(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘルペスウイルス変異体であって、以下：
（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活性化変異；ならびに
（ｂ）細胞特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも１コピーの該γ３４．５遺伝子の挿入
を含む、ヘルペスウイルス変異体。
【請求項２】
前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス１型である、請求項１に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項３】
前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス２型である、請求項１に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項４】
ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも１つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項１に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項５】
ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも１つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項２に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項６】
ヘルペスウイルス遺伝子の前記内因性欠失または不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、またはｄＵＴＰａｓｅをコードする遺伝子内にある、請求項５に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項７】
導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子の産物が腫瘍性細胞に対して細胞傷害性である、請求項５に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項８】
前記導入遺伝子が、化学療法剤を活性化または増強し得る産物、サイトカイン遺伝子、癌抑制遺伝子、または以下：ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、および、リボザイムからなる群から選択される殺腫瘍性遺伝子をコードする、請求項７に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項９】
前記導入遺伝子が、本来のγ３４．５欠失においてか、またはヘルペスＵＬ４０遺伝子座における任意の場所に挿入される、請求項８に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項１０】
前記導入遺伝子が、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をコードする、請求項８に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項１１】
前記自殺遺伝子が、哺乳動物シトクロムＰ４５０である、請求項１０に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項１２】
前記哺乳動物シトクロムＰ４５０が、Ｐ４５０  ２Ｂ１、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１１、またはＰ４５０  ３Ａ４である、請求項１１に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項１３】
前記腫瘍特異的プロモーターが、ＤＦ３（ＭＵＣ１）；ＡＦＰ；ＣＥＡ、ＰＳＡ；チロシナーゼ、Ｂ−ｍｙｂ、またはｃ−ｅｒｂＢ２である、請求項２に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項１４】
前記腫瘍特異的プロモーターがＢ−ｍｙｂである、請求項１３に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項１５】
単純ヘルペスウイルス１型変異体であって、以下：
ａ）γ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失変異；
ｂ）ｂ−ｍｙｂプロモーターの転写制御下にある１コピーのγ３４．５遺伝子の挿入物；および、
ｃ）リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子内の内因性欠失、
を含む、単純ヘルペスウイルス１型変異体。
【請求項１６】
前記細胞特異的プロモーターが、内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ｆｌｋ１）プロモーター；膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター；視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子；破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ９プロモーター；骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター；またはノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーターである、請求項２に記載のヘルペスウイルス変異体。
【請求項１７】
ヘルペスウイルス変異体を含む、既知の腫瘍特異的プロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための組成物であって、該ウイルス変異体が、以下：
（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異；および
（ｂ）該腫瘍特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも１コピーの該γ３４．５遺伝子の挿入であって、その結果、該プロモーターが該γ３４．５遺伝子の発現を駆動する、挿入
を含む、組成物。
【請求項１８】
前記ヘルペスウイルス変異体が、ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも１つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ヘルペスウイルス遺伝子の前記さらなる内因性欠失または不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、またはｄＵＴＰａｓｅをコードする遺伝子における欠失または不活性化変異である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ウイルス変異体が、以下：
ａ）γ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失変異；
ｂ）ｂ−ｍｙｂプロモーターの転写制御下にある１コピーのγ３４．５遺伝子の挿入物；および、
ｃ）リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子内の内因性欠失、
を含む、単純ヘルペスウイルス１型変異体である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組成物であって、ここで前記ウイルス変異体が、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をさらに含み、そして該組成物が、該化学療法剤とともに投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２２】
前記自殺遺伝子が、シトクロムＰ４５０をコードする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記シトクロムＰ４５０が、Ｐ４５０  ２Ｂ１、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１１、および、Ｐ４５０  ３Ａ４からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記シトクロムＰ４５０がＰ４５０  ２Ｂ１である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記化学療法剤が、シクロホスファミドまたはイホスファミドである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ヘルペスウイルス変異体における前記腫瘍特異的プロモーターが、ＤＦ３（ＭＵＣ１）；ＡＦＰ；ＣＥＡ、ＰＳＡ；チロシナーゼ、Ｂ−ｍｙｂ、またはｃ−ｅｒｂＢ２である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヘルペスウイルス変異体における前記腫瘍特異的プロモーターがＢ−ｍｙｂである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ヘルペスウイルス変異体が、以下：
ａ）γ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失変異；
ｂ）ｂ−ｍｙｂプロモーターの転写制御下にある１コピーのγ３４．５遺伝子の挿入物；および、
ｃ）リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子内の内因性欠失、
を含む、単純ヘルペスウイルス１型変異体である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ヘルペスウイルス変異体を含む、既知の細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を選択的に排除するための組成物であって、該ウイルス変異体が、以下：
（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異；および
（ｂ）該細胞特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも１コピーの該γ３４．５遺伝子の挿入であって、その結果、該プロモーターが該γ３４．５遺伝子の発現を駆動する、挿入
を含む、組成物。
【請求項３０】
前記ヘルペスウイルス変異体が、ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも１つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ヘルペスウイルス遺伝子の前記さらなる内因性欠失または不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、またはｄＵＴＰａｓｅをコードする遺伝子における欠失または不活性化変異である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記細胞特異的プロモーターが、内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ｆｌｋ１）プロモーター；膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター；視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子；破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ９プロモーター；骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター；またはノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーターである、請求項３０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府によって支援された研究および開発のもとでなされた本発明に対する権利に関する陳述）
本発明の開発の間に実施された研究のすくなくとも一部は、国立癌研究所からの助成金（助成金番号ＣＡ６９２４６０２）を利用した。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、腫瘍細胞および／または他の特定の細胞集団を選択的に標的化し得るヘルペスウイルス変異体に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍および特定の細胞型に対して変異体ヘルペスウイルスベクターを再標的化するための、細胞特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターの使用に関する。この細胞特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターを使用して、ヘルペスガンマ（γ）３４．５遺伝子の発現を駆動する。このヘルペスガンマ（γ）３４．５遺伝子の遺伝子産物は、感染した細胞における大量の子孫ウイルス産生を担う。
【０００３】
γ３４．５遺伝子を有さないヘルペスベクターは十分に複製せず、このことは、臨床的用途に所望されている。しかし、γ３４．５遺伝子を欠損することはまた、このウイルスが、腫瘍または任意の他の感染組織を殺傷する能力を減少させる。本発明は、細胞特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターを使用し得る細胞における、ヘルペスウイルスの大量産生を可能にする。しかし、プロモーターをオン（ｔｕｒｎ  ｏｎ）にし得ない細胞は、ウイルス複製を支持せず、このようにして、それらの細胞およびその近隣の細胞が、活性かつ有害なウイルスの感染および複製から免れ、従って、ヘルペスの毒力を所望される標的細胞に対して再指向する。
【０００４】
（関連技術）
（Ａ．従来の癌治療）
新形成は、癌において生じるプロセスであり、これによって、細胞の増殖および分化を調節する正常な制御機構が損なわれ、進行性の増殖が生じる。この制御機構の欠損は、腫瘍を増大させ、そして身体の致命的領域の空間を占拠させる。腫瘍が周辺組織に浸潤し、そして遠位に輸送（転移）される場合、この個体の死を招く可能性がある。
【０００５】
１９９９年に、米国のみにおいて、約５６３，１００人、すなわち一日あたり約１，５００人が癌で死亡すると予期される（Ｌａｎｄｉｓら，「Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，１９９９」ＣＡ  Ｃａｎｃ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．４９：８−３１（１９９９））。さらに、癌は、１〜１４歳の年齢の小児の間で、事故に次いで２番目の主要な死亡原因である。同書。従って、明らかに、新たな癌治療の開発の必要性が存在する。
【０００６】
（１．従来の治療の一般的制限）
癌治療に関して所望される目標は、正常細胞に対して有害な影響を有さずに、優先的に癌細胞を殺傷することである。いくつかの方法（外科手術、放射線療法、および化学療法を含む）が、この目標に到達する試みにおいて使用されてきた。
【０００７】
外科手術は、利用可能な第一の癌の処置であった。そしてこれはなお、癌の診断、病期分類、および処置において主要な役割を果たしており、そして早期癌についての主要な処置であり得る（Ｓｌａｐａｋ，Ｃ．Ａ．およびＫｕｆｅ，Ｄ．Ｗ．，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．ら編，第１４版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｓ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８，５２４を参照のこと）。しかし、外科手術は、特定の部位に限定された腫瘍を治療するに有効な方法であり得るが、これらの腫瘍は、腫瘍の場の外側の微小転移性病態に起因して、切除によって治癒可能でない可能性がある。同書。一定レベルの転移を示す任意の癌が、外科手術のみを通してでは、有効に治療され得ない。同書。
【０００８】
放射線療法は、局所的な癌の制御のために使用される別の局所的な（非組織化）形態の処置である。同書（５２５）。多くの正常細胞は、腫瘍性細胞よりも高い細胞間修復能力を有し、それらを放射線の損傷に対して、より低感受性にする。放射線療法は、照射による損傷に対する感受性における腫瘍性細胞と正常細胞との間のこの差異、および正常細胞が分節的にのみ損傷を受けた場合に十分に機能し続ける正常細胞の能力に依存する。同書。従って、放射線療法の成功は、放射線療法に対する腫瘍周辺の組織の感受性に依存する。同書。放射線療法は、投与部位に一部依存する副作用を付随する。この副作用には、疲労、局所的な皮膚反応、悪心、および嘔吐が挙げられる。同書（５２６）。さらに、放射線療法は、変異促進性、発癌性、および催奇形性であり、そして患者を、二次性腫瘍を発達させる危険にさらし得る。同書。
【０００９】
局所的な治療の他の型が探求されており、これには、局所的過温症（ｌｏｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）（Ｓａｌｃｍａｎ，Ｍ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ．１：２２５−２３６（１９８３））、光放射線治療（Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．Ｋ．ら，Ｓｕｒｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：４２３−４３５（１９８６））、および組織内照射（Ｇｕｔｉｎ，Ｐ．Ｈ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ６７：８６４−８７３（１９８７））が含まれる。不幸なことに、これらの治療は、中程度の成功しか満たしていない。
【００１０】
局所的処置（例えば、放射線療法および外科手術）は、外科手術技術または高用量の放射線療法を通して到達し得る身体の領域における腫瘍塊を減少させる方法を提供する。しかし、副作用のより少ない、より有効な局所的治療が必要とされる。さらに、これらの処置は、大半の癌患者において最終的に見出される、広範に散在しているかまたは循環している腫瘍細胞の破壊には適用可能でない。腫瘍細胞の蔓延に対抗するために、全身的な治療が使用される。
【００１１】
１つのこのような全身的処置が化学療法である。化学療法は、散在性の悪性癌の主要な処置である（Ｓｌａｐａｋ，Ｃ．Ａ．およびＫｕｆｅ，Ｄ．Ｗ．，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．ら編，第１４版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｓ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８，５２７）。しかし、化学療法剤は、多くの癌の型（多くの一般的な固形腫瘍を含む）を処置するためのその有効性が制限されている。同書。この不全は、多くの腫瘍細胞の固有または獲得性の薬物耐性に一部起因する。同書（５３３）。化学療法剤の使用に対する別の欠点は、その重篤な副作用である。同書（５３２）。これらとしては、骨髄抑制、悪心、嘔吐、毛髪喪失、および口内の潰瘍化が挙げられる。同書。明らかに、化学療法剤が、同時に全身的毒性を回避しつつ、悪性腫瘍細胞を殺傷し得る有効性を増強するための新たなアプローチが必要である。
【００１２】
（２．中枢神経系腫瘍によって提示されるチャレンジ）
癌の処置における別の問題は、特定の型の癌（例えば、神経膠腫（これは、ヒト脳において生じる最も一般的な原発性悪性疾患である））が、現在の処置様相に抗するということである。外科手術、化学療法、および放射線療法にも関わらず、多形性膠芽腫（最も一般的な神経膠腫）は、ほぼ一般的に致死的である（Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍ．Ｄ．Ｗａｌｋｅｒ編，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ（１９８３）；Ｌｅｖｉｎら，第４６章、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第２巻，第３版，Ｄｅ  Ｖｉｔａら編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８９），１５５７−１６１１頁）。
【００１３】
神経膠腫は、原発性脳腫瘍全体のほぼ４０％を表し、多形性膠芽腫が、大半の悪性形態を構成する（Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ，「Ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｕｍｏｒｓ」、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｌｋｅｒ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３））。現在の処置様相（外科手術、放射線療法および／または化学療法）で仮定すると、この高い悪性度分類型の星状細胞腫を有するヒトについて、５年の生存率は５％未満である（Ｍａｈａｌｅｙら，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ７１：８２６−８３６（１９８９）；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｌｋｅｒ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：２７−３７（１９９１），Ｄａｕｍａｓ−Ｄｕｐｏｒｔら，Ｃａｎｃｅｒ  ２：２１５２−２１６５（１９８８））。放射線療法後に、膠芽腫は通常、局所的に再発する。Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３０：９０７−９１１（１９８０）。膠芽腫を有する個体における神経学的機能不全および死亡は、腫瘍の局所的増殖に起因する。全身的な転移は稀である。同書。この理由のために、全身的な方法ではなく局部的（ｒｅｇｉｏｎａｌ）な癌治療方法が、膠芽腫の処置に特に適切であり得る。
【００１４】
さらに、膠芽腫は、この腫瘍型に特徴的な増殖におそらく起因して、多くの化学療法剤に対して耐性である。多くの化学療法剤は、細胞周期活性（すなわち、主に活性に周期運動中の細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ）に対して細胞傷害性）である（Ｓｌａｐａｋ，Ｃ．Ａ．，およびＫｕｆｅ，Ｄ．Ｗ．，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．ら編，第１４版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｓ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８，５２７）。一般的に、化学療法は、少量の腫瘍負荷（ここで、腫瘍の増殖比が最大である）を有する癌に対して最も有効である。同書。膠芽腫瘍についての増殖比は、わずか３０％であり、残りの７０％の細胞は、Ｇ0である休止期にある（Ｇ0における細胞は死滅であり得るか、または活性な細胞周期に再エントリーし得る）（Ｙｏｓｈｉｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６５：６５９−６６３（１９８６））。活性に分裂する３０％の膠芽腫細胞が、この腫瘍の致死的な進行に寄与するが、休止性の７０％は、活性に増殖している細胞を標的化する多くの化学療法剤に対するこれらの腫瘍の耐性を担う。
【００１５】
不幸なことに、局部的な処置（例えば、外科手術および放射線療法）もまた、膠芽腫の処置における成功は限られていることが見出されている（Ｂｕｒｇｅｒら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．５８：１５９−１６９（１９８３）；Ｗｏｗｒａら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．（Ｗｉｅｎ）９９：１０４−１０８（１９８９）；Ｚａｍｏｒａｎｏら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．補遺（Ｗｉｅｎ）４６：９０−９３（１９８９））。膠芽腫の外科的処置は、腫瘍と周辺の実質との間の明確な境界線の欠如によって、そして原発部位から伸長する白質路（ｔｒａｃｔ）における腫瘍細胞の移動によって妨害され（Ｂｕｒｇｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．５８：１５９−１６９（１９８３））、これらがその完全な除去を妨げている。急速に増殖している細胞を標的化する放射線療法は、膠芽腫における低い増殖比によって、そして隣接する正常細胞の放射線感受性によって、制限される（Ｗｏｗｒａら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．（Ｗｉｅｎ）９９：１０４−１０８（１９８９）；Ｚａｍｏｒａｎｏら，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．補遺（Ｗｉｅｎ）４６：９０−９３（１９８９））。従って、脳腫瘍を処置するための新たなアプローチが特に必要とされる。
【００１６】
（Ｂ．ウイルスを使用する、癌治療に対する非伝統的アプローチ）
癌治療に対する１つの非伝統的アプローチは、腫瘍性細胞を標的化するために、変異ウイルスを使用する。Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．Ｙ．およびＣｈｉｏｃｃａ，Ｅ．Ａ．，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．７：５８９−６０２（１９９８）を参照のこと。
【００１７】
