(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の生体試料において、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断量を測定することを特徴とする、ＤＡＮＣＥ切断量の検査方法。
【請求項２】
（１）哺乳動物がヒトであり、ＤＡＮＣＥの切断量として、ＤＡＮＣＥの切断により生じる、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの量を測定する；
（２）哺乳動物がマウスであり、ＤＡＮＣＥの切断量として、ＤＡＮＣＥの切断により生じる、配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの量を測定する；又は
（３）哺乳動物がラットであり、ＤＡＮＣＥの切断量として、ＤＡＮＣＥの切断により生じる、配列番号１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの量を測定する
請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
ＤＡＮＣＥ断片に対する抗体を含有する、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断量の測定用試薬であって、
（１）ＤＡＮＣＥ断片が、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＤＡＮＣＥがヒトＤＡＮＣＥである；
（２）ＤＡＮＣＥ断片が、配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＤＡＮＣＥがマウスＤＡＮＣＥである；又は
（３）ＤＡＮＣＥ断片が、配列番号１４又は１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＤＡＮＣＥがラットＤＡＮＣＥである
測定用試薬。
【請求項４】
配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列（ここで、該アミノ酸配列においては配列番号６で表されるアミノ酸配列において３１番目〜３３番目に相当するＲＧＤモチーフが保持されている）からなり、かつインテグリン結合活性およびＤＡＮＣＥ間の結合活性を有する、ポリペプチド。
【請求項５】
ヒト又はマウス由来のポリペプチドである、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号８で表されるアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリシルオキシダーゼ様−１結合活性およびＬＴＢＰ２結合活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１０】
ヒト又はマウス由来のポリペプチドである、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ＤＡＮＣＥを、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに接触させることを特徴とする、ＤＡＮＣＥの切断方法であって、
i) 皮膚線維芽細胞、２９３Ｔ細胞、肺組織由来の細胞、皮膚組織由来の細胞、及びこれらの細胞から誘導される細胞からなる群から選択されるいずれかの前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞へＤＡＮＣＥ発現ベクターを導入することにより得られるＤＡＮＣＥ及び前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの両方を発現する細胞を培養すること、又は
ii) 皮膚線維芽細胞、２９３Ｔ細胞、肺組織由来の細胞、皮膚組織由来の細胞、及びこれらの細胞から誘導される細胞からなる群から選択されるいずれかの前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞の培養上清、当該細胞の抽出液、肺組織又は皮膚組織の抽出液、或いは当該培養上清や抽出液からの粗精製液へＤＡＮＣＥを添加すること
により、ＤＡＮＣＥが前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに接触される、方法。
【請求項１５】
請求項４〜６のいずれか１項記載のポリペプチドに特異的親和性を有する抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１６記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断部位に、当該プロテアーゼに抵抗性を示すようにアミノ酸変異が導入されている、ＤＡＮＣＥ変異体であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において７７番目〜７８番目のアミノ酸が変異したアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において５４番目〜５５番目のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を含む、ＤＡＮＣＥ変異体。
【請求項１９】
請求項１８記載のＤＡＮＣＥ変異体をコードする塩基配列からなる、又は該塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９記載のポリヌクレオチド及びそれに機能可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項２２】
請求項１８記載のＤＡＮＣＥ変異体又は請求項２０記載の発現ベクター、及び医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）皮膚線維芽細胞、２９３Ｔ細胞、肺組織由来の細胞、皮膚組織由来の細胞、及びこれらの細胞から誘導される細胞からなる群から選択されるいずれかの前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞の培養上清、当該細胞の抽出液、肺組織又は皮膚組織の抽出液、或いは当該培養上清や抽出液からの粗精製液へ被検物質を添加することにより、被検物質を、前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じる前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を測定し、該活性を被検物質を接触させない場合の前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性の調節をもたらす被検物質を選択する工程。
【請求項２４】
弾性線維形成調節剤を同定するための方法である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）被検物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じる前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を測定し、該活性を被検物質を投与しない場合の前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、前記ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性の調節をもたらす被検物質を選択する工程。
【請求項２６】
ＤＡＮＣＥの切断活性を指標とする、セリンプロテアーゼインヒビターであるアプロチニンにより阻害され、システインプロテアーゼインヒビターであるＥ６４により阻害されない、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのスクリーニング方法。
【請求項２７】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞の同定方法：
（ａ）所定の動物細胞とＤＡＮＣＥとを接触させる工程；
（ｂ）ＤＡＮＣＥが切断されるか否かを評価する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＤＡＮＣＥの切断により得られるポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド；ＤＡＮＣＥの切断方法；ＤＡＮＣＥの切断により得られるポリヌクレオチドに対する抗体；ＤＡＮＣＥ切断量の測定方法・キット；ＤＡＮＣＥ変異体及びそれをコードするポリヌクレオチド；種々のＤＡＮＣＥ複合体及びその調製方法；ＤＡＮＣＥの活性を調節し得る物質又はＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのスクリーニング方法、及びそれにより得られる物質；弾性線維形成調節剤；並びにＤＡＮＣＥ及びそれをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含むキットなどに関する。
【背景技術】  弾性線維は、肺・動脈・皮膚等の伸縮性組織に富む、組織の弾性を担う細胞外線維である。ヒトの老化の大きな特徴は、組織の弾性の喪失であり、これにより肺気腫、動脈の硬化と蛇行、皮膚のたるみ等が生じる。これらは高齢化社会において重要性を増している課題であるが、その多くは弾性線維の劣化・断裂が原因である。弾性線維の重要性にもかかわらず、弾性線維の形成および劣化の分子機構に関する詳細は依然として不明である。
弾性線維の形成時には、ミクロフィブリルとよばれる線維に沿ってエラスチンが沈着し、リシルオキシダーゼファミリーの酵素〔リシルオキシダーゼ（ｌｙｓｙｌｏｘｉｄａｓｅ：ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様（ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ：ＬＯＸＬ）１−４〕によりエラスチンがクロスリンクされることが重要である（Ｍｏｌｎａｒ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６４７：２２０−４（２００３）、Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ，Ｊ．ら，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．７：１２０８−１８．（１９９３））。しかしこの手順がどのような分子機構に基づき生体内で行われているのかについてわかっていることは少ない。また、ミクロフィブリルの本体はフィブリリン１、フィブリリン２、ＬＴＢＰ２（ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）といった細長い高分子量タンパク質であると言われているが、フィブリリン１，フィブリリン２遺伝子のノックアウトマウスはいずれも弾性線維に異常が無いためこれらタンパク質の弾性線維形成への寄与は考えにくく（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｌ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２１８−２２（１９９７）、Ｐｕｔｎａｍ，Ｅ．Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：４５６−８（１９９５）、Ｃｈａｕｄｈｒｙ，Ｓ．Ｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：８３５−４３（２００１））、ＬＴＢＰ２遺伝子のノックアウトマウスは胎生早期致死であるため、ＬＴＢＰ２が弾性線維形成に寄与しているかどうかは不明である（Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：４８７９−８７（２０００））。
本発明者らは、Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｒａｐ法を用いてＤＡＮＣＥ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；ｆｉｂｕｌｉｎ−５ともいう）という分泌タンパク質をクローニングし（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２４７６−８３（１９９９））、そのノックアウトマウスを作成したところ、全身の弾性線維がばらばらになっていることを見出した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１７１−５（２００２））。このためＤＡＮＣＥ遺伝子欠損マウスの表現型はヒトの老化に非常に類似しており、皮膚は弾性が無くたるみ、重度の肺気腫をきたし、動脈は蛇行して硬化していた。すなわち、ＤＡＮＣＥは弾性線維形成に必須のタンパク質である。また、本発明者らは、ＤＡＮＣＥのインテグリンへの結合が生体において重要な役割を果たし得ることを明らかにしている（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２４７６−８３（１９９９））。
最近、エラスチンをクロスリンクする酵素のひとつ、ＬＯＸＬ１のノックアウトマウスはＤＡＮＣＥノックアウトマウスとよく似て弾性線維の形成異常をきたすことが報告された（Ｌｉｕ，Ｘ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：１７８−８２（２００４））。ＬＯＸＬ１はＤＡＮＣＥと結合すること、ＤＡＮＣＥノックアウトマウスではＬＯＸＬ１は弾性線維上に局在しなくなることから、ＤＡＮＣＥはＬＯＸＬ１酵素をしかるべき位置につなぎ止めておくアダプターとして働くと推測される。ＬＯＸＬ１ノックアウトマウスの表現型はＤＡＮＣＥノックアウトマウスの表現型よりも弱く、やや遅れて出現するため、ＤＡＮＣＥの役割はＬＯＸＬ１をつなぎ止めるだけではないと考えられるが、ＤＡＮＣＥがエラスチンクロスリンク酵素の局在を規定するという知見は、ＤＡＮＣＥが弾性線維形成に寄与する分子機構を理解する上で重要である。
しかし、弾性線維がミクロフィブリルに沿って形成されることを考えると、ＤＡＮＣＥがエラスチンクロスリンク酵素と結合するだけでは不十分で、ＤＡＮＣＥがミクロフィブリルの構成タンパク質と結合することが必要であると考えられる。しかしながら、ＤＡＮＣＥがミクロフィブリルのどのタンパクと結合するのかは依然として不明のままである。ＤＡＮＣＥの詳細な機能が明らかになれば、弾性線維形成を調節し得る新たな作用機序を有する医薬の開発が可能になると考えられるため、その機能の解明が切望されている。
【発明の開示】
従って、本発明は、ＤＡＮＣＥの機能の一端を解明することにより、当該解明された機能を利用して、弾性線維形成を調節し得る医薬の開発を可能とするスクリーニング方法、弾性線維形成の状態についての診断方法、当該スクリーニング方法及び診断方法に必要な種々の手段を提供することなどを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＤＡＮＣＥの一部が生体内で切断されて機能変化をおこすことを見出した。切断型ＤＡＮＣＥは、細胞表面インテグリンとの結合能、ＤＡＮＣＥ同士の結合能を失い、ミクロフィブリルの構成タンパク質であるＬＴＢＰ２に対するより強い結合能を獲得する。従って、ＤＡＮＣＥの切断は弾性線維形成の調節に重要であると考えられる。
また、本発明者らは、ＤＡＮＣＥがＬＴＢＰ２と結合すること、ＤＡＮＣＥ同士が結合すること、ＤＡＮＣＥがリシルオキシダーゼに結合することなどを見出した。ＤＡＮＣＥのこれらタンパク質への結合は弾性線維形成の調節に重要であると考えられる。
本発明者らは、以上の知見に基づき本発明を完成した。即ち、本発明は下記の通りである：
＜１＞配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断により得られるポリペプチド。
＜２＞配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜３＞上記＜１＞のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
＜４＞配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
