(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体の表層に標的分子を付加するための、親水性ポリマー骨格を有する１又は複数の試薬分子を含んでなる試薬組成物であって、当該試薬に標的分子を吸引させるための１又は複数のイオン基と、この吸引された標的分子上の対応の官能基と共有結合を形成するための１又は複数の熱化学反応性のアミン反応基又はスルフヒドリル反応基とが、前記の１又は複数の試薬分子の親水性ポリマー骨格に結合してなる、試薬組成物。
【請求項２】
前記標的分子が核酸であるとともに、適当なエネルギー源由来のエネルギーの適用により前記試薬組成物を前記表層に付加させるための１又は複数の光反応基が、前記の１又は複数の試薬分子の親水性ポリマー骨格に結合してなり、前記光反応基が光反応性アリールケトン類である、請求項１記載の試薬組成物。
【請求項３】
基体の表層に標的分子を付加するための、第一試薬と第二試薬とを含んでなる試薬組成物であって、
第一試薬が親水性骨格を有するとともに、１又は複数のイオン基と、１又は複数の光反応基とが、前記第一試薬の親水性骨格に結合してなり、
第二試薬が親水性骨格を有するとともに、１又は複数の熱化学反応性のアミン反応基又はスルフヒドリル基と、１又は複数の光反応基とが、前記第二試薬の親水性骨格に結合してなる、試薬組成物。
【請求項４】
基体の表層に標的分子を付加するための方法であって、
（ａ）請求項１記載の試薬組成物を、当該基体の表層に供与する工程；
（ｂ）当該標的分子を前記表層に、当該イオン基が前記標的分子を結合した前記試薬組成物に吸引させることを可能にするのに十分に近づける工程；そして
（ｃ）前記熱化学反応性のアミン反応基又はスルフヒドリル反応基を、当該吸引された標的分子と共有結合を形成させるようにする工程を含んで成る方法。
【請求項５】
適当なエネルギー源に由来するエネルギーの適用により前記試薬組成物を前記表層に付加させるための１又は複数の光反応基が、前記の１又は複数の試薬分子の親水性ポリマー骨格に結合してなる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記イオン基が第四アンモニウム基を含んで成る、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記標的分子が核酸であり、そして前記光反応基が光反応性アリールケトン類である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
基体の表層に標的分子を付加するための方法であって、
（ａ）請求項３記載の試薬組成物を、当該基体の表層に供与する工程；
（ｂ）当該標的分子を前記表層に、当該イオン基が前記標的分子を結合した前記試薬組成物に吸引させることを可能にするのに十分に近づける工程；そして
（ｃ）前記熱化学反応性のアミン反応基又はスルフヒドリル反応基を、当該吸引された標的分子と共有結合を形成させるようにする工程を含んで成る方法。
【請求項９】
前記標的分子が核酸である、請求項４又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン基が第四アンモニウム基及びプロトン化第三アミンから成る群から選ばれる、請求項４又は請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸がアミン及びスルフヒドリル基から成る群から選ばれる官能基を含んで成る、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記光反応基が光反応アリールケトン類である、請求項４又は請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記光反応アリールケトン類が各々、独立して、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環から成る群から選ばれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項４又は請求項８に記載の方法により標的分子及び試薬組成物でコーティングされた基体表層。
【請求項１５】
前記試薬組成物がそれを適当な起源に由来するエネルギーの適用により前記表層に付加させるための１又は複数の光反応基を更に含んで成る、請求項１４記載の表層。
【請求項１６】
前記標的分子が核酸である、請求項１５記載の表層。
【請求項１７】
前記イオン基が第四アンモニウム基及びプロトン化第三アミンから成る群から選ばれる、請求項１４記載の表層。
【請求項１８】
前記核酸がアミン及びスルフヒドリル基から成る群から選ばれる官能基を含んで成る、請求項１６記載の表層。
【請求項１９】
前記光反応基が光反応アリールケトン類から成る群から選ばれる、請求項１４記載の表層。
【請求項２０】
前記光反応アリールケトン類が各々、独立して、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環から成る群から選ばれる、請求項１９記載の表層。
【請求項２１】
請求項１又は請求項３に記載の試薬組成物がコーティングされてなる表層。
【請求項２２】
前記試薬組成物がそれを適当な起源に由来するエネルギーの適用により前記表層に付加させるための１又は複数の光反応基を更に含んで成る、請求項２１記載の表層。
【請求項２３】
前記標的分子が核酸である、請求項２２記載の表層。
【請求項２４】
前記イオン基が第四アンモニウム基及びプロトン化第三アミンから成る群から選ばれる、請求項２１記載の表層。
【請求項２５】
前記核酸がアミン及びスルフヒドリル基から成る群から選ばれる官能基を含んで成る、請求項２３記載の表層。
【請求項２６】
前記光反応基が光反応アリールケトン類から成る群から選ばれる、請求項２１記載の表層。
【請求項２７】
前記光反応アリールケトン類が各々、独立して、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環から成る群から選ばれる、請求項２６記載の表層。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は標的分子、例えばオリゴヌクレオチド（オリゴ）を表層に付加させるための方法、及びかかる方法において利用するための組成物に関する。別の観点において、本発明は得られるコーティングされた表層自体に関連する。更なる別の観点において、本発明は分子を表層に付加させるための光化学及び熱化学手段の利用に関連する。
【０００２】
発明の背景
支持体の表層上へのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の固定化はＤＮＡを基礎とするアッセイ系の開発、並びにＤＮＡ分析のためのマイクロ集成アレーの開発等のその他の目的において重要な観点となってきている。例えば、「The Development of Microfabricated Arrays of DNA Sequencing and Analysis」O'Donnell-Maloney ら、TIBTECH 14 : 401-407 (1996) を参照のこと。一般に、かかる手順はマイクロウェルプレート、チューブ、ビーズ、顕微鏡スライド、シリコンウェーハー又は膜の表層上で実施する。特に、一定のアプローチが開発され、合成オリゴの表層への終点付着の可能性を実現又は向上させている。終点付着（即ち、一方又は他方の末端ヌクレオチドを介する核酸配列の付加による）が所望され、なぜなら配列全体が別の核酸配列とのハイブリダイゼーションのために有効となるからである。これはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での一塩基対変化の検出のために極めて有利である。
【０００３】
ハイブリダイゼーションは固相支持体上に固定化されたプローブに対する塩基対形成により核酸を測定するための最も日常的に利用されている方法である。増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と組合せると、ハイブリダイゼーションアッセイは診断及び研究のための強力な手段となる。特にマイクロウェルプレートは比較的大量のサンプルをアッセイするために簡便且つ有用である。核酸プローブをマイクロウェルプレートに固定するためにいくつかの方法が利用されている。そのいくつかは未改質又は改質オリゴのポリスチレンプレートへの吸着を包含する。その他は共有固定化を包含する。様々な方法がハイブリダイゼーションアッセイの感度を高めるためにも利用されている。ポリマー捕獲及び検出プローブが合成され、そして１０7 ＤＮＡ分子／mlまでの感度を得るのに利用されている。別の方法はハイブリダイゼーションアッセイの感度を高めるために枝分れオリゴを利用する。更なる別の方法はマルチステップ抗体増強方法を利用する。その他のタイプの核酸プローブ、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）も診断用途におけるＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションのためにマイクロウェルに固定化されている。更に、ＰＣＲプライマーが固相ＰＣＲのためにマイクロウェルに固定化されている。
【０００４】
今日まで、商業的製品に至っているＤＮＡを固定化するアプローチはごくわずかしかない。かかる製品の一つは「ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋ（商標）」として知られ、そしてNalge Nunc Internationalから入手できる（例えば、Nunc Tech Note Vol. 3, No. 17 参照のこと) 。この製品において、ＤＮＡはカルボジイミドと反応させて５′リン酸基を活性化させ、次いでそれを表層上の官能基と反応させている。このアプローチの欠点はそれがカルボジイミドの添加という追加の工程、並びにＤＮＡの固定化のための５時間の反応を要し、そしてそれが単一タイプの基体材料に制約される点にある。
【０００５】
別の例として、Ｐｉｅｒｃｅは最近「Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）DNA Coating Solutions 」として知られる適当なＤＮＡ固定化製品を紹介している (「Instructions-Reacti-BindTM DNA Coating Solution 」１／1997参照のこと) 。この製品はＤＮＡと混合し、そしてポリスチレン又はポリプロピレンの如き表層を適用するものである。一夜のインキュベーション後、溶液を除去し、表層をバッファーで洗い、そして乾かし、しかる後それはハイブリダイゼーションの用意が整う。この製品の説明書はそれが研究室において利用される全ての一般的なプラスチック表層に有用であると記載されてはいるものの、実際にはいくつかの制約がある。例えば、出願人はその製造者の仕様書を利用してポリプロピレンにＤＮＡを固定化するのに有用であることを実証できなかった。更に、この製品は大量のＤＮＡを必要とする。この仕様書はＤＮＡが０．５〜５μｇ／mlの濃度で使用すべきことを示唆している。
【０００６】
