(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の検出、定量および／または分析のための組成物であって、以下：
（ａ）ポリ核酸塩基鎖；および
（ｂ）組み合わせオリゴマーであって、第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックを含み、該ブロックは、各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである、組み合わせオリゴマー；
を含有し、ここで、該第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックは、少なくとも３原子長のリンカーによって互いに共有結合しており、そして該第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックは、該ポリ核酸塩基鎖における連続する核酸塩基の標的配列にギャップ塩基が存在しないように並列して配列特異的にハイブリダイズし、これによって、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成し、該リンカーが、１つのアミノ酸残基、２つのアミノ酸残基、３つのアミノ酸残基、１つのＥ−リンカー残基、２つのＥ−リンカー残基、１つのＯ−リンカー残基、２つのＯ−リンカー残基、１つのＸ−リンカー残基、および２つのＸ−リンカー残基からなる群より選択され、該第１のオリゴマーブロックは、そのカルボキシ末端で該リンカーに結合し、該第２のオリゴマーブロックは、そのアミノ末端で該リンカーに結合する、組成物。
【請求項２】
第３のオリゴマーブロックをさらに含有する、請求項１に記載の組成物であって、該第３のオリゴマーブロックは、少なくとも３原子長の第２のリンカーによって、前記第１のオリゴマーブロックまたは第２のオリゴマーブロックに共有結合しており、その結果、該第２のリンカーは、前記第１のリンカーと同じ種類であるか、または異なる種類である、組成物。
【請求項３】
前記第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックが、ペプチド核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記リンカーが、アミノ酸グリシン、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｌｙｓ、アミノ酸ダイマーｌｙｓ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｕ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｃｙｓ、アミノ酸ダイマーｃｙｓ−ｇｌｙ、およびアミノ酸ダイマーａｓｐ−ｇｌｙからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組み合わせオリゴマーが、少なくとも１つのエネルギー移動セットの標識をさらに含み、その結果、該エネルギー移動セットの少なくとも１つのアクセプター部分が、該組み合わせオリゴマーの結合したオリゴマーブロックのうちの１つに結合し、一方で該エネルギー移動セットの少なくとも１つのドナー部分が、該組み合わせオリゴマーの結合したオリゴマーブロックのうちの別のものに結合し、ここで、該セットの標識は、該組み合わせオリゴマーが非ハイブリダイズ状態にある場合と比較して、該組み合わせオリゴマーが前記標的配列にハイブリダイズする場合に、少なくとも１つの標識の検出可能なシグナルの変化を容易にする位置で、該オリゴマーブロックに結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記エネルギー移動セットが、単一のドナー部分および単一のアクセプター部分を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ドナー部分が、ドナー発蛍光団であり、そして前記アクセプター部分が、非蛍光性クエンチャー部分である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組み合わせオリゴマーが、１つ以上のレポーター部分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記レポーター部分が、各々独立して、発色団、蛍光色素、クエンチャー、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテンおよび化学発光化合物からなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リンカーが、酵素に対する切断部位を含み、そしてＧｌｙ−ＧｌｕおよびＧｌｙ−Ｌｙｓからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組み合わせオリゴマーが、支持体に結合されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記標的配列が、核酸増幅プロセスによって増幅された核酸のポリ核酸塩基鎖の部分配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
標的配列を含有するポリ核酸塩基鎖を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリ核酸塩基鎖を、請求項１において定義された組み合わせオリゴマーと、適切なハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによって二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成する工程：および
（ｂ）該二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を  確定し、これによって、該標的配列を決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記標的配列が、核酸増幅プロセスによって増幅された核酸の部分配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸増幅プロセスが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、Ｑ−βレプリカーゼ増幅（Ｑ−β）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み合わせオリゴマーが、第３のオリゴマーブロックをさらに含有し、該第３のオリゴマーは、少なくとも３原子長の第２のリンカーによって、前記第１のオリゴマーブロックまたは第２のオリゴマーブロックに共有結合しており、その結果、該第２のリンカーは、前記第１のリンカーと同じ種類であるか、または異なる種類である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンカーが、アミノ酸グリシン、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｌｙｓ、アミノ酸ダイマーｌｙｓ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｕ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｃｙｓ、アミノ酸ダイマーｃｙｓ−ｇｌｙ、およびアミノ酸ダイマーａｓｐ−ｇｌｙからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み合わせオリゴマーが、少なくとも１つのエネルギー移動セットの標識をさらに含み、その結果、該エネルギー移動セットの少なくとも１つのアクセプター部分が、該組み合わせオリゴマーの結合したオリゴマーブロックのうちの１つに結合し、一方で該エネルギー移動セットの少なくとも１つのドナー部分が、該組み合わせオリゴマーの結合したオリゴマーブロックのうちの別のものに結合し、ここで、該セットの標識は、該組み合わせオリゴマーが非ハイブリダイズ状態にある場合と比較して、該組み合わせオリゴマーが前記標的配列にハイブリダイズする場合に、少なくとも１つの標識の検出可能なシグナルの変化を容易にする位置で、該オリゴマーブロックに結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記エネルギー移動セットが、単一のドナー部分および単一のアクセプター部分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ドナー部分が、ドナー発蛍光団であり、そして前記アクセプター部分が、非蛍光性クエンチャー部分である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組み合わせオリゴマーが、１つ以上のレポーター部分をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記レポーター部分が、発色団、蛍光色素、クエンチャー、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテンおよび化学発光化合物からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的配列が、レポーター部分で標識されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的配列も組み合わせオリゴマーもいずれも、レポーター部分で標識されておらず、そして前記複合体が、該複合体に特異的に結合する標識された抗体を使用して決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンカーが、酵素に対する切断部位を含み、そしてＧｌｙ−ＧｌｕおよびＧｌｙ−Ｌｙｓからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み合わせオリゴマーが、支持体に結合されている、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．技術分野）
本発明は、組み合わせオリゴマーの分野に関し、テンプレートの非存在下の組み合わせオリゴマーのブロック合成、ならびに方法、キット、ライブラリー、および他の組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
（２．序説）
核酸ハイブリダイゼーションは、分子生物学における基礎的なプロセスである。プローブに基づいたアッセイは、核酸の検出、定量および／または分析において有用である。核酸プローブは、細菌、真菌類、ウイルスまたは他の生物由来の核酸の存在についてサンプルを分析するために長期にわたり使用され、目的の遺伝に基づく疾患状態または臨床状態を調べることにおいてもまた有用である。それでもなお、核酸プローブに基づくアッセイは、商業的な成功を収めることにおいては不振であった。この商業的な成功の欠如は、少なくとも部分的に、特異性、感受性、および／または信頼性に関わる困難性の結果である。
【０００３】
核酸増幅アッセイは、現在の生物学における特定の標的配列検出方法の重要なクラスを含み、遺伝性疾患の診断、本人確認、微生物の同定、実父確定試験、ウイルス学、およびＤＮＡ配列決定における多様な適用を有する。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法は、高い感受性および特異性を伴って、標的核酸配列の作製および検出を可能にする。ＰＣＲ法は、クローニング、遺伝発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝地図作製、薬物発見、などにとって絶対不可欠である（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２７２５−２７２９（１９９０）；Ｂｅｖａｎ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：２２２−２２８（１９９２）；Ｇｒｅｅｎ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：７７−９０（１９９１）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｑｕｉｒｋｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．Ｒ．ｉｎ  ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５））。標的配列またはアンプリコンにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを使用するＰＣＲ産物（アンプリコン）の検出方法は、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号；ＥＰ２３７，３６２号に記載される。
【０００４】
その名称にもかかわらず、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチドでもヌクレオチドでもなく、酸でもない。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、配列特異性を有する核酸塩基（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズし得る天然に存在しないポリアミド（偽ペプチド）である（米国特許第５，５３９，０８２号およびＥｇｈｏｌｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８（１９９３）を参照のこと）。ＰＮＡは、核酸アナログというよりも、核酸模倣物として、科学文献では特徴付けられてきたが、これは、その構造が、完全な合成物であり、かつ、核酸に由来しなかったためである（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３２：６２４−６３０（１９９９）を参照のこと）。
【０００５】
天然に存在しない分子であるので、非修飾ＰＮＡが、ペプチドまたは核酸を分解することが知られている酵素にとっての基質であることは知られていない。従って、ＰＮＡは、生物学的サンプルにおいて安定であるべきであり、同様に、長期の貯蔵寿命を有するべきである。イオン強度に非常に依存する核酸ハイブリダイゼーションとは違い、核酸とのＰＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度に全く非依存性であり、かつ、低イオン強度（核酸と核酸のハイブリダイゼーションにとって非常に不都合となる条件）でも有利である（Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ、５６７頁）。この独特の特性のために、ＰＮＡは、構造または機能のいずれにおいても核酸と等価ではないことは明らかである。
【０００６】
選択性／区別の限界に加え、費用対効果の高いほど十分に小さい規定されたスケールにおけるアッセイでプローブまたはプライマーとして使用され得る多くのオリゴマーを迅速かつ効率的に調製し得る必要性が存在する。この必要性は、有用な情報が引き出され得る膨大な量の生配列データであるゲノム配列決定が提供されてきたために、生じてきた。情報の量が非常に膨大であるがために、このマイニング操作から生じたスクリーニング結果は、代表的には、数万〜数十万のプローブおよびプライマーを必要とするハイスループット分析を伴う。しかし、段階的モノマーアセンブリ（デノボ合成）に基づいて核酸およびペプチド核酸を構築する市販の機器は、数万〜数十万のプローブまたはプライマーの製造ついて大変費用のかかるスケールで単一のプローブを作製するのに数時間必要とする。さらに、このプローブがデノボ合成されるので、主要な装置における非常におおい投機なしには、短期間（例えば、６ヶ月以下）で数万〜数十万のプライマーまたはプローブの送達を効率よくすることは、困難である。従って、数万〜数十万の所望の核酸塩基配列のオリゴマーの迅速（数日または数週間）、効率的、かつ費用対効果の大きい作製のための方法を有することが可能であることは、利点であり、ここで、この所望の核酸塩基配列は、発現分析またはゲノムのマイニングのためのようなハイスループット用途のためのプローブまたはプライマーとして使用され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
（１．要旨）
本発明は、組み合わせオリゴマーの分野に関し、テンプレートの非存在下での組み合わせオリゴマーのブロック合成、ならびに関連方法、キット、ライブラリー、および他の組成物を含み得る。本明細書中で使用される場合、組み合わせオリゴマーは、標識されても標識されなくとも、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラおよびＰＮＡの組み合わせオリゴマーからなる群より独立して選択される２つ以上のオリゴマーブロックを含む組成物であり、ここで、上記のオリゴマーブロックは、リンカーにより連結されている。このリンカーは、必要に応じて、酵素にとっての切断部位となり得る。上述の組成物は、本明細書中では、その作製方法に関係なく、組み合わせオリゴマーと称される。なぜならば、このハイブリダイゼーション特性は、２つの構成オリゴマーブロックの組み合わされた特性、ならびにリンカーの性質および組み合わせオリゴマーが標的配列にハイブリダイズするときのブロック間の相互作用の機会から生じる。
【０００８】
１つの実施形態において、本発明は、新規の組み合わせオリゴマーに関する。本発明の新規の組み合わせオリゴマーは、本明細書中で自己指示（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ）組み合わせオリゴマーおよび基質組み合わせオリゴマーとして言及され；これらの各々は以下に詳細に記載される（以下の実施例４および実施例５を参照のこと）。組み合わせオリゴマーは、多くの用途におけるプローブまたはプライマーとして使用され得る。プローブについての要件は、単に、プローブは配列特異性をもって、標的配列にハイブリダイズすることである。従って、プローブとして使用される場合、組み合わせオリゴマーの特異的な特徴においてさらなる限定はない。しかし、プライマーとして使用される場合、組み合わせオリゴマーが、ポリメラーゼ酵素が非修飾ＰＮＡオリゴマーに作用することが知られていないので、酵素の認識および作用にとって適切な部位を含むことが必要である（Ｌｕｔｚら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  １１９：３１７７〜３１７８（１９９７））。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、ポリ核酸塩基鎖およびこのポリ核酸塩基鎖中の連続した核酸塩基の標的配列に特異的にハイブリダイズして、それによって、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成する、組み合わせオリゴマー配列を含む組成物に関する（図１を参照のこと。この配置は、本明細書中で、配置とは、標的配列と並置されてハイブリダイズしており、その結果、ギャップがなく、またはギャプ塩基が存在しないことをしばしば称することもまた留意のこと）。この組み合わせオリゴマーは、第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロック含み、これらのオリゴマーブロックの各々は、独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。第１および第２のオリゴマーブロックは、少なくとも３原子長のリンカーによって共有結合的に連結される。
