(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．２ｍｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌのシコリイン酸、０．０２ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよび１０ｍｇ／ｍｌから８００ｍｇ／ｍｌのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを含む、免疫系を刺激するためのＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物。
【請求項２】
前記シコリイン酸の量が、０．３ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌであり、前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量が、０．０５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌであり、そして前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量が、２０ｍｇ／ｍｌから８００ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物。
【請求項３】
前記シコリイン酸の量が、５．０ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌであり、前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量が、０．８ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌであり、そして前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量が、５０ｍｇ／ｍｌから８００ｍｇ／ｍｌである、請求項２に記載のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物。
【請求項４】
０．０１ｍｇ／ｇから５００ｍｇ／ｇのシコリイン酸、０．００５ｍｇ／ｇから１００ｍｇ／ｇのＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよび５ｍｇ／ｇから９００ｍｇ／ｇのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを含む、免疫系を刺激するためのＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物。
【請求項５】
前記シコリイン酸の量が、０．０５ｍｇ／ｇから５００ｍｇ／ｇであり、前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量が、０．１ｍｇ／ｇから１００ｍｇ／ｇであり、そして前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量が、１０ｍｇ／ｇから９００ｍｇ／ｇである、請求項４に記載のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物。
【請求項６】
前記シコリイン酸の量が、１５ｍｇ／ｇから５００ｍｇ／ｇであり、前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量が、５ｍｇ／ｇから１００ｍｇ／ｇであり、そして前記Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量が、２００ｍｇ／ｇから９００ｍｇ／ｇである、請求項４に記載のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物。
【請求項７】
前記組成物が、固体、ゲルまたは液体である、請求項４に記載のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物。
【請求項８】
免疫系を刺激するためのＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法であって、該方法は、ある量のシコリイン酸、ある量のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよびある量のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを混合して、０．２ｍｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌのシコリイン酸、０．０２ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよび１０ｍｇ／ｍｌから８００ｍｇ／ｍｌのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを含むＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じる工程を包含する、方法。
【請求項９】
免疫系を刺激するためのＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法であって、該方法は、ある量のシコリイン酸、ある量のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよびある量のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを混合して、０．０１ｍｇ／ｇから５００ｍｇ／ｇのシコリイン酸、０．００５ｍｇ／ｇから１００ｍｇ／ｇのＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよび５ｍｇ／ｇから９００ｍｇ／ｇのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを含むＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ属の植物から調製される栄養的なサプリメントに関する。
【０００２】
（発明の背景）
多数の研究によって、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ属の植物に由来する抽出物の健康を増進（促進）する特性が証明されている。例えば、Ａ．ＡｗａｎｇおよびＤ．Ｋｉｎｄａｃｋ、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１２４：５１２−５１６（１９９１）を参照のこと。良好な健康状態を促進すると考えられている生物学的に活性な成分を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物についての強力な商業的な市場が存在している。さらに、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物に由来する生物学的に活性な成分の標準化された量を含有するように、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を処方することが所望される。このような、標準化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、１つ以上の生物学的に活性なＥｃｈｉｎａｃｅａ成分の有効な用量を一貫して消費者に提供する。
【０００３】
詳細には、良好な健康状態を促進すると考えられる１つ以上の生物学的に活性な高濃度のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物についての強力な商業的な市場が存在している。このような高度に富化された抽出物は、食餌療法のサプリメントとして直接使用され得るか、または生物学的に活性であるＥｃｈｉｎａｃｅａ成分の標準化された量を含有している食餌療法のサプリメントを調製するため他のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物と混合され得る。
【０００４】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａに由来するポリサッカライド、アルキルアミド、および、シコリイン酸（ｃｉｃｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）（シコリイン酸、２，３−ｏ−ジ−カフェオイル酒石酸としてもまた公知のコーヒー酸誘導体）が、それぞれ、健康を促進する特性を有することが、化学的な研究によって示される。例えば、Ｅｃｈｉｎａｃｅａに由来するアルキルアミドは、約０．１ｐａｒｔ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ（ｐｐｍ）の濃度でマウスの顆粒球中での食作用を刺激することが示されている。Ｂａｕｅｒ，Ｒ．ら、Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８：２７６−２８１（１９８８）。同様に、シコリイン酸は、顆粒球中での食作用を増大させ、そして０．０１ｐｐｍ程度の低い濃度で免疫系を刺激し得ることが示されている。例えば、Ａ．Ａｗａｎｇら、前出を参照のこと。Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドは、マウスにおいて、ヒアルロニダーゼを阻害し、食作用を増大させ、インターフェロン−６の放出を誘導し、そしてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染に対する耐性を増強することが示されている。例えば、Ａ．Ａｗａｎｇら、前出、Ｗａｎｇｅｒ，Ｈ，ら、Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１０６９−１０７５（１９８５）を参照のこと。
【０００５】
高濃度のポリサッカライド、アルキルアミド、および／またはシコリイン酸を有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を産生するために、多数の因子を考慮し、そして最適化しなければならない。例えば、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物中のポリサッカライド、アルキルアミド、および／またはシコリイン酸の量は、植物の種類、植物の年齢、および植物の生長条件によって影響を受ける。さらに、溶媒およびプロセスのパラメーター（例えば、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物からポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸を抽出するために利用される、温度、抽出される時間の長さ）は、これらの成分の収量に大きく影響を与え得る。
【０００６】
従って、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物からポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸を効率よく抽出するための方法、ならびに高濃度のポリサッカライド、アルキルアミド、および／またはシコリイン酸を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物が必要とされている。さらに、ポリサッカライド、アルキルアミド、および／またはシコリイン酸抽出物を含有している、予め決定された所望される量のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を含有している標準化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物が、必要とされている。
【０００７】
（発明の要旨）
１つの局面においては、本発明は、標準化された量の少なくとも２つのＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を提供する。より好ましくは、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、標準化された量の少なくとも３個のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含有している。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を意味する。本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ成分は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびシコリイン酸である。本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために有用である本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、またはＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）において富化された抽出物である。本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、液体の形態、ゲルの形態、または固体の形態（例えば、散剤、または錠剤、またはカプセル剤）であり得、そして好ましくは、ヒトに対する投与（より好ましくは、経口投与）のために適合させられる。
【０００８】
別の局面においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、少なくとも２つのＥｃｈｉｎａｃｅａ成分（好ましくは、３個のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分）の、混合されたＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物のそれぞれの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を生じるために十分な量を混合する工程を包含する。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を意味する。本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ成分は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびシコリイン酸である。本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために有用である本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、またはＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）において富化された抽出物である。
【０００９】
別の局面においては、本発明は、少なくとも１つのＥｃｈｉｎａｃｅａ成分において富化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を調製するための方法を提供する。富化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を調製するための本発明の方法は、以下の工程を包含する：増強された量の所望される成分（例えば、シコリイン酸、アルキルアミド、またはポリサッカライド）を有している発達段階でＥｃｈｉｎａｃｅａ植物を選択する工程；所望される成分において富化されている選択された植物の一部を選択する工程；および選択された一部を、植物の一部から所望される成分を抽出するために有用である、エタノールおよび水ならなる群より選択される一定量の溶媒と接触させる工程。好ましくは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は次いで濃縮される。任意の種のＥｃｈｉｎａｃｅａ植物が、本発明の実施において利用され得るが、本発明においては、好ましい種はＥ．ｐｕｒｐｕｒｅａである。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物材料の抽出は、約１部の溶媒に対して約２部未満の、溶媒に対する植物材料の比（重量）を利用する。本発明において好ましい、溶媒に対する植物材料の比（重量）は、約４部の溶媒に対する約１部の植物材料である。
【００１０】
