(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＩＧＦ１型受容体と同等の親和性でＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと結合することができる改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子であって、ヒトＩＧＦＢＰ−２分子における１１４−１７０のアミノ酸が欠失している点でヒトＩＧＦＢＰ−２分子とは異なるものである改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子。
【請求項２】
ヒトＩＧＦＢＰ−２分子における１８０、１８１、２２７、２３４、および２３７のうち１つまたは複数の位置にあるリシンが中性アミノ酸または酸性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子。
【請求項３】
１８０、１８１、２２７、２３４、および２３７のうち１つまたは複数の位置にあるリシンがアラニンに置換されている、請求項２に記載の改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子。
【請求項４】
１８０および１８１の位置にあるリシンがアラニンに置換されている、請求項２に記載の改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子。
【請求項５】
２３４の位置にあるリシンがアラニンに置換されている、請求項２に記載の改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子。
【請求項６】
１８０、１８１および２３４の位置にあるリシンがアラニンに置換されている、請求項２に記載の改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子。
【請求項７】
少なくともＩＧＦ１型受容体と同等の親和性でＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと結合することができる改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子をコードする、単離された核酸分子であって、前記改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子が、ヒトＩＧＦＢＰ−２分子における１１４−１７０のアミノ酸が欠失している点でヒトＩＧＦＢＰ−２分子とは異なるものである、核酸分子。
【請求項８】
前記ヒトＩＧＦＢＰ−２分子における１８０、１８１、２２７、２３４、および２３７のうち１つまたは複数の位置にあるリシンが中性アミノ酸または酸性アミノ酸に置換されたものである、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子が、１８０、１８１、２２７、２３４、および２３７のうち１つまたは複数の位置にあるリシンがアラニンに置換されたものである、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子が、１８０および１８１の位置にあるリシンがアラニンに置換されたものである、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
前記改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子が、２３４の位置にあるリシンがアラニンに置換されたものである、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子が、１８０、１８１および２３４の位置にあるリシンがアラニンに置換されたものである、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項７〜請求項１２のいずれか一項に記載の核酸分子を保持する宿主細胞。
【請求項１４】
癌性細胞集団のＩＧＦに媒介された増殖を低減する方法であって、前記細胞集団を請求項１から６のいずれか一項に記載の改変ヒトＩＧＦＢＰ−２分子に接触させる工程を含む方法（ヒトに対する治療を除く）。
【請求項１５】
前記癌性細胞が前立腺、結腸および乳癌細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の癌性細胞集団のＩＧＦに媒介された増殖を低減する方法。
【請求項１６】
前記癌性細胞が結腸癌細胞である、請求項１４に記載の癌性細胞集団のＩＧＦに媒介された増殖を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）放出特性が低減された改変インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）に関する。本発明のＩＧＦＢＰは、ある種の癌の治療など、治療目的において有用であることが提案される。本発明の具体的な形態は改変ＩＧＦＢＰ−２に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、多様な種類の細胞においてタンパク質同化（anabolic）活性、分裂促進（mitogenic）活性および抗アポトーシス活性を媒介する小形で高い関連性のある蛋白質（約７．５キロダルトン）である。これらの作用は、ＩＧＦが１型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ１Ｒ）と相互作用しこれによってＩＧＦ１Ｒが活性化されることの結果として生じる（Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ、（１９９８）、Ｂａｓｅｒｇａ、１９９９）。第２の関連しない受容体（２型ＩＧＦ受容体あるいはＩＧＦ２Ｒ）は、インターナリゼーションと分解とによるＩＧＦ−ＩＩレベルの調節という主要機能を有し（Ｗａｎｇら、１９９４）、最近の証拠は、ＩＧＦ２ＲがＩＧＦ−ＩＩ依存性腫瘍の腫瘍サプレッサーとして作用することを示唆している（Ｂｒａｕｌｋｅ、１９９９）。
【０００３】
ＩＧＦは、肝臓で産生されて循環性ＩＧＦとなるほか、ほとんどの組織で局所的に分泌される。６つの高親和性ＩＧＦ結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ−１から−６）のファミリーは、（主として、ＩＧＦＢＰ−３・ＡＬＳ・ＩＧＦ複合体として）血液循環中のＩＧＦの半減期を延ばすとともに、ＩＧＦを標的組織へ輸送する作用を有する。標的組織内で、ＩＧＦＢＰはＩＧＦの作用を増大したり阻害したりすることができる。ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦの相互作用を、ＩＧＦ１Ｒへの結合を遮断することによって阻害することができる。しかし、ある状況下では、ＩＧＦＢＰはＩＧＦを放出することができ、これによってＩＧＦをＩＧＦ１Ｒに結合可能にする。これは、ＩＧＦ作用の増大効果をもたらす。この放出機序は、１）ＩＧＦＢＰの蛋白質加水分解と、２）ＩＧＦＢＰの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への結合とを含み、どちらもＩＧＦに対する親和性を低減させる。細胞外マトリックス結合はまた、ＩＧＦを細胞表面の近傍すなわちＩＧＦ１Ｒの近くに局在させることを支援すると考えられている。ＩＧＦＢＰの活動の成果は、局所的な蛋白質加水分解活性とＩＧＦＢＰのＥＣＭへの結合とのバランスで制御される。
【０００４】
多くの証拠（ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ）が、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）およびＩＧＦ結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）が癌に関与していることを示している。多くの腫瘍細胞（前立腺および乳房など）は、それらに対応する正常な細胞に比べてより多くのＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦＢＰ−２を分泌し、それらの血清中レベルは通常、癌が進行するにつれて上昇する（Ｃｏｈｅｎら、（１９９４）；Ｔｈｒａｓｈｅｒら、（１９９６）；Ｈｏら、（１９９７）；Ｃｈａｎら、１９９８）。腫瘍細胞から分泌されたＩＧＦは１型ＩＧＦ受容体に結合し、腫瘍形成および転移を強化する（ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉら、２０００）。
