(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
0004531167.tif 000012
で示されるＡ−５００３５９Ｅ化合物又はその塩。
【請求項２】
下記式（ＩＩ）
【化２】
0004531167.tif 000013
で示されるＡ−５００３５９Ｆ化合物又はその塩。
【請求項３】
下記式（ＩＩＩ）
【化３】
0004531167.tif 000014
で示されるＡ−５００３５９Ｆアミド化合物又はその塩。
【請求項４】
下記式（ＩＶ）
【化４】
0004531167.tif 000015
で示されるＡ−５００３５９Ｈ化合物又はその塩。
【請求項５】
下記式（Ｖ）
【化５】
0004531167.tif 000016
で示されるＡ−５００３５９Ｊ化合物又はその塩。
【請求項６】
下記式（ＶＩ）
【化６】
0004531167.tif 000017
で示されるＡ−５００３５９Ｍ−３化合物又はその塩。
【請求項７】
ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）を培養し、その培養物より請求項１、請求項２、請求項４又は請求項５記載の化合物を採取することを特徴とする、該化合物の製造法。
【請求項８】
請求項1、請求項２、請求項４又は請求項５記載の化合物を生産することを特徴とするストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）。
【請求項９】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５又は請求項６記載の化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩を含むことからなる医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗菌活性を有する化合物、該化合物の製造法、該化合物を有効成分として含有する医薬（特に抗菌剤）、又は該化合物を生産する新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、結核を含む細菌感染症の予防および治療には各種ベータラクタム抗生物質、マクロライド、キノロン、アミノ配糖体、イソナイアジド、リファンピシン、などが使われてきたが、最近これらの抗生物質に耐性を示す感染菌が増加しており、従来のタイプとは異なる抗生物質が渇望されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来の薬剤とは交差耐性のない新規化合物を培養液中に見出し、さらに、かかる新規化合物の製造法および該化合物を生産する新規微生物およびその生産法を確立し、これら化合物の薬理活性について永年に亘り鋭意研究を行った結果、これらの化合物が優れた抗菌活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００４】
本発明の化合物は、現在問題となりつつある耐性菌を含む細菌感染症の予防および治療に供することが可能であり、又、該化合物はより優れた抗菌活性を有する誘導体を合成する際の出発原料とすることも可能である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）  下記式（Ｉ）
【０００６】
【化７】
0004531167.tif 000002
で示されるＡ−５００３５９Ｅ化合物又はその塩、
（２）  下記式（ＩＩ）
【０００７】
【化８】
0004531167.tif 000003
で示されるＡ−５００３５９Ｆ化合物又はその塩、
（３）  下記式（ＩＩＩ）
【０００８】
【化９】
0004531167.tif 000004
で示されるＡ−５００３５９Ｆアミド化合物またはその塩、
（４）  下記式（ＩＶ）
【０００９】
【化１０】
0004531167.tif 000005
で示されるＡ−５００３５９Ｈ化合物またはその塩、
（５）  下記式（Ｖ）
【００１０】
【化１１】
0004531167.tif 000006
で示されるＡ−５００３５９Ｊ化合物またはその塩、
（６）  下記式（ＶＩ）
【００１１】
【化１２】
0004531167.tif 000007
で示されるＡ−５００３５９Ｍ−３化合物またはその塩、
（７）  ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）を培養し、その培養物より（１）、（２）、（４）又は（５）記載の化合物を採取することを特徴とする、該化合物の製造法、
（８）  （１）、（２）、（４）又は（５）記載の化合物を生産することを特徴とするストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）、及び
（９）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）に記載の化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を含むことからなる医薬である。
【００１２】
本発明の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）で表わされる化合物は、茨城県筑波山にて採取された土壌より分離した、ストレプトマイセス属に属するストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６株の培養液中に生産されるか、又は培養過程における微生物変換若しくは単離精製過程における化学変換によって生成する。
【００１３】
本発明の前記式（Ｉ）で示されるＡ−５００３５９Ｅ化合物、前記式（ＩＩ）で示されるＡ−５００３５９Ｆ化合物、前記式（ＩＩＩ）で示されるＡ−５００３５９Ｆアミド化合物、前記式（ＩＶ）で示されるＡ−５００３５９Ｈ化合物、前記式（Ｖ）で示されるＡ−５００３５９Ｊ化合物及び前記式（ＶＩ）で示されるＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、それぞれいくつかの不斉炭素原子を有する。それゆえ、種々の光学異性体が存在する。本発明においては、これらのＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の各異性体がすべて単一の式で示されているが、本発明は、ラセミ化合物を含むこれらの異性体及びこれらの異性体の混合物をもすべて含むものである。立体特異的合成法が使用される場合、または光学活性化合物が原料化合物として使用される場合、個々のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の各異性体は直接的に製造してもよいし、一方、異性体の混合物が製造されれば、個々の異性体は常法により得てもよい。
【００１４】
本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明はそのようなＡ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の塩も包含する。Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。なお、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の塩が、医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として用いられる場合にはなんら限定はない。そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル-フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。より好適には、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。
【００１５】
また、本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物、またはそれぞれの塩は、溶剤和物となることがある。例えば、大気中に放置したり、または、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような溶剤和物も本発明に包含される。
【００１６】
さらに本発明は、生体内において代謝されてＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物に変換される化合物、いわゆるプロドラッグもすべて含むものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）で表わされる化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、ストレプトマイセス属に属する該化合物の生産菌を適当な培地で培養し、該培養物から採取することによって得られる。好適なＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産菌であるストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６株（以下、「ＳＡＮＫ６０１９６株」と記す。）は、前述のように、茨城県筑波山の土壌から常法に従って採集、分離されたものである。
【００１８】
ＳＡＮＫ６０１９６株の菌学的性状は次の通りである。
【００１９】
１）形態学的特徴
ＳＡＮＫ６０１９６株はインターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ：以下、「ISP」と記す。）規定（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ，Ｅ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｄ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １６，３１３−３４０、１９９６）の培地上で２８℃、１４日間の培養により次のような形態学的特徴を示した。光学顕微鏡による観察ではＳＡＮＫ６０１９６の基生菌糸は良好に伸長、分岐し黄味灰、黄味茶ないし薄オリーブ色を示すがノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株様の断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単純分岐する。胞子連鎖の形態は直ないし曲状を示し、およそ１０〜５０個またはそれ以上の胞子の連鎖を形成する。走査型電子顕微鏡による観察では胞子は楕円形で、その表面構造は平滑状（Ｓｍｏｏｔｈ）を示す。胞子の大きさは０．６〜０．８×０．７〜１．２μｍである。胞子は気菌糸上にのみ形成される。また、胞子のう、気菌糸の車軸分岐、気菌糸の断裂、菌核などの特殊器官は認められない。
【００２０】
２）各種培養基上での培養性質
ＳＡＮＫ６０１９６株の２８℃、１４日間培養後の寒天培地上での培養性状は表１に示すとおりである。
0004531167.tif 000008
0004531167.tif 000009
0004531167.tif 000010
表１中、ISP番号の記されている培地の組成はそれぞれISPの規定の通りである。また項目Ｇは生育、ＡＭは気菌糸、Ｒは裏面、ＳＰは可溶性色素をそれぞれ表す。色調の記述は「色の標準（日本色彩研究所版）」によるものであり、カッコ内の色調の表示は、マンセル方式に準拠したカラーナンバーである。水寒天培地中に産生される薄黄色の可溶性色素は０．０５規定（ｎｏｒｍａｌｉｔｙ：以下、「Ｎ」と記す。）塩酸により無色に変化し、０．０５Ｎ水酸化ナトリウムによりなんらの変化も示さなかった。
【００２１】
３）生理学的性質
２８℃で培養後、２〜２１日間に観察した本菌株の生理学的性質は、表２に示した通りである。
