(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬製造溶液中のインフルエンザ抗原である血球凝集素から菌体内毒素を解離させる効果を有するデオキシコール酸ナトリウムで前記溶液を処理し、そして前記血球凝集素を保持するが、解離された細菌菌体内毒素は通過させることができるのに有効な孔サイズを有する分子量分離フィルタにより前記溶液を濾過することを含む、インフルエンザ抗原である血球凝集素を含む医薬品製造溶液からの細菌菌体内毒素除去方法。
【請求項２】
前記デオキシコール酸ナトリウムが、その臨界ミセル濃度と少なくとも同じ濃度で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記デオキシコール酸ナトリウムが、その臨界ミセル濃度の１．５から５倍の濃度で存在する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記デオキシコール酸ナトリウムが、その臨界ミセル濃度の２倍と４倍との間の濃度で存在する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分子量分離フィルターが、再生酢酸セルロース膜もしくはポリスルフォン膜を含む請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記細菌菌体内毒素の除去の後、前記医薬製造溶液は前記デオキシコール酸ナトリウムが除去されるさらなる工程に供される請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記さらなる工程が、前記医薬製造溶液を透析に供することを含むものである請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、例えばワクチン組成物といった医薬組成物から細菌菌体内毒素の除去方法に関するものである。
【０００１】
菌体内毒素は、細菌、特にグラム陰性菌の細胞壁から典型的に誘導されるリポ多糖類である。菌体内毒素を伴う不純物は、医薬工業、特に、非無菌製造工程における一般的な問題である。
【０００２】
例えばウィルスワクチンといったワクチンは、適当なウィルス基質にウィルスを接種し、ウィルスが複製するように基質を培養し、そして基質からウィルスを得ることにより製造することができる。そして、ウィルスは好適な不活性剤を用いて不活性化され、さらにウィルス液が調製され、そしてワクチンを得るために精製される。
【０００３】
ワクチン、特にインフルエンザワクチンのようなウィルスワクチンを製造する方法の一つにおいては、卵がウィルスの基質として用いられる。例えば、卵は種ウィルスにより接種され、ウィルスが複製されるように培養され、そしてウィルスを含む尿膜腔液が卵から採取される。そして、ウィルスを粉砕しそして要求されるウィルス抗原を放出するために、尿膜腔液はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）のような洗浄剤で溶解され得る精製されたウィルス画分を得るための一連の精製工程に供される。ウィルス抗原は、さらに精製され、そして必要であれば、多効果のワクチン組成物を得るため他の抗原と混合されてもよい。ワクチンの調製は、一般的には無菌室で行われ、チオマーサル（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）のような防腐剤は、細菌の増殖を最小限にするか、もしくは防止する工程の間における種々の工程で添加される。
【０００４】
卵がウィルスの基質として用いられた場合は、接種の前に、生物学的負担を減少させるための洗浄工程が行われても、洗浄工程は完全に微生物を取り除くことを保障するものではない。さらには、卵が病原菌に汚染されている可能性があり、また細菌を含む可能性もある。結果として、卵におけるウィルスの成長期間中に、不純物である多くの細菌は増殖するであろう。細菌は防腐剤により殺菌されたとしても、菌体内毒素を有する細菌の細胞壁が残る。洗浄剤によるウィルス粒子の破壊の間、細菌の細胞壁も最終的なワクチン組成物内で共に精製される菌体内毒素を放出することになる破壊がなされる。高いレベルの細菌性の菌体内毒素がワクチン内で検出された場合、現在の慣行では、菌体内毒素を取り除くことを試みるよりむしろ汚染されたワクチンとして処理される。結果的に、菌体内毒素による汚染により、ワクチンの製造の間、重大で高価な廃棄物となる。
