(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉ：
【化１】
0004538455.tif 000014
の化合物又は医薬適合性のその塩。
【請求項２】
ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）又はＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）又はそれらの天然もしくは人工突然変異株を栄養培地中で培養すること及びその発酵ブロスから構造式Ｉの化合物を回収することを含む、構造式Ｉ：
【化２】
0004538455.tif 000015
の化合物の調製のためのプロセス。
【請求項３】
前記発酵が、１０℃〜４０℃の温度で実施される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記発酵が２８℃の温度で実施される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）。
【請求項６】
ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）。
【請求項７】
医薬適合性の担体と、構造式Ｉ：
【化３】
0004538455.tif 000016
の化合物の有効量とを含む医薬組成物。
【請求項８】
宿主における細菌感染症の治療のための請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌活性を有する新規天然産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌により起こる感染は、これらの病原体の多くが様々な一般的抗生物質に耐性があることから、医学上の関心が高まっている。このような微生物には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（表皮ブドウ球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（溶血性ブドウ球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（エンテロコッカス  フェカーリス菌）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（エンテロコッカス  フェシウム菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｅｔｉｃｕｓ（アクチノバクター  カルコエチクス）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）及びＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（ステノトロホモナス  マルトフィリア）が含まれる。本発明の抗生物質は、様々な既知の抗生物質に対して耐性のある感染症を処置するための治療に対して重要な貢献を果たす。概説として、Ｆ．Ｄ．Ｌｏｗｙ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２００３，１１１（９），１２６５を参照のこと。
【０００３】
本発明において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）の真正細菌性の発酵から単離された新規天然産物について述べる。この化合物は、現在使用可能な抗生物質に対して耐性を示していることが多い様々な病原体に対して抗菌活性を示す。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、式Ｉで示される新規天然産物及び抗菌剤としてのその使用：
【０００５】
【化３】
0004538455.tif 000002
又は細菌感染症の治療に効果的な医薬適合性のその塩について述べる。
【０００６】
本発明はまた、真正細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）を用いた発酵による化合物Ｉの産生のためのプロセスにも関する。本発明はまた、発酵ブロスから式Ｉの化合物を単離するためのプロセスにも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、構造式Ｉ：
【０００８】
【化４】
0004538455.tif 000003
の化合物又は医薬適合性のその塩について述べるものである。
【０００９】
本発明の化合物の医薬適合性の塩には、非毒性の無機塩基又は有機塩基から形成される従来の非毒性塩が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、アルカリ金属又はアルカリ土類金属水酸化物、例えばカリウム、ナトリウム、リチウム、カルシウム又はマグネシウムなどの無機塩基から誘導される塩：及び、アミン、例えばジベンジルエチレンジアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、ピロリジン、ベンジルアミンなど、又は、水酸化テトラメチルアンモニウムなどのような第四級水酸化アンモニウムなどの有機塩基から調製される塩が含まれる。
【００１０】
それらの医薬適合性の塩は、従来の化学的方法により本発明の化合物から合成することができる。一般に、それらの塩は、ある適切な溶媒中において、もしくは、様々な溶媒の混合液中において、その遊離酸を、所望する塩形成無機塩基又は有機塩基の化学量論的な量もしくは過剰量と反応させることにより調製される。
【００１１】
本発明の化合物Ｉは、細菌感染症の治療に有用な抗生物質活性を示す。これは、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（エンテロコッカス属菌）（ＶＲＥ）、多剤耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．フェシウム菌）、マクロライド耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（表皮ブドウ球菌）、及びリネゾライド耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．フェシウム菌）などの、多くの既知の抗生物質に対して耐性を示す菌種を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｅ．フェカーリス）、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．フェシウム菌）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）及びＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）の様々な菌株に対して抗菌活性を示す。