なお別の局面においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の１つ以上のメンバーにおいて富化された、液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化された液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約１％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、約５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約１０％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化された液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．１％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、約１．０％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約３．０％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化された液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．２％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、約０．５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約３．０％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【００１１】
なお別の局面においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の１つ以上のメンバーにおいて富化された、固体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化された固体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．０１％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、約０．０５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約２０％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化された固体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．００１％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、約０．０１％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約０．５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化された固体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．００５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、０．０５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約１．５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【００１２】
本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、例えば、食餌療法のサプリメントして、混合して、そして本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるための、ポリサッカライド、アルキルアミド、またはシコリイン酸の供給源として、有用である。本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、例えば、ヒトの食餌療法のサプリメントとして有用である。限定的ではない例として、哺乳動物に対して投与されると、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物は、免疫系の以下の局面の１つ以上を刺激する：マクロファージの食作用活性；マクロファージによる一酸化窒素の産生；マクロファージによるＴＮＦ−αの産生；脾臓細胞によるＩＦＮ−γの産生；および脾臓細胞によるＴＮＦ−αの産生。
【００１３】
なお別の局面においては、本発明は、哺乳動物中の免疫系の活性を増強するための方法を提供する。１つの実施態様においては、この方法は、哺乳動物に対して、標準化された量のＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の毎日の有効投与量を投与する工程を包含する。別の実施態様においては、この方法は、ＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドからなる群より選択されるＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物の毎日の有効投与量を哺乳動物に投与する工程を包含する。用語「毎日の有効投与量」およびその文法上の等価物は、哺乳動物中の免疫系の活性を増強するために有効である毎日の投与量を意味する。
【００１４】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
以下の略号が、本明細書中で使用される：ｍｇ／ｍｌ（またはｍｇ／ｍＬ）は、１ミリリットルあたりのミリグラムについての略号である；ｍｇ／ｇは、１グラムあたりのミリグラムについての略号である。
【００１５】
本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物、ならびに本発明の組成物および抽出物を調製するための方法を提供する。任意の種のＥｃｈｉｎａｃｅａが、本発明の実施において利用され得る。植物科学は、現在、９個のＥｃｈｉｎａｃｅａ種を認識している。Ｅ．ｐａｌｌｉｄａは、黒っぽい花弁、毛状の葉、および白色の花粉を有する四倍体種である。Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａは、代表的には、野生では乾燥した地面で生長し、そして短い毛状の葉および垂れた花によって特徴付けられる。Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａは、豊かな土壌を好み、黒っぽい紫色の花、および広い葉を有する。Ｅ．ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓは、茎の上に平たい毛を有し、茎に対して近くで折れ曲がった舌状花冠、および毛のない葉を有する。Ｅ．ｓａｎｇｕｉｎｅａは、Ｅ．ｐａｌｌｉｄａの見た目と似ているが、黄色の花粉を有する二倍体の植物である。Ｅ．ｓｉｍｕｌａｔａは、Ｅ．ｓｔｉｍｕｌａｔａが黄色の花粉を有することを除いて、Ｅ．ｐａｌｌｉｄａと物理的に同一であるようである。Ｅ．ｐａｒａｄｏｘａは、黄色またはピンク色のいずれかの花を有し、そして平たい毛を有する。Ｅ．ｔｅｎｅｓｅｅｎｓｉｓは、上方へ曲がった舌状花冠を有し、そして全てのＥｃｈｉｎａｃｅａ種の毛深い種である。Ｅ．ｌａｅｖｉｇａｔａは、Ｅ．ｐａｌｌｉｄａのような長い垂れた舌状花冠を有するが、その葉はＥ．ｐｕｒｐｕｒｅａのものと同様に広い。Ｅｃｈｉｎａｃｅａの任意の種が、本発明の実施において利用され得るが、Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａが、本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ種である。
【００１６】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａは、種子、クラウン部分から、そして植物の根の切片（好ましくは、１０〜１２ｃｍの長さ）から繁殖させられ得る。種子は、秋の熟成後すぐに屋外に種を蒔かれ得、そして春以降に発芽するが、発生の速度は、種によって変化する種子の休眠の程度によって影響を受ける。種子の発芽は、いくつかの因子によって影響を受ける。３年以上にわたる室温での長期間の種子の保存は、発芽の速度を低下させる。種子の大きさおよび開花位置は種子の発芽には影響を与えない。しかし、生理学的な成熟時であるが老化の前に回収された種子は、乾燥後に回収された種子よりも速い発芽速度を有する。本発明の実験においては、種子の供給源（すなわち、種子の供給者）は、Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａの発芽速度のバリエーションの主要なものを説明する。詳細には、種子の商業的に購入されたバッチにおけるＥｃｈｉｎａｃｅａハイブリッド種子の存在は所望されない。本発明において好ましい、Ｅｃｈｉｎａｃｅａのハイブリッド種子を同定する方法は、以下のとおりである。試験される種子は、毎日水やりされながらプランター中で発芽させられる。芽は、発芽の１週間後、生長させられる。次いで、芽が回収され、そして水で洗浄され、そして乾燥させられる。清潔な芽が、次いで、それらが微細に混合されるまで、キッチンブレンダーで処理される。植物材料は、５μｍのフィルターを通じる濾過によって回収される。残存している液体が、その最初の容量の半分まで、減圧下で蒸発によって濃縮され、次いで、０．４５μｍのフィルターを通じてＨＰＬＣ分析のために濾過される。本明細書中の実施例６に記載されるシコリイン酸アッセイ方法を使用するＨＰＬＣ分析は、ハイブリッドではない種子についての異なるシコリイン酸ピークを示すが、一方、シコリイン酸ピークはハイブリッドの種子においては存在しない。
【００１７】
直接播種された場所からの芽の出現は、成層（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）後の室内での発芽のようには均一ではない場合がある。種子の成層のための１つの本発明において好ましい方法は、プラスチックバッグの中で清潔な砂と種子を混合（１：１  ｖ／ｖの比で）すること、そして約１℃から約−４℃の間の温度で４から６週間の間約１０パーセントの湿度に維持することである。成層した種子を、次いで、砂から分離し、そして土壌の表面または表面から０．５ｃｍの深さに、またはピートおよび真珠岩（パーライト）の混合物（１：１  ｖ／ｖの比で）で満たされた小さい穴の中に、種を蒔く。平地に蒔かれた種子は、約１８〜２０℃で維持され、代表的には、播種の７から１０日以内に発生を開始する。芽は、好ましくは、屋外に移植されるまで、光を補って温室または室内で、生長させられる。代表的には、Ｅ，ｐｕｒｐｕｒｅａについての約２５７，０００個の種子／ｋｇから、Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａについての約３１９，０００個の種子／ｋｇまでである。約５００ｇの種子が、０．５ヘクタール（ｈａ）の平地への移植を提供するために必要とされる。
【００１８】
切断から細胞培養までの無性の生長もまた可能である。無性の生長は、活性な化合物の高い収量のために、選択的な品種改良または遺伝子操作を通じて、改善され得る、遺伝的に同一の植物の大きな集団を産生し得る。
【００１９】
野生では、Ｅｃｈｉｎａｃｅａは、代表的には、豊かではない、岩だらけの土壌でも、十分な太陽の光があれば生長する。しかし、中程度に豊かな、そして十分に水抜きされた土または砂の多い土の土壌（これは、中性からわずかに酸性（ｐＨ６〜７）である）における培養下でも、これはまた、生長する。Ｅｃｈｉｎａｃｅａは、根菜作物であり、従って、岩だらけのまたは重たい土壌が避けられるべきである。Ｅｃｈｉｎａｃｅａは、乾燥耐性であるので、水がその生長には重要であり、そして調節灌流が推奨される。
【００２０】
集中的な肥沃化は高い草本の収量を生じるが、根の収量は低くなる。バランスの取れた肥沃化（窒素は少なく、そして適切な量のリンおよびカリウムを含む）が、通常は十分である。骨粉またはリン酸の石（１４．５〜２０ｋｇ／ｈａ）および木炭（４５〜５１．５ｋｇ／ｈａ）が播種の前に適用され、そしてウシまたはウマの堆肥が、播種の後に３回適用され、これらは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａの生長のために有機肥沃化の本発明においてこのましい組合せである。４ｍＬ／Ｌの作業濃度で適用された魚による肥沃化（それぞれ、５−２−２の比でＮ−Ｐ2Ｏ5−Ｋ2Ｏを含む）は、Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａの生長を促進する。これらに加えて、堆肥および腐敗した地方自治体の廃棄物、緑色の被覆作物（例えば、キノア、イラクサ）、または赤色の被覆作物もまた有用である。化学的な肥沃化もまた、非有機的な培養のために使用され得る。窒素の肥沃化が、一般的な植物の健康状態について使用され、そしてより詳細には、葉の多い、暗い緑色の植物を産生するために、使用される。リン酸塩の肥沃化は、開花を増大する。
【００２１】
さらに、植物の面間隔が収量に影響を与える。好ましくは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａは、１２０ｃｍの土台において３０ｃｍ離して植えられるべきである。これによって、１つの土台あたり５つの並びとなり、そして約７４，０００本の植物／ｈａを生じる。これは、活発なＥｃｈｉｎａｃｅａ種が使用されるか、または植物が４年間より長い間生長させられる場合には、いっぱいの密度であり得る、最大の密度である。
【００２２】
根被い（マルチ）は、土壌の湿度および温度を維持する目的のために、そしてより重要なことは、雑草を制御する目的のために提供される。芽は、黒色のプラスチックの根被い（マルチ）または暗い根被い（マルチ）の下で生長する。芽が屋外である場合は、芽に清潔なストロー（２〜３ｃｍ）をかぶせる根被いが必須であると考えられる。Ｅｃｈｉｎａｃｅａは、雑草には耐性ではなく、従って、雑草のコントロールは重要な因子である。本発明の実験においては、Ｅｃｈｉｎａｃｅａを有機的に生長させる局面に関して、黒色のプラスチック、または暗い根被いは、特に、新しく確立される植物についての、最良の雑草のコントロール手段である。プラスチックの根被いは、７０から８０パーセントで雑草のコントロールのための労働コストを減少させ得る。暗い根被いは、播種後すぐに行われるべきであり、そして表面が乾燥し、そして雑草の発芽に好ましくない条件を作成することを可能にするためには、目の粗いものであるべきである（すなわち、約２ｃｍ×２ｃｍより大きい直径を有する暗い根被いの断片を利用する。播種の少なくとも１年前の、土地の獲得は、多年生の雑草を除き、そして一年草の雑草の集団を減少させるための別の方法である。土地の調製の好ましい方法は、雑草が成長する春に、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物を播種する前に土地を耕すことである。この方法では、雑草は、それらの根を曝すことによって駆除される。
【００２３】
徹底的な土壌の肥沃化が、Ｅｃｈｉｎａｃｅａの増殖および収量を最適にするために必須である。通常は、根は、種まきの３〜４年後まででは所望される大きさには到達しない。注意深く調節された生長条件を用いて、Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａからの収量が、２．５トン／ｈａに達し得る。Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａの収量は、代表的には、Ｅ，ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａのものよりも多い。
【００２４】
本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、標準化された量の少なくとも２つのＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含む。より好ましくは、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、標準化された量の少なくとも３個のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含む。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を意味する。標準化された量のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含むＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を処方することが所望される。なぜなら、このような標準化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、生物学的に活性な成分（単数または複数）の有効な用量を、一貫して（すなわち、バッチ間で変化しない）消費者に提供するからである。
【００２５】
