(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ．哺乳動物の抗原提示関連細胞を糖鎖含有高分子でコートされた培養容器で培養すること、
ｂ．培養容器を振盪させ、細胞を剥離すること、ただし、細胞を酵素で処理することなく、かつ、細胞剥離用器具を用いない
を含む、養子免疫細胞の調製方法。
【請求項２】
上記工程ａ．に用いる培養液が、生理活性物質及び抗原を含む、請求の範囲第１項記載の調製方法。
【請求項３】
さらに、下記工程：
ｃ．剥離された細胞を生理活性物質及び抗原を含む培養液で培養すること
を含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の調製方法。
【請求項４】
生理活性物質が、ＰＭＡ、ＰＨＡ、蓮見ワクチン  Ｍ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、結核菌体成分、ＬＰＳ、ピシバニール、ポリＩ：Ｃ及びヒアルロン酸結合物破片からなる群より選択される、請求の範囲第２項又は第３項に記載の調製方法。
【請求項５】
抗原が、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、癌細胞関連合成ペプチド、ＩｇＭイディオタイプ、ＭＵＴ１ペプチド、ＨＰＶ１６−Ｅ７ペプチド、ｐ５３変異ペプチド、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、チトシナーゼペプチド、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＰＳＡ、プロテイナーゼ３、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＴＰＩ、ＣＡＳＰ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ｂｃｒ−ａｂｌ(０２１０)、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｗ、ｒａｓ、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＳＡＲＴ−１、ＫＩＡＡＯ１５６、シクロフィリンＢ、Ｌｃｋ、ＭＵＣ−１、変異ＨＬＡ−Ａ２、ＨＡ１、ＨＡ２、Ｈ−Ｙ、ＬａｃＺからなる群より選択される、請求の範囲第２項又は第３項に記載の調製方法。
【請求項６】
抗原提示関連細胞が、樹状細胞又はランゲルハンス細胞を含む、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
哺乳動物が、ヒトである、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
糖鎖含有高分子が、ＰＶＬＡ、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）、ＰＶＧｌｃＮＡｃ、ＰＶＭＡ、ＰＶＣＡ、ＰＶＭｅａ、ＰＶＬａｍ又はＰＶＭａｎである、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項９】
上記工程ｂ．が、下記工程
ｂ１．培養液を除去し、ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えること
ｂ２.４−１０℃で１０分間、容器を静置すること
ｂ３．容器を振盪し、細胞を剥離すること
を含む、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１０】
ＥＤＴＡの濃度が、０．０２mM〜２０mMである、請求の範囲第９項に記載の調製方法。
【請求項１１】
ＥＤＴＡを含むＰＢＳの液深が、２〜５mmである、請求の範囲第９項又は第１０項に記載の調製方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載の調製方法に用いるための、糖鎖含有高分子でコートされた培養容器の使用。
【請求項１３】
糖鎖含有高分子が、ＰＶＬＡ、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）、ＰＶＧｌｃＮＡｃ、ＰＶＭＡ、ＰＶＣＡ、ＰＶＭｅａ、ＰＶＬａｍ又はＰＶＭａｎである、請求の範囲第１２項に記載の培養容器の使用。
【請求項１４】
請求の範囲第１２項又は第１３項に記載の培養容器を含む、養子免疫細胞ワクチン調製のためのキット。
【請求項１５】
さらに、細胞分離用チューブ、抗原及び／又は培養液を含む、請求の範囲第１４項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、腫瘍ワクチンなどへの養子免疫細胞に関する。
【背景技術】  癌に対する細胞免疫療法
癌に対する細胞免疫療法として、以下のような方法が知られている（Ｃｈｏｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４，２７０９−２７１６，１９９８、Ｈｓｕ  ＦＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，２，５２−５８，１９９６、Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９５，２９６−３０３，１９９５、Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ  ＶＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９３，２４１１−２４１９，１９９９、Ｗａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１，５５１６−５５２４，１９９８、Ｍｏｒｓｅ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５，１３３１−１３３８，１９９９）。アフェレーシスにより樹状細胞（ＤＣ）／マクロファージを選択的に集め、次いでこのアフェレーシスで得られた細胞を、さらにインターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを添加した培養液中で培養し、分化誘導させる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）。続いて細胞を、培養容器より、（ｉ）酵素処理方法、（ｉｉ）スクレーパーにてかき取る方法、（ｉｉｉ）ピペットにて培養液を吹きつける方法のいずれかによって剥離回収する（Ｈｏｄｅｓ  ＲＪ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ  Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，８９２−，１９７７）。このようにして得られた成熟ＤＣ／マクロファージを、標的抗原を含む培養中にて共存培養し、標的抗原エピトープとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体を持つ癌特異的抗原提示細胞を作成する。この、培養容器底面に付着した抗原提示細胞を（ｉ）酵素処理方法、（ｉｉ）スクレーパーにてかき取る方法、（ｉｉｉ）ピペットにて培養液を吹きつける方法により剥離回収し、癌特異的抗原提示細胞として同一人へ投与する。
従来の免疫細胞療法においては、培養した細胞を、培養容器より、（ｉ）酵素処理方法、（ｉｉ）スクレーパーにてかき取る方法、（ｉｉｉ）ピペットにて培養液を吹きつける方法のいずれかによって剥離回収することがなされてきている（Ｈｏｄｅｓ  ＲＪ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ  Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，８９２−，１９７７）。
酵素を用いた剥離回収方法