0004531167.tif 000011
表２中、培地１はイーストエキス・麦芽エキス寒天（ISP 2）を指す。また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ISP 9）を使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮＫ６０１９６株の炭素源の資化性は表３に示した通りである。
［表３］
――――――――――――――――――――――――――――
Ｄ−グルコース          ＋
Ｌ−アラビノース        −
Ｄ−キシロース          ＋
イノシトール            −
Ｄ−マンニトール        ＋
Ｄ−フルクトース        ＋
Ｌ−ラムノース          −
シュクロース            −
ラフィノース            −
対照                    −
――――――――――――――――――――――――――――
表３中、「＋」は資化する、「−」は資化しないことを示す。
【００２２】
４）化学的分類学的性質
本菌株の細胞壁を長谷川らの方法（Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２９，３１９−３２２、１９８３）に従い検討した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出された。また、本菌株の全細胞中の主要糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方法（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｍ．Ｐ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７１，９３４−９４４，１９６８）に従い検討した結果、特徴的な成分は検出されなかった。
【００２３】
以上の菌学的性質から、本菌株は放線菌の中でもストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属することが明らかにされた。シャーリングとゴトリーブによるISP菌株記載（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ，Ｅ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｄ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８，６８−１８９  ａｎｄ  ２７９−３９２，１９６８：１９，３９１−５１２，１９６９：２２，２６５−３９４，１９７２）、ワックスマン（Ｗａｋｓｍａｎ，Ｓ．Ａ．）著「ジ・アクチノミセーテス（Ｔｈｅ  Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）第２巻、１９６１年」、ブキャナンとギボンズ（Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｒ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｎ．Ｅ．）編「バージーズ・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版、１９７４年」、ウィリアムズ等（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．）編「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第４版、１９８９年」及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に関する最近の文献に記載されている菌種と比較したところ、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）に極めて近縁であることが判明した。しかしながら、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）とは、グリセリン・アスパラギン寒天において黄味灰色の、ペプトン・イーストエキス・鉄寒天において薄黄味茶色の可溶性色素を産生するが、ポテトエキス・人参エキス寒天および水寒天においては可溶性色素を産生しないこと、生育上限温度が４０℃であること、および食塩７％存在下で生育することにおいて差異が認められた。
【００２４】
このような菌学的特徴を有する本菌株は、明らかにストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）とは異なる新菌株であると考えられるが、これらの差異のみをもって種を区別することはできない。そこで、本発明者等は本菌株をストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６と同定した。該菌株は平成８年２月２２日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０が付された。
【００２５】
以上、ＳＡＮＫ６０１９６株について説明したが、放線菌の諸性質は一定したものではなく、自然に又は人工的に容易に変化することは周知の通りである。本発明で使用しうる菌株は、そのようなすべての変異株を包含する。すなわち、本発明は、ストレプトマイセス属に属し、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物又はＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を生産する全ての菌株を包含するものである。
【００２６】
本発明のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物又はＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産菌を培養するに際し使用される培地としては炭素源、窒素源、無機イオンおよび有機栄養源等より選択されたものを適宜含有する培地であれば合成または天然培地の何れでも使用可能である。
【００２７】
該栄養源としては、従来真菌類や放線菌類の菌株の培養に利用されている公知の、微生物が資化できる炭素源、窒素源および無機塩が使用できる。
【００２８】
具体的には、炭素源としてはグルコース、フルクトース、マルトース、シュクロース、マンニトール、グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、水飴、糖蜜、大豆油、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併用して使用できる。一般には、培地量の 1〜10重量％で変量するが、この範囲に限定されない。
【００２９】
また、窒素源としては、一般に蛋白質またはその水解物を含有する物質を用いることができる。好適な窒素源としては、例えば大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実粉、スキムミルク、カゼイン加水分解物、ファーマミン（ＳｈｅｆｉｅｌｄＣｈｅｍｉｃａｌ社製）、魚粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、生イースト、乾燥イースト、イーストエキス、マルトエキス、ジャガイモ、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用し得る。該窒素源は、単一または併用して培地量の０．２〜６重量％の範囲で用いられることが好ましい。
【００３０】
さらに栄養無機塩としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることのできる通常の塩類を使用し得る。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も使用され得る。
【００３１】
特にＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物及びＡ−５００３５９Ｊ化合物の生産にはコバルト、スキムミルクおよびイーストエキスの添加が効果的である。
【００３２】
さらに、該生産菌を培養するに際し、抗生物質生合成阻害剤を添加し、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物を生産させることもできる。Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産は、例えば、アスパラギン酸キナーゼ阻害剤であるＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインまたはその塩を培地添加剤として単独またはコバルト、スキムミルクおよびイーストエキスと併用して用いることにより達成される。該添加剤を、特にスキムミルクと併用することにより、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産性が向上する。該添加剤は、終濃度として１〜１００ｍＭの範囲で用いることができる。好ましくは終濃度として１０ｍＭで良好なＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産が可能である。
【００３３】
また、前記添加剤を種々のアミノ酸又はその塩と併用することにより、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の有用関連化合物を生産させることもできる。特にＬ−アリルグリシン又はその塩を併用することにより、Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物（ＶＩ）が得られる。Ｌ−アリルグリシンは、終濃度として１〜１００ｍＭの範囲で用いることができる。好ましくは終濃度として１０ｍＭで良好なＡ−５００３５９Ｍ−３物質の生産が可能である。
【００３４】
なお、液体培養に際しては、消泡剤としてシリコン油、植物油、界面活性剤等を使用することができる。
【００３５】
ＳＡＮＫ６０１９６株を培養してＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物及びＡ−５００３５９Ｊ化合物を生産するための培地のｐＨは、好適には５．０〜８．０である。
【００３６】
ＳＡＮＫ６０１９６株の生育温度は１２〜３６℃であるが、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物及びＡ−５００３５９Ｊ化合物を生産させるためには該菌株を１８〜２８℃で培養することが好ましく、より好適には、１９〜２３℃で培養するのが好ましい。
【００３７】
Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、ＳＡＮＫ６０１９６株を好気的に培養することにより得られるが、そのような培養法としては、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等を用いることができる。
【００３８】
小規模の培養においては、１９〜２３℃で数日間振とう培養を行うのが好適である。培養は、バッフル（水流調節壁）のついた、あるいは通常の三角フラスコ中で、１〜２段階の種の発育工程により開始する。種発育段階の培地には、炭素源および窒素源を併用できる。種フラスコは定温インキュベーター中で１９〜２３℃、５日間振とうするか、または充分に成長するまで振とうする。成長した種は、第二の種培地、または、生産培地に接種するのに用いる。中間の発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成長させ、その一部を生産培地に接種する。接種したフラスコを一定の温度で数日間振とう培養し、培養終了後フラスコ内の培養物を遠心分離またはろ過する。