＜５＞配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断により得られるポリペプチド。
＜６＞配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜７＞上記＜５＞のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
＜８＞配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
＜９＞ＤＡＮＣＥをＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに接触させることを特徴とする、ＤＡＮＣＥの切断方法。
＜１０＞上記＜１＞又は＜２＞のポリペプチドに特異的親和性を有する抗体。
＜１１＞上記＜５＞又は＜６＞のポリペプチドに特異的親和性を有するモノクローナル抗体。
＜１２＞動物由来の生体試料においてＤＡＮＣＥの切断量を測定することを特徴とする方法。
＜１３＞抗ＤＡＮＣＥ抗体を含有することを特徴とする、ＤＡＮＣＥの切断量の測定用キット。
＜１４＞ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断部位に、当該プロテアーゼに抵抗性を示すようにアミノ酸変異が導入されている、ＤＡＮＣＥ変異体。
＜１５＞上記＜１４＞のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
＜１６＞少なくとも２つのＤＡＮＣＥを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体。
＜１７＞識別可能な形態である少なくとも２種類のＤＡＮＣＥを含んでなる、上記＜１６＞の複合体。
＜１８＞リシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２をさらに含んでなる上記＜１６＞又は＜１７＞の複合体。
＜１９＞少なくとも１つのＤＡＮＣＥ、並びにリシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２を含んでなるＤＡＮＣＥ複合体。
＜２０＞少なくとも２つのＤＡＮＣＥを接触させ、複合体を形成させることを特徴とする、少なくとも２つのＤＡＮＣＥを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体の調製方法。
＜２１＞少なくとも１つのＤＡＮＣＥをリシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２に接触させ、複合体を形成させることを特徴とする、少なくとも１つのＤＡＮＣＥ、並びにリシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２を含んでなるＤＡＮＣＥ複合体の調製方法。
＜２２＞以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）被検物質を、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を測定し、該活性を被検物質を接触させない場合のＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性の調節をもたらす被検物質を選択する工程。
＜２３＞弾性線維形成調節剤を同定するための方法である、上記＜２２＞の方法。
＜２４＞以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）被検物質を動物に投与する工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を測定し、該活性を被検物質を投与しない場合のＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性の調節をもたらす被検物質を選択する工程。
＜２５＞以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、少なくとも２つのＤＡＮＣＥを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）被検物質の存在下、少なくとも２つのＤＡＮＣＥを接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ複合体の量を測定し、該量を被検物質の不在下におけるＤＡＮＣＥ複合体の量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節する被検物質を選択する工程。
＜２６＞識別可能な形態である少なくとも２種類のＤＡＮＣＥを用いる、上記＜２５＞の方法。
＜２７＞以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、少なくとも１つのＤＡＮＣＥ、並びにリシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２を含んでなるＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法：
（ａ）被検物質の存在下、少なくとも１つのＤＡＮＣＥをリシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２に接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ複合体の量を測定し、該量を被検物質の不在下におけるＤＡＮＣＥ複合体の量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節する被検物質を選択する工程。
＜２８＞上記＜２３＞〜＜２７＞のいずれかの方法により得られる弾性線維形成調節剤。
＜２９＞ＤＡＮＣＥの切断活性を指標とする、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのスクリーニング方法。
＜３０＞上記＜２９＞の方法により得られるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ。
＜３１＞上記＜２９＞の方法により得られるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
＜３２＞上記＜３０＞のＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ、又は上記＜３１＞のポリヌクレオチドを含有する弾性線維形成調節剤。
＜３３＞以下（ａ）及び（ｂ）を含むキット：
（ａ）ＤＡＮＣＥ、又はＤＡＮＣＥをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）以下（ｉ）〜（ｖｉ）の少なくとも１つの成分；
（ｉ）（ａ）のＤＡＮＣＥと識別可能な形態のＤＡＮＣＥ；
（ｉｉ）（ａ）のＤＡＮＣＥと識別可能な形態のＤＡＮＣＥをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）リシルオキシダーゼ；
（ｉｖ）リシルオキシダーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖ）ＬＴＢＰ２；
（ｖｉ）ＬＴＢＰ２をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
＜３４＞以下の工程（ａ）〜（ｂ）を含む、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞の同定方法：
（ａ）所定の動物細胞とＤＡＮＣＥとを接触させる工程；
（ｂ）ＤＡＮＣＥが切断されるか否かを評価する工程。
本発明のスクリーニング方法は、弾性線維形成を調節し得る新規作用機序の医薬の開発、又はＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの同定を可能にするため有用である。また、本発明の測定方法は、弾性線維形成の状態の診断を可能とするため有用である。さらに、本発明のポリペプチド、複合体及びキットは、本発明の方法を行うため、弾性線維形成の調節が所望される状態の予防、治療又は改善のため、あるいは研究・診断用試薬などとして好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＤＡＮＣＥ欠失変異体のコンストラクトを示す。横線ボックス：シグナル配列；白ボックス：カルシウム結合性ＥＧＦ様（ｃｂＥＧＦ）モチーフ；黒ボックス：ＲＧＤモチーフ；縦線ボックス：Ｃ末端ドメイン；斜線ボックス：ＦＬＡＧタグ。
図２は、２９３Ｔ細胞でのヒト、マウスＤＡＮＣＥの強制発現を示す。
図３は、マウス皮膚線維芽細胞の培養上清におけるＤＡＮＣＥの発現を示す。
図４は、マウス肺組織のウエスタンブロッティングを示す。
図５は、全長ＤＡＮＣＥ、Ｎ末端切断ＤＡＮＣＥの精製を示す。
図６は、セリンプロテアーゼインヒビターによるＤＡＮＣＥの切断阻害を示す。
図７は、インビトロ培養物におけるヒトＤＡＮＣＥの切断部位、及び変異型ＤＡＮＣＥのアミノ酸変異部位を示す。
図８は、変異型ＤＡＮＣＥ（Ｒ７７Ａ）によるＤＡＮＣＥ切断量の低下を示す。
図９は、平滑筋細胞培養物におけるＤＡＮＣＥ結合タンパク質を示す。
図１０は、ＤＡＮＣＥ欠失変異体を用いた、ＤＡＮＣＥ同士の結合、ＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ２の結合に必要な領域の解析を示す。
図１１は、ＤＡＮＣＥとリシルオキシダーゼの結合を示す。
図１２は、種々の年齢のヒトの皮膚におけるＤＡＮＣＥ蛋白質の発現を示す。Ｂａ：背部；Ｆ：顔面；Ｎ：頸部；Ｂｕ：臀部；Ｔ：口唇・腫瘍摘出時の余剰皮膚（炎症有り）
図１３は、ＤＡＮＣＥの変異蛋白質の血管内皮細胞に対する細胞接着アッセイの結果を示す。
発明の詳細な説明
１．切断型ＤＡＮＣＥ、及びそれをコードするポリヌクレオチド
本発明は、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断により得られるポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
「ＤＡＮＣＥ」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列（配列番号２で表されるアミノ酸配列から推定シグナル配列を除いたアミノ酸配列）からなるポリペプチド、又はそれらの均等物（例えば、ＳＮＰ、ハプロタイプを含むバリアント、哺乳動物オルソログなど）をいう。具体的には、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、且つＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼにより切断されるポリペプチドである。本発明では、このようなＤＡＮＣＥがＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼにより切断されることを発見し、この知見に基づきＤＡＮＣＥの切断により得られる新規ポリペプチドを提供することに成功した。
ＤＡＮＣＥの哺乳動物オルソログは特に限定されるものではないが、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスのオルソログが好ましく、ヒト、サル、ラットまたはマウスのオルソログがより好ましい。
本明細書中、「ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＤＡＮＣＥにおいて７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間を切断するプロテアーゼをいう。ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼは、セリンプロテアーゼインヒビターであるアプロチニンにより阻害され、システインプロテアーゼインヒビターであるＥ６４により阻害されないという特徴を有する。また、ＤＡＮＣＥ特異的プロテーゼは、皮膚線維芽細胞、２９３Ｔ細胞、肺組織などでの発現が確認されている。さらにＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼは、７７番目のアルギニン残基をアラニン残基に置換した変異型ＤＡＮＣＥに対する切断能の低下が確認されている。
従って、かかるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断により得られる本発明のポリペプチドの一方は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において２４番目から７７番目に相当するアミノ酸配列（即ち、配列番号６で表されるアミノ酸配列）からなるポリペプチド、又はその均等物である。具体的には、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物は、配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
また、本発明により提供されるＤＡＮＣＥの切断により生成する別のポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において７８番目から４４８番目に相当するアミノ酸配列（即ち、配列番号８で表されるアミノ酸配列）からなるポリペプチド、又はその均等物である。具体的には、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物は、配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは２以上（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列である。
また、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として、配列番号６又は８に示されるアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上、いっそうより好ましくは約９７％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を用いることもできる。同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０ｍａｔｒｉｘ、並びにｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４、及びｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５若しくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４を用いることができる。
また、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同質の活性（ここで、「活性」とは機能と同義とする）を保持していることが好ましい。「同質の活性」とは活性が定性的に同等であることを意味し、定量的にも同等であることが好ましいが、許容し得る範囲（例えば、約０．５〜約２倍）で異なっていてもよい。
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同質の活性としては、例えば、インテグリン結合活性、ホモ複合体形成活性（換言すれば、ＤＡＮＣＥ間の結合活性）が挙げられる。従って、配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、好ましくは、インテグリン結合部位であるコンセンサスＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフ（配列番号６で表されるアミノ酸配列において３１番目〜３３番目に相当するアミノ酸配列）、及び／又はホモ複合体形成部位を保持することが好ましい。ホモ複合体形成部位の正確な位置は、欠失解析等の自体公知の方法により同定できる。
配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドの好適な例としては、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（マウスオルソログ）、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ラットオルソログ）が挙げられる。
