(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおいて、脊椎動物の胞胚又は原腸胚の予定外胚葉片をアクチビンで処理し、３〜１５時間後にレチノイン酸で処理し、その後培養することを特徴とする脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法。
【請求項２】
アクチビンによる処理が、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度のアクチビンでの０．５〜２時間の静置培養処理であることを特徴とする請求項１記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法。
【請求項３】
レチノイン酸による処理が、１０-5Ｍ以上の濃度のレチノイン酸での０．５〜２時間の静置培養処理であることを特徴とする請求項１又は２記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法。
【請求項４】
その後の培養が、生理食塩中での静置培養処理であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法。
【請求項５】
脊椎動物が、両生類に属する動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法。
【請求項６】
両生類に属する動物が、アフリカツメガエルであることを特徴とする請求項５記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵臓のインビトロ形成方法、より詳しくは、脊椎動物の胞胚の予定外胚葉域をアクチビンとレチノイン酸で時間差をつけて処理し、その後培養することを特徴とする膵臓のインビトロ形成方法や、インビトロで誘導した膵臓や、インビトロで誘導した膵臓を利用した膵臓に起因する疾病の診断・治療に有用な物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
すべての多細胞動物の発生は受精にはじまり、細胞分裂（卵割）と細胞分化を経て、多くの組織とバランスのとれた体制をもつ個体として完成されるが、このような分化のプロセスはきわめて複雑であり、誘導現象と呼ばれる重要な細胞間の相互作用が多段階にわたって行われていると考えられ、そして、もっとも重要なのは「形作りを支配する分子」の解明といわれており、またこのような研究の材料として、主に両生類胚がよく用いられるが、体づくりの基本的な法則はすべての脊椎動物に共通であり、相同な遺伝子は異なった生物種においてもきわめて類似した機能をもつことが知られている。
【０００３】
従来より、両生類の胚は実験発生学においてきわめて重要な材料とされ、多くの研究がなされてきている。その理由は、体外で受精と発生をおこない、卵が大きいために胚手術が可能で、経時的変化を容易に観察できることにある。両生類の原腸胚の原口上唇部は特殊な領域であり、他の胚の腹側にこれを移植すると頭部もしくは胴尾部を含む二次胚が誘導され、このことから、原口上唇部は胚の体制を決定し形態形成の中心として働く領域として形成体(organizer)と名付けられており、形成体は原腸陥入の間に予定外胚葉へと働きかけて中枢神経を誘導し、それ自身は背側の中胚葉及び前方内胚葉に分化することはよく知られている。
【０００４】
一方、膵臓はほとんどの脊椎動物、すなわち哺乳類、鳥類、は虫類、両生類に共通した組織形態と発生様式を示す内分泌、および外分泌器官であり、発生過程においては、内胚葉から背側原基と腹側原基が生じ、これらが融合して膵臓が形成されることが知られている（Development 121, 1569-1580, 1995）。
【０００５】
胚発生の過程では内胚葉の近傍には中胚葉が存在し、膵臓の分化には内胚葉に対する間充織からの作用が必要であるとされてきた（Dev. Biol. 4, 242-255, 1962）。また最近の研究から、ニワトリの膵臓形成には脊索の関与が必要であり、背索が近傍の内胚葉におけるＳｈｈの発現を抑制することによって膵臓が分化するが、脊索の作用によって膵臓へ分化するのは膵臓予定域の内胚葉であり、膵臓予定域以外の内胚葉では脊索が共存しても膵臓には分化しないことが報告されている（Development 124, 4243-4252, 1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13036-13041, 1998、Genes and Dev. 12, 1705-1713, 1998）。
【０００６】
また、遺伝子レベルでの研究では、マウスの膵臓原基で発現するｉｐｆ−１やｐｄｘ−１として知られているホメオボックス遺伝子が膵臓の形成過程に必須であり、ｉｐｆ−１のジーンターゲッティング実験から、この遺伝子をもたないマウス胚は膵臓を欠損することが報告されている（Nature 371, 606-609, 1994）。しかし、この遺伝子を欠損しても膵臓の原基は形成され、グルカゴン陽性細胞の存在も確認されている（Development 122, 983-995, 1996）。また、アフリカツメガエルの胞胚の植物極細胞はＰＤＸ−１のホモログで膵臓特異的転写因子であるＸｌＨｂｏｘ８と小腸上皮のマーカーであるＩＦＡＢＰのどちらも発現するが、内胚葉でのＴＧＦ−β系のシグナルを阻害すると，ＸｌＨｂｏｘ８の発現が阻害されることが知られている（Development 122, 1007-1015, 1996）。
