(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、Ｎ−（４−フルオロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナールまたはその医薬上許容される塩を含有してなる、網脈絡膜疾患、緑内障および光凝固による眼球後眼部合併症からなる群より選ばれる疾患を眼底組織細胞の障害を改善することにより予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２】
網脈絡膜疾患の予防または治療用である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
網脈絡膜疾患が、網膜血管閉塞症、網膜静脈周囲炎、Ｅａｌｅｓ病、虚血性眼症候群、網膜細動脈瘤、高血圧または腎疾患による網膜症、糖尿病網膜症、網膜色素上皮症、網膜ジストロフィ、黄斑ジストロフィ、網脈絡膜萎縮、網脈絡膜症、黄斑変性症、黄斑浮腫、網膜色素上皮剥離、網膜剥離、変性網膜分離症、網膜芽細胞腫、網膜色素上皮腫瘍、視神経乳頭毛細血管腫、虚血性視神経症およびうっ血乳頭／乳頭浮腫からなる群より選ばれる１つである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
網脈絡膜疾患が網膜血管閉塞症である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
網脈絡膜疾患が黄斑変性症である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
光凝固による眼球後眼部合併症の予防または治療用である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
光凝固による眼球後眼部合併症が、黄斑部浮腫、網膜剥離、視神経炎、視野異常、光覚異常および色覚異常からなる群より選ばれる１つである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
緑内障の予防または治療用である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
緑内障が、開放隅角緑内障、低眼圧緑内障および閉塞隅角緑内障からなる群より選ばれる１つである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
緑内障が低眼圧緑内障である、請求項９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、眼底組織細胞障害による疾患の予防および治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
眼底組織は、網膜、網膜血管、網膜色素上皮、視神経乳頭、脈絡膜および強膜等の組織から構成され、水晶体から入った光刺激を視神経細胞を通して脳に伝える器官である。そのため、眼底組織細胞の障害は失明につながる重篤な疾患を誘発することが多い。眼底組織細胞の障害は、虚血や、興奮性アミノ酸の上昇やＡＴＰの減少等、種々の生体内物質の変動に起因する場合が多い。また、高血圧や糖尿病等のような全身性疾患や加齢、外傷等によっても眼底組織細胞は障害を受ける。糖尿病網膜症や黄斑変性症における新生血管の抑制や除去、網膜血管閉塞症における血管閉塞部の除去などにレーザー照射による光凝固が用いられるが、レーザー照射周辺部の循環の変化、光凝固熱による炎症反応などによる、眼底組織細胞障害が問題となっている。
【０００３】
眼底組織細胞の障害による疾患は上記した種々の要因により、また種々の要因が複雑に組合わさって発症する。眼底組織細胞の障害による疾患としては、網脈絡膜疾患（例えば網膜血管閉塞症、網膜静脈周囲炎、Ｅａｌｅｓ病、虚血性眼症候群および網膜細動脈瘤等の網膜血管異常；高血圧または腎疾患による網膜症；糖尿病網膜症；網膜色素上皮症；網膜ジストロフィ；黄斑ジストロフィ；網脈絡膜萎縮；網脈絡膜症；黄斑変性症；黄斑浮腫；網膜色素上皮剥離；網膜剥離；変性網膜分離症；網膜芽細胞腫、網膜色素上皮腫瘍、視神経乳頭毛細血管腫等の腫瘍；虚血性視神経症等の視神経症；うっ血乳頭／乳頭浮腫等の乳頭腫脹等）；および眼底組織細胞障害を伴う緑内障（例えば開放隅角緑内障、低眼圧緑内障、閉塞隅角緑内障等）；さらに光凝固による眼球後眼部合併症（例えば黄斑部浮腫、網膜剥離、視神経炎、視野異常、光覚異常、色覚異常等）が挙げられる。ここで、光凝固による眼球後眼部合併症とはレーザー照射による光凝固の際に発生するレーザー照射周辺部の循環の変化、凝固熱による炎症反応などの眼底組織障害、およびその障害により誘発される疾患をいう。
【０００４】
現在、眼底組織細胞の障害による疾患の薬物療法としては、ビタミンＥ製剤であるニコチン酸トコフェロール、ペントキシフィリン等の微小循環改善剤、種々のステロイド剤、抗プロスタグランジン剤、消炎酵素製剤等の経口投与が行われている。しかしながら、当該治療では効果が十分でなかったり、血圧降下や胃腸障害等の副作用が問題となっている。また、緑内障の治療法としては、ピロカルピンを代表とするコリン作動薬、エピネフリン、ジピベフリン等の交感神経作動薬、チモロール、ピンドロール、カルテオロール等の交感神経β遮断薬等を局所投与（例えば点眼）するのが有用であるが、これらの作用機構に応じた種々の副作用が問題となっている。
【０００５】
