(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の１つの真核細胞表面での発現を誘導するものである、悪性疾患の遺伝子治療に使用するための組換え核酸ベクター。
（ａ）切り詰められた細胞質の尾部を有するキメラテナガザル白血病ウイルスエンベロープポリペプチド（ここにおいて、前記悪性疾患の細胞がキメラテナガザル白血病ウイルスエンベロープ受容体を発現する）、
（ｂ）麻疹ウイルスＨ糖タンパク質および麻疹ウイルスＦ糖タンパク質（ここにおいて、前記悪性疾患の細胞がＣＤ４６を発現する）、または、
（ｃ）麻疹ウイルスＦ糖タンパク質およびキメラ麻疹ウイルスＨ糖タンパク質（ここにおいて、キメラ麻疹ウイルスＨ糖タンパク質は麻疹ウイルスＨ糖タンパク質およびリガンドを含み、前記悪性疾患の細胞が前記リガンドの受容体を発現する）。
【請求項２】
前記リガンドがＥＧＦまたはＩＧＦ配列であり、前記受容体がそれぞれＥＧＦ受容体またはＩＧＦ受容体である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
請求項１または２に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項４】
単離されたヒト宿主細胞である、請求項３に記載の単離された宿主細胞。
【請求項５】
腫瘍性細胞、移動性細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および他の造血細胞からなる群より選択される、請求項３または４に記載の単離された宿主細胞。
【請求項６】
ヒトの患者の悪性疾患を治療するための医薬の調製における、請求項１または２に記載の組換え核酸ベクターの使用、または、請求項３〜５のいずれかに記載の複数の単離された宿主細胞の使用。
【請求項７】
医薬として許容される担体との混合物において、請求項１または２に記載のベクターまたは請求項３〜５のいずれか１項に記載の複数の単離された宿主細胞を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本願は、１９９７年４月３０日に出願された米国仮特許出願連続番号第６０／０４５，１６４号の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、望ましくない細胞を選択的に排除するための、シンシチウム誘導性ウイルス膜糖タンパク質をコードする遺伝子の治療への使用に関する。
発明の背景
細胞と細胞との融合を媒介する、ウイルス膜糖タンパク質
エンベロープウイルスは、哺乳類の細胞表面に付着し、その後に膜融合を引起してウイルスの細胞内への侵入を可能にする、膜スパイク糖タンパク質を有する。あるウイルスにおいては、付着および融合の誘発が単一のウイルス膜糖タンパク質によって媒介される一方、あるウイルスにおいては、これらの機能は２またはそれ以上の別個の糖タンパク質によってもたらされる。時には（たとえばミクソウイルス、トガウイルス、ラブドウイルスでは）、融合を誘発する機構は、酸性のｐＨにおいて、ウイルスがエンドサイトーシスによって標的細胞内に侵入した後にのみ活性化される。
他のウイルス（たとえば、パラミクソウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス）は、中性のｐＨにおいて標的細胞の膜に直接融合することが可能であり、それに伴って、感染した標的細胞と隣接する感染していない細胞との間の膜融合を引起す傾向にある。細胞と細胞の融合を引起すこの後者の傾向の目に見える結果として、１００個にも及び得る核を含む細胞シンシチウム（多核細胞または多核巨大細胞としても知られる）が形成される。シンシチウムの形成は、そのシンシチウムを形成する細胞の死滅をもたらす。これら後者のウイルス群のウイルス膜タンパク質が、特に本発明において重要である。
パラミクソウイルス科のウイルスは、シンシチウムを誘導する傾向が強い。これはほとんどの場合、融合タンパク質（Ｆ）およびウイルス付着タンパク質（Ｈ、ＨＮまたはＧ）という２つのホモオリゴマーのウイルス膜糖タンパク質が同時に発現することに依存する。シンシチウムの誘導には培養細胞系統内でこれらの対となる膜糖タンパク質が同時に発現することが要求されるが、この法則には例外があり、たとえば、ＳＶ５の場合、シンシチウムの誘導にはそのＦタンパク質のみで十分である。Ｆタンパク質は、最初、ポリタンパク質前駆体（Ｆo）として合成される。これは、切断活性化を経るまでは膜融合を引起すことができないものである。活性化プロテアーゼが、このＦo前駆体をウイルス外Ｆ1領域と膜固定化Ｆ2領域とに切断するが、それら２つの領域は、ジスルフィド結合によって共有結合されたままである。この活性化プロテアーゼは通常、セリンプロテアーゼであり、切断の活性化は通常、細胞表面へのタンパク質の輸送中に、ゴルジ区画内の細胞内プロテアーゼによって媒介される。これに代えて、切断シグナルがゴルジプロテアーゼによって認識されない場合には、切断の活性化は、ウイルスの出芽が起こった後、細胞外の位置に分泌されたプロテアーゼ（たとえばトリプシンまたはプラスミン）によって、媒介されることも可能である（Ward他、Virology, 1995, 209, p242-249; Paterson他、J. Virol., 1989, 63, 1293-1301）。
ヘルペスウイルス科に含まれるいくつかのウイルスはその強いシンシチウム誘導活性がよく知られている。実際、水痘帯状ヘルペスウイルスは、組織培養において自然の無細胞（セルフリー）状態を有さず、ほとんど細胞融合を誘導することによってのみ広がり、単層全体を最終的に取囲む大きなシンシチウムを形成する。ｇＨは、ヘルペスウイルスの中で高度に保存される、強い融合誘導性の糖タンパク質である。ｇＨの成熟および膜の発現は、ウイルスにコードされるシャペロンタンパク質ｇＬの同時発現に依存する（Duus他、Virology, 1995, 210, 429-440）。ｇＨはヘルペスウイルスのゲノム中にコードされる唯一の融合誘導性膜糖タンパク質ではないが（ｇＢもまたシンシチウムの形成を誘導することがわかっている）、これは、ウイルスの感染力を発現するのに必要である（Forrester他、J. Virol., 1992, 66, 341-348）。
レトロウイルスは、付着および融合誘発のために、単一のホモオリゴマー膜糖タンパク質を使用する。オリゴマー複合体中の各サブユニットは、ポリタンパク質前駆体として合成され、これが、タンパク質加水分解により、膜固定化（ＴＭ）成分とウイルス外（ＳＵ）成分とに切断される。これら両成分は、共有結合的または非共有結合的相互作用によって結合されたままである。
レトロウイルスエンベロープ前駆体ポリペプチドの切断活性化は通常、細胞表面へのタンパク質の輸送中に、ゴルジプロテアーゼによって媒介される。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびメイソンファイザー（Mason Pfizer）サルウイルス（ＭＰＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質のＴＭサブユニットにおける細胞質尾部には、阻害（Ｒ）ペプチドが存在し、これは、ウイルスの出芽が起こった後に、ウイルスにコードされるプロテアーゼによって切断される。このＲペプチドの切断は、これらエンベロープ糖タンパク質の融合誘導能力を完全に活性化するのに必要とされ、Ｒペプチドを欠く突然変異体は、細胞融合アッセイにおいて非常に増強された活性を示す（Rein他、J. Virol., 1994, 68, 1773-1781; RaghebおよびAnderson, J. Virol., 1994, 68, 3220-3231; Brody他、J. Virol., 1994, 68, 4620-4627）。
天然に生じるＭＬＶ株もまた、特定の細胞の種類または組織においてシンシチウムを誘導させる性質が大いに異なり得る。あるＭＬＶ変異体は、脳血管に内皮細胞シンシチウムの形成を誘導する傾向が強く、脳内出血および神経系疾患をもたらす。ＭＬＶ変異体のこの異常な性質は、フレンドＭＬＶの非神経毒性株のｅｎｖ遺伝子内に単一の点突然変異を導入することによって再現することが可能であり、それは、ＳＵ糖タンパク質の可変領域内のアミノ酸位置１２０において、トリプトファンのグリシンへの置換をもたらす（Park他、J. Virol., 1994, 68, 7516-7524）。ＨＩＶ株もまた、Ｔ細胞シンシチウムの形成を誘導する能力の間に大きな違いがあることが知られており、その違いは、大部分、異なる株のエンベロープ糖タンパク質間の可変性によって決まることが知られている。