【０００５】
菌体内毒素の不純物は、インフルエンザワクチンの製造において、特有の問題が示される。インフルエンザワクチンの主たる構成要素は、より少ない量のノイラミニターゼ表面抗原（ＮＡ）と共にある、血球凝集素（ヘムアグルチニン（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ））表面抗原である。ＨＡおよびＮＡの両者は、抗原の両タイプを含む、単独のもしくは混合されたロゼットとしてのいずれかの特徴的なロゼット構造を形成することができる。この挙動は、膜を移動する疎水性の柄が、安定な疎水性の微細環境を得るために自己結合される場合の膜タンパクにおける典型である。
【０００６】
ノイラミニダーゼ抗原は四量体の形状で存在する傾向にあるが、血球凝集素は、一般的に三量体を形成して存在する。一度形成されると、ロゼットはとても安定であり、そして例えば洗浄剤で容易に破壊されない（Ｓｉａｎ  Ｒｅｎｆｒｅｙ  ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄ  １９９４）。
【０００７】
細胞菌体内毒素は、親水性の多糖類の長鎖と、疎水性の脂肪酸含有尾部を有するリポ多糖類である。したがって、これらは両親媒性の構造を有する。水性の環境においては、凝集体を形成する傾向にある。
【０００８】
インフルエンザの表面抗原および菌体内毒素は、それぞれを分離することは困難であり、例えばＨＡといったインフルエンザ表面抗原および菌体内毒素の両者は両親媒性構造を有し、水性の条件下では強力に結合されるようになるためであると考えられている。菌体内毒素はＨＡ／ＮＡロゼット内に含まれていることも明らかである。
【０００９】
ワクチン組成物から菌体内毒素を除去するいかなる方法も、多くの基準を満たさなければならない。第１に、その方法は製造される抗原の過剰な損失を招いてはならない。第２に、比較的高い濃度の菌体内毒素を除去できることが必要である（例えば、２００ＥＵ／ｍｌより少なく、例えば１００ＥＵ／ｍｌより少なくなるように菌体内毒素のレベルを減少させることができる必要がある。）。その方法は、製造物内に潜在的に毒性を有する化学物質を導入してはならず、さらに用いられるいかなる化合物も抗原に悪影響を与えてはならない。このようないかなる方法も、製造条件下で行う際に好適にスケールアップができることも必要である。小さいスケールでのみ行われ、効率よくスケールアップができない方法は、工業上の面においては有用でない。最後に、菌体内毒素の除去の方法は、現存する方法や製造装置を用いて実行できるものである必要がある。
【００１０】
ワクチンから菌体内毒素を除去するための数多くの試みがなされたが、これまで概して失敗に終わっている。
【００１１】
ショ糖密度勾配遠心分離は、それら特定の分子密度を基礎とした物質間の分離による技術であり、物質間に相互作用がないものと仮定している。この技術は、インフルエンザ抗原溶液から菌体内毒素を除去する問題に対するこの用途に適用された。菌体内毒素の３０％がショ糖密度勾配上の血球凝集素から分離して溶出したにもかかわらず、残りの７０％は表面抗原に結合して残存した。ショ糖密度勾配への洗浄剤の添加は、比較的小さい範囲における血球凝集素からの菌体内毒素の分解能を改良しただけであった。
【００１２】
トリエチルアミンは、菌体内毒素の疎水性を増加させることにより菌体内毒素と相互作用し、そしてこれによりトリメチルアミンは、形成されていると予想されているＨＡ／ＮＡ／菌体内毒素錯体の分離を導くと仮定されたことが報告されている。したがって、トリメチルアミンはショ糖密度勾配に添加された。しかしながら、これは血球凝集素からの菌体内毒素の分解能を改良することには成功しなかった。
【００１３】
活性化木炭、ガラス、陰イオン交換媒体（ＤＥＡＥ）およびポリエステル上への菌体内毒素の非特異的な吸着も試みられたが、このような試みも失敗であった。
【００１４】
