(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット分子が結合する複数のプローブサイトが配置されたバイオチップにおいて、
前記プローブサイトの生体高分子と同等の分子量の生体高分子が同等の環境条件で同等の分子数をスポットされて形成されたマーカサイトが配置され、前記マーカサイトの生体高分子には予め数量が既知である蛍光分子が結合されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項２】
前記マーカサイトは前記プローブサイトと同種の生体高分子を用いて形成されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
蛍光の発光量が異なる複数の前記マーカサイトが配置されていることを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載のバイオチップ。
【請求項４】
前記ターゲット分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖、メタボロームのいずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオチップ。
【請求項５】
前記蛍光分子の代わりにリンカーが前記マーカサイトの生体高分子に結合され、前記リンカーに結合する物質を付加した蛍光分子が前記マーカサイトに結合できるように構成したことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項６】
前記リンカーをビオチンとし前記リンカーに結合する物質をアビジンとしたことを特徴とする請求項５に記載のバイオチップ。
【請求項７】
ターゲット分子が結合する複数のプローブサイトが配置されたバイオチップを分析する分析装置であって、
前記バイオチップ上に配置されて前記プローブサイトの生体高分子と同等の分子量の生体高分子が同等の環境条件で同等の分子数をスポットされて形成され、前記生体高分子には予め数量が既知である蛍光分子が結合されているマーカサイトと、
前記バイオチップに励起光を照射する照射手段と、
前記励起光を照射したときの前記プローブサイトおよび前記マーカサイトの蛍光の発光量を取得する取得手段と、
取得された前記プローブサイトおよび前記マーカサイトの蛍光の発光量を比較することで前記プローブサイトのハイブリダイゼーション効率を算出する算出手段と、
を備えることを特徴とする分析装置。
【請求項８】
前記マーカサイトの蛍光に基づいて前記取得手段による取得領域の位置決めを行う位置決め手段を備えることを特徴とする請求項７に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションの原理を利用したバイオチップおよびバイオチップを分析する分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
相補的な塩基同士が特異的に結合するハイブリダイゼーションの原理を利用したバイオチップが知られている。このようなバイオチップ上には、各ターゲットＤＮＡに対応するプローブＤＮＡが固定されたプローブサイトが配置されており、ハイブリダイゼーションによってターゲットＤＮＡがそれぞれ対応するサイトに結合する。結合したターゲットＤＮＡの量は、蛍光マーカを用いることで測定することができる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−７８７６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
プローブサイトに結合するターゲットＤＮＡの量は、そのプローブサイトのプローブＤＮＡの数に応じて変動する。しかし、従来のバイオチップでは、各プローブサイトにおけるプローブＤＮＡの数が不明であるため、ハイブリダイゼーション効率を定量的に把握することができないという問題がある。
【０００５】
ハイブリダイゼーション効率を定量化する方法として、CodeLink Expression Bioarray System（商標名）で用いられている方法がある。この方法は、スポットによるプローブサイトの形成後、各プローブサイトにおけるスポット量を計測し、計測値のデータを出荷時に添付するものである。
【０００６】
しかし、この方法によっても、ハイブリダイゼーションの処理中に離脱するプローブＤＮＡの比率が不明なため、結果的に正確なハイブリダイゼーション効率を算出することはできない。
【０００７】
本発明の目的は、ハイブリダイゼーション効率を定量的に把握できるバイオチップ、およびこのようなバイオチップに適合する分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のバイオチップは、ターゲット分子が結合する複数のプローブサイトが配置されたバイオチップにおいて、前記プローブサイトの生体高分子と同等の分子量の生体高分子が同等の環境条件で同等の分子数をスポットされて形成されたマーカサイトが配置され、前記マーカサイトの生体高分子には予め数量が既知である蛍光分子が結合されていることを特徴とする。
