(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変されているトランスジェニック植物細胞であって、遺伝子改変が、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする外来核酸分子の導入であり、該外来核酸分子の発現が、野生型植物からの対応する遺伝子改変していない植物細胞と比較してプラスチドADP/ATP転移因子活性の増加を導き、ならびに該トランスジェニック植物細胞は、対応する遺伝子改変していない植物細胞と比較して増加した澱粉含有量を有し、および／または対応する遺伝子改変していない植物細胞からの澱粉と比較して増加したアミロース含有量を示す澱粉を合成する、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２】
核酸分子がシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のプラスチドADP/ATP転移因子をコードする、請求項１記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３】
請求項１または２記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項４】
澱粉貯蔵植物である、請求項３記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
トウモロコシ、コムギ、またはジャガイモ植物である、請求項４記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
野生型植物と比較して増加した澱粉含有量を有し、および／または野生型植物からの澱粉と比較して増加したアミロース含有量を有する澱粉を合成する、トランスジェニック植物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）植物細胞が、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする外来核酸分子の導入によって遺伝子改変される段階であって、該外来核酸分子の発現が、野生型植物と比較して細胞におけるプラスチドADP/ATP転移因子活性の増加を導く段階；および
（b）植物が、段階（a）に従って製造された細胞から再生される段階。
【請求項７】
さらに以下の段階を含む、請求項６記載の方法：
（c）さらなる植物が、段階（b）に従って製造された植物から製造される段階。
【請求項８】
請求項６または７記載の方法によって得ることができるトランスジェニック植物。
【請求項９】
繁殖材料が請求項１または２に記載のトランスジェニック細胞を含む、請求項３〜５、または８のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。
【請求項１０】
トランスジェニック植物を製造するための、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする核酸分子の使用であって、該トランスジェニック植物は、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする外来核酸分子の導入によって遺伝子改変された植物細胞を含み、該外来核酸分子の発現が、野生型植物と比較して細胞におけるプラスチドADP/ATP転移因子の活性の増加を導き、ならびに該トランスジェニック植物は、野生型植物と比較して増加した澱粉含有量を有し、および／または野生型植物からの澱粉と比較して増加したアミロース含有量を有する澱粉を合成する、使用。
【請求項１１】
請求項３〜５および８のいずれか一項記載の植物、または請求項９に記載の繁殖材料から澱粉を抽出することを含む、改変された澱粉の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プラスチドADP/ATP転移因子活性が増加したトランスジェニック植物細胞および植物に関する。そのような細胞および植物は収量の増加、好ましくは油および／または澱粉含有量の増加を示し、ならびに好ましくはアミロース含有量が増加した澱粉を合成する。
【０００２】
さらに、本発明はADP/ATP転移因子活性が減少したトランスジェニック植物細胞および植物に関する。そのような細胞および植物はアミロース含有量が減少した澱粉を合成する。
【０００３】
農業および林業の分野では、収量が増加した植物を提供する、特に絶えず増加しつつある世界の人口に食物を確実に供給するために、そして再生原料の供給を保証するために、絶え間ない努力が行われてきた。従来、育種によって収量の高い植物を得ることが試みられてきた。しかし、これは時間がかかり、費用が高くつく。さらに、対応する育種プログラムは、関係するそれぞれの植物種について実施しなければならない。
【０００４】
植物の遺伝子操作によって、すなわち植物に組換え型核酸分子を意図的に導入して発現させることによって、これらは部分的に進歩した。その種のアプローチは、一般的にそれらが１つの植物種に限定されず、他の植物種にも伝搬できるという利点を有する。
【０００５】
例えば、EP-A 0 511 979において、原核生物のアスパラギンシンターゼを植物細胞において発現させると、とりわけバイオマス産生が増加することが記述された。例えば、国際公開公報第96/21737号は、光合成速度の増加によって脱調節された、または調節されないフルクトース1,6-ビスホスファターゼの発現による植物の収量の増加を記述している。それにもかかわらず、農業または林業に関して関心の高い植物では、収量の改善に関して一般的に応用可能な方法がなおも必要とされている。
【０００６】
さらに、植物に含まれる物質が原料の再生可能源としてより一層重要な役割を果たすという事実に関して、バイオテクノロジー研究における問題の１つは、上記植物原料を、加工産業の需要に合わせることである。可能な限り多くの分野において再生原料を応用できるようにするために、広範囲に及ぶ物質を得ることがさらに必要である。その上、植物からの原料の再生可能資源の生産効率を増加させるために、上記植物含有物質の収量を増加させることが必要である。
【０００７】
脂肪および蛋白質は別として、油および多糖類は、本質的な再生植物原料である。セルロースを別として、多糖類の中心的な役割は、高等植物における最も重要な貯蔵物質の１つである澱粉について発揮する。中でも、特にジャガイモおよびトウモロコシは、それらが澱粉生産にとって重要な栽培植物であるために、興味深い植物である。
【０００８】
植物の世界において最も重要な保存物質の１つである多糖類澱粉は、その食品産業における用途とは別に、工業製品を製造する再生原料として広く用いられている。
【０００９】
澱粉産業は、概して、乾燥重量の増加を意味する澱粉含有量が増加した植物に大きな関心を寄せている。乾燥重量が増加すると、澱粉収量が増加することにより澱粉産業（トウモロコシ、ジャガイモ、タピオカ、コムギ、オオムギ、コメ等）において加工される植物の価値が増加する。さらに、澱粉含有量の高い植物細胞または器官は、それらが脂肪またはフライ油の吸収が少なく、カロリー含有量が減少した「より健康的な」製品が得られることから、食品産業における加工にとっての利点を提供する。上記の特性は、例えばトウモロコシからのポップコーン、コーンフレークス、またはジャガイモからのチップス、クリスプ、またはポテトフリッターの製造において非常に重要である。
【００１０】
ジャガイモ澱粉の産業加工に関して、乾燥重量（澱粉含有量）は、それが加工コストを左右するために重要な量である。乾燥重量（澱粉含有量）の増加は、同じ収量でジャガイモ塊茎の水分含有量が減少していることを意味する。水分含有量が減少すれば輸送コストが低下し、調理に必要なまさにその調理時間が短縮される。
【００１１】
したがって、澱粉含有量の増加を示す植物細胞および植物、ならびにそのような植物細胞および植物の製造方法を提供することが望ましいと考えられる。
【００１２】
その上、そのアミロースおよびアミロペクチン含有量が加工産業の需要と一致する澱粉を提供することが望ましいと考えられる。この意味において、アミロース含有量が増加した澱粉およびアミロース含有量が減少した澱粉はいずれも、それらがそれぞれの特定の用途に特に適しているために重要である。
【００１３】
このように、本発明の基礎となる課題は、対応する改変していない野生型植物細胞および野生型植物と比較して、好ましくは油および／もしくは澱粉の収量の増加を示す、ならびに／または改変されたアミロース含有量を有する澱粉を合成する植物細胞および植物を提供することである。
【００１４】
この課題は特許請求の範囲に特徴を示す態様を提供することによって解決される。
【００１５】
このように、本発明は、遺伝子改変が、その存在または発現によって、野生型植物からの対応する遺伝子改変していない植物細胞と比較して、トランスジェニック細胞においてプラスチドADP/ATP転移因子の活性が増加する、外来核酸分子の導入である、遺伝子改変されたトランスジェニック植物細胞に関する。
【００１６】
この意味において、遺伝子改変はプラスチドADP/ATP転移因子活性の増加に至る如何なる遺伝子改変ともなりうる。例えば１つの可能性は、遺伝子改変が、上記遺伝子の発現の増加に至るような、内因性ADP/ATP転移因子の調節領域の変化である、いわゆる「インサイチュー活性化」である。これは、例えば、対応する遺伝子の前に、例えば相同的組換えによって、非常に強いプロモーターを導入することによって行うことができる。
【００１７】
さらに、いわゆる「活性化タギング」の方法を適用する可能性がある（例えば、ワルデン（Walden）ら、Plant J.（1991）、281〜288；ワルデン（Walden）ら、Plant Mol. Biol. 26（1994）、1521〜1528を参照のこと）。上記方法は、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーターのエンハンサー、またはオクトピンシンターゼエンハンサーのような、エンハンサー要素による内因性プロモーターの活性化に基づく。
【００１８】
しかし、好ましい態様において、遺伝子改変はプラスチドADP/ATP転移因子をコードする外来核酸分子を植物細胞のゲノムに導入することを含む。
【００１９】
したがって、「トランスジェニック」という用語は、本発明の植物細胞が、ゲノム、好ましくは核酸分子に安定的に組み入れられたプラスチドADP/ATP転移因子をコードする外来核酸分子を少なくとも１つ含むことを意味する。
【００２０】
「外来核酸分子」という用語は好ましくは、プラスチドADP/ATP転移因子の生物活性を有する蛋白質をコードする核酸分子であって、対応する植物細胞では天然に存在しないか、もしくは植物細胞における正確な空間的秩序では天然に存在しないかのいずれかである、または植物細胞のゲノムの中の天然に存在しない場所に存在する核酸分子を意味する。好ましくは、外来核酸分子は、様々な要素からなりその組合せまたは特定の空間的配置が植物細胞において天然には存在しない組換え型分子である。本発明のトランスジェニック植物細胞は、上記核酸分子が好ましくは植物細胞において転写を確実にする調節DNAエレメント、特にプロモーターに結合している、プラスチドADP/ATP転移因子の生物活性を有する蛋白質をコードする外来核酸分子少なくとも１つを含む。
【００２１】
