(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドの分析のための装置を較正するための方法であって、以下：
（ｉ）該装置の細長分離チャネル中に、（ａ）未知のヌクレオチド配列の複数の分析物のポリヌクレオチドフラグメントを含むサンプルであって、該フラグメントの各々は、第１、第２、第３または第４の蛍光標識と結合する、サンプル、および（ｂ）既知のヌクレオチド長の複数のポリヌクレオチドフラグメントを含む内部標準であって、該ポリヌクレオチドフラグメントの各々が、第５の蛍光標識と結合する、内部標準、を提供する工程であって；ここで該第１、第２、第３および第４の蛍光標識は、該サンプル中に存在し、そしてさらにここで、該第１、第２、第３、第４および第５の蛍光標識は、互いにスペクトル識別可能である、工程；
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドフラグメントを電気泳動分離する工程；
（ｉｉｉ）（ａ）分離しているまたは分離されたポリヌクレオチドフラグメントの標識が該装置の検出ゾーンに沿って通過する場合、該分離しているかまたは分離されたポリヌクレオチドフラグメントの標識から蛍光発光を誘発する工程、（ｂ）該誘発された蛍光発光を検出する工程、および（ｃ）該検出された標識の各々についての蛍光強度トレースを表すデータを収集する、工程；
（ｉｖ）該第５の標識に対応するトレースのピークを位置決めし、該ピークの形状を決定する、工程；ならびに
（ｖ）該ピークの形状に少なくとも部分的に基づいて較正モデルを作成し、該モデルを、該第１、第２、第３および第４の標識に対応するピークの位置決めおよび分析に適用する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ピークの形状の特徴が、（ａ）ピーク高さ、（ｂ）ピーク幅、および（ｃ）ピーク面積のうちの１つ以上を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記分析物のポリヌクレオチドフラグメントのヌクレオチド配列が、決定され、該方法は、以下の工程：
（ｖｉ）該分析物のポリヌクレオチドフラグメントについてのベースコールを作製する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４】
電気泳動装置を使用して、ポリヌクレオチド分析物の分解能を決定するための方法であって、以下：
（ｉ）１つ以上の配列決定サンプルを内部標準と組み合わせて、１つ以上のそれぞれのサンプル混合物を形成する工程であって；該配列決定サンプルの各々は、未知のヌクレオチド配列の複数の分析物ポリヌクレオチドフラグメントを含み、該分析物ポリヌクレオチドフラグメントは、第１、第２、第３または第４の蛍光標識と結合し；ここで該内部標準は、既知のヌクレオチド長の１つ以上のポリヌクレオチドフラグメントを含み、該１つ以上のポリヌクレオチドフラグメントの各々は、第５の蛍光標識と結合し；さらにここで、該第１、第２、第３、第４および第５の蛍光標識は、互いにスペクトル識別可能である、工程；
（ｉｉ）該サンプル混合物を、該装置のそれぞれの分離レーンに充填する工程；
（ｉｉｉ）該サンプル混合物の各々を、そのそれぞれのレーンを下向きに、その検出ゾーンに沿って移動させるのに十分な電気泳動力を適用する工程；
（ｉｖ）分離しているポリヌクレオチドフラグメントまたは分離されたポリヌクレオチドフラグメントが該検出ゾーンを通過する場合に、該分離しているポリヌクレオチドフラグメントまたは分離されたポリヌクレオチドフラグメントの標識から蛍光発光を誘発するのに十分な励起放射線を、該検出ゾーンに向かって方向付ける工程、（ｂ）誘発された蛍光発光について検出する工程、および（ｃ）該検出された標識の各々の蛍光強度トレースを示すデータを収集する工程；
（ｖ）各サンプル混合物について、該第５の標識のトレースのピークを決定し、そしてピークの位置およびピークの半値幅を決定する工程；
（ｖｉ）工程（ｖ）の該検出されたピークについてのピークからピークの距離を決定する工程；ならびに
（ｖｉｉ）工程（ｖ）および（ｖｉ）からの結果を使用して、分解能値を算出する工程、
を包含する方法。
【請求項５】
機械により読み取り可能なプログラム記憶デバイスであって、該デバイスは、該機械により実行可能な指示プログラムを具現化し、ポリヌクレオチド配列データの較正のための方法工程を実行し、該方法工程は、以下の工程：
蛍光強度シグナルのセットを受信する工程であって、該セットの該蛍光強度シグナルの各々は、複数の成分シグナルから構成され、該成分シグナルの各々は、未知のヌクレオチド配列の複数の分析物ポリヌクレオチドフラグメントを含む多成分混合物中のそれぞれのヌクレオチド塩基または内部標準を示す、工程；
該内部標準に対応する第１の成分シグナルを決定する工程；
該それぞれのヌクレオチド塩基を示す、第２、第３、第４および第５の成分シグナルを決定する工程；
該第１成分シグナルからの特徴を同定し、そのピークの形状を決定する工程；ならびに
該ピークの形状に少なくとも部分的に基づいて較正モデルを作成し、該較正モデルを、該第２、第３、第４および第５の成分シグナルに適用する工程、を包含する、
デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願番号６０／３０４，９３４（２００１年７月１１日出願）（これは、本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（分野）
本発明の教示は、ポリヌクレオチド配列決定およびフラグメント分析、ならびに光学蛍光検出技術を用いる、ポリヌクレオチドシーケンサーおよびポリヌクレオチド分析器に関する。
【０００３】
（参考文献）
【０００４】
【表１】
0004436672.tif 000002
【背景技術】
【０００５】
（背景）
自動化ＤＮＡ配列決定は、データ解析プロセスへの多数のチャレンジを示す。この入力データは、非常に可変であり得、データ挙動の予測モデルがないが、コンピューター解析ルーチンは、非常に正確な出力データを作成すると予測される。
【０００６】
ベースコーリング（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ）は、自動化ＤＮＡ配列決定のデータ解析部分であり、これは、４つの蛍光強度の時間変動（ｔｉｍｅ−ｖａｒｙｉｎｇ）シグナルを受け取り、そしてこのシグナルを生じる基礎となるＤＮＡ配列の推定を行う。
【０００７】
一般に、ベースコーリングソフトウェアは、種々の現象（例えば、拡散および塗沫）の「モデル」、移動における種々の色素および配列特異的改変物の移動度の差異を、観察されるスペクトルデータに適用して、フラグメントの正味の挙動およびそれらがどのように分離されるかを予測することで働く。このモデルがより現実的になると、アルゴリズムは、生のシグナルデータを、実際のフラグメント分離順序、従って配列（および／またはフラグメントサイズ）の表示へと、より良好に逆重畳し得る。広範に使用されるアルゴリズムは、非常に単純でかつ概算的なモデルのみを提供する。
【０００８】
改善のためのこれらの供給源の各々は、ある程度の成功まで処理されるが、より完全なアプローチが、現在の方法を越える画期的な向上を遂げるために必要とされることは明らかである。改善されたアルゴリズムに、必要とされるさらなる情報を提供して、正味のデータシグナルのより正確な表示および分離フラグメントの現実的なモデルを開発し得る配列決定プロセスに対する改変が、特に有用である。
【０００９】
ベースコーリング誤差の主な供給源は、空間の不正確な推定であり、すなわち、これは、特定の塩基に関連するフラグメントが検出器を通過する際に、認識される。これは、特に、操作後期のホモポリマー領域において認識可能である（例えば、５Ａｓが６Ａｓとして不正確に呼ばれ得る）。現在、多数の別々の較正操作および広範な分析が、ハードコード（ｈａｒｄ−ｃｏｄｅｄ）間隔曲線を生じる。しかし、適用された操作条件におけるバリエーションまたは全く制御されていない実験バリエーションは、フラグメント分離プロフィールを生じ得、このプロフィールは、ハードコード曲線から実質的に逸脱している。異なる操作条件に対して頑健性であるピーク間隔を決定する力学的方法は、操作後期のベースコーリング精度を実質的に改善する。
【００１０】
逆重畳の数学的方法または数学的技術は、ベースコーリング精度を改善するための別の機会を提供する。逆重畳は、生のデータを一連の既知のピーク形状として説明するように試み、そして重複しているピークを正確に分離することが示されている。しかし、逆重畳は、正味のピーク形状およびピークサイズが事前に知られていない場合、擬似ピークを生じ得る。このピーク形状および単離された既知のピーク幅を測定する方法は、逆重畳方法を改善し、次いで、この方法は、ベースコーリング精度、特に操作後期（さらに一緒に）を改善する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