【００１０】
さらに別の実施形態において、本発明は、連続した核酸塩基の標的配列を決定するための方法に関する。本方法は、適切なハイブリダイゼーション条件下でこの標的配列を組み合わせオリゴマーに接触する工程を包含し、ここで、組み合わせオリゴマーは、各々が独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである第１および第２のオリゴマーブロックを含む。第１および第２のオリゴマーブロックは、少なくとも３原子長あるリンカーによって互いに共有結合的に連結される。さらに、第１および第２のオリゴマーブロックは、連続した核酸塩基の標的配列に特異的にハイブリダイズし、それによって二本鎖の標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成する配列であり得る。複合体形成が決定され、それによって、標的配列を決定する。なぜならば、この複合体は、標的配列の非存在下では、形成しないからである。この複合体の決定としては、その複合体の存在、非存在、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）（量（ａｍｏｕｎｔ））または位置を決定し、それによって、その標的配列の存在、非存在、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）（量（ａｍｏｕｎｔ））、位置または同一性を決定することが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、実施例３〜５を参照のこと）。
【００１１】
なお別の実施形態において、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）について核酸接合構造を決定するための方法に関する。本方法は、核酸サンプルを少なくとも２つの独立して検出可能な組み合わせオリゴマーに接触する工程を包含する。各独立して検出可能な組み合わせオリゴマーは、各々が独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである第１および第２のオリゴマーブロックを含み、そして、これらのオリゴマーブロックは、互いに少なくとも３原子長のリンカーによって共有結合的に連結している。一緒に用いられる第１および第２のオリゴマーブロックは、存在する場合に、核酸サンプルのポリ核酸塩基鎖における連続した核酸塩基の標的配列に対して特異的にハイブリダイズし、それによって、二本鎖標的配列／独立して検出可能な組み合わせオリゴマー複合体を形成するように設計されたプローブ化核酸塩基配列をコードする。各独立して検出可能な組み合わせオリゴマーにおけるプローブ化核酸塩基配列は、もう一方と、少なくとも１つの核酸塩基（ＳＮＰ核酸塩基）だけ相違する。しかし、このプローブ化核酸塩基配列は、プローブの設計に依存して、１よりも多い核酸塩基の分だけ異なり得るが、但し、これらは、決定されるＳＮＰにて、単一の核酸塩基だけ異なる（例えば、実施例５、表９、そして、特に、ＳＮＰ６８７６および６８７９におけるＰＮＡ組み合わせオリゴマープローブのセットを参照のこと）。
【００１２】
本方法に従って、この核酸サンプルおよび組み合わせオリゴマーは、そのサンプル中に存在する核酸を増幅させる核酸増幅反応を実施するために適切な１以上の試薬と接触され、そして、この核酸増幅は、核酸、組み合わせオリゴマーおよび試薬の存在下で実施される。各々が独立して検出可能な組み合わせオリゴマー／標的配列複合体についての複合体形成が決定され、それによって、この核酸が特定のＳＮＰに対して、ヘテロ接合性かまたはホモ接合性かを決定する。複合体決定は、特定のＳＮＰの接合構造と相関し得、これは、この複合体は、各特定の組み合わせオリゴマーについての連続した核酸塩基のそれぞれの標的配列の非存在下で、形成されないためである。さらに、これらの２つの独立して検出可能な組み合わせオリゴマーは、複合体が形成されるかまたは形成されないかに依存した３つの可能な遺伝子型を決定するのに必要な情報の全てを提供する。
【００１３】
１つの実施形態において、独立して検出可能な組み合わせオリゴマーは、独立して検出される、自己指示化組み合わせオリゴマーである。この方法に従って、各組み合わせオリゴマーが連続した核酸塩基のそれぞれの標的配列にハイブリダイズしたか否かの指標としての、適切なハイブリダイゼーション条件下での決定は、独立して検出可能なエネルギー移動セットの各々の少なくとも１つの標識から生じた検出可能なシグナルの任意の変化から行われる。このような決定は、核酸増幅の最中（例えば、リアルタイムで）または核酸増幅反応が完結した後（例えば、終端点で）のいずれかで実施され得る。本発明に従って、各組み合わせオリゴマーにおけるエネルギー移動セットの各々の少なくとも１つの標識に対するシグナル変化の結果は、２つの可能な標的配列／独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマー複合体の各々の形成の結果と相関する。このデータに基づいて、特定のＳＮＰについてサンプルの接合構造の３つの可能な状態のうちの１つが、決定され得る（例えば、実施例５を参照のこと）。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、オリゴマーブロック由来の組み合わせオリゴマーを形成する方法に関する。この方法は、第１のオリゴマーブロック、第２のオリゴマーブロック、および必要に応じて縮合剤を、縮合条件下で反応させ、それによって、この第１のオリゴマーブロックと第２のオリゴマーブロックとを共有結合的に連結させる少なくとも３原子長のリンカーを有する、組み合わせオリゴマーを形成する工程を包含する。この方法に従って、第１および第２のオリゴマーブロックは、各々独立した、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである。第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックのいずれも、支持体に結合せず、そして、組み合わせオリゴマーは、テンプレートの非存在下で形成される。この連結／縮合反応は、水溶液において実施され得る。この核酸塩基は、この連結／縮合反応の間において保護される必要はない。
【００１５】
さらに別の実施形態において、本発明は、オリゴマーブロックから組み合わせオリゴマーを形成するための別の方法を包含する。この方法は、第１のオリゴマーブロック、第２のオリゴマーブロック、および必要に応じて、縮合剤を、縮合条件下で反応させ、それによって、この第１のオリゴマーブロックを第２のオリゴマーブロックで連結させる少なくとも３原子長のリンカーを有する組み合わせオリゴマーを形成する工程を包含する。この方法に従って、第１および第２のオリゴマーブロックは、各々独立した、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである。オリゴマーブロックの核酸塩基は保護基を含まず、そして、組み合わせオリゴマーは、テンプレートの非存在下で形成される。この連結／縮合反応は、水溶液において実施され得る。
【００１６】
上述した組み合わせオリゴマーを形成する方法に関わらず、別の実施形態において、連結／縮合反応の生成物は，必要に応じて、さらに延長／伸長され得る。したがって、組み合わせオリゴマーが、形成されると、オリゴマーブロックとして使用され得、その結果、本方法を反復することによって、延長／伸長されたオリゴマーをさらに作製し得る。この方法に従って、この組み合わせオリゴマーは、予め形成され、必要応じて脱保護され得、必要とされ得る場合、次ぎの縮合／連結工程を促進し得る。予め形成されそして必要に応じて脱保護された組み合わせオリゴマーは、第３のオリゴマーブロックおよび必要に応じて縮合剤と縮合条件下で反応される。これは、第３のオリゴマーブロックを組み合わせオリゴマーに共有結合的に連結する、少なくとも３原子長の共有結合を有する伸長された組み合わせオリゴマーを形成し、ここで、伸長された組み合わせオリゴマーは、テンプレートの非存在下で形成する。この方法に従って、このプロセスは、この組み合わせオリゴマーが所望の長さになるまで、必要に応じて繰り返され得る。連続する伸長のこのようなプロセスは、例えば、アレイの調製について有用であり得、これは、長いオリゴマーがこの用途について頻繁に使用され得るからである。
【００１７】
本発明の特定の他の実施形態において、酵素のための切断部位をプロセシングする組み合わせオリゴマーが形成され、ここで、この切断部位は、組み合わせオリゴマーが結合対と結合するときに、切断から保護されている。したがって、本発明はまた、可能な結合パートナー（例えば、アプタマーまたは標的配列）に組み合わせオリゴマーが結合しているか否かを決定するための方法に関する。本方法は、この組み合わせオリゴマーと可能な結合パートナーを適切な結合条件下で、接触させ、それによって、可能な限り、組み合わせオリゴマー／結合パートナー複合体を形成する。本方法に従って、この組み合わせオリゴマーは、以下の式のセグメントを含むポリマーである：Ａ−Ｃ−Ｗ、ここで、ＡおよびＣは、必要に応じて他の部分と連結されるオリゴマーブロックであり、そして、これらの各々は、独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡのオリゴマーである。このＷ基は、オリゴマーブロックＡをオリゴマーブロックＣに共有結合的に連結し、かつ酵素にとっての切断部位である、少なくとも３原子長のリンカーである。
【００１８】
本方法に従って、この結合パートナーおよび組み合わせオリゴマーは、適切な酵素切断条件下で、切断部位を切断するのに適切な酵素を使用して処理される。次いで、組み合わせオリゴマーが、酵素の活性によって切断されたか否かの決定がなされ、それにより、組み合わせオリゴマー／結合パートナー複合体が形成されたか否かを決定する。
【００１９】
この結合パートナーが標的配列であり、そして、この組み合わせオリゴマーがこの標的配列に結合している場合、これは、この酵素の活性から保護されている。従って、このアッセイが、この組み合わせオリゴマーが実質的に分解されないことを決定する場合は、その標的配列に結合したはずである（実施例４を参照のこと）。逆に、この組み合わせオリゴマーが分解から保護されない場合、この標的配列は存在しないことが結論づけられ得る。このようなアッセイは、酵素事象に基づいているので、標的配列の定量は、酵素活性を決定することによって決定され得ることもまた理解される。
【００２０】
なお別の実施形態において、本発明は、キットに関する。１つの実施形態において、このキットは、２以上の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーを含み、ここで、上記の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々は、第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックを含み、これらのオリゴマーブロックの各々は、独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである。これらのオリゴマーブロックは、少なくとも３原子長であるリンカーによって、互いに共有結合的に連結される。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々において、一緒に使用される第１および第２のオリゴマーブロックは、二本鎖の標的配列／組み合わせオリゴマー複合体の形成について適切である連続した核酸塩基の標的配列に配列特異的にハイブリダイズするように設計されたプローブ化核酸塩基配列をコードする。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々におけるプローブ化核酸塩基は、少なくとも１つの核酸塩基分、他の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーのプローブ化核酸配列と異なる。各独立して検出可能な組み合わせオリゴマーは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。このキットは、必要に応じて、以下を含む：（ｉ）１以上のオリゴヌクレオチド（ｉｉ）１以上の緩衝液；（ｉｉｉ）１以上のヌクレオチド三リン酸；（ｉｖ）核酸増幅マスターミックス；または（ｖ）１以上のポリメラーゼ酵素。
【００２１】
なお別の実施形態において、本発明は、２以上独立して検出可能な組み合わせオリゴマーのセットに関する。このセットの各々の組み合わせオリゴマーは、第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックを含み、これらのオリゴマーブロックの各々は、独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。これらのオリゴマーブロックは、少なくとも３原子長であるリンカーによって、互いに共有結合的に連結される。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々において、一緒に使用される第１および第２のオリゴマーブロックは、連続した核酸塩基の標的配列に配列特異的にハイブリダイズして、それによって、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成するように設計された、プローブ化核酸塩基配列をコードする。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々におけるプローブ化核酸塩基は、少なくとも１つの核酸塩基分、他の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーのプローブ化核酸配列と異なる。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々は、少なくとも１つの独立して検出可能な標識を含む。
【００２２】
本発明はまた、二機能性の単一セットのライブライブラリーリーからの、末端オリゴマーブロックおよび縮合化オリゴマーブロックを形成するための方法に関する。本方法は、少なくとも２つのオリゴマーブロックの二機能性の単一セットのライブラリーを提供すること包含する。この二機能性の単一セットのライブラリーの１つのオリゴマーブロックが処理されて、それによって、１以上の保護基を取り除き、それにより、末端オリゴマーを作製する。二機能性の単一セットのライブラリーの１つのオリゴマーブロックは、処理されて、末端オリゴマーブロックを作製するするオリゴマーブロックと比較したときに、１以上の異なる保護基を取り除き、それによって縮合オリゴマーブロックを作製する。
【００２３】
従って、本発明はまた、オリゴマーブロックの二機能性の単一セットを含む化合物ライブラリーに関する。このセットのオリゴマーブロックは、特定の保護基を除去することによって、末端オリゴマーブロックおよび縮合オリゴマーブロックの両方を作製するために使用され得る。二機能性セットのオリゴマーブロックは、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである。二機能セットのオリゴマーブロックは、末端オリゴマーブロックが縮合オリゴマーブロックと縮合されるときに、少なくとも３原子長のリンカーを形成する機能性部分を含むように選択される。さらに、これらのオリゴマーブロックは、支持体に結合されず、そして核酸塩基保護基を含まない。
【００２４】
なお別の実施形態において、本発明は、別の化合物ライブラリーに関する。本発明に従って、この化合物ライブラリーは、少なくとも１つのセットの末端オリゴマーおよび少なくとも１つのセットの縮合化オリゴマーブロックを含み、ここで、ブロックの各セットは、２以上の異なるオリゴマーを含み、そして上記のオリゴマーブロックは以下からなる群より選択される：ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラおよびＰＮＡの組み合わせオリゴマー。これらのオリゴマーブロックは、末端オリゴマーブロックが縮合オリゴマーブロックと縮合されるときに、少なくとも３原子長のリンカーを形成する機能性部位を含むように選択される。さらに、このオリゴマーブロックは、支持体に結合せず、そしてこのオリゴマーブロックは、核酸塩基保護基を含まない。本発明の化合物ライブラリーは１または２セットのブロックオリゴマーに限定されないことが理解される。非限定的な例として、このライブラリーは、３セット以上のオリゴマーブロックを含み得ない。
【００２５】
従って、さらに別の実施形態において、本発明は、別の化合物ライブラリーに関する。この化合物ライブラリーは、少なくとも１つのセットの末端オリゴマーブロックおよび少なくとも２つのセットの縮合オリゴマーブロックを含む。本発明に従って、オリゴマーブロックの各セットは、２以上の異なるオリゴマーを含み、そして各セットのオリゴマーブロックは、独立して、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである。これらのオリゴマーブロックは、末端オリゴマーブロックが縮合オリゴマーブロックと縮合されるときに、このオリゴマーブロックに共有結合的に連結される少なくとも３原子長のリンカーを形成する機能性部分を含むように選択される。さらに、これらのオリゴマーブロックは、支持体に結合されず、そして核酸塩基保護基を含まない。さらに、１セットの縮合化オリゴマーブロックのオリゴマーブロックの全ては、同じ独立して検出可能なレポーター部分を含み、そして、末端オリゴマーブロックの少なくとも１つのセットのオリゴマーブロックの全ては、同じクエンチャー部分を含む。
【００２６】