原則として、外来核酸分子は、発現後プラスチドの内膜に局在するADP/ATP転移因子をコードする如何なる核酸分子ともなりうる。この意味において、プラスチドADP/ATP転移因子はプラスチドへのATP、およびプラスチドからのADPの輸送を触媒する蛋白質である。そのような核酸分子は、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（カンフェンケル（Kampfenkel）ら、FEBS Lett. 374（1995）、351〜355；ゲンバンク受入番号X94626および受入番号Z49227）、またはジャガイモ（ゲンバンク受入番号Y10821）由来の分子が既知である。上記の既知の核酸分子によって、当業者は、標準的な方法に従って例えば非相同スクリーニングによって、他の生物、特に植物から対応する配列を単離することができる。特に、ADP/ATP転移因子をコードし、プラスチド内膜での局在を確実にする標的配列に結合している植物以外の核酸分子も用いることができる。この意味において、例えばADP/ATP転移因子は発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazeki）（ウィリアムソン（Williamson）ら、Gene 80（1989）、269〜278）およびトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）由来のものが知られている。
【００２２】
好ましい態様において、外来核酸分子はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のプラスチドADP/ATP転移因子、特にカンプフェンケル（Kampfenkel）ら（1995、上記引用）が記述した蛋白質AATP1をコードする。
【００２３】
本発明の細胞は、中でもそれらが上記細胞において天然に存在しない外来核酸分子を含むという点において、または上記分子が、細胞のゲノムにおいて通常存在しない場所、すなわち別のゲノム環境で組み入れられているという点において、天然に存在する植物細胞とは区別することができる。さらに、本発明の上記トランスジェニック植物細胞は、それらが、選択的に細胞において天然に存在する上記分子のコピーの他に、そのゲノムに安定的に組み入れられた外来核酸分子のコピーを少なくとも１つ含むという点において、天然に存在する植物細胞とは区別することができる。細胞に導入された核酸分子が、細胞において天然に存在する分子のさらなるコピーである場合、本発明の植物細胞は、特に、上記のさらなるコピーが、それがゲノムにおいて天然に存在しない場所に存在するという点において、天然に存在する植物細胞とは区別することができる。これは、例えばサザンブロット解析によって決定することができる。
【００２４】
本発明の植物細胞はさらに、好ましくは以下の特徴の少なくとも１つによって、天然に存在する植物細胞とは区別することができる：核酸分子が植物細胞に関して異種である場合、トランスジェニック植物細胞は導入された核酸分子の転写物を示し、これを例えばノーザンブロット解析によって検出することができる。好ましくは、本発明の植物細胞は、導入された核酸分子によってコードされる蛋白質を含む。これは、例えば免疫学的方法、特にウェスタンブロット解析によって検出することができる。
【００２５】
核酸分子が植物細胞に関して同種である場合、本発明の細胞は例えば、導入された外来核酸分子のさらなる発現によって天然に存在する細胞とは区別することができる。好ましくは、トランスジェニック植物細胞は外来核酸分子のより多くの転写物を含む。これは、例えばノーザンブロット解析によって検出することができる。
【００２６】
「遺伝子改変された」という用語は、植物細胞が外来核酸分子の導入によってその遺伝情報が改変され、且つ外来核酸分子の存在または発現によって表現型が変化することを意味する。この意味において、表現型の変化は好ましくは細胞の１つまたは複数の機能の測定可能な変化を意味する。例えば、本発明の遺伝子改変された植物細胞は、導入された外来核酸分子の存在または発現によって、プラスチドADP/ATP転移因子の活性の増加を示す。
【００２７】
本発明の意味において、「活性の増加」という用語は、プラスチドADP/ATP転移因子遺伝子の発現の増加、プラスチドADP/ATP転移因子蛋白質の量の増加および／または細胞におけるプラスチドADP/ATP転移因子活性の増加を意味する。
【００２８】
例えば、発現の増加は例えばノーザンブロット解析によって、ADP/ATP転移因子をコードする転写物の量を測定することによって決定することができる。これに関連して、増加は好ましくは、対応する遺伝子改変されていない細胞と比較して転写物の量の少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、特に少なくとも50％の増加を意味し、特に少なくとも75％の増加が好ましい。ADP/ATP転移因子蛋白質の量の増加は例えば、ウェスタンブロット解析によって決定することができる。これに関連して、増加は好ましくは、対応する遺伝子改変されていない細胞と比較して、ADP/ATP転移因子蛋白質量の少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、特に少なくとも50％の増加を意味し、特に少なくとも75％の増加が好ましい。
【００２９】
プラスチドADP/ATP転移因子の活性は、例えば対応する組織からプラスチドを単離して、シリコン油濾過法によってATP輸送のVmax値を決定することによって決定することができる。様々なプラスチド型の精製は、例えばノイハウス（Neuhaus）ら（Biochem. J. 296（1993）、395〜401）に記述されている。シリコン油濾過法は例えば、クイック（Quick）ら（Plant Physiol. 109（1995）、113〜121）に記載されている。
【００３０】
プラスチドADP/ATP転移因子の活性が増加した上記植物細胞を含む植物に関して、含有物質および／またはバイオマスの収量が、対応する遺伝子改変していない野生型植物と比較して増加していることが意外にも判明した。本発明の植物の油含有量および／または澱粉含有量が、改変されていない野生型植物と比較して増加していること、および／またはこれらの澱粉のアミロース含有量が増加していることも判明した。
【００３１】
この文脈において、「野生型植物」は、記載の植物を製造するための開始材料として役立つ植物、すなわち、導入された遺伝子改変とは別の遺伝情報が本発明の植物の遺伝情報と同一である植物を意味する。
【００３２】
「収量の増加」という用語は、含有物質の一部、好ましくは本発明の植物細胞の澱粉または油が、改変していない野生型植物の植物細胞と比較して、少なくとも10％増加している、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、および最も好ましくは少なくとも40％増加していることを意味する。
【００３３】
「澱粉含有量の増加」という用語は、本発明の植物細胞における澱粉の一部が、改変していない野生型植物の植物細胞と比較して、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは30％、および最も好ましくは少なくとも40％増加していることを意味する。
【００３４】
澱粉量の定量は添付の実施例に記載の方法に従って実施する。
【００３５】
「アミロース含有量の増加」という用語は、本発明の植物細胞において合成された澱粉のアミロース含有量が、改変していない野生型植物の植物細胞と比較して少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、および最も好ましくは少なくとも40％増加していることを意味する。
【００３６】
アミロース含有量は、添付の実施例に記載の方法を実施することにより決定される。
【００３７】
上記のように、プラスチドADP/ATP転移因子は、プラスチドの内膜に存在し（ヘルド（Heldt）ら、FEBS Lett. 5（1969）、11〜14；ポズエタ・ロメオ（Pozueta-Romero）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）、5769〜5773；ノイハウス（Neuhaus）、Plant Physiol. 101（1993）573〜578；シューネマン（Shunemann）ら、Plant Physiol. 103（1993）、131〜137）、プラスチドへのATPの輸送およびプラスチドからのADPの輸送を触媒する輸送蛋白質である。このように、プラスチドADP/ATP転移因子は、間質にサイトソルATPを提供する。
【００３８】
カンプフェンケル（Kampfenkel）ら（FEBS Lett. 374（1995）、351〜355）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ノイハウス（Neuhaus）ら、Plant J. 11（1997）、73〜82）からADP/ATP転移因子をコードするcDNA（AATP1）を初めて単離したが、これはグラム陰性菌である発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii）のADP/ATP転移因子と大きな類似性（66.2％類似性）を示している。シロイヌナズナ（A. thaliana）からのAATP1-cDNAは、アミノ酸589個からなる非常に疎水性の蛋白質をコードしており、これは可能性がある12個の膜貫通ヘリックスを示している（カンプフェンケル（Kampfenkel）ら（FEBS Lett. 374（1995）、351〜355））。上記cDNAは、パン酵母および大腸菌において機能的に発現させることができる。蛋白質を抽出してプロテオリポソームに再構成すると、ATP輸送速度の増加を決定することが可能であった（ノイハウス（Neuhaus）ら、Plant J. 11（1997）、73〜82）。シロイヌナズナからのAATP1のペプチド断片に対する抗体を用いて、ADP/ATP転移因子AATP1は、葉緑素外膜の内側に存在することを示すことができる（ノイハウス（Neuhaus）ら、Plant J. 11（1997）、73〜82）。
【００３９】
植物代謝にとってのプラスチドADP/ATP転移因子の機能は、これまで明確に明らかにすることができなかった。例えば、間質にサイトソルATPを提供すると、プラスチドへの蛋白質の輸送、アミノ酸生合成、脂肪酸代謝、または澱粉代謝に影響を及ぼしうる（フルッゲ＆ヒンツ（Flugge and Hinz）、Eur. J. Biochem. 160（1986）、563〜570；テトロウ（Tetlow）ら、Planta 194（1994）、454〜460；ヒル＆スミス（Hill and Smith）、Planta 185（1991）、91〜96；クレッピンガー・スパレース（Kleppinger-Sparace）ら、Plant Physiol. 98（1992）、723〜727）、といった様々な機能が検討されてきた。
【００４０】
しかし、プラスチドADP/ATP転移因子の活性の増加によって、対応するトランスジェニック植物における澱粉含有量が増加するという事実は、全く意外であった。プラスチドADP/ATP転移因子の活性の増加が産生された澱粉の分子組成に影響を及ぼす、という知見も同様に驚きであった。例えば、本発明のジャガイモ植物の塊茎からの澱粉は、形質転換していないジャガイモ植物の塊茎からの澱粉と比較してアミロース含有量の増加を示している。
【００４１】
これまで、澱粉の分子特性は、分岐酵素（E.C. 2.4.1.18）、澱粉シンターゼ（E.C. 2.4.1.21）、およびADP-グルコースピロホスホリラーゼ（E.C. 2.7.7.27）のような澱粉合成酵素の相互作用によって専ら決定されると仮定されてきた。しかし、プラスチド輸送蛋白質の発現が澱粉の構造に影響を及ぼすという事実は、全く意外である。
