(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列の
【外１】
0004494633.tif 000010
の一つを有する単離され、合成され又は組換えで得られたω−コノトキシン・ペプチド。
【請求項２】
下記の配列
ＣＫＳＫＧＡＫＣＳＫＬＭＹＤＣＣＳＧＳＣＳＧＴＶＧＲＣ（配列番号：５）
を有する請求項１記載のω−コノトキシン・ペプチド。
【請求項３】
Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネルよりＮ−型カルシウムチャンネルに対してより高い選択性を有する請求項１又は請求項２記載のω−コノトキシン・ペプチド。
【請求項４】
ペプチド又は他の化合物のカルシウムチャンネル結合活性を試験するための受容体結合検定における、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の単離され、合成され又は組換えで得られたω−コノトキシン・ペプチドの使用。
【請求項５】
請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ペプチド（ただし、配列番号５，１４，１５または２０のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものに限る。）をコードするヌクレオチド配列又は該ペプチドをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ペプチドの全て若しくは一部をコードするヌクレオチド配列又は該ペプチドの全て若しくは一部をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸プローブであって、該ω−コノトキシン・ペプチドの第四ループの全てをコードするプローブ又はそれらと相補的であるプローブ。
【請求項７】
請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ペプチドに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体。
【請求項８】
ベクター部分及び請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ペプチド（ただし、配列番号５，１４，１５または２０のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものに限る。）をコードできる核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項９】
請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ぺプチド、並びに薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む組成物。
【請求項１０】
Ｎ−型カルシウムチャンネルの遮断が有効な治療に結びつく状態を治療するための医薬の製造における、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ペプチドの使用。
【請求項１１】
虚血後のニューロン損傷の減少、無痛覚の形成、又は麻酔の無痛覚の増大、精神分裂病の治療又は興奮性の精神病や高血圧や炎症や気管支収縮を引き起こす疾患の治療、又は神経障害痛の進行の阻害、のための医薬の製造における、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ペプチドの使用。
【請求項１２】
無痛覚の形成のため、麻酔の無痛覚の増大のため又は神経障害痛の進行阻害、のための医薬の製造における、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
Ｎ−型ＶＳＣＣでの活性をもつ化合物を同定するためのスクリーニングにおける請求項１〜請求項３いずれか１項に記載のω−コノトキシン・ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規なオメガ−コノトキシン（ω−コノトキシン）クラスの新規なペプチドに関し、そして薬理手段としてのそれらの使用、並びにＮ−型カルシウム・チャンネルの遮断が、例えば、虚血後のニューロン損傷の減少、無痛覚の形成、又は麻酔の無痛覚の増大において有益であり、精神分裂病、興奮性の精神病、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患の治療において有益であり、そして神経障害痛の進行阻害において有益である任意の適応におけるそれらの使用に関する。本発明はこれらのペプチドを含む薬学的組成物及びこれらのペプチドの有用な類似体を見出す際に役立つ核酸プローブにも関する。
【０００２】
コナス属（円錐巻貝）の捕食性の海洋性巻貝類は、毒の注入により獲物を動けなくする海洋性軟体動物の多様な一つの科である。この毒は、種々の異なる種類の細胞受容体を標的にするコノトキシン類として知られるペプチド類の複雑な混合物である。これらの軟体動物が餌にする獲物が異なるように、毒中に見出されるペプチド類の混合物は円錐巻貝の種の間で異なる。
【０００３】
このような毒から単離され、ω−コノトキシン類として知られるペプチド類の一つの特定のファミリーは、電位感受性カルシウムチャンネル（ＶＳＣＣ）を標的にし遮断することが見出されてきた。これらのω−コノトキシン類は六つの特徴的なシステイン置換とジスルフィド結合の様式を備えたかなり小さなペプチド類（典型的には２４から３２アミノ酸）である。ジスルフィド結合の様式及びシステイン残基の分布は、このペプチドが四つのループを含むと理論的に考えられうることを意味している。システイン残基の１と２、２と３、４と５、及び５と６の間のアミノ酸がループを規定し、システイン残基の３と４は隣接する。
【０００４】
コナス属の種々の異なる種の複雑なペプチド毒から単離されたか、又は既知のω−コノトキシン類の化学的変異体として合成された異なるω−コノトキシン類の研究は、ニューロンのカルシウムチャンネルの種々のサブタイプに対する親和性及び選択性を様々に示すω−コノトキシン類の配列を提供してきた。ＶＳＣＣに対するこれらのペプチド類の一部の親和性の中には、幾つかのω−コノトキシン類がニューロンの電位感受性カルシウムチャンネルの異なるサブタイプを規定するための重要な研究手段となっている程のものもある。ＧＶＩＡなどのω−コノトキシン類はＮ−型カルシウムチャンネルに対して高レベルの選択性を有し、一方、ＭＶIIＣなどの他のω−コノトキシン類はＮ−型チャンネルに対して低い親和性を有するがＰ／Ｑ−型チャンネルに強く結合する。これらのリガンドの標識形（例えば、 125ヨウ素化ＭＶIIＡ）は、通常、ＶＳＣＣに関する薬理学的検定に使用される。
【０００５】
この入手可能なコノトキシン類は幾つかのカルシウムチャンネルのサブタイプを定義するのに役立つのに対し、異なる結合の様式及び異なる親和性を示す新規なリガンドはチャンネルのサブタイプをさらに定義するのに有用でありうる。
【０００６】
研究手段としてのこれらの使用に加えて、Ｎ−型カルシウムチャンネルを標的にするω−コノトキシン類は、虚血誘導性の脳障害、薬物誘導性でありうるか又は精神医学障害に起因しうる急性の精神病発現、気管支収縮、高血圧、炎症及び慢性痛を引き起こす疾患を含む種々の状態の治療における使用が提唱されてきた。ω−コノトキシン類は精神分裂病の治療、無痛覚の形成、及び麻酔誘導性の無痛覚の増大にも使用されうる。本発明の化合物はＮ−型カルシウムチャンネルの遮断が有益な任意の適応症に有用でありうる。ＭＶIIＡ、又は合成形態ではＳＮＸ−１１１として知られる一つの特定のω−コノトキシンはこれらの適用の幾つかのために臨床試験中である。
【０００７】
ω−コノトキシン類の使用におけるこれらの前進にも関わらず、現在利用できる化合物は理想的な治療法ではない。例えば、ＳＮＸ−１１１は末梢のチャンネルでの作用の結果として高血圧を惹起すると報告されている。別のω−コノトキシン類であるＧＶＩＡはＮ−型カルシウムチャンネルの強力なアンタゴニストであるが、不可逆的な様式で上記チャンネルに結合するため、治療法として適していない。多くの他の既知のω−コノトキシン類は、適切な治療法候補と考えられるほどＮ−型チャンネルに対する十分なレベルの選択性を有しておらず、Ｐ／Ｑ−型チャンネルの遮断は死に至りうる。
【０００８】
従って、Ｐ／Ｑ−型チャンネルよりＮ−型カルシウムチャンネルに対して選択性を有する新規な治療薬剤が必要とされており、この薬剤はＮ−型カルシウムチャンネルに関する状態の治療に有用でありうる。
【０００９】
本発明の第一の側面においては、システイン残基５とシステイン残基６の間の第四のループが、下記のアミノ酸配列
ＳＧＴＶＧＲ（配列番号：１）
又は一つ以上のアミノ酸の置換若しくは側鎖の修飾をうけた上記配列を含む、単離され合成され又は組換えで得られたω−コノトキシン・ペプチドを提供する。
【００１０】
第四のループは上記の配列、又は一つ以上のアミノ酸の同類置換若しくは側鎖の修飾を受けた上記配列から構成されることが好ましい。
【００１１】
ω−コノトキシン・ペプチドの第一、第二、及び第三のループのそれぞれが天然のω−コノトキシン・ペプチドのループ、又は一つ以上のアミノ酸の置換、付加若しくは欠失をうけた上記のアミノ酸配列に対応することが好ましい。
【００１２】
置換は、アミノ酸が異なる天然のアミノ酸残基又は非通常のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸の変更を包含する。このような置換は「同類」として分類され、その場合、ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基は類似の特性をもつ他の天然のアミノ酸と置き換わり、例えば、Ｇｌｙ←→Ａｌａ、Ｖａｌ←→Ｉｌｅ←→Ｌｅｕ、Ａｓｐ←→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ←→Ａｒｇ、Ａｓｎ←→Ｇｌｎ又はＰｈｅ←→Ｔｒｐ←→Ｔｙｒが挙げられる。幾つかの非通常アミノ酸も天然のアミノ酸との置換に適しうると理解されるべきである。例えば、オルニチン、ホモアルギニン及びジメチルリシンはＨｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓと関連する。
