精製されたヒトミニプラスミンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図１に示す。還元剤非存在下で、ミニプラスミンは約３６−３８ｋＤａのほぼ単一の蛋白バンドを示し、還元剤存在下では２８ｋＤａの蛋白と１２ｋＤａの２本の蛋白バンドに分離した。この事からミニプラスミンは、２８ｋＤａの蛋白と１２ｋＤａの蛋白がＳ−Ｓ結合していることが明らかになった。２８ｋＤａと１２ｋＤａの蛋白バンドをＰＶＤＦ膜にプロットした後、それぞれＮ端末から約２０残基のアミノ酸シークエンスの解析を行なった。その結果、１２ｋＤａの蛋白バンドは、ＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＮＶＥＴＰＳＥＥＤ−の配列を、２８ｋＤａの蛋白バンドはＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰ  ＷＤＶＳＬＲＹ−の配列を示した。なおヒトの顆粒球のエラスターゼで処理した場合も、１２ｋＤａ、２８ｋＤａの蛋白バンドは全く同一のアミノ酸配列を示した。
以上のことから図２に示すように、ヒトのミニプラスミンは、１２ｋＤａ蛋白はＶ４４１から始まるクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）５を、２８ｋＤａはＶ５６１から始まるミクロプラスミンからなることが明らかになった。
２．ヒトミニプラスミンの性質
このようにして得られたミニプラスミンはプラスミンと比較して種々の性質を異にする。表１に示すようにミニプラスミンはプラスミンのＮ端末側に存在するクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）１〜４の領域（アンギオスタチン）を欠くことから分子量は９４ｋＤａから３８ｋＤａに減少すると共に疎水性が著しく増加する。その結果ミニプラスミンは細胞膜表面に強固に結合することになり、０．５Ｍ以上のＮａＣｌか０．５％トリトンＸ（商品名：シグマ社製のポリオキシエチレンオクチルエーテル）のような界面活性剤を用いないと可溶化できないように変化する。
なお、ミニプラスミンのＫｒｉｎｇｌｅ５を除いたミクロプラスミンは、ｐＨが中性領域において極めて不安定となり、数分のうちに自己分解により活性が５０％以下に減少する。しかし、ミニプラスミンは同じ条件下でも数時間は不安定な活性が保たれている。
３．ヒトミニプラスミンの基質特異性
表２にヒトミニプラスミンの基質特性を示す。種々のトリプシン型プロテアーゼの人工基質の中で、特にプラスミンの人工基質Ｂｏｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡが最も高い切断活性を示した。次いで、これまでに報告されているヒトのインフルエンザウイルスに共通して認められている切断部位認識アミノ酸配列（切断モチーフ）と同じタイプであるＧｌｕ（Ｇｌｕ）−Ｘ−Ａｒｇの配列を持つ人工基質群に対し、Ａｒｇの後を良く切断した。
しかし、血液凝固因子の１つでトリプシン様活性を示す蛋白分解酵素であるファクターＸａの人工基質Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡや、リソゾーム酵素の１つであるカテプシンＢの人工基質Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡには殆ど切断活性を示さなかった。
４．ヒトミニプラスミンのインヒビター特異性
表３にヒトミニプラスミンのインヒビター特異性を示す。種々のプロテアーゼインヒビターの中でウシの肺に由来するアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎｅ）、植物に由来するクニックタイプソイビーントリプシンインヒビター（Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とボウマンバークトリプシンインヒビター（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はミニプラスミンのプロテアーゼ活性を強く阻害した。しかし、エラスターゼやトリプシンの活性を阻害するアンチロイコプロテアーゼ（Ａｎｔｉ−ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅａｓｅ：別名ＭＰＩ、ＳＬＰＩ）は殆どミニプラスミンの活性を阻害しない。またトリプシンの活性を阻害するベンザミジン（Ｂｅｎｚａｍｉｚｉｎｅ）やジイソプロピルフルオロフォスフェート（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）の場合１ｍＭ〜１０ｍＭといった高濃度で強い阻害活性を示した。
５．ヒトミニプラスミンのインフルエンザウイルス、センダイウイルスの活性化作用
図３に示すように［３Ｈ］グルコサミンでラベルした非感染型インフルエンザウイルスとセンダイウイルスをミニプラスミン（１．５μｇ）とそれぞれ３７℃で１５分、３７℃で６０分処理することにより、インフルエンザウイルスの殆ど全てのＨＡは、ＨＡ１とＨＡ２のサブユニットに、センダイウイルスのＦ０は約１／３がＦ１とＦ２のサブユニットに分解された。なおセンダイウイルスに関しては更に３時間まで処理を延長することにより全てのＦ０をＦ１とＦ２のサブユニットに分解できた（図５）。
そこで、ミニプラスミンで処理したインフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させたときの細胞への感染価（ＣＩＵ）を調べた（図４）。具体的には、非感染型インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）株に種々の濃度のミニプラスミンをＰＢＳ存在下に３７℃で１５分間処理した後にウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させ、感染した細胞数を蛍光標識した抗インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）抗体で検出してＣＩＵを算出した。
