(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞から正常では分泌されないタンパク質に機能的に連結している哺乳動物シグナルペプチドをコードするＲＮＡ分子であって、該シグナルペプチドが少なくとも該タンパク質の一部をそれが分泌され得るように小胞体上で合成させるものであり、該ＲＮＡ分子が該タンパク質をコードする天然に生ずるＲＮＡ中に存在する対応する３’非翻訳領域と比べて３’非翻訳領域の全て又は一部に欠失、挿入又は置換を含み、それにより該ＲＮＡ分子を細胞内の小胞体以外の位置に、又は遊離のポリソーム及び／又は細胞骨格結合ポリソームに向ける際における該３’非翻訳領域の効果が消失、又は対応する天然に生ずる３’非翻訳領域と比べて低下しているものであるＲＮＡ分子。
【請求項２】
該シグナル配列が成長ホルモン、ミルクタンパク質又はアルブミンから選択されるシグナル配列である、請求項１記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
哺乳動物細胞から正常では分泌されないタンパク質が、哺乳動物の細胞内タンパク質である、請求項１もしくは２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
分泌タンパク質のｍＲＮＡ由来の３’非翻訳領域を含む、請求項１、２もしくは３に記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
転写されて請求項１〜４のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子を生ずることができるＤＮＡ分子。
【請求項６】
ベクターの形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項７】
細胞培養中又は非ヒト動物中に存在するとき、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子を含んでいる哺乳動物細胞。
【請求項８】
哺乳動物細胞からタンパク質を取得する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子を用いてその細胞中にタンパク質を発現させる工程、及びその細胞にそのタンパク質を分泌させる工程を含んで成る方法。
【請求項９】
３’ＵＴＲに機能的に連結された哺乳動物タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたシグナル配列を含むベクターであって、該シグナル配列及び３’ＵＴＲが、該ヌクレオチド配列によりコードされた哺乳動物タンパク質とは異なる分泌タンパク質のｍＲＮＡに由来するものであるベクター。
【請求項１０】
シグナル配列及び３’ＵＴＲが同一タンパク質に由来するものである、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
該ヌクレオチド配列によりコードされた哺乳動物タンパク質が、正常では分泌されないものである、請求項９又は請求項１０に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞からのタンパク質の分泌に関する。
【０００２】
哺乳動物細胞株は、細胞工場及びトランスジェニック動物において組換えタンパク質の商業上相当な量を製造するため、その使用が次第に増加しつつある。正常に分泌されるタンパク質がこのようにして製造されつつあるという例が非常に多くあり（ボック(Bock)ら 1982,ミシェル(Michel)ら 1985,リン(Lin) ら 1986,デブリン(Devlin)ら 1987,シャク(Shak)ら 1990)、また異種タンパク質の分泌用のベクターが多数市販されている。しかしながら、そのような系は大抵、正常には細胞内にあるタンパク質ではなく分泌性タンパク質の製造に使用されており、したがって哺乳動物の発現系における細胞内タンパク質の分泌は、バイオテクノロジーによる研究では重要性が増加している目標である（ジェームス(James) とシンプソン(Simpson), 1996)。本発明者らは、哺乳動物細胞からの細胞内タンパク質の分泌に成功したことを記載する文献（リー(Lee) ら，1996) は一つしか知らない。しかしながら、このタンパク質（シアリルトランスフェラーゼ）は小胞体（ＥＲ）で正常に合成され、分泌の成功はｍＲＮＡの最初の指示の書き直し（転送）に依存するものではなかった。
【０００３】
特異的なｍＲＮＡが細胞内の特異的な位置で翻訳されることは、よく確立されており、例えば、膜及び分泌タンパク質は、膜結合ポリソームに会合して粗面小胞体上で翻訳され（ブローベル(Blobel)とドッベルスタイン(Dobberstein), 1975)、ｃ−ｍｙｃ（ヘスキース(Hesketh) ら，1994) 、メタロチオネインＩ（マホン(Mahon) ら 1995)、リボソームタンパク質及びサイクリンＡ（ホフラント(Hovland) ら，1995) 等のタンパク質に対するｍＲＮＡは、細胞骨格に結合したポリソームに会合して翻訳される（概説に関しては、ヘスキース 1996,  ホフラントら 1996 を参照のこと) 。現在、タンパク質合成装置は、少なくとも三つのポリソーム集団、すなわち、遊離ポリソーム（ＦＰ）、細胞骨格結合ポリソーム（ＣＢＰ）及び膜結合ポリソーム（ＭＢＰ）に区画分けされるようである。ｍＲＮＡのこれらの三つの集団を、連続的な界面活性剤／塩抽出を用いて分離することができる（ベデラー(Vedeler) ら 1991)。異なるシグナルがこれらのｍＲＮＡをそれらの翻訳のための部位に向ける。膜タンパク質及び分泌性タンパク質の場合、シグナルペプチドがリボソーム−ｍＲＮＡ複合体を小胞体に標的化することが必要であることは、十分確立されたが、一方、細胞質に局在するｍＲＮＡ又は細胞骨格に会合したｍＲＮＡに関しては３’非翻訳領域にシグナルが存在するという証拠が最近示された（キスラウスキス(Kislauskis)ら 1994,  ヘスキースら 1994,  ウイルソン(Wilson)ら 1995,  ベイルーン(Veyrune) ら 1996)。
