(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらかじめ決定された外因性組換えポリペプチド又はタンパク質を製造する方法を実施するための、突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ−ＲＮＡ）を分解する活性をもはや有しないような突然変異を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有するエシュリヒア  コリ（Escherichia coli（Ｅ．ｃｏｌｉ））株の使用であって、該突然変異が、該Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖に有意に影響を与えず、突然変異が、配列番号１の２１９６位から２１９８位に位置する終止コドンＴＡＡを作出するための、配列番号１の２１９６位のグアニンＧのチミジンＴによる置換に相当することを特徴とする、エシュリヒア  コリ株の使用。
【請求項２】
ＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子が、該突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ＲＮａｓｅＥのリボソームＲＮＡ（ｒ−ＲＮＡ）の成熟のための活性を維持しているが、ｍ−ＲＮＡの分解のための活性をもはや有しないような突然変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＥ．ｃｏｌｉ株の使用。
【請求項３】
該株が、外因性誘導可能発現系を含有し、あらかじめ決定された組換えポリペプチドの発現が該発現系の調節下に置かれ、ここで該発現系はＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のＥ．ｃｏｌｉ株の使用。
【請求項４】
外因性誘導可能発現系を含有するように形質転換され、突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ｍ−ＲＮＡの分解のための活性をもはや有しないような突然変異を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株であって、かつこの突然変異が該Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖に有意に影響を与えず、突然変異が、配列番号１の２１９６位から２１９８位に位置する終止コドンＴＡＡを作出するための、配列番号１の２１９６位のグアニンＧのチミジンＴによる置換に相当することを特徴とする、Ｅ．ｃｏｌｉ株。
【請求項５】
外因性誘導可能発現系を含有するよう形質転換され、該突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ＲＮａｓｅＥのｒ−ＲＮＡの成熟のための活性を保存しているが、ｍ−ＲＮＡの分解のための活性をもはや有しないような突然変異を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有する、請求項４に記載のＥ．ｃｏｌｉ株。
【請求項６】
誘導可能発現系がＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、請求項４又は５に記載のＥ．ｃｏｌｉ株。
【請求項７】
誘導可能発現系が、１個又は数個のあらかじめ決定された組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写を調節することを特徴とする、請求項４から６のいずれか１項に記載のＥ．ｃｏｌｉ株。
【請求項８】
−該１個又は数個の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写が誘導可能発現系の調節下に置かれている、請求項７に記載のＥ．ｃｏｌｉ株を得るため、請求項４から６のいずれか１項に記載のＥ．ｃｏｌｉ株を、１個又は数個の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するベクター、特にプラスミドで形質転換する工程、
−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における１個又は数個の組換えポリペプチドの発現を許容するために十分な時間、前工程において得られた形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を培養し、該発現系を誘導する工程、
−及び、前工程において産生された１個又は数個の組換えポリペプチドを回収する工程、を含むことを特徴とする、あらかじめ決定された組換えポリペプチドを製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、変異型Ｅ．ｃｏｌｉ株、及び組換えポリペプチドを製造するための方法を実施するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
高等生物、微生物、及びウイルスのゲノム研究は、例えば、抗体を得るため、又は生化学的研究もしくは結晶学的研究を実施するため、それらの遺伝子のクローニングに加え、それらの産物（タンパク質）の大規模製造を、ほぼ必ず必要とする。
【０００３】
適用の観点から、多数のヒトのペプチド及びタンパク質の医学領域における利用も、異種生物における対応する遺伝子の発現を必要とする。
【０００４】
発現系は、様々な真核生物宿主（特に、酵母、昆虫、及び霊長類細胞）において確立されているが、これらの発現法のため最も広範に使用されている宿主は、依然として細菌、エシュリヒア  コリ（Eschericha coli（Ｅ．ｃｏｌｉ））である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて製造されているバイオテクノロジー又は薬理学に関して重要なタンパク質のリストは、広範囲に及んでおり、古典的な例は、ヒト・インスリン及びヒト成長ホルモンを含む。
【０００５】
