(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステム-ループ構造を有し、このループ構造部分の一部が検出配列である標的核酸、該検出配列と相補的な配列を有するプローブ核酸、及び、前記ループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する保護核酸を準備する工程と、
該保護核酸を前記標的核酸にハイブリダイズさせて、該標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを行い、該プローブ核酸とハイブリダイズした標的核酸を検出する工程とを行うことを特徴とする、標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記標的核酸のループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する、請求項１に記載の検出方法で用いるための保護核酸。
【請求項３】
ステムーループ構造を有し、このループ構造部分の一部が検出配列であるLAMP増幅産物、該検出配列と相補的な配列を有するプローブ核酸、及び、前記ループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する保護核酸を準備する工程と、
該保護核酸を前記増幅産物にハイブリダイズさせて、該増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを行い、該プローブ核酸とハイブリダイズした増幅産物を検出する工程とを行うことを特徴とする、LAMP法による増幅産物の検出方法。
【請求項４】
前記増幅産物のループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する、請求項３に記載の検出方法で用いるための保護核酸。
【請求項５】
前記保護核酸は、前記LAMP増幅産物中に存在するループ構造において、ループ両端の相補的配列部分をそれぞれＦ１領域及びＦ１ｃ領域、又はＢ１領域及びＢ１ｃ領域としたとき、
Ｆ１領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第一の保護核酸、Ｆ１ｃ領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第二の保護核酸、Ｂ１領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第三の保護核酸、及び、Ｂ１ｃ領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第四の保護核酸から成る群から選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の保護核酸。
【請求項６】
ステム-ループ構造を有する標的核酸のループ構造部分の一部を検出配列とし、前記ループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する保護核酸を前記標的核酸にハイブリダイズさせ、該標的核酸を前記検出配列と相補的な配列を有するプローブ核酸とハイブリダイズさせて検出する方法のための、前記保護核酸及びバッファーを具備することを特徴とするアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はステム-ループ構造を有する核酸の検出方法に関し、特にLAMP法による増幅産物をハイブリダイゼーション法によって検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸配列を持った核酸鎖を検出するためには、検出対象に相補的なプライマーを用いて増幅し、増幅の有無を電気泳動で確認する方法、増幅産物中の検出対象となる配列に相補的なプローブを用いて検出する方法が一般的に知られている。プローブを用いた検出方法は、増幅産物の特異性を改めて確認することができるといった利点がある。
【０００３】
遺伝子の増幅技術として、PCR(Polymerase Chain Reaction)法が一般に知られているが（非特許文献１）、PCR法の問題点として複雑な温度制御装置が必要であること、数塩基違いの鋳型に対して特異的な増幅反応が難しいことが指摘されている。このPCR法に替わり、複雑な温度制御を必要としない遺伝子増幅法として、LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法が開発された（特許文献１）。LAMP法とは、標的遺伝子の6つの領域を認識する4種類のプライマーを設定し、鎖置換型DNA合成酵素、サンプルとなる遺伝子、基質を混合し、等温条件下60〜65℃で遺伝子増幅する技術である。反応の進行に伴い、ループ構造が形成され、同一鎖上で互いに相補的な配列を持つさまざまなサイズの繰り返し構造が形成される。LAMP法はPCR法と比較して、短時間で多量の増幅産物が得られるという点でも有利であり、今後、幅広い分野で応用されることが期待される。
【０００４】
LAMP法による増幅産物はステム-ループ構造を有し、その簡易検出方法については、増幅の過程で生成される副産物ピロリン酸Ｍｇの白濁を測定する手法が有効である。しかしながら、白濁を測定する方法は、非特異的な増幅が起こってしまった場合に、誤った判定をしてしまうという可能性や、複数の標的核酸を同時に検出することができないという問題を有する。
【０００５】
