(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の標準核酸、合成的に製造した標準核酸、又は酵素的に製造した標準核酸で被覆された反応室であって、その被覆が、担体核酸を添加され、標量化された標準核酸により、前記反応室の内壁の化学的に又は生化学的に改変されていない表面上に、非共有的方法で設けられていることを特徴とする、前記の反応室。
【請求項２】
ガラス容器若しくはプラスチック容器、又はガラス毛細管であることを特徴とする、請求項１に記載の反応室。
【請求項３】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの合成同等物、又はｄＵ含有ＤＮＡを標準核酸として用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の反応室。
【請求項４】
（ａ）標準核酸としてのＤＮＡの希釈には、担体核酸として分析すべき核酸化合物に対して相同性が可能な限り小さいＤＮＡを含む溶液を使用し、そして（ｂ）標準核酸としてのＲＮＡの希釈には、担体核酸としてｔＲＮＡを含む溶液を使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応室。
【請求項５】
超音波処理によって、平均長さが約１〜２ｋｂで容易に脱着可能な断片に、予め変換させておいたラムダファージのＤＮＡを、担体核酸として使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応室。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の反応室を製造する方法であって、酵素的増幅に適した反応室中に、標量化した標準核酸及び添加した担体核酸をアリコート化して直接入れ、続いて、凍結乾燥又は真空−遠心凍結乾燥することによって前記反応室の内壁中に非共有的に直接吸着させることを特徴とする、前記製造方法。
【請求項７】
プラスチック容器又はガラス毛細管を被覆することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの合成した同等物、又はｄＵ含有ＤＮＡを標準核酸として用いることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）標準核酸としてのＤＮＡの希釈には、担体核酸として分析すべき核酸化合物に対して相同性が可能な限り小さいＤＮＡを含む溶液を使用し、そして（ｂ）標準核酸としてのＲＮＡの希釈には、担体核酸としてｔＲＮＡを含む溶液を使用することを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
超音波処理によって、平均長さが約１〜２ｋｂで容易に脱着可能な断片に、予め変換させておいたラムダファージのＤＮＡを、担体核酸として使用することを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応室を、異なる分析対象の配列に特異的で標量化した複数（少なくとも２種）の標準核酸で同時に被覆することを特徴とする、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の標準核酸が、異なる細胞の又は異なる生物起源の、あるいは異なる種が起源の核酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロタイター形式で配置した少なくとも９６個の反応室の被覆を、測定すべき分析対象核酸の予測される全濃度範囲をカバーし、徐々に減少する濃度の分析される核酸に特異的な標準核酸少なくとも１２×８個を用いて実施することを特徴とする、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記の被覆した反応室が、少なくとも９６個の容器が入る適当な担体箱中に直立して閉鎖されている、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標量化した標準核酸とは別に、プライマー又はプローブとして作用する特異的に標識化した又は標識化していないオリゴヌクレオチド少なくとも２種類、担体核酸、及び酵素的増幅に要求される別の反応成分を前記反応室中に凍結乾燥した形態で含むか、あるいは、プライマー又はプローブとして作用する特異的に標識化した又は標識化していないオリゴヌクレオチド、担体核酸、及び酵素的増幅に要求される別の反応成分を、標準核酸を含まない別々の容器中に凍結乾燥した形態で含む、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試験キット中に含まれる請求項１〜５のいずれか一項に記載の標準核酸で被覆された反応室の、生物学的検体中の分析される核酸の検出における使用。
【請求項１７】
前記試験キットが、オリゴヌクレオチド少なくとも２種類及び担体核酸１種類をフィルム／ホイルで閉鎖したゼプトストリップ少なくとも１個を含み、前記ゼプトストリップが、８種の核酸濃度で被覆されている閉鎖された反応室の８連ストリップである、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸で被覆された反応容器（ｇｅｆａｅｓｓｅ）、標準核酸で反応容器を被覆することによる前記反応容器の製造方法、本発明方法によって製造される標準ストリップを含む試験キット、その目的に適した少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドのセット、担体核酸、及び生物学的物質中における選択された核酸の定量的検出に関する複数の利用可能性に関する。
【０００２】