【０００５】
ＩＧＦＢＰ−２の蛋白質加水分解は、多くの正常および異常な生理的条件のもとで検出されている。例えば、ＩＧＦＢＰ−２断片がヒトの乳において検出されており、切断は、Ｎ−およびＣ−ドメインの間のリンカー領域において発生し、主としてｈＩＧＦＢＰ−２の１６８残基および１８０／１８１残基のサイトを含む（ＨｏとＢａｘｔｅｒ、１９９７；Ｅｌｍｉｎｇｅｒら、１９９９）。蛋白質加水分解されたＩＧＦＢＰ−２はまた、妊娠期間において血清中で確認される。ＩＧＦＢＰ−２はまた、癌細胞によって産生されるプロテアーゼによっても切断される（Ｍｉｃｈｅｌｌら、１９９７）。この特異的癌細胞プロテアーゼは、その特性について十分には明らかにされていないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前立腺上皮細胞によって産生されたカテプシンＤがＩＧＦＢＰ−２を分解することが示されている（Ｋａｎｅｔｙら、１９９３；Ｎｕｎｎら、１９９７）。ＩＧＦＢＰ−２の優先的な蛋白質加水分解が、結腸癌（Ｍｉｃｈｅｌｌら、１９９７）および神経芽腫細胞（Ｍｅｎｏｕｎｙら、１９９７）において実証されている。特異的切断部位は、癌プロテアーゼによる蛋白質加水分解産物については未だ記述されていない。
【０００６】
ＩＧＦＢＰ−３、−４および−５の配列においては、プロテアーゼ切断部位が同定されている。蛋白質加水分解は、通常はこれら蛋白質のリンカー領域内で起きるが、Ｃ−ドメインでも起こりうる。プロテアーゼ抵抗性ＩＧＦＢＰ−４およびＩＧＦＢＰ−５（Ｉｍａｉら、１９９７）が、切断部位の特異的残基を変異させることによって、あるいはいくつかのリンカー領域の残基を欠失させることによって生成された（ＩＧＦＢＰ−４では１２１−１４１の欠失によって、妊娠期の血清中のあるプロテアーゼに対して抵抗性になった（Ｂｙｕｎら、２０００））。
【０００７】
ＩＧＦＢＰ−２は、ヒト線維芽細胞外膜の調製物（Ａｒａｉら、１９９６）とグリコサミノグリカン（Ｒｕｓｓｏら１９９７、Ａｒａｉら、１９９６）とに結合する。ＩＧＦＢＰ−２配列内には２つの潜在的なマトリックス結合部位がある。最近の証拠は、ｈＩＧＦＢＰ−５の２０１〜２１８残基に対応するｈＩＧＦＢＰ−２の塩基性領域（２２７〜２４４残基）が、マトリックス結合の部位として作用するかもしれないことを示唆している（Ａｒａｉら、１９９６）。ｈＩＧＦＢＰ−５の２０１〜２１８残基（マトリックス結合に重要であるとして知られている残基）（Ａｒａｉら、１９９６）に基づく合成ペプチドの使用は、ＩＧＦＢＰ−２のヘパリンセファロースへの結合を阻害した。Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎら（１９９４）は、ＣａｒｄｉｎとＷｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８９）によって記述された短いＧＡＧ結合コンセンサス配列に基づいてＩＧＦＢＰ−２におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位を予想した。このｈＩＧＦＢＰ−２の１７９〜１８４残基の位置のＸＢＢＸＢＸ（Ｂ＝塩基性、Ｘ＝不定）モチーフは、中央ドメインに存在する。このモチーフがＧＡＧ結合において何らかの役割を果たすという公表された証拠はない。
【０００８】
この明細書において、用語「含む、有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含むがそれに限定されない」を意味し、用語「含む、有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」はそれに対応する意味を有する。また、この明細書内における文献の参照は、その文献の開示内容がオーストラリアの一般的な知識であると認めるものとして理解されるべきではない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの放出を阻害する形でのＩＧＦＢＰ−２の改変から得られたものである。この放出阻害は、ＩＧＦＢＰ−２への変化の導入によって、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への結合性が低減され、かつ１種類または複数種類のプロテアーゼによる蛋白質加水分解に対する感受性が低減されることの結果として生じる。この改変ＩＧＦＢＰ−２は、結腸癌、前立腺癌、乳房癌など、ＩＧＦ依存性腫瘍の成長を阻害する能力のために有用であると提案されている。改変ＩＧＦＢＰが、低減されたＥＣＭ結合性と低減された蛋白質加水分解感受性との両者を含むように構築されたのは、本発明者の知るところでは、これが初めてであり、さらに、この組合せがＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの放出の阻害に効果的であると示されたのも、これが初めてである。このアプローチは、ＩＧＦＢＰ−２のみならず他のＩＧＦＢＰにも効果的であることが提案されている。また、本発明者の知るところでは、ＩＧＦＢＰ−２の２つのＥＣＭ結合部位の位置を示す実用的なデータが得られ、かつ、これらが蛋白質加水分解部位の改変とともにＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの放出の阻害をもたらすことが示されたのも、これが初めてである。さらに、本発明者の知るところでは、重なり合ったＩＧＦおよびＥＣＭ結合部位が、ＩＧＦ結合は依然として許容するがＥＣＭ結合は許容しない形で改変されたのはこれが初めてである。
【００１０】
それゆえに、本発明は、第１の広義の態様では、細胞外マトリックスとの接触またはプロテアーゼへの曝露時のＩＧＦ放出の阻害によって特徴付けられる、高い親和性でＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと結合することができる改変ＩＧＦＢＰ−２分子にあるといってもよい。
【００１１】
本発明の第１の態様の第２の形態では、細胞外マトリックスとの接触またはプロテアーゼへの曝露時のＩＧＦの放出の阻害によって特徴付けられる、高い親和性でＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと結合することが可能な改変ＩＧＦＢＰ分子にあるといってもよい。
【００１２】
切断ＩＧＦＢＰ−２では、ＩＧＦに対する親和性が１０分の１未満に低下している（Ｃａｒｒｉｃｋ、２００１）。改変ＩＧＦＢＰ−２は、少なくとも、ＩＧＦ−Ｉに対して、天然のＩＧＦＢＰ−２のＩＧＦ−Ｉに対するそれと比べて１０分の１の低さであるＩＧＦ１型受容体と同等の親和性を有することが必要であることが望ましい。これによって、ＩＧＦ結合において受容体との効果的な競合が可能になり、ＩＧＦの高親和性結合という語は、その文脈において理解されるべきである。
【００１３】
ＩＧＦ結合に必要な領域は十分には解明されていないが、これらの領域を決定するために多くの努力がなされている。例えば、我々（Ｈｏｂｂａら、１９９８）および他の人たち（Ｚｅｓｌａｗｓｋｉら、２００１）は、ＩＧＦ結合に関与するＮ−ドメインの末端部分の残基を同定した。同様に、ＩＧＦ結合に必要なＩＧＦＢＰ−２の最小Ｃ−ドメイン長が記述されている（Ｆｏｒｂｅｓら、１９９８）。ＷＯ００／２３４６９においても、ＩＧＦ結合ドメインについて述べられており、この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＩＧＦ結合を分析するための複数の方法が、当該技術分野において知られており、改変ＩＧＦＢＰがＩＧＦに結合することができるか否かを確認するために容易に用いることができる。
【００１４】