【０００４】
本発明によれば、哺乳動物細胞から正常には分泌されないタンパク質に機能的に連結している哺乳動物のシグナルペプチドをコードするＲＮＡ分子であって、該タンパク質が該哺乳動物細胞から分泌され得るように、該シグナルペプチドが該タンパク質の少なくとも一部を小胞体で合成させるものであるＲＮＡ分子を提供する。
【０００５】
理論に束縛されることなく、該シグナルペプチドが最初に提供され、次いで、ｍＲＮＡの翻訳が停止するか又は速度を下げて、このシグナルペプチドをシグナル認識粒子に結合させ、そしてｍＲＮＡと会合したリボソームを小胞体に向けさせるものと思われる。次いで、翻訳が再開するか又は速度を上げて、残りのタンパク質が翻訳されるようにする。
【０００６】
本明細書において「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸を含有する部分を含むように広い意味で用いられる。したがって、「タンパク質」は、ペプチド及びポリペプチドを含む。
【０００７】
本発明は、広範に適用可能である。原理的には、哺乳動物細胞から分泌されるタンパク質と正常に連結している天然に生ずるいかなる哺乳動物シグナルペプチドの配列も、本発明で使用するための哺乳動物シグナルペプチドをコードする適当なＲＮＡ分子を設計するために使用することができる。
【０００８】
また、そのようなタンパク質を分泌させるために使用可能なそのような天然に生ずるシグナルペプチドの改変体を使用してもよく、そしてそれは本発明の目的にとって、「哺乳動物シグナルペプチド」という用語の範疇内にあると考えられる。そのような改変体は、天然に生ずる哺乳動物シグナルペプチド配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列の同一性を有することが好ましい。配列の同一性の程度は少なくとも７５％であることがより好ましい。少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性が最も好ましい。本発明のための配列同一性は、ウイスコンシンシーケンス・アナリシス・パッケージ(Wisconsin Sequence Analysis Package) ＧＣＧ８．０の「ＢＥＳＴＦＩＴ」プログラムを用いることにより決定することができる。
【０００９】
好ましいシグナルペプチド配列は、ラットアルブミン（データベース寄託番号Ｊ００６９８）、ウシ成長ホルモン、ラクトアルブミン及び他のミルクタンパク質を含む。
【００１０】
当業者は、利用可能なデータベース配列又は刊行物から多くのタンパク質のシグナル配列を確認することができる。これらの配列が発表されていない場合でさえも、例えば、配列ホモロジー研究を用いて、候補のアミノ酸配列と既知のシグナル配列のアミノ酸配列とを比較することができる。
【００１１】
本発明の好ましい態様においては、ＲＮＡ分子は、小胞体以外の細胞内の位置に又は遊離の及び／又は細胞骨格に結合したポリソームにこの分子を向けうる配列を含まないか、又は含むとしても、それは小胞体以外の細胞内の位置に又は遊離の及び／又は細胞骨格に結合したポリソームに分子を向ける際には、（対応する天然に生ずる配列と比べて）その有効性を低下させるように改変された形状でそのような配列を含んでいる。
【００１２】
本発明のこの好ましい態様においては、小胞体にタンパク質を向けるシグナル配列と、小胞体以外の細胞内の位置に又は遊離の及び／又は細胞骨格に結合したポリソームにタンパク質をコードするＲＮＡを向けるＲＮＡ配列との間の競合の可能性を回避することができ、あるいは少なくとも小胞体に向けられるタンパク質の確率を増加させるように変化させることができる。
【００１３】
これは、哺乳動物細胞から正常には分泌されないタンパク質をコードする天然のＲＮＡに存在する対応領域と比べて３’非翻訳（ＵＴＲ）領域の全部又は一部に欠失、挿入又は置換を有するＲＮＡ分子を提供することにより達成できる。特定の細胞内位置に又は遊離の若しくは細胞骨格に結合したポリソームに向けられたＲＮＡ分子の３’ＵＴＲ領域に存在するシグナルは、そのようなｍＲＮＡのそれらへの局在化を少なくともある程度まで制御すると信じられており、そしてそのような領域中の突然変異は、そのシグナルを不活性化することができる。ＲＮＡ分子の３’ＵＴＲ領域中のシグナルは、前記ｍＲＮＡ分子の３’ＵＴＲ領域内の配列の欠失又は突然変異並びにレポーター遺伝子への連結及び培養中の哺乳動物細胞へのトランスフェクション後のハイブリダイゼーション試験によるｍＲＮＡ分布の検出による局在可能性の測定により同定することができる。
【００１４】
