(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（１）
【化１】
0004585644.tif 000003
（１）
で表される化合物PF1223、または、その薬理学的に許容されうる塩。
【請求項２】
ネオサルトリア（Neosartorya）属に属する微生物を培養し、請求項１記載の化合物を生成せしめ、これを採取することを特徴とする該化合物の製造法。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物、またはその薬理学的に許容されうる塩を含有してなる殺虫剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は殺虫剤または医薬として利用可能なGABA受容体塩素イオンチャネル複合体阻害活性を有する新規物質PF1223（以下、「PF1223物質」という）の製造法及び用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来、様々な構造や作用性を有する殺虫剤が利用されてきたが、近年、抵抗性を獲得した害虫個体群の発達、より高い選択毒性を有する剤に対する要請により、新しい系統の殺虫剤が一層求められている。
γ−アミノ酪酸（GABA）は、昆虫の中枢及び末梢神経における神経伝達物質であり、歩行、飛翔等の運動の制御に重要な働きをすることが知られているが、哺乳動物の場合、GABAは中枢神経系でのみ作用することや、昆虫と哺乳動物の受容体の構造に違いがあることから、昆虫のGABA作動性神経を撹乱する物質は、昆虫に高い選択性を示す新しい殺虫剤となることが期待される。
一方、上記のようにGABAは哺乳動物の中枢神経系で抑制性神経伝達物質として重要な機能を担っており、GABA受容体に作用する物質は医薬としても用いうるものである。
本発明は、GABA受容体塩素イオンチャネル複合体（ＧＲＣ）を特異的に阻害する化合物および組成物に関する。具体的には、本発明は、ＧＲＣのピクロトキシニン結合部位への結合を介して殺虫作用または医薬としての作用を示す化合物および組成物に関する。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
このような実情を踏まえ、本発明者らは、より有効かつ安全な新規殺虫活性物質を見出すべく、幅広く微生物を採取・培養し、ＧＲＣのピクロトキシニン結合部位に特異的に作用する化合物を、同部位の特異的阻害剤として知られている４'−エチニル−４−ｎ−プロピルビシクロオルソベンゾエート(EBOB）の結合阻害物質のスクリーニングを行なった結果、ネオサルトリア（Neosartorya）属に属する特定の菌株を培養することによって、EBOB結合阻害物質が培養物中に生産、蓄積されることを見いだし、その有効成分を採取することに成功した。さらに、本発明者らは前述構造式（１）で表される有効物質PF1223を単離し、その理化学的性状を明らかにすることにより本発明を完成した。したがって第１の本発明の要旨とするところは、前述構造式（１）で表され、下記の理化学的性状を有する新規物質にある。
【０００４】
＜PF1223物質の理化学的性状＞
（１）色および性状         : 白色粉末
（２）分子式: C25H28O8
0004585644.tif 000002
（４）比旋光度            ：  [α]D22.5 = + 11.8° ( c = 0.14, MeOH )
（５）紫外線吸収スペクトル λmax  nm ( E%cm )
[ MeOH ]  ： 217 ( 420 ), 264 ( 288 ), 310 ( 80 )
[ 0.1N-HCl-MeOH ]   ： 217 ( 350 ), 264 ( 300 ), 315 ( 80 )
[ 0.1N-NaOH-MeOH ]  ： 217 ( 690 ), 256 / s ( 135 ), 306 ( 325 )
（６）赤外線吸収スペクトル
(KBr cm-1) : 3410, 2975, 2928, 2855, 1726, 1692, 1651, 1605, 1509, 1466, 1441,1389, 1371, 1295, 1279, 1248, 1208, 1161, 1120, 1078
（７）1H-NMRスペクトル   (400MHz, CDCl3)
δ(ppm) : 7.86 (2H, m), 6.86 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.39 (1H, s), 5.32 (1H, t, J = 7.3 Hz), 4.79 (1H，d, J = 12.0 Hz), 4.51 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.87 (3H, s), 3.40 (2H, d, J = 7.1 Hz), 3.39 (1H, q,J = 7.0 Hz), 2.09 (3H, s), 1.79 (6H, s), 1.28 (3H, d, J = 7.1  Hz)
（８）13C NMR スペクトル  (100MHz, CDCl3)
δ(ppm) : 168.1, 166.4, 164.8, 163.1, 159.4, 141.4, 135.8, 132.2, 130.1,   127.2, 121.2, 120.8, 115.7, 115.5, 102.4, 99.1, 97.5, 65.9, 55.8, 36.1, 25.8, 17.9, 16.4, 10.1
（９）溶解性: クロロホルム、メタノールに可溶、水に難溶。
【０００５】
