(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原に対する少なくとも一次自己抗体および二次自己抗体について体液サンプルをスクリーニングするインビトロ方法であって、該方法は：
（ａ）該抗原に対する少なくとも１つの抗体をその上に固定化する基材を提供する工程であって、固定化された抗体は、該抗原の一次結合部位と結合する、工程；
（ｂ）該抗原に対する少なくとも一つの非固定化抗体を提供する工程であって、該抗体は、（ｉ）工程（ｅ）にしたがって該基材に沿って流動し、（ｉｉ）該抗原の二次結合部位に結合し、そして（ｉｉｉ）該抗原への該一次自己抗体および／または二次自己抗体の結合をモニタリングすることを可能にする標識化手段が提供される、工程；
（ｃ）該少なくとも一つの抗原供給源を提供する工程であって、該抗原は、該一次自己抗体または該固定化抗体のいずれかが結合し得る一次結合部位、および該二次自己抗体または該非固定化抗体のいずれかが結合し得る二次結合部位を含む、工程；
（ｄ）混合物を得るために、工程（ｃ）の該抗原供給源と体液サンプルおよび該非固定化抗体を接触させる工程であって、該抗原は、該サンプル中および／または該非固定化抗体中に存在する場合、該一次自己抗体および／または二次自己抗体との結合を可能にされる、工程；
（ｅ）該基材に固定された該抗体に該混合物を接触させることを可能にするために、該基材に対して混合物を流動させることを可能にする工程；ならびに
（ｆ）該体液サンプル中の該一次自己抗体または二次自己抗体の存在の指標を提供するための、結合をモニタリングする工程；
を包含し、該一次自己抗体および／または二次自己抗体は、該サンプル中に存在する場合、該抗原への該一次自己抗体および／または二次自己抗体の競合的結合のために、該抗原の該一次結合部位および該二次結合部位との該固定化抗体および／または該非固定化抗体のそれぞれの結合が阻害されるように、工程（ｄ）における該抗原の該一次結合部位および該二次結合部位と結合することをさらに特徴とし、それにより、該標識手段が該基材上で検出可能でないか、または該一次自己抗体および二次自己抗体の非存在下でのスクリーニングと比較して低いレベルまで検出可能であり、ここで抗原が該固定化抗体および該非固体化抗体の両方と非競合的に結合する、方法。
【請求項２】
前記抗原が、甲状腺タンパク質を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記甲状腺タンパク質が、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイログロブリンおよび甲状腺刺激ホルモンレセプターからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記甲状腺タンパク質が、甲状腺ペルオキシダーゼおよびサイログロブリンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記体液サンプル中において、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トリ−ヨードサイロニン、およびサイログロブリンのうちの少なくとも一つの検出のためにスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記非固定化抗体が、精製された形態で供給される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記非固定化抗体が、モノクローナル抗体を含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記非固定化抗体が、前記抗原に対する自己抗体を含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記固定化抗体が、前記抗原に対する一次自己抗体を含み、前記非固定化抗体は、該抗原に対する二次自己抗体を含み得る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｆ）における前記モニタリング工程が、工程（ｃ）の前記混合物中に存在する前記自己抗体および前記抗原の前記結合に依存する比色変化を観察する工程を包含する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記標識化手段が、金コロイドを含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法であって、スクリーニングされている前記自己抗体の存在下または非存在下で存在するポジティブコントロールを提供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１３】
前記ポジティブコントロールは、前記抗原に対する少なくとも１つのコントロール抗体を前記基材に付着させる工程を含み得、該コントロール抗体は、スクリーニングされる自己抗体のためのその結合部位と別の抗原上の部位に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポジティブコントロールは、少なくとも１つの非固定化抗体に結合し得る、少なくとも１つのコントロール剤を前記基材に付着させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）において得られた前記混合物が、前記基材に沿って流動すること、および該基材に対して固定化された前記抗体と相互作用することが可能である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも前記体液サンプルが、前記基材のアプリケーションゾーンと接触され、該アプリケーションゾーンが、前記固定化抗体に対する該基材の上流に提供され、そして該固定化抗体と相互作用するために、前記混合物が、該アプリケーションゾーンから該基材に沿って流動することが可能である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アプリケーションゾーンが、工程（ａ）の前記抗原の前記供給源を含有し、そして工程（ｄ）における前記混合物が、前記体液サンプルを該アプリケーションゾーンの該抗原に接触させることにより得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アプリケーションゾーンが、前記非固定化抗体をさらに含有し、そして工程（ｄ）における前記混合物は、前記体液サンプルおよび前記抗原を、該アプリケーションゾーン中に存在する該非固定化抗体に接触させることにより得られる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）の前記混合物を提供するために、工程（ｃ）の前記抗原供給源および前記体液サンプルが、前記基材から隔てて接触され、そして該混合物はその後、前記アプリケーションゾーンと接触される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｄ）の前記混合物を提供するために、工程（ｃ）の前記抗原供給源、前記体液サンプルおよび／または前記非固定化抗体が、前記基材から隔てて接触され、そして該混合物はその後、前記アプリケーションゾーンと接触される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記基材がニトロセルロース、セルロースアセテートまたはポリアミドのメンブランを含有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記固定化抗体が、精製された形態にある、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記固定化抗体が、前記抗原に対する自己抗体を含有する、請求項１〜８および１０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記固定化抗体がモノクローナル抗体を含有する、請求項１〜８および１０〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または尿を含有する、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの抗原に対する少なくとも一次自己抗体および二次自己抗体について体液サンプルのスクリーニングに使用するためのキットであって、該キットは：
（ａ）該抗原に対する少なくとも１つの抗体をその上に固定化した基材であって、固定化された抗体は、該抗原の一次結合部位と結合する、基材；
（ｂ）該抗原に対する少なくとも一つの非固定化抗体であって、該抗体は、（ｉ）工程（ｅ）にしたがって該基材に沿って流動し、（ｉｉ）該抗原の二次結合部位に結合し、そして（ｉｉｉ）該抗原への該一次自己抗体および／または二次自己抗体の結合をモニタリングすることを可能にする標識化手段が提供される、非固定化抗体；
（ｃ）該少なくとも一つの抗原の供給源であって、該抗原は、該一次自己抗体または該固定化抗体のいずれかが結合し得る一次結合部位、および該二次自己抗体または該非固定化抗体のいずれかが結合し得る二次結合部位を含む、供給源；
（ｄ）混合物を得るために、該抗原供給源と体液サンプルを接触させるための手段であって、該抗原は、該サンプル中および／または該非固定化抗体中に存在する場合、該一次自己抗体および／または二次自己抗体との結合を可能にされる、手段；
（ｅ）該基材に固定された該抗体に該混合物を接触させることを可能にするために、該基材に対して混合物を流すことを可能にするための手段；ならびに
（ｆ）該体液サンプル中の該一次自己抗体または二次自己抗体の存在の指標を提供するための、結合をモニタリングするための手段；
