(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２であるスレオニン（Ｔｈｒ）がアラニン（Ａｌａ）に置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項４】
Mycobacterium  aurum  SC−S423から得られうるモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質であって、かつラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列に対応するアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
【請求項６】
下記（ａ’）又は（ｂ’）の塩基配列のいずれかを有する遺伝子。
（ａ’）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列。
（ｂ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に置換された塩基配列。
【請求項７】
配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項８】
配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に置換された塩基配列を有する遺伝子。
【請求項９】
宿主細胞で機能可能なプロモーターと、請求項５記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子。
【請求項１０】
請求項５記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項５記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞が微生物の細胞である請求項１１または１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項５記載の遺伝子または請求項１０記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１５】
請求項５記載の遺伝子を有する微生物を培養する工程を含むことを特徴とする、下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質の製造方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
【請求項１６】
請求項１１または１２記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする、下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質の製造方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
【請求項１７】
一般式（１）
0004496593.tif 000037
（式中、Ｘ１は、Ｃ１−Ｃ９アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、又はＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表わし、Ｒ１は、カルボキシル基、又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を表わし、ｍは０を表わす。）
で示されるケトン化合物に、一般式（２）
0004496593.tif 000038
（式中Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（３）
0004496593.tif 000039
（式中、Ｘ１、Ｒ１およびｍは前記と同じ意味を表わし、＊は不斉炭素原子を表わす。）
で示される光学活性アミノ化合物（Ｒ−体）の製造方法。
【請求項１８】
一般式（１）で示されるケトン化合物のＲ１がカルボキシル基である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
一般式（４）
0004496593.tif 000040
（式中、Ｘ２は置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいナフチル基を表わし、Ｒ4はＣ１−Ｃ６のアルキル基を表わし、ｎは０を表わす。）
で示されるケトン化合物に、
0004496593.tif 000041
（式中Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（６）
0004496593.tif 000042
（式中、Ｘ２、Ｒ４およびｎは前記と同じ意味を表わす。）
で示される光学活性アミノ化合物（Ｒ−体）の製造方法。
【請求項２０】
一般式（７）
0004496593.tif 000043
（式中、Ｘ４は置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基、置換されていてもよいＣ4−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルキル基、又は水素原子を表わし、Ｒ７およびＲ８は互いに同一又は異なって、水素原子又はＣ１−Ｃ３アルキル基を表わし、ｐは１〜３の整数を表わし、ｑは０を表わす。）
で示されるケトン化合物に、一般式（２）
0004496593.tif 000044
（式中Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（８）
0004496593.tif 000045
（式中、Ｘ4，Ｒ７、Ｒ８、ｐおよびｑは前記と同じ意味を表わす。）
で示される光学活性アミノ化合物（Ｒ−体）の製造方法。
【請求項２１】
一般式（１３）
0004496593.tif 000046
（式中、Ｘ５は、Ｃ１−Ｃ９アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基、又はＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基を表わし、Ｒ９は、カルボキシル基、Ｃ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基又は水素原子を表わし、ｒは０を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体に、一般式（１１）
0004496593.tif 000047
（式中、Ｒ１０は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ１１は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を示す。）
で示されるケトン化合物の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（９）
0004496593.tif 000048
（式中Ｘ５、Ｒ９およびｒは前記と同じ意味を表わし、＊は不斉炭素原子を表わす。）
で示されるアミノ化合物Ｓ−体の比率の向上方法。
【請求項２２】
一般式（１０）
0004496593.tif 000049
（式中Ｘ６は置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいナフチル基を表わし、Ｒ１２はＣ１−Ｃ６アルキル基を表わし、ｔは０の整数を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物に、一般式（１１）
0004496593.tif 000050
（式中、Ｒ１０は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ１１は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を示す。）
で示されるケトン化合物の存在下、請求項１の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（１２）
0004496593.tif 000051
（式中Ｘ６、Ｒ１２及びｔは前記と同じ意味を表わす。）
で示されるアミノ化合物Ｓ−体の比率の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力を有する蛋白質、その遺伝子及びその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般式（３）
0004496593.tif 000002
（式中、Ｘ1は置換されていてもよいＣ１−Ｃ９アルキル基、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換されていてもよいＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基、シアノ基、ハロゲン原子又は水素原子を表わし、Ｒ1はＣ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基、Ｃ２−Ｃ６アルキルオキシカルボニル基又は水素原子を表わし、ｍは０−６の整数を表わし、＊は不斉炭素を表わす。）
で示される光学活性アミノ化合物は各種の用途で利用される化合物の合成中間体として有用な化合物である。例えば、
一般式（１０）
0004496593.tif 000003
（式中Ｘ6は置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいナフチル基を表わし、Ｒ12はＣ１−Ｃ６アルキル基を表わし、ｔは０〜４の整数を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物の光学活性体は、糖尿病治療薬、抗肥満薬、気管支拡張剤等の医薬品や抗カビ剤、除草剤等の農薬などの合成中間体として有用な化合物であり、また、一般式（８）
0004496593.tif 000004
（式中Ｘ4は置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルキル基、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基又は水素原子を表わし、Ｒ7およびＲ8は互いに同一または異なって、水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル基又は水酸基を表わし、ｐは０〜３の整数を表わし、ｑは０〜２の整数を表わす。）
で示される光学活性アミノ化合物は血液凝固阻止剤、抗ガン剤、成長障害抑制剤等の医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
かかる光学活性アミノ化合物の製造に用いられる生体触媒としては、例えば、ある種のケトン化合物を原料とする光学活性アミン化合物の製造において触媒作用を有するアルスロバクター属の微生物に由来するトランスアミナーゼ（ＷＯ９７／１５６８２、ＷＯ９８／４８０３０）が知られている。さらにはある種のケト酸化合物を原料とする光学活性Ｄ−アミノ酸の製造において触媒作用を有するバシルス属の微生物に由来するＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ（特公平５−５４７２）等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、光学活性アミノ化合物を効率良く製造するための優れた触媒能力を有する新たな蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子及びその利用を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、光学活性アミノ化合物の製造のための生体触媒について鋭意検討した結果、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力を有する新規な蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子等を見出し、本発明に至った。
【０００５】
すなわち本発明は、
１．下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列；
２．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
３．配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２であるスレオニン（Ｔｈｒ）がアラニン（Ａｌａ）に置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質；
４．Mycobacterium  aurum  SC−S423から得られうるモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質であって、かつラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質；
【０００６】
５．下記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列に対応するアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列；
６．下記（ａ’）〜（ｃ’）の塩基配列のいずれかを有する遺伝子
（ａ’）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列。
（ｂ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に置換された塩基配列。
（ｃ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、かつMycobacterium属に属する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の方法によるＰＣＲによって増幅する１０２０ｂｐからなる塩基配列；
７．配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、かつMycobacterium属に属する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の方法によるＰＣＲによって増幅する１０２０ｂｐからなる塩基配列。
＜ＰＣＲ方法＞
４種類のｄＮＴＰを各々終濃度が２００μＭとなるよう含み、上記の2種類のプライマーを各々終濃度が２００ｎＭとなるよう含み、ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを合計２６ｍＵ／μｌ含み、鋳型となる染色体ＤＮＡを終濃度が１ｎｇ／μｌになるよう含む反応液を用い、95℃にて２分間保温した後、96℃にて15秒間次いで60℃にて15秒間さらに72℃にて1分間の保温を1サイクルとしてこれを25サイクル繰り返し、さらに72℃にて10分間保温する。；
８．配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に置換された塩基配列を有する遺伝子；
９．宿主細胞で機能可能なプロモーターと、５．記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子；
【０００７】
１０．５．記載の遺伝子を含むベクター；
１１．５．記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
１２．１０．記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
１３．宿主細胞が微生物の細胞である１１．または１２．記載の形質転換体；
【０００８】
１４．５．記載の遺伝子または１０．記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法；
１５．５．記載の遺伝子を有する微生物を培養する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の蛋白質の製造方法；