提案されたウイルスによる癌治療は、以下の２つの異なるアプローチを包含する：（１）変異誘発されたウイルスによる、直接的な細胞殺傷（腫瘍崩壊）（Ｍａｒｔｕｚａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８５４−８５６（１９９１）；Ｍｉｎｅｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １：９３８−９４３（１９９５）；Ｂｏｖｉａｔｓｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５７４５−５７５１（１９９４）；Ｋｅｓａｒｉら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：６３６−６４８（１９９５）；Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５）；Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８６：１２２８−１２３３（１９９４）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：３７３−３７６（１９９６）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２５５９−２５６３（１９９７））；および（２）導入遺伝子（この発現産物が化学療法剤を活性化する）を送達するためのウイルスベクターの使用（Ｗｅｉら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：９６９−９７８（１９９４）；ＣｈｅｎおよびＷａｘｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５８１−５８９（１９９５）；Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：２７９−２８７（１９９４）；Ｆａｋｈｒａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３．２９０９−２９１４（１９９６）；Ｒｏｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：９８５−９９１（１９９６）；Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：５２７６−５２８１（１９８６）；Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１．３０５４−３０５７（１９９４））。
【００１８】
（１．ウイルス性腫瘍崩壊）
腫瘍崩壊剤として使用するためのウイルスの遺伝子操作は、当初、複製能を有さない（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ウイルスの使用に焦点を当てていた。このストラテジーによって、ウイルスによる非腫瘍細胞への損傷を予防することが期待された。このアプローチの主な制限は、これらの複製能を有さないウイルスが、宿主細胞中に組み込まれ得、および／または複製し得るために、ヘルパーウイルスを必要とすることであった。ウイルスによる腫瘍崩壊アプローチの１つの例である、神経系腫瘍を処置するための複製欠損レトロウイルスの使用は、ウイルスを伝播させるために、プロデューサー細胞株の移植を必要とする。これらのレトロウイルスは、その有効性が制限されている。なぜなら、各複製欠損レトロウイルス粒子は、単一の細胞にのみ進入し得、そしてその後、他の細胞に生産的に感染し得ないからである。従って、これらは、プロデューサー細胞から離れて伝播し得ず、そしてインビボで、深部の多層化腫瘍に完全には侵入し得ない（Ｍａｒｋｅｒｔら，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７７：５９０（１９９２）；Ｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：１３５４−１３６１（１９９７））。
【００１９】
より近年では、腫瘍崩壊性ウイルスの遺伝子操作は、他の腫瘍細胞にウイルスが伝播するのを可能にしつつ、全身的感染を回避する試みにおける条件的複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）ウイルスの生成に焦点を当てていた。条件的複製ウイルスは、活性に分裂している細胞（例えば、腫瘍細胞）において優先的に複製するように設計される。従って、これらのウイルスは、腫瘍崩壊のために腫瘍細胞を標的化するべきであり、そしてこれらの細胞において複製するべきであり、その結果、ウイルスは他の腫瘍細胞に伝播し得る。
【００２０】
抗癌剤として条件的複製ウイルス変異体を作製するための、いくつかの近年のストラテジーは、条件的複製性にさせるための、選択されたアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）遺伝子の変異を使用していた（Ｍａｒｔｕｚａ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８５４−８５６（１９９１）；Ｍｉｎｅｔａ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １：９３８−９４３（１９９５）；Ｂｏｖｉａｔｓｉｓ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５７４５−５７５１（１９９４）；Ｋｅｓａｒｉ，Ｓ．ら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：６３６−６４８（１９９５）；Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５）；Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８６：１２２８−１２３３（１９９４）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：３７３−３７６（１９９６）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２５５９−２５６３（１９９７））。例えば、Ｅ１Ｂ−５５Ｋｄをコードする遺伝子において欠失を有するアデノウイルスは、ｐ５３欠損腫瘍細胞において選択的に複製することが示されている（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ら，前出）。
【００２１】
単一遺伝子における条件的複製ＨＳＶ変異体の２つの広範な型が、現在までに研究されている。第一は、核酸代謝に必要とされるウイルス遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ（Ｍａｒｔｕｚａ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８５４−８５６（１９９１）），リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｊ．＆Ｗｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６−２０５（１９８８）；Ｂｏｖｉａｔｓｉｓ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：３２３−３３１（１９９４）；Ｂｏｖｉａｔｓｉｓ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５７４５−５７５１（１９９４）；Ｍｉｎｅｔａ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３３６３−３３６６（１９９４）），または、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｐｙｌｅｓ，Ｒ．Ｂ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６８：４９６３−４９７２（１９９４））の機能において欠損を有する有するウイルス変異体から構成される。
【００２２】
第二は、γ３４．５遺伝子の機能において欠損を有するウイルス変異体から構成される（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））。これらは、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して、感染細胞のウイルス放出量を著しく増大させることによって、毒性因子として機能する（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．およびＲｏｉｚｍａｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３２６６−３２７０（１９９２））。
【００２３】
これらの単一変異体株は、特定の固有の制限を有しており、この制限には、ＴＫ変異体についてのガンシクロビルおよびアシクロビルに対する耐性（Ｍｉｎｅｔａ，Ｔ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３３６３−３３６６（１９９４））、野生型ウイルスとの単回の組換え事象による野生型への復帰変異の危険性、および少なくとも特定の腫瘍細胞株におけるγ３４．５変異体についての腫瘍崩壊効力の減少（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７）；Ｍｏｈｒ．Ｉ．＆  Ｂｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：４７５９−４７６６（１９９６）；Ｔｏｄａ，Ｍ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２１７７−２１８５（１９９８））が含まれる。
【００２４】
野生型組換えの危険性を減少させる試みにおいて、多重に変異させたＨＳＶウイルスが開発された。これらは、変異体Ｇ２０７（Ｍｉｎｅｔａ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ  １：９３８−９４３（１９９５）；Ｍａｒｔｕｚａらに対する米国特許第５，５８５，０９６号（１９９６年１２月１７日付発行））、およびＭＧＨ１（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７）（これは、γ３４．５の両方のコピーの欠失およびＲＲの挿入性変異を有する）を含む。
【００２５】
別の多重に変異させたＨＳＶウイルスは、γ３４．５／ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）変異体株３６１６ＵＢ（Ｐｙｌｅｓ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５３３−５４４（１９９７））である。これらの二重変異体株は、直接的な頭蓋内注射に際して、神経毒性の著しい減少を示し、ガンシクロビルに対する感受性を保持し、そして正常組織と比較して、腫瘍細胞において相対的に選択的な複製を示す。このような二重変異体ＨＳＶ株は、欠損性のγ３４．５遺伝子を保持し、従って、正常組織に対してほとんど毒力を示さない。これらは明らかに、腫瘍細胞に対して腫瘍崩壊効果を示すが、このような効果は、インタクトなγ３４．５遺伝子を有する変異体において観察されるよりも小さい（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７）；Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｎ．およびＣｈｉｏｃｃａ，Ｅ．Ａ．未公開データ）。他方で、インタクトなγ３４．５遺伝子によって示される毒性は、腫瘍崩壊剤としての後者のウイルスの潜在的な適用を減少させ得る。
【００２６】
（２．抗癌性導入遺伝子のウイルス性送達）
ウイルスによる癌治療の第二のアプローチが、抗癌性導入遺伝子のウイルス性送達であり、これによって、標的腫瘍細胞の表現型を遺伝的に改変して、腫瘍の薬物感受性および応答性を増加させる。このアプローチは、さもなくば無害である因子に対する感受性を付与するために、プロドラッグ活性化酵素をコードする「化学的感作」または「自殺」遺伝子を悪性細胞に直接移動させることを包含する（Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｆ．Ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：２７９−２８７（１９９４）；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：３１−４５（１９９６）；Ｄｅｏｎａｒａｉｎ，Ｍ．Ｐ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２３５−２４４（１９９５））。
【００２７】
いくつかのプロドラッグ活性化遺伝子は癌遺伝子治療における適用のために研究されてきている。１つの例において、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）と、プロドラッグガンシクロビルとの組合せは、癌遺伝子治療におけるその可能な適用に関して当該分野における公知のプロトタイプのプロドラッグ／酵素活性化系を代表する。ＨＳＶ−ＴＫは、プロドラッグであるガンシクロビルをリン酸化し、そして活発に分裂する細胞におけるＤＮＡ鎖の終結および細胞死ヌクレオシドアナログを生成する。ＨＳＶ−ＴＫで形質導入された腫瘍細胞は、ガンシクロビルに対する感受性を獲得する。ガンシクロビルは、もともとウイルス感染の処置のために設計された臨床的に証明された薬剤である。Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：２９７−３００（１９９０）；Ｅｚｚｅｄｄｉｎｅ，Ｚ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．３：６０８−６１４（１９９１）。
【００２８】
第二の例において、細菌遺伝子シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、公知の癌化学療法剤である５−フルオロウラシルに対しその形質転換の結果、抗真菌剤５−フルオロシトシンに対して腫瘍細胞を感受性にさせることが示されたプロドラッグ／酵素活性化系である（Ｍｕｌｌｅｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３３−３７（１９９２）；Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４６１９４６２６（１９９３）；Ｍｕｌｌｅｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１５０３−１５０６（１９９４））。
【００２９】
これらの薬物感受性遺伝子を用いた最近の研究は、有望な結果を得ている。例えば、以下を参照のこと：Ｃａｒｕｓｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７０２４−７０２８（１９９３）；Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：３９（１９９３）；Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ４０：５１０（１９９４）；Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｊｒ．，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１７３７−１７４１（１９９６）；Ｒａｉｎｏｖ，Ｎ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：９９−１０６（１９９６）。
【００３０】
いくつかの他のプロドラッグ活性化酵素系もまた、研究されている（Ｔ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｒｓ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：７０２−７０９（１９９５））。これらには、細菌の酵素であるカルボキシペプチダーゼＧ２（これは、哺乳動物ホモログを有さず、そしてグルタミン酸部分の切断によって特定の合成マスタードプロドラッグを活性化するために使用され、活性な細胞傷害性マスタード代謝物を放出させ得る（Ｍａｒａｉｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４７３５−４７４２（１９９６）））、およびＥ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼ（これは、プロドラッグＣＢ１９５４および関連するマスタードプロドラッグアナログを活性化する（Ｄｒａｂｅｋ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：９３−１００（１９９７）；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：２２９−２３８（１９９７））が挙げられ、これらのいくつかは、ＣＢ１９５４よりも優れ得る（Ｆｒｉｅｄｌｏｓ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４０  ：１２７０−１２７５（１９９７）））が含まれる。プロドラッグ活性化遺伝子治療に対するこれらのアプローチの元にある原理は、腫瘍細胞集団の外来遺伝子での形質導入によって、その細胞において、独特のプロドラッグ活性化能力、それゆえ、その遺伝子を発現しない宿主細胞にはない化学感受性が付与されることである。
【００３１】
より最近になって、薬物活性化／遺伝子治療戦略は、Ｐ４５０遺伝子（「ＣＹＰ」または「Ｐ４５０」）触媒モノオキシゲナーゼ反応を通じて活性化される癌化学療法剤との組合わせたシトクロムＰ４５０に基づいて開発されてきている（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：５８１−５８９（１９９５）；Ｗｅｉ，Ｍ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９６９−９７８（１９９４）；米国特許第５，６８８，７７３号、１９９７年１１月１８日発行）。上記のプロドラッグ活性化戦略とは異なり、Ｐ４５０に基づくの薬物活性化戦略は、（細菌またはウイルスに由来する遺伝子ではなく）哺乳動物薬物活性化遺伝子を利用し、そしてまた、癌療法において広汎に使用される、確立した化学療法剤を利用する。
【００３２】
多くの抗癌薬物は、シトクロム４５０酵素によって酸素化されて腫瘍細胞に対して細胞傷害性または細胞分裂抑止性である代謝物を生成することが知られている。これらには、いくつかの一般に使用される癌化学療法剤が含まれる（例えば、シクロホスファミド（ＣＰＡ）、その異性体であるイフォスファミド（ＩＦＡ），ダカルバジン、プロカルバジン、チオテパ、エトポシド、２−アミノアントラセン、４−イポメアノール、およびタモキシフェン（ＬｅＢｌａｎｃ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．２０：３９５−４３９（１９８９）；Ｎｇ，Ｓ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２：７３１−７３８（１９９３）；Ｇｏｅｐｔａｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：２４１１−２４１８（１９９４）；ｖａｎ  Ｍａａｎｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：４６５８−４６６２（１９８７）；Ｄｅｈａｌ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３４０２−３４０６（１９９７）；Ｒａｉｎｏｖ，Ｎ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１２６１−１２７３（１９９８））。
【００３３】
このアプローチの１つの例において、腫瘍細胞は、高速度のＣＰＡおよびＩＦＡ活性化を示す肝臓Ｐ４５０酵素をコードするＣＹＰ２Ｂ１の形質導入によってＣＰＡまたはＩＦＡに対して高度に耐性にされる（Ｃｌａｒｋｅ，Ｌ．ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：２３４４−２３５０（１９８９）；Ｗｅｂｅｒ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：１６８５−１６９４（１９９３））。この亢進された化学感受性は、インビトロおよび皮下齧歯類固形腫瘍モデルおよびヌードマウスにおいて増殖させたヒト胸部腫瘍を用いたインビボの研究の両方で実証されている。そして、これは、これらの動物における薬物活性化のための実質肝関連能力の存在にもかかわらず、驚くほど有効である。（Ｃｈｅｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５８１−５８９（１９９５）；Ｃｈｅｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１３３１−１３４０（１９９６））。このＰ４５０に基づくのアプローチはまた、脳腫瘍の処置における遺伝子適用のために顕著な有用性を示す（Ｗｅｉ，Ｍ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９６９−９７８（１９９４）；Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ    Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：５１３−５２０（１９９６）；Ｃｈａｓｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４４−４４８（１９９８））。
【００３４】
プロドラッグ活性化または「自殺」遺伝子を含む導入遺伝子に加えて、他の型の抗癌導入遺伝子もまた研究されており、これらには、サイトカイン遺伝子（腫瘍に対する免疫防御を増強するため）（Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔ．１７３：１０４７−１０５２（１９９１）；Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１６：４２１−４３２（１９９７）；Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １５：４８−５１（１９９４））、および他の殺腫瘍性遺伝子（例えば、ジフテリア毒素（Ｃｏｌｌ−Ｆｒｅｓｎｏ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２４３−２４７（１９９７））、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ）、癌抑制遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、およびリボザイム（Ｚａｉａ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：９５−１０６（１９９２））。
【００３５】
ウイルスに基づくアプローチおよび遺伝子に基づくのアプローチは、腫瘍動物モデルにおいて顕著な治療効果の証拠を提供してきているが、各々の方法は、固有の限界という問題がある。ウイルスに基づくアプローチは腫瘍塊において広がったウイルスの広汎な複製に関する可能性を理論的には提供するものの、その効果は、以下により制限される：ウイルス感染の効率；いくつかのウイルスベクターについてのヘルペスウイルスまたはプロデューサー細胞株の要件；他のウイルスベクターについてウイルス変異体増殖を補完する細胞因子に関する腫瘍細胞異種性（Ｓｉｄｒａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，３５５：８４６−８４７（１９９２）；Ｂｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４０：２０１−２２９（１９８１））；ならびに抗ウイルス免疫応答。
【００３６】
これまで試験された遺伝子ベーアプローチにおいて、腫瘍塊内の細胞の形質導入の効率は、ベクターの欠損特性により制限される。事実、陽性導入される細胞の大部分は、ベクター接種の部位からいくつかの細胞層内で生じる（Ｎｉｌａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２１：９８２９９８３３（１９９５）；Ｍｕｌｄｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：１８４０−１８５１（１９９５）；Ｒａｍ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８２，３４３Ａ（ａｂｓｔ．）（１９９５））。さらに、プロデューサー細胞株が不必要であるかまたは自殺遺伝子／薬物組合せにより殺傷されないウイルスベクター系についてでさえ、ウイルス複製は、使用される薬物により阻害され得る。さらに、自殺遺伝子／薬物組合せがＴＫ／ＧＣＶである場合、薬物が腫瘍細胞を殺傷する能力は、ＧＣＶはＤＮＡ複製のプロセスにおける細胞のみを標的とすることから、その細胞の細胞周期の段階によって制限を受ける。従って、これらの複製欠損ベクターによって治療遺伝子送達が接種部位から離れた腫瘍細胞に影響を与えることは、治療遺伝子がサイトカインまたはＣＰＡ代謝物のような自由に拡散する抗癌剤を生成する場合においてでさえ、ありそうもない。
【００３７】
従って、正常組織に対して毒性を欠如したまま腫瘍または他の標的化された細胞集団について選択的毒力を達成する手段を提供する安全かつ効率のよいウイルス変異体についての必要性が継続して存在する。
【００３８】
（発明の要旨）
従って、本発明は、先行技術の不利益を、γ３４．５の作用を転写再標的化することによりウイルス腫瘍崩壊性について腫瘍性細胞を選択的に標的化し得るヘルペスウイルス変異体を提供することによって、克服する。本発明のヘルペスウイルス変異体はまた、他の細胞集団もまた標的化し得る。
【００３９】