同様に、Ｃｏｓｔａｒはマイクロウェルプレート内のウェルの表層にＤＮＡを付加するために利用する「ＤＮＡ−ＢＩＮＤ（商標）」という名の製品を販売している（例えば、DNA-BINDTM「Application Guide 」を参照のこと) 。ＤＮＡ−ＢＩＮＤ（商標）プレートの表層にはＮ−オキシスクシニミド（ＮＯＳ）反応基を含む無電荷の非ポリマー性低分子量ヘテロ二価試薬がコーティングされている。この基は求核基、例えば第一アミンと反応する。このヘテロ二価コーティング試薬は更にこの反応基をポリスチレンプレートの表層に共有結合させる光化学基及びスペーサーアームを含む。その後、アミン改質ＤＮＡがＮＯＳ表層に共有カップリングされうる。このＤＮＡは第一アミンを合成プロセスの際に新生オリゴマーに付加することにより又は予備成形した配列に酵素的に付加させることにより改質されている。ＤＮＡ−ＢＩＮＤ（商標）製品はポリスチレン系であるため、熱サイクルの如き高温を要する用途への利用は制約される。
【０００７】
このような様々な製品はいくつかの目的又は所定の環境のもとで有用でありうるが、全て１又は複数の欠点及び制約に悩される傾向にある。特に、それらは不適切に高いバックグランドノイズの原因となる大量のオリゴを要する傾向にあり、及び／又は多様性を欠く。
【０００８】
オリゴの如き分子を表層に、このような従来のアプローチの欠点の一部又は全てを回避しながら付加させることができることが極めて所望されるであろう。
【０００９】
発明の概要
本発明は基体、例えばマイクロウェルプレート、チューブ、ビーズ、顕微鏡スライド、シリコンウェーハー又は膜に標的分子を共有付加するための方法及び試薬組成物を提供する。好適な態様において、この方法及び組成物は核酸プローブをプラスチック材料、例えばハイブリダイゼーションアッセイに利用するためのマイクロウェルプレート等に固定化するために利用する。例えば、マイクロウェルプレートは様々な材料、例えば限定することなく、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルクロリド及びポリプロピレンから製造でき、そして本発明の試薬でコーティングされる。この試薬組成物はかくして核酸を吸引及び共有付加の双方のために利用でき、これにより核酸はその相補鎖とハイブリダイゼーションするのに利用できるようになる。
【００１０】
本発明の試薬組成物は熱化学反応基（即ち、温度依存性の反応速度を有する基）及び吸引基を含む。任意的、且つ好適には、この組成物は更に光反応基も含みうる。更に、この試薬は１又は複数の親水性ポリマーを含んで成ってよく、それに熱化学反応性、吸引性及び／又は光反応性の基が懸垂している。この光反応基（又の名を「光学基」）は、例えば光の如き適当なエネルギー源の適用により試薬分子を支持体の表層に付加するのに利用できる。かくして、熱化学反応基は標的分子上の適当且つ相補的な官能基との共有結合を形成するのに利用できうる。一般に、この試薬分子をまず光学基の活性化を介して表層に付加させ、しかる後に標的分子（例えばオリゴ）を結合試薬に対し、結合試薬上の吸引（例えばイオン）基と標的上の対立に帯電した基との間でイオン的相互作用をほとんど頼りにして吸引させる。結合試薬、換言すれば表層に一旦吸引すると、この標的分子は結合試薬の反応基と標的分子上の適当な官能基との反応により結合試薬に熱化学的にカップリングされうる。この熱化学反応基及びイオン基は同一のポリマー上にあるか、又は表層に一緒に固定化されている別々のポリマー上にあってよい。
【００１１】
理論に拘束されるつもりはないが、イオン基、例えば陽イオン基、例えば第四アンモニウム基又はプロトン化（即ち、酸性化）第三アミンの存在は、静電力及びその他の力を介して表層に核酸配列を吸引させるのを担うようである。この吸引は、かくして、核酸配列上の対応の反応基と効率的にカップリングするその反応基の能力を増強させる。任意的、且つ好適には、この標的分子は当該試薬分子の反応基で調製されているか、又はその反応基となる官能基が施されている。例えば、合成の際、オリゴはアミン及びスルフヒドリル基の如き官能基で調製できる。
【００１２】
本発明は更に標的分子、例えばオリゴを表層に本明細書に記載の試薬を利用して付加する方法を提供する。かくして、本発明はかかる試薬を介して付加された核酸を有する表層、並びにかかる表層を提供する材料（例えばマイクロウェルプレート）を提供する。
【００１３】
別の観点において、本発明は本発明の試薬と、この試薬の熱化学反応基と反応性の１又は複数の官能基を含む標的分子との組合せを含んで成る組成物を提供する。
【００１４】
例えば、特に好適な試薬の例は本明細書の中で「フォトポリＱｕａｔ」として記載されているものであり、それにおいては複数個の光学基及び複数個の陽イオン基（第四アンモニウム基の形態）が親水性ポリマー骨格に付加されている。かかる試薬は光学ポリＮＯＳに、標的分子の固定化のための最適な濃度及び比で一緒に固定化されることにより、著しい多様性を供する。
【００１５】
かかる試薬を利用して、出願人は捕獲プローブを様々な表層、例えば本来はプローブを吸着しないであろう表層（例えばポリプロピレン及びポリビニルクロリド）等に共有固定化することができる。得られる表層はポリスチレン又はポリカーボネート上に吸着される改質オリゴで得られるものと同等又はそれより優れたシグナルを供する。
【００１６】
当該固定化試薬及び方法は従来報告されているものよりも簡単な態様で増幅方法に利用でき、そして求核試薬誘導化核酸の共有固定化のための改良された表層も提供できる。増幅方法及びハイブリダイゼーションアッセイのための固定化プローブの他に、本発明の試薬はＰＣＲ及びその他の固相配列決定のため及び増幅技術のための固定化プライマーのための改良された核酸固定化を提供できうる。
【００１７】
詳細な説明
本発明の好適な試薬組成物は対応の標的分子を吸引する能力を有する１又は複数のイオン基を、表層に当該試薬を付加するのに有用な１又は複数の光反応基及び当該標的分子の対応の反応基と共有結合を形成するのに有用な１又は複数の熱化学反応基と共に抱える親水性骨格を含んで成る。任意的、且つ好適には、この組成物は２種類以上の試薬分子の利用を含むことができ、その第一の試薬分子は対応の標的分子を吸引する能力を有する１又は複数のイオン基を、表層に当該試薬を吸引するのに有用な１又は複数の光反応基と共に抱える親水性骨格を含んで成る。第二の試薬分子は前記標的分子の対応の官能基と共有結合を形成するのに有用な１又は複数の熱化学反応基を、表層に当該試薬を吸引するのに有用な１又は複数の光反応基と共に抱える親水性骨格を含んで成る。任意的に、当該試薬分子の一方が光反応基を有するだけでよく、なぜならこの試薬は光化学架橋を通じて第二ポリマーを一緒に固定化できるからである。しかしながら、このような場合、この試薬分子は表層及び第二ポリマーへのカップリングを供するために２以上の光反応基を有さなくてはならない。
【００１８】
本発明の更なる外延において、イオン基及び熱化学反応基の双方が親水性ポリマーの一部として組込まれている必要はない。例えば、適当なスペーサーにより分離された１又は複数の光反応基と１又は複数の熱化学反応基を有する小型のヘテロ二価分子をイオン基を有する光反応親水性ポリマーと一緒に核酸配列の固定化を成し遂げるために利用してよい。反対に、適当なスペーサーにより分離された１又は複数の光反応基と１又は複数のイオン基とを有するヘテロ二価分子を熱化学反応基を有する光反応親水性ポリマーと一緒に利用してよい。好適ではあるが、親水性ポリマー骨格の利用は任意的にすぎず、なぜならイオン基及び熱化学反応基は共に２つの独立した光反応ヘテロ二価分子として又は双方のタイプの基を抱える単独の光反応分子として組込むことができるからである。
【００１９】
本発明の別の態様において、光反応基を利用することなく核酸配列を固定化することが可能である。例えば、コーティングを施すべき材料の表層に、前述の通りイオン及び熱化学反応基を有する親水性ポリマーを固定化するのに利用できうる熱化学反応基を施してよい。例えば、表層をアンモニアプラズマで処理して所定の数の反応性アミンを材料の表層に導入することができる。この表層を次に第四アンモニウム基及びＮＯＳ基の双方を有する親水性ポリマーで処理するなら、このポリマーはそのＮＯＳ基と表層上のアミンとの反応を通じて固定化できる。好ましくは、このポリマー上のＮＯＳ基は、十分な数の熱化学反応基が固定化の後に残り、核酸配列のカップリングを可能にすることを確実にするよう、表層上のアミンに対して過剰量とする。
【００２０】
当業者は、本説明により、注目の標的分子のタイプに依存して適当なイオン基を特定及び選定できるであろう。標的分子には、限定することなく、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（限定することなく、酵母、ウィルス、細菌、哺乳動物、昆虫等）、ＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ＰＮＡ及びオリゴが挙げられる。
【００２１】
適当なイオン基には第四アンモニウム塩、プロトン化第三アミン及びその他の陽イオン基、例えばホスホニウム化合物が挙げられる。更に含まれるのは、酸性環境に置かれたときにプロトン化されることのできる第三アミン基である。第四アンモニウム塩にはアルキル第四アンモニウム化合物、例えば［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＭＡＰＴＡＣ）、並びに第四アンモニウム群、例えばピリジニウム化合物が挙げられる。ホスホニウム化合物にはトリブチル（４−ビニルベンジル）ホスホニウムクロリドの如きモノマーから調製され、そしてJ. Appl. Polymer Sci. 53, 1237 (1994)(その開示内容は引用することで本明細書に組入れる) に記載のポリマーが挙げられる。
【００２２】
ポリマー骨格は合成又は天然であってよく、そして好ましくはオリゴマー、ホモポリマー及び付加又は縮合重合から得られるコポリマーから成る群から選ばれる合成ポリマーである。天然ポリマー、例えば多糖類、ポリペプチドも同様に利用できうる。好適な骨格は、それが記載の態様での利用に適合しない、又は有害な生物学的機能を供与しない点で生物学的に不活性なものとする。
【００２３】
かかるポリマー骨格にはアクリル、例えばヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、アクリルアミド及びメタクリルアミドから重合されたもの、ビニル、例えばポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコール、ナイロン、例えばポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジパミド及びポリヘキサメチレンドデカンジアミド、ポリウレタン及びポリエチレンオキシドが挙げられうる。
【００２４】
本発明のポリマー骨格は所望の数及びタイプのイオン基、光学基及び熱化学反応基を抱えることのできる親水性骨格を供与するよう選定され、その組合せは選定の試薬に依存する。このポリマー骨格は表層と、様々なイオン基及び熱化学反応基との間のスペーサーを供するよう選定する。このようにして、この試薬は最適活性を発揮する十分な運動自由度を有するその他の基を供すよう、表層又は隣りの試薬分子に結合させることができる。このポリマー骨格は好ましくは親水性（例えば水溶性）であり、ポリアクリルアミド及びポリビニルピロリドンが特に好適なポリマーである。
【００２５】
本発明の試薬は当該ポリマー骨格に共有結合した１又は複数の懸垂潜伏反応（好ましくは光反応）基を担持する。光反応基は本明細書において規定されたものであり、そして好適な基はその特性を保持する条件下で保存されるときに十分に安定なものである。例えば、引用することで本明細書に組入れる米国特許第５，００２，５８２号を参照のこと。潜伏反応基は電磁スペクトルの様々な領域に応答性であるように選定でき、紫外光及びスペクトルの可視領域に対して応答性（ここでは、「光反応性」と称する）であることが特に好ましい。
