(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸及び/又はその塩からなる緩衝剤を含む緩衝液中にヒト型化抗PTHrP抗体が溶解して、ｐＨが5〜8の溶液の形態にある、ヒト型化抗PTHrP抗体の安定化製剤。
【請求項２】
製剤中の緩衝剤の総濃度が0.1〜100 mmol/Lである請求項１記載の製剤。
【請求項３】
製剤中の緩衝剤の総濃度が5〜50 mmol/Lである請求項１記載の製剤。
【請求項４】
酢酸及び/又はその塩からなる緩衝剤を含む緩衝液中にヒト型化抗PTHrP抗体が溶解して、ｐＨが5〜8の溶液の形態にある、安定化されたヒト型化抗PTHrP抗体溶液組成物。
【請求項５】
ヒト型化抗PTHrP抗体溶液組成物がバルク用の溶液組成物である請求項４記載のヒト型化抗PTHrP抗体溶液組成物。
【請求項６】
緩衝剤及び等張化剤以外に、実質的に他の安定化剤を含まない請求項５記載のヒト型化抗PTHrP抗体溶液組成物。
【請求項７】
酢酸及び/又はその塩からなる緩衝剤を含む緩衝液中にヒト型化抗PTHrP抗体が溶解してなる注射製剤。
【請求項８】
ｐＨが5〜8の溶液の形態にある請求項７記載の注射製剤。
【請求項９】
上記緩衝剤の総濃度が0.1〜100 mmol/Lである請求項７記載の注射製剤。
【請求項１０】
上記緩衝剤の総濃度が5〜50 mmol/Lである請求項７記載の注射製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体の安定化製剤及び注射製剤に関する。
背景技術
副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「ＰＴＨｒＰ」という。）は、高カルシウム血症の主原因物質の腫瘍が産生する蛋白で、骨吸収・腎尿細管でのカルシウム再吸収を促進することにより腫瘍産生性の高カルシウム血症（Ｈｕｍｏｒａｌ  ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ、以下「ＨＨＭ」という。）を惹起する。現在、ＨＨＭの治療には、骨吸収抑制作用を有するカルシトニンやビスホスホネート製剤が用いられているが、ＨＨＭの進行は速く、末期癌患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を著しく悪化させていることから、原因に則したより効果的な治療薬の開発が求められている。
副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体（以下「抗ＰＴＨｒＰ抗体」と言う。）は、ＨＨＭに対して投与後すぐに効果が現れるため、効果発現までに日にちを必要とするビスホスホネート製剤に比べても優れている。さらに、末期癌患者に見られる悪液質の治療薬剤としても有用である（特開平１１−８００２５号）。
発明の開示
抗ＰＴＨｒＰ抗体を疾病の治療薬として利用するにあたっては、抗ＰＴＨｒＰ抗体の生物活性を長期間保持できる安定な製剤として提供する必要がある。従って、本発明は、抗ＰＴＨｒＰ抗体の安定化製剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、抗ＰＴＨｒＰ抗体溶液を調製し、抗ＰＴＨｒＰ抗体の物理化学的性質に及ぼす水素イオン濃度（ｐＨ）および緩衝液濃度の影響について確認を行い、抗ＰＴＨｒＰ抗体の安定化製剤を製造することに成功した。
すなわち、本発明は、酢酸、クエン酸、リン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の緩衝剤を含む緩衝液中に抗ＰＴＨｒＰ抗体が溶解して、ｐＨが５〜８の溶液の形態にある、抗ＰＴＨｒＰ抗体の安定化製剤を提供する。
また、本発明は、酢酸、クエン酸、リン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の緩衝剤を含む緩衝液中に抗ＰＴＨｒＰ抗体が溶解して、ｐＨが５〜８の溶液の形態にある、安定化された抗ＰＴＨｒＰ抗体溶液組成物を提供する。
詳しくは、抗体溶液組成物がバルク用の溶液組成物である上記の抗体溶液組成物を提供する。
さらに詳しくは、緩衝剤及び等張化剤以外に、実質的に他の安定化剤を含まない上記の抗体溶液組成物を提供する。
本明細書において、「緩衝液」とは、緩衝作用（すなわち、ｐＨの変化をゆるめる作用）のある溶液をいう。「緩衝剤」とは、緩衝作用をもつ物質をいう。
製剤あるいは組成物中の緩衝剤の総濃度は、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであるとよい。
製剤には、さらに、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤を、本質的にヒトの血液とおなじ浸透圧になるように添加してもよい。一般的には約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧が好ましい。
抗ＰＴＨｒＰ抗体はモノクローナル抗体であるとよく、この抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体またはキメラ抗体であることが好ましい。
さらに、本発明者らは、抗ＰＴＨｒＰ抗体溶液を含む注射製剤を調製し、緩衝液の種類によって投与時の疼痛作用が異なることを確認し、抗ＰＴＨｒＰ抗体を含み、疼痛の少ない注射製剤を製造することに成功した。
すなわち、本発明は、酢酸及び／又はその塩からなる緩衝剤を含む緩衝液中に抗ＰＴＨｒＰ抗体が溶解してなる注射製剤を提供する。
詳しくは、ｐＨが５〜８の溶液の形態にある上記注射製剤を提供する。
さらに詳しくは、緩衝剤の総濃度が０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである上記注射製剤を提供する。
抗ＰＴＨｒＰ抗体はモノクローナル抗体であるとよく、この抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体またはキメラ抗体であることが好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．抗ＰＴＨｒＰ抗体
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体は、所望の薬理効果を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問うものではない。
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。この抗体はＰＴＨｒＰと結合することにより、ＰＴＨｒＰがＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体に結合するのを阻害してＰＴＨｒＰのシグナル伝達を遮断し、ＰＴＨｒＰの生物学的活性を阻害する抗体である。
このような抗体としては、ハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１により産生される＃２３−５７−１３７−１抗体が挙げられる。
なお、ハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１は、ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＃２３−５７−１３７−１として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日付で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３１としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
２．抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＨｒＰを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＰＴＨｒＰを、Ｓｕｖａ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３７，８９３に開示されたＰＴＨｒＰ遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ＰＴＨｒＰをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＰＴＨｒＰタンパク質を公知の方法で精製する。
次に、この精製ＰＴＨｒＰタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＰＴＨｒＰのＮ末端の３４個のペプチドについて、化学合成により作製することもでき、これを感作抗原として使用することもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＨｒＰに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＰＴＨｒＰへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＰＴＨｒＰを投与して抗ＰＴＨｒＰ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＨｒＰに対するヒト抗体を取得してもよい（国際公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
３．組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗ＰＴＨｒＰ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＰＴＨｒＰ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認する。
目的とする抗ＰＴＨｒＰ抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
４．改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、以下の方法を用いて製造することができる。
本発明に有用なキメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により増幅する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化抗体を得ることができる（ＥＰ  ２３９４００号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の薬剤の有効成分として有用である。
本発明に使用できるヒト型化抗体としてはヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体が挙げられる。ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体は、マウス由来の＃２３−５７−１３７−１抗体の相補性決定領域を、Ｌ鎖についてはヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（ＧＥＮ−ＢＡＮＫ，Ｄｅｆｔｏｓ  Ｍら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，１９９４）由来の３つのＦＲ断片（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３）並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ）由来のＦＲ断片（ＦＲ４）に連結したものであり、Ｈ鎖についてはヒト抗体Ｓ３１６７９（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ  ＡＭら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，１９９３）のフレームワーク領域と連結し、抗原結合活性を有するようにフレームワーク領域のアミノ酸残基を一部置換したものである。
なお、ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体のＬ鎖またはＨ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日付で、Ｈ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２９として、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３０として、ブダペスト条約に基づきそれぞれ国際寄託されている。
５．抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、ＰＴＨｒＰに結合し、ＰＴＨｒＰの活性を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＰＴＨｒＰ抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
６．組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ  ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ  ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ  ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
７．抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
８．抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＢＩＡＣＯＲＥ法（表面プラズモン共鳴を利用する分析法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、ＰＴＨｒＰ（１−３４）をコーティングしたプレートに、抗ＰＴＨｒＰ抗体を含む試料、例えば、抗ＰＴＨｒＰ抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
本発明で使用される抗体の活性を確認するには、抗ＰＴＨｒＰ抗体の中和活性を測定する。
９．バルク
「バルク」とは抗ＰＴＨｒＰ抗体を含む組成物であり、前記の方法を用いて発現・産生された抗体を、細胞・宿主動物から分離・精製した抗ＰＴＨｒＰ抗体組成物のことである。分離・精製されたバルクには、分離・精製時に用いた溶媒（緩衝液など）が含まれる。更には、本発明で精製された抗ＰＴＨｒＰ抗体溶液組成物に、等張化剤としてハロゲン化金属類等、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等、好ましくは、塩化ナトリウムを、本質的にヒトの血液とおなじ浸透圧になるように添加する。一般的には約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧が好ましい。
さらに、酢酸、クエン酸、リン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の緩衝剤を、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ程度添加し、ｐＨを５〜８、好ましくは５．５〜７．０、最も好ましくは、約６．０に調整し、バルク用抗体溶液組成物を調製する。
本バルク用抗体溶液組成物は、製剤として調製されるまでの間、溶液状態あるいは凍結状態、好ましくは凍結状態で保存する。