原核生物における最も周知の発現系は、１９８０年代に、スチューディア及びリチャードソンのグループにより、米国において開発された（Tabor and Richardson,1985;Studier and Moffat,1986）。それは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（即ち、Ｔ７バクテリオファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼ）の特性の活用に基づいている。毒性なしにＥ．ｃｏｌｉ細胞において発現されうるその酵素は、極めて特異的なプロモーターを認識する。任意の目的の遺伝子（標的遺伝子）が、それをこのプロモーターの下流に置き、それをＴ７ポリメラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞へ導入することにより、極めて効率的に転写されうる。
【０００６】
にもかかわらず、発現に関して、結果は不確実である。順当に過剰発現されうる標的遺伝子も存在するが、中程度にしか、又は全く発現されないものも存在する。
【０００７】
本発明者らによる以前の研究は、これらの障害の主要な原因が、メッセージ伝達により合成されるポリペプチドの数の減少を引き起こす、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより合成されるｍ−ＲＮＡの特別な不安定性にあることを明らかにした（Lopez et al.,1994;Iost and Dreyfus,1994,1995）。この不安定性は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの高速な伸長速度の結果である（Makarova et al.,1995）。特に、Ｔ７ポリメラーゼの伸長速度は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの速度とは対照的に、リボソームによるｍ−ＲＮＡの翻訳速度よりもはるかに大きい。従って、新生ｍ−ＲＮＡはその長さの大部分にわたり曝露され、従って、ヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉにおいては特にＥ型リボヌクレアーゼ（又はＲＮａｓｅＥ）（そのアミノ酸配列はカサレゴラら（Casaregola et al.,1992,1994）により記載されている）による攻撃を受け易い。
【０００８】
ＲＮａｓｅＥは、Ｅ．ｃｏｌｉの必須酵素であり、ｍ−ＲＮＡの分解及びリボソームＲＮＡ（ｒ−ＲＮＡ）の成熟の両方に関与している。触媒領域（即ち、ＲＮａｓｅＥのＮ末端部分）における変異は、これらの２つの機能に同時に影響を与え、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を減速させるか、又はさらには阻止する（Cohen and McDowall,1997）。
【０００９】
他方、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分における欠失は、Ｅ．ｃｏｌｉの生存に影響を与えない。特に、複製後の染色体の分離にとって必要なタンパク質（ＭｕｋＢ）における突然変異の復帰突然変異体を研究することにより、キド（Kido）らは、Ｃ末端部分が短縮されたＲＮａｓｅＥの合成を引き起こす、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＲＮａｓｅＥをコードするｒｎｅ遺伝子における様々な生存可能突然変異を得た（Kido et al.,1996）。これらの著者らは、これらの実験から、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分がＥ．ｃｏｌｉの生存にとって必須でないという結論を下した。彼らは、さらに、ＲＮａｓｅＥの短縮によるｍｕｋＢ突然変異の抑制は、短縮型ＲＮａｓｅＥのｍｕｋＢ ｍ−ＲＮＡ分解効率が野生型酵素より低いという事実を反映しているという仮説を形成した。このようにして安定化された比較的強力な変異型ＭｕｋＢタンパク質の合成が達成され、それにより、変異と関連した表現型が修正された。しかし、このｍｕｋＢメッセンジャーの安定化は証明されておらず、他の著者らは、ｍｕｋＢ突然変異に対するＲＮａｓｅＥ短縮の抑制効果を説明するための完全に異なる解釈を提唱した（Cohen and McDowall,1997）。これらの著者らは、特にＲＮａｓｅＥとＭｕｋＢとの直接的な相互作用を仮定する。その概念の基本は、ＲＮａｓｅＥが、それ自体のＲＮａｓｅ活性とは別に、ＭｕｋＢと同様に構造的な役割を果たしていることを示唆する、ＲＮａｓｅＥが、真核生物ミオシンと極めて実質的な類似性を有しているという事実であった（Casaregola et al.,1992；McDowall et al.,1993）。
【００１０】
本発明は、ＲＮａｓｅＥの短縮が、ｒ−ＲＮＡの成熟を有意に妨害することなく、全体として考慮された細胞ｍ−ＲＮＡ、及び調査された個々のｍ−ＲＮＡの大部分の全体的な安定化を引き起こすという事実の、本発明者らによる証明から生まれた（Lopez et al.,1999）。
【００１１】
それに関して、欠失の効果は、ＲＮａｓｅＥに熱感受性活性を与える、ｒｎｅ１（Babitzke and Kushner,1991）と改名されたａｍｓ突然変異（Ono and Kuwano,1979）のようなＮ末端領域における突然変異の効果とは極めて異なっていた。例えば、３７℃において、ｒｎｅ１突然変異は、ｍ−ＲＮＡの寿命の中程度の増加（平均１．５倍、ｍ−ＲＮＡの寿命とは、本明細書において、タンパク質合成のためのマトリックスとして機能する時間と定義される）を引き起こすが（Mudd et al.,1990a）、それは、ｒ−ＲＮＡの成熟の有意な減速も引き起こし（「ノーザン」法により推定；Lopez et al.,1994を参照のこと）、増殖を２倍遅延させる。対照的に、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分、特にＲＮａｓｅＥのアミノ酸５８６から１０６１の欠失は、ｒ−ＲＮＡの成熟の減速を引き起こすことなく、そして増殖を遅延させることなく、より有意なｍ−ＲＮＡの安定化を引き起こす（平均２倍）。従って、後知恵的に、ＲＮａｓｅＥのＮ末端の突然変異で観察された増殖の欠損は、単に細胞のｒ−ＲＮＡ成熟能の欠如によるものである可能性が高い。
