(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ε−ポリリジンとそれ以外の成分とを含む液体にα−シクロデキストリンを添加し、ε−ポリリジンを軸分子としα−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンを形成させて分離精製することを特徴とするε−ポリリジンの製造方法。
【請求項２】
α−シクロデキストリンの添加割合が、リジン１ユニット当たりα−シクロデキストリン１〜３個の割合である請求項１記載のε−ポリリジンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリロタキサンおよびε−ポリリジンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ε−ポリリジンは抗菌活性を有することから、食品をはじめとする各分野で抗菌剤として使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ε−ポリリジンは極めて親水性が高く、容易に溶解することからその抗菌活性の発現は速効的であり、緩効的な抗菌活性の発現は困難であった。
【０００４】
また、ε−ポリリジン発酵液から菌体その他の固形物を遠心分離またはフィルター濾過などにより除去した上澄液からのε−ポリリジンの分離精製は、従来、複数のイオン交換樹脂を用いて行われていたが、該方法では多大な工数と長時間を要し、且つε−ポリリジンの回収効率が低いことから、より簡便な分離精製法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決する手段】
本発明者らは前述の従来技術の問題点に鑑み鋭意研究を重ねた。その結果ε−ポリリジンを軸分子とし、α−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンであれば、ε−ポリリジンの抗菌活性が緩効化すること、更に、ε−ポリリジンとそれ以外の成分とを含む例えば発酵液にα−シクロデキストリンを添加し、ε−ポリリジンを軸分子としα−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンを形成させ、沈殿させ、回収することによって分離精製されたε−ポリリジンの製造方法であれば、簡便にε−ポリリジンの分離精製が達成されることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【０００６】
本発明は下記の（１）〜（８）の構成からなる。
（１）ε−ポリリジンを軸分子とし、α−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサン。
【０００７】
（２）リジン１ユニット当たりのα−シクロデキストリンの個数が０．３〜１個の割合であるポリロタキサン。
【０００８】
（３）前記第１項または第２項記載のポリロタキサンを含有することを特徴とする食品保存料。
【０００９】
（４）前記第１項または第２項記載のポリロタキサンを含有することを特徴とする抗菌剤。
【００１０】
（５）前記第１項または第２項記載のポリロタキサンおよび該ポリロタキサンを化学修飾して得られる化合物から選ばれた１種以上を含有する刺激応答材料。
【００１１】
（６）前記第１項または第２項記載のポリロタキサンおよび該ポリロタキサンを化学修飾して得られる化合物から選ばれた１種以上に薬効成分を化学修飾および／または担持して得られる医薬品。
【００１２】
（７）ε−ポリリジンとそれ以外の成分とを含む液体にα−シクロデキストリンを添加し、ε−ポリリジンを軸分子としα−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンを形成させて分離精製することを特徴とするε−ポリリジンの製造方法。
【００１３】
（８）α−シクロデキストリンの添加割合が、リジン１ユニット当たりα−シクロデキストリン１〜３個の割合である前記第７項記載のε−ポリリジンの製造方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるε−ポリリジンは何れの方法で得たものであっても良い。具体的にはε−ポリリジン生産菌であるストレプトマイセス属に属するストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離、採取する方法（特公昭５９−２０３５９号公報）によって得られたε−ポリリジンを挙げることができる。該ε−ポリリジンは厚生省の既存添加物名簿にも記載されている物質であり、食品保存料等に利用されている。
【００１５】
本発明で用いるα−シクロデキストリンは、澱粉にバチルス属のバチル・スマセランス菌やバチルス・ステアロサーモフィラス菌などが生産するシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより生成される天然由来の化合物である。該α−シクロデキストリンは厚生省の既存添加物名簿にも記載されている物質であり、食品などの安定化剤や粉末化基剤等に利用されている。
【００１６】
