(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスゲノムの発現に必要な複製欠陥レトロウイルスゲノムのすべての配列を含むことを特徴とするキメラポックスウイルスであって、外来配列が核−活性プロモーターの転写制御下にてレトロウイルスゲノムに挿入される、キメラポックスウイルス。
【請求項２】
レトロウイルスのパッケージング成分gag-polおよびenvの配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
【請求項３】
該ポックスウイルスがコルドポックスウイルスであることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載のキメラポックスウイルス。
【請求項４】
該コルドポックスウイルスがオルトポックスウイルスであることを特徴とする、請求項３に記載のキメラポックスウイルス。
【請求項５】
該オルトポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする、請求項４に記載のキメラポックスウイルス。
【請求項６】
複製欠陥ワクシニアウイルスであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラポックスウイルス。
【請求項７】
レトロウイルスゲノムの配列がポックスウイルスプロモーターの転写制御下にあることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のキメラポックスウイルス。
【請求項８】
パッケージング成分の配列がポックスウイルスプロモーターの転写制御下にあることを特徴とする、請求項３〜６のいずれかに記載のキメラポックスウイルス。
【請求項９】
ポックスウイルスプロモーターが初期ポックスウイルスプロモーターであることを特徴とする、請求項７または８に記載のキメラポックスウイルス。
【請求項１０】
レトロウイルスゲノムがイントロン配列を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のキメラポックスウイルス。
【請求項１１】
レトロウイルスゲノムが内部ポリアデニル化配列を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のキメラポックスウイルス。
【請求項１２】
レトロウイルスゲノムの発現に必要な複製欠陥レトロウイルスゲノムのすべての配列ならびにレトロウイルスのパッケージング成分gag-polおよびenvの配列を含むキメラポックスウイルスと、製薬的に許容し得る担体とを含有する組成物であって、外来配列が核−活性プロモーターの転写制御下にてレトロウイルスゲノムに挿入される、組成物。
【請求項１３】
医薬品を製造するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のキメラポックスウイルスの使用。
【請求項１４】
遺伝子治療に適用する医薬品を製造するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のキメラポックスウイルスの使用。
【請求項１５】
腫瘍の治療に適用する医薬品を製造するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のキメラポックスウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はレトロウイルス（欠損）ゲノムのベクター成分を含むキメラポックスウイルスに関する。さらに本発明はレトロウイルスの欠損ウイルスを産生するためのベクター成分およびパッケージング成分を含むキメラポックスウイルス、ならびに本発明のキメラポックスウイルスの遺伝子治療または腫瘍治療への使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子治療の主要な目的は標的細胞の安定な遺伝子修飾であり、従来は遺伝子治療用に、複製能欠損アデノウイルスおよびレトロウイルスに基づく基本的なウイルスベクターが構築されていた。
特にアデノウイルスベクターを用いると多数の異なる細胞に形質導入できるため、アデノウイルスベクターによるインビボ遺伝子転移は非常に効率的である。しかし、アデノウイルス感染では、ＤＮＡは宿主ゲノムに組込まれず、エピソーム形態で存在する。さらに外来遺伝子発現を制限する細胞免疫反応を引き起こし得る（Liら、1993、Hum．Gene Ther. 4：403-409)。アデノウイルスＥ３領域が欠失していないベクターを用いてこの反応を弱めることが可能である（Ilanら、1997．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 94：2587-2592)。これらの修飾は治療遺伝子の一時的な発現を何ヶ月間か持続させる。しかし、上記のようにアデノウイルスベクターは宿主細胞のゲノムに安定に組込まれないため、恒久的な効果は得られない。
【０００３】
これとは対照的に、レトロウイルスベクターは外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに安定に組込むことができる。レトロウイルスは外来ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組込む機構を有している少数の現在既知のウイルスに属するため、宿主細胞を恒久的に形質転換できる。この性質のため、レトロウイルスは遺伝子治療アプローチに頻繁に用いられる。この目的のためにこれまで用いられていた技術では、外来遺伝子をレトロウイルス中のプロウイルスＤＮＡにクローン化していたが、これでは、パッケージング機能をコードする少なくとも１つのレトロウイルス遺伝子（gag-polまたはenv）が不活性化、あるいは欠失されている複製欠陥レトロウイルス遺伝子を用いていることになる。これらの構築体はプロウイルスのパッケージングシグナルpsiおよびフランキング長末端繰り返し（ＬＴＲ）配列を含む。これらの転写単位は通常のトランスフェクション技術によりプラスミドベクターを用いて細胞に導入され、一般にＬＴＲプロモーターの制御下に核内でＲＮＡに転写される。パッケージングシグナルpsiのため、これらのＲＮＡはゲノムウイルスＲＮＡとして受け入れられ、レトロウイルス粒子にパッケージングされる。
【０００４】
最も単純な場合、感染性レトロウイルス粒子が形成されるためには、遺伝子産物gag-polおよびenvが存在しなければならない。これらの遺伝子はプラスミドトランスフェクションを介して、パッケージングシグナルを伴わなくても細胞に挿入され、あるいはヘルパーウイルスを介して提供され得る。またレトロウイルス粒子の調製のためには、パッケージング成分gag、polおよび／またはenvのウイルス遺伝子が安定に組込まれており、該遺伝子を発現するセルラインを形質導入できる。このようなセルラインは「パッケージング」ラインという用語で表され、例えばＷＯ９７／３５９９６に記載されている。
非複製レトロウイルス粒子の形成に必要なすべての成分をコードするプラスミド構築物はいわゆる「プラスモウイルス」として記載されている（Noguiez-Hellinら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：4175-4180)。
しかし、複製欠陥レトロウイルスの使用は、レトロウイルスＤＮＡがヘルパー遺伝子と組換えし、それにより腫瘍を発生させる可能性を有する複製可能ウイルスが産生されることになるかもしれない危険性を完全には排除できない。
【０００５】
レトロウイルスベクターを用いた細胞の形質転換はインビトロで非常に効率的であるが、遺伝子治療への適用において現在、困難に遭遇している。即ち、プラスミド構築物を介するレトロウイルスベクターの産生に必要とされるトランスフェクション技術はインビトロで行うことができるのみである。欠損レトロウイルス粒子の産生に用いるプラスミド構築物を体内に直接投与することは非常に非効率的である。同様にインビトロのレトロウイルス粒子は比較的低い力価までしか産生できない。これらの粒子は不安定であるため、粒子の濃縮もまた、限られた程度でしか実行できない。レトロウイルスの低い力価および不安定性はしばしばインビボでの効率的な形質転換を妨げる。これゆえ、粒子の標的器官への直接注射、または組織を取り出した後のエクスビボ（ex vivo）形質転換および形質転換細胞の移植のような方法が現在試みられている。またレトロウイルスベクターの場合、ある標的器官への目標を定めた形質導入、いわゆる「ターゲティング」は、非常に困難である。異種エンベロープタンパク質によって粒子の向性を変化させること（擬似タイピング、pseudotyping）が試みられている。
単純レトロウイルス、たとえばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく広く用いられるレトロウイルスベクターは分裂期の細胞のみを形質導入することができる。しかし、多くの完全に成長した器官での細胞成長は非常に低い。肝臓遺伝子治療の試験では腹腔内処理が試みられ、肝臓の部分的取り出しにより、成長しているがゆえに形質転換が可能な組織を得ている。同様に例えば、ＨＩＶ（レンチウイルスベクター）のような複合レトロウイルスは非分裂細胞を形質転換することもできるので、そのようなウイルスに基づくレトロウイルスベクターが構築されている（Reiserら、1996．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93：15266-15271)。
【０００６】