付着細胞の剥離回収方法として最も良く用いられる方法にトリプシンを用いる剥離方法がある（Ｈｏｄｅｓ  ＲＪ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ  Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，８９２−，１９７７）。この方法では、細胞の付着した培養容器をＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋不含ＰＢＳにて洗浄後、０．０５％トリプシン、０．０２４％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳをフラスコ底面より深さが０．１−１ｍｍになるよう加え、室温にて静置する。５−１０分後に４℃に冷却した０．１−１％アルブミン添加培養液を加えゆるやかに撹拌後、浮遊細胞を集める。集めた細胞は、アルブミン添加培養液にて洗浄後、以後の実験に用いる。
しかし、酵素を用いた剥離方法では、付着性の免疫細胞の細胞膜上の機能タンパク分子を消化分解するため、剥離回収されても細胞機能を十分に発揮できないという問題がある。これまでは、テフロンフィルムなどを培養容器に用いる方法等（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  ＪＷＭ，Ｂｕｌｔｅｒｍａｎ  Ｄ．，Ｖａｎ  Ｚｗｅｔ  ＴＬ，Ｅｌｚｅｎｇａ−Ｃｌａａｓｅｎ  Ｉ，ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｆｕｒｔｈ  Ｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７，２７１−，１９７８；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  ＪＷＭ，Ｖａｎ  ｄｅ  Ｇｅｖｅｌ  ＪＳ，Ｅｌｚｅｎｇａ−Ｃｌａａｓｅｎ  Ｉ，ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｆｕｒｔｈ  Ｒ，Ｊ，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２，２０８，１９７９）が試されてはきているが、培養面への付着が阻害されるため、培養による機能獲得に難があった。そのため、「培養中は付着性を保ち、かつ、剥離回収時には細胞に対しての親和性を失う」という相反する性質を持つ培養基材の開発が望まれていた。
本発明の目的は、上記問題点を解決した培養基剤を用いることによって、細胞機能を十分に発揮することができる養子免疫細胞を提供することである。
【発明の開示】
本願発明者は、鋭意研究を行ったところ、ＰＶＬＡに代表される糖鎖含有高分子をコートした培養容器を用いることによって上記問題点を解決することができることを見出し、本発明を完成させたものである。したがって、本発明は、下記を提供する。
１．  下記工程：
ａ．哺乳動物の抗原提示関連細胞を得ること、
ｂ．得られた細胞を糖鎖含有高分子でコートされた培養容器で培養すること、
ｃ．培養容器を振盪させ、細胞を剥離すること、ただし、細胞を酵素で処理することなく、かつ、細胞剥離用器具を用いない
を含む、養子免疫細胞の調製方法。
２．上記工程ｂ．に用いる培養液が、生理活性物質及び抗原を含む、上記１記載の調製方法。
３．さらに、下記工程：
ｄ．剥離された細胞を生理活性物質及び抗原を含む培養液で培養すること
を含む、上記１又は２に記載の調製方法。
４．生理活性物質が、ＰＭＡ、ＰＨＡ、蓮見ワクチン  Ｍ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、結核菌体成分、ＬＰＳ、ピシバニール、ポリＩ：Ｃ及びヒアルロン酸結合物破片からなる群より選択される、上記２又は３に記載の調製方法。
５．抗原が、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、癌細胞関連合成ペプチド、ＩｇＭイディオタイプ、ＭＵＴ１ペプチド、ＨＰＶ１６−Ｅ７ペプチド、ｐ５３変異ペプチド、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、チトシナーゼペプチド、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＰＳＡ、プロテイナーゼ３、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＴＰＩ、ＣＡＳＰ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ｂｃｒ−ａｂｌ（０２１０）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｗ、ｒａｓ、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＳＡＲＴ−１、ＫＩＡＡＯ１５６、シクロフィリンＢ、Ｌｃｋ、ＭＵＣ−１、変異ＨＬＡ−Ａ２、ＨＡ１、ＨＡ２、Ｈ−Ｙ、ＬａｃＺからなる群より選択される、上記２又は３に記載の調製方法。
６．抗原提示関連細胞が、樹状細胞又はランゲルハンス細胞を含む、上記１〜５のいずれか１に記載の調製方法。
７．哺乳動物が、ヒトである、上記１〜６のいずれか１に記載の調製方法。
８．糖鎖含有高分子が、ＰＶＬＡ、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）、ＰＶＧｌｃＮＡｃ、ＰＶＭＡ、ＰＶＣＡ、ＰＶＭｅａ、ＰＶＬａｍ又はＰＶＭａｎである、上記１〜７のいずれか１に記載の調製方法。
９．上記工程ｃ．が、下記工程
ｃ１．培養液を除去し、ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えること
ｃ２．４−１０℃で１０分間、容器を静置すること
ｃ３．容器を振盪し、細胞を剥離すること
を含む、上記１〜８のいずれか１に記載の調製方法。
１０．ＥＤＴＡの濃度が、０．０２ｍＭ〜２０ｍＭである、上記９に記載の調製方法。
１１．ＥＤＴＡを含むＰＢＳの液深が、２〜５ｍｍである、上記９又は１０に記載の調製方法。
１２．上記１〜１１のいずれか１に記載の調製方法で得られる養子免疫細胞。
１３．上記１〜１１のいずれか１に記載の調製方法に用いるための、糖鎖含有高分子でコートされた培養容器。
１４．糖鎖含有高分子が、ＰＶＬＡ、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）、ＰＶＧｌｃＮＡｃ、ＰＶＭＡ、ＰＶＣＡ、ＰＶＭｅａ、ＰＶＬａｍ又はＰＶＭａｎである、上記１３に記載の培養容器。
１５．上記１３又は１４に記載の培養容器を含む、養子免疫細胞ワクチン調製のためのキット
１６．さらに、細胞分離用チューブ、抗原及び／又は培養液を含む、上記１５に記載のキット。
１７．上記１２に記載の養子免疫細胞を用いる悪性腫瘍、Ｉ型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための方法。
１８．上記１２に記載の養子免疫細胞を含む、悪性腫瘍、Ｉ型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための医薬。
【図面の簡単な説明】  図１は、１°ＭＬＲ培養中より剥離回収されたＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞の比較を示す。ａのｘ軸は、剥離回収されてきた細胞中のＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞数であり、ｂのｘ軸は、剥離回収されてきた細胞中のＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞の百分率である。