【００４２】
本発明の植物細胞は、如何なる植物種、すなわち単子葉植物および双子葉植物のいずれにも由来しうる。好ましくは、植物細胞は農作物植物、すなわち栄養目的、または技術、特に工業目的のためにヒトによって栽培される植物に由来する。油および／もしくは澱粉合成、または油および／もしくは澱粉貯蔵植物からの植物細胞が一般的に好ましい。このように、本発明は好ましくは、穀物（ライ麦、オオムギ、オート麦、コムギ、キビ、サゴ等）、コメ、エンドウ、トウモロコシ、メデュラ・ピー（medullar pea）、キャッサバ、ジャガイモ、菜種、大豆、麻、亜麻、ヒマワリまたは野菜（トマト、チコリ、キュウリ、レタス等）のような、澱粉合成もしくは澱粉貯蔵植物からの植物細胞に関する。ジャガイモ、ヒマワリ、大豆、コメからの植物細胞が好ましい。特に好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、菜種およびコメからの植物細胞である。
【００４３】
さらに、本発明の主題は、上記のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物である。上記植物は例えば、本発明の植物細胞からの再生によって作製することができる。トランスジェニック植物は、原則的に如何なる種の植物、すなわち単子葉植物および双子葉植物ともなりうる。好ましくはそれらは有用な植物、すなわち栄養目的、または技術、特に工業目的のためにヒトによって栽培される植物である。これらの植物は油および／もしくは澱粉合成、または油および／もしくは澱粉貯蔵植物となりうる。本発明は、好ましくは、穀物（ライ麦、オオムギ、オート麦、コムギ、キビ、サゴ等）、コメ、エンドウ、トウモロコシ、メデュラ・ピー（medullar pea）、キャッサバ、ジャガイモ、菜種、大豆、麻、亜麻、ヒマワリまたは野菜（トマト、チコリ、キュウリ、レタス等）のような植物に関する。ジャガイモ、ヒマワリ、大豆、コメが好ましい。特に好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、菜種およびコメである。
【００４４】
先に述べたように、プラスチドADP/ATP転移因子の活性が増加した本発明の植物細胞を含む澱粉貯蔵植物において、澱粉含有量は野生型植物と比較して増加していること、および／またはこれらの澱粉のアミロース含有量もまた、対応する改変していない野生型植物と比較して増加していることが意外にも判明した。
【００４５】
このように、好ましい態様において、本発明は本発明の植物細胞を含み、且つ改変していない野生型植物と比較して澱粉含有量の増加を示す、および／または対応する改変していない野生型植物と比較して上記澱粉のアミロース含有量が増加している澱粉貯蔵植物にも関する。
【００４６】
「澱粉貯蔵植物」という用語は、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、ライ麦、オオムギ、オート麦のような澱粉貯蔵組織を有する全ての植物を含む。コメ、オオムギ、およびジャガイモが好ましい。特に好ましいのはトウモロコシおよびコムギである。
【００４７】
この文脈において、「収量」における増加（「収量の増加」）、澱粉含有量における増加（「澱粉含有量の増加」）、アミロース含有量における増加（「アミロース含有量の増加」）、および「野生型植物」という用語は、上記の定義の意味の範囲内で用いられ、本発明の以下の態様に関しても同じ意味の範囲内で用いられる。「収量の増加」という用語は、好ましくは、特に植物あたりの新鮮重量に関して測定した場合、含有物質の産生および／またはバイオマスの増加を意味する。
【００４８】
上記の収量の増加は、好ましくは種子、果実、貯蔵根、根、塊茎、花、つぼみ、苗条、茎、または木のような、収穫することができる植物の一部に関する。
【００４９】
本発明に従って、収量の増加は、上記植物が同じ条件で栽培される場合、対応する形質転換していない同じ遺伝子型の植物と比較して、バイオマスおよび／または含有物質に関して少なくとも３％、好ましくは少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、および最も好ましくは少なくとも30％または野生型植物と比較して40％でさえある。
【００５０】
本発明の上記植物は、トウモロコシのアミロース・エクステンダー（amylose extender）およびダル（dull）変異体のように、アミロース含有量が増加した澱粉を合成する他の植物と比較して、アミロース含有量の増加とは別に、澱粉含有量の減少を示さず、増加さえ示すという長所を有する。
【００５１】
その上、本発明の主題は、本発明の植物細胞を含み、且つ改変されていない野生型植物細胞と比較して、好ましくは油貯蔵組織の細胞において油含有量の増加を示す油貯蔵植物である。
【００５２】
「油貯蔵植物」という用語は、菜種、キャノーラ、大豆、ヒマワリ、トウモロコシ、ピーナッツ、コムギ、綿、ギネアアブラヤシ、オリーブの木、およびアボガドのような、油を貯蔵することができる全ての植物を含む。好ましいのはトウモロコシ、コムギおよび大豆である。特に好ましいのは、菜種およびキャノーラである。
【００５３】
「油含有量の増加」という用語は、本発明の植物細胞における油含有量が、改変していない野生型植物の植物細胞と比較して少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、および最も好ましくは少なくとも40％増加していることを意味する。
【００５４】
油含有量の決定方法は当業者に公知であり、例えば、マテウス＆ブルール（Matthaeus and Bruehl）（GIT Labor-Fachz. 43（1999）、151〜152、154〜155；マテウス（Matthaeus）、Laborpraxis 22（1998）、52〜55）に記載されている。油含有量の定量は、（育種において一般的に用いられている）分析法であって、例えばシュルツ（Schulz）ら（J. Near Infrared Spectrosc. 6（1998）、A125〜A130）；スター（Starr）ら（J. Agric. Sci. 104（1985）、317〜323）によって記述された非侵襲的近赤外分光光度法によって行ってもよい。
【００５５】
油の濃度の増加を示す植物は商業的に非常に重要である。例えば、その穀粒が高レベルの澱粉を示し、副産物である油の含有量も増加を示すトウモロコシ植物は、副産物の価値が非常に高いため、湿式ミル産業にとって非常に重要である。飼料産業もまた、油含有量が増加した飼料植物は栄養的価値が増加していることから、これらの植物に関心を抱いている。油植物加工産業にとって、油含有量の増加は油抽出プロセスの効率の増加を意味する。
【００５６】
本発明はさらに、
（a）植物細胞が外来核酸分子の導入によって遺伝的に改変されており、遺伝子改変によってプラスチドADP/ATP転移因子の活性が増加する；および
（b）細胞から植物が再生される；および選択的に
（c）（b）に従って植物からさらなる植物が産生される、
野生型植物と比較して収量の増加を示す、トランスジェニック植物の製造方法に関する。
【００５７】
本発明はさらに、
（a）植物細胞が外来核酸分子の導入によって遺伝的に改変されており、遺伝子改変によってプラスチドADP/ATP転移因子の活性が増加する；および
（b）細胞から植物が再生される；および選択的に
（c）（b）に従って植物からさらなる植物が産生される、
野生型植物と比較して澱粉含有量の増加を示し、および／またはその澱粉が対応する野生型植物と比較してアミロース含有量の増加を示す、トランスジェニック植物の製造方法に関する。
【００５８】
その上、本発明の主題は、
（a）植物細胞が外来核酸分子の導入によって遺伝的に改変されており、遺伝子改変によってプラスチドADP/ATP転移因子の活性が増加する；および
（b）細胞から植物が再生される；および選択的に
（c）（b）に従って植物からさらなる植物が産生される、
野生型植物と比較して、油含有量の増加を示す、トランスジェニック植物の製造方法である。
【００５９】
段階（a）に従って、植物細胞に導入された改変に関して、同じことが本発明の植物細胞および植物に関する先の記述に当てはまる。
【００６０】
段階（b）による植物の再生は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【００６１】
本発明の方法の段階（c）によるさらなる植物の再生は、例えば栄養繁殖（例えば、挿し木、塊茎、またはカルス培養によって、および植物全体の再生によって）、または有性繁殖によって行うことができる。好ましくは有性繁殖は制御された様式で起こる、すなわち特定の特性を有する選択された植物を互いに交雑させて繁殖させる。
【００６２】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる植物にも関する。
【００６３】
本発明はまた、本発明の植物の繁殖材料と共に、本発明の遺伝子改変された細胞を含む、本発明の方法に従って製造されたトランスジェニック植物にも関する。この文脈において、繁殖材料という用語は栄養的、または有性的方法によって子孫の産生に適した植物のそれらの成分を含む。栄養繁殖に適しているのは、例えば、挿し木、カルス培養、根茎、または塊茎である。その他の繁殖材料は例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、培養細胞等を含む。好ましくは繁殖材料は塊茎、特に好ましいのは種子である。
【００６４】
本発明はさらに、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする核酸分子を、野生型植物と比較して収量が増加したトランスジェニック植物の製造に使用することに関する。
【００６５】
本発明はさらに、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする核酸分子を、野生型植物と比較して澱粉合成および／もしくは貯蔵組織における澱粉含有量が増加した植物の製造に、または野生型植物の澱粉と比較してアミロース含有量の増加を示す澱粉を合成する植物の製造に使用することに関する。好ましくは、上記の核酸分子を本発明の細胞と共に用いる。
【００６６】
本発明はさらに、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする核酸分子を、野生型植物と比較して、油含有量が増加しているトランスジェニック植物の製造に使用することに関する。
【００６７】
本発明はさらに、遺伝子改変によって、対応する野生型植物の遺伝子改変されていない植物細胞と比較して、植物細胞に内因性に存在するプラスチドADP/ATP転移因子の活性が減少する、遺伝子改変されているトランスジェニック植物細胞に関する。
【００６８】
本明細書において用いられる「トランスジェニック」という用語は、本発明の植物細胞が遺伝子改変、特に外来核酸分子の導入によって、対応する改変されていない植物細胞からその遺伝子情報が逸脱していることを意味する。
【００６９】
この文脈において、「遺伝子改変された」という用語は、植物細胞が外来核酸分子の導入によってその遺伝情報が改変されていること、および外来核酸分子の存在または発現によって表現型の変化が起こることを意味する。表現型の変化は好ましくは、細胞の１つまたは複数の機能の測定可能な変化を意味する。例えば、本発明の遺伝子改変された植物細胞は、プラスチドADP/ATP転移因子の活性の減少を示す。
【００７０】
