(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準クロックを基にパルス励起光を一定周期で試料上に集光しながら、試料に対してパルス励起光を相対的に位置操作して各操作位置における蛍光信号を検出し、検出した蛍光信号を基に蛍光相関関数を求めることにより蛍光相関分析を行う蛍光相関法であって、検出した信号データのうち、前記パルス励起光と同じ周期を有するとともに該周期のうち蛍光信号パルスの時間幅に相当する時間帯は第１のレベルとなりそれ以外の時間帯は第２のレベルとなるゲートパルスにしたがい、ゲートパルスが第１のレベルの時間帯の信号データは有効データとし、第２のレベルの時間帯の信号データは無効データとして蛍光相関関数の演算から除去して蛍光相関関数を求めることを特徴とする蛍光相関法。
【請求項２】
前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる励起光波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ２のイレース光とを用い、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせ、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域が一部分抑制された状態となるように、ポンプ光とイレース光を試料上に集光させることを特徴とする請求項１の蛍光相関法。
【請求項３】
前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ２のイレース光とを用い、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせて、ポンプ光およびイレース光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびイレース光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出することを特徴とする請求項１の蛍光相関法。
【請求項４】
前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を一重項状態の第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ２のプローブ光とを用い、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせて、ポンプ光およびプローブ光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出することを特徴とする請求項１の蛍光相関法。
【請求項５】
前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態からそれよりも低エネルギーである三重項準位へ遷移した試料分子をその三重項準位よりも高い励起三重項準位へ励起させる波長λ３のプローブ光とを用い、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせて、ポンプ光およびプローブ光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出することを特徴とする請求項１の蛍光相関法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、蛍光相関法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、一分子レベルでの蛍光分析を高感度で行うことのできる蛍光相関法が知られている。この蛍光相関法は、ブラウン運動などの粒子の拡散運動に関する解析に古くから用いられてきた方法である。たとえば、希薄な蛍光分子の溶液に、細いレーザー励起光ビームを当てて、蛍光強度を長時間測定することを考える。測定領域に入っている蛍光分子数をＮとすると、蛍光強度はＮに比例する。このため、ゆらぎの大きさをＳ／Ｎで表現すると（１／Ｎ）1/2となる。
【０００３】
蛍光相関法は、このように蛍光の小さなゆらぎの大きさと、後述する時間相関を測定する方法である。蛍光相関関数が１／２に減少する時間、すなわち相関時間τ0は、次式で表される。
【０００４】
【数１】
0004408523.tif 000002
【０００５】
数１において、Ｄは蛍光分子の並進拡散係数であり、Ｗはレーザービームの動径方向の強度分布関数がガウス分布であるときのビーム半径である。物理的には、このτ0は蛍光分子が拡散によってレーザービームを横切る時間に相当する。
【０００６】
蛍光のゆらぎを測定する際、光電子増倍管の出力電流ｆ（ｔ）を測定するのであるが、レーザー光が極端に大きくない場合には、蛍光量とｆ（ｔ）は比例する。実は、蛍光相関関数はこのｆ（ｔ）について時間に関する相関関数を求めることに他ならない。この相関関数をＧ（ｘ）と書けば、次式で与えられる。
【０００７】
【数２】
0004408523.tif 000003
【０００８】
もし、レーザー強度がガウス分布に近いときは、
【０００９】
【数３】
0004408523.tif 000004
