(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列の該配列に相同のヌクレオチド配列による交換反応の促進方法において、該交換反応が
（ｉ）ポリリジンに由来する主鎖と水溶性ポリアルキレングリコールまたは水溶性多糖に由来するグラフト型側鎖とから構成されるカチオン性高分子、または、
（ｉｉ）ポリアリルアミンに由来する主鎖とデキストランに由来するグラフト型側鎖から構成されるカチオン性高分子、
の存在下で生じることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、該カチオン性高分子がポリリジンに由来する主鎖とデキストランまたはポリエチレングリコールに由来するグラフト型側鎖とから構成される、上記方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、交換反応が、蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）またはＤＮＡチップと標的の二重鎖構造を有するＤＮＡとのハイブリダイゼーションに際して生じる、上記方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、交換反応が、二重鎖構造を有するｍＲＮＡ鎖における特定のヌクレオチド配列と、その相補的配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムもしくはデオキシリボザイムを構成するＲＮＡ、及び３重鎖形成用オリゴヌクレオチドから選ばれる単鎖配列の間で生じる、上記方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、交換反応が、二重鎖構造を有するＤＮＡ鎖における特定のヌクレオチド配列と該配列に相同のヌクレオチド配列とによって生じることにより、遺伝子の発現及び複製を調整する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの操作の際に使用するためのカチオン性高分子の調製物に関する。より具体的には、二重鎖ＤＮＡ鎖あるいはＲＮＡ鎖における特定部位のヌクレオチド配列を相同なヌクレオチド配列（もう一方のＤＮＡあるいはＲＮＡ鎖の対応部位に対しては相補配列である。）で交換する際に用いるカチオン性高分子の調製物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
相同的組換えは、二重鎖ＤＮＡにおける遺伝情報の再編成であり、遺伝情報の保存および複製のために生物界では普遍的に行われる生物現象である。その相同的組換えには、無数の塩基配列から相同な塩基配列を探し出し、相同鎖同士の交換プロセスが含まれる。今日までに、大腸菌内でこれらの機能をつかさどるタンパク質（ＲｅｃＡ）が同定され（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ.，１５５，７７−８５（１９７７）．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ，７４，５２８０−５２８４（１９７７）；Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，２６１１−２６１５（１９８０）など）、類似構造を持ち同様の機能を有するタンパク質が原核生物、真核生物（Ｃｅｌｌ，６９，４５７−４７０（１９９２）など）、ウイルス（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.，１３，７４７３−７４８１（１９８５））など広い範囲で見出されている。また、これらＲｅｃＡタンパク質が、相同的組換えに深く関与していることが明らかとなりつつある。ＲｅｃＡタンパク質は、単鎖ＤＮＡに結合し複合体を形成し、この単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの間における相同な塩基配列を探し出す。相同配列を見つけ出すと、単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの複合体（三重鎖）形成を経て、ＤＮＡを放出する（Ｔａｎｐａｋｕｓｈｉｔｓｕ  Ｋａｋｕｓａｎ  Ｋｏｓｏ．４４，６３１−６４２（１９９９））。このようにＲｅｃＡは二重鎖の一方を交換したヘテロ二重鎖を形成して行く。この過程には、ＡＴＰおよびＭｇ2+が補助因子として必要である。
【０００３】
一方、上述した二重鎖ＤＮＡ上のＤＮＡ鎖交換の原理は、高次構造を持つＲＮＡからの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）やプラスミドＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅過程において重要なプロセスである。具体的には、これら二重鎖ＤＮＡや高次構造を有する単鎖ＲＮＡ鎖上の相補配列へのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にすること、さらには、目的とする増幅産物の合成が完了した時点で、加熱することにより鋳型となる単鎖ＤＮＡあるいは単鎖ＲＮＡを増幅産物である二重鎖ＤＮＡまたは二重鎖ＲＮＡ鎖から解離させることにより、次のプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする必要がある。
【０００４】
二重鎖ＤＮＡのＤＮＡ交換を加熱などの変性過程を行わずに人工的に達成した例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）があり（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｐｇｙ，１４．１７００  １７０４（１９９６）など）、このＰＮＡを用いた新しいＤＮＡおよびゲノム解析法が種種報告されている。しかしながら、ＰＮＡは低イオン濃度下ではＤＮＡ鎖交換を促進するが、生理的イオン濃度条件下では、その性能が極めて低下する。また、天然型ＤＮＡやＲＮＡと異なり、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼやリガーゼなどの基質とならない問題があり、ＰＮＡによるＤＮＡやゲノム解析に制約をもたらしているのが現状である。
【０００５】