【０００７】
他方、レチノイン酸は前後軸に沿った胚のパターンニングに対する調節因子であること（Nature 340, 140-144, 1989、Development 112, 945-958, 1991、Dev. Biol. 192, 1-16, 1997、Zool. Sci. 15, 879-886, 1998）や、このレチノイン酸がツメガエル胚における前方神経組織を後方化させ、中胚葉の発達において影響を及ぼすこと（Genes Dev. 5, 175-187, 1991、Develop. Growth. Differ. 35, 123-128, 1993）が知られている。また、ツメガエルアニマルキャップ細胞（animal cap cell）にアクチビンの投与量を変化させて処理することにより脊索、筋肉、間充織及び体腔上皮のようなほとんどの中胚葉組織を誘導することができること（Roux's Arch. Dev. Biol. 198, 330-335, 1990、Nature 347, 391-394, 1990、Roux's Arch. Dev. Biol. 200, 230-233, 1991）や、アクチビンと共処理するレチノイン酸の投与量を変化させることにより、アニマルキャップ細胞から分化する脊索、筋肉及び前腎のような中胚葉組織を側後方化させること(Develop. Growth. Differ. 35, 123-128, 1993)が報告されている。
【０００８】
内胚葉性器官に対するレチノイン酸の作用については、発生段階２２〜３２のツメガエル胚をレチノイン酸で処理すると、腸、肝臓、胃などの消化器官の形態が異常になることが、Ｄｉｘｏｎらにより報告されているが、レチノイン酸で処理した発生段階２２〜３２のツメガエル胚の膵臓は正常に形成され、内胚葉特異的マーカーであるＸｌＨｂｏｘ８の発現にも影響がみられないことも報告されている(Dev. Genes Evol. 208, 318-326, 1998)。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従来、特定の臓器をインビトロで特異的に誘導させることは非常に困難とされ、また、膵臓は生体内で重要な役割を果たす内分泌及び外分泌器官であるが、その複雑な分化・形成機構はいまだ明らかになっていない。本発明者らは、ツメガエル初期原腸胚の原口上唇部細胞をレチノイン酸で処理することにより、高率に膵臓を形成できることを報告（Moriya, N. et al.; Develop. Growth. Differ. 42, 175-185, 2000）しているが、この系によると高率で膵臓を形成させることができるものの、膵臓分化のメカニズムを解明するには未だ複雑な実験系である本来自律分化能を有する原口上唇部の細胞を用いている。本発明の課題は、膵臓の分化・形成機構に関しての知見を得ることができる、発生工学あるいは臓器工学上有用なインビトロ誘導膵臓や、インビトロで誘導した膵臓が実際に生体内でも機能できるかどうかを評価することができる移植用膵臓や、より高等な動物の膵疾患の診断・治療への道を拓くインビトロ誘導膵臓を、人工的に膵臓予定域以外の原腸胚から高率に誘導しうる方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本来、インビトロで培養すると不整表皮を形成し、膵臓を形成しない後期胞胚の未分化細胞の予定外胚葉域を、アフリカツメガエルの後期胞胚から切り出しアクチビンで処理し、３〜５時間後にレチノイン酸で処理した後、ＢＳＡを含むスタインバーグ溶液中でこれらの外植体を静置培養することにより、その発生運命を膵臓へと変化させ、形態的かつ機能的な膵臓をインビトロで高率に形成しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、インビトロにおいて、脊椎動物の胞胚又は原腸胚の予定外胚葉片をアクチビンで処理し、３〜１５時間後にレチノイン酸で処理し、その後培養することを特徴とする脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法（請求項１）や、アクチビンによる処理が、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度のアクチビンでの０．５〜２時間の静置培養処理であることを特徴とする請求項１記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法（請求項２）や、レチノイン酸による処理が、１０-5Ｍ以上の濃度のレチノイン酸での０．５〜２時間の静置培養処理であることを特徴とする請求項１又は２記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法（請求項３）や、その後の培養が、生理食塩中での静置培養処理であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法（請求項４）や、脊椎動物が、両生類に属する動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法（請求項５）や、両生類に属する動物が、アフリカツメガエルであることを特徴とする請求項５記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法（請求項６）に関する。
【００１２】