【００１０】
と簡略に表現できる。
【００１１】
また、蛍光相関法は、上述したように、蛍光性分子の並進拡散係数（数１におけるＤ）が得られる物理量を測定するものであるが、基本的には蛍光のゆらぎを与える熱力学量であれば、どんな量でも同じ原理で測定できる。
【００１２】
たとえば、蛍光分子の流動によってレーザービームを横切れば、蛍光のゆらぎが観測される。また、化学反応などで蛍光性分子が他の分子と結合することで分子の速度をゆらぎとして観測できる。すなわち、化学反応の進行をリアルタイムで知ることができるのである。また、偏光解析をすることで分子の回転運動をも測定できる。これは自明であるがＧ（τ）の強度から、観察領域に存在する分子数も直接測定できる。具体的には、たとえば図１に例示したように、期待するゆらぎ現象が完結するような特定の計測時間内のゆらぎ関数ｆ（ｔ）を測定し、その測定したｆ（ｔ）から上記数２を用いて相関関数を求めればよい。なお、一般には、励起光源としては、連続発振のアルゴンレーザーやクリプトンレーザーを用いて色素分子の蛍光相関分析を行うのが主流である。
【００１３】
図２は、蛍光相関法を用いて蛍光相関分析を行うシステムの代表的な一例を示したものである。この図２に例示したシステムでは、アルゴンレーザー等の連続発振レーザー（２０１）を励起光源として用い、そのレーザービームを蛍光色素を含有した観察試料溶液（２０２）にレンズ（２０３）によって集光照射する。蛍光は、レンズ（２０３）でコリメートされた後、ビームスプリットミラー（２０４）で折り返され、再びレンズ（２０５）で集光される。集光蛍光はピンホール（２０６）を通過して、光電子増倍管やＣＣＤなどの検出器（２０７）で検出される。検出された蛍光は、電流として出力され、プリアンプ（２０８）で増幅さてた後、アナログ・デジタル変換器（２０９）によってデジタルデータに変換される。最後に、このデジタル蛍光信号は時系列データとしてコンピュータ（２１０）のメモリに取り込まれる。コンピュータ（２１０）内では、上記数２に従って相関関数Ｇ（τ）が計算される。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のとおりの従来の蛍光相関法には、実用上以下のような問題点がある。
【００１５】
すなわち、従来の蛍光相関法は、前記数２からもわかるように、計測時間内では時間を関数として連続的に変化することを前提にしている。これに対し、励起光源として高繰り返しのパルスレーザーを用いた計測システムにおいては、たとえば図３に例示したように、励起光源の発光が間欠的になり、それに応じて蛍光信号も間欠的なパルス波形として観測されるため、従来の蛍光相関法を利用できないのである。
【００１６】
より具体的には、高繰り返しのパルスレーザーを励起光源とした場合、たとえば図３に例示したように、励起パルスが存在せず、且つ蛍光信号も存在しない時間帯ｔｏｆｆが存在する。この時間帯では、単なる検出器の雑音や、外部の迷光といった蛍光分子のゆらぎと全く関係のない信号成分が観測される。このとき数２により蛍光相関をとれば、蛍光現象と全く関係のない信号成分をも含んで積分をしてしまうことになる。極端な場合では、蛍光発光の時間帯ｔｏｎがｔｏｆｆより小さいと、蛍光分子のゆらぎを示す蛍光相関関数を測定しているのではなく、むしろ、光電子像倍管をはじめとする検出器の暗電流のゆらぎを示す蛍光相関関数を計測してしまうことになる。これでは、従来の蛍光相関法はパルスレーザーを励起光源として用いたシステムには適用不可能である。
【００１７】
また、この出願の発明の発明者は、高性能かつ多機能な顕微鏡の一つとして、二重共鳴吸収過程あるいはそれと過渡ラマン散乱過程を用いることにより超解像性を実現した顕微鏡（以下、二重共鳴吸収顕微鏡と呼ぶ）をすでに提案しているが、この二重共鳴吸収顕微鏡においても、励起光源としてパルスレーザーを用いることが多く、従来の蛍光相関法は利用できない。
【００１８】
まず、二重共鳴吸収過程を用いた二重共鳴吸収顕微鏡（特願平６−３２９１６５号、特願平８−３０２２３２号、特願平９−２５５４４４、特願平１０−９７９２４を参照）は、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ1のポンプ光の光源と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ2のイレース光の光源と、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段とを備えており、重ね手段を介してポンプ光およびイレース光を試料に照射することにより、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域を一部分抑制することをその基本構成としている。
【００１９】