１６．１１．または１２．記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする、蛋白質の製造方法；
を提供するものである。
【０００９】
１７．一般式（１）
0004496593.tif 000005
（式中、Ｘ１は置換されていてもよいＣ１−Ｃ９アルキル基、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換されていてもよいＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基、シアノ基、ハロゲン原子、又は水素原子を表わし、Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基、Ｃ２−Ｃ６アルキルオキシカルボニル基、又は水素原子を表わし、ｍは０−６の整数を表わす。）で示されるケトン化合物（以下、ケトン化合物（１）と記す）に、一般式（２）
0004496593.tif 000006
（式中Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ３は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（３）
0004496593.tif 000007
（式中、Ｘ1、Ｒ1およびｍは前記と同じ意味を表わし、＊は不斉炭素原子を表わす。但し、Ｒ1がＣ１−Ｃ６アルキル基または水素原子の場合、一般式（３）の立体配置は以下のとおり
0004496593.tif 000008
であり、Ｒ１がカルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基の場合、一般式（３）の立体配置は以下のとおり
0004496593.tif 000009
である。）
で示される光学活性アミノ化合物の製造方法；
１８．ケトン化合物（１）のＲ１がカルボキシル基である１７．に記載の方法；
【００１０】
１９．一般式（４）
0004496593.tif 000010
（式中、Ｘ２は置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいナフチル基を表わし、Ｒ4はＣ１−Ｃ６のアルキル基を表わし、ｎは０〜４の整数を表わす。）
で示されるケトン化合物に、
0004496593.tif 000011
（式中Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ3は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（６）
0004496593.tif 000012
（式中、Ｘ２、Ｒ４およびｎは前記と同じ意味を表わす。）
で示される光学活性アミノ化合物の製造方法；
【００１１】
２０．一般式（７）
0004496593.tif 000013
（式中、Ｘ４は置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基、置換されていてもよいＣ4−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルキル基、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基又は水素原子を表わし、Ｒ７およびＲ８は互いに同一又は異なって、水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル基又は水酸基を表わし、ｐは０〜３の整数を表わし、ｑは０〜２の整数を表わす。）
で示されるケトン化合物に、一般式（２）
0004496593.tif 000014
（式中Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ３は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（８）
0004496593.tif 000015
（式中、Ｘ4，Ｒ７、Ｒ８、ｐおよびｑは前記と同じ意味を表わす。）
で示される光学活性アミノ化合物の製造方法；
【００１２】
２１．  一般式（１３）
0004496593.tif 000016
（式中、Ｘ5は置換されていてもよいＣ１−Ｃ９アルキル基、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換されていてもよいＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基、シアノ基、ハロゲン原子又は水素原子を表わし、Ｒ9はＣ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基、Ｃ２−Ｃ６アルキルオキシカルボニル基又は水素原子を表わし、ｒは０〜６の整数を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物（以下、アミノ基含有化合物（１３）と記す）に、一般式（１１）
0004496593.tif 000017
（式中、Ｒ10は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基を表わし、Ｒ11は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基を示す。）
で示されるケトン化合物（１１）の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（９）
0004496593.tif 000018
（式中Ｘ5、Ｒ9およびｒは前記と同じ意味を表わし、＊は不斉炭素原子を表わす。但し、Ｒ9がＣ１−Ｃ６アルキル基または水素原子の場合、一般式（９）の立体配置は下記のとおり
0004496593.tif 000019
であり、Ｒ9がカルボキシル基又はＣ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基の場合、一般式（９）の立体配置は下記の通り
0004496593.tif 000020
である。）
で示されるアミン化合物異性体（以下、アミン化合物異性体（９）と記す）の比率向上方法；
【００１３】
２２．  一般式（１０）
0004496593.tif 000021
（式中Ｘ6は置換されていてもよいフェニル基又は置換されていてもよいナフチル基を表わし、Ｒ12はＣ１−Ｃ６アルキル基を表わし、ｔは０〜４の整数を表わす。）
で示されるアミノ基含有化合物（以下、アミノ含有化合物（１０）と記す）に、ケトン化合物（１１）の存在下、請求項１の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（１２）
0004496593.tif 000022
（式中Ｘ6、Ｒ12及びｔは前記と同じ意味を表わす。）
で示されるアミノ化合物異性体（以下、アミノ化合物異性体（１２）と記す）の比率の向上方法；
を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明蛋白質には、下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列、（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、を含む。具体的には、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質や、Mycobacterium  aurum  SC−S423から得られうるモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質であって、かつラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質等をあげることができる。
【００１５】
上記の蛋白質は、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を消失しない限りにおいて、そのアミノ酸配列を適当な長さのアミノ酸配列に短くすることができ、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２３〜３３９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質とすることも可能である。本蛋白質は、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力として、少なくともラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有している。例えば、本蛋白質を含有する１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）中に、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミン、アセトフェノン及びピリドキサール−５−リン酸（ＰＬＰ）を最終濃度がそれぞれ４００ｍＭ、１０ｍＭ、２０μＭとなるように添加することにより反応液を調整し、この反応液を約３０℃から約４０℃にて、約２時間から４日間保温した後、当該反応液中に生成した光学活性１−フェニルエチルアミンの量を分析すれば、当該能力の有無を判定することができる。尚、１−フェニルエチルアミンのＲ−体の定量分析方法については実施例の欄等において一例を記載する。
【００１６】
本蛋白質が立体選択的に触媒するアミノ基転移反応としては、例えばアミノ基含有化合物（２）の存在下にケトン化合物（１）を光学活性アミノ化合物（３）に変換する反応、アミノ基含有化合物（２）の存在下にケトン化合物（４）を光学活性アミノ化合物（６）に変換する反応、アミノ基含有化合物（２）の存在下にケトン化合物（７）を光学活性化合物（８）に変換する反応、ケトン化合物（１１）の存在下にアミノ基含有化合物（１３）に含まれる光学活性アミノ化合物（９）の比率を向上させる反応、ケトン化合物（１１）の存在下にアミノ基含有化合物（１０）に含まれる光学活性アミノ化合物（１２）の比率を向上させる反応等をあげることができる。本発明において配列番号１で示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性とは、９５％以上のアミノ酸同一性をあげることができる。
【００１７】
本発明の遺伝子には、下記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質をコードする遺伝子
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列に対応するアミノ酸配列、（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列；及び下記（ａ’）〜（ｃ’）の塩基配列のいずれかを有する遺伝子
（ａ’）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列、
（ｂ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン(a)がグアニン(g)に置換された塩基配列、
（ｃ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、かつMycobacterium属に属する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって増幅する約１０２０ｂｐからなる塩基配列；を含む。具体的には、例えば、配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列等をあげることができる。
【００１８】
上記の遺伝子としては、天然の遺伝子であってもよいし、例えば、部位特異的変異導入法やランダム変異導入法等によって、天然の遺伝子に変異を導入することにより作出された遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えばMycobacterium  aurum、Mycobacterium  neoaurum、Mycobacterium  chubuense等のMycobacterium属に属する微生物を好ましい対象としてあげることができる。
【００１９】
本遺伝子は、例えば以下のようにして調製することができる。
マイコバクテリウム・オーラム(Mycobacterium aurum)SC-S423株[通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７００９（原寄託日：平成１０年３月３０日）としてブタペスト条約に基づき国際寄託されている。]などのマイコバクテリウム属に属する微生物等から、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により染色体ＤＮＡを調製する。次いで、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて下記の反応条件にてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅することができる。
ここで、ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々終濃度が２００μＭとなるよう含み、上記の2種類のプライマーを各々終濃度が２００ｎＭとなるよう含み、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 及び Ｐｗｏ ＤＮＡ ポリメラーゼを合計２６ｍＵ／μｌ含み、鋳型となる染色体ＤＮＡを終濃度が１ｎｇ／μｌになるよう含む反応液を用い、95℃にて２分間保温した後、96℃にて15秒間次いで60℃にて15秒間さらに72℃にて1分間の保温を1サイクルとしてこれを25サイクル繰り返し、さらに72℃にて10分間保温する条件をあげることができる。
【００２０】
また、このようなＰＣＲのプライマーに用いるオリゴヌクレオチドを、例えば、配列番号２で示される塩基配列に基づいて適宜設計して合成し、上記の条件に準じてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、具体的には例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号23〜339で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡや、かかるＤＮＡの塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅することができる。尚、このようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。具体的には、例えば配列番号１１又は配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等をあげることができる。また、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡがベクターに挿入されてなるＤＮＡライブラリーを鋳型とする場合には、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の5'末端側の約14塩基程度以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、ライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列を有する約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することもできる。
上記のようにして増幅されたＤＮＡは、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じた方法によりベクターにクローニングすることができる。具体的には、例えばInvitrogen社のTAクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやStratagene社のpBluescriptIIなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
