(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つの光路の光路長の差によって焦点位置の異なる画像を作り出し、この二つの光路により得られる二つの画像を受光面に投影する光学装置と、前記受光面を有し前記光学装置により投影された画像に基づき、二つの異なる焦点面の画像情報を取得する画像取得装置とを具備する顕微鏡装置であって、
前記光学装置は、
一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、
光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、
該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、
結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、
分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、
前記画像取得装置は、
観察標本内の試料の焦点の異なる二画像を取得する手段、
前記試料の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布の重心位置を計算することで、該試料の水平方向の位置を取得する手段、
上記重心位置における点像分布関数の標準偏差よりも狭い範囲における蛍光強度を取得する手段、
上記二画像による蛍光強度の差から、該試料の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における試料の三次元位置を取得する手段
を具備することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
二つの光路の光路長の差によって焦点位置の異なる画像を作り出し、この二つの光路により得られる二つの画像を受光面に投影する光学装置と、前記受光面を有し前記光学装置により投影された画像に基づき、二つの異なる焦点面の画像情報を取得する画像取得装置とを具備する顕微鏡装置であって、
前記光学装置は、
一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、
光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、
該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、
結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、
分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、
前記画像取得装置は、
観察標本内の粒子の焦点の異なる二画像を取得する手段、
回折限界より小さな粒子の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布が近似的にガウス分布に従うことを利用して、該粒子の散乱像、蛍光像を二次元ガウス関数で近似し、該粒子の水平方向の位置を取得する手段、
前記散乱像、あるいは、蛍光像の中心位置の蛍光強度を取得する手段、
上記二画像による蛍光強度の差から、該粒子の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における粒子の三次元位置を取得する手段
を具備することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項３】
試料が載置される試料ステージと、
試料面に対して操作されるガラスニードル或いはカンチレバーと、
ガラスニードル或いはカンチレバーを操作するための三軸マニピュレータと、
試料を照射するレーザー光を射出するレーザーとを、更に備え、
試料に照射されたレーザー光を、光学装置における一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは有限系対物レンズを介して前記光学装置へ導くように構成されていることを特徴とする請求項１または請求項２項に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡により取得された画像情報と簡易な光学系を使用して、粒子の三次元的位置取得する顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質機能解析の研究では、エバネッセント蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡を用いて、観察の対象となる蛋白質に蛍光粒子を負荷し、蛍光粒子から発せられる信号から、蛍光粒子の位置、すなわち、蛋白質の位置を継時的に検出することで、前記蛋白質の挙動および状態を解析する。この解析方法に関しては、特許文献１に開示されている。上記の方法では、蛋白質の挙動を妨害しないように、蛍光粒子は出来る限り小さな方が良い。蛋白質を蛍光標識するための物質として、蛍光色素分子を用いるのが一般的である。特に蛍光色素分子として蛍光蛋白質を用いる場合、遺伝子工学的に標的蛋白質に融合させることができる。