また本発明は、請求項１〜８のいずれか記載の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法により得られることを特徴とするインビトロで誘導した膵臓（請求項９）や、請求項９記載のインビトロで誘導した膵臓を用いることを特徴とする膵臓の機能低下又は機能異常を治癒しうる物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、請求項９記載のインビトロで誘導した膵臓を用いることを特徴とする膵臓の機能低下又は機能異常を検出しうる物質のスクリーニング方法（請求項１１）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法としては、インビトロにおいて、脊椎動物の胞胚の未分化細胞である予定外胚葉片をアクチビンとレチノイン酸とにより処理し、その後培養して、インビトロで膵臓を分化・誘導しうる方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の膵臓のインビトロ形成方法における膵臓としては、インビトロ誘導膵臓臓器の他、膵臓特異的な分子マーカー遺伝子、例えばインスリン遺伝子、ＩＰＦ１やＰＤＸ１等のホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１のホモログで膵臓特異的転写因子であるＸＩＨｂｏｘ８遺伝子等の発現能を有する外植体や、生体膵臓と類似の細胞形態を有する外植体や、生体膵臓と類似の分泌腺様構造を有する外植体も便宜上含まれる。
【００１４】
上記脊椎動物としては、膵臓を有する哺乳類、鳥類、は虫類、両生類に属する脊椎動物であれば特に制限されるものではないが、膵臓の分化・形成機構に関しての発生工学あるいは臓器工学上有用な知見を得るレベルにおいては、その取り扱いが比較的簡単で、かつ現在までの発生工学あるいは臓器工学上の知見が豊富な両生類に属する動物、特にアフリカツメガエルを好ましい脊椎動物として例示することができる。脊椎動物であるツメガエルの未分化細胞を用いてインビトロで膵臓が誘導できたことは、ヒトも含めた哺乳動物の未分化細胞であるＥＳ細胞を用いると、インビトロで膵臓を誘導できることを示している。
【００１５】
また、上記胚胞としては、中〜後期胚胞を用いることが好ましく、かかる中〜後期胚胞としては、アフリカツメガエルにおける発生段階８〜１０の中〜後期胞胚を具体的に挙げることができる。このアフリカツメガエルにおける発生段階は、文献（Nieuwkoop, P. D., Faber, J., 1956. Nomal Table of Xenopus laevis. North-Holland Pub. Co. Amsterdam.）記載の定めた基準によって判断することができる。
【００１６】
上記アクチビンとレチノイン酸とによる処理方法としては、インビトロにおいて、脊椎動物の胚胞の未分化細胞である予定外胚葉をアクチビンとレチノイン酸とを用いて処理し、その後培養することにより膵臓を分化・誘導しうる処理方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、アクチビンとレチノイン酸との同時処理、アクチビン処理後引き続いてのレチノイン酸処理でもよいが、アクチビンで処理し、所定時間後、好ましくは３〜１５時間後、特に好ましくは３〜５時間後にレチノイン酸で処理する方法を挙げることができ、アクチビン処理後３〜１５時間、特に３〜５時間のタイムラグ後にレチノイン酸で処理することにより膵臓への誘導率をより高めることができる。タイムラグ期間中、アクチビン処理後の予定外胚葉片は生理食塩水、好ましくはＢＳＡ（牛胎児血清）を含む生理食塩水中で静置培養することが望ましい。
【００１７】
アクチビンによる処理としては、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは８０〜１２０ｎｇ／ｍｌの濃度のアクチビンでの０．５〜２時間の静置培養処理を具体的に例示することができる。また、レチノイン酸による処理方法としては、１０-5Ｍ以上、好ましくは１０-4Ｍ〜１０-3Ｍの濃度のレチノイン酸での０．５〜２時間の静置培養処理を具体的に例示することができる。レチノイン酸は水溶性ではないので、エタノールやジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等に一旦溶解させた後、生理食塩水で希釈して用いることが好ましい。そして、本発明においては、アクチビンとレチノイン酸とによる処理後に培養することが必要である。かかる処理後の培養としては、生理食塩水、好ましくはＢＳＡ（牛胎児血清）を含む生理食塩水中での５〜２０時間、好ましくは８〜１２時間の静置培養を具体的に挙げることができる。
【００１８】
本発明のインビトロで誘導した膵臓は、上記の膵臓のインビトロ形成方法により得られるものであれば特に制限されるものではなく、前記のように、インビトロ誘導膵臓臓器の他、膵臓特異的な分子マーカー遺伝子の発現能を有する外植体や、生体膵臓と類似の細胞形態を有する外植体や、生体膵臓と類似の分泌腺様構造を有する外植体も含まれる。また、本発明のスクリーニング方法は、かかるインビトロで誘導した膵臓を用いた診断や治療等に有用な物質、例えば膵臓の機能低下又は機能異常を治癒しうる物質や膵臓の機能低下又は機能異常を検出しうる物質等をスクリーニングする方法であれば特に制限されることはなく、例えば、本発明により得られるインビトロ誘導膵臓の膵細胞に被検物質をインジェクションし、インスリン等のマーカー分子の発現能を対照と比較することにより、膵臓の機能を亢進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００１９】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（アフリカツメガエル後期胞胚の予定外胚葉部分の準備）
