(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される３６４番目から８６１番目の連続した４９８ｂｐの塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ、プロモーター活性を有する塩基配列、を含む、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター。
【請求項２】
配列番号１に示される１番目から８６１番目の連続した８６１ｂｐの塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ、プロモーター活性を有する塩基配列、を含む、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター。
【請求項３】
配列番号１に示される１番目から１２８１番目の連続した１２８１ｂｐの塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ、プロモーター活性を有する塩基配列、を含む、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター。
【請求項４】
配列番号１に示される１番目から１８４３番目の連続した１８４３ｂｐの塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ、プロモーター活性を有する塩基配列、を含む、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター。
【請求項５】
請求項１、２、３または４に記載のプロモーター及び異種遺伝子を含む発現カセット。
【請求項６】
さらにターミネーターを含む請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
請求項５または６に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を適切な培地中で培養し、得られる培養細胞または培養液から異種遺伝子の発現産物を採取することを含む、異種遺伝子の発現産物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（「ＤＡＳ」ともいう）のプロモーター、該プロモーター、異種遺伝子及びターミネーターを含む発現カセット、該発現カセットを含む発現ベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、並びに該形質転換体を用いる異種遺伝子産物の製造方法に関する。
発明の背景
メタノール資化性酵母は、メタノールを唯一の炭素源とする培地で生育可能な酵母である。メタノール資化性酵母におけるメタノール代謝は以下のようにして行われる。まず、最初の反応としてアルコールオキシダーゼによりメタノールと酸素からホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。生成した過酸化水素はカタラーゼにより水と酸素に分解される。一方、ホルムアルデヒドは、ホルムアルデヒド脱水素酵素、Ｓ−ホルミルグルタチオンヒドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素の作用により、二酸化炭素まで酸化され、その際生じるＮＡＤＨは細胞のエネルギー源となる。それと同時にホルムアルデヒドはジヒドロキシアセトンシンターゼによりキシルロース−５−リン酸と縮合し、グリセルアルデヒド−３−リン酸とジヒドロキシアセトンへと変換され、これらはその後ペントースリン酸経路を経て菌体構成成分となる。
ここで挙げたアルコールオキシダーゼ、ジヒドロキシアセトンシンターゼ、ギ酸脱水素酵素はメタノール存在下で培養すると、著量生産され、菌体内可溶性蛋白質の約４０％まで蓄積する。前述のごとく、メタノール資化性酵母は安価なメタノールで大量培養が可能なうえに、他の酵母には見られない強力な転写活性を有するメタノール誘導性プロモーターを有するという点で、異種遺伝子発現系として優れた酵母であるといえる。
カンジダ・ボイジニイは、メタノール資化性酵母の一種である。そして該酵母を利用してアルコールオキシダーゼ遺伝子、ギ酸脱水素酵素遺伝子の調節領域を用いた異種遺伝子の発現方法が研究されている（特開平５−３４４８９５号公報、国際公開第ＷＯ９７／１０３４５号パンフレット、等参照）。
一方、ジヒドロキシアセトンシンターゼはアルコールオキシダーゼ、ギ酸脱水素酵素と同様に著量生産される酵素であるが、該酵素の発現制御に関する知見は全く得られていない。それゆえジヒドロキシアセトンシンターゼの発現制御の解明、及び強力な転写活性を用いた異種遺伝子の効率的発現の点から、当該酵素のプロモーターの提供が求められている。
本発明は、異種遺伝子を発現させるのに有用な強力な転写活性を有するプロモーター、該プロモーターを含む発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに該宿主細胞を用いた異種遺伝子発現産物の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、メタノール資化性酵母カンジダ・ボイジニイのジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子の発現制御系を解析し、異種遺伝子の効率的発現を達成すべく鋭意研究を行った結果、強力な転写活性を有するプロモーター配列を見出し、その配列を用いて異種遺伝子の高発現を達成することにより、本発明を完成するに至った。
発明の概要
すなわち、本発明は配列番号１に示す塩基配列を実質的に含むカンジダ・ボイジニイのジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーターに関するものである。具体的には、本発明のプロモーターは、配列番号１に示される３６４番目から８６１番目の連続した４９８ｂｐの塩基配列を実質的に含み、したがってこの領域を包含する配列番号１に示される１番目から８６１番目の連続した８６１ｂｐの塩基配列、１番目から１２８１番目の連続した１２８１ｂｐの塩基配列、１番目から１８４３番目の連続した１８４３ｂｐの塩基配列を実質的に含むものが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、たとえ配列番号１中配列３６４−８６１を含まなくてもプロモーター活性を有する場合には、本発明の範囲内にあるものとする（図５）。本明細書中「塩基配列を実質的に含む」とあるのは、目的とするプロモーター活性を大なり小なり有する限り、配列番号１で示される塩基配列に置換、欠失、付加または挿入等の変異が生じてもよいことを意味する。例えば、配列番号１で示される塩基配列の第３番目の「Ａ」が「Ｔ」に置換されても、本発明の目的とするプロモーター活性を有する限り、かかる置換された配列も本発明に含まれることを意味する。すなわち、本発明には、配列番号１に示される上記定義の塩基配列と相同性７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であって、かつ目的とするプロモーター活性を有する、変異体もしくは改変体をも包含する。
また、本発明は、前記プロモーター及び異種遺伝子を含む発現カセットを提供する。この発現カセットはさらに、ターミネーター配列を含んでもよく、必要に応じて選択マーカー配列（たとえば、薬剤耐性遺伝子）、リボソーム結合部位、等を含むこともできる。
本発明はさらに、上記の発現カセットを含む異種遺伝子を発現可能にする発現ベクターに関する。
本願明細書中、異種遺伝子とは、発現の対象となる任意の遺伝子を意味する。異種遺伝子としては例えば、酸性フォスファターゼ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、各種インターフェロン遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子遺伝子、等が挙げられるが、これらに限定されない。またいかなる手法によって得られるものであってもよい。
本発明はさらにまた、前記発現ベクターによって形質転換された形質転換体に関する。
