(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記（１）〜（１２）に係る火落菌を含む乳酸菌に対して抗菌活性を有する抗菌活性物質を生産するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＮＰＩＢ−０２９０（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３６）を培養した培養上清液を酒母、モロミ若しくは製成酒などに添加して抗腐敗酒を製造することを特徴とする抗腐敗酒の製造方法。  
記
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＩＦＯ  ３４２５
（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＩＦＯ  ３５４１
（３）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＩＦＯ  ３５３５
（４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ＩＦＯ  ３２０２
（５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＩＦＯ  １２４５６
（６）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＩＦＯ  １５８９３
（７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ
ＩＦＯ  １２００７
（８）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ  ＩＦＯ  １５８８６
（９）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ
ＩＦＯ  １５８８３
（１０）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  １５８８５
（１１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＩＦＯ  １５８９１
（１２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＩＦＯ  １３９５１
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＮＰＩＢ−０２９０（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３６）由来の抗菌活性物質を使用した抗腐敗酒の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
清酒を製造する際には、通常、火落菌の汚染による白濁、酸の生成及びジアセチルなどによる特異臭の発生等の品質劣化（以下、火落という）を防ぐため、清酒の加熱殺菌及び無菌濾過が行われる（火落菌の汚染・増殖ができない状態を作出する。）。
【０００３】
尚、火落菌とは２０％のエタノール耐性を持つ乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属するグラム陽性菌の総称で、清酒に含まれるメバロン酸を必須栄養素とする真性火落菌と、通常の培地でも生育が可能な火落性乳酸菌に大別されており、これらの火落菌が清酒中に繁殖することにより火落が起こる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述の加熱殺菌及び無菌濾過は完全な火落菌の除去方法ではなく、清酒を製造する際には常に火落菌汚染の危険性がある。
【０００５】
本発明は、清酒の製造工程中、貯蔵中または瓶詰め後、火落菌の増殖を抑え腐敗が生じない抗腐敗酒の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の要旨を説明する。
【０００７】
少なくとも下記（１）〜（１２）に係る火落菌を含む乳酸菌に対して抗菌活性を有する抗菌活性物質を生産するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＮＰＩＢ−０２９０（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３６）を培養した培養上清液を酒母、モロミ若しくは製成酒などに添加して抗腐敗酒を製造することを特徴とする抗腐敗酒の製造方法。  
記
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＩＦＯ  ３４２５
（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＩＦＯ  ３５４１
（３）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＩＦＯ  ３５３５
（４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ＩＦＯ  ３２０２
（５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＩＦＯ  １２４５６