【００２１】
また、本遺伝子は、例えばMycobacterium属に属する微生物等由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーに、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する約１５塩基以上の塩基からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによって取得することもできる。
【００２２】
染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて構築されている場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを、ライブラリーの作製に用いられたプラスミドベクターが複製可能な微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで培養を行う。ライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合には、プラークハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーの作製に用いられたファージベクターが複製可能な微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合した後、更に軟寒天培地と混合し、これを寒天培地にまく。その後、プラークが現れるまで培養を行う。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーションの場合も、前記の培養を行った寒天培地の表面にメンブレンを載せ、形質転換体またはファージを該メンブレンに転写する。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、DNAを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的に例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地の上にニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレン等、具体的には例えば、Hybond-N+(アマシャム社登録商標)等を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5N NaOH）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させてファージDNAをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5Mトリス-塩酸緩衝液pH7.5）に約５分間浸す。該メンブレンを洗浄液（0.3M塩化ナトリウム、30 mMクエン酸ナトリウム、0.2M トリス-塩酸緩衝液pH7.5）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間ベーキングすることによりファージDNAをメンブレンに固定する。
【００２３】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００２４】
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー社または宝酒造社製のRandom Labeling Kit等を用いることができ、通常のPCR反応液中のdCTPを(α-32P)dCTPに替えて、プローブに用いるDNAを鋳型にしてPCRを行うことにより、標識することもできる。また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例えば、450〜900mMの塩化ナトリウムおよび45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム(以下、SDSと記す。)を0.1〜1.0%の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1.0%のSDSおよび100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むプレハイブリダイゼーション液を、上記のようにして作製したメンブレン1cm2当たり50〜200μlの割合で準備し、該溶液に前記メンブレンを浸して42〜65℃で1〜4時間、好ましくは、65℃で2時間保温する。次いで例えば、450〜900mMの塩化ナトリウムおよび45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、SDSを0.1〜1.0%の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1.0%のSDSおよび100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン1cm2当たり1.0x104〜2.0x106cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン1cm2当たり50〜200μlの割合で準備し、該溶液にメンブレンを浸し42〜65℃で12〜20時間、好ましくは、65℃で16時間保温しハイブリダイゼーション反応を行う。該ハイブリダイゼーション反応後、メンブレンを取り出し、15〜300mMの塩化ナトリウム、1.5〜30mMクエン酸ナトリウムおよび0.1〜1.0 %のSDS等を含む42〜65℃の洗浄液等を用い、好ましくは、15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウムおよび1.0 %のSDSを含む65℃の洗浄液で15分間の洗浄を2回行う。さらに、メンブレンを2xSSC溶液（300mM塩化ナトリウム、30mMクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後乾燥させる。このメンブレンを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするDNAのメンブレン上の位置を検出する。検出されたDNAのメンブレン上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該DNAを有するクローンを単離することができる。
【００２５】
上述のようにして得られるＤＮＡは、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。ベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK331-1（Pharmacia社製）などを利用することができる。
また、上述のようにして得られるＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of National Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００２６】
上述のようにして得られるＤＮＡにコードされる蛋白質の、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力の確認は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、該ＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで、該形質転換体の培養物を、ケトン化合物（１）にアミノ基含有化合物（２）の存在下作用させ、その結果生じた反応生成物を分析する。このようにして光学活性アミノ化合物（３）を優先的に生成する能力を有する形質転換体を特定することができ、当該形質転換体はかかる能力を有する蛋白質をコードする本遺伝子を保有していると判断することができる。より具体的には、例えば、１０ｍＭアセトフェノン、４００ｍＭのラセミ体のｓｅｃーブチルアミンおよび２０μＭピリドキサール−５−リン酸を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液(pH６.０)に、上記形質転換体の培養物を最終容量１ｍｌになるよう懸濁し、これを1.５ml容量のサンプルチューブに入れ、振盪機で振盪させながら約３０℃〜４０℃にて約２時間から４日間保温する。保温後の該懸濁液２００μlにメタノール４００μｌを加えて攪拌し、１００００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を回収してフィルターろ過し、得られたろ液をガスクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと記す。）で分析することにより、１−フェニルエチルアミンの生成量、光学純度を定量することができ、上記形質転換体の光学活性１−フェニルエチルアミン生成能をアミノ基転移反応を立体選択的に触媒する代表的な能力として判定することができる。
【００２７】
本遺伝子を宿主細胞で発現させるには、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本遺伝子とが、機能可能な形で接続されてなる遺伝子、当該遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する。ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子が宿主細胞に導入された際に、本遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、例えば、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーターなどをあげることができる。また、本遺伝子の元来のプロモーターを利用してもよい。一般的には、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本遺伝子を、前述のようなベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、本遺伝子が導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
【００２８】
本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターが導入される宿主細胞としては、例えば、Esherichia、Bacillus、Corynebacterium、Staphylococcus、Streptomyces、Saccharomyces、Kluyveromyces、Aspergillus、Mycobacterium属等に属する微生物などの細胞があげられる。遺伝子を宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法などをあげることができる。
本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターが導入された形質転換体は、前述のような本遺伝子が組込まれたベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選抜することができる。形質転換体が本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターを保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等）を行うことにより確認することができる。
【００２９】
本蛋白質は、例えば本遺伝子を有する微生物を培養することによって調製することができる。かかる微生物としては、本遺伝子を発現し本蛋白質を産生する能力を有する微生物であって、例えば、本遺伝子を有する微生物の、自然界から分離された野性株、該野生株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株等をあげることができる。さらにまた本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターが宿主細胞に導入された形質転換体等をあげることもできる。具体的な例としては、例えば、本発明者らが自然界から分離したマイコバクテリウム・オーラム(Mycobacterium aurum)SC-S423株等があげられる。また、tacプロモーター、trcプロモーターまたはlacプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本遺伝子が宿主細胞に導入された大腸菌株、例えばE.coli JM109/ptrc9等をあげることもできる。
【００３０】
上記のような本遺伝子を有する微生物を培養する為の培地としては、微生物にの培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸等があげられる。これら炭素源の培地への添加量は、培地全量に対し、通常約0.1％(w/v)〜約10％(w/v)程度とするとよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンステイープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源又はアミノ酸類等があげられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は、多くの場合、炭素源としても使用することができる。窒素源の添加量は培地全量に対し通常、約０．１％(w/v)〜約１０％(w/v)程度とするとよい。
無機塩類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等のリン酸塩、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト６水和物等の塩化物塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物等の硫酸金属塩等をあげることができ、その添加量は培地全量に対し通常、約０．０００１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。
【００３１】
また、かかる培地にあらかじめアミノ化合物類、例えばアミノ基含有化合物や光学活性アミノ化合物等を少量添加しておいてもよく、これにより前記した微生物による本蛋白質の生産性が高まることがあり、また、アミノ化合物類は、前記微生物の培養における窒素源および炭素源にもなる。このように添加するアミノ化合物類の量は培地全量に対し、通常約0.001％（ｗ／ｖ）程度以上、好ましくは約0.01％（ｗ／ｖ）〜約1％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター等のラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入された宿主細胞の場合には、本蛋白質の生産を誘導するための誘導剤として、例えばｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えてもよい。
【００３２】
本遺伝子を有する微生物の培養は、微生物の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば旋回振盪培養、往復振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermenter)培養もしくはタンク培養等の液体培養、または、固体培養等の方法が可能である。ジャーファーメンターを用いる場合には、ジャーファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液容量の約０．１倍〜約２倍／分の通気条件をが用いられる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度が一般的であり、培地のｐＨとしては、約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常は約１日間〜約１０日間程度である。
