(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノプロテインＰのＣ末端側１０３アミノ酸残基からなる配列（配列番号３）、式（Ｉ）：
Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu（配列番号１）又は式（II）：
Thr Gly Ser Ala Ile Thr Xaa Gln Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gln Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn Ile（配列番号２）
（式中、Xaaはセレノシステインを表す）で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列のうち１ のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、細胞死抑制活性を有するペプチド断片。
【請求項２】
血漿蛋白質に由来する請求項１に記載のペプチド断片。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の細胞死抑制活性を有するペプチド断片 を主要構成成分とする、細胞培養用添加剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は、新たな機能を有する蛋白質に関する。詳細には、本願発明は、細胞死抑制活性を有するペプチド断片又はペプチド断片群及びその精製方法並びに前記ペプチド断片又はペプチド断片群に対する抗体に関する。さらに詳細には、本願発明は、各種疾患例えば細胞死に関連した疾病に対する病態悪化阻止、予防又は治療剤及び細胞培養における細胞死を抑制することによる有用物質生産を可能にする添加物となりうるペプチド断片又はペプチド断片群並びに前記ペプチド断片又はペプチド断片群に対する抗体に関する。
背景技術
細胞死は、高等生物の神経系、内分泌系、免疫系における基本的な制御に重要な働きをしているばかりでなく、多くの疾病に深く関わっていることが指摘されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｃ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２６７，ｐ．１４５６−１４６２（１９９５））。例えば、全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患、神経細胞死による神経変性疾患、臓器移植に伴う臓器移植傷害等、これらはアポトーシスが関与する細胞死の影響による疾患として捉えることができる。
ところで、細胞死を引き起こす要因には外的要因と内的要因がある。外的要因としては、細胞死を促進するものとして実体的に物質として捉えられているものは、免疫系に関与するＴＮＦ（Ｚｈｅｎｇ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３７７，ｐ．３４８−３５１（１９９５））、Ｆａｓリガンド（Ｓｕｄａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７５，ｐ．１１６９−１１７８（１９９３））、グルココルチコイド（Ｗｙｌｌｉｅ  Ａ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２８４，ｐ．５５５−５５６（１９８０））等があり主としてこれらに起因するもの、他にも細胞増殖に必要なエリスロポエチン、インターロイキン、神経成長因子等の増殖因子や栄養因子の欠乏によるもの等があり、生理的条件の変化によってアポトーシスによる細胞死が惹起される。さらに、放射線、温度、制癌剤、カルシウムイオノフォア、活性酸素等による非生理的なストレスが情報となってアポトーシスが誘導される場合がある。他にも、火傷、毒物、虚血、補体攻撃、溶解性ウイルス感染、過剰な薬物投与や放射線投与によりネクローシスが生じる。
内的要因としては、細胞内Ｃａ２＋濃度、核酸代謝、アミノ酸代謝、エネルギー代謝等の代謝系の変化などがあり、これら要因により細胞を死に至らしめる。これらのアポトーシスシグナルをコントロールすることができれば各種疾患の病態悪化阻止、予防又は治療に利用可能なはずであるが、機序が単純ではないため現在確認されている物質・要因の制御だけでは医療への応用は実現困難な状況にある。
一方、現在までに確認されている細胞死を抑制する物質としては、ほとんどのアポトーシスシグナルを抑制するとされている細胞内因子であるｂｃｌ−２やｂｃｌ−ｘ等が知られているが（Ｂｏｉｓｅ  Ｌ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７４，ｐ．５９７−６０８（１９９３））、これらは細胞内に発現される必要があり細胞外に添加してもほとんど意味をなさない。それに対して、細胞外の因子としては、活性酸素によるアポトーシスを抑制するスーパーオキサイドディスムターゼ（以下、ＳＯＤと称することがある）（Ｇｒｅｅｎｌｕｎｄ  Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．１４，ｐ．３０３−３１５（１９９５））、カタラーゼ（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｂｕｔｔｋｅ  Ｔ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐ．４７０８−４７１２（１９９３））、グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｋａｙａｎｏｋｉ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｖｏｌ．１１９，ｐ．８１７−８２２（１９９６））等が報告されているが、これらだけで全ての細胞死を効果的に抑制することはできない。
細胞を培養する際、主として培養細胞自身由来もしくは添加物由来の物質による細胞に対するストレスが原因で細胞死が誘導されるが、同じ条件で全ての細胞に対する細胞死が誘導されるわけではない。通常、そのような環境に適応する細胞には、ストレスによる細胞死誘導シグナルを閾値以下に保つために必要な蛋白質が、細胞内外にすでに発現されているか、新たに誘導されている筈である。それらの蛋白質としては転写因子、合成酵素、代謝酵素、酸化還元酵素、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、転移酵素、アポトーシス抑制蛋白等が考えられる。つまり、個々の細胞でストレスに対する感受性に差が生じるのは、それらの蛋白質の発現量に差があるためであると予想される。そこで、細胞死の機序がそれぞれ異なるにせよ、あるストレスによる細胞死に対して抑制する因子を外から添加することにより、その細胞死誘導のシグナルを閾値以下に保つことが可能であれば、培養細胞の場合だけではなく、生体内でも同様のストレスが生じた場合に起こる細胞死を抑制することが可能と考えられる。
また、細胞死と疾患には密接な関係が存在しているため、生体内の細胞死抑制効果を示す物質を数多く同定することにより多くの細胞死をコントロールすることができれば、疾患の治療等、医療への応用が実現できるばかりでなく、同様に、培養細胞の効果的培養系への応用も可能となる。実際、前述のように細胞内の細胞死抑制因子としてｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘ等が、細胞外の細胞死を抑制する因子としては活性酸素によるアポトーシスを抑制するＳＯＤ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等が存在するが、これらの因子を細胞外に添加することにより全ての細胞死が抑制されることは難しい。それは、その作用機序の差異により、細胞死の発生過程が異なるためである。そのことを考慮すれば、種々の細胞死に対して、有意に、そしてより特異的に細胞死を抑制する活性を同定する必要がある。つまり、既知の物質により抑制を受けない細胞死に対しては、細胞死を有意に抑制する物質を探索することが必要とされている。また、生体内の細胞死抑制物質は生体の恒常性を保つ働きを有する物質として存在している可能性は高く、それらを同定する意味は大きい。
細胞の無血清培養時もしくは特殊な条件下での培養時には、培養時のストレスにより起こるアポトーシスが度々観察される。このような細胞死が誘導される条件で細胞培養を実施し、その細胞死を抑制する活性を指標に各種クロマトグラフィー手法を用いて血液中の有効成分を精製すれば、細胞死を抑制する蛋白質成分を調製することができる。
発明の開示
種々の検討の結果、セレノプロテインＰのＣ末端側１０３アミノ酸残基からなる配列又は当該アミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列又は前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列を有する、ペプチド断片又は前記ペプチド断片を起源とする一連のペプチド断片群が、優れた細胞死抑制活性を有することが判明した。なお、本願発明でいうペプチド断片群とは、糖鎖の有無、荷電の相違、断片化の多様性等に起因する微細構造の異なるペプチド断片の集合体を意味する。
