(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織の修復を促進するための組織グラフト構成物であって、温血脊椎動物（ヒトを除く）の腸の筋層、および粘膜の少なくとも内腔部分の両方から剥雛した腸粘膜下組織、またはその消化物と、付加的増殖因子とを含む前記構成物。
【請求項２】
前記増殖因子が神経増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される請求項１記載の構成物。
【請求項３】
前記粘膜下組織が粘膜下組織の固形管と前記粘膜下組織管の内腔に配置される流動状粘膜下組織とを含み、前記流動状粘膜下組織が細砕および可溶化粘膜下組織、またはそれらの抽出フラクションからなる群から選択される請求項１記載の組織グラフト。
【請求項４】
温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織の修復を促進するための組織グラフト構成物であって、前記構成物が神経組織を受容する寸法の管腔直径を有する生体内分解可能の管と、前記管の内腔に配置される、脊椎動物（ヒトを除く）の流動状粘膜下組織とを含んでなる構成物。
【請求項５】
前記流動状粘膜下組織が細砕粘膜下組織である、請求項４に記載の組織グラフト構成物。
【請求項６】
前記流動状粘膜下組織が可溶化粘膜下組織である、請求項４に記載の組織グラフト構成物。
【請求項７】
前記生体内分解性管が粘膜下組織を含む請求項４〜６のいずれかに記載の組織グラフト構成物。
【請求項８】
前記生体内分解性管が０．５ｍｍないし２ｃｍの内腔直径を有する請求項４〜６のいずれかに記載の組織グラフト構成物。
【請求項９】
温血脊椎動物の腸の筋層、および粘膜の少なくとも内腔部分の両方から剥雛された腸粘膜下組織、またはその消化物を含んでなり、内因性硬膜の欠損または孔を覆う形のパッチ組織グラフトとして成形された生体内分解性硬膜代替物材料。
【請求項１０】
前記パッチ組織グラフトの縁部が折り返され、内因性組織に付着するための強化領域が与えられる請求項９記載の生体内分解性硬膜置換材料。
【請求項１１】
温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織の修復を促進するための組織グラフト構成物の製造における温血脊椎動物（ヒトを除く）の粘膜下組織の使用であって、前記製造が温血脊椎動物の粘膜下組織またはその消化物を、神経増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される付加的増殖因子と組み合わせる段階を含んでなる。
【請求項１２】
温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織の修復を促進するための組織グラフト構成物の製造における温血脊椎動物（ヒトを除く）の粘膜下組織の使用であって、前記製造が０．５ｍｍないし２ｃｍの内腔直径を有する粘膜下組織管を形成し、前記粘膜下組織管の内腔を細砕および可溶化粘膜下組織からなる群から選択される流動状粘膜下組織で満たす諸段階を含んでなる。
【請求項１３】
前記粘膜下組織管の縁部が封止されて閉じられる請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
温血脊椎動物（ヒトを除く）の腸の筋層、および粘膜の少なくとも内腔部分の両方から剥離した腸粘膜下組織を含む組成物の使用であって、温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織の修復を促進するための組織グラフト構成物の製造のための使用。
【請求項１５】
前記神経学的関連組織が硬膜である請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記神経学的関連組織が中枢神経系のニューロンを含む請求項１４記載の使用。
【請求項１７】
前記粘膜下組織が流動化される請求項１４記載の使用。
【請求項１８】
前記粘膜下組織を、修復を必要とする部位に注入する請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記粘膜下組織を、修復を必要とする部位に外科的に移植する請求項１４記載の使用。
【請求項２０】
前記粘膜下組織が粉末状である請求項１４記載の使用。
【請求項２１】
温血脊椎動物（ヒトを除く）の粘膜下組織の使用であって、温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織の修復を必要とする部位で神経学的関連組織構造を架橋し、前記架橋した神経学的関連組織構造間に前記神経学的関連組織の修復を促進するためのグラフト組成物を製造するための使用。
【請求項２２】
前記グラフト組成物が流動状であり、注射によって前記温血脊椎動物に投与される請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記グラフト組成物を前記温血脊椎動物に外科的に移植することによって、前記グラフト組成物を投与する請求項２１記載の使用。
【請求項２４】
前記神経学的関連組織が硬膜である請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
前記神経学的関連組織が中枢神経系のニューロンを含んでなる請求項２１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は損傷または疾患神経学的関連組織構造の再生および治癒の促進に有用な組織グラフト構成物に関するものである。より詳細に述べるならば、本発明は内因性神経学的関連組織増殖を必要とする部位に、その部位と粘膜下組織グラフト構成物とを接触させることによって内因性神経学的構造の形成を誘導する方法に関するものである。
発明の背景および概要
神経外科医は、外傷、腫瘍切除、および減圧術による硬膜欠損を修復する必要性に直面することが多い。硬膜およびその下の組織の修復に使用するために多くの材料が研究された。現在選択可能なものとしては、自家材料（例えば頭蓋骨膜、側頭筋膜、および大腿張筋膜）、凍結乾燥死体材料（例えば硬膜および大腿張筋膜）および合成材料（例えばシラスチック（Silastic）シート、ダクロン（Dacron）シート、ヴィクリル（Vicryl）メッシュ）が含まれる。しかしこれらの材料には著しい制限がある。
本発明の目的の一つは、硬膜代替物として機能し得る生体内分解性材料を提供することである。
