(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリペプチドであって、配列番号１の９位のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）残基、１０位のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）残基で、１３位のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）残基で、１４位のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）残基で置換されているポリペプチド：
（ａ）スタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳＰＡ）ドメインの誘導体であるポリペプチドであって、当該ＳＰＡドメインはＢまたはＺドメインであり、当該ＳＰＡドメインの１ないし２０アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、当該置換によって、当該ＳＰＡドメインの基本構造および安定性が実質的に失われず、当該置換によって当該ポリペプチドがヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の少なくとも１ドメインと相互作用する能力を有することとなっているポリペプチドであって、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＳＰＡドメインＺの誘導体であるポリペプチド、または当該ＳＰＡドメインＺの変異体の誘導体である、当該変異体がＳＰＡドメインＺと同じ基本構造および安定性を本質的に有するポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドであって、当該ＳＰＡドメインの少なくとも４アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドであって、配列番号１の少なくとも、９、１０、１３および１４位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、配列番号１の少なくとも９、１０、１３、１４および１７位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｅ）（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドであって、さらに配列番号１の１１、１８、２４、２５、２７、２８、３２および３５位の１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｆ）（ａ）ないし（ｅ）のいずれかのポリペプチドであって、ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の当該ドメインが９０ｋＤａドメインであるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のポリペプチドであって、配列番号１の１７位のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）残基で置換されているポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２のポリペプチドであって、配列番号１の３５位のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）、ロイシン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）またはフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換されているポリペプチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドであって、配列番号１の１７位のアミノ酸残基がリジン（Ｋ）残基で置換されているポリペプチド。
【請求項５】
請求項３のポリペプチドであって、配列番号１の３５位のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）残基で置換されているポリペプチド。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのペプチドであって、配列番号２ないし６、または８ないし４０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド：
（ａ）スタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳＰＡ）ドメインの誘導体であるポリペプチドであって、当該ＳＰＡドメインはＢまたはＺドメインであり、当該ＳＰＡドメインの１ないし２０アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、当該置換によって、当該ＳＰＡドメインの基本構造および安定性が実質的に失われず、当該置換によって当該ポリペプチドがヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の少なくとも１ドメインと相互作用する能力を有することとなっているポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＳＰＡドメインＺの誘導体である（ａ）のポリペプチド、または当該ＳＰＡドメインＺの変異体の誘導体である、当該変異体がＳＰＡドメインＺと同じ基本構造および安定性を本質的に有するポリペプチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドであって、当該ＳＰＡドメインの少なくとも４アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドであって、配列番号１の少なくとも、９、１０、１３および１４位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｅ）（ｂ）ないし（ｄ）のいずれかのポリペプチドであって、配列番号１の少なくとも９、１０、１３、１４および１７位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）のポリペプチドであって、さらに配列番号１の１１、１８、２４、２５、２７、２８、３２および３５位の１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、
