(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然型の黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）のアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸残基の置換を有するＳＥＢ改変体 を有効成分として含有する慢性関節リウマチの予防・治療用剤であって、該改変体 は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の特異的Ｖβ成分と相互作用するが、天然型ＳＥＢや組換え野生型ＳＥＢによって惹起される特定のＶβ成分をもつＴ細胞の除去を誘導することなくＳＥＢに対する免疫学的応答性のみを低下させるＴ細胞活性化の抑制作用を有するものであり、該アミノ酸残基の置換が、
（i）天然型ＳＥＢを基準にして９位のアミノ酸がアスパラギンで置換；
（ii）天然型ＳＥＢを基準にして２３位のアミノ酸がチロシン、アスパラギン酸、イソロイシンまたはリジンで置換；
（iii）天然型ＳＥＢを基準にして４１位のアミノ酸がアルギニンもしくはスレオニンで置換、かつ４４位のアミノ酸がバリンに置換もしくは４５位のアミノ酸がバリンに置換；および
（iv）天然型ＳＥＢを基準にして４４位のアミノ酸がセリンに置換
よりなる群から選ばれたものであることを特徴とする、慢性関節リウマチの予防・治療用剤。
【請求項２】
生理学的に許容しうるｐＨ及び許容しうる強度のイオン強度を有する水溶液である請求項１記載の慢性関節リウマチの予防・治療用剤。
【請求項３】
生理学的に許容しうる張度を溶液に与えるのに十分な量で、炭水化物、糖、糖アルコールおよびアミノ酸よりなる群から選ばれる物質を含有する請求項２記載の慢性関節リウマチの予防・治療用剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な免疫異常性疾患の予防・治療用剤に関する。さらに詳細には、スーパー抗原の一つとして知られる天然型の黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ；以下、ＳＥＢと呼称することもある）の改変体またはその誘導体を有効成分として含有する慢性関節リウマチ、アレルギー性疾患等の免疫異常性疾患の予防・治療用剤に関する。
背景技術
自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；以下、ＲＡと呼称することがある）等の臓器非特異的自己免疫疾患と潰瘍性大腸炎等の臓器特異的自己免疫疾患とに大きく分けられるが、通常は免疫学的寛容の状態にある自己の抗原に対して応答するＴ細胞が、何らかの原因で自己の組織内で活性化され自己の抗原と応答するようになり、これが持続的な炎症反応となって組織に障害を与えることに起因するものである。その場合の自己の抗原とは、それぞれ自己の関節の成分であるＩＩ型コラーゲンや消化管粘膜の主成分である。
これら疾患の患者数は毎年、僅かながら増加しているにも拘わらず、今なお有効な治療薬や予防方法は見出されていない（山村雄一、岸本忠三、ロバート・Ａ・グッド編：薬剤による免疫不全、「免疫科学」、９巻、ｐ．２８５−２８９、（１９８４））。現在、これらの疾患の治療には、サラゾピリン、５−アミノサリチル酸、アザチオプリン、６−ＭＰ、トラニラスト、メトトレキシサート、シクロスポリンＡ、メトロダニゾールの投与および７Ｓ−免疫グロブリンの大量投与等の薬物療法や胸腺摘出術、人工関節への置換術等の外科的療法、さらには栄養療法等の対症療法が行われている（市川陽一ら：慢性関節リウマチにおけるメトトレキサートおよびサラゾスルファピリジン長期投与例の検討、リウマチ、３５巻、ｐ．６６３−６７０、（１９９５）；柏崎禎夫：慢性関節リウマチに対するオーラノフィンとメトトレキシサートによる併用療法の検討、リウマチ、３６巻、ｐ．５２８−５４４、（１９９６）；古谷武文ら：慢性関節リウマチにおける低用量メトトレキシレート療法の有害事象、リウマチ、３６巻、ｐ．７４６−７５２、（１９９６）；渡辺言夫：若年性関節リウマチの薬物療法、リウマチ、３６巻、ｐ．６７０−６７５、（１９９６）；八倉隆保：免疫抑制療法・自己免疫疾患の治療  総合臨床、３０巻、ｐ．３３５８、（１９８１）；都外川新ら：慢性関節リウマチにおけるメトトレキシサート療法の検討−有効性のより高い投与法を求めて−、リウマチ、３７巻、ｐ．６８１−６８７（１９９７））。しかしながら、これらは根治的な療法とはいえず、むしろ長期服用によるため重篤な副作用の原因ともなり、より有効な予防・治療薬、治療法の開発が望まれている。
ＳＥＢは周知のように細菌性スーパー抗原の一種である（Ｗｈｉｔｅ  Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５６，ｐ．２７−３５，１９８９）。通常の抗原はクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：以下、ＭＨＣと呼称することもある）と複合体を形成した状態でＴ細胞上のＴ細胞抗原受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下、ＴＣＲと呼称することもある）に認識され、しかもその認識はクラスＩＩＭＨＣのハプロタイプに限定される（これをＭＨＣ拘束性という）。これに対して、スーパー抗原はクラスＩＩＭＨＣ分子にハプロタイプに関係なく結合し、さらに特定のＴＣＲのβ鎖可変領域（Ｖβ鎖）に結合する。このような結合が生じると、スーパー抗原が結合したＴ細胞は一時的に活性化され分裂増殖を引き起こし、炎症性のサイトカインを産生する（Ｍｉｃｕｓａｎ  Ｖ．Ｖ．＆  Ｔｈｉｂｏｄｅａｎ  Ｊ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，ｐ．３−１１，１９９３）。
