(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分析体中に２種以上のターゲット配列が同時に存在することを判定するための試料の分析方法であって、前記ターゲット配列のぞれぞれは第一及び第二のオリゴヌクレチオチドプライマー配列に結合するものであり、下記工程
（ｉ）第一の複数の異なるオリゴヌクレチオチドプライマーであって、各々が共有結合でその５’末端が固体支持材表面に結合するに適したものを用意する工程、
（ii）溶液状態にある第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーであって、前記第一及び第二のオリゴヌクレチオチドプライマーのそれぞれの配列が互いに同一であるものを用意する工程、
（iii）複数の固体支持材表面であって、それぞれが独立して識別可能となるように分割されるものを用意する工程、
（iv）第一の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのそれぞれを、複数の固体支持材表面のそれぞれに識別可能な状態で共有結合させる工程、
（ｖ）前記結合した第一の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーを含む複数の固体支持材表面のすべてに対して、前記試料を用いて、前記第一及び第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーの存在下ポリメラーゼ連鎖増幅反応を実施して、前記の結合オリゴヌクレチオチドプライマーを結合ポリヌクレオチド鎖伸張生成物に変換する工程、
（vi）前記固体支持材表面に共有結合したポリヌクレチド鎖伸張生成物を非共有結合的に結合したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと分離する工程、及び
（vii）前記共有結合した鎖伸張生成物のそれぞれに対して、前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのいずれが前記鎖伸張生成物の部分への相補的配列であるかを同定する工程
を含み、単一の分析操作においてプライマーのすべての組み合わせによる増幅物を生成させ得る分析方法。
【請求項２】
前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのいずれが前記鎖伸張生成物の部分への相補的配列であるかを同定する前記工程が、標識化された複数のオリゴヌクレチオチドプライマーであって、それぞれの配列が前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのそれぞれの配列と同じであるプライマーをプローブとして用いて行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのいずれが前記鎖伸張生成物の部分への相補的配列であるかを同定する前記工程が、第三の複数の異なるオリゴヌクレチオチドプライマーであってそれぞれの配列が前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのそれぞれの配列と同じであるプライマーと標識化されたヌクレオチドモノマーとを用いたプライマー依存型相補鎖合成を利用し、共有結合したすべての鎖伸張生成物に対し多重プロービング工程により行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
別々の固体支持材に結合した前記鎖伸張生成物のそれぞれが、別々に処理されるものであって、前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのいずれが前記鎖伸張生成物の部分への相補的配列であるかを同定する前記工程が、標識化された複数のオリゴヌクレチオチドプライマーであって、それぞれの配列が前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのそれぞれの配列と同じであるプライマーをプローブとして用い、固体支持材に結合した鎖伸張生成物のそれぞれに対し平行多重プロービングにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
別々の固体支持材に結合した前記鎖伸張生成物のそれぞれが、別々に処理されるものであって、前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのいずれが前記鎖伸張生成物の部分への相補的配列であるかを同定する前記工程が、第三の複数の異なるオリゴヌクレチオチドプライマーであってそれぞれの配列が前記第二の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーのそれぞれの配列と同じであるプライマーと標識化されたヌクレオチドモノマーとを用いたプライマー依存型相補鎖合成を利用し、固体支持材に結合した鎖伸張生成物のそれぞれに対し平行多重プロービングにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
追加の固体支持材に結合したオリゴヌクレチオチドが、対照として前記第一の複数のオリゴヌクレチオチドプライマーと共に含まれる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
固体支持材に結合したオリゴヌクレチオチドプライマーが、分割された固体支持材表面に結合されており、それがマイクロアレイとして供給される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
固体支持材に結合したオリゴヌクレチオチドプライマーが、分割された固体支持材表面に結合されており、それが同定指標を備えた個々のビーズとして供給される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレチオチドプライマーが、ホスホジエステル類、ホスホロチオエート類及びメチルホスホン酸エステル類を含む群から選択されるヌクレチオチド間の結合を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸分析体が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡを含む群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法を実施するのに用いられる装置であって、
複数の別個の固体支持材表面であって、前記固体支持材表面のそれぞれは他の固体支持材表面と区別し独立して識別し得るように形成かつ配列されたもの、
第一の複数のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記プライマーの５’末端に前記固体支持材表面のそれぞれ一つが共有結合により結合したもの、
分析体、酵素及び試薬の溶液を前記固体支持材表面に接触して維持するための封じ込め手段、及び
前記表面の溶液中で漏出が起こらないようにポリメラーゼ・チェーン・リアクション増幅処理を行うための密閉手段を含み、
使用に際し、装置は単一の分析操作でプライマーのすべての組み合わせによる反応物を生成させ、前記封じ込め手段は前記第一の複数のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか一つが結合した支持材表面が、同じく第一の複数のオリゴヌクレオチドプライマーが結合した他の支持材表面から区別できるように形成かつ配列されている装置。
【請求項１２】
前記第一の複数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーが前記固体支持材表面に安定なリンカー部分を介して結合している請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記固体支持材表面が、より大きな表面領域としての固体支持材表面に設けた分離区域によって構成される請求項１１に記載の装置。
【請求項１４】
前記固体支持材表面が、それぞれ同定指標を備えたビーズからなる固体支持材の表面によって構成される請求項１１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質分析用の方法および装置に関する。本発明は、特にポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡを分析するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ・チェーン・リアクションは生化学研究の分野ではよく知られており、広く生物学的試料の単離および分析に使用され、多数の刊行物(例えば、C.R. Newton and A. Graham,"PCR", published by Bios scientific publishers, Oxford 1997（非特許文献１））に記載されている技術である。
【０００３】
一般に、ポリメラーゼ・チェーン・リアクションは、２種以上のオリゴヌクレオチドを使用し、これをプライマー依存型ＤＮＡポリメラーゼ酵素に対してプライマーとして機能させ、この酵素を利用して検体中に存在する２本鎖ＤＮＡ分子のコピーを多数生産する。標的ＤＮＡの特定の領域と一致する適当なプライマーを選択すれば、反応混合物に対して所定の温度プロフィールサイクル（これは、２本鎖ＤＮＡの変性工程、変性されたテンプレートＤＮＡにオリゴヌクレオチドプライマーをアニールする工程および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用するプライマー伸張工程を含む。）を繰り返すことによって、これらの領域を選択的に増幅できる。
【０００４】
オリゴヌクレオチドを固体支持材上に固定してＰＣＲ用プライマーとして使用する方法が、多数の文献に記載されている。例えば、米国特許第５，６５６，４６２号明細書（特許文献１）は、ＰＣＲマイクロプレート上に固定されたポリヌクレオチドを合成する方法を記載しており、また、国際公開公報第９９／３２６５４号パンフレット（特許文献２）は、オリゴヌクレオチドを固定したＰＣＲマイクロプレート上でＲＴ−ＰＣＲを実行する方法について記載している。これらの特許文献は、いずれも、多数の分析試料の並行処理を可能とするために、マイクロプレートのすべてのウェルの表面に同一のオリゴヌクレオチドを固定している。
【０００５】
米国特許５，７７０，３５８号明細書（特許文献３）は、固形支持ビーズに結合させたオリゴヌクレオチド「タグ」をＰＣＲを使用して増幅するもので、これによりそうしたビーズを異なる集合ごとに区別する。