臨床的な研究及び診断、薬理学的薬剤試験、及び食品分析における多くの分野で、分析すべきサンプルにおいて、決定した核酸（デオキシリボ核酸［ＤＮＡ］又はリボ核酸［ＲＮＡ］）の濃度の正確な認識が要求される。分析対象物の濃度が非常に低い測定に対しては、酵素による増幅法がしばしば用いられる。これに関して、特に、以下の方法：すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，ＵＳＰ４６８３１９５及び４６８３２０２，ＥＰ０２０１１８４；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，イリノイ州，米国）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ，Ｗａｌｋｅｒら，［１９９３］，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．．３：１−６  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｒｅｓａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）、及び転写媒介増幅（ＴＭＡ，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）を挙げることができ、これらによって、分析対象核酸の濃度を非常に高感度で測定することができる。全ての前記技術を定量に使用するための必要条件は、正確に規定された濃度の、適当な合成又は天然核酸標準物の入手可能性であり、これらの標準物は、いずれも、外部標準物として使用される、すなわち、平行アッセイにおいて増幅されるか、又は内部標準物として、すなわち、同じアッセイにおいて同時に増幅される、いわゆる競合物として使用される。適当な標準物の製造は、当業者に公知である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｈａｌｔｅｒ  １９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１：２６８−２７９，Ｋｏｅｈｌｅｒら，１９９５，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  −  ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。しかしながら、これらの標準物を、安定で利用が容易な形態に変換させる場合に、工程技術の点で今まで未解決の問題が存在し、このことは、未知の核酸濃度に関して再現性を有する測定を行うための基本的な必要条件である。特に、高度に希釈した核酸を、可能な限り最良に貯蔵する場合に、問題がある。これらの問題は、実際に、非常に低濃度の標準物希釈シリーズ〔反応アッセイ当たり約１〜１０００００分子数；これは、−２０℃〜−８０℃の温度で貯蔵した場合であっても、しばしば不安定である（Ｋｏｅｈｌｅｒら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：７２２−７２６）〕について、ほとんどの場合に実際的に実施される点に本質的に基づいている。この問題の解消は、検出すべき核酸配列に対する配列相同性が可能な限り少ないことを特徴とする特定の担体核酸の規定量を低濃度核酸希釈物に添加した形態で、前記の低濃度核酸希釈物を安定化することによる（ＤＥ  Ｋａｎｔら，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：９３４−９４２；Ｋｏｅｈｌｅｒら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：７２２−７２６）。しかしながら、これは、常に成功するとは限らず（図１参照）、従って、一般的に、毎日規定濃度の原液から新たに出発して、全ての必要な希釈工程を実施することが推���されている。しかしながら、これは、使用する前記の標準物を労働集約的方法で調製しなければならず、ピペット作業の精度が変化し、そして高価な希釈バッチを部分的にしか使用することができないという欠点をもたらしている。こうして、費やされる経費及び時間が自動的に増加すると同時に、その方法論の再現性及び信頼性が減少する。利用技術の観点から言えば、前記手順は不経済であって、いくつかの攪乱因子に支配され、従って、診断上の定型的実験室用としては不適切である。
【０００３】
本発明の課題は、当業界の現状の方法による欠点を解消することができ、適用が容易であり、そして品質を変えずに長期間貯蔵することができ、更に、試験キットの構成員であることもできる容器（Ｇｅｆａｅｓｓｅ）及び方法を開発することにある。
【０００４】
前記の課題は、以下の工程：
・吸着可能な適当な核酸標準物を調製及び精製し、
・高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（下記において検量と称する）によって前記生成物の正確な濃度を決定し、
・規定量の担体核酸を加えた前記の検量標準物から希釈シリーズを調製し、
・増幅反応に適した反応室上に、前記の標準／担体核酸化合物を本発明により吸着させる（こうすることによって、標準物として使用可能で規定どおりに被覆された容器は、品質を下げずに、長期間に亘って耐久性を有する形態に転換することができる）ことを含んで、規定の標準核酸濃度で反応室（ｒｅａｕｍｅｎ）を被覆することによって、解決することができる。
【０００５】
本発明の別の主題事項は、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドのセット、定型的実験室の要求を満たす試験キット、及び前記方法の多くの使用可能性である。
続いて、本発明を、分子生物学的方法に関して説明する。すなわち、予備的酵素増幅と組み合わせて種々の生物学的材料中の最小量の分析対象核酸の量を（好ましくは自動的に）定量的に測定するための基礎を説明する。本発明の方法は、定量的な酵素的増幅反応の標準化に適した形態に核酸を転換することを含む。驚くべきことに、本発明の方法によると、核酸で被覆され、いわゆる“使用準備のできた（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）”標準反応室を製造することができることが分かった。これは、簡単に使用するように生産されたものであり、長期間に亘って問題なく、品質を変化させずに貯蔵することができ、そして試験キット用の成分として用いることができる。従って、定型的診断実験室の要件を、特に自動化分析の観点から良好に満たすことができる。
【０００６】