（６）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＩＦＯ  １５８９３
（７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ
ＩＦＯ  １２００７
（８）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ  ＩＦＯ  １５８８６
（９）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ
ＩＦＯ  １５８８３
（１０）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  １５８８５
（１１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＩＦＯ  １５８９１
（１２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＩＦＯ  １３９５１に係るものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、火落菌による腐敗を防止し得る抗腐敗酒の製造方法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好適と考える本発明の実施形態を説明する。
【００１０】
本発明における抗腐敗酒の製造方法は、抗菌活性物質を生産する乳酸菌（受託年月日：平成１７年５月１１日，寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター，受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３６、以下、寄託乳酸菌という。）を培養した培養上清液若しくは該培養上清液から精製した抗菌活性物質（現時点では未同定）を例えば酒母、モロミ若しくは製成酒等に添加すると、既に例えばモロミに混入している火落菌を死滅させたり、あらたな火落菌の付着（感染）や増殖が防止されることを確認した。
【００１１】
従来、多くの乳酸菌が種々の抗菌活性物質を生産することが知られているが、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質が種々の火落菌に対して抗菌作用を有することは、本発明者がはじめて見出した。
【００１２】
よって、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質を利用することで清酒の火落が防止でき、常に高品質な清酒が得られることになる。
【００１３】
また、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質は、熱に対して安定であることを実験により確認しており、従って、加熱殺菌工程を経る清酒の場合（例えば最終的瓶詰め前に加熱工程を採用する場合）にも当該寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質は利用でき、長時間火落防止効果が期待できる。即ち、瓶詰めの処理の際、空気中から火落菌が混入しても、当該寄託乳酸菌から生産される抗菌活性物質は抗菌活性を失っていない為、火落防止効果が継続することになる。
【００１４】
また、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質はｐＨ３〜８の間で安定であることを実験により確認しており、従って、ｐＨ４〜５の清酒に当該寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質を利用でき、長時間火落防止効果が期待できる。
【００１５】
本発明は上述のように、酒母、モロミ若しくは製成酒等に寄託乳酸菌の抗菌活性物質を含む培養上清液若しくは該培養上清液から精製した抗菌活性物質を添加することで、清酒の製造工程中、貯蔵中または瓶詰め後、火落菌に汚染されても火落菌の増殖が抑えられ腐敗防止効果が期待できることになる。
【実施例】
【００１６】
本実施例は、常法に従って清酒製造工程において抗菌活性物質を生産するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＮＰＩＢ−０２９０（新潟県新潟市水道町２丁目5932-133所在の新潟県醸造試験場保有；寄託乳酸菌）を培養した培養上清液を、酒母、モロミ若しくは火入れ後の製成酒に添加する場合である。
【００１７】
本実施例の寄託乳酸菌は、ＭＲＳ培地（商品名Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ、ＤＩＦＣＯ社製）、ＧＹＰ培地等の通常の乳酸菌用培地を用いて培養する。
【００１８】
寄託乳酸菌は通常、上述した乳酸菌用培地で３０℃で培養され、この培養上清液が使用される。
【００１９】
また、前記培養上清液を硫酸ナトリウムによる塩析、遠心分離、透析、各種のカラムクロマトグラフィーなど通常の手段で精製して用いることも可能である。
【００２０】
以下に本発明の作用効果をより具体的に示す実験例について述べる。
【００２１】
＜実験例１＞  寄託乳酸菌の培養上清液の調製
寄託乳酸菌の培養上清液を以下の方法により調製した。