さらに別の実施形態において、本発明は、新規の組み合わせオリゴマー（例えば、自己指示組み合わせオリゴマー）に関する。従って、本発明はまた、以下の式のセグメントを含む共有結合的に連結したオリゴマーブロックの組成物に関する：Ａ−Ｂ−Ｃ。本発明に従って、オリゴマーブロックＡおよびオリゴマーブロックＣの各々は、独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡの組み合わせオリゴマーであり、そして、必要に応じて、このセグメントの他の部分に連結する。このリンカーＢは、少なくとも３原子長であり、かつオリゴマーブロックＡをオリゴマーブロックＣに共有結合的に連結する。さらに、一緒に用いられるオリゴマーブロックＡおよびＣは、連続した核酸塩基の標的配列に対して特異的にハイブリダイズし、それによって、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成するように設計されたプローブ化核酸塩基配列をコードする。
【００２７】
自己指示組み合わせオリゴマーは、標識のエネルギー移動セットをさらに含み、その結果、このエネルギーセットの少なくとも１つのアクセプター部分がこの組成物の連結したオリゴマーブロックの１つに連結しているが、その一方で、このエネルギー移動セットの少なくとも１つのドナー部分が、この組成物の別の連結したオリゴマーブロックに連結し、ここで、このセットの標識は、この組み合わせオリゴマーが、この組み合わせオリゴマーが非ハイブリダイゼーション状態にあるいときと比較して特異的に標的配列とハイブリダイズしているときに、少なくとも１つ標識の検出可能なシグナルの変化を容易にするように位置でこの組み合わせオリゴマーに連結している。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの組み合わせオリゴマーのアレイに関し、ここで、この組み合わせオリゴマーのうちの少なくとも１つが以下の式のセグメントを含む：Ａ−Ｂ−Ｃ。本発明に従って、オリゴマーブロックＡおよびオリゴマーブロックＣの各々は、独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡの組み合わせオリゴマーであり、そして、必要に応じて、他の部分に連結する。このリンカーＢは、少なくとも３原子長であり、かつオリゴマーブロックＡおよびオリゴマーブロックＣを共有結合的に連結する。一緒に用いられるオリゴマーブロックＡおよびＣは、連続した核酸塩基の標的配列に対して配列特異的にハイブリダイズし、それによって、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成するように設計されたプローブ化核酸塩基配列をコードする。
【００２９】
なお別の実施形態において、本発明は、組み合わせオリゴマーのアレイを形成する方法に関する。１つの実施形態において、この方法は、固体キャリア上の部位において、第１のオリゴマーブロック、第２のオリゴマーブロック、および必要に応じて縮合剤を、縮合条件下で反応させ、それによって、この第１のオリゴマーブロックと第２のオリゴマーブロックとを共有結合的に連結させる少なくとも３原子長のリンカーを有する、組み合わせオリゴマーを形成する工程を包含する。本発明に従って、上記の２つのオリゴマーブロックのうちの１つは、支持体に結合される。さらに、第１および第２のオリゴマーブロックは、各々独立した、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである。さらに、１つまたは両方のオリゴマーブロックは、核酸塩基保護基を含まず、そしてこの組み合わせオリゴマーはテンプレートの非存在下で形成される。本方法は、組み合わせオリゴマーの所望のアレイが構築されるまで、１つ以上の異なった部位で、１つ以上の異なったオリゴマーブロックを用いて、この方法を繰り返す工程を包含する。
【００３０】
なお別の実施形態において、本方法は、組み合わせオリゴマーのアレイを形成する別の方法に関する。この方法は、固体キャリア上の部位で、この第１のオリゴマーブロックと第２のオリゴマーブロックとを共有結合的に連結させる少なくとも３原子長のリンカーを有する、組み合わせオリゴマーの官能基と表面に官能基とを反応させ、それによって、この組み合わせオリゴマーを共有結合的にこの表面に結合する。本方法に従って、第１および第２の組み合わせオリゴマーブロックは、各々独立して、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡの組み合わせオリゴマーである。さらに、１つまたは両方のオリゴマーブロックは、核酸塩基保護基を含まない。本方法は、組み合わせオリゴマーの所望のアレイが構築されるまで、１つ以上の異なった部位で、この組み合わせオリゴマーを１つ以上の異なったオリゴマーブロックと結合する方法を繰り返す工程をさらに包含する。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
本明細書を理解する目的のために、以下の定義を適用し、そして、適切に用いられる場合いつでも、単数形で使用された用語は、その複数形もまた包含し、またその逆も真である。
【００３２】
ａ．本明細書中で使用される場合、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基および核酸技術を使用するか、またはペプチド核酸技術を使用して、それによって、核酸に配列特異的に結合し得るポリマーを生成する通常知られているそれらの非天然に存在するヘテロ環式部分を意味する。適切な核酸塩基の非限定的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピルニル−ウラシル、２−チオ−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２−チオウライシル、および２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８アザ−アデニン）。適切な核酸塩基の他の非限定的な例は、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（ＷＯ９２／２０７０２またはＷＯ９２／２０７０３）の図２（Ａ）および図２（Ｂ）において例示される核酸塩基が挙げられる。
【００３３】
ｂ．本明細書中に使用される場合、「核酸塩基配列」は、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーの、任意のセグメントまたは２以上のセグメントの凝集体（例えば、２以上のオリゴマーブロックが凝集した核酸塩基配列）を意味する。適切なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的例は、オリゴデオキヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡ組み合わせオリゴマー、核酸アナログ、および／または核酸模倣物を含む。
【００３４】
ｃ．本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、決定することが求められるポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列である。この標的配列の性質は、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。この標的配列を含むポリ核酸塩基鎖は、任意の供給源から提供され得る。例えば、この標的配列は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＰＮＡ、核酸アナログ、または他の核酸模倣物の部分でとして存在し得る。この標的配列を含むサンプルは、天然から提供され得るか、またはこれは、製造工程から合成もしくは供給され得る。標的配列が、核酸の部分配列である場合、上記の核酸は、任意の供給源から得られ得る。例えば、上記の核酸は、核酸増幅過程から作製されるか、細胞または生物体に含まれるか、また、さもなければ、細胞もしくは生物体から抽出され得る。核酸の供給源であり得る核酸増幅過程の非限定的としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ストランド置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、転写物媒介性増幅（ＴＭＡ）、Ｑ−βリプリカーゼ増幅（Ｑ−β）およびローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａａｔｉｏｎ；ＲＣＡ）。
【００３５】
ｄ．本明細書中で使用される場合、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基サブユニットを含む完全な単一のポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸のうちの単一の核酸鎖は、ポリ核酸塩基鎖である。
【００３６】
ｅ．本明細書中で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはそのアナログによって形成された骨格を有する、核酸塩基含有ポリマーまたは、ポリマーセグメントである。好ましい核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡである。いずれの疑いも回避するために、ＰＮＡは核酸模倣物であって、核酸アナログではない。
【００３７】
ｆ．本明細書中で使用される場合、「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」は、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、および同第６，１０７，４７０号（これらの全てが本明細書中で参考として援用されている）の中でペプチド核酸として言及されているか、またはこれらの中でペプチド核酸として特許請求されている、オリゴマーまたはポリマーのいずれかが挙げられるがこれらに限定されない、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）（核酸サブユニット（またはそのアナログ）ではない）を含有している任意のオリゴマーまたはポリマーセグメント（例えば、オリゴマーブロック）を意味する。用語「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」はまた、以下の刊行物中で記載されている核酸模倣物の２つ以上のサブユニットを含有している任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントに対しても適用されるべきである：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．、３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ���、５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）およびＷＯ９６／０４０００号に開示されているＳｈａｈらのＰｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭ）。疑いを回避するために、１以上のアミノ酸サブユニットまたは１以上の標識もしくはリンカーの、ＰＮＡオリゴマーまたはセグメント（例えば、ＰＮＡオリゴマーブロック）への連結は、ＰＮＡキメラを生成しない。
【００３８】
特定の実施形態においては、「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」は、以下の式の２つ以上の共有結合したサブユニットを含有しているオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントである：
【００３９】
【化１０】
0004408628.tif 000002
ここで、Ｊはそれぞれ同じであるかまたは異なり、そしてＨ、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、ＮＲ１２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択される。Ｋはそれぞれ同じであるかまたは異なり、そしてＯ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＲ１からなる群より選択される。Ｒ１はそれぞれ同じであるかまたは異なり、そして必要に応じてヘテロ原子または置換もしくは未置換のアリール基を含み得る、１個から５個の炭素原子を有しているアルキル基である。Ａはそれぞれ、単結合、式：−（ＣＪ２）ｓ−の基、および式：−（ＣＪ２）ｓＣ（Ｏ）−の基からなる群より選択される。ここでは、Ｊは上記で定義されており、そしてｓはそれぞれが１個から５個までの自然数である。ｔはそれぞれ１または２であり、そしてｕはそれぞれ１または２である。Ｌはそれぞれ同じであるかまたは異なり、そしてアデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、他の天然に存在する核酸塩基アナログまたは他の天然には存在しない核酸塩基からなる群より独立して選択される。
【００４０】
特定の他の実施形態においては、ＰＮＡサブユニットは、Ｎ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシン窒素に対してメチレンカルボニル結合を介して結合された天然に存在する核酸塩基または天然に存在しない核酸塩基からなり；これは、最近、ペプチド核酸サブユニットの最も一般に使用される形態である。
【００４１】
ｇ．本明細書中で使用される場合、用語「ＰＮＡキメラ」は、異なるクラスのサブユニットから選択され、そしてリンカーではなく共有結合によって連結されている、２つ以上のＰＮＡサブユニットおよび１以上の核酸サブユニット（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはそのアナログを含有している、オリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントを意味する。例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、少なくとも１つの２’−デオキシリボ核酸サブユニットに化学結合を介して共有結合された少なくとも２つのＰＮＡサブユニットを含有している（ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ調製に関する例示的な方法および組成物については、ＷＯ９６／４０７０９号を参照のこと）。本発明の目的のために、ＰＮＡキメラは、サブユニットを含む異なる型の核酸塩基（例えば、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の組み合わせを含むが、アミノ酸サブユニット（例えば、グリシン）または１以上の標識もしくはリンカーの単なる組込みは、オリゴマーがＰＮＡキメラであることを意味しない。
【００４２】
ｈ．本明細書中で使用する場合、「ブロック」、「オリゴマーブロック」または「ブロックオリゴマー」は、第二の適切に改変されたオリゴマーに連結され、それによって、適切な場合に組み合わせオリゴマーまたは伸長した組み合わせオリゴマーを調製するように設計されかつ利用可能な、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡ組み合わせオリゴマーを意味する。オリゴマーブロックは、１以上のレポーター部分で標識されなくてもされてもよく、そして／または１以上の保護もしくは未保護の官能基を含み得る。
【００４３】
ｉ．本明細書中で使用する場合、「ＰＮＡ組み合わせオリゴマー」は、少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーブロックまたはＰＮＡキメラオリゴマーブロックを含む組み合わせオリゴマーを意味する。
【００４４】
ｊ．本明細書中で使用する場合、「組み合わせオリゴマー」は、リンカーによって連結された、２以上のオリゴマーブロックを含むオリゴマーを意味する。
【００４５】
ｋ．本明細書中で使用する場合、「リンカー」は、ポリマーの骨格サブユニットを含む核酸塩基の一部ではない、長さが少なくとも３つの原子である部分を意味し、この少なくとも３つの原子は、２つの成分オリゴマーブロックの骨格サブユニットを含む核酸塩基に共有結合する。
【００４６】
ｌ．本明細書中で使用する場合、「ネイティブオリゴマー」は、２つのオリゴマーブロックを分離するリンカーを含まない、ペプチド核酸、核酸またはＰＮＡキメラを意味する。従って、キメラであっても、ネイティブオリゴマーは、骨格サブユニットが、直接かまたは長さが２つ以下の原子である結合部分を介してかのいずれかで一緒に連結された骨格を含む。
【００４７】
ｍ．本明細書中で使用する場合、「ギャップ」は、標的配列に隣接してハイブリダイズした２つのオリゴマーブロックの末端核酸塩基間の、少なくとも１ヌクレオチド長の空間を意味する（例えば、図１を参照のこと）。
【００４８】
ｎ．本明細書中で使用する場合、用語「標識」、「レポーター部分」または「検出可能部分」は、相互変換可能であり、そしてオリゴマーブロックまたは組み合わせオリゴマーに結合され得るか、さもなければレポーター系において使用され、それによって、オリゴマーを機器または方法によって検出可能にする部分をいう。例えば、標識は、以下を行う任意の部分であり得る：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第二の標識と相互作用して、第一または第二の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変する；または（ｉｉｉ）捕捉機能（すなわち、疎水的親和性、抗体／抗原、イオン錯体化）を付与する。
【００４９】
ｏ．本明細書中で使用する場合、「配列特異的に」は、水素結合を介した塩基対形成によるハイブリダイゼーションを意味する。標準的な塩基対形成の非限定的な例としては、チミンまたはウラシルとのアデニンの塩基対形成、およびシトシンとのグアニンの塩基対形成が挙げられる。塩基対形成モチーフの他の非限定的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、２−チオウラシルもしくは２−チオチミンのいずれかとのアデニンの塩基対形成；５−メチルシトシンもしくはプソイドイソシトシンのいずれかとのグアニンの塩基対形成；ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）もしくはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかとのシトシンの塩基対形成；２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）もしくはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）のいずれかとのチミンもしくはウラシルの塩基対形成；および、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）もしくはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかのような他の核酸塩基との、汎用塩基であるＮ８（７−デアザ−８−アザ−アデニン）の塩基対形成（Ｓｅｅｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓ．：２８（１７）：３２２４−３２３２（２０００）を参照のこと）。