本発明者は、ＩＧＦＢＰ−２について２つのＥＣＭ部位を同定し、これら部位内の変異がヘパリン結合性の低下に繋がることを示した。ＩＧＦＢＰ−２についての第１のＥＣＭ部位は、配列１７９〜１８４にわたっており、配列ＰＫＫＬＲＰ［配列番号１］からなり、これは最初にマトリックス結合蛋白質に対するコンセンサス配列（すなわちＸＢＢＸＢＸ、Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎら、１９９４）との相同性に基づいて提案された。同定されたＩＧＦＢＰ−２の第２のＥＣＭ結合配列は、ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−５との相同性から２２７〜２４４であり、配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲ［配列番号２］からなる。適当な参照配列は配列データベースから入手可能である。このように、ヒトＩＧＦＢＰ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ配列データベースから登録番号 (accession number) ＮＭ０００５９７としてアクセスしてもよい。適当なアミノ酸配列の推定はヌクレオチド配列から予測することができる。
【００１５】
第１の態様の第３の形態において、本発明は、高い親和性でＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと結合することが可能な改変ＩＧＦＢＰ−２分子であって、前記ＩＧＦＢＰ−２分子は両方のＥＣＭ結合部位内のいずれか１つまたは複数のアミノ酸に改変を有し、第１のＥＣＭ結合部位は配列１７９から１８５に位置し、第２のＥＣＭ結合部位は配列２２７から２４４に位置し、前記改変は別々におよび共同してＩＧＦＢＰ−２のＥＣＭへの結合を阻害するものであるＩＧＦＢＰ−２分子にあるといってもよい。
【００１６】
好ましくは、２２７と２３６の間の残基は、置換変異である。この部位の少なくとも一部分はＩＧＦ結合に重要であるかもしれないと考えられているためである。これに対し、１７９〜１８５の改変は、欠失、逆位、置換またはその他の総体的な改変によって達成してもよいが、アミノ酸置換によって改変されることが好ましい。
【００１７】
一般的に、塩基性アミノ酸を別の性質の、すなわち中性または酸性のアミノ酸で置換すると、一般的にマトリックス結合性モチーフ（matrix binding motifs）への攪乱が見られる。
【００１８】
これまでにＩＧＦＢＰ−２に導入された変異を利用して、２つのＥＣＭ部位のうちの１つを改変するだけではＥＣＭ結合を完全に破棄するために十分ではないことが本発明者によって確認されている。本発明は好ましくは両方のＥＣＭ部位に改変を提供しているが、一方で、本発明は、ＥＣＭ結合部位のうちの一方のみにおける改変を、おそらくは、改変されたプロテアーゼ切断および／または結合部位との組合せで、提供することも含むことができる。
【００１９】
下に掲げたのは、６つのＩＧＦＢＰすべてについてのＥＣＭ結合部位であると示されたまたは提案された配列である。
【００２０】
ＥＣＭ結合部位（１４番目と１６番目のシステイン残基の間のＣ−ドメインに存在）
IGFBP-3  CDKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFC [配列番号３]    (Firth, 1998)
IGFBP-5  CDRKGFYKRKQCKPSRGRKRGIC [配列番号４]    (Arai, 1996b)
IGFBP-2  CDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGEC [配列番号５]
*      *  *      *
IGFBP1  CNKNGFYHSRQCETSMDGEAGLC [配列番号６]
IGFBP4  CDRNGNFHPKQCHPALDGQRGKC [配列番号７]
IGFBP6  CDHRGFYRKRQCRSSQGQRRGPC [配列番号８]
＊＝保存された正帯電残基
【００２１】
ＩＧＦＢＰ３とＩＧＦＢＰ５についての部位は以前に公表されており、本データはＩＧＦＢＰ−２についての結合部位を決定するものであり、ＩＧＦＢＰ１、４および６についての該部位はアミノ酸アラインメントに基づいて提案されている。
【００２２】
本発明はまた、ＥＣＭ結合部位が改変された改変ＩＧＦＢＰ−１、−４または−６も含むことができる。
【００２３】
あるいは、本発明のこの第１の態様において、ＩＧＦの放出の満足のいく低減を、第２のＥＣＭ結合部位でのアミノ酸置換によるＥＣＭ結合の阻害のみによって達成することもできる。そのような放出の低減は、ＩＧＦ結合部位と第２のＥＣＭ結合部位との間の密接な関連の結果であるかもしれない。したがって、本発明の第１の態様は、依然としてＥＣＭの結合を阻害しそれによってＩＧＦ放出も阻害する一方でＩＧＦの結合を依然として許容するＥＣＭ結合部位内において１つまたは複数のアミノ酸置換を有する改変ＩＧＦＢＰ分子およびおそらく好ましくはＩＧＦＢＰ−２分子にある。
【００２４】
正帯電残基は結合に重要であり、これら残基の置換は結合の阻害をもたらしやすいと考えられる。その置換は、下記のアラニン（Ａ）によるリシン（Ｋ）の置換などの非保存的置換でもよい。
【００２５】
Site 1                        Site 2
PKKLRP [配列番号９]    KHGLYNLKQCKMSLNGQR [配列番号14]
PAKLRP [配列番号10]    AHGLYNLKQCKMSLNGQR [配列番号15]
PKALRP [配列番号11]    KHGLYNLAQCKMSLNGQR [配列番号16]
PKKLAP [配列番号12]    KHGLYNLKQCAMSLNGQR [配列番号17]
PAALAP [配列番号13]    AHGLYNLAQCAMSLNGQR [配列番号18]
【００２６】
リシン残基を他のアミノ酸で置換することも企図できる。
【００２７】
本発明の第１の態様の改変ＩＧＦＢＰ−２は、好ましくは、いずれか１つまたは複数の蛋白質加水分解切断部位に改変を有し、これによって、この蛋白質加水分解切断部位に特異的なプロテアーゼに曝されたときにＩＧＦの放出を阻害する。
【００２８】
本発明の第１の態様の好ましい形態は、１つまたは複数の蛋白質加水分解切断部位を除去するリンカードメインにおけるいずれか１つまたは複数の欠失とともに、第１および第２のＥＣＭ結合部位、おそらく上記した部位に置換変異を含む。
【００２９】
上記のある態様で示唆したように、本発明は、１つまたは複数の蛋白質加水分解酵素への曝露時にＩＧＦの放出を阻害する改変を含む。ＩＧＦＢＰが感受性である多くの蛋白質加水分解酵素は、それらの標的を前記リンカードメインとする。治療目的の送達中に改変ＩＧＦＢＰが曝露される蛋白質加水分解酵素は、治療すべき症状によって異なってもよい。腫瘍細胞系は、それが産生する蛋白質加水分解酵素において多様であることが知られている。本発明者によって、ＩＧＦＢＰ−２のリンカードメインにおけるかなりの欠失は、蛋白質加水分解性の切断に対する抵抗性をもたらし、同時に蛋白質安定性を維持すると共に高い親和性でのＩＧＦ結合を維持することが示された。プロテアーゼ抵抗性をもたらすＩＧＦＢＰの好ましい改変は、したがって、前記リンカードメイン内における１つまたは複数の欠失である。１つの欠失または複数の欠失の大きさは多様であってよい。実質的にすべてのリンカー領域の欠失も依然としてＩＧＦ結合をもたらすことが本発明者によって見出された。実質的にすべてのリンカー領域の欠失があっても、およそ１８０から１９１までのアミノ酸は維持されることが好ましい。
【００３０】
より小さな欠失も、ＩＧＦＢＰを蛋白質加水分解に対して感受性の高い部位の除去に適している可能性がある。それゆえに、およそ１１０からおよそ１７０までのアミノ酸の欠失が、蛋白質加水分解に対する感受性の低下という結果になった。
【００３１】
蛋白質加水分解に対する抵抗性は、蛋白質加水分解性の切断や結合に重要な部位へのより的を絞った改変によって達成されてもよい。
【００３２】
蛋白質加水分解またはＥＣＭ結合に関与する残基以外の残基の置換を考慮することもできる。これらの置換は、改変ＩＧＦＢＰが依然として高親和性ＩＧＦ結合が可能であるかぎり、保存的置換、非保存的置換、欠失、重複、逆位や他の再構成でもよい。加えて、改変ＩＧＦＢＰは、グリコシル化や他の化学修飾など、さらなる変化を有していてもよい。
【００３３】