ADP/ATP転移因子の活性が減少した本発明の上記植物細胞は、当業者に公知の様々な方法、例えばプラスチドADP/ATP転移因子をコードする内因性遺伝子の発現を阻害する方法によって作製することができる。そのような方法には、例えば対応するアンチセンスRNAの発現、共抑制作用を得るためのセンスRNAの発現、ADP/ATP転移因子をコードする転写物を特異的に切断する、対応するように構築されたリボザイムの発現、またはいわゆる「インビボ変異誘発」が含まれる。
【００７１】
本発明の細胞においてADP/ATP転移因子の活性を減少させるため、好ましくはアンチセンスRNAを発現する。
【００７２】
発現させるために、おそらく存在する隣接配列を含むADP/ATP転移因子をコードする全配列を含むDNA分子、またはこれらの一部が細胞においてアンチセンス作用を起こすために十分に長くなければならない、コード配列のごく一部を含むDNA分子のいずれかを用いることができる。一般的に、効率的なアンチセンス阻害を得るためには少なくとも長さが15 bp、好ましくは長さが100〜500 bp、特に長さが500 bp以上の配列を用いることができる。5000 bpより短いDNA分子が一般的に用いられるが、好ましくは配列は2500 bpより短い。
【００７３】
同様に、植物細胞において内因性に存在し且つプラスチドADP/ATP転移因子をコードする配列と高度の相同性を有するDNA配列を用いることも可能である。最小の相同性は約65％より高くなければならない。95〜100％の間の相同性を有する配列の使用が好ましい。
【００７４】
または、本発明の植物細胞におけるADP/ATP転移因子活性の減少はまた、共抑制作用によって得ることができる。この方法は当業者に公知であり、例えば、ヨーゲンセン（Jorgensen）（Trends in Biotechnol.8（1990）、340〜344）、ニーベル（Niebel）ら（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197（1995）、91〜103）、フラベル（Flavell）ら（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197（1995）、43〜46）、プラキ＆ボーシェレ（Plaqui and Vaucheret）（Plant. Mol. Biol. 29（1995）、149〜159）、ボーシェレ（Vaucheret）ら（Mol. Gen. Genet. 248（1995）、311〜317）、デボーン（de Borne）ら（Mol. Gen. Genet. 243（1994）、613〜621）および他の文献に記載されている。
【００７５】
細胞において特定の蛋白質の活性を減少させるためにリボザイムを発現させることも、当業者に公知であり、例えば、EP-B1 0 321 201に記載されている。植物細胞におけるリボザイムの発現は例えば、フェイター（Feyter）ら（Mol. Gen. Genet. 250（1996）、329〜338）に記載された。
【００７６】
その上、本発明の植物細胞におけるADP/ATP転移因子活性の減少はまた、ハイブリッドRNA-DNAオリゴヌクレオチド（「キメロプラスト」）を、細胞の形質転換によって細胞に導入する、いわゆる「インビボ変異誘発」によって得ることができる（キップ（Kipp, P. B.）ら、1997年９月21〜27日にシンガポールで開催された第５回国際植物分子生物学会でのポスター発表；ディクソン＆アーンツェン（R. A. Dixon and C. J. Arntzen）、「トランスジェニック植物における代謝の操作（Metabolic Engineering in Transgenic Plants）」に関する会議報告書、基調シンポジウム、カッパーマウンテン、コロラド州、アメリカ、TIBTECH 15（1997）、441〜447；国際特許出願国際公開公報第95/15972号；クレン（Kren）ら、Hepatology 25（1997）、1462〜1468；コール・ストラウス（Cole-Strauss）ら、Science 273（1996）、1386〜1389）。
【００７７】
RNA-DNAオリゴヌクレオチドのDNA成分の一部は、内因性ADP/ATP転移因子の核酸配列と相同であるが、内因性ADP/ATP転移因子の核酸配列と比較して、変異を示す、または相同な領域によって囲まれている異種領域を含む。
【００７８】
RNA-DNAオリゴヌクレオチドの相同領域と、相同的組換え後の内因性核酸分子との塩基対形成によって、RNA-DNAオリゴヌクレオチドのDNA成分に含まれる変異または異種領域は、植物細胞のゲノムに移すことができる。これによって、プラスチドADP/ATP転移因子の活性が減少する。
【００７９】
本発明の主題は特に、以下のトランスジェニック植物細胞である：
（a）プラスチドADP/ATP転移因子をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こすアンチセンスRNAを合成することができるDNA分子を含む；および／または（b）プラスチドADP/ATP転移因子をコードする内因性遺伝子の発現の減少を引き起こす共抑制RNAを合成することができるDNA分子を含む；および／または
（c）ADP/ATP転移因子をコードする内因性遺伝子の転写物を特異的に切断することができるリボザイムを合成することができるDNA分子を含む；および／または（d）変異誘発、もしくは挿入が遺伝子の発現の減少を引き起こす、または不活性な輸送分子の合成を引き起こす、インビボ変異誘発によって、変異、またはプラスチドADP/ATP転移因子をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子において異種DNA配列の挿入を示す。
【００８０】
本発明において「活性の減少」という用語は、ADP/ATP転移因子をコードする内因性遺伝子の発現の減少、細胞におけるADP/ATP転移因子蛋白質の量の減少、および／または細胞におけるADP/ATP転移因子蛋白質の生物活性の減少を意味する。
【００８１】
発現の減少は、例えばADP/ATP転移因子をコードする転写物の量を測定することによって、例えばノーザンブロット解析によって測定することができる。減少は好ましくは、遺伝子改変していない細胞と比較して、転写物の量の少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも85％および最も好ましくは少なくとも95％の減少を意味する。
【００８２】
ADP/ATP転移因子蛋白質の量の減少は例えば、ウェスタンブロット解析によって測定することができる。減少は好ましくは、対応する遺伝子改変していない細胞と比較して、ADP/ATP転移因子蛋白質の量の少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも85％および最も好ましくは少なくとも95％の減少を意味する。
【００８３】
意外にも、プラスチドADP/ATP転移因子の発現が減少している、そしてこのように活性が減少している植物細胞の澱粉含有量は、野生型植物からの対応する改変していない植物細胞と比較して減少しており、同様にこれらの澱粉のアミロース含有量も、野生型植物からの対応する改変していない植物細胞と比較して減少していることが判明した。本発明の植物の澱粉が改変された構造を有するという事実は、それがこれまで、澱粉の分子特性は分岐酵素（E.C.  2.4.1.18）および澱粉シンターゼ（E.C. 2.4.1.21）のような澱粉合成酵素の相互作用によって専ら決定されると考えられていたため、特に意外である。プラスチド輸送蛋白質の発現が澱粉の構造に影響を及ぼすことは全く意外である。
【００８４】
本発明における「澱粉含有量の減少」とは、本発明の植物細胞における澱粉の含有量が、改変していない野生型植物の植物細胞と比較して、少なくとも15％、好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも40％、および最も好ましくは少なくとも50％減少していることを意味する。澱粉含有量は実施例に記載の方法に従って決定される。
【００８５】
「減少したアミロース含有量」という用語は、本発明の植物細胞におけるアミロースの含有量が、改変していない野生型植物の植物細胞と比較して、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％および最も好ましくは少なくとも40％減少していることを意味する。アミロース含有量は実施例に記載の方法に従って決定される。
【００８６】
「野生型植物」という用語は上記の意味を有する。
【００８７】
本発明の植物細胞は、如何なる植物種、すなわち、単子葉植物および双子葉植物の双方に由来することができる。好ましくはこれらは農作物植物からの植物細胞、すなわち栄養目的、または技術的、特に工業目的のためにヒトによって栽培される植物由来の植物細胞である。このように、好ましくは、本発明は、穀物（ライ麦、オオムギ、オート麦、コムギ、キビ、サゴ等）、コメ、エンドウ、トウモロコシ、メデュラ・ピー（medullar pea）、キャッサバ、ジャガイモ、トマト、菜種、大豆、麻、亜麻、ヒマワリ、ササゲ、およびクズウコンのような、澱粉合成または澱粉貯蔵植物からの植物細胞に関する。特に好ましいのはジャガイモ由来の植物細胞である。
【００８８】
その上、本発明の主題は上記のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物である。上記植物は本発明の植物細胞からの再生によって産生することができる。トランスジェニック植物は原則的に、如何なる植物種の植物、すなわち単子葉植物および双子葉植物ともなりうる。好ましくはそれらは、農作物植物からの植物細胞、すなわち栄養目的、または技術的、特に工業目的のためにヒトによって栽培される植物からの植物細胞である。好ましくは、これらは、穀物（ライ麦、オオムギ、オート麦、コムギ、キビ、サゴ等）、コメ、エンドウ、トウモロコシ、メデュラ・ピー（medullar pea）、キャッサバ、ジャガイモ、トマト、菜種、大豆、麻、亜麻、ヒマワリ、ササゲおよびクズウコンのような、澱粉合成または澱粉貯蔵植物である。特に好ましいのはジャガイモである。
【００８９】
本発明の上記植物は、対応する野生型植物からの澱粉と比較して、アミロース含有量が減少している澱粉を合成する。「アミロース含有量の減少」および「野生型植物」という用語は上記のように定義される。
【００９０】
さらに、本発明はまた、
（a）植物細胞が外来核酸分子の導入によって遺伝子改変されており、遺伝子改変によって、植物細胞に内因性に存在するプラスチドADP/ATP転移因子の活性が減少する；および
（b）段階（a）に従って産生された細胞から植物が再生される；および選択的に（c）段階（b）に従って産生された植物からさらなる植物が産生される、
その澱粉が対応する野生型植物からの澱粉と比較して、アミロース含有量の減少を示す、トランスジェニック植物を製造する方法にも関する。
【００９１】
段階(a)に従って植物細胞に導入される改変について、同じことが本発明の植物細胞および植物に関連して先に述べたことに当てはまる。
【００９２】
段階（c）による植物の再生は、当業者に公知の方法に従って実施することができる。
【００９３】
本発明の方法の段階（c）によるさらなる植物の産生は、例えば、栄養繁殖（例えば挿し木、塊茎、もしくはカルス培養、および植物全体の再生によって）、または有性繁殖によって行うことができる。好ましくは有性繁殖は制御された方法、すなわち特定の特性を有する選択された植物を互いに交雑させて繁殖させることによって行う。