ＳＥＢは食中毒を起こす毒素の一つであるが、食中毒様の症状はＳＥＢを動物に静脈内投与しても認められることからＳＥＢの上記生物活性を介して、毒性が発現されていることが示唆される（Ｍｉｃｕｓａｎ  Ｖ．Ｖ．＆  Ｔｈｉｂｏｄｅａｎ  Ｊ，  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，ｐ．３−１１，１９９３）。
ところが、スーパー抗原を新生マウスに静脈内或いは腹腔内に投与すると、これに応答するＶβ鎖（ＳＥＢではＶβ７及びＶβ８ＴＣＲ）を持ったＴ細胞亜集団は除去され、同じ抗原に対して応答しなくなる免疫寛容の状態になる（Ｗｈｉｔｅ  Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５６，ｐ．２７−３５，１９８９）。一方、ＳＥＢを成体のマウスに投与した場合は、前述のような一時的な活性化の後に応答性のＶβ７、Ｖβ８ＴＣＲを持つＴ細胞亜集団は、再度のＳＥＢの刺激に対して応答しなくなる状態、即ちアナジーの状態が誘導されて免疫寛容になる。ＳＥＢがこのような活性を有することから、前述の慢性関節リウマチや潰瘍性大腸炎のような難治性の自己免疫疾患、さらには免疫異常性疾患の予防・治療用薬剤になる可能性が示唆されている（特開平９−１１０７０４）。また、ＳＥＢはブドウ球菌の食中毒を引き起こす腸管内毒素でもあるため、生体内に投与したときのＳＥＢの病原性の問題があるが、かかる毒性を回避するため、特開平９−１１０７０４では、高度に精製したＳＥＢを病原性を与えない投与量で連続的に長期間経口投与することにより生体に病原性を与えることなく免疫寛容のみ有効に誘導させている。
ＳＥＢの毒性を回避する他の方法としては、カップラー及びマーラックらが特表平８−５００３２８で開示している「突然変異したスーパー抗原の保護作用」があり、彼らの発明の骨子は以下のものである。ＳＥＢの突然変異体を調製し精製した後、ヒトのクラスＩＩＭＨＣ分子及びＴＣＲに結合可能なＳＥＢ突然変異体を選択した。その後、突然変異していないＳＥＢと区別できないほどにクラスＩＩ陽性細胞に結合し、Ｔ細胞の増殖を刺激しないＳＥＢ突然変異体をＳＥＢに暴露する前に動物に注射するとＳＥＢの毒性作用に対して完全な防御を示した。
特表平８−５００３２８の開示がもたらす特に重要な知見は、毒性除去に関わるＳＥＢの構造研究である。ＳＥＢの３次元構造はスワミノサンら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３５９，ｐ．８０１（１９９２））によって報告されている。ＳＥＢ分子は２つのドメインから構成され、最初のドメインは残基１−１２０よりなり、２番目は残基１２７−２３９よりなる。また、ＳＥＢのＮ−末端部分にはクラスＩＩＭＨＣ分子結合及び／またはＴＣＲ結合に影響を与える３つの領域（領域１（残基９−２３）、領域２（残基４１−５３）および領域３（残基６０−６１））が同定されている。
発明の開示
上述の知見に着目し、本発明者らは、本来のＳＥＢの有する毒性を軽減し免疫異常性疾患の予防・治療に効果を発揮し得るＳＥＢ改変体及びそれらの誘導体を本態とする新規な免疫異常性疾患の予防・治療用薬剤を提供する本発明を完成した。
すなわち、本発明は、天然型の黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）のアミノ酸配列において少なくとも１のアミノ酸残基の置換を有するＳＥＢ改変体またはその誘導体を有効成分として含有する免疫異常性疾患予防・治療用剤であって、該改変体または該誘導体は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の特異的Ｖβ成分と相互作用するが、天然型ＳＥＢや組換え野生型ＳＥＢによって惹起される特定のＶβ成分をもつＴ細胞の除去を誘導することなくＳＥＢに対する免疫学的応答性のみを低下させるＴ細胞活性化の抑制作用を有するものであることを特徴とする、免疫異常性疾患予防・治療用剤を提供するものである。
本発明の第一の態様において、ＳＥＢ改変体またはその誘導体は、部位特異的突然変異により、天然型ＳＥＢを基準にして９位のアミノ酸がアスパラギン酸以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはアスパラギンで置換されているもの，またはその誘導体である。
本発明の第二の態様において、ＳＥＢ改変体またはその誘導体は、部位特異的突然変異により、天然型ＳＥＢを基準にして２３位のアミノ酸がアスパラギン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはチロシン、アスパラギン酸、イソロイシンまたはリジンで置換されているもの、またはその誘導体である。
本発明の第三の態様において、ＳＥＢ改変体またはその誘導体は、部位特異的突然変異により、天然型ＳＥＢを基準にして４１位のアミノ酸がイソロイシン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはアルギニンもしくはスレオニンで置換されており、かつ４４位のアミノ酸がフェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはバリンに置換されているかもしくは４５位のアミノ酸がロイシン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはバリンに置換されているもの、またはその誘導体である。