成体アフリカツメガエル（Xenopus laevis）のオスとメスの背側リンパ嚢に各６００ＩＵのｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；Ｇｅｓｔｒｏｎ；デンカ製薬、日本）を注射し、これらアフリカツメガエルを交配させて受精卵を得た。これら後期胞胚［発生段階９］を、４．５％のシステイン塩酸塩（ｐＨ７．８）を含んだスタインバーグ溶液（ＳＳ：５８．００ｍＭのＮａＣｌ、０．６７ｍＭのＫＣｌ、０．３４ｍＭのＣａ（ＮＯ3）2、０．８３ｍＭのＭｇＳＯ4、３．００ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１００ｍｇ／ｌのカナマイシン硫酸塩；ｐＨ７．４）で脱ゼリーし、スタインバーグ氏液中で卵膜をピンセットで除去した。得られたアフリカツメガエル後期胞胚の予定外胚葉部分をタングステン針により０．４ｍｍ角のサイズに切り出した。
【００２０】
実施例２（予定外胚葉片のアクチビン／レチノイン酸同時１時間処理により分化する組織）
ヒトリコンビナントアクチビンＡ（味の素社製）を１００ｎｇ／ｍｌになるように、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有スタインバーグ溶液に溶解し、アクチビン溶液を調製した。オールトランス（all-trans）レチノイン酸粉末（ＣＡＴ＃Ｒ２６２５，シグマ社製）は予め１０-2Ｍになるようにエタノールに溶解し、予定外胚葉片を処理する際にこのエタノール溶液を、表１に示される各濃度になるように上記アクチビン溶液に希釈してアクチビン／レチノイン酸混合液をそれぞれ調製し、以下の実験に用いた。
【００２１】
実施例１の切り出した予定外胚葉片を、上記調製したアクチビン／レチノイン酸混合液中で１時間静置して処理し、０．１％のＢＳＡ含有スタインバーグ溶液で２回洗浄した後、同液中で２０℃で１０日間培養した（図１の一時的処理参照）。これら培養した外植体をブアン（Ｂｏｕｉｎ）氏液で固定した後、エタノール−キシレンシリーズにて脱水処理し、これらの外植体をパラフィン包埋し、６μｍ厚に薄切りし、これらの小片をヘマトキシリン−エオシン染色し、分化した組織を光学顕微鏡にて観察・検定した。また、無処理の予定外胚葉片についても同様に光学顕微鏡で観察・検定した。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0004426064.tif 000002
【００２３】
上記の結果から、無処理の予定外胚葉片は培養開始４日後の時点で不整形表皮を形成することがわかった（図２Ａ：参考写真１参照）。また、予定外胚葉片をアクチビン（１００ｎｇ／ｍｌ）のみで処理した場合には、脊索や筋肉、咽頭上皮等の背側中胚葉及び前方内胚葉組織が分化し、背側中胚葉によって二次的に誘導されたと推測される神経組織も一部認められた（表１、図２Ｂ：参考写真１参照）。アクチビン／レチノイン酸混合液による処理では、レチノイン酸濃度の上昇にしたがって、まず脊索形成率が低下し、次いで筋肉形成率が低下することがわかった（表１）。一方、前腎管の形成率は上昇し、レチノイン酸濃度１０-5〜１０-4Ｍのとき最大となっていた（６０％以上）。また、レチノイン酸濃度が高くなるにつれて腸上皮の分化が多少促進されていた（１０-4Ｍのとき２３％）。膵臓形成に関しては、レチノイン酸が高濃度のときに分化が認められたが、その割合は１６％（１０-4Ｍ）と低かった。このようにアクチビンにレチノイン酸が添加された場合、レチノイン酸濃度の影響を受けて中胚葉性組織の分化パターンは大きく変化するが、内胚葉性組織の分化パターンに関してはほとんど変化がみられなかった。なお、図２Ｂ中のｎｏｔは脊索を、ｎｅｕは神経組織をそれぞれ意味し、スケールバーは１００μｍを表す。
【００２４】
参考例１（予定外胚葉片のアクチビン／レチノイン酸同時継続処理により分化する組織）
実施例２の結果から、レチノイン酸処理の影響が中胚葉組織の分化パターンに現れたことから、レチノイン酸は、中胚葉が各中胚葉組織（例えば、脊索、筋肉、前腎管など）へと運命が決定される時期に作用したと考えられる。一方、正常発生においては、各内胚葉組織の形成は各中胚葉組織の形成より遅れておこることが報告されている（Nieuwkoop, P. D. and Faber, J.; (1956) Normal table of Xenopus laevis (Daudin). (Amsterdam: North-Holland Publishing Company)。このため、各内胚葉組織への分化決定は各中胚葉組織への決定よりも時期的に遅くおこると推測できる。しかし、インビトロではその時期を厳密には特定できない。そこで、処理時間及びタイミングの影響を除くために、以下のようにアクチビン／レチノイン酸混合液で継続処理をおこなった。実施例１の切り出した予定外胚葉片を、上記調製したアクチビン／レチノイン酸混合液中で２０℃で１０日間培養した（図１の継続処理参照）。これら培養した外植体を実施例２の方法と同様に染色し、分化した組織を光学顕微鏡にて観察・検定した。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