このようなＰＮＡの問題点を克服した例としては、ペプチド-ＤＮＡ複合体がある（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，１２１，２０１２−２０２０（１９９９））。しかしながら、Ｍｇイオン存在下ではＤＮＡ鎖交換活性が阻害されるため、ＤＮＡポリメラーゼなどのＭｇイオン依存型酵素との併用が制限される。
【０００６】
上述のように、生体内でＲｅｃＡが行っている機能を模写し、多種多様な条件下において十分な機能を発揮できるものは報告されていない。
【０００７】
一方、最近、本発明者を初めとする研究者らにより、くし型（ｃｏｍｂ-ｔｙｐｅ）のコポリマーが、生体内と同等の条件下でＤＮＡ二重鎖あるいは三重鎖の形成及び安定化を促進することが報告された（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ.，８，３−６（１９９７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．３９，１３３−１３４（１９９８）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ.，９，２９２−２９９（１９９８））。また、上記の最後の論文では、上記コポリマー、特に高度にグラフト化されたコポリマーが低イオン強度媒体中でＤＮＡ鎖間のハイブリダイゼーションが促進されることも示唆されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、人工的に二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位におけるヌクレオチド配列を、それに相同なヌクレオチド配列で交換する際に、ＤＮＡやＲＮＡの加熱などの変性過程を必要とすることなく、反応プロセスの省略あるいは短縮、その他の条件の緩和を可能とするような手段を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上述したように、ある一定のくし型コポリマーは生体内と同等の条件下でＤＮＡ二重鎖あるいは三重鎖の形成及び安定化を促進し、しかも、ＤＮＡ鎖間のハイブリダイゼーションをも促進することが知られている。しかしながら、かような三重鎖ＤＮＡが特定のコポリマーによって安定化されるにもかかわらず、該コポリマーを初めとするカチオン性高分子は上記のような作用と共にまたは別個に単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡと二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとの間の鎖交換をも促進しうることが、今回、見出された。
【００１０】
すなわち、本発明はかような知見に基くものである。
【００１１】
したがって、本発明によれば、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列の該配列に相同のヌクレオチド配列による交換反応を促進するための、カチオン性高分子を有効成分とする調製物が提供される。
【００１２】
【発明を実施するための好ましい態様】
二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとは、相補的な塩基（またはヌクレオチド）対、例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）及びグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、ＲＮＡでは、Ａとウラシル（Ｕ）およびＧとＣとの対合により形成されるＤＮＡ間で、あるいはＲＮＡ間で形成された高次構造を保ちうる鎖を意味する。本発明の文脈上、このようなＤＮＡあるいはＲＮＡは生体成分から単離されたものであっても、また単離されることなく、生体組織片中に存在するものであってもよい。勿論のこと、合成された二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡも包含される。
【００１３】
かようなＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列とは、直鎖状になったＤＮＡあるいはＲＮＡの末端部位あるいは中間部位等のいかなる部位のヌクレオチド配列であってもよい。また、該配列に相同のヌクレオチド配列とは、配列を構成する塩基が実質的に同一であることを意味する。実質的に同一とは、上記特定部位のヌクレオチド配列とそれに対する相同配列はＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのそれぞれが少なくとも９５％は連続する配列順において同一であるか、あるいはそのような配列においてＴがＵに置き代えられている場合をいう。
【００１４】
したがって、交換反応は、相補的な二本の鎖からなる二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが、二本の鎖のうちの一本の鎖における特定部位のヌクレオチド配列がそれに相同のヌクレオチド配列を有する単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにより交換されることが意図されている。具体的な交換の様式としては、二重鎖ＤＮＡの特定部位のヌクレオチド配列が単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける相同のヌクレオチド配列により交換されるか、あるいは二重鎖ＲＮＡの特定部位のヌクレオチド配列が単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける相同のヌクレオチド配列により交換される場合が挙げられる。
【００１５】
単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける相同のヌクレオチド配列は、該単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子全体を占めるものであっても、一部分を占めるものであってもよいが、一般的に全体を占めるものを強く意図している。
【００１６】
交換あるいは交換反応とは、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの特定部位のヌクレオチド配列が、該配列に相同の単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにヌクレオチド配列により単に入れ替わり再構成されることを意味し、生来の特定部位のヌクレオチド配列の切断除を伴うものでない。