このバイオチップによれば、マーカサイトに結合される蛍光分子の数量が既知であるので、プローブサイトの蛍光の光量と、マーカサイトの蛍光の光量を比較することで、プローブサイトのハイブリダイゼーション効率を定量的に把握できる。マーカサイトにはバイオチップの作成時から蛍光分子が結合されていてもよいし、バイオチップに対する所定の処理により、所定の量の蛍光分子が結合するようにマーカサイトを構成してもよい。
また、マーカサイトがプローブサイトの生体高分子と同等の分子量の生体高分子を用いて形成されているので、バイオチップの作成時にマーカサイトとプローブサイトに与えられる生体高分子の量を揃えることができる。このため、作成時の条件と無関係に常に蛍光の光量の比率がハイブリダイゼーション効率を正しく示す。また、バイオチップに対する処理によって離脱する生体高分子の比率がマーカサイトとプローブサイトの間で同等となるため、処理の段階と無関係に常に蛍光の光量の比率がハイブリダイゼーション効率を正しく示す。
【０００９】
前記マーカサイトは前記プローブサイトと同種の生体高分子を用いて形成されていてもよい。
この場合には、マーカサイトがプローブサイトと同種の生体高分子を用いて形成されているので、バイオチップの作成時にマーカサイトとプローブサイトに与えられる生体高分子の量を揃えることができる。このため、作成時の条件と無関係に常に蛍光の光量の比率がハイブリダイゼーション効率を正しく示す。また、バイオチップに対する処理によって離脱する生体高分子の比率がマーカサイトとプローブサイトの間で同等となるため、処理の段階と無関係に常に蛍光の光量の比率がハイブリダイゼーション効率を正しく示す。
【００１１】
蛍光の発光量が異なる複数の前記マーカサイトが配置されていてもよい。
この場合には、広範囲にわたり、ハイブリダイゼーション効率を安定して把握できる。
【００１２】
前記ターゲット分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖、メタボロームのいずれかであってもよい。
前記蛍光分子の代わりにビオチンが前記マーカサイトの生体高分子に結合され、アビジンを付加した蛍光分子が前記マーカサイトに結合できるように構成してもよい。
【００１３】
本発明の分析装置は、ターゲット分子が結合する複数のプローブサイトが配置されたバイオチップを分析する分析装置であって、前記バイオチップ上に配置されて前記プローブサイトの生体高分子と同等の分子量の生体高分子が同等の環境条件で同等の分子数をスポットされて形成され、前記生体高分子には予め数量が既知である蛍光分子が結合されているマーカサイトと、前記バイオチップに励起光を照射する照射手段と、前記励起光を照射したときの前記プローブサイトおよび前記マーカサイトの蛍光の発光量を取得する取得手段と、取得された前記プローブサイトおよび前記マーカサイトの蛍光の発光量を比較することで前記プローブサイトのハイブリダイゼーション効率を算出する算出手段と、を備えることを特徴とする。
この分析装置によれば、バイオチップのマーカサイトに結合される蛍光分子の数量が既知であるので、プローブサイトの蛍光の光量と、マーカサイトの蛍光の光量を比較することで、プローブサイトのハイブリダイゼーション効率を定量的に把握できる。
また、マーカサイトがプローブサイトの生体高分子と同等の分子量の生体高分子を用いて形成されているので、バイオチップの作成時にマーカサイトとプローブサイトに与えられる生体高分子の量を揃えることができる。このため、作成時の条件と無関係に常に蛍光の光量の比率がハイブリダイゼーション効率を正しく示す。また、バイオチップに対する処理によって離脱する生体高分子の比率がマーカサイトとプローブサイトの間で同等となるため、処理の段階と無関係に常に蛍光の光量の比率がハイブリダイゼーション効率を正しく示す。
【００１４】
前記マーカサイトの蛍光に基づいて前記取得手段による取得領域の位置決めを行う位置決め手段を備えてもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のバイオチップによれば、マーカサイトに結合される蛍光分子の数量が既知であるので、プローブサイトの蛍光の光量と、マーカサイトの蛍光の光量を比較することで、プローブサイトのハイブリダイゼーション効率を定量的に把握できる。
【００１６】
本発明の分析装置によれば、バイオチップのマーカサイトに結合される蛍光分子の数量が既知であるので、プローブサイトの蛍光の光量と、マーカサイトの蛍光の光量を比較することで、プローブサイトのハイブリダイゼーション効率を定量的に把握できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図１〜図４を参照して、本発明によるバイオチップの一実施形態について説明する。