転写して前記ＲＮＡ分子を提供することができるＤＮＡ分子もまた本発明の範疇にある。必須ではないが、それらは、ベクターの形（例えば、プラスミド、ファージ又はコスミド）で提供されてもよい。
【００１５】
前記のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞もまた本発明の範疇にある。哺乳動物細胞は、細胞培養又は非ヒト動物中に存在してもよい。本明細書において使用される「細胞培養」という用語は、動物には存在せず、適当な条件下でタンパク質を発現させるために使用されうる一以上の細胞を意味する。通常、そのような細胞は、緩衝化された条件下で適当な生育培地中に維持されるであろう。細胞培養は、哺乳動物繊維芽細胞の培養、ＣＨＯ、ＢＨＫ又は骨髄腫の細胞培養であってもよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であってもよい。（「トランスジェニック動物」という用語は、核転移された動物を含む。）トランスジェニック動物は、そのミルク中に異質タンパク質を分泌してもよい。
【００１６】
また、本発明は、本発明の核酸分子を用いてタンパク質を発現する工程及び哺乳動物細胞にタンパク質を分泌させる工程を含む哺乳動物細胞からタンパク質を得る方法をも含む。次いで、前記タンパク質を、既知の精製技術により精製することができる。
【００１７】
哺乳動物細胞から正常には分泌されないタンパク質に連結した哺乳動物シグナル配列を含有するキメラタンパク質は、本発明の別の側面である。そのようなタンパク質は、本発明のＲＮＡ分子を翻訳することにより製造することができる。
【００１８】
本発明の他の側面に加えて、本発明は前記核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。これらは、プローブ、プライマー又は発現等を変化させるのに使用されるアンチセンス分子等として有用である。
【００１９】
そのようなハイブリダイズする核酸分子は、少なくとも１０ヌクレオチド長が望ましく、少なくとも２５又は少なくとも５０ヌクレオチド長が好ましい。それらは、厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。厳格なハイブリダイゼーション条件の一例は、試みられたハイブリダイゼーションが約０．９モルの塩溶液を用いて約３５℃〜約６５℃の温度で行なわれる場合である。しかしながら、当業者は、プローブ長、塩基の組成、存在するイオンの型等のような変数を考慮に入れるためにパラメーターを適当に変化させることができる。
【００２０】
本発明は、ほとんど天然に生ずる哺乳動物シグナルペプチド又はその改変体を参照しながら上述したけれども、その最も広い範疇では、哺乳動物細胞で機能することができる全てのシグナルペプチドを使用することができる。これらは、天然又は非天然に生ずるものであってもよい。それらは、原核生物（大腸菌等）には天然に生じないものが好ましい（必須ではないが）。
【００２１】
本発明を、添付の図面のみを参照しながら実施例により記述する。
【００２２】
図１は、材料と方法に記載された構築物の概略図を示す。親ベクターは、ｐｃＤＮＡ３である。黒塗り四角は、ウサギベータ−グロビンの天然の５’ＵＴＲを表す。ＳＳは、ラットアルブミンシグナル配列である。
【００２３】
図２は、トランスフェクトした細胞から単離したポリソーム由来の全ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションを示す。すべてのレーンは、１０μｇのＲＮＡを負荷した。このフィルターをウサギベータ−グロビンｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰを用いて−７０℃で３日間のオートラジオグラフィーすることにより特異的なバンドが検出された。Ｆは遊離のポリソーム、Ｃは細胞骨格結合ポリソーム、Ｍは膜結合ポリソームである。
【００２４】
図３は、トランスフェクトした細胞におけるグロビンｍＲＮＡの分布を定量的に示す。結果は、キャンベラ・パッカード・インスタントイメージャーを用いる直接の放射能画像化から得られた単位１８ＳｒＲＮＡ当たりの任意単位のｍＲＮＡで表す。各実験に対し、遊離のポリソーム中の生成量を１００として生成値を規格化した。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）である。グループを、スチューデント「ｔ」検定を用いて比較した。すなわち、膜結合ポリソーム中の転写物の生成量は、両側検定を用いてＧＧ細胞とＳＳＧＧ細胞との間で（ｐ＝０．０１）、及びＧＭ細胞とＳＳＧＭ細胞との間で有意の相違があり（ｐ＜０．０５）そして片側検定を用いてＳＳＧＭ細胞とＳＳＧＧ細胞との間で有意の相違があった。
【００２５】
図４は、転写物のｍＲＮＡ安定性を示す。細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、転写をアクチノマイシンＤで阻害した。ＲＮＡを各時点で抽出し、次いで、ノーザンブロッティングで分析した。キャンベラ・パッカード・インスタントイメージャーを用いる直接の放射能画像化により定量を行なった。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、最初の生成量のパーセントとして現す。
ＧＧとＳＳＧＧ（ｎ＝６）
【００２６】
