(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原または抗原製剤、水中油型エマルションおよびサポニンを含むワクチン組成物であって、前記油が代謝可能油であって、代謝可能油：サポニン(w/w）の比が 1:1〜200:1 の範囲であることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
代謝可能油：サポニン(w/w）の比が 1:1〜100:1 の範囲であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記サポニンがクイルＡに由来する請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記クイルＡに由来するサポニンが、QS21である請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記代謝可能油がスクアレンである請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
ステロールをさらに包含する請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ステロールがコレステロールである請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
１又は複数のその他の免疫調節剤をさらに含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記免疫調節剤が3D-MPL及びα−トコフェロールから成る群から選択される請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
さらに3D-MPLを含んで成りQS21:3D-MPL の比(w/w) が1:10〜10:1である請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
QS21:3D-MPL の比(w/w) が 1:1〜1:2.5 である請求項10に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
さらにコレステロールを含んで成り、前記サポニンがQS21であり、QS21：コレステロールの比(w/w) が 1:1〜1:20である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記抗原または抗原製剤が、ヒト免疫不全ウイルス、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ、Ｂ、ＣもしくはＥ型肝炎、ＲＳウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、サルモネラ、ナイセリア、ボレリア、クラミジア、ボルデテラ、ＴＢ、EBV 、プラスモジウムおよびトキソプラズマから成る群から調製される請求項１〜12のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記抗原または抗原製剤が、マラリア抗原RTS, SおよびTRAPの組合せである請求項１〜12のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記抗原または抗原製剤が、腫瘍または宿主由来抗原であるか、あるいはそれらから得られる請求項１〜12のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
水中油型エマルションが１μ未満の直径を有する油小滴を含んで成る請求項１〜15のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記水中油型エマルションが直径 120〜750nm の範囲である油小滴を含んで成る請求項１〜16のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記水中油型エマルションが直径 120〜600nm の範囲である油小滴を含んで成る請求項１〜17のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
抗原または抗原組成物に対して哺乳類における細胞溶解性Ｔ細胞応答を引き起こし得る請求項１〜18のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
抗原または抗原組成物に対して哺乳類におけるインターフェロン−γ産生を刺激し得る請求項１〜18のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
医薬品中に使用するための請求項１〜20のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
請求項１〜21のいずれか１項に記載のワクチン組成物の製造方法において、抗原または抗原製剤、水中油型エマルションおよびサポニンを混合することを含んで成る方法。
【請求項２３】
水中油型エマルション、QS21、コレステロール、3D-MPL、α−トコフェロール、および抗原または抗原製剤を混合することを含んで成る請求項１〜21のいずれか１項に記載のワクチン組成物の製造方法。
【請求項２４】
疾病に罹り易いまたは罹患中の個体の治療のために適当なワクチンの製造のための、請求項１〜12のいずれか１項に記載されたようなワクチン組成物の使用。
【請求項２５】
前記水中油型エマルションの油相中へのステロールの付加を包含する請求項１〜21のいずれか１項に記載のワクチン組成物中に存在するサポニンの安定化方法。
【請求項２６】
前記サポニンがQS21である請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステロールがコレステロールである請求項25または26記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、水中油型エマルションワクチン組成物に関する。特に本発明は、代謝可能油およびサポニンを包含する水中油型エマルションを基礎にしたワクチンアジュバントに関する。本発明は、エマルションの製造方法および医薬品中のその使用にも関する。
【０００２】
細胞傷害性Ｔ細胞(CTL）応答の誘導は、標的細胞の感染、または腫瘍抗原の非制御化合成中に自然に起こるが、この場合、標的抗原の酵素的分解は、細胞の細胞質中で起こる。この現象は、病原体または腫瘍特異的抗原に由来する細胞質ペプチドをTh1 （内因性抗原プロセッシング）経路に入らせ、そしてMHC クラスＩ分子に関連した細胞の表面に存在させる。ワクチン抗原が宿主細胞の細胞質中に入らない場合には、それは細胞に取り込まれ、外因性抗原プロセッシング経路に入り、最後にMHC クラスII分子に関連した細胞の表面に存在し得る。この代替路は、一般に、Ｔヘルパー応答および抗原特異的抗体応答をもたらす。
【０００３】
サブユニットまたは非生ワクチンによる従来のワクチン接種後、抗原は一般的に宿主細胞の細胞質に入らず、したがって内因性抗原プロセッシング経路に入らず、最終的にはCTL 応答を誘導しない。CTL 誘導は、Th-1サイトカインプロフィール応答と、特にIFN-γおよびIL-2分泌と相関すると考えられる。IFN-γ分泌は、細胞内病原体、例えば寄生体、細菌およびウイルスに対する防御的応答と関連がある。
【０００４】
IFN-γによる白血球の活性化は細胞内病原体の殺害を増強し、Ｆｃ受容体の発現を増大する。直接細胞傷害性は、特にリンホトキシン（TH1 細胞のもう一つの生成物質）と共働しても起こり得る。IFN-γは、防御の主要な生得的エフェクターであるＮＫ細胞のインデューサーでありそして生成物でもある。IFN-γまたはその他のメカニズムによるTH1 型応答は、ネズミIgG2a およびヒトIgGIイムノグロブリンイソタイプに対する選択的援助を提供する。
【０００５】
国際特許出願WO95/17210は、スクアレン、α−トコフェロールおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80）を基礎にし、免疫刺激剤QS21を、任意に3D-MPLを処方したアジュバントエマルション系を開示する。このアジュバント処方物は、広範囲の免疫応答の非常に強力なインデューサーである。
南米の樹木であるキラヤサポナリアモリナQuillaja Saponaria Molina の樹皮から得られるアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン分画（例えばクイルＡ）が当業界では知られている。
【０００６】
クイルＡの誘導体、例えばQS21（クイルＡのHPLC精製分画誘導体）およびその製造方法は、米国特許第5,057,540 号に開示されている。QS21（QA21として知られている）の中で、その他の分画、例えばQA17も開示されている。単離におけるこのようなサポニンの使用は、局所的壊死、即ち局在性組織死が障害部位で起こり、それにより疼痛をもたらす、という欠点を伴う。
【０００７】
南米の樹木であるキラヤサポナリアモリナQuillaja Saponaria Molina の樹皮から得られるアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン分画が当業界では知られている。例えば、キラヤサポナリアモリナ木から得られるHPLC精製分画であるQS21およびその製造方法（QA21として既知）は、米国特許第5,057,540 号に開示されている。このようなサポニンの使用は、局所的壊死、即ち局在性組織死が障害部位で起こり、これが疼痛をもたらす、という欠点を伴う。
【０００８】
3De-O-アシル化モノホスホリル脂質Ａ（3D-MPL）は、Ribi Immunochem, Montanaにより製造された周知のアジュバントである。化学的には、それはしばしば、3De-O-アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５または６つのアシル化鎖との混合物として供給される。それは、GB2122204Bにより教示された方法により製造され得る。3De-O-アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態は、直径 0.2μ未満の小粒子サイズを有するエマルションの形態であり、その製造方法は欧州特許EP 0 671 948 B1 に開示されている。
【０００９】
ヒトへの投与に適した任意の水中油型組成物のためには、エマルション系の油相は代謝可能油を包含しなければならない。代謝可能油という用語の意味は、当業界では周知である。代謝可能とは、「代謝により転換され得る」と定義される(Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B.Sanders Company, 25th edition（1974））。油は、受容者に対して有毒でなく、代謝により転換され得る任意の植物油、魚油、動物油または合成油であり得る。木の実、種子および穀物は植物油の一般的供給源である。