【００１３】
本発明により包含される置換は「非同類」であってもよい。その場合、ポリペプチド中に存在するアミノ酸残基は、異なる群に由来する天然のアミノ酸などの異なる性質を有するアミノ酸と置換される（例えば、電荷を帯びたアミノ酸又は疎水性のアミノ酸をアラニンと置換する）、又は天然のアミノ酸は非通常のアミノ酸と置換される。
【００１４】
アミノ酸の置換は、通常、一つの残基であるが、固まりの又は分散した複数の残基であってもよい。
【００１５】
アミノ酸の置換は同類であることが好ましい。
【００１６】
付加は一つ以上の天然又は非通常のアミノ酸残基の付加を包含する。欠失は一つ以上のアミノ酸残基の欠失を包含する。
【００１７】
上述したように、本発明は一つ以上のアミノ酸が側鎖の修飾をうけたペプチド類を含む。本発明により意図される側鎖の修飾の例には、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化後のＮａＢＨ4 による還元、メチルアセチミデートでのアミディネーション、無水酢酸でのアシル化、シアン酸塩でアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、及びピリドキサール−５−リン酸でのリシンのピリドキシル化後のＮａＢＨ4 による還元などのアミノ基の修飾が含まれる。
【００１８】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬による複素環縮合産物の形成により修飾されうる。
【００１９】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレア形成を経るカルボジイミド活性化後、例えば対応するアミドへの誘導により修飾されうる。
【００２０】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによりカルボキシメチル化、過ギ酸酸化によるシステイン酸形成、他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸又は他の置換されたマレイミドとの反応、４−クロロメルクリ安息香酸塩、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、フェニルメルクリ塩化物、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール及び他の水銀剤を用いる水銀誘導体の形成、アルカリ性ｐＨにおけるシアン酸塩によるカルバモイル化などの方法により改変されうる。システイン残基のいかなる修飾も、必要なジスルフィド結合を形成するペプチドの能力に悪影響を及ぼしてはいけない。ペプチドが一つ以上のジスルフィド結合の代りにジセレン結合を形成するようにシステインのスルフヒドリル基をセレンの等価物と置換することも可能である。
【００２１】
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化、又は２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド若しくはスルフェニルハロゲン化物によるインドール環のアルキル化により修飾されうる。他方で、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により改変して３−ニトロチロシン誘導体を形成しうる。
【００２２】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化又はジエチルピロカルボン酸塩によるＮ−カルベトキシル化により達成されうる。
【００２３】
プロリン残基は、例えば、４位のヒドロキシル化により修飾されうる。
【００２４】
幾つかのアミノ酸残基、例えば、メチオニンはある状況下で酸化されやすい。時には、酸化された残基は親ペプチドの生物活性と同様な該活性を保持しうるため、ペプチドの酸化形態は本発明の範囲内であると考えられ、例えば、ＣＶＩＤでは、メチオニン残基が酸化されている。しかし、時には、アミノ酸残基の酸化は活性又は選択性を低下させうる。従って、酸化可能な残基が存在する場合、それらは別のアミノ酸で置換されうる。置換は、例えば、電荷及びサイズなどの同様の性質を有するアミノ酸でなされてもよく、又は異なる性質を有するアミノ酸でなされてもよい。例を挙げると、ＣＶＩＤの場合、１２位のメチオニン残基は、例えば、ノルロイシン、Ｏ−メチルセリン、Ｏ−メチルホモセリン又はアラニンで置換されてもよい。
【００２５】
修飾された側鎖を有するアミノ酸及び他の非天然のアミノ酸の一部の一覧を表１に示す。
【００２６】
【表１】
0004494633.tif 000002
【００２７】
【外４】
0004494633.tif 000003
【００２８】
【外５】
0004494633.tif 000004
【００２９】
これらのタイプの修飾は、個体に投与される場合又は診断薬として使用される場合、ペプチドを安定化するために重要である。ペプチドを安定化するため又は、例えば、膜貫通性若しくは溶解性などの他の性質を強化するために、他の修飾がペプチドに施されうる。このような修飾は、一つ以上のアミノ酸の側鎖を修飾して他のタイプの基、例えば、親油性の基を結合させることを含む。このような結合は、ペプチドの活性を妨げないようにペプチドから離して他の基又は複数の基を配置するよう設計された連結基を介して行われる。当業者は本発明のペプチドを修飾する方法を容易に決定できるはずである。このようなペプチドの全ての修飾形態が本発明の範囲内であると考えられる。
【００３０】
本発明により意図される他の誘導体は完全な非グリコシル化分子から修飾されたグリコシル化分子までの範囲のグリコシル化変異体を含む。改変されたグリコシル化の様式は異なる宿主細胞における組換え分子の発現から生じうる。
【００３１】
本発明のω−コノトキシン類は、通常、Ｃ末端でアミド化（amidated) されているのが通常であるが、遊離のカルボキシル末端をもつ化合物又はＣ末端で他の修飾を持つ化合物も本発明の範囲内であると考えられる。このペプチド類はアミド化されているか遊離のカルボキシル基を有することが好ましい。
【００３２】
該ペプチド類はＣｙｓ残基及び特徴的なジスルフィド結合様式を保持することが好ましい。さらなるＣｙｓ残基がジスルフィド結合の形成中保護されるならば、該ぺプチド類はさらなるＣｙｓ残基を含んでもよい。
【００３３】
該ペプチド類が、
ＳＫＬＭＹＤ（配列番号：２）、
ＳＲＬＭＹＤ（配列番号：３）、
ＤＲＬＭＹＤ（配列番号：４）、
ＤＫＬＭＹＤ（配列番号：３３）、
ＳＫＬＡＹＤ（配列番号：３４）、
ＳＫＬＮｌｅＹＤ（配列番号：３５）、
ＳＲＬＮｌｅＹＤ（配列番号：３６）、
ＳＫＬＯｈｍｈｓｅｒＹＤ（配列番号：３７）、
ＳＫＬＯｍｓｅｒＹＤ（配列番号：３８）
から選択される配列又は一つ以上の同類アミノ酸置換若しくは側鎖の修飾をうけた上記配列を含む第二ループを有することが好ましい。
【００３４】
特に好ましい態様においては、ω−コノトキシンぺプチド類は下記の配列を有する：
ＣＶＩＤ（１）  ＣＫＳＫＧＡＫＣＳＫＬＭＹＤＣＣＳＧＳＣＳＧＴＶＧＲＣ
１              ２          ３        ４
（配列番号：５）
【００３５】
４個のループは下線を付けて示される。このペプチドはコナス・カタス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｔｕｓ）から単離され、本明細書ではＣＶＩＤと称する。このペプチドは、受容体結合検定においてＰ／Ｑ−型カルシウムチャンネルよりＮ−型カルシウムチャンネルに対して強い効力と高い選択性を有することが示された。ＣＶＩＤの二つの修飾形もＮ−型カルシウムチャンネルに対する強い効力と高い選択性を有することが示された。これらは下記の通りＲ10−ＣＶＩＤ及びＤ9 Ｒ10−ＣＶＩＤと称する。
Ｒ10−ＣＶＩＤ（２）      ＣＫＳＫＧＡＫＣＳＲＬＭＹＤＣＣＳＧＳＣＳＧＴＶＧＲＣ（配列番号：６）
Ｄ9 Ｒ10−ＣＶＩＤ（３）  ＣＫＳＫＧＡＫＣＤＲＬＭＹＤＣＣＳＧＳＣＳＧＴＶＧＲＣ（配列番号：７）
【００３６】
本発明のペプチド類はＣＶＩＤなどの天然のコノトキシン・ペプチド類であってもよく、このような天然ペプチド類の誘導体であってもよい。天然のコノトキシン・ペプチド類の誘導体は、上述したような一つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により天然のものとは異なっていてもよい。
【００３７】
天然ペプチド類の誘導体を形成するための修飾では、活性な天然ペプチド類のアミノ酸配列を比較し、もしあれば、活性種間でどの残基が保存されるかを決定することが役立つ。これらの保存された残基の置換は、禁止はしないが、非保存的残基の置換より好まれない。
【００３８】
Ａｌａが一つ以上の残基と置換した誘導体は、薬理団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を同定するために使用できる。一時に一つ又は二つのアミノ酸だけがＡｌａと置換されることが好ましい。電荷を帯びた残基、極性残基、又は疎水性残基がそれぞれ置換されたさらなる新規なペプチド類を作成することができ、これらは受容体に対するこのペプチドの薬理学的クラスの結合に関与する相互作用のタイプをより正確に定義する助けとなる。電荷が逆になる又は極性残基が疎水性残基と置換した非同類置換は、さらに結合に関与する残基を同定できる。これら全てのペプチド類は、改良された効力又はより高い選択性を示す可能性を有する。効力、選択性及び／又は安定性を改良するために非天然アミノ酸の変更も含めることができよう。
