(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一平面に位置する第一電極及び第一平面とは異なる第二平面に位置する第二電極、その間に存在する電解質溶液、並びに該電解質溶液と第二電極との間の界面に懸濁した多数の粒子を用意し、前記第二電極は表面及び内部を有し該表面又は内部が界面電場の空間分布を修正するようにパターン化された平面電極からなり、前記粒子は区別可能な緩和周波数をそれぞれ有する少なくとも２種の粒子からなる方法であって、
第一電極及び第二電極間にＡＣ電圧を印加して、該二つの電極間に、前記粒子のうち少なくとも１種の粒子の緩和周波数以下の周波数を有し、かつ少なくとも１つの他の粒子の緩和周波数を上回る周波数の電場を発生させ、電場と界面を照射する光パターニングとの組み合わせ、又は、電場と電極パターニングとの組み合わせにより、電場周波数以上の緩和周波数を有する粒子を他の粒子から分別することを特徴とする粒子混合物の分別方法。
【請求項２】
空間的に変調された、酸化物成長、表面化学的パターニング又は表面プロファイリングの少なくとも１つを利用して電極パターニングを行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
粒子の緩和周波数が粒子サイズを反映し、粒子が粒子サイズに基づいて分別されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
粒子の緩和周波数が該粒子の表面組成を反映し、粒子がその表面組成の特質に基づいて分別されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
電場の発生により、第二電極上の指定領域に実質的に一層の粒子の平面アレイが形成され、該指定領域は第二電極表面の電場の局所的分布によって定義され、該アレイの粒子は電場の周波数以上の緩和周波数を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
第二電極が、誘電層で被覆されたシリコン電極からなることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
電場の周波数が、１２０Ｈｚ〜１００ｋＨｚであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
第一電極が光透過性電極からなり、さらにビデオ検出器又はカメラを用いて、粒子の分別をモニタリングすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
粒子混合物が２種の粒子から構成される方法であって、粒子が第二電極表面における電場の局所的分布によって指定された第二電極領域の平面アレイにおいてアッセンブルしている電場の周波数以上の緩和周波数を有して、電場と電極パターニングとの組み合わせにより、一方の粒子が他方の粒子から分別されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
粒子混合物が３種以上の粒子からなって、該粒子を１種ずつ連続して分別可能なように周波数を調整して、粒子を１種ずつ分別することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
粒子が真核細胞又は原核細胞を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
電場及び照射の組み合わせによって、電極パターニングにより定義される電極の指定領域に、実質的に一層の細胞の平面アッセンブリが形成され、該アッセンブリにおける粒子の緩和周波数は電場の周波数以上であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第二電極が感光性電極からなり、さらに所定の照明パターンで界面を照射し、該照射が電場及び電極パターニングと組み合わされることによって粒子が分別されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
明と暗のゾーンが所定配置された照射パターンを作成して基質に画像処理することをプログラムできる装置によって、所定の照明パターンがもたらされる方法であって、
該装置が、
照射源と、
明と暗のゾーンが所定配置された照射パターンを形成するように各画素から発せられる照射の強度を一時的に制御するソフトウェアプログラムを用いて操作されるコンピュータ制御回路、及びコンピュータインターフェイスによって、積極的に制御可能かつ直接アドレス可能な画素のアレイからなる再配列可能なマスクと、
再配列可能なマスクを基質に画像処理することに適したプロジェクション・システムと、
重なった照射パターンが形成された基質を見ることができるカメラを組み込んだ画像システムと
を備えたこと特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第一平面に位置する第一電極及び第一平面とは異なる第二平面に位置する第二電極、その間に存在する電解質溶液、並びに該電解質溶液と第二電極との間の界面に懸濁した多数の粒子を用意し、前記第二電極は表面及び内部を有し該表面又は内部が界面電場の空間分布を修正するようにパターン化された平面電極からなり、前記粒子は区別可能な緩和周波数をそれぞれ有する少なくとも２種の粒子からなり、さらに電解質溶液に懸濁された粒子のゼータ電位及び／又は表面伝導率を決定する方法であって、
第二電極を感光性電極とし、所定の光パターンで該電解質溶液と第二電極との間の界面を照射し、第一電極及び第二電極間にＡＣ電圧を用いて界面に周波数を有する電場を生じさせ、該電場の周波数を調整することにより、照射パターンにより定義された電極の指定領域に実質的に一層の粒子の平面アレイを形成し、前記界面は電場及び照射にさらされる時にインピーダンス勾配を示しており、前記粒子の緩和周波数を決定し、粒子を分別し、さらに前記粒子の最大速度（Ｖｍａｘ）を決定し、前記粒子の最大速度及び緩和周波数をゼータ電位及び／又は表面伝導率に変換することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
粒子のゼータ電位及び表面伝導率が同時に決定されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
粒子の緩和周波数が、アレイが形成されている電場の周波数を測定することによって決定されることを特徴とする請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
さらに、印加電場の周波数を変更し、アレイコンフィグレーションの反応を分析するステップを含むことを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
アレイアッセンブリの過程でインピーダンス勾配を横切る粒子の速度を測定することによって、最大速度が決定されることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
粒子の最大速度が、画像解析及び粒子追跡を用いて決定されることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
粒子の最大速度及び緩和周波数が、数値的モデリング方法を用いて、ゼータ電位及び表面伝導率に変換されることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
電極が誘電層で被覆されたシリコン電極からなることを特徴とする請求項１５〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
粒子のゼータ電位を決定する方法であることを特徴とする請求項１５〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
粒子の表面伝導率を決定する方法であることを特徴とする請求項１５〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
第一平面に位置する第一電極及び第一平面とは異なる第二平面に位置する第二電極、その間に存在する電解質溶液、並びに該電解質溶液と第二電極との間の界面に懸濁した多数の粒子を用意し、前記第二電極は表面及び内部を有し該表面又は内部が界面電場の空間分布を修正するようにパターン化された平面電極からなり、前記粒子は区別可能な緩和周波数をそれぞれ有する少なくとも２種の粒子からなり、さらに電解質溶液に懸濁された各々の粒子のゼータ電位及び／又は該粒子の近接領域内におけるイオン又は分子の移動度を決定する方法であって、
第一電極及び第二電極間にＡＣ電圧を印加して、該二つの電極間に、周波数を有する電場を発生させ、該電場の周波数を調整して、電極のパターニングによって定義される電極の指定領域内へ粒子を輸送し、前記１又は２種以上の粒子の緩和周波数を決定し、粒子を分別し、さらに前記粒子の輸送の最大速度（Ｖmax）を決定し、前記緩和周波数及び最大速度を該粒子のゼータ電位及び／又は該粒子の近接領域内におけるイオン又は分子の移動度に変換することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
粒子のゼータ電位及び該粒子の近接領域内におけるイオン又は分子の移動度が同時に決定されることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
粒子の緩和周波数が、アレイが形成されている電場の周波数を測定することによって決定されることを特徴とする請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
さらに、印加電場の周波数を変更し、アレイコンフィグレーションの反応を分析するステップを含むことを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか記載の方法。
【請求項２９】
アレイアッセンブリの過程でインピーダンス勾配を横切る粒子の速度を測定することによって、最大速度が決定されることを特徴とする請求項２５〜２８のいずれか記載の方法。
【請求項３０】