【００９４】
好ましい態様において、本発明の方法はトランスジェニックジャガイモ植物の製造に用いられる。
【００９５】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる植物にも関する。
【００９６】
本発明はまた、本発明の遺伝子改変された細胞を含む、本発明の方法に従って作製されたトランスジェニック植物と共に本発明の植物の繁殖材料にも関する。この文脈において、繁殖材料という用語は、栄養的または有性的な方法によって子孫の形成に適している植物のそれらの成分を含む。栄養繁殖に適しているのは例えば、挿し木、カルス培養、根茎、または塊茎である。その他の繁殖材料は、例えば果実、種子、実生、プロトプラスト、培養細胞等を含む。好ましくは繁殖材料は種子であり、特に好ましいのは塊茎である。
【００９７】
さらに、本発明は、プラスチドADP/ATP転移因子をコードする核酸分子、その相補体、または上記分子の一部を、野生型植物からの澱粉と比較してアミロース含有量が減少している澱粉を合成する植物の製造に使用することに関する。好ましくは、上記の核酸分子は、ADP/ATP転移因子活性の増加を示す本発明の植物細胞と共に用いられる。
【００９８】
植物宿主細胞にDNAを導入するために多様な技術が自由に利用できる。これらの技術は、形質転換物質としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いるT-DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、インジェクション、DNAの電気穿孔、バイオリスティック（biolistic）アプローチによるDNAの導入およびその他の可能性を含む。
【００９９】
植物細胞のアグロバクテリウム（Agrobacteria）による形質転換の使用は詳細に分析されており、欧州特許第120516号：ホーケマ（Hoekema）「バイナリ植物ベクター系（The Binary Plant Vector System）」、Offsetdrukkerij Kanters B. V.、アルブラッセルダム（1985）、第V章；フラレー（Fraley）ら、Crit. Rev. Plant Sci. 4、1〜46およびアン（An）ら、EMBO J. ４（1985）、277〜287に十分に記述されている。ジャガイモの形質転換に関しては、例えばロチャ・ソサ（Rocha-Sosa）らEMBO J. ８（1989）、29〜33を参照のこと。
【０１００】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）に基づくベクターによる単子葉殖物の形質転換も記述された（チャン（Chan）ら、Plant Mol. Biol. 22（1993）、491〜506；ヒエイ（Hiei）ら、Plant J. 6（1994）、271〜282；デング（Deng）ら、Science in China 33（1990）、28〜34；ウィルミンク（Wilmink）ら、Plant Cell Reports 11（1992）、76〜80；メイ（May）ら、Bio/Technology 13（1995）、486〜492；コナー＆ドミッセ（Connor and Domisse）、Int. J. Plant Sci. 153（1992）、550〜555；リッチー（Ritchie）ら、Transgenic Res. 2（1993）、252〜265）。単子葉植物を形質転換するもう一つの系はバイオリスティック（biolistic）アプローチによる形質転換（ワン＆レモー（Wan and Lemaux）、Plant Physiol. 104（1994）、37〜48；バジル（Vasil）ら、Bio/Technology 11（1993）、1553〜1558；リタラ（Ritala）ら、Plant Mol. Biol. 24（1994）、317〜325；スペンサー（Spencer）ら、Theor. Appl. Genet. 79（1990）、625〜631）、プロトプラスト形質転換、部分的透過細胞の電気穿孔、グラスファイバーによるDNAの導入である。特にトウモロコシの形質転換は文献に数回記述されている（例えば、国際公開公報第95/06128号、欧州特許第0513849号、EO第0465875号、欧州特許第292435号；フロム（Fromm）ら、Biotechnology 8（1990）、833〜844；ゴードン・カム（Gordon-Kamm）ら、Plant Cell 2（1990）、603〜618；コジール（Koziel）ら、Biotechnology 11（1993）、194〜200；モロク（Moroc）ら、Theor. Appl. Genet. 80（1990）、721〜726を参照のこと）。
【０１０１】
他の穀物の形質転換の成功もまた、例えばオオムギ（ワン＆レモー（Wan and Lemaux）、上記引用、リタラ（Ritala）ら、上記引用、クレンス（Krens）ら、Nature 296（1982）、72〜74）およびコムギ（ネーラ（Nehra）ら、Plant J. 5（1994）、285〜297）について記載されている。
【０１０２】
植物細胞においてセンスまたはアンチセンス方向にADP/ATP転移因子をコードする核酸分子を発現する場合、上記核酸分子は好ましくは、植物細胞において転写を確実にする調節DNAエレメントに結合している。上記エレメントには、特にプロモーターが含まれる。一般的に植物細胞において活性な如何なるプロモーターも適している。
【０１０３】
プロモーターは、構成的に、または植物生育の特定の時点もしくは外的要因によって決定される時点で特定の組織のみに発現が起こるように、選択することができる。植物と核酸分子の双方に関して、プロモーターは同種または異種となりうる。
【０１０４】
適したプロモーターは、例えば、構成的な発現に関してはカリフラワーモザイクウイルスの35S RNAのプロモーターおよびトウモロコシからのユビキチンプロモーターであり、ジャガイモの塊茎特異的発現に関してはパタチン遺伝子プロモーターB33（ロチャ・ソサ（Rocha-Sosa）らEMBO J. ８（1989）、23〜29）であり、ならびに光合成によって活性な組織に限って発現を確実にするプロモーター、例えばST-LS1プロモーター（ストックハウス（Stockhaus）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（1987）、7943〜7947；ストックハウス（Stockhaus）ら、EMBO J. 8（1989）、2445〜2451）、または内胚葉特異的発現に関してはコムギのHMGプロモーター、USPプロモーター、ファセオリンプロモーター、トウモロコシのゼイン遺伝子からのプロモーター（ペダーセン（Pedersen）ら、Cell 29（1982）、1015〜1026；クアトロッキオ（Quatroccio）ら、Plant Mol. Biol.15（1990）、81〜93）、グルテリンプロモーター（レイジー（Leisy）ら、Plant Mol. Biol. 14（1990）、41〜50；ツェン（Zheng）ら、Plant J. 4（1993）、357〜366；ヨシカワ（Yoshikawa）ら、FEBS Lett. 383（1996）、213〜218）、またはシュランケン-1プロモーター（ウェール（Werr）ら、EMBO J. 4（1985）、1373〜1380）である。しかし、外的要因によって決定される時点に限って活性化されるプロモーターも用いることができる（例えば、国際公開公報第9307279号を参照のこと）。この文脈において、単純誘導を可能にする熱ショック蛋白質のプロモーターは、特に重要となりうる。その上、ソラマメ（Vicia faba）および他の植物において種子特異的発現を確実にするソラマメからのUSPプロモーター（フィードラー（Fiedler）ら、Plant Mol. Biol. 22（1993）、669〜679；バウムレイン（Baumlein）ら、Mol. Gen. Genet. 225（1991）、459〜467）のような種子特異的プロモーターを用いることができる。
【０１０５】
内胚葉特異的（endospecific）プロモーターに関する上記態様は、特に、内胚葉における澱粉含有量を増加させるために適している。これとは対照的に、胚特異的プロモーターを用いることは、概して油は主に胚に貯蔵されるために、油含有量を増加させる場合に特に重要である。
【０１０６】
このように、好ましくは、本発明に従って胚または種子における発現を確実にするプロモーターを用いる。本発明の好ましい態様において、プロモーターは、トウモロコシからのグロブリン-1（glb1）プロモーター（スタイアー＆カントリッフェ（Styer and Cantliffe）、Plant Physiol. 76（1984）、196〜200）である。本発明のもう一つの態様において、胚特異的プロモーターは植物、好ましくはキュフェア・ランセオラタ（Cuphea lanceolata）、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、またはブラシカ・ナプス（Brassica napus）に由来する。プロモーターpCIFatB3およびpCIFatB4が特に好ましい（国際公開公報第95/07357号）。これらはそれぞれ、遺伝子CIFatB3およびCIFatB4のプロモーターであり、これは、中等度の長さの脂肪酸の生合成のためにトランスジェニック菜種において首尾よく用いられており、このように、本問題の溶液にとって適した発現ウインドウを有する。
【０１０７】
もう一つの好ましい態様において、pCIGPDHプロモーター（国際公開公報第95/06733号）、ナピン（例えば、クリドル（Kridl）、Seed Sci. Res.1（1991）、209〜219；エラーストロム（Ellerstrom）ら、Plant Mol. Biol. 32（1996）、1019〜1027；スタルバーグ（Stalberg）ら、Planta 199（1996）、515〜519に記載されている）、またはオレオシンプロモーター（例えば、ケディ（Keddie）、Plant Mol. Biol. 24（1994）、327〜340；プラント（Plant）ら、Plant Mol. Biol. 25（1994）、193〜205に記載されている）を用いる。
【０１０８】
その上、転写の正しい終結の役に立つ終結配列が存在することができ、ポリAテールを転写物に付加すると、転写物を安定化させる機能を有すると見なされた。上記エレメントは文献（例えば、ギーレン（Gielen）ら、EMBO J. ８（1989）、23〜29）に記述されており、必要に応じて互換可能である。
【０１０９】
本発明のトランスジェニック植物細胞および植物は、好ましくはプラスチドADP/ATP転移因子の活性の増加または減少によって、野生型植物において合成された澱粉と比較して、その物理化学特性、特にアミロース／アミロペクチン比が改変されている澱粉を合成する。特に、上記の澱粉は、野生型の澱粉と比較して、上記澱粉糊の粘度および／またはゲル形成特性に関して改変することができる。
【０１１０】