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同質の活性としては、例えば、リシルオキシダーゼ結合活性、リシルオキシダーゼ様−１結合活性、ＬＴＢＰ２結合活性などが挙げられる。従って、配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、好ましくは、リシルオキシダーゼ結合部位、リシルオキシダーゼ様−１（ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  １）結合部位、ＬＴＢＰ２（Ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−β−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）結合部位の少なくとも１以上、好ましくは２以上、より好ましくは全てを保持することが好ましい。例えば、ＬＴＢＰ２結合部位は、ＤＡＮＣＥの中央にあるカルシウム結合性ＥＧＦ（ｃｂＥＧＦ）様モチーフ〔代表的には、（Ｄ／Ｎ）Ｘ（Ｄ／Ｎ）（Ｅ／Ｑ）Ｘｍ（Ｄ／Ｎ）＊Ｘｎ（Ｙ／Ｆ）：ここで、ｍ、ｎは変数であり、アステリスクはβ水酸化を示す〕が連続するドメインに存在すると考えられるが（例えば、実施例６参照）、リシルオキシダーゼ結合部位、リシルオキシダーゼ様−１結合部位、ＬＴＢＰ２結合部位のより正確な位置は、欠失解析等の自体公知の方法により同定できる。
配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドの好適な例としては、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（マウスオルソログ）、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ラットオルソログ）が挙げられる。
本発明はまた、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその均等物をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。
配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの好適な例としては、配列番号５又は配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
別の局面では、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５で表される塩基配列の相補配列に対してハイストリンジェント（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリダイズするが、配列番号７で表される塩基配列の相補配列に対してハイストリンジェント条件（好ましくは、中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ）のストリンジェント条件）下でハイブリダイズしないポリヌクレオチドである。
また、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７で表される塩基配列の相補配列に対してハイストリンジェント条件下でハイブリダイズするが、配列番号５で表される塩基配列の相補配列に対してハイストリンジェント条件（好ましくは、中程度のストリンジェント条件）下でハイブリダイズしないポリヌクレオチドであり得る。
上記ハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，６．３．１−６．３．６，１９９９）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／５０〜６５℃での一回以上の洗浄が挙げられる。また、中程度のストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、２×ＳＳＣ／３０℃の後、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／３０〜５０℃での１回以上洗浄が挙げられる。
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物をコードするポリヌクレオチドの好適な例としては、配列番号９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（マウスオルソログ）、配列番号１３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ラットオルソログ）が挙げられる。
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物をコードするポリヌクレオチドの好適な例としては、配列番号１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（マウスオルソログ）、配列番号１５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ラットオルソログ）が挙げられる。
２．切断型ＤＡＮＣＥ、及びそれをコードするポリヌクレオチドの作製方法
２．１．非切断方法
本発明のポリヌクレオチドは、自体公知の方法により作製できる。例えば、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、その発現部位（例えば、心臓、卵巣、結腸など）から総ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した後、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりクローニングできる。また、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの均等物をコードするポリヌクレオチドは、上記の通りクローニングしたポリヌクレオチドに変異を導入することにより作製できる。変異導入法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、ランダムに点突然変異を導入する方法（例えば、亜硝酸若しくは亜硫酸での処理）、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスマッチプライマー法などの方法が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドについても自体公知の方法により作製できる。例えば、上記のように作製した本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを適切な宿主細胞に導入して形質転換体を得た後、形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドを産生させ、次いで回収すればよい。本発明はまた、このような組換えベクター、及び当該ベクターが導入された形質転換体をも提供する。
発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、エンハンサー配列、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
ターミネーター領域、複製可能単位、エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、自体公知のものを用いることができる。
選択マーカーとしては、自体公知のものを用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
本発明の組換えベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素切断部位など）を用いることができる。
本発明の形質転換体は、上述の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（好ましくは、Ｓｆ９）などが例示される。
発現ベクターの宿主細胞への導入は自体公知の方法を用いて行うことができる。例えば、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．４５６，１９７３）、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３，ｐ．２１５６−２１６５，１９８３）によってそれぞれ形質転換することができる。
本発明のポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のポリペプチドが大量に生産されるように適宜選択される。
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。
宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
本発明のポリペプチドは、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。
単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
また、タグ（例えば、ヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ）などを付加したポリペプチドを形質転換体に産生させ、当該タグに親和性を有する物質（例えば、Ｎｉ２＋レジン、タグに特異的な抗体）を用いることにより、より簡便に、本発明のポリペプチドを単離、精製することもできる。
さらに、本発明のポリペプチドは、無細胞系にて合成可能である。無細胞系による本発明のポリペプチドの合成では、例えば、大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽からの抽出液などを使用できる。また、本発明のポリペプチドは、固相合成法、液相合成法等の自体公知の有機化学的方法によって作製できる。
２．２．切断方法
また、本発明のポリペプチドは、ＤＡＮＣＥをＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに接触させ、ＤＡＮＣＥを切断することにより得ることができる。本発明はさらに、このような切断方法を提供する。
本方法におけるＤＡＮＣＥのＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼへの接触は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間が切断される限り如何なる様式でもよいが、かかる切断を達成する接触の態様としては、例えば、ＤＡＮＣＥ及びＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの両方を発現する細胞の培養が挙げられる。かかる細胞の培養は、上述した形質転換体の培養に準じて行うことができる。
ＤＡＮＣＥ及びＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの両方を発現する細胞は、この２つのタンパク質を発現する限り特に限定されない。このような細胞は、例えば、ＤＡＮＣＥ発現細胞（例えば、ＤＡＮＣＥを天然で発現する細胞、又は遺伝子操作によりＤＡＮＣＥの発現が可能となった細胞）へのＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現ベクターの導入、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞へのＤＡＮＣＥ発現ベクターの導入、任意の細胞へのＤＡＮＣＥ発現ベクター及びＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現ベクターの導入などにより作製できる。
また、発現を増強させる目的で、ＤＡＮＣＥ及び／又はＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの発現細胞に、それぞれ、ＤＡＮＣＥ及び／又はＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの発現ベクターを導入してもよい。
ＤＡＮＣＥ発現細胞は、初代培養細胞、細胞株のいずれでもよい。ＤＡＮＣＥの主要な発現部位としては、特に限定されるものではないが、例えば、心臓、腎臓、膵臓、精巣、卵巣、小腸、結腸、動脈、肺、子宮、皮膚が知られているので、これら発現部位に相当する組織由来の細胞自体、又はそれから誘導される細胞を、ＤＡＮＣＥ発現細胞として用いることができる。初代培養細胞、細胞株は、自体公知の方法により作製できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）；機能細胞の分離と培養，丸善書店（１９８７）参照）。
ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞についても、初代培養細胞、細胞株のいずれでもよい。例えば、皮膚線維芽細胞、２９３Ｔ細胞などの細胞、並びに肺、皮膚などの組織においてＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの発現が確認されているので、これらの細胞自体、又はこれらの組織由来の細胞、あるいはそれらから誘導される細胞を、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞として用いることができる。また、ある細胞がＤＡＮＣＥの切断活性を有するか否か評価した結果、ＤＡＮＣＥの切断活性を有することが明らかになった細胞についても同様に、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞として用いることができる。本発明はまた、動物細胞（例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞）を用いる、このようなＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞の同定方法を提供する。
本切断方法で用いられる細胞種としては、上述した形質転換体の作製に用いられる宿主と同種の細胞を用いることができるが、なかでも、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）が好ましい。
ＤＡＮＣＥ発現ベクターは、本発明のポリペプチドを発現するベクターと同様の方法により作製できる。
ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現ベクターは、後述するＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのスクリーニング方法に記載される方法により作製できる。なお、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現ベクターは、後述の発現スクリーニングにおける、ＤＡＮＣＥ特異的発現ベクターが濃縮された形質転換体から得られる、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ以外の遺伝子産物発現ベクターとの混合物であってもよい。
本切断方法における接触の別の態様としては、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ含有画分へのＤＡＮＣＥの添加が挙げられる。ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ含有画分は、ＤＡＮＣＥの切断活性を有する限り特に限定されず、例えば、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞の培養上清、当該細胞の抽出液、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼを発現する組織の抽出液、当該培養上清や抽出液からの粗精製液などが挙げられる。また、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼが単離精製された場合には、ＤＡＮＣＥ含有画分又は単離されたＤＡＮＣＥと単離されたＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼとの混合により、ＤＡＮＣＥの切断が可能となる。
ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断は、抗ＤＡＮＣＥ抗体を用いた免疫学的手法（例えば、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング）などにより確認できる。
本切断方法は、本発明のポリペプチドの作製のみならず、本発明のスクリーニング方法における指標としても有用である。
３．ＤＡＮＣＥの切断により生じるＮ末端側及びＣ末端側ポリペプチドに対する抗体
本発明はまた、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断により生じる、Ｎ末端側のポリペプチド（即ち、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその均等物）に対する抗体、並びにＣ末端側のポリペプチド（即ち、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその均等物）に対する抗体を提供する。
本発明の抗体の作製に用いられる抗原としては、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその均等物、あるいはそれらの部分ペプチドを用いることができる。部分ペプチドとしては、抗原性を有する限り特に限定されないが、例えば、配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は配列番号６又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも６個、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個、さらにより好ましくは少なくとも１５個以上の連続したアミノ酸からなるペプチドであり得る。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。この抗体は、完全な抗体分子だけでなく、本発明のタンパク質に対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるフラグメントであってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
さらに、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化、ヒト型、キメラ抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開Ｗ０９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの一方を特異的に検出又は阻害できるため、例えば、本発明のスクリーニング方法を行うため、並びに弾性線維形成調節剤及びＤＡＮＣＥに関する研究・診断用試薬として有用である。
４．ＤＡＮＣＥ切断量及び切断活性の測定方法、キット
本発明は、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性を測定することを特徴とする方法、なかでも、動物由来の生体試料において、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥ切断量を測定することを特徴とする方法、ならびに当該測定を可能とするキットを提供する。
本方法において、動物由来の生体試料が用いられる場合、使用される動物は、温血動物である限り特に限定されないが、例えば、哺乳動物であり得る。哺乳動物は特に限定されるものではないが、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスが挙げられる。
生体試料は、上記動物から採取可能なものである限り特に限定されない。生体試料としては、例えば、皮膚、動脈、肺、子宮等の組織から採取したものが挙げられる。
ＤＡＮＣＥ切断量は、自体公知の方法により測定できる。例えば、ＤＡＮＣＥ切断量は、抗ＤＡＮＣＥ抗体を用いる免疫学的手法（例えば、ウエスタンブロッティング）により測定できる。この場合、上述した本発明の抗体に限らず、任意の抗ＤＡＮＣＥ抗体（例えば、ＤＡＮＣＥの切断部位にまたがる部分ペプチドを抗原として用いて作製した抗体）を使用できる。かかる抗体は、上述した抗体の作製方法に準じて作製できる。
ＤＡＮＣＥ切断量の測定に抗ＤＡＮＣＥ抗体を用いる場合、例えば、標識された抗ＤＡＮＣＥ抗体の使用、あるいは抗ＤＡＮＣＥ抗体と標識された２次抗体の併用により、ＤＡＮＣＥ切断量が測定できる。
抗ＤＡＮＣＥ抗体の標識としては、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素、蛍光物質などが挙げられる。これらの標識と抗ＤＡＮＣＥ抗体との結合は自体公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、マレイミド法などにより行なうことができる。
標識が酵素である場合、基質としては、選択した酵素に応じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを選択した場合においてはｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）等が挙げられ、この際の発色剤としてｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）などが使用される。また、洗浄液、反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを特に制限なく適宜使用することができる。
また、ＤＡＮＣＥ切断活性は、例えば、ＤＡＮＣＥ切断部位を有するポリペプチドの一端に蛍光分子、もう一端にクエンチャーを結合しておき、切断が生じた際にのみ蛍光を発するシステムを構築、使用することにより、測定できる。このようなシステムの構築は、自体公知の方法により行うことができる。
ＤＡＮＣＥ切断活性の測定に用いられる蛍光分子としては、ＤＡＮＣＥ切断活性を評価し得る限り特に限定されるものではないが、例えば、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＥＤＡＮＳ、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。
ＤＡＮＣＥ切断活性の測定に用いられるクエンチャーとしては、ＤＡＮＣＥ切断活性を評価し得る限り特に限定されるものではないが、例えば、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＱＳＹクエンチャー色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。
本発明の測定方法は、例えば、本発明のスクリーニング方法を行うため、並びに弾性線維形成の状態についての診断、特に分子レベルでの解析を可能とするため有用である。
また、本発明は、ＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性の測定を可能とするキットに関する。
ＤＡＮＣＥ切断量の測定を可能にする本発明のキットは、上述した抗ＤＡＮＣＥ抗体に加え、ＤＡＮＣＥ、２次抗体、標識酵素に対する基質、生体試料の処理に必要な試薬などを含むことができる。このキットはまた、ＤＡＮＣＥの切断により生じるポリペプチド（即ち、本発明のポリペプチド）の一方、両方をコントロールとして含むことができる。このキットはさらに、ＤＡＮＣＥ切断量が弾性線維形成の指標となり得る旨を記載している説明書を含んでいてもよい。
ＤＡＮＣＥ切断活性の測定を可能にする本発明のキットは、ＤＡＮＣＥ、蛍光分子、クエンチャーなどを含むことができる。このキットはまた、上述したＤＡＮＣＥ変異体をコントロールとして含むことができる。このキットはさらに、ＤＡＮＣＥ切断活性が弾性線維形成の指標となり得る旨を記載している説明書を含んでいてもよい。
本発明の測定用キットは、ＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性を簡便に測定し得る手段を提供するため有用である。
５．ＤＡＮＣＥ変異体、それをコードするポリヌクレオチド
また、本発明は、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断部位に、当該プロテアーゼに抵抗性を示すようにアミノ酸変異が導入されているＤＡＮＣＥ変異体、又は当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明のＤＡＮＣＥ変異体は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、あるいは配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列において、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに抵抗性を示すようにプロテアーゼ切断部位（Ａｒｇ−Ｇｌｙ：配列番号２で表されるアミノ酸配列において７７番目〜７８番目のアミノ酸、および配列番号４で表されるアミノ酸配列において５４番目〜５５番目のアミノ酸に相当）又はその近傍のアミノ酸（例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において７０番目〜８５番目、好ましくは７２番目〜８３番目、より好ましくは７４番目〜８１番目、さらにより好ましくは７６番目〜７９番目のアミノ酸、あるいは配列番号４で表されるアミノ酸配列において４７番目〜６２番目、好ましくは４９番目〜６０番目、より好ましくは５１番目〜５９番目、さらにより好ましくは５３番目〜５６番目のアミノ酸）が変異（例えば、欠失、付加、置換）していることを特徴とする。ここで、「実質的に同一」は、上述したものと同義である。
「ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに抵抗性を示す」とは、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断能が、変異後においてより低下（例えば７５％以下、好ましくは５０％以下の低下）することを意味し、切断能の低下の程度は特に限定されない。ＤＡＮＣＥ変異体がＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに対して抵抗性を示すか否かは、上述した切断方法による正常ＤＡＮＣＥ、ＤＡＮＣＥ変異体の切断処理後、正常ＤＡＮＣＥ、ＤＡＮＣＥ変異体の切断量を測定・比較することで確認できる。
本発明のＤＡＮＣＥ変異体としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列において、７７番目のアルギニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、並びに、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列において、５４番目のアルギニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明はまた、本発明のＤＡＮＣＥ変異体を含む組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明のＤＡＮＣＥ変異体及び当該変異体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、本発明のスクリーニング方法におけるネガティブコントロールとして、並びに弾性線維形成調節剤（例えば、弾性線維の形成のため）及び研究用試薬として有用である。
６．ＤＡＮＣＥ複合体
６．１．少なくとも２つのＤＡＮＣＥを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体Ｉ）
本発明は、少なくとも２つのＤＡＮＣＥを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体Ｉ）を提供する。
本複合体Ｉは、リシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２をさらに含んでいてもよい。リシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２は、後述の通り調製できる。
本複合体Ｉはまた、インテグリン及び／又はリシルオキシダーゼ様−１をさらに含んでいてもよい。本発明において使用できるインテグリンとしては種々のインテグリンが挙げられるが、なかでもα５β１、αＩＩｂβ３、全てのαｖβ、α９β１が好ましい。これらインテグリン及びリシルオキシダーゼ様−１、及びその発現部位は公知であり、遺伝子のクローニング、発現細胞の調製は、自体公知の方法により行うことができる。
好ましくは、本複合体Ｉは、識別可能な形態である少なくとも２種類のＤＡＮＣＥを含んでなる。ここで、「識別可能な形態」とは、少なくとも２つのＤＡＮＣＥに差異が存在し、当該差異が検出可能であることを意味する。ＤＡＮＣＥの識別可能な形態の組合せとしては、標識ＤＡＮＣＥと非標識ＤＡＮＣＥとの組合せ、２つの異なる標識ＤＡＮＣＥの組合せが例示される。
ＤＡＮＣＥの標識は、標識体を非標識体又は異種標識体と識別可能である限り特に限定されないが、例えば、エピトープによる標識、放射性同位体（例えば、３５Ｓ）による標識が挙げられる。
ＤＡＮＣＥの標識に用いられるエピトープとしては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなどが挙げられる。
本発明の複合体Ｉが、さらにリシルオキシダーゼ、ＬＴＢＰ２、インテグリン、リシルオキシダーゼ様−１から選ばれる１以上を含んでなる場合、それらは標識されていても標識されていなくともよい。
エピトープ標識ＤＡＮＣＥは、自体公知の方法により作製できる。例えば、エピトープをコードしているヌクレオチドにＤＡＮＣＥをコードするポリヌクレオチドを適切に連結して、ＤＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることによりエピトープ標識ＤＡＮＣＥを調製できる。一方、放射性同位体（例えば、３５Ｓ）標識ＤＡＮＣＥは、ＤＡＮＣＥ発現細胞を放射性同位体含有培地で培養することで調製できる。
本発明はまた、上述の複合体Ｉの調製方法を提供する。複合体Ｉの調製方法は、少なくとも２つのＤＡＮＣＥを接触させ、複合体を形成させることを特徴とする。
また、複合体Ｉの調製の際、リシルオキシダーゼ及び／又はＬＴＢＰ２をさらに接触させてもよい。さらに、インテグリン及び／又はリシルオキシダーゼ様−１を接触させることもできる。
複合体Ｉの形成は、ＤＡＮＣＥの調製により（即ち、ＤＡＮＣＥの調製に伴う必然的な会合）、あるいは別々に調製した少なくとも２種のＤＡＮＣＥ（標識ＤＡＮＣＥ−非標識ＤＡＮＣＥ、２つの異なる標識ＤＡＮＣＥ）の接触により達成できる。
より具体的には、複合体Ｉの形成は、単離されたＤＡＮＣＥに対する単離されたＤＡＮＣＥ（例えば、識別可能な形態）の接触、及びＤＡＮＣＥ発現細胞に対するＤＡＮＣＥ発現ベクターの導入（インビトロ、インビボを含む）などにより達成できる。
複合体Ｉ、特に、識別可能な形態である少なくとも２種類のＤＡＮＣＥを含んでなる複合体、及び当該複合体の調製方法は、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法における指標として、並びに弾性線維形成調節剤及びＤＡＮＣＥに関する研究用試薬として有用である。
６．２．少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びリシルオキシダーゼを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体ＩＩ）
本発明は、少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びリシルオキシダーゼを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体ＩＩ）を提供する。
本複合体ＩＩは、ＤＡＮＣＥ（例えば、識別可能な形態のＤＡＮＣＥ）及び／又はＬＴＢＰ２をさらに含んでいてもよい。本複合体ＩＩはまた、インテグリン及び／又はリシルオキシダーゼ様−１をさらに含んでいてもよい。なお、ＬＴＢＰ２、インテグリン、リシルオキシダーゼ様−１は、それぞれ、上述したように標識されていても標識されていなくともよい。