他方、二重共鳴吸収顕微鏡とともに過渡ラマン散乱過程をも利用した二重共鳴吸収顕微鏡（特願２０００−８２９３０を参照）は、一重項過渡ラマン散乱過程を利用する場合には、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ1のポンプ光の光源と、第一電子励起状態の試料分子を一重項状態の第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ2のプローブ光の光源と、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせる重ね手段とを有しており、重ね手段を介してポンプ光およびプローブ光を試料に照射し、試料内のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光を検出することをその基本構成としており、また、三重項過渡ラマン散乱過程を利用する場合には、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ1のポンプ光の光源と、第一電子励起状態からそれよりも低エネルギーである三重項準位へ遷移した試料分子をその三重項準位よりも高い励起三重項準位へ励起させる波長λ3のプローブ光の光源と、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせる重ね手段とを有しており、重ね手段を介してポンプ光およびプローブ光を試料に照射し、試料内のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光を検出することをその基本構成としている。
【００２０】
これらの二重共鳴吸収顕微鏡では、たとえば図４に例示したように、ポンプ光およびイレース光（あるいは過渡ラマン散乱過程を併用する場合にはプローブ光）を微妙に調整されたタイミングで試料に照射する必要があり、且つ蛍光を抑制するイレース光は非常に強い強度を有することが必要とされる。このため、検出器にいたるまでの光路に然るべきフィルターを設けるようにしても、完全にはポンプ光およびイレース光、特に強度の強いイレース光、の迷光が検出器に入る恐れがある。仮に、観察領域に蛍光分子が１つしかない場合には蛍光信号の強度が迷光信号に対して相対的に弱くなり、蛍光相関を測定しても、所望しない「光源のゆらぎ」を測定してしまう結果となる。
【００２１】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、パルス光源を用いた場合においても蛍光現象のみによる蛍光相関関数を的確に計測することのできる、新しい蛍光相関法を提供することを課題としている。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、基準クロックを基にパルス励起光を一定周期で試料上に集光しながら、試料に対してパルス励起光を相対的に位置操作して各操作位置における蛍光信号を検出し、検出した蛍光信号を基に蛍光相関関数を求めることにより蛍光相関分析を行う蛍光相関法であって、検出した信号データのうち、前記パルス励起光と同じ周期を有するとともに該周期のうち蛍光信号パルスの時間幅に相当する時間帯は第１のレベルとなりそれ以外の時間帯は第２のレベルとなるゲートパルスにしたがい、ゲートパルスが第１のレベルの時間帯の信号データは有効データとし、第２のレベルの時間帯の信号データは無効データとして蛍光相関関数の演算から除去して蛍光相関関数を求めることを特徴とする蛍光相関法。
【００２３】
また、この出願の発明は、上記蛍光相関方法において、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる励起光波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ２のイレース光とを用い、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせ、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域が一部分抑制された状態となるように、ポンプ光とイレース光を試料上に集光させること（請求項２）や、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ２のイレース光とを用い、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせて、ポンプ光およびイレース光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびイレース光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出すること（請求項３）や、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態の試料分子を一重項状態の第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ２のプローブ光とを用い、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせて、ポンプ光およびプローブ光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出すること（請求項４）や、前記パルス励起光として、試料分子を基底状態から一重項状態の第一電子励起状態へ励起させる波長λ１のポンプ光と、第一電子励起状態からそれよりも低エネルギーである三重項準位へ遷移した試料分子をその三重項準位よりも高い励起三重項準位へ励起させる波長λ３のプローブ光とを用い、ポンプ光およびプローブ光の照射領域を一部分もしくは全部分重ね合わせて、ポンプ光およびプローブ光を試料上に集光させ、試料のポンプ光およびプローブ光が重なり合った領域から発生する過渡ラマン散乱光からなる蛍光信号を検出すること（請求項５）をその態様として提供する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