普通は酸性ｐＨで融合を引起すウイルスの膜糖タンパク質は、通常、シンシチウムの形成を促進することはない。しかし、それらは、ある状況下においては、細胞と細胞の融合を引起すことが可能である。たとえば、インフルエンザ赤血球凝集素または水泡性口内炎ウイルスのＧタンパク質を発現する細胞が酸に晒されたとき（Steinhauer他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 12873-12878）、あるいは、融合誘導性糖タンパク質が非常に高い密度で発現されたとき（Yang他、Hum. Gene Ther. 1995, 6, 1203-1213）、シンシチウムが観察されてきた。さらに、酸によって誘発される融合誘導性ウイルス膜糖タンパク質は、融合誘発のための最適ｐＨを変えるよう変異させることが可能である（Steinhauer他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 12873-12878）。
中性のｐＨにおいて細胞融合を引起すことのできるポックスウイルスの能力は、ＨＡ生産の欠如と強い相関関係にある（IchihashiおよびDales, Virology, 1971, 46, 533-543）。野生型のワクシニアウイルスであるＨＡ陽性オルソポックスウイルスは、中性のｐＨにおいては細胞融合を引起すことはないが、感染した細胞を酸性ｐＨ処理することによって細胞融合を引起すよう誘導され得る（Gong他、Virology, 1990, 178, 81-91）。これに対し、ＨＡ遺伝子を欠く野生型の家兎痘ウイルスは、中性のｐＨで細胞融合を引起す。一方、ＨＡ陽性オルソポックスウイルスにおけるＨＡまたはＳＰＩ−３（セルピン）遺伝子の不活性化は、中性ｐＨにおいて、感染した細胞の融合によるシンシチウムの形成をもたらす（TurnerおよびMoyer, J. Virol. 1992, 66, 2076-2085）。最近の証拠が示すところは、ＳＰＩ−３およびＨＡ遺伝子の生産物が、オルソポックスウイルスの融合誘発ウイルス糖タンパク質の活性を制御すべく共通の経路を通じて作用し、それによって野生型ウイルスに感染した細胞の融合を阻止しているということである。
所定のウイルスが細胞と細胞の融合を促進するかどうかは、感染した細胞の種類に大いに影響される（Poste, Adv. Virus Res. 1970, 303-356での論評）。同じウイルス株が、ある種類の細胞においてはシンシチウム形成を大いに引起す一方で、別の種類の細胞ではそうではなく、しかしどちらの種類の細胞においても同等に良く複製される場合があることが、多くの例で知られている。細胞の特定の対において、その一方が特定の融合誘導性膜糖タンパク質複合体を発現している場合、その細胞対が互いに融合し合う可能性を決定するのに、多数の宿主細胞因子が役割を果たしていることが知られている。寄与因子には、適当なプロセシングプロテアーゼおよび膜受容体の発現、プラスマ膜の脂質組成（Daya他、Virology, 1988, 163, 276-283）、およびグリコカリックスの厚さ（Poste, Adv. Virus Res. 1970, 303-356）が含まれる。
一般に、確立された形質転換細胞系は、形質転換されていない細胞系または初代細胞よりも、シンシチウム形成をより受けやすい。極体化された上皮細胞に関しては、（タンパク質分解により活性化された）センダイウイルスエンベロープ糖タンパク質の基底外側での発現が、細胞融合を誘導するのに必要であることがわかっている。野生型のセンダイウイルスＦ糖タンパク質は、極体化されたＭＤＣＫ細胞の頂端領域に向けられ、Ｆ糖タンパク質がトリプシンで活性化された場合でも、細胞融合を誘導することはない。しかしながら、頂端領域および基底外側領域において双極性で出芽するＦタンパク質突然変異体は、その基底外側で発現したタンパク質がその活性な立体配座にある場合には、ＭＤＣＫ細胞の細胞融合を誘導することができる（Tashiro他、Arch. Virol. 1992, 125, 129-139）。
シンシチウムが形成されないことは、融合活性がないことを必ずしも示すものではない。融合能力を有するもののシンシチウムを生成させることのない、変異体ヘルペスウイルスおよびパラミクソウイルスが存在する。このような非シンシチウム表現型は、ある場合には、融合の誘発に関係する膜糖タンパク質に位置する（Cai他、J. Virol. 1988, 62, 2596-2604）が、ある場合には、他のウイルス遺伝子に位置する。細胞表面における融合タンパク質の密度もまた、細胞間融合の可能性を決定する重要な要素の１つである（Gething他、J. Cell Biol. 1986, 102, 11-23）。
癌遺伝子治療のための治療用遺伝子
ヒトの悪性腫瘍を遺伝子治療によって治療しようとする試みは、今日まで有効ではなく、よりよいベクターおよびよりよい治療用遺伝子の必要性は明らかである。癌遺伝子治療において、理想的な治療用遺伝子は、以下の性質を有するタンパク質をコードすべきである。
１．局所的バイスタンダー効果をもたらすもの。すなわち、そのタンパク質は、形質導入された腫瘍細胞とともに形質導入されていないその隣接細胞を殺すべきである。
２．全身性バイスタンダー効果をもたらすもの。通常これは、その治療が、離れた腫瘍細胞上の腫瘍抗原に対して免疫応答を増強する効果を有することを意味する。
３．選択性。その治療が、正常な（癌性でない）宿主組織、特に生体の重要器官に対して過度の損傷を及ぼさないことが重要である。選択性は、治療用遺伝子によってコードされるタンパク質に本来備わっている性質であってもよく、かつ／または、その作用モードから生じるものであってもよい。代わりに、または付加的に、選択性は、治療用遺伝子が非標的細胞に配達されないことを確実にするためベクターを用いて狙いを定めることによって、あるいは、非標的細胞において遺伝子発現をもたらすことのない遺伝子調節要素（プロモータ／エンハンサ／サイレンサ／遺伝子座制御配列）を使用することによって、達成し得る。
治療用遺伝子の現時点において好ましいクラスは以下のとおりである。
（１）  腫瘍細胞の免疫原性を増強するタンパク質をコードする遺伝子。これらは、プロ炎症性サイトカイン、Ｔ細胞共刺激因子、および外来ＭＨＣタンパク質を含み、これらは局所的炎症性応答によって局所的バイスタンダー効果をもたらす。局所的炎症性応答は、サイトカインが豊富な環境を作り出す。この環境は、腫瘍特異的Ｔ細胞の補充および活性化による全身性バイスタンダー効果の生成に有利である。
（２）  腫瘍細胞を「プロドラッグ」感受性にする酵素をコードする遺伝子。チミジンキナーゼ遺伝子の転移に関して、ガンシクロビアトリホスフェート（活性化された薬剤）を緊密な接合を介して隣接する腫瘍細胞へと移転することによる局所的バイスタンダー効果が認められる証拠がある。しかしながら、多くの腫瘍はそれに必要とされる緊密な接合を有さず、観察される局所的および全身性バイスタンダー効果はしたがって、プロドラッグによって殺された細胞に対する局所的炎症性応答と、それに伴う腫瘍反応性Ｔ細胞の活性化によってもたらされるものと考えられる。
設計され／標的化される融合誘導性ウイルス膜糖タンパク質をコードする遺伝子は、局所的バイスタンダー効果、全身性バイスタンダー効果（全身性の免疫を増強することを助ける局所的炎症性応答を促進することによるもの）、および特異性という、３つの基準すべてを満たすことができるものであり、さらに、先に述べた治療用遺伝子のグループのいずれよりも優れている候補の中で、これまで癌遺伝子治療のための治療用遺伝子として使用されたことのなかったものである。それらは、有効な局所的バイスタンダー効果を生成させる能力を有するものであり、というのも、それらは、遺伝子修飾された細胞とそれを取囲む形質導入されていない細胞との融合を誘導し、その結果、互いに融合したすべての細胞を死滅させるものであるからである。それらはまた、細胞間の融合を引起すそれらの能力を増強するよう、したがってそれらの治療能力を増強するように設計することもできる。さらに、たとえば、融合誘導性タンパク質を発現する循環性の腫瘍細胞が他の腫瘍細胞とのみ融合することができ、したがって正常な宿主組織には損傷を与えないことを確実にするよう、融合誘導性タンパク質を設計することによって、細胞間の融合プロセスの特異性を作り出すこともできる。
融合誘導性の膜糖タンパク質をコードする治療用遺伝子
実験的な癌治療においては、複製ウイルスが、腫瘍崩壊性薬剤として広く使用されてきた（Russell, 1994, Semin. Cancer Biol. 5, 437-443）。使用されてきたこれらウイルスのいくつかは、融合誘導性のウイルス膜糖タンパク質をコードすることが知られている。たとえば、おたふく風邪ウイルスの組織培養懸濁液が、末期の悪性腫瘍を有する９０人の患者を治療するために、腫瘍表面への局所的塗布、腫瘍内接種、経口接種、直腸接種もしくは静脈内接種、または吸入によって投与された（Asada, 1974, Cancer, 34, 1907-1928）。毒性は最小限であり、９０人の患者のうち３７人において、腫瘍が消えるかまたは当初のサイズの半分以下に減少した。弱い応答がさらに別の４２人の患者において観察された。腫瘍の破壊は、ウイルス投与後数日で最大となり、その後、しばしば、腫瘍の増殖が長期にわたって抑えられた。これはおそらくは、抗腫瘍性免疫の刺激によるものである。
