(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランケートされたgag遺伝子を含むが、gagパッケージングシグナルを保持することを特徴とするパッケージング可能なEIAVベクターゲノムであって、
(i) gagの前記トランケーションがgagコード配列の350番目のヌクレオチドの下流の1以上のヌクレオチドを取り除くものであり；かつ
(ii) 前記パッケージングシグナルが、gagコード配列の少なくとも1−109番目のヌクレオチドを含む、
前記EIAVベクターゲノム。
【請求項２】
前記パッケージングシグナルがgagコード配列の1−150番目のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のEIAVベクターゲノム。
【請求項３】
前記トランケーションが、gagコード領域の350番目のヌクレオチドからgag-polコード領域の少なくともC-末端までの全てのヌクレオチドを欠失するものである、請求項１又は２に記載のEIAVベクターゲノム。
【請求項４】
EIAVゲノムは、tat遺伝子が欠けたものであるが、5'LTRの末端とgagのATGとの間にリーダー配列を含むものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクターゲノム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のEIAVベクターゲノム、EIAV由来のgag-pol遺伝子及びエンベロープ遺伝子を含むパッケージング細胞を含んでなる、細胞性EIAV産生系。
【請求項６】
dUTPアーゼ、S2、env及びtatから選択される1個以上の遺伝子が前記ベクターゲノムに存在しない、請求項５に記載の産生系。
【請求項７】
産生系がRRE/Revを欠いている、請求項５又は６に記載の産生系。
【請求項８】
gag-pol遺伝子はコドンが最適化されている、請求項７に記載の産生系。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の産生系により産生されたEIAV粒子。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のEIAVベクターゲノム、又は請求項９に記載の粒子でトランスフェクト又は形質導入された細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、レトロウイルスベクターに関する。特に、限定するものではないが、遺伝物質を非分裂または低速分裂細胞に導入する能力を有する、非霊長類レンチウイルスから誘導されたレトロウイルスベクターに関する。
【０００２】
レトロウイルスの小さなサブグループであるレンチウイルスに基づくレトロウイルスベクター系の開発には、以前からかなりの関心が持たれている。この関心は、第１に、抗HIV治療遺伝子の標的をHIV感受性細胞とするためにHIV系ベクターを用いるという概念から生じており、第２に、レンチウイルスは非分裂細胞に感染し得るので(Lewis & Emerman 1993 J. Virol. 68, 510)、これらのウイルスに基づくベクター系は非分裂細胞を形質導入し得るであろうという予想から生じている(VileおよびRussel 1995 Brit. Med. Bull. 51, 12)。HIVに基づくベクター系は製造されており(Buchschacher および Panganiban 1992 J. Virol. 66, 2731)、それらを用いることによりCD4+細胞と、予想どおりであるが、非分裂細胞が形質導入されている(Naldiniら, 1996 Science 272, 263)。さらに、レンチウイルスベクターは、対象となる遺伝子の非常に安定な長期間発現を可能にする。このことは、形質導入されたラット神経細胞について少なくとも3ヶ月間であることで示されている。MLV系ベクターは、対象の遺伝子を6週間発現させることができるのみであった。
【０００３】
今までに製造されたHIV系ベクターにより、形質導入細胞中で、その末端にHIV LTRを有する組込み型プロウイルスが得られる。このことは、これらのベクターの使用を制限するものである。なぜなら、内部プロモーターが用いられない限り、LTRは任意の挿入遺伝子についての発現シグナルとして用いられなければならないからである。内部プロモーターの使用には重大な不利益がある。レトロウイルスLTR転写ユニット内に追加のプロモーターを配置することの予測不可能な結果が詳細に記録されている(Bowtellら, 1988 J.Virol. 62, 2464; Correllら, 1994 Blood 84, 1812; EmermanおよびTemin 1984 Cell 39, 459; Ghattasら, 1991 Mol. Cell. Biol. 11, 5848; Hantzopoulosら, 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglouら, 1991 J. Biol. Chem 266, 8416; Hatzoglouら, 1988 J. Biol. Chem 263, 17798; Liら, 1992 Hum. Gen. Ther. 3, 381; McLachlinら, 1993 Vriol. 195, 1; Overellら, 1988 Mol. Cell Biol. 8, 1803; Scharfmanら, 1991 PNAS 88, 4626; Vileら, 1994 Gene Ther 1, 307; Xuら, 1989 Virol. 171, 331; Yeeら, 1987 PNAS 84, 5197)。関与する要因には、2つのプロモーターの相対的位置および向き、プロモーターおよび発現遺伝子の性質ならびに採用され得る任意の選別操作があると考えられる。内部プロモーターの存在は、パッケージング細胞系から得られる形質導入力価および組込みベクターの安定性の両方に影響を及ぼし得る。
【０００４】
HIVおよびその他のレンチウイルスLTRは、遺伝子発現に対してウイルス特異的な必要条件を有する。例えば、HIV LTRは、ウイルスTatタンパク質不在下では活性でない(Cullen 1995 AIDS 9, S19)。したがって、遺伝子発現に対する必要条件を変化させるような様式でLTRを改変することが望ましい。特に、いくつかの遺伝子治療用途には組織特異的遺伝子発現シグナルが必要であり得る。
【０００５】
HIVベクターには、一定の病気に対するその治療用途を制限し得るいくつかの重大な不利益がある。HIV-1には潜在的に腫瘍原性のタンパク質および配列を有するヒト病原体であるという不利益がある。HIV gag-polを発現するパッケージング細胞内で産生されたベクター粒子を導入すると、これらのタンパク質が患者に導入され、セロコンバージョンが生じる。これらの理由から、HIVタンパク質を患者に導入しないレンチウイルス系ベクターの開発が必要とされている。
【０００６】
本発明者らは、今や、HIV系ベクターの限界を克服する改良型レンチウイルスベクターを提供することが可能であることを見出した。任意のレトロウイルスベクター系の開発において、レトロウイルスゲノムから、異種遺伝子を導入するためのベクターの能力を阻害し得る配列、または不都合なタンパク質コード配列を標的細胞に導入し得る配列を除去することは重要である。レトロウイルスは、効率的にパッケージング可能なRNA配列の長さに制約があり、そのためレトロウイルスゲノムの長い領域の存在は異種コードRNAに対するベクターのコード能力を厳しく制限する。
【０００７】
本発明者らは、異種コード配列のコード能力が高く、標的細胞にレトロウイルス成分を導入する能力が低下した、非霊長類レンチウイルスに基づくレンチウイルスベクターを提供することが可能であることも見出した。
【０００８】
驚いたことに、効率的なクローニングベクターを産生させるために必要とされる非霊長類レンチウイルス由来のベクターゲノム配列の量は、HIV系ベクターについて記載された量よりもかなり少ないということが分かった。
【０００９】
HIVベクターゲノムをパッケージングするための配列の必要条件は複雑である。HIV-1パッケージングシグナルは、スプライスドナー部位を包含し、4個の短いステムループを含む推定上の二次構造をもつgag遺伝子の5'-非翻訳領域の一部を含む。ゲノム内の他の位置にある別の配列もHIVの効率的なキャプシド形成に重要であることが知られている。例えば、gagタンパク質コード配列の最初の350bpは、効率的なパッケージングに寄与し得るものであり、envの不明確な領域も関係している。異種遺伝子を発現する能力を有するHIV-ベクターの構築のために、gagタンパク質コード領域の350bpにまで及ぶパッケージングシグナルが用いられている。
【００１０】
本発明者らは、驚いたことに、非霊長類レンチウイルスにおけるパッケージングシグナルの構造がHIVのものとは全く異なるということを見出した。本発明者らは、その後ろにenv配列およびgagの不明確な領域が続く4個の短いステムループの配列の代わりに、gag遺伝子のより短い領域が効率的なパッケージングには十分であるということを発見した。実際は、EIAVベクターにおけるgag遺伝子のより大きな領域の欠失が有利であり、高力価のウイルスベクターの産生がもたらされる。この情報を用いることにより、HIVベクターと比較して力価が高く有利な特徴をもつ、非霊長類レンチウイルス配列から構築された改良型ベクターを提供することができる。
【００１１】
本発明の第1の態様においては、非霊長類レンチウイルスから誘導された、欠失されたgag遺伝子を含むレトロウイルスベクターゲノムであって、gagの欠失がgagコード配列のヌクレオチド350の下流にある1個以上のヌクレオチドを取り除くものである上記ゲノムが提供される。好ましくは、欠失は、gagpolコード領域のヌクレオチド350から少なくともC-末端に及ぶ。より好ましくは、欠失はgagコード領域のヌクレオチド300をさらに取り除くものであり、最も好ましくは、欠失はgagコード領域の最初の150ヌクレオチドのみを保持する。しかしながら、gagのより大きな欠失も用いることができ、例えばgagコード領域はgagコード領域の最初の109ヌクレオチドを含む。gagコード領域にgagコード領域の最初の2ヌクレオチドのみを含ませることも可能である。
【００１２】
標的細胞の形質導入、複製、逆転写および組込みに必要なレンチウイルスゲノムのその他の特徴は、ベクターゲノムに含まれている。これらは、少なくとも、R-領域およびU5領域由来のLTR含有配列の一部、ポリプリントラクト(PPT)を含む3'LTRおよび非霊長類レンチウイルス由来の3'LTR由来の配列または非霊長類レンチウイルス由来の配列およびその他のエレメントを含むハイブリッドLTRである。場合によって、レトロウイルスゲノムは、レトロウイルス由来の補助遺伝子、例えば限定するものではないが、rev遺伝子、tat遺伝子、vif遺伝子、nef遺伝子、vpr遺伝子またはS2遺伝子を含んでもよい。イントロン、スプライス-ドナー部位、rev応答性エレメント(RRE)、クローニング部位および選択マーカー遺伝子などの追加の成分を加えてもよい。
【００１３】
さらに、本発明者らは、驚いたことに、今やベクター産生または分裂細胞および非分裂細胞の形質導入に対してS2、Tat、env、dUTPアーゼのどれも必要としない非霊長類レンチウイルス最小ベクター系を構築できることを証明した。
【００１４】
よって、別の態様によれば、ベクターが誘導される非霊長類レンチウイルスゲノムは1個以上の補助遺伝子が欠けている。
【００１５】
補助遺伝子の欠失は非常に都合がよい。第1に、レンチウイルス(例えばHIV)感染における病気に通常関連した遺伝子を持たないベクターを産生させることができる。特に、tatおよびenvが病気に関連している。第2に、補助遺伝子の欠失により、ベクターがより多くの異種DNAをパッケージングすることが可能になる。第3に、dUTPアーゼおよびS2のようなその機能が知られていない遺伝子を除くことができ、よって望まれない作用を引き起こすリスクが軽減される。
【００１６】
さらに、本発明者らは、非霊長類レンチウイルスゲノムのリーダー配列が、gagおよびgagpolの多量のタンパク質発現に必須であることを示した。
【００１７】
したがって、さらなる態様においては、ベクターが誘導される非霊長類レンチウイルスゲノムはtat遺伝子が欠けているが、5'LTRの末端とgagのATGとの間にリーダー配列を含む。
【００１８】
これらのデータは、最適レンチウイルスベクターに最小限欠かせない機能的成分のセットをさらに規定する。最大遺伝的能力および高い力価を有するが、機能が知られておらず(S2、UTPアーゼ)、よってリスクが存在し得る補助遺伝子を含まず、エイズと関連し得るHIVタンパク質の類似体である補助遺伝子(tat、env)を含まないベクターが提供される。
【００１９】
本発明が非霊長類レンチウイルス由来のレトロウイルスベクターであって、 (1) 欠失されたgag遺伝子であって、gagの欠失がgagコード配列のヌクレオチド350の下流にある1個以上のヌクレオチドを取り除くものであるものを含み、(2) 非霊長類レンチウイルスゲノム由来の1個以上の補助遺伝子が存在せず、(3) 非霊長類レンチウイルスゲノムはtat遺伝子が欠けているが、5'LTRの末端とgagのATGの間にリーダー配列を含み、そして(1)、(2)および(3)の組合せを含むものである上記ベクターを提供するものであることは認識されるだろう。好ましい実施形態においては、レトロウイルスベクターは、(1)、(2)および(3)の特徴を全て含む。
【００２０】
「非霊長類」ベクターとは、本明細書で用いられる場合、本質的に霊長類、特にヒトに感染しないウイルスから誘導されたベクターを意味する。したがって、非霊長類ウイルスベクターとしては、イヌ、ヒツジおよびウマのような非霊長類哺乳動物、爬虫類、鳥類および昆虫類に感染するベクターが挙げられる。
【００２１】
レンチウイルスベクターは、本明細書で用いられる場合、レンチウイルス由来の少なくとも1つの構成部分を含むベクターである。好ましくは、かかる構成成分は、ベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現し、複製される生物学的機構に関与している。
【００２２】
非霊長類レンチウイルスは、天然では霊長類に感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであり得るものであり、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎‐脳脊髄炎ウイルス(CAEV)、マエディビスナウイルス(MMV)またはウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)が挙げられ得る。好ましくはレンチウイルスはEIAVである。ウマ伝染性貧血ウイルスは、全てのウマ類に感染し、血漿ウイルス血症(plasma viremia)および血小板減少症を引き起こす(Claboughら, 1991, J. Virol. 65:6242-51)。ウイルス複製は、単球のマクロファージへの成熟過程により制御されると考えられる。
【００２３】
EIAVは、レンチウイルスの中の最も単純なゲノム構造をもつ。gag、polおよびenv遺伝子に加えて、EIAVは3個のその他の遺伝子、tat、revおよびS2をコードする。Tatは、ウイルスLTRの転写アクチベーターとして作用し(DerseおよびNewbold1993 Virology, 194:530-6; Maury, ら 1994 Virology. 200:632-42)、Revはrev-応答エレメント(RRV)によりウイルス遺伝子の発現を調節し、調和させる(Martaranoら, 1994, J. Virol. 68:3102-11)。これらの２つのタンパク質の作用の機構は、おおざっぱに言えば霊長類ウイルスにおける類似機構と同様であると考えられる(Martanoら, 同上）。S2の機能は知られていない。さらに、膜貫通タンパク質の出発点(start)にあるenvコード配列にスプライスされたtatの第1エキソンによりコードされるEIAVタンパク質Ttmが同定されている。
【００２４】
プロテアーゼ、逆転写酵素およびインテグラーゼに加えて、非霊長類レンチウイルスは、dUTPアーゼをコードする第4のpol遺伝子を含む。これは、一定の非分裂細胞型に感染するこれらのレンチウイルスの能力において役目を果たし得る。
【００２５】
本発明の第１の態様におけるウイルスRNAはプロモーターから転写される。このプロモーターはウイルス起源のものでもウイルス起源のものでなくてもよいが、哺乳動物細胞などの真核細胞において発現を指令する能力を有する。場合によって、エンハンサーがプロモーターの上流または下流に付加される。RNA転写物は、末端に、レンチウイルス3'LTRに提供されるものであり得るポリアデニル化部位または別のポリアデニル化シグナルを有する。
【００２６】
したがって、本発明は、レトロウイルスベクターゲノムの発現を指令する能力を有するプロモーターと、任意にエンハンサーとを含むDNA転写ユニットを提供する。
【００２７】
本明細書に記載された転写ユニットは、転写可能な配列を含む核酸の領域を含む。よって、この定義にはmRNA、tRNAおよびrRNAをコードする配列が含まれる。この配列は、プロモーターに対してセンス方向でもアンチセンス方向でもよい。アンチセンス構築物を用いることにより公知の技術にしたがって細胞内の遺伝子の発現を阻害することができる。核酸は、例えば、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはそれらの類似体であり得る。mRNAをコードする配列は、任意に、転写されるが翻訳されない5'および／または3'隣接配列の一部または全部を、天然で、さもなければ翻訳コード配列と関連して含んでいる。例えば、転写終結シグナル、ポリアデニル化部位および下流エンハンサーエレメントのような、通常、転写配列と関連した付随調節配列を任意にさらに含み得る。核酸は、cDNAまたはゲノムDNA（イントロンを含んでいてもよい）を含み得る。
【００２８】
「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味で、例えば、遺伝子発現のJacob-Monod理論におけるRNAポリメラーゼ結合部位等の意味で用いられる。
【００２９】