多くのアフィニティー・クロマトグラフィー媒体は、医薬品からの菌体内毒素の除去を目的として商品化されている。独占的な解毒媒体”Ａｃｔｉｃｌｅａｎ  Ｅｔｏｘ”，”Ｐｒｏｓｅｐ−Ｒｅｍｔｏｘ”および”ＣＵＮＯ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＺＡ”が、試みられ、一様でない程度での成功を得た。例えば、”Ａｃｔｉｃｌｅａｎ  Ｅｔｏｘ“は、小さなスケールの実験においては、血球凝集素から菌体内毒素の９９％の分離に成功した。しかしながら、小さなスケールでの分離は、十分に再現することができず、そしてその方法は、大きなスケールにおいて十分に働かないものであった。”Ｐｒｏｓｅｐ−Ｒｅｍｔｏｘ”は、菌体内毒素もしくは血球凝集素のいずれをも吸着せず、また”ＣＵＮＯ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＺＡ”は１００％の菌体内毒素と。１００％の血球凝集素を吸着した。
【００１５】
したがって、医薬組成物、そして特にワクチン組成物から菌体内毒素を除去する方法に対して緊急の必要性が存在する。
【００１６】
本発明の目的は、工業的なスケールにおいて効果的であり、毒性のもしくは問題の有りそうな化学的な副産物を医薬製造物の中に残さず、従来の製造設備を利用でき、そして特にワクチンの場合に、過度の損失や抗原の変性とならない菌体内毒素の除去方法を提供することである。
【００１７】
ＨＡおよびＮＡといったインフルエンザ表面抗原および菌体内毒素は、洗浄剤を添加し、そして、濾過により濾液と共に菌体内毒素が通過すると同時に、抗原がフィルター残渣に残るような孔の大きさを有する分子量分離（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ（ＭＷＣＯ））フィルターを用い、得られる混合物を濾過することにより分離することができることが見出された。この技術は、他の医薬製造物、特にポリペプチド鎖を含むかもしくは両親媒性構造を有する医薬およびワクチンにも適用され得ることが予想される。
【００１８】
したがって、本発明は、医薬製造用溶液から細菌菌体内毒素を除去する方法であって、上記溶液中のワクチン物質もしくは医薬品から上記菌体内毒素を解離させることに有効な界面活性剤で溶液を処理し、そして医薬品もしくはワクチン物質を保持するが、解離された菌体内毒素は通過することができることに有効な孔の大きさを有する分子量分離フィルターにより上記溶液を濾別する方法を提供する。
【００１９】
ここで用いられる「医薬製造溶液」の語は、いかなる医薬品物質を含む、もしくはワクチンの抗原を含む溶液であって、最終産物までの、および最終産物を含む医薬製造工程の一部として製造される溶液を示すものである。医薬製造溶液は、例えば、微生物粒子（例えば、ウィルス粒子）もしくは細胞から細胞廃棄物もしくは望まれない物質が除去された部分的に精製されたワクチン抗原の溶液であってもよい。
【００２０】
医薬品物質としては、その製造工程中で菌体内毒素汚染に対して感受性のある、もしくは潜在的に感受性のあるいかなる医薬品もしくはワクチン物質であってもよい。例えば、物質は、ペプチドホルモン、もしくは血液製剤のような治療的なポリペプチド産物もしくはワクチン物質であってもよい。特に、治療的ペプチド産物は、組換えペプチド産物であってもよい。ここで用いられる用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、例えば糖タンパクのように単糖類のような他の成分と連結もしくは結合したペプチドを含む物質と共に、ペプチド単独からなる物質も含むものである。
【００２１】
その物質は、例えば錯体を形成して菌体内毒素と結合するものが典型例であろう。両親媒性構造を有し、結果的に菌体内毒素と錯体を形成する非ペプチド医薬品は、本発明の方法対して有効に用いることができる。
【００２２】
界面活性剤は、陽イオン性、非イオン性、両性イオン性、両性、もしくは陰イオン性界面活性剤であり、抗原の特性、特にＭＷＣＯフィルター上に保持される能力に悪影響を与えずに、抗原から菌体内毒素を解離させる効果を提供する。しかしながら、イオン性の界面活性剤、特に陰イオン性の界面活性剤が好ましい。
【００２３】