【００１２】
要約すると、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分の欠失は、ｒ−ＲＮＡの迅速な成熟から判断して、触媒ドメインの活性に対する効果を有しない。その迅速な成熟は、そのような欠失を含有する細胞が生存可能である理由である。他方、欠失は、おそらく、ｍ−ＲＮＡの分解にとって必要であるのかもしれない、多重タンパク質構造、いわゆる「デグラドソーム（degradosome）」内のＲＮａｓｅＥと他の酵素との相関を阻害するために、全体としてのｍ−ＲＮＡを安定化する（Carpousis et al.,1994;Miczack et al,1996;Py et al.,1996;Kido et al.,1996;Cohen and McDowall,1997）。本発明の見地から重要な点は、これらの欠失のため、正常な増殖を維持しつつ、増強されたｍ−ＲＮＡ安定性を有するＥ．ｃｏｌｉ株を得ることが可能であるという点である。
【００１３】
本発明者らは、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分の欠失によるｍ−ＲＮＡの安定化が、均一ではなく、ｍ−ＲＮＡの安定性が低いほど、より明白であることも示した。既知のように、これは発現系における「標的」遺伝子のｍ−ＲＮＡにしばしば当てはまる。従って、このｍ−ＲＮＡの全体的なタンパク質合成への寄与は、欠失の存在により増強される。従って、そのような欠失を含むＥ．ｃｏｌｉ株は、特に、該組換えポリペプチドの発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの調節下に置かれた場合、その変異を含まないＥ．ｃｏｌｉ株による組換えポリペプチドの発現収率と比較して、極めて高い収率（特に約３倍から２５倍）で組換え外因性ポリペプチドを発現する。
【００１４】
従って、本発明は、従来記載された方法の製造収率よりも実質的に大きい製造収率で、組換えタンパク質又はポリペプチド、特に薬学的又は生物学的に重要な組換えタンパク質又はポリペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉから製造するための新規な方法を提供することを、目的として有する。
【００１５】
本発明は、前記の方法を実施するための新規なＥ．ｃｏｌｉ株、及びそのような株を調製するための方法を提供することも、目的として有する。
【００１６】
本発明は、あらかじめ決定された外因性組換えポリペプチド（又はタンパク質）を製造するための方法を実施するための、突然変異（該突然変異は、該突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ｍ−ＲＮＡ分解活性をもはや有しないような変異であり、かつ該Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖に有意に影響を与えない突然変異である）を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株の使用を、目的として有する。
【００１７】
本発明は、より具体的には、あらかじめ決定された外因性組換えポリペプチド（又はタンパク質）を製造するための方法を実施するための、突然変異（該突然変異は、該突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ＲＮａｓｅＥのｒ−ＲＮＡの成熟活性を維持しているが、ｍ−ＲＮＡの分解活性をもはや有しないような突然変異である）を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株の使用に関する。
【００１８】
本発明は、より具体的には、突然変異が、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分をコードする遺伝子の領域における１個又は数個のヌクレオチドの置換又は欠失からなることを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株の前記の利用を、目的として有する。
【００１９】
本発明は、さらに具体的には、突然変異が、配列番号１により表されるＲＮａｓｅＥをコードするＤＮＡの１９３５位に位置するヌクレオチド及び３６２３位に位置するヌクレオチドを境界とする領域の１個又は数個のヌクレオチドの置換又は欠失に相当することを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株の前記の利用に関する。
【００２０】
有利には、前記の突然変異は、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分からの少なくとも１個のアミノ酸の修飾又は欠失を引き起こす。
【００２１】
このために、本発明は、突然変異が、配列番号２により表されるＲＮａｓｅＥの配列の最後の５６３アミノ酸のうちの少なくとも１個から全部までの欠失を引き起こすことを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株の前記の利用を、目的として有する。
【００２２】
本発明は、より具体的には、突然変異が、配列番号１の２１９６位から２１９８位に位置する終止コドンＴＡＡを作出するための、配列番号：１の２１９６位のグアニンＧのチミジンＴとの置換に相当することを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株の前記の利用を、目的として有する。
【００２３】
有利には、本発明に関連して使用される前記の突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉ株は、外因性誘導可能発現系、特にＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを使用した誘導可能発現系を含有し、あらかじめ決定された組換えポリペプチドの発現が該発現系の調節下に置かれる。
