(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１に基づくベクターであって：
ａ）少なくとも１コピーのレトロウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性領域を備えた単離又は精製された核酸であり、前記ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が三本鎖ＤＮＡ構造を誘導する核酸と、
ｂ）異種核酸配列と
を備え、当該ＨＩＶ−１のＬＴＲが、Ｕ３のプロモーターおよびエンハンサーを欠失しているベクター。
【請求項２】
前記少なくとも１コピーのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えた核酸が、レンチウイルスの核酸である請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記少なくとも１コピーのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えた核酸が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の核酸である請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記少なくとも１コピーのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えた核酸が、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の核酸である請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記少なくとも１コピーのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えた核酸が、ＶＩＳＮＡ、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、又はＣＡＥＶの核酸である請求項２に記載のベクター。
【請求項６】
単一コピーの前記レトロウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えた請求項１〜５に記載のベクター。
【請求項７】
前記異種核酸配列が、前記少なくとも１コピーのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えた核酸に作用可能に又は物理的に連結された、請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
前記異種核酸配列が、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
当該ｃＰＰＴ−ＣＴＳシス作用性領域の１コピー、ＥＦ１αプロモーターの制御下にあるＧＦＰレポーター遺伝子、およびプロモーターおよびエンハンサーを取り除いたＬＴＲのＵ３配列を含む請求項８に記載のベクターであって、ｐＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＥＦ１α  ＧＦＰであるベクター。
【請求項１０】
前記異種核酸配列が治療用タンパク質をコードする請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターを有する組換え細胞。
【請求項１２】
前記細胞がＨｅＬａ細胞又は造血細胞である請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
造血幹細胞である請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
標的細胞の核に異種核酸配列を挿入するインビトロの方法であって、
前記異種核酸配列が前記標的細胞に取り込まれ得る条件下で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターを暴露することを備える方法。
【請求項１５】
前記目的の核酸の標的細胞の核への挿入効率が３０％以上である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記異種核酸配列がペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が治療用タンパク質である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的細胞が非分裂細胞である請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的細胞がＨｅＬａ細胞又は造血細胞である請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的細胞が造血幹細胞である請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
異種核酸配列をインビトロで発現させる方法であって、
ａ）前記異種核酸配列を含むベクターが標的細胞中に取り込まれて組換え細胞を作出可能な条件下で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターに対して、標的細胞を暴露することと、
ｂ）前記異種核酸配列が発現される条件下で前記組換え細胞を培養することと
を含む方法。
【請求項２２】
前記異種核酸配列が組織培養中で発現される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種核酸配列の発現産物を精製又は単離することをさらに含む請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
個体の体内で前記組換え細胞に前記核酸を発現させる治療用化合物としての使用のための請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
造血幹細胞中の治療用化合物としての使用のための請求項２４に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
治療用化合物としての使用のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターであって、前記核酸は個体の体内で目的の遺伝子の発現をもたらすのに十分な量及び形態であるベクター。
【請求項２７】
標的組織中で発現される請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
ＨＩＶ−１ベクターであって、
ａ）少なくとも１コピーのレトロウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性領域を備えた単離又は精製された核酸であり、前記ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が三本鎖ＤＮＡ構造を誘導する核酸と、
ｂ）異種核酸配列と
を備え、ＨＩＶ−１のＬＴＲが、Ｕ３のプロモーターおよびエンハンサーを欠失し、遺伝的基礎を有する疾病若しくは疾患に罹患した個体、又は遺伝的基礎を有する疾病若しくは疾患を発症する可能性が高い個体の治療における使用のためのベクターであって、前記レトロウィルス・ベクターが前記疾病又は疾患を治療するのに十分な量の前記治療用タンパク質の発現をもたらすのに十分な量のベクター。
【請求項２９】
予防的、改善的、又は治療的治療における薬剤としての使用のための請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
血液疾病若しくは疾患、脳若しくは神経系の疾病若しくは疾患、又は成育疾病若しくは疾患の治療における使用のための請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターを含む少なくとも1つの容器を含むキット。
【請求項３２】
前記異種核酸配列が治療用タンパク質をコードする請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
宿主細胞核への前記核酸の移行速度をインビトロで増大させるための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３４】
宿主細胞核への前記ベクターの移行速度を増大させ、前記宿主を処理するための使用のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の背景
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特にウイルスの核酸及びウイルスの核酸を含有する細胞に関する。より具体的には、本発明は、三重鎖ＤＮＡ構造の一部であり得るウイルスの核酸配列並びにこれらのウイルスの核酸配列を含有する核酸ベクター、ウイルス、及び細胞に関する。本発明は、さらに、このようなＤＮＡ構造及び核酸配列を用いる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
関連技術の説明
造血幹細胞（ＨＳＣ、ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）への遺伝子導入は、遺伝性及び後天性疾患の遺伝子治療に対して大きな可能性を有するとともに、正常及び病的な造血を制御する機序を理解する上でも大きな可能性を有している。ＨＳＣは著しい増殖能を有するので、遺伝子が安定に導入されるには、導入遺伝子がゲノムに組み込まれることを要する。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に基づいたレトロウイルスは、宿主細胞のゲノムに組み込まれて、長期にわたり導入遺伝子を発現させ得るので頻用されている。しかしながら、これらのオンコレトロウイルスは分裂していない細胞には組み込まれず、しかもＨＳＣの多くは静止状態にある。ＨＳＣの細胞周期を誘発して、オンコウイルス由来の有糸分裂依存性遺伝子導入ベクターによってＨＳＣが形質導入され得る状態にするために、刺激に先立って様々なサイトカイン群を用いる多くのプロトコールが開発されている。しかしながら、サイトカインによる刺激は、増殖とともに分化をも引き起こすので、形質導入過程の間にＨＳＣの潜在能力が喪失される可能性があり得る。レンチウイルス類は分裂細胞と非分裂細胞の何れにも感染することが示されている（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）ので、この課題はレンチウイルス由来のベクターを使用することによって克服することができる。ここ３年に発表された、かかるＨＳＣ導入用のレンチウイルス由来ベクターを用いた最初の報告は有望ではあるが、極めて多様な結果を示した（Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０００３】
レンチウイルスは核内に移行するための戦略を進化させており、これによって、レンチウイルスのＤＮＡゲノムは宿主細胞の核膜を通過することが可能となる。組織マクロファージのような分裂していない標的細胞中で効率的に複製することができるというレトロウイルスの中でもレンチウイルスに特有の能力は、レンチウイルスのかかる能動的核内移行によって説明される。ＭｏＭＬＶのようなオンコウイルスの複製が分裂細胞に限定されるのは、有糸分裂に際して核膜の障壁が崩壊して、ＭｏＭＬＶの前組込み複合体（ＰＩＣ、ｐｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が核に侵入できるようにする必要があることに起因するものと思われる（Ｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。レンチウイルスのインビボでの複製戦略の発端となる（従って、レンチウイルスの病原性の発端にもなる）レンチウイルスの有糸分裂非依存性複製によって、有望な治療への用途を有するレンチウイルスの遺伝子導入ウベクターを作製することも可能となる（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０００４】
有糸分裂非依存性のレンチウイルスの複製は、ＶＩＳＮＡレンチウイルスが有糸分裂していない軟骨細胞に増殖性感染することによって初めて実証された（Ｔｈｏｒｍａｒ，１９６３）。この発見の直後に、ＨＩＶが分化した一次マクロファージの中で複製することが示された（Ｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。ＨＩＶ  ＤＮＡが有糸分裂していない標的細胞のクロマチンに組み込まれる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）ということは、ＨＩＶ−１のＰＩＣは宿主細胞の核膜を通過できるということを示唆している（Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。このように、有糸分裂非依存性の核内移行は、レンチウイルスが分裂していない細胞中で複製可能となるために必要な中心的現象である。
【０００５】
ＨＩＶ−１  ＤＮＡゲノムの能動的核内移行の原因となるウイルスの決定要素を探索することは、活発だが議論の余地を残す調査分野となっている。核内移行シグナル（ＮＬＳ）候補がマトリックス（ＭＡ）とＶｐｒ（ウイルスタンパク質）の中に存在しているということは、ＨＩＶ−１  ＤＮＡの核内移行において、それらが重複した態様で作用し得るという仮定を導く（Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ｂ；Ｅｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｐｏｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；ｖｏｎ  Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ＭＡ分子のＣ末端チロシン残基が極一部（１％）リン酸化されることによって、形質膜からＭＡ分子が放出され、ＨＩＶ−１のインテグラーゼタンパク質との会合が誘発されるという提案がなされている（Ｇａｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５ａ；１９９５ｂ）。これらのタンパク質が、ＨＩＶ−１  ＰＩＣの核親和的特性に寄与しているかどうかということは、現在、激しい議論の対象となっている（Ｆｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，１９９４；Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋｏｏｓｔｒａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｉｔｅｍａｋｅｒ，１９９９）。さらに最近になって、インテグラーゼタンパク質（ＩＮ）の中にＮＬＳモチーフが同定され、これらのモチーフの突然変異がＩＮとカリオフェリンα（細胞のＮＬＳ受容体）との相互作用を喪失せしめることが報告されている（Ｇａｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の要約
ＨＩＶの核内移行におけるこれらの候補ウイルスタンパク質の役割がいかなるものであれ、本発明は、逆行転写された（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ＨＩＶ−１ゲノム自身がその核内移行を決定するシス作用性因子を保有することを示す。
【０００７】
本発明は、レンチウイルスから得られた核酸のような、三重鎖（ｔｒｉｐｌｅｘ）構造を有する核酸を提供する。前記三重鎖は細胞の核内への核酸の侵入を刺激する。前記核酸は、レンチウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性配列を含有し得る。前記レンチウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＶＩＳＮＡ、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、及びＣＡＥＶを含む任意のレンチウイルスであり得るが、これらに限定されるものではない。複数の実施態様において、前記核酸は、発現ベクターのようなベクターという状態にある。