この組成物には、約１〜１００ｍｇ／ｍＬの抗体が含まれており、更には、凍結融解の際に抗体の微粒子形成を減少し得るクライオプロテクタントあるいは凍結乾燥時のリオプロテクタントとなる界面活性剤（たとえば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシル硫酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリル−・リノレイル−・ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−・ミリスチル−・リノレイル−・ステアリル−サルコシン、ミリスチル−・リノレイル−・セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−・コカミドプロピル−・リノールアミドプロピル−・ミリスタミドプロピル−・パルミドプロピル−・イソステアラミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−・パルミドプロピル−・イソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、ナトリウムメチルココイル−・二ナトリウムメチルオレイル−タウレート、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールやプロピレングリコールのコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓなど）や糖または糖アルコール（例えば、スクロース、トレハロース、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどのポリオールなど）、グルタミン酸やヒスチジンのようなアミノ酸等が含まれていてもよい。またこれらの濃度は、抗体濃度および調製する製剤の等張性に依存する。
本発明のバルク用抗体溶液組成物は、少なくとも２〜８℃で２年間で安定であることが好ましい。
バルク用溶液組成物は、長期保存性や、輸送時の物理的ストレスに対して安定であることを要求されるのと同時に、ある実施形態において、この組成物を用いて治療される患者に適した投与方法（例えば皮下投与）の製剤に調製するために、できるだけ安定化剤等の添加物を添加しないことが望ましい。
したがって、本発明のバルク用溶液組成物は、緩衝剤、ハロゲン化金属類等の等張化剤、界面活性剤、糖または糖アルコール以外の安定化剤を含んでいないことが好ましい。さらに本発明のバルク用溶液組成物は、緩衝剤、ハロゲン化金属類等の等張化剤、界面活性剤以外の安定化剤を含んでいないことが好ましい。最も好ましくは、本発明のバルク用溶液組成物は、緩衝剤、ハロゲン化金属類等の等張化剤以外の安定化剤を含んでいない組成物である。
１０．投与方法および製剤
抗ＰＴＨｒＰ抗体は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰに起因する疾患（例えば、高カルシウム血症、高カルシウム血症クリーゼ、薬剤抵抗性高カルシウム血症、悪液質、低バゾプレシン濃度の症状など）の治療剤、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰに起因する疾患による症状を緩和するためのＱＯＬ改善剤、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰに起因する中枢神経系疾患の改善剤、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ−サイトカインカスケードに起因する疾患の改善剤、中枢神経系調節剤、サイトカインネットワーク調節剤などの有効成分として使用することができる。抗ＰＴＨｒＰ抗体は、上記の用途のいずれか一つあるいは複数を目的として、投与することができる。
抗ＰＴＨｒＰ抗体を有効成分として含有する薬剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には経肺剤型（例えばネフライザーなどの器具を用いた経肺投与剤）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
特に、注射製剤の場合は、緩衝剤として酢酸及び／又はその塩を使用することが好ましい。緩衝剤として酢酸及び／又はその塩を使用した場合には、注射製剤投与時の疼痛が少ないものとなる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは０．１〜１００００ｍｇ／ｂｏｄｙ、さらに好ましくは０．５〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙ、さらに好ましくは１〜１００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗ＰＴＨｒＰ抗体を含有する薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
また、投与時期としては、疾患または症状が生ずる前後を問わず投与してもよく、あるいは体重減少が予測される時に投与してもよい。
本発明の抗ＰＴＨｒＰ抗体を有効成分として含有する薬剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、アミノ酸、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明の薬剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗ＰＴＨｒＰ抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
抗ＰＴＨｒＰ抗体の安定化製剤を提供するためには、ｐＨが５〜８の範囲となるように、抗ＰＴＨｒＰ抗体を緩衝液に溶解するとよい。緩衝液は、酸（好ましくは、酢酸、クエン酸、リン酸などの弱酸）とその塩（好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ塩）の混合溶液であるとよい。製剤中の緩衝剤（例えば、酸およびその塩）の総濃度は、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液などは一般的な方法で調製される（Ｄ．Ｄ．ペリン、Ｂ．デンプシー著、「緩衝液の選択と応用」講談社サイエンティフィック）。
抗ＰＴＨｒＰ抗体の安定化製剤の処方の一例を以下に記載する。
抗ＰＴＨｒＰ抗体                      ２０〜１００ｍｇ
緩衝液＊                                ５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム                      １３０〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
全量                                    １〜５ｍＬ（ｐＨ５〜８）
＊：酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはそれらの組み合わせ。
なお、本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願１１−３７５２０３号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、参考例および実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕  水素イオン濃度（ｐＨ）の影響
実施例１および２で用いる抗ＰＴＨｒＰ抗体は後述の参考例１〜４で作製したヒト型化抗体（以下、この抗体を「ヒト型化抗体」という。）である。また、実施例１および２において用いた分析法と分析条件は以下の通りである。
・ＧＰＣ−ＵＶ
移動相：３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：Ｇ−３０００ＳＷＸＬ
検出：２８０ｎｍ
試料注入量：９０μｇ（３ｍｇ／ｍｌを３０μｌ注入）
・ＢＩＡＣＯＲＥ法（表面プラズモン共鳴を利用する分析法。ファルマシアバイオテク社のＢＩＡＣＯＲＥを使用。）
１）試薬
ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド），ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド），Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：アミンカップリングキット（ビアコア社）
ＰＤＥＡ（２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミンヒドロクロリド）：チオールカップリングキット（ビアコア社）、ＰＴＨｒＰ（１−３４＋Ｃ）：合成品（サワデー社）
２）センサーチップリガンド：抗原ＰＴＨｒＰあるいは抗原Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ
３）サンプル溶液の調製
ｉ）試料溶液を注射用蒸留水を用いて約１００μｇ／ｍＬに希釈し、２８０ｎｍにおける吸光度法によって濃度を決定した。
ｉｉ）未知試料サンプルの調製：吸光度法により決定した濃度を基準に、ＢＩＡＣＯＲＥ測定時と同じＨＢＳ−ＥＰバッファー（ビアコア社、Ｃｏｄｅ  ＃ＢＲ−１００１−８８）で希釈し、２０μｇ／ｍＬの溶液を調製した。希釈に用いるＨＢＳ−ＥＰバッファーはすべてＢＩＡＣＯＲＥ測定時と同じものを用いた。この溶液２０μＬとＨＢＳ−ＥＰバッファー１８０μＬを混合し２μｇ／ｍＬの溶液を未知試料サンプルとした。
ｉｉｉ）検量線用サンプルの調製：基準となる試料の約１００μｇ／ｍＬの溶液を５点以上の濃度に希釈した。
・イオン交換クロマトグラフィー（以下、ＩＥＣ−ＵＶと言う）
カラム：ＰｏｌｙＣＡＴ  Ａ  ４．６×２５０ｍｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２８０ｎｍ
注入量：約３０μｇ
溶出条件：Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．１）
Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．１），５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元，非還元／ＣＢＢ，ＷＢ）
サンプル：前処理溶液＝１：１で混和し、１００℃−１ｍｉｎ加温し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  １０−１５を使用）を実施した。試料アプライ量は、約１〜２ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。染色、脱色した。５％グリセリンを含む脱色液に３０分以上浸し、乾燥した。
前処理溶液：５％ＳＤＳを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（還元処理では１０％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含む。）
染色：０．１％ＣＢＢ（ＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｒ）
分子量マーカー：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ／Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１−０３１７）
0004516711.tif 000002
（１）リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液
以下の組成の製剤を調製して、加速試験を行った。
ヒト型化抗体  １ｍｇ／ｍＬ
クエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜５．５）１００ｍｍｏｌ／Ｌまたはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６〜８）１００ｍｍｏｌ／Ｌ
加速試験の実験条件は、以下の通りである。製剤は、５０℃−１週から１ヶ月で保たれ、その期間で安定性を測定する。一般的には、製剤を２〜８℃で貯蔵する場合、少なくとも、２５℃−６ヶ月、３０℃−１ヶ月または４０℃−１ヶ月で安定で、２〜８℃−２年で安定であるべきである。また、製剤を２５℃または３０℃で貯蔵する場合、一般的には、少なくとも４０℃−６ヶ月で安定で、２５℃−２年または３０℃−２年で安定であるべきである。
加速試験前後の製剤のＧＰＣ−ＵＶによるヒト型化抗体残存率［％］、ＢＩＡＣＯＲＥによるヒト型化抗体生物活性残存率［％］およびＩＥＣ−ＵＶによるヒト型化抗体メインピーク残存率［％］を表１に示す。
0004516711.tif 000003
（２）酢酸緩衝液
以下の組成の製剤を調製して、加速試験を行った。
ヒト型化抗体  １３ｍｇ／ｍＬ
酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
加速試験前後の製剤の水素イオン濃度、ＵＶ３６０ｎｍ、ＧＰＣ−ＵＶによるヒト型化抗体残存率［％］、ＢＩＡＣＯＲＥによるヒト型化抗体生物活性残存率［％］およびＩＥＣ−ＵＶによるヒト型化抗体メインピーク残存率［％］を表２に示す。
0004516711.tif 000004
また、加速試験前後のヒト型化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図１に示す。図１の上段は還元条件下、下段は非還元条件下、左は加速試験前の製剤、中は５０℃−１週の加速試験後の製剤、右は５０℃−１ヶ月の加速試験後の製剤のレーンである。また、レーンは、左から、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５および７．０の製剤である。
ＵＶ３６０ｎｍ、ＧＰＣ−ＵＶ、ＢＩＡＣＯＲＥおよびＩＥＣ−ＵＶの分析結果より、ヒト型化抗体は、ｐＨ６〜７で安定で、ｐＨ６で最も安定であった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果より、ｐＨ７および６．５でＨ鎖の上のバンドが増加し、ｐＨ５および５．５で低分子分解物の増加が認められたことにより、至適ｐＨは６であると判断した。
〔実施例２〕  緩衝液濃度の影響
（１）酢酸緩衝液
以下の組成の製剤を調製して、加速試験を行った。
ヒト型化抗体  ６．５ｍｇ／ｍＬ
酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）１０，５０，１００ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
加速試験前後の製剤の水素イオン濃度、ＵＶ３６０ｎｍ、ＧＰＣ−ＵＶによるヒト型化抗体残存率［％］、ＢＩＡＣＯＲＥによるヒト型化抗体生物活性残存率［％］を表３に示す。
0004516711.tif 000005
（２）クエン酸緩衝液
以下の組成の製剤を調製して、加速試験を行った。
ヒト型化抗体  ８ｍｇ／ｍＬ
クエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）  １０，５０，１００ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
加速試験前後の製剤の水素イオン濃度、ＵＶ３６０ｎｍ、ＧＰＣ−ＵＶによるヒト型化抗体残存率［％］、ＢＩＡＣＯＲＥによるヒト型化抗体生物活性残存率［％］を表４に示す。
0004516711.tif 000006
また、加速試験前後のヒト型化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図２に示す。図２の上段は還元条件下、下段は非還元条件下、左は加速試験前の製剤、中は５０℃−１週の加速試験後の製剤、右は５０℃−１ヶ月の加速試験後の製剤のレーンである。また、レーンは、左から、酢酸緩衝液１０、５０、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、クエン酸緩衝液１０、５０、１００ｍｍｏｌ／Ｌの製剤である。
