(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高いダイオキシン類分解能を有する新菌株モルチエレラ・エスピーＤ５（Mortierella sp.D5）FERM  P−１７６８７又は新菌株ペニシリウム・エスピー D７（Penicillium sp. D7）FERM  P−１７６８８。
【請求項２】
高いダイオキシン類分解能を有する新菌株モルチエレラ・エスピーＤ５（Mortierella sp.D5）FERM  P−１７６８７又は新菌株ペニシリウム・エスピー D７（Penicillium sp. D7）FERM  P−１７６８８を、ダイオキシン類を含有する環境に接種、生育させることを特徴とするダイオキシン類の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ダイオキシン類を分解する微生物に関するものである。さらには、ダイオキシン類を分解する微生物を用いダイオキシン類を分解する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ダイオキシン類は、極めて微量の内在によって、生体内で正常に営まれているホルモン作用に重大な影響を与える外因的物質であり、最強の内分泌撹乱化学物質、いわゆる環境ホルモンと位置付けられている。すなわち、ダイオキシン類は、一般に脂溶性が高いため微量でも生体組織中に蓄積され、遺伝毒性、催奇形性、発癌性、免疫異常、発育異常を引き起こすと云われている。生体内や自然状態では分解や無毒化が全く期待できず、解毒剤も無い状態の中で、これらダイオキシン類をはじめとする塩素系有害化学物質による空気、水、土壌の汚染は、調査・研究が進むにつれ、看過できない大きな社会問題となって来ている。
【０００３】
ダイオキシン類の発生源としては、ゴミ焼却炉、廃棄物埋立地、ハイテク産業工場（排水）、製紙パルプ工場（排水）、あるいは過去に多用された塩素系除草剤施用農地（土壌、排水）などが報告されている。
【０００４】
このような極めて有害なダイオキシン類を分解処理する方法、装置として各種のものが提案されている。なかでも、１０００℃以上の高温で加熱完全燃焼する方法は、９０%以上を分解でき、確実性が高いが、燃焼施設費が高額につき、また燃焼コストも高くかかるという欠点がある。
また、低酸素雰囲気下で加熱して、ダイオキシン類を脱塩素化、水素化して分解する方法は、分解率は高いものの、分解操作条件の管理が難しく、操作を誤るとダイオキシン類再生の危険を孕んでいる（特開平11−315796号公報、特開平11−76756号公報）。
【０００５】
又、ダイオキシン類を含む無機粉末を超臨界水中で分解させる方法が提案されているが、閉鎖施設中で雑多な、大量のごみや、土壌中のダイオキシン類の処理には難点がある（特開平９−３２７６７８号公報）。
【０００６】
さらには、木材腐朽菌であるファネロカエート属（Phanerochaete）、コリオラス属(Coriolus)、フザリウム属(Fusarium)、シュードモナス属 (Pseudomonas)等に属する微生物による分解法も知られているが、分解時間が月単位の長時間を要するものであったり、微生物活性を高める操作管理が難しい上に、塩素置換数の多いダイオキシン類ほど分解率が低下するという欠点がある（橘  燦郎  セミナー「微生物による有害物質分解技術の現状と展望」１９９８．３．３  東京）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
基本骨格がジベンゾーパラーダイオキシン、又はジベンゾフランにそれぞれ複数の塩素が結合した毒性が強く且つ分解が困難であるポリ塩化ジベンゾーパラーダイオキシンやポリ塩化ジベンゾフランをも短時間に高率で分解する安全性の高い微生物を提供する。又、微生物を用いて、これらポリ塩化ジベンゾーパラーダイオキシンやポリ塩化ジベンゾフランを短時間に高率で安全に分解する方法を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、毒性が強く且つ分解が困難であるポリ塩化ジベンゾーパラーダイオキシンやポリ塩化ジベンゾフランを短時間に高率で分解する微生物を鋭意探索した結果、新菌株モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）（Mortierella sp. D5 ）及び新菌株ペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）（Penicillium sp. D7）が、極めて強力なダイオキシン類分解力を有し、しかもこれらは魚毒性も発芽毒性も無く安全であり、増殖スピードも速いことを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、ダイオキシン類分解能を有する新菌株モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）及び新菌株ペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）を提供する。