米国特許第５，９１６，７７６号明細書（特許文献４）は、標的核酸の増幅方法について記載したもので、この方法では、ファーストストランドのコピーを固体支持材上の第１の位置に捕捉し、これを第２の位置に移動させてファーストストランドのコピーを再生する。磁気粒子および微量液体デバイス(microfluidic device)を用いてこの方法を実行する手順も示されている。米国特許第５，９３９，２９１号（特許文献５）には同一の出願人による別の微量液体デバイスも記載されている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，６５６，４６２号明細書
【特許文献２】国際公開公報第９９／３２６５４号パンフレット
【特許文献３】米国特許５，７７０，３５８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９１６，７７６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９３９，２９１号明細書
【非特許文献１】C.R. Newton and A. Graham,"PCR", Bios scientific publishers社刊, Oxford 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、固体支持材上に固定された多数のオリゴヌクレオチドプライマーの使用をするコンビナトリアル法によるＤＮＡ分子の分析方法及び装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料ＤＮＡに含まれている配列情報について予め何らかの知識を必要とせずに、１回の実験から多数のデータを得るＤＮＡ試料の分析方法および装置を提供するものであり、用いる成分や物質は標準的なものでよく、かつ大量生産ができるという利点を有する。
【０００９】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドプライマーの鎖伸張によって遺伝物質からヌクレオチド配列情報を転写または増幅する方法において、前記方法の実行中に以下の点：
（ｉ）少なくとも２個のオリゴヌクレオチドが溶液中に存在すること、および
（ｉｉ）少なくとも２個の別のオリゴヌクレオチドが固体支持材に付着していること、および
（ｉｉｉ）固体支持材に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチド配列は、溶液中の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に部分的もしくは完全に同一であるか、または相補的であることを特徴とする方法が提供される。
【００１０】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドプライマーの鎖伸張によってポリヌクレオチドから配列情報を転写または増幅する方法において、前記方法の実行中に以下の点：
（ｉ）少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマーが溶液中に存在すること；
（ｉｉ）少なくとも１種の別のオリゴヌクレオチドプライマーが固体支持材に付着していること；および
（ｉｉｉ）固体支持材に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチド配列は、１個のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部に部分的もしくは完全に同一であるか、または相補的であることを特徴とする方法が提供される。
【００１１】
本発明はさらに、複数の固体支持材表面、前記固体支持材表面のそれぞれに１個ずつのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが担持されるように前記表面に付着している複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、前記固体支持材表面のそれぞれを他の固体支持材表面と区別する識別手段、前記固体支持材表面が検体、酵素または試薬の溶液と接触し得るようにする封じ込め手段、撹拌、加熱または冷却しても漏出が起こらないようにするための密閉手段を含む複数検体分析用装置を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、複数の領域に分離された単一の固体支持材表面、前記領域のそれぞれに１個ずつのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが担持されるように前記領域に付着している複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、前記領域のそれぞれを他の領域と区別する識別手段、前記固体支持材表面が検体、酵素または試薬の溶液と接触するようにするための封じ込め手段、撹拌、加熱または冷却しても漏出が起こらないようにするための密閉手段を含む複数検体分析用装置を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、上記のように規定される装置であって、さらに、個々の固体支持材表面が特定の検体、酵素または試薬の溶液と接触するが他の固体支持材表面とは接触せず、各固体支持材表面には異なる検体、酵素または試薬が接触するような封じ込め手段を含む装置を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、上記のように規定される装置であって、さらに、個々の固体支持材表面または前記表面の各領域が複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合わせを担持し、各固体支持材表面は異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合わせを担持し、前記組合わせが、装置の前記表面または領域の全部に対してはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの全体が付着するようなサブセットを含む装置を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、上記のように規定される複数の領域に分離された単一の固体支持材表面を含む装置であって、さらに前記領域のそれぞれを他の領域から物理的に分離する手段をさらに含み、これにより支持材表面全体を個別領域に物理的に分離する装置を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、
（ｉ）複数の支持材表面を用意し
（ｉｉ）各オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合するとともに支持材表面に共有結合する安定なリンカーを介して、１または複数のオリゴヌクレオチドを前記表面のそれぞれに共有結合させ、前記表面が各々異なるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組合わせを担持するようにし、
（ｉｉｉ）前記支持材表面の各々を、酵素の基質及び補因子を伴った酵素（単数または複数）の存在下に１または複数の追加的なオリゴヌクレオチドおよび核酸または核酸の混合物に接触させ、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドに移し、
（ｉｖ）必要に応じ前記固体支持材上の１または複数のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｖ）必要に応じ、前記固体支持材に結合した１または複数のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドにさらに移し、
（ｖｉ）必要に応じ（ｉｖ）〜（ｖ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、支持材表面の個々のオリゴヌクレオチドを、核酸または核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドへと転換する工程を含む、複数の固体支持材表面に付着した複数のポリヌクレオチドの製造方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、
（ｉ）支持材表面を用意し
（ｉｉ）前記表面を個別の領域に分離し、
（ｉｉｉ）各オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合するとともに支持材表面に共有結合する安定なリンカーを介して、複数のオリゴヌクレオチドを前記領域に共有結合させ、前記領域が各々異なるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組合わせを担持するようにし、
（ｉｖ）前記支持材表面を、酵素の基質及び補因子を伴った酵素（単数または複数）の存在下に１または複数の追加的なオリゴヌクレオチドおよび核酸または核酸の混合物に接触させ、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドに移し、
（ｖ）必要に応じ、前記固体支持材に結合した１または複数のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｖｉ）必要に応じ、前記固体支持材に結合した１または複数のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドにさらに移し、
（ｖｉｉ）必要に応じ（ｖ）〜（ｖｉ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、支持材表面の個々のオリゴヌクレオチドを、核酸または核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドへと転換する工程を含む、複数の固体支持材表面に付着した複数のポリヌクレオチドの製造方法を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、
（ｉ）核酸または核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドを多数担持する１または複数の支持材表面を製造するための上に規定した方法を適用し、
（ｉｉ）前記支持材表面の少なくとも１つを、支持材表面（単数または複数）のポリヌクレオチドにハイブリダイズできる１または複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブに接触させ、
（ｉｉｉ）支持材表面（単数または複数）を洗浄してハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブを除去し、