本発明はさらに、前記形質転換体を適切な培地中で培養し、得られる培養細胞から異種遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする、異種遺伝子の発現産物の製造方法に関する。ここで、培地としては、たとえば、炭素源としてメタノール、メタノールにグリセロールを添加した培地が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第１０−３７２６３号の明細書および／または図面に記載される内容の全部または一部を包含する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、カンジダ・ボイジニイが有するジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子の塩基配列をそのプロモーターと共に解明し、プロモーターを単離し、発現ベクターを構築し、さらに本発現ベクターを用いて形質転換体を作製し、異種遺伝子を発現させた時、その発現がカンジダ・ボイジニイのジヒドロキシアセトンシンターゼと同様にメタノールによって誘導されることを確認した。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のクローニング
本発明の遺伝子を取得するための出発材料としては、カンジダ・ボイジニイ、特にＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  Ｓ２  ＡＯＵ−１株（Ｔａｎｉ，Ｙ．ら，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，２６９９（１９８５））が例示される。
本発明においてクローニング工程は、公知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４（１９９１））に従って行なうことが出来る。すなわち、上記酵母の全ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片、もしくは上記酵母のｍＲＮＡより合成されたｃＤＮＡ断片を組み込んだ遺伝子導入用ベクターを宿主に導入して上記酵母の遺伝子ライブラリーを作製し、ついで、かかる遺伝子ライブラリーから所望のクローンを選択して、当該クローンを増幅することにより上記のクローニング工程を実施することが出来る。
（ａ）酵母の遺伝子ライブラリーの調製
酵母の全ＤＮＡの抽出は、例えば酵母のプロトプラストを調製して、当該プロトプラストから、通常公知のＤＮＡ抽出法、すなわち細胞残渣を除去した後、高塩濃度下でＤＮＡをアルコール沈殿し、さらにフェノールやクロロホルム抽出後にアルコール沈殿して精製する方法を用いて行なうことが出来る。なお、上記の予めプロトプラストを調製する方法の他に、ガラスビーズ等による細胞破砕法等によってもＤＮＡの抽出を行なうことが出来るが、高分子量のＤＮＡを調製することが容易であるという点から上記プロトプラスト法を行なうのが好ましい。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素（Ｓａｕ３ＡＩ等）によって部分消化し、適当なベクターに連結した後、適当な大腸菌宿主に形質転換することによってゲノミックライブラリーを得ることができる。
上記酵母由来ｃＤＮＡの作製は、目的とする遺伝子が発現している増殖期の酵母細胞より、通常公知のｃＤＮＡ作製法に従い、行うことができる。得られた染色体ｃＤＮＡの末端に適当な制限酵素（ＥｃｏＲＩ等）でベクターにクローニングできるように、アダプター、リンカーを付加し、適当なベクターに連結した後、適当な宿主に形質転換することによってｃＤＮＡライブラリーを得ることができる。この際用いられるベクターとしては、一般的に公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られる、ｐＢＲ系統、ｐＵＣ系統、ブルースクリプト（ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）系統等の一般に市販されている入手可能なプラスミドを用いることも出来る。あるいは、ｇｔ系統やＥＭＢＬ系統のファージベクターあるいはコスミド等も広く用いることが出来る。調製した遺伝子ライブラリー作製用ベクターで形質転換もしくは形質導入を行なう宿主は、上記ベクターの種類に応じたものを採用することが出来る。
（ｂ）クローンの選択
上記遺伝子ライブラリーから、所望のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子を有するクローンをジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いてコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等により選択し、取得することが出来る。また上記遺伝子ライブラリーから、所望のジヒドロキシアセトンシンターゼを発現しているクローンをジヒドロキシアセトンシンターゼに特異的に結合する抗体を用いたイムノスクリーニング法等により選択し、得ることも出来る。
プローブに用いるジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子に特有の配列は、カンジダ・ボイジニイから精製したジヒドロキシアセトンシンターゼ蛋白質のアミノ酸配列に対応する２組のオリゴヌクレオチドを合成し、それらをプライマーとしてカンジダ・ボイジニイの染色体ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ａｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））を行うことにより所望するＤＮＡ断片を特異的に増幅して、取得することができる。なお、合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてもよい。
ジヒドロキシアセトンシンターゼに特異的に結合する抗体は、次のようにして取得することができる。公知の方法（Ｋａｔｏ，Ｎ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７１５，１４３（１９８２））に従って精製したジヒドロキシアセトンシンターゼをウサギ等の動物に免疫注射する。免疫した動物より採血し、遠心分離により抗血清を単離する。得られた抗血清より、塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製手法により目的とする抗体を精製することも可能である。
上記方法により得られる所望の遺伝子の塩基配列の決定および確認は、例えばマクサム・ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．とＶｉｅｉｒｅ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９（１９８２））及びその自動化された変法等により行なうことができる。
（２）プロモーター領域の単離
プロモーター領域を取り出すには、制限酵素を用いて切り出すことも可能であるが、一般的に言って、適切な制限酵素部位が、都合の良い位置に存在するとは限らない。そこでコーディング領域内の制限酵素部位からＤＮＡ分解酵素によってプロモーターの方向にＤＮＡを削って行き、適当なところまで削れたクローンを探す方法がある。最近では予め制限酵素認識部位を末端に設けたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅し取得することが容易である。
また、本明細書に記載の配列に基づいてこれらの領域を化学合成することも可能であるし、一部の領域を化学合成して、クローン化したＤＮＡと制限酵素部位を利用して連結させた半合成のプロモーターを作製することも可能である。
配列番号１にジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター配列を例示するが、本質的に転写活性を担持する配列であればこの配列に限定されるものではなく、欠失、挿入、置換または付加などによってその塩基配列を改変することが可能である。改変は例えば、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発法等の変異誘発法（例えばＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄｅｄ．：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）に記載の方法）によって実施可能である。
