(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１）前記ＤＮＡライブラリー中の前記第一のｄｓＤＮＡと前記第二のｄｓＤＮＡを対応する第一のｓｓＤＮＡと第二のｓｓＤＮＡに変換して、該第一のｓｓＤＮＡと該第二のｓｓＤＮＡとを含むライブラリーを調製する工程と；
（２）工程（１）で調製した前記ライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡに相同な直鎖ｄｓＤＮＡとを加えて前記第二のｓｓＤＮＡから前記第二のｄｓＤＮＡを再生することにより、前記第一のｓｓＤＮＡと再生された第二のｄｓＤＮＡとを含むライブラリーを得る工程と；
（３）工程（２）で得られた前記ライブラリーから前記再生された第二のｄｓＤＮＡを除去する工程と；
（４）前記第一のｓｓＤＮＡから前記第一のｄｓＤＮＡを再生することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡライブラリー、とりわけｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子をクローニングするための極めて有用なツールである。これまでに、ｃＤＮＡライブラリーから多くの遺伝子がクローニングされている。クローニングされた遺伝子は、遺伝子自身の塩基配列を決定するのに用いられるのみならず、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定したり、該タンパク質を細菌や酵母細胞内で大量に作らせるために用いられている。
【０００３】
しかしながら、ｃＤＮＡライブラリーから容易にクローニングし得るｃＤＮＡは、その鋳型となったｍＲＮＡが細胞中に大量に発現しているｃＤＮＡに限られるため、多くの遺伝子がクローニングされた現在では、クローニングし易いｃＤＮＡの多くは殆どクローニングされてしまい、新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングすることが困難になりつつある。
【０００４】
ｃＤＮＡライブラリーから新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングするためには、既にクローニングされたｃＤＮＡをライブラリーから除去することが必要であり、この目的のために、以下の従来技術が考案されている。
【０００５】
まず、この目的を達するために使用されている最も基本的な方法としては、差引きハイブリダイゼーションがある。
【０００６】
該方法では、目的の遺伝子を発現している細胞（又は組織）と目的の遺伝子を発現していない細胞からｍＲＮＡを調製し、一方からｃＤＮＡを合成した後、両者をハイブリダイゼーションさせるので、両細胞に共通するｃＤＮＡのみが除去され、ある組織や細胞に特異的に発現している遺伝子を濃縮、単離することが可能となる。
【０００７】
差引きハイブリダイゼーションを利用した方法としては、「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｓｅｐ；６（９）：７９１−８０６」が、ヒドロキシアパタイトカラムを用いた差引きハイブリダイゼーション法を開示している。該方法では、一本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとしてベクター由来の配列からのプライマーの伸長反応を行い、変性・再会合した後、再び二本鎖となるもののみをヒドロキシアパタイトカラムを用いて除去する。再会合する確率は濃度に依存するため、多数存在するクローンから優先的に除去される。
【０００８】
しかしながら、インサートサイズが３ｋｂを超えるような長い配列を含むｃＤＮＡライブラリーの場合、非特異的ハイブリダイゼーションが起こる可能性が高くなるので、該方法は、０．４〜２．５ｋｂ程度の比較的短いＤＮＡからなるｃＤＮＡにしか適用できない。長い配列は、多機能タンパクや複雑な構造のタンパク質をコードする機能的に重要な遺伝子を含む可能性が高いので、長い配列を含むライブラリーに適用し得ないことは、本方法の大きな欠点である。また３、同一の遺伝子に由来し、３’末端と５’末端が共通であるが、中央が異なる配列は、短いｃＤＮＡであっても該方法では区別することができない。
【０００９】
また、同様の目的を達成するために多用される他の方法として、ディファレンシャルハイブリダイゼーションがある。
【００１０】
該方法では、特異的遺伝子の取得を目的とする細胞と対照の細胞から調製したｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡのプローブを合成する。続いて、目的の細胞から作成したｃＤＮＡライブラリーをプレートに播種し、同一プレートからコロニーを２枚のフィルターにレプリカする。一方のフィルターは目的の細胞由来のｃＤＮＡプローブを用いて、他方のフィルターは対照細胞由来のｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、結果を比較すれば、目的の細胞に特異的なｃＤＮＡを検出することができる。
【００１１】
しかしながら、この方法は、２つのフィルターのハイブリダイゼーションの差をコロニー毎に比較しなければならないため、多くのコロニーを処理することが難しく、ライブラリー全体の再構築には向いていない。また、該方法には、偽陽性もしくは偽陰性のシグナルが多くあるために、検討に時間を要するという欠点も存する。
【００１２】