本願発明による特に好ましいペプチド断片群は、式（Ｉ）：
Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ（配列番号１）及び／又は式
（ＩＩ）：
Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ（配列番号２）
（式中、Ｘａａはセレノシステインを表す）で表されるアミノ酸配列もしくは当該アミノ酸配列の部分配列を有するものである。
また、その精製過程における知見により、当該ペプチド断片又はペプチド断片群は（ａ）分子量分画膜に基づき１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量画分に回収され、（ｂ）イオン交換樹脂への結合性の検討の結果、血中でｐＨ７からｐＨ８の間に等電点を示す構造とｐＨ８以上に等電点を示す構造を有し、（ｃ）非還元系ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量１３〜１４ｋＤａの２本のバンド及びそれらに糖鎖の付加された１６〜１７ｋＤａの２本のバンドを示し、また（ｄ）還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、前記バンドに加えて３〜４ｋＤａ、７〜９ｋＤａ及び１０〜１２ｋＤａのバンドを呈する性状を有すること、さらに断片化された前記ペプチドにも活性が存在することが明らかになった。
発明を実施するための最良の形態
細胞死抑制活性を有する因子をスクリーニングするためには、細胞死を誘導する培養系を構築する必要がある。本願発明では、好適な一例としてアルブミン添加無血清培地を用いたヒト巨核芽球系のＤａｍｉ細胞の培養系をスクリーニング方法として用いた。Ｄａｍｉ細胞はＲＰＭＩ  １６４０、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２の１：２：２混合培地（０．１％ＢＳＡ及び０．０５μＭ２−メルカプトエタノール含）により継代可能であるが、アルブミン不含培地では殆ど増殖しない。このとき、培地中に０．０１から０．５％のヒト血清アルブミンが存在する条件下においては細胞は正常に増殖するが、４日目以降に全ての細胞が徐々にではなく突然死する。この培養系に活性画分の希釈試料を添加することにより細胞死抑制活性の大小を比較することが可能である。
アッセイにはＤａｍｉ細胞の利用が最も効果的であるが、特にこの細胞に限定されるものではなく、同様の条件で細胞死が生じるものであればどのような細胞を用いても細胞死抑制活性をスクリーニングすることは可能である。他にも適用可能な細胞としては、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ４等の細胞が例示される。また、このアッセイ系に用いるアルブミンは細胞死を観察できるアルブミンならどのようなアルブミンでもよいが、例えばＳＩＧＭＡ社製のヒト血清アルブミンＦ−Ｖは好ましい態様の一つである。
上述のアッセイ系に基づいて、体内成分とりわけ血液由来の成分に着眼し、鋭意活性探索を検討した結果、本願発明者らはヒトを初めとする哺乳動物の血漿又は血清中に所望の活性を見出すに至った。検出された細胞死抑制活性画分は、ヒト血漿及び血清を原料とした場合では１６００〜３２００倍希釈まで細胞死抑制活性を示し、牛胎児血清を原料とした場合では１００倍希釈以下の活性を示した。本明細書では、細胞死抑制活性を定量化する際、希釈倍率１００以下を０、それ以上の希釈倍率の値をそのまま活性値として表す。
本願発明により提供される活性物質であるペプチド断片群は、一般的な酵素類よりも熱、変性剤、幅広いｐＨ、血中のプロテアーゼに対して安定であるため、広範な精製法を適用することが可能である。すなわち、種々のクロマトグラフィー工程、例えば、ヘパリンクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等、適用可能な種々の担体を用いた分画方法の他、硫酸アンモニウム沈殿分画、分子量膜分画、等電点分画、電気泳動分画等、種々の分画法が利用可能である。これらの分画法を適宜組み合わせることにより、所望の細胞死抑制活性を分画することが可能である。その望ましい組み合わせの一例を実施例２に示す。態様の概略は、操作順に従って、ヘパリンクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿分画、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーである。
この組み合わせにより、得られる活性画分は純度的に推定夾雑物５％以下、例えばヒト血漿を出発原料とした場合、２×１０５／１ｍｇ蛋白質／ｍｌの活性を示す状態で精製することが可能である。出発原料の血漿の活性が約２０〜４０／１ｍｇ蛋白質／ｍｌ程度であるので、比活性で推定５，０００〜１０，０００倍程度上昇する。
上述のごとく精製同定された本願発明の血漿中の細胞死抑制活性成分は、下記の性質によって特徴づけられる物質である。
ヘパリン結合性
ヘパリンカラムへの結合性を調べると、細胞死抑制活性成分は弱いヘパリン結合性を示す。この知見により、本願発明の細胞死抑制活性成分は相対的に正電荷を帯びている物質であり、血球、血管内皮等血中においてストレスに曝されやすい細胞表面のヘパラン硫酸と結合することにより細胞表面の保護に関与する物質であることが予想される。
分子量分画膜による活性の挙動
血漿中のヘパリン結合画分について、分画分子量１０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａの膜により抑制活性を濃縮すると、分画分子量１０ｋＤａで９０〜９５％、３０ｋＤａで１０〜２０％、５０ｋＤａで０〜１０％の活性が回収される。このことより、本願発明の細胞死抑制活性成分は、他のヘパリン結合蛋白が存在する条件下において、その８０〜９０％は１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量を示すが、一部にはそれ以上の分子量を示すこともあることから、修飾、重合、プロセシングの差に起因する分子量の異なる活性物質が一部存在することも示唆される。
硫酸アンモニウム分画
粗分画の試料は２Ｍ程度で全ての活性が沈殿する。ただし、厳密には、全ての活性を沈殿させるためには３Ｍ程度の硫酸アンモニウムを添加する必要がある。本願発明の活性成分は、塩析操作により他の蛋白質と共沈することもあるが比較的塩析されにくい性質を示す。
イオン交換樹脂への結合性
２０ｍＭ程度の適当な緩衝液を用いた場合、ｐＨ８．０以上で陰イオン交換体へ一部結合性を示すが、全ての活性が完全に結合することはない。また、ｐＨ７．０以下で陽イオン交換体への結合性を示す。このことから、本願発明の活性成分は血中でｐＨ７からｐＨ８の間に等電点を示す構造と、ｐＨ８以上に等電点を示す構造を有する物質であることが推察される。
疎水クロマトグラフィーによる分画
Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−ｂｕｔｙｌ  ＨＩＣ担体を用いた場合、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２Ｍ硫酸アンモニウム存在下での活性画分の吸着はほとんど観察されない。１．５Ｍまで硫酸アンモニウム濃度を高めると３〜５割が吸着され、さらに２〜２．４Ｍまで硫酸アンモニウム濃度を高めるとほとんど全ての活性を吸着させることができる。異なる担体を用いた場合も、同様の条件により本願発明の活性成分を効果的に精製することが可能である。
ゲル濾過による分画
ヘパリン結合画分についてゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画した場合、分子量が３０ｋＤａ〜４０ｋＤａのサイズに殆どの活性が回収されるが、実際に得られる本願発明の活性物質は電気泳動で明らかに３０ｋＤａ以下の分子量を示すことから、他の分子と結合しやすい可能性のある物質と予想される。
ＰＡＧＥ（ポリアクリドアミドゲル電気泳動）
本願発明の活性物質を未変性ＰＡＧＥにより分画すると活性が単一のバンドに収束しないことから、活性物質は単一の構造ではなく、２量体の形成、荷電の違い、糖鎖の付加又は本願発明の活性物質を構成するペプチド断片の断片化の形態の相違等により多様な分子量の状態で存在していることが示唆される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、非還元状態での電気泳動において、分子量約１３〜１４ｋＤａの２本のバンド及びそれらに糖鎖の付加された約１６〜１７ｋＤａの２本のバンドを示すペプチドにより構成されていることを確認することができる。また、還元条件では、それらに加えて約３〜４ｋＤａ、約７〜９ｋＤａ及び約１０〜１２ｋＤａのバンドが出現することから、内部にＳ−Ｓ結合を持つ約１３〜１４ｋＤａ及び約１６〜１７ｋＤａのバンドに相当するペプチドの一部に内部切断が生じているものが存在し、還元によりＳ−Ｓ結合が切断され、前述の新たなサイズのペプチドが出現することを示している。このことは、約３〜４ｋＤａのペプチド断片に対する抗体が約７〜９ｋＤａ及び約１０〜１２ｋＤａのペプチド断片以外の全てのペプチド断片と反応することからも支持される。また、還元状態で得られる約３〜４ｋＤａのペプチド自体にも細胞死抑制活性が存在することより、このペプチド部位が最も活性に関係する領域である可能性は高い。
