(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブピバカインが封入されている多胞状リポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームが、
ブピバカインまたはその塩、
リン酸、硫酸、およびポリヒドロキシカルボン酸、ならびにその組合せからなる群より選択される少なくとも１種の酸、ならびに
少なくとも１種の両親媒性脂質、および親水性頭部基を欠いた少なくとも１種の中性脂質を含む脂質成分を含み、かつ場合によりコレステロールおよび／または植物性ステロール類を含むまたは含まない、
前記医薬組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１種の両親媒性脂質が、ジエルコイルホスファチジルコリンおよびジパルミトイルホスファチジルグリセロールからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１種の両親媒性脂質が、ジエルコイルホスファチジルコリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１種の両親媒性脂質が、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種の中性脂質がトリカプリリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ブピバカインが塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記酸がリン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記酸が硫酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記両親媒性脂質が、コレステロールとの混合状態で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酸がリン酸であり、前記少なくとも１種の両親媒性脂質がジエルコイルホスファチジルコリンおよび／またはジパルミトイルホスファチジルグリセロールを含み、前記少なくとも１種の中性脂質がトリカプリリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酸がリン酸であり、前記両親媒性脂質がジエルコイルホスファチジルコリンおよびジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり、各中性脂質がトリオレイン、トリパルミトレイン、トリミリストレイン、トリリノレイン、トリブチリン、トリカプロイン、トリカプリリンおよびトリカプリンからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記中性脂質がトリカプリリンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
コレステロールを含んでなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ブピバカインを含有する多胞状リポソーム組成物の調製方法であって、次のステップ、
a)  ポリヒドロキシカルボン酸、リン酸、硫酸、およびその組合せからなる群より選択される酸を、ブピバカインまたはその塩が可溶化されるのに十分な量で含んでなる第１の水性成分を調製すること、
ｂ)  少なくとも１種の有機溶媒、少なくとも１種の両親媒性脂質、および、
少なくとも１種の親水性頭部基を欠いた中性脂質を含んでなる脂質成分を調製すること、
ｃ)  前記第１の水性成分と前記脂質成分を混合して油中水型エマルションを形成すること、ここで少なくとも１つの成分はブピバカインまたはその塩を含んでなり、
ｄ)  前記油中水型エマルションを第２の水性成分と混合して溶媒球状体を形成すること、ならびに
ｅ)  前記溶媒球状体から有機溶媒を除去して多胞状リポソームを形成すること、
を含む前記方法。
【請求項１５】
水相がさらに塩酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシカルボン酸の塩がグルクロン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記両親媒性脂質がジエルコイルホスファチジルコリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記両親媒性脂質がジパルミトイルホスファチジルグリセロールである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記中性脂質がトリカプリリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸がリン酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸が硫酸である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
1997年9月18日に出願した米国仮特許出願第60/059,233に基づく優先権を主張する。
（発明の背景）
本発明は薬物などの化合物のリポソーム製剤に関する。さらに特定すると、本発明は、麻酔薬が高効率に封入され、そのin vivo放出速度が持続的になるように多胞状リポソームに麻酔薬を封入する方法に関する。