0004426064.tif 000003
【００２６】
表２の結果から、継続的にアクチビン／レチノイン酸混合液で処理した場合においても、１時間処理と同様にレチノイン酸濃度が上昇するにつれて脊索、筋肉の形成率が低下し、前腎管形成率が上昇していた（表２）。レチノイン酸濃度１０-5Ｍにおいて咽頭上皮の形成が低率で認められたが（２０％）、膵臓が分化することはなかった。また、１０-4Ｍのレチノイン酸が含まれる処理ではどの外植体も培養期間中に死亡することがわかった。一方で、本発明者らにより、初期原腸胚の原口上唇部を切り出したのち、１〜３時間レチノイン酸で処理した場合には、細胞の予定運命が変更され、膵臓が形成されることを報告している（Moriya, N. et al.; Develop. Growth. Differ. 42, 175-185, 2000）。この場合、レチノイン酸処理開始の時点では、原口上唇部は既に背側中胚葉／前方内胚葉となるように方向付けされた状態にある。しかし、予定外胚葉片を上記の様に処理した場合、高濃度アクチビンの作用（背側中胚葉／前方内胚葉への誘導）と、レチノイン酸の作用とを同時に受けることになる。このときには、予定外胚葉細胞は背側中胚葉／前方中胚葉になり得ず、側方中胚葉が誘導されてしまうと推測される（Moriya, N. et al.; Develop. Growth. Differ. 35, 123-128, 1993）。また、レチノイン酸の膵臓誘導作用は、すでに背側中胚葉／前方内胚葉へと方向付けされている細胞に対してのみ有効である可能性が考えられる。
【００２７】
実施例３（予定外胚葉片のアクチビンとレチノイン酸の時間差処理により分化する組織）
アクチビンの作用により背側中胚葉／前方内胚葉への分化が決定された後、初めてレチノイン酸の作用を受けられるように、アクチビン処理とレチノイン酸処理の間にタイムラグを設けた。実施例１の切り出した予定外胚葉片を、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビン溶液中に１時間静置した後、０．１％のＢＳＡ含有スタインバーグ溶液で２回洗浄し、０．１％のＢＳＡ含有スタインバーグ溶液中に表３に示す各タイムラグ時間だけ静置した。タイムラグ経過後、予定外胚葉片を１０-4Ｍのレチノイン酸溶液中で１時間静置し、０．１％のＢＳＡ含有スタインバーグ溶液で２回洗浄した後、０．１％のＢＳＡ含有スタインバーグ溶液中で２０℃で１０日間培養した（図１のタイムラグ処理参照）。これら培養した外植体を実施例２の方法と同様に染色し、分化した組織を光学顕微鏡にて観察・検定した。結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
0004426064.tif 000004
【００２９】
上記の結果から、アクチビン（１００ｎｇ／ｍｌ）とレチノイン酸（１０-4Ｍ）の同時処理あるいはタイムラグ０時間の処理（アクチビン処理後すぐにレチノイン酸処理）の場合には、前腎管が高率に分化していた（表３、図２Ｃ：参考写真１参照）。タイムラグが３〜５時間の場合、前腎管形成率は低く、膵臓形成率は最も高く８０％以上であることがわかった（表３、図２Ｄ：参考写真１参照）。タイムラグ１５時間以上では脊索や咽頭上皮が分化することがわかった（表３、図２Ｅ：参考写真１参照）。しかし、タイムラグが３時間未満あるいは１５時間以上の場合の膵臓形成率は低かった（表３）。光学顕微鏡による観察では、タイムラグが３〜５時間のときにみられた膵臓は複数の細胞が集合して分泌腺（腺房）様構造を示し、これらの細胞群の中には中央に腺腔様の空洞が明確に認められるものがあった。また、これらの膵臓は、核が腺房の基底側に位置し、腺房の中央付近がエオシンで強く染まり、ブドウ状の細胞集合体を形成することから正常胚の膵臓に類似していることがわかった（図２Ｄ）。
【００３０】
これらのことから、タイムラグを設けることにより膵臓に分化するようになったことは、アクチビンにより予定外胚葉細胞が背側中胚葉／前方内胚葉へと方向付けされてから、レチノイン酸の膵臓誘導作用を有効に受けられる準備が整うまでに３〜５時間を要することを示唆する。この期間以前ではレチノイン酸の作用は、おこりつつある中胚葉性組織の決定に影響し、この時期間以降では内胚葉性組織の決定も終了してしまうと推測できる。したがって、タイムラグ１〜３時間の処理では前腎管が誘導され、３〜５時間では膵臓が誘導され、５時間以降ではレチノイン酸処理しない場合と同様に脊索や咽頭上皮が形成されたと考えられる。なお、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ中のｎｏｔは脊索を、ｎｅｕは神経組織を、ｐｒｏは前腎管を、ｐａｎは膵臓を、ｉｎｔは腸上皮を、ｐｈａは咽頭上皮をそれぞれ意味し、スケールバーは１００μｍを表す。
【００３１】
また、光学顕微鏡において、上記外植体中に分化した膵臓は肥厚した腸上皮によって囲まれていることがわかった。正常胚において内胚葉性上皮は口から肛門までつながっており、その形態は連続的に変化する。また、咽頭と腸はどちらも内胚葉性上皮であるが、咽頭上皮は細胞高が低く立方体状の細胞が並んだ形態を示すのに対し、腸上皮は細胞高が高く、縦長の細胞が並んで上皮を形成していることが知られている（Chalmers, A. D. and Slack, J. M. W.; Dev. Dyn. 212, 509-521, 1998）。そこで、上皮の肥厚の度合いを基準にして、細胞の「縦／横」の比が３以下のものを「咽頭上皮」とし、３以上のものを「腸上皮」としてカウントした。また、アクチビン処理とレチノイン酸処理の間に５時間のタイムラグを設けた場合、レチノイン酸はアクチビン処理により誘導される咽頭上皮の形成を抑制して、膵臓や腸を誘導していることがわかった。なお、正常胚及び成体では、咽頭は胚の前方に位置し、膵臓と十二指腸はそれより後方に互いに接近して存在し、膵臓は十二指腸につながって消化酵素を分泌していることが知られている。