蛋白質は、精製を助ける融合蛋白質であってもよく、それゆえに、蛋白質は、ニッケル親和性の精製を提供するＣ末端６ヒスチジンタグを含んでいてもよい。他の融合精製系も知られており、使用してもよい。細菌系においては、融合蛋白質は、この蛋白質を細胞表面から分泌させるように変化したシグナル配列、例えばｏｍｐＡ由来の配列、を含んでいてもよい。
【００３４】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の蛋白質またはアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をコードする核酸にあるといってもよい。好ましい形態では、この核酸はベクターに保持されており、このベクターは、蛋白質またはアミノ酸の発現をもたらす転写のためのプロモータを含む制御配列に作用可能に連結された核酸を有している。上記の目的のための大変に多くの公知のベクターのうちのいずれか１つを使用してもよい。あるいは、このベクターは、単に染色体宿主細胞への組み込みのために宿主細胞内へ改変ＩＧＦＢＰをコードする核酸を導入するために使用してもよく、したがってレトロウィルス発現ベクターでもよい。
【００３５】
第３の形態では、本発明は、本発明の第２の態様のベクターまたは核酸を保持する組換え細胞にあるといってもよい。宿主細胞は、精製後の蛋白質が個々に使用され望み通りに投与されるように産生・精製されることが可能な改変ＩＧＦＢＰの発現を意図したものであってもよい。この宿主細胞は、細菌系、酵母菌系、植物系または哺乳動物系のものであってもよい。あるいは、この宿主細胞は、遺伝子治療目的のために、ヒトなど、治療対象の動物への導入を意図したものであってもよい。
【００３６】
第４の形態では、本発明は薬剤組成物にあるといってもよい。この組成物は、本発明の第１の態様の改変ＩＧＦＢＰ−２を活性成分として含む。この薬剤組成物は、認可された方法にしたがって配合してもよく、そして、改変ＩＧＦＢＰに融合または改変ＩＧＦＢＰに複合されている、またはされていない担体を含んでいてもよい。この組成物は、他の医療薬剤、治療薬剤、アジュバント、希釈剤、賦形剤などをさらに含んでいてもよい。
【００３７】
本発明は、第５の形態において、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの改変ＩＧＦＢＰからの放出を阻害しそれによって生物学的に活性であるＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの血清および組織中のレベルを低減するために有効な量の本発明の第１の態様の改変ＩＧＦＢＰを哺乳動物に投与することによって、生物学的に活性なＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの血清および／または組織中のレベルを低減するための方法にあるといってもよい。
【００３８】
本発明の第５の態様は、いわゆる遺伝子治療アプローチとして、動物またはヒト患者の１つまたは複数の細胞内での改変ＩＧＦＢＰ−２をコードする外因性の核酸の発現を企図している。
【００３９】
通常は、哺乳動物において改変ＩＧＦＢＰ−２レベルを上げる（または過剰発現させる）ために遺伝子治療法が使用される。ＩＧＦＢＰ−２をコードする核酸は、この目的のために使用することができる。所望のアミノ酸配列をコードする遺伝子コードの縮重を用いて、いくつかの核酸分子が生成されてもよい。
【００４０】
遺伝子治療の目的のために核酸（ベクターに含有されていてもよい）を患者の細胞内に入れるためには２つの主要なアプローチ、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏがある。ｉｎ  ｖｉｖｏで投与する場合には、核酸は患者に対して直接的に、一般にはビペリン（viperine）が必要とされる場所に、投与される。好ましくは、これは肝臓内であろう。ｅｘ  ｖｉｖｏ治療では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、この変更された細胞を患者に直接に投与するかまたは、例えば、多孔性の膜に包んでこれを患者に移植する。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照されたい。
【００４１】
生存可能な細胞に核酸を導入するためには様々な手法が利用可能である。これらの手法は、核酸の培養細胞への導入をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うか、意図した宿主の細胞内でｉｎ  ｖｉｖｏで行うかによって異なっている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞内への核酸の導入に適した手法は、リポソーム法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム共沈法などの使用を含む。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達に一般に使用されるベクターはレトロウィルスである。
【００４２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ核酸導入の手法は、ウィルスベクター（アデノウィルス、単純ヘルペスＩ型ウィルスまたはアデノ関連ウィルス）および脂質系システム（遺伝子の脂質を介した導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）によるトランスフェクションを含む。ある状況では、核酸供給源を細胞表面の膜蛋白質や標的細胞に特異的な抗体や、標的細胞上の受容体に対するリガンドなど、標的細胞を標的とする薬剤とともに供給することが望ましい。リポソームが用いられる場合には、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜蛋白質に結合する蛋白質を、ターゲティングのためおよび／または取り込みを容易にするために用いてもよく、その例として、特定の種類の細胞に対して刺激性のカプシド蛋白質またはその断片、サイクル中にインターナリゼーションを起こす蛋白質に対する抗体、細胞内局在化を狙いかつ細胞内半減期を延長する蛋白質があげられる。受容体が媒介するエンドサイトーシスの手法は、例えば、ＷｕらによってＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９〜４４３２頁（１９８７）に、Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：３４１０〜３４１４頁（１９９０）により記述されている。公知の遺伝子マーキングおよび遺伝子治療法のプロトコルの概要は、ＡｎｄｅｒｓｏｎらのＳｃｉｅｎｃｅ、２５６：８０８〜８１３頁（１９９２）を参照されたい。また、ＷＯ９３／２５６７３およびそこに引用されている参考文献も参照されたい。
【００４３】
あるいは、精製された改変ＩＧＦＢＰを適当な担体を用いて哺乳動物に投与することもできる。この改変ＩＧＦＢＰは、経口的、非経口的、局所的、経皮的に投与することができる。この改変ＩＧＦＢＰはゆっくりと放出される形態で提供することが好ましいであろう。適切な投与量や配合の決定は、当該分野における通常の技能を有する者が通常手順の実験法を用いて達成できる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｅ．Ｅ．編、最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡを参照されたい。
【００４４】