Ｎ末端アミノ酸配列分析
上記ＰＡＧＥで確認されたペプチド断片は、ヒトセレノプロテインＰのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列中のＣ末端側１０３アミノ酸残基部分と高い相同性を示す物質であることが明らかになった。
Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、本願発明の細胞死抑制活性を有するペプチド断片又は当該ペプチド断片と起源を同じくするペプチド断片群は、▲１▼ヒト・セレノプロテインＰの２６０位のＬｙｓより始まる、Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ（配列番号１）の配列、及び▲２▼ヒトセレノプロテインＰの２９３位のトレオニンより始まるＴｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｇｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ（配列番号２）（Ｘａａはセレノシステインである）の配列を含むペプチドを基本ユニットとしていることが判明した。本願発明の活性物質は、構成ユニットとしての前記ペプチド断片の結合体又は複合体として存在し細胞死抑制活性を発揮する。一方、構成ユニットの各々にも活性が認められる。さらに、糖鎖の付加の相違、荷電の違い、また断片化の形態の相違、とりわけペプチド断片のＣ末端側の多様性等により多様な分子種が混在しており、混在状態においても本願発明の細胞死抑制活性を呈する。従って、本願発明の活性物質には、細胞死抑制活性を呈する限りにおいて、活性を有する個々のペプチド断片及びその部分断片のみならず、多様なペプチド断片の集合体、即ちペプチド断片群が包含される。
ところで、これまでセレノプロテインＰには本願発明で特徴づけられるサイズを有するプロセスされたフォームが存在するという報告はなされておらず、ましてこの部位のみで活性を持つことを示唆する報告もなされていない。
セレノプロテインＰは１９７７年にグルタチオンペロキシダーゼ（ｇｕｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）とは異なるセレン含有タンパク質として確認され、１９８２年にセレンがセレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）の形態で取り込まれていることが明らかにされた。さらに、１９９１年にセレノプロテインＰのｃＤＮＡのクローニングにより全長のアミノ酸配列が明らかにされ、その結果、当該蛋白質は最大１０個のセレノシステインを含む可能性等が示された（Ｈｉｌｌ  Ｋ．Ｅ．及びＢｕｒｋ  Ｒ．Ｆ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．，１０，ｐ．１９８−２０８（１９９７））。しかし、実際には、組換え蛋白の発現や、精製セレノプロテインＰにおける本願発明中の活性ペプチド断片又は活性ペプチド断片群に相当するアミノ酸配列の同定等はなされておらず、活性部位の同定もなされていない。また、抗セレノプロテインＰ抗体を用いてヒトセレノプロテインＰを精製したという報告もあるが、用いられた抗体がセレノプロテインＰのＮ末端側を認識する抗体に相当するため、今回得られたペプチド断片のみの精製も不可能である。よって、本願発明で特徴づけられる活性ペプチド断片又は活性ペプチド断片群についての活性評価を行なったのは、本願が最初である。
セレノプロテインＰの活性としては、セレンに由来する抗酸化活性、グルタチオンペルオキシダーゼ活性が報告されているが、現在までに、本願発明により得られたペプチド断片又はペプチド断片群が生体に存在し優れた活性を示すという報告はなく、当然、本願発明中に特徴づけられる活性の存在も報告されていない。
その他の蛋白との活性比較
本願発明の細胞死抑制活性を示すペプチド断片又はペプチド断片群以外のセレノ蛋白及び抗酸化関連蛋白について、Ｄａｍｉ細胞の細胞死抑制活性の有無を相対比較すると、グルタチオンペルオキシダーゼ、ＳＯＤには若干の活性が観察される。しかし、本願発明の細胞死抑制活性を示すペプチド断片又はペプチド断片群と比較した場合、これらは１／１００以下の活性しか示さず、この活性は殆ど無いに等しい値である。また、本願発明の活性物質に関連性の高い完全長のセレノプロテインＰとの比較では、断片化された本願発明の活性物質の細胞死抑制活性に関する顕著な優位性が認められ、「断片化」の意義の重要性が如実に示される。つまり、本願発明の活性物質は、本願発明により特徴づけられる明らかな細胞死抑制活性を示す蛋白質としては知り得る限り唯一の血中成分であり、この存在を明らかにしたことに大きな意義が存在する。
なお、上述の知見に基づき本願発明により得られたペプチド断片をリード物質として、化学合成物をデザインすることも可能である。
前述の本願発明の細胞死抑制活性を示すペプチド断片を免疫原として用いることにより、このような新規なペプチドを認識し結合する抗体を得ることができる。本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群を含むものであれば免疫原としての能力を有するが、実施例２で調製した画分を使用するのが望ましい。また、ペプチド合成機を用いる方法あるいは遺伝子組換え技術により大腸菌、酵母等の微生物に産生させる方法等を用いて、本願発明のペプチド断片、又はその一部に相当するペプチドを得、免疫原とすることもできる。さらに、本願発明のペプチド断片もしくはその一部をコードする遺伝子を組み込んだ動物細胞用の発現プラスミドもＤＮＡワクチンとしての免疫原として使用可能である。
そのようなペプチド断片の望ましいアミノ酸配列として、Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｘａａ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ａｒｇ  Ｘａａ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｇｌｕ  Ｘａａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ（Ｘａａはセレノシステインである）（配列番号３）あるいはＬｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ（配列番号４）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
免疫する哺乳動物は限定されるものではないが、抗血清を得る場合にはウサギ等が望ましく、後に述べるモノクローン抗体を細胞融合等で得る場合にはマウスが望ましい。動物の週齢は、例えばマウスでは５〜１０週齢がよい。性は雌雄どちらでもよい。免疫用抗原は、例えば適当なアジュバントに懸濁させるか、又は生理食塩水等に溶解して、動物の腹腔内、皮下、静脈内等に投与するのが好ましい。この免疫操作を２〜３週間隔で１〜５回行なう。最終免疫は、例えば免疫用抗原を生理食塩水に懸濁させ、動物の静脈内に投与する。このような免疫動物から採血し抗血清を調製するか、あるいは脾臓細胞を調製し、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．とＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃの方法（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ．４９５（１９７５））に基づいて、抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。例えばマウスの場合、免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合してハイブリドーマを得る。
ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、一般的には、ＲＰＭＩ  １６４０培地又はＥａｇｌｅのＭＥＭ培地に、牛胎児血清（５〜１０％）、Ｌ−グルタミン（３．５〜４．０ｇ／ｌ）及び抗生物質（ペニシリンＧやストレプトマイシン等）を添加したものが用いられる。また、ＡＳＦ１０４（味の素社製）、ＣＭ−Ｂ（三光純薬）等の無血清培地を用いることもできる。得られたハイブリドーマの中から、本願発明ペプチドに特異的なモノクローン抗体を産生するもののみをスクリーニングする。スクリーニングは、例えば、ハイブリドーマの培養上清を一部採取し、それが本願発明ペプチド断片又はその一部分に相当するペプチドと反応するかどうかを、ＥＩＡ法あるいはＲＩＡ法、ウエスタンブロット法等の公知の方法で調べることが可能である。この方法は免疫動物の抗体の力価が上昇しているかどうかを知る方法としても使用できる。
産業上の利用可能性
