(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸３２〜１９４で表されシグナル配列を有するかまたは有しないＫＧＦと称される天然型ケラチノサイト成長因子の類似体であって、配列番号３２（Ｃ（１，１５）Ｓ）、配列番号６２（Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ）、配列番号６４（Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ）、配列番号７８（Ｃ（１，１５，４０）Ｓ）、配列番号８０（Ｃ（１，１５，１０２）Ｓ）および配列番号８２（Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、但し最初のメチオニン残基を有していなくてもよい、前記類似体。
【請求項２】
類似体がシグナル配列またはアミノ末端メチオニン残基を有する請求項１に記載の類似体。
【請求項３】
該シグナル配列が配列番号２のアミノ酸１から３１である請求項２に記載の類似体。
【請求項４】
該類似体が化学部分に共有結合で結合している請求項１〜３のいずれか一項に記載の類似体。
【請求項５】
該化学部分がポリエチレングリコールである請求項４に記載の類似体。
【請求項６】
凍結乾燥されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の類似体。
【請求項７】
医薬的に有効な量の請求項１〜６のいずれか一項に記載のＫＧＦ類似体及び医薬的に許容できる担体を含み、非繊維芽上皮細胞の産生を刺激するための医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の類似体をコードする組換え核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含む生物学的に機能性のベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸分子または請求項９に記載の生物学的に機能性のベクターを含む真核または原核宿主細胞。
【請求項１１】
Ｅ．ｃｏｌｉ．である請求項１０に記載の原核宿主細胞。
【請求項１２】
哺乳類細胞である請求項１０に記載の真核宿主細胞。
【請求項１３】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１２に記載の真核宿主細胞。
【請求項１４】
ＫＧＦ類似体を生産する方法であって、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を、適切な栄養条件下、コードされた類似体が発現されるように増殖させ、かく生産された類似体を単離することを含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＫＧＦ類似体を有効量含む非繊維芽上皮細胞の生産を刺激するための医薬組成物。
【請求項１６】
該非繊維芽上皮細胞が付属器構造、肝臓細胞、呼吸器管若しくは消化管の粘膜上皮、角膜細胞または鼓膜上皮細胞から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載のＫＧＦ類似体または請求項７に記載の医薬組成物を適用することを含む非繊維芽上皮細胞の生産をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する方法。
【請求項１８】
有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載のＫＧＦ類似体または請求項７に記載の医薬組成物を投与することを含む非繊維芽上皮細胞の産生を刺激する方法であって、非繊維芽上皮細胞の産生を必要とする非ヒト哺乳動物体内で非繊維芽上皮細胞を刺激する、前記非繊維芽上皮細胞の産生刺激方法。
【請求項１９】
該非繊維芽上皮細胞が付属器構造、肝臓細胞、呼吸管および消化管における粘膜上皮、角膜細胞または鼓膜上皮細胞から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＫＧＦの類似体がＩＶ、ＩＴ、ＩＭ、ＳＣまたはＩＰ経路により投与される請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＫＧＦの類似体または請求項７の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術および蛋白工学に関する。本出願は、１９９５年１０月２１日の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３７１による出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００９７１であり、該出願は１９９４年１０月３１日出願の本願の共出願である米国特許出願番号０８／３２３４７５および１９９５年６月７日出願の本願の共出願である米国特許出願番号０８／４８７８２５の部分継続出願であり、１９９４年１０月１３日出願の放棄された米国特許出願番号０８／３２３３４０の部分継続出願である。具体的には、組換えＤＮＡ法を適用して、非線維芽細胞性上皮細胞成長の強力な有糸分裂促進物質である表皮ケラチン細胞成長因子（keratinocyte growth factor；ＫＧＦ）のポリペプチド類縁体であって、親ＫＧＦと比較して安定性の向上した類縁体を得た。
発明の背景
組織の形成・再生の複雑な過程には、場合によって軟組織成長因子と称されるいくつかの蛋白因子が仲介している。これらの分子は一般に、ある型の細胞によって放出され、他の型の細胞の増殖に影響を与える（Rubinら（1989）,Proc.Nat′l.Acad.Sci,USA,86:802-806）。一部の軟組織成長因子は、特定の型の細胞によって分泌され、多細胞生物の発生において反応性の細胞の増殖、分化および／または成熟に影響を与える（Finchら，（1989）,Science,245:752-755）。生物発生におけるそれらの役割に加えて、さらに成熟した系における継続的健康および維持において重要なものもある。例えば、哺乳動物においては、急速な細胞代謝が起こる多くの系がある。そのような系には皮膚および消化管などがあり、そのいずれも、上皮細胞を有する。この群の軟組織成長因子には、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の蛋白質ファミリーが含まれる。
現在知られているＦＧＦファミリーメンバーは８種類であり、それらは一次構造に関連性を持っている。それらはすなわち、塩基性線維芽細胞成長因子であるｂＦＧＦ（Abrahamら，（1986）,EMBO J.,5:2523-2528）；酸性線維芽細胞成長因子であるａＦＧＦ（Jayeら，（1986）,Science,233:541-545）；ｉｎｔ−２遺伝子産物であるｉｎｔ−２（Dickson & Peters（1987）,Nature,326:833）；ｈｓｔ／ｋＦＧＦ（Delli-Boviら，（1987）,Cell,50:729-737およびYoshidaら，（1987）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7305-7309）；ＦＧＦ−５（Zhanら，（1988）,Mol.Cell.Biol.,8:3487-3495）；ＦＧＦ−６（Maricsら，（1989）,Oncogene,4:335-340）；表皮ケラチン細胞成長因子（Finchら，（1989）,Science,24:752-755）；およびヒサクトフィリン（hisactophilin）（Habazzettlら，（1992）,Nature,359:855-858）である。
ＦＧＦファミリーの蛋白の中で、表皮ケラチン細胞成長因子（「ＫＧＦ」）が、間充組織由来の非線維芽細胞性上皮細胞（特に表皮ケラチン細胞）増殖に固有のエフェクターである。「天然型ＫＧＦ」という用語は、配列番号２で示されるアミノ酸配列によって表される天然のヒト（ｈＫＧＦ）または組換え（ｒＫＧＦ）ポリペプチド（シグナル配列を持つものまたは持たないもの）、あるいはその対立遺伝子変異体を指す［特に断らない限り、本明細書に記載の分子についてのアミノ酸番号は、配列番号２のアミノ酸３２〜１９４によって示される成熟天然型分子（すなわち、シグナル配列を含まないもの）について表示されるものに対応するものとする］。
天然型ＫＧＦは、天然のヒト起源（ｈＫＧＦ）から単離されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ法（ｒＫＧＦ）（Finchら，（1989）,前出；Rubinら，（1989）,前出；Ronら，（1993）,The Journal of Biological Chemistry,268（4）:2984-2988；およびYanら，（1991）,In Vitro Cell.Dev.Biol.,27A:437-438）によって生成することができる。
天然型ＫＧＦは水性状態では比較的不安定であり、処理および保存中に化学的・物理的変性を受けて生物活性を喪失する（Chenら，（1994）,Pharmaceutical Research,11:1582-1589）ことが知られている。天然型ＫＧＦは、高温で凝集する傾向も有しており、かつ酸性条件下で失活する（Rubinら，（1989）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:802-806）。水溶液中での天然型ＫＧＦの凝集によっても、失活蛋白が生じる。そのような活性喪失が起こると、長期間にわたって天然型ＫＧＦ蛋白の水性製剤を保存したり、その蛋白を長期間かけて投与することができなくなることから不利である。さらに、凝集蛋白は免疫原性であることが知られていることから（Clelandら，（1993）,Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems,10:307-377;Robbinsら，（1987）,Diabetes,36:838-845;およびPinckardら，（1967）,Clin.Exp.Immunol.,2:331-340）、医薬組成物を調製する際に、その点は特に問題となる。
天然型ＫＧＦは５つのシステイン残基、すなわちアミノ酸１、１５、４０、１０２および１０６を有する（Finchら，（1989）,Science,24:752-755）。天然型ＫＧＦのシステイン含有量は報告されているが、システイン残基が活性に関して果たす役割（例：生物活性における必須性）および３次構造（例：望ましくない分子間または分子内ジスルフィド結合を形成する傾向）は報告されていない。したがって、システイン残基が必須であるのか、あるいは望ましくないジスルフィド結合の形成に関与して蛋白を凝集および／または不安定化させることに関して教示する先行技術はない。
天然型ＫＧＦの１以上の特徴の改善もしくは変更を試みるには、蛋白工学を用いることができる。天然型ＫＧＦの配列を改変するには、組換えＤＮＡ技術が利用されてきた。
ロンら（Ronら，（1993）,J.Biol.Chem.268（4）:2984-2988）は、Ｎ末端から３、８、２７、３８または４９個のアミノ酸が欠失した改変型ＫＧＦポリペプチドを報告している。３、８または２７個のＮ末端残基を欠くポリペプチドはヘパリン結合能力を保持していたが、他のものは保持していなかった。さらに、３残基または８残基を欠くポリペプチドは十分活性であると報告されているが、２７残基を欠くものは有糸分裂促進活性が１／１０〜１／２０であり、３８または４９個のアミノ酸を欠くものは有糸分裂促進活性を持たなかった。改変型ＫＧＦポリペプチドの安定性については考察も、報告もされていない。
前述のＰＣＴ出願公開第９０／０８７７１号にもキメラ蛋白の製造が報告されており、このキメラ蛋白においては、成熟天然型ＫＧＦの最初の約４０個のＮ末端アミノ酸が、ａＦＧＦのＣ末端部分（約１４０アミノ酸）と結合している。そのキメラは、ＫＧＦのような表皮ケラチン細胞を標的とすることが報告されているが、ａＦＧＦの特徴であるがＫＧＦの特徴ではないヘパリンに対する感受性を持たない。キメラの安定性については考察も、報告もされていない。
このように、この文献には、天然型ＫＧＦと比較して安定性がかなり改善された改変型ＫＧＦ分子は報告されていない。さらに、この文献には、そのような所望の性質を有するＫＧＦ分子を首尾よく生成させ得るという妥当な期待を持たせるだけの十分な教示や証拠は報告されていない。
一般に、ある蛋白におけるアミノ酸の変化が生理活性に与える影響は、蛋白の三次構造ならびに蛋白の一次配列の受容体結合領域に対する改変の有無などのいくつかの因子によって変動するものである。天然型ＫＧＦの三次構造も、その一次構造における受容体結合領域も公表されていないことから、当業界における知識では、一般的に分類された蛋白でさえ、それに対するアミノ酸改変の影響に基づいて、天然型ＫＧＦに対するアミノ酸改変の影響について一般化を行うことはできない。
したがって、本発明の目的は、天然型ＫＧＦと比較して高い安定性（例：典型的なｐＨ条件、温度条件および／またはその他保存条件下にある場合）を示す類縁体をコードするポリペプチド分子を提供することにある。
発明の概要
本発明は、新規で生物活性なＫＧＦのポリペプチド類縁体を提供する。本発明の趣旨において、「ＫＧＦ」という用語は、天然型ＫＧＦならびに、天然型ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列であって、天然型ＫＧＦのＣｙｓ1およびＣｙｓ15に相当するシステイン残基（配列番号２におけるＣｙｓ32およびＣｙｓ46）を保持し、しかも天然型ＫＧＦの生物活性の一部もしくは全て、特に非線維芽細胞性上皮細胞増殖を保持しているペプチド配列を特徴とする蛋白、を含む。図４、７〜２４及び３７〜５０及び特異的アミノ酸の位置を参照すると、配列中の最初のメチオニン残基は残基番号０とみなされる。「天然型ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列を特徴とする」という表現は、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、配列番号１のヌクレオチド２０１〜６８４にハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列によってコードされるペプチド配列を意味している。
２つのアミノ酸配列間の対応するアミノ酸位置の決定は、候補物質の配列におけるアミノ末端および／またはカルボキシル末端の移動、必要に応じてのギャップの導入および／または挿入体として存在する残基の欠失などを含む残基間の一致を最大とするようにその２つの配列を整列させることによって決定することができる。公知で常法として用いられる配列相同性／同一性走査アルゴリズムプログラム（例：PearsonとLipman（1988）,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444-2448;Altschulら，（1990）,J.Mol.Biol.,215:403-410;LipmanとPearson（1985）,Science,222:1435またはDevereuxら，（1984）,Nuc.Acids Res.,12:387-395）を用いてデータベース検索、配列解析および処理を行うことができる。
ハイブリダイゼーションに関して、ストリンジェントな条件とは、塩、温度、有機溶媒およびハイブリダイゼーション反応において通常制御されるその他パラメータの条件の組み合わせが厳しいものをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６２〜６７℃で４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションと、それに続く約１時間の６２〜６７℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄である。さらに別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４５〜５５％ホルムアミド中、４０〜４５℃で４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションである［T.Maniatisら．，Molecular Cloning（実験手引書）；Cold Spring Harbor Laboratory（1982）,387-389頁参照］。
したがって、蛋白は、対立遺伝子変異、あるいはアミノ酸の欠失、置換または挿入を含み、すなわち天然型ＫＧＦの断片、キメラ分子またはハイブリッド分子を含む。ＫＧＦの１つの例は、電荷が変化したポリペプチドを含むが、その場合、天然型ＫＧＦのアミノ酸残基４１〜１５４のうちの１以上（好ましくは、Ａｒｇ41、Ｇｌｎ43、Ｌｙｓ55、Ｌｙｓ95、Ｌｙｓ128、Ａｓｎ137、Ｇｌｎ138、Ｌｙｓ139、Ａｒｇ144、Ｌｙｓ147、Ｇｌｎ152、Ｌｙｓ153またはＴｈｒ154の残基）が欠失しているか、あるいは正電荷の低減した蛋白を得るために選択される中性残基または負電荷を有する残基によって置換されており（１９９４年１０月１３日出願の同一所有者の米国特許出願第０８／３２３，３３７号に記載のもの）、具体的な例としては、天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１４４のアルギニンがグルタミンに置換されているＫＧＦであるＲ（１４４）Ｑが挙げられる。ＫＧＦの別の例としては、天然型ＫＧＦのＡｓｎ115−Ｈｉｓ116−Ｔｙｒ117−Ａｓｎ118−Ｔｈｒ119のループ形成領域内の１以上のアミノ酸がより高いループ形成能力を有する１以上のアミノ酸によって置換されて得られる蛋白などがあり（１９９４年１０月１３日出願の同一所有者の米国特許出願第０８／３２３，４７３号に記載のもの）、具体的な例としては、天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１１６のヒスチジンがグリシンに置換されているＫＧＦであるＨ（１１６）Ｇが挙げられる。さらに別の例としては、天然型ＫＧＦの１２３〜１３３領域（配列番号２のアミノ酸１５４〜１６４）内に１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有する蛋白などがあり、それらの蛋白は、作働薬活性または拮抗薬活性を持ち得る。