本発明の第四の態様において、ＳＥＢ改変体またはその誘導体は、部位特異的突然変異により、天然型ＳＥＢを基準にして４４位のアミノ酸がフェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸、好ましくはセリンに置換されているもの、またはその誘導体である。
発明を実施するための最良の形態
本発明では、ＳＥＢ改変体の調製に際し、ＴＣＲとの結合に係る部位には改変を施すことなく、クラスＩＩＭＨＣ分子への結合に影響を与えるものについて鋭意検討を重ねた。スーパー抗原とクラスＩＩＭＨＣとの結合は、スーパー抗原によるＴ細胞活性化に必須であるため、直接ＴＣＲ結合部位に影響を与えずともクラスＩＩＭＨＣ分子への結合を抑制することによりＴ細胞のＳＥＢに対する応答性が低下する可能性（アナジーの誘導）が期待されたからである。
９−２３のアミノ酸残基として定義される領域１では、特に重要なクラスＩＩＭＨＣ分子への結合を妨害する２３位アスパラギンの改変（Ｎ２３Ｄ、Ｎ２３Ｋ、Ｎ２３Ｙ、Ｎ２３Ｉ）について重点的に検討した。また、９位アスパラギン酸（Ｄ９Ｎ）及び１７位フェニルアラニン（Ｆ１７Ｓ）の改変についても同様に調べた。なお、本明細書に用いられる改変に係る表記は、アミノ酸残基位置の数字の前に改変前のアミノ酸名を、後に改変後のアミノ酸名を表記したものであり、例えば「Ｎ２３Ｄ」の場合、Ｎ末端から２３番目（２３位）のＮ（Ａｓｎ：アスパラギン）をＤ（Ａｓｐ：アスパラギン酸）に置換した改変体を意味する。
残基４０−５３で定義される領域２は、全ての黄色ブドウ球菌の腸管内毒素においてクラスＩＩＭＨＣ分子への結合を仲介するのに重要である。ここで４１位、４４位、４５位及び５３位の変異について検討した。これらの残基はクラスＩＩＭＨＣ分子への結合に特異的である。残基４１、４４、４５、５３位、さらに５９位に点突然変異（部位特異的突然変異）を導入し改変体を作製した。即ち、Ｉ４１Ｔ  Ｌ４５Ｖ、Ｉ４１Ｒ  Ｆ４４Ｖ、Ｆ４４Ｓ、Ｆ４４Ｌ  Ｉ５３Ｎ、Ｆ４４Ｌ  Ｉ５３Ｎ  Ｇ５９Ｗである。
上述のＳＥＢ改変体について後述の方法でその安全性と有効性について検討した結果、以下の態様のＳＥＢ改変体が、慢性関節リウマチ等の免疫異常性疾患に対する新規な予防・治療用薬剤の本態として安全で、かつ良好な機能を発揮し得ることを確認した。
▲１▼天然型ＳＥＢを基準にして９位のアミノ酸がアスパラギン酸以外のタンパク質構成アミノ酸、とりわけアスパラギンで置換されているＳＥＢ改変体またはその誘導体。
▲２▼天然型ＳＥＢを基準にして２３位のアミノ酸がアスパラギン以外のタンパク質構成アミノ酸、とりわけチロシン、アスパラギン酸、イソロイシンまたはリジンで置換されているＳＥＢ改変体またはその誘導体。
▲３▼天然型ＳＥＢを基準にして４１位のアミノ酸がイソロイシン以外のタンパク質構成アミノ酸、とりわけアルギニンもしくはスレオニンで置換されており、かつ４４位のアミノ酸がフェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸、とりわけバリンに置換されているかもしくは４５位のアミノ酸がロイシン以外のタンパク質構成アミノ酸、とりわけバリンに置換されているＳＥＢ改変体またはその誘導体。
▲４▼天然型ＳＥＢを基準にして４４位のアミノ酸がフェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸、とりわけセリンに置換されているＳＥＢ改変体またはその誘導体。
さらに、これらのＳＥＢ改変体を本態とする薬剤において、とりわけ、経口投与ルートでの投与形態が驚くべき効果をもたらすことを見出した。
まずＳＥＢ改変体の毒性低減について体重減少誘発を指標として検討した。体重減少の評定はＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて行なった。含まれるエンドトキシンを実験に影響を与えない濃度に除去したＳＥＢ３００μｇをＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）に溶解し、マウスに腹腔内投与し、翌日より各個体の体重測定を行なった。結果は、野生型ＳＥＢ及びＤ９Ｎでは７〜９％の体重減少が投与後３日まで認められたが、残り全ての改変体では体重減少は認められなかった。
さらに、本発明者らはこれら改変体について、Ｄ−ガラクトサミン誘導致死毒性の有無について検討した。Ｄ−ガラクトサミンを投与するとＳＥＢに対するマウスの感受性が著しく上昇し、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合ＬＤ５０が２μｇ／マウスまで低下し、２０μｇ／マウスでは１００％死亡することをＭｉｅｔｈｋｅ  Ｔ．らが報告している（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１７５，ｐ．９１−９８（１９９２））。
本発明者らは、この実験系を用いて改変体の致死毒性の有無について検討した。その結果、野生型とＤ９Ｎでは４８時間後の死亡率がそれぞれ９／１０、８／１０であったのに対して、Ｉ４１Ｔ  Ｌ４５Ｖが３／１０、Ｉ４１Ｒ  Ｆ４４Ｖが１／１０、Ｆ４４Ｓが０／１０、Ｆ４４Ｌ  Ｉ５３Ｎが０／１０、Ｆ４４Ｌ  Ｉ５３Ｎが１／１０、そしてＦ４４Ｌ  Ｉ５３Ｎ  Ｇ５９Ｗが０／１０であり、これらの改変体では致死毒性は著しく低減されていることが判明した。これは、特表平８−５００３２８で開示された毒性低減のみならず、致死毒性も除去できることを明確に示している。