粒子の最大速度が、画像解析及び粒子追跡を用いて決定されることを特徴とする請求項２５〜２９のいずれか記載の方法。
【請求項３１】
粒子の最大速度及び緩和周波数が、数値的モデリング方法を用いて、ゼータ電位及びイオン又は分子の移動度に変換されることを特徴とする請求項２５〜２９のいずれか記載の方法。
【請求項３２】
電極が、誘電層で被覆されたシリコン電極からなることを特徴とする請求項２５〜３１のいずれか記載の方法。
【請求項３３】
粒子のゼータ電位を決定する方法であることを特徴とする請求項２５〜３２のいずれか記載の方法。
【請求項３４】
粒子の近接領域内におけるイオン又は分子の移動度を決定する方法であることを特徴とする請求項２５〜３２のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、分析化学及び材料の評価（キャラクタリゼーション）の分野に関連する。本発明は特に、粒子分極化の特徴的周波数依存性に基づく、粒子異種混合物の分別、及び粒子の電子化学的特性の分析に関連する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ.１  分別及び分類方法
分析的分離技術のなかで、フローサイトメトリー法は、任意の異種集団における粒子（細胞を含む）の分類に用いられてきた。しかしながら、これらの方法には任意の選択判定基準を満たす粒子を選択し、物理的に集団から分離させることのできる専用の機器が必要である。例えば、フローサイトメトリーの細胞分類の目的は通常、集団内で特徴的な蛍光シグナルを表示している細胞を選択することにある。
Ｉ.２  粒子分析法
粒子分析は、物理化学的、及び組成上の特性を特定するために用いられる分析化学全般における標準的な手法である[Hunter, "Introduction to Modern Colloid Science", Oxford University Press, Oxford, UK, 1993；非特許文献１]。広範囲に及ぶ技術は、医療診断から化粧品に至る多くの化学及び産業用途において、様々な粒度（size）、形状、組成及び化学反応性の粒子の多様な利用法を反映している。粒子の特徴付けは、特に表面特性について、周囲の培養液における粒子懸濁の安定性、及び粒子と分子の相互依存性を特定する化学修飾と並んで、製造を管理し最適化することにおいて有用である。
【０００３】
標準的な技術は以下のように分類される。すなわち第一群は、沈降法及び遠心分離法、電気音響学、光散乱法、流体力学的方法並びに誘電分光法であり、第二群は、電気パルス計測法、フローサイトメトリー及び電気泳動ゼータ電位測定法であり、第三群は、誘電泳動（ＤＥＰ）や、かかるＤＥＰとフィールド・フロー・フラクショネーション方法論との組み合せを含む特殊方法である。
【０００４】
第一群の方法は、バルク懸濁（バルクサスペンション）にあてはまり、多数の粒子についての測定量の平均値を提供する。大量の産業的数量を特徴付ける状況においては望ましいが、バルク測定法は一般的に小型化には有用ではなく、少数の粒子の特徴付け、特に粒子対粒子の変動が対象となっている場合や、複数の粒子パラメーターを同時に特定しなければならないときなどには適していない。
【０００５】
第二群の方法は、測定の「単一ファイル」連続形式を用いる。これらの方法は、個別の粒子特性を特定するが、十分に高い処理速度を達成するためには、実施に際して搬送ガス又は流体の高い流動性及び高速データ記録並びに読み出し用電子機器を必要とし、一般的に装置は複雑で高価である。各粒子について複数のパラメーターを特定しなくてはいけない場合に特にこの傾向が見られる。例えば、フローサイトメーターの多色検出には、複数のレーザー及び複数の光電子増倍管の使用が必要である。最先端装置において粒度及びゼータ電位の特定には、ZetaSizer (Malvern Instruments社製, Southborough, MA)のように、関連する光源の光散乱及び読み出しの適用と並んで、チャンネルに沿って印加されるＤＣ電圧に反応する狭小な毛細管(キャピラリー)に沿って移動する粒子の電気泳動度の測定が必要である。フローサイトメトリーの場合のように、小型化は処理の連続モードを保持し、限られた処理能力の制約を受ける［Fu, AX, Spence, C., Scherer, A., Arnold, F.H. and Quake, S.R. A Microfabricated Fluorescent- Activated Cell Sorter, Nature Biotechnology, Vol. 17, November 1999, 1109-1111；非特許文献２］。
【０００６】
第三群の方法には、低伝導粒子懸濁液を特徴付け、分類及び分別するための様々な誘電技術が含まれる[Becker, F.F., Gascoyne, P.R.C., Huang, Y. and Wang, X-B, Method and Apparatus for Fractionation Using Generalized Dielectrophoresis and Field Flow Fractionation, US Patent No. 5,888,370, March 30, 1999；特許文献１、Rousselet, J., Markx, G.H. and Pething, R., Separation of Erythrocytes and Latex Beads by Dielectrophoretic Levitation and Hyperlayer Field-Flow Fractionation, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 140 (1998) 209-216；非特許文献３、 Pethig, R., Markx, G.H., Apparatus for Separating by Dielectrophoresis, US Patent No. 5,814,200, Sep 29th, 1998；特許文献２、Pohl, H.A., Continuous Dielectrophoretic Cell Classification Method, US Patent No. 4,326,934, April 27th 1982；特許文献３、 Parton, A., Huang, Y., Wang, X-B., Pethig, R., MacGregor, A.R., and Polland-Knight, D.V., Methods of Analysis/Separation, US Patent No. 5,653,859, Aug. 5, 1997；特許文献４、Crane, S., Dielectrophoretic Cell Stream Sorter, US Patent No. 5,489,506, Feb 6th, 1996；特許文献５、 Benecke, W., Wagner, B., Hagedorn, R., Fuhr, G., Muller, T., Method of Continuously Separating Mixtures of Microscopic Dielectric Particles and Apparatus for carrying through this method, US Patent NO.5,454,472, Oct. 3th 1995；特許文献６]。本出願中で引用される全ての文献は、この引用により、その全てが開示に含まれる。
【０００７】
適切な画像システムに加えて、この群の技術は単一粒子の情報を提供することができる。粒子分類は、平面パターン化された微小電極の複数セットにＡＣ電圧を印加して発生させた不均一なＡＣ電場に、粒子混合物をさらすことにより達成される。そのようなスキームには、一般的に、複雑な電極シグナリング／アドレス方式が要する。なお、操作の連続モードには、最も単純な場合でも、外部流動との共役（カップリング）又はフィールドフローフラクショネーションの使用が必要である。単純な誘電泳動設備では、一般的に粒子の表面電位又は表面伝導率の定量評価を行うことはできない。これらの定量は単一粒子の電気回転スペクトルによって特定されるであろうが、このアプローチには、単一粒子を、周波数がスキャンされている回転電場の原点に閉じ込めて、他方では、かかる閉じ込められた粒子の回転運動を記録するという複雑で時間のかかる設備が必要である。実験に必要不可欠なコンフィグレーションを実行するために必要な設備の複雑性に加えて、この方法の処理能力の低さは、複数粒子の平均値を求められた時に、深刻な不都合さを露呈する。
【非特許文献１】Hunter, Oxford University Press, Oxford, UK, 1993
【非特許文献２】Fu, AX, Spence, C., Scherer, A., Arnold, F.H. and Quake, Nature Biotechnology, Vol. 17, November 1999, 1109-1111
【非特許文献３】Rousselet, J., Markx, G.H. and Pething, R., Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 140 (1998) 209-216
【特許文献１】Becker, F.F., Gascoyne, P.R.C., Huang, Y. and Wang, X-B, Method and Apparatus for Fractionation Using Generalized Dielectrophoresis and Field Flow Fractionation, US Patent No. 5,888,370, March 30, 1999
【特許文献２】Pethig, R., Markx, G.H., Apparatus for Separating by Dielectrophoresis, US Patent No. 5,814,200, Sep 29th, 1998;
【特許文献３】Pohl, H.A., Continuous Dielectrophoretic Cell Classification Method, US Patent No. 4,326,934, April 27th 1982；