さらに、本発明の範囲には、改変ＩＧＦＢＰ−２の細胞毒性剤または抗癌剤との共投与が含まれる。そのような薬剤の好適なものとしては、代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、フルダラビン）、微小管阻害剤（antimicrotubule agents）（例えば、ビンクリスチン 、ビンブラスチンや、パクリタキセルやドセタキセルなどのタキサン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メルファラン、ビスクロロエチルニトロソウレア 、ヒドロキシウレア）、プラチナ剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＪＭ−２１６、ＣＩ−９７３）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、抗生物質（例えば、マイトマイシン、イダルビシン、アドリアマイシン、ダウノマイシン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポサイド、カンプトテシン）または他のいかなる抗腫瘍性の薬剤（リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン）も含まれる。
【００４５】
種々の抗癌剤との組合せで使用された改変ＩＧＦＢＰ−２は、癌性細胞への細胞毒性作用の顕著な増大を引き起こし、これにより治療効果の増大を提供することが予想される。具体的には、抗癌剤を単独で使う治療型に比べて低い濃度の抗癌剤を用いた上記開示の組合せによって、成長阻害効果のかなりの増大が得られるので、抗癌剤を単独で使い投与量がより多い場合に通常観察されるよりも、抗癌剤に関連する有害な副作用がかなり低減される治療を提供し得る。
【００４６】
本発明の化合物は、経腸的、非経腸的および局所的な投与経路を含む多様な方法で投与することができる。例えば、投与の好適な方式は、経口、皮下、経皮、経粘膜（transmucosal）、イオン導入法、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、硬膜下、直腸内、経膣などを含む。
【００４７】
薬学的に許容される好適な賦形剤は、処理剤（processing agent）および薬物送達の変更因子（drug delivery modifiers）および賦活剤（enhancer）、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、でんぷん、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストロース、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポリビニルピロリジノン、低融点ワックス、イオン交換樹脂など、さらに、それらのうちのいずれか２つ以上の組合せを含む。他の好適で薬学的に許容される賦形剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．（１９９１）に記述されており、参照により本明細書に組み込まれている。
【００４８】
第６の態様では、本発明は、ＩＧＦ存在下での癌性細胞集団のＩＧＦが媒介する増殖を、本発明による改変ＩＧＦＢＰにこの細胞集団を接触させることによって低減する方法にあるといってもよい。
【００４９】
このような方法での治療に反応する可能性のある症状はＩＧＦ依存性の癌を含み、これは、乳房、前立腺、結腸直腸、肺、甲状腺、卵巣および脳のある種の癌さらに小児白血病、神経グリア芽細胞腫および神経芽腫を含むだろう。
【００５０】
本発明による、例えば、前立腺癌の治療は、必ずしもそのままで用いなくてもよく、他の方法の補助として用いることが企図される。
【００５１】
簡略表記法として、アミノ酸残基を表す３文字および１文字略号を表１で定義したように本明細書で使用する。
【００５２】
ある特定のアミノ酸残基を蛋白質のポリペプチド内での位置によって示す場合、アミノ酸略号に残基番号を上付で添えて使用する。（すなわち、Ｘａａｎ）
【００５３】
【表１】
0004559222.tif 000002
【発明の詳細な説明】
【００５４】
材料と方法
変異誘発とサブクローニング
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてｈＩＧＦＢＰ−２をコードするｃＤＮＡの突然変異を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて導入した。リシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への変異および欠失変異Ｄｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓを導入するために、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００５５】
K180A K181AHis    順方向  5'CTT GGC CTG GAG GAG CCT GCC GCC CTG CGA CCA CCC CCT 3'
[SEQ ID No 19]
逆方向  5'AGG GGG TGG TCG CAG GGC GGC AGG CTC CTC CAG GCC AAG 3'
[SEQ ID No 20]
K227AHis    順方向  5'ATC CCC AAC TGT GAC GCC CAT GGC CTG TAC ACC 3' 
[SEQ ID No 21]
逆方向  5'GGT GTA CAG GCC ATG GGC GTC ACA GTT GGG GAT 3' 
[SEQ ID No 22]
K234AHis  順方向  5'GGC CTG TAC AAC CTC GCC CAG TGC AAG ATG TCT 3' 
[SEQ ID No 23]
逆方向  5'AGA CAT CTT GCA CTG GGC GAG GTT GTA CAG GCC 3' 
[SEQ ID No 24]
K237AHis  順方向  5'AAC CTC AAA CAG GCC ATG TCT CTG AAC GGG 3' 
[SEQ ID No 25]
逆方向  5'CCC GTT CAG AGA CAT GGC GCA CTG TTT GAG GTT 3' 
[SEQ ID No 26]
Des(114-170)His   順方向１  5'GTT GCA GAC AAT GGC GCC GGC CAC TCA GAA GAA GCC 3'
[SEQ ID No 27]
逆方向１  5'GCC TCC TTC TGA GTG GCC GGC GCC ATT GTC TGC AAC 3'
[SEQ ID No 28]
順方向２  5'CGG CAC ATG GGC AAG GCC GGC AAG CAT CAC CTT 3' 
[SEQ ID No 29]
逆方向２  5'AAG GTG ATG CTT GCC GGC CTT GCC CAT GTG CCG 3' 
[SEQ ID No 30]
【００５６】
欠失変異体Ｄｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓは、それぞれ１１４および１７０残基をコードするｃＤＮＡ内の２個のＮａｅＩ制限部位を順次導入することによって生成した。この新たなクローンは、ＮａｅＩで分解して、その後再連結することにより、これらの部位の間の配列を欠失させた。
【００５７】
得られた変異体ＩＧＦＢＰをコードするｃＤＮＡを、ＤＨ５α大腸菌内に形質転換した。正しい変異導入を確認するためにクローンの配列決定を行った。続いてそれらを、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いてｐＸＭＴ−２ベクターにサブクローニングし、ＤＨ５α大腸菌内へ形質転換した（図１参照；Ｒａｔｈｊｅｎ  Ｐ．Ｄ．ら、（１９９０）；Ｗｈｙａｔｔ  Ｌ．Ｍ．ら、（１９９３））。変異体ＩＧＦＢＰ−２蛋白質は、変異体ＩＧＦＢＰ−２  ｃＤＮＡを用いたＣＯＳ−１サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ  １６５０）の一時的なトランスフェクションで発現させた。Ｃｏｓ−１細胞は、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳで培養する。培養と精製方法はＦｏｒｂｅｓら（１９９８）に記述されている。
【００５８】
精製と純度の解析