ところで、免疫異常性疾患の予防・治療用剤としての可能性が期待されるＳＥＢであるが、この物質そのものが免疫異常性疾患の発症に関与しているとの報告がある（Ｏｍａｔａ  Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７９，ｐ．１３８−１４５（１９９７））。そこで、ＳＥＢそのもの及び本発明のＳＥＢ改変体の免疫異常性疾患発症との関連について、ヒトの慢性関節リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；以下、ＣＩＡと呼称することがある）の系を用いて検討した。コラーゲンを投与して関節炎を誘導したマウスに、天然型ＳＥＢ及び本発明によって提供される代表的なＳＥＢ改変体を追加投与すると、天然型ＳＥＢを投与されたマウス群では関節炎の発症率が高度に高く、その重症度も高度であって、発症とＳＥＢとの関連が否定できないデータが得られたのに対して、ＳＥＢ改変体の投与では重篤な発症を生じることはなかった。
ＳＥＢによるいくつかの毒性はＳＥＢによって刺激された白血球が産生するモノカイン、とくに腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）に起因すると考えられる。事実、ヒトの末梢血リンパ球にＳＥＢを反応させると多量のＴＮＦ−αが産生される。しかしながら、ＳＥＢ改変体によるＴＮＦ−α産生は著しく少なく、特にＮ２３Ｙの刺激活性は最も低かった。
このように、ＳＥＢ改変体は増殖あるいはサイトカイン産生などの刺激活性が低下していた。この活性低下がインビボにおけるマウスの致死毒性の軽減や、関節炎惹起能の失活などと密接にかかわるものと推察された。しかしながら興味深いことに、ＳＥＢ改変体は上述のＴリンパ球刺激活性は著しく低下しているものの、逆に、Ｔリンパ球の活性化を抑制する活性が認められた。Ｔ細胞を抗原提示細胞存在下で抗原で刺激した場合、Ｔ細胞は増殖したりガンマーインターフェロン（γ−ＩＦＮ）等のサイトカインを産生するが、本系にＳＥＢ改変体を加えるとこれらの反応が抑制された。すなわち、ＳＥＢを改変することによって、単に天然型ＳＥＢの有する毒性が軽減されるだけでなく、Ｔ細胞の活性化反応を抑制するという天然型ＳＥＢにはみられない作用が新たに生じることがわかった。
このＴ細胞活性化の抑制効果はインビボでも認められた。まず、前述の実験系で関節炎の発症に深く関与する天然型ＳＥＢの投与に先立ち、本発明のＳＥＢ改変体を投与しておくと、重篤な関節炎の発症を防御し得るという、ＳＥＢ改変体投与の優れた効果を支持する結果が得られた。
本発明のこれらＳＥＢ改変体について経口投与による自己免疫疾患治療薬への応用の可能性について、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の系で検討した。その結果、野生型、Ｉ４１Ｔ  Ｌ４５Ｖ、  Ｉ４１Ｒ  Ｆ４４Ｖ、Ｆ４４Ｌ  Ｉ５３Ｎ  Ｇ５９Ｗ、Ｆ４４Ｓ、Ｎ２３Ｙ、Ｎ２３Ｉ、Ｎ２３Ｄは関節炎の増悪を抑制することが判明し、有効性が保たれていることが確認された。とりわけ、Ｎ２３Ｙは改変体の中でも最も強くＣＩＡを抑制した。
従って、本発明によってもたらされるＳＥＢ改変体を本態とする薬剤は、従来のものと比べて毒性が低く、且つＴ細胞の抑制活性に基づいたより有効性の高い慢性関節リウマチの予防・治療用剤、特に経口投与剤として利用可能である。また、特開平９−１１０７０４で開示される天然型ＳＥＢで示されているような炎症性腸疾患に対する発症予防効果も期待できる。
本願発明の免疫異常性疾患の予防・治療用経口投与剤は、その本態であるＳＥＢ改変体を他の投与形態の薬剤に比べて極めて少量含有することを特徴とする。これらＳＥＢ改変体はＳＥＢと同様にＳＥＢ結合性のＶβＴＣＲ  Ｔ細胞亜集団に特異的に弱いトレランスを誘導するが、一方で、経口投与した場合、炎症性のＴ細胞の作用を抑制する働きを有している。
本発明に使用されるＳＥＢ改変体を調製する方法は特に限定されることはないが、遺伝子組み換え技術によって得られるＳＥＢ産生細胞より分離する方法によって調製することができる。
例えば、本発明の薬剤の本態となるＳＥＢ改変体の基本となる野生型ＳＥＢ（黄色ブドウ球菌に由来するＳＥＢと同じアミノ酸配列を有する遺伝子組換え技術に基づいて調製されたＳＥＢ）は、概略以下の方法で調製する。
ＳＥＢの染色体ＤＮＡは公知であるので（Ｒａｎｅｌｌｉ  Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８２，ｐ．５８５０〜（１９８５））、ＤＮＡ合成機等を用いて５’センスプライマー及び３’アンチセンスプライマーを合成することができる。該プライマーと市販されているＳＥＢのＤＮＡライブラリーに存する染色体ＤＮＡによるプラークハイブリダイゼーションによりプラークを採取し、さらにセンスのプライマーを用いてＰＣＲを行ない、得られたバンドからＤＮＡを抽出する。そして、好適なクローニングベクターに抽出されたＤＮＡを挿入してクローニングする。