を包含し、該一次自己抗体および／または二次自己抗体は、該サンプル中に存在する場合、該抗原への該一次自己抗体および／または二次自己抗体の競合的結合のために、該抗原の該一次結合部位および該二次結合部位との該固定化抗体および／または該非固定化抗体のそれぞれの結合が阻害されるように、工程（ｄ）にしたがって該抗原の該一次結合部位および該二次結合部位と結合することをさらに特徴とし、それにより、該標識手段が該基材上で検出可能でないか、または該一次自己抗体および二次自己抗体の非存在下でのスクリーニングと比較して低いレベルまで検出可能であり、ここで抗原が該固定化抗体および該非固体化抗体の両方と非競合的に結合する、方法。
【請求項２７】
前記抗原が甲状腺タンパク質を含有する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記甲状腺タンパク質が、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイログロブリンおよび甲状腺刺激ホルモンレセプターからなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記甲状腺タンパク質が、甲状腺ペルオキシダーゼ、およびサイログロブリンからなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記体液サンプル中において、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トリ−ヨードサイロニン、およびサイログロブリンのうちの少なくとも一つの検出のためにスクリーニングするための手段をさらに包含する、請求項２６〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
前記非固定化抗体が、精製された形態で提供される、請求項２６〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
前記非固定化抗体が、モノクローナル抗体を含有する、請求項２６〜３１のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
前記非固定化抗体が、前記抗原に対する自己抗体を含有する、請求項２６〜３１のいずれかに記載のキット。
【請求項３４】
前記固定化抗体が、前記抗原に対する一次自己抗体を含み、前記非固定化抗体は、該抗原に対する二次自己抗体を含み得る、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記モニタリング手段が、前記混合物中に存在する前記自己抗体および前記抗原の前記結合に依存する比色変化を観察するための手段を含む、請求項２６〜３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３６】
前記標識化手段が、金コロイドを含有する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
請求項２６〜３６のいずれかに記載のキットであって、スクリーニングされる前記自己抗体の存在下または非存在下において存在するポジティブコントロールをさらに含む、キット。
【請求項３８】
前記ポジティブコントロールは、前記抗原に対する少なくとも１つのコントロール抗体を前記基材に付着させる工程を含み得、該コントロール抗体は、スクリーニングされる自己抗体のためのその結合部位と別の抗原上の部位に結合する、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記ポジティブコントロールは、少なくとも１つの非固定化抗体に結合し得る、少なくとも１つのコントロール剤を前記基材に付着させる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記基材が、少なくとも前記体液サンプルに対するアプリケーションゾーンを含み、該アプリケーションゾーンが、前記固定化抗体に対する該基材の上流に提供され、それによって前記混合物を、該固定化抗体と相互作用させるため、該アプリケーションゾーンから該基材に沿って流動させることを可能にする、請求項２６〜３９のいずれかに記載のキット。
【請求項４１】
前記アプリケーションゾーンが、前記抗原の前記供給源を含み、そして前記混合物は、前記体液サンプルを該アプリケーションゾーンの該抗原に接触させることにより得られる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記アプリケーションゾーンが、前記非固定化抗体および手段をさらに含み、それにより前記混合物が、前記体液サンプルおよび前記抗原を、該アプリケーションゾーン中に存在する該非固定化抗体に接触させることにより得られる、請求項４０または４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記抗原供給源および前記体液サンプルが、前記基材から隔てて接触される手段が提供され、該手段は、前記混合物、および該混合物が続いて前記アプリケーションゾーンに接触される手段を提供するためである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
前記抗原供給源、前記体液サンプルおよび前記非固定化抗体が、前記基材から隔てて接触される手段が提供され、該手段は、前記混合物、および該混合物が続いて前記アプリケーションゾーンに接触される手段を提供するためである、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記基材がニトロセルロース、セルロースアセテートまたはポリアミドのメンブランを含む、請求項２６〜４４のいずれかに記載のキット。
【請求項４６】
前記固定化抗体が、精製された形態で提供される、請求項２６〜４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】
前記固定化抗体が、前記抗原に対する自己抗体を含有する、請求項２６〜３３または３５〜４６のいずれかに記載のキット。
【請求項４８】
前記固定化抗体が、モノクローナル抗体を含有する、請求項２６〜３３または３５〜４７のいずれかに記載のキット。
【請求項４９】
前記体液サンプルが、血液、血漿、血清または尿を含有する、請求項２６〜４８のいずれかに記載のキット。
【請求項５０】
少なくとも一つの抗原に対する少なくとも一次自己抗体および二次自己抗体についての体液サンプルのスクリーニングにおける、請求項２６〜４９のいずれかに記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（自己抗体のためのアッセイ）
本発明は、種々の抗原に対する自己抗体について、体液サンプルをスクリーニングするためのアッセイに関する。特に、本発明は、自己免疫性甲状腺疾患に関連する自己抗体について、体液サンプルをスクリーニングすることに関する。
【０００２】
自己免疫疾患は、循環自己抗体の存在によって特徴付けられ、そして自己免疫甲状腺疾患において、例えば、自己抗体は、３つの異なる甲状腺タンパク質、すなわち、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、サイログロブリン（Ｔｇ）および甲状腺刺激ホルモンに対するレセプター（ＴＳＨＲ）に指向する。
【０００３】
甲状腺疾患の非存在下において、甲状腺の機能は、下垂体に関与するフィードバック系によって制御される。下垂体は、循環血液中でホルモン甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を分泌する。次いで、ＴＳＨは、甲状腺ホルモン（これは、ほとんど全ての細胞のおいて代謝の工程を刺激する）の合成および放出を刺激するように、甲状腺細胞の表面上でＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ）に作用する。循環甲状腺ホルモンのレベルの上昇に従い、これらのホルモンは、ＴＳＨ放出を阻害するために、下垂体の後方で作用する。これは、血液の甲状腺ホルモンのレベルを低下させる効果とともに、血液のＴＳＨレベルを低下させる。このフィードバック機構は、循環甲状腺ホルモンのレベルを正確な範囲内で維持することを可能にし、従って、代謝活動にわたって良好な制御を保証する。
【０００４】
しかし、甲状腺疾患において、上記のフィードバック系は、しばしば歪められる。例えば、甲状腺が異常に不活性（甲状腺機能不全症）である場合、甲状腺ホルモンのレベルは、正常よりも低く、そしてこれらの低いレベルはＴＳＨ放出を抑制しないので、循環ＴＳＨレベルは高い。甲状腺が異常に活性（甲状腺機能亢進症）である場合、甲状腺のレベルは、正常よりも高く、そしてこれらの高いレベルは、正常よりもＴＳＨ放出を多く抑制し、そして循環ＴＳＨレベルは低い。
【０００５】
甲状腺機能不全症は、しばしば甲状腺を攻撃する自己免疫によって生じる。そしてこの攻撃は、２つの異なる甲状腺タンパク質（自己抗原）、すなわち、ＴＰＯおよびＴｇに対する自己抗体の形成に関連する。ＴＰＯに対する自己抗体および／またはＴｇに対する自己抗体についてのスクリーニングは、分娩後の甲状腺炎などを含む、種々の形態の自己免疫甲状腺機能不全症の診断ならびに管理において重要である。ＴＰＯ自己抗体および／またはＴｇ自己抗体（これは、甲状腺の異常な不活性のもっともらしい原因を示すようである）についてのこのスクリーニングは、甲状腺の異常な不活性および処置の効力の程度を反映する、循環ＴＳＨレベルまたは甲状腺ホルモンレベルの観測を完全にする。
【０００６】
甲状腺機能亢進症はまた、しばしば甲状腺を攻撃する自己免疫によって生じるが、この状態において、自己抗体は、ＴＳＨＲに対して形成される。これらのＴＳＨＲ自己抗体は、ＴＳＨの効果を模倣し、そして循環甲状腺ホルモンのレベルを高くする。このような高い甲状腺ホルモンのレベルは、下垂体において作用し、そして循環ＴＳＨレベルを抑制し、そして結果としてＴＳＨレベルは、正常よりも低くなる。ＴＳＨＲに対する自己抗体についてのスクリーニングは、自己免疫甲状腺機能亢進症の診断において重要である。自己免疫甲状腺機能不全症を伴うために、ＴＳＨＲ自己抗体についてのスクリーニングは、甲状腺の異常な活性および処置の効力の程度を反映する、循環ＴＳＨレベルまたは甲状腺ホルモンレベルの観測を完全にする。
