(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平行な照明光路（３）が、該光路上に配置されたビームスプリッタ（６）の前に位置し、かつ、互いに平行な光線入射面および光線放射面を有する透明光学素子（４）が、前記ビームスプリッタ（６）の前に配置された前記照明光路（３）の領域内に配置される、デジタル画像生成を有する顕微鏡のフォーカス制御装置であって、
前記透明光学素子（４）は、前記光線入射面の中心垂線が前記照明光（１）の光軸と平行となるように配置され、
前記透明光学素子（４）が回転自在に装着され、回転時に前記光線入射面の中心垂線が前記照明光（１）の光軸と角度α°をなし、
前記透明光学素子（４）の回転軸（５）は、回転時に放射された光線が、試料に対して主走査方向に変位されるように位置付けられ、
中央制御評価ユニットが、前記透明光学素子（４）を制御し、記録画像を処理し、該処理結果をフォーカス制御に用いる、
ことを特徴とする顕微鏡のフォーカス制御装置。
【請求項２】
前記透明光学素子（４）は、平坦プレート、サイコロ、直方体または円筒形の形状であり、モータ、またはステッピングモータによって回転可能であること特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡のフォーカス制御装置。
【請求項３】
デジタル画像生成のために、前記ビームスプリッタ（６）後方の光路内にレーザ走査装置が配置されることを特徴とする、請求項１または２に記載の顕微鏡のフォーカス制御装置。
【請求項４】
デジタル画像生成のために、前記ビームスプリッタ（６）後方の前記光路内にＣＣＤマトリクス（１６）が受像器として配置されることを特徴とする、請求項１または２に記載の顕微鏡のフォーカス制御装置。
【請求項５】
平行な照明光路（３）が、該光路上に配置されたビームスプリッタ（６）の前に位置し、かつ、前記照明光路（３）の領域内で互いに平行な光線入射面および光線放射面を有する透明光学素子（４）を有する、デジタル画像生成が可能な顕微鏡のフォーカス制御方法であって、
フォーカス制御に必要な画像を検出器によって検出し記録するものであり、
対象となる第１の画像を、透明光学素子（４）が＋α°回転したときに記録すること、
対象となる第２の画像を、透明光学素子（４）が−α°回転したときに記録すること、
前記２つの画像を、照度と輝度の差分に関して補正すること、
および、前記第１、第２の画像を画素毎に変位させて前記画像間の相関関係が最大限に一致するときの画像の変位Δｓを算出し、この時の前記変位Δｓの値を用いて焦点面からの偏差値Δｚを決定することを特徴とする顕微鏡のフォーカス制御方法。
【請求項６】
対象となる第３の画像を、透明光学素子（４）が＋α°回転したときに記録し、
前記第１および第３の画像の平均値を算出し、
前記第１および第３の画像の平均値と、前記第２の画像を画素毎に変位させて前記画像間の相関関係を算出することを特徴とする、
請求項５に記載の顕微鏡のフォーカス制御方法。
【請求項７】
前記角度αの絶対値は、対象となる瞳孔における照明光（１）の光軸を瞳孔径の約半分変位できる約２０°であることを特徴とする、請求項５または６に記載の顕微鏡のフォーカス制御方法。
【請求項８】
前記照度と輝度の差分に関する補正は、
前記２つの画像において、画像境界右側と左側におけるそれぞれ約１０〜１５画素の領域について照度差をシェーディング修正することにより境界右側と左側の照度差を補正し、
前記補正された２つの画像において、最小輝度および最大輝度を算出し、該算出結果を用いて前記画像を規格化することにより輝度差を補正し、
前記画像間の相関関係は、
一方の画像と他方の画像との位置関係を左右方向に１画素ごとにシフトさせ、該シフトさせた各変位Δｓごとに一方の画像から他方の画像を減算し、差分を二乗した値に基づいて、前記画像間の相関が最大限に一致する変位Δｓを算出することを特徴とする、請求項５〜７のうちの１に記載の顕微鏡のフォーカス制御方法。
【請求項９】
前記画像の照度の差分を補正する前に、
縦の画素ごとに平均値を算出し、該平均値を用いて前記照度と輝度の差分に関する補正を行うことを特徴とする、請求項５〜８のうちの１に記載の顕微鏡のフォーカス制御方法。
【請求項１０】
照度補正および規格化された前記画像間の相関関係を算出する際に、画像をシフトさせる範囲を各方向で１０画素とすることを特徴とする、請求項５〜９のうちの１に記載の顕微鏡のフォーカス制御方法。