（ｉｖ）支持材表面（単数または複数）の各ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブの量を測定し、
（ｖ）必要に応じ、支持材表面（単数または複数）を、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブを除去するのに十分な条件下に洗浄してから、（ｉｉ）〜（ｉｖ）の工程を１回以上、各回ごとに異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブ（単数または複数）を使用する工程を含む、核酸または核酸混合物の分析方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、
（ｉ）核酸または核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドを多数担持する１または複数の支持材表面を製造するための上に規定した方法を適用し、
（ｉｉ）前記支持材表面の少なくとも１つを、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに、１または複数のオリゴヌクレオチドプローブに接触させて、支持材表面（単数または複数）のポリヌクレオチドに相補的な１または複数のポリヌクレオチドを生産し、
（ｉｉｉ）必要に応じ、前記支持材表面（単数または複数）、オリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｉｖ）必要に応じ、前記支持材表面（単数または複数）、オリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、支持材表面（単数または複数）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをさらに生産し、
（ｖ）必要に応じ（ｉｉｉ）〜（ｉｖ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、プライマーオリゴヌクレオチド（単数または複数）を、支持材表面（単数または複数）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドへと転換し、
（ｖｉ）前記相補的ポリヌクレオチドを支持材表面（単数または複数）のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、
（ｖｉｉ）支持材表面（単数または複数）を洗浄してハイブリダイズしていないポリヌクレオチドを除去し、
（ｖｉｉｉ）支持材表面（単数または複数）の各ポリヌクレオチドにハイブリダイズした相補的ポリヌクレオチドの量を測定し、
（ｉｘ）必要に応じ、支持材表面（単数または複数）を、ハイブリダイズした相補的ポリヌクレオチドを除去するのに十分な条件下に洗浄してから、（ｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）の工程を１回以上、各回ごとに異なるオリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）を使用して繰り返す工程を含む、核酸または核酸混合物の分析方法を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、
（ｉ）それぞれ一意的な識別手段を備えた多数の支持材表面を用意し、
（ｉｉ）ｎ個のオリゴヌクレオチドからなるセット（ここで、ｎは１より大きな整数である。）を前記支持材表面のうちの１つに、各オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合するとともに支持材表面に共有結合する安定なリンカーを介して、各個別のオリゴヌクレオチドが個別の支持材表面に付着するように共有結合させ、
（ｉｉｉ）前記支持材表面の全部を、ｎ個すべてのオリゴヌクレオチド、分析しようとする核酸または核酸混合物の溶液に、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに接触させて、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面に結合したオリゴヌクレオチドに移し、
（ｉｖ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｖ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドにさらに移し、
（ｖｉ）必要に応じ（ｉｖ）〜（ｖ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、支持材に結合した個々のオリゴヌクレオチドを、核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドに変換することによって支持材に結合したｎセットのポリヌクレオチドを生産し、
（ｖｉｉ）前記支持材表面を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、前記支持材に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを除去し、
（ｖｉｉｉ）前記ｎ個の支持材表面の１または複数を、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに、前記ｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つを含む溶液に接触させて、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを生産し、
（ｉｘ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｘ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをさらに生産し、
（ｘｉ）必要に応じ（ｉｘ）〜（ｘ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、プライマーオリゴヌクレオチドを、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに変換し、
（ｘｉｉ）前記相補的ポリヌクレオチドを、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズし、
（ｘｉｉｉ）前記支持材表面を非変性条件下に洗浄して、ハイブリダイズしていないポリヌクレオチドを除去し、
（ｘｉｖ）前記支持材表面の各々を他の支持材表面から分離し、
（ｘｖ）前記支持材表面を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを溶液中に放出し、
（ｘｖｉ）各支持材表面から溶液中に放出された、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを分析し、および
（ｘｖｉｉ）必要に応じ（ｖｉｉｉ）〜（ｘｖｉ）の工程を１回以上、各回ごとに、前記ｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーからなるセットの異なるメンバーを使用して繰り返す工程を含む、核酸または核酸混合物の分析方法を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、
（ｉ）それぞれ一意的な識別手段を備えた多数の支持材表面を用意し、
（ｉｉ）ｎ個のオリゴヌクレオチドからなるセット（ここで、ｎは１より大きな整数である。）を前記支持材表面のうちの１つに、各オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合するとともに支持材表面に共有結合する安定なリンカーを介して、各個別のオリゴヌクレオチドが個別の支持材表面に付着するように共有結合させ、
（ｉｉｉ）前記支持材表面を、前記ｎ個すべてのオリゴヌクレオチドおよび分析しようとする核酸または核酸の混合物を含む溶液に、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに接触させて、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面に結合したオリゴヌクレオチドに移し、
（ｉｖ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｖ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドにさらに移し、
（ｖｉ）必要に応じ（ｉｖ）〜（ｖ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、支持材に結合した個々のオリゴヌクレオチドを、核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドに変換することによって支持材に結合したｎセットのポリヌクレオチドを生産し、
（ｖｉｉ）前記支持材表面を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、前記支持材に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを除去し、
（ｖｉｉｉ）前記ｎ個の支持材表面のそれぞれを個別に、酵素（単数または複数）の存在下、酵素基質及び補因子とともに、前記ｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つを含む溶液に接触させて、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを生産し、前記ｎ個の支持材表面の各々がｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーからなるセットの一意なメンバーに接触するようにし、
（ｉｘ）必要に応じ、前記支持材表面のそれぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｘ）必要に応じ、前記支持材表面のそれぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをさらに生産し、
（ｘｉ）必要に応じ（ｉｘ）〜（ｘ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、プライマーオリゴヌクレオチドを、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに変換し、
（ｘｉｉ）前記相補的ポリヌクレオチドを、前記支持材表面に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズし、