遺伝子治療において欠損遺伝子を矯正するためには、対応する遺伝子の効率的な挿入およびその遺伝子の長期間の発現が特に重要である。これゆえ安定なインビボ形質導入のためのベクターを調製する新たなアプローチでは、レトロウイルス欠損粒子の担体としてウイルスを用いるという原理を利用する。そのようにする場合、特にＤＮＡウイルス、例えばヘルペスウイルスおよびアデノウイルスの大きな挿入潜在能力を利用する。キメラウイルス系のはるかに発達したアプローチは、それぞれレトロウイルスベクターおよびパッケージング機能をコードする２つの組換えアデノウイルスの同時感染による欠損レトロウイルス粒子の調製であり、核レトロウイルスベクターおよびパッケージングタンパク質はアデノベクター系を介して導入され、これにより導入細胞は一時的なレトロウイルス産生細胞になり、その方法で形成されるレトロウイルスベクター粒子は近隣の細胞に感染できる（Fengら、1997. Nat. Biotechn. 15：866-870、Bilbaoら、1997. FASEB J. 11：624-634)。
【０００７】
しかしこの系はいくつかの決定的な不都合を有する：アデノウイルスベクターの外来遺伝子の許容量が数キロ塩基に限られているために、欠損レトロウイルスを産生するためのすべての機能（パッケージング成分およびレトロウイルスベクター成分）を１つのアデノウイルス中に一体化することが困難である。しかし、このような構築物は効率的なインビボ遺伝子治療の必要条件である。さらに、アデノウイルスならびにレトロウイルス遺伝子およびゲノムの両者はそれぞれ宿主細胞の核内で転写され、複製される。このトポグラフィー上の近接は野生型レトロウイルスの組換えを可能にする。原理的に、この系では重要なレトロウイルス転写制御領域は核内における転写に必要だから、欠失させることができない。これゆえ、安全な技術の点から所望の程度にまでアデノウイルス／レトロウイルス系を減弱させることができない。同じことがヘルペス単純アンプリコン系にも当てはまる；従来、これはレトロウイルス構造タンパク質の発現に関して記載されるのみであり、ここではパッケージング成分を含むＨＳＶアンプリコンベクターでｌａｃＺプロウイルスを含む細胞を感染させることにより、レトロウイルスｌａｃＺ粒子を得ている（Savardら、1997．J．Virol．71：4111-4117)。
【０００８】
アデノウイルスおよびレトロウイルスベクターの両方に伴う不利益は特に、形質導入細胞における外来遺伝子発現性の向上またはベクターＲＮＡの安定性のためのイントロンが、ベクター産生の間に核特異的スプライシング機構によって除去されるため、利用できないことである。
【０００９】
キメラレトロウイルス担体としてのウイルスのウイルスベクターについては、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルをレトロウイルス欠損ウイルスゲノムの正しい位置に存在させることで、形質導入されるレトロウイルスゲノムの転写中にそれぞれ欠陥スプライシングまたは時期尚早の鎖終結を誘導しないようにしなければならない。例えば核のポリアデニル化シグナルが第２の下流のレトロウイルスＬＴＲプロモーターの前に置かれたならば、これは核内における転写物の鎖終結および、もはや形質導入能のないレトロウイルス欠損ゲノムを誘導する。これらのシグナルが場違いな部位に存在する場合、核内で複製するアデノまたはヘルペスウイルスは形質導入する欠損レトロウイルスを形成せず、この態様では安全性を高めることができない。さらにヘルペスウイルス内にレトロウイルスＬＴＲを挿入すると、非発ガン性ヘルペスウイルスから発ガン性亜種が産生されることがある（Isfortら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 89：991-995)。ヘルペスウイルスの生活環は核内で行われるので、このことは特に起こり得る。
またαウイルスはレトロウイルス産生用のベクターとして用いられている。インビトロ合成ＲＮＡによって得られたいくつかのセムリキ森林熱ベクターの同時感染は、結果として感染性レトロウイルスベクター粒子を生じさせた（Liら、1993．Hum．Gene．Ther．4：403-409)。担体ウイルスの天然の向性をそれぞれの好ましい細胞タイプおよび組織への遺伝子転移に用いることができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記不都合を有しないベクター系を提供することおよびレトロウイルス粒子を効率的に形成させることである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明では、レトロウイルス粒子のベクター成分の配列を含むキメラポックスウイルスを提供することによってこの課題を達成した。
本明細書中では「ベクター成分」によって、パッケージングシグナルpsiを含むレトロウイルスゲノムの発現に必要なすべての配列、および外来のタンパク質をコードする配列を含む欠損レトロウイルスベクターゲノムが理解される。本発明のキメラポックスウイルス中では、ベクター成分の配列は特に、外来遺伝子、特に外来タンパク質をコードする１つ（またはいくつか）の配列、アンチセンスＤＮＡ、１つ（またはいくつか）のリボザイム（群）が核−活性プロモーター、特にβ−アクチン、ＣＭＶまたはＳＶ４０初期プロモーターの転写制御下にある修飾レトロウイルスゲノムを含む。
外来タンパク質は所望のいずれのタンパク質としてもよいが、置換治療または腫瘍治療用タンパク質が特に好ましい。置換治療に適したタンパク質は血漿タンパク質、例えば第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、フォンビルブラント因子またはエリトロポエチンであり得る。腫瘍治療に適したタンパク質は腫瘍抑制タンパク質、例えばｐ５３またはｐ７３、または「自殺遺伝子」、例えば ＨＳＶ ＴＫ、免疫刺激物質、例えばＢ７である。
【００１２】
ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス転写装置はレトロウイルスのプロウイルスＤＮＡのＬＴＲプロモーターをプロモーターとして認識せず、またプロウイルスＲＮＡプロセッシングシグナルも認識しない。これゆえ、本発明の特別な態様では、ベクター成分の配列をポックスウイルス特異的プロモーターの転写制御下に置く。
ここに、特に好ましいプロモーターは初期遺伝子の発現を制御するポックスウイルスプロモーターである。本発明のキメラワクシニアウイルス（RetroVacベクター、RetroVac vector）では、これらは特に、例えばDavisionら（1989，J．Mol．Bio．210：749-769）およびPfleidererら（1995, Protein Expr. Purif. 6：559-569）によって記載される天然および合成プロモーターの両者を含む初期プロモーターである。
【００１３】
このような構築物を調製するため、例えばプロウイルスＤＮＡの５’末端由来のＵ３領域を欠失させ、ポックスウイルス特異的プロモーターと置き換えることができる。同様に、プロウイルスＤＮＡの３’末端由来のＵ５領域を欠失させることができ、「Ｒ」領域の末端にＴＴＴＴＴＮＴシグナルを付加することができる。転写物末端の繰り返し領域「Ｒ」は逆転写に必須であり、これゆえベクター粒子の機能性に必須である。通常の転写開始の上流での開始は非繰り返し５’末端を有する転写物の合成を誘導し、これゆえ予想されるように、ベクターの力価を減少させる。正しいＲＮＡの５’末端を得る観点から、原型構築物に挿入されるポックスウイルスプロモーターの開始部位それぞれは個々のケースで最適にするべきである。このような構築物の最適化は当業者の一般知識の範囲内にあり、大きな労力なしに実行できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のキメラポックスウイルスを用いて、例えばＷＯ９７／３５９９６に記載の、パッケージング成分を発現する適当なパッケージングセルラインを感染させることにより欠損レトロウイルス粒子を簡単に製造できる。
本発明の特別な態様として、キメラポックスウイルスはベクター成分およびパッケージング成分をコードする配列を含む。
ベクター成分およびパッケージング成分の両方を含む、本発明のキメラポックスウイルスは、標的細胞内でパッケージング成分の遺伝子およびレトロウイルス欠損ゲノムをコードする転写単位の両方を発現するため、インシトゥー（in situ）で組換え欠損レトロウイルスを遊離させることができる。レトロウイルス複製シグナルおよびパッケージングシグナルに加えて、レトロウイルス欠損ゲノムは好ましくは、レトロウイルス長末端繰り返し（ＬＴＲ）プロモーター自体か、あるいは別のプロモーターのどちらかによって制御される、形質導入され発現される外来遺伝子をも含む。
【００１５】
本発明の範囲内では「パッケージング成分」は、レトロウイルスベクターの形成に必要なレトロウイルスのあらゆる遺伝子、例えばgag-polおよびenvを意味する。本発明のキメラポックスウイルス（いわゆるRetroVacベクター）を構築するため、単純レトロウイルス、例えばＭＬＶ、および複合レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をも用いることができる。同様に、宿主スペクトルを変化させるため、すでにレトロウイルスベクターについて記載したように、形質転換するレトロウイルス粒子に対して異種エンベロープタンパク質（例えばＶＳＶ−Ｇ）を発現させることができる。概して、レトロウイルスベクターのさらなる開発のほとんどは、RetroVacベクターにも適用することができる。これには、組織特異的プロモーターおよび外来ＤＮＡの部位特異的組込みのためのベクターの制御下における外来遺伝子の発現が含まれる。