クローニングされたＳＥＢをコードする遺伝子をＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ等の制限酵素で切断し、同じく制限酵素ＸｍｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ等で切断したベクターに組み込むことによって組換え体ＤＮＡを得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、第９章、１９８９年、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。ベクターとしては、分泌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａ等が好適に用いられ得る。
得られた組換え体ＤＮＡを適当な宿主、例えば大腸菌に組み込むことにより、形質転換体を得ることができる。当該形質転換体を常法により培養した後、培養終了後に菌体を採取し、常法により菌体を破砕し懸濁液より所望の野生型ＳＥＢを得ることができる。なお、条件によっては培養上清中に好適に野生型ＳＥＢが分泌されている場合があり、この場合、培養上清が調製の出発原料となり得る。出発原料を、例えば、抗ＳＥＢ単クローン抗体を吸着体に結合させた免疫アフィニティークロマトグラフィー等の精製手段により精製する。なお、各種試験に用いられる最終調剤の緩衝液は、トリス―塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等を用いることが好ましい。
本発明のＳＥＢ改変体の調製は前述の野生型ＳＥＢの調製に準じて行うことができる。ただし、ＳＥＢのＸ線構造解析データに基づく分析によりクラスＩＩＭＨＣ分子との結合部位を解析し、アミノ酸の特定の改変部位を決定して好適なプライマーを調製し、ＰＣＲによる点突然変異の操作を加えることが必須の要件となる。
調製された野生型ＳＥＢ及びＳＥＢ改変体を最大限に維持するためには、新鮮であるか、４℃で保存する場合は保存後約５日以内のものが好ましい。あるいは、本発明のＳＥＢ改変体は、ゼラチン、塩、糖、糖アルコールまたはアミノ酸等の好適な環境で保存することができる。
また、本発明では有効成分としてのＳＥＢ改変体もしくはその誘導体と公知の適当な賦形剤を組み合わせ、公知の方法で本発明の免疫異常性疾患予防・治療用剤とすることができる。本薬剤の最終的な剤型については、経口投与用の薬剤である限り特別の制約はなく粉末（固形）状、溶液状あるいはシロップ状のものが考慮され得る。例えば、ＳＥＢ改変体もしくはその誘導体を適当な賦形剤、例えば炭水化物、糖、糖アルコールおよびアミノ酸等と共に凍結乾燥し固形状としたものまたはＳＥＢ改変体もしくはその誘導体を生理食塩水および許容し得る張度のイオン強度を有する適当な緩衝液中に溶解した液状製剤等は好適な態様である。また、本態となるＳＥＢ改変体もしくはその誘導体を市販の飲料水に溶解し経口的に摂取することも考えられ得る。薬剤中の含量については、１回の投与当たり０．０５μｇ〜５０ｍｇ（０．００１〜１，０００μｇ／ｋｇ体重）、好ましくは０．５μｇ〜０．５ｍｇ（０．０１〜１０μｇ／ｋｇ体重）のＳＥＢ改変体もしくはその誘導体を含有する薬剤が好適である。
本発明のＳＥＢ改変体もしくはその誘導体を本態とする免疫異常性疾患予防・治療用剤の有効投与量は、例えば投与対象者の年齢、症状および重症度などにより変動し、最終的には医師の意図により変動するものであるが、例えばＳＥＢ改変体に換算した場合、一般に成人１日当たり０．０５〜５０，０００μｇであり、好ましくは０．５〜５００μｇを１〜２回に分けて経口的に投与するのがよい。また、場合により例えばアザチオプリン、シクロフォスファミド、またＴＮＦα抗体等の高分子の抗炎症剤等の他の薬剤と併用することも可能である。
本発明のＳＥＢ改変体含有免疫異常性疾患予防・治療用剤が適用できる免疫異常性疾患としては、慢性関節リウマチや潰瘍性大腸炎等の自己免疫疾患が主たる適用疾患として挙げられるが、自己免疫疾患以外にも例えば骨髄移植後の移植片対宿主病やＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型アレルギー性疾患にも適用できる。
また、本発明のＳＥＢ改変体の「誘導体」とは、上記少なくとも１のアミノ酸残基の置換を有するＳＥＢ改変体がさらにアミノ酸修飾を受けたものをいい、上記特定のアミノ酸以外に天然型ＳＥＢのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸残基がさらに置換、欠失、挿入等されたもので、本発明のＳＥＢ改変体と同等の活性を有するものはいずれも本発明に包含される。
産業上の利用可能性
本発明により、従来より強く望まれていた慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患をはじめとする免疫異常性疾患に対する新規な予防・治療用薬剤を提供することが可能となる。
実施例
以下に、調製例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
調製例１（組換えＳＥＢ改変体の作製と発現）
１−１  ＳＥＢ遺伝子のクローニング
ＣＬＯＮＯＴＥＣ社よりＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ＋Ｂ＋ＤのＤＮＡライブラリーを購入し、プラークハイブリダイゼーション法を行なった。プローブとして、アンチセンスの合成ＤＮＡあるいはＰＣＲ断片を用いた。プライマーは以後のクローニング操作を容易にするために両端にＳａｌＩ切断部位を付加した。