【０００３】
光学顕微鏡の結像面にビデオレートカメラを設置することで、試料を実時間で観察できる。共焦点顕微鏡によって、光学切片の薄い試料の断面像を取得できるので、光軸方向に対物レンズを走査し、取得した光学切片を光軸方向に並べることで、三次元画像を取得することができる。共焦点顕微鏡を用いて、ビデオレートカメラの垂直同期信号と同期させて、ピエゾアクチュエータにより対物レンズの焦点位置を制御して、三次元画像を得る技術は、特許文献２に開示されている。この技術は、前記ビデオレートカメラの撮影時間の間は対物レンズを固定させ、それ以外の時間に対物レンズを目的の位置に移動させることで、必要とする焦点位置での共焦点像をビデオフレームに合わせて取得できる。図２に示すように階段状に対物レンズを移動させ、得た共焦点像をＺ軸方向に重ねれば、三次元画像が構築される。しかしながら、上記の方法では、広視野の観測が可能であると言う利点はあるが、対物レンズを光軸方向に走査する必要がある為、時間分解能は低い。また、レーザー走査型の共焦点顕微鏡、あるいは、２光子励起顕微鏡などは、集光したレーザー光を水平面に走査する必要がある為、さらに時間分解能は低下する。
【０００４】
代わりに、単粒子しか観測できないが、高速に三次元位置を取得できる技術が、非特許文献１、２に挙げられる。非特許文献１では、粒子の水平面上の位置は、四分割フォトダイオードにより取得し、光軸方向の位置は、像の散乱強度により取得する。非特許文献２は、２光子励起法を用いて、集光したレーザー光を水平面に走査し、同時に、特許文献２と同様に対物レンズを走査するが、走査範囲を狭することで、高速化を図っている。双方どちらの方法も、粒子ひとつのみの三次元位置計測が可能であり、複数の計測は不可能である。また、これらの方法は、粒子の散乱光の強度を指標に光軸方向の位置を計測する。従って、粒子の大きさが精度に大きく影響を与える。蛋白質機能解析の研究に用いる場合、１ミクロンを超える粒子を用いることはできない。蛍光粒子、あるいは、蛍光色素を用いて、散乱光の代わりに蛍光を用いる方法も考えられるが、径の小さい蛍光粒子や蛍光色素は、フォトンを発する過程が確率的であるため、その蛍光強度が激しく揺らぐ。その為、光軸方向の位置計測の精度は著しく低下する。
【０００５】
また、上記方法は、共焦点光学系、２光子励起光学系、対物レンズを走査する為のアクチュエータなど、多くの高額な部品を具備するため、装置としては非常に高価になってしまう。これを避ける技術として、特許文献３が挙げられる。特許文献３では、二色のレーザーを有し、光軸方向に沿って二色の諧調を作り、粒子の二色の散乱光の出力差から、粒子の光軸方向の位置を計測する。この方法は、安価で、かつ、広視野を観測できる。さらに、走査を行わない為、時間分解能は、映し出すカメラ等の画像取得装置のフレームレートのみで決定する。しかし、蛍光粒子、あるいは、蛍光色素を用いた場合、その蛍光強度の揺らぎが、光軸方向の位置計測の精度を低くさせる。
【０００６】
蛋白質機能解析の研究において、蛋白質-蛋白質相互作用を計測するために、原子間力顕微鏡が用いられる。原子間力顕微鏡は、光軸方向の微弱な力を計測することができるからである。しかしながら、原子間力顕微鏡は、光軸方向の力しか計測できない。そこで、原子間力顕微鏡のカンチレバーのひねりを計測することで、水平方向の力も計測できる技術がある。しかし、原子間力顕微鏡では、カンチレバーの中心にレーザーを照射する等の複雑かつ高精度の光学系が必要であるため、装置は高額である。
原子間力顕微鏡において、カンチレバーの代わりに細いガラスニードルを用いる技術が、非特許文献３に挙げられる。一般的な原子間力顕微鏡は、カンチレバーの光軸方向への撓りを検出する技術であるが、非特許文献３の技術は、カンチレバーの様な板状ではなく、円筒状のガラスニードルを用いて、光軸方向ではなく、光軸に対して垂直方向への撓りを検出する。この技術は、ガラスニードルのばね定数がカンチレバーより小さいため、非常に感度が良い。しかし、光軸方向の撓りは捉えることはできない。ガラスニードルによる原子間力顕微鏡にて、光軸方向の撓りを捉える場合、ガラスニードルの先端に金属片を反射板として付加する。これにより、従来の原子間力顕微鏡と同様の光学系を用いて、光軸に対して垂直方向への撓りと光軸方向の撓りを同時に計測する事が可能となる。
