(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−（i）ヒトＴＳＨレセプター（ｈＴＳＨＲ）に対する自己抗体およびヒトＴＳＨの結合に関して天然のヒトＴＳＨＲと同様に挙動する、完全なＴＳＨレセプターのアミノ酸配列、（ii）このアミノ酸配列を伸ばし、かつ、それ自体またはそれに結合したビオチン残基を介して、適切な固体相に選択的に結合されうるペプチド残基、並びに（iii）前記ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列と前記ペプチド残基との間に、適切なプロテアーゼの作用によりＴＳＨレセプターのアミノ酸配列から選択的に除去される挿入された付加的アミノ酸配列を少なくとも有する、組み換え融合ＴＳＨレセプター（融合ＴＳＨＲ）が調製され、
−前記融合レセプターが適切な固体相に結合され、洗浄によって混入成分が除かれ、
−固体相に結合した前記融合レセプターが、ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列に標識部分を直接結合させる反応に処され、
−固体相に結合した前記標識融合レセプターが、固体相に結合した融合レセプター残基から酵素分解によりＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を除去するプロテアーゼで処理され、かつ、
−精製され直接標識された、得られたｒＴＳＨＲ調製物であって、ｈＴＳＨＲに対する自己抗体およびｈＴＳＨの結合に関して天然のヒトＴＳＨＲと同様に挙動するｒＴＳＨＲ調製物が回収される、
ｈＴＳＨＲに対する自己抗体およびｈＴＳＨの結合に関して天然のヒトＴＳＨＲと同様に挙動する、直接標識され、精製された組み換え甲状腺刺激ホルモンレセプター調製物（ｒＴＳＨＲ調製物）の調製方法。
【請求項２】
前記ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列が、ヒトＴＳＨレセプターのアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融合ＴＳＨＲが、ビオチニル化されたビオチンキャリアータンパクペプチド残基と、前記ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列からプロテアーゼＸａによって除去され得る挿入されたアミノ酸配列とを備えるビオチニル化された融合ＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ）であり、かつ、固体相がアビジンまたはストレプトアビジン固体相であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
固体相がストレプトアビジンアガロースであることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
放射性ヨウ素標識されたｒＴＳＨＲ調製物を得るために、固体相に結合した状態の融合ＴＳＨＲが、ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列に放射性ヨウ素同位体の導入を引き起こす反応に処され、かつ反応混合物の未結合の放射性成分が、反応後に固体相に結合した成分から分離されることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
固体相に結合した融合ＴＳＨＲを、それ自体周知の方法でＮａ125Ｉ／クロラミンＴと反応させることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項５または６に従って得られた放射性ヨウ素標識された完全なｒＴＳＨＲ調製物からなる、ＴＳＨレセプター自己抗体の検出剤。
【請求項８】
請求項７定義の放射性ヨウ素標識されたｒＴＳＨＲ調製物からなる、定性的検出または定量的測定のための、ヒト血清または血漿におけるＴＳＨレセプター自己抗体の沈降剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は、精製され任意に標識されたＴＳＨレセプター調製物の調製方法、新規の放射性ヨウ素標識ＴＳＨレセプター調製物、並びに診断および治療における当該調製物の使用に関する。
ホルモンＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）のレセプター、ＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ）は、甲状腺細胞の機能および成長に関して重要な役割を演じる。このレセプターは、リガンド結合に本質的に重要であり、かつシグナル伝達に関わることが証明された大きなＮ末端細胞外ドメインを備えたＧタンパク結合型糖タンパクレセプターのサブファミリーのメンバーである。ＴＳＨＲシグナルの伝達は、主として、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を招くアデニレートシクラーゼの活性化によって媒介される。
ＴＳＨＲに向けられた多くの関心の一部は、甲状腺のハイパーファンクション（hyperfunction）を引き起こし、最も多く見られるヒトの自己免疫疾患の一つであるグレーヴズ病における主要な自己抗原としての役割にある。ＴＳＨＲは、甲状腺細胞の表面に非常に少量だけ（細胞当たり、１０００−１００００のレセプターの量）現れる。
