(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを含有する試料に、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含む酵素系を作用させて、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に、１，５−アンヒドログルシトールを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換し、ついで酸化型補酵素存在下に１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の脱水素反応を行い、生成する還元型補酵素を定量することを特徴とするグルコース含有試料中の１，５−アンヒドログルシトールの定量方法。
【請求項２】
還元型補酵素の定量が、テトラゾリウム塩から生成する色素を比色定量して行うものである請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有する１，５−アンヒドログルシトールの定量用試薬。
【請求項４】
テトラゾリウム塩および電子受容体をさらに含有する請求項３記載の定量用試薬。
【請求項５】
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含む試薬と、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む試薬とからなる１，５−アンヒドログルシトールの定量用試薬キット。
【請求項６】
試料中に存在するグルコースに、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを作用させて、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換することを特徴とする試料中のグルコース消去方法。
【請求項７】
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含むグルコース消去用試薬。
【請求項８】
試料中のグルコースに、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを作用させて、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換したのち、試料中の成分を化学的または酵素的反応を用いて定量することを特徴とするグルコース含有試料中成分の定量方法。
【請求項９】
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、定量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する物質を含む、物質の定量用試薬。
【請求項１０】
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含む試薬と、定量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する物質を含む試薬とからなる物質の定量用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のグルコースを他の物質に変換した後、試料中の特定の物質、例えば１，５−アンヒドログルシトール等を酵素反応を利用して定量する方法並びにそれに用いる定量用試薬および定量用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中にはグルコースが存在し、しかも定量すべき物質に比べ非常に高濃度である場合があり、定量すべき物質の定量結果が不正確なものになる場合がある。このような場合、該物質の定量に先立って、試料中のグルコースを試料中から除去するか、定量すべき物質の定量に影響しない他の物質に変換した後定量する方法が行われる。
【０００３】
試料中からグルコースを除去する方法としては、例えばイオン交換カラムクロマトグラフィーでグルコースを分離する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報、特公昭６４−６７５６号公報）等が知られている。また試料中のグルコースを他の物質に変換する方法としては、例えば、（１）アデノシン三リン酸存在下に、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ等のリン酸化酵素を作用させ、グルコースをグルコース−６−リン酸に変換する方法、（２）酸素の存在下に、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼまたはソルボースオキシダーゼ等の酸化酵素を作用させ、グルコースをグルコノラクトンに変換する方法が知られている。
【０００４】
これらの変換方法において種々の改良が知られている。（１）のリン酸化酵素を用いる方法においては、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼを作用させ、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換させることにより、グルコース−６−リン酸が平衡反応によりグルコースに再変換されるのを防止する方法（特開平５−７６３９７号）、酸化型補酵素存在下にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させる方法（特開平１−３２０９９８号公報、特開平３−２７２９９号公報、特開平６−２３７７９４号公報）、アデノシン二リン酸存在下にピルビン酸キナーゼを作用させ、グルコース消去時に減少するアデノシン三リン酸の濃度変化を防止し、アデノシン三リン酸濃度を一定に保つ方法（特開平２−１０４２９８号公報）等が知られている。（２）の酸化酵素を用いる方法においては、グルコースオキシダーゼを作用させた後、カタラーゼを作用させ生成する過酸化水素を消去する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報）等が知られている。
【０００５】
しかしながら、グルコースを他の物質に変換する際に使用する物質並びにその変換系で変化する物質およびその濃度等により、物質を定量するための酵素反応系が影響を受けてしまうという問題点がある。例えば、グルコースをグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼを用いて消去しようとする場合（特開平５−７６３９７号公報）には、アデノシン二リン酸が大量に生成してしまうという問題点がある。特に、完全にグルコースを消去するためにアデノシン三リン酸を十分量供給した場合にはグルコース濃度の２倍高濃度のアデノシン二リン酸が生成してしまうことになり、このアデノシン二リン酸濃度の影響は無視できないものとなる。
【０００６】
髄液、血漿、血清、尿中など生体液中に存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低下し、糖尿病診断マーカーとして有用である１，５−アンヒドログルシトールにおいては、１，５−アンヒドログルシトールがグルコースに酷似した構造を持ったものであり、また量的にもグルコースに比べて微量であることから、その定量は困難を極めている。