【００１０】
合成油も本発明の一部であって、市販油、例えばNEOBEE（登録商標）およびその他も含み得る。スクアレン（２，６，10，15，19，23−ヘキサメチル−２，６，10，14，18，22−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝油中に大量に、そしてオリーブ油、コムギ胚芽油、米糠油および酵母菌中に少量見出される不飽和油であり、そして本発明で用いるために特に好ましい油である。スクアレンは、それがコレステロールの生合成の中間体である（Meuk index, 10th Edition, entry no. 8619）という事実に基づいて、代謝可能油である。
【００１１】
水中油型エマルションは、それ自体、当業界で知られており、アジュバント組成物として有用であることが示唆されてきた（EPO 399843）。
国際特許出願WO95/17210に記載されている水中油型エマルション中に処方された抗原の投与に対する免疫学的応答は、Th2 およびTh1 応答の両方が観察されることを特徴とし得る。多くの場合、Th1 型応答は疾病の予防および治療に重要であると確認されており、したがって、さらなるTh1 寄りのアジュバントが開発されるのが望ましい。これは、非常に意外なことに、余分の免疫刺激剤の付加によるのでなく、本来の構成成分の１つの低減により成し遂げられた。
【００１２】
国際特許出願WO95/17210に記載されている水中油型アジュバントエマルションは、240:1 又は1250:1という高比率のスクアレン：サポニン(w/w) を有する。本発明の実施態様は、 1:1〜200:1 の範囲のスクアレン：QS21比を有し、20:1〜200:1 の範囲も好ましいが、好ましくは20:1〜100:1 、最も好ましくは実質的に48:1である。構成成分の１つのこの低減は、その結果生じる免疫応答を定性的に改良するという意外な効果を有する。この新規のアジュバント処方物を用いると、強力なTh-2型応答が保持されるが、さらにその上にこのような処方物は、IFN-γ、Ｔ細胞増殖およびCTL 応答を特徴とするTh-1型応答に特に関連した免疫応答増強を発揮する。
【００１３】
本発明の好ましい一実施態様は、クイルＡまたはその誘導体、例えばQS21を包含するアジュバントまたは製剤処方物、および水中油型エマルションであるが、この場合、水中油型エマルションは代謝可能油、例えばスクアレン、およびポリソルベート（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、トゥイーン80TMを含む）を包含し、前記のエマルションは、油：QS21比が20:1〜200:1 (w/w) であることを特徴とする。別の好ましい実施態様では、アジュバント処方物はさらに、その他の免疫調節剤、例えばα−トコフェロールおよび3D-MPLを包含する。
【００１４】
抗原または抗原製剤と一旦併合されたこのような処方物は、広範囲の一価または多価ワクチンとして適している。さらに、水中油型エマルションは、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（SPAN85）を含有し得る。3De-O-アシル化モノホスホリル脂質Ａは、国際特許出願92116556（SmithKline Beecham Biological s.a.）に開示されている。
【００１５】
好ましくは、本発明のワクチン処方物は、抗原またはヒト病原体に対する免疫応答を発揮し得る抗原組成物を含有し、この場合、抗原または抗原組成物はHIV-1 （例えばtat 、nef 、gp120 またはgp160)、ヒトヘルペスウイルス、例えばｇＤまたはその誘導体、あるいは極初期タンパク質、例えばHSV1またはHSV2からのICP27 、サイトメガロウイルス（特にヒト）（例えばｇＢまたはその誘導体）、ロタウイルス（例えば生弱毒化ウイルス）、エプスタイン・バーウイルス（例えば、gp350 またはその誘導体）、水痘−帯状疱疹ウイルス（例えばgpI およびIE63）から、
【００１６】
あるいは肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎表面抗原またはその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスから、あるいはその他のウイルス性病原体、例えばパラミクソウイルス；ＲＳウイルス（例えばＦおよびＧタンパク質またはその誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えばHPV6、11、16、18、．．．）、フラビウイルス（例えば黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス、
【００１７】
あるいは細菌性病原体、例えばナイセリア種Neisseria spp.例えばN. gonorrheaおよびN. meningitidis （例えば、莢膜多糖およびその複合体、PsaA、PspA、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質）、S. pyogenes （例えば、Ｍタンパク質またはその断片、C5A プロテアーゼ、リポテイコ酸）、S. agalactiae 、S. mutans ；H. aemophilus spp 、例えばＢ型H. influenzae （例えばPRP 及びその複合体）、分類不可能なH. influenzae （例えばOMP26 、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、リポタンパク質Ｄ）、H. ducreyi；
【００１８】
モラクセラの種（Moraxella spp ）、例えばブランハメラ亜属のブランハメラ・カタラリス（Branhamella catarrhalis ）としても知られているＭ．カタラリス（M. catarrhalis）（例えば高および低分子量アドヘシンおよびインバシン）、；ボルデテラ種（Bordetella spp）、例えばボルデテラ・ペルツシス（B. pertussis）（例えばペルタクチン、百日咳毒素またはその誘導体、糸状赤血球凝集素、アデニレートシクラーゼ、フィンブリエ）、ボルデテラ・パラペルツシス（B. parapertussis）およびボルデテラ・ブロンキセプチカ（B. bronchiseptica ）；
【００１９】
ミコバクテリウムの種（Mycobacterium spp ）、例えばミコバクテリウム・ツベルクロシス（M. tuberculosis ）（例えば、ESAT6 、抗原85A 、-Bまたは-C）、ミコバクテリウム・ボビス（M. bovis）、ミコバクテリウム・レプラ（M.leprae）、ミコバクテリウム・アビラム（M. avium）、ミコバクテリウム・パラツベルクロシス（M. paratuberculosis ）、ミコバクテリウム・スメグマチス（M. smegmatis）；レジオネラの種（Legionella spp）、例えばレジオネラ・ニウモフィラ（L. pneumophila）;
【００２０】
エシェリキアの種（Escherchia spp）、例えば腸毒素大腸菌（例えばコロニー形成因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸出血性大腸菌、腸病原性大腸菌（例えばベロ毒素様毒素またはその誘導体）；
ビブリオの種（Vibrio spp）、例えばビブリオ・コレラ（V. cholera）（例えばコレラ毒素またはその誘導体）；シゲラの種（Shigella spp）、例えばシゲラ・ソンネイ（S. sonnei ）、シゲラ・ダイセンテリア（S. dysenteriae）、シゲラ・フレキシネリ（S.flexnerii ）；
エルジニアの種（Yersinia spp）、例えばエルジニア・エンテロコリチカ（Y. enterocolitica ）（例えばYop タンパク質）、エルジニア・ペスティス（Y. pestis ）、エルジニア・シュードツベルクロシス（Y. pseudotuberculosis ）；
【００２１】
カンピロバクターの種（Campylobacter spp ）、例えばカンピロバクター・ジエジュニ（C. jejuni ）（例えば毒素、アドヘシンおよびインバシン）およびカンピロバクター・コリ（C.coli）；サルモネラの種（Salmonella spp）、例えばサルモネラ・ティフィー（S.typhi ）、サルモネラ・パラチフィー（S. paratyphi）、サルモネラ・コレラエスイス（S. choleraesuis ）、サルモネラ・エンテリチデス（S. enteritidis）；
リステリアの種（Listeria spp）、例えばリステリア・モノシトゲネス（L. monocytogenes）；ヘリコバクターの種（Helicobacter spp）、例えばヘリコバクター・ピロリ（H. pylori ）（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；
シュードモナスの種（Pseudomonas spp ）、例えばシュードモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa ）；
【００２２】
スタフィロコッカスの種（Staphylococcus spp）、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（S. epidermidis）；
エンテロコッカスの種（Enterococcus spp）、例えばエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis ）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）；
クロストリジウムの種（Clostridium spp ）、例えばクロストリジウム・テタニ（C. tetani ）（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、クロストリジウム・ボツリヌム（C. botulinum）（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）；
コリネバクテリウムの種（Corynebacterium spp ）、例えばコリネバクテリウム・ジフテリア（C. diphtheriae）（例えばジフテリア毒素またはその誘導体）；
【００２３】
ボレリアの種（Borrelia spp）、例えばボレリア・ブルガドルフェリ（B. burgdorferi）（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、ボレリア・ガリニ（B. garinii）（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、ボレリア・アフゼリ（B. afzelii）（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、ボレリア・アンデルソニ（B.andersonii）（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、ボレリア・ヘルミシー（B. hermsii）；