各蛋白質のＣ末端の６ヒスチジンタグを利用して標準的なニッケル親和性精製法を用いて蛋白質を精製した。ＩＧＦＢＰが分泌されるので、精製は培地から行う（Ｆｏｒｂｅｓら、１９９８）。ニッケルカラムからの溶出に続いて、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて蛋白質をさらに精製した。純度は、ｒｐＨＰＬＣ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよび質量分析法によって解析した。各変異体の質量を、エレクトロスプレー質量分析法（Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓ  Ｂａｇｌｅｙ、Ｈａｎｓｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅによる）によって求め、正確であることがわかった（一般的に質量分析の限界＝１質量単位／１０，０００ダルトンの範囲内）。
【００５９】
ＩＧＦ結合親和性の測定
ｈＩＧＦＢＰ−２および変異体のＩＧＦ結合親和性を、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩをセンサ表面に固定化したＢＩＡｃｏｒｅを使った表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）によって求めた（方法の詳細は、Ｃａｒｒｉｃｋら（２００１）を参照されたい）。ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（７０ＲＵ）を、標準的な固定化の手順（ＬｏｆａｓとＪｏｈｎｓｓｏｎ、１９９０）を用いてＣＭ−５バイオセンサチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ）にアミン基を介して固定化した。簡単に説明すると、５μｌ／分で、ＣＭ５チップを３５μｌのＮＨＳ（０．４ｍｇ）／ＥＤＣ（２．６ｍｇ）で活性化し、３５μｌのＩＧＦ（１０μｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中で固定化した。未反応の基を、３５μｌの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で不活性化した。一定範囲のｈＩＧＦＢＰ−２または変異体濃度（５０、２５、１２．５、６．２５および３．１ｎＭ）での速度論的研究を、結合に３００秒、解離に９００秒かけて、質量輸送（mass transport）の影響を最小にするために４０μｌ／分で行った。ＩＧＦ表面は１０ｍＭＨＣｌで再生処理した。
【００６０】
蛋白質加水分解分析
蛋白質加水分解試験のためのプロテアーゼの供給源は、癌細胞のならし培地（conditioned medium）であった。細胞は、ウシ胎児血清の存在下で密集するまで増殖させた。（Ｔ８４細胞は、ＤＭＥＭ：１０％ウシ胎児血清ＦＢＳとＨａｍのＦ１２（５０：５０ｖ：ｖ）中で増殖する。ＬＮＣａＰは、ＲＰＭＩ＋６％ＦＢＳ中で増殖させた。ＰＣ３とＤＵ１４５は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた。すべての培地とＦＢＳはＧＩＢＣＯからのものである）。その後、細胞を無血清培地で２×２時間洗浄した。その後、無血清条件で３日間培養し、培地を採取した。ならし培地を、セントリコン−１０（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０ ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、ＭＡ  ＵＳＡ）でおよそ１０倍に濃縮した。精製されたｈＩＧＦＢＰ−２またはその変異体（２μｌ中２５０ｎｇ）を３７℃で２４時間ならし培地と混合して、蛋白質加水分解を行わせた。蛋白質を、１２％トリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースに移した。ニトロセルロースフィルターを、特異的ポリクローナル抗ＩＧＦＢＰ−２抗体（我々の実験室で作製）でプローブしてＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−２断片を検出した。アビジンアルカリホスファターゼに結合させた２次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、抗ＩＧＦＢＰ−２抗体を検出した。アビジンアルカリホスファターゼの基質（ニトロブルーテトラゾリウムと５  ブロモ  ４  クロロ  ３−インドリルリン酸  ｐ−トルイジン塩）を加え、呈色したバンドはＩＧＦＢＰ−２の存在を示唆した。
【００６１】
マトリックス結合分析
ヘパリンを、ビオシチンヒドラジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、その製造業者が推奨する条件を用いてビオチン化した。反応に続いて、ビオチン化されたヘパリンを、セントリコン−３（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３ ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、ＭＡ  ＵＳＡ）を用いて濃縮し、Ｈ２Ｏに対して透析した。ビオチン化ヘパリンを、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよびＨＢＳ（界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）中でストレプトアビジンバイオセンサチップに固定化した。異なる濃度（６．２５ｎＭから３００ｎＭ）のｈＩＧＦＢＰ−２と変異体を１０μｌ／分で注入した。表面の再生処理は２Ｍ  ＮａＣｌによって行なった。
【００６２】
ＨＴ−２９結腸直腸細胞の増殖
細胞を、ＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中の９６ウェルプレートに１ウェル当たり細胞１２０００個で植え付け、２日間増殖させ、無血清ＲＰＭＩで３時間洗浄し、その後ＲＰＭＩ＋５％ＢＳＡ中でブチレート（５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）またはブチレートと多様な濃度のＩＧＦ−Ｉとの組合せで処理する。この実験では、種々の量のＩＧＦＢＰ−２または変異体ＩＧＦＢＰ−２をブチレート＋ＩＧＦ−１処理細胞に加えた。増殖は、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ−ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏキットを用いて測定する。これは基本的にはＡＴＰレベルを測定する。ＩＧＦは細胞をアポトーシスから救済し、結合蛋白質（天然あるいは変異体）は、細胞をアポトーシスから救済するＩＧＦの能力を阻害する（ＩＧＦを受容体から隔離する）。
【００６３】
結果と考察
クローニング、発現、純度およびＩＧＦ結合親和性
５つの変異体を、プロテアーゼ抵抗性の導入またはマトリックス結合の妨害のために設計した（Ｋ１８０Ａ  Ｋ１８１ＡＨｉｓ、Ｋ２２７ＡＨｉｓ、Ｋ２３４ＡＨｉｓ、Ｋ２３７ＡＨｉｓ、Ｄｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓ）。これらは、精製して均質化し（図２）、質量分析にかけ、期待した質量を有していることを確認した。残基Ｋ１８０とＫ１８１は、プロテアーゼ切断の潜在的部位であり（Ｈｏ，Ｊ．Ｐ．＆  Ｂａｘｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．（１９９７）、またマトリックス結合に関与しているかもしれない（Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎら（１９９４））。Ｋ２２７、Ｋ２３４およびＫ２３７は、マトリックス結合性モチーフに対応するＩＧＦＢＰ−３および−５の類似領域内の残基である。蛋白質加水分解性の切断およびマトリックス結合の潜在的部位は、図３でハイライト表示されている。
【００６４】
精製された変異体を、ＢＩＡｃｏｒｅ解析によって、ＩＧＦ−Ｉに結合する能力について分析した（図４）。すべての変異体は、天然ｈＩＧＦＢＰ−２と類似した親和性を有している。変異体Ｋ２３７ＡＨｉｓは、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの両者に対しておよそ２倍高い親和性を有し、Ｄｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓは、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩに対する親和性においてそれぞれ５倍または２倍低減している（表２と３）。