【００２４】
本発明は、突然変異（該突然変異は、該突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ｍ−ＲＮＡの分解活性をもはや有しないような変異であり、かつ該Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖に有意に影響を与えない変異である）を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有する、外因性誘導可能発現系を含有するよう形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株にも関する。
【００２５】
本発明は、突然変異（該突然変異は、該突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ＲＮａｓｅＥのｒ−ＲＮＡの成熟活性を維持しているが、ｍ−ＲＮＡの分解のための活性をもはや有しないような突然変異である）を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有する、特に前記の発現系から選択される外因性誘導可能発現系を含有するよう形質転換された前記のようなのＥ．ｃｏｌｉ株も、対象として有する。
【００２６】
本発明は、より具体的には、誘導可能発現系が、Ｔ７バクテリオファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、前記のＥ．ｃｏｌｉ株を、対象として有する。
【００２７】
本発明は、突然変異が、ＲＮａｓｅＥのＣ末端部分をコードする遺伝子の領域からの１個又は数個のヌクレオチドの置換又は欠失からなることを特徴とする、前記のＥ．ｃｏｌｉ株にも関する。
【００２８】
本発明は、より具体的には、突然変異が、配列番号１により表されるＲＮａｓｅＥをコードするＤＮＡ配列の１９３５位に位置するヌクレオチド及び３６２３位に位置するヌクレオチドを境界とする領域からの１個又は数個のヌクレオチドの置換又は欠失に相当することを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株に関する。
【００２９】
本発明は、より具体的には、前記の突然変異が、該株により発現されるＲＮａｓｅＥのＣ末端部分の少なくとも１個のアミノ酸の修飾又は欠失を引き起こすことを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株を、対象として有する。
【００３０】
そのため、本発明は、変異が、配列番号２により表されるＲＮａｓｅＥの配列の最後の５６３アミノ酸のうちの少なくとも１個、最大全部の欠失を引き起こすことを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株を、対象として有する。
【００３１】
本発明は、より具体的には、突然変異が、配列番号１の２１９６位から２１９８位に位置する終止コドンＴＡＡを作出するための、配列番号１の２１９６位のグアニンＧのチミジンＴとの置換に相当することを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株を、目的として有する。
【００３２】
本発明は、誘導可能発現系が、１個又は数個の予定された組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写を調節することを特徴とする、上記で定義されたＥ．ｃｏｌｉ株も、対象として有する。
【００３３】
本発明は、
−突然変異（該突然変異は、該突然変異遺伝子の発現により産生される酵素が、ｍ−ＲＮＡの分解活性をもはや有しないような突然変異であり、かつ該Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖に有意に影響を与えない突然変異である）を含むＲＮａｓｅＥをコードする遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株を、１個又は数個の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するベクター、特にプラスミドで形質転換する工程、
−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における組換えポリペプチドの発現を許容するために十分な時間、前工程において得られた形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を培養する工程、
−及び、前工程において産生された１個又は数個の組換えポリペプチドを、場合により、特にクロマトグラフィ、電気泳動、又は選択的沈殿による精製の後、回収する工程、を含むことを特徴とする、あらかじめ決定された組換えポリペプチドを製造するための任意の方法にも関する。
【００３４】
本発明は、より具体的には、
−該１個又は数個の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写が誘導可能発現系の調節下に置かれている、前記のＥ．ｃｏｌｉ株を得るため、前記のＥ．ｃｏｌｉ株を、１個又は数個の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するベクター、特にプラスミドで形質転換する工程、