このような問題は、本明細書中の教示によって（例えば、較正標準をポリヌクレオチド分析（例えば、配列決定またはサイズ決定）反応物に加えることによって）、取り組まれる。例えば、ピーク形状およびピーク間隔情報のうちの１つまたは両方が、標準から有用に抽出され、各個々の実験に耐性な、フラグメント移動挙動の良好なモデルを提供する。
【００１２】
本発明の教示は、とりわけ、以下の１つ以上を提供する：改善された長さまたは読み取り、わずかなベースコーリング誤差、データおよび実験品質の良好な評価、および／または広範な種々の実験条件下においてデータを呼び出す性能。
【００１３】
本発明の種々の局面は、ポリヌクレオチドの分析用装置を較正するための方法に関する。種々の実施形態において、このような方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）この装置の細長分離チャネルに、（ａ）サンプル、および（ｂ）内部標準を提供する工程であって、このサンプルは、未知のヌクレオチド配列の複数の分析物ポリヌクレオチドフラグメントを含み、これらの各々は、第１の蛍光標識、第２の蛍光標識、第３の蛍光標識または第４の蛍光標識に結合し、そしてこの内部標準は、未知のヌクレオチド長の複数のポリヌクレオチドフラグメントを含み、これらの各々は、第５の（５番目の）蛍光標識に結合し；ここで、この第１の蛍光標識、第２の蛍光標識、第３の蛍光標識および第４の蛍光標識は、サンプル中に存在しており、そしてさらにここで、この第１の蛍光標識、第２の蛍光標識、第３の蛍光標識、第４の蛍光標識および第５の蛍光標識は、スペクトルによって互いに識別可能である、工程；
（ｉｉ）これらのポリヌクレオチドフラグメントを電気泳動によって分離する工程；
（ｉｉｉ）（ａ）この装置の検出領域に沿って通過する場合、この分離しているポリヌクレオチドフラグメントまたは分離したポリヌクレオチドフラグメントの標識から、蛍光発光を誘導する工程、（ｂ）この誘導された蛍光発光を検出する工程、および（ｃ）この検出された標識の各々についての蛍光強度痕跡を表わすデータを収集する工程；
（ｉｖ）第５の標識に対応する痕跡のピークを位置付ける工程、およびそれらの少なくとも１つの特徴（ピーク形状およびピーク間間隔の少なくとも１つ）を決定する工程；
（ｖ）この少なくとも１つの特徴に、少なくとも部分的に基づいた較正モデルを作成する工程、ならびに第１の標識、第２の標識、第３の標識および第４の標識に対応するピークを位置付けて分析する際に、このモデルを適用する工程。
【００１４】
種々の実施形態において、このような方法は、未知のヌクレオチド配列の分析物ポリヌクレオチドフラグメントに対するベースコールを作製する工程をさらに包含し得る。
【００１５】
これらおよび種々の他の実施形態は、以下の説明、図面、および添付の特許請求の範囲に示される。
【００１６】
（種々の実施形態の記載）
種々の実施形態に対して、参照がなされ、この例は、添付の図面において例示される。本発明の教示は、種々の実施形態とともに記載されているが、それらは、本発明の教示をそれらの実施形態に対して制限することを意図しないことが理解される。対照的に、本発明の教示は、当業者によって理解されるような、種々の代替物、改変物、および等価物を包含することが意図される。
【００１７】
現代のシーケンサー（例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３７００、３１００および３７７  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））の高度に進化した検出器性能を用いると、ＤＮＡ配列決定およびフラグメント分析に代表的に使用される、４色の検出スキームにもはや制限されない。従って、異なる色素または「第５」の色素で標識される標準は、サンプルと同じ分離レーンに加えられ得、そして配列決定またはサイズ決定のために現在使用されている基礎的な４つとともに検出され得る。次いで、これらの「内部」標準は、追跡、シグナル分析、および／またはサイズ決定機能などのために使用され得る。種々の実施形態において、本明細書中に提供されるような内部標準は、標識分子（例えば、既知のサイズのポリヌクレオチドフラグメント）のセットを含み、これを使用して、所定の分離時間間隔内で見出される塩基の数、およびゲルの領域についてのより正確なピーク形状モデル（レーンおよび移動時間）を推定し得る。
【００１８】
本記載の大部分は、キャピラリーベースのシステムの文脈において、第５色素標準に焦点を合わせているが、同様に、スラブゲルベースのデバイスが本発明の教示を組み込み得ることが理解されるべきである。また、本記載の大部分は、同時に第５の標準の使用を記載しているが、１レーンあたり１つより多い余分な色素（例えば、第６の色素、第７の色素、またはそれより多い）を使用するのに、固有の制限がないことが理解されるべきであり、最終的な数は、主に、利用可能な色素のプロセスの必要性およびスペクトル分離に依存する。
【００１９】
（配列決定／マッピング／対立遺伝子検出の関係）
本発明の教示は、内部標準の配列決定レーン（キャピラリー、チャネル、ゲルトラック）に封入物を提供し、この内部標準は、基礎となるシグナルのより正確なモデルを可能にし、基準ピークのより正確な逆重畳を可能にする。この標準は、例えば、以下の１つ以上を提供し得る：
・どれだけの塩基が所定の分離間隔内にあるべきかを決定するための間隔曲線；
・レーン／キャピラリー／トラックおよび実験特異的ピーク形状モデル（例えば、サンプルデータの逆重畳のため）；
・全シグナル、ピーク形状および標準ピーク間のベースラインを使用する、より正確なベースライン予測；
・較正されたピーク形状およびベースラインを使用する、ピークと実験との間、および混合された塩基（例えば、ヘテロ接合体）分析における、より正確な相対的な定量化の推定；
・移動度補正のための較正；
・開始点（すなわち、塩基１）インジケータ；
・バーコード様サンプル／実験追跡標識；
・サンプルの充填およびデバイスの状態についての、品質評価（ＱＡ）インジケータ；ならびに／または、
・正規化標準および定量化標準。
【００２０】
種々の実施形態において、標準は、既知のセットの分子を含み、この分子は、配列決定および／またはフラグメントサイズ決定のために使用される４色セットからスペクトルによって区別される蛍光を用いて標識される。特定の実施形態において、本発明の教示に従う標準は、配列決定−標識ＤＮＡフラグメントの様式を模範し得る様式で、移動可能であり、検出の際に類似のピーク形状を提供する。本明細書中の教示に従う標準は、例えば、標識配列反応またはサイズ決定実験の１つ以上のレーンに充填され、余分な色素または第５の色素の色データは、従来の４色セットとともに、このようなレーンに戻される。第５の色標準によって提供される情報を使用して、ピーク形状、ベースライン、移動度、相対的移動度、および／または相対的なサンプル品質のためのモデルは、各レーンおよび操作条件の組み合わせについて特有に構成され得る。このようなモデルは、先行技術方法を超える多数の利点（絶対的により長い読み出し長さ性能だけでなく、それらがより高速のゲルのゲル分解能を低下させるように補正し得る場合、匹敵する読み出し長さのための高速な操作時間を含む）の実現を可能にする。このハイブリッドアプローチは、配列決定の（最終データの）正味のスループットをかなり増加させ、最終塩基あたりのコストを低下させ、そしてさらなるユーザがアクセス可能な配列決定を実行し得る。また、良好なシグナルモデルは、品質値評価およびヘテロ接合性区別におけるより高い精度のために、より正確なビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）機能を可能にする（ｌａ  ＴｒａｃｅＴｕｎｅｒＴＭ−Ｐａｒａｃｅｌ；Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）。特定の標準および特定のレーンに送達されるべき量を認識するのに、実験プロセスおよび機械状態のＱＡが、追跡される。
【００２１】
本発明の教示は、かなり多数の環境での使用を見出し得る；例えば、非常に高スループットのグループ、作業を完了するための長期読み取りに関与し、高い「正確さ（ａｃｃｕｒａｂｃｙ）」および「精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）」が必要である調節された環境（スクリーニングおよび診断）に関与し、そして発見または診断のための混合された配列決定ストラテジーに関する。
【００２２】