ＢＩＡＣＯＲＥの分析結果より、酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液ともに、１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌで安定で、１０ｍｍｏｌ／Ｌでより安定であった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果より、酢酸よりクエン酸の方が、高濃度より低濃度の方が分解物が少なかった。
〔実施例３〕
実施例３では、注射製剤を調製し、当該注射製剤における疼痛緩和作用を検討した。なお、本実施例で用いる抗ＰＴＨｒＰ抗体は後述の参考例１〜４で作製したヒト型化抗体（以下、この抗体を「ヒト型化抗体」という。）である。
本例では、表５に示す１０種類の注射製剤を調製した。
0004516711.tif 000007
なお、これら注射製剤は、準無菌的に調製し、冷蔵にて保存し、投与時にはシリンジに分注し使用した。
使用動物および飼育環境
使用動物には生物学的特性がよく研究されており、均質な動物が多数入手できるほか、投与部位である後耳介静脈周囲皮下が投与および検査に適した大きさであり、また傷害部位の観察が肉眼的にも容易であることからウサギを選択した。ニュージーランドホワイト種ウサギ（Ｋｂｌ：ＮＺＷ）の雄を北山ラベス株式会社より購入（入荷時１２週齢）し、７日間の馴化飼育を行った。動物の選択は馴化期間中の一般状態および体重を考慮して行い、２２匹の動物を使用した。投与時（投与時１３週齢）の体重は２．６〜３．３ｋｇであった。
これらの動物は温度２４±２℃、湿度５５±１０％、１４時間照明（５：００〜１９：００点灯），換気回数１４〜１６回／時に設定された動物室内で幅３５０ｍｍ×奥行５００ｍｍ×高さ３５０ｍｍのアルミニウム製吊りケージに個別収容した。飼料は固型飼料ＲＣ４（オリエンタル酵母工業（株））をステンレススチール製給餌器にて不断給餌法で、また飲料水として水道水を不断給水法で自動給水器を用いて、それぞれ自由に摂取させた。個体識別は油性マーカーペンによる耳介（投与部位を避け、外側に記載）への動物番号の記入により行い、ケージの識別はケージカードの添付により行った。
なお、試験期間中の飼育室の環境、飼料および飲料水の分析において、試験系に影響を及ぼす異常は認められなかった。
投与液の設定および群構成
表５に示した注射製剤の投与容量については既に実施された局所障害性試験［須永昌男，下村和裕，小泉治子、ガドテリドールのウサギ静脈内および静脈周囲皮下投与局所刺激性試験、Ｐｒｅｃｌｉｎ．Ｒｅｐ．Ｃｅｎｔ．Ｉｎｓｔ．Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．１９９２；１８（１）：４７−５７．］に準じて０．２ｍＬ／（投与部位）とした。各注射製剤をそれぞれ２匹（耳介静脈周囲皮下４カ所）に投与し、各群の一方を投与後２日、他方を投与後４日の剖検にあてた。
投与方法
注射製剤投与部位は耳介のほぼ中央部に位置する後耳介静脈で、小血管の分岐が少ない部分を選択した。投与はディスポーザブルのシリンジと針（２７Ｇ）を用い、耳根部に向けて注射針を静脈に沿って皮下に刺入し、約３秒にてゆっくりと単回投与した。また、針の刺入部ならびに刺入した針の先端部（注入部）を特定できるように油性マーカーペンにて刺入部ならびに先端部の横に印を付けた。投与部位の観察（肉眼所見）
投与直後から投与後２あるいは４日（投与日を０日として起算）まで毎日１回、投与部ならびにその周囲を観察し、観察された変化の大きさ（長径および短径）をノギス（ＪＩＳ規格）を用いて測定し、その積（長径×短径）を面積とした。
病理組織学的検査（病理組織所見）
投与直後２あるいは４日における投与部位の観察が終了した後、麻酔量算出のための体重測定を行い、動物をペントバルビタールナトリウム麻酔下（ネンブタール：大日本製薬（株））で腹大動脈より放血して安楽死させた。なお、麻酔薬の投与は耳根部の後耳介静脈にて実施し、投与部位の評価に影響を及ぼさないように配慮した。また、放血前に投与部位の写真撮影を実施した。
試験物質が投与された左右の耳介を耳根部より採取した後、２０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。その後、左右耳介の試験物質の注入部を投与部位に接する血管を含むように血管の走行に対して垂直方向に切り出し、常法に従ってパラフィン包埋薄切組織標本を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を施し光学顕微鏡下で病理組織学的検索を実施した。
病理組織学的検査による刺激性の判定は次の基準に基づいて行った。
（１）出血は、投与手技の変化として刺激性の指標としない。
（２）投与部位の軽微な細胞密度の増加、空隙形成を指標とした組織の軽微な変化については、投与手技の変化として刺激性の指標としない。
（３）他の組織学的変化が軽微な場合に、表皮角化細胞の空胞形成と表皮の肥厚がみられた場合は刺激性の指標としない（これらの変化は組織学的影響が強い場合に発現すると考えられるこのことから、他の組織学的変化が軽微な場合に、表皮角化細胞の空胞形成と表皮の肥厚が見られた時は刺激性の指標としない）。
（４）炎症性細胞浸潤と水腫が軽度以上を刺激性の指標とする。
（５）表皮の肥厚は、炎症性細胞浸潤と水腫が軽度以上の場合に刺激性の指標とする。
そして、各検査結果について各群間の差あるいは経時的変化を生物学的に評価した。結果を表６に示す。
0004516711.tif 000008
表６に示すように、ヒト型化抗体（１６．８ｍｇ／ｍＬ）／２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ６）溶液は、肉眼的には紅斑および腫脹、病理組織学的検査では軽度の炎症性細胞浸潤および軽度の水腫を惹起するため、局所刺激性を有すると判断した。これに対して、ヒト型化抗体（１３．０ｍｇ／ｍＬ）／２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸酸緩衝液（ｐＨ６）溶液は、肉眼所見及び病理組織所見ともに症状が認められず、刺激性を有していないと判断した。
以上の結果から、緩衝剤として酢酸を用いることによって、疼痛緩和作用を有する注射製剤が得られることが明らかとなった。
〔参考例１〕
抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ＃２３−５７−１５４および＃２３−５７−１３７−１は、以下の通り作製した（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．８，８４９−８６０，１９９３）。なお、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）のアミノ酸配列を配列番号７５に示す。
免疫原として使用するために、ＰＴＨｒＰ（１−３４）（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ製）とキャリアータンパクであるサイログロブリンをカルボジイミド（Ｄｏｊｉｎｎ）を用いて結合した。サイログロブリンと結合したＰＴＨｒＰ（１−３４）を透析し、タンパク濃度として２μｇ／ｍｌとなるように調製した後、フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と１：１で混合し、エマルジョン作製後、１６匹の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あたり１００μｇを１１回免疫した。初回免疫は、フロイント完全アジュバントを用い、二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバントを使用した。
免疫したマウスの血清中の抗体価の測定は、以下の方法で行った。すなわち、マウス尾静脈より採血し、血清分離後ＲＩＡバッファーで希釈した抗血清と１２５Ｉ標識ＰＴＨｒＰ（１−３４）を混合し、結合活性を測定した。抗体価の上昇したマウスの腹腔に、キャリアータンパクを結合していないＰＴＨｒＰ（１−３４）を動物あたり５０μｇを最終免疫した。
最終免疫３日目にマウスを屠殺し、脾臓を摘出後、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１を５０％ポリエチレングリコール４０００を用いる常法にしたがって細胞融合した。細胞融合した細胞を２×１０４／ウェルの細胞数で８５枚の９６穴プレートに蒔き込んだ。ハイブリドーマの選別はＨＡＴ培地を用いて行った。
ハイブリドーマのスクリーニングは、ＨＡＴ培地中で生育の認められた穴の培養上清を固相化ＲＩＡ法にてＰＴＨｒＰ認識抗体の有無を測定し選択することにより行った。抗体との結合能の認められた穴からハイブリドーマを回収し、１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にＯＰＩ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地に懸濁し、限界希釈法にてハイブリドーマの単一化を実施した。ＰＴＨｒＰ（１−３４）との結合能の強いクローン＃２３−５７−１５４および＃２３−５７−１３７−１を得た。
なお、ハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１は、ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＃２３−５７−１３７−１として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３１としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
〔参考例２〕ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体＃２３−５７−１３７−１の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローニングした。
（１）ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１からのｍＲＮＡをＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて調製した。ハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１の細胞を抽出バッファーで完全にホモジナイズし、キット添付の処方に従い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｓｐｕｎ  ＣｏｌｕｍｎにてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿をおこなった。ｍＲＮＡ沈殿物を溶出バッファーに溶解した。
（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のｃＤＮＡの作製および増幅
（ｉ）＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５’−ＲＡＣＥ法には５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）を用い、操作はキット添付の処方にしたがって行った。ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーは、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするＭＨＣ２プライマー（配列番号１）を用いた。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてＭＨＣ２プライマー１０ｐｍｏｌｅを加え、逆転写酵素と５２℃、３０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。
６Ｎ  ＮａＯＨでＲＮＡを加水分解（６５℃、３０分間）した後、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを精製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで３７℃で６時間、室温で１６時間反応することにより、合成したｃＤＮＡの５’末端にＡｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  Ａｎｃｈｏｒ（配列番号４２）を連結した。これを鋳型としてＰＣＲにより増幅するためのプライマーとしてＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号２）およびＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号３）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を使用した。
ＰＣＲ溶液は、その５０μｌ中に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造）、１０ｐｍｏｌｅのＡｎｃｈｏｒプライマー、並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー及びＡｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  Ａｎｃｈｏｒを連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に５０μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４８０Ｊ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３０回行った。
（ｉｉ）＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡのクローニング  ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５’−ＲＡＣＥ法には５’−Ａｍｐｌｉ  Ｆｉｎｄｅｒ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用い、操作は添付の処方に従った。ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーは、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いた。前記のように調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを加え、逆転写酵素と５２℃、３０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。６Ｎ  ＮａＯＨでＲＮＡを加水分解（６５℃、３０分間）した後、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを精製した。合成したｃＤＮＡの５’末端に前記Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＡｎｃｈｏｒをＴ４  ＤＮＡリガーゼで３７℃で６時間、室温で１６時間反応させることにより連結した。