本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために有用である本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、生存している生物体中に導入した場合に、免疫機能の刺激のような、生物学的な応答を誘導し得る少なくとも１つのＥｃｈｉｎａｃｅａ成分において富化されている。限定的ではない例として、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために有用であるＥｃｈｉｎａｃｅａ成分として、以下が挙げられる：揮発性油、アルカミド（アルキルアミドを含む）、シコリイン酸、ポリサッカライド、ポリアルキン、およびポリアルケン。Ｅｃｈｉｎａｃｅａの揮発性油の代表的な例として、ボルネオール、ボルニルアセテート、ペンタデカ−８−エン−２−オン、ゲルマクレン（ｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ）Ｄ、カリオフィレン、カリオフィレンエポキシド、およびパルミチン酸が挙げられる。Ｅｃｈｉｎａｃｅａの揮発性油は、例えば、本明細書中で参考として援用されているＡ．ＡｗａｎｇおよびＤ．Ｋｉｎｄａｃｋ、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１２４：５１２−５１６（１９９１）、およびＢａｕｅｒ．Ｒ，「Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ」、Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５巻、２６１−２６７頁（１９９１）に記載されている。本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために有用である本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ成分は、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、またはＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）である。
【００２６】
１つの好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量の第１のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分、および標準化された量の第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を提供する。ここでは、第１および第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分は、それぞれ、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）からなる群より別々に選択され、そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約０．２ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌまでであり、より好ましくは、約０．３ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまでであり、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまでである；Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの標準化された量は、約０．０２ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでであり、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでであり、最も好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでである；そして、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量は、約１０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでであり、より好ましくは、約２０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでであり、最も好ましくは、約５０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでである。
【００２７】
第２の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量のシコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を提供する。そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約０．２ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌまでであり、より好ましくは、約０．３ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまでであり、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまでである；Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの標準化された量は、約０．０２ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでであり、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでであり、最も好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでである；そして、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量は、約１０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでであり、より好ましくは、約２０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでであり、最も好ましくは、約５０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでである。
【００２８】
第３の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量の第１のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分、および標準化された量の第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を提供する。ここでは、第１および第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分は、それぞれ、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）からなる群より別々に選択され、そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約０．０１ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでであり、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでであり、最も好ましくは、約１５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでである；Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの標準化された量は、約０．００５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでであり、より好ましくは、約０．１ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでであり、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでである；そして、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量は、約５ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでであり、より好ましくは、約１０ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでであり、最も好ましくは、約２００ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでである。
【００２９】
第４の本発明の好ましい実施態様においては、本発明は、標準化された量のシコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を提供する。そしてここでは、シコリイン酸の標準化された量は、約０．０１ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでであり、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでであり、最も好ましくは、約１５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでである；Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの標準化された量は、約０．００５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでであり、より好ましくは、約０．１ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでであり、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでである；そして、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量は、約５ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでであり、より好ましくは、約１０ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでであり、最も好ましくは、約２００ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでである。
【００３０】
別の局面においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、少なくとも２つのＥｃｈｉｎａｃｅａ成分（好ましくは、３個のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分）の、混合されたＥｃｈｉｎａｃｅａ成分のそれぞれの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を生じるために十分な量を混合する工程を包含する。この状況においては、用語「標準化された量」またはその文法上の等価物は、所望される定量された量のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を意味する。本発明に従って、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ成分を調製するために有用である、本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、生存している生物体中に導入された場合に、免疫機能の刺激のような、生物学的な応答を誘導し得る。限定的ではない例として、本発明の方法に従って、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために有用であるＥｃｈｉｎａｃｅａ成分として、以下が挙げられる：揮発性油、アルカミド（アルキルアミドを含む）、シコリイン酸、ポリサッカライド、ポリアルキン、およびポリアルケン。本発明の方法に従って、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために有用である、本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ成分は、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）である。本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、液体の形態、ゲルの形態、または固体の形態（例えば、散剤、またはカプセル剤）であり得、そして好ましくは、ヒトに対する投与（より好ましくは、経口投与）のために適合させられる。
【００３１】
１つの本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、第１のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分および第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分の量を混合する工程を包含する。上記の第１および第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分のそれぞれは、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）からなる群より別々に選択される。上記のシコリイン酸の量は、約０．２ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌまで、より好ましくは、約０．３ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；上記のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量は、約０．０２ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまで、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；そして、上記のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量は、約１０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまで、より好ましくは、約２０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは、約５０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である。
【００３２】
第２の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）の量を混合する工程を包含する。上記のシコリイン酸の量は、約０．２ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌまで、より好ましくは、約０．３ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；上記のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量は、約０．０２ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまで、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは、約０．８ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；そして、上記のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量は、約１０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまで、より好ましくは、約２０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは、約５０ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌまでのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である。
【００３３】