【０００７】
甲状腺癌を有する患者において、Ｔｇの循環レベルについてのスクリーニングは、しばしば、処置後にいくらか残存する、悪性の甲状腺腫瘍細胞の存在の指標として使用される。Ｔｇレベルは、通常、Ｔｇに対するモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体に基づくアッセイによって測定されるが、Ｔｇに対する抗体が自己抗体が患者の試験サンプル中に存在する場合、これらの自己抗体は、Ｔｇアッセイを妨げ得、誤った結果を与え得る。結果として、Ｔｇに対する自己抗体についてのスクリーニングは、しばしば循環Ｔｇレベルの検出および観測と同時に実行される。
【０００８】
他（すなわち、甲状腺でない）の自己免疫疾患の多くの例は、例えば、１型糖尿病（ここで、自己抗体は、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼに対して、および島細胞タンパク質ＩＣＡ５１２またはＩＡ２に対して形成される）、スプルー，シェリアキー，セリアック病（ここで、自己抗体は、組織のトランスグルタミナーゼに対して形成される）、重症筋無力症（ここで、自己抗体は、アセチルコリンレセプターに対して、およびカルシウムチャネルに対して形成される）、全身性エリテマトーデス（ここで、自己抗体は、ＤＮＡに対して、および種々の核タンパク質に対して形成される）などが公知である。
【０００９】
現在、いくつかの型のアッセイが、自己抗体を測定するために使用されている。これらは、例えば、放射性標識（ここで、標識された抗原は、それぞれの自己抗体に直接結合する）を使用する方法、または競合アッセイにおいて放射性標識を使用する方法が含まれる。抗原でコートされた粒子の凝集に基づくアッセイを含む、いくつかの非放射性アッセイがまた、使用される。さらに、サンドイッチ型酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、利用可能である。これらのサンドイッチ型酵素結合イムノソルベントアッセイは、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素と結合させた抗ヒトＩｇＧ試薬と合わせて、抗原でコートされたＥＬＩＳＡプレートを使用する。
【００１０】
しかし、これらには、自己抗体のための現在のアッセイ法に関連して、いくつかの重要な制限がある。例えば：
現在のアッセイは、患者から離れた特別な設備の研究室でのみ、実施され得る；および現在のアッセイは、経験を積んだ作業者によってのみ実施され、そして完了するまでに数時間を要し得る。
【００１１】
従って、本発明の目標は、上述の問題のいくつかを多少とも解決する、改良されたアッセイ系を提供することである。
【００１２】
さらに、本発明の目的は、自己抗体の観測のための、単純かつ迅速なアッセイ方法を提供することであり、そしてまた、自己免疫疾患の診断のための、自己抗体の単純かつ迅速な検出に使用するための診断キットを提供することである。さらに、本発明の目的は、実験手順の経験を有さない作業者によって、患者管理の場所の近くで実施され得るアッセイ方法を提供することである。
【００１３】
従って、本発明に従って、少なくとも１つの抗原に対する、少なくとも１つの自己抗体のために、体液サンプルをスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）自己抗体に対する少なくとも１つの抗原の供給源を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の上記の抗原に対する少なくとも１つの抗体が固定化されている基材を提供する工程；
（ｃ）上記の自己抗体がこのサンプル中に存在する場合、この抗原がこの自己抗体と実質的に結合し得る混合物を得るために、この体液サンプルと工程（ａ）の上記の抗原の供給源を接触させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られる上記の混合物が、工程（ｂ）の上記の基材に固定化した上記抗体と接触するように、上記の基材に対して流動することを可能にする、工程；
（ｅ）工程（ｃ）において得られる上記混合物中に存在する上記自己抗体と上記抗原との結合の観測を可能にするために標識化する手段を提供する工程；および
（ｆ）上記体液サンプルにおいて、上記の自己抗体の存在の指標を提供するために、上記の結合を観測する工程、を包含する。
【００１４】
本発明に記載される方法は、特に、自己免疫甲状腺疾患に関連する、少なくとも１つの自己抗体についてのスクリーニングにおける使用に適切であり、そしてこの抗原は、甲状腺タンパク質を含む。有利に、甲状腺タンパク質は、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、サイログロブリン（Ｔｇ）および甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）からなる群から選択され、そしてさらにより有利に、甲状腺タンパク質は、ＴＰＯおよびＴｇからなる群から選択される。
【００１５】
本発明の特に好ましい局面に従って、ＴＰＯ、Ｔｇ、およびＴＳＨＲからなる群から選択される甲状腺タンパク質を含む、少なくとも１つの抗原に対する、少なくとも１つの自己抗体について、体液サンプルをスクリーニングする方法が、提供され、この方法は、以下：
（ａ）上記自己抗体に対する少なくとも１つの抗原の供給源を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の上記の抗原に対する少なくとも１つの抗体が固定化されている基材を提供する工程；
（ｃ）上記の自己抗体がこのサンプル中に存在する場合、この抗原がこの自己抗体と実質的に結合し得る混合物を得るために、この体液サンプルと工程（ａ）の上記の抗原の供給源を接触させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られる上記の混合物が、工程（ｂ）の上記の基材に対して固定化された上記抗体と接触するように、上記の基材に対して流動することを可能にする、工程；
（ｅ）工程（ｃ）において得られる上記混合物中に存在する上記自己抗体と上記抗原との結合の観測を可能にするために標識化する手段を提供する工程；および
（ｆ）上記体液サンプルにおいて、上記の自己抗体の存在の指標を提供するために、上記の結合を観測する工程、を包含する。
【００１６】
本発明に記載される方法はさらに、好ましくは、自己抗体スクリーニングに加えて、患者由来の体液サンプルに存在する少なくとも１つの、さらなる生物学的マーカー（このマーカーは、自己免疫（代表的に、甲状腺）疾患を示す）についてのスクリーニングを包含する。適切な生物学的マーカーは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、サイロキシン、トリヨードサイロニン、サイログロブリン（Ｔｇ）などからなる群から選択され得る。従って、本発明に記載される方法はさらに、好ましくは、ＴＳＨ、サイロキシン、トリヨードサイロニン、Ｔｇなどからなる群のうち少なくとも１つの存在についてのスクリーニングを包含し、このスクリーニングは患者から得られる体液サンプルにおいて、自己抗体甲状腺疾患のために試験される。
【００１７】
さらなる生物学的マーカーの存在についてのこのようなスクリーニングは、少なくともサイロキシンおよび／またはトリヨードサイロニンの場合、全体または遊離（循環）サイロキシンおよび／あるいは全体または遊離（循環）トリヨードサイロニンについてのスクリーニングを含み得る。本発明において使用される基材に提供される、このようなさらなる生物学的マーカーの存在についてのスクリーニング手段が、所望され得る。あるいは、このようなさらなる生物学的マーカーの存在についてのスクリーニング手段は、本明細書中の先に記載されるように、実質的に基材から離れて提供され得、そして、適切なこのような遠隔スクリーニング手段は、分離キットによって提供され得る。
【００１８】
本発明に記載される方法はまた、非甲状腺の自己免疫疾患に関連する少なくとも１つの自己抗体（例えば、１型糖尿病、スプルー，シェリアキー，セリアック病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデスなどに関連する自己抗体）についてのスクリーニングにおける使用に適している。
【００１９】
本発明に記載される方法が、抗原に対して、少なくとも１つの実質的な非固定化抗体をさらに使用し、そして好ましくは、本発明に記載される方法が、工程（ｃ）において、抗原供給源および体液サンプルを少なくとも１つの実質的な非固定化抗体と接触する工程を包含することが、しばしば好ましい。本明細書中で使用される用語「実質的な非固定化抗体」は、工程（ｃ）において得られた混合物中で提供されたときに、本発明において使用される基材に対して流動することが可能であり得る抗体を示す。
【００２０】
好ましくは、本発明に記載される方法の工程（ｆ）の観測する工程は、工程（ｃ）によって得られた混合物中に存在する、自己抗体および抗原の結合に依存する比色変化を観察する工程を包含する。適切な標識手段は、金コロイド（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｇｏｌｄ）、コロイド炭素、着色のラテックス、染色ポリマーなどからなる群から選択される比色標識を包含し得る。好ましくは、比色標識は、金コロイドを包含する。あるいは、工程（ｆ）における観測する工程は、電気的観測を含み得、これによって視覚的な読み出しが、自己抗体および抗原結合を示すように得られ得る。
【００２１】
比色標識が上記のように実質的に使用される場合、標識手段は、さらに比色標識（例えば、金コロイド）が、標識された抗原および／または抗体に付着し得ることによるリンカーを包含し得る。例えば、適切なリンカーは、−ビオチン−抗ビオチン−、−ビオチン−ストレプトアビジン−（ＳＡ）などを包含し得る。標識手段は、基材から実質的に離れて標識された抗原および／または抗体に対して適用され得る。あるいは、標識手段は、基材に対して提供され得、そしてこのような標識手段は、抗原および／または抗体がまた、基材に対して提供された場合、標識された抗原および／または抗体に対して適用され得る。