【００５０】
ｐ．本明細書中で使用する場合、「縮合条件」は、選択された縮合／連結化学に従って、２つのオリゴマーブロックを縮合／連結するために適切な条件を意味する。
【００５１】
ｑ．本明細書中で使用する場合、「連結」および「縮合」は、オリゴマーブロックを連結するために適切な方法のすべてが厳密には縮合反応ではないので、相互変換可能であり、そして２つのオリゴマーブロックを共有結合させて、長さが少なくとも３つの原子であるリンカーを含む組み合わせオリゴマーを形成するプロセスをいう。連結／縮合化学が、オリゴマーブロック間にリンカーを生成する限り、これらの方法に限定されないこともまた理解される。組み合わせオリゴマーを形成するために適切な多数の連結／縮合化学の非限定的な例は、図２８ｂおよび図２９ｂ〜３２を参照して、本明細書に記載される。
【００５２】
ｒ．本明細書中で使用する場合、「核酸塩基保護基」は、核酸塩基の官能基に共有結合されて、特定の化学反応（例えば、連結／縮合）の間にこの官能基を非反応性にする保護基を意味する。例えば、アデニン、シトシンおよびグアニンの環外アミノ基は、代表的に、新規の化学的オリゴマー合成の間に、適切な保護基で保護される。しかし、核酸塩基は、本明細書中に記載される連結／縮合反応の間には保護される必要がない。疑いを回避するために、化学反応の間に官能基を非反応性にするこの基の塩の形成は、本明細書中で使用する場合、共有結合が存在しないので、核酸塩基保護基ではない。
【００５３】
ｓ．本明細書中で使用する場合、「クエンチする」は、その機構に関わらず、クエンチャー部分に関連するエネルギー移動によって引き起こされる、蛍光レポーター部分の蛍光の減少を意味する。
【００５４】
ｔ．本明細書中で使用する場合、「固体支持体」または「固体キャリア」は、組み合わせオリゴマーが合成されるか、結合されるか、連結されるか、またはさもなければ固定化される、任意の固相材料を意味する。固体支持体は、「樹脂」、「固相」、「表面」または「支持体」のような用語を包含する。固体支持体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド）ならびにコポリマーおよびその移植体から構成され得る。固体支持体はまた、無機物（例えば、ガラス、シリカ、制御された孔隙ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、または逆相シリカ）であり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲルまたは表面の形態であり得る。表面は、平面か、実質的に平面か、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性でも非多孔性でもよく、そして膨張特性を有しても非膨張特性を有してもよい。固体支持体は、ウェル、凹部の形態で構成され得るか、または他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、特徴または位置で構成され得る。複数の固体支持体は、試薬のロボット送達のためにアドレス可能であるか、またはレーザー照射および共焦点顕微鏡または倒立光学顕微鏡による走査を含む検出手段によってアドレス可能な、種々の位置でアレイ中に構成され得る。
【００５５】
ｕ．本明細書中で使用する場合、「支持体結合」は、固体支持体上または固体支持体への固定化を意味する。固定化は、例えば、以下を含む任意の手段によって生じ得ることが理解される：共有結合、静電的固定化、リガンド／リガンド相互作用を介した結合、接触または表面上の堆積。
【００５６】
ｖ．「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体上または容器の配置中に存在するオリゴマーの、予め決定された空間的配置を意味する。特定のアレイ様式が、「チップ」または「バイオチップ」として好まれる（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ、編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｂｏｏｋｓ、
Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ（２０００））。アレイは、低密度数（例えば、２〜１２）の位置、中間の密度（例えば、約１００以上）の位置、または高密度数（例えば、１０００以上）の、アドレス可能な位置を含み得る。代表的には、このアレイ形式は、製造、取り扱い、配置、保管、試薬導入、検出および保存を可能にする、幾何学的に通常の形状である。このアレイは、各位置の間に一定の間隔を有する行および列の形式で構成され得る。あるいは、これらの位置は、同等化処理またはサンプリングのために、束にされるか、混合されるか、または均質に混和され得る。アレイは、構成された複数のアドレス可能な位置を含み得、その結果、各位置は、高スループットの取り扱い、ロボット送達、マスキングまたは試薬の送達のために空間的にアドレス可能であるか、またはレーザー照射および共焦点顕微鏡または倒立光学顕微鏡による走査を含む検出手段によって空間的にアドレス可能である。
【００５７】
（ＩＩ．一般）
（ＰＮＡ合成）
ＰＮＡの化学的なアセンブリのための方法は周知である（米国特許同第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、および同第６，１０７，４７０号（これらの全てが本明細書中で参考として援用されている）（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅをもまた参照のこと）。ＰＮＡ合成方法論についての一般的参考文献としては、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）もまた参照のこと。
【００５８】
ペプチド核酸の支持体結合自動的化学的アセンブリのための化学物質および機器は、現在は市販されている。標識ＰＮＡオリゴマーおよび未標識ＰＮＡオリゴマーの両方が同様に、特注ＰＮＡオリゴマーの商業的販売業者から入手可能である。ＰＮＡの化学的アセンブリは、固相ペプチド合成と同様であり、ここで、オリゴマーは、アセンブリのそれぞれのサイクルで成長中のポリマーに対して添加される次の合成要素（ｓｙｎｔｈｏｎ）と縮合される反応性アルキルアミノ末端を有する。
【００５９】
ＰＮＡは、マイクロモル未満からミリモルまたはそれ以上の、任意の規模で合成され得る。最も簡便には、ＰＮＡは、ＸＡＬもしくはＰＡＬ支持体上のＥｘｐｅｄｉｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で；またはＭＢＨＡ支持体と共にＭｏｄｅｌ  ４３３Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で；あるいは他の自動化合成器で、Ｆｍｏｃ／Ｂｈｏｃ、ｔＢｏｃ／ＺまたはＭＭＴ保護基モノマーを使用して、２μモルの規模で合成される。標準的なペプチド化学が利用されるので、天然または非天然のアミノ酸は、ＰＮＡオリゴマー中に慣用的に取り込まれ得る。ＰＮＡはポリアミドなので、ＰＮＡは、Ｃ末端（カルボキシル末端）およびＮ末端（アミノ末端）を有する。（好ましい配向の）標的配列に逆並行に結合するのに適切なハイブリダイゼーションプローブの設計の目的のために、ＰＮＡプローブの探索核酸塩基配列のＮ末端は、等価なＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル末端の等価物である。
【００６０】
連結反応において使用する場合、選択される連結化学の性質が考慮されるべきである。単純化のために、本発明者らは、しばしば、末端ブロックとして連結反応において、そして縮合ブロックとして他の反応において使用される、オリゴマーブロックの１つをいう。この区別は、一般に、同じ核酸塩基配列を含む場合に特に、異なるブロック間の区別以外では不適切である。少なくとも連結において使用される官能基の性質は、異なる連結化学を適合するために設計され得るので、しばしば、末端および縮合ブロックについて異なる。しかし、オリゴマーが複数の連結によって伸長される場合、本発明者らは、一般に、この末端オリゴマーブロックを、第一の連結または直前の連結工程から生成されるオリゴマーブロックという。従って、オリゴマーブロックが縮合オリゴマーブロックであるか末端オリゴマーブロックであるかに依存することは、末端の実際の組成に対して影響を有し得る。連結化学のいくつかの非限定的な例は、図２８〜３１ａおよび図３１ｂに例示される。１つより多い慣用実験および本明細書に含まれる記載を使用して、当業者は、本発明に従う組み合わせオリゴマーを容易に調製し得る。
【００６１】
末端ブロックは、比較的非反応性のＣ末端アミドを含み得る。対照的に、縮合ブロックは、連結反応に適切なＣ末端を含み得る。しかし、縮合化学の性質に依存して、オリゴマーのＣ末端は、Ｃ末端酸または代替的官能基を含み得る（例えば、図２８ａ〜３１ｂを参照のこと）。官能基の場合、末端は、縮合化学／連結化学の性質に依存して、保護基の付加を必要としてもしなくてもよい。オリゴマーブロック自体は、新規方法によってしばしば調製され、そして適切な市販の試薬および機器が、Ｃ末端アミノ酸、代替的官能基またはＣ末端アミドのいずれかを含むＰＮＡオリゴマーの生成のために利用可能であるので、当業者は、所望のＣ末端構成のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
【００６２】
Ｎ末端に関して、再び、正確な構成は、選択される連結化学の性質、およびこのオリゴマーが縮合オリゴマーブロックであるか末端オリゴマーブロックであるかに依存し得る。オリゴマーが末端オリゴマーブロックである場合、Ｎ末端は、反応性官能基を含み得るが、オリゴマーが縮合オリゴマーブロックである場合には、Ｎ末端はキャップされ得る。キャップの非限定的な例としては、標識を用いるＮ末端の標識化またはアセチルのような比較的非反応性の部分とＮ末端との反応が挙げられる。Ｎ末端が連結反応に関与する場合、Ｎ末端は、代表的には、代替的縮合化学が使用されない限りは、遊離のアミンとして存在する（例えば、図２８ａ〜３１ｂを参照のこと）。オリゴマーブロック自体は、新規方法によって調製され、そして適切な市販の試薬および機器がＰＮＡオリゴマーの生成のために利用可能であるので、当業者は、所望のＮ末端構成のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
【００６３】
連結のための末端の改変に加えて、オリゴマーブロックは、改変および／または適切に保護され、それによって、標識化または表面への結合のために官能基を取り込み得る。このような官能基は、以下のような因子に依存して、連結の前または後のいずれかに利用され得る：１）オリゴマー合成化学（例えば、標識を破壊し得る、必要とされる厳しい脱保護条件）、選択される縮合／連結化学（例えば、所望の標識の官能基は、縮合化学と相互作用し得る）および官能基の意図された使用（例えば、標識化または固体支持体への結合について意図されるか否か）。
【００６４】
（ＰＮＡ標識／改変）
ＰＮＡを標識するための好ましい非限定的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，２８０，９６４号、ＷＯ９９／２２０１８、ＷＯ９９／２１８８１、ＷＯ９９／３７６７０、およびＷＯ９９／４９２９３（本明細書の実施例の節に記載されているか、またはそうでなければ、ＰＮＡ合成およびペプチド合成の分野で周知である）に記載される。ＰＮＡを標識するための方法は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）においても議論される。ブロックオリゴマーとして使用され得るか、そうでなければ組み合わせオリゴマーを調製するために使用され得るかのいずれかであるＰＮＡオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、以下に示される。
【００６５】
アセンブリの合成化学は実質的に同じであるので、ペプチドを標識するために一般に使用される任意の方法は、しばしば、ＰＮＡオリゴマーの標識化をもたらすように適合され得る。一般に、ポリマーのＮ末端は、カルボン酸基または活性化カルボン酸基を有する部分との反応によって標識され得る。１以上のスペーサー部分が、標識化部分と核酸塩基含有オリゴマーサブユニットとの間に、必要に応じて導入され得る。一般に、スペーサー部分は、連結反応を実行する前に取り込まれ得る。所望の場合、スペーサーは、標識内に包埋され、それによって標識化反応の間に取り込まれ得る。
【００６６】
代表的には、ポリマーのＣ末端は、標識された部分または官能基部分を、ＰＮＡオリゴマーがアセンブリされる支持体と最初に縮合することによって標識され得る。次に、ＰＮＡオリゴマーの合成要素を含む第一の核酸塩基は、標識された部分または官能基部分と縮合され得る。あるいは、１以上のスペーサー部分（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；「Ｏ−リンカー」）が、標識部分または官能基部分とオリゴマーの第一の核酸塩基サブユニットとの間に導入され得る。調製されるべき分子が一旦完全にアセンブリ、標識および／または改変されると、これは、脱保護された支持体から切断され得、そして標準的な方法論を使用して精製され得る。
【００６７】
例えば、標識された部分または官能基部分は、リジン誘導体であり得、ここで、ε−アミノ基は、保護もしくは脱保護された官能基であるか、またはさもなければレポーター部分で改変される。レポーター部分は、発蛍光団（例えば、５（６）−カルボキシフルオレセイン）またはクエンチャー部分（例えば、４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）））であり得る。合成支持体とのリジン誘導体の縮合は、標準的な縮合（ペプチド）化学を使用して達成され得る。次いで、このリジン誘導体のα−アミノ基は、脱保護され得、そして核酸塩基配列アセンブリは、第一のＰＮＡ合成要素とＰＮＡリジンアミノ酸のα−アミノ基との縮合によって開始され得る。上記で議論したように、スペーサー部分は、適切なスペーサー（例えば、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）を第一のＰＮＡ合成要素の縮合の前にリジンアミノ酸と縮合させることによって、リジンアミノ酸と第一のＰＮＡ合成要素との間に必要に応じて挿入され得る。
【００６８】
あるいは、アセンブリされたかまたは部分的にアセンブリされたポリマー上の官能基は、オリゴマーがなお支持体結合したままで導入され得る。次いで、官能基は、任意の目的のために利用可能である（例えば、オリゴマーを支持体に結合させるため、またはさもなければレポーター部分と反応させるため（連結後の反応を含む（連結後によって、本発明者らは、１以上の縮合／連結反応の実行によって組み合わせオリゴマーが完全に形成された後の時点を意味する））のいずれかのために使用することを含む）。しかし、この方法は、適切に保護された官能基が、アセンブリの間にオリゴマーに取り込まれることを必要とし、その結果、アセンブリが完了した後に、反応性の官能基が作製され得る。従って、保護された官能基は、組み合わせオリゴマーまたはブロック内の任意の位置（ブロックオリゴマーの末端、オリゴマーブロックに対して内側の位置を含む）で結合され得るか、またはリンカーにとって重要な位置で連結され得る。
【００６９】
例えば、リジンのε−アミノ基は、４−メチル−トリフェニルメチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシ−トリフェニルメチル（ＭＭＴ）または４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基で保護され得る。Ｍｔｔ、ＭＭＴまたはＤＭＴ基は、穏やかな酸性条件下で合成樹脂処理することによって、（市販のＦｍｏｃ  ＰＮＡモノマーおよびＰＡＬリンカーを有するポリスチレン支持体（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使用してアセンブリされた）オリゴマーから除去され得る。結果として、ドナー部分、アクセプター部分または他のレポーター部分は、次いで、ポリマーがなお支持体結合したままで、例えば、リジンアミノ酸のε−アミノ基と縮合され得る。アセンブリおよび標識化が完了した後、次いでこのポリマーは、周知の方法論を使用して支持体から切断され、脱保護され、そして精製される。
【００７０】
なお別の方法によって、レポーター部分は、完全にアセンブリされ、そして支持体から切断された後で、組み合わせオリゴマーまたはオリゴマーブロックに結合される。この方法は、この標識が、オリゴマーを製造するために一般に使用される切断レジメン、脱保護レジメンまたは精製レジメンを用いて取り込み可能である場合に好ましい。この方法によって、ＰＮＡオリゴマーは、ポリマー上の官能基と標識上の官能基との反応によって、一般に溶液中で標識される。当業者は、カップリング溶液の組成が、オリゴマーおよび標識（例えば、ドナー部分またはアクセプター部分）の性質に依存することを認識する。この溶液は、有機溶媒、水またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。一般に、この有機溶媒は、極性の非求核溶媒である。適切な有機溶媒の非限定的例としては、アセトニトリル（ＡＣＮ）、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）が挙げられる。
【００７１】
標識されるべきポリマー上の官能基は、求核試薬（例えば、アミノ基）であり得、そして標識上の官能基は、求電子試薬（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）であり得る。しかし、これが逆転され得ることもまた意図され、その結果、ポリマー上の官能基は、求電子試薬（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）であり得、そして標識上の官能基は、求核試薬（例えば、アミノ基）であり得る。活性化カルボン酸官能基の非限定的な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが挙げられる。水溶液中で、ＰＮＡまたは標識のいずれかのカルボン酸基は、（選択された成分の性質に依存して）水溶性カルボジイミドを用いて活性化され得る。試薬（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ））は、水性アミド形成縮合反応について特異的に販売される市販の試薬である。本出願人らは、このような縮合反応が、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｚｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）（ＨＯＢｔ）がＥＤＣと混合される場合に改善され得ることを同様に観察した。