レーンの追跡は、通常、キャピラリー機器を必要としないが、ゲルベースのシステムの巨大な接地されたベースがなお存在する（例えば、ＡＢＩＰｒｉｓｍ（登録商標）３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。有利には、第５の染色標準は、より良好なレーン区分を提供し得、従って、追跡する（すなわち、それが検出器の前を移動する際に、単一サンプルのフラグメントを追跡し、そして単離する）。これは、順に、より高密度なサンプルの充填を促進し得、面倒な手動の再追跡を排除し、そして乏しいサンプル対レーンの基準に起因して、一般的に、ゲル機械上で小さい値である様々な配列決定モデル（例えば、同じクローンの両端からの配列決定）が可能である。（欠損ウェルなどからの）異常なレーンを補正するか、またはバンドの異常が解像度を歪めないような追跡に対する単一（最良）点をちょうど選ぶいずれかの方法をまた提供し得る。レーンの密度が増加するので、これは、オーバーラップするシグナルのシグナル分解が減少するのを助け得る。本発明の１つの実施形態は、隣接するレーン（少なくとも２つの交互）または時差充填における異なる標準フラグメント対を使用する。この適用を使用して、単一ゲル上で分離され得るレーンの数は、劇的に増加し得る。
【００２３】
レーン追跡（ｔｒａｃｋｉｎｇ）は、代表的に、キャピラリーシステムに対してほとんど関連性を有さないが、差次的な標準は実際に、テンプレート／反応セットの追跡について関係する。基本的なテンプレート標識化は、結果の誤標識を除外することによって、大規模指向性の配列決定ストラテジーまたは二重末端配列決定ストラテジーを、大いに容易にし得る。次いで、この標識化は下流のアセンブリプログラムについての要求を低減し、さらにプロジェクトが重要性を有する前に行われるべき配列の量を低減する。このことはまた、クローン同定が重要である、スクリーニング適用、診断的適用および法医学的適用において、より高い保証性を提供する。例えば、１組の５番目の色素で標識化されたサイズ化フラグメントは、全てのテンプレートサンプルをコードする、完全な３２ビット（またはそれより大きい）バーを提供し得る。１つの実施形態において、バーコードがウェルに予め添加されたマイクロタイタープレートが製造される。このようなバーコードは、異なる研究室の間でさえ、唯一のサンプル識別を保証するのに役立ち得る。これは、特に、医療サンプルの維持において有用であり得る。
【００２４】
このようなサンプルのタグ化は、サンプルの物理学的マッピングにおける使用もまた見出し得る。例えば、初期のテンプレートレベルでのタグの付加は、クローンのフットプリンティングの調製、およびその後の配列決定（マップされた低パス配列決定のストラテジー）を容易にし得る。サンプルＩＤがサブクローンをマッピングするプロジェクトに対してさらに困難である可能性がある（これらは、サブクローニングして配列決定のために選別する追跡（ｔｒａｃｉｎｇ）のために、ハイスループット方法および高度に自動化された方法を必要とする）ことが注目され得る。本明細書中に記載される、統合されたサイズ化標準物は、サイズ化に対して、現在のＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）方法が提供する増強と同じ増強を提供し得るが、より大きいスループットを提供する（サンプル／レーン）。また、本発明によって可能とされる、（修正、逆重畳積分、などのために）シグナルをよりよく理解する能力は、任意のサイズ化プロセス、特に、より大きなクローンのＳＴＲマッピングおよびＩＩ型酵素マッピングのより乱雑なピークデータに、まさしく有用であり得る。
【００２５】
第５の色素系の１つの重要な含意は、第５の色素系がプロトコールおよび泳動条件を改変および改善するために提供する柔軟性である。各新たなマトリックス、色素セットまたは分離時間についての塩基呼び出し（ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）ソフトウェアを微調整すること、保持することおよび／または再較正は、かなり最小化または排除され得る。本発明での使用に好ましいソフトウェアは、含まれる任意の新しい内部標準を本質的に使用するために適応される。このソフトウェアは、好ましくは泳動時間パラメータとして、検索するための色、検索するためのフラグメントパターン、そのパターンに関連させるサイズ、ピーク形状変換機能および任意の組成物特異的な標準化因数（以下で考察される）を持つように構成される。その上、標準の登録は、別の含意を有する。標準の登録は、サンプルの第１の塩基位置をよりうまく算出するために使用され得る。これは、より正確かつより長い初期の読み取りを可能にするだけではなく、排除、分類などのために、主なベクターまたはタグ配列のよりよい同定を促進する。
【００２６】
よりよいピーク形状およびベースラインのモデル（本発明によって理解され得る）は、混合された配列決定の必要性（相対的頻度測定）に決定的な相対的定量化にかなり役立ち得る。これは、ＳＮＰ頻度の解析および掘り出し（ｍｉｎｉｎｇ）ならびに診断（体細胞性の変動について）のいずれにおいても有用であり得る。
【００２７】
（技術的含意）
色素（標識）特性：
配列決定に慣習的に使用される４つの色素は、便利な励起振動数（多重光源または非レーザー光源が使用されない限り、通常は４つの色素に共通の振動数）のための要件、それらの発光振動数において十分な分離と、シグナル強度と、類似のサイズ／移動度プロフィールと、酵素適合性と、配列特異的な色素の相互作用（移動度の差異に影響する）と製造可能性（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ）との間での譲歩を表す。任意の新たな第５の色素は、全てのこれらの関係から免除されないが、それらの要件は、一般に非常に限定的である。
【００２８】
その励起振動数は、好ましくは従来の対（共通のレーザーを与えられる）と同じ範囲内であるが、発光振動数は、好ましくは配列決定色素からうまく除外される。このことは、配列決定色素についても同様に好ましいが、第５の色素は、移動度が一致するようには制約されない。従って、この選択は、この分離を強調し得る。このことは、実際に全シグナル中で最良のノイズプロフィールを維持するために特に重要であり得る。相対的移動度は、合理的にのみ類似していなければならない（多重の塩基によって離され得る）。移動が一貫しており、そして予測可能であることだけが重要である。
【００２９】
（標識分子特性：）
第５の色素試薬で標識される分子の望ましい特徴は、標識されるセットの意図される使用に少なくとも一部依存する。本明細書中の実施形態に企図されるように、（標識剤といかに相互作用するかとともに）標識される分子の２つの主要な特徴は、一致した結果を生じること、および最も少ない分子がロードされ得る一方で、代表的なピーク挙動を維持することである（形状は、好ましくは、類似のサイズの配列フラグメントとおよそ同じである）。特定の実施形態が、ネスト化したセットのＤＮＡフラグメントを標識することが少なくとも最初には容易であることを企図するものの、使用される分子に固有の制限はない。例えば、レーンおよびサンプル追跡は、実際の形状もサイズの要件も有さず、一致したバンド形成のみを要件として有する。また、第５の色素に加えて、本発明は、スペクトル分解が提供される限り、第６（またはそれ以上）の使用を企図する。シグナル分析およびサンプル追跡は、組み合わせた機能を有する必要はない。フラグメントは、妥協した移動度一貫性を有さないでシグナルが改善される場合、複数の色素で標識され得る。ピーク形状は、そのサイズのサンプルフラグメントが見える場所に予測可能にマッピングされる限り、類似のサイズのサンプルフラグメントと同一である必要はない。ピーク形状間にマッピングするこの能力は、多数の較正配列を実行する必要なく、新規なプロトコルに対して信頼のある値の測定を推測するために有用であり得る。
【００３０】
本明細書中の特定の実施形態は、第５の色素標識ＤＮＡフラグメントの使用を企図する。ＤＮＡベースのラダーの例（本発明によって企図される）は、以下の特性のうちの１つ以上を含み得る：
・既知の標準（例えば、Ｔラダー）の単一塩基配列決定反応；
・既知の長さのセットのＰＣＲフラグメント（１つの実施形態において、一連の非関連配列とは反対に、共通末端（ｃｏｍｍｏｎ  ｅｎｄ）でネストされたセット）；
・細菌により増幅されたクローン挿入物−例えば、セットのＳ１ヌクレアーゼ産物；
・ラダーを生成するように自己連結された粘着性末端を有する単一オリゴ；
・２分子構造の特定の特性、標識の容易化、製造性、移動度一貫性、組成などについて設計されたセットの完全合成ネスト化配列。
【００３１】
上記の任意が、容易に標識化され得る既知のそれぞれのサイズのセットのＤＮＡフラグメントを提供し得る。ラダーの横木（ｒｕｎｇ）間のサイズの違いが一致する（同じである）ことは重要ではない。実際、いくらの不一致は、ベースカラーに提供されるサイズ情報を用いてフラグメントデータを記載するには有用であり得る。しかし、同じ配列の増分を構成するラダーの一貫性は、魅力的であり得る（連結ラダーモデル）。同じ長さの配列および同じ標識が、配列特異的移動の問題（ピリミジンリッチな配列は、プリンリッチな配列よりも速く移動する傾向がある）に起因して、わずかに異なって移動し得るので、増分の配列は、「平均」配列を反映するように選択され得る。補正因子は、標準フラグメントに対してその領域での推定ベース組成物に依存して、２つの標準的な点間でベースの数を推定する場合、ベースカラーに含まれ得る。標準配列は、好ましくは、異常な予測不可能な局所フラグメント移動度を導く２次構造の問題を避けるかまたは最小化するように設計される。