（ｇ）（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのポリペプチドであって、ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の当該ドメインが９０ｋＤａドメインであるポリペプチド、
（ｈ）（ｂ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドであって、配列番号１の９位のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）残基、１０位のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）残基で、１３位のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）残基で、１４位のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）残基で置換されているポリペプチド、
（ｉ）（ｂ）ないし（ｈ）のいずれかのポリペプチドであって、配列番号１の１７位のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、グリシン（Ｇ）、またはアラニン（Ａ）残基で置換されているポリペプチド、
（ｊ）（ｂ）ないし（ｉ）のいずれかのポリペプチドであって、配列番号１の３５位のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）、ロイシン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）またはフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換されているポリペプチド。
【請求項７】
請求項６の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリペプチドであって、ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の当該ドメインが８０ｋＤａドメインであり、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、スタフィロコッカスタンパク質A（SPA)ドメイン、特にBまたはZドメインの誘導体であるポリペプチドに関する。ここで、当該SPAドメインの１ないし２０アミノ酸残基は、他のアミノ酸残基で置換されており、当該置換によって、当該ポリペプチドはヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質と相互作用能を有することとなる。当該ポリペプチドは、例えば、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の精製および血友病の診断において有用である。
【０００２】
背景技術
修飾されたバクテリアレセプター構造
有効な表現型選択手法と組み合わされたランダム突然変異誘発は、タンパク質の構造および機能を分析するために分子生物学において重要な手法であるとわかった。ランダム突然変異誘発、続いて表現型選択のための興味深い標的は、バクテリアレセプターの溶媒に曝露した表面である。そのようなタンパク質は、非常に安定的であることができ、広範な応用に適当である(Alexander et al.(1992)Biochemistry 31, 3597-3603)。特に、ヘリックス束構造を含むバクテリアレセプターに関して、そのコンホメーションはヘリックスパッキング界面に関係しない残基の側鎖の変化に抵抗性であることが期待できる。そのような分子の例は、比較的小さい(58残基)のスタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳＰＡ）のＩｇＧ結合ドメインＢおよびドメインＺと命名されたドメインＢの合成アナログである(Nilsson et al.(1987)Protein Engineering 1, 107-113)。
【０００３】
ＳＰＡから誘導されたドメインＺ(配列番号1)は、新規機能を有するドメイン変異体を構築するためのスキャフォールドとして利用された。突然変異体Ｚドメイン遺伝子のレパートリーは集められ、Ｚドメイン変異体を１価ファージディスプレイするために適合されたファージミドベクターに挿入された。それぞれおよそ４×１０７の形質転換体を含む２のコンビナトリアルなライブラリーが構築された。種々の標的タンパク質、すなわちＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトインスリンおよびヒトアポリポタンパク質Ａ−１変異体に対する選択が実施された。得られた結合タンパク質を、「アフィボディ(affibodies)」と称する。ＷＯ９５／１９３７４；Nord et al.(1995)Protein Engineering, Vol. 8(6), 601-608(後記においてNord-95と称する)；およびNord et al.(1997)Nature Biotechnology, Vol. 15, 772-777(後記においてNord-97と称する)を参照。
【０００４】
血友病および第ＶＩＩＩ因子欠乏
血友病は遺伝疾患であり、何百年間も知られてきたが、最近の40年でやっと種々の型を区別することが可能となった。すなわち血友病Ａおよび血友病Ｂである。血友病Ａは、最も頻度の高い型である。１００００人の男性生産児当たり１または２人の頻度で男性のみ罹患する。この疾患は、生物学的に活性の凝血因子ＶＩＩＩ(抗血友病因子、ＡＨＦとしても知られる）の非常に低レベルの存在または不存在によって起きる。それは通常は血漿中に存在するタンパク質である。
【０００５】
血友病の処置のための治療用第ＶＩＩＩ因子濃縮物が、血漿の分別によって製造される。ヒト血漿に由来する第ＶＩＩＩ因子濃縮物は、Andersson et al.(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983に記載されたようにいくつかの断片化された十分に活性のある第ＶＩＩＩ因子型を含む。これまでに記載された最小の活性のある型は、１７０ｋＤａの分子量を有し、金属イオン(複数を含む)と共に含まれる９０ｋＤａおよび８０ｋＤａの二本の鎖からなる。ＥＰ−Ａ−０１９７９０１参照。
【０００６】