【００１２】
本発明の化合物は、化合物Ｉを医薬適合性の担体と混合することにより医薬組成物に調合することができる。そのような担体の例を以下に述べる。
【００１３】
本化合物は、粉末又は結晶の形態で、液状の溶液で、又は懸濁液の形態で用い得る。本化合物は、様々な方法で投与することができ、そのうち、特に関心のある投与方法には、局所投与、経口投与及び注射による非経口投与（静脈内注射又は筋肉内注射）が含まれる。
【００１４】
送達経路の１つである注射用の組成物は、アンプルに入った単位剤形で調製することができ、又は、多回量容器に入った形態で調製することもできる。それらの注射可能な組成物は、油性もしくは水性のビヒクル中における懸濁液、溶液又は乳濁液などの形態をとり得るか、又は様々な調合用物質を含有し得る。あるいは、その活性成分は、送達時に滅菌水などの適切なビヒクルで再構成するための粉末状の（凍結乾燥された、又は、凍結乾燥されていない）形態であり得る。注射可能な組成物において、担体は、通常、滅菌水、生理食塩水又は別の注射可能な液体、例えば筋肉内注射用のラッカセイ油などから成る。また、様々な緩衝剤、保存剤なども含まれ得る。
【００１５】
局所適用製剤は、軟膏、クリ−ム、ロ−ションを形成するための疎水性基剤又は親水性基剤などの担体中、塗布剤を形成するための水性、油脂性又はアルコ−ル性液体中、又は粉末剤を形成するための乾性希釈剤中において調合し得る。
【００１６】
経口用組成物は、錠剤、カプセル剤、経口用懸濁液及び経口用溶液などの形態をとり得る。それらの経口用組成物は、従来の調合用物質などの担体を利用し得、徐放特性ならびに速放性送達形態を含み得る。
【００１７】
投与すべき用量は、主に、治療を受ける対象の状態及び大きさ、投与経路及び投与頻度、本化合物に対する病原体の感受性、その感染物質の毒性及び他の要因に依存する。しかし、そのような事柄は、抗菌技術分野において周知の治療の原理に従う医師の通常行う判断に任される。
【００１８】
液体であるか固体であるかに関わらず、ヒトに投与する場合、１回量当たりのそれらの組成物には、化合物Ｉが約０．０１％から約９９％という高濃度で含有され得るが、この範囲のある実施態様において、化合物Ｉが約１０％から６０％含有され得る。この組成物は、一般に、約１５ｍｇから約２．５ｇの化合物Ｉを含み、この範囲のある実施態様において、約２５０ｍｇから１０００ｍｇの化合物Ｉを含む。非経口投与形態において、通常、単位用量は、滅菌水溶液中において、又は、溶液とするよう意図された可溶性粉末の形態で純粋な化合物Ｉを含み、それを、中性のｐＨ及び等張性に調製することができる。
【００１９】
ここで説明されている本発明はまた、細菌感染症の治療が必要な哺乳動物にその感染症を治療するのに有効な量で化合物Ｉを投与することを含む、細菌感染症の治療が必要な哺乳動物における細菌感染症を治療するための方法も含む。
【００２０】
化合物Ｉを投与する方法のある実施態様には、経口的方法、及び非経口的方法、例えば、ｉ．ｖ．注入、ｉ．ｖ．ボ−ラス、及びｉ．ｍ．注射が含まれる。
【００２１】
成人の場合、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから５０ｍｇの化合物Ｉを１日に１回から４回与えることが好ましい。１日あたり１回から４回与えられる本抗菌物質の好ましい用量は、２５０ｍｇから１０００ｍｇである。より具体的には、軽度の感染症の場合、１日に２回又は３回、約２５０ｍｇの用量が推奨される。感受性の高いグラム陽性菌に対する中等度の感染症の場合、１日に３回から４回、約５００ｍｇの用量が推奨される。本抗生物質に対する感受性が上限である微生物に対する、生命に関わる重篤な感染症の場合、１日に３回から４回、約１０００ｍｇから２０００ｍｇの用量が推奨され得る。
【００２２】
子供に対しては、１日あたり２回、３回又は４回与えられる約５ｍｇ／ｋｇ体重から２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量が好ましく；通常は、１０ｍｇ／ｋｇの用量が推奨される。
【００２３】
本発明の別の局面は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）微生物を適切な栄養培地中で培養し、次にその発酵ブロスから本発明の化合物を回収することを含む、化合物Ｉを生成するためのプロセスである。関心のある微生物は、分類学に従い、真正細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）として同定され、Ｍｅｒｃｋ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている、ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）の２種類ある。
【００２４】
これらの生物は、後に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２に永久寄託し、受託番号ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（Ｍｅｒｃｋ＃ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（Ｍｅｒｃｋ＃ＭＡ７３３１）を割り当てられている。
【００２５】
本微生物への公共的アクセスに関するあらゆる制限は、特許発行時に撤回不能に解除されることになっている。本発明と関連付けてこの特定の種の使用を説明しているが、化合物Ｉを生成することができる他の種及び上述の微生物の突然変異株もあり得、それらの使用も本発明のプロセスを実施する際の範囲に入るべく意図されている。
【００２６】
構造式Ｉの化合物は、真正細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）の培養物の接種を介した、制御条件下における適切な培地の好気性発酵により産生される。適切な培地は、好ましくは、水性であり、同化可能な炭素、窒素及び無機塩のソ−スを含む。