驚くべきことに、天然型ＫＧＦのＣｙｓ1およびＣｙｓ15に相当するシステイン残基（上記の方法を用いて決定したもの）（配列番号２のシステイン残基３２および４６）を有するＫＧＦ分子（すなわち、親分子）を、相当するシステインを置換することで改変した場合に、親分子と比較して、得られたＫＧＦ類縁体において安定性が向上することが発見された。好ましくは、安定性の向上だけでなく、本発明は、天然型ＫＧＦと比較して完全な生物活性（すなわち、少なくとも実質的に類似の受容体への結合または親和性）をも示す類縁体に関する。
本発明の別の態様においては、種々の生物活性なＫＧＦポリペプチド類縁体をコードする精製・単離された核酸分子を提供する。１実施態様において、そのような核酸は、生物学的機能性のプラスミドまたはウィルスベクター中にクローニングされたＤＮＡ分子を包含する。別の実施態様においては、核酸構築物を利用して、原核または真核宿主細胞を安定に形質転換することができる。さらに別の実施態様において、本発明は、核酸分子によって安定に形質転換した原核宿主細胞（好ましくは大腸菌）または真核宿主細胞を、ＫＧＦ類縁体を発現させるように適切な栄養条件下に成長させる方法を含む。発現後、得られた組換えポリペプチドは、単離・精製することができる。
本発明のさらに別の態様は、治療上有効な量のＫＧＦ類縁体と、許容される医薬担体とを含有する医薬組成物に関する。そのよう組成物は、上皮の疾患および損傷をもつ患者の治療に有用である。
本発明において、別の態様は、治療上有効な量のＫＧＦ類縁体を患者に投与することで、上皮細胞の成長を刺激する方法に関する。１実施態様において、非線維芽細胞性上皮細胞が、増殖が刺激される細胞である。そのような上皮細胞には、各種の付属器細胞、膵臓細胞、肝細胞、ならびに呼吸管および消化管における粘膜上皮などがある。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び１Ｂは、天然型ＫＧＦのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。（天然型ＫＧＦの成熟型をコードするヌクレオチドは配列番号１の塩基２０１〜６８４で示され、ＫＧＦの成熟型は配列番号２のアミノ酸残基３２〜１９４で示されている）
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、それぞれｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
図３は、構築物ＲＳＨ−ＫＧＦのヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図４は、プラスミドＫＧＦに含まれる構築物のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
図５は、プラスミドＫＧＦに含まれる構築物においてＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間のＤＮＡ配列（配列番号６のアミノ酸位置４６〜８５）を置換して、プラスミドＫＧＦ（ｄｓｄ）中にその構築物を形成するのに使用される化学的に合成されたＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃６〜ＯＬＩＧＯ＃１１；それぞれ配列番号１２〜１７）を示す。
図６は、ＫＧＦ（最適化コドン）の構築に使用される化学的に合成されたＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃１２〜ＯＬＩＧＯ＃２４；それぞれ配列番号１８〜３０）を示す。
図７は、天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１および１５のシステインがセリンに置換されているＫＧＦ類縁体であるＣ（１，１５）Ｓのヌクレオチド配列（配列番号３１）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
図８は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の３個のアミノ酸を欠失し、かつアミノ酸位置１５のシステインをセリンで置換したＫＧＦ類緑体であるΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓのヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
図９は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１５のシステインの欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ３／Ｃ（１５）−のヌクレオチド配列（配列番号３５）およびアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。
図１０は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の８個のアミノ酸の欠失と、アミノ酸位置１５のシステインのセリンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓのヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。
図１１は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の８個のアミノ酸の欠失と、アミノ酸位置１５のシステインの欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ８／Ｃ（１５）−のヌクレオチド配列（配列番号３９）およびアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。
図１２は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の１５個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ１５のヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
図１３は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の１６個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ１６のヌクレオチド配列（配列番号４３）およびアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
図１４は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の１７個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ１７のヌクレオチド配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。
図１５は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の１８個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ１８のヌクレオチド配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
図１６は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の１９個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ１９のヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。
図１７は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の２０個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２０のヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。
図１８は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の２１個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２１のヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。
図１９は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の２２個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２２のヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。
図２０は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３のヌクレオチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。
図２１は、天然型ＫＧＦのＮ末端の最初の２４個のアミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２４のヌクレオチド配列（配列番号５９）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。
図２２は、天然型ＫＧＦにおいてアミノ酸位置１および１５のシステインのセリンによる置換とアミノ酸位置１４４のアルギニンのグルタミン酸による置換を有するＫＧＦ類縁体であるＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅのヌクレオチド配列（配列番号６１）およびアミノ酸配列（配列番号６２）を示す。
図２３は、天然型ＫＧＦにおいてアミノ酸位置１および１５のシステインのセリンによる置換とアミノ酸位置１４４のアルギニンのグルタミンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑのヌクレオチド配列（配列番号６３）およびアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。
図２４は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１４４のアルギニンのグルタミンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑのヌクレオチド配列（配列番号６５）およびアミノ酸配列（配列番号６６）を示す。
図２５は、天然型ＫＧＦおよびＣ（１，１５）ＳをｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中にて３７℃で２７時間保存した場合の残留可溶性蛋白の量を示す。
図２６は、天然型ＫＧＦ、ΔＮ１５およびＣ（１，１５）ＳをｐＨ７．０の５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中にて３７℃で２７時間保存した場合の残留可溶性蛋白の量を示す。
図２７は、３７℃でのインキュベーション時間の関数として、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定された天然ＫＧＦの可溶性蛋白、Ｃ（１、１５）Ｓ、Ｃ（１、１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ及びＣ（１、１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑの量を示す。
図２８は、天然型ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥにおけるｐＨの関数としての推定融点（Ｔm）を示す。
図２９は、ＤＮＡ合成時における［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定することで求めたＣ（１，１５）Ｓの有糸分裂促進活性の、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較した代表的なプロファイルを示す。
図３０は、ＤＮＡ合成時における［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定することで求めたΔＮ１５の有糸分裂促進活性の、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較した代表的なプロファイルを示す。
図３１は、ＤＮＡ合成時における［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定することで求めたΔＮ２３の有糸分裂促進活性の、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較した代表的なプロファイルを示す。
図３２は、ＤＮＡ合成時における［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定することで求めたΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの有糸分裂促進活性の、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較した代表的なプロファイルを示す。
図３３は、ＤＮＡ合成時における［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定することで求めたＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑの有糸分裂促進活性の、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較した代表的なプロファイルを示す。
図３４は、ＤＮＡ合成時における［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定することで求めたＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの有糸分裂促進活性の、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較した代表的なプロファイルを示す。
図３５は、血清中の化学物質に対する天然ＫＧＦ、ＫＧＦ−α、ΔＮ１５、Ｃ（１、１５）ＳおよびΔＮ２３の影響を示す。
図３６は、天然型ＫＧＦにおいてアミノ酸位置１、１５および４０のシステインがセリンで置換されたＫＧＦ類縁体であるＣ（１，１５，４０）Ｓのヌクレオチド配列（配列番号７７）およびアミノ酸配列（配列番号７８）を示す。
図３７は、天然型ＫＧＦにおいてアミノ酸位置１、１５および１０２のシステインがセリンで置換されたＫＧＦ類縁体であるＣ（１，１５，１０２）Ｓのヌクレオチド配列（配列番号７９）およびアミノ酸配列（配列番号８０）を示す。
図３８は、天然型ＫＧＦにおいてアミノ酸位置１、１５、１０２および１０６のシステインがセリンで置換されたＫＧＦ類縁体であるＣ（１，１５，１０２，１０６）Ｓのヌクレオチド配列（配列番号８１）およびアミノ酸配列（配列番号８２）を示す。
図３９は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１３７のアスパラギンのグルタミン酸による置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔ２３／Ｎ（１３７）Ｅのヌクレオチド配列（配列番号８３）およびアミノ酸配列（配列番号８４）を示す。
図４０は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１３９のリジンのグルタミン酸による置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｅのヌクレオチド配列（配列番号８５）およびアミノ酸配列（配列番号８６）を示す。
図４１は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１３９のリジンのグルタミンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑのヌクレオチド配列（配列番号８７）およびアミノ酸配列（配列番号８８）を示す。
図４２は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１４４のアルギニンのアラニンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａのヌクレオチド配列（配列番号８９）およびアミノ酸配列（配列番号９０）を示す。