図２は、アロ抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞試験の結果を示す。ｘ軸は、死んだ標的細胞数を示す。図中の標的細胞に関しては以下の略号を用いた。ｎ；標的抗原細胞を加えない、ａ；アロ抗原細胞  Ｃ５６Ｂｌ／６  （Ｈ−２ｂ）  ＭＮＬ、ｓ；同種同系細胞  ＢＡＬＢ／ｃ  （Ｈ−２ｄ）  ＭＮＬ．  Ｘ−Ｘ−Ｘ；１項目は１°  ＭＬＲの抗原、２項目はＣＴＬ誘導に用いた抗原、３項目は細胞傷害試験に用いた標的細胞を示す。具体的には、ａ−ａ−ａ；１°ＭＬＲの抗原はアロ抗原Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＮＬを、ＣＴＬ誘導にはアロ抗原Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＮＬを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＮＬを用いた実験群。ｓ−ａ−ａ；  １°ＭＬＲの抗原は同種同系細胞ＢＡＬＢ／ｃ  ＭＮＬを、ＣＴＬ誘導にはアロ抗原Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＮＬを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原細胞Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＮＬを用いた実験群。ｓ−ｓ−ａ；  １°ＭＬＲの抗原は同種同系細胞ＢＡＬＢ／ｃ  ＭＮＬを、ＣＴＬ誘導には同種同系細胞ＢＡＬＢ／ｃ  ＭＮＬを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原細胞Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＮＬを用いた実験群。ｎ−ｓ−ａ；  １°ＭＬＲの抗原はなにも添加しない、ＣＴＬ誘導には同種同系細胞ＢＡＬＢ／ｃ  ＭＮＬを、細胞傷害試験の標的細胞としてはアロ抗原細胞Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＮＬを用いた実験群。
図３は、１°ＭＬＲ培養細胞を剥離回収後の各実験群のフラスコ培養面に残存する細胞密度の比較を示す。
Ａ実験群は、ＰＶＧｌｃＮＡｃ塗布培養フラスコ培養面より、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）中にて震盪法により細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
Ａ−１；倍率４０倍。枠内に、ポリマー未塗布面（円形）と塗布面との境界における、剥離操作後における残存細胞密度差を示す。
Ａ−２；倍率１００倍。矢印は、ポリマー未塗布面（円形）と塗布面との境界における、剥離操作後における残存細胞密度差を示す。
Ａ−３；倍率２００倍。矢印は、ポリマー未塗布面（円形）と塗布面との境界における、剥離操作後における残存細胞密度差を示す。
Ｂ実験群は、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）塗布培養フラスコ培養面より、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）中にて震盪法により細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
Ｂ−１；倍率４０倍。
Ｂ−２；倍率１００倍。
Ｂ−３；倍率２００倍。
Ｃ実験群は、市販培養フラスコ培養面より、タンパク質分解酵素（トリプシン）にて細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
Ｃ−１；倍率４０倍。
Ｃ−２；倍率１００倍。
Ｃ−３；倍率２００倍。
Ｄ実験群は、市販培養フラスコ培養面より、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）中にて震盪法により細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
Ｄ−１；倍率４０倍。
Ｄ−２；倍率１００倍。
Ｄ−３；倍率２００倍。
Ｅ実験群は、市販培養フラスコ培養面より、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）をピペットにて強く吹きつけることによる細胞の剥離回収操作後に、培養面に残存している細胞をギムザ染色法により染色し、顕微鏡撮影した。
Ｅ−１；倍率４０倍。矢印は、培養面へピペットにてＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を吹きつけた方向に沿って細胞が剥離した部分を示す。
Ｅ−２；倍率１００倍。
Ｅ−３；倍率２００倍。矢印は、培養面へピペットにてＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を吹きつけた方向に向かって、付着細胞のラッフル（ｒｕｆｆｌｅ）辺縁部が捲れている様子を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、下記工程：
ａ．哺乳動物の抗原提示関連細胞を得ること、
ｂ．得られた細胞を糖鎖含有高分子でコートされた培養容器で培養すること、
ｃ．培養容器を振盪させ、細胞を剥離すること、ただし、細胞を酵素で処理することなく、かつ、細胞剥離用器具を用いない
を含む、養子免疫細胞の調製方法に関する。
本発明で「抗原提示」とは、細胞外から取り込んだ抗原を分解処理し、その結果生じたフラグメントとＭＨＣ分子の複合分子を細胞膜上に発現し、これを抗原特異的免疫発現のためナイーブな免疫細胞へ提示することをいう。
本発明で「抗原提示関連細胞」とは、抗原提示能力を有する細胞又は抗原提示能力を有する細胞に分化することができる細胞をいう。
抗原提示能力を有する細胞とは、胸腺上皮細胞、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞等を挙げることができるが、これらに限定されることはなく、抗原提示能力を有するあらゆる細胞をいう。
抗原提示能力を有する細胞に分化することができる細胞とは、胸腺上皮細胞、幹細胞、造血幹細胞、ＥＳ細胞、ＥＳ培養細胞、骨髄前駆細胞、骨髄芽球細胞、ミエロイド系前駆細胞等を挙げることができるが、これらに限定されることはなく、抗原提示能力を獲得することができるあらゆる細胞をいう。
本発明の「抗原提示関連細胞」は、それを含む組織又は体液から取得することができる。具体的には、幹細胞又は造血系幹細胞を含む組織及び体液、胎生初期の卵黄嚢、胎生期２ヶ月から出産までの期間の肝臓、胎生期２ヶ月から出産までの期間の脾臓、胎生期２ヶ月以降、及び出産後を含む骨髄、臍帯血、末梢血、重篤な感染症の回復期の末梢血、ＧＭ−ＣＳＦ等の増血剤投与後の末梢血を挙げることができるが、これらに限定されることはなく、抗原提示関連細胞を取得することができるあらゆる生物学的資源を含む。
上記細胞の取得方法としては、従来知られている細胞の取得方法であれば任意の方法を用いることができ、例えば、全血又は骨髄液を採取すること、アフェレーシスにより、末梢血から単球部分を採取すること、又は単球由来初代培養細胞又は細胞株を増殖させることによって取得することができる。
本発明の調製方法に用いる培養液は、生理活性物質及び抗原を含むことができる。
本発明で「生理活性物質」とは、細胞、組織又は器官の生理的活性を調節することができる物質をいい、酵素、トキシン、細胞障害性タンパク、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、インターフェロンのようなタンパク質；ポリペチド；オリゴペプチド；糖；ヒト遺伝子、動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡのようなヌクレオチド；アミノ酸、及び、脂肪酸を挙げることができる。