ヒトＴＳＨレセプター（ｈＴＳＨＲ）の化学的構造、すなわちそれをコードするＤＮＡ配列の構造、およびそれから導かれた、レセプター自体のアミノ酸配列の構造は、１９８９年の末に調べられた（Libert F.ら, Biochem. Biophys. Res. Cummun. 165: 1250-1255; Nagayama Y.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1184-1190参照; さらに欧州特許公開第０４３３５０９号公報または国際公開第０９１２１号公報; 並びに国際公開第９１／０９１３７号公報；国際公開第９１／１０７３５号公報および国際公開第９１／０３４８３号公報；さらにYuji Nagayama & Basil Rapoport, in: Molecular Endocrinology, Vol.6 No.2, 145-156頁，およびそこに引用された文献も参照）。そのときから、ｈＴＳＨＲポリペプチドと選択されたそのペプチドフラグメントが多くのシステムにおいて発現され、機能的ＴＳＨＲは、哺乳動物細胞においてのみ、一過性の形態または安定な細胞系の形態の両方において、かつ、アデノウイルスとワクシニアウイルス発現システムの使用を伴って、調製されうることが見出された。自己抗原としてのｈＴＳＨＲが重要であるために、組み換え技術の手段によって得られたｈＴＳＨＲタンパク（ｒｈＴＳＨＲ）を精製するために、近年、多くの努力がなされてきた。
多くの試行錯誤にもかかわらず、今日まで、ＴＳＨＲに対する病原性自己抗体（以下、ＴＳＨＲ−自己−ａｂと省略）と結合するのに十分な量の機能的ｒｈＴＳＨＲタンパクを単離可能にする方法を開発することが実際に可能であること、および、それらを臨床的に検出したことを示す説得力のある実験データは無かった。好結果の精製も、哺乳動物細胞において比較的少量のＴＳＨＲしか発現されないこと、並びにタンパクの機能的不安定性によって妨げられた。
アッセイで用いることのできる精製されたＴＳＨＲ調製物を得る際の困難性に寄与する重要なファクターは、ＴＳＨＲ−自己−ａｂが、ホルモンであるＴＳＨ自体と同様に、見たところ圧倒的に、精製の試みおよび標識化の試みによって容易に損なわれ得る高度のコンホメーショナルエピトープを認識するという事である。
また、標識された、可溶性または分散性のｈＴＳＨＲ抗原が入手不可能であることにより、病原性ｈＴＳＨＲ自己抗体の検出のための臨床的に使用可能な直接的免疫沈降アッセイの開発も妨げられた。
N.G.Morgenthalerら, Exp Clin Endocrinol Diabetes 104（1996）Suppl 4, 56-59頁の研究が、ＴＳＨＲ−自己−ａｂの免疫沈降アッセイを開示していることは事実である。このアッセイでは、35Ｓ−メチオニンの取り込みによって標識された組み換えＴＳＨレセプターの細胞外部分の調製物が、サンプルに存在するＴＳＨＲ−自己−ａｂを沈降させるための試薬として用いられる。係るアッセイは、刺激ＴＳＨＲ−自己−ａｂ（ＴＳＩ）に対しても、またｂＴＳＨと競合するＴＳＨＲ−自己−ａｂ（ＴＢＩＩ）に対しても選択性が無いという固有の利点を有する。しかしながら、インビトロでの翻訳による35Ｓ−標識化レセプターの調製は、極端に複雑かつ高価であり、35Ｓによって放射される放射能の機械的な臨床的測定に適した測定装置がない。この方法は、それゆえ機械的な臨床的診断の測定方法として不適切である。臨床的に使用可能なＴＳＨＲ−自己−ａｂ免疫沈降アッセイについて、慣例的な標識の一つ、特に125Ｉのような放射性同位元素を用いて標識された機能的なｈＴＳＨＲ調製物が必要とされる。しかしながら、このような125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲ調製物は、未だ入手不可能である。
それゆえ、臨床的実施において現在使用可能な唯一のアッセイは、界面活性剤の助けを借りて可溶化されたブタ甲状腺由来のブタＴＳＨＲに対するｂＴＳＨの結合阻害が利用された間接的アッセイである。直接的免疫沈降アッセイは、ＴＳＨＲに結合するがＴＳＨＲとＴＳＨホルモンまたは競争的ｂＴＳＨとの相互作用を妨げないものを含む、ＴＳＨＲに対する全ての自己抗体を検出することを可能にすることから、グレーヴズ病の診断について顕著に有利であろう。
治療における自己抗原ｈＴＳＨＲの適用を試験するための、再現性のある動物実験または臨床試験を可能にする量の十分に純粋なＴＳＨＲ調製物は、今日まで無かった。実際に、Guimaraes VCら, Endocrinology 1996, 137（6）: 2199-2207は、甲状腺自己抗原サイログロブリン（ＴＧ）のマウスへの経口投与により、これが続けて注入されれば、動物実験において前記自己抗原に対するマウスの寛容を顕著に増大することが可能であることを開示している。“70th Annual Meeting of the American Thyroid Association”, 15.-19.10.1997（アブストラクト２０６参照）において、以前に経口投与された自己抗原による細胞性免疫反応の特異的抑制としてそれ自身を現す（manifest）対応する寛容が、経口ＴＧ投与を介してヒトにおいても達成されるらしいことが述べられている。これらの結果は、上記の意味において、治療上の有益性についてＴＧ以外の甲状腺自己抗原を試験することが非常に興味深いことを示唆している。しかしながら、十分な量の高純度の自己抗原が、それぞれこの目的のために必要である。今日まで、このような実験に必要とされる純度／濃度の自己抗原ｈＴＳＨＲを提供する周知の方法はなかった。