【０００８】
従って、本発明は、ベクター、例えば、核酸ベクターも提供する。前記核酸ベクターは、細胞中に核酸を導入するために、又はインビボ若しくはインビトロでの核酸の発現に有用であるとして当業者に公知の任意のベクターから得られた配列を含み得る。
【０００９】
本発明は、さらに、本発明の核酸を含有するウイルス及び細胞（真核及び原核）を提供する。該細胞は組換え細胞であり得る。
【００１０】
本発明は、さらに、例えば、前記核酸、ベクター、ウイルス、又は本発明の細胞に前記宿主細胞を暴露して組換え細胞を得ることによって、宿主細胞の核に核酸を導入する方法を提供する。本発明の方法によれば、造血幹細胞の核のような宿主の細胞核に、高い効率で核酸を導入することが可能となる。高効率の導入によって、当業者は、予防的な治療法、改善的な（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅ）治療法、及び治療的な（ｃｕｒａｔｉｖｅ）治療法を含む様々な治療法を実施することが可能となるが、これらに限定されるものではない。例えば、遺伝子治療法が本発明によって可能となる。一般的に、遺伝子治療は、血液疾患、脳疾患、ウイルス疾患、並びにその他の多くの遺伝的及び後天的疾患を治療するために使用することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の詳細な説明
本発明者らは、ＨＩＶ−１が、複雑な逆転写戦略を進化させており、この戦略は、ゲノムの中央で起こる２つの工程がオンコウイルスの戦略とは異なる（すなわち終結工程と組み合わされたプラス鎖合成の開始が１つ付加されている）ことを以前に示した。ＨＩＶ−１のプラス鎖ＤＮＡは、２つの分離した半ゲノムセグメントとして合成される。全てのレンチウイルスゲノムの中心に存在するポリプリン広域シス作用性配列（ｃＰＰＴ）の更なるコピーが、下流のプラス鎖の合成を開始させる（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、１９９２）。３’ＰＰＴで開始される上流のプラス鎖セグメントは、鎖の転移後に、ゲノムの中心の方に進み、別の鎖置換現象の後に終結するであろう（図６Ａ）。ＨＩＶ−１の逆転写のこの最後の経時的現象は、鎖置換合成と関連して、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）をこの部位に特異的に排出する中央部終結配列（ＣＴＳ）シス作用性配列によって調節される（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｌａｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。このため、ＨＩＶ−１逆転写の最終産物は、その中心に、９９ヌクレオチド長さの安定なＤＮＡフラップ（本明細書では、中心部ＤＮＡ三重鎖と表記する）を有する直鎖ＤＮＡ分子である（図６Ａ）。
【００１２】
中央部開始及び終結変異ウイルスは何れも、野生型ＤＮＡ三重鎖を欠いた逆転写産物を合成する。図６Ａに図示されているように、中央部開始変異体の場合には、最終産物は中央部三重鎖を欠く連続する二重鎖の直鎖ＤＮＡである（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ｃＰＰＴから開始された下流のプラス鎖セグメントは合成されない。このため、鎖の置換はゲノムの中心では全く起こらない、すなわち、転移されたプラス鎖の伸長は、ゲノム全体にわたって進行する。中央部終結変異体の場合には、中心部鎖置換現象は、変異したＣＴＳ配列によってはもはや調節されず、分離した野生型ＤＮＡ三重鎖と比べて長く、ランダムに分布したプラス鎖の重複が生じる（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ｃＰＰＴ又はＣＴＳシス作用性配列の変異はＨＩＶの複製を著しく損なうので、レトロウイルスの生活環で中心部三重鎖が直接的な役割を果たしていることが推測される（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｈｕｎｇｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【００１３】
本発明は、ＨＩＶ−１の前記中央部ＤＮＡ三重鎖が、ウイルスＤＮＡ転移の直前又は転移中に、核膜孔を通じたＨＩＶ−１ゲノム核内移行の最後の工程に関与していることを開示する。このため、分裂していない細胞中で複製することができるというレトロウイルスの中でもレンチウイルスに特有の能力の少なくとも１部は、レンチウイルスの逆転写に特有の特徴によって説明される。本発明は、前記中央部ＤＮＡ三重鎖を欠くＨＩＶ遺伝子導入ベクターが強い核内移行欠損を示すことも開示する。本発明は、以前に記載されたＨＩＶベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）中にＨＩＶ−１ゲノムの中央部シス作用性配列を挿入することによって、元のベクターＤＮＡの核内移行欠損を野生型レベルに相補することによって形質導入効率を増加させることを確証する。この発見は、前記中央部ＤＮＡ三重鎖のＨＩＶ−１核内移行における役割に対する独立の証拠をさらに与える。レンチウイルスの核内移行決定因子としてＤＮＡ三重鎖を記載することによって、効率的なレンチウイルスのベクターのデザインに関する重要な示唆が与えられる。レンチウイルスの非分裂標的細胞への感染は、ウイルスが活性な核内移行経路を使用することに依拠しているので、得られたベクター構築物にはレンチウイルスの核内移行決定因子を保持させることが好ましい。古典的なレトロウイルス構築物は、ＬＴＲ間に存在するウイルスのコード配列全体が欠失され、目的の配列と置換された置換ベクターである（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ，１９９７）。レンチウイルスベクターの場合には、この古典的な戦略は、中央部シス作用性配列ｃＰＰＴ及びＣＴＳの欠失をもたらす。ＨＩＶ核内移行において前記三重鎖が重要な役割を果たしているということは、このような置換ベクター構築物が最適ではないことを示唆している。この知見は、ＤＮＡ三重鎖核内移行決定因子がＨＩＶ−１由来のレンチウイルスベクターの異種的な状況下においても作用し得るという事実を確証している。天然のＨＩＶ−１ゲノムに置かれていない前記ＤＮＡ三重鎖それ自体が、異種ＤＮＡ配列の核内移行を促進することができる（ＰＣＴ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｎｏ．９８  ０５１９７，２４  Ａｐｒｉｌ  １９９８）。ＤＮＡ三重鎖配列の存在は、造血幹細胞に遺伝子形質導入効率の顕著な増加を誘導する。
【００１４】
このように、１つの側面において、本発明は、三重鎖核酸構造（すなわち、三本鎖核酸）に関与することができる核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの類縁体）を提供する。本発明の態様では、前記核酸はレンチウイルス配列である。複数の実施態様において、前記核酸は、位置指定変異導入（すなわち、少なくとも１つのヌクレオチドを意図的に欠失、挿入、又は置換させること）又は選択圧変異導入などによってレンチウイルスの配列から誘導される。本発明の核酸は、宿主細胞の中に、とりわけ宿主細胞の核の中に核酸を高い効率で導入することを可能とする。この能力のため、本発明の核酸に作用可能に又は物理的に連結された遺伝子は、高レベルで、及び／又は前記核酸に暴露された細胞に高い割合で発現することができる。本発明によるレンチウイルスのゲノムの三本鎖領域中に挿入されたＤＮＡは、前記構築物中において特に安定であり、高レベルの形質導入及びトランスフェクションを達成するのに役立つ。
【００１５】
好ましい態様では、本発明は、ベクターＤＮＡを宿主細胞核内に高い割合で移行せしめることができる、又はベクターＤＮＡの核内移行の割合を増加させることができる、レンチウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域によって誘導された三本鎖ＤＮＡ配列を提供する。複数の態様で、前記三本鎖ＤＮＡ配列は、レポーター遺伝子又はその他の目的の遺伝子のような異種の核酸配列を共有結合させることができる。例えば、本発明の核酸は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする異種の核酸配列を備え得る。複数の態様で、前記異種核酸配列は三重螺旋領域内に存在する。複数の態様で、前記異種核酸配列は前記三重螺旋領域と同一の核酸上であるが、前記三重螺旋の外側に存在する。複数の態様において、単一の核酸がレンチウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域によって誘導された三本鎖配列を２以上備える。
【００１６】
別の側面では、本発明は、三重鎖核酸構造の形成に関与することができる少なくとも１つの配列を含有する、シャトルベクター、発現ベクター、組込みベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン等のベクターを提供する。複数の態様において、前記ベクターは、三重鎖核酸構造の形成に関与することができる単一の配列を備える。複数の態様において、前記ベクターは、三重鎖核酸構造の形成に関与することができる配列を２以上備える。前記ベクターは、本発明の前記核酸をある細胞から別の細胞に転移させるために、本発明の核酸の大量作製を補助するために、及びその中に目的の他の核酸配列（例えば、レポーター遺伝子、治療用遺伝子）を挿入することができる基本分子として機能させるために使用することができる。
【００１７】
さらに別の側面において、本発明は、三重鎖核酸構造に関与し得る少なくとも１つの配列を有するウイルス核酸配列で細胞を効率的に感染させ、トランスファクトし、又は形質導入する方法を提供する。複数の態様において、前記方法は、少なくとも１コピーの本発明の核酸、ベクター、ウイルス、又は細胞に、１個の細胞又は複数の細胞を暴露することを備える。複数の態様において、本発明の核酸、ベクター、ウイルス、又は細胞に前記１又は複数の細胞を暴露する前記工程は、本発明の前記核酸、ベクター、ウイルス、又は細胞が前記１又は複数の標的（宿主）細胞に入ることができるような条件下で実施される。好ましい態様では、前記条件は、高レベルの本発明の核酸、ベクター、ウイルス、又は細胞が前記１又は複数の標的細胞に入ることができるような条件である。
【００１８】
複数の態様において、前記方法は高度に効率的であり、本発明の前記核酸は前記核酸に暴露された細胞の核の３０％以上に挿入され得る。複数の態様において、本発明の核酸を取り込む核のパーセントは４０％以上、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％〜１００％である。好ましい態様では、本発明の核酸を取り込む核のパーセントは８０％超であり、より好ましくは８５％であり、最も好ましくは９０％超（例えば９５％超）である。複数の態様において、前記細胞は、本発明の核酸を含有する完全なウイルス体（ファージを含む）又は細菌体によって感染され、又はトランスフェクトされる。複数の態様において、本発明の前記核酸は、機械的及び／又は化学的手段（例えば、電気穿孔、リポソーム融合）を用いて前記細胞に導入される。複数の態様において、本発明の裸の核酸が標的宿主細胞によって取り込まれる。
【００１９】
このように、１つの態様では、本発明は、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えたヌクレオチド配列の使用であって、レンチウイルス又はレトロトランスポゾンベクターの中で、逆転写後に、三本鎖ＤＮＡ構造（三重鎖）を採り、形質導入された細胞の核内へのベクターＤＮＡの侵入、及び核内移行の割合を刺激するヌクレオチド配列の使用を提供する。
【００２０】
本発明のある側面では、本発明の核酸又はベクターを含有する組換え細胞が提供される。該組換え細胞は、その子孫又は派生物を含む任意の細胞（原核又は真核）であり得る。このため、本発明には、本発明の細胞を用いて作製される細胞が含まれる。複数の態様において、前記細胞は真核細胞である。複数の態様において、前記細胞は、ＨｅＬａ細胞又は造血幹細胞のような造血細胞などの哺乳類細胞である。このように、複数の態様において、本発明は、真核細胞を形質導入する方法であって、該方法は、レンチウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域によって誘導された三本鎖ＤＮＡ配列であって、宿主細胞核へのベクターＤＮＡの侵入を高い割合で誘導することができ、又はベクターＤＮＡの核内移行の割合を増大させることができる三本鎖ＤＮＡ配列の使用を備えた方法を提供する。
【００２１】
本発明の組換え細胞は目的の異種遺伝子を高いレベルで発現することができるので、これらの細胞は数多くの用途に使用することができる。用途には、細胞培養中において、目的のタンパク質（治療的価値を有するタンパク質など）を高レベルで産生すること、及びタンパク質を必要とする個体に本発明の前記組換え細胞を導入することにより、目的のタンパク質をインビボで産生させることが含まれるが、これらに限定されるものではない。前記個体は動物又はヒトであり得る。従って、本発明は、獣医用と医療用の両者に用いることができる。
【００２２】
複数の態様において、本発明の該側面は、本発明の核酸、ベクター、又はウイルスに標的細胞を暴露し、例えば、形質導入、形質転換、又はトランスフェクションを介して、該標的細胞に本発明の核酸を取り込ませることによって、目的の組換えタンパク質を生産する方法を提供する。核酸を標的細胞に導入した後、前記細胞は、目的の前記組換えタンパク質が発現され、従って標的細胞によって産生される条件下で培養される（この段階で、本発明の組換え細胞になると考えられる）。本方法は、単一の各細胞に対して実施することができるが、全ての細胞がクローンである細胞の集合に対して実施すれば、多くの場合、本方法はより実用的となるはずであることは明らかである。本明細書で使用する「細胞」とは、各細胞又は同一細胞の集合を指す。
【００２３】
本方法は、さらに、組換え細胞又は細胞培養液から目的のタンパク質を精製し、又は単離することを含み得る。このような方法では、当業者に公知であるタンパク質の発現及び精製の操作を適用することができる。これらの操作は当業者には周知なので、本明細書に詳述する必要はない。
【００２４】
好ましい態様において、本発明の該側面は、目的の遺伝子をインビトロで発現する方法であって、ａ）目的の遺伝子と、三本鎖ＤＮＡ構造を誘導する少なくとも１コピーのレトロウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性領域とを含む単離又は精製された核酸に、該核酸が標的細胞中に取り込まれて組換え細胞が作出され得る条件下で、標的細胞を暴露することと、ｂ）前記組換え細胞の核に導入すべき前記核酸の少なくとも一部と前記目的の遺伝子とが発現し得る条件下で前記組換え細胞を培養することとを備えた方法を提供する。複数の態様において、該方法では本発明のベクターを使用する。このように、本発明は、インビトロで、例えば、組織培養中において、目的の遺伝子を発現する方法を提供する。複数の態様において、該方法は、標的細胞が目的の遺伝子を含有する本発明の分子を取り込むことができる条件下で、本発明の核酸、ベクター、ウイルス、又は細胞を標的細胞に暴露することを備える。このようにして作製された前記組換え細胞は、次いで前記目的の遺伝子が発現される条件下で増殖させ、複製させることができる。複数の態様において、前記インビトロでの遺伝子の発現方法は、目的のタンパク質を精製し、又は単離する方法と組み合わされる。これらの態様において、目的のタンパク質は、液体クロマトグラフィー、沈殿、遠心、ゲル濾過、及びアフィニティークロマトグラフィーを含む当業者に公知の手法を用いて（これらに限定されない）、他の細胞成分から精製し、又は単離することができる。適切な技術は当業者に公知であり、本明細書で詳述する必要はない。
【００２５】