【特許文献４】Parton, A., Huang, Y., Wang, X-B., Pethig, R., MacGregor, A.R., and Polland-Knight, D.V., Methods of Analysis/Separation, US Patent No. 5,653,859, Aug. 5, 1997
【特許文献５】Crane, S., Dielectrophoretic Cell Stream Sorter, US Patent No. 5,489,506, Feb 6th, 1996
【特許文献６】Benecke, W., Wagner, B., Hagedorn, R., Fuhr, G., Muller, T., Method of Continuously Separating Mixtures of Microscopic Dielectric Particles and Apparatus for carrying through this method, US Patent NO.5,454,472, Oct. 3th 1995
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、粒子混合物の分別及び粒子分析のための方法並びに装置を提供するものであり、SeulによるＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９７／４０３８５に記載されている「ＬＥＡＰＳ」と命名された技術に一部基づいている。本発明は、ＬＥＡＰＳ（Light-Controlled Electrokinetic Assembly of Particles near Surfaces）を用いて、例えば、大きさ（サイズ）及び形状を含む形態特性；ある一定の電気化学的特性に関連する表面電位及び表面伝導率を含む表面組成；装置内で与えられる露出面への特異的及び非特異的な付着性に基づき、異種粒子混合物を分別するものである。ここで「分別」とは、粒子の分離又は分類を意味し、多成分粒子混合物をそれらが構成する亜集団に分離することを含む。粒子は、粒子分極の特徴的な周波数依存性に基づいて分離され、かかる依存性は粒子の物理的及び化学的特性を反映する。
【０００９】
本発明はまた、装置の表面又は他の粒子への付着性といったような表面電気化学的特性及び表面化学特性等の形態特性を含む粒子の様々な物理的又は化学的な特性を特定するためのＬＥＡＰＳの使用方法を提供する。
【００１０】
本発明は、構成する粒子又は粒子集団のそれぞれ特徴的な緩和周波数に基づいた粒子混合物の分別方法及び装置を提供する。かかる方法の実施例では、多数の粒子が電解質溶液と感光性電極との間の界面に懸濁（浮遊）される。粒子は少なくとも２種の粒子から構成され、それぞれの粒子は、区別できる緩和周波数を有する。ＡＣ電圧を界面に印加することにより、前記粒子のうち少なくとも１種の粒子の緩和周波数以下の周波数を有し、かつ他の粒子の緩和周波数を上回る周波数を有する電場を発生する。また、界面は所定の光パターンにより照射される。照射が電場と組み合わされて、電場以上の緩和周波数を有する粒子を他の粒子から分別することができる。例えば、印加される電気の周波数より高い周波数を有する粒子のアッセンブリにより、実質的に一層の粒子の平面アレイが、照射パターンにより指定された電極部分に形成される。ある実施例では、照射は電解質−電極界面インピーダンスに影響を与える。
【００１１】
好ましい実施例において、電極は誘電層で被覆されたシリコン電極からなる。ある望ましい実施例では、付加電極が用意され、感光性電極及び付加電極が実質的に平面で、互いに平行で、間隙をもって隔たっている状態（例えば、サンドウィッチ形状）となり、かかる間隙に粒子を含有する電解質溶液が存在する。
【００１２】
本発明の他の実施例では、パターン化された電極は、照射の代り又はそれとの組み合せで用いられ、粒子混合物を分別する。かかる実施例では、第一平面に位置する第一の電極及び第一平面とは異なる第二平面に位置する第二の電極が、間隙をあけて設けられる。このような配置を、ここでは、「サンドウィッチ形状」と呼ぶ。粒子混合物は電解質溶液で懸濁され、間隙に存在する。第二の電極は表面及び内部を有する平面電極からなり、かかる表面及び内部のいずれも界面（電解質溶液及び第二電場の界面）の電場の空間的分布を修正するようにパターン化されている。第一電極と第二電極との間にＡＣ電圧を印加することにより、電場がかかる二電極間に発生した場合には、電場は電極のパターニングと組み合わされ、緩和周波数に従って粒子を分別する。例えば、印加電場の緩和周波数より高い周波数を有する粒子は、照射又はパターニングによりもたらされた第二電極表面の指定領域へ移動し、かかる領域において実質的に一層の平面アレイを形成する。好ましい実施例では、第二電極は、空間的に変調された、酸化物成長、表面化学的パターニング又は表面プロファイリングによりパターン化される(１９９８年１０月２６日出願の米国特許出願第０９／１７１，５５０号記載、２００１年６月２６日発行の米国特許第６，２５１，６９１号)。好ましくは、かかるパターニングが、電解質溶液と第二電極との界面のインピーダンスに影響する。好ましい実施例では、第二電極は誘電層で被覆されたシリコン電極からなる。
【００１３】
ある実施例では、異種混合物における粒子の緩和周波数の違いは、粒度又は表面組成の違いと対応しており、従って混合物がそれぞれの粒度や表面組成に従って粒子の同種亜集団に分別できるようになる。分別過程はビデオ検出器又はカメラを用いてモニタリングすることもできる。
【００１４】
従って、本発明は、粒子混合物の構成粒子又は粒子亜集団の特徴的な緩和周波数に基づいた、粒子混合物の分別方法及び装置を提供する。本発明では、電極において指定された低インピーダンス領域への粒子輸送を管理し、かかる指定領域における粒子形成を媒介する電気流体力学的力の周波数依存性を特定することができる。本明細書記載の通り、粒子緩和周波数ωRは、粒子と溶液の界面に関連する特徴であり、アレイ・アッセンブリが必要とするω≦ωRの条件から特定される。そして、この判定基準に見合わない粒子は低インピーダンス領域から排除される。
【００１５】
本発明はまた、サイズ、形態、表面電位及び表面伝導率を含む、粒子のさまざまな物理的又は化学的特性を特定するための粒子分析方法及びその装置を提供する。例えば、緩和周波数及び／又は粒子輸送の最大速度が、粒子の評価に用いられる。
【００１６】
本発明のある実施例では、電解質溶液と感光性又はパターン化電極との界面に懸濁（浮遊）された多数の粒子が、上記のように、粒子分別と関連して用意された。
【００１７】
ＡＣ電圧を印加することにより界面に電場が発生すると、電場の周波数は、照射パターンまたは電極パターンにより指定された領域において、実質的に一層の粒子の平面アレイ形成を促すように調整される。アレイ・アッセンブリの過程での粒子輸送の分析から、緩和周波数及び粒子輸送の最大速度が決定される。あるいは、粒子の緩和周波数は、印加電場の周波数変化に対するアレイコンフィグレーションの反応を分析することによっても決定される。
【００１８】
本発明はさらに、アレイ・アッセンブリの過程でインピーダンス勾配を横切る粒子によって得られ、周波数及び電圧に依存する最大速度Ｖmaxの決定を提供するものである。本明細書記載の通り、Ｖmaxは、画像分析及び粒子追跡により決定される。ある実施例では、ωR及びＶmaxの組み合せにより、例えば、本明細書に記載されている粒子運動の現象学的方程式の数値的分析に基づいて、粒子表面（「ゼータ」）電位φs及び表面伝導率σを同時に決定することができる。
【００１９】
ひとたびこれらの数値が得られると、粒子を特徴付けるために用いられ、たとえば、粒子のゼータ電位及び／又は粒子表面近辺の電解質溶液中のイオン又は分子の移動度を決定するために用いられる。好ましい実施例では、緩和周波数及び最大速度が、共に粒子の特徴付けに用いられる。一部の好ましい実施例では、本発明により、ゼータ電位及びイオン又は分子の移動度といった複数の粒子特性を同時に決定することができる。他の実施例では、本発明により、対象となる一つの粒子特性を他の特定とは独立して特定することができる。例えば、ある実施例では、粒子と溶液の界面と関係するイオン又は分子の移動度が、緩和周波数のみから決定される。
【００２０】
ここでいう「粒子」という用語には、コロイド性ビーズ、真核及び原核細胞、ミセル、ベシクル、並びにエマルジョン液滴が含まれる。好ましい実施例では、粒子はコロイド性ビーズ又は真核若しくは原核細胞からなる。
【００２１】
フィールド・フロー・フラクショネーションのような、従来の粒子混合物分別方法に対し、本発明の方法では、対象粒子の周波数依存性分極化に基づく分別を媒介する縦方向及び横方向の電気流体力学的力を提供する単純なサンドウィッチ幾何構造において、個々に画像処理された多数の粒子の操作に基づく並行方式を提供する。特に、本発明の方法は、粒子の亜集団を他から一度に分別することができる。
【００２２】
蛍光活性化粒子及び細胞の分類のような従来技術の分類方法とは対照的に、本発明の方法では、処理スピードを高めることにより、多数の粒子に適応した並行処理を提供する。本発明の方法はまた小型化にも大変適している。
【００２３】
バルク粒子懸濁に用いられ、対象となる粒子特性の全体平均を与える従来技術の粒子分析法に対し、本発明の方法及び装置は、分析過程の小型化をもたらす。従来技術の粒子移動度の連続分析法に対し、本発明の方法は、画像処理及び画像分析、又は光散乱のいずれかに利用できる多様な粒子特性の同時分析の並行方式の基礎として、粒子アレイ・アッセンブリの集合現象を引き起こす。本発明の方法は、同時に、表面電位及び表面コンダクタンスを含む電気化学的パラメーターに加えて、サイズ、配向（orientation）及び多分散性(polydispersity)を含む形態学的パラメーターの決定を独立して行うことができる。
【００２４】
上記従来技術とは対照的に、本発明の分別方法の実施は、総合分析分野において、小型化に適し、付加的準備及び付加的な分析手法との統合に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
Ｉ．  誘電媒質の静電理論
