(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
0004467084.tif 000020
［式中、
−Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して水素原子又は−（ＣＨ2）q−ＮＲＲ’を表し、
・ｑは１〜６の整数であり、ｑの値はＲ1、Ｒ2及びＲ3各基の間で相互に独立しており、
・Ｒ及びＲ’は相互に独立して水素原子又は式（ＩＩ）：
0004467084.tif 000021
（式中、ｒは０であり、Ｒ5基は水素原子を表し、
但し、Ｒ1及びＲ2基の少なくとも１種は式（ＩＩ）の基を含む）の基を表し、
−ｍ及びｎは相互に独立して１〜６の整数を表し、ｎが１よりも大きいときにはｍは種々の値をとることができ、Ｒ3は一般式（Ｉ）において種々の意味をもち、
−ｐは１〜６の整数を表し、
−Ｒ4は一般式（ＩＩＩ）：
0004467084.tif 000022
（式中、
・Ｒ7及びＲ8は相互に独立して水素原子又は飽和又は不飽和、直鎖又は分枝鎖の炭素数５〜２２の脂肪族基を表し、Ｒ7及びＲ8の少なくとも一方は水素以外のものであり、
・ｔは０〜１０から選択される整数であり、Ｒ6、Ｘ、Ｙ及びｓはｔが１よりも大きい整数であるときには種々のモチーフ［Ｘ−（ＣＨＲ6）s−Ｙ］において異なる意味をもつことができ、
・Ｘは酸素もしくは硫黄原子又はアミノもしくはアルキルアミノ基を表し、アルキル置換基は直鎖でも分枝鎖でもよく、１〜８個の炭素原子を含み、
・Ｙはカルボニル基又はメチレン基を表し、
・Ｒ6は水素原子を表し、
・ｓは１〜１０の整数を表し、ｓが１よりも大きいときにはＲ6は水素原子を表す）の基を表す］のＤ、Ｌ又はＤＬ形態の化合物及びその塩。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2及び／又はＲ3が水素以外のものであり、式（ＩＩ）を含むときにはｑが２又は３であり、ｒが０であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）中、ｍが２、３及び４から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）中、Ｒ7及びＲ8基の少なくとも一方が１個以上の飽和又は不飽和、直鎖又は分枝鎖の炭素数５〜２２の脂肪族基を表すことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
飽和又は不飽和、直鎖又は分枝鎖の炭素数５〜２２の脂肪族基がコレステロール、コレスタノール、３−α−５−シクロ−５−コレスタン−６−β−オール、コリン酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート、３α，５−シクロ−５α−コレスタン−６β−イルホルメート、コレステリルアミン、６−（１，５−ジメチルヘキシル）−３ａ，５ａ−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ［ａ］シクロプロパ［２，３］シクロペンタ［１，２−ｆ］ナフタレン−１０−イルアミン、又はコレスタニルアミンから選択されるステロイド誘導体であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ7及びＲ8基の両方が飽和又は不飽和、直鎖又は分枝鎖の炭素数５〜２２の脂肪族基を表すことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ7及びＲ8基の両方が炭素原子数５〜２２、より好ましくは炭素原子数１２〜２２の脂肪鎖を表すことを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ1が式（ＩＩ）の基を含み、Ｒ2とＲ3が水素原子であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ1とＲ2が各々式（ＩＩ）の基を含み、Ｒ3が水素原子であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1とＲ3が各々式（ＩＩ）の基を含み、Ｒ2が水素原子であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が各々式（ＩＩ）の基を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
細胞外又は細胞内ターゲティングエレメントに結合していることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ4及びＲ5が請求項１に記載した意味をもつ下式の化合物から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
0004467084.tif 000023
【請求項１４】
下記化合物から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
0004467084.tif 000024
0004467084.tif 000025
0004467084.tif 000026
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物と核酸を含む核酸を細胞に導入するための組成物。
【請求項１６】
更に１種以上のアジュバントを含むことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
更に１種以上の中性脂質を含むことを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
中性脂質が２個の脂肪鎖をもつ脂質であることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
中性脂質が生理的条件下で両性イオン性又はイオン電荷をもたない天然又は合成脂質であり、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン及びその１〜３倍Ｎ−メチル化誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（例えば特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴ脂質（例えば特にスフィンゴミエリン）又はアシアロガングリオシド（例えば特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択される請求項１６から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
アジュバントが核酸の圧縮レベルに直接又は間接的に関与する化合物であることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アジュバントが全体又は一部がプロタミン、ヒストン又はヌクレオリン及び／又はそれらの誘導体の１種から誘導されるか、あるいは全体又は一部がペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／又は（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成され、モチーフ数が２〜１０であり、連続又は不連続に反復しし得ることを特徴とする請求項１６から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
更にターゲティングエレメントを含むことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
注射用製剤に医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことを特徴とする請求項１５から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
皮膚及び／又は粘膜に塗布するのに医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことを特徴とする請求項１５から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
核酸を細胞に導入するための請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２６】
尿素のチオ又はオキソ誘導体をリポポリアミンに作用させることによりアミジン基を形成するか、ペプチド結合によりポリアミノアミジンを脂質にグラフトすることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物の製造方法。
【請求項２７】
（１）請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物及び場合により１種以上のアジュバント及び／又はターゲティングエレメントと核酸を接触させて複合体を形成する段階と、
（２）（１）で形成された複合体と細胞を接触させる段階を含むことを特徴とする核酸の細胞導入方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は核酸を細胞に導入するための新規化合物に関する。これらの新規化合物はより詳細にはリポポリアミン系に属し、アミジン基を含む。これらの化合物は着目核酸を種々の細胞型にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ導入するために使用することができる。
バイオテクノロジーの発展に伴い、核酸を細胞に有効に導入できることが必要になっている。例えば組換えタンパク質の製造や、実験室で遺伝子発現の調節の研究、遺伝子クローニング又は他の任意のＤＮＡ操作を行うには核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞導入が必要である。また、例えばトランスジェニック動物の創製、ワクチンの製造、標識試験又は治療アプローチには核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞導入が必要である。更に、骨髄移植、免疫療法又は後で再投与する目的で生物から抽出した細胞に遺伝子を導入する他の方法のアプローチでは核酸のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞導入が必要である。
核酸の細胞導入を改善するために種々の合成ベクターが開発されている。これらのベクターのうちで、カチオン脂質は有利な性質をもつ。これらベクターは核酸と相互作用する極性カチオン部分と、細胞侵入を助長する疎水性脂質部分から構成される。カチオン脂質の特定例は特にモノカチオン脂質（ＤＯＴＭＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））、所定のカチオン洗剤（ＤＤＡＢ）、リポポリアミン及び特にジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）又は例えばその製法が特許出願ＥＰ３９４１１１に記載されているパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミラミド（ＤＰＰＥＳ）である。別のリポポリアミン系は参考資料として本明細書の一部とする特許出願ＷＯ９７／１８１８５に記載されている化合物に代表される。