本発明はまた、上述の複合体ＩＩの調製方法を提供する。複合体ＩＩの調製方法は、少なくとも１つのＤＡＮＣＥをリシルオキシダーゼに接触させ、複合体を形成させることを特徴とする。
また、複合体ＩＩの調製の際、ＤＡＮＣＥ（例えば、識別可能な形態のＤＡＮＣＥ）及び／又はＬＴＢＰ２をさらに接触させてもよい。さらに、インテグリン及び／又はリシルオキシダーゼ様−１を接触させることもできる。
複合体ＩＩの形成は、例えば、未標識ＤＡＮＣＥと未標識リシルオキシダーゼの接触、未標識ＤＡＮＣＥと標識リシルオキシダーゼの接触、標識ＤＡＮＣＥと未標識リシルオキシダーゼの接触、同種の標識をそれぞれ有するＤＡＮＣＥとリシルオキシダーゼの接触、あるいは異なる標識をそれぞれ有するＤＡＮＣＥとリシルオキシダーゼの接触により達成できる。
より具体的には、複合体ＩＩの形成は、単離されたＤＡＮＣＥと単離されたリシルオキシダーゼの接触、並びにＤＡＮＣＥ発現細胞に対するリシルオキシダーゼ発現ベクターの導入、及びリシルオキシダーゼ発現細胞に対するＤＡＮＣＥ発現ベクターの導入（インビトロ、インビボを含む）などにより達成できる。
リシルオキシダーゼ、及びその発現部位は公知である。従って、リシルオキシダーゼ発現ベクター、及びリシルオキシダーゼ発現細胞（例えば、初代培養細胞、細胞株）は、自体公知の方法により作製できる。例えば、リシルオキシダーゼは、血管平滑筋、皮膚、線維維芽細胞などの細胞、並びに動脈、皮膚、肺、子宮などの組織において発現が確認されているので、これら細胞、組織よりリシルオキシダーゼ遺伝子がクローニングでき、また、リシルオキシダーゼ発現細胞が調製できる。
複合体ＩＩ、及び当該複合体の調製方法は、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法における指標として、並びに弾性線維形成調節剤及びＤＡＮＣＥに関する研究用試薬として有用である。
６．３．少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びＬＴＢＰ２を含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体ＩＩＩ）
本発明は、少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びＬＴＢＰ２を含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体ＩＩＩ）を提供する。
本複合体ＩＩＩは、ＤＡＮＣＥ（例えば、識別可能な形態のＤＡＮＣＥ）及び／又はリシルオキシダーゼをさらに含んでいてもよい。本複合体ＩＩＩはまた、インテグリン及び／又はリシルオキシダーゼ様−１をさらに含んでいてもよい。なお、リシルオキシダーゼ、インテグリン、リシルオキシダーゼ様−１は、それぞれ、上述したように標識されていても標識されていなくともよい。
本発明はまた、上述の複合体ＩＩＩの調製方法を提供する。複合体ＩＩＩの調製方法は、少なくとも１つのＤＡＮＣＥをＬＴＢＰ２に接触させ、複合体を形成させることを特徴とする。
また、複合体ＩＩＩの調製の際、ＤＡＮＣＥ（例えば、識別可能な形態のＤＡＮＣＥ）及び／又はリシルオキシダーゼをさらに接触させてもよい。さらに、インテグリン及び／又はリシルオキシダーゼ様−１を接触させることもできる。
複合体ＩＩＩの形成は、例えば、未標識ＤＡＮＣＥと未標識ＬＴＢＰ２の接触、未標識ＤＡＮＣＥと標識ＬＴＢＰ２の接触、標識ＤＡＮＣＥと未標識ＬＴＢＰ２の接触、同種の標識をそれぞれ有するＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ２の接触、あるいは異なる標識をそれぞれ有するＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ２の接触により達成できる。
より具体的には、複合体ＩＩＩの形成は、単離されたＤＡＮＣＥと単離されたＬＴＢＰ２の接触、並びにＤＡＮＣＥ発現細胞に対するＬＴＢＰ２発現ベクターの導入、及びＬＴＢＰ２発現細胞に対するＤＡＮＣＥ発現ベクターの導入（インビトロ、インビボを含む）などにより達成できる。
ＬＴＢＰ２、及びその発現部位は公知である。従って、ＬＴＢＰ２発現ベクター、及びＬＴＢＰ２発現細胞（例えば、初代培養細胞、細胞株）は、自体公知の方法により作製できる。例えば、ＬＴＢＰ２は、血管平滑筋細胞、皮膚線維芽細胞などの細胞、並びに動脈、皮膚、肺、子宮などの組織において発現が確認されているので、これら細胞、組織よりＬＴＢＰ２遺伝子がクローニングでき、また、ＬＴＢＰ２発現細胞が調製できる。
複合体ＩＩＩ、及び当該複合体の調製方法は、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法における指標として、並びに弾性線維形成調節剤及びＤＡＮＣＥに関する研究用試薬として有用である。
７．スクリーニング方法
本発明は、種々のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法Ｉ、ＩＩ）、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩＩ〜Ｖ）、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのスクリーニング方法（スクリーニング方法ＶＩ）に大別される。以下、それぞれのスクリーニング方法について詳述する。
７．１．ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質のスクリーニング方法（インビトロ）（スクリーニング方法Ｉ）
スクリーニング方法Ｉは、動物を用いずにＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を評価できる限り特に限定されないが、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被検物質を、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼに接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を測定し、該活性を被検物質を接触させない場合のＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性の調節をもたらす被検物質を選択する工程。
なお、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質は、いわゆるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのアゴニスト、アンタゴニストのみならず、本スクリーニング方法Ｉの性質上、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの発現量を変動させ得る物質をも含む。
工程（ａ）において、被検物質としては、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
被検物質のＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼへの接触は、「２．２．切断方法」で言及した接触と同様である。
工程（ｂ）において、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性は、ＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性に基づいて評価できる。例えば、ＤＡＮＣＥ切断量及び切断活性は、「４．ＤＡＮＣＥ切断量及び切断活性の測定方法、キット」で言及した方法により測定できる。
ＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性の比較は、被検物質の存在下、不在下において、ＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性における有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質の不在下におけるＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性は、被検物質の存在下におけるＤＡＮＣＥ切断量及び／又は切断活性の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものが好ましい。
次いで、工程（ｃ）において、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節する被検物質が選択される。このように選択された被検物質は、弾性線維形成調節剤又は研究用試薬として有用である。例えば、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を阻害する物質は、弾性線維形成の維持に有用であり得る。
７．２．ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質のスクリーニング方法（インビボ）（スクリーニング方法ＩＩ）
スクリーニング方法ＩＩは、動物を用いてＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を評価できる限り特に限定されないが、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被検物質を動物に投与する工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を測定し、該活性を被検物質を投与しない場合のＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性の調節をもたらす被検物質を選択する工程。
なお、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節し得る物質は、いわゆるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのアゴニスト、アンタゴニストのみならず、本スクリーニング方法ＩＩの性質上、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの発現量を変動させ得る物質をも含む。
工程（ａ）において、被検物質としては、スクリーニング方法Ｉと同様のものを用いることができる。
被検物質の動物への投与は、自体公知の方法により行なわれる。投与量・頻度、投与期間は、任意に設定できる。なお、本方法が適用される動物は、「４．ＤＡＮＣＥ切断量の測定方法、キット」で言及した動物と同様である。
工程（ｂ）において、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性は、例えば、対象動物からの生体試料の採取後、当該生体試料におけるＤＡＮＣＥ切断量に基づいて評価できる。生体試料、ＤＡＮＣＥ切断量の測定方法は、「４．ＤＡＮＣＥ切断量及び切断活性の測定方法、キット」で言及したものと同様である。
ＤＡＮＣＥ切断量の比較は、被検物質の投与時、非投与時において、ＤＡＮＣＥ切断量における有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質の非投与時におけるＤＡＮＣＥ切断量は、被検物質の投与時におけるＤＡＮＣＥ切断量の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものが好ましい。
次いで、工程（ｃ）において、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を調節する被検物質が選択される。このように選択された被検物質は、弾性線維形成調節剤又は研究用試薬として有用である。例えば、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの活性を阻害する物質は、弾性線維形成の維持に有用であり得る。
７．３．少なくとも２つのＤＡＮＣＥを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体Ｉ）の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩＩ）
スクリーニング方法ＩＩＩは、複合体Ｉの形成を評価できる限り特に限定されないが、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被検物質の存在下、少なくとも２つのＤＡＮＣＥを接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ複合体の量を測定し、該量を被検物質の不在下におけるＤＡＮＣＥ複合体の量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節する被検物質を選択する工程。
工程（ａ）において、被検物質としては、スクリーニング方法Ｉと同様のものを用いることができる。
少なくとも２つのＤＡＮＣＥの接触は、「６．１．少なくとも２つのＤＡＮＣＥを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体Ｉ）」で言及した接触と同様である。なお、本スクリーニング方法ＩＩＩでは、識別可能な形態のＤＡＮＣＥを用いることが好ましい。
工程（ｂ）において、複合体Ｉの量は、例えば、免疫沈降法（例えば、実施例６参照）とデンシトメトリーの併用、表面プラズモン共鳴等の相互作用解析法、ＥＬＩＳＡに準じる方法などにより測定できる。
複合体Ｉの量の比較は、被検物質の存在下、不在下において、複合体Ｉの量における有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質の不在下における複合体Ｉの量は、被検物質の存在下における複合体Ｉの量の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものが好ましい。
次いで、工程（ｃ）において、複合体Ｉの形成を調節する被検物質が選択される。このように選択された被検物質は、弾性線維形成調節剤又は研究用試薬として有用である。例えば、複合体Ｉの形成を促進する物質は、弾性線維形成に有用であり得る。
７．４．少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びリシルオキシダーゼを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体ＩＩ）の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＶ）
スクリーニング方法ＩＶは、複合体ＩＩの形成を評価できる限り特に限定されないが、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被検物質の存在下、少なくとも１つのＤＡＮＣＥをリシルオキシダーゼに接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ複合体の量を測定し、該量を被検物質の不在下におけるＤＡＮＣＥ複合体の量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節する被検物質を選択する工程。
工程（ａ）において、被検物質としては、スクリーニング方法Ｉと同様のものを用いることができる。
少なくとも１つのＤＡＮＣＥとリシルオキシダーゼの接触は、「６．２．少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びリシルオキシダーゼを含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体Ｉ）」で言及した接触と同様である。
工程（ｂ）において、複合体ＩＩの量は、免疫沈降法（例えば、実施例７参照）とデンシトメトリーの併用、表面プラズモン共鳴等の相互作用解析法、ＥＬＩＳＡに準じる方法などにより測定できる。
複合体ＩＩの量の比較は、被検物質の存在下、不在下において、複合体ＩＩの量における有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質の不在下における複合体ＩＩの量は、被検物質の存在下における複合体ＩＩの量の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものが好ましい。
次いで、工程（ｃ）において、複合体ＩＩの形成を調節する被検物質が選択される。このように選択された被検物質は、弾性線維形成調節剤又は研究用試薬として有用である。