その結果、ミニプラスミンの濃度に依存して、著しい感染価の増加が認められ、１０．４ｍＵ／ｍｌ以上でプラトーに達した。なおここで示したミニプラスミンの活性は人工基質Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡを１分間に１μｍｏｌ分解する酵素をもって１ｕｎｉｔとした。
上記結果より、ヒトミニプラスミンが、非感染型インフルエンザウイルスやセンダイウイルスを感染型へ変換する活性を有することが分かった。
発明を実施するための最良の形態
参考例１  ヒトプラスミンからのヒトミニプラスミンの作成
ヒトプラスミン（シグマ社製）１ｍｇとブタ膵エラスターゼ３μｇを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、３時間１５分間まわしながら反応させた。反応後、終濃度５０μＭとなるようにエラスタチナールを加え、更に３０分まわしながら室温で反応させた。反応後、終濃度５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ  ＮａＣｌとなるようにＮａＣｌを含む緩衝液を加え、１４，０００ｘｇで、３０分遠心した。上清をソイビーントリプシンインヒビターセファロース（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂカラムにかけてミニプラスミンを吸着させ、十分に洗浄した後吸着部分を５０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）／０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。これをゲルろ過ＨＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００：商品名、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）にかけ、不純物を取り除いた後、最終標品を得た。
参考例２  ヒトプラスミンからのヒトミニプラスミンの作成
ヒトプラスミン（シグマ社製）１ｍｇとヒト顆粒球エラスターゼ３μｇを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、３時間１５分間まわしながら反応させた。反応後、終濃度５０μＭとなるようにエラスタチナールを加え、更に３０分まわしながら室温で反応させた。反応後、終濃度５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ  ＮａＣｌとなるようにＮａＣｌを含む緩衝液を加え、１４，０００ｘｇで、３０分遠心した。上清をソイビーントリプシンインヒビターセファロース（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂカラムにかけてミニプラスミンを吸着させ、十分に洗浄した後吸着部分を５０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）／０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。これをゲルろ過ＨＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００：商品名、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）にかけ、不純物を取り除いた後、最終標品を得た。
実施例１
始めに［３Ｈ］標識センダイウイルスに、参考例１で得られたミニプラスミン（０．１μｇ）を３７℃で３時間処理したところ、Ｆ０が殆ど全てＦ１とＦ２のサブユニットに限定分解されたことを確認した（図５）。
そこでこの反応系に１ｍＭジイソプロピルフルオロフォスフェート（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加え、３７℃で３時間処理した後、反応系のＦ１とＦ２のサブユニットの存在を以下の方法で確認した。
すなわち、反応後、反応液１０μＬに３μＬの３倍に濃縮された電気泳動用サンプル緩衝液（６％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．８）を加え、すみやかに１００℃で５分間加熱処理を行なった。サンプルはその後１０−２０％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけ、電気泳動を行なった。泳動は１枚のポリアクリルアミドゲル当たり３０ｍＡで２時間行なった。電気泳動後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを固定液（メタノール５０％、酢酸５０％）中で１時間固定した後、増感液（Ａｍｐｌｉｆｙ：商品名：アマシャム  ライフ  サイエンス社製）で２０分間処理した。増感液で処理したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを加熱乾燥した後、オートラジオグラフを行なった。オートラジオグラフはＲＸ−Ｕ（商品名：富士写真フィルム社製）を用いて、３日間−８０℃で被爆した後、現像定着をして、Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２のバンドの検出を行なった。
その結果、ほぼ完全にＦ０からＦ１とＦ２への変換を阻止したことが確認され、ジイソプロピルフルオロフォスフェートがミニプラスミンの阻害物質であることを確認した。
実施例２
実施例１と同様の反応系に１μＭアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加え、３７℃で３時間処理した後、反応系中のＦ１とＦ２のサブユニットの存在を実施例１に記載した方法で確認した。