【００２７】
上述のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）による発酵で使用される培地は、それが単独であるか、又は、当業者が通常使用する栄養素が添加されているかは別にして、基本的に、周知のＤｉｆｃｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈである。
【００２８】
本明細書中で述べる栄養培地は、使用され得る広範囲の様々な培地のうちの単なる例証にすぎず、どのような意味においても本発明の範囲を制限すべく意図されたものではないことに留意されたい。
【００２９】
発酵は、約１０℃〜約４０℃の温度で実施される。しかし、最適な結果を得るためには、その発酵を約２８℃で行うことが好ましい。発酵中の栄養培地のｐＨは、約５．５から約７．５であり得る。
【００３０】
本発明の化合物の発酵による産生に対して、本発明が、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（Ｍｅｒｃｋ＃７３２７）及びＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（Ｍｅｒｃｋ＃７３３１）を有する特定のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）を使用することに限定されるものではないことを理解されたい。特に、本発明の化合物を産生することができる限りにおいて、説明した培養物から生成又は誘導される他の天然又は人工突然変異株の使用、又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）属の他の変異株又は菌種の使用を本発明の範囲に含めることが望ましく、また、そのように意図されている。ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（Ｍｅｒｃｋ＃７３２７）及びＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（Ｍｅｒｃｋ＃７３３１）からのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）の突然変異種又は変異菌株の人工的な生成は、従来の物理的又は化学的な突然変異誘発要因、例えば上記で説明した培養物の紫外線照射又はニトロソグアニジン処理などにより達成し得る。プロトプラスト融合、プラスミド取り込み、染色体フラグメント取り込みなどの組み換えＤＮＡ技術も有用であることが認められ得る。
【実施例１】
【００３１】
化合物Ｉの産生−ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）両者に対して同じ方法を適用する。
【００３２】
【表１】
0004538455.tif 000004
【００３３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトミセス属菌）ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）の凍結縣濁液（２．０ｍＬ）を、播種用培地  ５０ｍＬを含有する２５０ｍＬ  バッフル付きフラスコに接種した。このフラスコを２８．０℃にて２２０ＲＰＭで撹拌しながら４８時間インキュベーションした。第一段階の種培養  １０ｍＬを、播種用培地  ５００ｍＬを含有する、２リットルのバッフルの付いていない振盪フラスコに接種することにより、第二段階の種培養を行った。このフラスコを２８．０℃にて１８０ＲＰＭで撹拌しながら４８時間インキュベーションした。ＣＬＡ産生用培地  ５０リットルを含有する、７５リットルの規模のＣｈｅｍａｐ発酵槽に、第二段階の種培養から１．５リットルを接種した。７５リットルの規模の発酵槽の操作パラメーターは：温度＝２８℃、振盪＝３００ＲＰＭ、空気循環＝３０ｓｌｐｍ及び気圧＝５ｐｓｉｇであった。ブロス  ４３Ｌを含有する発酵槽を、インキュベーション９日後に回収した。
【００３４】
化合物Ｉの単離：４３Ｌ  発酵ブロスに、２９Ｌ  ＭｅＯＨを添加し、ｐＨ３．０に酸性化し、７２Ｌの最終体積をとした。この抽出物を濾過し、濾過液を直接、１．５Ｌ  アンバークロムに添加し、４０％から１００％のＭｅＯＨ水溶液勾配で溶出し、各画分  ６００ｍＬを回収した。化合物Ｉを主に含有する画分１１から１３をプールし、大部分が水性の２００ｍＬに濃縮し、それを３００ｍＬの水で希釈し、５００ｍＬの最終体積とした。固形の重炭酸ナトリウムを添加し、ｐＨを９に上昇させた。この溶液を塩化メチレン  等体積で３回抽出した。この水層を６Ｎ  ＨＣｌ（塩酸）でｐＨ２．０に酸性化し、塩化メチレン  等体積で４回抽出し、合わせた抽出物（１９００ｃｃ）を濃縮し、半精製化合物Ｉ  ２．６ｇを得た。
【００３５】
この半精製物質を酢酸エチル少量に溶解し、８０：２０；ヘキサン−酢酸エチル中で充填した５００ｃｃシリカゲルカラムに載せた。ヘキサン−酢酸エチル（８：２）の４カラム体積でこのカラムを洗浄し、次に、酢酸エチル：ヘキサン：水：氷酢酸：メタノール＝８０：２０：０．５：０．５：０．５の４カラム体積で洗浄し、各画分２００ｍＬを回収した。画分６から１０をプールし、減圧下で濃縮し、化合物Ｉ  １．２４ｇを得た。
【００３６】
化合物Ｉの大規模単離法：５リットルの発酵ブロスを４Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、酢酸イソプロピル  ２．５リットルで抽出し、それを、重炭酸ナトリウムの５％水溶液  ３００ｍＬで抽出した。１５０ｍＬ  アンバークロムカラムに重炭酸層を負荷し、溶出液のｐＨが中性になるまで水で洗浄した。０．１Ｎ  ＨＣｌの１カラム体積でそのカラムを洗浄し、溶出液のｐＨが中性になるまで水で洗浄した。２０、４０、６０、８０、９０及び１００％  メタノール水溶液  各２カラム体積でそのカラムを溶出した。化合物Ｉは、９０％及び１００％  メタノール水溶液画分において溶出された。プールした画分をほとんど水性になるまで減圧下で濃縮し、塩化メチレン  等体積で抽出した（酢酸イソプロピル及び酢酸エチルも同様に有効である。）。その有機層を乾燥するまで濃縮し、非晶質粉末として化合物Ｉ  １９３ｍｇを得て、それを熱いニトロメタン、酢酸イソプロピル、酢酸エチル又はアセトニトリル−水から結晶化することができた。