【００３９】
露出した残基は最も受容体結合に関与するらしく、体系的に置換できる。効力及び／又は選択性を改良するためのさらなる結合相互作用を得るため、より長い側鎖の形態又は非同類変更を用いて、結合に関与する残基及び薬理団のちょうど周囲にある残基を変更することに特に重点がおかれる。
【００４０】
当業者に知られているタイプ（ニールセンら、１９９６年及び／又は１９９９年）及び実施例５にさらに記載されるタイプの三次元 1Ｈ・ＮＭＲ研究により、ＣＶＩＤがＭＶIIＡなどの既知のω−コノトキシン類と同様な折りたたみを採ることが示される。しかし、これらのω−コノトキシン類と違って、ＣＶＩＤのループ４は既知のω−コノトキシン類とは異なる方向で見出され、ＣＶＩＤはループ２とループ４をともに維持する二つの水素結合をも有する。これらはＣＶＩＤのＶＳＣＣ間を識別する能力に寄与しうる因子である。
【００４１】
このループ４の新規なコンホーメーション及びＣＶＩＤのループ２とループ４間の安定化を考慮して、一つの好ましい誘導体群はＣＶＩＤに見られる方向と同様なループ４の方向を維持する群である。誘導体のさらに好ましい群は、ループ２及びループ４のコンホーメーションを安定化するループ２とループ４の間の一つ又は複数の相互作用を有するこれらのω−コノトキシン類である。当業者は、特定のペプチド類の三次元構造、ループ４の方向及びループ間の相互作用を容易に決定しうる。
【００４２】
誘導体の別の好ましい群は、ＣＶＩＤの残基１０、１１、２２及び２３を維持するか又はこれらにおける同類置換のみを有するものである。
【００４３】
本発明の別の様態において、コノトキシンＣＶＩＤのループ１から３の一つ以上が異なるω−コノトキシンの対応するループで置換されたキメラのω−コノトキシン・ペプチドを提供する。
【００４４】
好ましい基を持つＣＶＩＤ誘導体は、ＣＶＩＤのある残基を維持するω−コノトキシン・ペプチド類である。これらの誘導体は下記の配列
ＣｘｘｘＧｘｘＣｘＫＬｘＹｘＣＣｘＳＣＳＧｘＶＧＲＣ
で表され、ここで、ｘは任意の他のアミノ酸であってもよく、一つまでのｘは欠失してもよい。ｘに対する好ましい選択は、Ｎ−型ＢＳＣＣ選択性及び同類置換又はこれらのアミノ酸のアラニン置換を備えたω−コノペプチド類由来の対応する天然のアミノ酸であり、それらの全てが修飾された側鎖を有してもよい。例えば、メチオニンはＯ−メチルセリン又はＯ−メチルホモセリンで置換してもよい。
【００４５】
幾つかの既知のコノトキシン類はつぎの通りである。
ＭＶIIＡ（ＳＮＸ−III ）  ＣＫＧＫＧＡＫＣＳＲＬＭＹＤＣＣＴＧＳＣＲＳＧＫＣ（配列番号：８）
ＭＶIIＣ                  ＣＫＧＫＧＡＰＣＲＫＴＭＹＤＣＣＳＧＳＣＧＲＲＧＫＣ（配列番号：９）
ＧＶＩＡ                  ＣＫＳＯＧＳＳＣＳＯＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＯＹＴＫＲＣＹ（配列番号：１０）
【００４６】
ＧＶＩＡの配列において、「Ｏ」は４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を指す。このアミノ酸残基は、コードされたペプチドの翻訳後修飾から生じるものであり、そのヌクレオチド配列が直接コードしているわけではない。
【００４７】
本発明により意図されるキメラのω−コノトキシン類はＤＡＤＤ、ＤＡＧＤ、及びＧＧＧＤを含む。ここで、Ｄ、Ａ又はＧはＣＶＩＤ、ＭＶIIＡ又はＧＶＩＡからそれぞれ選択されるループを表す。従って、ＤＡＤＤはＣＶＩＤから選択されるループ１、３及び４並びにＭＶIIＡから選択されるループ２に対応し、このキメラのω−コノトキシンはＲ10−ＣＶＩＤと同一である。
【００４８】
本発明の幾つかの他のω−コノトキシン・ペプチド類は、実施例３で記載される一般的手順にしたがってコナス・カタスから単離されたｍＲＮＡによりコードされていることが見出された。これらのコードされたペプチド類は標準的手法により合成され、ＣＶＩＤの誘導体と考えられうる。配列はつぎの通りである。
【００４９】
【外６】
0004494633.tif 000005
【００５０】
ＣＶＩＤの他の誘導体の例には下記の配列が含まれる。
【００５１】
【外７】
0004494633.tif 000006
【００５２】
化合物（１３）及び（１５）（配列番号：２３及び２５）はＣ末端及びＮ末端でそれぞれ付加的アミノ酸を有する。
【００５３】
化合物（１４）（配列番号：２４）はＣ末端に遊離のカルボキル基を有する。
【００５４】
化合物（１６）（配列番号：２６）はＮ末端でアシル化されている。
【００５５】
化合物（２２）（配列番号：３２）はスルフォキシドに酸化されたメチオニン残基を有する。
【００５６】
化合物（１０）、（１７）、（２）及び（２１）（それぞれ配列番号：２０、２７、３０及び３２）はメチオニン置換体を表す。
【００５７】
ω−コノトキシン・ペプチドの好ましい群はＣＶＩＤ、化合物（４）、（５）、（１０）、（１７）、（１８）（２０）及び（２１）である。特に好ましいω−コノトキシン・ペプチドはＣＶＩＤである。
【００５８】
添付の配列表において、アミノ酸Ｘａａは表２に示すものである。
【００５９】
【表２】
0004494633.tif 000007
【００６０】
本発明によるペプチド類はＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルよりＮ−型カルシウムチャンネルに対して選択性を有することが好ましい。本明細書で使用される「選択的」及び「選択性」という用語は、Ｎ−型カルシウムチャンネルにおけるペプチドの結合活性がＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルにおける結合活性より高いことを意味する。当業者は標準技術を用いてこれらのカルシウムチャンネルに対するペプチドの選択性を容易に測定できるであろう。
【００６１】
ヨー素化されたＣＶＩＡ及びＭＶIIＡは、それぞれ、Ｎ−型及びＰ／Ｑ型のカルシウムチャンネルに対する高親和性リガンドであり、受容体結合検定（クリスティパティら、１９９４；ナダスディら、１９９５）に日常的に使用されている。このような検定は本発明のペプチド類のカルシウムチャンネル結合活性を試験するために使用されうる。リューら（１９９７）によって記述されたような機能検定もＮ−型カルシウムチャンネルにおける活性を測定するのに役立ちうる。本発明のペプチド類もこのような検定に使用されうる。
【００６２】
本発明のω−コノトキシン類は、Ｎ−型カルシウムチャンネル及び／又はこのようなチャンネルの特定のサブタイプと相互作用する化合物を同定するための検定及び／又はスクリーニングを実施するために、通常、放射性ヨウ素化されたＣＶＩＤなどの標識形態で使用されうる。当業者はこのような検定及び／又はスクリーニングを容易に確立することができるであろう。本発明の化合物の標識された種々の変形体は標準的方法により容易に調製され、標準検定でＮ−型カルシウムチャンネルに対する結合能の保持について評価されうる。次に、Ｎ−型カルシウムチャンネルに対する結合能又はこのようなチャンネルの結合部分を実際に保持する標識された化合物の変形体を、検定及び／又はスクリーニングに使用しうるであろう。従って、本発明は、Ｎ−型ＶＳＣＣで活性をもつ化合物を同定するためのスクリーニングにおける本発明のペプチド類の使用にまで及ぶ。
【００６３】
本発明のω−コノトキシン類は、標準的ペプチド合成法を用い、その後酸化ジスルフィド結合を形成させることにより調製されうる。例えば、直鎖状ペプチド類はシュノルツァーら（１９９２）により記述されているようなＢＯＣ化学を用いる固相手順によって合成されうる。脱保護化及び固体支持体からの切断の後、還元されたペプチド類を調整用クロマトグラフィーを用いて精製する。精製された還元型ペプチド類は例えば、実施例２で記載するように緩衝系で酸化する。酸化型ペプチド類は調製用クロマトグラフィーを用いて精製した。
【００６４】
コノトキシン類の合成を述べている参考文献として、サトーら、リューら及びＷＯ９１／０７９８０が挙げられる。
【００６５】
ω−コノトキシン類は組換えＤＮＡ技術を用いても調製されうる。所望のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入し、タンパク質を適切な発現系で発現しうる。場合によっては、発現したペプチドのさらなる化学的修飾、例えば、Ｃ末端のアミド化が適している。ある状況下においては、ペプチド発現後の化学的段階として発現したペプチドの酸化的結合の形成を行うことが望ましい。折りたたまれていないペプチドを提供するために、この段階の前に還元的段階を置いても良い。当業者はペプチドの還元及び酸化のための適切な条件を容易に決定しうる。
【００６６】
天然のＣＶＩＤは、検定により誘導されたこの毒の分画の後、精製したペプチドを配列決定することにより、コナス・カタスから単離した。
【００６７】
本発明は、上述したようなω−コノトキシン・ペプチドをコードするヌクレオチド配列又は該ぺプチドをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子をさらに提供する。
【００６８】
本発明のさらなる側面において、ＣＶＩＤの第四ループを有するω−コノトキシン・ペプチド類をコードするヌクレオチド配列又は該ペプチド類をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供する。該プローブはω−コノトキシンＣＶＩＤのループ４の全部若しくは一部又は一つ以上のアミノ酸の置換若しくは側鎖の修飾をうけた上記配列をコードするか又はこれに相補的である。
【００６９】
特に好ましい態様において、核酸プローブは配列番号：１に示される配列をコードするか又は該配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「プローブ」に対する言及には、増幅で使用されるプライマー又は直接ハイブリダイゼーションにおいて用いられるプローブに対する言及が含まれる。