図５は、トランスフェクトしたＬｔｋ- 細胞のポリソームプロフィールを示す。可溶性の界面活性剤／塩抽出した物質を、１５％〜４０％スクロース勾配に重層し、２０００００×ｇで１時間遠心分離した。フローセルを用いる２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ポリソームプロフィールを測定した。
【００２７】
図６は、ＳＳＧＡのノーザンハイブリダイゼーション及び定量を示す。
図６Ａ：ｐｃＫＳＳＧＡでトランスフェクトしたＬｔｋ- 細胞のノーザンハイブリダイゼーション。すべてのレーンは、２０μｇのＲＮＡを負荷した。フィルターをウサギベータ−グロビンｃＤＮＡプローブでハイブリダイズした。
図６Ｂ：ｍＲＮＡの生成量の定量。
結果は、直接の放射能画像化から得られた単位１８ＳｒＲＮＡ当たりの任意単位のｍＲＮＡで表し、各実験に対し遊離のポリソーム中の生成量を１００として生成量を取ることにより規格化した。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）である。
【００２８】
実施例
三段階を含むアプローチ：ウサギベータ−グロビン５’非翻訳領域及びレポーター遺伝子としてのコーディング配列に連結した、アルブミンシグナルペプチド配列及び異なる３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）配列を有する一連のベクターを構築すること、これらの構築物を安定なトランスフェクションにより細胞に導入すること、次に、ｍＲＮＡの細胞下位置並びにその安定性及び翻訳効率を決定すること。
【００２９】
材料と方法
細菌及び細胞培養：標準的な手法により、プラスミドをクローニングして増殖させた。ＣＨＯ・Ｋ１細胞は、ハムのＦ１２培地で生育させ、マウスの繊維芽細胞株であるＬｔｋ- 細胞は、ダルベッコの最小イーグル培地で生育させた。１０％ウシ胎仔血清で培地を補足し、５％ＣＯ2 の雰囲気下で生育させた。細胞は、分画用に９０ｍｍのペトリ皿で及びトランスフェクション用に３５ｍｍのペトリ皿で増殖させた。
【００３０】
ベクターの構築：すべての構築物（図１）は、表１に記載されたプライマーを用いたＰＣＲクローニングによりウサギベータ−グロビンコーディング配列から誘導し、そして全てが天然のグロビン５’ＵＴＲを含んでいた。各構築物は、ＡＢＩ３７３Ａシークェンサー及びサイクルシーケンスを用いる配列決定により確認した。天然の５’及び３’ＵＴＲを持つウサギベータ−グロビンを発現するプラスミドであるｐｃＫＧＧの構築は、以前に記載された（マホン(Mahon) ら，1997) 。ｐｃＫＧＭは、マウスｃ−ｍｙｃの３’ＵＴＲを持つグロビンを発現し、以下のように作製された。グロビンをコードする領域の一部及びｃ−ｍｙｃの３’ＵＴＲの全体を、プライマーＫＰ４及びＫＰ５並びに鋳型としてプラスミドＭＰ１３を用いるＰＣＲにより増幅した（ベイルン(Veyrune) ら 1996)。このＫＰ４はグロビンをコードする領域でＢａｍＨＩ部位を維持し、ＫＰ５はｃ−ｍｙｃのポリＡシグナルの下流にＸｂａＩ部位を創出する。１ｎｇの鋳型、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 中２０ｐｍｏｌの各プライマー及び４ユニットのＴａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー）を用いて、反応は、９４℃１分間、５５℃１分間及び７２℃２分間のサイクルで行った。断片及びｐｃＫＧＧをＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、標準的方法を用いて連結した（サンブルック(Sambrook)ら 1989)。
【００３１】
シグナル配列構築物の作製には、ＡＵＧコドンにおける適当な制限部位の創出が必要であった。これは、プライマーＫＰ６及びＫＰ７を用いるＰＣＲにより達成された。このＫＰ６が７３１位でｐｃＤＮＡの配列に適合し、ＫＰ７がＡＵＧ及び読み取り枠を維持しながらＮｄｅＩ部位を創出する。鋳型はｐｃＫＧＧであり、反応は前記した条件を用いた。反応産物を精製し、次いで、５μｇを、プライマーＫＰ８（ＢａｍＨＩ部位を含むグロビンコーディング領域中の配列をカバーする）、鋳型として１μｇのｐｃＫＧＧ及び前記したサイクルを用いるＰＣＲメガプライムに使用した。得られた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＫｐｎＩとＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ｐＢＳ−Ｎｄｅを作製した。
【００３２】
シグナル配列は、ラットアルブミンシグナル配列（ＳＳ１及びＳＳ２）に対応する合成オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより提供された。挿入物をｐＢＳ−ＮｄｅのＮｄｅＩ部位に連結させ、ｐＢＳ−ＳＳを作製した。次いで、５’ＵＴＲ、アルブミンシグナル配列及びグロビンコーディング領域をカバーするｐＢＳ−ＳＳからＢａｍＨＩ部位までのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を、適当に消化したｐｃＫＧＧ及びｐｃＫＧＭに連結し、ｐｃＫＳＳＧＧ及びｐｃＫＳＳＧＭを作製した。
【００３３】