マウスＬ鎖λ鎖定常領域の保存配列からＰＣＲプライマーＭＬＣ（配列番号４）を設計し、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて合成した。ＰＣＲ溶液は、その１００μｌ中に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５Ｍｍ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）、５０ｐｍｏｌｅのＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号２）、並びにＭＬＣ（配列番号４）およびＡｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  Ａｎｃｈｏｒを連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に５０μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｍｏｄｅｌ４８０Ｊ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３５回行った。（３）ＰＣＲ生成物の精製および断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を、３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。Ｈ鎖Ｖ領域として約５５０ｂｐ長、Ｌ鎖Ｖ領域として約５５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
こうして、５’−末端にＥｃｏＲＩ認識配列を有し、３’−末端にＸｍａＩ認識配列を有するマウスＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｍａＩ  ＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩ及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。次に１０μｌの上記連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、この細胞を氷上で１５分間、４２℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。次いで３００μｌのＳＯＣ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｇｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を加え３７℃にて３０分間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、２０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地または２ｘＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｇｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を１００μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地または２×ＹＴ培地２ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からプラスミド抽出機ＰＩ−１００Σ（クラボウ）又はＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行った。
（４）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（ＡＢＩ社Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）（配列番号５）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）（配列番号６）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
こうして得られたハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＭＢＣ１Ｈ０４、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＭＢＣ１Ｌ２４と命名した。プラスミドＭＢＣ１Ｈ０４およびＭＢＣ１Ｌ２４に含まれるマウス＃２３−５７−１３７−１抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号５７、６５に示す。これらのアミノ酸配列を、Ｈ鎖Ｖ領域の断片については配列番号４６、Ｌ鎖Ｖ領域の断片については配列番号４５に示す。
なお、前記プラスミドＭＢＣ１Ｈ０４およびＭＢＣ１Ｌ２４を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｈ０４）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｌ２４）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｈ０４）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｌ２４）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２７としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（５）ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体＃２３−５７−１３７−１のＣＤＲの決定
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全般の構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表７に示すごとく決定した。
なお、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号５９〜６１に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号６２〜６４に示した。
0004516711.tif 000009
〔参考例３〕キメラ抗体の構築
（１）キメラ抗体Ｈ鎖の構築
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡを含む発現ベクターに連結するために、クローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１−Ｓ１（配列番号７）はＶ領域のリーダー配列の５’−側をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）及び制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩの認識配列を有するように設計した。前方プライマーＭＢＣ１−ａ（配列番号８）はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、スプライスドナー配列及び制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を有するように設計した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、５０μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして０．０７μｇのプラスミドＭＢＣ１Ｈ０４、プライマーとしてＭＢＣ１−ａおよびＭＢＣ１−Ｓ１をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ含む条件で添付緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層し、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４３７ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）により３７℃１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＨｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するためプライマーＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４およびＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶをプライマーとして、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５’−側にＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３’−側にＢａｍＨＩ認識配列を持つプラスミドをＭＢＣ１Ｈ／ｐＵＣ１９と命名した。
（ｉｉ）ｃＤＮＡタイプのマウス−ヒトキメラＨ鎖の作製のためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上記のようにして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２（配列番号９）はＶ領域のリーダー配列の最初をコードする配列の２番のアスパラギンをグリシンに変換し、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）並びにＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２（配列番号１０）はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、Ｃ領域の５’−側の配列をコードしＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、５０μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして０．６μｇのプラスミドＭＢＣ１Ｈ／ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ２およびＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを２．５Ｕ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層して９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を１％Ｓｅａ  Ｋｅｍ  ＧＴＧ  アガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４５６ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノール沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。
得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ  ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するため、プライマーＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶをプライマーとして、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５’−側にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列並びにＫｏｚａｋ配列、３’−側にＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドをＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
（ｉｉｉ）キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡは、以下のようにして調製した。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域ＩｇＧ１のゲノムＤＮＡ（Ｎ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２９，６７１−６７９  １９８２）をコードする発現ベクターＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ−１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡをコードする発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ（ＷＯ９２／１９７５９参照）とを導入したＣＨＯ細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡをクローニングし、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、正しい配列を持つプラスミドをｐＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡと命名した。
ＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ−１−ｆ上のＳＶ４０プロモーターとＤＨＦＲ遺伝子との間にあるＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位、およびＥＦ−１αプロモーターとヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域との間にあるＥｃｏＲＩ部位を欠失した発現ベクターを作製し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡの発現ベクターの構築のために使用した。
ｐＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、さらにＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ平滑化断片を調製した。このＨｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ平滑化断片を、上記のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位が欠失したＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳｍａＩで消化することにより調製した発現ベクターに連結し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡを構築した。
ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで梢化した後、Ｈ鎖Ｃ領域を含むＤＮＡ断片を回収し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製したＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラスミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含み、５’−末端にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列、３’−末端にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。
プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたキメラ抗体のＨ鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現ベクターｐＣＯＳ１に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。なお、発現ベクターｐＣＯＳ１は、ＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（宝酒造）を連結することにより構築した。
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するため、プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたキメラ抗体Ｈ鎖配列を含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＨＯ１に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１と命名した。なお、発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−△Ｅ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造）を連結することにより構築した。
（２）ヒトＬ鎖定常領域の構築
（ｉ）クローニングベクターの作製
ヒトＬ鎖定常領域を含むｐＵＣ１９ベクターを構築するために、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位欠失ｐＵＣ１９ベクターを作製した。ｐＵＣ１９ベクター２μｇを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。
回収したＤＮＡを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、６ＵのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有する５０μｌの反応混合液中で室温にて２０分間反応させ、末端を平滑化させた。反応混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ベクターＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。
回収したベクターＤＮＡを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール−８０００、０．５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有する反応混合液１０μｌ中で１６℃で２時間反応させ、自己連結させた。反応混合液５μｌを大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間静置した後、４２℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。ＳＯＣ培地５００μｌを加えて、３７℃で１時間インキュベーションした後、Ｘ−ｇａｌとＩＰＴＧを表面に塗布した２×ＹＴ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｇｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）にまき、３７℃で一夜培養して形質転換体を得た。
形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２０ｍｌで３７℃一夜培養し、菌体画分からＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付の処方に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位が欠失していることを確認したプラスミドをｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩと命名した。
（ｉｉ）ヒトＬ鎖λ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
ヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域は、Ｍｃｇ＋  Ｋｅ＋  Ｏｚ−、Ｍｃｇ−  Ｋｅ−  Ｏｚ−、Ｍｃｇ−  Ｋｅ−  Ｏｚ＋、Ｍｃｇ−  Ｋｅ＋  Ｏｚ−の少なくとも４種類のアイソタイプが知られている（Ｐ．Ｄａｒｉａｖａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，９０７４−９０７８，１９８７）。＃２３−５７−１３７−１マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域と相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をＥＭＢＬデータベースで検索した結果、アイソタイプがＭｃｇ＋  Ｋｅ＋  Ｏｚ−（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５７８１９）（Ｐ．Ｄａｒｉａｖａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，９０７４−９０７８，１９８７）のヒト抗体Ｌ鎖λ鎖が最も高い相同性を示し、＃２３−５７−１３７−１マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性はアミノ酸配列で６４．４％、塩基配列で７３．４％であった。
そこで、このヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の構築をＰＣＲ法を用いて行った。各プライマーの合成は、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて行った。ＨＬＡＭＢ１（配列番号１１）およびＨＬＡＭＢ３（配列番号１３）はセンスＤＮＡ配列を有し、ＨＬＡＭＢ２（配列番号１２）およびＨＬＡＭＢ４（配列番号１４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両端に２０から２３ｂｐの相補的配列を有する。
外部プライマーＨＬＡＭＢＳ（配列番号１５）、ＨＬＡＭＢＲ（配列番号１６）はＨＬＡＭＢ１、ＨＬＡＭＢ４とそれぞれ相同な配列を有しており、またＨＬＡＭＢＳはＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、ＢｌｎＩ認識配列を、ＨＬＡＭＢＲはＥｃｏＲＩ認識配列をそれぞれ含んでいる。第一ＰＣＲでＨＬＡＭＢ１−ＨＬＡＭＢ２とＨＬＡＭＢ３−ＨＬＡＭＢ４の反応を行った。反応後、それらを等量混合し、第二ＰＣＲでアセンブリを行った。さらに外部プライマーＨＬＡＭＢＳおよびＨＬＡＭＢＲを添加し、第三ＰＣＲにより全長ＤＮＡを増幅させた。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を使い、添付の処方に従って行った。第一ＰＣＲでは、５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ１および０．５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ２と５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）とを含有する１００μｌの反応混合液、あるいは０．５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ３および５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ４と５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）とを含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行った。
第二ＰＣＲは、反応液を５０μｌずつ混合し、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３回行った。
第三ＰＣＲは、反応液に外部プライマーＨＬＡＭＢＳおよびＨＬＡＭＢＲを各５０ｐｍｏｌｅずつ添加し、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
第三ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ）で電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、添付の処方に従ってゲルから回収、精製した。
得られたＤＮＡ断片を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８ＵのＥｃｏＲＩ（宝酒造）を含有する２０μｌの反応混合液中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液８μｌに溶解した。
プラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩ  ０．８μｇを同様にＥｃｏＲＩで消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収した。消化したプラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５，宝酒造）を含有する反応混合液５０μｌ中で３７℃、３０分間反応させ脱リン酸処理（ＢＡＰ処理）した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
上記のＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩ  １μｌと先のＰＣＲ産物４μｌをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
上記プラスミドについて、クローニングされたＤＮＡの塩基配列の確認を行った。塩基配列の決定には３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）を用い、プライマーにはＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４およびＭ１３  Ｐｒｉｃｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用いた。その結果、クローニングされたＤＮＡの内部に１２ｂｐの欠失があることが判明した。このＤＮＡを含むプラスミドをＣλΔ／ｐＵＣ１９と命名した。そこで、その部分を補うためのプライマーＨＣＬＭＳ（配列番号１７）、ＨＣＬＭＲ（配列番号１８）を新たに合成し、ＰＣＲで再度正しいＤＮＡの構築を行った。
第一ＰＣＲで欠失ＤＮＡを含むプラスミドＣλΔ／ｐＵＣ１９を鋳型とし、プライマーＨＬＡＭＢＳとＨＣＬＭＲ、ＨＣＬＭＳとＨＬＡＭＢ４で反応を行った。ＰＣＲ産物をそれぞれ精製し、第二ＰＣＲでアセンブリを行った。さらに外部プライマーＨＬＡＭＢＳおよびＨＬＡＭＢ４を添加し、第三ＰＣＲにより全長ＤＮＡを増幅させた。
第一ＰＣＲでは、鋳型としてＣλΔ／ｐＵＣ１９  ０．１μｇ、プライマーＨＬＡＭＢＳおよびＨＣＬＭＲ各５０ｐｍｏｌｅ、あるいはＨＣＬＭＳおよびＨＬＡＭＢ４各５０ｐｍｏｌｅ、５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
ＰＣＲ産物ＨＬＡＭＢＳ−ＨＣＬＭＲ（２３６ｂｐ）、ＨＣＬＭＳ−ＨＬＡＭＢ４（１４７ｂｐ）をそれぞれ３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。第二ＰＣＲでは精製ＤＮＡ断片各４０ｎｇ、１ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する２０μｌの反応混合液を用い、２５μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを５回行った。
第三ＰＣＲでは、第二ＰＣＲ反応液２μｌ、外部プライマーＨＬＡＭＢＳ、ＨＬＡＭＢ４各５０ｐｍｏｌｅ、５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲは、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。第三ＰＣＲ産物である３５７ｂｐのＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
得られたＤＮＡ断片０．１μｇをＥｃｏＲＩで消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩにサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドについて塩基配列をＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４、Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）にて決定した。欠失のない正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣλ／ｐＵＣ１９とした。
（ｉｉｉ）ヒトＬ鎖κ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
プラスミドＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇｋ（ＷＯ９２／１９７５９）からＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いてクローニングした。３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて合成した前方プライマーＨＫＡＰＳ（配列番号１９）はＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、ＢｌｎＩ認識配列を、後方プライマーＨＫＡＰＡ（配列番号２０）はＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。
鋳型となるプラスミドＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇｋ  ０．１μｇ、プライマーＨＫＡＰＳ、ＨＫＡＰＡ各５０ｐｍｏｌｅ、５ＵのＴａｋａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層した。９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の反応を３０サイクル行った。３６０ｂｐのＰＣＲ産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩにクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドの塩基配列をＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４、Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）にて決定した。正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣκ／ｐＵＣ１９とした。
（３）キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