このように、本発明は、例えば、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質を必要としている個体にインビボで前記目的の遺伝子を発現させる方法も提供する。複数の態様において、インビボで遺伝子を発現させる前記方法は、本発明の核酸、ベクター、ウイルス、又は細胞に宿主細胞を暴露させて、本発明の組換え細胞を作製することによって、前記個体の体外で組換え細胞を作製することを備える。本発明の前記組換え細胞は、続いて、前記個体に投与され、導入され、あるいは暴露され、その時点で、前記目的の遺伝子が発現される。例えば、本方法は、本発明の核酸を含む組換え細胞を個体に投与し、前記個体の体内で前記組換え細胞が前記核酸を発現できるようにすることを備え得る。好ましい態様において、前記組換え細胞は造血幹細胞である。複数の態様において、前記組換え細胞は、まず、非組換え細胞から精製又は単離され、続いて、前記個体に投与され、導入され、さもなければ暴露される。
【００２６】
別の態様では、インビボで遺伝子を発現させる前記方法は、本発明の核酸、ベクター、及び／又はウイルスに前記個体を暴露すること（例えば、投与し、導入することなど）を備える。複数の態様において、前記核酸、ベクター、及び／又はウイルスは、少なくとも１つの前記個体の細胞にトランスフェクト／形質導入／感染し、この時点で、目的の遺伝子が発現される。例えば、前記方法は、前記個体の体内で前記目的の遺伝子の発現をもたらすのに十分な量及び形態で、本発明の核酸、ベクター、又はウイルスを個体に投与することを備え得る。好ましくは、前記方法は、標的組織又は細胞内で目的の遺伝子の発現をもたらす。
【００２７】
ある態様において、本発明の該側面は、遺伝的基礎を有する疾病又は疾患に罹患した個体、又は遺伝的基礎を有する疾病又は疾患を発症する可能性が高い個体を治療する方法を提供する。該方法は、ａ）治療用タンパク質をコードする核酸と、ｂ）三重鎖ＤＮＡ構造を誘導する少なくとも１コピーのレトロウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性領域とを有するレトロウイルスベクターを、前記疾病又は疾患を治療するのに十分な量の前記治療用タンパク質を発現させるのに十分な量で前記個体に投与することを備える。前記治療は予防的、改善的、又は治療的であり得る。該方法は、血液疾病若しくは疾患、脳若しくは神経系の疾病若しくは疾患、又は発育の疾病又は疾患を治療することができる。インビボで遺伝子を導入し、及び／又は発現する手法は当業者に公知である。実施者は、所定のタンパク質又は標的組織若しくは細胞にとって最も適切な手法を選択し得る。
【００２８】
従って、本発明は、宿主細胞の核内にベクターＤＮＡを高い割合で侵入せしめることができ、又はベクターの核内移行の割合を増加させることができるレンチウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域によって誘導される三本鎖ＤＮＡ配列を含有するレトロウイルスベクターの使用を含む、宿主の治療方法を提供する。
【００２９】
本発明の上記側面によれば、キットも提供される。該キットは、本発明の少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのベクター、少なくとも１つのウイルス、若しくは少なくとも１つの細胞、又はこれらのうちの何れか若しくは全ての組合せを含有することができる。前記キットは、単一の組成物の中に本発明の上記態様をそれぞれ合わせて提供し、又は、例えば異なる容器の中に別々に提供することができる。複数の態様において、前記キットは、所望の目的のために、本発明の核酸、ベクター、ウイルス、及び細胞を使用するのに必要な前記試薬及び補給品（ｓｕｐｐｌｉｅｓ）のうちの一部又は全部を含む。
【００３０】
本発明は、ＨＩＶ−１核内移行の独自の機序を開示し、該機序では、三本鎖ＤＮＡ構造（ＤＮＡ三重鎖）が中心的役割を果たしている。ＨＩＶ−１は、複雑な逆転写戦略を進化させており、中央部での逆転写の開始と終結に続いて、中央部での鎖置換現象によって、組み込まれていない状態の直鎖ＨＩＶ−１  ＤＮＡ分子の中央にＤＮＡ三重鎖が作られる。該ＤＮＡ三重鎖は、続いて、ＨＩＶ−１ゲノムの核内移行のシス作用性決定因子として作用する。本発明は、ＨＩＶ−１の逆転写における２つの別個の工程である中央部での開始と終結によって、分裂していない標的細胞に感染できるというＨＩＶ−１の能力が説明されることを示している。
【００３１】
本発明の実施例は、さらに、ＤＮＡ三重鎖を欠くことによって、分裂又は非分裂細胞中において殆ど非感染性であるウイルスが得られることを示している。ｃＰＰＴ中の変異は、ウイルスＤＮＡの合成速度に、又はインビトロでウイルスが組込まれる能力に影響を与えないが、ｃＰＰＴ変異ウイルスから得られる逆行転写されたＤＮＡ分子の多くは、長時間にわたって、組み込まれていない直鎖ＤＮＡとして蓄積する。これに対して、野生型ウイルスからの直鎖ＤＮＡは、ほとんど完全に、組み込まれたプロウイルス及びＤＮＡ環に加工される。ｃＰＰＴ変異ウイルスの細胞内ＤＮＡのプロフィールは、核内移行の欠損の可能性を示しており、ウイルスＤＮＡは、核内の区画（ウイルスＤＮＡはここで組み込まれ、又は環状化し得る）に接近できないために、直鎖分子として蓄積する。感染細胞の分画及び細胞内ウイルスＤＮＡの直接的な可視化（ＦＩＳＨ）によって、ウイルスＤＮＡの移入の後期欠損（ＮＰＣを通じた転移に影響を与える可能性が最も高い）。が実証されている。前記三重鎖を欠いた直鎖ＤＮＡ分子は、核膜と会合してしまう。
【００３２】
本発明は、中央部ＤＮＡ三重鎖が存在しないことを特徴とするｃＰＰＴ変異ウイルスの分析に焦点を当てている。本明細書に示された実験の多くは、これまでに記載されたＣＴＳ変異ウイルス（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を用いても実施され、同じ結果を得た（データは示さず）。ＣＴＳ変異ウイルスでは、野生型ウイルスの分離した中央部ＤＮＡ三重鎖と比べて大きく、ランダムに分布したプラス鎖重複部を含有する直鎖ＤＮＡ分子が、逆転写によって作られる。このため、ＤＮＡ三重鎖の存在のみならず、その構造的な完全性がＨＩＶ  ＤＮＡの核内移行には重要である。
【００３３】
本発明は、ＨＩＶ−１に基づくベクター系において、前記ＤＮＡ三重鎖が作動し得ることを示している。三重鎖を欠くベクターの中にＤＮＡ三重鎖を挿入すると、ベクターＤＮＡの強い核内移行欠損が野生型の核内移行レベルにまで復活する。
【００３４】
前記中央部ＤＮＡ三重鎖は、レンチウイルス類に共通の核内移行決定因子である。前記中央部ＤＮＡ三重鎖の位置は、ＨＩＶ−１の場合、正確に確定されている。中央部での鎖置換は、ｃＰＰＴ配列に続く最初のヌクレオチドから始まり（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ａｎｄ  Ｃｌａｖｅｌ，１９９１）、略９９ヌクレオチド下流、ＣＴＳ配列のｔｅｒ２部位で停止する（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。前記三重鎖の３つのＤＮＡ鎖の三次元配置は、まだ明らかになっていない。しかしながら、ゲノムの中央にＤＮＡ三重鎖が存在することは、全てのレンチウイルスに対して一般化することができる。ＰＰＴの中央コピーは全てのレンチウイルスゲノムに共通する特徴であり、（Ａ）ｎと（Ｔ）ｎが広がって存在することを特徴とするＣＴＳターミネーター要素の候補も、約１００ヌクレオチド下流に存在している（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。最近、有蹄類のレンチウイルスであるＥＩＡＶの中央部ＤＮＡ三重鎖の性質が決定された（Ｓｔｅｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＶＩＳＮＡウイルスＤＮＡの中央部に鎖の不連続（ギャップと称されるが、中央部の鎖置換から生じた切れ目である可能性が最も高い）が存在することが、Ｓ１ヌクレアーゼ切断によって明らかとなった（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。レンチウイルスの多くには、有糸分裂非依存性の複製が報告されている（Ｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｔｈｏｒｍａｒ，１９６３）ので、ＨＩＶ−１について本明細書に記載した、核内移行におけるＤＮＡ三重鎖の役割は全てのレンチウイルスに一般化することができる。
【００３５】
限定的なものではないが、本発明は、以下のように、ＨＩＶ−１核内移行における前記中央部ＤＮＡ三重鎖の役割に関する機構の仮説を与える。すなわち、ＨＩＶ−１の核内移行のシス作用性決定因子として作用する三本鎖ＤＮＡ構造は、細胞又はウイルスに対応するものが知られていない新規な生物現象である。従って、ＨＩＶ核内移行における前記中央部ＤＮＡ三重鎖の役割について記載している分子機構についての仮説は、何れも推定の域を出ない。前記中央部三重鎖は、核膜孔を通じたＨＩＶ  ＤＮＡ繊維の取り込みを開始するためのウイルスの決定因子として作用することができるかもしれない。これは、前記孔の成分と前記ＤＮＡ三重鎖が直接相互作用することによって達成されるか、あるいは、前記三重鎖が、宿主細胞の細胞質と核の間を輸送し、前記ＨＩＶゲノムを核内に引き込むことができる細胞又はウイルスのタンパク質と相互作用することを介して達成される可能性がある。２６ｎｍの最大直径を有する核膜孔を通じた９．７ｋｂのＨＩＶゲノムの転移は、取り込みを開始するためにＨＩＶ−１  ＤＮＡ繊維の一方の端部を認識した後に、特異的な方向性で起こるにちがいない。同様の状況はメッセンジャーＲＮＡが核外に排出される際に起こり、前記孔を介したＲＮＡ繊維の取り込みは５’Ｃａｐ構造によって誘導される（Ｈａｍｍ  ａｎｄ  Ｍａｔｔａｊ，１９９０）。
【００３６】
ＨＩＶ−１  ＰＩＣのコンフォメーションは、よく明らかとなっていないが、前記直鎖ＤＮＡの端は、おそらく、ＬＴＲの先端に結合したインテグラーゼタンパク質が二量体となった後に、架橋されることは確定されている（Ｍｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。興味深いことに、前記ｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性配列は、全てのレンチウイルスゲノムの中央部に見出されている。レンチウイルスの理論構造の１つとしては、インテグラーゼの二量体化によって前記中央部三重鎖の何れかの側に対称的に折り畳まれた二重ＤＮＡ繊維が考えられるであろう（図６Ｂ）。それ故、前記三重鎖は、繊維状ＨＩＶ−１  ＰＩＣの一方の端部を構成し、前記インテグラーゼ二量体は逆側の端部を構成する。ｃＰＰＴ変異体ＰＩＣｓには、ＤＮＡ三重鎖が欠如しているため、核膜孔の機構又はシャトルタンパク質によって認識されないことになろう。中央部のＤＮＡ三重鎖のタンパク質リガンドを同定することは、我々がＨＩＶ−１  ＰＩＣの核内への輸送を理解する上で最も重要であるとともに、ＨＩＶ複製のこの段階を標的とする薬物を最終的に開発する上でも重要となるはずである。
【００３７】
三重鎖変異体ウイルスの性質を説明する別の機構に関する仮説としては、ウイルスＤＮＡが核に移行するのに先立って、ＨＩＶキャプシドのＰＩＣへの成熟化が欠損することが含まれるであろう。かかるモデルに従えば、三重鎖が欠損したウイルスＤＮＡは、完全なウイルスキャプシドによって閉じ込められた状態のままとなり、移行を為し得ないであろう。感染細胞の細胞質でウイルスの構成成分が極めて希釈されると、レトロウイルスによる逆転写は生じないので、逆転写のためには、構成成分がキャプシドタンパク集合体に拘束された、逆転写複合体の構造的な環境を必要とする。ＨＩＶキャプシドの大きさは核膜孔の最大排除直径より大きい（Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ，１９９１）。それ故、ウイルスＤＮＡが核に侵入し得るより前に、前記ＨＩＶ逆転写複合体は成熟化して、核膜孔を介して移行し得る大きさのＰＩＣｓとならねばならない（Ｋａｒａｇｅｏｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。複製サイクルが宿主細胞の核膜を介したＤＮＡゲノムの移行に関与する他のいくつかのウイルスシステムにおいて、核内移行に先立ってウイルスキャプシドが成熟化することは十分に立証されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，１９９８）。ＭＬＶに関しては、ウイルスキャプシド内の逆転写が物理的に実証されてきたのに対して（Ｂｏｗｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、恐らくＨＩＶ−１キャプシドが壊れやすいために、ＨＩＶ−１については未だこのようなことは可能となっていない（Ｂｏｒｒｏｔｏ−Ｅｓｏｄａ  ａｎｄ  Ｂｏｏｎｅ，１９９１）。前記ＨＩＶ逆転写複合体はＲＴポリメラーゼのコピーを数多く含有する（キャプシド当たり約３０〜５０）（Ｐａｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。ＨＩＶ−１逆転写酵素の分布が重要であるため、例えばプラス鎖及びマイナス鎖合成中に、並びに中央部三本鎖の正確な形成中に起こる鎖の移行又は重合反応の休止などの逆転写における数多くの律速段階を乗り越えるには、ウイルスＲＮＡの鋳型鎖に対して化学量論的に多量の酵素が必要である（Ｋｌａｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。このことは、レンチウイルスの逆転写の最終段階である中央部の終結反応が完全なキャプシド構造内で生じることを強く示唆している。ウイルスのＤＮＡ合成が終了したことの指標となる中央部の終結反応は、ウイルスＤＮＡの脱キャプシド化、及びこれに続く核への移行に必要な信号であるかもしれない。
【００３８】
ＨＩＶ−１のＤＮＡ三本鎖を介した核内への移行に関する、推定されているかかる二つの分子機構は両立し得るものである。中央部ＤＮＡ三本鎖が形成されることにより、ウイルスキャプシドのＰＩＣｓへの成熟が誘発され得るために、ＤＮＡ三本鎖は輸送タンパク質に接近することが可能となる。
【００３９】
ＨＩＶ−１ゲノムが宿主細胞の核に移入するためには中央部ＤＮＡ三本鎖全体が必要であるという事実により、最終の中央鎖置換現象を含むＤＮＡ合成の全工程は、核膜孔を介してＨＩＶ  ＰＩＣが移行する前に完了するものと推察される。レンチウイルスの逆転写の細胞下での分布については現在議論が為されているところであり、ＨＩＶの複製が特定の細胞区画で生じるかどうかは、なお未解決の問題である。分画研究に基づいて、ＨＩＶの逆転写は全て細胞の核内で起こり得ると報告されている（Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ａ）。しかしながら、分画技術では、核内への局在と核膜への会合とを区別し得ない。別の著者は、これとは逆に、逆転写複合体と細胞骨格と会合がウイルスのＤＮＡ合成に必須条件であると提案している（Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＨＩＶ−１  ＤＮＡの合成に対する、及び該ＤＮＡの核画分との会合に対する速度論的研究では、後者の過程が前者よりもずっと急速であることが示されている。単一サイクルの逆転写中に起こるＨＩＶ−１ＤＮＡの合成は、感染後２４〜４８時間経過しなければプラトーに達しないのに対して、感染から４〜６時間後には早くも、９５％超のＨＩＶ−１  ＤＮＡが感染細胞の核に分画される。（Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。それ故、レンチウイルスの逆転写は、主に核膜や核膜孔複合体（ＮＰＣｓ）の直近において、ウイルスのキャプシド内で起こるという第三の可能性を本発明者らは支持するが、かかる仮説を確認するためには、さらなる実験が必要とされるであろう。
【００４０】