７．５．少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びＬＴＢＰ２を含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体ＩＩＩ）の形成を調節し得る物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法Ｖ）
スクリーニング方法Ｖは、複合体ＩＩＩの形成を評価できる限り特に限定されないが、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被検物質の存在下、少なくとも１つのＤＡＮＣＥをＬＴＢＰ２に接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＤＡＮＣＥ複合体の量を測定し、該量を被検物質の不在下におけるＤＡＮＣＥ複合体の量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）７の比較結果に基づいて、ＤＡＮＣＥ複合体の形成を調節する被検物質を選択する工程。
工程（ａ）において、被検物質としては、スクリーニング方法Ｉと同様のものを用いることができる。
少なくとも１つのＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ２の接触は、「６．３．少なくとも１つのＤＡＮＣＥ及びＬＴＢＰ２を含んでなるＤＡＮＣＥ複合体（複合体ＩＩＩ）」で言及した接触と同様である。
工程（ｂ）において、複合体ＩＩＩの量は、免疫沈降法（例えば、実施例６参照）とデンシトメトリーの併用、表面プラズモン共鳴等の相互作用解析法、ＥＬＩＳＡに準じる方法などにより測定できる。
複合体ＩＩＩの量の比較は、被検物質の存在下、不在下において、複合体ＩＩＩの量における有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質の不在下における複合体ＩＩＩの量は、被検物質の存在下における複合体ＩＩＩの量の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものが好ましい。
次いで、工程（ｃ）において、複合体ＩＩＩの形成を調節する被検物質が選択される。このように選択された被検物質は、弾性線維形成調節剤又は研究用試薬として有用である。
７．６．ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのスクリーニング方法（スクリーニング方法ＶＩ）
スクリーニング方法ＶＩは、ＤＡＮＣＥの切断活性を指標に、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼをスクリーニングすることを特徴とする。
ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼは、例えば、当該プロテアーゼを発現する細胞より得ることができる。ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞は、「２．２．切断方法」で言及した細胞と同様である。
例えば、スクリーニング方法ＶＩとして、発現クローニングの方法を用いることができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第３版），Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）参照）。
具体的には、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞よりｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え発現ベクターを作製し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。組換え発現ベクターを、該ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞に由来する遺伝子産物を発現する形質転換体を作製し、この形質転換体のなかからＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼを産生する形質転換体を選択する。次いで、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼを産生する形質転換体に導入したｃＤＮＡにコードされている遺伝子配列を決定することにより、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼを取得することができる。
本スクリーニング方法ＶＩで用いられる宿主細胞としては、ＤＡＮＣＥの切断活性を有していないか、又はＤＡＮＣＥの切断活性が極めて低い細胞であれば如何なる細胞でも用いることができる。ある細胞がＤＡＮＣＥの切断活性を有するか否かは、当該細胞にＤＡＮＣＥ発現ベクターを導入し、発現されたＤＡＮＣＥの切断の有無を確認することにより評価できる。
ｃＤＮＡの作製に用いられる細胞としては、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞、例えば、皮膚線維芽細胞、２９３Ｔ細胞、動脈平滑筋細胞などの細胞、並びに肺組織、子宮組織などの組織由来の細胞が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、自体公知の方法により行なわれる。先ず、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞から、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法等の方法により全ＲＮＡを調製する。次いで、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法等の方法により、又は市販のキット（例えば、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製））を用いて、ｍＲＮＡを調製する。次いで、調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第３版）参照）。ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いられる発現ベクターとしては、用いる宿主細胞においてインサートの発現が可能である限り特に限定されない。
作製したｃＤＮＡライブラリーをそのまま用いてもよいが、目的とする遺伝子を濃縮するために、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼを発現していない細胞のｍＲＮＡを用い、サブトラクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５７８３（１９８８））を行なって作製したｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
また、ＤＡＮＣＥを発現していない細胞を宿主細胞として選択した場合には、上記の通り調製されたｃＤＮＡライブラリーに加えて、ＤＡＮＣＥ発現ベクターもまた宿主細胞に導入される。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法が挙げられる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養することにより、導入したｃＤＮＡがコードする遺伝子産物を発現させることができる。形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、１９９培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行われる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本スクリーニング方法ＶＩでは、上述した形質転換体の培養後、培養上清においてＤＡＮＣＥの切断の有無又は程度をウエスタンブロッティング等の方法により確認することで、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼを産生する形質転換体を選択することができる。必要に応じて、上述の工程を複数繰り返すことで、ＤＡＮＣＥ特異的発現ベクターが濃縮された形質転換体を得ることができる。選択した形質転換体に導入したｃＤＮＡの単離、および単離したｃＤＮＡの遺伝子配列の決定は、自体公知の方法により行うことができる。なお、本発明はまた、このように取得されたＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドについても提供する。
スクリーニング方法ＶＩは、発現クローニングの方法以外でも行うことができる。具体的には、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ発現細胞の抽出液又は培養上清を調製し、ＤＡＮＣＥの切断活性を指標として該抽出液又は培養上清を分画することにより、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼを精製することができる。精製方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法、あるいはこれら方法の組合せが挙げられる。
また、ヒト等のゲノム解析が完了した現在では、データベースに登録されている配列、発現部位等の情報、相同性検索等の手段に基づきプロテアーゼをクローニングし、当該プロテアーゼにつきＤＡＮＣＥ切断活性を逐一評価することで、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼをスクリーニングすることもできる。なお、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼは、セリンプロテアーゼインヒビターであるアプロチニンにより阻害されるという知見が得られている。従って、本スクリーニング方法では、効率性重視の観点から、セリンプロテアーゼが優先的にスクリーニングされる。
本スクリーニング方法ＶＩは、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼのスクリーニングを可能にするため有用である。また、当該スクリーニング方法により得られるＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼは、弾性線維形成調節剤として（例えば、弾性線維の破壊のため）、ＤＡＮＣＥの切断において、並びに本発明のスクリーニング方法を行うために有用である。
８．キット
また、本発明は、以下（ａ）及び（ｂ）を含むキットを提供する：
（ａ）ＤＡＮＣＥ、又はＤＡＮＣＥをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）以下（ｉ）〜（ｖｉ）の少なくとも１つの成分；
（ｉ）（ａ）のＤＡＮＣＥと識別可能な形態のＤＡＮＣＥ；
（ｉｉ）（ａ）のＤＡＮＣＥと識別可能な形態のＤＡＮＣＥをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）リシルオキシダーゼ；
（ｉｖ）リシルオキシダーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖ）ＬＴＢＰ２；
（ｖｉ）ＬＴＢＰ２をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
また、本発明のキットは、弾性線維形成を調節するために、又はスクリーニングを行うために使用すべき、又は使用されうることなどを記載する説明書を含むことができる。
本発明のキットはまた、上記成分に加え、インテグリン、インテグリンをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、リシルオキシダーゼ様−１、リシルオキシダーゼ様−１をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。これらは、自体公知の方法により作製できる。
本発明のキットはさらに、上記成分に加え、ＤＡＮＣＥ、リシルオキシダーゼ、ＬＴＢＰ２、インテグリン、リシルオキシダーゼ様−１に対する抗体を含んでいてもよい。これら抗体は、上述した抗体の作製法に準じて作製できる。
本発明のキットは、上記スクリーニング方法Ｉ〜ＶＩ、及びＤＡＮＣＥに関連する他の研究などを行い得る簡便な手段の提供を可能にするため、並びに、弾性線維形成調節剤として（例えば、弾性線維の形成又は維持のために）有用である。
９．弾性線維形成調節剤
本発明の調節剤は、本発明のポリペプチド、抗体、ＤＡＮＣＥ変異体、複合体又は当該複合体を構成する複数の成分、ＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼ、あるいはこれらをコードするポリヌクレオチドなどを含有する。
本発明の調節剤は、任意の担体、例えば、医薬上許容される担体を配合することにより弾性線維形成の調節が所望される状態の予防、治療又は改善などのために用いることができる。
例えば、本発明の調節剤が、弾性線維を形成又は再生させる成分を含む場合、当該調節剤は、弾性線維形成の調節が所望される状態、例えば、肺気腫、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの）、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤の予防、治療又は改善のため、あるいは美容の目的のために有用である。
一方、本発明の調節剤が、弾性線維の形成を抑制する成分を含む場合、当該調節剤は、弾性線維形成の抑制が所望される状態、例えば心筋梗塞の予防、治療又は改善のために有用である。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の製剤の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
本明細書中で挙げられた全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】１．材料及び方法
１．１．発現プラスミドの構築
本発明で用いた発現プラスミドは、下記の通り作製した。なお、これらコンストラクトはすべて塩基配列を確認した後、発現実験に用いた。
ｐＥＦ６／ｓｓＦＬＡＧ：
ｐＥＦ６／Ｖ５−Ａプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎ  Ｉ−Ｐｍｅ  Ｉ部位に、合成ヌクレオチド
ｇｇｔａｃｃｇｃｔａｇｃｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｃｔｔｃｔｇａｔｃｃｔａｇｃｔｃｔｔｇｔｔｇｇａｇｃｔｇｃａｇｔｔｇｃｔｇａｃｔａｃａａａｇａｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇａｃｔａｇｔｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｔｃｔａｇａｇａａｇｇａｔｃｃｇａｔａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃａｔｃｇａｔｔｇａｃｔａｇｃｔｇａｇｇｃｃｇｃａａａｃｃｃ（配列番号１７）およびその相補鎖合成ヌクレオチドを組み込んだ。これにより、Ｋｐｎ  Ｉ−Ｎｈｅ  Ｉ−ＥｃｏＲＩ−プレプロトリプシンシグナルペプチド（ＭＳＡＬＬＩＬＡＬＶＧＡＡＶＡ（配列番号１８））−ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１９））−ＳｐｅＩ−６  ｘ  Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０））−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ−ＣｌａＩが伸長因子（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）プロモーターの下流、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に位置する。
ｐＥＦ６／ｓｓＭｙｃ：