【００３２】
本発明とともに使用可能な標識化技術は、例えば、色素標識化ターミネーターを用いる単一塩基伸長、増幅スキームにおける標識プライマーの使用または任意の連結方法における標識末端フラグメントの直接的組み込みのいくつかの形態であり得る。選択される特定の方法は、標識の容易さ、フラグメント生成の容易さ、および異なる標識（ターミネーターまたはプライマー）がピーク形状モデル化のために有する意味の間のバランスを反映する。
【００３３】
種々の実施形態に従って、標識化標準分子が、サイズ決めされるフラグメントに対して直接的な類似の移動曲線を提供するように設計および／または選択される。種々の実施形態が、実際の配列決定またはサイズ反応標識化に類似の標識化を利用することによって、最も良いシグナルモデルを達成する。例えば、大部分の配列決定が、標識化ターミネーターを用いてなされる。標準フラグメント（本発明に従う）は、同じ方法で標識化され得る。これは、サンプルと標識の配列特異的相互作用の性質によって複雑になり得；標識されたプラマーは全て、色素の隣に同じ局所配列を有し、一方ターミネーター標識は、通常、異なる局所配列に隣接する。本明細書中の実施形態に提供されるように、標準ＤＮＡフラグメントは、この問題を最小化するために、同じ局所末端配列を有するように設計され得る（例えば、連結ラダーモデル、あるいは連結ラダーまたはカスタム設計の最もランダムな配列（ジデオキシ配列決定反応において使用される標識されるべき塩基に隣接する短い共通エレメントを有する）から作製されるクローン）。
【００３４】
種々の実施形態に従って、費用を減少し、そしてロードする容積および過剰ロードする歪みに起因して分解能を低下させないために、できるだけ少ない標準がロードされるが、代表的なピーク特徴を提供するには十分にロードされる。標準の実際のピークサイズは、配列決定ピークより有意に少なくあり得、スペクトル分離が改善するように多い。なぜなら、ベースカラーは、何を探し、基本的にどこに見えるかを知り得るからである。従って、多くの場合において、規則的な配列反応ロードのモル量の１０分の１ほどの少なさで、十分であり、いくらかの場合、より少ない。使用者が反応混合物を希釈するので、絶対的なシグナルは、問題になり得、含まれるべきより多くの標準を必要とすることが注意される。ラダー分子が正常な色素／配列フラグメントセットの移動度のオフセットを正確に反映し得る必要がない（重要であるのは、フラグメントの絶対的なサイズではなく、フラグメント間の相対的な差異である）ので、多くの標識フラグメントが、より少ない標準がロードされ得るように、シグナル強度を増加するために使用され得る。
【００３５】
（ラダー密度）
本発明の実施形態において、本発明の好ましいラダーは、それらの長さ範囲にわたって完全に分離した（明確なベースライン）ピークを提供するが、レーン当たりの移動度（移動度  対  ゲルランタイム）プロフィールの生成のために第５の色素標識フラグメントの十分な分離を提供するために、それ以下を有することが必要である。このようなラダーが実験的に決定され得る。１つの実施形態において、１０〜５０のオーダー（例えば、１６、１８または２０）のラダーが使用される。ラダーが規則的である必要はない（すなわち、第１の数百ほどの塩基が、５０塩基毎の密度を有し得、後者のサイズは、１０により近くあり得る）ことが理解されるべきである。また、たとえラダーが多かれ少なかれ規則的であるとしても、マーカーピーク位置間の差異は、正確に同じである必要はなく、ただ正確に知られればよい。実際いくらかの不規則性が、ある絶対的なサイズ標準に対してデータを記録する場合、有用性を提供し得る。また、より多くのフラグメントを有することは、それぞれが使用されなければないことを意味しない。例えば、移動の平均は、セットの２つの間隔マーカーの重なりを使用することによって計算され得る。選択は、現在の実験的必要性に最も適合する標準からなされ得る。
【００３６】
実際に、実際の標準サイズＤＮＡ分子がない（同じ数の塩基を有する２つのフラグメントが、組成の違いおよび色素自身との配列特異的相互作用のため、依然として異なって移動する−ときどき劇的に−）ので、局所組成の極度について調節し、そして試験することが望ましくあり得る。１つの実施形態は、移動平均が使用され得るように、ラダーの密度（所定のロードおよび製造性の要件）を最大化することが好ましいことを提供する。より長い間隔およびより短い間隔の両方が、ある領域において探されるべき塩基の推定の数を計算する場合に、適用され得る。例えば、これは、未知のデータについて最良の「平均」間隔曲線を得るために１０塩基の距離および５０塩基の差異の両方を提供するために、１０塩基ラダーを使用することを含み得る。これは、例えば、標準の間隔配列が異なった場合、有用である。
【００３７】
（シグナル補正）
特定の実施形態において、使用される標準色素は、配列決定色素の発光シグナルとそれ自身との間で最大の区別を提供するように選択される。これは、例えば、そのシグナルの最良のＩＤを提供するため、そして複数の成分の分析において固有のノイズを減少させるために有用であり得る。これは、真実のシグナル特性およびベースラインについてのより良い特徴付けのためのツールを提供し得る。シグナルは、好ましくは、真実のサンプルシグナルを表すピーク形状を提供するように十分大きい。異なる実験条件下での標準的な実施はまた、新たな試験されてない条件についての構成（学習）モデルを提供し得る。１つ以上の独立した実験由来の構成モデルが実施され、そしてこれらの新たな実験に含まれる第５の色素なしでさえ、類似の実験のためにモデルを提供するために使用され得る。
【００３８】
第５の色素ピークが、配列決定フラグメントと正確に同じ形状を与える必要はないことが注意されるべきである。しかし、これらは、好ましくは、適切な外挿を行うには十分な一貫性が存在する。この変換を行い得ることはまた、まだ訓練されていない新規な条件下で、第５のピークデータ実行を使用して予期される実験ピーク形状を予測するための方法を提供する。これは、劇的に（同じ「実施」の間）なされ得るか、または有用性およびプロセスが、新規なプロトコルを用いて実施される既知の配列からの正確なデータ（例えば、ベクター配列のＴ反応）に提供され得、そのプロトコル下での実際の実験の実施において使用のために内部標準に形状−参照モデルをマップする。
【００３９】
（平坦なゲルシステムの使用）
スラブゲルベースシステムについて、特定のレーンの移動プロファイルを決定する際に、ソフトウェアがゲル幅情報（すなわち、解釈される個々のレーンのデータから分離された他のレーン／ゲル領域からのデータを含む）を使用し得る条件で、いくつかの数だけのレーンが、このラダーを含むのに必要とされる。内挿は、介在するレーンについての「仮想的な」標準プロフィールを提供し得る。
【００４０】
（レーン追跡）
平坦なゲル機械について、レーン追跡を容易にするために、ゲルの長さにわたるシグナルを提供することが有用である。これは、サイズ標準の改変によって提供され得る。各レーンが同じサイズ標準でロードされる場合、レーン追跡についてかなり少ない利点が存在する（レーンが、隣接レーンをオフセットするために非同期的にロードされる場合、幾分和らげる）。しかし、隣接レーンが（異なるパターンのバンド間隔のために）異なるセットのサイズフラグメントを有する場合、レーン追跡ソフトウェアは、レーンを追跡するためのこの情報を使用し得、そして適切なフラグメントセット内に維持し得る。レーン毎にサイズ標準をロードしないことについての上記示唆とは異なり、このスキームの１つの実施形態は、シグナルを有するための各レーンを必要とする。例えば、最小の２つのセットは、使用され得、代替的にロードされ得る。別の実施形態は、３つ（またはそれ以上）のセットの使用を企図する。
【００４１】
種々の実施形態において、単一の完全なセットのサイジングマーカーは、３つのサブセットに分けられ（２つの連続的サイズが同じセットにないように分けられる）、そして上記完全ゲル分析が使用される。基本的に、この実施形態において、３つのレーン毎に、それらの隣接するレーンに全てのサイズ範囲を提供し、なお、追跡を支持するためのレーン特異的パターンを提供する。隣接レーンが同じ標準バンドパターンを有し得ないことを期待して、追跡／呼びかけソフトウェアは、「失われた」レーン（すなわち、ロードに失敗した場所）を認識し得、正しいレーン−サンプルの対応を維持し得る。
【００４２】
（サンプル追跡：）