より具体的には、生理活性物質は、ＰＭＡ（ホルボール  １２−ミリステート  １３−アセテート）、ＬＰＳ、ピシバニール、蓮見ワクチン  Ｍ、ＰＨＡ、ポリＩ：Ｃ、ＴＳＳＴ−１（毒素性ショック症候群毒素−１）、コレラ毒素Ｂサブユニット、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、結核菌菌体成分、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ブドウ球菌、百日咳菌、トキソプラズマ・ゴンディ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、細胞・細菌産物（リポ多糖類、リポタイコ酸、バクテリア熱ショックタンパク質、ＣｐＧモチーフ、ミコバクテリアトレハロース、ミコール酸、トキソプラズマ・ゴンディ由来可溶性抗原、リーシュウマニア・リポゾームタンパク質、２重鎖ＤＮＡ等）、ヒアルロン酸結合物破片、エオタキシン−１α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＥＬＣ、  ＲＡＮＴＥＳ、ＳＬＣ、ＢＡＣＡ−１、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２α、ＭＩＰ−２β、ＭＩＧ、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１βであることができる。
本発明で「抗原」とは、脊椎動物の宿主において、特異的抗体の形成を惹起する物質、または、その物質と反応する特異的リンパ球集団の発生を惹起する物質であり、抗原となりうる限り、有機・無機化合物を含む。例えば、タンパク質、核酸、炭水化物又は脂質、又はそれらの断片又は誘導体を挙げることができる。
より具体的には、抗原は、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、ＩｇＭイディオタイプ、β−Ｇａｌタンパク質、ＭＵＴ１ペプチド、ＨＰＶ１６−Ｅ７ペプチド、ＯＶＡペプチド、ｐ５３変異ペプチド、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、サイトキナーゼペプチド、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＰＳＡ、プロテイナーゼ３、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＴＰＩ、ＣＤＣ２７、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、ＣＡＳＰ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＥＦ２、ｂｃｒ−ａｂｌ（０２１０）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｗ、ｒａｓ、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＳＡＲＴ−１、ＫＩＡＡＯ１５６、シクロフィリンＢ、Ｌｃｋ、Ｆ４．２、ＭＵＣ−１ムチン、ＲＡＧＥ、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ−２，３，４，６、ＥＢＶ−ＬＭＰ２、ＨＴＬＶ−１ｔａｘ、変異ＨＬＡ−Ａ２、ＨＡ１、ＨＡ２、Ｈ−Ｙ、ＨＢ１、ＰＲＡＭＥ、ＧｎＴ−Ｖ、ｐ１５、ＬａｃＺ、ＭＡＲＴ−１、ＡＦＰ、ＴＲＰ−２、Ｎｅｔであることができる。
剥離された細胞を生理活性物質及び抗原を含む培養液で培養する工程は、上記細胞剥離工程の後に、行うこともできる。
本発明の好ましい哺乳動物は、ヒトである。
本発明で用いられる糖鎖含有高分子は、ＰＶＬＡに代表され、ＰＶＬＡ（ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド））は、ラクトースを側鎖にもつポリスチレン誘導体であり、ラクトース側鎖内のβ−ガラクトースが、肝実質細胞の膜表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰＲ）に特異的に認識され、肝細胞の機能化や組織化にとって非常に重要かつ有用であることが知られている。
ＰＶＬＡは、下記構造式で示される。
0004485523.tif 000002
ポリマー合成は、モノマーをＤＭＳＯ、トルエン、シクロヘキサンなどの溶媒に熔解し、酸素を脱気処理により除いた後、ＡＩＢＮ，ＢＰＯなどの開始剤を加える。この後、密閉容器にて、開始剤の解裂温度以上で加熱し、２時間以上の適当な時間反応させることにより、容易に合成することができる。ＶＬＡ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコアミド）のような糖鎖モノマーの場合、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの比較的極性の高い溶媒が好ましく用いられるが、この溶媒に限定されるものではない。
ＶＬＡが溶解し、共重合させるモノマーが溶解しない溶媒を用いる場合は、両者が溶解する溶媒を選択するか、両者を溶解した溶液を混合することで容易にポリマーを合成することができる。
本発明の別の態様においては、ＶＬＡに変えて、ＶＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−β−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコアミド、ＶＭＡ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコアミド）、ＶＣＡ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコアミド）、ＶＭａｎ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１−４）−Ｄ−マンアミド）、ＶＭｅａ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−６）−Ｄ−グルコアミド）、ＶＬＡｍ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−３）−Ｄ−グルコアミド）あるいは、市販のモノマーを単独あるいは共重合体として用いることができる。
ＰＶＧｌｃＮＡｃの構造式
0004485523.tif 000003
Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）の構造式
0004485523.tif 000004
本発明の好ましい糖鎖含有高分子としては、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）又はＰＶＧｌｃＮＡｃを挙げることができる。
本発明の細胞剥離工程は、下記工程：
ｃ１．培養液を除去し、ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えること
ｃ２．４−１０℃で１０分間、容器を静置すること
ｃ３．容器を振盪し、細胞を剥離すること
を含むことができる。
ＥＤＴＡの濃度は、好ましくは、０．０２ｍＭ〜２０ｍＭである。
ＥＤＴＡを含むＰＢＳの液深は、好ましくは、２〜５ｍｍである。
また、本発明は、本発明の調製方法で得られる養子免疫細胞にも関する。
また、本発明は、本発明の調製方法に用いるための、ＰＶＬＡ、好ましくは、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）又はＰＶＧｌｃＮＡｃでコートされた培養容器にも関する。
糖鎖含有高分子は、適当な水溶液としてシャーレにコーティングすることができる。好ましくは、０．０１ｗｔ％の純水あるいはＰＢＳ溶液として用いることができるが、これに限定されるものではない。シャーレの大きさに応じて適量の糖鎖含有高分子溶液を添加して、コーティングすることができる。この際、好ましくはシャーレが溶液で覆われる量の液深を保つ必要があり、好ましくは１ｍｍから５ｍｍの液深を用いることができるが、これに限定されるものではない。コーティング時間は、１時間から２４時間の処理を行うことでコーティングすることができるが、より好ましくは２時間の処理を行うことでコーティングできるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、上記培養容器を含む、養子免疫細胞ワクチン調製のためのキットにも関する。本発明のキットには、さらに、細胞分離用遠心管、抗原及び／又は培養液を含むことができる。
また、本発明は、本発明の養子免疫細胞を用いる悪性腫瘍、Ｉ型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための方法にも関する。