【００１６】
本発明では、gag、polおよびenv遺伝子はポックスウイルスプロモーターの制御下にあることが好ましい。ポックスウイルスの発現特性にしたがって、大きな初期部分を有するプロモーターが好ましい。パッケージング成分をコードする配列gag／polおよびenvは、ポックスウイルス／ワクシニアウイルス特異的プロモーターの制御下、ポックスウイルスゲノムの必須領域または必須でない領域に組込むことができる１つの転写単位で、あるいは複数の異なる転写単位で発現させることができる。
【００１７】
ポックスウイルス転写物にはスプライシングが起きない。したがって発現にスプライシングを含むレトロウイルス遺伝子は、本発明のさらなる態様では、イントロンを伴わない読み枠としてキメラポックスウイルス中にクローン化する。選択するレトロウイルス系に応じて、このことを遺伝子env、tat、refまたは他の遺伝子に適用する。
【００１８】
本発明に記載のキメラウイルスを用いて、欠損レトロウイルス粒子をインビトロおよびインビボの両方で簡単に産生できる。従来、欠損レトロウイルス粒子に関するすべての成分がコードされ、１つの単一の担体ウイルス上に組合されている系は開示されていない。このことは上記ベクターをインビボにおいて効率的に適用するための必須の必要条件である。
キメラポックスウイルスに基づく形質導入欠損レトロウイルスのパッケージングベクターおよび分配／増幅系の開発は、従来記載されていなかった。しかし、記載されていたことは、ポックスウイルスベクター中のレトロウイルス成分、特にＨＩＶのgag-polおよびenvの発現にポックスウイルスベクターを用いることである（Moss、1996，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 93：11341-11348、Paoletti、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：11349-11353)。しかし、これらの研究の目的は基礎的なウイルス学的研究およびワクチン開発である。これゆえ、例えばＶＶ（ワクシニアウイルス）におけるＨＩＶ−１ gag-pol読み枠の発現は擬似粒子の形成を導くことが知られている（Karacostasら、1989，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 86：8964-8967)。同様にgagおよびenvの同時発現は、ワクチン開発に特に適したＨＩＶ様粒子の形成を誘導する（Haffarら、1990，J．Virol．64：2653-2659)。また、ＳＩＶ候補ワクチンとしてポックスウイルスベクターにおけるgag-polおよびenvの二重発現物が記載されている（Hirschら、1996，J．Virol．70：3741-3752)。
【００１９】
本発明のキメラポックスウイルス用ベクターとしては、特にコルドポックスウイルスが使用され、また、オルトポックスウイルス群およびアビポックス（avipox）ウイルス群由来のウイルスが使用される（Moss、1996，Poxviridae：the viruses and their replication. In：Fieldsら、(ed.) Fields Virolory. Third Edition (3rd. Ed.) Vol. 2. Lippincott-Raven, Philadelphia, 2637-2671)。しかし、哺乳類細胞に感染するが、その中で増殖しないポックスウイルス（非複製ベクター）を用いるのが好ましい。これゆえ、このようなベクターとしてワクシニアウイルス、特に、弱毒ワクシニアウイルス（Paoletti，1996，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 93：11349-11353)、修飾ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara、ＭＶＡ)またはＷＯ９５／３００１８およびHolzerら（1997，J．Virol，71：4997-5002）に記載の欠損ワクシニアウイルスを用いるのが好ましい。最後に述べた欠損ウイルスベクターは容易に、１０8プラーク形成単位（ＰＵＦ)／ｍＬの力価まで増殖させることができ、１０11ＰＵＦ／ｍＬの力価まで濃縮することができる。さらに、例えばＤ４欠失欠損ウイルスは複製の初期に残存し、初期ＲＮＡの持続した合成を誘導する。初期ワクシニアウイルス（ＶＶ)−ＲＮＡのみが５’および３’末端の規定を行い、これが機能的レトロウイルスゲノム合成の基礎的な必要条件である。レトロウイルスベクターに関するすべての遺伝情報を発現するワクシニアウイルス欠損粒子は、感染細胞内で非複製レトロウイルス粒子を形成させ、この粒子が形質転換潜在能を示す。上記のように特にワクシニアウイルスは１０11ＰＵＦ／ｍＬの力価まで濃縮することができるため、形質転換に基づく力価（これはＣＦＵ／ｍＬで表される）は通常のレトロウイルス力価（＞１０6−１０7）より高い。さらに、レトロウイルス粒子のインシトゥー発現によって経時的に放出されるすべての形質転換用粒子は形質導入に適しており、レトロウイルスのインビトロ産生におけるような、細胞培養物上清の容量当たりの形質導入用粒子には適切でない。
【００２０】
本発明の特別な態様では、ＷＯ９５／３００１８に記載されるような非複製ワクシニアウイルスを非複製欠陥レトロウイルスに関する遺伝情報の担体として用いる。外来遺伝子およびパッケージングシグナルpsiを含む修飾レトロウイルスゲノムならびにレトロウイルス遺伝子gag-polおよびenvの両者は欠損ワクシニアウイルスのゲノムにコードされる。パッケージング成分をコードする配列gag/polおよびenvは、ポックスウイルス／ワクシニアウイルス特異的プロモーターの制御下、１つの転写単位で、あるいはいくつかの転写単位で発現させることができ、ポックスウイルスゲノムの必須領域または必須でない領域に組込むことができる。ベクター成分の配列は、ポックスウイルス、好ましくは初期ポックスウイルスプロモーターの制御下、組換えウイルスの必須領域または必須でない領域に自律転写単位として挿入することができる。必須領域に挿入するのが好ましい。
【００２１】
ＤＮＡ配列ＴＴＴＴＴＮＴは初期ポックスウイルス／ワクシニア転写の終結を導く。効率的にレトロウイルス配列を発現するために、レトロウイルス配列内または外来遺伝子内に存在することもあるＴＴＴＴＴＮＴシグナルはそれぞれ、レトロウイルスタンパク質のアミノ酸配列を変化させず、あるいは欠損レトロウイルスのＲＮＡゲノム上の制御シグナル、例えばpsi、および組込み領域「att」を崩壊させずに点突然変異によって修飾すべきである。
【００２２】
本発明の特別な態様では、パッケージング成分およびベクター成分をコードする配列はそれぞれ、いかなるポックスウイルス／ワクシニアウイルス特異的終止シグナルも含まない。
ベクター成分配列の発現に関するかぎりでは、本発明のキメラポックスウイルス−RetroVac系において、ベクター成分配列をポックスウイルス特異的プロモーターの転写制御下に置くことが好ましい。
本発明の好ましいキメラ欠損ワクシニアウイルス構築物では、初期ワクシニアウイルス転写物の終結用シグナルは３’領域の下流に挿入され、これゆえ生じるｍＲＮＡの３’末端は前記レトロウイルスベクターゲノムの３’末端と異なる。いわゆる初期ワクシニアｍＲＮＡについては、ほとんどが規定の３’末端を有する。ウイルス転写物の大部分を構成する後期ワクシニアｍＲＮＡは具体的なシグナルで終結せず、異なる長さを有し、それゆえレトロウイルスベクターゲノムとして適当でない。Ｄ４−欠損ＶＶは複製の後期には入らない。このことはタンパク質の35Ｓ標識実験およびノザンブロット実験において初期発現が予想外に長く持続することによって証明された（Holzerら、1997, J. Virol. 71：4997-5002)。即ち、これらは規定のレトロウイルスゲノムの合成のための、ポックスウイルス間に特有なツールであることが証明された。
【００２３】
本発明のキメラポックスウイルスの１つの利点は、これらを非常に高いウイルス力価にまで増殖させ、濃縮することができることである。さらにポックスウイルス、特にワクシニアウイルスから派生したベクターは非常に安定であり、肝臓または脾臓のような器官に効率的に感染し、そして複製しない形質転換レトロウイルス粒子を直接標的器官において産生する（レトロウイルス粒子のインビボ増幅)。
ポックスウイルスは組織特異的（最初に結合した器官に特異的）であるから、本発明のキメラポックスウイルス、特にキメラワクシニアウイルスによって組織特異的に形質転換が行われる。例えばキメラワクシニアウイルス（RetroVacハイブリッドベクター）による感染は、ワクシニアウイルスの向性に対応し、また用いるレトロウイルスエンベロープタンパク質に対するレセプターを発現している組織で優先的に起こる。用いるワクシニアウイルス株および擬似タイピングの適当な組合せを介して、治療遺伝子およびレトロウイルスベクターの両者のより厳密なターゲティングが達成できる。
【００２４】
キメラポックスウイルスベクター、特に欠損ワクシニアウイルスに基づくRetroVacベクターは、外来ＤＮＡを標的細胞に安定に組込むレトロウイルスの能力とポックスウイルス／ワクシニアベクターの技術的利点とを合わせ持つ。この系の主な特徴は宿主細胞にキメラポックスウイルス、特にワクシニアウイルスベクターに基づくRetroVacベクターが感染するときに、機能的レトロウイルス粒子の形成に必要なタンパク質が発現され、外来遺伝子を含むｍＲＮＡがゲノムＲＮＡとして転写されてレトロウイルス粒子にパッケージングされることである。これらの粒子は増殖できない（複製欠陥性）が、形質転換潜在能力は有している。最初にキメラポックスウイルス、特にキメラワクシニアウイルスによって感染された細胞は死ぬが、形成されるレトロウイルス粒子による二次レトロウイルス感染の細胞では、レトロウイルス配列、およびしたがって外来遺伝子が細胞ゲノム中に恒久的に組込まれる。