エールリヒアの種（Ehrlichia spp ）、例えばエールリヒア・エクイ（E. equi ）およびヒト顆粒球性エールリヒア症；
リケッチアの種（Rickettsia spp）、例えばリケッチア・リケッシー（R. rickettsii ）；
【００２４】
クラミジアの種（Chlamydia spp ）、例えばクラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、クラミジア・ニューモニア（C. pneumoniae ）（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、クラミジア・プシタシ（C. psittaci ）；
レプトスピラの種（Leptospira spp）、例えばレプトスピラ・インテロガンス（L. interrogans）；
トレポネマの種（Treponema spp ）、例えばトレポネマ・パリダム（T.pallidum）（例えば稀外膜タンパク質）、トレポネマ・デンチコラ（T. denticola）、トレポネマ・ヒオディセンテリア（T. hyodysenteriae ）から；
【００２５】
または寄生体、例えばプラスモジウムの種（Plasmodium spp）、例えばプラスモジウム・ファルシパルム（P. falciparum ）；
トキソプラズマの種（Toxoplasma spp）、例えばトキソプラズマ・ゴンディー（T. gondii ）（例えばSAG2、SAG3、Tg34）；
エントアメーバの種（Entamoeba spp ）、例えばエントアメーバ・ヒストリチカ（E. histolytica）；
バベシアの種（Babesia spp ）、例えばバベシア・ミクロチ（B. microti）；
トリパノソーマの種（Trypanosoma spp ）、例えばトリパノソーマ・クルジ（T.cruzi ）；
ジアルジアの種（Giardia spp ）、例えばジアルジア・ランブリア（G. lamblia）；
【００２６】
レシュマニアの種（Leshmania spp ）、例えばレシュマニア・マジョー（L. major）；ニューモシスティスの種（Pneumocystis spp）、例えばニューモシスティス・カリニ（P. carinii）；
トリコモナスの種（Trichomonas spp ）、例えばトリコモナス・バギナリス（T. vaginalis）；
シストマの種（Schistosoma spp ）、例えばシストマ・マンソニ（S. Mansoni）から、
あるいは酵母菌、例えばカンジダの種（Candida spp ）、例えばカンジダ・アルビカンス（C. albicans ）；
クリプトコッカスの種（Cryptococcus spp）、例えばクリプトコッカス・ネオホルマンス（C. neoformans ）から得られる。
【００２７】
Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体波頭業界で周知であり、その例としては、とりわけ、例えば欧州特許出願EP-A-414 374、EP-A-0304 578 およびEP-198-474に記載されているPreS1 、PreS2 Ｓ抗原が挙げられる。好ましい一局面では、本発明のワクチン処方物は、特にCHO 細胞中で発現される場合には、HIV-1 抗原gp120 を包含する。さらなる実施態様では、本発明のワクチン処方物は、前記のようなgD2tを包含する。
【００２８】
本発明の好ましい一実施態様では、特許請求されたアジュバントを含有するワクチンは、性器疣に関与すると考えられるHPV ウイルス（HPV6またはHPV11 等）、および頸部癌に関与するHPV ウイルス（HPV16 、HPV18 等）を包含する。特に好ましい形態のワクチンは、L1粒子またはカプソマー、ならびにHPV6およびHPV11 タンパク質E6、E7、L1およびL2から選択される１つ又はそれ以上の抗原を含む融合タンパク質を包含する。最も好ましい形態の融合タンパク質は、GB95 15478.7に開示されているようなL2E7、およびGB9717953.5 に開示されているようなタンパク質D(1/3)-E7 である。
【００２９】
本発明のワクチンは、マラリアを引き起こす寄生虫から得られる抗原も包含する。例えば、熱帯熱マラリア原虫プラスモディア・ファルシパルム（Plasmodia falciparum）からの好ましい抗原としては、RTS ，S およびTRAPが挙げられる。RTS は、Ｂ型肝炎表面抗原のプレＳ２部分の４つのアミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に結合されるP. falciparum のサーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の実質的にすべてのＣ末端部分を包含するハイブリッドタンパク質である。その全構造は、国際特許出願PCT/EP92/02591（英国特許出願第9124390.7 号からの優先権を請求するWO93/10152下で公開された）に開示されている。
【００３０】
酵母菌中で発現される場合、RTS はリポタンパク質粒子として産生され、それがHBV からのＳ抗原と同時発現される場合には、それはRTS 、S として既知の混合粒子を産生する。TRAP抗原は、国際特許出願PCT/GB89/00895（WO90/01496下で公開）に記載されている。本発明の好ましい実施態様は、抗原製剤がRTS 、S およびTRAP抗原の組合せを包含するマラリアワクチンである。多段階マラリアワクチンの構成成分であると思われるその他のマラリア原虫抗原は、熱帯熱マラリア原虫P. faciparum  MSP1、AMA1、MSP3、EBA 、GLURP 、RAP1、RAP2、セクエストリン、PfEMP1、Pf332 、LSA1、LSA3、STARP 、SALSA 、PfEXP1、Pfs25 、Pfs28 、PFS27/25、Pfs16 、Pfs48/45、Pfs230およびマラリア原虫種におけるそれらの類似体である。
【００３１】
処方物は抗腫瘍抗原も含有し、免疫療法的治療癌に有用であり得る。例えば、アジュバント処方物は、例えば前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌または黒色腫に関する腫瘍拒絶抗原とともに効用を見出す。抗原の例としては、黒色腫の治療のためのMAGE1 およびMAGE3 またはその他のMAGE抗原、PRAME 、BAGEまたはGAGEが挙げられる（Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps628-636; Van den Eynde et al.（1997）, Journal of the National Cancer Institute 89, p293 ）。
【００３２】
実際、これらの抗原は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌といった広範囲の腫瘍型で発現される。その他の腫瘍特異的抗原は本発明のアジュバントと用いるのに適しており、その例としては前立腺特異的抗原(PSA）またはHer-2/neu 、KSA(GA733)、MUC-1 および癌胎児性抗原(CEA）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の一局面では、本発明のアジュバント組成物および腫瘍拒絶抗原を包含するワクチンが提供される。
【００３３】
本発明の組成物は、ボレリア種に由来する抗原を含有するワクチンを処方するために用いられる、と予測される。例えば、抗原としては、核酸、病原体由来の抗原または抗原製剤、組換え的産生タンパク質またはペプチド、ならびにキメラ融合タンパク質が挙げられる。特に、抗原はOspAである。OspAは、（Lipo-OspA ）と呼ばれる宿主細胞（大腸菌）による脂質化形態の全成熟タンパク質または非脂質化誘導体であり得る。このような非脂質化誘導体としては、インフルエンザ宇するの非構造タンパク質(NS1）の最初の81個のＮ末端アミノ酸を有する非脂質化NS1-OspA融合タンパク質および完全OspAタンパク質が挙げられ、そして別のMDP-OspAは、３個の付加的Ｎ末端アミノ酸を有する非脂質化形態のOspAである。
【００３４】
本発明のワクチンは、アレルギーの予防または治療のために用い得る。このようなワクチンは、アレルゲン特異的（例えばDer p1）およびアレルゲン非特異的抗原（例えばスタンワースデカペプチド）を包含する。
本発明の好ましい実施態様におけるQS21：3D-MPL(w/w) の比率は、典型的には1:10〜10:1、好ましくは 1:5〜5:1 であり、しばしば実質的には1:1 である。最適共働作用のための好ましい範囲は、 2.5:1〜1:1 の3D MPL：QS21である。典型的には、ヒト投与のためのワクチン中のQS21および3D-MPLの用量は、１μｇ〜1000μｇ、好ましくは10μｇ〜500 μｇ、最も好ましくは10〜100 μｇ／１投与量である。
【００３５】
典型的には、水中油型エマルションは、２〜10％のスクアレン、２〜10％のα−トコフェロールおよび 0.4〜２％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80）を包含する。好ましくは、スクアレン：α−トコフェロールの比は、これがモル安定エマルションを提供する場合と等しいかまたはそれより小さい。ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（SPAN85）も、 0.5〜１％のレベルで存在し得る。いくつかの場合には、本発明のワクチンは安定剤、例えばその他の乳化剤／界面活性剤、例えばカプリル酸（Merck Index 10th Edition, 登録番号1739）をさらに含有するのが有益であり、その中でもトリカプリリンが特に好ましい具体例である。
【００３６】
したがって、本発明の別の実施態様は、所望の比率内でQS21および水中油型エマルションを含有するワクチンであって、これは、QS21により付与される局所的反応原性を低減するために、ステロール、好ましくはコレステロールの存在下で処方される。本発明の特定の実施態様中に存在するQS21対コレステロールの比(w/w) は、 1:1〜1:20、実質的には1:10の範囲であるよう意図される。
【００３７】
国際特許出願WO95/17210に用いられる先のエマルションは、慣用的非Th1 誘導アジュバントを上回るいくつかの利点を明らかに有する。しかしながら、QS21の含入は、今まで、この強力なアジュバント反応原性を生じさせ、それにより疼痛をもたらしてきた。コレステロール含有リポソーム中へのQS21の処方は、損傷の部位に生じる壊死を防止するのに役立ち得る、ということが観察されている。この観察は、国際特許出願PCT/EP96/01464に従属する。