【００３９】
大量培養の場合には、攪拌機、通気装置が付いたジャーファーメンターあるいはタンクで培養するのが好ましい。そのためにはまず栄養培地を１２１〜１３０℃まで加熱して滅菌し冷却しておき、ついで、該滅菌済培地に前述したような方法によって予め成長させておいた種を接種する。その後の培養は１９〜２３℃で通気攪拌して行う。この方法は、多量の化合物を得るのに適している。
【００４０】
Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の生産は、該滅菌済培地に予めろ過滅菌しておいたアスパラギン酸キナーゼ阻害剤であるＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインまたはその塩の水溶液を培養開始時点あるいは培養中に培地に添加することによっても達成される。
【００４１】
Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産は、該滅菌培地に予めろ過滅菌しておいたＳ−（2−アミノエチル）−Ｌ−システイン又はその塩及びＬ−アリルグリシン又はその塩の水溶液を、培養開始時点あるいは培養中に同時に又は別個に培地に添加することによって達成される。
【００４２】
培養の経過に伴って生産されるＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の量は、培養液の一部を採取してＨＰＬＣ分析を実施することにより測定することができる。Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生産量は、通常３〜１５日で最高値に達する。
【００４３】
培養終了後、珪藻土をろ過操作助剤として用いるろ過操作又は遠心分離によって、培養液中の菌体成分を分別し、そのろ液または上清中に存在するＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を、ＨＰＬＣ分析を指標にして、それらの物理化学的特性を利用し精製する。珪藻土としては、例えば、セライト５４５（Ｃｅｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）が好適に用いられる。ろ液中に存在するＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の精製は、吸着剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０Ｐ、ＨＰ−５０、セパビーズＳＰ２０５、ＳＰ２０６、ＳＰ２０７（三菱化学社製）等の単独使用、またはそれらの組み合わせにより達成できる。Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を含む溶液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を吸着させた後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水、アンモニア水、アンモニアを含有したメタノール水、アンモニアを含有したアセトン水などを用いて溶出させる事により、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を分離することができる。なお、溶出液として、アンモニアを含有する溶液を用いた場合には、カラムからの溶出時または濃縮の際にＡ−５００３５９Ｆアミド化合物が生成する場合がある。
【００４４】
さらに、このようにして得られたＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、更にシリカゲル、フロリジル、コスモシル（ナカライテスク社製）、ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ、ＳＰ２０７（三菱化学社製）のような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー；セファデックスＧ−１０（ファルマシア・バイオテク社製）、トヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー社製）などを用いたゲルろ過クロマトグラフィー；ダウエックス１、ＳＢＲ−Ｐ（ダウケミカル社製）、ダイヤイオンＰＡ３１６（三菱化学社製）などを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー；および順層、逆層カラムを用いたＨＰＬＣ等により精製することが出来る。
【００４５】
以上の分離、精製の手段を単独または適宜組み合わせ、場合によっては反復して用いることにより、本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物を分離精製することができる。
【００４６】
Ａ−５００３５９Ｆ化合物は、Ａ−５００３５９Ｅ化合物を加水分解しても得ることができる。たとえば塩基性条件下、好ましくは塩基性水溶液において、良好に加水分解される。
【００４７】
使用可能な塩基性化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムのようなアルカリ金属水酸化物またはその弱酸塩；水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、酢酸マグネシウムのようなアルカリ土類金属水酸化物またはその弱酸塩；アンモニアのような無機塩基性化合物または塩基性を示すその塩；ｔ−オクチルアミン、ジベンジルアミン、モルホリン、グルコサミン、フェニルグリシンアルキルエステル、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、グアニジン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ−ベンジル-フェネチルアミン、ピペラジン、テトラメチルアンモニア、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのような有機アミンまたは塩基性を示すそれらの塩があげられる。また、それらのアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニアのような無機イオン、有機アミンイオンを含有する塩基性緩衝液も使用可能である。これらの塩基性化合物のうち、アルカリ金属水酸化物、特に水酸化ナトリウムが好適である。特に水酸化ナトリウムを用いてＡ−５００３５９Ｅ化合物を加水分解する方法では、Ａ−５００３５９Ｆ化合物を容易に得ることができる。
【００４８】
上記反応に用いられる塩基性化合物の濃度は好ましくは０．００１〜１Ｎ、より好ましくは０．３〜０．１Ｎである。反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。反応時間は３０秒〜１５時間、より好ましくは３０分〜２時間である。
【００４９】
特に水酸化ナトリウムを用いた場合、その濃度は好ましくは０．００１〜１Ｎ、より好ましくは０．０１〜０．１Ｎである。反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。反応時間は、好ましくは３０秒〜２時間、より好ましくは３０分〜１時間である。
【００５０】
尚、塩基としてアンモニア水を使用する場合、Ａ−５００３５９Ｆ化合物の他にＡ−５００３５９Ｆアミド化合物も生成するが、これらは前述の方法で分離精製することができる。
【００５１】
Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物はＡ−５００３５９Ｅ化合物に溶媒中アンモニアを作用させることによって得ることができる。
【００５２】
使用される溶媒としては、水またはエタノール、メタノールのようなアルコール類であり、好適には水またはメタノールである。
【００５３】
使用されるアンモニアは、ガスとして化合物の溶液中に導入しても良いが、通常、水またはメタノール、エタノールのようなアルコール類に溶かして使用される。好適には水またはメタノール溶液が使用される。
【００５４】
アンモニア水を用いた場合、その濃度は好ましくは０．１〜１Ｎ、より好ましくは０．３〜０．７Ｎである。反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。反応時間は、好ましくは３０分〜１５時間、より好ましくは１〜４時間である。
【００５５】
尚、アンモニア水を用いた場合、目的のＡ−５００３５９Ｆアミド化合物の他に、エステルが加水分解されてＡ−５００３５９Ｆ化合物が生成するが、これらは前述の方法で分離精製することができる。
【００５６】
Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物はＡ−５００３５９Ｆ化合物に溶媒中でメチル化試薬を反応させ、該化合物のメチルエステル体すなわちＡ−５００３５９Ｅ化合物に変換したのち、前述のようにアンモニアと反応させることによっても製造することができる。
【００５７】
メチル化試薬としては、例えばジアゾメタン、ジメチル硫酸等を使用することができ、好適にはジアゾメタンである。Ａ−５００３５９Ｆ化合物をＡ−５００３５９Ｅ化合物に変換するための反応溶液中のメチル化試薬は、好ましくは１〜５当量、より好ましくは１．５〜２当量である。
【００５８】
使用される溶媒としては、例えば水又はメタノール、エタノールのようなアルコール類を挙げることができ、好適には水又はメタノールである。
【００５９】
反応温度は、好ましくは−２０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃である。
反応時間は、好ましくは３０分〜１５時間、より好ましくは１〜２時間である。
【００６０】
反応終了液からＡ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｅ化合物及びＡ−５００３５９Ｆアミド化合物を単離する手段は、前述のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の分離・精製手段の項に記載の方法により適宜選択できる。
【００６１】
以上、Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の製造法の代表的な方法を説明したが、製造方法はこれらに限定されず、既に当業者に知られているこれら以外の製造方法を用いることもできる。
【００６２】
以上のごとくして得られる本発明の化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物は、文献未掲載の新規化合物であるが、その一般グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対する生育阻止活性は普通寒天培地（栄研化学社製）やハートインフュージョンアガー培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いたディスクアッセイ法で測定される。さらに、グラム陽性細菌放線菌目マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）に対する生育阻害活性は上記培地にグリセリンを添加した培地で同様に測定される。
【００６３】
以上、化合物Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物の生物活性の代表的な評価方法を説明したが、評価方法はこれらに限定されず、既に当業者に知られているこれら以外の抗菌活性の評価方法を用いることもできる。
【００６４】