そこで、LAMP産物中に存在する一本鎖ループ領域を利用し、この領域によってプローブ核酸とハイブリダイゼーションを行い検出する方法が開発されている。例えば、一本鎖ループ領域にハイブリダイズするプローブ核酸を蛍光標識し、蛍光偏光度を測定する方法(特許文献２)、一本鎖ループ領域にハイブリダイズするプライマーの5’末端を固定化担体に固定化し、凝集反応を観察する方法(特許文献３)、一本鎖ループ領域にハイブリダイズするプローブ核酸を固相上に固定化し、プローブとLAMP増幅産物とのハイブリを蛍光または電気化学的な原理により検出する方法(特許文献４)がある。しかしながら、LAMP産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの効率が低く、測定効率、精度などにおいて問題がある場合もあった。
【特許文献１】特許第3313358号明細書
【特許文献２】特開2002-272475号公報
【特許文献３】特開2002-345499号公報
【特許文献４】特開2005-143492号公報
【非特許文献１】Science,230,1350-1354,1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記問題に鑑み、本発明は、ステム-ループ構造を有する核酸鎖をプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせて検出する方法において、ハイブリダイゼーション効率が改善された検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は前記課題を解決すべく、はじめに、ステム-ループ構造を有する核酸とプローブ核酸のハイブリ効率が低下する原因について検討した。その結果、LAMP増幅産物のようにステム-ループ構造を有する核酸鎖は、一本鎖ループ部分が複雑な高次構造を示す場合や、LAMP産物中の相補的な配列を示す一本鎖ループ同士が結合しやすい場合には、プローブ核酸とのハイブリ効率が低下してしまうことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明の第１の様態に従うと、ステム-ループ構造を有し、このループ構造部分の一部が検出配列である標的核酸、該検出配列と相補的な配列を有するプローブ核酸、及び、前記ループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する保護核酸を準備する工程と、該保護核酸を前記標的核酸に結合させて、該標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを行い、該プローブ核酸と結合した標的核酸を検出する工程とを行うことを特徴とする標的核酸の検出方法が提供される。
【０００９】
また、本発明の第2の様態に従うと、ステムーループ構造を有し、このループ構造部分の一部が検出配列であるLAMP増幅産物、該検出配列と相補的な配列を有するプローブ核酸、及び、前記ループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する保護核酸を準備する工程と、該保護核酸を前記増幅産物に結合させて、該増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを行い、該プローブ核酸と結合した増幅産物を検出する工程とを行うことを特徴とするLAMP法による増幅産物の検出方法が提供される。
【００１０】
また、本発明の他の側面から、上記検出方法のための保護核酸が提供される。さらに、該保護核酸及び適切なバッファー等を具備するアッセイキットが提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に従えば、ステム-ループ構造を有する核酸鎖をプローブ核酸と効率よくハイブリダイゼーションさせることができ、検出精度を向上させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書においては、検出されるべき核酸を標的核酸と称し、その塩基配列を標的配列と称する。また、本発明の検出方法に供され、この標的核酸を含み得る溶液を試料溶液と称する。
【００１３】
本発明における標的核酸は、ステム-ループ構造を有するものである。ここでステム-ループ構造とは、核酸鎖内に相補的配列部分を含み、その部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分及びその間のループ状一本鎖部分を含む構造を意味する。このようなステム-ループ構造の核酸は、例えば一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが自己ハイブリダイゼーションしたときにも形成されるが、最も典型的な例は、LAMP法による増幅産物として形成される。
【００１４】
また、本発明の方法においては、標的核酸（又は増幅産物）をプローブ核酸とハイブリダイズさせることによって検出するが、標的核酸（又は増幅産物）中のプローブ核酸とハイブリダイズするための配列を検出配列と称することとする。従って、プローブ核酸は、該検出配列と相補的な配列を有する。
【００１５】
LAMP法とは、試料中に存在する標的核酸を複数のプライマーと鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する方法である。増幅産物の検出方法には種々の方法があるが、本発明は上記の通りプローブ核酸を用いて検出する。
【００１６】
以下、LAMP法の概要を説明する。LAMP法では、図１に示すように、標的核酸に対してその５’末端側から順にF3領域、F2領域、F1領域を規定し、３’末端側から順にB3c領域、B2c領域、及びB1c領域を規定する。そして、図１に示すような4種のプライマーを用いて標的核酸を増幅する。なお、F1c、F2c、F3c、B1、B2、及びB3領域はそれぞれ、F1、F2、F3、B1c、B2c、及びB3c領域の相補鎖における領域を示している。