【００３８】
本発明の実施態様では、好ましいステロールはコレステロールである。本発明の実施態様に用いられるその他のステロールとしては、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびコレステロールが挙げられる。ステロールは、当業界で周知である。コレステロールは当業界で周知であって、例えば Merck Index, 11th Edn., page341に、動物脂肪中に見出される天然ステロールとして開示されている。
【００３９】
水性溶液中のQS21は、時間が経つとアジュバント不活性形態、即ちQS21-Hに分解することが知られているが、この分解は水性媒質によるＯＨ加水分解により媒介される。このような分解は、QS21が水中油型アジュバントの水性相中に存在する場合に起こり得る。意外にも、水中油型エマルションの油相へのコレステロールの付加はその活性形態のQS21を保持する作用を有する、ということが判明したが、これはアジュバント／ワクチン処方物の保存寿命にとって明らかに有益である。本発明は、QS21が水中油型エマルションベースのアジュバント中に存在する場合、その非加水分解化アジュバント活性形態での、サポニン、好ましくはQS21の製剤の安定化方法を提供する。この方法は、水中油型エマルションの油相中へのステロール、好ましくはコレステロールの付加を包含する。
【００４０】
このような製剤は、ワクチンアジュバント系として用いられ、強力ワクチン用に、一旦抗原または抗原製剤と一緒に処方される。それらは選択的にTh1 応答を誘導するのが有益である。
本発明のエマルション系は、μ以下の範囲の小油滴サイズを有する。好ましくは、油小滴サイズは、直径 120〜750nm 、最も好ましくは 120〜600nm の範囲である。
【００４１】
各ワクチン投与量中のタンパク質の量は、典型的ワクチンにおいて有意の副作用を伴わずに免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特異的免疫原が用いられるか、そしてそれがどのように存在するかによって変わる。一般に、各投与量は、１〜1000μｇのタンパク質、好ましくは１〜500 μｇ、好ましくは１〜100 μｇ、最も好ましくは１〜50μｇのタンパク質を包含する、と予測される。特定のワクチンに関する最適量は、被験者における適切な免疫応答の観察を含む標準試験により確認し得る。最初のワクチン接種後、適切な間隔で、被験者は１回または数回の追加免疫感作を受け得る。
【００４２】
本発明の処方物は、予防的および治療的な両目的のために用い得る。本発明のさらなる局面では、医薬品中に用いるための本明細書中に記載したようなワクチンたが提供される。ワクチン製剤は、一般に、New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al.. University Park Press, Baltimore,Maryland, U.S.A. 1978に記載されている。
【００４３】
本発明の組成物は、広範囲の供給源から得られる抗原を含有するワクチンを処方するために用いられる、と予測される。例えば、抗原としては、ヒト、細菌またはウイルスの核酸、病原体由来の抗原または抗原製剤、腫瘍由来の抗原または抗原製剤、宿主由来の抗原、例えばIgE のヒスタミン放出デカペプチド（スタンワースデカペプチドとして知られている）、組換え的産生タンパク質またはペプチド、ならびにキメラ融合タンパク質が挙げられる。
【００４４】
本発明のワクチン製剤は、全身または粘膜経路を介して前記のワクチンを投与することにより、疾病に罹り易いまたは罹患中の哺乳類を予防または治療するために用い得る。これらの投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路による、あるいは経口的／栄養的、または気道への粘膜投与による注入が挙げられる。
【００４５】
実施例１．水中油型エマルションアジュバントの調製
以後の実施例に用いられる水中油型エマルションアジュバント処方物は、各々、以下の水中油型エマルション構成成分を包含して製造される：５％スクアレン、５％α−トコフェロール、 2.0％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80）。
エマルションは、２倍濃縮液として以下のように調製された。免疫学的実験に用いられる実施例はすべて、余分量の構成成分および希釈剤の付加により希釈されて、１ｘ濃縮物（240:1 のスクアレン：QS21(w/w) に等しい）、またはそのさらなる希釈液を生じる。
【００４６】
要するに、トゥイーン80をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS）中に溶解して、PBS 中の２％溶液とする。100ml の２倍濃縮エマルションを提供するために、５mlのDLαトコフェロールおよび５mlのスクアレンを攪拌して十分混合する。95mlのPBS/トゥイーン溶液を油に付加して、十分混合する。その結果生じたエマルションを次に注射針に通して、最後にM110S ミクロフルイディクス機を用いてミクロ流動体化する。その結果生じた油小滴は、約 145〜180nm (PCSにより測定される平均ｚとして表される）のサイズを有し、「全投与量」SB62と呼ばれる。
【００４７】
その他のアジュバント／ワクチン構成成分（QS21、3D-MPLまたは抗原）は単純混和物中のエマルションに付加される。
本明細書中で用いられる抗原含有ワクチンは、全投与量SB62アジュバントを用いて処方されて高スクアレン：QS21比（240:1 ）を生じるか、または低量のSB62を用いて低比率処方物（48:1）を生じ、これらのアジュバント処方物はそれぞれ、SB62およびSB62’と呼ばれる。その他のワクチンは、エマルションの油相へのコレステロールの付加により任意に処方され得る（文字「ｃ」の付加で示される）。
【００４８】
実施例２．組換え抗原Ｓ，Ｌ* による免疫原性試験
種々のＳ，Ｌ* 含有処方物の免疫原性を比較するために、Balb/Cマウスで試験を実施した。Ｓ，Ｌ* は、ともにＢ型肝炎ウイルス（HB）から得られる修飾化表面抗原Ｌタンパク質（Ｌ* ）およびＳタンパク質を包含する複合抗原である。この複合抗原は、欧州特許出願EP0414374 の対象である。この免疫感作計画は、Balb/cマウスにおけるCTL の誘導を支持することが従来示されているＨＢトランスジェニックマウスモデルで用いられた。
【００４９】
スクアレン：QS21の異なる比で、任意にコレステロールを包含して（1:10のQS21：コレステロール比(w/w) ）、実施例１に前記したようなエマルション系を用いた異なるアジュバント処方物を、Ｓ，Ｌ* と組合せて、体液および細胞媒介性免疫応答（サイトカイン産生およびCTL ）を誘導するそれらの能力を比較した。水酸化アルミニウム（AlOH3 ）上に吸着されたＳ，Ｌ* をTh2 誘導対照として用いた。
【００５０】
要するに、10匹のマウスの群を３週間間隔で４回、種々の水中油型エマルション系（SB62）と組合せた２μｇの親油性化Ｓ，Ｌ* で筋注感作した。４回目の免疫感作後14日目に、サイトカイン（IL5 およびIFN-γ）の産生およびCTL 活性を、Ｓ，Ｌ* 抗原による脾臓およびリンパ節のin vitro再刺激後に分析した。Ｓ，Ｌ* に対する抗体応答および誘導されたイソタイププロフィールを、II後21日目およびIV後14日目にELISA によりモニタリングした。
【００５１】
マウス群
10匹のBalb/Cマウスの群を下記の処方物で筋内的に免疫感作した。SB62を高（240:1 ，SB62）および低（48:1、SB62’）比率のスクアレン：QS21での抗原と一緒に、任意にコレステロール（ｃ）を付加して処方した。
【００５２】
【表１】
0004426091.tif 000002
【００５３】
免疫感作計画
０、21、42および63日目に、足に筋肉内注射して、動物を免疫感作した(100μｌを注入した第５群以外の全群に対しては50μｌ）。免疫感作後種々の時点で、眼窩後洞から血液を採取した。77日目に、各群からの動物を屠殺し、脾臓および注射部位を排液するリンパ節（腸骨リンパ節）をin vitro再刺激のために取り出した。各群に関して３または４つの脾臓のプールおよび10LNの１つのプールを得て、in vitro検定において別々に処理した。
【００５４】
マウスの血清学的知見
コーティング抗原としてＨＢ表面抗原を用いたElisa により、抗ＨＢ抗体の定量を実施した。抗原および抗体溶液は、50μｌ／ウエルで用いた。抗原をPBS 中１μｇ／mlの最終濃度で希釈し、４℃で一夜、96ウエルミクロ滴定プレート（Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark）のウエルに吸着させた。次にプレートを、１％ウシ血清アルブミンおよび 0.1％トゥイーン20（飽和緩衝液）を含有するPBS とともに37℃で１時間インキュベートした。飽和緩衝液中の血清（1/100 希釈液で出発）の２倍希釈液をＨＢ被覆プレートに付加し、37℃で１時間30分インキュベートした。
【００５５】
プレートを PBS、 0.1％トゥイーン20で４回洗浄し、そして飽和緩衝液中に1/1000希釈したビオチン複合抗マウスIgG1、IgG2a 、IgG2b またはＩｇ（Amersham, UK）を37℃でさらに１時間３０分付加した。プレートを前記と同様に洗浄し、 0.1％トゥイーン20、0.05Ｍクエン酸緩衝液、pH4.5 中のｏ−フェニレンジアミン（Sigma ）0.04％ H2O2 0.03％の溶液とともに20分間インキュベートした。２ＮのH2SO4 で反応を停止させて、492/620nm で読み取った。SoftmaxPro（４パラメーター等式を使用）による参照からELISA 力価を算出し、EU／mlで表した。
【００５６】
Ｔ細胞増殖
二次免疫感作後２週間目に、マウスを屠殺し、脾臓およびリンパ節をプール（脾臓細胞に関しては３または４器官／プール、LNC に関しては10器官の１プール）中に無菌的に取り出した。２mMのＬ−グルタミン、抗生物質、５ｘ10-5Ｍの２−メルカプトエタノールおよび１％同系正常マウス血清を含有するRPMI1640培地（GIBCO ）中で、細胞懸濁液を調製した。細胞は、異なる濃度（10〜0.03μｇ／ml）のＳ，Ｌ* 抗原（25D84)を含有する丸底96ウエルプレート中の 200μｌ中で最終濃度２ｘ106 細胞／ml（LNC またはSPC に関して）で培養した。
【００５７】
各試験は、４回反復実施した。５％ CO2中で37℃で96時間培養後、細胞を 0.5μCi／ウエルで3H−チミジン（Amersham, UK、５Ci／mmol）で18時間パルス処理した後、細胞採取器でファイバーグラスフィルター上に採取した。取り込まれた放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。結果はcpm （４回のウエル中の平均cpm ) で、または刺激指数（抗原を含有する細胞培養中での平均 cpm／抗原を含有しない細胞培養中の平均cpm ）として表される。