細胞の有糸分裂により、三重鎖欠損ウイルスＤＮＡが宿主細胞の核に入るための代替経路が与えられるわけではない。本例が示すところでは、中央部三重鎖変異体ウイルスは、分裂していない標的細胞のみならず、分裂する標的細胞においても、ウイルスの複製能を強く阻害する。逆に、ＨＩＶ−１由来のべクター中にＤＮＡ三重鎖配列を挿入すると分裂細胞、非分裂細胞の何れにおいても遺伝子の形質導入が刺激される。これは、専ら非分裂細胞で複製が欠損すると報告されているＭＡ／Ｖｐｒ変異ウイルスの公表された表現型とは異なる（Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ｂ；Ｈｅｉｎｚｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；ｖｏｎ  Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。これ故、ＭＡ／ＶｐｒＨＩＶ変異体は有糸分裂依存性オンコウイルスのように振舞うであろう。中央部三重鎖変異体の挙動が異なることについての説明の一つとしては、かかるウイルスは核内移行過程の後期段階が欠損しており、その結果、前記三重鎖欠損ＤＮＡ分子は核膜と会合することになるということが考えられる。この緊密な会合は有糸分裂の間、持続する。変異体ウイルスＤＮＡは有糸分裂の核膜小胞内に捕捉され、ＮＬＳ−ＬａｃＺタンパク質の場合に報告されたように（Ｂｏｎｎｅｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、細胞の染色体に達することができないのかもしれない。しかしながら、カリオフェリン（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎｓ）との相互作用を阻害する細胞のＮＬＳの変異が、変異タンパク質の細胞質への蓄積を誘導することは公知である（Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｌａｎｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｂｕｔｅｌ，１９８４）。これ故、以前に示唆されたように（Ｇｕｌｉｚｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ＨＩＶ−１  ＰＩＣｓの核親和的特性に対するＮＬＳ配列の寄与が変異すれば、前記ウイルスＤＮＡの細胞質への滞留を誘導するはずである。それ故、ＭＡ／Ｖｐｒ変異体ウイルス由来のＰＩＣｓは、有糸分裂中に起こる核膜の崩壊後に、細胞の染色体に到達する可能性がある。然るに、レンチウイルスＤＮＡゲノムの有糸分裂依存的な核内移行経路についての直接的な実験的証拠は、現在のところ得られていない。ＭＡ／Ｖｐｒ変異体ウイルスの公表された表現型は若干慎重に考察しなければならないので、レンチウイルスの核内移行欠損が専ら非分裂細胞に複製欠損を誘導するはずであるという新たな仮説にも同様の注意を払わなければならない。レンチウイルスが有糸分裂依存的な核内への移行戦略を採用しているのか、それとも、レンチウイルスゲノムの能動的な核内移行が分裂細胞、非分裂細胞の両者で起こるのかということは、なお未確定の問題である。
【００４１】
本発明はレンチウイルスのベクターの設計を提供する。レンチウイルスによる非分裂性標的細胞への感染は能動的な核内移行経路の使用に依存しているので、得られたベクター構築物中にレンチウイルスの核内移行決定因子を保持させることが重要である。古典的レトロウイルスベクター構築物は、ＬＴＲの間にあるウイルスのコード配列全体が欠失され、目的の配列で置換した置換ベクタ−である。レンチウイルスベクターの場合には、この古典的戦略によって、中央部シス作用性配列であるｃＰＰＴとＣＴＳが欠失されることになる。ＨＩＶの核内移行における三重鎖の役割の重要性は、このような置換ベクター構築物が最適ではないことを示唆する。それ故、ＨＩＶ  ＤＮＡ三重鎖をＨＲ  ＧＦＰ置換ベクターに挿入すると（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ＨＲベクターゲノムの核内移行欠損を補完することによって、野生型ＨＩＶ−１のＤＮＡ移行率に近い率まで、ベクタ−の遺伝子形質導入効率が増強された。
【００４２】
特筆すべきことは、ＤＮＡ三重鎖を欠如するＨＩＶベクターは遺伝子の形質導入能をなお有するが（図２Ｃ、２Ｄ）、ｃＰＰＴが変異したウイルスに残存する複製は、存在しないか、あるいは極めて低いことである（図６Ａ、６Ｂ）。考えられる一つの説明としては、三重鎖に依存しない核内移行が小規模なベクターゲノム（ＨＲ−ＧＦＰの場合約４ｋｂ）の場合には生じ得るが、９．７ｋｂの天然型ＨＩＶ−１ゲノムの移行にはＤＮＡ三重鎖の存在が必要と考えられることである。実際には、比較的非効率ではあるにしても、３〜４ｋｂの規模のＤＮＡ分子の能動的な核内移行が報告されている（Ｈａｎｇｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００４３】
ＤＮＡ三重鎖の形成を司るシス作用性配列は全てのレンチウイルスゲノムの中央部に見出される。ＮＰＣｓを介した効率的な取り込みのために、三重鎖の周囲に直鎖状ＤＮＡ分子の左腕及び右腕が対称的に折り畳まれる必要があり得るとするならば、この中央部位はＰＩＣｓのコンフォメーションと構造的に関与しているために進化したのかもしれない（図７Ｂ）。もしウイルスに対してもこのことが当てはまるのであれば、ベクターゲノムの効率的な核内移行にはＤＮＡ三重鎖の中央位も必要とされるかもしれない。
【００４４】
例
本発明は、以下の例によってさらに明らかになると思われるが、これらの例は純粋に本発明を例示したものにすぎない。
【００４５】
例１：実験の操作
細胞
ＭＴ４細胞は、ＨＴＬＶ−１を形質転換したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞であり、細胞変性を伴う急性ＨＩＶ−１感染を受け得る（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。Ｈ９細胞は、ＨＩＶに対して許容性が低いが，感染後に慢性的な産生が起こり得る。ＭＴ４とＨ９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）は健康なドナーから採取し、１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）で刺激し、インターロイキン−２（１０％リンフォカルト（ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ）；Ｂｉｏｔｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の存在下で維持した。２９３Ｔ細胞は１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。Ｐ４指示細胞はＨＩＶ感染性のＨｅＬａ ＣＤ４＋細胞であり、ＨＩＶ−１  ＬＴＲの制御下にあるＬａｃＺ遺伝子を担持する（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。Ｐ４細胞は１０％ＦＣＳと５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ培地中で培養する。
【００４６】
細胞の採集と分画
臍帯血試料は、母親のインフォームドコンセントを得て捕集した。ｍｉｎｉＭＡＣＳ免疫磁気ビーズ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、以前記載されたように（Ｒｏｂｉｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ＣＤ３４＋細胞を精製した。ビーズ分離したＣＤ３４＋細胞の精製度は７５％超であった。さらにアルゴンイオンレーザーを備えたＦＡＣＳ  ＶａｎｔａｇｅＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、ＣＤ３４−ＰＥ−Ｃｙ５（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）とＣＤ３８−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に対して誘導されたマウスのモノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）を使用して、細胞選別によりＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ／−画分を精製した。ＣＤ３４＋細胞は１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含有するウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）の中で凍結するか、又は即時に使用した。
【００４７】
ＤＮＡ構築物
プロウイルスプラスミド：
以前に記載されたように（Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５）、感染性の分子クローンであるｐＬＡＩ３由来のＥｃｏＲＩの１．１ｋｂ挿入物（４６８４〜５７７９）を担持するＭ１３ｍｐ１８に、位置指定突然変異導入を施した。突然変異プライマーは以下の通りであった。
ｃＰＰＴ−ＡＧ５’ｐＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＴ３’（配列番号１）
ｃＰＰＴ−Ｄ：５´ｐＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＧＧＧＧＴＡＣ３’（配列番号２）。
ｐＬＡＩ３に変異ＥｃｏＲI断片をクローニングバックすることにより、ｐｃＰＰＴ−ＡＧ、ｐｃＰＰＴ−Ｄ、ｐｃＰＰＴ−２５及びｐＣＴＳを構築した。
【００４８】
ベクタープラスミド：
ベクタープラスミドは、ＨＲ’ＣＭＶＬａｃＺ（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）由来であった。ＬａｃＺレポーター遺伝子はＥＧＦＰ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって置換した。ｐＥＧＦＰ―Ｎ１プラスミド由来のＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲによって、ＥＧＦＰ遺伝子を増幅し、５’末端と３’末端に、それぞれＢａｍＨＩとＸｈｏＩの制限部位を加えた。ＰＣＲプライマーは、以下のとおりであった。
Ｂａｍ  ＧＦＰ：５’ＣＣ ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＣＣ３’（配列番号３）
Ｘｈｏ  ＧＦＰ：５’ＣＣ ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＧＡＧ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ３’（配列番号４）。
ｐＨＲ’ＣＭＶＬａｃＺのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位にこのＰＣＲ断片をクローニングバックすることにより、ＨＲ  ＧＦＰベクターを構築し、ＬａｃＺ  ＯＲＦをＥＧＦＰで置換した。
【００４９】
ＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＣＭＶ  ＧＦＰとＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＰＬ  ＣＭＶ  ＧＦＰ：
まず、特有のＬＴＲを含有するサブクローンを構築し、ｐＵＣ  ＬＴＲと命名した。その３’ＬＴＲを包含するＴＲＩＰ  ＧＦＰのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片をｐＵＣ１８にクローン化した。続いて、埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｉｎ）によって前記ＥｃｏＲＩ部位を破壊し、ベクターｐＵＣ  ＬＴＲ  ＲＩ−を作成した。Ｕ３配列のプロモーターとエンハンサーを除くプラスミド全体を増幅するために、ｐＵＣ  ＬＴＲ  ＲＩ−に対して、発散性（ｄｉｖｅｒｇｉｎｇ）ＰＣＲを行った。プライマーは、
ＤＵ３−：５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＴＴＧＧＧＡＧＴＧ ３'（配列番号５）
ＤＵ３＋：５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＣ  ３’（配列番号６）であった。
前記プライマーは、各プライマー上に存在するＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｕ３配列に代わって挿入すべき制限部位を含有する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化した後、形質転換受容性の細菌を形質転換するのに使用した。これにより構築したプラスミドをｐＬＴＲ  ΔＵ３  ＲＩ−と命名した。
【００５０】
ｐＬＴＲ ΔＵ３ ＲＩ−に、Ｕ３配列に代えて挿入したポリリンカーは、
ＣｌａＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ−ＸｈｏＩである。
３’ＬＴＲを含有するＴＲＩＰ  ＧＦＰのＫｐｎＩ／Ｎｈｅｌ断片をｐＬＴＲ  ΔＵ３  ＲＩ−のＫｐｎＩ／ＸｂａI断片に置換することにより（ＮｈｅＩ及びＸｂａＩ制限産物は互換性がある）、前記ＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＧＦＰプラスミドを構築した。続いて、ＣｌａＩ／ＸｈｏＩによる消化と埋め込みによって、ｐＬＴＲ  ΔＵ３  ＲＩ−から前記ポリリンカー（ＰＬ）を除去した。
前記ＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＧＦＰプラスミドは、ＴＲＩＰ  ＧＦＰのＫｐｎＩ／Ｎｈｅｌ断片をｐＬＴＲ  Ｕ３ΔＰＬ  ＲＩ−のＫｐｎＩ／Ｘｂａｌ断片と交換することによって構築した。
ｃＰＰＴとＣＴＳを包含するｐＬＡＩ３の１７８ｂｐ断片（４７９３〜４９７１）をＰＣＲで増幅した。ＨＲ  ＧＦＰの唯一のいＣｌａＩ部位に該断片を挿入するために、プライマーの５’端にＮａｒＩ制限部位を付加した。
Ｎａｒ  ＴＲＩＰ＋：５’ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＧＧＣＧＣＣ  ＧＡＡＴＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣ  ３’（配列番号７）
Ｎａｒ  ＴＲＩＰ−：５’ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＧＣＧＣＣ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  Ｃ  ３’（配列番号８）
この三重鎖配列を正規の方向で挿入すると、ＴＲＩＰ  ＧＦＰプラスミドベクターを生じ、逆の方向ではＴＲＩＰｉｎｖ  ＧＦＰを生じた。あるいは、ｃＰＰＴ又はＣＴＳ中に、対応するウイルスと同じ変異を含有するベクターを産生するために、同じ三重鎖断片をｐｃＰＰＴ−ＡＧ、ｐｃＰＰＴ−Ｄ、ｐｃＰＰＴ−２２５、及びｐＣＴＳプラスミドから増幅した。
【００５１】
ＴＲＩＰ  ＥＦ１α  ＧＦＰとＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＥＦ１α  ＧＦＰ：
ＴＲＩＰ  ＧＦＰのＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターで置換した。まず、重複するプライマーを用いて、前記三重鎖配列とＥＦ１αプロモーターを各別に増幅した。ｐＬａｉマトリックス上でプライマーＮａｒ  ＴＲＩＰ＋とＭｌｕ  ＴＲＩＰ−を用いて前記三重鎖配列を増幅し、プライマーＭｌｕ  ＥＦ１＋とＢａｍ  ＥＦ１−を用いてｐＥＦｐｇｋｎｅｏマトリックス上でＥＦ１αプロモーターを増幅した。
Ｎａｒ  ＴＲＩＰ＋：  ５’ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＧＣＧＣＣ  ＧＡＡＴＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣ  ３’（配列番号９）
Ｍｌｕ  ＴＲＩＰ−：  ５’ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＡＣＧＣＧＴ  ＡＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  Ｇ  ３’（配列番号１０）