【００２６】
光反応基は特定の外部刺激に応答して活性種構築に入り、例えば同一又は別々の分子により供与される隣接化学構造への共有結合をもたらす。光反応基は保存条件下ではその共有結合をそのまま保持するか、外部エネルギー源による活性化により、他の分子と共有結合を形成する分子内の原子の基である。
【００２７】
光反応基は活性種、例えばフリーラジカル、そして特にニトレン、カルベン及び励起状態のケトンを電磁エネルギーの吸収により構築する。光反応基は電磁スペクトルの様々な領域に対して応答性となるよう選定し、そして例えば紫外光及びスペクトルの可視領域に対して応答性である光反応基が好ましく、そして本明細書において時々「光化学基」又は「光学基」と呼ぶことがある。
【００２８】
光反応アリールケトン類、例えばアセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環（即ち、１０位においてＮ，Ｏ又はＳを有するようなアントロンの複素環類似体）又はその置換化（例えば、環置換化）誘導体が好ましい。かかるケトン類の官能基が好ましく、なぜならそれらは本明細書に記載の活性化／不活性化／再活性化サイクルに容易に入ることができるからである。ベンゾフェノンが特に好適な光反応成分であり、なぜならそれは三重項状態へのシステム間移行に入る励起単項状態の一次形成により光化学励起が可能だからである。励起三重項状態は水素原子の引き抜き（例えば支持体表層から）により炭素・水素結合に侵入でき、かくしてラジカルペアーが構築される。ラジカルペアーのその後の崩壊は新しい炭素−炭素結合の形成を招く。反応基（例えば炭素−水素）が結合のために有効でないなら、ベンゾフェノン基の紫外光誘導励起は可逆式となり、そしてその分子はエネルギー源の除去により基底状態のエネルギーレベルにまでもどる。光学活性化性アリールケトン類、例えばベンゾフェノン及びアセトフェノンが特に重要であり、なぜならこれらの基は水中で多重の再活性化に委ねられ、それ故コーティング効率の増大を供するからである。従って、光反応アリールケトン類が特に好ましい。
【００２９】
アジドは光反応基の好適なクラスを構成し、そしてアリールアシド（Ｃ6 Ｒ5 Ｎ3 ）、例えばフェニルアシド、そして特に４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、アシルアジド（−ＣＯ−Ｎ3 ）、例えばベンゾイルアジド及びｐ−メチルベンゾイルアジド、アジドホルメート（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ3 ）、例えばエチルアジドホルメート、フェニルアジドホルメート、スルホニルアジド（−ＳＯ2 −Ｎ3 ）、例えばベンゼンスルホニルアジド及びホスホリルアジド（ＲＯ）2 ＰＯＮ3 、例えばジフェニルホスホリルアジド及びジエチルホスホリルアジドが挙げられる。ジアゾ化合物は別のクラスの光反応基を構成し、そしてジアゾアルカン（−ＣＨＮ2 ）、例えばジアゾメタン及びジフェニルジアゾメタン、ジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ2 ）、例えばジアゾアセトフェノン及び１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン、ジアゾアセテート（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮＨ2 ）、例えばｔ−ブチルジアゾアセテート及びフェニルジアゾアセテート、及びベーターケト−アルファージアゾアセテート（−ＣＯ−ＣＮ2 −ＣＯ−Ｏ−）、例えばｔ−ブチルアルファージアゾアセトアセテートが挙げられる。その他の光反応基にはジアジリン（−ＣＨＮ2 ）、例えば３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン、及びケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）、例えばケテン及びジフェニルケテンが挙げられる。光学活性化性アリールケトン類、例えばベンゾフェノン及びアセトフェノンが特に重要であり、なぜならこれらの基は水中で多重の再活性化に委ねられ、それ故コーティング効率の増大を供するからである。
【００３０】
光反応基の活性化により、この試薬分子は光反応基の残基を介する共有結合により互いと及び／又は材料表層と共有結合する。典型的な光反応基及び活性化によるその残基を以下に示す。
【００３１】
0004426092.tif 000002
【００３２】
当業者は、本説明により、適切に誘導化された核酸配列の共有固定化を供するよう適当な熱化学反応基を特定及び選定できるであろう。例えば、アミノ誘導化核酸配列は活性化エステル、例えばＮＯＳエステルとの共有カップリング反応を経てアミド連結基を供するであろう。類似の活性化エステル、例えばｐ−ニトロフェニル及びペンタフルオロフェニルエステルもアミン基と反応したときにアミド結合を供するであろう。当業者は多種多様なその他のアミン反応性官能基、例えばイソシアネート、チオイソシアネート、カルボン酸クロリド、エポキシド、アルデヒド、アルキルハライド及びスルホネートエステル、例えばメシレート、トシレート及びトレシレートの各々も熱化学反応基として働きうることを認識している。
【００３３】
別の例において、この核酸配列は当業界周知の技術を利用してスルフヒドリル基で誘導化されうる。対応の熱化学反応基は、例えば、マレイミド環構造体又はα−ヨードアセトアミドであろう。これらの構造体はいずれもスルフヒドリル誘導化核酸配列と共有結合を供するよう容易に反応するであろう。
【００３４】
本発明の官能化ポリマーは予備形成ポリマーの適当な誘導化により、又はより好ましくは、所望の置換パターンを供するよう一組のコモノマーの重合により調製できうる。この後者のアプローチが好ましく、その理由は様々なコモノマーの比の変更の容易性及びポリマーへの組込みレベルの管理能力にある。これら２通りのアプローチの組合せも最適な構造体の提供に利用されうる。
【００３５】
好適な態様において、例えば、分子の一端において、他端にある光反応基又は熱化学反応基とはスペーサー基により隔離された重合性基を有するモノマーを調製する。例えば、重合性ビニル基、例えばアクリルアミド、アクリレート、又はマレイミドは短い炭化水素エステルを介して活性化エステル、例えばＮＯＳエステルに、又は光反応基、例えば置換化ベンゾフェノンにカップリングされうる。これらの化合物は当業者に周知の有機合成技術を利用して調製且つ精製されうる。所望のモノマーのいくつか、例えばＭＡＰＴＡＣ、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）及びＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）は市販されており、そしてこのような化合物はポリマーの骨格と一緒に第四アンモニウム塩、第三アミン及び第一アミンを供する。
【００３６】
コポリマーも当業者に公知の技術を利用して上記のモノマーから調製できる。好ましくは、これらのモノマー及びコポリマーはアゾ開始剤、例えば２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）又はペルオキシド、例えばベンゾイルペルオキシドを利用してビニル基のフリーラジカル重合に入る。重合のために選定されるモノマーは最終ポリマー生成物の種類に基づいて選ばれる。例えば、第四アンモニウム基を含む光反応性ポリマーは光反応基を含むモノマーと第四アンモニウム基を含む第二モノマーとから調製する。ＮＯＳ基を含む光反応性ポリマーは光反応基を含むモノマーと活性化ＮＯＳエステルを含む第二モノマーとから調製する。第四アンモニウム基及びＮＯＳエステルの双方を含む光反応性ポリマーは３種類のモノマー全てを利用して調製する。
【００３７】
最終ポリマーの組成は重合反応に添加するモノマーのモル比により調節できる。典型的には、このような官能化モノマーは重合反応の総モノマー含有量のうちの比較的低いモル％において利用され、この組成の残りは核酸配列に対して光反応でも熱化学反応性でもないモノマーから成る。かかるモノマーの例には、限定することなく、アクリルアミド及びＮ−ビニルピロリドンが挙げられる。利用するモノマーの相対的な反応性に基づき、骨格伝いのモノマーの分布はかなりランダムである。
【００３８】
時折り、このポリマーの骨格上の熱化学反応基は重合の間に存在しているならそれ自体が重合性モノマーとして働くことがあり、かくしてポリマーの一次形成の後の第二工程においてその基の導入が必要となる。例えば、骨格伝いにマレイミドを有する光反応性ポリマーの調製は、上記の技術を利用しての光反応基及びアミン基の双方を含むポリマーの一次調製、しかる後のアミン基と短い炭化水素スペーサーにより接続されたマレイミド基及びイソシアネートを含むヘテロ二価分子との反応により成し遂げることができる。多種多様なかかるポリマー修飾技術が当業者に公知の典型的な有機反応を利用して有用である。
【００３９】
本発明を以下の非限定例で更に詳しく説明する。当業者は本発明の範囲を逸脱することなくそれらの態様に様々な変更を施すことができることを承知しており、また本発明は開示の態様に限定されるものでもない。何らかのことわりのない限り、％は全て重量％で表示する。この実施例を通じて特定されている様々な「化合物」の構造は以降の表９に示してある。
【００４０】
実施例
実施例１
４−ベンゾイルベンゾイルクロリド（ＢＢＡ−Ｃ１）の調製（化合物Ｉ）
４−ベンゾイル安息香酸（ＢＢＡ）、１．０kg（４．４２mole）を還流コンデンサー及びオーバーヘッドスターラーの付いた乾燥した５リットルＭｏｒｔｏｎフラスコに加え、次いで６４５ml（８．８４mole）の塩化チオニル及び７２５mlのトルエンを加えた。次にジメチルホルムアミド３．５mlを加え、そしてこの混合物を４時間還流加熱した。冷却後、その溶媒を減圧で除去し、そして残留塩化チオニルは３×５００mlのトルエンを利用する３回のエバポレーションにより除去した。この生成物を１：４のトルエン：ヘキサンから再結晶化し、真空オーブンで乾燥後９８８ｇ（収率９１％）が得られた。生成物の融点は９２−９４℃であった。８０MHz (1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ））での核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は所望の生成物と一致した：芳香族プロトン７．２０−８．２５（ｍ，９Ｈ）。テトラメチルシラン内部標準の下流の化学シフト値は全てppm で表示する。最終化合物を、例えば実施例３記載の光活性化性ポリマーの合成において利用するモノマーの調製に利用するために保存した。
【００４１】
実施例２
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）の調製（化合物II）