ここでは、この発明の蛍光相関法の原理について説明する。
【００２５】
図５は、この発明の蛍光相関法について説明する図である。この図５において、Ｐは、周期ｔcycle、パルス幅tlaserで発振しているパルスレーザーなどのパルス光源からのパルス励起光（図中ポンプ光と表示）のパルス列であり、パルス状で間欠的に発光している様子を表している。Ｓは、蛍光信号列であり、パルス光照射に応じて、蛍光寿命ｔgで蛍光分子が発光している様子を表している。Ｇは、ゲート信号のパルス列であり、周期ｔcycle、パルス幅tgの負極性の信号である。このゲート信号パルス列は、完全に蛍光発光の周期と同期しており、位相ずれを持たず、しかも蛍光寿命の幅と同じパルス幅を有している。
【００２６】
図５に例示したように、蛍光信号は無いが、パルスレーザー制御用のゲート信号のパルスが存在する時間帯ｔopenがある。この時間帯ｔopenは、全く蛍光信号が存在しないので、計測には全く無関係である。もし、計測時間をＴとして、このような状況で蛍光相関関数を従来の蛍光相関法における前記数２を用いて求めると、ｔopenという無意味な積分区間を含んで計算してしまい、検出器や光源に起因する不要なゆらぎも積分することとなってしまう。
【００２７】
そこで、この発明の蛍光相関法では、周期的に現れるtopenという時間帯を積分区間から除くことことにより、信号の質を向上する。より具体的には、この発明の蛍光相関法では、次式で与えられる相関関数を用いる。
【００２８】
【数４】
0004408523.tif 000005
【００２９】
ここで、τは、ｔcycleの整数倍となっており、ある整数iとして、
【００３０】
【数５】
0004408523.tif 000006
【００３１】
で与えられる。
【００３２】
図６は、この関係を例示したものである。すなわち、この図６に例示したように、量子的にtcycleの整数ｉ倍だけ完全に位相をずらして、蛍光信号ｓ（ｊ）とｓ（ｊ＋１）のパルスの積の積分を行い、そして各ｎについて測定時間に相当するj全ての和をとれば数４の右辺の分子を計算したことになる。分母ついては、ｓ（ｊ）とｓ（ｊ＋１）の積について同じ操作を行えば良い。これにより計算された相関関数Ｇ（τ）*は連続的でなく、数５が示すようにtcycle間隔でとびとびの値をとる（図７参照）。なお、その包絡線は数２のＧ（τ）と同じ物理的な意味をもつことは言うまでもない。
【００３３】
したがって、この発明の蛍光相関法によれば、検出器や光源に起因する不要なゆらぎを含むことなく、純粋に蛍光現象に起因したゆらぎのみを検出することができ、高感度・高精度な蛍光分析を実現できるようになる。
【００３４】
また、たとえば前述の二重共鳴吸収顕微鏡においてこの発明の蛍光相関法を用いる場合には、パルス光源と検出器に信号を取り込むタイミングを制御するゲートとを同期させ、間欠的に来る蛍光信号を時系列に測定したｆ（ｔ）より、ハードウェアーまたはソフトウェアー的手段を用いて数４を基に算出すればよい。
【００３５】
この出願の発明は、以上のとおりの特徴を有するものであるが、以下に、添付した図面に沿って実施例を示し、さらに詳しくこの発明の実施の態様について説明する。
【００３６】
【実施例】
［実施例１］
図８は、この発明の蛍光相関法を実現する蛍光相関計測システムの一例を示した概略ブロック図である。
【００３７】
この図８に例示した蛍光相関計測システムの全系は、基本的にコンピュータ（１０１）によって制御される。まず、コンピュータ（１０１）は基準クロックを発生させ、これを基に、パルス光源としてのパルスレーザー（１０２）の発振、試料（１０３）が載置された試料走査ステージ（図示していない）の駆動制御、そして各種データの管理を行う。
【００３８】
より具体的には、系のタイミングは全てコンピュータ（１０１）のクロックに準拠しており、このクロックは分周器（１０４）によってレーザー発振可能な周波数まで分周される。まず、分周されたクロック信号は、ゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）により遅延および波形整形されて、レーザー制御用信号としてのＱスィッチパルスとされ、パルスレーザー（１０２）はこのＱスイッチパルスによって発振制御される。他方、試料（１０３）の試料走査ステージの駆動制御には、パルスレーザー（１０２）のレーザー発振と同期させるために、Ｑスイッチパルスと同期したゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）からのパルス信号が使われる。またさらに、ゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）からは、蛍光相関計測に必要となるＱスイッチパルスと同期したゲート信号であるゲートパルスが、後述するラインセレクター（１０８）に与えられる。