上記プライマーと結合したプラークを採取し、さらにセンスのプライマーを用いてＰＣＲを行ない、得られたバンドからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ−ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。上記ハイブリダイゼーションに用いたプライマーを表１に示す。
0004422330.tif 000002
その後、オートシークエンサーを使用して、ＤＮＡの塩基配列を確認した。得られたＳＥＢ遺伝子はプロモーター領域（ＳＥＢ−Ｐｒｏ）を含んでいたので、プロモーター領域を含まないＳＥＢ遺伝子を得るために更に、表２に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、得られたＤＮＡ断片をＰＣＲ−ＩＩベクターにクローニングした。
0004422330.tif 000003
得られたＳＥＢ遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、オートシークエンサーを用いて決定したが、上記のようにして得られたＳＥＢ遺伝子には突然変異は含まれていなかった。プロモーター領域を含まないＳＥＢ遺伝子を、ＳａｌＩで切断し、同じ切断部位を持つ分泌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にクローニングし、正常な方向に挿入されているものを使用して、ＩＰＴＧを用いた誘導を行ない、ＳＥＢが分泌発現されることを確認した。
１−２  ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）
本実施例では、ＰＣＲはＳａｉｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．，２３９，ｐ．４８７（１９８８））の報告に従い、ＴａｑポリメラーゼとＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて行なった。２本鎖テンプレートＤＮＡを変性解離させるための１分間の変性工程（９４℃）、プライマーとテンプレートを会合させるための２分間のアニーリング工程（５５℃）及び合成のための２分間の延長工程（７２℃）を３０〜３５サイクル行なった。テンプレート濃度は１〜１０Ｍであり、オリゴヌクレオチドプライマー濃度は１ｍＭとした。ｄＮＴＰの濃度は２００ｍＭであるが、突然変異を導入する場合は１つのｄＮＴＰ濃度を２０ｍＭに低下させた。
１−３  組換えＳＥＢ改変体の作製と発現
ＳＥＢ改変体は、アミノ酸置換導入を行なったもののみ組換え発現した。Ｍａｒｒａｃｋ  Ｐ．ｅｔ．ｅｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．，１７１，ｐ．４４５（１９９０））の報告に基づき、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する結合力に影響を与える領域を改変した。表３にアミノ酸置換の導入部位について示す。
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１−４  アミノ酸置換の導入
ＰＣＲＩＩベクターに挿入したＳＥＢ−Ｐｒｏ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして、５’末端にＳｆｉＩ部位を、３’末端にＮｏｔＩ部位をＰＣＲを用いて付加した。得られたＤＮＡ断片をｐＴｒｃ９９ＡｐｅｌＢベクターに挿入し、塩基配列をシーケンシングして確認した。各ＳＥＢ改変体のアミノ酸置換導入位置の遺伝子に本来のアミノ酸が目的とするアミノ酸に変換されるように塩基配列に変異を入れたＰＣＲ用プライマーをセンス側及びアンチセンス側それぞれ１本ずつ合成した。まずアンチセンス側のプライマー（Ｄ９Ｎ、Ｎ２３Ｉ、Ｎ２３Ｙ、Ｎ２３Ｄ、Ｎ２３Ｋ、Ｆ１７Ｓ、Ｆ１７Ｓ  Ｎ２３Ｄ）−ＳＥＢを用いて先に作製し、ＳｆｉＩ部位付加用プライマーをセンスプライマーにしてＰＣＲを行なった。
図１及び図２にそれぞれの改変体に用いたＰＣＲプライマーの塩基配列を示す（配列番号５〜１９）。
次に、センスプライマーを用いて先に作製したＮｏｔＩ部位付加用プライマーをアンチセンスプライマーとしてＰＣＲを行なった。得られた２本のＤＮＡ断片を使用してＰＣＲを行ない、得られたＤＮＡ断片をｐＴｒｃ９９Ａにクローニングした。その後ＳｆｉＩとＮｏｔＩで挿入されたベクターを処理して目的とするサイズのＤＮＡ断片に切断されるか調べ、切断されたものについてＤＮＡ塩基配列のシーケンシングを行ない変異の導入が正確になされているかどうか確認した。
１−５  ＳＥＢ改変体の発現及び該改変体の調製
ＳＥＢ改変体の発現はｐＴｒｃ９９Ａベクターに挿入された改変体遺伝子を用いて行なった。遺伝子を組み込んだ大腸菌を４％ＣＩＲＣＬＥＧＲＯＷ（ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、アンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を溶かした培地で３７℃１８時間培養し、細胞を集めた後、さらに同じ培地に、Ｏ．Ｄ．５５０ｎｍが０．３〜１．０になるように調整して浮遊し、２ｍＭイソプロピル−Ｂ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて３７℃で一晩振とうすることにより誘導を行なった。誘導後、遠心分離により宿主の大腸菌を除去し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した。