「エンハンサー」という用語には、転写開始複合体のその他のタンパク質成分に結合し、よってその関連プロモーターにより誘導される転写の開始を促進するDNA配列が含まれる。
【００３０】
第1ウイルスベクター成分をコードする転写ユニットのプロモーターおよびエンハンサーは、本発明のレトロウイルスベクターを産生させるための条件下にてプロデューサー細胞内で、および／または第2ウイルスベクターを産生させるための条件下にて一次標的細胞内で、活性が強く、または強力に誘導可能であるのが好ましい。第2ウイルスベクター成分をコードする転写ユニットのプロモーターおよびエンハンサーは、標的細胞内で活性が強く、強力に誘導可能であるのが好ましい。プロモーターおよび／またはエンハンサーは常時効果的であるものの場合もあり、またはその活性が組織限定または時期限定されるものでもあり得る。適当な組織限定プロモーター／エンハンサーとしては、MUC1遺伝子、CEA遺伝子または5T4抗原遺伝子由来のプロモーター／エンハンサーのような、腫瘍細胞において非常に活性が高いものが例示される。時期限定されたプロモーター／エンハンサーとしては、低酸素応答エレメントまたはgrp78もしくはgrp94遺伝子のプロモーター／エンハンサーのような、虚血および／または低酸素に応答性のものが例示される。好ましいプロモーター−エンハンサーの組合せの一つは、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)主要即時早期(major immediate early, MIE)プロモーター／エンハンサーの組合せである。
【００３１】
LTRは、例えば、U3(強い恒常的発現、誘導発現または組織特異的発現を得るためなど）；R(TARステムループを除去するためなど)；またはU5(例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来の増強型(enhanced)非U5系ポリアデニル化シグナルを用いるためなど)において変更し得る。
【００３２】
一つの構成においては、内部プロモーターカセットが逆転し、ポリアデニル化シグナルがカセットの下流に配置される。
【００３３】
別の実施形態においては、用いられるポリアデニル化シグナルは少なくとも1個のイントロンを含む。
【００３４】
本発明のベクターは、自己不活化法を利用し得る。自己不活化レトロウイルスベクターは、転写エンハンサーまたは3'LTRのU3領域内のエンハンサーおよびプロモーターを欠失させることにより構築された。ベクター複製が1回行われた後、これらの変更が不活性プロウイルスを産生する5'および3'LTRの両方にコピーされた。しかしながら、そのようなベクターにおけるLTRの内側にあるプロモーターはどれも依然として活性である。この方法を用いて、内部に位置する遺伝子からの転写におけるウイルスLTRのエンハンサーおよびプロモーターの作用を排除した。そのような作用には、転写の増大または転写の抑制がある。またこの方法を用いて3'LTRからゲノムDNAへの下流の転写を排除することもできる。これは内因性癌遺伝子の任意の活性化を防止することが非常に重要であるヒト遺伝子治療に特に関係がある。
【００３５】
パッケージングシグナルが逆転写中にしばしば欠失され、パッケージングに欠陥があるウイルスが産生されるようなパッケージングシグナルに隣接するダイレクトリピートを有する別のタイプの自己活性化ベクターを構築した。十分に長いダイレクトリピートにより、得られたプロウイルスの大部分がそのパッケージング配列を失う。欠失の割合は、パッケージングシグナル欠失がG418においてベクター感染細胞を選択するneoマーカーnadを再構成するようにベクターを設計することにより100％まで増大させることができた。この方法は、遺伝子導入後のベクターの拡散が望ましくない遺伝子治療用途に特に有用であり得る。
【００３６】
本発明の第1の態様のさらに好ましい実施形態においては、対象のヌクレオチド(NOI)の1個以上をベクターのクローニング部位に導入する。そのような治療遺伝子は、レトロウイルスLTRに配置したプロモーターから発現される場合もあり、またはクローニング部位に導入された内部プロモーターから発現される場合もある。
【００３７】
適当なNOIコード配列としては、治療および／または診断用途のものが挙げられ、例えば、限定するものではないが、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、遺伝子工学的に操作した免疫グロブリン様分子、1本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫共刺激性分子、免疫モジュレート分子、抗センスRNA、標的タンパク質のトランス優性(transdominant)陰性突然変異体、毒素、条件(conditional)毒素、抗原、腫瘍サプレッサタンパク質および増殖因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（関連レポーター基を有するものなど）をコードする配列が挙げられる。そのようなコード配列が含まれる場合、それらは典型的には適当なプロモーターに機能し得るように連結され得る。適当なプロモーターは、1個または複数のリボザイムの発現誘導プロモーターまたは1個または複数の異なるプロモーターであり得る。
【００３８】
NOIコード配列は、融合タンパク質またはコード配列のセグメントをコードし得る。
【００３９】
本発明のレトロウイルスベクターは、癌の治療のために、プロドラッグ活性化酵素などのNOIを腫瘍部位に送達するために用いることができる。各場合において、適当なプロドラッグは、適切なプロドラッグ活性化酵素と組合せて個体(患者など）の治療に用いられる。適切なプロドラッグはベクターとともに投与される。プロドラッグとしては、例えば、リン酸エトポシド(アルカリホスファターゼとの組合せ、Senterら 1988 Proc Natl Acad Sci 85:4842-4846); 5-フルオロシトシン(シトシンデアミナーゼとの組合せ, Mullenら 1994 Cancer Res 54:1503-1506); ドキソルビシン-N-ヒドロキシフェノキシアセトアミド(ペニシリン-V-アミダーゼとの組合せ、Kerrら 1990 Cancer Immunol Immunother 31:202-206); パラ-N-ビス(2-クロロエチル)アミノベンゾイルグルタメート(カルボキシペプチダーゼG2との組合せ); セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート(β-ラクタマーゼとの組合せ); SR4233(P450レダクターゼとの組合せ); ガンシクロビル(HSVチミジンキナーゼとの組合せ、Borrelliら 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 7572-7576); マスタードプロドラッグとニトロレダクターゼとの組合せ(Friedlosら 1977 J Med Chem 40:1270-1275)ならびにシクロホスファミド(P450との組合せ、Chenら 1996 Cancer Res 56:1331-1340)が挙げられる。
【００４０】
本発明のベクターはウイルスまたは非ウイルスベクターによって標的部位に送達される。
【００４１】
当技術分野でよく知られているように、ベクターは、ある物をある環境から別の環境に移すことを可能にするか、または促進するための道具である。一例として、組換えDNA技術で用いられるいくつかのベクターは、DNAのセグメント（たとえば、異種cDNAセグメントのような異種DNAセグメント）のような物を、標的細胞の中に移すことを可能とする。必要に応じて、一旦標的細胞内に入った後、続いてベクターはその異種DNAを細胞内に維持するために働く場合や、DNA複製ユニットとして機能する場合がある。組換えDNA技術において用いられるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体またはウイルスが含まれる。
【００４２】
非ウイルス送達システムにはDNAトランスフェクション法が含まれるが、これに限定されない。ここで、トランスフェクションは非ウイルスベクターを用いて、遺伝子を標的哺乳動物細胞に送達するプロセスを含む。
【００４３】
典型的なトランスフェクション法には、電気穿孔法、DNAバイオリスティクス(biolistics)、脂質仲介トランスフェクション、圧縮DNA仲介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン剤仲介、カチオン表面両親媒性(cationic facial amphiphiles)(CFAs)(Nature Biotechnology 1996 14; 556)、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００４４】
ウイルス送達システムには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。ベクターの他の例としては、 ex vivo送達システムが含まれ、これには電気穿孔法、DNAバイオリスティクス、脂質仲介トランスフェクション、圧縮DNA仲介トランスフェクションのようなDNAトランスフェクション法が含まれるがこれらに限定されない。
【００４５】
用語「レトロウイルスベクター粒子」は、好ましくは標的細胞に結合し、これに入ることができるパッケージングされたレトロウイルスベクターを指す。粒子の構成成分は、ベクターに関して既に論じたように、野生型レトロウイルスについて改変してもよい。たとえば、粒子のタンパク質性被覆中のEnvタンパク質を、その標的特異性を変える、または他の所望の機能を達成するために遺伝的に改変してもよい。
【００４６】
好ましくは、ウイルスベクターは１つまたは複数の特定の細胞型に優先的に形質導入する。
【００４７】
より好ましくは、ウイルスベクターは標的ベクターであって、天然のウイルスと比較して変化した組織向性を有するので、このベクターは特定の細胞を標的とする。
【００４８】
レトロウイルスベクターに関しては、これはEnvタンパク質を改変することによって得られる。レトロウイルス第２ベクターのEnvタンパク質は、たとえばMMLV両栄養性エンベロープまたは改変両栄養性エンベロープのような、無毒性エンベロープまたは１次標的細胞内に無毒性の量で生産され得るエンベロープである必要がある。このような場合の安全性の特徴は、好ましくは、レトロウイルスの構成成分の間の配列相同性または領域の欠失である。
【００４９】
好ましくは、エンベロープはヒト細胞の形質導入ができるものである。好ましいenv遺伝子の例としては、VSV-G、4070A envのようなMLV両栄養性env、RD114ネコ白血病ウイルスenvまたはインフルエンザウイルス由来の血球凝集素(HA)が含まれるが、これらに限定されない。Envタンパク質は、限られた数のヒト細胞タイプ上の受容体に結合することができるものであってよく、また標的部分を含む遺伝子操作されたエンベロープであってよい。envおよびgag-polコード配列はプロモーターおよび場合によっては選択されたパッケージング細胞系において活性なエンハンサーから転写され、転写ユニットはポリアデニル化シグナルによって終結する。たとえば、パッケージング細胞がヒト細胞である場合、好ましいプロモーター-エンハンサーの組み合わせは、ヒトサイトメガロウイルス主要即時早期(hCMV-MIE)遺伝子から得たものと、SV40ウイルスから得たポリアデニル化シグナルとが用いられ得るものである。他の好ましいプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは当技術分野で公知である。
【００５０】
パッケージング細胞は治療される個体の体内のin vivoパッケージング細胞であってよく、または、組織培養細胞系のようなin vitroで培養された細胞であってもよい。好ましい細胞系には、マウス線維芽細胞由来の細胞系またはヒト細胞系のような哺乳動物細胞が含まれる。パッケージング細胞系は、好ましくは、たとえば293細胞系、HEK293、293-T、TE671、HT1080のようなヒト細胞系である。
【００５１】
あるいは、パッケージング細胞は治療される個体に由来する細胞、たとえば、単球、マクロファージ、幹細胞、血液細胞または線維芽細胞であってもよい。細胞は個体から単離され、パッケージングおよびベクター成分をex vivoで投与された後、自己由来のパッケージング細胞を再投与する。あるいは、パッケージングおよびベクター構成成分をin vivoでパッケージング細胞に投与してもよい。レトロウイルスパッケージングおよびベクター構成成分を個体の細胞中に導入する方法は当技術分野で公知である。たとえば、一つの方法は、たとえばenvコード配列、gag-polコード配列および欠損レトロウイルスゲノムのような、レトロウイルスベクター粒子を生産するために必要な異なるDNA配列を、一時的な三重トランスフェクションにより、同時に細胞内に導入することである(Landau & Littman 1992 J.Virol. 66, 5110; Soneokaら、1995 Nucleic Acids Res 23:628-633)。
【００５２】
一つの実施形態において、本発明のベクターの構成は、その生産システムとして、ゲノム、gag-pol成分およびエンベロープを発現する３つの転写ユニットを使用する。エンベロープ発現カセットには、VSV-Gまたはさまざまなマウスレトロウイルスエンベロープ（4070A等）のような多数のエンベロープのうちの一つを含み得る。
【００５３】
従来技術では、これらの３つのカセットは、293Tのような適当な細胞系に一過性でトランスフェクトされた３つのプラスミドから、または安定な生産細胞系に組み込まれたコピーから発現される。別のアプローチは、３つのカセットに対する発現システムとして別のウイルス、たとえばバキュロウイルスまたはアデノウイルスを用いることである。これらはどちらも核発現システムである。今日までのところ、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターシステムのすべての構成成分を発現するためにポックスウイルスを使用することは文献に記載されていない。特に、レンチウイルスが通常ではないコドン使用をし、およびこれらがrev/RREシステムのようなRNA処理システムを要求するという状況があるので、３つのカセットすべての取り込み、およびそれに続く、核ではなく細胞質に発現するそれらのベクターへの発現が実現可能かどうか明らかでなかった。今までのところ、ベクター構成成分の発現およびその遺伝子送達運搬体における機能に、鍵となる核因子および核RNA処理経路が必要とされる可能性が残っている。本明細書において、本発明者らはこのようなシステムについて記載し、レンチウイルス構成成分が細胞質で作られ得ること、およびこれらが機能的遺伝子送達システムに組み立てられることを示す。このシステムの利点は、ポックスウイルスを扱う際の容易さ、高い発現レベル、およびベクターゲノムにイントロンを保持する能力である。
【００５４】
それ故に、別の態様によれば、in vivoでの遺伝子送達のためのハイブリッドウイルスベクターシステムが提供される。このシステムは、ポックスウイルスから得られる、あるいはポックスウイルスに基づく第１ウイルスベクター、およびベクトロウイルスベクター（好ましくはレンチウイルスベクター、さらに好ましくは非霊長類レンチウイルスベクター）から得られる、あるいはこれに基づく第２ウイルスベクターからなる。
【００５５】
この第２ベクターは、第１ベクターのDNAにコードされるレトロウイルスベクターの生産のための必須遺伝子を発現することにより生産される。このような遺伝子は、レトロウイルスからのgag-pol、エンベロープで覆われたウイルスからのenv遺伝子、および１以上の治療用または診断用のNOIを含む欠損レトロウイルスベクターを含む。欠損レトロウイルスベクターは、一般的な用語で言うところの、逆転写を可能にする配列、5'の長い末端の繰り返し(LTR)の少なくとも一部、3'LTRの少なくとも一部およびパッケージングシグナルを含む。
【００５６】
第２ベクターを複製不能とすることが望まれる場合には、第２ベクターは、１つのまたは２以上のアデノウイルスまたは他の第１ベクターに位置する、複数の転写ユニットによりコードされる。
【００５７】
いくつかの治療または実験の状況において、MVAに由来するEAIVをin vitroで作る必要性をなくすことが望ましい場合がある。MVA-EIAVハイブリッドは患者/動物に直接送達される。たとえば、MVA-EIAVをマウスの尾静脈に静脈注射すると、この組換えウイルスはさまざまなマウスの組織、たとえば肺、脾臓等に感染する。感染した細胞は、たとえば遺伝子治療に用いる治療用遺伝子を含む形質導入可能なEIAVを発現する。EIAVベクター粒子はこれらの細胞から出芽し、周囲の細胞を形質導入する。次いで、形質導入された細胞はEIAVベクターゲノムの組み込まれたコピーを含み、治療用遺伝子生産物または他の目的とする遺伝子生産物を発現する。治療用遺伝子生産物の発現が宿主に有毒である可能性がある場合には、発現を特異的なプロモーター、たとえば、低酸素の環境においてこれらの細胞の発現を制限する低酸素反応要素(HRE)によって制御する。肺/気管上皮細胞の遺伝子治療のために、たとえば嚢胞性線維症を治療するために、MVA-EIAVを鼻腔内に送達されるエアロゾルとして与えてもよい。あるいは、in vitroでマクロファージを形質導入した後、再導入してEIAVに基づくベクターのマクロファージ工場を作ることもできる。さらに、MVAは複製能力がないので、MVA-EIAVハイブリッドもまた免疫抑制された宿主を治療するために用いることができる。
【００５８】
poxviridae科orthopox属の原型のメンバーであるワクシニアウイルスは、組換え外因性タンパク質の発現に用いられた最初のウイルスである(Mackettら、1982, PaolettiおよびPanicalli、1982)。ワクシニアウイルスは、180kb以上の大きなDNAゲノムを有し、報告によれば25kbの外来DNAを収容可能である(MerchlinskyおよびMoss、1992)。ポックスウイルスの他のいくつかの株が組み換え発現ベクターとして適応された(概説として、CarrollおよびMoss、1997を参照されたい)。たとえば、家禽痘(fowlpox)(TaylorおよびPaoletti、1988)、カナリア痘(canarypox)(Taylorら、1991)、豚痘(swinepox)(van der Leekら、1994)、および昆虫痘(entomopox)(Liら、1997)が挙げられる。さらに、安全性のために、ヒトおよび他の哺乳動物細胞内で不全である、ワクシニアウイルスのいくつかの高度に弱毒化させた株、たとえば、改変ワクシニアウイルスAnkara(MVA) (Mayr 1978、Sutter 1992)、NYVAC(Paolettiら、1994)、DNA複製酵素欠損ワクシニアウイルス(Holzerら、1997)が開発された。これらはすべて本発明で使用され得る。