しかし、例えばWood et al. (1984)Nature 312, 330-337によって、そしてＥＰ−Ａ−０１６０４５７に報告されたように、組換えＤＮＡ技術を使用する細胞培養による第ＶＩＩＩ因子の製造方法も利用可能である。組み変え体第ＶＩＩＩ因子産物の構造および生化学は、Kaufman, R.J.によってTrends in Biotechnology Vol. 9(10), 353-359, 1991およびHematology Vol. 63, 155-165, 1991に記載された。ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱと称する組変え体第ＶＩＩＩ因子フォームは、１７０ｋＤａの血漿型に対応するのだが、ＷＯ９１／０９１２２に記載されている。
第ＶＩＩＩ因子タンパク質と相互作用する能力を有し、例えば、第ＶＩＩＩ因子の精製のために、第ＶＩＩＩ因子欠乏に関連する病状、例えば、血友病の診断のために、治療において、または調査目的のために使用できる新規のポリペプチドが必要である。
【０００７】
図面の簡単な説明
図１：本発明のStaphylococcus aureusタンパク質Ａに由来するＺドメイン（Ｚｗｔ）および修飾されたポリペプチド（アフィボディ）のアミノ酸配列(１文字コード)。コンビナトリアルなライブラリーの構築中のランダム突然変異誘発から選択された１３個の位置が太字で示されている。
図２：アフィボディＺｆＶＩＩＩ：３(配列番号４)とｒ第ＶＩＩＩ因子(パネルＡ)；ｒ第ＶＩＩＩ因子の８０ｋＤａ鎖(パネルＢ)；およびポリクローナルヒトＩｇＧ(パネルＣ) との生体特異的相互作用分析からのセンサーグラム。
図３：競合体としてモノクローナル抗体８Ａ４、ネガティブコントロール競合体としてポリクローナルなヒトＩｇＧを使用するアフィボディＺｆＶＩＩＩ：３(配列番号４）での競合的結合測定法からのセンサーグラムのオーバーレイプロット。３種の異なるサンプル(純粋なｒＶＩＩＩ；ｍＡｂ  ８Ａ４と混合されたｒＶＩＩＩ；およびポリクローナルＩｇＧと混合されたｒＶＩＩＩ）をアフィボディ表面に注入した。
図４：合成アフィボディ(配列番号４０）表面上に注入された第ＶＩＩＩ因子の結合分析からのセンサーグラム。
(Ａ)組変え体第ＶＩＩＩ因子（ｒＶＩＩＩ）へのアフィボディ結合。
(Ｂ)第ＶＩＩＩ因子を含む血液血漿へのアフィボディ結合。
図５：組変え体第ＶＩＩＩ因子（ｒＶＩＩＩ）の等モル濃度の第二世代アフィボディＺｆＶＩＩＩ ｍａｔ：２６(配列番号３３）；ＺｆＶＩＩＩ ｍａｔ．２８(配列番号３５）およびＺｆＶＩＩＩ ｍａｔ３１(配列番号３８）、並びに第一世代アフィボディＺｆＶＩＩＩ：３（配列番号４）との結合分析からのセンサーグラムのオバーレイプロット。
【０００８】
発明の開示
本発明は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質と相互作用能を有し、例えば、第ＶＩＩＩ因子の分析および第ＶＩＩＩ因子の精製方法に使用できる修飾されたポリペプチド（アフィボディ）を提供する。当該アフィボディは、例えば、第ＶＩＩＩ因子と相互作用する小分子の同定のためのリード化合物であって、当該小分子は治療に潜在的に有用であるリード化合物として使用され得る。
【０００９】
本発明のポリペプチド（「アフィボディ」）は、通常の抗体と比べていくつかの利点を有する。例えば、（ｉ）低製造コスト；（ｉｉ）小サイズ；（ｉｉｉ）高安定性で丈夫；（ｉｖ）組み変え的にバクテリア宿主でまたは化学的合成によって製造可能であり、ウイルス汚染の危険を回避する。
【００１０】
故に、第１の態様では、本発明は、スタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳＰＡ）ドメインの誘導体であるポリペプチドであって、当該ＳＰＡドメインがＢまたはＺドメインであるポリペプチドを提供する。ここで、いくつかアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、当該置換によって、当該ＳＰＡドメインの基本構造および安定性が実質的に失われず、当該置換によって当該ポリペプチドがヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の少なくとも１ドメインと相互作用する能力を有することとなる。置換されたアミノ酸残基の数は、１ないし約２０、または１ないし約１３であってよい。他の可能な範囲は、４ないし約２０；４ないし約１３；５ないし約２０；または５ないし約１３アミノ酸残基である。当業者は、例えば引用のNoed-95およびNord-97から、Ｚドメインの表面に位置するアミノ残基を選択的に置換することができ、このとき、束のコアーは不変で、その分子の構造的特性を保持していることがわかる。
【００１１】
本発明において、「誘導体」の語は、ＮまたはＣ末端に付加的なアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。付加的なアミノ酸残基は、製造、精製または安定化、例えば、クロマトグラフィーレジンへの結合を容易化することに関する種々の理由のために含まれ得る。したがって、本発明は、もとのＳＰＡドメインより長いが、第ＶＩＩＩ因子との相互作用能をなお有するポリペプチド（アフィボディ）を含む。
当該ＳＰＡドメインＺは、好ましくは、配列番号１に示したアミノ酸配列を有する。しかし、「ドメインＺ」の語は、ＳＰＡドメインＺとしての本質的に同じ基本構造および安定性を有するドメインＺの変異体をも含む。
【００１２】
好ましくは、当該ＳＰＡドメインの少なくとも４アミノ酸残基が、他のアミノ酸残基によって置換されている。置換されたアミノ酸残基は、例えば配列番号１の９、１０、１３および１４位、または９、１０、１３、１４および１７位にあるものであることができる。さらに配列番号１の１１、１８、２４、２５、２７、２８、３２および３５位の１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基によって置換されることができる。前記のように、ドメインＺの基本構造特性が維持されるならば、他のアミノ酸残基を置換してもよいことが理解される。
【００１３】
特に好ましい形態では、本発明は配列番号１の９位のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）残基で置換され；１０位のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）残基で；１３位のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）残基で、１４位のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）残基で置換されているポリペプチドを含む。