Ｍｌｕ  ＥＦ１＋：  ５’ＣＴＧ  ＡＴ  ＡＣＧＣＧＴ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ３’（配列番号１１）
Ｂａｍ  ＥＦ１−：  ５’ＣＧ  ＧＧＡＴＣＣ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＡＡＣ３’（配列番号１２）
続いて、最初の二つのＰＣＲ産物の混合物に対し、外側プライマーＮａｒ  ＴＲＩＰ＋とＢａｍ  ＥＦ１−を用いて、二回目のＰＣＲを行った。前記三重鎖配列と前記ＥＦ１αプロモーターはこの技術により結合した。
プラスミドＴＲＩＰ  ＥＦ１α  ＧＦＰは、三重鎖配列とＣＭＶプロモーターとを含有するＴｒｉｐ  ＧＦＰのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ産物ＴＲＩＰ  ＥＦ１αに置換することによって構築した（Ｎａｒ  ＴＲＩＰ＋プライマーはその５’端にＥｃｏＲＩ部位を保有する）。
ＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＥＦ１α  ＧＦＰプラスミドを構築するため、前記三重鎖配列と前記ＥＦ１αプロモーターを含有するＴＲＩＰ  ＥＦ１α  ＧＦＰのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片を、三重鎖配列とＣＭＶプロモーターを含有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片に代わってＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＧＦＰに挿入した。
【００５２】
ウイルスとベクターの産生
図１〜図６で報告した研究については、リン酸カルシウム共沈殿法によりＨｅＬａ細胞に一過的にトランスフェクションすることによってウイルスを産生した。以前に記載されたように（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ベクタープラスミド、キャプシド形成プラスミド（ｐ８．２）、及びＶＳＶエンベロープ発現プラスミド（ｐＨＣＭＶ−Ｇ（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４））によって２９３Ｔ細胞を一過性共トランスフェクションすることによってベクター粒子を産生した。全てのウイルスとベクターの上清を、３７℃で１５分間、ＤＮａｓｅＩ（１μＭ  塩化マグネシウム存在下で１μｇ／ｍｌ）で処理した。
【００５３】
レンチウイルスベクタ−粒子の産生
図７〜９で報告される研究については、以前に記載されたように（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ベクタープラスミド、キャプシド形成プラスミド（ｐ８．２）及びＶＳＶエンベロープ発現プラスミド（ｐＨＣＭＶ−Ｇ（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４））による２９３Ｔの一過性共トランスフェクションによって、ウイルスを産生した。全てのウイルスとベクターの上清は３７℃で１５分間ＤＮａｓｅＩ（１μＭ  塩化マグネシウム存在下で１μｇ／ｍｌ）で処理した。
【００５４】
ウイルスとベクタ−の力価測定
図１〜６に報告されている研究のために、２０μＭのＤＥＡＥ−デキストランの存在下、９６ウェルプレートに播種したＰ４細胞を感染させることにより、等量の粒子（１ウェル当たり１ｎｇのｐ２４ウイルス抗体）を用いて、１サイクルのウイルス力価測定を三回に分けて行った。実験を通じて、プロテアーゼ阻害剤Ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ（Ｒｏｃｈｅ）を加え（１μＭ）、分析を単一サイクルの感染に限定した。細胞の有糸分裂は、感染の前日にアフィコリン（ａｐｈｉｃｏｌｉｎ）処理（８μＭ）によって阻害した。βガラクトシターゼ活性は化学発光性β−Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、感染４８時間後に計測した。
Ｈｅｌａ細胞は、等量のベクター粒子（１ウェル当たり５ｎｇのｐ２４）を用いて、三回に分けて感染させた。形質導入後４８時間後に、培地を２００μｌのＴＮＢ（Ｔｒｉｓ５０ｍＭ  ｐＨ７．５、Ｎａｃｌ１５０ｍＭ）に交換し、マイクロプレート蛍光器（Ｖｉｃｔｏｒ２、Ｗａｌｌａｃ）及びＥＧＦＰを接着させたフィルター（励起４８５ｎｍ、発光５２０ｎｍ）を用いて、生存細胞の蛍光を定量化した。
【００５５】
形質導入プロトコール
図７〜９に報告した研究のために、製造業者の指示に従って、２４又は９６ウェルの組織培養プレートをフィブロネクチン（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅ）でコートした。精製又は解凍後即座に、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）、４つの組み換え型（ｒ）ヒト（ｈｕ）サイトカイン、すなわちｒｈｕ−幹細胞因子（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ、Ａｍｇｅｎより調達）、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ、１００ｎｇ／ｍｌ、Ｄｉａｃｌｏｎｅ）、ＩＬ−３（６０ｎｇ／ｍｌ、Ｓａｎｄｏｚ）、及びＰＥＧ化された（ＰＥＧ）−ｒｈｕ−巨核球成長分化因子（Ｍｅｇａｃａｒｙｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ、ＭＧＤＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ、Ａｍｇｅｎ）の存在下で、無血清培地（１１．５μＭ  ａ−チオグリセロール、１．５％  ＢＳＡ（双方ともＳｉｇｍａ）、超音波処理された脂質、及び鉄飽和結合型ヒトトランスフェリンを含有するＩＭＤＭ）、又は１０％  ＦＣＳを含有するａ−ＭＥＭ中に、２〜３×１０５細胞／ｍｌでヒトＣＤ３４＋細胞群を播種し、２４時間の間に、ウイルスＰ２４の濃度が１ｍｌ当たり１００ｎｇとなるようにレンチウイルスを濃縮した。その後、細胞を洗浄し、リンパ骨髄系の条件下（１０％ヒト血清、５％ＦＣＳ，及び以下の７つのサイトカイン、ｒｈｕ−ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈｕ−ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＥＧ−ｒｈｕ−ＭＧＤＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈｕ−ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈｕ−ＩＬ−２（５ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈｕ−ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びｒｈｕ−ＩＬ−７（２０ｎｇ／ｍｌ）（３つのＩＬはＤｉａｃｌｏｎ製）を添加したＲＰＭＩ中でＭＳ５細胞をあらかじめコートした培養組織用培養プレートにおいて）で４８時間培養した。その後、ＣＤ３４−ＰＥ−Ｃｙ５ＭｏＡｂ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）を使用して、ＣＤ３４＋細胞画分中のｅＧＦＰの発現を評価した。Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＦＡＣＳ  Ｓｃａｎ上で分析を行った。
【００５６】
クローン原性と長期培養（ＬＴＣ）アッセイ
新しいヒトＣＢ細胞由来のクローン原性前駆細胞を５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈｕ−ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈｕ−ＧＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ）、２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈｕ−ＩＬ３、及び２Ｕ／ｍｌ  ｒｈｕ−ＥＰＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下で、３０％ＦＣＳ、１％脱イオンＢＳＡ、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含有する０．８％メチルセルロース中でアッセイした。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ移植マウス由来の骨髄（ＢＭ）細胞を、記載に従って（Ｐｆｌｕｍｉｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ｒｈｕ−ＳＣＦ、−ＩＬ−３、−ＥＰＯ、及び−ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で播種した。すでに記載された基準に従って（Ｃｒｏｉｓｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、１４〜１６日に前駆細胞を計数し、ニコンのＥｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００顕微鏡を使用した蛍光顕微鏡により、ＥＧＦＰの発現を観察した。以前記載されたように（Ｉｓｓａａｄ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ＡＣＤＵ（ＢＤ）を備えたファックスバンテ−ジ（ＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ）を使用して、９６ウェルプレート中で限界希釈するか、又はマウス間質細胞株ＭＳ５の集密層を含有する２４−ウェルプレートで大量培養を行うかの何れかで、長期培養（ＬＴＣ）を実施した。５〜１０週間後、接着細胞及び非接着細胞を回収し、クローン原性アッセイのために播種した。クローン原性及びＬＴＣ−ＩＣアッセイの双方のために、コロニーを個々に採取し、ＰＣＲ分析の前に凍結した。
【００５７】
ＰＣＲ分析
クローン原性前駆細胞由来のコロニー又はリンパ骨髄系の培地で培養したクローン由来のコロニーのいずれかから得たゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行った。細胞を溶解し、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）、塩化カリウム（５０ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．３）、塩化マグネシウム（２．５ｍＭ）、ゼラチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ＮＰ４０（０．４５％）、及びトゥイーン２０（０．４５％）を含有する２０μｌの緩衝液中でタンパク質を消化した。ゲノムＤＮＡの増幅は、センスプライマー５’ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧ  ３’（配列番号１３）、及びアンチセンスプライマー５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣ  ３’（配列番号１４）を用いて、６２℃のアニ−リング温度で行った。増幅すると８００ｂｐの産物が得られた。
【００５８】
ウイルスとベクターＤＮＡの分析
Ｐ４又はＭＴ４細胞を、高感染度のウイルス（１０６細胞当たり１５０ｎｇのｐ２４）に感染させるか、又はベクター（１０６細胞当たり２５ｎｇのｐ２４）によって形質導入し、Ｐ４細胞の場合には２０μｇ／ｍｌのＤＥＭＥ−デキストランの存在下で行った。感染又は形質導入した細胞由来のＤＮＡを様々な時点で抽出し、制限酵素にかけてサザンブロットで分析した。全てのケースにおいて、ＤｐｎＩ消化によって、混入している細菌性プラスミドＤＮＡを分析物から除去した。感染細胞由来のＤＮＡをＭｓｃＩとＸｈｏＩによって消化し、形質導入した細胞由来のＤＮＡはＥｃｏＮＩ、ＡｖａＩＩ、ＸｈｏＩによって消化した。１０μｇの消化したＤＮＡを電気泳動し、転写した後、ランダムプライマー法で合成した［３２Ｐ］標識ＤＮＡプローブ（ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて膜にハイブリダイズさせた。以下のプライマーを使用してｐＬＡＩ３プラスミドテンプレートから、ウイルス特異的ＤＮＡプローブをＰＣＲにより増幅した。
５Ｍｓｃ：  ５’ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ３’（配列番号１５）
３Ｍｓｃ：  ５’ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＣＴＣ  ＴＧ  ３’（配列番号１６）。
得られた１６８０ｂｐのＤＮＡ断片（ｐＬＡＩ３上の１８１８〜３４９８位）はウイルスゲノムの２６５５位でＭｓｃＩ制限部位が重なる。
ベクタープローブは、プライマー、
５ＥｃｏＮＩ：  ５´ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  ＡＧ  ３’（配列番号１７）
３ＥｃｏＮＩ：  ５´ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ３’（配列番号１８）
を用いて、ｐＴＲＩＰ  ＧＦＰに対するＰＣＲによって合成した。
ベクタープローブは１０２７ｂｐ断片（ｐＴＲＩＰ  ＧＦＰの６４９〜１６７６位）であり、ベクターゲノムの１１５６位で前記ＥｃｏＮＩ部位が重なる。
野生型、ＰＰＴ−ＡＧ、ｃＰＰＴ−Ｄウイルス由来の逆行転写ＤＮＡの量をアッセイするために、感染１２時間後に抽出したＤＮＡをＭｃｓＩとＤｐｎＩによって制限消化したことを除いて、同様のプロトコールに従った。ハイブリダイゼーションに使用するプローブはｐＬＡＩ３由来のＭｓｃＩ  １．９ｋｂ内部断片であった。燐光画像化装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して、ハイブリダイゼーション信号を定量した。
【００５９】
インシチュハイブリダイゼーション
２０μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥデキストランの存在下で、高感染度（１０６細胞当たり２μｇの各ウイルスのｐ２４抗原）Ｐ４細胞に感染させた。感染から２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、（形質膜に吸着したウイルス粒子を除去するため）隈なく洗浄し、２４ウェルのプレート中のガラスカバースライド上に再度播種した。細胞をさらに４８時間培養し、２０分間室温で４％  ＰＦＡ／ＰＢＳ中で固定した。細胞をＰＢＳで洗浄して、５分間室温で、ＰＢＳ中で０．５％トリトン／０．５％サポニンによって透過性にした。脱水したサンプルを、ＲＮａｓｅＡ（２Ｘ  ＳＣＣ中に２００μｇ／ｍｌ）で３７℃１時間処理し、プロテインキナーゼＫで（ＰＢＳ中に６μｇ／ｍｌ）約５分間処理した。７０％の脱イオン化ホルムアルデヒド／２Ｘ  ＳＳＣ中で７０℃２分間インキュベ−トした後、３０％の脱イオン化ホルムアルデヒド／２ＸＳＣＣで２分間７０℃インキュベートして、サンプルを変性させた。ニックトランスレーション法によりビオチン化標識したｐＬＡＩ３プラスミドを使用して、３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った（２Ｘ  ＳＣＣ中で、５０％脱イオン化ホルムアルデヒド、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％トゥイーン２０）。サンプルは隈なく洗浄した（２Ｘ  ＳＣＣ／５０％ホルムアルデヒド中にて、室温で、続いて５０℃で連続洗浄）。製造業者の指示に従って、Ｔｙｒａｍｉｄ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＴＳＡ−Ｄｉｒｅｃｔキット（ＮＥＮ）を使用してハイブリダイズしたプローブを検出した。
【００６０】
例２：中央部分からの逆転写の開始はＨＩＶ−１複製サイクルの重要な工程である