（３）発現ベクターの構築
上記で得られたプロモーター配列は、異種蛋白質の構造遺伝子、および／またはターミネーター配列、選択マーカー遺伝子等と共に適当なベクターの中に挿入され、異種遺伝子発現ベクターとして使用される。使用されるベクターとしては、通常公知のベクターとして知られるｐＢＲ系統、ｐＵＣ系統、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ系統等の大腸菌プラスミドベクターが例示されるが、これらに限定されない。ターミネーター配列、選択マーカー遺伝子は宿主内で機能するものであれば、当業者が容易に決めることができる。ターミネーター配列としては、例えばアクチン遺伝子ターミネーター、ギ酸脱水素酵素遺伝子ターミネーター、等が例示され、また選択マーカー遺伝子としては、Ｇ４１８等の抗生物質耐性遺伝子、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２等の宿主の栄養要求性を相補する遺伝子が例示される。発現ベクターの構成成分をベクターに挿入することは、後記実施例の記載を参照して、あるいは慣用の技術により当業者が容易に実施することが可能である。
（４）形質転換体の作製および培養
本発明の形質転換体は、上記で得られた組み換え発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによって調製される。
使用される宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母などの原核生物または真核生物が挙げられる。限定されるものではないが、好ましくは酵母、より好ましくはメタノール資化性酵母である。具体的にはカンジダ・ボイジニイが例示される。宿主へのプラスミドの導入は、通常形質転換に用いられる一般的な方法を使用することが可能である。すなわち、プロトプラスト法、リチウム法、エレクトロポレーション法、カルシウム法等を適用することが出来る。
本発明の発現ベクターは宿主染色体ＤＮＡに組み込まれる。また宿主細胞内で自己複製可能な自律性複製配列を有するベクターを用いて、プラスミド状態で存在させることも可能である。宿主細胞内に存在する異種遺伝子のコピー数は１コピーでも複数であってもよい。
このようにして得られた形質転換体を適切な培地中で培養し、得られる培養細胞から精製することにより、目的とする遺伝子発現産物を取得することができる。本発明の形質転換体は、メタノールにより異種遺伝子を誘導発現することができるので、培地としては以下のものが例示される。
炭素源としてメタノールを含む他に、酵母エキス、トリプトン、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、アンモニウム塩等の１種以上の窒素源に、リン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、銅、マンガン、コバルト等の無機塩類を添加し、さらに必要に応じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、誘導を阻害しないグリセロール等の糖質原料を便宜添加したものが挙げられる。
培地のｐＨは、５〜８の範囲が好ましい。また培養温度は通常１５〜４５℃、好ましくは２８℃前後である。培養時間は２４〜１０００時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養又は連続培養により実施することができる。
培養終了後、該培養物より遺伝子産物を採取するには、通常のタンパク質精製手段を用いることができる。例えば、形質転換細胞内に産生された場合は、常法により菌体を超音波処理、磨砕処理、加圧破砕等により遺伝子産物を含む粗蛋白質溶液を取得する。必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する。培養上清中に生産された場合、培養液そのものから遺伝子産物を回収することができる。得られた溶液をろ過、遠心分離等により固形部分を除去し、粗タンパク質溶液を得る。必要によりプロタミン処理等による核酸の除去を行う。粗タンパク質溶液から塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製手法を組み合わせることにより、目的タンパク質を分離精製することができる。
本発明により異種遺伝子を発現させるのに強力な転写活性を有するプロモーターが提供される。該プロモーター及び目的とする異種遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養することによって、種々の有用なタンパク質を、効率良く発現、生産することができる。
本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例
実施例１
カンジダ・ボイジニイのジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のクローニング
この実施例は、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  Ｓ２  ＡＯＵ−１（Ｔａｎｉ，Ｙら，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，２６９９（１９８５））よりジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子を取得し、その塩基配列決定を行なった例である。
（１−１）プローブ作製
メタノールを炭素源とした培地で対数増殖期中期まで培養したＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＡＴＣＣ３２１９５株からｃＤＮＡを作製し、これをλｇｔｌｌ（ストラタジーン社）に組み込んでｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｍＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの合成は、公知の方法（Ｌｉｓａ，Ｊ．，ＧａｒｒａｒｄとＪｏｅｌ，Ｍ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１３９２９（１９８９））に従って行った。Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｌａｍｄａ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社）を用いて、組み換えファージＤＮＡをパッケージングした後、大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株（ストラタジーン社）に感染させ、プラークを形成させた。
Ｋａｔｏ，Ｎ．ら  （Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７１５，１４３（１９８２））に記載されている方法に従って精製したジヒドロキシアセトンシンターゼをウサギに免疫注射し、抗ジヒドロキシアセトンシンターゼ抗体を含む血清を取得した。
組み換えファージによって形成されたプラークより、上記ジヒドロキシアセトンシンターゼ抗体を用いて、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９）；またはＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ＧｌｏｖｅｒＤ．Ｍ．編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５））に従ってイムノスクリーニングを行った。２次抗体として、ホースラデッシュパーオキシダーゼで標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラッド社）を用いた。パーオキシダーゼ反応により発色したプラークより、陽性クローンを取得した。
常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９））に従い、陽性クローンより組み換えファージＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後、２．２ｋｂのジヒドロキシアセトンシンターゼｃＤＮＡ断片をゲルから回収した。