このようにして調製した培養上清を、抗ＳＥＢ単クローン抗体ＳＡ５８−２−６ＩｇＧを固相化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムに通液し、含まれるＳＥＢ改変体を吸着させた。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄したのち、４Ｍ  ＭｇＣｌ２で溶出した。溶出画分は、２０倍容の生理食塩水に３回透析後、２０倍容のＰＢＳに２回透析した。今回調製したＳＥＢ改変体は全てこの単クローン抗体カラムで精製することが可能であった。
実施例１（マウスを用いた致死毒性試験）
Ｍｉｅｔｈｋｅ  Ｔ．らが報告しているように、天然型ＳＥＢは通常はマウスに致死毒性をもたらさないが、これにＤ−ガラクトサミンを２０μｇ／ｋｇで投与し、さらに２０μｇ／マウスのＳＥＢを投与静脈内若しくは腹腔内に投与することで、死亡することが知られている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．，１７５，ｐ．９１−９８（１９９２））。本実施例では予めＤ−ガラクトサミンを投与したマウスに引き続きＳＥＢ及びＳＥＢ改変体を投与して、これらが実際に死亡率を改善するものであるかどうかを調べた。
先ず、エンドトキシンに対する感受性を調べるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＤ−ガラクトサミン２０ｍｇ／マウスを投与後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ４株由来のＬＰＳ（リポ多糖）を静脈内投与して２４時間後の死亡率を調べた。その結果、ＬＰＳ投与量が１ｎｇ／マウス以下では死亡例は０であった（表４）。
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ＳＥＢ改変体標品中に含まれるエンドトキシンの量を最終投与量が１０ｎｇ／マウス以下になるように除去し、雄を使用して実験を行なった。雄では、Ｄ−ガラクトサミン投与後のＳＥＢの致死毒性は１００μｇ／マウス以上を投与したときに発現されたので、ＳＥＢ改変体の投与量は１００μｇ／マウスとした。表５に示すように、天然型ＳＥＢ、野生型ＳＥＢ及びＤ９Ｎ−ＳＥＢではマウスの死亡率は高く、致死毒性があることが示されたが、他の改変体では致死毒性は低減されていた。なお、ここでいう天然型ＳＥＢとは黄色ブドウ球菌に由来する腸管内毒素を意味し、野生型ＳＥＢは天然型ＳＥＢとアミノ酸配列を同じくする遺伝子組換え技術に基づいて調製されたＳＥＢを意味する。
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次に、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて実験を行なった。雌ではＤ−ガラクトサミン４０ｍｇ／マウスを投与したとき、ＳＥＢ２０μｇ／マウスで高い致死毒性が認められた。天然型−ＳＥＢ、野生型−ＳＥＢ、Ｄ９Ｎ−ＳＥＢでは高い死亡率となったが、その他の改変体では死亡率は低く、致死毒性が低減されていることが示された。
実施例２（ＳＥＢ及びＳＥＢ改変体刺激によるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＴＮＦ−α産生の比較）
健常人末梢血よりリンパ球分離液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させた。１００ｍｌの細胞浮遊液を９６穴マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ）に加え、これにさらに１００ｍｌのＳＥＢ及びＳＥＢ改変体溶液を添加して３７℃で２４時間培養した。２４時間後に培養上清を回収し、上清中のＴＮＦ−αをヒトＴＮＦ−α用エンザイムイムノアッセイキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で定量した。図３にその結果を示す。ＳＥＢでＰＢＭＣを刺激した場合、多量のＴＮＦ−αが産生されたのに対し、ＳＥＢ改変体ではＴＮＦ−α産生は著しく低下していた。特にＮ２３Ｙが最も低い値を示し、ＳＥＢに対する比活性は１０００倍以下であった。
実施例３（ＳＥＢ改変体によるＴ細胞抑制活性）
ＳＥＢ改変体によるＴ細胞抑制活性をｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（ＰＰＤ）応答性マウスＴ細胞株ＰＰＤ９１４を用いて評価した。本Ｔ細胞株はＶβ８ＴＣＲ陽性であり、抗原であるＰＰＤのみならず、ＳＥＢにも反応することができる。１×１０４個のＰＰＤ９１４をマイトマイシン処理したＤＢＡ／１Ｊ由来の脾臓細胞５×１０５個を９６穴マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ）で培養し、０．５ｍｇ／ｍｌのＰＰＤを加えて刺激した。この系にＳＥＢ改変体を１ｍｇ／ｍｌで添加し、３７℃で４８時間培養した。４８時間後に０．５ｍＣｉ／ｗｅｌｌでトリチウムチミジンを加えて、さらに１６時間追加培養し増殖反応を測定した。ＳＥＢ改変体による抑制活性は改変体非添加群と比較することにより評価した。結果を図４に示す。改変体Ｎ２３Ｙ及びＦ４４Ｓは抗原であるＰＰＤによって惹起されるＴ細胞の増殖応答を抑制した。
実施例４（コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）でのＳＥＢ改変体の安全性の評価）