【００５８】
サイトカイン産生
二次免疫感作後２週間目に、マウスを屠殺し、脾臓およびリンパ節をプール（脾臓細胞に関しては３または４器官／プール、LNC に関しては10器官の１プール）中に無菌的に取り出した。２mMのＬ−グルタミン、抗生物質、５ｘ10-5Ｍの２−メルカプトエタノールおよび５％胎仔ウシ血清を含有するRPMI1640培地（GIBCO ）中で、細胞懸濁液を調製した。細胞は、異なる濃度（10〜0.01μｇ／ml）のＳ，Ｌ* 抗原（25D84 ）を含有する平底24ウエル中の１ml中で最終濃度 2.5〜５ｘ106 細胞／ml（それぞれLNC またはSPC に関して）で培養した。上清を96時間後に収穫して、Elisa によりIFNgおよびIL-5の存在に関して試験するまで凍結させた。
【００５９】
IFN-γ産生
Genzyme からの試薬を用いたElisa により、 IFNγの定量を実施した。試料および抗体溶液は、50μｌ／ウエルで用いた。炭酸塩緩衝液、pH9.5 中で 1.5μｇ／mlに希釈したハムスター抗マウスIFNg  50μｌを用いて、４℃で一夜、96ウエルミクロ滴定プレート（Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark）を被覆した。次にプレートを、１％ウシ血清アルブミンおよび 0.1％トゥイーン20（飽和緩衝液）を含有する PBS 100μｌとともに37℃で１時間インキュベートした。飽和緩衝液中のin vitro刺激からの上清（１／２で出発）の２倍希釈液を抗IFNg被覆プレートに付加し、37℃で１時間30分インキュベートした。
【００６０】
プレートを PBS、 0.1％トゥイーン（洗浄緩衝液）で４回洗浄し、そして最終濃度 0.5μｇ／mlで飽和緩衝液中に希釈したビオチン複合ヤギ抗マウスIFNgを各ウエルに付加し、37℃で１時間インキュベートした。洗浄工程後、飽和緩衝液中に1/10000 希釈したAMDEX 複合体（Amersham）を37℃で30分間付加した。プレートを前記と同様に洗浄し、50μｌのTMB （Biorad）とともに10分間インキュベートした。 0.4ＮのH2SO4 で反応を停止させて、450nm で読み取った。SoftmaxPro（４パラメーター等式）による標準曲線を用いて濃度を算出し、pg／mlで表した。
【００６１】
IL-5産生
Pharmingenからの試薬を用いたElisa により、IL5 の定量を実施した。試料および抗体溶液は、50μｌ／ウエルで用いた。炭酸塩緩衝液、pH9.5 中で１μｇ／mlに希釈したラット抗マウスIL5 50μｌを用いて、４℃で一夜、96ウエルミクロ滴定プレート（Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark）を被覆した。次にプレートを、１％ウシ血清アルブミンおよび 0.1％トゥイーン20（飽和緩衝液）を含有する PBS 100μｌとともに37℃で１時間インキュベートした。飽和緩衝液中のin vitro刺激からの上清（１／２で出発）の２〜４倍希釈液を抗IL5 被覆プレートに付加し、37℃で１時間30分インキュベートした。
【００６２】
プレートを PBS、 0.1トゥイーン（洗浄緩衝液）で４回洗浄し、そして最終濃度１μｇ／mlで飽和緩衝液中に希釈したビオチン複合ラット抗マウスIL5 を各ウエルに付加し、37℃で１時間インキュベートした。洗浄工程後、飽和緩衝液中に1/10000 希釈したAMDEX 複合体（Amersham）を37℃で30分間付加した。プレートを前記と同様に洗浄し、50μｌのTMB （Biorad）とともに15分間インキュベートした。 0.4ＮのH2SO4 で反応を停止させて、450nm で読み取った。SoftmaxPro（４パラメーター等式）による標準曲線（組換え体マウスIL5 ）を用いて濃度を算出し、pg／mlで表した。
【００６３】
CTL 誘導
二次免疫感作後２週間目に、マウスを屠殺し、脾臓およびリンパ節を３〜４匹のマウスのプール（１群当たりマウス３匹の２プールおよび４匹の１プール）中に無菌的に取り出した。２mMのＬ−グルタミン、抗生物質、５ｘ10-5Ｍの２−メルカプトエタノールおよび５％胎仔ウシ血清を含有するRPMI 1640 培地（GIBCO ）中で、細胞懸濁液を調製した。細胞は、２μｇ／mlのＳ，Ｌ* および1.25％ConA supを含有する（25cm2 ファルコンフラスコ）10ml培地中で最終濃度２ｘ106 細胞／mlで培養し、５％ CO2下で37℃で８日間インキュベートした。
【００６４】
CTL 検定
CTL 検定前日（７日目）に、10μｇ／mlでＳ，Ｌ* （バッチ25D84 ）またはペプチドＳ28-39 を用いたP815細胞（106 細胞／ml）のインキュベーションにより、標的細胞を調製した。小容量で15mlファルコン試験管中で１時間インキュベーション後、細胞を24ウエルプレートに移して、37℃でインキュベートした。
検定当日、２ｘ106 のＳ，Ｌ* およびＳ28-39 パルス処理P815細胞およびP815-Sを遠心分離して、50μｌのFCS 中に再懸濁し、75μｌの 51Cr (375μCi）とともに37℃で１時間（15分毎に振盪）インキュベートした。次に細胞を10mlの完全培地で４回洗浄し、４回目の洗浄後に４℃で30分間インキュベートした。次に細胞を遠心分離して、２ｘ104 細胞／mlの濃度で再懸濁する。
【００６５】
次にエフェクター細胞を遠心分離して、計数し、２ｘ106 細胞／mlで再懸濁する。２ｘ105 細胞／ウエル／100 μｌの濃度で出発して、96V 底プレート中でエフェクター細胞の３倍連続希釈を実行する。
100 μｌ中の２ｘ103 標的細胞をエフェクター細胞に付加した。この操作は３度実施する。それぞれ培地または３％トリトンX100とともに標的細胞をインキュベートすることにより、自発性または最大放出を査定する。
【００６６】
プレートを700rpmで３分間遠心分離し、37℃で４時間インキュベートする。インキュベーション時間後、50μｌの上清を各ウエルからルーマプレートに移して一夜乾燥後、Top カウントシンチレーションカウンターで計数する。
結果は特異的溶解として表され、以下のように算出される：
％SR＝（試料平均 cpm−培地平均 cpm／最大平均 cpm−培地平均cpm)ｘ100
【００６７】
結果
血清学的知見
コーティング抗原としてＨＢ表面抗原を用いるELISA により、体液性応答（ＩｇおよびIgG イソタイプ）を測定した。II後21日目からのデータのみを示す。これらの結果は、図１および２に示されている。
図１は、II後14日目に、個々のマウス血清および群平均で測定されたHbs 特異的Ｉｇ抗体応答を示す。
図２は、ワクチン接種マウスにおける血清中のHbs 特異的IgG の亜イソタイプ分布を示す。
【００６８】
・図１から分かるように、SB62関連処方物は、Ｓ，Ｌ* Alum処方物よりはるかに高い抗体力価を誘導する。
・個々の血清に関する統計分析（Anoval検定、Newman Keuls）は、SB62およびSB62’により誘導される抗体力価に有意差を示さないか、あるいはSB62およびSB62’により誘導される抗体力価は等しい。その結果生じる抗Ｓ，Ｌ* 抗体力価は、したがって、スクアレン：QS21比とは無関係である。
・亜イソタイプ分布プロフィール（図２に示したように）は、SB62関連処方物に関して類似する（25〜30％ IgG2a）が、一方Alumは４％ IgG2aを誘導するだけである。
【００６９】
細胞媒介性免疫応答
細胞媒介性免疫応答（リンパ球増殖、 IFNγ／IL5 産生およびCTL ）をＳ，Ｌ* 抗原で脾臓および腸骨リンパ節をin vitro再刺激後、IV後14日目に測定した。
サイトカイン産生
Ｓ，Ｌ* で脾臓細胞および腸骨リンパ節細胞を96時間in vitro再刺激後、サイトカイン産生（IFN-γおよびIL-5）を測定した。これらの結果を図３〜６に示す。
【００７０】
図３は、脾臓細胞によるIFN-γ産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
図４は、脾臓細胞によるIL-5産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
図５は、腸骨リンパ節細胞によるIFN-γ産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
図６は、腸骨リンパ節細胞によるIL-5産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
【００７１】
【表２】
0004426091.tif 000003
【００７２】
考察
・少量のエマルションはIFN-γ産生に有益である。極高レベルのINF-γが、低比率エマルションを含有する処方物により免疫感作された動物からの脾臓細胞の再刺激により産生される。これらのレベルは、全用量エマルションを用いた対応する処方物によるワクチン接種後に得られるものより有意に大きい。最強IFN-γ産生は、Ｓ，Ｌ* SB62およびSB62'cにより免疫感作された動物からの脾臓細胞の再刺激後に得られる。
【００７３】
・低比率処方物（図５および６の第３および４群）の有益な作用は、脾臓から得られるものと比較して、排液中リンパ節（腸骨リンパ節）から得られる細胞で見た場合に、非常に顕著である。
・IFN-γ：IL-5比＞１ということは、前TH1 応答がすべてのSB62関連処方物により誘導されることを明らかに示唆する（表１参照）。
・コレステロールを含有しないＳ，Ｌ* SB62処方物より高レベルのIL-5が、Ｓ，Ｌ* SB62c 処方物で免疫感作された動物により産生される。Ｓ，Ｌ* Alum免疫感作動物は、最高レベルのIL-5を産生する。
・より強力なIFN-γ産生は、低比率スクアレン：QS21処方物（SB62’およびSB62'c）が用いられる場合に観察される。
【００７４】
細胞傷害性Ｔ細胞応答
抗Ｓ，Ｌ* 応答を図７に示す。
図７は、Ｓ，Ｌ* 抗原で７日間in vitro刺激された脾臓Ｔ細胞のCTL 活性を示す（３プールの特異的溶解の平均％）。
CTL 応答の考察
・すべての水中油型エマルション処方物を用いて、特異的溶解が得られる。
・より強力なCTL 応答は、３／１のような限定E/T 比で見つけた場合に、SB62’エマルションを含有する処方物を用いて得られる。
【００７５】
結論
１．最強IFN-γ産生は、SB62’エマルションで免疫感作後に観察される。
２．全用量エマルションを用いる対応する処方物に比してわずかに良好なCTL 応答は、SB62’エマルションを含有する処方物により誘導される。
３．すべてのSB62関連処方物により誘導される免疫応答のTH1 型プロフィールは、IFN-γ／IL-5比によりさらに確証される。
４．SB62c 全用量またはSB62'cによる免疫感作後に誘導される抗体力価間に、有意差は観察されない。
