(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシンのＡ２サブユニットに融合した志賀毒素または志賀毒素様毒素のＡ１サブユニットを含んでなるハイブリッド細菌毒素サブユニット。
【請求項２】
該Ａ１サブユニットがＳｔｘ２ｅのＡ１サブユニットである、請求項１記載のハイブリッド細菌毒素サブユニット。
【請求項３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシンの５個のＢサブユニットと請求項１または２記載のハイブリッド細菌毒素サブユニットとを含んでなるハイブリッド二成分細菌毒素。
【請求項４】
請求項１または２記載のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項５】
請求項４記載の核酸分子を含んでなるＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項４記載の核酸分子または請求項５記載のＤＮＡ断片を、機能的に連結されたプロモーターの制御下で含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
請求項４記載の核酸分子、請求項５記載のＤＮＡ断片または請求項６記載の組換えＤＮＡ分子を含んでなる生組換え担体（ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）。
【請求項８】
請求項４記載の核酸分子、請求項５記載のＤＮＡ断片、請求項６記載の組換えＤＮＡ分子または請求項７記載の生組換え担体を含んでなる宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッド細菌毒素サブユニット、ハイブリッド二成分細菌毒素、およびそのような細菌毒素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。さらに、本発明は、該細菌毒素を含むワクチン、ワクチンにおけるその使用、そのようなワクチンの製造方法、およびそのようなワクチンの製造のためのそのような細菌毒素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のようなエンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の多数のメンバーは１以上の毒素を産生することが公知である。これらのなかには、いくつかの強力な細胞毒および神経毒がある。シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）はいわゆる志賀毒素を産生することが公知である（Ｓａｎｄｖｉｇ，Ｋ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１６２９−１６３５（２００１））。一群の非常に密接に関連した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）毒素はアフリカミドリザル（ベロ）細胞に対して毒性であり、したがってそれらはベロ毒素として知られるようになった。これらの毒素は、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）１型において既に見出されていた細胞毒性毒素に対する著しい類似性を示し、このことが、それらの現在用いられている名称である志賀毒素様毒素（ＳＬＴ）の由縁である。志賀毒素様毒素は、とりわけ、Ａｇｂｏｄａｚｅ，Ｄ．（Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ＆  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２２：２２１−２３０（１９９９））による総説およびＯ’Ｂｒｉａｎ，．Ｄ．およびＨｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗ  ５１：２０６−２２０（１９８７））による総説に記載されている。
【０００３】
言うまでもなく、本発明は、志賀毒素および志賀毒素様毒素の両方に適用可能である。志賀毒素様毒素は、現在では、とりわけ、ヒトにおける出血性大腸炎および溶血性尿毒症症候群（Ｋａｒｍａｌｉら，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉ：１２９９−１３００（１９８３））、子ウシにおける下痢（Ｃｈａｎｔｅｒ，Ｎ．，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：２４１−２５３（１９８６）およびＭａｉｎｉｌら，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４８：７３４−７４８（１９８７））およびブタにおける水腫疾患（Ｄｏｂｒｅｓｃｕ，Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４４：３１−３４（１９８３），Ｃａｎｎｏｎ，Ｖ．Ｐ．Ｊ．ら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５３：３０６−３１２（１９８９），Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｌ．Ｒ．Ｍ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４：３３−３８（１９８７），Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：３１２１−３１３７（１９８３）およびＳｍｉｔｈ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：４５−５９（１９６８））の原因であることが公知である。
【０００４】
ブタにおける水腫の臨床徴候、とりわけ、神経機能不全は、特異的志賀毒素様毒素変異体Ｓｔｘ２ｅにより引き起こされる小血管症および血管壊死から生じる（Ｎｅｉｌｓｅｎ，Ｎ．Ｏ．，Ｅｄｅｍａ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｐ．５２８−５４０（１９８６）  ｉｎ  Ａ．Ｄ．Ｌｃｈｍａｎ，Ｓｔｒａｗ，Ｂ．，Ｇｌｏｃｋ  Ｒ．Ｄ．ら（編），Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ，６ｔｈ  ｅｄ．Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｅｓ．ＵＳＡ）、（Ｇａｎｎｏｎ，Ｖ．．Ｊ．ら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５３：３０６−３１２（１９８９），Ｋｕｒｔｚ，Ｈ．Ｊ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３０：７９１−８０６（１９６９）およびＭａｒｑｕｅｓ，Ｌ．Ｒ．Ｍ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４：３３−３８（１９８７））。この変異体Ｓｔｘ２ｅは、当技術分野においてはＳＬＴ−ＩＩｅ、ＳＬＴ−ＩＩｖ、ベロ細胞毒素２ｅおよびＶＴ２ｅとしても公知であり、離乳の約１週間後に生じる疾患を引き起こす。該疾患は、それが引き起こす水腫およびそれに続く特異的神経障害により特徴づけられ、一般には、離乳後水腫（ＰＷＥ）または水腫疾患として公知である。
【０００５】
志賀毒素および全ての志賀毒素様毒素は、同じ全体構造を共有する。それらは、Ｂサブユニットの複数のコピーに結合した単一のＡサブユニットよりなる。通常、単一のＡサブユニットがＢサブユニットの五量体に結合している。Ａサブユニットが実際の毒素部分であり、それは宿主のタンパク質合成の抑制において何らかの役割を果たしている。Ｂサブユニット（より詳しくは、その五量体形態）は受容体結合に関連している。単一のＢサブユニットは約７．５ｋＤであり、Ａサブユニットは約３２ｋＤである。
【０００６】
志賀毒素様毒素変異体Ｓｔｘ２ｅのＡ１部分（後記を参照されたい）のＤＮＡ配列を配列番号１に示す。多数の他の志賀毒素様毒素変異体の完全配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトｗｗｗ．ＮＣＢＩ．ＮＬＭ．ＮＩＨ．ＧＯＶにおいて容易に見出されうる。検索方法は当業者に公知であり、単なる一例として挙げると、ヌクレオチドバンクにおいて、すべての公知変異体およびそれらの説明を見つけるためには検索語として「ｓｈｉｇａ  ｌｉｋｅ  ｔｏｘｉｎ（志賀毒素様毒素）」と打ち込むだけで十分である。あるいは、配列番号１の志賀毒素様毒素のＡ１部分の配列を単に使用し、それを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトの細菌遺伝子のバンクに対してブラスト操作（ｂｌａｓｔ）することが可能である。これは他の公知志賀毒素様毒素変異体を同様に提供するであろう。