特に界面活性剤が、ステロイド様の構造を有する陰イオン性の界面活性剤、特に胆汁酸塩類に相当する、もしくは類似の界面活性剤である。したがって、例えば、界面活性剤がデオキシコール酸塩、コール酸塩（ｃｈｏｌａｔｅ）、グリココール酸塩（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ）、タウロデオキシコール酸塩、もしくはタウロコール酸塩の好適な塩を例として挙げることができる。デオキシコール酸塩の塩類（ＤＯＣ）が現在より好ましい。
【００２４】
陰イオン界面活性剤の他の例としては、アルキル−ベンゼンスルホン酸塩およびドデシルスルホン酸塩のような長鎖のアルキルおよびアルキルアリールスルホン酸塩を含む。
【００２５】
界面活性剤の濃度は、抗原もしくはそのＭＷＣＯ膜上に保持される能力に悪影響を有さずに、抗原から菌体内毒素を解離するのに有効なものであろう。界面活性剤の濃度は、好ましくは、少なくともその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と同等であり、より好ましくは、その臨界ミセル濃度より濃度が高いことである。現在最も好ましい界面活性剤の用いられる濃度としては、臨界ミセル濃度の１．５〜５倍、より好ましくは２〜４倍である。
【００２６】
界面活性剤は、例えば透析技術により産物から容易に取り除くことができるものが最も好ましい。
【００２７】
分子量分離（ＭＷＣＯ）濾過膜は、要求される産物抗原の膜上において保持されることができ、菌体内毒素および界面活性剤が膜を通過することができる分子量分離性を有する点で選択される。
【００２８】
例えば、インフルエンザ抗原に対しては、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ膜を採用することができる。これは、分子量約２３０ｋＤを有する３量体を形成して典型的に存在する血球凝集素抗原の多くを保持するであろう。
【００２９】
菌体内毒素が、界面活性剤と共にミセルもしくは凝集体を形成することができ、そのような状況下で界面活性剤は、菌体内毒素と形成されたいかなるミセルの全分子量が濾過膜の分子量分離性より低くなるようにする必要がある。
【００３０】
その膜は、例えば再生酢酸セルロース膜、もしくはポリスルフォン膜であってもよい。本発明の方法において好ましく、もしくは用いられる膜の特定の例としては、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ酢酸セルロースミリポア膜である。
【００３１】
本発明の方法は、インフルエンザウィルス表面抗原から細菌菌体内毒素を分離するために有用であることが見出されたが、この方法は、菌体内毒素汚染が問題となる他のポリペプチド物質および他の医薬物質と同様に、他のウィルス、細菌、原生動物、および寄生性のワクチン抗原、特に他の血球凝集素抗原の用途も見出されることが予想される。
【００３２】
本発明の方法は、限定されるものではないが、以下の実施例を参照することにより説明される。
【００３３】
図１は、インフルエンザワクチンの製造に含まれる工程の代表的な順序を概略示す。例えば、まず鶏卵は外側の不純物を除去するために洗浄され、活性のある種ウィルスが接種され、そして卵内でウィルスの成長と増殖が行えるように培養される。ウィルスの培養工程の終わりに、卵は冷却され、ウィルスを含む尿膜腔液が卵から採取される。
【００３４】
採取の後、防腐剤（チオマーサル（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）であってもよい。）が添加される。得られた防腐処理がされた溶液は、その後、溶液の清澄化のため遠心分離され、ウィルス成分を濃縮させるため限外濾過に供される。
【００３５】
濃縮の後、溶液はゾーン遠心分離による全ウィルスの精製の前に、例えばβ−プロピオラクトンといったウィルス不活性化剤で処理される。
【００３６】
そして、精製されたウィルス画分は、ウィルス粒子を破壊するためにトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｎ１０１といった洗浄剤で処理され、そして得られる混合物は、インフルエンザ表面抗原からより密度の高いウィルス核物質を分離するためにゾーン遠心分離に供される。
【００３７】