アルブミン３’ＵＴＲを、制限酵素によりラットアルブミン遺伝子から取り出し、制限されたグロビンベクターをＶｅｎｔポリメラーゼで処理した後、平滑末端化連結によりこのアルブミン３’ＵＴＲを導入した。ｐｃＫＳＳＧＡは、ｐｃＫＳＳＧＧ及びｐｃＫＳＳＧＭについて記述されたように構築した。
【００３４】
トランスフェクション：トランスフェクションは、製造業者の指示に従い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）（ギブコ）で行なった。細胞を、５ｘ１０5 細胞／皿の密度で３５ｍｍのペトリ皿にサブ培養し、７０〜８０％コンフルエンスまで生育させた。この細胞を、無血清培地中１μｇのプラスミドＤＮＡ及び６〜１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥで重層した。５時間後に、血清を１０％の最終濃度まで添加した。２４時間目にこの培地を完全培地と交換し、７２時間目に２００μｇ／ｍｌのＧ４１８での選択を開始した。一旦安定にトランスフェクトした後は、細胞は１００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で維持された。この細胞株を、トランスフェクトした構築物に合わせて命名し、例えば、ｐｃＫＧＧでトランスフェクトした細胞はＧＧと称する。
【００３５】
細胞分画：Ｌｔｋ−細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、ラバーポリースマンを用いて集め、連続的な界面活性剤／塩抽出手法により分画した（ベデラーら, 1991；ヘスキースら，1994) 。ポリソームを、４０％スクロースの１５ｍｌクッションを通す３２，０００ｇでの１７時間遠心分離により、モノソーム及びより軽いリボ核タンパク質粒子から分離した（ホフラントら，1995) 。
【００３６】
ＲＮＡ抽出及びＲＮＡゲル電気泳動：チョムクジンスキー(Chomczynski) とサッチ(Sacchi)(1987)の酸／グアニジニウム／フェノール／クロロホルム法により、全ＲＮＡを抽出し、その標品をＡ２６０／Ａ２８０により評価した。次いで、ＲＮＡを、変性２．２Ｍのホルムアルデヒド、１．２％アガロースゲルによる電気泳動により分離し（サンブルック(Sambrook)ら 1989)、毛細管ブロッティングによりナイロン膜（ジーンスクリーン、ＮＥＮデュポン社）に転写した。ＲＮＡをＵＶ光により膜に固定し、乾燥させて保存した。
【００３７】
ノーザンハイブリダイゼーション及びＤＮＡプローブ：  膜を、４２℃で最小限６時間、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、０．２％ウシ血清アルブミン、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ及び５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５中０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡでプレハイブリダイズした。ベータ−グロビンｃＤＮＡプローブは前に記述された（ベイルン(Veyrune) ら 1996)。ｃ−ｍｙｃプローブは、ネズミ遺伝子の３つのエキソンのｃＤＮＡであり（ヘスキースら，1994) 、コール(M. Cole) 博士（プリンストン大学、ニュージャージー  米国）から恵与され、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プローブは、ヒトｃＤＮＡ（アメリカンティッシュカルチャーコレクション、寄託番号５７０９０）由来の０．７８ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片であり、そして１８Ｓ・ｒＲＮＡプローブは、フルトン(R. Fulton) 博士、ビートソン研究所、グラスゴーから入手したｃＤＮＡ由来の１．４ｋｂＢａｍＨＩ断片であった。２０〜３０ｎｇのプローブを、ランダムプライミング（メガプライム・キット、アマシャム・インターナショナル、英国製）により32Ｐ−ｄＣＴＰで標識化した。標識化したプローブをプレハイブリダイゼーション混合物に添加し、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。フィルターを２×ＳＳＣ中、室温で簡単に洗浄して、ハイブリダイゼーション混合物を除いた。６５℃での洗浄は、以下のようにプローブ特異的であった、すなわち、グロビンは１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、３０分を２回、ｃ−ｍｙｃは０．５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１時間を２回、ＧＡＰＤＨは１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１時間を２回、１８Ｓは０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳであった。０．１×ＳＳＣ中の最終の簡単な洗浄によりＳＤＳを除去した。特異的なハイブリダイゼーションを検出し、キャンベラ・パッカード・インスタントイメージャーで定量した。特異的に結合したプローブの量を、非特異的結合に対して補正し、そのデータを、１８Ｓ・ｒＲＮＡプローブへのハイブリダイゼーションにより測定されたｒＲＮＡの単位当たりで表した。再精査する前に、フィルターを０．１％ＳＤＳ中１０分間９５℃まで加熱することによりきれいにした。