具体的ではあるが非限定的な例において、本発明者らは、γ３４．５遺伝子を細胞周期調節されたＢ−ｍｙｂプロモーターの転写制御下でＲＲ／γ３４．５二重変異体株（ＭＧＨ１）に再導入した。これらは、この新規な腫瘍崩壊性ウイルス（「Ｍｙｂ３４．５」と呼ばれる）が野生型γ３４．５遺伝子を有した単一のＲＲ変異体ウイルスと同じぐらい腫瘍崩壊性を保持したが、なおもγ３４．５−欠失変異体のものと類似する有利な毒性プロファイルを保持したことを実証した。従って、これらの知見は、感染した細胞のタンパク質合成の遮断を妨害することを担うウイルス遺伝子の転写再標的化が選択的腫瘍崩壊性を達成するための道筋を提供することを示す。従って、γ３４．５の発現の転写再標的化は、腫瘍または他の標的化細胞集団について選択的毒力を達成する手段を提供する。
【００４０】
本発明の１つの実施形態において、ヘルペスウイルス変異体は、γ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーにおいて欠失または不活化変異を含み、ここで、γ３４．５遺伝子の少なくとも１コピーは細胞特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターの転写制御下で再導入される。
【００４１】
当然、γ３４．５遺伝子に加え、ヘルペスウイルス遺伝子の１を超える特異的内因性欠失または不活化変異が存在し得る。これらには、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、またはより特定するとＲＲのラージサブユニットをコードする遺伝子における欠失が包含される。あるいは、ＲＲをコードする遺伝子は、スモールサブユニット（ＵＬ４０）をコードする。任意の他のヘルペスウイルス遺伝子もまた欠失され得る（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ウラシルＲＮＡＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）またはｄＵＴＰａｓｅなど）。これらのウイルス遺伝子が好ましい。なぜなら、これらの遺伝子の哺乳動物ホモログはしばしば、腫瘍性細胞のようなＥ２Ｆの上昇したレベルを伴う細胞においてアップレギュレーションされており、従って欠失したウイルス酵素を補完し得、それによりこれらの細胞における選択的複製を促進するからである。
【００４２】
別の実施形態において、本発明のヘルペス変異体は、その産物が腫瘍細胞に対して細胞毒性であり得る導入遺伝子を送達し得る。例えば、この導入遺伝子は、化学療法剤（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ、ＣＤのような自殺遺伝子またはシトクロムＰ４５０）を活性化し得るかまたは増強し得る。あるいは、その導入遺伝子は、腫瘍免疫原性を増強するサイトカイン遺伝子（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン類（ＩＬ−２、ＩＬ−４）、インターフェロンγ、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、癌抑制遺伝子または当業者に公知の他の任意の殺腫瘍性遺伝子（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム））であり得る。従って、この実施形態において、ヘルペス変異体は、さらに、化学療法剤をその細胞傷害性形態に変換し得る遺伝子産物をコードする導入遺伝子、サイトカイン遺伝子または他の任意の腫瘍殺傷遺伝子を含む。この導入遺伝子は、もとのγ３４．５欠失またはＵＬ４０の遺伝子座のどこかに挿入され得る。
【００４３】
本発明は、上記ヘルペスウイルス変異体の好ましい実施形態を提供する。ここで、この導入遺伝子は、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をコードする。そのような自殺遺伝子の特に好ましい例は、哺乳動物シトクロムＰ４５０である。より特定すると、このシトクロムＰ４５０は、Ｐ４５０  ２Ｂ１であり得、、またはあるいは、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１１またはＰ４５０  ３Ａ４であり得る。Ｐ４５０  ２Ｂ１は、特に好ましい。そのような自殺遺伝子が上記ウイルス変異体に存在する場合、活性化される化学療法剤は、オキサゾホリンクラスのメンバーである。特に、シクロホスファミド、イフォスファミド、Ｎ−メチルシクロホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソウレア、ポリマー性シクロホスファミド、ポリマー性イフォスファミド、ポリマー性Ｎ−メチルシクロホスファミド、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソウレアである。
【００４４】
本発明はまた、上記ヘルペスウイルス変異体の実施形態を提供する。ここで、そのヘルペスウイルス変異体は、単純ヘルペスウイルスであり、そしてより特定すると、その変異体は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型または２型である。ＨＳＶ−１は特に好ましい。
【００４５】
本発明の非常に好ましい実施形態において、そのヘルペスウイルス変異体は、ＨＳＶ−１から誘導され、そして以下を含む：（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活化変異；および（ｂ）γ３４．５遺伝子の発現を細胞型特異的および／または腫瘍特異的プロモーターが制御するような、その細胞型特異的および／または腫瘍特異的プロモーターの転写制御下での、そのγ３４．５の少なくとも１つのコピーの挿入。
【００４６】
γ３４．５に加えて、他のヘルペスウイルス遺伝子における欠失または変異体もまた、本発明のヘルペスウイルス変異体において存在し得る。ヘルペスＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧまたはｄＵＴＰａｓｅにおける欠失は、例示のヘルペスウイルス遺伝子である。
【００４７】
この実施形態において、細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターは、腫瘍型特異的遺伝子発現および／または細胞型特異的な発現を制御する、十分に特定された制御エレメントのいずれか１つであり得る。概説について、以下を参照のこと：Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．ａｎｄ  Ｗｈｅｌａｎ，Ｊ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８  ：８０３−８１５（１９９７）；Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，Ｕ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７４：３７９−３９２（１９９６）；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ  Ｇｒｏｎｅｒ，Ｂ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１０６９−１０７３（１９９６）；Ｌａｎ，Ｋ−Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：４２７９−４２８４（１９９７）；Ｃｌａｒｙ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５６５−５７４（１９９８）；Ｄａｃｈｓ，Ｇ．Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．９：３１３−３２５（１９９７））。
【００４８】
腫瘍特異的なプロモーターの代表的な例としては、例えば以下が挙げられる：ＤＦ３（ＭＵＣ１）（これは、乳癌のほとんどにおいて過剰発現される）（Ａｂｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８２−２８６（１９９３）；Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：６８５，Ａ０５１（１９９５）；Ｃｈｅｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２７７５−２７８２（１９９５））；ＡＦＰ（これは、肝細胞腫において過剰発現される）（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２２：１７８８−１７９６（１９９５）；Ｉｄｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３１０５−３１０９（１９９５））；ＣＥＡ（これは、結腸および肺癌において過剰発現される）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．５：３４４−３６６（１９９１）；Ｏｓａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５２５８−５２６１（１９９４））；ＰＳＡ（これは、前立腺癌において過剰発現される）（Ｌｕｎｄｗａｌｌ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：１１５１−１１５６（１９８９））；チロシナーゼ（これは、メラノーマにおいて過剰発現される）（Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｒ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７（１９９３）；Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｒ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ  ５（Ｓｕｐｐｌ．４）：Ｓ５９−Ｓ６５（１９９４）；Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６  ：２２１−２２５（１９９４））；およびｃ−ｅｒｂＢ２（これは、乳癌、膵臓癌、卵巣癌または胃癌において過剰発現される）（Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ，Ｄ，ａｎｄ  Ｈｕｒｓｔ，Ｈ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：２３６９−２３７５（１９９３））。
【００４９】
好ましい実施形態において、腫瘍特異的プロモーターはＢ−ｍｙｂである。上記ヘルペスウイルス変異体の特に好ましい実施形態において、ウイルス変異体は、Ｍｙｂ３４．５である。
【００５０】
例示的な細胞特異的プロモーターとしては、以下が挙げられる：内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ｆｌｋ１）プロモーター（Ｋａｐｐｅｌら、Ｂｌｏｏｄ  ９３：４２８２−４２９２（１９９９））；膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター（Ｒａｙら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８４：１９９−２０３（１９９９））；視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子（Ａｌｂａｒｒａｃｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：２４１５−２４２１（１９９９））；破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ９プロモーター（Ｍｕｎａｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５５８８−５５９６（１９９９））；骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター（Ａｍｉｚｕｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：３７３−３８１（１９９９））；ノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１８１３−１８２６（１９９８））。
【００５１】
本発明はまた、上記のヘルペスウイルス変異体を使用して、既知の腫瘍特異的プロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法を提供し、この方法は、この腫瘍性細胞にこのヘルペスウイルス変異体を感染させる工程であって、このウイルス変異体は、以下の工程：（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子における欠失または不活化変異；および（ｂ）この腫瘍特異的プロモーターの転写制御下でのこのγ３４．５遺伝子の少なくとも１コピーの挿入を含み、その結果、このプロモーターが、このγ３４．５遺伝子の発現を駆動する、工程；ならびに、この腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程、を包含する。
【００５２】
腫瘍特異的プロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられる：ＤＦ３（ＭＵＣ１）（これは、大部分の乳癌において過剰発現される）（Ａｂｅ，Ｍ．およびＫｕｆｅ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８２−２８６（１９９３）；Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：６８５，Ａ０５１（１９９５）；Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２７７５−２７８２（１９９５））；ＡＦＰ（これは、ヘパトームにおいて過剰発現される）（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ，Ｐ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２２：１７８８−１７９６（１９９５）；Ｉｄｏ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３１０５−３１０９（１９９５））；ＣＥＡ（これは、結腸癌および肺癌において過剰発現される）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．５：３４４−３６６（１９９１）；Ｏｓａｋｉ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５２５８−５２６１（１９９４）９；ＰＳＡ（これは、前立腺癌において過剰発現される）（Ｌｕｎｄｗａｌｌ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：１１５１−１１５６（１９８９））；チロシナーゼ（これは、黒色腫において過剰発現される）（Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．およびＨａｒｔ，Ｉ．Ｒ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７（１９９３）；Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．およびＨａｒｔ，Ｉ．Ｒ．、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ  ５（補遺４）：Ｓ５９−Ｓ６５（１９９４）；Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：２２１−２２５（１９９４））；およびｃ−ｅｒｂＢ２（これは、乳癌、膵臓癌、卵巣癌または胃癌において過剰発現される）（Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ，Ｄ．およびＨｕｒｓｔ，Ｈ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：２３６９−２３７５（１９９３））。
【００５３】
好ましくは、腫瘍特異的プロモーターは、Ｂ−ｍｙｂである。この方法の特に好ましい実施形態において、ウイルス変異体は、Ｍｙｂ３４．５である。
【００５４】
γ３４．５に加えて、他のヘルペスウイルス遺伝子における欠失または変異が、本発明の方法において使用されるヘルペスウイルス変異体に存在し得る。ヘルペスのＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧまたはｄＵＴＰａｓｅにおける欠失が、例示的なヘルペスウイルス遺伝子である。
【００５５】
さらに、本発明は、このヘルペスウイルス変異体が、導入遺伝子をさらに含み、この導入遺伝子が、自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子または任意の殺腫瘍性遺伝子である、腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための上記方法を提供する。この導入遺伝子が、自殺遺伝子である場合、次いで、この方法は、この自殺遺伝子によって活性化され得る化学療法剤をこの腫瘍性細胞に接触させる工程、およびこの腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程をさらに包含する。好ましい自殺遺伝子は、シトクロムＰ４５０である。Ｐ４５０  ２Ｂ１が、特に好ましい。あるいは、そのコードされるシトクロムＰ４５０は、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１１、またはＰ４５０  ３Ａ４である。さらに、この化学療法剤は、好ましくは、オキサゾスフォリン（ｏｘａｚｏｓｐｈｏｒｉｎｅ）クラスのメンバー、特に、シクロホスファミド、イホスファミド、Ｎ−メチルシクロホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソ尿素、ポリマー性シクロホスファミド、ポリマー性イホスファミド、ポリマー性Ｎ−メチルシクロホスファミド、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソ尿素である。
【００５６】
本発明の別の実施形態は、本発明のヘルペスウイルス変異体を使用して、既知の細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を選択的に除去するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：この標的細胞にこのヘルペスウイルス変異体を感染させる工程であって、このウイルス変異体は、（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子における欠失または不活化変異；および（ｂ）この細胞特異的プロモーターの転写制御下でのこのγ３４．５遺伝子の少なくとも１コピーの挿入を含み、その結果、このプロモーターが、このγ３４．５遺伝子の発現を駆動する、工程；ならびに、この標的細胞を選択的に除去する工程、を包含する。
【００５７】
例示的な細胞特異的プロモーターとしては、以下が挙げられる：内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ｆｌｋ１）プロモーター（Ｋａｐｐｅｌら、Ｂｌｏｏｄ  ９３：４２８２−４２９２（１９９９））；膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター（Ｒａｙら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８４：１９９−２０３（１９９９））；視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子（Ａｌｂａｒｒａｃｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：２４１５−２４２１（１９９９））；破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ９プロモーター（Ｍｕｎａｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５５８８−５５９６（１９９９））；骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター（Ａｍｉｚｕｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：３７３−３８１（１９９９））；ノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１８１３−１８２６（１９９８））。
【００５８】
γ３４．５に加えて、他のヘルペスウイルス遺伝子における欠失または変異が、本発明の方法において使用されるヘルペスウイルス変異体に存在し得る。ヘルペスのＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧまたはｄＵＴＰａｓｅにおける欠失が、例示的なヘルペスウイルス遺伝子である。
【００５９】
この実施形態の例示的適用としては、以下が挙げられる。
【００６０】
１）有害な細胞集団を除去するための治療的選択肢：例えば、血管の過増殖性の新脈管形成が存在する状態（例えば、脳性モヤモヤ病）において、γ３４．５遺伝子発現を駆動するためのｆｌｋ１レセプタープロモーターの使用は、この疾患を引き起こす血管の選択的除去を可能にする。別の例は、高度の骨の再造形および骨の除去が存在する状態（例えば、骨粗しょう症）において、γ３４．５の発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテイナーゼ９または副甲状腺ホルモンレセプターの使用は、骨のさらなる再造形から骨の破骨細胞を除去する。
【００６１】
２）発生プロセスを研究するため：発生プロセスに対する細胞集団の除去の効果を研究するために、例えば、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼプロモーターを使用してノルアドレナリン作動性ニューロンを除去し得、次いで、動物発生に対する効果を研究し得る。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、任意の前述のウイルス変異体を含む薬学的組成物であり、この組成物はまた、１以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。
【００６３】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示し、例示目的のみで提供されることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。
【００６４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、ウイルス媒介性腫瘍崩壊単独またはウイルス媒介性腫瘍崩壊および自殺遺伝子治療の組み合わせによる、腫瘍性細胞の選択的殺傷に関する。本発明は、ヘルペスウイルス変異体、このヘルペスウイルス変異体を使用して腫瘍性細胞を選択的に殺傷する方法、およびこのウイルス変異体を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本発明のヘルペスウイルス変異体を使用して、標的細胞集団を選択的に除去するための方法を提供する。
【００６５】
より詳細には、本発明は、（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活化変異；および（ｂ）腫瘍特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターの転写制御下でのこのγ３４．５遺伝子の少なくとも１コピーの挿入を有するように遺伝子操作され、その結果、このプロモーターが、このγ３４．５遺伝子の発現を駆動する、ヘルペスウイルス変異体を提供する。このヘルペスウイルス変異体はまた、他のヘルペスウイルス遺伝子（例えば、ＲＲ，ＴＫ、ＵＮＧ、およびｄＵＴＰａｓｅのような）における１以上のさらなる欠失または変異を含み得る。このヘルペスウイルス変異体はまた、化学療法剤を活性化する産物をコードする導入遺伝子、サイトカイン遺伝子または任意の他の殺腫瘍性遺伝子を送達し得る。
【００６６】
（ヘルペスウイルス変異体の設計）
本発明のヘルペスウイルス変異体は、いくつかの異なる型のヘルペスウイルスから誘導され得る。本発明のウイルス変異体を誘導するために使用され得るヘルペスウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスが挙げられる。
【００６７】
単純ヘルペスウイルスが、特に興味深い。「単純ヘルペスウイルス」によって、上記のような欠失または不活化変異を含む亜科ヘルペスウイルス科α（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ  ａｌｐｈａ）の任意のメンバーが意図される。本発明の好ましい実施形態は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を使用して、ヘルペスウイルス変異体を作製し、ＨＳＶ−１が、最も好ましい。
【００６８】
ＨＳＶ−１は、実質的に全ての脊椎動物細胞を感染し得る、ヒト神経向性ウイルスである。自然感染は、溶解性の複製サイクルを伴うか、または潜伏（通常、末梢神経節において）を確立するかのいずれかであり、ＤＮＡは、エピソーム状態で不明確に維持される。ＨＳＶ−１は、１５３キロベース長の二本鎖の直鎖状ＤＮＡゲノムを含み、ＭｃＧｅｏｃｈによって完全に配列決定されている（ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１（１９８８）；ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：１７２７（１９８６）ｌＭｃＧｅｏｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：１（１９８５）；ＰｅｒｒｙおよびＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２８３１（１９８８））。ＤＮＡ複製およびビリオン構築は、感染された細胞の核において生じる。感染後期で、コンカテマーウイルスＤＮＡが、ゲノム長分子に切断され、この分子がビリオンにパッケージングされる。ＣＮＳにおいて、単純ヘルペスウイルスは、経ニューロン的に伝播し、その後、核へ軸索内輸送され（逆行的または順行的のいずれか）、ここで、複製が生じる。