かくして、外来のペプチド配列を含まない液体相に得られ、任意に標識された形態、特に放射線標識された形態の、精製された機能的ｈＴＳＨＲの調製方法を提供することが本発明の目的である。
さらに、新規の標識された機能的ｒｈＴＳＨＲ調製物を提供すること、並びに本発明に係る方法で得られる新規の精製され、かつ任意に標識されたｒｈＴＳＨＲ調製物によって達成されるｒｈＴＳＨＲ調製物の新規の診断および治療的使用を提供することも、本発明の目的である。
これらの目的は、請求項１記載の方法、請求項８記載の標識されたｒｈＴＳＨＲ調製物、並びに請求項９、１０および１１に係る使用によって達成される。
請求項１記載の本発明に係る方法の有利かつ現在のところ好ましい実施態様は、従属請求項２ないし７に記載されている。
本発明は、組み換え技術によって産生されたＴＳＨＲ（ｒＴＳＨＲ）、特にヒトＴＳＨＲ（ｒｈＴＳＨＲ）の精製方法および放射線標識方法を提供するものであり、当該方法においては使用された出発材料が、組み換えワクシニアウイルスの使用を伴ってＨｅＬａ細胞において発現され得るように、融合ＴＳＨＲ、特に特許出願PCT/EP97/06121号; “70th Annual Meeting of the American Thyroid Association”, 15.-19.10.1997（アブストラクト８９参照）; およびW B Minich, J D WeymayerおよびU Loos, Thyroid, Vol.8, 3-7頁（1998;出版）に係るビオチニル化された融合ＴＳＨＲである。本発明に従って最初に得られた125Ｉ標識化機能的組み換えｈＴＳＨＲ（125Ｉ−ｒＴＳＨＲ）は、グレーヴズ病患者の未分画の血清における病原性自己抗体の検出および測定のための直接的な免疫沈降アッセイに用いられた。
また、これは、上記の意味においてグレーヴズ病および内分泌眼窩疾患（endocrinal orbitopathy）患者における経口寛容を付与する治療的効力を試験するのに適切であり、かつその試験を意図するものである。
係る適用は、特に内分泌眼窩疾患の発達に関するその効果の形態において、グレーヴズ病における自己免疫工程に有利に影響するのに適しているように見える。
高度に精製され任意に標識された可溶性のＴＳＨＲタンパクの、ここに記載された本発明に係る調製の原理は、自己免疫疾患を引き起こす別の自己抗原、特に単離が困難で敏感な膜結合抗原に相応じて適用されうる。請求項１２は、この本発明のより一般的な態様に関する。
本願の上述および後述する内容において、使用された試薬およびアナライト／生物学的分子は、その特別な前後関係から当業者にとって他に自明でない限り、概して、常に以下の意味を有するものと解される種々の略語によって特徴付けされる。特別な用語は、実施された試験および測定を正確に記述するために用いられるが、この使用は、記述された結果および結論が記述された特別なケースにのみ適用されて、関連する技術的知識の使用と共により一般的に適用され得ないことを意味するものではない。
ＴＳＨ＝甲状腺刺激ホルモン（チロトロピン）。さらに付加することなく略語ＴＳＨが用いられた場合には、特定の産物を指さないが、その代わりに、ホルモンの結合または機能は一般的な形態で議論される。
ｂＴＳＨ＝ウシＴＳＨ（すなわち、ウシから得られたもの）。ＴＳＨレセプターに対する自己抗体を測定するためのアッセイにおける競争物として、特に標識された形態（放射性ヨウ素標識、あるいは化学発光標識、特にアクリジニウム（acridinium）エステル標識で標識された形態）で使用された調製物。
125Ｉ−ｂＴＳＨ＝競争物として用いられた放射性ヨウ素標識ｂＴＳＨ。B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH社のアッセイの記述と関連して、125Ｉ−ｂＴＳＨは、ＤＥ０４２３７４３０Ｃ１またはＥＰ０６６８７７５Ｂ１に従って得られ、かつ、B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH社の商品名TRAK-Assayの一部のような産物を示す。
ＴＳＨＲ＝ＴＳＨレセプター、甲状腺膜に固定された糖タンパクレセプター。さらに付加することなく略語ＴＳＨＲが用いられた場合には、特定の産物を指さないが、その代わりに、レセプターの機能またはその結合におけるその関連は一般的な形態で議論される。
ブタＴＳＨＲ＝ブタの甲状腺から抽出することによって得られた粗製のレセプター調製物。ＴＳＨＲに対する自己抗体を測定するために従来技術の競争レセプター沈降アッセイ（慣例的な、B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH社の商品名TRAK-Assay）における特異的バインダーとして使用。