なお、本発明で用いるα−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリンとの混合物を用いてもよいが、α−シクロデキストリンのみからなる純品であることが好ましい。
【００１７】
本発明のポリロタキサンは、α−シクロデキストリンの水溶液にε−ポリリジンを添加・溶解させる操作、もしくはε−ポリリジンの水溶液にα−シクロデキストリンを添加・溶解させる操作によって得ることができる。具体的には前述の操作によって生成した白色沈殿を回収・水洗し、減圧乾燥などにより水分を取り除くことによって得ることができる。
【００１８】
本発明のポリロタキサンを生成させる際の温度としては、１０℃から５０℃が好ましく、この範囲内であれば温度が高いほど、また、α−シクロデキストリンの濃度が飽和に近いほど、リジン１ユニット当たりのα−シクロデキストリンの個数が増加し１に近づく。
【００１９】
本発明のポリロタキサンにおける、軸分子であるε−ポリリジンと回転子であるα−シクロデキストリンとの割合は特に限定されるものではないが、リジン１ユニット当たりのα−シクロデキストリンの個数が０．３〜１個の割合であることが好ましい。該割合を変えることによりε−ポリリジンの抗菌効果の持続期間を制御することが可能である。
【００２０】
該割合は、ポリロタキサンの調製温度（１０℃〜５０℃）、水洗の回数、およびα−シクロデキストリンの水溶液にε−ポリリジンを添加・溶解させる操作によってポリロタキサンを得る場合には、α−シクロデキストリン水溶液の濃度により、ε−ポリリジンの水溶液にα−シクロデキストリンを添加・溶解させる操作によってポリロタキサンを得る場合には、ε−ポリリジンの添加量により調節することができる。
【００２１】
本発明の食品保存料は、本発明のポリロタキサンを含有するものであればその組成については特に限定されるものではなく、該ポリロタキサンのみからなるものであってもよく、該ポリロタキサン以外の成分として、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖エステル、グリシン、カテキン、キトサン、プロタミン、リボソーム、竹抽出物、有機酸および／または有機酸塩などを挙げることができる。
【００２２】
食品保存料として用いた場合は、調理中の加熱による食材との相互作用を防ぐことによりε−ポリリジンの使用量を低減できる。また、本発明の食品保存剤の用途並びにその使用方法は限定されるものではなく、例えば、魚のすり身、ハンバーグ、パン、麺および野菜の煮物や炒め物などの食品に、そのままの状態または食用に供する液体に溶解または懸濁した状態で添加すればよい。
【００２３】
本発明の抗菌剤は、本発明のポリロタキサンを含有するものであればその組成については特に限定されるものではなく、該ポリロタキサンのみからなるものであってもよく、該ポリロタキサン以外の成分として、カテキン、キトサン、パラベン、銀ゼオライト、第４級アンモニウム塩、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖エステル、有機酸および／または有機酸塩などを挙げることができる。
【００２４】
本発明の抗菌剤の用途並びにその使用方法は限定されるものではなく、例えば、合成樹脂、紙、不織布、塗料、インキ、漆、ワニス、エナメルおよび化粧品などに対して、そのままの状態または各用途に適した液体に溶解または懸濁した状態で添加すればよい。
【００２５】
本発明の刺激応答材料は、本発明のポリロタキサンおよび該ポリロタキサンを化学修飾して得られる化合物から選ばれた１種以上を含有するものであればその組成については特に限定されるものではない。
該ポリロタキサンのみからなるものであってもよく、該ポリロタキサン以外の成分として、該ポリロタキサンとは異なる刺激に応答する化合物を挙げることができる。
【００２６】
本発明のポリロタキサンは、塩酸、アンモニア水および６０℃以上の温水において溶解するため、特定の刺激に対して応答することが要求される化合物またはその中間体として有用である。
【００２７】
本発明のポリロタキサンを化学修飾して得られる化合物としては、例えば、軸分子であるε−ポリリジンの末端にポリエチレングリコールをペプチド結合させた化合物や、ε−ポリリジンの両末端に安息香酸およびフェニルアラニンを、ペプチド結合を介して導入した化合物などを挙げることができる。
【００２８】
前者の化合物では、水素イオン濃度や温度の刺激により軸分子と回転子および回転子間の水素結合性が変化し、回転子であるα−シクロデキストリンがε−ポリリジンとポリエチレングリコールとの間を可逆的に移動することができる。
後者の化合物では、ペプチド結合を分解するような刺激を与えることにより、安息香酸およびフェニルアラニンが両末端から分離し、回転子であるα−シクロデキストリンが軸分子であるε−ポリリジンから解離することによって、ε−ポリリジンが有するカチオン性を発現することが可能となる。
【００２９】
本発明の医薬品は、本発明のポリロタキサンおよび該ポリロタキサンを化学修飾して得られる化合物から選ばれた１種以上に薬効成分を化学修飾および／または担持したものであれば特に限定されるものではない。