【００６９】
（ヘルペスガンマ（γ）３４．５遺伝子）
公開された結果は、ヘルペスγ３４．５遺伝子の少なくとも１つの機能が、ウイルス感染への宿主細胞応答を妨げること、すなわち、アポトーシス様応答における宿主タンパク質合成遮断の誘因であることを示した（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．およびＲｏｉｚｍａｎ，Ｂ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３２６６−３２７０（１９９２）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１０５１６−１０５２０（１９９５））。類似した機能は、病原性ウイルスの間に広まっている（Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９４４５−９４４９（１９９５）；Ｇａｌｅ，Ｍ．，Ｊｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：５２０８−５２１８（１９９８）；Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：７５−７８（１９９５）；Ｓｈａｒｐ，Ｔ．Ｖ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４４８３−４４９０（１９９３））。
【００７０】
γ３４．５は、Ｖｅｒｏ細胞の培養物中でウイルス増殖に必須ではないが、γ３４．５は、ウイルスがマウスの中枢神経系（ＣＮＳ）で広がることを可能にし、そしてＣＮＳ複製において以前に関連付けられたＨＳＶゲノムの領域をマップする（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５５６０−５５６９（１９９７）；Ｃｅｎｔｉｆａｎｔｏ−Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｙ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｓｐ．Ｍｅｄ．１５５：４７５−４８９（１９８２））。これは、γ３４．５にコードされるタンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性キナーゼ（ＰＫＲ）を阻害する事実に起因し得る。二本鎖ＲＮＡ分子への曝露（ウイルス感染によって通常見出されるように）の際、ＰＫＲは、伸長開始因子ｅＩＦ−２のαサブユニットをリン酸化し、タンパク質合成の阻害を引き起こす（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．およびＲｏｉｚｍａｎ，Ｂ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３２６６−３２７０（１９９２）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：８３０４−８３１１（１９９４））。γ３４．５を発現し得ない変異を有する神経細胞起源の細胞の感染は、ウイルス産生の結果として起こる限定を伴って、細胞タンパク質合成の遮断を引き起こす。
【００７１】
要約すると、γ３４．５の存在下において、ＨＳＶは、アポトーシスを回避し、このようにして子孫のウイルスの産生を可能にする。γ３４．５の非存在下において、細胞は死滅し、そして感染性ＨＳＶは、子孫のウイルスを産生し得ない。従って、器官を通じたＨＳＶの感染／増殖は、排除される。
【００７２】
従って、本発明の腫瘍特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーター／γ３４．５アプローチは、このプロモーターを使用し得る細胞中のウイルス産生を可能にするが、このプロモーターを刺激し得ない細胞は、感染を伝播しない。
【００７３】
本発明のヘルペスウイルス変異体は、γ３４．５遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活性化変異を含み、ここで、γ３４．５遺伝子の少なくとも１つのコピーは、細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターの制御下で再び導入される。
【００７４】
本明細書中に使用される場合、用語「欠失」は、遺伝子（例えば、γ３４．５遺伝子）からの核酸の排除を意味することを意図する。
【００７５】
本明細書中に使用される場合、用語「不活性化変異」は、遺伝子に対する変異または変更の広い意味を意図し、ここで、この遺伝子の発現は、有意に減少されるか、またはここで、遺伝子産物は、非機能的にされるか、または機能に対するその能力は、有意に減少される。
【００７６】
用語「遺伝子」は、別な方法で示されない限り、遺伝子産物をコードする領域ならびにこの遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の両方を含む。
【００７７】
このような変更を達成するための方法は、以下が挙げられる：（ａ）この遺伝子産物の発現を破壊する任意の方法、または（ｂ）発現された遺伝子を非機能的にする任意の方法。遺伝子の発現を破壊する多数の方法は公知であり、これらには、挿入、欠失および／または塩基の変更による、この遺伝子のコード領域またはそのプロモーター配列の変更が挙げられる（Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ．およびＪｅｎｋｉｎｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０８−１２１４（１９８５）を参照のこと）。
【００７８】
（細胞特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーター）
本発明のヘルペスウイルス変異において、細胞特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターは、γ３４．５の発現を駆動するために使用される。このプロモーターは、腫瘍型特異的遺伝子発現および／または細胞型特異的遺伝子発現を制御する十分に特徴付けられた調節エレメントのうちの任意の１つであり得る。総説に関して、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．およびＷｈｅｌａｎ，Ｊ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：８０３−８１５（１９９７）；Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．およびＳｔｅｉｎ，Ｕ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７４：３７９−３９２（１９９６）；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．およびＧｒｏｎｅｒ，Ｂ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１０６９−１０７３（１９９６）；Ｌａｎ，Ｋ−Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４２７９−４２８４（１９９７）；Ｃｌａｒｙ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５６５−５７４（１９９８）；Ｄａｃｈｓ，Ｇ．Ｕ．ら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．９：３１３−３２５（１９９７）を参照のこと。
【００７９】
「プロモーター」は、ＤＮＡ領域、通常、遺伝子またはオペロンのコード配列の上流を意味することを意図し、これは、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そして酵素を正確な転写開始部位に対して指向する。
【００８０】
「細胞特異的プロモーター」は、特定の細胞型における発現を指向するプロモーターが意図される。当業者は、「腫瘍特異的」プロモーターがまた、「細胞特異的」プロモーターを考慮に入れ得ること（すなわち、腫瘍細胞に対して特異的である）を理解する。しかし、明確にするために、本明細書中に使用される場合、「細胞特異的プロモーター」は、他に示されない限り、腫瘍特異的プロモーターを除外することを意図する。例示的な細胞特異的プロモーターとしては、以下が挙げられる：内皮細胞で発現される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ｆｌｋｌ）プロモーター（Ｋａｐｐｅｌら、Ｂｌｏｏｄ  ９３：４２８２−４２９２（１９９９））；膵臓のベータ細胞で発現されるインスリンプロモーター（Ｒａｙら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８４：１９９−２０３（１９９９））；視床下部の細胞で発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子（Ａｌｂａｒｒａｃｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：２４１５−２４２１（１９９９））；破骨細胞およびケラチノサイトで発現されるマトリクスメタロプロテアーゼ９プロモーター（Ｍｕｎａｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５５８８−５５９６（１９９９））；骨細胞で発現される副甲状腺ホルモンレセプター（Ａｍｉｚｕｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：３７３−３８１（１９９９））；およびノルアドレナリン作動性ニューロンに発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１８１３−１８２６（１９９８））。
【００８１】
細胞周期調節プロモーターはまた、細胞特異的プロモーターの１つの型である。他の細胞特異的プロモーターが、当業者に公知である。
【００８２】
このベクター実施形態の適用としては、器官での選択有害細胞集団の排除、ならびに発生の間の器官中の選択集団の排除を研究するための動物モデルが挙げられる。この実施例の例示的な適用としては、以下が挙げられる：
１）有害細胞集団を排除するための処置選択：１つの例において、血管の豊富な新脈管形成が存在する条件（例えば、脳のモヤモヤ病）において、γ３４．５遺伝子発現を駆動するためのｆｌｋ１レセプタープロモーターの使用は、これらの疾患を引き起こす血管の選択的排除を可能にする。
【００８３】
別の例において、大規模な骨のリモデリングおよび骨の排除（例えば、骨粗鬆症）が存在する条件下において、γ３４．５の発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテアーゼ９または甲状腺ホルモンレセプターの使用は、骨のさならるリモデリングから骨の破骨細胞を排除する。
【００８４】
２）発達の間の器官における選択的な集団の排除効果の研究。例えば、発達プロセスにおける細胞集団の排除効果を研究するために、例えば、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼプロモーターを使用して、ノルアドレナリン作動性ニューロンを排除し、次いで、動物の発達に対する効果を研究し得る。
【００８５】
「腫瘍特異的プロモーター」は、正常細胞よりも標的腫瘍細胞において、選択的に誘導されるかまたはより高いレベルで発現されるプロモーターを意図する。本発明のヘルペスウイルス変異体に対する腫瘍標的化の特異性は、腫瘍特異的プロモーターを使用して、原発性腫瘍部位またはその転移のいずれかにおいて、腫瘍細胞中で形質転換された遺伝子の発現を選択的に活性化することによって達成される（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．およびＷｈｅｌａｎ，Ｊ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：８０３−８１５（１９９７）；Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．およびＳｔｅｉｎ，Ｕ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７４：３７９−３９２（１９９６）；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．およびＧｒｏｎｅｒ，Ｂ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１０６９−１０７３（１９９６）；Ｌａｎ，Ｋ−Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４２７９−４２８４（１９９７）；Ｄａｃｈｓ，Ｇ．Ｕ．ら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．９：３１３−３２５（１９９７））。
【００８６】
腫瘍特異的プロモーターの例としては、以下をコードする遺伝子由来のものが挙げられる：チロシナーゼ（黒色腫に対する標的化を可能にする）（Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．およびＨａｒｔ，Ｉ．Ｒ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７（１９９３）；Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．およびＨａｒｔ，Ｉ．Ｒ．、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ  ５（補遺４）：Ｓ５９−Ｓ６５（１９９４）；Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：２２１−２２５（１９９４））；ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子（乳癌、膵臓癌、胃癌および卵巣癌を標的化する）（Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ，Ｄ．およびＨｕｒｓｔ，Ｈ．、ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：２３６９−２３７５（１９９３））；  癌胎児抗原（ＣＥＡ）（結腸癌、膵臓癌および胃癌を含む、肺および胃腸の悪性腫瘍を標的化する）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．５：３４４−３６６（１９９１）；Ｏｓａｋｉ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５２５８−５２６１（１９９４））；ＤＦ３／ＭＵＣ１（乳癌を標的化する）（Ａｂｅ，Ｍ．およびＫｕｆｅ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８２−２８６（１９９３）；Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：６８５，Ａ０５１（１９９５）；Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２７７５−２７８２（１９９５））；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（前立腺癌を標的化する）（Ｌｕｎｄｗａｌｌ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：１１５１−１１５６（１９８９））；およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（肝細胞癌腫を標的化する）（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ，Ｐ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２２：１７８８−１７９６（１９９５）；Ｉｄｏ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３１０５−３１０９（１９９５））。合成遺伝子調節システム（これは、転写制御および別の形態の調節された発現を可能にする）の使用がまた、用いられ得る（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．およびＷｈｅｌａｎ，Ｊ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：８０３−８１５（１９９７）；Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．５：４２９−４３６（１９９４）；Ｈｗａｎｇ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８１３８−８１４１（１９９６）；Ｍａｓｓｉｅ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２８９−２２９６（１９９８））。
【００８７】
腫瘍細胞はまた、特定の癌遺伝子を過剰発現することが公知であり、この結果、アップレギュレートされた遺伝子発現を伴う細胞は、そのような遺伝子のプロモーターエレメントを用いて標的化され得る。Ｂ−ｍｙｂ癌遺伝子、Ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子、ｃ−ｋｉｔ癌遺伝子、およびｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子は、これらの型のいくつかの代表的な例である。Ｂ−ｍｙｂプロモーター（Ｌｙｏｎ，Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ５：３７３−３８８（１９９４）を参照のこと）は、コンセンサスＥ２Ｆ結合部位を含み、細胞周期が厳格に調節され、そして事実Ｇ0で抑制される（Ｌａｍ，Ｅ．Ｗ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２７０５−２７１３（１９９３）；Ｌａｍ，Ｅ．Ｗ．ら、Ｇｅｎｅ  １６０：２７７−２８１（１９９５）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：１０７３−１０８２（１９９６））。従って、Ｂ−ｍｙｂプロモーターは、特に好ましい腫瘍特異的プロモーターである。
【００８８】
十分に特徴付けられたプロモーターを有する任意の癌の型が、本発明の使用に見出される。そのようなプロモーターの例は、Ｃｌａｒｙ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５６５−５７４（１９９８）の表１；Ｓｐｅａｒ，Ｍ．Ａ．、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：３２２３−３２３２（１９９８）の表Ｉ；Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．およびＳｔｅｉｎ，Ｕ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７４：３７９−３９２（１９９６）の表２；ならびにＤａｃｈｓ，Ｇ．Ｕ．ら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．９：３１３−３２５（１９９７）に見出され得る。
【００８９】
全てではないがほとんどの上記の腫瘍特異的プロモーターの遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースから入手可能である。
【００９０】
（γ３４．５に加えた構築物における他の変異／欠失）
本発明のウイルス変異体はまた、任意のウイルス遺伝子（その哺乳動物ホモログは、上昇したレベルのＥ２Ｆによってアップレギュレートされる）、ただし、最もこの好ましくは複製に必要とされる遺伝子中にさらなる変異を保有し得る。
【００９１】
例えば、哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼ（ｍＲＲ）は、細胞周期のＧ1期の間にアップレギュレートされ、そしてこの転写は、「遊離」のＥ２Ｆによって調節される（ＤｅＧｒｅｇｏｒｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４２１５−４２２４（１９９５）；Ｌｕｋａｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１０４７−１０５７（１９９６）；Ｄｙｎｌａｃｈｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１７７２−１７８６（１９９４））。ＲＲ-ウイルス変異体は、新生物性細胞において補体哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼ（ｍＲＲ）の存在に起因して、これらの細胞において選択的に複製すると仮説が立てられている（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＷｅｌｌｅｒ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６−２０５（１９８８））。
【００９２】
遊離Ｅ２Ｆレベルの上昇は、いくつかの哺乳動物遺伝子（そのウイルスホモログは、ウイルスの複製に必要とされる）の発現の増加を引き起こす。リボヌクレオチドレダクターゼ（ｍＲＲ）に加えて、これらの遺伝子としては、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、およびウラシルトリホスファターゼ酵素（ｄＵＴＰａｓｅ）が挙げられる。これらの遺伝子の１つ以上に変異を含むウイルスは、上昇したレベルの遊離Ｅ２Ｆを有する細胞において、選択的に複製する。従って、本発明は、γ３４．５における変異に加えて、これらの遺伝子の１つ以上に変異を有するヘルペスウイルス変異体を含む。本発明の好ましい実施形態において、この変異は、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の中である。
【００９３】
Ｅ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５を含む）は、ｐｌ６、サイクリンＤ／ｃｄｋ４、およびｐＲＢを含む細胞周期調節転写カスケードの初期メディエーターのようである（ＤｅＧｒｅｇｏｒｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４２１５−４２２４（１９９５）；Ｌｕｋａｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１０４７−１０５７（１９９６；Ｄｙｎｌａｃｈｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１７７２−１７８６（１９９４））。従って、このカスケードに関与する遺伝子における欠失は、増加したレベルのＥ２Ｆを導き得、これによって、哺乳動物のＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧおよびｄＵＴＰａｓｅのレベルを増加する。例えば、ｐ１６、ｐ２１および／またはｐ２７の発現に欠失を有する細胞は、サイクリンＤ、サイクリンＤキナーゼ４（Ｃｄｋ４）および／またはサイクリンＤキナーゼ６（Ｃｄｋ６）のレベルを増化し得、これは、次には増加したｐＲＢのリン酸化を導き得、それによってＥ２Ｆを遊離する。さらに、ｐＲＢ、ｐ１０７および／またはｐ１３０、ＤＰ１、ＤＰ２、および／またはＤＰ３の発現に欠失を有する細胞はまた、増加したＥ２Ｆの遊離を導き得る。
【００９４】
大多数の腫瘍は、このカスケードの成分をコードする遺伝子の不活性化を保有し（Ｕｅｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１５０−１５３（１９９６））、従って、Ｅ２Ｆを遊離し、そして哺乳動物のＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧ、およびｄＵＴＰａｓｅの転写を可能にする。さらに、他の癌抑制遺伝子または癌遺伝子における変化はまた、増加したレベルの遊離Ｅ２Ｆを導き得、それによって、哺乳動物のＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧ、およびｄＵＴＰａｓｅのレベルを増加する。従って、ＲＲ-ウイルス変異体、ＴＫ-ウイルス変異体、ＵＮＧ-ウイルス変異体、およびｄＵＴＰａｓｅ-ウイルス変異体は、腫瘍細胞の大きな割合を効果的に標的化し得る（特に、「遊離」Ｅ２Ｆの増加を導くｐｌ６／サイクリンＤ／ｐＲＢ経路における欠失を保有する場合）。
【００９５】
さらに、多くの異なる起源（例えば、肺、胸部、前立腺、脳、肝臓、膵臓、皮膚など）由来の腫瘍細胞は，上昇したレベルのＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧ、およびｄＵＴＰａｓｅを導く上記の経路において変化を有し、従って、本発明のウイルス変異体に対する標的である。例えば、神経膠腫瘍細胞株（ラット９Ｌ細胞、ヒトＵ８７細胞、およびヒトＴ９８細胞）は、ｐ１６の不活性化変異（Ｖａｎ  Ｍｅｉｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６４９−６５２（１９９４））、ならびに上昇したレベルのｍＲＲを保有する。従って、これらの細胞は、野生型ＫＯＳ株に近いレベルまでＨＳＶ−１由来のウイルス変異体ｒＲｐ４５０の複製を補完し得、一方、検出可能でないレベルのｍＲＲである（かつ正常なｐ１６経路を有する）ニューロンは、補完しなかった。
【００９６】
「リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子」は、酵素（リボヌクレオチドレダクターゼ）の任意のサブユニットまたは一部をコードする核酸を意図し、機能的であろうとまたは非機能的であろうと、この核酸が細胞で発現される場合、この部分またはサブユニットが産生される。リボヌクレオチドレセプターダクターゼ（ＲＲ）は、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒する、ＤＮＡ前駆体のデノボ合成における重要な酵素である。ＨＳＶ−１は、２つの非同一のサブユニットから構成される自分自身のＲＲ（ＵＬ３９およびＵＬ４０遺伝子）をコードする（Ｄｕｉｔａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５１３（１９８３））。ラージサブユニット（１４０ｋ分子量）（ＩＣＰ６と命名される）は、スモールサブユニット（３８ｋ分子量）と密接に関連している。単純ヘルペスウイルスＲＲは、非分裂細胞における効率的なウイルス増殖に必要とされることが見出されているが、多数の分裂細胞では必要とされていない（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６（１９８８）；ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ｖｉｒｏｌ．１６６：４１（１９８８）；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．１７３：２７６（１９８９））。ＲＲのスモールサブユニットにおける変異はまた、ＲＲ活性および神経病原性の喪失を生じるが（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｊ．Ｇｎｅ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６０７（１９８８））、特に好ましいのは、ラージサブユニットにおける変異である。
【００９７】
リボヌクレオチドレダクターゼＩＣＰ６のプロモーター領域は、ＩＣＰ６構造遺伝子の５’上流配列にマッピングされる（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６（１９８８）；ＳｚｅおよびＨｅｒｍａｎ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２６：１４１（１９９２））。ＲＲのスモールサブユニットの転写開始部位（すなわち、ＵＬ４０）は、ＩＣＰ６のコード領域内に分類される（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎおよびＣｌｅｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：９９７（１９８３）；ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１（１９８８））。
【００９８】
ＨＳＶ−１ゲノムを用いて本明細書中で示されるウイルス変異体に基づいたＨＳＶ−２由来のウイルス変異体は、本発明によって包含される。ＨＳＶ−２は、両方のＲＲサブユニットを含み；さらに、ＨＳＶ−２  ＩＣＰ１０は、ＨＳＶ−１  ＩＣＰ６に類似性である。Ｎｉｌａｓら、Ｒｒｏｔｅｉｎｓ  １：３７６（１９８６）；ＭｃＬａｕｇｈｌａｎおよびＣｌｅｍｅｎｔｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１９５３（１９８３）；ＳｗａｉｎおよびＨａｌｌｏｗａｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：８０２（１９８６）。
【００９９】
リボヌクレオチドレダクターゼ欠損（ＲＲ-）と他の単純ヘルペスウイルス変異体との間の１つの差異は、アシクロビルおよびガンシクロビルに対する過感受性である。当該分野で公知のＴＫ-ＨＳＶ−１変異体は、これらの抗ウイルス剤に対して抵抗性であるため、これらの変異体は、全身感染または脳炎の事象の際、除去するのが困難であり得る。対照的に、ウイルス脳炎の事象において、ＴＫ+ウイルス変異体（例えば、ＲＲ-−ＨＳＶ変異体）は、抗ウイルス治療に対して応答性である。
【０１００】
さらに、ＲＲ-−ＨＳＶ変異体は、感染を行なう能力およびインビトロで３９．５℃でウイルスＤＮＡを合成する能力が損なわれる（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６６：４１（１９８８））。従って、これらの変異体は、神経毒性が弱毒化され、そして、感染した宿主における熱の事象において、より増殖しそうにない。このような特徴は、弱毒化された神経毒性でなければららない治療ベクターに対して重要であり、そして、ウイルス脳炎の事象の際、抗ウイルス治療を受け入れられる。
【０１０１】
ＲＲ-ウイルス変異体の温度感受性は、本発明のウイルス変異体の別の利点を実証する。ウイルス変異体で処置された患者において、多数の宿主因子（熱、抗ウイルス免疫応答）が、このウイルス変異体の増殖を阻害することが可能である。これらの場合において、化学療法剤および導入遺伝子による活性化を使用した処置（ウイルス変異体によって感染された細胞のための）が、補充的な抗癌処置を提供することが予測される。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、「変異」は、その遺伝子の発現が有意に減少するか、またはその遺伝子産物が非機能的になるか、または機能に対するその能力が有意に減少する、遺伝子に対する任意の変更をいう。用語「遺伝子」は、遺伝子産物を含むコード領域およびその遺伝子についての調節領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の両方を含む。このような変更は、遺伝子の非機能的産物を付与するかまたは遺伝子の発現を減少し、その結果、ウイルス変異体は、本発明の性質を有する。さらに、本発明は、目的の１つ以上の遺伝子における１つ以上の変異を有する変異体を含む。従って、「ａ」は、１つ以上を意図する。
【０１０３】
このような変更を達成する方法としては：（ａ）遺伝子の産物の発現を破壊する任意の方法；または（ｂ）発現タンパク質を非機能的にする任意の方法を包含する。遺伝子の発現を破壊することが公知の多数の方法は、挿入、欠失、および／または塩基変化によって、遺伝子またはそのプロモーター配列のコード領域の変更を含むことが公知である。（Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ．およびＪｅｎｋｉｎｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０８−１２１４（１９８５）を参照のこと）。欠失は、好ましい変異である。
【０１０４】
操作されたウイルスの構築およびＤＮＡ配列の遺伝的操作のための方法は、当該分野で公知である。一般的に、これらは、Ａｕｓｕｂｅｌら、１６章、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；Ｐａｏｌｅｔｔｉら、米国特許第４，６０３，１１２号（１９８６年７月）を含む。ウイルス学的考慮はまた、Ｃｏｅｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０（第２版）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  １２３−１５０頁において、総説される。
【０１０５】
ＨＳＶ−１変異体の構築は、例えば、Ｍａｒｔｕｚａら、米国特許第５，５８５，０９６号（１９９６年１２月）；Ｒｏｉｚｍａｎら、米国特許第５，２８８，６４１号（１９９４年２月）；Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ．およびＪｅｎｋｉｎｓ，Ｆ．Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０８−１２１４（１９８５）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２９５２（１９９２）；Ｇａｇｅ，Ｐ．Ｊ．ら編、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５５０９−５５１５（１９９２）；ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６−２０５（１９８８），Ｃｏｅｎ，Ｄ．，第７章、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０（第２版）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ；ＢｒｅａｋｅｆｉｅｌｄおよびＤｅＬｕｃａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３：２０３（１９９１）；ＬｅｉおよびＯｌｉｖｏ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １５：５４７（１９９３）；Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：２６５（１９９２）；Ｃｈｏｕ、Ｊ．およびＲｏｉｚｍａｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３２６６−３２７０（１９９２）Ｓｈｉｈら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ８５，１９８５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１７７−１８０頁；Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７）；Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，Ｊ．Ｃ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：６７５−７１０（１９９５）；Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ２２：２４３（１９８０）において記載される。
【０１０６】
ウイルスゲノムの遺伝的変更は、制限エンドヌクレアーゼ消化したウイルスＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション、ウイルスＤＮＡの変異した領域の配列決定、新しい（または失われた）制限エンドヌクレアーゼ部位の検出、リボヌクレオチドレダクターゼ活性の酵素学的活性などの標準的な方法によって、決定され得る（Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．およびＢａｃｃｈｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：５８０−５９８（１９８１））。変異したウイルス遺伝子（例えば、ＲＲ）の哺乳動物の相同体を欠く細胞については、ウイルスゲノムの遺伝子変更は、（１）変異したウイルス相同体（例えば、ＲＲ）の抗体を使用する感染した細胞タンパク質のウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ分析によってか、または、（２）変異したウイルス相同体（例えば、ＲＲ）の転写についての感染した細胞のノーザンブロット分析によって、決定され得る（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７３：２７６−２８３（１９８９））。１つ以上の遺伝子において変異したウイルス変異体は、変異誘発後に単離され得るか、または、ウイルスゲノムと遺伝的に操作した配列との間の組換えを介して構築され得る。
【０１０７】
「アップレギュレーション」は、上流制御される遺伝子産物をコードする遺伝子の発現が、非腫瘍性細胞において見出されるように、この産物の発現の基本レベルよりも、より高いことを意図する。
【０１０８】
「遊離Ｅ２Ｆのレベルが上昇した」は、細胞中の利用可能な未結合Ｅ２Ｆの量が、非腫瘍性細胞に代表的に見出される量よりもより大きいことを意味する。
【０１０９】
「選択的に腫瘍性細胞を殺傷する」は、本発明のヘルペスウイルス変異体が、非腫瘍性細胞ではなく、腫瘍性細胞を主に標的にすることを意味する。
【０１１０】
「腫瘍性細胞」は、正常な増殖制御機構が破壊された（代表的に蓄積された遺伝子変異によって）細胞を意味し、それによって、制御されていない増殖の可能性を提供する。従って、「腫瘍性細胞」は、分裂細胞および非分裂細胞の両方を含む。本発明の目的のために、腫瘍性細胞は、腫瘍、新生物、癌、肉腫、白血病、リンパ腫などの細胞を含む。特に興味深いのは、中枢神経系腫瘍、特に、脳腫瘍である。これらとしては、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、脳室上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫などが挙げられる。本発明は、腫瘍学のために、末梢および脳における良性および悪性腫瘍性細胞の両方を標的するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語末梢は、脳の外側の体の他の全ての部分を意味することが意図される。従って、末梢腫瘍は、脳の外側の体の部分における腫瘍を意味することが意図される。
【０１１１】
（ヘルペスウイルス変異体によって運搬される導入遺伝子）
ヘルペスγ３４．５遺伝子（およびおそらく１つ以上のさらなる変異（上記のように、例えば、ＲＲ、ＴＫ、ＵＮＧ、またはｄＵＴＰａｓｅ））の発現を駆動する腫瘍特異的または細胞特異的プロモーターを有することに加えて、本発明のウイルス変異体はまた、異種導入遺伝子を運搬する。
【０１１２】
導入遺伝子は、自殺遺伝子、すなわち、化学療法剤を、その細胞傷害性形態に活性化可能である遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ、ＣＤ、またはシトクロムＰ４５０）である。好ましい実施形態において、この自殺遺伝子は、シトクロムＰ４５０遺伝子である。
【０１１３】
「化学療法剤をその細胞傷害性形態に変換可能である遺伝子産物」は、遺伝子産物が以前にそれに対して作用したよりも、より細胞傷害性を付与する化学療法剤に対して作用する遺伝子産物を意味する。化学療法剤をその最も細胞傷害性形態に変換するために、この遺伝子産物に加えて、他のタンパク質または因子が必要であり得る。
【０１１４】
「化学療法剤をその細胞傷害性形態に変換可能な遺伝子産物をコードする導入遺伝子」は、発現の際に、この遺伝子産物を提供する核酸を意味する。
【０１１５】
「細胞傷害性」は、細胞死を引き起こすまたは細胞死に導くことを意味するように、本明細書中で使用される。
【０１１６】
「遺伝子産物」は、広く特定の遺伝子によってコードされるタンパク質をいう。
【０１１７】
「化学療法剤」は、新生物の処置において使用され得る薬剤、およびプロドラッグから細胞傷害性形態へ活性され得る薬剤をいう。好ましくは、本発明における使用のための化学療法剤は、ウイルス変異体の複製を有意に阻害せず、これは、ウイルス複製が、感染した細胞の死を導き、そして、ウイルスの他の細胞への広がりを増幅させるのに十分なレベルで生じることを意味する。
【０１１８】
用語「シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子」は、Ｐ４５０  ２Ｂ１、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１１、またはＰ４５０  ３Ａ４などの哺乳動物シトクロムＰ４５０遺伝子を意味する。これらの遺伝子のそれぞれは、抗癌薬物シクロホスファミドおよびイホスファミドの活性化に関連しており（Ｃｌａｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：２３４４−２３５０（１９８９）；Ｃｈａｎｇら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：５６２９−５６３７（１９９３）；ＷｅｂｅｒおよびＷａｘｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４５：１６８５−１６９４（１９９３））そして、これらの遺伝子のｃＤＮＡ配列はまた、公開されている（Ｎｅｌｓｏｎら、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２：１−５１（１９９３）および本明細書中に記載された参考文献；Ｙａｍａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：１３２２−１３２９（１９９０）；Ｙａｍａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：７３４０−７３４８（１９８９））。さらに、シトクロムＰ４５０はまた、Ｎ−メチルシクロホスファミド（Ｎ−メチルＣＰＡ）、メチルシクロプロピルニトロソウレア（ＭＣＰＮＵ）、およびＣＰＡ、イホスファミド、Ｎ−メチルＣＰＡ、およびＭＣＰＮＵのポリマー形態を活性化し得る。化学療法剤のポリマー形態は、Ｂｒｅｍ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１：６９９−７０１（１９９０）；ＢｕａｈｉｎおよびＢｒｅｍ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ  ２６：１０３−１１０（１９９５）；Ｔａｍａｒｇｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３２９−３３３（１９９３）；ならびにＬａｎｇｅｒ，Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２３：１０１−１１１（１９９５）において考察される。
【０１１９】
当業者は、酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーによって活性化される他の多数の抗癌薬物を使用して（ＬｅＢｌａｎｃおよびＷａｘｍａｎ、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．２０：３９５−４３９（１９８９））、および、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ１、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１１、またはＰ４５０  ３Ａ４に相同な他の種（例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、イヌなど）由来の薬物代謝シトクロムＰ４５０遺伝子（それらのｃＤＮＡ配列は公知である（Ｎｅｌｓｏｎら、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２：１−５１（１９９３）））を使用して、本発明の方法を利用し得る。特に好ましい実施形態では、チトクロームＰ４５０  ２ＢＩをコードする遺伝子が使用される。
【０１２０】
ヘルペスウイルス変異体が自殺遺伝子を含む場合、ウイルス変異体がウイルス腫瘍崩壊および自殺遺伝子の送達によって腫瘍細胞を殺傷することを可能にするように、自殺遺伝子によって活性化される化学療法剤は、ウイルス変異体の複製を有意に阻害するべきではない。化学療法剤またはその活性代謝産物が、代わりにＤＮＡ架橋によってかまたはＤＮＡ修復を阻害することによって作用する、化学療法剤／導入遺伝子の組み合わせの使用は、ウイルス変異体の複製を有意に阻害しない。従って、このような化学療法剤／導入遺伝子の組み合わせが、本発明のウイルス変異体および方法によって包含される。
【０１２１】
従って、好ましい化学療法剤／導入遺伝子の組み合わせは、ＣＰＡ、イホスファミド、Ｎ−メチルシクロホスファミド、ＭＣＰＮＵ、またはＣＰＡ、イホスファミド、Ｎ−メチルシクロホスファミドおよびＭＣＰＮＵのポリマー形態と組み合わせたシトクロムＰ４５０である。より好ましい化学療法剤／導入遺伝子の組み合わせは、ＣＰＡ／シトクロムＰ４５０  ２Ｂ１である。
【０１２２】
本発明における使用のための他の化学療法剤／導入遺伝子の組み合わせは以下を含む：ＣＢ１９５４／Ｅ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼ（Ｆｒｉｅｄｌｏｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１０５−１１２（１９９８）；Ｇｒｅｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：２２９−２３８（１９９７））；トポイソメラーゼＩまたはＩＩインヒビター／エステラーゼ様活性を有する酵素（例えば、ＣＰＴ−１１／カルボキシルエステラーゼ（Ｊａｎｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０：３３５−３４０（１９９７）；Ｄａｎｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２０−２２（１９９８））；４−イポメアノール／シトクロムＰ４５０  ４Ｂ１（Ｖｅｒｓｃｈｏｙｌｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２３：１９３−１９８（１９９３））；ならびに２−アミノアントラセン／シトクロムＰ４５０  ４Ｂ１（Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１５６７−１５７５（１９９５））。
【０１２３】
ＣＰＡなどのアルキル化剤の使用は、抗癌効果を提供するが、ウイルスタンパク質合成またはウイルス複製を有意に阻害しない。この発見についての説明は、これらの薬物の作用の型に存在し得る。ＣＰＡの活性代謝物、ホスファミドマスタード（ＰＭ）は、細胞内ＤＮＡにおける鎖間および鎖内架橋を生成する。多数のＤＮＡ鎖の切断が架橋部位で発生する場合、細胞内ＤＮＡに対する最大の細胞傷害性は、通常、有糸分裂の間に達成される（Ｃｏｌｖｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｈｏｌｌａｎｄら編、１９９３．ＬｅａおよびＦａｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，７３３−７３４頁）。対照的に、非有糸分裂、架橋ウイルスＤＮＡは、広範な損傷から逃れ得、従って、細胞内ＤＮＡよりもより簡単に修復され得る。
【０１２４】
ガンシクロビルは、活性化されたとき、ウイルス複製を阻害する化学療法剤の一例である。ｈｒＲ３およびガンシクロビルの組み合わせが、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子によるガンシクロビルの変換に起因して有意な抗癌効果を提供することが実証されているが（Ｂｏｖｉａｔｓｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：  ５７４５−５７５１  （１９９４））、変換されたガンシクロビル分子もまたウイルス複製を阻害する。この理由のために、ＴＫ／ＧＣＶの使用は、この範例において好ましい選択ではないかもしれない。プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ）は、「偽」ヌクレオチドとして作用する抗癌代謝産物を生成する。これは、ＤＮＡ鎖の複製の未熟な終結を生じる。従って、これらのプロドラッグ活性化酵素は、ウイルスＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方の合成に影響することが予想され、自殺遺伝子を含む本発明のヘルペスウイルス変異体において使用するために良好な選択ではない。
【０１２５】
その作用機構がＤＮＡの架橋またはＤＮＡ修復酵素の阻害である化学療法剤を使用する別の利点は、これらの薬剤がＧ0の細胞に対してさえも有効であることである。従って、これらの薬剤が腫瘍性細胞の殺傷において有効であるために、標的化された細胞は、その薬物が投与された時点で活発に分裂する必要はない。これは、大部分の細胞がＧ0期にある腫瘍について有意な利点である。
【０１２６】
このタイプの腫瘍の一例は、膠芽腫である。膠芽腫については、増殖割合、または任意の一時点で腫瘍において増殖する細胞の相対的割合は、３０％でしかなく、残りの７０％の細胞は、Ｇ0期にある。これらの腫瘍は、特に、活発に分裂する細胞をのみ標的化する化学療法剤に対して耐性である。なぜなら、活発に分裂する３０％の膠芽腫細胞は、この腫瘍の致死的進行に寄与するが、この細胞の７０％は、Ｇ0期にあり、死亡するかもしれないし、または活動細胞周期に再進入するかもしれない。Ｙｏｓｈｉｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６５：６５９−６６３（１９８６）。従って、静止している７０％が、活発に分裂している細胞を標的化する化学療法剤に対するこれらの腫瘍の耐性の原因である。
【０１２７】
この実施例は、本発明の別の利点を実証する。本発明のウイルス変異体および方法は、条件的複製ウイルスまたは複製能を有さないウイルスの媒介する腫瘍崩壊（ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ）単独に基づく治療を超える利点を提供する。これらの治療は、ウイルス変異を補い得る細胞のみを標的化するからである。一方、本発明のウイルス変異体は、導入遺伝子における複製、および溶解、導入遺伝子の発現および活性化について高レベルのＥ２Ｆを伴う細胞（主に腫瘍性細胞）を標的化するが、化学療法剤は、次いで周囲の腫瘍細胞に拡散し得る、活性な代謝産物を提供する。これらの代謝産物は、それにより、Ｇ0期にある周囲の腫瘍細胞（膠芽腫における細胞の７０％）でさえも殺傷し得る。
【０１２８】
従って、本発明は、膠芽腫の処置において特別の用途を見出す。膠芽腫は、全ての原発性脳腫瘍のおよそ３０％または５０％を代表し、そして手術、化学療法、および放射線療法にもかかわらず、ほとんど一般的に致死的である。
【０１２９】
ヘルペスウイルス変異体により保有される遺伝子の遺伝子産物による化学療法剤の局所活性化に起因して、本発明の方法は、同じ薬物濃度では、より腫瘍傷害性となり、従って、正常細胞に対する傷害性を増大させることなく、より高い腫瘍投与量とすることが可能である。さらに、全身腫瘍集団の化学療法処置もまた、本発明の方法を用いることにより改善され得る。なぜなら、薬物のより低い用量が、増大した効力によって可能であり得るからである。
【０１３０】