【００３３】
本遺伝子を有する微生物によって産生される本蛋白質は、例えば、本蛋白質を産生する微生物の培養物、本蛋白質を産生する微生物の菌体、かかる菌体の処理物、無細胞抽出液、粗精製蛋白質、精製蛋白質等の種々の形態で光学活性アミノ化合物の製造に用いることができる。ここで菌体の処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物等をあげることができる。また、上記のような種々の形態の本蛋白質を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、ＤＥＡＥ−セルロース等の多糖類の誘導体、もしくはアンバーライトＩＲＡ９３５（商品名：ローム・アンド・ハース社製）等の合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲルもしくは寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化して光学活性アミノ化合物の製造に用いることもできる。
【００３４】
本蛋白質を前記のような本遺伝子を有する微生物の培養物から精製する方法としては、蛋白質の精製において通常使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法をあげることができる。
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理もしくはフレンチプレス処理等の物理的破砕方法、または界面活性剤もしくはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本蛋白質を精製することができる。クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基、もしくはブチル基等を導入したセルロース、デキストランまたはアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることもでき、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等があげられる。
【００３５】
本蛋白質の精製操作の一例を示す。
本蛋白質を産生する微生物の菌体を遠心分離により集めた後、例えば２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）等の緩衝液に懸濁する。これを超音波破砕機にて２０分間程度破砕処理し、得られた菌体破砕液を約１３０００×ｇで１５分間程度遠心分離した後、上清を回収してメンブレンフィルターにてろ過して不溶物を除去し、無細胞抽出液を調製する。こうして得られた無細胞抽出液を例えば Q Sepharose FFカラム（商品名、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に導入し、塩化ナトリウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次溶出させ、分画された溶出液を得る。本蛋白質を含む画分を、次いで、例えば Phenyl-Sepharose HP カラム（商品名、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に導入し、硫酸アンモニウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次溶出させ、分画された溶出液を得る。本蛋白質を含む画分を、さらに、限外ろ過膜等を用いて濃縮した後、例えばＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラム（600mm×7.5mmID）（商品名、東ソー社製）に導入し、例えば０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液等で溶出させ、分画された溶出液を得ることによって、本蛋白質を精製することができる。尚、本蛋白質を含む画分は、例えば、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを光学活性１−フェニルエチルアミンに変換する能力を指標にして選択することがよい。
【００３６】
ケトン化合物（１）に、アミノ基含有化合物（２）の存在下、本蛋白質を作用させることにより光学活性アミノ化合物（３）を得ることができる（以下、本製造方法１と記す。）。
ケトン化合物（１）において、Ｘ1は置換されていてもよいＣ１−Ｃ９アルキル基（Ｃ１−Ｃ９アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ９アルキル基）、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基（Ｃ６−Ｃ１４アリール基、置換Ｃ６−Ｃ１４アリール基）、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基（Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、置換Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基）、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基（Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基）、置換されていてもよいＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基（Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基、置換Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基）、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基、シアノ基、ハロゲン原子又は水素原子を表わす。ここで上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ９アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ９アルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ６−Ｃ１４アリール基における水素原子の１〜２個、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基における水素原子の１〜２個またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２アルキルチオ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
【００３７】
該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子をあげることができる。
Ｒ1としては、水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１〜Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基；カルボキシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基等のＣ２〜Ｃ５（直鎖または分岐）アルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
【００３８】
アミノ基含有化合物（２）において、Ｒ2は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基）、置換されていてもよいフェニル基(フェニル基、置換フェニル基)、置換されていてもよいフェニルアルキル基(フェニルアルキル基、置換フェニルアルキル基)を表わす。ここで上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基またはフェニルアルキル基における水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ６アルキル基における水素原子の１〜２個、フェニル基における水素原子の１〜２個またはフェニルアルキル基における水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子をあげることができる。
【００３９】
Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１−Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができ、Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基としては、ベンジル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、α−メチルベンジル基等のＣ７−Ｃ１０フェニル（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができる。
【００４０】
置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基として具体的には、例えばカルボキシメチル基、カルボキシエチル基、１−アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基、ヒドロキシメチル基、メチルチオエチル基等を挙げることができ、置換フェニル基として具体的には、例えばｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｍ，ｐ−ジヒドロキシフェニル基等を挙げることができ、置換Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基として具体的にはｐ−ヒドロキシフェニルエチル基、ｐ−クロロフェニルメチル基、１−フェニル−１−ヒドロキシメチル基等をあげることができる。
Ｒ3としては、水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１〜Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基；カルボキシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基等のＣ２〜Ｃ５（直鎖または分岐）アルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
【００４１】
アミノ基含有化合物（２）として具体的には、例えばアラニン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、リジン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルセリン等のα−アミノ酸またはその（Ｃ１−Ｃ４アルキル）エステル；プロピルアミン、１，２−ジアミノプロパン、ｎ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、１，４−ジアミノブタン、２−アミノペンタン、ｎ−ヘキシルアミン、２−アミノヘプタン等の脂肪族アミン類；１−フェニルエチルアミン、２−フェニルエチルアミン、ベンジルアミン、３−アミノ−１−フェニルブタン、４−アミノ−１−フェニルペンタン等のフェニルアルキルアミン類；２−アミノ−１−プロパノール等のアミノアルコール類等が挙げられる。
【００４２】
なお、アミノ基含有化合物（２）において、不斉炭素原子を有する化合物については、光学異性体のうちのいずれか、またはその２種以上の混合物を適宜選択して用いることができるが、通常はアキラルな化合物が用いられる。また、アミノ基含有化合物（２）は光学活性アミノ化合物（３）とは異なる化合物であることが必要である(但し、その異なりが、光学異性、幾何異性等の立体異性のみに基づく場合には、ここでは異なる化合物とは見なさない)。即ち、本製造方法１において選択されるアミノ基含有化合物（２）と光学活性アミノ化合物（３）との組み合わせにおいて、アミノ基含有化合物(２)におけるＲ2と光学活性アミノ化合物(３)におけるＸ1とが同一で、かつアミノ基含有化合物（２）におけるＲ3と光学活性アミノ化合物（３）における−（ＣＨ2）m−Ｒ1基とが同一であることはない。
【００４３】
本製造方法１は通常、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩や、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性バッファー液中で行われ、ケトン化合物（１）及びアミノ基含有化合物（２）の本製造方法１の反応液中における濃度はそれぞれ通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。また、ケトン化合物（１）に対するアミノ基含有化合物（２）の重量割合は、一般的には０．０１〜１００程度であるが、ケトン化合物（１）に対するアミノ基含有化合物（２）の重量割合を例えば１０〜１００等のように比較的大きく設定することが、反応速度や光学活性アミノ化合物（３）の収率等の点で有利なことが多い。本蛋白質の量は、例えば反応時間や生成する光学活性アミノ化合物（３）の選択性等を考慮して適宜決めることができる。例えば本蛋白質が精製酵素または粗酵素として用いられる場合、その量はケトン化合物（１）に対して、通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、一方、本蛋白質が微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体のの処理物等の形態で用いられる場合、微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等の量はケトン化合物（１）に対して、通常は０．０１〜２００重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。反応温度は通常、１０〜７０℃程度が適しており、好ましくは２０〜６０℃程度である。反応液のｐＨは通常４〜１２程度が適しており、好ましくは５〜１１程度である。反応時間は、任意に設定することができるが、通常は約１時間〜７日間程度である。
【００４４】
さらに界面活性剤、補酵素、有機溶媒等を補助剤として本製造方法１の反応系内に共存させると、反応時間の短縮や光学活性アミノ化合物（３）の収率等の点で有利な場合があり、必要に応じてこれらの補助剤を単独又は適宜組み合わせて反応液に添加することもできる。使用し得る界面活性剤として具体的には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、臭化セチルピリジウム等を挙げることができ、また補酵素として具体的には、例えばピリドキサル−５−リン酸（ＰＬＰ）等をあげることができる。また有機溶媒として具体的には、例えば、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、イソオクタン等のアルカン類、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、メタノール、イソプロパノール、ｎ−オクタノール等のアルコール類、ＤＭＳＯ等のスルホキシド類等をあげることができる。
【００４５】
本製造方法１により得られる光学活性アミノ化合物（３）は、公知の処理方法により、反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等により精製することにより、あるいは前記上清液をイオン交換クロマトグラフィー等の手法により精製することにより光学活性アミノ化合物（３）が得られる。
【００４６】