該ポリロタキサンの化学修飾としては、例えば両末端に安息香酸およびフェニルアラニンを、ペプチド結合を介して導入することをあげることができ、これにより薬効成分を必要とする消化器官まで、回転子かつ該薬効成分の担体であるα−シクロデキストリンが解離しないようにすることができる。
【００３０】
薬効成分としては、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、利胆剤および整腸剤などを挙げることができ、ポリロタキサンの化学修飾および／または該薬効成分の化学修飾の具体的方法としては、イミド結合、ペプチド結合およびエステル結合など、該薬効成分を必要とする消化器官で分解する結合様式を選択することができる。本発明の医薬品であれば、特定の消化器官で該薬効成分を解離・溶解して放出することが可能である。
【００３１】
本発明の分離精製されたε−ポリリジンの製造方法は、ε−ポリリジンとそれ以外の成分とを含む液体にα−シクロデキストリンを添加し、ε−ポリリジンを軸分子としα−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンを形成させる工程を有するものである。
ε−ポリリジンとそれ以外の成分とを含む液体としては、具体的には、ε−ポリリジン発酵液を挙げることができる。
【００３２】
ε−ポリリジン発酵液の製造方法は特に限定されるわけではないが、例えば、ε−ポリリジン生産菌として、ストレプトマイセス・アルブラス・リジノポリメラスＮｏ．３４６−Ｄ株（微工研菌寄第３８３４号）、ストレプトマイセス・アルブラス・リジノポリメラス１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）およびストレプトマイセス・アブプラス・リジノポリメラス５０８３３株（微工研条寄第１１１０号）から選ばれた１種以上を、シュークロース、グルコース、グリセリン、スターチなどの炭素源、ペプトン、カゼイン分解物、アミノ酸、無機アンモニウム塩などの窒素源、燐酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオンなどの無機物、その他栄養物として酵母エキスなどを適当に含有する培地を用いて培養することにより得ることができる。
ε−ポリリジンとそれ以外の成分とを含む液体がε−ポリリジン発酵液の場合、該液体は該発酵液から菌体その他の固形物を遠心分離またはフィルター濾過などにより除去した上澄液であることが好ましい。
【００３３】
該液体に添加するα−シクロデキストリンの添加割合は、ε−ポリリジンのリジン１ユニット当たり１〜３個の割合であることが好ましい。１個より少ないと回収率が低下し、３個より多くても回収率の増大は見込まれない。
【００３４】
該液体に添加するα−シクロデキストリンは、α−シクロデキストリンのみからなる純品であることが好ましいが、本発明の製造方法においては、β−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリンとの混合物を用いてもよい。
【００３５】
該液体にα−シクロデキストリンを添加・溶解させることにより、ε−ポリリジンを軸分子としα−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンが形成されると、該ポリロタキサンは白色の沈殿物となることから、この白色沈殿物を回収し塩酸またはアンモニア水に溶解させ、次いで陽イオン交換樹脂またはゲル濾過などにかけることにより、ε−ポリリジンのみを分離精製することができる。
【００３６】
本発明の製造方法において、前述のようにβ−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリンを含有するα−シクロデキストリンを用いた場合には、β−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリンはε−ポリリジンとの間でポリロタキサンを形成せず、α−シクロデキストリンのみがポリロタキサンを形成し白色沈殿として回収されることから、本発明の製造方法はα−シクロデキストリンの分離方法としても利用可能である。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明する。
実施例１
［ε−ポリリジン粉末の製造］
ε−ポリリジンの２５ｗｔ％水溶液（チッソ株式会社製）１５０ｍｌを、４０℃に設定したロータリーエバポレーターを用いて、液量が６０ｍｌ程度となるまで減圧脱水を行った。純度９９．５ｗｔ％の特級エチルアルコール（以下、「エタノール」という。）を、残っている該ε−ポリリジン水溶液と等量加え共沸混合物とした後、再度４０℃にて液量が６０ｍｌ程度となるまで減圧条件で共沸・脱水を行った。上記共沸操作を三回繰り返し、三回目の減圧共沸操作は、エタノールの蒸発が認められなくなるまで行い、半固形状のε−ポリリジンを得た。次に、４０℃に設定した減圧乾燥装置で、該ε−ポリリジンを１２時間乾燥し、残存するエタノールを除去して得られた固形物をフードミル（フィリップス（株）製ＨＬ２０５３）で粉砕し、ε−ポリリジン粉末を得た。
【００３８】
［ε−ポリリジンを軸分子とし、α−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンの調製］
