(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱サイクラの熱ブロックの上面に形成された、同様に成形されたサンプルウェルと同一の高さの小容積ウェルの列で構成され、ウェルの壁は、２０−４０ミクロンの平均厚さを有しており、その厚さが、上から下へ減少していることを特徴とするサンプルの熱ブロック熱サイクル用の超薄マルチウェルプレート。
【請求項２】
前記プレートの前記ウェルの高さは、前記熱サイクラの熱ブロックの上面に形成された前記サンプルウェルの高さよりも大きくないことを特徴とする請求項１に記載の超薄マルチウェルプレート。
【請求項３】
前記ウェルの壁を円錐状に成形することを特徴とする請求項１に記載の超薄マルチウェルプレート。
【請求項４】
前記マルチウェルプレートの前記ウェルを陰性モールドにより熱形成することを特徴とする請求項１に記載の超薄マルチウェルプレート。
【請求項５】
前記ウェルの前記壁は、変形可能であることを特徴とする請求項１に記載の超薄マルチウェルプレート。
【請求項６】
前記マイクロウエルプレートは、剛性の支持フレームから成ることを特徴とする請求項１に記載の超薄マルチウェルプレート。
【請求項７】
前記ウェルの容積は、１６−８５μｌの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の超薄マルチウェルプレート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、従来の生体試料の熱ブロック熱サイクル用のプラスチックプレート、特にマルチウェルプレートに関するものである。さらに具体的には、小容積のサンプルへの熱伝達が改良された超薄型マルチウェルプレートに関するものである。増大されたブロック温度傾斜率（すなわち４℃／秒およびそれ以上）を有する熱ブロック熱サイクラと、サンプルをシールするための標準の加熱蓋技術を用いることによって、多数の小量サンプル（すなわち、１−２０μｌ）の迅速な温度サイクルのために、このようなプレートを使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
微生物サンプルの熱サイクルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡ増幅における中心積率である（Saiki等、サイエンス、２３９、４８７−４９１、［１９８８］）。少量サンプルの急激な熱サイクルのための種々の他の反応及び技術を開発するために多くの努力がはらわれてきた（Kopp等、サイエンス２８０、１０４６−１０４８［１９８８］；Belgrader等、J．Forensic Science ４３、３１５−３１９［１９９８］；Wittwer等、分析的生化学、１８６，３２８−３３１［１９９０］及びアメリカ特許第５，４５５，１７５号；Woolly等、分析的生化学、６８，４０８１−４０８６［１９９６］）。
【０００３】
少量サンプルの急激な熱サイクルのための商業的に入手可能なマイクロリアクタ(microreacter)や熱サイクラ(thermocycler)は、ガラス製毛細管及びRoche Molecular Biochemicals（cat No. １９０９．３３９及びcat No. 210,468）からの熱空気熱サイクラである。ガラス製毛細管、反応量を１０乃至２０ミリリットルの範囲にとどめている。熱空気熱サイクラは、３２本の毛細管を保持し、２０−３０分の間に３０−４０回のＰＣＲサイクルを行う。しかしながら、こうした高速DNA増幅技術は、種々の欠点を有している。例えば、
ａ） 個別の毛細管の取り扱いは比較的面倒である。
ｂ） 比較的大きなガラス面が標準ＰＣＲ混合物の成分を吸収する。これは、反応を不能とする可能性がある。従って、種々の担体分子、即ちタンパク質やＤＮＡを付加する必要があり、成分の濃度を再最適化しなければならない。
ｃ） 使い捨てＰＣＲ容器としての毛細管のコストが、標準の０．２ミリリットルのＰＣＲ管に比べて高い。
ｄ） このシステムを実験的なスループットが限られている。