【００７２】
水溶液のｐＨは、縮合反応の間に緩衝液を用いて調節され得る。例えば、縮合の間のｐＨは、４〜１０の範囲であり得る。一般に、非水性反応の塩基性は、非求核有機塩基の添加によって調節される。適切な塩基の非限定的な例としては、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。あるいは、ｐＨは、生物学的緩衝液（例えば、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）もしくは４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ））または無機緩衝液（例えば、重炭酸ナトリウム）を使用して調節され得る。
【００７３】
（キメラ合成および標識化／改変）
ＰＮＡキメラは、核酸サブユニットおよびペプチド核酸サブユニットの組み合わせである。従って、ＰＮＡキメラの合成、標識化および改変は、当業者に公知の方法および上記の方法を利用し得る。ＰＮＡキメラの合成、標識化および改変について適切な参考文献は、ＷＩＰＯ公開特許出願番号ＷＯ９６／４０７０９（現在、米国特許第６，０６３，５６９号として発行、本明細書中で参考として援用される）に見出され得る。さらに、ＰＮＡの合成および標識化についての上記の方法は、しばしば、ＰＮＡキメラのＰＮＡ部分を改変するために使用され得る。さらに、核酸の合成および標識化のための周知の方法は、しばしば、ＰＮＡキメラの核酸部分を改変するために使用され得る。例示的な方法は、米国第５，４７６，９２５号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４１９，９６６号、同第５，３９１，７２３号、同第５，３９１，６６７号、同第５，３８０，８３３号、同第５，３４８，８６８号、同第５，２８１，７０１号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２６２，５３０号、同第５，２４３，０３８号、同第５，２１８，１０３号、同第５，２０４，４５６号、同第５，２０４，４５５号、同第５，１９８，５４０号、同第５，１７５，２０９号、同第５，１６４，４９１号、同第５，１１２，９６２号、同第５，０７１，９７４号、同第５，０４７，５２４号、同第４，９８０，４６０号、同第４，９２３，９０１号、同第４，７８６，７２４号、同第４，７２５，６７７号、同第４，６５９，７７４号、同第４，５００，７０７号、同第４，４５８，０６６号、および同第４，４１５，７３２号（これらの全てが本明細書中で参考として援用されている）において見出され得る。
【００７４】
（標識された組み合わせオリゴマーおよびオリゴマーブロック）
ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡ組み合わせオリゴマーもしくはこれらのバリエーションであれ、本発明の実施のために使用される組み合わせオリゴマーまたはオリゴマーブロックは、レポーター部分を用いて標識され得る。標識またはレポーター部分の各々は、組み合わせオリゴマーまたはオリゴマーブロック内の任意の位置（ブロックオリゴマー末端、オリゴマーブロックに対して内側の位置、またはリンカーに対して重要な位置を含む）で連結され得る。本発明の実施において使用される組み合わせオリゴマーまたはオリマーブロックの直接的な標識に適切なレポーター部分（標識）の非限定的な例としては、量子ドット、副溝結合剤、デキストラン結合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、クエンチャー、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、および化学発光化合物が挙げられる。クエンチング部分もまた、標識とみなされる。他の適切な標識試薬および好ましい結合方法は、ＰＮＡ、ペプチド、または核酸合成の当業者によって認識されている。非限定的な例は、記載または上記に対して参照される。
【００７５】
ハプテンの非限定的な例としては、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンが挙げられる。
【００７６】
蛍光色素（発蛍光団）の非限定的な例としては、以下が挙げられる：５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン、他の蛍光色素（本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，１８８，９３４号；同第６，００８，３７９号；同第６，０２０，４８１号を参照のこと）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、他のローダミン色素（本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；同第６，１９１，２７８号；同第６，２４８，８８４号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、シアニン２（Ｃｙ２）色素、シアニン３（Ｃｙ３）色素、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）色素、シアニン５（Ｃｙ５）色素、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）色素、シアニン７（Ｃｙ７）色素、シアニン９（Ｃｙ９）色素（シアニン色素２、３、３．５、５、および５．５は、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬからＮＨＳエステルとして入手され得る）、他のシアニン色素（Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ９７／４５５３９）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５（６）−カルボキシ−テトラメチルローダミン（Ｔａｍａｒａ）、色素１（図３３ａ）、色素２（図３３ｂ）またはＡｌｅｘａ色素系列（Ｍｏｌｅｃｉｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【００７７】
酵素の非限定的な例としては、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＰＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼが挙げられる。
【００７８】
クエンチング部分の非限定的な例としては、以下の構造：
【００７９】
【化１１】
0004408628.tif 000003
に従う、ジアゾ含有部分（例えば、アリールジアゾ化合物（例えば、ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）およびダブシル（ｄａｂｓｙｌ）））、もう１つのさらなるジアゾ基および／またはアリール基を含むホモログ（例えば、Ｆａｓｔ  Ｂｌｏｃｋ（Ｎａｒｄｏｎｅ、米国特許第６，１１７，９８６号））および置換化合物（ここで、Ｚは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４アリール、ニトロ、シアノ、スルホネート、ＮＲ２、−ＯＲおよびＣＯ２Ｈのような置換基であり、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ５〜Ｃ１４アリールである）が挙げられ、以下の例示的な構造：
【００８０】
【化１２】
0004408628.tif 000004
を含むシアニン色素（Ｌｅｅ、米国特許第６，０８０，８６８号）、ならびに他の発色団（例えば、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール化合物など）（ここで、基Ｘは、本発明の組み合わせオリゴマーへの結合またはリンカーの共有結合部位である）が挙げられる。
【００８１】
マイナーグローブ結合体（ｂｉｎｄｅｒ）の非限定的な例は、以下の構造：
【００８２】
【化１３】
0004408628.tif 000005
によって示されるＣＤＰＩ３であり、ここで、Ｘは複合（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）オリゴマーに対する例示的な結合部位である（Ｄｅｍｐｃｙ、ＷＯ０１／３１０６３）。
【００８３】
非放射性標識方法、技術および試薬は、以下に概説される：Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９７）。
【００８４】
（オリゴマーブロックを連結／縮合する場合の標識選択のガイダンス）
本発明に従って、組み合わせオリゴマーを生成するためにオリゴマーブロックが縮合／連結される場合、成分オリゴマーブロックの潜在的に反応性の官能基の全体的な性質を、潜在的副反応または交差反応について考慮するべきであることは、当業者に理解される。保護基はまた、潜在的な副反応および交差反応を最少にするかまたは排除するために、適切な場合に使用される。例えば、標識されたオリゴマーが連結される場合、選択され得る種々の連結化学の性質の観点から１つ以上の標識の官能基活性の能力について考慮することが賢明である。
【００８５】
説明の目的で、アミノ基、カルボン酸基および水溶性カルボジイミドを含む縮合／連結反応が実行される場合（例えば、実施例２および６）、エネルギー移動セットの標識（以下のエネルギーセットの考察を参照のこと）は、一般的に、保護されていない反応性アミノ官能基およびカルボン酸官能基を避け、それにより潜在的副反応／交差反応を回避するように選択されるべきである。実施例２および６に実証されるように、標識されたＰＮＡオリゴマーブロックおよび標識されていないＰＮＡオリゴマーブロックを、良好な収率で連結することが可能であるが、但し、縮合反応の間に交差反応を生じる官能基は存在しない。その結果、当業者は、選択された特定の連結／縮合化学の性質の観点から、成分部分の反応性官能基の性質を考慮することによって、いかにして最適な連結／縮合状態をもたらすかを理解する。
【００８６】
（エネルギー移動）
ハイブリダイゼーションの決定において有用であるエネルギー移動のために、少なくとも１つのエネルギー移動ドナー部分および少なくとも１つのエネルギー移動アクセプター部分を含むエネルギー移動部分のセットが存在するべきである。しばしば、このエネルギー移動セットは、単一のドナー部分および単一のアクセプター部分を含むが、限定ではない。エネルギー移動セットは、１つより多くのドナー部分および／または１つより多くのアクセプター部分を含み得る。ドナー部分およびアクセプター部分は、１つ以上のアクセプター部分が１つ以上のドナー部分から移動されるエネルギーを受容するようにか、またはそうでなければ、ドナー部分からのシグナルを消滅させるように、作動する。従って、１つの実施形態において、ドナー部分およびアクセプター部分の両方は、発蛍光団である。先に列挙した発蛍光団（適切なスペクトル特性を有する）もまたエネルギー移動アクセプターとして作動し得るが、好ましくは、アクセプター部分はクエンチャー部分である。好ましいクエンチャー部分は、４−（（−４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（ｄａｂｃｙｌ））である。エネルギー移動セットの標識は、オリゴマーブロック末端で連結されるか、またはオリゴマーブロック内の部位で連結され得る。１つの実施形態において、エネルギー移動セットの２つの標識の各々は、組み合わせオリゴマーの最遠位末端において連結され得る。
【００８７】
ドナー部分とアクセプター部分との間のエネルギー移動は、任意のエネルギー移動プロセスにより（例えば、エネルギー移動セットに近接して結合した部分の衝突により、または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のような無放射プロセスにより）起こり得る。ＦＲＥＴが起こるために、エネルギー移動セットのドナー部分とアクセプター部分との間のエネルギーの移動は、これらの部分が空間的に近いこと、およびドナーの発光スペクトルが、アクセプターの吸収スペクトルとの実質的な重なりを有していることを必要とする（Ｙａｒｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）および特に２３２頁第１欄〜２３４頁第１欄を参照のこと）。あるいは、衝突媒介（無放射）エネルギー移動は、ドナー部分の発光スペクトルがアクセプター部分の吸収スペクトルと実質的な重なりを有していてもいなくても、非常に近接して結合したドナー部分とアクセプター部分との間で起こり得る（（Ｙａｒｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）および特に２２９頁第１欄〜２３２頁第１欄を参照のこと）。このプロセスは、分子内衝突といわれる。なぜなら、消光は、ドナー部分とアクセプター部分の直接接触により引き起こされると考えられるからである（Ｙａｒｏｎら参照）。本出願におけるエネルギー移動に対する任意の言及は、これらの機構の異なる現象の全てを包含することが理解されるべきである。エネルギー移動が、１つより多くのエネルギー移動プロセスにより同時に起こり得ること、および検出可能なシグナルの変化が、２つ以上のエネルギー移動プロセスの活性の尺度でありえることもまた理解されるべきである。従って、エネルギー移動の機構は、本発明の限定事項ではない。
【００８８】
（自己指示（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ）組み合わせオリゴマーにおけるエネルギー移動の検出）
特定の実施形態において、組み合わせオリゴマーは、自己指示する。１つの実施形態において、自己指示組み合わせオリゴマーは、表題：「Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｋｉｔｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｐｅｒｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｏ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ」の同時係属中の共有に係る特許出願ＵＳＳＮ０９／１７９，１６２号（現在は特許される）およびＷＯ９９／２１８８１としても現在公開されている関連ＰＣＴ出願（これらの両方は、本明細書に参考として援用される）に記載される様式で標識され得る。これらの自己指示組み合わせオリゴマーは、主に、ドナー部分またはアクセプター部分のうちのいずれか一方が連結される２つのオリゴマーブロックの間に位置するリンカーの存在において、ＵＳＳＮ０９／１７９，１６２号またはＷＯ９９／２１８８１に最初に記載される例示的なプローブと異なる。
【００８９】
自己指示組み合わせオリゴマーと標的配列との間のハイブリッド形成は、エネルギー移動セットの少なくとも１つのメンバーの少なくとも１種の物理的特性を測定することによりモニタリングされ得、この物理的特性は、その組み合わせオリゴマーが非ハイブリダイズ状態で存在する場合と比較した場合に、ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合に検出可能に異なる。本発明者らは、この現象を、組み合わせオリゴマーの自己指示特性と呼ぶ。検出可能シグナルにおけるこの変化は、ドナー部分とアクセプター部分との間のエネルギー移動効率の変化から生じ、この変化は、組み合わせオリゴマーの標的配列へのハイブリダイゼーションにより引き起こされる。
【００９０】
例えば、検出手段は、エネルギー移動セットのドナー発蛍光団またはアクセプター発蛍光団の蛍光を測定することを含み得る。１つの実施形態において、エネルギー移動セットは、ドナー発蛍光団の蛍光の測定を使用して、標的配列への組み合わせオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出、同定、または定量し得るように、少なくとも１つのドナー発蛍光団および少なくとも１つのアクセプター（蛍光性または非蛍光性）クエンチャーを含み得る。例えば、標的配列への組み合わせオリゴマーのハイブリダイゼーションの際にドナー発蛍光団の蛍光は、測定可能に増加し得る（実施例２、３および５を参照のこと）。
【００９１】
別の実施形態において、エネルギー移動セットは、少なくとも１つのドナー部分または少なくとも１つのアクセプター部分のいずれかまたは両方の蛍光の測定を使用して、標的配列に対する組み合わせオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出、同定または定量し得るように、少なくとも１つのドナー発蛍光団および少なくとも１つのアクセプター発蛍光団を含む。
【００９２】
（検出複合体におけるエネルギー移動の検出）
別の実施形態において、本発明の組み合わせオリゴマーは、クエンチャー部分のみで標識され、そして検出複合体における成分オリゴマーとして使用される（表題：「Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｋｉｔｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｐｅｒｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」のＵＳＳＮ０９／２７５，８４８号およびＷＯ９９／４９２９３としても現在公開されている関連ＰＣＴ出願（両方とも本明細書中に参考として援用される）により充分に説明される）。この検出複合体が形成される場合、１つの成分ポリマー中の少なくとも１つのドナー部分は、第２の成分ポリマーの少なくとも１つのアクセプター部分に空間的に十分近くにされる。このセットのドナー部分およびアクセプター部分は空間的に近くに位置しているので、エネルギー移動は、エネルギー移動セットの部分間で起こる。例えば、ポリメラーゼが、検出複合体鎖の１つをコピーする場合に、検出複合体が解離する場合、ドナー部分およびアクセプター部分は、エネルギー移動セットのドナー部分およびアクセプター部分からのエネルギーの実質的な移動を生じるほど十分には相互作用せず、そしてエネルギー移動セットのドナー部分および／またはアクセプター部分からの検出可能なシグナルにおける相関する変化がある。結果として、検出複合体形成／解離は、エネルギー移動セットの少なくとも１つのメンバーのすくなくとも１種の物理的特性を測定することにより決定され得、この物理的特性は、この検出複合体の成分ポリマーが独立してかつ解離せずに存在する場合と比較して複合体が形成される場合に、検出可能に異なる。