第３の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、第１のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分および第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分の量を混合する工程を包含する。上記の第１および第２のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物のそれぞれは、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）からなる群より別々に選択される。上記のシコリイン酸の量は、約０．０１ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまで、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまで、最も好ましくは、約１５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；上記のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量は、約０．００５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまで、より好ましくは、約０．１ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまで、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；そして、上記のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量は、約５ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまで、より好ましくは、約１０ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまで、最も好ましくは、約２００ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である。
【００３４】
第４の本発明において好ましい実施態様においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するための方法を提供する。この方法は、シコリイン酸（最も好ましくは、本発明に従って調製されたシコリイン酸）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド）、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド（最も好ましくは、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド）の量を混合する工程を包含する。上記のシコリイン酸の量は、約０．０１ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまで、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまで、最も好ましくは、約１５ｍｇ／ｇから約５００ｍｇ／ｇまでのシコリイン酸の標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；上記のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの量は、約０．００５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまで、より好ましくは、約０．１ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまで、最も好ましくは、約５ｍｇ／ｇから約１００ｍｇ／ｇまでのアルキルアミドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である；そして、上記のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの量は、約５ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまで、より好ましくは、約１０ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまで、最も好ましくは、約２００ｍｇ／ｇから約９００ｍｇ／ｇまでのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの標準化された量を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を生じるために十分な量である。
【００３５】
本発明に従って調製されるＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、液体の形態、ゲルの形態、または固体の形態（例えば、散剤、またはカプセル剤）であり得、そして好ましくは、ヒトに対する投与（より好ましくは、経口投与）のために適合させられる。代表的には、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を形成するための混合の前に、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物のアリコートが、効力について試験される。抽出物は、濃縮または適切な増量剤もしくは溶媒（水、アルコール、ダイズ油、または他の油、レシチン、グリセリンなど）での稀釈によって、所望される濃度（単数または複数）に調節される。混合のための容器は、窒素ガスでパージされ得、そして混合が、酸化を防ぐために窒素下で行われ得る。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物または個々のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物が、アルコールまたはグリセリン基剤中で処方され得る。粉末にされたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物または組成物は、スプレー乾燥または凍結乾燥を通じて製造され得る。液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物または組成物もまた、自由に流れる粉末の形態にマイクロカプセル化され得る。液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物または抽出物は、軟らかいゼラチンの液体のカプセルおよび硬いゼラチンのカプセル中の成分として直接使用され得、そして錠剤は、粉末状にされた材料から作成され得る。
【００３６】
一般的には、本発明に従って調製されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物および組成物は、１つ以上の賦形剤を含み得る。適切な薬学的に受容可能な賦形剤としては、処理剤、および薬物送達の改変因子およびエンハンサー（例えば、植物油の粉末、クロスカルメロースナトリウム（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、アカシアガム、およびグアーガム）が挙げられる。他の適切な薬学的に受容可能な賦形剤は、本明細書中で参考として援用されている、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されている。
【００３７】
別の局面においては、本発明は、富化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を調製するための方法を提供する。本発明において好ましい本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、またはシコリイン酸において富化されている。本発明の方法は、以下の工程を包含する：増強された量の所望される成分（例えば、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、またはシコリイン酸）を有している発達段階でＥｃｈｉｎａｃｅａ植物を選択する工程；所望される成分において富化されている植物の一部を選択する工程；および選択された一部を、植物の一部から所望される成分を抽出するために有用である、エタノールおよび水からなる群より選択される一定量の溶媒と接触させる工程。好ましくは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は次いで濃縮される。任意の種のＥｃｈｉｎａｃｅａ植物が、本発明の実施において利用され得るが、本発明においては、好ましい種はＥ．ｐｕｒｐｕｒｅａである。本発明に従って、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物から抽出される本発明において好ましい成分は、ポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸である。本発明の方法が、ポリサッカライドを抽出するために使用される場合は、抽出されるＥｃｈｉｎａｃｅａ植物は、好ましくは、約１年齢から４年齢までである。好ましいポリサッカライドは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物の花、葉、茎、および／または根から抽出される。本発明の方法が、アルキルアミドを抽出するために使用される場合は、抽出されるＥｃｈｉｎａｃｅａ植物は、好ましくは、約２年齢から４年齢までである。好ましいアルキルアミドは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物の成熟した花および根から抽出される。本発明の方法が、シコリイン酸を抽出するために使用される場合は、抽出されるＥｃｈｉｎａｃｅａ植物は、好ましくは、約１年齢から３年齢までである。好ましいシコリイン酸は、若いＥｃｈｉｎａｃｅａ植物から、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物の葉から、および未成熟の花から抽出される。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物材料の抽出は、約１部の溶媒に対して約２部未満の植物材料の溶媒に対する植物材料の比（質量）を利用する。本発明において好ましい、溶媒に対する植物材料の比（質量）は、約４部の溶媒に対して約１部の植物材料である。
【００３８】
本発明の１つの局面に従うと、ポリサッカライドは、植物材料を、約０．１％（ｗ／ｗ）のエタノールから約５０％（ｗ／ｗ）のエタノールまで（好ましくは、約５％のエタノールから約２０％のエタノールまで）を含有しているエタノールと水の混合物と接触させることによって、選択されたＥｃｈｉｎａｃｅａ植物材料から抽出され得る。ポリサッカライドは、好ましくは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物の花、葉、茎、および根から抽出される。植物の空中部分は、代表的には、根よりも高い濃度のポリサッカライドを含有し、そして成熟した花は、代表的には、未成熟の花よりも高い濃度を含む。ポリサッカライドを抽出するための好ましい抽出温度は、約２０℃から約８０℃まで、より好ましくは、約３０℃から約７０℃まで、最も好ましくは、約３０℃から約５０℃までである。ポリサッカライドの抽出の期間は、約４８時間から約１４日間の間、より好ましくは、約３日間から約１２日間、最も好ましくは、約４日間から約８日間である。上昇させられた温度での拡大された抽出時間は、ポリサッカライドが可能な限り完全に抽出されることを確実にするが、ポリサッカライドのいくらかの加水分解が、高温で生じる、しかし、低温では、抽出プロセスは有意に遅くなる。低いエタノール濃度を含有しているポリサッカライド抽出物は、細菌、酵母、または真菌の増殖、およびその結果である腐敗を妨げるために、しっかりとモニターされなければならない。
【００３９】
本発明に従って調製されたポリサッカライド抽出物は、代表的には、約０．５ｍｇ／ｍＬから約２０．０ｍｇ／ｍＬまでの濃度でポリサッカライドを含む。本発明の実施においては、ポリサッカライド抽出物は、好ましくは、約１ｍｇ／ｍＬから約９００ｍｇ／ｍＬまでの最終ポリサッカライド濃度に、より好ましくは、約６０ｍｇ／ｍＬから約９００ｍｇ／ｍＬまでのポリサッカライド濃度に、最も好ましくは、約１００ｍｇ／ｍＬから約９００ｍｇ／ｍＬまでのポリサッカライド濃度に、濃縮される。本発明において好ましい、ポリサッカライド抽出物を濃縮するための方法は、蒸発である。蒸発は、好ましくは、約２０℃から約８５℃の温度で、約５時間から約６日間までの間、行われる。適用される減圧は、代表的には、約５ミリバール（ｍｂａｒ）から約３２０ｍｂａｒまでの絶対真空である。
【００４０】
本発明の１つの局面に従うと、アルキルアミドは、植物材料を、約５０％のエタノールから約９５％のエタノール（ｗ／ｗ）まで、好ましくは、約６５％のエタノールから約８５％のエタノールまで、より好ましくは、約７０％のエタノールから約８０％のエタノールまでを含有している、エタノールと水の混合物と接触させることによって、選択されたＥｃｈｉｎａｃｅａ植物材料から抽出され得る。アルキルアミドは、全てのＥｃｈｉｎａｃｅａ種において見出され、そして全アルキルアミド濃度（およびアルキルアミドの画分の複雑性）は、葉よりも根において大きい。イソブチルアミドは、Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａおよびＥ．ｐｕｒｐｕｒｅｓの根のアルキルアミド画分の主要な成分であるが、これらは、Ｅ．ｐａｌｌｉｄａの根においては、アルキルアミド画分の主要ではない成分である。イソブチルアミドは、Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅｓ、およびＥ．ｐａｌｌｉｄａの空気中の部分に存在する。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物の成熟した花および根は、好ましくは、アルキルアミド抽出物を調製するための出発材料として使用される。なぜなら、これらの植物材料は、最も多い量のアルキルアミドを含有しているからである。アルキルアミドは好ましくは、約２年齢以上であるＥｃｈｉｎａｃｅａ植物から抽出される。
【００４１】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドを抽出するための好ましい抽出温度は、約４℃から約８５℃まで、より好ましくは、約３０℃から約７０℃まで、最も好ましくは、約４０℃から約６０℃までである。アルキルアミドの抽出の時間は、好ましくは、約２４時間から約７日間の間、より好ましくは、約１日間から約４日間、最も好ましくは、約２日間から約３日間である。選択されたアルキルアミドの抽出温度は、一部は、出発物質の生の植物材料中の他の化合物の内容物に依存する。大部分のアルキルアミドおよびわずかなシコリイン酸を含有している植物材料の場合においては、抽出は、８５℃で行われ得る；しかし、有意な量のシコリイン酸もまた出発物質である植物材料中に存在し、そして最終的な抽出物中にシコリイン酸を保存することが所望される場合には、抽出温度は、シコリイン酸の分解を避けるために、４０℃未満に下げられるべきである。
【００４２】
本発明に従って調製されたアルキルアミド抽出物は、代表的には、約０．１ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬまでの濃度でアルキルアミドを含む。本発明の実施においては、アルキルアミド抽出物は、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬまでの最終アルキルアミド濃度に、より好ましくは、約１ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬまでのアルキルアミド濃度に、最も好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬまでのアルキルアミド濃度に、濃縮される。本発明において好ましい、アルキルアミド抽出物を濃縮するための方法は、蒸発である。蒸発は、代表的には、約１０℃から約９０℃の温度で、約３時間から約３日間までの間、行われる。適用される減圧は、代表的には、約５ミリバール（ｍｂａｒ）から約３２０ｍｂａｒまでの絶対真空である。
【００４３】