（ｘｉｉｉ）前記支持材表面を非変性条件下に洗浄して、ハイブリダイズしていないポリヌクレオチドを除去し、
（ｘｉｖ）前記支持材表面を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを溶液中に放出し、
（ｘｖ）各支持材表面から溶液中に放出された、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを分析し、および
（ｘｖｉ）必要に応じ、各回ごとに前記ｎ個の支持材表面のそれぞれに対しｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーからなる前記セットの異なるメンバーを使用して、（ｖｉｉｉ）〜（ｘｖ）の工程を１回以上、繰り返す工程を含む核酸または核酸混合物の分析方法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、
（ｉ）支持材表面を用意し
（ｉｉ）前記表面をｎ個（ここで、ｎは１より大きな整数である。）の個別の領域に分離し、
（ｉｉｉ）前記領域の各々に一意的な識別手段を付与し、
（ｉｖ）ｎ個のオリゴヌクレオチドからなるセットの各々を前記領域のうちの１つに、各オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合するとともに支持材表面に共有結合する安定なリンカーを介して、各個別のオリゴヌクレオチドが支持材表面の個別の領域に付着するように共有結合させ、
（ｖ）前記支持材表面を、ｎ個すべてのオリゴヌクレオチドおよび分析しようとする核酸または核酸の混合物を含む溶液に、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに接触させて、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面に付着させたオリゴヌクレオチドに移し、
（ｖｉ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｖｉｉ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドにさらに移し、
（ｖｉｉｉ）必要に応じ（ｖｉ）〜（ｖｉｉ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、支持材に結合した個々のオリゴヌクレオチドを、核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドに変換することによって支持材に結合したｎセットのポリヌクレオチドを生産し、
（ｉｘ）前記支持材領域を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、前記支持材に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを除去し、
（ｘ）前記ｎ個の支持材領域の１または複数を、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに、前記ｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つを含む溶液に接触させて、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを生産し、
（ｘｉ）必要に応じ、前記支持材領域、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｘｉｉ）必要に応じ、前記支持材領域、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをさらに生産し、
（ｘｉｉｉ）必要に応じ（ｘｉ）〜（ｘｉｉ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、プライマーオリゴヌクレオチドを、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに変換し、
（ｘｉｖ）前記相補的ポリヌクレオチドを、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズし、
（ｘｖ）前記支持材領域を非変性条件下に洗浄して、ハイブリダイズしていないポリヌクレオチドを除去し、
（ｘｖｉ）前記支持材領域の各々を他の支持材領域から分離し、
（ｘｖｉｉ）前記支持材領域を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを溶液中に放出し、
（ｘｖｉｉｉ）各支持材領域から溶液中に放出された、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを分析し、および
（ｘｉｘ）必要に応じ、各回ごとにｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーからなるセットから選択される異なるオリゴヌクレオチドプライマーの溶液を使用して、（ｘ）〜（ｘｖｉｉｉ）の工程を１回以上、繰り返す工程を含む核酸または核酸混合物の分析方法を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、
（ｉ）支持材表面を用意し
（ｉｉ）前記表面をｎ個（ここで、ｎは１より大きな整数である。）の個別の領域に分離し、
（ｉｉｉ）前記領域の各々に一意的な識別手段を付与し、
（ｉｖ）ｎ個のオリゴヌクレオチドからなるセットの各々を前記領域のうちの１つに、各オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合するとともに支持材表面に共有結合する安定なリンカーを介して、各個別のオリゴヌクレオチドが支持材表面の個別の領域に付着するように共有結合させ、
（ｖ）前記支持材表面を、前記ｎ個すべてのオリゴヌクレオチドおよび分析しようとする核酸または核酸の混合物を含む溶液に、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに接触させて、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面に付着させたオリゴヌクレオチドに移し、
（ｖｉ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｖｉｉ）必要に応じ、前記支持材表面、オリゴヌクレオチドと核酸との混合物、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、遺伝子配列データを核酸または核酸の混合物から支持材表面のオリゴヌクレオチドにさらに移し、
（ｖｉｉｉ）必要に応じ（ｖｉ）〜（ｖｉｉ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、支持材に結合した個々のオリゴヌクレオチドを、核酸の混合物に由来する遺伝子配列データを含むポリヌクレオチドに変換することによって支持材に結合したｎセットのポリヌクレオチドを生産し、
（ｉｘ）前記支持材表面を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、前記支持材に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを除去し、
（ｘ）前記支持材表面を物理的に分割して、それぞれが、支持材に結合したｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーの１つの伸長に由来する、支持材領域に結合したポリヌクレオチドのセットを担持する個々に識別されるｎ個の支持材領域を形成し、
（ｘｉ）前記ｎ個の支持材領域の各々を、酵素（単数または複数）の存在下、基質及び補因子とともに、前記ｎ個の支持材領域のそれぞれがｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーのセットの一意的なメンバーに接触するように前記ｎ個のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つを含む溶液に個別に接触させて、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを生産し、
（ｘｉｉ）必要に応じ、前記支持材領域のすべて、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を加熱するかｐＨを変えて二重鎖分子を解離させ、
（ｘｉｉｉ）必要に応じ、前記支持材領域のすべて、オリゴヌクレオチドプライマー、酵素（単数または複数）、基質及び補因子を冷却するかｐＨを変え、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをさらに生産し、
（ｘｉｖ）必要に応じ（ｘｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）の工程を１回以上循環的に繰り返し、プライマーオリゴヌクレオチドを、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに変換し、
（ｘｖ）前記相補的ポリヌクレオチドを、前記支持材領域に結合したポリヌクレオチドにハイブリダイズし、
（ｘｖｉ）前記支持材領域を非変性条件下に洗浄して、ハイブリダイズしていないポリヌクレオチドを除去し、
（ｘｖｉｉ）前記支持材領域を変性条件下に洗浄して二重鎖分子を変性させ、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを溶液中に放出し、
（ｘｖｉｉｉ）各支持材領域から溶液中に放出された、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを分析し、および
（ｘｉｘ）必要に応じ、各回ごとに、前記ｎ個の支持材領域の各々について、ｎ個のオリゴヌクレオチドプライマーからなる前記セットの異なるメンバーを使用して、（ｘｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）の工程を１回以上、繰り返す工程を含む核酸または核酸混合物の分析方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、
（ｉ）核酸の第１の混合物に由来する遺伝子配列データを含む固定されたポリヌクレオチドの第１のセットを、前記固定されたポリヌクレオチドの第１のセットに相補的なポリヌクレオチドの第１のセットとともに、担持する支持材表面または領域のセットを生じるべく、上に規定した方法を適用し、