本発明のＡ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物及びＡ−５００３５９Ｍ−３化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩は、種々の形態で投与される。その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点滴剤、坐剤等による非経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００６５】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等が例示できる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００６６】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等が例示できる。
【００６７】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。
【００６８】
注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすべて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００６９】
さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。
【００７０】
上記医薬製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常全組成物中１７０重量％、好ましくは１〜３０重量％含まれる量とするのが適当である。
【００７１】
上記医薬製剤の投与方法は特に限定は無く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与される。また、注射剤の場合には単独であるいはグルコース、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、さらに必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸投与される。
【００７２】
その使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１日あたり、上限として２０００ｍｇ（好ましくは１００ｍｇ）であり、下限として０．１ｍｇ（好ましくは１ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ）を症状に応じて１回または数回に分けて投与することができる。
【００７３】
本発明のＡ−５００３５９Ｅ化合物及びＡ−５００３５９Ｆ化合物は、分子内に水酸基、カルバモイル残基、エステル基またはカルボキシル基を有するので、それらの官能基において、各種のエーテル、エステル、チオエステル、アミド等の誘導体に変換することができる。これらのうちエステル基またはカルボキシル基を各種のアミドに修飾した誘導体及び水酸基を各種のエーテル若しくはエステルに修飾した誘導体が好適である。
【００７４】
【実施例】
以下に実施例、試験例及び製剤例をあげて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７５】
実施例１．  ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する前培養培地５００ｍｌを入れた２Ｌの三角フラスコ（種フラスコ）に、ＳＡＮＫ６０１９６株を無菌的に４白金耳接種し、次いで該フラスコ４本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０回転／分（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ：以下、「ｒｐｍ」と記す。）にて振とうして、３日間の前培養を行った。
【００７６】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【００７７】
マルトース            ３０ｇ
肉エキス                ５ｇ
ポリペプトン            ５ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
炭酸カルシウム          ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２      ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整した後１２１℃にて３０分間滅菌した。
【００７８】
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、下記本培養培地１５Ｌの入った３０Ｌ容ジャーファーメンター２基に、前培養液を３％（容量／容量：以下、「ｖ/ｖ」と記す。）植菌した。２３℃で培養開始後６時間目にフィルター除菌したＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン塩酸塩を終濃度１０ｍＭとなるように添加した後、6日間通気攪拌培養を行った。
【００７９】
本培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【００８０】
マルトース            ３０ｇ
イーストエキス          ５ｇ
（Ｄｉｆｃｏ社製）
肉エキス                ５ｇ
ポリペプトン            ５ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
炭酸カルシウム          ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２      ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整した後１２５℃にて３０分間滅菌した。
【００８１】
実施例２．  Ａ−５００３５９Ｅ化合物の精製
実施例1にて得られた培養終了液（３０Ｌ）を、セライト５４５（Ｃｅｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）をろ過助剤としてろ過した。
【００８２】
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び分析条件のＨＰＬＣでモニターした。
【００８３】
カラム：Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＯＤＳ−Ｈ−２１５１
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学社製）
溶媒：４％アセトニトリルを含有する０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ/分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：２１．２分
得られたろ液３０Ｌを、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填したカラム（６Ｌ）に供与した。その後、カラムを１２Ｌの純水で洗浄した後、素通り画分と洗浄画分を合併した（以下、この合併した画分を「素通り・洗浄画分」と記す。）。吸着物質は１２Ｌの１０％アセトン水で溶出した。この溶出画分を濃縮、アセトンを留去した後、凍結乾燥し、３９ｇの粗粉末が得られた。
【００８４】
この粗粉末を２００ｍｌの純水に溶解し、ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（２Ｌ）に供与した。その後、カラムを４Ｌの純水および４Ｌの１０％メタノール水で洗浄し、吸着物質を４Ｌの１５％メタノール水、４Ｌの２０％メタノール水で溶出した。１５％メタノール水画分の２〜４Ｌ部分および２０％メタノール水画分を合併し濃縮、メタノールを留去した後、凍結乾燥し、８．９ｇの粉末が得られた。
【００８５】
この粉末を２００ｍｌの純水に溶解し、トヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー社製）を充填したカラム（１Ｌ）に供与し、カラムを純水で展開した。１００ｍｌ毎に溶出液を分画したところ、上記ＨＰＬＣにて保持時間２１．２分の活性物質はフラクション５〜１０に溶出された。この画分を濃縮後、凍結乾燥し、２．７ｇの粉末が得られた。
【００８６】
この粉末を２００ｍｌの水に溶解し４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、カラムを４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水にて流速２０８ｍｌ／分で展開した。溶出液を１Ｌ毎に分画したところ、活性物質はフラクション６および７に溶出された。
【００８７】
この画分を合併しエバポール（大川原製作所社製）で２００ｍｌに濃縮した後、凍結乾燥することにより、９９ｍｇの粉末が得られた。この粉末を５ｍｌの蒸留水に懸濁し、不溶物をろ別した。ろ液をロタリーエバポレーターで２ｍｌに濃縮し、凍結乾燥することにより、８７ｍｇのＡ−５００３５９Ｅ化合物が純品として得られた。
【００８８】
Ａ−５００３５９Ｅ化合物は下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C18H23N3O12
４）分子量：473（FAB マススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は、次に示す通りである：
実測値：474.1349
計算値：474.1359
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
251 nm (ε10,000)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]D20：+115°(c 0.28)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（KBr）錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3410, 2955, 1683, 1464, 1441, 1396, 1309, 1267, 1206, 1138, 1115, 1088, 1062, 1023 cm-1
９）1H-核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中、内部基準にテトラメチルシランを用いて測定した、1H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  3.24 (3H, s), 3.52 (1H, dd, J=4.5, 6.1Hz), 3.72 (3H, s), 3.98 (1H, m), 4.10 (1H, m), 4.25 (1H, m), 4.29 (1H, d, J=2.0Hz), 4.33 (1H, dd, J=2.0, 6.1Hz),  5.05 (1H, d, J=3.9 Hz), 5.16 (1H, d, J=6.8Hz), 5.45 (1H, d, J=4.2Hz), 5.54 (1H, d, J=5.9Hz), 5.61 (1H, d, J=3.3Hz), 5.61 (1H, d, J=8.1Hz), 5.93 (1H, dd, J=1.3, 2.9 Hz), 7.56 (1H, br. s), 7.69 (1H, br. s), 7.74 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm.