１０００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 中の１，３−ジアミノプロパン１９１０ｇ（２５．７７mole）の溶液を１２リットルのＭｏｒｔｏｎフラスコに加え、そして氷浴上で冷却した。２５０mlのＣＨ2 Ｃｌ2 中のｔ−ブチルフェニルカルボネート１０００ｇ（５．１５mole）の溶液を反応温度が１５℃未満に保たれる速度で滴下した。添加の後、この混合物を室温にまで温め、そして２時間撹拌した。この反応混合物を９００mlのＣＨ2 Ｃｌ2 及び５００ｇの氷で希釈し、次いで２５００mlの２．２ＮのＮａＯＨをゆっくりと添加した。この溶液が塩基性であることを確認する検査の後、この生成物を分液ろう斗に移し、そして有機層を除去し、そして抽出物＃１としてとっておいた。次いで水性相を３×１２５０mlのＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出し、各抽出物は別々の画分に保っておいた。４つの有機抽出物を画分＃１から画分＃４の順番で１２５０mlの０．６ＮのＮａＯＨで１回づつ洗った。２回目のこの洗浄工程を新しい１２５０mlの０．６ＮのＮａＯＨで繰り返した。その有機抽出物を合わせ、そしてＮａ2 ＳＯ4 で乾かした。一定重量に至るまでの溶媒の濾過及びエバポレーションは８２５ｇのＮ−モノ−ｔ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパンを供し、それは更に精製することなく使用した。
【００４２】
１０２０mlのＣＨＣｌ3 中の８０６ｇ（５．２３mole）の無水メタクリル酸の溶液をオーバーヘッドスターラーの付いた１２リットルのＭｏｒｔｏｎフラスコに入れ、そして氷浴上で冷却した。フェノチアジン６０mgをインヒビターとして加え、次いで８２５mlのＣＨＣｌ3 中のＮ−モノ−ｔ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパン８２５ｇ（４．７３mole）を添加した。添加速度は反応温度を毎回１０℃未満に保つようにコントロールした。添加が完了した後、氷浴を取外し、そしてその混合物を一夜撹拌しておいた。この生成物を２４００mlの水で希釈し、そして分液ろう斗に移した。よく混合した後、水性層を除去し、そして有機層を２４００mlの２ＮのＮａＯＨで洗い、水性層が塩基性であることを確実にした。その有機層をＮａ2 ＳＯ4 で乾かし、そして濾過して乾燥剤を除去した。ＣＨＣｌ3 溶媒部を減圧で、生成物と溶媒の合計重量が約３０００ｇとなるまで除去した。次に所望の生成物を１１．０リットルのヘキサンを撹拌ＣＨＣｌ3 溶液にゆっくり添加することにより沈殿させ、次いで４℃で一夜保存した。この生成物を濾過により単離し、そしてその固体を９００mlのヘキサンと１５０mlのＣＨＣｌ3 との組合せ溶媒により２回すすいだ。この固体の十分な乾燥はＤＳＣによりm.p.８５．８℃の９００ｇのＮ−［Ｎ′−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−メタクリルアミドを供した。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）アミドＮＨ  ６．３０−６．８０、４．５５−５．１０（ｍ，２Ｈ）、ビニルプロトン５．６５、５．２０（ｍ，２Ｈ）、Ｎに隣接のメチレン２．９０−３．４５（ｍ，４Ｈ）、メチル１．９５（ｍ，３Ｈ）、残りのメチレン１．５０−１．９０（ｍ，２Ｈ）及びｔ−ブチル１．４０（ｓ，９Ｈ）。
【００４３】
三つ口の２リットルの丸底フラスコにオーバーヘッドスターラー及びガススパージチューブを付けた。メタノール７００mlをこのフラスコに加え、そして氷浴上で冷却した。撹拌しながら、ＨＣｌガスをこの溶媒に約５リットル／分の速度で全部で４０分吹込んだ。最終ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液のモル濃度は、インジケーターとしてフェノールフタレインを利用する１ＮのＮａＯＨによる滴定により８．５Ｍと決定された。Ｎ−［Ｎ′−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］メタクリルアミド９００ｇ（３．７１mole）をオーバーヘッドスターラー及びガス出口アダプターの付いた５リットルのＭｏｒｔｏｎフラスコに加え、次いで１１５０mlのメタノール溶媒を添加した。フラスコ内に残っている多少の固体はこの溶媒の容積を有する。フェノチアジン３０mgをインヒビターとして加え、次いで６５５ml（５．５７mole）の８．５ＭのＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液を加えた。この固体をガスを発生させながら、しかし反応が発熱しないようにしてゆっくりと溶解させた。この混合物を室温で一夜撹拌し、反応の完了を確実にした。固体を全て濾過により除き、そして更に３０mgのフェノチアジンを添加した。この溶媒を減圧で除去し、そして得られる固体残渣を３×１０００mlのイソプロパノールと減圧でエバポレーションしながら共沸させた。最後に、この生成物を２０００mlの還流イソプロパノールに溶かし、そして４０００mlの酢酸エチルを撹拌しながらゆっくりと添加した。この混合物をゆっくりと冷却し、そして４℃で一夜保存した。化合物IIを濾過により単離し、そして一定の重量となるまで乾かし、ＤＳＣにより１２４．７℃の融点を有する生成物を収量６３０ｇで供した。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）ビニルプロトン５．６０、５．３０（ｍ，２Ｈ）、アミドのＮに隣接するメチレン３．３０（ｔ，２Ｈ）、アミンのＮに隣接するメチレン２．９５（ｔ，２Ｈ）、メチル１．９０（ｍ，３Ｈ）及び残りのメチレン１．６５−２．１０（ｍ，２Ｈ）。最終化合物を例えば実施例３に記載の光活性化性ポリマーの合成に利用するモノマーの調製において利用するために保存した。
【００４４】
実施例３
Ｎ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メチルアクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＰＭＡ）の調製（化合物III ）
実施例２に記載の一般方法に従って調製した化合物II  １２０ｇ（０．６７２mole）をオーバーヘッドスターラーの付いた乾燥した２リットルの三つ口丸底フラスコに加えた。フェノチアジン２３〜２５mgをインヒビターとして加え、次いで８００mlのクロロホルムを加えた。この懸濁物を氷浴上で１０℃未満に冷却し、そして実施例１に記載の一般方法に従って調製した化合物Ｉ  １７２．５ｇ（０．７０５mole）を固体として加えた。５０mlのクロロホルム中のトリエチルアミン２０７ml（１．４８５mole）を次に１〜１．５時間かけて滴下した。氷浴を取外し、そして周囲温度での撹拌を２．５時間続けた。次いでこの生成物を６００mlの０．３ＮのＨＣｌ及び２×３００mlの０．０７ＮのＨＣｌで洗った。硫酸ナトリウムで乾燥後、クロロホルムを減圧で除去し、そしてその生成物を４：１のトルエン：クロロホルムから２回再結晶化させ、各再結晶化においては重合を防ぐために２３〜２５ｇのフェノチアジンを使用した。化合物III の典型的な収率は９０％であり、融点は１４７−１５１℃であった。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物を一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）芳香族プロトン７．２０−７．９５（ｍ，９Ｈ）、アミドＮＨ  ６．５５（ブロードｔ，１Ｈ）、ビニルプロトン５．６５、５．２５（ｍ，２Ｈ）、アミドのＮに隣接するメチレン３．２０−３．６０（ｍ，４Ｈ）、メチル１．９５（ｓ，３Ｈ）、及び残りのメチレン１．５０−２．００（ｍ，２Ｈ）。最終化合物を例えば実施例９〜１１に記載の光活性化性ポリマーの合成に利用するために保存した。
【００４５】
実施例４
Ｎ−スクシニミジル６−マレイミドヘキサノエート（ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＣ）の調製（化合物IV）
官能化モノマーを下記の通りにして調製し、そしてポリマーの骨格上に活性化エステル基を導入するために実施例９及び１２に記載の通りにして利用した。６−アミノヘキサン酸１００．０ｇ（０．７６２mole）をオーバーヘッドスターラー及び乾燥チューブの付いた三つ口３リットルフラスコ内の３００mlの酢酸に溶かした。無水マレイン酸７８．５ｇ（０．８０１mole）を２００mlの酢酸に溶かし、そして６−アミノヘキサン酸溶液に加えた。この混合物を沸騰湯浴上で加熱しながら１時間撹拌し、白色固体の形成が得られた。室温で一夜冷却後、固体を濾過により集め、そして２×５０mlのヘキサンですすいだ。乾燥後、（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセンジオン酸の典型的な収量は１５８−１６５ｇ（９０−９５％）であり、融点は１６０−１６５℃であった。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）アミドプロトン８．６５−９．０５（ｍ，１Ｈ）、ビニルプロトン６．１０、６．３０（ｄ，２Ｈ）、窒素に隣接するメチレン２．８５−３．２５（ｍ，２Ｈ）、カルボニルに隣接するメチレン２．１５（ｔ，２Ｈ）、残りのメチレン１．００−１．７５（ｍ，６Ｈ）。
【００４６】
（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセンジオン酸１５０．０ｇ（０．６５４mole）、無水酢酸６８ml（７３．５ｇ、０．７２１mole）及びフェノチアジン５００mgをオーバーヘッドスターラーの付いた２リットルの三つ口丸底フラスコに加えた。トリエチルアミン９１ml（０．６５３mole）及び６００mlのＴＨＦを加え、そしてこの混合物を撹拌しながら還流加熱した。全部で４時間の還流の後、暗色の混合物を＜６０℃に冷却し、そして３リットルの水中の２５０mlの１２ＮのＨＣｌの溶液に注ぎ入れた。この混合物を室温で３時間撹拌し、次いで濾過パッド（Celite 545, J.T. Baker, Jackson, TN ) に通して濾過して固体を除去した。この濾液を４×５００mlのクロロホルムで抽出し、そして合わせた抽出物を硫酸ナトリウムで乾かした。重合を防ぐために１５mgのフェノチアジンを添加した後、その溶媒を減圧で除去した。６−マレイミドヘキサン酸を２：１のヘキサン：クロロホルムから再結晶化させ、７６−８３ｇ（５５−６０％）の典型的な収量を供し、融点は８１−８５℃であった。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）マレイミドプロトン６．５５（ｓ，２Ｈ）、窒素に隣接するメチレン３．４０（ｔ，２Ｈ）、カルボニルに隣接するメチレン２．３０（ｔ，２Ｈ）、及び残りのメチレン１．０５−１．８５（ｍ，６Ｈ）。
【００４７】
６−マレイミドヘキサン酸２０．０ｇ（９４．７mmol）をアルゴン雰囲気下で１００mlのクロロホルムに溶かし、次いで４１ml（０．４７mole）の塩化オキサリルを加えた。室温で２時間撹拌後、溶媒を減圧で除去し、ここで最後の過剰量の塩化オキサリルを除くために４×２５mlの追加のクロロホルムを使用した。この酸クロリドを１００mlのクロロホルムに溶かし、次いで１２．０ｇ（０．１０４mol ）のＮ−ヒドロキシスクシニミド及び１６．０ml（０．１１４mol ）のトリエチルアミンを加えた。室温で一夜撹拌後、その生成物を４×１００mlの水で洗い、そして硫酸ナトリウムで乾かした。溶媒の除去は２４．０ｇの生成物（８２％）を供し、それを更に精製することなく使用した。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）マレイミドプロトン６．６０（ｓ，２Ｈ）、窒素に隣接するメチレン３．４５（ｔ，２Ｈ）、スクシニミジルプロトン２．８０（ｓ，４Ｈ）、カルボニルに隣接するメチレン２．５５（ｔ，２Ｈ）、及び残りのメチレン１．１５−２．００（ｍ，６Ｈ）。最終化合物を例えば実施例９及び１２に記載の通りにして光活性化性ポリマーの合成に使用するために保存した。