本発明に従うと、シコリイン酸は、植物材料を、約４０％のエタノール（ｗ／ｗ）から約９５％のエタノール（ｗ／ｗ）まで、好ましくは、約４０％のエタノール（ｗ／ｗ）から約８５％のエタノール（ｗ／ｗ）まで、より好ましくは、約５０％のエタノール（ｗ／ｗ）から約７０％のエタノール（ｗ／ｗ）までを含有している、エタノールと水の混合物と接触させることによって、選択されたＥｃｈｉｎａｃｅａ植物材料から抽出され得る。最も高い濃度のシコリイン酸を含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ植物の部分が、好ましくは、高い濃度のシコリイン酸を含有している抽出物を生じるために抽出される。Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａにおいては、最も高い濃度のシコリイン酸は、根、花、および葉において見出されるが、Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａにおいては、シコリイン酸は、根だけにおいて見出される。一般的にはシコリイン酸は、好ましくは、若い植物、葉、および未成熟の花から抽出される。本発明のこの局面においては、好ましくは１年齢未満であるＥｃｈｉｎａｃｅａ植物が、選択される。
【００４４】
シコリイン酸を抽出するための好ましい抽出温度は、約４℃から約４５℃まで、より好ましくは、約４℃から約３０℃までである。シコリイン酸の抽出の時間は、好ましくは、約２４時間から約３日間の間、より好ましくは、約２４時間から約４０時間、最も好ましくは、約２４時間から約３６時間である。シコリイン酸の分解は、４０℃よりも高い温度での抽出で有意となる。植物材料中に最初に存在するシコリイン酸の９５％程度の量が、抽出が４０℃以上で４８時間以上行われた場合に、失われ得る。さらに延長された抽出は、シコリイン酸を完全に欠失している抽出物を生じ得る。本発明に従って調製されたシコリイン酸抽出物は、代表的には、約０．２ｍｇ／ｍＬから約２．０ｍｇ／ｍＬまでの濃度でシコリイン酸を含有する。本発明の実施においては、シコリイン酸抽出物は好ましくは、約１ｍｇ／ｍＬから約７００ｍｇ／ｍＬまでの最終シコリイン酸濃度に、より好ましくは、約５ｍｇ／ｍＬから約７００ｍｇ／ｍＬまでのシコリイン酸濃度に、最も好ましくは、約３０ｍｇ／ｍＬから約７００ｍｇ／ｍＬまでのシコリイン酸濃度に、濃縮される。本発明において好ましいシコリイン酸抽出物を濃縮するための方法は、蒸発である。蒸発は、好ましくは、約１０℃から約４５℃の温度で、約５時間から約２．５日間までの間、行われる。適用される減圧は、代表的には、約５ミリバール（ｍｂａｒ）から約３２０ｍｂａｒまでの絶対真空である。
【００４５】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を調製するための本発明の方法においては、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出条件は、好ましくは、ポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸の分解を最少にする。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ中の多くの生物学的に活性な化合物は、分解に対して敏感であり、そしてそれぞれの化合物または化合物のグループは、分解を引き起こし得る種々の条件に対して敏感である。例えば、シコリイン酸は、溶液中で安定ではない。シコリイン酸の分解は、フェノールオキシダーゼによって媒介される酸化によって、加水分解によって、そして化学的な分解によって迅速に生じ得る。熱もまた、シコリイン酸の分解を引き起こし得る。同様に、内因成の植物の酵素（例えば、グリコシドヒドロラーゼおよびアミラーゼ）は、加水分解によってポリサッカライドを分解し得る。さらに、ポリサッカライド抽出物は、糸状菌、酵母、および真菌の増殖によって容易に腐敗させられる。アルキルアミドは、一旦乾燥または精製されると、迅速に分解する。
【００４６】
抽出の間の生物学的に活性な化合物の分解を減少させる１つの方法は、窒素またはアルゴンを多く含む空気を利用することであり、それによって、酸素が排除される。窒素は、任意の液体が導入される前に、全ての機器および容器をそれを徹底的にパージすることによって適用され得る。さらに、窒素ガスは、保存および抽出の間にＥｃｈｉｎａｃｅａの液体抽出物を通じて持続的に泡立てられ得る。プロセスのパラメーター（例えば、温度および濃度）の正確な制御もまた、酸化および加水分解を減少させることを助け得る。例えば、ポリサッカライドのモノサッカライド残基への酵素的な加水分解は、４０℃よりも７４℃ではるかにより容易に生じ得る。化学的な加水分解は、７５℃から１２０℃で生じる。処理の間、温度を低く維持することによって、加水分解が最少にされ得る。酸化もまた、低い処理温度によって減少させられる。内因性の酵素活性を減少させることにおけるさらなる補助は、水含有量を最少にするために液体抽出物を濃縮することである。
【００４７】
草本に由来する生成物が、無毒性の溶媒のみを用いて産生されることを多くの消費者が必要としているので、日常的に研究室で使用される多くの溶媒（例えば、ヘキサン、クロロホルム、エーテル、およびケトン）は、本発明の実施において使用されるには好ましくない。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を調製するための本発明の方法は、抽出溶媒として水およびエタノールを利用し、そして種々のエタノールおよび水の混合物が、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物から種々の有効成分を抽出するために利用される。好ましくは、植物材料は、４部の液体の溶媒に対して１部の植物材料の比（質量）で、液体の溶媒中で抽出される。しかし、抽出はまた、１部の液体の溶媒に対する２部の植物材料の程度の液体の溶媒に対する植物材料の比を利用して行われ得る。Ｅｃｈｉｎａｃｅａの抽出物はまた、２０部の液体の溶媒に対して１部の植物材料の液体の溶媒に対する植物材料の比を利用することによって、本発明に従って調製される。植物材料に対する高い溶媒の比を用いる抽出は、より稀釈された形態で植物からの活性な化合物のより多い量の抽出を生じる。稀釈抽出物は好ましくは、ポリサッカライド、アルキルアミド、および／またはシコリイン酸の所望される濃度に達するように濃縮される。
【００４８】
あるいは、超臨界の二酸化炭素が、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物から生物学的に活性な化合物を抽出するための無毒性の溶媒として使用され得る。超臨界の液体は、抽出が所望される程度に完全に生じるまで、植物材料を通じて循環させられる。超臨界の液体の二酸化炭素を使用して調製したＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、ほとんど無極性の化合物（例えば、油）を含む。種々のさらなる抽出溶媒（例えば、プロパンおよびアセトン）が、より高い割合の極性の化合物を抽出するために、超臨界の液体の二酸化炭素に対して添加され得るが、水およびエタノールの添加だけが、健康を自覚している消費者に対して受容可能である。
【００４９】
一般的には、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を調製するための本発明の方法において利用される抽出容器は、それを通じて植物材料および抽出溶媒が容易に充填され得そして除去され得る、１つ以上の開口部を有する大きな容器である。攪拌機械は、抽出が抽出時間を減少させるように一定に攪拌しながら生じるように、抽出容器中で組立てられ得る。抽出容器は、５００ｍＬ程度の大きさであり、そして３０００Ｌ程度の大きさが、本発明の実施において首尾良く利用されている。容器は、エタノールによる分解に対して耐性である金属（好ましくは、ポリプロピレンおよびステンレス鋼）から構築されるべきである。
【００５０】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を調製するための本発明の方法の実施においては、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は好ましくは、保存空間を減少させるために、保存の安定性を増大させるために（すなわち、水の量を減少させることによって）、そして所望されるポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸の濃度を達成するために、濃縮される。濃縮工程は、好ましくは、ポリサッカライド、アルキルアミド、およびシコリイン酸の生物学的活性の損失を最少にするように最適化される。高温が多くの化合物の迅速な分解を引き起こすので、濃縮は通常は、低温で、そして減圧下で行われる、通常は、回転式のエバポレーターが使用される。蒸発反応フラスコは代表的には、２０Ｌから１００Ｌまでの間の大きさの範囲である。抽出のために使用される溶媒の５〜９０％が回収され得る。
【００５１】
なお別の局面においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の１つ以上のメンバーにおいて富化された液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化された液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約１％（ｗ／ｖ）より大きい濃度、より好ましくは、約５％（ｗ／ｖ）より大きい濃度、最も好ましくは、約１０％（ｗ／ｖ）より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．１％（ｗ／ｖ）より大きい濃度、より好ましくは、約１．０％（ｗ／ｖ）より大きい濃度、最も好ましくは、約３．０％（ｗ／ｖ）より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．２％（ｗ／ｖ）より大きい濃度、より好ましくは、約０．５％（ｗ／ｖ）より大きい濃度、最も好ましくは、約３．０％（ｗ／ｖ）より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【００５２】
なお別の局面においては、本発明は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびシコリイン酸からなる群の１つ以上のメンバーにおいて富化された、固体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物を提供する。本発明において好ましい、ポリサッカライドにおいて富化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．０１％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、０．０５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約２０％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、ポリサッカライドを含む。本発明において好ましい、アルキルアミドにおいて富化されたＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．００１％（ｗ／ｗ）の濃度、より好ましくは、０．０１％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、最も好ましくは、約０．５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、アルキルアミドを含む。本発明において好ましい、シコリイン酸において富化された固体のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物は、約０．００５％（ｗ／ｗ）の濃度、より好ましくは、０．０５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度、より好ましくは、約１．５％（ｗ／ｗ）より大きい濃度で、シコリイン酸を含む。
【００５３】
本発明において好ましい本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド抽出物は、少なくとも６０％（質量で）のアラビノースおよびガラクトースを含み、そしてポリサッカライドの分子は、約１０，０００より大きい分子量を有する。
【００５４】
本発明において好ましい本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物は、約７０％（ｗ／ｗ）より多いイソブチルアミドを含む。本発明においてより好ましい本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物は、約７０％（ｗ／ｗ）よりも大きいイソブチルアミド濃度を有し、そして約３０％（ｗ／ｗ）よりも多い、２Ｅ，４Ｅ，８Ｅ，１０Ｅ／Ｚテトラエン−ドデカ−イソブチルアミドを含む。
【００５５】
なお別の実施態様においては、本発明は、標準化された用量の、少なくとも２つ、好ましくは３個のＥｃｈｉｎａｃｅａ成分を提供するように処方された栄養的な組成物を提供する。本発明において好ましいＥｃｈｉｎａｃｅａ成分は、シコリイン酸、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、およびＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドである。本発明において好ましい、標準化された用量のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドは、約０．０１ｍｇから約１００ｍｇまで、より好ましくは、約０．１ｍｇから約４０ｍｇまで、最も好ましくは、約０．１ｍｇから約１ｍｇまでである；本発明において好ましい、標準化された用量のシコリイン酸は、約０．０１ｍｇから約１２０ｍｇまで、より好ましくは、約０．１ｍｇから約１５ｍｇまで、最も好ましくは、約０．５ｍｇから約３ｍｇまでである；本発明において好ましい、標準化された用量のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドは、約１ｍｇから約５００ｍｇまで、より好ましくは、約５ｍｇから約１００ｍｇまで、最も好ましくは、約１０ｍｇから約５０ｍｇまでである。
【００５６】
なお別の局面においては、本発明は、哺乳動物中の免疫系の活性を増強するための方法を提供する。この方法は、標準化された量のＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、およびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドを含有しているＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の毎日の有効投与量を、哺乳動物に対して投与する工程を包含する。代表的な標準化された量のＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸は、５μｇ／Ｋｇ体重から２０００μｇ／Ｋｇ体重まで、例えば、１２０μｇ／Ｋｇから１０００μｇ／Ｋｇ体重まで（例えば、８００μｇ／Ｋｇ体重）である。代表的な標準化された量のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドは、０．５μｇ／Ｋｇ体重から２００μｇ／Ｋｇ体重まで、例えば、１２μｇ／Ｋｇから１００μｇ／Ｋｇ体重まで（例えば、８０μｇ／Ｋｇ体重）である。代表的な標準化された量のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドは、１２５μｇ／Ｋｇ体重から５０ｍｇ／Ｋｇ体重まで、例えば、３ｍｇ／Ｋｇから３０ｍｇ／Ｋｇ体重まで（例えば、２０ｍｇ／Ｋｇ体重）である。限定的ではない例として、哺乳動物の免疫系の活性を増強するための方法（上記に記載されるようなＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を利用する）は、マクロファージの食作用活性を増強するため、マクロファージによる一酸化窒素の産生を増強するため、マクロファージによるＴＮＦ−αの産生を増強するため、脾臓細胞によるＩＦＮ−γの産生を増強するため、および脾臓細胞によるＴＮＦ−αの産生を増強するために有用である。
【００５７】
さらなる局面においては、本発明は、ＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドおよびＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドからなる群より選択されるＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物の毎日の有効投与量を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物の免疫系の活性を増強するための方法を提供する。Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの代表的な毎日の有効投与量は、０．５μｇ／Ｋｇ体重から２００μｇ／Ｋｇ体重まで、例えば、１２μｇ／Ｋｇから１００μｇ／Ｋｇ体重まで（例えば、８０μｇ／Ｋｇ体重）である。本発明のこの局面に従うと、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの毎日の有効投与量は、マクロファージの食作用活性を増強するため、マクロファージによる一酸化窒素の産生を増強するため、および／またはマクロファージによるＴＮＦ−αの産生を増強するために有用である。