【００１７】
LAMP法において核酸を増幅するために使用される４種のプライマーとは、（１）３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し、且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー；（２）前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー；（３）３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し、且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー；及び、（４）前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマーである。一般に、FIPプライマー及びBIPプライマーはインナープライマーと呼ばれ、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーはアウタープライマーと呼ばれる。
【００１８】
上記4種のプライマーを用いてLAMP増幅を行うと、図2に示すようなダンベル構造を有する中間産物が生成される。一本鎖ループ内のF2c及びB2c領域にFIP及びBIPプライマーが結合し、該プライマーの３’末端及び中間産物自体の３’末端から伸長反応が進行する。詳細には、特許第3313358を参照されたい。
【００１９】
さらに、LAMP法では、上記4種のプライマーに加えて、ループプライマーと呼ばれるプライマーを使用することができる。ループプライマーは、図3に示すようにF2−F1領域間、B2−B1領域間にアニールするように設計される。このように設計すると、ループプライマーは図4に示すようにFIP、BIPプライマーが結合する一本鎖ループとは別の一本鎖ループにアニールすることとなり、これによりLAMP反応の合成起点を増やすことができ、効率的にLAMP増幅反応を行うことができる。詳細については、WO2002/024902を参照されたい。
【００２０】
以上概要を述べたLAMP法による増幅産物は、一本鎖であるループ構造部分の配列を用いることによって有利にハイブリダイゼーションすることができる。このため、図５に示すように、プローブ核酸とハイブリダイズさせるための検出配列、FP領域を、F1領域とF2領域の間(F2領域を含む)に規定する。同様に検出配列であるBP領域を、B2領域とB1領域の間(B2領域を含む)に規定する。なお、検出配列には、FP、FPc、BP、及びBPc領域のいずれか一つを用いてもよいし、二つ以上を用いてもよい。
【００２１】
このように検出配列を規定すると、図6に示すように、検出配列を含む一本鎖ループ領域を有するステム-ループ構造がLAMP産物中に形成される。検出配列が一本鎖であることから、ハイブリダイゼーションに先立って二本鎖から一本鎖にするという煩雑な操作が不要であり、またハイブリダイゼーションの効率を改善することもできる。
【００２２】
しかしながら、このハイブリダイゼーションにおいてなお効率が低い場合があり、測定効率、精度などに問題が生じる場合がある。その原因の一つとして、ステム-ループ構造の中のループ部分が溶液中で複雑な高次構造を形成してしまい、プローブ核酸とハイブリダイズできないことが挙げられる。
【００２３】
さらに、LAMP法においては、増幅産物中に互いに相補的な配列から成るループ部分が多量に存在するため、ループ部分同士が結合してしまい、増幅産物が本来結合すべきプローブ核酸とハイブリダイズすることができない場合が生じる。例えば図6に示すLAMP増幅産物のループにおいて、（ａ）と（ｂ）、（ｃ）と（ｄ）は互いに相補的な配列を有する。そのため、ループ部分が長い場合やGC含量が高い場合などには、相補的な配列を示す一本鎖ループ同士が互いに結合し、プローブとの反応効率を低下させる要因に成り得る。
【００２４】
そこで、本発明においては、前記ループ構造部分における前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する保護核酸を用い、該保護核酸を前記標的核酸に結合させて、該標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを行い、該プローブ核酸と結合した標的核酸を検出する。
【００２５】
LAMP法の増幅産物を検出する場合は、増幅産物中のループ構造部分における検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する保護核酸を用い、該保護核酸を増幅産物に結合させて、該増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを行い、該プローブ核酸と結合した増幅産物を検出する。
【００２６】
上記保護核酸は、前記標的核酸におけるループ構造部分の前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する核酸である。LAMP産物のための保護核酸は、前記増幅産物におけるループ構造部分の前記検出配列以外の部分の配列と相補的な配列を有する核酸である。
【００２７】
LAMP増幅産物のための保護核酸を具体的に例示すると、図７における矢印の部分に相補的な配列を有する核酸である。ループ両端の相補的な部分Ｆ１領域及びＦ１ｃ領域、又はＢ１領域及びＢ１ｃ領域の間であって、Ｆ１領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第一の保護核酸、Ｆ１ｃ領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第二の保護核酸、Ｂ１領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第三の保護核酸、Ｂ１ｃ領域から検出配列までの配列と相補的な配列を有する第四の保護核酸に分類することができる。