近年、カルパイン阻害活性を有する化合物に虚血性細胞死を抑制する作用があることが報告されている［Lee K., Frank S., Vanderklish. P., Arai A., Lynch G., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 7233-7237 (1991), Rami A., Krieglstein J., Brain Res., 609, 67-70 (1993)］。しかし、これらの報告は脳の海馬における神経細胞の死に関連した細胞死の抑制効果のみを開示しており、眼底組織細胞障害に対する薬剤の抑制効果や、眼科領域での使用は開示されていない。また、これまで用いられてきた阻害剤は、組織移行性および副作用の点で問題が多い。ＥＰ０７７１５６５には、システインプロテアーゼ阻害剤が糖尿病網膜症等にみられる血管新生に有用である旨の記載が認められるが、眼底組織細胞障害に起因する疾患については全く示唆すらなされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題を解決した、眼底組織細胞障害の予防および治療剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は眼底組織細胞障害による疾患の予防および治療剤を提供すること、並びにこれらの疾患の予防および治療方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明において、「眼底組織」という用語は、網膜、網膜血管、網膜色素上皮、視神経乳頭、脈絡膜、強膜および硝子体基底を含めた意味であり、これらの組織のうち、網膜、網膜血管、網膜色素上皮、視神経乳頭および脈絡膜を総称して網脈絡膜ということもある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、眼底組織細胞障害の改善に優れた安全性の高い、眼底組織細胞障害の予防および治療剤を開発すべく、鋭意研究を重ねた結果、下式（Ｉ）
【０００９】
【化５】
0004422894.tif 000002
【００１０】
〔式中、Ｒ1は炭素数１〜４のアルキル基または置換されていてもよい炭素数６〜１０のアリール基を示し；Ｒ2とＲ3は同一または異なってもよく、それぞれ水素または炭素数１〜４のアルキル基を示すか、あるいはＲ2とＲ3とが連結して炭素数３〜７の環を形成してもよく；Ｒ4はアリール、シクロアルキルまたは芳香族複素環残基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。〕
の化合物およびその医薬上許容される塩が強い眼底組織細胞障害の予防および治療効果を発揮することを見出した。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明で使用する式（Ｉ）の化合物およびその医薬上許容される塩は、特開平９−４３４６４号（ＥＰ０７７１５６５）に開示されている公知の化合物であり、そこに開示されている製造法によって製造することができる。
【００１２】
式（Ｉ）において、アミノ酸分子が光学異性体として存在する場合、特に明示しなければそれらはＬ体である。
【００１３】
式（Ｉ）において、Ｒ1の炭素数１〜４のアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。それらのうちメチルが好ましい。
【００１４】
Ｒ1の炭素数６〜１０のアリール基としては、フェニル、ナフチル、インデニル、アズレニル等が挙げられる。好ましくはフェニルおよびナフチルである。
【００１５】
該アリール基上に存在していてもよい置換基としては、例えばハロゲン（例えばフッ素、塩素等）、直鎖状または分岐鎖状である炭素数１〜５のアルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等）、トリフルオロメチル、直鎖状または分岐鎖状である炭素数１〜５のアルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、ｔｅｒｔ−ペントキシ等）、ヒドロキシ、炭素数２〜５のアシルオキシ（例えばアセトキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、イソブチリルオキシ、バレリルオキシ等）、カルボキシル及び炭素数２〜５のアシル（例えばアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル等）が挙げられる。好ましくはハロゲンおよび炭素数１〜５のアルキル基である。より好ましくはフッ素、塩素およびメチルである。
【００１６】
Ｒ1の置換されていてもよい炭素数６〜１０のアリール基の好適な具体例としては、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、ｐ−トリルおよび２−ナフチルである。
【００１７】
直鎖状または分岐鎖状である、Ｒ2およびＲ3で表される炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。好ましくはプロピル、イソプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチルである。より好ましくはイソプロピルである。
【００１８】