【００１７】
本発明に従えば、このような交換反応は、カチオン性高分子の存在下で効率よく起こすことができる。カチオン性高分子としては、上記交換反応に資するものであればいかなるポリマーであってもよいが、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等のアミノ酸、グルコサミン等の糖、エチレンイミン、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクノレート等の合成モノマー等のカチオン性基を形成しうるモノマーに由来するカチオン性ホモポリマー及びコポリマーを挙げることができる。
【００１８】
カチオン性高分子は、さらに、上記のカチオン性ホモポリマーあるいはコポリマーが親水性高分子で側鎖修飾されたグラフト型構造を有するものが好ましい。このような側鎖（グラフト鎖）としては、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、アミロース、アラビノガラクタン等の水溶性多糖、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等の親水性アミノ酸を含む水溶性ポリアミノ酸、アクリルアミド及びその誘導体をモノマーとして用い合成される水溶性高分子、メタクリル酸及びアクリル酸並びにその誘導体（例、ヒドロキシエチルメタクリレート）をモノマーとして用い合成される水溶性高分子、ポリビニルアルコール及びその誘導体からなる群より選ばれる１種以上の水溶性高分子により形成されるものを挙げることができる。
【００１９】
より好ましいカチオン性高分子としては、例えば、上記Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ.，９，２９２−２９９（１９９８）に記載されているような下記の一般式で表されるものを挙げることもできる。
【００２０】
【化１】
0004516643.tif 000002
【００２１】
デキストラン側鎖修飾α-ポリ（Ｌ-リジン）
（以下、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘと略記する）
【００２２】
【化２】
0004516643.tif 000003
【００２３】
デキストラン側鎖修飾ε-ポリ（Ｌ-リジン）
（以下、ε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘと略記する）
【００２４】
【化３】
0004516643.tif 000004
【００２５】
デキストラン側鎖修飾型ポリアリルアミン
（以下、ＰＡＡ-ｇ-Ｄｅｘと略記する）
上記のカチオン性高分子のうち、特に、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ及びε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが本発明において好ましく使用できる。
【００２６】
かようなカチオン性高分子の分子量、また、側鎖修飾基それ自体の鎖長及びグラフトの程度は、具体的な使用目的により最適な値が変動するので限定できないが、当業者であれば、後述の実施例を参照に各最適値を選択することができるであろう。
【００２７】
本発明に従えば、上記カチオン性高分子を有効成分とする調製物が提供されるが、かような調製物は、目的とする交換反応に悪影響を及ぼさない限り、合成された高分子の粗製物あるいは精製された高分子と、必要により、緩衝剤、生理食塩水等から構成することができる。また、高分子は１種または２種以上の混合物であってもよい。
【００２８】
このようなカチオン性高分子は、本発明に従う交換反応においては、一般的に、交換反応に供される総（単鎖＋二重鎖）ＤＮＡあるいはＲＮＡにおけるホスフェートに対するカチオン性基の荷電比が０.１以上、好ましくは０.５〜１０００となるように選ばれる。一方、被交換反応に供される二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡに対する単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡのモル比率は約５を超えるように選ぶことが有利である。
【００２９】
交換反応は、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡが熱変性しないような温度下で行うことができ、ＡＴＰやＭｇ2+などの補助因子を必要とすることなく行うことができる。上記温度は、生物細胞等に悪影響が生じない生理的に許容できる温度、例えば、約５℃〜約４０℃であることが好ましい。
【００３０】
本発明に従うカチオン性高分子は、上記の条件下で二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列を単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの相同のヌクレオチド配列で効率よく交換できる。オリゴヌクレオチドは、５ｍｅｒ以上であれば理論上いかなる鎖長のものでもよい。なお、好ましくは１０ｍｅｒ以上５００ｍｅｒ以下の配列に本発明は適用できる。したがって、本発明のカチオン性高分子の調製物は、例えば、二重鎖ＤＮＡやＲＮＡに対するプライマーやプローブまたは、それ自体既知の標識や医薬等を担持するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、次いで二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの特定部位にハイブリダイズしたプライマーやプローブまたはオリゴヌクレオチドの機能を利用するＰＣＲ及びＲＴ-ＰＣＲプロセスやＤＮＡチップを用いるプロセス、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用する核酸分析において有用である。
【００３１】
また、２重鎖構造を持つｍＲＮＡ上へ特定の部位に対し、その相補的配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、デオキシリボザイム、３重鎖形成用オリゴヌクレオチドとの交換を促進し、これらオリゴヌクレオチドの遺伝子制御機能を向上させる上でも本発明によるカチオン性高分子は有用である。さらに、ゲノムＤＮＡ２重鎖上の特定の部位との相補的ヌクレオチド鎖の交換を生じさせることにより、（ＤＮＡ結合性タンパク質の結合を調整し）複写および転写課程を制御する上でも有用である。