本発明は、配列番号１の１７位のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、または好ましくはリジン（Ｋ）で置換され、配列番号１の３５位のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）または、好ましくは、ロイシン（Ｌ）残基で置換されたポリペプチドを含む。
【００１４】
「ヒトの第ＶＩＩＩ因子タンパク質のドメイン」の語は、特に９０ｋＤａおよび８０ｋＤａのドメインを含む。本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号２ないし６、または８ないし３９のいずれかに示すアミノ酸配列を有し得る。ここに、その第ＶＩＩＩ因子ドメインは、９０ｋＤａドメインである。本発明のポリペプチドは例えば、配列番号７に示したアミノ酸配列を有し得る。ここに、第ＶＩＩＩ因子ドメインは８０ｋＤａドメインである。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、前に定義したようなポリペプチド（アフィボディ）の製造方法を提供する。当該製造方法は下記のような段階を含む。
（ｉ）例えばファージディスプレイ（総説は、例えば、Kay, K. et al.(eds.)Phage Display of Peptide and Proteins:A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, ISBN 0-12-402380-0参照）、リボゾームディスプレイ（総説は、例えば、Hanes, J. et al.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(24), 14130-14135参照)または細胞ディスプレイ(総説は、例えば、Dangherty, P.S. et al.(1998)Protein Eng. 11(9), 825-832)によって、ＳＰＡドメインＢまたはＺに由来するポリペプチド変異体のレパートリーに含まれるタンパク質ライブラリーに由来するポリペプチド変異体をディスプレイする；
（ｉｉ）ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質に結合するポリペプチドを発現しているクローンを選択する；そして
（ｉｉｉ）選択されたクローンの組変え体発現または化学的合成によってポリペプチドを製造する。
当該ＳＰＡドメインは、好ましくは、前記のように配列番号１に示したアミノ酸配列を本質的に有するＺドメインである。種々の製造方法を、当業者は本発明に記載された方法、特に、後記の実施例によって記載の方法、および当業界で周知の方法によって実施できる。
【００１６】
なおさらなる態様では、本発明は、ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の精製方法であって、前記のようにポリペプチド（アフィボディ）の当該ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質との相互作用を含む精製方法を提供する。そのような方法は、例えば、下記の段階を含み得る。
（ａ）本発明のポリペプチド（アフィボディ）をマトリックスであって、例えばセファロース、シリカ、セルロースまたはメンブランから調製したマトリックスに結合させる；
（ｂ）ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含むサンプルをマトリックスに接触させ、当該ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質と当該ポリペプチドを相互作用させる；
（ｃ）後記の実施例６に記載のような、ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質とアフィボディの間の相互作用を維持するために適当な条件下でマトリックスを洗浄する；そして
（ｄ）生物学的に活性のヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質を、例えばエチレングリコールよる溶出によって取得する。
【００１７】
当該ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ヒト血漿に由来することができ、または、当業界で周知の組み変えＤＮＡ技術によって製造することができる。「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」の語は、野生型第ＶＩＩＩ因子の生物学的機能を本質的に有する誘導体を含むことが意図されている。そのような第ＶＩＩＩ因子誘導体は、例えば、ＷＯ９１／０９１２２に記載されたアミノ酸７４０ないし１６４９位の領域（Ｂドメイン）の１以上のアミノ酸を欠く欠失誘導体であってよい。他の第ＶＩＩＩ因子誘導体がＷＯ９２／１６５５７に記載されている。アフィボディと相互作用する第ＶＩＩＩ因子タンパク質の部分は、使用されるアフィボディの特異性に依存して９０ｋＤａまたは８０ｋＤａのドメインであってよいことがわかる。
【００１８】
実施例
実施例１．ライブラリーの構築
従来述べられたライブラリーＺ−ｌｉｂ１およびＺ−ｌｉｂ２(Ｎｏｒｄ−９５およびＮｏｒｄ−９７)は、合成５８残基ＳＰＡドメインＺに基づいており(Nilsson et al.(1987) Protein Engineering 1, 107-113)、組換え体第ＶＩＩＩ因子(以下、ｒＶＩＩＩと称する)に結合する新規タンパク質の選択に使用する。Ｚドメインライブラリーの構築において、３つのヘリックス束Ｚドメインのヘリックス１および２中の１３の表面に位置する残基(Ｑ９、Ｑ１０、Ｎ１１、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｈ１８、Ｅ２４、Ｅ２５、Ｒ２７、Ｎ２８、Ｑ３２およびＫ３５)が、Ｚ−ｌｉｂ１中のＮＮ(Ｇ／Ｔ)コドン同義性およびＺ−ｌｉｂ２中の(Ｃ／Ａ／Ｇ)ＮＮ同義性を用いるランダム化を標的とした。当該ライブラリーは、ファージコートタンパク質３のトランケートバージョンとの融合を介する繊維状バクテリオファージの表面上で一価ディスプレイ(monovalent display)に適用された。
【００１９】