【００１８】
図１（ａ）は、本実施形態のバイオチップの構成を示す斜視図である。
【００１９】
図１（ａ）に示すように、本実施形態のバイオチップは、基板１上にターゲットＤＮＡを検出するためのプローブサイト２群と、基板１上にマーカが固定されたマーカサイト３と、を有する。図１（ａ）において、基板１の四隅にそれぞれマーカサイト３が、他の位置にマトリクス状にプローブサイト２が、それぞれ設けられている。
【００２０】
図１（ｂ）はプローブサイト２およびマーカサイト３に固定されたＤＮＡを模式的に示す図である。
【００２１】
図１（ｂ）に示すように、個々のプローブサイト２では、特定のターゲットＤＮＡを検出するためのプローブＤＮＡ２１が固定されている。
【００２２】
また、マーカサイト３では、その末端に蛍光分子６が１つずつ固定されたＤＮＡ３１が固定されている。
【００２３】
図１（ａ）に示すように、本実施形態のバイオチップでは、例えば、所定のＤＮＡ溶液を付着させたピン４を、順次、基板１に接触させてスポットすることでプローブサイト２およびマーカサイト３を形成する。この場合、基板１をステージに固定した状態で、プローブサイト２およびマーカサイト３を続けて形成することにより、プローブサイト２とマーカサイト３間の正確な位置関係を確保できる。
【００２４】
図１（ｃ）に示すように、通常、プローブサイト２は目視では確認できない。しかし、本実施形態ではマーカサイト３の位置が蛍光分子６の発光により確認できるため、マーカサイト３の位置を基準として、プローブサイト２の位置を把握できる。
【００２５】
本実施形態では、プローブサイト２およびマーカサイト３を、ともにＤＮＡ溶液をスポットすることで形成している。また、形成するＤＮＡの分子数を揃えることで、プローブサイト２およびマーカサイト３にスポットされるＤＮＡ溶液の流動特性や粘性を同等にしている。このため、プローブサイト２およびマーカサイト３にスポットされる溶液量を同等にすることができる。一般に、バイオチップの作成時には、温度や湿度等の環境に応じてピン４により供給されるＤＮＡ溶液の量が変動する。しかし、本実施形態によれば、プローブサイト２およびマーカサイト３に対する変動が連動するので、プローブサイト２およびマーカサイト３にスポットされたＤＮＡ量を常に一致させることができる。
【００２６】
本実施形態のバイオチップでは、プローブサイト２およびマーカサイト３にスポットされたＤＮＡ量が一致しているため、バイオチップの作成後にマーカサイト３のスポット量を測定することにより、プローブサイト２のスポット量を把握できる。マーカサイト３のスポット量は、蛍光分子６に対応する波長の励起光を照射したときのマーカサイト３の発光量に基づいて正確に測定できる。
【００２７】
また、プローブサイト２およびマーカサイト３に同等の分子量のＤＮＡが同等の状態でスポットされているので、バイオチップに対する処理によって離脱するＤＮＡの比率がプローブサイト２およびマーカサイト３間で同等となる。このため、ターゲットＤＮＡの固定化処理、洗浄、あるいはプレハイブリダイゼーションの処理後における各プローブサイト２のプローブＤＮＡ２１の量なども、その時点におけるマーカサイト３のスポット量に基づいて把握できる。
【００２８】
図２はハイブリダイゼーションを行った後の状態を示しており、図２（ａ）はバイオチップの状態を模式的に示す図、図２（ｂ）は励起光を照射したときの各サイトの発光の様子を示す図である。
【００２９】
図２（ａ）に示すように、ハイブリダイゼーションによって蛍光分子６が付けられたターゲットＤＮＡ７が、プローブＤＮＡ２１に結合する。ハイブリダイゼーションの後、バイオチップに励起光を照射すると、図２（ｂ）に示すように、各サイトの蛍光分子６が発光する。この発光量は蛍光分子６の数に対応しているため、マーカサイト３の発光量を基準として、各プローブサイト２の蛍光分子６の数を評価することができる。
【００３０】
例えば、マーカサイト３のすべてのＤＮＡ３１に蛍光分子６を結合させておけば、マーカサイト３の光量がハイブリダイゼーション効率１００パーセントに相当する。したがって、マーカサイト３の光量を基準とすることで、各プローブサイト２でのハイブリダイゼーション効率を定量的に評価できる。
【００３１】
図３はマーカサイト３および各プローブサイト２の光量を示す図である。図３において、マーカサイト３の光量はハイブリダイゼーション効率１００パーセントに相当しており、各プローブサイト２の光量、すなわち各プローブサイト２のハイブリダイゼーション効率が絶対値として示される。
【００３２】
図４はハイブリダイゼーション後のバイオチップを分析する分析装置の構成を示すブロック図である。
【００３３】
図４に示すように、測定装置はバイオチップに励起光を照射する照射手段１０１と、励起光を照射したときのプローブサイト２およびマーカサイト３の蛍光の発光量を取得するスキャナ（取得手段）１０２と、スキャナ１０２により取得されたプローブサイト２およびマーカサイト３の蛍光の発光量を比較することでプローブサイト２のハイブリダイゼーション効率を定量的に算出する算出手段１０３と、マーカサイト３の蛍光に基づいてスキャナ１０２の撮影範囲の位置決めを行う位置決め手段１０４と、を備える。