本発明がより良く理解されるために、Landau, Lifshitz & Pitaevskii, "Electrodynamics of Continuous Media", Butterworth-Heinemann, Oxford, UK, 1998を全般的に引用し、誘電媒質の静電理論の結果について、ここに要約する。
Ｉ.１  動重力(Ponderomotive Forces)
電荷量Ｑの領域Ａにおける二つの平行コンデンサープレート間の間隔Ｈの間隙を満たす誘電率εMの誘電媒質の自由エネルギーは、Ｊ0＝−１／２Ｃ0φ2で与えられ、静電容量（キャパシタンス）Ｃ0＝εMＡ／Ｈは、印加電位及び蓄積電荷量Ｑ＝Ｃ0φの割合を表す。プレートの静電電位はチャージされないままであるとの仮定に基づいて、半径ａ＜＜Ｈ及び誘電率εSの球体を間隙に導入すると、次式の通りに自由エネルギーが変化する。
【数１】
0004422409.tif 000002
ここで、係数ｋ＝（εS−εM）／（εS＋２εM）が、誘電率εMの誘電媒質に埋められ均一な電場Ｅ0を受ける半径Ｒで誘電率εSのチャージされていない誘電球体の電位を決定する。
【数２】
0004422409.tif 000003
【００２６】
式（１）と一致して、εM＜εSである限り、球体を誘電媒質へ挿入することによって、自由エネルギーは実際に低下した。結果として、プレート端のすぐ外側に位置する球体は、力Ｆ〜∇Ｊによりプレートとプレートとの間に引きこまれる。式（１）から、Ｅ0＝φ／Ｈであるから、
【数３】
0004422409.tif 000004
【００２７】
このように、この動重力は、球体における分極と電場の空間的不均一性との相互作用から起こる。式（３）は、かかる力は電場の信号（the sign）からは独立していることを示している。すなわち、不均一な電場においては、分極性粒子はより高い場へ進入するか、かかる場から出てくるが、そのことは、粒子と懸濁媒質の誘電率の相対的な大きさのみにより決定される。本明細書記載の通り、一般的に、分極係数ｋは周波数に依存する（ｋ＝ｋ（ω））。
Ｉ.２  電解質溶液の界面分極
本明細書で電解質溶液と呼ばれる流体媒質の分極は、構成分子の空間分布又は配向における勾配の形となって典型的に現れる。従って、電解質溶液は、境界表面又は境界界面を有する界面近くで分極される。かかる界面領域が、周波数が変化する外部場にさらされている場合には、媒質の反応は、構成分子の再分布又は再配向を媒介する過程、及びこれらの過程と関連する特徴的な分子の移動度によって決定される。
【００２８】
自由イオンの空間分布：二重層
移動電荷を含有する電解質は、荷電境界表面の存在に反応して、その表面の電荷によって生じる場を遮蔽（screening）するように、その表面近傍に過剰電荷の層を形成する。このように、荷電粒子と自由イオン含有電解質との間の界面の分極は、過剰な対イオンの遮蔽殻を形成するためのイオン再分布という形をとって現れる。この「二重層」は、球体に近接する自由電荷担体の超過分に対応する表面電位φS及び媒質のイオン強度１／２Σｎi0ｚi2 に直接関連する特徴的な遮蔽長κ-1によって特徴付けられる。すなわち、１：１電解質では、κ-1＝（εMε0ｋBＴ／２ｚ2ｅ2ｎ0）1/2である。なお、ｎ0が電解質のモル濃度であり、ｚが各イオンの電荷である。イオンの局所的な超過濃度は、球体表面に固着された分子を伴う結合反応に影響を与えうる。均一な電場は、「二重層」に近接すると共に、層内にあるイオンの再分布を誘導し、「濃度分極」とよばれることもある現象を引き起こす（図１）。遮蔽層を形成する分子の再分布は、分子の並進移動度（translational molecular mobilities）により決定される。
【００２９】
双極性分子の好ましい再配向
双極性分子を含有する電解質が荷電境界表面（charged bounding surface）と反応することにより、かかる分子が好ましい配向を呈する層を形成する。前記の場合と同様に、好ましい分子配向の界面領域は、表面過剰分極及び統計学的理論から直ちに決定される特徴的な崩壊長（decay length）により特徴付けられる。局所的な過剰配向は、球体表面に固着した分子を伴う結合反応に影響を与えうる。遮蔽層を形成する分子の再分布は、配向分子移動度により決定される。あらゆる任意の電解質においても、過剰濃度及び配向が、（分子電荷分布の高モーメント（higher moment）同様に）遮蔽層の形成に貢献すると考えられる。
Ｉ.３  場−誘導分極の周波数依存性
外部から印加される電場は、構成分子の再分布又は再配向を誘導することにより、電解質の界面分極を変化させる。従って、印加されるＡＣ電場は時間依存性の界面分極を誘導する。平行プレートコンデンサーの再荷電と同様に、時間依存性界面分極は、一過性の荷電電流（transient charging current）ｊ〜∂tＰに対応する。時間依存性界面分極が、自由イオンの空間再分布によって媒介される場合には、荷電電流ｊは、二重層内のイオンの再分布と二重層及びその周囲の媒質の間の荷電交換とをそれぞれ反映する縦方向及び横方向の構成成分によって構成される。この結果を以下に示す。ここでは、一致した結果が双極性分子の時間依存性再分布においても示されている点が注目される。
【００３０】
縦方向の構成成分は、特徴的時間スケールτ‖〜（α＋１／κ）2／Ｄ〜１／ωR上の印加された場に対応する二重層内の主に対イオンの再分布を反映する。なお、α、１／κ及びＤがそれぞれ、粒子直径、デバイ遮蔽長及び主要担体の特徴的拡散率を示す。特徴的時間スケールτ＝τ‖は、主に、対イオン移動度ｕ〜ｚｅ／ｆにより決定される。なお、ｎ及びｆが、それぞれ、局所的対イオン濃度及び抵抗係数（drag coefficient）を示す。粒子表面近傍におけるイオン移動度は、局所的な化学環境の詳細を反映し、また一般的にバルク媒質において対応する数値とは明らかに異なる。アインシュタインの関係式、１／ｆ＝Ｄ／ｋBＴを用いると、緩和周波数ωRは、対イオン移動度ｕに関して、
【数４】
0004422409.tif 000005
で表される。
【００３１】
縦方向の対イオン電流は、時間スケールτ┴〜１／κ2Ｄ〜１／ω⊥の二重層を横切る共イオン（coion）及び対イオンの動径輸送（radial transport）を反映する横方向電流により平衡が保たれている。二重層に隣接した電解質において、電気的中性が厳密に保たれるとすると、動径輸送を経由した、二重層と周囲の電解質との間の対イオン交換には、同数の共イオンの動径輸送が伴わなくてはならない。その結果として、二重層に隣接した電解質において局所的なイオン強度が変化する。すなわち、電解質濃度の勾配は粒子直径のスケールで現れ、またこれらは、特徴的な時間スケールτ〜１／ωRにおいて崩壊する（decay away）。周波数が増加すると、二重層内のイオンの再分布は、最終的に、完全分極化状態に達するには不十分となり、ωRτ≒１の時に緩和が起こる。典型的な粒子半径１μｍ、典型的数値ω⊥≒１０5／ｓについて、緩和周波数ω〜ω⊥／（１＋κα）2は約１ｋＨｚである。
【００３２】
分極係数ｋ（ω）の現象学理論−現象学的モデルは、場−誘導、周波数依存分極ｋ＝ｋ（ω）を粒子表面電位φs及び表面伝導率σに関係付けるために開発された。前者は、所定のバルクイオン表面強度に対して、二重層内の総電荷密度を決定する。後者は、二重層が、経時的に変化する印加電場に対応して再調整できる割合を決定する。特に、表面小電位に有効な線形化理論は、二重層内における一過性のイオン荷電電流及び荷電平衡への横方向イオンの流れの寄与を取り扱うことができ、周波数依存性ｋ＝ｋ（ω）の発現をもたらすことができる［Dukhin and Shilov, "Dielectric Phenomena and the Double Layer in Disperse Systems and Polyelectrolytes", Keter Publishing, Jerusalem, 1974］。近年において考案された濃度分極の基礎をなす界面動電輸送現象(electrokinetic transport phenomena)の線形化理論は、コロイド性懸濁液の低周波数誘導体反応の分析のために開発されたが、周波数依存性ｋ（ω）の有用な分析方法をもたらす［Minor et al, J. Colloid & Interface Science 206, 397-406 (1998)］。
【００３３】
外部の場の低い数値を仮定すると、電位及びイオン分布は、外部場がない場合に起こる平衡状態近傍で線形化する。二重層から遠く離れた懸濁媒質内の領域では、（ｉ−ｔｈ種のための）イオンバランスは、Nernst-Planck方程式、すなわち
【数５】
0004422409.tif 000006
に従う。ここで、‘δ’に続く項は、対応する平衡値からの一次偏差（first order）をそれぞれ表し、またｆはイオン移動度の基準となる有効摩擦係数である。線形化ポアソン方程式に沿って式（５）を解くと、δｎif；ｆ及びδφfの量(fare)は次式の通り見い出された。
【数６】
0004422409.tif 000007
ここで、λａ＝（１＋ｉ）（ωτ）lであり、時間スケールτは、粒子の周に沿って輸送するための特徴的な拡散時間によって設定され、τ≒ａ2／Ｄ＝∫∽ａ2／２ｋBＴである。
【００３４】
分極パラメーターｋは、粒子及び関連する二重層の存在により、媒質の有効誘電率の上昇を決定する。対象となるシステム特性の点からｋ＝ｋ（ω）を表すために、境界条件は、流量バランスの形をとった式（６）に適合する。二重層内の接線イオン流量は、電気的中性が外部溶液において常に保たれることを保証するために、二重層へ流入しかつ二重層から流出する動径イオン流量と平衡が保たれる。単一共イオン（上付き“１”）及び単一対イオン種（上付き“２”）のみを含有する電解質に注目せず、二重層の共イオン流量を対イオン流量に比べて極僅かとして無視すると、二重層の外側縁（ｒ＝ａ+）の流量バランスは、次式の通り表される。
【数７】
0004422409.tif 000008
【００３５】
ここで∇tは、接線勾配オペレーターを表す。動径及び接線の対イオン流量は、定数Ｄｕ2と関連付けられ、かかる定数は（対イオン媒介の）表面伝導率と（対イオン媒介の）バルク伝導率Ｄｕ2＝σ／ａσ∽の無次元割合を表し、ａは粒子の直径を表す。Ｄｕ2は、表面電位φS及び無次元対イオン移動度ｍ2に関連して、次の通りに表される。