一般的に、何らかのストレス（例えば、止血状態、炎症の発生、臓器障害、細胞の損傷、血管の損傷、細菌感染、ウイルス感染など）が生じると遊離の脂肪酸量が３倍以上も増加し細胞毒性が出現すると報告されている（「脂質の化学」、ｐ．１７０−１７９、中村治雄編  朝倉書店（１９９０年）；「脳卒中実験ハンドブック」、ｐ．４３７−４７１、佐野圭司監修  アイピーシー（１９９０年））。この知見からも、ストレス状態が維持される環境では、種々の細胞の感受性の差があるにせよ、脂肪酸による細胞への悪影響が出現すると予想される。つまり、手術時のストレス（出血、止血、虚血）、疾患や臓器移植などに伴う虚血後の再灌流のストレス、持続的な炎症によるストレスなどに対して、本願発明のセレノプロテインＰに由来する活性ペプチド断片又はペプチド断片群が細胞の抗酸化能を上げることにより細胞への悪影響を低減させ、病態悪化を防ぐことができる。また、同様の機序で細胞内の酸化ストレスを上昇させる現象に対して、当該活性ペプチド断片又はペプチド断片群は細胞内の抗酸化能を上昇させることにより細胞を安定化する働きが期待できる。
本願発明中の活性ペプチド断片又はペプチド断片群は生体内においてプロセスされた活性フォームとして血中で機能しており、ストレス由来により起きる細胞死を防御し、細胞の安定維持に働いていると予想される。つまり、過剰のストレスを防御しきれない場合などには細胞死が生じるはずであるから、このような時、本願発明の活性ペプチド断片又はペプチド断片群を外部から補給することが可能であれば、重篤な疾患への移行を未然に防ぐことも可能であるし、治療につなげることができる。本願発明の活性ペプチド断片又は活性ペプチド断片群が予防ないし治療可能な疾患として、具体的には、酸化ストレスに起因して影響を受ける疾患、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、パーキンソン病、アルツハイマー病等が挙げられる。また、動脈硬化の原因因子として酸化ＬＤＬが関与していることから、動脈硬化の病態悪化の阻止、治療、予防等への使用も考えられる。あるいは心筋梗塞、脳梗塞や臓器移植等再灌流傷害が観察される疾病にも有効である。
とりわけＡＩＤＳに対しては、セレン蛋白とＡＩＤＳやＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）との間に密接な関連があることが、近年、報告されている。すなわち、ＨＩＶ感染に伴って血清中のセレン濃度が低下し、その際、セレン濃度の低下とＣＤ４細胞数の低下やｍｏｒｔａｌｉｔｙとに相関があるとの報告がある（Ｏｌｍｓｔｅｄ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，ｐ．５９−６５，１９８９；Ａｌｌａｒｄ  Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．１４３−１４７，１９９８）。また、ＨＩＶの核酸配列にはフレームシフトさせるとセレン蛋白を合成できる配列が存在しており、実際、ＨＩＶを感染させたＴリンパ球腫は、本来合成すべきセレン蛋白（グルタチオンペルオキシダーゼなどの抗酸化酵素）を合成できなくなることが報告されている（Ｔａｙｌｏｒ  Ｅ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５６，ｐ．６３−９１，１９９７；Ｇｌａｄｙｓｈｅｖ  Ｖ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９６，ｐ．８３５−８３９，１９９９）。さらに、ＡＩＤＳにおけるＴリンパ球の細胞死における酸化ストレスの関与が示唆されている（Ｒｏｍｅｒｏ−Ａｌｖｉｒａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，ｖｏｌ．５１，ｐ．１６９−１７３，１９９８）。
実際、セレン定量の結果、ＡＩＤＳ患者は血中セレン濃度が正常人と比較して半分程度しか存在していないことがわかっている。この際にＡＩＤＳ患者の血中セレノプロテインＰ濃度も正常人と比較して異なる可能性があるため、ＥＩＡの測定系を用いてＡＩＤＳ患者の血漿中のセレノプロテインＰ量を測定したところ、早く病態が悪化した患者より病態の進行の遅い患者及び発症しない患者の方がセレノプロテインＰの量が多い傾向のあることが観察された。また、ＡＩＤＳ患者と健常人血漿中のセレノプロテインＰの状態を比較するために抗セレノプロテインＰ抗体固定化担体を用いた免疫沈降を試みたところ、患者の病態の進行の遅いグループ及び発症しないグループは健常人と類似のパターンを示したのに対し、早く病態の悪化した患者のグループは健常人と明らかに異なるパターンを示す傾向にあることを確認した。これらの結果より、セレノプロテインＰはＡＩＤＳの症状改善、発症予防に有用である可能性が示唆された。
このように、血中セレン濃度、とりわけセレノプロテインＰ濃度とＡＩＤＳとの関連が示唆されているが、セレノプロテインＰの特定の配列を有するＣ末端側部分断片がセレノプロテインＰ自体と比較して有意に高い細胞死抑制活性を有し、それゆえＡＩＤＳの予防・治療に有用であることについては、これまで全く知られていなかった。
その他にも、Ｂ細胞及びＴ細胞系の培養においても、この活性ペプチド断片又はペプチド断片群が有効に働いていることは明らかであるから、免疫細胞系の安定化、制御等を行なうことによる、免疫促進、制御薬等への応用も可能である。また、培養細胞においても過剰のストレス由来の細胞死を防ぐことにより、有用な生体物質を産生させる場合などにおける培養条件の効率化などに利用可能である。
本願発明のペプチド断片又はその一部からなるペプチド並びに当該ペプチド断片との結合能を有する抗体は、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法等の抗原検出系に利用することができ、診断薬を構築する材料となる。また、上記の抗体を適当な担体に結合させ、これを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、本願発明の活性を有するペプチド断片を精製することができる。さらに、Ｂ細胞及びＴ細胞系の培養においてもこの活性ペプチド断片が有効に働いていることは明らかであり、加えて本願発明の活性ペプチド断片の免疫時の知見による、免疫原としての活性ペプチド断片に対する抗体がＢ細胞に影響を与えている、との示唆を勘案すれば、免疫細胞系の安定化、制御等を行なうことによる、本願発明の抗体の免疫促進、制御薬等への応用も可能である。
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製の試薬を使用した。
実施例１
（アッセイ法）
０．０５μＭ  ２ＭＥ及び０．１％ＢＳＡを含有する無血清培地ＳＦＯ３（三光純薬社製）で継代可能なＤａｍｉ細胞（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｄ  ｖｏｌ．７２，ｐ．１９６８−１９７７（１９８８）に記載：１×１０６細胞／ｄｉｓｈ／３ｍｌ）１ｍｌにＲＰＭＩ１６４０／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１：２：２混合培地（ＳＡ培地）を２ｍｌ添加後、３日間培養し、アッセイ時に当該細胞を回収した。細胞を５０％ＰＢＳ／ＳＡ／０．０３％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）により２回洗浄し、同培地で３×１０４細胞／ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ウェルのみ２００μｌ、段階希釈のためのウェルには１００μｌずつを９６ｗｅｌｌプレートに分注した。サンプル添加ウェルにアッセイ試料を２μｌ添加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウェルに対して段階希釈した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し判定した。
アッセイの評価法としては培養４日目以降、活性のないｗｅｌｌの細胞は死滅し活性のあるｗｅｌｌの細胞は生存し続けることから、生細胞が被検試料の何倍希釈まで存在するかで評価した。
実施例２
（細胞死抑制活性成分の精製）
以下の精製工程における活性の追跡は、すべて実施例１に記載のアッセイ法に拠った。
血漿中の細胞死抑制活性はヘパリン結合性を示す。そこで、先ず、血漿中のヘパリン結合画分を集めるためにヘパリンカラムを用いた分画を行なった。ヒト血漿を出発原料とし、血漿中のヘパリン結合蛋白をヘパリンカラム（Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に吸着させた後、０．３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウムにより吸着画分を溶出した。目的の細胞死抑制活性の殆どは０．３Ｍ塩化ナトリウム洗浄画分に回収されるが、活性物質の精製には２Ｍ塩化ナトリウム溶出画分を用いた。
ヘパリンに結合した細胞死抑制活性の粗分画を実施するために、硫酸アンモニウム沈殿による分画を行なった。２Ｍ塩化ナトリウムヘパリン溶出画分の総量に対して３１．３％Ｗ／Ｖ（約２Ｍ）の硫酸アンモニウムを添加し、沈澱物を回収した。沈殿物を水に溶解し、分子量３，５００カットの透析膜を用いて水に対して透析した。透析の完了した溶液を回収後、その総量に対して１／５０量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、さらに、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてＯＤ２８０の値で２０〜３０になるように溶液濃度を調整した。この溶液から不溶物質を除去するため、１．０μｍ及び０．４５μｍの濾過フィルターを用いて濾過した。