【請求項１１】
前記画像間の相関が最大限に一致するかどうかを算出するため変位Δｓごとに算出した差分の二乗値を用いて算出された値を複数用い、該値間を補間法により補間して、前記画像間の相関が最大限に一致する変位Δｓを１画素よりも小さな単位で算出することを特徴とする、請求項５〜１０のうちの１に記載の顕微鏡のフォーカス制御方法。
【請求項１２】
前記透明光学素子（４）の回転時に放出される光線の移動方向が、試料の主走査方向に対して角度βであるとき、
主走査方向（ｘ軸方向）と、該方向に対して直交する方向（ｙ軸方向）の２つの方向についてそれぞれ前記画像間の相関関係を算出し、各方向ごとに画像間の相関関係が最大限一致する変位Δｓを算出し、該算出された２つの変位Δｓをピタゴラスの定理を用いて角度β方向における変位ΔｓＲｅｓを算出し、該変位ΔｓＲｅｓより最適な焦点面からの偏差値Δｚを決定すること、
を特徴とする、請求項５〜１１のうちの１に記載の顕微鏡のフォーカス制御方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、デジタル画像式顕微鏡、それも特に共焦点顕微鏡における焦準操作の制御および追跡を可能にする装置および方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
公知技術レベルのものに関しては、顕微鏡における最適焦平面の決定および追跡方法として様々な解決策が知られている。
最適な焦平面測定方法では、目的物から反射した光線の評価装置が装備されている。最適な集束位置は、反射光線が最高強度のときに達成される。国際公開第００／０８４１５号によれば、そのため様々な焦平面を有する多数の光点が生成される。また英国特許第２３２１５１７号に記載されている共焦点顕微鏡用装置でも、最適な集束位置を検出するために、目的物で反射した光線の評価手段が装備されている。この解決策の欠点は、実際の最適焦平面を求めるのに、やはり多大な時間を要することにある。それには一連の測定が必要である。というのは、最適集束位置に相当する値の決定は近似的にしか行ない得ないからである。
【０００３】
そのほか、技術の現況では、検査には使用されないスペクトル領域からの光をオートフォーカス目的に利用する解決策も公知になっている。その一例がＩＲオートフォーカスシステムである。ＩＲオートフォーカスシステム用に主光学系の利用を前提とする解決策には、この場合次の著しい欠点がある。即ち、場合によってはＤＵＶ（長波長紫外線）領域からＩＲ領域までの極めて広いスペクトル領域に亘って主光学系が利用可能でなければならないという条件が付くからである。ドイツ国特許第１９９ ３１ ９４９に記述されているような、それに適した対物レンズは、高い技術製作費を使って初めて実現可能である。
【０００４】
ドイツ国特許第１９９ １９ ８０４には、オートフォーカスシステムが、別の光学系を利用し、主光学系は利用しないという解決策が記載されている。この解決策はフォーカス制御のために２次レーザ光源の使用を前提としている。フォーカス制御用に付加的手段を装備することによって、装置全体が著しく嵩高に複雑になる。しかも最適焦平面が既知でなければならないことが不利に作用する。というのはオートフォーカスシステムは、ただその時々の光線状態を理想的光線誘導に対し比較するだけだからである。
【０００５】
またＷＯ９９／０３０１１で記載されている解決策の場合でも、フォーカス制御に必要な追加の光学素子により技術コストが著しく高くなる。ここでのフォーカス制御は、デフォーカシングの際に様々な光学面での多重反射によって発生した光線ずれに基づき行われる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現状技術レベルで公知である技術解決策は次の欠点を有している。即ち、必要な付加光源が結果として技術的配置を複雑化しており、多数の測定を必要とし、および／またはフォーカス制御の殆どが反射性目的物の場合にしか可能でない。
【０００７】