【００７１】
本発明のさらなる別の側面は、本発明のω−コノトキシン・ペプチド類に対する抗体に関する。このような抗体はモノクローナル又はポリクローナルであってもよく、該ペプチド類に対する天然の抗体から選択してもよく、標準技術を用いて該ペプチド類に対して特異的に形成させてもよい。後者の場合、ペプチド類をまず担体分子と混ぜる必要がある。本発明の抗体は治療薬または診断薬として特に有用である。
【００７２】
この点で、特異的抗体は本発明のペプチド類をスクリーニングするために使用することができる。このような検定の技術は当分野では周知であり、例えば、サンドウィッチ検定及びＥＬＩＳＡが含まれる。ペプチドレベルの知識はある治療プロトコルを監視するために重要でありうる。
【００７３】
本発明の核酸分子はＤＮＡ又はＲＮＡである。核酸分子がＤＮＡ形である場合、それはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである。本発明の核酸分子のＲＮＡ形は一般にｍＲＮＡである。
【００７４】
本発明の核酸分子は、通常、単離された形態であるが、ベクター分子、特に発現ベクター分子などの他の遺伝分子に組込まれていてもよく、又は連結されていてもよく、又は他の方法で融合又は会合してもよい。ベクター類及び発現ベクター類は、一般的に、原核細胞又は真核細胞のいずれか又は両方で複製でき、そして適応可能であれば、発現できる。原核細胞は、大腸菌、バシラス・エスピー及びシュードモナス・エスピーを含むことが好ましい。真核細胞は、酵母、真菌、哺乳類及び昆虫の細胞を含むことが好ましい。
【００７５】
従って、本発明の別の側面は、ベクター部分及び本発明のペプチドをコードできる遺伝子を含む遺伝子構築物を予定する。
【００７６】
好ましくは、遺伝子構築物の遺伝子部分はベクター上でプロモーターに機能しうるように連結されており、該プロモーターは適切な細胞において遺伝子部分の発現を指示することができる。
【００７７】
本発明はこのような遺伝子構築物及び該構築物を含む原核細胞又は真核細胞に及ぶ。
【００７８】
Ｐ／Ｑ型よりＮ−型カルシウムチャンネルに対する高い効力及び選択性を考慮して、本発明のω−コノトキシン・ペプチド類はＮ−型カルシウムチャンネルの遮断が有益な任意の適応に役立ちうる。このような適応には、虚血後のニューロン損傷の低減、無痛覚の形成、麻酔性無痛覚の増大や、精神分裂病、興奮性の精神病、高血圧、炎症及び気管支収縮を引き起こす疾患等の治療、並びに神経障害痛の進行の阻害が含まれる。無痛覚は一般的に痛みの緩和を意味し、急性の痛み、持続性の痛み、又は神経障害の痛みからの緩和が含まれる。該ペプチド類が役立つ好ましい適応には、無痛覚の形成、麻酔性無痛覚の増大、及び神経障害の進行の阻害が含まれる。
【００７９】
本発明のω−コノトキシン類などのＮ−型カルシウムチャンネルで活性をもつ化合物を評価するのに役立つ検定はインビトロ検定又はインビボ検定であり、当業者には周知である。検定の例として、ＷＯ９１／０７９８０、ＷＯ９３／１３１２８、ＵＳ５８２４６４５、ＷＯ９７／０４７９７、未来の薬物（１９９４年及び１９９８年）、薬物データ報告（１９９３年）又はヘディング（１９９９年）に記載されているもの又は引用されているものが挙げられる。
【００８０】
役立ちうる具体的な検定には、インビトロ結合検定、侵害受容試験、例えば、ホルマリン試験及びホットプレート試験（モルムバーグとヤッシュ、１９９５年）、尾部軽打試験及び機械的足圧試験（オモートら、１９９６年）、又は神経障害痛のモデル（ワイトとカズン、１９９８年）など、神経保護試験、例えば、ラットの４−管閉塞モデル又はインビトロ細胞生存検定など、例えばＰ物質などの神経伝達物質の放出についての影響を観察する他の検定（レイら、１９９１；キャボットら、１９９８）が含まれる。
【００８１】
本発明のω−コノトキシン類はこれらの検定の幾つかにおいて有用な活性を示した。
【００８２】
従って、本発明のさらなる側面において、システイン残基５とシステイン残基６の間の第四ループが下記のアミノ酸配列
ＳＧＴＶＧＲ（配列番号：１）
又は一つ以上のアミノ酸の同類置換をうけた該配列を含む単離され、合成され又は組換えで得られたω−コノトキシン・ペプチド、並びに薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む組成物が提供される。
【００８３】
該組成物は薬学的組成物の形態であることが好ましい。
【００８４】
虚血後のニューロン損傷の低減、無痛覚の形成、麻酔性無痛覚の増大、精神分裂病の治療、又は興奮性の精神病、高血圧、炎症及び気管支収縮を引き起こす疾患の治療、又は神経障害痛の進行阻害のための医薬の製造における、システイン残基５とシステイン残基６の間の第四ループが下記のアミノ酸配列
ＳＧＴＶＧＲ（配列番号：１）
又は一つ以上のアミノ酸の同類置換若しくは側鎖の修飾をうけた該配列を含む単離され、合成され又は組換えで得られたω−コノトキシン・ペプチドの使用も提供される。
【００８５】
本発明は、システイン残基５とシステイン残基６の間の第四ループが下記のアミノ酸配列
ＳＧＴＶＧＲ（配列番号：１）
又は一つ以上のアミノ酸の同類置換若しくは側鎖の修飾をうけた該配列を含む単離され又は組換えで得られたω−コノトキシン・ペプチドの有効量を哺乳類に投与する工程を含む方法であって、虚血後のニューロン損傷の低減のため、無痛覚の形成のため、麻酔性無痛覚の増大ため、精神分裂病や、興奮性の精神病や、高血圧や、炎症や気管支収縮を引き起こす疾患等の治療のため、又は神経障害痛の進行の阻害のための方法をさらに提供する。
【００８６】
該ペプチドは予防的な意味で投与されうるが、哺乳類にはこのような治療の必要のあることが好ましい。
【００８７】
当業者には容易に理解されるように、投与経路及び薬学的に許容しうる担体の性質は、その状態の性質及び治療される哺乳類の性質に依存する。特定の担体又は送達システムの選択及び投与経路の選択は、当業者により用意に決定されうるであろう。該ペプチド活性体を含む任意の製剤の調製においては、該ペプチドの活性が工程中に壊されず且つ該ペプチドが壊されることなくその作用部位に到達できることを保証するよう注意を払うべきである。状況によっては、例えば、マイクロカプセル化などの当分野で知られる手段によりペプチドを保護する必要のあることがある。同様に、選択される投与経路は該ペプチドがその作用部位に到達するようなものであるべきである。
【００８８】
注射可能な使用に適する薬剤形には、滅菌した注射可能な溶液又は分散液、及び注射可能な滅菌溶液の即時調製用の滅菌した粉末が含まれる。これらは製造及び貯蔵の状況下で安定であるべきであり、酸化、及び細菌若しくは真菌などの微生物の汚染作用から保護されうる。
【００８９】
当業者は、従来のアプローチを用いて本発明のペプチド類又は修飾されたペプチド類のための適切な製剤を容易に決定しうる。好ましいｐＨの範囲、及び、例えば、酸化防止剤などの適切な賦形剤の決定は当分野では常套手順である（例えば、クリーランドら、１９９３を参照）。緩衝系は所望範囲のｐＨ値を付与するために日常的に使用され、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩及びコハク酸塩などのカルボン酸緩衝液が含まれる。このような製剤のために、ＢＨＴ若しくはビタミンＥなどのフェノール化合物、メチオニン若しくは亜硫酸塩などの還元剤、及びＥＤＴＡなどの金属キレート剤を含む種々の酸化防止剤が利用できる。
【００９０】
注射可能な溶液又は分散液用の溶媒又は分散媒は、ペプチド活性体のための任意の従来の溶媒又は担体系を含んでも良く、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール等）、これらの適切な混合物、及び植物油を含んでも良い。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆物の使用により、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の防止は、必要ならば、例えば、パラベン、塩化ブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗細菌剤及び抗真菌剤を含めることにより可能となる。多くの場合、重量オスモル濃度を調整するための薬剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムなどを含むことが好ましい。注射用の製剤は血液と等張であることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収性は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を組成物に含めることによりもたらされる。注射可能な使用に適切な薬剤形は、静脈内、筋肉内、大脳内、鞘内、硬膜外の注射又は注入を含む任意の適切な経路により送達されうる。
【００９１】
注射可能な滅菌溶液は、必要量の活性化合物を、上に列挙したような種々の他の成分と適切な溶媒中で混合し、必要ならば濾過滅菌することにより調製される。一般的に、分散液は、基本的な分散媒と上に列挙したものから選択された必要な他の成分とを含む滅菌ビークル中に種々の滅菌した活性成分を混合することにより調製される。注射可能な滅菌溶液調製用の滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、予め滅菌濾過した活性成分の溶液及び任意のさらなる所望の成分の真空乾燥又は凍結乾燥である。
【００９２】