【００６５】
表２は、ＩＧＦ−Ｉに結合するｈＩＧＦＢＰ−２と変異ｈＩＧＦＢＰ−２のＢＩＡｃｏｒｅ解析から得られた速度定数を示す。データは、ＢＩＡ評価ソフトウェア３．０を用いて解析され、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１結合モデルに適合させた。解離定数（ＫＤ）はｋｄ／ｋａの計算から決定された。ここで、ｋａは結合速度であり、ｋｄは解離速度である。相対ＫＤ（Relative KD）は、ｈＩＧＦＢＰ−２のＫＤ／ｈＩＧＦＢＰ−２変異体のＫＤに等しい。
【００６６】
【表２】
0004559222.tif 000003
【００６７】
表３．ＩＧＦ−ＩＩに結合する変異体ｈＩＧＦＢＰ−２とｈＩＧＦＢＰ−２のＢＩＡｃｏｒｅ解析から得られた速度定数。データは、ＢＩＡ評価ソフトウェア３．０を用いて解析され、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１結合モデルに適合させた。解離定数（ＫＤ）はｋｄ／ｋａの計算から決定された。ここで、ｋａは結合速度であり、ｋｄは解離速度である。相対ＫＤは、ｈＩＧＦＢＰ−２のＫＤ／ｈＩＧＦＢＰ−２変異体のＫＤに等しい。
【００６８】
【表３】
0004559222.tif 000004
【００６９】
プロテアーゼ分析
変異体結合蛋白質を、材料と方法で記述した分析法でプロテアーゼ感受性について分析した。我々はまず、切断型変異体Ｄｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓを解析し、Ｔ８４、ＨＴ２９、ＣａＣＯ（すべての結腸癌細胞）およびＰＣ３（前立腺癌細胞系）を含む多くのならし培地でプロテアーゼ抵抗性を観察した。表４は、どの細胞系が使用されたか、プロテアーゼ活性の相対量（ゲルの観察からの定性量）およびどのならし培地が切断型変異体をもはや切断できないプロテアーゼを含有していたかについての概略を示す。
【００７０】
表４．蛋白質加水分解活性を有するならし培地の供給源として用いられた細胞系のリスト。細胞系は、癌の種類別にグループ分けされている。定性的なスコアが各細胞系に与えられ、ｈＩＧＦＢＰ−２とのインキュベーションで明らかになる蛋白質加水分解活性の量を示している（中央の列）。ｈＩＧＦＢＰ−２の切断型（Ｄｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓ  ｈＩＧＦＢＰ−２）においては、ｈＩＧＦＢＰ−２と比較してならし培地による切断からの保護という結果が得られており、このことは右側の列に示されている。
【００７１】
【表４】
0004559222.tif 000005
【００７２】
重要なことに、Ｔ８４細胞系ならし培地ではかなりの量の容易に検出可能なプロテアーゼ活性があった（図５Ａと５Ｂ）。切断型変異体は、この培地での蛋白質加水分解に対して明らかに抵抗性であった。ｈＩＧＦＢＰ−２の蛋白質加水分解は、ＰＣ３ならし培地でも容易に検出され、切断型変異体は、この培地による蛋白質加水分解に対してやはり抵抗性であった（図５Ａ）。他の細胞系では、蛋白質加水分解活性がより低く、プロテアーゼ抵抗性の検出が比較的困難であった（例、ＬＩＭ１２１５）。他の細胞系では、切断型変異体は明らかに蛋白質加水分解された（図５Ｂ）。
【００７３】
これらの結果は、各細胞系は異なる群のプロテアーゼを産生することを強調している。どのプロテアーゼがＴ８４およびＰＣ３培地においてｈＩＧＦＢＰ−２を切断しているかは不明である。Ｔ８４培地の切断産物は、Ｃ末端残基に特異的な抗体によって検出されたことから、ｈＩＧＦＢＰ−２のＣ末端断片に対応する。我々は、Ｔ８４ならし培地内で他の変異体をプロテアーゼ抵抗性について分析した。これらの残基は１１４〜１７０切断型の外にあるので、どれ１つとして蛋白質加水分解に抵抗性ではなかったことは驚くことではなく、このことは切断がＫ１８０、Ｋ１８１、Ｋ２２７、Ｋ２３４、Ｋ２３７では発生しないことを示している。
【００７４】
ヘパリン結合
我々は、通常使用されるヘパリン結合のモデル系を用いてマトリックス結合を解析した。我々は、ＢＩＡｃｏｒｅを用いてヘパリン結合を解析した。予備的データは、Ｋ２３４Ａ変異がヘパリン結合を５倍低減し（図８）、Ｋ１８０Ａ、Ｋ１８１Ａ変異がヘパリン結合に大きな効果を有することを示している。このデータは、おそらく２つのヘパリン結合部位がＩＧＦＢＰ−２にあることを示唆している。
【００７５】
表５．ｈＩＧＦＢＰ−２およびＫ２３４ＡＨｉｓ  ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合親和性が表面プラズモン共鳴によって測定された。データをＢＩＡ評価ソフトウェア３．０を用いて解析し、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１結合モデルに適合させた。解離定数（ＫＤ）はｋｄ／ｋａの計算から決定された。ここで、ｋａは結合速度であり、ｋｄは解離速度である。
【００７６】
【表５】
0004559222.tif 000006
【００７７】
ＨＴ−２９結腸直腸細胞の増殖
本検定は、ＨＴ−２９結腸直腸癌細胞が５ｍＭブチレート中でアポトーシスに至ることを示している。ＩＧＦ−Ｉの添加は、細胞をブチレート誘発アポトーシスから、投与量依存性の態様で救済する。ＩＧＦＢＰ−２の増量は、細胞をブチレート誘発アポトーシスから救済するＩＧＦ−Ｉの能力を、ＩＧＦをＩＧＦ受容体から隔離することによって阻害する。変異体Ｄｅｓ（１１４〜１７０）とＤｅｓ（１１４〜１７０）Ｋ１８０Ａ  Ｋ１８１Ａは、ＩＧＦ−Ｉの作用の阻害においてより有効である。この分析は、Ｄｅｓ（１１４〜１７０）とＤｅｓ（１１４〜１７０）Ｋ１８０Ａ  Ｋ１８１Ａとの間にほとんど差異がないことを示し、最大の利点が、プロテアーゼ切断部位の除去によってその分子に与えられる蛋白質加水分解への抵抗性であることを示唆している。Ｋ１８０ＡおよびＫ１８１Ａの位置の変異によっても、さらなる蛋白質加水分解からの保護や細胞外マトリックスとの相互作用の阻害が可能となるだろう。しかし、この分析の条件下では、Ｄｅｓ（１１４〜１７０）とＤｅｓ（１１４〜１７０）Ｋ１８０Ａ  Ｋ１８１Ａとの間に有意の差異を検出することは不可能である。
【００７８】
参考文献
Arai et al.,. Endcrinology 137, 4571-4575 (1996)
Arai et al., J. Biol. Chem. 269, 20388-20393 (1996)
Baserga, Exp. Cell Res. 253(1),1-6 (1999)
Braulke, Horm. Metab. Res. 31(2-3), 242-246 (1999)
Byun et al., J Clin Endocrinol Metab 85(1):373-81 (2000).
Chan et al., Science 279, 563-566 (1998)
Cardin. & Weintraub Arteriosclerosis 9, 21-32 (1989).
Carrick et al., J. Biol. Chem. 276, 27120-27128 (2001)
Cohen et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 79, 1410-1415(1994)
DiGiovanni et al., PNAS 97, 3455-3460 (2000)
Elminger et al., Mol. Cell. Endocrinol. 175(1-2), 211-218 (1999)
Firth et al., J. Biol. Chem. 273, 2631-2638 (1998)
Forbes et al., J. Biol. Chem. 273, 4647-4652 (1998)
Ho & Baxter, Clin. Endocrinol. 46, 333-342 (1997)
Ho & Baxter Endocrinology 138, 3811-3818 (1997).