プラスチック管やマルチウエル(multiwell)プレート内に含まれる広く使用されている従来の熱ブロック熱サイクルのサンプルの大きさや速度における基本性能の改善に関してほとんど研究されていないことは驚くべきことである。プラスチック管に含まれたサンプルの熱ブロックの温度サイクルの公知の改良の一つは、Half 等、（Biotechniques、１０ｍ、１０６−１１２、［１９９１］及びアメリカ特許第５，４７５，６１０号）に示されている。それらは、特別な耐ＰＣＲ反応性のワンピースのプラスチック製マイクロ遠心管、すなわち薄肉ＰＣＲ管を開示している。管は、円筒形状の上側壁部と、比較的薄肉で（即ち、約０．３ｍｍ）の円錐形状の下側壁部及びドーム状の底部を有している。２０マイクロリットルと非常に少量のサンプルは、管内に配置され、管は、変形可能で、気密のキャップによって閉塞され、熱ブロック中の本体内に切削形成された同形の円錐状ウェル内に配置される。加熱されたカバーは、各キャップを圧縮し、各管をカバーに設けたウェル内に緊密に押し込む。加熱されたプラテン（即ち、加熱された蓋）は管のキャップに適当な圧力を与えることによっていくつかの機能を行うもので、上昇された温度によって管内に生じる圧力の増加によるキャップの開放を防止する。さらに、熱サイクル中に水の凝集やサンプルの損失を防止するために９５℃−１００℃でブロックの上面の上に突出する管の一部を保持する。これは、管への熱伝達を改善するためにブロックのウェルへの鉱物油やグリセロールの進入の排除を可能とし、蒸発を防止するばかりではなく付加的な熱塊として作用する鉱物油がサンプルに重なることを防止する。さらに、ＰＣＲ管は、１から９６の間の何れかの数の個別の反応管によりサンプルの高いスループットの必要に答えるために用いられる９６ウェルのマイクロプレート形状の８ｘ１２のツーピースのホルダ（アメリカ特許第５，７１０，３８１号）に配置される。
【０００４】
ＤＥ４０２２７９２において、発明者は、ウェルの円筒形壁を備えたプレート及び球形の底部を開示している。プレートの個別のウェルは、高温空気のスチームによって０．２７−０．５ｍｍの範囲のポリカーボネートシートの溶融によって形成される。この技術は、０．０８−０．２ｍｍの範囲における比較的薄い壁を形成する。微生物サンプルは、ウェルに収容され。ポリカーボネートフィルム（０．１ｍｍ）によって被覆され、格別のウェルは、特別なプレスによって熱シールされる。シールする際に、プレートは熱ブロック中に配置され、ねじによって固定される。理論的には、サンプルへの熱伝達を改善するが、プレートをブロック上に配置する方法は、ウェルの円筒形で球状の幾何形状は、熱ブロックとの近接した熱接触を防止する。熱サイクル中に、大きな熱膨張のために、ねじによって固定されたプレートは、変形され、近接した熱コンタクトはもはや維持されない。従って、上記の技術を用いて、急激な反応を行うことが出来ない。
【０００５】
他の熱ブロックの熱サイクラに関する周知の改良は、国際公開公報ＷＯ９８／４３７４０に開始されている。熱サイクラは、９６のＰＣＲ管（それぞれの要領は０．２ミリリットル）又は９６のウェルＰＣＲプレートを保持することが出来る。理論的には、熱サイクラは、２０−３０分で３０のＰＣＲサイクルを行うことが出来、熱ブロックとサンプルの間が温度均衡に到るまでに数秒を要するのみである。
【０００６】
しかしながら、アメリカ特許第５，５０８，１９７号に開示されているように、熱伝達媒体の温度、即ち水は、ほぼ瞬間的に変化するとしても、標準のＰＣＲプレート中の水と１５−２０マイクロリットルのサンプルが均衡に到るには約１５秒の時間がかかる。これは、３０ＰＣＲサイクルにおいてプレート内の熱交換媒体と１５−２０マイクロリットルサンプルが均衡に到るには約２０分の時間がかかる。