さらに、化学療法剤の局所活性化は、別の利点を提供する。いくつかの化学療法剤は、末梢における細胞または器官において活性化または活性状態への変換を必要とするが、しかし、しばしば、活性（細胞傷害性）代謝産物は、血液脳関門を横断し得ず、従って脳腫瘍に対して有効ではない。従って、本発明の方法は、これらの化学療法剤による脳腫瘍の処置を可能にするべきである。１つのこのような化学療法剤は、ＣＰＡである。ＣＰＡは、中枢神経系新生物に対して大いに有効でない。なぜなら、ＤＮＡアルキル化の細胞傷害性代謝産物へのそれの変換は主として肝臓に制限され、そしてこれらの代謝産物は、血液脳関門を容易に横断しないからである。しかし、本発明のウイルス変異体（チトクロームＰ４５０遺伝子を保有するように操作され、そして脳腫瘍に適用される）の使用は、ＣＰＡの局所活性化を提供し得る。従って、好ましい実施形態では、チトクロームＰ４５０遺伝子は、シクロホスファミド（ＣＰＡ）の細胞傷害効果に対して中枢神経腫瘍細胞を感作するために使用される。
【０１３１】
「自殺遺伝子」に加えて、導入遺伝子はまた、腫瘍指向性免疫応答を刺激または増強するサイトカインをコードし得る。Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｔ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：  １０４７−１０５２  （１９９１）；  Ｃｏｌｏｍｂｏ，  Ｍ．  Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．  １６：  ４２１−４３２  （１９９７）；  Ｃｏｌｏｍｂｏ，  Ｍ．  Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １５：  ４８−５１  （１９９４））を参照のこと。代表例としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−γ、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））が挙げられる。
【０１３２】
導入遺伝子はまた、癌抑制遺伝子、または当業者に公知の任意の他の殺腫瘍性遺伝子（例えば、ジフテリア毒素（Ｃｏｌｌ  Ｆｒｅｓｎｏ，  Ｐ．  Ｍ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：  ２４３−２４７  （１９９７））、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイム（Ｚａｉａ，  Ｊ．  Ａ．ら、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ６６０：  ９５−１０６  （１９９２））をコードし得る。
【０１３３】
従って、本発明のこの実施形態では、γ３４．５遺伝子の腫瘍特異的または細胞特異的プロモーター駆動発現を伴うヘルペスウイルス変異体は、化学療法剤をその細胞傷害形態に変換し得る遺伝子産物をコードする導入遺伝子、または上述したような任意の他の殺腫瘍導入遺伝子をさらに含む。導入遺伝子は、これが発現される任意の位置でウイルスゲノム中に挿入され得る。導入遺伝子についてウイルスゲノムにおける好ましい位置は、もとのγ３４．５欠失の遺伝子座であるか、またはヘルペスＵＬ４０遺伝子座のいずれでもある。
【０１３４】
（ヘルペスウイルス変異体の投与）
本発明の方法に従う処置のための例示の候補としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）腫瘍特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターにより特徴付けられる新生物に罹患した非ヒト動物；（ｉｉ）腫瘍特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターにより特徴付けられる新生物に罹患したヒト；（ｉｉｉ）特定の細胞集団を根絶する必要のあるヒトまたは非ヒト動物。
【０１３５】
「腫瘍性細胞」とは、正常な増殖制御機構が破壊されて（代表的には、遺伝子変異の蓄積によって）、それによって制御されない増殖能を提供する細胞が意図される。この用語は、中枢神経系および末梢の両方における良性および悪性の両方の腫瘍性細胞を含むことが意図される。本明細書中で使用されるように、用語「末梢」は、脳または脊髄の外側の身体の他の全ての部分を意味することが意図される。
【０１３６】
本発明の目的のために、腫瘍性細胞は、腫瘍、新生物、癌腫、肉腫、乳頭腫、白血病、リンパ腫などの細胞を包含する。特に興味深いのは、哺乳動物身体の任意の器官または組織において生じ得る固形腫瘍である。
【０１３７】
悪性脳腫瘍は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、脳室上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）、および髄芽細胞腫を包含する。
【０１３８】
好ましくは、この処置は、直接的な新生物内接種によって開始される。脳内の腫瘍について、ＭＲＩ、ＣＴ、または他の画像化誘導定位技術（ｉｍａｇｉｎｇ  ｇｕｉｄｅｄ  ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）が、ウイルス接種を指示するために使用され得るか、またはウイルスが、開頭時に接種される。特定の細胞集団を根絶しようとする患者について、ベクターが、目的の組織に接種される。
【０１３９】
一般に、目的の細胞のウイルス感染のための方法は、当該分野で公知である。例えば、ウイルス変異体は、新生物増殖の部位でまたはその近傍に注入され得るか、または血管内接種によって投与され得る。代表的には、ウイルス変異体は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注入可能物として調製され得る；注入前に液体に入れて溶液または懸濁液とするのに適切な固形形態もまた調製され得る。調製物はまた、乳化され得る。活性成分は、好ましくは、薬学的に受容可能であり、かつ活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、調製物は、少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバントまたは免疫増強剤（これは、ウイルス変異体の有効性を増強する）を含有し得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．  Ｒ．ら編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，出版，第１８版、１９９０を参照のこと）。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、水溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム）、リンガーデキストロースなどが挙げられる。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充物（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）を含む。薬学的組成物のｐＨおよび種々の成分の正確な濃度の決定は、慣用的であり、当業者の知識の範囲内である（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｇｉｌｍａｎ，  Ａ．  Ｇ．ら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，出版，第８版、１９９０を参照のこと）。
適切であるさらなる処方物は、経口処方物を包含する。経口処方物は、以下のような代表的な賦形剤を含む（例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）。経口組成物は、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方物、または粉末の形態をとり得、そして１０〜９５％の活性成分、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含み得る。
【０１４０】
投与されるべきウイルス変異体の投薬量（治療数および量に関して）は、処置される被験体、この被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される防御の程度に依存する。投与されることが必要とされる活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、そして各個体に特有である。大部分では、ウイルスは、標的細胞を感染および殺傷するのに治療的に有効な量で提供される。
【０１４１】
（腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法）
本発明はまた、上記のヘルペスウイルス変異体を用いて公知の腫瘍特異的プロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法を提供する。この方法は、腫瘍性細胞にヘルペスウイルス変異体を感染させる工程、および腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程を包含し、このウイルス変異体は、（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異；および（ｂ）腫瘍特異的プロモーターの転写制御下にある少なくとも１コピーのγ３４．５遺伝子の挿入であって、これによりこのプロモーターがγ３４．５遺伝子の発現を駆動する、挿入を含む。
【０１４２】
もちろん、上記方法で使用されるヘルペスウイルス変異体において、γ３４．５遺伝子に加えて、ヘルペスウイルス遺伝子の１つより多い特異的内因性欠失または不活性化変異が存在し得る。これらは、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）をコードする遺伝子における欠失、またはより特定すると、ＲＲの大きなサブユニットを含む。あるいは、ＲＲをコードする遺伝子は、スモールサブユニットをコードする。任意の他のヘルペスウイルス遺伝子もまた欠失され得る。例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、またはｄＵＴＰａｓｅ。これらのウイルス遺伝子は好ましい。なぜなら、これらの遺伝子の哺乳動物ホモログが、しばしば、高レベルのＥ２Ｆを有する細胞（例えば、腫瘍性細胞）においてアップレギュレートされ、従って、欠失されたウイルス酵素を補い得、それによりそれらの細胞において選択的な複製を促進するからである。
【０１４３】
例示の腫瘍特異的プロモーターは、上述され、そして、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、チロシナーゼ、およびＰＳＡを包含する。腫瘍細胞はまた、特定の癌遺伝子を過剰発現することが公知であり、従ってアップレギュレートされた遺伝子発現を伴う細胞は、このような遺伝子のプロモーターエレメントを用いて標的化され得る。Ｂ−ｍｙｂ、Ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｋｉｔ、およびｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子は、これらのタイプのいくつかの代表的な例である。Ｂ−ｍｙｂプロモーター（Ｌｙｏｎ，  Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ５：  ３７３−３８８  （１９９４）を参照のこと）は、コンセンサスＥ２Ｆ結合部位を含み、細胞の周期において厳密に調節され、そして実際、Ｇ0期では抑制される（Ｌａｍ，  Ｅ．  Ｗ．およびＷａｔｓｏｎ，  Ｒ．  Ｊ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：  ２７０５−２７１３  （１９９３）；  Ｌａｍ，  Ｅ．  Ｗ．ら、Ｇｅｎｅ  １６０：  ２７７−２８１  （１９９５）；  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｊ．  Ｄ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：  １０７３−１０８２  （１９９６））。従って、Ｂ−ｍｙｂプロモーターは、特に好ましい腫瘍特異的プロモーターである。本方法の特に好ましい実施形態では、本方法において使用されるウイルス変異体は、Ｍｙｂ３４．５である。
【０１４４】
よく特徴付けられたプロモーターを有する任意の癌タイプが、本発明の方法において用途を見出す。このようなプロモーターの例は、以下に見出され得る：Ｃｌａｒｙ，  Ｂ．  Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：  ５６５−５７４  （１９９８）のＴａｂｌｅ  １；  Ｓｐｅａｒ，Ｍ．  Ａ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：  ３２２３−３２３２  （１９９８）のＴａｂｌｅ  Ｉ；  Ｗａｌｔｈｅｒ，  Ｗ．およびＳｔｅｉｎ，  Ｕ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７４：  ３７９−３９２  （１９９６）のＴａｂｌｅ  ２；およびＤａｃｈｓ，  Ｇ．  Ｕ．，ら、Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｓ．９：  ３１３−３２５  （１９９７））。
【０１４５】
上述の腫瘍特異的プロモーターの遺伝子配列の全てではなくてもほとんどが、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから入手可能である。
【０１４６】
さらに、本発明は、腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための上記方法を提供する。ここで、ヘルペスウイルス変異体が導入遺伝子をさらに含み、ここで導入遺伝子は、自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子、または任意の殺腫瘍性遺伝子である。導入遺伝子が自殺遺伝子である場合、この方法は、腫瘍性細胞を、自殺遺伝子によって活性化され得る化学療法剤と接触させる工程および腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程をさらに包含する。好ましい自殺遺伝子は、チトクロームＰ４５０である。Ｐ４５０  ２Ｂ１が特に好ましい。あるいは、コードされるチトクロームＰ４５０は、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１１、またはＰ４５０  ３Ａ４である。さらに、化学療法剤は、好ましくは、オキサゾスフォリンクラスのメンバーであり、特に、シクロホスファミド、イホスファミド、Ｎ−メチルシクロホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソウレア、ポリマー性シクロホスファミド、ポリマー性イホスファミド、ポリマー性Ｎ−メチルシクロホスファミド、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソウレアである。
【０１４７】
本発明の別の実施形態は、前述のウイルス変異体を含有する薬学的組成物である。ここで、この組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤もまた含み得る。
【０１４８】
（標的細胞集団を選択的に排除するための方法）
本発明の別の実施形態は、本発明のヘルペスウイルス変異体を使用して既知の細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を特異的に排除するための方法である。この方法は、この標的細胞をこのヘルペスウイルス変異体で感染する工程であって、このウイルス変異体は以下：（ａ）γ３４．５をコードする遺伝子における欠失および不活性化変異体；および（ｂ）この細胞特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも１つのコピーのこのγ３４．５遺伝子の挿入であって、その結果、このプロモーターはこのγ３４．５遺伝子の発現を駆動する挿入；ならびに標的細胞集団を選択的に排除する工程を包含する。
【０１４９】
「標的細胞集団を選択的に排除する」によって、多くの標的細胞対非標的細胞における顕著な減少、ならびに、標的細胞の完全かまたはほぼ完全な排除を含むことが意図される。
【０１５０】
もちろん、上記の方法で使用されるヘルペスウイルス変異体において、γ３４．５に加えて、ヘルペスウイルス遺伝子の１より多い特異的内因性欠失または不活性化変異体が存在し得る。これらは、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、またはより特定には、ＲＲのラージサブユニットをコードする遺伝子における欠失を含む。あるいは、ＲＲをコードする遺伝子は、スモールサブユニットをコードする。他の任意のヘルペスウイルス遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）またはｄＵＴＰａｓｅなど）はまた、欠失され得る。
【０１５１】
模範的な細胞特異的プロモーターは、以下を含む：上皮細胞に発現される血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ｆｌｋ１）プロモーター（Ｋａｐｐｅｌら、Ｂｌｏｏｄ  ９３：４２８２−４２９２（１９９９））；膵臓のベータ細胞に発現されるインスリンプロモーター（Ｒａｙら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８４：１９９−２０３（１９９９））；視床下部の細胞に発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子（Ａｌｂａｒｒａｃｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：２４１５−２４２１（１９９９））；破骨細胞およびケラチン生成細胞に発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ９プロモーター（Ｍｕｎａｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５５８８−５５９６（１９９９））；骨細胞に発現される副甲状腺ホルモンレセプター（Ａｍｉｚｕｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：３７３−３８１（１９９９）；ノルアドレナリン作動性ニューロンに発現されるドパミンβヒドロキシラーゼプロモーター（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１８１３−１８２６（１９９８））。
【０１５２】
本実施形態の模範的な適用は以下を含む：
１）有害な細胞集団を排除するための処置選択肢：例えば、血管の豊富な新脈管形成の存在する条件下（例えば、大脳のモヤモヤ病）において、γ３４．５遺伝子発現を駆動するためのｆｌｋ１レセプタープロモーターの使用は、この疾患を引き起こす血管の選択的排除を可能にする。別の例は、広範な骨再モデル化および骨の排除が存在する条件下において（例えば、骨粗しょう症）、γ３４．５の発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテイナーゼ９または副甲状腺ホルモンレセプターの使用は、更なる骨の再モデル化から破骨細胞を排除する
２）発達プロセスを研究するため：発達プロセスにおける細胞集団の排除の効果を研究するために、例えば、ドパミンβヒドロキシラーゼプロモーターを使用してノルアドレナリン作動性ニューロンを排除し、次いで、動物の発達に対する効果を研究し得る。
【０１５３】
以下の実施例は、限定の目的ではなく例示の目的で提供される。
【０１５４】
（実施例１）
（序論）
毒力をコードするγ３４．５遺伝子の欠失は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって媒介される細胞傷害性を顕著に減少する。腫瘍に対して細胞を溶解する毒力を標的するために、本発明者らは、Ｍｙｂ３４．５と名付けられた単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）変異体を作製した。このウイルス変異体は、（ＵＬ３９またはリボヌクレオチドレダクターゼとしても公知の）ＩＣＰ６における欠失によって、γ３４．５遺伝子（ＲＬ１）の２つの内因性コピーとして、そしてＥ２Ｆ応答性の細胞性Ｂ−ｍｙｂプロモーターの制御下でのγ３４．５の１つのコピーの再誘導によって特徴付けられる。
【０１５５】
マウスでの直接の大脳内播種において、Ｍｙｂ３４．５は、γ３４．５変異体ウイルスとして無毒性であり続けた。しかし、培養物中およびインビボの種々のヒト神経膠腫細胞に対するその腫瘍細胞崩壊性の効果は、野生型γ３４．５遺伝子を有する単一のＩＣＰ６変異体株のそれと類似した。抗腫瘍効果および保持した神経弱毒化の組み合わせは、細胞周期調節プロモーターが腫瘍に対して標的ＨＳＶ−１毒力を標的するために使用され得、一方、γ３４．５変異体の所望の神経弱毒化表現型を維持する。
【０１５６】
（方法および材料）
（プラスミドおよびウイルス）
ＨＳＶ株Ｆ（野生型）を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を通じて取得した。変異体ウイルスＲ３６１６（Ｃｈｏｕ，Ｊ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０））（両方のγ３４．５座に１０００ｂｐのＢｓｔＥＩＩ−ＳｔｕＩの欠失を含む）は、Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ）によって親切にも提供された。変異体ウイルスｈｒＲ３（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｊ．およびＷｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６−２０５（１９８８））（Ｓ．Ｗｅｌｌｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）によって親切にも提供された）は、ＵＬ３９座に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ  ｃＤＮＡを含む。変異体ウイルスＭＧＨ１を、ＵＬ３９座へのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ  ｃＤＮＡの挿入および両方のγ３４．５座の欠失によって特徴付け、そしてウイルス変異体Ｒ３６１６（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７））へのｈｒＲ３のＩＣＰ６−ｌａｃＺ領域の再組換えによって構築した。ＩＣＰ６（ＫＯＳ起源、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｊ．およびＷｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２９７０−２９７７（１９８８）を参照のこと）の２．３ｋｂのＸｈｏＩ領域内にｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＫＫ−ＢＧ３は、２．３ｋｂのＩＣＰ６（ＵＬ３９）遺伝子を含むプラスミドｐＫｐＸ２と同様にＳ．Ｗｅｌｌｅｒによって提供された。γ３４．５コード配列の全体を含むプラスミドｐＢＧＬ３４．５は、Ｘａｎｄｒａ  ＢｒｅａｋｅｆｉｅｌｄおよびＰｅｔｅｒ  Ｐｅｃｈａｎ（ＭＧＨ）によって提供された。Ｂ−ｍｙｂプロモーターを、プラスミドｐＢＧＬ２ｍｙｂ（Ｒ．Ｗａｔｓｏｎ博士（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＫ）によって親切にも提供された）からのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして摘出し、そしてγ３４．５の上流に指向性にクローニングした。
【０１５７】
（Ｍｙｂ３４．５およびＭｙｂ３４．５復帰変異体の操作）
ＭＧＨ１への相同組換えによるＭｙｂ３４．５の操作のために使用されるプラスミドを設計し、ＭＧＨ１中のｌａｃＺ  ｃＤＮＡのその全体を置換し、そしてＩＣＰ６（ＵＬ３９）配列のさらなる８８８ヌクレオチドを欠失した。特に、再結合プラスミド（ｐＫｐＸ２−ｍｙｂ３４．５）を以下のように操作した。全長γ３４．５ｃＤＮＡをＮｃｏＩ−ＳａｃＩフラグメントとしてｐＢＧＬ３４．５から抽出し、平滑末端化し、次いで、ｐＢＳＫＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ）にサブクローニングしてプラスミドｐＢＳ３４．５を作製した。Ｂ−ｍｙｂプロモーターを、ｐＢＧＬ２ｍｙｂからＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして抽出して、そしてｐＢＳ３４．５にγ３４．５の上流に指向性にクローニングした。γ３４．５生じた発現カセット（ｃＤＮＡの上流にＢ−ｍｙｂプロモーターを含む）を、ＫｐｎＩ−ＸｂａＩフラグメントとして抽出し、平滑末端化し、次いで、ｐＫｐＸ２のＮｒｕＩ部位にサブクローニングした。このプロセスを通じて、ＵＬ３９内に介在するＮｒｕＩ−ＮｒｕＩフラグメントを欠失した。次いで、生じたプラスミドｐＫｐＸ２−ｍｙｂ３４．５を、ＳｃａＩで直線化し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で種々のモル比にてＶｅｒｏ細胞にＭＧＨ１ウイルスＤＮＡと共に同時トランスフェクトした。細胞病理学的効果が現れた場合に、ウイルスの子孫をトランスフェクションの５〜７日後に回収した。ウイルスの子孫は、３回の凍結融解を通じて細胞から再放出され、次いで、単層のＶｅｒｏ細胞上にプレートした。アガロースでこの単層を覆った後、５％二酸化炭素を含む雰囲気下にて３７℃でのインキュベーションを実施した。次いで、５−ブロモー４−クロロ−３−インドイリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）でプラークを染色した。染色されなかったプラークを、潜在的な組換え体として選択した。これらの単離体を、サザンブロット分析によって試験された遺伝的同一性を有する前に、プラーク精製を３回行った。親株としてのＭｙｂ３４．５ならびにＩＣＰ６座へ戻すｌａｃＺ  ｃＤＮＡの相同組換えおよびＢ−ｍｙｂ／γ３４．５発現カセットの欠失のためのプラスミドとしてのｐＫＸ−ＢＧ３を使用することによって、Ｍｙｂ３４．５復帰変異体（ＭｙｂＲｅｖｔ）を操作した。