図４３は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１４４のアルギニンのグルタミン酸による置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｅのヌクレオチド配列（配列番号９１）およびアミノ酸配列（配列番号９２）を示す。
図４４は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１４４のアルギニンのロイシンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌのヌクレオチド配列（配列番号９３）およびアミノ酸配列（配列番号９４）を示す。
図４５は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１４７のリジンのグルタミン酸による置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅのヌクレオチド配列（配列番号９５）およびアミノ酸配列（配列番号９６）を示す。
図４６は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１４７のリジンのグルタミンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑのヌクレオチド配列（配列番号９７）およびアミノ酸配列（配列番号９８）を示す。
図４７は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１５３のリジンのグルタミン酸による置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅのヌクレオチド配列（配列番号９９）およびアミノ酸配列（配列番号１００）を示す。
図４８は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失とアミノ酸位置１５３のリジンのグルタミンによる置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑのヌクレオチド配列（配列番号１０１）およびアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す。
図４９は、天然型ＫＧＦにおいてＮ末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失と、アミノ酸位置１５２のグルタミンのグルタミン酸による置換およびアミノ酸位置１５３のリジンのグルタミン酸による置換を有するＫＧＦ類縁体であるΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅのヌクレオチド配列（配列番号１０３）およびアミノ酸配列（配列番号１０４）を示す。
図５０は、スプラーグ・ドーリーラットにおけるストレプトゾトシン誘発糖尿病に対するΔＮ２３の効果を示す。
発明の詳細な説明
本発明によれば、新規なＫＧＦ類縁体が提供される。現在、天然型ＫＧＦのシステイン残基のうちの４個（Ｃｙｓ1およびＣｙｓ15、ならびにＣｙｓ102およびＣｙｓ106）が２個のジスルフィド架橋の形成に関与することが明らかになっている。Ｃｙｓ40は分子内ジスルフィド形成には関与しない。従ってＫＧＦは、ほぼ９０個のアミノ酸によって隔てられた２個の小さいジスルフィドループを有する。基本原理（first principals）に基づくと、ジスルフィド架橋にどのシステイン残基が関与するかが明らかになれば、どのシステインが遊離の状態にあって、蛋白に望ましくない三次構造（例：蛋白の活性を低下させるコンホメーション）を取らせる望ましくない分子間架橋または分子内結合を形成するかが示唆される。
驚くべきことに、ＫＧＦの位置１および１５に相当するシステイン残基（配列番号２の位置３２および４６）の欠失またはそれら残基のアミノ酸残基による置換によってＫＧＦを改変すると、安定性がかなり向上した（すなわち、不適切な再折り畳み、分子間ジスルフィド形成および／または蛋白凝集によって生じる問題が低減した）ＫＧＦ類縁体が得られることが判明した。例えばＫＧＦ類縁体を一般的に精製すると、可溶性で正しく折り畳まれた蛋白がより高い収率で得られる。さらに、その材料を精製すると、親分子の安定性と比較して、ｐＨ、温度などに対する安定性が高くなる。理論に拘束されるつもりはないが、ある一定の条件下で、分子内ジスルフィド架橋およびＮ末端ジスルフィドループの形成に加えてＫＧＦのＣｙｓ1およびＣｙｓ15は、分子間ジスルフィド結合を形成して、蛋白の不安定化および凝集を起こし得る遊離システインとしても存在すると考えられている。さらに、Ｎ末端ジスルフィドループの欠失は、受容体結合や有糸分裂促進活性において重要ではないことが判明した。
本発明で使用する場合、「ＫＧＦ類縁体」または「ＫＧＦのポリペプチド類縁体」とは、ＫＧＦの２４個のＮ末端アミノ酸（配列番号２のアミノ酸３２〜５５）に相当するペプチド配列において改変を有することでＫＧＦと構造的に異なる前述の天然および人為的ポリペプチドであって、ＫＧＦのＣｙｓ1およびＣｙｓ15（配列番号２のシステイン残基３２および４６）が置換または欠失しているものを意味する。システインが置換もしくは欠失する形態は重要ではなく、例えば、１以上のアミノ酸の欠失および／または置換を有するポリペプチド類縁体などがある。従って本発明は、新規な表皮ケラチン細胞成長因子蛋白ファミリーを提供する。この蛋白ファミリーは、いくつかの蛋白群から成る。
ＫＧＦ類縁体の一つの群には、蛋白中では天然には生じないものを含めて、ＫＧＦの位置１および１５のシステインがアミノ酸によって置換されている分子が含まれる。置換類縁体を形成する戦略では、部位特異的突然変異誘発を用いる方法などがある（Hoら，（1989）,Gene,77:51-59;Innisら,″PRC Protocols″,Academic Press,Inc.,San Diego,CA）［アミノ酸置換を有するＫＧＦ類縁体は、配列番号２に示した成熟蛋白（シグナル配列を含まないもの）でのその位置に認められる残基と、次に括弧に入ったそのアミノ酸位置と、新たなアミノ酸とによって表される。例えば、ＫＧＦのアミノ酸位置１５（配列番号２の位置４６）においてシステインからセリンへの置換を有する類縁体は「Ｃ（１５）Ｓ」と表される］。好ましくはそのシステインは、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、トレオニンおよびメチオニンなどの中性アミノ酸に変換され、システインとの化学的類似性から最も好ましくはセリン、トレオニンおよびアラニンによって変換される。実施例１には、部分的遺伝子合成（他の組換え法との併用で）とそれに続く安定に形質転換した細菌宿主での組換え体の発現によるＣ（１，１５）Ｓの形成が詳細に説明してある。
ＫＧＦ類縁体の別の群には、位置１および１５のシステインがＫＧＦから欠失している分子が含まれる。そのようなＫＧＦ類縁体を形成するには、Ｎ末端の切断（トランケーション）および部位特異的欠失または両者の併用などの各種戦略を用いることができる。
「Ｎ末端切断」とは、Ｃｙｓ1およびＣｙｓ15を含めたＫＧＦの１〜２４のＮ末端アミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸３２〜５５）が欠失しているＫＧＦの改変を指す［アミノ酸の切断（トランケーション）を有するＫＧＦ類縁体は、欠失の部位から始めて、配列番号２に示した成熟蛋白（シグナル配列を含まないもの）でのその位置で欠失している残基と、失われた残基数によって表される。例えば、ＫＧＦの２４個の残基のＮ末端切断を有するＫＧＦ類縁体（配列番号２の残基１〜５５）は「ΔＮ２４」類縁体と称される］。具体的には、アミノ酸残基４１〜１５４（配列番号２のアミノ酸７２〜１８５）のうちの１以上のアミノ酸残基、具体的にはアミノ酸残基１２３〜１３３（配列番号２のアミノ酸１５４〜１６４）が欠失しているか、あるいは正電荷の低減した蛋白を得るために選択された中性残基もしくは負電荷を有する残基で置換されている天然型ＫＧＦのΔＮ２３類縁体がこの群に含まれる。改変に好ましい残基には、Ａｒｇ41、Ｇｌｎ43、Ｌｙｓ55、Ｌｙｓ95、Ｌｙｓ128、Ａｓｎ137、Ｇｌｎ138、Ｌｙｓ139、Ａｒｇ144、Ｌｙｓ147、Ｇｌｎ152、Ｌｙｓ153またはＴｈｒ154などがあり、Ｇｌｎ138、Ｌｙｓ139、Ａｒｇ144、Ｌｙｓ147、Ｇｌｎ152またはＬｙｓ153がより好ましく、最も好ましくはＡｒｇ144である。さらにこの群には、Ａｓｎ115−Ｈｉｓ116−Ｔｙｒ117−Ａｓｎ118−Ｔｈｒ119（配列番号２のアミノ酸１４６〜１５０）のループ形成領域内にループ形成改変、好ましくはアミノ酸残基１１６の電荷改変など、より好ましくは位置１１６のＧｌｙの置換を有する天然型ＫＧＦのΔＮ２３類縁体も含まれる。さらにこの群には、天然型ＫＧＦの領域１２３〜１３３（配列番号２の１５４〜１６４のアミノ酸）内に１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有する天然型ＫＧＦのΔＮ２３類縁体も含まれる。
実施例１には、他の組換え法との併用で部分的遺伝子合成と、それに続く安定に形質転換された細菌宿主における組換え体発現によって得られる系統的なＮ末端切断の形成について詳細に説明されている。そのようなＮ末端切断の例としては、ΔＮ１５〜ΔＮ２４などがある。さらに、実施例３には、天然型ＫＧＦおよび不均一性Ｎ末端グリコシル化イソフォームをコードするＤＮＡの哺乳動物培養細胞での発現、好ましくは天然型ＫＧＦの成熟体のアミノ酸１〜２３のＮ末端切断を有するグリコシル化イソフォームの精製について詳細に説明されている。
それとは対照的に、部位特異的欠失とは、１以上のアミノ酸残基（例：Ｃｙｓ1またはＣｙｓ15）が除去されたＫＧＦの改変を指す。ＫＧＦのＣｙｓ1またはＣｙｓ15が特異的に欠失すると、その類縁体はＫＧＦよりアミノ酸１個分だけ短くなる［アミノ酸の欠失を有するＫＧＦ類縁体は、配列番号２に示した成熟蛋白（シグナル配列が含まないもの）でのその位置に認められる残基と、次に括弧に入ったそのアミノ酸位置と、マイナスの記号とによって表される。例えば、ＫＧＦの位置１５（配列番号２の位置３６）のシステインが欠失しているこの群に含まれる類縁体は、「Ｃ（１５）−」と称される］。部位特異的欠失は、前述のように、部位特異的突然変異誘発を用いて形成することができる。
さらにこの群には、ＫＧＦのＣｙｓ1およびＣｙｓ15が切断（トランケーション）および欠失によって除去された類縁体も含まれる。例えば、代表的なＫＧＦ類縁体は、ＫＧＦの最初の３個のアミノ末端残基（Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ）の切断またはＫＧＦの最初の８個のアミノ酸（Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）の切断ならびにＫＧＦのアミノ酸位置１５のシステインの欠失の両方を有する（これらの類縁体はそれぞれ、ΔＮ３／Ｃ（１５）−およびΔＮ８／Ｃ（１５）−と称される）。天然型ＫＧＦの４番目および９番目のアミノ酸位置には天然にはメチオニン残基があることから、適切な翻訳を開始できるようにするのに別のＭｅｔコドンは必要ない。
さらに別の群には、ＫＧＦの位置１および１５のシステインが切断および置換によって切り替わっている分子がある。例えば、代表的なＫＧＦ類縁体には、ΔＮ３／Ｃ（１５）ＳおよびΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓがある。そのような類縁体は、ＫＧＦの最初の３個のアミノ末端残基の切断またはＫＧＦの最初の８個のアミノ末端残基の欠失と、アミノ酸位置１５のシステインの別のアミノ酸（例：セリン）による置換の両方を持つものである。
ＫＧＦ類縁体が生物学的に形成される場合、すなわちそれが固相合成、天然産物の蛋白分解的もしくは酵素的な誘導体化などの生成物に対する細胞発現の産生物などである場合、そのようなポリペプチドをコードする核酸は、天然型ＫＧＦのヌクレオチド配列と比較して１以上のヌクレオチドが異なっている。そのようなポリヌクレオチドは発現させることができ、得られるポリペプチドは、当業者には公知の多くの組換え技術の方法のいずれかによって精製することができる。
ＫＧＦ類縁体の全体もしくは一部をコードするＤＮＡ配列には特に、容易に発現されるベクターの構築を促進するための、選択された宿主細胞における発現に「好ましい」コドン（例：「大腸菌発現コドン」）の組み込み；制限酵素による開裂のための部位の提供；ならびに別の開始、停止もしくは中間のヌクレオチド配列（例：大腸菌細胞における発現のための開始メチオニンアミノ酸残基）の提供などがあり得る。
本発明はさらに、ポリペプチドの発現方法において使用する組換え体分子またはベクターをも提供するものである。そのようなベクターはＤＮＡもしくはＲＮＡから構成することができ、性質的には環状、直鎖、一本鎖または二本鎖であることができ、天然物であるかまたは天然もしくは合成の多様な成分の集合体であることができる。
そのような発現ベクターには多くの例が知られている。ベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーターなどは、天然起源から得るかあるいは公知の手順によって合成することができる。各場合において、本発明で有用な発現ベクターは、ＫＧＦポリペプチド類縁体をコードする挿入核酸分子と機能的に結合する１以上の発現調節要素を有する。この調節要素は、本発明の核酸分子からのポリペプチドの発現の調節を担当する。有用な調節要素には例えば、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ファージλからのオペレーターおよびプロモーター、解糖系酵母プロモーター、酵母酸性ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーター、酵母α接合因子（mating factor）ならびにアデノウィルス・エプスタイン・バールウィルス、ポリオーマおよびサルウィルス由来のプロモーター、各種レトロウィルス由来のプロモーターなどがある。しかしながら、当業界においては、原核または真核生物発現に好適な他のベクターおよび調節要素が多く知られており、本発明の実施において使用することができる。
好適な原核生物クローニングベクターの例としては、大腸菌からのプラスミド（例：ｐＢＲ３２２、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＵＣおよびＦ因子）などがあり、好ましいプラスミドとしてはｐＣＦＭ１１５６（ＡＴＣＣ６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ６９５７６）およびｐＣＦＭ３１０２（以下の実施例のセクションに記載）である。哺乳動物、昆虫、酵母、真菌および細菌での発現について当業界で公知の多くの種類のうちの他の適切な発現ベクターも、この目的に使用することができる。これらのベクターの適切な宿主細胞へのトランスフェクションにより、ＫＧＦ類縁体ポリペプチドを発現させることができる。
本発明に有用な宿主微生物は、原核生物または真核生物のいずれかであることができる。好適な原核生物宿主には、各種の大腸菌（例：ＦＭ５、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）、シュードモナス菌、バチルス菌およびストレプトミセス菌などがあり、大腸菌が好ましい。好適な真核宿主細胞には、酵母その他の真菌、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞などがあり、例としてはＣＯＳ（例：ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７）およびＣＶ−１サル細胞系、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨ細胞から誘導された３Ｔ３系、ＨｅＬａおよびＬ−９２９マウス細胞、ならびにＣＨＯ、ＢＨＫもしくはＨａＫハムスター細胞が挙げられる。用いる宿主に応じて、本発明によって形成される組換えポリペプチドは、哺乳動物その他の真核生物の炭水化物によるグリコシル化を受けるか、あるいはグリコシル化されないものとすることができる。
好ましい製造方法は、多くの因子および考慮事項に応じて変わるものである。所定の状況に関して最適な製造手順は、わずかな実験を行うことで当業者には明らかになる。次に、得られる発現産生物を当業界で公知の手順を用いて精製してほぼ均質なものとすることができる。原核細胞産生において代表的な精製手順は、高圧その他の手段による細胞壁の破壊、遠心または濾過による細胞破片の除去とそれに続く上清もしくは濾液のイオン交換クロマトグラフィー、ならびに最終的な疎水的相互作用クロマトグラフィーを含むものである。類縁体が不溶性の形態で発現される場合の別の精製法は、最初に類縁体を含有する包接体の溶解とその後のイオン交換クロマトグラフィー、次に蛋白の再折り畳み、ならびに最後に疎水的相互作用クロマトグラフィーを含む。精製法の例としては、１９９４年１０月１３日出願の同一所有者の米国特許出願第０８／３２３，３３９号に記載されたものがある。米国特許出願第０８／３２３，３３９号には、（ａ）ＫＧＦを含有する溶液の取得；（ｂ）（ａ）の溶液からのＫＧＦのカチオン交換樹脂への結合；（ｃ）カチオン交換樹脂からのＫＧＦの溶離液中への溶離；（ｄ）（ｃ）からの溶出液を適切な分子量排除マトリックス通過させるか、または（ｃ）の溶出液についての疎水的相互作用クロマトグラフィーの実施；ならびに（ｅ）分子量排除マトリックスもしくは疎水的相互作用クロマトグラフィーからのＫＧＦの回収、を含む表皮ケラチン細胞成長因子の精製方法が記載されている。