それ故、本発明の課題は、即ち、デジタル画像式顕微鏡、それも特に共焦点顕微鏡に使用するフォーカス制御のための方法とその実施に適した装置を開発すること、但し顕微鏡の構造が著しく複雑にならず、しかも焦平面の制御に、できる限り既存の照明装置および画像評価装置が使用できるようにすることである。その場合フォーカス制御は、検査対象の目的物の特性（透明、反射性または蛍光性）如何に関わらず適用できなければならない。さらに通常の作業過程間での焦平面の制御が、装置構造の変更なく極めて迅速に簡易にできなければならない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によればこの課題は、フォーカス制御のための装置および方法の適用により解決される。即ち、平行な照明光線の領域内で、かつ設置された主要ビームスプリッタの前に、適当な大きさの回転可能な平坦プレートを、その回転軸が試料との関係で言えば、回転と共に主走査方向または主画像方向にて光線束シフトが起きるように配置する。フォーカス制御に必要な画像は、高倍率ズームおよび１エアリより大きな口径を持つピンホールのもとで記録する。第１画像は、平坦プレートが角度＋αだけ傾斜したときに、第２画像は、その角度が−αだけ傾斜したときに記録する。両画像を光線移動の方向に画素単位でシフトすることによって画像内容の相関性を確認検査する。最適相関関係におけるシフト幅△ｓが、そのときのフォーカシングまたはデフォーカシングの尺度となる。シフト△ｓが０でない場合は、△ｓに比例した距離だけ焦点外れがある。
【０００９】
上記提案のフォーカス制御法およびそれの実施用装置は、デジタル画像形成のための方法および装置の適用が可能な顕微鏡であれば、いずれに対しても僅かな調整操作を加えるだけで適用することができる。共焦点顕微鏡では、デフォーカシングへの適用は約５〜８×λ／ＮＡ２の深度領域に限定される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
次に２つの実施例に基づき本発明を説明する。
図１に描かれた共焦点レーザ走査顕微鏡用フォーカス制御装置の場合、照明光源として使用されるレーザから出た照明光１は、コリメータ２、ダイクロイック分配器として構成されている主要ビームスプリッタ６、走査ユニット７、走査対物レンズ８、鏡胴レンズ１０および対物レンズ１１を経て試料１２上に到達する。試料１２によって反射した光線は、対物レンズ１１、鏡胴レンズ１０、走査対物レンズ８、走査ユニット７、主要ビームスプリッタ６、ピンホール対物レンズ１３およびピンホール１４を経て検出器１５上に到達する。
公知である共焦点顕微鏡の前記配置に加えて、平行な照明光路３の領域内で、かつビームスプリッタ６の前に、互いに平行な光線入射口面と光線放射口面とを持つ透明光学素子４を、光線入射面の中心垂線と照明光１の光軸とが平行な位置関係になるように、配置する。この位置は以下では基本位置と称す。透明光学素子４は、例えば平坦プレートまたは稜長１０ｍｍのサイコロの形態をしており、中央制御モータ、好ましくはステップモータにより回転可能である。回転時には、光線入射面の中心垂線と照明光１の光軸とが角度αを形成する。透明光学素子４の回転軸５は、試料１２との関係で言えば、好ましくも（ｙ軸方向で）角度αの回転時に、走査ユニット７の主走査方向（ｘ軸）にて光線のシフトが生じるような位置関係になっている。それによって光線はポジション９ａからポジション９ｂへシフトする。中央制御、評価ユニット（図示されていない）は、透明光学素子４の制御、記録画像の加工、全出力データの捕捉ならびに結果の計算、評価を担っている。
【００１１】
本発明に基づく共焦点レーザ走査顕微鏡用のフォーカス制御法の場合、切取画像には目的物の検査対象データが含まれている。個々の操作ステップは図２を用いて説明する。この方法には約１６の横列と５１２の縦列を持つ切取画像で充分である。これについては図２ａ）参照。フォーカス制御に必要な画像は、高倍率ズームおよび約４〜５エアリー（エアリーディスク中心部の４〜５倍）に開口されたピンホール１４のもとで記録する。高倍率ズームとは、５１２×１６画素という選択した切取画像に含まれる目的物の小領域を結像させることを意味している。レーザ走査顕微鏡の場合、これは走査ユニット７の走査角度を縮小することによって、つまり中間画像平面の画像長さが約１ｍｍなるように縮小することによって実現される。通常の画像加工過程では、透明光学素子４はその基本位置に留まり回転しない。即ち、光線入射面の中心垂線は照明光１の光軸と平行な位置関係にある。
【００１２】