Ｒ2およびＲ3において、好ましくはそれらの一方が水素であり、かつ他方がプロピル、イソプロピル、イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである。より好ましくはＲ2がプロピル、イソプロピル、イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、かつＲ3が水素である。さらにより好ましくはＲ2がイソプロピルであり、かつＲ3が水素である。
【００１９】
Ｒ2とＲ3とが連結して形成してもよい炭素数３〜７の環としては、シクロプロピリデン、シクロブチリデン、シクロペンチリデン、シクロヘキシリデン、シクロヘプチリデン等が挙げられる。とりわけシクロペンチリデンおよびシクロヘキシリデンが好ましい。
【００２０】
Ｒ4で表される低級アルキル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数１〜６のもの、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル等が挙げられる。好ましくはメチルおよびイソブチルである。上記低級アルキル基は、下記のアリール基、シクロアルキル基または芳香族複素環残基で置換されていてもよい。
【００２１】
該アリール基としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル等が挙げられる。とりわけフェニルが好ましい。
【００２２】
該シクロアルキル基としては、好ましくは炭素数３〜６のシクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。とりわけシクロヘキシルが好ましい。
【００２３】
該芳香族複素環残基としては、酸素、窒素およびイオウからなる群より選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子をそれぞれ含む単環式複素環残基および対応の縮合型複素環残基が挙げられる。単環式複素環残基としては、特に限定はなく、ピロリル、フリル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル等が挙げられる。縮合型複素環残基としては、特に限定はなく、インドリル、キノリル、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、インダゾリル、キナゾリニル、フタラジニル、キノキサリニル等が挙げられる。とりわけインドリルが好ましい。
【００２４】
Ｒ4で表される、アリール、シクロアルキルまたは芳香族複素環残基で置換されていてもよい低級アルキル基の好適な具体例は、イソブチル、ベンジル、シクロヘキシルメチルおよびインドール−３−イルメチルである。
【００２５】
代表的な式（Ｉ）の化合物は、
Ｎ−（２−ナフタレンスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナール、
Ｎ−（４−フルオロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナール、
Ｎ−（４−クロロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナール、
Ｎ−（４−メチルフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナール、
Ｎ−（４−フルオロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニナール、
Ｎ−（２−ナフタレンスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニナール、
Ｎ−（４−クロロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニナール、
Ｎ−（４−メチルフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニナール、
Ｎ−（４−クロロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−トリプトファナール、
Ｎ−（４−フルオロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−シクロヘキシルアラニナール、
Ｎ−（２−ナフタレンスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−シクロヘキシルアラニナールおよび
Ｎ−（４−クロロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−シクロヘキシルアラニナール、並びにこれらの医薬上許容される塩である。
【００２６】
とりわけＮ−（４−フルオロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナールおよびその医薬上許容される塩が好ましい。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩；トリメチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩；塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；アルギニン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸との塩が挙げられる。
【００２８】