【００３９】
さて、Ｑスイッチパルスに従って発振されたパルスレーザー（１０２）からのパルスレーザー光は種々の光学系を介して試料（１０３）に集光照射され、パルスレーザー光のショット毎に試料（１０３）から蛍光が発生する。
【００４０】
このショット毎の蛍光は、検出器（１０６）で検出される。検出器（１０６）としては、たとえば、回折光子などの分光器およびＩＣＣＤカメラを基本構成としたものを用いることができる。ＩＣＣＤカメラは、マイクロチャンネルプレートの前側および後側それぞれに光電子変換器面を備えたことを基本構成としており、入射した光を前側の光電子変換面によって電子に変換し、マイクロチャンネルプレートでその電子を増幅した後、増幅電子を再度後側の光電変換面で光に変換する装置である。回折格子などの分光器はこのＩＣＣＤカメラの入力側前方に配置されている。この場合、ショット毎の蛍光は、検出器（１０６）において、分光器で分光された後、ＩＣＣＤカメラにより蛍光スペクトルとして検出される。そして、その蛍光波長領域の総光量はＩＣＣＤカメラからアナログ信号として出力され、このアナログ信号はプリアンプ（１０７）で増幅された後、ラインセレクター（１０８）へ入力される。
【００４１】
ラインセレクター（１０８）は、独立に入力される２つのアナログ信号に対して、各々のパルスゲート信号の極性に従ってどちらか一方を通過させるものである。本実施例では、ラインセレクター（１０８）には、プリアンプ（１０７）を介したアナログ蛍光信号が入力されるとともに、前述したようにゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）からのゲートパルスも入力される。そして、ラインセレクター（１０８）は、ゲートパルスが負レベルの場合にはプリアンプ（１０７）からの蛍光信号を通過させ、ゲートパルスが正レベルの場合にはグランドレベルすなわちゼロレベルの信号を出力する。パルスレーザー（１０２）は、ゲートパルスの立ち下がりで発振し、そのパルス幅が丁度プリアンプ（１０７）からの出力信号の時間幅をもつので、パルス幅の間である蛍光発光した時間だけ、蛍光信号がラインセレクター（１０８）を通過することとなる。これは、前述の図５に対応するもであり、実効的に蛍光信号のみがラインセレクター（１０８）を通過する。
【００４２】
そして、もともとゲートパルスは、コンピュータ（１０１）のシステムクロックを分周して生成したものであり、ゲートパルスのパルス周波数はシステムクロックの整数分の１になっているので、このシステムクロックの周波数で、ラインセレクター（１０８）の出力信号をサンプリングする。
【００４３】
システムクロックは同時にカウンター（１１１）を駆動し、その出力バイナリー信号はラインメモリ（１１０）のメモリアドレスを与える。このメモリアドレス信号と同期して、Ａ／Ｄ変換器（１０９）によりデジタル化された蛍光信号は、ラインメモリ（１１０）に格納される。このデータ転送操作により、ある特定の観察領域をレーザー照射したときの蛍光相関関数を求めるのに必要な観測時間分の全データが、ラインメモリ（１１０）に格納することになる。
【００４４】
そして、ラインメモリ（１１０）に格納されたデータは、Ｉ／Ｏポート（１１２）を介して、コンピュータ（１０１）の要求するタイミングで、コンピュータ（１０１）内のメモリに転送される。
【００４５】
以上の手順を繰り返しながら、試料走査ステージの移動およびレーザー発光と同期しながら、各画素ごとの蛍光相関関数を計算するためのデータがコンピュータ（１０１）のメモリに転送される。
【００４６】
コンピュータ（１０１）のメモリに記憶された蛍光スペクトルデータは、コンピュータの数値演算処理により、各画素ごとの蛍光相関関数に変換される。
【００４７】
なお、この蛍光相関計測システムは、たとえば、水銀ランプなどの照射で得られる試料（１０３）の蛍光画像を同時にＣＣＤカメラでモニターし、その画像データを随時フレームメモリーに蓄積できる構成を有していてもよく、この場合では、２次元走査画像とは別に、随時、試料（１０３）の蛍光像の全体をモニターしておくことができる。この他、コンピュータ（１０１）は画像表示や画像処理を随時行い、形成された画像データは、ディスプレイ（１１３）やビデオプリンター（１１４）などの出力手段により出力される。
【００４８】
ここで、蛍光信号が如何にしてラインメモリ（１１０）に格納されるかを、図９を用いてさらに説明する。図９は、レーザーショット毎のＳ（ｎ）番目からＳ（ｎ＋１）番目のパルス列の蛍光信号がラインメモリ（１１０）に入力される場合のタイムチャートを示している。なお、図９では、この発明の蛍光相関法を、二重共鳴吸収過程あるいはそれと過渡ラマン散乱過程を利用した二重共鳴吸収顕微鏡に適用する場合を考えて、パルスレーザー（１０２）からのレーザー光を用いてポンプ光およびイレース光（二重共鳴吸収過程と過渡ラマン散乱過程とを併用する場合にはプローブ光）の２波長光を発生させるものとする。二重共鳴吸収顕微鏡については、特願平６−３２９１６５号、特願平８−３０２２３２号、特願平９−２５５４４４、特願平１０−９７９２４、特願２０００−８２９３０を参照されたい。
【００４９】