多くの人々が中枢神経系に損傷を受け、その損傷が彼らに部分的麻痺を残し、または運動機能の制限をもたらす。中枢神経系の損傷を修復するための修復法およびグラフト材料は現在のところ存在しない。特に、末梢神経とは構造的に異なる脳および脊髄内の神経線維は、それらが切断または圧潰された後には再生しない。例えば、完全脊髄横断面または切断された視神経をつなぐ機能的再生を促進するヒトの治療法は現在知られていない。
本発明のその他の目的は、内因性中枢神経細胞の産生を促進し、中枢神経系組織および末梢神経組織両方の損傷を修復することのできる組成物および方法を提供することである。
温血脊椎動物の腸の筋層および粘膜の少なくとも内腔部分の両方から剥離した粘膜下組織からなる組成物は組織グラフト材料として使用できることは公知である。例えば、米国特許第４,９０２,５０８号および第５,２８１,４２２号を参照されたい。これらの特許に記載されている組成物はすぐれた機械的特性、例えば高コンプライアンス、高破裂圧力点、および有効多孔度指数などによって特徴づけられ、これらの特性のおかげでこのような組成物は血管グラフト構成物として、そして結合組織置換の用途に好都合に用いられる。このような用途に用いるとき、粘膜下組織グラフト構成物はグラフト構成物によって置換される組織の再増殖のための基質として役立つようにみえる。さらに、米国特許第５,２７５,８２６号に記載されているように、脊椎動物の流動状粘膜下組織も注入可能または移植可能組織グラフトして、バイオトロピック（生物向性）特性の損失なく使用できる。これもまた重要なことだが、６００以上の種間インプラントにおいて、粘膜下組織由来グラフト組成物が組織グラフト拒絶反応の原因になることは示されていない。
出願人は、粘膜下組織が硬膜および、中枢神経系および末梢神経系の神経細胞を含む神経学的関連組織の成長および増殖を誘発することを発見した。したがって、本発明は、損傷または疾患神経学的関連組織の修復を促進するためのグラフト構成物として粘膜下組織を使用することに向けられている。
好適実施態様の詳細な説明
本発明の粘膜下組織構成物は神経学的関連組織の増殖を促進または誘発することが見いだされた。本発明によると、用語「神経学的関連組織」はニューロンおよび神経膠細胞および硬膜、クモ膜および軟膜組織を含める。本発明により、温血脊椎動物粘膜下組織を含む組成物を使用して、温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織を修復し、または修復を促進する方法が提供される。その方法は、修復を必要とする部位を粘膜下組織を含む組成物と接触させる段階を含んでなる。
本発明によって用いられる適切な粘膜下組織は、高度に保存されたコラーゲン類、糖タンパク質類、プロテオグリカン類およびグリコサミノグリカン類をそれらの天然の形および天然濃度で含む天然コラーゲン基質を含んでなる。粘膜下組織の一ソースは温血脊椎動物の腸組織である。小腸組織はこの発明に使用する粘膜下組織の好適ソースである。
本発明に使用するための粘膜下組織は、種々の温血脊椎動物ソースから得られ、例えば食肉生産のために飼育される動物、例えばブタ、牛、ヒツジまたはその他の温血脊椎動物から得られる腸組織を含む。この組織はその天然の形または細砕した形、または酵素で一部消化した流動形で使用される。脊椎動物粘膜下組織は、市場における食肉製造処理の豊富な副産物であり、したがって、粘膜下組織を天然の層状シート形で用いる場合は特に、低コストのグラフト材料である。
適切な腸粘膜下組織は典型的には筋層および粘膜の少なくとも内腔部分の両方から剥離された粘膜下組織を含む。本発明の一実施態様において、腸粘膜下組織は粘膜下組織と、粘膜筋板と緻密層とを含む粘膜(tunica mucosa)の基底部分とを含む。これらの層は厚さおよび定義が原料となる脊椎動物種によって変化することは知られている。
本発明によって使用される粘膜下組織の製法は米国特許第４,９０２,５０８号に記載されている。この開示は参考としてここに明白に組み込まれるものとする。脊椎動物、好適にはブタ、ヒツジまたはウシから（ただしその他の種を排除するものではない）得られた腸切片を縦方向のふき取り運動を用いてこすり、平滑筋組織からなる外側層と、最も内側の層、すなわち粘膜の内腔部分とを除去する。粘膜下組織を生理的食塩液ですすぎ、任意に滅菌する。それを水和状態または脱水状態で保存することができる。凍結乾燥または空気乾燥した粘膜下組織を再水和し、そのバイオトロピックおよび機械的特性の顕著な損失なしに本発明にしたがって使用することができる。
温血脊椎動物臓器から作られる粘膜下組織は典型的にabluminal（内腔とは離れた）表面および内腔表面を有する。内腔表面は臓器ソースの内腔に面する粘膜下組織表面であり、典型的にはその臓器ソースの内側粘膜層に隣接する、一方abluminal面は臓器ソースの内腔から離れた側に面する粘膜下組織面で、典型的にはその臓器ソースの平滑筋組織と接触する。
本発明の粘膜下組織グラフト組成物は、米国特許第５,２７５,８２６号に記載されているように、その材料を縦方向または横方向に伸ばすことによってあらかじめ調整される。この開示は参考としてここに明白に組み込まれる。複数片／枚の粘膜下組織を一つに融合して、個々片／枚の粘膜下組織のどれよりも大きい面積を有する一つになった多層粘膜下組織構成物を形成することもできる。広面積／多層粘膜下組織構成物の形成法は米国特許出願第０８／４１８,５１５号に記載されている。この開示は参考としてここに明白に組み込まれるものとする。つまり、粘膜下組織の広面積シートの形成法は粘膜下組織の１枚の少なくとも一部分を他の粘膜下組織片の少なくとも一部分と重ね合わせ、その粘膜下組織が脱水し得る条件下で少なくとも前記重ね合わせた部分を加圧することを含んでなる。これらの条件下で重ね合わせた部分は融合し、一つになった大きい組織シートを形成する。
広面積グラフト構成物は実質上、接着および化学的予備処理を損なう可能性のない粘膜下組織からなる。そしてそれらはグラフト構成物の形成に用いられる個々の組織片より大きい表面積および大きい機械的強度を有する。多層粘膜下組織構成物は米国特許出願第０８／４１８,５１５号に記載されているように、任意に孔を開けることができる。この開示は参考としてここに組み込まれる。粘膜下組織構成物に孔を開けると、細胞外液をその組織グラフト材料から通過させることができ、グラフト内の液体貯留を減少させ、組織グラフトの再形成特性を高めることができる。粘膜下組織の穿孔は隣接する層の接着力をも高め、多層組織グラフト構成物では特に好都合である。