本発明の治療方法の具体的な態様を下記に例示するが、これに限定されるものではない。
１．腫瘍摘出後、被摘出者本人の造血の回復を待ってアフェレーシスにより末梢血単核球成分を主とした細胞分画を採取する。造血の回復は、末梢血中の各成分細胞数により担当医が確認する。
２．アフェレーシスにより得られた、血球分画をさらに比重遠心法（分離液；リンホセパールＩ、遠心条件；４００×ｇ、３０分間）にて分画し赤血球・血小板等を含まない末梢血単核球成分を得る。これをＰＢＭＮＬ（末梢血単核白血球）と以後記述する。
３．得られたＰＢＭＮＬを洗浄後、生理活性物質（例えば、ＰＭＡ、ＰＨＡ、蓮見ワクチン  Ｍ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、結核菌体成分、ＬＰＳ、ピシバニール、ポリＩ：Ｃ、ヒアルロン酸結合物破片）を添加した培養液にて培養を開始する（樹状細胞の分化成熟誘導）。培養容器は、糖鎖含有高分子（例えば、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）又はＰＶＧｌｃＮＡｃ）を塗布したプラスチック培養容器をもちいる。培養期間を通じて、全ての培養細胞へ３日おきに新鮮培養液を加える。
培養７日目に、新鮮培養液とともに癌関連抗原溶液（例えば、癌細胞溶解物、癌細胞酸抽出ペプチド、癌細胞関連合成ペプチド、ＩｇＭイディオタイプ、ＭＵＴ１ペプチド、ＨＰＶ１６−Ｅ７ペプチド、ｐ５３変異ペプチド、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、チトシナーゼペプチド、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＰＳＡ、プロテイナーゼ３、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１．２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＴＰＩ、ＣＡＳＰ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ｂｃｒ−ａｂｌ（０２１０）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｗ、ｒａｓ、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＳＡＲＴ−１、ＫＩＡＡＯ１５６、シクロフィリンＢ、Ｌｃｋ、ＭＵＣ−１、変異ＨＬＡ−Ａ２、ＨＡ１、ＨＡ２、Ｈ−Ｙ、ＬａｃＺ）を加え、更に７日間培養を続ける（癌特異抗原提示細胞の誘導）。
培養最終日に、培養容器より細胞を剥離回収する。付着細胞の剥離回収は、震盪法にて行う。震盪法による剥離回収方法は、以下のように行うことができる。浮遊細胞を遠心管に回収しＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）にてフラスコ底面を１回すすぐ。次いで、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を底面からの深さが２−５ｍｍになるように加え、４℃にて１０分間静置する。続いて振盪器にて振幅２．０−４．０ｃｍ、速度１３０−１６０回／分の条件で１０分間震盪する。震盪後に剥離してくる細胞を回収する。フラスコを、さらにＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、剥離してくる細胞を前述の遠心管に集める。得られた細胞を該当癌抗原特異的抗原提示細胞と呼ぶ。
４．該当ガン抗原特異的抗原提示細胞の誘導培養工程と同時に平行して、活性化Ｔ細胞培養の誘導培養を行う。手順を以下に記述する。
前述２工程にて得られたＰＢＭＮＬを、新鮮培養液にＰＨＡ（最終濃度；１０μｇ／ｍｌ）を添加した培養液にて、３日間培養する。培養容器は、糖鎖含有高分子（例えば、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）又はＰＶＧｌｃＮＡｃ）を塗布したプラスチック培養容器をもちいる。培養期間を通じて、全ての培養細胞へ２日おきに新鮮培養液を加える。３日後、各培養中へイノマイシン（最終濃度；１μｇ／ｍｌ）を加え更に３時間培養する。
培養終了後に培養器中の細胞を集める。付着細胞の剥離回収は、震盪法にて行う。震盪法による剥離回収方法は、以下のように行うことができる。
浮遊細胞を遠心管に回収しＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）にてフラスコ底面を１回すすぐ。次いで、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を底面からの深さが２−５ｍｍになるように加え、４℃にて１０分間静置する。続いて振盪器にて振幅２．０−４．０ｃｍ、速度１３０−１６０回／分の条件で１０分間震盪する。震盪後に剥離してくる細胞を回収する。フラスコを、さらにＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、剥離してくる細胞を前述の遠心管に集める。得られた細胞をＡＴ細胞と呼ぶ。
５．該当癌抗原特異的抗原提示細胞及びＡＴ細胞を新鮮培養液にて洗浄する。
パイロージェン・細菌汚染の有無を確認後に両細胞を、該当ＰＢＭＮＬを得た同一人へ投与する。
また、本発明は、養子免疫細胞を用いる悪性腫瘍、Ｉ型糖尿病、アトピー型アレルギー疾患又は感染症を治療するための医薬にも関する。
上記医薬は、本発明の養子免疫細胞をそのまま又は公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なる。
【実施例】  次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
＜材料と方法＞
動物
１）マウス：
Ｃ５７Ｂｌ／６、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、オリエンタル酵母工業（株）より４週令雄を購入し用いた。
細胞
１）マウス単核白血球の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスを頚椎切断法にて死亡させ無菌的に脾臓、胸腺、腹腔リンパ節を得た。得られた組織から、２枚のスライドグラスにて培養液中でゆるやかに解すことにより浮遊細胞を得た。この細胞浮遊液から、綿ろ過により組織片を除き、３００×ｇ、４℃にて７分間遠心した。遠心後上清を除き、培養液に再浮遊させた。この一連の手順を３回繰り返すことにより細胞以外の組織・細胞片を除いた。洗浄後、脾臓細胞・胸腺細胞・リンパ節細胞をプールした。これを、以下の実験ではＭＮＬ（ｍｏｎｏ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）とよぶ。
２）コンカナバリンＡ芽細胞（ＣｏｎＡ  ｂｌａｓｔ細胞）の調製
１−５×１０６細胞／ｍｌの細胞浮遊液にＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｃ−０４１２）を最終濃度２μｇ／ｍｌとなるように加えてインキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。４８時間後に培養容器より浮遊細胞を５０ｍｌ遠心管に回収し、培養液にて５回洗浄した。
３）マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理細胞の調製
１−５×１０６細胞／ｍｌの細胞浮遊液にＭＭＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｍ−０５０３）を最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃にて静置した。
６０分後培養液にて５回洗浄し、培養液に再浮遊させた。
４）免疫蛍光染色