−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における１個又は数個の組換えポリペプチドの発現を許容するために十分な時間、前工程において得られた形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を培養し、該発現系を誘導する工程（該発現系の誘導は、特に、該発現系がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを要求する場合、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの合成を引き起こすことによりなされ、この合成は、培養培地へＩＰＴＧを添加することにより、又は温度を上昇させることにより顕著に誘発され、このＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、ｌａｃリプレッサーにより制御されるプロモーター（Studier and Moffat,1986）の調節下又は熱誘導可能プロモーター（Tabor and Richardson,1985）の調節下に置かれる）、
−及び、前工程において産生された１個又は数個の組換えポリペプチドを回収する工程、を含むことを特徴とする、上記で定義された予定された組換えポリペプチドを製造するための任意の方法を、目的として有する。
【００３５】
本発明に関連して使用されうる、前記の変異型Ｅ．ｃｏｌｉ株を得るための一般的な方法は、以下の工程を含む。
−前記の突然変異を含むｒｎｅ遺伝子を含有するプラスミド（該ｒｎｅ遺伝子のプロモーターは抑制されている）の調製、
−誘導可能発現系と、宿主の増殖を熱感受性にし、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上のｒｎｅ遺伝子の所望の突然変異の獲得を選択することを許容する、いわゆるｒｎｅ１突然変異（Ono and Kuwano,1979）のような、該Ｅ．ｃｏｌｉに特定の特性を与えるｒｎｅ遺伝子における染色体の突然変異とを含むＥ．ｃｏｌｉ株への、前工程において得られたプラスミドの導入、
−このようにして形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株の培養、及び前記の特定の特性を有するＥ．ｃｏｌｉ株、即ち該染色体の突然変異と該プラスミドの突然変異ｒｎｅ遺伝子に対応する相同配列との交換を許容する相同的組み換えから生じたクローンの選択、特に染色体の突然変異が該ｒｎｅ１突然変異である場合には熱抵抗性クローンの選択、
−選択されたクローンからのプラスミドの排除、及び特に突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉ細胞により産生される前記の突然変異型ｒｎｅ遺伝子によりコードされた短縮型ＲＮａｓｅＥポリペプチドの長さを電気泳導により分析することによる、前記の突然変異ｒｎｅ遺伝子を含むクローンの、これらのクローンの中からの同定。
【００３６】
本発明は、本発明に係る突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉ株の調製、及び予定されたポリペプチドを製造するためのその使用の、以下の詳細な説明を用いて、有利に例示される。
【００３７】
１）５８６番目のコドンに終止コドンを含有する突然変異型ｒｎｅ遺伝子の構築
この特定の位置を選択したのは、このようにしてＲＮａｓｅＥにおいて作出される短縮は、キドら（１９９６）により得られた自然ｓｍｂＢ１３１突然変異（本明細書においては、ｒｎｅ１３１と改名）から生じるものと形式的に等価であるためである。ｒｎｅ１３１は、ＲＮａｓｅＥの通常の配列と関係のない３２コドンの相補的な翻訳の後、終止コドン前のリーディング・フレーム・シフトを引き起こす、５８６番目のコドンの２ヌクレオチドの欠失である。
【００３８】
そのような遺伝子を構築するため、配列のＧ２１９６ヌクレオチドを、Ｔと置換し、配列番号１のヌクレオチド２１９６〜２１９８にＴＡＡコドン（終止）を作出した（この突然変異は、本明細書において、慣例に従い「Ｇ２１９６Ｔ」と呼ばれる）。
【００３９】
所望の置換を作出するためには、まず、野生型ｒｎｅ遺伝子をｐＥＭＢＬ８+「ファージミド」（Dente et al.,1983）へサブクローニングした。そのため、完全なｒｎｅ遺伝子の転写された配列を、以下のプライマー：
【００４０】
【化１】
0004422336.tif 000002
【００４１】
（太字の配列は、配列番号：１のヌクレオチド（ｎｔ）８１〜９８に相当し、イタリック体の配列はＰｓｔＩ酵素の認識配列である）、及び
【００４２】
【化２】
0004422336.tif 000003
【００４３】
（太字の配列は、配列番号：１のｎｔ３６３０から３６４７と相補的であり、イタリック体の配列はＢｇｌＩＩ酵素により認識される）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムから増幅した。
【００４４】
次いで、増幅された断片を、酵素ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ（これらの酵素はｒｎｅ配列の内部に分解部位を有しない）により消化し、ｐＥＭＢＬ８+（ＢａｍＨＩ部位とＢｇｌＩＩ部位は相互にライゲートされうることに留意）のＢａｍＨＩ部位とＰｓｔＩ部位の間に挿入した。このようにしてクローニングされたｒｎｅ配列は、プロモーターを欠いていることに注意されたい。
【００４５】
次に、得られた配列のＰｓｔＩ部位へ、ｒｎｅ遺伝子と同一の方向で、以下の合成断片：
【００４６】
【化３】
0004422336.tif 000004
【００４７】
（太字の配列は、トリプトファン・オペロン（Christie et al.,1981）の極めて効率的な転写終結因子に相当し、イタリック体の末端部はＰｓｔＩにより認識される配列に相当する）を導入することにより、ベクターから生じる任意の寄生的な転写を排除した。これらの予防措置は、原形質が保持するｒｎｅ配列がプラスミドのプロモーターから転写され得ず、従ってプラスミドからＲＮａｓｅＥが合成され得ないことを保証する。この点の重要性は後に明らかとなろう。以下の記載において、このようにして得られたプラスミドをｐＲＮＥと名付ける。
【００４８】