本発明は特に有利な性質をもつ新規型の核酸導入剤に関する。より詳細には、本発明の化合物は改善された性質を分子に与える独自のカチオン領域をもつカチオン脂質である。このカチオン部分はより詳細には１個以上のアミジン基をもつ特定ポリアミンである。
本発明の第１の目的はより詳細には一般式（Ｉ）：
0004467084.tif 000002
［式中、
−Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して水素原子又は−（ＣＨ2）q−ＮＲＲ’を表し、
・ｑは１〜６の整数であり、ｑの値はＲ1、Ｒ2及びＲ3各基の間で相互に独立しており、
・Ｒ及びＲ’は相互に独立して水素原子又は式（ＩＩ）：
0004467084.tif 000003
（式中、ｒは０〜６の整数であり、Ｒ5基は相互に独立して水素原子又は炭化水素残基を表し、
但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3基の少なくとも１種は少なくとも１個の式（ＩＩ）の基を含む）の基を表し、
−ｍ及びｎは相互に独立して１〜６の整数を表し、ｎが１よりも大きいときにはｍは種々の値をとることができ、Ｒ3は一般式（Ｉ）において種々の意味をもち、
−ｐは１〜６の整数を表し、
−Ｒ4は一般式（ＩＩＩ）：
0004467084.tif 000004
（式中、
・Ｒ7及びＲ8は相互に独立して水素原子又は親油基を表し、Ｒ7及びＲ8の少なくとも一方は水素以外のものであり、
・ｔは０〜１０から選択される整数であり、Ｒ6、Ｘ、Ｙ及びｓはｔが１よりも大きい整数であるときには種々のモチーフ［Ｘ−（ＣＨＲ6）s−Ｙ］において異なる意味をもつことができ、
・Ｘは酸素もしくは硫黄原子又はアミノもしくはアルキルアミノ基を表し、アルキル置換基は直鎖でも分枝鎖でもよく、１〜８個の炭素原子を含み、
・Ｙはカルボニル基又はメチレン基を表し、
・Ｒ6は水素原子又は場合により置換基をもつ天然アミノ酸の側鎖を表し、
・ｓは１〜１０の整数を表し、ｓが１であるときにはＲ6は場合により置換基をもつ天然アミノ酸の側鎖を表し、ｓが１よりも大きいときにはＲ6は水素原子を表す）の基を表す］のＤ、Ｌ又はＤＬ形態の化合物とその塩に関する。
上記に使用したような「ＤＬ形態」なる用語は、任意割合、例えば等しい割合のＤ形態とＬ形態の混合物を意味する。
本発明では「炭化水素残基」とは、場合によりハロゲン化された任意アルキル、カルバミン酸又は脂肪族もしくは芳香族アシル置換基を意味する。脂肪族残基としては、特に場合によりハロゲン化された飽和又は不飽和、直鎖又は分枝鎖、環状又は非環状脂肪族残基を挙げることができる。炭素原子数１〜１０の脂肪族残基がより好ましい。特に、アルカノイル、アルキル及びアルキルカルバミン酸置換基（例えばホルミル、ブチル、第３級ブチル又は第３級ブチルカルバミン酸置換基）を挙げることができる。本発明の変形例によると、Ｒ5は第３級ブチルカルバミン酸を表す。
芳香族残基のうちでは、特にベンジルとその誘導体（例えばクロロベンジル、ベンジルカルバミン酸又はクロロベンジルカルバミン酸）を挙げることができる。
Ｒ5は第３級ブチルカルバミン酸、ベンジルカルバミン酸又はクロロベンジルカルバミン酸を表すことが好ましい。
本発明の第１の変形例では、Ｒ5基の一方が水素原子を表し、他方が炭素原子数１〜１０の脂肪族残基を表す。
本発明の第２の変形例では、Ｒ5基の一方が水素原子を表し、他方が好ましくはベンジルとその誘導体から選択される芳香族残基を表す。
本発明の別の変形例では、２個のＲ5基が水素原子を表す。
Ｒ1、Ｒ2及び／又はＲ3が水素以外のものであり、一般式（ＩＩ）を含むときには、ｑは２又は３であるｒは０にすると有利である。
一般式（Ｉ）においてｍは２、３及び４から選択することが好ましい。
上述のように、式（ＩＩＩ）においてＲ7及びＲ8基の少なくとも一方は親油基を表す。本発明で「親油基」とは、細胞侵入を助長する当業者に公知の任意の脂質型疎水基を意味する。特に、１個以上の脂肪鎖、ステロイド誘導体、好ましくはラメラもしくは六方相を形成することが可能な天然もしくは合成脂質、又は場合によりその組み合わせを挙げることができる。より詳細には、場合によりハロゲン化された飽和又は不飽和、直鎖又は分枝鎖の炭素原子数５〜２２の脂肪族基を挙げることができる。更に、ステロイド誘導体や、例えばコレステリルホルメート、アラキドニル又はコリン酸等の（ＣＨ2）u−ＮＨ−Ｒ9基（式中、ｕは２〜６の整数であり、Ｒ9はアシル基である）も挙げられる。
ステロイド誘導体の他の例は特にコレステロール、コレスタノール、３−α−５−シクロ−５−コレスタン−６−β−オール、コリン酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート、３α，５−シクロ−５α−コレスタン−６β−イルホルメート、コレステリルアミン、６−（１，５−ジメチルヘキシル）−３ａ，５ａ−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ［ａ］シクロプロパ［２，３］シクロペンタ［１，２−ｆ］ナフタレン−１０−イルアミン、又はコレスタニルアミンである。
好ましくは、親油基は炭素原子数１０〜２２、好ましくは炭素原子数１４、１６、１７、１８又は１９の脂肪族基である。特に、親油基（ＣＨ2）13ＣＨ3、（ＣＨ2）15ＣＨ3、（ＣＨ2）16ＣＨ3、（ＣＨ2）17ＣＨ3、（ＣＨ2）18ＣＨ3及びオレイルを挙げることができる。
特定実施態様では、Ｒ7及びＲ8基の両方が上記のような親油基を表す。特に、好ましい実施態様では、Ｒ7及びＲ8基の各々が炭素原子数５〜２２、より好ましくは炭素原子数１２〜２２の脂肪鎖を表す。
本発明の変形例によると、Ｒ6は天然アミノ酸の側鎖を表す。特に、天然アミノ酸の側鎖は例えばアルギニンの側鎖のようにアミジニウムモチーフを含むことができる。この側鎖Ｒ6は上述のように、炭素原子数１〜２４の飽和又は不飽和、直鎖、分枝鎖又は環状脂肪族基で置換してもよい。例えばコレステリル基、アラキドニル基、レチノイル基、モノ又はポリ芳香族基（例えば置換もしくは非置換ベンジルオキシカルボニル、ベンジルエステル、ローダミニル又はビオチニル誘導体）により置換されたアミノ酸の側鎖を挙げることができる。
特に有利な実施態様では、本発明の化合物は更に化合物が結合した核酸の導入を導くことが可能なターゲティングエレメントを更に含む。このターゲティングエレメントはＲ6置換基により示されるアミノ酸側鎖のレベルで一般式（Ｉ）の化合物に組み込むことが好ましい。ターゲティングエレメントは共有又は非共有的に本発明の化合物に結合するとより好ましい。
このようなエレメントとしては、所望される所定細胞型又は所定組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞等）に核酸導入を導くことが可能な細胞外ターゲティングエレメントを挙げることができる。例えば標的細胞型の表面に存在する細胞レセプターのリガンド（例えば糖、葉酸、トランスフェリン、インスリン、アシアロオロソムコイドタンパク質又は細胞外レセプターにより認識される任意生物活性分子）を挙げることができる。また、所定の優先細胞区画（ミトコンドリア、核等）に向けて核酸の導入を導くことが可能な細胞内ターゲティングエレメント（例えば核の内部にトランスフェクトしたＤＮＡを優先的に蓄積する核局在シグナル（ｎｌｓ）配列）でもよい。
より一般には、本発明の範囲で利用可能なターゲティングエレメントとしては、糖、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ステロイド又は脂質が挙げられる。糖及び／又はペプチド（例えば抗体又は抗体フラグメント、細胞レセプター又はそのフラグメントのリガンド、レセプター又はレセプターフラグメント等）が好ましい。特に、増殖因子レセプター、サイトカインレセプター、細胞レクチンレセプター又は接着タンパク質のレセプター（例えばインテグリン）のリガンドが挙げられる。トランスフェリン、脂質ＨＤＬ及びＬＤＬのレセプターも挙げることができる。ターゲティングエレメントはレクチンをターゲティングすることが可能な糖（例えばアシアログリコプロテインレセプター）や、イムノグロブレンのＦｃフラグメントのレセプターをターゲティングすることが可能な抗体のＦａｂフラグメントでもよい。
同様に、例えばビオチン、ローダミン、葉酸型のマーカー物質をアミノ酸側鎖Ｒ6で一般式（Ｉ）の化合物に結合することも考えられる。このマーカー物質はインテグリン型の接着タンパク質の一次及び／又は二次レセプターの認識エピトープＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む直鎖又は環状ペプチド又はプソイドペプチド配列でもよい。
本発明の化合物の特定系は、Ｒ1が式（ＩＩ）の基を含み、Ｒ2とＲ3が水素原子である系である。
本発明の化合物の第２の特定系はＲ1とＲ2が各々式（ＩＩ）の基を含み、Ｒ3が水素原子である系である。
本発明の化合物の別の特定系はＲ1とＲ3が各々式（ＩＩ）の基を含み、Ｒ2が水素原子である系である。
本発明の化合物の別の特定系はＲ1、Ｒ2及びＲ3が各々式（ＩＩ）の基を含む系である。
本発明の一般式（Ｉ）の新規化合物は塩の形態でもよく、非毒性で医薬的に許容可能であることが好ましい。これらの非毒性塩は鉱酸（塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸又は蓚酸）、無機塩基（ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム）又は有機塩基（トリエチルアミン等の第３級アミン、ピペリジン、ベンジルアミン）と共に形成される塩を含む。
より詳細には、下記一般式により表される本発明の化合物を挙げることができる。
0004467084.tif 000005
0004467084.tif 000006
（式中、Ｒ4及びＲ5は上記と同義である）。
本発明の核酸導入剤の例として、下式の化合物を挙げることができる。
0004467084.tif 000007
0004467084.tif 000008
本発明の化合物は種々の方法で製造することができ、特に溶液中で合成及び／又はポリマー支持体上で固相合成により製造することができる。
第１の合成経路によると、一般式（Ｉ）の本発明の化合物は場合によりアミンを保護した尿素のチオ又はオキソ誘導体を式（ＶＩＩＩ）：
0004467084.tif 000009
［式中、
Ｒ’1、Ｒ’2、Ｒ’3は相互に独立して水素原子又は（ＣＨ2）q−ＮＲ9Ｒ10基を表し、ｑは１〜６であり、各ｑは相互に独立しており、
Ｒ9及びＲ10は相互に独立して水素原子又は式（ＣＨ2）r−ＮＨ2の基を表し、ｒは相互に独立して１〜６であり、
ｍ、ｎ、ｐ及びＲ4は上記と同義である］のリポポリアミンに作用させることにより得られる。
尿素誘導体の作用は一般に適当なプロトン又は非プロトン性溶剤中で塩基の存在下に０℃〜１００℃の温度で実施される。