ｒｈＴＳＨＲ＝少なくとも“機能的ヒトＴＳＨＲレセプター”と見なし得る程度に天然に生じるヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列を備える遺伝学的に操作された（組み換え）ポリペプチドであって、これは、ＴＳＨＲに対する自己抗体またはｈＴＳＨの結合に関して、相当な程度まで、天然に生じるヒトＴＳＨＲと同様に挙動することを意味する。さらに付加することなく略語ｒｈＴＳＨＲが用いられた場合には、特定の産物を指さない、すなわち、ｒｈＴＳＨＲは、組み換えの完全な多かれ少なかれグリコシル化されたポリペプチド、十分な長さの部分的配列、または遺伝学的に操作された融合産物を表してもよい（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１に記述されている）。さらに説明がなければ、単に“ｒｈＴＳＨＲ”と称された産物は、粗製の膜調製物、すなわち界面活性剤の使用を伴う、組み換えポリペプチドを発現するために用いられた細胞の膜を慣例的に可溶化することによって得られた形態で存在する。
ｒＴＳＨＲ＝遺伝学的操作（組み換え）によって産生され、何らかの（ヒトまたは動物の）生物学的起源のＴＳＨＲのアミノ酸配列を有する機能的ＴＳＨＲであり、他に定義すれば、まさに実施例において特別に用いられたｒｈＴＳＨＲとして、調製され、かつ任意に用いられる。
融合ＴＳＨＲ＝天然に生じる機能的ＴＳＨＲのポリペプチド配列を伸ばすアミノ酸配列が付着されたｒｈＴＳＨＲ。
ｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯ＝調製および使用が先の出願ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１に記述されたビオチニル化融合ＴＳＨＲ。
ｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ＝プロテアーゼＸａ（ファクターＸａ）の攻撃点が挿入されて伸びたｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯ。
ｒｈＴＳＨＲ（純粋）＝固体相に結合されたｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯのプロテアーゼＸａによる切断によって得られた、精製された機能的ｒｈＴＳＨＲ調製物。
125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲ＝固体相に結合され、この状態で放射性ヨウ素標識ｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯのプロテアーゼＸａによる切断によって得られた、放射性ヨウ素標識ｒｈＴＳＨＲ調製物。
ａｂ＝抗体。
ＴＳＨＲ−自己−ａｂ＝生物学的サンプル、特にヒト血清または血漿において検出可能なＴＳＨレセプターに対する自己抗体。これらの検出は、特異的甲状腺自己免疫疾患に関係し得る。刺激ＴＳＨＲ−自己−ａｂ（文献においてもＴＳＩ＝甲状腺刺激イムノグロブリンと省略される）の検出は、グレーヴズ病の診断に特に重要である。ＴＳＨＲ−自己−ａｂの測定用の商業的アッセイ（放射線レセプターアッセイ）は、B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH社の商品名TRAK-Assayである。
組み換えワクシニアウイルスの使用を伴うＨｅＬａ細胞におけるビオチニル化ｒｈＴＳＨＲ（ｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯ）の発現は、先に公開されていない先の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１またはThyroid 1998の上記刊行物に記載されている。前記二つの刊行物の内容は、本願記述を補助するために特別に参照としてここに含める。ビオチニル化融合ＴＳＨＲ（ｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯ）は、ＴＳＨＲの実際のポリペプチド部とその残部との間でビオチンと結合し、プロテアーゼ、すなわち本願のケースではプロテアーゼＸａのインターフェイスを有する、修飾されたビオチニル化ＴＳＨレセプターを調製するために用いられた。この修飾されたビオチニル化ｒｈＴＳＨＲ（ｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ）は、融合レセプターｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯについて記述したように固定化されうる。
ストレプトアビジンがビオチンに対して並外れて高い親和性（Ｋdは約１０-15Ｍ）を有し、最も強い、周知の、タンパクとリガンドとの間の非共有結合を示すので、ビオチニル化されたＴＳＨ融合レセプターは、ストレプトアビジンアガロースに非常に効果的に結合される。固定化された形態で、ビオチニル化融合ＴＳＨＲは、例えば125Ｉを用いて放射性ヨウ素標識され、かつ、固体相に対して放射性ヨウ素標識タンパクが固定されているために、タンパクを失うことなく、非特異的な残余放射能が洗浄により容易に除去されうる。固定化されたｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯのｒｈＴＳＨＲポリペプチド部がクロラミンＴ／Ｎａ125Ｉ法によって放射性ヨウ素標識され得ることが見出された。
放射性ヨウ素化の別の既知の方法、特にこの種のより緩やかな方法も、適切であろう。例えばバッファーの置換、レセプター安定化溶液成分、例えばＢＳＡ等の添加による、次なる使用に必要な反応媒体への変更は、放射性ヨウ素化された125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲのタンパク分解除去（“分解”）の段階において簡単な方法で達成され得る。