【００２８】
例えば図７（ａ）においては、第一の保護核酸はF1-FP領域間の配列に相補的な核酸であり、第二の保護核酸はFP-F1c領域間の配列に相補的な核酸である。図７（ｂ）においては、第一の保護核酸はF1-FPc領域間の配列に相補的な核酸であり、第二の保護核酸はFPc-F1c領域間の配列に相補的な核酸である。同様に、図７（ｃ）においては、第三の保護核酸はB1-BP領域間の配列に相補的な核酸であり、第四の保護核酸はBP-B1c領域間の配列に相補的な核酸である。図７（ｄ）においては、第三の保護核酸はB1-BPc領域間の配列に相補的な核酸であり、第四の保護核酸はBPc-B1c領域間の配列に相補的な核酸である。
【００２９】
上記保護核酸を一本鎖ループ領域に導入することにより、相補的な配列を示す一本鎖ループ同士の結合を回避することができる。さらに、一本鎖ループ構造部分の高次構造を解くことができる。これらによって、ループ構造中の検出配列が一本鎖状態であることが保証され、プローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を改善することができる。
【００３０】
なお、例えば検出配列がFP領域の場合、図7(a)の保護核酸の他に、図7(b)の保護核酸を使用することができる。この場合は、1本鎖ループ構造の高次構造を解く効果は期待できないが、相補的は配列を示す1本鎖ループ同士の結合は回避することができる。しかし、図7(a)と図7(b)の保護鎖を同時に用いると、保護核酸同士が互いに結合してしまい、増幅産物への結合が妨げられる恐れがあるため、何れか一方の場合の保護核酸を用いることが好ましい。検出配列にFPc、BP、BPcを用いる場合も同様である。
【００３１】
保護核酸を予め標的核酸（又は増幅産物）と結合させた後、プローブ核酸と標的核酸（または増幅産物）とのハイブリダイゼーションを行ってもよいし、或いはプローブ核酸と標的核酸（または増幅産物）とのハイブリダイゼーションに同時に保護核酸が添加されてもよい。なお、F領域またはB領域に検出配列を設計しない場合には、その一本鎖領域全てに結合する保護核酸を添加することができる。
【００３２】
さらに、本発明の他の側面から、上記方法に用いるための保護核酸が提供される。さらに、該保護核酸や、適切なバッファー等を含むアッセイキットが提供される。
【００３３】
＜検体試料＞
本発明が対象とする検体は特に限定される物ではなく、例えば、個体から採取した血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等を用いることができる。個体とは、ヒト、ヒト以外の動物及び植物、並びにウィルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物であってもよい。これら検体試料から核酸成分の抽出を行い、標的核酸の検出試験に供される試料溶液を調製する。抽出方法は特に限定される物ではないが、例えば、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用することも可能である。
【００３４】
＜プローブ核酸＞
プローブ核酸とは、検出配列と相補的な配列を示すプローブである。プローブは未標識のものであってもよいし、検出方法に応じて、Cy5、Cy3、FITC、ローダミン等の蛍光物質を標識したもの、ルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル誘導体などの発光物質を標識したもの、ハプテンや酵素を標識したものであってもよい。また、固相にプローブ核酸を固定化させるためにアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、アビジン、ビオチン等の物質で修飾したものであってもよい。
【００３５】
固相としては、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、ガラス、シリコン、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂、光ファイバーなどがあげる。
【００３６】
プローブ核酸に結合する検出配列は、標的核酸（LAMP産物中）に一つ以上設計するが、二つ以上設計する場合には、検出方法に応じて、未標識のプローブと標識されたプローブ、固相に固定化されているプローブと固定化されていないプローブを同時に使用してもよい。例えば、捕獲用のプローブ核酸と検出用の標識プローブ核酸を使用するサンドイッチハイブリダイゼーションなどでは、標識プローブ核酸は溶液中に浮遊し検出配列とハイブリダイズするが、捕獲用のプローブ核酸は、溶液中に浮遊し検出配列とハイブリダイズした後に固相上に固定化されるか、または、あらかじめ固相上に固定化されている。
【００３７】
さらに、プローブ核酸がDNAチップを構成しているものであってもよい。DNAチップとは、ガラスやシリコンの基板上に高密度にプローブ核酸を固定化したもので、一度に多くの遺伝子の配列情報を調べることができるデバイスである。現在主流の方式である蛍光検出方式は、蛍光で標識したサンプル遺伝子をチップ上のプローブと反応させ、高感度な蛍光解析装置を使って検出する方式である。また別の検出方法として、電流検出方式のDNAチップも開発されている。これは、電極上に固定化したプローブ核酸と標的核酸をハイブリダイゼーションした後、二本鎖ＤＮＡに特異的に反応する挿入剤を添加し、挿入剤から得られる電気化学的な信号を測定する方法である。電気化学的なＤＮＡチップは標識が不要であり、検出に高価な装置が必要ないことから第二世代のＤＮＡチップとして期待されている（例えば、特開平5−199898号公報参照）。