【００５９】
MVAは複製可能ワクシニア痘瘡ワクチン株、Ankaraに由来する。ニワトリ胚線維芽細胞に500回以上の継代の後、単離されたウイルスは、免疫欠損マウスを含む多くの動物モデルにおいて高度に弱毒化されていることが示された(Mayrら、1978)。弱毒化された単離体、MVAを用いて、その多くは免疫が弱った120,000人以上の人々に対して有害作用を伴わずにワクチン接種をおこなった(Mahnel 1994)。研究により、MVAは広い範囲の哺乳動物細胞に感染することができるが、生産力のある感染はハムスター腎臓細胞BHK-21において観察されたのみであることが示された(Carroll 1997)。他のテストされたすべての哺乳動物細胞系において早期発現、DNA複製および後期発現、および続いての非感染性の未熟なウイルス粒子の生産が観察された(Carroll 1997、Meyer 1991)。ウイルスの複製の研究によって、少数の哺乳動物細胞のみが感染性ウイルスの非常に低いレベルでの生産を維持可能であること、すなわちBS-C-1細胞において、1つの細胞あたり１つの感染性のMVA粒子を生産することが示された(CarrollおよびMoss、1997)。後期遺伝子の発現は、通常、これらの遺伝子が初期プロモーターのもとで発現するのと比べて10倍以上のタンパク質を生じる(Chakrabartiら、1997、Wyattら、1996)。他のすべての弱毒化されたポックスウイルス株において、後期遺伝子の発現は哺乳動物細胞ではほとんど観察されない。
【００６０】
レトロウイルスベクターシステム、たとえばMLV-HIV、およびレンチウイルスベクターシステムの生産には、ウイルスゲノム、および形質導入受容能のあるウイルスを作るために必須の構造タンパク質を発現する生産者ラインの構築を必要とする。一般的に、これは比較的効率の悪いプロセスであって、ウイルスがVSV-Gのような毒性のエンベロープタンパク質とともに偽型(pseudotype)とされている場合にはさらに複雑になる。組換えポックスウイルスの中からの機能ゲノムおよび必要な構造タンパク質の発現は、現行の非効率的なレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター生産技術の多くを不要にすることができる。さらに、このような組換えポックスウイルスは直接患者に注入してin vivoでレトロウイルスまたはレンチウイルスの生産を引き起こすことができる。
【００６１】
MVAは、その複製をおこなわない表現型、およびその高力価ベクター標品を生産する初期および強い後期発現をおこなう能力のために、ポックス-レトロウイルスまたはポックス-レンチウイルスハイブリッドの構築に特に好ましいポックスウイルスである。
【００６２】
機能レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターゲノムを生産するために、RNAゲノムの5'が正確である必要がある(Cannonら、1996)。多くのワクシニアプロモーターが転写効率の下流決定基を含むので、これはワクシニアに基づく生産システムにおける挑戦である(Davison 1989b、Moss 1996)。しかしながら、本発明者等はこの問題を解決するいくつかの方法があることを示す。
【００６３】
a.  T7プロモーターおよびT7終止配列の使用。
【００６４】
b.  初期プロモーターの使用（これにおいて、RNA開始部位の下流の配列は高度に保存されていない）(Davison 1989a)。
【００６５】
c.  真正の5'末端を生成する方策と組合わせた開始部位の下流の付加的な配列を必要とする、または、付加的な下流配列を両方のR領域中に位置させている、ワクシニアの中間および後期プロモーター。後期プロモーターの転写開始の下流の４ヌクレオチドの特異的な配列が必要である(Davison 1989b、Moss 1996)。第１の場合には、リボザイムをプロモーターの下流でR領域の上流に位置させる。リボザイムはRNAをシスに開裂して正しい5'末端を生成するようにデザインされる。第２のアプローチにおいては、R領域を改変して余分の配列を取り込むようにする。これは5'および3'LTR R領域の両方でおこなわれなければならない。
【００６６】
T7依存システムを有する利点は、これが形質導入するEIAVウイルス粒子を生産するためには、細胞が２つの組換えワクシニアウイルスに感染することを必要とすることである。たとえば、１つのMVAはT7プロモーターの制御下に、gag/polおよびenv配列はワクシニアプロモーターの制御下に、ベクターゲノムを運ぶことができる。別のMVAはワクシニアプロモーターの制御下にT7ポリメラーゼ遺伝子を運ぶ(Wyattら、1995)。
【００６７】
本発明のレトロウイルスベクター粒子は、低速で分裂し、またMLVのような非レンチウイルスが効率的に形質導入することができないような細胞にも形質導入することができる。低速分裂細胞は約3、４日に１度分裂し、これにはある種の腫瘍細胞が含まれる。腫瘍には分裂が速い細胞も含まれるが、いくつかの腫瘍細胞、特に腫瘍の中心にある細胞は、まれにしか分裂しない。あるいは、標的細胞は、腫瘍の固まりの中心部分の細胞、または造血幹細胞またはCD34-陽性細胞のような幹細胞のように、細胞分裂を経験することができる成長停止細胞であってよい。また別の方法では、標的細胞は、単球前駆体、CD33-陽性細胞、または骨髄前駆体のような分化した細胞の前駆体であってよい。さらに別の方法では、標的細胞は、ニューロン、星状細胞、神経膠細胞、小膠細胞、マクロファージ、単球、上皮細胞、内皮細胞、または肝細胞のような分化した細胞であってよい。標的細胞は、ヒトの個体から単離した後にin vitroで形質導入されてもよいし、in vivoで直接形質導入されてもよい。
【００６８】
本発明のベクターシステムによる１以上の治療用遺伝子の送達は、単独で使用してもよいし、他の治療あるいは治療用の成分と組み合わせて用いてもよい。
【００６９】
たとえば、本発明のレトロウイルスベクターは、WO-A-98/05635に列挙される障害の治療に有用な１以上のNOIを送達するために用いることができる。参照を容易にするためにそのリストの一部をここに記載する。癌、炎症または炎症性疾患、皮膚障害、発熱、心血管効果、出血、凝血および急性反応、悪液質、食欲不振、急性感染、HIV感染、ショック状態、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、再灌流損傷、髄膜炎、片頭痛およびアスピリン依存抗血栓症；腫瘍の成長、侵入および拡大、脈管形成、転移、悪性、腹水および悪性胸膜滲出；大脳虚血、虚血性心臓病、変形性関節症、関節リュウマチ、オステオポローシス、喘息、多発性硬化、神経退化、アルツハイマー病、アテローム硬化、発作、脈管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピ―性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水胞症；角膜潰瘍、網膜症および手術による傷の治癒；鼻炎、アレルギ―性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、うっ血性心不全、子宮内膜症、アテローム硬化または内硬化(endosclerosis)。
【００７０】
これに加えて、またはこれに代えて、本発明のレトロウイルスベクターは、WO-A-98/07859に列挙される障害の治療に有用な１以上のNOIを送達するために用いることができる。参照を容易にするためにリストの一部をここに記載する。サイトカインおよび細胞増殖/分化活性；免疫抑制剤または免疫促進剤活性（たとえば、ヒト免疫欠損ウイルスの感染を含む免疫欠損の治療；リンパ球の成長の制御；癌および多くの自己免疫疾患の治療、および移植の拒絶反応の防止または腫瘍免疫の誘導）；造血の制御、たとえば骨髄またはリンパ系の疾病の治療；骨、軟骨、腱、靱帯および神経組織の成長の促進、たとえば、傷の治癒、やけど、潰瘍および歯周病および神経変性の治療；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（受胎能の活性調節）；走化性/ケモキネシス活性（たとえば、特定の細胞型を損傷または感染の部位に結集させるため）；止血および血栓崩壊活性（たとえば、血友病および発作を治療するため）；抗炎症活性（たとえば、敗血症性ショックまたはクローン病を治療するため）；抗菌剤として；たとえば代謝または行動のモジュレーターとして；鎮痛薬として；特定の欠乏障害の治療；ヒトまたは獣医学用医療におけるたとえば乾癬の治療のため。
【００７１】
これに加えて、またはこれに代えて、本発明のレトロウイルスベクターは、WO-A-98/09985に列挙される障害の治療に有用な１以上のNOIを送達するために用いられる。参照を容易にするために、リストの一部をここに記載する。マクロファージ阻害性および/またはT細胞阻害性活性、およびこれによる抗炎症活性；抗免疫活性、すなわち、炎症を伴わない反応を含む、細胞性および/または体液性免疫反応に対する阻害作用；マクロファージおよびT細胞の細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに粘着する能力、およびT細胞における促進的に調節されたfas受容体発現の阻害；望ましくない免疫反応および炎症の阻害で、望ましくない免疫反応および炎症には、慢性関節リウマチを含む関節炎、過敏症に伴う炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病および他の自己免疫疾患、アテローム硬化に伴う炎症、動脈硬化、アテローム性心臓病、再灌流損傷、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸困難症候群または他の心肺疾患、消化性潰瘍に伴う炎症、潰瘍性大腸炎、および他の胃腸管疾患、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎または泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周病または他の歯の疾患、睾丸炎または睾丸副睾丸炎、不妊症、睾丸外傷または他の免疫関連睾丸疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣流産、子癇、子癇前症および他の免疫および/または炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部(intermediate)ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、uveoretinitis、視神経炎、眼内炎、たとえば網膜炎または嚢様斑水腫(cyctoid macular oedema)、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変形性fondus症の免疫および炎症要素、眼球外傷の炎症要素、感染によりおこされる眼球炎症、増殖性ガラス体網膜症、急性虚血性眼神経障害、たとえば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕、眼球移植に対する免疫および/または炎症反応および他の免疫および炎症関連眼疾患に伴う炎症、自己免疫疾患、または中枢神経系(CNS)または他のいずれかの器官における、免疫および/または炎症の抑制が有益であるような病状または障害、パーキンソン病、パーキンソン病の治療の合併症および/または副作用、AIDS関連痴呆複合HIV関連脳障害、ドヴィック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性病、CNSの病状または障害、発作の炎症要素、ポリオ後症候群、精神障害の免疫および炎症要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギャン-バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、脳偽腫瘍、ダウン症候群、ハンティントン病、筋萎縮性側索硬化、CNS圧縮またはCNS外傷またはCNSの感染の炎症要素、筋萎縮および筋ジストロフィーの炎症要素、および中枢および末梢神経系の免疫および炎症関連の疾病、病状または障害、外傷後の炎症、敗血症ショック、感染症、手術の炎症性合併症または副作用、骨髄移植または他の移植の合併症および/または副作用、たとえばウイルス担体への感染、またはAIDSに伴う炎症のため、体液性および/または細胞性免疫反応を抑制するため、単球または白血球増殖性疾患、たとえば白血病を単球またはリンパ球の量を減らすことにより���療または改善するため、天然または人工の細胞、組織および器官、たとえば角膜、骨髄、器官、水晶体、ペースメーカー、天然または人工の皮膚組織の移植の場合の移植片拒絶の予防および/または治療のための遺伝子治療の炎症性および/または免疫性合併症および副作用が含まれる。
【００７２】
また、本発明は、遺伝子治療によって個体を治療するための医薬組成物を提供し、ここで、この組成物は、１以上の送達可能な治療用および/または診断用のNOI、または同じものにより生産されるまたはこれから得られるウイルス粒子を含む本発明のレトロウイルスベクターを、治療上有効な量で含む。この医薬組成物はヒトまたは動物に対して使用できる。典型的には、医師が個々の被験者に最適な実際の投与量を決定し、投与量は年齢、体重および特定の個体の応答によって変化する。
【００７３】
組成物は、必要に応じて製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含んでいてもよい。製薬上の担体、賦形剤または希釈剤の選択は、使用する予定の投与経路および標準的な製薬の実施方法を考慮して選択される。医薬組成物は担体、添加剤、または希釈剤として、またはこれに加えて、適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、および、ウイルスの標的部位への侵入を助けるまたは増加させるような他の担体（たとえば、液体送達システムのような）から成っていてもよい。
【００７４】
必要に応じて、医薬組成物は以下のいずれか１つ以上の方法によって投与することができる。すなわち、吸入剤、坐剤またはペッサリーの剤形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の剤形で局所に、皮膚パッチの使用により、でんぷんまたはラクトースのような添加剤を含む錠剤、あるいは単独のまたは添加剤との混合によるカプセル剤または小卵の剤形による、または着香剤または着色剤を含むエリキシル剤、溶液または懸濁液の剤形による経口投与で、または非経口の注入、たとえば空洞内、静脈内、筋肉内または皮下注射によって投与することができる。非経口投与のためには、組成物は、他の物質、たとえば血液と等張な溶液を作るために十分な塩または単糖類を含む無菌水溶液の形で用いられるのが最適である。口腔または舌下投与のためには、組成物は、通常の方法で製剤された錠剤またはトローチの剤形で投与される。
【００７５】
本発明のベクターシステムによる１以上の治療用遺伝子の送達は、単独でまたは他の治療または治療の要素と組み合わせて使用してよい。治療される疾病には、癌、神経疾患、遺伝病、心臓病、発作、関節炎、ウイルス感染および免疫系の疾患が含まれるが、これらに限定されない。好ましい治療用遺伝子には、腫瘍サプレッサータンパク質、酵素、プロドラッグ活性化酵素、免疫調節分子、抗体、工学的に処理されたイムノグロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン、膜タンパク質、血管作動性タンパク質またはペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルスタンパク質、アンチセンスRNAおよびリボザイムをコードしたものが含まれる。
【００７６】
本発明の治療方法の好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムを用いてプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子を腫瘍に送達し、次いでその個体は適切なプロドラッグで治療される。プロドラッグの例としては、以下のものが挙げられる。リン酸エトポシド（アルカリホスファターゼとともに使用する。Senterら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:4842-4846)；5-フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼとともに。Mullenら、1994 Cancer Res. 54: 1503-1506)；ドキソルビシン-N-p-ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン-V-アミダーゼとともに。Kerrら、1990 Cancer Immunol. Immunother. 31:202-206)；パラ-N-ビス(2-クロロエチル)アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチダーゼ G2とともに）；カルバミン酸セファロスポリンナイトロジェンマスタード（b-ラクタマーゼとともに）；SR4233（P450レダクターゼ(Reducase)とともに）；ガンシクロビル（HSVチミジンキナーゼとともに。Borrelliら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7572-7576)；ニトロレダクターゼとともに、マスタードプロドラッグ（Friedlosら、1997 J Med Chem 40: 1270-1275)およびシクロホスファミドまたはIfosfamide（シトクロムP450とともに。Chenら、1996 Cancer Res 56: 1331-1340)。