本発明によって使用するように指定された粘膜下組織は流動状でもよい。粘膜下組織は、その組織を細かく砕き、任意にそれを酵素消化して実質上均質の溶液を形成することによって流動化することができる。流動状粘膜下組織の製法は米国特許第５,２７５,８２６号に記載されている。その開示は参考としてここに明白に組み込まれるものとする。流動状粘膜下組織は、得られた粘膜下組織の引き裂き、切断、細砕または剪断による粘膜下組織の粉砕によって作られる。例えば粘膜下組織細片を高速ブレンダーで破砕するか、または凍結または凍結乾燥状態の粘膜下組織を細砕して細かくして粉末にし、その粉末をその後水または緩衝生理的食塩液で水和して、液体、ゲル状またはペースト状粘稠度の粘膜下組織液を形成することができる。その流動化粘膜下組織組成物をさらに、トリプシンまたはペプシンを含めるプロテアーゼなどの酵素類で、酸性ｐＨで、その粘膜下組織成分の全部または大部分を溶解するのに十分な時間処理し、任意に濾過して、部分的に溶解化された粘膜下組織の均質溶液を作る。
本発明のグラフト組成物はグルタールアルデヒドなめし、酸性ｐＨにおけるホルムアルデヒドなめし、プロピレンオキシド処理、エチレンオキシド処理、ガスプラズマ滅菌、ガンマ照射または電子ビーム処理、および過酢酸（ＰＡＡ）滅菌を含める従来の消毒／滅菌法を用いて滅菌できる。粘膜下組織の機械的強度、構造およびバイオトロピック特性に悪影響を与えない滅菌法が好ましい。例えば、強いガンマ照射は粘膜下組織シートの強度低下をおこす。好適滅菌法は、グラフトを過酢酸、１ないし４Ｍｒａｄｓガンマ照射（より好適には１ないし２.５Ｍｒａｄｓのガンマ照射）またはガスプラズマ滅菌にさらすことである。典型的には粘膜下組織に２種類以上の滅菌処理をおこなう。粘膜下組織を例えば過酢酸処理による最初の滅菌段階で処理した後、その組織をプラスチックまたはホイールラップに包み、再度、電子ビームまたはガンマ照射滅菌法を用いて滅菌してもよい。
一実施態様により、粘膜下組織は損傷または疾患神経学的関連組織の置換または修復のための組織グラフト構成物として用いられる。特に、本発明の粘膜下組織構成物はニューロンの成長および増殖を促進することが判明している。よって、本発明の組成物を温血脊椎動物の損傷または疾患神経学的関連組織の修復法に用いることができる。
本発明によって用いられる粘膜下組織構成物は、温血脊椎動物腸の筋層、および粘膜の少なくとも内腔部分から剥離した腸粘膜下組織、またはその消化物を含む。その構成物は付加された増殖因子、例えば血管内皮増殖因子、神経増殖因子または線維芽細胞増殖因子または粘膜下組織の抽出物を含む増殖因子と組み合わせることができる。或いは、組織グラフト構成物は粘膜下組織を末梢神経組織または任意に付加的増殖因子と組み合わせて含むことができる。
一実施態様において、固体状の粘膜下組織を、増殖因子を含む緩衝溶液に浸すことによって、１種類以上の増殖因子と組合わせる。例えば粘膜下組織を４℃で約５ないし約５００ｍｇ／ｍｌ、より好適には２５ないし約１００ｍｇ／ｍｌの増殖因子を含むＰＢＳ緩衝溶液に７ないし１４日間浸す。粘膜下組織はタンパク質類と結合しやすく、数日間生物活性化（bioactive）剤との結合を保持する。しかし、粘膜下組織への増殖因子の取り込みを高めるために、組織を増殖因子溶液と接触させる前に一部脱水することができる。粘膜下組織の流動化した、可溶性の、またはグアニジン抽出物を含む組成物では、増殖因子の凍結乾燥粉末または溶液は直接その粘膜下組織と混合できる。例えば、流動化されたまたは可溶性の粘膜下組織を増殖因子と混合し、それから粘膜下組織（またはその他の生体内分解性組織）の管のなかに詰める。この管の開放端は、その管に流動化されたまたは可溶性の粘膜下組織を充填した後、閉じて封止される。
本発明により、温血脊椎動物の粘膜下組織を用いて温血脊椎動物の神経学的組織修復の誘導に役立つ組織グラフト構成物が製造される。その製法は、温血脊椎動物の粘膜下組織、またはその消化物を血管内皮増殖因子、神経増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択した付加的増殖因子と組み合わせる段階を含んでなる。
一実施態様では、粘膜下組織を用いて、ニューロンの生体内成長をあらかじめ決めた経路に沿うように誘導するグラフト構成物を作る。その製法は、生体内分解性材料の管を形成し、その管に流動化粘膜下組織を充填する段階を含む。その管は末梢神経に使用するためには約０.５ｍｍないし約４ｍｍの直径を、そして中枢神経に使用するためには約１ｍｍないし約２ｃｍの直径をもっていなければならない。一実施態様では管は粘膜下組織から作られ、その粘膜下組織は好適寸法の直径をもつシリンダの形に成形されている。典型的には、粘膜下組織は腸組織から直接作られるから、概ねシリンダ状の形を有する。その組織を処理して、好適直径を有するシリンダの形にする。そのためにはそのグラフトを縦方向に縫い付け、またはその他の方法で固定して過剰組織を除去する。例えば、形成されるグラフト構成物の管腔の所望直径に等しい外側直径を有する滅菌ガラス棒を選択することによって、そのグラフト構成物は作られる。ガラス棒をグラフト内腔に挿入し、余分の組織を集め、そのグラフトの長さに沿って縫合するとか、またはその他の当業者には公知の組織固定法を用いて所望内腔直径を得る。
或いは、粘膜下組織片を心棒に巻き付け、その際巻き付けた粘膜下組織が下地の心棒のどの部分も露出しないように重ね合わせることによって粘膜下組織の管を形成できる。米国仮出願明細書第６０／０３２,６７９号を参照されたい。この開示は参考としてここに明白に組み込まれる。粘膜下組織は粘膜下組織の連続片として心棒に螺旋状に巻き付けられ、多数の粘膜下組織片を用いて管状構成物を形成できる。巻き付けられた粘膜下組織をその後脱水条件下で圧縮し、その管状人工物をその心棒から外す。本実施態様による螺旋状に巻き付けられた構成物における重なりの量はもとの片の幅の１０ないし６０％の範囲で、より好適には重なり部分は５０％である。
生体内分解性管が形成されたならば、その管を流動状または可溶性粘膜下組織で満たし、その管の１端または両端を公知の方法（クランプ、縫合、接着ペースト、および脱水条件下における圧縮）を用いて封止する。或いは、流動化／可溶性組織を充填する前に、管の１端または両端をシールする。それから注射器を使用して管腔に流動化／可溶性組織を注入することによって管を充填することができる。