【００３８】
＜ハイブリダイゼーション反応条件＞
標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、標的産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、プローブ核酸の種類によって異なるが、例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加しても良い。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めても良い。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３９】
＜検出方法＞
プローブ核酸にハイブリダイズした標的核酸を検出する方法には、任意の方法を用いることができる。その具体例を以下に述べる。
【００４０】
第一の検出方法として、核酸の二本鎖に結合する挿入剤を用いる方法がある。プローブ核酸をアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、ハプテン、アビジン、ビオチン等の物質で修飾し、固相に固定化させる。保護核酸を標的核酸にハイブリダイズさせた後、固相上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる。その後、プローブ核酸と標的核酸のハイブリの有無を挿入剤の信号から検出する。
【００４１】
挿入剤としては、光化学的な活性または電気化学的な活性があれば特に限定されない。例えば、エチジュウム、エチジュウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ、ヘキスト33342、ヘキスト33258、アクラルビシン、ＤＡＰＩ、アドリアマイシン、エピルビシン、アクラシノマイシン等を用いることができる。また、その他の使用可能な挿入剤としては、特開昭62-282599 号公報に記載されたものが挙げられる。
【００４２】
また、電極を用いて電気化学的変化を検出する場合には、上述の挿入剤自身が酸化還元反応に対して可逆的である物質の他に、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質を中心金属として含有する金属錯体、すなわちメタロインターカレーターを用いることができる。このようなメタロインターカレーターとしては、例えばトリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、タ−ピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体を挙げることができる。
【００４３】
さらに、電極を用いて核酸の検出を行う場合には、電気化学発光を生じる挿入剤を利用することもできる。このような挿入剤は特に限定されるものではなく、例えば、ルミノ−ル、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセンおよびルブレンを挙げることがで
きる。これらの挿入剤による電気化学発光は、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノ−ル、クロロフェノ−ルのようなフェノ−ル類もしくはナフト−ル類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
【００４４】
光学的に活性な挿入剤の場合には、挿入剤単独の場合と、二本鎖に結合した場合との信号の差を吸光度、蛍光、発光、消光、蛍光偏光、円偏光二色性などの光学的な情報に基づく検出方法、あるいは、二本鎖に結合した挿入剤の吸収波長、蛍光波長、発光波長、消光波長の変化を検出する方法がある。
【００４５】
電気化学的に活性な挿入剤の場合には、中心金属または挿入剤自身の酸化還元電流を測定することにより検出する。
【００４６】
第二の検出方法として、固相上に固定化したプローブ核酸と、標識した（１）プローブ核酸または（２）保護核酸をサンドイッチハイブリさせる方法がある。（１）の標識したプローブ核酸をサンドイッチハイブリさせる方法とは、標識したプローブ核酸と未標識の保護核酸の両方を標的核酸にハイブリダイズさせ、その後、固相上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる方法である。（２）の標識した保護核酸をサンドイッチハイブリさせる方法とは、標識したプローブ核酸は使用せずに、保護核酸を直接標識し標的核酸にハイブリダイズさせ、その後、固相上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる方法である。（２）の場合、保護核酸は検出用の標識プローブ核酸の役割も担っている。
【００４７】
ここで使用される標識物質はその後に行われる検出方法に応じて決めることができる。例えば電極活性物質、蛍光物質、発光物質、電気化学発光物質、酵素、酵素基質、ハプテン、抗原、抗体、放射性同位元素などで標識し、標的核酸とハイブリダイズさせる。上記ハプテンのように直接信号を検出できないような物質は、酵素結合アビジンのような酵素結合抗ハプテン抗体を利用して酵素反応による物質の濁度、吸光度、蛍光、発光、消光、蛍光偏光、円偏光二色性のような光学的な情報により測定するか、もしくは電気活性を測定することにより間接的に遺伝子の検出を行う。