【０００２】
局所麻酔薬の投与後の作用の持続時間は、通常、大部分の外科手術中に受ける痛みをカバーするには十分な長さである。しかしながら、その作用の持続時間の長さは、大部分の手術後の痛み、または多くの侵襲性診断術もしくは外傷から来る痛みをカバーするには十分ではない。外科的創傷、診断「ポート」または損傷部位への局所麻酔薬の連続注入または繰り返し浸潤は実際には不可能である。したがって、局所麻酔薬の徐放性製剤は、特に外来患者の手術および救急医療センターについての現在の動向を考慮すると、痛みの管理に有用である。望ましくは、そのような製剤は外傷および診断上の痛みにも有用である。
【０００３】
局所麻酔薬の徐放性製剤の開発のためのいくつかのアプローチが文献に記載されている。例えば、ブピバカインおよびデキサメタゾンの両方を含有するポリ乳酸-グリコール酸共重合体ミクロスフェアにより持続時間の長い局所麻酔薬が得られている。結晶形態の局所麻酔薬も作用の持続時間が長いことが示されている。多重層リポソームおよびプロトン勾配負荷をかけた (proton-gradient-loaded)大きな単層状リポソームからなる膜に組み込まれた親油性ブピバカイン遊離塩基は効果が6〜11時間持続することが示された。
【０００４】
多胞状リポソーム(MVL)は、局所、局部または全身的薬物送達のための脂質ベースの徐放性薬物送達系として開発されている。MVLに封入された多くの水溶性薬物の徐放性は、動物モデルにおいては髄腔内、皮下、腹腔内、および硬膜外投与経路により、ならびにヒト患者においては脳室内、髄腔内、皮下および硬膜外経路により示されている。複数の研究機関による細胞毒性物質シタラビンのMVL製剤の無作為化第III相臨床試験により、この製剤が髄膜癌腫症の治療において遊離シタラビンよりも有効であることが示された。
【０００５】
MVLは、「発泡体様」マトリックスに似た、各リポソーム粒子内に多数の非同心状の空洞(chamber)を含むリポソームと定義される。そのような粒子は、多重層リポソームとしても知られている、各リポソーム粒子内に多数の同心円状の空洞を含む多重層小胞（MLV)と区別されるべきである。さらに別の粒子は、１個の内部水性区画を囲む単層リポソームとしても知られた単層小胞(ULV)である。本発明はMVLに関する。従来技術にはMVLの調製が記載されている（Kimら, Biochim. Biophys. Acta 728, 339-348, 1983)。
【０００６】
MVL封入技術に用いられるカチオン性の生物活性物質の多くはモノプロトン型無機酸の塩（例えば、塩酸塩など）として使用されている。従来技術では、リポソームへの封入のためのカチオン性生物活性物質のそのような一般的に利用可能なモノプロトン型無機酸塩を、何らかの修飾を加えてジプロトン型またはトリプロトン型無機酸の塩にすることなく用いている。また、従来技術では、封入を生じさせるためにクエン酸またはグルタミン酸などの有機酸も用いている。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、多胞状リポソーム(MVL) 、すなわちMVL全体にネットワークとして分布した内部膜を含む多数の非同心状内部水性空洞を有する脂質小胞に封入された局所麻酔薬を提供する。前記空洞は、一定の麻酔薬の封入を可能にし、封入された麻酔薬の放出速度を調節するのに有効な酸を含有する。本発明は、かかる組成物の製造方法、および該組成物を投与することによって被験者に局所麻酔を施す方法も提供する。
【０００８】
従来技術では、生物活性化合物の一般的に利用可能なモノプロトン型（例えば塩酸またはグルタミン酸）塩が用いられている。これは、MVL中に生物活性物質を封入するのに受け入れがたい製剤をもたらすか、あるいは封入効率がきわめて低いものとなる。本発明は、MVLに含有せしめるために、リン酸で可溶化した遊離塩基形態の麻酔化合物を含有せしめるか、または麻酔化合物の一般的に利用可能な塩酸塩をリン酸塩（トリプロトン型無機酸の塩）または硫酸塩（ジプロトン型無機酸の塩）に転換すると、生物学的に関連した媒質における封入効率ならびに徐放性が著しく改善されるという驚くべき知見からなされたものである。グルクロン酸またはグルコン酸のようなポリアルコール性有機酸も含まれ、ここで、かかる酸は麻酔薬と共封入されることにより、麻酔薬の封入を手助けし、麻酔薬の徐放性をもたらすものである。驚いたことに、ポリアルコール性有機酸は非ポリアルコール性有機酸よりも優れており、麻酔薬が高効率で封入され、かつ持続放出される組成物が得られる。ポリアルコール性有機酸は、麻酔薬の封入および製剤の許容度を非常に改善する。硫酸塩およびいくつかのその他の塩は、許容される製剤の形成にかかる酸を含有せしめることが必要である。
【０００９】
封入麻酔薬が皮内または皮下単回投与で投与される場合、局所注射部位における麻酔薬の持続時間および薬物の半減期は非封入麻酔薬を注射した場合と比べて増大する。また、封入麻酔薬の最大許容用量も、リポソーム製剤の場合には非封入麻酔薬の注射の場合よりも著しく増大する。
【００１０】
本発明の主な使用は、二重層脂質膜を通過する拡散速度が大きい生物活性物質の徐放性製剤の製造である。生物活性物質のジプロトン型およびトリプロトン型無機酸塩の使用およびポリアルコール性有機酸の共封入により、これらの封入が困難な薬物を容易に封入することができ、ゆっくりと放出させることができる。
【００１１】