先の研究において、我々はｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列中の保存的変異がウイルスの複製を著しく阻害することを示した（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｈｕｎｇｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。中央部開始変異ウイルス（ｃＰＰＴ−２２５）及び終結変異ウイルス（ＣＴＳ）は、１回の力価測定実験で、それぞれ４倍及び１０倍の感染力の減少を示した。ｃＰＰＴの機能を不活性化するために、重複するインテグラーゼコーディング領域に半保存的変異を導入した。変異ウイルスｃＰＰＴ−Ｄでは、１８８番アミノ酸のリジンをアルギニンに変えるには、ｃＰＰＴプライマーの１９塩基の配列中に１０の変異を導入するが可能であった（図１Ａ）（Ｈｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９９０）。対照ｃＰＰＴ−ＡＧ変異ウイルスの構築（ｃＰＰＴのポリプリンという性質を考慮してプリンからプリンへの単一変異を導入することによりｃＰＰＴ−Ｄと同一のアミノ酸変化を起こす）によって、ウイルスの複製に対する該アミノ酸変化の影響を調べた。以前に記載されたもの（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１；  Ｃｈａｒｎｅａｕ  ａｎｄ  Ｃｌａｖｅｌ，  １９９１）と同様の感染細胞由来のＨｉｒｔ  ＤＮＡのＳ１ヌクレアーゼ切断によって、逆転写された野生型及びｃＰＰＴ−ＡＧウイルスＤＮＡ中にＤＮＡ三重鎖が存在すること、及びｃＰＰＴ−ＤウイルスＤＮＡにはＤＮＡ三重鎖が存在しないことを確認した。
【００６１】
まず細胞培養中での古典的な動的複製実験においてウイルスの感染力を評価した。ＰＨＡで刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）及びＭＴ４細胞に同数のウイルス粒子を感染させ、ウイルス上清のキャプシドタンパク質（ｐ２４）含量によって標準化し、培養上清中の逆転写活性を経時的に追跡した（図１Ｂ）。野生型ＨＩＶ−１  ＬＡＩ及びｃＰＰＴ−ＡＧ対照ウイルスの成長曲線は両細胞系で類似していた。Ｋ１８８Ｒ変異が幾つかのＨＩＶ−１単離体で自然発生するという事実は、該変異がインテグラーゼ及びＰＰＴの機能にほとんど又は全く影響を与えないということを既に示唆していた。これに対して、ＰＢＬをｃＰＰＴ−Ｄ変異体に感染させても、１５日間の培養中には複製は検出されなかった。ＨＩＶの感染を非常に受けやすいにも関わらずＭＴ４細胞においても同様であった。ｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスはＨ９又はＣＥＭのような不死化した細胞株においても感染力がなかった（データは示さず）。
【００６２】
次に１ラウンドの複製による力価測定によって、ウイルスの感染力を量的に解析した（図１Ｃ）。Ｐ４指示細胞（ＨｅＬａ  ＣＤ４  ＬＴＲ−ＬａｃＺ）（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４）に、前記異なるウイルスのウイルス粒子を同じ数だけ感染させた。該１サイクルの力価測定により、ｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスの感染力がほぼ完全に失われていることが確認された。Ｐ４細胞では、ｃＰＰＴ−ＡＧコントロールの感染力は野生型ウイルスの感染力と同一であったのに対して、ｃＰＰＴ−Ｄ変異体の感染力はバックグラウンドレベル付近にまで激しく減少していた。同一の結果がアフィジコリン処理した非分裂Ｐ４細胞で得られた（図１Ｃ、右パネル）。
【００６３】
これらの発見により、非分裂細胞及び増殖している細胞中でのＨＩＶの複製に、中央部分からの逆転写の開始が必要であることが強く示唆される。
【００６４】
例３：ウイルス産生はｃＰＰＴの変異に影響されない
本発明者らは、ｃＰＰＴ−ＡＧ及びｃＰＰＴ−Ｄプラスミドプロウイルスに導入された様々な変異が複製サイクルの後期段階には影響を与えないことを確認した。ＨｅＬａ細胞にプロウイルスプラスミドを一過的に感染させた後、上清のＰ２４含量によってウイルス産生を定量した。ｃＰＰＴ変異体ウイルスの産生と野生株ウイルスの産生には著しい変化はないことが分かった（図２Ａ）。従って、変異Ｋ１８８ＲはＨＩＶ−１の複製の後期段階には影響を与えない。従って、ｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスの表現型に関わる欠失段階はウイルスＤＮＡの発現に先立つはずであり、ＨＩＶ複製サイクルの早い段階に含まれるはずである。
【００６５】
例４：ｃＰＰＴの変異はＨＩＶ−１ゲノムの逆転写の速度に影響を与えない
単一ラウンドの逆転写で合成されるＤＮＡを定量することによって、ウイルスＤＮＡの合成に対するｃＰＰＴの変異の影響を定量化した（図２Ｂ）。対応するＭｓｃＩＤＮＡ断片をプローブとして用いて、感染細胞のウイルスＤＮＡ由来の内部ＭｓｃＩ制限断片をサザンブロットで検出し、定量した。前記内部ＭｓｃＩ断片はゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡ、及び組み込まれていない直鎖状及び環状分子に共通のものであるため、その定量化は全量のウイルスＤＮＡを示し、組み込まれた状態か否かには関係ない。分析を逆転写の第一サイクルに限定するために、感染から１２時間後、感染の第二ラウンドの開始前に感染したＰ４細胞のＤＮＡを回収した。単一サイクルの逆転写で逆行転写されたＤＮＡの全量は、ｃＰＰＴ−Ｄ、ｃＰＰＴ−ＡＧ対照、又は野生型ウイルスを感染させた後で等量であった。該実験によりｃＰＰＴ中の変異はウイルスの複製を阻害するが、ＤＮＡ合成の速度には影響を与えないことが示された。ｃＰＰＴ変異ウイルスの複製欠損はウイルスＤＮＡ合成に続く段階と関係していると考えられる。
【００６６】
例５：中央部ＤＮＡ三重鎖の欠如はＨＩＶ−１  ＰＩＣのインビトロでの組み込みに影響を与えない
Ｆａｒｎｅｔ（Ｆａｒｎｅｔ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，  １９９０）によって記述された定量インビトロインテグレーションアッセイを若干改変して利用し、野生型ＨＩＶ−１由来のＰＩＣのインビトロでの組み込み能及び中央部開始変異体由来のＰＩＣの組み込み能を比較した（図２Ｃ）。ＨＩＶ−１の複製複合体は感染直後の細胞の細胞質に一過性にしか存在しないので（Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）、十分な量のＨＩＶ  ＰＩＣを調製するには大量の感染及び４〜６時間以内の細胞分画が必要である。慢性的に野生型又はｃＰＰＴ−２２５ウイルスの何れかに感染したＨ９細胞と非感染ＨＵＴ−７８標的細胞を共培養することによって、これを達成した。慢性的な感染を確立し得ない非感染性のｃＰＰＴ−Ｄに代えて、ｃＰＰＴ−０２２５変異ウイルス（図１Ａ）を該実験のために選択した。ｃＰＰＴ−２２５変異ウイルスの残存感染力は低いが、細胞培養中でゆっくりと伝播するには十分な感染力である（Ｃａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。
【００６７】
ＨＩＶ  ＰＩＣを感染細胞の細胞質から単離し、直鎖化したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド標的ＤＮＡの存在下でインキュベートした。ＨＩＶ−１プローブに反応する１２．７ｋｂ断片（３ｋｂの標的ＤＮＡに組み込まれた９．７ｋｂの直鎖状ＨＩＶゲノムの予想サイズに相当する）の存在により組み込みが示された。
【００６８】
前記プラスミドＤＮＡに組み込まれた直鎖状ＤＮＡの量は野生型及びｃＰＰＴ−２２５変異ウイルスの間で異ならなかった（図２Ｃ）。従ってｃＰＰＴ変異体由来のＨＩＶ−１  ＰＩＣはインビトロでは完全な組み込み能を保持していた。中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスの不完全な複製工程は、逆転写の後であるが、直鎖状ＨＩＶゲノムが宿主細胞のクロマチンに組み込まれる前に起こるはずである。
【００６９】
例６：中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスの核内移行障害
前記実験によって、中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスの複製欠損はＨＩＶ  ＰＩＣの細胞標的のクロマチンへの接触と相関があることが示唆された。従って、我々はｃＰＰＴ変異ウイルス由来ＤＮＡの核内移行が欠損しているという仮説を検証した。ＨＩＶ−１  ＰＩＣの核内移行に関する研究は、ウイルスＤＮＡレベルでの核内移行の定量的且つ再現性あるアッセイが存在していないために進展していない。細胞質で一度逆行転写されると、レトロウイルスの直鎖状ＤＮＡは核に移行し、組み込まれるか環状化する。１又は２個のＬＴＲを含有する、ゲノムに組み込まれないレトロウイルスＤＮＡ環は専ら核内に見られ、従って有用なウイルスＤＮＡの核内移行マーカーになる。ＨＩＶ  ＤＮＡの核内移行を評価するために、先行研究では２つの組み込まれていないＬＴＲ  ＤＮＡ環のＰＣＲ増幅を利用した。しかしながら、本明細書及びＢａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）に報告されているように、２個のＬＴＲ環は感染細胞中のＨＩＶ  ＤＮＡとしては極一部に相当するので、その検出は細胞の生理機構及びウイルスの感染力の微妙な変化に対して非常に敏感である。従って、本発明者らはＨＩＶ  ＤＮＡの合成、環状化、及び組み込みをサザンブロットによって定量的に追跡することができる新たなアッセイを設計した。
【００７０】
端的には、感染細胞由来のＤＮＡを様々な時点で調製し、ＨＩＶ−１ゲノムを２回切断する制限酵素であるＭｓｃＩで処理する。ＰＣＲで作製された前記５’ＭｓｃＩ部位に正確に重なるＤＮＡプローブを用いると、いくつかの特異的なバンドが見られる（図３Ａ）。内部１．９ｋｂ  ＭｓｃＩ断片は組み込まれている状態か否かに関わらず全てのウイルスＤＮＡ種に共通であり、該バンドを定量することによって感染細胞におけるウイルスＤＮＡの総量が示される。２．６ｋｂのバンドは組み込まれていない直鎖状ＨＩＶ−ＤＮＡの遠位の５’ＭｓｃＩ断片に相当する。ＤＮＡ環特異的な断片のサイズが大きいことに起因する転写バイアスを最小限にするために、前記ＤＮＡを更にＸｈｏＩで切断する。１又は２個のＬＴＲ環状ＤＮＡが、次いで、２．８ｋｂ及び３．４ｋｂのバンドにそれぞれ現れる。ＤＮＡプローブは５’ＭｓｃＩ部位に正確に重複するので、各々のバンドの強度は相当するウイルスＤＮＡ種の量に直接比例する。組み込まれたプロウイルスＤＮＡの量はウイルスＤＮＡの総量から組み込まれていない直鎖状及び環状のウイルスＤＮＡのシグナルを差し引くことにより算出される。低分子量の組み込まれていないウイルスＤＮＡと高分子の組み込まれたプロウイルスＤＮＡを分離するために、Ｈｉｒｔ断片化の後に、同一の感染細胞集団に類似の定量化を行った。これにより同一の結果が得られたので、１ステップの引き算の有効性が確認された。
【００７１】
全ウイルスＤＮＡ（１．９ｋｂ内部断片）の蓄積の速度論により示されるように、ウイルスＤＮＡの合成は感染後２４〜４８時間に進行し、非同調的な感染プロセスを反映した。ｃＰＰＴ−ＡＧ及びｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルス由来の全ウイルスＤＮＡの量は野生型ＨＩＶ−１のＤＮＡ量とほぼ同じであった。先のように、ｃＰＰＴにおける変異はＤＮＡの合成速度に影響を与えなかった。組み込まれていない完全長直鎖状ＤＮＡの検出可能な量は感染後６時間には既に細胞内に存在した（図３Ｂ）。組み込まれたプロウイルス及びＤＮＡ環は、まず感染１２時間後に検出された。組み込み及び環状化はさらに３６時間にわたって完了する。
【００７２】
１サイクルの感染が完了するとすぐに、野生型ウイルスの場合には、約５５％のウイルスＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡに組み込まれ、約３５％は１  ＬＴＲ環の中に環状化され、１０％未満の小画分は安定な組み込まれていない直鎖ＤＮＡのままであった（図３Ｃ）。特に、２  ＬＴＲ環状ＤＮＡは感染から４８時間後には検出可能ではあるが、極少量しか存在しなかった。ｃＰＰＴ−ＡＧ対照ウイルス由来のＤＡＮは野生型ウイルス由来のＤＮＡと極めて類似した形態で処理された。
【００７３】
ｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスの場合には、細胞内ＤＮＡのパターンにおける際立った変化、組み込まれていない直鎖状分子の明瞭且つ持続的な蓄積が明らかである。感染から４８時間後には、極少量の１個のＬＴＲ環状ＤＮＡ及び組み込まれたプロウイルスＤＮＡが合成され、９０％超のｃＰＰＴ−Ｄ変異ＤＮＡは組み込まれない直鎖状の形態で阻害されていた（図３Ｃ）。
【００７４】
核内移行欠損は核ウイルスＤＮＡ種（組み込まれたプロウイルス及び１個及び２個のＬＴＲ環）の割合を減少させ、それに伴って、移行しなかった直鎖状ＤＮＡ分子の割合を上昇させると予測される。従って、ｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスの細胞内ＤＮＡプロフィールはウイルスＤＮＡの核内移行欠損を強く示唆する。
【００７５】
例７：中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルス由来の直鎖ＤＮＡは核膜の近傍に蓄積する
中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスの核内移行欠損の性質をさらに決定するために、本発明者らは変異した直鎖ＤＮＡ分子が特定の細胞内区画に蓄積するのかどうかという問題に取り組んだ。核内移行プロセスは２つの主な相、核構成要素の核膜へのドッキングと、核膜孔複合体（ＮＰＣ）を通じた該構成要素の移行とに分けることができる。本発明者らは、まず古典的な感染細胞の核／細胞質分画を行った後にウイルスＤＮＡのサザンブロット検出を行った。全ウイルスの総ウイルスＤＮＡは感染から２４時間後には感染Ｐ４細胞の核と共に局在した（図４Ａ）。このことはＨＩＶ  ＤＮＡの核膜へのドッキングは中央部ＤＮＡ三重鎖の欠如により影響を受けなかったことを示唆する。
【００７６】
中央部三重鎖欠失ＤＮＡ分子が核膜に蓄積することを確認するために、本発明者らは蛍光インシチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を利用してＨＩＶゲノムの細胞内局在を直接可視化した。１サイクルの条件において、Ｐ４細胞を高感染度で感染させ、完全長のＨＩＶ−１ゲノムプローブとハイブリダイズさせ、デコンボリューション顕微鏡で観察した。野生型及びｃＰＰＴ−ＡＧ対照ウイルスの場合には、特異的なドットが主として核内に見られた（図４Ｂ）。ＦＩＳＨでは異なるＨＩＶ  ＤＮＡ種同士を識別することができないので、該核内ウイルスＤＮＡ分子は組み込まれたプロウイルスか、又は組み込まれていないＤＮＡ環であり得た。いくつかの珍しいゲノムは核膜と結合しており、おそらく感染後同時にサザンブロットによって検出される残りの直鎖ＤＮＡであろう。他のドットは細胞膜と共に存在しており、部分的に逆行転写されたゲノムを含有する膜吸着欠損粒子に由来する可能性が最も高い（Ｌｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。これに対して、ｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスの場合、ＨＩＶゲノムは主に核膜に局在しており、核にはほぼ完全に存在しなかった。事実上全てのｃＰＰＴ−Ｄ  ＤＮＡが直鎖の形態で遮断されているということがサザンブロットＤＮＡプロフィールによって示されたので、本発明者らは、核膜に付随する該ＨＩＶゲノムは組み込まれていない直鎖ＤＮＡ分子であると推定することができる。感染細胞中のウイルスＤＮＡをこのように直接可視化することによって、中央部三重鎖変異体のウイルスＤＮＡが核膜に付随していることが確認された。
【００７７】