【０００７】
１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素としては、ソルボースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼなどがある。しかしこれらの酵素は１，５−アンヒドログルシトールの他に共存するグルコース等の糖類と反応してしまい、何らかの方法でグルコース等の糖類を除去あるいは消去する必要がある。
【０００８】
１，５−アンヒドログルシトールの酸化反応を触媒するピラノースオキシダーゼまたはソルボースオキシダーゼを用いて生成する過酸化水素を定量する方法を用いる場合は下記のグルコース消去方法が知られている。
（１）イオンクロマトカラムで試料中のグルコースを分離した後、試料にピラノースオキシダーゼを作用させ生成する過酸化水素を定量し１，５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開昭６３−１８５３０７号公報、特開昭６４−６７５６号公報）、（２）試料中のグルコースに、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて、グルコースをピラノースオキシダーゼに反応しない化合物に変換したのち、試料にピラノースオキシダーゼを作用させ生成する過酸化水素を定量し、１，５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平１−３２０９９８号公報、特開平３−２７２９９号公報）、（３）試料中のグルコースに、グルコキナーゼとピルベートキナーゼを用いてグルコースをピラノースオキシダーゼに反応しない化合物に変えた後、試料にピラノースオキシダーゼを作用させ生成する過酸化水素を定量し、１，５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平２−１０４２９８号公報）、（４）試料中のグルコースに、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼを作用させてグルコースをピラノースオキシダーゼに反応しない化合物に変えた後、試料にソルボースオキシダーゼまたはピラノースオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量し、１，５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平５−７６３９７号公報）等が知られている。
【０００９】
しかし（１）に記載のカラムを用いる方法は操作性に問題があり、（２）〜（４）に記載の消去系では、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼが、１，５−アンヒドログルシトールにも作用し１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を生成することから、正確な１，５−アンヒドログルシトールの定量が困難である。
【００１０】
１，５−アンヒドログルシトールのリン酸化反応を触媒するヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼを用いて生成する物質を定量する方法を用いる場合は下記の方法が知られている。
（５）イオンクロマトカラムで試料中のグルコースを分離した後、試料にヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼを作用させ生成するアデノシン二リン酸を定量し１，５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平８−１０７７９６号）、（６）試料中のグルコースに、（ａ）グルコースオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼおよびカタラーゼ、（ｂ）グルコースデヒドロゲナーゼ、あるいは、（ｃ）ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼなどの酵素を作用させてグルコースをアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼに反応しない化合物に変えたのち、試料にアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼおよび１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）を定量することにより１，５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平１０−１９１９９８号公報）がある。
【００１１】
しかしながら、（５）の方法では操作が煩雑である、（６）の方法においてはグルコースオキシダーゼを用いる（ａ）の方法では、被検液中に高濃度のグルコースが存在する場合は酸素供給が律速となる、グルコースデヒドロゲナーゼを用いる（ｂ）の方法では、グルコースから生成される還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）の消去系が必要となる、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼを用いる（ｃ）の方法では、グルコースから生成するグルコース−６−リン酸に１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼが作用してしまうため分別定量することができず、またグルコースが大量に存在する糖尿病患者等に由来する試料を測定対象とする場合には、反応系にアデノシン二リン酸が大量に生成し１，５−アンヒドログルシトールの定量が不正確となる等の問題がある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、グルコースを含有する試料中の特定の物質、例えば１，５−アンヒドログルシトールを簡便に定量する方法、試料中の特定物質を定量するに際し実質的にグルコースを完全に消去できる試料中のグルコース消去方法、およびそれらのための試薬ならびにキットを提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グルコースを含有する試料に、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換し、かつ１，５−アンヒドログルシトールを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換することができる酵素系を作用させることにより１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を生成させ、ついで酸化型補酵素存在下に１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて１，５−アンヒドログルシトール−6−リン酸の脱水素反応を行い、生成する還元型補酵素を定量することを特徴とするグルコース含有試料中の１，５−アンヒドログルシトールの定量方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ，もしくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、を含有する１，５−アンヒドログルシトールの定量用試薬に関する。