キメラ＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した。プラスミドＣλ／ｐＵＣ１９、Ｃκ／ｐＵＣ１９のヒト抗体定常領域の直前にあるＨｉｎｄ  ＩＩＩ、ＢｌｎＩ部位に、＃２３−５７−１３７−１  Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによって、それぞれキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびＬ鎖λ鎖またはＬ鎖κ鎖定常領域をコードするｐＵＣ１９ベクターを作製した。ＥｃｏＲＩ消化によってキメラ抗体Ｌ鎖遺伝子を切り出し、ＨＥＦ発現ベクターへサブクローニングを行った。
すなわち、プラスミドＭＢＣ１Ｌ２４から＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法を用いてクローニングした。各プライマーの合成は、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて行った。後方プライマーＭＢＣＣＨＬ１（配列番号２１）はＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列とＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）を、前方プライマーＭＢＣＣＨＬ３（配列番号２２）はＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．１μｇのＭＢＣ１Ｌ２４、プライマーとしてＭＢＣＣＨＬ１およびＭＢＣＣＨＬ３を各５０ｐｍｏｌｅ、１μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３０回行った。
４４４ｂｐのＰＣＲ産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。ＰＣＲ産物１μｌをそれぞれ１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）および８ＵのＥｃｏＲＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液８μｌに溶解した。
プラスミドｐＵＣ１９  １μｇを同様にＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収し、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５，宝酒造）でＢＡＰ処理した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
ＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９  １μｌと先のＰＣＲ産物４μｌをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）に前述と同様に形質転換した。これを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで３７℃で一夜培養した。菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。塩基配列を決定後、正しい塩基配列を有するプラスミドをＣＨＬ／ｐＵＣ１９とした。
プラスミドＣλ／ｐＵＣ１９、Ｃκ／ｐＵＣ１９  各１μｇをそれぞれ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）および２ＵのＢｌｎＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、３７℃で３０分間ＢＡＰ処理を行った。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
＃２３−５７−１３７−１  Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドＣＨＬ／ｐＵＣ１９から８μｇを同様にＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化した。得られた４０９ｂｐのＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
このＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡ  ４μｌをＢＡＰ処理したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９またはＣκ／ｐＵＣ１９各１μｌにサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地３ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９、ＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｐＵＣ１９とした。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９およびＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｐＵＣ１９をそれぞれＥｃｏＲＩで消化し、３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、７４３ｂｐのＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
発現ベクターとしてプラスミドＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇｋ  ２．７μｇをＥｃｏＲＩで消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した。回収したＤＮＡ断片をＢＡＰ処理した後、１％低融点アガロースゲルで電気泳動し、６５６１ｂｐのＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
ＢＡＰ処理したＨＥＦベクター２μｌを上記プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）またはＭＢＣ１Ｌ（κ）ＥｃｏＲＩ断片各３μｌと連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）および２ＵのＰｖｕＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれぞれＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏとした。
（４）ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
すなわちキメラ抗体の一過性発現は、プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏまたはＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ  １０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてキット添付の処方に従って行った。
（５）ＥＬＩＳＡ
（ｉ）抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．０２％  ＮａＮ３）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％  ＮａＮ３、１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ  ＩｇＧ１λ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いた。
（ｉｉ）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥｌＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）（ペプチド研究所）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。
その結果、キメラ抗体は、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能を有しており、クローニングしたマウス抗体Ｖ領域の正しい構造を有することが示された。また、キメラ抗体においてＬ鎖Ｃ領域がλ鎖あるいはκ鎖のいずれであっても抗体のＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能は変化しないことから、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｃ領域は、ヒト型化抗体Ｌ鎖λ鎖を用いて構築した。
（６）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏまたはＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖ＤＮＡにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収してエレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ  １０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加したＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、３枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地を交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により細胞破片を除去した。
ＣＨＯ細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
〔参考例４〕ヒト型化抗体の構築
（１）ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Ｓ３１６７９（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ  Ａ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，１９９３）由来のＦＲを有するヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために６個のＰＣＲプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２４）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番号２７）及びＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１及びＭＢＣ１ＨＧＰ４とホモロジーを有する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）にて行った。
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１及びＭＢＣ１ＨＶＲ１を加え、同じ温度サイクルを３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を４％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
（ｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖ｃＤＮＡのためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上記のようにして構築したヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２はＶ領域のリーダー配列の５’−側をコードする配列とハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つＣ領域の５’−側の配列をコードしＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、鋳型ＤＮＡとして０．４μｇのｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９を用い、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ２およびＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付緩衝液を使用し、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４５６ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化することで調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５’−側にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３’−側にＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドをｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
（２）ヒト型化抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ｈＰＭ１抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩにて消化し、Ｈ鎖Ｃ領域を含むＤＮＡ断片を回収し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製したｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含み、５’−末端にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３’−末端にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９に含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン”ａ”の塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号５８に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＯＳ１に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するためｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＨＯ１に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１と命名した。
（３）Ｌ鎖ハイブリッド可変領域の構築
（ｉ）ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体の作製