本発明の粘膜下組織グラフト構成物を用いて神経学的関連組織、より詳細に述べるならば中枢および末梢神経系の諸構成要素を修復する。この方法は修復が必要な部位と温血脊椎動物腸の筋層および粘膜の少なくとも内腔部分の両方から剥脱した腸粘膜下組織を含む組成物とを接触させることを含む。粘膜下組織を例えばシート、片、ひも状またはループ状の形で用い、修復の必要な部位に外科的に移植することができる。粘膜下組織組成物を流動状形で温血脊椎動物の修復の必要な部位に投与し、注入することができる。最後に、その組成物は流動状粘膜下組織を充填した粘膜下組織シリンダを含める。
本発明による一実施態様において、粘膜下組織構成物を用いて温血脊椎動物の内因性神経学的組織構造間に神経学的関連組織生成を誘導する。その方法は、温血脊椎動物の粘膜下組織を含む組織グラフト組成物をホスト生体に外科的に移植し、内因性神経学的組織構造を架橋し、架橋された神経学的構造間に内因性神経学的関連組織の増殖を誘発する諸段階を含む。
粘膜下組織と、粘膜筋板および緻密層を含む粘膜(tunica mucosa)の基底部分とを含む粘膜下組織を非流動型で用いるとき、緻密層が、グラフト材料との接着を最も形成しやすい表面組織に接触するようにそれを移植するのが好ましい。
一実施態様によると、脊髄損傷は、脊髄の隣接する縦方向の神経線維を手で分離することによって修復でき、その際その分離または切開は脊柱のニューロンの軸索に平行に走り、硬膜、クモ膜および軟膜層に達する。粘膜下組織片は垂直離開に、または天然溝に外科的に移植され、神経学的関連組織と直接接触させ、これらの組織によって適所に保たれる。或いは、粘膜下組織のシートを用いて損傷領域の外部を包み、損傷組織の修復を促進することができる。オプション的に、縫合によって粘膜下組織をその所望位置に固定することができる。
脊髄を横断するような使用では、粘膜下組織は２つの切断端の間に置かれ、隙間を架橋し、２つの切断端のニューロンの成長を相互の方向に向ける枠組みとして役立ち得る。本発明による粘膜下組織の流動型を用いて、損傷または疾患神経学的関連組織を修復することもできる。好都合なことに流動型は、修復を必要とする部位に注入することができ、そのため比較的侵襲性の小さいやり方で、内因性神経学的関連組織の増殖を誘導することができる。
一実施態様によると、温血脊椎動物の粘膜下組織を含む組織グラフト組成物を温血脊椎動物の内因性神経学的関連組織の増殖を必要とする部位に、その組成物の投与部位に内因性神経学的関連組織増殖を誘導するのに有効な量を投与する。粘膜下組織のバイオトロピック特性は移植された粘膜下組織経路によって決まる「路（tracts）」に沿った神経学的組織の増殖を促進する。よって、中枢および末梢神経系のニューロンを含めるニューロンの成長は神経支配を必要とする部位に向けられる。一実施態様において、神経学的組織の成長は、流動状粘膜下組織が充填された管を含む組織グラフト組成物を用いることにより誘導される。一実施態様においては、健康なニューロン組織を管の１端に挿入し、その管に含まれる流動状粘膜下組織と直接接触するようにして配置する。管の反対側の端は神経支配の必要な部位に、またはその近くに配置される。管は適所に固定され、所望部位の新しいニューロン成長および神経支配のための生体内での導管となる。流動状粘膜下組織の管は、切断された神経の修復に用いることもできる。その場合切断された神経の２端をその管に挿入し、切り離された端を再付着させ、神経機能を回復させる。
本発明の組織グラフト構成物に関して下記の方法の各々を用いて、ニューロン組織の有向性新成長のための導管を提供することができる。一実施態様において、粘膜下組織を内腔および２つの開放端を有する管の形に作る。一実施態様において、その粘膜下組織管を直接ホスト生体に移植し、損傷神経線維の端をその粘膜下組織管の内腔に挿入することができる。それから注射器を用いてその管に、細切した、または可溶化した粘膜下組織を満たす。或いは粘膜下組織を管状に形成し、流動化／可溶化粘膜下組織を満たし、各端を封止することができる。その封止した粘膜下組織管はその後必要になるまで保存することができる。一実施態様において、封止した粘膜下組織管をホスト生体に挿入し、熟練せる当業者には公知の技術を用いて適所に固定することができる。挿入したグラフト構成物は新しいニューロン組織の増殖のための導管となる。一好適実施態様において、その粘膜下組織管に切り目または孔を開け、神経組織の損傷または切除端をその切り目または孔を通して管の内腔に挿入する。
本発明によって用いられる粘膜下組織は単独で、または付加的増殖因子、例えば血管内皮増殖因子、神経増殖因子または酸性線維芽細胞増殖因子などと組み合わせて使用できる。その上、末梢神経インプラントを粘膜下組織と組み合わせて用いてニューロン組織の修復を高めることができる。ここに用いられる用語、末梢神経インプラントとは、温血脊椎動物の末梢神経系から得られた神経組織、好適には自家末梢神経組織である。その神経組織グラフト組成物には、その組成物に使用時に構造的サポートを与える付加的諸成分、例えば脊髄など（脊柱の部分が欠如していたり、または置換する必要がある場合には特に）を加えることができる。例えばヒドロキシアパタイトおよび／またはその他の生体適合性のカルシウム含有ミネラル類をグラフト組成物と組み合わせることができ、又は金属の柱またはワイヤーも粘膜下組織と組み合わせて用い、置換組織のための付加的構造的サポートを与えることができる。
本発明の粘膜下組織グラフト構成物を用いて、その他の中枢神経関連組織および支持組織の成長および増殖を促進することもできる。粘膜下組織は神経膠細胞、および硬膜、クモ膜および軟膜組織の修復を促進する。
一実施態様において、粘膜下組織は硬膜代替物として用いられる。それは内因性硬膜に形成された欠損または孔を覆うような形をしたパッチ状組織グラフトとして形成されている。現在硬膜代替物材料として使用できるオプションは著しく制限されている。自家材料は量が不十分なことが多く、付加的切除に関連する疾患を伴うし、合成シートの取り扱い特性は生物学的材料に比較してよくない。その上、合成グラフト材料に対する組織反応による出血の長期的リスクの懸念が持ち上がっている。死体の硬膜は高価で、時には供給に制限があるが、それなのに並の取り扱い特性を示すに過ぎない。より大きい懸念の一つは、それがヤコブークロイツフェルト病のような緩徐なウィルスの伝染におけるベクターとしての役割をもつことが報告されていることである。