当然のことながら、これら類縁体は迅速にスクリーニングして、その物性を評価することができる。実施例のセクションには、各種公知の安定性アッセイ法が記載されている。ただし、類縁体の試験に用いられる特定のアッセイ法は必須ではない。さらに、生物活性（例：受容体への結合および／または親和性、有糸分裂促進活性、細胞増殖活性および／またはin vivo活性）のレベルを各種アッセイを用いて調べることができ、そのアッセイのうちの一部については実施例セクションに記載してある。多くのアッセイが公知であり、それを用いてＫＧＦ類縁体のスクリーニングを迅速に行って、それらが許容できる生物活性を有するか否かを求めることもできる。そのようなアッセイの一つでは、125Ｉ−ＫＧＦ結合と競合させることで、ＫＧＦ受容体（ＫＧＦＲ）に対する結合能力に関してＫＧＦ類縁体を特異的に調べる（Bottaroら，（1990）,J.Biol.Chem.,265:12767-12770;Ronら，（1993）,J.Biol.Chem.,268:2984-2988）。ＫＧＦＲ／ＫＧＦ類縁体の相互作用についての別のアッセイ方法は、リアルタイムの生物特異的相互作用分析（ＢＩＡ）などの方法の使用を含む（Felderら，（1993）,Molecular & Cellular Biology,13:1449-1455）。さらに、有糸分裂促進アッセイを利用して、ＫＧＦ類縁体のＤＮＡ合成刺激能力を調べることができる（Rubinら，（1989）,前出）。最後に、細胞増殖アッセイを利用して、ＫＧＦ類縁体が細胞増殖を刺激する能力を調べることができる（Falcoら，（1988）,Oncogene,2:573-578）。前述のアッセイ系のいずれかを用いて、ＫＧＦ類縁体を迅速にスクリーニングしてその生物活性を調べることができる。
好ましい実施態様において、本発明は天然型ＫＧＦの活性と比較して完全な（すなわち、少なくとも実質的に同様の）in vitroまたはin vivoでの生物活性を保持するＫＧＦ類縁体に関する。１以上の上記のアッセイによって決定されたこれらの性質を有するＫＧＦ類縁体の例としては、Ｃ（１，１５）Ｓ、ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ３／Ｃ（１５）−、ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ８／Ｃ（１５）−、ΔＮ１５、ΔＮ１６、ΔＮ１７、ΔＮ１８、ΔＮ１９、ΔＮ２０、ΔＮ２１、ΔＮ２２、ΔＮ２３、ΔＮ２４またはΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑがある。
ＫＧＦ類縁体をさらに改変して、通常はそのペプチドの一部ではない別の化学的部分を持たせることもできる。そのような誘導体化部分によって、ＫＧＦ類縁体の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。それ以外に、そのような部分によって蛋白の望ましくない副作用などを排除もしくは低減することができる場合もある。そのような効果に介在することができる部分は文献に開示されている（例：REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA（1990））。ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖もしくは末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることで、分子中に共有結合的修飾を導入することができる（T.E.Creighton（1983）,PROTEINS:STRUCTURE AND MOLECULE PROPERTIES,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86）。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、蛋白治療薬の製造に使用されているそのような化学的部分の一つである。一部の蛋白では、ポリエチレングリコールの結合によって、蛋白分解に対する保護を得られることが明らかになっており（Sadaら，（1991）,J.Fermentation Bioengineering,71:137-39）、ある種のポリエチレングリコール部分を結合させる方法が知られている。１９７９年１２月１８日発行の米国特許第４，１７９，３３７号（Davisら，″Non-Immunogenic Polypeptides″）および１９７７年１月１１日発行の米国特許第４，００２，５３１号（Royer,″Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby″）を参照のこと。総説については、アブコウスキー（Abuchowski）ら，Enzymes as Drugsを参照のこと（HolcerbergとRoberts（編）367-383頁（1981））。ポリエチレングリコールの場合、各種方法を用いて、蛋白にポリエチレングリコール分子を結合させている。一般に、ポリエチレングリコール分子は、蛋白上に認められる反応性基を介して蛋白に結合される。リジン残基またはＮ末端にあるアミノ基などのアミノ基が、そのような結合に好都合である。例えば、ロイヤー（Royer,上記の米国特許第４，００２，５３１号）は、還元的アルキル化を行って酵素にポリエチレングリコール分子を結合したと述べている。１９９３年４月２８日公開のＥＰ  ０５３９１６７号（Wright,″Peg Imidates and Protein Derivates Thereof″）には、遊離アミノ基を有するペプチドおよび有機化合物が、ＰＥＧのイミデート誘導体または関連する水溶性有機ポリマーで修飾されることが記載されている。１９９０年２月２７日発行の米国特許第４，９０４，５８４号（Shaw）は、反応性アミノ基を介したポリエチレングリコール分子の付加のための蛋白におけるリジン残基の数の変更に関するものである。
さらに別の実施態様において、本発明は、非経口的または経口的に投与して温血動物（ヒトなど）における疾患を安全に治療することができる単回投与単位の医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は、生理的に許容できる溶媒を加えることで再構成することができる凍結乾燥または脱水された治療薬もしくは診断薬の形態とすることができる。そのような溶媒は、無菌水、生理食塩水、グルコース液または他の水性炭水化物液（例：マニトール、キシリトールまたはグリセリンなどのポリオール）で、乾燥組成物を溶解することができ、選択される投与経路に適合し、しかも使用される有効成分および再構成安定剤に悪影響を与えないものなどの媒体であり得る。ある特定の実施態様において、本発明は、単回投与単位を調製するキットに関する。そのキットには、乾燥蛋白の入った第１の容器と再構成安定剤を含有する水性製剤の入った第２の容器の両方を含むものである。溶液における蛋白の濃度、各容器に入れる溶液の量、ならびに容器の容量、等（最終投与単位における有効成分の所望の濃度に応じて、適切に変更することができる相互に関係するパラメータ）に関しては、当業者には公知の広い範囲で変動し得るものである。
本発明のＫＧＦ類縁体は、治療薬および診断薬として、さらには研究試薬として有用なものとなり得る。従って、本発明のＫＧＦ類縁体をin vitroおよび／またはin vivoの診断アッセイに用いて、組織または器官の検体中のＫＧＦの量を定量した限り、あるいはＫＧＦＲを発現する細胞を決定および／または単離することができる（Bottaroら，（1990）J.Biol.Chem.,265:12767-12770;Ronら，（1993），J.Biol.,Chem.,268:2984-2988）。組織または器官のアッセイでは、未標識の天然型ＫＧＦがＫＧＦＲに結合するため、125Ｉ−ＫＧＦ類縁体の標準化結合曲線と比較して、ＫＧＦＲに結合する125Ｉ−ＫＧＦ類縁体からの放射能はより少ない。同様に、125Ｉ−ＫＧＦ類縁体を使用することで、各種細胞型中のＫＧＦＲの存在を検出することができる。
本発明はさらに、ペプチドに対する抗体であって天然型ＫＧＦにも結合する抗体の製造における、ＫＧＦ類縁体の使用にも関する。この実施態様においては、抗体の起源はモノクローナルまたはポリクローナルであり、ＫＧＦ類縁体を用いて製造される。得られる抗体は、好ましくは天然型ＫＧＦがその本来（生物活性）のコンホメーションにある場合に、優先的にその蛋白に結合する。その抗体を用いて、天然型ＫＧＦの検出または精製を行うことができる。
さらに本発明は、例えば有効なＫＧＦ送達の方法としてあるいはＫＧＦ活性の阻害薬として、治療用途を持つ高親和性もしくは低親和性のＫＧＦ結合分子の発見におけるＫＧＦ類縁体の使用を含む。そのような結合分子のＫＧＦに対する親和性は非常に温度依存性が高く、しかも４℃で認められる親和性からは予測できないことから、生理条件下（すなわち、３７℃）でそのような結合分子を同定するには、ＫＧＦ類縁体の熱安定性が重要である。
in vivoで使用する場合、ＫＧＦ類縁体を添加剤とともに製剤化することができる。そのような添加剤には、緩衝剤、担体、安定剤、賦形剤、保存剤、張性調節剤、酸化防止剤など（例：粘度調節剤または増量剤）がある。具体的な添加剤の選択は、ＫＧＦ類縁体の保存形態（すなわち、液体または凍結乾燥品）および投与法によって決まる。当業界で公知の好適な製剤化は、文献に記載されている（REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES（最新版），Mack Publishing Company,Easton,PA）。
ＫＧＦ類縁体は、具体的には非線維芽細胞性上皮細胞に対する損傷または臨床的な該細胞の数の不足を特徴とする組織に対して治療上有効量で投与することができる。ＫＧＦ類縁体を投与して奏功する症状には、火傷および他の部分的および全層性損傷の患者における毛包、汗腺および皮脂腺などの付属器構造体の刺激、増殖および分化；下層にある真皮への表皮の付着における欠陥であって、重度の病状を引き起こし得る頻繁な開放性で疼痛を伴う水疱を生じる表皮水疱症によって生じる病変の再上皮形成促進；化学療法誘発の脱毛症の防止ならびに男性型禿頭症または男性および女性における進行性脱毛の治療；胃潰瘍および十二指腸潰瘍の治療；クローン病（主として小腸を冒す）および潰瘍性大腸炎（主として大腸を冒す）などの炎症性腸疾患の治療；処置（例：前処置および／または後処置）を介しての放射線治療および化学療法における胃腸毒性の防止または低減による細胞保護効果もしくは再生またはその両方の誘発；消化管全体における粘膜の生成刺激；未熟児におけるヒアリン膜疾患などの疾患（すなわち、幼児呼吸障害症候群および気管支肺形成異常）の治療もしくは予防に役立ち得るＩＩ型肺細胞の増殖および分化の誘発；吸入損傷（高酸素濃度など）、気腫、肺に損傷を与える化学療法の使用、人工呼吸器性外傷その他の肺に損傷を与える環境による急性もしくは慢性の肺の損傷もしくは機能不全がある場合の細気管支および／または肺胞の上皮の増殖および分化の刺激；肝機能向上による、肝硬変、劇症性肝不全、急性ウィルス性肝炎によって生じる損傷および／または肝臓に対する毒性傷害の治療もしくは予防；例えば角膜剥離の治療における角膜細胞再生誘発；上皮細胞再生誘発による進行性歯肉病の治療；鼓膜上皮細胞の再生誘発による鼓膜損傷の治療；ならびに真性糖尿病の治療もしくは発症防止など、あるいは島（islet）細胞移植の場合の補助剤としてのものなどがあるが、ただしそれらに限定されない。
非線維芽細胞性上皮細胞の増殖を必要とする患者には、有効量のＫＧＦ類縁体を投与する。「有効量」とは、治療される患者において所望の応答を誘発するのに必要なＫＧＦ類縁体の量であり、従って、担当医が決定するものである。投与されるＫＧＦ類縁体の量に影響を与える因子としては、患者の年齢および全身状態、治療する疾患などがある。代表的な用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲である。
ＫＧＦ類縁体は、温血動物（ヒトなど）に対して、非経口的（例：ＩＶ、ＩＴ、ＩＭ、ＳＣもしくはＩＰ経路にて）、経口的または局所的に安全に投与することができる。ＫＧＦ類縁体は単回投与または反復投与で使用することができ、それは疾患および患者の状態によって決まる。場合によっては、ＫＧＦ類縁体を、他の療法の補助剤として、さらには他の医薬製剤と併用して投与することができる。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。記載の手順については、本発明の思想から逸脱しない限りにおいて、変更が可能であることは明らかである。
実施例
以下の実施例に記載の手順または好適な代替手順の多くに関する標準的方法は、分子生物学の広く認められた手引書に記載されている（例：Molecular Cloning,Second Edition,Sambrookら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1987）およびCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausabelら，Greene Publishing Associates/Wiley Interscience,New York（1990））。
実施例１：ＫＧＦおよびＫＧＦ類縁体をコードするＤＮＡの製造
全長のヒトＫＧＦ遺伝子（天然型ＫＧＦの配列を有するポリペプチドをコードしている）のクローニングを、動物細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および化学合成（大腸菌最適化コドン）オリゴヌクレオチド（「ＯＬＩＧＯ」）のＰＣＲの両方によって行った。この両方法について以下に記載する。
該ポリペプチドを産生することが知られている細胞から単離されたＲＮＡを使用してＰＣＲ増幅を行った。最初に、ヒト線維芽細胞系ＡＧ１５２３Ａ（ニュージャージー州カムデンのHuman Genetic Mutant Cell Culture Repository Institute For Medical Researchから入手）からの細胞をグアニジウムチオシアネートで破壊し、次に抽出した（コミジンスキーらの方法（Chomyzinski et al.（1987）,Anal.Biochem.,172:156）による）。全ＲＮＡについての標準的逆転写酵素プロトコールを用いて、ＫＧＦ  ｃＤＮＡを作製した。テンプレートとしてのＫＧＦ  ｃＤＮＡならびにＫＧＦ遺伝子の５’および３’に直接ＤＮＡ配列をコードするプライマーＯＬＩＧＯ＃１およびＯＬＩＧＯ＃２を用いて、ＫＧＦ遺伝子のＰＣＲ（ＰＣＲ＃１）増幅を実施した［９６００型サーモサイクラー（thermocycler）（Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT）；２８サイクル；各サイクルは９４℃で１分間の変性、６０℃で２分間のアニーリングおよび７２℃で３分間の伸長から成る］。次に、少量のＰＣＲ＃１生成物をテンプレートとして用いて、アニーリング温度を５０℃とする以外は上記のサイクル条件と同じ２回目のＫＧＦ  ＰＣＲ（ＰＣＲ＃２）増幅を行った。ＫＧＦ遺伝子の発現クローニングについては、ネステッド（nested）ＰＣＲプライマーを用いて、ＫＧＦ遺伝子の両末端で簡便な制限部位を形成した。ＯＬＩＧＯ＃３およびＯＬＩＧＯ＃４を用いて、ＰＣＲ＃２からのＫＧＦ  ＤＮＡ産生物を改変して、遺伝子の５’末端および３’末端にそれぞれＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩの制限部位を設けた［ＰＣＲ＃３；３０サイクル；各サイクルは９４℃で１分間の変性、６０℃で２分間のアニーリングおよび７２℃で３分間の伸長から成る］。このＤＮＡを次に、ＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩで切断し、フェノール抽出し、エタノールで沈殿させた。それを次に再懸濁し、「ＲＳＨ」シグナル配列を有するｐＣＦＭ１１５６プラスミド（図２Ａ）に連結して（Ｔ４リガーゼを用いて）、構築物ＲＳＨ−ＫＧＦを作製した（図３）。
連結反応生成物を大腸菌株ＦＭ５（ＡＴＣＣ：５３９１１）中に形質転換し（ハナーンらの方法（Hanahan（1983）,J.Mol.Biol.,166:557）に従って）、２８℃でＬＢ＋カナマイシンにプレーティングした。いくつかの形質転換細胞を選択し、カナマイシンを２０μｇ／ｍＬで含有する少量の液体培地で成長させた。ＲＳＨ−ＫＧＦプラスミドを各培地の細胞から単離し、ＤＮＡ配列の決定を行った。ＫＧＦ遺伝子に内部ＮｄｅＩ部位があるため、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの同じ制限部位をもつ所望の発現ベクターに天然型遺伝子配列を直接クローニングすることはできなかった。これは、３連の連結反応（three-way ligation）によってうまく行えた。プラスミドＲＳＨ−ＫＧＦをＢｓｍＩおよびＳｓｔＩの各単一の制限部位で切断し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＫＧＦ遺伝子の３’末端を有する）を、１％アガロースゲルによる電気泳動によって単離した。ＯＬＩＧＯ＃３に代えてＯＬＩＧＯ＃５を用いる以外はＰＣＲ＃３に関して記載の方法に従って、ＰＣＲ（ＰＣＲ＃４）を行った。次に、ＰＣＲ  ＤＮＡ産生物をＮｄｅＩおよびＢｓｍＩで切断し、４％アガロースゲルでの電気泳動によって３１１ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。連結反応の第３の断片は、ＮｄｅＩおよびＳｓｔＩによって切断され、１％アガロースゲルでの電気泳動によって単離したｐＣＦＭ１１５６の１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片である。前述のような連結反応（Ｔ４リガーゼ）、形質転換、カナマイシン選択およびＤＮＡ配列決定後、図４の構築物およびＫＧＦと称されるプラスミドを含むクローンを取った。切頭型産生物を産生する内部リボソーム結合部位があることから、単一のＫｐｎＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位の間のＫＧＦ  ＤＮＡ配列を化学合成ＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃６〜ＯＬＩＧＯ＃１１）で置換して、内部開始部位の使用を最小にした（図５）。