この他にも、ヒトの被験者または実験用マウスモデルにおいて癌治療に使用されてきた、融合誘導性のウイルス膜糖タンパク質をコードするウイルスには、ウエストナイル（West Nile）ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロシア極東脳炎、ニューカッスル病ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎、狂犬病、痘疹および水痘がある（Russell, 1994, Eur. J. Cancer, 30A, 1165-1171）。これらの研究における理論的根拠は、多くのウイルスは形質転換されていない組織においてよりも腫瘍性の組織においてより急速に複製しかつ広がり、したがって、宿主に対してよりも腫瘍に対してより損傷を与えるものと期待できる、というものであった。
癌ウイルス治療に使用されてきたウイルスの融合誘導性膜糖タンパク質は、感染した腫瘍細胞が感染していないそれらの隣接細胞と融合するように仕向けることによって、観察された治療効果に寄与し得たとも考えることができよう。しかしながら、癌遺伝子治療のための治療用処方物として使用するために、融合誘導性膜糖タンパク質をコードする遺伝子を、それらの自然の（本来の）コンテクストから取出し、ベクターゲノムに挿入することは、これまで提案されてこなかった。
発明の概要
本発明は、第１の局面において、悪性疾患の遺伝子治療に使用するための組換え核酸ベクターを提供する。このベクターは、真核細胞の表面におけるシンシチウム誘導性ポリペプチドの発現を誘導する。
好都合には、シンシチウム誘導性ポリペプチドは、ウイルスの融合誘導性膜糖タンパク質（ＦＭＧとして省略し得る）の融合誘導部を少なくとも含む。ある具体例において、このシンシチウム誘導性ポリペプチドは、ほぼ中性のｐＨ（すなわちｐＨ６〜８）において、シンシチウム形成を誘導できることが好ましい。多くの適当なＦＭＧが当業者には知られており、それらのいくつかは、この明細書中、「発明の背景」と題された部分に記載されている。本発明に関し、シンシチウムは、組織生検または組織培養の試料において細胞質の多核形成領域として現われる、細胞と細胞との融合体であると定義することができる。
典型的には、ベクターは、ヒト細胞の表面にシンシチウム誘導性ポリペプチドを発現するように作られたものであり、それにより、正しく発現された場合には、ポリペプチドは、ヒト細胞がシンシチウム誘導性ポリペプチドを発現しない他のヒト細胞と融合するように仕向けることができる。
ポリペプチドがウイルスＦＭＧを含む場合には、そのＦＭＧは、他のウイルス成分から実質的に分離して発現されることが好ましい。ただし、それらが標的細胞上の融合誘導活性に必須である場合を除く（たとえば、パラミクソウイルスの「Ｆ」および「Ｈ」糖タンパク質は双方とも、シンシチウム形成に必要である）。
さらに、シンシチウム誘導性ポリペプチドを、医療用途のためのその特性を最適化し、ベクターが天然に存在しないポリペプチドの発現を誘導するように「設計する」ことがしばしば望まれる。特定の具体例において、ＦＭＧは、たとえばＭＬＶまたはＧａＬＶのような、Ｃ型レトロウイルスエンベロープタンパク質からの融合誘導領域を少なくとも含む。細胞質領域がほとんどまたはすべて欠失したレトロウイルスエンベロープタンパク質は、ヒト細胞に対して高度な融合誘導活性を示すために、好ましいであろう。
ウイルス膜糖タンパク質には、シンシチウムの形成を誘導するその能力を大いに増強するために、ある種の修飾を導入することができる。たとえば、いくつかのレトロウイルスおよびヘルペスウイルス糖タンパク質の細胞質領域の切詰め（トランケーション）は、それらの融合活性を高め、また時として同時に、それらがビリオン内に組込まれる効率を低下させることが知られている（Rein他、J. Virol. 1994, 68, 1773-1781; Brody他、J. Virol. 1994, 68, 4620-4627; Mulligan他、J. Virol. 1992, 66, 3971-3975; Pique他、J. Virol. 1993, 67, 557-561; Baghian他、J. Virol. 1993, 67, 2396-2401; Gage他、J. Virol. 1993, 67, 2191-2201）。加えて、ＭＬＶとＨＴＬＶ−１との間のＴＭ領域交換実験は、細胞間アッセイにおいては容易に融合誘導を示しかつビリオン内に効率的に組込まれるエンベロープが、必ずしもウイルスと細胞との間の融合誘導性を与えるものではないことを示した（Denesvre他、J. Virol. 1996, 70, 4380-4386）。
タンパク質工学によって、新規な結合特異性またはプロテアーゼ依存性を融合誘導性ウイルス膜糖タンパク質に導入し、それによって、それらの誘導融合活性を、標的受容体を発現する特定の種類の細胞に向けさせるか、または適当な活性化プロテアーゼが豊富である特定の微小環境に向けさせることが可能であることが知られている（下記「プロテアーゼターゲット」を参照；また、CossetおよびRussell, Gene Therapy, 1996, 3, 946-956を参照）。
プロテアーゼターゲット
腫瘍細胞の表面に優先的に発現される多数の膜プロテアーゼが存在するものと考えられる。それらは、浸潤、転移、補体耐性等の、病気の進行および治療耐性に寄与する、種々のプロセスに関係している。
補体耐性：ヒト黒色腫細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−１７０は、補体を媒介とする溶解に耐性である。この補体耐性に対する分子的根拠は、ＳＫ−ＭＥＬ−１７０細胞表面に配置されたＣ３ｂを急速かつ特異的に切断する、膜プロテアーゼｐ６５にあることが明らかにされている（Ollert他、Cancer Res. 1993, 53, 592-599）。
前立腺特異的抗原：射出された精液は、粘性ゲルへと即座に変換され、これは、２０分以内に液化する。ＰＳＡは、セメノゲリン（semenogelin）（射出された精液の凝固した部分において優勢なタンパク質）を切断することでこの液化プロセスに関与する、前立腺カリクレイン様セリンプロテアーゼである（Lilja他、Clin. Invest. 1987, 80, 281-285）。ＰＳＡは、前立腺内皮細胞によってのみ生成され、これは、前立腺癌の有益なマーカーである。ＰＳＡはまた、ＩＧＦＢＰ−３を切断して、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）に対するその親和力を大いに減じることがわかっている（Cohen他、J. Endocrinol. 1994, 142, 407-415）。プラスマ中で流通するＰＳＡは、セルピンに結合されているため不活性である。一方、自明なこととして仮定されているのは、前立腺癌の転移病巣におけるＰＳＡの局所的放出が、ＩＧＦＢＰ結合タンパク質３を切断することによるＩＧＦ１の放出をもたらし、それにより、腫瘍の増殖が増強され得るということである（Cohen他、J. Endocrinol. 1994, Vol. 142 p407-415）。
凝固促進プロテアーゼ：癌細胞上のフィブリンの堆積によって、癌細胞が免疫系から守られる可能性があり、また、転移における凝固酵素の関与が示唆されている（Dvorak, Hum. Pathol. 1987, 18, 275-284）。この観点から重要であると思われる膜結合凝固促進剤には、組織因子（Edwards他、Thromb. Haemostasis, 1993, 6, 205-213）、ファクターＸを直接活性化する酵素（GordonおよびCross, J. Clin. Invest. 1981, 67, 1665-1671）、およびプロトロンビンを活性トロンビンに直接変換するプロテアーゼ（Sekiya他、J. Biol. Chem. 1994, 269, 32441-32445）が含まれる。
プラスミノーゲン活性化系：プラスミンは、フィブリン、ならびにラミニン、トロンボスポンジンおよびコラーゲンを含むＥＣＭタンパク質を分解し、コラゲナーゼのような他の潜在的マトリックス分解プロテアーゼを活性化させる、広いスペクトルのトリプシン様プロテアーゼである。腫瘍細胞によるプロテアーゼ活性の発現が、基底膜、毛細血管壁、および間隙の結合組織への腫瘍細胞の浸透を容易にし、腫瘍細胞の他の部位への広がりおよび転移の確立を可能にすると考えられている（Dano他、Adv. Cancer Res. 1985, 44, 139-266）。プラスミノーゲンは、約２μＭの濃度で通常存在する、豊富な血漿タンパク質（Ｍｒ＝９０，０００）である。赤血球を除く分析されたほとんどの種類の細胞は、高密度の低親和性（０．１〜２．０μＭ）プラスミノーゲン結合部位を有し、この部位は、プラスミノーゲンのクリングルドメインと結合するリシン結合部位を認識する（RedlitzおよびPlow, Clin. Haem. 1995, 8, 313-327）。細胞結合プラスミノーゲンは、単一のペプチド結合開裂によって活性化され、ジスルフィド結合された重鎖（Ｍｒ＝６０，０００、５つのクリングルモチーフを含む）と軽鎖（Ｍｒ＝２４，０００、セリンプロテイナーゼの触媒三つ組残基を含む）とからなるプラスミンを形成する。プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化は、（以下に示す）細胞結合ｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡによって第１に媒介される。細胞結合プラスミンは、可溶性プラスミンよりも活性であり、血清中に存在するα−２−アンチプラスミンによる不活性化に対し耐性であるが、細胞からの解離後に急速に不活性化される（Stephens他、J. Cell Biol. 1989, 108, 1987-1995）。
ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータ（ｕ−ＰＡ）は、傷が治る間、マクロファージの侵入中、胚の着床、シグナル導入、浸潤および転移の間、細胞が媒介するタンパク質分解に関与する。プロｕＰＡは、通常、５５ｋＤａの一本鎖（ｓｃｕＰＡ）として細胞によって放出され、そのＧＰＩ固定化細胞受容体（ｕＰＡＲ−Ｋｄ０．０５−３．０ｎＭ）に結合し、そこで、プラスミンまたは他のプロテアーゼによってその活性（２鎖）形状へと効率的に変換される。
トロンビンは、この活性形のｕ−ＰＡを不活性化する（Ichinose他、J. Biol. Chem. 1986, 261, 3486-3489）。細胞結合ｕ−ＰＡの活性は、３つの阻害剤、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２およびプロテアーゼネキシン（ＰＮ）によって調節される。これらの阻害剤は、細胞結合酵素に結合することができ、それにより、該酵素を細胞表面からエンドサイトーシス的に隔離する（ConeseおよびBlasi, Clin. Haematol. 1995, 8, 365-389）。
癌の浸潤では、プラスミノーゲン−プラスミノーゲン活性化因子系の種々の成分の間に複雑な相互作用があるものと思われる。細胞表面のｕＰＡＲ集塊は、プラスミンを媒介とする細胞周囲のタンパク質分解プロセスを腫瘍の浸潤最前部に集中させるよう働く。癌細胞、あるいは腫瘍浸潤部位における形質転換されていない間質細胞は、プロｕ−ＰＡ、ｕＰＡＲ、ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２を、種々の量で生産することができ、これら異なる種類の細胞によるその生産は、種々の刺激によって調節することができる（Laug他、Int. J. Cancer, 1992, 52, 298-304; CiambroneおよびMckeown-Longo, J. Biol. Chem. 1992, 267, 13617-13622; KesslerおよびMarkus, Semin. Thromb. Haemostasis, 1991, 17, 217-224; Lund他、EMBO J., 1991, 10, 3399-3407）。かくして、種々の異なる種類の細胞は、マトリックスの破壊のために必要とされるタンパク質分解機構のすべての成分を腫瘍細胞上に集合させるのに寄与することができる。
トリプシン様プロテアーゼ：腫瘍結合トリプシン阻害剤（ＴＡＴＩ）は、６−ｋＤａのプロテアーゼ阻害剤であり、そのレベルは、癌が進行した患者において増大する（Stenman他、Int. J. Cancer, 1982, 30, 53-57）。ＴＡＴＩに対する標的プロテアーゼの探索において、２つのトリプシン様プロテアーゼがムチン卵巣腫瘍の嚢胞液から精製されている（Koivunen他、J. Biol. Chem. 1989, 264, 14095-14099）。それらの基質特異性は、膵臓トリプシン１および２のものと非常に似ていることが見出され、また、それらがプロウロキナーゼの効率的な活性化因子ではあるが直接プラスミノーゲンを活性化することはできないことがわかった。
カテプシンＤ：これは、乳癌細胞によっておよび他の種類の癌細胞によって大量に分泌される、ペプスタチン感受性リソソームアスパルチルプロテアーゼである。カテプシンＤ分泌細胞からの精製されたカテプシンＤおよび調整培地は、ｐＨ４．５において細胞外マトリックスを分解するが、中性のｐＨでは分解しないことがわかっている（Briozzo他、Cancer Res. 1988, 48, 3688-3692）。したがって、この酵素は、酸性の（ｐＨ＜５．５）微小環境に放出された場合には、腫瘍浸潤の重要な促進因子になり得ると考えられる。これを他のプロテアーゼクラスと区別する１つのファクターは、それが、分泌された後に癌細胞から離れた所で作用できるということである。
カテプシンＢ、Ｌ：酸性のｐＨで作用する、ロイペプチン感受性リソソームシステイニルプロテアーゼ。
したがって、タンパク質工学による改良を受けやすいと考えられるウイルスＦＭＧの可能な特性は以下のとおりである。
（１）  融合が媒介される際のｐＨ（他にも説明されるように、多くのウイルスＦＭＧは酸性のｐＨにおいてのみ融合を媒介するが、これに対し、中性ｐＨにおける融合がしばしば好まれ得る）。
（２）  ある種のプロテアーゼにさらされた際の融合機能の活性化（これは、腫瘍細胞の表面またはその近辺における局所的な活性化につながり得る。腫瘍細胞の多くは、本明細書中「プロテアーゼターゲット」と題された部分において説明したように、腫瘍結合プロテアーゼを分泌または発現する。したがって、ＦＭＧは、腫瘍細胞を攻撃目標とすることができる）。
（３）  天然のＦＭＧの修飾（たとえば、アミノ酸の置換、切り詰め（トランケーション）、またはキメラＦＭＧの生産）−キメラＦＭＧは、ＦＭＧを特定の細胞表面マーカーに向けさせる新規な結合特異性を含み得るか、あるいは、異なる複数のタンパク質からの他の望ましい特性を組合わせ得る。
要約すると、多数のウイルス膜糖タンパク質またはそれらの組合せが知られており、それらは、哺乳類細胞の表面で発現される場合、哺乳類細胞がウイルス膜糖タンパク質を発現しない隣接細胞と融合し、生存能力のないシンシチウムを形成するように仕向けることができる。このプロセスを媒介するタンパク質は、融合誘導活性を高めるよう（たとえばその細胞質領域の一部分またはすべての欠失によって）、受容体特異性を変更するよう（たとえば他の結合特異性を有するポリペプチドに融合することによって）、あるいは新規のプロテアーゼ依存性を目的として、設計することができる。
第２の局面において本発明は、ヒトの患者における悪性疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、患者に対し、ヒト細胞においてシンシチウム誘導性ポリペプチドの発現を誘導する組換え核酸を投与することを含み、それにより、組換え核酸を取込む患者の細胞（「指標」細胞）は、悪性疾患を引き起こしている癌性細胞（「標的」細胞）と融合するようになる。
特定の具体例において、核酸は、（トランスフェクション、形質導入または形質転換等の、種々の知られた標準的な方法のいずれかによって）インビトロで適当なヒトの指標細胞に導入され、次いでその指標細胞は、患者に導入され、そこで、標的細胞に対して融合誘導作用を発揮することができる。
本発明のＦＭＧは、癌遺伝子治療のためにさまざまな方法で使用することができる。ＦＭＧが発現される第１の標的細胞（指標細胞）は、静止した細胞（たとえば、塊となった腫瘍中の腫瘍性細胞または間質要素）であってもよく、移動性の細胞（たとえば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、および他の造血細胞、あるいは血液学的悪性腫瘍における移動性の腫瘍性細胞）であってもよい。（ＦＭＧを発現する標的細胞がそれに融合する）二次的標的細胞もまた同様に、静止した細胞であっても移動性の細胞であってもよい。標的細胞はエクスビボまたはインビボで、ＦＭＧコードベクターによって形質導入され得る。どのベクター系も、それがウイルス性であるか非ウイルス性であるかに関わらず、ＦＭＧ遺伝子を標的細胞に配達するのに使用することができる。標的化要素（狙いを定めるための要素）を、標的細胞への遺伝子デリバリーの的確性を高めるためにベクター処方物中に含ませてもよいし、また、ＦＭＧ遺伝子の発現が選ばれた標的細胞に限られるのを確実にするために、ベクターゲノムに組織／腫瘍選択的調節要素を含ませてもよい。
したがって、ＦＭＧをコードする遺伝子は、治療効果を得るために種々の方法で使用することができる。すべての場合において目指すのは、ＦＭＧを発現する指標細胞と望ましくない標的細胞を融合させることによって、その望ましくない標的細胞を破壊することである。したがって、遺伝子移転の最初の標的となるのは指標細胞であるが、治療のための戦略の最終的な標的は、それらが融合する細胞である。多種多様の治療戦略が考えられ得る。
たとえば、プロトコルの目標が患者の腫瘍性細胞を破壊することである場合、指標細胞は腫瘍性である必要はない。腫瘍選択的ＦＭＧを発現する移動性のＴリンパ球は、腫瘍性細胞とのみ、シンシチウムを形成する可能性がある。塊となった腫瘍中の間質細胞、血管内皮細胞、または腫瘍性細胞における、腫瘍選択的（あるいは、非選択的が最良ではない）ＦＭＧの局所的発現は、隣接する腫瘍性細胞のシンシチウムへの補充（取込み）をもたらす可能性がある。