５．SB62c およびSB62’による免疫感作後に誘導される抗体力価間に、有意差は観察されない。
６．比較可能イソタイププロフィール（25〜30％ IgG2a）がすべてのSB62関連処方物を用いて得られたが、これはTH1 型ＨＢ特異的免疫応答の誘導を示唆する。
【００７６】
【表３】
0004426091.tif 000004
【００７７】
実施例３．マラリア抗原TRAPおよびRTS, Sを用いた免疫原性試験
熱帯熱マラリア原虫Plasmodia falciparumマラリア抗原TRAPおよびRTS, Sを、各々が水中油型エマルション系をベースとする種々のアジュバントと組合せて用いる免疫感作実験。RTS は、Ｂ型肝炎表面抗原のプレＳ２部分の４つのアミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に結合されるP. falciparum のサーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の実質的にすべてのＣ末端部分を包含するハイブリッドタンパク質である。
【００７８】
その全構造は、国際特許出願PCT/EP92/02591（英国特許出願第9124390.7 号からの優先権を請求するWO93/10152下で公開された）に開示されている。酵母菌中で発現される場合、RTS はリポタンパク質粒子として産生され、それがHBV からのＳ抗原と同時発現される場合には、それはRTS, Sとして既知の混合粒子を産生する。TRAP抗原は、国際特許出願PCT/GB89/00895（WO90/01496下で公開）に記載されている。TRAP抗原はポリペプチドであり、いわゆるトロンボスポンジン関連無名タンパク質で、これは種々のP. falciparum タンパク質と相同を共有する。
【００７９】
実施例１に記載したようなエマルション系を用い、異なる比率のスクアレン：QS21比で、任意にコレステロールを包含する（QS21：コレステロール比1:10）異なるアジュバント処方物を、マラリア抗原と組合せて、体液および細胞媒介性免疫応答（Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生）を誘導するそれらの能力を比較した。SB62を、高（240:1 、SB62）または低（48:1、SB62’）比率のスクアレン：QS21比の抗原と一緒に、任意にコレステロール（ｃ）を付加して、処方した。
【００８０】
５匹のマウス（６週齢メスマウス、C57/BL6xCBA/J ［H-2k］系統）の群を種々の水中油型エマルション系（SB62）と組合せた10μｇのRTS, Sまたは４μｇのTRAPを用いて、14日間隔で、後足肉趾内に２回（２ｘ50μｌ容量）免疫感作した。二次免疫感作後14日目に、サイトカイン（IL5 およびIFN-γ）の産生およびＴ細胞増殖を、マラリア抗原による脾臓およびリンパ節細胞のin vitro再刺激後に分析した。RTS, SおよびTRAPに対する抗体応答および誘導されたイソタイププロフィールを、ELISA により調べた。
【００８１】
【表４】
0004426091.tif 000005
【００８２】
脚注：
SB62  −水中油型エマルション全用量
SB62’−SB62の１／５用量として図に例示された水中油型エマルション。
SB62c またはSB62'c−水中油型エマルション（いずれかの用量）＋油相中コレステロール。
Vac 、Vir 、3D7 ＝CSタンパク質を発現し、106PFU／マウスで投与される組換え体ワクシニアウイルス構築物。
【００８３】
Ｔ細胞増殖
脾臓または膝窩リンパ節細胞を無菌的に取り出して、洗浄した。２ｘ106 ／mlの細胞を含有するRPMI培地（１％熱不活性化正常マウス血清、NMS ）中の 100μｌの細胞を、RTS, SまたはTRAP抗原の存在下で丸底プレート中で培養した。 0.1、0.5 および 2.5μｇの抗原で96時間、または２μｇ／mlのConAで48時間刺激後、細胞を3H−チミジン（１μCi／ウエル）で16時間標識した後、収穫し、β−カウンターで計数した。
【００８４】
RPMI培地：
Ｌ−グルタミン無含有（Life technologies No.31870025 ）、２mMのＬ−グルタミン（Life technologies No.25030024 ）、50μＭの２−メルカプトエタノール（Life technologies No.11360039 ）、１mMのナトリウムピルベート（Life technologies No.11360039 ）、１ｘMEM 非必須アミノ酸（10ｘストック、Life technologies No.11140035 ）、 100IU／mlのペニシリン− 100μｇ／mlのストレプトマイシン（Life technologies No.15140114 ）含有RPMI。
【００８５】
サイトカイン検出
脾臓または膝窩リンパ節細胞を無菌的に取り出して、洗浄した。５ｘ106 ／mlの細胞を含有するRPMI培地（５％熱不活性化胎仔ウシ血清、FCS ）中の1000μｌの細胞を、RTS, SまたはTRAP抗原の存在下で24ウエル平底プレート中で培養した。0.5 および 2.5μｇの抗原で、または４μｇ／mlのConAで何時間も、プレートをインキュベートした（37℃、５％ CO2）。
【００８６】
細胞がインキュベートされる時間の長さは、検出される特定のサイトカインによっており、IL-2は72時間、IL-5は72または96時間、そしてIFN-γは96時間刺激された。各サイトカインは、市販のELISA キットを用いて検出された（IL-2およびIFN-γはそれぞれDuoset Genzyme No.80-3573-00および80-3931-00；IL-5はPharmingenキットを用いて検出された）。
【００８７】
血清学的知見
サンドイッチELISA を用いて、TRAPに向けられる抗体を分析した。ヒツジ抗TRAP抗血清をELISA プレート上に被覆し、これを用いて、 0.5μｇ／mlで付加されたTRAP抗原を捕捉した。実験群からのプールされた血清の滴定を付加し、インキュベートした。最後に、ビオチニル化抗マウスイソタイプ特異的抗体、その後ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて、結合TRAP特異的抗体を検出した。
直接ELISA により抗HBV 体液性応答を分析し、HBsAg をELSAプレート上に１μｇ／mlで被覆した。異なる実験群からのプール血清を滴定し、結合抗体を前記と同様に検出した。
【００８８】
結果
抗原に対する応答におけるリンパ様細胞の増殖
抗原に対する増殖応答が、図８〜11で観察される。ワクチン製剤はすべて、抗原に対してin vitro増殖し得た局所的膝窩リンパ節中の細胞を刺激し、その大きさはコレステロールの付加とは無関係であった。
ワクチン製剤はすべて、抗原に対してin vitroで増殖した脾臓細胞を刺激し得た。刺激指数を考察した場合、脾臓中で最高応答を発揮した製剤は、低比率のスクアレン：QS21比（48:1または1/5 用量SB62）を有するものであった。
【００８９】
図８は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた膝窩リンパ節細胞の増殖性応答（生数／分(CPM）形態で）を示す。
図９は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた脾臓細胞の増殖性応答（生数／分(CPM）形態で）を示す。
図10は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた膝窩リンパ節細胞の増殖性応答（刺激指数）を示す。
図11は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた脾臓細胞の増殖性応答（刺激指数）を示す。
【００９０】
増殖結果の考察
図１および２は、すべてのワクチン処方物が、用量依存的方式で抗原の存在下でin vitroで増殖し得るリンパ様細胞を刺激することを明らかに示す。生cpm データは、アジュバント処方物中のコレステロールの含入が増殖応答の大きさに影響を及ぼさないことを示唆する（例えば、それぞれRTS, S/MPL/QS21/SB62およびRTS, S/MPL/QS21/SB62c と呼ばれる第１群と第６群を比較）。
cpm の実験ならびに刺激指数結果（抗原特異的増殖に関する生cpm を非特異的増殖から得られた値で割って得られる）は、最高増殖応答を生じるワクチン処方物が測定された元のリンパ球によっていることを示す。低比率のスクアレン：QS21（48:1）を含有するアジュバント処方物は、脾臓において最高増殖応答を生じる。
【００９１】
抗原による刺激時のin vitroサイトカイン産生
抗原に対してin vitroで測定されるサイトカイン産生は、in vivo の免疫応答の誘導の定量的および定性的測定であり得る。概して、高レベルのIFN-γおよびIL-2はTh1 型免疫応答の測定値であると受け取られ、IL-5はTh2 型サイトカインであると考えられる。以下の図面（図12〜14）は、低比率のスクアレン：QS21を含有するSB62’（SB62 1/5用量と呼ばれる）の使用がIFN-γの産生を増強する場合に顕著な作用を有することを実証する（図６）。さらにコレステロールの付加は、抗原に対してin vitroで産生されるサイトカインプロフィールに定性的または定量的影響を及ぼさないという証拠がある。この作用は、Th1 型免疫応答の誘導、ならびに免疫療法にも有意の結論を有し得る。
【００９２】
図12は、VII 後14日目にTRAPまたはRTS, S抗原による刺激後の脾臓細胞のIL-2産生を示す。
図13は、VII 後14日目にTRAPまたはRTS, S抗原による刺激後の脾臓細胞のIFN-γ産生を示す。
図14は、VII 後14日目にTRAPまたはRTS, S抗原による刺激後の脾臓細胞のIL-5産生を示す。
【００９３】
血清学的知見
Th1 型あるいはTh2 型免疫応答と相関し得る免疫の別の測定は、発揮されるIgG 亜イソタイプである。IgG1亜イソタイプの選択的刺激は一般に、Th2 型免疫応答の誘導の測定値であり、逆にIgG2a およびIgG2b はTh1 型免疫応答の測定値であると受け取られる。
プールマウス血清に関してELISA 試験を実施し、HBsAg およびTRAP特異的抗体の両方に関する中点力価を確認した。これらの図から、抗原特異的IgG1およびIgG2a 中点力価の比が算出され、体液性免疫応答のTh1/Th2 平衡の測定値であると解釈された（結果は表４に示されている）。
【００９４】
【表５】
0004426091.tif 000006
【００９５】
血清学的結果の考察
マウス血清のプールを各群から分析し、HBsAg およびTRAP特異的抗体を首尾よく刺激していることが判明した。概して、HBsAg に対する抗体中点力価は、TRAPに対するものより高かった。イソタイプ分布は、２つの抗体間で異なった。全処方物中のRTS, Sは、IgG1：IgG2a 比が１より低いことにより示されるように、明瞭なTh1 パターンを発揮した。
【００９６】