比較において、４℃／秒の傾斜率で動作する上記の熱ブロックサイクラ（ＷＯ９８／４３７４０）は、３０ＰＣＲサイクル中の熱ブロックの温度遷移には１０分のみが必要となる。これは、ＰＣＲ管又はＰＣＲプレート内の少量のサンプルの急激な温度サイクルを制限する主要な要因は従来のＰＣＲ管又はプレートのそれぞれの壁を通る熱伝達の効率の低さである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、多数のサンプルの熱ブロック熱サイクルを行うためのプラスチックのマルチウェルプレートに関するものである。特に、少ないサンプルへの熱伝達が改良された超薄型マルチウェルプレートに関するものである。超薄型マルチウェルプレートは、小容積のサンプル（すなわち、約１−２０μｌ）の迅速であって油を使っていない熱ブロック温度サイクルに適しているが、従来のピペット装置の信頼性によって下限が決められる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの構成は、公知の薄肉ＰＣＲチューブ（米国特許第５，４７５，６１０号）に比較して、ウェル壁の厚さがかなり減少される（すなわち、約７．５−１５フォールド）ことに関するものである。例えば、薄い熱可塑性フィルムからプレートを熱形成することによって、これを達成することができる。このような熱可塑性フィルムは、例えば、メタロセン触媒ポリオレフィンフィルムおよび／または共重合体フィルム等のポリオレフィンフィルムである。一般に、マルチウェルプレートは、非配向ポリプロピレンフィルム、ポリプロピレン−ポリエチレン共重合体フィルム、またはメタロセン触媒ポリプロピレンフィルムから真空成形される。フィルムは、複数の離間した円錐状に成形されたウェルを有する陰性（「雌型」）モールドに形成される。ウェルは、モールドの本体部において矩形または四角配列の形状で機械加工されている。円錐状に成形されるウェルを真空成形するためのフィルムの厚さは、真空成形に使用される基準規則に従って選択される。すなわち、フィルムの厚さ＝ウェルの延伸倍率 ｘ 形成されるウェルの壁厚さである。
【０００９】
例えば、２の延伸倍率と平均壁厚さ３０ミクロンを有するウェルを真空成形することによって、フィルム厚さが６０ミクロンとなる。最適な平均壁厚さは、２０−４０ミクロンであることが分かった。ウェルの厚さは、米国特許第５，４７５，６１０号に記載された以前に改良されたＰＣＲチューブの壁厚さと比較すると、７．５−１５フォールド減少されている。熱伝達のフーリエ方程式と、固体を介する温度伝達の方程式を使用して、プレートのウェル表面の１平方ミリメータを介する熱伝達が、前記ＰＣＲチューブと比較して７．５−１５フォールド増し、壁を介する温度伝達時間は５６−２２５フォールド減少することを示すことができる。この時間の大幅な減少は、温度伝達に必要とされる時間が距離の平方根に比例するという事実によって説明することができる。多層ウェルプレートの超薄壁を介する温度伝達時間は、ミリセカンドの範囲であることは容易に計算できるが、前記ＰＣＲチューブ（米国特許第５，４７５，６１０号）の温度伝達時間は秒範囲である。これにより、薄い（２０−４０ミクロン）プラスチックフィルムは劣った熱絶縁体であるというよく知られている事実が説明される。
【００１０】
形成されたウェルの壁の厚さは、陰性のモールド内にウェルを真空成形することによってウェルの底面に向かって徐々に減少している。ウェルの壁のこの幾何学的形状により幾つかの利点が付与される。
・ウェルの壁の比較的厚い上側部分により、マルチウェルプレートの全体の付加的な剛性がもたらされる。
・熱サイクルの熱ブロックの加熱時に、ウェルの壁の厚さ勾配によりサンプルにおいて垂直な温度勾配が形成される。この垂直温度勾配により、円錐状に成形されたウェルにおいてサンプルの集中的な対流混合が生じ、サンプルを介する熱伝達が増大される。相対的に、このサンプルの対流混合は、均一な壁厚さを有する従来のＰＣＲプレート／チューブでは有効なものではない。
【００１１】