Hobba et al., J. Biol. Chem. 273:19691-19698 (1998).
Hodgkinson et al. J. Mol. Endocrinol. 13, 105-112 (1994); 
Imai et al., J. Clin. Invest. 100(10), 2596-2605 (1997)
Kanety, et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 229-233 (1993).
Lofas and Johnsson, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 21, 1526-1528 (1990)
Menouny et al.,  Endocrinology 138, 683-690 (1997).
Michell et al.,  Br. J. Cancer 76, 60-66 (1997).
Nunn et al.,  J. Cell. Physiol. 171, 196-204 (1997).
Rathjen et al., Cell 62(6),1105-1114 (1990)
Russo et al. Endocrinology 138, 4858-4867 (1997)
Sepp-Lorenzino, Breast Cancer Res. Treat. 47(3), 235-253 (1998)
Thrasher et al.,  J. Urol. 155, 999-1003 (1996)
Wang et al., Nature 372, 464-467 (1994)
Whyatt et al., Mol. Cell. Biol. 13, 7971-7976 (1993) 
Zeslawski et al., EMBO J.  20, 3638-44 (2001)
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】哺乳動物発現ベクターｐＸＭＴ２（Ｒａｔｈｊｅｎら、（１９９０）；Ｗｈｙａｔｔら、（１９９３））から構成されたｈＩＧＦＢＰ−２発現ベクターの模式図。コリシンＥ１複製起点（ｏｒｉ）とβ−ラクタマーゼアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）は大腸菌において選択と増殖を可能にする。ＩＧＦＢＰ−２  ｃＤＮＡの哺乳動物発現は、アデノウィルス主要後期プロモータ（ＭＬＰ）によって駆動される。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子は選択のために存在する。６ヒスチジンタグがＩＧＦＢＰ−２  ｃＤＮＡ配列の３'末端にコードされている。
【図２】精製されたｈＩＧＦＢＰ−２と変異体は１２％トリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離された。蛋白質はクマシーブルーで染色された（サイプロルビーで染色されたＤｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓ  ｈＩＧＦＢＰ−２を除く）。すべての変異体は、分子サイズ標準（Ｎｏｖｅｘ  Ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ）との比較から推定される予測サイズで移動した。副次的な破壊産物がこの特定のＫ２３４ＡＨｉｓ調製物において検出された。
【図３】リンカードメインによって結合した保存されたＮ−およびＣ−システインドメインを示すｈＩＧＦＢＰ−２と切断型ｈＩＧＦＢＰ−２の模式図。公知のジスルフィド結合（横白色縞で示される）および残基番号が上に示されている。潜在的な切断およびＥＣＭ部位も同定されている。
【図４】ＩＧＦ−Ｉに結合するｈＩＧＦＢＰ−２と変異体のＢＩＡｃｏｒｅ解析。ヒトＩＧＦＢＰ−２（濃度３．１、６．２５、１２．５、２５および５０ｎＭで）をバイオセンサ表面（７０レゾナンスユニットのｈＩＧＦＢＰ−２）において３００秒間（ｔ＝１５０秒から）結合させ、その後９００秒間解離させた。リアルタイム結合は応答単位（response units）で測られる。質量移動（mass transfer）の影響を最小にするために３０μｌ／分の流速で速度論的調査を行った。ＩＧＦ−Ｉにより被覆されたバイオセンサ表面は、結合サイクルの間に１０ｍＭＨＣｌで再生処理された。各結合曲線について、対照表面（蛋白質の結合無し）を用いて得られた応答を差し引いた。
【図５Ａ】癌細胞によるならし培地内での蛋白質加水分解に対する切断型ｈＩＧＦＢＰ−２の感受性の解析。切断型ｈＩＧＦＢＰ−２とｈＩＧＦＢＰ−２は、ａ）Ｔ８４結腸癌およびｂ）ＰＣ３前立腺癌の培地に、３７度で０、３もしくは２４時間曝露した。サンプルは、１０％トリシンゲル上のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移した。ｈＩＧＦＢＰ−２と切断産物は抗ＩＧＦＢＰ−２ポリクローナル抗体で検出した（左）。ｈＩＧＦＢＰ−２は３４ｋＤａへ移動し、一方でＤｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓは２０ｋＤａへ移動する。二量体はｈＩＧＦＢＰ−２調製物中に存在する。蛋白質加水分解断片は１４から２０ｋＤａの大きさの範囲に分布している。ブロット上に示されたバンドの密度は、ＮＩＨ画像プログラムと、グラフで示された未切断または切断ｈＩＧＦＢＰ−２の量とを用いて定量された（右）。
【図５Ｂ】癌細胞によるならし培地内での蛋白質加水分解に対する切断型ｈＩＧＦＢＰ−２の感受性の解析。切断型ｈＩＧＦＢＰ−２とｈＩＧＦＢＰ−２は、ｃ）ＤＵ１４５およびｄ）ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系の培地に、３７度で０、３もしくは２４時間曝露した。サンプルは、１０％トリシンゲル上のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移された。ｈＩＧＦＢＰ−２と切断産物は抗ＩＧＦＢＰ−２ポリクローナル抗体で検出した（左）。ｈＩＧＦＢＰ−２は３４ｋＤａで移動し、一方でＤｅｓ（１１４〜１７０）Ｈｉｓは２０ｋＤａで移動する。二量体がｈＩＧＦＢＰ−２調製物内に存在する。蛋白質加水分解断片はサイズ１４から２０ｋＤａの間に分布している。ブロット上に示唆されたバンドの密度は、ＮＩＨ画像プログラムと、グラフで示された未切断または切断ｈＩＧＦＢＰ−２の量とを用いて定量された（右）、および
【図６】Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏ検定（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定されたＨＴ−２９結腸直腸細胞の増殖。アポトーシスを５ｍＭブチレートで誘発し、細胞生存を促進するＩＧＦ−１の能力を測定した。天然ＩＧＦＢＰ−２と、ＤＥＳ（１１４〜１７０）と、ＤＥＳ（１１４〜１７０）  Ｋ１８０Ａ  Ｋ１８１Ａとを、ブチレートの存在下で様々な濃度（０、０．１、０．３および０．６５ｎＭ）でＩＧＦ−１で処理した細胞に添加した。結果は、培地のみの存在下での増殖のパーセンテージで表す。Ｄｅｓ（１１４〜１７０）とＤｅｓ（１１４〜１７０）Ｋ１８０Ａ  Ｋ１８１Ａは、それぞれＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩに対して２分の１の親和性を有するので、それに応じてこれら処理のための増殖パーセンテージを調節した。
【図１】
0004559222.tif 000007
【図２】
0004559222.tif 000008
【図３】
0004559222.tif 000009
【図４】
0004559222.tif 000010
【図５Ａ】
0004559222.tif 000011
【図５Ｂ】
0004559222.tif 000012
【図６】
0004559222.tif 000013
【配列表】
0004559222000001.app