ケトン化合物（４）に、アミノ基含有化合物（２）の存在下、本蛋白質を作用させることにより光学活性アミノ化合物（６）を得ることができる(以下、本製造方法２と記す。)。
ケトン化合物（４）において、Ｘ2はフェニル基、置換されていてもよいフェニル基(フェニル基、置換フェニル基)、置換されていてもよいナフチル基（ナフチル基、置換ナフチル基）を表わす。ここで、上記の「置換」とは、フェニル基又はナフチル基の水素原子の１個以上、通常はフェニル基の水素原子の１〜２個又はナフチル基の水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子をあげることができる。
Ｒ4はＣ１−Ｃ６のアルキル基を表わし、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキル基をあげることができ、さらに好ましくはメチル基及びエチル基をあげることができる。
【００４７】
ケトン化合物（４）として具体的には、例えばアセトフェノン、２−メトキシアセトフェノン、３−メトキシアセトフェノン、２，４−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジクロロアセトフェノン、３−シアノアセトフェノン、４−ヒドロキシアセトフェノン、４−メトキシアセトフェノン、４-メチルアセトフェノン、４−クロロアセトフェノン、１−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−メトキシフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−クロロフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−メチルフェニル）プロパン−２−オン、１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）プロパン−２−オン、１−フェニルプロパン−１−オン、α−アセトナフトン、β−アセトナフトン等を挙げることができる。
【００４８】
なお、アミノ基含有化合物（２）は、光学活性アミノ化合物（６）とは異なる化合物であることが必要である（但し、その異なりが、光学異性、幾何異性等の立体異性のみに基づく場合には、ここでは異なる化合物とは見なさない）。即ち、本製造方法２において選択されるアミノ基含有化合物（２）と光学活性アミノ化合物（６）との組み合わせにおいて、アミノ基含有化合物（２）におけるＲ2と光学活性アミノ化合物（６）におけるＸ2−（ＣＨ2）n−基とが同一で、且つアミノ基含有化合物（２）におけるＲ3と光学活性アミノ化合物（６）におけるＲ4とが同一であることはない。
本製造方法２は本製造方法１において記載した条件等に準拠して実施することができる。本製造方法２により得られる光学活性アミノ化合物（６）は、公知の処理方法により、反応液から回収できる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、その処理物等を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等により精製することにより光学活性アミノ化合物（６）が得られる。
【００４９】
本製造方法２により製造し得る光学活性アミノ化合物（６）としては、一般式（６）において特定された立体配置を有する例えば以下の化合物を挙げることができる。
1−フェニルエチルアミン、１−（２−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（３−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３−シアノフェニル）エチルアミン、１−（４−ヒドロキシフェニル）エチルアミン、１−（４−メトキシフェニル）エチルアミン、１-（４-メチルフェニル）エチルアミン、１−（４−クロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−クロロフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３、４−メチレンジオキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−フェニル−１−アミノプロパン、1−（α−ナフチル）エチルアミン、1−（β−ナフチル）エチルアミン等。
【００５０】
ケトン化合物（７）に、アミノ基含有化合物（２）の存在下、本蛋白質を作用させることにより光学活性アミノ化合物（８）が得られる（以下、該方法を本製造方法３と記す。）。
【００５１】
ケトン化合物（７）において、Ｘ4は置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基（Ｃ６−Ｃ１４アリール基、置換Ｃ６−Ｃ１４アリール基）、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基（Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基）、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルキル基（Ｃ１−Ｃ３アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ３アルキル基）、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基又は水素原子を表わす。
ここで上記の「置換」とは、該アリール基、該ヘテロアリール基又は該アルキル基の水素原子の１個以上、通常はＣ６−Ｃ１４アリール基の水素原子の１〜２個、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基の水素原子の１〜２個又はＣ１−Ｃ３アルキル基の水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基およびハロゲン原子、好ましくは、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子からなる群より選択される１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
また、Ｒ7およびＲ8は互いに同一または相異なって、水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル基又は水酸基を表わす。
Ｃ１−Ｃ３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基をあげることができる。
ｐは０〜３の整数を表わし、ｑは０〜２の整数を表わす。
【００５２】
Ｃ６−Ｃ１４アリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基等をあげることができ、Ｃ４−Ｃ１２のヘテロアリール基としては例えば２−チエニル基、３−チエニル基等のイオウ原子をその環構造に１個以上含有するヘテロ芳香環、２−インドリル基、３−インドリル基、２−イミダゾリル基、４−イミダゾリル基、５−イミダゾリル基等の窒素原子をその環構造に１〜４個含有するヘテロ芳香環をあげることができ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基をあげることができる。
【００５３】
ケトン化合物（７）として具体的には、ピルビン酸、β−ヒドロキシピルビン酸、２−ケト−３−メルカプトプロピオン酸、２−ケト−３−ヒドロキシ酪酸、２−ケト−４−（メチルチオ）酪酸、３−メチル−２−オキソ酪酸、４−メチル−２−オキソ吉相酸、３−メチル−２−オキソ吉相酸、トリメチルピルビン酸、フェニルピルビン酸、４−クロロフェニルピルビン酸、４−シアノフェニルピルビン酸、α−ナフチルピルビン酸、β−ナフチルピルビン酸、ｐ−ヒドロキシベンゾイル蟻酸、２−ケト−４−フェニル酪酸、３−（２−チエニル）ピルビン酸、３−ヒドロキシ−３−フェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドール−３−ピルビン酸、オキサロ酢酸、２−ケトスクシナミックアシッド、α−ケトグルタル酸、２−ケト−５−アミノ−５−オキソペンタン酸、２−ケト−６−アミノヘキサン酸、２−ケト−５−グアニジノペンタン酸、２−ケト−３−（４−イミダゾリル）プロピオン酸、２−ケト酪酸、３―ケト酪酸、３−ケト−３−フェニルプロピオン酸等が挙げられる。
【００５４】
また、本製造方法３において、アミノ基含有化合物（２）は、本製造方法２に準拠して使用することができる。ただし、光学活性アミノ化合物（８）とは異なる化合物であることが必要である（但し、その異なりが、光学異性、幾何異性等の立体異性のみに基づく場合には、ここでは異なる化合物とは見なさない）。即ち、本製造方法３において選択されるアミノ基含有化合物（２）と光学活性アミノ化合物（８）との組み合わせにおいて、アミノ基含有化合物（２）におけるＲ2と光学活性アミノ化合物（８）におけるＸ4−（ＣＲ7Ｒ8）p−基とが同一で、且つアミノ基含有化合物（２）におけるＲ3と光学活性アミノ化合物（８）における−（ＣＨ2）q−ＣＯＯＨ基とが同一であることはない。
【００５５】
本製造方法３は、本製造方法２において記載した条件等に準拠して実施することができる。
本製造方法３により得られる光学活性アミノ化合物（８）は、公知の処理方法により、反応液から回収できる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、その処理物等を分離後、イオン交換クロマトグラフィー等の手法により光学活性アミノ化合物（８）が得られる。
【００５６】
本製造方法３により製造し得る光学活性アミノ化合物（８）としては、一般式（８）において特定された立体配置を有する例えば以下の化合物を挙げることができる。
アラニン、セリン、システイン、トレオニン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｐ−シアノフェニルアラニン、α−ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、３−（２−チエニル）アラニン、フェニルセリン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、２−アミノ酪酸等のα−アミノ酸、３−アミノ酪酸、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸等のβ−アミノ酸等。
【００５７】
アミン化合物（１３）に、ケトン化合物（１１）の存在下、本蛋白質を作用させることにより、アミノ化合物異性体（９）の比率を向上させることができる（以下、本向上方法Ａと記す）。
【００５８】
本向上方法Ａにおいて、アミノ化合物異性体（９）の比率を向上させるとは、アミノ基含有化合物（１３）のアミノ基に結合する不斉炭素に基づく２種の光学異性体のうち、アミノ化合物異性体（９）とは異なる異性体に対するアミノ化合物異性体（９）の比率を向上させることを意味する。
【００５９】
ケトン化合物（１１）におけるＲ10は、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基）、置換されていてもよいフェニル基（フェニル基、置換フェニル基）、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基（Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基、置換Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基）を表わす。
【００６０】
ここで、上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基またはＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基の水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ６アルキル基の水素原子の１〜２個、フェニル基の水素原子の１〜２個あるいはＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基の水素原子の１〜３個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基およびハロゲン原子、好ましくは、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子からなる群より選択される１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
【００６１】
Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１−Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができ、Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基としては、ベンジル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、α−メチルベンジル基等のＣ７−Ｃ１０フェニル（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができる。
【００６２】
置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基として具体的には、例えばカルボキシメチル基、カルボキシエチル基、１−アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基、ヒドロキシメチル基、メチルチオエチル基等を挙げることができ、置換フェニル基として具体的には、例えばｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｍ，ｐ−ジヒドロキシフェニル基等を挙げることができ、置換Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基として具体的にはｐ−ヒドロキシフェニルエチル基、ｐ−クロロフェニルメチル基、１−フェニル−１−ヒドロキシメチル基等をあげることができる。
【００６３】
Ｒ11としては、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１−Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基；カルボキシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基等のＣ２−Ｃ５（直鎖または分岐）アルキルオキシカルボニル基等をあげることができる。
【００６４】
ケトン化合物（１１）として具体的には、例えばアセトン、２−ブタノン等のケトン類、プロピオンアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアルデヒド類、オキサロ酢酸、ピルビン酸、α−ケト酪酸等のケト酸類、ピルビン酸ナトリウム等前記ケト酸類のアルカリ金属塩、ピルビン酸メチル等のケト酸類のアルキルエステル等をあげることができる。
【００６５】