先に示されるように、標識分子は、必ずしもＤＮＡではない。ゲル上の適切なサイズ範囲内で移動する任意の分子であり得、そして比較的容易に標識される。添加される場合に依存して、これはまた、好ましくは、反応条件と親密であり、反応条件によって害されない。１つの実施形態において、好ましいモデルは、代表的なバーコードのモデルである（実際、標準バーコードコードスキームが使用され得る）。１つの実施形態において、少なくとも１６ビット、より好ましくは、２４〜３２ビットが、多くの十分なサンプル数を提供するために使用される。このスキームは、２進法（存在するまたは存在しない）であり得るか、または複雑（例えば、３進法−０、１Ｘまたは２Ｘの強度）であり得る。第１は、より単純であり、そして精密さを必要としないが、第２のものは、より小さなマーカー成分（標識されたエレメント）および分離のためのより小さいゲル長さを必要とするが、潜在的に、より複雑な製造プロセスを要する。１つの実施形態において、開始モチーフ（フラグメントバンドパターン）は、各タグセットについて提供され、その結果、それぞれは、正しい相に記録され得る。これは、必要とされるバンドの数を増加し得ることが注意される。サイズエレメント（バンド）間の少なくとも２〜３塩基の等価な分離が、ベースライン分離のために好ましい。１つの実施形態において、合計のバーコードは、１００塩基分離範囲以下（好ましくは５０）で読み取り可能である。
【００４３】
いつ標識（バーコード）を追加するかは、サンプルコーディングをどれだけ良好に行うか、または少なくともどれだけ意義があるかを規定することに重要であり得る。１つの好ましいプロセスにおいて、サンプルＩＤは、プラークまたはコロニーがつみ取られるとすぐに加えられる。１つの実施形態において、サンプルの処理が進むにつれて、コードは情報を増加する（各工程は、その工程についてコードするビットのいくらかの数を加える）。あるいは、別の実施形態において、プロセスの完全な記録は、情報管理システム（ＬＩＭＳ）によって維持される。
【００４４】
サンプルがその元のつみ取りの後に、いくらかの形態の増幅を受ける状況において、コードフラグメントセットをつみ取りのときに加えることは、最適ではない。なぜなら、それは、希釈され得、増幅テンプレートで単離され得ず、そして／または増幅に影響し得るからである。これを認識すると、１つの実施形態は、固体支持体（例えば、ビーズ）に取り付けられたタグを提供し、これは、元のプラークピックに添加され、これは、次いで、適切なプロトコルの変化とともに、調製および配列決定反応を介してテンプレートが物理的に続き得る。次いで、コードセットが、ゲルロード時間においてビーズから捕まれ得る。最終コードの異なる部分を有する一連のビーズは、サンプル履歴を追跡するためにプロセスの間、添加され得る。１つの実施形態において、一連の複数標識化ビーズは、予め作製され、そしてコンビナトリアルの様式で、ヘキサマー配列決定に添加される。
【００４５】
別の実施形態において、タグセット添加は、増幅の直後にもたらされる。これが元のピックに対していくらかの参照的整合性の損失を生じ得るが、本発明は、すでに比較的小さな問題を最小化するために、追跡プログラム（例えば、自動化ピッカーを増幅デバイス（使用される場合）に連結すること）の使用を企図する。この点から、異なるプロセシングについてのサンプルの任意の分割がカバーされる。ここで制限は、タグが、配列決定反応を妨害しないことである。なおさらなる実施形態（実施するのが最も簡単であるものであり得る）において、各配列反応セットは、ロードの前に標識される。これは、独特のレーン同定ならびに配列決定プロセスにおけるチューブまたはウェルとゲルロードプロセスにおけるチューブまたはウェルとの間の参照整合性（最も有意な点の誤差の２つ）を提供する。
【００４６】
本発明の技術はさらに、ここで記載されるように、レーン同定（ＩＤ）のための実施形態を提供する。１つの実施形態において、レーンＩＤは、上記のようにバーコードタグによって提供される。特定の他の（幾分より簡単な）実施形態は、単一ゲルにおいてレーンを識別するためのみに提供される（レーンＩＤ対サンプルＩＤ）。本明細書中に企図されるように、１つの方法は、完全なサンプルＩＤ実施形態に類似するが、より少ないタグ化成分を必要とする（すなわち、潜在的な数のレーンほどに多くの数を生成するのにちょういど十分なビット（例えば、７〜８ビット））。サンプルＩＤが完全な配列決定反応に加えられるのみであり、そしてテンプレートに加えられない場合において、このより単純な方法は、おそらく反応セットの使用されない部分が再ロードのために保存される場合を除いて、ほぼ利点であり得る。テンプレートの２つの端部が配列決定される場合でさえ、この方法は、テンプレートが、別の配列決定反応位置（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）に直接アリコートされる限り、良好であり、その結果、追跡が、データベースによってなされ、そして手動で維持されず／ノートを入力しない。サンプルが、自動反応プロセスに配置される場合、正しくサンプルが追跡される（記録される）と仮定すると、これらのタグは、同じレベルの識別を提供する。これは、反応が進まず、レーン追跡が混乱し、そして同じテンプレート配列に連結を提供し得る場合、曖昧なくデータのレーンを識別するのに有用である。
【００４７】
本発明によって企図される、レーンＩＤについての別の潜在的に単純な方法は、サイジング／移動度タグを直接組み込む。レーン特異的移動度の予測を提供するために、基本的にサイジング標準を必要とする。レーン追跡を容易にするために、隣接するレーンが異なる（しかし、機能的に等価な）レーンであるように、複数のこのようなサイジング標準を提供することが有用であり得る。これらの規定されたマーカーがレーンの長さについて異なることを知ることは、ラインで追跡を維持するために直接的に使用され得る。同時に、これは、レーンＩＤにつて最小の指定を提供する。この極限において、この実施形態は、レーン毎に異なる標準を呼び出す。しかし、代替的にロードされる２および好ましくは３個の標準は、レーン指定のために少なくとも一貫性チェックを提供し得る（例えば、レーン４は、ロードされた標準＃１を有するが、反応４が進まなかったので、追跡が戻り、考えているレーン５は、レーン４であった場合、それは、その中に標準＃２を有し、そして誤差が認識される）。この方法は、バーコードレーンタグの必要を除くが、きわめて簡単でなくても良い（どれだけタグ化された配列がゲルにロードされるかにおいて柔軟でなくても良い）。１つの実施形態において、２つのサイズの標準のみ（テンプレートタグ化が使用されないと仮定する）を用いて両方の方法を組合せることが好ましい。
【００４８】
ゲルベースのシステムについて、特定のレーンについて移動度プロフィールを予測する場合に、提供されるソフトウェアがゲル幅情報を使用する場合、いくつかの数のレーンだけがこのラダーを有さなければならない。
【００４９】
レーン分離がキャピラリー電気泳動シークエンサーの問題でないので、単純な単一パターンの第５の色素較正標準が、配列決定化学キットにおいて直接的に含まれ得る。このようなキットを使用して、使用者は、新たな試薬を混合または添加する必要がない；標準は、使用者に対して透明である。
【００５０】
（実験的プロセスの意義）
モデルおよび生データの正確な最高の表示に対する能力を改善することならびにサンプルとデータ間の参照整合性を維持することを越えて、第５の色素は、個々の実験の状態および質の追跡、異なる実験からの結果の比較、およびデバイス（例えば、シークエンサー）の性能の特定の局面の分析を補助し得る。これらは、一般的に、品質制御／評価（ＱＣ／ＱＡ）機能として議論され得、そしてより効率的な全体の実験／工業プロセスを容易にしないが、より制御された努力のために必要な正確な実験的記載を生じ得る。
【００５１】
（サンプル注入／ロードモニタリング：）
現在の方法とともに、シグナルがレーンまたはキャピラリーにおいて検出されない場合、問題が注入／ロードプロセスに関連するのか、または実際の配列決定反応に関連するのか明瞭でない。これは、既知の標準（第５の色素）フラグメントセットが含まれ、そして配列決定反応生成物に含まれる場合、よりよくモニターされ得る：第５の色素シグナルの存在または非存在が可能な誤差条件を制限し得る。この適用において、第５の色素フラグメント密度は、任意の数（レーン当たり１つのフラグメントでさえ）であり得る。この適用の実施形態は、以下の通りである：
配列決定反応生成物は、第５の色素フラグメントセットと組み合わされる。このサンプルは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３７００機器にロードされ、そして各色チャネルからのシグナルが収集され、そして抽出される（この場合、チャネル１〜５）。第５の色素チャネルからのシグナルが調べられ、そして他の４つのチャネルと比較される。第５の色素チャネルからのシグナルのみが存在する場合、配列決定反応は、いくらかの点で失敗すると推定される。チャネル１〜４が、予期されるように（そして／または、存在する場合、他のレーン／キャピラリーと比較して（例えば、存在する場合、任意の他のレーンの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、そして／または少なくとも９０％）シグナル強度で存在するが、第５のチャネルシグナルがないかまたは予想されるよりも（そして／または他のレーン／キャピラリーと比較して（例えば、存在する場合、任意の他のレーンの５０％未満、３０％未満、２０％未満、そして／または１０％未満）かなり少なく存在する場合、混合プロセスが疑われる。第５のチャンネルシグナルがないことまたは減少したことを、サンプルチャネル強度がないことまたは減少したことと組み合わせる場合、ロードがおそらく失敗している。種々の実施形態において、この機能は、各レーンがかなりの量の存在する標準を有するべきなので、レーン間の値を比較するための能力を含む。