【００９３】
（検出可能でかつ独立して検出可能な部分／マルチプレックス分析）
本発明の特定の実施形態において、マルチプレックスハイブリダイゼーションアッセイが実行される。マルチプレックスアッセイにおいて、目的の多数の状態が、同時にまたは連続して試験される。マルチプレックス分析は、そのアッセイの間またはアッセイが完了した後に、サンプル成分またはそのサンプル成分に関連したデータをソートする能力に依存する。マルチプレックスアッセイを行う際に、１つ以上の個々の独立して検出可能な部分を使用して、アッセイに使用されるべき２つ以上の異なる組み合わせオリゴマーを標識し得る。独立して検出可能により本発明者らは、他の標識と独立してかつ他の標識の存在下で１つの標識を検出ことが可能であることを意味する。独立して検出可能な部分の各々を区別し、そして／または定量する能力は、ハイブリダイゼーションアッセイを多重化する手段を提供する。なぜなら、このデータは、サンプル中で検出しようとする特定の標的配列への個々の独立して標識された組み合わせオリゴマーの各々のハイブリダイゼーションと相関するからである。結果として、本発明のマルチプレックスアッセイを使用して、例えば、同じサンプル中の２つ以上の標的配列の存在、非存在、数、位置またはアイデンティーを同じアッセイにおいて同時にまたは連続的に検出し得る。
【００９４】
以下の実施例５は、本明細書中で考察される本発明を使用するマルチプレックスアッセイの一例である。この実施例において、ＳＮＰ分析において使用されるプローブの各対を、それぞれ独立して検出可能な色で蛍光を発する色素で標識する。その結果：（ｉ）本質的に２つの色のうち一方のみが検出される場合、そのサンプルは、一方のＳＮＰ状態について同型接合的であり、（ｉｉ）本質的に２つの色のうち他方が検出される場合、そのサンプルは、別のＳＮＰ状態について同型接合的であるが；（ｉｉｉ）両方の色が検出される場合、そのサンプルは、ＳＮＰ状態について異型接合的である。このようにして、全ての可能なＳＮＰ順列が、１回の「マルチプレックス」アッセイから決定可能であり、このアッセイにおいて、アッセイにおいて使用される、異なる自己指示組み合わせオリゴマープローブに連結された蛍光性色素標識の独立して検出可能な色は、目的の特定の状態と関連しており、そして同じアッセイにおける両方の標識の決定を使用して、３種の異なる可能なＳＮＰ状態の任意の１つを決定し得る。
【００９５】
（スペーサー／リンカー部分）
一般的に、スペーサーを使用して、嵩高い標識試薬が、プローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション特性に対して有し得る不利な影響を最小にし得る。本発明において、リンカーを使用して、組み合わせオリゴマーの２つ以上のオリゴマーブロックを連結し得る。本発明における使用のために適切なスペーサー／リンカー部分の非限定的な例は、以下からなる：１つ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖）、１つ以上の天然アミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシ二酸（例えば、ジグリコール酸）またはアルキルジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）。スペーサー／リンカー部分はまた、組み合わせオリゴマーの水溶性を改善するように、偶発的または意図的に構築され得る（例えば、Ｇｉｌｄｅａら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５−７２５８（１９９８）を参照のこと）。
【００９６】
本発明のリンカーは、無塩基である。無塩基により、本発明者らは、それらが核酸塩基を含まないことを意味する。リンカーは、少なくとも３原子長である。疑念を避けるために、リンカーを規定する原子は、そのオリゴマーのモノマーサブユニットを構成する原子ではない。例えば、ヌクレオチドサブユニットの３’ヒドロキシルおよび５’ヒドロキシル基は、リンカーの原子ではない。同様に、ＰＮＡサブユニットのＮ−（２−アミノエチル）−グリシン部分の１級アミンおよびカルボニル炭素は、リンカーの原子として数えられない。
【００９７】
例えば、このリンカーは、１つのアミノ酸残基、２つのアミノ酸残基、３つのアミノ酸残基、１つのＥリンカー残基、２つのＥリンカー残基、１つのＯリンカー残基、２つのＯリンカー残基、１つのＸリンカー残基、または２つのＸリンカー残基であり得る。より具体的には、このリンカーは、アミノ酸グリシン、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｌｙｓ、アミノ酸ダイマーｌｙｓ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｕ−ｇｌｙ、アミノ酸ダイマーｇｌｙ−ｃｙｓ、アミノ酸ダイマーｃｙｓ−ｇｌｙおよびアミノ酸ダイマーａｓｐ−ｇｌｙであり得る。
【００９８】
（ハイブリダイゼーション条件／ストリンジェンシー）
ハイブリダイゼーションの当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを強要または制御するために一般的に使用される因子としては、ホルムアミド濃度（または他の化学的変性試薬）、塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨおよびカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在または非存在が含まれることを認識する。組み合わせオリゴマー／標的配列の組み合わせについての最適なストリンジェンシーは、しばしば、前述のストリンジェンシー因子のいくつかを固定し、次いで単一のストリンジェンシー因子を変化させる効果を決定する周知の技術により見出される。ＰＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度とほとんど独立しているということを除いて、同じストリンジェンシー因子を調節して、それにより核酸へのＰＮＡのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御し得る。アッセイに最適または適切なストリンジェンシーは、所望の程度の識別が達成されるまで各ストリンジェンシー因子を試験することにより実験的に決定され得る。
【００９９】
（適切なハイブリダイゼーション条件）
一般的に、核酸混入を引き起こすバックグラウンドが標的配列に密接に関連しているほど、より注意深くストリンジェンシーを制御しなければならない。ブロックプローブはまた、ストリンジェンシー因子の単なる最適化により可能な限界を超えて識別を改善するための手段として使用され得る。従って、適切なハイブリダイゼーション条件は、アッセイが正確で（アッセイに所望の許容範囲内）かつ再現可能な結果を生じるように、所望の程度の識別が達成される条件を含む。しばしば、このことは、プローブおよび標的配列の配列特異的ハイブリダイゼーションが達成されるまで、ストリンジェンシーを調節することにより達成される。それにもかかわらず、慣用の実験および本明細書中に提供される開示内で補助されて、当業者は、本明細書中に記載される方法および組成物を利用するアッセイを実行するための適切なハイブリダイゼーション条件を決定することができる。
【０１００】
（ブロックプローブ）
ブロックプローブは、非標的配列への組み合わせオリゴマーのプローブ核酸塩基配列の結合を抑制するために使用され得る、核酸プローブまたは非核酸プローブである。好ましいブロックプローブは、ＰＮＡプローブである（Ｃｏｕｌｌら、米国特許第６，１１０，６７６（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本発明の組み合わせオリゴマーは、同様にブロックプローブとして使用され得る。
【０１０１】
代表的には、ブロックプローブは、プローブ核酸塩基配列に密接に関連しており、そして好ましくは、これらは、アッセイにおいて検出しようとする標的配列と比較して、１つ以上の一点変異を含む。ブロックプローブは、非標的配列に対するハイブリダイゼーションにより作動して、それによりプローブ核酸塩基配列と非標的配列との間のハイブリダイゼーションにより形成される複合体より熱力学的に安定な複合体を形成すると考えられる。より安定で好ましい複合体の形成は、プローブ核酸塩基配列と非標的配列との間のより不安定な好ましくない複合体の形成を防ぐ。従って、ブロックプローブは、本発明の方法および組成物と共に使用されて、アッセイに存在し得、それによりアッセイの性能を妨害し得る非標的配列に対する核酸または非核酸組み合わせオリゴマーの結合を抑制し得る。（Ｆｉａｎｄａｃａら、「ＰＮＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｉｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２９〜１４１頁、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，ＵＫ，１９９９を参照のこと）。
【０１０２】
（プローブ核酸塩基配列）
組み合わせオリゴマーのプローブ核酸塩基配列は、構築物の特異的配列認識部分である。本発明者らは、本発明のオリゴマーを、その製造方法に関わらず、組み合わせオリゴマーと呼ぶ。なぜなら、それらのハイブリダイゼーション特性は、２つ以上の成分オリゴマーブロック、リンカーの性質、およびこの組み合わせオリゴマー配列が標的配列に特異的にハイブリダイズする場合のブロック間の相互作用の機会という組み合わされた特性から生じるからである。従って、組み合わせオリゴマーのプローブ核酸塩基配列は、サンプル中の連続した核酸塩基の特異的標的配列にハイブリダイズするように設計されるオリゴマーブロックの凝集核酸塩基配列である（例えば、図１を参照のこと）。従って、組み合わせオリゴマーのプローブ核酸塩基配列は、その組み合わせオリゴマーの少なくとも２つのオリゴマーブロック間に分布される（必ずしも一様に分布される必要はない）。結果として、選択されたアッセイ形式についての組み合わせオリゴマーの要件を熟慮して、組み合わせオリゴマーのプローブ核酸塩基配列の長さおよび配列組成は、一般的に、適切なハイブリダイゼーション条件下で、連続した核酸塩基の標的配列と二本鎖複合体を形成する（すなわち、オリゴマーブロックが、隙間のないように並列してハイブリダイズする）ように選択される。
【０１０３】
実施例１に考察されるように、本発明の組み合わせオリゴマーは、等価なプローブ核酸塩基配列のネイティブオリゴマーよりも低いＴｍ、およびミスマッチが、一方のオリゴマーブロックの末端以外に位置する場合に、それらのミスマッチを識別するより高い能力を示し得る。従って、組み合わせオリゴマーのプローブ核酸塩基配列の設計は、オリゴマーブロックの末端以外の位置において識別されるべき一点変異（ミスマッチ、一塩基多型またはＳＮＰ）の位置決めを含み得る。
【０１０４】
（連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）／縮合化学の非限定的例）
図２８ａおよび図２８ｂを参照して、適切に調製されたオリゴマーブロックは、カルボジイミド（例えば、水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ））を使用して結合され得る。図示されるように、代表的にオリゴマーブロックの一方が、カルボン酸部分を有し、他方がアミン基を含む。ＰＮＡオリゴマーは、それらが連結された天然アミノ酸部分を含んでいてもいなくても、アミン末端およびカルボン酸末端を含み得るので、ＰＮＡオリゴマーブロックが、この結合化学を促進させるための改変を必要としないことは利点である。このオリゴマーは、必要に応じて１％〜７５％（ｖ／ｖ）の有機改変剤を含有する水溶液中で結合され得る。ｐＨは、６．５未満である。出願人らは、活性化剤（例えば、トリアゾール化合物（例えば、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））の添加により、縮合／連結反応の全体の収率が増加することを観察した。従って、この化学が選択された場合に結合を行うために、カルボジイミドと共に活性化剤を使用することを薦める。
【０１０５】
再び図２８ａおよび図２８ｂを参照して、図２８ａの結合の生成物は、ネイティブＰＮＡオリゴマーであり、一方図２８ｂの結合の生成物は、ｇｌｙ−ｇｌｙリンカーを含む組み合わせオリゴマーである。従って、オリゴマーブロックが、ネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーの両方を調製するように選択され得ること、ならびに例えば、ライブラリーのオリゴマーブロックの選択が、意図した縮合／連結の所望の生成物と共に生じ得ることが理解されるべきである。
【０１０６】
図２９ａ、図２９ｂ、図２９ｃ、図３０ａおよび図３０ｂを参照して、オリゴマーブロックの連結／縮合についてのいくつかの選択肢が例示されており、ここでシアノホウ水素化ナトリウムが還元剤として使用される。このシアノホウ水素化ナトリウムが、これらの結合戦略を使用してオリゴマーブロックの結合を行うために使用され得る多くの還元試薬のうちの１つであることが理解されるべきである。
【０１０７】
図２９ａおよび図２９ｂを参照して、結合されるべきオリゴマーブロックのうちの一方は、アミンを含み、そして結合されるべき他方のオリゴマーブロックは、アルデヒドを含む。これらのオリゴマーブロックを接触させてそれによりイミンを形成し得る。イミン形成は可逆的であるので、このイミンは、しばしば、例えば、シアノホウ水素化ナトリウムにより還元されて、それにより、結合された組み合わせオリゴマーを形成する。図２９ａおよび図２９ｂを参照すると、この例は、図２８ａおよび図２８ｂで見られるものと、それぞれ結合生成物がネイティブオリゴマーまたは組み合わせオリゴマー（この場合は、Ｎ−［２−アミノエチル］−グリシンリンカーを含む）のいずれかであるという点で類似している。
【０１０８】
図２９ｃ、図３０ａおよび図３０ｂを参照して、結合されるオリゴマーブロックのうちの一方は、アルデヒドまたはケトン（例えば、グリシナールまたはβ−アラニナール（ａｌｉｎａｌ））であり、そして結合される他方のオリゴマーブロックは、アミノオキシ含有部分（例えば、アミノオキシアセチル）を含む。適切に修飾されたオリゴマーブロックの反応は、イミンよりも安定であるイミノキシ組み合わせオリゴマーの形成をもたらす。従って、このイミノキシ組み合わせオリゴマーは、調製したまま使用され得るか、または必要に応じて、例示されるように、例えば、シアノホウ水素化ナトリウムで還元して、それにより、リンカーを含むより安定な組み合わせオリゴマーにされ得る。
【０１０９】
図３１ａ、図３１ｂおよび図３１ｃを参照して、各場合において、オリゴマーブロックの一方は、求核性チオールおよび脱離基を含む。図３１ａは、組み合わせオリゴマーを形成するための、Ｌｕら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８（３６）：８５１８−８５２３（１９９６））に従う結合を例示する。求核性チオール（例えば、２−アミノエチルチオール（図３１ｃ）、２−チオアセチルまたは３−チオプロピオニル）の、例えば、ハロアセチル（図３１ｂ）、マレイミド（ｍａｌｉｍｉｄｏ）（図３１ｃ）またはビニルのいずれかとの反応は、同様に組み合わせオリゴマーを生成する。
【０１１０】
（固体支持体または表面への組み合わせオリゴマーの固定化）
本発明の１つ以上の組み合わせオリゴマーは、必要に応じて、標的配列の検出のために表面または固体支持体に固定化され得る。固定化は、例えば、捕捉アッセイにおいて、そしてアレイを調製するために使用され得る。
【０１１１】
ブロックオリゴマーおよび／または組み合わせオリゴマーは、周知のプロセスであるＵＶ架橋を使用して表面に固定され得る。オリゴマーブロックはまた、合成支持体からの切断ではなく脱保護に適切な様式で表面上で合成され得る（Ｗｅｉｌｅｒ，Ｊら、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ａｒｒａｙｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１４：２７９２−２７９９（１９９７年７月）を参照のこと）。なお別の実施形態において、１つ以上の組み合わせオリゴマーは、表面上の官能基とオリゴマー上の適切な官能基との反応により表面に共有結合で連結され得る（Ａｎｎａｐｏｌｉｓ（１９９７年１０月）でのＢｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｅｃｅで発表された、Ｌｅｓｔｅｒ，Ａら、「ＰＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」を参照のこと）。この方法は、他の方法のいくつかと比較して有利である。なぜなら、固定化のために表面上に沈着されたオリゴマーは、高度に精製され得、そして確定された化学により結合され、それによりおそらく非特異的相互作用を最小にするかまたは排除するからである。
【０１１２】
オリゴマーブロックまたは組み合わせオリゴマーの表面への化学的結合のための方法は、固定化されるべきプローブの求核性基（例えば、アミンまたはチオール）の、改変される支持体上の求電子性基との反応を含み得る。あるいは、この求核剤は、支持体上に存在し得、そして求電子剤（例えば、活性化カルボン酸）は、オリゴマー上に存在し得る。ネイティブＰＮＡは、アミノ末端を有するので、ＰＮＡは、表面に固定化するための改変を必要としてもしなくてもよい（Ｌｅｓｔｅｒら、表題「ＰＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」のポスターを参照のこと）。
【０１１３】
組み合わせオリゴマーを表面に固定化するために適切な条件は、一般的にポリマーを標識するために適切な条件と類似する。固定化反応は、標識が、ポリマーが連結されるべき表面と置換されるように標識することと本質的に等価である（上記を参照のこと）。
【０１１４】
アミノ基、カルボン酸基、イソシアネート、イソチオシアネートおよびマレイミド基で誘導体化された多くの型の固体支持体が、市販されている。適切な固体支持体の非限定的例としては、膜、ガラス、制御孔（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ）ガラス、ポリスチレン粒子（ビーズ）、シリカおよび金ナノ粒子が挙げられる。上記の固定化方法の全ては、いかなる様式でも限定を意図されず、単に例示として提供される。
【０１１５】
（本発明に伴う利点の非限定的リスト）
保護されていない核酸塩基を含む組み合わせオリゴマーは、テンプレートの非存在下で効率的に結合され得る。結合の効率はまた、規模にはあまり依存しないようであり、それにより特に、生成されたオリゴマーの量が、必要な量よりかなり過剰であり得る場合のように、従来の新たなオリゴマー合成の費用が非常に高い多数の適用のための広範な使用を促進する。従って、本発明の方法により、所望の量で所望の核酸塩基配列のオリゴマーを産生することが可能となり、そしておそらく、新たに産生する方法と比較して実質的に費用を抑えることができる。