アミノ基含有化合物（１３）において、Ｘ5は置換されていてもよいＣ１−Ｃ９アルキル基（Ｃ１−Ｃ９アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ９アルキル基）、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基（Ｃ６−Ｃ１４アリール基、置換Ｃ６−Ｃ１４アリール基）、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基（Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、置換Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基）、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基（Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基）、置換されていてもよいＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基（Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基、置換Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基）、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基、シアノ基、ハロゲン原子又は水素原子を表わす。ここで上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ９アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ９アルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ６−Ｃ１４アリール基における水素原子の１〜２個、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基における水素原子の１〜２個またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２アルキルチオ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子をあげることができる。
【００６６】
本向上方法Ａにおいて用いられるアミノ基含有化合物（１３）における光学異性体の比率は、特に限定されないが、工業的な見地からは、通常、アミノ基含有化合物（１３）がラセミ体で供給されることが多いので、アミノ基含有化合物（１３）としてはラセミ体を用いることが有利である。
【００６７】
本向上方法Ａは通常、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性バッファー液中で行われ、ケトン化合物（１１）及びアミノ基含有化合物（１３）の本向上方法Ａの反応液中における濃度はそれぞれ通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。また、アミノ基含有化合物（１３）に対するケトン化合物（１１）の重量割合は、一般的には０．０１〜１００程度であるが、アミノ基含有化合物（１３）に対するケトン化合物（１１）の重量割合を例えば１〜１０等のように比較的大きく設定することが、反応速度やアミノ化合物異性体（９）の収率等の点で有利なことが多い。本蛋白質の量は、例えば反応時間や生成するアミノ化合物異性体（９）の選択性等を考慮して適宜決めることができる。例えば本蛋白質が精製酵素または粗酵素として用いられる場合、その量はアミノ基含有化合物（１３）に対して、通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、一方、本蛋白質が微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等として用いられる場合、微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等の量はアミノ基含有化合物（１３）に対して、通常は０．０１〜２００重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。反応温度は通常、１０〜７０℃程度が適しており、好ましくは２０〜６０℃程度である。反応液のｐＨは通常４〜１２程度が適しており、好ましくは５〜１１程度である。反応時間は、任意に設定することができるが、通常は約１時間〜７日間程度である。一般に反応時間を長くすれば、変換率の増大に伴ってアミノ化合物異性体（９）の比率（光学純度は向上する。
また、予めアミノ基アミノ基含有化合物（１３）を添加した培地に、本蛋白質を産生する微生物を接種し、該微生物を培養しながら培地に添加したアミノ基含有化合物（１３）に本蛋白質を作用させてもよい。
【００６８】
さらに界面活性剤、補酵素、有機溶媒等を補助剤として本向上方法Ａの反応系内に共存させると、反応時間の短縮やアミノ化合物異性体（９）の収率等の点で有利な場合があり、必要に応じてこれらの補助剤を単独又は適宜組み合わせて反応液に添加することもできる。使用し得る界面活性剤として具体的には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、臭化セチルピリジウム等を挙げることができ、また補酵素として具体的には、例えばピリドキサル−５−リン酸（ＰＬＰ）等を挙げることができる。また有機溶媒として具体的には、例えば、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、イソオクタン等のアルカン類、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、メタノール、イソプロパノール、ｎ−オクタノール等のアルコール類、ＤＭＳＯ等のスルホキシド類等をあげることができる。
【００６９】
本向上方法Ａにより得られるアミノ化合物異性体（９）比率の向上したアミノ含有化合物（１３）は、公知の処理方法により反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し、水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等の精製を加えて、あるいは前記上清液をイオン交換クロマトグラフィー等の手法により精製して回収できる。
【００７０】
アミノ基含有化合物（１０）に、ケトン化合物（１１）の存在下、本蛋白質を作用させることにより、アミノ化合物異性体（１２）の比率を向上させることができる（以下、本向上方法Ｂと記す）。
【００７１】
アミノ基含有化合物（１０）におけるＸ6は置換されていてもよいフェニル基（フェニル基、置換フェニル基）、置換されていてもよいナフチル基（ナフチル基、置換ナフチル基）を表わす。ここで、上記の「置換」とは、フェニル基またはナフチル基の水素原子の１個以上、通常はフェニル基の水素原子の１〜２個またはナフチル基の水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子をあげることができる。
Ｒ12はＣ１−Ｃ６アルキル基を表わし、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキル基をあげることができ、さらに好ましくはメチル基及びエチル基をあげることができる。
【００７２】
アミノ基含有化合物（１０）として具体的には、例えば1−フェニルエチルアミン、１−（２−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（３−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３−シアノフェニル）エチルアミン、１−（４−ヒドロキシフェニル）エチルアミン、１−（４−メトキシフェニル）エチルアミン、１-（４-メチルフェニル）エチルアミン、１−（４−クロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−クロロフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３、４−メチレンジオキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−フェニル−１−アミノプロパン、1−（α−ナフチル）エチルアミン、1−（β−ナフチル）エチルアミン等をあげることができる。
【００７３】
本向上方法Ｂにおいて用いられるアミノ基含有化合物（１０）における光学異性体の比率は、特に限定されないが、工業的な見地からは、通常、アミノ基含有化合物（１０）がラセミ体で供給されることが多いので、アミノ基含有化合物（１０）としてはラセミ体を用いることが有利である。
本向上方法Ｂは、本向上方法Ａにおいて記載した条件等に準拠して実施することができる。本向上方法Ｂにおいて、アミノ化合物異性体（１２）の比率を向上させるとは、アミノ基含有化合物（１０）のアミノ基に結合する不斉炭素に基づく２種の光学異性体のうち、アミノ化合物異性体（１２）とは異なる異性体に対するアミノ化合物異性体（１２）の比率を向上させることを意味する。
本向上方法Ｂにより得られるアミノ化合物異性体（１２）比率の向上したアミノ基含有化合物（１０）は、公知の処理方法により反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物を分離後、上清液を酸性に調製し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し、水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等の精製を加えて回収できる。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１から８における光学活性アミノ化合物の定量分析は下記（１）の条件にてガスクロマトグラフィーで行い、光学純度分析は下記（２）の条件にてＨＰＬＣで行った。また実施例１２から１５における光学活性アミノ化合物の定量分析および光学純度分析は、下記（３）の誘導化処理の後、下記（４）の条件にてＨＰＬＣで行った。
【００７５】
（１）アミノ化合物の定量分析（ガスクロマトグラフィー）
・カラム：ＤＢ−１７（内径０.２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ、長さ３０ｍ、Ｊ＆Ｗ社製）
・カラム温度条件：８０℃〜２５０℃まで昇温（昇温速度  ５℃／分）
・検出器：ＦＩＤ（検出器温度２５０℃）
（２）アミノ化合物の光学純度分析（ＨＰＬＣ）
・カラム：ＯＡ−４１００またはＯＡ−４８００（住化分析センター(株)製）
・移動相：ｎ−ヘキサン：エタノール：トリフルオロ酢酸＝２４０：１０：１
検出波長：２５４ｎｍ
（３）アミノ化合物の誘導化
反応液５０μｌに、４ｍｇ／ｍｌの2,3,4,6-テトラ−Ｏ−アセチル β−グルコピラノシル イソチオシアネート（ＧＩＴＣ、和光純薬製）のアセトニトリル溶液１００μｌおよび２ｍｇ／ｍｌのトリエチルアミンのアセトニトリル溶液５０μｌを添加し、３０℃で３０分間静置する。０．２μｍフィルターでろ過した後のろ液をＨＰＬＣ用サンプルとする。
（４）アミノ化合物の定量および光学純度分析（ＨＰＬＣ）
・カラム：スミパックスＯＤＳ Ｌ−０３−４６１５（住化分析センター製）
カラム温度：３５℃
流速：１ｍｌ／分
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
溶出液Ａ：２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ３．７）
溶出液Ｂ：アセトニトリル
溶出条件：分析化合物により溶出液中のＢの割合を１０〜６０％に変更する
【００７６】
実施例１（本蛋白質の精製）
（１）グリセロール０．２％（ｗ／ｖ）、ピルビン酸ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン０．２％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．４５％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）の組成の滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Mycobacterium aurum ＳＣ−Ｓ４２３株の培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら７日間培養した。このようにして得られた培養液４Ｌから遠心分離(１０、０００×Ｇ、１０分間)によって菌体を集め、得られた湿菌体を１００ｍＬの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄することにより、１８ｇの湿菌体を得た。
【００７７】
（２）該湿菌体１６ｇを、２０μＭ−ピリドキサール−５−リン酸（以下、ＰＬＰと記す。）を含む２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）６０ｍｌに懸濁した。これを、超音波破砕機（SONIFIER (Branson Sonic Power社登録商標)）にて２０分間破砕処理し、菌体破砕液を得た。該菌体破砕液を１３、０００×ｇで１５分間遠心分離した後、メンブレンフィルター(０．４５μ)にてろ過し、ろ液を回収してこれを無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を Q Sepharose FFカラム（２６ｍｍφ×１０ｃｍ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に導入し、２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）中で塩化ナトリウム直線濃度勾配（濃度勾配０．０１Ｍ／ｍｉｎ 、濃度範囲０Ｍ〜０．６Ｍ 、流速８ｍｌ／ｍｉｎ）により溶出させる陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウム濃度０．３５Ｍから０．４５Ｍにて溶出された画分８０ｍｌを回収した。この画分のうちの６３ｍｌに終濃度０．８Ｍになるように硫安を添加した後、これをPhenyl-Sepharose HPカラム（１６ｍｍφ×１０ｃｍ、アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に導入し、２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）中で硫酸アンモニウム直線濃度勾配（濃度勾配０．００８Ｍ／ｍｉｎ 、濃度範囲０．８Ｍ〜０Ｍ 、流速３ｍｌ／ｍｉｎ ）により溶出させる疎水クロマトグラフィーを行った。硫酸アンモニウム濃度０．４Ｍから０．３５Ｍにて溶出された画分２４ｍｌを回収し、これを酵素液とした。
【００７８】
（３）（２）で得られた酵素液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル：PhastGel Gradient 10-15、バッファーストリップ：PhastGel SDS buffer strip、システム：Phast System（いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製））で解析したところ、ほぼ単一のバンドが検出された。
また、当該酵素液を、ゲルろ過カラムＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（６００ｍｍ×７．５ｍｍＩＤ、東ソー社製）に導入し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて溶出したところ、分子量約３１０kDaに相当する位置に光学活性アミノ化合物生成活性が溶出された。
【００７９】
実施例２
実施例１で得られた酵素液２００μｌを、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で２００μｌに希釈し、これを、１０μｍｏｌのアセトフェノン、１００μｍｏｌのラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミン、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液８００μｌに添加し、４０℃にて、７１時間保温した。保温後、反応液中の光学活性アミノ化合物の定量分析を行った。その結果、１−フェニルエチルアミン収率は１９．９％であり、その光学異性体の比率はＲ−体が１００％であった。
【００８０】
実施例３