本発明の要旨とするところは、ネオサルトリア（Neosartorya）属に属する、EBOB結合阻害活性を有するPF1223物質生産菌を培養し、その培養物からPF1223物質を採取することを特徴とする製造法にある。本発明に使用できるEBOB結合阻害活性物質PF1223生産菌の一例としては、新たに分離されたネオサルトリア（Neosartorya）属PF1223株がある。
【０００６】
PF1223株の菌学的性状は以下のとおりである。
１．各種培地上での性状
ツアペック酵母エキス寒天培地上での生育は良好で、25℃、7日間で85 mm以上のコロニーとなる。淡黄色〜灰緑色、羊毛状、平坦、緩やかな菌糸層からなる。中央に子のう果、周辺に分生子を形成する。裏面は黄土色となる。
麦芽エキス寒天培地上での生育は良好で、25℃、7日間で85 mm以上のコロニーとなる。淡黄色〜淡茶色、羊毛状、平坦、緩やかな菌糸層からなる。中央に子のう果、周辺に分生子を形成する。裏面は黄土色となる。
オートミール寒天培地上での生育は良好で、25℃、7日間で85 mm以上のコロニーとなる。淡黄色、全面に子のう果を形成し粒状、やや密な菌糸層からなる。周辺に分生子をわずかに形成する。裏面は淡黄色となる。
37℃の培養ではどの培地でも生育は良好で、25℃の培養より分生子の形成が多い。
２．形態的性状
子のう果は閉鎖型、表在性、球形〜亜球形、菌糸に緩やかに覆われる。殻壁は半透明、膜質、多角形〜長円形の細胞と織り交わった菌糸から構成される。子のうは8胞子性、亜球形〜楕円形、13 〜 15 x 10 〜 13μm、成熟すると消失する。
子のう胞子はレンズ形、2対4枚の帯状隆起を生じ、レンズ面には不規則な突起を形成する。本体は4.5 〜 5 x 3.5 〜 4μm、隆起の幅は0.8 〜 1μmである。
分生子頭は緑色、緩い円筒形、分生子柄は滑面、長いものは250 〜 350μmとなる。頂のうはフラスコ形、15 〜 20μmである。
フィアライドは単列、頂のうの1/2 〜 1/3から生じ、6 〜 8 x 2 〜 2.5μmである。
分生子は球形-亜球形、2 〜3μm、表面は滑面となる。
以上の菌学的性状より本菌株を不整子のう菌綱ユーロチウム目ネオサルトリア(Neosartorya)属と同定した。同定のための参考文献としてThe Genus Aspergillus (Kenneth B. Raper、Dorothy I. Fennell著、Robert E. Krieger社、New York、1973)およびAspergillus species on Stored Products(Z.Kozakiewicz著、CAB International Mycological Institute、UK、1989)を使用した。
なお 、本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17658として寄託されている。
【０００７】
＜PF1223物質生産菌の培養法＞
本発明の方法では、 ネオサルトリア（Neosartorya）属に属するPF1223物質生産菌を通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地で培養する。
栄養源としては、従来カビの培養に利用されている公知のものが使用できる。
例えば、炭素源としては、グルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油等を使用し得る。
また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用し得る。
その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。
また、菌の発育を助け、PF1223物質の生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加することができる。
【０００８】
培養法としては、好気的条件での培養法、特に静置培養法が最も適している。培養に適当な温度は25〜30℃であるが、多くの場合26℃付近で培養する。PF1223物質の生産は培地や培養条件によって異なるが、静置培養、振とう培養、タンク培養のいずれにおいても、通常2〜14日間でその蓄積が最高に達する。 培養液中のPF1223物質の蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製する。
【０００９】
＜PF1223物質の製造法＞
生産されるPF1223物質は、前記の理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から精製することが可能である。
例えば、有機溶媒を用いて培養物よりPF1223物質を抽出した後、吸着剤を用いた吸脱着法、ゲル濾過剤を用いた分子分配法、適当な溶剤からの再結晶法等を用いて精製することが可能である。
例えば、有効成分を含む培養物を酢酸エチルにより抽出する。抽出液を減圧濃縮し、この抽出物を少量のクロロホルム、酢酸エチル等の有機溶剤に溶解し、クロロホルム／メタノール、ヘキサン／アセトンまたはヘキサン／酢酸エチル等の溶媒系で繰り返しシリカゲルクロマトグラフィ−，  分取薄層クロマトグラフィーを行うことによりPF1223物質を単離することができる。必要に応じてセファデックス LH-20（ファルマシアファインケミカルズ社製）等のゲル濾過をメタノール等で溶出することにより精製できる。  PF1223物質を含む分画を減圧濃縮した後、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、メタノール等の有機溶剤を適宜組み合わせ再結晶することにより、PF1223物質を得ることができる。