【００３８】
ｍＲＮＡの安定性：  ｍＲＮＡの安定性は、転写の阻害後２〜１２時間の期間にわたる生成量を測定することにより決定した。細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、アクチノマイシンＤの添加（５μｇ／ｍｌ）により転写を阻害した。ＲＮＡを前記のように抽出した。
【００３９】
ポリソームプロフィール及び翻訳効率：  細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、ラバーポリースマンを用いて培地中にはがし、次いで、４℃、２０００ｒｐｍで５分間ペレット化した。細胞をＤＥＰＣ・ＰＢＳで洗浄し、前述のようにペレット化した。その細胞を１０ｍＭのＴＥＡ（トリエタノールアミン）ｐＨ７．６、１３０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭのＣａＣｌ2 、０．２５ｍＭスクロースに０．５％デオキシコール酸塩及び０．５％トリトンＸ１００を補足した溶液に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。その核を、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレット化した。０．３ｍｌの上清を７ｍｌの１５％〜４０％スクロース勾配に重層し、２００，０００×ｇで１時間遠心分離し、次いで、ツァイスＰＭ・２Ａ分光光度計に載せＷ＋Ｗ記録計に連結したフロースルーセルを用いる２６０ｎｍでの吸光度を測定することによりモニターした。フローセルからの流出液を集め、各勾配を三つの画分、すなわち、ポリソーム、モノソーム及び残りのもの（非翻訳物質）に分割した。ポリソームは、３２０００×ｇで１７時間の遠心分離によりペレット化し、ＲＮＡをペレットから抽出した。モノソームＲＮＡはイソプロパノールと酢酸アンモニウムで沈澱させ、次いで、前に記述したように抽出した。
【００４０】
結果
アルブミンシグナル配列によるグロビンｍＲＮＡの転送：  最初に、、ウサギベータ−グロビン５’ＵＴＲと天然の３’ＵＴＲ又はｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲのいずれかを有するコーディング領域に、それぞれアルブミンシグナル配列を加えるか又は加えないかに基づいて四つのプラスミドを構築した。これらの構築物をＬｔｋ−繊維芽細胞に導入して、安定なトランスフェクトした細胞株を確立した。トランスフェクトした遺伝子の発現は、グロビン転写物を検出するためのノーザンハイブリダイゼーションにより評価して四つの遺伝子すべてが発現していることがわかった。本発明者らは、７０％コンフルエンスでグロビン発現の最高のレベルを見出し（データは示さず）、その後のすべての実験は、その段階の生育で行なった。
【００４１】
界面活性剤／塩による分画は、ＦＰ、ＣＢＰ及びＭＢＰ間の転写物の区画化を研究するために行なった。各細胞株を分画し、ポリソームをペレット化し、次いで、ＲＮＡをそのペレットから抽出し、グロビン転写物の生成量についてノーザンハイブリダイゼーションにより分析した。図２に示すように、対照細胞株（ＧＧ）では、グロビン転写物は遊離のポリソームに大部分見出された。対照的に、アルブミンシグナル配列を有するグロビン転写物を発現する細胞（ＳＳＧＧ）においては、この転写物は、ＭＢＰ／ＥＲに多く見出された。また、ＳＳＧＭ転写物も、ＭＢＰ／ＥＲ画分中に最高の生成量で見出された。
【００４２】
１８Ｓ・ｒＲＮＡプローブでフィルターを再精査すると、ＲＮＡ負荷に関する補正及び単位ＲＮＡ当たりのハイブリダイゼーションデータの定量化が可能になった。ＦＰ、ＣＢ及びＭＢＰにおけるグロビン転写物の生成量は、それぞれ、ＧＧ細胞において２．５±０．４、２．９±１．０及び２．１±０．９（少なくとも４回の別々の実験からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．、結合した１８Ｓプローブのｃ．ｐ．ｍ．当たりの結合したグロビンプローブのｃ．ｐ．ｍ．の任意の単位として表す）であり、ＳＳＧＧ細胞において０．９±０．２、１．３±０．２及び２．５±０．８であった。これらの実験において最も重要なパラメーターであったのは、全体の発現レベルではなく相対的な転写物の分布であったので、これらのデータを次に、ＦＰ画分での生成量と比較して図３に示すように表した。これらのデータから、アルブミンシグナル配列の付加がグロビンｍＲＮＡをＥＲに転送することが確認される（ｐ＝０．０１）。
【００４３】