ビオチニル化されたタンパクとアビジンまたはストレプトアビジンとの間の極端に強い結合のために、結合したビオチニル化タンパクを固体相から取り外すことは通常困難である。ビオチニル化融合レセプターに特別に挿入されたプロテアーゼインターフェイスの使用を伴う本発明に従って用いられた分離は、清潔かつ選択的な方法でｒｈＴＳＨＲ（純粋）の分離を可能にする。使用されたプロテアーゼ、ファクターＸａは、高度の特異性でテトラペプチド配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ後のペプチド結合の選択的切断を行うセリンプロテアーゼである（Nagai, KとThogersen, H.C.（1987）, Methods Enzymol. 153, 461-469参照）。固体相に結合している固定化されたレセプター（ｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ）からの除去によって得られた125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲは、グレーヴズ病患者の血清の免疫沈降分析用に用いられた。ＴＳＨレセプターに対する病原性自己抗体の直接的免疫沈降アッセイが得られることが見出された。ホルモンＴＳＨ（ｂＴＳＨ形態）を用いた自己抗体の競争に基づくものではないので、沈降アッセイは、ｂＴＳＨと競争しうる能力とは別にＴＳＨＲ−自己−ａｂを検出することが可能である。
（ａ）ストレプトアビジンアガロースにおけるｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯの固定化、および（ｂ）プロテアーゼＸａを用いた、結合したＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯの選択的切断といった、二つの連続する高度に選択的な精製工程の組み合わせにより、以前には知られていなかった純度であって、全てのまたは少なくとも殆どの不純物を含まないｒｈＴＳＨＲポリペプチドを含む産物が生じる（ｒｈＴＳＨＲ（純粋））。固定化段階でｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯの放射性ヨウ素化後、切断することにより、直接的に放射性ヨウ素標識されたｒｈＴＳＨＲ（125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲ）を含む調製物が生じる。
以下に、本発明を、図面を参照しながら調製および使用例に基づいてより詳細に例証する。ヒトＴＳＨＲの配列の代わりに、動物ＴＳＨＲの配列も発現され、精製された形態で調製され得ること、並びに本発明の一般的な教示がヒトＴＳＨＲの性質をおびた材料に限定されないことは、当業者にとって自明である。
図面（図１）は、プロテアーゼＸａの作用のもとでストレプトアビジンに固定化されたＴＳＨＲ−ＢＩＯ（−〇−）またはＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ（−●−）の挙動を示す。示された各測定点は、互いに近い二重測定の各測定結果の平均値を示す。
材料と方法
材料
測定に使用された125Ｉ−ｂＴＳＨ（５６μＣｉ／μｇ）および商品名TRAK-Assayキットは、B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH社, Berlinから供給された。ストレプトアビジンアガロースは、Sigma社の商品として入手された。プロテアーゼＸａ（ファクターＸａ）は、Bohringer Mannheim社から入手された。ＤＮＡプライマーＰ１（5’GTCGGTTACCATGAAGGCCGCATGGAAGCGCCAGCAGCAG-3’）およびＰ２（5’-CGCGGATCCTTATTCGATAACAACAAGCGGTTC-3’）は、Interactiva社から入手された。
細胞培養
ＨｅＬａ細胞は、１０％胎児ウシ血清および１ｍＭビオチンが添加されたダルベッコ修飾イーグル培地中で培養された。細胞は、３７℃の５％ＣＯ2大気中で培養された。
ｈＴＳＨＲビオチンｃＤＮＡ配列に対するＸａプロテアーゼのインターフェイスの添加
プラスミドｐ７．５Ｋ１３１−ＴＳＨＲ−ＢＩＯ（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１参照）は、大腸菌（E.coli）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのビオチンカルボキシルキャリアータンパク（ＢＣＣＰ）サブユニットの８７アミノ酸の長さを備えたＣ末端ドメインに結合したヒトＴＳＨレセプターのＮ末端７２５アミノ酸の配列を含む（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１、実験シリーズＢ参照）。ＢＣＣＰ配列は、ＰＣＲ技術を用いて、かつ、プライマーＰ１（BstEIIインターフェイスとＸａプロテアーゼインターフェイスの配列を有する）およびプライマーＰ２（停止コドンとBamHI制限部位を有する）を用いて増加され、BstEII-BamHI-PCRフラグメントが得られた。ｐ７．５Ｋ１３１−ＴＳＨＲ−ＢＩＯプラスミドは、制限酵素BstEIIおよびBamHIを用いて切断され、BstEII/BamHIフラグメントが除かれ、BstEII/BamHI−ＰＣＲフラグメントで置換され、その結果、新しいワクシニア組み換えプラスミドｐ７．５Ｋ１３１−ＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯが得られた。