さらに本発明は、モルチエレラ属又はペニシリウム属に属し、ダイオキシン類分解能を有する微生物を、ダイオキシン類を含有する環境に接種、生育させることにより、ダイオキシン類を容易且つ短時間に高率に分解する方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明においてダイオキシン類とは、ジベンゾーパラーダイオキシン、ジベンゾフラン、及び基本骨格としてジベンゾーパラーダイオキシン若しくはジベンゾフランを有し、これらに塩素が複数個結合したポリ塩化ジベンゾーパラーダイオキシン（以下PCDDと略す）、ポリ塩化ジベンゾフラン（以下PCDFと略す）を云い、その例としては、２，７−ジクロロジベンゾーパラ−ダイオキシン（以下２，７−D2CDDと略す）、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾーパラーダイオキシン（以下２，３，７，８−T4CDDと略す）、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾーパラーダイオキシン（以下１，２，３，７，８−P5CDDと略す）、１，２，３，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾーパラーダイオキシン（以下１，２，３，６，７，８−H6CDDと略す）、１，２，３，４，６，７，８―ヘプタクロロジベンゾーパラーダイオキシン（以下１，２，３，４，６，７，８―H７CDDと略す）、１，２，３，４，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾーパラーダイオキシン（以下Ｏ8CDDと略す）、２，４，８−トリクロロジベンゾフラン（以下２，４，８−T3CDFと略す）、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン（以下２，３，７，８−T４CDFと略す）、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン（以下１，２，３，７，８−P５CDFと略す）、１，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン（以下１，２，３，４，７，８−H６CDFと略す）、１，２，３，７，８，９−ヘキサクロロジベンゾフラン（以下１，２，３，７，８，９−H６CDFと略す）、１，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾフラン（以下１，２，３，４，６，７，８−Ｈ７CDFと略す）、１，２，３，４，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾフラン（以下Ｏ８CDFと略す）などがあげられる。
【００１１】
本発明者らは、広島県因島市の山林土壌、及び大阪府高槻市の山林土壌から、極めて強力なＰＣＤＤ分解力を有する微生物２株を分離し、それぞれ新菌株モルチエレラ・エスピー D5及び新菌株ペニシリウム・エスピー D７と命名した。これらの菌株は、５００ｍｌ容フラスコ中、酵母エキス４．０ｇ/ｌ、麦芽エキス１０．０ｇ/ｌ、食塩２．０ｇ/ｌ及びポリペプトン１．０ｇ/ｌからなり、滅菌前のｐＨ６．８〜７．２の栄養培地（以下ＹＭ改変培地という）１００ｍｌにおいて、予め２５℃、１４０rpmにて５日間振盪培養した。この種培養液に、PCDD各異性体の初期設定濃度が５nｇ/ｌになるようにPCDD混合溶液を添加し、25℃、１４０rpmで3週間振盪培養した後、培養液中の各異性体毎のPCDD残存量を分析した。２，３，７，８−T4ＣＤＤの分解率がそれぞれ、３７％、３５％を示し、Ｏ8CDDの分解率は両菌株共３６％という高い分解率を示した。
【００１２】
モルチエレラ・エスピー D5の菌学的性質は、以下の通りである。
ポテトデキストロース寒天平板培地、ポテトキャロット寒天平板培地及びオートミール寒天平板培地に接種して、２５℃で５〜６０日間培養して観察した。