【０００７】
図１は典型的な志賀毒素様毒素の概要図；その全体構造、ＡサブユニットのＡ１／２部分の位置（後記を参照されたい）およびＢサブユニットの位置を示す。
【０００８】
したがって、全毒素が、単一のＡサブユニットと５個のＢサブユニットにより形成される単一の五量体とを含む二成分毒素（すなわち、２つの成分よりなる毒素）として最良に記載されている。ついで、Ａサブユニット自体は、実際の酵素部分であるＡ１部分と、Ｂサブユニットの五量体の結合に関与するＡサブユニット部分であるＡ２部分とに、機能的に分割されうる。ＡサブユニットのＡ２部分を介した、ＢサブユニットへのＡサブユニットの結合は鍵と鍵穴説に従って生じる。すなわち、志賀毒素様毒素のＡサブユニットのＡ２部分は、志賀毒素様毒素のＢサブユニットのみに適合（ｆｉｔ）し、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）のＢサブユニットのような密接に関連したＢサブユニットを除く他のものには適合しない。
【０００９】
志賀毒素様毒素を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株により引き起こされる疾患を予防するためには、不活化毒素でのワクチン接種を用いうることが公知である（Ａｗａｄ−Ｍａｓａｌｍｅｈ，Ｍ．，Ｉｎ  Ｐｒｏｃ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｐｉｇ  Ｖｅｔ．Ｓｏｃ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｒｉｏ  ｄｅ  Ｊａｎｅｉｒｏ，Ｂｒａｚｉｌ（１９８８），Ａｗａｄ−Ｍａｓａｌｍｅｈ，Ｍ．，Ｄｔｓｃｈ．Ｔｉｅｒａｅｒｔｚｌ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．９６：４１９−４２１（１９８９），Ｈｏｗａｒｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：４３９−４４７６（１９５５），Ｉｓｌａｍ，Ｍ．Ｓ．およびＳｔｉｍｓｏｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３：１１−１６（１９９０），ＭａｃＬｅｏｄ，Ｄ．ＬおよびＧｙｌｅｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：３０９−３１８（１９９１），Ｗａｄｏｌｋｏｗｓｋｙ，Ｅ．Ａ．ら，Ｉｎｆｅｃｔ．  ＆  Ｉｍｍｕｎ．５８：３９５９−３９６５（１９９０），Ｂｏｓｗｏｒｔｈ，Ｂ．Ｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．  ＆  Ｉｍｍｕｎ．６４：５５−６０（１９９６））。
【００１０】
志賀毒素様毒素に関するゲノム体制ならびにＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子の位置および配列は公知である（Ｓｐｉｃｅｒ  Ｅ．Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，．２５７：５７１６−５７２１（１９８２），Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ，Ｓ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４３６４−４３６８（１９８７），Ｄａｌｌａｓ  Ｗ．Ｓ．およびＦａｌｋｏｗ  Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８８：４９９−５０１（１９８０），Ｌｅｏｎｇ  Ｊ．ら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４８：７３−７７  （１９８５））。
【００１１】
したがって、原理上は、必要な遺伝情報が手元にあり、志賀毒素様毒素を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株により引き起こされる疾患を予防するために不活化毒素でのワクチン接種を用いうることが公知であれば、ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子の大規模なインビトロ発現はワクチンの製造のための良好な出発点であると考えられる。
【００１２】
しかし、予想に反して、比較しうる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方の製造およびそれに続く精製は非常に効率的であったものの（後記を参照されたい）、志賀毒素および志賀毒素様毒素の発現／精製は非常に困難であることが判明した。
【００１３】
まず第１に、細菌発現系における志賀毒素様毒素Ｂサブユニットの発現は問題ではないが（Ａｃｈｅｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．  ＆  Ｉｍｍｕｎ．６３：３０１−３０８（１９９５））、志賀毒素様毒素Ａサブユニットは細菌発現系において発現され得ないか、または微量で発現されたに過ぎない。
【００１４】
さらに、二成分志賀毒素および志賀毒素様毒素の精製は（ＬＴの精製とは対照的に）困難であり、高い経費を要する。ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／５４２１５は、精製において遭遇する問題を克服するための方法を提供しているが、それは、二糖を含む高価なアフィニティーリガンドを使用するアフィニティーカラムの使用に基づくものである。志賀毒素または志賀毒素様毒素に基づくワクチンの製造のためには、この精製方法は、経済的な観点からは、それほど望ましいものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、志賀毒素または志賀毒素様毒素の発現および精製は共に、依然として問題を伴う。
【００１６】
前記の問題を伴わない新規ハイブリッド志賀毒素および志賀毒素様毒素を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
そのような新規ハイブリッド志賀毒素および志賀毒素様毒素は、それらが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ２部分に融合した志賀毒素様毒素のＡ１部分を含む点で、公知志賀毒素様毒素とは異なる。野生型の場合には、志賀毒素様毒素のＡ１部分は志賀毒素様毒素のＡ２部分に融合している。
【００１８】
驚くべきことに、このハイブリッド志賀毒素または志賀毒素様毒素Ａサブユニットは、その天然対応体とは対照的に、細菌発現系において効率的に発現されうることが、本発明において見出された。また、それは容易に、かつ経済的な方法により精製されうる。さらに、志賀毒素または志賀毒素様毒素のＡ１部分を含むが本発明においてはＬＴのＡ２部分に融合しているこのハイブリッド志賀毒素または志賀毒素様毒素サブユニットは、より一層驚くべきことに、野生型志賀毒素または志賀毒素様毒素に対する防御を誘導する能力を十分に有している。
【００１９】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の志賀毒素様毒素と同様に、ＡＢ５多量体構造を有する細菌タンパク質毒素であり、そのＢ五量体は膜結合機能を有し、Ａサブユニットは酵素活性に必要である（Ｆｕｋｕｔａ，Ｓ．ら，Ｉｎｆ．  ＆  Ｉｍｍｕｎ．５６：１７４８−１７５３（１９８８），Ｐｉｃｋｅｔｔ，Ｃ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：３４８−３５２（１９８６），Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１３６８−１３７４（１９９８）およびＬｅａ，Ｎ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：９９９−００４（１９９９））。
【００２０】
「融合」なる表現は、Ａ１部分を構成するアミノ酸配列が、Ａ２部分を構成するアミノ酸配列に共有結合していることを意味する。これは、最終的なサブユニットが、野生型の場合と同様に単一タンパク質を形成することを意味する。
【００２１】