該活性成分が適切に保護されている場合、該成分は、例えば、不活性希釈剤若しくは同化しうる食用担体とともに経口投与してもよく、又は硬外皮若しくは軟外皮のゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、常食の食物と直接混合してもよい。経口治療投与では、該活性化合物は賦形剤と混合してもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート剤等の剤形で用いてもよい。このような組成物及び調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含むことが好ましい。もちろん、組成物及び調製物の百分率は様々であり、その単位の重量の約５％から約８０％の間にあるのが都合がよい。治療に有用な組成物における活性化合物の量は、適切な服用量が得られるような量である。
【００９３】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は以下に列挙するような成分も含みうる。ゴム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤、リン酸二カルシウム塩などの賦形剤、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム塩などの滑剤、スクロース、ラクトース又はサッカリンなどの甘味料が添加されてもよく、ペパーミント、冬緑油、又はさくらんぼ風味などの香味料が添加されてもよい。投与単位剤形がカプセルの場合、上記タイプの物質に加えて液体の担体を含んでもよい。種々の他の物質が被覆剤として又はその他の方法で投与単位の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセルがセラック、糖又はその両方で被覆されてもよい。シロップ又はエリキシルは活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、さくらんぼ又はオレンジ風味の色素及び香味料を含んでもよい。もちろん、いずれの投与単位剤形を調製するのに用いられる任意の物質も、その使用量において薬学的に純粋であり実質的に無毒性であるべきである。さらに、これらの活性化合物は放出制御調製物及び製剤に組込まれてもよい。
【００９４】
本発明は、投与、例えば、クリーム、ローション、ジェル等の局所的適用、又は、例えば、溶液若しくは乾燥粉末の吸入若しくは鼻腔内送達に適した組成物にふさわしい任意の他の剤形にも及ぶ。
【００９５】
非経口投与剤形は静脈内、大脳内、鞘内若しくは硬膜外の送達に適するものを含むことが好ましい。
【００９６】
薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当分野では周知である。任意の簡便な媒体及び薬剤が活性成分と配合禁忌であるときに限りそれを除いて、治療用組成物にそれを使用することが意図される。補足的活性成分もまた該組成物に組み込まれ得る。
【００９７】
投与の容易性及び服用量の均一性のため、非経口組成物を投与単位剤形に製剤化することはとくに都合がよい。本明細書で使用される投与単位剤形とは、治療される哺乳類の患者にとって一回の投薬に適した物理的に個別の単位を指し、各単位は必要とされる薬学的担体とともに所望の治療効果を生じるように計算され予め決められた量の活性物質を含む。本発明の新規な投与単位剤形の仕様は、（ａ）活性物質のユニークな特性及び達成される具体的な治療効果ならびに（ｂ）本明細書で詳細に開示されるように身体の健康が損なわれる疾病状態を有する生物の患者における病気の治療のためこのような活性物質を調合する技術における本来の制限によって左右され、直接これらに依存する。
【００９８】
この主要な活性成分は、簡便かつ効果的な投与のために投与単位剤形中に適切な薬学的に許容しうる担体とともに有効な量で調合される。単位投与剤形は、たとえば、0.２5 μｇから約２０００ｍｇの範囲の量で主要な活性成分を含む。割合で表現すると、この活性化合物は一般的に 1ｍｌの担体に対して約０．２５μｇから約２００ｍｇ存在する。補足的活性成分を含む組成物の場合、一回投薬量は前記成分の通常の服用量及び投与様式を参照することにより決定される。
【００９９】
本発明の理解を容易にするため、本発明の幾つかの好ましい態様を説明する実施例及び図面を参照する。しかし、これまでの記載の一般性が以下の記載の具体性に置換えられるべきでないことを理解すべきである。
【０１００】
予期される発現タンパク質の末端グリシンは翻訳後修飾の幾つかの形態により除去され、巻貝から単離されるタンパク質のＣ末端システインはアミド化されたままである。
【０１０１】
実施例
実施例１
コナス・カタスの毒の検定により誘導される分画はつぎのように実施した：
オメガ・コノトキシンＣＶＩＤ（１）は、最初、オーストラリアのグレート・バリア・リーフから採集されたコナス・カタスの毒管から抽出した粗毒より単離した。勾配逆相ＨＰＬＣを用いて、この粗毒を幾つかの画分に分離した後、これらの画分を 125Ｉ・ＧＶＩＡ結合検定で検定した（実施例４参照）。結合検定で活性な画分はさらに検定誘導による逆相ＨＰＬＣにより精製し、エドマン配列決定法により確実な一次構造を得た。ＣＶＩＤに対応する画分は約２５〜２７分の保持時間を有した。
【０１０２】
逆相ＨＰＬＣは調製用及び分析用ヴィダックＣ１８カラム上でウォーターズ６００ＨＰＬＣシステムで実施した。試料は、通常、１％勾配（１００％Ａで５分、１００％Ａから６０％Ｂまでで６０分）を用いて１ｍｌ／分で流し、２１４ｎｍでモニターした。時々、サイズ排除ＨＰＬＣを用いてさらなる分画を行った。検定用の画分は、１分間隔で又はｕ．ｖ．検出器で検出されるピークに対応して採取した。全分析に使用された緩衝系はＡ＝Ｈ2 Ｏ中０．１％ＴＦＡ、そしてＢ＝０．０９％ＴＦＡ＋１０％Ｈ2 Ｏ＋９０％ＣＨ3 ＣＮであった。
【０１０３】
実施例２
ペプチド類の合成は下記の手順にしたがって実施した。
【０１０４】
材料と方法
材料
Ｃ末端がアミド化されたペプチド類の合成は、ペニンスラ・ラボラトリーズとペプチド・インスチチュートから得られる、置換値が０．６６から０．９３ｍｅｑ／ｇの範囲のｐ−ＭＢＨＡ樹脂上で実施した。Ｃ末端の酸はアプライド・バイオシステム社から入手したＢｏｃで保護されたＰＡＭ樹脂上で合成した。Ｂｏｃで保護されたアミノ酸はペプチド・インスチチュート社、ビーエイ・ケム社、ノバ・バイオケム社、フルカ社、バイオサーチ社及びオースペップ社から購入した。ｂｏｃアミノ酸用に選択された側鎖の保護は、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（ＤＮＰ）、Ｌｙｓ（ＣｌＺ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（ＢｒＺ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、ＨｙＰ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｃｙｓ（ｐ−ＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｎ（Ｘａｎ）であった。使用された他の全てのＢｏｃアミノ酸は側鎖の保護がなされなかった。ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＤＩＥＡ、ＴＦＡ、ジシクロヘキシルカルボジイミド及びヒドロキシベンゾトリアゾールは全てオースペップ社（オーストラリア、メルボルン）から購入したペプチド合成のグレードであった。アセトニトリル及びメタノール（ハイパーソルブ−ファー  ＵＶグレード）はＢＤＨ社（英国、プール）から購入した。水は縦列のミリポア・ミリ‐ＲＯ−ミリ‐Ｑ系から得た。ｐ−クレゾール及びｐ−チオクレゾールはフルカ社（ドイツ）から購入した。ＨＦはＢＯＣガシーズ（オーストラリア、ブリスベン）により供給された。酢酸アンモニウム（ＡＲ）及び硫酸アンモニウム（ＡＲ）はＡＪＡＸケミカルズ社（オーストラリア）から購入した。グアニジンＨＣｌ（９９％＋）並びに還元型及び酸化型のグルタチオンはシグマ・アルドリッチ社（ＵＳＡ）から購入した。
【０１０５】
方法
合成
ペプチドの自動合成は、Ｂｏｃで保護されたアミノ酸を該樹脂に結合させるために対称無水物又は活性エステルの化学を用いて、アプライド・バイオシステムズ４３０Ａ合成機で実施した。手動の逐次合成はＢＯＣ化学方法論を用いて行った。この方法では、各２ｍｍｏｌのアミノ酸をＨＢＴＵの０．５ＭのＤＭＦ溶液４ｍｌ及びＤＩＥＡ４７０μｌを用いて活性化し、そして定量的ニンヒドリン2 分析により＞９９％のカップリングが得られるようにインサイチュのカップリングを平均１０分行う。両方法共ｐ−ＭｅＢＨＡ樹脂又はＰＡＭ樹脂（０．５ｍｍｏｌ規模）からの開始を含む。−ＯＣＨ2 −ＰＡＭ樹脂が使用されると、最初のアミノ酸は樹脂上に存在した。カップリング前のＢｏｃ保護基の除去は１００％のＴＦＡ中で攪拌又は振とうすることにより行った。ＤＭＦはフローの洗浄用やカップリング溶媒として用いた。ニンヒドリン値が９９％未満のカップリングを示したときは、各残基（２ｍｍｏｌ）を常套的に合成機上及び手動合成で２倍結合させた。カップリングが９９％未満のままであれば、残りのアミノ基は無水酢酸のＤＭＦ溶液（８７μｌ／ｍｌ）でアセチル化した。
【０１０６】
脱保護化及び切断
ヒスチジン−ＤＮＰを含むペプチド類では、十分に保護化されたペプチドをまずチオール開裂（２０％β−メルカプトエタノール、ＤＩＥＡの１０％ＤＭＦ溶液、２ｘ３０分）にかけ、側鎖の保護を取除いた。次に、Ｎ−α−Ｂｏｃ基を除去し（ＴＦＡ、２ｘ１分）、トリプトファン−ＣＨＯを含むペプチドでは、水の５％ＤＭＦ溶液２５ｍｌ中のエタノールアミン（１．５ｇ）の溶液を用いて、脱ホルミル化を行った（２ｘ３０分）。このペプチドをＤＣＭで洗浄し窒素下で乾燥した。樹脂からの切断及び同時に行った側鎖の脱保護化は、液化ＨＦ中で捕捉剤のｐ−クレゾール及びｐ−チオクレゾールの存在下において（容量比で１８：１：１）、１．５時間、−５℃〜５℃で実施した。ＨＦを真空除去し、該ペプチドを冷エーテルで沈殿させ、焼結ロート上で濾過により回収し、冷エーテルで洗浄し、捕捉剤の付加物を除去した。このペプチドを５０％ＡｃＯＨ又は４５％アセトニトリル水溶液に溶解し、水で希釈し、凍結乾燥した。