【００１５】
また本発明は、（ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含む試薬，もしくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含む試薬と、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む試薬とからなる１，５−アンヒドログルシトールの定量用試薬キットに関する。
【００１６】
また本発明は、試料中に存在するグルコースに、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼを作用させて、グルコースをフルクトース−１，６―二リン酸に変換することを特徴とする試料中のグルコース消去方法に関する。
【００１７】
また本発明は、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼを含むグルコース消去用試薬に関する。
また本発明は、試料中のグルコースに、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼを作用させて、グルコースをフルクトース−１，６―二リン酸に変換したのち、試料中の成分を化学的または酵素的反応を用いて定量することを特徴とするグルコース含有試料中成分の定量方法に関する。
【００１８】
また本発明は、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼと、定量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する物質とを含む、物質の定量用試薬に関する。
また本発明は、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼを含む試薬と、定量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する物質とを含む試薬とからなる物質の定量用試薬キットに関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明で扱う試料としては、グルコースが混在する可能性のある試料であればどのようなものでもよく、例えば血液、血漿、血清、尿等の生体試料があげられる。
試料中のグルコースの消去は、グルコースを下記反応式に従ってフルクトース−１，６−二リン酸に変換することにより行われる。
【００２０】
【化１】
0004412780.tif 000002
【００２１】
グルコースをグルコース−６−リン酸に変換しただけでは反応が可逆反応であるため生成したグルコース−６−リン酸がグルコースに再変換してしまうが、この反応系においては、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸にまで変換することにより、グルコースの再変換が進行せず試料中のグルコースが完全に消去できる。
【００２２】
グルコースからフルクトース−１，６−二リン酸にまで変換する酵素系には、グルコースからグルコース−６−リン酸を生成する酵素系（酵素系１という）、グルコース−６−リン酸からフルクトース−６−リン酸を生成する酵素系（酵素系２という）およびフルクトース−６−リン酸からフルクトース−１，６−二リン酸を生成する酵素系（酵素系３という）が含まれる。
【００２３】
酵素系１においては、（ａ）酵素がヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌクレオシド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換を伴うものと、（ｂ）酵素がヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼまたはヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼであり補酵素がヌクレオシド三リン酸からヌクレオシド二リン酸への変換を伴うものとがある。酵素系２においては、酵素はホスホヘキソースイソメラーゼである。酵素系３においては、酵素は６−ホスホフルクトキナーゼであり補酵素はヌクレオシド三リン酸からヌクレオシド二リン酸への変換を伴う。
【００２４】
酵素系１において、酵素がヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌクレオシド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換を伴うものである場合、グルコース濃度に応じてヌクレオシド二リン酸が消費されるが、６−ホスホフルクトキナーゼにより、ヌクレオシド三リン酸から、消費したヌクレオシド二リン酸量と等しい量のヌクレオシド二リン酸が生成されるため、ヌクレオシド二リン酸濃度を一定濃度に保つことができ、試料中に含まれるグルコース濃度により反応系に存在するヌクレオシド二リン酸濃度がばらつくことがない。
【００２５】
本発明においてグルコースの消去方法を実施するに際しては、グルコースが共存する試料に（ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼ、もしくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを加え、必要に応じて水性媒体、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等の存在下に、１０〜５０℃で１〜３０分間、好ましくは、２〜１０分間反応させる。
【００２６】
ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼまたはヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼの濃度は、０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／ｍｌがより好ましく、１〜５０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
ホスホヘキソースイソメラーゼの濃度は、０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／ｍｌがより好ましく、５〜５０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
【００２７】
６−ホスホフルクトキナーゼの濃度は、０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／ｍｌがより好ましく、５〜５０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
【００２８】