【００７７】
本発明は、当技術分野の技術レベルの範囲の標準的な分子生物学技術が用いられる。このような技術は文献に完全に記載されている。たとえば、Sambrookら、(1989)「分子クローニング；研究室マニュアル」(Molecular Cloning; a laboratory manual)；HamesおよびGlover(1985-1997)、「DNAクローニング：実践的アプローチ」第I-IV巻（第２版）(DNA Cloning: a practical approach, Volumes I-IV (second edition)；イムノグロブリン遺伝子の遺伝子工学の方法については、McCaffertyら、(1996)「抗体工学：実践的アプローチ」(“Antibody Engineering: A Practical Approach”)を参照されたい。
【００７８】
以下に、本発明を図面を参照しながら実施例によりさらに詳細に説明する。
【００７９】
より詳細には、図１は、この研究に用いられたプラスミドを示す。EIAVのゲノム構成は、スプライスドナー(d1、d2およびd3)およびスプライスレセプター(a1、a2およびa3)部位を含めて示されている。gag、pol、env、tat、rev、S2およびウイルスLTRの位置も示されている。プラスミドpESPは、SV40プロモーターおよびプロマイシン耐性遺伝子を含むEIAVベクターゲノムである。プラスミドpONY3は、EIAV gagpol発現プラスミドである。pONY2.1nlslacZは、HCMV IEエンハンサー/プロモーターおよびβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(nlslacZ)を含むEIAVベクターゲノムである。
【００８０】
図２は、組み込まれたEIAVベクターのPCR分析を示す。PCRは、EIAVベクターを形質導入された細胞（レーン１および５）または擬似形質導入された細胞（レーン２および６）のいずれかのゲノムDNAについて行った。対照としてpONY2.1nlsLacZ（レーン３および７）およびpONY3（レーン４および８）が用いられた。Aは、EIAV LTRのPCRによる検出である。Bは、polのPCRによる検出である。
【００８１】
表２は、分裂するまたは分裂しない細胞の形質導入を示す。293T細胞を、Lewisらの方法（Lewis,P.F.およびM.Emerman、1994. J Virol. 68:510-6.)に従って、アフィジコリンを存在させて（白い柱）または存在させずに（斜線をつけた柱）処理した後、EIAVベクターPONY2.1nlsLacZまたはMLVベクターHIT111のいずれかを形質導入した(Soneokaら、1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633)。48時間後、細胞をX-galによって染色した。力価は、２回の独立した実験の平均を取り、mlあたりのlacZコロニー形成ユニットとして計算した。実験の間には10%以上の変動はなかった。
【００８２】
図10は、gagpol発現構築物の分析を示す。30μgの総細胞タンパク質をSDS/Page電気分解によって分離し、ニトロセルロースに移して、抗EIAV抗体によってプローブした。第２の抗体は抗ウマHRP(Sigma)であった。力価は３回の独立した実験の平均を取り、mlあたりのlacZ形成ユニットとして計算した。実験の間には10%以上の変動はなかった。pONY2.1nlslacZおよびエンベロープ発現プラスミドは、EIAV gagpolと共トランスフェクトされた。
【００８３】
実施例1-欠失gag遺伝子を含むEIAVベクターの構築
複製不能EIAVベクター系を構築するために、本発明者等は、開始点として、Payneらによって記載された（1994,J Gen Virol. 75:425-9）感染性プロウイルスクローンpSPEIAV19（受託番号:U01866）を使用した。最初のEIAV系ベクターは、Payneら（同書）のナンバリング系に従った座標5835/6571に相当するHind III/Hind III断片を除去しenvの一部を単純に欠失させて構築した。この断片を、pTIN500（Cannonら、1996 J. Virol. 70:8234-8240）に由来するSV40初期プロモーター制御下にあるプロマイシン耐性遺伝子により置換し、pESP（図1）を作成した。ウイルスストックを、293T細胞（Soneokaら、1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633）を、誘発pESPおよびpRV67（Kimら、1998 J. Virol. 72(1):811-6、HCMV-IEエンハンサー/プロモーターから水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）が発現されるプラスミド）によりリン酸カルシウムトランスフェクションして作成した。他には、別のVSV-G発現プラスミド、例えばYeeら、1994 PNAS 91:9564-9568等を使用できる。その結果得られた上清を使用して、ヒト腎臓（293T）細胞およびイヌ骨肉腫細胞（D17）を以下のように形質導入した。トランスフェクション後48時間の組織培養液を回収し、0.45μｍフィルターを通して濾過した。10倍希釈液を、ポリブレンを8μｇ/ｍｌで含む培養培地中で作成し、続いて500μｌのアリコートを、前日に12ウェルプレート中に1.6×105/ウェルで接種されたD17細胞上に添加した。2時間後、1ｍｌの培養培地を加えた。2日後、プロマイシンを最終濃度4μｇ/ｍｌで添加し、さらに7日間インキュベーションを続けた。陽性対照として、プロマイシン耐性遺伝子をSV40初期プロモーターの制御下に含有するマウス白血病ウイルス（MLV）系ベクター（pTIN500）を、pHIT60（MVL gagpol）およびpRV67（Cannonら、1996 J. Virol. 70:8234-8240）と組み合わせて使用した。7日後、EIAVベクターに関してのプロマイシン
選択においては、いずれの細胞タイプでも、耐性コロニーは検出されなかった。MLVベクターは、293T細胞では5.0×104c.f.u/ml、D17細胞では1.0×104c.f.u/mlで作成した。
【００８４】
この結果に対する、考えられる説明は、EIAV LTRは、ヒト細胞中ではtatが不在の場合機能性を持たず、そのためgag-polおよびtatのような重要な成分の産生量が不十分になるというものである。
【００８５】
それ故に、3つの転写ユニットを有する更なるベクター系を構築し、以下のものを作成した：1）ベクターゲノムRNA、2）envおよび3）gag-pol。各々の成分を確実に十分産生させるため、envおよびgag-pol転写ユニットは、選択されたヒトパッケージング細胞系において活性であるプロモーター-エンハンサーから転写される。この方法により、十分なgag-polと、おそらくtatが生成され、確実に形質導入能力のあるベクター粒子が効率よく生産される。
【００８６】
レポーター遺伝子をゲノムのpol領域内部に有するベクターゲノムを以下のように構築した。pONY1と命名したプラスミドを、PCRによってpSPEIAV19から増幅させたEIAV LTRをpBluescript II KS+（Stratagene）中に挿入することによって構築した。EIAVクローンpSPEIAV19の5’LTRを、pfuポリメラーゼを以下のプライマーとともに使用してPCR増幅した。
【００８７】
5’ GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG
3’ GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC
アンプリコンを5’突出部フィルインによって平滑末端化し、予めT4DNAポリメラーゼを用いて3’突出部を除去し平滑末端化したBss HIIで切断したpBluescript II KS+中に挿入した。この構築物をpONY1と称し、方向はpBluescript II KS+のβ-ガラクトシダーゼに関して5’から3’であった。pONY1の配列決定により、突然変異が存在しないことが判明した。
【００８８】
ベクターゲノムpSPEIAV19DHを、Mlu I（216/8124）で切断し、Mlu I切断（216）pONY1中に挿入し、pONY2を作成した。pBluescript II KS+のBss HII消化（619/792）を行い、マルチクローニング部位を得た。これを5’突出部フィルインによって平滑末端化し、Bgl IIおよびNco I（1901/4949）で切断し5’突出部フィルインにより平滑末端化したpONY2に連結した。EIAV配列に関して方向は3’から5’であった。これをpONY2.1と称した。pSPCMVを、pLNCX（受託番号:M28246）（Pst I/Hind III）をpSP72（Promega）中に挿入して作成した。pTIN414（Cannon PMら、J. Virol. 70, 8234-8240）由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、pSP72（Xho I/Sph I）中に挿入し、pSPlacZを作成した。β-ガラクトシダーゼ遺伝子への5’末端を、pAD.RSVbgal（J. Clin. Invet. 90:626-630, 1992）に由来するSV40 T抗原核局在化シグナルで置換した。pAD.RSVgalをXho I/Cla Iで切断し、Xho I/Cla I pSPlacZ中に挿入し、pSPnlslacZを作成した。pSPlacZおよびpSPnlslacZに由来するCMV核局在化および非核局在化β-ガラクトシダーゼをPst Iで切断し、pONY2.1のPst I部位に、EIAVの5’から3’の方向で挿入した。これらをpONY2.1nlslacZおよびpONY2.1lacZと称した。
【００８９】
続いて、EIAV gagpol発現プラスミド（pONY3）を、pONY2ΔH由来のMul I/Mul I断片を、哺乳動物発現プラスミドpCI-neo（Promega）中に挿入して作成し、hCMV-MIEプロモーター/エンハンサーからgag-pol遺伝子を発現させた。特に、gagpol pSPEIAV19DHをMlu I（216/8124）で切断し、Mlu I切断（216）pCI-Neo（Promega）中に挿入し、pONY3を作成した。プラスミドpONY3は、機能性ゲノムを作成しないはずであるが、それは好適なLTR配列を欠損（lack）しているためである。ウイルスを、3種類のプラスミド（pRV67、pONY3およびpONY2.10nlsLacZ）で293T細胞を、MLV系ベクターについて記述されたように（Soneokaら、1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633）一過性で共トランスフェクションさせて作成した。続いてウイルスを使って、293T細胞およびD17細胞を以下のように形質導入した。トランスフェクション後48時間の組織培養液を回収し、0.45μｍフィルターを通して濾過した。10倍希釈液を、ポリブレンを8μｇ/ｍｌで含む培養培地中で作成し、続いて500μｌのアリコートを、前日に12ウェルプレート中に1.6×105/ウェルで接種されたD17細胞上に添加した。2時間後、1ｍｌの培養培地を加えた。48時間インキュベーションを続け、その後に、E.coli β-ガラクトシダーゼについてのX-gal染色手順を使用して、LacZ遺伝子発現の評価を行った（macGregorら、1991 Methods in Molecular Biology Vol 7 ed EJ Murray p217-235）。両方の場合において、ウイルスは、約105 LacZ-形質導入細胞-形成-単位（transducing cell-forming-unit）（i.f.u.）/ｍｌの頻度で細胞を形質導入したが、これはpHIT111から作成されたMLV系ベクターで形質導入した場合よりも約10倍少ないものであった。これらのデータは、本発明者等がEIAV系ベクター系を創り出したことを示し、そして、env中のHind III/Hind III断片を外来DNAで置換することによりゲノムの
機能を崩壊させ得ることを示唆していた。
【００９０】
次に本発明者等は、EIAVベクター粒子の、他のウイルスに由来するエンベロープタンパク質とともに偽型となり得る能力を特徴づけた。pONY2.10nlsLacZおよびpONY3を、VSV-G(pRV67)ならびに、MLV両栄養性（pHIT456）およびMLVエコトロピック（pHIT123）エンベロープ（Soneokaら、1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633）を生産するエンベロープ発現プラスミドとともに共トランスフェクトした（表1）。pHIT111（MLVベクターゲノム）およびpHIT60（MLV gagpol発現プラスミド）をエンベローププラスミドとともに陽性対照として共トランスフェクトした（表1）。ウイルス上清を使用して、ヒト腎臓（293T）、マウス胚（NIH3T3）およびイヌ骨肉腫（D17）を含む多様な細胞系を形質導入した。予測されたように、ウイルスの細胞向性は、大部分はエンベロープによって決定された。EIAVは両栄養性エンベロープとともに偽型となり得たが、形質導入効率は変動的であった。両栄養性偽型ウイルスは、D17細胞では約102、NIH3T3細胞では103、293T細胞では104の力価を提供した。これらの差が生じた理由については追求しなかった。EIAVはまた、MLVエコトロピックエンベロープとともに偽型となり得、これらのウイルスはNIH3T3細胞を104 l.f.u./ｍｌの力価で形質導入した。EIAVは、VSV-Gエンベロープとともに偽型となり、全ての被験細胞系を形質導入した。異なるエンベロープの間、および異なる細胞型の間で力価は変動したが、全体としての効率は非マウス細胞に関しては比較的高かったが、しかしマウスベクター系に関する効率と比較するとはるかに低かった。まとめると、これらのデータは、EIAVベクター系はEIAVエンベロープに依存することなく、幅広い宿主領域を付与する3種類のエンベロープとともに効果的に偽型となり得ることを示している。このことは、本発明の系を、現在のMLV系と同程度に一般に有用なものにする。
【００９１】
EIAVベクターは、RD114エンベロープを使用する、例えばpRDF（Cossetら、1995 J. Virol. 69:7430-7436）を使用する同様のやり方においてもまた、偽型となり得る。
【００９２】
形質導入現象をさらに特徴づけするために、本発明者等は、VSV-Gとともに偽型とされたEIAVベクターによって形質導入された293T細胞について、PCR分析を行った。特に、本発明者等は、gagpol発現プラスミドpONY3を有する組換体に対して、ベクターゲノムはβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の形質導入運搬体であったか否かを調査した。EIAV LTRに特異的なプライマーを使用したPCR増幅により、形質導入された細胞から単離されたゲノムDNAを使用した場合には、310bpの予測されたPCR産物が得られた（図2A、レーン1）。擬似（mock）形質導入された293T細胞DNAを鋳型として使用した場合には、PCR産物は検出されなかった（図2A、レーン2）。pONY2.10nlsLacZを陽性対照として用いた（図2A、レーン3）。pONY3を鋳型として使用した場合には、PCR産物は検出されなかった（図2A、レーン4）。pol特異的プライマーを使用した場合には、PCR産物は検出されず（図2B）、pONY3由来のgagpol配列が宿主の染色体中に組み込まれていないことが確認された。まとめると、これらのデータは、信頼すべきベクターゲノムが細胞を形質導入したことを示している。
【００９３】
EIAVベクターが非分裂（non-dividing）細胞を形質導入する能力を保持しているか否かを決定するために、293T細胞をG1/S期で、刊行物に記載された手順に従って（LewisおよびEmerman 1994）、アフィジコリンを使用し処理することにより抑止状態とし、続いてVSV-Gとともに偽型とされたEIAV系ベクターおよびMLV系ベクターで形質導入した。MLVベクターの形質導入効率は、アフィジコリン処理された細胞中では非処理細胞と比較して4桁低いものであった。MLVによる細胞形質導入の不完全なブロックは、恐らくは、分裂中の細胞数が少ないことによるものであった。これとは対照的に、EIAV系ベクターの場合には顕著な差は見られなかった。このことは、EIAVベクターは、HIVベクターのように、効率的に非分裂細胞を形質導入できることを示している。
【００９４】
ベクターゲノムpONY2.10lacZは、gagの1377ntを含んでいる。RNA2次構造予測（”http://www.ibc.wustl.edu/〜zuker/rna/”）を使い、gagの5’末端およびリーダー内で起こり得るステムループ構造を同定した。これらの予測に基づき、pONY2.10lacZのgag領域内部で4つの欠失を生じさせた（図1）。欠失は、標準的な技術を用いてPCR突然変異誘発により実施した。
【００９５】
pONY2.1lacZは、gagの1377ntを含む（位置1901ntから欠失）。pONY2.11lacZは、gagの354ntを含む（位置878ntから欠失）。pONY2.12lacZは、gagの184ntを含む（位置708ntから欠失）。pONY2.13lacZは、gagの109ntを含む（位置633ntから欠失）。pONY2.14lacZは、gagの2ntを含む（位置526ntから欠失）。
【００９６】
これらのベクターを、MLV系ベクターについて記述されたように（Soneokaら、1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633）、3種類のプラスミドの共トランスフェクションにおいて使用し、生成されたウイルスを293T細胞およびD17細胞中で力価測定した。
【００９７】