本発明者らのＦＩＳＨ実験によりｃＰＰＴ変異ウイルスはＮＰＣを通したゲノムの転移に欠陥があることが示唆される。しかしながら、ＦＩＳＨ実験では、ＮＰＣの細胞質側に変異ウイルスＤＮＡが局在するということによって、転移の欠損を明確に示すことはできない。
【００７８】
綜合すると、本発明者らは、これらの結果から逆転写の際の中央部分からの転写開始及び終結工程によって作製されるＨＩＶ−１の中央部ＤＮＡ三重鎖はＨＩＶ−１  ＰＩＣが宿主細胞の核に移行するのに重要であると結論する。ＤＮＡ三重鎖の非存在下では、ＨＩＶ−１  ＤＮＡが核膜孔を通じて転移する直前又は間にウイルスＤＮＡの核内移行は著しく阻害された。
【００７９】
例８：ＨＩＶ−１に基づいたベクター系による遺伝子の形質導入に対する中央部ＤＮＡ三重鎖の影響
中央部ＤＡＮ三重鎖がＨＩＶ−１の核内移行の中心的決定因子として同定されたので、本発明者らは、以前に記載されたＨＲ  ＨＩＶ−１ベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）の中に、ＨＩＶ−１の中央部シス作用性配列を挿入する効果をテストした（図５Ａ）。遺伝子の形質導入をモニターするために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を更に挿入した。ＤＮＡ三重鎖配列を含むベクターをＴＲＩＰ  ＧＦＰと呼んだ。対照は変異を有するｃＰＰＴ又はＣＴＳと類似した構築物、及び逆向きの機能しない方向に挿入された野生型中央部領域（ＴＲＩＰｉｎｖ  ＧＦＰ）を含んだ。逆行転写されたＴＲＩＰ  ＧＦＰベクターＤＮＡ中にＤＮＡ三重鎖が存在すること、及びＨＲ  ＧＦＰ、ＴＲＩＰｉｎｖ  ＧＦＰ、及び中央部三重鎖配列の変異バージョンを含有するベクターに該三重鎖が存在しないことは、形質導入した細胞から単離されたＨｉｒｔＤＮＡのＳ１ヌクレアーゼ切断により確認した。
【００８０】
形質導入に先立って、トランスフェクト細胞上清中のキャプシドタンパク質（ｐ２４）のレベル、逆転写酵素活性、及びゲノムベクターＲＮＡの質によって、一過的なトランスフェクションによって産生されたベクターの粒子の数を標準化した。３つの標準化基準の間で線形の関係を持つ結果が得られ、様々なベクターが同様に産生された（データは示さず）。従ってＨＩＶ−１ゲノムの中央部領域をＨＲベクターに挿入しても、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成の速度には影響を与えなかった。分裂又は非分裂（アフィジコリン処理）ＨｅＬａ細胞を同数のＨＲ−ＧＦＰ又はＴＲＩＰ−ＧＦＰベクター粒子で形質導入し、ＧＦＰの発現を蛍光定量化により４８時間後にモニターした。融合ベクター粒子による標的細胞へのＧＦＰタンパク質の直接的な輸送によるＧＦＰ活性の偽形質導入がＨＩＶ−１  ＲＴ阻害剤（１μＭ  ネビラピン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）で処理した細胞の形質導入から計算され、該バックグラウンドを蛍光シグナルから差し引いた。ベクター上清中にカルシウム／リン酸ＤＮＡ共沈によって引き起こされる第２のトランスフェクションによる非特異的蛍光は、形質導入に先立ってベクターストックをＤＮａｓｅＩで処理することによって除去した。
【００８１】
これらの条件下では、前記ＨＩＶベクター中に三重鎖配列が存在することによって、ＨｅＬａ細胞中でのＧＦＰ形質導入が１０倍超上昇した（図５Ｂ）。遺伝子の形質導入の増強が、同様に、ＭＴ４又は２９３Ｔのような他の標的細胞株で観察された（データは示さず）。該影響は三重鎖配列を逆向きに挿入するか、又は三重鎖配列のｃＰＰＴに変異を導入すると（図５Ｂ）失われた（データは示さず）。
【００８２】
例９：ＨＩＶ−１ベクター中にＤＮＡ三重鎖が存在すると、ベクターゲノムの核内移行速度が野生型のレベルにまで増加する
次いで興味深いのは、ＨＩＶベクター中の三重鎖配列の挿入によって誘導されるＧＦＰの蛍光の増加が、ベクターＤＮＡの核内移行に対する三重鎖配列の影響によるものであるのか否かを決定することである。該問題を扱うために、本発明者らは、細胞内ウイルスＤＮＡのための定量サザンブロットアッセイを前記ベクター系に適合させた。０．８ｋｂの内部断片を産生するためにＥｃｏＮＩとＡｖａＩＩを用いて、並びにＸｈｏＩを用いて、ベクターを形質導入した細胞由来のＤＮＡを消化した。ＰＣＲで作製されたＥｃｏＮＩ部位に正確に重複するＤＮＡプローブを用いて、組み込まれていない直鎖状ベクターゲノムに特異的なシグナル、及び１又は２のＬＴＲ  ＤＮＡ環に特異的なシグナルが、それぞれ１．２ｋｂ、１．４ｋｂ、及び２ｋｂに得られることが予想された。ＨｅＬａ細胞への形質導入後、様々な時点で、ベクターＤＮＡのプロセシングを解析した。
【００８３】
形質導入した細胞中で合成されたベクターＤＮＡの総量は、前記ＤＮＡ三重鎖を含む、又は欠失するベクターと同等であった（図５Ｃ）。この場合にも、前記ＨＲベクターに何れの方向でｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列を挿入しても、該ゲノムの逆転写速度には影響を与えなかった。燐光画像化による定量化の後、本発明者らは、前記ＨＲ−ＧＦＰ及びＴＲＩＰｉｎｖ−ＧＦＰベクター（図５Ｄ）由来のＤＮＡの細胞内での運命が中央部三重鎖欠損ウイルスのＤＮＡに酷似しており、前記ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクター由来のＤＮＡの運命が野生型ＨＩＶ−１  ＬＡＩウイルス由来のＤＮＡの運命を辿るということを見出した（図３Ｃ）。
【００８４】
ＤＮＡの核内移行の欠損はＨＲ−ＧＦＰ及びＴＲＩＰｉｎｖ−ＧＦＰベクターの場合には明らかである。該ベクター由来のＤＮＡの細胞内における運命は、少量の組み込まれたプロウイルス並びに１及び２のＬＴＲ環と共に、組み込まれていない直鎖状分子が多量に蓄積することによって特徴付けられた。該ＤＮＡプロフィールはｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスのプロフィールを強く想起させるものであった。形質導入細胞におけるベクターＤＮＡのプロセシングが完了するとすぐに、ＨＲ−ＧＦＰ及びＴＲＩＰｉｎｖ−ＧＦＰ構築物由来の７０〜８０％のＤＮＡは組み込まれていない直鎖状分子の形態のままであるのに対して、僅かに１０〜１５％がＬＴＲ環上に組み込まれない状態で存在し、５〜１０％は組み込まれたプロウイルスとして存在した。少量ではあるが、検出可能な量のこの組込まれたベクターＤＮＡによって、ＨＲ−ＧＦＰ又はＴＲＩＰ−ｉｎｖ−ＧＦＰベクターを用いて得られた遺伝子の形質導入が説明されるであろう。
【００８５】
該定量的アッセイにより、ＨＩＶ  ＤＮＡの三重鎖配列をＨＲベクターに正しい方向で導入すると、その核内移行の欠損が野生型のレベルにまで補完されることも示された。形質導入された細胞中でのＴＲＩＰ−ＧＦＰ  ＤＮＡの最終状態は、野生型ＨＩＶ−１ウイルスに観察されるのと同様の状態であった。すなわち、５０％以上のベクターＤＮＡが標的細胞のクロマチンに組み込まれ、且つかなりの画分が環状化され、組み込まれない直鎖状ＤＮＡのままであるのは少数の分子にとどまった（図５Ｄ及び３Ｃ）。これに対して、内部ＣＭＶプロモーターのＨＲベクター上流に三重鎖配列を挿入しても、転写レベルでは、ＧＦＰの発現に影響を与えなかった。このことはＨｅＬａ細胞にｐＨＲ−ＧＦＰ、ｐＴＲＩＰ−ＧＦＰ、及びｐＴＲＩＰｉｎｖ−ＧＦＰプラスミドをトランスフェクションさせ、蛍光定量化によってチェックした（データは示さず）。
【００８６】
これらの結果から、ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターを用いたときにＧＦＰの形質導入が増加するのは、三重鎖が存在することによって核内移行が強く刺激されることに専ら起因することが推測され得る。この発見も、ウイルス及びベクターＤＮＡの核内移行においてＨＩＶ  ＤＮＡ三重鎖が重要な役割を果たしていることを強く裏付けるものである。
【００８７】
例１０：ＤＮＡ三重鎖配列を含有するＨＩＶ−１ベクターは造血幹細胞における効率的な遺伝子の移行を可能にする
図７Ａ及び７Ｂに、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞を用いた２つの成功した形質導入実験の結果を示す。該結果により、短縮した２４又は６０時間形質導入のプロトコール後に、それぞれ７１．５％及び９０％超のＣＤ３４＋細胞がＧＦＰレポータータンパク質を強く発現することを示される。クローン原性前駆細胞アッセイに細胞の播種を開始してから１４日後に回収した前駆細胞由来の細胞コロニーから抽出されたＤＮＡに対するＰＣＲアッセイによって、少なくとも同じ比率でウイルスの組み込みが確かめられたので、該発現は前記細胞の安定な形質導入を反映している。精製直後のＣＤ３４＋細胞を用いて、又は精製後に凍結され、数週間後に形質導入実験のために融解した同一のＣＤ３４＋細胞を用いて、同じ結果を得た。本発明者らは、別の造血幹細胞源である末梢血動員幹細胞（ＰＢＭＣ、ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（サイトカイン刺激後の血球分離により回収）を用いた場合も、同様の形質導入効率を得た。ＣＤ３４＋ＰＢＭＣは、精製直後にも、凍結／融解工程後にも同一の結果で形質導入された。長期培養（ＬＴＣ）及びＮＯＤ−ＳＣＩＤ再集合アッセイを用いて、本発明者らは、多様なリンパ球−骨髄になる可能性と、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄を移植から４ヵ月後に再集合させる能力とを有する細胞を形質導入したことを示した。これらの機能的アッセイは、現時点では、ヒト造血幹細胞の機能を評価するために使用できる最終的な実験である。
【００８８】
例１１：レンチウイルスベクター構築物の中にＤＮＡ三重鎖配列が存在することによって、造血幹細胞への遺伝子の移行が強く刺激される
ＤＮＡ三重鎖配列を含む又は欠如するＨＩＶ−１ベクターのヒト造血幹細胞中での形質導入効率を比較するために、図８に報告された投与／応答実験（３実験の代表）を設計した。本発明者らは、まず、（Ａ）形質導入に用いられたベクター濃度の関数として得られたＣＤ３４＋ｅＧＦＰ＋細胞のパーセントをプロットした。本発明者らは、ベクターがいかなる用量であっても、ＴＲＩＰ＋ベクターはＴＲＩＰ−ベクターよりも効率が高いということを観察した（１ｍｌの各ベクター当たり５００ｎｇのウイルスＰ２４について、ｅＧＦＰ＋であるＣＤ３４＋細胞が、それぞれ平均４０±１９％及び１５．４±１２．５％であった（ｎ＝３実験））。ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターによる形質導入後に、ＨＲ−ＧＦＰベクターの形質導入後に得られる結果と比較すると、ＧＦＰ＋細胞の最終的な割合において４−６倍の増加が得られた。さらに、前記２つのベクター間の効率の差は、ウイルスの投与量の関数として蛍光強度の平均をプロットすると強調される。ＴＲＩＰ−（ＨＲ−ＧＦＰ）ベクターの場合、１００ｎｇのＰ２４／ｍｌの用量でプラトーに達するのに対して、形質導入された細胞中の蛍光強度はＴＲＩＰ＋ベクターの用量とともに増加する。このことは、前組み込み型のＴＲＩＰ−ベクターの核内移行には限界があること、及びＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターの投与量の増加に伴って形質導入後の細胞当たりの組み込まれたコピー数が増加することを反映している可能性がある。第三のプロットは両側面を統合し、ヒトＨＳＣ中のＧＦＰ蛍光活性に対する、ＤＮＡ三重鎖配列の生じた効果を示している。示されるように、ＨＩＶベクターにおけるＤＮＡ三重鎖配列の存在は、１０倍超の桁で、ＨＳＣ中でのＧＦＰ産生の増加を誘導する。
【００８９】
例１２：ＨＩＶベクターゲノムの組み込まれたコピーの一部はヒト造血形質導入細胞中でサイレントな状態に留まる
組み込まれた導入遺伝子の不活性化を起こすことは可能である。形質導入プロトコールの終了から４８時間後に、ＦＡＣＳ解析によって測定されたＣＤ３４＋／ｅＧＦＰ＋細胞の割合によって評価する場合より、組み込まれたレンチウイルスベクター用のＰＣＲアッセイによって決定された被形質導入前駆細胞由来細胞のコロニーの割合によって評価した方が、導入効率は常に良い。このことは、前記細胞が増殖及び分化する間に、プロウイルスの組み込み部位による、又は進行性及びランダムなプロウイルスの不活性化による転写不活性なプロウイルスが生じることを反映している。本発明者らは、幾つかのサブクローンではＧＦＰの輝度が高いのに、他のサブクローンではＧＦＰが陰性であるような、単一の骨髄性クローン原性前駆細胞由来のコロニーを観察した。これは表現型としては均一であるクローン前駆細胞中に組み込まれた導入遺伝子の転写が、ランダムに不活性化されることを反映している。
【００９０】
例１３：ＬＴＲのＵ３領域及び内部ＥＦ１αの欠失バージョンを含有するＨＩＶベクターは、造血幹細胞の形質導入に対するより強力な系である
図９において、本発明者らは、ＤＮＡ三重鎖配列を含む様々なＨＩＶ−１由来のベクターがヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞に形質導入する能力を比較した。３’ＬＴＲのＵ３領域の大部分を欠失させたときの、ＣＤ３４＋細胞中でのＧＦＰの形質導入と発現に対する影響を解析した。ＣＭＶ内部プロモーター又はＥＦ１α内部プロモーター（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）によるＧＦＰレポーター遺伝子発現の誘導について、完全な状態のＨＩＶ−１  ＬＴＲ又はＵ３が欠失したバージョンを含有するベクターの比較を行った。全ての形質導入実験は、同じ濃度のベクター粒子（５００  ｎｇ  Ｐ２４／ｍｌ）を用いて、市販のＰ２４（キャプシドタンパク質）ＨＩＶ−１抗原（Ｄｕｐｏｎｔ）用のＥＬＩＳＡアッセイを用いてベクターストックを標準化した後に行った。２４時間の形質導入期間から４８時間後（図９Ａ）に、又は１２０時間（図９Ｂ）に、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）を行った。
【００９１】
興味深いことに、ＨＩＶ−１ベクターからＬＴＲのＵ３領域を欠失させると、全てのケースで、ＧＦＰ陰性細胞の割合が僅かに増加した。この増加は４８時間の時点での解析では小さなものであった。この場合に、ＧＦＰ陽性細胞が一部存在したのは偽形質導入機構のためかもしれない。偽形質導入は、レトロウイルスベクターゲノムが実際に組み込まれる必要なしに、レトロウイルスベクター粒子を融合させることによって標的細胞にＧＦＰタンパク質を直接輸送するものである。ＨＩＶ−１ベクターのＵ３欠失バージョンによって形質導入した後のＧＦＰ陽性割合の増加は、形質導入から１２０時間後により顕著となった（図９Ｂ）。この場合、ＴＲＩＰ  ΔＵ３−ＥＦ１α―ＧＦＰベクターによって形質導入すると、同じベクターであるが、完全なＨＩＶ−１  ＬＴＲを含有するベクターを用いたときに得られる結果と比べて、ＧＦＰ陽性細胞の割合が２倍まで増加することが観察される。
【００９２】
さらに重要なことに、ＨＩＶ−１三重鎖ベクターからＨＩＶ−１  ＬＴＲのＵ３領域を欠失させると、ＧＦＰレポータータンパク質の発現が増加した。形質導入されたヒトＨＳＣにおける平均の蛍光強度は、ＦＡＣＳによって解析すると、Ｕ３欠失バージョンの場合原型のＨＩＶ−１  ＬＴＲを含むベクターと比較して常に３〜５倍を上回る。このＧＦＰ発現の利点は、ＨＩＶ−１ベクター構築物中の内在性プロモーターとして用いられたＣＭＶ又はＥＦ１αプロモーターで観察される。形質導入された細胞で、ＧＦＰタンパク質の発現がこのように発現されることを説明する分子的なメカニズムは知られていない。ＨＩＶ−１  ＬＴＲ中の何らかの配列が、内在性のプロモーターによって誘導される発現に負の影響を与えるのかもしれない。あるいは、ＨＩＶ−１  ＬＴＲから開始される基底の転写が内在性プロモーターにおける転写の開始を阻害するのかもしれない。
【００９３】
本研究によって、ヒトＨＳＣには、ＥＦ１αプロモーターの方がＣＭＶプロモーターよりも好適なプロモーターであることも示される。図９Ｂでは、ＥＦ１αプロモーターはＣＭＶプロモーターよりもＧＦＰ蛍光強度の平均が３〜５倍強い。
【００９４】
本発明を実施するに当たって、本発明の範囲又は思想から逸脱することなく、様々な修飾や変形を加え得ることが、当業者には明らかであろう。
【００９５】