白血病および他の血液原性悪性腫瘍について、血管内皮細胞または間質骨髄細胞内での白血病選択的ＦＭＧの発現は、循環する白血病細胞の静止したシンシチウムへの補充（取込み）をもたらす可能性がある。一方、循環するＴ細胞または白血病細胞自体での白血病選択的ＦＭＧの発現は、ひどく浸潤された組織においてこれらの細胞が白血病細胞シンシチウムを形成し始めることを可能にするか、または、白血球細胞の再循環シンシチウムへの補充（取込み）をもたらす可能性がある。
第３の局面において本発明は、悪性疾患の遺伝子治療における組換え核酸ベクターの使用を可能にする。このベクターは、シンシチウム誘導性ポリペプチドの真核細胞表面での発現を誘導する配列を含む。
第４の局面において本発明は、ヒトの患者における悪性疾患を治療するための医薬を調製するのに使用するための組換え核酸ベクターを提供する。このベクターは、シンシチウム誘導性ポリペプチドの真核細胞表面での発現を誘導する配列を含む。
第５の局面において本発明は、本発明の上述の第１の局面による組換え核酸ベクターを含む、宿主細胞を提供する。この細胞は、典型的に真核細胞（特にヒトの細胞）であり、望ましくはその表面でシンシチウム誘導性ポリペプチドを発現するものである。本発明はまた、医薬として許容される担体と混合して本発明の第１の局面による組換え核酸ベクターを含む医薬組成物を提供し、さらに、医薬として許容される担体と混合して、本発明の第１の局面による組換え核酸ベクターを含有する真核細胞を含む医薬組成物を提供する。
本発明によるベクターは、患者に直接投与してもよい。あるいは、本発明によるベクターは、エクスビボの方法を利用して投与してもよく、それによって細胞は、患者またはドナーから取出され、ベクターで形質導入され、そして、その患者に再び移植される。ベクター、またはベクターを含有する宿主細胞は、予防のために投与してもよいし、あるいは、悪性疾患もしくは治療に適する他の症状を有する患者に投与してもよい。投与は、デリバリー媒体（たとえばリポソーム）を使用して行なってもよく、あるいは、イオントホレシス、電気穿孔もしくは他薬理学的に認められたデリバリー方法を伴ってもよい。投与の経路はとりわけ、筋肉内、静脈内、エアロゾル吸入、経口、局所、全身、接眼または腹腔内の経路を含み得る。
以下、本発明を具体例により、添付の図面を参照してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
図１から図３は、組換え核酸ベクターを再現する模式図である。図２において、ＣＭＶはＣＭＶプロモータであり、図１および図３において、ＬＴＲは長い末端反復配列である。図３において、phleorはフレオマイシン耐性遺伝子であり、図２および図３において、ＩＥＧＲリンカー配列はＦＸａプロテアーゼのためのプロテアーゼ切断シグナルである。＊は終結コドンを示す。
図４は、ＴＥＬＣｅＢ６トランスフェクタント、ｐＦＢＨ、ｐＦＢＨ  ＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＸＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＩＧＦ、ｐＦＢＨ  ＸＩＧＦ、および対照の形質導入されていないＴＥＬＣｅＢ６から調製された、細胞溶解産物の免疫ブロットであり、抗ＭＶ  Ｈ抗血清でプローブ（標識）されている。
図５は、Ｘ−ガル染色後の、細胞間融合アッセイにおける大型Ｃ１７０シンシチウムを示す拡大図である。キメラＭＶ  Ｈタンパク質は、シンシチウム形成を示すが、これは、非修飾Ｈタンパク質のそれよりも低いレベルである。
図６は、先端が切詰められた高融合誘導性のＧａＬＶエンベロープタンパク質の、ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
図７は、さらなる組換え核酸ベクターを再現する模式図である。図７において、斜線を付したボックスは、ＦＸａ切断シグナルであって、薄く影を付したボックスは、成熟した（残基４３〜６５３のみの）ＧａＬＶエンベロープである。濃く影を付したボックスは、モロニーＭＬＶエンベロープの残基６３３〜６７４であり、ｐｏｌｙＡはポリアデニル化シグナル、Ｌはリーダー配列である。
例
癌の遺伝子治療のための（標的化）融合誘導性膜糖タンパク質をコードする遺伝子の医療における使用の実証
麻疹ウイルスのＦおよびＨ糖タンパク質は、同じ細胞で同時に発現されると、隣接する細胞との細胞間融合を媒介することができる。ただし、隣接する細胞が麻疹ウイルス受容体（ＣＤ４６）を発現するものとする。ヒトの細胞はＣＤ４６麻疹ウイルス受容体を発現するが、ネズミの細胞はそれを発現しない。以下に説明する実験においては、麻疹ウイルスＦおよびＨ遺伝子を移転することのできるレトロウイルスベクターを使用して、癌治療のために狙いを定めたまたは狙いを定めていない融合誘導性ウイルス膜糖タンパク質をコードする遺伝子治療ベクターの治療上の可能性を実証する。これらベクターは、腫瘍細胞に遺伝子を直接移すのに、または、非腫瘍細胞の形質導入のために使用することができ、それらはその後、選択的な抗腫瘍作用のために用いられる。
例１  麻疹ウイルスＦおよびＨ糖タンパク質をコードするレトロウイルスベクタープラスミドの構築。
図１に模式的に示すプラスミド（実際に即した比率ではない）は、標準的なクローニング法を使用して構築される。図１に関連して、ＬＴＲ＝モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列、Ψ＝モロニーマウス白血病ウイルスパッケージングシグナル、ＩＲＥＳ＝ポリオウイルス内部リボソーム侵入部位、Ｈ＝麻疹ウイルスＨ糖タンパク質コード配列、Ｆ＝麻疹ウイルスＦ糖タンパク質コード配列、ＰＨＬＥＯ＝フレオマイシン耐性マーカーであって、点線は（ｐＵＣまたはｐＢＲ３２２ベースのいずれかの）ベクターの骨格を表わす。簡単に言えば、麻疹ウイルスＨ遺伝子のコード配列は、ｐＣＧＨ５（Cathomen他、1995, Virology, 214, 628-632）から、（ＮｏｔＩおよびＣｌａＩクローニング部位が隣接する、ポリオウイルス内部リボソーム侵入部位を含む）レトロウイルスベクタープラスミドｐＧＣＰのＮｏｔＩ部位にクローニングされる。麻疹ウイルスＦ遺伝子はその後、ｐＣＧＦ（Cathomen他、1995, Virology, 214, 628-632）から同じベクターのＣｌａＩ部位、内部リボソーム侵入部位の５′にクローニングされ、ｐＨＦと命名するベクターを生成させる。フレオマイシン選択性マーカー遺伝子は、次いで、その５′ＬＴＲの５′でベクターに導入される。
１．２  レトロウイルスベクターストックの調製
プラスミドｐＨＦは、ネズミ線維芽細胞から誘導された両種指向性のレトロウイルスパッケージング細胞系にトランスフェクションされる。適当なパッケージング細胞系は広く入手可能であり、それらは、ＮＩＨ３Ｔ３から誘導された細胞系ＰＡ３１７およびＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２を含む。安定してトランスフェクションされたパッケージング細胞は、フレオマイシン５０μｇ／ｍｌ中で選択され、麻疹ウイルスＦおよびＨ遺伝子をヒトおよびネズミの標的細胞に効率的に移転することのできる、ＨＦレトロウイルスベクター源として使用される。
１．３  細胞間融合を導入することによって多核シンシチウムの形成を引き起こす、移植可能なヒト腫瘍細胞系の形質導入
ＨＦレトロウイルスベクターストックを使用して、ヒト腫瘍細胞系のパネルを形質導入する。これらをその後、多核シンシチウムの形成に関して観察するが、これは、細胞のレトロウイルス形質導入後、最大で２４〜７２時間かかるものと予測される。腫瘍細胞系は、形質導入の前に集密近くまで増殖させる。このアッセイのために使用できる腫瘍細胞系の例として、Ａ４３１（類表皮癌）、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＥＪ（膀胱癌）、Ｃ１７５（結腸癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、Ｋ４２２（小胞リンパ腫）、およびＵ２６６（骨髄腫）がある。検査されたヒト腫瘍細胞系のすべてではないにせよほとんどは、ＨＦレトロウイルスベクターで形質導入した後すぐに、活発な細胞間融合を示す。
１．４  移植可能なヒト腫瘍細胞系のヌードマウスへの接種、ならびにその後のＨおよびＦ遺伝子の腫瘍沈着物へのインビトロ転移：機能し得る免疫系が存在しない場合に、融合誘導性膜糖タンパク質が腫瘍の破壊を媒介することの実証。
マウスのわき腹に、１０7個のヒト腫瘍細胞を皮下接種する。この実験に使用するのに適当な細胞系は、上記１．３に記載されるものである。腫瘍細胞を皮下接種した後、１日〜１４日の間で、増殖する腫瘍異種移植片に、濃縮ＨＦレトロウイルスベクターストック、または、麻疹Ｆまたは麻疹Ｈ糖タンパク質のいずれかをコードする対照のベクターストックを接種する。ＨＦレトロウイルスベクターの接種によって、腫瘍の増殖は遅らされるかまたは完全に阻害されるが、対照の（ＨまたはＦのみの）ベクターの接種によってはそのような結果は得られない。
１．５  ネズミ線維芽細胞の形質導入；細胞間融合が起こらず多核シンシチウムが存在しない場合。