【００４８】
実施例５
Ｎ−スクシニミジル６−メタクリルアミドヘキサノエート（ＭＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）の調製（化合物Ｖ）
官能化モノマーを下記のようにして調製し、そしてポリマーの骨格上に活性化エステル基を導入するために実施例１１に記載の通りにして利用した。６−アミノカプロン酸４．００ｇ（３０．５mmol）を乾燥チューブの付いた乾燥丸底フラスコに入れた。無水メタクリル酸５．１６ｇ（３３．５mmol）を加え、そしてこの混合物を室温で４時間撹拌した。得られる粘性の油をヘキサンで３回砕き、そして残りの油をクロロホルムに溶かし、次いで硫酸ナトリウムで乾かした。濾過及びエバポレーションの後、生成物の一部をシリカゲルフラッシュクラマトグラフィーにより、クロロホルム中の１０％のメタノールの溶媒系を用いて精製した。適当な画分を合わせ、１mgのフェノチアジンを加え、そして溶媒を減圧で除去した。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）カルボン酸プロトン７．８０−８．２０（ｂ，１Ｈ）、アミドプロトン５．８０−６．２５（ｂ，１Ｈ）、ビニルプロトン５．２０及び５．５０（ｍ，２Ｈ）、窒素に隣接するメチレン３．００−３．４５（ｍ，２Ｈ）、カルボニルに隣接するメチレン２．３０（ｔ，２Ｈ）、メチル基１．９５（ｍ，３Ｈ）及び残りのメチレン１．１０−１．９０（ｍ，６Ｈ）。
【００４９】
６−メタクリルアミドヘキサン酸３．０３ｇ（１５．２mmol）を３０mlのドライクロロホルムに溶かし、次いで１．９２ｇ（１６．７mmol）のＮ−ヒドロキシスクシニミド及び６．２６ｇ（３０．４mmol）の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。反応体をドライ雰囲気下で室温で一夜撹拌した。次いで固体を濾過により除去し、そして一部をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。非極性不純物をクロロホルム溶媒を利用して除去し、次いでクロロホルム中の１０％のテトラヒドロフランを利用して所望の生成物を溶出させた。適当な画分をプールし、０．２mgのフェノチアジンを加え、そして溶媒を減圧下でエバポレーションした。不純物として少量の１，３−ジシクロヘキシル尿素を含むこの生成物を更に精製することなく使用した。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）アミドプロトン５．６０−６．１０（ｂ，１Ｈ）、ビニルプロトン５．２０及び５．５０（ｍ，２Ｈ）、窒素に隣接するメチレン３．０５−３．４０（ｍ，２Ｈ）、スクシニミジルプロトン２．８０（ｓ，４Ｈ）、カルボニルに隣接するメチレン２．５５（ｔ，２Ｈ）、メチル１．９０（ｍ，３Ｈ）、及び残りのメチレン１．１０−１．９０（ｍ，６Ｈ）。最終化合物を例えば実施例１１に記載の通りにして光活性化性ポリマーの合成に利用するために保存した。
【００５０】
実施例６
４−ブロモメチルベンゾフェノン（ＢＭＢＰ）の調製（化合物VI）
４−メチルベンゾフェノン７５０ｇ（３．８２mole）をオーバーヘッドスターラーの付いた５リットルのＭｏｒｔｏｎフラスコに加え、そして２８５０mlのベンゼンに溶かした。この溶液を還流加熱し、次いで３３０mlのベンゼン中の６１０ｇ（３．８２mole）のブロミンを滴下した。添加速度は約１．５ml／min とし、そしてフラスコに９０ワット（９０ジュール／sec ）のハロゲンスポットライトで照射して反応を開始させた。１０％の実働サイクル（５秒間オン、４０秒間オフ）、次いで１時間後の２０％の実働サイクル（１０秒間オン、４０秒間オフ）を供するようランプと共にタイマーを使用した。添加の終了時に、この生成物をガスクロマトグラフィーにより分析し、そして７１％の所望の化合物VI、８％のジブロモ生成物及び２０％の未反応の４−メチルベンゾフェノンを含むことが認められた。冷却後、反応混合物を１００mlの水中の１０ｇの亜硫酸水素ナトリウムで洗い、次いで３×２００mlの水で洗った。この生成物を硫酸ナトリウムで乾かし、そして１：３のトルエンから２回再結晶化させた。真空乾燥後、６３５ｇの化合物VIが単離され、６０％の収率であり、そして１１２−１１４℃の融点を有した。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）芳香族プロトン７．２０−７．８０（ｍ，９Ｈ）及びベンジルプロトン４．４８（ｓ，２Ｈ）。最終化合物を実施例７に記載の通りにして光活性化性連鎖移動剤の調製に利用するために保存した。
【００５１】
実施例７
Ｎ−（２−メルカプトエチル）−３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンズアミドの調製（化合物VII ）
３，５−ジヒドロキシ安息香酸４６．２ｇ（０．３０mol ）をソクスレーエキトラクター及びコンデンサーの付いた２５０mlのフラスコの中に秤量した。メタノール４８．６ml及び濃硫酸０．８mlをフラスコに加え、そして４８ｇの３Ａモレキュラーシーブをソクスレーエキトラクターに入れた。このエキストラクターをメタノールで満たし、そしてこの混合物を一夜還流加熱した。得られる生成物のガスクロマトグラフィー分析は所望のメチルエステルへの９８％の転換率を示した。溶媒を減圧で除去して約５９ｇの粗生成物を得た。この生成物を以下の工程に更に精製することなく使用した。少量のサンプルを予めＮＭＲ分析のために精製し、所望の生成物と一致するスペクトルが得られた： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）芳香族プロトン６．７５（ｄ，２Ｈ）及び６．３８（ｔ，１Ｈ）及びメチルエステル３．７５（ｓ，３Ｈ）。
【００５２】
以上に由来する全メチルエステル生成物をオーバーヘッドスターラー及びコンデンサーの付いた２リットルのフラスコに入れ、次いで実施例６に記載の一般方法に従って調製した１７３．２５ｇ（０．６３mol ）の化合物VI、２０７ｇ（１．５０mol ）の炭酸カリウム及び１２００mlのアセトンを添加した。得られる混合物を一夜還流し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による指示に従い完全な反応が得られた。この固体を濾過により除去し、そしてアセトンを減圧でエバポレーションして４９ｇの粗生成物が得られた。この固体を１リットルの水に希釈し、そして３×１リットルのクロロホルムで抽出した。その抽出物をアセトン可溶性画分と合わせ、そして硫酸ナトリウムで乾かし、１７７ｇの粗生成物が得られた。この生成物をアセトニトリルから再結晶化させ、１５０．２ｇの白色固体が得られ、最初の２工程では９０％の収率であった。この生成物の融点は１３１．５℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）芳香族プロトン７．２５−７．８０（ｍ，１８Ｈ）、７．１５（ｄ，２Ｈ）及び６．７０（ｔ，１Ｈ）、ベンジルプロトン５．０５（ｓ，４Ｈ）及びメチルエステル３．８５（ｓ，３Ｈ）。
【００５３】
メチル３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンゾエート６０．０５ｇ（０．１０８mol ）を２リットルのフラスコに入れ、次いで１２０mlの水、４８０mlのメタノール及び６．４８ｇ（０．１６２mmol）の水酸化ナトリウムを添加した。この混合物を３時間還流し、エステルの加水分解を完了させた。冷却後、メタノールを減圧除去し、そして酸のナトリウム塩を２４００mlの温水に溶かした。この酸を濃塩酸を用いて沈殿させ、濾過し、水で洗い、そして真空オーブンで乾かして５８．２ｇの白色固体（収率９９％）を得た。この生成物の融点は１８８．３℃（ＤＳＣ）であり、そしてＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）芳香族プロトン７．３０−７．８０（ｍ，１８Ｈ）、７．１５（ｄ，２Ｈ）及び６．９０（ｔ，１Ｈ）及びベンジルプロトン５．２２（ｓ，４Ｈ）。
【００５４】
３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）安息香酸２０．０ｇ（３６．８６mmol）を２５０mlのフラスコに加え、次いで３６mlのトルエン、５．４ml（７４．０mmol）の塩化チオニル及び２８μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを添加した。この混合物を４時間還流し、酸クロリドを形成した。冷却後、溶媒及び過剰の塩化チオニルを減圧で除去した。残留塩化チオニルを２０mlづつのクロロホルムを用いながらの４回の更なるエバポレーションにより除去した。その粗材料をトルエンから再結晶化させ、１８．４５ｇの生成物、収率８９％を得た。この生成物の融点は１２６．９℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）芳香族プロトン７．３０−７．８０（ｍ，１８Ｈ）、７．２５（ｄ，２Ｈ）、及び６．８５（ｔ，１Ｈ）、及びベンジルプロトン５．１０（ｓ，４Ｈ）。
【００５５】
２−アミノエタンジオール塩酸塩４．１９ｇ（３６．７mmol）をオーバーヘッドスターラーの付いた２５０mlのフラスコに加え、次いで１５mlのクロロホルム及び１０．６４ml（７６．５mmol）のトリエチルアミンを加えた。このアミン溶液を氷浴上で冷却後、５０mlのクロロホルム中の３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンゾイルクロリド１８．４ｇ（３２．８mmol）の溶液を５０分かけて滴下した。水上での冷却を３０分続け、次いで室温に２時間温めた。この生成物を１５０mlのクロロホルムで希釈し、そして５×２５０mlの０．１Ｎの塩酸で洗った。この生成物を硫酸ナトリウムで乾かし、そして１５：１のトルエン：ヘキサンで２回再結晶化させ、１３．３ｇの生成物、収率６７％を得た。この生成物の融点は１１５．９℃（ＤＳＣ）であり、そしてＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）芳香族プロトン７．２０−７．８０（ｍ，１８Ｈ）、６．９８（ｄ，２Ｈ）及び６．６５（ｔ，１Ｈ）、アミドＮＨ６．５５（ブロードｔ，２Ｈ）、ベンジルプロトン５．１０（ｓ，４Ｈ）、アミドのＮに隣接するメチレン３．５２（ｑ，２Ｈ）、ＳＨに隣接するメチレン２．１０（ｑ，２Ｈ）及びＳＨ１．３８（ｔ，１Ｈ）。最終化合物を例えば実施例１２に記載の通りにして光活性化性ポリマーの合成における連鎖移動剤として利用するために保存した。
【００５６】
実施例８
Ｎ−スクシニミジル１１−（４−ベンゾイルベンズアミド）ウンデカノエート（ＢＢＡ−ＡＵＤ−ＮＯＳ）の調製（化合物VIII）
実施例１に記載の一般方法に従って調製した化合物Ｉ（５０ｇ、０．２０４mol ）を２５００mlのクロロホルムに溶かし、次いで１５００mlの水中の４３．１ｇ（０．２１４mol ）の１１−アミノウンデカン酸及び６０．０ｇ（１．５mol ）の水酸化ナトリウムの溶液を添加した。この混合物を５リットルのＭｏｒｔｏｎフラスコの中で１時間強く撹拌し、２層の十分な混合を確実なものとした。この混合物を２５０mlの濃塩酸で酸性にし、そして更に３０分撹拌した。その有機層を分離し、そして水性層を３×５００mlのクロロホルムで抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾かし、濾過し、そしてエバポレーションして固体を得た。その生成物をトルエンから再結晶化させ、６８．３７ｇ（８２％）の１１−（４−ベンゾイルベンズアミド）ウンデカン酸が得られ、融点は１０７−１０９℃であった。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）芳香族プロトン７．２０−７．８０（ｍ，９Ｈ）、アミドＮＨ６．３０（ブロードｔ，１Ｈ）、アミドのＮに隣接するメチレン３．３５（ｍ，２Ｈ）、カルボニルに隣接するメチレン２．２５（ｔ，２Ｈ）及び残りのメチレン１．００−１．８０（ｍ，１６Ｈ）。