gagをコードする配列の最初の109ntは、非翻訳領域に加えて、最大のパッケージングに必要であることが見出された；pONY2.13lacZ（表2）。D17細胞においてもまた、同様の力価が観察された。pONY2.13lacZにおけるgag配列由来のRNAの予測された2次構造を図4に示す。
【００９８】
図4中の2次構造予測に基づいて、pONY2.13lacZ中の主要スプライスドナーコドンの上流および下流領域内で、4つの更なる欠失を生じさせた。
【００９９】
pONY2.21lacZは、位置409から421ntの間の欠失を含む。pONY2.22lacZは、位置424から463ntの間の欠失を含む。pONY2.23lacZは、位置470から524ntの間の欠失を含む。pONY2.24lacZは、位置529から582ntの間の欠失を含む。pONY2.25lacZは、位置584から645ntの間の欠失を含む。pONY2.26lacZは、位置409から421ntの間および位置470から524ntの間の欠失を含む。
【０１００】
これらのベクターを、上記のように3種類のプラスミドの共トランスフェクションにおいて上記のように使用し、生成されたウイルスをD17細胞にて力価測定した。この領域内における欠失がウイルスの力価に重大な影響を及ぼすことが判明した（表3）。構築物pONY2.23およびpONY2.26は、最も低い力価を示した。これらは両方とも位置470から524ntの間の欠失を含んでいる。最も影響の少ない欠失は、位置409から421ntの間の欠失であった。これらの知見に基づくと、主要スプライスドナーの周辺領域は、最適なパッケージングに有用である。
【０１０１】
同様の2次構造予測および欠失分析を、他の非霊長類レンチウイルスにおけるパッケージングシグナルの同定に使用し得るであろう。
【０１０２】
【表１】
0004578678.tif 000002
【表２】
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【表３】
0004578678.tif 000004
実施例２  pEGASUS-1の構築
EIAV系ベクターで、EIAV配列のうちの759nt(268nt〜675ntおよび7942nt〜8292nt)のみを含むベクター(pEGASUS-1)を以下のように作製した。
【０１０３】
EIAVポリプリントラクト（PPT)および3'LTRを囲む配列を、PCR増幅によりpONY2.10LacZからプライマーPPTEIAV+(Y8198):GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG、および3'NEGSpeI（Y8199）：CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAGを用いて得た。産生物を精製しSpeI（ACTAGT)で消化し、SpeI消化およびアルカリフォスファターゼ処理で調製済みのpBS II KS+に連結させた。大腸菌の形質転換後に得られたコロニーであるXL-1Blueを、3'LTRのU5領域がpBS II KS+リンカーのNotI部位に隣接する配列で3'LTRが存在するかどうかについてスクリーニングした。クローン化された挿入物の配列を決定したところ、EIAVクローンpSPEIAV19（AC:U01866)と１ヶ所の変化しか含有しないことが示された。この変化とは、R領域の塩基３および４間への「C」挿入であった。同様の変化がPCR反応に使用した鋳型においても見られた。該クローンをpBS.3'LTRと名づけた。
【０１０４】
次にレポーター遺伝子カセット、CMVプロモーター/LacZをpBS.3'LTRのPstI部位に導入した。CMV/LacZカセットを、pONY2.10LacZ(上記参照）由来のPstI断片として得た。上記断片を結合する連結反応により大腸菌、XL-1Blueを形質転換した。CMV/LacZ挿入物において、LacZ遺伝子が３’LTRに隣接するように配列される若干のクローンを、標準的な手法を用いて細胞系293Tをトランスフェクトすることにより、CMV/LacZカセットの活性について評価した。トランスフェクション後48時間にX-galでの顕色により青色の細胞が生じたクローンを、次の使用のために選択してpBS CMVLacZ.3'LTRと名づけた。
【０１０５】
EIAVベクターの該5'領域を発現ベクターpCIEneo中に構築した。該発現ベクターpCIEneoは、前記CMVプロモーター全体の5'末端に由来するおよそ400塩基対の封入により改変されたpCIneo(Promega)の誘導体である。この400塩基対の断片はPCR増幅により、プライマーVSAT1（GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT)およびVSAT2（TATTAATAACTAGT)および鋳型としてpHIT60を用いて得られた。産生物をBglIIおよびSpeIで消化し、同様に消化したpCIneo中に連結した。
【０１０６】
R領域からのgagをコードする領域nt150までのEIAVゲノムの断片(nt 268〜675）を、プライマーCMV5'EIAV2(Z0591) (GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG)および鋳型DNAとして3'PSI.NEG（GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG)を用いて増幅した。プライマーCMV5'EIAV2の5'領域は、CMVプロモーターの転写開始部位のすぐ上流の配列を含み、SacIによって切断することができる。3'PSI.NEGは、欠失解析（上記）によって決定したEIAVパッケージング配列の３'に結合され、XbaI部位を含む。該PCR産物をSacIおよびXbaIによって処理し、連結するために同じ酵素で消化して準備したpCIEneo中に連結させた。この操作によりEIVA R領域の開始をCMPプロモーターの転写開始点に配置し、こうして産生した転写産物は、EIAVが使用する本当の開始位置から始まり、パッケージングシグナルの3'側まで伸びる。切断解析による評価で、正確であることが明らかとなったクローンを配列決定した。クローンをpCIEneo.5'EIAVと名づけ、次の研究のために選択した。
【０１０７】
次のステップで、pBS.CMVLacZ.3'LTR中のCMVLacZおよび3'LTRカセットをpCIEneo.5'EIAV中に導入した。pBS.CMVLacZ.3'LTRをApaIで消化し、3'突出部をT4 DNAポリメラーゼで除去し、続いてNotIで消化した。CMVLacZ.3'LTRを含む断片を標準的な分子生物学的技術により精製した。この断片と連結させるためのベクターをpCIEneo.5'EIAVをSalIで消化して調製し、続いてT4 DNAポリメラーゼを用いて5'突出物を埋めた。そして、該DNAをNotIで消化し連結反応に使用する前に精製した。大腸菌XL-1Blueの形質転換後、コロニーを制限解析により挿入物の存在でスクリーニングし、必要なクローンである指定のpEGASUS-1を同定した。
【０１０８】
pEGASUS-1 EIVAベクターの機能を実施例１に記載の3種のプラスミド共トランスフェクション系を用いて、pONY2.10LacZと比較した。両方のベクターから類似の力価が得られ、pEGASUS-1が効率のよいパッケージングに必要なすべての配列を含んでいることが示された。
【０１０９】
実施例３  RREのEIAVベクターへの導入
EIAVベクターpEGASUS-1は、付加的なエレメントの導入により力価を上げることでさらに改良され得る。このようなエレメントを導入するのに都合のよい部位はSalI部位であり、pEGAUSUS-1のパッケージングシグナルの3'側のXbaIとCMV/LacZカセットの上流の間に存在する。例えば、HIVまたはEIAV由来のRREをこの部位に挿入できる。
【０１１０】
HIV-1 RREを、HIV-1分子クローンpWI3（KimptonおよびEmerman 1992, J.Virol. 66:2232-2239)から、プライマーRRE(+) GTCGCTGAGGTCGACAAGGCAAAGAGAAGAGおよびRRE(-) GACCGGTACCGTCGACAAGGCACAGCAGTGGを用いたPCR増幅により得た。DNA断片およびpEGASUS-1をSalIで消化し、続いて連結し、大腸菌XL-1 Blueを形質転換した。コロニーをHIV RREおよび２つのクローンの存在について、順方向または逆方向の向きのHIV RREを用いてスクリーニングし、さらなる研究に用いた。これらのベクター、pEGASUS-2.HIV RRE(+)またはpEGASUS-2.HIV RRE(-)は、293T細胞内で、４つのプラスミドで共トランスフェクションすることによってテストできる。その際、HIV-1由来のrevタンパク質を発現するプラスミドpCIneoHIVrevをベクター、pONY3およびpRV67プラスミドとともに共トランスフェクションする。
【０１１１】
既に明らかにされているEIAV RRE（Martaranoら、1994）をPCR増幅により以下のようにして得た。pONY2.10LacZを鋳型として使い、2回の増幅を行って、EIAV RREの2つの部分を得た。5'エレメントは、プライマーERRE1 (TTCTGTCGACGAATCCCAGGGGGAATCTCAAC)およびERRE2 (GTCACCTTCCAGAGGGCCCTGGCTAAGCATAACAG)を用いて、ならびに３'エレメントは、ERRE3(CTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAAGGTGAC)およびERRE4 (AATTGCTGACCCCCAAAATAGCCATAAG)を用いて得られた。これらの産物は、お互いにアニーリングするので、EIAV RREを「コードする」DNAを得るための第2のPCR反応に用いることができる。該PCR増幅は、始めの10サイクルはプライマーERRE1およびERRE4なしで開始し、次にこれらのプライマーを反応に加え、さらに10サイクルの増幅を実施した。得られたPCR産物およびpEGASUS-1をSalIで消化し、連結して大腸菌XL-1Blueを形質転換した。EIAV RREが順方向または逆方向の向きで存在するクローンを次の研究のために選択した。これらのベクターの活性を４種の共トランスフェクションで評価し、pEGASUS-１をSalIで消化し、連結して大腸菌XL-1Blueを形質転換した。EIAV RREが順方向または逆方向のいずれかの向きで存在するクローンを、さらなる研究のために選択した。これらのベクターの活性を、3つのプラスミドの共トランスフェクション（EIAVrevはpONY3によって供給される）、またはさらなるEIAV revを供給するためにpCIneo.EIAV Revを用いる以外は上記と同様の４つのプラスミドの共トランスフェクション実験で評価した。
【０１１２】
pCIneo EIAV REVを構築するために、EIAV REVをコードする配列をPCR増幅によって得た。EIAV REV配列をEIAV RREについて上に記載した2段階「重複」PCR増幅工程を用いて得た。該2反応のための鋳型をpONY3とし、5'断片のためのプライマーを、EIAV REV5'O (CCATGCACGTCTGCAGCCAGCATGGCAGAATCGAAG)およびEIAV REV IN (CCTGAGGATCTATTTTCCACCAGTCATTTC)そして3'産生物のためのプライマーをEIAV REV IP (GTGGAAAATAGATCCTCAGGGCCCTCTGG)および EIAV.REV3'O(GCAGTGCCGGATCCTCATAAATGTTTCCTCCTTCG)とした。第2のPCR増幅を、プライマーEIAV REV5'OおよびEIAV REV3'Oを10サイクル後に添加して行った。得られた産物をPCR断片「TA」クローニングベクターpCR2.1（Invitrogen)と連結させた。EIAV REV挿入物の向きを制限酵素分析によって評価し、正確なEIAV REV配列が存在することを確認した。構築物をpTopoRevposと名づけた。EIAV REV挿入物をpTopoRevposからSpeIおよびNotIによる消化で切り出し、NheIおよびNotIで消化したpCIneo中に連結した。
【０１１３】
実施例４  ヒトマクロファージの形質導入
原始のヒト単核細胞を白血球に富んだ血液（National Blood Transfusion Service, Southmead Rd Bristol, UK)から次のように得た。末梢血液単核細胞（PBMC)をFicoll不連続勾配（Phamacia）で、製造元の指示に従って遠心で濃縮した。マクロファージはこの細胞群を、2%熱不活性化ヒトAB血清（Sigma)または10%FSC（Sigma）を含むRPMI1640培地(Dutch modified; Sigma)中、組織培養プラスチックに7日間にわたり付着させることによって得られた。付着しない細胞は、プレートを培養液で広範に洗浄して取り除いた。
【０１１４】
形質導入実験のためのウイルスを、293T細胞への3種のプラスミド共トランスフェクションによって得た。実験のためのベクターは、CMV/LacZレポーターカセットがCMV/green蛍光タンパク質（GFP)と置き換わったpONY2.13誘導体であった。
【０１１５】
ベクターpONY2.13GFPを以下のように作製した。レッドシフトGFPおよび真核細胞翻訳シグナルをコードする配列をpEGFP-NI（Clontech”http://www.clontech.com/")からBglIIおよびXbaIで切り出し、同じ酵素で消化して調製した一般的なクローニングベクターpSP72（Promega)中に連結した。次にGFPをコードする配列をXhoIを用いて切り出し、XhoIで切断した（そのためLacZをコードする領域を放出する）pONY2.13中に連結した。大腸菌XL-1Blueを形質転換した後、CMVプロモーターに対するGFP挿入物の向きが発現が期待されるような向きであるクローンを制限酵素分析によって確認し、GFPの発現をDNAによる293T細胞のトランスフェクションにより確認した。ベクターを293T細胞への3種のプラスミド共トランスフェクションによって回収し、トランスフェクション後42〜48時間で回収した。組織培養液を0.45μl-濾過し、続いてウイルスをSW40Tiローター中4℃で90分、50,000g（20Krpm)の遠心分離でペレット化した。ウイルスを50〜100μlの完全培地に2時間かけて再懸濁し、続いて形質導入実験に使用した。pONY2.13GFPベクターによる形質導入を次のように実施した。48-ウェルプレートのウェル毎に5×105で播いたマクロファージを培地で一度洗浄し、次に300μlの培地を細胞上に戻した。ウイルスを培地に加え、確実に混合するように穏やかに２〜3回ピペッティングした。形質導入の効率は、形質導入の3〜5日後に評価した。形質導入したマクロファージの数を蛍光顕微鏡で測定した。GFPの発現は、長期間、例えば数週間にわたって観察することもできる。また形質導入はLacZマーカーを有するベクターで実施できる。このような実験において、形質導入の頻度は、免疫学的方法を用いてβ-ガラクトシダーゼの存在を検出することによって評価する。
【０１１６】
実施例5 in vivoラット脳におけるEIAVベクターの導入
成体Wisterラットを、ネンブタール(体重35gmあたり0.1ml）１部、Novetal(体重35gmあたり0.1ml）１部、およびdH2O ２部を含む溶液で麻酔し、定位装置に固定した。頭皮の吻から尾方向に沿って正中切開し、頭蓋骨が露出するように皮膚をめくった。後方3.00mmおよび横方向3.00の定位の座標（Bregma測定）を用いて、頭蓋骨に直径1mmの穴を開けた。片側の皮質内にEIAVベクターを、10μlハミルトンシリンジまたは1.0μlガラス毛細管を用いて、脳の表面から様々な深さで注射した。シリンジは、逆流を防ぐためにさらに5分間そのままにした。対照動物には、ハミルトンシリンジまたは1.0μlガラス毛細管で生理食塩水のみを10μl皮質内注射した。動物を縫合し、回復するまで放置した。48時間後、これらの動物は上記のように強く麻酔されており、200mlのリン酸バッファー食塩水（PBS)を心臓に灌流した。次に脳を切り裂いてドライアイス冷却イソペンタン（-30℃）中で凍結し、低温維持装置で環状(10μm)に切断した。注射した部位の切片５つごとおよび2mmの吻および尾部をSuper-Frostスライド上に回収して固定し、X-gal若しくは免疫染色またはクレシルバイオレットで染色した。
【０１１７】
実施例６  培養物中で分化した気管支細胞の形質導入
上皮細胞を分化させて、電気抵抗（＞1000Ωcm3）を示す上皮様単層および立方体様形態を形成させることができる。これを行うには様々な方法がある（例えばFullerら、1984）。これにより極性を持つ細胞が創られる。この極性は機能的で、in vivoで上皮細胞を模倣する。従って、EIAVベクターは、実施例１〜３に記載のベクターおよび調製物を用いて先端面または基底面を通してこれらの細胞を形質導入するのに使用できる。
【０１１８】
実施例７  最小EIAV系
、治療に適用する際有害な影響を持つ補助遺伝子およびコード配列の危険性を排除するため、tat、S2およびdUTPaseを欠失したベクター系を構築する。
【０１１９】
S2突然変異体の構築
A)ベクターゲノム
pONY2.13lacZはgagの109nt(ヌクレオチド位置633から4949を欠失）を含む（pONY2.13lacZは上記）。このベクターを用いてヌクレオチド位置5345〜5397の欠失によりS2の発現が除去されているEIAVベクターゲノムを作製する。これによりS2のATG開始コドンおよびenvの開始コドンが除去される。S2内に欠失を作るため、pONY2.13DNAを鋳型として用いてSY2/SY5およびSY3/SY4でPCRを実施する。２つのPCR産物をプールし、プライマーSY5およびSY3でPCRを実施する。1.1kbの産物をpGEMT-easy（Promega)に連結し、pGEMS2を作製し、配列決定して欠失を確認する。pONY2.13lacZDS2を、CelIIでpGEMS2の1.1kbのS2領域を切り出し、pONY2.13lacZに連結することにより作製する。
【０１２０】
B)Gagpolの構築