粘膜下組織はすぐれた硬膜代替物を提供する、なぜならばこの材料は不都合な免疫学的反応を誘発せず、侵入する内因性細胞の増殖を誘導し、結局はそのグラフトを内因性細胞で置換させるからである。ラットホストを用いて実験が行われ、硬膜代替物としての粘膜下組織組成物の有用性が確認された。
例１に記載するように、硬膜切除後にラットに移植した粘膜下組織は適切な硬膜代替物として機能する。移植後２８日目には、紡錘細胞の存在、盛んな血管新生、および結合組織基質のエオシン好性染色によって示されるように粘膜下組織のリモデリングが始まった。グラフトの挿入およびリモデリングは下にある脳皮質に何ら悪影響を与えずに行われる。
例  １
硬膜代替物としての粘膜下組織
実験計画および外科的処置
中位の大きさのSprague-Dawley実験用ラット２０匹を麻酔し（ケタミン９０ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）、頭部を安定させるために定位頭部枠（stereotaxic head frame）内に置いた。頭皮を剃り、クロロヘキサジンで準備し、１％リドカインをしみ込ませた。上側頭線の筋膜を切開した後、側頭筋を正中頭皮切開により側方に持ち上げ、頭頂骨の凸部を露出させた。両大脳半球の頭頂頭蓋局部、約４ｍｍ×８ｍｍ、を電気ハンドドリルおよびバール（burr）で切除した。頭蓋局部切除部位のラット硬膜（ほとんど透明で薄い膜）を、ループ下で拡大して切除した。下にある脳皮質に傷をつけないように注意して行った。
シート状の小腸粘膜下組織グラフト材料を本発明によって作り、０.１％過酢酸にさらして滅菌した。グラフトを大体の寸法に切り、１つの凸部上にアンレー移植片として置いた。その移植片は緻密層表面が脳皮質に面するような方向に置かれた。反対側の大脳半球にはグラフトを置かず、手術処置に対するホスト応答の対照とした。２匹の動物で骨断片を置換した。創傷を正常食塩液で洗浄し、ステープルで閉鎖した。術後、アンピシリン（２５ｍｇ／ｋｇ、ＳＱ）一回投与を行った。手術直後のケアとしては、加熱パッド上に置き、タオルで覆い、目が覚めて動くまで１５分ごとに回転させ、心拍数および呼吸をモニターすることが含まれた。動物を毎日調べ、発作または神経学的症状の発生、食欲および液体摂取量および体重を検査した。グラフト挿入後７日目にラット１０匹は過量のバルビツール酸投与（１５０ｍｇ／ｋｇ、皮内）によって死んだ。残る１０匹のラットはグラフト挿入後２８日目に死んだ。
組織標本および評価
２０匹中３匹のラットが麻酔関連性合併症のため手術期間後早期に死んだ。残る１７匹は処置から無事に回復し、発作、感染または神経病学的症状は証明されなかった。８匹は７日目に死んだ。９匹は２８日目に死んだ。
死んだ後、ラットに頸動脈カテーテルを介してホルマリンを潅流した。それから頭蓋をホルマリン中で固定し、脱石灰した。６ミクロン厚さの切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、組織学的検査の準備をした。検査すべき組織はグラフトと、皮質、骨および頭皮との界面であった。対照の側も同様に準備した。
切片の顕微鏡的評価を行い、細胞侵潤物、血管分布、欠損部位の厚さを画像分析装置（Optimus Image Analysis System；Bioscan社;エドモンズ、ＷＡ）を用いて定量化した。粘膜下組織グラフト移植治療した欠損部位のデータを７日および２８日両時点において対照側と比較した。リモデリング組織に与えられた数字的スコアは、表１に挙げた基準に基づくものであった。数値をスチュデントのＴ検定を用いて比較した。それぞれの群の総スコアを用いて、粘膜下組織充填対粘膜下組織非充填欠損部位で７または２８日目に見られる形態学的変化の間に差はないとする帰無仮説を検定した。０.０５未満のｐ値を有意と考えた。
0004572009.tif 000002
採点基準として厚さ、血管分布、および細胞密度を用いて、粘膜下組織グラフト部位を対照部位と比較する。列挙した数値は平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ.をあらわす。
0004572009.tif 000003
組織学的評価は、紡錘形単核細胞によるグラフト侵潤、結合組織の沈着、および血管新生を示した。さらに、組織学的分析は、粘膜下組織で修復した欠損と対照（すなわち欠損部位に何らの材料も置かずに治癒させた欠損部位）との間に明らかな差をあらわした。それぞれの群の総スコアをスチュデントのＴ検定を用いて比較し、ｐ＜０.０５を有意とみなした。粘膜下組織グラフト部位と対照部位との組織学的スコアの有意差が７日目（３.４±０.８対０.１±０.１）および２８日目（４.６±１.１対２.２±０.５）に見いだされた。下の皮質に対する悪影響の証拠は認められなかった。
７日目の２群間の主な差は細胞侵潤、血管分布、および欠損部位に沈着した結合組織の厚さであった。これらの形態学的変化を表１に示すように半定量的に比較した。この比較法では、粘膜下組織で治療した欠損部は、粘膜下組織で治療しなかった対照欠損部に比較して、増加した厚さ、増加した血管分布およびより多い細胞侵潤を示した。７日目に粘膜下組織材料の内部およびその周囲に認められる単核細胞は紡錘形を示すことが多く、エオシン好性染色細胞外基質（ＥＣＭ）物質によって取り巻かれていた。リモデリング粘膜下組織材料は、非粘膜下組織対照欠損に認められるものとは異なり、毛細管寸法の血管を多数示した。
２８日までに、細胞侵潤は粘膜下組織充填欠損部では弱まり、ＥＣＭの量は増加した。粘膜下組織内および周囲のエオシン好性染色結合組織はカットされた頭蓋冠の一方の縁部から他方の縁部へ伸びる方向にあるのがわかった。非粘膜下組織欠損部に見られる結合組織もゆるやかに組織化された；しかし存在する物質量は粘膜下組織欠損部よりはるかに少なかった。粘膜下組織材料そのものは２８日までに識別されなくなった。これらのＨ＆Ｅ染色切片ではＥＣＭは均質にあらわれた。細胞侵潤物は２８日目には７日目よりずっと少なく、存在する細胞のほとんどすべてが紡錘形の間葉細胞と一致した。
粘膜下組織部位および非粘膜下組織部位両方で、欠損部位内のＥＣＭとその下の脳皮質との間に時々付着が認められた。どの標本も脳炎、変性または壊死に相当する変化は示さなかった。
例  ２
犬モデルにおける硬膜代替物としての粘膜下組織
実験計画および外科的処置