ヒト型化抗体とマウス（キメラ）抗体のＦＲ領域を組み換えたＬ鎖遺伝子を構築し、ヒト型化のための各領域の評価を行った。ＣＤＲ２内にある制限酵素ＡｆｌＩＩ切断部位を利用することによって、ＦＲ１及び２はヒト抗体由来、ＦＲ３及び４はマウス抗体由来とするハイブリッド抗体を作製した。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ各１０μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＡｆｌＩＩ（宝酒造）１０Ｕを含有する反応混合液１００μｌ中で３７℃にて１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｃ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｃ２とする）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｈ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｈ２とする）を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
回収したｃ１、ｈ１断片各１μｇについてＢＡＰ処理を行った。ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出、エタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
ＢＡＰ処理したｃ１及びｈ１断片１μｌをそれぞれｈ２、ｃ２断片４μｌに連結し（４℃、一夜）、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １ｍＭ  ＤＴＴ，ＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕ、またはＢａｍＨＩ（宝酒造）８Ｕ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃、１時間消化した。ｃ１−ｈ２が正しく連結されていれば、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで７１３４／２６９ｂｐの消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。
これをヒトＦＲ１，２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。一方、ｈ１−ｃ２のクローンが得られなかったので、ｐＵＣベクター上で組換えてからＨＥＦベクターにクローニングした。その際、アミノ酸置換のないヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、及びＦＲ３内の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに置換したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９を鋳型として用いた。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９の各１０μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＨｉｎｄＩＩＩ  １６Ｕ，ＡｆｌＩＩ  ４Ｕを含有する反応混合液３０μｌ中で３７℃、１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９から２１５ｂｐ（ｃ２’）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９からそれぞれ３２１８ｂｐ（ｈａ１’，ｈｄ１’）のＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
ｈａ１’、ｈｄ１’断片をそれぞれｃ２’断片に連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９とした。
得られたプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９，ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化した。それぞれ７４３ｂｐのＤＮＡ断片を２％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。
各ＤＮＡ断片４μｌを前述のＢＡＰ処理したＨＥＦベクター１μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製した各プラスミドを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕ，ＰｖｕＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれマウスＦＲ１，２／ヒトＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏとした。
（ｉｉ）ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体の作製
ＣＤＲ１内にあるＳｎａＢＩ切断部位を利用することによって、同様にＦＲ１とＦＲ２のハイブリッド抗体を作製した。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏの各１０μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＳｎａＢＩ（宝酒造）６Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。次に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＰｖｕＩ  ６Ｕを含有する反応混合液５０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
反応液を１．５％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｍ１）および２３４９ｂｐ（ｍ２）、プラスミドｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｈｍ１）および２３４９ｂｐ（ｈｍ２）の各ＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液４０μｌに溶解した。
ｍ１、ｈｍ１断片１μｌをそれぞれｈｍ２、ｍ２断片４μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製した各プラスミドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，ＡｐａＩ（宝酒造）８Ｕ、またはＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
各断片が正しく連結されていれば、ＡｐａＩで７３０４ｂｐ、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ（ｍ１−ｈｍ２）、ＡｐａＩで６５３８／７６６ｂｐ、ＡｐａＬＩで３５３５／２０２５／１２４６／４９８ｂｐ（ｈｍ１−ｍ２）の消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれヒトＦＲ１／マウスＦＲ２，３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、マウスＦＲ１／ヒトＦＲ２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。
（４）ヒト型化抗体Ｌ鎖の構築
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（ＧＥＮ−ＢＡＮＫ、Ｄｅｆｔｏｓ  Ｍら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，１９９４）由来のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ）由来のＦＲ４を有するヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために６個のＰＣＲプライマーを使用した。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配列番号３０）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）及びＭＢＣ１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ４とホモロジーを有する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）にて行った。
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、この反応混合液に５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＶＲ１を加え、さらに同じ温度サイクルで３０回反応させた。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９と命名した。しかしながらＣＤＲ４の１０４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号９６位）のアミノ酸がアルギニンになっていたため、これをチロシンに修正するための修正プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒ（配列番号３５）を設計し、合成した。ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして０．６μｇのプラスミドｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４プライマー及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶプライマーを用いて塩基配列を決定した結果、正しい配列を得ることができたので、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、４１６ｂｐの断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９に導入し、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＣＯＳ１と命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン”ａ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号６６に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号４７に示す。
バージョン”ｂ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。バージョン”ｂ”では４３位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４３位）のグリシンをプロリンに、４９位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４９位）のリジンをアスパラギン酸に変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ５Ｒ（配列番号３６）とプライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。塩基配列決定後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。
こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含む断片をプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｃ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。バージョン”ｃ”では８４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８０位）のセリンをプロリンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ６Ｓ（配列番号３７）とプライマーＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶによりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
塩基配列決定後、制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化し、ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｄ”、”ｅ”及び”ｆ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に”ａ”、”ｂ”、”ｃ”バージョンの９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１１Ｒ（配列番号３８）とプライマーＭ−Ｓ１（配列番号４４）によりそれぞれｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＣＯＳ１，ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＣＯＳ１，ｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣＯＳ１を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｈＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することより調製したＣλ／ｐＵＣ１９と連結した。
こうして得られたプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＵＣ１９とした。これらのプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＣＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＣＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｇ”及び”ｈ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に”ａ”、”ｄ”バージョンの３６位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号３６位）のヒスチジンをチロシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ９Ｒ（配列番号３９）およびＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶをプライマーとして用いて、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物とＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４をプライマーとして用いて、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてさらにＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することで調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。このプラスミドを鋳型として、プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１３Ｒ（配列番号４０）とＭＢＣ１ＬＶＳ１をプライマーとしたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩで消化し、ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９に導入した。塩基配列を決定し、正しい配列を含むプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＵＣ１９とし、これらのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＣＯＳ１およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｋ”、”ｌ”、”ｍ”、”ｎ”および”ｏ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１４Ｓ（配列番号４１）とプライマーＶ１ＲＶ（λ）（配列番号４３）によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定を行い、それぞれのバージョンに対応した変異が導入されたクローンを選択した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＵＣ１９（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）と命名した。バージョン”ｊ”、”ｌ”、”ｍ”および”ｏ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号６７、６８、６９、７０に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４８、４９、５０、５１に示す。