使用する塩基は一般に例えば第３級アミン、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム等の非求核性塩基である。例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）又はＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ）等の第３級アミンを使用すると有利である。
反応は、水、アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール）、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、四塩化炭素、ベンゼン、アセトニトリル、Ｎ−メチルピロリドン等の溶剤中で実施すると有利である。反応温度は好ましくは２０℃〜６０℃、より好ましくは３０℃〜５０℃とする。
特に有利な尿素誘導体は例えばＯ−メチルイソ尿素（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８（１９９５），１６，３０５３−３０６１）、Ｓ−メチルイソチオ尿素の半硫酸塩（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４０（１９９２），１１９−１２６）、ビス−Ｂｏｃ−チオ尿素（Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．４８（１９９３），７６７７−７６８０）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素又はＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素（Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６（１９９６），２，４０７−４１３）である。
一般式（ＶＩＩＩ）のリポポリアミンは参考資料として本明細書の一部とする特許出願ＷＯ９７／１８１８５に記載されている方法又は当業者に公知の任意の類似方法により得られる。
本発明によると、一般式（Ｉ）の導入剤は一般式（ＩＸ）：
0004467084.tif 000010
の酸と脂質分子Ｒ4Ｈ（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、ｍ、ｎ、ｐ及びＲ4は上記と同義である）のペプチド結合によっても得られる。
ペプチド結合は慣用方法（Ｂｏｄａｎｓｋｉ  Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅ−Ｖｅｒｌａｇ編）又は当業者に公知の任意の類似方法により実施される。
特に、反応は一般に適当な非プロトン性溶剤中で非求核性塩基の存在下に０〜１００℃の温度、９〜１１のｐＨで実施される。
例えば、クロロホルム、ジメチルホルム、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、ジクロロメタン、トルエン又はベンゼンを溶剤として使用することができる。
使用する非求核性塩基は第３級アミン、炭酸カルシウム又は重炭酸カルシウムが好ましい。使用するアミンは例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）やＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ）等の第３級アミンがより好ましい。
反応は０℃〜５０℃、より好ましくは１０℃〜３０℃の温度で実施すると有利である。
Ｒ4が上記と同義である式ＲＨ4の脂質分子は一般式（Ｘ）：
0004467084.tif 000011
の市販化合物と式ＮＨＲ7Ｒ8（式中、Ｘ、Ｙ、ｓ、ｔ、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は上記と同義である）のアミンのペプチド結合により得られる。
ペプチド結合は慣用方法（Ｂｏｄａｎｓｋｉ  Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅ−Ｖｅｒｌａｇ編）又は当業者に公知の任意の類似方法により実施される。
特に、反応は上述のように一般に適当な非プロトン性溶剤中で非求核性塩基の存在下に０〜１００℃の温度、９〜１１のｐＨで実施される。
一般式（ＩＸ）の酸は下記３段階で固相合成経路により得られる。
−一般式（ＸＩ）：
0004467084.tif 000012
（式中、Ｒ’1、Ｒ’2、Ｒ’3、ｍ及びｎは上記と同義である）のポリアミンをポリマー支持体Ｐにグラフトし、一般式（ＸＩＩ）：
0004467084.tif 000013
のグラフト化合物を得る。
反応は例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン等の適当な非プロトン性溶剤の存在下に０〜１００℃の温度で実施するのが好ましい。反応温度は周囲温度とすると有利である。
種々のポリマー支持体を利用できる。市販の固相ペプチド合成（メリフィールド合成）用樹脂を選択すると有利である。特に、遊離酸基をもつ生成物を提供する塩化ｏ−クロロトリチル樹脂又はＨＭＰ樹脂や、Ｒｉｎｋ型の樹脂を選択することができる。ポリアミノ酸は、固相で予め合成したブロモアルキル基又はω−アルデヒド酸をもつペプチドで直接合成することができる。
適当な樹脂を得るために使用するアルキル化剤はアルキル化方法に応じて選択する。慣用アルキル化には、例えばブロモ酢酸又はω−ハロゲノカルボン酸を選択する。還元アルキル化には、例えばω−アルデヒドカルボン酸（例えばグリオキサル酸、コハク酸セミアルデヒド等）、又はケト酸（例えばアセト酢酸又はピルビン酸等）を選択する。
一般式（ＸＩ）の出発ポリアミンは、例えばスペルミジン、スペルミン、トリス−（２−アミノエチル）アミン、フェニレンジアミン、ジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）等の市販品でもよいし、例えばジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）、アミン、スペルミジン、スペルミン等の市販アミンのシアノエチル化等の慣用方法により合成して分枝鎖ポリアミンを得ることもできる。
−第２段階では、一般式（ＸＩＩ）のグラフト化合物を場合によりアミンを保護した尿素のチオ又はオキソ誘導体と反応させ、一般式（ＸＩＩＩ）：
0004467084.tif 000014
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、ｍ、ｎ及びｐは上記と同義である）のグラフトポリアミノアミジン化合物を得る。
反応は当業者に公知の方法（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｒ．Ｊ．とＭｃＭａｎｉｓ，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １５−Ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，５２，１７００−１７０３）又は類似方法により実施される。
反応は特にプロトン又は非プロトン性溶剤の存在下に−２０℃〜１００℃の温度で実施される。
例えば、水、アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール等）、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、クロロホルム、芳香族溶剤（トルエン、ベンゼン等）、四塩化炭素、アセトニトリル、Ｎ−メチルピロリドン等を溶剤として使用する。
特に有利な尿素誘導体は例えばＯ−メチルイソ尿素（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８（１９９５），１６，３０５３−３０６１）、Ｓ−メチルイソチオ尿素の半硫酸塩（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４０（１９９２），１１９−１２６）、ビス−Ｂｏｃ−チオ尿素（Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．４８（１９９３），７６７７−７６８０）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素又はＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素（Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６（１９９６），２，４０７−４１３）である。
−最後に、最終段階で一般式（ＸＩＩＩ）のグラフトポリアミノアミジンをポリマー支持体から分離し、上記のような一般式（ＩＸ）の酸を得る。分離は当業者に公知の慣用方法により実施される。特に、分子の残余を分解しない弱酸の作用により操作する。好ましい弱酸は例えばフッ化アルコール、特に１，１，１−トリフルオロエタン−２−オールである。
酸、アミノ、アルキルアミノ及び／又はアミジン基を含む一般式（ＸＩＩＩ）のポリアミノアミジンは、場合によりポリマー支持体から分離する前に保護することが好ましい。保護は、その使用と脱離が分子の残余を変化させないような任意の適合可能な基により実施することができる。特に、Ｔ．Ｗ．ＧＲＥＥＮＥ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９８１）又はＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９７３）に記載されている方法に従って操作する。
場合により実施する保護基の脱離は、当業者に公知の慣用方法に従い、ポリマー支持体から分離後に得られる一般式（ＩＸ）の酸と一般式Ｒ4Ｈの化合物のペプチド結合の前に実施される。
例えば、保護基はトリメチルシリル、ベンズヒドリル、テトラヒドロピラニル、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルオキシカルボニル等の基から選択することができる。
本発明の核酸導入剤を生成する当業者に公知の他の任意方法、特にＢｏｄａｎｓｋｉ  Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅ−Ｖｅｒｌａｇ編に記載されている方法も本発明の範囲に含まれる。
本発明の別の目的は、上記のような物質と核酸を含む組成物に関する。化合物と核酸は、好ましくは核酸の負電荷に対する化合物の正電荷の比Ｒが０．１〜５０、より好ましくは０．１〜２０となるような量で存在する。この比は使用する化合物、核酸及び所期用途（特にトランスフェクトしようとする細胞型）に応じて当業者が容易に調節することができる。
本発明では「核酸」とはデオキシリボ核酸とリボ核酸を意味する。核酸は天然配列でも合成配列でもよく、特にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ハイブリッド配列、合成又は半合成配列、修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルス等の起源とすることができる。これらの核酸は当業者に公知の任意方法により得られ、特にバンクスクリーニング、化学合成、又はバンクスクリーニングにより得られた配列の化学もしくは酵素修飾を含む混合法により得られる。核酸は化学的に修飾することができる。