【０１５８】
（サザンブロット分析）
感染させたＶｅｒｏ細胞の細胞融解後に、ウイルスＤＮＡを、ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の反復を反復して単離した。ＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ）で消化し、アガロース電気泳動で分離し、そしてナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）に転写した。プローブは、ｐＫｐＸ２由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩＩＣＰ６フラグメント、ｐＢＳＫγ３４．５由来のＢｓｔＥＩＩ−ＢｂｓＩフラグメント、およびｐＫＸ−ＢＧ３由来のＬａｃＺのＢｂｓＩフラグメントを含んだ。プローブ標識およびハイブリダイゼーションを、ＥＣＬ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って実施した。
【０１５９】
（細胞培養物の研究）
すべての細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１ｍｌ中１００Ｕのペニシリン、および１ｍｌ中１０μｇのストレプトマイシンを補填したＤｕｌｂｅｃｃｏ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で５％二酸化炭素を含む雰囲気下にて３７℃で培養した。宿主タンパク質合成遮断研究を、ウイルス株で１６時間細胞に感染させることによって実施した。次いで、細胞を、メチオニン不含培地中に１０分間置き、次いで、35［Ｓ］−メチオニン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）を使用して９０分間標識した。次いで、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７）で洗浄し、可溶化し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に転写し、そしてオートラジオグラフィーに供した。タンパク質濃度を、市販のキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）で計算した。感染した細胞ポリペプチド（ＩＣＰ）を、以前に刊行された（Ｍｏｒｓｅ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２６：３８９−４１０（１９７８））ように標識した。ヒト神経膠芽細胞株Ｕ８７、Ｕ３７３、Ｔ９８ＧおよびＵ３４３；ラット神経膠肉腫９Ｌ細胞；ヒト神経芽腫ＳＫＮＳＨ細胞およびＶｅｒｏ（アフリカミドリザル）細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得、そして１０％血清および抗生物質を補填したＤＭＥＭまたは最小α必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。マウス胎仔線条体神経初代細胞（胎仔段階１８）（Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｚｃｈｉｌｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｗｎ，ＭＡ）によって親切にも提供された）を、刊行された手順（Ｓｃｈｗａｒｚｓｃｈｉｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：３４５５−３４６６（１９９７））を使用して単離した。
【０１６０】
（動物の研究）
ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、Ｃｏｘ７  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ）から得た。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得た。皮下の腫瘍を、無胸腺症のマウス（９Ｌ神経膠肉腫細胞について１群あたり５動物、およびヒトＵ８７ΔＥＧＦＲ神経膠腫細胞について１群あたり６動物）の脾腹への２×１０5細胞を注射することによって得た。腫瘍移植後１４日目（９Ｌについて）または１０日目（Ｕ８７ΔＥＧＦＲについて）に、同様の腫瘍塊を有する動物を無作為に隔離し、そして種々のウイルス株を１００μｌ容積中に１容量あたり５×１０7ＰＦＵで、１、３、５および７日目に腫瘍内に注射した。動物を３３日目（９Ｌについて）または３４日目（Ｕ８７ΔＥＧＦＲについて）に安楽死させた。腫瘍塊を、以前（Ｗｅｉ，Ｍ．Ｘ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９６９−９７８（１９９４））に記載されるように外部測径器で測定した。神経毒性の実験について、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、１０μｌ容量のウイルスをストックの取得し得る最大の力価までの異なる希釈で、右前葉（深さ３ｍｍ）に定位的に注射した。動物を２８日間毎日チェックした。動物の研究の全てを、Ａｎｉｍａｌ  ＣａｒｅのＭＧＨ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって発行されるガイドラインに従って実施した。ウイルス播種およびウイルスを保有する動物の世話を、認可されたウイルスベクター室で実施した。
【０１６１】
（結果）
（Ｍｙｂ３４．５の遺伝的操作）
多重に変異されたウイルスＭｙｂ３４．５を、ＭＧＨ１のＵＬ３９（ＩＣＰ６またはＲＲとしても公知の）座にＢ−ｍｙｂプロモーター／γ３４．５構築物を再連結することによって構築した。ＭＧＨ１（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７））を、γ３４．５欠失変異体Ｒ３６１６（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）のＩＣＰ６座へのｌａｃＺ  ｃＤＮＡの再連結によって作製した。図１Ａは、Ｍｙｂ３４．５のＤＮＡ構造の模式図を提供する。この構造を、制限エンドヌクレアーゼマップ（データは示さず）、サザンブロットハイブリダイゼーション（図１Ｂ〜１Ｄ）、そしてＵＬ３９とＢ−ｍｙｂプロモーター／γ３４．５発現カセットとの間の連結の配列分析（データは示さず）によって確認した。Ｍｙｂ３４．５におけるｌａｃＺの欠失を示すために、ＸｈｏＩ消化したＭｙｂ３４．５ＤＮＡを、ＩＣＰ６（図１Ｂ）またはｌａｃＺ（図１Ｃ）の配列のいずれかを含むプローブとハイブリダイズした。予想通り、親ウイルスであるＭＧＨ１は、ＩＣＰ６プローブ（図１Ｂ）とハイブリダイズする９．０ｋｂのＸｈｏＩ  ＩＣＰ６−ｌａｃＺフラグメント（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら、前出）を含んだ。相同組換えは、ｌａｃＺおよびさらなるＩＣＰ６配列の欠失、ならびにＢ−ｍｙｂプロモーター／γ３４．５配列の挿入を導いた。これは、Ｍｙｂ３４．５ＤＮＡ（図１Ｂ）における６．７ｋｂフラグメントに対するＩＣＰ６プローブのハイブリダイゼーションによって明白である。ｌａｃＺプローブでのハイブリダイゼーションは、Ｍｙｂ３４．５から消化されたＤＮＡにおけるハイブリダイズするフラグメントの不存在、およびＭＧＨ１（図１Ｃ）から消化されたＤＮＡにおける期待された９．０ｋｂのハイブリダイズするフラグメントの存在を示した。Ｍｙｂ３４．５がγ３４．５遺伝子の再誘導を有することを確認するために、ＢａｍＨＩ消化したウイルスＤＮＡを、ＢｓｔＥ１１−Ｂｂｓγ３４．５フラグメント（欠失した領域の内部）とハイブリダイズした。これは、代表的には野生型Ｆ株で観察される、ハイブリダイズするバンドのラダーを示した。Ｃｈｏｕら（１９９１）（前出）の研究において議論されるように、γ３４．５はＢａｍＨＩ  ＳおよびＰのフラグメントをマップし、５００ｂｐずつ増加するバンドの特徴的なラダーを形成する。このラダーは、長い成分の独特の配列に隣接する反復における多くのａ配列が連続する。このラダーは、Ｆ株（図１Ｄのレーン１）についてのサザンブロットにおいて観察され、ここで、最も上のハイブリダイズするバンドは、終端のＢａｍＨＩ  ＳフラグメントとＢａｍＨＩ  Ｐとの融合によって形成されたＢａｍＨＩ  ＳＰフラグメントを示し、一方、最も下のハイブリダイズするバンドは、ＢａｍＨＩ  Ｓフラグメントを示す（Ｃｈｏｕ，Ｊ．らＳｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）。
【０１６２】
Ｒ３６１６ならびにその誘導体ウイルスであるＭＧＨ１、Ｍｙｂ３４．５およびＭｙｂ３４．５Ｒｅｖｔにおいて、全長γ３４．５ｃＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションに利用される場合、分子サイズが約１ｋｂ（Ｒ３６１６におけるγ３４．５の内部欠失のサイズ）だけ減少したハイブリダイズするバンドの同様のラダーは期待された。実際に、Ｃｈｏｕら（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０））の研究において、このハイブリダイゼーションパターンは、Ｒ３６１６について明白であり、Ｋｒａｍｍら（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７））の研究において、このハイブリダイゼーションパターンは、ＭＧＨ１について明白である。しかし、図１Ｄに示されたサザン分析について、Ｒ３６１６、ＭＧＨ１、Ｍｙｂ３４．５およびＭｙｂ３４．５Ｒｅｖｔのγ３４．５遺伝子の１ｋｂ欠失フラグメントの内部である、ＢｓｔＥＩＩ−Ｂｂｓγ３４．５フラグメントを、プローブとして利用した。従って、ＭＧＨ１（図１Ｄ、レーン２）およびＭｙｂ３４．５Ｒｅｖｔ（図１Ｄ、レーン４）についてハイブリダイズするバンドは観察されず、一方、γ３４．５遺伝子に対応する単一の５．３ｋｂのハイブリダイズするフラグメントが、Ｍｙｂ３４．５について観察され（図１Ｄ、レーン３）、ＩＣＰ６座に再導入される。
【０１６３】
Ｍｙｂ３４．５の改変された表現型が、Ｂ−ｍｙｂ／γ３４．５挿入の結果であったことを示すために、復帰変異体（マーカーが奪還された）ウイルスをまた操作し、そしてＭｙｂＲｅｖｔと称した。これは、親株としてＭｙｂ３４．５を、そして組換えるプラスミドとして線状化ｐＫＸ２−ＢＧ３を用いる、相同的組換えにより達成した。このプラスミドは、ｌａｃＺ／ＩＣＰ６挿入を含み、そしてＭＧＨ１中のＩＣＰ６：：ｌａｃＺ融合領域の供給源であるｈｒＲ３を創出するために用いた（Ｋｒａｍｍ、Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｄ．Ｊ．＆Ｗｅｌｌｅｒ、Ｓ．Ｋ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２９７０−２９７７（１９８８））。ＭｙｂＲｅｖｔ復帰変異体は、サザンハイブリダイゼーションで、ＩＣＰ６（図１Ｂ）、ｌａｃＺ（図１Ｃ）、およびγ３４．５（図１Ｄ）プローブに対するパターンを示し、これは、Ｍｙｂ３４．５の親株であるＭＧＨ１により示されるそれと同一であった。
【０１６４】
（γ３４．５の機能的発現）
γ３４．５が機能的γ３４．５タンパク質を産生したことを確認するために、ヒトＳＫＮＳＨ神経芽腫細胞を、種々のウイルス株で感染した。図２は、予期されるように、ＭＧＨ１および復帰変異体ウイルス（ＭｙｂＲｅｖｔ）が、インタクトなγ３４．５機能であるタンパク質合成の遮断からなる感染細胞応答（Ｃｈｏｕ、Ｊ．１９９２、前述）を防げないことを示す。しかし、Ｍｙｂ３４．５およびインタクトなγ３４．５をもつその他の株（野生型ＦおよびｈｒＲ３）は、感染細胞応答（タンパク質合成の遮断）を防ぎ、それ故ウイルスタンパク質産生に至った。
【０１６５】
Ｍｙｂ３４．５が機能的γ３４．５タンパク質を発現したことのさらなる証拠は、γ３４．５変異体ＨＳＶ株の複製を制限することを先に注記された（Ｍｏｈｒ．Ｉ．およびＢｌｕｚｍａｎ、Ｙ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：４７５９−５７６６（１９９６））、Ｕ３７３膠芽腫の細胞株におけるウイルス複製の評価により提供された。１．０のＭＯＩで、５×１０5細胞を感染し、そして４８時間後のウイルスアウトプットを回収した後、Ｍｙｂ３４．５収率は、野生型Ｆ株のそれと類似であった（それぞれ、１．１×１０7ＰＦＵ  対  ５．０×１０7ＰＦＵ）。対照的に、ＭＧＨ１（３．３×１０4ＰＦＵ）またはＭｙｂＲｅｖｔ（３．４×１０4ＰＦＵ、３つの実験の平均）の収率は有意により少なかった。ＭＧＨ１またはＭｙｂＲｅｖｔのそれとは対照的に、Ｍｙｂ３４．５がこの非許容株中で効率的に複製する能力は、Ｍｙｂ３４．５中でコードされたγ３４．５が機能的であったことを示す。
【０１６６】
（神経傷害性試験）
任意の複製能を有するＨＳＶ株の１つの重要な特徴は、その神経毒性のレベルであり、これは、インビトロおよびインビボの両方で評価され得る。Ｍｙｂ３４．５ウイルスが一次ニューロン培養で複製する能力は、Ｆ、ｈｒＲ３、ＭＧＨ１、およびＭｙｂＲｅｖｔ株との比較で測定した。マウス胎児線条体ニューロンを感染し、そしてウイルス収率をＶｅｒｏ細胞（これは、効率的ウイルス複製にγ３４．５を必要としない）上のプラークアッセイにより評価した。野生型Ｆ株はニューロン中で活発な複製を示したが、Ｍｙｂ３４．５を含むすべての変異体株は、最小のウイルス複製を示した（表１を参照のこと）。
【０１６７】
【表１】
0004551042.tif 000002
＊合計２．５×１０5のマウス胎児（１８日）線条体ニューロンを回収し、そして先に記載のようにプレートに撒いた（Ｃｈａｓｅ、Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４４−４４８（１９９８））。プレートに撒いて２日後、細胞を、野生型（Ｆ株）および変異体ウイルス株を用い二重の実験において０．１のＭＯＩで感染した。感染の２４時間後、細胞および上清液を回収し、そして凍結融解サイクルに供し、ウイルス粒子を遊離させた。ウイルスアウトプットは、Ｖｅｒｏ細胞上のプラークアッセイにより決定した。標準偏差（ＳＥＭ）を括弧内に示す。４つのウイルス変異体株（ｈｒＲ３、ＭＧＨ１、Ｍｙｂ３４．５、およびＭｙｂＲｅｖｔ）は、グループ間で統計的に異ならなかった（ｔ検定、ｐ＞３）。
【０１６８】
インビボのセッティングにおいて、ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるＭｙｂ３４．５の直接脳内接種は、このウイルスが、野生型ＨＳＶと比較して、顕著に神経弱毒化されていることを示した。表２は、Ｍｙｂ３４．５のＬＤ50が、Ｆ株のそれより少なくとも３対数単位高く、２．７×１０7ＰＦＵであったことを示す。γ３４．５変異体（ＭＧＨ１、Ｒ３６１６、およびＭｙｂＲｅｖｔ）は、良好に生育せず、そして＞１０9ＰＦＵ／ｍｌの力価の達成は、大スケール生産なくしてはなはだ高価である。これは、これらの実験においてこれらの変異体に対するＬＤ50を正確に推定する能力を制限する。比較目的のために、６匹のマウスのうち１匹は、Ｍｙｂ３４．５の１０7ＰＦＵを脳内に接種するときに死亡し、その一方、同じ量のＭＧＨ１を接種したとき６匹のマウスは死亡しなかった。これらの知見は、Ｂ−ｍｙｂプロモーターの制御下のγ３４．５の再導入が、最小の神経毒性を生成したことを確認した。
【０１６９】
【表２】
0004551042.tif 000003
＊血清フリー培地（容量１０μｌ）中のウイルスの系列希釈を、３週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＰＦＵレベルあたり６匹の動物）の右半球中に定位的に注射した。動物を、運動性について２８日間毎日視察し、そしてＬＤ50をＰＦＵで、比例距離モデルを用いて計算した。Ｒ３６１６およびＭＧＨ１についての二重のアスタリスク（＊＊）は、列挙された投与量で死滅がなかったことを示し、これは、所定の注射容量でこれらの株について最高の達成可能なものであった。これは、＞１０9ＰＦＵ／ｍｌの力価が、工業的スケール生産なくして増殖するＶｅｒｏ細胞中でこれらの変異体を用いて技術的に達成できなかったからであり、そして脳内注射は、１０μｌの最大容量に制限されていた。三重のアスタリスク（＊＊＊）は、平行する実験において、１０7ＰＦＵの投与量で６匹の動物あたり１匹が死亡したことを示す。急速に分割するＶｅｒｏまたは腫瘍細胞中でＭｙｂ３４．５を用いて５×１０9〜１×１０10ＰＦＵ／ｍｌの力価が達成されたので、より正確なＬＤ50が測定できた。
【０１７０】
（抑止細胞および周期運動中の細胞におけるγ３４．５遺伝子発現の調節）
休止細胞  対  そうでない細胞周期を行う細胞におけるＭｙｂ３４．５の挙動をさらに評価するために、一次ヒト線維芽細胞をプレートに撒き、そして細胞周期を、２０μＭのロバスチン（これは、ヘルペスウイルス複製を妨害しないことが示されている（Ｓｃｈａｎｇ、Ｌ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６２６−５６３７（１９９８）））で休止させた。休止した一次線維芽細胞、ＭＧＨ１、Ｍｙｂ３４．５、およびＭｙｂＲｅｖｔは、単一ＲＲ変異体ｈｒＲ３より１対数単位（ＰＦＵ）低いレベルで、Ｆ株と比較して、最小のウイルス複製を示した（図３）。対照的に、血清の存在下で、ｈｒＲ３およびＭｙｂ３４．５は顕著な複製の誘導を示し、その一方、ＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔはそうではなかった。これらの結果は：１）この非形質転換細胞型では効率的な複製にγ３４．５が必要であること、および２）Ｂ−ｍｙｂプロモーター機能が周期運動中の細胞におけるＭｙｂ３４．５の効率的な複製を可能にすることを示唆する。Ｍｙｂ３４．５が、ｈｒＲ３のそれより、休止細胞  対  周期運動中の細胞におけるウイルス子孫の産生においてより大きな差動（３  対  ２対数単位）を示し、しかも休止細胞におけるそのウイルス産生がγ３４．５ウイルスのそれと同じであったことは注目され得る。
【０１７１】
（腫瘍崩壊効果に関する比較研究）
Ｍｙｂ３４．５の腫瘍崩壊効率を決定するために、５つの異なる神経膠腫細胞株（９Ｌ、Ｕ８７、Ｕ８７ΔＥＧＦＲ、Ｔ９８Ｇ、およびＵ３４３）を、偽感染（ウイルスなし）またはＦ株、ＭＧＨ１、Ｍｙｂ３４．５、およびＭｙｂＲｅｖｔを含むウイルス株のパネルで感染した。４８時間後生存細胞を計数し、そして偽処理プレート上で生存する細胞のパーセントとして表した。ラット９Ｌ神経膠腫細胞の公開されたデータ（Ｋｒａｍｍ、Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７））中、およびヒト神経膠腫細胞Ｕ３４３およびＴ９８に関する未公開実験（Ｑｕｒｅｓｈｉ、Ｎ．およびＣｈｉｏｃｃａ、Ｅ．Ａ．、未公開データ）中では、ＭＧＨ１による腫瘍細胞死滅が、２つのヒト神経膠腫株について、Ｒ３６１６によるそれと類似であることが予備的に示されており（表３）、そしてそれ故、後者の変異体は、さらなる分析から排除された。
【０１７２】
試験されたすべての腫瘍細胞株において、Ｍｙｂ３４．５は、親株ＭＧＨ１が示したより大きいインビトロ腫瘍崩壊効率を示し、そしていくつかの腫瘍細胞株についてその腫瘍崩壊効力は野生型ウイルスのそれに接近した（表３）。従ってこれらの知見は、Ｍｙｂ３４．５の腫瘍崩壊効果がγ３４．５変異体ウイルス（ＭＧＨ１、ＭｙｂＲｅｖｔ、およびＲ３６１６、それらの殺傷効力はＭＧＨ１のそれのほぼ２倍）のそれより大きかったことを示した。
【０１７３】
【表３】
0004551042.tif 000004
＊ヒト（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３４３、Ｔ９８Ｇ、およびＵ９８ΔＥＧＦＲ）およびラット（９Ｌ）神経膠腫由来細胞株を、５×１０5細胞／６０ｍｍ直径プレートでプレートに撒き、そして次に注記された株を用い０．１のＭＯＩで感染した。腫瘍崩壊効果は、感染４８時間後の細胞生存により反映され、３重の非感染コントロールプレートからの生存細胞の数のパーセントとして表した。値は３重の実験の平均を表す（括弧内はＳＥＭ）。Ｍｙｂ３４．５  対  ＭＧＨ１またはＭｙｂＲｅｖｔによる腫瘍細胞の死滅における差は、統計的に有意あった。例えば、Ｕ８７神経膠腫細胞において、Ｐは０．００１未満であった（Ｔｕｋｅｙのペア多重比較手順による分散の１方向分析）。
＊＊Ｒ３６１６の死滅は、この特定のセットの実験には含めなかった。なぜなら、それは、ＭＨＧ１で観察されたそれと比較的類似であるからである。これは、ラット９Ｌ神経膠腫についてＫｒａｍｍら（Ｋｒａｍｍ、Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７））、および本実験とは異なる時点で実施された多くの先の未公開実験で示された。例えば、ＭＧＨ１またはＲ３６１６細胞を用い０．１のＭＯＩで感染したヒトＵ３４３神経膠腫細胞について、生存率は、２日目で、それぞれ５４％および５０％であった。ＭＧＨ１またはＲ３６１６を用い０．１のＭＯＩで感染したヒトＴ９８細胞について、生存率はそれぞれ４０％および３８％であった。
【０１７４】
（インビボ抗癌効果）
次いで、Ｍｙｂ３４．５のインビボ抗癌効果を決定した。無胸腺マウスの脇腹中に、ラット９Ｌ神経膠腫（図４Ａ）またはヒトＵ８７ｄＥＧＦＲ神経膠腫（図４Ｂ）腫瘍を確立した後、各ウイルスを用いた腫瘍内接種を実施した。平均腫瘍容積により評価したとき、９Ｌ腫瘍増殖は、コントロール動物と比較してＭｙｂ３４．５処理により顕著に低減し、ｈｒＲ３処理後のそれと定量的に類似の阻害であった（図４Ａ）。通例の短縮形ＥＦＧレセプターを発現するヒト神経膠腫であるＵ８７ΔＥＧＦＲ（Ｎａｇａｎｅ、Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５０７９−５０８６（１９９６）；Ｈｕａｎｇ、Ｈ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９２７−２９３５（１９９７）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ、Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７７２７−７７３１（１９９４））に対し、すべての株は、顕著に増殖を阻害し、ｈｒＲ３およびＭｙｂ３４．５は、６のうち３で完全な退行を生じ、その一方、ＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔは、６のうち２で退行を生じた（見える腫瘍はない、図４Ｂ）。
【０１７５】
図４Ｂのぞんざいな分析は、γ３４．５変異体（ＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔ）  対  γ３４．５+ウイルス（ｈｒＲ３およびＭｙｂ３４．５）で処理されたヒトＵ８７ΔＥＧＦＲ腫瘍の増殖に有意な差はなかったという結論に至り得るが、３４日時点における実際の腫瘍容積のレビューは、有意な差の存在を示す（表４）。これらの結果は、それ故、Ｍｙｂ３４．５のインビボ腫瘍崩壊効果が単一ＲＲ変異体のそれと平行し、かつγ３４．５変異体のそれより優れたことを示した。
【０１７６】
【表４】
0004551042.tif 000005
ａ  実験手順の詳細は、図４への説明文中に提供されている。結果は、３４日時点からである。
ｂ  処置群間の中央値における差は、統計的に異なった（Ｐ＝０．００４［ランクに関する分散のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの１方向分析］）。
【０１７７】
（考察）
この実施例では、標的とされた二重変異体ＨＳＶ株Ｍｙｂ３４．５が、悪性神経膠腫細胞を、マウスにおける直接脳内接種に対する神経毒性の点から高い程度の安全性を保持しながら、インビトロおよびインビボの両方で効率的に殺傷したことが示された。この株はまた、単一ＲＲ変異により特徴付けられるＨＳＶで見られる誘導に類似の、初期休止線維芽細胞中で最小の複製および周期運動中の細胞中の複製の顕著な誘導を示した。腫瘍細胞において、それはまた、親の二重ＲＲ／γ３４．５変異体であるＭＧＨ１と比較して改善された腫瘍崩壊効力で活発に複製した。これは、ＭＧＨ１およびその他のγ３４．５変異体が、感染細胞から得られるより低いウイルス収率に起因して限られた効力を有し得る（Ｋｒａｍｍ、Ｃ．Ｍ．ら、前述）ので、適切である。おそらく最も重要なことは、Ｍｙｂ３４．５が、ＭＧＨ１またはその他のγ３４．５変異体のように、神経弱毒化されたまま、１０7ＰＦＵの脳内投与量でマウスちにおいてほとんど病原性を示さなかったことである。したがって、Ｍｙｂ３４．５は、＞１０7ＰＦＵのＬＤ50で、神経弱毒性の特徴を維持しながら、親の変異体ＭＧＨ１、マーカー奪還復帰変異体ＭｙｂＲｅｖｔ、およびＭＧＨ１の親変異体Ｒ３６１６と比較して改良された腫瘍崩壊効力を示す。この値は、厳密な定量的比較が後者のグループの変異体についてＬＤ50を正確に決定することが技術的にできないことによって制限されたが、γ３４．５変異体で観察されたそれに定性的に類似している。
【０１７８】
癌遺伝子治療における主な目標は、顕著な抗癌効果を提供し、一方で同時に、正常な細胞および組織に対して最小の副作用および毒性を示すウイルス変異体を同定することである。この離れ業は、感染した正常細胞および腫瘍細胞に対して最小の毒性を示す複製欠損ウイルスベクターを操作すること、およびこのベクターに、抗癌遺伝子を発現する能力を付与して、生物学的効果を果たすことによって達成された（Ｍｏｒｉｕｃｈｉ，Ｓ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５７３１−５７３７（１９９８））。大きなヒト腫瘍塊に対する接種材料として適用される場合、このようなベクターは、そのサイズに起因して十分に拡散せず、従って、抗癌効果は、注射路に近接して位置づけられた細胞に制限される（Ｂｏｂｏ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０７６−２０８０（１９９４）；Ｐｕｕｍａｌａｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．９：１７６９−１７７４（１９９８））。
【０１７９】