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）により平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー担体（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ：ＢｉｏＲａｄ社製）に、濾過済みの蛋白溶液を通液し、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。この時、非吸着画分及び５０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分に活性が存在していたため、この画分を回収し混合した。陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性画分に対して、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）と１Ｍクエン酸を６：４の割合で混合した溶液を総量の１／５０量添加し、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ約４．０）となるように蛋白溶液を調製した。
２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）により平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー担体（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ：ＢｉｏＲａｄ社製）に、前述の蛋白溶液を通液し、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。２２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄後、５５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）により溶出される画分に活性が存在したため、この画分を回収した。
得られた５５０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分の総量に対して１Ｍ  Ｔｒｉｓアミノメタン溶液を１／３０量添加し、ｐＨを約７．５に調整した。この溶液に対して３．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を１／５０量添加しｐＨを約７．５に調整）を２／３量添加後、硫酸アンモニウム濃度が１．４Ｍ、塩化ナトリウム濃度が３３０ｍＭになるように塩濃度を調整した。さらに、不溶物質を除去するために、０．４５μｍの濾過フィルターを用いて濾過した。
次に１．４Ｍ硫酸アンモニウム及び３３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水クロマトグラフィー担体（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ：ＢｉｏＲａｄ社製）に前述の濾過済み蛋白溶液を通液し、疎水クロマトグラフィーを実施した。非吸着画分及び平衡化緩衝液（ｐＨ７．５）洗浄画分に活性が存在したため、この画分を回収した。吸着画分には殆ど活性は存在しなかった。活性画分を疎水クロマトグラフィー担体に結合させるために、活性画分に対して硫酸アンモニウム濃度が２．０Ｍになるように上記の約ｐＨ７．５の３．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液を添加した。２．０Ｍ硫酸アンモニウム及び２４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化した疎水クロマトグラフィー担体（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ：ＢｉｏＲａｄ社製）に試料を通液し、活性成分を吸着させた。平衡化緩衝液により洗浄後、吸着している活性を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）により溶出した。回収した活性画分を水に対して１昼夜透析し、この回収した活性画分をヘパリンカラムに確実に吸着させるために、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１／５０量添加し、ｐＨを約５．０に調整した。以上、図１参照のこと。
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）（緩衝液Ａ）及び２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）（緩衝液Ｂ）を調製し、緩衝液Ａで平衡化したヘパリンカラム（Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にｐＨ調整した活性画分を通液した。その後、緩衝液Ｂを緩衝液Ａに対して５％混合した溶液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ）によりカラムの２倍量洗浄した後、さらに、緩衝液Ｂの緩衝液Ａに対して２０％混合した溶液（０．４Ｍ  ＮａＣｌ）により溶出し、活性画分を回収した。ここで得られた活性画分を１５ｍｇ／ｍｌ程度の濃度まで膜濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３：Ａｍｉｃｏｎ社製）により濃縮した。濃縮した活性画分の総量に対して２％の酢酸を添加後、０．４５μｍの濾過フィルターにより不溶物の除去を行なった。
２％酢酸及び５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶液により平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー担体（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に活性画分を１ｍｌ通液し、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施し、活性を分画後、回収した。
０．１％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロパノールを含む１％アセトニトリルにより平衡化したＣ４逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｋｏｓｉｌ  ５Ｃ４−２００  ６ｍｍ×１５０ｍｍ：和光純薬社製）に前述の画分を通液し、平衡化溶媒で洗浄後、０．１％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロパノールを含む条件下で１％から４０％アセトニトリルのリニアグラジエント溶出により得られた活性画分を回収した。ここまでの各精製工程における活性及び比活性の推移を表１にまとめる。
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得られた活性画分をさらに細かく分画するためにイオン交換クロマトグラフィー担体ＭｉｎｉＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）による分画を実施した。２０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ９．１５）の条件下で塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を行なった。分画された画分には全て活性が存在しており、全ての画分が後述の実施例４で得られた抗体と反応した。つまり活性物質はいくつかの構造の異なる状態で存在していることが確認された。
この段階での目的の活性物質は、電気泳動による解析の結果、非還元状態で１０ｋＤａから３０ｋＤａの数本のバンドより構成され、還元状態では３〜４ｋＤａと７〜９ｋＤａにスメアなバンドが１本、１３〜１４ｋＤａに２本、１６〜１７ｋＤａに２本の最低６本のバンドを示した。これらのバンドは全て実施例４に示す抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出可能であった。非還元状態での電気泳動において、２８〜２９ｋＤａ近傍にも抗体に反応する蛋白が確認されることより、２量体を形成しているものも存在している可能性が示唆された。図２参照のこと。
実施例３
（活性成分のＮ末端配列解析）
気相シーケンサーによるアミノ酸配列解析の結果、本願発明の活性画分は、Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ（配列番号１）の配列及びＴｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ（配列番号２）（Ｘａａはセレノシステインである）の配列を含むペプチドより構成されていた。この画分のシークエンス解析時のアミノ酸回収量より予想されるそれぞれの存在比は１：１から２：１の範囲であった。また、この２種のペプチド以外の蛋白由来のアミノ酸の回収は５％以下であった。この２種のペプチドは還元状態でのゲル濾過クロマトグラフィー及びＣ４逆相ＨＰＬＣにより分離されるため、Ｓ−Ｓにより結合しているものが存在することが予想された。