このため、該方法のかかる欠点を克服するために、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９５；  ２５４：３０４−３２１”は、従来のディファレンシャルハイブリダイゼーションとポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称する）を組み合わせたディフェレンシャルディスプレー法を開示しているが、該方法は発現レベルの差が著しくないとパターンの差が見出せないのみならず、クローンを直接取得できないために、ＰＣＲ産物をもとに何らかの方法によってクローンを選択しなければならない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術に存する上記課題を解決するためになされたものであり、ＤＮＡライブラリーから、長いインサートサイズの所望のＤＮＡを特異的に濃縮することが可能であり、且つ該ＤＮＡのクローンを直接取得することができる方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、
含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１）前記ＤＮＡライブラリー中の前記第一のｄｓＤＮＡと前記第二のｄｓＤＮＡを対応する第一のｓｓＤＮＡと第二のｓｓＤＮＡに変換して、該第一のｓｓＤＮＡと該第二のｓｓＤＮＡとを含むライブラリーを調製する工程と；
（２）工程（１）で調製した前記ライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡに相同な直鎖ｄｓＤＮＡとを加えて前記第二のｓｓＤＮＡから前記第二のｄｓＤＮＡを再生することにより、前記第一のｓｓＤＮＡと再生された第二のｄｓＤＮＡとを含むライブラリーを得る工程と；
（３）工程（２）で得られた前記ライブラリーから前記再生された第二のｄｓＤＮＡを除去する工程と；
（４）前記第一のｓｓＤＮＡから前記第一のｄｓＤＮＡを再生することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００１６】
本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク質」とは、大腸菌やλファージの相同的組換えやＤＮＡの修復、及び大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現に関与するタンパク質である。
【００１７】
図１のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡに結合した後（ＲｅｃＡ−一本鎖ＤＮＡ繊維）、該一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに対合させて三元複合体（トリプレックス）を形成し、相同ＤＮＡの検索を行った後、ＡＴＰ存在下でＤＮＡ鎖交換反応を触媒する。ＤＮＡ鎖交換反応後には、前記一本鎖ＤＮＡが前記二本鎖ＤＮＡに取り込まれた雑種二本鎖ＤＮＡと前記二本鎖ＤＮＡから分離された一本鎖ＤＮＡが形成される。
【００１８】
本発明の方法は、ＲｅｃＡタンパク質が有する、一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡに相同な二本鎖ＤＮＡとの交換反応を利用することにより、ＤＮＡライブラリーから所定のＤＮＡを除去する。
【００１９】
ＲｅｃＡタンパク質に類似した構造を有し、相同なＤＮＡの対合を促進するタンパク質は、大腸菌以外の原核生物、真核生物を問わず生物界に広く分布していることが知られており、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク質と呼称されている
上述のように、本発明の方法では、ＲｅｃＡタンパク質が相同なＤＮＡの対合を促進し、相同的な組換えを触媒する機能を利用するので、本発明の方法には、これらのＲｅｃＡ類似タンパク質も使用することができる。
【００２０】
それ故、本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク質」なる語には、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質のみならず、ＲｅｃＡ類似タンパク質も含む。
【００２１】
本発明で使用するのに好ましいＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質である。
【００２２】
本明細書において、「ＤＮＡライブラリー」なる語は、遺伝子ライブラリーとｃＤＮＡライブラリーを総称する用語として使用する。「遺伝子ライブラリー」とは、単一の生物種の全ゲノムＤＮＡ断片を含むファージ又はコスミドの集合体であり、「ゲノムＤＮＡライブラリー」と同義である。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、特定の組織や細胞由来のｍＲＮＡから作成された相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡと称する）をベクターに挿入することによって作成される多種類のｃＤＮＡ分子種の集合体をいう。
【００２３】
また、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡは、それぞれｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡと略記する。
【００２４】
以下、本発明の方法の詳細について述べる。
【００２５】
まず、本発明の方法の第一の工程では、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡと、該第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡであってライブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーに対して、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに変換する操作を施す。
【００２６】
第一のｄｓＤＮＡ及び第二のｄｓＤＮＡのサイズは、３〜１３ｋｂであり得る。６ｋｂ以上でサイズ分画されたライブラリー中のＤＮＡであることが好ましい。