２０ｍｌのα−シクロデキストリン飽和水溶液（０．１５ｇ／ｍｌ）に０．４ｇのε−ポリリジン粉末を加え、完全に溶解するまで撹拌した後、一晩静置した。得られた白色沈殿を遠心分離により回収し、イオン交換水で２回洗浄した後、５０℃で２４時間減圧乾燥した。固形物の収量は、３．１ｇであった。
【００３９】
［ポリロタキサンの同定］
以下の、重水素核磁気共鳴、熱分析および粉末Ｘ線回折により、得られた固形物は、ε−ポリリジンを軸分子とし、α−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンであることが確認された。
【００４０】
［1Ｈ−ＮＭＲ分析］
得られた固形物の０．５ｗｔ％重塩酸重水溶液の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルはα−シクロデキストリンとε−ポリリジンの単体のスペクトルを重ね合わせたものと同等であった。このことから、該固形物は両成分を含有し、かつ、該重塩酸重水溶液中ではε−ポリリジンからα−シクロデキストリンが解離していることが確認された。
【００４１】
［ＤＳＣ分析］
ε−ポリリジンおよび該固形物の示差走査熱量分析の結果、本実施例で用いたε−ポリリジンの融点は１６２℃であったが、該固形物の融解ピークは２５０℃まで認められなかったことから、該固形物はε−ポリリジンとα−シクロデキストリンによって形成された錯体であることが確認された。
【００４２】
［ＴＧＡ分析］
ε−ポリリジンおよび該固形物の熱重量分析の結果、該固形物の熱分解温度は３１３℃であり、本実施例で用いたε−ポリリジンの熱分解温度である２９７℃と比較して１６℃上昇していることから、該固形物はε−ポリリジンとα−シクロデキストリンによって形成された錯体であることが確認された。
【００４３】
［粉末Ｘ線回折］
図１はα−シクロデキストリン、ε−ポリリジンおよび該固形物の粉末Ｘ線回折パターンを示す線図であり、横軸のθは回折角を、縦軸のcounts/sは回折強度を表す。図１から、該固形物はα−シクロデキストリンとε−ポリリジンの単体のスペクトルを重ね合わせたものとは異なり、２θ＝２０゜のチャンネル型構造に特徴的なピークが認められることから、ポリロタキサンを形成していることが確認された。
【００４４】
実施例２
［ε−ポリリジンの発酵生産］
グリセロール５０ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、酵母エキス５ｇ、硫酸マグネシウム（７水化物）０．５ｇ、硫酸亜鉛（７水化物）０．０４ｇ、および硫酸第一鉄（７水化物）０．０３ｇを０．０２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０００ｍｌに加えて調製した培地を、１２１℃で２０分間加熱滅菌する。これに、ε−ポリリジン生産菌であるストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスＮｏ．３４６−Ｄ株の斜面培養物を１白金耳接種し、ミニジャーファーメンターにて３０℃、４８時間好気培養を行い発酵液を得た。
【００４５】
［ε−ポリリジンの分離精製］
該発酵液から、菌体その他の固形物を孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで減圧濾過した濾過液１００ｍｌに、α−シクロデキストリン１４ｇを添加し完全に溶解するまで撹拌した後、一晩静置した。得られた白色沈殿を遠心分離（２０℃、毎分１００００回転、３０分）により回収し、イオン交換水で２回洗浄した後、６０℃の温水１００ｍｌに溶解し、ゲル濾過（６０℃）にてε−ポリリジンとα−シクロデキストリンを分画し、ε−ポリリジン水溶液を得た。
【００４６】
比較例
［ε−ポリリジンの分離精製］
実施例２で生産した発酵液から、菌体その他の固形物を孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで減圧濾過した濾過液を、陽イオン交換樹脂ＩＲＣ−５０（Ｈ+型）（ローム・アンド・ハース社製）を充填したカラムに通し、ε−ポリリジンを吸着させる。該カラムを０．２Ｎ酢酸で洗浄後、ε−ポリリジンを０．１Ｎ塩酸で溶出する。該溶出液を強塩基性陰イオン交換樹脂ＩＲＡ−４０２（ＯＨ-型）（ローム・アンド・ハース社製）を充填したカラムに通した後、活性炭で処理して脱色し、ε−ポリリジン水溶液を得た。
【００４７】
実施例２
実施例２による濾過液中のε−ポリリジンに対する回収率は８５％であり、比較例の回収率７３％を上回った。
【００４８】
【発明の効果】
本発明のε−ポリリジンを軸分子としα−シクロデキストリンを回転子とするポリロタキサンであれば、緩効的な抗菌活性の発現が可能であり、本発明のε−ポリリジンの製造方法であれば、簡便且つ高い回収率で分離精製されたε−ポリリジンを得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はα−シクロデキストリン、ε−ポリリジンおよび本生成物の粉末Ｘ線回折パターンを示す線図である。
【図１】
0004513184.tif 000002