さて、この図９において、メモリアクセスクロックはコンピュータ（１０１）のシステムクロックに相当し、そのタイミングでラインメモリ（１１０）のアドレスがカウンター（１１１）より出力される。クロック信号は、前述したように分周器（１０４）およびゲート＆ディレイジェネレータ（１０５）を介してゲートパルス（図９中ゲート信号と記載）およびＱスイッチパルスに変換される。ラインセレクター（１０８）を制御するゲートパルスは、蛍光信号パルスの時間幅ｔgだけ負レベルになり、蛍光信号が存在しないtopenの間は正レベルになる。ポンプ光およびイレース光のパルスは、時間幅ｔcycleで周期的に発振する。当然、蛍光信号およびゲートパルスもｔcycleの周期で出力される。ここで、各時間幅には、ｔcycle ＝ｔg＋ｔopenの関係がある。
【００５０】
図９を、別の時間系列の関係から説明する。まず、メモリークロックを分周したＱスイッチパルスによりポンプ光パルスが発振される。続いて、光路分だけ遅延したイレース光が発振される。これらポンプ光・イレース光パルスによって、時間幅ｔgを持った蛍光信号Ｓ（ｎ）がプリアンプ（１０７）から出力される。ゲートパルスもレーザー駆動の周期に、つまりＱスイッチパルスの周期に完全同期をしているが、ポンプ光およびイレース光が発振終了後に、多少遅延してゲートパルスは負レベルになり（図中のｇ（ｎ））、その後ｔg間その状態が持続する。続いて、ゲートパルスは正レベルとなってｔopenの間この状態が続く。ゲートパルスは、蛍光相関を求めるのに十分な時間Ｔに渡って、ｔcycleでこの変化を繰り返す。このような操作により、ラインセレクター（１０８）は、Ｓ（ｎ）が存在するときの信号をＡ／Ｄ変換器（１０９）に送り込み、それ以外の時間帯はゼロレベルのグランド電圧の信号を送り込む。
【００５１】
これにより、検出器（１０６）のゆらぎに起因する信号やレーザー散乱光などは、ラインセレクター（１０８）からは出力されず、Ａ／Ｄ変換器（１０９）には入力されないこととなる。
【００５２】
Ａ／Ｄ変換を行う時のサンプリングのタイミングは、コンピュータ（１０１）が供給するシステムクロックのタイミングであり、そのタイミングでラインメモリ（１１０）の特定の番地にデータが書き込まれる。この時の大前提として、ゲートパルスの周波数は、システムクロックの周波数よりも低く、最低限レーザー１ショットで、蛍光信号Ｓ（ｎ）が１個分のデジタルデータが得られなくてはならない。図９では、ｔcycleの区間を（ｇ＋ｈ）分のデータサンプルリングを行っている。そのうち、ｇ個は有効信号蛍光Ｓ（ｎ）をサンプリングして、ｈ個は実質的に蛍光相関に関係しないゼロレベルの信号をサンプリングする。当然サンプリング周波数は、レーザーの繰り返し周波数の（ｇ＋ｈ）となる。言い換えると、レーザーの駆動パルス、つまりＱスイッチパルスはシステムクロックを１／（ｇ＋ｈ）に分周したものである。図９によれば、カウンター（１１１）で指定されたアドレスに従って、ｎ（ｇ＋ｈ）番地からｎ（ｇ＋ｈ）＋ｇ番地までデジタル化されたＳ（ｎ）のデータが格納され、ｎ（ｇ＋ｈ）＋ｇ＋１番地から（１＋ｎ）（ｇ＋ｈ）までは無効のゼロ信号が存在する。このようにして、ラインメモリ（１１０）内には、1番地から最終番地までＳ（１）からＳ（Ｍ）までの蛍光信号のデータが格納されることとなる。
【００５３】
このようにして、観測期間Ｔの間に計測したＳ（１）からＳ（Ｍ）までの蛍光信号のデータから、１測定点における蛍光相関関数を求めることができる。具体的には、ラインメモリ（１１０）にあるデータを、いったんＩ／Ｏボード（１１２）を介して、コンピュータ（１０１）内のメモリに転送する。その結果として、全体でＭ（ｇ＋ｈ）個のデジタルデータが、コンピュータ（１０１）内のメモリに存在する。仮に、このデータ群にＤ（Ｉ）という配列名を与え、Ｄ（１）からＤ（Ｍ（ｇ＋ｈ））を具体的なデータとして、蛍相関関数Ｇ（τ）*の計算に用いる。この場合、蛍光データはＳ（ｎ）間欠的に存在するので、τも離散的な値をとり、レーザーの繰り返し間隔に相当する、（ｇ＋ｈ）の整数倍の値しか取らない。仮に、その整数の標識をｋと書くと、ｋは１からＭまでの整数をとる。したがって、コンピュータ（１０１）内で数値計算をするときはＧ（ｋ）*という離散的な配列群として与えられる。数4に従い、以下の数6で与えられる積分計算を行えば、観測期間内での蛍光相関関数Ｇ（ｋ）*を各観測ポイントで求めることができる。ここで、数4の積分は、不連続な関数となるので和の形移行する。
【００５４】
【数６】
0004408523.tif 000007
【００５５】
この数６は演算方式で不要な積分時間帯を省いたものである。したがって、原理的にはラインセレクター（１０８）を通さなくても相関関数を計算できることにもなる。また、図９のメモリの格納状態を見ると、ｔopenの区間はラインメモリ（１１０）にはゼロの値が入っているので、数６のように積算区間を考慮した２重和算は必ずしも行わなくてもよく、下記の数７のように簡略化された演算でもよい。
【００５６】
【数７】
0004408523.tif 000008
【００５７】
この数７によれば、和算操作が一回なので、演算処理が簡単であり、演算アルゴリズムやハードウェアーの設計を簡略化できる。
【００５８】