（１−２）ライブラリーの作製、及びスクリーニング
Ｃｒｙｅｒ，Ｄ．らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２，３９（１９７５））に基づいて調製したＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  Ｓ２  ＡＯＵ−１株の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で切断した後、上記（１−１）で得られたＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行なった。プローブの放射性標識はメガプライマーＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社）を用いて行ない、ハイブリダイゼーションは、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９））に従って行なった。その結果、約８．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片にジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子が存在すると考えられた。そこでそのＤＮＡ断片をクローニングすべく、ライブラリーを作製した。カンジダ・ボイジニイの染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後、８．３ｋｂ付近のＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入し、得られた組み換えプラスミドをＨａｎａｈａｎの方法（Ｇｅｎｅ，１０，６３（１９８０））に基づき大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換して、ライブラリーを作製した。
これらのライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。オートラジオグラフィーによって、プラスミドｐＤＡＳ１を保持するクローンが陽性クローンとして選抜された。
（１−３）塩基配列決定
プラスミドｐＤＡＳ１の制限酵素地図（図１）を作成した。上記（１−１）に記載のＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＡＴＣＣ３２１９５株由来のジヒドロキシアセトンシンターゼｃＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによる解析を行った後、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子を含むと考えられた図１の約１．８ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ（図１において（１）で示した領域）間の領域の塩基配列をダイプライマーサイクルシーケンスキット及びダイターミネーターサイクルシーケンスキット（パーキンエルマー社）を用いて決定した。塩基配列決定のための欠失変異体はキロシーケンス用デレーションキット（宝酒造社）を用いて取得した。その結果、得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に既に報告されているメタノール資化性酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のジヒドロキシアセトンシンターゼのアミノ酸配列（Ｊａｎｏｗｉｃｚ，Ｚ．，Ａ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，３０４３（１９８５）；または遺伝子登録番号Ｐ０６８３４）と高い相同性を示す領域が存在するとともに、精製したジヒドロキシアセトンシンターゼより決定したＮ末端アミノ酸配列（ＭＡＬＡＫＡＡＳＩＮＤＤＩＨＤＬＴＭＲＡＦ；配列番号２３）と一致する配列が存在したことから、図１の矢印で示す位置に目的とするジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子が存在することが推定された。さらにジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子の５’上流領域の塩基配列を決定するために、図１のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ領域（図１において（２）で示した領域）の塩基配列を同様の方法で決定した。本領域内には、ジヒドロキシアセトンシンターゼのＮ末端１３アミノ酸配列（ＭＡＬＡＫＡＡＳＩＮＤＤＩ；配列番号２）に相当する３９ｂｐの塩基配列（ＡＴＧＧＣＴＣＴＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴＡＴＣ；配列番号３）の上流に１８４３ｂｐの塩基配列が含まれていた。本実施例で決定した翻訳開始点ＡＴＧの５’上流領域の１８４３ｂｐの塩基配列を図２に示す。なお図中の配列番号は３’末端のＡを−１番目としたときの番号を示している。
実施例２
ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーターによる異種遺伝子の発現
この実施例では、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  Ｓ２  ＡＯＵ−１株由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（ＤＡＳ）のプロモーター領域を利用したサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）の発現ベクターを作製し、カンジダ・ボイジニイに形質転換した例を説明する。
（２−１）酸性フォスファターゼ発現プラスミドの作製
ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の単離はＰＣＲを用いた。図２（または配列番号１）の情報よりＰＣＲのプライマーとして以下に示す２種類のオリゴヌクレオチドを合成した：
ＰＤＡＳ５：ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣ（配列番号４）；
ＰＤＡＳ３：ＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣ（配列番号５）。
プラスミドｐＤＡＳ１と、プライマーＰＤＡＳ５、ＰＤＡＳ３を混合し、Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社）を用いたＰＣＲ（（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２０サイクル）を行った。増幅ＤＮＡ断片はｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社）にクローニングした後、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片として単離した。この断片を国際公開第ＷＯ９７／１０３４５号明細書に記載されているプラスミドｐＰＵＦ１（マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を含み、ＦＤＨプロモーター／ターミネーターによる酸性フォスファターゼ発現プラスミド）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ間に挿入し、得られたプラスミドをｐＤＳＰＨ１と命名した（図３）。前述のｐＰＵＦ１は国際公開第ＷＯ９７／１０３４５号明細書に記載されている方法に従えば容易に作製可能である。ＦＤＨターミネーター、ＵＲＡ３遺伝子、ＰＨＯ５遺伝子はそれぞれ国際公開第ＷＯ９７／１０３４５号、Ｓａｋａｉ  Ｙ．ら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７３，２５５−２６０（１９９２）、Ａｒｉｍａ，Ｋ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１６５７（１９８３）に記載されている配列をもとに化学合成による取得も可能である。
（２−２）形質転換