したがって、本発明の１つの実施形態は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ２部分に融合した志賀毒素様毒素のＡ１部分を含んでなるハイブリッド細菌毒素Ａサブユニットに関する。
【００２２】
ＡサブユニットのＡ１部分とＡ２部分との境界は、志賀毒素様毒素およびＬＴの両方に関して、非常に厳密に決められうる。Ａ１部分およびＡ２部分は、２つのジスルフィドにより連結されたシステインの間の短いループにより互いに連結される。このループがＡ１部分とＡ２部分とを連結する。哺乳類細胞内へのＬＴまたは志賀毒素様毒素の進入後、このループ内に切断が生じ、この間に、（志賀毒素様毒素２７．５ｋＤの場合には）Ａ１部分および（志賀毒素様毒素４．５ｋＤの場合には）Ａ２部分が分離される（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１３６８−１３７４（１９９８）およびＬｅａ，Ｎ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：９９９−００４（１９９９））。
【００２３】
配列番号１に示す配列においては、Ｓｔｘ２ｅ  Ａ１部分とＬＴ−Ａ２部分とを含む本発明のハイブリッドＡサブユニットの核酸配列の一例を示す。この配列によりコードされるハイブリッド細菌毒素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ハイブリッドＡサブユニットをコードする核酸配列は１位で始まり、９５１位で終わる。この例においては、ＡサブユニットのＳｔｘ２ｅ  Ａ１部分は核酸の１位で始まり、７８９位で終わり、したがって、これは第１のジスルフィド連結システインの直上流に位置する。ＡサブユニットのＬＴ−Ａ２部分は核酸の７９０位で始まり、９５１位で終わる。ジスルフィド連結システイン残基は、それぞれ７９０−７９２位および８２６−８２８位にコードされている。
【００２４】
したがって、Ａ１部分は、ループのＮ末端側に位置する部分と呼ぶことも可能であり、一方、Ａ２部分は、ループのＣ末端側に位置する部分と呼ぶことが可能である。原理上は、Ａ１部分とＡ２部分との間の移行点は決定的なものではないことが明らかである。前記の例においては、該移行点は、第１のジスルフィド連結システインの直上流に位置する。しかし、２つのシステイン残基の間のいずれかの位置または８２６−８２８位の第２のジスルフィド連結システインの直下流にも同様に位置しうるであろう。実際には、前提条件は、ただ１つ存在するのみである。すなわち、Ａ１部分は、志賀毒素様毒素に対する免疫を付与しうるものでなければならず、Ａ２部分は、ＬＴ五量体に結合しうるものでなければならない。さらに、本発明のハイブリッドＡサブユニットにおいては、Ａサブユニット内にタンパク質切断部位が維持される必要はない。なぜなら、これは、免疫の誘導において何の役割も果たさないからである。
【００２５】
また、ＬＴ−Ｂサブユニットが位置する位置は配列番号３に示されている。このサブユニットをコードするヌクレオチド配列は９５１位で始まり、１３２２位で終わる。勿論、この例と同様に、本発明のハイブリッドＡサブユニットをコードするヌクレオチド配列およびＬＴ−Ｂサブユニットを、同一のプラスミド内に維持するのが好都合である。そのようなプラスミドは、同時に、本発明の二成分細菌毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方の遺伝情報を与える。コード配列は、配列番号１の場合と同様に、同一のプロモーターの制御下に置かれうる。ハイブリッドＡサブユニット対ＬＴ−Ｂサブユニットの比の更なる微調整が要求される場合には、両方の発現を２つの異なるプロモーターの制御下に置くのが好都合であり得る。
【００２６】
本発明は志賀毒素および全ての志賀毒素様毒素変異体に適用可能である。これらの変異体には、ヒトにおいて疾患を引きこすことが判明しているもの、および前記のとおりに動物において疾患を引き起こすものが含まれる。志賀毒素様毒素変異体Ｓｔｘ２ｅはブタにおいて離乳後疾患を引き起こすことが公知であるため、この変異体は、明らかに、養豚業用のワクチンにおける使用のための魅力的な候補である。したがって、この実施形態の好ましい形態は、ＡサブユニットのＡ１部分がＳｔｘ２ｅのＡ１部分であるハイブリッドＡサブユニットに関する。
【００２７】
特に有益なのは、熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニットをコードする遺伝子の存在下での本発明のハイブリッド毒素Ａサブユニットの発現である。これは既に前記で説明されている。本発明のハイブリッドＡサブユニットハイブリッド志賀毒素様毒素および熱不安定性エンテロトキシンの両方の、同一細胞内での発現は、ハイブリッド二成分細菌毒素（すなわち、ＬＴのＡ２部分に融合しておりＬＴのＢサブユニットに結合している志賀毒素様毒素のＡ１部分を有する毒素）の自発的形成を招きうる。
【００２８】
このようにして得られたハイブリッド二成分毒素は、まず第１に、容易に発現されることが可能であり、第２に、それが志賀毒素様毒素に対する防御の誘導に使用しうるという点において志賀毒素様毒素の免疫原性を有し、第３に、それがＬＴの精製のための公知方法に従い容易に精製されうるという利点を有する（Ｕｅｓａｋａ，Ｙ．ら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１６：７１−７６（１９９４））。
【００２９】
したがって、この実施形態の、より好ましい形態は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）の５個のＢサブユニットと本発明のハイブリッド細菌毒素Ａサブユニットとを含んでなるハイブリッド二成分細菌毒素に関する。
【００３０】
志賀毒素様毒素およびＬＴの両方のＡサブユニットおよびＢサブユニットをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は公知であるため、本発明のハイブリッド毒素サブユニットＡをコードするヌクレオチド配列を構築するためには、遺伝子操作のための標準的な技術で十分であることは明らかである。そのようなヌクレオチド配列を操作するための１つの方法を実施例に記載する。当業者は、必要に応じて、本発明の他の志賀毒素様毒素変異体をコードする比較しうるヌクレオチド配列を製造するための十分な指針をこの実施例において見出す。
【００３１】
したがって、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子に関する。
【００３２】
そのようなヌクレオチド配列に、ＬＴのＢサブユニットをコードするヌクレオチド配列を更に加えることが、より一層有益であろう。細胞内でのそのような組合せヌクレオチド配列の発現は、本発明のハイブリッド毒素ＡサブユニットおよびＬＴ  Ｂサブユニットの自発的産生を招くであろう。そしてＨｉｓは本発明のハイブリッド二成分細菌毒素の自己形成を招く。以下に、コード化タンパク質の発現を実際に如何に行いうるかを示す。
【００３３】
ハイブリッドＡサブユニットおよびＢサブユニットをコードする遺伝情報を同一ヌクレオチド配列上に配置することは、効率的ではあるが、必ずしも必要ではない。単なる一例として示すと、それらの２つのサブユニットのそれぞれに関する遺伝情報はそれ自身のプラスミド上に位置することが可能であろう。両方のプラスミドを含む宿主細胞は、本発明のハイブリッド二成分細菌タンパク質を形成しうるであろう。さらに、異なる細菌内で両方のサブユニットを合成すること、それらを単離すること、およびそれらを一緒に、単離後に再生条件下に置くことが可能である。
【００３４】
ハイブリッド細菌毒素サブユニットの発現は、例えば、商業的に入手可能な発現系を使用することにより行うことが可能である。したがって、この実施形態の、より好ましい形態においては、本発明は、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含んでなるＤＮＡ断片に関する。ＤＮＡ断片は、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子の担体として機能するヌクレオチドの伸長である。そのようなＤＮＡ断片は、例えば、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子がクローニングされたプラスミドでありうる。後記のとおり、そのようなＤＮＡ断片は、例えば、ＤＮＡの量を増加させるのに、および本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現させるのに有用である。
【００３５】
ハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の発現のための必須要件は、そのヌクレオチド配列を含む核酸分子に機能的に連結された適当なプロモーターであり、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子が該プロモーターの制御下に置かれていることである。プロモーターの選択は、タンパク質の発現のための宿主細胞として使用する細胞内での遺伝子の転写を導きうる任意の真核性、原核性またはウイルス性プロモーターに拡張されることが当業者に明らかである。したがって、この実施形態の、より一層好ましい形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ここで、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、機能的に連結されたプロモーターの制御下に置かれる）および／またはＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは、例えば標準的な分子生物学的技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）により得ることが可能である。機能的に連結されたプロモーターは、それが連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子の転写を制御しうるプロモーターである。そのようなプロモーターは、志賀毒素様毒素の天然プロモーター、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の別のプロモーターでありうる（ただし、そのプロモーターは、発現に使用する細胞内で機能的でなければならない）。また、それは異種プロモーターでありうる。宿主細胞が細菌である場合には、使用可能な有用な発現制御配列には、Ｔｒｐプロモーターおよびオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーターおよびオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．およびＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージλプロモーターおよびオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（ビー・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））プロモーターおよびオペレーター、終結配列および他の発現増強および制御配列（選択した宿主細胞に適したもの）が含まれる。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御配列には、例えば、α接合因子が含まれる。昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスのポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターを使用することが可能である（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が脊椎動物由来である場合には、例示される有用な発現制御配列には、（ヒト）サイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ら，ＰＮＡＳ  ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（���ＳＶ，Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ら，ＰＮＡＳ  ７９，６７７７−６７８１，１９８２；Ｆｙｎａｎら，前掲；Ｕｌｍｅｒら，前掲）、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５０，７２５−７３２，１９８４）、ＳＶ−４０最初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，７７３，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーターおよびβアクチンプロモーター（Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２−１５４，１９９２）が含まれる。調節配列には、ターミネーターおよびポリアデニル化配列も含まれうる。使用しうる配列には、よく知られたウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーターおよびポリアデニル化配列が含まれる。
【００３６】
細菌、酵母、真菌、昆虫および脊椎動物細胞発現系は、非常に頻繁に使用される系である。そのような系は当技術分野でよく知られており、一般に入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡから商業的に入手可能である。これらの発現系に次ぐものとしては、寄生生物に基づく発現系が魅力的な発現系である。そのような系は、例えば、公開番号２  ７１４  ０７４のフランス国特許出願、およびＵＳ−ＮＴＩＳ公開ＵＳ  ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，ＳおよびＲｏｇｅｒｓ，Ｗ．：１９９３年１２月１日付け公開）に記載されている。
【００３７】
本発明のこの実施形態の更により一層好ましい形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、本発明のＤＮＡ断片または本発明の組換えＤＮＡ分子を含んでなる生組換え担体（Ｌｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ（ＬＲＣ））に関する。これらのＬＲＣは、追加的な遺伝情報（この場合には、本発明のハイブリッドサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子）がクローニングされている微生物またはウイルスである。そのようなＬＲＣに感染したブタは、該担体の免疫原に対してだけでなく該タンパク質の免疫原性部分（それに関する遺伝暗号が該ＬＲＣ内に追加的にクローニングされているもの、例えば、本発明の新規ハイブリッド細菌毒素サブユニット）に対しても免疫応答を産生することとなる。
【００３８】
細菌ＬＲＣの一例として、当技術分野で公知の弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株が非常に魅力的に使用されうる。また、生組換え担体寄生生物は、とりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８）により記載されている。さらに、ＬＲＣウイルスは、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を標的細胞内に輸送する手段として使用することが可能である。また、生組換え担体ウイルスは、ベクターウイルスとも称される。ベクターとしてしばしば使用されるウイルスとしては、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）およびレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら；ｉｎ  Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．およびＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ−１９８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９（１９８９））が挙げられる。
【００３９】
本発明の挿入されたヌクレオチド配列の発現を宿主動物において誘導しうる選択した細菌、寄生生物またはウイルスのゲノム内に組換え核酸分子を導入するためには、当技術分野でよく知られているインビボ相同組換えの技術を用いることが可能である。
【００４０】