【００２５】
本発明のキメラポックスウイルスによる欠損レトロウイルス粒子の遊離は、レトロウイルスの転写およびゲノムＲＮＡのキャッピングが通常、核で生じることを考えると驚くべきことである（Coffin、1996，Retroviridae：the viruses and their replication. In：Fieldsら、(ed.) Fields Virology. Third Edition (3rd Ed.) Vol. 2, Lippincott-Raven, Philadelphia, 1767-1847)。示したキメラポックスウイルス系では、転写およびキャッピングが細胞質で生じる。これゆえワクシニアウイルス特異的キャップ構造はレトロウイルスパッケージングを妨げない。驚くべきことに、細胞質性ポックスウイルス／ワクシニア転写系によって産生される転写物がレトロウイルス転写および複製系と両立可能であることがわかった。核で認識されるポリアデニル化シグナルがプロウイルスのＵ３およびＲ領域内に局在することを考えるかぎりでは、このことは予想できないことであった。
【００２６】
概してポックスウイルスは細胞溶解性のウイルスであり、これによりキメラポックスウイルスによって感染された細胞は多くの場合死ぬ。組織中に生じる障害のため、近隣の細胞の分裂が引き起こされ、これゆえ形成されるレトロウイルス粒子によるレトロウイルス性形質転換をさらにより受けやすくなる。外胚葉細胞の場合には、ポックスウイルス自身の成長因子によってこの増殖作用が増加する。
したがって特別な態様では、本発明のキメラポックスウイルスは成長因子または有糸分裂促進物質をコードする配列を含む。これにより、ポックスウイルス感染細胞の近隣の細胞の増殖作用はキメラポックスウイルスの発現によって増加され得る。
さらなる特別な態様では、レンチウイルスに基づいてRetroVacベクターを構築することが可能であるが、系に所望の性質を与える付随レンチウイルス遺伝子（accessory lentivirus gene）はＶＶ担体内に発現されなければならない。
【００２７】
プラスミドトランスフェクション、キメラアデノウイルス／レトロウイルスベクターまたはキメラヘルペスウイルス／レトロウイルスベクターとは対照的に、ワクシニアウイルスによる発現は宿主細胞の細胞質で生じる。プラスミドトランスフェクションの後、あるいはアデノウイルス／レトロウイルス感染の場合、細胞質の転写装置の援助により外来遺伝子の転写が核内で生じるが、ワクシニアウイルスの遺伝子発現は、細胞の転写装置とは異なるウイルスの転写装置を用いて、もっぱら細胞質内（サイトソル）で起こる。これにより複製レトロウイルスが発生する可能性が非常に低いかぎり、このことは本発明のポックスウイルスベクターの利点である決定的な安全性に寄与する。ワクシニアウイルスによるゲノムレトロウイルスＲＮＡの転写は標的細胞の核から独立して起こるので、このアプローチはもっぱら最適な外来遺伝子発現および形質導入標的細胞の安全性の観点から、レトロウイルスゲノム上での核転写シグナルの配置を初めて可能にする。同様に、イントロンはワクシニアウイルス系におけるベクターＲＮＡの発現に影響しないので、治療遺伝子の発現を高めるのにイントロンを用いることができる。
【００２８】
細胞質で複製するＤＮＡウイルスに基づく本発明のウイルスベクター系のさらに特別な利点は、核内でのウイルス増殖とは異なり、細胞質で転写されるウイルスベクターの生活環ではスプライシングが生じないので、レトロウイルス転写単位が、通常は核と共にあることが許容されず、あるいは可能でない転写シグナルを含むことができることである。これゆえRetroVac系では、例えばレトロウイルスのパッケージングシグナルpsiをスプライシングシグナルの横に置くことができ、これにより、パッケージングシグナルを有さないためにレトロウイルスゲノムの本質的性質を喪失したＲＮＡが宿主細胞におけるレトロウイルス欠損ゲノムの形質導入および同ゲノムの転写後に誘導される（図２Ｃ参照)。この可能性はポックスウイルス系で産生されるレトロウイルス欠損ゲノムの系の安全性を実質的に増加させる。野生型状況と異なるパッケージングシグナルの機能性はすでに示した。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、レトロウイルス欠損ＲＮＡを細胞質で転写する場合、レトロウイルス性形質導入を介してイントロン−エキソン構造を有する確立した転写単位を損傷なしに（スプライシングなしに）宿主細胞のゲノムに組込むことができることである（図２Ａ参照)。恒久的に発現するセルラインを確立する場合には、概して、プロモーター、外来遺伝子のオープン読み枠（ＯＲＦ)、イントロンおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットを転移させ、細菌プラスミドにクローン化する。最適なｍＲＮＡ産生のためには、イントロンが転写単位内にあることが必要とされ、このことは特にトランスジェニック動物において観察されている。市販の高等細胞用発現ベクターのほとんどはその発現カセット内に経験的に定められたプロモーター−イントロンの組合せを含む：例えばベクターｐＣＭＶβ上のＣＭＶプロモーター／エンハンサーＳＶ４０イントロンの組合せ（Clontech Laboratories, Palo Alto）は首尾よいことが証明されている。従来既知のレトロウイルスまたはキメラ遺伝子転移ベクターそれぞれによって、このようなイントロン−エキソン構造を有する最適化単位を形質導入することはできない。
【００３０】
本発明に記載のRetroVac系はこの問題を解決する。これは、スプライシング装置が存在しないため、転写中にワクシニアウイルス中のイントロンは除去されないからである。したがって、RetroVac系で産生されるレトロウイルス欠損ゲノムの転写後、完全な転写単位を標的細胞に組込むことができる（図２Ａ参照)。凝固第ＶＩＩＩ因子のような遺伝子治療のために発現させることが困難なｃＤＮＡを転移する点でこれは特に重要であり、最適化プロモーター／イントロンの組合せの転移を可能にする。
本発明の特別な態様として、本発明に記載の系によりイントロン含有ゲノムを含む欠損レトロウイルス粒子を提供する。
【００３１】
細胞質性の転写系によってのみ標的細胞の定められた部位に転移され得るＲＮＡプロセッシングシグナルは、核内において転写物の定められた終結を生じさせる内部ポリアデニル化シグナルである（図２Ｂ)。核内における完全レトロウイルス欠損ゲノムの完成前の、例えばRetroVac系で産生されるレトロウイルス欠損ゲノムの形質導入による転写物の終結は、いったん組込まれた外来遺伝子は、その転写物が成熟前に終結するため、さらに形質導入させることができないので、特に安全な遺伝子治療を可能にする。同様に、スプライシングシグナル間のパッケージングシグナルの局在（図２Ｃ）は、RetroVac系でのみ可能であり、宿主細胞内でパッケージングシグナルを欠いたレトロウイルス欠損ゲノムの転写を誘導する。これゆえ、内部ポリアデニル化シグナルと組合せて、特に安全な遺伝子カセットを転移させることができる。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、上記明確にしたタイプのキメラポックスウイルスおよび製薬的担体を含む組成物に関する。
本発明に記載のRetroVac系は、レトロウイルスで遺伝子治療する意義のあるすべての適用において利用することができる。これは血漿タンパク質欠損、特に血友病（第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子欠損）およびエリトロポエチン欠損を処置するためのインビボ遺伝子治療に適している。投与は静脈内または筋肉内が可能である。
適当に製剤化すれば、本発明に記載のキメラポックスウイルスの安定性は、ベクターをスプレー剤として経口投与することを可能にし、これにより嚢胞性繊維症の吸入処置が可能となる。
【００３３】
RetroVacベクターのさらなる適用は腫瘍治療である。例えば、いわゆる自殺遺伝子が腫瘍またはその転移物に転移することは動物実験モデルにおいて裏付け証明されたことが示されている（Carusoら、1993，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 90：7024-7028. Culverら、1992，Science 256：1550-1552)。このような実験では、無毒性ヌクレオシド類似体（例えばガンシクロビル）を有毒なものに変換するＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を、欠損レトロウイルス粒子をインシトゥーで遊離するパッケージングセルラインを腫瘍内注射することによって形質導入させ、次いでガンシクロビルでの化学療法を実行する。これにより本発明のRetroVacベクターを用いて、自殺遺伝子を安全に、そしてより効率的に投与できる。
【００３４】
同様にアポトーシス誘導性腫瘍抑制遺伝子、例えば腫瘍の５０％以上を変化させるｐ５３遺伝子は外来遺伝子として本発明のRetroVacベクターに挿入できる。これらの腫瘍抑制遺伝子を遺伝子治療的に転移させると、腫瘍細胞は内発性制御のために成長をやめる。