次いで、クンケル（Kunkel et al.,1987）により記載された特異的突然変異導入の一般的な技術を使用することにより、所望の置換（Ｇ→Ｔ）をｐＲＮＥプラスミドへ導入した。そのため、ｐＲＮＥプラスミドをＲＺ１０３２株（Hfr KL16PO/45(lysA61-62 dut1 ung1 thi1 relA1 supE44 zbd-279::Tn10）へ導入した。この株に存在するｄｕｔ１変異及びｕｎｇ１変異は、ＤＮＡ中のチミジン（Ｔ）の代わりにデオキシウリジン（ｄＵ）の取り込みを引き起こす。次に、Ｋ０７「ヘルパー」Ｍ１３ファージ（ファルマシア（Pharmacia））を細胞に過剰感染させ、それにより、Ｔの代わりにｄＵを有する一本鎖形態のｐＲＮＥの配列を含む「ファージ」の、培地中の蓄積を引き起こした。除タンパク質後、この一本鎖マトリックスに、配列番号：１の２１８８位から２２０８位に相当する以下の合成オリゴヌクレオチド：
【００４９】
【化４】
0004422336.tif 000005
【００５０】
（Ｇの代わりに取り込まれることが望まれる「Ｔ」は太字で示されている）をハイブリダイズさせ、クレノウ・ポリメラーゼ、Ｔ４リガーゼ、ＡＴＰ及びｄＮＴＰとのインキュベーションにより、ハイブリッドを二本鎖ＤＮＡへ変換した（Kunkel et al.,1987）。次いで、クローニングに一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ株であるＸＬ１（ストラタジーン（Stratagene））へ二本鎖ハイブリッドを導入した。この株のｄｕｔ遺伝子及びｕｎｇ遺伝子はネイティブであり、従って、Ｔの代わりにｄＵを含む第一鎖は分解されるであろう。このようにして得られたＸＬ１コロニーの大多数が、ｐＲＮＥプラスミドに所望の突然変異を含む。
【００５１】
４つの候補を選択することにより、所望の突然変異が明らかに存在すること、及びプラスミドが他を含まないことを確認した。それに関して、適当なオリゴヌクレオチド・プライマーを使用して、ＡｆｌＩＩ−ＮｒｕＩ領域（配列番号１のｎｔ１９３１〜２３４５）の配列を決定し、この領域に他の修飾は含まずに単一の所望の突然変異を含む候補のみを選択した。次いで、そのような候補から生じたＡｆｌＩＩ−ＮｒｕＩ断片を単離し、最初の（突然変異を導入されていない）ｐＲＮＥ原形質のＡｆｌＩＩ−ＮｒｕＩ断片をその中に置換した。このようにして、所望の突然変異を含むプラスミドが得られた。このプラスミドを以後ｐＲＮＥ−ＳＴＯＰと呼ぶ。
【００５２】
２）Ｔ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを発現する株であるＢＬ２１（ＤＥ３）の染色体への、ＲＮａｓｅＥのコドン５８６に終止を作出する突然変異の導入
一般的な原理。所望の突然変異（Ｇ２１９６Ｔ）は、野生型と比較して表現型の変化を生じない。従って、それを染色体に導入するためには、２段階での実施が必要である。第一に、ＲＮａｓｅＥのコドン６６に誤方向の突然変異（ａｍｓ又はｒｎｅ１と呼ばれる突然変異；Ono and Kuwano,1979）を導入する。この突然変異は、配列番号１の番号付けによるとＧ６３６Ａ転位に相当する（McDowall et al.,1993）。それは、ＲＮａｓｅＥの熱安定性を減少させ、高温における増殖を妨害する。
【００５３】
次に、得られた株へｐＲＮＥ−ｓｔｏｐプラスミドを導入し、高温において新たに増殖することができる細胞を選択する。原形質が保持するｒｎｅ−ｓｔｏｐ遺伝子は、転写されず、機能的なＲＮａｓｅＥの合成に至らないことを想起されたい。いずれにせよ、二重の相同的組み換えのため、プラスミドは、染色体ｒｎｅ遺伝子の６３６位に野生型配列を輸送することができ（Ａ６３６Ｇ突然変異）、同時に高温における増殖を再確立する。プラスミドと染色体ｒｎｅ領域との間の相同領域は、原形質が保持するＧ２１９６Ｔ突然変異の下流の約１５００ｎｔにわたっており、Ｇ２１９６Ｔ突然変異は、Ａ６３６Ｇと同時に染色体へ移入される可能性が高い。次いで、プラスミドを排除すると、ＲＮａｓｅＥの染色体遺伝子に唯一の突然変異Ｇ２１９６Ｔを含む株が得られる。
【００５４】
ＢＬ２１（ＤＥ３）株のｒｎｅ１（ａｍｓ）誘導体の調製。ＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｔ７ポリメラーゼによる異種遺伝子の転写に基づく細菌発現系のための典型的な宿主である（Studier and Moffat,1986）。特にＢＬ２１（ＤＥ３）及びその誘導体に関して、任意の所望の遺伝的背景へのｒｎｅ突然変異の導入を許容する技術が記載されている（Mudd et al.,1990b;Iost & Dreyfus,1995）。簡単に説明すると、ａｍｓ／ｒｎｅ１突然変異、及びｒｎｅ遺伝子から近位の染色体遺伝子座（ｚｃｅ−７２６）に挿入されたテトラサイクリン抵抗性遺伝子を含む細菌株（ＣＨ１８２８）から出発した。Ｐ１バクテリオファージ形質導入（Silhavy et al.,1984）として知られる一般的な技術を使用して、テトラサイクリンに対する耐性（ＴｅｔR）の獲得を選択することにより、ｚｃｅ−７２６遺伝子座の周囲の数千ヌクレオチドのうちの数十のＣＨ１８２８染色体の長い領域を、ＢＬ２１（ＤＥ３）へ移入した。これらのＴｅｔRクローンは、高い割合（約５０％）で、それらがｒｎｅ１対立遺伝子も受容したことを示す、熱感受性増殖も示した。得られた株をＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１と名付けた。
【００５５】
Ｇ２１９６Ｔ突然変異のＢＬ２１（ＤＥ３）染色体への導入。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１をｐＲＮＥ−ｓｔｏｐプラスミド（そして、対照として、初期プラスミドｐＥＭＢＬ８+）で形質転換し、次いで、３０℃における完全液体培地（ＬＢ培地；(Miller,1972)）中での増殖の後、約１０5個の細菌をアガロース中に同培地を含有するペトリ皿に播き、次いで、４２℃でインキュベートした。対照の細菌に関しては、２４時間後に増殖が観察されなかった（ａｍｓ／ｒｎｅ１変異は自然には復帰しない）。対照的に、ｐＲＮＥ−ｓｔｏｐで形質転換された細菌は、プラスミドが保持する野生型配列のため、染色体ｒｎｅ１突然変異の復帰突然変異から生じた多数の熱抵抗性クローンを示した。次に、これらの熱抵抗性クローン１２個を選択し、ＬＢ液体培地中で約２０世代にわたりアンピシリンなしで培養することにより（４２℃）、これらの候補からプラスミドを排除した。アンピシリンは、ｐＥＭＢＬ８+に由来するプラスミドを維持するために必要であり、それが存在しない場合には、プラスミドは極めて容易に分離する（Dreyfus,1988）。このようにして処理された候補の、ＬＢ／アガロース培地における再単離の後、個々のコロニーがアンピシリンの存在下でもはや増殖し得ないことを試験することにより、プラスミドの欠損を確認した。