実施例１で得られた酵素液２００μｌを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で２００μｌに希釈し、これを、１０μｍｏｌのアセトフェノン、１００μｍｏｌのＤ−アラニン、０．０２μｍｏｌのピリドキサール−５−リン酸（ＰＬＰ）を含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）水溶液８００μｌに添加して４０℃にて、３時間保温した。次いで、該反応液の一部を取り、アミノ化合物の定量分析を行った。その結果、１−フェニルエチルアミンの収率は２．６％であり、その光学異性体の比率はＲ−体が１００％であった。
【００８１】
実施例４
表１に示したラセミ体のアミノ化合物５μｍｏｌ、ピルビン酸ナトリウム１０μｍｏｌ、ＰＬＰ０．０１μｍｏｌを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）３６０μｌに、ラセミ体のアミノ化合物として１−フェニルエチルアミンを用いる場合には実施例１で得られた酵素液１４０μｌを添加し、１−（３，４−ジクロロフェニル）−エチルアミン又は１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンを用いる場合には実施例１で得られた酵素液を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）を用いて２倍に希釈したもの１４０μｌを添加して、４０℃で１時間反応させた。反応液中に残存したアミノ化合物の光学異性体の比率を調べた。結果を表１に示す。
【００８２】
【表１】
0004496593.tif 000023
【００８３】
実施例５
（１）  グリセロール０．２％（ｗ／ｖ）、ピルビン酸ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン０．２％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．４５％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）の組成の滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Mycobacterium aurum ＳＣ−Ｓ４２３株培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら７日間培養した。
【００８４】
（２）  この培養液から遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め湿菌体を得た。
【００８５】
（３）  得られた湿菌体を２ｍＬの１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．０）に懸濁した。０．２％（ｖ／ｖ）ラセミ体の１−フェニルエチルアミン水溶液（ｐＨ９．０）１２６０μＬに対し、２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液２００μＬ、１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．０）４４０μＬを添加し、さらに上記菌体懸濁液を１００μＬ添加し、３０℃、２１．５時間インキュベーションした。反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加、充分な攪拌の後、遠心分離により菌体を除去した上清液をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、５４％の１−フェニルエチルアミンが消失していた。また、残った反応液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１２に調整した後、ジエチルエーテルを用いて残存した１−フェニルエチルアミンを抽出した。抽出液中の１−フェニルエチルアミンの光学純度をＨＰＬＣを用いて測定したところ、（Ｒ）体／（Ｓ）体の比は０／１００であった。
【００８６】
実施例６
（１）  実施例５（１）と同じ方法により５００ｍＬ容坂口フラスコ１０本にて培養して得られた培養液１Ｌから遠心分離(１０、０００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、得られた湿菌体を５０ｍＬの蒸留水に懸濁した。
【００８７】
（２）  ２００μＬのラセミ体の１−フェニルエチルアミンと９００μＬの２Ｎ硫酸水溶液を蒸留水１００ｍｌに溶解させたラセミ体の１−フェニルエチルアミン水溶液６３０μＬに２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液１００μＬを添加し、そこへ種々のｐＨに調整した１Ｍのバッファー（ｐＨ５〜６はクエン酸バッファー、ｐＨ６〜８はリン酸バッファー、ｐＨ８〜９はトリス塩酸バッファー、ｐＨ９〜１０はグリシンバッファー、ｐＨ１１は炭酸バッファーを使用）１００μｌと蒸留水７０μＬを加えて、さらに上記菌体懸濁液を１００μＬ添加し、反応を開始した。３０℃、１時間インキュベーションしたのち、反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加し、充分に攪拌した後、遠心分離により菌体を除去し、上清液を分取してガスクロマトグラフィーにて分析した。アミンの消失速度をｐＨ６（クエン酸バッファー）を１００とした相対値で比較した。結果を表２に示す。
【００８８】
【表２】
0004496593.tif 000024
【００８９】
実施例７
２００μＬのラセミ体の１−フェニルエチルアミンと９００μＬの２Ｎ硫酸水溶液を蒸留水１００ｍｌに溶解させたラセミ体の１−フェニルエチルアミン水溶液６３０μＬに２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液１００μＬを添加し、そこへ１ＭのｐＨ９に調整したグリシンバッファー１００μｌと蒸留水７０μＬとを加えて、さらに実施例６（１）と同様にして得られた菌体懸濁液を１００μＬ添加し、反応を開始した。２０℃〜６０℃の各温度にて、１時間インキュベーションした後、反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加した。この混合物を充分に攪拌した後、遠心分離により菌体を除去し、上清液を分取してガスクロマトグラフィーにて定量分析した。アミノ化合物の消失速度を５０℃を１００とした相対値で比較した。結果を表３に示す。
【００９０】
【表３】
0004496593.tif 000025
【００９１】
実施例８
０．０２％（ｖ／ｖ）ラセミ体の１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミン水溶液（ｐＨ９．０）１３７０μＬに対し、２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液２００μＬ、１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．０）２３０μＬを添加し、さらに実施例６（１）で得られた菌体懸濁液のうち２００μＬを添加し、３０℃、１１０時間インキュベーションした。反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加し、充分に攪拌した後、遠心分離により菌体を除去し、上清液を分取してガスクロマトグラフィーにて定量分析した。その結果４６％の１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミンが消失していた。また、残った反応液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１２に調整した後、ジエチルエーテルを用いて残存した１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミンを抽出した。抽出液中の１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミンの光学純度をＨＰＬＣを用いて測定したところ、（Ｒ）体／（Ｓ）体の比は２０／８０であった。
【００９２】
実施例９
実施例１で得られた酵素液２ｍｌを、４回に分けて逆相カラムを用いたＨＰＬＣに供した。該逆相ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
[逆相ＨＰＬＣ条件]
カラム：Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＰ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ、粒径５μｍ
（YMC（株）製）
カラム温度：室温
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水
溶出液Ｂ：０．０８％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
溶出条件：溶出液Ａで平衡化させたカラムにサンプルをアプライし、以後、４０分間かけて溶出液Ｂの割合を０％から８０％に上げながら、溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合液で溶出させる。
【００９３】
溶出液Ｂの割合が６０％付近の溶出液で溶出した画分を分取した。得られた画分約３ｍｌ（約８００μｌ×４回分）を凍結乾燥した後、その一部の凍結乾燥サンプルを気相プロテインシークエンサー４７０Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）に供することにより、本蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列を調べた。その結果、当該蛋白質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有することが判った。
【００９４】
また、残りの凍結乾燥サンプルを蒸留水に溶解した後、これに１ｍｇ／ｍｌトリプシン溶液を２μｌを加え、３７℃で２４時間保温した。保温後の溶液を逆相ＨＰＬＣに供しトリプシン消化物を分離精製した。逆相ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
【００９５】
[逆相ＨＰＬＣ条件]
カラム：ＯＤＳ−Ａ２１１、２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ、粒径５μｍ
（住化分析センター 製）
カラム温度：室温
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／水
溶出液Ｂ：０．０８％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
溶出条件：溶出液Ａが９５％、溶出液Ｂが５％の割合で混合された溶出液で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、以後、６０分間かけて溶出液Ｂの割合を６５％まで上げながら、溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合液で溶出させる。
【００９６】
得られた各トリプシン消化物について前記と同様の方法によりアミノ酸配列を調べた。その結果、当該消化物は配列番号４で示されるアミノ酸配列及び配列番号５で示されるアミノ酸配列を有することが分かった。
【００９７】
実施例１０
（１）Mycobacterium aurum SC-S4-23株の染色体ＤＮＡの調製
グルコース０．５％（ｗ／ｖ）、ペプトン１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１．２５％（ｗ／ｖ）、マルトエキス１．０％（ｗ／ｖ）および塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）の組成の滅菌培地（ｐＨ７．０）に、Mycobacterium aurum SC-S4-23株を植菌し、６４時間培養した後、得られた培養液１０００ｍｌから遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、Ｄ−シクロセリン１００μｇ／ｍｌ、グリシン１．４（ｗ／ｖ）％、ＥＤＴＡ６０ｍＭ、リゾチーム２００μｇ／ｍｌの組成の滅菌培地９００ｍｌに再懸濁し、３０℃、２１時間インキュベートした。
該懸濁液９００ｍｌを遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体を、１０ｍｌの緩衝液（ｐＨ8.０、トリス５０ｍＭ、ＥＤＴＡ５０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭを含む）に再懸濁した。これに最終濃度が０．5％となるようＳＤＳを加え、さらに最終濃度が２００μｇ／ｍｌとなるようＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ベーリンガーマンハイム社製）を加え、５５℃にて１８時間インキュベートした。
インキュベートした懸濁液からフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール法によりＤＮＡを抽出した後、抽出画分に−２０℃に冷却したエタノールを添加し、析出してくるＤＮＡをガラス棒にて巻き取った。このＤＮＡを風乾した後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．0）に溶解させ、これにＲＮＡａｓｅを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃、１時間保温した。これを染色体ＤＮＡ試料とした。
【００９８】
（２）プライマー合成
配列番号４で示されるアミノ酸配列に基づいて、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物（以下、プライマーＧ２４−１と記す。）を合成した。また、配列番号５で示されるアミノ酸配列に基づきいて、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物（以下、プライマーＲＧ３２−１と記す。）を合成した。尚、オリゴヌクレオチドの合成には、ＤＮＡ自動合成装置モデル380A（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００９９】
（３）本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡのＰＣＲによる増幅とクローニングＩ
（２）で合成されたプライマーＧ２４−１およびプライマーＲＧ３２−１を用い、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの条件を以下に示す。反応液の調製には、CLONTECH社製のAdvantage  cDNA  PCR  Kitを使用した。
【０１００】
[反応液組成]
染色体ＤＮＡ試料（1ng／μｌ）            １μｌ
プライマー（各10μＭ）             各０．５μｌ×２種
×50 dNTPs ｍｉｘ（各１０ｍＭ ）      ０．５μｌ
×10 cDNA PCR Reaction Buffer        ２．５μｌ
×50 Advantage cDNA Polymerase Mix   ０．５μｌ
超純水                             １９．５μｌ
[反応温度条件]
１）  ９４℃  １分間
２）  ９４℃  ３０秒間
３）  ６８℃  ３分間
４）  ９４℃  ２０秒間
５）  ６８℃  ３分間
６）  ６８℃  ３分間
ただし、４）から５）を１サイクルとしてこれを３４サイクル繰り返す。
【０１０１】
反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して生成物を調べた結果、約８００ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。該ＤＮＡを、TA cloning kit（Invitrogen社製）を用いて、プラスミドベクターｐCR2.1の「PCR  Product挿入サイト」にライゲーションし、ライゲーションしたＤＮＡをE．coli JM109株に導入し(東洋紡製compitent high JM109を使用)、形質転換体を取得した。