【００３２】
これまでの報告により、ツメガエル初期胚をレチノイン酸処理すると頭部欠損胚となること（Durston, A. J. et al.; Nature 340, 140-144, 1989）や、レチノイン酸は前方分子マーカーを抑制し、後方マーカーを誘導すること（Ruizi Altaba, A. and Jessell, T.; Development 112, 945-958, 1991、Ruizi Altaba, A. and Jessell, T.; Genes. Dev. 5, 175-187, 1991、Lopez, S. L. and Carrasco, A. E.; Mech. Dev. 36, 153-164, 1992、Kolm, P. J. et al.; Dev. Biol. 192, 1-6, 1997）や、レチノイン酸及びその受容体が胚の後方部分に局在すること（Ellinger-Ziegelbauer, H. and Dreyer, C.; Genes. Dev. 5, 94-104, 1991、Chen, Y. et al.; Dev. Biol. 161, 70-76, 1994）が知られている。これらのことから、高濃度アクチビンにより誘導された前方内胚葉（このままでは咽頭に分化する）をレチノイン酸が後方化し、膵臓と腸上皮が形成されたと推測できる。なお、表中で高濃度レチノイン酸処理の場合にも咽頭上皮の形成率が高いのは、外植体中に少しの咽頭上皮がある場合にもカウントしているためであり、実際の組織観察においては膵臓と共存して分化しているのは腸上皮が圧倒的に多かった（図２Ｄ）。
【００３３】
また、ツメガエル胚の内胚葉に対するレチノイン酸の影響を調べた報告がある（Zeynali, B. and Dixon, K. E.; Dev. Genes. Evol. 208, 318-326, 1998）。ツメガエル胚をレチノイン酸で処理し、その後の消化管の形成を調査したところ、消化管の形態に異常が認められたが、膵臓形成は正常であった。ここでレチノイン酸が膵臓形成に影響を与えなかった理由は、処理する時期が発生段階２２〜３２と遅かったこと、胚全体に対する影響をみていることが考えられる。本発明者らは、胞胚〜原腸胚の時期に胚全体のレチノイン酸処理を実施した。これらの胚は頭部欠損胚となったが、内胚葉性器官に特異的な欠損や肥大はみられず、体内で膵臓が特異的に誘導されることはなかった。ただし、各内胚葉性器官の位置関係は異常で、前後軸方向に凝集して形成されていた。このことからも、レチノイン酸は膵臓を特異的に誘導する作用を有するのではなく、内胚葉性細胞に対する後方化作用によって膵臓分化を誘導したと考えられる。
【００３４】
次に実施例１の切り出した予定外胚葉片を、タイムラグを５時間として上記と同様に処理し、２０℃で１０日間培養した外植体を緩衝液Ｉ（３％のパラホルムアルデヒド、２．５％のグルタルアルデヒド、０．１Ｍのカコジル酸塩；ｐＨ７．４）で１日間前固定した。この固定した外植体を、緩衝液Ｉで洗浄し、続いて緩衝液II（１％のＯｓＯ4、０．１Ｍのカコジル酸塩；ｐＨ７．４）で２時間固定し、緩衝液IIで洗浄した後、エタノール−アセトンシリーズで脱水処理し、エポキシ樹脂に包埋した。この包埋した外植体を超薄切片に切断し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛により二重染色し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−２００ＣＸ；ＪＯＥＬ社製）で観察した（図３：参考写真２参照）。この結果、外植体中にはいくつかの細胞が集合した外分泌腺様構造が確認できた。これらの細胞群の中央には、腺腔と思われる空洞があり（図３Ａ）、空洞の反対側すなわち、腺房細胞の基底側に核、空洞側の細胞内部には電子密度の高い分泌顆粒（直径０．２〜１．０μｍ）が数多く存在しており、これらの構造は正常胚の膵臓の外分泌腺及び外分泌顆粒に酷似していることがわかった（Lozano, M. T. et al1.; Gen. Comp. Endocrinol. 114, 191-205, 1999）。また、これ以外に２種類の異なる分泌顆粒を含包する細胞が確認できた。一つは、電子密度の高い分泌顆粒（直径０．１〜０．３μｍ）を含む細胞で、これは膵臓ランゲルハンス島のグルカゴン産生細胞（Leone, F. et al.; L. Embryol. Exp. Morph. 36, 711-724, 1976、Lozano, M. T. et al1.; Gen. Comp. Endocrinol. 114, 191-205, 1999）に類似するものであり（図３Ｂ）、もう一つは分泌顆粒（直径０．２〜１．０μｍ）内に電子密度の高い核を持つものでインスリン産生細胞（Leone, F. et al.; L. Embryol. Exp. Morph. 36, 711-724, 1976、Lozano, M. T. et al1.; Gen. Comp. Endocrinol. 114, 191-205, 1999）に類似するものであることがわかった（図３Ｃ）。なお、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ中のスケールバーはそれぞれ、５、１、１μｍを表し、ｌｕは腺腔を意味し、図３Ａ中の矢印は外分泌顆粒を、図３Ｂ中の矢印はグルカゴン産生細胞様の分泌顆粒を、図３Ｃ中の矢印はインスリン産生細胞様の分泌顆粒をそれぞれ示している。