本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１２】
（詳細な説明）
手術後または外傷後の痛みは、手術直後または損傷直後およびその後24時間の間が最も強いと考えられる。手術後の痛みの調節を改善することにより肺および胃腸合併症を減少させることができ、恐らく入院期間を短縮することができる。この手術後期間に痛みを調節するために一般的に用いられている全身性アヘン製剤は、肺機能を低下させ、胃-腸回復を遅延させ得るものである。非ステロイド系抗炎症剤ケトロラクトロメタミンなどのその他の抗侵害受容剤は出血を増大させ、このストレス時期において胃腸刺激を増大させ得るものである。外科手術的介入または外傷的損傷から生じる侵害受容性刺激の源は、通常、局所的または局部的なものであり、痛みの調節のための長期にわたる局所的または局部的感覚ブロックは興味をそそる概念である。したがって、局所麻酔による処置の改善は長期間麻酔レベルを維持することを含むと考えられる。残念なことに、多くの麻酔薬の腹腔内(IP)、静脈内(IV)、髄腔内 (IT)、関節内(IA)、筋内(IM)、または皮下(SC)投与後の半減期は非常に短い。したがって、局所麻酔薬の治療的濃度での長期および持続性暴露をもたらす遅延放出性調製物が必要とされている。本発明は、かかる調製物の製造、組成物、および使用に関する。
【００１３】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味と同じ意味である。本明細書に記載されたものと同様の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、適当な方法および材料は下記に示す。本明細書に挙げた全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は参照により本明細書に含まれるものである。さらに、材料、方法および実施例は単に説明のためのものであり、限定するものではない。
【００１４】
麻酔薬
本発明は、MVLを含む組成物を投与した後の、該MVLからの局所麻酔、特に「アミド型の」麻酔薬の長時間にわたる放出を提供する。本発明は、MVLに封入された局所麻酔を使用する。一般に、局所麻酔はアミド型の麻酔薬として知られるクラスに属する。この名前は、その分子の中央部分にアミド（-NHCO-）結合が存在することに由来する。このアミドの窒素末端に結合している基は、置換されたフェニル環、特に少なくとも１つの短鎖アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピルまたはブチルなど）を含むフェニル環である。このような基の例としては、２-メチルフェニル、2,6-ジメチルフェニル、2-エチルフェニル、2,6-ジエチルフェニルおよび2-エチル-6-メチルフェニルが挙げられる。置換基が2,6-ジメチルフェニルである場合、該局所麻酔は2,6-キシリジド麻酔薬とも呼ばれる。
【００１５】
アミド結合基のCO末端に結合した基は、CHR1R2と表記される。この表記において、R1は第２級または第３級アルキルアミン（例えばN-アルキルアミンまたはN,N-ジアルキルアミンなど）である。短鎖アルキル基（炭素原子１〜４個）が好ましい。例としては、N-メチルアミン、N-エチルアミン、N-プロピルアミン、N-ブチルアミン、N,N-ジメチルアミン、N,N-ジエチルアミン、N-エチル-N-メチルアミン、および同様な構成の置換基が挙げられる。炭素数３個および４個のアルキル鎖は、任意の構成、つまり直鎖状鎖（n-アルキル）または分岐状（イソ-、第２級または第３級アルキル）であってもよい。あるいは、R1は、第２級または第３級アルキレンアミノ基であってもよく、これはさらにR2に結合している。例えば、R1およびR2は、第２級または第３級の窒素含有アルキル鎖により結合されて、N-アルキル置換ピペリジン環またはN-アルキル置換ピロリジン環を形成することができる。このような例において、N-アルキル基は、好ましくは短鎖（炭素原子１〜４個）であり、例えばN-メチル、N-エチル、N-プロピルまたはN-ブチルが挙げられるが、鎖は直鎖状であっても分岐状であってもよい。R1-R2結合置換基は、2-ピペリジル、2-ピロリジル、3-ピペリジル、3-ピロリジル、４-ピペリジルまたは４-ピロリジルであってもよい。好ましくは、R1およびR2が第２級もしくは第３級窒素含有アルキレン鎖により結合されたときに形成される置換基は、２-ピペリジルまたは2-ピロリジルである。この化合物の立体化学は、RまたはSのどちらかであり、最も効率的な麻酔活性によって決まる。例えば、市販されているロピバカイン（ropivacaine）は、（S）（-）立体配置で見られる。また、ブピビカイン（Bupivicaine）は、レボ-ブピバカインとして知られる形態でも見られる。前記表記において、R2は、水素、短鎖アルキル（炭素原子１〜４個）または第２級または第３級アルキレンアミノ鎖のいずれかであり、上記のようにR1に結合する。
【００１６】
本発明に有用なアミド型の麻酔薬は、以下の構造式で表される。
【００１７】
【化２】
0004467789.tif 000002
[式中、R1およびR2は上記と同じ意味を表わし、R3は、上記のとおりアルキル置換フェニル環である。]
【００１８】
本発明に有用な上記記載のアミド型の麻酔薬の例としては、例えばブピバカイン、レボ-ブピバカイン、メピバカイン、リドカイン、ピロカイン（pyrrocaine）、プリロカインおよびロピバカイン（ropivacaine）が挙げられる。