腫瘍治療（例えば白血病の治療）のためのエクスビボ細胞形質導入も同様に可能であり；さらにガン治療のために直接腫瘍内注射することができる。
系の安全性を増加させるために、インビボにおいて形質導入手順のせいで腫瘍形成の活性化が生じた場合に、化学治療を可能にするいわゆる自殺遺伝子を運搬するベクター、例えば挿入チミジンキナーゼ遺伝子を有するヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）を用いることができる。
【００３５】
また、レトロウイルス粒子は特に効率的な形質導入を可能とし、ＲＮＡプロセッシングシグナル（イントロン、ポリアデニル化部位）の転移により、最適な遺伝子カセットを転移させることができるため、この系は恒久的セルラインを産生するために用いることができる。このように遺伝子カセットを非常に効率的に転移させることを初めて可能にし、これによりスクリーニング技術と組合せて高度に発現する細胞クローンの迅速な同定が可能となる。
これゆえ、本発明の特別な態様は、特に遺伝子治療および腫瘍治療に用いることができる医薬を製造するための、本発明に記載のキメラポックスウイルスの使用に関する。
本発明の範囲内では、特にイントロン含有ゲノムを含んだままである点に特徴がある上記キメラポックスウイルスによって欠損レトロウイルス粒子を得る。
以下に実施例および図面を挙げ、本発明をより詳細に説明するが、これらに限定されない。
【００３６】
【実施例】
実施例１：ワクシニアウイルス（ＶＶ）欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮの構築
プロウイルスベクタープラスミドｐＬＸＳＮ（Millerら,1989, Riotechniques. 7: 980-990）のレトロウイルス欠損ウイルスゲノムにおいて、初期ワクシニアウイルス（ＶＶ）転写終止シグナルを除去し、このように除去されたゲノムを強力なＶＶ初期プロモーターの後ろにクローニングした後、ＶＶ欠損ウイルス種ｖＤ４−ｖＡ（Holzerら, 1997, J. Virol. 71: 4997-5002）のチミジンキナ−ゼ（ｔｋ）座へ挿入した。これにより、レトロウイルス欠損ゲノムは、生じたＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮにおいて、初期ＶＶ感染サイクルにおいて転写された。
【００３７】
プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮの構築
プラスミドｐＬＸＳＮ（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）におけるレトロウイルス欠損ゲノムは、以下のような順序の遺伝エレメントを有してｓている：ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＭＣＳ／ＳＶ４０−ｎｅｏ−遺伝子カセット−ＬＴＲ（ＬＴＲ、長末端反復配列；ｐｓｉ、レトロウイルスＲＮＡのためのパッケージングシグナル；ＭＣＳ、多重クローニング部位（multiple cloning site）；ＳＶ４０−ｎｅｏ、ＳＶ４０プロモーターネオマイシン耐性遺伝子カセット）。この構築物のＭＣＳに、適当な外来遺伝子を挿入し得る。ＳＶ４０−ｎｅｏ遺伝子カセットは、その助けによりレトロウイルス形質導入細胞が選択され得る選択マーカーとしてはたらく。
【００３８】
ｐＬＸＳＮのプロウイルスレトロウイルスＤＮＡは、初期転写の部分的な終止を導く３つのＴＴＴＴＴＮＴシグナルを有している。個々のフラグメントをＰＣＲによってクローニングし、突然変異誘発によって修飾した（図３）。このために、テンプレートとしてプラスミドｐＬＸＳＮを用い、異なるオリゴヌクレオチドによって以下の３つのＰＣＲフラグメントを増幅した。これにより、存在するＴＴＴＴＴＮＴシグナルを修飾する点変異を導入した。フラグメントＬＸ１、ＬＸ２およびＬＸ３の調製を以下に記載するように行った。
【００３９】
ＬＸ１：オリゴヌクレオチドプライマーｏＲＶ−５（５'−ＴＡＣＧＴＡＣＧＧＣ  ＧＣＧＣＣＡＧＴＣＴ  ＴＣＣＧＡＴＡＧ−３'）およびｏＲＶ−６（５'−ＧＡＡＣＣＧＧＴＣＧ  ＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴ  ＧＡＣ−３'）によって、ｏＲＶ−５によりＳｎａＢＩ開裂部位が導入され、ｏＲＶ−６によりＡｇｅＩ開裂部位が導入されている１．６ｋｂのフラグメントを作成した。
【００４０】
ＬＸ２：オリゴヌクレオチドプライマーｏＲＶ−７（５'−ＡＧＡＣＧＴＣＣＣＡ  ＧＧＧＡＣＴＴＴＧＧ  ＧＧＧＣＣＧＴＡＴＴ  ＴＧＴＧＧＣ−３'）およびｏＲＶ−８（５'−ＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣ  ＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣ  ＴＣＴＧＣＡＴＡＡＡ  ＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴ  ＴＡＧ−３'）によって１ｋｂのフラグメントを作成し、ＴＴＴＴＴＮＴモチーフをこの２つのプライマーによって点変異により修飾した。ｏＲＶ−７はＡａｔＩＩ開裂部位の領域に結合し、ｏＲＶ−８はＳｆｉＩ開裂部位の領域に結合する。
【００４１】
ＬＸ３：オリゴヌクレオチドプライマーｏＲＶ−９（５'−ＣＧＡＣＣＧＧＴＴＣＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴ−３'）およびｏＲＶ−１０（５'−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＧＧＡ−３'）によって、設計したベクター構築物の３'末端を１．２ｋｂのＰＣＲフラグメントとして作成した。ｏＲＶ−１０は“Ｒ”配列の３'末端に結合してＮｏｔＩ開裂部位を導入する。
【００４２】
ｎｅｏ読み取り枠のＴＴＴＴＴＮＴシグナルを修飾するために、プラスミドｐＬＸＳＮにおいて突然変異誘発を行った。突然変異誘発は、Stratagene 社の QuickChange(登録商標)突然変異誘発キットおよびプライマーｏＲＶ−３５（５'−ＡＡＡＴＡＧＡＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＡＣ−３'）およびｏＲＶ−９によって行った。得られたプラスミドをｐＬＸＳＮｍｕｔ（図４）と命名し、これは突然変異誘発した部位においてＰｉｎＡＩ開裂部位を含んでいる。
【００４３】
ＬＸ１ ＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲＩＩ（Invitrogen）へクローニングし、所望の方向でＰＣＲ生成物を含むプラスミドを選択し、ｐＣＲ−ＬＸ１（ｂ）と命名した。ＬＸ２ ＰＣＲ生成物を酵素ＡａｔＩＩおよびＳｆｉＩで開裂し、ＡａｔＩＩおよびＳｆｉＩで開裂したｐＣＲ−ＬＸ１（ｂ）へ挿入した。得られたプラスミドは、修飾されたＴＴＴＴＴＮＴシグナル以外はｐＣＲ−ＬＸ１（ｂ）と同一であり、ｐＣＲ−ＬＸ４と命名した。プラスミドｐＬＸＳＮｍｕｔ由来の１．４ｋｂのＳｆｉＩ／ＳａｃＩフラグメントをＳｆｉＩ／ＳａｃＩで開裂したｐＣＲ−ＬＸ４にライゲーションしてｐＣＲ−ＬＸ４＋を得た。このプラスミドは、一番外側の３'末端を除いて、ベクターの転写された領域全体を含んでいる。
【００４４】
正確な３'末端を、ｐＣＲ−ＬＸ３から０．８ｋｂフラグメントとして、ＶＶ組換えベクターｐＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰ（Pfleidererら, 1995, Protein Expr. Purif. 6: 559-69）へ挿入した。得られたプラスミドをｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ３（図３）と命名した。ｐＣＲ−ＬＸ４から２．７ｋｂのＳａｃＩ／ＳｎａＢＩフラグメントとして切り出し、ＳａｃＩおよびＳｔｕＩで開裂したｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ３へクローニングすることによりプラスミドベクターｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮが得られた。これは、強力なＶＶプロモーターの制御下で、５'ＬＴＲの“Ｒ”配列（Coffin, J. M., 1996, Retroviridae: The viruses and their replication, p. 1767-1847. In: Fieldsら（編）Fields, Virology, 第３版  Vol.2, Lippincott-Raven, Philadelphia）の始めから３'ＬＴＲの“Ｒ”配列の終わりまでベクターｐＬＸＳＮの転写された領域全体を含んでいた（図４）。その中では、始めに存在していた３つのＴＴＴＴＴＮＴモチーフが修飾されている。
【００４５】
ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮの構築
ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮを構築するため、ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞を、欠損ＶＶ ｖＤ４−ｖＡについての標準的なプロトコル（Holzerら, 1997, J. Virol. 71: 4997-5002）にしたがって感染させ、プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮによりトランスフェクトした。ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞においてウイルス単離物をｇｐｔ選択下でプラーク精製した（Falknerら, 1998, J. Virol. 62: 1849-1854）。このようにして得られたＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮは、ｐＬＸＳＮの欠損レトロウイルスＲＮＡゲノム全体を発現する。ｖｄ−ＬＸＳＮの正確なゲノム構造は、サザンブロッティングおよびＰＣＲによって証明された。
【００４６】
実施例２：パッケージング細胞系ＰＴ６７におけるＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮによる欠損レトロウイルス粒子の製造。
欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮはレトロウイルスの欠損ゲノムを含み、転写する（実施例１参照）。細胞系ＰＴ６７（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA より入手）は、レトロウイルス欠損ゲノムのパッケージングに必要な、ネスミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）のｇａｇ−ｐｏｌおよび ｅｎｖ遺伝子を発現する（MIllerら, 1996, J. Virol. 70: 5564-71）。欠損ＶＶがｇａｇ−ｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質の存在下で欠損レトロウイルス粒子を形成し得るという仮説を確かめるために、ＰＴ６７細胞をｖｄ−ＬＸＳＮで感染させた。ＰＴ６７細胞の培養は、RetroXpress System User Manual. Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA, 1997 に記載されているように標準的な条件にしたがって行った。ｖｄ−ＬＸＳＮによる感染は、１細胞あたり０．０５または０．５ＰＦＵ（プラーク形成単位）で行った。種々の時点（感染後３時間から７２時間）で、５００μｇ／ｍLのＧ４１８（Millerら, 1996, J. Virol. 70: 5564-71）の存在下、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）の上清中のレトロウイルスベクター粒子の力価を測定した。レトロウイルス力価は、ＶＶ感染後６時間で最大に達し、この範囲ではそれぞれ vｄ−ＬＸＳＮ感染用量に対して無関係であった。典型的な実験では、１細胞あたり０．５ＰＦＵｖｄ−ＬＸＳＮでの一次感染について、培養上清１ｍLあたり、３時間後で１０2ＣＦＵ（コロニー形成単位）、そして６時間後で２×１０2ＣＦＵであると計測された。プラスミドｐＬＸＳＮでの対照実験は、感染４８時間後で１０2ＣＦＵ〜１０3ＣＦＵであった。ｖｄ−ＬＸＳＮ感染によって誘導されたレトロウイルス力価は、感染１２時間後で２０ＣＦＵ／ｍLに減少し、感染後４８〜７２時間後で最大２×１０2ＣＦＵ／ｍLに上昇した。この２回目の上昇は最初の感染用量とは無関係であり、ＶＶ非感染ＰＴ６７のレトロウイルスが介在する形質転換に帰すものである。ＰＴ６７におけるプラスミドｐＴＫｇｐＬ−ＬＸＳＮのトランスフェクション後にレトロウイルス粒子は得られなかった。このことは、それ以外では、例えば、アデノウイルスキャリヤーによるこの構築物の発現は、ウイルスの状況（context）においてのみ可能であるということを証明している。この例は、欠損ＶＶが、レトロウイルス欠損ゲノムを形質導入するキャリヤーとして適当であることを示している。結果は、核においてゲノムＲＮＡのキャッピングおよびレトロウイルスの転写が正常に起こっている限りにおいて驚くべきものである（Coffinら、前掲）。示したRetroVac系では、細胞質において転写とキャッピングがワクシニアがコードした酵素によって起こっている。ＶＶ特異的キャップ構造は明らかに、レトロウイルスパッケージングにとって障害とはならない。
【００４７】
実施例３：ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ｅ１０Ａ１の構築
実施例１および２において、レトロウイルスゲノムを転写する欠損ＶＶは、パッケージング細胞系において機能的な欠損レトロウイルスを形成することが示された。以下において、欠損ＲＶ粒子の形成のための成分のすべてを１つの欠損ＶＶにおいて一緒にするための更なる工程として、ＶＶのＤ４座で１０Ａ１ ｅｎｖ遺伝子を発現させた。ｅｎｖ領域のＴＴＴＴＴＮＴモチーフを削除しなければならないため、クローニングは途中の工程で行った（図５）。
【００４８】
プラスミドｐＤ４−ＳＸの構築
プラスミドｐＣＲ−ＳＸ３ｍｕｔ：ＭＬＶｅｎｖ遺伝子（ｅｎｖ ＳＸ：４７０４Ａおよび１０Ａ１種に由来するハイブリッド）を、ｏＲＶ−３７（５'−ＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴＣ−３'）およびｏＲＶ−３８（５'−ＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴＡＧＧＣＴＴＣ−３'）により、ＰＴ６７細胞系（Millerら, 1996, J. Virol. 70: 5564-5571）から２ｋｂのＰＣＲ生成物として増幅し、プラスミドベクターｐＣＲＩＩへクローニングした。ｅｎｖ読み取り枠のＴＴＴＴＴＮＴシグナルを、突然変異誘発によりこのプラスミド上で修飾した。突然変異誘発は、Stratagene社の QuickChange（登録商標）突然変異誘発キット、およびプライマーｏＲＶ−４１（５'−ＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＧＡＣＴＡＧＴＧＡＧＡＧ−３'）およびｏＲＶ−４２（５'−ＣＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣ−３'）により行った。得られたプラスミドをｐＣＲ−ＳＸ３ｍｕｔと命名した。
【００４９】
プラスミドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔ：ｐＣＲ−ＳＸ３ｍｕｔから、酵素ＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩにより、ｅｎｖ読み取り枠を２ｋｂのフラグメントとして切り出し、ＮｃｏＩおよびＳｔｕＩで開裂したプラスミドｐＴＫＬ−ｓｅｌＰへライゲーションし、プラスミドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔを得た。
【００５０】
プラスミドｐＴＫＬ−ｓｅｌＰ：プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰ（実施例１）において、開裂部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩにより、オリゴヌクレオチドｏＲＶ−２２（５'−ＡＧＣＴＣＧＣＡＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＣＡＣＡ−３'）およびｏＲＶ−２３（５'−ＴＡＴＧＴＧＡＴＧＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＧ−３'）を有する合成リンカーで０．３ｋｂフラグメントを置換し、さらに開裂部位ＮｓｉＩおよびＭｕｎＩを挿入した。
【００５１】
プラスミドｐＤ４−ＳＸ：強力なＶＶプロモーターｓｅｌＰおよびｅｎｖ読み取り枠からなる発現カセットを、酵素ＭｕｎＩおよびＮｏｔＩによりプラスミドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔから切り出し、ＭｕｎＩ／ＮｏｔＩ開裂させたｐＤ４−ｖＡへライゲーションした（２１）。このようにして得られたベクターｐＤ４−ＳＸ（図５）は、記載した発現カセットをＶＶ−Ｄ４座のフランキング配列の間に含んでいる。ＶＶにおけるこのＤＮＡの組込みによって、ｅｎｖ遺伝子を発現する欠損、非複製変異体が得られる。
【００５２】
ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ｅ１０Ａ１の構築
ＶＶ野生型ウエスタンリザーブ（ＷＲ）種によるｐＤ４−ＳＸの相同的組換えを、標準的な技術にしたがってＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞において行った。プラーク精製をＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞において行い、ｇｐｔ選択およびｌａｃＺ陽性プラークのスクリーニングについて２回、選択なしおよびｌａｃＺ陰性プラークのスクリーニングについて２回行った（Holzerら, 1997, J. Virol. 71: 4997-5002）。得られた単離物をｖｄ−ｅ１０Ａ１と命名した。ｅｎｖ発現の対照をウェスタンブロッティングにおいて行った。ＭｏＭＬＶ特異的抗血清は、Quality Biotech/Camden, NJから入手した（血清番号：８１Ｓ００００４４“破壊されたウイルス”）。
【００５３】
実施例４：ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ｅｇの構築
ＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠を、ＶＶベクターｖｄ−ｅ１０Ａ１（実施例３）のヘマグルチニン遺伝子座に挿入した。したがって、ｇａｇ−ｐｏｌMLVとｅｎｖ10-A1の両方を発現し、偽粒子（pseudoparticle）を形成することが可能な欠損ＶＶが生じる。このＭＬＶパッケージングベクターは、遺伝子治療に適当な外来遺伝子を含むレトロウイルスの欠損ゲノムをそこに挿入し得る、フリーのチミジンキナ−ゼ遺伝子座を依然として含んでいる（実施例５および６に記載）。
【００５４】
ｇａｇ−ｐｏｌ領域の３つのＴＴＴＴＴＮＴモチーフを削除しなければならなかったので、クローニングを中間の工程で行った（図６および図７）。
ＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠（５．２ｋｂ）を、パッケージング細胞系ＰＴ６７（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）からＰＣＲによって増幅した。このために、それらの末端が重複した４つのＰＣＲフラグメント（Ｇ１〜Ｇ４）を増幅した。プライマーにより、存在していた３つのＴＴＴＴＴＮＴモチーフが修飾されて、アミノ酸配列に影響を与えることなく適合性のある開裂部位が生じた。
【００５５】
フラグメントＧ１の増幅：オリゴヌクレオチドプライマーｏＲＶ−１１（５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴ−３'）およびｏＲＶ−１２（５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＧＴＴ−３'）によって、ｏＲＶ−１１によりＮｃｏＩ開裂部位が生じており、ｏＲＶ−１２によりＴＴＴＴＴＮＴシグナルが変異し、ＢａｍＨＩ開裂部位が導入されている、０．８ｋｂのフラグメントをＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５６】
フラグメントＧ２の増幅：オリゴヌクレオチドｏＲＶ−１３（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴ  ＣＴＴＴＴＴＣＴＧＡ  ＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴ−３'）およびｏＲＶ−１４（５’−ＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡ  ＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡ  ＧＴＧＴＡＣＣＡＣＴ  Ｇ−３'）によって、ｏＲＶ−１３によりＢａｍＨＩ開裂部位ならびにさらにそのフラグメントの３'末端にあるＳｓｐＩ開裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１４によりＥｃｏＲＩ開裂部位が導入されている、１．７ｋｂのフラグメントをＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５７】
フラグメントＧ３の増幅：オリゴヌクレオチドｏＲＶ−１５（５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＴ  ＴＣＴＧＣＣＴＧＡ−３'）およびｏＲＶ−１６（５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＧＣ  ＣＡＴＡＣ−３'）によって、ｏＲＶ−１５によりＴＴＴＴＴＮＴシグナルが変異し、ＥｃｏＲＩ開裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１６によりＳｐｅＩ開裂部位とさらにそのフラグメントの３'末端にあるＮｏｔＩ開裂部位が導入されている、２ｋｂのフラグメントをＭＬＶ−ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５８】
フラグメントＧ４の増幅：オリゴヌクレオチドｏＲＶ−１７（５’−ＡＴＡＴＣＴＡＣＴＡ  ＧＴＴＴＴＣＡＴＡＧ  ＡＴＡＣＣＴ−３'）およびｏＲＶ−１８（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴ  ＡＧＧＧＧＧＣＣＴＣ  ＧＣＧＧＧＴＴＡ−３'）によって、ｏＲＶ−１７によりＴＴＴＴＴＮＴモチーフが修飾されＳｐｅＩ開裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１８によりＮｏｔＩ開裂部位が導入されている、０．８ｋｂのフラグメントをＭＬＶ−ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５９】
プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇおよびｐＨＡ−ＭＬＶｇのクローニング
Ｇ２ ＰＣＲフラグメントをベクターｐＣＲＩＩ（Invitrogen, Inc）へクローニングし（ｐＣＲ−Ｇ２）、ここから酵素ＳｓｐＩおよびＮｏｔＩにより再び単離した（図６）。ＢａｌＩおよびＮｏｔＩで開裂したベクターｐＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰにおけるライゲーションにより、プラスミドｐＴＫ−Ｇ２を得た（図７）。Ｇ１ ＰＣＲ生成物を、酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩによってｐＣＲ−Ｇ２から切り出し、単離し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで線状化したプラスミドｐＴＫ−Ｇ２へライゲーションし、プラスミドｐＴＫ−Ｇ１２を得た（図５）。
【００６０】
Ｇ３ ＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲＩＩへライゲーションしてｐＣＲ−Ｇ３を得た。酵素ＢａｍＨＩおよびＳｔｕＩによる消化、クレノウ処理と再ライゲーションによって、１ｋｂの配列をｐＣＲ−Ｇ３から削除し、このようにして生じたプラスミドｐＣＲ−Ｇ３ｄへ、０．８ｋｂの大きさにしたＧ４ ＰＣＲ生成物を、開裂部位ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで挿入した。得られたプラスミドをｐＣＲ−Ｇ３ｄ４と命名した。酵素ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶによるｐＣＲ−Ｇ３の消化によって得られた１．１ｋｂのフラグメントを、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶで開裂したプラスミドｐＣＲ−Ｇ３ｄ４へ挿入することにより、ＭＬＶ−ｇａｌ−ｐｏｌ読み取り枠の３'側半分を含んでいるプラスミドｐＣＲ−Ｇ３４を得た。ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ開裂部位で３ｋｂのフラグメントを消化し、ｐＣＲ−Ｇ３４の再ライゲーションによりプラスミドｐＴＫ−１２へ再クローニングした。得られたプラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇには、強力な初期後期（early-late）ＶＶプロモーターｓｅｌＰの下流にＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠全体が含まれている（図７）。
【００６１】
プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇをＮｄｅＩ（部分的）およびＮｏｔＩにより開裂し、ｓｅｌＰ−ｇａｇ−ｐｏｌカセットを５．３ｋｂフラグメントとして単離した。フラグメントをクレノウ処理し、ＳｎａＢＩで線状化したＶＶ組込みプラスミドベクターｐＨＡ−ｖＡへライゲーションした。得られたプラスミドをｐＨＡ−ＭＬＶｇと命名した。
【００６２】
パッケージングベクターｖｄ−ｅｇの構築および機能性試験
プラスミドＤＮＡ ｐＨＡ−ＭＬＶｇおよび出発ウイルスｖｄ−ｅ１０Ａ１（実施例３）の相同的組換え、並びにプラーク精製を、標準的なプロトコルにしたがい、ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞（Holzerら, 1997, J. Virol. 71: 4997-5002）において行った。ｇａｇ−ｐｏｌとｅｎｖを発現する単離物をｖｄ−ｅｇと命名した。
さらに、発現したレトロウイルス遺伝子の機能性を、レトロウイルスベクターｐＬＸＳＮによる形質転換によって得られた３Ｔ３細胞クローンで試験した。このために、RetroXpress System User Manual, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA (1997)に記載されているように、３Ｔ３細胞を欠損ＬＸＳＮレトロウイルスで形質転換した。５つのＧ４１８耐性クローンを単離した。これら培養細胞の上清は非感染であり、したがって天然の３Ｔ３細胞の形質導入を引き起こすことができなかった。これら細胞系を組換えウイルスｖｄ−ｅｇで感染させた（ｍｏｉ＝１）。３日後、上清を回収し、３Ｔ３細胞の形質転換に使用した。形質転換実験は、Millerら, (1996. J. Virol. 70: 5564-5571)によって記載されたように行った。このように形質転換された３Ｔ３細胞はＧ４１８耐性であり、選択されたクローンの上清は形質転換されていなかった。このように観察された形質転換は、増殖可能なレトロウイルスの再活性化によっては起こらなかった。この実験によって、パッケージングベクターｖｄ−ｅｇによるレトロウイルス遺伝子の発現が、形質転換レトロウイルス欠損ゲノムのパッケージングを可能にすることが証明される。