（ｉｉ）核酸の第２の混合物に由来する遺伝子配列データを含む固定されたポリヌクレオチドの第２のセットを、前記固定されたポリヌクレオチドの第２のセットに相補的なポリヌクレオチドの第２のセットとともに、担持する支持材表面または領域のセットを生じるべく、上に規定した方法を適用し、
（ｉｉｉ）固定されたポリヌクレオチドの前記第１のセットに前記第１の相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、
（ｉｖ）固定されたポリヌクレオチドの前記第１のセットにハイブリダイズされた相補的ポリヌクレオチドを個別に放出させて分析し、
（ｖ）固定されたポリヌクレオチドの前記第２のセットに前記第２の相補的ポリヌクレオチドをハイブリダイズし、
（ｖｉ）固定されたポリヌクレオチドの前記第２のセットのそれぞれにハイブリダイズされた相補的ポリヌクレオチドを個別に放出させて分析し、
（ｖｉｉ）必要に応じ、相補的ポリヌクレオチドの前記第１のセットの１以上のメンバーを固定されたポリヌクレオチドの前記第２のセットの１以上のメンバーにハイブリダイズさせ、固定されたポリヌクレオチドの前記第２のセットのそれぞれにハイブリダイズされた相補的ポリヌクレオチドを個別に放出させて分析し、
（ｖｉｉｉ）必要に応じ、相補的ポリヌクレオチドの前記第２のセットの１以上のメンバーを固定されたポリヌクレオチドの前記第１のセットの１以上のメンバーにハイブリダイズさせ、固定されたポリヌクレオチドの前記第１のセットのそれぞれにハイブリダイズされた相補的ポリヌクレオチドを個別に放出させて分析し、
（ｉｘ）別の核酸混合物について工程（ｉｉ）および（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を随意に繰り返すこと
を含む２種以上の核酸混合物の分析方法を提供する。
【００２５】
本発明は、上記に規定する方法であって、こうした方法の少なくとも１工程を終えた後に、複数の領域に分離された一つの支持材表面を個別の領域に物理的に分割し、これらの領域のそれぞれをその方法において後に続く工程で別々に処理する方法をさらに提供する。
【００２６】
本発明は、上記に規定する方法であって、５’−末端ヌクレオチドの炭水化物基の１つ以上の原子に共有結合させることにより、安定したリンカー部分を各オリゴヌクレオチドの５’−末端に共有結合させる方法をさらに提供する。
【００２７】
本発明は、上記に規定する方法であって、安定したリンカー部分が、５’−末端ヌクレオチドの複素環部分の１つ以上の原子への共有結合により各オリゴヌクレオチドの５’−末端に共有結合される方法をさらに提供する。本発明はさらに、上記に規定する方法であって、安定したリンカー部分が、支持材表面の１平方ミリメートル当たり１００〜５０００ピコモルの化学的な当量を有する共有結合的に結合された官能基を含む方法を提供する。
本発明は、上記に規定する方法であって、安定したリンカー部分が９５℃の水溶液中で熱的に安定している方法をさらに提供する。
【００２８】
本発明は、上記に規定する方法であって、安定したリンカー部分がｐＨ４とｐＨ１１の間の水溶液中で加水分解に対し安定している方法をさらに提供する。本発明はオリゴヌクレオチドが、上記に規定する方法であって、ホスホジエステル類、ホスホロチオエート類およびメチルホスホン酸エステル類から選択されるヌクレオチド間の結合を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明は、上記に規定する方法であって、１つ以上のオリゴヌクレオチドが、蛍光性分子、発光分子、ビオチン標識分子、放射性同位体で標識された分子および酵素標識体を含む群から選択される、標識された分子を含む方法をさらに提供する。
本発明は、上記に規定する方法であって、分析される核酸または核酸混合物が、１本鎖ＤＮＡ分子、２本鎖ＤＮＡ分子およびメッセンジャーＲＮＡ分子を含む群から選択される方法をさらに提供する。
【００３０】
本発明は、上記に規定する方法であって、酵素（単数または複数）が、ＤＮＡポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、熱安定性逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼを含む群から選択される方法をさらに提供する。
【００３１】
本発明は、上記に規定する方法であって、酵素基質および補因子が、ヌクレオシド三リン酸塩、蛍光性のヌクレオシド三リン酸塩、発光性のヌクレオシド三リン酸塩、ビオチン標識されたヌクレオシド三リン酸塩、アミノ−アリルヌクレオシド三リン酸塩、放射性同位体で標識されたヌクレオシド三リン酸塩、金属塩類、緩衝剤、キレート剤、カオトロピック剤およびヌクレアーゼ抑制剤を含む群から選択される方法をさらに提供する。
【００３２】
本発明は、上記に規定する装置であって、支持材表面、封じ込め手段および閉鎖手段が装置を形成するために組み立て可能な個別の部品を含む装置をさらに提供する。
本発明は、上記に規定する装置であって、固定されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの各セットが、同定、アラインメントまたは較正目的で使用される対照物質または指標を含む装置をさらに提供する。
【００３３】
本発明はさらに、上記に規定する装置および方法であって、コンピュータ制御の下、高処理能力のＤＮＡ試料分析を可能にする自動化された取り扱い器具を含む装置および方法を提供する。
【００３４】
本発明は、上記に規定する本発明の方法を実行するのに適合し装置を制御するためのソフトウェア・コード部分を含むコンピュータ・プログラムをさらに提供する。
【００３５】
本発明は、与えられた任意のオリゴヌクレオチドの組合わせが、１つ以上のポリヌクレオチドからなる検体中に存在するか否かに関する上記に規定する本発明の方法の結果を予測するためのソフトウェア・コード部分を含むコンピュータ・プログラムをさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、添付図面を参照して本発明の具体例を説明する。
【００３７】
本発明の装置の好ましい実施形態では、支持材表面は図１に例示するような無線周波数タグ（ＲＦタグ）の外部ガラス表面である。図面を参照すると、これは、フェライトコア３にアンテナ・コイル２を巻いたマイクロエレクトロニクスの無線周波数トランスポンダ回路１からなる。組立体全体はガラスエンベロープ４内に気密に封止されており、その外表面５は本発明においてオリゴヌクレオチドを固定するための支持材表面として役立つ。
【００３８】
本発明の装置の第２の好ましい実施形態では、支持材表面は、図２に例示するように複数の領域に分割したガラス・プレート表面である。図面を参照すると、ガラス・プレートの表面は、例えばガラス・ナイフまたはダイヤモンド筆を用いて表面にグリッドライン６を刻みつけて領域に分割するか、または例えばフッ化水素酸による化学処理によって、あるいはレーザー・アブレーションによりエッチングする。領域にはそれぞれを一意的に識別するマーク７が備わっている。
【００３９】
本発明の装置の第３の好ましい実施形態では、支持材表面は図３に例示するような複数の領域に分割されたシリコン・ウエハー表面である。図面を参照すると、シリコン・ウエハーの表面は、例えばレーザー・アブレーションにより表面にグリッドライン８を形成することによって領域に分割する。領域は、レーザー・アブレーションによって形成された二次元のバーコードの形態の一意的な識別マーク９を備えている。ウエハーをオリゴヌクレオチドの固定（不動化）のための固体支持材として使用する前に、標準的なマイクロエレクトロニクス製造方法を使用して、ウエハーの表面にシリコン酸化物層を形成する。
【００４０】
本発明を実行する好ましい方法を図４に模式的に示す。
この方法によれば、溶液中におけるオリゴヌクレオチドプライマーのセット１０を、同一のオリゴヌクレオチドプライマーのセット１１と共に使用し、これらは各々を個別支持材表面１２〜１９のセットのうちの１つに付着させる。固体支持材表面の各々は別個の要素（例えば上に説明した図１に例示されるようなＲＦタグ）でもよいし、または、例えば図２のガラス・プレートや図３のシリコン・ウエハーのようなより大きな表面の領域でもよい。本発明の実施に適した他のタイプの支持材表面は、一意的に識別可能なマーカー（例えば、蛍光性染料の定義された比率の組合わせまたは他の分子の特定の組合わせなど）で標識されたガラスまたはプラスチックのビーズを含む。これらのタイプの支持媒体は、コンビナトリアルケミストリーおよび生化学的分析での利用のために市販されている。
【００４１】
この実施形態における方法の第一工程では、固体支持材表面１２〜１９に付着したオリゴヌクレオチドプライマーのセット１１を、同一のオリゴヌクレオチドプライマーのセット１０、および分析しようとする２本鎖ＤＮＡ分子の試料２０、ポリメラーゼ酵素２１（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、Ａ−、Ｇ−、Ｃ−およびＴ−デオキシヌクレオシド三リン酸塩を含む標識していないデオキシヌクレオシド三リン酸塩の混合物２２、並びに塩化マグネシウムとバッファーの塩類の混合物２３を含む溶液に接触させ、固体支持材表面１２〜１９をすべて含むことが可能な封止できる容器に入れる。本発明の実施には種々様々な容器が適している。また、例えば、ＲＦタグを固体支持材として使用する場合は、微量遠心分離チューブを使用してもよい。あるいは、封止可能なマルチウェルプレートも適している。本発明の実施において一つの支持材表面を複数の領域に細分して用いる場合は、顕微鏡用スライドを染色するのに使用するような封止可能な容器も使用できる。このような支持材表面を物理的な分割した後、個別領域は、本発明の方法の後工程を行なうために微量遠心分離チューブに移してもよい。
【００４２】
コンビナトリアルケミストリー合成用に設計された装置も、本発明の方法を行なうのに使用できる。一つの支持材表面を複数の領域に物理的に細分した後は、例えば、ＲＦタグまたは支持材表面の個別領域とともに使用するために、多数の反応室を含む反応器が適している。生化学分析の分野における当業者には理解されるであろうが、ここで言及した以外の種々様々の容器も、本発明の技術思想内において本方法を実施するのに使用できる。
【００４３】
次いで、密封容器を、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を実行するのに適した加熱ブロックまたは加熱サイクラーに入れ、変性工程、アニーリング工程および伸張工程をそれぞれ含む多数回の増幅サイクルを施す。各増幅サイクルにおいて、分析試料中の２本鎖ＤＮＡ配列のセグメントはＰＣＲによって増幅され、増幅したそうした配列それぞれの部分を、１以上のオリゴヌクレオチドプライマー対に相補性を有する各配列内のセグメントの存在および位置によって決定される。
【００４４】