【００３５】
実施例５（膵臓特異的遺伝子の発現）
次に実施例１の切り出した予定外胚葉片を、タイムラグを５時間として実施例４と同様に処理し、２０℃で３日間培養した後、膵臓特異的遺伝子であるインスリン（Henry, G. L. et al.; Development 122, 1007-1015, 1996）とＸｌＨｂｏｘ８（Lemaire, P. et al.; Development 125, 2371-2380, 1998）の発現を文献（Yokota, C. et al.; J. Biochem. 123, 339-346, 1998）記載の方法により調べてみた。培養した外植体からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（GIBCO BRL社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ（２μｇ／μｌ）１μｌに対して、ＰＣＲ反応を行い、膵臓に特異的な遺伝子であるインスリンとＸｌＨｂｏｘ８（ＰＤＸ１のホモロジー）の発現パターンを調べてみた。なお、ローディングコントロールとしてＥＦ−１α（延長因子１α）を用いた。ＰＣＲ反応における各遺伝子のプライマーの組合せとしては、インスリン［ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｆ：５′−ＡＴＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧ−３′（配列番号１）、ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｒ：５′−ＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡ−３′（配列番号２）］、ＸｌＨｂｏｘ８［ＸｌＨｂｏｘ８−Ｆ：５′−ＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＴＡ−３′（配列番号３）、ＸｌＨｂｏｘ８−Ｒ：５′−ＧＧＧＣＴＣＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＴＣ−３′（配列番号４）］、ＥＦ−１α［ＥＦ−１α−Ｆ：５′−ＴＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＧＣＴＴＧＣ−３′（配列番号５）、ＥＦ−１α−Ｒ：５′−ＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣ−３′（配列番号６）］、をそれぞれ用いた。
【００３６】
上記ｃＤＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）５μｌに、ＤＤＷを７６μｌ、１０×Ｅｘ  ｂｕｆｆｅｒを１０μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ  ｍｉｘを８μｌ、５Ｕ／μｌのＥｘＴａｑを０．５μｌ、１００μＭの上記各プライマーを０．５μｌ加え、全量１００μｌでＰＣＲ反応を行った。サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ9４℃で４分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５８℃で１分間伸張させ、７２℃で１分間アニーリングするというサイクルを２３〜３０回繰り返し、最後に７２℃で９分間アニーリングを行った。その後、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル（１．５％）電気泳動法により分離した後、サザンハイブリダイゼーションにより検出した（図４）。なお、ネガティブコントロールとしてＥＦ−１αを逆転写因子を除いた条件でＲＴ−ＰＣＲをおこなったものを用いた。
【００３７】
上記図４の結果から、無処理の外植体とレチノイン酸単独処理の外植体にはこれらの遺伝子発現はみられず（図４のレーン１，３）、アクチビン単独処理ではこれらの発現は若干誘導されるにすぎなかった（図４のレーン２）。しかし、アクチビンとレチノイン酸で同時に処理された外植体はこれらの遺伝子を発現し（図４のレーン４）、アクチビンとレチノイン酸が時間差５時間で処理されたものはさらに強く発現していることがわかった（図４のレーン５）。また、アクチビンとレチノイン酸が時間差２５時間で処理されたものは、これらの発現が時間差５時間の場合より低下していた（図４のレーン６）。以上のことから、アクチビン単独処理で膵臓を特異的に分化させる可能性は低く、アクチビンとレチノイン酸で処理することにより膵臓は高率で形成されることがわかった。
【００３８】
実施例６（アクチビンとレチノイン酸処理した外植体の免疫組織化学）