なお、原理的には、蛍光信号のパルス列Ｓ（ｎ）のデータが存在するメモリアドレスを対応させることができれば、図２に例示したシステムでも、上述したこの発明の蛍光相関法を適用することができる。
【００５９】
以上のように、この発明の蛍光相関法によれば、間欠的な蛍光信号間で、全く蛍光信号成分の無い区間のデータ成分を除いて蛍光相関関数を求めるので、精度良く蛍光分子ゆらぎ以外の成分を除去することができる。したがって、蛍光分子ゆらぎのみに起因する蛍光相関関数を測定し、得られた蛍光相関関数を解析することで、試料（１０３）からの蛍光分子の移動速度や、粘度、分子数といった各物理量を高精度で求めることができる。またさらに、コンピュータ（１１０）のメモリ上で２次元再配列することで、多角的に試料（１０３）の２次元画像を形成することもできる。すなわち、この発明の蛍光相関法は、励起光源としてパルス光源を用いた場合においても、蛍光相関計測による優れた蛍光分析を実現できるのである。
【００６０】
［実施例２］
図１０は、二重共鳴吸収顕微鏡の一例を示した概略図である。この図１０に例示した二重共鳴吸収顕微鏡は、特願２０００―８２９３０に開示されている二重共鳴吸収過程および過渡ラマン散乱過程を併用した二重共鳴吸収顕微鏡と同じものである。この場合、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）がポンプ光およびプローブ光の光源、つまりパルス光源であり、前述したと同様に、この発明の蛍光相関法によって、蛍光分子ゆらぎのみに起因する蛍光相関関数を測定し、優れた蛍光分析を実現することができる。
【００６１】
もちろん、二重共鳴吸収過程のみを利用した二重共鳴吸収顕微鏡においても同様な効果を実現することができる。
【００６２】
したがって、この発明の蛍光相関法を、ポンプおよびイレース光もしくはプローブ光の光源としてパルス光源を備えた二重共鳴吸収顕微鏡において用いれば、二重共鳴吸収顕微鏡の特徴である超解像性の実現（たとえば空間分解を数１０ｎｍで画像化）とともに、蛍光相関関数による様々な物理量の分析および２次元マップ化をも可能となるのである。
【００６３】
以下に、図１０の二重共鳴吸収顕微鏡の説明をしておく。
【００６４】
まず、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）の基本波をＫＤＰ結晶（２）で波長変換することで５３２ｎｍ、３５５ｎｍ、２６６ｎｍ等の高次高調波を発振させる。これらの光をさらにオプティカルパラメトリクジェネレーター（５）によって観察対象の試料分子をＳ0→Ｓ1励起可能な波長λ1に変換し、これをポンプ光とする。
【００６５】
また、ハーフミラー（３)により２倍高調波の１部を取り出し、ハーフミラー（４）を介して別のオプティカルパラメトリクジェネレーター（６）へ入射させ、試料分子をＳ1→Ｓ2励起可能な波長λ2またはＴ1→Ｔ2励起な波長λ3に変換し、これを一重項用プローブ光または三重項用プローブ光とする。これらプローブ光は、遅延光学系（７）により、パルスポンプ光と適当な時間差を得るために光学遅延される。時間差は、遅延光学系（７）に搭載されたプリズム（７１）の平行移動で簡単に調節できる。具体的には、照射時間調整手段としての遅延光学系（７）の光路調整による光学遅延によって、波長λ2の一重項用プローブ光は、ポンプ光の照射後、試料分子が一重項状態の第一電子励起状態Ｓ1から三重項準位Ｔ1へ遷移する前に試料面へ到達するように照射され、他方、波長λ3の三重項用プローブ光は、ポンプ光の照射後、試料分子が一重項状態の第一電子励起状態Ｓ1から三重項準位Ｔ1へ遷移した後に試料面へ到達するように照射される。
【００６６】
このように照射時間調整されるプローブ光は、その光路上の偏光子（９）および揺動ミラー(１０)を介してダイクロイックミラー（１１）へ入射され、ポンプ光は、その光路上の偏光子（８）を介してダイクロイックミラー（１１）へ入射される。両光は、ダイクロイックミラー（１１）によって同一光路とされる。偏光状態可変手段としての偏光子（８）および（９）は、ポンプ光およびプローブ光の偏光面を自由に回転できる。
【００６７】
さらに、本実施例では、重ね手段としての振動ミラー（１０）によって、プローブ光の光路をポンプ光に対して調整することで、集光面上で互いの照射領域を一部分重ね合わせることができる。もちろん両光の照射領域の全部分を重ね合わせるようにしてもよいが、平面分解能をより優れたものとするには、一部分のみを重ね合わせ、且つその重合せ領域を狭くする方が望ましい。
【００６８】
このように照射領域および照射時間が調整されるポンプ光およびプローブ光は、リレーレンズ（１２）により成形されて、ハーフミラー（１３）へ入射され、対物レンズ（１４）を通り試料（１５）上へ集光される。試料（１５）は試料走査ステージ（１６）上に設置されている。
【００６９】
ポンプ光の照射後に、一重項用プローブ光が照射された場合には一重項過渡ラマン散乱光が試料（１５）から発生し、三重項用プローブ光が照射された場合には三重項過渡ラマン散乱光が試料（１５）から発生する。
【００７０】