【００３７】
化合物Ｉの物理学的データ：淡黄色の針状晶としてニトロメタンから結晶化した。ｍｐ  ２２０−２２３℃（２３０℃で分解）、ＵＶ（ＣＨ３ＯＨ）λｍａｘ２２７（ε  ２８，１６７），２９６（４，８２５）ｎｍ，［α］２３Ｄ  −５１．１°（ｃ  ０．１３５，ＣＨ３ＯＨ），ＦＴＩＲ（ＺｎＳｅ）３４００，２９６４，１７１３（ｗ），１６５０，（ｂｒ，ｓｔｒｏｎｇ），１５３５，１４４６，１３７８，１２９６，１２４０，１１５３，１１０５，１０９１，１０２４，９５３，８２８，７９１，６０８ｃｍ−１．
ＨＥＥＳＩＦＴＭＳ：実測値：４４２．１８５３；Ｃ２４Ｈ２７ＮＯ７＋Ｈに対する計算値：４４２．１８６６，
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）Ｃ５Ｄ５Ｎ  δＨ：１．１４（３Ｈ，ｓ），１．４０（３Ｈ，ｓ），１．４８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ），１．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．５Ｈｚ），１．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３Ｈｚ），１．８１（２Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），１．９０（１Ｈ，ｍ），２．０（１Ｈ，ｍ），２．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．４５（１Ｈ，ｂｒｓ），２．６８（１Ｈ，ｍ），２．７５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．５，１１．５，５），２．８３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．５，１１．５，５．５Ｈｚ），４．４９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），５．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），６，３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），６．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），１０．５（１Ｈ，ｓ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）Ｃ５Ｄ５ＮδＣ：２３．９，２５．１，３２．４，３２．８，４１．４，４３．７，４５．７，４６．８，４７．２，４７．４，５５．６，７７．１，８７．５，１０７．８，１１０．５，１１５．９，１２７．９，１３０．１，１５４．６，１５８．５，１５９．１，１７５．０，１７５．２，２０３．８
培養菌の特性決定
成長、培養菌の全般的特徴及び炭素源利用をＳｈｉｒｌｉｎｇ及びＧｏｔｔｌｉｅｂの方法に従い観察した（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９６６）１６：３１３−３４０）。培養菌の色調は、Ｍｅｔｈｕｅｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｕｒ（Ａ．Ｋｏｒｎｅｒｕｐ及びＪ．Ｈ．Ｗａｕｓｃｈｅｒ，第三版，１９７８）に記載の色度標準と比較して決定した。
【００３８】
細胞の化学組成は、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ及びＬｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ（１９８０）の方法を用いて決定した。
【００３９】
脂肪酸組成は、改変試料調製法（Ｓａｓｓｅｒ，１９９０）を用いて決定した。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥｓ）の分析は、フェニルメチルシリコンカラム（０．２ｍｍｘ２５ｍ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｍｏｄｅｌ  ６８９０Ｎガスクロマトグラフ／Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウエア（ＭＩＤＩ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌ）を使用して、キャピラリーガスクロマトグラフィーにより行った。個々の脂肪酸同定は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウエアを用いて行った。
プライマー、２７ｆ及び１５２５ｒ（Ｌａｎｅ，１９９１）を用いて得られた１５００ｂｐのＰＣＲフラグメントから、１６ＳｒＤＮＡの完全配列を決定した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した配列決定反応において、このＰＣＲ産物をテンプレートとして使用した。ＧＣＧ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８）を使用して部分配列を組み立て、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｉｎｔｅｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、配列をアライメントした。Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＡＵＰ）プログラムバージョン４．０（Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，１９９３）の分枝限定アルゴリズムを用いた最大節約法を使用して、アライメントした配列の系統発生解析を行った。
【００４０】
ソース
菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）は、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃａｐｅ，Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａで採取した土壌から得た。この土壌試料は、フィンボス及び砂丘の沿岸地域において、Ｍａｎｕｌｅａ  ｏｂｏｖｂａｔａ（マヌレ  オボバータ）の根圏に付着していた。土壌試料を連続希釈し、２０μｇ／ｍｌのナリジクス酸を含有するデンプンゼイン寒天培地に播種した後、その菌株を単離した。