集落：白色、褐色〜ピンク色を呈し、表面は波状、裂片状、ビロード状となる。
胞子嚢胞子：胞子嚢柄先端の胞子嚢内に形成されるが、ムコール（Mucor）のような明確な柱軸は形成されない。胞子嚢の顕微鏡写真（微分干渉、９４０倍）及び胞子嚢胞子の顕微鏡写真（微分干渉、９４０倍）をそれぞれ図1、図2に示した。
YM改変培地でフラスコ培養するとパルプ状で増殖し、生育は早い。
以上の諸性質について、独  アイ・エッチ・ダブリュー社、コンペンヂアム  オブ  ソイル  ファンジャイ、第1巻（再版１９９３）（IHW；  Compendium of Soil Fungi; Volume 1）と対比して、本菌株はモルチエレラ属に属する糸状菌と考えられその極めて強力なＰＣＤＤ分解力から新菌株と同定し、モルチエレラ・エスピーD5と命名した。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年１２月２４日に寄託されており、その寄託番号はFERM  P-１７６８７である。
【００１３】
又、上と同様に、ポテトデキストロース寒天平板培地、ポテトキャロット寒天平板培地及びオートミール寒天平板培地に接種して、２５℃で５〜６０日間培養して観察した、ペニシリウム・エスピー D７の菌学的性質は、以下の通りであった。
集落：緑色〜白色を呈する。
形態：ペニシリ構造を有し、フィアライド先端部から連鎖した分生子を形成する。分生子形成構造を示す顕微鏡写真（微分干渉、480倍）を図3に示した。
子嚢及び子嚢胞子の形成：形成しない。
生育は早い。
菌核形成：形成する。菌核の顕微鏡写真（微分干渉、480倍）を図４に示した。YM改変培地でフラスコ培養するとペレット状（直径５ｍｍ）で増殖する。
以上の諸性質をコンペンヂアム  オブ  ソイル  ファンジャイ、第1巻（Compendium of Soil Fungi; Vol.1）の記載及び厚生省生活衛生局監修、食品衛生検査指針  微生物編（1992年2刷）、社団法人日本食品衛生協会発行と対比し、本菌株はペニシリウム属に属する糸状菌と考えられその極めて強力なＰＣＤＤ分解力から新菌株と同定し、ペニシリウム・エスピーD７と命名した。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年１２月２４日に寄託されており、その寄託番号はFERM  P-１７６８８である。
【００１４】
次に、本発明の方法においては、モルチエレラ属又はペニシリウム属に属し、ダイオキシン類分解能を有する微生物を、ダイオキシン類を含有する環境に接種、増殖させることによって、ダイオキシン類を短時間、高率で分解させる。本発明が適用できるダイオキシン類を含む環境としては、ハイテク産業工場、製紙パルプ工場からの排水等の水系の環境、ゴミ焼却炉の残灰、廃棄物埋立地の土壌、農産廃棄物、更には、かって塩素系農薬が大量に使用された耕作土壌等に、例えば予め適当な栄養培地に種培養したモルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）や、ペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）の培養液を添加、混合し、放置するだけでダイオキシン類が短時日、且つ、高率で分解される。あるいは、これらの菌株を適当な微生物担体、例えば、活性炭、ゼオライト、ピートモス、珪藻土、米ぬか、コンポスト等に吸着固定化して播種することにより、一層効率良くダイオキシン類が分解除去される。低濃度で且つ広範囲に拡散している廃水や残灰、飛灰等は、適当なリアクター（分解装置）を用いて温度、酸素の管理下に反応させることにより、残ダイオキシン類の拡散を防止しながら、分解除去が効率よく行える。
更に、ダイオキシン類を含有する環境に本発明の菌株を接種、生育させてダイオキシンを分解させるに当たって、該環境に栄養成分として、綿実かす、大豆粉、魚粉等を適量存在させることによって一層効率良くダイオキシンを分解させることが出来る。
【００１５】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
YM改変培地を調製し、その１００ｍｌを５００mlフラスコに分注し、モルチエレラ・エスピー D5（FERM   P-１７６８７）、又はペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）を１白金鈎ずつ植付け、２５℃にて4日間１６０ｒｐｍで振盪培養して種培養液を調製した。得られた種培養液を５％宛、同様の組成を有する本培養培地100mlに接種し、25℃、１６０ｒｐｍにて1週間振盪培養した。この培養液に、表1に示したPCDF各異性体を各５nｇ/ｌ宛添加し、25℃、１４０ｒｐｍで3週間振盪培養した。