１０）13C-核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中、内部基準にテトラメチルシランを用いて測定した、13C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  52.0 (q), 57.3 (q), 61.5 (d), 64.9 (d), 72.1 (d), 75.4 (d), 78.2 (d), 81.3 (d), 89.0 (d), 99.2 (d), 101.2 (d), 114.2 (d), 139.2 (s), 139.8 (d), 150.3 (s), 161.8 (s), 163.1 (s), 170.1 (s) ppm.１１）高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下、「ＨＰＬＣ」と記する。）分析：
カラム：  センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：4%アセトニトリルを含有する0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.0 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間：21分。
【００８９】
実施例３．  Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の精製以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び分析条件のＨＰＬＣでモニターした。
【００９０】
カラム：Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＯＤＳ−Ｈ−２１５１
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学社製）
溶媒：０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．５ｍｌ/分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：  ８分（Ａ−５００３５９Ｈ化合物）
１８分（Ａ−５００３５９Ｆ化合物）。
【００９１】
実施例２で得られた素通り・洗浄画分４２ＬのｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムを用いて９に調整した後、ダイヤイオンＰＡ３１６（Ｃｌ-）（三菱化学社製）を充填したカラム（８．５Ｌ）に供与した。カラムを２７Ｌの純水で洗浄した後、吸着物を２７Ｌの０．１Ｎ塩酸で溶出した。
【００９２】
溶出液のｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムで７に調整した後、この溶出液を活性炭カラム（２Ｌ）に供与した。カラムを８Ｌの純水で洗浄した後、活性物質を１０％アセトンを含有する０．５Ｎアンモニア水８Ｌで溶出した。この溶出液を濃縮、凍結乾燥することにより、２８ｇの粉末が得られた。
【００９３】
この粉末を４００ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを３．０に調節した後、純水で調製したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（２Ｌ）に供与した。通過液および水洗液を回収し、濃縮、凍結乾燥することにより１２ｇのアメ状物質が得られた。
【００９４】
得られたアメ状物質を２００ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で３．３に調整した後、０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（１Ｌ）に再度供与した。カラムを２Ｌの０．０４％のトリフルオロ酢酸水で展開し、０．８〜１．４Ｌの間に溶出された画分（Ｈ画分）をプールした後、溶出液を２Ｌの蒸留水に切り替え溶出した。蒸留水溶出画分２Ｌ（Ｆ画分）を濃縮、凍結乾燥し、６０５ｍｇの粉末が得られた。
【００９５】
Ｈ画分６００ｍｌを蒸留水で１Ｌに希釈し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で２．８に調整した後、０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（１Ｌ）に再度供与した。カラムを２．２Ｌの０．０４％のトリフルオロ酢酸水で溶出した。２００ｍｌ毎に分画したフラクション８〜１１を濃縮、凍結乾燥し、２３３ｍｇの粉末が得られた。
【００９６】
この粉末のうち１００ｍｇを５ｍｌの水に溶解し、各１ｍｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＯＤＳ−Ｈ−５２５１：２０φ×２５０ｍｍ：センシュー科学社製）に供与し、流速１０ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間１４分〜１６分に溶出されるピークを５回分取した。得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し２３ｍｇのＡ−５００３５９Ｈ化合物が純品として得られた。
【００９７】
６０５ｍｇのＦ画分凍結乾燥粉末を１５ｍｌの水に溶解し、各１ｍｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ  ＰａｋＯＤＳ−Ｈ−５２５１：２０φ×２５０ｍｍ：センシュー科学社製) に供与し、流速１０ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間２９分〜３１分に溶出されるピークを１５回分取した。得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、１３４ｍｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【００９８】
Ａ−５００３５９Ｆ化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C17H21N3O12
４）分子量：459（FAB マススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は、次に示す通りである：
実測値：460.1201
計算値：460.1203
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
262 nm (ε7,000)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]D20：+111°(c 0.41)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（KBr）錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3391, 2941, 1684, 1466, 1400, 1333, 1269, 1205, 1137, 1115, 1062, 1020 cm-1
９）1H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、水のシグナルを4.75 ppmとして測定した、1H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  3.37 (3H, s), 3.79 (1H, dd, J=5.1, 6.4Hz), 4.17 (1H, ddd, J=1.6, 3.4, 4.6 Hz), 4.38 (1H, dd, J=3.5, 5.1 Hz), 4.48 (1H, dd, J=2.4, 6.4 Hz), 4.49 (1H, ddd, J=0.6, 2.7, 4.6 Hz), 4.69 (1H, d, J=2.4 Hz), 5.32 (1H, dd, J=0.6, 3.4 Hz), 5.77 (1H, d, J=3.5 Hz), 5.90 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.11 (1H, dd, J=1.6, 2.7 Hz), 7.75 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm.
１０）13C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した、13C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  58.6 (q), 62.7 (d), 65.5 (d), 72.7 (d), 76.3 (d), 78.8 (d), 91.2 (d), 100.0 (d), 102.7 (d), 114.8 (d), 140.7 (s), 141.9 (d), 152.1 (s), 165.4 (s), 167.0 (s), 173.9 (s) ppm.