最後に、本発明のこの実施形態のもう１つの形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、そのような核酸分子を含むＤＮＡ断片、または機能的に連結されたプロモーターの制御下でそのような核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞に関する。この形態はまた、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む生組換え担体を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌に基づくプラスミドまたはｐＧＥＸのような細菌発現ベクターまたはバクテリーファージと組合された、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）およびラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種などの細菌由来の細胞でありうる。また、宿主細胞は、真核生物由来であることが可能であり、例えば、酵母特異的ベクター分子と組合された酵母細胞、あるいはベクターまたは組換えバキュロウイルスと組合された昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８））、例えばＴｉ−プラスミドに基づくベクターまたは植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら；Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））と組合された植物細胞、同様に適当なベクターまたは組換えウイルスと組合されたＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、クランデル・フェリン腎細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ−ｃｅｌｌｓ）などの哺乳類細胞などの高等真核細胞でありうる。
【００４１】
本発明の十分な量のハイブリッド毒素サブユニットＡおよびハイブリッド二成分毒素をインビトロ発現系において製造することが本発明において初めて可能となったため、これらのハイブリッド毒素に基づくワクチンを製造することが可能となった。
【００４２】
これらの遺伝子の発現産物に基づくワクチンは、本発明の毒素を、後記の製薬上許容される担体と混合することにより容易に製造することが可能である。
【００４３】
必要に応じて、当技術分野で公知の技術、例えばホルマリン処理により、毒素を解毒することが可能である。
【００４４】
したがって、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素または本発明のハイブリッド二成分細菌毒素と製薬上許容される担体とを含んでなるワクチンに関する。
【００４５】
本発明のもう１つの実施形態は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）感染に対するワクチンの製造のための、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットまたはハイブリッド二成分細菌毒素の使用に関する。
【００４６】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質を発現しうる前記の生組換え担体を含みうる。そのようなワクチン、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）担体またはウイルス担体（例えばヘルペスウイルスベクター）に基づくものは、それらが、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の感染の天然態様をより良く模擬する点で、サブユニットワクチンより優れている。さらに、それらの自己増殖は利点である。なぜなら、免疫には、少量の該組換え担体が必要とされるに過ぎないからである。
【００４７】
ワクチンは、本発明の細菌毒素を含む前記の宿主細胞に基づくことも可能である。
【００４８】
したがって、ワクチン実施形態のもう１つの形態は、本発明の生組換え担体または本発明の宿主細胞と製薬上許容される担体とを含んでなるワクチンに関する。
【００４９】
本発明の更にもう１つの実施形態は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）感染に対するワクチンの製造のための、本発明の生組換え担体または宿主細胞の使用に関する。
【００５０】
本発明の更にもう１つの実施形態は、ワクチンにおける使用のための本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットまたはハイブリッド二成分毒素に関する。
【００５１】
本発明の更にもう１つの実施形態は、ワクチンにおける使用のための本発明の生組換え担体または宿主細胞に関する。
【００５２】
前記のすべてのワクチンは能動ワクチン接種に寄与する。すなわち、それらは宿主の防御系を惹起する。あるいは、抗体を例えばウサギにおいて産生させることが可能であり、あるいは後記の抗体産生細胞系から得ることが可能である。ついでそのような抗体を、防御すべきヒトまたは動物に投与することが可能である。このワクチン接種方法、すなわち受身免疫は、動物が既に感染しており自然免疫応答を惹起させる時間が無い場合に選択されるワクチン接種である。また、それは、急な高い感染の圧力を受ける傾向にある動物をワクチン接種するための好ましい方法である。本発明のタンパク質またはその免疫原性断片に対する投与された抗体は、これらの場合、志賀毒素様毒素に直接的に結合しうる。これは、それがシゲラ毒素様毒素産生シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による感染の有害な作用を軽減または阻止するという利点を有する。したがって、本発明のこの実施形態の１つの他の形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素に対する抗体と製薬上許容される担体とを含んでなる、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）感染に対するワクチンに関する。
【００５３】
本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のハイブリッド毒素に対する抗体に関する。
【００５４】
本発明の抗体の大規模製造のための方法も当技術分野で公知である。そのような方法は、ファージディスプレイのための線維状ファージにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝情報の（断片の）クローニングに基づく。そのような技術は、とりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．における“ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”の“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｇｅ”、およびＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら，（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９４），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５、およびＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら，（１９９４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５の総説に記載されている。ついで該ファージを使用して、ラクダ科動物重鎖抗体を発現するラクダ科動物発現ライブラリーをスクリーニングする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．およびＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：１３１−１４０（１９９９）ならびにＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望の抗体を発現するライブラリーからの細胞を増殖させ、ついで抗体の大規模発現に使用することが可能である。
【００５５】
さらにもう１つの実施形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素に対する抗体と製薬上許容される担体とを混合することを含んでなる、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【００５６】