【数８】
0004422409.tif 000009
【００３６】
境界条件を適用すると、分極パラメーターｋ（ω）が次式の通りにもたらされ、
【数ｉ】
0004422409.tif 000010
ここで、
【数ｉｉ】
0004422409.tif 000011
かつ
【数ｉｉｉ】
0004422409.tif 000012
である。図２は、様々な表面電位、表面イオン移動度の割合ｕ、及びバルクイオン移動度の割合ｕ∽に対するｋ（ω）の代表的なグラフを示す。これらのプロットの各々における屈折点は、分散のピークを同定し、代りに対応する周波数を緩和周波数ωRとして同定する。図３のグラフは、任意の値ｕ／ｕ∽に対して、ωRが一般的に表面電位に依存することを示すことを表している。すなわち、ωRは、表面電位によって制御される局所的イオン密度及びイオン移動度の両方に依存する量であるところの、イオン伝導率σ〜ｅｕｎ〜ｚｅ2ｎ／ｆの一機能であると理解される。
【００３７】
しかしながら、図３はまた、表面電位φSの十分に大きな値に対して、ωRの表面電位依存性は消滅し、代りにスケーリング関係式（４）と一致する、線形関係ωR〜ｕ／ｕ∽をもたらすことを示している。図１０のデータ分析の基礎となるこの関係は、緩和周波数の決定からイオン及び分子の移動度を直接実験により決定する基礎を提供している。
ＩＩ．動電学的粒子輸送及び粒子アレイ・アッセンブリ
粒子近接表面の光制御した動電学的アッセンブリ（ＬＥＡＰＳ）は、ＷＯ９７／４０３８５において開示されているように、リアルタイム視覚制御下の基質の指定領域における粒子の平面アレイ（オン・キュー(on-cue)形成も含む）形成を可能にする。ＬＥＡＰＳは、電場、界面パターニング及び／又は光を組み合わせて用いて、電解質−絶縁体−半導体（ＥＩＳ）界面のインピーダンスの空間的かつ時間的な変調を誘導する。ＬＥＡＰＳは、側方インピーダンス勾配に合わせて生じる電気流体力学的力を引き起こし、アレイ・アッセンブリ過程同様に流体及び懸濁粒子の結合輸送を制御する。
【００３８】
本発明は、ＬＥＡＰＳの独特の条件の下での粒子輸送及びアレイ・アッセンブリに寄与する分極誘導力の役割について記載されている。これらのモデルは、時変性電場の組合せに応じた粒子混合物の分別の条件選択方法を導く。これらのモデルはまた、対象となる粒子の特徴的特性を決定するために、結合流体粒子輸送の分析方法も提供する。
III.流体流動（fluid flow）、粒子捕集及びアレイ・アッセンブリ
粒子近接表面の光制御した動電学的アッセンブリ（ＬＥＡＰＳ）は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８１５９（ＷＯ９７／４０３８５にて公開）及び、１９９８年１０月２６日出願の米国特許出願第０９／１７１，５５０号（２００１年６月２６日、米国特許第６，２５１，６９１号として発行）に記載されており、その全てがこの引用により開示に含まれる。その他に引用によってこの開示に含まれるものとしては、１９９９年９月１７日出願の米国特許出願第０９／３９７，７９３号（ＷＯ０１／２０５９３にて公開）（プログラム可能な照射パターン生産のためのシステム及び方法を記載）、及び１９９９年５月２８日出願の米国特許出願第０９／３２０，２７４号及びＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／１４９５７（ＷＯ００／７３７７７にて公開）（アレイサイトメトリーに関連）である。ＬＥＡＰＳは、流体流動、粒子輸送及びアレイ・アッセンブリを誘導する数種の動電学的力の相互作用に関与する。例えば、サンドウィッチ幾何学では、流体間隙を横切って印加されたＡＣ電場は、界面パターン化又は空間的に変化する照射により生じた電解質−絶縁体−半導体（ＥＩＳ）インピーダンスの側方勾配近傍における電気浸透性流を調整する（図４）。一般的に、これらの流動はω≦ω⊥の条件下において見い出され、後者の特徴的な周波数は、ＥＩＳ界面の分極反応を支配する分子過程（molecular processes）において決定される。これら流動場（flow field)の作用のもとで、粒子は微小距離にわたって「捕集」され、界面インピーダンスのより高い領域からより低い領域へ粘性抵抗によって押し流される。
【００３９】
分極性粒子は、動電学的流に沿って押し流されるが、同時に印加電場に応答しており、特に粒子が荷電されると、印加された場は局所的な荷電電流を誘導し、かかる荷電電流は前述のメカニズムに沿って実質的な濃度分極を作りだす。この場−誘導の分極は、分極性粒子の有効誘電率を決定し、界面インピーダンスにおける近接したステップ又は他の急勾配を生み出すような電場の高速空間変化領域において、かかる粒子に及ぼされた動重力を管理する。
【００４０】
従って、ＥＩＳインピーダンスのステップに近づく粒子は勾配∇（Ｅ・Ｅ）の影響下におかれ、例えば、流体によって働く流体抵抗等により、ステップを交差する際に加速して、低インピーダンス領域に進入したところで減速する。粒子は低インピーダンス領域へ入り、ω≦ωR（“凝集”）のときアレイを形成し、対照的に、ω＞ωRの場合、粒子は境界近傍の高インピーダンス側に集まる。照射は、インピーダンスに勾配を引き起こし、また、ω≦ωRという条件で、電極の照射された領域にアレイ形成を引き起こす。
【００４１】
本発明のある実施例では、アレイ形成過程の周波数依存により、特徴的な周波数ωRを実験的に決定することができた。同種粒子群に対して、緩和周波数は、アレイコンフィグレーションにおける移行を引き起こすことにより決定され、ω＜ωRの条件下で構築されたアレイは、密集コンフィグレーションであると仮定され、その後、周波数がω＞ωRに変わると、アレイは拡張コンフィグレーションへ移行される［Chau et al, Proc. SPIE, 3877, 36-42］。従って、印加ＡＣ電場の周波数はまず、指定領域内でのアレイ・アッセンブリが可能である程度低い値で設定され、その後、拡張アレイ・アッセンブリへの移行を誘発するように次第に高い値に設定される。
【００４２】
パターン化された電極表面に配置された粒子の異種混合物については、所定の粒子の種類を特徴付ける緩和周波数の完全なセットは以下の通りに決定されるであろう。印加されたＡＣ電場の周波数は、まず粒子が低インピーダンスの指定領域へ輸送されるのを防ぐために、十分に高い値で設定され、その後、判定基準ω≦ωRを満たし、粒子のアレイ・アッセンブリが可能になるように、次第に低い値で設定される。
【００４３】
粒子サイズ（粒度）
ωRを決定するアレイコンフィグレーションにおけるこの移行を用いて、異なる電解質濃度及び異なる表面特性を示す粒子について、ωR及び粒度の関係が決定される（実施例２参照。）。
【００４４】
表面化学組成
所定の粒度について、ωRは粒子表面の化学的性質によっても異なる。例えば、タンパク質がビーズ表面に結合している場合、ωRは減少し、オリゴヌクレオチドがタンパク質コーティングビーズに結合している場合、ωRは増加する。一般的に、荷電担体の局所的密度ｎ、及びそのイオン移動度ｕの両方が影響を受ける。
【００４５】
非水電解質
非水性懸濁液においては、粒子輸送、及びインピーダンスステップを交差する加速を伴うアレイ・アッセンブリに加えて、整流された場−誘導流体流も起こる。ＤＭＳＯ及びアセトニトリルにアッセンブルされた粒子の緩和周波数は、水性懸濁液に比べて低い値へ移行する。
ＩＶ．異種粒子混合物の分別
粒子サイズ及び表面化学組成に対するωRの特徴的な依存性は、本明細書記載の通り、ＬＥＡＰＳ特有の条件下における粒子輸送及びアレイ・アッセンブリに対する効果において顕在化するが、基質上（例えば、オンチップ（on-chip））で細胞懸濁液を含む複合的異種粒子混合物を分別する方法の基礎を提供する。本発明の方法の実施の基礎となる原理は、ＬＥＡＰＳにおいてもたらされる界面パターニング又は照射のいずれかにより、ＥＩＳ界面の低インピーダンス指定領域を形成することと、任意の粒子異種セットにおける少なくとも一つの構成サブセットの集団と一致する条件下において印加電圧の一つの周波数を選択すること又は連続的に印加電圧の複数の周波数を選択することである。
【００４６】
それぞれ緩和周波数が異なる２つの異なる種類のビーズからなる混合物を分別するには、印加電圧の周波数は、より高い緩和周波数のビーズを選択的にアッセンブルするために中間値に設定される。本明細書で開示されている通り、粒度への緩和周波数の依存性に従って、条件ωRL＜ω＜ωRSは、小さい粒子のみ（周波数ωRSによって特徴付けられる）が、低インピーダンス領域に進入し、他方、大きい粒子（周波数ωRLにて特徴付けられる）が、その特徴の高インピーダンス側に並ぶ（実施例４）ことを保証する。同様に、表面化学組成への緩和周波数依存は、粒子の分別に用いることができる（実施例５）。
【００４７】
表面化学組成の変化をもたらす機能ビーズ表面へのリガンドの結合は、対応する緩和周波数の変化に基づいて検出することができる。最も単純な形式では、図８で示されるように、操作周波数（operating frequency）ωR1＜ω＜ωR2を選択することにより、緩和周波数ωR1＜ωR2をそれぞれ有する２種の粒子の当初ランダムに混合されたセットの一方のみの電極の低インピーダンス領域における選択的な集団によって、その過程は明らかになる。
【００４８】
本発明におけるこの分別過程は、１つの構成ビーズサブセットを単離しアッセンブルするように次第に周波数を選択することにより、多成分混合物へ一般化される。また、本発明の方法は、ＬＥＡＰＳ媒介の分別に新たな際立った特徴を与える差別的な付着特性をもった細胞にも適用できる。本発明の方法によると、フローサイトメーターのような複雑で高価な装置も必要とせずに、異なる種類のビーズ及び細胞を分別及び分類することができる。
【００４９】
本明細書で開示されている方法の場合と同様に、誘電泳動法においても、分極依存力は異種細胞群分別のための役割を担っている。しかしながら、本発明の方法は以下のような、いくつかの明らかな有利性を有する：
−電極の指定領域における分別に伴う粒子輸送の統一をもたらす、粒子アレイ・アッセンブリの集合過程における動電学的流動及び分極依存性粒子反応の組み合せ；
−結合アッセイ中に粒子又は細胞の表面組成における変化を検出する、表面化学性特性に基づく分別；