【００３２】
【実施例】
以下、理解を容易にするため、二重鎖オリゴヌクレオチドと単鎖オリゴヌクレオチドの交換反応を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの反応は長鎖の二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡと単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとの間でも、同様に起こるものと理解されている。
【００３３】
実施例１：α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘによる単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの間でのＤＮＡ鎖交換
下記表−１のオリゴヌクレオチドをＨｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。精製済みオリゴヌクレオチドを１０ｍＭの燐酸緩衝液（０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ．pＨ７.２）に溶解し、ＵＶ  スペクトロスコピー（ＢｅｃｋｍａｎＤＵ  ６００）にてＵＶ吸収測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。表−１のＥ−１とＥ−２の相補的配列を有するＤＮＡを等モル（１.５４μＭ）混合し、アニーリングすることにより、二重鎖ＤＮＡを調製した。
【００３４】
【表１】
0004516643.tif 000005
【００３５】
α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘは、その合成、精製、分析を上記Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ.，８，３−６，（１９９７）に従って行って得られたカチオン性ポリマーを用いた。
【００３６】
ＤＮＡ交換実験は以下の手順で行った。１.５４μＭの二重鎖ＤＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ）溶液１０μＬに一定量の単鎖ＤＮＡを添加し、［単鎖ＤＮＡ］／［二重鎖］のモル比率が５になるようにＤＮＡ溶液を調製した。このＤＮＡ混合溶液に、ポリマーアミノ基のＤＮＡ中ホスフェート基に対するモル比
【００３７】
【数１】
0004516643.tif 000006
【００３８】
が２になるようにポリマーを添加した。さらに、最終的に１０ｍＭとなるようにＭｇＣｌ2を添加し、各ＤＮＡ溶液が２５μＬとなるように緩衝溶液を添加した。この各サンプル溶液を３７℃及び１５℃でインキュベートした。所定時間後サンプルチャーブを氷冷することによりＤＮＡ鎖交換反応を停止した。その後、ＤＮＡとポリマーを解離させる目的で、サケ精子ＤＮＡ（５μＬ，１.７ｍｇ／ｍＬ）を添加した。ＤＮＡ交換量は、サンプルをＴＢＥ緩衝溶液中１３％ポリアクリルアミド電気泳動（１００Ｖ／ｃｍ，２時間）し、蛍光標識された二重鎖ＤＮＡのフラクションをＢｉｏｆｉｌ  Ｂｉｏｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒで解析することにより求めた。また、ＤＮＡ交換率は、以下の式−１により算出した。
［式１］
ＤＮＡ鎖交換率（％）＝（１−［反応後の２重鎖の蛍光強度］／［反応前の２重鎖の蛍光強度］）×｛（２重鎖のモル数＋単鎖のモル数）／（単鎖のモル数）｝×１００
結果を図１に示す。３７℃においては、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが存在しない場合、３０分インキュベートしても二重鎖ＤＮＡ中のＦＩＴＣ-ラベルＤＮＡの３０％が相同的単鎖ＤＮＡによって交換されたのみであったのに対し、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ存在下においては、５分のインキュベーションでもＤＮＡ鎖交換率が９０％に達した。また、１５℃で同様の実験を行ったところ、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが存在しない場合においては、ＤＮＡ交換率５０％に達するのに２４時間以上必要であったのに対して、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが存在下においては、１時間でＤＮＡ交換率５０％に達した。
【００３９】
実施例２：α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換促進効果に及ぼすＭｇイオンの効果
実施例１と同じＤＮＡを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含まない緩衝溶液と含む緩衝溶液に様々な単鎖ＤＮＡ／２重鎖ＤＮＡの比になるように調製し、これに荷電比が２になるようにα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘを加えた。このサンプルを３７℃で３０分インキュベート後、実施例１と同等な方法でＤＮＡ交換率を求めた。
【００４０】
結果を図２に示すが、Ｍｇイオンの存否に関わらずα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが優れたＤＮＡ鎖交換促進能を有することが明らかになった。
【００４１】
実施例３：α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ、α-ポリ（Ｌ-リジン）（α-ＰＬＬ）及びε-ポリ（Ｌ-リジン）（α-ＰＬＬ）によるＤＮＡ鎖交換の比較
α-ＰＬＬ及びε-ＰＬＬは、シグマアルドリッチジャパンおよび和光純薬工業より購入したものを用いた。α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘは、実施例１と同様のものを用いた。一方、ＤＮＡ鎖交換反応は、ポリマーの添加量及び反応時間以外は実施例１と同様に行った。すなわち、ポリマーは、系中に存在するＤＮＡ対するポリマーの電荷比が、０.５、１及び５になるように添加し、反応時間３０分で交換反応を施したのち、ＤＮＡ鎖交換率を求めた。