これら過渡ラマン散乱光は、ハーフミラー（１３）を通過し、ハーフミラー（１７）で反射されて、検出光学系に入射される。本実施例における検出光学系は、偏光子（１８）、レンズ（１９）、ピンホール（２０）、レンズ（２１）、透過型回折光子（２２）、およびＩＣＣＤカメラ（２３）で構成されている。この場合、過渡ラマン散乱光は、偏光子（１８）を介してレンズ（１９）によってピンホール（２０）の中央に集光され、さらにレンズ（２１）によって透過型回折格子（２２）を介して光電子変換原理を用いた高感度のＩＣＣＤカメラ(２３)へ入射される。ピンホール（２０）は空間フィルターとして機能し、試料（１５）以外から発する、たとえば光学系からの蛍光等をカットして測定のＳ／Ｎ比をより高めることができる。また、透過型回折光子（２２）はスペクトルメーターとして機能するので、過渡ラマン散乱光の測定はもちろんのこと、ラマンスペクトルやレーザー照射に対する時間応答をも測定できるので、試料（１５）の化学構造や組成の解析が可能となる。さらにまた、偏光子（８）（９）によってポンプ光およびプローブ光の偏光面を相対的に変化させることで、試料（１５）の組成の空間配向情報も得られる。
【００７１】
このように図１０に例示した二重共鳴吸収顕微鏡は、過渡ラマン散乱光の測定によって極めて優れた平面分解能および三次元分解能を有する、高機能分析型の超解像顕微鏡を実現している。そして、これに前述したこの発明の蛍光相関法を用いることで、さらに様々な蛍光分析が可能となるのである。
【００７２】
なお、過渡ラマン散乱過程を利用した二重共鳴吸収顕微鏡は、試料のポンプ光およびイレース光が重なり合った領域からの過渡ラマン散乱光を検出するものであるが、試料のポンプ光およびイレース光が重なり合った領域から検出できる信号は過渡ラマン散乱光に限らず、他にも分子によっては第二電子励起状態より蛍光を発光する場合もある。このように両光の重ね領域からの光応答を検出する二重共鳴吸収顕微鏡においても、この発明の蛍光相関法を用いることができるのは言うまでもない。
【００７３】
もちろん、この発明は以上の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能である。
【００７４】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この出願の発明は、パルス光源を用いた場合においても蛍光現象のみによる蛍光相関関数を的確に計測することのできる、新しい蛍光相関法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の蛍光相関法を説明する図である。
【図２】従来の蛍光相関法を用いて蛍光相関分析を行うシステムの代表的な一例を示した概略図である。
【図３】パルスレーザーを励起光源として用いた計測システムにおけるポンプ光と蛍光信号との時間関係を例示した図である。
【図４】二重共鳴吸収顕微鏡におけるポンプ光・イレース光と蛍光信号との時間関係を例示した図である。
【図５】この発明の蛍光相関法の原理について説明する図である。
【図６】この発明の蛍光相関法の原理について説明する別の図である。
【図７】この発明の蛍光相関法の原理について説明するさらに別の図である。
【図８】この発明の蛍光相関法を実現する蛍光相関計測システムの一例を示したブロック概略図である。
【図９】図８の蛍光相関計測システムにおけるレーザーショット毎のＳ（ｎ）番目からＳ（ｎ＋１）番目のパルス列の蛍光信号がラインメモリ（１１０）に入力される場合のタイムチャートを例示した図である。
【図１０】二重共鳴吸収顕微鏡の一例を示した概略図である。
【符号の説明】
１０１  コンピュータ
１０２  パルスレーザー
１０３  試料
１０４  分周器
１０５  ゲート＆ディレイジェネレータ
１０６  検出器
１０７  プリアンプ
１０８  ラインセレクター
１０９  Ａ／Ｄ変換器
１１０  ラインメモリ
１１１  カウンター
１１２  Ｉ／Ｏボード
１１３  ディスプレイ
１１４  ビデオプリンタ
２０１  連続発振レーザー
２０２  観察試料溶液
２０３  レンズ
２０４  ビームスプリットミラー
２０５  レンズ
２０６  ピンホール
２０７  検出器
２０８  プリアンプ
２０９  アナログ・デジタル変換器
２１０  コンピュータ
１  Ｎｄ：ＹＡＧレーザー
２  ＫＤＰ結晶
３，４  ハーフミラー
５，６  オプティカルパラメトリックジェネレーター
７  遅延光学系
７１  プリズム
８，９  偏光子
１０  揺動ミラー
１１  ダイクロイックミラー
１２  リレーレンズ
１３  ハーフミラー
１４  対物レンズ
１５  試料
１６  試料走査ステージ
１７  反射ミラー
１８  偏光子
１９，２１  レンズ
２０  ピンホール
２２  透過型回折光子
２３  ＩＣＣＤカメラ
【図１】
0004408523.tif 000009
【図２】
0004408523.tif 000010
【図３】
0004408523.tif 000011
【図４】
0004408523.tif 000012
【図５】
0004408523.tif 000013
【図６】
0004408523.tif 000014
【図７】
0004408523.tif 000015
【図８】
0004408523.tif 000016
【図９】
0004408523.tif 000017
【図１０】
0004408523.tif 000018