【０１１６】
所望の核酸塩基配列の組み合わせオリゴマーは、オリゴマーブロックの容易に入手可能なライブラリーから単一工程で迅速かつ効率的に調製され得る（「ライブラリーアプローチ」）。標的配列に結合し得る確立された核酸塩基配列のオリゴマーを迅速に製造する能力は、ハイスループット適用（例えば、核酸配列決定、ＳＮＰ分析、遺伝子分析、発現分析およびアレイ製造）を可能にする。なぜなら、数十、数百、数千、数万または数十万そしておそらく数百万のプローブが、非常に時間が決定的な様式で生成され得るからである。
【０１１７】
組み合わせオリゴマーは、ネイティブオリゴマーと比較して一般的に低い絶対Ｔｍを示すが、２つのオリゴマーブロックが、隙間のないように結合対に並列してハイブリダイズする場合、より大きなΔＴｍを示し得る（図１を参照のこと）。ネイティブオリゴマーと比較した場合のこのより大きなΔＴｍを原因として、これらの組み合わせオリゴマーは、ネイティブオリゴマーと比較してより特異的かつ識別力があり得る（Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３６５；５６６−５６８（１９９３を参照のこと）、ここでは、核酸ミスマッチのΔＴｍと比較した場合に、ＰＮＡについてのより大きなΔＴｍは、ハイブリダイゼーション反応におけるその分子の識別力の尺度であると示されている）。組み合わせオリゴマーの高い識別力を原因として、一点変異（一塩基多型（ＳＮＰ）としても知られる）についてのアッセイは、野生型または変異標的が存在するか否かに依存して、結合するかまたは結合しないかのいずれかであるように、オリゴマーが本質的に二元モードで作動するように設計され得る。１０マーＰＮＡ組み合わせオリゴマーおよびその相補的標的配列のハイブリッドは、代表的に周囲温度よりわずかに高いＴｍ（例えば、３５〜４５℃）を示す。しかし、このハイブリッド中の１つ以上の非相補的核酸塩基は、このＴｍを室温より低く低下させる。従って、１０マーＰＮＡ組み合わせオリゴマーは、周囲温度で行われる分析において特に有用であり得かつ識別力があり得る。周囲温度における分析は、費用の高い温度制御装置の必要性を回避するので、本発明のハイブリッドおよびアッセイのこの特性は、当業者に相当な利益をもたらす。
【０１１８】
組み合わせオリゴマーは、２つのオリゴマーブロックを連結するリンカーとして酵素切断部位を含むように設計され得る。このような切断部位の組み込みは、以下のような出願人の観察と合わせて考慮する場合に有利であり得る：組み合わせオリゴマーは、酵素および存在する切断部位の性質に依存して、適切な結合対（例えば、標的配列）への組み合わせオリゴマーの結合の結果として切断から保護され得る。従って、このようなリンカーを組み込むことにより、特定の組み合わせオリゴマーが、他の用途の中でも、潜在的な結合パートナーがこの組み合わせオリゴマーに結合するか否かを決定するためのアッセイにおいて基質として使用され得ることは、有利である。なぜなら、結合が存在するか否か、およびどんな量で存在するかは、サンプル中に結合パートナー（例えば、標的配列）が存在するか否か、どんな量で存在するかを決定するために使用され得るからである。
【０１１９】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような従来の方法によるオリゴマー精製は高価であり得かつ時間がかかり得る。組み合わせオリゴマーは、精製されたサブユニットからそれ自体が生成されるので、送達はより迅速かつ費用効率的であり、この場合、産物は結合後に精製される必要はない。さらに、結合される未反応の成分オリゴマーブロックは、必ずしも、問題となる不純物ではなく、多くの適用では、組み合わせオリゴマーを、結合後および使用前に精製する必要性はないかもしれない。このことは、一旦、適切なライブラリーが構築されると、所望の組成のプローブ／プライマーの迅速な利用性を促進し得る。
【０１２０】
（本発明の用途の非限定的な例）
本発明の方法、キット、組成物、ライブラリー、およびアレイは、科学研究の多くの分野または用途に有用である。例えば、本発明は、食物、飲料、水、薬品、個人医療製品、日用品または植物、動物、ヒト、もしくは環境起源のサンプル中のウイルス、細菌、および真核生物（ｅｕｃａｒｙａ）（例えば、病原体）の検出、同定、および／または数え上げ（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）に有用であり得る。本発明はまた、食物、飲料、水、薬品、個人医療製品、日用品または環境サンプルを製造または保存するために使用される原材料、機器、製品、またはプロセスの分析に有用であり得る。さらに、本発明は、ヒトまたは動物を処置するために使用される臨床用試料、機器、設備、または製品ならびに臨床サンプルおよび臨床環境における細菌および真核生物（例えば、病原体）の検出に有用であり得る。例えば、目的の微生物の分析は、ＰＮＡ−ＦＩＳＨまたは多重ＰＮＡ−ＦＩＳＨを用いて実施され得る（本明細書の実施例３、ならびに同時係属中の共願の米国出願０９/３３５，６２９および０９/３６８，０８９を参照のこと）。
【０１２１】
本発明の方法、キット、組成物、ライブラリー、およびアレイは、特に、発現分析、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析（以下の実施例５を参照のこと）、ヒト、動物、真菌、酵母、ウイルス、および植物（遺伝子改変生物を含む）の遺伝子分析、治療モニタリング、薬理ゲノム学、薬理遺伝学、エピゲノム学（ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ならびに高スループットスクリーニング操作のような分野において有用である。本発明のライブラリーは、これらのプローブの集中的な用途に有用であり得る。なぜならば、それらは、高度な選択性／識別性の組み合わせオリゴマーの大量、迅速、効率的、かつ適切なスケールの合成（これらは、これらのプローブまたはプライマーの集中的な用途を十分可能にするためになおも十分に履行されなければならない要件である）を容易にするからである。
【０１２２】
（ＩＩＩ．本発明の好ましい実施形態）
（組み合わせオリゴマーの総論）
本発明は、テンプレートの非存在下での組み合わせオリゴマーのブロック合成、ならびに関連する方法、キット、ライブラリー、および他の組成物を含む、組み合わせオリゴマーの分野に関する。本発明の組み合わせオリゴマーは、市販の化学物質および機器を用いたモノマー／シントンの段階的な構築（デノボ合成）により生成され得る。あるいは、組み合わせオリゴマーは、以下（「ライブラリーアプローチ」）に大まかに記載されるような（例えば、本明細書の実施例２および／または実施例６に詳細に記載されるような）連結によって生成され得る。当業者は、個人的な観点で選択された用途に最も適した組み合わせオリゴマー生成の様式を決定し得る。必然的に、組み合わせオリゴマーの生成方法が本発明の限定であることを意図しないことが理解される。
【０１２３】
本明細書中で使用する場合、組み合わせオリゴマーは、標識されているかまたは標識されていない、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、およびＰＮＡ組み合わせオリゴマーから独立して選択される、２つ以上のオリゴマーブロックを含む組成物である。ここで、このオリゴマーブロックは、リンカーにより連結される。このリンカーは、必要に応じて、酵素切断部位であり得る。上記組成物は、その生成方法に関わらず、本明細書中で組み合わせオリゴマーと呼ばれる。なぜならば、そのハイブリダイゼーション特性は、２つの構成成分のオリゴマーブロックの組み合わされた特性、ならびに組み合わせオリゴマーが標的配列にハイブリダイズする場合はリンカーの性質およびブロック間の相互作用の機会に起因するからである。
【０１２４】
組み合わせオリゴマーは、多くの用途においてプローブまたはプライマーとして使用され得ることが理解される。プローブについての必要性は、それらが、配列特異的に標的配列にハイブリダイズすることのみである。従って、プローブとして使用される場合、組み合わせオリゴマーの特定の特徴に対するさらなる限定は存在しない。しかし、プライマーとして使用される場合、組み合わせオリゴマーが、酵素の認識および作用に適切な部分を含むことが必要である。なぜならば、ポリメラーゼ酵素は、非改変ＰＮＡオリゴマーにおいて作用することが知られていないからである（Ｌｕｔｚら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：３１７７−３１７８（１９９７）を参照のこと）。
【０１２５】
本発明の多くの実施形態について、この組み合わせオリゴマーの一般的な実施形態は、本発明の説明に関して考慮されるべきであることが理解される。本明細書中で特に他にそうでないことが示されない限り、新規の組み合わせオリゴマーは、本明細書中で、自己指示組み合わせオリゴマーと呼ばれ、そして基質組み合わせオリゴマーは、本発明の他の実施形態に一般的に適用可能でない制限を含み得る。
【０１２６】
（新規の組み合わせオリゴマー）
１つの実施形態において、本発明は、新規の組み合わせオリゴマーに関する。本発明の新規の組み合わせオリゴマーとしては、以下で議論されるような、基質組み合わせオリゴマーまたは自己指示組み合わせオリゴマーが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない（以下の実施例１、４、および５もまた参照のこと）。基質組み合わせオリゴマーであっても自己指示組み合わせオリゴマーであっても、これらの新規の組み合わせオリゴマーは、式：Ａ−Ｗ−ＣまたはＡ−Ｂ−Ｃのセグメントを含む。ここで、ＷまたはＢは、それぞれ、リンカーが酵素切断部位を含むか含まないかを識別するために使用される。従って、本発明の新規の基質組み合わせオリゴマーは、酵素の基質であるリンカーＷを含むのに対し、自己指示組み合わせオリゴマーは、一般的に、リンカーＢの使用により例示される。しかし、自己指示組み合わせオリゴマーはまた、基質組み合わせオリゴマーでもあり得る（例えば、実施例４を参照のこと）。
【０１２７】
本発明に従って、ＡおよびＣは、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーのいずれかとして独立して選択されるオリゴマーブロックである。リンカーＢまたはＷは、状況に応じて、少なくとも３原子の長さであり、オリゴマーブロックＡとオリゴマーブロックＣを共有結合により連結する連結である。この構成において、１つ以上のさらなるオリゴマーブロックまたは他の部分（例えば、固体支持体、１つ以上の保護官能基または非保護官能基、あるいは１つ以上の標識）は、ＡおよびＣのいずれかまたは両方に共有結合され得る。
【０１２８】
（自己指示組み合わせオリゴマー）
１つの実施形態において、本発明は、自己指示組み合わせオリゴマーに関する。従って、本発明はまた、式：Ａ−Ｂ−Ｃのセグメントを含む共有結合により連結されたオリゴマーブロックの組成物に関する。オリゴマーブロックＡおよびＣは、各々独立してペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーであり、そして必要に応じて、セグメントの他の部分に連結される。リンカーＢは、少なくとも３原子の長さであり、オリゴマーブロックＡとオリゴマーブロックＣを共有結合により連結する。さらに、一緒になったオリゴマーブロックＡおよびＣは、連続核酸塩基の標的配列に配列特異的にハイブリダイズし、それによって二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成するよう設計されたプローブ核酸塩基配列をコードする。
【０１２９】
自己指示組み合わせオリゴマーはさらに、エネルギー輸送セットの標識を含み、その結果、このエネルギー輸送セットの少なくとも１つのアクセプター部分が、この組成物の連結されたオリゴマーブロックのうちの１つに連結され、エネルギー輸送セットの少なくとも１つのドナー部分がこの組成物の連結されたオリゴマーブロックの別の部分に連結される。ここで、このセットの標識は、組み合わせオリゴマーが非ハイブリダイズ状態の場合と比較して、組み合わせオリゴマーが標的配列にハイブリダイズする場合に、少なくとも１つの標識の検出可能なシグナルにおける変化を促進する位置で組み合わせオリゴマーに連結される。先に議論されたように、自己指示組み合わせオリゴマーは、このオリゴマーが非ハイブリダイズ状態で存在する場合と比較して、オリゴマーのハイブリダイゼーションの際に、任意のエネルギー輸送機構を通じて、検出可能なシグナルの変化を生じることから、そのように命名されている。従って、このオリゴマーのハイブリダイゼーションの状態は、リアルタイムでかまたはアッセイの終了時点かのいずれかにおいて決定され得る。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーのさらなるセットは、実施例５に示されるような多重分析のために調製され得る。
【０１３０】
本発明の他の実施形態において、自己指示組み合わせオリゴマーは、必要に応じてさらに、１つ以上の保護官能基または非保護官能基を含み得るか、またはそうでなければ１つ以上のさらなるレセプター部分で標識され得る。本発明に従って、官能基またはレポーター部分は、各々独立して、オリゴマーブロック末端に連結され得るか、オリゴマーブロックの中間の位置に連結され得るか、またはこのリンカーに不可欠な位置に連結される。適切なレポーター部分は、本明細書中で先に記載されている。１つ以上の保護官能基または非保護官能基が、脱保護された場合に、それらにレポーター部分を連結するために使用され得るか、またはそうでなければ組み合わせオリゴマーと支持体を連結するために使用され得る。結果的に、自己指示組み合わせオリゴマーは、支持体に結合され得る（適切な場合、オリゴマーのアレイ（自己指示組み合わせオリゴマーのアレイを含む）のうちの１つのオリゴマーであることを含む）。
【０１３１】
（基質組み合わせオリゴマー）
別の実施形態において、本発明は、基質組み合わせオリゴマーに関する。従って、本発明はまた、式：Ａ−Ｗ−Ｃのセグメントを含む共有結合により連結されたオリゴマーブロックの組成物に関する。オリゴマーブロックＡおよびＣは、各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。リンカーＷは、少なくとも３原子の長さであり、そしてブロックＡとブロックＣを共有結合により連結する。リンカーＷはまた、酵素切断部位を含む。
【０１３２】
切断部位を含むリンカーＷの非限定的な例として、ｌｙｓ−Ｘ、ａｒｇ−Ｘ、Ｇｌｕ−Ｘ、ａｓｐ−Ｘ、ａｓｎ−Ｘ、ｐｈｅ−Ｘ、ｌｅｕ−Ｘ、ｌｙｓ−ｇｌｙ、ａｒｇ−ｇｌｙ、ｇｌｕ−ｇｌｙ、およびａｓｐ−ｇｌｕが挙げられるがこれらに限定されない。ここで、Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸である。これらの基質の１つ以上を切断するのに適した酵素の非限定的な例のリストとしては、エンドプロチナーゼ（Ｅｎｄｏｐｒｏｔｉｎａｓｅ）Ｇｌｕ−Ｃ（ＥＣ３．４．２１．１９）、Ｌｙｓ−Ｃ（ＥＣ３．４．２１．５０）、Ａｒｇ−Ｃ（ＥＣ３．４．２２．８）、Ａｓｐ−Ｎ（ＥＣ３．４．２４．３３）、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、ペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）、プロテイナーゼＫ（３．４．２１．１４）、キモトリプシン（ＥＣ３．４．２１．１）、およびトリプシン（３．４．２１．４）が挙げられる。
【０１３３】
本発明の他の実施形態において、基質組み合わせオリゴマーは、必要に応じてさらに、１つ以上の保護官能基または非保護官能基を含むか、またはそうでなければ１つ以上のレポーター部分で標識される。本発明に従って、官能基またはレポーター部分は、各々独立して、オリゴマーブロック末端に連結されるか、オリゴマーブロックの中間の位置に連結され得るか、またはこのリンカーに不可欠な位置に連結される。適切なレポーター部分は、本明細書中で先に記載されている。１つ以上の保護官能基または非保護官能基が、脱保護された場合に、それらにレポーター部分を連結するために使用され得るか、またはそうでなければ組み合わせオリゴマーと支持体を連結するために使用され得る。結果的に、基質組み合わせオリゴマーは、標識されていようとなかろうと、支持体に結合され得る（適切な場合、オリゴマーのアレイ（基質組み合わせオリゴマーのアレイを含む）のうちの１つのオリゴマーであることを含む）。
【０１３４】
（標的配列および組み合わせオリゴマーのハイブリッド）
別の実施形態において、本発明は、ポリ核酸塩基鎖およびこのポリ核酸塩基鎖内の連続する核酸塩基の標的配列に特異的にハイブリダイズされる組み合わせオリゴマー配列を含み、それによって、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成する組成物に関する（図１を参照のこと；この構成はときどき、ギャップまたはギャップ塩基が存在しないように標的配列と並列してハイブリダイズされることが、本明細書中で言及されることにもまた注意されたい）。組み合わせオリゴマーは、第１および第２のオリゴマーブロックを含み、これらは各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。第１および第２のオリゴマーブロックは、少なくとも３原子の長さのリンカーによって共有結合により連結される。このハイブリッドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で組み合わせオリゴマーとポリ核酸塩基鎖とを接触させることによって形成され得る。
【０１３５】
このハイブリッドの組み合わせオリゴマーは、標識され得ないか、あるいは保護されているかまたは保護されていない官能基および／またはレポーター部分をさらに含み得る。組み合わせオリゴマーは、自己指示組み合わせオリゴマーであり得る。組み合わせオリゴマーのリンカーは、酵素切断部位を含み得る。ハイブリッドは、溶液中に遊離状態で存在し得るかまたは支持体に結合され得る。特定の実施形態において、ハイブリッドは、アレイの固有の位置に存在し得る。
【０１３６】
（標的配列を決定する方法）