【００２２】
寄託乳酸菌をＭＲＳ培地で７２時間培養し、得られた培養液中の菌体を遠心分離（１５，５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により除去した。
【００２３】
続いて、得られた培養上清液中に残存する菌体の殺菌や酵素の失活の為、８０℃で１５分間加熱処理後、同条件で遠心分離を行い、培養上清液を得た。
【００２４】
＜実験例２＞  抗菌活性物質の熱安定性
実験例１と同様の方法で調製した寄託乳酸菌の培養上清液を８０℃、１００℃及び１２０℃の各温度で１０〜６０分間加熱処理を行い、氷中で冷却後、残存活性をナイシン相当活性として以下の方法で測定した。
【００２５】
ナイシン標準液の調製は次のとおりである。
【００２６】
ナイシン（２.５％、Ｎｉｓｉｎ、ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｇを８０ｍｌの０.０２規定の塩酸水溶液に完全に溶解後、１００ｍｌにメスアップし、１００Ｕ／ｍｌの溶液を調製した。この溶液を０.０２規定の塩酸水溶液で４０Ｕ／ｍｌとなるように希釈し標準液とした。
【００２７】
また、残存活性測定は次のとおりである。
【００２８】
指標菌としてＬｂ．ｓａｋｅｉ．  ＩＦＯ３５４１を使用した。
【００２９】
シャーレに１％寒天を含むＭＲＳ培地を１０ｍｌ注ぎ、水平面で固化させた。
【００３０】
次に、あらかじめＭＲＳ培地で培養した指標菌を１％寒天水溶液に濁度（６６０ｎｍ）が約０.００３になるように接種し、これを先に固化させた寒天培地上に４ｍｌ重層した。
【００３１】
この寒天平板に、ステンレス製カップ（内径６ｍｍ、外形８ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を置き、この中に加熱処理した寄託乳酸菌の培養上清液、及び、ナイシン標準液を０.１ｍｌ添加し、３０℃、４８時間培養した。
【００３２】
培養後、カップのまわりに、生育阻害による阻止円が形成された。この阻止円の直径をノギスを用いて残存活性として測定し、ナイシン標準液により形成された阻止円と比較することによりナイシン相当活性とした。結果は図１に示す。
【００３３】
図１によれば、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質を含む培養上清液は８０℃及び１００℃で６０分加熱しても活性が失われないことが確認された。更に、１２０℃で６０分加熱しても６０％の活性が保持されることが確認された。
【００３４】
＜実験例３＞  抗菌活性物質のｐＨ安定性
実施例１と同様の方法で調製した寄託乳酸菌の培養上清液（ｐＨ３．９２）に４規定の水酸化ナトリウム水溶液及び４規定の塩酸水溶液を添加し、ｐＨ２〜１０に調製した。
【００３５】
ｐＨ調整後、６０℃で２４時間静置した。即ち、火入れ時の上限温度である６０℃に設定した場合に各ｐＨ条件下での抗菌活性物質の変性の有無を確認するために、２４時間の静置時間を設定した。
【００３６】
その後、ｐＨを３.９２に戻し、更に６０℃で２時間静置した。
【００３７】
残存活性をナイシン相当活性として実験例２と同様の方法で測定した。結果は図２に示す。
【００３８】
図２によれば、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質を含む培養上清液はｐＨ３〜８の間で安定であることが確認された。また、抗菌活性物質はｐＨ３〜８の間で６０℃、２４時間静置しても変性しないことも確認した。
【００３９】
＜実験例４＞  火落菌を含む乳酸菌に対する培養上清液の抗菌スペクトル実験
実験例１と同様の方法で調製した寄託乳酸菌の培養上清液の抗菌スペクトルを測定した。
【００４０】
抗菌スペクトルの測定は以下の方法に基づき行った。
【００４１】
シャーレに１％寒天を含むＭＲＳ培地を１０ｍｌ注ぎ、水平面で固化させた。
【００４２】
次に、あらかじめＭＲＳ培地で培養した乳酸菌（表１参照）を１％寒天水溶液に濁度（６６０ｎｍ）が約０．００３になるように接種し、これを先に固化させた寒天培地上に４ｍｌ重層した。
【００４３】
この寒天平板に、ステンレス製カップ（内径６ｍｍ、外形８ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を置き、この中に前記培養上清液を０.１ｍｌ添加し、３０℃、４８時間培養した。
【００４４】
培養後、カップのまわりに、生育阻害による阻止円が形成されたものを感受性菌、阻止円が形成されないものを非感受性菌とした。尚、生育阻止円の直径はノギスを用い測定した。結果は表１に示す。
【００４５】
【表１】
0004507258.tif 000002
【００４６】
上記表１によれば、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質を含む培養上清液は種々の火落菌に対して抗菌活性を示すことが確認された。
【００４７】
以上、上記実験例１〜４によれば、本実施例の寄託乳酸菌の抗菌活性物質は、酒母、モロミ、清酒などに対し、既に感染している火落菌を死滅させたり、あらたな火落菌の感染や増殖を防止して火落を生じさせない効果があるといえる。
【００４８】