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ＯＬＩＧＯをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次に熱変性した。次に、温度を徐々に室温まで低下させることで、１本鎖（ｓｓ）ＯＬＩＧＯをｄｓＤＮＡ断片にした。次にＴ４リガーゼを用いて、内部のＯＬＩＧＯ粘着性両末端を共有結合させ、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したＫＧＦプラスミドに、ｄｓＯＬＩＧＯ断片全体を共有結合した。新たなプラスミドはＫＧＦ（ｄｓｄ）と称した。
化学合成ＯＬＩＧＯ＃１２〜ＱＬＩＧＯ＃２４のＰＣＲ増幅によって、完全に大腸菌コドンが最適化されたＫＧＦ遺伝子を構築した。
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ＯＬＩＧＯ＃１２〜ＯＬＩＧＯ＃２４の設計は、天然型ＫＧＦをコードするＤＮＡ配列全体が「ワトソン（Watson）」またはクリック（Crick）」鎖からのＯＬＩＧＯによって表され、ＰＣＲ増幅時に、所望の２本鎖ＤＮＡ配列（図６）を産生するようなものとした［ＰＣＲ＃５、９６００型サーモサイクラー、Perkin-Elmer Cetus;２１サイクル、各サイクルは９４℃で３１秒間の変性、５０℃で３１秒間のアニーリングおよび７３℃で３１秒間の伸長から成る；２１サイクル後、７分間の最終伸長段階によってＰＣＲを終了した］。ＰＣＲ増幅後、ＤＮＡ断片をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、その５２１ｂｐ断片を、同じ酵素で切断した発現プラスミドｐＣＦＭ１１５６に連結した。ＰＣＲ＃５では、外部プライマー（１００ｐｍｏｌ／１００μＬ  ｒｘｎ）であるＯＬＩＧＯ＃１２およびＯＬＩＧＯ＃１３、ならびに連結反応用のバンド補助（band-aid）オリゴ（Jayaramanら，（1992）,Biotechniques,12:392）としてＯＬＩＧＯ＃２０〜ＯＬＩＧＯ＃２４を用いるＯＬＩＧＯ＃１４〜ＯＬＩＧＯ＃１９（ＯＬＩＧＯ＃１５〜ＯＬＩＧＯ＃１８はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した）の連結反応（Ｔ４リガーゼによる）によって誘導されるＫＧＦテンプレート１μＬ／１００μＬ  ｒｘｎを利用した。最終構築物はＫＧＦ（最適化コドン）と称した。
本明細書に記載の全てのＫＧＦ類縁体は、部分的に、ＫＧＦ（ｄｓｄ）またはＫＧＦ（最適化コドン）あるいはそれら２つの組み合わせに認められるＤＮＡ配列から構成される。１以上の上記のＤＮＡ断片合成法を利用して形成された特定のＫＧＦ類縁体アミノ酸をコードするＤＮＡ配列の簡便な制限部位に挿入することで、その配列をさらに改変する。上記の方法によって、あらゆる類縁体を全長にわたって形成することができる。しかしながら、一般的ＯＬＩＧＯ設計の一部として、適宜に最適化大腸菌コドンを用いた。ただし、調べたところ、大腸菌最適化コドンが遺伝子の一部もしくは全体で存在しても、培養細菌細胞から得られる蛋白の収量は有意には向上しなかった。図７〜２４および図３７〜５０に、簡便な例によって、特定のＫＧＦ類縁体ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の構築を示してある。すなわち、Ｃ（１，１５）Ｓ（図７）；ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ（図８）；ΔＮ３／Ｃ（１５）−（図９）；ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ（図１０）；ΔＮ８／Ｃ（１５）−（図１１）；ΔＮ１５（図１２）；ΔＮ１６（図１３）；ΔＮ１７（図１４）；ΔＮ１８（図１５）；ΔＮ１９（図１６）；ΔＮ２０（図１７）；ΔＮ２１（図１８）；ΔＮ２２（図１９）；ΔＮ２３（図２０）；ΔＮ２４（図２１）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ（図２２）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ（図２３）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ（図２４）；Ｃ（１，１５，４０）／Ｓ（図３６）；Ｃ（１，１５，１０２）Ｓ（図３７）；Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ（図３８）；ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ（図３９）；ΔＮ２３／Ｎ（１３９）Ｅ（図４０）；ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ（図４１）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ（図４２）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｅ（図４３）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ（図４４）；ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ（図４５）；ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ（図４６）；ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ（図４７）；ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ（図４８）；およびΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ（図４９）である。ここに記載のＫＧＦ類縁体構築物はいずれも、ＤＮＡ配列を確認した。
実施例２：大腸菌での産生
Ａ．ＫＧＦ誘導体の発現
３つの異なる発現プラスミドをＫＧＦ類縁体遺伝子のクローニングに用いた。それらは、ｐＣＦＭ１１５６（ＡＴＣＣ＃６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）およびｐＣＦＭ３１０２（それぞれ図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）。プラスミドｐ３１０２は、オリゴ突然変異誘発と重複させてＰＣＲによる一連の部位特異的塩基変換を行うことによって、プラスミドｐＣＦＭ１６５６から誘導することができる。プラスミド複製プロモーターであるＰcopBの５’の直のところにあるＢｇｌＩＩ部位（ｐＣＦＭ１６５６プラスミドｂｐ＃１８０）から始めて、プラスミド複製遺伝子の方向に進むとしたとき、塩基対変換は次の通りである。
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上記でわかるように、ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２は互いに非常に類似しており、同一制限部位を多く有する。これらプラスミドは便宜的に選択したものであり、ベクターＤＮＡ成分は、新規の構築物の目的に応じて容易に交換することができる。全てのクローニングのために使用した宿主は大腸菌株ＦＭ５（ＡＴＣＣ：５３９１１）であり、形質転換は上記のハナーンの方法（Hanahan（1983）,前出）によって行うか、あるいは製造業者の説明に従ってジーン・パルサー（Gene Pulser；登録商標）トランスフェクション装置（BioRad Laboratories,Inc.,Hercules,CA）を用いる電気溶離（electroelution）によって行った。
最初に、３個のｐＣＦＭベクターのうちの１個に所望の構築物を保有する所望の組換え大腸菌クローンの培養したばかりの少量の接種物について、ルリア（Luria）ブロス５００ｍＬが入った２リットルフラスコ中に適切な株の冷凍グリセリンストック０．１ｍＬを入れることで開始した。培地を３０℃で１６時間振盪し、次に培地を、無菌バッチ培地（Tsaiら，（1987）,J.Industrial Microbiol.,2:181-187）８リットルの入った１５リットル発酵槽に移した。
フィード＃１培地（Tsaiら，（1987）,前出）を供給することで、フィードバッチ発酵を開始する。ＯＤ６００が３５に達した時に、培地の温度を急上昇させて３７℃として２時間経過させ、次に４２℃まで上昇させてＣＩリプレッサーを変性させることで、所望のＫＧＦ類縁体の発現を誘発した。フィード１の添加を中止してフィード２に切り替え、その添加速度は最初は３００ｍＬ／ｈｒとした。フィード２は、１７５ｇ／Ｌのトリプチカーゼ−ペプトン、８７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物および２６０ｇ／Ｌのグルコースを含むものであった。４２℃で１時間後、培養温度を下げて３６℃とし、その温度をさらに６時間維持した。
次に発酵を停止し、１リットルの遠心瓶に入ったプラスチックバッグ中に遠心によって細胞を回収した。４００ｒｐｍで６０分間遠心することで細胞をペレットとし、その後上清を除去し、細胞ペーストを−９０℃で冷凍した。
大腸菌での各種ＫＧＦ類縁体の発現の後、天然型ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ１５、ΔＮ２３およびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの蛋白を、以下の手順によって精製した。好適な高剪断ミキサーを用いて、高細胞密度発酵から得られた細胞ペーストを４℃で０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５の溶液中に１０〜２０％（重量／容量）液として懸濁させた。次に、得られた液をホモジナイザー（APV Gaulin,Inc.,Everett,MA）に３回通して、懸濁した細胞を溶解した。流れ出てくるホモジネートを、好適な熱交換器を用いて冷却して４〜８℃とした。次に、ＪＳ４．２ローターを搭載したＪ−６Ｂ（登録商標）遠心機（Beckman Instruments,Inc.,Brea,CA）中、４℃で、４２００ｒｐｍにて溶解物を３０〜６０分間遠心することで、細胞破片を除去した。次に上清を注意深く傾斜法除去し、４℃で０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５の溶液で平衡状態としたＳ−セファロース・ファスト・フロー（S-Sepharose Fast Flow；登録商標）樹脂（Pharmacia,Piscataway,NJ）の予め準備しておいた４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムにロードした。次に、４℃で、カラム容量の５倍量（２２５０ｍＬ）の０．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５でカラムを洗浄した。０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５の溶液５リットルでカラムを洗浄することで、所望の蛋白を溶離した。５０ｍＬずつの分画を採取し、溶出液のＡ280を連続的にモニターした。Ａ280によって溶離物を含有すると確認された分画を１４％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、所望のポリペプチドの存在を確認した。
目的の蛋白を含有するこれらの分画をプールし、次に等量の蒸留水を加えた。次に、４℃で０．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８溶液で平衡化したＳ−セファロース・ファスト・フローの予め準備しておいた４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムに、希釈サンプルをロードした。０．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８の溶液２２５０ｍＬでカラムを洗浄し、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８から０．６Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８へのカラム容量の２０倍量の直線的グラジエントを用いて蛋白を溶離した。やはり、溶出液の定常的Ａ280モニタリング下に５０ｍＬずつの分画を採取した。蛋白を含有する分画（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定）をプールし、３５ｃｃの攪拌セル（Amicon,Inc.Maryberry,MA）中、ＹＭ−１０膜（分子量１００００カットオフ）を用いて濃縮して容量３０〜４０ｍＬとした。
１×ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝塩水、「Ｄ−ＰＢＳ」、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）または０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．０を含むカラム緩衝液で予め平衡化しておいたスーパーデックス−７５（Superdex-75；登録商標）樹脂（Pharmacia）１３００ｍＬ（４．４ｃｍ×８５ｃｍ）に濃縮液をロードした。サンプルをカラムに流した後、カラム緩衝液を用いてゲル濾過マトリックスから蛋白を溶離した。その後、１０ｍＬずつの分画を回収し、類縁体を含む分画（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定）をプールした。代表的には、得られたプール中の蛋白濃度は約５〜１０ｍｇ／ｍＬであった。以上の手順はいずれも、別段の断りがない限り、４〜８℃で行った。
別途の精製手順を行って、天然型ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）ＳおよびΔＮ２３を精製した。その手順では以下の段階を行い、別段の断りがない限り、全ての手順、溶液および材料は２３±５℃で実施／使用した。
細菌発酵の産生期終了後、細胞培地を冷却して４〜８℃とし、遠心または類似の方法によって細胞を回収した。単位重量の細胞ペースト当たりの蛋白の予想収量と要求される精製蛋白の量に基づいて、重量基準で適切な量の細胞ペーストを、懸濁すべき細胞ペーストの約５倍重量の２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の温和な緩衝液に懸濁した。高剪断ミキサーを用いて細胞を分散させて、均一溶液を得た。均質化の際、細胞ペースト分散液の温度は４〜８℃に維持した。
次に、例えば細胞ペースト分散液を適切な大きさの細胞ホモジナイザーに２回通して、細胞を加圧溶解した。得られたホモジネートを冷却して５±３℃とした。適切なフィルター表面積を有するフィルターを取り付けて、好適な容量の０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５液で予め平衡化しておいたデプスフィルターケース（Cuno,Inc.,Meriden,CT）を用いて、細胞溶解物を透明とした。平衡および清澄化は、５±３℃で行った。清澄化に先だって、適切な量の好適なフィルター助剤を用いてフィルターを予備被覆し、細胞溶解物と十分に混和し、その後フィルター装置に溶液を通過させて、溶解物を清澄化した。濾液を０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５で洗浄した。濾液およびその後の全ての洗液を好適な容量の冷却容器に回収した。その間温度は常時１０℃未満に維持した。
清澄化後、細胞ペースト２ｇ当たり少なくとも１ｍＬの樹脂を含むＳＰ−セファロース・ファスト・フローの予め準備しておいたカラムに溶解物を通した。ＳＰ−セファロース・ファスト・フローのカラムを、冷却（５±３℃）した０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５で平衡状態とした。カラム温度は１０℃未満に維持した。透明溶解物（５±３℃）をイオン交換カラムにロードし、溶出液を２８０ｎｍ（Ａ280）での吸収で連続的にモニターした。サンプルをロードした後、カラムを冷たい０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５で洗浄し、次に２３±５℃で０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５にて洗浄した。