【００１６】
得られた各培養液に１nｇ/μｌの内部標準（１３Ｃ−ＰＣＤＦ）１０μｌと濃塩酸５０ｍｌを添加して１時間放置後、菌体を濾去し得られた濾液及び残渣について、日本工業規格K0312「工業用水・工業排水中のダイオキシン類及びコプラナーPCBの測定法」に準じて、溶媒抽出法、クリーンアップ法、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析法（HRGC/HRMS）によって、PCDFの各異性体毎の残存PCDF量を定量した。結果を表1に示す。
なお、対照区は、YM改変培地のみを用いて同様に処理した。
この表から明らかなように、モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）は、25℃、3週間の培養処理で各種PCDFを７０％以上分解する強力な分解能を示した。
なお、ペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）の方も、平均24％の分解率であった。
【００１７】
HRGC/HRMS分析条件
（１）４〜６塩化PCDFの異性体濃度分析条件及び各同族体毎の濃度測定
分析装置：JMS-700      HRGC条件
カラム ：SP-2331溶解シリカキャピラリーカラム０．３２ｍｍ×６０mm
キャリアーガス ：He  1．5ml／秒(定速流量)
昇温条件 ：１００℃×１秒
１００〜１５０℃    ２０℃／秒
１５０〜２４０℃      ２℃／秒
２４０〜２６０℃      １℃／秒
２６０℃              保持
注入口温度 ：２７０℃（スプリットレス）
試料注入量 ：１．０μL
【００１８】
HRMS条件
原理 ：二重収束形
分解能 ：１００００以上
検出 ：選択イオンモニタリング（SIM）法、PFKを用いたロックマス方式
イオン化方式 ：電子衝撃イオン化方式
イオン源温度 ：２７０℃
イオン化電流 ：６００μA
電子加速電圧 ：７０ｅＶ
イオン加速電圧 ：１０ｋV
【００１９】
（２）７，８塩化の2,3,7,8異性体濃度分析条件及び各同族体毎の濃度測定
分析装置：JMS-700
HRGC条件
カラム ：DB-5 キャピラリーカラム０．25ｍｍ×3０ｍｍ
キャリアーガス ：He  10.8ml／秒(定速流量)
昇温条件 ：１００℃×１秒
１００〜２５０℃      ８℃／秒
２５０〜２９０℃      ４℃／秒
２９０℃              保持
注入口温度 ：２７０℃（スプリットレス）
試料注入量 ：１．０μL
【００２０】
HRMS条件
原理 ：二重収束形
分解能 ：１００００以上
検出 ：選択イオンモニタリング（SIM）法、PFKを用いたロックマス方式
イオン化方式 ：電子衝撃イオン化方式
イオン源温度 ：２７０℃
イオン化電流 ：６００μA
電子加速電圧 ：７０ｅＶ
イオン加速電圧 ：１０ｋV
【００２１】
【表１】
0004420508.tif 000002
注：括弧内の数字は、対照のテスト値に対する残存率
【００２２】
実施例２
５００ｍｌ容三角フラスコにＹＭ改変培地１００ｍｌを仕込み、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。室温まで冷却後、本培地にモルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）を接種し、２５℃、１６０ｒｐｍで６日間振盪培養し、得られた培養液８０ｍｌを、予め滅菌しておいた外径４０ｍｍ、高さ１３０ｍｍのガラス製リアクター（図５に示す）に無菌的に移し変えた。
この培地にPCDD各異性体が１００ｐｇ/μｌ濃度のＰＣＤＤ混合溶液を４μｌ宛注入（ＰＣＤＤの水相濃度は各々５nｇ/ｌ）、電動エアーポンプで４０ｍｌ／分の空気を通気しながら２５℃の恒温槽中で１週間培養、反応させた。
なお、本リアクターには、入口、出口に無菌フィルターが設置してあり、排気は椰子ガラ活性炭１００ｍｌを通過させてダイオキシンを吸着除去した。
【００２３】
得られた各培養液に１nｇ/μｌの内部標準（１３Ｃ−ＰＣＤＤ）１０μｌと水相の２分の１量の濃塩酸を添加して１時間放置後、菌体を濾去し得られた濾液及び残渣を実施例１の方法に準じて、残存ＰＣＤＤ量を定量した。