本発明のもう一つの構成は、マルチウェルプレートのウェルの高さに関するものである。円錐状に成形されたウェルの高さは、熱ブロックの本体部に機械加工された同様に成形されたサンプルウェルの高さと同じである。従って、ウェル（２）のこの幾何学的形状により、図２に示したようにプレート（１）を熱ブロック（４）の上に位置決めすることができる。（図２に）図示したように、従来のＰＣＲプレートとは対照的に、マルチウェルプレート（１）のウェル（２）の壁は、ブロック（４）の上面の上に突出しない。この位置決め形式により幾つかの利点が付与される。例えばシリコンマット（１３）によってシールされるサンプル（９）の効果的なシールを行うために、ネジ（１２）により生じる蓋（１０）（熱要素（１１））への圧力を増大させることができる。この場合に、圧力は、熱ブロック（４）の上面によって（または熱ブロックの幾何学的形状に応じて個々のウェルを包囲する上面の部分によって）支持されるマルチウェルプレート（１）のそれらの部分に実際に付与され、ＰＣＲチューブまたは従来のＰＣＲプレートの場合のようにプレートのウェルの薄い壁には付与されない。この利点により、ウェル（２）の円錐状に成形された壁をクラッキングすることなくウェルごとに従来使用されていた３０−５０ｇの圧力と比較して、加熱蓋（１０）のシール圧力を数フォールド増大させることが可能となる。
【００１２】
マルチウェルプレートは高弾性フィルム（または延伸倍率に応じたシート）から熱形成されるため、ウェルの非常に薄い、すなわち２０−４０ミクロンの壁は、非常に可撓性である。ウェルの壁は、その可撓性および弾性により、ストレスクラッキングに対して非常に抵抗力がある。熱ブロック上に配置されたプレートのウェルは室温でしっかりシールされるため、ウェルの空気圧力が高温で増大する。増大された空気圧力によりウェルの壁の変形が生じ、ウェルの壁を熱ブロックの本体に機械加工された個々のサンプルウェルの壁表面としっかり熱接触させる。（比較的厚く、剛性のウェルの壁を有する）標準のＰＣＲプレートは、近接した熱的接触を保証するために、ウェルの円錐状に成形される壁が熱ブロックの本体部に機械加工されるウェルの形状と完全に一致していなくてはならない必要がある（例えば、米国特許第５，４７５，６１０号を参照のこと）。ウェルの壁の可撓性および弾性を有するため、この必要条件は本発明による超薄マルチウェルプレートにとって重大なものではない。この利点を使用して、プレートのウェルの壁および熱ブロックのウェルの両方の特定の形状を異なるように設計することができる。これらの異なるように設計されるウェルは、プレートの熱ブロック内への位置決め後により近接した熱的接触を助長することができる。
【００１３】
本発明のもう一つの構成は、マルチウェルプレートのフレームに関するものである。プレートは、非常に薄いフィルム（ウェルの,延伸比に応じて変化する）ので、例えば、標準形式のプレート、即ち９６−ウェルＰＣＲ（８，５ｘ１２．５ｃｍ）プレートの可撓性は取扱がもはや容易ではない程度となる。従って、プレートの幾何学形状に応じて、例えば、工業的な標準形式、即ち９６−、１９２−３８４−ウェルのＰＣＲプレートに対しては支持フレームが必要となる。フレームは、例えば、小さいプレート、プレートの端縁又はプレートの個別のウェルまたはウェル群を支持することが出来る。ロボットによる取扱のために、例えば、フレームは、超薄マルチウェルプレートのウェル配列に一致するフレームの上面の孔配列を含む標準の円形サポートを持つマイクロプレートの形式で射出成形することが出来る。プレートは、例えば、ヒートシールによってフレームに取り付けられる。しかしながら、小さな形式のプレートについて、フレームは、特別な設計のモールドを用いて、ワンピースとして形成される。
【００１４】
ポリプロピレン基材のプラスチックは、ＰＣＲ耐性のプラスチックであり、従ってＰＣＲ管及び／またはマルチウェルプレートの射出成形に広く用いられる。さらに、それらは、応力クラッキングに対して耐性を持ち、他のプラスチック（例えば、ポリカーボネート）に比べて水蒸気の吸収性が低くなっている。こうしたプレートは、ロボットによってサポートされる大規模な用途のための工業的な標準形式、即ち９６−、１９２−３８４−ウェルのＰＣＲプレート及び小さなフットプリントの熱サイクルに適合する小さなフットプリント形式、即ち「パーソナル熱サイクル」の双方の熱成形が可能である。