宿主株はＵＲＡ３遺伝子の変異株であるＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＫＳＴ２５１５株（ＷＯ９７／１０３４５）を用いた。本実施例ではＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＫＳＴ２５１５株を用いているが、他のカンジダ・ボイジニイ株、例えばＩＦＯ  １００３５株を用いても、公知の方法（Ｓａｋａｉ  Ｙ，ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７４５８（１９９１））に従えば容易にＵＲＡ３遺伝子の変異株を取得できることから、当該プラスミドを用いた形質転換が実施可能である。
上記（２−１）で得たプラスミド  ｐＤＳＰＨ１の５μｇをＢａｍＨＩで切断し、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＫＳＴ２５１５株に形質転換した。得られた形質転換体のうちプラスミドが１コピー組み込まれた株を、０．１７％のＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ（ディフコ社）と図４に示す種々の炭素源、窒素源を含むｐＨ５．５の培地で培養し、酸性フォスファターゼ活性を測定した。１コピー挿入形質転換体の確認は、公知の文献（Ｓａｋａｉ  Ｙ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，３５５６（１９９３））に従い、形質転換体のマーカーのＵＲＡ３遺伝子産物であるオロチジン酸デカルボキシラーゼ活性を測定することによって行った。酸性フォスファターゼ活性の測定法は、Ｔｏｈｅ，Ａ．らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１３，７２７（１９７３））に従い、菌体懸濁液をそのまま酵素として用いた。１単位の酵素活性は、３０℃で１分間に１ｍｍｏｌｅのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量とした。図４に示すように、酸性フォスファターゼの誘導発現は、炭素源がメタノールの時に強力に誘導され、グルコース、グリセロールの時には誘導が認められなかった。また窒素源としてコリン、メチルアミンを用いた場合、炭素源がグリセロールの時には誘導が認められたが、グルコースの時には認められなかった。ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーターは、グリセロール単独では誘導されない点でアルコールオキシダーゼ遺伝子プロモーターと、グルコースによって完全に誘導が抑制されている点でギ酸脱水素酵素遺伝子プロモーターとは異なった制御を受けていることが判明した。
実施例３
５’側ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーター活性領域の解析
本実施例は、上流領域を欠失したカンジダ・ボイジニＤＡＳプロモーターを作製し、上流欠失型ＤＡＳプロモーターにより支配される酸性フォスファターゼ活性を測定することによりＤＡＳプロモーターの機能に必要な領域を同定した例である。
（３−１）上流欠失型ＤＡＳプロモーターにより支配されるＰＨＯ５発現プラスミドの構築
上流領域を欠失したＤＡＳプロモーターは、キロシークエンス用デレーションキット（宝酒造社）及びＰＣＲにて作製した。プラスミドｐＤＳＰＨ１をＡｐａＩ−ＸｈｏＩで切断し、キロシークエンス用デレーションキットを用いて処理し、上流欠失型ＤＡＳプロモーターにより支配されるＰＨＯ５発現プラスミドｐＤＳＰＨΔ１、ｐＤＳＰＨΔ２、ｐＤＳＰＨΔ３、ｐＤＳＰＨΔ４、ｐＤＳＰＨΔ５、ｐＤＳＰＨΔ６、ｐＤＳＰＨΔ７、ｐＤＳＰＨΔ８を取得した。これらのプラスミドのプロモーター領域の５’側塩基配列を決定し、プラスミドｐＤＳＰＨΔ１、ｐＤＳＰＨΔ２、ｐＤＳＰＨΔ３、ｐＤＳＰＨΔ４、ｐＤＳＰＨΔ５、ｐＤＳＰＨΔ６、ｐＤＳＰＨΔ７、ｐＤＳＰＨΔ８はＤＡＳプロモーター領域として、それぞれ１４８０ｂｐ（図２の−１から−１４８０番目の配列）、８７８ｂｐ（図２の−１から−８７８番目の配列）、８１３ｂｐ（図２の−１から−８１３番目の配列）、７４６ｂｐ（図２の−１から−７４６番目の配列）、６０７ｂｐ（図２の−１から−６７０番目の配列）、５２４ｂｐ（図２の−１から−５２４番目の配列）、４３９ｂｐ（図２の−１から−４３９番目の配列）、２８６ｂｐ（図２の−１から−２８６番目の配列）を有していることを確認した。
ＰＣＲにて上流領域を欠失したＤＡＳプロモーターを作製するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
ＰＤＳ１１９９；ＣＣＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＡＣＣ（配列番号６）；
ＰＤＳ１００６；ＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号７）；
ＰＤＳ５８３；ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＣＧ（配列番号８）；
ＰＤＳ５６５；ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＴＧＧＡＴＡＧ（配列番号９）；
ＰＤＳ５４３；ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＡＴＴＣＴＴＡＴＣＣＣＣＴＣ（配列番号１０）。
ＰＤＳ１１９９、ＰＤＳ１００６、ＰＤＳ５８３、ＰＤＳ５６５、ＰＤＳ５４３のいずれかとＰＤＡＳ３とをプライマーとして用いて、ｐＤＡＳ１を鋳型としたＰＣＲ（（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル）を行った。それぞれの増幅ＤＮＡ断片はｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社）にクローニングした後、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片として単離し、ｐＤＳＰＨ１のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間に挿入して、プラスミドｐＤＳＰＨΔ１１９９、ｐＤＳＰＨΔ１００６、ｐＤＳＰＨΔ５８３、ｐＤＳＰＨΔ５６５、ｐＤＳＰＨΔ５４３を構築した。プラスミドｐＤＳＰＨΔ１１９９、ｐＤＳＰＨΔ１００６、ｐＤＳＰＨΔ５８３、ｐＤＳＰＨΔ５４３はＤＡＳプロモーター領域として、それぞれ１１９９ｂｐ（図２の−１から−１１９９番目の配列）、１００６ｂｐ（図２の−１から−１００６番目の配列）、５８３ｂｐ（図２の−１から−５８３番目の配列）、５６５ｂｐ（図２の−１から−５６５番目の配列）、５４３ｂｐ（図２の−１から−５４３番目の配列）有している。
（３−２）形質転換
上記（３−１）で得たプラスミドＤＮＡそれぞれ５μｇをＢａｍＨＩで切断し、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＫＳＴ２５１５株に形質転換した。得られた形質転換体より１コピー挿入形質転換体を選抜し、メタノール１．５％、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ０．６７％を含むｐＨ５．５の培地で培養し、酸性フォスファターゼ活性を測定した。それぞれのプラスミドによる形質転換体の示す酸性フォスファターゼ比活性（ユニット／ＯＤ６１０）を図５に示す。図５の結果から、上流欠失型ＤＡＳプロモーターが野生型プロモーターと同程度のメタノール誘導性を示すには、プロモーター領域として、図２の−１から−１４８０番目までの１４８０ｂｐ領域を有していることが必要であり、欠失が進むに連れて、誘導活性が徐々に低下することが示された。また図２の−１から−５４３番目までの５４３ｂｐ領域では、メタノール誘導性をほとんど示さないことが確認された。
実施例４
内部領域欠失型変異体を用いたジヒドロシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーター活性領域の解析
本実施例は、内部領域を欠失したカンジダ・ボイジニイＤＡＳプロモーターを作製し、内部欠失型ＤＡＳプロモーターにより支配される酸性フォスファターゼ活性を測定することによりＤＡＳプロモーターの機能に必要な領域を同定した例である。