本発明の予防および治療剤は、所望により、例えば医薬上許容される担体または賦形剤と合して、活性化合物を混合、溶解することを含む公知の製剤技術に従って製剤化できる、自体公知のいかなる剤型としても提供できる。そのような剤型のうち、ヒトに経口的に投与される剤型としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤およびその他の液剤が挙げられる。粉末、顆粒、錠剤等は、固形製剤に適する任意の製薬担体、例えば賦形剤（例えばデンプン、ブドウ糖、果糖、白糖、乳糖等）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等）、崩壊剤（例えばデンプン、結晶セルロース等）、結合剤（例えばデンプン、アラビアゴム等）等を用いて製剤化することができる。そのような固形製剤は、コーティング剤（例えばゼラチン、白糖等）または腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、セラック等）でコーティングされていてもよく、これにより活性化合物を特に腸で放出することができる。シロップやその他の液剤の製剤化において、安定剤（例えばエデト酸ナトリウム等）、懸濁化剤（例えばアラビアゴム、カルメロース等）、矯味剤（例えば単シロップ、ブドウ糖等）、芳香剤等の様々な添加剤を適宜に選択して添加することができる。非経口的に投与する剤型としては、注射剤、坐剤等が挙げられる。注射剤は、溶剤（例えば注射用水等）、安定剤（例えばエデト酸ナトリウム等）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グリセリン、マンニトール等）、ｐＨ調整剤（例えば塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウム等）、懸濁化剤（例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）およびその他の適当な添加剤を用いて製剤化できる。坐剤の製剤化においては、坐剤基剤（例えばカカオ脂、マクロゴール等）等を適宜に選択して使用することができる。局所投与するための剤型としては、例えば点眼剤や眼軟膏が挙げられる。点眼剤や眼軟膏の製剤化においては、溶剤（例えば生理食塩水、滅菌精製水等）、安定剤（例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等）、乳化剤（例えばポリビニルピロリドン等）、懸濁化剤（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース等）、界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等）、保存剤（例えば塩化ベンザルコニウム、パラベン類、クロロブタノール等）、緩衝剤（例えばホウ酸、ホウ砂（ホウ酸ナトリウム）、酢酸ナトリウム、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤等）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グリセリン、マンニトール等）、ｐＨ調整剤（例えば塩酸、水酸化ナトリウム等）および軟膏基剤（例えばワセリン、ラノリン等）のような種々の公知物質を適宜に選択して使用することができる。
【００２９】
本発明の予防および治療剤は、網脈絡膜疾患および眼底組織細胞障害を伴う緑内障や高眼圧症、さらに光凝固による眼球後眼部合併症の予防および治療に有用である。網脈絡膜疾患としては、特に限定はなく、網膜血管閉塞症、網膜静脈周囲炎、Ｅａｌｅｓ病、虚血性眼症候群および網膜細動脈瘤等の網膜血管異常；高血圧または腎疾患による網膜症；糖尿病網膜症；網膜色素上皮症；網膜ジストロフィ；黄斑ジストロフィ；網脈絡膜萎縮；網脈絡膜症；黄斑変性症；黄斑浮腫；網膜色素上皮剥離；網膜剥離；変性網膜分離症；網膜芽細胞腫、網膜色素上皮腫瘍、視神経乳頭毛細血管腫等の腫瘍；虚血性視神経症等の視神経症；うっ血乳頭／乳頭浮腫等の乳頭腫脹等が挙げられる。特に、本発明の予防および治療剤は網膜血管閉塞症および黄斑変性症の予防および治療に有用である。眼底組織細胞障害を伴う緑内障や高眼圧症としては、開放隅角緑内障、低眼圧緑内障、閉塞隅角緑内障や視野変化の伴う高眼圧症等が挙げられる。特に、本発明の予防または治療剤は低眼圧緑内障の予防および治療に有用である。光凝固による眼球後眼部合併症としては、黄斑部浮腫、網膜剥離、視神経炎、視野異常、光覚異常、色覚異常が挙げられる。
【００３０】
本発明における式（Ｉ）で示される化合物およびその医薬上許容される塩の投与量は、対象となる疾患、患者の症状やその他の条件、投与方法およびその他の要因に依存する。一般的に一回あたりの投与量は、経口投与では通常１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇ、注射剤では通常０．１〜３００ｍｇ、好ましくは１〜１５０ｍｇ投与することにより、所望の効果が得られる。局所投与する場合には、通常０．００１〜１．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０１〜０．５ｗ／ｖ％の濃度である点眼液を、１回２０〜５０μｌ、１日５〜６回程度点眼するのがよい。
【００３１】