【００５２】
配列決定における別の共通の問題は、レーン／キャピラリー（例えば、気泡）あるいはロードウェルまたは注入容積における不完全さの存在である。これらの全てが、変形を導き、従って、たとえ合計のサンプルシグナルが精密でも、バンドを識別するのは困難で、乏しい配列測定を生じる。この問題は、種々のチャネルのトレースを見ることによって、単純に乏しいまたは「汚い」配列決定反応を識別することは困難であり得る。しかし、標準的なフラグメントのベースライン分離（予期されるピーク間のいくらかの距離）が存在するので、さらにゆがんだ第５の色素のバンドは、単離可能なようである。従って、ゆがんだ（乏しい形状、広すぎるなど）バンドは、問題の性質を示し得る。最高の場合に、上に示されるように、この情報は、使用可能な配列データ（ピーク検出機能において実際のピーク形状を組み込むことによる）を得るのに十分にデータを「クリーンアップ」するために使用され得る。
【００５３】
（レーンシグナルクロストーク：）
１つのレーンからのシグナルは、隣接レーンからのシグナルに流れ込み得る。キャピラリーにおいて、これは、光源のまずい較正ならびに／あるいはキャピラリーおよび供給源／検出器要素のまずい整列の結果であり得る（例えば、１つのレーンからの散乱蛍光が別のレーンの検出器によって検出される）。スラブゲルにおいて、これは、２つのレーン間のフラグメントの実際のクロストークによって悪化され得る（まずいロード、変形したゲルなど）。全体として、このシグナルクロストークは、レーンの価値を深刻に減少させ得る。クロストークは、同じ走査点および色チャネルにおいて「正常」なシグナルの量に起因して定量化するのは困難である。従って、単純に乏しい配列反応からこの結果を区別することは困難である。しかし、第５の色素フラグメントセットがキャピラリーまたはスラブゲル機器のいずれかに配列決定反応サンプルをロードする場合、シグナルクロストークは、配列決定シグナルから独立して決定され得る。これは、基本的に可能である。なぜなら、特にキャピラリーにおいて、標準バンドは、決して、２つの別々のレーンに同時に正確にラインナップされないからである。最も明らかな場合において、隣接レーンのシグナルピークに対応する１つのレーンの第５の色素チャネルのゴーストピークまたはショルダーは、クロストークであると推定され得る。しかし、より拡散するシグナルの散乱は、単純にノイズバックグラウンドを生じ得る。このシグナルの漏れは、補正され得る（分析の前に流れ出たシグナルを引く）。重要なことは、機器およびその較正を診断するために使用され得る。この現象に「気付いている」ベースカラーとともに、自動報告が生成され得、そしてシステム操作者および援助要員が、気づき得る。この適用の実施形態は、以下の通りである：
配列決定反応サンプルは、第５の色素フラグメントセットと組合わせられる。このサンプルは、機器（キャピラリーまたはスラブシステムのいずれか）にロードされる。全ての５個のシグナルチャネルからのシグナルは、各レーンで収集される。各時点における第５の色素の量は、各レーンについて計算される。クロストークの比は、サンプルレーンにおいて第５の色素のシグナルによって、隣接レーンの第５の色素のシグナルを割ったシグナルとして決定される。
【００５４】
（インサイチュクロスオーバー（解像度）決定）
特定の条件下での分離マトリックスの解像力は、フラグメントが隣接するフラグメントから分離される際にいかに良好に同定され得るかを決定する。多くの要因が、この解像度に影響を与える。従って、特定のプロセスの解像力を計算し得ることは、実験の問題を診断する際、およびいかに多くの有用なデータが収集され得るかを予測する際に、有用であり得る。ピークの解像度は、しばしば、隣接するピークまでのそのピークの距離と、そのピークの幅（その高さの半分において計算される）との比として決定される。これは、時々、クロスオーバープロットと称される（この距離が、クロスオーバーが達成される幅の半分より小さく、そしてピークが単離可能であるとみなされない場合）。これは、４色の配列決定反応データのみを用いて決定することが、困難である。なぜなら、バンドの密度が、ピークの有意な重なりをもたらし、ピークをさらに連続させるからである。ピークの形状が乏しいモデルは、ベースラインの乏しい決定と組み合わせて、ピーク間距離の計算およびそれらのピークの真の高さの計算さえも、疑わしくする。しかし、中程度の密度〜高密度であるがベースラインがなお解像された（１００の塩基あたり２〜１０のフラグメントの）５番目の色素フラグメントのセットが、配列決定反応サンプルと共に充填される場合、システムの解像度は、配列決定反応サンプルのシグナルとは無関係に決定され得る。この適用の実施形態は、以下の通りである：
配列決定サンプルが、複数の５番目の色素フラグメントと混合され、そして配列決定反応生成物を充填される。５番目の色素からのシグナルが収集され、そしてピーク位置および各ピークの半分の高さにおけるピーク幅が、決定される。ピーク間距離が決定され、そして解像度が決定される。
【００５５】
（シグナル強度の標準化）
ＤＮＡフラグメント分析の多くの適用は、より量的な記載を必要とするか、またはより量的な記載から利益を受け得る。充填、検出器の感度などの差異に起因して、この記載は、特に実験間で困難である。しかし、既知の量の内部標準が、異なる機器に対してさえも、実験間の標準化のための基礎を提供し得る。これは、少なくとも相対的な量的比較のための基礎を提供する。この適用の実施形態は、以下の通りである：
配列決定サンプルが、高密度の５番目の色素フラグメントと混合され、そして配列決定反応生成物を充填される。サンプルチャネルおよび５番目の色素のチャネルからのシグナルが収集され、そして適切なウィンドウ（ピークの数（１つ以上））にわたって、各々の合計が計算される。サンプルシグナル対５番目の色素のシグナルの比が決定される。サンプルの相対量が、実験間のこのサンプル値の比として決定される。
【００５６】
（追跡システムの性能）
経時的に組み合わされ、そして追跡される場合、上記分析の結果を使用して、システム全体（デバイスおよびプロセス）にわたる性能をモニタリングし得る。例えば、充填される標準の量および性質は、各実験について既知であるので、実験間（泳動間）でのシグナル強度、解像度、クロスオーバー、クロストークおよびピーク形状の一貫性の比較が、進行中の基礎で決定され得る。この比較は、化学、操作プロセス（例えば、充填）、使用されるマトリックス（個々のキャピラリー、ゲルロットなど）、検出デバイスの較正などを反映し得る変化の記載を提供する。適切な報告手順（ソフトウェアなど）を構築して、これらの変化を説明し得、そしてこれらの変化をプロセス性能の推定機能および／またはメンテナンスの介入の要件に結び付け得る。
【００５７】
（機器システム）
図３は、機器システムの実施形態の構成要素を図示し、この機器システムは、本明細書中の教示に従って分析されるべきデータシグナルを発生させるための、電気泳動および蛍光の検出機器を備える。別の構成要素間の適切なインターフェース（例えば、これらの構成要素をユニット間の情報の伝達に適合させるためのもの）が、それぞれ構成要素に備えられる。
【００５８】
図３によれば、サンプル１０３および参照１０５のポリヌクレオチド溶液（おそらく、電気泳動および蛍光の検出のために調製されている）が、検出可能な成分への分離のために、電気泳動機器１０７に添加される。分離の間または分離後に、これらの成分は、励起ビーム（例えば、レーザー光）によって励起される場合に放出される蛍光によって、検出される。
【００５９】
蛍光検出ユニット１０９は、サンプルおよび参照配列のそれぞれのヌクレオチド塩基について、それぞれの蛍光の強度レベルを提示するシグナル１１１を発生させる。強度シグナル１１１が、ベースコーリングユニット１１３に出力され、そしてまた、記憶デバイス１１７（例えば、ディスプレイデバイス（モニタ）、プリンターまたはディスクドライブ）に送られ得る。
【００６０】
ベースコーリングユニット１１３は、本明細書中の教示を使用して、強度シグナル１１１を解釈し、そしてヌクレオチド塩基の配列に対応する出力１２１を提供する。ベースコーリングユニット１１３は、配列における、十分に高い信頼度で決定されない１つ以上の位置を特異的に標識し得ることが、理解されるべきである。
【００６１】
（コンピュータ実行）