この問題に対する１つの潜在的な解決策は、腫瘍または有糸分裂細胞において比較的選択的な様式で複製する能力を維持し、一方で正常細胞ではその複製能力を制限される、条件的複製（腫瘍崩壊性で複製制限的）ウイルス変異体を使用することから構成される。従って、このようなウイルス変異体は、最初に感染した腫瘍細胞から周辺の腫瘍細胞へと伝播し、このようにして、大量の分布および抗癌効果の増強を達成する。しかし、これらの変異体に付随する毒性の増加が予期され得る。条件的複製ＨＳＶ−１に付随する潜在的毒性を最小化するために、内因性γ３４．５遺伝子の欠失は、齧歯類（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）；Ｍａｒｋｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ３２：５９７−６０３（１９９３）；Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｎ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５５６０−５５６９  １９９７））およびＡｏｔｕｓサル（Ｍｉｎｅｔａ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ  １：９３８−９４３（１９９５））での大脳内注射に際して、脳炎または髄膜炎の危険性を有意に制限または排除することが示された。さらに、悪性脳腫瘍に冒されたヒトにおけるフェーズＩ臨床試験において、この型の変異体は害の証拠を示さなかった（Ｍａｒｕｚａ，Ｒ．Ｌ．，個人通信）。
【０１８０】
しかし、１つの懸念は、内因性γ３４．５機能の完全な排除がまた、ＨＳＶの抗癌効果を制限するということである。公表された実験では、この制限が、インビトロおよびインビボの両方において、ラット９Ｌ神経膠肉腫細胞について示された（Ｋｒａｍｍ，Ｓ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７））。本実施例において本発明者らは、５つのヒト神経膠腫細胞株のパネルに対する、γ３４．５機能欠失ＨＳＶ変異体（ＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔ）によって媒介される殺傷を試験した（表２）。予期されたように、これらの変異体は、野生型Ｆ株と比較して、その腫瘍崩壊性効力を比較的制限された。同様の知見はまた、Ｒ３６１６、ＭＧＨ１の親株でもまた観察された（Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｎ．およびＣｈｉｏｃｃａ，Ｅ．Ａ．，未公開データ）。しかし、ＭＧＨ１の腫瘍崩壊性効力は、Ｂ−ｍｙｂプロモーター制御下での単一のγ３４．５遺伝子の挿入に際して、野生型Ｆ株で観察されたレベルに近接したレベルまで回復した。
【０１８１】
この結果の意義は、腫瘍中へのＭｙｂ３４．５の注射が、腫瘍中へのＭＧＨ１、Ｒ３６１６、または他のγ３４．５変異体の注射よりも広範な腫瘍崩壊を生じることが予期されるということである。
【０１８２】
実際、インビボでのＭｙｂ３４．５の抗癌効力は、単一のＲＲ変異体（ｈｒＲ３）の効力と量的に類似することが見出されており、このことは、腫瘍細胞におけるγ３４．５産物の活性な発現が、Ｍｙｂ３４．５をγ３４．５陽性表現型へと回復させることを示唆する。しかし、ｈｒＲ３は単純な挿入変異体であるので、Ｍｙｂ３４．５は、潜伏性の既存のＨＳＶ感染またはその後のＨＳＶ感染の存在下で、野生型へ組換え修復する傾向が低いという理論上の利点を提供する。相同組換えを介したＩＣＰ６遺伝子座の修復が生じ得るという見込みの低い事象においてさえ、Ｂ−ｍｙｂ／γ３４．５挿入物は切り出され、そしてＲ３６１６（ＭＧＨ１についての親ウイルス）のγ３４．５欠失遺伝子型にＭｙｂ３４．５を回復させる。
【０１８３】
公表された結果によって、γ３４．５の少なくとも１つの機能は、ウイルス感染に対する宿主細胞応答を防止すること、すなわち、アポトーシス様応答における宿主タンパク質合成の遮断の誘発であることが示された（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１０５１６−１０５２０（１９９５）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．およびＲｏｉｚｍａｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３２６６−３２７０（１９９２））。同様の機能は、病原性ウイルスの間で広範に広がっている（Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏ，Ｇ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９４４５−９４４９（１９９５）；Ｇａｌｅ，Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５２０８−５２１８（１９９８）；Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３．７５−７８（１９９５）；Ｓｈａｒｐ，Ｔ．Ｖ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４４８３−４４９０（１９９３））。γ３４．５は、Ｖｅｒｏ細胞における培養物でのウイルス増殖には必須ではないが、マウス中枢神経系においてウイルスを伝播させ得（Ｋｅｓａｒｉ，Ｓ．ら，Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５２５−５３６（１９９８）；Ｋｅｓａｒｉ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：５６４４−５６５３（１９９６）；Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｎ．Ｓ．ら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：５５６０−−５５６９（１９９７））、そしてＣＮＳ複製において以前に関連付けられたＨＳＶゲノムの領域にマッピングさせる（Ｃｅｎｔｉｆａｎｔｏ−Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｙ．Ｍ．ら，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １５５：４７５−４８９（１９８２）；Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｎ．Ｓ．ら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１．５５６０−−５５６９（１９９７））。これは、γ３４．５コードタンパク質が、二本鎖ＲＮＡ依存性キナーゼを阻害するという事実に起因し得る。二本鎖ＲＮＡ分子への曝露に際して、ウイルス感染で通常見られるように、ＲＮＡ依存性キナーゼは、延長開始因子２のαサブユニットをリン酸化して、タンパク質合成の阻害を生じさせる（Ｃｈｏｕ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１２６２−１２６６（１９９０）；Ｃｈｏｕ  Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：８３０４−８３１１（１９９４）；Ｃｈｏｕ，Ｊ．およびＲｏｉｚｍａｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３２６６−３２７０（１９９２））。γ３４．５を発現し得ない変異体を、ニューロン起源の細胞に感染させることは、細胞のタンパク質合成の遮断を生じさせ、結果としてウイルス産生の制限を生じさせる。
【０１８４】
本研究の１つの重要な局面は、Ｂ−ｍｙｂプロモーター転写制御による、γ３４．５機能の回復を示すことであった。これは、ＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔでの細胞の感染が、タンパク質合成の抑制を生じさせたが、タンパク質合成はＭｙｂ３４．５が感染性ウイルスであった場合には回復されたということを実証することによってなされた。細胞周期に対するγ３４．５機能の新規なＢ−ｍｙｂ転写依存性についてのさらなる証拠が、ロバスタチン休止実験によって与えられた。これらは明らかに、増殖休止状態下において、Ｂ−ｍｙｂ転写活性が最小である場合、Ｍｙｂ３４．５の力価がＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔの力価と類似しており、そして野生型Ｆ株およびｈｒＲ３株の力価とは異なることを示した。しかし、細胞が血清刺激された場合、Ｍｙｂ３４．５の力価は、３桁増加して、Ｆ株およびｈｒＲ３で得られた力価に近づくが、γ３４．５変異体（ＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔ）の力価は、わずかにのみ増加した。Ｍｙｂ３４．５複製の基底レベルが、休止細胞におけるｈｒＲ３のレベルよりも低く、そして量的にはＲＲγ３４．５変異体ＭＧＨ１のレベルにより類似していたことは注目に値した。Ｍｙｂ３４．５は、ｈｒＲ３よりも高い倍率での、周期運動中の細胞における複製誘導を示したが、ＭＧＨ１およびＭｙｂＲｅｖｔは、最小の誘導を示した。このことは、Ｍｙｂ３４．５構築物の効果が、リボヌクレオチドレダクターゼの単純な補完効果に勝ることを示唆する。
【０１８５】
これらの結果により、Ｂ−ｍｙｂプロモーターが、休止細胞におけるウイルス複製を制限し、そして周期運動中の細胞に対してウイルス複製を再指向させるという仮定が確証された。従って、脳腫瘍治療の状況下では、Ｍｙｂ３４．５は、休止している細胞においては比較的低レベル（ＭＧＨ１で観察されるレベルに類似する）で複製するが、分裂中の脳腫瘍細胞の感染によって、ウイルス力価の顕著な増加を生じさせ、このようにしてＭＧＨ１または他のγ３４．５変異体を超える治療的利点を与える。正常な脳細胞の感染は、γ３４．５変異体で生じ得（Ｋｅｓａｒｉ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５２５−５３６（１９９８）；Ｋｅｓａｒｉ，Ｓ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：５６４４−５６５３）（１９９６）；Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｎ．Ｓ．ら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：５５６０−５５６９（１９９７））、そしてＭｙｂ３４．５作用が休止している感染神経細胞におけるこれらの変異体の作用を模擬することが予期される。実際、本発明者らのインビトロおよびインビボ研究によって、培養ニューロンおよびマウスの脳におけるＭｙｂ３４．５複製が、γ３４．５変異体ウイルス（ＭＧＨ１、ＭｙｂＲｅｖｔ、およびＲ３６１６）の複製と類似し、そして野生型Ｆ株およびｈｒＲ３の複製とは異なることが示された。
【０１８６】
代替的な説明によれば、Ｍｙｂ３４．５の観察された効果が、単一のγ３４．５遺伝子による２つの内因性γ３４．５遺伝子の置換に起因し、そして、内因性ＨＳＶ  γ３４．５プロモーターよりも弱く、かつその厳密な細胞周期調節の特徴が、ＨＳＶゲノムの状況下では破壊されるプロモーター（Ｂ−ｍｙｂ）を使用することによるということであり得る。この可能性を正式に排除することは、変異体Ｂ−ｍｙｂプロモーターでの広範なさらなる実験を必要とするが、本発明者らは、現在の実験データに照らして、これは見込みが低いままであると考える。この実験が真実である場合には、以下のことが予期される：（ｉ）休止細胞におけるＭｙｂ３４．５複製は、γ３４．５欠失変異体の複製よりも高い（前者の変異体における調節解除されたＢ−ｍｙｂプロモーターによるγ３４．５遺伝子の低レベル発現が原因）；（ｉｉ）Ｍｙｂ３４．５に感染した神経芽細胞腫細胞において観察される宿主タンパク質合成の遮断の阻害（図２）は、ＦまたはｈｒＲ３に感染した細胞において観察される阻害よりも、さほど明白ではない（内因性ＨＳＶプロモーターによって駆動される２つのγ３４．５遺伝子によって達成される強力な発現と比較して、より弱いプロモーターでの単一のγ３４．５遺伝子のより弱い発現が原因）；（ｉｉｉ）Ｕ３７３細胞におけるＭｙｂ３４．５の複製（γ３４．５変異体の厳しく制限された複製に対して公知（Ｍｏｈｒ，Ｉ．およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：４７５９−４７６６（１９９６）））はまた、ＦまたはｈｒＲ３の発現と比較した、Ｍｙｂ３４．５における弱いγ３４．５遺伝子発現によって、幾分制限される；ならびに（ｉｖ）休止中の細胞と周期運動中の細胞との間の複製における差異は、Ｍｙｂ３４．５（調節解除されたＢ−ｍｙｂプロモーターによって駆動される１コピーのγ３４．５を発現する）についてよりもｈｒＲ３またはＦ株（内因性ＨＳＶプロモーターによって駆動される２コピーのγ３４．５を発現する）について高い。
【０１８７】
本実施例における実験データは、前述の予測と一致しない。この観察された結果について最も見込みある説明は、Ｂ−ｍｙｂプロモーターが、ＨＳＶゲノムの状況下においてさえ、比較的厳重な様式で調節を維持し、このようにして、休止細胞においては、存在するにしても最小のγ３４．５発現へと導き、そして周期運動中の細胞および腫瘍細胞においては、インタクトなγ３４．５機能を有するウイルス株で観察されるレベルと機能的に類似していると思われる発現レベルへと導くということである。
【０１８８】
ＨＳＶ変異体が、ベクターとして機能するように操作され得るということが、近年示された。このことは、ＨＳＶ変異体に、ウイルス腫瘍崩壊機能のみならず、さらなる抗癌効果を発現させることを可能にし、その治療的効果を増加させる（Ｃｈａｓｅ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４４−４４８（１９９８））。明らかに、Ｍｙｂ３４．５はまた、抗癌遺伝子（例えば、プロドラッグを活性化させる遺伝子）の付加のために適切な骨格を提供し得る。腫瘍選択的なプロモーターが同定される場合、正常細胞に対して腫瘍細胞へとウイルス産生をさらに制限するために、γ３４．５遺伝子または他の毒力遺伝子の発現を制御するようにこれらを使用することは、比較的容易である。本明細書中に記載したアプローチをまた使用して、細胞特異的プロモーターを用いることにより、組織中の特定の細胞型に毒力を制限し得る。
【０１８９】
Ｂ−ｍｙｂプロモーターは、コンセンサスなＥ２Ｆ結合部位を含み、周期運動中の細胞に厳密に制限され、そして実際に、Ｇ0において発現される（Ｌａｍ，Ｅ．Ｗ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２７０５−２７１３（１９９３）；Ｌａｍ，Ｅ．Ｗ．ら，Ｇｅｎｅ  １６０：２７７−２８１（１９９５）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：１０７３−１０８２（１９９６））。Ｅ２Ｆ応答性プロモーターを含む複製欠損アデノウイルスを用いて、休止ニューロン組織に対してのみならず、形質転換されていない正常な周期運動中の細胞に対しても相対的な、腫瘍特異的な遺伝子発現が示された（Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ３：１１４５−１１４９（１９９７））。Ｅ２Ｆを調節する、細胞周期調節ｐ１６／網膜芽細胞腫／ｃｄｋ４経路のいくつかの部分の変更は、ヒト神経膠腫ならびに多くの他の腫瘍型におけるほぼ普遍的な事象であるように思われ、そしてウイルス遺伝子産物の腫瘍特異的発現を標的化するための優良な基質を提供する（Ｈｅ，Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５８０４−５８０７（１９９４）；Ｕｅｋｉ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１５０−１５３（１９９６））。
【０１９０】
別のＨＳＶ−１変異体（ここでは、肝細胞に対してＩＣＰ４発現を調節するために、アルブミンプロモーターを使用した）が記載された（Ｍｉｙａｔａｋｅ，Ｓ．ら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：５１２４−５１３２（１９９７））。本報告において記載されたストラテジーからの主要な差異は、肝細胞特異的な代わりに腫瘍特異的または細胞周期特異的と考えられ得るプロモーターを使用すること、および必須の転写因子（例えば、ＩＣＰ４）ではなく毒力（γ３４．５）に直接関係したＨＳＶ遺伝子を使用することである。膠芽腫の処置についての研究の下での多くのウイルスベクターとは対照的に、Ｍｙｂ３４．５と称される例示されたベクターは複製能を有し、そして標的化した毒力は、ウイルス複製および直接的な腫瘍崩壊を調節することによって得られる。これに関して、Ｍｙｂ３４．５は新規な標的化された腫瘍崩壊性ヘルペスウイルスを表し、そして近年記載された２つの腫瘍選択的な腫瘍崩壊性アデノウイルスおよびレオウイルスに加えられる（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：３７３−３７６（１９９６）；Ｃｏｆｆｅｙ，Ｍ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１３３２−１３３４（１９９８））。Ｅ１Ｂ欠損アデノウイルスＯＮＹＸ−０１５は、腫瘍細胞における効率的な複製のためのｐ５３腫瘍抑制経路の変更に依存すると考えられるが、この機構は近年、異議を唱えられている（Ｇｏｏｄｒｕｍ，Ｆ．Ｄ．ら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７９−９４９０（１９９８））。
【０１９１】
レオウイルス株は、活性化ｒａｓ経路を有する細胞において選択的に複製することが示された（Ｃｏｆｆｅｙ，Ｍ．Ｃ．ら，前出）。Ｍｙｂ３４．５は、ｐｌ６／ｃｄｋ４／ＲＢ／Ｅ２Ｆ経路の変更を利用し得、そして、複数の腫瘍の遺伝的変更が異なるウイルス処置ストラテジーによって標的化され得る可能性に加えられる。γ３４．５遺伝子の発現を駆動するために細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターを使用するストラテジーはまた、インビボにおいて選択された細胞集団を排除するための手段として適切であり得る。最終的に、強力な抗腫瘍効力と組み合わせて、安全性増加の知見は、Ｍｙｂ３４．５が、悪性腫瘍の処置のための優れた候補であることを示唆する。
【０１９２】
医学、ウイルス学、分子生物学、免疫学、薬理学、および／または関連の分野の当業者に自明である、本発明を実施するための上記様式の改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０１９３】
本明細書中において言及されたすべての刊行物および特許は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示す。すべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されると示された場合と同程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０１９４】
前述の本発明は、理解の明快さの目的のために、例示および実施例によって幾分詳細に記載されたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、ＨＳＶ株Ｆ（野生型）、ＭＧＨ１（二重ＲＲ（ＩＣＰ６）／γ３４．５変異体）、およびＭｙｂ３４．５の概略マップを示す。全ての株は、２つの固有のセグメントであるＵＬおよびＵＳを有する、代表的なＨＳＶゲノムを含み、このセグメントの各々には、それぞれ、逆方向反復セグメントａｂおよびｃａが隣接する（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０５７−３０７５（１９９１））。固有のセグメントまたは反復セグメントのいずれかにおける局在に依存して、ＨＳＶ遺伝子は、１コピーまたは２コピーで存在する。黒ボックスは、ＩＣＰ６内のＢａｍＨＩ部位へのＬａｃＺ挿入を示し（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｊ．およびＷｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２９７０−２９７７（１９８８））、一方、Δは、ＭＧＨ１およびＭｙｂ３４．５におけるγ３４．５内の欠失を示す（Ｋｒａｍｍ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０５７−２０６８（１９９７））。斜線バーは、ＩＣＰ６遺伝子座内へのＢ−ｍｙｂプロモーター−γ３４．５構築物の組換えを示す。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、サザンブロット分析による、ＨＳＶ変異体Ｍｙｂ３４．５の特徴付けを示す。ＩＣＰ６に対する完全長プローブへのＸｈｏＩ消化ウイルスＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ＭＨＧ１（レーン２）およびＭｙｂＲｅｖｔ（レーン４）における完全長ｌａｃＺ挿入を有するＩＣＰ６遺伝子の、予測される９．０ｋＢフラグメントサイズを表す。Ｍｙｂ３４．５（レーン３）において、Ｂ−ｍｙｂプロモーター／γ３４．５カセットによる置換およびＩＣＰ６のさらなる欠失が存在し、６．７ｋＢのバンドを与える。野生型Ｆ株由来のＤＮＡは、レーン１にある。
【図１Ｃ】  図１Ｃは、ｌａｃＺプローブでのハイブリダイゼーションを示し、そしてＭＧＨ１（レーン２）およびＭｙｂＲｅｖｔ（レーン４）を有するフラグメントを表す。Ｍｙｂ３４．５（レーン３）へのハイブリダイゼーションは存在しない。
【図１Ｄ】  図１Ｄは、Ｒ３６１６およびＭＧＨ１の欠失領域に対して内側の、γ３４．５のＢｓｔＥＩＩ−Ｂｂフラグメントを示し、これは、ＢａｍＨＩ消化Ｍｙｂ３４．５  ＤＮＡ（レーン３）における５．３ｋＢのフラグメントおよびＦ（レーン１）におけるいくつかのバンドを明らかにするが、ＭＧＨ１（レーン２）およびＭｙｂＲｅｖｔ（レーン４）のいずれにもハイブリダイズしない。
【図２】  図２は、変異体ウイルス株による宿主タンパク質合成の遮断の阻害を実証する、電気泳動分離した感染細胞の溶解物のオートラジオグラフ像を示す。ヒト神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を、１×１０6細胞／１００ｍｍディッシュでプレートした。２４時間後、細胞を、３．０のＭＯＩで感染させた。ウイルス感染の１５時間後、細胞を、メチオニンを含まない培地で手短に洗浄し、次いで、６０μＣｉ  Ｓ35−メチオニンを含む培地と共に９０分間インキュベートした（Ｔｏｄａ，Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．９：１７７−２１８５（１９９８））。標識後、細胞を収集し、ＳＤＳを含む緩衝液中に可溶化し、そして１０％アクリルアミドゲル上で電気泳動した。次いで、ゲルをニトロセルロースに転写しそしてオートラジオグラフィーに供した。感染細胞のポリペプチドを、Ｍｏｒｓｅ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２６：３８９−４１０（１９７８）に従って設計した。
【図３】  図３は、分裂停止細胞または周期運動中の細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ）におけるウイルス複製を示す棒グラフである。ヒト胚由来初代線維芽細胞（ＣＲＬ  ７７０６）を、１×１０5細胞／６０ｍｍディッシュでプレートした。プレーティング後４８時間で、培地を、３６時間、２０μＭ  ロバスタチンを含むＤＭＥＭで置換した（斜線バー）。３連のプレートを計数し、そして種々の変異体株を１．０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた（３連での実験）。感染後４８時間で、細胞および上清を回収し、凍結融解サイクルによってウイルスを遊離させた。並行実験を、１０％ウシ胎仔血清（黒バー）を含む培地中に維持させた細胞を用いて行った。ウイルス力価（ｏｕｔｐｕｔ）を、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞に対するプラークアッセイによって決定し、ｌｏｇ  １０  ＰＦＵ／１×１０5侵入（ｉｎｐｕｔ）ウイルスとして表す（値は、３連での実験の平均を表す）。試験したウイルスについて、ロバスタチンでの力価は、血清を用いて得られた力価よりも統計的に低い（スチューデントＴ検定値；Ｆ、ｐ＝０．０２７；ｈｒＲ３、ｐ＝０．００１；ＭＧＨ１、ｐ＝０．０１１；Ｍｙｂ３４．５、ｐ＝０．００１；ＭｙｂＲｅｖｔ、ｐ＝０．００３）。
【図４Ａ】  図４Ａおよび４Ｂは、Ｍｙｂ３４．５によるインビボ増殖阻害を示す。類似の実験において、ラット神経膠肉腫９Ｌ細胞（図４Ａ）およびヒトＵ８７ΔＥＧＦＲ神経膠腫細胞（図４Ｂ）を、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。１４日後（９Ｌ）または１０日後（Ｕ８７）に開始し（１日目）、ビヒクルまたは変異体ウイルス株を、腫瘍に腫瘍内接種した。矢印は、ウイルス注射時（１、３、５、７日目）を示し、一方、値は、１グループあたり５匹のマウス（９Ｌ）または１グループあたり６匹のマウス（Ｕ８７ΔＥＧＦＲ）の平均を示す。図４Ａにおいて、腫瘍体積の差異は、１２日目、１８日目および３３日目の時点で有意であった（ｐ＜０．０５、分散の一方向反復測定）。
【図４Ｂ】  図４Ａおよび４Ｂは、Ｍｙｂ３４．５によるインビボ増殖阻害を示す。類似の実験において、ラット神経膠肉腫９Ｌ細胞（図４Ａ）およびヒトＵ８７ΔＥＧＦＲ神経膠腫細胞（図４Ｂ）を、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。１４日後（９Ｌ）または１０日後（Ｕ８７）に開始し（１日目）、ビヒクルまたは変異体ウイルス株を、腫瘍に腫瘍内接種した。矢印は、ウイルス注射時（１、３、５、７日目）を示し、一方、値は、１グループあたり５匹のマウス（９Ｌ）または１グループあたり６匹のマウス（Ｕ８７ΔＥＧＦＲ）の平均を示す。図４Ｂにおいて、腫瘍体積の差異は、１８日目、２７日目および３４日目の時点で有意であった（ｐ＜０．０５、分散の一方向反復測定）。表４に示されるように、３４日目のみについては、ｐ＜０．００５である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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