特にデオキシリボ核酸については、１本鎖でも２本鎖でもよいし、短いオリゴヌクレオチドでもより長い配列でもよい。特に、核酸はプラスミド、ベクター、エピソーム、発現カセット等から構成すると有利である。これらのデオキシリボ核酸は標的細胞で機能的又は非機能的な複製起点と、１個以上のマーカー遺伝子と、転写又は複製の調節配列と、着目治療遺伝子と、修飾又は非修飾アンチセンス配列と、他の細胞成分との結合領域等を含むことができる。
核酸は標的細胞で活性な１種以上のプロモーターと転写ターミネーターの制御下におかれた１種以上の着目治療遺伝子から構成される発現カセットを含むことが好ましい。
本発明では、着目治療遺伝子とは特に治療効果をもつタンパク性物質をコードする任意遺伝子を意味する。このようにコードされるタンパク性物質は特にタンパク質又はペプチドであり得る。このタンパク性物質は標的細胞に対して同種の外来又は内因物質、即ち標的細胞が疾病をもたないときに標的細胞で正常に発現される物質とすることができる。この場合には、タンパク質が発現されると、例えば細胞で不十分な発現や修飾により不活性又は活性が弱まっているタンパク質の発現を補ったり、このようなタンパク質を過剰に発現することができる。着目治療遺伝子は安定性の増加、活性の変化等を示す細胞タンパク質の突然変異体をコードするものでもよい。タンパク性物質は標的細胞に対して異種でもよい。この場合には、発現されるタンパク質は例えば細胞に欠失している活性を補充又は付加し、疾病に対抗できるようにしたり、免疫応答を刺激したりすることができる。
本発明の意味での治療物質としては、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等（ＦＲ９２／０３１２０））、増殖因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン等）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等、ＦＲ９３／０５１２５）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ９１／１１９４７））、膵臓線維症に関連するタンパク質ＣＦＴＲ、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等、ＦＲ９３／０４７４５号）、凝血に関与する因子（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ因子）をコードする遺伝子、ＤＮＡの修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビン又は他のタンパク質体の遺伝子、代謝酵素、同化酵素等を特に挙げることができる。
着目治療核酸は更に、標的細胞で発現されると遺伝子発現又は細胞ｍＲＮＡ転写を調節することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列は、例えば特許ＥＰ１４０３０８に記載の技術に従って、標的細胞で細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡに転写され、こうしてそのタンパク質翻訳を阻止することができる。治療遺伝子は更に、標的ＲＮＡを選択的に破壊することが可能なリボソームをコードする配列も含む（ＥＰ３２１２０１）。
核酸は更に、ヒト又は動物で免疫応答を発生することが可能な抗原ペプチドをコードする１個以上の遺伝子を含んでいてもよい。従って、この特定態様によると、本発明はヒト又は動物で特に微生物、ウイルス又は癌に対するワクチン又は免疫治療を実現することができる。特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、偽狂犬病ウイルス、シンシチウム形成ウイルス、他のウイルスの特異的抗原ペプチド又は腫瘍特異的抗原ペプチド（ＥＰ２５９２１２）を挙げることができる。
好ましくは、核酸は更に所望細胞又は臓器において着目治療遺伝子及び／又は抗原ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列も含む。このような配列としては、これらの配列が感染細胞で機能できるときに該当遺伝子の発現に天然に関与する配列が挙げられる。異なる起源の配列でもよい（他のタンパク質の発現に関与する配列でもよいし、あるいは合成配列でもよい）。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。例えば、感染させたい細胞のゲノムに由来するプロモーター配列が挙げられる。また、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ等の遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、活性化配列や調節配列等を付加してこれらの発現配列を修飾してもよい。誘導又は抑制プロモーターでもよい。
更に、核酸は合成された治療物質を標的細胞の分泌経路に導くシグナル配列も特に着目治療遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は着目治療物質の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。核酸は更に合成治療物質を特定細胞区画に導くシグナル配列も含んでいてもよい。
別の態様において、本発明は核酸と、上記のようなトランスフェクション剤と、トランスフェクション剤／核酸複合体に結合してトランスフェクト能を改善することが可能な１種以上のアジュバントを含む組成物に関する。この種のアジュバント（脂質、ペプチド又はタンパク質）が存在すると、トランスフェクト能を増加できるという利点がある。
この点で、本発明の組成物はアジュバントとして１種以上の中性脂質を含むことができる。このような組成物は特に核脂質複合体のＲ比が小さいときに特に有利である。本願出願人は実際に、中性脂質を加えると核脂質粒子の形成を改善し、細胞膜を不安定にして粒子の細胞侵入を助長できることを立証した。
より好ましくは、本発明の範囲内で使用する中性脂質は２個の脂肪鎖をもつ脂質である。生理的条件下で両性イオン性又はイオン電荷をもたない天然又は合成脂質を使用すると特に有利である。脂質は特にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン及びその１〜３倍Ｎ−メチル化誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（例えば特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴ脂質（例えば特にスフィンゴミエリン）又はアシアロガングリオシド（例えば特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択することができる。
これらの種々の脂質は当業者に周知の慣用技術により合成するか又は臓器（例えば脳）もしく胎児から抽出することにより得られる。特に、天然脂質の抽出は有機溶剤を用いて実施することができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ参照）。
ごく最近になって本願出願人は前記核酸の圧縮レベルに直接又は間接的に作用する化合物をアジュバントとして使用すると特に有利であることも立証した（ＷＯ９６／２５５０８）。本発明の組成物中にこのような化合物が存在すると、トランスフェクタント化合物の量を低減でき、トランスフェクト活性を損なわずに毒物学的面で有益な結果が得られる。核酸の圧縮レベルに作用する化合物とは、核酸を直接又は間接的に圧縮する化合物として定義される。より詳細には、この化合物はトランスフェクトしようとする核酸のレベルに直接作用するか、又はこの核酸の圧縮に直接関与する付加化合物のレベルに作用することができる。核酸のレベルに直接作用するものが好ましい。例えば、予備圧縮剤は任意ポリカチオン、例えばポリリジンとすることができる。好ましい態様によると、核酸の圧縮レベルに作用するこの物質は全体又は一部がプロタミン、ヒストン又はヌクレオリン及び／又はそれらの誘導体の１種から誘導される。このような物質は全体又は一部をペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／又は（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成してもよく、モチーフ数は２〜１０である。本発明による化合物の構造において、これらのモチーフは連続又は不連続的に反復し得る。従って、これらのモチーフは生化学的結合（例えば１個以上のアミノ酸）又は化学的結合により分離することができる。
好ましくは、本発明の組成物は核酸１当量当たりアジュバント０．０１〜２０当量（モル／モル）、より好ましくは０．５〜５当量を含む。
特に有利な実施態様では、本発明の組成物は更に核酸の導入を導くことが可能なターゲティングエレメントを含む。このターゲティングエレメントは所望の所定細胞型又は所定組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞等）へのＤＮＡの導入を導くことが可能な細胞外ターゲティングエレメントとすることができる。所定の優先細胞区画（ミトコンドリア、核等）への核酸の導入を導くことが可能な細胞内ターゲティングエレメントでもよい。ターゲティングエレメントは上述のように本発明の核酸導入剤又は核酸に結合することができる。
本発明の範囲で利用可能なターゲティングエレメントとしては、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ビタミン又はその誘導体が挙げられる。糖、ペプチド又はタンパク質（例えば抗体又は抗体フラグメント、細胞レセプター又はそのフラグメントのリガンド、レセプター又はレセプターフラグメント等）が好ましい。特に、増殖因子レセプター、サイトカインレセプター、細胞レクチン型レセプター又は接着タンパク質レセプター（例えばインテグリン）に対して親和性をもつＲＧＤ配列をもつリガンドが挙げられる。トランスフェリン、脂質ＨＤＬ及びＬＤＬのレセプター又は葉酸の輸送体も挙げることができる。ターゲティングエレメントはアシアログリコプロテイン又はシアリド（例えばシアリドルイスＸ）に対するレセプター等のレクチンをターゲティングすることが可能な糖や、抗体のＦａｂフラグメント又は１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）でもよい。
ターゲティングエレメントと核脂質複合体の結合は、当業者に公知の任意方法により実施することができ、例えば疎水性部分又は本発明の導入剤の核酸と相互作用する部分又は本発明の導入剤もしくは核酸と相互作用する基と結合することにより実施することができる。該当相互作用は好ましい態様によるとイオン性又は共有性である。
本発明は更に核酸（より一般にはポリアニオン）を細胞に導入するための上記化合物の使用にも関する。