【００４８】
第三の検出方法として、天然高分子担体、合成高分子担体、金属コロイド、磁性粒子などの不溶性担体を固定化させたプローブ核酸を、保護核酸がハイブリダイズした標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、その凝集反応を観察する方法がある。
【００４９】
第四の検出方法として、プローブ核酸を電極活物質、蛍光物質、発光物質、電気化学発光物質、酵素、酵素基質、ハプテン、抗原、抗体、放射性同位元素などで標識し、保護核酸がハイブリダイズした標的核酸にハイブリダイゼーションさせる方法がある。第四の検出方法の特徴は、プローブ核酸を固相上に固定化せず、溶液中を浮遊している点にある。標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの有無は、二本鎖に結合する前と後との信号の変化を濁度、吸光度、蛍光、発光、消光、蛍光偏光、円偏光二色性などの情報に基づいて検出する。
【００５０】
本発明の検出方法において、プローブ核酸がDNAチップを構成している場合は、装置の小型化、検出操作の簡便性などが期待でき、望ましい。プローブ核酸がDNAチップを構成している場合、電流検出方式と蛍光検出方式などにより検出することができる。
【００５１】
電流検出方式の場合には、一般的に第一の検出方法に従い、核酸の二本鎖に結合する挿入剤を用いて検出を行う。ガラスやシリコンの基板上に電極を配置し、その電極上にプローブ核酸を固定化する。電極の数および配置パターンは、当業者が必要に応じて適宜設計することができる。また、他の一般的な電気化学検出法と同じように対極や参照極を使用してもよい。
【００５２】
ここで使用される電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いる事ができる。
【００５３】
続いて、未標識の保護核酸がハイブリダイズした標的核酸を基板上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる。その後、電気化学的に活性な挿入剤を添加し、挿入剤の電気化学的な信号から標的核酸の有無を検出する。
【００５４】
電気化学的な測定は、例えば挿入剤が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、挿入剤に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは定電位を印加してもよい。測定の際に、例えばポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。
【００５５】
二本鎖に入り込む挿入剤は電気化学的に活性な物質、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドーノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。
【００５６】
蛍光検出方式の場合には、一般的に第二の検出方法に従い、プローブ核酸または保護核酸をCy5、Cy3、FITC、ローダミン等の蛍光色素で標識し、標的核酸をサンドイッチハイブリさせる方法、および蛍光色素で標識したプライマーまたはｄNTPなどを用いることにより標的核酸を標識し、その後、固相に固定化したプローブ核酸とハイブリダイズする方法などがある。標的核酸と固相上のプローブ核酸との結合は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて行う。
【実施例】
【００５７】
本発明による核酸検出方法の応用例として、標的核酸配列の一塩基変異(Single  Nucleotide  Polymorphisms:SNPs)を検出した。本実施例では、サンプル用核酸として、ヒトSAA1遺伝子を使用し、SAA1プロモーター領域に存在するT/C SNPの検出を行った。図８にヒトSAA1遺伝子のプラス鎖を示し、各プライマーの配列部分を矢印で示した。点線で囲った部分は保護核酸の配列を示す。実線で囲った部分は検出配列部分であるが、本実施例ではマイナス鎖を検出配列としたため、図８の実線で囲った部分は検出配列と相補的なプローブ配列である。
【００５８】
ここで、FIPプライマーはF1c部分とF2部分とを含み、BIPプライマーはB1c部分とB2部分とを含む。それらの間は任意の配列を挿入してもよいし、挿入しなくてもよい。なお図8においては、Ｆ領域ではcが付加された部分（即ちF1c）は図8に示した配列の逆鎖を用い、反対にＢ領域ではcが付加されない部分（即ちB2及びB3）が図8に示した配列の逆鎖を用いることを意味する。
【００５９】
一塩基変異部位を含む検出配列を一本鎖ループ部分に位置するようにプライマーを設計し、LAMP法により増幅した。検出配列を含む一本鎖ループ部分(B2領域を含む)は47塩基である。LAMP増幅産物に、検出配列を含む一本鎖ループ側に結合する保護核酸を添加し、金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。その後、該LAMP増幅産物中に存在するSNPsを電流検出方式を用いて検出した。
【００６０】
＜検出配列＞
CTGCCAGGGAACGGTGG
＜合成ヌクレオチドプライマー＞
SAA1  F3プライマー  GTCTCCTGCCCTGACAGC
SAA1  FIPプライマー  CAGTGGTTTCTTCATCCCG(F1c)‐CAGGCACATCTTGTTCCCTC(F2)
SAA1  B3プライマー  ACTCCTTGGTGTGCTCCTC
SAA1  BIPプライマー  GGAAGGCTCAGTATAAATAGCA(B1c)‐GTGCTGTAGCTGAGCTGCG(B2)