−光学的モニタリング下における基質と実質的同一エリア内での連続的多段階分別
−サイズ、表面組成及び選択的付着を含む複数パラメーターによる分別
−多元分別、例えば、アレイ・アッセンブリの周波数分散と、それに続く選択的付着；
−光学的イメージングを通じた検出の並行、マルチコントラストモード；
−電気接触の単純操作による利便性；
半導体操作の一般的な方法によるフレキシブルな電極パターン化；
−誘電泳動分離法との互換性；
−Seul and Chauにより提供されたように、光学的にプログラム可能であること[Chau et al. Proc. SPIE, 3877, 36-42]
本発明の方法と、粒子分離のための誘電泳動法は、以下のいくつかの関連する特異点によって区別される。
【００５０】
基礎過程
本発明で生じる濃度分極過程は、粒子懸濁液の誘導分光法により検出可能であり［Minor, et al. J. Colloid & Interface Science 206, 397-406 (1998)］、粒子表面と関連する分子コンフィグレーション及び輸送現象を精査する。本出願の典型的な対象となる粒度範囲（０．１μｍ−１０μｍ）の粒子について、この過程は、数百Ｈｚから数十Ｈｚの範囲の特徴的な緩和周波数と関連しており、かかる範囲は、電極表面と関連するＡＣ場駆動（AC field-driven）動電学的流動現象からなる［Yeh et al. Nature 386, 57-59 (1997)］。
【００５１】
他方、Pethigのグループ［G. H. Markx, M. S. Talary, R. Pethig, J. Biotechn 32, 29-37 (1994)］、及びGascoyneのグループ［Y. Huang, X-B. Wang, F. F. Becker & P. R. C. Gascoyne, Biophys. J. 73, 1118-1129 (1997)により開発された粒子混合物分別の誘電泳動法の代表的な実施においては、細胞の種類を区別するために、高周波数（一般的に、１００ｋＨｚ超）の細胞の正の誘電泳動反応から負の誘電泳動反応への周波数依存移行が用いられ、かかる移行は、電気回転測定法において回転電場に対する個々の細胞の反応により検出可能であるが、細胞の総誘電性反応に対する誘電体誘電率及び膜電気コンダクタンスの相関する寄与を反映している［Jones, "The Electromechanics of particles", Cambridge University Press, Cambridge, UK 1995］。本発明に基づく電場誘導流体流による巨視的距離における粒子の捕集とは対照的に、粒子分別の誘電泳動法に関する従来技術は、分別過程において電場誘導流体流を引き起こさない。
【００５２】
電場コンフィグレーション
ＬＥＡＰＳの場合と同様に、ＥＩＳ界面に対して標準的なＡＣ電圧を印加する（例えば、電解質溶液を閉じ込めている一対の平行平面の間に電圧が印加されたサンドウィッチコンフィグレーションを用いる）ことにより、本発明の方法による電場のコンフィグレーションがもたらされる。すなわち、印加場は、名目上、電極表面で定位である。本発明の方法とは対照的に、これらの誘電泳動分離法での電圧は流体間隙を交差して印加されず、その代わりに、同一表面上に配置された一対の電極の間に印加される。これら従来技術の方法の対象となる力は、非常に範囲が狭く、主に電極縁の「フリンジ」場の空間的不均質性から生じているため、設計には一般的に反極性（opposite polarity）の密集した金属性の電極が採用される。
【００５３】
Pethigらは、連動する（interdigitated）、「溝付きの」(castellated)微小電極デザインを用いて、周波数をスキャンする個々の細胞の正負誘電泳動により（positive and negative dielectrophoresis）細胞を分離する。例えば、生存可能な細胞が正の誘電泳動を経験する一方で、生存不能な細胞は負の誘電泳動を経験するところの一定範囲の周波数が見出される。異なる保有力は、正の誘電泳動下で細胞を強力に制限し、負の誘電泳動を経験している細胞を外部からの側方流体流により押し流すようにする。Gascoyneらは、誘電空中浮遊法（dielectropheretic levitation method）を考案した。その方法においては、進行波誘電泳動が、異なる種類の細胞の差別的な誘電泳動リフトが分離室において保持されているパラボリック特性を有する異なる流動速度を細胞に与えるフィ−ルドフローフラクショネーション過程において、電極表面に沿った外部に向かう層流と組み合わされている。流動に同調されて、細胞は、下流細胞計器（downstream cell counter）を通過する際に一つずつ検出される。
【００５４】
同時輸送及びアッセンブリ
本発明のＬＥＡＰＳ使用可能な分別方法は、動電学的流を集合過程における濃度分極と組み合わせて、流動媒介粒子移動を動重力への差別的反応と統合させ、粒子の長距離輸送（“捕集”）及びアレイ・アッセンブリ過程における分別をもたらす。誘電泳動分析に一般的に用いられる周波数範囲は、電場誘導動電学的流と関連する特徴的な緩和周波数を超え、そのことは、粒子捕集に利用できる短距離の誘電泳動力を許容する電極コンフィグレーションの設計に対して、深い因果関係を有する。電圧切り替え方法（例えば、進行波誘電泳動のように）は、粒子の連続輸送及び分別を可能にするが、複雑な電極のコンフィグレーション及びデザインが必要であるという不利な点がある。
【００５５】
光学的プログラム可能性
本発明の方法は、プログラム可能な照射パターンの作成によってもたらされる光誘導界面インピーダンス変調による分別過程のリアルタイム制御を提供している点で独特である。
Ｖ．粒子分析
本発明には、ＬＥＡＰＳに基づく粒子アレイ・アッセンブリの過程における粒子輸送の分析に基づいて、粒子を分析する方法も含まれる。これを受けて、粘性抵抗及び動重力を含む球状粒子の運動方程式は、次式で表される。
【数９】
0004422409.tif 000013
【００５６】
ここで、ｖb及びｖfはそれぞれ粒子速度及び流体媒質速度を表し、またＫ（ω）＝２πａ3εＭｋ、ｋは式（１）及び（２）との関係において定義される。動重力は、ｋ→０又はεS→εMのように消滅する。図２を参照すると、この条件は緩和に対応していることが分かる。すなわち、外部電場の周波数がωRに近づくと、完全分極状態はもはや達成されなくなる。一般的に、ｖmaxはこのようにして表面電位、イオン移動度、及び周波数に依存する。
【００５７】
この方程式は、以下のステップを取りこむことで、粒子捕集及びアレイ・アッセンブリ過程における粒子運動の分析に用いることができる。
【００５８】
１．所定のＥＩＳパターニング幾何学について、例えば、電極表面電位φS（ｘ，ｙ）＝φ（ｘ，ｙ，ｚ＝０）の式で規定され、ラプラス方程式を解いて電位および電場分布Ｅ（ｘ，ｙ，ｚ）＝−∇φ（ｘ，ｙ，ｚ）を得ると、関連するコンフィグレーションについて、分析モデルφS（ｘ，ｙ）＝φ（ｘ，ｙ，ｚ＝０）を用いることができる（実施例１）。
【００５９】
２．∇（Ｅ・Ｅ）を求める。
【００６０】
３．電極の滑り平面（slipping plane）におけるｖfmax＝−ｅ／ｕ∇φの動電学的流体速度を求め、この値は電極上部の流体場（フローフィールド）の評価の境界条件となり、さらに流体は、電極からの無限遠点（infinite distance）において静電気（static）になると仮定する。
【００６１】
４．式：Ｋ（ω）＝２πａ3εM（εS（ω）−εM）／（εS（ω）＋２εM）を用いてＫ（ω）を決定する。
【００６２】
５．粒子運動枠において、粒子速度ｄｘb／ｄｔ＝νb（ｔ）＋νf（ｔ）を決定し、最大（相対）粒子速度νmaxが急インピーダンス勾配近傍において達成され、粒子位置ｘb＝ｘb（ｔ）を決定する。
【００６３】
６．（ステップ４及び５で得られた関数を用いて）、位置関数としての粒子速度：ｄｘb／ｄｔ＝ｆ（ｘb）を決定する。
【００６４】
本発明のある実施例では、図５のフローチャートで詳述されているアルゴリズムを用い、インピーダンス勾配近くで得られる緩和周波数ωR及び周波数依存性最大粒子速度νmaxの実験的に得られた値を（図６参照。）、粒子表面（“ゼータ”）電位φS及び表面誘電率σに変換する。図３及び図７に示されるように、ωR及びνmaxはいずれも表面電位及びイオン移動度に依存しており、フローチャートに要約されている数値解析を用いて、一組のパラメーター（φS，ｕ）がωR＝ωRexp及びνR＝νRexpのように決定された。また、本発明には、小型化画像フォーマットの電気パラメーターと並んで、サイズ及び形状といった形態学的パラメーターを同時に特定できるような分子分析方法も含まれる。
【００６５】
この方法は、表面機能化に特に感度の良い品質管理技術の基礎を提供するものである。さらに、ビーズ表面に広がった適合分子への生体分子の結合を検出するための基礎も提供する。すなわち、ある分子が粒子又は細胞表面に結合した結果により生じた表面化学組成の変化を蛍光又は他の光学的標識を用いずに検出することができる。
【００６６】
以下に記載された実験内容により、本発明をより良く理解することができる。しかしながら、当業者は、論じられている特異的方法及び結果は、請求項に記載されているように、発明の実例に過ぎないことを直ちに理解するはずである。
［一般的な実験条件］
好ましい粒子アレイ・アッセンブリは流体ミクロセルにおいて実施され、かかるミクロセルは、例えばシリコンチップ（同一パターン化又はリソグラフィックパターン化された薄型ＳｉＯ2層によってキャップされた、ｎ−タイプ）のような、電気的にパターン化された、底面電極としても作用する１ｃｍ×１ｃｍの基質と、上面電極として作用する、１４００ Ｏｈｍ平方の典型的なシート抵抗のインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）でコーティングされたガラス蓋スリップの間に、厚さ〜１００μｍの両面カプトン（Kapton）スペーサーを挟むことにより形成されたものである。数百ヘルツから数キロヘルツの範囲の周波数における１−１０Ｖp-pＡＣ電圧は、流体間隙を交差して電極間に印加される。粒子輸送及びアッセンブリは、更なる分析のために、フレームキャプチャー及びフレームのデジタル化が可能なビデオ顕微鏡によりモニタリングされた。