バイオパンニング(biopanning)のラウンドのためのファージストックは、ポリエチレングリコール沈殿後、ｍｌあたり１０１１から１０１２の範囲のコロニー形成単位において力価を常に生ずるヘルパーファージＭ１３Ｋ０７(New England Biolabs, Beverly, MA)を含む標準的手法を用い調製した。
【００２０】
実施例２．第一世代のアフィボディの選択
(ａ)組換え体第ＶＩＩＩ因子のビオチン化および固定化
標的タンパク質、Ｂドメイン欠損した組換え体第ＶＩＩＩ因子(以下、ｒＶＩＩＩと称する)を本質的にはＷＯ９１／０９１２２に記載のように得、ビオチン化キット(EZ-Link(登録商標)、Sulfo-NHS-LC-ビオチン、手順番号21335、Pierce Chemical Company、Rockford、IL)を用い、バイオパンニング手順用のストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ上に強固な固定化を可能とするためにインビトロでビオチン化した。
【００２１】
約１００μｇのインビトロビオチン化ｒＶＩＩＩを、最終体積１ｍｌの結合緩衝液(０．１Ｍ 酢酸アンモニウム、５ｍＭ 塩化カルシウム、０．８Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．１)中に５ｍｇの洗浄前(提供者の推奨により)ストレプトアビジンコート常磁性ビーズ(SAビーズ)(Dynabeads M-280 Streptavidin、Dynal AS、Oslo、Norway)と混合し、ローターにおいて１時間室温でおよび２時間＋４℃でインキュベーションした。その後、固定化ｒＶＩＩＩを有するＳＡビーズを、６倍の結合緩衝液で洗浄した。この手順は、５ｍｇのＳＡビーズあたり約１０μｇの９０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩの固定化を生じ、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で決定した。
【００２２】
(ｂ)バイオパンニング
溶液中に５倍のモーラーを超える８０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩの存在下(可能性ある８０ｋＤａ鎖バインダーの殆どを除去するため)、４ラウンドのバイオパンニング(親和性に基づく選択)は、各サイクルにおいて洗浄量を増加するとともに、行なわれた。低ｐＨの溶出液およびエチレングリコールは、パラレルバイオパンニングで行った。
【００２３】
バイオパンニングは以下のように行った：第１のサイクルでは、溶液中、Ｚ−ｌｉｂ１またはＺ−ｌｉｂ２の何れかによる１００μｌファージストック、９０μｌの８０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩ(約２．５μＭ)および１０μｌ  ２％ゼラチン溶液を乾燥ビーズの２つのチューブに固定化ｒＶＩＩＩと共に加え、ローターにおいて２時間室温でインキュベーションした。ＳＡビーズは結合緩衝液で一度洗浄し(５分間の洗浄時間)、その後、結合ファージ粒子を０．５ｍｌグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２で１０分間室温で溶出させた。当該上清を直ぐに５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５で中性化した。溶出ファージ粒子を用い、１ｍｌの対数増殖期(Ａ６００が約１)のE. coli RR1ΔM15細胞(Ruether(1982) Nucleic Acids Research 10, 5765-5772)に２０分間＋３７℃で感染させ、その後、グルコース２％およびアンピシリン(１００ ｍｇ／ｍｌ)を加えたＴＹＥ(リッターあたり：１５ｇ寒天、８ｇ ＢａＣｌ、１０ｇ トリプトンおよび５ｇ酵母抽出物)寒天プレートに、新規ファージストックの調製のため、塗布した。
【００２４】
第２のサイクルでは、ビオチン化ｒＶＩＩＩを含むＳＡビーズの２つのチューブを、第１のサイクルにおいて、Ｚ−ｌｉｂ２によるバイオパンニングからの５０μｌファージストックと混合したＺ−ｌｉｂ１によるバイオパンニングからの５０μｌファージストックと共にインキュベーションした。他に、条件は、第１のサイクルと同じであった。ＳＡビーズを、結合緩衝液で３回洗浄し、洗浄緩衝液で２回洗浄した(５０ｍＭ 塩化カルシウム、５０ｍＭ ヒスチジン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．６)(総洗浄時間２５分間)。１つのチューブを前述のようにグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２で溶出させた。但し、２０分であった。他のチューブは、室温で２０分間、溶出緩衝液(５０ｍＭ 塩化カルシウム、５０ｍＭ ヒスチジン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％エチレングリコール、ｐＨ６．６)で溶出した。
【００２５】
第３のサイクルでは、当該条件は、第２のサイクルと同じであった。但し、１つのチューブに添加するファージストックは、事前のサイクル中のｐＨ２．２溶液の溶出ファージから調製し、他のチューブへの添加は、エチレングリコール溶出液から調製した。ＳＡビーズを結合緩衝液で５回洗浄し、洗浄緩衝液で５回洗浄した(約１時間の洗浄時間)。当該溶出は、前述のように、ｐＨ２．２溶出添加ファージストックを伴うチューブ内のｐＨ２．２溶出液で行い、エチレングリコール溶出添加ファージストックを伴うチューブ内のエチレングリコール溶出液により行なった。サイクル４は、正確にサイクル３と同じように行なった。
【００２６】
各パンニングラウンドからの溶出ファージを、＋３７℃で２０分間、連続希釈の溶出液で対数増殖期RR1ΔM15細胞(６００ｎｍのＯＤが約０．５)に感染させることにより力価測定した。残りの溶出ファージを用い、１０ｍｌの細胞を感染させた。当該細胞を、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＴＹＥ寒天プレートに塗布し、＋３７℃で一夜インキュベーションした。当該コロニーを回収し、次のラウンドのパンニングのため新規ファージストックの調製のため、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＴＳＢに接種した。最後のパンニングの後、再感染した細胞をプレートに塗布し、選択Ｚドメイン変異体のＤＮＡ配列分析用のクローンを作製した。
【００２７】
(ｃ)ＤＮＡシーケンシング