【００２２】
有利に、本発明に記載される方法の工程（ｆ）におけるモニタリング工程はさらに、スクリーニングされる自己抗体の存在下または非存在下において存在するポジティブコントロールを提供する工程を包含する。
【００２３】
例えば、ポジティブコントロールは、基材へ付着させる工程、比色標識のための捕獲試薬（例えば、金コロイドなど）を含み得る。あるいは、ポジティブコントロールは、抗原に対する少なくとも１つのコントロール抗体を基材に付着させる工程を含み得、このコントロール抗体は、スクリーニングされる自己抗体のためのその結合部位と別の抗原上の部位に結合する。コントロール抗体は、好ましくは、固定化抗体に対して下流の基材の位置で、本発明に記載される方法で使用される基材に付着される。さらなる代替のポジティブコントロールは、少なくとも１つの実質的な非固定化抗体に結合し得る、少なくとも１つのコントロール剤を基材に付着させる工程を含み得る。適切なコントロール剤は、抗マウスＩｇＧ、抗ヒトＩｇＧなどからなる群から選択され得、そして代表的に、固定化抗体に対して下流の基材に付着される。
【００２４】
適切には、本発明に記載される方法は、工程（ｃ）において得られる混合物が基材に沿って流動し、そして基材に固定化された抗体と相互作用することを可能にする工程を含む。少なくとも体液サンプルは、基材のアプリケーションゾーンで接触されることが好ましく、このアプリケーションゾーンは、免疫化された抗体に対して、基材の上流で提供され、そしてここで、混合物は、固定化抗体と相互作用するように、基材に沿ってアプリケーションゾーンから流動することが可能である。
【００２５】
適切には、このアプリケーションゾーンは、工程（ａ）の抗原の供給源を含み得、そして工程（ｃ）における混合物は、体液のサンプルとアプリケーションゾーンの抗原とを接触させることにより得られる。少なくとも１つの実質的に非固定化である抗体が本発明による方法において用いられる場合、このアプリケーションゾーンは、さらに、非固定化抗体を含み得、そして工程（ｃ）における混合物は、体液の上記サンプルおよび抗原と、このアプリケーションゾーンに存在する非固定化抗体とを接触させることにより得られ得る。
【００２６】
あるいは、工程（ｃ）の混合物は、基材から実質的に離れて工程（ａ）の抗原供給源および体液のサンプルを接触させることにより提供され得、そしてこの混合物は、基材のアプリケーションゾーンと引き続き接触される。少なくとも１つの実質的に非固定化である抗体が本発明による方法において用いられる場合、工程（ａ）の抗原供給源、体液のサンプルおよび非固定化抗体は、実質的に基材から離れて接触されて工程（ｃ）の混合物を提供し、そしてこの混合物は、引き続きこの基材のアプリケーションゾーンと接触される。
【００２７】
本発明による第１のスクリーニング方法において、体液のサンプルは、１つの自己抗体についてスクリーニングされる。好ましくは、この抗原は、自己抗体または固定化抗体のいずれかが結合し得る結合部位を含む。これにより工程（ｄ）において、結合部位への固定化抗体の結合は、自己抗体が工程（ｃ）における結合部位に実質的に結合した場所で実質的に防止される。
【００２８】
本発明による第２のスクリーニング方法において、体液のサンプルは、抗原に対する少なくとも一次および二次の自己抗体についてスクリーニングされる。ここで、抗原に対する少なくとも一次および二次の抗体は、工程（ｂ）において基材に対して固定化される。好ましくは、この抗原は以下を含む：
一次自己抗体または一次固定化抗体のいずれかが結合し得る一次結合部位（ｆｉｒｓｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）であって、これにより工程（ｄ）における一次の結合部位への一次固定化抗体の結合は、一次自己抗体が工程（ｃ）における一次結合部位に実質的に結合した場所で実質的に防止される、一次の結合部位；および
二次自己抗体または二次固定化抗体のいずれかが結合し得る二次結合部位（ｓｅｃｏｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）であって、これにより工程（ｄ）における二次結合部位への二次固定化抗体の結合は、二次自己抗体が工程（ｃ）における第２の結合部位に実質的に結合した場所で実質的に防止される、二次結合部位；
ここで、一次および二次の結合部位は、実質的に、抗原上の別の部位である。
【００２９】
標識化の手段は、実質的に上記の第１または第２のスクリーニング方法において、抗原に適切に提供され得る。あるいは、本発明による第１または第２のスクリーニング方法において、少なくとも１つの実質的に非固定化である抗体が用いられる場合、この非固定化抗体は、標識化手段で提供され得る。ここで、この非固定化抗体は、（ｉ）自己抗体もしくはスクリーニングされている自己抗体、または（ｉｉ）固定化抗体のいずれかについての結合部位とは実質的に別の抗原上の部位と結合し得、これによって、工程（ｄ）において、抗原は、固定化抗体および非固定化抗体の両方に対して実質的に結合され得る。
【００３０】
抗原に対する少なくとも一次および二次の自己抗体について体液のサンプルをスクリーニングするための、（そして、ここで少なくとも１つの実質的に非固定化された抗体が用いられる）本発明による第３のスクリーニング方法において、この非固定化抗体は、一次または二次の自己抗体のいずれかが結合し得る、そして固定化抗体に対する抗原上の結合部位と実質的に別である、抗原上の部位に結合し得る。これにより工程（ｄ）において抗原は固定化抗体および非固定化抗体の両方に対して実質的に結合され得る。
【００３１】
本発明による第３のスクリーニング方法において、この抗原は好ましくは以下を含む：
一次自己抗体または固定化抗体のいずれかが結合し得る一次結合部位であって、これにより工程（ｄ）における一次結合部位への固定化抗体の結合は、一次の自己抗体が工程（ｃ）における一次結合部位に実質的に結合した場所で実質的に防止される、一次の結合部位；および
二次自己抗体または非固定化抗体のいずれかが結合し得る二次結合部位；
ここで一次および二次結合部位は抗原上の実質的に別の部位である。
【００３２】
本発明による第３のスクリーニング方法において、好ましくは、非固定化抗体は、標識化手段で提供される。適切には、固定化抗体は、抗原に対する一次自己抗体を含み得、そして非固定化自己抗体は、抗原に対する二次自己抗体を含み得る。
【００３３】
本発明はさらに、少なくとも１つの抗原に対する少なくとも１つの自己抗体についての体液サンプルのスクリーニングにおける使用のためのキットを提供する。このキットは以下を含む：
（ａ）自己抗体に対する少なくとも１つの抗原の供給源；
（ｂ）抗原に対する、固定化された少なくとも１つの抗体を有する基材；
（ｃ）混合物を得るために、抗原供給源と体液サンプルを接触させるための手段であって、この抗原は、サンプル中に自己抗体が存在する場合、自己抗体との結合を実質的に可能にされる、手段；
（ｄ）上記基材に固定された抗体に混合物を接触させることを可能にするために、基材に対して混合物を流すことを可能にするための手段；
（ｅ）混合物中に存在する自己抗体および抗原の結合のモニタリングを可能にする標識化手段；ならびに
（ｆ）体液サンプル中の自己抗体の存在の指標を提供するための、結合をモニタリングする手段。
【００３４】
実質的に、本発明によるスクリーニングの方法を参照して本明細書中上記のように、本発明によるキットは、特に、自己免疫（代表的には甲状腺）の疾患に関連する少なくとも１つの自己抗体についてのスクリーニングにおける使用に適切であり、そしてここで抗原は甲状腺のタンパク質を含む。有利には、この甲状腺タンパク質は、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、サイログロブリン（Ｔｇ）および甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）からなる群から選択され、そしてなおより有利には、この甲状腺タンパク質はＴＰＯおよびＴｇからなる群から選択される。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様に従って、ＴＰＯ、ＴｇおよびＴＳＨＲからなる群から選択される甲状腺タンパク質を含む少なくとも１つの抗原に対する少なくとも１つの自己抗体についての体液サンプルのスクリーニングにおける使用のためのキットが提供される。このキットは以下を含む：
（ａ）自己抗体に対する少なくとも１つの抗原の供給源；
（ｂ）抗原に対する、固定化された少なくとも１つの抗体を有する基材；
（ｃ）混合物を得るために、抗原供給源と体液サンプルを接触させるための手段であって、この抗原は、サンプル中に自己抗体が存在する場合、自己抗体との結合を実質的に可能にされる、手段；
（ｄ）上記基材に固定された抗体に混合物を接触させることを可能にするために、基材に対して混合物を流すことを可能にするための手段；
（ｅ）混合物中に存在する自己抗体および抗原の結合のモニタリングを可能にする標識化手段；ならびに
（ｆ）体液サンプル中の自己抗体の存在の指標を提供するための、結合をモニタリングする手段。
【００３６】
実質的に、本発明によるスクリーニングの方法を参照して本明細書で上記したように、本発明によるキットは、さらに、患者に存在する少なくとも１つのさらなる生物学的マーカーについてのスクリーニングのための手段を含む。このマーカーは、自己免疫（代表的には、甲状腺）の疾患の指標である。適切な生物学的マーカーは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、チロキシン、トリ−ヨードサイロニン、サイログロブリン（Ｔｇ）などからなる群から選択され得る。従って、好ましくは、本発明によるキットは、さらに、体液のサンプル中の少なくとも１つのＴＳＨ、チロキシン、トリ−ヨードサイロニン、Ｔｇなどの存在についてスクリーニングするための手段を含む。