しかし、ガラスニードルの先端に金属片を光軸に対し垂直に付加する事は、技術的に困難である。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２９４６３１号公報
【特許文献２】特開２００４−１８４６９９号公報
【特許文献３】特開２００２−１３１０１５号公報
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒｓ  ＩＭ，ｖａｎ  Ｋｏｏｙｋ  Ｙ，ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ  ＳＪ，ｄｅ  Ｇｒｏｏｔｈ  ＢＧ，Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ，Ｇｒｅｖｅ  Ｊ；３Ｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｐ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，（１９９９）Ｊｕｌ  １；３６（３）：１８９−９４．
【非特許文献２】Ｌｅｖｉ  Ｖ，Ｒｕａｎ  Ｑ，Ｇｒａｔｔｏｎ  Ｅ；３−Ｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，（２００５）Ａｐｒ；８８（４）：２９１９−２８，Ｅｐｕｂ，（２００５）Ｊａｎ  １４．
【非特許文献３】Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｋ，Ｔｏｋｕｎａｇａ  Ｍ，Ｉｗａｎｅ  ＡＨ，Ｙａｎａｇｉｄａ  Ｔ；Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｄ  ｍｏｖｅｓ  ａｌｏｎｇ  ａｎ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｒ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ５．３ｎａｎｏｍｅｔｒｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９９）Ｊａｎ  １４；３９７（６７１５）：１２９−３１４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、上記問題に鑑みて、本発明では、光学顕微鏡により取得された画像情報を使用して、回折限界より小さな蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の三次元的な重心位置を取得する際に、共焦点光学系、２光子励起光学系等を使わずに、安価であり、広視野を保ちながら、かつ、時間分解能をカメラ等の画像取得装置のフレームレート以下に下げることのない、及び、簡易に三次元的に力を計測できる顕微鏡装置の構築を課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための手段として、本発明は以下の特徴を有している。
本発明に係る顕微鏡装置は、二つの光路の光路長の差によって焦点位置の異なる画像を作り出し、この二つの光路により得られる二つの画像を受光面に投影する光学装置と、前記受光面を有し前記光学装置により投影された画像に基づき、二つの異なる焦点面の画像情報を取得する画像取得装置とを具備する顕微鏡装置であって、前記光学装置は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、前記画像取得装置は、観察標本内の試料の焦点の異なる二画像を取得する手段、前記試料の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布の重心位置を計算することで、該試料の水平方向の位置を取得する手段、上記重心位置における点像分布関数の標準偏差よりも狭い範囲における蛍光強度を取得する手段、上記二画像による蛍光強度の差から、該試料の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における試料の三次元位置を取得する手段を具備することを特徴とする。