ワクチン接種のための代替的な効率的方法は、関連抗原をコードするＤＮＡでの直接的ワクチン接種である。タンパク質をコードするＤＮＡでの直接的ワクチン接種は多種多様なタンパク質において成功している（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：２０−２６（１９９３）において概説されている）。このワクチン接種方法は、志賀毒素様毒素を産生するシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株による感染に対するヒトおよび動物のワクチン接種にも魅力的なものである。
【００５７】
したがって、本発明のこの実施形態の更に他の形態は、本発明のハイブリッド毒素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、本発明のＤＮＡ断片または本発明の組換えＤＮＡ分子と製薬上許容される担体とを含んでなるワクチンに関する。
【００５８】
本発明のＤＮＡワクチンにおける使用に適したＤＮＡプラスミドの例としては、細菌、真核生物および酵母宿主細胞のための通常のクローニングまたは発現プラスミドが挙げられ、該プラスミドの多くは商業的に入手可能である。そのようなプラスミドのよく知られた例としては、ｐＢＲ３２２およびｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。本発明のＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列を含む核酸分子のタンパク質発現を誘導しうるはずである。該ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は本発明の１以上のヌクレオチド配列を含みうる。また、該ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は、非メチル化ＣｐＧジ−ヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドのようなヌクレオチド配列または他の抗原タンパク質もしくはアジュバント性サイトカインをコードするヌクレオチド配列を含む他の核酸分子を含みうる。
【００５９】
本発明のワクチンにおいて使用する、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子、または本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むＤＮＡプラスミド（好ましくは、転写調節配列に機能的に連結されたもの）は、裸形態であることが可能であり、あるいは運搬系に組込まれていることが可能である。適当な運搬系は、脂質小胞、イスコム（ｉｓｃｏｍｓ）、デンドロマー（ｄｅｎｄｒｏｍｅｒ）、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、多糖マトリックスなど（後記を参照されたい）であり、これらは全て、当技術分野で公知である。また、運搬系として非常に適しているのは、弱毒化生細菌、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、および弱毒化生ウイルス、例えばヘルペスウイルスベクター（前記のとおり）である。
【００６０】
ＤＮＡワクチンは、皮内適用により、例えば無針注射器を使用することにより容易に投与することが可能である。この投与方法は、ワクチン接種すべき動物の細胞内に該ＤＮＡを直接的に運搬する。１０ｐｇ〜１０００μｇの範囲のＤＮＡ量が良好な結果を与える。好ましくは、１〜１００μｇのマイクログラム範囲の量を用いる。
【００６１】
本発明のもう１つの実施形態は、ワクチンにおける使用のための、本発明のヌクレオチド配列、本発明のＤＮＡ断片または本発明の組換えＤＮＡ分子を含む核酸分子に関する。
【００６２】
本発明の更にもう１つの実施形態は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）感染に対するワクチンの製造のための、本発明のヌクレオチド配列、ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子を含む核酸分子の使用に関する。
【００６３】
もう１つの実施形態においては、本発明のワクチンは更に、病原生物およびウイルスに由来する１以上の抗原、それらの抗原に対する抗体またはそのような抗原をコードする遺伝情報を含む。
【００６４】
勿論、そのような抗原は、例えば他のシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原でありうる。それはまた、もう１つの他のブタ病原生物またはウイルスから選ばれる抗原でありうる。ブタのワクチン接種に該ワクチンを使用する場合には、そのような生物およびウイルスは、好ましくは、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオニュウモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタヒロコッカス・ヒイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の群から選ばれる。
【００６５】
本発明の全てのワクチンは、製薬上許容される担体を含む。製薬上許容される担体は、例えば無菌水または無菌生理食塩水でありうる。より複雑な形態においては、該担体は、例えばバッファーでありうる。
【００６６】
ワクチンの製造方法は、本発明のタンパク質および／またはそのタンパク質もしくはその免疫原性断片に対する抗体および／またはヌクレオチド配列を含む核酸分子および／またはＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体または宿主細胞と、製薬上許容される担体とを混合することを含む。
【００６７】
本発明のワクチンは、好ましい形態においては、免疫刺激性物質、いわゆるアジュバントを含有しうる。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質を含む。多種多様なアジュバントが当技術分野で公知である。ブタワクチンにおいて頻繁に使用されるアジュバントの具体例としては、ムラミルジペプチド、リポ多糖、いくつかのグルカンおよびグリカンならびにカルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））（ホモポリマー）が挙げられる。該ワクチンはまた、いわゆる「ビヒクル」を含みうる。ビヒクルは、該タンパク質が、それに共有結合することなく、付着している化合物である。そのようなビヒクルとしては、とりわけ、バイオマイクロカプセル（ｂｉｏ−ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅ）、マイクロアルギナート（ｍｉｃｒｏ−ａｌｇｉｎａｔｅ）、リポソームおよびマクロゾル（ｍａｃｒｏｓｏｌ）が挙げられ、これらの全ては当技術分野で公知である。該抗原がビヒクル内に部分的に包埋されている、そのようなビヒクルの特別な形態が、いわゆる、ＩＳＣＯＭ（ＥＰ  １０９．９４２、ＥＰ  １８０．５６４、ＥＰ  ２４２．３８０）である。
【００６８】
また、該ワクチンは、１以上の適当な界面活性化合物または乳化剤、例えばスパン（Ｓｐａｎ）もしくはトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）を含みうる。
【００６９】
しばしば、該ワクチンを安定剤と混合して、例えば易分解性タンパク質の分解を防ぎ、該ワクチンの貯蔵寿命を増加させ、あるいは凍結乾燥効率を改善する。有用な安定剤としては、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼインまたはそれらの分解産物、およびバッファー、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。また、該ワクチンを、生理的に許容される希釈剤に懸濁させることが可能である。言うまでもなく、アジュバント化、ビヒクル化合物または希釈剤の添加、タンパク質の乳化または安定化のための他の方法も本発明に包含される。
【００７０】
本発明の細菌毒素および／またはサブユニットに基づくワクチンは、非常に適切には、動物当たりタンパク質１〜１００マイクログラムの量で投与されうるが、原理上はそれより少量を用いることも可能である。１００マイクログラムを超える用量は、免疫学的には非常に適しているが、商業的理由からはそれほど魅力的ではないであろう。
【００７１】
前記のＬＲＣ−ウイルスおよび細菌のような生弱毒化組換え担体に基づくワクチンは、はるかに低い用量で投与されうる。なぜなら、それらは感染中に増殖するからである。したがって、非常に適した量は、それぞれ細菌およびウイルスに関して、１０３および１０９  ＣＦＵ／ＰＦＵの間の範囲であろう。
【００７２】