【００３７】
適切には、本発明によるキットはさらに、実質的に本明細書において上記された抗原に対する少なくとも１つの実質的に非固定化である抗体の供給源、ならびに非固定化抗体が抗原供給源および体液サンプルと接触され得る手段を含む。
【００３８】
有利には、本発明によるキットにおいて用いられるモニタリング手段は、実質的に本明細書中に上記したように、上記の混合物中に存在する自己抗体および抗原の結合に依存した比色変化を観察するための手段を含む。しかし他のモニタリング手段もまた実質的に本明細書中に上記されたように用いられ得る。適切には、標識化手段は、実質的に本明細書に上記されたように金コロイドのような比色標識を含み得る。そしてリンカーは、実質的に本明細書中に上記されたように、再度標識される抗原および／または抗体に対する比色標識と結合するように提供され得る。標識化手段が、基材への抗原および／または抗体の適用後に、抗原および／または抗体に対して適用される場合、この基材は以後の適用のための標識化手段を提供され得る。
【００３９】
好ましくは、本発明によるキットの基材は、さらに、本発明による方法を参照して実質的に本明細書中に上記されるように陽性コントロールを含み得る。
【００４０】
好ましくは、本発明によるキットの基材は、固定化抗体に対して基材の上流に備わるアプリケーションゾーンを含み得る。これによりこの混合物は、固定化抗体と相互作用するように基材にそってアプリケーションゾーンから流れることが可能になる。
【００４１】
適切には、このアプリケーションゾーンは、抗原の供給源を含み得る、そして混合物は、体液のサンプルとアプリケーションゾーンの抗原との接触により得られる。本発明によるキットがさらに、実質的に本明細書中に上記されるように少なくとも１つの実質的に非固定化である抗体を含む場合、このアプリケーションゾーンはさらに、非固定化抗体を含み得、そして体液のサンプルおよび抗原とアプリケーションゾーンに存在する非固定化抗体との接触によって混合物が得られる手段が提供される。
【００４２】
あるいは、本発明によるキットは、混合物を提供するための、抗原の供給源および体液サンプルが基材から実質的に離れて接触する手段、ならびに混合物が実質的にアプリケーションゾーンと接触される手段を含み得る。本発明によるキットが少なくとも１つの実質的に非固定化である抗体を含む場合、抗原供給源、体液のサンプルおよび／または非固定化抗体が、混合物を提供するために、基材から実質的に離れて接触される手段、ならびに混合物が実質的にアプリケーションゾーンに接触される手段が提供され得る。
【００４３】
本発明によるキットは、好ましくは、固定化抗体への少なくとも体液のサンプルの流れを可能にするまたは増強するために、固定化抗体に対して下流に配置されるウィック（ｗｉｃｋ）手段をさらに含む。
【００４４】
本発明による第１のキットは、体液サンプル中の１つの自己抗体についてのスクリーニングに適しており、そして抗原は、自己抗体または固定化抗体のいずれかが結合し得る結合部位を含み、これにより、結合部位への固定化抗体の結合は、自己抗体が結合部位に先に実質的に結合した場所で実質的に防止される。
【００４５】
本発明による第２のキットは、抗原に対する少なくとも一次および二次の自己抗体について体液のサンプルをスクリーニングするのに適切である。ここで抗原に対する少なくとも一次および二次の抗体は基材に固定化される。好ましくはこの抗原には以下を含む：
一次自己抗体または一次固定化抗体のいずれかが結合し得る一次結合部位であって、これにより一次結合部位への一次固定化抗体の結合は、一次自己抗体が一次結合部位に先に実質的に結合した場所で実質的に防止される、一次結合部位；および
二次自己抗体または二次固定化抗体のいずれかが結合し得る二次結合部位であって、これにより第２の結合部位への二次固定化抗体の結合は、二次自己抗体が二次結合部位に先に実質的に結合した場所で実質的に防止される、二次結合部位；
ここで、一次および二次の結合部位は、実質的に抗原上の別の部位である。
【００４６】
適切には、標識手段は、本発明による第１または第２のキットの抗原に対して提供され得る。あるいは、本発明による第１または第２のキットがさらに、少なくとも１つの実質的に非固定化である抗体を含む場合、この非固定化抗体は、標標識化手段で提供され得る。この非固定化抗体は、（ｉ）自己抗体もしくはスクリーニングされている自己抗体、または（ｉｉ）固定化抗体、のいずれかについての結合部位とは実質的に別の抗原上の部位と結合し得、これによって、抗原は、固定化抗体および非固定化抗体の両方に対して実質的に結合され得る。
【００４７】
本発明に基づく第３のキットは、抗原に対する少なくとも第１および第２の自己抗体について体液サンプルをスクリーニングするのに適している。第３のキットは、実質的に少なくとも１つの非固定化抗体をさらに含み、ここで非固定化抗体は、第１または第２の自己抗体のいずれかが結合し得る抗原上の部位に結合し得、この部位は、固定化抗体に対する抗原上の結合部位とは実質的に異なる。そのため抗原は、固定化抗体および非固定化抗体の両方に、実質的に結合することを許容される。
【００４８】
好ましくは、第３のキットの抗原は、以下を含む：
第１の自己抗体または固定化抗体のいずれかが結合し得、それによって固定化抗体の第１結合部位への結合が、実質的に除外され、ここで第１の自己抗体は、前もって第１結合部位に実質的に結合する、第１結合部位；ならびに
第２の自己抗体または非固定化抗体のいずれかが結合し得る、第２結合部位；
ここで、第１結合部位および第２結合部位は、抗原上の実質的に異なる部位である。
【００４９】
適切には、非固定化抗体は、本発明に従った第３のキットにおいて標識手段とともに提供される。固定化抗体が、抗原に対する第１の自己抗体を含み、そして非固定化抗体が抗原に対する第２の自己抗体を含むことが好まれ得る。
【００５０】
本発明に従った方法またはキットで使用される、非固定化抗体および固定化抗体は一般的に、十分に精製された形態で提供され、そしてモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、合成抗体、抗体模倣物質、自己抗体などを含み得る。本発明の好ましい局面は、自己抗体を含む非固定化抗体および／または固定化抗体を包含し、これらは好ましくはモノクローナル抗体であり得、ならびに／あるいは非固定化抗体および／または固定化抗体が、モノクローナル抗体を含み得る。
【００５１】
本発明に従った第１および第２のスクリーニング方法、ならびに第１および第２のキットにおいて、体液サンプル中でスクリーニングされる自己抗体の存在下で、抗原と自己抗体との一般的な結合は、抗原の固定化抗体との結合を除外する。本発明に従った第１および第２スクリーニング方法、ならびにキットで比色ラベルを使用する場合、従って、自己抗体の存在下においては、抗原の固定化抗体への結合に起因し、十分な呈色変化は認められない；あるいは、自己抗体の非存在下においては、抗原の固定化抗体への結合に起因して、呈色変化が認められる。
【００５２】
本発明に従った第３のスクリーニング方法およびキットにおいて、自己抗体の非存在下において再びスクリーニングされ、抗原と固定化抗体との結合は、呈色変化によって示される。自己抗体の存在下においては、実質的な呈色変化は認められ得ないか、または自己抗体および抗原との結合の競合において、非固定化抗体の抗原への結合に起因する若干の呈色変化が認められ得、それによって、非固定化抗体に結合した抗原はまた、呈色変化を示す固定化抗体と結合し得る。
【００５３】
適切には、本発明の方法またはキットに使用される抗原は、組換え抗原、ネイティブ抗原（自己抗原）、合成抗原、抗原フラグメント、抗原模倣物質などを含み得る。
【００５４】
本発明に使用するための基材は、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリアミドなどの膜を含み得る。
【００５５】
一般的に、本発明は、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、または尿サンプルを少なくとも１つの自己抗体についてスクリーニングする工程を包含する。
【００５６】
本発明はさらに、本明細書中の上文に再度十分に記載したように、少なくとも１つの抗原に対する少なくとも１つの自己抗体について体液サンプルをスクリーニングする工程で、本明細書中の上文に十分に記載したようなキットの使用を提供する。
【００５７】
本発明によって、患者を少なくとも１つの抗原に対する少なくとも１つの自己抗体についてスクリーニングする方法が、よりさらに提供される。この方法は以下を包含する：
（ａ）患者から体液サンプルを得る工程；
（ｂ）工程（ａ）の体液サンプルを、本明細書中の上文に十分に記載したようなキットの抗原供給源と接触し、混合物を得る工程、ここで自己抗体がサンプル中に存在する場合、上記抗原は自己抗体と実質的に結合することを許容される；
（ｃ）上記混合物が工程（ｂ）のキットの基材に対応して流動することを許容し、混合物が基材に固定された抗体に接触することを許容する工程；ならびに
（ｄ）混合物に存在する自己抗体と抗原との結合をモニターし、患者からの体液サンプルにおける自己抗体の存在の指標を提供する工程。
【００５８】
実質的に上記で記載したように、方法は好ましくは、自己免疫甲状腺疾患について患者を試験するためであり、そして好ましくは、さらに本明細書中の上文に十分に記載したように、患者から得られた体液サンプル中のＴＳＨ、サイロキシン、トリヨードサイロニン、およびＴｇの少なくとも１つの存在についてスクリーニングする工程を包含し得る。
【００５９】
本発明によって、自己免疫疾患を患っている患者、または自己免疫疾患に感受性の患者を処置する方法がさらに提供され、この方法は以下を包含する：
本明細書中の上文に十分に記載したように、少なくとも１つの抗原に対する少なくとも１つの自己抗体について患者をスクリーニングする工程；ならびに