ＧＭ細胞において、ＦＰ、ＣＢＰ及びＭＢＰにおけるグロビン転写物の生成量は、それぞれ、２．６±０．７、２．８±０．９及び１．６±０．５（少なくとも４回の別々の実験からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．、結合したグロビンプローブのｃ．ｐ．ｍ．の任意の単位として表す）であり、ＳＳＧＭ細胞においては、生成量の分布は、それぞれ、２．５±１．１、２．３±０．８及び３．０±１．４であった。ＦＰにおけるものに比べた生成量として表されたこれらのデータの分析から、ＧＭ転写物は以前（ヘスキースら、1994) に見出されたようにほとんどＣＢＰに存在するが、対照的に、ＳＳＧＭ転写物はＣＢＰ及びＭＢＰで同様の相対的な生成量で見出される（図３）ことが示された。ＭＢＰにおけるグロビン転写物の生成量は、ＧＭ細胞よりもＳＳＧＭ細胞において有意に多く、ＥＲに転写物を転送するシグナル配列の能力を再び示す。しかしながら、ＧＭ細胞と比べたＳＳＧＭ細胞におけるＭＢＰの生成量の増加は、ＧＧ細胞と比べたＳＳＧＧ細胞における生成量の増加よりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。こうして、このシグナル配列は、付着したｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲを有するグロビンコーディング領域及び５’ＵＴＲを転送するものの、ｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲとこのシグナル配列の両方の存在は、転送が起こる程度を低下させた。これは、ＥＲ局在化シグナル（シグナルペプチド）と細胞骨格局在化シグナル（ｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲ；ベイルンら,1996)との間に競合が存在することを示唆する。
【００４４】
シグナル配列の付加はｍＲＮＡの安定性及び翻訳効率に何の影響も有さない：  ５’シグナルの操作がグロビンｎＲＮＡの安定性を変えた可能性が理論的には存在したので、本発明者らは、キメラ転写物の安定性を測定した。各細胞株を７０％コンフルエンスまで生育させ、次いで、アクチノマイシンＤで処理してさらなる転写を阻害した。ＲＮＡの生成量は、ノーザンブロッティングにより測定した。グロビンは高度に安定なメッセージであるので（アビブ(Aviv)ら, 1976) 、ＧＧ及びＳＳＧＧ転写物の生成量は１２時間の期間にわたって測定した。図４に示すように、追加のアルブミンシグナル配列は、グロビンｍＲＮＡの安定性を有意に変化させなかった。同様に、ＧＭ、ＳＳＧＭ細胞株の分析から、ｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲを有するグロビン転写物へのシグナル配列の付加は、ｎＲＮＡを不安定化させなかった（データは示さず）。フィルターの再精査から、ＧＡＰＤＨｎＲＮＡが検出され、転写が四つの細胞株すべてにおいて阻害されたことが示された（データは示さず）。
【００４５】
ｍＲＮＡの安定性におけるシグナル配列の効果：  ５’及び３’シグナルの操作がグロビンｍＲＮＡの安定性を変化させた可能性が理論的には存在したので、本発明者らは、追加したシグナル配列のｍＲＮＡ安定性に対する安定効果を決定した。細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、次いで、アクチノマイシンＤで処理してさらなる転写を阻害した。ＲＮＡの生成量は、ノーザンブロッティングにより測定した。グロビンは高度に安定なメッセージであるので（アビブ(Aviv)ら, 1976) 、ＧＧ及びＳＳＧＧ転写物の生成量は、１２時間の期間にわたって測定した。図４に示すように、アルブミンシグナル配列の付加は、グロビンｍＲＮＡの安定性を有意に変化させなかった。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを検出するためのフィルターの再精査（データは示さず）は、転写が両方の細胞株で阻害されたことを示した。
【００４６】
翻訳の効率：  外来性遺伝子内のシグナルの操作が翻訳全般に影響を与えたのかそれとも特定の改変された遺伝子の翻訳に影響を与えたのかを決定するために、四つの細胞株のタンパク質合成装置をポリソームプロフィール分析に付した。細胞を塩と界面活性剤で溶解し、可溶性物質を１５％〜４０％スクロース勾配に重層した。ポリソームプロフィールを記録した。図５に示す。ポリソーム／モノソーム比を表２に示す。ポリソームプロフィールは四つの細胞株全てにおいて非常に類似しており、活性なポリソームに存在するリボソームの割合は類似していた。ピークの高さが異なるのは、勾配に重層したＲＮＡの全量の相違を表す。したがって、４つの構築物でのトランスフェクションは、タンパク質合成全体に影響しなかった。スクロース勾配由来のポリソーム及びモノソーム画分におけるグロビン転写物の割合の分析（表３）から、シグナル配列の付加が転写物の翻訳を有意に変化させないことが示される。
【００４７】
アルブミン３’ＵＴＲの影響：  図３における結果は、５’ターゲッティングシグナルと３’ターゲッティングシグナルとの間に競合が存在することを示唆したが、本発明者らは、観察された効果がグロビンコーディング配列と、そのシグナル伝達の役割を果たすシグナル配列を抑制するｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲとの間の何らかの形の相互作用によるものであることを懸念した。この疑問を解決するために、本発明者らは、異なる３’ＵＴＲ、すなわち、アルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲを有するさらなるベクター、すなわち、ラットアルブミンｍＲＮＡの３’ＵＴＲとラットアルブミンシグナル配列の両方を有するグロビンコーディング領域（ＳＳＧＡ）を構築した。このプラスミドをＬｔｋ−細胞にトランスフェクトし、安定な細胞株を確立した。ＳＳＧＡ細胞を、前記したように分画して分析した。図６に示すように、その結果は、アルブミン３’ＵＴＲとシグナル配列の両方を含むＳＳＧＡ転写物がＭＢＰ／小胞体画分に優勢に回収されたことを示す。このことは、グロビン転写物のＥＲへの転送を阻止するには外来性の３’ＵＴＲの導入それ自体では十分でないことを示す。グロビンコーディング配列がラットアルブミン３’ＵＴＲに連結するがシグナル配列を持たないさらなるベクター（ＧＡ）を作製したが、不幸にも、本発明者らはこの遺伝子を発現するトランスフェクト細胞を検出することができなかったので、さらなる分析は不可能であった。