【０１０７】
折りたたみ及び酸化
精製され還元されたペプチド類は、０．０１ＭのＮＨ4 ＯＨでｐＨ７．５〜８．０に調整された０．３３ＭのＮＨ4 ＯＡｃ／０．５ＭのＧｎＨＣｌ水溶液又は２Ｍの（ＮＨ4 ) 2 ＳＯ4 ／０．１ＭのＮＨ4 ＯＡｃ水溶液中で０．０２から０．０５ｍＭの濃度で酸化した。この溶液を還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンの存在下で（ペプチド：ＧＳＨ：ＧＳＳＧのモル比は１：１００：１であった）４℃で３日から５日間攪拌した。この反応混合液を定期的に採取し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。溶出画分をエレクトロスプレー質量分析法の分析用に回収した。ＬＣ及びＭＣにより酸化が完全であることが確認されると、ＴＦＡでｐＨを２〜３に下げることにより酸化を終結させた。
【０１０８】
クロマトグラフィー分析及び精製
自動注入器を備えたウォーターズ６００ＨＰＬＣ系を全てのＲＰ−ＨＰＬＣ用に使用した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣはウォーターズ・デルタ・パックＣ１８の３００Ａ（０．３９ｘ３０ｃｍ）カラム又はヴィダックＣ１８の５μ（０．４６ｘ２５ｃｍ）カラムで実施した。試料は１％勾配（１００％Ａで５分、１００％Ａから６０％Ｂまでで６０分）を用いて１ｍｌ／分で流し、２１４ｎｍでモニターした。全分析に使用された緩衝系はＡ＝Ｈ2 Ｏ中の０．１％ＴＦＡ及びＢ＝０．０９％ＴＦＡ＋１０％Ｈ2 Ｏ＋９０％ＣＨ3 ＣＮであった。
【０１０９】
ヴィダックＣ１８の５μ（１．０ｘ２５ｃｍ）カラムは半調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ用に使用し、ヴィダックＣ１８の１０μ（２．２ｘ２５ｃｍ）カラムは調製用ＲＰ−ＨＰＬＣに用いた。粗還元型ペプチドは、１％勾配（１００％Ａから８０％Ｂまでで８０分）を用いて、８ｍｌ／分の流速及び２３０ｎｍのｕ．ｖ．検出で調製用クロマトグラフィーにより精製した。画分を回収し、エレクトロスプレー質量分析法により分析した。次に、所望の質量を有する画分を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、純度を確認した。これらの純粋な画分を合わせ、凍結乾燥して還元型ペプチドを得た。酸化型ペプチドは、酸性化された反応混合物を調製用カラムに８ｍｌ／分の流速でかけ、全ての酸化緩衝液が溶出されるまで１００％Ａで洗浄した後、８ｍｌ／分の流速及び２３０ｎｍのｕ．ｖ．検出で１％勾配（１００％Ａから８０％Ｂまでで８０分）にかけて精製した。画分を回収し、還元型ペプチドと同様に分析した。さらなる精製が必要であった場合、ペプチドを、３ｍｌ／分の流速及び２３０ｎｍのｕ．ｖ．検出で１％勾配（１００％Ａから８０％Ｂまでで８０分）の半調製用カラムにかけて再精製した。画分を回収し、上記のように分析した。
【０１１０】
質量分析法
質量スペクトルはＰＥサイックスＡＰＩ−III トリプル四重極イオンスプレー質量分析計で測定した。データは、０．１ａｍｕのスキャン・ステップ及び０．３秒の遅延時間を用いる数スキャンからの４００〜２１００ａｍｕの範囲におけるデータの蓄積により正イオンモードで得た。
【０１１１】
ペプチドは０．１％のＴＦＡを含む４５％アセトニトリル水溶液中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。試料は、レオダイン・インジェクターを用いて直接的注入（５−２０μｌ）し、ガラス毛細管を介して開口部から０．０５％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液の３０〜４０μｌ／分の溶媒流中へと輸送された。得られたデータはデコンボリューション（解きほぐし）（ハイパーマス−マックスペック３．２、サイックス社、カナダ）にかけ、観察されるプロトン化された種のＭｒを決定した。
【０１１２】
他の高分解能データはブルーカー・スペクトロスピン・バイオアペックス外部イオン源フーリエ変換エレクトロスプレー質量分析計で４．７Ｔの磁場で得た。
【０１１３】
合成されたペプチドの一部のデータを以下の表に示す。
【０１１４】
【表３】
0004494633.tif 000008
【０１１５】
実施例３
ＣＶＩＤ遺伝子配列の単離及び特性決定
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
コナス・カタスの二つの種をクイーンズアイランドのグレート・バリア・リーフにあるレディー・エリオット島から採取した。これらの動物に氷上で麻酔をかけ、解剖し、毒球（ｖｅｎｏｍ  ｂｕｌｂ）から吻管に至る領域の毒管を得た。この管を切断し、グアニジニウム・チオシアネート／Ｎ−ラウリルサルコシンを含む緩衝液に入れた後、手動で粉砕して乳化した。ポリＡ尾部を持つｍＲＮＡをファルマシア・バイオテク・クイックプレップ・ｍＲＮＡ精製システムを用いて該混合物から抽出した。
【０１１６】
鎖−１のｃＤＮＡは、スーパースクリプトII逆転写酵素（ギブコＢＲＬ社）と連係してＮｏｔ１−ｄ（Ｔ）18二元機能プライマー（５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴ18−３’）（ファルマシア・バイオテク社）を用い、シー・カタスのポリＡｍＲＮＡの鋳型から３’末端合成した。得られたｃＤＮＡの鋳型は、ファルマシア・バイオテク社のｃＤＮＡタイムセーバー・プロトコル通りにＲＮアーゼＨ／ＤＮＡポリメラーゼ手法を用いて二本鎖ｃＤＮＡを製造するために使用した。次に、マラソン（クローンテック社）アダプターをｄｓ−ｃＤＮＡ分子の５’及び３’の末端に付加し、ｃＤＮＡ構築を完了した。イモ貝の毒ペプチドの完全なｃＤＮＡ分子の表示は図１に示す。
【０１１７】
ＣＶＩＤ及び関連するｃＤＮＡ配列のＰＣＲ誘導
シー・カタス由来のｄｓ−ｃＤＮＡ、ＣＳＲＤ−３０１Ａプライマー（５’−ＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＧＴＣ−３’）、アンカープライマー（５’−ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴ−３’）及び適切なタック・ポリメラーゼ（バイオテク・インターナショナル社）及び緩衝液（２５ｍＭのＭｇ、１００μＭのデオキシヌクレオチド、ｐＨ８．５で緩衝処理）を含む試料について、９５℃／２分を１サイクル、９５℃／３０秒、５５℃／６０秒、７２℃／９０秒を３５サイクル、及び７２℃／１０分を１サイクルでサーマル・サイクラー（オムニゲン社）中でＰＣＲを行った。このＰＣＲにより約３８０ｂｐから５００ｂｐまでの不均一なＤＮＡ産物が生成した。このＰＣＲ産物に由来するクローンの配列分析により、該産物がＣＶＩＤ配列並びに他の関連する毒ペプチドの配列を含むことが示された。
【０１１８】
ＣＶＩＤのクローニング及び配列決定
シー・カタスのｃＤＮＡのＣＳＲＤ−３０１Ａ−アンカーにより駆動されるＰＣＲから生成したＤＮＡ産物を低融点アガロース中で電気泳動し、切り出した。このＤＮＡをキアーゲン社のカラムでアガロースから抽出し、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ（プロゲン社）で再リン酸化し、クレノウ・ポリメラーゼ（プロゲン社）で平滑末端化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロゲン社）を用いて、脱リン酸化されＳｍａＩで切断したｐＵＣ１８プラスミドベクターＤＮＡ（ファルマシア・バイオテク社）の多重クローニング部位に連結した。このベクターＤＮＡをブルースクリプト大腸菌細胞中に電気形質転換し、ＰＣＲ産物を表すクローンのライブラリーを作成した。ライブラリーの一部をＬＢamp プレートに播き、個々のクローンを選択し、ＬＢamp ブロス中で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡはＲＰＭシステム（ＢＩＯ−１０１社）を用いて培養物から精製し、ベクター内のＰＣＲ・ＤＮＡ挿入物を、ｐＵＣ１８の順方向と逆方向のプライマー（ファルマシア・バイオテク社）、ジデオキシターミネーター配列決定化学（パーキン・エルマー社）を用いてＡＢＩ３７３シークエンサー上で配列決定した。配列データはシークエンシング・ナビゲーター・ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて分析した。
【０１１９】
ＣＶＩＤ遺伝子の配列
ＣＳＲＤ−３０１Ａ／アンカーによるシー・カタスの毒管ｃＤＮＡのＰＣＲライブラリーにおけるクローン番号Ｃｃａ−６は、ＣＶＩＤペプチドの配列を提供した。ＣＶＩＤ遺伝子のヌクレオチド配列及び関連するアミノ酸配列の予想される翻訳を図１に示す。このクローンライブラリーのさらなる分析により、同一の配列をもつ全部で八つのクローンが示された。全クローンは両方向から配列決定し一致した配列を得た。
【０１２０】
ＣＶＩＤ配列は下記の特性を有する：
・７３アミノ酸に翻訳される２２２塩基対のコード配列
・２８アミノ酸の成熟ペプチドの推定配列。巻貝から単離されたタンパク質において、予想される発現タンパク質の末端グリシンはある形態の翻訳後修飾により除去されアミド化されたＣ末端のシステインが残存することに留意すべきである。
・予想される成熟ペプチドはＣ−ａ6 −Ｃ−ａ6 −ＣＣ−ａ3 −Ｃ−ａ6 −Ｃのパターンで六つのシステイン・フレームワークを有する。
【０１２１】
リーダーペプチド及び成熟ペプチドの両方のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は既知のペプチド配列のいずれとも同一ではない。
【０１２２】