増幅サイクルを多数回経た後、溶液は分析試料中に含まれるＤＮＡセグメントの増幅されたコピーを含む。これは、溶液中に初めから存在したオリゴヌクレオチドプライマーのセット１０を構成するメンバーの伸張によって形成されたものである。さらに固体支持材に結合したオリゴヌクレオチドプライマーのセット１１も増幅プロセスに参加し、その結果、各支持材表面は、分析試料中に含まれているＤＮＡセグメントの共有結合的に結合された増幅コピーを担持する。
【００４５】
ＰＣＲプロセスの完了後、溶液を除去し、支持材表面を、非共有結合的に結合したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドをすべて除去するために変性条件下で洗浄する。この操作の後、固体支持材表面のセットは、試料ＤＮＡ  ２０の分子の増幅によって生じ、固体支持材に共有結合している一本鎖ポリヌクレオチドのセット２４を担持する。
【００４６】
この実施形態における方法の第二工程では、図５に模式的に示すように、固体支持材に共有結合に結合した一本鎖ポリヌクレオチドのセット２４について、プライマー依存型ポリメラーゼ反応を行なう。この場合、固体支持材を収容する封止可能な容器には単一のオリゴヌクレオチドプライマー２５を含む溶液を入れるが、このプライマーは、方法の第一工程で使用したオリゴヌクレオチドプライマーのセット１０から選択することできる。あるいは、第一工程と関係のないオリゴヌクレオチドプライマーを使用してもよい。このオリゴヌクレオチドは、固体支持材に結合された一本鎖ポリヌクレオチドのセット２４の各々に対し相補鎖を合成するためのプライマーとして機能する。溶液は、ポリメラーゼ酵素２６（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、また、塩化マグネシウムと緩衝塩類およびデオキシヌクレオシド三リン酸塩の混合物２７（Ａ−、Ｇ−、Ｃ−およびＴ−デオキシヌクレオシド三リン酸塩からなる）および標識された分子をさらに含む。
【００４７】
標識された分子は、プライマー依存型ポリメラーゼ反応において、各ポリヌクレオチド上に形成された相補鎖と一体化されるものとすることができる。例えば、プライマー依存型ポリメラーゼ反応において、標識のためビオチンまたはアミノアリル置換体を組込むためには、ビオチン−１６−ｄＵＴＰまたはアミノアリル−ｄＵＴＰなどのウリジン誘導体を相補鎖中のチミジン単位の代わりにポリメラーゼ反応混合物中に含有させる。あるいは、ＤＮＡ配列決定において一般に使用されるように、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に標識を付けてもよい。この場合、合成する際に、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡおよびＲＯＸなどとして一般に知られているもの(これはApplied Biosystemsから市販されている）などの蛍光性染料を、オリゴヌクレオチドプライマーに組み入れてもよい。
【００４８】
同様に、合成の際にビオチンホスホラミダイトを使用して５’−ビオチン標識をオリゴヌクレオチドに組み入れてもよい。適する場合には放射性標識を使用してもよい。標識をオリゴヌクレオチドに付着させる場合、ポリメラーゼによる後の反応を省略し、単なるハイブリダイゼーションに置き替えてもよい。この場合、標識されたオリゴヌクレオチドは、固体支持材に結合された一本鎖ポリヌクレオチドに含まれる相補的な配列を検知するためのプローブとして機能する。しかし、標識されたヌクレオチド三リン酸塩の存在下にポリメラーゼ反応を実行することにより、第２ストランドに多数の標識を組み込んでより大きな感度を得ることもできる。
【００４９】
あるいは、様々な標識をオリゴヌクレオチドプライマーおよびヌクレオチド三リン酸塩に組み入れ、第２ストランド合成の間に組み込まれる標識に対する５’−末端の比率の決定を行なうようにしてもよい。これは例えば、第２ストランドの鎖長および基礎組成物を評価するために使用できる。適当な検知手段が利用できる場合は、多数の蛍光性染料その他の標識をこの目的のために使用し、４種のヌクレオチド三リン酸塩の各々を異なる染料に含有させて各ヌクレオチドに結合した標識を個別に決定してもよい。適当な場合は、オリゴヌクレオチドの同じ組合わせを用いて多数の反応を行ない（但し、反応ごとに異なる標識ヌクレオチドを用いる）、ヌクレオチドに特異的な情報をさらに得ることもできる。
【００５０】
プライマー依存型ポリメラーゼ反応は、この実施形態の方法の第一工程についての前記説明で記載したように、溶液を加熱サイクルに服させることにより完了させることができる。しかし、この第２工程では、重合生成物は固体支持材表面上ではなく溶液中に形成され、固体支持材に結合された一本鎖ポリヌクレオチドのセット２４は、第２ストランド合成用のテンプレートとして機能する。生じる溶液は、固体支持材表面に結合したポリヌクレオチドに相補的な標識されたポリヌクレオチドを含む。次いで、これらをともにハイブリダイズさせて二本鎖ポリヌクレオチド（その一方のストランドは固体支持材表面に結合している）を形成する。洗浄して結合していない物質を除去した後、各支持材表面に付着した標識の量を、蛍光性分子または発光分子についての標準的な操作により、また、放射性標識の場合には放射分析またはオートラジオグラフィーを使用して測定する。適当な場合は、各領域に付着した標識された分子の定量前に、図２または図３に例示するような領域に分割した支持材表面を、初めに物理的に分割してもよい。次いで、標識された分子を溶離し、例えば、溶離液の分光分析、分光蛍光分析または放射分析を行なうことによって分割した複数の領域を個別に計測できる。溶離および定量の方法を図６に模式的に例示する。図中、個々の支援領域に付着した２本鎖ポリヌクレオチド  ２９は適当な緩衝溶液中で加熱され、支持材に結合した一本鎖ポリヌクレオチド３０と標識された相補鎖３１（これは溶液中に放出される）に解離する。固体支持材の除去後、溶液中の標識分子の濃度を分光分析、分光蛍光分析または適する場合には放射分析によって決定する。
【００５１】
ＤＮＡ配列分析技術を熟知している者には明らかなように、上に記載した本発明の方法は、本発明の思想から外れずに、様々なかたちで修正することができる。例えば、上記方法の第一工程に生産された、固体支持材に結合されたポリヌクレオチドのセットは、そのような支持された分子を用いる他の技術（例えば、ハイブリダイゼーションによって遺伝配列を検出するためのＤＮＡマイクロアレイの調製および利用など）に直接適用できる。同様に、試料分子からのＰＣＲによる遺伝子配列情報の増幅は、固体に支持されたプライマーを導入する前に予備的な程度の増幅を得るために溶液相プライマーだけを最初に使用して、２段階で行なうことができる。適する場合は、残留する試料ＤＮＡを除去するかまたは特定の増幅産物をさらなるＰＣＲサイクルによって固体支持材に結合されたポリヌクレオチドに選択的に組み入れるために、そのような初期の増幅の後に精製または濃縮工程を含めてもよい。同様に、標識付与のための制約を解消するために、例えば、ポリヌクレオチドを同定する質量分析や電気化学手法を用いるなど、他の検出戦略を採用してもよい。
【００５２】
複数の支持領域に分割された一つの支持材表面に対し本発明の方法を適用する態様を、図７（この図は、固体支持材領域に結合した一本鎖ＰＣＲ産物の生産をまとめたものである。）および図８（この図は、それに続く相補鎖合成、支持材の個別領域への分離および標識された相補鎖の溶離および定量に係る操作をまとめたものである。）に模式的に示す。
【００５３】
あるいは、適当な装置や手法が利用できる場合は、支持材表面を物理的に分割することなく表面の各領域を個別に定量してもよい。例えば、蛍光標識された分子を測定する場合は、レーザー・スキャナが使用できる。個々の支持材表面は、図２および図３の表面領域に付着もしくは刻まれた指標であれ図１に示すようにコード化されたＲＦタグであれ、識別手段を各表面から読むことにより識別される。
【００５４】
各固体支持材に結合されたポリヌクレオチドの５’末端の配列は、その支持材表面に当初適用されたオリゴヌクレオチドの配列からわかり、また、各固体支持材に結合されたポリヌクレオチドの３’配列は、方法の第２工程で溶液中に存在する単一のプライマーオリゴヌクレオチドに相補的であることがわかっているため、支持材表面からの結果をすべて用いれば、分析試料の配列情報を推定できる。例えば、プライマーオリゴヌクレオチドの配列は、検体中に微生物の感染症または他の疾病に関係している特定のポリヌクレオチドが存在するか否か、または遺伝子疾患が存在するか否かを示すように選択できる。
【００５５】
さらに詳しい配列情報を得るために、支持材に結合したポリヌクレオチドは同一のセットを用い溶液中では異なるプライマー・オリゴヌクレオチドを用いて方法の第２工程を繰り返してもよい。この操作は選択したプライマー・オリゴヌクレオチドセットの可能なあらゆる組合わせを検討するために反復して適用してもよい。図４に模式的に示す例では、８個のプライマー・オリゴヌクレオチドからなるセットを使用しているが、上記のように調べるとすると、プライマー・オリゴヌクレオチドの可能な組合わせは６４通りある。
【００５６】
この実施形態の方法の特に有利な点は、それが結果の立証をもたらす能力を有しているという点である。すなわち、二本鎖テンプレートＤＮＡを分析しようとする場合、可能なオリゴヌクレオチド対はいずれも２種の信号、一方は固体支持材結合されたプライマーＰ１と溶液相プライマーＰ２との組合わせ、および固体支持材結合されたプライマーＰ２と溶液相プライマーＰ１との組合わせによって表わされる相補鎖についての対応する信号を生じるはずである
【００５７】
ＤＮＡ分析およびコンビナトリアルケミストリー技術を熟知している者は、これらの例で示したよりもはるかに大きな数のプライマー・オリゴヌクレオチド・セットを用いて、数百または数千のプライマー・オリゴヌクレオチドの組合わせ結果を生成し得ることを理解するであろう。
【００５８】
図９に例示するように、本発明の装置の第４の好ましい実施形態は、１セット９６種類のプライマー・オリゴヌクレオチドを使用する、ＤＮＡ試料分析用の装置を含む。この実施形態では、支持材表面は、ウェル中に形成する。ここで、各ウェルの底部は平面であり多数のオリゴヌクレオチドを担持する。図面を参照すると、図９は、各ウェル３３がオリゴヌクレオチドアレイ３４を含む９６−ウェルプレート３２の平面図を示す。個々のアレイの詳細な平面図は、図１０に示され、ここで円形の底部３５は多数のサブ領域３６を有し、それぞれにオリゴヌクレオチドが付着している。各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’−末端に共有結合されるとともに支持材表面に共有結合された安定したリンカー部分によって表面に付着させられる。
【００５９】