本発明に係る顕微鏡装置は、二つの光路の光路長の差によって焦点位置の異なる画像を作り出し、この二つの光路により得られる二つの画像を受光面に投影する光学装置と、前記受光面を有し前記光学装置により投影された画像に基づき、二つの異なる焦点面の画像情報を取得する画像取得装置とを具備する顕微鏡装置であって、前記光学装置は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズと、光学顕微鏡の結像面に配置されたスリットと、該結像面の実像を同倍あるいは数倍に伝達するためのリレーレンズと、結像側の光路を二つに分けるためのハーフミラーあるいはダイクロックミラーと、分けられた二つの光路を一つにまとめるミラーとを具備し、前記画像取得装置は、観察標本内の粒子の焦点の異なる二画像を取得する手段、回折限界より小さな粒子の散乱像、あるいは、蛍光像の強度分布が近似的にガウス分布に従うことを利用して、該粒子の散乱像、蛍光像を二次元ガウス関数で近似し、該粒子の水平方向の位置を取得する手段、前記散乱像、あるいは、蛍光像の中心位置の蛍光強度を取得する手段、上記二画像による蛍光強度の差から、該粒子の光軸方向における位置を取得し、観察標本内における粒子の三次元位置を取得する手段を具備することを特徴とする。
本発明に係る顕微鏡装置は、試料が載置される試料ステージと、試料面に対して操作されるガラスニードル或いはカンチレバーと、ガラスニードル或いはカンチレバーを操作するための三軸マニピュレータと、試料を照射するレーザー光を射出するレーザーとを、更に備え、試料に照射されたレーザー光を、光学装置における一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは有限系対物レンズを介して前記光学装置へ導くように構成されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
上記課題を解決するための手段により、本発明は、光学顕微鏡により取得された画像情報を使用して、複数の回折限界より小さな蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の三次元的な重心位置を取得できる原子間力顕微鏡として機能できる。また、光軸方向のみならず光軸に直交する方向の力も計測できる原子間力顕微鏡として機能する顕微鏡装置を構築できる。
また、本発明は、特に蛋白質機能解析の研究で役立ち、ｎｍ（ナノメートル）、ｍｓ（ミリ秒）の精度で蛋白質の挙動および状態を三次元的に観測することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。ただし、これらは一実施形態にすぎず、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
図１は、本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す概略図である。図示するように、顕微鏡装置は、光学装置として、スリット１０１、リレーレンズ１０２、ハーフミラー１０３、ミラー１０４を備え、これ以外に画像取得装置１０５を備える。スリット１０１は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズからなる光学系の結像面に配置する。リレーレンズ１０２によって、スリット１０１により視野が絞られた像を画像取得装置１０５まで伝達する。リレーレンズ１０２によって、顕微鏡像の倍率を変化させることができる。ハーフミラー１０３は、リレーレンズの近傍に配置し、光路を光路ａ、光路ｂの二つに分割する。ハーフミラーの代わりにダイクロックミラーを用いてもよい。蛍光色素等が発する蛍光波長は広がりを持っているので、ダイクロックミラーによって、光路を分割することができる。レーザー照射による散乱像を観測する場合は、二色のレーザー光による散乱像を取得すればよい。ハロゲン光等の白色光を用いても良い。光路ｂは、光路ａと直交するが、ミラー１０４によって曲げられ、画像取得装置１０５上に結像する。ここで、ハーフミラー１０３と画像取得装置１０５の受光面までの距離をＬ、ハーフミラー１０３とミラー１０４までの距離をＤとすると、行路ａと光路ｂの光路長には、｛ｓｑｒｔ（Ｌ２＋Ｄ２）＋ｄ｝−Ｌだけの差が生じる。すなわち、行路ａと光路ｂのそれぞれから、焦点面の異なる顕微鏡像を得ることができる。光路ｂによる像は、光路長が光路ａに比べて長い為、光路aによる像より拡大率が若干大きくなる。光路ｂは、画像取得装置１０５に対し、ａｔａｎ（Ｄ／Ｌ）の角度で入射することになるが、Ｌが十分にＤよりも大きければ無視できる。本実施例では、Ｌ＝２６０ｍｍ、Ｄ＝４０ｍｍであり、入射角は８．７度である。