【００１０】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではない。ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段を用い得ることは勿論のことである。
PF1223株は他のカビに見られるようにその性状が変化し易い。例えば、PF1223に由来する突然変異株（自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換体であっても、PF1223物質を生産するものはすべて本発明に使用できる。
【００１１】
【実施例１】
PF1223物質の製造法
種培地として、でんぷん2.0％、ブドウ糖1.0％、ポリペプトン 0.5%、小麦胚芽 0.6%、酵母エキス 0.3%、大豆粕 0.2%および炭酸カルシウム 0.2% の組成からなる培地（殺菌前pH7.0）を用いた。また、生産培地としては、充分吸水した米に大豆粕2.5％を添加した固形培地を用いた。
前記の種培地20 mlを分注した100 ml容三角フラスコを120℃で15分間殺菌し、これにPF1223株(FERM P-17658)の斜面寒天培養の1白金耳を植菌後、25℃で2日間振とう培養した。次いで、生産培地100 gを分注した500 ml容三角フラスコを120℃で15分間殺菌し、これに上記種培養液を4 mlずつ植菌し、よく撹拌後、28℃で14日間静置培養した。
こうして得られた培養物10 kgを50％アセトン水20 lで抽出した。この抽出液を減圧下、アセトンを留去し、濃縮液( 9  L )とした。この濃縮液を１N塩酸でｐH２に調整後、酢酸エチル( 10  L )で抽出、減圧下溶媒を留去し、油状物質(19.05 g )を得た。この油状物質をシリカゲル（和光純薬社製C-300）カラム(500g)の上部に載せ、クロロホルム−メタノール( 10：１)を溶出溶媒とするクロマトグラフィーを行い、溶出液を 10  mlずつ分画した。溶出されたEBOB結合阻害活性を示した画分を合わせ濃縮乾固し、油状物質(8.2g )を得た。この油状物質をシリカゲルカラム(400  g )に付し、クロロホルム−メタノール (10 :１)で溶出し、溶出液を7.5 mlずつ分画した。溶出された活性画分を合わせ濃縮乾固し、1.53ｇの褐色残さを得た。この残さをメタノールを溶出溶媒とするLH-20（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーを行い3000ｐｐｍで48〜81％の阻害活性を示す画分を合わせて溶媒を留去することにより873ｍｇの褐色残さを得た。この残さをクロロホルム−メタノール (10 :１)を展開溶媒とする分取薄層クロマトグラフィー（キーゼルゲル６０  0.5mm メルク社製）を繰り返し無色粉末状のPF1223物質を10.4ｍｇ得た。
【試験例１】
EBOB結合阻害活性
＜イエバエ神経膜画分GABA受容体阻害試験＞
羽化5〜10日後のイエバエ成虫頭部を0.25Msucrose /10mM Tris-HCl buffer(pH7.5)中でガラス−テフロンホモジナイザーを用いて磨砕し、4重にした64μｍメッシュナイロンスクリーンでろ過した後、ろ液を500×gで5分間遠心分離した。上清を再度同様にろ過した後25,000×g で30分間遠心分離し、沈殿を300mM NaCl/ 10mM sodium phosphate buffer中に懸濁し氷冷下30分間放置した。この懸濁液を再び、25,000×g で30分間遠心分離し、沈殿を300mM NaCl / 10mM sodium phosphate buffer中に懸濁し、ただちに以下の実験に用いた。
供試化合物を微量のDMSOに溶解し、0.5nM[3H]EBOB（デュポン／NENリサーチプロダクツ社製）を添加した上記イエバエ頭部磨砕懸濁液1.0ml中22℃で70分間インキュベートした。その後、神経膜画分をGF/Bガラス濾紙（ワットマン社製）上に24穴セルハーベスタ（ブランデル社製）を用いてろ集し、氷冷した5mlの300mM NaCl / 10mM sodium phosphate buffer で2回洗浄した。濾紙上の膜画分に結合した
[3H]EBOBの放射活性を液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて測定し、供試化合物添加区の全結合(dpm)を求めた。
各供試化合物処理区の非特異的結合(dpm)は、上記条件下5μMの非放射ラベルEBOBを添加して求めた。供試化合物を用いない区を対照区とした。
上記膜画分にたいする[3H]EBOBの特異的結合を式(1)にしたがい求めた。
特異的結合(dpm)  =  全結合(dpm)−非特異的結合(dpm)    式(1)
供試化合物の[3H]EBOB 特異的結合阻害度(%)を式(2)にしたがい求めた。
[3H]EBOB 特異的結合阻害度(%)  =
(1−各供試化合物処理区の特異的結合(dpm)/対照区の特異的結合(dpm))×100   式(2)
PF1123物質2.2μM処理区の[3H]EBOB 特異的結合阻害度は、65%であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】PF1223物質(20μg/ml)のメタノール中での紫外線吸収スペクトルを示す図面である。
【図２】PF1223物質の赤外線吸収スペクトルを示す図面である。
【図３】PF1223物質の重クロロホルム中での400 MHz 1H核磁気共鳴スペクトルを示す図面である。
【図４】PF1223物質の重クロロホルム中での100 MHz13C核磁気共鳴スペクトルを示す図面である。
【図１】
0004585644.tif 000004
【図２】
0004585644.tif 000005
【図３】
0004585644.tif 000006
【図４】
0004585644.tif 000007