本発明の観念において、核酸は、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはＤＮＡ及びＲＮＡの合成同等物、並びにＤＮＡにおける天然のデオキシチミジン（ｄＴ）塩基を、完全に又は部分的にデオキシウラシル（ｄＵ）によって置換したＤＮＡを意味する。適当な核酸標準物を調製し、好ましくは特定のプライマーヌクレオチドを用いるＰＣＲによって、当業者に公知の形態にする（実施例１，項目１Ａ−Ｂ）。核酸標準物としては、酵素的に調製した天然増幅生成物、又は合成核酸を使用し、その核酸配列は、決定すべき配列に相同性があるか、あるいは好ましくは同一であるか、あるいは１又は複数の点突然変異、欠失、若しくは挿入（これらは、そのプライマー又はプローブが結合する位置よりも外側に位置することが好ましい）により特徴付けられる。ＤＮＡ標準物は、標的配列を酵素的に（好ましくはＰＣＲによって）増幅することによって調製するのに対し、ＲＮＡ断片は、ＲＮＡポリメラーゼを用いるイン・ビトロＲＮＡ合成によって、公知の方法で得ることができる（実施例２，項目２．１．，Ｃ参照）。この調製された核酸断片に対して、次に、精製手順を適用する。好ましくは、アガロースゲル電気泳動で処理し、次に分離したゲルから標準核酸を抽出することによってＤＮＡを精製する（実施例１，項目１Ｂ）。これに対し、イン・ビトロで調製したＲＮＡは、当業者に公知の方法で前記のイン・ビトロ合成アッセイから抽出する（実施例２，項目２．１．，Ｃ参照）。精製した核酸生成物の濃度の正確な測定は、好ましくはＨＰＬＣによって得られる（Ｋｏｅｈｌｅｒら．１９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：７２２−７２６，実施例１，項目２）。次に、前記の測定した標準核酸の希釈シリーズを調製する。ＤＮＡ標準物の希釈には、好ましくは、約１〜２キロ塩基（ｋｂ）の断片に超音波処理（５×１分間持続）することによって、ラムダファージ（例えば、株：ラムダｃｌ８５７Ｓａｍ７，４８５０２ｂｐ，ラムダＤＮＡ）のＤＮＡを形質転換することによって調製されるＤＮＡ溶液を使用する（実施例１，項目３；アガロースゲル電気泳動によってフラグメントの平均長さを決定）。この工程は、凍結乾燥工程の間に吸着の向上をもたらし、そして反応室中の標準核酸の耐久性の増加に貢献するものと考えられる。また、前記ラムダＤＮＡを修正せずに用いること、又はラムダＤＮＡの代わりにＥ．ｃｏｌｉのｔＲＮＡを用いることもできる。ＲＮＡ標準物の希釈には、好ましくは、トランスポートＲＮＡ（ｔＲＮＡ）溶液を使用する（Ｋｏｅｈｌｅｒら，１９９５，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，実施例２，項目２．２．）。
【０００７】
測定パラメータを定量するために、種々の標準希釈物を調製する（実施例１，項目３；実施例２，項目２．２）。これらの希釈物により、測定すべき分析対象の完全な生理学的又は技術的濃度範囲を好適に測定することができる。それらのアリコートは、反応室を被覆するために使用され、その反応室内で、例えば、検量グラフの確立に必要な酵素的核酸増幅が実施されることになる。好ましくは、別々の反応室８個を、８種類の標準希釈物で被覆する〔いわゆる、八重ストリップ（８−ｅｒ  ｓｔｒｉｐ）〕。本発明によると、前記担体核酸を補った前記のそれぞれの標準核酸希釈物のアリコートを、使用する反応室内で直接穏和に乾燥させることによって前記被覆を実施する（実施例１，項目４；実施例２，項目２．３．）。特に好ましい方法では、前記凍結乾燥は、真空遠心分離又は冷凍乾燥機によってもたらされる。別の態様においては、前記乾燥は、同等の乾燥法、例えば、マイクロ波（例えば、ＧＷＥ  ｍｂＨ，Ｌｅｕｎａにより販売されている）による過加熱を伴わない生成物乾燥法によって実施する。製造した被覆反応室（例えば、前記のもの）は、吸着した核酸標準物が、被覆に使用した反応室の内部表面上に強固に接着するので、例えば、郵便による出荷が問題を起こさないことを保証することができるという特徴を有する。図１〜図４では、ある典型的な態様において、本発明の方法により調製した核酸標準物によって品質的要求が満たされることが示されている。前記の方法に基づく製造物の実施−関連試験には、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００配列検出システム［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ］（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（これが、現在最良であり、非常に再現性のある結果を生じる）が用いられた。本発明を使用し、検出自動装置により、−０．９９より大きい相関関係を含有し、本質的に高い再現性がある検量グラフを確立することができる（図１）。本発明によりＤＮＡで被覆された反応室（実施例１）〔例えば、いわゆる“光学的”ＰＣＲ管〕は、従来から使用されているＰＣＲ標準物と比較して明らかに高い安定性を有し（図２）、また、室温においてさえ１年を超えて品質を損なわずに貯蔵することができる（図３）ので、当業界の現状のものよりも優れている。イン・ビトロで合成したＲＮＡで被覆した反応室は、−２０℃及び室温において、少なくとも６ヶ月間安定である（図４，実施例２）。
【０００８】
前記の被覆反応容器は、少なくとも９６個の容器を含む適当な担体箱中で直立しており、自己接着フィルム（例えば、プラスチックフィルム、アルミホイル、又はパラフィルム［ｐａｒａｆｉｌｍ］）で密閉して、貯蔵及び輸送の間に外部の核酸により汚染することを回避する。１つの八重ストリップは、それぞれ、一つのフィルム／ホイルで閉鎖されており、従って、１つのストリップは、被覆に使用する８種類の濃度の核酸を含んでおり、これを“ゼプトストリップ（ＺｅｐｔｏＳｔｒｉｐ）”と称する。
【０００９】
前記反応室中には、前記の測定された核酸とは別に、プライマー又はプローブとして作用する標識されているか又は標識されていない特異的なオリゴヌクレオチド少なくとも２種、並びに酵素的増幅に要求される更なる反応成分を、凍結乾燥形態で含有することができる。あるいは、使用される反応室は、プライマー又はプローブとして作用する前記の特異的なオリゴヌクレオチド、前記担体核酸、又は酵素的増幅に要求される更なる反応成分を、凍結乾燥形態で、単独で含有することもできる。本発明の試験キットは、“ゼプトストリップ”少なくとも１組み、オリゴヌクレオチド少なくとも２個、及び担体核酸１種類からなる。
【００１０】
本発明の本質は、相互に作用し合う公知の要因と新規アプローチとの組合せにあり、そして今では、使用上の利点及び所望の成功をもたらす前記の新規の全効果（これは、生物学的物質における選択された核酸の定量的検出用の使用準備ができている標準反応室からなる）を得ることができるようになった。