このように、本発明は、上記の植物の１つから、および／または上記植物の澱粉貯蔵部分から澱粉を抽出する段階を含む、改変された澱粉の製造方法に関する。好ましくは、上記方法は、澱粉を抽出する前に栽培された植物および／または上記植物の澱粉貯蔵部分を採取する段階、およびさらに、特に好ましくは採取する前に本発明の植物を栽培する段階を含む。植物または植物の澱粉貯蔵部分から澱粉を抽出する方法は当業者に公知である。その上、様々な他の澱粉貯蔵植物から澱粉を抽出する方法は、例えば「澱粉：科学と技術（Starch：Chemistry and Technology）」（ウィスラー、ベミラー＆パスチャル（Whistler, BeMiller and Paschall）編（1994）、第二版、アカデミックプレスインクロンドン；ISBN 0-12-746270-8；例えば、第XII章、412〜468頁を参照のこと：トウモロコシおよびモロコシ澱粉：産生；ワトソン（Watson）；第XIII章、469〜479頁；タピオカ、クズウコン、およびサゴの澱粉：産生；コービッシュレイ＆ミラー（Corbishley and Miller）、第XIV章、491〜506章：コムギからの澱粉：産生、改変および用途；ナイト＆オソン（Knight and Oson）；および第XVI章、507〜528頁：コメの澱粉：産生と用途；ローマー＆クレム（Rohmer and Klem）；トウモロコシの澱粉；エクホフ（Eckhoff）ら、Cereal Chem. 73（1996）、54〜57、工業標準によるトウモロコシからの澱粉の抽出は通常、いわゆる「湿式ミル」によって行われる）に記載されている。植物材料から澱粉を抽出するための方法に通常用いられる器具は、分離器、デキャンター、液体サイクロン、噴霧乾燥器および流動床乾燥器である。
【０１１１】
さらに、本発明の主題は、本発明のトランスジェニック植物細胞、植物、および繁殖材料から得ることができる澱粉、および上記の本発明の方法によって得ることができる澱粉である。
【０１１２】
本発明の澱粉は、当業者に公知の方法に従って改変することができ、非改変型または改変型として食品または食品以外の産業での様々な用途に適している。
【０１１３】
原則として、用途の可能性は大きく２つの領域に分けることができる。１つの領域は澱粉の加水分解産物を含み、主に酵素的または科学的方法によって得られるグルコースとグルカン建築ブロック（building blocks）を含む。それらは、さらなる化学改変および発酵のようなプロセスのための開始材料として役に立つ。コストを削減するために、加水分解法の単純かつ安価な方法が重要となりうる。現在のところ、方法は本質的にアミログルコシダーゼを用いて酵素的に行われている。酵素の利用を減少させることによってコストを削減することは可能であると思われる。これは澱粉の構造、例えば粒子の表面拡大、低い分岐程度によるより容易な消化性、または用いる酵素の近づき易さを制限する立体構造を変化させることによって得ることができる。
【０１１４】
そのポリマー構造のためにいわゆる天然澱粉として澱粉が用いられるその他の分野は、さらに２つの適用分野に分類することができる。
【０１１５】
１. 食品における使用
澱粉は、様々な食品に対する典型的な添加剤であって、本質的に水性添加剤を結合する目的を果たし、および／または粘度の増加もしくはゲル形成の増加を引き起こす。重要な特徴的特性は、例えば、流動および収着作用、膨張およびペースト化温度、粘度、および濃化作用、澱粉の可溶性、透明性およびペースト構造、熱、離断および酸抵抗性、老化傾向、薄膜形成能力、凍結／融解抵抗性、消化性ならびに無機または有機イオンとの複合体形成能である。
【０１１６】
２. 食品以外における使用
その他の主な適用分野は、様々な生産プロセスにおける補助剤、または技術的製品の添加剤としての澱粉の利用である。補助剤としての澱粉の利用に関する主な適応分野は、第一に、紙および厚紙産業である。この分野では、澱粉は主に保持力(固体の引き留め)のため、固化物質として整粒充填剤および細粒のため、ならびに脱水のために用いられる。さらに、堅さ、硬度、音、握り、つや、なめらかさ、離断強度ならびに表面に関する澱粉の有利な特性が利用されている。
【０１１７】
2.1. 紙および厚紙産業
製紙過程では、４つの適応分野、すなわち表面、コーティング、重量および吹き付けを区別することができる。
表面処理に関する澱粉の必要条件は、本質的に、高度の輝き、相応な粘度、高度の粘度安定性、良好な薄膜形成ならびにほこりの低発生である。固体内容物のコーティングに用いる場合には、関係する粘度、高度の結合能力ならびに高度の色素親和性が重要な役割を果たす。塊体に対する添加剤としては、急速、均一、無駄のない拡散、高い機械的安定性および紙パルプにおける完全な保持性が重要である。澱粉を吹き付けに用いる場合には、相応な固体含量、高い粘度ならびに高い結合能力も重要である。
【０１１８】
2.2 接着産業
主な適用分野は例えば、接着産業であり、ここでは適用分野は４つの領域に分割される：純粋な澱粉糊としての利用、特殊化学物質を用いて調製した澱粉糊における利用、合成樹脂およびポリマー分散物に対する添加剤としての澱粉の利用ならびに合成接着剤の拡張剤としての澱粉の利用である。澱粉に基づく接着剤全体の90％が、段ボール紙、紙袋および紙バッグ、紙およびアルミニウムの合成材料、箱、ならびに封筒、切手等の水糊の産生に利用される。
【０１１９】
2.3 紡績および紡績ケア産業
補助剤および添加剤として考えられるもう一つの利用は、紡績および紡績ケア製品の産生においてである。紡績産業において、以下の４つの適用分野に分類することができる：整粒剤、すなわち、なめらかにし、織り上げの際の着用抵抗性の増加と共に、織り上げの際に働く張力に対する保護のためのぎざぎざ作用(burring behaviour)を強化するための補助剤として、漂白、染色等の、主として品質を劣化させる前処置後の織物改善剤として、色素拡散防止のための染料ペースト産生における濃縮剤としての、および織り糸の整経剤のための添加剤としてとしての澱粉の利用。
【０１２０】
2.4 建築産業
さらに、澱粉は、建築材料における添加剤としての使用できる。一つの例は、石膏ボードの産生であり、薄い石膏と混合させた澱粉を水と共にペースト状にし、石膏ボードの表面に拡散させ、厚紙をボードに結合させる。もう一つの適用領域は、これを石膏および鉱物繊維と混合することである。予め混合させたコンクリートにおいて、澱粉を整粒プロセスの減速のために用いてもよい。
【０１２１】
2.5 地盤の安定化
さらに、澱粉は、人工的な地盤シフトにおいて水に対する地盤粒子の一時的な保護のために用いられる地盤安定化手段の産生に有用である。先端技術の知識に従って、澱粉およびポリマー乳化剤を含む配合製品は、これまで用いられていた製品と同じ腐食減少および表皮形成減少効果を有すると見なすことができる；しかし、それらはかなり安価である。
【０１２２】
2.6 植物保護剤および肥料における利用
もう一つの適用分野は、植物保護剤におけるこれらの調製物の特殊な特性の修飾における澱粉の利用である。例えば澱粉は、植物保護剤および肥料の湿化の改善に、活性成分の一定量放出に、液体、揮発性および／または臭いがある活性成分の、微小結晶の安定で変形可能な物質への転化に、相容れない組成の混合に、および分散低下による効果持続の延長に用いられる。
【０１２３】
2.7 薬物、医薬品および化粧品産業
澱粉はまた、薬物、医薬品および化粧品産業の分野で用いてもよい。製薬産業において、澱粉を錠剤の結合剤として、またはカプセル中の結合剤の希釈に用いてもよい。さらに、澱粉は、飲み込む際に水を吸収し、短時間で活性成分を放出するにつれ膨張するため、錠剤の崩壊剤としても適している。品質的理由から、医薬品の潤滑剤および外傷治療粉剤がさらに適応分野となる。化粧品分野において、澱粉は例えば、香水およびサリチル酸などの粉末添加剤の担体として用いてもよい。澱粉の比較的広範な適応分野は歯磨きである。
【０１２４】
2.8 石炭および練炭における添加剤としての澱粉
澱粉はまた、石炭および練炭における添加剤として使用することもできる。澱粉を加えることによって、石炭を定量的に塊にし、および／または高品質の練炭にすることができ、このように練炭の未成熟崩壊を防ぐことができる。バーベキュー用木炭は付加澱粉を４〜６％、熱発生石炭を0.1〜0.5％含有する。さらに、澱粉は、これを石炭および練炭に加えると、毒性物質の放出をかなり減少させることができるため、結合剤として適している。
【０１２５】
2.9 鉱石および石炭スラリーの加工
さらに、澱粉は鉱石および石炭スラリーの加工において凝集剤として用いてもよい。
【０１２６】
2.10 鋳造材料の添加剤
もう一つの適用分野は、鋳造において物質を加工するための添加剤としての利用である。様々な鋳造プロセスにおいて、結合剤と混合した砂から産生された中心核が必要とされる。今日では、最も一般的に用いられている結合剤は、たいていの場合、膨張する澱粉である修飾澱粉と混合したベントナイトである。澱粉を加える目的は、結合力の改善と共に、流体抵抗の増加である。加えて、膨張澱粉は、冷水における分散性、再水和性、砂との良好な混和性、および水の高い結合能力などの、生産プロセスに対して予めさらに必要な条件を満たす可能性がある。
【０１２７】
2.11 ゴム産業
ゴム産業では、澱粉を技術的および視覚的品質の改善のために用いてもよい。この理由は、表面のつや、握り、および外観の改善である。この目的のために、低温加硫前に、ゴム物質の粘着性のゴム引き表面上に澱粉を拡散させる。ゴムの印刷可能性を改善するために用いてもよい。
【０１２８】
2.12 皮革代用品の産生
修飾澱粉のもう一つの適用分野は、皮革代用品の産生である。
【０１２９】
2.13 合成ポリマーにおける澱粉
プラスチック市場において、以下の適用分野が明らかである：澱粉由来製品の加工プロセスへの組み込み(澱粉は単なる充填剤で、合成ポリマーと澱粉との間の直接結合はない)、または澱粉に由来する製品のポリマー産生への組み込み(澱粉とポリマーは安定な結合を形成する)。
【０１３０】
澱粉を純粋な充填剤として用いても、タルカムのような他の物質に匹敵することは不可能である。この状況は、特殊な澱粉特性が有効になる場合、および最終製品の特性プロフィールがこのように明らかに変化する場合には異なる。一つの例は、ポリエチレンなどの熱可塑性材料の加工における澱粉製品の利用である。これによって、澱粉と合成樹脂は、「マスターバッチ」を形成するために、共発現によって１：１の比で配合し、ここから様々な製品が顆粒化ポリエチレンを用いた一般的技法によって産生される。ポリエチレン薄膜への澱粉の組み込みは、水性染料による印刷可能性の改善と共に、中空体における物質透過性の増加、水蒸気透過性の改善、抗静電気防止作用の改善、抗ブロック作用の改善を引き起こす。
【０１３１】
もう一つの可能性は、ポリウレタンフォームにおける澱粉の利用である。加工技術の最適化によるばかりでなく澱粉誘導体の適合により、合成ポリマーと澱粉の水酸基との反応を特異的に調節することが可能である。結果は、澱粉の利用によって以下の特性プロフィールを有するポリウレタン薄膜である；熱膨張係数の減少、収縮作用の減少、圧／張力作用の改善、水許容性の変化を伴わない水蒸気透過性の増加、可燃性およびひび割れの減少、可燃性部分の落下なし、ハロゲン化物なし、および加齢の減少。現在なお存在する不利な点は、圧および衝突強度の減少である。
【０１３２】
薄膜の製品開発が唯一の選択肢ではない。ポット、プレート、およびボウルなどの固形プラスチック製品は、50％以上の澱粉含量を用いて産生することができる。さらに、澱粉／ポリマー混合物はそれらがはるかに容易に生体崩壊するという長所を付与する。
【０１３３】
さらに、それらの水との強い結合能力により、澱粉接合ポリマーは最も重要となった。これらは、澱粉の骨格を有し、ラジカル連鎖メカニズムの原理に従って合成モノマーの側面格子を接合した製品である。今日利用できる澱粉接合ポリマーの特徴は、結合の改善、および高い粘度での澱粉１g当たり1000 gまでの水の保持能力である。これらの超吸収剤は、農業分野例えば種子ペレットと共に、主として衛生分野、例えば、紙おむつやシートなどの製品で用いられる。