【００１９】
該麻酔薬は、本発明の組成物中に約0.01重量％〜約5.0重量％、好ましくは約0.5重量％〜約2.0重量％の濃度で存在しなければならない。重量％は、MVLの体積当たりの麻酔薬の重量として定義される。
【００２０】
本発明の局所麻酔薬の遊離塩基形態は、可溶性である。望ましくは、保存用およびMVLからの送達用には、水溶性塩の形態が形成される。塩形態のものは、それ自体としてMVLの第１水相に導入することもできるし、あるいは、遊離塩基形態および十分な酸を加えて形成して該麻酔薬を所望の程度に溶解させることもできる。この塩は、医薬として許容可能な任意のジ-もしくはトリ-プロトン型無機塩（例えばリン酸塩または硫酸塩）であってもよい。その他に有用なものとしては、該麻酔薬のポリヒドロキシルカルボン酸塩、例えば酒石酸塩、グルコン酸塩またはグルクロン酸（gluconurate）塩などがある。このような塩の組合せは、本発明の組成物の第１水相の成分として好ましい。従って、アミド型の麻酔薬は、本発明の医薬組成物中に、ポリヒドロキシカルボキシル酸塩、ならびにジ-およびトリ-プロトン型無機塩の形態で存在する。本発明の好適な実施形態は、アミド型の麻酔薬塩の２成分混合物を用いるものであり、その一方はポリヒドロキシカルボキシル酸から誘導したものであり、他方はジ-またはトリ-プロトン型無機酸から誘導したものである。
【００２１】
多胞状リポソーム
また、本発明の麻酔薬組成物は多胞状リポソーム（MVL）も含んでおり、MVLは上記麻酔薬を封入しており且つその調節された持続性放出を提供する。MVLは、以下の工程により製造される。上記麻酔薬のいずれかの親水性（hydrohalic）酸塩を含む「油中水」型エマルションを、２つの不混和相、つまり脂質相および第１水系相から形成する。
【００２２】
脂質相は、揮発性有機溶媒中の少なくとも１つの両親媒性脂質および少なくとも１つの中性脂質からなる。「両親媒性脂質」という用語は、親水性「ヘッド」基および疎水性「テイル」基を有する分子をさし、膜形成能を有し得る。本明細書中に使用する両親媒性脂質には、正味負電荷を有するもの、正味正電荷を有するもの、および両性イオン性脂質（その等電点で正味電荷を有さない）が含まれる。「中性脂質」という用語は、それ自体では小胞体形成能を有さず、荷電した若しくは親水性の「ヘッド」基を有さない油または脂肪をさす。中性脂質の例としては、荷電した若しくは親水性の「ヘッド」基を有さないグリセロールエステル、グリコールエステル、トコフェロールエステルおよびステロールエステル、ならびにアルカンおよびスクアレンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
両親媒性脂質は、疎水性領域および親水性領域を同じ分子中に有する種々の脂質から選択される。好適な両親媒性脂質としては、両性イオン性リン脂質が挙げられ、これにはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、リソホスファチジルコリン、およびリソホスファチジルエタノールアミンが含まれる。その他に好適なものとしては、アニオン性の両親媒性リン脂質があり、これには、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびカルジオリピンが含まれる。また、カチオン性の両親媒性脂質も好適であり、これには、アシルトリメチルアンモニウムプロパン、ジアシルジメチルアンモニウムプロパンおよびステアリルアミンが含まれる。
【００２４】
好適な中性脂質としては、トリグリセリド、プロピレングリコールエステル、エチレングリコールエステルおよびスクアレンが挙げられる。本発明に有用なトリグリセリドの例としては、トリオレイン、トリパルミトレイン、トリミリストレイン(trimyristolein)、トリリノレイン、トリブチリン、トリカプロイン、トリカプリリンおよびトリカプリンが挙げられる。本発明に有用なトリグリセリド中の脂肪鎖は、全て同じであっても、全て同じでなくてもよく（混合鎖トリグリセリド）、全て異なるものも含む。飽和脂肪鎖および不飽和脂肪鎖はどちらも本発明に有用である。ポリピレングリコールエステルは、カプリル酸およびカプリン酸の混合ジエステルであってもよい。
【００２５】
多くのタイプの揮発性有機溶媒を本発明に使用することができ、このような溶媒には、エーテル、エステル、ハロゲン化エーテル、炭化水素、ハロ炭化水素またはフレオンが含まれる。例えば、ジエチルエーテル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、エチルアセテート、フォーレン(Forane)、およびこれらの任意の組合せが、本発明の麻酔薬組成物の製造に使用するのに好適である。
【００２６】
場合により、しかし非常に望ましくは、他の成分が該脂質相に含まれる。特に、コレステロールや植物性ステロールが挙げられる。
【００２７】
第１水相は、麻酔薬、少なくとも１つのポリヒドロキシカルボン酸および少なくとも１つのジ-もしくはトリ-プロトン型無機酸を含む。本発明の幾つかの実施の形態においては、塩酸も含まれる。塩酸は必須な成分ではないが、任意であり、幾つかの実施形態においては望ましい。このジ-もしくはトリ-プロトン型無機酸には、硫酸およびリン酸が含まれる。このほかに第１水相に含まれるものとしては、ポリヒドロキシカルボン酸、たとえばグルクロン酸、グルコン酸および酒石酸などが挙げられる。ジ-もしくはトリ-プロトン型無機酸およびポリヒドロキシ有機酸は、第１水相中に0.01mM〜約0.5M、好ましくは約5mM〜約300mMの濃度で存在する。塩酸を使用する場合、塩酸は少量で、つまり約0.1mM〜約50mM、好ましくは約0.5mM〜約25mMで存在する。