その結果、ほぼ完全にＦ０からＦ１とＦ２への変換を阻止したことが確認され、アプロチニンがミニプラスミンの阻害物質であることを確認した。
実施例３
実施例１と同様の反応系に１μＭベンザミジン（Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）を加え、３７℃で３時間処理した後、反応系中のＦ１とＦ２のサブユニットの存在を実施例１に記載した方法で確認した。
その結果、ほぼ完全にＦ０からＦ１とＦ２への変換を阻止したことが確認され、ベンザミジンがミニプラスミンの阻害物質であることが確認された。
実施例４
実施例１と同様の反応系に、１μＭクニックタイプソイビーントリプシンインヒビター（Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を加え、３７℃で３時間処理した後、反応系中のＦ１とＦ２のサブユニットの存在を実施例１に記載した方法で確認した。
その結果、ほぼ完全にＦ０からＦ１とＦ２への変換を阻止したことが確認され、クニックタイプソイビーントリプシンインヒビターがミニプラスミンの阻害物質であることが確認された。
実施例５
始めに非感染型インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）株に、ミニプラスミン（９４４ｍＵ／ｍｇ）の標品をＰＢＳ存在下に３７℃で１５分間それぞれ（０、１．２、５．２、１０．４、５２ｍＵ／ｍｌ）の濃度で処理した後ウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させ、感染した細胞数を蛍光標識した抗インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）抗体で検出して感染価（ＣＩＵ）を算出した。感染価はそれぞれ（０（検出不能値）、１×１０６、１．３×１０７、７．５×１０７、９．６×１０７）ＣＩＵを示した。
次に、この反応系の中でプラトーを示したミニプラスミン（１０．４ｍＵ／ｍｌ）に１μＭアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加え、３７℃で１５分間処理した後、上記と同様の方法でＣＩＵを算出した。
その結果、１μＭアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を処理することにより、感染価は３．７×１０３ＣＩＵ値を示した。探索物質の無添加群におけるミニプラスミンによって活性化されたウイルスのＣＩＵ値が７．５×１０７ＣＩＵであることから、ＣＩＵの値がアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）の処理により減少し、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）はほぼ完全に非感染型インフルエンザウイルスから感染型のウイルスへの変換を抑制したことが判明した。
産業上の利用可能性
ミニプラスミンをプローブとすることにより、抗インフルエンザウイルス作用を有する物質をインビトロで、効率的に探索することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトミニプラスミンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す電気泳動測定結果を示す。
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１、２は非還元下で、３、４は還元下で電気泳動を行った後、銀染色を行った。
＊分子量マーカー：ｒａｂｂｉｔ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｓｅ  Ｂ（９７．２ｋＤａ），ＢＳＡ（６６．４ｋＤａ），ｏｖａｌｍｉｎ（４５．０ｋＤａ），ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（２９．０ｋＤａ），ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０．１ｋＤａ），ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４．３ｋＤａ）
図２は、ヒトプラスミノーゲンとヒトミニプラスミンの１次構造を示す図である。
ヒトのプラスミノーゲン（１−７９０残基）とミニプラスミン（４４１−７９０残基）を示す。
図３は、ミニプラスミンによるインフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８のＨＡとセンダイウイルスＦ０の限定分解を示す電気泳動測定結果を示す。
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図４は、非感染型インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のミニプラスミンによる感染型への変換と、アプロチニンによる阻害効果を示すグラフである。
非感染型インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８／（Ｈ３Ｎ２）を種々の濃度のミニプラスミン（●）で処理するか、２０ｍＵ／ｍｌのミニプラスミンに最終濃度１μＭびアプロチニン（□）を加え、３７℃で１５分間処理した後ＭＤＣＫ細胞に投与して１０時間後の感染細胞数を蛍光色素（ＦＩＴＣ）標識抗インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ抗体によって検出した。
図５は、［３Ｈ］標識センダイウイルスを基質としたときの精製酵素標品のインヒビター特異性を示す電気泳動測定結果を示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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