中くらいの大きさのモングレル犬（２０ないし３０ｋｇ）８匹を麻酔し、挿管し、仰臥位に寝かせた（２％チオペンタール１.０ｍｇ／ｋｇ静脈注射で誘導；イソフルラン１％ないし２％、アトロピン０.５ｍｇ／ｍｌ静脈注射で維持）。眼軟膏を投与した。頭皮を剃り、クロルヘキサジンで準備をし、１％リドカインをしみ込ませた。正中頭皮切開し、上側頭線の筋膜に切り目を入れた後、側頭筋を側方に挙げて、頭頂部の凸部を露出させた。２×３ｃｍ側頭頭頂頭蓋局部切除を電気ハンドドリルおよびバールで行った。出血している骨縁部にワックスを塗った。ループ下で拡大して頭蓋局部切除部位の硬膜を切り取った。下にある脳皮質を傷つけないように注意した。
粘膜下組織グラフト材料を収穫し、２０％エタノール中０.１％過酢酸に１２０分間さらすことによって滅菌した。その材料を適当な寸法に切り、筋層の緻密基底層を脳皮質の方に向けて置き、編んだナイロン縫合糸で固定した。５匹の動物では、反対側の欠損部を、切除した自家硬膜を用いて閉鎖する処置を行い、それを外科的処置に対するホスト応答の対照とした。
３匹の動物では、反対側を硬膜切除し、最初の処置の６０日後に腸粘膜下組織で置換した。頭蓋局部切除術のフラップを置換し、創傷を正常生理的食塩液で洗い、ステープルで閉鎖した。トリビオチック軟膏、滅菌頭部包帯、およびエリザベス カラーを使用した。手術の前日および術後３日間、セファレキシン１０００ｍｇ、１日２回経口投与からなる抗生物質治療を行った。手術直後のケアは、毛布で覆い、心拍数および吸引物をモニターすることを含めた。術後痛はブトルファノール（２.４ｍｇ、筋肉内）およびＡｃｅプロマジン（２.０ｍｇ、筋肉内）で治療した。動物の発作または神経病的症状の発生、食欲および水分摂取およ体重をモニターした。最初のグラフト移植後７、３０、６０、９０、および１２０日目、および再度腸粘膜下組織にさらした後７、３０および６０日目に過量のバルビツール酸塩（１５０ｍｇ／ｋｇ、心臓内）によって死んだ。死ぬ前に、ＣＳＦ５ｃｃを後頭下穿刺によって吸引し、種々の細胞数を数えた。
組織標本および評価
死後、犬の頭部および頸部を頸動脈カテーテルを介してホルマリンで潅流した。頭蓋をホルマリン中で固定し、脱石灰した。パラフィンに埋封後、手術部位を６ミクロン厚さに切って切片を作り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、組織学的検査の用意をした。試験組織はグラフトと脳皮質、骨および頭蓋との界面を含めた。
結果
８匹全部の犬が無事に処置から回復し、発作、感染または神経病学的欠陥の証拠はなかった。反復グラフトは、粘膜下組織に対する過敏症の臨床的証拠を伴わなかった。
移植後７日目に、腸粘膜下組織に対する強い単核細胞応答があり、同時に広範囲の血管新生、および組織化されていない細胞外基質の粘膜下組織周囲への沈着が見られた。しかし下の脳皮質が巻き込まれているという証拠はなかった。グラフト部位の周囲および内部には線維芽細胞に一致する紡錘形細胞が少数あった。
７日以後の期間（３０、６０、９０、および１２０日）のすべての試験で、十分組織化されたエオシン好性染色の緻密な結合組織が明らかになり、６０日まで粘膜下組織が残っているという証拠はなかった。髄膜脳付着は認められなかった。２回目の腸粘膜下組織適用を行った犬の応答は、一回の腸粘膜下組織適用時と区別できなかった。
若干の動物では、試験部位でも対照部位でも、脳に隣接する軟膜の軽度の炎症反応があった。これは対照部位にも試験部位にもみられたため、外科的処置に対する反応であるらしい。どの動物でも脳皮質そのものが巻き込まれた証拠はなかった。７日および３０日時点での血管新生は、対照部位に比較して粘膜下組織部位の方がより強かった。最初の移植片でも再移植した動物でもホスト過感作の免疫性グラフト反応の証拠はなかった。術後サンプルのどれにも血清化学またはＣＳＦ細胞学の異常は見いだされなかった。
検討
硬膜代替物として現在選択可能のものは、自家材料（例えば頭蓋骨膜、側頭筋膜、および大腿張筋膜）、凍結乾燥された死体材料（例えば硬膜および大腿張筋膜）、異種生物材料（ウシおよびヒツジ心膜）、ウシ硬膜および再構成ウシコラーゲンスポンジ）および合成材料（例えば発泡ポリマーフルオロエチレン、シラスチック・シート、ダクロン・シート、ヴィクリル・メッシュ）を含める。しかしこれら各材料にはかなり制限がある。
自家材料は量が不十分なことが多く、付加的切除に関連する疾患を伴う。合成シートの取り扱い特性は生物学的材料に比較してよくない。その上、そのグラフトに隣接する組織反応から出血する長期リスクの懸念が持ち上がっている。死体硬膜は高価で、時には供給に制限があり、並の取り扱い特性を示すに過ぎない。その、ヤコブークロイツフェルト病の伝播におけるベクターとしての役割が報告されており、その魅力を著しく制限している。同様に、ウシ海綿状脳症がヒトへ伝染するという最近の証拠も、ウシをベースにした神経学的組織に関する懸念を高めた。
硬膜は主としてＩ型コラーゲンからなり、したがってコラーゲンをベースにした生成物は硬膜置換の合理的な候補である。さらに、これまでは相対的生物学的不活性が所望インプラント特性と考えられてきたが、移植に対して引き起こされる好ましい生物学的反応の潜在的な利点もだんだん知られるようになった。実際、線維芽細胞および内皮細胞が再構成されたコラーゲンの足場に沿って侵入し、それを新たに合成されたコラーゲンに取って替わることが示された。数種のコラーゲンをベースにした製剤が研究され、これら特性の多くを示すように見える。硬膜置換に関して報告された製剤には処理されたブタ腹膜および真皮、ウシ真皮および心膜、ヒツジ心膜、およびヒト胎盤の多くの再構成製品を含める。グラフト挿入およびその後の吸収がこれら各材料において報告されている。その上、それらは皮質に適用したとき、急性免疫応答もてんかん誘発性髄膜脳炎性瘢痕も生じなかった。
にもかかわらず、ウシ心膜のみが市販されている。例えば、好都合な生物学的特性を有するウシをベースとしないコラーゲン製剤は多くの利点を提供し、しかも多くの欠点を回避するように見える。本発明の無細胞粘膜下組織材料は硬膜置換構成物のための新規の材料を提供する。不都合な免疫原性応答がないことに加えて、粘膜下組織の明白なリモデリングおよびホスト組織への組み込みが証明されている。リモデリングされた硬膜グラフトの最終的な形は、天然組織と組織学的に区別できないようにみえる。その上、最初の移植後２カ月目に腸粘膜下組織にさらされても、不都合な臨床的できごとを伴わなかった。通常のＣＳＦ細胞学は粘膜下組織グラフトに対する不都合なホスト応答の証拠を示さなかった。
例  ３