【００２８】
脂質相および第１水相は、機械攪拌（例えば、回転ブレードもしくは振動ブレードを用いた攪拌）、振盪、バッフル構造もしくは多孔性パイプを介する押出し、超音波処理、またはノズル噴霧により混合し、油中水型エマルションを製造する。こうして、本発明の麻酔薬はMVL製造の第１工程で直接封入される。
【００２９】
つぎに、上記手段によりこの油中水型エマルション全部を第２水相の中に分散させ、第２水相中に懸濁された溶媒球状体を作製する。「溶媒球状体」という用語は、有機溶媒の微小な長球状液滴を指し、そのなかにはこれより小さな水系溶液の複数の小液滴が懸濁されている。従って、得られた溶媒球状体は、中に麻酔薬が溶解されている複数の水系液滴を含む。第２水相は、さらにグルコースおよび/またはリジンなどの他の成分も含むことができる。
【００３０】
つぎに揮発性有機溶媒を球状体から、例えば懸濁液からの表面蒸発により除去する。溶媒が実質的にまたは完全に蒸発すると、MVLが形成される。蒸発に使用することができる気体には、窒素、アルゴン、ヘリウム、酸素、水素よび二酸化炭素が含まれる。あるいは、揮発性溶媒は、スパージング（sparging）、ロータリーエバポレーション、または溶媒選択膜の使用により除去することができる。
【００３１】
麻酔薬の提供方法
本発明は、請求の範囲に記載された麻酔薬組成物を、皮膚内もしくは皮下内投与により、または局所的もしくは局部的神経ブロック（nerve block）を介して投与することにより、被験者への部分麻酔をもたらす方法も提供する。投薬（dosage）は神経ブロック（運動神経ブロックとして作用する限界までを含む）または感覚ブロックなどとして投与することができる。
【００３２】
「治療上有効な」という用語は、本発明の組成物に関して使用される場合、MVL中の第１水相中に存在する麻酔薬が、特定のレベルの麻酔を行うのに十分な方法で放出されることを意味する。正確な用量は、個々の麻酔薬などの要因、ならびに年齢、性別、総合的な体調などの患者の要因によりかわる。当業者であれば、これらの要因を考慮に入れ、これらを利用して過度の実験を行うことなく有効な治療濃度を確立することができるであろう。
【００３３】
しかし、一般的には、ヒトに対して使用する場合に適切な用量範囲は、総量約20mg〜約300mgの範囲の麻酔薬を含む。上限は、個々の麻酔薬の毒性により制限され、下限は上限の約10％である。
【００３４】
本発明は、以下の実施例においてさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態の調製および特質を例示するものである。
【００３６】
実施例１：ブピバカイン-リン酸塩含有MVLの製造
塩酸ブピバカイン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)水溶液を1N水酸化ナトリウムで初めに沈殿させて遊離塩基を調製することによって、塩酸ブピバカインをリン酸ブピバカインに転換した。沈殿物を水で激しく洗浄してから、等モル量のリン酸でリン酸塩に転換した。
【００３７】
製剤の各バッチについて、５mLの不連続第１水性成分(60 mg/mLのリン酸ブピバカイン、150 mM グルクロン酸、15mN 塩酸、および20mM リン酸を含有)を、脂質成分(溶剤として５mL USPクロロホルム(Spectrum Chemical Co., Gardena, CA)、18.6mM 1,2-ジエルコイル(dierucoyl)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DEPC)、4.2mMジパルミトイルホスファチジルグリセロール(Avanti Polar-Lipids, Inc., Alabaster, AL)(陰イオン両親媒性脂質)、30mMコレステロール(Avanti Lipids)、および10.8mMトリカプリリン(tricaprylin)を含有)を含むミキサー容器に添加した。混和していない第１水性成分および脂質成分を、Omniミキサー(OMNI International, Gainesville, VA)中16,000rpmで９分間混合した。得られた油中水型エマルションを25mLの連続第２水性成分(32mg/mLのグルコースおよび10mM遊離塩基リシン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含有)を含む50mL混合用容器に移した。次いで、混合物をOmniミキサー中4000rpmで20秒間混合した。
【００３８】
得られた水中油中水型ダブルエマルションを、275mLの連続第２水相(グルコース、32mg/mL：遊離塩基リシン、40mM)を含む１Ｌエルレンマイヤーフラスコに移した。一定流量(90L/分)の窒素ガス下で37℃にて15分間クロロホルムを蒸発させ、懸濁液中にMVL粒子を形成した。200×gで10分間の遠心分離によってMVL粒子を単離し、NaClの0.9％(w/v)溶液で３回洗浄した。それぞれのバッチを２〜８℃にて保存し、その後48時間内に研究に使用した。
【００３９】
実施例２：種々のMVL製剤からのブピバカインの回収率