還元状態でのＣ４ＨＰＬＣにより分離されたペプチドの中で３〜４ｋＤａの分子量を示すペプチドはシークエンス解析の結果、Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ（配列番号５）の配列を示し、７〜９ｋＤａが大部分を占める画分は、Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ（配列番号２）の配列を示した。また、１３〜１４ｋＤａ、１６〜１７ｋＤａの画分もＬｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ（配列番号５）の配列を示した。これらの得られたアミノ酸配列は、下記表２に示す公表されているヒト・セレノプロテインＰのｃＤＮＡ配列（Ｈｉｌｌ  Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９０，ｐ．５３７−５４１（１９９３））より推測されるアミノ酸配列のシグナル以降２６０番目のリジンより始まる断片と２９３番目のトレオニンより始まる断片に相当することが推察された。
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実施例４
（活性成分に対する抗体の作製）
実施例２で示された物質が、同一の物質由来のバンドであることを明らかにするために、以下に示すようにポリクローナルペプチド抗体及びモノクローン抗体を作製した。これらの抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果、電気泳動で観られる全てのバンドが同一のモノクローン抗体及びペプチド抗体により認識されることから、均一の構造ではないが全て同一の構造を持つペプチド断片であることを確認した。
▲１▼ペプチド抗体の調製
ペプチド抗体については、還元条件下で活性画分のゲル濾過及びＣ４逆相ＨＰＬＣを実施することにより３〜４ｋＤａのペプチドを分取し、そのアミノ酸配列解析の結果に従って２０アミノ酸を合成し、ウサギに免疫することにより抗体を得た。詳細には、先ず、ＮＨ２−Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ−ＣＯＯＨ（配列番号４）のペプチドをペプチド合成機により合成し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドをグルタルアルデヒド法によりＫＬＨと１：１で結合し、その２００μｇをニュージーランドホワイトウサギ２匹に接種した。初免疫感作は背部皮下経路でフロイント完全アジュバント存在下１回接種し、さらに２週間毎にフロイント不完全アジュバント存在下、背部皮下経路で３回追加免疫を行ない採血した。抗血清のＥＩＡによる免疫原との反応性は、４０，０００倍まで抗体価の上昇がみられた。この抗血清を出発材料としてアガロースに抗原を結合させた担体によるアフィニティー精製を行なった。得られた抗体は抗血清と同様の反応性を示した。
▲２▼モノクローン抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、初免疫感作として腹腔内経路でフロイント完全アジュバント存在下で実施例２に記載の本願発明活性成分の精製画分５０μｇを１回接種した後、２週間毎に腹腔内経路でフロイント不完全アジュバント存在下で２回免疫した。その１週後に静脈内経路で当該精製画分を５０μｇ接種した。最終免疫から３日後に、常法に従いマウスより脾臓細胞を採取した。マウス５匹のうち、抗血清を用いたウエスタンブロットにより免疫原と反応の強かった２匹の脾臓細胞は、通常の細胞数の１／１０と極端に少なく、免疫原に対する抗体がＢ細胞に影響を与えていることが予想された。この得られた細胞をミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５９７：Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．８１，ｐ．１（１９７８））と細胞数１対１〜２の割合で混合し、遠心処理（１，５００ｒｐｍ、５分）して上清を除き、沈殿した細胞塊を充分ほぐした後、予め３７℃に加温しておいた１ｍｌのポリエチレングリコール溶液（４５％ポリエチレングリコール４０００、５５％  ＲＰＭＩ培地）を攪拌しながら加えた。３７℃で５分間インキュベートした後、液の全量が５０ｍｌとなるようにゆっくりとＲＰＭＩ培地を加えた。遠心分離（１，３００ｒｐｍ、７分）後、上清を除去して緩やかに細胞をほぐした。これにエスクロンＣＭ−Ｂ培地（三光純薬社製）５０ｍｌを加え、メスピペットを用いて緩やかに細胞を懸濁した。この細胞懸濁液を４〜５枚の９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに１００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日に、ＨＡＴ培地（エスクロンＣＭ−Ｂ培地にヒポキサンチン１×１０４Ｍ、チミジン１．５×１０−３Ｍ、アミノプテリン４×１０−７Ｍになるよう添加したもの）を各ウェルに１００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養した。ハイブリドーマのコロニーが十分生育したものからＨＴ培地（上記ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）に交換し、培養上清の一部を分取し、以下に述べるスクリーニング法にて目的のハイブリドーマを選別した。
目的のハイブリドーマの選別は下記のＥＩＡ法、ウエスタンブロッティング法を組み合わせて実施した。
（１）ＥＩＡ法
９６穴のマイクロテストプレートに前記のごとく作製した合成ペプチド抗原、もしくは精製抗原（蛋白質濃度２μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／穴で加え、４℃で一晩インキュベートすることにより固相化した。さらに、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液３００μｌを加え、同様にインキュベートしてマスキングを行なった。このようにして作製した抗原固相化プレートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマ及びクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加えて、４℃で１．５時間インキュベート後、ＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液（カッペル社製、５，０００倍希釈）を１００μｌ／穴加えた。４℃で１時間インキュベート後、ＰＢＳにて５回洗浄し、その後ＴＭＢＺ基質溶液を加え、常法により発色させその吸光度を波長４５０ｎｍにて測定した。こうして精製抗原と反応するハイブリドーマクローンを選択した。この方法により、ハイブリドーマ約５００個から陽性コロニーとして１６個を選択した。
（２）ウエスタン・ブロッティング法
ＥＩＡで得られた陽性コロニーについてウエスタンブロッティング法によるスクリーニングを行なった。精製抗原を１７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜上に移行させ、膜を０．４〜０．５ｃｍ幅に切断した。各細片をハイブリドーマ培養上清液に浸し、１時間３７℃でインキュベートした。その後、細片をＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含）で３回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧＯ社製）の１：２０００希釈液中で３７℃、１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いる発色試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で発色させ、精製抗原の発色バンドを示すハイブリドーマを選択しクローニングした。クローニング後のハイブリドーマクローンについても同様の手法で選別した。上記の選別方法によって所望のモノクローン抗体を産生するハイブリドーマが２クローン得られた。
実施例５
（抗セレノプロテインＰ抗体結合担体カラムを用いたセレノプロテインＰ断片の精製）