ＨＦレトロウイルスベクターストックを使用して、ネズミＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を形質導入し、その後、多核シンシチウムの形成を観察する。細胞間融合は起こらず、多核シンシチウムも観察されない。
１．６  ＨＦ形質導入されたネズミ線維芽細胞を形質導入されていないヒト腫瘍細胞と混合することで、ＨＦ形質導入されたネズミ線維芽細胞と形質導入されていないヒト腫瘍細胞との間の細胞間融合が起こり、多核シンシチウムが形成される。
ＨＦレトロウイルスベクターストックを使用して、ネズミＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を形質導入する。これにその後、形質導入されていないヒト腫瘍細胞系を、１：１〜１：１０，０００の種々の比率で混合する。混合された細胞群をその後、高い密度で平板培養し、多核シンシチウムの形成を観察する。細胞間融合が、ＨＦ形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞と形質導入されていないヒト腫瘍細胞との間で起こり、多重ハイブリッドシンシチウムの形成がもたらされる。シンシチウムのそれぞれは、形質導入された１つのＮＩＨ３Ｔ３細胞を核とする。シンシチウムは、形質導入されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞と形質導入されていないヒト腫瘍細胞とを混合した対照培養においては観察されない。
１．７  ＨＦ形質導入されたネズミ線維芽細胞と形質導入されていないヒト腫瘍細胞との混合物のヌードマウスへの接種：融合誘導性膜糖タンパク質を発現する細胞が、形質導入されていないヒト腫瘍細胞のシンシチウムへの補充によって腫瘍の破壊を媒介することの実証。
ＨＦレトロウイルスベクターストックを使用して、ネズミＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を形質導入し、それをその後、形質導入されていないヒト腫瘍細胞系と、１：１〜１：１０，０００の種々の比率で混合する。１０3個から１０7個のＨＦ形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞と混合された１０7個の腫瘍細胞を含有する混合細胞群をその後、ヌードマウス（ＢＡＬＢＣｎｕ／ｎｕ）のわき腹に皮下接種する。マウスの皮下腫瘍の増殖をモニタし、その直径を毎日記録する。対照マウスには、１０7個の形質導入されていないヒト腫瘍細胞を接種する。腫瘍の増殖は、麻疹ウイルスＦおよびＨ糖タンパク質を発現する、混合されたＨＦ形質導入ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞によって遅らされるかまたは完全に阻害されるが、混合された形質導入されていないＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞によっては阻害されない。
例２  麻疹Ｈ糖タンパク質上のＥＧＦおよびＩＧＦの提示
材料および方法
プラスミドの構築
非修飾麻疹ウイルス（ＭＶ）ＦおよびＭＶ  Ｈタンパク質をそれぞれ、発現プラスミドｐＣＧ−ＦおよびｐＣＧ−Ｈによってコードした（Catomen他、Virology 214 p628, 1995）。キメラＭＶ  Ｈ発現構造物を作るために、まず、ｐＣＧ−Ｈ中のＳｆｉＩ部位を欠失させ、それにより、我々の提示リガンドをＳｆｉＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして導入することができるようにした。これは、ＳｆｉＩでｐＣＧ−Ｈを消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントおよびｄＮＴＰを使用して付着末端を端末充填し、次いで、精製物を再結合することによって行なった。この構造物をテストして、それがなお細胞融合アッセイにおいて機能し得るかどうかをチェックした（下記参照）。我々はここで、リガンドをＳｆｉＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして挿入することを可能にするであろう、構造物を作ることができた。構造物ｐＣＧ−Ｈ  ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩは、ＭＶ  Ｈ配列のＣ末端においてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位を導入するが、この構造物を作るために、オリゴヌクレオチドＨＸｍａｂａｋ（5’-CCG GGA AGA TGG AAC CAA TGC GGC CCA GCC GGC CTC AGG TTC AGC GGC CGC ATA GTA GA-3’, Seq ID No.1）およびＨＳｐｅｆｏｒ（5’-CTA GTC TAC TAT GCG GCC GCT GAA CCT GAG GCC GGC TGG GCC GCA TTG GTT CCA TCT TC-3’, Seq ID No.2）を作った。これら２つのオリゴヌクレオチドは、ともにアニーリングされると、ＸｍａＩおよびＳｐｅＩ付着末端を有する、ＤＮＡフラグメントを形成する。このフラグメントを、ＸｍａＩ／ＳｐｅＩ消化ｐＣＧ−Ｈ（Ｓｆｉ−）骨格に連結した。この構造物の正しい配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＭＶ  Ｈ配列のＣ末端においてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位の前にＦＸａプロテアーゼ切断シグナルがある、構造物ｐＣＧ−Ｈ  ＦＸＳｆｉＩ／ＮｏｔＩを作るために、オリゴヌクレオチドＨＸｍａＦＸｂａｋ（5’-CCG GGA AGA TGG AAC CAA TAT CGA GGG AAG GGC GGC CCA GCC GGC CTC AGG TTC AGC-3’, Seq ID No.3）およびＨＮｏｔＦＸｆｏｒ（5’-GGC CGC TGA ACC TGA GGC CGG CTG GGC CGC CCT TCC CTC GAT ATT GGT TCC ATC TTC-3’, Seq ID No.4）を作った。これら２つのオリゴヌクレオチドは、ともにアニーリングされると、ＸｍａＩおよびＮｏｔＩ付着末端を有するＤＮＡフラグメントを形成する。このフラグメントを、ＸｍａＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＣＧ−ＨＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ骨格に連結した。この構造物の正しい配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。構造物ｐＣＧ−Ｈ  ＥＧＦR-、ｐＣＧ−Ｈ  ＸＥＧＦR-、ｐＣＧ−Ｈ  ＩＧＦおよびｐＣＧ−ＨＸＩＧＦを、ｐＥＧＦR-ＧＳ１Ａ１（Peng, PhD Thesis）およびｐＩＧＦＡ１（ＩＡ）（WO97/03357, Russell他）からのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ  ＥＧＦおよびＩＧＦフラグメントを、それぞれ、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＣＧ−Ｈ  ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩおよびｐＣＧ−Ｈ  ＦＸＳｆｉＩ／ＮｏｔＩに移すことによって作った。図２はこれら４つの構造物を模式的に再現する。
哺乳類の細胞中にキメラＨタンパク質を安定に発現させることができるようにするには、発現構造物中に選択可能なマーカーを入れる必要がある。これは、そのＣ末端においてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位を有するＭＶ  Ｈ遺伝子全体を、エンベロープ発現構造物であるＥＭｏ１に移すことによって達成された（Cosset他、J. Virol. 69 p6314, 1995）。そして、ｐＦＢＨ  ＳｆｉＩ／Ｎｏｔを作るために、ｐＣＧ−Ｈ  ＳｆｉＩ／ＮｏｔをＣｌａＩおよびＳｐｅＩで切断し、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位を有するＨ遺伝子を放出させ、さらに、ＥＭｏ１をＸｂａＩおよびＣｌａＩで切断し、ＥＧＦおよびＭｏエンベロープ配列を取出し、骨格を得た。これら双方のフラグメントの付着末端を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントおよびｄＮＴＰを使用して端末充填した。骨格を、ホスファターゼで分解し、精製したフラグメントをともに結合した。この構造物を、その正しい配向について分析用消化物でチェックした。構造物ｐＦＢＨ  ＦＸＳｆｉＩ／Ｎｏｔを作るために、ｐＣＧ−Ｈ  ＦＸＳｆｉＩ／ＮｏｔをＮｓｉＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＦＸａプロテアーゼ切断シグナルおよびそのＣ末端にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニング部位を有するＨ配列の部分を放出させた。