安定したリンカー部分は、９５℃の水溶液において熱に安定で、かつ、ｐＨ  ４とｐＨ１１の間で加水分解に対して安定である必要があり、これにより、オリゴヌクレオチドの表面への結合がポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）などの技術を実施する際に通常用いられる条件に耐え得るようになる。リンカー部分は、スペーサー分子と一体になってオリゴヌクレオチドと支持材表面との間の共有結合の一部をなしてもよく、これによりオリゴヌクレオチドが関与する反応（例えば、オリゴヌクレオチドの酵素分子への結合）を阻害する立体効果を低減または解消する。
【００６０】
アレイの各位置に付着したオリゴヌクレオチドの同一性は製造時に確立されているので、各オリゴヌクレオチドを個別に識別する手段は必要なく、アレイ中でのオリゴヌクレオチドの位置がそれらを一意的に識別する役目を果たす。特に自動化されたシステムを使用して定量およびデータ収集を行なう場合、各アレイには追加的な位置を含め、対照物質や較正およびアラインメント用のインデックス・マーカーを置く場所としてもよい。図１０にこのような例を示すが、この例では、オリゴヌクレオチドの配置のために必要な９６個の領域に加えて、８個の追加的なサブ領域３５を含んでいる。
【００６１】
各ウェルの平底部へのオリゴヌクレオチドへの付着は、９６−ウェルプレート上に直接行なってもよいし、例えば、上記の米国特許第５，６５６，４６２号およびＷＯ９９／３２６５４に記載されているようなポリスチレンまたはポリプロピレン表面に適切なリンカー分子を付着させることにより行なうことができる。もっとも、製造を容易にするためには、支持材料を平たい薄片に切ったものにオリゴヌクレオチドを付着させ、次いで、これを各ウェルの底部に装入するのが好ましい。これにより、射出成形法で使用するのに適したプラスチック材料から９６ウェルプレート本体が大量生産可能となるが、他の材料をアレイのための支持材表面として用い、嵌め込み等による固定や融着または適当な接着剤を使用することによって位置を固定することもできる。平たい薄片として好ましい材料は、ガラスまたはシリコンウエハー上に形成したシリコン酸化物層であり、薄片は任意の適切な形であってもよく、例えば、円状、正方形、、長方形、六角形などの形である。
【００６２】
本発明の装置の第５の好ましい実施形態では、モジュール化された９６ウェルプレートの構築物が提供される。これは３つの主な部品を有する。すなわち、カバープレート、本体（両面が９６個の円筒状コンパートメントに分割されているもの）、および９６個のオリゴヌクレオチドアレイを担持するベースプレートである。これらの部品を組合わせて、図１１に示すようなスタックを形成する。ここで、カバープレート３７を本体部分３８の上に重ね、さらにこれをアレイを担持するベースプレート上に置く。スタック組立体の断面図を図１２に示すが、ここでは、カバープレート３７が本体部分３８に重ねられ、次いで、これがアレイ４０を担持するベースプレート３９上に置かれている。本体部品の円筒状の穴の上端及び下端にはＯリング封止材４５および４６を嵌め、カバープレートおよびベースプレートに対して液密な状態を形成する。
【００６３】
使用時には、図１３に示すように、ベースプレートおよび本体を金属ベース４１に嵌め、スプリングクリップ４２および４３によって適所に保持する。この段階では、各ウェルはその下端がベースプレートに対して封止され、分析実行に適した溶液を注入する。これに続いて、図１４に示すように、カバープレート３７をして、金属プレッシャープレート４４によってその場に保持する。これは、各ウェルの上端をカバープレートに対して封止する役目を果たす。図１５に示すように、例えばアレイ上でポリメラーゼ・チェーン・リアクションを実行するために熱サイクルが必要な場合は、組立体全体を、例えば、２枚の加熱した金属板４７と４８にはさんで圧縮する。ここで、上部の板はカバープレートの裏（下）側で凝縮が起こるのを防ぐためのものである。「ホットスタート」条件が要求される場合は、ウェル中の溶液をロードするに先立ち、金属ベース４１を熱した表面の上に置き、次いでカバープレート３７およびプレッシャープレート４４を嵌める。
【００６４】
組み立てられた装置の各ウェルの内部配置は、図１６に示すようであり、オリゴヌクレオチド配列４０を担持するベースプレート３９は金属ベース４１上に支持され、本体部品３８の円筒状の穴はＯリング封止材４６によってベースプレートに対し、およびＯリング封止材４５によってカバープレート３７（これはプレッシャープレート４４によって適所に保持される）に対して封止される。
【００６５】
これまでに記載したように、溶液相プライマーのみを使用した初期の増幅工程を行なった後、固体支持材に結合されたプライマーを導入する。これは単に、方法の第一工程の間に最初に装置を引っくり返しオリゴヌクレオチドアレイを担持するベースプレートをいちばん上にするだけである。この構成では、各ウェル中の溶液は、アレイ表面の固体支持材に結合したオリゴヌクレオチドには接触せず、ＰＣＲは溶液相プライマーのみを使用して進行する。最初の増幅工程の後、装置を、再び引っくり返して以後のＰＣＲ増幅サイクルでは固体支持材に結合したプライマーが参加できるようにする。金属ベース４１およびプレッシャープレート４４を構成するのに好ましい材料は、アルミニウムまたはステンレス鋼である。本体３８およびカバープレート３７を構成するのに好ましい材料は、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）またはポリスチレンである。ベースプレート３９を構成するのに好ましい材料はガラスである。Ｏリング封止材を構成するのに好ましい材料はフルオロカーボンゴムまたはＥＰＤＭである。
【００６６】
アレイ４０は、商用のロボット式配置システムを使用して、ベースプレート３９の表面に直接形成できる。あるいは、アレイは、ガラスまたは前に記載されるような表面を酸化したシリコン・ウエハーのプレート上に個別に形成してもよいし、融着によりまたは適当な接着剤を使用してベースプレート３９に固定してもよい。この場合、ベースプレートは、ポリプロピレンまたはポリスチレンなどのプラスチック材料から製造できる。アレイを担持するプレートは図１０に描くように円板状でもよいが、あるいは等しい形状であれば長方形、正方形、または六角形でもよい。アレイの形成のためにシリコン・ウエハーを使用する場合、正方形または長方形の形状が好ましい。これによりダイ状に切断したウエハー部分は標準的な微細製造および取り扱い装置を使用して容易に取り扱いを行なうことができる。
【００６７】
本発明の装置のこの実施形態は、９６個のオリゴヌクレオチドの可能なすべての組合わせを単一の分析で行なうことを可能にする。多数回の実験から得た結果を分析することによって、特に生成されたデータを解釈するのに適したコンピュータ・プログラムを使用して、試料ＤＮＡ分子の配列に関する情報を推定できる。９６−ウェルのレイアウトはさらに、３８４−ウェル、または１５３６−ウェルのフォーマットに拡張してもよく、これにより、さらに多数のプライマーの組合わせを生成できる。
【００６８】
本発明操作の特に有用な側面は、含まれている遺伝配列に関してほとんど知られていない場合であってもＤＮＡ分子集団を識別できる点である。これは、任意に選択されたオリゴヌクレオチドのセットからプライマーを選ぶことにより達成できる。但し、それらの（Ｇ＋Ｃ）含量が６０  〜７０％の間である必要があり、また、それらには自己相補的な端部があってはならない。これらの条件は、オリゴヌクレオチドがＰＣＲプロセスにおいて効率的に反応を開始することを保証するものである。オリゴヌクレオチドのこのようなランダムなセットは、ＰＣＲによる無作為増幅多型ＤＮＡ(RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA)製造技術において一般に使用されている。また、このようなオリゴヌクレオチドは市販されている。典型的な１０塩基プライマーセットの例を図１７に示す。この図に示すヌクレオチド配列は、例示の目的だけのためのものであり、実際の生体物質の配列を表わすものではない。
【００６９】
本発明方法の第２の好ましい実施形態では、前記方法を実施するに先立って個別の支持材表面を、２種以上のオリゴヌクレオチドを組合わせた混合物で機能化する。これにより、オリゴヌクレオチドのセットの１個以上のサブセットについて結果を得ることが可能になる。これは、例えば、後に行なう実験で精製する（前記の方法など、個別支持材に結合されたオリゴヌクレオチドの使用による。）場合の予備スクリーニング方法として、有用であろう。
【００７０】
本発明方法の第３の好ましい実施形態では、方法の第２工程で使用する溶液（この溶液中で相補鎖合成が実施される。）が、２種以上のオリゴヌクレオチドを組合わせた混合物を含む。それ以外の点はこれまでに記載したようにして行なう。これにより、オリゴヌクレオチドのセットの１個以上のサブセットについて結果を得ることが可能になる。これは、例えば、後に行なう実験で精製する（前記の方法など、個別支持材に結合されたオリゴヌクレオチドの使用による。）場合の予備スクリーニング方法として、有用であろう。
【００７１】
本発明方法の第４の好ましい実施形態では、２種以上のオリゴヌクレオチドを組合わせた混合物で、個別の支持材表面を機能化し、また、方法の第２工程で使用する溶液（この溶液中で相補鎖合成が実施される。）は２種以上のオリゴヌクレオチドを組合わせた混合物を含む。それ以外の点はこれまでに記載したようにして行なう。これにより、オリゴヌクレオチドのセットの１個以上のサブセットについて結果を得ることが可能になる。これは、例えば、後に行なう実験で精製する（前記の方法など、個別支持材に結合されたオリゴヌクレオチドの使用による。）場合の予備スクリーニング方法として、有用であろう。
【００７２】
本発明方法の第５の好ましい実施形態では、２種以上の異なるオリゴヌクレオチドの溶液を、方法の第２工程（この工程で相補鎖合成が実施される。）の間に、個々の固体支持材または固体支持材領域に個別に塗布する。それ以外の点はこれまでに記載したようにして行なう。これには、個別の固体支持材または固体支持材領域を個別に封じ込める手段が必要となる。個別の固体支持材が個別の実体（例えば図１に示すようなＲＦタグ）である場合、または前記のような個々の支持領域に物理的に分割された一つの支持材表面である場合、これは、前記のような方法の第２工程を実施するに先立ち、各支持実体を個別のチューブまたは他の容器に装入することにより実行できる。物理的に分割されていない領域へ細分された一つの支持材表面の場合には、これは、支持材表面上において適当なガスケットを用いることにより実施できる。これにより異なる溶液はそれぞれの領域に塗布され互いに汚染を引き起こすことがない。
【００７３】