免疫染色したい細胞の浮遊液を１５ｍｌ遠心管にて遠心（３００×ｇ、４℃、７分間）した。上清を捨てペレットにした。ペレットをゆるやかに解し、これにＦｃ  ＢｌｏｃｋＴＭ（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃０１２４１Ｄ）を１×１０６細胞あたり２μｌ加えた。次いで、１×１０６細胞あたりＰＥ−抗マウスＩ−Ａｄ（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃０６０３５Ａ）を２μｌ、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ１１ｃ（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃５５７４００）を２μｌ、ビオチン−抗マウスＣＤ８０（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃５５３８６７）を２μｌ、ビオチン−抗マウスＣＤ８６（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃５５３６９０）を２μｌ加えた。この混合物を氷上にて３０分間静置した。反応後洗浄バッファーを１０ｍｌ加え、３００×ｇ、４℃、７分間遠心し上清をすてる操作を３回繰り返した。この細胞ペレットに、ストレプトアビジン−Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃５５４０６２）を２μｌ加え氷上に３０分間静置した。反応後、細胞に洗浄バッファー１０ｍｌを加え３００×ｇ、４℃、７分間遠心し上清を捨てた。細胞について、この操作を３回繰り返し、洗浄バッファー１ｍｌに再浮遊させ、フローサイトメトリー（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｍｏｄｅｌ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ）にて蛍光ラベル抗体陽性の細胞の解析を行った。
５）１次混合白血球反応（ｍｉｘｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、１°ＭＬＲ）
１°ＭＬＲ培養によりアロ抗原に対する抗原特異的抗原提示細胞を得た。操作は、下記に従った。５×１０６細胞／ｍｌに調整されたＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）由来ＭＮＬ１２ｍｌとＭＭＣ処理Ｃ５７Ｂｌ／６（Ｈ−２ｂ）由来ＭＮＬ５×１０６細胞／ｍｌ  １２ｍｌとを７５ｃｍ２培養フラスコに加え、ついでインターロイキン２（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｉ−０５２３）を最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるよう加え、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。
従来の方法により剥離回収に供する付着細胞用培養フラスコは日本ベクトンディッキンソン（株）のＣａｔ  ＃３５３１３６のフラスコを用い、検定ポリマーをコートしたフラスコは日本ベクトンディッキンソン（株）のＣａｔ  ＃３５３１３３のフラスコに各々ポリマーをコートしたものを用いた。培養は、１２日間行いその間３日おきに新鮮培養液を２ｍｌずつ加えた。
６）１°ＭＬＲ培養フラスコからの細胞の剥離回収
１°ＭＬＲ培養１２日後に各フラスコより細胞を以下のようにして回収した。
ポリマーをコートしたフラスコについては、浮遊細胞を５０ｍｌ遠心管に回収しＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）にてフラスコ底面を１回すすいだ。次いで、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を底面からの深さが２−５ｍｍになるように加え、４℃にて１０分間静置した。続いて振盪器（Ｎｉｓｓｉｎ社、レシプロ振盪器  ＮＡ−２０１）にて振幅３．０ｃｍ、速度１３０−１６０回／分の条件で１０分間震盪した。震盪後に剥離してくる細胞を回収した。フラスコを、さらに５ｍｌのＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、剥離してくる細胞を前述の遠心管に集めた。
酵素処理方法で剥離回収した細胞は、以下のように調製した。
ポリマーコートをしていない付着細胞用フラスコより、１°ＭＬＲ培養後浮遊細胞を５０ｍｌ遠心管に回収した。フラスコ培養面にＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）５ｍｌを加え前後にゆるやかに傾ける操作を４−５回繰り返した。この操作で浮遊してくる細胞も同じ遠心管にプールした。フラスコにトリプシン／ＥＤＴＡを５ｍｌ加え、室温にて５−１０分間静置した。時間が来たらフラスコをゆるやかに傾けては戻す操作（「すすぎ」操作）を５−６回繰り返し行い、浮遊してくる細胞を、培養液１０ｍｌを予め加えた５０ｍｌ遠心管に回収した。フラスコ培養面をさらにＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）５ｍｌにて２回すすいだ。得られた剥離細胞群を各実験群ごとに１つにプールした。
ピペッティング方法では、付着細胞用フラスコより１°ＭＬＲ培養後浮遊細胞を５０ｍｌ遠心管に回収した。フラスコ培養面にＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）５ｍｌを加え、前後にゆるやかに傾ける操作を４−５回繰り返した。この操作で浮遊してくる細胞も同じ遠心管にプールした。次いで、１０ｍｌプラスチックピペット（日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃３５７５５１）にてＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を強く吹きつけるようにして全培養面を洗い込んだ。洗い込みは、毎回新しいＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）と置き換え３回繰り返した。洗い込みごとに得られた細胞を実験群ごとにプールした。
７）細胞傷害試験
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって傷害された標的細胞の死細胞数の測定は、７−アミノ−アクチノマイシン（７−ＡＡＤ、日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃５５５８１６）を用いて行った。操作は、１×１０６細胞ペレットをＣ５７Ｂｌ／６標的ＭＮＬと特異的に反応するＦＩＴＣ−抗マウスＨ−２Ｄｂ抗体２０μｌとＦｃ  ＢｌｏｃｋＴＭ２０μｌとを混合し４℃にて３０分間反応をおこなった。反応後、細胞を洗浄バッファー１０ｍｌにて１回洗浄し、７−ＡＡＤを２０μｌ加え室温にて静置した。１０分後にフローサイトメトリー（日本ベクトンディッキンソン（株）、型式ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ）にてＨ−２Ｄｂ陽性の細胞の比率と細胞数を求めた。この数値が、求めるＣＴＬによって傷害された標的細胞を示している。
試薬
１）ＰＶＬＡの合成
ＶＬＡの合成：
反応スキーム１  ビニルベンジルフタルイミドの合成
適量のナスフラスコ中でクロロメチルスチレン１ｋｇをＤＭＦ３．２Ｌに溶解し、フタルイミドカリウム１．２ｋｇを加えた。これを５０℃、４時間反応させた。エバポレーターを用いてＤＭＦを留去したのち、ベンゼン４．５Ｌを加えて残渣を溶解した。ベンゼンを０．２Ｎ  ＮａＯＨ溶液で数回洗浄した（全量３．２５Ｌ）。ベンゼンを更に水で数回洗浄し（全量３．２５Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ４等で乾燥させた後、エバポレーターを用いて溶媒を留去した。残渣をメタノールから再結晶して目的物を得た。収量１．５ｋｇ
反応スキーム２  ビニルベンジルアミンの合成