リン酸緩衝液を添加した後、表面抗原が、単一株の抗原溶液を得るためにゾーン遠心分離により洗浄剤から分離される。分離産物工程からの溶液のバッチは、多効果ワクチンを得るために他のウィルス株からモノブレンドプール（ｍｏｎｏｂｌｅｎｄ  ｐｏｏｌｓ）で混合する前に、限外濾過によりさらに濃縮および精製されることができる「モノブレンドプール（Ｍｏｎｏｂｌｅｎｄ  Ｐｏｏｌ）（ＭＢＰ）」を得るために集められる。
【００３８】
上述した工程の間、菌体内毒素のレベルは通常いくつかのポイントで測定され、得られるポイントにおけるレベルが既定の限界を超える場合、本発明前の状況における手順では、バッチは廃棄される。
【００３９】
しかしながら、菌体内毒素と精製された表面抗原との間のいかなる結合をも破壊する適当な洗浄剤での処理に単一価ブレンドプール（Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｂｌｅｎｄ  Ｐｏｏｌ（ＭＢＰ））を供し、そして菌体内毒素は通過させるが、精製された表面抗原は保持されるのに十分なグレードの分子量分離フィルターにより得られる混合物を濾過することにより、菌体内毒素が除去されることが見出された。そして、実質的に菌体内毒素の無い精製された表面抗原は、フィルターの残渣から回収される。以下の実験は、陰イオン性洗浄剤デオキシコール酸ナトリウムでの処理、およびその後の１００ｋＤ分離フィルターを用いたＭＷＣＯ濾過での菌体内毒素のレベルについての効果を説明するものである。
【００４０】
実施例１
小スケールでの研究
１００ｋＤ  ＭＷＣＯフィルタによる菌体内毒素の除去における、２％ｗ／ｖ（５０ｍＭ）および０．２％ｗ／ｖ（５ｍＭ）濃度のデオキシコール酸ナトリウムの効果について、小スケールでの研究が、約１０，０００ＥＵ／ｍｌの抗原を含む試料Ａ／テキサス／３６／９１バッチ５３１  ＭＢＰで行われた。上述した方法にしたがって調製された抗原試料は、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１％のチオマーサル（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）を含むｐＨ７．２の食塩加リン酸緩衝液１０ｍＭ内で表面抗原を精製した血球凝集素およびノイラミニダーゼから実質的になるものである。
【００４１】
デオキシコール酸（ＤＯＣ）は、そのｐＫａ値より低いｐＨ値のゲルを形成する傾向を有する。ゲルの形成を防止するために、抗原試料のｐＨは、最初、洗浄剤の添加前にはｐＨ８もしくはそれより大きいｐＨ値に調整された。例えば、２％ｗ／ｖ（０．１４Ｍ）のリン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が、リン酸二ナトリウムが完全に溶解することを確認することに注意が払われながら、３７℃に暖められたＭＢＰに添加された。ＭＢＰのｐＨは、これにより、約ｐＨ７．４からｐＨ８．１に上昇した。得られた溶液中のナトリウムイオンの濃度は、約０．３Ｍであった。
【００４２】
デオキシコール酸ナトリウムは、最終的なＤＯＣ濃度が０．２％ｗ／ｖ（５ｍＭ）および２％ｗ／ｖ（５０ｍＭ）であるテスト溶液を得るために、ＭＢＰ溶液に添加された。そして、テスト溶液は３７℃で約１時間培養された。培養の後、各混合物は図２に示すようなミリポアミニタントランスバースフロウ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｎｉｔａｎ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｆｌｏｗ）濾過装置を用いて、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ膜により濾過された。
【００４３】
ＤＯＣ処理ＭＢＰ試料の濾過および濃縮の後、残渣および濾液はそれらの最初の容量となったので、ＨＡおよび菌体内毒素の濃度は、直接比較することができた。
【００４４】