本発明方法の第６の好ましい実施形態では、２種以上の異なるオリゴヌクレオチドの溶液を、方法の第１工程（この工程ではＰＣＲ増幅産物が固体支持材上に形成される。）の間に、個々の固体支持材または固体支持材領域に個別に塗布する。それ以外の点はこれまでに記載したようにして行なう。これには、個別の固体支持材または固体支持材領域を個別の封じ込める手段が必要となる。個別の固体支持材が個別の実体（例えば図１に示すようなＲＦタグ）である場合、これは、前記のような方法を実施するに先立ち、各支持実体を個別のチューブまたは他の容器に装入することにより実行できる。領域に細分された一つの支持材表面の場合には、これは、支持材表面上において適当なガスケットを塗布することにより実施できる。これにより異なる溶液はそれぞれの領域に塗布され互いに汚染を引き起こすことがない。
【００７４】
本発明方法の第７の好ましい実施形態では、１つの支持材表面から溶出した、標識された相補鎖溶液を別の支持材表面に塗布しそれとハイブリダイズさせる。この操作に続いて、支持材表面を洗浄して未結合物質を除去し、よりストリンジェントな条件下で洗浄することによりハイブリダイズされたポリヌクレオチドを溶出し、適当な方法によって定量する。このような溶出された相補鎖と表面のすべての組合わせについてこの操作を繰り返し、それにより得られたデータを様々な方法、例えば、検体のＤＮＡ試料についてのリンケージマップの構築に用いることができる。
【００７５】
生化学分析およびＤＮＡ技術を熟知している者には明白であろうが、オリゴヌクレオチドの多数の異なる組合わせは、与えられた任意の鎖長のオリゴヌクレオチドについて可能な全部から選ぶことができる。また、本発明の実施により分析するＤＮＡの所定の試料について各組合わせが異なる結果をもたらすものでもよい。したがって、それぞれの場合において異なるオリゴヌクレオチドの組合わせを使用して、試料の多数回の分析を実行することにより非常に大量のデータが生成されることもある。また、生化学分析技術に熟知している者には明白であろうが、所与の任意のオリゴヌクレオチドと、与えられた試料を構成するＤＮＡ分子配列の合致を見出す統計的確率は、オリゴヌクレオチド長さの関数であり、このパラメーターは、本発明の方法から有益な結果を得るために、必要に応じて変更できる。
【００７６】
本発明の手法の特に有利な特徴は、与えられたＤＮＡ分子集団において１を超えて存在する２個のサブ配列の特定の組合わせが統計的に得られない点である。これとは対照的に、与えられたＤＮＡ分子集団において単一のサブアレイが無作為に存在する確率は比較的高い。１０個のヌクレオチドからなるサブ配列を例にとると、このような配列について可能な配列の総数はおよそ１００万である。これは、例えばヒトゲノム（これは３０億塩基対を含む。）のサイズに比べれば比較的小さな数である
【００７７】
したがって、１０個のヌクレオチドからなる特定の配列をランダムはヒトゲノム内では比較的頻繁に生じると予想されるであろう。対照的に、２種の異なる１０−ヌクレオチド配列の可能な組合わせの数は、およそ５００×１００万×１００万×１００万である。この数は、ヒトゲノム中の塩基対の数よりはるかに大きい。また、ヒトゲノムを含むＤＮＡ分集団に２種の１０−ヌクレオチド配列の特定の組合わせが１を超えて存在する確率は、相応して減じる。
【００７８】
したがって、本発明の技術を使用すれば、試料中のＤＮＡ配列と偶然に合致する誤った結果を得る可能性の低い、特定の遺伝物質についての高度に特異的なＤＮＡベース検出操作を実施することができる。
【００７９】
２個の異なるＤＮＡ分子を識別する本発明方法の適用例を図１８に示す。このダイアグラムで与えられるヌクレオチド配列は、例示的な目的のみのものであり、実際の生体物質の配列を表わすものではない。
【００８０】
この図を参照すると、２種の二本鎖１００−塩基対ＤＮＡ配列である配列Ｘと配列Ｙ．を識別することが望まれる場合、これは適当な配列の１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して達成できる。図には８個の１５−塩基オリゴヌクレオチドプライマーＡ〜Ｈを示してある。この図の下部に示す８×８マトリックス（表）は、プライマーのこのセットを使用する本発明の方法を２種のＤＮＡ試料分子ＸおよびＹに適用して得られる結果を表わす。各表において、各垂直欄は、方法の第一工程で固体支持材に付着したオリゴヌクレオドを表わし、ここでは、試料分子からの配列情報は、固体支持材プライマー伸張産物に転写される。これに対し、各表の水平欄は、方法の第２工程で使用される溶液相オリゴヌクレオチドを表わし、ここでは、支持材に結合したポリヌクレオチドに相補的な標識された第２ストランドが生成する。
各表中「＋」符号がある場合は、生成物中へ標識された分子の組込みを生じさせる組合わせを示し、「−」符号は、標識された分子が含まれていないことを表わす。
【００８１】
太字で強調した部分に示すように、配列Ｘは、前記８個のプライマーのうちの２種と合致する２種のヌクレオチド配列を含む。プライマーＣへの合致は配列Ｘの「最上欄」ストランド中に見出され（左から右に読む）、プライマーＢへの合致は「最下欄」ストランド中に見つかっている（ここでは、５’末端は右端にあり、したがって、配列は右から左に読む。）。配列Ｘについてのマトリックス（表）を参照すると、プライマーのこの組合わせに対しては陽性な結果が得られることが示されている（それらは、２種のプライマーのどちらを固体支持材に付着させるかによて２様の異なるかたちで生成され得る）。
【００８２】
同様に、配列Ｙは、プライマーＡに合致する配列を「最上欄」ストランド中に含み（左から右に読む）、「最下欄」ストランド中にはプライマーＨに合致する配列を含む（配列は右から左に読む。）。配列Ｙについてのマトリックス（表）を参照すると、ここでもプライマーのこの組合わせが生成される態様に応じて二様の肯定的な結果が得られていることが示されている。
【００８３】
電子論理回路類の技術に熟知している者には明らかであろうが、図中で示されるマトリックス（表）は、半導体論理素子の分析で使用される「真理値表」と類似しており、本発明の方法はＤＮＡ配列に「ＡＮＤ」ロジック・ゲートの機能を付与するものと見ることもできる。そのため、試料分子およびプライマーのヌクレオチド配列が既知の場合、具体的な実験結果は予め予想可能であり、コンピュータモデルリング技術を使用すれば、特定の用途における分析操作を「インシリコ」で設計することができる。
【００８４】
ＤＮＡ分析およびコンビナトリアルケミストリー技術に熟知している者であれば理解できるであろうが、本発明の方法の実施するために必要な操作は、コンビナトリアルケミストリー合成やハイスループットスクリーニングで使用されるように設計された実験室設備の標準的器材を使用することにより容易に自動化できる。これらは熱サイクラー、自動ピペッター、希釈装置、ディスペンサー、ロボットシステム、二次元（Ｘ−Ｙ）位置決めシステムおよび三次元（Ｘ−Ｙ−Ｚ）運動システム、マルチ・チューブ・ラック、マルチ・コンパートメント反応ブロック、マルチ・ウェル・プレート・システム、プレート読取器、自動サンプリング装置、フロスルータイプの分光光度計および分光蛍光計を含むおよび分光光度計および分光蛍光計を含むが、ここに挙げたものに限定されない。さらに、オリゴヌクレオチド合成に特化して設計された装置も、本発明の実施に用い得る。そのような装置は、「オリゴヌクレオチドの化学合成装置」と題する本願出願人の米国特許第４，７２８，５０２号および「コンビナトリアル合成装置」と題する本願出願人の英国特許第２，３４７，１４１号に記載されているような自動合成装置を含む（但し、これらに限定されるものではない。）。
【００８５】
これまでの記載は、本発明の実施形態を例示するものである。しかし、本発明は記載してきた特定の実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術思想から外れることなく本発明の多種多様な変形が行ない得ることは生化学分析技術およびＤＮＡ技術に熟知している者には明らかであろう。例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクションの代わりに、種々様々の酵素および酵素法を使用して本発明を実施できるであろう。こうしたものとしては、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施するための逆転写酵素やリガーゼ連鎖反応を実施するためのＤＮＡリガーゼが含まれる。
【００８６】
同様に、細分化された支持材表面はこれまでの記載では長方形フォーマットで揃えているが、他のフォーマット（例えばサブ領域として六角形や三角形のレイアウトを使用するフォーマット）も、等しく有効であろう。
【００８７】
従って、本発明の範囲は前述の記載を参照するだけで決定してはならず、添付クレームを参照し、その等価物の最大範囲を含むものとして決定しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の実施において固体支持材表面としてその表面が使用できるガラスエンベロープ中に封止された無線周波数トランスポンダを示す断面図。
【図２】本発明の実施において固体の支持材表面として使用できる領域に分割されたガラス・プレートを示す平面図。
【図３】本発明の実施において固体の支持材表面として使用できる領域に分割されたシリコン・ウエハーを示す平面図。
【図４】多数の固体支持材上でＰＣＲを実行する方法を示す模式図。
【図５】ＰＣＲによって生産された固定されたポリヌクレオチドに相補的な、標識されたポリヌクレオチドを生成する方法を示す模式図。
【図６】相補的ポリヌクレオチドの分析操作を示す模式図。
【図７】領域へ細分された単一の固体支持材上でＰＣＲを実行する方法を示す模式図。
【図８】単一の固体支持材を個別領域に分割した後に標識された相補配列を生成する方法を示す模式図。
【図９】各ウェルがオリゴヌクレオチド配列を含む９６ウェルプレートの平面図。
【図１０】個々のオリゴヌクレオチド配列を示す平面図。
【図１１】モジュール化された９６ウェルプレートの部品を示す分解図。
【図１２】加熱ブロック間に装入されたモジュール化９６ウェルプレート部品の組立を示す断面図。
【図１３】加熱ブロック間に装入されたモジュール化９６ウェルプレート部品の組立を示す断面図。
【図１４】加熱ブロック間に装入されたモジュール化９６ウェルプレート部品の組立を示す断面図。
【図１５】加熱ブロック間に装入されたモジュール化９６ウェルプレート部品の組立を示す断面図。
【図１６】９６ウェルプレートの個々のウェルの組立の詳細を示す断面図。
【図１７】本発明の実施において使用できるオリゴヌクレオチドを例示する模式図。
【図１８】本発明を用いて２種のＤＮＡ試料を識別する方法を示す模式図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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