表記した酸の１Ｍ溶液を等モル容量添加し、次に、60mg/mLになるか、または澄んだ溶液が得られるまで、攪拌しながら水をゆっくりと添加して、ブピバカイン試料を可溶化した。次いで、pHを約５に調整した。HPLCによって内部標準に対するブピバカインの最終濃度を決定した。
【００４０】
各製剤試験において、第１水相溶液にはブピバカイン対イオンを１mL当たりブピバカイン60mgで、またはpH５におけるブピバカイン対イオンの溶解限度で含有せしめた。MVL製造のためのその他のパラメータは上記した通りである。回収率とは、最終的なMVL生成物中に封入され、回収された対イオン溶液中のブピバカインのパーセントを指す。研究２では、第１水相に150mMグルクロン酸も含有せしめた。結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
0004467789.tif 000003
【００４２】
表１に示す結果は、ポリヒドロキシ有機酸(この場合グルクロン酸)をその他の多くある酸のうちの１つ(例えば、リン酸などのトリプロトン型無機酸、グルクロン酸などのポリヒドロキシ有機酸)と共に添加すると、顕著な相乗効果が得られることを明確に示している。この驚くべき発見は、本発明のMVLが従来に見出されたものよりも高い配合量(loading)および回収率をもたらすことを示す。
【００４３】
実施例３：皮内注射を用いたin vivo動物研究
体重800〜1000グラムのオスのモルモット(Harlan Sprague-Dawley, San Diego, CA)を用いて有効性について試験した。体重400〜600グラムのオスのモルモット(Harlan-Sprague-Dawley)を薬物動態の試験に用いた。動物を１ケージにつき１匹収容し、温度制御された環境下において、12時間周期で交互に明るくしたり暗くしたりし、餌および水は自由にとれるようにした。動物は、それぞれの研究の前に少なくとも７日間この環境に慣れさせた。体重22〜28グラムのメスCD1マウス(Sprague-Dawley)を、最大許容用量(MTD)の決定に使用した。全ての動物は、Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Councilのガイドラインに従って飼育した。
【００４４】
上記したように調製したMVL封入ブピバカインおよび塩酸ブピバカインの製剤を、通常の食塩水にて、１mLの一定容量にブピバカインを2.1％、1.0％、または0.5％(w/v)の濃度で含むように希釈した。50μlアリコートのMVL製剤を１mLのイソプロピルアルコールに可溶化し、水で希釈し、過去に発表されたHPLC法を記載されているように行って(P. Le Guevelloら、J.Chromatography 622:284-290, 1993)アッセイすることにより濃度を確認した。MVL製剤のHPLC分析から、合計ブピバカインの５％未満が、非封入ブピバカインとして製剤中に存在していることが分かった。
【００４５】
記載されているように、改変した皮内膨疹針刺(pin-prick)モデルを用いて浸潤麻酔についての研究を試験モルモットに対して行った(R.H. de Jongら、Anesth. Analog. 59:401-5, 1980)。実験前日、動物の背中の毛を刈り取った。それぞれの動物に、MVL封入ブピバカイン(0.5、1.0または2.1％(w/v)の濃度のブピバカイン)または非封入ブピバカイン(0.25、0.5、0.75または1.0(w/v)％の濃度のブピバカイン)を投与し、膨疹を生じさせた。膨疹のまわりに消えないインクで印をつけた。注射部位における針刺に対する反応を、注射の直前(ゼロ時)、ならびにMVL封入ブピバカインの注射の15分、3時間、6時間、12時間、18時間、24時間、30時間および36時間後、そして塩酸ブピバカインの注射の0、5分、15分、1時間、1.5時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間および8時間後に検査した。それぞれの時点において、まず膨疹の外側の対照領域に針刺を行った。針刺に対する動物の正常反応(発声反応)を観察してから、膨疹の内側に針刺を６回行い、モルモットが反応しなかった針刺の数を応答無しとして記録した。針刺は毎回３〜５秒の間隔で行った。ベースラインにおいては全ての動物が６回の針刺全てに対して発声反応した。
【００４６】
得られた動物データから、MVLに封入されたブピバカインを１回皮内投与すると、迅速に麻酔が開始され、その後持続した感覚麻酔が、投与されたMVL中のブピバカインの濃度に応じて最長28時間まで持続することがわかる。迅速な麻酔開始は、一部には、上記実験で用いたMVL封入ブピバカインのバッチ中の低いが有意な量の非封入ブピバカイン(合計量の約５％)によるものである。これらの製剤を使用することによって得られる麻酔の持続時間は、最もひどい術後期間(即ち最初の24時間)をカバーし得るものである。癌や神経障害性疼痛などの慢性疼痛には、さらに長い麻酔持続期間(おそらく７日間以上)がより適しているだろう。
【００４７】
実施例４：有効性試験のデータ分析
麻酔効力曲線は、応答無しの数を時間の関数としてプロットすることにより作成した。曲線下面積(AUC)を、最後のデータ点までの台形公式により求めた。図１Ａを参照すると、MVL封入ブピバカイン濃度の重量/容量パーセント(w/v％)は、2.1％(●)、1.0％(■)、および0.5％(▲)であった。図１Ｂを参照すると、非封入ブピバカイン濃度の重量/容量パーセントは0.25％(▽)、0.5％(△)、0.75％(○)および1.0％(□)であった。各データ点は、5〜6匹の動物の平均を表わす。誤差棒線は、平均の標準誤差(SEM)を示す。