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、ＤＢＡ／１マウスに、ウシＩＩ型コラーゲンをフロイント完全アジュバントとともに、２００μｇ／マウスで皮内投与して誘導した。ウシＩＩ型コラーゲン投与より２１日後にＳＥＢ、Ｆ４４ＳまたはＮ２３Ｄを各々５０μｇ／マウスの投与量で腹腔内投与し、一週間後（初回のコラーゲンの投与より２８日後）に関節炎の発症率を比較した。表６に関節炎発症率と重症度について結果をまとめてある。ＳＥＢを投与されたマウスでは強力な関節炎が８例中５匹に観察されたが、Ｆ４４ＳまたはＮ２３Ｄの投与群のマウスには１例も関節炎は認められなかった。
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実施例５（ＳＥＢ誘導性関節炎におけるＳＥＢ改変体の予防効果）
実施例４と同様の方法で誘導したＤＢＡ／１マウスに、ウシＩＩ型コラーゲン投与より１８日後、Ｆ４４ＳまたはＮ２３Ｄおよび対照としてリン酸緩衝液を各々５０μｇ／マウスの投与量で腹腔内投与した。さらに３日後に５０μｇ／マウスのＳＥＢを腹腔内投与した。表７にリン酸緩衝液投与群では８例中４例（５０％発症率）のマウスに関節炎が認められたが、Ｆ４４ＳまたはＮ２３Ｄを前投与することによって、発症率はそれぞれ１３％及び２５％に抑制された。
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実施例６（コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）でのＳＥＢ改変体の経口投与による治療効果）
実施例４と同様にしてＣＩＡを誘導したＤＢＡ／１マウスに、その後２１日後にウシＩＩ型コラーゲンをそのまま腹腔内投与するブースターを行なった。ＣＩＡの発症は関節炎スコアを測定し、重症度を比較し、実験開始時点での疾患の重症度を一定にそろえた。経口投与は、予め計算したマウス１日の飲水量を調べ平均飲水量を計算し、適度にバラツキがでるように群分けしたものを用いた。
群分け後、ＳＥＢ改変体を自由飲水投与し、疾患の軽減を見る実験を開始した。毎週１回スコアを読み、重症度の推移を記録した。これらの結果を図５及び図６に示す。ＣＩＡの症状軽減、増悪抑制活性については、Ｉ４１Ｒ  Ｆ４４Ｖ、Ｉ４１Ｔ  Ｌ４５Ｖ、Ｄ９Ｎ、Ｎ２３Ｋ、Ｆ４４Ｓ、Ｎ２３Ｉ及び野生型ＳＥＢについて有効であった。各実験群の関節炎スコアを基にＰＢＳ（ＣＩＡ発症群）投与群と改変体投与群との間でウイルコクソン検定による有意差検定を行なった。その結果、上記の改変体投与群すべてにおいて、発症からの経過日数が２５日〜７５日の間は０．０５以下の危険率で有意であり、これらの改変体はＣＩＡで症状軽減効果があることが判った。従って、毒性が低減されかつＣＩＡでの有効性が保持されているＳＥＢ改変体の有効性が確認され、これらは副作用の極めて少ないヒトの慢性関節リウマチの治療用経口投与剤としての可能性が高いことを示唆している。
一方、Ｄ９Ｎ  Ｎ２３Ｄ、Ｆ１７Ｓ  Ｅ２２Ｄ及びＮ２３Ｙ  Ｆ２０８Ｌの投与群ではＰＢＳ投与群との比較で、ウイルコクソン検定において０．０５の危険率で有意差はなかった。
実施例７（コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）でのＳＥＢ改変体の経口投与による予防的治療効果）
実施例４と同様にして、２００μｇのウシＩＩ型コラーゲンをＣＦＡに懸濁してＤＢＡ／Ｉマウスの尾部皮内に免疫した。免疫後２０日後より生理食塩水に溶解したＳＥＢ改変体をマウスあたり０．５ｍｇ、隔日経口投与した。初回免疫後３０日目に１００μｇのコラーゲンを腹腔内に投与した（ブースター）。経時的に関節炎を観察しスコア化し、ＳＥＢ改変体のＣＩＡ抑制作用を評価した。図７に示すように、ブースターの１０日前よりＳＥＢ改変体を投与する系においてもＳＥＢ改変体はＣＩＡを抑制し、ＳＥＢ改変体の関節炎に対する予防的治療効果が確認された。なかでもＮ２３Ｙは最も効果的で、関節炎を顕著に軽減させた。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のＳＥＢ改変体調製時のアミノ酸置換に用いたそれぞれの改変体に応じたＰＣＲプライマーの塩基配列を示す図である。
図２は、本願発明のＳＥＢ改変体調製時のアミノ酸置換に用いたそれぞれの改変体に応じたＰＣＲプライマーの塩基配列を示す図である。
図３は、野性型ＳＥＢ及びＳＥＢ改変体刺激によるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＴＮＦ−α産生量を示す図である。
図４は、ＳＥＢ改変体によるＴ細胞抑制活性を示す図である。
図５は、コラーゲン誘導関節炎に対するＳＥＢ改変体の経口投与による治療効果を示した図であり、有効であった投与群のものである。縦軸は被験マウスの重症度、横軸は発症してからの経過日数を示す。
図６は、コラーゲン誘導関節炎に対するＳＥＢ改変体の経口投与による治療効果を示した図であり、無効であった投与群のものである。縦軸は被験マウスの重症度、横軸は発症してからの経過日数を示す。
図７は、コラーゲン誘導関節炎に対するＳＥＢ改変体の経口投与による予防的治療効果を示した図である。縦軸は被験マウスの重症度、横軸はＳＥＢ改変体の投与開始からの経過日数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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