【００１１】
従って、従来技術の前記の欠点を克服した結果として、本発明の方法は、以下の利点を特徴とする：
１．使用される反応区画中に、標準化に用いる希釈した酸を、手動で又は自動的に移動させることが不必要である、なぜなら、それらの酸が凍結乾燥形態で既に反応容器中に存在しているからである。これによってユーザーフレンドリー性が大きく増加している、なぜなら、必要なことが、前記の使用準備のできた標準ストリップを取り出して、９６ウェル担体プレート中に挿入するだけであるからである。続く増幅反応用の前記の好ましい予備混合試薬を添加するだけで、これ以上の操作は必要ない。従って、この簡易化によって、定量的酵素反応の一貫した自動化が可能である。
２．今後は、濃縮した標準物をピペッティング操作することがなくなるので、その結果、潜在的な汚染源が排除され、従って不正確な陽性結果の危険性が非常に減少する。
３．非水性培体中に前記標準核酸を移動することにより、（ａ）標準物として用いる核酸が微生物によって望ましくない分解をうける可能性が、制限又は予防され、そして（ｂ）非常に低濃度の核酸においてさえ、室温においてでさえ、非常に長期にわたる貯蔵能力が達成される（図２〜４）。この利点は、出荷及びこの方法に基づく試験キットの適用を、非常に大幅に促進する。
４．使用する前記担体核酸は、希釈シリーズの調製に使用する一方通行（Ｅｉｎｗｅｇ）材料中への標準物の非特異的な吸着を予防し、また（ＰＣＲアッセイへ添加することにより検出可能となり）同時に、前記の酵素増幅に対する強力な「増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」である。
【００１２】
図１は、本発明の方法により調製したｍｄｍ−２（ｍｕｒｉｎｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ−２）核酸標準物を用い〔或る標準ストリップ、すなわち、８種類の凍結乾燥したｍｄｍ−２標準核酸濃縮物を使用〕、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００配列検出システムにおいて、実時間（リアルタイム）ＰＣＲ生成物測定によって得られる典型的な検量グラフを示す（実施例１，項目５）。この場合に計算された相関係数は、−０．９９６であった。
【００１３】
図２は、本発明の被覆方法及び図１のものと同様の実時間検出を用いた場合と、当業界の現状との比較を、グラフ形態で示す。種々の濃度（ＰＣＲアッセイ当たりの分子数５０、２５０、２５００、１００００、及び５００００）の従来の、すなわち水性培体中で貯蔵し、試験当日にアリコートし、担体ＤＮＡを補足したｍｄｍ−２標準ＤＮＡフラグメントを、同じ濃度の凍結乾燥標準物と比較した。従来の方法により貯蔵し、特に非常に低濃度（アッセイ当たりの分子数５０又は２５０）の標準物は、１４日間の貯蔵及び４回の冷凍／解凍サイクルの後、完全に分解されている（これは、増幅能力０に相当する閾値サイクル４０に到達することによって示されており、グラフ中に反映されている）。一方、凍結乾燥標準物（ゼプトストリップ）を使用すると、最も低い核酸濃度を使用した場合であっても、欠損は全く検出されない。
【００１４】
図３は、−２０℃又は室温で１年間貯蔵した“ｍｄｍ−２−ＤＮＡ”ゼプトストリップを使用して得られたＰＣＲの結果を示す。前記貯蔵温度とは無関係に、全く同一のＰＣＲの結果、すなわち、ＣT値（すなわち、平行曲線）が得られたことを認めることができる。これらの結果から、前記の固定化したｍｄｍ−２−ＤＮＡは、アッセイ濃度や貯蔵温度に関わらず、全試験期間に亘って安定なままで維持されると推察することができる。
【００１５】
図４は、−２０℃又は室温で６ヶ月間貯蔵した“ｂｃｌ２−ｃＲＮＡ”ゼプトストリップを使用して得られたＴａｑＭａｎ  ＰＣＲの結果を示す。ｍｄｍ−２−ＤＮＡに対する結果と類似して、前記の固定化したｂｃｌ２−ｃＲＮＡもまた、アッセイ濃度や貯蔵温度に関わらず、全試験期間に亘って安定であった。
【００１６】
核酸で被覆された前記反応容器の本発明による使用は、生物学的物質中の選択された核酸を検出するキットにおいて実施する。前記試験キットは、オリゴヌクレオチド少なくとも２種類及び担体核酸１種類をフィルム／ホイルで閉鎖した八重ストリップ少なくとも一組を含有する。
以下の実施例は、本発明を説明するために提供するものであり、それらに限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
【実施例１】
《規定濃度の二本鎖ｍｄｍ−２標準ＤＮＡによるポリプロピレン反応室（“光学的管［ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｕｂｅ］”）の被覆》
１．１，ＰＣＲによるｍｄｍ−２−特異的標準ＤＮＡ断片の調製
Ａ．ＡＤＲ５０００Ｔ−リンパ腫細胞系から単離された全ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製（培養培体１ｍＬ当たりアドリアマイシン５μｇを用いた耐性選択）
ＲＮＡ１μｇを、ＡＭＶ逆転写酵素緩衝液（トリス／ＨＣｌ２５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．３；ＫＣｌ２５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ2５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ジチオトレイトール５０ｍｍｏｌ／Ｌ，スペルミジン２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＡＭＶ逆転写酵素５Ｕ、ｄＮＴＰそれぞれ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウイスコンシン州，米国）、組換えＲＮアーゼ阻害剤１０Ｕ（ＡＧＳ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ）、オリゴ（ｄＴ）２００ｎｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）からなる標準反応アッセイ２０μＬ中のＲＮＡｚｏｌ（商標）“Ｂ”（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，テキサス州，米国）によって精製して、１時間かけて４２℃でｃＤＮＡ中に転写した。