【００６７】
水性懸濁
アッセンブリに先立ち、緩衝液に保存されていた粒子は洗浄され、脱イオン化され、限外濾過水で再懸濁された（伝導率＜５０Ｓｃｍ-1）。一部の例では、塩（≦１ｍＭ）を緩衝用に加えた。シリカ又は変性ポリスチレンからなり、様々な表面化学物質群により機能化された直径０．５μｍ〜１０μｍの陰イオン性及び陽イオン性粒子を、様々な製造者から入手したコア・シェル粒子（core shell particles）と共に使用した。これらの粒子は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片又はタンパク質を表わすように更に変性された。
【００６８】
非水性懸濁
このシステムの解説は以下の通りである。
【００６９】
ＤＭＳＯ（εDMSO＝４７．２４）：カルボン酸ＰＳ粒子４．４μｍ（Dyno社製、オスロ、ノルウェー）；フルオレセインで染色されたカルボン酸ＰＳ粒子２．１μｍ（Molecular Probes社製、ユージーン、オレゴン州）；いずれの例でも、貯蔵粒子は、最初に水／緩衝液で懸濁され、水を除くための数回連続の遠心分離及び再懸濁サイクルによってＤＭＳＯ内で再懸濁された。ガラスビーズ（直径３〜１０μｍ）（Polyscience社製、ペンシルバニア州）；乾燥粉末状で提供された貯蔵粒子はアッセンブリに先立ち、最適な溶媒の中で再懸濁された。アセトニトリル（εacetonitrile３６．６４）：非多孔性オキシランアクリレートビーズ１μｍ（Sigma社製、ミズーリ州）；ガラスビーズの場合と類似の手順である。
【実施例１】
【００７０】
粒子アレイ・アッセンブリ：半空間幾何学（Half-space Geometry）
図６は、直径２．８μｍのオリゴｄＴ（２５）粒子（Dynal社より入手、オスロ、ノルウェー）のアレイ・アッセンブリの過程で、κａ≒４５（下方パネルの挿入欄に示された条件も参照のこと）を用いて、ビデオ顕微鏡を作動させて測定されたビーズ速度を示している。図６上部の、１／３０倍の露光で撮影されたスナップショットのすじ（streaking）の分析により、１０００Å以下から１００Å以下の酸化物の厚さの変動によって作り出されたインピーダンスステップを交差する粒子が有意に加速することが明らかになった。画像検査（visual inspection）により、粒子が同時に基質に移動することも明らかになった。一連のスナップショットの画像分析によって抽出された瞬間速度は、図６の下方パネルにグラフ化されている。アッセンブリされた粒子のアレイは、基質の低インピーダンス領域と同様の動作を行う。かかるアレイは、アレイ周に直接向かう流入を生みだし、アレイに対して加速する付加的な粒子を引き付ける。
【００７１】
半空間幾何学のインピーダンスステップを仮定すると、運動方程式の数値解によって、図７に示されるように、ｕ／ｕ∽の割合及び所定の粒子サイズについての表面電位に対するνmaxの強い依存性が明らかになった。これは、予想された通りであった。すなわち、高表面電位は、大量の誘導双極子モーメント及びこれによる大きな動重力に対応し、一方で、イオン移動度への依存性は弱いのである。
【００７２】
運動方程式には、動重力、流体抵抗、及び流体基準の移動フレームが考慮されている。いかなるビーズの経路も、電圧、間隙サイズ、イオン強度、イオン移動度、酸化物の厚さなどの実験条件を仮定し、粒子サイズや表面電位のような適切なビーズ特性を仮定すればシミュレートすることができる。一般的に、実験データに合った数値的モデルを用いて、νmax決定の正確性を向上させることが望ましい。
【００７３】
運動方程式の典型的な解は、式φS＝Ａ ｔａｎｈ（κｘ）における表面電位プロファイリングにより半空間的幾何学を表すことにより、数値的に得られるものであり、図９に示されている。グラフの基点は、インピーダンスステップの位置を表す。ビーズの状態は、厚い酸化物領域にあるときは負であり、かかる領域では、あらゆる任意の地点においても、ビーズ速度が流体速度によって決定される。しかしながら、インピーダンスステップがデバイ長オーダーの距離内に近づくと、ビーズは前記の動重力を経験し、流体に関連するステップを加速して交差する。動重力の距離が短い（short range）（〜∇Ｅ2）と仮定すると、ステップ近距離内での加速は止まり、ビーズは流体抵抗を受けて周囲流体の速度まで減速する。ステップから更に遠い距離においては、側方流体運動が止まり、結果として、既存のビーズアレイ又はクラスターを取り囲む動重力がアレイ境界に向けて更に加速をしない限り、ビーズは停止する。
【実施例２】
【００７４】
緩和周波数ωRの粒子サイズ（粒度）及び組成に対する依存性
図１０は、多様な粒度及び異なるタイプの粒子表面化学的特性に対してアレイの拡大を誘導することにより、緩和周波数を決定した結果を示す。第一群に含まれる粒子としては、カルボン酸変性又はアミン変性のポリスチレン粒子（Dyno社より入手、オスロ、ノルウェー）、並びに「オリゴｄT（２５）」粒子（Dyno社より入手、オスロ、ノルウェー）が挙げられる。第二群では、粒子はインターロイキン−６に対するモノクローナル抗体（R&D Systems社より入手、ミネアポリス、ミネソタ）でコーティングされていた。本明細書記載の通り、緩和周波数ωR1/2〜ａ（粒度）の予測された「スケーリング則」（scaling behavior）は、実験によって確認された。
【００７５】
実線は、本明細書記載の単純式にデータが適合していることを表し、本明細書記載の通り、局所的なイオン媒介の表面コンダクタンスを反映する拡散率パラメーターＤを生み出す。式４を用いると、図１０のデータは、所定のａ及びκについて、タンパク質又は他の巨大分子のビーズ表面への結合がここで導入された表面伝導率σ〜ｅ2ｎ／ｆを減少させることを示唆すると理解される。
【実施例３】
【００７６】
粒子分析
図６及び図１０において例証された実験から、ステップを厚い酸化物から薄い酸化物へ横切るビーズの最大速度νmax≒０．８ｍｍ／ｓ及び緩和周波数ωR≒２ｋＨｚの値が決定された。図３、５及び７の基礎となる論理的モデル及びアルゴリズムは、対応する値φS≒０．５Ｖ及びｕ／ｕ∽≒３．９×１０-3をもたらし、この組み合せは、次にσ≒０．１５Ｓ／ｍ及びＤｕ≒２９０の値をもたらした。ここで、Ｎａ+に対して集計されたモル伝導率から、ｕ∽≒０．０２Ｓ／ｍ2が決定された。φSの値は、１ ＣＯＯ-／４Å2又は４００μＣ／ｃｍ2のカルボン酸変性ポリスチレン粒子の滴定電荷に対応する〜３３０ｍＶの表面電位と比較される。得られる結果から、オリゴヌクレオチド変性粒子の有効表面電荷が、カルボン酸変性粒子の表面電荷を実質的に超過することが示唆される。ωRの値は、実験に関連する小さい陽イオンの表面移動度が、バルクの移動度より≧１００の係数分小さいことを示唆している。しかしながら、表面伝導率は、バルクの伝導率を２オーダー分上回っており、高い表面電位値を反映している。
【実施例４】
【００７７】
ωRの粒度依存性を用いた粒子混合物の分別
図１１は、明るい陰影で示されたストライプ内の〜１０００Åから〜１００Åの酸化物の厚さの変動によって作り出された低い界面インピーダンスの領域の表面設計を用いて、より小さい粒子（直径２．１μｍ、特徴的周波数ωRS）及びより大きな粒子（直径４．５μｍ、特徴的周波数ωRL）の二元混合物の分別を図示している。印加電圧の周波数ωが、ωRL＜ω＜ωRSのように調整されると、小さい粒子のみが低インピーダンス領域に向かって加速され、アレイにアッセンブルしていく。ストライプを狭めたり、広げたりすることにより、ストライプに沿った流動も作成され、そのように実現した横流における二次元分別の基礎となる。
【実施例５】
【００７８】
ωRの組成依存性を用いた粒子混合物の分別
図１２は、粒度は同一であるが表面化学組成が異なる赤と青の粒子の二元混合物の分別を図示している。緑色の染料でタグ付けされたカルボン酸変性粒子の緩和周波数ωRbareは、赤の染料で標識されたタンパク質の結合によって、特徴的緩和周波数ωRmodまで低下する。ωRmod＜ω＜ωRbareの条件下で、非変性粒子のみが低インピーダンスのストライプ領域に入り、その一方で変性されたタンパク質コーティング粒子は、特徴の（feature）高インピーダンス側に並ぶ。特徴的周波数移行の規模は結合タンパク質の量により特定される。
【実施例６】
【００７９】
ビーズ又は細胞に結合するタンパク質のタグを用いない検出
表面化学特性に変化をもたらす既知の粒子表面における分子結合現象（すなわち、粒子の誘電特性の変化を上回る、粒子プラス結合分子の誘電特性の変化）は、結合効果が粒子の緩和周波数における変化に反映されるという事実を活用することにより容易に検出することができる。例えば、図１０は、その表面にカルボキシレート又は抗体のキャプチャー層を有するカルボキシレートを備えた粒子の緩和周波数の変化を実験的に評価した結果を図示している。抗体の粒子表面への結合は、非変性粒子の特徴的緩和周波数ωRbareと関連する変性粒子の特徴的緩和周波数ωRmodを低下させた。同様に、ストレプトアビジン機能化粒子表面におけるビオチン化オリゴヌクレオチドプローブ（biotinylated oligonucleotide probes）の結合が検出される。オリゴヌクレオチド断片の結合は、オリゴ非結合粒子の特徴的周波数ωRbareと関連する結合粒子の特徴的周波数ωRmodを上昇させた。
【実施例７】
【００８０】
ヒト骨髄性細胞(human myeloid cells)の周波数依存性捕集及びアッセンブリ
図１３は、パターン化されたシリコン基質の指定領域における、ヒト骨髄性細胞ＨＬ−６０（ＣＣＬ−２４０、ＡＴＣＣから入手し、実験用に、８．５％ショ糖／０．３％ブドウ糖にて保存）の捕集及び濃縮を図示している。明るさの違いによって示されたインピーダンスの「ステップ」で区切られた１００〜２００μｍの典型的な範囲の薄い酸化物（≦１００Å）のストライプを特徴とするパターン化された酸化表面のシリコンチップを用いて、図の２枚のパネルに表されている値に設定された周波数で、最大振幅５Ｖの電圧を印加すると、指定されたストライプに隣接し又はストライプ内において、印加電圧の周波数選択を反映した集合体が形成される。
【実施例８】
【００８１】
細菌細胞のアッセンブリ及び選択的付着による分別