ｐＥＦ６／ｓｓＦＬＡＧプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ部位に、合成ヌクレオチドｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｃｔｔｃｔｇａｔｃｃｔａｇｃｔｃｔｔｇｔｔｇｇａｇｃｔｇｃａｇｔｔｇｃｔｇａｃｔａｃｇａａｇａｇｇａｃｇａａｃａａａａａｃｔｃａｔｃｔｃａｇａａｇａｇｇａｔｃｔｇａｃｔａｇｔ（配列番号２１）およびその相補鎖合成ヌクレオチドを組み込んだ。これにより、ＫｐｎＩ−ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ−プレプロトリプシンシグナルペプチド（ＭＳＡＬＬＩＬＡＬＶＧＡＡＶＡ（配列番号１８））−Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２２））−ＳｐｅＩ−６  ｘＨｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０））−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ−ＣｌａＩが伸長因子プロモーターの下流、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に位置する。
ｐＥＦ６／ＦＬＡＧ：
ｐＥＦ６／Ｖ５−Ａプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ−ＰｍｅＩ部位に、合成ヌクレオチド
ｔｇｇｔａｃｃｇａｇｃｔｃｇｇａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｃａｇｔｇｔｇｇｔｇｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔａｔｃｃａｇｃａｃａｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｔｃｔａｇａｇａｃｔａｃａａａｇａｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇａｇａｇｇｇｔｃｔｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｔｇａｇｃｇｇｃｃｇｃａａａｃｃｃ（配列番号２３）およびその相補鎖合成ヌクレオチドを組み込んだ。これにより、ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ−ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１９））−６  ｘ  Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０））−ストップコドン−ＮｏｔＩが伸長因子プロモーターの下流、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に位置する。
ｐＥＦ６／ｓｓＦＬＡＧ−ｈＤＡＮＣＥ：
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＤＡＮＣＥの２５番アミノ酸からストップコドンまでをプライマーｔｃｔａｇａｇｃａｃａｇｔｇｃａｃｇａａｔｇｇｃｔｔｔｇ（配列番号２４）およびｇｃｇｇｃｃｇｇｔｃａｇａａｔｇｇｇｔａｃｔｇｃｇａｃａｃａｔａｔａｔｃｃｇ（配列番号２５）を用いてＰＣＲ法にて増幅し、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ  Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製品記載の方法によりクローニングし、配列を確認したあとＸｂａＩ−ＮｏｔＩで切り出し、ｐＥＦ６／ｓｓＦＬＡＧのＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ部位に組み込んだ。
ｐＥＦ６／ｓｓＭｙｃ−ｈＬＴＢＰ２：
ヒトＬＴＢＰ２の３６番アミノ酸からストップコドンまでを
ｔｃｔａｇａｃａａａｇｇｇａｃｃｃｃｇｔａｇｇｇａｇａｔａｃｇａｇ（配列番号２６）およびｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｇｇｔａｃｔｃｃｔｔｇｇｃａｇｔｇｃａｇｔｇｇｇ（配列番号２７）を用いてＰＣＲ法にて増幅し、上記と同様にｐＥＦ６／ｓｓＭｙｃのＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ部位に組み込んだ。
ｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ−ＦＬＡＧ：
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＤＡＮＣＥの１番アミノ酸から最後の４４８番アミノ酸までをプライマーｇａａｔｔｃｔｔｃｔｔｃｔｃｇｃｃｔｔｃｇｃａｔｃｔｃｃｔｃｃ（配列番号２８）とｔｃｔａｇａｇａａｔｇｇｇｔａｃｔｇｃｇａｃａｃａｔａｔａｔｃｃｇ（配列番号２９）を用いてＰＣＲ法にて増幅し、上記と同様にクローニング、シークエンスの後、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで切り出してｐＥＦ６／ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に組み込んだ（図１）。
ｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ（Ｒ７７Ａ）−ＦＬＡＧ：
Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてヒトＤＡＮＣＥの７７番アミノ酸であるアルギニンをアラニンに置換した。その他はｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ−ＦＬＡＧに同じである。
ｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ  ΔＮＤ−ＦＬＡＧ：
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＤＡＮＣＥの１番アミノ酸から２６番アミノ酸まで、７８番アミノ酸から４４８アミノ酸までをそれぞれＰＣＲ法で増幅し、ＮｈｅＩ部位で結合した後、ｐＥＦ６／ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に組み込んだ（図１）。
ｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ  ΔＮ−ＦＬＡＧ：
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＤＡＮＣＥの１番アミノ酸から２６アミノ酸まで、１１３番アミノ酸から４４８アミノ酸までをそれぞれＰＣＲ法で増幅し、ＮｈｅＩ部位で結合した後、ｐＥＦ６／ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に組み込んだ（図１）。
ｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ  ΔＭ−ＦＬＡＧ：
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＤＡＮＣＥの１番アミノ酸から１１２番アミノ酸まで、３１５番アミノ酸から４４８アミノ酸までをそれぞれＰＣＲ法で増幅し、ＮｈｅＩ部位で結合した後、ｐＥＦ６／ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に組み込んだ（図１）。
ｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ  ΔＣ−ＦＬＡＧ：
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＤＡＮＣＥの１番アミノ酸から３１５番アミノ酸までをＰＣＲ法で増幅し、ｐＥＦ６／ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に組み込んだ（図１）。
ヒトリシルオキシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０３９２９１．１）ｃＤＮＡにコードされるポリペプチド（４１７個のアミノ酸）の２２番アミノ酸から４１７アミノ酸までをＰＣＲ法で増幅し、ｐＥＦ６／ｓｓＭｙｃのＸｂａＩ／ＮｏｔＩ部位に組み込んだ。
１．２．細胞、トランスフェクション
発現実験には２９３Ｔ細胞を用いた。トランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＰｌｕｓ試薬を用い、製品記載の方法で行った。トランスフェクション後２４時間で無血清培地に交換し、さらに４８時間培養した上清または細胞ライセートをウエスタンブロッティング、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバインディングアッセイに用いた。
マウス新生仔の皮膚線維芽細胞は、″Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ″に記載の方法で採取、培養した。
ウシ大動脈平滑筋は、Ｃａｍｂｒｅｘより購入した。
１．３．組換えＤＡＮＣＥ
２９３Ｔ細胞とｐＥＦ６−ｈＤＡＮＣＥ−ＦＬＡＧを用いてヒトＤＡＮＣＥ安定発現細胞株を作成し、その培養上清からＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて組換えＤＡＮＣＥを精製した後、脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて脱塩した。
１．４．抗体
抗マウスＤＡＮＣＥ抗体ＢＳＹＮ１９２３は、マウスＤＡＮＣＥ７６−９８アミノ酸に対応する合成ペプチドをウサギに免疫して作成し、抗原ペプチドを固定したカラムを用いてアフィニティー精製した。抗エラスチンモノクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎとＥｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＥＰＣ）から、フィブリリン１ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体、フィブリリン２ポリクローナル抗体、ＬＴＢＰ２モノクローナル抗体はＥＰＣから購入した。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体と抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースはＳｉｇｍａ、抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚより購入した。ポリクローナル抗エラスチン抗体（ＰＲ５３３）はＥｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＩＮＣから購入した。抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６抗体はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。
１．５．３５Ｓ−Ｍｅｔ，Ｃｙｓを用いたメタボラベリング（ｍｅｔａｂｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ）、免疫沈降、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバインディングアッセイ、ウエスタンブロッティング
″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．″に記載の方法で行った。
１．６．線維芽細胞培養
ヒト線維芽細胞は京都大学附属病院形成外科より供与して頂いた。２４ウエルプレートの底にＣｏｖｅｒ  Ｇｌａｓｓを置き、その上にヒト線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０４個播種し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。３日目にＰＢＳで洗浄後、ＦＢＳを添加していないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に換え、精製したＤＡＮＣＥ蛋白質、切断型ＤＡＮＣＥ蛋白質４μｇ／ｍｌ、もしくはＦＢＳを添加した。引き続き３７℃、５％ＣＯ２で培養し、１４日目に固定、免疫染色を行った。
１．７．免疫染色
培養１４日目に、１ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄後、１００％メタノールにて、−２０℃で３０分間固定した。ＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳにて、室温で３０分間ブロッキングした後、ポリクローナル抗エラスチン抗体（希釈率１／１００）、および、モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（希釈率１／１００）と室温で１時間以上インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、さらに抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（希釈率１／１００）、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６抗体（希釈率１／１００）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒドにて、室温で１０分間固定し、ふたたびＰＢＳで洗浄後、ＤＡＰＩ含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄにてスライドガラス上にサンプルをマウントした。観察は共焦点顕微鏡により行った。
実施例１：ＤＡＮＣＥの一部はｉｎ  ｖｉｔｒｏ，ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮ末端が切断されている
１．１．ヒト及びマウスＤＡＮＣＥの２９３Ｔ細胞での強制発現
シグナルペプチド切断部位直下にＦＬＡＧタグをつけたヒト及びマウスＤＡＮＣＥ  ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、無血清培地に交換後４８時間培養を続け、その培養上清１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ウエスタンブロットを行った。抗体はマウスＤＡＮＣＥの７６−９８番目のアミノ酸に対応するペプチドをウサギに免疫して得られたＢＳＹＮ、および抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いた。
その結果、図２に示す通り、ＢＳＹＮはヒトＤＡＮＣＥを認識せず、マウスＤＡＮＣＥは２本のバンドとして検出された。これに対して抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体は、ヒト・マウスＤＡＮＣＥを１本のバンドとして検出した。
１．２．マウス由来皮膚線維芽細胞でのＤＡＮＣＥの発現
新生仔期のＤＡＮＣＥノックアウトマウス（Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１７１−１７５（２００２）参照）およびその同腹のコントロールマウス皮膚より線維芽細胞を培養し、３５Ｓ−Ｍｅｔ，Ｃｙｓで２４時間ラベルした後、培養上清をＢＳＹＮ抗体で免疫沈降した。免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィーで検出した。
その結果、ＤＡＮＣＥ＋／＋マウス由来の皮膚線維芽細胞では２本のバンドが検出され、ＤＡＮＣＥ−／−マウス由来の皮膚線維芽細胞ではバンドが検出されなかった（図３）。
１．３．マウス肺組織のウエスタンブロット
１２週齢のＤＡＮＣＥノックアウトマウスおよびその同腹のコントロールマウスの肺組織抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、ＢＳＹＮ抗体でウエスタンブロットを行った。
その結果、ＤＡＮＣＥ＋／＋マウスの肺組織では、ＤＡＮＣＥが２本のバンドとして検出され、ＤＡＮＣＥ−／−マウスの肺組織ではバンドが検出されなかった（図４）。