【００１２】
上記のような光路ｂの画像取得装置１０５に対する入射の傾きを除去する為に、図２に示す方法がある。図２に示す顕微鏡装置は、スリット２０１、リレーレンズ２０２、ダイクロックミラー２０３、２０４、ミラー２０５、画像取得装置２０６、及び、ガラスキューブ２０７または凹レンズ２０８からなる。ダイクロックミラー２０３と２０４は、同じ波長特性を持つ。図１に示す装置と同様に、スリット２０１は、一対の無限系対物レンズと結像レンズ、あるいは、有限系対物レンズからなる光学系の結像面に配置し、リレーレンズ２０２によって、スリット２０１により視野が絞られた像を画像取得装置２０５まで伝達する。リレーレンズ２０２の近傍に配置されたダイクロックミラー２０３が、光路を光路ｃ、光路ｄ二つに分ける。二つのミラー２０５、及び、ダイクロックミラー２０４によって、二つの光路が一つにまとめられる。上記により、二つの光路は、画像取得装置２０６に対し垂直に入射される。ここで、光路ｃ、光路ｄの長さには差がない。焦点位置に差を設けるため、光路ｄにのみ、ガラスキューブ２０７を配置する。ガラスは、空気よりも屈折率が高いため、光路ｄは、ガラスを通り屈折され画像取得装置２０６に入射される。これは、光路長を長くした事と等価である。ガラスキューブ２０７の代わりに凸レンズを挿入しても同様の効果が得られる。光路ｄの光路長を短くしたい場合は、ガラスキューブ２０７の代わりに凹レンズ２０８を挿入すれば良い。
【００１３】
図１に示す顕微鏡装置を用いて取得された画像を図３に示す。上半分が光路ａによる、下半分が光路ｂによる画像である。図１、および、図２に示す顕微鏡装置を用いれば、図３に示すように、焦点の異なる二つの画像を受光面で一枚の画像として取得できる。
【００１４】
図４に、６００ｎｍ毎に焦点の位置をずらした時の蛍光粒子の蛍光像を示す。観察試料として、半導体ナノクリスタル蛍光粒子（Ｅｖｉｄｅｎｔ社）を用いた。波長５３２ｎｍのレーザーで励起し、６００ｎｍ以上の反射光を蛍光として取得した。上記半導体ナノクリスタルは、発光部の直径が約５ｎｍであり、回折限界よりも十分小さいので、得られる蛍光像の蛍光強度は、近似的にガウス分布に従う。図４上部の５つの図は、光路ａにより作られた６００ｎｍ毎の上記半導体ナノクリスタルの蛍光像である。下部の５つの図は、同じ半導体ナノクリスタルの像であるが、光路ｂにより作られた蛍光像である。焦点が適合した位置から、観察試料の載る顕微鏡ステージを光軸（Ｚ軸）方向に移動させて行くと、像がぼけ、少しずつ暗くなっていく。光路ｂにより作られた蛍光像は、光路ａで焦点が合っている時、像がぼけて暗いが、顕微鏡ステージを移動させて行くにつれ、像が鮮明になり明るくなる。
【００１５】
非特許文献１、２の方法では、上記の焦点移動に伴う、粒子像の蛍光強度から、粒子のＺ軸上の位置を算出する。本実施例では、回折限界より小さな蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の散乱像、もしくは、蛍光像は、近似的に二次元ガウス分布に従うことを利用して、粒子の蛍光像を［数１］にて近似する。
【数１】
0004572162.tif 000002
ここで、（ｘ０，ｙ０）は、光軸に直交したｘ、ｙ軸からなる平面座標系における蛍光粒子の重心位置、σｘｙは標準偏差、Ｉは蛍光粒子の重心位置における粒子が発する蛍光強度、Ｃは背景光を表す。粒子の像全体の蛍光強度よりも、粒子の重心位置（ｘ０，ｙ０）における狭範囲の蛍光強度の方が、Ｚ軸上の位置変化に対し強度変化が顕著である。非特許文献１では、蛍光強度を取得するセンサの受光面の大きさを点像分布関数の標準偏差程度とし、非特許文献２では、二光子励起法による共焦点効果を利用している。本実施例では、粒子の像全体の蛍光強度ではなく、［数１］で近似計算を行った時のパラメータＩを蛍光強度とした。
【００１６】
図５（ａ）に、８０ｎｍ毎に７５００ｎｍ／ｓの速度で顕微鏡ステージを階段状にずらした時の光路ａ、及び、光路ｂにおける蛍光粒子の蛍光像を［数１］で近似した時のパラメータＩを示す。灰色の実線が光路ａ、黒色の実線が光路ｂを示す。それぞれの光路で、焦点が適合した時に、パラメータＩは最も大きくなる。顕微鏡ステージを焦点方向に移動させ、その時の顕微鏡ステージの位置と、粒子の蛍光強度を記録しておくことにより、図５（ｂ）に示すような、光路ｂの粒子におけるパラメータＩと、Ｚ軸上の位置の相関のグラフを作る。図５（ｂ）の相関表を元に、図５（ａ）の０から２５００ｍｓの間の蛍光強度をＺ軸上の位置に変換したグラフを図５（ｃ）に示す。この方法は、蛍光強度の揺らぎ（分散）が、そのままＺ軸上の位置計算の精度となる。従って、蛍光強度の低さ（画像のＳ／Ｎが低い）、あるいは、蛍光強度の明滅、照射むら、レーザーの出力揺らぎなどが、位置精度を低下させる。図５（ｃ）の例では、位置精度は、Ｚ軸上の粒子の位置が２５０ｎｍから１２５０ｎｍで、１５ｎｍ程度であった。