濾液および残渣中の血球凝集素の濃度は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＺＡ）によりおよび放射状免疫拡散法により決定された。菌体内毒素のレベルは、自動ＬＡＬアッセイ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｋ−ＱＣＬ  ＬＡＬ  Ａｓｓａｙ）を用いて決定された。ＤＯＣでの処理前後のテスト試料の電子顕微鏡写真は、インフルエンザ表面抗原のロゼットクラスタにおけるＤＯＣの影響を決定するため、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ３００  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて撮影された。ＨＡ  ＥＬＩＳＡおよびＳＲＤアッセイの結果は、下記の表１および２にまとめられている。
【００４５】
小スケールにおける結果
表１
残渣と濾液中の％ＨＡにおけるＤＯＣ処理（５ｍＭおよび５０ｍＭ）の効果を示す結果のまとめ（０ｍＭ  ＤＯＣをコントロールとして使用）
【００４６】
【表１】
0004426720.tif 000002
ａ：ＤＯＣ５０ｍＭのスタート試料が得られていないので、５０ｍＭ  ＤＯＣの残渣および濾液試料における％ＨＡおよび％ＬＰＳを計算するための除数として０ｍＭ  ＤＯＣのスタート試料が用いられた。
ｂ：濃度因子は、希釈後の抗原の濃度と関連する濾過および濃縮工程の後の溶液中の抗原の濃度を示すものである。
ｃ：ＮＤ：行っていない。
【００４７】
ＨＡおよびＬＰＳレベル（％）は以下のようにして測定された。
【００４８】
【数１】
0004426720.tif 000003
表２
ＳＲＤによる測定された０．２％（５ｍＭ）ＤＯＣの有無におけるダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）前後の実際のＭＢＡ、ＨＡレベルの比較
【００４９】
【表２】
0004426720.tif 000004
ＨＡアッセイの結果は、一般的にＨＡは、ＤＯＣの存在下でほとんど大きな程度では膜を通過することはないことを示す。一つの実験例（実験例４）において、テスト溶液（５ｍＭ  ＤＯＣ）の濾液におけるＨＡのレベルは、他の実験例におけるものと比較してむしろより高かった。これは、１００ｋＤのＭＷＣＯ膜を通過することが可能な分子量（７７ｋＤ）である、モノマー形状のＨＡが大きな比率で含有されたＨＡの特別なバッチのためであろう。
【００５０】
菌体内毒素レベルの決定
菌体内毒素のレベルは、上述したように、ＤＯＣを用いた処理およびダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および透析の前後でアッセイされた。結果は、図３および図４に示す。
【００５１】
図３に示すように、結果は、ダイアフィルトレーション単独では、ＭＢＰから菌体内毒素を除去されないであろうことを示した。ＤＯＣが添加され（図４）、溶液が濾過された場合、残渣（混合産品）における菌体内毒素のレベルは、処理前のレベルと比較して実質的に減少している。濾液（廃棄物）中の菌体内毒素のレベルは、それに応じて増加した。ＤＯＣ（５ｍＭおよび５０ｍＭ）の両濃度は、ＭＢＰからの菌体内毒素の除去において効果的であった。
【００５２】
実施例２
パイロットスケールでの実験
実施例１に記載された小スケールの実験は、ｐＨ８．１５を得るために２％ｗ／ｖのリン酸二ナトリウムで４．３２Ｌインフルエンザ  Ａ／テキサスバッチ＃５３１  ＭＢＰのバッチを処理し、０．２％ｗ／ｖのＤＯＣを添加し、そして１００ｋＤ  ＭＷＣＯ低結合（Ｌｏｗ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）再生酢酸セルロース膜（ミリポア）により濾過することにより、スケールアップされた。コントロールとして、インフルエンザＡ／テキサスバッチ＃５３１  ＭＢＰは、ＤＯＣによる処理はなされないが、同じ膜により濾過された。ダイアフィルトレーションの後、そして菌体内毒素のレベルの測定の前に、溶液の各々は、スタート溶液の容量（４．３Ｌ）に調整された。
【００５３】
図５は、スタートの溶液、残渣、および濾液における菌体内毒素の結果の分布を示すものである。図５に示す結果は、小さいスケールでの実験と同様に、９０％を超える菌体内毒素が、デオキシコール酸塩の存在下におけるダイアフィルトレーションにより除去できることを示した。