フォーカス制御には透明光学素子４を回転させるが、それによって光線入射面の中心垂線と照明光１の光軸とは角度αを形成する。第１画像は透明光学素子４の回転角度α１＝約＋２０°、第２画像はその回転角度α２＝約−２０°のときに記録する。他の影響要因を排除するために、透明光学素子４の回転角度α１＝約＋２０°のときには加えて第３画像も記録する。画像記録条件としてα１＝−α２が成立する。中央制御、評価ユニットにより、第１、第３画像から求めた縦列当りの平均値を第２画像と共に光線移動方向に画素単位でシフトさせて画像内容の相関関係を算出する。
【００１３】
図２のステップｂ）では、比較対象である両切取画像のデータ量が縦列の平均値化により削減される（５１２×１６画素から５１２×１画素へ）。続いてのステップｃ）では、画像の左右両端間の照度差を約１０〜１５画素クラス用低域フィルタの使用のもとでシェーディング修正することにより数学的に補正する。これは、両画像の強度関数勾配を算出および補正することにより行う。
ここで、Ａを勾配、ｎ＝１を第１画像と第３画像の平均値、ｎ＝２を第２画像、ｂｎを第ｎ画像における左端の照度の値、ａｎを第ｎ画像における右端の照度の値とした場合、勾配Ａを以下の計算式によって算出する。
Ａ ＝（ｂｎ−ａｎ）／ｂｎ または Ａ ＝（ａｎ−ｂｎ）／ａｎ
計算は比較対象の両画像について行う。画像内容を比較して勾配が同結果になれば、照度差は補正されている。
次に、これら修正画像において輝度の最小値および最大値を求めて画像を規格化（正規化）する。それにはステップｄ）に基づき、各画像毎に全画素の値を合計する（Σ１およびΣ２）。次に、第１画像の各画素に係数（２５６＊５１２／Σ１）を、第２画像の各画素に係数（２５６＊５１２／Σ２）を掛け合わせる。尚、数字２５６は規格化係数であり、５１２は画像の画素数である。この作業ステップで、現にある輝度差が補正される。照度修正および規格化のなされたこれら２つの画像の内容を比較して差分を算出し、差分を２乗し、２乗した値の総和を求める。
この総和を求める計算を、２つの画像を縦列の並びの方向（ｘ軸方向）へ画素単位でシフトさせながら行い、その総和が最小になるシフト位置を見つけ出す。
【００１４】
図２のステップｅ）では、シフトが約０画素のときにこれが最小になる。総和算出の経過から、最大限一致する位置は補間法により１画素よりも小さな単位まで正確に求めることができる。比較対象画像における画素単位の差引計算は、Δｓのシフトに対して各方向とも最大１０画素までの範囲とする。シフトΔｓの大きさは、所定の機器構造の場合、使用対物レンズ、試料（反射性または透過性）に依存するほか、それ程でもないが波長や機器の調整状態にも依存する。調整状態を除くすべてのファクタは構造的に固定していて、高品質顕微鏡では調整後の応答により求めることが可能であるし、あるいは検度によって決定することもできる。従って、両画像のシフトΔｓの測定値は最適焦点面からの偏差値Δｚに比例しており、算出できる。
【００１５】
図４に例示されているように、両画像シフト幅Δｓ＝０の場合、フォーカシング状態は最適である。それに対し両画像シフト幅Δｓが０でない場合は、Δｓに比例した幅だけ焦点ずれがある。図３および図５はそれぞれシフト幅Δｓ＝−３画素、＋３画素の例を示したものである。操作迅速化のため、比較対象画像の画像内容で照度差および輝度差を補正する前に縦列毎に平均値を出しておくのが有利である。そのようにすれば、後続の作業ステップでは５１２×１画素の大きさを持つ切取画像の加工だけでよいことになる。それによって、顕微鏡フォーカス制御法の精度が損なわれることはない。
【００１６】
さらに、本発明に基づくフォーカス制御法は、透明光学素子４が回転したときに、光線が主走査方向に対して角度βの傾斜角でポジション９ａからポジション９ｂへシフトする場合にも適用できる。その場合も同様に画素単位のシフトによって光線移動方向での画像内容の相関関係を算出するが、主走査方向（ｘ軸）と画像面においては、それとは垂直な方向（ｙ軸）とに分けて行う。画素毎に行うそれぞれのシフトΔｓに対する画素単位の差引計算でもある照度差および輝度差の補正も、同様にｘ軸方向、ｙ軸方向とを別々に行う。角度β方向に現われるシフトΔｓＲｅｓは、両方向で測定したシフトΔｓの結果にピタゴラスの定理を適用して求める。
【００１７】
総和から補間法により１画素以下の単位まで正確に算出可能なシフトΔｓの値より、最適焦点面からの偏差値Δｚを得られた出力値の考慮下で決定する。図６に描かれたＣＣＤマトリックス１６付き顕微鏡のフォーカス制御装置の場合は、照明光１は、レンズ１８、開口絞り１９、照明面遮光具１７、コリメータ２、強度またはスペクトルに依存する部分透光性ビームスプリッタ６、対物レンズ１１を通って試料１２に達する。試料１２で反射した光線は、対物レンズ１１、ビームスプリッタ６、鏡胴レンズ１０および特に好ましい例では装備されているズームシステム２０を経由してＣＣＤマトリックス１６に到達する。この場合照明源としては光線またはレーザ光線が使用できる。