【００４２】
結果を、図３に示す。α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘでは電荷比０.５で約９０％の交換率を示したのに対して、α-ＰＬＬでは約６０％、α-ＰＬＬでは４０％と交換効率が低かった。しかし、いずれのＰＬＬでも、添加量を増やし電荷比５にすると、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ（電荷比０.５のとき）と同等の交換率を示した。
【００４３】
実施例４：α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘとＰＡＡ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換促進能の比較
上記Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ.，８，３−６，（１９９７）に記載の方法により、種々α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘを合成した（表−２）。また、ＰＡＡ-ｇ-ＤｅｘはＰＡＡ（日東紡績）とデキストランからα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘと同様の手法で合成した（表−３）。
【００４４】
【表２】
0004516643.tif 000007
【００４５】
ＤＮＡ鎖交換反応及び評価は、使用したポリマー（表−２、表−３）以外は実施例３と同様に行った。
【００４６】
結果を図４に示す。いずれのＤｅｘ含量およびいずれの電荷比においてもα-ＰＬＬを主鎖に持つα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘの方が、ＰＡＡを主鎖に持つＰＡＡ-ｇ-ＤｅｘよりＤＮＡ鎖交換促進能が高いことが明らかとなった。
【００４７】
実施例５：他のカチオン性化合物とα-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換促進能の比較二重鎖ＤＮＡを安定化することが知られているスペルミン（および相補的ＤＮＡ鎖の単鎖からのハイブリダイゼーションを著しく促進することが知られているカチオン性界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８．８２３７−８２４１（１９９１））、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘとε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘの比較を行った。なお、ε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘは、出発物質としてε-ＰＬＬを用い、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ同様に合成した。スペルミンおよびＣＴＡＢはシグマアルドリッチジャパンより購入し、実施例３と同様な方法でＤＮＡ鎖交換反応および評価を行った。
【００４８】
結果を図５に示す。α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘがもっとも効果的に鎖交換反応を促進することがわかった。
【００４９】
【発明の効果】
以上本発明により、これまで変性を必要としたＰＣＲなどＤＮＡやＲＮＡのハイブリダイゼーションにおいて、プロセスの短縮、条件の緩和、さらには、非特異的結合を押さえることにより効率を向上させ、さらには、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖交換やインキュベーションの機能向上に伴う、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ、リボザイムおよび三重鎖形成性オリゴヌクレオチド等による遺伝子発現調節機能の向上を可能にする。
【００５０】
【配列表】
0004516643.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ交換反応に関する結果を示す。Ｄｅｘで側鎖修飾したＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが、きわめて良好なＤＮＡ鎖交換促進能を有することを示す図である。
【図２】α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換反応促進効果をＭｇイオン存否において検討した結果である。α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換反応促進効果は、Ｍｇイオンの存否に関わらず高く保持されていることがわかる。
【図３】ＰＬＬ、ε-ＰＬＬ及びα-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ交換試験に関する結果を示す。ＰＬＬ、ε-ＰＬＬもＤＮＡ鎖交換能を有するが、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘがより優れたＤＮＡ鎖交換作用を示す図である。
【図４】α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘとＰＡＡ-ｇ-Ｄｅｘの中のＤＮＡ鎖交換反応に与える影響を見たものである。ＰＡＡを主鎖とするＰＡＡ-ｇ-Ｄｅｘに比べα-ＰＬＬを主鎖とするα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘはそのデキストラン含量に依存せず優れたＤＮＡ鎖交換促進能を発現することを示す図である。
【図５】種々のカチオン性化合物のＤＮＡ鎖交換反応に与える影響を見たものである。２重鎖安定下可能をもつスペルミンや相補的な単鎖のハイブリダイゼーションを著しく促進するＣＴＡＢに比べ、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが優れたＤＮＡ鎖交換促進能を発現することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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