血漿中のヘパリンセファロース結合画分を２Ｍ硫酸アンモニウムにより沈殿させ、その沈殿画分に対して５倍容量以上の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて沈殿を溶解させた。この溶液に存在するセレノプロテインＰを前記実施例４に記載の抗セレノプロテインＰ抗体を担体に結合させた抗セレノプロテインＰ抗体結合担体カラムに吸着させ、リン酸化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。その後、４Ｍ尿素を含有する２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）によりセレノプロテインＰを溶出し、当該溶出液をさらに２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化した陽イオン交換体（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、ＢｉｏＲａｄ社）に吸着させた。これを、塩化ナトリウムによる塩濃度勾配溶出し、細胞死抑制活性を示すセレノプロテインＰ断片画分を回収した。このとき、全長のセレノプロテインＰを得ることが可能であるが、この物質は蛋白質当たりの細胞死抑制活性は明らかに弱い値を示した。本方法によれば、短時間の精製が可能であるため、蛋白質当たりの細胞死抑制活性の強いセレノプロテインＰ断片を得ることができた。ここで得られた断片もまた、糖鎖の有無、分子間結合の有無、内部切断の有無などにより種々の大きさの分子種を含む混合画分であり、非還元電気泳動で１０〜３０ｋＤａのサイズを示すセレノプロテインＰ断片群であった。図３参照のこと。
実施例６
（ｍｉｎｉＱ活性画分のＮ−グリコシダーゼの処理）
活性画分の糖鎖結合の有無を確認するため、ｍｉｎｉＱにより分画された活性フラクションについてＮ−グリコシダーゼＦによるＮ型糖鎖の切断を行なった。反応は１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で実施した。その結果、明らかに、１６〜１７ｋＤａの２本のペプチドが１３〜１４ｋＤａのサイズにシフトすることを確認した。他のペプチドには大きな変化は観察されなかった。図４参照のこと。
実施例７
（還元カルボキシメチル化）
さらに、詳細な情報を得るために、本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群について還元カルボキシメチル化処理後の逆相Ｃ４ＨＰＬＣによる分離を行ない、得られたペプチドについての電気泳動及びアミノ酸配列解析を実施した。電気泳動の結果、未処理の状態では７〜９ｋＤａと予想される２本のペプチドが還元カルボキシメチル化による影響で１２〜１４ｋＤａに相当する移動距離に変化したＦ３のペプチド断片及び未処理の状態で１０〜１２ｋＤａの分子量を示すと予想されるＦ２の１６〜１８ｋＤａの２本のペプチド断片だけがＬｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ（配列番号４）の配列よりなるペプチド断片を含んでいないことをペプチド抗体との反応性から確認した。
アミノ酸配列解析の結果、Ｆ２及びＦ３の画分に含まれる前記のペプチド断片はＴｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｘａａ  Ｇｌｎ（配列番号７）（Ｘａａはセレノシステイン）の配列を示し、Ｎ−グリカナーゼ処理によりＦ２の１６〜１８ｋＤａのバンドがＦ３のバンドにシフトしていることより、Ｆ２がＦ３のフラグメントに糖鎖が付加したものであることを確認した。また、Ｎ−グリカナーゼ処理により分子量がシフトするペプチドの存在する画分を含めペプチド抗体で反応が観られる画分は全てＬｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ（配列番号５）の配列を示した。
実施例３の結果及び上述の結果を勘案すれば、活性物質の▲１▼３〜４ｋＤａ、▲２▼７〜９ｋＤａ、▲３▼１０〜１２ｋＤａ、▲４▼１３〜１４ｋＤａ、▲５▼１６〜１７ｋＤａのバンドに相当する各ペプチド断片の中で、▲１▼、▲４▼及び▲５▼は２６０番目のリジンより始まる断片、▲２▼及び▲３▼は２９３番目のトレオニンより始まる断片であることが理解される。また、非還元条件では▲１▼、▲２▼及び▲３▼のペプチド断片は得られないことから、これらのペプチド断片は、元来Ｓ−Ｓにより結合しているユニット構造を有する▲４▼又は▲５▼のペプチド断片が内部切断されて生じたものであることが確認された。▲５▼についてはＮ−グリカナーゼ処理により▲４▼のサイズにシフトすること、加えて▲１▼に対する抗体により認識されることより、▲４▼に糖鎖が付加したものであることが確認された。その他、糖鎖の付加によらないサイズの異なるバンドがそれぞれのサイズ近傍に確認されることから、Ｃ末端側の長さの異なるペプチドが数種存在することが推察された。図５及び図６参照のこと。
実施例８
（他の蛋白質との活性比較）
本願発明の活性成分に属さないその他のセレノ蛋白及び抗酸化関連蛋白質の細胞死抑制活性の有無について検討した。相対比較するため、抗酸化関連セレノ蛋白としてグルタチオンペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）、その他の抗酸化関連蛋白としてグルタチオンレダクターゼ（オリエンタル酵母社製）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）、スーパーオキサイドディスムターゼ（生化学工業社製）を用いて、Ｄａｍｉ細胞の細胞死抑制活性の有無を検討した。活性測定試料としては７０μＭ相当を等量用いた。アッセイの結果、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーペーオキサイドディスムターゼには若干の活性が観察されたが、これらは本願発明に特徴づけられる細胞死抑制活性を示すペプチド断片又はペプチド断片群と比較した場合１／１００程度の活性しか示さず、明らかに、本願発明の細胞死抑制活性を示すペプチド断片又はペプチド断片群が優位な活性を示した。図７参照のこと。
さらに、抗体アフィニティーカラムを用いて調製された完全長セレノプロティンＰとの上記と同じ評価系での細胞死抑制活性の比較では、断片化された本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群の、比活性で８０倍以上という顕著な優位性が示され、「断片化」の意義を確認することができた。表３参照のこと。
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実施例９
（他の抗酸化剤との活性比較）
脂質酸化の抗酸化剤として一般的に有用であるとされているビタミンＥ及び過酸化水素の除去に働いているカタラーゼについて、本願発明のＨＳＡ存在下、無血清培養下で誘導される細胞死をどの程度抑制するものか検討した。
無血清培地ＳＦＯ３（三光純薬）（０．０５μＭ２ＭＥ加、０．１％ＢＳＡ含）で継代可能なＤａｍｉ細胞（１×１０６細胞／ｄｉｓｈ／３ｍｌ）１ｍｌにＲＰＭＩ  １６４０／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１：２：２混合培地（ＳＡ培地）を２ｍｌ添加後、３日間培養し、アッセイ時にその細胞を回収した。その細胞を５０％ＰＢＳ／ＳＡ／０．０３％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）により２回洗浄し、同培地で３×１０４／ｍｌになるように懸濁後、細胞懸濁液をサンプル添加ウェルのみ１９０μｌ、段階希釈のためのウェルには１００μｌずつを、９６ｗｅｌｌプレートに分注した。
アッセイ試料として２０μＭのビタミンＥ、カタラーゼ及びセレノプロテインＰ断片をそれぞれサンプル添加ウェルに１０μｌずつ添加し、攪拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウェルに対して段階希釈を行なった。培養は３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間行ない、判定した。アッセイの評価法としては培養４日目以降、細胞死抑制に必要な試料濃度の相対比較を実施した。その結果、カタラーゼは細胞死抑制活性は示さず、ビタミンＥは１２５ｎＭまでは細胞死を抑制したが６２ｎＭでは細胞死を抑制できなかった。これに対してセレノプロテインＰ断片は６０ｐＭまで細胞死を抑制することが可能であった。また、この結果より、ビタミンＥで細胞死が抑制されたことから本願アッセイ系においてはＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ）に結合している脂肪酸類の過酸化が細胞死を誘導していると予想され、さらに、ビタミンＥよりも効果的に細胞死を抑制するセレノプロテインＰ断片はビタミンＥが有効である現象に対してなお有効に作用することが予想された。図８参照のこと。
実施例１０
（脂肪酸により誘導される細胞死の抑制活性）
種々の二重結合を分子内に２個以上有する長鎖の脂肪酸（例えば、ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ｄｉｈｏｍｏ−γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ｄｏｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ａｄｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ，ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）は全て、セレノプロテインＰ非存在下の無血清培養において１０μＭの濃度で細胞死を誘導した。この中で、強く細胞死を誘導するアラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）及びリノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）についてそれらが細胞死を誘導する濃度、並びにそれを抑制するセレノプロテインＰの濃度について詳細に検討した。