【０１３４】
組換えDNA技法によって修飾した新規の澱粉の使用に関して決定的なことは、一方では、構造、水分含量、蛋白含量、脂質含量、繊維含量、灰／リン酸含量、アミロース／アミロペクチン比、相対モル重量配分、分岐程度、顆粒径、および結晶と共に形状、ならびに一方では以下の特徴となる特性：流体および吸収作用、ペースト化温度、粘度、濃化能力、可溶性、ペースト構造、透明度、熱、離断および酸抵抗性、老化傾向、ゲル形成能力、凍結／融解抵抗性、複合体形成能力、ヨウ素結合、薄膜形成、接着力、酵素安定性、消化性および反応性である。
【０１３５】
トランスジェニック植物の遺伝子操作による修飾澱粉の産生は、化学または物理的方法によってさらなる修飾が不要になるような方法で、植物から得た澱粉の特性を修飾してもよい。一方で、組換えDNA技法によって修飾された澱粉をさらに化学修飾してもよく、その結果、上記の特定の適応分野に関して品質のさらなる改善が起こる。これらの化学修飾は主として公知である。これらは特に以下による修飾であり、それによりリン酸、硝酸、硫酸、キサントゲン酸、酢酸、およびクエン酸澱粉が形成される：
−  加熱処理
−  酸処理
−  酸化および
−  エステル化。
その他の有機酸をエステル化に用いてもよい：
−  澱粉エーテルの形成
澱粉アルキルエーテル、O-アリルエーテル、ヒドロキシアルキルエーテル、O-カルボキシメチルエーテル、N-含有澱粉エーテル、P-含有澱粉エーテルおよびS-含有澱粉エーテル。
−  分枝状澱粉の形成
−  澱粉接合ポリマーの形成。
【０１３６】
以下の実施例により本発明を説明する。
【０１３７】
実施例１
細菌発現ベクターpJT118の構築および大腸菌の形質転換
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のAATP2蛋白質（遺伝子ライブラリX94626）は、N末端がアミノ酸10個を含む「ヒスチジンタグ」に融合している。
【０１３８】
このため、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの全AATP2蛋白質をコードするcDNAをPCRアプローチによって単離した。以下のオリゴヌクレオチドはセンスプライマーとして用い、これはさらに、XhoI制限部位を有した：cgtgagagatagagagctcgagggtctgattcaaacc（配列番号：１）、塩基対66〜102位を含む。
【０１３９】
さらなるBamHI制限部位を有するオリゴヌクレオチドはアンチセンスプライマー：gatacaacaggaatcctggatgaagc（配列番号：２）として使用でき、これは塩基対1863〜1835位を含む。得られたPCR産物はアガロースゲルによって精製して、制限酵素XhoI/BamHIによって切断して、プラスミドpET16bに「インフレーム」で導入した（Novagene、ハイデルベルグ、ドイツ）。これによって、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの全AATP2蛋白質をコードするcDNAのN末端でアミノ酸10個のヒスチジンタグが示された（His-AATP2）。上記ベクターは、pJT118と呼ばれた。PCR産物の配列は、双方のヌクレオチド鎖をシークエンシングすることによって決定した（Eurogentec）。大腸菌C43の形質転換（ミロー＆ウォーカー（Miroux and Walker）、J. Mol. Biol. 260（1996）、289〜298）は標準的な方法に従って実施した。
【０１４０】
大腸菌株C43は、動物（ミロー＆ウォーカー（Miroux and Walker）、上記引用）および植物（トジャデン（Tjaden）ら、J. Biol. Chem. （1998）（印刷中））の膜蛋白質の異種発現を可能にする。
【０１４１】
上記株をベクターpJT118によって形質転換した後、放射性標識したADPおよびATPによる取り込み試験を実施した。His-AATP2は、大腸菌C43において、大腸菌の細胞質膜に機能的に発現されうることがこれらの試験から証明することができた。これは実際にAATP2がADP/ATP転移因子をコードしていることを示した。N末端ヒスチジンタグが存在すれば、N末端ヒスチジンタグを有しないAATP2と比較して、大腸菌においてシロイヌナズナ（A. thaliana）のAATP2の輸送活性が増加（２〜３倍）する。
【０１４２】
実施例２
プラスミドpJT31の構築とジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドの導入
植物形質転換ベクターを構築するために、長さ2230 bpのシロイヌナズナ（A. thaliana）からのAATP1-cDNA（カンプフェンケル（Kampfenkel）ら、FEBS Letters 374（1995）、351〜355）のEcoRV/BamHI断片を、SmaI/EcoRVおよびBamHIによって切断したベクターpBinARにライゲーションした（ヘフゲン＆ウィルミッツァー（Hofgen and Willmitzer）、Plant Sci. 66（1990）、221〜230）。cDNA断片を挿入することによって、以下のような断片A、B、およびCで構成される発現カセットが形成される（pJT31）（図１参照）：
【０１４３】
断片A（540 bp）はカリフラワーモザイクウイルスからの35Sプロモーターを含む。
【０１４４】
断片Bは隣接領域に加えて、シロイヌナズナ（A. thaliana）からのADP/ATP転移因子の蛋白質コード領域（AATP1）を含む。上記領域は上述のように単離して、pBinARにおいて35Sプロモーターとセンス方向に融合した。
【０１４５】
断片C（215 bp）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からのオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。
【０１４６】
プラスミドpJT31の大きさは約14.2 kbである。
【０１４７】
ロチャ・ソサ（Rocha -Sosa）ら（EMBO J. 8（1989）、23〜29）のように、アグロバクテリウム（Agrobacteria）を用いて、プラスミドをジャガイモ植物に移した。形質転換の結果として、トランスジェニックジャガイモ植物はプラスチドADP/ATP転移因子のmRNAの増加を示した。これはノーザンブロット解析によって検出した（図６参照）。RNAは、ジャガイモ植物の葉および塊茎組織から標準的なプロトコールに従って単離した。RNA 50μgをアガロースゲル上で分離した（1.5％アガロース、１×MEN緩衝液、16.6％ホルムアルデヒド）。電気泳動した後、RNAを20×SSCと共に、毛細管ブロットによってナイロンメンブレンハイボンドN（Amersham、イギリス）に移した。UV照射によってRNAを膜上に固定した。メンブレンを燐酸ハイブリダイゼーション緩衝液中で２時間予めハイブリダイズして（サムブルック（Sambrook）ら、上記引用）、その後放射性標識プローブを加えることによって10時間ハイブリダイズさせた。
【０１４８】
実施例３
プラスミドpJT32の構築とジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドの導入
植物形質転換ベクターを構築するために、長さ1265 bpのジャガイモ（S. tuberosum）からのAATP1-cDNA（ゲンバンクY10821）のコード領域のBamHI/NdeI断片を、SmaI/NdeIおよびBamHIによって切断したベクターpBinARにライゲーションした（ヘフゲン＆ウィルミッツァー（Hofgen and Willmitzer）、Plant Sci. 66（1990）、221〜230）。
【０１４９】
cDNA断片を挿入することによって、以下のような断片A、B、およびCで構築される発現カセットが形成される（図２参照）：
【０１５０】
断片A（540 bp）はカリフラワーモザイクウイルスからの35Sプロモーターを含む。
【０１５１】
断片Bは、長さ1265 bpのジャガイモ（S. tuberosum）からのADP/ATP転移因子（AATP1 S.t.）の領域を含む。この領域を、pBinARにおいて35Sプロモーターとアンチセンス方向で融合した。
【０１５２】
断片C（215 bp）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からのオクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。
【０１５３】
プラスミドpJT32の大きさは約13.3kbである。
【０１５４】
ロチャ・ソサ（Rocha -Sosa）ら（EMBO J. 8（1989）、23〜29）のように、アグロバクテリウム（Agrobacteria）を用いて、プラスミドをジャガイモ植物に移した。
【０１５５】
形質転換の結果として、トランスジェニックジャガイモ植物はプラスチドADP/ATP転移因子のmRNAの減少を示した。これはノーザンブロット解析によって検出した（図５参照）。RNAは、ジャガイモ植物の葉および塊茎組織から標準的なプロトコールに従って単離した。RNA 50μgをアガロースゲル上で分離した（1.5％アガロース、１×MEN緩衝液、16.6％ホルムアルデヒド）。電気泳動した後、RNAを20×SSCと共に、毛細管ブロットによってナイロンメンブレンハイボンドN（Amersham、イギリス）に移した。UV照射によってRNAを膜上に固定した。メンブレンを燐酸ハイブリダイゼーション緩衝液中で２時間予めハイブリダイズして（サムブルック（Sambrook）ら、上記引用）、その後放射性標識プローブを加えることによって10時間ハイブリダイズした。
【０１５６】
実施例４
トランスジェニックジャガイモ植物の澱粉、アミロース、および糖類含有量の解析
可溶性糖の含有量の決定は、ローリー＆パッソニュー（Lowry and Passonneau）の「フレキシブルな酵素解析システム（A Flexible System of Enzymatic Analysis）」、アカデミックプレス、ニューヨーク、アメリカ（1972）に記述されたように実施した。澱粉含有量の測定はバッツ（Batz）ら（Plant Physiol. 100（1992）、184〜190）によって記述されたように実施した。
【表１】
0004494634.tif 000002
【０１５７】
アミロース含有量の測定は、ホーヘンカンプ・ヘルメリンク（Hovenkamp-Hermelinlk）らが記述したように実施した（Potato Res. 31（1988）、241〜246）。
0004494634.tif 000003
【０１５８】
実施例５
発現カセットの作製および菜種植物の形質転換
pBluescript誘導体における発現カセットpTE200（ショート（Short）ら、Nucl. Acid Res. 16（1988）、7583〜7600）は、キュフェア・ランセオラタ（Cuphea lanceolata）からのチオエステラーゼ遺伝子CIFatB4（ゲンバンク受入番号：AJ131741）のプロモーターおよびターミネーター配列、ならびに様々な有用な遺伝子の挿入に適したポリリンカー配列を有する。多様な認識領域における非適合性ヌクレオチドを有する末梢のSfiI認識部位は、バイナリプラスミドベクターpMH000-0の対応する制限部位への有用な遺伝子を含む発現カセット全体の指向性移入、pLH9000のさらなる発達（ハウスマン＆テプファー（Hausmann and Topfer）（1999）：第９章：アブラナ種の相応のバイオエンジニアリングにおける「プラスミドベクターの開発」（Entwicklung von Plasmid-Vektoren in Bioengineering fur Rapssorten nach Mass）、ブラウア、レッベレン＆テプファー（D. Brauer, G. Robbelen, and R. Topfer）編、植物栽培講義第45巻、155〜172）を可能にして、レシピエントベクターにおけるDNAの再環状化を防止する。