所望の蛋白を溶離するため、０．２〜１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５の範囲の直線的勾配溶離を行った。溶出液のＡ280に基づいて、いくつかの分画でバルク生成物を回収した。溶離後、これらの分画を合わせ、容量を記録した。
遊離のスルフヒドリル基を酸化するため、酸化段階を行った。天然型ＫＧＦと比較してシステインパターンの異なる蛋白については、酸化剤（例：シスタミン二塩酸塩または別の適切な酸化剤、例えばシスチン、酸化型グルタチオンもしくは２価の銅）を最終濃度１〜２０ｍＭで加え、ｐＨを７〜９．５に調節した。シスタミン二塩酸塩を用いた場合は、ｐＨは好ましくは９．０±０．３とした。酸化は、適切な時間にわたり１０〜３０℃で行った。天然型ＫＧＦ蛋白の場合、酸化は、１〜２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4のような適切な量の（ＮＨ4）2ＳＯ4を加え、ｐＨを７．５±０．５に調節し、適切な時間にわたり温度を２３±５℃に維持することで行った。
酸化後、溶液のｐＨを６．５〜９．５に調節した。必要に応じて、固体の（ＮＨ4）2ＳＯ4を、最終濃度２Ｍとなるまで溶液に加えた。溶液を適切な清澄化フィルターに通して、粒状物を除去した。
濾過した酸化生成物について、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行った。ＨＩＣ担体は、ブチル−６５０Ｍトヨパール（Butyl-650M Toyopearl；登録商標）樹脂（Tosohaas,Inc.,Montgomeryville,PA）であった。２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．０で予め平衡状態としておいたカラムに、蛋白含有溶液をロードした。サンプルをロードした後、カラムを２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．０で洗浄した。次に、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．０において（ＮＨ4）2ＳＯ4について２Ｍから０Ｍへの直線的減少の勾配を用いて所望の蛋白を溶離した。溶出液のＡ280上昇によって所望の蛋白の溶出開始が示された時に、分画を回収した。各分画のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。所望の蛋白を含有する分画を合わせ、十分混和し、合わせた液の容量を測定し、その中の蛋白の濃度も測定した。
合わせたＨＩＣ蛋白含有溶出液を濃縮し、溶離緩衝液を交換した。代表的には、蛋白濃度５．０〜１０．０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。適切な大きさのカットオフ膜を用いるＰＴＧＣペリコン（Pellicon；登録商標）カセットシステム（Millipore,Inc.,Bedford,MA）を取り付けた限外濾過システムを用いて、限外濾過を行った。
濃縮後、サンプルを適切な緩衝液に対して透析濾過（diafilter）した。濃縮段階から得られた濃縮液を、その濃縮液の導電率が０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．０の導電率の５％以内となるまで、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．０に対して透析濾過した。
さらに、存在する可能性のある沈殿物および細菌内毒素を除去するため、濃縮・透析濾過した蛋白含有サンプルを、ポジダイン（Posidyne；登録商標）フィルター（Pall,Inc.,Cortland,NY）に通した。溶液の蛋白濃度を測定した後、最終バルク生成物の所望の濃度に基づいて、溶液を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０液で希釈して、所望の最終濃度とした。最終バルク生成物を、さらなる製剤化に向けた保存（約５℃）のため、０．２２μｍフィルターによる最終滅菌濾過を行い、発熱物質を含まない容器に移した。
Ｂ．分析
大腸菌から誘導された、天然型ＫＧＦ；Ｃ（１，１５）Ｓ；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ；ΔＮ１５；ΔＮ２３；およびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑを用いて分析を行った。
コンホメーションの安定性
ポリペプチドについて、その保存安定性、熱的アンフォールディング転移温度（Ｔm）および広範囲のｐＨ条件における安定性の比較を行った。
保存安定性
図２５では、２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で３７℃にて２７時間保存した場合について、天然型ＫＧＦおよびＣ（１，１５）Ｓを比較している。Ｃ（１，１５）Ｓは、天然型ＫＧＦと比較して可溶性蛋白における大幅増量を示した。
図２６では、ＰＢＳ中および５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で３７℃にて１８時間保存した場合の天然型ＫＧＦ、ΔＮ１５およびＣ（１，１５）Ｓの安定性を比較している（データはない）。可溶性蛋白の回収率は、リン酸緩衝液中の方がＰＢＳでの場合よりかなり高い。ΔＮ１５とＣ（１，１５）Ｓはいずれも、天然型ＫＧＦと比較してかなり高い安定性を示した。ΔＮ１５およびＣ（１，１５）Ｓはさらに、天然型ＫＧＦの結果から予想されるように、高リン酸塩で約１００％の回収率を与えた。
しかしながら、保存安定性について１回の予備的比較例を、Ｃ（１，１５，４０）ＳとＣ（４０）Ｓ（Ｓｅｒ40がＡＧＡによってコードされている以外、配列番号１の塩基２０１〜６８４によってコードされたもの）との間、ならびにＣ（１，１５，１０２）およびＣ（１０２）Ｓ（Ｓｅｒ102がＡＧＧによってコードされている以外、配列番号１の塩基２０１〜６８４によってコードされたもの）で行った。結果（ここでは示さなかった）は、安定性の低下を示した（すなわち、３７℃で保存した後、可溶性蛋白が減少）。しかしながら、培養培地から精製した可溶性で正しく折り畳まれたＣ（１，１５，４０）Ｓ蛋白はＣ（４０）Ｓの場合より値が大きいことから、Ｃ（１，１５，４０）Ｓの方が実際に安定性が高いこと、ならびに比較例からの結果からは明瞭な結論は得られないことが示唆される。本発明は好ましくは、Ｃｙｓ40、Ｃｙｓ102、Ｃｙｓ106での置換以外の置換を有するＫＧＦ類縁体を含むものであり、より好ましくは、Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２）ＳおよびＣ（１，１５，４０，１０２、１６０）を除外するものである。
高温での天然型ＫＧＦ、Ｃ（１、１５）Ｓ、ΔＮ２３、Ｃ（１、１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの凝集防止能力も調べた。蛋白０．５ｍｇ／ｍＬを含有するサンプルをＤ−ＰＢＳで調製した。各サンプル０．５ｍＬずつを３ｃｃの１型ガラス試薬瓶に小分けした。試薬瓶をゴム栓で封止し、１３ｍｍのフリップオフ（flip-off）アルミニウムシールの端を曲げた。これらの試薬瓶を３７℃のインキュベータに入れた。所定時間後、試薬瓶を取り出し、可溶性蛋白の喪失について分析した。０．２２μｍスピン−Ｘ（Spin-X；登録商標）フィルターユニット（Costar,Cambridge,MA）によって各サンプル２５０μＬを遠心することで、肉眼で観察できる沈殿を除去した。次に、濾過した溶液中の可溶性蛋白を、サイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。可溶性蛋白の量は、ＨＰＬＣピーク面積を積分し、結果を３７℃でのインキュベーション時間の関数としてプロットすることで求めた。天然型ＫＧＦ、Ｃ（１、１５）Ｓ、Ｃ（１、１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ及びＣ（１、１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの結果は図２６に示してある（ΔＮ２３とΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑについてデータはない）。
次に、得られた反応速度曲線から、可溶性モノマー蛋白の喪失についての半減期を推定した。表１には、これら蛋白について３７℃で保存した場合の残留可溶性ＫＧＦに関する半減期を示してある。
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上記の表１および図２７からわかるように、天然型ＫＧＦが最も早く凝集し、溶解度半減期は０．６日であった。Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは、溶解度半減期にかなりの上昇を示し、それぞれ１３．３日、２２．３日および３８日であった。
熱的アンフォールディング（thermal unfolding）
ＰＴＣ−３４３ペルティエル（Peltier）型温度制御システムを搭載したＪ−７２０（登録商標）分光偏光計（Jasco,Inc.,Easton,MD）を用いる２３０ｎｍでの円偏光二色性分光分析（ＣＤ）によって熱的アンフォールディングをモニターした。ＣＤ分析用に、分析対象のポリペプチド０．１ｍｇ／ｍＬを含有する個々のサンプルをＤ−ＰＢＳ（Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY）で調製した。各サンプルについて、約２．５ｍＬを光路長１０ｍｍの矩形スプラジル（Sprasil；登録商標）石英（Heraeus Quarzschmelze,GmbH,Hanau,Germany）蛍光セル（Hellma Cells,Inc.,Jamaica,Germany）に入れた。次にセルを、分光偏光計のペルティエル型温度制御システムに装着した。５０℃／ｈｒの速度で熱的アンフォールディングを実施した。楕円率の変化を２３０ｎｍでモニターして、アンフォールディングの指標とした。溶液中の蛋白分子の５０％がアンフォールドした温度を確認することで、各サンプルのＴmを推定した（Biophysical Chemistry,Cantor and Schimmel（eds）,W.H.Freeman and Co.San Francisco（1980））。３つの蛋白のそれぞれについての推定Ｔmを表２に挙げてある。
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結果から明らかなように、Ｃ（１，１５）ＳおよびΔＮ１５は、天然型ＫＧＦと比較して、Ｔmが１℃上昇している。ΔＮ２３ではさらにＴmが上昇している。しかしながら、Ｒ１１４ＱをＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱまたはΔＮ２３に代えると、Ｔmに６℃を超える上昇があり、天然型ＫＧＦと比較して７℃を超える上昇があった。さらに、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅでは天然型ＫＧＦと比較して９℃より大きい安定性向上がある。
ｐＨ
さらに、濃ＨＣｌまたはＮａＯＨを加えてＤ−ＰＢＳを各種ｐＨ値に調節することで、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの酸安定性を天然型ＫＧＦの安定性と比較した。各種ｐＨ値のＤ−ＰＢＳ約２．３５ｍＬを石英セル中で、２．４５ｍｇ／ｍＬ  ＫＧＦ蛋白液１００μＬと混合した。これらのサンプルについて、５０℃／ｈｒの速度で熱的アンフォールディングを行い、２３０ｎｍでのＣＤによってモニタリングした。図２８には、天然型ＫＧＦ、Ｃ（１、１５）Ｓ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥについてのｐＨの関数としてＴmを示してある。調べたｐＨ範囲では、Ｃ（１、１５）Ｓ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは常に、天然型ＫＧＦより高いＴmを有している。
in vitro生理活性
さらに、Ｃ（１，１５）Ｓ、ΔＮ１５、ΔＮ２３、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅのin vitroでの有糸分裂促進活性を、蛋白濃度およびＢａｌｂ／ＭＫ細胞による［3Ｈ］−チミジン取り込み測定による半最大（half-maximal）濃度の関数として求めた（ルビンらの方法（Rubinら（1989）、前出）による）。一般に、公知の標準的天然型ＫＧＦと比較した各ＫＧＦ類縁体の濃度は、in vitroの生物学的アッセイを用いて求めた。各ＫＧＦ類縁体を希釈し、Ｂａｌｂ／ＭＫ有糸分裂促進アッセイを用いて生物活性を定量した。最初にサンプルを、５０％カスタマーメイドイーグル（Eagle′s）ＭＥＭ、５０％カスタマーメイドＦ１２、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、０．０００５％ＨＳＡおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０から成るバイオアッセイ培地で希釈した。次に、ＫＧＦサンプルを、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞を接種してあるファルコン・プリメリア（Falcon Primera）９６穴プレートに加えた。ＤＮＡ合成時の［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定・変換し、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較することで、天然型ＫＧＦ濃度を入力した。結果を図２９〜３４に示してある。これらの図からわかる通り、図２８〜３３に示した被験ＫＧＦ類縁体は、天然型ＫＧＦと同等の活性を有する。
実施例３：哺乳動物培養細胞での産生
本実施例では、哺乳動物発現系で産生される２つの生物活性組換えＫＧＦ（ｒＫＧＦ）の発現、単離および特性決定について説明する。
ヒトの正常皮膚線維芽細胞から作製したｃＤＮＡ（Clonetec,Inc.,San Diego,CA）のＰＣＲ増幅によって、ヒトＫＧＦ遺伝子を単離した。逆転写酵素によるｃＤＮＡ形成後、ＰＣＲを行ってＫＧＦ遺伝子を増幅した。ＯＬＩＧＯ＃２５およびＯＬＩＧＯ＃２６を用いて前記ｃＤＮＡから遺伝子を増幅し、ＯＬＩＧＯ＃２７およびＯＬＩＧＯ＃２８を用いて、図１Ａ及び１Ｂに示したように、第２のＰＣＲ増幅によって断片末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を形成した。
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クローニングおよびＤＮＡ配列確認後、ＫＧＦ遺伝子ＤＮＡを用いた。ＯＬＩＧＯ＃２９およびＯＬＩＧＯ＃３０を用いて増幅を行った。
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センスプライマーＯＬＩＧＯ＃２９は、ＸｂａＩ部位と、開始コドンＡＴＧの上流にコンセンサスコザック（Kozak）翻訳配列（5′-CCACC-3′）を持っていた。アンチセンスプライマーであるＯＬＩＧＯ＃３０は、ＳａｌＩクローニング部位および別の停止コドンを持っていた。１８サイクルのＰＣＲ増幅後（９４℃での変性３０秒、５５℃でのアニーリング４０秒、７２℃での伸長４０秒）、産生物をＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化させ、同様に消化されたｐＤＳＲα２のＤＮＡと連結した（ブードレルらの方法（Bourdrel et al.（1993）,Protein Exp.& Purif.,4:130-140）およびルーらの方法（Lu et al.（1992）,Arch.Biochem.Biophys.,298:150-158）による）。これにより、ＳＶ４０初期プロモーター配列とα−ＦＳＨポリアデニル化配列の間にヒト遺伝子を有するプラスミドＫＧＦ／ｐＤＳＲα２が得られた。２個のクローンを取り、ＤＮＡ配列分析により、所望のベクターの構造を確認した。
ＫＧＦ／ｐＤＳＲα２  ＤＮＡ  ２μｇをＰｖｕＩによって線状とした。０．８×１０6細胞／６０ｍｍ培養皿で前日に接種しておいたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、標準的リン酸カルシウム沈殿法を用いて、処理したＤＮＡでトランスフェクションした（Bourdrelら、前出）。２週間後、個々のコロニーを取り、２４穴プレートに移した。細胞が密集状態となった時に、ならし培地は血清を含まないものと見なし、その少量サンプルについて大腸菌発現ヒトＫＧＦに対して反応性のポリクローナルウサギ抗血清を用いるウェスタンブロッティングによる分析を行った。