【００５７】
１１−（４−ベンゾイルベンズアミド）ウンデカン酸６０．０ｇ（０．１４６mol ）をオーブン乾燥した２０００mlのフラスコ内の１２００mlの無水１，４−ジオキサンの中に温めながら溶解した。室温にまで冷却後、１７．７ｇ（０．１５４mol ）のＮ−ヒドロキシスクシニミド及び３３．２ｇ（０．１６１mol ）の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドをこの溶液に加え、そしてこの混合物を乾燥雰囲気下で一夜撹拌した。固体を濾過により除去し、フィルターケーキを１，４−ジオキサンですすいだ。この溶媒を真空下で除去し、そしてその生成物をエタノールから２回再結晶化させた。真空オーブンの中で十分に乾燥後、５３．８９ｇ（収率７３％）の白色固体が得られ、融点は９７−９９℃であった。ＮＭＲスペクトルメーターでの分析は所望の生成物と一致した： 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）芳香族プロトン７．２０−７．８０（ｍ，９Ｈ）、アミドＮＨ６．２５（ブロードｔ，１Ｈ）、アミドのＮに隣接するメチレン３．３５（ｍ，２Ｈ）、スクシニミジル環上のメチレン２．７５（ｓ，４Ｈ）、カルボニルに隣接するメチレン２．５５（ｔ，２Ｈ）、及び残りのメチレン１．００−１．９０（ｍ，１６Ｈ）。
【００５８】
実施例９
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ及びＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳのコポリマー（ランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ）の調製（化合物IX、Ａ−Ｃ）
本発明の光活性化性コポリマーは下記のようにして調製した。アクリルアミド４．２９８ｇ（６０．５mmol）を５７．８mlのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、次いで実施例３に記載の一般方法に従って調製した０．２１９ｇ（０．６３mmol）の化合物III 、実施例４に記載の一般方法に従って調製した０．４８３ｇ（１．５７mmol）の化合物IV、０．０５８ml（０．３９mmol）のＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）及び０．１５４ｇ（０．９４mmol）の２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を溶解した。この溶液を３分間のヘリウムスパージ、その後の更に３分間のアルゴンスパージにより脱酸素した。次いでシールをした槽を６０℃で一夜加熱し、重合を完了させた。その固体生成物を濾過により単離し、そしてフィルターケーキをＴＨＦ及びＣＨＣｌ3 でよくすすいだ。この生成物を真空オーブン内で３０℃で乾かし、５．３４ｇの白色固体を得た。ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）は２．７５ppm でのＮＯＳ基の存在を確証し、そして光学基負荷量は０．１１８mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーと決定された。ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳは化合物IX−Ａを供するようこの反応において２．５モル％の重合性モノマーを占める。
【００５９】
上記の手順を５モル％の化合物IVを有するポリマーを調製するために利用した。アクリルアミド３．８４９ｇ（５４．１mmol）を５２．９mlのＴＨＦに溶かし、次いで実施例３に記載の一般方法に従って調製した０．２１３ｇ（０．６１mmol）の化合物VI、実施例４に記載の一般方法に従って調製した０．９３８ｇ（３．０４mmol）の化合物IV、０．０５３ml（０．３５mmol）のＴＥＭＥＤ及び０．１４２ｇ（０．８６mmol）のＡＩＢＮを溶解した。得られる固体、化合物IX−Ｂを前述の通りに単離すると、４．９３５ｇの生成物が得られ、光学基負荷量は０．１０１mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーであった。
【００６０】
上記の手順を１０モル％の化合物IVを有するポリマーを調製するために利用した。アクリルアミド３．２４１ｇ（４５．６mmol）を４６．４mlのＴＨＦに溶解し、次いで実施例３に記載の一般方法に従って調製した０．１７９ｇ（０．５１mmol）の化合物III 、実施例４に記載の一般方法に従って調製した１．５７９ｇ（５．１２mmol）の化合物IV、０．０４７ml（０．３１mmol）のＴＥＭＥＤ及び０．１２６ｇ（０．７７mmol）のＡＩＢＮを溶解した。得られる固体、化合物IX−Ｃを上記の通りに単離すると、４．７５８ｇの生成物が得られ、光学基負荷量は０．０９８mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーであった。
【００６１】
実施例１０
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ及び〔３−（メタクリロイルアミノ）プロピル〕トリメチルアンモニウムクロリドのコポリマー（ランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ）の調製（化合物Ｘ、Ａ−Ｂ）
本発明の光活性化性コポリマーを下記のようにして調製した。アクリルアミド１０．６８１ｇ（０．１５０mol ）を１５０mlのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで実施例３に記載の一般方法に従って調製した０．５９２ｇ（１．６９mmol）の化合物III 、７．０８mlの５０％の水性溶液として導入する３．７２７ｇ（１６．９０mmol）の〔３−（メタクリロイルアミノ）プロピル〕トリメチルアンモニウムクロリド（ＭＡＰＴＡＣ）、０．１６９ml（１．１２mmol）のＴＥＭＥＤ及び０．３３３ｇ（２．０３mmol）のＡＩＢＮを溶解した。この溶液を４分間のヘリウムスパージ、次いで更に４分間のアルゴンスパージで脱酸素した。シールした槽を次に５５℃で一夜加熱し、重合を完了させた。このＤＭＳＯ溶液を水で希釈し、そして１２，０００−１４，０００の分子量カットオフチューブを利用して水に対して透析した。得られる溶液の凍結乾燥は１４．２１ｇの白色固体を供した。ＮＭＲ分析（Ｄ2 Ｏ）は第四アンモニウム基上での３．１０ppm のメチル基の存在を示し、そして光学基負荷量は０．１０１mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーと決定された。化合物III は化合物Ｘ−Ａを供するこの反応において重合性モノマーの１モル％を占めた。
【００６２】
上記の手順を２モル％の化合物III を有するポリマーの調製のために用いた。アクリルアミド１０．２３７ｇ（０．１４４mol ）を１４５mlのＤＭＳＯに溶解し、次いで実施例３に記載の一般方法に従って調製した１．１４８ｇ（３．２７７mmol）の化合物III 、７．２３mlの５０％の水性溶液として導入する３．８０７ｇ（１７．２４mmol）のＭＡＰＴＡＣ、０．１６４ml（１．０９mmol）のＴＥＭＥＤ及び０．３２２ｇ（１．９６mmol）のＡＩＢＮを溶解した。上記の通りの作業は１２．５４ｇの生成物（化合物Ｘ−Ｂ）を供し、光学基負荷量は０．１７６mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーであった。
【００６３】
実施例１１
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ、ＭＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ及び〔３−（メタクリロイルアミノ）プロピル〕トリメチルアンモニウムクロリドのコポリマー（ランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ−ポリＱｕａｔ）の調製（化合物XI）
本発明の光活性化性コポリマーを下記のようにして調製した。市販の５０％の水性ＭＡＰＴＡＣ中の水をクロロホルムとの共沸蒸留により除去した。１０．８８ｇのＭＡＰＴＡＣを含む水性ＭＡＰＴＡＣ溶液を２０mlのＤＭＳＯ及び１００mlのクロロホルムで希釈した。この混合物を無水硫酸ナトリウムを含む水より重い液−液エキストラクターへと全部で８０分間還流した。ゆっくりとしたエアフローを還流の間維持し、モノマーの重合を防いだ。還流の終了時に、過剰のクロロホルムを減圧で除去してＭＡＰＴＡＣのＤＭＳＯ溶液を約３５２mg／mlの濃度にした。
【００６４】
アクリルアミド１．７ｇ（２３．９０mmol）を５７．７mlのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで実施例３に記載の一般方法に従って調製した０．２１５ｇ（０．６１４mmol）の化合物III 、１．９３ml（０．６７７ｇ、３．０６７mmol）の上記のＭＡＰＴＡＣ／ＤＭＳＯ溶液、実施例５に記載の一般方法に従って調製した０．９１ｇ（３．０６８mmol）の化合物Ｖ、及び０．０６０ｇ（０．３６５mmol）のＡＩＢＮを溶解した。この溶液を４分間のヘリウムスパージ、次いで更に４分間のアルゴンスパージにより脱酸素した。シールした槽を５５℃で一夜加熱し、重合を完了させた。この反応混合物を６００mlのジエチルエーテルに注ぎ入れることによりポリマーを単離した。これらの固体を遠心分離により分離し、そしてその生成物を２００mlのジエチルエーテル及び２００mlのクロロホルムで洗った。真空下の溶媒のエバポレーションは３．２７８ｇの生成物を供し、光学基負荷量は０．１８５mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーであった。
【００６５】
実施例１２
Ｎ−（２−メルカプトエチル）−３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンズアミドを利用するアクリルアミド及びＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳのコポリマー（終点ジフォトＰＡ−ポリＮＯＳ）（化合物XII ）
本発明の光活性化性コポリマーを下記のようにして調製した。アクリルアミド３．１６ｇ（４４．５mmol）を４５．０mlのテトラヒドロフランに溶解し、次いで０．１６４ｇ（１mmol）のＡＩＢＮ、０．０４５ml（０．３０mmol）のＴＥＭＥＤ、実施例７に記載の一般方法に従って調製した０．３０１ｇ（０．５mmol）の化合物VII 及び実施例４に記載の一般方法に従って調製した１．５３９ｇ（５mmol）の化合物IVを溶解した。この溶液を４分間のヘリウムスパージ、次いで更に４分間のアルゴンスパージにより脱酸素した。シールした槽を５５℃で一夜加熱して重合を完了させた。沈殿ポリマーを濾過により単離し、そしてクロロホルムで洗浄した。最終生成物を真空オーブンで乾かし、０．０１１mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーの光学基負荷量を有する４．７２７ｇのポリマーが得られた。