【００５６】
６３６位における野生型配列と同時にＧ２１９６Ｔ突然変異も獲得した、熱抵抗性復帰突然変異体（大部分）の同定が残っている。これは、２段階で実施した。第一に、最小アガロース培地（本発明者らは、炭素源としてグリセロールを含むＭ６３Ｂ１培地を使用する；（Miller,1972））上で候補を再単離し、対照としてＢＬ２１（ＤＥ３）初期株及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１熱感受性突然変異体も同ディッシュに播いた。次いで、これらを４３℃でインキュベートした。Ｇ２１９６Ｔ突然変異は、これらの極度の条件下でわずかな増殖の減速を引き起こした。従って、研究された組換え体は、野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞よりも小さいコロニーをもたらし、それが、これらの組換え体の研究のための一次スクリーニングを許容した。最終的な試験は、「ウェスタン」免疫学的技術（Sambrook et al.,1989）を使用して、ＲＮａｓｅＥポリメラーゼのサイズを決定することによる。簡単に説明すると、様々な候補（及び前記の２つの対照）をＬＢ液体培地中で増殖させた。６００ｎｍにおける培養物の光学濃度が０．５に達したとき、細胞を収集した。次いで、それらをリン酸緩衝液に再懸濁させ、超音波処理により溶解した。細胞片の排除後、細胞抽出物中のタンパク質を決定し（Bradford,1976）、次いで７．５％ポリアクリルアミドゲルを使用することにより、２０μgのタンパク質混合物をレムリの技術（Laemmli,1970）による電気泳動にかけた。この技術は、タンパク質のサイズによる分離を可能にする。電気泳動後、タンパク質混合物をニトロセルロース膜へ電気的に転写した。次いで、膜を非特異的タンパク質で飽和し、次いで、ウサギにおいて作製されたＲＮａｓｅＥに対するポリクローナル抗体の１／１０，０００希釈物と共にインキュベートした。これを、ペルオキシダーゼ酵素とカップリングしたウサギＩｇＧに対して作製されたヤギ抗体と共にインキュベートすることにより、固定された抗ＲＮａｓｅＥ抗体を有する膜の領域を検出した。アマシャム（Amersham）により市販されているキットを使用して、強化化学発光（ＥＣＬ）技術により、膜上のペルオキシダーゼの存在それものを明らかにした。この技術は、各候補により合成されたＲＮａｓｅＥポリペプチドが移動した位置の決定を許容し、従ってこのポリペプチドのサイズの決定を許容する。特に、Ｇ２１９６Ｔ変異により引き起こされるサイズの減少は、これらの試験において即座に可視となる。この実験において得られた熱抵抗性候補の過半数が、所望の変異を保有していた。
【００５７】
ｒｎｅ３１３変異の特定の例
ＢＬ２１（ＤＥ３）染色体へキドらにより単離された（ｒｎｅ１３１のような）自然発生的突然変異を導入し、短縮型ＲＮａｓｅＥの合成をもたらすためにも、前記のプロトコルを使用した。しかし、これらの突然変異は、最初から染色体上に局在しており、それらのプロトコルは単純化された。
【００５８】
ＢＺ３１株（Kido et al.,1996）は、ｒｎｅ３１３突然変異を保持している。Ｐ１バクテリオファージによる形質導入（Silhavy et al.,1984；前記参照）により、４２℃において増殖することが可能な形質転換体を選択することにより、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１のｒｎｅ遺伝子座の周囲にＢＺ３１染色体の領域を転位させた。次に、前記の「ウェスタン」技術を使用することにより、これらのクローンが短縮型ＲＮａｓｅＥポリペプチドを十分に合成することを確認した。試験された候補全て（６／６又は１００％）が、所望の修飾を獲得した。付随的に、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１を構築するための実験を考慮して予想されるように、熱抵抗性形質転換体の５０％が、野生型ｚｃｅ−７２６遺伝子座も獲得し、従って再びテトラサイクリンに対して感受性（ＴｅｔS）となった。続いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１と呼ばれるＴｅｔS候補を選択した。
【００５９】
３）Ｔ７プロモーターにより調節される効率的な遺伝子発現のための、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅＧ２１９６Ｔ株又はＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１株の利用
原理。ｒｎｅＧ２１９６Ｔ突然変異又はｒｎｅ１３１突然変異は、ｍ−ＲＮＡの約２倍の全体的な安定化を引き起こす。しかし、この安定化は、ｍ−ＲＮＡの全てに均一ではない。特に、間違いなくＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（この酵素はメッセージを翻訳するリボソームの速度よりもはるかに高速な伸長速度を有する；前記参照）の特定の特性のため、この酵素により合成されるｍ−ＲＮＡは細胞ｍ−ＲＮＡの大部分と同程度に有利に安定化されていると考えられる。従って、ｒｎｅＧ２１９６Ｔ又はｒｎｅ１３１のような突然変異が細胞内に存在する場合、これらの特定のｍ−ＲＮＡの産物により構成される全タンパク質の割合は、増加することになる。この観察は、本発明の基礎である。いくつかの例を以下に挙げる。
【００６０】