なお、対照区は、ＹＭ改変培地のみを用いて同様に処理した。結果を表２に示す。この表から明らかなように、モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）は、25℃、1週間の通気分解反応で供試の各種PCDDを平均５０％以上分解する強力な分解能を示した。特に、２，３，７，８―T4CDDに対しては、８０％程度の分解率が認められた。
【００２４】
【表２】
0004420508.tif 000003
【００２５】
試験例１  急性魚毒性試験
モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）及びペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）を、それぞれYM改変培地において２５℃で７日間振盪培養して培養ブロスを調製した。１つの菌株につき１本の１リットルガラスビーカーを用意し、この中へ上記培養ブロス５ｍｌをそれぞれ入れた。蒸留水で全量を５００mlとし、上記培養ブロスの１/１００希釈液からなる被験液を調製した。被験液を２０℃に半日放置した後、これらに体長２〜２．５ｃｍのヒメダカの1群（10尾）を入れ、20℃無通気で48時間後の生残率をみた。その結果、いずれの供試菌株についても生残率は１００％であり、顕著な急性魚毒性はないことが確認された。
【００２６】
試験例２  植物発芽・生長試験
ガラスシャーレ（直径100ｍｍ、深さ20mm）の底に東洋濾紙No.2（直径９０ｍｍ）1枚を敷き、これに上記培養ブロスの１/１０希釈液（蒸留水希釈）１０ｍｌを入れた。対象として蒸留水のみの区を設置した。いずれも反復数3枚で行った。
濾紙の上にコマツナの種子30粒を撒き、暗条件下20℃で48時間静置した後の発芽率を調べた。その結果、いずれの供試菌株についても１００％の発芽率が観察された。
その後、直ちに25℃の室に移し、４，０００ルックス、24時間明の条件下で1週間、対照区と比較しながらコマツナの生長を観察した。D5株及びD7株添加区はいずれも対照区と同様、健常な生長が認められた。
【００２７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のダイオキシン類分解能を有するモルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）又はペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）は、ポリ塩化ジベンゾーパラーダイオキシン（PCDD）、ポリ塩化ジベンゾフラン（PCDF）を極めて短い時間に高率、且つ広範囲の異性体に対して適応出来、これらを分解、除去することが出来る。従来公知の微生物が月単位でせいぜい５０％程度の分解率であり、しかも毒性が最も強いとされる２，３，７，８−Ｔ４CＤＤについては分解能が明確でない状態であるところ、本発明の微生物によるときは、１週間で８０％程度分解する。本発明によるときは、ダイオキシン類の分解を２５℃程度の低温で実施できるので、ダイオキシン類の再生も全く無く、安全に実施できる。しかも、モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）及びペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）は、魚毒性や発芽毒性は全く示さない安全な微生物である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）の胞子嚢の顕微鏡写真である。
【図２】  モルチエレラ・エスピー D5（FERM  P-１７６８７）胞子嚢胞子の顕微鏡写真である。
【図３】  ペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）の分生子形成構造を示す顕微鏡写真である。
【図４】  ペニシリウム・エスピー D７（FERM  P-１７６８８）の菌核の顕微鏡写真である。
【図５】  本発明において使用したリアクターの模視図である。
【符号の説明】
１  モーター
２  流量計
３  無菌フィルター
４  恒温槽
５  リアクター
６  活性炭
【図１】
0004420508.tif 000004
【図２】
0004420508.tif 000005
【図３】
0004420508.tif 000006
【図４】
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【図５】
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