以下の実施例は、発明を示すもので、限定として解釈されるべきものではない。
【００１５】
【発明の実施の形態】
図１には、本発明による３６のウェルを有する超薄マルチウェルプレートが示されている。プレートは、「ブドウ搾りの桶」型の加熱された蓋（図２）が設けられる小さなフットプリントペルティエ駆動（peltier-driven）熱ブロック熱サイクラを用いて、０．５−４μｌの範囲のサンプルの迅速な温度サイクルのために設計されている。ウェルの容積は１６μｌであり、ウェル間の距離は４．５ｍｍであって、これは高密度サンプルの３８４ウェルＰＣＲプレート用の工業規格のものである。ウェルの開口部の直径は３．８ｍｍであり、ウェルの高さは３ｍｍである。ウェルの壁の平均厚さは、３０μｍである。フレーム（３）は、厚さ０．５ｍｍのポリプロピレンシートから切り取られ、プレート（１）にヒートシールされている。プレート（１）の面積は、３０ｘ３０ｍｍである。図１に示したように、複数のウェル（２）を含むプレート（１）の取り扱いは、プレートにヒートシールされる厚さ０．５−１ｍｍの剛性のプラスチックフレーム（３）によって容易となっている。図２に示したように、フレーム（３）の内側輪郭（５）は、熱サイクラ（７は熱電ポンプであり、８は熱風ヒートシンクである）の加熱ブロック（４）の外側輪郭（６）と接合するため、フレーム（３）は熱サイクル中にブロック（４）と直接熱的接触はしない。
【００１６】
本発明による超薄マルチウェルプレート（図１）は、ヒト乳頭腫ウイルスＤＮＡの４５５の塩基対の長いセグメントの増幅のために実験的にテストされた。サンプル量は、３μｌであった。種々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために、熱サイクラの平均傾斜率は毎秒４℃から８℃に変えられた。従来のピペット装置を用いて、サンプル（すなわち、いかなる担体分子も有さない標準のＰＣＲ混合物）をプレートのウェル内に移した。プレートは、標準規格のシールフィルム（マイクロシールＡ；アメリカ合衆国のＭＪ−リサーチ（MJ-Research）によってカバーされ、熱サイクラの熱ブロックに移され、図２に示したような加熱された蓋によってしっかりシールされた。シール時に、熱サイクラの傾斜率により１５−２５秒で、多数の３０ＰＣＲサイクルが達成された。ＰＣＲ生成物は、従来のアガロース電気泳動法によって分析された。４５５の塩基対の長いＤＮＡセグメントを高特定性で（上記の）望ましい傾斜率で増幅した。
【００１７】
容積３５μｌのウェルを有する本発明によるプレートは、容積２０μｌのサンプルの温度サイクル用にうまくテストされた。それによって、毎秒６℃の傾斜率で、２０−３０分で３０ＰＣＲサイクルが達成された。意外にも、壁の平均厚さが２０ミクロンであり、ウェルの容積が３５μｌであったにもかかわらず、ＰＣＲ効率を低減することなく、わずか０．５μｌの容積のサンプルを容易に増幅することができた。
【００１８】
この結果、本発明による超薄マルチウェルプレートにより、従来のピペットにより多数のサンプルの簡単かつ迅速な装填が可能となり、従来のシールフィルムを用いることによって全てのサンプルを迅速にシールすることが可能となり、適当な熱ブロック熱サイクラ（すなわち、毎秒４℃から８℃の範囲の傾斜率）を用いることによって、迅速なサイクルによる改良された特定性（ビィトワ−等による「分析的生化学」（Wittwer et al., Analytical Biochem.）１８６，３２８−３３１（１９９０）)を有する迅速なＤＮＡ増幅（３０サイクルで１５−３０秒）が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明によるマルチウェルプレートの実施例を示す。
【図２】  熱サイクラのブロックにおけるプレートの位置決めを示す。
【図１】
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【図２】
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