少なくとも１つの自己抗体が、患者から得られた体液サンプルにおいて自己免疫疾患を示すレベルで検出された場合、自己免疫疾患の処置において有効な、少なくとも１つの治療的に活性な物質を患者に投与する工程。
【００６０】
本明細書中の上文に十分に記載したように、自己免疫疾患は、甲状腺自己免疫疾患であり、そして治療的に活性な物質は、甲状腺自己免疫疾患の処置に有効な医薬品を包含する。投与様式、用量などは一般的に、主治医の裁量である。
【００６１】
本発明によって、本明細書中の上文に十分に記載したようなキットおよび本明細書中の上文に十分に記載したような自己免疫疾患（代表的には、甲状腺自己免疫疾患）の処置に有効な、少なくとも１つの治療的に活性な物質がまたさらに組み合わせて提供される。
【００６２】
（実施例１）
以下の表は、図１ａおよび図１ｂに示されるＴＰＯスクリーニングキットならびに図４に示されるＴｇスクリーニングキットを使用して得られた結果を示す。
【００６３】
【表１】
0004426110.tif 000002
【００６４】
【表２】
0004426110.tif 000003
【００６５】
（実施例２）
この実施例は、図７および図８の図示されるキットを用いて、Ｔｇに対する自己抗体のスクリーニングを記載する。
【００６６】
９０μｌの血漿（もしくは血清）、または３０μｌの全血液に加え６０μｌの希釈緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６）を使用した。１０分後に結果を得た。先行技術の参考文献の放射性方法は、Ｂｅｅｖｅｒら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（１９８９）１９４９−１９５４の方法に基づいた。
【００６７】
【表３】
0004426110.tif 000004
【００６８】
【表４】
0004426110.tif 000005
【００６９】
上記のデータは、本発明に従ってＴｇ自己抗体をスクリーニングする方法が、参照の放射性試験と同じ罹患率で、健常な血液ドナーの血漿中、または全身性エリテマトーデスを有する患者の血清中のＴｇ自己抗体を検出し得ることを示す。
【００７０】
（実施例３）
本実施例は、図９および図１０に図示されるキットを使用して、ＴＰＯに対する自己抗体のスクリーニングを記載する。
【００７１】
９０μｌの血漿（もしくは血清）、または３０μｌの全血液に加え６０μｌの希釈緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６）を使用した。１０分後に結果を得た。先行技術の参考文献の放射性方法は、Ｂｅｅｖｅｒら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（１９８９）１９４９−１９５４の方法に基づいた。
【００７２】
【表５】
0004426110.tif 000006
【００７３】
【表６】
0004426110.tif 000007
【００７４】
上記のデータは、本発明に従ってＴＰＯ自己抗体をスクリーニングする方法が、参照の放射性試験と同じ罹患率で、（ａ）健常な血液ドナー、または（ｂ）自己免疫性甲状腺疾患を罹患している疑いのある患者においてＴＰＯ自己抗体を検出し得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付の図に対する参照で例証され、これは例示のみの方法で提供される。
【図１ａ】  図１ａは、ＴＰＯ自己抗体をスクリーニングするための本発明に従ったキットの側面図である。
【図１ｂ】  図１ｂは、図１ａに示されるキットの平面図である。
【図２ａ】  図２ａおよび図２ｂは、図１ａおよび図１ｂのキットの平面図であり、それぞれは、体液サンプル中のＴＰＯに対する自己抗体の非存在下および存在下で得られる結果を示す。
【図２ｂ】  図２ａおよび図２ｂは、図１ａおよび図１ｂのキットの平面図であり、それぞれは、体液サンプル中のＴＰＯに対する自己抗体の非存在下および存在下で得られる結果を示す。
【図３ａ】  図３ａおよび図３ｂは、陽性コントロールを組み入れている、本発明に従ったキットの平面図であり、そしてＴＰＯに対する自己抗体の非存在下および存在下で得られた結果を示す。
【図３ｂ】  図３ａおよび図３ｂは、陽性コントロールを組み入れている、本発明に従ったキットの平面図であり、そしてＴＰＯに対する自己抗体の非存在下および存在下で得られた結果を示す。
【図４】  図４は、Ｔｇ自己抗体についてスクリーニングするための、本発明に従ったキットの平面図である。
【図５】  図５は、Ｔｇ自己抗体およびＴＰＯ自己抗体の両方についてスクリーニングするための、本発明に従ったキットの平面図である。
【図６】  図６は、ＴＰＯの異なる部分（エピトープ）に対する自己抗体についてスクリーニングするためのキットの平面図である。
【図７ａ】  図７ａは、Ｔｇ（自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１およびＴｇ−ＡＡｂ２）に対する第１および第２の自己抗体についてスクリーニングするための、本発明に従ったキットの側面図である。
【図７ｂ】  図７ｂは、図７ａに示されるキットの平面図である。
【図８ａ】  図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、図７ａおよび図７ｂに示されるキットの平面図であり、そしてＴｇ（自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１およびＴｇ−ＡＡｂ２）に対する第１および／または第２の自己抗体の非存在下および存在下において得られた結果を示す。
【図８ｂ】  図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、図７ａおよび図７ｂに示されるキットの平面図であり、そしてＴｇ（自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１およびＴｇ−ＡＡｂ２）に対する第１および／または第２の自己抗体の非存在下および存在下において得られた結果を示す。
【図８ｃ】  図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、図７ａおよび図７ｂに示されるキットの平面図であり、そしてＴｇ（自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１およびＴｇ−ＡＡｂ２）に対する第１および／または第２の自己抗体の非存在下および存在下において得られた結果を示す。
【図８ｄ】  図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、図７ａおよび図７ｂに示されるキットの平面図であり、そしてＴｇ（自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１およびＴｇ−ＡＡｂ２）に対する第１および／または第２の自己抗体の非存在下および存在下において得られた結果を示す。
【図９ａ】  図９ａは、ＴＰＯ（自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１およびＴＰＯ−ＡＡｂ２）に対する第１および第２の自己抗体についてスクリーニングするための本発明に従ったキットの側面図である。
【図９ｂ】  図９ｂは、図９ａに示されるキットの平面図である。
【図１０ａ】  図１０ａおよび図１０ｂは、図９ａおよび図９ｂに示されるキットの平面図であり、そしてＴＰＯ（自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１およびＴＰＯ−ＡＡｂ２）に対する第１および／または第２の自己抗体の非存在下および存在下において得られた結果を示す。
初めに、図１ａおよび図１ｂを参照すると、ＴＰＯに対する自己抗体についてスクリーニングするためのキット（１）が示され、このキットは体液サンプル（好ましくは、血液）を受けるためのゾーン（２）を含み、そして、血液試料の残余物から赤血球を分離するための細胞フィルターを含む（未掲載）。ストレプトアビジン−ゴールド（ＳＡ−ｇｏｌｄ）（４）を含むパッド（３）は、受入ゾーン（２）に隣接する。パッド（３）は、ニトロセルロース膜（６）に乾燥させたＴＰＯ−ビオチン（ＴＰＯ−ｂｉ）（５）を含むゾーンと相互連絡する。さらに、ＴＰＯに対する精製抗体（７）を、ニトロセルロース膜（６）に固定し、そしてＴＰＯ−ｂｉ（５）を含むゾーン（５）より下流に配置する。紙区画（８）を受入ゾーン（２）の反対端に配置する。受入ゾーン（２）から、ＴＰＯに対する精製した固定化抗体（７）側への流動を許容または増強するように紙区画（８）を設計する。
次の一連の工程は、本発明に従ったスクリーニング方法における、図１ａおよび図１ｂに示されるキット（１）の使用を例証する。
（工程１）
第１の工程は、血液などのサンプルを、受入ゾーン（２）へ供する工程を包含する。次いで、血漿サンプルは、区画（８）側へ流動する。
（工程２）
この血球は受入ゾーン（２）で保持される。次いで、血漿はパッド（３）を通って流動し、そしてＳＡ−ゴールド（４）と混合物を形成し、そしてこの混合物はＴＰＯ−ｂｉ（５）側へ流動する。
（工程３）
血漿−ＳＡ−ゴールド混合物は、ＴＰＯ−ｂｉ（５）を含むゾーンに達し、ここでＴＰＯ−ｂｉ（５）は溶解し、ＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体の形成を許容する。ＴＰＯに対する自己抗体が血漿中に存在する場合、これらは、ＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体中のＴＰＯに結合する。
（工程４）
次いで、血漿およびＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体との混合物は、ＴＰＯに対する固定化抗体（７）側へ流動する。
（工程５）