【００４８】
討論
本発明の結果は、ＤＮＡ組換え技術とトランスフェクションとの組合せにより、グロビンｍＲＮＡが小胞体に標的化し直される細胞株を作成することが可能であることを示す。こうして、Ｌｔｋ−繊維芽細胞では、天然のグロビン３’ＵＴＲを有するグロビンにラットアルブミンシグナル配列を付加することにより、そのｍＲＮＡは膜結合型ポリソームに転送された。これは、安定な細胞株において、遊離のポリソームからＥＲへのｍＲＮＡの転送の最初の証明である。ヒストンｍＲＮＡのＭＢＰへの部分的な転送は、大腸菌シグナル配列を用いて哺乳動物細胞（ヒーラ）で以前に証明されている（ザンベッティ(Zambetti)ら 1987)。また、リー(Lee) と共同研究者(1996)らは、ＩｇＭシグナルペプチドを用いてＣＯＳ−７細胞から活性なシアリルトランスフェラーゼを分泌させたが、この場合、天然のシアリルトランスフェラーゼはＥＲで合成される。しかしながら、これらの場合のいずれにおいても、トランスフェクションが一過性であったことは重要である。
【００４９】
遊離のポリソーム上で翻訳されるｍＲＮＡに加えて、相当の割合のｍＲＮＡが細胞骨格に会合したポリソームで翻訳される（ヘスキース，1996) 。ｍＲＮＡの細胞骨格への標的化は、３’ＵＴＲのシグナルによるものであることが示された（ヘスキースら，1994; ベイルーンら, 1996; マホンら, 1997) 。図３に示すように、シグナルペプチドに加えて、細胞骨格標的化シグナルが転写物の３’ＵＴＲ中に存在するときは、膜結合ポリソームへの移行が減少する。これは、アルブミン由来の異なる「外来性」３’ＵＴＲのグロビンへの付加（ＳＳＧＡ；図６）がシグナル配列による転送を低下させなかったことから、「外来性」３’ＵＴＲの非特異的効果により生じたものではないように思われる。したがって、このデータは、ハイブリッド転写物がシグナル配列と３’ＵＴＲ局在化シグナルの両方を含む場合、５’シグナルと３’シグナルとの間に競合が存在することを示す。こうして、ｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲ局在化シグナルは、シグナル配列を介するｍＲＮＡの区画分けを妨害するように見える。
【００５０】
これらのデータは、バイオテクノロジーに重要な関係を有する。第一に、これらのデータは、細胞内タンパク質をコードするｍＲＮＡがＥＲに転送される安定な細胞株を形成させることが可能であることを証明する。第二に、これらのデータは、そのようなｍＲＮＡが３’ＵＴＲ局在化シグナルを含むときは、そのようなシグナルは効率的な転送を達成するために除去されなければならないことを示す。
【００５１】
アルブミン３’ＵＴＲでの本発明の結果により示されるように（図６）、特にシグナル配列と同じ遺伝子が用いられるとき、分泌タンパク質のｍＲＮＡ由来の３’ＵＴＲを含むベクターを用いることが最も適当でありうる。このようにして、所望のコーディング領域を、５’ＵＴＲ／シグナル配列と分泌されるタンパク質のｍＲＮＡ由来の３’ＵＴＲとの間に挿入し、シグナル競合の問題を根絶できる。
【００５２】
そのような改変遺伝子が市販目的に使用されるべきものである場合、理想的にはシグナルの改変は、いかなる主要な程度にもｍＲＮＡの安定性と翻訳の効率を減少させるべきでない。図４と５におけるデータは、グロビンへのシグナル配列の付加がｍＲＮＡの安定性と翻訳の効率に何の効果も持たなかったことを示す。したがって、標的化のし直しは、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の維持と両立させることができる。レポーターとしてルシフェラーゼを用いて、本発明者らは、アルブミンシグナル配列によるｍＲＮＡの標的化のし直しが、ＥＲ中で免疫学的に認識可能なタンパク質の合成を伴うことを示した。
【００５３】
結論として、本発明の結果は、安定性と翻訳を維持しながらｍＲＮＡのＥＲへの標的化のし直しが可能であることを示す。
【００５４】
参考文献
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【００６３】
【表１】
0004436563.tif 000002
【００６４】
【表２】
0004436563.tif 000003
【００６５】
【表３】
0004436563.tif 000004
【図１】
0004436563.tif 000005
【図２】
0004436563.tif 000006
【図３】
0004436563.tif 000007
【図４】
0004436563.tif 000008
【図５】
0004436563.tif 000009
【図６】
0004436563.tif 000010