適量のセパラブルフラスコ中で１ｋｇのビニルベンジルフタルイミドを２．７Ｌのエタノールに溶解し、窒素気流下、加熱灌流させた。これに滴下ロートを用いて、８０％ヒドラジン一水和物０．３６ｋｇ／５４５ｍｌ  エタノール溶液を滴下した（滴下時間４０分程度）。反応は、９０分間、加熱灌流させて行った。反応終了後、得られた固体を濾取し、これに、ＫＯＨ溶液（１ｋｇ／６．５Ｌ  Ｈ２Ｏ）を加えて溶解したのち、エーテルにて抽出した（全量３．６Ｌ×３）。エーテル層をさらに、２％Ｋ２ＣＯ３溶液で洗浄し、さらに水で数回洗浄した。エーテル層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥した後、エーテルを留去し、残渣を減圧蒸留した。
沸点７２−７３℃／３ｍｍＨｇ
収量０．４５ｋｇ
反応スキーム３  ラクトースラクトンの合成
ラクトース１２ｇをメタノール３００ｍｌに分散させ、４０℃に加熱した。これに、ヨウ素１８ｇのメタノール溶液を滴下し、４０分間反応させた。これに、４ＮのＫＯＨメタノール溶液を、ヨウ素の着色が無くなるまで添加した。沈澱を濾取し、冷メタノールで数回洗浄後、エーテルで洗浄した。一旦秤量した。
その後、得られた結晶をごく少量の水に溶解し、アンバーライト１２０Ｂのプロトン型イオン交換樹脂にアプライし、酸性分画を単離した。得られた水溶液にメタノールとエタノールを添加してエバポレーションした。完全に乾固したのち、再び、メタノールとエタノールを加えて溶解し、エバポレーションした。この操作を数回繰り返し、ラクトースラクトンを作製した。
反応スキーム４  ＶＬＡの合成
適量のナスフラスコ中で、ラクトースラクトン１ｋｇをメタノール５．４Ｌに７０℃で溶解したのち、これにビニルベンジルアミン０．４ｋｇを加え、１２０分、７０℃で反応させた。反応終了後、２１．７Ｌのアセトンを加えて、目的物を沈殿させた、これを４℃で数時間放置したのち、濾取し、沈殿をメタノールから再結晶した。収量１．１ｋｇ
ポリマーの合成
ＶＬＡを真空反応管に分注した。ＤＭＳＯあるいはＤＭＳＯ−トルエンの混合溶媒を加えて完全に溶解した後、凍結−脱気−融解を繰り返して、酸素を溶液中から取り除いた。これに１００分の１モルのＡＩＢＮを添加して、溶解したのち、減圧密閉した。６０℃で５時間反応させてポリマーを合成した。
得られた溶液を大過剰のメタノールに滴下して、ポリマーを沈澱させた。これを適当な溶媒に溶解し、再びメタノールに滴下してポリマーを沈澱させる操作を３回繰り返した。
最終的に得られたポリマーを蒸留水に溶解し、大過剰の水に対して透析した。その後、凍結乾燥により目的のポリマーを得た。
シクロヘキシル４−［（２’）−アクチルアミド−エチル］ベンゼンスルホニルウレア（ＳＵ）の合成
ｐ−アミノエチルベンゼンスルホンアミド（８ｇ  ３０ｍｍｏｌ、東京化成工業試薬）と塩化アクリロイル（２．７ｇ  ３０ｍｍｏｌ、和光純薬試薬）をアセトン１５ｍｌ中で混合し、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液１５ｍｌを加えて、室温で２時間攪拌し反応させた。その後、沈澱を回収し、メタノールで再結晶して４−［（２’）−アクチルアミド−エチル］ベンゼン  スルホンアミドを得た。
４−［（２’）−アクチルアミド−エチル］ベンゼンスルホンアミド（３ｇ、１２ｍｍｏｌ）をアセトン６ｍｌに溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を６ｍｌ加えた。これに、シクロヘキシルイソシアネート（０．９ｍｌ、７ｍｍｏｌ）をアセトン６ｍｌに溶解したものを加えて、室温で１６時間反応させた。塩酸で中和した後、生じた結晶を回収し、メタノールから再結晶し、目的物を得た。
コポリマー
ＶＬＡと共重合させるモノマーをモル比９：１、８：２、７：３等の割合で秤量し、真空反応管に分注した。ＤＭＳＯあるいはＤＭＳＯ−トルエンの混合溶媒を加えて完全に溶解した後、凍結−脱気−融解を繰り返して、酸素を溶液中から取り除いた。これに１０ｍｍｏｌのＡＩＢＮを添加して、溶解したのち、減圧密閉した。６０℃で５時間反応させてポリマーを合成した。
得られた溶液を大過剰のメタノールに滴下して、ポリマーを沈澱させた。これを適当な溶媒に溶解し、再びメタノールに滴下してポリマーを沈澱させる操作を３回繰り返した。
最終的に得られたポリマーを蒸留水に溶解し、大過剰の水に対して透析した。その後、凍結乾燥により目的のポリマーを得た。
コモノマーとしては、上記ＳＵをはじめとして、上記糖鎖結合モノマーや市販のモノマーを好ましく用いることができる。
２）培養フラスコのポリマーコーティング方法：
ＰＶＬＡ、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）、ＰＶＧｌｃＮＡｃをそれぞれ０．０１ｗｔ％水溶液とした。これら溶液を日本ベクトンディッキンソン（株）のＣａｔ  ＃３５３１３３のフラスコに５ｍｌずつ分注した。その後室温で、遮光下２時間コーティング処理を行った。その後、ポリマー溶液を回収し、各フラスコを純水１０ｍｌで３回洗浄し、各実験に用いた。
３）培養液：Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｇ−５８８９）０．６ｇ、ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｈ−４０３４）１ｇ、ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｓ−５７６１）２ｇをＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ  ＃３１８００−０１４）１Ｌに溶かし、次いで２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｍ−３１４８）を最終濃度５×１０−５Ｍ、牛胎児血清（ＪＲＨ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ  ＃１２１０３−７８９）を最終濃度１０％になるように加えた。以上を混合後に、０．２２μｍ滅菌フィルター（日本ミリポア（株）、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＳ  Ｃａｔ  ＃ＳＶＧＳＢ１０１０）にてろ過滅菌を行った。これを以後培養液と呼ぶ。
４）Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋不含ＰＢＳ
Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．，のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（Ｃａｔ  ＃ＢＲ００１４Ｇ）１０タブレットを純水（日本ミリポア（株）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水装置システムＥｌｉｘ  ５キット  ＭｉｌｌｉＱ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）１Ｌに溶かしてオートクレーブにて１２１℃、２０分間高温高圧滅菌を行った。以下、これをＰＢＳ（−）と記す。
５）０．２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）
ＰＢＳ（−）１Ｌに対しＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ・４Ｎａ、和光純薬（株）、Ｃａｔ  ＃３４３−０１８８３）を２ｇ添加し、オートクレーブにて１２１℃、２０分間高温高圧滅菌を行った。以下、これをＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）と記す。
６）０．０５％トリプシン、０．０２４％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ（−）