【００６６】
実施例１３
Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕メタクリルアミド及びＢＢＡ−ＡＰＭＡのコポリマー（ランダムフォトＰＡ−ポリ第三アミン）（化合物XIII）
本発明の光活性化性コポリマーを下記のようにして調製した。Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕メタクリルアミド３３．９３ｇ（０．２mol ）を２７３mlのＤＭＳＯに溶解し、次いで１６．６mlの濃塩酸及び実施例３に記載の一般方法に従って調製された６．０７１ｇ（１７．３mmol）の化合物III を溶解した。最後に、０．２９ml（１．９３mmol）のＴＥＭＥＤ、０．４２６ｇ（２．６mmol）のＡＩＢＮ及び１００mlの水をこの反応混合物に加えた。この溶液を１０分間ヘリウムスパージで脱酸素し、そしてヘッドスペースをアルゴンで満たした。シールした槽を５５℃で一夜加熱し、重合を完了した。その生成物を脱イオン水に対して数日間、１２，０００−１４，０００ＭＷＣＯのチューブを利用して透析した。この生成物を透析後に濾過して全ての固体を除去し、そして凍結乾燥して４７．２７ｇの固体生成物を得た。このポリマーは０．３３mmolのＢＢＡ／１ｇのポリマーの光学基負荷量を有することが決定された。
【００６７】
実施例１４
ポリスチレン（ＰＳ）マイクロウェルプレート上のランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物IX−Ｃ）とランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ−ポリＱｕａｔ（化合物XI）との比較
化合物IX−Ｃ及び化合物XIを別々に脱イオン水に５ng／mlで溶解させた。別々のウェルに１００μｌの化合物IX及び化合物XIを含むＰＳプレート（PS, Medium Bind, Corning Costar, Cambridge, MA）にＨｅｒａｅｕｓバルブ（W.C.Heraeus GmbH, Hanau, Federal Republic of Germany）を含むＤｙｍａｘランプ（モデルNo. ＰＣ−２、Dymax Corporation, Torrington, CT ）で照射した。照射時間は１．５分、３３０−３４０nmの波長域で１〜２mW／cm2 の強度とした。このコーティング溶液を捨て、そしてウェルを２時間風乾した。このプレートに更に１分間照光を行った。このコーティングプレートを直ちに、２ケ月までシールパウチの中に保存しておいたオリゴを固定化するために用いた。
【００６８】
５０塩基オリゴマー捕獲プローブ５′−ＮＨ2 −GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAACAGCAGGAGCAGCGTGCACGG−３′（ＩＤ１）（Ｃ−１２スペーサーを含む５′−アミノモディファイヤーで合成）を１０pmole ／ウェルでＰＳウェル内にて５０mMのリン酸バッファーpH８．５、１mMのＥＤＴＡの中で３７℃で１時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーションは下記の通りにして、相補性５′−ビオチン−CCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGAC−３′（ＩＤ３）検出プローブ又は非相補性５′−ビオチン−CGGTGGATGGAGCAGGAGGGGCCCGAGTATTGGGAGCGGGAGACACAGAA−３′（ＩＤ４）オリゴを利用して実施した。それらは共に５′−ビオチン修飾で合成したものである。
【００６９】
固定化捕獲プローブを有するプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１０mMのＮａ2 ＰＯ4 、１５０mMのＮａＣｌ、pH７．２）により、マイクロプレートオートウォッシャー（モデルＥＬ４０３Ｈ、Bio-Tek Instruments, Winooski, VT ）を用いて洗浄した。このプレートを５５℃で３０分ハイブリダイゼーションバッファーでブロッキングした。このバッファーは５×のＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸塩、pH７．０）、０．１％のラウロイルサルコシン、１％のカゼイン及び０．０２％のドデシル硫酸ナトリウムから成る。検出プローブを捕獲プローブにハイブリダイズさせるとき、１００μｌ中の５０fmole の検出プローブを各ウェルに加え、そして５５℃で１時間インキュベーションした。次いでこのプレートを０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含む２×のＳＳＣで５５℃で５分かけて洗った。結合した検出プローブをストレプトアビジン及び西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート１００μｌ（ＳＡ−ＨＲＰ、Pierce, Rockford, IL）を０．５μｇ／mlで加え、そして３７℃で３０分インキュベーションすることによりアッセイした。次いでこのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗い、次いでペルオキシダーゼ基質（Ｈ2 Ｏ2 及びテトラメチルベンジジン：Kirkegard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）を添加し、そしてマイクロウェルプレートリーダー（モデル３５５０、Bio-Rad Labs, Cambridge, MA ）で６５５nmで測定を行った。プレートは１０分目に測定した。
【００７０】
表１に挙げる結果は、化合物IX−Ｃでコーティングされたマイクロウェルプレートがアミン捕獲プローブを有効に固定しなかったことを示す。しかしながら、コーティングとしての化合物XIとの対比により、有意義な結合及び良好なハイブリダイゼーションシグナルが供された。化合物IX−Ｃ試薬は表層をほとんど通り過ぎてしまい、そして捕獲オリゴの結合を阻害した。反対に、化合物XIを使用すると、オリゴはイオン相互作用により表層に吸引され、そこでそれらはＮＯＳ基と共有結合できた。
【００７１】
【表１】
0004426092.tif 000003
【００７２】
実施例１５
ランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物IX−Ｂ）及びランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ（化合物Ｘ−Ｂ）の混合物による様々なマイクロウェルプレートのコーティング
５mg／mlの化合物IX−Ｂ及び０．５mg／mlの化合物Ｘ−Ｂを含むコーティング溶液を脱イオン水中で調製した。この混合物をポリプロピレン（ＰＰ、Corning Costar, Cambridge, MA ）、ＰＳ、ポリカーボネート（ＰＣ、Corning Costar, Cambridge, MA ）及びポリビニルクロリド（ＰＶＣ、Dynatech, Chantilly, VA ）マルチウェルを実施例１４に記載の通りにして処理するのを用いた。３０量体の捕獲オリゴ５′−ＮＨ2 −GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAAC−３′（ＩＤ２）（Ｃ−１２スペーサーを含む５′−アミノモディファイヤーで合成）を０．０３，０．１，０．３，１，３又は１０pmole ／ウェルにて４℃で一夜インキュベーションした。ハイブリダイゼーションは実施例１４において前述した通りにして、相補性ＩＤ３検出オリゴ又は非相補性ＩＤ４オリゴを用いて実施した。ＰＰプレートは光学的に透明ではないため、各ウェルの内容物を２０分間のインキュベーションの後に発色基質と一緒にＰＳウェルに移した。ハイブリダイゼーションシグナルがＰＳプレートで測定された。その他のプレートは１０分目に移すことなく測定を行った。シグナルレベルは同一の基質グループ内でのみ同等であり、その理由は異なる材料から作られたマイクロウェルプレートの異なる幾何学形態による。表２はハイブリダイゼーションシグナルを挙げ、そしてハイブリダイゼーションシグナルの強度と化合物IX−Ｂ及び化合物Ｘ−Ｂの混合物でコーティングされた様々なマイクロウェルプレートに適用した捕獲プローブの量との関係を示す。ＰＰ及びＰＶＣプレート上では、プローブの吸着はごくわずかであり、そしてポリマー試薬によるコーティングはシグナルを劇的に上昇させた。シグナルはコーティングウェルに加える捕獲プローブを増やすと上昇するが、約３pmole ／ウェルの捕獲プローブで平衡に達する。発生シグナル値におけるこのプラトーはハイブリダイゼーションの飽和レベルによるものではなく、比色アッセイにおける色調変化反応の限界によるものである。
【００７３】
オリゴ誘導体はコーティングされていないＰＳ及びＰＣマイクロウェルプレートに効率的に吸着し、そして特異的なハイブリダイゼーションシグナルをもたらす。Crosら（米国特許第５，５１０，０８４号）はアミン官能化オリゴが不明なメカニズムによりポリスチレンマイクロウェルプレート上に十分に吸着することを報告している。しかしながら、種々のロット内でコーティングされていないＰＳプレート上での吸着量に著しい変動がある（Chevier ら、FEMS 10: 245, 1995 ）。
【００７４】
【表２】
0004426092.tif 000004
【００７５】
実施例１６
ＰＰ及びＰＶＣマイクロウェルプレート上の終点ジフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物XII ）及びランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ（化合物Ｘ−Ｂ）の評価
５mg／mlの化合物XII 及び０．５mg／mlの化合物Ｘ−Ｂの混合物を含むコーティング溶液を脱イオン水で調製した。この２種類の試薬の混合物を、実施例１４に記載のものと同じ条件下でＰＰ及びＰＶＣマイクロウェルプレートをコーティングするのに用いた。３０量体のＩＤ２捕獲プローブを０．０３，０．１，０．３，１，３又は１０pmole ／ウェルにおいて０．１mlで４℃で一夜インキュベーションした。ハイブリダイゼーションは相補性ＩＤ３検出オリゴ又は非相補性ＩＤ４オリゴを利用して実施例１４に記載の通りにして実施した。表３に挙げるハイブリダイゼーションシグナルはハイブリダイゼーションシグナルの強度と化合物XII 及び化合物Ｘ−Ｂの混合物でコーティングされたＰＰ及びＰＶＣマイクロウェルプレートに適用した捕獲プローブの量との関係を示す。シグナルはコーティングウェルに添加する捕獲オリゴを増やすと上昇するが、約１pmole ／ウェルで平衡に達する。シグナル、対、ノイズ比（相補性検出プローブ、対、非相補性検出プローブに由来）はコーティングＰＰ及びＰＶＣ表層についてそれぞれ２６及び１１と高かった。
【００７６】
【表３】
0004426092.tif 000005
【００７７】
実施例１７
ランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ（化合物Ｘ−Ｂ）及びＢＢＡ−ＡＵＤ−ＮＯＳによる逐次コーティング（化合物VIII）