【００１７】
本発明では、上記の蛍光強度の揺らぎによる、位置精度の低下を除去する為に、二つの焦点位置の異なる画像を同時に取得する。光路ａにおける粒子の蛍光像を［数１］で近似計算を行った時のパラメータＩをＩＡとすると、ＩＡは、［数２］に従う。
【数２】
0004572162.tif 000003
ここで、Ｐは焦点が適合した時の粒子の蛍光強度、ｚＡは光路ａの焦点位置、σｚは焦点深度の標準誤差を表す。同様に、光路ｂにおけるパラメータＩをＩＢとすると、ＩＢは、［数３］に従う。
【００１８】
【数３】
0004572162.tif 000004
ｚＢは、光路ｂの焦点位置であり、その他のパラメータは、［数２］と同じである。ＩＡ、ＩＢの差分は［数４］、加算は［数５］のようになる。
【００１９】
【数４】
0004572162.tif 000005
【００２０】
【数５】
0004572162.tif 000006
【００２１】
従って、ＩＡ、ＩＢの差分を加算で割ることで、［数６］に示すように蛍光強度の項Ｐが打ち消される。
【数６】
0004572162.tif 000007
【００２２】
図６に、図５（ａ）の１０００ｍｓから３０００ｍｓの間における、（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）を示す。図５（ｂ）と同様にして、（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）とＺ位置の相関表を作ることで、ＩＡ、ＩＢから、Ｚ位置を計算することができる。図６（ｂ）に上記相関表を、図６（ｃ）に（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）から得られる焦点位置のグラフを示す。８０ｎｍの階段状の変位が明瞭に確認できる。この時の分解能は、位置精度は、Ｚ軸上の粒子の位置が７５０ｎｍから１７５０ｎｍで、７ｎｍ程度であった。この様に、異なる焦点面における２枚の画像を用いて、粒子の蛍光揺らぎの効果を除去することにより、従来の方法に比べ分解能が向上する。本発明は、粒子の散乱像、あるいは、蛍光像を［数１］で近似した時に、水平方向の座標は取得できているので、粒子の三次元位置が取得できることになる。
【００２３】
上記の方法を数値計算的に簡単にすることもできる。［数７］を用いて粒子の水平方向の座標を、蛍光強度を重みとした重心位置として計算する。
【数７】
0004572162.tif 000008
ただし、Ｐｘｙは、座標（ｘ，ｙ）における蛍光強度、Ｘ０、Ｙ０は粒子の重心である。座標（Ｘ０，Ｙ０）における蛍光強度を取得し、上記方法のＩＡ、ＩＢとすれば良い。しかし、蛍光強度を取得する範囲の広さによって、Ｚ軸上の位置変化に対する感度が異なる。
【００２４】
図７に蛍光強度を取得する範囲の広さを変えた時のＺ位置計算の精度を示す。横軸に、蛍光強度を取得する範囲の広さを点像分布関数の標準偏差に対する倍率で示し、縦軸に上記方法にて、Ｚ位置を計測した時の位置精度を示す。１２回試行を繰り返し、その平均値をプロットした。図７によれば、蛍光強度を取得する範囲の広さが点像分布関数の標準偏差の二倍を越えると、急激に位置精度が低下する。横軸のゼロは、上述したガウス関数で近似した場合を示した。蛍光強度を取得する範囲の広さを点像分布関数の標準偏差以下であれば、上述したガウス関数で近似した方法と分解能に大きな差はない。この方法は、計算が簡単であると共に、散乱像あるいは蛍光像が、ガウス分布に従う必要がない。従って、回折限界よりも大きな粒子の三次元位置も計測することができる。また、観察対象が、粒子のような球形でなくても、その重心位置を三次元的に取得することができる。
【００２５】
観察試料として、半導体ナノクリスタルを用いた例で説明したが、蛍光ビーズの蛍光像や、微小ビーズの暗視野像など、コントラストの良い像を用いれば、本手法の位置分解能は、１ｎｍ以下となる。また、本手法は、エバネッセント照明、共焦点、射光照明、暗視野照明、二光子励起照明等、様々な照明法によって作られる、散乱像、および、蛍光像で利用可能である。
【００２６】