ウェスタンブロッティングは、サンプルを１２．５％（重量／容量）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに通し、次に半乾燥トランスファー装置（Hoefer Scientific Instruments,San Francisco,CA）を用いてニトロセルロース膜上で４００ｍＡで１時間電気ブロッティングすることで行った。トランスファー緩衝液としては、２０ｍＭトリス、１５０ｍＭグリシン、２０％メタノール液を用いた。１０％正常ヤギ血清ＰＢＳ液とともにインキュベーションすることでニトロセルロースシートをブロックした。大腸菌由来のＫＧＦに対するウサギ抗血清を、一次抗体として用いた。用時に、それを１％正常ヤギ血清のＰＢＳ溶液で１／１００００希釈し、室温で、ブロックしたニトロセルロースシートとともにインキュベーションし、次に、ＰＢＳでの３０分間洗浄を３回行って過剰の抗体を除去した。次に、１％正常ヤギ血清のベクタステイン（Vectastain；登録商標）ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（二次抗体、Vector Labs,Burlingame,CA）を含有するＰＢＳ溶液１００ｍＬ中、室温で、そのニトロセルロース膜を３０分間インキュベーションした。ＰＢＳでの１０分間の洗浄を３回行った後、製造業者の説明（Vector Labs）に従って調製した、ストレプトアビジンおよびビオチニル化ペルオキシダーゼを含有する１％正常ヤギ血清の１００ｍＬ溶液中、３０分間の室温でのインキュベーションを行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、３０％（重量／容量）Ｈ2Ｏ2（６０μＬ）のＰＢＳ（１００ｍＬ）溶液および４−クロロナフトール（５０ｍｇ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液の混合物中でインキュベーションして、ＫＧＦ交差反応性物を肉眼で観察できるようにした。１０分後に水で洗浄して、反応を停止した。
染色の分析により、ＫＧＦ特異的抗体が３つの別個の蛋白バンドに結合しており、２つは約２５〜２９ｋＤａの分子量を持って密接に係しており、一つは推定分子量が約１７ｋＤａであることが明らかになり、それに対して１６３アミノ酸成熟蛋白の予想分子量は約１８．８ｋＤａであった。さらに、ウェスタン分析で測定した値で１リットル当たり２．０ｍｇを超えるｒＫＧＦを分泌するいくつかの高発現クローンを選択し、回転瓶中で増殖して（ルーらの前出の方法による）、血清を含まないならし培地を大量に得て、前述のようにカチオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過によるＫＧＦの精製を行った。
血清を含まないならし培地３リットルからのＫＧＦを、予めｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウムで平衡状態としておいたＳ−セファロース・ファスト・フロー（Pharmacia）のカラムで、スルホエチル４５０ｍＬを充填したカチオン交換カラム（５×２４ｃｍ）に直接流して精製した。カラム容量の５倍量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した後、０．２から１．０Ｍ  ＮａＣｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）のカラム容量の２０倍量での直線的勾配溶離でｒＫＧＦの溶離を行った。連続的Ａ280モニタリングを行いながら、５０ｍＬずつの分画を採った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって各分画の少量サンプルを分析することで、ＫＧＦ蛋白を検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、成形済みの１４％トリス−グリシンプレキャストゲルを用いる電気泳動システム（Novex,San Diego,CA）で行った（レムリの方法（Laemmli（1970）Nature,227:680-685）による）。サンプルを、加熱せずに非還元性ＳＤＳサンプル緩衝液と混合してからロードした。クマシブルーまたは銀染色によって蛋白を検出した。遅れて溶離する２本のピークが、ウェスタンブロッティングによって検出される２５〜２９ｋＤａおよび１７ｋＤａのバンドに相当する蛋白バンドを含むことが分かった。これらの各ピークを含む分画を別個に濃縮して容量を１．０ｍＬ未満とし、ゲル濾過した。
ゲル濾過では、ｐＨ７．２のＰＢＳで予め平衡状態とし、公知の分子量標準（BioRad,San Francisco,CA）、すなわちチログロブリン（６７０ｋＤａ）、ｇ−グロブリン（１５８ｋＤａ）、オボアルブミン（４４ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ−１２（１．４ｋＤａ）で較正したスーパーデックス−７５（登録商標）樹脂（HR 10/30,Pharmacia）のカラムを用いた。これらの精製段階によりｒＫＧＦが約２０００倍に精製され、具体的には銀染色による推定で、１７ｋＤａおよび３０ｋＤａの物質が含まれていた。
さらに分子量の大きい物質の場合、ｒＫＧＦは主要な対称形ピーク（Ａ280により）として溶出し、それをＫＧＦ−ａと称した。この物質の比較的少量についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ（３μｇ／レーンと６μｇ／レーン）、分子量差が１〜２ｋＤａである２個のバンドが分離された。低分子量側の物質の場合（ＫＧＦ−ｂと称する）、ゲル濾過によって、予想された移動度を有する蛋白生成物が得られた。ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂのいずれについても、精製後の総収率は約３０〜４０％であった。
ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂからのアミノ酸配列も分析した。その分析は、１２０Ａ型オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析装置および９００Ａ型データ収集システムを搭載した自動配列分析装置（４７７Ａもしくは４７０Ａ型、Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA）で行った（ルーらの方法（Lu et al.（1991）,J.Biol.Chem.266:8102-8107）。ＫＧＦ−ａのエドマン配列分析により、X1-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X3-S-という主要なＮ末端配列（配列番号７５）が明らかになった。３番目のＮ末端アミノ酸であるアスパラギン酸から開始するマイナーな配列も、全配列決定可能蛋白中で１．６％存在した。Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、配列分析時にフェニルチオヒダントイニル（ＰＨＴ）アミノ酸シグナルがなかったため、未確定であったことを示す。ｃＤＮＡ配列から予想されるＫＧＦのＮ末端アミノ酸配列は、Ｘ1およびＸ3がＣｙｓ残基であり、Ｘ2がアスパラギンであることを示している。Ｘ1およびＸ3の不在は、これらのシステインがジスルフィド架橋を形成している可能性のあることを示している。コンセンサスＮ−結合グリコシル化配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒに基づくと、Ｘ2に相当する予想されたＡｓｎ残基の不在は、それがＮ−結合グリコシル化部位である可能性があることを示している。
興味深いことに、ＫＧＦ−ｂのＮ末端配列分析から、S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V-のＮ末端アミノ酸配列（配列番号７６）が明らかになり、それがＡｒｇ23−Ｓｅｒ24ペプチド結合での蛋白分解的に開裂したＮ末端切断型ＫＧＦであることを示している。
公知の方法（Sasakiら，（1987）,J.Biol.Chem.,262:12059-12076;Takeuchiら，（1988）,J.Biol.Chem.,263:3657-3663;Zseboら，（1990）,Cell,63:195-201）を用いて、蛋白をグリコシダーゼ（ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリカナーゼおよび／またはＮ−グリカナーゼ）処理して、精製したＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂについてさらに特性決定を行った。得られたデータは、ＫＧＦ−ａがＮ−結合およびＯ−結合炭水化物を含有することを示している。ただし、低分子量型であるＫＧＦ−ａはＮ−結合糖のみを有する可能性が高い。グリコシダーゼ処理によって、ＫＧＦ−ｂに分子量低下は起こらず、その分子がグリコシル化されていないことが示された。
上記のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ形成ペプチドの質量スペクトル法により、ＫＧＦ−ａのグリコシル化パターンについてさらに特性決定を行った。質量スペクトル分析の階段的（stepped）オリフィス法によるグリコペプチドの炭水化物構造の解明は、他の蛋白に適用されて奏功している（Huddlestonら，（1993）,Anal.Chem.,65:877-884;Carrら，（1993）,Prot.Sci.,2:183-196）。非グリコシル化ペプチドの単離によって確認したところ、Ｔｈｒ22は部分的にグリコシル化されているように思われる。Ａｓｎ14についての同様の質量スペクトル分析により、各種程度のシアリル化を有するジ、トリおよびテトラアンテナ構造があり、グリコシル化における微小な不均一性が示唆された。
表３Ａには、表皮ケラチン細胞の［3Ｈ］−チミジン取り込みを刺激して半最大速度とするＫＧＦ濃度をまとめてある（ルビンらの方法（Rubin et al.（1989）、前出）による）。Ｂａｌｂ／ＭＫマウス表皮ケラチン細胞から得られた単離ＫＧＦ受容体膜調製物を用いてＫＧＦ受容体との相互作用を調べた（マッサグーの報告（Massague（1983）,J.Biol.Chem.,258:13614-13620）に記載の手順による）。具体的には、０．２％ウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で各種形態のＫＧＦを希釈して、濃度を０．８ｎｇ〜１００ｎｇ／５０μＬの範囲とした。それらを個々に、膜調製物（７５ｎｇ／ｍＬ）および125Ｉ標識大腸菌由来ＫＧＦ（１．５ｎｇ）とともにインキュベーションした。受容体の結合・競合実験を４℃で１６時間行い、その後、経時的にサンプルを採取し、遠心し、上記の緩衝液で２回洗浄して、未結合または非特異的に結合した標識ＫＧＦを除去した。次に、サンプルについて残留放射能をカウントした。非競合パーセントを各ＫＧＦサンプルの濃度に対してプロットすることで、ＫＧＦサンプルと標識ＫＧＦとの間の受容体結合に関する競合曲線を作成した。表３Ｂには、標識大腸菌由来ＫＧＦに対して６０％非競合を得るのに必要なＫＧＦ濃度をまとめてある（ｎｇ／ｍＬで表してある）。
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表３Ａで明らかなように、ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂは［3Ｈ］−チミジン取り込みを同等に刺激し、半最大速度刺激はいずれの類縁体においても約３０ｎｇ／ｍＬで得られた。従って、切頭（トランケーション）によって分子の生物活性は低下しない。しかしながら、その２つの類縁体が有する活性は、大腸菌由来の全長ＫＧＦの約１／３である。表３Ｂから明らかなように、放射性受容体アッセイ非競合実験は、大腸菌由来のＫＧＦ、ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂが同様の受容体結合活性を有することを示した。
実施例４：大腸菌および哺乳動物培養細胞で産生されるＫＧＦポリペプチドのin vivoでの生物学的アッセイ
ＫＧＦの単回皮下投与により、２４時間以内にマウスにおける血清コレステロールに用量依存的上昇が生じることが明らかになっている。天然型ＫＧＦ、ＫＧＦ−ａ、Ｃ（１，１５）Ｓ、ΔＮ１５およびΔＮ２３について、用量依存的に血清コレステロール濃度を上昇させる能力の評価も行った。
各投与群は、ＣＲＬから入手した雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１８〜２０ｇ）５匹とした。蛋白を０．９％生理食塩水で希釈して、最終注射容量を１００μＬ／マウスとなるようにした。各マウスについて、以下の用量で、単回皮下注射による投与を行った。
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注射から２４時間後、マウスを屠殺し、心臓穿刺によって放血した。血液検体を処理して、血清コレステロールを測定した。
図３５に示したように、各被験ＫＧＦ類縁体は、用量依存的に血清コレステロールを上昇させることが認められた。さらに、被験ＫＧＦ類縁体のいずれの間でも、生物活性に明らかな差はなかった。
in vivoの糖尿病モデル
各種動物で化学的に誘発した真性糖尿病モデルを従来通り用いて、疾患およびその治療について調べた。ストレプトゾトシンにより、マウス、ラット、ハムスター、イヌおよびサルにおいて糖尿病を誘発した。ただし、ほとんどの場合でラットおよびマウスでの試験を用いた（Junodら，Proc.Soc.Exp.Pio.Med.126:210-205（1967）;Rerup,Pharm.Rev.22:485-518（1970）;Rossiniら，P.N.A.S.74:2485-2489（1977）;およびAr′RajabとAhren,Pancreas 8:50-57（1993））。ラットにおいては、単回静脈内投与としてのストレプトゾトシン用量４５〜７０ｍｇ／ｋｇによって安定な疾患が誘発される。４５ｍｇ／ｋｇ以下の用量では可逆性の一過性疾患状態が誘発される。ストレプトゾトシン注射の第１日中で、高血糖状態が誘発される。血中インシュリン濃度は健常ラットと比較してほとんど変わらない。しかしながら、膵臓におけるインシュリンおよびＣ−ペプチドの総含有量は、大幅に低下する。ラットはヒトでの糖尿病に典型的な徴候および症状、すなわち血糖値上昇（高血糖症）、尿中の糖（糖尿）、渇きの亢進（煩渇多飲症）、排尿頻度の亢進（頻尿症）、食欲の亢進（摂食亢進症）を発症する。
本明細書に記載の試験は、スプラーグ・ドーリーラットでのストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルを用いて行った。試験開始時に体重２００〜２６０ｇの雄ラットを用いた。クエン酸ナトリウム緩衝液中ストレプトゾトシンを用量５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射することで、糖尿病を誘発した。非糖尿病対照ラットには、対照を目的として、クエン酸ナトリウム緩衝液の単回静脈内注射を行った。ＫＧＦを１日１回皮下注射で投与した。ＫＧＦの用量は、実験に応じて３または５ｍｇ／ｋｇ／日とした。最初の実験では、糖尿病誘発の２日前にＫＧＦ療法を開始し、糖尿病誘発後にも継続して、計８回注射した。第２および第３の実験では、ストレプトゾトシンによる糖尿病誘発の１日後に、皮下投与ＫＧＦ療法を開始した。第４の実験では、７日間のＫＧＦ療法を、ストレプトゾトシン投与から７日後に開始し、次に動物にはさらに１２週間投与した。第４の実験を除くいずれの実験においても、血糖値、尿糖値および尿量を、分析のエンドポイントとして用いた。さらに、一部の実験では、飲料水摂取、尿Ｃ−ペプチド濃度または総膵臓インシュリンおよびＣ−ペプチド含有量を測定した。第４の実験では、血糖のみが評価したエンドポイントであった。大部分のインシュリンは肝臓による循環から除去されることから、末梢インシュリン濃度の測定値は、膵臓からのインシュリン分泌ではなく、肝臓代謝後の事象を反映するものである。従って多くの場合、Ｃ−ペプチドの測定を行って、インシュリン分泌の末梢標識として用いた。Ｃ−ペプチドはプロインシュリンからインシュリンへのプロセシングによって産生される。インシュリンおよびＣ−ペプチドは、等モル量でβ細胞から分泌され、肝臓によって抜き取られるＣ−ペプチドはごく少量である。
本試験により、スプラーグ・ドーリーラットでのストレプトゾトシン誘発糖尿病に対するｒＫＧＦの効果を調べた。第０日目に、ラットの群を４５または５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）に曝露した。この投与後、非絶食時血糖濃度を毎日モニターして、ランゲルハンス島損傷の重症度を評価した。第５日目に、ＳＴＺ投与動物を、高血糖の程度に応じて２群中のいずれかの群（２０匹／群）に入れた。群分けの基準は、血糖濃度３００ｍｇ／ｄＬに設定した。ＳＴＺ未投与動物群を対照として用いた。第７日目、各高血糖群からの動物１０匹に、皮下注射にて７日間にわたり、ΔＮ２３（３ｍｇ／ｋｇ／日）またはＰＢＳを投与した。次に、血糖濃度を毎日、２日に１回または１週間に１回モニターした。その結果を図５０に示してある。注意すべき点として、ΔＮ２３投与を受けた両群からのＳＴＺ投与動物において、ΔＮ２３投与期間時の血糖に大幅な低下があった。重要な点として、開始時血糖が＜３００ｍｇ／ｄＬの群からのＳＴＺ投与動物で生じた平均血糖低下は約１５０ｍｇ／ｄＬで安定していたが、開始時血糖が＞３００ｍｇ／ｄＬの群で認められた血糖低下は一時的なものにすぎなかった。日数スケールが直線的ではないことに注意する。
以上、本発明について一般的にもかつ好ましい実施態様によっても説明したが、当業者であれば以上の説明を考慮して他の変形および変更を行いうると理解すべきである。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：８６２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２
配列の長さ：１９４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３
配列の長さ：５９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：４