脱イオン水中の０．１mg／mlの化合物Ｘ−ＢをＰＰ及びＰＶＣウェルの中に２０分インキュベーションした。ウェルにこの溶液が入っているこのプレートを実施例１４において前述した通りにして１．５分照射に付した。この溶液を捨て、そしてウェルを乾かした。イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）中の０．５mg／mlの化合物VIIIを化合物Ｘ−Ｂのコーティングされたウェルの中で５分間インキュベーションした。次いでこの溶液を捨て、プレートを乾かし、そしてウェルが乾燥してから実施例１４に記載の通りにして１分間照射した。０．１ml中において０．０３，０．１，０．３，１，３又は１０pmole ／ウェルの３０量体のＩＤ２捕獲オリゴを４℃で一夜インキュベーションした。ハイブリダイゼーションを相補性ＩＤ３検出オリゴ又は非相補性ＩＤ４オリゴを利用して実施例１４に記載の通りにして実施した。表４はハイブリダイゼーションシグナルを含み、そしてハイブリダイゼーションシグナルの強度と、化合物Ｘ−Ｂでコーティングされ、続いて化合物VIIIコーティングの施されたＰＰ及びＰＶＣマイクロウェルプレートに適用した捕獲プローブの量との関係を示す。シグナルは、コーティングウェルに加える捕獲プローブを増やすと上昇するが、約１pmole ／ウェルの捕獲オリゴで平衡となった。シグナルは、非コーティングコントロールと比較し、コーティングＰＰ及びＰＶＣ表層のそれぞれについて２９及び１１倍高くなった。
【００７８】
【表４】
0004426092.tif 000006
【００７９】
実施例１８
ランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物IX−Ａ）及びランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ（化合物Ｘ−Ａ）の混合物とのランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ（化合物Ｘ−Ａ）の比較
化合物Ｘ−Ａを０．５又は０．１mg／mlにおいてＰＰマイクロウェルプレート内で１０分インキュベーションした。次いでこれらのプレートを実施例１４に記載の通りにして照射した。化合物IX−Ａ及び化合物Ｘ−Ａの混合物を含むコーティング溶液をＰＰマイクロウェルプレートにコーティングを施すため、脱イオン水中の５／０．５mg／ml及び０．５／０．１mg／mlの化合物IX−Ａ／化合物Ｘ−Ａの２通りの割合で調製した。この溶液をウェル内で１０分間インキュベーションし、そしてウェルを実施例１４に記載の通りにして照射した。３０量体のＩＤ２捕獲プローブを１pmole ／ウェルにおいて各ウェル内で３７℃で１時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーションは相補性ＩＤ３検出オリゴ又は非相補性ＩＤ４オリゴを利用して実施例１４に記載の通りにして実施した。表５に挙げる結果は、化合物IX−Ａ及び化合物Ｘ−Ａの組合せを含むコーティングが化合物Ｘ−Ａコーティングのみから由来するものと比べて高いシグナルを供することを示した。
【００８０】
【表５】
0004426092.tif 000007
【００８１】
実施例１９
コーティングマイクロウェルプレート上でのランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物IX−Ｂ）及びランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ（化合物Ｘ−Ｂ）に対する非修飾オリゴ対アミン修飾オリゴの比較
化合物IX−Ｂ（５mg／ml）及び化合物Ｘ−Ｂ（０．５mg／ml）の混合物を含むコーティング溶液を脱イオン水中で調製し、ＰＰ，ＰＳ及びＰＶＣマイクロウェルコートをコーティングした。この溶液を約１０分インキュベーションし、そして実施例１４に記載の通りにして照射した。３０量体の捕獲５′−ＮＨ2 −TTCTGTGTCTCCCGCTCCCAATACTCGGGC−３′（ＩＤ５）オリゴを１pmole ／ウェルにおいて５０mMのリン酸バッファー、pH８．５、１mMのＥＤＴＡ中でウェル内に４℃で一夜かけてカップリングさせた。ハイブリダイゼーションは相補性検出オリゴＩＤ４又は非相補性オリゴＩＤ３を利用して実施例１４に記載の通りにして実施した。捕獲オリゴのアミン官能基の効果を調べるため、非修飾３０量体捕獲プローブ５′−TTCTGTGTCTCCCGCTCCCAATACTCGGGC−３′（ＩＤ６）（アミンなし）もコーティング表層に加え、そして試験した。表６に示す結果は５′−アミン修飾のないオリゴを化合物IX−Ｂ／化合物Ｘ−Ｂコーティング表層上に捕獲プローブとして利用すると、ハイブリダイゼーションシグナルはアミン修飾によるものの３０％未満であることを示す。
【００８２】
【表６】
0004426092.tif 000008
【００８３】
実施例２０
ランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物IX−Ａ）及びランダムフォトＰＡ−ポリＱｕａｔ（化合物Ｘ−Ａ）でコーティングされたマイクロウェルプレート上のオリゴ付加密度
オリゴ付加密度を決定する及び比色アッセイ系の結果を確認するため、放射性ラベルアッセイを実施した。本実施例においては、化合物IX−Ａ及び化合物Ｘ−Ａの組合せコーティングを実施例１４に記載の通りにしてＰＶＣウェルで実施した。ＩＤ２及びＩＤ５の３０量体捕獲オリゴをコーティングウェル上に固定化させた。放射性ラベルしたＩＤ２プローブをウェル表層上の固定化捕獲オリゴの付加密度を測定するために利用した。ＩＤ２に対しては相補性であるが、ＩＤ５に対しては相補性でない放射性ラベルされたＩＤ３を固定化捕獲プローブのハイブリダイゼーション反応を測定するために利用した。オリゴＩＤ２及びＩＤ３を末端トランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim Indianapolis, IN）及びα−32Ｐ−ｄｄＡＴＰ（3000Ci／mmole, Amersham, Arlington Heights, IL）を利用し、その製造者の仕様書に従って３′末端においてラベルした。32Ｐ−ラベルされたＩＤ２並びにラベルされていないＩＤ２及びＩＤ５捕獲プローブをコーティングウェル内で５０pmole ／ウェルで室温にて２．２５時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして実施例１４に記載の通りにしてブロッキングした。
【００８４】
ラベルされていない捕獲プローブの入ったウェルを32Ｐ−ラベル化ＩＤ３検出プローブと、ハイブリダイゼーションバッファーの中で５５℃で１時間ハイブリダイゼーションさせた。32Ｐ−ラベル化捕獲プローブを含むウェルをＩＤ３プローブの入っていないハイブリダイゼーションバッファー内でインキュベーションした。０．１％のＳＤＳを含む２×のＳＳＣで５５℃で５分にて３回、次いでＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、プレートを個々のウェルに切り、そしてテトラヒドロフランに溶解した。各ウェル内の放射能の量をAquasol-2 Fluor （DuPont NEN, Boston, MA）でのシンチレーションカウンティングにより測定した。表７の結果は捕獲プローブの良好な固定化のために化合物IX−Ａ及び化合物Ｘ−Ａの双方が必要であることを示す。また、化合物IX−Ａ及び化合物Ｘ−Ａの濃度を上げると固定化される捕獲オリゴの量が増える。試験した最大の濃度において、シグナル、対、ノイズ比は３０００、対、１より高かった。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
実施例２１
ランダムフォト−ＰＡ−ポリ第三アミン（化合物XIII）、ランダムフォト−ＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物IX−Ａ）、並びにランダムフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物IX−Ａ）及びランダム−ＰＡ−ポリ第三アミン（化合物XIII）の混合物間の比較
化合物XIIIを０．０２mg／mlにて脱イオン水中でＰＰマイクロウェルプレート内で１０分インキュベーションした。ウェルを実施例１４に記載の通りにして照射した。化合物IX−ＡをＰＰウェル上に２mg／mlに脱イオン水中で化合物XIIIについて記載の通りにコーティングした。脱イオン水中の２mg／mlの化合物IX−Ａ及び０．０２mg／mlの化合物XIIIを含むコーティング溶液を調製し、そして化合物XIIIについて記載の通りにコーティングした。ハイブリダイゼーションは相補性ＩＤ３検出オリゴ及び非相補性ＩＤ４オリゴを利用して実施例１４に記載の通りにして実施した。各ウェルの内容物をペルオキシダーゼ基質との１０分間のインキュベーションの後にＰＳウェルに移した。表８に挙げる結果は化合物IX−Ａ及び化合物XIIIの組合せが、化合物IX−Ａ又は化合物XIIIのコーティングのみからのものと比べて高いシグナルを供与することを示した。
【００８７】
【表８】
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【００８８】
実施例２２
アミン誘導化表層上の核酸配列の固定化
本発明のコポリマーは下記のようにして調製される。アクリルアミド５．６８６ｇ（８０．０mmol）を１００mlのＤＭＳＯに溶解し、次いで実施例４に記載の一般方法に従って調製した３．０８３ｇ（１０．０mmol）の化合物IV及び実施例１１に記載の方法に従って調製したドライＤＭＳＯ溶液として導入する２．２０７ｇ（１０．０mmol）のＭＡＰＴＡＣを溶解する。ＴＥＭＥＤ  ０．１３４ml（０．８９mmol）及びＡＩＢＮ  ０．１９７ｇ（１．２０mmol）をこの混合物に加え、そしてこの系をヘリウムスパージで５分間、次いでアルゴンスパージで更に５分間脱酸素する。シールした槽を５５℃に加熱して重合を完了させる。ポリマーは反応混合物を８００mlのジエチルエーテルに注ぎ、そして遠心分離して固体を分離することにより単離する。この生成物を２００mlのジエチルエーテル、次いで２００mlのクロロホルムで洗う。このポリマーを真空乾燥し、残りの溶媒を除去する。
【００８９】
ポリマー表層をメタン及びアンモニアガスの３：１の混合物を利用してプラズマ処理することにより誘導化する（例えば、米国特許第５，６４３，５８０号に記載の一般方法を参照のこと）。メタン（４９０SCCM）及びアンモニア（１６１SCCM）の混合物を、コーティングするポリマーと一緒にプラズマチャンバーに入れる。ガスを０．２〜０．３torrの圧力に保ち、そしてチャンバー内に３００〜５００ワットのグロー放電を樹立させる。サンプルを全部で３〜５分、この条件下で処理する。アミン誘導化表層の形成は、非コーティング表層と比べての水接触角の縮小により確認する。
【００９０】
アミン誘導化表層を室温で１０分、５０mMのリン酸バッファー、pH８．５中の上記のポリマーの１０mg／mlの溶液とインキュベーションする。この反応時間の経過後、コーティング溶液を除去し、そして表層を脱イオン水で十分に洗い、そして十分に乾かす。オリゴマー捕獲プローブの固定化及びハイブリダイゼーションを実施例１４に記載の通りに実施する。
【００９１】
表９：化合物
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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