【００５８】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの代表的な毎日の有効投与量は、１２５μｇ／Ｋｇ体重から５０ｍｇ／Ｋｇ体重まで、例えば、３ｍｇ／Ｋｇから３０ｍｇ／Ｋｇ体重まで（例えば、２０ｍｇ／Ｋｇ体重）である。本発明のこの局面に従うと、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドの毎日の有効投与量は、マクロファージによるＴＮＦ−αの産生を増強するために有用である。
【００５９】
以下の実施例は、本発明の実施のために意図される最良の態様を単に説明するにすぎず、本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【００６０】
（実施例１）
（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物からのアルキルアミドの抽出）
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物を、約２フィート離して生長させ、そして花を回収する１週間前まで、１週間に１回水をやる。好ましくは、２および／または３年齢のＥｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ植物の花を回収する。完全に成熟しているＥｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａの花の球花を、好ましくは、８月のおわりに回収し、そして約７００ｋｇの花を、代表的には、１エーカーの土壌から回収する。
【００６１】
５００ｋｇの新しく回収した花を、約１．５ｃｍ3またはそれよりも小さい大きさの粒子にするためのハンマーミルを用いて、細かく砕く。次いで、３５℃で７２時間、約２０００ｋｇの７５％のエタノールで抽出する。低いエタノール濃度および温度によっては収量が減少するが、高いエタノール濃度および温度ではコストが増大する。液体および植物材料を、約２０ｃｍ離して間隔を空け、そして抽出容器中の中心の心棒から放射状に配置した回転式の機械的なへら（パドル）を回転させながら、１分間に３回転で攪拌する。抽出時間の最後に、２３００ｋｇの液体抽出物を、抽出した花から取り出す。
【００６２】
液体の抽出物は、ここで、約０．６ｍｇ／ｍＬのアルキルアミドを含む。２５ｍｂａｒおよび４０℃で３０時間での液体の抽出物の濃縮によって、約１０ｍｇ／ｍＬのアルキルアミド濃度を有しているアルキルアミドを多く含む液体の濃縮物を約１００ｋｇ得る。濃縮物を、暗い緑色であるとして特徴づける。なぜなら、植物のクロロフィルの存在、および代表的には、約１ｍｇ／ｍＬ未満のシコリイン酸および約１０ｍｇ／ｍＬ未満のポリサッカライドを含むからである。
【００６３】
（実施例２）
（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物からのシコリイン酸の抽出）
芽を、２月のおわりおよび３月のはじめに選択したハイブリッドではない種子から発芽させ、そして３月の中頃およびおわりに土壌に移植する。植物を、約２フィートの間隔を空けて配置し、そして回収するまで１週間に２回水をやる。黒色のプラスチックの根被い（マルチ）を、雑草の成長を減少させ、そして植物の成長をスピードアップさせるために使用する。種子を注意深く選択する。なぜなら、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａの種子（またはＥ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ／Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａハイブリッドに由来する種子）の混入は、増大した酵素的分解に起因して２０倍以上、シコリイン酸の収量を減少させるからである。植物を、９月のおわりに全植物体として回収し、そして植物の茎、葉、および花を抽出のために取り出す。代表的には、１エーカーのＥｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ植物によって、約１０００ｋｇの植物材料を生じる。好ましくは、１年齢のＥｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ植物を回収する。
【００６４】
５００ｋｇの新しく回収した植物を、１．５ｃｍ2から約４ｃｍ2の粒子の大きさを生じるようにハンマーミルを用いて、細かく砕く。細かく砕いた材料を、２５℃で３０時間、２０００ｋｇの５０％のエタノールを用いて抽出する。低いエタノール濃度および高い抽出温度は、分解を増大させ、一方、高いエタノール濃度および低い温度は収量を減少させる。窒素ガスを、シコリイン酸の分解の量を減少させるために、抽出液体中を通じて持続的にパージさせる。抽出液体を、１時間あたり５００Ｌまでの能力を有する回転式ポンプによる植物の押しつぶしによって、循環させる。抽出時間の最後に、約２．０ｍｇ／ｍｌのシコリイン酸濃度を有している２１００ｋｇの液体の抽出物を得ることができる。
【００６５】
１０ｍｂａｒおよび３５℃で２０時間の液体の抽出物の濃縮によって、３０ｍｇ／ｍＬのシコリイン酸濃度を有しているシコリイン酸を多く含む１００ｋｇの濃縮物を得る。濃縮物は、暗い緑色によって特徴づけられる。これは、植物のクロロフィルの存在、ならびに、約２ｍｇ／ｍＬ未満のアルキルアミドおよび約２０ｍｇ／ｍＬ未満のポリサッカライドを含むことによって生じる。
【００６６】
（実施例３）
（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物からのポリサッカライドの抽出）
植物を、約２フィート離して生長させ、そして花を回収する１週間前まで、１週間に１回水をやる。完全に成熟しているＥｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａの花の球花を、８月のおわりに回収する。代表的には、約７００ｋｇの花を、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ植物の１エーカーの土壌から回収する。好ましくは、２および／または３年齢のＥｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ植物を回収する。
【００６７】
５００ｋｇの新しく回収した花を、約１．５ｃｍ3またはそれよりも小さい大きさの粒子にするためハンマーミルを用いて、細かく砕く。次いで、５５℃で７２時間、約２０００ｋｇの２０％のエタノールで抽出する。高いエタノール濃度および低い温度によっては収量が減少するが、低いエタノール濃度では、最終的な抽出物の微生物による容量を増大させ、そして高い温度ではコストが増大する。液体および植物材料を、約２０ｃｍ離して間隔を空け、そして抽出容器中の中心の心棒から放射状に配置した回転式の機械的なへらを回転させながら、１分間に３回転で攪拌する。抽出時間の最後に、１９００ｋｇの液体抽出物を、抽出した花から取り出す。
【００６８】
液体の抽出物は、ここで、代表的には、約１５ｍｇ／ｍＬのポリサッカライド含む。これは、５０ｍｂａｒ、６０℃で１５時間で濃縮されて、約１２０ｍｇ／ｍＬのポリサッカライド濃度を有している２００ｋｇの濃縮物を生じ得る。濃縮物を、暗い茶色によって特徴づけられる。そしてこれは、代表的には、約２ｍｇ／ｍＬ未満のアルキルアミドおよび約２ｍｇ／ｍＬ未満のシコリイン酸を含む。
【００６９】
（実施例４）
（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物から抽出したポリサッカライドのアッセイ）
ポリサッカライドアッセイ方法は、ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９５）、ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９９８．１２、「Ｄｅｘｔｒａｎ  ｉｎ  Ｒａｗ  Ｃａｎｅ  Ｓｕｇａｒ」、４４．１．３０、「Ｐａｒｔ  Ｅ−−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｈ2ＳＯ4  Ｔｅｓｔ」に示されている方法の改変されたバージョンである。ポリサッカライドアッセイを、１３×１００ｍｍの使い捨ての培養チューブ中で行うことができる。アッセイの最終的な反応容量は、１．５ｍｌである。蒸留水を、ポリサッカライドサンプルに対して添加して、４００μｌの、水およびポリサッカライドのサンプルを得る。次いで、１００μｌの５％（ｗ／ｖ）の試薬グレードのフェノール溶液を、稀釈したポリサッカライドサンプルに対して添加し、そして混合する。次いで、１ミリリットルの濃硫酸（試薬グレード、９５〜９８％に濃縮された）を添加し、そしてボルテックスすることによって迅速に混合する。次いで、サンプルを含有しているチューブを沸騰している水浴中に２分間置く。次いで、チューブを３０分間室温に冷却させ、そして４８５ナノメートル（ｎｍ）でのサンプルの吸光度を、分光光度計を使用して蒸留水のブランクに対して測定する。分光光度計は、０から１．５の範囲でＡ485での吸光度を正確に読み取ることが可能であるはずである。
【００７０】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド濃度の標準を、Ｅｃｈｉｎａｃｅａの花の水抽出物から、以下の様式でエタノール沈殿を用いて調製する。濃縮したＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド材料を、本明細書中の実施例３に記載するように得る。抽出物を、さらに、約４００ｍｇ／ｍＬのポリサッカライドにまで濃縮する。次いで、この濃縮物を、４℃で一晩、４容量の９５％のエタノールで沈殿させる。沈殿を遠心分離によって取り出し、そして３５〜４０℃の水浴中で再度溶解させる。この段階で溶解しない材料を廃棄し、そして上清を、１容量の３０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を用いて沈殿させる。再び、沈殿を遠心分離によって取り出し、そして上清を、４容量のエタノールで沈殿させる。沈殿したポリサッカライドを、２％の酢酸ナトリウム溶液中に溶解させ、そしてエタノールで３回沈殿させる。上清を廃棄し、そして沈殿を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標１０，０００ＭＷカットオフ透析チューブを用いる透析のために水中に溶解させる。透析を、３日間にわたって行い、そして残存している材料を、凍結乾燥させて毛羽立った（ｆｌｕｆｆｙ）固体の物質を得る。
【００７１】
既知の量の凍結乾燥させたポリサッカライドを、既知の濃度のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド標準を得るために、既知の容量の水中に溶解させる。Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド標準溶液の稀釈を行い、そしてそれぞれの稀釈物のＡ485を、４８５ナノメートルでの吸光度対ポリサッカライド濃度の標準曲線を構築するために測定する。
【００７２】
（実施例５）
（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物から抽出したアルキルアミドのアッセイ）
本発明において好ましいアルキルアミドアッセイ方法は、Ｂａｕｅｒ、Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｉｄｃａ、５５、３６７−３７１（１９８９）によって公開されている方法の改変である。この方法の移動相は、サンプルの沈殿の問題に起因して、アセトニトリルからメタノールに変更された。この方法は、勾配ポンプ、自動サンプリング装置、およびＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ検出装置から構成されるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用する。好ましくは、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムおよびＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １０５０シリーズＨＰＬＣシステムを使用する。適合している４．０×４．０ｍｍのガードカラムとともに、カラムＣ−１８カラム（好ましくは、１２５×４．０ｍｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳカラム）を使用する。移動相は、分析の開始時には６０％のメタノールおよび４０％の水（ｖ／ｖ）からなり、そして直線的な様式で、分析中の１２．５分で、９５％のメタノールおよび５％の水に変更する。全実行時間は、１９．００分であり、４分間の実行後の平衡を伴う。移動相を、１．００ｍＬ／分で注入する。１０μＬのサンプルを注入し、そしてサンプルの２５４ｎｍでの吸光度を測定する。アルキルアミドは、２．０分から９．０分でカラムから溶出する。より詳細には、ドデカ−２Ｅ，４Ｅ，８Ｅ，１０Ｅ／Ｚ−テトラエン酸イソブチルアミドが、５．０から８．０分で溶出する。
【００７３】
アルキルアミド濃度標準を、室温で５００ｍｌの石油エーテルを用いて、本明細書中の実施例３の記載するように調製した、アルキルアミドを多く含む液体の濃縮物の５００ｍｌを抽出することによって、好ましくは調製する。石油エーテル画分を１日後に採取し、そして減圧下で乾燥させるために蒸発させ、そして暗い黒色の油状の残渣を得る。残渣を、最小量のメタノール（約２０ｍＬ）中に溶解させ、そして沈殿を除去するために遠心分離する。オクタデシルで官能化したシリカを、ガラスカラム中にセットする。容量で７０％のメタノールおよび３０％の水からなる移動相を、溶出のために使用する。液体の濃縮物から調製した材料をカラムに適用し、そして１０ｍＬの画分を回収する。画分を、記載する分液方法を使用してアルキルアミド含有量について分析し、そして９０％およびそれより高い目的のアルキルアミドの純度を含有している画分を、プールする。プールした画分を、次いで、回転式エバポレーターで４５℃で蒸発させて、全容量を減少させる。カラム溶出物から精製したアルキルアミド画分を減圧下で蒸発させて、透明な（黄色に着色した）液体にする。石油エーテルを残渣に対して添加し、そして暖かい水浴中で暖める。残渣および液体を、精製したアルキルアミドで溶液を飽和させるために超音波処理する。飽和させた溶液を回収し、そして室温にまで冷却させる。次いで、溶液を、−２０℃の冷凍庫に移す。一晩、結晶を形成させる。５００ｍＬの飽和させた溶液は、特異的なアルキルアミドの可溶性に依存して、約０．１〜５ｇの精製された結晶を生じる。
【００７４】
精製されたアルキルアミド標準を種々の濃度で溶解させ、そして本明細書中に記載するようなＨＰＬＣカラムを通過させる。検量曲線を、得られたピーク面積対アルキルアミド標準溶液の濃度から構築する。未知の濃度のアルキルアミドサンプルに由来するピーク面積を、それぞれのサンプル中での濃度を決定するために検量曲線に対して比較する。
【００７５】
（実施例６）
（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ植物から抽出したシコリイン酸のアッセイ）
シコリイン酸分析方法は、Ｂａｕｅｒ、Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｉｄｃａ、５７、４４７−４４９（１９９１）によって公開されている方法の改変である。この方法の移動相は、サンプルの沈殿の問題に起因して、アセトニトリルからメタノールに変更された。この方法は、勾配ポンプ、自動サンプリング装置、およびＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ検出装置から構成されるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用する。この場合においては、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムおよびＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １０５０シリーズＨＰＬＣシステムを使用する。適合している４．０×４．０ｍｍのガードカラムとともに、カラムＣ−１８カラム（この場合には、１２５×４．０ｍｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳカラム）を使用する。移動相は、分析の開始時には、０．１％のリン酸（ｖ／ｖ）を含有している、７．０％のメタノールおよび９３．０％の水からなり、そして直線的な様式で、分析中の１１．６分で、０．１％のリン酸（ｖ／ｖ）を含有している、３２％のメタノールおよび６８％の水に変更する。次いでこれを、１９．１分で、０．１％のリン酸を含有している、４０．７％のメタノールおよび５９．３％の水に変更する。全実行時間は、２２．００分であり、３．５０分間の実行後の平衡を伴う。移動相を、１．００ｍＬ／分で注入する。１０μｌのサンプルを注入し、そしてデータを３３０ｎｍで回収する。サンプルのピーク面積を、定量のための精製した化学的な標準に対して比較する。コーヒー酸誘導体が、７．０分から１８．０分でカラムを溶出する。より詳細には、コーヒー酸は、１４．５．０から１７．０分で溶出する。