pONY3中、S2の同一領域を欠失させS2遺伝子を再構築するpONY3DS2とpONY2.13DS2間の遺伝子組換えを阻止する。pONY3DS2を、pONY3DNAを鋳型として用いて、SY1/SY2およびSY3/SY4でPCR増幅することにより作製する。２つのPCR産物をプールし、プライマーSY1およびSY3でPCRを実施した。0.7kb産物をpGEMT-easy（Promega)に連結してpGEMS22を作製し、配列決定して欠失を確認する。0.7kbのS2コード領域をpGEMS22からNotIで切り出し、pBluescript KS＋(Strategene)に挿入してpBPCRS2を作製する。pONY3のEcoRVおよびNcoI断片(2.2kb）をEcoRVおよびNcoIで切断したpBPCRS2に挿入し、pBpONYS2を作製する。続いてこれをEcoRVおよびCelIIで切断し（2.9kb断片）、EcoRVおよびCelIIで切断したpONY3に挿入してpONY3DS2を作製する。
【０１２１】
dUTPase突然変異体の構築
pONY3DdUTPaseをヌクレオチド4176のT残基をA残基にする部位特異的突然変異誘発により作製する（Payneら、Virology、210：302-313）。これはアスパラギン酸をグルタミン酸に変異させる。これはPCRプライマーdUTPaseFおよびdUTPaseRを用いるPCR増幅により実施する。鋳型DNAをpOMY3とする。PCR産物をpGEMT-easyに挿入し、配列決定して変異を確認する。これをpGDdUTPaseと称する。pONY3をNotIおよびEcoRVで切断し（4.6kb）、pBluescript KS+（Strategene)に挿入してpBEVを作製する。pGDdUTaseをPacIおよびPstIで切断し、0.4kbバンドをPacIおよびPstIで切断したpBEVに挿入する。これをpONY3pBDUTPaseと称する。続いてこれをNotIおよびEcoRVによりpONY3に挿入して(4.6kb)、pONY3DdUTPaseを作製する。
【０１２２】
S2およびdUTPase二重突然変異体の構築
pONY3の二重突然変異体を構築するため構築物pBpONYS2を使用する。pGDdUTPaseをPacIおよびPstIで切断し、断片をPacIおよびPstIで切断したpBpONYS2に挿入して構築物pS2DdUTPaseを作製する。続いてこれをEcoRVおよびCelIで切断し、EcoRVおよびCelIで切断したpONY3に挿入してpONY3DS2DdUTPaseを作製する。
【０１２３】
S2およびdUTPase突然変異体の分析
pONY2.13lacZDS2、pONY3DdUTPaseおよびpONY3DS2DdUTPaseベクターを3つのプラスミドの共トランスフェクションにおける多数の組合せに使用して、MLV系ベクターについての記載（Soneokaら、1995 Nucl.Acids Res.23：628-633）のようにウイルスを作製する。作製したウイルスを、分裂または非分裂状態の293TおよびD17細胞上で力価測定する。細胞をアフィジコリン処理によりG1/S期に停止させ（9）、そしてVSV-Gとともに偽型となるEIAV系ベクターおよびMLV系ベクターで形質導入する（表4）。MLVベクターの形質導入効率は、アンフィジコリン処理した細胞では処理していない細胞と比べると4桁低い。MLVによる細胞形質導入の阻止が不完全なのは、おそらく分裂細胞の数が少なかったことによる。対照的に、EIAV系ベクターの場合は、有意な違いは見られない。この事実は、EIAV系においては、産生および形質導入のいずれにもS２とdUTPaseはどちらも必要でないことを示している。Payneら（Payneら、Virology, 210：302-313）および他は、EIAV dUTPaseがウママクロファージの感染に必要であることを示した。以上のことは、EIAVによるマクロファージ感染に制約があることを示しているといえる。
【０１２４】
S2およびdUTPase突然変異体の特性を、最小培地で7日間培養した海馬胚14日齢の神経細胞の形質導入によって調査する。それぞれのEIAVベクター間で有意な違いは見られない。しかしながら、形質導入効率の大幅な減失が、MLVベクターでは見られる。これはS2およびdUTPaseが、生理学的に非分裂性の細胞の形質導入には必要でないことを示す。
【０１２５】
総合すると、tat、S2およびdUTPaseはベクター系のいかなる部分においても、ベクターの産生または形質導入に必要でないと結論づけることができる。
【０１２６】
実施例８  Rev/RREの添加
pEGASUS-1の構築について既に記載した。このベクターはEIAV配列のうち759bpを含む。EIAV RRE（0.7kb）をpEGASUS-1中に導入してpEGASUS/RREを作製すると、Revを途中で(in trans)供給した場合に力価が4倍に増加した（表2）。このベクターはEIAVの1.47kbを含む。
【０１２７】
実施例9  改良型gagpol発現プラスミドの構築
pONY3中にはgagpolコード配列の開始位置の前に延長された5'非翻訳領域がある。この通常はみられない長さの配列がgagpolカセットの発現を損ないうる。gagpolの発現を改善するためにpONY3を改変して残存している5'LTRを除去する。このことはpONY3をNarIおよびEcoRVで切断することによって行う。2.4kbの断片をpBluescript KS＋(Stratagene)のClaIおよびEcoRV部位に挿入して構築物pBSpONY3.0を作製する。pBSpONY3.0をXhoIおよびEcoRVで切断する。2.4kbの断片をpONY3のXho IおよびEco RVに挿入してpONY3.1を作製する。
【０１２８】
この操作によって5'LTRをプライマー結合領域(386nt)内のNarI部位まで除去する。この構築物はタイターが2倍となり、タンパク質発現が増加する(図10)。
【０１２９】
pONY3.1はpONY3と同様にgag、gagpol、Tat、S2、およびRevをコードする。S2を変異させた実験でS2は産生系にもEIAVベクターゲノム中にも必要ではないことが示されたので、gagpol発現構築物をS2を含めずにデザインすることが可能である。2種類のそのような構築物、pHORSEおよびpHORSE3.1を産生させる。
【０１３０】
pHORSEはpONY3を鋳型DNAとしてEGAGP5'OUTER/EGAGPINNER3およびEGAGP3'OUTER/EGAGPINNER5を用いてPCR増幅で作製する。2種類のPCR産物を精製し、プールし、プライマーEGAGP5'OUTER/EGAGP3'OUTERを用いて再増幅する。この産物をpSP72のXhoIおよびNcoI部位に挿入してpSP72EIAVgagpolO'lapを作製する。pONY3をPvuIIおよびNcoIで切断し、4.3kb断片をPvuIIおよびNcoIで切断したpSP72EIAVgagpolO'lap中に挿入してpSPEGPを作製する。これをXhoIおよびSalIで切断し(4.7kb)、pCI-NeoのXhoIおよびSalI部位へ挿入する。この構築物をpCIEGPと呼ぶ。RREをpEGASUSからSalIを用いて切り出し(0.7kb)、pCIEGP構築物のSalI部位に挿入してpHORSEを作製する。
【０１３１】
この構築物からのタンパク質の発現をpCI-Rev(EIAV Revオープンリーディングフレームを発現している構築物、上記参照)の存在下もしくは不在下でアッセイすると、予測通り、Rev依存性であることがわかる。しかし、タンパク質の発現はpONY3.1からの場合よりもはるかに低い。さらにウイルス産生に用いた場合にはタイターはpONY3.1からの産生の1/100であることが見出された。
【０１３２】
予測していなかったことだが、pONY3.1のリーダー配列(5'LTRのU5の末端からgag383-524ntのATG開始までの配列からなる)をpHORSEに挿入してpHORSE3.1を作製するとタンパク質発現とウイルス産生は改良される。pHORSE3.1はpHORSEの1.5kbのXhoI/XbaIをpONY3.1の1.6kbのXhoI/XbaIと置換することによって作製される。pHORSE3.1で得られるタイターはpONY3.1で得られるものと同様である。pHORSE3.1のタイターがpONY3.1よりわずかに低いのはおそらくpHORSE3.1では4つのプラスミドの共トランスフェクションが必要となるためであろう(この系のRev依存性のため)。従って、最小限のEIAVベクター系にはgagpolの発現を最大のものとするためにこのリーダー配列があるべきであると結論づけることができる。
【０１３３】
4つのプラスミドの共トランスフェクションにpHORSE3.1、pRV67、pCIRev、およびpEGASUS/RREが用いられると(表6)、ウイルスは高いタイター(2.0 X 104 l.f.u./mL)で産生される。この系はTatのトランス活性化の原因となっているTatの第2エキソンを欠いている(Southgateら, J. Virology, 1995, 69:2605-2610)。このことはTatがEIAV系ベクター系には必要でないことを示している。
【０１３４】
pHORSE3.1の骨格をRevを発現するように加工することによって(NeoオープンリーディングフレームをEIAV Revで置換する)、4つのプラスミドの共トランスフェクションの必要性を排除することができた。このことはpCI-NeoをStu IおよびBst XIで切断し、5'のオーヴァーハングにT4 DNAポリメラーゼを用いて充填することによって行った。これによって4.6kbのベクター断片が産生され、その中にRevオープンリーディングフレームがpTopoRevpos(Sac IおよびXba Iでの切断によって0.6kbのバンドが得られ、それにはT4 DNAポリメラーゼを用いて5'オーヴァーハングが充填されている)から挿入されていた。これをpCREVと呼んだ。RREおよびリーダーを含むEIAVgagpolリーディングフレームをpHORSE3.1からXhoIおよびNotI(5.5kb)で切断し、pCREV中のXhoIおよびNotI部位へ挿入してpEGPR3.1を作製した。
【０１３５】
EIAVgagpolのコドン最適化によって、RRE/Rev系のgagpolタンパク質発現依存性が排除されるはずである。Rev/RREに対してのpEGASUS-1の必要性も、Mason-Pfizer Monkeyウイルス(MPMV)から得た構成的輸送エレメント(CTE)などの異種RNA核外移行系を用いることによって、排除することができる(Brayら, PNAS, 1994, 91:1256-1260; Kimら, 1998)。
【０１３６】
【表４】
表４
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pONY2.10LacZとpEGASUS＋/−EIAV RREの比較。
【０１３７】
【表５】
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Revを有している場合のタイターはpEGASUS-1ではRREを持っていないが、より高い。おそらくRevの効果はgagpolの発現を増強することによるものであろう。
【０１３８】
【表６】
表6
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トランスフェクションはpCI-RevおよびpRV67を用いて239T細胞中で行った。ウイルスのタイターはD17細胞で調べた。
【０１３９】
プライマー
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実施例10 pONY4シリーズのベクター
EIAVゲノムの転写のためのTatの使用を排除するため、および完全長の転写物の量を増加させるために、EIAV U3(5'LTR)をpEGASUSベクターの場合(実施例2)と同様にHCMVエンハンサー/プロモーターで置換した。
【０１４０】
プラスミドの構築
pONY2.11lacZにはgag ORFの373bpのみが残るようにgag内に欠失がある。pONY4は、5'LTRをCMV LTRで置換することによってpEGASUS-1から作製した。pEGASUS-1をBglII/XhoIで切断し3.2kbの断片(CMV LTRを含んでいる)を放出させ、それをBglII/XhoIで切断したpSP72中に挿入した。この構築物はpSPPEG213と名付けた。これをHpaI/NarIで切断し、1.3kbの断片(CMV LTRを包含する)をNae I/Nar Iで切断したpONY2.11lacZ中に挿入した。pONY4.1は、tat、S2、env、rev、およびRREが欠失しているかもしくは高度に末端を切断されていることとなるように、lacZ遺伝子の下流(SfuIとSalI部位の間)に欠失(2.4KB)を含んでいる(図11c)。pONY4.1はそれをSfu I/Sal Iで切断し、クレノウポリメラーゼで平滑端として再連結したものである。pONY4GはpONY4のlacZ遺伝子(Sac II/Kpn Iで切断し次いでクレノウポリメラーゼで平滑端としたもの)をpEGFP-N1(Clonetech)(Bam HI/Xba Iで切断し次いでクレノウポリメラーゼで平滑端としたもの)から平滑端断片として得たGFPのlacZ遺伝子と置換したものである。
【０１４１】
ベクターの産生とアッセイ
10cmの皿にプレートしたヒト腎293T細胞を、16μgのベクタープラスミド、16μgのgag-polプラスミド、および8μgのエンベローププラスミドを用いてリン酸カルシウムでトランスフェクションすることによってベクターストックを作製した。トランスフェクションの36-48時間後、上清をろ過(0.45μm)し、いくつかに分け、−70℃で保存した。濃縮ベクター調製品は20000rpm、90分間、4℃で超遠心(SW40Tiローター)することによって作製した。ウイルスをPBS中に3-4時間再懸濁し、いくつかに分け、−70℃で保存した。形質導入はポリブレン(8μg/mL)の存在下で行った。pONY2.11lacZは、より欠失の少ないpONY2.10.lacZと比べると常に2ないし4倍高いタイターを示した。5'LTR中のU3を、pONYのようにCMVエンハンサー/プロモーターで置換するとタイターはさらに5-10倍増加する。
【０１４２】
実施例11 EIAV"自己不活化"ベクター(SINベクター)
特定のタイプの細胞中でのEIAVベクターからのトランスジーンの発現はLTR中のエレメントによって影響を受ける可能性がある。そのようなエレメントを除去するためにSIN(自己不活化性)ベクターを構築することができるがベクターの精密な配置はそのベクターの効率的な産生のために必要な特定の配列を維持することの必要性によって影響を受ける(Mol. Cell Biol. 1996 Sep; 16(9):4942-51, RNA structure is a determinant of poly(A) site recognition by cleavage and polyadenylation specificity factor.  Graveley BR, Fleming ES, Gilmartin GM)(J. Virol. 1996 Mar; 70(3):1612-7, A common mechanism for the enhancement of mRNA 3' processing by U3 sequences in two distantly related lentiviruses, Graveley BR, Gilmartin GM)。さらにSINベクターは形質導入された細胞中での完全長の転写物の産生を排除する方法を提供する。
【０１４３】
2種類のSINベクターを作製した：1つは重要と推定される配列(ポリアデニル化のための)を含有するもので、MluI部位とMunI部位の間に位置し、もう1つはこれらの配列を欠失させたものである。欠失の5'の境界は3'LTRのU3領域の5'末端から112塩基のところであった。2種類のSINベクターの構造を図12に示す。
【０１４４】
pONY4G.SIN-MLUとpONY4G.SIN-MUNベクター中にある欠失部分は点線で示した。プライマーはイタリック体で示している。
【０１４５】
ヌクレオチド7300と8079(番号はEIAVのクローンpSＰEAIV19、アクセス(Accession)番号U01866に従って付けたもの)の間のDNA配列をpONY4Gを鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応法で増幅して得た。正のセンスプライマーはERRE3で、負のプライマーは
0004578678.tif 000010
であり、これらの配列で下線を付した部分はヌクレオチド8058から8079(pSPEIAV19の)に相補的なものである。これらのPCR産物をNspVおよび、MluIもしくはMunIのどちらかでそれぞれ消化した。次いでこれらをNspV(SfuI)、およびMluI(部分消化)もしくはMunIのどちらかでそれぞれ消化することによって連結用に調製したpONY4G中に連結した。
【０１４６】
実施例12  逆に配置された内部プロモーター-リポーターカセットを有するEIAVベクター
pONY4ZもしくはpONY4GなどのEIAVベクター中では内部CMVリポーターカセットは、5'LTRおよび内部プロモーターからの転写が同方向となるように向けられており、3'LTR中のポリアデニル化シグナルは双方のプロモーターからの転写物に用いられる。あるいは別の配置は内部プロモーター-リポーターカセットを逆転させることによるものであるが、ポリアデニル化シグナルをそのカセットの下流に置かなければならない。
【０１４７】
この「逆向き」ベクターの例は下記のとおり作製した。pONY4ZをPst Iで消化し、オーヴァーハングとなっている末端をT4DNAポリメラーゼでもとの形に整えた。次いでこのものを、CMV-GFP-SV40初期mRNAポリAシグナルカセットを含んでいる配列を含有しているpEGFP-C1から得たMlu IからAse Iまでの断片との連結に「ベクター」断片として用いた。連結前にこの断片をT4DNAポリメラーゼで平滑端化した。プラスミドをコードするベクターはpONY4Greverseと呼んだ。
【０１４８】
ベクター粒子を、pONY3.1およびpRV67、これらはそれぞれEIAVgag/polおよびVSV-Gタンパク質を発現するが、それらと共トランスフェクションすることによってpONY4Greverseから回収した。D17ネコ細胞でのpONY4Greverseからのタイターは、平行して回収したpONY4Gベクターからのものと比べて低く、1/13であった。
【０１４９】