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム：  センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.5 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間18分。
【００９９】
Ａ−５００３５９Ｈ化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C16H19N3O12
４）分子量：445
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は、次に示す通りである：
実測値：446.1025
計算値：446.1047
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
262 nm (ε7,400)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]D20：+115°(c 0.33)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム (KBr)錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3361, 2934, 1683, 1467, 1403, 1336, 1270, 1206, 1114, 1090, 1058, 1021 cm-1
９）1H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、水を4.75 ppmとして測定した1H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  4.13 (br. t, J=5.4 Hz), 4.15-4.19 (2H), 4.43 (1H, dd, J=2.5, 5.8Hz), 4.48 (1H, dd, J=2.9, 4.7 Hz), 4.72 (1H, d, J=2.5 Hz), 5.31 (1H, d, J=4.0 Hz), 5.80 (1H, d, J=4.0 Hz), 5.89 (1H, d, J=8.3 Hz), 6.12 (1H, dd, J=1.4, 2.9 Hz), 7.75 (1H, d, J=8.3 Hz) ppm
１０）13C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した13C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  62.8 (d), 65.8 (d), 70.3 (d), 74.6 (d), 77.0 (d), 84.2 (d), 90.3 (d), 100.3 (d), 102.9 (d), 113.9 (d), 141.2 (s), 141.9 (d), 152.2 (s), 165.9 (s), 167.0 (s), 174.2 (s) ppm
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム：  センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.5 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間：8分。
【０１００】
実施例４．  ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する前培養培地５００ｍｌを入れた２Ｌの三角フラスコに、ＳＡＮＫ６０１９６株を無菌的に４白金耳接種し、次いで該フラスコ３本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、３日間の第一前培養を行った。
【０１０１】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１０２】
グルコース            ２０ｇ
可溶性澱粉            １０ｇ
生イースト              ９ｇ
肉エキス                ５ｇ
ポリペプトン            ５ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
炭酸カルシウム          ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２      ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整したのち１２１℃にて２０分間滅菌した。
【０１０３】
この第一前培養液を、同一の前培養培地３０Ｌを入れた６０Ｌのタンク１基に３％接種し、２３℃で１日通気攪拌培養を行った（第二前培養）。
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、下記本培養培地４００Ｌの入った６００Ｌ容タンク２基に、第二前培養液を３％（ｖ/ｖ）接種した後、２３℃で６日間通気攪拌培養を行った。
【０１０４】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１０５】
グルコース            ２０ｇ
可溶性澱粉            １０ｇ
生イースト              ９ｇ
肉エキス                ５ｇ
ポリペプトン            ５ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
炭酸カルシウム          ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２      ５０ｍｇ
（日本油脂社製）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調整した後炭酸カルシウム３ｇを添加し、
１２５℃にて２０分間滅菌した。
【０１０６】
実施例５．  Ａ−５００３５９Ｅ化合物の精製
実施例４にて得られた培養終了液（８１０Ｌ）を、セライト５４５（Ｃｅｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）をろ過助剤として、ろ過した。
【０１０７】
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び分析条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１０８】
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ａ−３１２
６φ×１５０ｍｍ（ワイエムシィ社製）
溶媒：４％アセトニトリルを含有する０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ/分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：１９．８分。
【０１０９】
得られたろ液８００ＬをダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填したカラム（１６０Ｌ）に供与した。その後、カラムを６４０Ｌの純水で洗浄した後、素通り画分と洗浄画分を合併した（素通り・洗浄画分）。吸着物質は３４８Ｌの１０％アセトン水で溶出した。
【０１１０】
この溶出画分を１０Ｌに濃縮した後、ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（４５Ｌ）に供与した。その後、カラムを９０Ｌの純水、１００Ｌの１０％メタノール水および１００Ｌの１５％メタノール水で洗浄し、吸着物質を１００Ｌの２０％メタノール水で溶出した。
【０１１１】
２０％メタノール水画分を５Lに濃縮した後、濃縮液をトヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー社製）を充填したカラム（２２Ｌ）に供与した。カラムを純水で展開し、５Ｌ毎に溶出液を分画したところ、上記ＨＰＬＣにて保持時間１９．８分の活性物質はフラクション３〜６に溶出された。この画分を５．８Ｌに濃縮後、凍結乾燥し、５５．８ｇの粉末が得られた。
【０１１２】
この粉末を１．２Ｌの純水に溶解し、そのうち２００ｍｌを４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、カラムを４％アセトニトリルを含有する０．０４％のトリフルオロ酢酸水にて流速２００ｍｌ／分で展開した。活性物質は１０５分から１２４分の間に溶出された。この操作を６回くりかえし、得られた画分を合併しエバポールで５Ｌに濃縮した後、凍結乾燥することにより、２４．２ｇのＡ−５００３５９Ｅ化合物が純品として得られた。
【０１１３】
実施例６．Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５００３５９Ｈ化合物の精製
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１１４】
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ａ−３１２
６φ×１５０ｍｍ（ワイエムシィ社製）
溶媒：０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：  ７．７分（Ａ−５００３５９Ｈ化合物）
１６．６分（Ａ−５００３５９Ｆ化合物）。
【０１１５】
実施例５で得られた素通り・洗浄画分１３７０Ｌを、活性炭カラム（６５Ｌ）に供与した。カラムを２６０Ｌの純水で洗浄した後、活性物質を１０％アセトンを含有する０．５Ｎアンモニア水２７０Ｌで溶出した。この溶出液を４０Ｌに濃縮し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で２．４に調節した後、０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（４５Ｌ）に供与した。カラムを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で展開し、０〜４７Ｌの間に溶出された画分（Ｈ画分）、４７〜９１Ｌの間に溶出された画分（Ｆ画分）が得られた。Ｈ画分は１．５Ｌに濃縮し、Ｆ画分は濃縮の後、凍結乾燥し２８７ｇの粉末とした。
【０１１６】
Ｈ画分の濃縮液を、純水で３．２Ｌに希釈した。このうち１６０ｍｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、流速２００ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間６７分〜７２分に溶出されるピークを分取した。この操作を２０回繰り返し、得られた画分をエバポール（大川原製作所社製）で濃縮後、凍結乾燥し、５．９ｇのＡ−５００３５９Ｈ化合物が純品として得られた。
【０１１７】
Ｆ画分の粉末のうち、２７７ｇを５０Ｌの純水に溶解し、ｐＨをトリフルオロ酢酸で２．２に調整した。この溶解液を０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラム（４５Ｌ）に再度供与した。カラムを９７Ｌの０．０４％のトリフルオロ酢酸水で洗浄した後、活性物質を１２０Ｌの純水で溶出した。この純水溶出画分を濃縮、凍結乾燥し、７５．６ｇのＦ画分凍結乾燥粉末が得られた。
【０１１８】
このF画分凍結乾燥粉末を４Ｌの水に溶解し、このうち１５０ｍｌを０．５％アセトニトリル−０．０４％トリフルオロ酢酸水混液で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−１０５０−２０−ＳＲ：１００φ×５００ｍｍ：ワイエムシィ社製）に供与し、同一溶媒系を用いて流速２００ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間８８分〜９７分に溶出されるピークを分取した。この操作を２７回繰り返し、得られた画分を濃縮後、凍結乾燥し、１９．２ｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【０１１９】
実施例７．Ａ−５００３５９Ｆ化合物及びＡ−５０３５９Ｆアミド化合物の製造方法（Ａ−５００３５９Ｅ化合物のアンモニア水による化学変換）
実施例２で得られたＡ−５００３５９Ｅ化合物７５ｍｇを２ｍｌの０．５Ｎアンモニア水に溶解した。室温で２時間放置した後、反応終了液を凍結乾燥し、７８ｍｇの粉末が得られた。
【０１２０】
この粉末を１ｍｌの０．０４％ＴＦＡ水に溶解し、各１００μｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  ＵＧ  １２０Å：２０φ×２５０ｍｍ：資生堂社製）に供与し、０．０４％のトリフルオロ酢酸水を用いて流速１０ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間２１分〜２２分に溶出されるピークおよび保持時間３１分〜３３分に溶出されるピークを１０回に分けて分取した。
【０１２１】
保持時間２１分〜２２分に溶出された画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、１４ｍｇのＡ−５００３５９Ｆアミド化合物が純品として得られた。
【０１２２】
また、保持時間３１分〜３３分に溶出された画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、５０ｍｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【０１２３】
Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C17H22N4O11
４）分子量：458（FAB マススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は、次に示す通りである：
実測値：459.1328
計算値：459.1364
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
258 nm (ε7,500)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]D25：+119°(c 0.87)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム（KBr）錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3339, 2943, 1686, 1598, 1495, 1402, 1337, 1272, 1205, 1136, 1115, 1060, 1019 cm-1
９）1H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、水のシグナルを4.75 ppmとして測定した、1H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  3.30 (3H, s) 3.67 (1H, dd, J=5.0, 6.8 Hz), 4.17 (1H, ddd, J=1.8, 2.9, 4.4 Hz), 4.35 (1H, dd, J=3.2, 5.0 Hz), 4.43 (1H, dd, J=2.3, 6.8 Hz), 4.45 (1H, dd, J=2.4, 4.4 Hz), 4.66 (1H, d, J=2.3 Hz), 5.35 (1H, d, J=2.9 Hz), 5.71 (1H, d, J=3.2 Hz), 5.85 (1H, d, J=8.1 Hz), 5.97 (1H, dd, J=1.8, 2.4 Hz), 7.71 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm.