【００４８】
針刺に対する反応の評価から、ブピバカインのMVL製剤(図１Ａ)または非封入塩酸ブピバカイン(図１Ｂ)のいずれかを皮内投与した後15分以内に、完全な局所麻酔(無反応状態)が得られることが示された。
【００４９】
図２は、様々な用量のMVL製剤(黒丸)および非封入薬物(白丸)についての最大応答半減(half maximal response)(Ｒ3)までの時間により測定した場合の麻酔効果の持続時間を示している。各データ点は、５〜６匹の動物の平均および平均の標準誤差(SEM)を示す。これらの結果は、麻酔効果の持続時間が両方の場合とも濃度に依存することを示している。しかし、リン酸ブピバカインを0.5および1.0重量パーセントの濃度で含有するMVL製剤は、匹敵する用量の塩酸ブピバカインと比較してそれぞれ3.2および2.9倍持続した。
【００５０】
実施例5  最大許容用量（ＭＴＤ）の決定
最大許容用量（ＭＴＤ）の決定を、当業者に公知の皮下試験（R.H.de  Jongら、Anesthesiology  54:177-81,1981）によってマウスについて行った。各群（1群は３匹のマウスから成る）に、硫酸プビバカインを含む先述のＭＶＬ製剤を、体重1ｋｇにつき７８０ｍｇまたは９８０ｍｇ注射した（５００μｌずつの２回投与、すなわち全部で１.0ｍＬ）。投与は、各側腹部にすばやく連続して行った。各対照群（1群は３匹のマウスから成る）には、非封入塩酸ブピバカインを、試験用量、すなわち体重1ｋｇについて10、20、30または50ｍｇのいずれかの用量で単回投与した。ＭＴＤは、どの動物も全身毒性を経験しない最大の投与量と定義される。
【００５１】
この試験により、封入していない塩酸ブピバカインの皮下投与を受けたマウスはどれも投与量１０および２０ｍｇ／ｋｇでは全身毒性の兆候をみせないということが分かった。しかし、投与量３０および５０ｍｇ／ｋｇでは、それぞれ、３匹中２匹の動物、および３匹中３匹の動物に毒性が現れた。一方、硫酸ブピバカインのＭＶＬ製剤を７８０ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下投与した場合、いずれの動物にも全身毒性の兆候はみられなかったが、９８０ｍｇ／ｋｇの投与では３匹中３匹の動物に毒性が現れた。したがって、非封入塩酸ブピバカインのＭＴＤは、およそ２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、ＭＶＬ−封入硫酸ブピバカインのＭＴＤは、およそ７８０ｍｇ／ｋｇと推定された。
【００５２】
局所麻酔薬の使用により生ずる最も深刻な毒性は、痙攣または心臓血管虚脱である。ブピバカインのＭＶＬ製剤投与後のピーク血清濃度が低いことと一致して、ＭＶＬ封入ブピバカインの最大許容用量（ＭＴＤ）は、塩酸ブピバカインのＭＴＤよりも何倍も高かった。こうしたデータから、本発明の方法により製造される組成物については、全身性安全特性より高まるものと予測される。活性および不活性成分の毒性特性が明確であるので、不測の毒性を見出す可能性は減少する。
【００５３】
実施例６：薬物動態試験
ブピバカインのMVL製剤ならびに封入していない塩酸ブピバカインのin vivoの薬物動態を、ブピバカイン1.0％(ｗ／ｖ)を含むMVL製剤、または0.5％(w/v)の非封入塩酸ブピバカインの1回分用量をモルモットの1群に1mL皮内単回投与した後に比較した。400〜600グラムの動物は、非封入薬物の1.0％濃度の投与には耐えれなかったので、塩酸ブピバカインについてはより低い濃度を選択した。封入していない塩酸ブピバカインを投与された動物については、注射後の０および３０分、ならびに１、３、６および９時間後に試料を採取し、一方、プビバカインのMVL製剤を投与された動物については、注射の０、６、１２，１８、２４、４８および７２時間後に試料を採取した。各時点で、３匹以上の動物をまずハロタンで麻酔し、次いで心臓穿刺により放血させた。血清試料は、凝固した全血を遠心分離して得た。皮膚は、注射部位の周囲３ｃｍを、その下にある皮下組織２〜3ｍｍの層とともに採取した。この皮膚と血清試料を、分析まで-20℃で凍結保存した。
【００５４】
組織を細かく刻み、その後ポリトロン（Polytron）ホモジナイザー（Brinkman.Littau,Switzerland）を使って水中でまとめてホモジナイズすることにより、注射部位に残存するブピバカインの全量を得た。ブピバカインをホモジネートから抽出した後、先に発表された方法（Le Guevello ら、J.Chromatography 622:284-290, 1993）を用いてＨＰＬＣにより分析した。血清中のブピバカイン濃度を、抽出後、ＨＰＬＣ（Le Guevelloら、前記）によって決定した。抽出の前に各試料に加えたテトラカインを内部標準として用いた。アッセイの検出限界は、20ng/mLであった。
【００５５】
試料から得た薬物動態データは、非仕切りモデル（WinNonlin software, Scientific Consulting, Inc., Apex, NC）を用いて分析した。算出したパラメータは、注射部位に残存する薬物量、「量対時間」曲線（ＡＵＣ）下の面積、および薬物の半減期（ｔ1/2）であった。ＡＵＣと半減期に加えて、ピーク濃度（Ｃmax）も血清ブピバカイン薬物動態のために記録した。