ＰＢＳ（−）１００ｍｌにトリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ｔ−７４０９）を０．０５ｇ、ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ・４Ｎａ、和光純薬（株）、Ｃａｔ  ＃３４３−０１８８３）を０．０２４ｇ加え溶解後に０．２２μｍ滅菌フィルター（日本ミリポア（株），Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＳ  Ｃａｔ  ＃ＳＶＧＳＢ１０１０）にてろ過滅菌を行った。これを以後トリプシン／ＥＤＴＡと呼ぶ。
７）洗浄バッファー
免疫蛍光染色に用いる洗浄バッファーを以下のように調製した。ＰＢＳ（−）に牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃａｔ  ＃Ａ−３０５９）を最終濃度０．１％に、ＮａＮ３（和光純薬（株）Ｃａｔ  ＃１９５−１１０９２）を最終濃度０．００１％になるように加え、４℃に冷やして用いた。
８）滅菌溶液の滅菌テスト
調製された溶液を１ｍｌ無菌１５ｍｌ遠心管に分注し３７℃にて８時間培養しカビ、バクテリアの増殖の有無を顕微鏡下（×１００）で確認した。
器具
１）浮遊細胞用培養フラスコ
ポリマーをコーティングするフラスコとして、日本ベクトンディッキンソン（株）の無処理ポリスチレン７５ｃｍ２フラスコ、Ｃａｔ  ＃３５３１３３を用いた。
２）付着細胞用培養フラスコ
コントロールとして用いた付着細胞用フラスコは、以下の物を用いた。日本ベクトンディッキンソン（株）処理済みポリスチレン７５ｃｍ２フラスコ、Ｃａｔ  ＃３５３１３６、日本ベクトンディッキンソン（株）処理済みポリスチレン２５ｃｍ２フラスコ、Ｃａｔ  ＃３５３１０８。
３）細胞用遠心管
遠心管は以下のものを用いた。１５ｍｌ遠心管は、旭テクノグラス（株）Ｃａｔ  ＃２３１５−０１５、５０ｍｌ遠心管は、（株）アシストＣａｔ  ＃６２．５４８．００４Ｓを用いた。
４）培養用プラスチックピペット
１０ｍｌプラスチックピペットは、日本ベクトンディッキンソン（株）Ｃａｔ  ＃３５７５５１を用いた。
＜結果＞
１°ＭＬＲ培養中のＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞の比較
ＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞の比較は、３カラー免疫蛍光染色によって行った。反応細胞（Ｈ−２ｄ）と、抗原用細胞（Ｈ−２Ｄｂ）の区別は、反応細胞のみを識別できるＰＥ−抗マウスＩ−Ａｄ抗体を用いることにより識別した。図１−ａに剥離回収されてきた細胞中のＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞数を比較した結果を示す。図に示される通りＰＶＧｌｃＮＡｃ、Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）をコートしたフラスコからの震盪法によって剥離回収されてくるＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞数は、従来の市販の付着細胞用フラスコを用い酵素処理・ピペッティング法・震盪法による剥離回収されてくるＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞数より有意に高い。同様の傾向は、１°ＭＬＲ培養フラスコより回収されたＣＤ８０／８６、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｄ陽性細胞の全細胞数に対する割合（％）においても認められた（図１−ｂ）。
剥離回収後の各実験グループのフラスコ培養面に残存する細胞密度の比較
細胞を剥離回収した後のフラスコは、直ちにギムザ染色原液（武藤化学（株）、Ｃａｔ  ＃１５００−２）を３ｍｌ加え固定した。室温（１５℃）にて３０−６０分間固定後に水道水を２０ｍｌ加え染色を開始した。染色は室温にて１時間行った。染色後水道水にてフラスコの培養底面洗浄を行い風乾し顕微鏡。（（株）ニコンインステック、型式ＤＩＡＰＨＯＴ）にて写真（（株）ニコンインステック、ＣＯＯＬＰＩＸミクロシステムＶＩ）を撮り残存細胞密度を比較した。
図３に結果を示す。市販の付着細胞用フラスコから各々酵素処理・ピペッティング法・震盪法により付着細胞を剥離回収した後のフラスコ培養面には、付着細胞が寄り集まったコロニーも認められ、ポリマーコートしたフラスコより震盪法にて付着細胞を剥離したフラスコに比べフラスコ面に残存する細胞の残存密度が高いことがわかる（図３）。
従来の剥離回収法であるピペッティング法（Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３）では、残存する細胞のうち特に強くＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を吹きつけられたと思える周辺に細胞周縁が捲れたようになった細胞（Ｅ−３）が見られることから、引きはがされることにより細胞膜にかなりのダメージが加わったことが推測される。
Ｃ−３（×２００）に見られるように、従来の方法ではトリプシンを用いた剥離方法においてさえ付着細胞のラッフルの伸展はよく細胞膜タンパクへのダメージの割に剥離回収効率は良くないことが分かる（Ｃ−１、Ｃ−２）。
アロ抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞試験
１°ＭＬＲにより得られた細胞の抗原提示能はさらに以下の方法によりアロ抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することにより検定した。１°ＭＬＲ培養より得られたＢＡＬＢ／ｃ由来細胞を抗原提示細胞（Ｈ−２ｄ）として１×１０５細胞／ｍｌに調整し１．５ｍｌを２５ｃｍ２フラスコへ入れた。これにアロ抗原としてＣ５７Ｂｌ／６由来ＣｏｎＡ  ｂｌａｓｔ細胞をＭＭＣで処理した。１×１０７細胞／ｍｌの密度の細胞浮遊液１．５ｍｌを加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて８日間混合培養した。培養期間中は３日目と６日目に各々新鮮培養液を２ｍｌずつ加えた。培養８日目に浮遊細胞を５０ｍｌ遠心管に集め、培養液にて３回洗浄後に１×１０７生細胞／ｍｌになるよう培養液に再浮遊させ、その２ｍｌを１５ｍｌ遠心管に分注した。この遠心管に標的細胞としてＣ５７Ｂｌ／６由来ＣｏｎＡ  ｂｌａｓｔ細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）を２ｍｌ加え６時間、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。培養後に３００×ｇ、４℃、７分間遠心し上清を捨てた。この細胞ペレットにＦＩＴＣ−抗マウスＨ−２Ｄｂ  ２０μｌとＦｃ  ＢｌｏｃｋＴＭ  ５０μｌを加え３０分間４℃にて静置した。１０分間反応後に洗浄バッファーを１ｍｌ加えフローサイトメトリーにてＨ−２Ｄｂ陽性、７ＡＡＤ陽性の割合を求めた。結果を図２に示す。死細胞のうち標的細胞（Ｈ−２Ｄｂ）であることは、ＦＩＴＣ−抗マウス（Ｈ−２Ｄｂ）にて免疫蛍光染色することにより確認した。
Ｈ−２Ｄｂ陽性の死細胞数は、１°ＭＬＲステップ、ＣＴＬ誘導ステップの各ステップに用いた標的細胞がアロ細胞（Ｃ５７Ｂｌ／６由来  ＭＮＬ）である場合（ａ−ａ−ａ；抗原特異的ＣＴＬ誘導）について比較するとポリマーコートフラスコを用い調製した抗原提示細胞が、従来の酵素処理による剥離方法より有意に高いＣＴＬ誘導をおこなっていた。Ｐ（ＶＬＡ−ｃｏ−ＳＵ）をコートしたフラスコから剥離回収されてきた１°ＭＬＲ培養細胞では１°ＭＬＲ及びＣＴＬ誘導培養においてアロの標的細胞を用いてない（ｓ−ｓ−ａ、ｎ−ｓ−ａ）非特異的な反応のレベルは低く特異的抗原提示細胞の培養、剥離回収に利用価値が高いと思はれる。一方で、従来の酵素処理方法によっては、アロ抗原特異的ＣＴＬ誘導が低くポリマー群に比べ抗原特異的反応と抗原非特異的反応の差が低いことが示される（図２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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