第４番目のサイクルから選択した２０のアフィボディクローン(ｐＨ２．２による溶出から１０クローンおよびエチレングリコールによる溶出から１０クローン)の固相シーケンシング(Hultman et al. (1989) Nucleic Acids Research 17, 4937-4946)を、ロボットワークステーション(Biomek 1000, Beckman, Instruments, Fullerton, CA)において、ヨードジカルボシアニン色素ＡＬＦｒｅｄ(Ｃｙ５)ホスホロアミダイト標識シーケンシングプライマーＮＯＫＡ−３を用いることにより行なった。サンガーフラグメントをＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓ(登録商標)(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)で分析した。９種の配列が同定され、幾つかは、１クローン以上により示された。
【００２８】
実施例３．第一世代アフィボディの作製および精製
ＤＮＡシーケンシングステップで同定された９種のアフィボディは、可溶性分泌タンパク質として生じ、それは、スタフィロコッカスタンパク質Ｇ(ＳＰＧ)(Nilsson et al.(1994) Eur. J. Biochem. 224, 103-108)由来の５ｋＤａ血性アルブミン結合ドメイン(ＡＢＤ)と融合し、この場合、非サプレッサー株、E. coli RV308(Maurer et al.(1980) J. Mol. Biol. 139, 147-161)においてファージミドベクター(Ｎｏｒｄ−９７)でコードされている。アフィボディ−ＡＢＤ融合タンパク質は、ペリプラズムから放出され、ＨＳＡ−セファロースカラムのアフィニティークロマトグラフィーにより精製され(Nygren et al. (1988) J. Mol. Recogn. 1, 69-74)、この発現系における発現レベルは、１０ｍｇ／ｌシェーカーフラスコ培養の範囲であった。
【００２９】
実施例４．第一世代アフィボディの生体特異的相互作用分析
ＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)２０００機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を、選択変異体とｒＶＩＩＩとの間の相互作用のリアルタイムBiospecific Interaction Analysis(ＢＩＡ)として使用した。当該リガンドを、製造者の推奨によりＣＭ５センサーチップ(研究仕様)(Biacore AB)のカルボキシル化デキストラン層上に結合するアミンにより固定化した。全分析は＋２５℃で行ない、特記しなければ、流速を５μｌ／ｍｉｎとし、注入サンプル体積を３５μｌとした。当該表面を１０μｌ １０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌで再生した。
【００３０】
選択されたアフィボディ変異体を１０００から２５００共鳴単位(ＲＵ)で被覆したセンサーチップ表面上で、(ｉ)ｒＶＩＩＩ、(ii)８０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩ、または(iii)対照ポリクローナル抗体としてヒトＩｇＧの注入により、５つのアフィボディ(ＺｆＶＩＩＩ：５に対するＺｆＶＩＩ：１；配列番号２から６)についてｒＶＩＩＩ(８０＋９０ｋＤａ鎖変異体)にのみ重要な応答が見られ、それは、当該結合が、９０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩに対して生じ、親Ｚドメインにより示されるＩｇＧ(Ｆｃ)に対する親和性が予想されるように喪失していることを示す。図２は、抗体ＺｆＶＩＩＩ：３(配列番号４)により得られる結果を示す。
【００３１】
1つのアフィボディの場合(ＺｆＶＩＩＩ：６；配列番号７)、応答は、ｒＶＩＩＩおよび８０ｋＤａ鎖のみの両方を注入したとき得られ、それは、当該結合は、少なくとも８０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩの一部に対し生ずることを示す。
【００３２】
４つの同義性残基(Ｗ９、Ｒ１０、Ｗ１３およびＷ１４)が、すべての９０ｋＤａ鎖バインダーに保存されており、２つの残基には、リジンまたはアルギニン(Ｒ／Ｋ１７およびＲ／Ｋ２７)の何れかに優先性(preference)が見られた。また、３５位はロイシンに優先性があった。
【００３３】
力学的パラメーターの決定として、アフィボディのＺｆＶＩＩＩ：４に対するＺｆＶＩＩＩ：１(配列番号２から５)を上述のように種々の表面に固定化した。対照センサーチップ表面は、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化、その後のエタノールアミンによる不活性化により調製された。組換え体第ＶＩＩＩ因子を、流速２０μｌ／ｍｉｎで表面上にランダムオーダーの体積１００μｌで１４種の濃度(０．２５ｎＭから１．２５ｎＭ)で注入した。各注入後、当該表面は、１０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌで再生した。ｒＶＩＩＩ応答は、各濃度に対しおよび各アフィボディ表面に対しブランク表面からの応答を差引いた。解離および会合率定数は、相関的な相互作用モデルのための標準プロトコールにより、ＢＩＡ評価２．４ソフトウェア(BIAcore AB)を用い算出した。調査変異体のための明らかな全体解離定数(ＫＤ)が範囲１−２×１０−７Ｍの範囲に算出された。
【００３４】
実施例５．競合的結合測定法(第一世代アフィボディ)
９０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩ上のアフィボディの結合部位を更に位置決定するため、事前に９０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩとマップ化結合相互作用する、８Ａ４と名付けたモノクローナル抗体を用いた。ＢＩＡ分析を行ない、３種の注入をアフィボディ表面上で行なった：(ａ)純粋ｒＶＩＩＩ(４２ｎＭ)；(ｂ)１７ｎＭ ｍＡｂ ８Ａ４と混合したｒＶＩＩＩ(４２ｎＭ)；および(ｃ)コントロールとして２６倍モーラー過剰のポリクローナルヒトＩｇＧ(１．１μＭ)と混合したｒＶＩＩＩ(４２ｎＭ)。図３に示すその結果は、ｍＡｂ ８Ａ４と事前に混合したときのみアフィボディに対するｒＶＩＩＩの結合が増加することを示し、アフィボディおよびｍＡｂ ８Ａ４がｒＶＩＩＩ上の少なくとも重複するエピトープで競合する。