【００４１】
菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）は、Ｍａｌｌｏｒｃａ，Ｂａｌｅａｒｉｃ  Ｉｓｌａｎｄｓ，Ｓｐａｉｎで採取した土壌から単離した。０．０１％塩化ベンゼトニウムで土壌を前処理し、２０μｇ／ｍｌ  ノボビオシンを添加したフミン酸使用寒天に播種した後、この菌株を単離した。
【００４２】
全般的な成長特性
菌株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）は、酵母麦芽エキス、オートミール、グリセロールアスパラギン、無機塩デンプン及びトリプチケースソイ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ）寒天などの一連の寒天培地において、２８℃にて良好に成長する。肉眼的なコロニーの形態は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓに特有なものであり、胞子塊の色調、基質菌糸の着色及び様々な色素産生を含む、その成長の特性を様々な寒天培地において記録した（表１）。
【００４３】
コロニー形態（麦芽酵母エキス寒天培地、ＩＳＰ２）：最初黄白色である基質菌糸は、インキュベーション２１日後、橙褐色（５Ｃ６）に変化する。２１日間のインキュベーション後、最初白色である気中菌糸体は成長を続け、黄灰色に変化し、最終的に、褐色の湿った浸出液の小滴を伴う灰色（５Ｄ２）となる。
微構造：光学顕微鏡により、４００Ｘ及び１０００Ｘの拡大率で、プレート上で直接胞子鎖の形態を調べた。麦芽酵母エキス寒天培地で７日、１４日及び２１日間培養した後に観察を行った。気中菌子体が広く分枝した基菌糸から生じる。まばらな分枝した気菌糸は、最初に、短く不規則で堅固な螺旋形態の胞子鎖に分化する。１０から２０個未満の胞子によって担胞子体が形成され、時間が経過するにつれて、より時間が経過した培養菌においては、暗色の粘液状の胞子塊に合着する傾向がある。他の試験培地の殆どにおいても同様の形態が観察されたが、合着の程度は様々であった。一方、グリセロールアスパラギン寒天培地では、この菌株は不稔の栄養菌子として成長する。
【００４４】
菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）は、酵母麦芽エキス、オートミール、グリセロールアスパラギン、無機塩デンプン及びトリプチケースソイ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ）寒天などの試験寒天培地において、２８℃にて良好に成長する。肉眼的なコロニー形態は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓに特有なものであり、その成長特性を様々な寒天培地において記録した（表１）。
【００４５】
コロニー形態（酵母麦芽寒天培地、ＩＳＰ２）：最初黄白色である基質菌糸は、インキュベーション２１日間後、黄褐色（５Ｅ７）に変化する。インキュベーション２１日後、最初黄白色である気中菌糸体は成長を続け、均一に灰色となる（５Ｅ１）。
微構造：光学顕微鏡により、４００Ｘ及び１０００Ｘの拡大率で、プレート上で直接胞子鎖の形態を調べた。麦芽酵母エキス寒天培地で７日、１４日及び２１日間培養した後に観察を行った。大規模な気中菌子体が分枝した基菌糸から生じる。担胞子体は、気菌糸の先端で、又は２次分枝した菌糸で生じる。それらは、ループ状又はコイル状の構造を伴う短く堅固で不規則な胞子鎖を形成するが、それらはさらに長時間インキュベーションすると合着する。菌株が不稔の栄養菌糸として成長するグリセロールアスパラギン寒天培地を除く他の試験培地において、合着の程度が異なる同様の形態が観察された。
【００４６】
化学分類分析
細胞壁組成の分析により、菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及び菌株ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）が、生物全体の加水分解物において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）の特徴である、ＬＬ−Ａ２ｐｍを含有していることが示される。菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）は、主要な細胞壁糖質としてグルコースを含有し、一方、菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）においては、特徴的な糖質としてグルコース及びガラクトースが見られる。両菌株とも、直鎖飽和脂肪酸及びイソ（ｉｓｏ）及びアンテイソ（ａｎｔｅｉｓｏ）脂肪酸に富んでいるが、完全に異なる脂肪酸パターンを示す。完全な脂肪酸組成を表２で示す。全細胞の加メタノール分解物で見られる主な脂肪酸は、１５：０  アンテイソ（ａｎｔｅｉｓｏ）と１６：０  イソ（ｉｓｏ）に相当し、これもまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）に特有である。これらの化学分類分析全てから、両菌株がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）属のメンバーに相当することが示される。
【００４７】
生理学的特性
これらの菌株は、わずかに異なる炭素利用パターンを示す（表３）：
ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）：Ｄ−グルコース、スクロース、Ｉ−イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フルクトース及びラフィノースを良好に利用し；Ｄ−キシロースを中程度に利用し；Ｌ−アラビノース及びセルロースをわずかに利用し；ラムノースを利用しない。
【００４８】
ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）：スクロース、Ｄ−キシロース、Ｉ−イノシトール、Ｄ−フルクトース及びラフィノースを良好に利用し；Ｄ−グルコース及びＤ−マンニトールを中程度に利用し；Ｌ−アラビノースをわずかに利用し；セルロース及びラムノースを利用しない。
【００４９】
１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列及び系統発生解析
両菌株に対して、１６ＳｒＤＮＡの完全配列を決定した（図２）。配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＡＢ０４５８８２）からのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）ヌクレオチド配列とアライメントし、１２６種類の確認済みＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）菌種の、アライメントを行った１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の系統発生解析を行うことにより、両株の分類学的位置を決定した。最大節約法を用いて、これらの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づく系統樹を作成した。各分類からのブーツストラップ反復推定値を統計信頼度の尺度として使用した。ブーツストラップ反復推定値の９５％で見られる分類を統計的に有意であるとみなした。
【００５０】
菌株ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）は、菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（ストレプトミセス  プラテンシス）ＡＴＣＣ  １３８６５に関連する同じ枝に現れる。この密接な関係はブーツストラップ反復推定値（９２％）により大いに裏付けられており、両分離株が菌種Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（ストレプトミセス  プラテンシス）の異なる株により同定され得ることが示唆される。
【００５１】
表１．
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）属菌  ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）の培養菌の特性（２８℃にて２１日間）
菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）
【００５２】
【表２】
0004538455.tif 000005
【００５３】
菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）
【００５４】
【表３】
0004538455.tif 000006
【００５５】
表２：菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）で見られる主要な脂肪酸
【００５６】
【表４】
0004538455.tif 000007
【００５７】
表３．菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）の炭水化物利用パターン
【００５８】
【表５】
0004538455.tif 000008
【００５９】
炭素源としてこの表の化合物を用いて培養菌の成長を監視した：２８℃にて、７日、１４日及び２１日の間隔で観察を行い、個々の炭素源の利用を下記に挙げた。成長レベル：３＝良好に利用、２＝中程度に利用、１＝わずかに利用、０＝利用なし。
【００６０】
図２．菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＭＡ７３２７）及びＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−５３１７（ＭＡ７３３１）の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列及びデータベースの配列
菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１６（ＮＡ７３２７）１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域（１から１４４９）−配列番号１
【００６１】
【化５】
0004538455.tif 000009
0004538455.tif 000010
【００６２】
菌株ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５３１７（ＮＡ７３３１）１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域（１から１４９６）−配列番号２
【００６３】
【化６】
0004538455.tif 000011
0004538455.tif 000012
【００６４】
化合物Ｉの抗菌活性を決定するために用いたプロトコールを下記に示す。
【００６５】
材料：
陽イオン調整済みミューラーヒントンブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ）（ＭＨ、ＢＢＬ）
５０％  ウマ溶血液（ＬＨＢ、ＢＢＬ）（冷凍保存）
ＲＰＭＩ  １６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）
ヒト血清（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）
ＲＰＭＩ  １６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）
ヘモフィルス試験培地（ＨＴＭ、Ｒｅｍｅｌ）
トリプチケースソイ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ）ブロス（ＴＳＢ、５ｍＬ／試験管；ＢＢＬ）
０．９％  塩化ナトリウム（生理食塩水、Ｂａｘｔｅｒ）
トリプチケースソイ＋５％ヒツジ血液寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＢＬ）
サブローデキストロース寒天プレート（ＢＢＬ）
チョコレート寒天プレート（ＢＢＬ）
２Ｘスキムミルク（Ｒｅｍｅｌ）