【００２７】
図２に示されているように、ライブラリー中のｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡするためには、ニッカーゼ等でｄｓＤＮＡにニック（切れ目）を導入した後に、ＥｘｏIII、Ｔ７ｇｅｎｅ６等のヌクレアーゼで処理すればよい。
【００２８】
その他、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡにする操作としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐｕｃ１９９等のファージミドベクターをファージ粒子として使用し、ｓｓＤＮＡを回収する操作もあるが、これらに限定されない。
【００２９】
該操作が終了すると、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡが第一のｓｓＤＮＡに、ライブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡが第二のｓｓＤＮＡにそれぞれ変換され、第一のｓｓＤＮＡと第二のｓｓＤＮＡを含むライブラリーが得られる。
【００３０】
なお、ライブラリー中に含まれるこれらのｄｓＤＮＡは、プラスミドやウイルスベクターに担持されていることが通常であろう。
【００３１】
続いて、該ライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と第二のｓｓＤＮＡに相同な直鎖ｄｓＤＮＡを加える。
【００３２】
ここで、除去すべき第二のｓｓＤＮＡに「相同な」直鎖ｄｓＤＮＡとは、何れかのストランド中に、第二のｓｓＤＮＡ全部又は一部と実質的に同じ塩基配列を有する部分を含んでいることをいう。「実質的に同じ塩基配列を有する」とは、ＲｅｃＡタンパク質による相同的組換えがなされ得る程度に同等の塩基配列を有することをいう。
【００３３】
典型的には、第二のｓｓＤＮＡに相同な直鎖ｄｓＤＮＡは、第二のｄｓＤＮＡと完全に同一のｄｓＤＮＡを制限酵素処理することによって得ることができる。
制限酵素は、相同なｄｓＤＮＡの一ヶ所を切断するものを選択することが好ましい。例えば、ライブラリー中のｄｓＤＮＡがベクターによって担持されているときには、ベクターの制限部位を切断し得る制限酵素を使用することができる。
【００３４】
このようにして得られた第二のｓｓＤＮＡに相同な直鎖ｄｓＤＮＡは、何れかのストランドが第二のｓｓＤＮＡの全部又は一部と同一の塩基配列を含むので、前工程で得られた第二のｓｓＤＮＡとＲｅｃＡタンパク質を加えると、交換反応が進行する。交換反応が終了すると、前行程で得られた第二のｓｓＤＮＡは、相同な直鎖ｄｓＤＮＡの一方のストランドと交換されて、相同な直鎖ｄｓＤＮＡの中に組み込まれる（図２参照）。
【００３５】
ＲｅｃＡタンパク質による交換反応には方向性があり、例えば、図２の線状ｄｓｄＮＡと環状ｓｓＤＮＡとの間で交換反応が起こるときには、線状ｄｓＤＮＡの中に組み込まれる環状ｓｓＮＡは、まず、交換反応で置換されないストランド（図２の線状ｄｓＤＮＡでは上側のストランド；以下非置換ストランド）の３’側から接着する。
【００３６】
従って、ライブラリー中のｓｓＤＮＡが共有する配列（図２ではベクター）と相補的な配列が、非置換ストランドの３’側に存在すると、ライブラリー中の全てのｓｓＤＮＡが線状ｄｓＤＮＡに結合してしまい、交換反応の進行が阻害される。それ故、ライブラリー中のｓｓＤＮＡが共有する配列を有する場合には、共通の配列は、線状ｄｓＤＮＡの非置換ストランドの５’側に配置することが好ましい。
【００３７】
ＲｅｃＡタンパク質による交換反応を実施するときには、ライブラリー中のｓｓＤＮＡと交換されて相同なｄｓＤＮＡから分離された直鎖ｓｓＤＮＡを分解して、交換反応の反応を促進させるために、分離された直鎖ｓｓＤＮＡを分解することが好ましい。分離された直鎖ｓｓＤＮＡを分解する場合には、他のｓｓＤＮＡを分解しない酵素を使用すべきである。図２のごとく、相同なｄｓＤＮＡから分離されたｓｓＤＮＡが直鎖ＤＮＡであり、他のｓｓＤＮＡが環状ＤＮＡである場合、エキソヌクレアーゼＩ等のエキソヌクレアーゼを用いれば、相同なｄｓＤＮＡから分離されたｓｓＤＮＡのみを分解し得る。
【００３８】
以上のように、ＲｅｃＡタンパク質を用いれば、ライブラリーの中から、特定のｓｓＤＮＡを除去することが可能となる。
【００３９】
ＲｅｃＡタンパク質による交換反応の後には、ライブラリー中の除去すべきＤＮＡが組み込まれた相同なｄｓＤＮＡと含有率を増加させるべきｓｓＤＮＡとを分離する。
【００４０】
ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡを分離するには、例えば、ヒドロキシアパタイトカラムを用いることができる。その他、ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡを分離するには、臭化エチジウム存在下で遠心する方法や制限エンドヌクレアーゼとマグネシウム−フェノール抽出を組み合わせた方法を利用し得るが、これらに限定されない。これらの方法の詳細については、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．１８，  Ｎｏ．１６，  ４８３３−４８４２ｐ．」を参照されたい。
【００４１】
最後に、含有率を増加させるべきｓｓＤＮＡをｄｓＤＮＡにすれば、該ｄｓＤＮＡの含有率が増加したライブラリーが得られる。
【００４２】
さらに、以上の各工程を２回以上繰り返えしてもよい。
【００４３】
また、図２及び上記の説明では、便宜上、２種類のｄｓＤＮＡの中から１種類のｄｓＤＮＡを除去する操作を記載したが、実際の操作では、数千〜数万種類のｄｓＤＮＡの中から数十〜数万種類のｄｓＤＮＡを同時に、又は順次に除去することもできる。
【００４４】