本発明の予防および治療剤は、本発明の目的を損なわない限り、他の活性成分を併用することもできる。そのような他の活性成分としては、ワーファリンカリウム、ウロキナーゼ、アスピリン等の抗凝血薬；カルバゾクロムスルホン酸ナトリウム等の血管強化・止血剤；カリジノゲナーゼ、ペントキシフィリン、塩酸サルポグレラート、ニコチン酸トコフェロール等の末梢循環改善剤；ベタメサゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン等の副腎皮質ステロイド剤；セラペプターゼ、ストレプトキナーゼ・ストレプトドルナーゼ等の消炎酵素剤；β遮断薬、マンニトール、アセタゾラミド等の抗緑内障剤および抗プロスタグランジン剤が挙げられる。
【００３２】
【実施例】
本発明を以下の実施例および試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例および試験例において、化合物１はＮ−（４−フルオロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナールを意味する。
実施例１
錠剤
化合物１                                    ５０ｍｇ
乳糖                                        ８０ｍｇ
デンプン                                    １７ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ３ｍｇ
結晶セルロース                              １０ｍｇ
以上の成分を１錠分の材料として、常法により錠剤を成形した。錠剤は必要に応じて通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、糖衣およびフィルム（例えばエチルセルロース）を適用してもよい。
【００３３】
実施例２
カプセル剤
化合物１                                    ７５ｍｇ
マンニトール                                ７５ｍｇ
デンプン                                    １７ｍｇ
ステアリン酸カルシウム                        ３ｍｇ
以上の成分を１カプセル剤の材料として均一に混合し、常法により顆粒状とし、硬カプセルに充填した。この充填する前に必要に応じて顆粒は通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、糖衣またはフィルム（例えばエチルセルロース）を適用してもよい。
【００３４】
実施例３
懸濁注射剤
化合物１                                        ７５０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースナトリウム            ５００ｍｇ
注射用水                                  全量  １００ｍｌ
以上の成分を常法により無菌的に混和して懸濁注射剤とした。
【００３５】
実施例４
点眼剤
化合物１                                    ５０ｍｇ
ホウ酸                                    ７００ｍｇ
ホウ砂                                          適量
塩化ナトリウム                              ５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース                  ０．５ｇ
エデト酸ナトリウム                        ０．０５ｍｇ
塩化ベンザルコニウム                    ０．００５ｍｇ
滅菌精製水                      全量        １００ｍｌ
【００３６】
試験例１
ラット眼底組織細胞障害に対する作用
方法：
雄性ＳＤラット（体重１５０ｇ）を用い、５ｗ／ｖ％塩酸ケタミン／２ｗ／ｖ％塩酸キシラジン（３：１，０．５ｍｌ，ｉ．ｐ．）麻酔下で網膜中心動脈を動脈瘤クリップで結紮し、７５分間の血流遮断を行った。正常群には、網膜中心動脈の露出のみ行い、虚血とはしなかった。血流再開後５日目に組織標本を作成した。組織標本として用いるため、摘出した眼球を４％ホルムアルデヒドにより固定し、常法に従いパラフィン包埋した。その後、視神経乳頭を含む網膜表面に対して垂直な水平断によって薄切片（３μｍ厚さ）を作成し、ヘマトキシリン−エオジンにより染色した。光学顕微鏡下で、視神経乳頭部から一定距離（１〜２ｍｍ）における網膜断面０．２５ｍｍ幅あたりの、網膜の神経細胞（ガングリオン細胞）数および内顆粒層細胞数を計測した。試験薬として、実施例３の懸濁注射剤を、化合物１が１００ｍｇ／ｋｇ体重となるよう、動脈結紮１５分前、血流再開直後およびその後毎日１回腹腔内に投与した（化合物１投与群）。対照群および正常群には、実施例３で用いた基剤を同様に投与した。陽性対照には、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈ［S.C. Hong ら，Stroke, 25 (3), 663-669, 1994］１００ｍｇ／ｋｇを同様に投与した（ＭＤＬ投与群）。
【００３７】
結果：
その結果を図１および２に示す。
動脈結紮により、ガングリオン細胞数および内顆粒層細胞数は共に、正常群に比較し有意に減少した。化合物１の投与は、動脈結紮によるガングリオン細胞数および内顆粒層細胞数の減少を有意に抑制した。ＭＤＬ投与群では、その抑制はわずかであった。