ＴＰＯに対する自己抗体の非存在下での反応は、図２ａに例示するように、ＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体が、ＴＰＯに対する固定化抗体（７）に結合することを許容し、レッド−ゴールド（ｒｅｄ−ｇｏｌｄ）ライン（１０）を生じる。
（工程６）
ＴＰＯに対する自己抗体の存在下の反応は、血漿中のＴＰＯに対する自己抗体が、ＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体に結合することを許容し、この複合体が固定化ＴＰＯ抗体（７）に結合することを妨げる。従って、固定化されたＴＰＯ抗体（７）の部位におけるレッド−ゴールドラインの欠如は、体液サンプル中にＴＰＯ自己抗体の存在を示す。
次に、図３を参照すると、ＴＰＯ自己抗体の存在または非存在に関係なく赤色に染色される、陽性コントロールを提供するために進展された本発明の実施態様が示され得る。ＴＰＯに対するウサギ抗体（１１）は、ＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体によってレッド−ゴールドに染色され、レッド−ゴールドライン（１２）を生じる。従って、例証されるように、試験されるべき体液サンプル中のＴＰＯに対する自己抗体の非存在下では、ＴＰＯに対する固定化抗体（７）は、ＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体によってレッド−ゴールドに染色され、レッド−ゴールドライン（１０）を生じる（これはまた、図２Ａで例証される）。従って、２つのレッド−ゴールドライン（１０、１２）は、ＴＰＯに対する自己抗体を含まない体液サンプルを示す。
図３ｂは、試験される体液のサンプルがＴＰＯに対する自己抗体を含む反応を図示していることを除き、図３ａと同一である。この状況において、血漿中のＴＰＯに対する自己抗体は、ＴＰＯ−ｂｉ−ＳＡ−ゴールド複合体に結合し、それによって、この複合体がＴＰＯに対する固定化抗体に結合するのを妨げる（７）。従って、この場合、１つのレッド−ゴールドライン（コントロールに対して）、すなわちライン（１２）のみが、体液サンプル中のＴＰＯ自己抗体の存在を視覚的に示し得る。
図４は、Ｔｇ自己抗体をスクリーニングするためのキット（１３）を図示する。キット（１３）は、図１で示されるキット（１）と同一であり、ＴＰＯ−ｂｉをＴｇ−ｂｉと置換するのではなく、ＴＰＯに対する固定化抗体をＴｇに対する固定化抗体と置換する。より詳細には、キット（１３）は、受容ゾーン（２）、ＳＡ−ゴールド（４）を含むパッド（３）、およびウィック（８）を同様に含む。キット（１３）はさらに、ニトロセルロース膜（６）に対して、乾燥されたＴｇ−ｂｉ（１４）を含むゾーンを含む。Ｔｇ（１５）に対する精製された抗体はニトロセルロース膜（６）に固定化され、そしてＴｇ−ｂｉ（１４）から下流に位置する。Ｔｇ（１６）に対する固定化ウサギ抗体はまた、陽性コントロールを提供するために存在し得る。
図５は、ＴＰＯに対する自己抗体およびＴｇに対する自己抗体の両方をスクリーニングするための単一のキット（１７）を図示する。より詳細には、キット（１７）は、（以前にキット（１）および（１３）において述べたように）受容ゾーン（２）、ＳＡ−ゴールド（４）を含むパッド（３）およびウィック（８）を含む。キット（１７）は、ニトロセルロース膜（６）に対して、乾燥されたＴＰＯ−ｂｉ（５）およびＴｇ−ｂｉ（１４）両方を含むゾーンをさらに含む。ＴＰＯ（７）に対する精製した抗体およびＴｇ（１５）に対する精製した抗体は、ニトロセルロース膜（６）に固定化され、そしてＴＰＯ−ｂｉ（５）およびＴｇ−ｂｉ（１４）から下流に位置する。ＴＰＯに対する固定化ウサギ抗体（１１）およびＴｇに対する固定化ウサギ抗体（１６）はまた、陽性コントロールを提供するために存在する。
図６は、ＴＰＯの異なる部分（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に対する自己抗体をスクリーニングするためのキット（１８）を図示する。このキットは、ＴＰＯの異なる部分（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に対する自己抗体を検出するために使用されるＴＰＯ上の異なる自己抗原性エピトープに対する固定化抗体を含む。より詳細には、キット（１８）は、（キット（１）、（１３）および（１７）において以前述べたように）受容ゾーン（２）、ＳＡ−ゴールド（４）を含むパッド（３）、およびウィック（８）を含む。ＴＰＯ−ｂｉ（５）はニトロセルロース膜（６）に対して乾燥させる。
第１のエピトープ（１９）に対するＴＰＯ抗体および第２のエピトープ（２０）に対するＴＰＯ抗体をニトロセルロース膜（６）上に固定化する。ＴＰＯに対する固定化ウサギ抗体（１１）はまた、陽性コントロールを提供するために存在する。
図７ａおよび図７ｂについて言うと、Ｔｇに対する第１の自己抗体および第２の自己抗体（自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１およびＴｇ−ＡＡｂ２）をスクリーニングするためのキット（２１）を示す。キット（１）、（１３）、（１７）および（１８）において以前述べたように、キット（２１）は、体液のサンプルを受容するためのゾーン（２）、パッド（３）、ニトロセルロース膜（６）、およびウィック（８）を含む。Ｔｇ−ゴールド（２２）は、パッド（３）上に存在し、そしてゾーン（２）に隣接して提供される。Ｔｇ−ゴールドは、予めビオチン−抗ビオチン−金コロイドで標識され、続いてパッド（３）に供したＴｇを示す。
精製された第１の抗体および第２の抗体（１５ａ、１５ｂ）はニトロセルロース膜（６）に固定化され（固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ１およびＴｇ−Ａｂ２）、そしてＴｇ−ゴールド（２２）より下流に位置する。Ｔｇに対する固定化ウサギ抗体（１６）はまた、陽性コントロールを提供するために存在する。
自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１は、固定化Ｔｇ−Ａｂ１（１５ａ）としてＴｇ−ゴールド（２２）の同じ部位に結合する。自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２は、固定化Ｔｇ−Ａｂ２（１５ｂ）としてＴｇ−ゴールド（２２）の同じ部位に結合する。
以下の一連の工程は、本発明に従うスクリーニングの方法において、図７ａおよび図７ｂに示されるキット（２１）の使用法を例示する。
（工程１）
第１の工程は、血液などのサンプルを受容ゾーン（２）へ供する工程を包含する。次いで、血漿サンプルは、ウィック（８）の方へ流れる。
（工程２）
血球は、受容ゾーン（２）中に保持される。次いで、血漿は、パッド（３）を通って流れ、そしてＴｇ−ゴールド（２２）と混合物を形成する。そしてこの混合物は、固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ１およびＴｇ−Ａｂ２（１５ａ、１５ｂ）の方へ流れる。
（工程３）
血漿およびＴｇ−ゴールド（２２）の混合物は、固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ１およびＴｇ−Ａｂ２（１５ａ、１５ｂ）に達する。
（工程４）
血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１および自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２の非存在下での反応は、Ｔｇ−ゴールド（２２）が固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ１および固定化抗体ＴｇＡｂ２（１５ａ、１５ｂ）の両方に結合するのを可能にし、そして図８ａに図示されるように、Ｔｇウサギ抗体（１６）のコントロールライン（２５）に加え、２つのレッド  ゴールドライン（２３、２４）を生じる。
（工程５）
血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１の存在下での反応は、Ｔｇ−ゴールド（２２）が固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ１（１５ａ）に結合するのを妨げるために、血漿中の自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１が、Ｔｇ−ゴールド（２２）に結合するのを可能にする。固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ１の部位にレッド  ゴールドラインは見られず、そして血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１の存在を示す。血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２の非存在下でのこの反応は、Ｔｇ−ゴールド（２２）が固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ２（１５ｂ）に結合するのを可能にし、そして図８ｂに図示されるように、コントロールライン（２５）に加えて、レッド  ゴールドラインが見られる。
（工程６）
血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２の存在下での反応は、Ｔｇ−ゴールド（２２）が固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ２（１５ｂ）に結合するのを妨げるために、血漿中の自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２が、Ｔｇ−ゴールド（２２）に結合するのを可能にする。固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ２（１５ｂ）の部位にレッド  ゴールドラインは見られず、そしてこれは、血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２の存在を示す。血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１の非存在下でのこの反応は、Ｔｇ−ゴールド（２２）が固定化抗体Ｔｇ−Ａｂ１（１５ａ）に結合するのを可能にする。そして、図８ｃに図示されるように、コントロールライン（２５）に加えてレッド  ゴールドライン（２３）が見られる。