【参照文献】
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【００９６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１は、中央部での逆転写の開始がＨＩＶ−１の複製サイクル中の重要な工程であることを示している。
（Ａ）ＨＩＶ−１  ｃＰＰＴ配列中に導入された変異。保存的及び半保存的ｃＰＰＴ変異体ウイルスを構築した。半保存的変異ｃＰＰＴ−Ｄは１９マーのｃＰＰＴ中に１０個の変異を含有している。変異ｃＰＰＴ−ＡＧは、プリンからプリンへの単一の変異によって、重複するインテグラーゼのコード領域に同一のアミノ酸変化が導入されたその対照ウイルスである。変異は反転した字体で示されている。
【図１Ｂ】  図１は、中央部での逆転写の開始がＨＩＶ−１の複製サイクル中の重要な工程であることを示している。
（Ｂ）ＨＩＶ−１の感染性に対するｃＰＰＴ中の変異の影響。ＰＨＡで刺激されたＰＢＬ（左のパネル）及びＭＴ４細胞（右のパネル）でのウイルス複製の速度解析。ウイルス上清のキャプシド抗原（ｐ２４）含量に従って等量のウイルス粒子を用いて細胞を感染させた。ＲＴ活性により、ウイルスの産生を経時的に追跡した。
【図１Ｃ】  図１は、中央部での逆転写の開始がＨＩＶ−１の複製サイクル中の重要な工程であることを示している。
（Ｃ）分裂している、又は分裂していないアフィジコリン被処理Ｐ４細胞（ＨｅＬａ  ＣＤ４−ＬＴＲ  ＬａｃＺ）中での単一サイクルのウイルスの力価。化学発光アッセイを用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果は、相対光単位（ＲＬＵ）／秒／接種物のＰ２４  ｎｇ、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図２Ａ】  図２は、ウイルス産生、ウイルスＤＮＡ合成、インビトロでウイルスＤＮＡが組み込まれる能力の何れにも影響を与えないｃＰＰＴ中の変異を図示している。
（Ａ）ウイルス産生に対するｃＰＰＴの変異の影響。ｐＬＡＩ、ｐｃＰＰＴ−ＡＧ、又はｐｃＰＰＴ−Ｄプラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞。トランスフェクションから４８時間後に、細胞上清中のｐ２４ウイルス抗原の定量によって、ウイルス産生を測定した。
【図２Ｂ】  図２は、ウイルス産生、ウイルスＤＮＡ合成、インビトロでウイルスＤＮＡが組み込まれる能力の何れにも影響を与えないｃＰＰＴ中の変異を図示している。
（Ｂ）逆転写の効率に対するｃＰＰＴの変異の効果。同量のウイルス粒子（３００ｎｇのｐ２４抗原／１０６細胞）でＰ４細胞を感染させ、１２時間後にＤＮＡを抽出した。内部ＭｓｃＩ  ＨＩＶ−１断片によって提示された、逆転写されたウイルスＤＮＡの総量を、同ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、サザンブロットにより検出し、燐光画像化装置を用いて定量した。
【図２Ｃ】図２は、ウイルス産生、ウイルスＤＮＡ合成、インビトロでウイルスＤＮＡが組み込まれる能力の何れにも影響を与えないｃＰＰＴ中の変異を図示している。
（Ｃ）インビトロでの組み込みに対するｃＰＰＴの変異の影響。Ｈ９−ＬＡＩ又はＨ９−ｃＰＰＴ−２２５を慢性的に感染させた細胞とともに、ＭＴ４細胞を成育させた。感染細胞の細胞質から単離されたウイルスの前組込み複合体のインビトロでの組み込みは、これまでに記載されているところに従って行った（Ｆａｒｎｅｔ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ）。各レーンには、２×１０８の感染細胞から得た細胞質ＤＮＡが与えられている。
【図３Ａ】図３は、中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスは、ウイルスＤＮＡを核内に移行させることができないことを示している。
（Ａ）ＨＩＶ−１  ＤＮＡの合成、環状化、及び組込みを定量的に追跡するための戦略。感染後様々な時点で、感染細胞から得られたＤＮＡを抽出し、ＭｓｃＩとＸｈｏＩで消化し、５’ＭｓｃＩ部位が重複するプローブを用いて、サザンブロットにより分析した。内部１．９ｋｂ  ＤＮＡ断片（ウイルスＤＮＡ種が組み込まれた状態か否かにかかわらず、全てのウイルスＤＮＡ種に共通する）は、感染細胞中のウイルスＤＮＡの総量を示している。それぞれ、組み込まれていない直鎖ＤＮＡ、１、及び２ＬＴＲｓ環状ＤＮＡに対応する２．６ｋｂ、２．８ｋｂ、及び３．４ｋｂのシグナルが示されている。ＰＣＲで作製されたプローブはＭｓｃＩ部位に正確に重なるので、各バンドの強度は、対応するウイルスＤＮＡ種の量と直接比例する。このため、組み込まれたプロウイルスＤＮＡの量は、ウイルスＤＮＡの総量から、組み込まれていない直鎖及び環状ウイルスＤＮＡのシグナルを差し引くことによって算出することができる。
【図３Ｂ】  図３は、中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスは、ウイルスＤＮＡを核内に移行させることができないことを示している。
（Ｂ）感染細胞中でのウイルスＤＮＡプロセッシングのサザンブロット分析。上清のｐ２４含量に対して標準化した等量の各ウイルスをＰ４細胞に感染させた。感染後異なる時点で、感染細胞を溶解させて、ＤＮＡを抽出し、上述の定量分析用に使用した。
【図３Ｃ】  図３は、中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスは、ウイルスＤＮＡを核内に移行させることができないことを示している。
（Ｃ）１サイクルの感染が完了した時点での、細胞内ウイルスＤＮＡのプロフィール（感染から４８時間後）。結果は、総ウイルスＤＮＡのパーセントとして表されている。ＭＴ４細胞を用いると、同様の細胞内ウイルスＤＮＡのプロフィールが得られた（データは図示せず）。
【図４Ａ】  図４は、中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスから得た直鎖ＤＮＡが核膜の近傍に蓄積することを示している。
（Ａ）感染Ｐ４細胞の核／細胞質の分画。核（Ｎ）及び細胞質（Ｃ）画分からのウイルスＤＮＡのサザンブロット分析、感染から２４時間後。Ｔｒｉｔｏｎによる溶解に基づく分画は、これまでに記載されたところに従って行った（Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＭｓｃＩを用いてＤＮＡを制限消化し、ＭｓｃＩ部位重複プローブを用いてハイブリダイズさせた。
【図４Ｂ】  図４は、中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスから得た直鎖ＤＮＡが核膜の近傍に蓄積することを示している。
（Ｂ）蛍光インシチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による各ＨＩＶ−１ゲノムの検出。高感染効率（２μｇのｐ２４抗原／１０６細胞）でＰ４細胞を感染させ、完全長のＨＩＶ−１ゲノムプローブを用いてハイブリダイズさせた。チラミド沈殿によって蛍光シグナルを増幅した。細胞を通過した光の区画をデコンボルーション顕微鏡によって分析した。
【図５Ａ】  図５は、ＨＩＶ−１に基づくベクター中に中央部ＤＮＡ三重鎖が挿入されると、ＧＦＰ形質導入とベクターＤＮＡゲノムの核内移行が増大することを示している。
（Ａ）ベクターゲノムの模式図。以前に報告されたＨＲ  ＧＦＰ  ベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）内の中央位に、ＨＩＶ−１ゲノムのｃＰＰＴ及びＣＴＳ中央シス作用性配列（逆転写中のＤＮＡ三重鎖の形成に必要）を挿入した。ＴＲＩＰｉｎｖ−ＧＦＰは、機能しない逆の方向に前記中央部ＤＮＡ三重鎖配列を含んでいる。
【図５Ｂ】  図５は、ＨＩＶ−１に基づくベクター中に中央部ＤＮＡ三重鎖が挿入されると、ＧＦＰ形質導入とベクターＤＮＡゲノムの核内移行が増大することを示している。
（Ｂ）中央部ＤＮＡ三重鎖を有する、又は有しないＨＩＶベクターを用いたＧＦＰ形質導入の効率比較。分裂又は非分裂（アフィジコリン処理）ＨｅＬａ細胞を標的として使用した。マイクロプレート蛍光光度計（Ｗａｌｌａｃ）を用いて、形質導入から４８時間後にＧＦＰ蛍光を定量した。結果は、３回行った代表的実験の平均±ＳＤとして表されている。ＧＦＰ活性の偽形質導入をシグナルから差し引いた。
【図５Ｃ】  図５は、ＨＩＶ−１に基づくベクター中に中央部ＤＮＡ三重鎖が挿入されると、ＧＦＰ形質導入とベクターＤＮＡゲノムの核内移行が増大することを示している。
（Ｃ）形質導入細胞中のベクターＤＮＡプロセッシングのサザンブロット分析。感染後の様々な時点で、形質導入されたＨｅｌａ細胞を溶解し、ＤＮＡを抽出、制限消化して、ウイルスに対するのと同様の戦略を用いてサザンブロットを行った。ＥｃｏＮＩとＡｖａＩＩによってＭｓｃＩ消化が置換されており、プローブはＥｃｏＮＩ部位と正確に重複するＰＣＲ  ＤＮＡ断片である。
【図５Ｄ】  図５は、ＨＩＶ−１に基づくベクター中に中央部ＤＮＡ三重鎖が挿入されると、ＧＦＰ形質導入とベクターＤＮＡゲノムの核内移行が増大することを示している。
（Ｄ）ベクターＤＮＡ細胞内の状態の定量分析、感染から４８時間後。結果は、総ベクターＤＮＡに対するパーセントとして表されている。
【図６Ａ】  図６は、ＤＮＡ三重鎖依存性のＨＩＶ−１ゲノム核内移行のモデルを図示している。
（Ａ）観察された中央部ＤＮＡ三重鎖変異ウイルスの表現型の概要。ＨＩＶ−１逆転写の中央部における開始及び終結工程によって、長いプラス鎖ＤＮＡのフラップ構造、すなわち中央部ＤＮＡ三重鎖が作られる。ＨＩＶ−１プラス鎖は、二つの分離した半ゲノムセグメントとして合成される。下流セグメントは、ポリプリン広域配列の中央コピー（ｃＰＰＴ；ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から開始される。上流セグメントは、９９ヌクレオチド長の鎖の置換を経た後、ｃＰＰＴの下流で終結し、中央部終結配列（ＣＴＳ）によってブロックされている。単一サイクルの感染が完了した時点で、野生型ウイルスからのウイルスＤＮＡは、ほぼ完全に、組み込まれたプロウイルス（約５５％）、１ＬＴＲ（約３５％）、及び２ＬＴＲ環状ＤＮＡ（＜５％）へとプロセッシングされるが、ごく一部は直鎖ＤＮＡのままである（＜１０％）。ｃＰＰＴの変異は、中央部ＤＮＡ三重鎖の形成に影響を与える。中央部開始変異ウイルスの最終逆転写産物は、前記中央ＤＮＡ三重鎖を欠く連続的な二本鎖直鎖ＤＮＡである（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ｃＰＰＴ−Ｄ変異ウイルスからのウイルスＤＮＡは、線状ＤＮＡ分子として感染細胞中に蓄積し、核膜の近傍に局在する。
【図６Ｂ】  図６は、ＤＮＡ三重鎖依存性のＨＩＶ−１ゲノム核内移行のモデルを図示している。
（Ｂ）逆転写複合体（ＲＴＣ）の前組込み複合体（ＰＩＣ、ｐｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）への成熟化及び核膜孔を通じた直鎖ＤＮＡの転移を介した三重鎖依存性のＨＩＶ−１ゲノムの核内移行に関して推測される２つの機序。ＨＩＶ−１の逆転写は、おそらく、キャプシドタンパク質の集合体に囲まれた規則的構造の（規則正しい）複合体内で起こる。ＲＴＣのサイズは、核膜孔の排除直径を超えている。転移前に、ＲＴＣは、キャプシドタンパク質を喪失して、より小さなＰＩＣへと成熟化する（Ｋａｒａｇｅｏｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＤＮＡ三重鎖の形成は、ウイルスＤＮＡ合成の終了をシグナル伝達し、ＨＩＶ  ＤＮＡのキャプシド集合体からの脱出をシグナル伝達し得るかもしれない。ＰＩＣ中で、直鎖ＤＮＡの端部は、おそらく、ＬＴＲの先端に結合したインテグラーゼタンパク質の二量体化の後、架橋される（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。前記ＤＮＡ三重鎖は中央位置に存在するので、ＨＩＶ−１  ＰＩＣの１つの理論構造としては、インテグラーゼ二量体化によって、中央部三重鎖の何れかの側に対称的に折り畳まれた二重繊維が考えられるであろう。それ故、前記ＤＮＡ三重鎖は、核親和性のシャトルタンパク質と相互作用することができるかもしれない先端を構成し、核膜孔を通じたＨＩＶ−１  ＤＮＡ繊維の通過が可能となるであろう。ｃＰＰＴ変異ウイルスでは、ＰＩＣへのＲＴＣの成熟化が不足することによって、核膜孔に完全なウイルスキャプシドの蓄積が誘導されるであろう。あるいは、ｃＰＰＴ変異直鎖ＤＮＡ中にＤＮＡ三重鎖が存在しないと、シャトルタンパク質との相互作用が妨げられ、核膜孔を通じたＨＩＶ−１ゲノムの転移が禁じられるであろう。何れの場合にも、ｃＰＰＴ変異ウイルスからのＤＮＡは、核膜の近傍に直鎖ＤＮＡとして蓄積する。
【図７Ａ】  図７は、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞を用いた形質導入実験の結果を示している。
（Ａ）本明細書に記載した条件で、１００ｎｇ／ｍＬのウイルスＰ２４の存在下において２４時間形質導入したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析。２４時間の形質導入期間の最終時点における細胞の洗浄から４８時間後に分析を行った。形態的に分別された造血細胞の割合としてパーセント表示されている。Ｘ平均は、緑色蛍光強度の平均値を示している。
【図７Ｂ】  図７は、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞を用いた形質導入実験の結果を示している。
（Ｂ）形質導入から５日後に、ＧＦＰ発現を分析した。
【図７Ｃ】  図７は、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞を用いた形質導入実験の結果を示している。
【図８】  図８は、トランスフェクション効率に対するウイルス用量の影響を模式的に表している。
（Ａ）ｅＧＦＰを発現しているＣＤ３４＋細胞のパーセント。
（Ｂ）ＣＤ３４＋ｅＧＦＰ＋細胞のＧＦＰ蛍光強度の平均値。
（Ｃ）ＣＤ３４＋ｅＧＦＰ＋細胞のＧＦＰ蛍光強度にＣＤ３４＋ｅＧＦＰ＋細胞のパーセントを乗じた平均値。本明細書に明記した条件下で、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｅＧＦＰコード配列を含み、前記三重鎖構造を含む（太線）又は含まない（破線）レンチウイルスベクターを用いて、２４時間、ＣＤ３４＋細胞を形質導入した。２４時間形質導入期間の最後に、細胞の洗浄から４８時間後に分析を行った。
【図９Ａ】  図９は、本明細書に記載されている条件下で、完全な状態のＨＩＶ−１  ＬＴＲ（左パネル）又はＵ３を欠失したＨＩＶ−１  ＬＴＲ（右パネル）、及び内部ＣＭＶプロモーター（上パネル）又はＥＦ−１αプロモーター（下パネル）を有するレンチウイルスベクターを用いて、２４時間形質導入したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を図示している。
（Ａ）２４時間の形質導入期間の終了時点での細胞の洗浄から４８時間後に分析を行った。
形態的に分別された造血細胞の割合としてパーセント表示されている。２番目の数字は、記載されていれば、緑色蛍光の平均を表している。
【図９Ｂ】  図９は、本明細書に記載されている条件下で、完全な状態のＨＩＶ−１  ＬＴＲ（左パネル）又はＵ３を欠失したＨＩＶ−１  ＬＴＲ（右パネル）、及び内部ＣＭＶプロモーター（上パネル）又はＥＦ−１αプロモーター（下パネル）を有するレンチウイルスベクターを用いて、２４時間形質導入したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を図示している。
（Ｂ）２４時間の形質導入期間の終了時点での細胞の洗浄から１２０時間後に分析を行った。該分析は、明るい（未成熟）及び暗いＣＤ３４細胞を識別する。
形態的に分別された造血細胞の割合としてパーセント表示されている。２番目の数字は、記載されていれば、緑色蛍光の平均を表している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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