それに対比して、TRAP特異的抗体はTh2 型イソタイプパターンを示した。この観察に対する例外は、SB62’処方物（低比率のスクアレン：QS21を含有。SB62 1/5用量と呼ばれる）中のTRAP単独を摂取した第２群と、TRAP／RTS, Sを摂取した第９群だけであった。したがって、SB62’の使用は、Th2 型免疫応答を選択的に誘導することが分かっている抗原を用いたTh1 誘導ワクチンの設計に有用であり得る。
【００９７】
実施例４．ネズミ腫瘍退行モデルを用いた免疫学的試験
この実験は、ヒトパピローマウイルス(HPV）発現腫瘍の治療のための水中油型エマルションの使用の可能性を調べた。HPV16 のＥ７タンパク質を発現することが知られている腫瘍細胞(TC1）をC57BL/6 の６〜８週齢マウスに接種した。これらの腫瘍細胞は、未処置のまま放置すると測定可能なサイズの腫瘍に成長した。これらの腫瘍を阻止するための水中油型エマルションアジュバントをベースにしたＥ７包含ワクチンの効力を調べた。ProtD1/3E7HPV16 組換え体抗原と組合せた種々の水中油型エマルション（詳細に関しては実施例１参照）SB62全用量、SB62 1/5、SB62c 全用量およびSB62 1/5の治療効力を、TC1-E7腫瘍モデルで評価した。さらにワクチン接種計画の関与も比較した。
【００９８】
要するに、８〜10匹のC57BL/6 マウスの群を、５ｘ105 TC1 腫瘍細胞（側腹部）を用いて試験した。次にマウスの群を種々の処方物と組合せた５μｇのProtD1/3E7を用いて、皮下腫瘍試験後７および14日目に、足肉趾を免疫感作した。
その他のワクチン接種案を比較した：SB62中の５μｇのProtD1/3E7を用いる２度のワクチン接種（腫瘍試験後14および21日目）とSB62中の５μｇのProtD1/3E7を用いる４度のワクチン接種（腫瘍試験後７、14、21、28日目）。
【００９９】
Ｅ７に対する抗体応答を、二次ワクチン接種後２および４週目の時点でELISA によりモニタリングした。二次ワクチン接種後２および４週目のタンパク質Ｅ７（10、１、 0.1μｇ／ml）による72時間の脾臓およびリンパ節細胞のin vitro再刺激リンパ増殖応答を分析した。CTL 応答は、放射線照射腫瘍細胞(TC1）またはＥ７−由来ペプチドを用いた脾臓細胞のin vitro再刺激後に測定した。クロム放出検定は、同系腫瘍細胞株：Ｅ７由来ペプチドでパルス化またはパルス化されないＥＬ４、あるいはＥ７組換え体ワクシニアウイルスで、または野生型ワクシニアウイルスに感染したEL4 に関して、TC1 細胞で実施した。
【０１００】
【表６】
0004426091.tif 000007
【０１０１】
治療実験：プロトコール
・５ｘ105 のTC1-E7発現腫瘍細胞を強い57BL/6免疫担当マウスの側腹部に皮下注射(200μｌ）した。
・ワクチン接種は、足肉趾内に注入(100μｌ：50μｌ／足肉趾）される５μｇのProtD1/3E7 HPV16を用いて、腫瘍試験後７、14、21または28日目に実施した。各ワクチンは、異なるアジュバント：SB62、SB62c 、SB62’またはSB62'cの存在下で処方された。
・二次免疫感作後２日４週目に、マウスを屠殺して、脾臓または膝窩リンパ節を取り出し、リンパ増殖またはCTL 検定で検定した。
【０１０２】
比較リポソームベース処方物（DO）
ProtD1/3E7抗原（５μｇ）を、10倍濃縮PBS pH7.4 および水の配合物としての緩衝液付加前に、MPL （５μｇ）とともに30分間インキュベートした。30分後、QS21（５μｇ）を、1:5 のQS21／コレステロール重量比でリポソームと混合した処方物に付加した（ＤＱと呼ばれる）。QS21の付加後30分に、50μｇ／mlのチオメルサルを防腐剤として処方物に付加した。インキュベーションはすべて、室温で攪拌しながら実施した。
【０１０３】
細胞株
TC1 (John Hopkin's University から入手）またはEL4 細胞を、10％ FCSおよび添加剤：２mMのＬ−グルタミン、１％の抗生物質(10000Ｕ／mlペニシリン、 10000μｇ／mlストレプトマイシン）、１％の非必須アミノ酸および 100ｘの１％ピルビン酸ナトリウム（Gibco ）、５  10e-5Mの２−メルカプトエタノールを含有するRPMI1640（Bio Whittaker ）中で増殖させた。マウスの側腹部に注入する前に、TC1 細胞をトリプシン処理し、血清無含有培地中で洗浄した。
【０１０４】
腫瘍増殖
個々の腫瘍増殖を経時的に追跡調査した。２つの主な直径（Ａ、Ｂ）を、キャリパーを用いて週に２回測定した。ＡｘＢは、「腫瘍表面積」を表し、各群の５つの値の平均として表される。
【０１０５】
in vitroリンパ増殖
個々の脾臓およびリンパ節プールで、リンパ増殖を実施した。赤血球を溶解するために、細胞懸濁液をトリス緩衝化アンモニウムクロリドとともに４℃で４分間インキュベートした。２ｘ105 脾臓細胞または膝窩リンパ節細胞を、１％正常マウス血清を含有するRPMI培地中で、96ウエルミクロプレートで３回プレート化した。異なる量のＥ７（10〜１〜0.1 μｇ／ml）とともに72時間インキュベーション後、 100μｌの培養上清を除去し、１μCiの3H−チミジンを含有する新鮮な培地と取り換えた。16時間パルス処理後、細胞をフィルタープレート上に収穫した。取り込まれた放射能をβカウンターで計数した。結果は、計数／分 (CPM 、３回のウエルの平均）で、または刺激指数（抗原を有する培養中の平均CPM ÷抗原を含有しない培養中の平均CPM ）として表される。
【０１０６】
CTL 検定
２ｘ106 脾臓細胞を２ｘ106 放射線照射（18000 ラド）TC1 細胞とともに７日間同時培養した。標的細胞はCr51（DuPont NEN 37MBq／ml）負荷（37℃で１時間）TC1 細胞またはＥ７組換え体ワクシニアウイルス（John Hopkins University のT.C. Wu から受理）に感染させたEL4 細胞（同系腫瘍細胞）であった。これらの細胞から得られた結果を、野生型ワクシニアウイルスに感染させておいたEL4 標的からの結果と比較した（ワクシニア感染は、CO2 インキュベーター中で37℃で１時間、小容量の血清無含有培地中の10のMOI で実施した。新鮮な培地を付加し、細胞を使用前に一夜ｋインキュベートした）。
【０１０７】
細胞のCr51付加中に37℃で１時間、10μｇ／mlのＥ７由来ペプチド（49〜57）(QCB）を用いてEL4 細胞をパルス処理した。2000個の標的細胞を96ウエルプレート（Ｖ底nunc2-45128 ）の各ウエルに付加し、100/l が最高エフェクター／標的比であった。自発的または最大Cr51放出に対する制御を６回実施して、培地中または 1.5％トリトン中に標的を存在させた。プレートはすべて、静かに遠心分離し、７％ CO2中で37℃で４時間インキュベートした。50μｌの上清を96ｗルーマプレート（Packard ）上に沈着させて、O/N 乾燥させ、トップカウントカウンターで計数した。データは、式（実験的放出−自発的放出）÷（最大放出−自発的放出）ｘ100 によりc.p.m.から算出される特異的溶解％として表される。
【０１０８】
血清学的知見
コーティング抗原としてＥ７を用いたElisa により、抗Ｅ７抗体の定量を実施した。抗原および抗体溶液は、50μｌ／ウエルで用いた。抗原を炭酸塩緩衝液、pH9.5 中３μｇ／mlの最終濃度で希釈し、４℃で一夜、96ウエルミクロ滴定プレート（Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark）のウエルに吸着させた。次にプレートを、１％ウシ血清アルブミンおよび 0.1％トゥイーン20（飽和緩衝液）を含有するPBS とともに37℃で１時間インキュベートした。飽和緩衝液中の血清（1/100 希釈液で出発）の２倍希釈液をＥ７被覆プレートに付加し、37℃で１時間30分インキュベートした。
【０１０９】
プレートを PBS、 0.1％トゥイーン20で３回洗浄し、そして飽和緩衝液中に1/5000希釈したビオチン複合抗マウスIgG1、IgG2a 、IgG2b またはIgGtot (Amersham, UK）を各ウエルに付加し、37℃でさらに１時間30分インキュベートした。洗浄工程後、飽和緩衝液中に1/5000希釈したストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Amersham, UK）を37℃でさらに30分間付加した。プレートを前記と同様に洗浄し、TMB （テトラメチルベンジジン）とともに10分間インキュベートした。４ＮのH2SO4 で反応を停止させて、450nm で読み取った。SoftmaxPro（４パラメーター等式を使用）により中点希釈を算出した。
【０１１０】
免疫組織化学的知見
腫瘍を切り出して、アセトンおよびパラホルムアルデヒド中で固定した後、切片とした。次に５μｍ厚クリオスタット切片を調べ、CD4 、CD8 およびCD3 発現Ｔ細胞浸潤に関して染色した。染色モノクローナル抗体の付加前に、切片を洗浄し、PBS 中の 0.5％ウシ血清アルブミン(BSA）、５％正常ウサギ血清(NRS）をしみこませた。この工程後、ラット抗CD3 、CD4 およびCD8 モノクローナル抗体を付加し、４℃で一夜インキュベートした。
【０１１１】
次に切片を洗浄し、ラットモノクローナル抗体との結合を、ビオチニル化ウサギ抗ラットＩｇにより明らかにした。室温（RT）で30分間インキュベーション後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼを付加し、ＲＴでさらに30分間インキュベートした。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼの結合は、ＲＴで10分間、DAB を用いて明らかにされた。次に切片をヘマトキシリンで後染色して、エタノール、イソプロパノール、そして最後にキシロールで脱水した。
【０１１２】
結果
腫瘍増殖（平均腫瘍増殖／群の表示のため。図15参照）。
図15は、種々のProtD1/3 E7 含有処方物を用いた７および14日目の試験およびワクチン接種後の平均増殖を示す。
図16は、ＤＱおよびSB62処方物中の抗原を摂取する群に関する４週間の期間に観察された平均腫瘍増殖を示し、そして異なるワクチン接種計画を比較した結果も表す。これらのワクチンは、７および14日目、14および21日目、または７、14、21および28日目に投与された。
【０１１３】
腫瘍退行試験の考察
ProtD1/3 E7 抗原使用
・ProtD1/3 E7 またはアジュバント単独によるワクチン接種は、TC1-E7発現腫瘍の増殖に影響を及ぼさない。
・個々の腫瘍増殖の分析は、いくつかの群で完全腫瘍拒絶を示した。
【０１１４】
【表７】
0004426091.tif 000008
【０１１５】
腫瘍拒絶を誘導するための最良処方物は、低用量SB62’水中油型エマルションを用いて処方された。