【０１５９】
発現カセットpTE200を作製するためには、まず、長さが約3.3 kbのプロモーターを有するSalI-BbvI断片を、C. ランセオラタ（C. lanceolata）からの完全なCIFatB4遺伝子を有するゲノムクローンCITEg16（国際公開公報第95/07357号）から単離した。これを得るために、プロモーターの3'末端でのBbvI制限部位を開裂させて、断片が、SalIおよびSmaIによって切断したpBluescript（Stratagene）によって取り込まれるように改変した。1211ヌクレオチド5'に位置する断片の内部EcoR制限部位は、開裂することによって欠失させ、T4ポリメラーゼによって改変して、その後再度閉鎖した。
【０１６０】
ターミネーター配列は、ポリメラーゼ連鎖反応およびCITEg16マトリクス（国際公開公報第95/07357号）での特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって増幅し、そしてプライマーを通じて様々なポリリンカー制限部位（MCS）を提供した。プライマーの配列は：5'GAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTCGAGAAGTGGCTGGGGGCCTTTCC3'（配列番号：３）＝5'プライマー：（MCS：EcoRI、PstI、SmaI、BamHI、SpeI、XhoI；CIFatB4ターミネーター：35〜56位）および5'TCTAGAGGCCAAGGCGGCCGCTTCAACGGACTGCAGTGC3'（配列番号：４）＝3'プライマー：CIFatB4ターミネーター：22〜39位、MCS：NotI、StyI、SfiI、XbaI。増幅体をEcoRIおよびNotIによって切断して、pBlueSfi BAの対応する制限部位に挿入した（ハウスマン＆テプファー（Hausmann and Topfer、上記参照）。プロモーターを有する断片をBamHIによって開裂させて、改変した後SalIによって切断してこれをSalIを通じてpBlueSfi BAベクターに入れて、ターミネーターの前のHindIII制限部位を改変した。その結果、発現カセットpTE200が得られる（図７参照）。
【０１６１】
植物形質転換ベクターの構築に関しては、長さが2270 bpのジャガイモのAATP1 cDNAのEcoRI断片（pTM1、トジャデン（Tjaden）ら、The Plant Journal 16（1998）、531〜540）を、EcoRIで開裂させたベクターpTE200にライゲーションした。方向性は制限消化によって制御した。その結果、プラスミドpTE208が得られた（図８）。次の段階で、pTE208からのSfiI断片をバイナリベクターpMH000-0のポリリンカー制限部位に定方向に挿入した（図９）。その結果、ベクターpMH0208が得られた。
【０１６２】
バイナリプラスミドベクターpMH000-0は、植物形質転換のための別の選択マーカーによってpLH9000（ハウスマン＆テプファー（Hausmann and Topfer、上記参照）からさらに発展させた。アスパラギン酸718位をXhoI制限部位に改変した後pS001の前駆体プラスミド（ライス（Reiss）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93（1996）、3094〜3098）からリブロース二燐酸カルボキシラーゼの小さいサブユニットのプラスチド輸送のために、スルホンアミド遺伝子（sul）をシグナルペプチド配列（tp）と共に単離した。SalIおよびBamHIを改変した後に、ノパリンシンターゼ遺伝子（pAnos）のターミネーターの前でXhoI-SalI断片をpBluescript誘導体のXhoI-およびBamHI制限部位に挿入した。その後３つの断片のライゲーションにおいて、pRT103pat（テプファー（Topfer）ら、Methods in Enzymol. 217（1993）、66〜78）から得られたtpsul-pAnos断片（XhoI-XbaI）およびXhoI-HindIII断片を、HindIIIおよびXbaIによって開裂されたプラスミドpK18（プリドモア（Pridmore）、Gene 56（1987）、309〜312）と統合させた。その結果、pRT103patからのCaMV35S rna遺伝子のターミネーターを有するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子をtpsul-pAnos単位の反対方向に置いた。pROA93（オット（Ott）ら、Mol. Gen. Genet. 221（1990）、121〜124）の子孫からのXhoI断片としてのCaMV35S rna遺伝子の二重プロモーターを、上記二重選択単位（殺虫剤バスタおよびスルホンアミドスルファジアジンに対する抵抗性）を完全にするために、抵抗性媒介遺伝子配列の間のXhoI制限部位に挿入した。隣接するポリリンカーにおいて対応する改変を行った後、得られた二重選択カセットを、XbaIおよびHindIIIによって、pLH9000前駆体プラスミドにおいてカナマイシンカセットと交換した（ハウスマン＆テプファー（Hausmann and Topfer、上記参照）。その結果、バイナリプラスミドベクターpMH000-0が得られた。
【０１６３】
菜種のドラッカー（Drakkar）変種の胚軸外植体の形質転換は、バイナリベクターpMH0208（ATP/ADP輸送因子センス）を有するアグロバクテリウム（株GV3101 C58C1 Rifr）によって、デブロック（De Block、Plant Physiol. 91（1989）、694〜701）のプロトコールに従って実施した。選択栄養培地（スルホンアミド）上で苗条を再生して、温室で種子が成熟するまで栽培した。PCRおよび葉の試験（グルホシナトアンモニウム（バスタ（登録商標））に対する抵抗性）によって、植物がトランスジーンを含むか否かを試験した。様々な発達段階での成熟しつつある胚を上記植物から採取して、液体窒素に保存した。
【０１６４】
油含有量の測定に関しては、トランスジェニック菜種株および対照株の成熟した種子を、非侵襲的近赤外線分光光度法を用いて分析した（例えば、シュルツ（Schulz）ら、J. Near Infrared Spectrosc. 6（1998）、A125〜A130；スター（Starr）ら、J. Agric. Sci. 104(2)、（1985）、317〜323）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドpJT31の略図を示す（AATP1（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））のセンス）；
【図２】  プラスミドpJT32の略図を示す（AATP1（ジャガイモ（Solanum tuberosum））のアンチセンス）；
【図３】  シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からのAATP2のアミノ酸配列とAATP1（シロイヌナズナ）および発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii）からの相同蛋白質（ウィリアムソン（Williamson）ら、Gene 80（1989）、269〜278）との比較を示す。
【図４】  フォンヘイン（von Heijne）ら（Eur. J. Biochem. 180（1989）、535〜545）の方法に従って実施したAATP2（シロイヌナズナ（A. thaliana））、AATP1（シロイヌナズナ（A. thaliana））およびリケッチアADP/ATP転移因子のヒドロパシー分析。
【図５】  ADP/ATP転移因子アンチセンス植物の葉および塊茎におけるAATP1（ジャガイモ）発現のノーザンブロット解析を示す。
【図６】  ADP/ATP転移因子過剰発現植物の葉および塊茎におけるAATP1（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））発現のノーザンブロット解析を示す。
【図７】  胚特異的遺伝子発現のためのカセットpTE200の概略マップ。EcoRI、SmaI、BamHI、XhoI、NotI、XbaI、SacI、KpnI、ApaI、SalIおよびSfiIは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を印す。現実的な理由から、SfiI（A）およびSfiI（B）は認識配列内で多様なヌクレオチド配列が異なる。略語は以下の通りである：PCIFatB4＝CIFatB4プロモーター、tCIFatB4＝CIFatB4ターミネーター、amp＝アンピシリンに対する細菌抵抗性、ColE1起点＝プラスミドColE1の「複製起点」、f1(-)起点＝ファージf1の「複製起点」。
【図８】  ADP/ATP転移因子発現カセットpTE208の概略マップ：ベクターpTE200のこの誘導体は（図７）は、センス方向のジャガイモ（Solanum tuberosum）からのプラスチドADP/ATP転移因子をコードするcDNAを有する。
【図９】  バイナリベクターpMH000-0の概略図。SfiI、SalI、ClaI、HindIII、EcoRI、NsiI、SmaI、BamHI、SpeI、NotI、KpnI、BgIII、ApaI、XhoI、XbaI、およびBstEIIは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を印す。SfiI（A）およびSfiI（B）は述べたようにその認識配列の可変のヌクレオチド配列が異なる。これがSfiI切断後に開始プラスミドの再環状化が防止され、pTE200誘導体からの発現カセットの直接挿入が可能となる理由である。略語は以下の通りである：RB、LB＝左右境界領域、t35S＝CaMVからの35S rna遺伝子の終結シグナル、pat＝ホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子、p35S＝CaMV由来の35S rna遺伝子のプロモーター、p35S（min）＝CaMV由来の35S rna遺伝子の最小プロモーター、tp-sul＝トランジットペプチドを有するスルホンアミド抵抗性遺伝子、tnos＝ノパリンシンターゼ遺伝子の終結シグナル、Sm/Sp＝ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンに対する細菌抵抗性、parA、parB、およびparR＝アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）および大腸菌に関して大きな宿主領域を有するプラスミドpVS1からのプラスミド複製機能。
【配列表】
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0004494634.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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