以上の結果は、本発明の活性化合物１が眼底組織細胞障害を改善するのに効果的であることを示している。
【００３８】
試験例２
ラット摘出網膜無酸素障害に対する作用
方法：
雄性ＳＤラット（体重１５０ｇ）の眼底組織（網膜）を単離し、ブドウ糖を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で無酸素下にインキュベートした。３および６時間後に眼底組織をホモジナイズした後、細胞内のスペクトリンの分解産物をＳＤＳ電気泳動法により分離し、Ｓａｉｄｏらの方法［The Journal of Biological Chemistry, 268, 25239-25243(1993)]によって作成した特異抗体を用いて検出した。試験化合物として、化合物１およびＭＤＬを２０ｍＭの濃度になるようエタノールに溶解し、培地に１００μＭの濃度になるように加えた。対照として、雄性ＳＤラット（体重１５０ｇ）の眼底組織をブドウ糖含有ＲＰＭＩ  １６４０培地中、酸素存在下で同様にインキュベートした。
【００３９】
結果：
その結果を図３（ａ）と図３（ｂ）に示す。
該組織をブドウ糖含有培地中、酸素存在下でインキュベートした場合、スペクトリンの分解は認められなかった。しかし、ブドウ糖を含有していない培地中、無酸素条件下では３時間および６時間インキュベートすると、２２０ｋＤａのバンドで示されるスペクトリンがカルパインによって切断され、１４５および１５０ｋＤａのバンドによって示されるスペクトリンの分解断片が検出された。組織を化合物１およびＭＤＬを添加した培地中でインキュベートした場合、スペクリンの分解による１５０ｋＤａのバンドは幾らか検出されたが、１４５ｋＤａのバンドは検出されなかった。
以上の結果は、無酸素により眼底組織中のカルシウム濃度が上昇し、それによりカルシウム依存性の蛋白質分解酵素であるカルパインが活性化され、細胞が障害をうけることを示した。その結果は、該障害を化合物１が改善したことを示した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の予防および治療剤は、眼底組織細胞障害による疾患、例えば網膜血管閉塞症、網膜静脈周囲炎、Ｅａｌｅｓ病、虚血性眼症候群、網膜細動脈瘤等の網膜血管異常；高血圧または腎疾患による網膜症；糖尿病網膜症；網膜色素上皮症；網膜ジストロフィ；黄斑ジストロフィ；網脈絡膜萎縮；網脈絡膜症；黄斑変性症；黄斑浮腫；網膜色素上皮剥離；網膜剥離；変性網膜分離症；網膜芽細胞腫、網膜色素上皮腫瘍、視神経乳頭毛細血管腫等の腫瘍；虚血性視神経症等の視神経症；うっ血乳頭／乳頭浮腫等の乳頭腫脹等の網脈絡膜疾患；開放隅角緑内障、低眼圧緑内障、閉塞隅角緑内障等の緑内障；視野変化の伴う高眼圧症、黄斑部浮腫、網膜剥離、視神経炎、視野異常、光覚異常および色覚異常のような光凝固による眼球後眼部合併症の予防および治療に有用である。
【００４１】
本出願は日本で出願された平成１０年特許願第５３６２４号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ラット網膜のガングリオン細胞障害に対する効果を示したグラフである。縦軸はガングリオン細胞数を示す。図中、ａ）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ法による正常群に対する有意差を示し（ｐ＜０．０１）、ｂ）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ法による対照群に対する有意差を示す（ｐ＜０．０１）。
【図２】  ラット網膜の内顆粒層細胞障害に対する効果を示したグラフである。縦軸は内顆粒層細胞数を示す。図中、ａ）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ法による正常群に対する有意差を示し（ｐ＜０．０１）、ｂ）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ法による対照群に対する有意差を示す（ｐ＜０．０１）。
【図３】  図３（ａ）および図３（ｂ）は、無酸素下にラット網膜組織をインキュベートした後に検出された網膜組織をホモジナイズした細胞内スペクトリンの分解産物を示したＳＤＳ電気泳動像であり、図３（ａ）および図３（ｂ）は、それぞれ３時間および６時間インキュベートした後のＳＤＳ電気泳動像を示す。図中、Ｍは分子量マーカーであり、１はブドウ糖含有培地中、酸素存在下でインキュベートした網膜組織を示し、２はブドウ糖不含培地中、無酸素条件下でインキュベートした網膜組織を示し、３はブドウ糖不含培地にＮ−（４−フルオロフェニルスルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナール（以下、化合物１と略す）を１００μＭ添加し、無酸素条件下でインキュベートした網膜組織を示し、４はブドウ糖不含培地にＣｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈ（以下、ＭＤＬと略す）を１００μＭ添加し、無酸素条件下でインキュベートした網膜組織を示す。２２０ｋＤａの蛋白質のバンドは完全な状態のスペクトリンを示し、１４５ｋＤａおよび１５０ｋＤａのバンドはスペクトリンの分解物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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