pONY4Greverseのタイターが低かったのはおそらく、ゲノムの転写を促進するCMVプロモーターとGFPとがお互いの方向を向いて妨害しているのであろうが、挿入したCMV-GFP-ポリAカセット中に存在するSV40由来のポリアデニル化シグナルによるゲノムRNAの末端切断も要因であろう。pONY4Greverseのポリアデニル化シグナルをウシ成長ホルモンのポリアデニル(BGHpA)化シグナルと置換することによって改良型ベクターを作製した。この改良を行うためにpONY4GreverseをBstAPIで消化し末端をT4DNAポリメラーゼで平滑端とし、次いでPstIで切断した。この「ベクター」断片を、pcDNA3.1＋(Invitrogen)からSpuIで消化して調製したBGHpAを表しているDNA断片に連結し、次いでその末端をT4DNAポリメラーゼで平滑端とし、PstIで消化した。
【０１５０】
実施例13  ポリAシグナルを含有しているイントロンの構築と使用
ここに記載したpONYベクター中で用いたポリアデニル化シグナルはEIAVからのものである。このポリアデニル化シグナルはRおよびU5の境界の3'LTR中に認められる。このシグナルはコンセンサス配列ではないため最適なものではないかもしれない(コンセンサスアデニル酸化シグナルについてはWhitelawとProudfoot, 1986, EMBO 5:2915-2922およびLevittら, 1989, Gen. and Dev. 3:1019-1025を参照せよ)。
【０１５１】
ウイルスのポリアデニル化を改良する１つの方法は3'LTRのポリAシグナルをコンセンサス/強力シグナルと置換することである。そのような方法によってそのシグナルはプロデューサー細胞中で最適なものとなる。しかし、複製中に5'LTRがポリAシグナルのソースとなるので、形質導入するとこのシグナルは失われる(レトロウイルスのライフサイクルについての総説はRetroviruses, 1998, CSH press(J.Coffin編)を参照せよ)。この問題(形質導入に際して強力なポリアデニル化シグナルがない)を克服する新しい方法の１つは、ここに概略を述べるやり方によってポリAシグナルを含ませることである：その方法はスプリットポリAシグナルを用いることで、それはエッセンシャルg/uボックスのポリAシグナルからイントロンによってaataaaモチーフを分断したものである。そのようなシグナルは既にLiuらによって用いられ、aataaaとg/uボックス間の大きなギャップはポリAシグナルを活動不能とし、ポリアデニル化プロセスはスプライシングに先行することを示すために用いられている(1993, N.A.R. 21:5256-5263)。スプリットポリAシグナルをレトロウイルスベクター中に置くことによって、そのようなシグナルは標的細胞の形質導入まで機能しなくなる。このことはポリアデニル化がスプライシングに先行するためであり、上流のスプリットポリAシグナルはプロデューサー細胞内部でのベクターの発現の際には用いられないこととなる。図13に概略を示したものはスプリットポリAシグナルを含有しているレトロウイルスベクターがプロデューサー細胞および形質導入細胞の双方でどのように機能するのか図示したものである。第1にこの図は、上流にコンセンサスポリアデニル化シグナルが存在するとはいえ、一次ベクター転写物は依然として通常の3'LTRの位置でウイルスのもしくは所望によりその他のポリAシグナルのいずれかを用いてポリアデニル化されている。このことは上流のポリAシグナルが最終的なベクターゲノム中で機能を有しているとはいえ、このシグナルはイントロン除去の際のみに作られ従って一次RNA産物中には存在しないのでポリアデニル化の仕組みでは読み取られないためである。第2には、この図は形質導入に際してその結果得られたベクター転写物は第1のシグナルでポリアデニル化されることを示している；このものはaataaaとg/uボックスを隔てるイントロンを取り除いたことで正常で強力なポリアデニル化シグナルとなった。
【０１５２】
上記のようなスプリットポリAシグナルをレトロウイルスベクター中に含ませることには多数の利点があり、それらとしては：
(1)強力な非ウイルス系ポリアデニル化シグナルを形質導入細胞中に用いることでそのような細胞中での遺伝子の発現が増強される。
【０１５３】
(2)天然のLTR(図13参照)系シグナルの上流にそのようなポリAシグナルを用いることによって、形質導入すると、3'末端に含有されるウイルス配列のより少ない、短いRNA転写物が産生され、そのことによってその後のレトロウイルス逆転写を起こすことができなくなる。確かに、もし所望の遺伝子がLTRではなくCMVなどの内部プロモーターから発現されれば、形質導入細胞中に発現される転写物にウイルス配列を全く含まないようにデザインしうる(図3A参照)。
【０１５４】
(3)3'LTRの上流にそのようなシグナルを含ませることは、スプリットポリAシグナルの下流のRNAの発現がプロデューサー細胞での発現に制限されることを意味するが、それはそのようなRNAが形質導入細胞中では転写されないためである。したがって、このことは特定の配列の発現をプロデューサー細胞中のみに限定するものである(例えばIRESneo; 図14B参照)。
【０１５５】
(4)プロデューサー細胞中のイントロンの存在は核からのベクターRNAの核外移行を助ける。
【０１５６】
(5)形質導入されると現存している機能を有する内部のポリAシグナルがあるので、5'LTR中のウイルスのポリAシグナル(逆転写の際に3'の位置に向かってコピーされたもの)を所望により除去するか、欠失させることができる。このことはプロデューサー細胞内で5'LTRからのプロモーター近位のポリアデニル化のプロセスを防ぐために有用であり(ScottとImperiale, 1997, Mol.Cell Biol. 17:2127-35を参照せよ)、ウイルスの完全長転写物の産生が奨励される。
【０１５７】
実施例
レトロウイルス中のこのようなシグナルの使用を示すためにスプリットポリAシグナルカセットを図15に示すとおり、pCI(Promega)由来のイントロン配列を用いて構築する。このカセットを作った後それをpONY4 GFPベクター中のpONY4-GFPのユニークで両立しうる(compatible) sse8387部位にPstIを用いてクローン化する(図16参照)。形質導入を行うと、上記の結果得られたベクターは3'LTRの前にポリアデニル化し、その結果ウイルスのRNAの3'からlacZは転写されない(図16を参照)。
【０１５８】
実施例14 MLV/EIAVベクターの構築
EIAV LTR配列をMLVの同等のものと置換することによってpONYベクターは反復領域(R)中に機能を有するtarエレメントを有さなくなり、その結果、U3プロモーターはTatを必要とせずに形質導入細胞中で機能することとなる。
【０１５９】
図17に概略を示したものはこのようなベクターが図18に記載したプライマーを用いたオーバーラップPCRによってどのように作製されるかを示している。プライマーMe1およびMe2はMLVベクターpHIT111(Soneokaら, 1995, NAR 23:628-633)からのPCR産物を増幅するために用い、一方Me3およびMe4はpONY4lacZからの産物を増幅するために用いる。この結果得られる2種類の産物をプライマーを用いないPCR反応でオーバーラップさせて組合わせた(2種の産物間の相同性は図17に影を付けて示した)。最終完全長産物をBglIIおよびXbaIで切断し、pONY4lacZ(CMV/R/U5を含有)のBglII-XbaI断片と置換するために用いてpONY4-5'MLVを作製する。この結果得られるベクターはEIAV U5(インテグレーションの前にインテグラーゼがゲノムを認識するために必要な配列)と連結されたMLVからのCMV/R/U5配列を有する。その次のステップはpONY4 lacZ鋳型から得たMe5およびMe6をプライマーとして用いるPCR増幅、およびpLXSN鋳型から得たMe7およびMe8を用いたPCR増幅である(MillerとRosman, , Biotechniques 7:980-990)。これら2種のPCR産物をプライマーを用いないPCRでオーバーラップさせ(プライマー間の相同性は陰影を付けた箱形hatched boxで示している)、その結果得られた断片をNspVおよびMunIで切断し、pONY4-5'MLVのNspV/MunI部位に挿入して、3'EIAV LTRを、pONY4 lacZの3'UTR/ppt/U3インテグラーゼ結合部位に融合させた3'MLV LTRと置換する。この結果得られたプラスミドをpONY-MOUSEと名付け(完全なDNA配列は図19を参照せよ)、HIT系でpONY3.1およびpRV67と組み合わせた時、タイターは10４-５/mLである。
【０１６０】
実施例15 初期プロモーターでドライブされるレンチウイルスベクターゲノム
この実施例においては、EIAVゲノムはワクシニア初期プロモーターP7.5E(Davison, 1989a)から発現される。このプロモーターは正しい5'RNA末端を有するEIAVゲノムを産生するように加工されている。さらにワクシニア初期終止配列はEIAVゲノムの下流に挿入される。このものはトランスファープラスミドpSC65中に挿入され、それはMVAゲノムのTK領域中に相同組換えすることができる。組換えウイルスはそのBudRに対する感受性の欠如によって選択することができる(Earlら, 1998)。
【０１６１】
図11は実施例10に述べられているEIAVゲノムベクターpONY4.0およびpONY4.1ベクター、ならびにワクシニアトランスファーベクターpSC65(Chakrabartiら, 1997)を図示したものである。P7.5E配列はAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTである。初期プロモーターに対する初期終止配列はTTTTTNT(N＝どのヌクレオチドでもよい)(Fields)。
【０１６２】
DNAの操作は下記のとおりで、図20と図21はPCRプライマーの配列を示す。プライマーEMVA1/2でPCRを行うとU3領域がP7.5Eプロモーターによって置換された5'LTRが産生される。これをプラスミドpSP72(Promega)中にHindIII/PstI部位を用いて挿入してpEMVA1を産生する。EIAV U3はワクシニア初期終止(TTTTTAT)の基準に適合する配列を含んでいる。プライマーEMVA3/4およびEMVA5/6およびオーバーラップPCRを用いて、初期終止を防止するためにこの領域をTTTCCATに変異させる。このPCR産物をpEMVA1中にBglII/PstI部位を用いて挿入してpEMVA2を作製する。終止配列(TTTTTTTTT)を3'LTR R領域の下流にプライマーEMVA7/8を用いて挿入する。このPCR産物をpEMVA2中にMunI/BglII部位を用いて挿入してpEMVA3を作製する。このプラスミド中にEIAVベクターゲノムの残り(pONY4)をNarI/NspV部位を用いて挿入してpEMVA4を作製する(図22)。次いで、これをPacI/BglIIで切断し、PacI/BamHIで切断したpSC65中に挿入してpEPONY4を作製する(BglIIおよびBamHIは両立可能である)(図23)。このことによりpSC65から2つのワクシニアプロモーターおよびlacZコードカセットが除かれる。
【０１６３】
この構築物のpONY4.1と類似の最小限のEIAVゲノムのものを作製するために、pEMVA4をSalI/NspVで切断して平滑端とし、再連結してpEMVA5を作製する(図24)。このことによってlacZ遺伝子の末端とエンベロープ領域の末端の間のほとんどの配列が除かれ、その結果このベクターはTat、Rev、S2、およびEnvマイナスとなる。このことは実施例10に記載している。次いでこれをPacI/BglIIで切断し、PacI/BamHIで切断したpSC65中に挿入してpEPONY4.1を作製する(BglIIおよびBamHIは両立可能である)(図24)。このことによりpSC65から2つのワクシニアプロモーターおよびlacZコードカセットが除かれる。
【０１６４】
pEPONY4.0およびpEPONY4.1は共にゲノム発現カセットをMVAゲノムのTK領域(Carroll MWとMoss B., Virology 1997 Nov. 24:238(2):198-211)中にBHK TK-ve細胞系(ECACC 85011423)および組換えポックスウイルス構築のための標準的手法(Earlら, 1998a & 1998b)を用いて挿入するために適している。
【０１６５】
実施例16 レンチウイルスベクターゲノムをドライブする合成初期/後期プロモーター
ワクシニアの合成初期/後期プロモーターはRNA開始部位の下流にある配列について要求事項がある(Davison 1989b)。このプロモーターをレトロウイルスゲノムを作成するために用いるにはR領域が改変されていなければならないかもしくは正しい5'末端を作製するためのリボザイムを用いるかどちらかでなければならない。R領域の改変は開始部位が正確には同定できておらず配列によって異なるので(Davison 1989b)、問題が多い。下記はEIAVゲノムを合成初期/後期プロモーター(Psyn)から発現させるトランスファープラスミドの作製について述べている。このプロモーターの下流にはRNAの正しい5'末端の創製を確実に行うリボザイムを挿入する。
【０１６６】
DNAの操作は下記のとおりである：プライマーEMVA9/1を用いてPCRを行い、U3領域をPsynプロモーターおよびハンマーヘッドリボザイムで置換した5'LTRを産生する(図25および26)。これをPacI/NarI部位を用いてプラスミドpEMVA4(実施例15)中に挿入してpEMVA6を作製する(図27)。次いでこれをPacI/BglIで切断し、PacI/BamHIで切断したpSC65中に挿入してpSynPONY4を作製する(BglIIとBamHIは両立可能である)(図27)。このことによりpSC65から2つのワクシニアプロモーターおよびlacZコードカセットが除かれる。
【０１６７】
この構築物のpONY4.1と類似の最小限のEIAVゲノムのものを作製するために、pEMVA6をSalI/NspVで切断して平滑端とし、再連結してpEMVA7を作製する(図28)。次いでこれをPacI/BglIIで切断し、PacI/BamHIで切断したpSC65(ワクシニアトランスファーベクター)中に挿入してpSynPONY4.1を作製する(BglIIおよびBamHIは両立可能である)(図24)。このことによりpSC65から2つのワクシニアプロモーターおよびlacZコードカセットが除かれる。
【０１６８】
pSynPONY4.0およびpSynPONY4.1は共にゲノム発現カセットをMVAゲノムのTK領域(Carroll M.W.とMoss B., Virology 1997 Nov. 24:238(2):198-211)中に組換えポックスウイルス構築のための標準的手法(Earlら, 1998a & 1998b)を用いて挿入するために適している。
【０１６９】
実施例17 T7プロモーターでドライブされるレンチウイルスベクターゲノム
T7プロモーターは正しい5'末端を作製することのできるレトロウイルスゲノムを作るために用いることができる。下記はEIAVゲノムをT7プロモーター(T7)から発現するトランスファープラスミドの作製について述べている。このプロモーターの下流にはT7終止配列が挿入されている。これをトランスファープラスミドpSC65中に挿入し、それはMVAゲノムのTK領域中に相同組換えされる。T7プロモーターはT7ポリメラーゼを必要とする。ワクシニアプロモーターからT7ポリメラーゼを発現するMVAウイルスは入手可能である(Wyattら, 1995)。
【０１７０】
そのT7プロモーターは配列(−)TAATACGACTCACTATAGG(＋2)を有し、好ましくは一続きのGと共にあるAの後ろの転写開始部位を有している。T7終了配列は
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGである。T7プロモーターおよびターミネーター配列はプラスミドpCITE-4a(＋)(Novagen)に記載のものと同様である。
【０１７１】
DNAの操作は次のとおりである。プライマーEMVA10/11(図29)を用いたPCRでU3領域がT7プロモーターと置換された5'LTRを産生する。これをPacI/NarI部位を用いてプラスミドpEMVA4中に挿入してpEMVA8(図30)を作製する。プライマーEMVA11/7を用いてPCRを行いT7終止配列を有する3'LTRの一部を産生する。これをMunI/BglII部位を用いてpEMVA8中に挿入してpEMVA9を作製する。次いでこれをPacI/BglIIで切断し、PacI/BmHIで切断したpSC65(ワクシニアトランスファーベクター)中に挿入してpT7PONY4(BglIIおよびBamHIは両立可能である)を作製する(図30)。このことによりpSC65から2つのワクシニアプロモーターおよびlacZコードカセットが除かれる。
【０１７２】
この構築物(pONY4.1)の最小限のEIAVゲノムのものを作製するために、pEMVA9をSalI/NspVで切断して平滑端とし、再連結してpEMVA10を作製する(図31)。次いでこれをPacI/BglIIで切断し、PacI/BamHIで切断したpSC65(ワクシニアトランスファーベクター)中に挿入してpT7PONY4.1を作製する(BglIIおよびBamHIは両立可能である)(図31)。このことによりpSC65から2つのワクシニアプロモーターおよびlacZコードカセットが除かれる。
【０１７３】
pT7PONY4.0およびpT7PONY4.1は共にゲノム発現カセットをMVAゲノムのTK領域(Carroll M.W.とMoss B., Virology 1997)中に組換えポックスウイルス構築のための標準的手法(Earlら, 1998a & 1998b)を用いて挿入するために適している。
【０１７４】
実施例18  ワクシニア中での発現のためのEIAV gag/polカセットの構築