公知である前記配置に加えて、平行な照明光路３の領域内で、かつビームスプリッタ６の前の位置に、光線入射面の中心垂線と照明光１の光軸とが平行になるように、透明光学素子４を配置する。透明光学素子４は、照明光１の方向に１０〜２５ｍｍの厚みを持つ直方体または円筒形のもので、中央制御モータ、好ましくはステップモータを通じて回転可能である。その回転により、光線入射面の中心垂線と照明光１の光軸とが角度αを形成する。透明光学素子４の回転軸５は、試料１２との関係で言えば、好ましくも回転と共に光線が主走査画像方向にてシフト（９ａから９ｂへ）するような構成になっている。従って、回転軸５はｙ方向についてはＣＣＤマトリックス１６を参照基準として配位されている。このような配置から光線はポジション９ａから９ｂへシフトする。中央制御、評価ユニット（図にはない）は、透明光学素子４の制御、記録画像の加工、全出力データの捕捉および結果の計算、評価を担っている。
【００１８】
フォーカス制御法に用いる、約１６の横列、５１２の縦列を持つ切取画像には目的物の検査対象データが含まれている。必要画像部分は高倍率ズームで記録する。高倍率ズームとは、５１２×１６画素という選択した切取画像に含まれる目的物の小領域を結像させることを意味している。ＣＣＤマトリックス付き顕微鏡の場合、これは光学ズームによって実現される。鏡胴レンズ１０の焦点距離を十分に大きく取れば、ズームシステム２０は省くことができる。
【００１９】
通常の画像加工過程では、透明光学素子４は回転しない。即ち、光線入射面の中心垂線は照明光１の光軸と平行な位置関係にある。フォーカス制御には透明光学素子４を回転させるが、それによって光線入射面の中心垂線と照明光１の光軸とは角度αを形成する。第１画像は透明光学素子４の回転角度α１＝約＋２０°、第２画像はその回転角度α２＝約−２０°のときに記録する。第３の影響要因を排除するために、透明光学素子４の回転角度α１＝約＋２０°のときには加えて第３画像も記録する。画像記録条件としてα１＝−α２が成立する。
【００２０】
中央制御、評価ユニットにより、第１、第３画像から求めた縦列当りの平均値を、第２画像と共に光線移動方向に画素単位でシフトさせることで画像内容の相関関係を算出する。このように、図１の説明に従って求めた両画像のシフト幅Δｓは最適焦点面からの偏差値Δｚに比例しており、同じように算出できる。
本発明に基づく装置によれば、フォーカス制御が非常に迅速に簡便に行え、通常の作業過程間においても実施できる。しかも照明装置または評価装置を変更する必要もない。特に３画像を対象に評価することにより、予備的に行う確認調整フォーカス制御も大した手間もかけずに何時でも実施可能である。
方法の感度は、検査対象である試料構造の配向性に依存し、主走査方向に直交する配位構造の場合が最大で、点状構造の場合でも非常に良く、主走査方向と同じ配位構造の場合が最小となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による装置を有する共焦点レーザ走査顕微鏡の概略構造図
【図２】本発明による操作ステップの概略図
【図３】シフト幅−３画素の場合の比較対象画像の画像内容
【図４】シフト幅０画素の場合の比較対象画像の画像内容
【図５】誤差総和の経過が併記された、シフト幅＋３画素の場合の比較対象画像の画像内容
【図６】ＣＣＤ（電荷結合素子）マトリックスおよび本発明による装置を有する顕微鏡の概略構造図
【符号の説明】
１    照明光
２    コリメータ
３    照明光路
４    透明光学素子
５    回転軸
６    主要ビームスプリッタ
７    走査ユニット
８    走査対物レンズ
９ａ,９ｂ    ポジション
１０    鏡胴レンズ
１１    対物レンズ
１２    試料
１３    ピンホール対物レンズ
１４    ピンホール
１５    検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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