【００５４】
血液凝集素の濃度は、上記実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡおよびＳＤＲにより決定された。
【００５５】
４．３２Ｌの菌体内毒素で汚染されたＭＢＰのＤＯＣ処理前および処理後のＨＡレベルは、実験誤差の限界の範囲内であり、実質的に同一であることが見出された。例えば、ＤＯＣによる処理前のＨＡレベルは、６８．２５μｇ／ｍｌであり、ＤＯＣ処理後のに検出されたＨＡのレベルは、６８．７５μｇ／ｍｌであった。これらの結果、ＤＯＣ処理は、ＨＡエピトープに影響しないことを示す。
【００５６】
実施例３
ＨＰＬＣを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
菌体内毒素で汚染されたモノブレンドプール（ＭＢＰ）は、（ａ）ＤＯＣがＨＡロゼットの大きさに影響を与えるか否か、（ｂ）ＨＡおよび菌体内毒素が同じ画分に溶出し、それによりそれらが連結している可能性があることを示されるか否か、を決定するために５０ｍＭ  ＤＯＣの有り無しで、ｐＨ８、１０ｍＭのＰＢＳで溶出するＳＥＣカラム（Ｇ４３０００  ＳＷＸＬ）に通された。
【００５７】
例えば、１０回保持（ｔｅｎ−ｈｏｌｄ）で濃縮されたＡ／テキサス＃５３１ＭＢＰは、ＤＯＣの存在が、ＨＡの分子径に影響するか否かを決定し、ＨＡはより凝集された形状において、分離した分子として存在するか否かを確認するために、０％および０．２％（５０ｍＭ）のＤＯＣと共に、ＳＥＣにより調査された。得られた画分は、ＨＡおよび菌体内毒素について分析され、そして２８０ｎｍのタンパク吸光度溶出プロファイルと比較された（図６および７参照）。ＤＯＣは、８００ｎｍと２００ｎｍとの間の光の吸収が見られなかったので、０および５０ｍＭのＤＯＣと共に、Ａ／テキサスＭＢＰの吸光パターンは直接比較された。ＨＡ−ＥＬＩＳＡの結果は、ＤＯＣが０％および０．２％存在下の両方において、約３０００ｋＤでの２８０ｎｍプロテインピークと一致するＨＡピークが見られる。ＨＡロゼッタがＤＯＣの有無でも同じ位置で溶出することを示すこれらの結果は、ＨＡ分子が５０ｍＭのＤＯＣ処理によって破壊されない凝集されたロゼッタを採用していることが示された。
【００５８】
ＤＯＣが存在しない場合に菌体内毒素がＨＡと共に溶出したことは、菌体内毒素がおそらくＨＡロゼッタと結合していることを示す（図６）。
【００５９】
ＬＡＬテストにおける菌体内毒素の測定は、ＤＯＣの存在により阻害されるので、５０ｍＭのＤＯＣを含む試料でのＳＥＣ画分の菌体内毒素プロファイルからはいかなる結論も導くことはできない（図７）。
【００６０】
図７において、９０分に出現する第２のピークは、洗浄剤ミセルによる光の回折によるものとして説明することができる。このようなミセルは、低いレベルのタンパク（例えば、２８０ｎｍプロファイル）を含みことができ、また菌体内毒素を含むことができる。
【００６１】
ＥＭ写真は、ＤＯＣ処理の前および後で約３４ｎｍの平均径のロゼッタを示し、これはＨＡロゼッタは２％ＤＯＣにより破壊されないことも示すものである（図８ａおよび８ｂ）。
【００６２】
上記実施例に示される結果は、ＭＢＰがＤＯＣの不存在下でダイアフィルタされた場合は、菌体内毒素は１００ｋＤのＭＷＣＯ膜を通過せず、そしてＨＡロゼッタと共に残渣に残ることを示した（図５）。ＨＡと同時に菌体内毒素が溶出したことを示した、０％のＤＯＣと共に行ったゲル濾過クロマトグラフィー分画の分析（図６）の分析は、それらが物理的に連結されていることを示した。５から５０ｍＭのＤＯＣを添加することは、菌体内毒素が１００ｋＤのＭＷＣＯ膜を自由に通過し濾液内に入ることを可能とし、これによりＨＡから分離される（図３、４および５、および表１）。またＨＡは、ＭＷＣＯ膜をそれほど多くの程度通過することはない。いかなる論理にも束縛されることを望むことがなければ、菌体内毒素とＤＯＣとの親和性は、菌体内毒素がＨＡよりむしろＤＯＣと結合するように、ＨＡロゼッタの菌体内毒素との親和性より大きいとすることができた。菌体内毒素の分子は、混合された菌体内毒素／ＤＯＣミセルの形状で、１００ｋＤのＭＷＣＯ膜を通過することができる。このようなミセルは、フィルター膜を通過するためには、１００ｋＤより小さい分子量を有する必要があるであろう。