＜保護核酸＞
GGACCCGCAGCTCAGCTACAGCAC
【００６１】
＜LAMP反応液＞
LAMP反応溶液は以下の組成とした。
【００６２】
滅菌超純粋                  1.5μL
Bst DNA Polymerase            1μL
Buffer                     12.5μL
Tris・HCl pH8.0 40mM
KCl 20mM
MgSO4 16mM
(NH4)2SO4 20mM
Tween20 0.2%
Betaine 1.6M
DNTP 2.8mM  
F3プライマー (10μM)               0.5μL
B3プライマー(10μM)                0.5μL
FIPプライマー(10μM)                 4μL
BIPプライマー(10μM)                 4μL
Template (purified human genome)     1μL
Total                              25 μL
【００６３】
＜LAMP法による増幅反応＞
温度は63℃、時間は1.5hで増幅反応を行った。増幅産物については、アガロース電気泳動で確認した。さらに、LAMP反応液調製時にゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した溶液についても同時に電気泳動し、コンタミネーションが起きていないかを確認した。  
プロモーター領域に存在するSNPの型については、シークエンスの結果、T/Tホモ型と判明しているゲノムを使用した。
【００６４】
＜プローブ核酸固定化電極の作製＞
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
【００６５】
ネガティブプローブ   GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA
マッチＴプローブ     CCACCGTTCCCTGGCAG
ミスマッチＣプローブ CCACCGCTCCCTGGCA
ネガティブプローブ、マッチＴプローブ、ミスマッチＣプローブについては、3’SH修飾プローブを用いた。ネガティブプローブ については、SAA1遺伝子配列とは無関係な配列を示す。
【００６６】
プローブの金電極への固定化は、チオールと金との強い化学結合性を利用して行った。末端をチオール修飾したプローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、１時間静置後、1mMメルカプトヘキサノール溶液に浸し、0.2×SSC溶液で洗浄した。スポットは、同一プローブについて、3電極ずつ割り当てた。洗浄後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極基板とした。
【００６７】
＜電極配置＞
1−3電極  ネガティブプローブ 
4−6電極  マッチＴプローブ
7−9電極  ミスマッチＣプローブ
【００６８】
＜プローブ核酸へのLAMP産物のハイブリダイゼーション＞
試料核酸は、上記で増幅したLAMP産物を用いた。LAMP産物に終濃度2×SSCの塩のみを添加したサンプルと、終濃度2×SSCの塩および終濃度1×1012copy/μlの保護核酸を添加したサンプルを上記で作製したプローブ核酸固定化電極基板上に0.2μｌずつスポットし、55℃で40分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、45℃の0.2×SSC溶液に浸漬し、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
【００６９】
＜結果＞
電流測定の結果を、図９に示す。保護核酸を添加しなったLAMP産物と保護鎖を添加したLAMP産物の電流値を比較すると、保護核酸を添加しなかったLAMP産物については、ほとんどハイブリに伴う電流値増加がみられなかったが、添加したLAMP産物については、顕著な電流値増加が認められた。ハイブリ後、電極を45℃の0.2×SSC溶液に浸漬することによってマッチＴプローブと一塩基違いのミスマッチＣプローブからの電流値増加はほとんどなくなった。このことから、プローブの配列条件、ハイブリ条件、洗浄条件を適宜選択することにより一塩基違いの配列も識別できることが明らかになった。本実施例で増幅した領域は遺伝子のプロモーター領域であり、検出配列を含む一本鎖ループ領域の複雑な高次構造が、プローブとのハイブリ効率が低下させていた可能性がある。保護核酸を添加することにより、一本鎖ループの高次構造が解け、プローブと検出配列のハイブリ効率が上昇したと推測された。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】標的核酸上での各領域の配置図。
【図２】LAMP法の増幅中間産物、及びプライマーのアニール位置を示す図。
【図３】標的核酸上でのループプライマー領域の配置図。
【図４】LAMP法の増幅中間産物、及びプライマーのアニール位置を示す図。
【図５】標的核酸上での検出領域の配置図。
【図６】LAMP産物中に形成される4種類の一本鎖ループ領域部分の模式図。
【図７】LAMP産物中に形成される4種類の一本鎖ループ領域部分における保護核酸の配置を示す模式図。
【図８】実施例における検出配列と保護核酸の領域設定を示す図。
【図９】実施例の結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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