【００１８】
Ｂ．ＰＣＲ増幅及びその生成物の精製
〔ＰＣＲ〕
前記で調製したｃＤＮＡのアリコート各２μＬを、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）９６００Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ）中で、３’プライマー又は５’プライマーのいずれかそれぞれ１００ｎｇ、１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（トリス／ＨＣｌ１００ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．３；ＭｇＣｌ2５００ｍｍｏｌ／Ｌ，ゼラチン０．０１％［ｗｔ／ｖｏｌ］）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ポリメラーゼ１．５Ｕ（Ｎｏｒｗａｌｋ，コネチカット州，米国，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及びｄＮＴＰ８μＬ（ｄＴＴＰに換えてｄＵＴＰを使用した各ヌクレオチド０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）からなる６個の同一の５０μＬ標準ＰＣＲアッセイ中で増幅する。
【００１９】
〈プログラム〉
９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間、３５サイクル
〈使用した増幅プライマー（ｍｄｍ−２に対するＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｄｅ：Ｉ２５３４１）の配列〉
ＭＤＭ２ＰＲ１（１２４５−１２６４）  ５’−ＧＣＣ．ＡＡＧ．ＡＡＧ．ＡＴＧ．ＴＧＡ．ＡＡＧ．ＡＧ−３’
ＭＤＭ２ＰＲ２（１４３９−１４５５）  ５’−ＡＣＴ．ＧＧＧ．ＣＡＧ．ＧＧＣ．ＴＴＡ．ＴＴ−３’
〈増幅されたＤＮＡ断片の長さ〉
２１１ｂｐ
【００２０】
〈アガロースゲル電気泳動による前記２１１ｂｐ断片の精製〉
１．５％アガロースゲル［Ｅａｓｙ−Ｃａｓｔ（商標）Ｍｉｎｉｇｅｌ，ＡＧＳ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ］を調製する。すなわち、ゲルスロットは、６つのカム状物（ｋａｍｍ）を有し、その部屋にＴＡＥ緩衝液（サブマリンゲル）を充填する。
調製したＰＣＲアッセイを貯蔵し、そして定量的に適用する。
１００Ｖで４５分間、前記電気泳動を実施する。
ＵＶ光中で見ることができる臭化エチジウム着色バンドを製造し、それらをメスを用いて可能な限り正確に及びすばやく切り取り、１．５ｍＬエッペンドルフ容器中に入れる。
指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｔｅｎ）を用いて（Ｈ2Ｏで溶出）、ゲル塊からＤＮＡを精製した。
【００２１】
１．２，ＨＰＬＣによる標準原液の検量
〈ＨＰＬＣ装置〉
３−Ｌｉｎｅ  Ｄｅｇａｓｓｅｒ  ＤＧ−９８０−５０，ＰＵ−９８０インテリジェントＨＰＬＣポンプ，低圧力勾配形成器，ＵＶ−９７５  ＵＶ／ＶＩＳ検出器，ＡＳ−９５０インテリジェントサンプラー，Ｃｏｌｕｍｎ−Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ  Ｊｅｔｓｔｒｅａｍ  ２（Ｊａｓｃｏ  Ｌａｂｏｒ  ｕｎｄ  Ｄａｔｅｒｎｔｅｃｈｉｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｇｒｏｓｓ−Ｕｍｓｔａｄｔ，ＦＲＧ）
〈固定相〉
ＴＳＫ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍＩＤ，長さ：３５ｍｍ）及びＤＥＡＥ−ＮＰＲプレカラム（４．６ｍｍＩＤ，長さ：５ｍｍ）（ＴｏｓｏＨａａｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｒｏｓｓ−Ｕｍｓｔａｄｔ，ＦＲＧ）
〈移動相〉
緩衝液Ａ：トリス／ＨＣｌ２５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＣｌ１ｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ９．０
緩衝液Ｂ：トリス／ＨＣｌ２５ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ９．０
【００２２】
〈ＨＰＬＣ実施条件〉
圧力：８０〜１２０ｂａｒ（最大２００ｂａｒ）
流速：１ｍＬ／分
温度：２０℃
２６０ｎｍにおいてＵＶ検出
分析対象：精製したＰＣＲ断片約１０〜２００ｎｇに緩衝液Ｂ４０μＬを補う、すなわち、実施例（どの例でも二重検出）ごとに２０μＬを注射する。
標準（別々に実施）：緩衝液Ｂ３６μＬ及びＬｏｗ  Ｍａｓｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（商標）４μＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州，米国）〔１００〜２０００ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片６種類（バンド当たりのＤＮＡ最終濃度：５〜１００ｎｇ）からなる〕を合わせ、実施例ごとに２０μＬを注射（二重検出）する。
以下に記載の方法で、不連続勾配プログラムを２５分間実施する：
１．緩衝液Ｂ中２５％緩衝液Ａで、カラムを平衡化
２．Ｂ中２５％Ａ：０．５分の時点までサンプルを適用
３．Ｂ中２５〜４３％Ａ：直線勾配０．５〜４．５分
４．Ｂ中４３〜６０％Ａ：直線勾配４．５〜２０分
５．Ｂ中６０〜１００％Ａ：直線勾配２０〜２２分
６．Ｂ中１００〜２５％Ａ：直線勾配２２〜２４分
７．Ｂ中２５％Ａ：平衡２４〜２５分
【００２３】
続いて、得られたデータを、Ｂｏｒｗｉｎ（商標）クロマトグラフィーソフトウェア，バージョン１．２０（ＩＭＢＳ  Ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｍｅｎｔｓ，フランス）によってピークを積分する。精製ＤＮＡ標準物の正確な濃度を測定するために、個々のピークを下回る表面を評価した。Ｌｏｗ  Ｍａｓｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（商標）によって得た検量グラフを用いて、未知濃度の標準核酸を計算した。