各酵素とも市販品が容易に入手可能である。例えば、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼは、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)またはピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の酵素が旭化成工業社より、ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼは、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、バチルス（Bacillus）属等の微生物由来の酵素が、例えばオリエンタル酵母工業社、東洋紡社、ベーリンガー・マンハイム社、旭化成工業社等より容易に入手できる。ヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼは、ザイモモナス（Zymomonas）属、バチルス（Bacillus）属等の微生物由来の酵素が、例えばユニチカ社等より容易に入手できる。ホスホヘキソースイソメラーゼはバチルス・ステアロサーモフィリウス（Bacillus stearothermophilus）由来の酵素がユニチカ社より、６−ホスホフルクトキナーゼはバチルス・ステアロサーモフィリウス（Bacillus stearothermophilus）由来の酵素がユニチカ社より入手できる。
【００２９】
ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド三リン酸の濃度は、０．０１〜１００ｍＭが好ましく、０．１〜５０ｍＭがより好ましく、１〜１０ｍＭが特に好ましい。賦活剤としては、各種無機塩類があげられ例えば、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等があげられる。無機塩類の濃度は、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、０．０１〜５ｍｇ／ｍｌがより好ましく、０．１〜２ｍｇ／ｍｌが特に好ましい。
【００３０】
上記反応によりグルコースを消去した後、試料中の物質を定量するのに必要な試薬の存在下に反応をおこない、反応により生成した物質または減少した物質を定量することによって目的の物質を定量できる。定量に必要な試薬としては特に限定されないが、定量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する物質を含む試薬があげられ、酵素を含有する試薬が好ましい。
【００３１】
定量すべき物質に作用する酵素がグルコースにも作用し、しかも該酵素が触媒する反応がヌクレオシド二リン酸濃度に影響を受ける場合には、グルコース消去方法としては、前述の（ａ）酵素がヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌクレオシド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換を伴うものが好ましい。
【００３２】
該酵素としては、例えば、ヌクレオチダーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ヌクレオシド二リン酸ピロホスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸グルコースピロホスホリラーゼ、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等があげられる。
【００３３】
定量の対象が１，５−アンヒドログルシトールの場合、上記グルコース消去のための酵素系による作用で同時に１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が生成するため、この１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を定量することにより試料中に存在した１，５−アンヒドログルシトールを定量することができる。
【００３４】
上記反応によりグルコースを消去した後、酸化型補酵素の存在下で１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを加え、必要に応じて水性媒体、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等の存在下に、１０〜５０℃で１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間反応させる。１，５−アンヒドログルシトール濃度は、反応により生成する還元型補酵素を直接例えば３４０ｎｍの吸光度を測定するか、該還元型補酵素を他の物質に導き、該物質を定量することにより定量できる。
【００３５】
１，５−アンヒドログルシトールの定量に使用する酸化型補酵素または１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方は、グルコース消去反応に影響しない範囲であらかじめグルコース消去反応に共存させていてもよい。
ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼとしては、グルコースを基質として、ヌクレオシド二リン酸を消費してグルコース−６−リン酸およびヌクレオシド一リン酸を生成する酵素であり、かつ１，５−アンヒドログルシトールを基質としてヌクレオシド二リン酸を消費して１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸およびヌクレオシド一リン酸を生成する酵素であればいかなる酵素でもよい。ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼの例としては、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８株由来の酵素（特開平９−２３４０９８号公報）、サーモコッカス・リトラリス由来の酵素（ＴＬＨＫ）が旭化成工業社から入手できる。
【００３６】
ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼとしては、グルコースを基質として、ヌクレオシド三リン酸を消費してグルコース−６−リン酸およびヌクレオシド二リン酸を生成する酵素であり、かつ、１，５−アンヒドログルシトールを基質としてヌクレオシド三リン酸を消費して１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸およびヌクレオシド二リン酸を生成する酵素であればいかなる酵素でもよい。具体的には、前記の酵素類があげられる。
【００３７】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとしては、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸と酸化型補酵素からＣ6Ｈ11Ｏ8Ｐ1で表される化合物と還元型補酵素を生成する酵素であればいかなる酵素でもよい。
【００３８】
【化２】
0004412780.tif 000003
【００３９】
この反応を触媒する酵素、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとしては、例えばエッシェリヒア・コリ（E. coli）・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来の酵素をあげることができる。該酵素は、例えば特開平１０−８４９５３号公報の記載に従って調製できる。