・２回のワクチン接種より良好な治療効果が、４回ワクチン接種後に観察された。個々の腫瘍増殖の分析は、SB62を用いた４回のワクチン接種後に60％の動物がそれらの腫瘍を完全に拒絶したが、一方２回ワクチン接種を受けたマウスで完全拒絶を示したのは40％に過ぎなかった。
・一次ワクチン接種を腫瘍試験後14日目まで遅らせると、完全拒絶は観察されなかった。しかしながら、腫瘍増殖は阻害されていると思われた。
【０１１６】
増殖結果
・増殖性応答はこの実験では、ProtD1/3 E7 またはアジュバント単独を摂取したマウスからの脾臓またはリンパ節で観察されなかった。
・抗原特異的リンパ増殖は、アジュバントの存在下でProtD1/3 E7 を摂取したマウスの群において増大した。高増殖応答は、脾臓のＤＱおよびSB62’で観察された（図17および18参照）。
図17は、二次ワクチン接種後２週目に脾臓細胞で観察されたリンパ増殖を示す。
図18は、二次ワクチン接種後２週目に脾臓細胞で観察されたリンパ増殖を示す。
【０１１７】
血清学的知見
抗Ｅ７抗体応答：コーティング抗原としてＥ７タンパク質を用いたELISA により、IgG の全および亜イソタイプ（IgG1、IgG2a 、IgG2b ）を測定した。二次ワクチン接種後２週目に観察された抗E7 Ig 力価を、表６に示す。図19は、二次ワクチン接種後２週目のワクチン接種マウスの血清中の異なるIgG イソタイプの相対％を示す。
【０１１８】
・ProtD1/3 E7 単独による２度のワクチン接種後に誘導された弱抗体応答は、アジュバントを摂取した動物では強力に増大した。最強抗体応答は、SB62で得られた。
・試験したすべてのワクチン処方物により誘導される優勢なＥ７特異的抗体サブイソタイプは、IgG2b （全IgG の80〜90％）であった。
【０１１９】
【表８】
0004426091.tif 000009
図19は、二次ワクチン接種後２週目のワクチン接種マウスの血清中の異なるIgG イソタイプの相対％を示す。
【０１２０】
CTL 結果
・CTL 応答は、最終ワクチン接種後２および４週目の時点で検出された。
・マウスがタンパク質またはアジュバント単独を摂取した場合は、溶血は観察されなかった。最良の特異的溶血は、マウスがＤＱまたはSB62’中の抗原を摂取した場合に観察された（表９参照）。
【表９】
0004426091.tif 000010
【０１２１】
免疫組織化学的結果
マウス（２匹／群）から腫瘍を取り出して、切片を凍結させた。腫瘍の凍結切片を抗CD4 および抗CD8 抗体で染色した。CD4 およびCD8+ve細胞により観察された腫瘍浸潤に関する結果を、表１０に示す。
【表１０】
0004426091.tif 000011
【０１２２】
結論
・ＤＱまたはSB62中のProtD-1/3 E7を摂取したマウスの群における腫瘍退行は、CD8+細胞の大量浸潤および少数のCD4+細胞の浸潤を示した。
・PBS 、抗原またはアジュバント単独を摂取した動物から取り出された腫瘍は、いかなるCD8+veリンパ球浸潤も含有しなかった。
・異なるSB62ベースの処方物中の５μｇのProtD1/3による２度のワクチン接種（７、14日目）は、遠くの部位に移植された前確定Ｅ７発現腫瘍の拒絶を誘導した。
・腫瘍拒絶は抗Ｅ７特異的CTL 応答に関連する。それらの腫瘍を拒絶した個体ではわずかに良好なCTL 応答を示す傾向がある。
【０１２３】
・免疫化学知見は、ProtD1/3 E7+DQおよびSB62によるワクチン接種時に退行した腫瘍中にCD8+T 細胞の大量浸潤を示した。
・SB62中の５μｇのProtD1/3 E7HPV16による２度のワクチン接種（腫瘍試験後14および21日目）はこれらの大型腫瘍の増殖を低減したが、しかし完全退行を誘導しなかった。
・SB62中の５μｇのProtD1/3 E7HPV16による４度のワクチン接種（腫瘍試験後７、14、21および28日目）は確立された腫瘍の完全拒絶を60％の動物で誘導したが、同一アジュバントによる２度のワクチン接種後では全体で40％の拒絶が観察された。
・低用量SB62’アジュバントの使用は、抗Ｅ７抗体力価の大きさに影響を及ぼさなかったが、最高レベルの脾臓リンパ球増殖および抗E7CTL 応答を誘導した。
【０１２４】
本発明に対する全体的結論：
本発明は、強力なTh1 型免疫応答、特にIFN-γ産生を選択的に誘導する、ということが前記の実施例から明らかである。これらの処方物は、広範な種々の抗原に対する免疫応答を刺激することが実証されており、したがって本発明は、本明細書中に記載したものに限定されない広範な種々の病原体に用途を見出すよう意図される。
【０１２５】
実施例５．コレステロールの付加によるQS21の安定化
QS21-HはQS21の加水分解生成物であって、アジュバントとしてもはや活性でないと従来記載されている。それは、水性溶液からのOH- によるQS21分子の切断により生成される。この反応は、水性媒質のpHが6.5 という値より高くなると起こり、高温になるほど加速される。本特許出願に記載した水中油型エマルション（例えばSB62）は、QS21のQS21-Hへの加水分解が抑制されるような安定化作用を示すことが知られている。一定QS21の存在下での水中油型エマルションの希釈に際して、それらはこの安定特性を失い、QS21は不活性QS21-H形態に分解する。意外なことに、1/1 の比率ではQS21の改良を示さない付加的コレステロールを含有するエマルションが、1/5 希釈でさえ安定作用を保持する。
【０１２６】
QS21およびQS21-Hは、エマルション中に直接検定される。これは、完全処方物を化学的に誘導することにより、そしてQS21を溶解するがほとんどの当該マトリックス化合物はそのまま残す選択的抽出工程を実施することにより、成し遂げられる。検定はHPLCベースで、化合物はダンシル化される。ダンシル化は、エマルションの試料を乾燥し、 100μｌの3.5mg ダンシルヒドラジン/mlC/M2/1 および 100μｌの1:4 酢酸：C/M2/1をその順に付加することにより実行される。混合物をよくかき混ぜて、60℃で２時間インキュベートする。反応混合物をSpeedvac中で乾燥させる。
【０１２７】
それを水中の30％ ACN 500μｌ中で再構築し、14000rpmで２分間、２回遠心分離する。次に上清を自動試料採取管中に収集する。試験中のエマルションと同一化合物を含有する混合物中にQS21およびQS21-Hを調製することにより、標準曲線を得る。
Vydac218TP54  ５μ粒子サイズC18RP カラム、 250* 4.6mm で、HPLC検定を実行する。溶媒は、Ａ：H2O ＋0.05％ TFA（トリフルオロ酢酸）およびＢ：アセトニトリル＋0.05％ TFA。勾配表を以下に示す：
【０１２８】
【表１１】
0004426091.tif 000012
【０１２９】
流量は１ml／分である。検出は、345nm で励起を、そして515nm で発光を有する蛍光で成される。50μｌの試料および標準物質を注入する。カラムヒーターをこの分離のために37℃に設定する。QS21、QS−イソおよびQS-Hに関するピークを、クロマトグラム上で識別する。
以下の組成物を有する一連の試料を分析した：
【０１３０】
【表１２】
0004426091.tif 000013
【０１３１】
種々の間隔の時間および温度（４℃および37℃）での試料のインキュベーション後に、QS21／QS21-Hの検定を実施した。このモデルの37℃での１ヶ月間のデータは、４℃で長期（例えば２年）保存後のQS21の安定性とよく相関する。
【０１３２】
【表１３】
0004426091.tif 000014
【０１３３】
前記の表に示したこの結果は、QS21の安定性を保持するに際してのこの場合のステロール（この場合はコレステロール）のSB62’への付加の効果を明らかに（７日間および１ヶ月）示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、II後14日目に、個々のマウス血清および群平均で測定されたHbs 特異的Ｉｇ抗体応答を示す。
【図２】  図２は、ワクチン接種マウスにおける血清中のHbs 特異的IgG の亜イソタイプ分布を示す。
【図３】  図３は、脾臓細胞によるIFN-γ産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
【図４】  図４は、脾臓細胞によるIL-5産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
【図５】  図５は、腸骨リンパ節細胞によるIFN-γ産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
【図６】  図６は、腸骨リンパ節細胞によるIL-5産生の結果を示す（３プール／群を用いて得られたデータの平均）。
【図７】  図７は、Ｓ，Ｌ* 抗原で７日間in vitro刺激された脾臓Ｔ細胞のCTL 活性を示す（３プールの特異的溶解の平均％）。
【図８】  図８は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた膝窩リンパ節細胞の増殖性応答（生数／分(CPM）形態で）を示す。
【図９】  図９は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた脾臓細胞の増殖性応答（生数／分(CPM）形態で）を示す。
【図１０】  図10は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた膝窩リンパ節細胞の増殖性応答（刺激指数）を示す。
【図１１】  図11は、TRAPおよびRTS, S抗原で刺激後に実験群から得られた脾臓細胞の増殖性応答（刺激指数）を示す。
【図１２】  図12は、VII 後14日目にTRAPまたはRTS, S抗原による刺激後の脾臓細胞のIL-2産生を示す。
【図１３】  図13は、VII 後14日目にTRAPまたはRTS, S抗原による刺激後の脾臓細胞のIFN-γ産生を示す。
【図１４】  図14は、VII 後14日目にTRAPまたはRTS, S抗原による刺激後の脾臓細胞のIL-5産生を示す。
【図１５】  図15は、種々のProtD1/3 E7 含有処方物を用いた７および14日目の試験およびワクチン接種後の平均増殖を示す。
【図１６】  図16は、ＤＱおよびSB62処方物中の抗原を摂取する群に関する４週間の期間に観察された平均腫瘍増殖を示し、そして異なるワクチン接種計画を比較した結果も表す。これらのワクチンは、７および14日目、14および21日目、または７、14、21および28日目に投与された。
【図１７】  図17は、二次ワクチン接種後２週目に脾臓細胞で観察されたリンパ増殖を示す。
【図１８】  図18は、二次ワクチン接種後２週目に脾臓細胞で観察されたリンパ増殖を示す。
【図１９】  図19は、二次ワクチン接種後２週目のワクチン接種マウスの血清中の異なるIgG イソタイプの相対％を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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