【００７６】
シコリイン酸濃度標準を、以下の様式で調製する。本明細書中の実施例２に記載するように調製したシコリイン酸を多く含む液体の濃縮物を、５０℃での減圧蒸留によって容量をさらに減少させる。ポリサッカライドを、２部のイソプロパノールおよび１部の蒸留濃縮物を使用するイソプロパノール沈殿を用いて除去する。上清を取り出し、そしてイソプロパノールを、３７℃での減圧蒸留を通じて蒸発させる。濃縮物の２倍容量の蒸留水を添加し、そして濃縮物のｐＨを、濃塩酸を用いてｐＨ０〜１に調節する。シコリイン酸をさらに、移動相として１００％のメタノールを用いる親油性のＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムを通じる溶出によって精製する。上記の方法によって分析した場合に、９０％より大きいシコリイン酸純度を有する画分をプールする。プールした画分を、減圧下で乾燥させるように減少させ、次いで、最少量の沸騰している熱水中に再溶解させる。シコリイン酸は冷却の際に、すぐに、白色の針状に結晶化する。
【００７７】
精製されたシコリイン酸標準を種々の濃度で溶解させ、そして本明細書中に記載するようなＨＰＬＣカラムを通過させる。検量曲線を、得られたピーク面積対シコリイン酸標準溶液の濃度から構築する。未知の濃度のシコリイン酸サンプルに由来するピーク面積を、それぞれのサンプル中での濃度を決定するために検量曲線に対して比較する。
【００７８】
（実施例７）
（本発明の例示的なＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物）
代表的な例として、本発明の混合された市販のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を、以下の様式で調製する。アルキルアミドを多く含む濃縮物（本明細書中の実施例１に従って調製した）、シコリイン酸を多く含む濃縮物（本明細書中の実施例２に従って調製した）、およびポリサッカライドを多く含む濃縮物（本明細書中の実施例３に従って調製した）を、以下の容量比で混合する：それぞれ、０．４：０．２：０．４。濃縮物を、電動の混合装置を用いて混合して、均質な生成物を得る。本発明の好ましい実施態様においては、この混合した液体の濃縮物は、５．２ｍｇ／ｍＬのアルキルアミド、７．２ｍｇ／ｍＬのシコリイン酸、および５６ｍｇ／ｍＬのポリサッカライドを含む。この混合した組成物を、以下のような市販されるＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を調製するために使用する：
（ａ）アルコールを含まない、市販される液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、混合したＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物をさらにエタノールを除去するために蒸発させ、そして次いで７０％（ｗ／ｗ）のグリセリンの９倍容量を添加することにより蒸発させた組成物を１０倍に稀釈することによって、調製する。得られた材料を、０．５２ｍｇ／ｍＬのアルキルアミド、０．７２ｍｇ／ｍＬのシコリイン酸、および５．６ｍｇ／ｍＬのポリサッカライドを含有している生成物にするために、完全に混合する。
【００７９】
（ｂ）アルコールを含有している市販される液体のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、９倍容量の４０％（ｗ／ｗ）のエタノールを添加することにより、混合したＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を１０倍に稀釈することによって調製する。得られた材料を、０．５２ｍｇ／ｍＬのアルキルアミド、０．７２ｍｇ／ｍＬのシコリイン酸、および５．６ｍｇ／ｍＬのポリサッカライドを含有している生成物にするために、完全に混合する。
【００８０】
（ｃ）市販される液体のＥｃｈｉｎａｃｅａソフトゼラチンカプセルは、９倍容量の、３０％のレシチンおよび７０％のダイズ油の混合物を添加することにより、混合したＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を１０倍に稀釈することによって調製する。得られた材料を完全に混合し、次いで、０．５２ｍｇ／カプセルのアルキルアミド、０．７２ｍｇ／カプセルのシコリイン酸、および５．６ｍｇ／カプセルのポリサッカライドを含有している生成物にするために、１つのカプセルあたり１．０ｍＬで、ソフトゼラチンカプセル中にカプセル化する。
【００８１】
（ｄ）凍結乾燥させたＥｃｈｉｎａｃｅａ粉末を、その９倍容量の水とともに混合したＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を混合し、次いでキャリアとしての１０％（ｗ／ｗ）の三リン酸カルシウムとともに凍結乾燥させることによって、調製する。乾燥させたケーキを、凍結乾燥の３０時間後に得る。一旦凍結乾燥させたケーキを、１００μｍの円錐形の粉砕機を通じて粉状にして、２．６ｍｇ／ｇのアルキルアミド、３．６ｍｇ／ｇのシコリイン酸、および２．８ｍｇ／ｇのポリサッカライドを含有している流動性の粉末を得る。
【００８２】
（ｅ）マイクロカプセル化したＥｃｈｉｎａｃｅａ粉末を、安定性のために１％（ｖ／ｖ）のビタミンＥとともに混合したＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物を混合し、次いで平均して１００μｍの大きさのカプセルでの５０％−ｆｉｌｌ（ｗ／ｗ）でのセルロースおよびワックスコーディングを用いて、混合物をマイクロカプセル化することによって、調製する。マイクロカプセルは、２．６ｍｇ／ｇのアルキルアミド、３．６ｍｇ／ｇのシコリイン酸、および２．８ｍｇ／ｇのポリサッカライドの組成物を有している、流動性の粉末として生じる。
【００８３】
（ｆ）ハードゼラチンＥｃｈｉｎａｃｅａカプセルは、凍結乾燥させた粉末（この実施例のセクション（ｄ）に記載する）またはマイクロカプセル化した粉末（この実施例のセクション（ｅ）に記載する）を、５部（質量で）の微結晶性セルロースおよび２％（ｗ／ｗ）のステアリン酸マグネシウムと混合することによって調製する。得られる粉末を、０．５２ｍｇ／カプセルのアルキルアミド、０．７２ｍｇ／カプセルのシコリイン酸、および５．６ｍｇ／カプセルのポリサッカライドを提供するように１０００ｍｇのカプセル中にカプセル化する。
【００８４】
（ｇ）Ｅｃｈｉｎａｃｅａの錠剤を、凍結乾燥させた粉末（この実施例のセクション（ｄ）に記載する）またはマイクロカプセル化した粉末（この実施例のセクション（ｅ）に記載する）を、３部（質量で）の二リン酸カルシウム、２部（質量で）の微結晶性セルロース、および３％（ｗ／ｗ）のステアリン酸マグネシウムと混合することによって調製する。得られる粉末を、０．５２ｍｇ／錠のアルキルアミド、０．７２ｍｇ／錠のシコリイン酸、および５．６ｍｇ／錠のポリサッカライドを提供するように１０００ｍｇの錠剤に打ち込む。
【００８５】
（実施例８）
（免疫機能に対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物の影響）  この実施例に示すデータは、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ抽出物および組成物が、ラットの免疫系の種々の局面を刺激することを示す。
【００８６】
動物の維持および組織のサンプリング：若い、成体の、雄性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（それぞれ約２４０ｇ）を、試験材料の投与の前の１週間、研究室で順応させた。本明細書中に記載する種々の濃度の試験材料の１００マイクロリットルをそれぞれの動物に対して、強制栄養針を通じて、４日間の間１日い２回、投与した。血液および組織サンプルを、分析の５日目に動物から採取した。それぞれの試験グループは、試験結果が平均される８匹の動物を含んだ。
【００８７】
試験材料：動物に投与したコントロールサンプルは、エタノールと水の混合物であった。以下の試験材料のうちの１つをそれぞれの動物に対して投与した（試験動物の１キログラム（ｋｇ）の体重あたりマイクログラム（μｇ）の試験材料として示した用量レベルを、表１に示す）：Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物の４つの用量レベルのうちの１つ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸抽出物の４つの用量レベルのうちの１つ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド抽出物の４つの用量レベルのうちの１つ、またはＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物（これは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド、シコリイン酸、およびポリサッカライド抽出物を含有している）の４つの用量レベルのうちの１つ。
【００８８】
Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、毎日の用量について特定された量において表１に列挙される３個の抽出物を含んだ。例えば、Ｅｃｈｉｎａｃｅｓ組成物のレベル１の毎日の投与量は、０．５μｇ／ｋｇのアルキルアミド、５．０μｇ／ｋｇのシコリイン酸、および１２５μｇ／ｋｇのポリサッカライドを提供した。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物を、本明細書中の実施例１〜３に記載するように調製した、３個のＥｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ抽出物（アルキルアミド、シコリイン酸、およびポリサッカライド）を混合することによって調製した。
【００８９】
【表１】
0004559683.tif 000002
血液の処理：血液を、心臓の穿刺によって試験動物から得、そして血漿を分離するために１０分間（ｍｉｎ．）３０００ｒｐｍで遠心分離したＥＤＴＡバキュテーナーチュに保存した。血漿を、使用するまで−３０℃で、蓋をしたプラスチックチューブ中に保存した。
【００９０】
脾臓細胞の調製：動物に由来する脾臓を、０．５％のウシの血清アルブミンを補充した冷却したＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−ＨＥＰＥＳ溶液（ＫＲＨ）中でナイロンメッシュを通じて押し潰し、そして５０ｍＬのチューブに回収した。次いで、回収した細胞を、２０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離し、そして上清をデカントした。１ミリリットルの溶解緩衝液ＡＣＫ（塩化アルミニウムおよびカリウムを含有している）を細胞に添加した。次いで、細胞を、５０ｍＬのＫＲＨ＋ＢＳＡで２回洗浄した。次いで、細胞を、１ｍＬのＣＣＭ（ＲＰＭＩ−１６４０および４％のウシの胎児の血清を含有しているＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）中に再懸濁した。ＲＰＭＩ−１６４０は、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、グルタミン、２−メルカプトエタノール、およびＨＥＰＥＳ（これらのそれぞれの成分は、１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する）を有する、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，３：５０３−５０８（１９７６））に開示されているようなＭｏｏｒｅおよびＷｏｏｄｓによって開発された重炭酸塩に基づく緩衝システムである。細胞を、３．０〜５．０×１０6／ｍＬに稀釈し、そして２０μＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（１０μｇ／ｍＬ）で活性化し、そして４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を遠心分離し、そして上清を回収し、そしてサイトカインおよび一酸化窒素アッセイのために−３０℃で凍結させた。
【００９１】
肺胞のマクロファージの調製：肺胞のマクロファージを、４０ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて気管支肺胞を洗浄することによって得た。細胞を、４℃で２０分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄した。１ｍＬのＡＣＫを細胞に添加し、次いで、冷却したＢＳＡで３回洗浄した。次いで、細胞を、１０％のウシの胎児の血清を補充した１ｍＬのＲＰＭＩ中に懸濁した。細胞を、５〜１０×１０6細胞／ｍＬに稀釈し、そして１００μの稀釈した細胞を、３７℃で２時間、Ｖ底マイクロタイタープレート中でインキュベートした。上清を廃棄し、そしてマイクロタイタープレートをＰＢＳで３回洗浄した。２００μＬのＬＰＳを添加して細胞を活性化し、次いで、細胞を２４時間インキュベートした。インキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインおよび一酸化窒素アッセイのために−３０℃で凍結させた。
【００９２】
食作用アッセイ：マクロファージを、接着のために３７℃で３時間インキュベートした。次いで、これらを、１０％のＲＰＭＩで３回洗浄し、次いでラテックスビーズを２．５×１０6個のビーズ／２００μＬの濃度で添加した。細胞を１時間以上インキュベートし、そしてＲＰＭＩで５回洗浄した。細胞を染色し、そして食作用を、顕微鏡試験によって決定した。
【００９３】
一酸化窒素アッセイ：４ｍＭの硝酸ナトリウムのストック溶液を作成し、そして４％のＣＣＭ緩衝液を用いて使用の直前に１ｍＭに稀釈した。硝酸ナトリウムストック溶液を、直線的な検量曲線を構築するために種々の濃度で使用した。Ｇｒｉｅｓｓ試薬を、０．５ｇのスルファニルアミド、および６ｍＬの８５％のリン酸を１００ｍＬの水中に溶解させ、そして０．０５ｇのＮ−（１−ナフチル）エチル−エネジアミンを１００ｍＬの水中に溶解させることによって調製した。マクロファージまたは脾臓細胞に由来する上清をＧｒｉｅｓｓ試薬に対して添加し、そして１０分間放置した。吸光度を５４０ｎｍで測定し、そして一酸化窒素濃度を、硝酸ナトリウムの標準曲線から計算した。
【００９４】
ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびインターロイキン−２アッセイ：抗体を、以下の供給業者のうちの任意の１つから得た：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｂｏｘ  １４５０８  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  ６３１７８，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，またはＰｈａｒＭａｇｅｎ，６３００  Ｋｉｔｉｍａｔ  Ｒｏａｄ，Ｕｎｉｔ  １，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｌ５Ｎ  ５Ｍ１，Ｃａｎｃｄａ。アッセイを、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを使用して行った。
【００９５】
肺胞のマクロファージ中の食作用活性および食作用指数に対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物の影響：図１に示すように、この実施例に記載するＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の全ての投与量レベル（表１に示すレベル２〜５）が、肺胞のマクロファージの食作用活性および食作用指数において増大を生じた。図２により明らかに示すように、投与量が増大する伴って、食作用活性および食作用指数に対する影響の大きさもまた増大する。
【００９６】