【００２４】
１．３，担体ＤＮＡによる標準物希釈シリーズの調製
〈担体核酸〉
１０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭＥＤＴＡ（０．５ｍＬ）に溶解した１０ＯＤラムダ（ｄａｍ＋）ＤＮＡ（起源：バクテリオファージ・ラムダｃｌ８５７  Ｓａｍ７，ＡＧＳ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を、５ｘ１分の間隔で約１〜２ｋｂの断片中に転移し、そして最大出力の超音波浴（Ｔｒａｎｓｓｏｎｉｃ  Ｔ５７０，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）によって氷上で中間冷却し；それらの１０ｎｇ／ｍＬ希釈物（１：１００）〔以下、ラムダＤＮＡと称する〕を調製した。
【００２５】
ｍｄｍ−２（２０ｘ濃度）に対する標準物希釈シリーズの調製
【表１】
0004496317.tif 000002
【００２６】
前記標準物希釈シリーズ５μＬを、それぞれ、別々の１．７ｍＬマルチツイストトップバイアル（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ユタ州，米国；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒ：Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ：カタログ番号：８１８４．１）中にピペットで入れて、使用準備のできた標準溶液を調製する。更に１９種類の標準物（標準核酸当たり、それぞれ５μＬ）を加え、そして必要であれば、ラムダＤＮＡを補給して最終体積１００μＬにすることによって、多機能ストリップ（すなわち、複数の異なる核酸配列を順々に又は同時に定量的に測定することに適したストリップ）を生成する。
【００２７】
１．４，反応室の被覆
サブ項目３で調製した使用準備のできた標準溶液５μＬを、それぞれ、８個の別々の“光学的管”（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号：Ｎ８０１０９３５）中に（Ａ１の位置からＡ８の位置に亘って次第に濃度が減少するように）ピペットで入れる。このアリコート化は、ピペッティングロボット（例えば、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００，Ｂｅｃｋｍａｎ社）によって実施すると、品質が向上するので好ましい。
増幅容器を黒色エッペンドルフ遠心アダプター（０．２ｍＬ）中に挿入し、そして完全な乾燥が達成されるまで、ローター逆加熱がある真空遠心分離機（例えば、Ｕｎｉｊｅｔ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ａｓｐｉｒａｔｏｒを備えたＵｎｉｖａｐｏ  １００Ｈ，ＵｎｉＥｑｕｉｐ社）中で、３０分間かけて前記サンプルを凍結乾燥する。
【００２８】
１．５，生成したストリップについてのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００配列検出システムによる試験
《最適化ｍｄｍ−２ＴａｑＭａｎ（商標）法》
〈プログラム〉
２工程−ＰＣＲ  ９５℃  １０：００分，連続的
４０サイクル    ９５℃  ００：１５分
６０℃  ０１：００分
【００２９】
〈反応条件〉
６０ｍＭ  ＭｇＣｌ2
１０ｐＭ  プライマー  ｍｄｍ−２Ｐｒ１１及びｍｄｍ−２Ｐｒ２１
２ｐｍｏｌ  ｍｄｍ−２プローブ
５０ｎｇ  ラムダＤＮＡ（５μＬ）
２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（商標）
ｄＮＴＰ（ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）Ｇｏｌｄを含むＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔに入っているもの）
アッセイ体積：５０μＬ
【００３０】
〈使用したプライマー及びプローブの配列（ｍｄｍ−２に対するＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｄｅ：Ｉ２５３４１）〉
ｍｄｍ２Ｐｒ１１（１２９５−１３１８）  ５’−ＧＡＧ．ＡＧＴ．ＧＴＧ．ＧＡＡ．ＴＣＴ．ＡＧＴ．ＴＴＧ．ＣＣＣ−３’
ｍｄｍ２Ｐｒ２１（１３５２−１３７３）  ５’−ＴＧＣ．ＡＡＣ．ＣＡＴ．ＴＴＴ．ＴＡＧ．ＧＴＣ．ＧＡＣ．Ｃ−３’
ｍｄｍ２プローブ（１３２０−１３５０）  ５’−ＦＡＭ−ＴＴＡ．ＡＴＧ．ＣＣＡ．ＴＴＧ．ＡＡＣ．ＣＴＴ．ＧＴＧ．ＴＧＡ．ＴＴＴ．ＧＴＣ．Ａ−ＸＴ−３’−ＴＡＭＲＡ
【００３１】
【実施例２】
《規定濃度のｂｃｌ２標準複製ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）によるポリプロピレン反応室（“光学的管”）の被覆》
２．１，天然ｂｃｌ２ｍＲＮＡに配列が相同的なｂｃｌ２標準ｃＲＮＡの調製
（Ｇｒａｓｓｉ  Ｇ．，Ｚｅｎｔｉｌｉｎ  Ｌ．，Ｔａｆｕｒｏ  Ｓ．，Ｄｉｖｉａｃｃｏ  Ｓ．，Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ．，Ｆａｌａｓｃｈｉ  Ａ．，Ｇｉａｃｃａ  Ｍ．，Ａ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ＲＮＡｓ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９４；２２：４５４７−４５４９による変形した方法に従う）
【００３２】
Ａ．挿入したＴ７プロモーターを有するｂｃｌ２テンプレートＤＮＡの調製
〈ＰＣＲ１によるｂｃｌ２標的断片の調製〉
ＣＣＲＦ  ＡＤＲ５０００  ｃＤＮＡ１００ｎｇ（実施例１．１，Ａ参照）を、例えば実施例１．１，Ｂに記載のとおりに、ＴＲＩＯ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（商標）４８Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）中で増幅した。