図４は、特定の実施形態によるコンピュータシステム５００を図示するブロック図であり、このコンピュータシステムにおいて、本教示の実施形態が実行され得る。コンピュータシステム５００は、バス５０２または情報を通信するための他の通信機構、および情報を処理するためのバス５０２に結合されるプロセッサ５０４を備える。コンピュータシステム５００はまた、メモリ５０６を備え、このメモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他の動的記憶デバイスであり得、ベースコール、およびプロセッサ５０４によって実行されるべき命令を決定するために、バス５０２に結合される。メモリ５０６はまた、プロセッサ５０４によって実行されるべき命令の実行の間に、一時的な変数または他の中間的な情報を記憶するために使用され得る。コンピュータシステム５００は、静的情報およびプロセッサ５０４のための指示を記憶するための、バス５０２に結合されたリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）５０８または他の静的記憶デバイスをさらに備える。記憶デバイス５１０（例えば、磁気ディスクまたは光ディスク）が、情報および命令を記憶するために提供され、そしてバス５０２に結合される。
【００６２】
コンピュータシステム５００は、バス５０２を介して、コンピュータのユーザに情報を表示するためのディスプレイ５１２（例えば、陰極線管（ＣＲＴ）または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ））に結合され得る。入力デバイス５１４（英数字および他のキーを備える）が、情報およびコマンド選択をプロセッサ５０４に通信するために、バス５０２に結合される。別の型のユーザ入力デバイスは、方向の情報およびコマンド選択をプロセッサ５０４に通信するため、ならびにカーソルの移動をディスプレイ５１２上で制御するための、カーソルコントロール５１６（例えば、マウス、トラックボールまたはカーソル方向キー）である。この入力デバイスは、代表的に、２つの軸（第１の軸（例えば、ｘ）および第２の軸（例えば、ｙ））での２の自由度を有し、これは、このデバイスが平面内で位置を特定することを可能にする。
【００６３】
ベースコールは、メモリ５０６に含まれる１つ以上の指示の１つ以上の順序を実行するプロセッサ５０４に応答して、コンピュータシステム５００によって提供される。このような命令は、別のコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、記憶デバイス５１０）から、メモリ５０６に読み込まれ得る。メモリ５０６に含まれる命令の順序の実行は、プロセッサ５０４に、本明細書中に記載されるプロセス状態を実施させる。あるいは、ハードワイヤード回路が、ソフトウェア指示の代わりにかまたはソフトウェア指示と組み合わせて使用されて、本教示を実行し得る。従って、本開示の実行は、ハードウェア回路とソフトウェアとのいずれの特定の組み合わせにも限定されない。
【００６４】
用語「コンピュータ読み取り可能媒体」とは、本明細書中において使用される場合、実行のためにプロセッサ５０４に指示を提供することに関与する、任意の媒体をいう。このような媒体は、任意の形態をとり得、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない。不揮発性媒体としては、例えば、光ディスクまたは磁気ディスク（例えば、記憶デバイス５１０）が挙げられる。揮発性媒体としては、動的メモリ（例えば、メモリ５０６）が挙げられる。伝送媒体としては、同軸ケーブル、銅線、および光ファイバーが挙げられ、バス５０２を構成するワイヤを含む。伝送媒体はまた、音波または光波の形態（例えば、伝播および赤外線のデータ通信の間に発生するもの）をとり得る。
【００６５】
コンピュータ読み取り可能媒体の通常の形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、または他の任意の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、他の任意の光媒体、穿孔カード、紙テープ、孔のパターンを有する他の任意の物理的媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリチップ、またはカートリッジ、本明細書中以下に記載されるような搬送波、あるいはコンピュータが読み取り得る他の任意の媒体が挙げられる。
【００６６】
種々の形態のコンピュータ読み取り可能媒体が、実行のためにプロセッサ５０４に１つ以上の指示の１つ以上の順序を運ぶことに関与し得る。例えば、これらの指示は、最初、遠隔コンピュータの磁気ディスク上で運ばれ得る。遠隔コンピュータは、これらの指示をその動的メモリにロードし得、そしてこれらの指示を、モデムを使用して電話回線を通して送信し得る。コンピュータシステム５００に局在するモデムは、電話回線上のデータを受信し得、そして赤外線送信機を使用して、これらのデータを赤外線シグナルに変換し得る。バス５０２に結合された赤外線検出器は、赤外線シグナル中で運ばれるデータを受信し得、そしてバス５０２上にデータを配置し得る。バス５０２は、このデータをメモリ５０６に運び、このメモリ５０６から、プロセッサ５０４が指示を検索および実行する。メモリ５０６によって受信される指示は、必要に応じて、プロセッサ５０４による実行の前または後のいずれかに、記憶デバイス５１０に記憶され得る。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、単なる例示であり、そして本発明の範囲および本発明に関する特許請求の範囲の範囲を、いずれの様式でも限定することは意図されない。
【００６８】
（実施例１）
図１は、シミュレートされた５番目の色素の泳動からのデータを示す、電気泳動図である。ｘ軸は、走査数であり、そしてｙ軸は、任意の単位での蛍光振幅である。各走査は、持続時間が約１秒間である。ピークの大部分は、等間隔である。すなわち、これらのピークは、各々１８塩基で生じる。３７００  ＰＯＰ５データ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に類似の移動度を使用して、現実的な走査間隔をシミュレートした。これらのピークのうちの少数が、規則的な１８塩基の間隔からずれている。このようなパターン化されたピークを使用して、開始位置（すなわち、塩基１）の絶対的な較正を提供する。同定を容易にするために、規則的に間隔を空けたピークは、空白（赤色）の円によって同定され、一方でパターン化されたピークは、塗りつぶされた（緑色の）円で同定される。
【００６９】
５番目の色素ラダー（図１Ａ）から、図１Ｂおよび１Ｃの曲線が推定され得る。図１Ｂは、走査数の関数として、ピーク間の間隔を表す。この間隔はまた、走査数で報告される。図１Ｃの曲線は、各ピークの幅を、走査数で、走査数の関数として表す。この幅は、そのピークの最大高さの半分の全幅（ＦＷＨＭ）として測定され得る。
【００７０】
幅曲線（図１Ｃ）を使用して、デコンボリューション技術を改善し得る。いくつかの技術（例えば、ＷｉｅｎｅｒおよびＭａｘｉｍｕｍのエントロピー）は、ピーク幅が比較的一定であるウィンドウに対して、フーリエ変換を実行する。走査軸を再補間して一定の幅を達成することによって、フーリエウィンドウは、データセット全体であり得る。このことは、有意に改善された実行時間をもたらし、そしてデコンボルブされたウィンドウを一緒に切り替える必要性を排除する。
【００７１】
（実施例２）
図２は、本発明の実施形態によって企図される工程を示すフローチャートを提供する。
【００７２】
ピーク検出は、当該分野において公知の多数の技術によって、達成され得る。例えば、ピーク検出は、不連続にサンプリングされたＥＰデータにおける局所的極大の同定によって達成され得る。本発明の実施形態は、Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化を包含するアルゴリズムを利用する。ピーク特徴を評価するための任意の種々の技術が、本発明を実施する際に使用され得る。目的の特徴としては、以下が挙げられる：位置（走査）および形状（例えば、高さ、幅）。Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化はまた、これらの終了の近くに使用され得る。
【００７３】
ピークの弁別がまた、種々の様式で達成され得る。種々の実施形態において、何らかの参照点からのピークの高さ−幅空間におけるユークリッド距離が記憶され、そして区別されて、引き続く分析のために考慮されるべきピークから、無視されるべきピークを分離する境界を決定する。
【００７４】
ピークをサイズ鮮明度からのサイズと適合させることは、ＲａｔｉｏＭａｔｃｈｅｒ（このような作業のために設計された動的プログラミングアルゴリズム、米国仮特許出願番号６０／１２９，６９７を参照のこと；本明細書中に参考として援用される）によって取り扱われ得る。本発明は、しばしば、比較的多数の大きさおよびピークを取り扱うことを包含するので、ＲａｔｉｏＭａｔｃｈｅｒは、いくつかの状況において、所望されるよりコンピュータ的に強くあり得る。しかし、ＲａｔｉｏＭａｔｃｈｅｒは、データのサブセットに対して使用され得、次いで、その結果が、より単純なアルゴリズム（５番目の色素データの特定の特徴（例えば、十分に改造された、ほぼ等しく間隔を空けたピーク）を利用する）のための開始点として使用され得る。