【００６３】
得られた結果は、ＨＡ−ＥＬＩＳＡによれば事実上ＨＡが濾液中で測定されなかったことから、Ａ／テキサス＃５３１、Ａ／テキサス＃５７０およびＢ／パナマ＃８７から誘導されたＭＢＰ  ＨＡは、５ｍＭもしくは５０ｍＭ  ＤＯＣと共に、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ膜を重大な程度には通過しないことを説明している（表１）。これは、ＨＡロゼットもしくはタンパク三量体が１００ｋＤより小さい分子までには解離されないことを示している。個々のＨＡ三量体の分子量は２３０ｋＤであると予想され、理論的にはそれらは１００ｋＤのＭＷＣＯ膜を通過しない。ＨＡ三量体が、ＤＯＣの存在下において、モノマー成分である７７ｋＤまで減少することは生じない。
【００６４】
（ａ）最終産物中において好ましくない点、（ｂ）ＤＯＣが試料中に存在すると汚染されたＭＢＰから菌体内毒素の分離を測定することができない点で、ＤＯＣの分離は重要な工程である。一つの実験例において、ＤＯＣは３０ｋＤ  ＭＷＣＯを透過するダイアフィルトレーションにより、当初約０．５％のＤＯＣを含む残渣試料から０．００２％より少なくなるまで除去することに成功した。
【００６５】
したがって、上述した結果は、抗原溶液のデオキシコール酸ナトリウムでの処理の後、分子量分離フィルター膜により濾過することにより、大きなスケールとすることができなかった前の概念にもかかわらず、ワクチンの調製から菌体内毒素を分離する効果的な手段を提供することができることを論証したものである。
【００６６】
上述した実施例は本発明を説明するものであるが、本発明の範囲に関していかなる場合も制限する意図はない。例えば、ＤＯＣと同様な特性を有する他の洗浄剤が本発明の方法に有用であることは予想され、またその方法が、インフルエンザ抗原より他の抗原から、また菌体内毒素の汚染が潜在的に問題である他の医薬品産物（例えば、他のポリペプチド）から、菌体内毒素の除去を行う際に有用であることが見出せることも予想される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ワクチンの製造に含まれる主たる工程の概略を示すものである。
【図２】  図２は、本発明の方法に用いられるＭＷＣＯダイアフィルトレーション装置を概略示すものである。
【図３】  図３は、界面活性剤の処理が無い場合の抗原溶液において保持された菌体内毒素の量（パーセントによる）を示す棒グラフである。
【図４】  図４は、ＭＷＣＯ膜による濾過後の抗原溶液において保持された菌体内毒素の量（パーセントによる）におけるデオキシコール酸ナトリウムの効果を示す棒グラフである。
【図５】  図５は、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ膜による濾過前後の０．２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）で前処理されたもしくは前処理されないインフルエンザＡ／テキサス＃５３１のパイロットスケールバッチにおける菌体内毒素のレベルを示すものである。
【図６】
【図７】  図６および図７は、それぞれ、０％および２％ｗ／ｖ（５０ｍＭ）ＤＯＣで処理された抗原調合品のゲル濾過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から収集された画分のＨＡ、および菌体内毒素およびＡ２８０測定を示すものである。
【図８】  図８ａおよび８ｂは、２％ｗ／ｖ（ｍＭ）デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）による処理前後のインフルエンザＡ／テキサス＃５３１モノブレンドプール（ｍｏｎｏｂｌｅｎｄ  ｐｏｏｌ）（ＭＢＰ）の電子顕微鏡写真を示し、その後１００ｋＤ  ＭＷＣＯ膜によりダイアフィルトレーションされ、そしてＤＯＣを除去するため１０ｋＤのＭＷＣＯ膜を用いたＰＢＳに対する透析がなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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