図３に示すように、本明細書中の実施例２に記載するように調製し、そして表１に示すような投与量レベル１〜４でラットに投与した本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸抽出物は、ラットの肺胞のマクロファージの食作用活性または食作用指数に対して有意な影響は有さなかった。同様に、図４に示すように、本明細書中の実施例３に記載するように調製し、そして表１に示すような投与量レベル１〜４でラットに投与した本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド抽出物は、ラットの肺胞のマクロファージの食作用活性または食作用指数に対して有意な影響は有さなかった。
【００９７】
対照的に、図５に示すように、本明細書中の実施例１に記載するように調製し、そして表１に示すような投与量レベル１〜４でラットに投与した本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物は、エタノールと水との混合物で処理したコントロールラットと比較して、ラットの肺胞のマクロファージの食作用活性および食作用指数の両方を増強した。詳細には、用量レベル３で、アルキルアミド抽出物は、マクロファージの活性および食作用指数の両方を有意に増大させ、コントロールと比較して、活性においては６０％、そして指数においては５０％増大させた。図６は、この実施例に記載するＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライドのそれぞれの食作用指数に対する影響の比較を示す。図６から、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物が個々の化合物と比較して統計学的に有意な共働作用活性を示したことが明らかである。
【００９８】
肺胞のマクロファージによる一酸化窒素の産生に対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物の影響：図１に示すように、この実施例に記載するＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の表１に示す投与量レベル３〜５が、肺胞のマクロファージによる一酸化窒素の産生の増大を生じた。投与量が増大するに伴って、一酸化窒素のレベルの大きさが増大した。
【００９９】
図３および４に示すように、本明細書中の実施例２および３に記載するように調製したＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸およびポリサッカライド抽出物は、肺胞のマクロファージによる一酸化窒素のレベルを有意には増大させなかった。対照的に、図５に示すように、本明細書中の実施例１に記載するように調製したＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物の投与量レベル１〜４（特に、投与量レベル３および４）は、肺胞のマクロファージによって産生される一酸化窒素のレベルの有意な増大を生じた。
【０１００】
マクロファージにおけるＴＮＦ−αの産生に対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物の影響：図１に示すように、この実施例に記載するＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、レベル４までの投与量で肺胞のマクロファージによるＴＮＦ−αの産生において増大を生じた。最初に、ＴＮＦ−αの産生が、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物の投与量の増大に伴って増大し、次いで、応答が減少する。図７に示すように、最適なＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の投与量はレベル３とレベル４との間に存在する。
【０１０１】
図３に示すように、本明細書中の実施例２に記載するように調製したＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸抽出物は、肺胞のマクロファージによるＴＮＦ−αの酸性のレベルを有意には増大しなかった。対照的に、図４および５に示すように、本明細書中の実施例３および１に記載するように調製したＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド抽出物およびＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物は、両方ともが、肺胞のマクロファージによって産生されるＴＮＦ−αのレベルにおける有意な増大を生じた。アルキルアミド抽出物の刺激効果は特に投薬レベル３で強力であった。しかし、アルキルアミドの投与量レベル４では、ＴＮＦ−αの産生はコントロールの産生にまでもどった。このことは、この用量での一酸化窒素の産生における顕著な増大の結果であり得る。
【０１０２】
脾臓細胞中でのＴＦＮ−γの産生に対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物の影響：図１に示すように、この実施例に記載するＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の全ての投与量レベル（表１に示すレベル２〜５）が、脾臓細胞によるＩＦＮ−γの産生における増大を生じた。この影響は、投与量レベル４および５で最も顕著であった。
【０１０３】
図３〜５に示すように、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物は、脾臓細胞によるＩＦＮ−γの産生において有意な増大は生じなかった。
【０１０４】
脾臓細胞中でのＴＦＮ−αの産生に対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物の影響：図１に示すように、この実施例に記載するＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の投与量レベル５が、脾臓細胞によるＩＦＮ−αの産生における有意な増大を生じた。
【０１０５】
脾臓細胞中でのＩＬ−２の産生に対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物および抽出物の影響：図１に示すように、この実施例に記載するＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の投与量レベル２および３が、脾臓細胞によるＩＬ−２の産生を抑制した。一方、投与量レベル４および５は、ＩＬ−２の産生についてのコントロールの値に近い値を生じた。抑制効果は、図８においてより明らかに観察され、これは、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物の相対的な濃度に対するＩＬ−２のラットの脾臓細胞での産生のプロットを示す。ＩＬ−２の抑制は、炎症性の疾患の症状の重篤度を軽減し得る、炎症性の応答の抑制を生じる（そして後期に発症する糖尿病の症状を緩和し得る）
図３〜５に示すように、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物は、脾臓細胞中のＩＬ−２の産生には影響を与えなかった。
【０１０６】
本発明の好ましい実施態様が説明されそして記載されるが、種々の変更が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書中で行われ得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
本発明の上記の局面および付随する多くの利点は、添付の図面と組合せた場合に、以下の詳細な記載を参照することによってそれらがより良好に理解されるので、より容易に理解される。
【図１】  図１は、ラットにおける種々の免疫系のパラメーターに対する、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の異なる投与量の影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を、本明細書中の実施例８に示されるように含む。投与量レベルは、本明細書中の表１に示される。略号は、ＩＬ２  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターロイキン−２の産生；ＴＮＦ−α  ＳＰ：脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生；ＩＦＮ−γ  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生；ＴＮＦ−α  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α；ＮＯ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生；ＰＩ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用指数；ＰＡ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図２】  図２は、本発明の種々の投与量のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の、ラットの肺胞マクロファージの食作用指数に対する影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、本明細書中の実施例８に示されるように、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。投与量レベルは、本明細書中の表１に示される。
【図３】  図３は、ラットの種々の免疫系のパラメーターに対する、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸抽出物の影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸抽出物は、本明細書中の実施例２に記載されるように調製された。略号は：ＩＬ２  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターロイキン−２の産生；ＴＮＦ−α  ＳＰ：脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生；ＩＦＮ−γ  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生；ＴＮＦ−α  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α；ＮＯ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生；ＰＩ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用指数；ＰＡ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図４】  図４は、ラットの種々の免疫のパラメーターに対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド抽出物の影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド抽出物は、本明細書中の実施例３に記載されるように調製された。略号は：ＩＬ２  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターロイキン−２の産生；ＴＮＦ−α  ＳＰ：脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生；ＩＦＮ−γ  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生；ＴＮＦ−α  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α；ＮＯ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生；ＰＩ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用指数；ＰＡ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図５】  図５は、ラットの種々の免疫のパラメーターに対する本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物の影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミド抽出物は、本明細書中の実施例１に記載されるように調製された。略号は：ＩＬ２  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターロイキン−２の産生；ＴＮＦ−α  ＳＰ：脾臓細胞中での腫瘍壊死因子αの産生；ＩＦＮ−γ  ＳＰ：脾臓細胞中でのインターフェロンγの産生；ＴＮＦ−α  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α；ＮＯ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での一酸化窒素の産生；ＰＩ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用指数；ＰＡ  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での食作用活性。結果は、コントロールの値に対して較正される。
【図６】  図６は、ラットの肺胞のマクロファージの食作用指数に対する、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の影響、ならびにその成分であるシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物のそれぞれの影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、本明細書中の実施例８に示されるように、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物の投与量は、本明細書中の表１に示されるような、レベル４であった。すなわち、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、８００μｇ／ｋｇのＥｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、２０ｍｇ／ｋｇのＥｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライド、および８０μｇ／ｋｇのＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドの毎日の投与量で提供された。Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸は、８００μｇ／ｋｇの毎日の投与量で別々に投与され、Ｅｃｈｉｎａｃｅａポリサッカライドは、２０ｍｇ／ｋｇの毎日の投与量で別々に投与され、そしてＥｃｈｉｎａｃｅａアルキルアミドは８０μｇ／ｋｇの毎日の投与量で別々に投与された。水およびエタノールの混合物が、コントロールのラットに対して投与された。
【図７】  図７は、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の種々の投与量の、ラットの肺胞のマクロファージにおけるＴＮＦ−αの産生に対する影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、本明細書中の実施例８に示されるように、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。ＴＮＦ−α  ＭＡ：肺胞のマクロファージ中での腫瘍壊死因子α。相対的な濃度が、表１に示される用量レベル２の濃度に対して、表１中の用量濃度のそれぞれを較正することによって得られた。
【図８】  図８は、本発明のＥｃｈｉｎａｃｅａ組成物の種々の投与量の、インターロイキン−２のラットの脾臓細胞での産生に対する影響を示す。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、本明細書中の実施例８に示されるように、Ｅｃｈｉｎａｃｅａシコリイン酸、アルキルアミド、およびポリサッカライド抽出物を含む。Ｅｃｈｉｎａｃｅａ組成物は、本明細書中の表１に示される投与量レベルで投与された。ＩＬ２  ＳＰ：インターロイキン−２の脾臓細胞での産生。結果は、コントロールの値に対して較正される。相対的な濃度が、表１に示される用量レベル２の濃度に対して、表１中の用量濃度のそれぞれを較正することによって得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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