例えば遺伝子調節研究、疾病動物モデルの作製又は治療にｉｎ  ｖｉｖｏ使用するには、本発明の組成物を局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、気管内、腹腔内等の経路で投与するように調剤することができる。好ましくは、本発明の組成物は特に所望臓器のレベルに直接注射するための注射用製剤又は局所投与（皮膚及び／又は粘膜）用として医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。このようなキャリヤーとしては、特に等張滅菌溶液又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えると注射可能な溶質を構成することが可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物が挙げられる。注射に使用する核酸の用量及び投与回数は種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当疾病、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて選択できる。特に投与方法については、組織（例えば腫瘍レベル）又は循環経路への直接注射や、培養細胞処理後の注射又は移植によるｉｎ  ｖｉｖｏ再移植が挙げられる。本発明の範囲に該当する組織又は循環経路は例えば筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、直腸、神経系、眼、腺、結合組織等である。
本発明は更に、
（１）核酸を上記導入剤と接触させて複合体を形成する段階と、
（２）（１）で形成された複合体と細胞を接触させる段階を含む核酸の細胞導入法にも関する。
細胞と複合体の接触は、細胞をこの複合体と共にインキュベートする（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ使用）か、複合体を生物に注入する（ｉｎ  ｖｉｖｏ使用）ことにより実施することができる。インキュベーションは例えば細胞１０6個当たり核酸０．０１〜１０００μｇの存在下に実施すると好ましい。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与では、例えば０．０１〜１０ｍｇの核酸用量を使用することができる。
本発明の組成物が更に上述のような１種以上のアジュバント及び／又はターゲティングエレメントを含む場合には、アジュバント及び／又はターゲティングエレメントを本発明の導入剤又は核酸に予め混合しておく。
従って、本発明は核酸導入、特に疾病治療に特に有利な方法を提供するものであり、上記条件下で一般式（Ｉ）の導入剤に結合した前記疾病を治療することが可能な核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｘ  ｖｉｖｏ投与を特徴とする。より詳細には、この方法はタンパク性又は核酸物質の不足に起因する疾病に適用することができ、投与する核酸は前記タンパク性物質をコードするか、核酸物質に転写されるか、又は前記核酸物質を構成する。
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞トランスフェクションのための本発明の一般式（Ｉ）の導入剤の全使用に及ぶ。
本発明の化合物は特に初代細胞又は樹立系に核酸を導入するために使用することができる。このような細胞としては、分化又は多能性（前駆物質）形態の繊維芽細胞、筋細胞、神経細胞（ニューロン、星状細胞、グリア細胞）、肝細胞、造血系細胞（リンパ球、ＣＤ３４、樹状細胞等）、上皮細胞等が挙げられる。
上記構成に加え、本発明は以下の実施例及び図面に明示される他の特徴及び利点も含むが、以下の実施例及び図面は例示に過ぎず、本発明を制限するとみなすべきではない。
図面
図１／１５：本発明の化合物の合成スキーム。
図２／１５：血清タンパク質の不在下における本発明の化合物１とそのアミン類似体（ＲＰＲ１２０５３５）のＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２及びＨｅＬａ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率の比較測定結果。
「アミン類似体」とは、アミジン及び／又はグアニジン基をアミノ基に置き換えた以外は同一のカチオン脂質を意味する。測定は横軸に示す種々の電荷比で実施した。縦軸にルシフェラーゼの発現をウェル当たりＲＬＵ（相対光単位）で示す。
図３／１５：血清タンパク質の不在下（白いバー）及び存在下（黒いバー）における本発明の化合物１とそのアミン類似体（ＲＰＲ１２０５３５）のＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２及びＨｅＬａ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率の比較測定結果。
測定は横軸に示す種々の電荷比で実施した。縦軸にルシフェラーゼの発現をウェル当たりＲＬＵ（相対光単位）で示す。
図４／１５：血清タンパク質の不在下における本発明の化合物２のＨｅＬａ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率の測定結果。測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物２で実施した。
横軸はカチオン脂質とＤＮＡの間に形成される複合体の電荷比を示す。縦軸は各々１０００００個の細胞を含むウェル当たりｐｇとしてルシフェラーゼの発現を示す。
図５／１５：血清タンパク質の不在下における本発明の化合物３のＨｅＬａ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率の測定結果。測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物３で実施した。
横軸はカチオン脂質とＤＮＡの間に形成される複合体の電荷比を示す。縦軸は各々１０００００個の細胞を含むウェル当たりｐｇとしてルシフェラーゼの発現を示す。
図６／１５：血清タンパク質の不在下における本発明の化合物５のＨｅＬａ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率の測定結果。測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物５で実施した。
横軸はカチオン脂質とＤＮＡの間に形成される複合体の電荷比を示す。縦軸は各々１０００００個の細胞を含むウェル当たりｐｇとしてルシフェラーゼの発現を示す。
図７／１５：血清タンパク質の不在下における本発明の化合物６のＨｅＬａ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率の測定結果。測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物６で実施した。
横軸はカチオン脂質とＤＮＡの間に形成される複合体の電荷比を示す。縦軸は各々１０００００個の細胞を含むウェル当たりｐｇとしてルシフェラーゼの発現を示す。
図８／１５：化合物２により形成される核脂質複合体の物理化学相（Ａ、Ｂ又はＣ相）をそのアミン類似体と比較して電荷比の関数として示す表。
相の測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物２とそのアミン類似体で実施した。
２つの表を比較すると、化合物２では不安定なＢ相が低電荷比側に移っている。
図９／１５：化合物３により形成される核脂質複合体の物理化学相（Ａ、Ｂ又はＣ相）をそのアミン類似体と比較して電荷比の関数として示す表。
相の測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物３とそのアミン類似体で実施した。
２つの表を比較すると、化合物３では不安定なＢ相が低電荷比側に移っている。
図１０／１５：化合物５により形成される核脂質複合体の物理化学相（Ａ、Ｂ又はＣ相）をそのアミン類似体と比較して電荷比の関数として示す表。
相の測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物５とアミン類似体で実施した。
２つの表を比較すると、化合物５では不安定なＢ相が低電荷比側に移っている。
図１１／１５：化合物６により形成される核脂質複合体の物理化学相（Ａ、Ｂ又はＣ相）をそのアミン類似体と比較して電荷比の関数として示す表。
相の測定はミセル形態と中性補助脂質（ＤＯＰＥ及びコレステロール）を加えた化合物６とそのアミン類似体で実施した。
２つの表を比較すると、化合物６では不安定なＢ相が低電荷比側に移っている。
図１２／１５：ミセル形態の化合物２、３、５及び６で臭化エチジウムの添加後の蛍光低下を示す表。ＤＮＡの臭化エチジウムが脂質で置換されると、ＤＮＡに結合したと判断される。ＤＮＡ単独に得られる蛍光を１００％と定義する。
図１３／１５：コレステロールの存在下の化合物２、３、５及び６で臭化エチジウムの添加後の蛍光低下を示す表。ＤＮＡの臭化エチジウムが脂質で置換されると、ＤＮＡに結合したと判断される。ＤＮＡ単独に得られる蛍光を１００％と定義する。
図１４／１５：ＤＯＰＥの存在下の化合物２、３、５及び６で臭化エチジウムの添加後の蛍光低下を示す表。ＤＮＡの臭化エチジウムが脂質で置換されると、ＤＮＡに結合したと判断される。ＤＮＡ単独に得られる蛍光を１００％と定義する。
図１５／１５：プラスミドｐＸＬ３０３１の地図。
略語及び記号
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル
ＢＯＣ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ：ジシクロヘキシル尿素
ＤＩＥＡ：Ｎ−エチルジイソプロピルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＯＤＡ：ジオクタデシルアミン
ＥＰ：石油エーテル
ＥｔＯＨ：エタノール
ＮＥｔ3：トリエチルアミン
Ｒｆ：前端保持率
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＳ：テトラメチルシラン
ＵＶ：紫外線
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
ＣｌＺ：ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル
化学合成用材料及び方法
ａ）化合物
−出発ポリアミンは例えばスペルミジン、スペルミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、フェニレンジアミン、ジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）等の市販品でもよいし、例えばジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）、アミン、スペルミジン、スペルミン等の市販アミンをシアノエチル化して分枝鎖ポリアミンを得ることにより慣用方法で合成してもよい。
−使用するポリマーは固相ペプチド合成（メリフィールド合成）用として市販されている樹脂、特に遊離酸基をもつ生成物を提供する塩化ｏ−クロロトリチル樹脂やＨＭＰ樹脂又はＲｉｎｋ型の樹脂である。ポリアミノ酸は、固相で予め合成したブロモアルキル基又はω−アルデヒド酸をもつペプチド上で直接合成することができる。