【００３５】
実施例６．アフィボディカラム上の第ＶＩＩＩ因子のアフィニティークロマトグラフィー
ＺｆＶＩＩＩ：３と名付けたアフィボディを、製造者の推奨により１ｍｌ ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(登録商標)Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を充填したＨｉＴｒａｐ(登録商標)アフィニティーカラムに結合させ、約２ｍｇの結合ＺｆＶＩＩＩ：３−ＡＢＤ融合タンパク質を生じた。当該カラムをＡＫＴＡ(登録商標) ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ｓｙｓｔｅｍ(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)と連結し、５カラム体積の結合緩衝液(０．１Ｍ 酢酸アンモニウム、５ｍＭ 塩化カルシウム、０．８Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．１)で平衡化し、サンプルをロードした。ｒＶＩＩＩを含む１ｍｌのサンプル(結合緩衝液中０．１ｍｇ／ｍｌ)を流速１ｍｌ／分でカラム適用した。３倍カラム体積の結合緩衝液および４カラム体積の洗浄緩衝液(５０ｍＭ 塩化カルシウム、５０ｍＭ ヒスチジン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．６)による洗浄後、捕捉タンパク質を、０．３Ｍ 酢酸、ｐＨ３．２または溶出緩衝液(５０ｍＭ 塩化カルシウム、５０ｍＭ ヒスチジン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％エチレングリコール、ｐＨ６．６)の何れかで溶出させ、２８０ｎｍのＵＶ検出でモニターした。溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は高純度のｒＶＩＩＩであった。
【００３６】
実施例７．第ＶＩＩＩ因子活性アッセイ
第ＶＩＩＩ因子活性アッセイを行い、アフィニティーカラムにロードしたサンプル中のｒＶＩＩＩ成分、分画を通過したフロー(flow through fraction)および溶出画分について決定した。当該活性アッセイは、実質的にはRosen(1984) J. Haematol. Vol. 33, Suppl. 40, 139-145およびCarlebjoerk et al. (1987) Thrombosis Research Vol. 47, 5-14の記載の通り行なった。
【００３７】
このアッセイでは、因子Ｘａ(活性化因子Ｘ)が、固有の経路を通じて生じ、この場合、第ＶＩＩＩ因子：Ｃは補因子として作用する。次いで因子Ｘａを、トロンビンにより基質の加水分解を防止するトロンビン阻害剤の存在下、合成色素生産性基質の使用により、決定する。当該反応は酸で停止させ、パラニトロアニリン(ｐＮＡ)の放出に比例する第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性は、４０５ｎｍで測光的に決定する。
【００３８】
分画を通過したフローには第ＶＩＩＩ因子活性は全く見られず、その一方、溶出画分では見られた。これは、アフィボディカラムがｒＶＩＩＩとの結合能を有し、その後、機能型として溶出し得ることを示す。
【００３９】
実施例８．合成アフィボディを用いる結合研究
ＺｆＶＩＩＩ：３(配列番号４)に基づき、Ｃ末端に余分にシステイン残基を有する合成アフィボディ(配列番号４０)を、既知の方法によるペプチド合成により作成した。機能を有する合成アフィボディは、ＢＩＡセンサーチップ表面上に、システイン残基を通じて直接結合する。そのため、合成アフィボディは、製造者の推奨によってＣＭ５センサーチップ(研究仕様)(Biacore AB)のカルボキシル化デキストラン層上に結合するリガンドチオールにより固定化し、４５０ＲＵの固定化を生じた。対照表面は、活性化後、不活性化により調製した。分析は、＋２５℃で行ない、流速は５μｌ／ｍｉｎであり、注入サンプル体積は２５μｌであり、再生は、０．０５％ＳＤＳで行なった。ｒＶＩＩＩを表面上に注入し、ｒＶＩＩＩ応答は、ブランク表面からの応答を差引いた。有意な応答が得られ(図４)、これは、アフィボディがうまく合成され、正確にフォールドされていることを示した。
【００４０】
血漿誘導性第ＶＩＩＩ因子(Octonativ-M, Pharmacia & Upjohn AB)を、結合研究(Nilsson et al. pp. 193-206 In: Smith Sibinga et al. (eds) Coagulatin and Blood Transfusion (Proc. Fifteenth Ann. Symp. Blood Transfusion, Groningen 1990) Kluwer Academic Publishers, 1991)に用いた。血漿誘導性第ＶＩＩＩ因子は、実質的に“Ｍｅｔｈｏｄ Ｍ”(Griffith, M. (1991) Ann Hematol. 63, 131-137)により、イムノアフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用い精製した。
【００４１】
精製血漿誘導性第ＶＩＩＩ因子を含むサンプルを、上記と同じ条件下、同じ表面に注入した(図４ｂ)。ｒＶＩＩＩによる結合プロファイルの相違は、第ＶＩＩＩ因子とフォン・ウィルブランド因子との会合に加えて、血漿中の別種型の第ＶＩＩＩ因子の生成に起因する。
【００４２】
血液血漿が野生型Ｚ(配列番号１)に注入されるネガティブ対照実験では、全く応答が生じなかった。これは、合成アフィボディが血漿中の第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合することを示した。
【００４３】
実施例９．親和性が改善されたｒＶＩＩＩ特異的アフィボディの選択のための第二世代ライブラリーの構築
ＳＰＡドメインＺ配列の第二世代コンビナトリアルライブラリーを、組換え体因子ＦＩＩＩに対する結合(完成した親和性)が改善するペプチドの選択のため、実質的に実施例１のように調製した。第二世代ライブラリー中の１３残基のうち５つを固定化した：残基９、１０、１３、１４および２７の、それぞれトリプトファン、アルギニン、トリプトファン、バリンおよびアルギニンであり、その一方、残基１７位のアミノ酸を、Ａ(Ａ／Ｇ)Ｇ同義性コドンによりリシンまたはアルギニンの何れかに固定した。１３表面に位置する残基のうち残りの７つを、天然ライブラリーに限りＮＮ(Ｇ／Ｔ)同義性を用い、再ランダム化の標的とした。