次に実施例１の切り出した予定外胚葉片を、タイムラグを５時間として実施例４と同様に処理し、２０℃で１０日間培養した後、外植体を緩衝液III［０．１Ｍの３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ：モプス）、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＳＯ4、３．７％のホルムアルデヒド］で固定し、生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、２％のスキムミルクを含む１％のＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした。このブロッキングした外植体を、抗インスリン（モルモットＩｇＧ）抗体（抗体希釈倍率＝１：１０００；ＣＡＴ＃Ａ０５６４；Dako Corporation又は抗体希釈倍率＝１：１０００；ＣＡＴ＃４０１０−０１；Linco Research Inc.）、あるいは抗グルカゴン（マウスＩｇＧ）抗体（抗体希釈倍率＝１：２０００；ＣＡＴ＃Ｇ−２６５４；シグマ社製）液中で１晩静置したのち、ＰＢＳで洗浄した。
【００３９】
上記１次抗体と反応させた外植体及びコントロールとしての１次抗体と反応させていない外植体をそれぞれ、アルカリホスファターゼで標識した抗モルモットＩｇＧ抗体（抗体希釈倍率＝１：５００；ＣＡＴ＃６１−４６２２；Zymed Laboratories Inc.）又はアルカリホスファターゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（抗体希釈倍率＝１：５００；ＣＡＴ＃ＡＱ１６０Ａ；Chemicon International Inc.）を用いて反応させ、ＰＢＳで洗浄した。これらの２次抗体で反応させた外植体をそれぞれ、ニトロ安息香酸（ＮＩＢ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）とを基質としたアルカリホスファターゼ緩衝液［１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（界面活性剤）；ｐＨ９.５］中で青色に発色させ、ブアン氏液で再固定した後、エタノール−キシレンシリーズにて脱水処理し、これらの外植体をパラフィン包埋し、１０μｍ厚に薄切りし、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−２００ＣＸ；ＪＯＥＬ社製）で観察した（図５：参考写真３参照）。
【００４０】
上記図５の結果から、二次抗体（アルカリホスファターゼで標識した抗モルモットＩｇＧ抗体又はアルカリホスファターゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体）のみのコントロールでは、どちらを用いても外植体中において染色される部分はなかった（図５Ａ、Ｄ）。しかし、１次抗体が抗インスリン抗体の場合では、外植体中に数カ所染色される部分を確認することができた（図５Ｂ、Ｃ）。また、１次抗体が抗グルカゴン抗体の場合でも同様に染色される部分が認められた（図５Ｅ、Ｆ）。これらのことから、タイムラグを５時間としてアクチビンとレチノイン酸で処理することにより、外植体においてインスリンやグルカゴンが合成することや外植体中に内分泌腺が分化することがわかった。これらのことから、試験官内で形成された膵臓は、形態的のみではなく機能的にも正常の膵臓に類似の性質を有するものであると考えられる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によると、膵臓の分化・形成機構に関しての知見を得ることができる、発生工学あるいは臓器工学上有用なインビトロ誘導膵臓や、インビトロで誘導した膵臓が実際に生体内でも機能できるかどうかを評価することができる移植用膵臓や、より高等な動物の膵疾患の診断・治療への道を拓くインビトロ誘導膵臓を、人工的に膵臓予定域以外の胚葉域から高率に誘導することができる。この方法を用いて、膵臓形成に関わる遺伝子の探索も可能であり、得られた膵臓形成のさまざまな遺伝子の解析も可能で、これら遺伝子を用いることで遺伝子治療や遺伝子診断への道が拓かれる。また、インスリン欠乏症で産まれてくる新生児や遺伝病に対して、これらの試験官内で形成された臓器（膵臓）を移植することにより、治療への道が拓かれる可能性がある。さらに、成人になって糖尿病などの成人病に対してインスリンをはじめとする膵臓の働きは極めて重要であり、そのような糖尿病やその他膵臓の機能変化によってもたらされる病気の治療への道が拓かれる可能性がある。
【００４２】
【配列表】
0004426064.tif 000005
0004426064.tif 000006
0004426064.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】アフリカツメガエル胚の予定外胚葉片のアクチビンとレチノイン酸による処理方法を示す図である。
【図２】各種処理により外植体中に分化する組織の光学顕微鏡観察像を示す図である。
【図３】アクチビンとレチノイン酸で処理した外植体の電子顕微鏡観察像を示す図である。
【図４】膵臓特異的遺伝子の発現パターンを示す図である。
【図５】アクチビンとレチノイン酸で処理した外植体の免疫組織化学を示す図である。
【図１】
0004426064.tif 000008
【図２】
0004426064.tif 000009
【図３】
0004426064.tif 000010
【図４】
0004426064.tif 000011
【図５】
0004426064.tif 000012