実施例２：切断型ＤＡＮＣＥのＮ末端は、ＤＡＮＣＥの７８番目以降のアミノ酸と一致する
カルボキシル末端にＦＬＡＧタグと６  ｘ  ＨｉｓタグのついたヒトＤＡＮＣＥ  ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、安定発現株を樹立した。その無血清培養上清８００ｍｌよりＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて組換えＤＡＮＣＥを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開してＣｏｏｍａｓｉｅ−Ｂｌｕｅで染色した。主要なバンド２本のうち、切断型ＤＡＮＣＥに相当するバンドを切り出し、エドマン分解によりＮ末端アミノ酸配列を解析した（図５）。
その結果、切断型ＤＡＮＣＥのＮ末端アミノ酸配列は、ＤＡＮＣＥの７８番目以降のアミノ酸配列と一致していた。
以上より、この低分子量タンパク質は、ＤＡＮＣＥの７７番目のアミノ酸と７８番目のアミノ酸との間での切断により生じると考えられた。
実施例３：ＤＡＮＣＥの切断はセリンプロテアーゼインヒビターで阻害される
カルボキシル末端にＦＬＡＧタグと６  ｘ  ＨｉｓタグのついたヒトＤＡＮＣＥ  ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、システインプロテアーゼインヒビター（Ｅ６４）またはセリンプロテアーゼインヒビター（アプロチニン）を含む無血清培地で４８時間培養し、培養上清からＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて沈降させた組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体でウエスタンブロットを行った。
その結果、ＤＡＮＣＥの切断はＥ６４で阻害されなかったが、アプロチニンにより阻害された（図６）。
以上より、ＤＡＮＣＥはセリンプロテアーゼにより切断されることが示唆された。
実施例４：ＤＡＮＣＥのＡｒｇ７７をＡｌａに置換すると切断されにくくなる
ＤＡＮＣＥの７７番目のアルギニンをアラニンに置換した変異型ＤＡＮＣＥ（Ｃ末端ＦＬＡＧ，６  ｘ  Ｈｉｓタグつき）（図７）の発現ベクター、及び正常型ＤＡＮＣＥ（Ｃ末端ＦＬＡＧ，６  ｘ  Ｈｉｓタグつき）の発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、無血清培地で４８時間培養した培養上清からＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて沈降させた組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体でウエスタンブロットを行った。
その結果、この変異型ＤＡＮＣＥは、プロテアーゼによる切断に対して抵抗性を示すことが明らかとなった（図８）。
実施例５：ＤＡＮＣＥはホモ複合体を形成し、また、ＬＴＢＰ２とも結合する
９ｃｍプレートに播いたウシ大動脈平滑筋細胞を３５Ｓ−Ｍｅｔ，Ｃｙｓで２４時間ラベルした後、培養上清と組換えヒトＤＡＮＣＥ（Ｃ末端ＦＬＡＧ，６  ｘ  Ｈｉｓつき）５０μｇを混ぜて、抗ＦＬＡＧアガロース（Ｓｉｇｍａ）で沈降させたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィーを行った。同じ培養上清を、弾性線維構成タンパク質（エラスチン、フィブリリン１、フィブリリン２、ＬＴＢＰ２）に対する市販の抗体で免疫沈降し、同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで展開し、オートラジオグラフィーを行った。
その結果、ＤＡＮＣＥがホモ複合体を形成すること、及びＤＡＮＣＥがＬＴＢＰ２に結合することが明らかとなった（図９）。
実施例６：ヒトＤＡＮＣＥとＤＡＮＣＥ又はＬＴＢＰ２との結合領域の解析
実施例５の結果より、ＤＡＮＣＥ同士の結合領域、ＤＡＮＣＥのＬＴＢＰ２に対する結合領域を解析することとした。
ＦＬＡＧタグのついたヒトＤＡＮＣＥコンストラクト（図８）、ＭｙｃタグのついたヒトＤＡＮＣＥコンストラクト、及びヒトＬＴＢＰ２コンストラクトを別々に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。無血清培地で４８時間培養後、それぞれの培養上清と細胞抽出液を混ぜ、タンパク質溶液とした。ＦＬＡＧタグのついたＤＡＮＣＥコンストラクトからのタンパク質溶液と、ＭｙｃタグのついたＤＡＮＣＥまたはＬＴＢＰ２からのタンパク質溶液を氷上で１時間混ぜ、抗ＦＬＡＧ抗体で沈降させたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗Ｍｙｃ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。
その結果、ＤＡＮＣＥ同士の結合には、Ｎ末端ドメインが、ＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ２との結合にはＤＡＮＣＥの中央のドメインが必要であることが明らかとなった（図１０）。また、ＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ２との結合は、ＤＡＮＣＥのＮ末端又はＣ末端ドメインが欠損しているほうが強いことが明らかとなった。
実施例７：ＤＡＮＣＥはリシルオキシダーゼに結合し得る
リシルオキシダーゼの遺伝子欠損マウスの表現型（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１６）：１４３８７−９３（２００３）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６（１９）：２５０３−９（２００２））は、本発明者らが以前に報告しているＤＡＮＣＥ遺伝子欠損マウスの表現型（Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１７１−１７５（２００２））に非常に類似することを本発明者らは見出した。そこで、本発明者らはＤＡＮＣＥとリシルオキシダーゼとの複合体の形成がその機能の発揮に重要である可能性があると考え、ＤＡＮＣＥがリシルオキシダーゼに結合するか否かを評価した。なお、アッセイは、抗ＦＬＡＧ抗体で沈降させたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗Ｍｙｃ抗体で検出した以外は、実施例６と同様にして行った。
その結果、ＤＡＮＣＥはリシルオキシダーゼに結合することが示唆された（図１１）。
考察
１．ＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ２の結合
本発明者らは、ＤＡＮＣＥがＬＴＢＰ２と特異的に結合することを見出した。この結合は、ＤＡＮＣＥの中央にあるカルシウム結合性ＥＧＦ様モチーフが連続するドメインを介しておきる。これまでに、本発明者らはＤＡＮＣＥのアミノ末端ドメインが細胞表面インテグリンに結合することを報告し、ＬｉｕらはＤＡＮＣＥのカルボキシル末端側の半分でＬＯＸＬ１に結合することを報告した。しかしエラスチンは細胞表面に密着して沈着するのではなく、ミクロフィブリルに沿って沈着していき、成熟した弾性線維になることが知られている（Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１９：４５５−６（２０００））。したがって、ＤＡＮＣＥとＬＯＸＬ１の結合がエラスチンのミクロフィブリルへの沈着・クロスリンクを促進するのであれば、ＤＡＮＣＥはミクロフィブリルと結合しているはずである。ミクロフィブリルは長い細胞外線維であり、フィブリリン１、フィブリリン２、ＬＴＢＰ２などの細長いタンパク質分子から成り立っていると考えられている。フィブリリンは１，２どちらのノックアウトマウスも弾性線維の形成異常を来さず、フィブリリンとＤＡＮＣＥの結合も否定的である。ＬＴＢＰ２は、ＬＴＢＰファミリーに属していながらＬａｔｅｎｔ  ＴＧＦβと結合せず、弾性線維中に局在するタンパク質であるが、その生体内での役割は、ＬＴＢＰ２ノックアウトマウスが早期胎生致死であることから、よくわかっていない（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：４８７９−８７（２０００））。今回の本発明者らの発見は、ＬＴＢＰ２がＤＡＮＣＥをミクロフィブリル上につなぎ止めることによってエラスチンクロスリンク酵素をミクロフィブリルに局在させ、ミクロフィブリルに沿ってエラスチンが沈着・クロスリンクするのを助けていることを示唆する。
２．ＤＡＮＣＥ同士の結合
ＤＡＮＣＥが単量体ではたらくのか、２量体もしくは多量体になるかどうかは今までわかっていなかったが、今回、平滑筋培養上清中にある主要なＤＡＮＣＥ結合タンパク質としてＤＡＮＣＥが見出された。このことはＤＡＮＣＥがホモ複合体（２量体または多量体）を形成することを示している。ＤＡＮＣＥ同士の結合はアミノ末端ドメインを介している。以前、本発明者らは、ＤＡＮＣＥのアミノ末端ドメインが細胞表面インテグリンに結合することを示したが（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３２）：２２４７６−２２４８３（１９９９））、今回のデータはアミノ末端ドメインの新たな機能としてＤＡＮＣＥ同士の結合促進があることを意味している。
３．ＤＡＮＣＥアミノ末端ドメインの切断
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＤＡＮＣＥの一部はアミノ末端ドメインが切断されることを見出した。この切断は未同定のセリンプロテアーゼによっておこり、切断部位のアルギニンをアラニンに置換すると切断されにくくなる。ＤＡＮＣＥアミノ末端ドメインの機能から推測されるように、切断型ＤＡＮＣＥは、（１）細胞表面インテグリンと結合しなくなり、（２）ＤＡＮＣＥ同士で結合しなくなり、また、（３）切断型ＤＡＮＣＥは全長ＤＡＮＣＥよりもＬＴＢＰ２との結合が強くなる。これら（１）〜（３）の新知見は、生体内ではプロテアーゼによるＤＡＮＣＥの切断が、ＤＡＮＣＥの機能変化、ひいては弾性線維形成の制御機構としてはたらいていることを示唆する。この考えに基づけば、薬剤によるＤＡＮＣＥ切断プロテアーゼの阻害もしくは促進が、弾性線維劣化の予防・再生促進に有用であり得る。
４．ＤＡＮＣＥとリシルオキシダーゼの結合
ＬＯＸ１遺伝子欠損マウスは弾性線維形成異常を来す。ＬＯＸＬ１はＤＡＮＣＥと直接会合し、ＤＡＮＣＥによって弾性線維形成部位につなぎとめられてエラスチンのクロスリンクを行うと考えられる。しかし、ＬＯＸＬ１遺伝子欠損マウスの表現型はＤＡＮＣＥ遺伝子欠損マウスの表現型と比べると弱く、ＬＯＸＬ１との結合だけではＤＡＮＣＥの作用の全てを説明できない。リシルオキシダーゼ遺伝子欠損マウスもやはり弾性線維形成異常を来すが、今回本発明者が見出したＤＡＮＣＥとリシルオキシダーゼの結合は、ＤＡＮＣＥがリシルオキシダーゼを繋ぎとめることでエラスチンのクロスリンクが効率よく行われることを示唆する。
実施例８：ＤＡＮＣＥの切断を調節する物質のスクリーニング
カルボキシル末端にＦＬＡＧタグと６  ｘ  ＨｉｓタグのついたヒトＤＡＮＣＥ  ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、被検物質の存在下、不在下の無血清培地で４８時間培養し、培養上清からＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて沈降させたヒトＤＡＮＣＥをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体でウエスタンブロットを行う。被検物質の存在下、不在下において、それぞれ２本のバンドを定量解析することで、被検物質がＤＡＮＣＥの切断を調節し得るか否かを評価する。
実施例９：種々の年齢のヒト皮膚における全長型及び切断型ＤＡＮＣＥの発現
形成外科手術に伴い切除された皮膚組織におけるＤＡＮＣＥの発現を調べるため、抗ヒトＤＡＮＣＥ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔを行った（図１２）。いずれの検体からも全長型および切断型ＤＡＮＣＥタンパクを検出することができたが、年齢及び皮膚採取部位によって発現レベルに大きな差を認めた。まず顔面皮膚において、０歳児では全長型、切断型ＤＡＮＣＥともに発現レベルが高く、特に全長型ＤＡＮＣＥ発現レベルが高かったが、成人では全長型、切断型ともに発現レベルが少なく、特に全長型が少ない傾向にあった。光の当たらない他の部位の皮膚では、成人でも全長型、切断型ともに比較的ＤＡＮＣＥ発現レベルが保たれる傾向が見られた。
参考例１：切断型ＤＡＮＣＥにはインテグリンを介した細胞接着促進活性がない
全長型ＤＡＮＣＥは細胞表面インテグリンを介して血管内皮細胞の接着と伸展を促進する。これまでに全長型ＤＡＮＣＥはインテグリンαｖβ３、αｖβ５、α９β１のリガンドとなりうることを本発明者は報告している。リガンドとなるドメインはＤＡＮＣＥアミノ末端ドメインのＲＧＤモチーフ周辺と考えられるため、ＲＧＤをＲＧＥに１アミノ酸置換したＤＡＮＣＥ変異体（ＲＧＥ  ＤＡＮＣＥ）、およびアミノ末端切断型ＤＡＮＣＥ（ΔＮＤ  ＤＡＮＣＥ）の各リコンビナントタンパクを精製し、全長型ＤＡＮＣＥとあわせて血管内皮細胞の細胞接着アッセイを行った（図１３）。全長型ＤＡＮＣＥの場合、コーティングに用いるタンパク濃度に依存して細胞接着が促進されたが、ＲＧＥ  ＤＡＮＣＥにはほとんど細胞接着活性が無く、ΔＮＤ  ＤＡＮＣＥには全く細胞接着活性が無かった。
参考例２：ＤＡＮＣＥのアミノ末端ドメインは弾性線維形成に必要である
次いで、プロテアーゼによるＤＡＮＣＥのアミノ末端ドメイン切断が弾性線維形成に影響するかどうかを検証した。
ヒト皮膚線維芽細胞をコンフルエントになるよう播種し、無血清培地もしくは１０％牛胎仔血清を含有する培地に替えて２週間培養して弾性線維の形成を抗エラスチン抗体による免疫染色で解析した。
その結果、１０％の牛胎仔血清を含有する培地では弾性線維の形成がみられた。無血清培地でも細胞は生存していたが、弾性線維はほとんど形成されなかった。しかし無血清培地に組換えＤＡＮＣＥを４μｇ／ｍｌになるように加えておくと、血清含有培地と同等以上の弾性線維が形成された。このとき加えた組換えＤＡＮＣＥの局在を抗ＦＬＡＧ抗体で見ると、形成された弾性線維と共局在していた。一方、ΔＮＤ−ＤＡＮＣＥを加えた培地では弾性線維形成が非常に少なく、ΔＮＤ−ＤＡＮＣＥには弾性線維形成活性がほとんどないか、あっても非常に弱いと考えられた。
以上より、プロテアーゼによるＤＡＮＣＥアミノ末端ドメインの切断は、ＤＡＮＣＥの不活化であると考えられるため、ＤＡＮＣＥ切断プロテアーゼの阻害剤は、全長型ＤＡＮＣＥを増やすことによる弾性線維の形成又は維持に有用な薬剤として期待できる。
【産業上の利用可能性】  本発明のスクリーニング方法は、弾性線維形成を調節し得る新規作用機序の医薬の開発、又はＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼの同定を可能にする。また、本発明の測定方法は、弾性線維形成の状態の診断を可能とする。さらに、本発明のポリペプチド、抗体、複合体及びキットは、本発明の方法を行うため、弾性線維形成の調節が所望される状態の予防、治療又は改善のため、あるいは研究・診断用試薬などとして好適である。
本出願は、２００４年３月２９日に日本で出願された特願２００４−０９６６８５を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
【図１】
0004452840.tif 000002
【図２】
0004452840.tif 000003
【図３】
0004452840.tif 000004
【図４】
0004452840.tif 000005
【図５】
0004452840.tif 000006
【図６】
0004452840.tif 000007
【図７】
0004452840.tif 000008
【図８】
0004452840.tif 000009
【図９】
0004452840.tif 000010
【図１０】
0004452840.tif 000011
【図１１】
0004452840.tif 000012
【図１２】
0004452840.tif 000013
【図１３】
0004452840.tif 000014
【配列表】
0004452840000001.xml