発明の定量的評価；ｌａｃＺ遺伝子をモデル系として。数年前、本発明者らは、染色体のｍａｌＡ領域に挿入された１コピーのｌａｃＺ遺伝子を含む、ＥＮＳ１３４と呼ばれるＢＬ２１（ＤＥ３）誘導体の構築を記載した（Iost & Dreyfus,1995;Lopez et al.,1994）。発現を定量することが特に容易であるＥ．ｃｏｌｉ酵素β−ガラクトシダーゼ（Miller,1972）をコードするこの遺伝子は、Ｔ７プロモーターの調節下に置かれている。その後には、発現が転写レベルの便利な尺度を提供するＥ．ｃｏｌｉの特定のｔ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡArgSをコードする遺伝子が続いている（Lopez et al.,1994）。このよく解明された系は、Ｔ７ポリメラーゼにより合成された特定のｍ−ＲＮＡの安定性、及び対応するポリペプチドの収量の、特に再現可能な測定を許容する。その試験により、前記のＢＬ２１（ＤＥ３）の場合と同様に、ｒｎｅ１３１突然変異をＥＮＳ１３４に導入した。本発明者らは、突然変異を保持するＥＮＳ１３４細胞又はその誘導体を３７℃で増殖させた。培養培地に関して、本発明者らは、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド；これはＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＴ７ポリメラーゼの合成にとって存在することが必要な誘導剤である；Studier and Moffat,1986）の存在下で、リッチ合成培地又は最小培地（Neidhart et al.,1974）を使用した。対数増殖期に細胞を収集し、次いで超音波処理により溶解し、酵素活性を測定するか、又はレムリによる電気泳動によりβ−ガラクトシダーゼ・ポリペプチドの量を調査することにより、細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼを決定した。突然変異の存在は、遺伝子の転写レベルに影響を与えることなく、リッチ培地においては約２５倍、又は酢酸塩細胞培地においては８０倍、β−ガラクトシダーゼの発現を増強することが観察された。モデル系を用いて得られたこの結果は、本発明の可能性を例示している。
【００６１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクローニングされた真核生物遺伝子の発現。Ｔ７ポリメラーゼの特性に基づく発現系において、発現すべき遺伝子、一般的には真核生物遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける翻訳を許容するＴ７プロモーター及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の下流に融合させた。構築物を、ｐＥＴと呼ばれるｐＢＲ３２２に由来する多コピー・プラスミドへ挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）株又はその誘導体のうちの一つへ置いた（Dubendorff & Studier,1991;Studier & Moffat,1986;Studier et al.,1990）。前記のように、発現すべき遺伝子、「標的」遺伝子の発現を、Ｔ７ポリメラーゼの合成を引き起こす、培養培地へのＩＰＴＧ誘導剤の添加により開始させた。しかし、Ｔ７プロモーターからの遺伝子の転写は、あまりに活性が高く、多コピー・プラスミド上にこのプロモーターが存在する場合には細胞が死滅するため、前記のモデル系とは対照的に、この場合のＩＰＴＧによる誘導は一時的に過ぎなかった。
【００６２】
ある一定数の真核生物遺伝子、即ちマウスの早熟の発生に関与しているＫｒｏｘ−２０遺伝子（Vesque & Charnay,1992）、ニワトリ胚の形態形成に関与しているｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２遺伝子（Logan et al.,1992）、及びヒト・レトロウイルスであるＨＴＬＶ１のプロテアーゼをコードする遺伝子（Malik et al.,1988）を含むｐＥＴプラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１又はＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅＧ２１９６Ｔへ導入した。細胞をＯＤ６００が約０．５になるまで増殖させ、次いでＩＰＴＧを添加した。４時間後に細胞を収集した。このようにして、前記のような電気泳動により分析される細胞抽出物が得られた。３つの例において、「標的」遺伝子の産物の検出を、「ウェスタン」技術により実施した（Ｋｒｏｘ−２０及びｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２に対して作製されたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、それぞれ、記載されている：（Patel et al.,1989;Vesque and Charnay,1992））。宿主がＢＬ２１（ＤＥ３）ではなくＢＬ２１（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１である場合、「標的」遺伝子の産物は、３倍から１０倍多量であることが観察できた。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
【表２】
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【００６５】
【表３】
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【００６６】
【表４】
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【００６７】
【表５】
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【配列表】
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