本発明のワクチンは、例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内または粘膜表面、例えば経口的もしくは鼻腔内に投与されうる。
【００７３】
本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のハイブリッド細菌毒素サブユニットまたはハイブリッド二成分細菌毒素と製薬上許容される担体とを混合することを含んでなる、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【００７４】
本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明の核酸配列、ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子を製薬上許容される担体と混合することを含んでなる、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【００７５】
最後に、本発明のもう１つの実施形態は、本発明の生組換え担体もしくは宿主細胞または本発明のハイブリッド（二成分）細菌毒素に対する抗体と製薬上許容される担体とを混合することを含んでなる、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【００７６】
実施例
【実施例１】
【００７７】
発現プラスミドの構築
細菌株およびプラスミド
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）およびＢＬ２１コドン＋ＲＩＬ（ＤＥ３）をＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１ＯＦ’ならびにプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ＴＡおよびｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。プラスミドｐＭＭＢ６６ＨＥはＦｕｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｇｅｎｅ  ４８：１１９−１３１（１９８６）に記載されている。
【００７８】
ＰＣＲ増幅およびＰＣＲ産物のクローニング
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡ上でのＰＣＲをＳｕｐｅｒｔａｑ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼで行った。該ＰＣＲ混合物は、２０Ｕ／ｍｌ  Ｓｕｐｅｒｔａｑ  ｐｌｕｓ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、８ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）、１０ｐｍｏｌのプライマーおよびＤＮＡ鋳型としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１５ｎｇの染色体ＤＮＡを含有するＳｕｐｅｒｔａｑバッファー（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を含有していた。ＤＮＡの増幅に使用する全てのプライマーのオリゴヌクレオチド配列を表１に示す。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用してゲル精製した。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６））に記載されているとおりに、重複伸長ＰＣＲを行った。ＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−ｔｏｐｏ内にクローニングした。クローニング反応は、製造業者の指示に従い行った。
【００７９】
ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂの構築
高忠実度ポリメラーゼを使用し、鋳型としてのＥＤＮＬ５０染色体ＤＮＡと共にプライマー＃１８３２および＃１８３３（表１を参照されたい）を使用するＰＣＲにより、Ｓｔｘ２ｅＡ１を増幅した。離乳後水腫疾患と診断されたブタからＥＤＮＬ５０を単離した。これに関しては、志賀毒素様毒素を産生する任意の他の株も同様に使用可能であったであろう。高忠実度ポリメラーゼを使用し、鋳型としてのプラスミドｐＭＭＢ６６−ＬＴと共にプライマー＃１８３４および＃１８３５（表１を参照されたい）を使用して、ジスルフィド架橋を含むＬＴＡ２ＬＴＢを増幅した。これに関しては、この場合にも、ＬＴを産生する任意の他の株も同様に使用可能であったであろう。プライマー＃１８３２および＃１８３５を使用して得た重複伸長ＰＣＲ産物においては、１マイクロリットルの各ＰＣＲ液を使用した。得られたＰＣＲ産物およびｐＭＭＢ６６ＨＥをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ついで連結して、ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂを得た。該プラスミドをヌクレオチド配列分析により調べたところ、人工産物は見出されなかった。図２は、ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂの構築スキームを示す。
【００８０】
【表１】
0004599354.tif 000002
【実施例２】
【００８１】
Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂの発現および精製
組換えタンパク質の発現
ｔａｃプロモーターに基づく発現ベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現株を、適当な抗生物質および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する５ｍｌのＴＢ中、３７℃、２００ｒｐｍで一晩増殖させた。翌朝、該一晩培養物を、適当な抗生物質を含有する５ｍｌのＴＢで１：１００希釈した。ＮｏｖａｓｐｅｃＩＩ分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｗｏｅｒｄｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）による測定でＯＤ６００が０．５に達するまで、これらの培養物を同一条件下で成長させた。この時点で、該培養物を、最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加により誘導し、ついで更に３７℃で３時間インキュベートした。適当な対照の及び最終インキュベーションの開始時および終了時に、分析のために、１００μｌのサンプルを採取した。該サンプルをＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびそれに続くクーマシーブリリアントブルー染色により分析した。残りの培養物を５，０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを更なる使用まで−２０℃で保存した。
【００８２】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット法
ＮｕＰＡＧＥ電気泳動系（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）からの４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。変性タンパク質プロフィールを得るために、分離前に、サンプルを、β−メルカプトエタノールの存在下、サンプルバッファー（サンプル：バッファー＝２：１）と共に５分間煮沸した。非変性タンパク質の分離のためには、β−メルカプトエタノールを含有しないサンプルバッファーをサンプルに加えた。これらのサンプルは、加熱することなくゲル上にローディングした。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、または標準的な半乾燥ウエスタンブロット法によりＩｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ−メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）上にブロットした。ウサギ抗ＬＴポリクローナルα０５０８／０９ＨＲＰおよびウサギ抗ＬＴポリクローナルα０５０６／０７をホルマリン不活化ＬＴに対して産生させた。抗ＬＴ−Ａモノクローナル抗体をＢｉｏｔｒｅｎｄ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。陽性対照として使用したＬＴ（Ｋ８４２５）は製造バッチからのものであった。該ＬＴは、培養上清から精製されたガラクトース−シリカであった。溶出に使用したガラクトースは透析により除去した。最終産物は１５６ｍｇ／ｌのＬＴを含有していた。