粘膜下組織に培養した神経細胞のin vitro増殖および分化
褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２細胞）は、神経増殖因子（ＮＧＦ）が存在しないと球形クロム親和性細胞として増殖するが、親和性増殖因子で処理すると分化して交感神経様ニューロンを形成する神経細胞である。ＰＣ１２細胞はニューロンの分化および増殖を研究するモデル系として利用、確立され、又十分研究された細胞系である。種々の形の粘膜下組織（脱水、ＥＴＯ、ＰＡＡ）にさらされたＰＣ１２の応答を研究し、粘膜下組織が神経細胞の分化、成長および増殖を促進するかどうかを調べた。
細胞培養物
ラット褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）は米国培養コレクション（ロックヴィル、ＭＤ）から入手し、グリーン・ティシュラー（Green Tishler）（１９８３）が記載したように培養した。先ず最初にそれら細胞をプラスチック７５ｃｍフラスコに付着した単層として融合するまで増殖させた。ＰＣ１２細胞を、１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。細胞を、０.２ｍｇ／ｍｌコラーゲンをあらかじめ塗布したプラスチック６ウェル培養皿に植え付けた。陽性対照として使われるＰＣ１２細胞は、ＲＰＭＩ中で５０ｍｇ／ｍｌ濃度の神経増殖因子（ＮＧＦ）で７ないし１０日処理することによって交感神経芽細胞様細胞に分化した。この期間中、ＮＧＦを含む培地を１日おきに取り替えた。培養１０日後にＰＣ１２は最終的に分化し、ＮＧＦに依存して生存した。
化学物質
ウマ血清およびウシ血清はハイクロン（ロガン、ＵＴ）から購入した。ＲＰＭＩはGibco BRL（グランドアイランド、ＮＹ）から購入した。小腸粘膜下組織は本明細書に記載の方法で作った。他のすべての化学物質はシグマ・ケミカル・カンパニーから購入した。
１．増殖および分化の研究
粘膜下組織上でＰＣ１２細胞が分化することを証明するために、細胞をプラスチック製の未被覆６ウェル培養プレートに植え付けた（５０,０００／ｍｌ）。各ウェルは１ないし２インチ四方の粘膜下組織（脱水した粘膜下組織が滅菌シート、ＥＴＯ、ＰＡＡとして保存された）およびＲＰＭＩ培地を１０日間含んでいた。粘膜下組織は小片に切り、滅菌ピンセットによって細胞培養プレートのウェルに置き、細胞をピペットでその粘膜下組織上に置いた。細胞を倒立顕微鏡下で毎日観察し、ＰＣ１２細胞の変化を調べた。
各２、４、６、８、１０日の写真をとり、神経突起数および神経突起の長さを定量的に観察することによってＰＣ１２細胞の分化程度を比較した。各実験を３回づつ３度（ｎ＝３）繰り返した。細胞の分化が粘膜下組織と直接接触している細胞にも、ウェル中に存在する粘膜下組織と直接接触していない細胞にも認められた。
次の対照を用いて実験的観察を比較した。各対照（４ウェルを占める）は３度反復された（ｎ＝３）：
陽性対照：５０ｍｇ／ｍｌＮＧＦを含む培地中、０.２ｍｇ／ｍｌコラーゲンをあらかじめ塗布したプラスチック製６ウェル培養プレートに細胞を植え付けた。細胞を、ＮＧＦを含むＲＰＭＩ（２日おきに取り替えた）中で１０日間増殖させた。
陰性対照１：ＮＧＦを含まない培地中で、０.２ｍｇ／ｍｌコラーゲンをあらかじめ塗布したプラスチック製６ウェル培養プレートに細胞を植え付けた。
陰性対照２：第二の陰性対照では、ＮＧＦを含まない培地中、未被覆のプラスチック６ウェル培養プラスチックに細胞を植え付けた。陰性対照２の細胞は２ないし３日後に死に始め、浮かび始めたため、この対照は棄て、実験データをこの対照と比較することはできなかった。
結果：
粘膜下組織基質上に培養したＰＣ１２ニューロン細胞は付加的増殖因子が存在しなくても分化、増殖し、その基質上に移動するように見えた。時間ベースの研究を行い、培養２、４、６、８および１０日後に観察し、粘膜下組織基質にさらす時間と神経細胞分化における変化とを関係づけた。ＰＣ１２細胞ははん種後１日で早くも分化した。２日目までには陰性対照に比較してかなりの分化があった。しかし培養２日後の細胞にはより多数の細胞の分化、およびより大きい程度の分化が認められた。対照と実験細胞との定性的な差は培養４日後も続いた：４日目までに陽性対照は粘膜下組織上に増殖した細胞より大きい程度の分化を示し、最終的に陰性対照は最小程度の分化を示した。
培養６日後に細胞を顕微鏡下で目で比較すると、細胞数の増加が見られた。しかし多くの細胞は浮遊し、凝集していた。これはＰＣ１２ in vitro細胞培養物に非常に典型的な結果であり、分化しなかった細胞が増殖し続け、細胞数が増えた結果それらは凝集することを示唆する。粘膜下組織に培養した細胞は６日目までに陽性対照と比較して非常に小さい神経突起を有するかまたは全くなかった。そして多くの細胞がこの段階で粘膜下組織に移動するようにみえる。培養プレート中の粘膜下組織と直接接触していない細胞に高度の分化認められた。すなわち腸粘膜下組織と直接接触はせず、間近に隣接しているＰＣ１２細胞が良好な分化を示した。
組織学的研究：
時間ベースの組織学的分析を用いて、粘膜下組織基質上でいつ細胞移動がおきるか、そして移動している細胞が分化したままでいるか、または未分化細胞に変化して神経突起を失うかどうかを研究した。粘膜下組織材料を含むウェルにＰＢＳ（２ｍｌ）を流し込み、それに続き一晩、生理的食塩液緩衝ホルマリン（４ｍｌ）に固定し、その後にスライド作成の処理を行うことができた。時間ベース研究の２、４、６、８および１０日目に二重に用意したサンプルをスライド作成のために用いた。スライドは作成中である。
粘膜下組織のどちら側（粘膜または漿膜）でＰＣ１２細胞がよりよく分化し得るかを証明するための実験も行われた。粘膜下組織の両側にＰＣ１２細胞を植え付ける方法は前記のようであった。粘膜下組織の漿膜側が、粘膜下組織の他の側に比較して神経細胞の分化のためにはより良いことが認められた。
ＰＣ１２細胞の分化に与えるガンマ照射の影響を観察するために、ＰＣ１２細胞をガンマ照射した粘膜下組織の両側に植え付けた。予備的結果は、ガンマ照射粘膜下組織に培養した細胞の分化程度が通常の粘膜下組織（水和ＥＴＯ、ＰＡＡ）に培養した細胞よりも高いことを示した。この研究は３回づつ一度だけ（ｎ＝1）行われた、そのため、結果を確認するためには再度研究を行うことが必要であった。しかしこれらの最初の結果は、ガンマ照射が粘膜下組織の機械的構造の破壊／妨害を助け、分化を高める或る種の分化促進因子を放出する可能性を示唆する。