【００４４】
実施例１０．第二世代アフィボディの選択
構築した第二世代ライブラリーを用いｒＶＩＩＩに対するバイオパンニングを、実施例２に示したようにストレプトアビジン被覆化常磁性ビーズ上に固定化したビオチン化ｒＶＩＩＩで行なった。バイオパンニングのラウンドは、可能性ある８０ｋＤａバインダーの殆どを除去するため、実施例２のように第ＶＩＩＩ因子由来の過剰の８０ｋＤａ鎖を用い行なった。バイオパンニングサイクルを通じて、洗浄ステップの回数を増やすことにより緊縮性を増大させ、固定化ｒＶＩＩＩの量を増大させた。全溶出ステップを５０％エチレングリコールで行なった。
【００４５】
パンニングサイクル４由来の１８クローン、サイクル５の１０クローン、およびサイクル６の８クローンにおけるファージミド挿入物のＤＮＡシーケンシングは、２対のクローンが同一であることを示した。特有の配列を有する選択アフィボディを図１に示し、配列番号８から２２(サイクル４)；配列番号２３から３１(サイクル５)および配列番号３２から３９(サイクル６)として配列表に示す。
【００４６】
アミノ酸型に関する幾つかの類似は、パンニングサイクル６(配列番号３２から３９)由来の８選択クローンにおいて検出された。２４、３２および３５位は、すべて、疎水性アミノ酸を含み、２８位は、アスパラギン酸またはグルタミン酸に優先性があり、１７位は、リシンで保存されていた(図１参照)。
【００４７】
サイクル６由来の選択アフィボディは、実施例３に記載の通りファージミド構築から作製した。
【００４８】
実施例１１．第二世代アフィボディを使用する結合研究
選択第二世代アフィボディのランキングとして、リアルタイムBiospecific Interaction Analysis(ＢＩＡ)を用いた。チップ表面をヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)および当該アフィボディで固定化し、アフィボディを、ＨＳＡ表面上に濃度１．４μＭで個々に注入し、その後、ｒＶＩＩＩ(３０ｎＭ)を注入した。第一世代アフィボディ、ＺｆＶＩＩＩ：３の１つを、比較のランキングに含めた。８つの第二世代アフィボディ、すべては、ｒＶＩＩＩに対する親和性がＺｆＶＩＩＩ：３アフィボディと比較して高くなった。図５は、アフィボディ、ＺｆＶＩＩＩｍａｔ．２６、ＺｆＶＩＩＩｍａｔ．２８およびＺｆＶＩＩＩｍａｔ．３１で得られた結果を示す。
【００４９】
力学的パラメーターの算出として、ｒＶＩＩＩを、アフィボディ、ＺｆＶＩＩＩｍａｔ．２６、ＺｆＶＩＩＩｍａｔ．２８およびＺｆＶＩＩＩｍａｔ．３１、それぞれによる表面上に１６種の濃度で注入した。当該会合および解離率を測定し、３つのアフィボディの場合、全体として明らかに５−１０×１０−９Ｍの範囲の解離定数(ＫＤ)を生じた。
【００５０】
ｍＡｂ ８Ａ４(９０ｋＤａ鎖の第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合する)およびｍＡｂ ２Ｂ５(８０ｋＤａ鎖の第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合する)と名付けられた２種のモノクローナル抗体を、上記３つのアフィボディの結合部位の位置決定のため使用した。ＢＩＡ分析を用い、表面上に４種の注入を行なった；純粋ｒＶＩＩＩ、ｍＡｂ ８Ａ４と混合したｒＶＩＩＩ、ｍＡｂ ２Ｂ５と混合したｒＶＩＩＩおよびポリクローナルヒトＩｇＧと混合したｒＶＩＩＩ。その結果、３つすべてのアフィボディ表面に対する、ｍＡｂ ２Ｂ５と混合したｒＶＩＩＩの結合が増加し、ｍＡｂ ８Ａ４と混合したｒＶＩＩＩの結合が減少した。ｍＡｂ ２Ｂ５で見られる増加シグナルは、ｍＡｂ ２Ｂ５およびアフィボディの別々のエピトープのｒＶＩＩＩ上における存在によって説明され、それは、ｒＶＩＩＩが、結合複合体の塊を増加するこれら２つの要素(entities)に同時に結合することを意味する。更に、ポリクローナルヒトＩｇＧと混合したｒＶＩＩＩによるアフィボディ表面に対する結合と比較する純粋ｒＶＩＩＩの結合、それらの間には明らかの違いはなかった。そのため、予想されるように、第二世代アフィボディは、９０ｋＤａ鎖のｒＶＩＩＩに結合し、ｍＡｂ ８Ａ４およびアフィボディは、ｒＶＩＩＩ上の少なくとも重複するエピトープで競合する。
【００５１】
配列表フリーテキスト
本特許明細書の最後にある配列表について、以下の“フリーテキスト”は、同一数字の＜２２３＞(他の情報)：“人工配列の記述：修飾された細菌性レセプター配列”の下、配列番号２から４０に含められている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１：本発明のStaphylococcus aureusタンパク質Ａに由来するＺドメイン（Ｚｗｔ）および修飾されたポリペプチド（アフィボディ）のアミノ酸配列(１文字コード)。コンビナトリアルなライブラリーの構築中のランダム突然変異誘発から選択された１３個の位置が太字で示されている。
【図２】  図２：アフィボディＺｆＶＩＩＩ：３(配列番号４)とｒ第ＶＩＩＩ因子(パネルＡ)；ｒ第ＶＩＩＩ因子の８０ｋＤａ鎖(パネルＢ)；およびポリクローナルヒトＩｇＧ(パネルＣ) との生体特異的相互作用分析からのセンサーグラム。
【図３】  図３：競合体としてモノクローナル抗体８Ａ４、ネガティブコントロール競合体としてポリクローナルなヒトＩｇＧを使用するアフィボディＺｆＶＩＩＩ：３(配列番号４）での競合的結合測定法からのセンサーグラムのオーバーレイプロット。３種の異なるサンプル(純粋なｒＶＩＩＩ；ｍＡｂ  ８Ａ４と混合されたｒＶＩＩＩ；およびポリクローナルＩｇＧと混合されたｒＶＩＩＩ）をアフィボディ表面に注入した。
【図４】  図４：合成アフィボディ(配列番号４０）表面上に注入された第ＶＩＩＩ因子の結合分析からのセンサーグラム。
(Ａ)組変え体第ＶＩＩＩ因子（ｒＶＩＩＩ）へのアフィボディ結合。
(Ｂ)第ＶＩＩＩ因子を含む血液血漿へのアフィボディ結合。
【図５】  図５：組変え体第ＶＩＩＩ因子（ｒＶＩＩＩ）の等モル濃度の第二世代アフィボディＺｆＶＩＩＩ ｍａｔ：２６(配列番号３３）；ＺｆＶＩＩＩ ｍａｔ．２８(配列番号３５）およびＺｆＶＩＩＩ ｍａｔ３１(配列番号３８）、並びに第一世代アフィボディＺｆＶＩＩＩ：３（配列番号４）との結合分析からのセンサーグラムのオバーレイプロット。
【配列表】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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