バージョン”ｐ”、”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”および”ｔ”は、バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｍ”、”ｌ”または”ｏ”のアミノ酸配列の８７位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョンであり、ＦＲ３内にある制限酵素Ａｏｒ５１ＭＩ切断部位を利用して、バージョン”ｈ”を、各バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｍ”、”ｌ”または”ｏ”とつなぎ換えることにより作製したものである。すなわち、発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｍ，ｌ，ｏ）中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐを除き、ここに発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＣＯＳ１中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐをつなぐことにより９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンとなるようにした。塩基配列決定を行い、各バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｍ”、”ｌ”および”ｏ”の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンに置換されたクローンを選択し、対応するバージョンをそれぞれ”ｐ”、”ｑ”、”ｓ”、”ｒ”および”ｔ”とし、得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｐ，ｑ，ｓ，ｒ，ｔ）と命名した。バージョン”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”および”ｔ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号７１、７２、７３、７４に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５２、５３、５４、５５に示す。
プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９にサブクローニングし、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９と命名した。
ヒト型化Ｌ鎖の各バージョンにおける置換アミノ酸の位置を表８に示す。
0004516711.tif 000010
表中、Ｙはチロシン、Ｐはプロリン、Ｋはリジン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロイシンを示す。
なお、前記プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（５）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ハイブリッド抗体およびヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。すなわちＬ鎖ハイブリッド抗体の一過性発現では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとの組み合わせを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１×１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ  １０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体の一過性発現では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ａ〜ｔ）のいずれかの組み合わせをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いて、前記ハイブリッド抗体の場合と同様の方法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、得られた培養上清をＥＬＩＳＡに供した。
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのハイブリッド抗体またはヒト型化抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、キット添付の処方に従って行った。
（６）ＥＬＩＳＡ
（ｉ）抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．０２％  ＮａＮ３）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％  ＮａＮ３、１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ  ＩｇＧ１λ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いた。
（ｉｉ）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。
（７）活性確認
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖の評価
ヒト型化Ｈ鎖バージョン”ａ”とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体とＰＴＨｒＰ結合能が同等であった。この結果は、Ｈ鎖Ｖ領域のヒト型化はバージョン”ａ”で十分なことを示す。以下、ヒト型化Ｈ鎖バージョン”ａ”をヒト型化抗体のＨ鎖として供した。
（ｉｉ）ハイブリッド抗体の活性
（ｉｉ−ａ）ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλあるいはｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλの場合はいずれもキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体と同等の結合活性を示した。これらの結果は、ＦＲ３，４はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ１，２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
（ｉｉ−ｂ）ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合はキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体と同等の結合活性を示した。これらの結果は、ＦＲ１，２のうちＦＲ１はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
（ｉｉｉ）ヒト型化抗体の活性
Ｌ鎖としてバージョン”ａ”から”ｔ”の各々一つを用いたヒト型化抗体について、抗原結合活性を測定した。その結果、Ｌ鎖バージョン”ｊ”、”ｌ”、”ｍ”、”ｏ”、”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”、”ｔ”を有するヒト型化抗体はキメラ抗体と同等のＰＴＨｒＰ結合能を示した。
（８）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｍλ／ｐＣＯＳ１またはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ１あるいはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｒλ／ｐＣＯＳ１の組み合わせで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖ＤＮＡにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し、エレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ  １０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）添加、ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８  Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生能の高い細胞を選別した。
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により細胞破片を除去した。ＣＨＯ細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
〔参考例５〕中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性の測定は、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８−５細胞を用いて行った。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８−５細胞を、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＨａｍ’Ｓ  Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ）中にて、ＣＯ２インキュベーターで培養した。ＲＯＳ１７／２．８−５細胞を９６穴プレートに１０４細胞／１００μｌ／穴で蒔込み１日間培養し、４ｍＭのＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅと１０％牛胎児血清を含むＨａｍ’Ｓ  Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ）に交換する。さらに３ないし４日間培養した後、２６０μｌのＨａｍ’Ｓ  Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄し、１ｍＭのイソブチル−１−メチル  キサンチン（ＩＢＭＸ、ＳＩＧＭＡ）および１０％の牛胎児血清と１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む８０μｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。
中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗体またはヒト型化抗体を、あらかじめ１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌおよび０．３７μｇ／ｍｌの群、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの群、または１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６３μｇ／ｍｌおよび０．３１μｇ／ｍｌの群に段階希釈し、４ｎｇ／ｍｌに調製したＰＴＨｒＰ（１−３４）と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）の混合液８０μｌを各穴に添加した。各抗体の最終濃度は上記抗体濃度の４分の１になり、ＰＴＨｒＰ（１−３４）の濃度は１ｎｇ／ｍｌになる。１０分間室温にて処理した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄したした後、１００μｌの０．３％塩酸９５％エタノールにて細胞内のｃＡＭＰを抽出する。水流アスピレーターにて塩酸エタノールを蒸発させ、ｃＡＭＰ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ’Ｓ）付属のＥＩＡバッファー１２０μｌを添加しｃＡＭＰを抽出後、ｃＡＭＰ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ’Ｓ）添付の処方に従ってｃＡＭＰを測定した。その結果、キメラ抗体と同等の抗原結合を有するＬ鎖バージョンのうち、９１位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョン”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”、”ｔ”を有するヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示し、その中でも、バージョン”ｑ”がもっとも強い中和能を示した。
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配列番号３９：合成ＤＮＡ
配列番号４０：合成ＤＮＡ
配列番号４１：合成ＤＮＡ
配列番号４２：合成ＤＮＡ
配列番号４３：合成ＤＮＡ
配列番号４４：合成ＤＮＡ
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体の安定化製剤が提供された。また、本発明により、疼痛緩和作用を有する注射製剤が提供された。
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【図面の簡単な説明】
図１は、種々のｐＨの製剤について、加速試験を行った前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す電気泳動写真である。
図２は、種々の緩衝液濃度の製剤について、加速試験を行った前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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