次に、本手法を用いた原子間力顕微鏡について説明する。図８に本実施形態に係る原子間力顕微鏡装置として機能する顕微鏡装置の構成の一例を示す。図１に示す顕微鏡装置に加え、無限系対物レンズ８０１、結像レンズ８０２、試料ステージ８０３、ガラスニードル８０４、三軸マニピュレータ８０５、照射用レーザー８０６、コンデンサレンズ８０７から成る。照射用レーザーは、コンデンサレンズ８０７を通り、試料を照射する。暗視野照明や射光照明を用いる場合、コンデンサレンズ８０７の開口数は、対物レンズ８０１より大きくする。対物レンズ８０１と結像レンズ８０２により、ガラスニードル８０４の顕微鏡像が画像取得装置１０５に映し出される。三軸マニピュレータ８０５は、ガラスニードル８０４を三次元的に動かせる。ガラスニードル８０４先端の画像を画像取得装置１０５に映し出し、その像の重心の三次元的位置を上述した方法により取得することで、光軸に対して垂直方向への撓りと光軸方向の撓りを同時に計測できる。また、さらに、コンデンサレンズ８０７の代わりに無限系対物レンズ、ダイクロックミラー８０８、結像レンズ８０９、画像取得装置８１０を設けることによって、ガラスニードルの三次元変位のみならず、蛍光像も同時に取得する事ができる。無限系対物レンズ８０１、結像レンズ８０２の代わりに、１つの有限系対物レンズを用いても良い。無限系対物レンズ８０７、結像レンズ８０９も同様に、１つの有限系対物レンズを用いても良い。ガラスニードル８０４の代わりにカンチレバーを用いることもできる。本発明は、従来の原子間力顕微鏡とは異なり、簡便な光学系である為、照射レーザー、ピンホールの微調整等を行う必要がない。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明によって開発された焦点の異なる２枚の画像をひとつの画像取得装置で取得するように用いられる光学装置と、蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の三次元重心位置計算方法を実行する画像取得装置及び、ガラスニードルを用いた顕微鏡装置であり、微小空間像を移動する粒子を三次元的に追跡することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の概略図である。
【図２】本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の概略図である。
【図３】本発明の実施形態に係る蛍光粒子の蛍光像である。
【図４】本発明の実施形態に係る、試料標本を光軸方向に移動させた時の蛍光粒子の蛍光像で  ある。
【図５】（ａ）は、本発明の実施形態に係る、試料標本を光軸方向に移動させた時の蛍光粒子の蛍光強度のグラフである。（ｂ）は、本発明の実施形態に係る、試料標本を光軸方向に移動させた時の蛍光粒子の蛍光強度と試料標本を光軸方向の位置のグラフである。（ｃ）は、本発明の実施形態に係る、試料標本を光軸方向に移動させた時の光軸方向の位置のグラフである。
【図６】（ａ）は、本発明の実施形態に係る、試料標本を光軸方向に移動させた時の二つの異なる焦点面における蛍光粒子の蛍光強度の差分のグラフである。（ｂ）は、本発明の実施形態に係る、試料標本を光軸方向に移動させた時の二つの異なる焦点面における蛍光粒子の蛍光強度の差分と試料標本を光軸方向の位置のグラフである。（ｃ）は、本発明の実施形態に係る手法を用いた時の、試料標本を光軸方向に移動させた時の光軸方向の位置のグラフである。
【図７】本発明の実施形態に係る手法にて、粒子の蛍光強度を取得する範囲と位置精度の相関を示したグラフである。
【図８】本発明の実施形態に係る、原子間力顕微鏡として機能する顕微鏡装置の概略図である。
【符号の説明】
【００２９】
１０１  スリット
１０２  結像レンズ
１０３  ハーフミラー
１０４  ミラー
１０５  画像取得装置
２０１  スリット
２０２  結像レンズ
２０３  ダイクロックミラー
２０４  ダイクロックミラー
２０５  ミラー
２０６  画像取得装置
８０１  無限系対物レンズ
８０２  結像レンズ
８０３  標本試料
８０４  ガラスニードル
８０５  三軸マニピュレータ
８０６  レーザー
８０７  コンデンサレンズ、もしくは、対物レンズ
８０８  ミラー、もしくは、ダイクロックミラー
８０９  結像レンズ
８１０  画像取得装置
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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