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの反応液中の濃度は、０．５〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、１〜５０Ｕ／ｍｌがより好ましく、２〜４０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。酸化型補酵素の反応液中の濃度は、０．１〜１００ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましく、２〜２０ｍＭが特に好ましい。
【００４０】
ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸の反応液中の濃度は、前述のグルコースの消去反応に用いる濃度と同一である。
【００４１】
酸化型補酵素としては、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等があげられる。
ヌクレオシド三リン酸としては、例えばアデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、チアミン三リン酸、ウリジン三リン酸、イノシン三リン酸等があげられ、アデノシン三リン酸が好ましい。
【００４２】
ヌクレオシド二リン酸としては、例えばアデノシン二リン酸、グアノシン二リン酸、シチジン二リン酸、チアミン二リン酸、ウリジン二リン酸、イノシン二リン酸等があげられ、アデノシン二リン酸が好ましい。
生成する還元型補酵素を他の物質に導き高感度に定量する方法としては、例えば次式で示すようにテトラゾリウム塩存在下に電子受容体を作用させ生成するホルマザン色素を比色定量する方法があげられる。
【００４３】
【化３】
0004412780.tif 000004
【００４４】
テトラゾリウム塩としては、例えばインドニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（以下、ＷＳＴ−１と略記する）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  一ナトリウム塩（以下、ＷＳＴ−３と略記する）、３，３'−［３，３'−ジメトキシ−（１，１'−ビフェニル）４，４'−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ  テトラゾリウム  クロライド］（ＮＴＢ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−フェニル）−５−（３−カーボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）等があげられる。
【００４５】
色源体として使用されているテトラゾリウム塩も使用することができる。テトラゾリウム塩としては、感度の増幅を目的とするため分子吸光係数が大きいものが良く、通常臨床の場で使用されることを考慮すると、還元後水溶性ホルマザン色素に変換されるものが望ましい。従ってＷＳＴ−１やＷＳＴ−３などが好適である。使用量としては臨床で使用する場合、０．０１〜５０ｍＭの範囲が好ましい。
本発明に用いるテトラゾリウム塩の反応液中の初期濃度としては、０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭである。
【００４６】
電子受容体としては、例えばフェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジンメトサルフェート、メルドラズブルーおよびジアホラーゼがあげられる。ジアホラーゼとしては、例えばバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来の酵素が旭化成工業社および東洋紡社から入手できる。本発明に用いる電子受容体の反応液中の初期濃度としては、０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭである。
【００４７】
反応は、１０〜５０℃で１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。本反応は、前述の還元型補酵素を生成する反応が終了した後行ってもよいが、同時に行うのが好ましい。
また生成する還元型補酵素を他の物質に導き定量する他の方法としては次式に示されるように色源体の存在下に還元型補酵素オキシダーゼおよびパーオキシダーゼを作用させ生成する色素を比色定量する方法があげられる。色源体は、例えば４−アミノアンチピリンとの組合わせで用いられる色源体でもよいが、単独で色素に変換する色源体が好ましい。
【００４８】
【化４】
0004412780.tif 000005
【００４９】
単独で用いられる色源体としては、例えばビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−カルボキシエチルアミノフェニル］アミン、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）等があげられる。
【００５０】
また、４−アミノアンチピリンと組合わせて用いる色源体としては例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−ｍ−トルイジン二ナトリウム塩等があげられる。
【００５１】
反応は、１０〜５０℃で１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。本反応は、前述の還元型補酵素を生成する反応が終了した後に行ってもよいが、同時に行うのが好ましい。
水性媒体としては、緩衝剤、食塩等を含有する水等の液体を例示できるが緩衝液が好ましい。
【００５２】
緩衝剤としては、例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。
【００５３】
酵素活性調節剤としては、１，１０−フェナントロリン等の金属キレート剤、マンニトール、グリセロール等の糖アルコール、マグネシウム、マンガン、亜鉛、銅等の金属イオン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド等のＳＨ阻害剤があげられる。
酵素の安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸等の金属キレート剤、可溶性デンプン等の多糖類またはその誘導体、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子化合物、ホスフィン、システイン等のＳＨ基含有化合物等があげられる。
【００５４】
界面活性剤としては、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ノニオンＨＳ−２１０、花王社製）、３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチルアミノ］プロパンスルホン酸、トリトンＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム等をあげることができる。