温度プロフィールＰＣＲ１：９４℃で３０秒間，５５℃で３０秒間，７２℃で１分間（４０サイクル）
【００３３】
〈使用した増幅用プライマー（ｂｃｌ２に対するＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｄｅ：Ｍ１４７４７）の配列〉
ＢＣＬ２ＰＲ１（３４９８−３５１６）：  ５’−ＣＴＴ．ＴＴＧ．ＣＴＧ．ＴＧＧ．ＧＧＴ．ＴＴＴ．Ｇ−３’
ＢＣＬ２ＰＲ２（３８９６−３９１５）：  ５’−ＣＴＴ．ＣＴＣ．ＣＴＴ．ＴＴＧ．ＧＧＧ．ＣＴＴ．ＴＴ−３’
〈増幅したＤＮＡ断片の理論的長さ〉
４１８ｂｐ
【００３４】
《前記で合成したｂｃｌ２標的断片中へのＰＣＲ２による前記Ｔ７プロモーター配列の挿入》
【表２】
0004496317.tif 000003
【００３５】
前記増幅は、以下の温度プロフィールに従って実施する、すなわち：
（１回）９５℃で１０分，（４０サイクル）９５℃で３０秒間，５５℃で３０秒間，７２℃で１分間，（１回）７２℃，５分，４℃で∞
【００３６】
〈使用した増幅用プライマーの配列〉
ＢＣＬ２ＰＲ２（３８９６−３９１５）：（前記参照）
ｂｃｌ２−ｌＴ７：（下線を引いた配列：Ｔ７プロモーター）
５’−ｃｇｇ．ｇａｔ．ｃｃｇ．ｇａｔ．ｃｃｔ．ａａｔ．ａｃｇ．ａｃｔ．ｃａｃ．ｔａｔ．ａｇｇ．ｇａｇ．ａＣＴ．ＴＴＴ．ＧＣＴ．ＧＴＧ．ＧＧＧ．ＴＴＴ．ＴＧ−３’
〈増幅したＤＮＡ断片の理論的長さ〉
４５５ｂｐ
【００３７】
Ｂ．前記ｂｃｌ２Ｔ７−ＤＮＡ断片の精製及び検量
例えば、実施例１．１．及び１．２に記載のとおりに実施する。
Ｃ．イン・ビトロｃＲＮＡ合成（同一のアッセイ３個の調製）
【表３】
0004496317.tif 000004
【００３８】
このアッセイのインキュベーションは、恒温振とう器中で、３７℃で１時間実施した。
ｃＲＮＡの収率を増加させるために、前記インキュベーションの終了後に、更にＴ７ポリメラーゼ２０Ｕを加え、その後、更に３７℃で１時間インキュベーション（恒温振とう器）した。
続いて、全ての３個のアッセイを混合し、そしてＤＮａｓｅ  Ｉ６０Ｕ（ＲＮアーゼ不含，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３７℃で５０分間消化した。
【００３９】
前記ｃＲＮＡの精製は、例えば「Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｔ．，Ｌａｓｓｎｅｒ  Ｄ．，Ｒｏｓｔ  Ａ．−Ｋ．，Ｔｈａｍｍ  Ｂ．，Ｐｕｓｔｏｗｏｉｔ  Ｂ．，Ｒｅｍｋｅ  Ｈ．，Ｅｄｓ．：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ｐ．３６−３７」に記載の通常のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出によって実施した。
前記ｃＲＮＡの沈殿は、−２０℃で約３時間かけて実施し、その後、７８％エタノール３００μＬで３回洗浄し、次に遠心分離し、そしてそのペレットを９６％エタノール１００μＬ下で−２０℃で一晩貯蔵した。
【００４０】
翌日、真空遠心分離器（Ｕｎｉｖａｐｏ１００Ｈ，ＵｎｉＥｑｕｉｐ）中でペレットを乾燥し、その乾燥したペレットをＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ２５μＬ中に入れ；２×２μＬアリコートをＵＶ２６０／２８０で測定してから、石英セル５００μＬ中で濃度を検出した。
全ての３個のアッセイの全収量は、２６０／２８０＞１．８の割合のｃＲＮＡ２３μＬであった。
【００４１】
Ｄ．非変性アガロースゲル電気泳動による合成したｃＲＮＡの特徴付け
（Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ．Ｌ．，Ｚａｙａｔｉ  Ｃ．，Ｄｅｔｍｅｒ  Ｊ．Ｊ．，Ｄａｌｙ  Ｂ．，Ｋｏｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ａ．，Ｃｈａ  Ｔ．Ａ．，Ｉｒｖｉｎｅ  Ｂ．Ｄ．，Ｔｕｃｋｅｒ  Ｊ．，Ｕｒｄｅａ  Ｍ．Ｓ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５；２２６：１２０−１２９による変形した方法に従う）
【００４２】
一晩かけて２％Ａｂｓｏｌｖｅ  ＮＥＦ−９７１Ｇ洗浄溶液（ＤｕＰｏｎｔ）によってミニゲルチャンバー〔Ｅａｓｙ−Ｃａｓｔ（商標），ＡＧＳ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ〕からＲＮアーゼを除去し、続いてＤＥＰＣ  Ｈ2Ｏで２回濯いだ。
〈ゲルの調製〉
１ｘＴＡＥ緩衝液（原液をＤＥＰＣ  Ｈ2Ｏで５０倍にしたもの）（臭化エチジウム［１０％ＥｔＢｒ１．６μＬ］を注ぎ入れる）を用いて１％アガロースゲル（Ｑｕａｌｅｘ−Ｇｏｌｄ−Ａｇａｒｏｓｅ，  ＡＧＳ）を調製し、１０個づつまとめる；作業用緩衝液：１ｘＴＡＥ（４μＬ  ＥｔＢｒ／１００ｍＬ）。
【００４３】
ホルムアミド４μＬを、精製及び再懸濁した前記ｃＲＮＡ（体積４μＬ当たり約１μＬ）、及び０．１６〜１．７７ＫｂＲＮＡラダー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）４μＬに加え、続いて６５℃で５分間インキュベートした。
それから、氷上で急速に冷却し、続いて管ごとに（ＲＮアーゼを含まない）ゲル状緩衝液１μＬを加えた。前記の完了したアッセイからのアリコート４μＬを、試験ゲル溝（スロット）中にピペットで入れる（外側の溝にマーカーを入れ、内側の溝にｃＲＮＡサンプルを入れた）。
【００４４】
氷浴で冷却したＲＮアーゼ不含ミニゲルチャンバー中で、８０Ｖで約２時間電気泳動を実施した。前記作業用緩衝液を断続的に動かすことによって緩衝液の循環を実施した。
前記ＲＮアーゼ不含に関する結果のドキュメンテーションは、ＯＮＥ−Ｄｓｃａｎ（商標）ソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，マサチューセッツ州，米国）を用いて、ＧｅｌＰｒｉｎｔビデオ・ドキュメンテーション・ワークステーション（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）によって実施した。
合成したｂｃｌ２ｃＲＮＡの理論的な分子量は４１８ｂであるが、実験により決定された分子量は約４００ｂであった。