（工程７）
血漿中のＴｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１および自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２の両方の存在下での反応は、血漿中の自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１および自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ２が、Ｔｇ−ゴールド（２２）に結合するのを可能にする。Ｔｇ−ゴールド（２２）は、固定化自己抗体Ｔｇ−Ａｂ１および固定化自己抗体Ｔｇ−Ａｂ２（１５ａ、１５ｂ）に結合するのを妨げられる。固定化自己抗体Ｔｇ−Ａｂ１および固定化自己抗体Ｔｇ−Ａｂ２（１５ａ、１５ｂ）の部位に、レッド  ゴールドラインは見られない。このことは、血漿中に、Ｔｇに対する自己抗体Ｔｇ−ＡＡｂ１およびＴｇ−ＡＡｂ２が存在することを示す。図８ｄに図示されるように、レッド  ゴールドコントロールライン（２５）は、見られる。
図９ａおよび図９ｂについて言うと、ＴＰＯに対する第１の自己抗体および第２の自己抗体（それぞれ、自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１およびＴＰＯ−ＡＡｂ２）をスクリーニングするためのキット（２６）が示される。キット（１０）、（１３）、（１７）、（１８）および（２１）において以前述べたように、キット（２６）は、体液のサンプルを受容するためのゾーン（２）、パッド（３）、ニトロセルロース膜（６）、およびウィック（８）を含む。金コロイドで標識化されたＴＰＯに対する非固定化第１抗体（非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド）（２７）は、パッド（３）上に提供され、そして、ゾーン（２）に隣接して提供される。非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）は、予めビオチン−抗ビオチン−金コロイドで標識化され続いてパッド（３）に供された、非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１を示す。ＴＰＯ（２８）は、ニトロセルロース膜（６）に対して乾燥される。精製されたＴＰＯに対する第２の抗体（２９）は、ニトロセルロース膜（６）に固定化され（固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２）、そして非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）および非固定化抗体ＴＰＯ（２８）の下流に位置する。
非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールドは、自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１としてＴＰＯ（２８）の同じ部位に結合する。固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２は、自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ２としてＴＰＯ（２８）の同じ部位に結合する。
以下の一連の工程は、本発明に従うスクリーニングの方法において、図９ａおよび図９ｂに示されるキット（２６）の使用法を例示する。
（工程１）
第１の工程は、血液などのサンプルを受容ゾーン（２）へ供する工程を包含する。次いで、このサンプルは、ウィック（８）の方へ流れる。
（工程２）
血球は、受容ゾーン（２）中に保持される。次いで、血漿は、パッド（３）を通って流れ、そして非固定化抗体ＴＰＯ−ＡＢ１−ゴールド（２７）と混合物を形成する。そしてこの混合物は、ＴＰＯ（２８）の方へ流れる。
（工程３）
工程２の混合物は、ＴＰＯ（２８）に達する。そして、ＴＰＯ（２８）をまた、混合物中に溶解する。
（工程４）
自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１が血漿中に存在しない場合、非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）は、混合物中でＴＰＯ（２８）と結合する。血漿中の自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１の存在下において、自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１および非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）は、混合物中でＴＰＯ（２８）と結合するために競合する。
（工程５）
血漿、非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）およびＴＰＯ（２８）の混合物は、固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２（２９）に達する。
（工程６）
血漿中のＴＰＯに対する自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１およびＴＰＯ−ＡＡｂ２の非存在下での反応は、ＴＰＯ（２８）が非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）および固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２（２９）に結合することを可能にする。
固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２（２９）の位置でレッド  ゴールドライン（３０）は、図１０ａに図示されるように、血漿中の自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１およびＴＰＯ−ＡＡｂ２が存在しないことを示す。
（工程７）
血漿中の自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１および／または自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ２の存在下での反応は、競合反応を起こす。ここで自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１および／またはＴＰＯ−ＡＡｂ２の結合は、非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）および固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２（２９）とＴＰＯ（２８）との結合と競合する。自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１および／またはＴＰＯ−ＡＡｂ２が、ＴＰＯ（２８）の、非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）および／または固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２（２９）との結合を妨げる場合、図１０ｂに図示されるように、レッド  ゴールドラインは見られない。あるいは、自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１およびＴＰＯ−ＡＡｂ２の存在下で上記のように競合が起こる場合、ＴＰＯ（２８）と非固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ１−ゴールド（２７）および固定化抗体ＴＰＯ−Ａｂ２（２９）との結合がいくらかまだ存在し得る。しかし、このような結合は、工程６での結合に比べてより少ない程度であり、そしてサンプル中の自己抗体ＴＰＯ−ＡＡｂ１およびＴＰＯ−ＡＡｂ２量の定性的な測定が得られる。
本発明は、今や、以下の実施例によりさらに例示され、これは、いずれにおいても本発明の範囲を制限しない。
【図１ａ】
0004426110.tif 000008
【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
0004426110.tif 000011
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
0004426110.tif 000014
【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
0004426110.tif 000018
【図８ａ】
0004426110.tif 000019
【図８ｂ】
0004426110.tif 000020
【図８ｃ】
0004426110.tif 000021
【図８ｄ】
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【図９ａ】
0004426110.tif 000023
【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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