【００６３】
実施例５：
RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮの構築
出発ベクターとしてのｖｄ−ｅｇＬＸＳＮにより、形質導入欠損レトロウイルス粒子の形成に必要な成分のすべてを発現するＶＶベクターを構築した。ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮの調製を、プラスミドＤＮＡ ｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮ（実施例１）およびパッケージングウイルスｖｄ−ｅｇ（実施例４）による相同的組換えにより、ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞（実施例１参照）において標準的なプロトコルにしたがって行った。ｇｐｔ選択下の、ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞における数ラウンドのプラーク精製において単離物を精製して、ｖｄ−ｅｇＸＬＳＮと命名した。ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮのスクロースグラジェント精製したウイルスストックによって、３Ｔ３細胞およびＲＫ１３細胞を感染させた（ｍｏｉ＝１）。６時間後、上清を回収し、実施例１と同様にして３Ｔ３細胞の形質転換について試験した。細胞系に依存して、１０6細胞の上清は１０2〜１０3ＣＦＵのレトロウイルスベクターを含んでいた。この実施例により、野生型細胞のRetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮによる感染は、形質転換レトロウイルスベクター粒子を発現するに十分であることが証明される。
【００６４】
実施例６：
第ＩＸ因子ｃＤＮＡ挿入によってｄＲＶ粒子を発現する RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＣ９の構築
以下の実験では、ヒトの凝固因子 ＦＩＸを RetroVacベクターへクローニングし、血友病Ｂの遺伝子治療に適当なレトロウイルス欠損粒子を製造する。この目的のために、ＲＮＡプロセシングを可能にするサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（Boshartら, 1985, Cell. 41: 521-530）と凝固因子ＦＩＸ−ｃＤＮＡおよび遺伝エレメントからなる遺伝子カセット（ＥＰ ０ ７１１ ８３５に記載された“ＦＩＸ遺伝子カセット”）を構築し、プラスミドｐＴＫ−ｇｐｔ−ＶＰへ挿入した。得られたプラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸを、パッケージングベクターｖｄ−ｅｇのｔｋ座に再結合し、RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＣ９を得た。
【００６５】
プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸの構築
第ＩＸ因子−ｃＤＮＡ（Kurachiら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 6461-6464）は、プライマーｏｍｉｔ．ＦＩＸ−１およびｏｍｉｔ．ＦＩＸ−２（図８）による突然変異誘発によって改変されたＴＴＴＴＴＮＴモチーフを含んでなる。得られたプラスミドをｐＣＭＶ−ＦＩＸｍｕｔと命名した。
ｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ。ｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮと同様、プラスミドベクターをＶＶ発現のためにｐＬＮＣＸに基づいて構築した。ｐＬＮＣＸのネオマイシン耐性遺伝子におけるＴＴＴＴＴＮＴモチーフをこの目的のために突然変異させた（プライマーｏＲＶ-３５およびｏＲＶ-９）。レトロウイルスベクター配列の右半分を、開裂部位ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにより、この突然変異したプラスミドｐＬＮＣＸｍｕｔからベクターｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮへトランスファーした。得られたプラスミドをｐＴＫｇｐｔ−ＶＰと命名した。ｐＴＫｇｐｔ−ＶＰは、以下のエレメント、ＶＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子フランク／ＶＶプロモーターｓｅｌＰ／ＲＶ−‘Ｒ’／ＲＶ−ｕ５／ｐｓｉ／Ｎｅｏ／ＣＭＶプロモーター／ＭＣＳ／ＲＶ Ｕ３／ＲＶ−‘Ｒ’／ＴＴＴＴＴＮＴ／ＶＶ−ｔｋフランクを含んでいる。
【００６６】
プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸを構築するために、ＣＭＶプロモーターの一部とＦＩＸ−ｃＤＮＡの全部を含んでなるＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＣＭＶ−ＦＩＸｍｕｔからＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（部分消化）で開裂したｐＴＫｇｐｔ−ＶＰへ挿入した。
【００６７】
RetroVac ベクターｖｄ−ｅｇＣ９の構築および試験
プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸを標準的な方法にしたがってパッケージングベクターｖｄ−ｅｇに再結合し、プラーク精製した（実施例５参照）。得られたウイルスをｖｄ−ｅｇＣ９と命名した。ｖｄ−ｅｇＣ９のスクロースグラジェント精製したストックを調製して、３Ｔ３およびＲＫ１３細胞を感染させた（ｍｏｉ＝１）。３日後、上清を回収して、実施例４と同様に３Ｔ３細胞の形質転換について試験した。細胞系に依存して、１０6細胞の上清は、１０2〜１０3ＣＦＵのレトロウイルスベクターを含んでいた。レトロウイルスＦＩＸ欠損粒子を含んでいる上清による半コンフルエントのＲＫ１３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３７）またはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５２）の感染によって、機能的な第ＩＸ因子（ＥＰ ０ ７１１ ３８５に記載されたように測定）が発現した。
【００６８】
実施例７：
ウサギにおける RetroVac ベクターｖｄ−ｅｇＣ９の注入およびウサギ血漿におけるヒト第ＩＸ因子の検出
以下の実施例では、動物実験において RetroVac ベクターｖｄ−ｅｇＣ９が in vivo でヒト第ＩＸ因子の発現を可能にすることが示された。
ニュージーランドホワイトラビットに１０8および１０9ｐｆｕのｖｄ−ｅｇＣ９を静脈投与し、１ヶ月間、２日毎に血液を採取し、ヒト第ＩＸ因子をＥＬＩＳＡにより定量した。注入前の血清を採取し、ＥＬＩＳＡがヒト第ＩＸ因子に特異的かどうかについて測定した。ヒト第ＩＸ因子は、血友病Ｂの治療に十分な濃度でウサギ血漿に存在した。４週間後、ウェスタンブロッティングで抗ヒト血漿タンパク質抗体の存在を測定した。対照実験（欠損ウイルスｖＤ４ｖＡによる感染）ではヒト第ＩＸ因子は検出されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  キメラワクシニアウイルスの構築の概略図である。図１Ａは、パッケージング成分およびベクター成分の可能な挿入位置を示している。パッケージング成分およびベクター成分はポックスウイルスプロモーターの転写制御下にあり、場合によりポックスウイルスゲノムの異なる領域に組み込まれていてもよい。図１Ｂは、本発明のポックスウイルスによる細胞の感染、および次いで細胞を感染させて安全な様式で宿主ゲノムに組込まれる欠損レトロウイルス粒子の産生を示す図である。
【図２】  細胞質において複製するキメラポックスウイルスと、特にスプライシング機構に関して核において複製するアデノまたはヘルペスウイルスの系との比較をそれぞれ示す図である。
【図３】  プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＳＸＮの構築を示す図である。
【図４】  プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＳＸＮの構築を示す図である。
【図５】  プラスミドｐＤ４−ＳＸの構築を示す図である。
【図６】  プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇの構築を示す図である。
【図７】  プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇの構築を示す図である。
【図８】  プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸの構築を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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