ＣＳＲＤ−３０１Ａプライマーの代わりに幾つかの追加のプライマーを用いて、上述した実験と同様なシー・カタスについてのさらなる実験を行った。これらのプライマーはより特異的であるように設計され、ＯＭ−２Ａ（５’−ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ−３’）及びＣｃａ−６−３Ｂ（５’−ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＴＡ−３’）であった。これらの実験により、ＣＶＩＤ誘導体の幾つかについて配列を同定した。
【０１２３】
実施例４
放射性リガンド結合検定
125Ｉ−ＧＶＩＡ及び 125Ｉ−ＭＶIIＣの調製
ペプチドはヨード−ゲン（登録商標）（フレーカー・ピー・ジェイら、１９７８）（１，３，４，６−テトラクロロ−２ａ，６ａ−ジフェニル−グリクオルリル）（アーマッド・エス・エヌら、１９８８、クルッズ・エル・ジェイら、１９８６）を用いてヨウ素化し、５μｌ（５．７５ｍｇ／ｍｌ、１７．４ｍＣｉ／ｍｇ）のＮａ 125Ｉ（デュポンＮＥＮ（登録商標）、ニュー・リサーチ・プロダクツ社、ボストン）及び２５μｌの燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）をヨードゲン（登録商標）（ピアス社、ロックフォード、ＵＳＡ）で被覆したエッペンドルフチューブに加え、５分間インキュベートした。反応混合物を攪拌し、目的のペプチド１０μｌを含むエッペンドルフチューブに移した。次に、この混合物をＨＰＬＣによる精製の前にさらに５分間反応させた。
【０１２４】
125Ｉ−標識されたペプチドの調製用ＨＰＬＣは、二つのウォーターズ５１０ＨＰＬＣポンプ及びウォーターズ４８１吸収検出器を備えたウォーターズ６８０勾配制御機で実施した。ペプチドはヴィダック逆相Ｃ１８分析用カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）で分析し、直線勾配０〜６７％の溶媒Ｂで１００分にわたって１ｍｌ／分で溶出した。ここで、溶媒Ａ＝１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、そして溶媒Ｂ＝９０％ＡＣＮ＋０．０９％ＴＦＡであった。分離は２１４ｎｍで観察し、１ｍｌの画分を採取した。目的の画分はＬＫＢヴァラック１２７２自動ガンマカウンターで検出した。
【０１２５】
ヨウ素化ペプチドの同一性を確認するため、ＰＥサイックスＡＰＩIII 質量分析計（ＰＥサイックス、トーンヒル、オンタリオ州、カナダ）で質量分析を行った。非放射活性Ｋ 127Ｉでヨウ素化されたペプチド由来のＨＰＬＣ画分を質量分析計に直接注入した。ソフトウェア・パッケージ・マックスペック（サイックス、トロント）を用いてアップル・マッキントッシュIIｆｘコンピューター上で質量スペクトルを得た。
【０１２６】
ラットの膜の調製
ラットの膜はヴァグナーら（１９８８）の手順に従って調製した。ラットは頸部脱臼により屠殺し、脳を取出し、直に液体窒素中で凍結した。凍結した脳は必要になるまで−７８℃で貯蔵した。三つの脳（湿体重、６．２５ｇ）を解凍し１２５ｍｌの５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）中でウルトラテューレックス（ultraturrex)（ＩＫＡ、１７０ワット）でホモジナイズした。ホモジナイズした脳を１６０００ｒｐｍ（３５０００ｇ）で２０分間４℃で遠心分離し、上清を捨てた。そのペレットをｐＨ７．４の５０ｍＭヘペス、１０ｍＭのＥＤＴＡ中でさらにホモジナイズすることにより再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。遠心分離を上述のように繰り返し上清を捨てた。そのペレットをｐＨ７．４、１２５ｍｌの５０ｍＭヘペス（１：２０希釈）中に再懸濁し、−７８℃で貯蔵した。
【０１２７】
結合検定
結合実験は先述（クリスティパティら、１９９４、ナダスディら、１９９５）のように実施した。リガンド結合検定はガラスチューブ中室温で三連で行った。簡単に述べると、検定は１２ｘ７５ｍｍのホウケイ酸塩の培養チューブ中で室温で実施し、１時間インキュベートした。各チューブにはそれぞれ１００μｌの試験化合物を含め、ヨウ素化リガンド（７ｆｍｏｌ）及びラットの膜（１６ｍｇ）をこの順に加えた。この検定緩衝液には２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．２）、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のＢＳＡ及びプロテアーゼ阻害剤、２ｍＭのロイペプチン及び０．５Ｕのアプロチニンを含めた。非特異的結合は１７ｎＭのＧＶＩＡ又は１００ｎＭのＭＶIIＣのいずれかの存在下で測定した。検定は、０．６％のポリエチレンイミン中に予め浸されたグラス・ファイバー・フィルター（ワットマンＧＦＢ）を用いてミリポア多岐濾過システムで真空ろ過により終結させた。各チューブは３ｍｌの氷冷の洗浄緩衝液（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．２、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び０．１％ＢＳＡ）で三回洗浄した。フィルターはガンマカウンターで計数した。幾つかの場合には、Ｎ−型カルシウムチャンネルにおける効力評価は、トムテック・ハーベスターで濾過しマクロベータ・ジェット・シンチレーション・カウンターで計数したラットの脳膜に結合した 125Ｉ−ＧＶＩＡを測定することにより決定した。両手法で同様な結果が得られた。全ての場合で、グラフパッド・プリズムを用いて結合曲線を作成し、ＥＣ50値を算出した。本発明の化合物の幾つかについての値は表４に示す。
【０１２８】
【表４】
0004494633.tif 000009
【０１２９】
実施例５
ＣＶＩＤにより示されるＮ−型ＶＳＣＣに対する高レベルの選択性に鑑みて、そのＮ−型選択性に寄与しうる構造上の特徴を調べた。これは、当業者には既知のタイプの標準的な 1Ｈ・ＮＭＲ技術を用いて行った。
【０１３０】
方法
1Ｈ・ＮＭＲによる構造研究
1Ｈ・ＮＭＲ分光法−全てのＮＭＲ実験は、ｚ−勾配装置を備えたブルーカーＡＲＸ５００分光計又はｘ、ｙ、ｚ−勾配装置を備えたブルーカーＤＭＸ７５０分光計で記録した。ペプチド濃度は１〜５ｍＭの範囲であった。各類似体は９５％のＨ2 Ｏ／５％のＤ2 Ｏ（ｐＨ２．５〜３．５）中で調べた。記録された 1Ｈ・ＮＭＲ実験は２００及び４００ｍｓの混合時間をもつＮＯＥＳＹ（クマールら、ジーナーら）及び１２０ｍｓの混合時間をもつＴＯＣＳＹ（バックス）であった。全てのスペクトルは２９３°Ｋで記録され、４Ｋデータポイント、４００〜５１２ＦＩＤ、１６−６４スキャン及び１秒のリサイクル遅延で６０２４Ｈｚ（５００ＭＨＺ）又は８１９２Ｈｚ（７５０ＭＨＺ）にわたって記録された。ＣＶＩＤについて記録されたその他の実験は、２９３°ＫでＮＯＥＳＹ（１００ｍｓの混合時間）、ＤＯＦ−ＣＯＳＹ（ランス）及びＥ−ＣＯＳＹ（グレイシンガー）（１００％Ｄ2 Ｏ）並びに２８０°Ｋでの重複実験が含まれた。
【０１３１】
溶媒はウォーターゲート配列（ピオットら，１９９２）を用いて抑制し、スペクトルはＵＸＮＭＲを用いて処理した。ＦＩＤには多項関数を乗じ、両次元に９０°シフトした正弦ベル関数又はフーリエ変換前にｆ1 における緩和ガウス関数を用いてアポダイズした。第５次数多項式を用いる基線の補正を適用し、化学シフトの値は０．００ｐｐｍのＤＳＳを内部標準とした。第二のＨαシフトはマルッカら（１９９５）のランダム・コイル・シフト値を用いて測定した。
【０１３２】
3Ｊ（ＮＨ−Ｈα）結合定数は高分解能１Ｄスペクトル（３２Ｋ）から測定し、８Ｋｘ１Ｋにストリップ変換しオーレリア・プログラム（ブルーカー，ＧＭＢＨ）におけるローレンツの線調整手順を用いて導き出したＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルから得られたものと比較した。 3Ｊ（Ｈα−Ｈβ）結合定数は高デジタル分解能（８Ｋｘ１Ｋ）に変換されたＥ−ＣＯＳＹスペクトルから直接測定した。
【０１３３】
距離の制限（distance restraints)及び構造計算−ＮＯＥＳＹスペクトルにおけるピーク量は、２．７、３．５、５．０及び６．０Åのプロトン間距離の長い範囲にそれぞれ対応させて強力、中間、微弱、非常に微弱として分類した。より短い距離の範囲は１．８Åに設定した。適切な偽原子（pseudoatom）補正を行い（ヴュスリッチら，１９８３）、０．５Å及び２．０Åの距離をメチルプロトン及びフェニルプロトンをそれぞれ含む制限の上限に加えた。 3Ｊ（ＮＨ−Ｈα）結合定数をφ二面角制限（パルディら，１９８４）を決定するために用い、関連するＮＯＥＳＹピーク強度とともに 3Ｊ（Ｈα−Ｈβ）結合定数を用いて、二面角制限χ１（ワグナーら，１９８７）を決定した。プロトンのプロキラル対(prochiral pair)についてのジアステレオ特異的な割り当てがない場合、二つの制限に対する最大の長い範囲を使用したが、ステレオ特異的な割り当てが確立された場合、この距離を明確に特定した。
【０１３４】
構造は、ＸＰＬＯＲ３．８版におけるねじれ角動力学／シミュレーション・アニ−リング・プロトコル（ブリュンガーら，１９８６、ブリュンガー，１９９２、ライス、スタイン）並びにエンフとフューバーのパラメータ（ブルックスら，１９８３）に基づく幾何学的力場を用いて算出した。開始の構造は、無作為（φ、ι）二面角及び最小限化されたエネルギー（５００工程）を用いて新たに作成し、正確な位置幾何学をもつ構造を作成した。この構造は合計１５ｐｓの高温（５００００°Ｋ）分子動力学にかけた後、１５ｐｓ間０°Ｋまで冷却し、最終的エネルギー最小化（１０００工程）に付した。構造の精巧化は改変されたエンフとフューバーの力場の影響下におけるエネルギー最小化（１０００工程）を用いて行った。
【０１３５】