無血清培地ＳＦＯ３（三光純薬）（０．０５μＭ２ＭＥ加、０．１％ＢＳＡ含）で継代可能なＤａｍｉ細胞（１×１０６細胞／ｄｉｓｈ／３ｍｌ）１ｍｌにＲＰＭＩ  １６４０／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１：２：２混合培地（ＳＡ培地）を２ｍｌ添加後、３日間培養し、アッセイ時にその細胞を回収した。その細胞をＳＡ／０．０５％脱脂肪酸ＢＳＡ（和光純薬社）により２回洗浄し、２〜１６μＭのアラキドン酸、リノール酸及びリノレン酸を含有する同培地で３×１０４／ｍｌになるように懸濁後、細胞懸濁液をサンプル添加ウェルのみ１９８μｌ、段階希釈のためのウェルには１００μｌずつを９６ｗｅｌｌプレートに分注した。これに１００μＭのアッセイ試料をそれぞれサンプル添加ウェルに２μｌずつ添加し攪拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウェルに対して段階希釈した。培養は３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間行い、細胞死誘導とセレノプロテインＰ断片による細胞死抑制の評価を１μＭのセレノプロテインＰ及びその希釈倍率による有効濃度を比較した。
アラキドン酸、リノール酸等の多価の不飽和脂肪酸が４μＭ以上存在する条件下で細胞の無血清培養を実施すると細胞死が誘導され、１μＭのセレノプロティンＰ断片によって完全に細胞死を抑制し得ることが判明した。図９参照のこと。４μＭのリノール酸が存在する条件下でビタミンＥが細胞死を抑制する有効濃度が１００ｎＭ程度であるのに対し、全長セレノプロテインＰが同等の約１００ｎＭ程度、セレノプロテインＰ断片が１０ｐＭとセレノプロテインＰ断片が最も低濃度で有効性を示した。図１０参照のこと。抗酸化剤であるビタミンＥを添加することにより細胞死を抑制したことから、おそらく細胞内外で過酸化を受けた脂肪酸が細胞に損傷を与えることにより細胞死が惹起され、セレノプロテインＰ断片は効率的にこれを抑制しているものと考えられる。
また、４μＭのリノール酸又はリノレン酸存在下で生じるＤａｍｉ細胞の細胞死の抑制効果の有無を種々の酸化還元に関する酵素類（グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、カタラーゼ）について検討したところ、グルタチオンペルオキシダーゼにおいて、リノール酸存在下で生じる細胞死を２５０ｎＭ以上で抑制し、リノレン酸存在下で生じる細胞死を５００ｎＭ以上で抑制したが、他の酵素類は１μＭの濃度でも細胞死抑制効果は観察されなかった。同条件下でセレノプロテインＰ断片が１０ｐＭという低濃度でも細胞死を抑制することから、セレノプロテインＰ断片の際だった有効性が明らかとなった。また、この細胞死を誘導する脂肪酸の濃度を変化させることにより、感受性の異なる種々の細胞への脂肪酸の影響及びセレノプロテインＰの影響を観察することができた。通常、２０μＭのリノール酸を添加すると細胞死が誘導され、この濃度で細胞死が誘導されない細胞はセレノプロテインＰが発現している可能性が高い。この系を利用することにより、種々の細胞における脂肪酸によって誘導される細胞死の抑制効果を評価することができる。この系は、ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）添加時に誘導される細胞死と同じ現象を反映していると推察された。
これまでの実験により、巨核球系細胞株（Ｄａｍｉ）、Ｔ細胞系細胞株（Ｍｏｌｔ４、ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ）、Ｂ細胞系細胞株（Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３、Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．Ｕ１）、肝臓系細胞株（ＨｅｐＧ２）、神経系細胞株（ＩＭＲ３２）、腎臓系細胞株（ＣＲＬ１９３２）等で本願発明のセレノプロテインＰ断片の効果が確認された。このことから、セレノプロテインＰ断片は、免疫系、神経系、造血系の細胞及び臓器由来の細胞に対して細胞死抑制の有効性を示すことが強く期待される。
実施例１１
（細胞死抑制物質の細胞培養時の添加物としての効果）
種々の細胞株（巨核球系細胞株：Ｄａｍｉ；肝臓由来細胞株：ＨｅｐＧ２；子宮由来細胞株：Ｈｅｌａ；腎臓由来細胞株：ＣＲＬ１９３２；組織性リンパ球細胞株：Ｕ９３７；Ｔ細胞系細胞株：Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ４、ＣＥＭ；線維芽細胞株：Ｌ９２９；単球系細胞株：ＴＨＰ−１；Ｂ細胞系細胞株：Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３、Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．Ｕ１；神経系細胞株：ＩＭＲ３２）をＲＰＭＩ１６４０／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（１：２：２）培地（トランスフェリン、インシュリン、亜セレン酸ナトリウム不含）で、セレノプロテインＰ断片の有無の条件下で培養した。その結果は、全ての細胞において、セレノプロテインＰ断片の存在下では細胞状態の悪化が観察されないか悪化を抑え得ることが判明した。表４参照のこと。加えて、トランスフェリン、インシュリン存在下では全ての細胞状態の維持が可能となり、更に加えて０．０５％ＢＳＡ存在下ではより効果的であった。
また、抗セレノプロテインＰ抗体固定化担体を用いてセレノプロテインＰを完全に除去したヒト血清５％存在条件でＪｕｒｋａｔ細胞を培養した際、当該細胞の増殖が悪化し細胞内抗酸化酵素の１種である細胞内グルタチオンペロキシダーゼ活性の低下が観察されたが、これにセレノプロテインＰ断片を添加することにより、細胞増殖及びグルタチオンペロキシダーゼ活性を正常に戻すことができた。なお、亜セレン酸ナトリウムでもこの効果は観察されたが、セレノプロテインＰ断片の効果はこれを凌いだ。また、セレン化合物であるエブセレンにはこの効果は観られなかった。以上のことから、セレノプロテインＰ断片で亜セレン酸ナトリウムを代替することが可能で、細胞培養時の添加物として有用であることが判った。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本願発明の細胞死抑制活性を有するペプチド断片又はペプチド断片群の各種精製工程での、電気泳動図（銀染色、ウエスタンブロッティング）である。
図２は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製ペプチド断片又はペプチド断片群の純度を示す電気泳動図（銀染色、ウエスタンブロッティング）である。
図３は、抗セレノプロテインＰ抗体結合担体カラムを用いて精製された本願発明の細胞死抑制活性を有する精製ペプチド断片又はペプチド断片群の純度を示す電気泳動図（銀染色）である。
図４は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製ペプチド断片又はペプチド断片群のＮ−グリコシダーゼ処理後の挙動を示す電気泳動図である。
図５は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製ペプチド断片又はペプチド断片群の還元カルボキシメチル化後の挙動を示す電気泳動図（銀染色）である。
図６は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製ペプチド断片又はペプチド断片群の還元カルボキシメチル化後の挙動を示す電気泳動図（ウエスタンブロッティング）である。
図７は、本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群とその他の蛋白質の、細胞死抑制活性に関する比較試験の結果を示す図である。
図８は、本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群と他の抗酸化剤の、細胞死抑制活性に関する比較試験の結果を示す図である。
図９は、脂肪酸により誘導される細胞死に対する本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群の細胞死抑制活性を示す図である。
図１０は、脂肪酸により誘導される細胞死に対する本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群とビタミンＥで代表される抗酸化剤の、細胞死抑制活性に関する比較試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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