防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム等があげられる。
【００５５】
他の酵素としては、例えば酸化型補酵素オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等をあげることができる。
本発明の１，５−アンヒドログルシトールの定量用試薬は、（ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ，もしくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有し、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含む。
【００５６】
これら試薬は、１）（ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ，もしくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含有する第一試薬および、２）１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化型補酵素と、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含有する第二試薬からなる１，５−アンヒドログルシトール定量用キットとすることができる。第二試薬中には１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼと酸化型補酵素のいずれか一方を含有させ、残りを第一試薬に含有させることもできる。
【００５７】
本発明のグルコース消去用試薬は、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、および６−ホスホフルクトキナーゼを含み、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含む。
【００５８】
本発明の、物質の定量用試薬は、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、定量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する物質からなり、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含む。
【００５９】
該定量試薬は、１）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含む第一試薬、および２）定量すべき物質に作用する酵素、定量すべき物質と反応する物質からなり、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含む第二試薬を含有するキットとして構成することができる。
【００６０】
本発明の試薬の各々は、凍結乾燥品を調製した後供給されてもよいが、水等の液体に溶解して供給されてもよい。
以下に具体的な実施例をあげる。
【００６１】
【実施例】
実施例１
下記の組成のグルコース消去用試薬を調製した。
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）                      ５０ｍＭ
塩化マグネシウム                                    １ｍｇ／ｍｌ
アデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼ
（Thermococcus litoralis由来、旭化成工業社製）      １０Ｕ／ｍｌ
ホスホヘキソースイソメラーゼ
（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製）    ４０Ｕ／ｍｌ
６−ホスホフルクトキナーゼ
（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製）    ３０Ｕ／ｍｌ
アデノシン二リン酸（オリエンタル酵母工業社製）            ３ｍＭ
アデノシン三リン酸（シグマ社製）                        １０ｍＭ
【００６２】
実施例２
下記の組成の１，５−アンヒドログルシトール定量用試薬を調製した。
試薬  １
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．５）                    ５０ｍＭ
塩化マグネシウム                                    １ｍｇ／ｍｌ
ＮＡＤＰ（シグマ社製）                                    ４ｍＭ
アデノシン二リン酸（オリエンタル酵母工業社製）            ３ｍＭ
アデノシン三リン酸（シグマ社製）                        １０ｍＭ
ホスホヘキソースイソメラーゼ
（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製）    ４０Ｕ／ｍｌ
６−ホスホフルクトキナーゼ
（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製）    ３０Ｕ／ｍｌ
ジアホラーゼ
（Bacillus megaterium由来、旭化成工業社製）          １０Ｕ／ｍｌ
アデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼ
（Thermococcus litoralis由来、旭化成工業社製）      １０Ｕ／ｍｌ
【００６３】
試薬  ２
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  １０．０）            ２００ｍＭ
ＷＳＴ−１（同仁化学社製）                            ０．５ｍＭ
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（E. coli・DH1(ATCC33849)株由来、旭化成工業社製）    ２０Ｕ／ｍｌ
【００６４】
実施例３
１，５−アンヒドログルシトールの２５μｇ／ｍｌの標準液を５段階に希釈して作成した試料及び精製水０．０７５ｍｌに実施例２で調製した試薬１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例２で調製した試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。このとき得られた検量線を第１図に示す。
【００６５】
実施例４
本法の有用性を確かめるためにグルコースの消去実験を行った。試験管に実施例２の試薬１を２．２５ｍｌ分注し、（ａ）精製水、（ｂ）１，５−アンヒドログルシトールを２５μｇ／ｍｌ含む検液、（ｃ）グルコースを２０００ｍｇ／ｄｌ含む検液、（ｄ）１，５−アンヒドログルシトールを２５μｇ／ｍｌとグルコース２０００ｍｇ／ｄｌを含む検液をそれぞれ０．０７５ｍｌ加えて３７℃で５分間加温後、実施例２の試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定し第１表の結果を得た。