（４−１）内部欠失型ＤＡＳプロモーターにより支配されるＰＨＯ５発現プラスミドの構築
内部領域を欠失したＤＡＳプロモーターは、ＰＣＲにて作製した（図６にｐＤＳＰ−ＩΔ１の構築法を示す）。ＰＣＲにて内部領域を欠失したＤＡＳプロモーターを作製するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
ＰＤＳ４８３；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＡＡＣ（配列番号１１）；
ＰＤＳｃ５８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＧＡＧＡＣＧＧＴＡＡＡＡＴＴＴＧＣ（配列番号１２）；
ＰＤＳｃ６８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＧ（配列番号１３）；
ＰＤＳｃ７８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＡＴＡＡＴＣ（配列番号１４）；
ＰＤＳｃ８８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＴＴＴＡＴＣＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣ（配列番号１５）；
ＰＤＳｃ９８３；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＡＣＡＴＴＴＣ（配列番号１６）；
ＰＤＳｃ１０８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＡＡＴＡＴＴＡＧＧＴＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＣＴＧ（配列番号１７）；
ＰＤＳｃ１１８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＡＧ（配列番号１８）；
ＰＤＳｃ１２８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＧ（配列番号１９）；
ＰＤＳｃ１３８４；ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＧＣＴＡＡＴＴＧＡＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧ（配列番号２０）。
ＰＤＳ４８３とＰＤＡＳ３を用いて、ｐＤＳＰＨ１を鋳型としたＰＣＲ（（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル）を行い、図２の−１から−４８３番目の領域を増幅した。増幅ＤＮＡ断片はｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒにクローニングした後、ＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片として単離した。さらにＰＤＳｃ５８４、ＰＤＳｃ６８４、ＰＤＳｃ７８４、ＰＤＳｃ８８４、ＰＤＳｃ９８３、ＰＤＳｃ１０８４、ＰＤＳｃ１１８４、ＰＤＳｃ１２８４、ＰＤＳｃ１３８４のいずれかとＰＤＡＳ５とをプライマーとして用いて、ｐＤＳＰＨ１を鋳型としたＰＣＲ（（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル）を行い、それぞれ図２の−５８４から−１８４３番目の領域、−６８４から−１８４３番目の領域、−７８４から−１８４３番目の領域、−８８４から−１８４３番目の領域、−９８３から−１８４３番目の領域、−１０８４から−１８４３番目の領域、−１１８４から−１８４３番目の領域、−１２８４から−１８４３番目の領域、−１３８４から−１８４３番目の領域を増幅した。それぞれの増幅ＤＮＡ断片はｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒにクローニングした後、ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片として単離し、前述のＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ  ＤＮＡ断片とともに、ｐＤＳＰＨ１のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間に挿入して、プラスミドｐＤＳＰ−ＩΔ１、ｐＤＳＰ−ＩΔ２、ｐＤＳＰ−ＩΔ３、ｐＤＳＰ−ＩΔ４、ｐＤＳＰ−ＩΔ５、ｐＤＳＰ−ＩΔ６、ｐＤＳＰ−ＩΔ７、ｐＤＳＰ−ＩΔ８、ｐＤＳＰ−ＩΔ９を構築した。プラスミドｐＤＳＰ−ＩΔ１は図２の−４８４から−５８３番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ２は−４８４から−６８３番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ３は−４８４から−７８３番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ４は−４８４から−８８３番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ５は−４８４から−９８２番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ６は−４８４から−１０８３番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ７は−４８４から−１１８３番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ８は−４８４から−１２８３番目の領域を欠失し、ｐＤＳＰ−ＩΔ９は−４８４から−１３８３番目の領域を欠失している。
（４−２）形質転換
上記（４−１）で得たプラスミドＤＮＡそれぞれ５μｇをＢａｍＨＩで切断し、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＫＳＴ２５１５株に形質転換した。得られた形質転換体より１コピー挿入形質転換体を選抜し、メタノール１．５％、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ０．６７％を含むｐＨ５．５の培地で培養し、酸性フォスファターゼ活性を測定した。それぞれのプラスミドからの形質転換体の示す酸性フォスファターゼ比活性（ユニット／ＯＤ６１０）を図７に示す。その結果、プロモーター内部の欠失領域が大きくなるにつれ、プロモーター活性が徐々に低下することが明らかにされた。図２に示すＤＡＳプロモーターの−４８４から−９８２番目の領域の欠失を含むプラスミドｐＤＳＰ−ＩΔ５から、−４８４から−１０８３番目の領域の欠失を含むプラスミドｐＤＳＰ−ＩΔ６まで欠失が進むことにより、プロモーター活性が大幅に低下した。この結果から、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーターのメタノールによる誘導には、プロモーター領域として、図２の−９８３番目より上流の領域を有していることが必要であることが明らかとなった。実施例３の５’側からの欠失変異プロモーターを用いた解析と合わせて、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーターのメタノールによる誘導には、プロモーター領域として、図２の−９８３より−１４８０番目（配列番号１に示される３６４−８６１の配列に相当する）の領域を有していることが必要であることが示唆された。
実施例５
他のプロモーター領域との融合によるＤＡＳプロモーター活性領域の解析
この実施例では、実施例４の（４−２）で得られた結果を確認するために、配列番号１に示すＤＡＳプロモーターの８６１番目より上流の領域とメタノールによる誘導を受けないプロモーターとの融合プロモーターを作製し、融合プロモーターにより支配される酸性フォスファターゼ活性を測定することによりＤＡＳプロモーターの機能に必要な領域を同定した例を示す。
（５−１）融合プロモーターにより支配されるＰＨＯ５発現プラスミドの構築