【００５６】
分散の一元分析（one way analysis）（ＡＮＯＶＡ）を利用して種々の薬剤および投与の経路（ＭＶＬまたは封入していない薬物経由）についての用量依存性、ならびに製剤間を比較するための用量依存性を個別に決定した。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を、全ＡＮＯＶＡ分析に用いた。こうした方法で得た薬物動態パラメータを、以下の表2にまとめた。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
「投与した薬物濃度」の単位は、ＭＶＬの１容量当たりの麻酔薬の重量である。「ピーク量」は、示した物質の皮膚試料中の最大量を表す。「Ｃｍａｘ」は、示した物質の血清中の最大濃度である。「ｔ1/2」は、薬物の半減期である。「ＡＵＣ面積」は、「量対時間」曲線下の面積である。「ｒ2」は、試料の相関係数の２乗である。
【００５９】
こうした結果が示すとおり、MVL製剤の皮内投与後、注射部位組織中の薬物の総量は、半減期12時間で減少したのに比べて、非封入塩酸ブピバカインについてはそれが1.3時間であった。1.0％MVL製剤の単回皮内投与後のブピバカインのピーク血清濃度は、0.5％塩酸ブピバカインの投与後と比べて、2.2倍（用量に対してホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ性すると４.４倍）減少した。同様に、1.0％(ｗ／ｖ)MVL製剤についての末期の血清半減期は、２０.５時間、これに対して0.5％(ｗ／ｖ)濃度での非封入塩酸ブピバカインのそれは2.1時間であった。
【００６０】
MVL製剤についての局所注射部位のＡＵＣは、非封入塩酸ブピバカインの81倍（用量に対して補正すると41倍）であり、血清ＡＵＣは、塩酸ブピバカインの２.６倍（用量に対して補正すると1.3倍）であった。
【００６１】
図3Aおよび3Bに、薬物動態試験の結果を示す。図３Aは、72時間までの各時点で注射部位に残存していた、ブピバカイン濃度1.0％（w／ｖ）のMVL-封入ブピバカイン（黒丸）あるいはブピバカイン濃度0.5％（w／ｖ）の非封入塩酸ブピバカイン（白丸）のどちらかの量を示す。図3Bは、ブピバカイン1.0％（w／ｖ）のMVL-封入製剤（黒丸）あるいはブピバカイン0.5％（w／ｖ）の非封入塩酸ブピバカイン（白丸）の、単回皮内投与後のブピバカインの血清濃度（μｇ／ｍL）を示す。それぞれの時点のデータは、動物３頭から６頭の平均ならびに平均の標準誤差(SEM)を表す。全ての試験について統計学上の危険率を0.05とした。
【００６２】
本実施例で得られた薬物動態データは、麻酔薬の効果の持続時間の延長と合致した。麻酔薬の持続時間は、MVL中に封入したブピバカインでは2.9〜3.2倍長く、注射部位の半減期は塩酸ブピバカインと比べて9.2倍長かった。ピーク血清濃度は4.5倍減少し（相当する用量に標準化）またMVL中に封入したブピバカインの投与後の末期血清半減期は、塩酸ブピバカインと比べて9.8倍増えた。
【００６３】
結論として、MVL中に封入したブピバカインの単回皮内投与により、麻酔薬の持続時間が延長され（最長28時間）、また塩酸ブピバカインと比べて局所注射部位の半減期が9.2倍（用量に対して補正せず）増加した。最大許容用量は、塩酸ブピバカインと比べて39倍増加した。したがって、本発明の製剤は、連続注入の必要がない持続作用性の浸潤麻酔法に有用であり、患者の満足度も上がると考えられる。
【００６４】
本発明の実施形態をいくつか記載した。いうまでもなく、本発明の数多の側面、利点、変更が、本発明の精神およびその範囲から逸脱することなく得られ得ることが理解されるであろう。以上の記載は、本発明を説明するものであって、これを限定するものではなく、本発明は特許請求の範囲によって定義されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、種々の濃度のブピバカインを含有するMVL-封入リン酸ブピバカインの皮内単回投与後の麻酔作用（６針刺に対して応答無しの数）を時間の関数として示すグラフである。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、種々の濃度の非封入塩酸ブピバカインの皮内単回投与後の麻酔作用（６針刺に対して応答無しの数）を時間の関数として示すグラフである。
【図２】  図２は、「最大応答半減(R3)までの時間」（縦座標）対投与した薬物の濃度（横座標）によって定量した場合の、図１Ａの製剤(MVL-封入リン酸ブピバカイン、黒丸）と１Ｂの製剤（非封入塩酸ブピバカイン、白丸）についての麻酔の持続時間の比較を示すグラフである。
【図３Ａ】  図３Ａは、MVL-封入リン酸ブピバカイン（黒丸）または非封入塩酸ブピバカイン（白丸）の皮内単回投与後72時間までの注射部位に残留するブピバカインの合計量(mg)を示すグラフである。
【図３Ｂ】  図３Ｂは、MVL-封入リン酸ブピバカインをブピバカイン1.0パーセント(w/v)の濃度で皮内単回投与した後（黒丸）、または0.5パーセント(w/v)の非封入塩酸ブピバカインを皮内単回投与した後（白丸）72時間までの血清中ブピバカイン濃度(μg/mL)を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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