−ジオクタデシルアミン、トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、ＢＯＰ、ＤＭＡＰ、クロロギ酸ベンジルは市販品である。ＮａＣｌとＮａＨＣＯ3の溶液は飽和溶液であり、ＫＨＳＯ4溶液は０．５Ｍである。
ｂ）物理的測定
陽子ＮＭＲスペクトルはスペクトロメーターＢｒｕｋｅｒ４００及び６００ＭＨｚで記録した。
質量スペクトル（ＭＳ）はＡＰＩ−ＭＳ／ＩＩＩで測定した。
ｃ）精製及び分析方法
ａ）順相クロマトグラフィー条件
−薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は厚さ０．２ｍｍのＭｅｒｃｋシリカゲルプレートで実施した。
検出には紫外線（２５４ｎｍ）を使用し、アミン又はアミドは１５０℃に加熱しながらニンヒドリンのエタノール溶液（４０ｍｇ／１００ｍｌ  ＥｔＯＨ）を噴霧（弱いスプレー）することによりニンヒドリンで検出し、第１級アミンは溶液（４０ｍｇ／１００ｍｌアセトン）を噴霧することによりフルオレサミンで検出し、あるいはヨード粉末でプレートを覆うことによりヨードで検出する。
−順相カラムクロマトグラフィーは粒度０．０６３〜０．２００ｍｍのシリカゲル６０  Ｍｅｒｃｋで実施した。
ｂ）分析クロマトグラフィー方法
ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析は積分計算器Ｄ２５００  ＨＩＴＡＣＨＩ、オートサンプラーＡＳ−２０００Ａ、インテリジェントポンプＬ−６２００Ａ及び分析分離用に２２０ｎｍに波長を調節可能な紫外−可視検出器Ｌ−４０００を備えるＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ装置で実施した。分析分離用カラムはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製カラムＢＵ−３００ａｑｕａｐｏｒｅ  Ｂｕｔｙｌ  ７ｍ，３００Ａ  ３００×４．６ｍｍである。移動相は０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水と０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。１００μｌ蛇の目弁に約１ｍｇ／ｍｌの溶液２０μｌを注入する。分析流速は１ｍｌ／分に調節する。
分離条件：
溶剤Ａ
脱イオン水                  ２５００ｍｌ
トリフルオロ酢酸                  ２ｍｌ
溶剤Ｂ
ＨＰＬＣ用アセトニトリル    ２５００ｍｌ
トリフルオロ酢酸                  ２ｍｌ
勾配：
0004467084.tif 000015
ｃ）分取クロマトグラフィー方法
装置はＵＶ検出可能な勾配モード液相クロマトグラフィー用装置である。この分取系は下記エレメントから構成される。
ポンプＡ：５０ＳＣヘッドを備えるＧＩＬＳＯＮモデル３０５。
ポンプＢ：５０ＳＣヘッドを備えるＧＩＬＳＯＮモデル３０３。
注入リング：２５ＳＣヘッドを備えるＧＩＬＳＯＮモデル３０３。
圧力モジュール：ＧＩＬＳＯＮモデル８０６。
混合機：２３ｍｌヘッドを備えるＧＩＬＳＯＮモデル８１１Ｃ。
ＵＶ検出器：分取セルを備えるＧＩＬＳＯＮモデル１１９。
フラクションコレクター：Ｎｏ．２１キャリヤーを備えるＧＩＬＳＯＮモデル２０２。
積分器：ＳＨＩＭＡＤＺＵモデルＣ−Ｒ６Ａ。
カラム：ＶＹＤＡＣモデル２１４ＴＰ１０２２として市販されている長さ２５ｃｍ及び直径２．２ｃｍのステンレス鋼カラムＣ４（１０ｍｍ）。
精製しようとする生成物の溶液を１５ｍｌ／分の流速で注入ポンプからカラムに充填し、溶出液を３０秒間チューブからフラクション毎に回収する。検出器は波長２２０ｎｍ及び２３５ｎｍに調節する。
移動相は次のように定義される。
溶剤Ａ
脱イオン水                  ２５００ｍｌ
トリフルオロ酢酸                  ２ｍｌ
溶剤Ｂ
ＨＰＬＣ用アセトニトリル    ２５００ｍｌ
トリフルオロ酢酸                  ２ｍｌ
勾配：
0004467084.tif 000016
ｄ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法
固相合成は手動製造用ＳＰＰＳペプチド合成用手動反応器で実施し、撹拌機はＦｌａｓｋ  Ｓｈａｋｅｒ  モデルＡ５−６０２１を用いる。ＳＰＰＳでポリアミンの固相結合とポリアミンの保護後にカイザー試験を行う［Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．，Ｃｏｌｅｓｃｏｌｔ，Ｄ．Ｌ．，Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｄ．及びＣｏｏｋ，Ｐ．Ｉ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４（２），５９５（１９７０）］。実施例でＳＰＰＳに使用した樹脂はＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ製「塩化クロロトリチル樹脂」である。
実施例
実施例１：化合物ＲＰＲ１２０５３５（その製法は参考資料として本明細書の一部とする特許出願ＷＯ９７／１８１８５に記載されている）から化合物１（Ｎ−ジオクタデシルカルバモイルメチル−２−｛３−［４−（３−グアニジノプロピルアミノ）ブチルアミノ］プロピルアミノ｝アセトアミド）の合成
合成スキームは図１／１５に示す。
磁気バーを備える丸底フラスコに入れたメタノール２５ｍｌに０．７８４ｍｍｏｌのＲＰＲ１２０５３５を溶かす。この溶液にトリエチルアミンＴＥＡ１０．２１ｍｍｏｌを加える。次に、水９ｍｌにｏ−メチルイソ尿素／硫酸Ｈ2ＳＯ4を溶かした溶液１．１７３ｍｍｏｌを混合物にゆっくりと（５分間）注ぐ。注ぎ終ると、混濁が現れる。混合物を４０℃に１６時間維持した後、溶液を乾燥蒸発させる。得られた生成物を次に分取ＨＰＬＣにより精製する。有用フラクションを集めて凍結乾燥する。
塩に転化した０．１５７ｍｍｏｌの化合物１が得られる（収率２０．１％）。
分析ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１４．９４分。
1ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ3）2ＳＯ  ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．８６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ3）；１．２４（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ2）15）；１．４３及び１．５３（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ2）；１．６３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ2）2）；１．８１及び１．９６（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ2）：２．８５〜３．１０及び３．２２（２ｍｔ，合計１６Ｈ：ブチルのＮＣＨ2−プロピルのＮＣＨ2及び脂肪鎖のＮＣＨ2）；３．８１（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ2ＣＯＮ）；４．０３（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ：グリシルのＣＯＮＣＨ2ＣＯＮ）；７．３２−７．９７−８．６２−８．７５及び９．０２（夫々ｍｆ−ｔ−ｔ−ｍｆ及びｍｆ：交換可能な陽子に対応するＨ）。
ＭＨ+＝８６３。
実施例２：化合物ＲＰＲ１２０５２７（その製法は参考資料として本明細書の一部とする特許出願ＷＯ９７／１８１８５に記載されている）から化合物２（２−｛２−［ビス−（２−グアニジノエチル）アミノ］エチルアミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアセトアミド）の合成
メタノール１０ｍｌに４８μｍｏｌのＲＰＲ１２０５２７を溶かした後、ＤＩＥＡ８５μｌ（１０当量）と１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチル−２−チオプソイド尿素３２ｍｇ（２．３当量）を加える。反応後にＨＰＬＣを実施する。２４時間後に溶剤を蒸発させ、得られた残渣に１：１容量ＴＦＡ／ジクロロメタン溶液２０ｍｌを加える。減圧蒸発後、分取ＨＰＬＣにより残渣を精製する。有用フラクションを混合し、液体窒素で凍結後、凍結乾燥する。
０．０３５ｍｍｏｌの化合物２が得られる（収率７３％）。
分析ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１６．２０分。
1ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ3）2ＳＯ  ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．９（ｍ：６Ｈ：ＣＨ3）；１．２（ｍ：６０Ｈ：ＣＨ2）；１．６（ｍ：４Ｈ：ＣＨ2ＣＨ2Ｎ）；２．７−２．９（ｍ：６Ｈ：ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2）2）；３．０（ｍ：２Ｈ：ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2）2）；３．２（ｍ：８Ｈ：ＣＨ2Ｎ）；３．８（ｍ：４Ｈ：ＣＨ2ＮＣＯＣＨ2Ｎ）。
ＭＨ+＝７９３。
実施例３：化合物ＲＰＲ１２２７６６（その製法は参考資料として本明細書の一部とする特許出願ＷＯ９７／１８１８５に記載されている）から化合物３（Ｎ−ジテトラデシルカルバモイルメチル−２−｛３−［４−（３−グアニジノプロピルアミノ）ブチルアミノ］プロピルアミノ｝アセトアミド）の合成
磁気バーを備える丸底フラスコに入れたメタノール２５ｍｌに０．７８４ｍｍｏｌのＲＰＲ１２２７６６を溶かす。この溶液にトリエチルアミンＴＥＡ１０．２１ｍｍｏｌを加える。次に、水９ｍｌにｏ−メチルイソ尿素／硫酸Ｈ2ＳＯ4を溶かした溶液１．１７３ｍｍｏｌを混合物にゆっくりと（５分間）注ぐ。注ぎ終ると、混濁が現れる。混合物を４０℃に１６時間維持した後、溶液を乾燥蒸発させる。得られた生成物を次に分取ＨＰＬＣにより精製する。有用フラクションを集めて凍結乾燥する。
０．２２８９ｍｍｏｌの化合物３が得られる（収率２９％）。
分析ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝９．８分。
1ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ3）2ＳＯ  ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ3）；１．１５〜１．４０（ｍｔ，４４Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ2）11）；１．４６及び１．５５（２ｍｔ，各２Ｈ：脂肪鎖の中心の１ＣＨ2）；１．６３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の２ＣＨ2）；１．８１及び１．９５（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ2）：２．８５〜３．１０（ｍｔ，１０Ｈ；ブチルのＮＣＨ2−２個のプロピルの一方の２ＮＣＨ2及び他方のプロピルの２ＮＣＨ2の１個）；３．１５〜３．２５（ｍｔ，６Ｈ：他方のプロピルの他方のＮＣＨ2及び脂肪鎖のＮＣＨ2）；３．８２（ｍｆ，２Ｈ：ＮＣＨ2ＣＯＮ）；４．０４（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ：グリシルのＣＯＮＣＨ2ＣＯＮ）；７．００〜７．６０−８．６０〜８．７５及び９．００（夫々広幅ｍｆ及び２ｍｆ，３Ｈ−５Ｈ及び２Ｈ：ＮＨ3+ＣＦ3ＣＯＯ-−ＮＨ2+ＣＦ3ＣＯＯ-及び＝ＮＨ）；７．７８（広幅ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ：Ｎ＝ＣＮＨ）；８．６５（ｍｆ：ＣＯＮＨに対応する１Ｈ）。
ＭＨ+＝７５１。
実施例４：化合物４（２−｛２−［ビス−（２−グアニジノエチル）アミノ］エチルアミノ｝−Ｎ−ジテトラデシルカルバモイルメチルアセトアミド）の合成。
段階Ａ：１０モル倍のトリス（アミノエチル）アミンをジクロロメタン５０ｍｌに溶かし、（ブロモ酢酸をクロロトリチル樹脂と反応させることにより予め得られた）ブロモアセチル（クロロ）トリチル樹脂を入れた反応器に溶液を導入する。反応器を２時間周囲温度で撹拌する。溶剤を濾過し、樹脂をジクロロメタンとイソプロパノール１０×５０ｍｌで洗浄する。カイザー試験は陽性である。
段階Ｂ：得られた樹脂をジクロロメタンに溶かした１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチル−２−チオプソイド尿素１０倍当量と撹拌下に２４時間接触させる。溶剤を濾過し、樹脂をジクロロメタンとイソプロパノール１０×５０ｍｌで洗浄する。３分間の常温カイザー試験は陰性である。
段階Ｃ：ＤＩＥＡ５０ｍｍｏｌをジクロロメタン５０ｍｌに溶かし、段階Ｂで得られた生成物を入れた反応器に混合物を導入する。次に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート４８ｍｍｏｌを注ぐ。反応器を一晩撹拌する。翌日、カイザー試験は陰性である。溶剤を濾過し、樹脂をジクロロメタンとイソプロパノール１０×５０ｍｌ、メタノール２×５０ｍｌ及びエーテル２×５０ｍｌで交互に洗浄する。次に樹脂を窒素流下に乾燥する。カイザー試験は依然として陰性である。
段階Ｄ：段階Ｃで得られた樹脂を磁気バーを備える２５０ｍｌ容丸底フラスコに導入する。ジクロロメタン５０ｍｌと１，１，１−トリフルオロエタン−２−オール２５ｍｌからなる溶液を加え、混合物を２時間撹拌する。溶液を濾過し、樹脂をジクロロメタン２×１０ｍｌで洗浄する。こうして得られた有機相を集めて減圧蒸発させる。次に生成物をシリカゲルで精製する（溶離剤：８：２容量クロロホルム／メタノール）。有用フラクションを合わせた後、減圧蒸発させると、下記構造：
0004467084.tif 000017
の生成物１６８ｍｇが得られる（収率２０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９。
ＭＨ+＝７８９。
段階Ｅ：磁気バーを備える丸底フラスコにＢｏｃ−グリシジルジテトラデシルアミド９ｍｍｏｌを導入する。４℃のトリフルオロ酢酸３０ｍｌを加える。溶液を１時間撹拌し、ＴＦＡを減圧蒸発させる。得られた生成物に再びＤＭＦ７０ｍｌを加えて溶かした後、ＴＥＡ３０ｍｍｏｌと先に得られた酸９ｍｍｏｌを加える。ｐＨを１０に調整し、ＢＯＰ３３ｍｍｏｌを加える。溶液を２時間撹拌した後、ＴＬＣを行う。結合したら硫酸カリウム溶液７００ｍｌを加え、生成物を酢酸エチル３×１００ｍｌで抽出する。有機相を硫酸カリウム３×５０ｍｌ、炭酸ナトリウム３×５０ｍｌ及び塩化ナトリウム３×５０ｍｌで洗浄する。次に、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。得られた生成物をＮＭＲ、ＴＬＣ及びＭＳにより分析し、予備精製せずに得られた生成物にＴＦＡ５０ｍｌを加えて脱保護する。次に、溶液を１．５時間撹拌する。最後に、ＴＦＡを蒸発させ、最終生成物を半分取ＨＰＬＣにより精製する。
最終的に８．１ｍｍｏｌの化合物４が得られる（この最終段階の収率９０％）。
分析ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１１．４分。
1ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（ＣＤ3）2ＳＯ  ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ3）；１．１５−１．３５（ｍｔ，４４Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ2）11）１．４５及び１．５４（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ2）；２．６５−２．７８−３．０６及び３．２３（夫々ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ−広幅ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ−ｍｆ及びｍｔ，夫々４Ｈ−２Ｈ−２Ｈ及び８Ｈ：ＮＣＨ2ＣＨ2Ｎ−２ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＣ＝Ｎ及び脂肪鎖のＮＣＨ2）；３．８３（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ2ＣＯＮ）；４．０４（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ：グリシルのＣＯＮＣＨ2ＣＯＮ）；７．３４（広幅ｍｆ，＝ＮＨ及びＮＨ2）；７．６１（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ：ＮＨ）；８．６５（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ：ＮＨ）；８．７５（ｍｆ：ＮＨ）。
ＭＨ+＝７３３。
段階Ｅで使用するグリシニルジテトラデシルアミドは予め次のように得られる。
Ｂｏｃ置換基により保護したグリシン１０ｍｍｏｌとジテトラデシルアミン１０ｍｍｏｌを２５０ｍｌ容丸底フラスコに導入する。クロロホルム１００ｍｌを加え、完全に溶けるまで混合物を撹拌する。次にＴＥＡ３０ｍｍｏｌとＢＯＰ３３ｍｍｏｌを加える。ｐＨをトリエチルアミンで１０に維持する。反応混合物を２時間撹拌する。反応後にＴＬＣを行い、クロロホルムを蒸発させる。得られた固体を再び酢酸エチル３００ｍｌに溶かす。次に有機相を硫酸カリウム４×１００ｍｌ、炭酸ナトリウム４×１００ｍｌ及び塩化ナトリウム４×１００ｍｌで洗浄する。次に、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。得られた生成物をＴＬＣ、ＮＭＲ及びＭＳにより分析し、精製せずに使用する。
実施例５：化合物５（Ｎ−ジテトラデシルカルバモイルメチル−２−｛（３−グアニジノプロピル）−［４−（３−グアニジノプロピルアミノ）ブチル］アミノ｝アセトアミド）の合成
出発ポリアミンとしてスペルミンから出発する以外は化合物４について上述したと同様に操作し、下記構造：
0004467084.tif 000018
の酸を得る。樹脂から分離後、この残渣をシリカゲルで精製する（溶離剤：８：２容量クロロホルム／メタノール）。有用フラクションを混合した後、減圧蒸発させると、上記分子０．６９ｍｍｏｌが得られる（収率５０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５。
ＭＨ+＝８４５。
化合物５は実施例４に記載したと同一の方法により、予め合成しておいた酸とグリシニルジテトラデシルアミドの結合により得られる。グリシニルジテトラデシルアミドも上記と同様に得られる。
こうして０．６５ｍｍｏｌの化合物５が得られる（この段階の収率９４％）。
分析ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１０．１分。
1ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ3）2ＳＯ  ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ3）；１．２５−１．４５（ｍｔ，４４Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ2）11）；１．５７（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の２ＣＨ2）；１．５７及び１．６７（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ2）；１．７４及び１．９１（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ2）；２．６２−２．８５−３．２０〜３．３５（３ｍｔ，合計１６Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ2−ＣＨ2ＮＣ＝Ｎ及びＮＣＨ2）；３．１７（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ2ＣＯＮ）；４．０２（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ：グリシルのＣＯＮＣＨ2ＣＯＮ）；６．８９−７．３０〜７．５５及び７．６５（夫々ｍｆ−広幅ｍｆ及びｍｆ：交換可能なＨ）。
ＭＨ+＝８４５。
実施例６：化合物６（２−｛３−［｛４−［ビス−（３−グアニジノプロピル）アミノ］ブチル｝−（３−グアニジノプロピル）アミノ］プロピルアミノ｝−Ｎ−ジテトラデシルカルバモイルメチルアセトアミド）の合成
出発ポリアミンとしてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−（テトラアミノプロピル）ブチレンジアミンから出発する以外は化合物４及び５について上述したと同様に操作し、下記構造：
0004467084.tif 000019
の酸を得る。樹脂から分離後、得られた残渣をシリカゲルで精製する（溶離剤：８：２容量クロロホルム／メタノール）。有用フラクションを混合した後、減圧蒸発させると、生成物０．０９９ｍｍｏｌが得られる（収率２０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３。
ＭＨ+＝１２０１。
化合物６は実施例４に記載したと同一の方法により、予め合成しておいた酸とグリシニルジテトラデシルアミドの結合により得られる。グリシニルジテトラデシルアミドも上記と同様に得られる。
こうして０．０９ｍｍｏｌの化合物６が得られる（この段階の収率９０％）。