【００８３】
発現タンパク質のガラクトース精製
誘導された５ｍｌの培養物をデューティーサイクル５０％およびマイクロティップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）で超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）して完全に細胞溶解した。ライセートを６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して不溶性タンパク質を除去した。清澄化上清を１ｍｌ  ガラクトース−シリカカラムに適用した。カラム物質はＯｒｇａｎｏｎ（Ｏｓｓ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給されたものである。このカラムを１０容量のＴＥＡＮバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，３ｍＭ  Ｎａ−アジド，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ  ７．５）で予め平衡化した。該上清の結合後、該カラムを５容量のＴＥＡＮバッファーで洗浄した。精製タンパク質を０．５Ｍ  ガラクトースで溶出し、更なる使用まで４℃で保存した。
【００８４】
結果
Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ融合タンパク質の発現
３つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現株を該融合タンパク質の発現に関して試験した。構築物ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２ＢをＢｌ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）およびＪＡ２２１に導入し、記載されているとおりに誘導した。発現株Ｂｌ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）が最高発現レベルを示した（データ非表示）。
【００８５】
ウエスタンブロット法を用いるＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２の同定
前記のＳＤＳ−ＰＡＡＧＥ−ゲルを標準的な半乾燥ウエスタンブロット法によりＩｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ−メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）上にブロットした。該ブロットを現像するためのウサギ抗ＬＴポリクローナルα０５０６／０７は、ホルマリン不活化ＬＴに対して産生させた。陽性対照として使用したＬＴは、アフィニティークロマトグラフィー（ガラクトース−シリカ）を用いて培養上清から精製したものであった。図３、レーン２から理解されうるとおり、両方のＬＴサブユニットがポリクローナル抗血清と反応した（ＬＴＡ（２６ｋＤａ）およびＬＴＢ（１４．１ｋＤａ））。この後者のバンドは、予想どおり、ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂの発現産物を含有するレーン１においても認められる。Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２におけるＬＴＡ２断片の存在は、予想サイズ（３５．１ｋＤａ）のレーン１における明らかに可視性のＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２バンドを得るのに十分なものであった。
【００８６】
Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂのガラクトース精製
ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂを、記載されているとおりに誘導し、Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ融合タンパク質をガラクトース精製により細菌ペレットから精製した。結果を図４に示す。この図は該ガラクトース−シリカカラムの種々の画分中のＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ発現産物の量および純度を示している：レーン１：前染色マーカー；レーン２：誘導前の全培養ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ；レーン３：未結合画分；レーン４：洗浄容量１；レーン５：洗浄容量５；レーン６：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物１；レーン７：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物２；レーン８：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物３；レーン９：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物４；レーン１０：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物５；レーン１１：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物６；レーン１２：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物７；レーン１３：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物８。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】典型的な志賀毒素様毒素の概要図；その全体構造、ＡサブユニットのＡ１／２部分の位置およびＢサブユニットの位置を示す。
【図２】ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂの構築。
【図３】抗ＬＴ血清で現像したウエスタンブロット。レーン１：Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ；レーン２：ＬＴＡ／Ｂ；レーン３：前染色マーカー。
【図４】ガラクトース−シリカ精製。ＰＡＡＧＥ−ゲル、クーマシー染色。レーン１：前染色マーカー；レーン２：誘導前の全培養ｐＭＭＢ  Ｓｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ；レーン３：未結合画分；レーン４：洗浄容量１；レーン５：洗浄容量５；レーン６：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物１；レーン７：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物２；レーン８：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物３；レーン９：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物４；レーン１０：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物５；レーン１１：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物６；レーン１２：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物７；レーン１３：精製されたＳｔｘ２ｅＡ１ＬＴＡ２Ｂ溶出物８。
【図１】
0004599354.tif 000003
【図２】
0004599354.tif 000004
【図３】
0004599354.tif 000005
【図４】
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【配列表】
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