【００３４】
プローブサイト２の光量は、スキャナ１０２により基板１の面を撮影することで取得される。このとき、撮影領域を特定する際に、マーカサイト３を位置決め手段１０４による位置決めの基準として使用することができる。また、プローブサイト２の光量に基づいて、算出手段１０３はハイブリダイゼーション効率の絶対値を算出する。絶対値はマーカサイト３の光量を基準とすることで算出される。
【００３５】
上記実施形態では、基板１の四隅に形成されたマーカサイト３のマーカ濃度を同一としたが、複数のマーカサイトのマーカ濃度にグラデーションを付けてもよい。この場合、マーカサイトの発光量と比較することにより、低発光量から高発光量まで広範囲においてプローブサイトの発光量を安定して算出することができる。マーカ濃度は、例えば、マーカサイト３にスポットされるＤＮＡ溶液について、蛍光分子を結合させたＤＮＡの比率を変化させることで制御できる。
【００３６】
上記実施形態では、マーカサイト３のすべてのＤＮＡ３１に蛍光分子６を１つずつ結合する例を示したが、蛍光分子の分子数を制御できればよく、例えば、２つ以上の蛍光分子を結合してもよい。
【００３７】
上記実施形態では、ＤＮＡの検出について例示したが、本発明は、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖、メタボローム等、種々のターゲット分子の検出に適用できる。また、本発明は、基板上での検出を行う場合に限定されず、例えば、メッシュあるいは３次元ゲル等の構造にプローブを結合させたバイオチップにも適用できる。
【００３８】
上記実施形態では、マーカサイト３の発光量をハイブリダイゼーション効率１００パーセントに対応させているが、マーカサイト３の発光量は任意の値（例えば、１０パーセント、１パーセント等）に設定できる。
【００３９】
また、本発明はプローブサイトに結合するターゲット分子を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）により増幅する場合についても適用できる。この場合、ＰＣＲによる増幅率や増幅時の蛍光分子付きＤＮＡの比率等を制御することで、マーカサイト３の発光量を基準として、プローブサイト２のハイブリダイゼーション効率を求めることができる。
【００４０】
上記実施形態では、ターゲット分子に蛍光分子を予め付加させてからハイブリダイゼーションを行っているが、本発明は、ハイブリダイゼーション後に蛍光分子を付加する場合にも適用できる。例えば、ターゲット分子をビオチンで標識しておき、ハイブリダイゼーション後に、アビジンを結合させた蛍光分子をターゲット分子に付加する手法にも適用できる。
【００４１】
また、上記実施形態では、マーカサイト３に予め蛍光分子６を付加しているが、バイオチップのユーザが所定の段階でマーカサイトに蛍光分子を結合できるようにしてもよい。例えば、バイオチップの作成時にはマーカサイトにビオチンを付加したＤＮＡを配置しておき、バイオチップの使用時、例えばハイブリダイゼーション後に、アビジンを付加した蛍光分子を結合させるようにしてもよい。
【００４２】
本発明は、２色法（競合ハイブリダイゼーション法）に対しても適用できる。この場合には、２色の蛍光の蛍光分子を付加したＤＮＡを混合してスポットすることで、各マーカサイトを形成すればよい。
【００４３】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、ハイブリダイゼーションの原理を利用したバイオチップおよびバイオチップを分析する分析装置に対し、広く適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本実施形態のバイオチップの構成を示す図であり、（ａ）は本実施形態のバイオチップの構成を示す斜視図、（ｂ）はプローブサイトおよびマーカサイトに固定されたＤＮＡを模式的に示す図、（ｃ）はマーカサイトの位置が認識される様子を示す図。
【図２】ハイブリダイゼーションを行った後の状態を示す図であり、（ａ）はバイオチップの状態を模式的に示す図、（ｂ）は励起光を照射したときの各サイトの発光の様子を示す図。
【図３】マーカサイトおよび各プローブサイトの光量を示す図。
【図４】ハイブリダイゼーション後のバイオチップを分析する分析装置の構成を示すブロック図。
【符号の説明】
【００４５】
１      バイオチップ
２      プローブサイト
３      マーカサイト
１０１  照射手段
１０２  スキャナ（取得手段）
１０３  算出手段
１０４  位置決め手段
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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