次いで、得られた形質転換体の保有するプラスミドのＤＮＡを調製し、Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kitと自動塩基配列解析装置373A（社）を用いてその塩基配列を決定した。その結果、このプラスミドには、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号２３１〜９６０で表わされる塩基配列（７３０ｂｐ）を有するＤＮＡが含まれることが判明した。
【０１０２】
（４）本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡのＰＣＲによる増幅とクローニングＩＩ
（３）で得られた７３０ｂｐの塩基配列をもとにして、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
（１）に記載の方法にて調製した染色体ＤＮＡを、制限酵素Sau3A1で部分分解し、これをプラスミドベクターpUC118のマルチクローニングサイトにライゲーションした。次いで、ライゲーションしたＤＮＡを鋳型とし、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ＲＶプライマー（宝酒造社製）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件を以下に示す。反応液の調製にはCLONTECH社製のAdvantage cDNA PCR Kitを使用した。
[反応液組成]
鋳型ＤＮＡ                              ５μｌ
プライマー （各１０μＭ）             各１μｌ×２種
×50 dNTPs ｍｉｘ（各１０ｍＭ ）         １μｌ
×10 cDNA PCR Reaction Buffer           ５μｌ
×50 Advantage cDNA Polymerase Mix      １μｌ
超純水                                ３６μｌ
［反応条件］
１）94℃（１分）
２）94℃（０．5分）
３）68℃（3分）
４）68℃（3分）
ただし、２）から３）を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返す。
反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して生成物を調べた結果、約１ｋｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。該ＤＮＡを、TA cloning kit（Invitrogen社製）を用いて、プラスミドベクターｐCR2.1の「PCR  Product挿入サイト」にライゲーションし、ライゲーションしたＤＮＡをE．coli JM109株に導入し(東洋紡製compitent high JM109を使用)、形質転換体を取得した。得られた形質転換体の保有するプラスミドのＤＮＡを調製し、（３）と同様の方法で塩基配列を決定した。その結果、このプラスミドには、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２３０で表わされる塩基配列が含まれることが判明した。
【０１０３】
（５）本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡのＰＣＲによる増幅とクローニングＩＩＩ
（３）で得られた７３０ｂｐの塩基配列をもとにして、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
（１）に記載の方法にて調製した染色体ＤＮＡを、制限酵素EcoRIで分解し、これをEcoRI Cassette（宝酒造株式会社製）とライゲーションした。反応液調製には宝酒造株式会社製のTakara LA PCR in vitro Cloning Kitを使用した。条件を以下に示す。
[反応液組成]
制限酵素処理ＤＮＡ                 ５μｌ
EcoRI Cassette                 ２．５μｌ（２０ｎｇ／μｌ）
ligation kit ver2 solnＩ         １５μｌ
ligation kit ver2 solnＩＩ     ７．５μｌ
16℃、30分反応後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、ＴＥバッファー５μｌに溶解した。
得られたＤＮＡの溶解液１μｌに、超純水１３．５μｌを加え、９４℃、１０分間加熱した。これを鋳型とし、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、Cassette Primer C1（宝酒造株式会社製）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件を以下に示す。反応液調製には宝酒造株式会社製のTakara LA PCR in vitro Cloning Kitを使用した。
[反応液組成]
鋳型ＤＮＡ                         １４．5μｌ
プライマー （各１０μＭ）             各１μｌ×２種
dNTPs                                  ８μｌ
×2 GC Buffer                         ２５μｌ
LA Taq                             ０．５μｌ（２．５Ｕ）
［反応条件］
１）94℃（０．5分）
２）55℃（2分）
３）72℃（3分）
【０１０４】
ただし、１）から３）を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返す。
次いで、上記反応後の反応液を１０倍に希釈してその１μｌを鋳型とし、配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、Cassette Primer C2（宝酒造株式会社製）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件を以下に示す。反応液調製には宝酒造株式会社製のTakara LA PCR in vitro Cloning Kitを使用した。
[反応液組成]
鋳型ＤＮＡ                              １μｌ
プライマー （各１０μＭ）             各１μｌ×２種
dNTPs                                  ８μｌ
×2 GC Buffer                         ２５μｌ
LA Taq                             ０．５μｌ（２．５Ｕ）
超純水                           １３．５μｌ
［反応条件］
１）94℃（０．5分）
２）55℃（2分）
３）72℃（3分）
ただし、１）から３）を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返す。
反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して生成物を調べた結果、ＤＮＡの増幅が確認された。該ＤＮＡ断片をゲルから回収し、pT７blue T-vector（Novagen社製）に゛クローニングした。得られたプラスミドのＤＮＡを調製し、（３）と同様の方法で塩基配列を決定した。その結果、このプラスミドには、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９６１〜１０２０で表わされる塩基配列が含まれることが判明した。
本実施例により、Mycobacterium aurum SC-S423株由来の遺伝子は、配列番号２で示される塩基配列（１０２０ｂｐ）を有することが明らかとなった。
【０１０５】
実施例１１
実施例１０で確認された配列番号２で示される塩基配列に基づき、配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、プライマーF-4／NcoIと記す。）および配列番号１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、プライマーR1030/BamHIと記す。）を合成した。
プライマーF-4/NcoIおよびプライマーR1030/BamH1を用い、実施例１０（１）に記載の方法にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの条件を以下に示す。反応液の調製には、ベーリンガー マンハイム社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用した。
【０１０６】
[反応液組成]
ゲノムＤＮＡ原液（０．１μｇ／μｌ）         １．０μｌ
プライマー（各４ｐｍｏｌ／μｌ  ）         各５．０μｌ×２種
ｄＮＴＰｍｉｘ（各２．５ｍＭ）                 ８．０μｌ
×10 Expand HF buffer with 15mM MgCl2       １０．０μｌ
Expand High Fidelity PCR System enzyme mix  ０．７５μｌ
超純水                                     ７１．０μｌ
［反応条件］
１）95℃（2分）
２）96℃（15秒）
３）60℃（15秒）
４）72℃（１分）
５）72℃（10分）
ただし、２）から４）を１サイクルとしてこれを25サイクル繰り返す。
【０１０７】
反応後のＤＮＡをNcoIおよびBamHIで切断した後、Qiagen purple spin column（キアゲン社製）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを、プラスミドベクターpTrc99a（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）のtrcプロモーター下流のNcoI、BamHIサイトにライゲーションし、ライゲーションしたＤＮＡをE．coli JM109株に導入し形質転換体を取得した。得られた形質転換体の有するプラスミドをptrc9と命名した。次いで、該プラスミドptrc9の塩基配列を、ABI Prism sequencung kit（パーキンエルマー社製）を用いて前述と同様の方法により決定した。その結果、ptrc9には配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０２０で表わされる塩基配列のうち、塩基番号４のａ（アデニン）がｇ（グアニン）に置換された塩基配列（１０２０ｂｐ）が含まれていることが判明した。
【０１０８】
実施例１２
アンピシリン（50μｇ/ｍｌ）とＩＰＴＧ（1ｍＭ）とを含む滅菌された５０ｍｌのＬＢ培地に、実施例１１にて調製した形質転換体 E.coli JM109/ptrc9を接種し、30℃にて一夜、振とう培養した後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を470μlの100ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.0）に懸濁した。
前記菌体懸濁液に、１０μｍｏｌのアセトフェノン、４００μｍｏｌのラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミン、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液５３０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて４０℃、６時間保温した。保温後、反応液中の１−フェニルエチルアミンの定量分析を行った。その結果、反応液中には０．４５ｍＭの１−フェニルエチルアミンが検出され、その光学異性体の比率はＲ体１００％であった。
【０１０９】
実施例１３
アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）とＩＰＴＧ（1ｍＭ）とを含む滅菌された５ｍｌのＬＢ培地に、実施例１１にて調製した形質転換体 E.coli JM109/ptrc9を接種し、30℃にて一夜、振とう培養した後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を280μlの100ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.0）に懸濁した。
得られた菌体懸濁液に、１０μｍｏｌのラセミ体の１−フェニルエチルアミン、２０μｍｏｌのピルビン酸ナトリウム、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液７２０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて４０℃、６０分保温した。保温後、反応液中の１−フェニルエチルアミンの定量分析を行った。その結果、１−フェニルエチルアミンの回収率は５０％であり、その光学純度はＳ体 99.5％e.e.であった。
【０１１０】
実施例１４
実施例１３と同様の方法で調製した菌体懸濁液２８０μｌに、１０μｍｏｌのＲ−１−フェニルエチルアミン、２０μｍｏｌのピルビン酸ナトリウム、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液７２０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて４０℃、７分保温した。保温後、反応液中の光学活性アミノ化合物の定量分析を行ったところ、アラニンが５．９ｍＭ生成しており、その光学純度はＤ体が７３.８％e.e.であった。
【０１１１】
実施例１５
アンピシリン（50μｇ/ｍｌ）とＩＰＴＧ（1ｍＭ）とを含む滅菌された３０ｍｌのＬＢ培地に、実施例１１にて調製した形質転換体 E.coli JM109/ptrc9を接種し、30℃にて一夜振とう培養した後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を２００μlの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.0）に懸濁した。
上記菌体懸濁液に、３０μｍｏｌのＲ−１−フェニルエチルアミン、３０μｍｏｌのβ−ヒドロキシピルビン酸リチウム、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液８２０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて振とうしながら４０℃、６０分保温した。保温後、反応液中の光学活性アミノ化合物の定量分析を行ったところ、セリンが２４．５ｍＭ生成しており（転換率８２％）、その光学純度はＤ体９９．４％e.e.であった。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明によれば、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力を有する新規な蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子等が提供可能となる。
【０１１３】
[配列表フリーテキスト]
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【０１１４】
【配列表】
0004496593.tif 000026
0004496593.tif 000027
0004496593.tif 000028
0004496593.tif 000029
0004496593.tif 000030
0004496593.tif 000031
0004496593.tif 000032
0004496593.tif 000033
0004496593.tif 000034
0004496593.tif 000035
0004496593.tif 000036