データ分析−構造は、Ｃα、Ｃ及びＮの原子（ＸＰＬＯＲ３．８版）についての対の様式及び平均のＲＭＳＤを用い、並びに骨格の二面角についての角次数パラメータ（ハイベルツら，１９９２、パラギーら，１９９３）を計算することにより比較した。構造の視覚化はインサイトII（ＭＳＩ）を用いて実施した。
【０１３６】
結果
1Ｈ・ＮＭＲ分光法
ＭＶIIＡと比較したＨαの二次シフトにおける最大の相違はＣＶＩＤのループ２及びループ４に見られた。ループ４の相違は、ＣＶＩＤが新規配列を有し二つのさらなる残基を取り込んでいることを考えれば驚くべきことではないが、ＭＶIIＡとＣＶＩＤのループ２は類似しているのでループ２の相違は注目に値する。ＣＶＩＤにおける残基９〜１４の二次シフトはＭＶIIＡにおけるそれらと同じ基本様式に従っているが、大きさはより大きくなっている。このことは、ＣＶＩＤにおけるループ２の構造がより安定化されていることを示している。これはループ４との長距離の相互作用に由来するものであろう。ループ２は以前にω−コノペプチド構造の最も少なく規定された領域であり、このループの残基は立体構造の交換を示す 1Ｈ・ＮＭＲスペクトルの比較的広いピークにより特性付けられる（ニールセンら，１９９６、リュ−ら，１９９７）。構造特定のこの欠如により、ループ２がω−コノペプチドの活性、機能、及び選択性に果たす重要な役割、とりわけＭＶIIＡにおけるＬｅｕ１１及びＡｒｇ１０などの二次的に重要な残基（ナダスディら、１９９５）と同様に重要な結合決定基のＴｙｒ１３の役割を理解する試みが妨げられてきた。従って、ＣＶＩＤは薬理団を開発するための新規な構造鋳型を提供しうる。ＣＶＩＤのループ２及びループ４における残基の二次Ｈαシフトにおける有意な相違が、既存のω−コノトキシン構造からのＣＶＩＤの正確なモデリングを排除し、そしてその増大したＮ−型選択性が与えられたので、ＣＶＩＤの３Ｄ構造は 1Ｈ・ＮＭＲ分光法を用いて下記のように決定された。
【０１３７】
ω−コノペプチドＣＶＩＤの３Ｄ構造
ＣＶＩＤの５０個の構造を含む一群について、１５９の残基内ＮＯＥ、１１０の連続ＮＯＥ、１８４の中間ＮＯＥ及び長距離ＮＯＥに由来する合計４８１の距離制限、合計１４のＨ結合を規定する２８のＨ結合の制限、並びに２３のφ及び１０のχ１の二面角の制限に基づき計算した。合計４７の構造は一つの共通の折りたたみに収束し、２Åより大きなＮＯＥの侵害（violation)はなく、３°以上の二面の侵害もなかった。これらの内、２０の最低エネルギー構造がＣＶＩＤ構造を表すために選ばれた。（全残基にわたって計算された）０．３５Åの骨格の対の様式のＲＭＳＤをもつ構造が非常によく確定される。φ及びιの骨格二面角についての角次数パラメータ（Ｓ）は平均０．９９であった。これは、低い平均ＲＭＳＤから０．２４Åの構造まで反映する高度の構造精度を示す。
【０１３８】
他のω−コノトキシン類では記載されなかったＣＶＩＤの新規な特徴には、それぞれ、Ｌｙｓ１０及びＬｅｕ１１のＮＨプロトンからＧｌｙ２２とＴｈｒ２３のＣ＝Ｏ酸素原子までのループ２とループ４の間の二つの水素結合の存在が含まれる。これらの水素結合が他のω−コノトキシン類と比べてＣＶＩＤにおけるループ２の安定性を増大させることは可能である。Ｔｙｒ１３の骨格が−６０°のχ１側鎖のねじれ角をもつαL コンホーメーションにおいて安定化されたことは重要である。他のω−コノトキシン類におけるＴｙｒ１３のコンホーメーションを定める試みは曖昧であり、実際に、Ｔｙｒ１３は他のω−コノトキシン類における平均化されたコンホーメーションを採択しうる。ＣＶＩＤにおけるＴｙｒ１３のコンホーメーションについての構造的観察は、残基内の強力なＮＨi −Ｈαi ＮＯＥ並びにより弱いＨαi-1 −ＮＨi ＮＯＥ及び 3Ｊ（ＮＨ−Ｈα）の７Ｈｚという結合定数の存在により支持される。
【０１３９】
論考
ＣＶＩＤはＭＶIIＡ、ＭＶIIＣ及びＧＶＩＡなどの既知のω−コノトキシン類と同様な球状の折りたたみを採択していることが見出された。この比較により、ＭＶIIＡ（最短のループ４を持つ）及びＭＶIIＣでは下向き、ＧＶＩＡでは外向きであるが、ＣＶＩＤではループ２方向に湾曲してより球状の表面を形成するというループ４の構造における有意な差異も強調される。ＣＶＩＤにおけるループ４とループ２の間の二つの水素結合の存在は、この方向ではループ４に有利に働きループ２の安定化を助けているようである。ＧＶＩＡ、ＭＶIIＡ又はＭＶIIＣに関しては、ループ２とループ４の間の水素結合はこれまで報告されてこなかったけれども、これは興味深い発見である。このＣＶＩＤ構造の独特の様相は、Ｎ−型ＶＳＣＣに対する選択性の向上に寄与しているのかもしれず、ループ２／４の組み合わせがω−コノペプチドの選択性の重要な決定基を含むことを示唆している。
【０１４０】
ＣＶＩＤの高い効力及び選択性により、ＣＶＩＤはその３Ｄ構造に基づく薬理団の開発のための魅力的な候補となる。ループ２の向上した安定性は、今日までに見つかった他のω−コノトキシン類に優るその優れた選択性にエントロピー的に寄与しうる。しかしながら、ＭＶIIＡ（Ａｒｇ２１、ナダスディら，１９９５）及びＧＶＩＡ（Ｌｙｓ２４、Ｔｙｒ２２、リュ−ら，１９９７）のループ４に存在する重要な二次的結合残基が欠如しているため、ω−コノトキシンの独特の群／ＶＳＣＣの相互作用は、ＣＶＩＤではループ４のおそらく比較的露出したＴｈｒ２３又はＶａｌ２４により生じるようである。
【０１４１】
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ピオット，エム．、サウデック，ブイ．及びスクレナー，ブイ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌｍｏｌ．ＮＭＲ、２、６６１−６６５。
【０１５１】
ランス，エム．、ゾレンソン，オー．ダブリュー．、ボーデンハウザー，ジー．、ワグナー，ジー．、エルンスト，アール．アール．及びヴュスリッチ，ケイ．（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７、４７９−４８５。
レイ，エヌ．ジェイ．、ジョーンズ，エイ．ジェイ．及びキーン，ピー．（１９９１）、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０２、７９７−８００。
ライス，エル．エム．とブランガー，エイ．ティー．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９、２７７−２９０。
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ワグナー，ジー．、ブラウン，ダブリュー．、ハーベル，ティー．エフ．、シャウマン，ティー．、ゴー，エヌ．及びヴュスリッチ，ケイ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６、６１１−６３９。
ワグナー，ジェイ．エイ．ら、（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８、３３５４−９。
ホワイト，ディー．エム．とカズンズ，エム．ジェイ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９８）、８０１、５０−５８。
【０１５４】
ヴュスリッチ，ケイ．、ビルター，エム．及びブラウン，ダブリュー．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６９、９４９−９６１。
【０１５５】
この明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈が別の意味を要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形語は、言明された完全体又は完全体の群を包含することを意味するが任意の他の完全体又は完全体の群を排除することを意味するものではないことが理解されよう。
【０１５６】
当業者は、本明細書に記載された発明が具体的に記載されたもの以外の変形及び修飾を許容することを理解するであろう。本発明はこのような全ての変形及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明は、この明細書で言及又は示された全ての工程、特性、組成物及び化合物も個々に又はまとめて含み、並びに該工程若しくは該特性の二つ以上の任意及び全ての組み合わせも含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はＣＶＩＤをコードする核酸配列の一例である。リーダー配列及び末端グリシンを含むアミノ酸配列も示す。核酸配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１２及び配列番号：１３としても示し、一方、第四ループをコードする核酸は配列番号：１１に示す。一次ヌクレオチド配列は長さ３８２ｂｐであり、リーダー配列（アミノ酸残基１から４５）、成熟ペプチド（アミノ酸残基４６から７３で囲みを付ける）、３’非翻訳領域（成熟ペプチド領域直後の小文字のレタリングにより表される）、及びＣＳＲＤ−３０１Ａプライマー中に組込まれた５’非翻訳領域の小部分（配列開始部における太字イタリック体の小文字のレタリングで表す）を含む。ペプチドをコードする領域を表す開始コドン及び終止コドンは下線を付す。リーダーペプチド及び成熟ペプチドの推定アミノ酸配列は一次ヌクレオチド配列から翻訳され、ヌクレオチド配列の下に一文字略語で示す。ヌクレオチド配列上の番号は開始コドンからのアミノ酸残基の位置に関する。ＣＶＩＤ配列内のＣＳＲＤ−３０１Ａ・ＰＣＲプライマーの位置は太字とイタリック体で強調する。アンカープライマーは（３８２＋ｂｐでの）ポリＡ尾部の３’側直前に位置するであろう。４５の位置でのアルギニン残基の矢印は、成熟ペプチドからリーダーペプチドを酵素的に切断するための最も可能性の高い部位を示す。
【図１】
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