Ｍｉｃｒｏｂａｎｋ  Ｂｅａｄｓ（Ｋｒａｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＭＩＣ２０００  マイクロタイタープレート  イノキュレーター
２Ｘトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ、ＢＢＬ）＋１５％グリセロール／５０％ウマ血清
９６ウェルマイクロタイタープレート、蓋、接種トレイ（Ｄｙｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
８チャネルのＦｉｎｎ社製マルチチャネルピペッター、０．５μＬから１０μＬ  容積
方法：
培地の調製
陽イオン調整済みミューラーヒントンブロス（ＢＢＬ）：製造者の使用説明書に従い調製する（１０００ｍＬの水に２２グラムを溶解し、２２分間オートクレーブする。）。冷蔵保存する。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ０．４５Ｔｍセルロースアセテートフィルターを用いて、使用前に濾過滅菌する。
【００６６】
５０％ウマ溶血液：脱繊維素ウマ血液を滅菌蒸留水で１：１希釈し、冷凍し、凍結融解し、再冷凍し（少なくとも７回繰り返す）、次に遠心する。−２０℃で冷凍保存する。
【００６７】
陽イオン調整済みミューラーヒントン＋２．５％ウマ溶血液：１００ｍＬ  陽イオン調整済みミューラーヒントンブロスに、５ｍＬ  ５０％ウマ溶血液を無菌的に添加する。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ０．４５Ｔｍセルロースアセテートフィルターを用いて、使用前に濾過滅菌する。
【００６８】
陽イオン調整済みミューラーヒントン＋５０％ヒト血清：５０ｍＬ  ヒト血清を５０ｍＬ  ２Ｘ陽イオン調整済みミューラーヒントンブロスに無菌的に添加する。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ０．４５Ｔｍセルロースアセテートフィルターを用いて、使用前に濾過滅菌する。
【００６９】
ヘモフィルス試験培地（Ｒｅｍｅｌ）：製造者から調製済みのものを受領する。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ０．４５Ｔｍセルロースアセテートフィルターを用いて、使用前に濾過滅菌する。
【００７０】
０．９％  塩化ナトリウム（生理食塩水；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ）：製造者から調製済みのものを受領する。
【００７１】
２Ｘスキムミルク（Ｒｅｍｅｌ）：製造者から調製済みのものを受領する。
【００７２】
寒天プレートは全て、製造者から調製済みのものを受領する。
【００７３】
【表６】
0004538455.tif 000013
【００７４】
テストを行う抗生物質の最高濃度＝６４μｇ／ｍＬ（５０％  ＤＭＳＯにおける１ｍｇ／ｍＬ溶液から開始した場合）。ウェルあたりＤＭＳＯの最終濃度＝３．２％
分離株の選択及び維持
使用する菌株は、Ｍｅｒｃｋ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は臨床試験のいずれかからの分離株である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ヘモフィルス  インフルエンザ）の菌株は、Ｍｅｒｃｋ社でのインビボ試験に使用されるマウスの病原体である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）株は、細胞壁透過性の菌株である。Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダ  アルビカンス）菌株を対照として使用する。これらの培養菌を、ａ．）Ｍｉｃｒｏｂａｎｋビーズ、ｂ．）２Ｘスキムミルク又はｃ．）２Ｘトリプチケースソイブロス＋１５％  グリセロール／５０％  ウマ血清（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（ヘモフィルス）及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌））中で、−８０℃にて冷凍保存物として維持する。
【００７５】
接種材料調製
選択した分離菌は、チョコレート寒天プレート（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ヘモフィルスインフルエンザ））、トリプチケースソイ＋５％ヒツジ血液寒天プレート（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌））、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（エンテロコッカス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス））、又はサブローデキストロース寒天（Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ））上のいずれかで継代培養し、３５℃でインキュベーションする。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（ヘモフィルス）及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）は、５％  ＣＯ２中でインキュベーションし、他の分離菌は全て、周囲空気中でインキュベーションする。アッセイ前に２回、分離菌を継代培養する。
【００７６】
プレートからコロニーを選択し、これを用いて、トリプチケースソイブロス中で０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準と等しい接種材料を調製する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）の場合は、１．０ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準と等しい密度を有する接種材料を調製する。全培養菌に対する接種材料密度は、ＴＢＳ中にて〜１０８ＣＦＵ／ｍＬである。このＴＢＳ接種材料を滅菌生理食塩水で１：１０に希釈し（４ｍＬ接種材料＋３６ｍＬ生理食塩水；〜１０７ＣＦＵ／ｍＬに相当）、マイクロタイタープレートへの接種に使用するまで氷上で保存する。