ワクシニアウイルス組み換え体の産生
ＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ−ｃＤＮＡ（ｐ７．５Ｋ１３１−ＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯプラスミド由来）は、先の出願ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１に詳細に記載されているように、相同的組み換えによって、野生型ワクシニアウイルス株Copenhagenのゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入された。
ＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ抽出物の調製
７５ｃｍ2プレートにおいて培養された融合性ＨｅＬａ細胞（約２０ｘ１０6細胞）は、細胞当たり一のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の組み換えワクシニアウイルスを用いて感染され、３７℃で２４時間インキュベートされた。感染細胞はリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を用いて洗浄され、１５００ｒｐｍで回収され、ペレット化された。得られた細胞を、凍結および解凍を伴って、０．３ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ  ＫＯＨ；ｐＨ７．５；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％Ｔｗｅｅｎ２０；１０％グリセロール）中に溶解した。得られた懸濁液を３００００ｇで１時間遠心し、上清（約８ｍｇ／ｍｌの全タンパク）を回収し、遊離のビオチンを除去するためにバッファーＡ溶液に対して一晩中透析した。
融合ＴＳＨレセプターｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯ（ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１参照）から出発して、完全な形態であれば７６４アミノ酸を含むヒトＴＳＨＲのＮ末端７２５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列は、かくして、４つのアミノ酸を含むＸａプロテアーゼインターフェイス、および大腸菌アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのビオチンカルボキシルキャリアータンパク（ＢＣＣＰ）サブユニットの８７アミノ酸を含むＣ末端ドメインをコードするＤＮＡ配列に接続された。ワクシニアウイルス発現システムの使用を伴って、対応する融合タンパク（ｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ）は、ビオチニル化融合ＴＳＨＲ（ｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯ）について以前に記載（ＰＣＴ／ＥＰ９７／０６１２１参照）されたのと同様に、ＨｅＬａ細胞において発現された。組み換えウイルスを用いて感染されたＨｅＬａ細胞は、細胞当たり約１２００００分子のｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯを発現した。発現されたレセプターは完全に機能的であり、すなわちＴＳＨと相互作用し、ｃＡＭＰ刺激試験で活性であることを証明した。付着したビオチン残基を介して、組み換え融合レセプターｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯの９０％より多くの分子が、ストレプトアビジンアガロースに対して約２．５から１（ｍｌ／ｍｌ）の比率でストレプトアビジンアガロースに結合した。
ｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯタンパクにおけるプロテアーゼＸａのインターフェイスは、Ｘａプロテアーゼを用いた切断に完全に利用されやすいことが見出された。この結果は図１に示されている。ストレプトアビジンアガロースに結合したビオチニル化ｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯは、洗浄によって混入タンパクを除去した後に、その125Ｉ−ｂＴＳＨ結合活性を測定することによって定量的に測定された。図１に示されているように、Ｘａプロテアーゼを用いた処理が、ストレプトアビジンアガロースからのｂＴＳＨ−結合レセプタータンパクの除去を完全なものとした。対照的に、Ｘａプロテアーゼのインターフェイスの無いビオチニル化ＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ−ＢＩＯ）は、広い範囲のプロテアーゼ／基質比にわたってＸａ分解に対して反応しなかった。