１０）13C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した、13C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  58.6 (q), 62.7 (d), 65.3 (d), 72.6 (d), 75.7 (d), 78.7 (d), 82.3 (d), 91.3 (d), 99.8 (d), 102.7 (d), 110.8 (d), 141.9 (d), 142.3 (s), 152.1 (s), 166.0 (s), 167.0 (s) ppm.
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム：  センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.04%トリフルオロ酢酸水
流速：1.5 ml/分
検出：UV 210 nm
保持時間：11分。
【０１２４】
実施例８．  Ａ−５００３５９Ｆ化合物の製造方法（Ａ−５００３５９Ｅ化合物の水酸化ナトリウムによる加水分解）
実施例２で得られたＡ−５００３５９Ｅ化合物４．４ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解した。０．５ｍｌの０．０２Ｎ水酸化ナトリウム水を滴下した後、１ｍｌの０．１Ｎ水酸化ナトリウム水を滴下し、室温にて５０分間放置した。反応液を1Ｎの塩酸で中和した後、２ｍｌの活性炭カラムに供与した。カラムを８ｍｌの蒸留水で洗浄した後、８ｍｌの１０％アセトンを含有する０．５Ｎアンモニア水で反応物質を溶出させた。
【０１２５】
この溶出液を７００μｌに濃縮した後、２３０μｌを０．０４％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＯＤＳ−Ｈ−４２５１：１０φ×２５０ｍｍ：センシュー科学社製）に供与し、流速４ｍｌ／分で展開した。活性物質の紫外部２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間２５分〜３０分に溶出されるピークを分取した。この操作を３回繰り返し、得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し、２．６ｍｇのＡ−５００３５９Ｆ化合物が純品として得られた。
【０１２６】
実施例９．  ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する組成の培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌの三角フラスコ(種フラスコ)にＳＡＮＫ６０１９６株を無菌的に１白金耳接種し、次いで該フラスコをロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、３日間の前培養を行った。
【０１２７】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１２８】
マルトース            ３０ｇ
肉エキス                ５ｇ
ポリペプトン            ５ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
炭酸カルシウム          ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２      ５０ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２１℃にて３０分間滅菌した。
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、滅菌済みの下記の組成の培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに前培養液を３％（Ｖ／Ｖ）植菌し、次いで該フラスコ１０本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、１１日間培養を行った。
【０１２９】
本培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１３０】
グルコース            ５０ｇ
肉エキス                ４ｇ
ポリペプトン            ３ｇ
スキムミルク          １０ｇ
コーンスチープリカー  １０ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
消泡剤ＣＢ４４２    ５０ｍｇ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２５℃にて３０分間滅菌した。
【０１３１】
実施例１０．Ａ−５００３５９Ｊ化合物の精製
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１３２】
カラム：ＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学(株)社製）
溶媒：０．０４％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：５．５７分。
【０１３３】
実施例９で得られた培養液を、セライト５４５をろ過助剤として５％（Ｗ／Ｖ）添加した後、ろ過した。得られたろ液（１Ｌ）を、ダイアイオンＨＰ−２０（２００ｍｌ）カラムに供与し、その後カラムを蒸留水(５００ｍｌ)で洗浄した。通過画分及び水洗画分の合併液１．５ＬのｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムを用いて９に調製した後、ダウエックスＳＢＲ−Ｐ（ＯＨ-）カラム（１００ｍｌ）に供与した。カラムを蒸留水(３００ｍｌ)で洗浄した後、吸着物を３００ｍｌの１Ｎ塩酸水で溶出した。
【０１３４】
溶出後のｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムで７に調製した後、この溶出液を活性炭カラム（５０ｍｌ）に供与した。カラムを蒸留水（１００ｍｌ）で洗浄した後、活性物質を６０％アセトン水（２００ｍｌ）で溶出した。この溶出液を濃縮、凍結乾燥することにより、５５８ｍｇの粉末が得られた。
【０１３５】
この粉末を５ｍｌの蒸留水に溶解し、各５００μｌを０．０５％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム(センシューパックＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ:２０φｘ２５０ｍｍ:センシュー科学(株)社製)に供与し、流速１０.０ｍｌ/分で展開した。活性画分の紫外部２６０ｎｍの吸収を検出し、保持時間１１．１分に溶出されるピークを１０回分取した。得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥し１６．２ｍｇのＡ−５００３５９Ｊ物質が純品として得られた。
【０１３６】
Ａ−５００３５９Ｊ化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水に可溶、メタノールに難溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C16H21N3O13
４）分子量：463（FABマススペクトル法により測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M-H]-は、次に示す通りである：
実測値：462.0996
計算値：462.1006
６）紫外吸収スペクトル：水中で測定した紫外吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
194（ε8800）、262（ε10000）nm
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]D28：+83°（c 0.1、H2O）
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム (KBr)錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3372, 2931, 1684, 1467, 1407, 1273, 1204, 1107, 1058 cm-1
９）1H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1,4-ジオキサン(3.53ppm)を用いて測定した1H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  3.75 (１H, t, J=3.4 Hz), 3.83 (1H, ddd, J=1.4, 1.9, 3.4 Hz), 4.02 (1H, ddd, J=1.4, 1.7, 3.4Hz), 4.05 (1H, dd, J=5.3, 5.6 Hz), 4.11 (1H, t, J=5.6 Hz), 4.13 (1H, dd, J=3.1, 5.6 Hz), 4.30 (1H, d, J=5.3 Hz), 4.33 (1H, d, J=1.7 Hz), 4.90 (1H, d, J=1.9 Hz), 5.50 (1H, d, J=3.1 Hz), 5.7 (1H,d, J=8.2 Hz), 7.6 (1H, d, J=8.2 Hz) ppm
１０）13C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した13C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  64.4 (d), 68.8 (d), 68.9 (d), 69.7 (d), 71.4 (d), 73.0 (d), 75.4 (d), 82.8 (d), 90.7 (d), 99.2 (d), 101.7 (d), 141.6 (d), 151.0 (s), 165.9 (s), 171.9 (s), 172.6 (s) ppm
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム：  センシューパックODS-H-2151、