【００７５】
５番目の色素データの分析の結果は、最初の４つの色素シグナルの処理および分析、ならびにピークの分類（すなわち、ベースのコーリング）を補助する。利点としては、以下が挙げられる：
５番目の色素のデータの十分に解像されたピークは、ピークの形状（幅、および充填／注入の異常、分離マトリックス中の気泡などに起因する不均一性の影響）ならびに間隔の良好な推定を、シグナルの位置の関数として提供する。これらの幅および間隔の推定は、乏しい解像度を有する付随するシグナルの、より良好な分析を可能にする。
【００７６】
移動度シフトの較正は、参照点（通常、「塩基１」と称される）の位置に依存する。この参照点の推定は、５番目の色素のシグナル分析によって提供される、大きさ−走査マップによって改善される。
【００７７】
（実施例３）
本開示の１つの例によれば、ラダーは、５番目の色素で標識されたフラグメントを、１０〜２０塩基ごとに、塩基約２０〜塩基約１２００〜１５００（すなわち、少なくとも６０フラグメント）で含むように、設計および構築される。さらなる２〜３個のピークは、塩基１の推定の開始の近くに存在するように設計され得る。ラダー配列は、この実施形態において、標準的な条件下で泳動される場合に、ほぼ「通常の」移動（例えば、４つ全ての塩基の全く等しい提示を有することによる）を示し、そして実質的な移動度不規則性を示さない。このラダーは、例えば、反復内部ユニットからなり得、従って、ピーク間で、同じ配列の一定の数の塩基が存在する。このラダーは、例えば、一塩基配列決定反応から生じ得る。別の実施形態において、テンプレートは、さらなるピークを含むが、（少なくとも約５塩基）単離されたピークを約２０塩基程度ごとに含む。理想的には、これは、上記反復ユニットを含む。
【００７８】
（実施例４）
この実施例は、以下の２つの異なる型の生成物を企図する：（ａ）合成（および連結）された核酸配列のセット、ならびに（ｂ）合成およびクローニングされた核酸配列のセット。生成物（ａ）は、種々の大きさの、（５’末端が標識された）５番目の色素で標識されたフラグメントから構成され、これは、泳動される場合に、例えば、３７００または３１００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で泳動される場合に、５番目の色素のラダーを生じる。生成物（ｂ）は、５番目の色素で標識されたジでオキシターミネーターを用いて、例えば、−２１Ｍ１３万能プライマーを使用して配列決定される場合、（３’末端が標識された）５番目の色素のラダーを生じるために使用され得るクローンである。
【００７９】
５番目の色素のラダーは、配列決定サンプルと共に、例えば、ＡＢＩ  ＤＮＡ  分析機器で泳動され得る。このラダーは、大きさが、例えば、１８または１９〜７２００を超える塩基までの範囲であり得、１つの５番目の色素で標識されたフラグメントは、１０〜５０塩基ごと（例えば、１２または１８塩基ごとなど）である。
【００８０】
生成物（ａ）または（ｂ）の実施形態において、５番目の色素で標識された３つのさらなるフラグメントが、５番目の色素ターミネーター配列決定反応によって、塩基５７、８７、および９４の近くに生じた。
【００８１】
（実施例５）
最初の較正標準は、３つの塩基（例えば、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔのいずれか３つ）がその配列の長さに沿ってランダムに組み込まれ、そして４番目の塩基（例えば、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔの４番目）が、その配列の長さに沿って規則的に間隔を空けた（例えば、１０番目の塩基位置ごと）間隔で（そしてこの間隔でのみ）組み込まれた配列を含んで作製される。第４の塩基は、標準的な配列決定反応を使用して、独特の蛍光標識で標識される。
【００８２】
（実施例６）
この実施例は、実施例４の生成物（ｂ）に関して上記したものと類似の様式で構築された、５番目の色素ラダーに関する。
【００８３】
最初のクローニングインサート（小容量）を、１つのＧのみ（これは、１２マーの末端に存在する）を含む１２マーの自己連結によって作製した。より大きい量を、連結産物をクローニングすることによって、生成した。次いで、規則的な４つの色素配列決定反応を、クローン産物に対して実施した。図５は、配列決定データからのこのＧのみの追跡を示すプロットである。示されるように、このプロットにおける軸は、より適切かつ有用な部分にズームインするようにクリッピングされて示される。
【００８４】
（実施例７）
この実施例は、サンプルの注入／充填のモニタリングに関する。
【００８５】
９６個の配列決定サンプルを、各々、５番目の色素フラグメントのセットと混合した。次いで、これらのサンプルを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器に充填し、そして泳動（分離）し、そしてシグナルを収集した。図６は、３７００機器からこれらのサンプルの各々に対して報告されたシグナルを示す。サンプルの完全性は、各サンプルの結果を個々に調査することによって、決定され得る。この図において、Ｃ０１位置におけるサンプルは、いずれの配列決定シグナル（色素１〜４）をも示さず５番目の色素シグナルが存在した。このことは、Ｃ０１には配列決定反応生成物が存在しないことを示し、このことは、プロセスの反応段階における問題を示す。他方で、プロフィールＡ０３は、配列決定と５番目の色素シグナルとの両方において、シグナルを示さなかった。このことは、サンプル充填（注入）の問題が起こったかもしれないことを示す。Ｅ０５位置は、配列決定と５番目の色素のシグナルとの両方を示したが、それぞれが、他の実験におけるそれらのプロフィールに相対的であるようであることを示した。このことは、キャピラリーまたは充填ウェル、あるいはサンプルの純度さえにおける問題を示し得る。
【００８６】
本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に、参考として援用されると示されたと同じ程度まで、本明細書中に参考として援用される。
【００８７】
当業者は、多くの改変が可能であることを理解する。このような改変の全ては、本明細書中に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
本発明の教示の例示的な構造および操作様式は、それらの種々の目的および利点とともに、添付の図面と組み合わせて与えられる以下の説明に記載される。ここで、同一の参照番号は、類似または同様な要素を同定する。
【図１Ａ】図１Ａは、シミュレートした第５色素電気泳動操作によって生じたデータを表わす電気泳動図である。任意の単位において、このｘ軸は、走査数であり、そしてｙ軸は、蛍光振幅である。規則正しく間隔を空けたピークは、白丸によって同定され、そしてパターン化されたピークは、黒丸を用いて同定される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの第５色素ラダー（ｌａｄｄｅｒ）から推定される曲線であり、これは、走査数の関数として、ピーク間の間隔を示している。この間隔はまた、走査数においても報告されている。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａの第５色素ラダーから推定される曲線であり、走査数の関数として、この走査数における各ピーク幅を示している。この幅は、このピークの高さの半波高全幅値（ＦＷＨＭ）として測定される。
【図２】図２は、本発明の教示の実施形態によって企図される工程を示すフローチャートである。
【図３】図３は、本明細書中の教示に従って、分析物についてのデータシグナルを発生させるためのシステムを例示する概略ブロック図である。
【図４】図４は、種々の実施形態に従う、コンピューターシステムを例示するブロック図であり、ここにおいて、本発明の教示の実施形態が実行され得る。
【図５】図５は、自動化ＤＮＡ分析器を使用する、種々の実施形態に従って構成される第５色素ラダーの電気泳動プロフィールである。ｘ軸は、走査数であり、ｙ軸は、蛍光振幅である。
【図６】図６は、９６個の配列決定サンプルの各々について、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器から報告されたシグナルであり、これらのサンプルの各々は、第５色素フラグメントのセットと組み合わされた。各ウェルについて、上部パネルは、配列決定シグナルを示し（色素１〜４）そして低部パネルは、第５色素シグナルを示す。
【図１Ａ】
0004436672.tif 000003
【図１Ｂ】
0004436672.tif 000004
【図１Ｃ】
0004436672.tif 000005
【図２】
0004436672.tif 000006
【図３】
0004436672.tif 000007
【図４】
0004436672.tif 000008
【図５】
0004436672.tif 000009
【図６】
0004436672.tif 000010