国際公開第ＷＯ９７／１０３４５号明細書に記載されている結果から明らかなように、カンジダ・ボイジニイギ酸脱水素酵素遺伝子（ＦＤＨ）プロモーターは、メタノールによって強力に誘導されるが、ギ酸脱水素酵素遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧの５’側上流５２１ｂｐの領域では、微弱な転写活性は保持するもののメタノールによる誘導効果は野生型のものと比較して大幅に減少している。そこで本領域とＤＡＳプロモーター活性に必要と考えられる領域との融合プロモーターを構築し、検討することにした。
翻訳開始コドンＡＴＧの５’側上流５２１ｂｐのＦＤＨプロモーター領域をＰＣＲにて取得するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
ＰＦ５２１；ＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＡＴＡＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＣ（配列番号２１）；
ＰＲＶ３；ＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＴＴＧＡＡＴＴＧＡＣＧＡＧＴＧ（配列番号２２）。
ＰＦ５２１とＰＲＶ３を用いて、国際公開第ＷＯ９７／１０３４５号明細書に記載のｐＰＵＦ１を鋳型としたＰＣＲ（（９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル）を行った。増幅ＤＮＡ断片はｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒにクローニングした後、ＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片として単離した。このＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片を本明細書実施例４の（４−１）に記載のｐＤＳＰ−ＩΔ５のＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ間に挿入し、融合プロモーターによる酸性フォスファターゼ発現プラスミドｐＤＳＦＰ１を構築した。次にｐＤＳＦＰ１をＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化後、セルフライゲーションによりプラスミドｐＰＵＦ５２１を構築した。ｐＰＵＦ５２１は５２１ｂｐのＦＤＨプロモーター領域によるＰＨＯ５発現プラスミドである。
（５−２）形質転換
上記（５−１）で得たプラスミドＤＮＡ、ｐＤＳＦＰ１、ｐＰＵＦ５２１とｐＰＵＦ１それぞれ５μｇをＢａｍＨＩで切断した後、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＫＳＴ２５１５株に形質転換した。得られた形質転換体より１コピー挿入形質転換体を選抜し、メタノール１．５％、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ０．６７％を含むｐＨ５．５の培地で培養し、酸性フォスファターゼ活性を測定した。それぞれのプラスミドからの形質転換体の示す酸性フォスファターゼ比活性（ユニット／ＯＤ６１０）を図８に示す。その結果、図２のＤＡＳプロモーターの−９８３から−１８４３番目の領域を、５２１ｂｐのＦＤＨプロモーターに結合することにより、酸性フォスファターゼ活性が、メタノールによって強力に誘導され、野生型ＤＡＳプロモーターと同程度の活性を示した。
以上のことから、配列番号１に示すＤＡＳプロモーターの８６１番目より上流の領域はメタノールによる発現の誘導効果を示すために必須であることが判明した。
実施例６
ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーターによる異種遺伝子の発現の経時変化
メタノールで誘導後、ＤＡＳプロモーターによる発現がどのように変化するかを、酸性フォスファターゼ遺伝子をレポーター遺伝子として調べた。また、メタノール資化性酵母において、ＤＡＳプロモーターと同様にメタノールによって強力に誘導されるアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＤ）プロモーターによる発現も調べ、比較を行った。
ＤＡＳプロモーターによるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の酸性フォスファターゼ遺伝子の発現プラスミドは実施例２に記述したｐＤＳＰＨ１、宿主Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ株はＵＲＡ３遺伝子の変異株であるＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＴＫ６２株（Ｓａｋａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７４５８（１９９１））を用いた。ＡＯＤプロモーターによる酸性フォスファターゼ遺伝子発現プラスミドは、以下のように構築した。
ｐＤＳＰＨ１をＳｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化後、ＮｏｔＩ  リンカー（宝酒造社）とライゲーションした。酸性フォスファターゼ遺伝子をＮｏｔＩ断片として単離し、ＡＯＤプロモーターによる発現プラスミドｐＮｏｔｅＩ（Ｓａｋａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３０８，８１（１９９６））のＮｏｔＩ部位に導入した。得られたプラスミドをｐＡＸＰＨ１と命名した。
プラスミドｐＤＳＰＨ１、ｐＡＸＰＨ１の５μｇをＢａｍＨＩで切断し、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＴＫ６２株に形質転換した。得られた形質転換株のうち、プラスミドが染色体に１コピー組み込まれた株をＵＲＡ３遺伝子がコードするオロチジン酸脱炭酸酵素活性を測定することによって、選抜した（Ｓａｋａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，３５５６（１９９３））。これらの酵母をＹＰＤ培地で３６時間培養後、ＯＤ６１０が０．５になるように前培養培地（グルコース２％、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ０．６７％、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ０．５％）に植菌して、さらに８時間培養した。前培養液をＯＤ６１０が１になるように３Ｌ容三角フラスコに調整した３００ｍｌの誘導培地（メタノール０．５％、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ０．６７％、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％）に添加し、２８℃、３２０ｒｐｍで回転培養した。各時間にサンプリングし、１ＯＤ６１０当たりの菌体が示す酸性フォスファターゼ活性を測定した。ＡＯＤプロモーター、ＤＡＳプロモーターとも誘導後２４時間で、活性は最大に達した。２４時間後の１ＯＤ６１０当たりの菌体が示す酸性フォスファターゼ活性はＤＡＳプロモーターでは７９４ｍＵ、ＡＯＤプロモーターでは４５９ｍＵで、ＤＡＳプロモーターの方が優れていた。２４時間後の値を１００としたときの酸性フォスファターゼ相対活性の経時変化を図９に示す。活性が最大に達する速度もＤＡＳプロモーターは、ＡＯＤプロモーターに比べて速かった。