【００７７】
ＣＦＵ／ウェルを確認するために、無作為に選択した分離菌のコロニー数を数える（ＴＳＡ  ＩＩ＋５％ＳＢ又はチョコレート寒天プレート上のいずれかに、ＴＳＢ接種材料を１０−５、１０−６播種し、３５℃、ＣＯ２中で一晩インキュベーションする）。
【００７８】
プレートへの注入
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）の全ウェルに、１００ＴＬ培地を満たす。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ヘモフィルス  インフルエンザ）を試験するために、ヘモフィルス試験培地プレートを調製し；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）を試験するために、陽イオン調整済みミューラーヒントン＋５％ウマ溶血液プレートを調製し；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（エンテロコッカス）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌ（大腸菌）及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）を試験するために、陽イオン調整済みミューラーヒントンブロスプレートを調製する。Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）を試験するために、ＲＰＭＩ  １６４０を使用する。血清中のある成分により本化合物が不活性化される（ＭＩＣが上昇することにより示される。）か否かを調べるために、陽イオン調整済みミューラーヒントン中及び陽イオン調整済みミューラーヒントン＋５０％  ヒト血清でＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｓｍｉｔｈ（黄色ブドウ球菌Ｓｍｉｔｈ型）に対するＭＩＣｓを決定する。注入済みプレートをビニール袋で包み（蒸発を最小限に抑えるため。）、凍結保存し、使用前に凍結融解する。
【００７９】
化合物の調製
化合物は重量ベースで調製する。化合物を１００％ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍＬに調製し、次にＤＭＳＯ／２ＸＣＡＭＨＢの１：１希釈で、１ｍｇ／ｍＬに希釈する（最終濃度＝５０％  ＤＭＳＯ／５０％  ＣＡＭＨＢ）。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ９６ウェルプレートにおいて、５０％ＤＭＳＯ／５０％ＣＡＭＨＢで、化合物を連続的に１：１希釈する（開始濃度は１ｍｇ／ｍＬ）。
【００８０】
マイクロブロス希釈アッセイ
Ｆｉｎｎ社製自動マルチチャネルピペットを使用して、(０．５μＬから１０μＬ容積)抗菌性試験溶液  ６．４ＴＬｓを、注入済みマイクロタイタープレートのウェルに添加する（最初のウェルの抗菌剤濃度＝６４μｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯ濃度＝３．２％）。このようにして抗菌剤を添加し、各ウェルのＤＭＳＯ量を一定に保持する（化合物を溶解した状態に維持し、ＤＭＳＯによる非特異的殺菌の可能性について説明するため。）。最終列には、３．２％  ＤＭＳＯの成長対照が含まれる。
【００８１】
各アッセイに対して、対照を試験する。この対照は、本化合物と同様の方法で調製する、ペニシリンＧ及びクロラムフェニコールである。血清タンパク質結合アッセイに対する対照として、エルタペネムが含まれる。
【００８２】
プレート接種
１ウェルあたり１．５ＴＬの接種材料を送達する自動プレート接種装置である、ＭＩＣ２０００システムを用いて、（生理食塩水で希釈した）培養菌をマイクロタイタープレートの全ウェルに接種する。周囲空気中で、プレートを３５℃にてインキュベーションする。非接種プレートも滅菌性をチェックするものとしてインキュベーションする。２２時間から２４時間のインキュベーション後に、結果を記録する。プレートにおいて、成長がないものを調べた。ＭＩＣは、２２−２４時間のインキュベーション後に成長が見られないという結果となった最低抗菌濃度として定義する。
【００８３】
化合物Ｉは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｅ．フェカーリス菌）、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．フェシウム菌）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）及びＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）の様々な菌株に対する抗菌作用を示す。化合物Ｉはまた、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌類(ＶＲＥ)、多剤耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．フェシウム菌）、マクロライド耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌及び、リネゾリド耐性黄色ブドウ球菌及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．フェシウム菌）などの多くの既知の抗生物質に耐性がある様々な菌種に対しても抗菌作用を示す。これらの試験菌株に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値は、０．１μｇ／ｍＬから３２μｇ／ｍＬの範囲にわたる。ＭＩＣｓはＮＣＣＬＳガイドラインに従って算出する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、Ｃ５Ｄ５Ｎ中での化合物Ｉの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、Ｃ５Ｄ５Ｎ中での化合物Ｉの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１】
0004538455.tif 000017
【図２】
0004538455.tif 000018