ｐＦＢＨ  ＳｆｉＩ／Ｎｏｔもまた、ＮｓｉＩおよびＮｏｔＩで切断し、骨格を得た。これら２つのフラグメントをともに結合した。この構造物を、その正しさについて配列決定によりチェックした。構造物ｐＦＢＨ  ＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＸＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＩＧＦおよびｐＦＢＨ  ＸＩＧＦを、ｐＥＧＦR-ＧＳ１Ａ１およびｐＩＧＦＡ１からのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ  ＥＧＦおよびＩＧＦフラグメントを、それぞれ、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＦＢＨＳｆｉＩ／ＮｏｔおよびｐＦＢＨ  ＦＸＳｆｉＩ／ＮｏｔＩに移すことによって作った。図３は、これら４つの構造物を模式的に表す。Ｃ末端伸長物のない、構造物ｐＦＢＨを作るため、ｐＣＧ−ＨをＣｌａＩおよびＳｐｅＩで切断し、Ｈ遺伝子を放出させ、また、ＥＭｏ１をＸｂａＩおよびＣｌａＩで切断して、ＥＧＦおよびＭｏエンベロープ配列を取出し、骨格を得た。これら双方のフラグメントの付着末端を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントおよびｄＮＴＰを使用して端末充填した。骨格をホスファターゼで分解し、精製したフラグメントをともに結合した。この構造物を、その正しい配向について分析用消化物によりチェックした。
細胞系
Ｃ１７０細胞、ヒトの結腸癌細胞系（Durrant他、Br. J. Cancer 53 p37, 1986）およびヒトＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５５５）を、１０％ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞と細胞の融合を容易に検出することができるように、Ｃ１７０およびＡ４３１細胞を、ＴＥＬＣｅＢ６プロデューサー細胞（Cosset他、J. Virol. 69 p6314, 1995）から収集したＡウイルスの上澄みで感染させた。この上澄みは、核局所化シグナルで標識されたβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を移転する。細胞の単一コロニーを増殖させ、青に染まったクローンを取出した。これら青に染まったＣ１７０およびＡ４３１細胞を使用して細胞融合アッセイを行なった。種々のＭＶ  Ｈ発現構造物、ｐＦＢＨ、ｐＦＢＨ  ＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＸＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＩＧＦおよびｐＦＢＨ  ＸＩＧＦ（５ｍｇＤＮＡ）を、３０ｍｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Qiagen）を使用してＴＥＬＣｅＢ６細胞（Cosset他、J. Virol. 69 p7430, 1995）にトランスフェクションした。安定したフレオマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）耐性コロニーを広げ、プールした。細胞は、１０％ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭにおいて増殖させた。
免疫ブロット
細胞溶解産物を得るために、ＭＶ  Ｈ構造物で安定にトランスフェクションされたＴＥＬＣｅＢ６細胞を、１％トリトンＸ−１００、０．０５％ＳＤＳ、５ｍｇ／ｍｌデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオライドを含有する、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で溶解した。溶解産物は、４℃で１０分間インキュベートし、その後、１０分間１０，０００×ｇで遠心分離にかけて、望ましくない核をペレット化した。細胞溶解産物のアリコート（５０μｌ）をその後、還元状態下、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、タンパク質をニトロセルロース紙（ＮＣ）（Amersham）上に移した。このＮＣは、室温で３０分間、ＰＢＳ−０．１％トゥイーン２０（ＰＢＳＴ）中５％脱脂乳粉（Marvel）でブロックした。ＭＶ  Ｈタンパク質は、（University of Zurich, Roberto Cattaneoからの提供物である）Ｈタンパク質のアミノ末端から得られたペプチドに対して誘導したＭＶ  Ｈ特異的ウサギ血清（３０００中１）とともにＮＣを３時間インキュベートすることによって検出された。ＰＢＳＴで入念に洗浄した後、ＮＣは、西洋わさびペルオキシダーゼ抱合ブタ抗ウサギ抗体（３０００中１）（DAKO, Denmark）とともに、室温で１時間インキュベートした。タンパク質は、強化された化学発光キット（Amersham Life Science, UK）を使用して視覚化した。
細胞と細胞の融合アッセイ
青に染色されたＣ１７０およびＡ４３１細胞を、６ウェルプレートに５×１０5細胞／ウェルで播き、３７℃で１晩インキュベートした。ＭＶ  Ｈ発現構造物であるｐＣＧ−Ｈ、ｐＣＧ−Ｈ  ＥＧＦR-、ｐＣＧ−Ｈ  ＸＥＧＦR-、ｐＣＧ−Ｈ  ＩＧＦおよびｐＣＧ−Ｈ  ＸＩＧＦを、ＭＶ  Ｆ発現構造物であるｐＣＧ−Ｆとともに、Ｃ１７０およびＡ４３１細胞に共導入した。このトランスフェクションは、当該プラスミド２．５ｍｇおよび１５ｍｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔを使用して行った。トランスフェクション後、それらの細胞を、シンシチウムが明確に見えるようになるまで、４８時間〜７２時間、通常の培地でインキュベートした。β−ガラクトシダーゼ活性を検出するためのＸ−ガル染色は、上述のとおりに行なわれた（Takeuchi他、1994）。融合の効率を記録した（−：シンシチウムなし、＋：明らかなシンシチウム、＋＋：豊富なシンシチウム）。
結果
キメラＭＶ  Ｈ発現構造物の構築
リガンドＥＧＦおよびＩＧＦがファクターＸａ切断可能リンカーとともにあるいは当該リンカーなしでＨタンパク質のＣ末端において融合されるキメラＭＶ  Ｈタンパク質をコードする、一連の発現構造物を作った（図２および図３）。図２は、ＣＭＶプロモータによって駆動される構造物を示すが、これらの構造物は哺乳類細胞における選択のための選択可能なマーカーを含んではいない。図３における構造物の発現は、レトロウイルスＬＴＲによって駆動され、これらの構造物は哺乳類細胞における選択のための選択可能なマーカーである、フレオマイシンを含む。
キメラＭＶ  Ｈタンパク質の発現
種々のＭＶ  Ｈ発現構造物、ｐＦＢＨ、ｐＦＢＨ  ＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＸＥＧＦR-、ｐＦＢＨ  ＩＧＦおよびｐＦＢＨ  ＸＩＧＦを、ＴＥＬＣｅＢ６細胞中に安定にトランスフェクションした。免疫ブロットは、これら安定なＴＥＬＣｅＢ６トランスフェクタントから調製された細胞溶解産物について行なった。図４は、すべてのキメラＭＶ  Ｈタンパク質が、野生型のＭＶ  Ｈタンパク質のレベルに匹敵するレベルまで発現されたことを示している。さらに、このブロットは、提示された領域がキメラＭＶ  Ｈ糖タンパク質から自然に切断されていないことも示している。
細胞間融合アッセイ
ＭＶ  Ｈ発現構造物であるｐＣＧ−Ｈ、ｐＣＧ−Ｈ  ＥＧＦR-、ｐＣＧ−Ｈ  ＸＥＧＦR-、ｐＣＧ−Ｈ  ＩＧＦおよびｐＣＧ−Ｈ  ＸＩＧＦを、ＭＶ  Ｆ発現構造物であるｐＣＧ−Ｆとともに、β−ガラクトシダーゼを発現するＣ１７０およびＡ４３１細胞に共導入した。これらの細胞は、トランスフェクション後７２時間の時点で、細胞間融合の検出を容易にするためにＸ−ガル基質で染色された。アッセイの結果を、表１および表２ならびに図５に示す。キメラＭＶ  Ｈタンパク質は、Ｃ１７０細胞中では細胞間融合の強い誘導物質であったが、その強さは、非修飾Ｈタンパク質に比較してわずかに小さかった（表１、図５）。Ａ４３１中の細胞間融合は、非修飾ＭＶ  Ｈタンパク質が細胞間融合の強い誘導物質であったのに比べて、キメラＨタンパク質では認められなかった（表２）。
この結果は以下のことを明らかにする。
１）  外来のポリペプチドは、ＭＶ  Ｈタンパク質の最Ｃ末端への融合物として提示され得る。
２）  キメラＨ糖タンパク質は、効率的に発現され、かつ細胞間融合アッセイにおいて機能し得る。
３）  提示されたリガンドは、細胞間融合の特異性を標的とすることができる。
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例３  細胞質の尾部が切詰められたＧＡＬＶエンベロープがヒト腫瘍細胞系に対し高融合誘導性であることの実証