通常はEIAV gag/polは、Revがスプライスされない転写物が核外移行されることを可能とするのでRev/RREを発現に必要とする。ポックスウイルスは細胞質性であるので、EIAVウイルスRNAの核外移行は問題がないはずである。しかし、もしRevが他の機能例えばRNA安定化などを有しているか、もしくは翻訳のエンハンサーとして働くとするならば、EIAV gag/polと同様の方法で発現させることができる(Martarano 1994)。あるいはまた、EIAV gag/pol配列のコドンを最適化して核外移行のためのRev/RRE要求性を克服してRNA安定性を増大させることができる。下記はEIAV gag/polを合成初期/後期プロモーター(Psyn)から発現するベクターの創製について述べている。これをトランスファープラスミドpLW-22(WyattとMoss, Appendix 1, Earlら, 1998a & b)中に挿入し、そのものはMVAゲノムのDelII領域中に相同組換えすることができる。組換えウイルスはそのlacZ発現によって選択することができる。
【０１７５】
リーダーgag/polオープンリーディングフレームおよびRREを含んでいるEIAV gag/polは、pHORSE3.1(実施例9)をXhoI/NotIで切断して5.5kbのバンドとして得られる(図32)。次いでこれをSalI/NotI(SalIとXhoIは両立可能である)で切断したワクシニアトランスファーベクターpLW-22に挿入してpLWHORSE3.1を作製する(図32)。
【０１７６】
実施例19 ワクシニア中での発現のためのEIAV revカセットの構築
ポックスウイルスからのEIAVウイルスベクター産生のためにRevが必要である場合には、それを合成初期/後期プロモーターから発現させることができる。この構築物をトランスファープラスミドpMC03中に挿入し、それはMVAゲノムのDelIII領域中に相同組換しうる。組換えウイルスはそのGUS発現によって選択することができる(Carrollら, 1995)。
【０１７７】
DNAの操作は下記のとおり行う。プラスミドpCIRevについては実施例9で述べている。そのプラスミドはEIAV Rev発現プラスミドである。これをAflII/NotI(0.6kb)で切断し、T4DNAポリメラーゼで平滑端とし、PmeIで切断したpMC03(Carrollら, 1995)中に挿入してpMCRevを作製する(図33)。
【０１７８】
実施例20  ワクシニアでの発現のための異種エンベロープカセットの構築
EIAVはVSV-GおよびアンホトロピックMLVのエンベロープなどの多数のエンベロープを用いて偽型とすることができる。下記はアンホトロピックエンベロープもしくはVSV-GエンベロープをP7.5初期/後期プロモーターから発現するMVAトランスファーベクターの創製について述べている。このトランスファーベクターはMVAのHA領域中に相同組換えしうるpYF6である。組換えウイルスは直接生きた状態での免疫染色法によってenvの発現を調べて選択することができる。
【０１７９】
VSV-Gカセットを含有するトランスファーベクターを産生させるためにVSV-G発現プラスミドpRV67(Kimら, 1998)をSmaI/EcoRV(1.7kb)で切断し、その結果得られた断片をSmaIで切断したpYF6中に挿入してpYFVSVGを作製する(図34)。同様に、類似のアンホトロピックエンベロープ構築物を産生させるためにpHIT456(Soneoka 1995)をXbaIで切断し、T4DNAポリメラーゼで平滑端とした2.2kbのバンドをSmaIで切断したpYF6中に挿入してpYFAmphoを作製する(図35)。
【０１８０】
pYFAmphoおよびpYFVSVGは共にゲノム発現カセットをMVAゲノムのHA領域中に組換えポックスウイルス構築のための標準的手法(Earlら, 1998a & 1998b, Flexnerら, 1987)を用いて挿入するために適している。
【０１８１】
実施例21 MVA-レンチ組換え体の構築と増幅
EIAVベクターのコンポーネントをコードする複数のインサートを含有している組換えワクシニアウイルスを、関連のトランスファープラスミドで順次組換えすることによって構築する。v.MEeG-0r(図36)の構築を例として用いる。
【０１８２】
1. gag-polを有しているプラスミド(pLWHORSE3.1)を、MVAであらかじめ感染させたBHK-21もしくはCEF細胞中にトランスフェクトさせる(CarrollとMoss, 1997, Earlら, 1998a & bに記載されているように行う)。
【０１８３】
2. 感染2日後にBHK-21/CEF細胞の組換えMVAウイルスをアッセイし、pLW22内から発現させた発色マーカー基質のβガラクトシダーゼ(Chakarabartiら, 1985)を含有する寒天培地で細胞を重層(over-layed)する。
【０１８４】
3. 青色のプラークを採取しプラーク精製を均一な組換えウイルス集団が得られるまで行う。
【０１８５】
4. 次いで組換えウイルスを他の組換え遺伝子を含有するトランスファープラスミドと組換えるために用いる。それらのプラスミドとしては、GUS発現に基づいて選択されるpMCRev(CarrollとMoss, 1995)、BudRを用いるTK陰性表現型に基づいて選択されるゲノム(pEPONY4.0)、および組換え体がVSV Gの直接免疫染色法で同定されるVSVG(pYFVSVG)(Earlら, 1998a & b)がある。
【０１８６】
組換えウイルスはBHK-21細胞もしくはCEF細胞中で下記の方法で増幅することができる。
【０１８７】
ワクシニアウイルスの増殖
高度に弱毒化された株であるMVAは複製コンピテント株Ankaraから由来し、それは一次ニワトリ胚線維芽細胞中で570以上のパッセージを経てきたものである。MVAの複製は哺乳類細胞中では最小限の複製しか起こらないと報告されていたために、当初はCEF細胞中に限られていると考えられていた。しかしさらに分析がなされた結果、ベイビーハムスター腎臓細胞(BHK-21)がMVAの高タイターの産生を行うことができることが示された。このようにMVAはBHK-21細胞もしくは一次CEF細胞で増殖することができる(CarrollとMoss, 1997, Virology 238:198-211)。
【０１８８】
CEF細胞を調製するために、10日令のニワトリ胚の内臓を除去し、ミンス(mince)する前に足と頭部を除去し、0.25%トリプシン溶液でトリプシン処理し37℃でインキュベートする。細胞懸濁液を粗フィルターメッシュを通してろ過し、細胞を洗い、Sorvall RC-3B中で1500rpmで5分間遠心して濃縮する。細胞を10%FCS含有のMEM中に懸濁し、175cm２のフラスコに分取しCO２インキュベーター中でインキュベートする。単層が95%コンフルエントとなったときにトリプシン処理して別のフラスコもしくは6ウエルのプレートに撒くために用いる。あるいはまた、一次培養物を31℃のインキュベーター中に後の使用のために移す(SutterとMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847-10851)。
【０１８９】
粗製、半精製、精製ウイルスストックの調製
粗製ウイルスストックは最初の組換えウイルス分析用もしくは引き続く高タイターのウイルス調製品のためのウイルスストックとして調製される。ワクシニアウイルス調製品は細胞膜および核を遠心して除去して、または、先に発現されているタンパク質産物および細胞小器官による汚染を防ぐためにショ糖遠心などの追加ステップによって、半精製することができる。用いる方法は、Earlら, 1998a & b; EarlとMoss, 同上, pp.16.17.1-16.17-16; EarlとMoss, 同上, pp.16.18.1-16.18.10; およびBronteら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(7):3183-3188に記載の方法を改変したものである。
【０１９０】
粗製ウイルス
MVAはCEFもしくはBHK-21(ATCCから入手)のいずれかで増殖させ、WRはHeLaもしくはBS-C-1(ATCC)で175cm２組織培養フラスコ中で増殖させる。簡潔に記せば、コンフルエントの単層に約1pfuの感染効率（moi）のMVAもしくはWRで感染させる。ウイルスを2%FCS含有のMEM 10mLに懸濁しコンフルエント細胞単層を含有する175cm２フラスコに添加する。37℃で1時間インキュベートした後、さらに2%FCS含有MEMを20mL添加する。48-72時間後、感染細胞を培地中に掻き取り、1500g(又は2000g)で5分間遠心してペレットとする。粗製ウイルス調製品は細胞を175cm２のフラスコあたり2mLのMEM中に再懸濁して製する。細胞の凍結-融解を3回行い超音波処理し1mLの凍結用試験管に分取する。代表的なアリコートを凍結融解させてウイルス濃度を測定する。ウイルスストックは−20℃以下で保存する。
【０１９１】
半精製調製品
感染細胞を既に報告されているように集める(Earlら, a & b; EarlとMoss, 1991)。遠心後、細胞をPBS(2mL/175cm２フラスコ)中に再懸濁し、氷上でタイトフィッティングガラスダウンス（tight fitting glass dounce）ホモジナイザー中で30-40ストローク行ってホモジナイズする。細胞の破裂は顕微鏡的にチェックする。核、細胞小器官、および膜は300gで5分間(4℃)遠心して除去し、上清を残す。細胞ペレットを1mL/175cm２フラスコ中に再懸濁し、再度遠心する。上清をプールし、分けて保存する。
【０１９２】
精製調製品
感染細胞は既に報告されている方法(Earlら, a & b; EarlとMoss, 1991)で集め、10mM Tris.Cl, pH9.0(2mL/フラスコ)中に再懸濁し、これ以降の過程ではサンプルを氷上に保持する。前述のやり方で10mMのTrisを用いてホモジナイズする。溶解物をXL2015超音波カップ(Misonics, 米国)を用いて最大出力(500W)で1分間超音波処理(氷上で)する。サンプルを氷上に1分間おき、超音波処理を3回まで繰り返す。一度に最高5mLまで超音波処理し、氷は超音波処理中補充する。溶解物をSW-27遠心管中の36%ショ糖(10mM Tris.Cl, pH9.0)の17mLのクッション上に穏和に重層(layered)する。溶解物をSW-27ローターで13500rpm(32,900 x g)で4℃で80分間遠心する。上清を傾斜して棄て、ウイルスペレットを滅菌PBS中に再懸濁し、カップソニケーター中で1分間(氷上)超音波処理する。濃縮されたウイルスは分けて−20℃以下で保存する。
【０１９３】
実施例22 MVA-EIAV ハイブリッドからのEIAVベクター粒子の産生
上述の方法で、組換えMVA-EIAVの大規模調製品が作製される。これらの調製品をMVAの増殖を許さない哺乳類細胞に感染させるために用い、結果として得られる上清がEIAVのみを含有し感染性のMVAを含まないようにする(Meyerら, 1991, CarrollとMoss, 1997)。適する細胞系はMRC5(ATCC)である。細胞はMOI 3で感染させる。感染は上清を集める前の約48時間続け、EIAVベクター粒子を直接用いるかまたは超遠心もしくはクロスフロー法で濃縮/精製する。大規模調製品を産生させるために、懸濁液中で、もしくはマイクロキャリアー上で、もしくはローラーボトル中で増殖させる。これらの方法で調製された対象の遺伝子を運ぶEIAVベクターはin vivoもしくはin vitroで標的細胞を形質導入するために用いられる。
【０１９４】
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Soneoka Y, Cannon PM, Ramsdale EE, Griftiths JC, Romano G, Kingsman SM,Kingsman AJ 1995 Nucleic Acids Res 1995 23628-33.
A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors.
「高力価レトロウイルスベクターの作成のための3種類のプラスミドの一過性発現システム」
Sutter G, Moss B
Non replicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.「非複製ワクシニアベクターが効率的に組換え遺伝子を発現する」
Proc Natl Acad Sci US A 1992 Nov 15;89(22):10847-51
Taylor J, Weinberg R, Tartaglia J, Richardson C, Alkhatib G, Briedis D, Appel M, Norton E, Paoletti E
Nonreplicating viral vectors as potential vaccines: recombinant canarypox virus expressing measles virus fusion (F) and hemagglutinin (HA)
glycoproteins.
「可能性のあるウイルスベクターとしての非複製ウイルスベクター：麻疹ウイルスの融合(F)糖タンパク質および血球凝集素(HA)を発現する組換えカナリアポックスウイルス」
Virology 1992 Mar; 1 87(1):32 1-8
Paoletti E, Tartaglia J, Taylor J
Safe and effective poxvirus vectors--NYVAC and ALVAC.
「安全で効果的なポックスウイルスベクタ--NYVACおよびALVAC」
Dev Biol Stand 1994;82:65-9
Wyatt LS, Moss B, Rozenblatt S
Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.
「バクテリオファージ T7 RNAポリメラーゼをコードする、哺乳動物細胞における一過性の遺伝子発現のための複製欠損ワクシニアウイルス」
Virology 1995 Jun 20;210(1):202-5
Wyatt LS, Carroll MW, Czerny CP, Merchlinsky M, Sisler JR. Moss B
Marker rescue of the host range restriction defects of modified vaccinia virus Ankara.
「改変ワクシニアウイルス  アンカラの宿主領域制限欠損のマーカーでのレスキュー」
Virology 1998 251:334-42
Wyatt LS, Shors ST, Murphy BR, Moss B
Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenza virus 3 infection in an animal model. 「動物モデルにおける、パラインフルエンザウイルス3感染に対する複製欠損組換えワクシニアウイルスワクチン」
Vaccine 1996 Oct; 14(15): 1451-8
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、プラスミドpESP、pONY3およびpONY2.1nlsLacZ由来の転写ユニットの構造を示す。
【図２】  図２は、組み込まれたEIAVベクターのPCR分析を示す。PCRは、EIAVベクターを形質導入された細胞（レーン１および５）または擬似形質導入された細胞（レーン２および６）のいずれかのゲノムDNAについておこなった。対照としてpONY2.1nlsLacZ（レーン３および７）およびpONY3（レーン４および８）を用いた。A. EIAV LTRのPCRによる検出。B. polのPCRによる検出。
【図３】  図３は、EIAVベクターのパッケージングに必要なものを同定するために用いた欠失プラスミド中のベクター転写ユニットの構造を示す。
【図４】  図４は、pONY2.13LacZ中に存在するgag転写ユニットに由来するRNAの２次構造の予想を示す。
【図５】  図５は、EIAVゲノムに由来するベクターを表す。
【図６】  図６は、EIAVに由来するgagpol構築物を表す。
【図７】  図７は、S2欠失を有するEIAVベクターを表す。
【図８】  図８は、欠失したS2およびdUTPアーゼ遺伝子を有するEIAV gagpol構築物を表す。
【図９】  図９は、EIAV最小ベクターを表す。
【図１０】  図10は、本発明のEIAV gagpol構築物の分析を示すゲルである。
【図１１】  図11は、pONY4ベクターの例を示す。
【図１２】  図12は、２つのSINベクターを示す。
【図１３】  図13は、スプリットポリAシグナルを有するベクターを表す。
【図１４】  図14は、スプリットポリAシグナルを有するベクターを表す。
【図１５】  図15は、スプリットポリAシグナルを有するベクターを表す。
【図１６】  図16は、スプリットポリAシグナルを有するpONY4-GFPの構築を示す。
【図１７】  図17は、MLV/EIAVベクターの構築を示す。
【図１８】  図18は、MLV/EIAVベクター構築のためのプライマーを示す。
【図１９】  図19は、pONY-マウスの完全な配列を示す。
【図２０】  図20は、PCRプライミングを示す。
【図２１】  図21は、PCRプライミングを示す。
【図２２】  図22は、（プライマーEMVA1-8によるPCR後の）pEMVA4を示す。
【図２３】  図23は、pEMVA4を示す。
【図２４】  図24は、pEMVA5を示す。
【図２５】  図25は、5'末端形成のためのハンマーヘッド法の例を示す。
【図２６】  図26は、5'末端形成のためのハンマーヘッド法の例を示す。
【図２７】  図27は、pEMVA6を示す。
【図２８】  図28は、pEMVA7およびpSyn pONY4.1を示す。
【図２９】  図29は、EMVA10/11を示す。
【図３０】  図30は、pEMVA9を示す。
【図３１】  図31は、pEMVA10を示す。
【図３２】  図32は、pLWHORSE3.1を示す。
【図３３】  図33は、pMCRevを示す。
【図３４】  図34は、pYFVSVGを示す。
【図３５】  図35は、pYFAmphoを示す。
【図３６】  図36は、組換えMVA構築物を示す。
【図３７】  図37は、pSC65の完全な配列を示す。
【図３８】  図38は、pLW22の完全な配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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