以下の実施例で実証されているように、本発明の方法を用いれば、除去すべき既知のｄｓＤＮＡを９０％以上除去することも可能である。
【００４５】
それ故、本発明を適用するライブラリーの種類に応じて、ライブラリーの新規クローンの出現率を１０％〜９０％増加させることができる。
【００４６】
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
【００４７】
［実施例１］
本実施例では、ＲｅｃＡタンパク質を用いた交換反応により、２種類のプラスミドＡ１０とＢ０３混合物からＡ１０の除去を行い、Ｂ０３の含有率を増加させた。
【００４８】
両プラスミドに交換反応溶液を加えて、交換反応を行った。交換反応溶液は、５０ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ  ７．２）、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、５０ｍＭ  グルタミン酸カリウム、１ｍＭジチオスレイトール、プラスミドから調製した環状ｓｓＤＮＡ、線状ｄｓＤＮＡ（Ａ１０プラスミド中の１ヶ所をＮｏｔＩで切断したもの）、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭ  クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ２μｇ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質０．２２μｇ、ＲｅｃＡタンパク質１μｇ、エキソヌクレアーゼＩ１０ユニットを２０μＬ中に含む。
【００４９】
１００ｎｇの環状ｓｓＤＮＡと２００ｎｇの線状ｄｓＤＮＡを含む２０μＬの交換反応溶液を３７℃、２時間の至適条件下で反応させた。
【００５０】
除タンパク質操作後、環状ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡを分離した。
【００５１】
除タンパク質操作後、環状ｓｓＤＮＡとベクター由来の線状ｄｓＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ（＋）／ＢｓｓＨＩＩ消化物）とを、ＲｅｃＡタンパク質を用いた交換反応によりｄｓＤＮＡに返還し、Ｖｅｎｔポリメラーゼによる修復後大腸菌に導入し、出現するコロニーを計測した。
【００５２】
下表１に示されているように、交換反応溶液中に、Ａ１０プラスミドと同一の配列を有する線状ｄｓＤＮＡを加えた場合、Ａ１０プラスミドは約９６％除去された。これに対して、ベクター部分のみが線状ｄｓＤＮＡと共通するＢ０３プラスミドは、全く除去されなかった。
【００５３】
【表１】
0004509307.tif 000002
【００５４】
［実施例２］
ＲｅｃＡタンパク質を用いた交換反応により、プラスミドライブラリーから既にプラスミド（３０００クローン）の除去を行った。
【００５５】
両プラスミドに交換反応溶液を加えて、交換反応を行った。交換反応溶液は、５０ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ  ７．２）、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、５０ｍＭ  グルタミン酸カリウム、１ｍＭジチオスレイトール、ライブラリーから調製した環状ｓｓＤＮＡ  １μｇ、線状ｄｓＤＮＡ  ２μｇ（既にプラスミドＤＮＡを１ヶ所のみＮｏｔＩで切断したもの）、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭ  クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ２０μｇ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質２．２μｇ、ＲｅｃＡタンパク質１０μｇ、エキソヌクレアーゼＩ１０ユニットを２０μＬ中に含む。
【００５６】
除タンパク質操作後、３７℃で２時間反応させ、環状ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡを分離した。
【００５７】
除タンパク質操作後、繰り返し交換反応を行うことにより、得られた環状一本鎖ＤＮＡ群から既知プラスミドの除去を行った。
【００５８】
最終的には、除タンパク質操作後、環状ｓｓＤＮＡとベクター由来の線状ｄｓＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）／ＢｓｓＨＩＩ）とを、上記ＲｅｃＡを用いた交換反応により、二本鎖ＤＮＡに変換し、Ｖｅｎｔポリメラーゼによる修復後、大腸菌に導入してライブラリーの再構成を行った。
【００５９】
それぞれのライブラリーからランダム９６クローンの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を既知クローンのデータベースと比較することにより、未知クローンの出現頻度を検討した。
【００６０】
表２に記載されているように、一度ないしは二度の既知クローン除去操作により、新規クローンの出現頻度が約６０％から約８０％へと上昇した。
【００６１】
【表２】
0004509307.tif 000003
【００６２】
【発明の効果】
本発明の方法を用いれば、ＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを直接構築することができる。
【００６３】
本発明の方法は、３〜１３ｋｂの核酸を除去するために使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用するＲｅｃＡタンパク質によるＤＮＡ鎖交換反応の概要を示す図。
【図２】本発明の方法の概略を示す図。
【図１】
0004509307.tif 000004
【図２】
0004509307.tif 000005