分析ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１１．２分。
1ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ3）2ＳＯ  ｄ６にＣＤ3ＣＯＯＤ  ｄ４を数滴添加，δ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ3）；１．２０−１．４０（ｍｔ，４４Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ2）11）；１．４５及び１．５４（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ2）；１．６７（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ2）；１．８０−２．１０（ｍｔ，８Ｈ：プロピルの中心のＣＨ2）；２．９５−３．３０（ｍｔ，２０Ｈ：プロピルのＮＣＨ2及びブチルのＮＣＨ2）；３．１５−３．３０（ｍｔ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ2）；３．８４（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ2ＣＯＮ）；４．０５（ｓ，２Ｈ：グリシルのＣＯＮＣＨ2ＣＯＮ）。
ＭＨ+＝９４９。
実施例７：遺伝子材料のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションのための化合物１の使用
使用した遺伝子材料
使用した核酸はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＸＬ２７７４（ＷＯ９７／１０３４３）である。
核酸溶液を生理的血清（塩化ナトリウムＮａＣｌ０．１５Ｍ）で２０μｇ／ｍｌまで希釈する。
トランスフェクション溶液（現場調製物）
本発明に記載する生成物を６０〜２４０μＭの濃度で水に溶かし、ＤＮＡ溶液と等容量混合する。最終塩濃度は７５ｍＭとする。
トランスフェクション
細胞を２４穴マイクロプレートで適当な条件下に培養し（２ｃｍ2／ウェル）、指数増殖期で５０〜７０％コンフルエントになったらトランスフェクトする。
血清タンパク質を含まない培地２×５００μｌで細胞を洗浄し、無血清培地（血清の不在下のトランスフェクション）又は完全培地（血清の存在下のトランスフェクション）で再び増殖させる。トランスフェクタント混合物５０μｌ（即ちＤＮＡ０．５μｇ／ウェル）を細胞に加える（ウェル３個／ベクター−ＤＮＡ条件）。血清の不在下で細胞にトランスフェクトする場合には、トランスフェクションから２時間後に適量の血清を増殖培地に補充する。
トランスフェクションから４８時間後に、Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の使用に推奨されている方法に従ってルシフェラーゼの発現を測定することによりトランスフェクション効率を評価する。細胞溶解液中のタンパク質濃度を測定することによりトランスフェクタント混合物の毒性を推定する。
結果
ＤＮＡベクターとして化合物１を（参考資料として本明細書の一部とする特許出願ＷＯ９７／１８１８５に記載されている）カチオン脂質ＲＰＲ１２０５３５（ＴＦＡの塩）と比較使用し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞の３種の異なる細胞系にトランスフェクトした。これらの３種の細胞型では、実施例１にその製法を記載した化合物１の有意毒性は検出されなかった。化合物ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡの比を３〜１２とし、３種の細胞型における化合物１と比較カチオン脂質のトランスフェクション効率を図２／１５に示す。
図２／１５から推察できるように、最大トランスフェクション効率はＮＩＨ３Ｔ３細胞ではカチオン脂質６ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ、ＨｅＬａ又はＨｅｐＧ２細胞ではカチオン脂質９ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡの比で得られる。血清の不在下のトランスフェクションでは、ＨｅＬａ又はＨｅｐＧ２細胞で得られる発現レベルは化合物１のほうが比較試験物質よりも２〜４倍高い。
図３／１５は上記と同一の参考カチオン脂質（ＲＰＲ１２０５３５）とＤＮＡの複合体に比較した化合物１／ＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率を示す。白いバーは２時間血清の不在下の核脂質複合体のトランスフェクション効率を示す。黒いバーは血清の存在下の核脂質複合体のトランスフェクション効率を示す。
こうして本発明の導入剤が特に有利であることを図３／１５から立証できる。実際に、本発明の化合物１の場合には血清タンパク質の有無に拘わらずトランスフェクションレベルは同一であるが、比較カチオン脂質では血清タンパク質の存在による強い阻害が認められる。この点は、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションに特に有利な性質である。
実施例８：遺伝子材料のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションのための化合物２、３、５及び６の使用
使用した遺伝子材料：
使用した核酸はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＸＬ３０３１である。このプラスミドｐＸＬ３０３１を図１５／１５に示す。このプラスミドは当業者に公知の標準プロトコール、特にＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８２，８３〜９４頁，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，ＮＹに従って単離した。
より具体的には、使用した方法はアルカリ溶解法と塩化セシウム勾配精製である。
トランスフェクション：
細胞を２４穴マイクロプレートで適当な条件下に培養する。一晩増殖後、各ウェルの細胞数は約１０００００個になる。
血清の不在下にＤＭＥＭ０．５ｍｌ中にＤＮＡ１μｇを含むトランスフェクタント混合物を各ウェルに導入する。トランスフェクションから５時間後に、増殖培地に適量の血清（ＤＭＥＭとウシ胎児血清，１０％）を補充する。トランスフェクションから２４時間後に細胞溶解液を回収し、Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の使用に推奨されている方法に従ってルシフェラーゼの発現を測定することによりトランスフェクション効率を評価する。
結果：
トランスフェクションレベルを図４／１５、５／１５、６／１５及び７／１５に示す。
各場合にミセル形態及び補助脂質（ＤＯＰＥ又はコレステロール）との混合物としての脂質についてトランスフェクション効率を測定した。これらの表から推察できるように、電荷比が非常に低くてもトランスフェクションレベルは非常に高いので、毒性に有益な効果がある。この点は本発明の化合物の利点の１つである。実際に、アミジン基を含まないカチオン脂質では、このようなトランスフェクションレベルを得るためには電荷比を非常に高くする必要があることが多く、一般に特性が増す。
実施例９：化合物２、３、５及び６のＤＮＡ親和性の試験
使用した核酸は上記実施例に記載したようなプラスミドｐＸＬ３０３１である。
所望電荷比に従って本発明に定義するような適量の脂質を用いてＤＮＡ０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で複合体を調製する。５％グルコースと２０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を含む媒体で複合体を調製する。その後、５％グルコースと２０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を含む溶液９５０μｌで核脂質複合体５０μｌを２０倍に希釈する。
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ４＋装置を使用して光の動的拡散により流体力学的直径を測定することにより複合体の寸法を測定した。
全化合物で、電荷比に応じて３種の異なる物理化学相が判明した。
−Ａ相はＤＮＡがカチオン脂質により飽和されていない相であり、即ち混合物中に裸のＤＮＡが残っており、ＤＮＡは脂質により完全に保護されていないので、酵素分解を受ける可能性がある。形成される複合体は総体的に負に帯電しているので、細胞膜を通過しにくい。従って、ＤＮＡをトランスフェクトするためにはこのゾーンにならないようにすることが好ましい。
−Ｂ相はＤＮＡがカチオン脂質により完全に飽和されており、複合体が総体的に中性であるか弱く正に帯電している。イオン反発が最大であるので、この相は不安定である。「架橋」現象が生じて複合体が沈殿する可能性がある。従って、この状態の複合体は注入に使用することができない。
−Ｃ相はＤＮＡが脂質により過剰飽和されているので、複合体は総体的に正である。従って、ＤＮＡは脂質により完全に保護されているので、（一般に負の）細胞膜を通過し易い。従って、Ｃ相の複合体は核酸の細胞導入に使用するのに特に適している。
図８／１５、９／１５、１０／１５及び１１／１５は電荷比の関数として複合体の相変化を示す表である。
図８／１５、９／１５、１０／１５及び１１／１５は本発明の化合物とそのアミン類似体即ちアミジン又はグアニジン基をアミノ基で置き換えたカチオン脂質の相を電荷比の関数として比較したものである。Ｂ相は著しく低い電荷比に移っていることが認められる。このように、カチオン主鎖にアミジン基を組み込むと、化合物のＤＮＡ親和性が増加する。本発明の化合物とＤＮＡにより形成される複合体は電荷比が過度に高くならないようにすればＣ相で使用することができるので、この点は本発明の化合物の重要な性質であり、毒性に有益な効果がある。
臭化エチジウム添加後の蛍光低下を測定することにより、本発明の化合物のＤＮＡ親和性も評価した。実際に、ＤＮＡの臭化エチジウムが脂質により置換されると、ＤＮＡに結合したと判断される。
従って、調製した複合体に１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液４μｌを加えた後、励起波長２６０ｎｍ及び発光波長５９０ｎｍで蛍光を測定する。ＤＮＡ単独に得られた蛍光を１００％と定義する。
結果を図１２／１５、１３／１５及び１４／１５に示す。これらの結果から明らかなように、本発明の化合物は非常に良好なＤＮＡ親和性をもち、この点は本発明の化合物の特に有利な性質である。
【図１】
0004467084.tif 000027
【図２】
0004467084.tif 000028
【図３】
0004467084.tif 000029
【図４】
0004467084.tif 000030
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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