図１４は、パターン化基質（ここではシリコンチップ）の異なる領域において、それぞれグラム陰性及びグラム陽性細菌のモデルシステムとして作用する、大腸菌及び表皮ブドウ球菌細菌細胞の捕集及び濃縮を図示している。すなわち、１００〜２００μｍの典型的な範囲の薄い酸化物（≦１００Å）のストライプを特徴付けるパターン化された酸化表面のチップを用いて、最大振幅５Ｖの電圧を１００μｍの流体間隙を横切って印加し、周波数を２ｋＨｚに設定すると、明るさの違いによって示されるインピーダンスの「ステップ」近辺における表皮ブドウ球菌の好ましい付着、及びストライプ中央における大腸菌の好ましい付着を反映する位置に細胞の「バンド」ができる。従ってバンドの位置は細菌の型に特有である。
【実施例９】
【００８２】
付着強度
表面に沿った細胞の回転は、多種の炎症性反応における最初のステップである。本発明では、対象細胞又はレセプター機能化電極表面に配置されたリガンド機能化微粒子間の付着強度を実験的に決定することができる。例えば、パターン化電極表面を記載の通りと仮定すると、ＨＬ−６０細胞のアッセンブリを調べるために低インピーダンス領域はＥ-セレクション（E-Selection）でコートされ得る（実施例７参照。）。ＬＥＡＰＳ媒介の流動作用のもとでは、細胞は、電極表面の低インピーダンス領域へ向けて輸送される一方で、回転と固着が見られ、後者は細胞と表面との間の陽性付着相互作用の存在を示している。接線方向の流体流動にさらされたレセプター機能化表面における、細胞又は配位子機能化微粒子の回転を用いるインビトロアッセイは、細胞又は微粒子と表面との付着強度を予測すると論じられてきた［Brunk, D. K. and Hammer, D. A., Biophysical Journal, 72, 1997, 2820-2833、 Hammer, D. A., and Apte, S. M, Biophysical Journal, 63, 1992, 35-57、Spring, T., Cell, 76, 301, 1994］。圧力駆動流動（pressure driven flow）存在下におけるＥ-セレクションコーティングガラス基板のＨＬ−６０細胞の回転又は固着の分析は、抗炎症剤のスクリーニングのために用いられてきた［Mossavi et al., Proceedings of Micro TAS '98 Workshop, D. J. Harrison and A. van den Berg (Eds.), 69-72, 1998］。本発明はＬＥＡＰＳによる流動制御の優れた型を提供する。例えば、対象細胞又は微粒子があらかじめ指定された領域に配置されているレセプター機能化電極は、方向及び強度が既に制御されたＬＥＡＰＳ媒介の流体流動にさらされる（図４）。このことにより、吸着細胞又は吸着粒子で作用する流動が生み出すせん断応力の強度と、流体動力学的剥離効率の相関性の評価が可能となり、続いて、細胞又は粒子とかかる表面との間で働く付着力の評価が可能となる。
【実施例１０】
【００８３】
多元分別
多元分別では、粒子の混合物が、２又はそれ以上のステージで、複数の識別パラメーターと一致するように亜集団に分離する。ここで、場−誘導分極の周波数分散に加えて、差別的選択付着等の他の特性を用いることもできる。例えば、ＨＬ−６０、大腸菌及び表皮ブドウ球菌の混合物は、１００〜２００μｍの典型的な範囲の薄い酸化物（≦１００Å）のストライプを特徴付けるパターン化チップを用いて分別することができる。最大振幅５Ｖの電圧を１００μｍの流体間隙に印加し、周波数を２ｋＨｚに設定すると、インピーダンスの「ステップ」近辺における表皮ブドウ球菌の望ましい付着及びストライプ中央における大腸菌の望ましい付着を反映する配置の細胞の「バンド」ができる。この条件下で、ＨＬ−６０細胞は、厚薄酸化物の境界において、厚い酸化物領域へ広がる直線鎖を形成する（実施例７参照。）。
【実施例１１】
【００８４】
多成分性混合物の連続的な光直接（light-directed）分別
図１５で示されるように、各粒子群が特有の緩和周波数（ωRi）を表わす多成分性粒子混合物は、パターン化電極及び照射の組み合せを用いて分別することができる。緩和周波数（ωRi）をωlow＜ωRi＜ωhighの範囲と仮定すると、印加ＡＣ電場の周波数は、範囲の上限（ωhigh）から下限（ωlow）へ向かってスキャンされる。粒子は、高い緩和周波数を持ったものから順に、厚い酸化物／低インピーダンス捕集領域へ押し流される。ひとたび中へ入ると、各粒子群は、光によって、狭い溝を経由して最初の捕集ゾーンにつながっている別個の薄い酸化物パッドへ導かれる。この特殊パターニングがビーズを個別のパッドに閉じ込める。
【実施例１２】
【００８５】
工学的粒子分極率を用いた粒子アレイのコード化
望ましい分極率及び対応する緩和周波数の粒子を作るための誘電性「タグ付け」を用いることにより、ＬＥＡＰＳに応答する粒子の特異的依存性を生み出す。誘電性タグ付けは、標識を粒子外部又は内部へ導入することにより達成される。例えば、粒子の金属化は、その分極率を変化させる。このアプローチは、分極率が光依存性の粒子工学へ拡大することができる。例えば、ＴｉＯ2ナノ粒子のような感光性のタグを用いると、光で照射された時、ＴｉＯ2タグ化粒子の分極は単独で増加した［Y. Komoda, Tata N. Rao, and A. Fujishima, Photoelectrorheology of TiO2 nanoparticle suspensions. Langmuir, 1997, 13, 1371-1373］。
【００８６】
本発明は、実例及び好ましい実施例の参照を伴って上記に記載されているが、その概念と必要不可欠な特徴から逸脱することなく、他の形態で具体化され又は他の方法で実施されると理解されるものである。従って、上記の記述は、あらゆる面において実例とはなるが、制限するものではなく、同等の意味と範囲内での変更は全ての容認されるものとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】球状粒子周辺における分極性二重層の時変性電場に対する反応を示す図である。パネル（ａ）〜（ｅ）は、単一サイクルに起こる分極の進行を示している。陰影部分は、拡散層の優位性イオン(predominant type of ion)の分布を示している。
【図２】周波数を有する粒子の分極因子の変化を示す図であり、本明細書記載の理論上のモデルに基づいて数値的に評価され、表示された粒子表面電位、粒子の直径２．８μｍ、イオン強度０．１ｍＭの溶液と仮定したものである。
【図３】（Ａ）は、表面電位における緩和周波数の依存性を示す図であり、本明細書記載の理論上のモデルに基づいて、イオン強度０．１ｍＭの溶液に懸濁された２．８μｍの粒子が数値的に評価されている。数値は、バルクイオン移動度に対する二重層における対イオン移動度の割合を示している。（Ｂ）は、１０００Ｈｚの特異的な緩和周波数に対する表面電位及び移動度の関係を示すグラフである。
【図４】ＬＥＡＰＳと互換性があるサンドウィッチ幾何学に特有の流体場（flow field）を示す図である。
【図５】アレイ・アッセンブリ中の粒子速度及び粒子緩和周波数の実験的に得られた値から、粒子表面電位及び表面伝導力を同時に決定する分析的手法をまとめたフローチャートである。また計算を行うために作成されたコンピュータプログラム(「コード」)も示されている。
【図６】粒子輸送、及びｘ＝０で定義された位置に対する各粒子の相対的位置を示す図である。かかる粒子輸送の結果はアレイ・アッセンブリであり、各粒子の具体的な位置はアッセンブリ過程の段階を表す。粒子は、シリコン／シリコン基質の薄い酸化物領域にアッセンブルし、薄い酸化物と厚い酸化物との間の境界が、位置ｘ＝０である。
【図７】表面電位の機能としての界面における粒子速度を示す図であり、本明細書記載の理論上のモデルに基づき数値的に評価されている。数値は、バルクイオン移動度に対する対イオン移動度の割合を示している。（Ｂ）は０．８ｍｍ／ｓの特異的ビーズ速度における表面電位及び移動度の関係を示すグラフである。
【図８】高いインピーダンスの一つに隣接するより低いインピーダンスの半面を特徴とする基質表面を用いて、２種類の異なる緩和周波数（ωR1 and ωR2，ωR1＞ωR2）を有する粒子の当初ランダムな二元混合物から周波数ω（ωR1＜ω＜ωR2）を選択することによって粒子を分別する過程を示す図である。
【図９】「０」の位置にあり、高電極及び低電極インピーダンス領域を分離する境界を加速して横切る時の粒子速度を示す図である。
【図１０】３つの異なる種類の粒子について、実験的に得られる粒子緩和周波数の粒子直径に対する依存性を示す図である。実験の詳細は、グラフ中の挿入欄に示されている。３つの異なる塩濃度についての結果は、二つのイオン拡散係数で示されている。この結果から、緩和周波数は塩濃度の変化によっては有意な影響を受けないことが明らかになった。
【図１１】高いインピ−ダンス領域（暗い部分）に囲まれた、より低いインピーダンスの空間（strip）（明るい部分）を特徴とする基質表面を用いて、粒子サイズに基づき、より大きい粒子及びより小さい粒子からなる当初ランダムな粒子混合物の分別過程を示す図である。
【図１２】同一粒度の粒子からなる当初ランダムな粒子混合物の分別過程における二つの連続する段階を示す図であり、タンパク質ストレプトアビジン（赤で示される）又はビオチンの機能によりストレプトアビジンコートされた粒子に付着した短オリゴヌクレオチドの層を示す（青緑色で示される）。
【図１３】パターン化されたシリコンチップ上の特徴的なコンフィグレーションにおけるヒト骨髄性細胞ＨＬ−６０（〜直径１５μｍ）の捕集及びアッセンブリを示す図である。
【図１４】パターン化されたシリコンチップ上の特徴的なバンドにおける、大腸菌及びブドウ球菌細菌性細胞（〜直径１μｍ）の捕集及びアッセンブリを示す図である。
【図１５】パターン化された電極及び照射パターンの連続を用いた多成分性粒子混合物（各粒子タイプは独特の緩和周波数（ωR1）を有する）の連続分別を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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