タンパク分解により得られた125Ｉ−ｒｈＴＳＨレセプターの精製および標識化
３段階の方法が、組み換えワクシニアウイルスを用いて感染したＨｅＬａ細胞から出発した放射化学的に純粋な125Ｉ−標識化ｒｈＴＳＨＲを得るために用いられた。他に説明がなければ、全ての操作が４℃で行われた。ｒｈＴＳＨＲタンパクの量は、その125Ｉ−ｂＴＳＨ結合活性に基づいて各ステージにおいて評価された。
ステージ１：ストレプトアビジンアガロース上へのビオチニル化ＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯの固定化
ＨｅＬａ細胞からの５ｍｌのＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ抽出物が、バッファーＡで平衡化された０．５ｍｌストレプトアビジンアガロースカラムに通された。混入タンパクを取り除くために、このカラムを１００ｍｌのバッファーＡと５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて洗浄した。上記比率の吸着剤に対する抽出物において、約５０％のＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯ融合タンパクがストレプトアビジンアガロースに結合した。出発抽出物と通過後の画分との間の125Ｉ−ｂＴＳＨ結合能力の差異は、約６５０００ｃｐｍであった。
ステージ２：ストレプトアビジンアガロースに結合したＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯタンパクの125Ｉ標識化
結合したＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯタンパクを備えたストレプトアビジンアガロースをエッペンドルフチューブに移し、１ｍＣｉのＮａ125ＩとクロラミンＴ（終濃度が０．００５ｍｇ／ｍｌとなるまで）を添加した。対照実験は、この量のクロラミンＴが、固定化されたｒｈＴＳＨＲ−Ｘａ−ＢＩＯタンパクのＴＳＨ結合活性に負の影響を与えないことを示した。１ｍｌの全体量を有する混合物を、室温で１分間振り混ぜながらインキュベートした。反応は、２μｇのジチオトレイトールを添加して停止させた。この樹脂をカラムに移し、未結合の放射性物質を除去するために、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）および１００ｍｌのバッファーＡを用いて洗浄した。
ステージ３：Ｘａプロテアーゼを用いたストレプトアビジンアガロースからの125Ｉ−標識化ｒｈＴＳＨレセプターの除去
結合したタンパクを有する、ステージ２から得られたストレプトアビジンアガロースを、３ｍｌのバッファーＢ（５０ｍＭのtris ＨＣｌ；ｐＨ８．０；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＣａＣｌ2；１％のTriton X-100；１０％グリセロール；３ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）を用いて洗浄した。125Ｉ標識化ｒｈＴＳＨＲを、４℃で１２時間のコースで、３μｇのプロテアーゼＸａを含む１２５ｍｌのバッファーＢを用いてカラムマトリックスの連続的攪拌を行いながらインキュベートすることによって溶出した。この懸濁液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲを含むその上清を回収した。得られた125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲは、Sephadex G-25上でスピン濾過を行うことによって、低分子量の125Ｉ−含有物質（おそらくＮａ125Ｉ）が除かれた。この目的のために、１．２５ｍｌのタンパク溶液が、バッファーＢで平衡化された６．５ｍｌのSephadex G-25カラムに添加された。このカラムを２０００ｒｐｍで５分間遠心し、流れ出た（１．２５ｍｌ）125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲ調製物を指す画分が等分され、−７０℃に貯蔵された。
このようにして、０．６ｘ１０6ｃｐｍの125Ｉ−ｈＴＳＨＲタンパクが単離された。対照実験（Ｎａ125Ｉが無いこと以外は同じ条件下で行われた）は、単離されたレセプターが、約４００００ｃｐｍの125Ｉ−ｂＴＳＨを結合した状態で活性であることを示した。非特異的相互作用は、１０-7ＭのＴＳＨの存在下で測定され、全結合の＜１０％であった。ｂＴＳＨ結合活性の測定は、ｒｈＴＳＨＲの収量が、元の細胞抽出物における融合ｒｈＴＳＨＲの約３０％であり、かつ、ストレプトアビジンアガロースに固定化された融合ｒｈＴＳＨＲの約６０％であったことを示唆した。（１）５ｍｌ抽出調製物に用いられた細胞量、（２）細胞当たりのレセプターの数、および（３）抽出調製物におけるｒｈＴＳＨＲの収量を考慮すれば、単離された125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲの量および比放射能が概算されうる。１−２μｇおよび０．１から０．３Ｃｉ／ｇの範囲（０．１から０．３ｘ１０5Ｃｉ／ｍｏｌ）とされる。