培養プレートの物理的運動が細胞分化に与える影響（“機械的妨害研究”）を調べるために、ＰＣ１２細胞を上記のとおり粘膜下組織に植え付けた。植え付けた培養プレートを５日間動かさず、細胞を顕微鏡下で観察した。実験は６ウェルで１回行われた（ｎ＝１）。培養プレートの物理的運動は、分化程度を低くし、はん種後培養プレートを動かすと細胞の分化が妨害されることが示唆された。
培地の交換が細胞分化に与える影響を調べるために２実験を２回ずつ行った。粘膜下組織粘膜側および粘膜下組織abluminal側に植え付けた細胞、陰性対照、および細胞をＮＧＦなしで未被覆プレートに植え付けた対照からなるウェルにおいて、ＲＰＭＩ培地を２、４、６、８および１０日目に変えた。実験は２度（ｎ＝2）、３回ずつ繰り返された。この研究の結果、培地の交換は、粘膜下組織の両側および陰性対照を用いた場合の細胞の分化に顕著な影響を与えないことを示した。しかし、対照では細胞は培地を変えずに培養した対照細胞の方が早く浮かんだり死んだりした。
例  ４
粘膜下組織基質上に培養したＰＣ１２細胞の抗体中和研究
材料および方法
細胞：ラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞は米国培養コレクション（ロックヴィル、ＭＤ）から入手し、グリーン・ティシュラー（１９８３）の記載のように培養した。先ず最初に細胞を、プラスチック７５ｃｍフラスコに付着した単層として融合するまで増殖させた。ＰＣ１２細胞を、１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。これらの研究では濃度４０,０００細胞／ｍｌで３ないし４継代培養を用いた。
培養プレート：１２ウェルプレート（ファルコン）を０.２ｍｇ／ｍｌラット尾コラーゲン溶液１ｍｌで３７℃の温度で一晩処理した。コラーゲン被覆プレートをコーティング３日以内の実験に用いた。
試験培地：これらの実験にはＲＰＭＩ完全培地および粘膜下組織コンディションド培地（ＳＴＣＭ）を用いた。ＳＴＣＭを作るためには、血清フリーＲＰＭＩ１６４０保存培地をＰＡＡ（０.１％）＆ガンマ（１Ｍｒａｄ）処理粘膜下組織と共に、各１５ｍｌ培地中粘膜下組織２ｇの濃度でインキュベートした。処理は３７℃で４８時間行った。血清と他の補充物をこの粘膜下組織処理培地に加え、ＳＴＣＭを得た。
増殖因子：マウス７Ｓ−ＮＧＦ（ＢＴ−５０２３）をハーラン（Harlan）から購入し、濃度５０ｎｇ／ｍｌで用いた。組換えウシＦＧＦ２（１３６３−７１９）はベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）から購入し、濃度１０ｎｇ／ｍｌで用いた。
抗体：抗マウスＮＧＦ（１０８７−７５４）はベーリンガーマンハイムから購入し、濃度１５０ｎｇ／ｍｌで用いた。ウサギ抗ウシＦＧＦ２（ＡＢ−３３−ＮＡ）はＲ＆Ｄから購入し、濃度４０ないし５０μｇ／ｍｌで用いた。
方法：ＰＣ１２細胞を０.５ｍｌＲＰＭＩ培地またはＳＴＣＭを含む１２ウェルプレートに、４０,０００細胞／ｍｌ濃度で二重に植え付けた。増殖因子および／または抗体類を適宜加えた。培養物について、植付け後４８時間のＰＣ１２の分化を、ウェルあたり３ないし２０×視野を数えることによって評価した。
分化：ＰＣ１２細胞は、もしもそれらが、細胞核から最低２細胞体の直径分だけ伸びた神経突起様伸長を少なくとも１つ示したならば、分化したと考えた。
結果
ＲＰＭＩ培地処理：ＮＧＦ＆ＦＧＦ２は両方共、試験濃度ではＰＣ１２の分化を誘発することが発見された。増殖因子を含まないウェルでは分化しなかった。増殖因子活性は、神経突起誘導因子に対する相当する中和抗体の添加によって効果的に中和されることが認められた。ＦＧＦ２含有ウェルへの抗ＮＧＦ添加もＲＰＭＩ１６４０培地における分化をブロックした。ＮＧＦ含有ウェルへの抗ＦＧＦ２の添加は分化を変化させなかった。
ＳＴＣＭ処理：ＳＴＣＭはＰＣ１２細胞の分化を誘発した。分化は抗ＦＧＦ２中和抗体の添加で効果的にブロックされた。抗ＮＧＦ中和抗体の添加は分化に影響を与えなかった。
結論
１．ＳＴＣＭはＰＣ１２の分化を誘起する物質を含む。この物質の効果は抗ＦＧＦ２中和抗体の添加によって中和され得る。
２．ＳＴＣＭにおけるＰＣ１２の分化は抗ＮＧＦ中和抗体の添加によって影響されない。
３．抗ＮＧＦ中和抗体はウシＦＧＦ２と交差反応することがあり得る。その抗体がＦＧＦ２受容体に非特異的に結合する可能性もある。
例  ５
座骨神経の再生
実験計画および外科的処置
本発明によりシート状の小腸粘膜下組織グラフト材料を作成し、０.１％過酢酸にさらして滅菌した。粘膜下組織の１枚のシートを内径約２ｍｍを有する管の形に成形し、シート組織の反対側の端を管の軸に沿って縦方向に縫合した。グラフト構成物をラットに移植する直前に、粘膜下組織管の内腔に細砕粘膜下組織の懸濁液を充填した。
中くらいの大きさのSprague-Dawley実験用ラット１１匹を麻酔し（ケタミン９０ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ）、各ラットの座骨神経の脛骨枝を約６ないし７ｍｍ切除した。切除部分は空のシラスチック管（対照として）または流動状粘膜下組織充填管構成物のどちらかで置換された。脛骨枝の両切断端を作成した管に挿入し、１つの切断神経端は管の第一端に、他の切断神経端はその管の反対側の端に挿入し、約６ないし約７ｍｍのギャップが切除脛骨枝の２端を分ける状態になった。５匹のラットを対照とし、それらのラットでは切断された神経端が空のシラスチック管に置かれていた。６匹のラットでは切断神経端が粘膜下組織管に挿入され、流動状粘膜下組織と直接接触していた（表２参照）。グラフト構成物は、周囲組織に縫合され、正しい位置に固定された。創傷を通常の生理的食塩液で洗い、ステープルで閉鎖した。手術直後のケアは加熱パッド上に寝かせ、タオルで覆い、目覚めて動くまで１５分おきに回転させ、心拍数および呼吸をモニターすることであった。
動物を毎日モニターし、３０日目には全ラットを、肢をpush offする方法を用いて観察した。握力は記録しなかった。４匹の動物が１９９７年８月２３日に死んだ。シラスチック管を移植した２匹のラットはニューロン組織増殖の若干の兆候および管の軸に沿った方向性をもった若干の成長を示した。しかし粘膜下組織管構成物においては脛骨枝の切断端が再結合しているようであった。
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