【００４５】
２．２．ｂｃｌ２ｃＲＮＡの希釈シリーズの調製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ溶液（１００ｎｇ／μＬ  ＤＥＰＣ  Ｈ2Ｏ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、前記の精製したｂｃｌ２ｃＲＮＡの希釈を実施した。
【００４６】
【表４】
0004496317.tif 000005
【００４７】
２．３，規定濃度のｂｃｌ２標準ｃＲＮＡによる９６“光学的管”（１枚の板）の被覆
前記の各ｂｃｌ２ｃＲＮＡ希釈物（表２−３参照）から１５０μＬを得て、そしてＢｉｏｍｅｋ（商標）２０００ピペッティング・ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，カリフォルニア州，米国）の調製した冷却可能な棚に配置した。
９６ウェル担体板に９６“光学的管”を入れ、そして前記ワークステーション中の意図した位置に平等に挿入した。
適当なプラグを備えた一方通行ピペットノズルを用いて、前記ロボットにより、標準“１”５μＬを、それぞれ、Ａ１〜Ａ１２の位置の“光学的管”にピペットで入れ、標準“２”５μＬを、それぞれ、Ｂ１〜Ｂ１２の管に入れ、標準“３”５μＬを、それぞれ、Ｃ１−Ｃ１２の管に入れるなどを実施する。
【００４８】
前記の標準ｃＲＮＡを含有する容器は、いずれも、−８０℃で３０分間冷凍貯蔵されているので、中間解凍を避けて、すぐに、予め冷却しておいたＬｙｏｖａｃ  ＧＴ２（ＡＭＳＣＯ  Ｆｉｎｎ−Ａｑｕａ  ＧｍｂＨ，  Ｈｕｅｒｔｈ）中で１時間かけて凍結乾燥される。
続いて、前記の管を、自己接着ホイル〔例えば、Ｂｉｏｍｅｋ（商標）シール＆サンプルアルミニウムホイル，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ〕を用いて手で閉じる。次に、管に接着している前記ホイルを垂直に切断して、Ａ１〜Ｈ１、Ａ２〜Ｈ２、Ａ３〜Ｈ３などの位置の連続したストリップ（いずれも、或る濃度の各ｂｃｌ２ｃＲＮＡ希釈物を含む）を形成することによって、前記“ＲＮＡ”ゼプトストリップを製造した。
前記で調製したストリップ１２個から、６個を、それぞれ−２０℃又は室温において、試験期間に亘って貯蔵した。
【００４９】
２．４．ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００配列検出システムによる調製したｂｃｌ２ｃＲＮＡストリップの分析
Ａ．材料
５×ＴａｑＭａｎ  ＥＺ緩衝液：Ｂｉｃｉｎｅ２５０ｍＭ、Ｋ−アセテート５７５ｍＭ、ＥＤＴＡ０．０５ｍＭ，ＲＯＸ（６−カルボキシテトラメチル  ローダミン）３００ｎＭ、グリセロール４０％（ｗ／ｖ）；ｐＨ８．２。
Ｍｎ（ＯＡｃ）2（２５ｍＭ）。
ｄＮＴＰ：体積比１：１：１：１でｄＡＴＰ（１０ｍＭ）、ｄＣＴＰ（１０ｍＭ）、ｄＧＴＰ（１０ｍＭ）、及びｄＵＴＰ（２０ｍＭ）を混合したもの
【００５０】
Ｂ．使用したオリゴヌクレオチドの配列
ｂｃｌ２Ｐｒ１（３４９８−３５１６）    （前出）
ｂｃｌ２Ｐｒ２１（３５７２−３５９１）  ５’−ＧＣＡ．ＡＧＴ．ＧＣＡ．ＧＣＣ．ＡＣＡ．ＡＴＡ．ＣＴ−３’
ｂｃｌ２プローブ（３５４７−３５６８）  ５’−ＦＡＭ−ＣＡＧ．ＴＴＣ．ＴＧＧ．ＧＧＣ．ＣＡＡ．ＧＡＧ．ＧＣＴ．ＧＴＸＴ−３’−ＴＡＭＲＡ
（ＦＡＭ＝６−カルボキシフルオレセイン，ＴＡＭＲＡ＝６−カルボキシテトラメチルローダミン）
【００５１】
Ｃ．前記酵素ｒＴｔｈポリメラーゼ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて組み合わせた逆転写とＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
それぞれの試験日に、−２０℃又は室温で別々に貯蔵した前記の各ｂｃｌ２ｃＲＮＡストリップ中に、以下の反応成分をピペットで加えた。
（表２−４において、Ｓ＝標準番号であり、アッセイ体積は、５０μＬである）
【００５２】
【表５】
0004496317.tif 000006
【００５３】
〈ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００配列検出システムにおける温度プロフィール〉
５９℃，３０分間（逆転写）
９５℃，５分間
４０サイクル  ９５℃，１５秒間
５９℃，１分間
７、１４、２８、９０、及び１８０日間の（−２０℃及び室温における）貯蔵後に、それぞれの場合について本発明によるｂｃｌ２ｃＲＮＡストリップの安定性をＰＣＲ３（表２−４）により分析した。その結果を図４にまとめる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の方法によりｍｄｍ−２ＤＮＡで被覆した“ゼプトストリップ（ＺｅｐｔｏＳｔｒｉｐ）”を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００配列検出システムにおけるＰＣＲ生成物の測定によって確立された典型的な検量グラフである（実施例１，項目５参照）〔ｒ＝−０．９９６〕。
【図２】  図２は、当業界の現状による水性培体中で従来どおりに貯蔵したゼプトストリップ（ＺＳ）の標準核酸と比較する上での利点を示す。破線は、従来の貯蔵を表し；連続線は、ゼプトストリップを表す。記号の説明（Ｌｅｇｅｎｄ）は、最初のＰＣＲアッセイ当たりの核酸分子数を表す。
【図３】  図３は、１年間の試験期間に亘って品質を損なうことのないｍｄｍ−２ＤＮＡ  ゼプトストリップの貯蔵性を示す。記号の説明は、最初のＰＣＲアッセイ当たりの核酸分子数を表す。連続線は、＋２５℃における貯蔵を表し、破線は、−２０℃における貯蔵を表す。
【図４】  図４は、−２０℃又は室温において６ヶ月間に亘って貯蔵した“ｂｃｌ２ｃＲＮＡ”ゼプトストリップの貯蔵性を示す。−２０℃及び＋２５℃における貯蔵のそれぞれの場合において得られた全ての測定値を鑑みた各標準濃度に対して計算した回帰線が表されている。記号の説明は、反応室中に固定化したｂｃｌ２ｃＲＮＡの濃度を、アッセイ当たりのゼプトモル（ｚｅｐｔｏｍｏｌ）で表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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