材料および方法
使用されるプラスミド
麻疹ウイルス（ＭＶ）ＦおよびＭＶ  Ｈタンパク質の発現構造物を、それぞれ、発現プラスミドｐＣＧ−ＦおよびｐＣＧ−Ｈによってコードした（Catomen他、Virology 214 p628, 1995）。ＦＢｄｅｌＰＧＡＳＡＦは野生型のＧＡＬＶエンベロープをコードし、ＦＢｄｅｌＰＧＡＳＡＦ−ｆｕｓは、細胞質尾部を欠くＣ末端が切詰められたＧＡＬＶエンベロープをコードする（添付の配列、図６を参照）。
細胞系
ヒトＣ１７０（Durrant他、Br. J. Cancer 53 p37, 1986）、ヒトＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５５５）、ヒトＴＥ６７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８８０５）、ヒトＨｅｌａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）およびネズミの細胞系ＮＩＨ３Ｔ３を、１０％ウシ胎児血清で補足されたＤＭＥＭ中で増殖させた。これら細胞系のすべては、ＮＩＨ３Ｔ３を除いて、ＧＡＬＶエンベロープおよびＭＶ  Ｈ糖タンパク質のための受容体を有する。
細胞間融合アッセイ
細胞を、６ウェルプレートに５×１０5細胞／ウェルで播き、３７℃で１晩インキュベートした。融合誘導性および非融合誘導性プラスミド、ＦＢｄｅｌＰＧＡＳＡＦおよびＦＢｄｅｌＰＧＡＳＡＦ−ｆｕｓをトランスフェクションし、また、ＭＶ  ＨおよびＦ発現構造物、ｐＣＧ−ＨおよびｐＣＧ−Ｆを、細胞系のパネルにトランスフェクションした。このトランスフェクションは、２．５ｍｇの当該プラスミド、および１５ｍｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Qiagen）を使用して実行した。トランスフェクション後、細胞は、シンシチウムが明らかに認められるようになるまで、４８時間〜７２時間、通常の培地でインキュベートし、その際、融合の効率を記録した（−はシンシチウムなし、＋は明らかなシンシチウム、＋＋は豊富なシンシチウム）。
結果
細胞間融合アッセイ
融合誘導性および非融合誘導性プラスミドならびにＭＶ  ＨおよびＦ発現構造物を、細胞系のパネルにトランスフェクションした。それら細胞は、７２時間放置した後に、細胞間融合を記録した。このアッセイの結果を表３に示す。融合誘導性ＧＡＬＶ構造物は、ＭＶ  ＦおよびＨタンパク質が示すのと同様のパターンの融合能力を示す。
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例４  ＧＡＬＶエンベロープ上のＥＧＦの提示
材料および方法
エンベロープ発現プラスミドの構築
エンベロープ発現プラスミドＧＡＬＶＭｏＴは、Ｘｂａ１およびＣｌａ１制限部位を尾部に持つプライマーＧａｌｖｒｅｖＸｂａおよびＧａｌｖｆｏｒｃｌａ２を使用して、プラスミドｐＭＯＶＧａＬＶＳＥＡＴＯｅｎｖ（Wilson他、J. Virol. 63, 2374-2378, 1989）からの、ＧａＬＶｅｎｖをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって、構築した。これらＰＣＲ生成物を、次いで、Ｘｂａ１およびＣｌａ１消化の後、プラスミドＦＢＭｏＳＡＬＦ中に連結した。
キメラエンベロープ発現プラスミドＥＸＧａＬＶＭｏＴを、プライマーｇａｌｖｓｌｑおよびｇａｌｖｆｏｒｃｌａ２を使用して、プラスミドｐＭＯＶＧａＬＶＳＥＡＴＯｅｎｖからのＧＡＬＶｅｎｖをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって構築した。プライマー「ｇａｌｖｓｌｑ」は、Ｎｏｔ１制限部位を尾部に持ち、ファクターＸａ切断シグナル（ＩＥＧＲ）のためのコード配列を含んだ。ＰＣＲ生成物を、Ｎｏｔ１およびＣｌａ１消化の後、プラスミドＥＭｏ中に連結した。これらプライマーの配列を下に示す。制限酵素部位には下線を付し、ファクターＸａ切断シグナルのためのコード配列は太字で示した。
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どちらの構造物の正しい配列も、ジデオキシ配列決定法によって確認された。これら構造物の模式的再現を図７に示す。
ベクター生成
エンベロープ発現プラスミドを、ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドおよびｎｌｓＬａｃＺレトロウイルスベクターを含有する、ＴＥＬＣｅＢ６補足細胞系にトランスフェクションした。安定なトランスフェクタントを５０μｇ／ｍｌフレオマイシンで選択し、プールした。
標的細胞の感染
トランスフェクションされたＴＥＬＣｅＢ６補足細胞系の細胞を３７℃で集密まで増殖させ、その後１日ないし３日間３２℃で放置した後に、その細胞系から上澄みを収集した。培地を取替えて、１晩インキュベーションした後に、上澄みを収集して０．４５μｍフィルタで濾過した。次いで濾過した上澄みを使用して、標的細胞を感染させた。付着性の標的細胞は、感染に先立つ晩に、ウェルあたりおよそ１０5個の細胞で、６ウェルプレートにおいて平板培養し、３７℃で１晩インキュベートした。懸濁細胞を、感染の１時間前に、ウェルあたりおよそ１０6個の細胞で、６ウェルプレートにおいて平板培養した。血清を含まない培地の濾過されたウイルス上澄みを、標的細胞に加えて、８ｍｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、２時間ないし４時間インキュベートした。ファクターＸａ開裂を伴う感染のために、ウイルスを、感染に先立って９０分間、２．５ｍＭのＣａＣｌ2の存在下、ファクターＸａプロテアーゼ４ｍｇ／ｍｌとともにインキュベートした。レトロウイルスの上澄みをその後標的細胞から取除き、培地を通常の培地に取替えた。細胞は３７℃でさらに４８時間ないし７２時間、置いた。β−ガラクトシダーゼの活性を検出するため、Ｘ−ガル染色をその後行った。
結果
ＨＴ１０８０細胞におけるＧａＬＶＭｏＴおよびＥＸＧａＬＶＭｏＴの力価検定
これらのベクターをＨＴ１０８０細胞、すなわちヒトＥＧＦ受容体陽性細胞系について力価検定したとき、ＧａＬＶＭｏＴの力価は１０6ｅｆｕ／ｍｌであったのに対し、ＥＸＧａＬＶＭｏＴの力価は３．６×１０3ｅｆｕ／ｍｌであった。しかしながら、提示された領域を切断するために、感染の前にファクターＸａプロテアーゼとともにベクター上澄みをインキュベートしたときには、ＧａＬＶＭｏＴの力価は１０6ｅｆｕ／ｍｌのままであったのに対し、ＥＸＧａＬＶＭｏＴの力価は３．６×１０4／ｍｌに増加した（表４）。
ＭＤＢＫ細胞におけるＧａＬＶＭｏＴおよびＥＸＧａＬＶＭｏＴの力価検定
これらのベクターをＭＤＢＫ細胞、すなわちウシのＥＧＦ−Ｒ陽性細胞系について力価検定した場合にも、同様の結果が得られた。ＥＸＧａＬＶＭｏＴの力価は、ＧａＬＶＭｏＴと比較して低かったが、プロテアーゼ開裂時には１０倍に増加した（表４）。
ＥＸＧａＬＶＭｏＴによる造血細胞の感染
２つのＥＧＦ−Ｒ陰性造血懸濁細胞系、ＨＭＣ−１およびＭｅｇ−Ｏ１をＥＸＧａＬＶＭｏＴで感染させ、それぞれ２８．８％および３１．６５％の力価（青色細胞のパーセンテージで表わす）を得た。これらの結果は、ベクターＥＸＡについて先に出版されたものと同様である（Fielding他、Blood 91, 1-10, 1998）。ＥＧＦ−Ｒ陽性細胞に関する上に示したデータと関連付けると、これは、提示ドメインが受容体に依存する態様で感染能の低下を引起すという、ＥＸＡベクターに似た特性をＥＸＧａＬＶＭｏＴが示すことを示唆している。
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結論
１．野生型（ＧＡＬＶＭｏＴ）およびキメラテナガザル（Gibbon Ape）白血病ウイルスエンベロープ発現構造物を構築し、ＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌコア粒子およびモロニーＭＬＶ  ｎｌｓＬａｃＺレトロウイルスベクターを含有するレトロウイルスベクター粒子に組込んだ。
２．野生型およびＥＧＦキメラベクターは双方とも、ヒト細胞系を感染させることができる。
３．ＥＧＦキメラの力価は、ＥＧＦ受容体陽性細胞系においてかなり減じられ、また、提示ドメインのファクターＸａ開裂によって増加し得る。力価における最大の低減は、密度が最高のＥＧＦ受容体を有する細胞系において見られる。
４．したがって、テナガザル白血病ウイルスＳＵ糖タンパク質のＮ末端伸長物としてのＥＧＦの提示は、ウイルスの親和性の変化をもたらし、これは、ネズミ白血病ウイルスエンベロープにおけるＥＧＦの提示において見られるものに似ており（Nilson他、Gene Ther. 3, 280, 1996）、ＥＧＦ受容体で媒介される可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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