前述した誘導速度の差を検証するためにメタノールが代謝されないアルコールオキシダーゼ遺伝子破壊株を用いて、酸性フォスファターゼ発現を試みた。ｐＭＯＸ６２０（特開平５−３４４８９５）からアルコールオキシダーゼ遺伝子領域を約３．３ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩとして単離し、ｐＢｌｕｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋に導入した。このプラスミドをＳｔｙＩで切断し、平滑化後、ｐＳＰＲ（Ｓａｋａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５９８８（１９９２））からＳａｃＩ−ＸｈｏＩ切断で切り出して平滑化処理した断片とライゲーションした。得られたプラスミドをＳａｃＩ−ＸｈｏＩ切断し、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ  ＴＫ６２株に形質転換した。得られた形質転換体についてその染色体ＤＮＡのサザン解析を行うことにより、アルコールオキシダーゼ遺伝子破壊株をスクリーニングした。すなわち宿主ＴＫ６２株及び形質転換株の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＭＯＸ６２０をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ切断してえられる３．３ｋｂのＤＮＡ断片をプローブとしてサザン解析を行った。宿主ＴＫ６２株では４．２ｋｂの位置に検出されるバンドが、破壊株では７．３ｋｂに検出された。公知の方法（Ｓａｋａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５９８８（１９９２））に従い、アルコールオキシダーゼ遺伝子破壊株をＹＰＤ培地で定常期まで培養した後、５−フルオロオロチジン酸（５−ＦＯＡ）に耐性を示すＵＲＡ３遺伝子が欠落した株を取得した。
得られたアルコールオキシダーゼ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子の２重変異株にＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＤＳＰＨ１、あるいはｐＡＸＰＨ１で形質転換した。プラスミドが１コピー組み込まれた株を選抜した後、前述の方法に従ってメタノール誘導２４時間後の酸性フォスファターゼ活性を測定した。図１０で示すように、ＤＡＳプロモーターによる発現では宿主間に大きな活性の差は観察されなかったが、ＡＯＤプロモーターによる発現はアルコールオキシダーゼ欠損株において、大幅な活性の低下が観察された。アルコールオキシダーゼ欠損株ではメタノールが代謝されないため、メタノールのみによる誘導が行なわれていると考えられる。したがって、ＤＡＳプロモーターの誘導はおもにメタノールによるものであり、ＡＯＤプロモーターの誘導はメタノールよりもむしろ、その代謝産物による事が示唆された。
以上のことから、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子プロモーターはメタノールによって俊敏かつ強力に誘導されるという点で、アルコールオキシダーゼ遺伝子プロモーターより優れているということが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願について、その全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。また、上記の実施例は単に例示のためのものであって本発明を制限することを意図したものではない。本発明はさらに、本発明の思想および範囲を逸脱しない限り、本発明の変更および変形をも包含することは、当業者には容易に明らかであろう。
以下に、本明細書に記載された配列に関する情報を示す。
配列番号１の配列：
0004420560.tif 000002
0004420560.tif 000003
配列番号２の配列：
0004420560.tif 000004
配列番号３の配列：
0004420560.tif 000005
配列番号４の配列：
0004420560.tif 000006
配列番号５の配列：
0004420560.tif 000007
配列番号６の配列：
0004420560.tif 000008
配列番号７の配列：
0004420560.tif 000009
配列番号８の配列：
0004420560.tif 000010
配列番号９の配列：
0004420560.tif 000011
配列番号１０の配列：
0004420560.tif 000012
配列番号１１の配列：
0004420560.tif 000013
配列番号１２の配列：
0004420560.tif 000014
配列番号１３の配列：
0004420560.tif 000015
配列番号１４の配列：
0004420560.tif 000016
配列番号１５の配列：
0004420560.tif 000017
配列番号１６の配列：
0004420560.tif 000018
配列番号１７の配列：
0004420560.tif 000019
配列番号１８の配列：
0004420560.tif 000020
配列番号１９の配列：
0004420560.tif 000021
配列番号２０の配列：
0004420560.tif 000022
配列番号２１の配列：
0004420560.tif 000023
配列番号２２の配列：
0004420560.tif 000024
配列番号２３の配列：
0004420560.tif 000025
【配列表】
0004420560.tif 000026
0004420560.tif 000027
0004420560.tif 000028
0004420560.tif 000029
0004420560.tif 000030
0004420560.tif 000031
0004420560.tif 000032
0004420560.tif 000033
0004420560.tif 000034
0004420560.tif 000035
0004420560.tif 000036
【図面の簡単な説明】
図１は、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（ＤＡＳ）を含むプラスミドｐＤＡＳ１の制限酵素地図を示したものである。
図２は、決定したジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧより上流領域の塩基配列を示したものである。なお配列の番号は３’末端を−１として対応させている。
図３は、プラスミドｐＤＳＰＨ１の構造を示したものである。
図４は、種々の炭素源、窒素源で培養した形質転換体のＤＡＳプロモーターの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性を示したものである。
図５は、上流欠失型ＤＡＳプロモーターの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性を示したものである。
図６は、内部領域が欠失したＤＡＳプロモーターによる酸性フォスファターゼ発現プラスミドｐＤＳＰ−ＩΔ１の構築法を示したものである。
図７は、内部領域が欠失したＤＡＳプロモーターの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性を示したものである。
図８は、ＤＡＳプロモーター活性に必要と考えられる領域を付加したギ酸脱水素酵素遺伝子（ＦＤＨ）プロモーターの構造、及びそれらの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性を示したものである。
図９はｐＤＳＰＨ１（ＤＡＳプロモーターによる酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）発現プラスミド）または、ｐＡＸＰＨ１（アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＤ）プロモーターによる酸性フォスファターゼ遺伝子発現プラスミド）の形質転換株について、メタノール誘導後の酸性フォスファターゼ活性の経時変化を示したものである。なお２４時間後の活性を１００としたときの相対値で示している。
図１０は野生株またはアルコールオキシダーゼ遺伝子破壊株をｐＤＳＰＨ１あるいはｐＡＸＰＨ１で形質転換した株について、メタノール誘導２４時間後の酸性フォスファターゼ活性を示したものである。なお野生株が示す活性を１００としその相対値で示している。
【図１】
0004420560.tif 000037
【図２】
0004420560.tif 000038
【図３】
0004420560.tif 000039
【図４】
0004420560.tif 000040
【図５】
0004420560.tif 000041
【図６】
0004420560.tif 000042
【図７】
0004420560.tif 000043
【図８】
0004420560.tif 000044
【図９】
0004420560.tif 000045
【図１０】
0004420560.tif 000046