また、本実施例の寄託乳酸菌の抗菌活性物質は、熱やｐＨに対する安定性が高く、ｐＨ３〜８の間で６０℃、２４時間静置しても変性しないので、清酒（ｐＨ４〜５）に添加された後に加熱（６０℃）が施される場合でも抗菌活性が失われずに長時間火落防止効果が期待できるといえる。
【００４９】
即ち、本実施例によれば、清酒の製造工程中、貯蔵中または瓶詰め後、火落菌に汚染されても火落菌の増殖が抑えられ腐敗が生じない抗腐敗酒の製造方法となる。
【００５０】
寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質は、上述したように熱やｐＨに対する安定性が高いため、本実施例の清酒は勿論、火落菌を含む乳酸菌の汚染を受け易い例えば味噌，漬物，ビール等の醸造食品にも広く応用できるといえる。尚、寄託乳酸菌が生産する抗菌活性物質は、火落菌だけではなく、例えば日和見菌であるリステリア菌に対しても効果が期待できる。
【００５１】
以下は、寄託乳酸菌の効果を確認する実験である。
【００５２】
＜実験例Ａ＞  寄託乳酸菌の培養上清液の調整
寄託乳酸菌の培養上清液を以下の方法により調製した。
【００５３】
寄託乳酸菌をＭＲＳ培地で３６時間培養し、得られた培養液中の菌体を遠心分離（１５，５００ｒｐｍ、１０分間）により除去した。
【００５４】
続いて、得られた培養上清液中に残存する菌体の殺菌や酵素の失活のため、８０℃で１５分間加熱処理後、同条件で遠心分離を行い、抗菌活性物質を含む培養上清液を得た。
【００５５】
次に、この抗菌活性物質の水麹安定性実験を行うことでこの抗菌活性物質の醪や酒等に対する腐敗防止効果の確認を行った。
【００５６】
＜実験例Ｂ＞  抗菌活性物質の水麹安定性実験
水麹培地を以下の方法で調製した。
【００５７】
まず、８.６ｍｌの１０℃あるいは２０℃に冷却した滅菌水、７７μlの乳酸、２.４ｇの乾燥麹を混合し、水麹培地とし、更に前記寄託乳酸菌の培養上清液３ｍｌを添加し、１０℃と２０℃で、夫々３０分間、１時間、２時間、２４時間反応させた。
【００５８】
夫々の時間に反応物から液相（溶液部分）を回収し、この回収した溶液を１００℃で２０分間加熱処理を行い、酵素を失活させ、氷中で冷却後、ナイシン相当活性として前記実験例２の方法で残存活性を測定した。
【００５９】
【表２】
0004507258.tif 000003
【００６０】
【表３】
0004507258.tif 000004
【００６１】
上記表２，表３及び図３によれば、１０℃、２０℃のどちらの場合においても、抗菌活性は徐々に減少した。また１時間の反応後、それぞれ１０℃の場合に約６５％、２０℃の場合に約４０％の抗菌活性が保持され、２４時間の反応後、夫々１０℃の場合に約２０％、２０℃の場合に約３６％の抗菌活性が保持されたことから、当該寄託乳酸菌から生産される抗菌活性物質は水麹培地に対して抗菌活性を失っていないことが確認された。
【００６２】
この事実は、麹に含まれる酵素によって培養上清液中の抗菌活性物質が分解されないことを示している。よって、この抗菌活性物質を含む培養上清液の添加で抗腐敗酒が得られることになる。
【００６３】
次にこの抗菌活性物質の定性データについて抗菌活性物質の酵素安定性を確認する実験を行った。
【００６４】
＜実験例Ｃ＞  抗菌活性物質の酵素安定性実験
２０ｍｇのアクチナーゼＥ，α−キモトリプシン，トリプシン，パンクレアチン，プロティナーゼＫの各酵素を、８ｍｌの０.２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７.５)にそれぞれ溶解した後、１０ｍｌにメスアップし、２ｍｇ／ｍｌの各酵素液を調製した。
【００６５】
前記実験例Ａで示した方法で調製した寄託乳酸菌の培養上清液と各酵素溶液を１：１の割合で混合し、２４時間反応させた。反応は、アクチナーゼＥ溶液を用いた場合には５５℃で行った。同様に、トリプシン溶液またはα−キモトリプシン溶液を用いた場合には２５℃、パンクレアチン溶液を用いた場合には４０℃，プロティナーゼＫ溶液を用いた場合には３７℃で行った。パパインは０.２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ６.２）に溶解し、２５℃で、ペプシンは０.３Ｍ ＨＣ１緩衝液に溶解し、３７℃で反応を行った（表４)。
【００６６】
【表４】
0004507258.tif 000005
【００６７】
反応終了後、（酵素を失活させるために）反応液を１００℃で２０分間加熱処理を行い、氷中で冷却後、反応液中の残存活性をナイシン相当活性として前記実験例２の方法で残存活性を測定した。
【００６８】
【表５】
0004507258.tif 000006
【００６９】
前記表５によれば、アクチナーゼＥ，α−キモトリプシン，トリプシン，パンクレアチン，プロティナーゼＫ等のタンパク質分解酵素によって、抗菌活性が完全に失われた。そのため、当該抗菌活性物質はタンパク質性の物質であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の抗菌活性物質の熱安定性を示すグラフ図である。
【図２】本発明の抗菌活性物質のｐＨ安定性を示すグラフ図である。
【図３】本発明の抗菌活性物質の水麹に対する安定性を示すグラフ図である。
【図１】
0004507258.tif 000007
【図２】
0004507258.tif 000008
【図３】
0004507258.tif 000009