125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲのＳＤＳ電気泳動は、もっぱら分子量約９０ｋＤＡの一つのバンドを示し、これはｒｈＴＳＨＲの期待された分子量と一致する。
免疫沈降分析
免疫沈降実験を行うために、１０μｌの125Ｉ−ＴＳＨＲ（約４０００ｃｐｍ）を２．５μｌの患者の血清と混合し、室温で２時間インキュベートした。バッファーＡ中に平衡化されたプロテインＡアガロースを添加し（２．５μｌのベッドボリュームの懸濁液）、室温で１時間インキュベートした。上清の除去後、この樹脂を、遠心しながら０．３ｍｌのバッファーＡを用いて洗浄し、ペレットのガンマ放射線をカウントした。この結果は、結合した放射能の形態で得られた（ｃｐｍ）。
125Ｉ−ｂＴＳＨとＴＳＨＲ−自己−ａｂの結合アッセイ
免疫沈降分析の参考値を得るために、競争放射線レセプター沈降アッセイを以下のように実施した。125Ｉ−ｂＴＳＨの結合、並びに、それと競合し、患者の血清から得られたＴＳＨＲ−自己−ａｂの、可溶化されたブタＴＳＨＲ（または可溶化および固定化されたｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯ）に対する結合は、製造元の指示に従って商品名TRAK-Assayキットを用いて実施した。このアッセイは、２００μｌの全体量中で行われ、これは５０μｌのブタＴＳＨＲ溶液、５０μｌのテスト血清または標準ヌル血清（null serum）、および１００μｌの125Ｉ−ｂＴＳＨ溶液（約２５０００ｃｐｍ）から構成されている。インキュベーションは、室温で２時間実施され、形成された125Ｉ−ｂＴＳＨ−ブタＴＳＨＲ複合体は、２ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することによって沈降され、２０００ｇで１０分間遠心することによって単離され、得られたペレットのガンマ放射線がカウントされた。この結果は、放射能濃度プロフィール（商品名TRAK-Assayキットからの０、５、１５、４５、１３５および４０５単位／リットルを用いて標準血清を用いて得られた、標準置換曲線）を用いて単位／リットルで表示された。非特異的相互作用は、１０-7ＭのＴＳＨの存在下で測定され、全結合の＜１０％であった。
固定化されたｒｈＴＳＨＲの場合には、ストレプトアビジンアガロースに結合したｒｈＴＳＨＲ−ＢＩＯの５０μｌの２０％懸濁液がレセプター調製物として使用されたこと以外は、125Ｉ−ｂＴＳＨ結合アッセイを上述のように実施した。この混合物は、連続的に攪拌しながら室温で２時間インキュベートされた。上清を除去した後、この樹脂を遠心しながら０．３ｍｌのバッファーＡを用いて洗浄し、ペレットのガンマ放射線をカウントした。非特異的相互作用は、１０-7ＭのＴＳＨの存在下で測定され、全体の結合の＜１０％であった。
125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲを用いた患者血清中のグレーヴズ病の自己抗体（ＴＳＨＲ−自己−ａｂ）の検出
上述のように得られた125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲ調製物は、免疫沈降分析によりグレーヴズ病患者の血清において病原性自己抗体を検出するために用いられた。反応混合物は、各ケースにつき、患者の試験血清、125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲおよびプロテインＡアガロースを含む。インキュベーション期間の最後に、形成された免疫沈降物が遠心により単離され、得られたペレットのガンマ放射線が測定された。測定された放射線は、独立に上記の別の方法（B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH社の商品名TRAK-Assay）によって患者の血清において測定したように、患者の血清中のＴＳＨＲ−自己−ａｂの量に比例した。免疫沈降アッセイの結果と商品名TRAK-Assayの結果との間の明確で疑いのない相関関係は、異なる発病度のグレーヴズ病患者の５２の血清に見出され、健常者の５１の血清に見出された。125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲの使用を伴う免疫沈降アッセイにおいて、グレーヴズ病患者の全ての血清が陽性であると測定され（５００から１０００ｃｐｍの範囲の結合）、添加された125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲの２５％までが沈降された。この反応において用いられた自己抗体の濃度は、高度に陽性のグレーヴズ患者の血清（２２０Ｕ／ｌ）を用いた商品名TRAK-Assayを用いて得られた直線的な結合曲線に対応する。対照血清は、１００から５００ｃｐｍの範囲ではより低い効率で125Ｉ−ｒｈＴＳＨＲと結合する。
特筆すべきは、125Ｉ−ＴＳＨＲ結合能力に関する大きな差異が、異なる対照サンプルにおいて見出されたことである。もし係る差異を、ｒｈＴＳＨＲに結合するが競争アッセイのデザインにおいてｂＴＳＨＲのｒｈＴＳＨＲに対する結合に逆の影響を与えない自己抗体の存在に帰することができるならば、グレーヴズ病の病原に関する上記抗体の重要性はさらに詳細に調べられるべきである。
【図１】
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