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：0.05%トリフルオロ酢酸水
流速：1.0 ml/分
検出：UV 260 nm
保持時間：5.57分。
【０１３７】
実施例１１．ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＳＡＮＫ６０１９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２０）株の培養
以下に記載する組成の培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌの三角フラスコ(種フラスコ)にＳＡＮＫ６０１９６株を無金的に１白金耳接種し、次いで該フラスコ４本分をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうして、３日間の前培養を行った。
【０１３８】
前培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１３９】
マルトース            ３０ｇ
肉エキス                ５ｇ
ポリペプトン            ５ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
炭酸カルシウム          ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２      ５０ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２１℃にて３０分間滅菌した。
【０１４０】
本培養は以下に記載するようにして行った。すなわち、滅菌済みの下記の組成の培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに前培養液を３％（Ｖ／Ｖ）  植菌し、次いで該フラスコ１０本をロータリー振とう機中で２３℃、２１０ｒｐｍにて振とうし培養をした。培養開始後６時間目にフィルター除菌したＳ-(２-アミノエチル)-Ｌ-システイン塩酸塩およびＬ-アリルグリシンを終濃度１０ｍＭとなるように添加した後、引き続き７日間培養を行った。
【０１４１】
本培養培地：下記の成分を水道水１０００ｍｌ中に含む。
【０１４２】
マルトース            ３０ｇ
イーストエキス          ５ｇ
（Ｄｉｆｃｏ社製）
肉エキス                ５ｇ
ポリペプトン            ５ｇ
塩化ナトリウム          ５ｇ
炭酸カルシウム          ３ｇ
消泡剤ＣＢ４４２    ５０ｍｇ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ｐＨを７．４に調製した後１２５℃にて３０分間滅菌した。
【０１４３】
実施例１２．  Ａ-５００３５９Ｍ−３物質の精製
実施例１１にて得られた培養終了液(１Ｌ)を、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清より精製した。
【０１４４】
以降の精製においては、活性画分を下記のカラム及び条件のＨＰＬＣでモニターした。
【０１４５】
カラム：ＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ
６φ×１５０ｍｍ（センシュー科学(株)社製）
溶媒：７．２％アセトニトリル-０．０５％トリフルオロ酢酸水
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：１０．１分。
【０１４６】
上清(１Ｌ)のｐＨをトリフルオロ酢酸を用いて３に調整後、０．０５％トリフルオロ酢酸水で平衡化したダイヤイオンＨＰ−２０カラム（２００ｍｌ）に供与した。その後、カラムを０．０５％のトリフルオロ酢酸水（５００ｍｌ）で洗浄し、蒸留水(５００ｍｌ)で溶出した。得られた蒸留水溶出画分(５００ｍｌ)を濃縮、凍結乾燥し２３０ｍｇの粗粉末が得られた。
【０１４７】
この粗粉末を２ｍｌの蒸留水に溶解し、そのうち５００μｌを７％アセトニトリルを含有する０．０５％のトリフルオロ酢酸水で平衡化したＨＰＬＣカラム(ＰｅｇａｓｉｌＯＤＳ:２０φｘ２５０ｍｍ:センシュー科学(株)社製)に供与した。
【０１４８】
カラムを同一溶媒で流速１０．０ｍｌ/分で展開し、２６０ｎｍの紫外部吸収でモニターしたところ、活性物質は２８．０分に溶出された。この操作を４回繰り返し得られた溶出液を合併し濃縮した後凍結乾燥することにより、１１．１ｍｇのＡ−５００３５９Ｍ−３物質が純品として得られた。
【０１４９】
Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物は、下記の物理化学的性状を有する。
１）物質の性状：白色粉末状物質
２）溶解性：水、メタノールに可溶、ノルマルヘキサン、クロロホルムに不溶
３）分子式：C22H28N4O13
４）分子量：556 （FABマススペクトルにより測定）
５）高分解能FABマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は、次に示す通りである：
実測値：557.1754
計算値：557.1731
６）紫外部吸収スペクトル：水中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：
236 nm (ε10,000)
７）旋光度：水中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
[α]D26：+92°(c 0.1, H2O)
８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム (KBr)錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す：
3407, 2938, 1684, 1524, 1465, 1399, 1385, 1335, 1268, 1205, 1139, 1118, 1095， 1063, 1021 cm-1
９）1H-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1,4-ジオキサンを用いて測定した1H-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  2.44 (1H, ddd, J=4.3, 7.3, 13.3 Hz), 2.52 (1H, ddd, J=4.3, 7.5, 13.3 Hz), 3.27 (3H, s), 3.66 (1H, t, J=5.5 Hz), 4.17 (1H, ddd, J=1.1, 2.5, 3.1 Hz), 4.32 (1H, dd, J=3.7, 5.5 Hz), 4.33 (1H, t, J=4.3 Hz), 4.45 (1H, m), 4.46 (1H, m), 4.73 (1H overlapped with HDO) , 5.07 (1H, d, J=10.2 Hz) , 5.36 (1H, d, J=3.1 Hz) , 5.51 (1H, d, J=17.1 Hz) , 5.58 (1H, d, J=8.1 Hz) , 5.73 (1H, m) , 5.74 (1H, d, J=3.7 Hz) , 5.95 (1H, dd, J=1.1, 1.9 Hz) , 7.72 (1H, d, J=8.1 Hz) ppm
１０）13C-核磁気共鳴スペクトル：重水中、内部基準に1, 4-ジオキサン (67.4 ppm) を用いて測定した13C-核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである：  37.1 (t), 55.4 (d), 58.6 (q), 62.6 (d), 65.3 (d), 72.6 (d), 75.7 (d), 78.9 (d), 82.4(d), 90.6(d), 99.8(d), 102.6(d), 109.9(d), 119.0(t), 134.0(d), 1414.7(d), 142.2 (s), 152.0 (s), 162.3 (s), 166.8 (s), 173.6 (s), 177.6 (s) ppm
１１）ＨＰＬＣ分析：
カラム：  Pegasil ODS
6φ×150 mm（センシュー科学社製）
溶媒：7.2%アセトニトリル-0.05%トリフルオロ酢酸水
流速：1.0 ml/分
検出：UV 260 nm
保持時間：10.1分。
【０１５０】
試験例１．  抗菌活性の測定
直径８ｍｍのペーパーディスクを用い、ディスク１枚当たり被検検体４０μｇを含むいわゆるディスクアッセイ（東京大学農学部農芸化学教室編「実験農芸化学  第３版、下巻」：朝倉書店、１９７８年）を行った。マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＳＡＮＫ７５０７５に対してＡ−５００３５９Ｅ化合物は直径１２ｍｍ、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物は直径１２ｍｍ、Ａ−５００３５９Ｍ−３化合物も直径１２ｍｍの阻止円を示した。
【０１５１】
製剤例１．
Ａ−５００３５９Ｅ化合物、Ａ−５００３５９Ｆ化合物、Ａ−５００３５９Ｆアミド化合物、Ａ−５００３５９Ｈ化合物、Ａ−５００３５９Ｊ化合物又はＡ−５００３５９Ｍ−３化合物１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇ、トウモロコシ澱粉１４８．８ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム１．２ｍｇ（全量３５０ｍｇ）の各粉末を混合し、６０メッシュのふるいに通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明の化合物及びその薬学的に許容される塩は、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む各種細菌に対して優れた抗菌力を示すので、それらの細菌に起因する感染症の予防薬または治療薬として有用である。また、本発明の化合物は、各種細菌感染症の予防薬または治療薬を目指した、有機化学的変換および微生物学的変換を用いた誘導体合成における原料化合物としても有用である。