【００６６】
【表１】
0004412780.tif 000006
【００６７】
第１表の結果が示すように、（ｃ）と（ａ）との値は完全に一致しており、本法では（ｃ）検液中のグルコース２０００ｍｇ／ｄｌが完全に消去された。また、（ｂ）と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本法の有用性が示された。
【００６８】
実施例５
本法と公知の方法との相関性を確かめるために、５０例の血清を用いて１，５−アンヒドログルシトール濃度の測定を行った。（ａ）実施例２の試薬１を２．２５ｍｌ分注し、血清０．０７５ｍｌを加えて３７℃で５分間加温後、試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで測定した吸光度を、実施例１の図１の検量線より得られた計算式にて血清中の１，５−アンヒドログルシトール濃度を算出した。（ｂ）体外診断用医薬品として承認されている「ラナ１，５−ＡＧオートII」（日本化薬社製  承認番号（０８ＡＭ）第０１１２号）を用いて、「測定操作方法」に従い５０例の血清の測定を行い、同じく「１，５−アンヒドログルシトール濃度の求め方」に従い１，５−アンヒドログルシトール濃度を算出した。（ａ）で得られた値を縦軸に、（ｂ）で得られた値を横軸にそれぞれプロットし図２の結果を得た。
【００６９】
図２の結果が示すように、相関係数ｒ＝０．９９６６、回帰式ｙ＝０．９８３９ｘ＋０．０５７６と良好な相関性が得られた。
【００７０】
実施例６
第一試薬のアデノシン二リン酸濃度を第２表に示す通りとし、また第二試薬にトリトンＸ−１００を０．４％となるように添加する以外は、実施例２と同様な試薬を調製した。
【００７１】
１，５−アンヒドログルシトール２５μｇ／ｍｌおよび第２表に示す濃度のグルコースを添加した試料を作成した。
実施例３と同様に操作し１，５−アンヒドログルシトールを定量した。
結果を第２表に示す。
【００７２】
【表２】
0004412780.tif 000007
【００７３】
本実施例で使用したアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼを用いるグルコースの消去方法を用いれば、試薬のアデノシン二リン酸濃度を変えても、また試料に種々の濃度のグルコースが含有されていても、これら条件に関わりなく、試料中の１，５−アンヒドログルシトールが正確に定量された。
【００７４】
実施例７
下記の組成の１，５−アンヒドログルシトール定量用試薬を調製した。
試薬１
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）                    ５０ｍＭ
塩化マグネシウム                                    １ｍｇ／ｍｌ
ＮＡＤＰ（シグマ社製）                                    ４ｍＭ
アデノシン三リン酸（シグマ社製）                        １０ｍＭ
ホスホヘキソースイソメラーゼ
（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製）    ４０Ｕ／ｍｌ
６−ホスホフルクトキナーゼ
（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製）    ３０Ｕ／ｍｌ
ジアホラーゼ
（Bacillus megaterium由来、旭化成工業社製）          １０Ｕ／ｍｌ
アデノシン三リン酸依存性ヘキソキナーゼ
（酵母由来、オリエンタル酵母工業社製）            １００Ｕ／ｍｌ
【００７５】
試薬２
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  １０．０）            ２００ｍＭ
ＷＳＴ−１（同仁化学社製）                            ０．５ｍＭ
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（E. coli・DH1(ATCC33849)株由来、旭化成工業社製）    ２０Ｕ／ｍｌ
【００７６】
実施例８
１，５−アンヒドログルシトール濃度、５０、１００、１５０、２００および２５０μｇ／ｍｌの標準液を作成した。該標準液または精製水０．０７５ｍｌに実施例７で調製した試薬１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例７で調製した試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。このとき得られた検量線を第３図に示す。
【００７７】
実施例９
本法の有用性を確かめるためにグルコースの消去実験を行った。試験管に実施例７の試薬１を２．２５ｍｌ分注し、（ａ）精製水、（ｂ）１，５−アンヒドログルシトールを２５０μｇ／ｍｌ含む検液、（ｃ）グルコースを１００ｍｇ／ｄｌ含む検液、（ｄ）１，５−アンヒドログルシトールを２５０μｇ／ｍｌとグルコース１００ｍｇ／ｄｌを含む検液をそれぞれ０．０７５ｍｌ加えて３７゜Ｃで５分間加温後、実施例７の試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定し第３表の結果を得た。
【００７８】
【表３】
0004412780.tif 000008
【００７９】
第３表の結果が示すように、（ｃ）と（ａ）との値はほぼ一致しており、本法では（ｃ）検液中のグルコース１００ｍｇ／ｄｌが完全に消去された。また、（ｂ）と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本法の有用性が示された。
【００８０】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便な１，５−アンヒドログルシトールの定量方法並びにそれに用いる定量用試薬および定量用キットが供給される。しかも共存するグルコースが高濃度であっても、それが酵素的に完全に消去され、正確な測定値を得ることができる。また本発明によれば、反応液中に存在するヌクレオシド二リン酸濃度を一定に保ちながら反応液中のグルコースをグルコース−１，６−二リン酸に変換することにより消去する方法およびそれに用いる消去用試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  １，５−アンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸の１，５−ＡＧは１，５−アンヒドログルシトールを示し、縦軸のｍＡｂｓはミリ吸光度を示す。
【図２】  本法で得られる１，５−アンヒドログルシトール濃度（ａ：縦軸）と対照方法（ラナ１，５−ＡＧオート）で得られる１，５−アンヒドログルシトール濃度（ｂ：横軸）の相関図を示す。
【図３】  １，５−アンヒドログルシトールの検量線を示す。
【図１】
0004412780.tif 000009
【図２】
0004412780.tif 000010
【図３】
0004412780.tif 000011