配列の長さ：１８６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：５
配列の長さ：４９９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：６
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：７
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配列の型：核酸
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トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：８
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トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列の型：核酸
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トポロジー：不明
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配列
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配列番号：１０
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１１
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トポロジー：不明
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配列
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配列番号：１２
配列の長さ：３７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１３
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配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１４
配列の長さ：３７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１５
配列の長さ：４５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１６
配列の長さ：４５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
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配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１８
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
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配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：１９
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
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配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２０
配列の長さ：９１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
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配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２１
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２２
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２３
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２４
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２５
配列の長さ：８８塩基対
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トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２６
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配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２７
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２８
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：２９
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
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配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：３０
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：３１
配列の長さ：４９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：３２
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３３
配列の長さ：４８３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：３４
配列の長さ：１６０アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３５
配列の長さ：４８０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：３６
配列の長さ：１５９アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３７
配列の長さ：４６８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：３８
配列の長さ：１５５アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：３９
配列の長さ：４６５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：４０
配列の長さ：１５４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：４１
配列の長さ：４５０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：４２
配列の長さ：１４９アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：４３
配列の長さ：４４７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：４４
配列の長さ：１４８アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：４５
配列の長さ：４４４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：４６
配列の長さ：１４７アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：４７
配列の長さ：４４１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：４８
配列の長さ：１４６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：４９
配列の長さ：４３８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：５０
配列の長さ：１４５アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：５１
配列の長さ：４３５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：５２
配列の長さ：１４４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：５３
配列の長さ：４３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：５４
配列の長さ：１４３アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：５５
配列の長さ：４２９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：５６
配列の長さ：１４２アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：５７
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：５８
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：５９
配列の長さ：４２３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：６０
配列の長さ：１４０アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：６１
配列の長さ：４９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：６２
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：６３
配列の長さ：４９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：６４
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000075
配列番号：６５
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000076
配列番号：６６
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000077
配列番号：６７
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000078
配列番号：６８
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｍｉｓｃ−特性
存在位置：相補体（1..24）
配列
0004426646.tif 000079
配列番号：６９
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000080
配列番号：７０
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000081
配列番号：７１
配列の長さ：２９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000082
配列番号：７２
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000083
配列番号：７３
配列の長さ：３８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000084
配列番号：７４
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000085
配列番号：７５
配列の長さ：１６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000086
配列番号：７６
配列の長さ：１２アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000087
配列番号：７７
配列の長さ：５１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000088
配列番号：７８
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000089
配列番号：７９
配列の長さ：５１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000090
配列番号：８０
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000091
配列番号：８１
配列の長さ：５１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000092
配列番号：８２
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000093
配列番号：８３
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000094
配列番号：８４
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000095
配列番号：８５
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000096
配列番号：８６
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000097
配列番号：８７
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000098
配列番号：８８
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000099
配列番号：８９
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：９０
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類．：タンパク質
配列
0004426646.tif 000101
配列番号：９１
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000102
配列番号：９２
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000103
配列番号：９３
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000104
配列番号：９４
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000105
配列番号：９５
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000106
配列番号：９６
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000107
配列番号：９７
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000108
配列番号：９８
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000109
配列番号：９９
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000110
配列番号：１００
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000111
配列番号：１０１
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000112
配列番号：１０２
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000113
配列番号：１０３
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0004426646.tif 000114
配列番号：１０４
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004426646.tif 000115
【図１】
0004426646.tif 000116
0004426646.tif 000117
【図２Ａ】
0004426646.tif 000118
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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