なお別の実施形態において、本発明は、連続する核酸塩基の標的配列を決定する方法に関する。この方法は、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列と組み合わせオリゴマーとを接触させる工程を包含する。ここで、組み合わせオリゴマーは、第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックを含み、これらは、各々独立してペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。第１および第２のオリゴマーブロックは、少なくとも３原子の長さのリンカーによって互いに共有結合により連結される。さらに、第１および第２のオリゴマーブロックは、連続する核酸塩基の標的配列に配列特異的にハイブリダイズし、それによって二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成し得る。従って、第１および第２のオリゴマーブロックの凝集体は、プローブ核酸塩基配列を含む。複合体形成が決定され、それによって、標的配列が決定される。なぜならば、この複合体は、標的配列の非存在下では形成しないからである。複合体の決定としては、この複合体の存在、非存在、量、または位置を決定し、それによって標的配列の存在、非存在、量、位置、または同一性を決定することが挙げられるがこれらに限定されない（例えば、実施例３〜５を参照のこと）。
【０１３７】
本発明に従って、ハイブリッドの組み合わせオリゴマーは、標識され得ないか、あるいは保護されているかまたは保護されていない官能基および／またはレポーター部分をさらに含み得る。組み合わせオリゴマーは、自己指示組み合わせオリゴマーであり得る。組み合わせオリゴマーのリンカーは、酵素切断部位を含み得る。複合体は、溶液中に遊離状態で存在し得るかまたは支持体に結合され得る。特定の実施形態において、複合体は、アレイの固有の位置に存在し得る。
【０１３８】
組み合わせオリゴマーが標識されている場合、複合体形成の決定は、１つ以上の標識の決定を含み得ることが理解される。しかし、組み合わせオリゴマーが標識されていない場合、標的配列、または標的配列を含むポリ核酸塩基鎖は、必要に応じて標識され得、その結果、標識の決定が、この複合体の形成の決定を容易にする。さらに別の実施形態において、組み合わせオリゴマーも標識配列もいずれも標識されない。複合体が直接的に標識されない場合でさえも、複合体形成を決定することはなお可能である。例えば、この複合体は、ＰＮＡ／核酸ハイブリッドの少なくとも１つのセグメントを含むので、このハイブリッドは、ＰＮＡ／核酸ハイブリッドを決定するために惹起された抗体を用いて決定され得る（本明細書中で参考として援用される、Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、米国特許第５，６１２，４５８号を参照のこと）。
【０１３９】
（ＳＮＰの接合生殖性を決定する方法）
さらに別の実施形態において、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）についての核酸の接合生殖性を決定する方法に関する。この方法は、核酸サンプルと、少なくとも２つの独立して検出可能な組み合わせオリゴマーを接触させる工程を包含する。各々の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーは、第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックを含み、それらは、各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。オリゴマーブロックは、少なくとも３原子の長さのリンカーにより互いに共有結合により連結される。一緒になった第１および第２のオリゴマーブロックは、プローブ核酸塩基配列をコードする。この配列は、存在する場合、核酸サンプルのポリ核酸塩基鎖中の連続する核酸塩基の標的配列に配列特異的にハイブリダイズし、それによって、二本鎖標的配列／独立して検出可能な組み合わせオリゴマー複合体を形成するよう設計されている。各々の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーにおけるプローブ核酸塩基配列は、少なくとも１つの核酸塩基（ＳＮＰ核酸塩基）が他と異なる。しかし、プローブ核酸塩基配列は、プローブ設計に依存して１つより多い核酸塩基が異なり得るが、だたし、それらは、決定されるＳＮＰにおいて単一核酸塩基が異なる（例えば、実施例５、表９、そして特に、ＳＮＰ６８７６および６８７９についてのＰＮＡ組み合わせオリゴマープローブのセットを参照のこと）。
【０１４０】
本発明に従って、核酸サンプルおよび組み合わせオリゴマーは、サンプル中に存在する核酸を増幅する核酸増幅反応を実施するのに適した１つ以上の試薬と接触され、そして核酸の増幅は、核酸、組み合わせオリゴマー、および試薬の存在下で実施される。核酸増幅反応の非限定的な例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅（Ｑβ）、およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が挙げられる。
【０１４１】
各々独立して検出可能な組み合わせオリゴマー／標的配列複合体の複合体形成が決定され、それによって、その核酸が特定のＳＮＰについてヘテロ接合性であるかホモ接合性であるかが決定される。複合体の決定は、特定のＳＮＰの接合生殖性状態と相関され得る。なぜならば、この複合体は、各々の特定の組み合わせオリゴマーに対する連続する核酸塩基のそれぞれの標的配列の非存在下で形成されないからである。さらに、２つの独立して検出可能な組み合わせオリゴマーについてのシグナルは、どの複合体が形成され、そして形成されないかに基づく３つの可能性のある遺伝子型状態を決定するのに必要とされる情報の全てを提供する。
【０１４２】
１つの実施形態において、独立して検出可能な組み合わせオリゴマーは、独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマーである。この方法に従って、適切なハイブリダイゼーション条件下での決定は、各々の組み合わせオリゴマーが、連続する核酸塩基のそれぞれの標的配列にハイブリダイズするか否かの測定としての、各々の独立して検出可能なエネルギー輸送セットの標識の少なくとも１つから生じる検出可能なシグナルにおける任意の変化で構成される。このような決定は、核酸増幅のプロセスの間（例えば、リアルタイムで）または核酸増幅反応が完了した後（例えば、その終了時点で）のいずれかで実施され得る。この方法に従って、各々の組み合わせオリゴマーの各々のエネルギー輸送セットの少なくとも１つの標識についてのシグナルの変化の結果は、２つの可能性のある標的配列／独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマー複合体の各々の形成の決定と相関される。このデータに基づき、特定のＳＮＰについてのサンプルの接合生殖性の３つの可能性のある状態のうちの１つが決定され得る（例えば、実施例５を参照のこと）。標的配列／組み合わせオリゴマーの複合体／ハイブリッドは、溶液中で遊離状態であり得るか、または決定がなされる場合、支持体に結合され得る。
【０１４３】
（組み合わせオリゴマーを形成するための非テンプレート直接方法）
別の実施形態において、本発明は、オリゴマーブロックから組み合わせオリゴマーを形成するための方法に関する。この方法は、第１のオリゴマーブロック、第２のオリゴマーブロック、および必要に応じて濃縮試薬を濃縮条件下で反応させることによって、第１のオリゴマーブロックと第２のオリゴマーブロックを共有結合により連結する少なくとも３原子の長さのリンカーを有する組み合わせオリゴマーを形成する工程を包含する。この方法に従って、第１および第２のオリゴマーブロックは、各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。第１のオリゴマーブロックも第２のオリゴマーブロックもいずれも支持体に結合されず、そして組み合わせオリゴマーはテンプレートの非存在下で形成する。この連結／濃縮反応は、水溶液中で実施され得る。核酸塩基は、濃縮／連結反応の間、保護される必要はない。
【０１４４】
なお別の実施形態において、本発明は、オリゴマーブロックから組み合わせオリゴマーを形成するための別の方法に関する。この方法は、第１のオリゴマーブロック、第２のオリゴマーブロック、および必要に応じて濃縮試薬を濃縮条件下で反応させることによって、第１のオリゴマーブロックと第２のオリゴマーブロックを共有結合により連結する少なくとも３原子の長さのリンカーを有する組み合わせオリゴマーを形成する工程を包含する。第１および第２のオリゴマーブロックは、各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。オリゴマーブロックの核酸塩基は、保護基を含まず、そして組み合わせオリゴマーはテンプレートの非存在下で形成する。この連結／濃縮は、水溶液中で実施され得る。さらに、オリゴマーブロックの１つは、支持体に結合されていてもいなくてもよい。
【０１４５】
上記のような組み合わせオリゴマーを形成する方法に関わらず、別の実施形態において、濃縮／連結反応の産物は、必要に応じて、さらに伸長（ｌｅｎｇｔｈｅｎｅｄ／ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）され得る。従って、形成される場合、組み合わせオリゴマーは、オリゴマーブロックとして使用され得、その結果、この方法の繰り返すことにより、さらに伸長したオリゴマーが生成される。この方法に従って、以前に形成された組み合わせオリゴマーは、必要に応じて、次の濃縮／連結工程を容易にするために必要とされ得る程度、脱保護され得る。以前に形成され、そして必要に応じて脱保護される場合、組み合わせオリゴマーは、第３のオリゴマーブロックおよび必要に応じて濃縮試薬と濃縮条件下で反応される。これにより、第３のオリゴマーブロックと組み合わせオリゴマーとを共有結合により連結する少なくとも３原子の長さの共有結合を有する伸長した組み合わせオリゴマーが形成される。ここで、伸長した組み合わせオリゴマーは、テンプレートの非存在下で形成される。本発明に従って、このプロセスは、組み合わせオリゴマーが所望の長さになるまで必要に応じて繰り返され得る。このような連続伸長プロセスは、例えば、アレイの調製に有用であり得る。なぜならば、より長いオリゴマーがこの用途にしばしば使用されるからである。
【０１４６】
本発明の方法に従って、構成成分のオリゴマーブロックは、完全に保護されていないか、または１つもしくは両方が部分的に保護されているかのいずれかである。従って、オリゴマーブロックは、保護された官能基を含み得る。部分的に保護されることによって、本発明者らは、オリゴマーブロックの求電子性官能基または求核性官能基が、除去可能な保護基によって、濃縮の間、反応から保護されることを意味する。保護基は、例えば、濃縮反応が実施された後に除去され得、それによってその後の濃縮／連結のための組み合わせオリゴマーが調製されるか、標識が導入されるか、または組み合わせオリゴマーが支持体に連結されることが明らかである。
【０１４７】
テンプレートが存在しないにもかかわらず、本出願人らは、オリゴマーブロックが標識されていようとなかろうと、５０％よりも高い収率で組み合わせオリゴマーを迅速、効率的、かつ反復的に獲得することができた（実施例２および６を参照のこと）。この非テンプレート直接連結の有効性は、本質的に、テンプレートの非存在下で連結が観察されなかったことを記載した公開された結果に照らすと驚くべきことである（Ｋｏｐｐｉｔｚら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：４５６３−４５６９（１９９８）の４５６５頁第１欄１６〜２０行、およびＦａｒｅｓｅら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：１４１３−１４１６（１９９６）を参照のこと）。
【０１４８】
本発明の連結／濃縮方法は、標識された組み合わせオリゴマーおよび標識されない組み合わせオリゴマーの両方（基質組み合わせオリゴマーおよび自己指示組み合わせオリゴマーが挙げられるがこれらに限定されない）の生成に使用され得る。本発明の方法により生成される組み合わせオリゴマーは、別の状況では、１つ以上の保護官能基または非保護官能基を含み得る（非保護官能基の存在は、可能性のある架橋反応を回避または最小限に抑えるよう選択される連結／濃縮化学の性質に一部依存する）。この連結方法は、酵素切断部位を含むリンカーを生成するために使用され得る。さらに、本明細書中に記載される連結方法は、支持体に結合された組み合わせオリゴマーおよび１つ以上の組み合わせオリゴマーを含むアレイの生成のために使用され得る。
【０１４９】
組み合わせオリゴマーの全てのオリゴマーブロックは、ペプチド核酸であり得る。末端オリゴマーブロックまたは濃縮オリゴマーブロックのいずれかまたは両方は、定常核酸塩基配列の少なくとも１つの領域および可変核酸塩基配列を含む少なくとも１つの領域を含み得る。定常核酸塩基配列は、長さが１と１０との間の核酸塩基を含むサブユニットであり得、そして可変領域は、長さが３と８との間の核酸塩基を含むサブユニットであり得る。
【０１５０】
（組み合わせオリゴマーの結合パートナーへの結合を決定する方法）
本発明の特定の他の実施形態において、酵素切断部位を有する組み合わせオリゴマーが形成される。ここで、この切断部位は、組み合わせオリゴマーが結合相手に結合する場合、切断から保護される。従って、本発明はまた、組み合わせオリゴマーが可能性のある結合パートナー（例えば、アプタマーまたは標的配列）に結合するか否かを決定する方法に関する。本発明は、組み合わせオリゴマーと可能性のある結合パートナーとを、適切な結合条件下で接触させ、それによっておそらく組み合わせオリゴマー／結合パートナー複合体を形成する工程を包含する。この方法に従って、組み合わせオリゴマーは、式：Ａ−Ｗ−Ｃのセグメントを含むポリマーである。ここで、ＡおよびＣは、必要に応じて他の部分に連結され、そして各々が独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーであるオリゴマーブロックである。基Ｗは、オリゴマーブロックＡとオリゴマーブロックＣを共有結合により連結し、かつ酵素切断部位である少なくとも３原子の長さのリンカーである。
【０１５１】
この方法に従って、結合パートナーおよび組み合わせオリゴマーは、適切な酵素切断条件下で切断部位を切断するのに適した酵素で処理される。次いで、組み合わせオリゴマーがこの酵素活性によって切断されたか否かの決定がなされ、それによって組み合わせオリゴマー／結合パートナー複合体が形成されたか否かを決定する。
【０１５２】
適切な酵素切断条件は、酵素が基質に対して作用するよう操作する条件である。多くの酵素が市販されており、一般的に、販売元の製品文献は、適切な酵素切断条件に関する情報を提供する。利用可能な情報および慣用的な実験を使用して、当業者が適切な酵素切断条件を決定することが可能である。
【０１５３】
この方法に従って、酵素は、組み合わせオリゴマーがその結合パートナーに結合する場合、それを実質的に切断しない。従って、結合は、酵素による実質的な分解から組み合わせオリゴマーを保護する。結果として、結合の決定は、切断産物を分析することによりなされ、その結果、実質的な切断産物が検出される場合、組み合わせオリゴマーは潜在的な結合パートナーに結合されてはならない。
【０１５４】
この方法が組み合わせオリゴマーの標的配列への結合を伴う場合、ハイブリダイゼーションは、適切なハイブリダイゼーション条件下で起こる。ここで、組み合わせオリゴマーは、標的配列に並列してハイブリダイズし、その結果、ギャップは存在しない。標的配列は、組み合わせオリゴマーよりも高濃度であり得、その結果、本質的に全ての利用可能な組み合わせオリゴマーが、連続する核酸塩基の標的配列が存在する場合に配列特異的に結合する。
【０１５５】
結合パートナーが標的配列である場合、および組み合わせオリゴマーがこの標的配列に結合する場合、それは、酵素の活性から保護される。従って、アッセイにより、組み合わせオリゴマーが実質的に分解しないことが決定される場合、組み合わせオリゴマーは標的配列に結合していたはずである（実施例４を参照のこと）。逆に、組み合わせオリゴマーが分解から保護されなかった場合、それは、標的配列が存在しないことを結論付け得た。このようなアッセイは酵素的事象に依存するので、標的配列の量は、酵素活性を決定することにより（例えば、酵素動態を測定することにより）決定され得ることもまた理解される。
【０１５６】
組み合わせオリゴマーのオリゴマーブロックは全て、ペプチド核酸であり得る。組み合わせオリゴマーは標識されていてもいなくてもよく、自己指示組み合わせオリゴマーが挙でありえるがこれらに限定されないか、または別の状況では、１つ以上の保護官能基または非保護官能基を含み得る。さらに、本明細書中に記載される連結方法は、支持体に結合された組み合わせオリゴマーおよび１つ以上の組み合わせオリゴマーを含むアレイの生成のために使用され得る。
【０１５７】
（本発明のキット）
さらに別の実施形態において、本発明はキットに関する。１つの実施形態において、このキットは、２つ以上の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーを含む。ここで、この独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々は、第１のオリゴマーブロックおよび第２のオリゴマーブロックを含み、これらは、各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。オリゴマーブロックは、少なくとも３原子の長さのリンカーにより互いに共有結合によって連結される。各々の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーにおいて、一緒になった第１および第２のオリゴマーブロックは、プローブ核酸塩基配列をコードする。この配列は、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体の形成に適した連続する核酸塩基の標的配列に配列特異的にハイブリダイズするよう設計される。各々の独立して検出される組み合わせオリゴマーにおけるプローブ核酸塩基配列は、他の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーのプローブ核酸塩基配列と少なくとも１つの核酸塩基が異なる。各々の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーは、少なくとも１つの独立して検出可能な標識を含む。このキットは、必要に応じて；（ｉ）１つ以上のオリゴヌクレオチド；（ｉｉ）１つ以上の緩衝液；（ｉｉｉ）１つ以上のヌクレオチド三リン酸；（ｉｖ）核酸増幅マスターミックス；または（ｖ）１つ以上のポリメラーゼ酵素を備える。１つの実施形態において、このキットは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【０１５８】
本発明に従って、組み合わせオリゴマーのオリゴマーブロックは全て、ペプチド核酸であり得る。組み合わせオリゴマーは標識されていてもいなくてもよく、自己指示組み合わせオリゴマーが挙げられるがこれらに限定されないか、または別の状況では、１つ以上の保護官能基または非保護官能基を含み得る。１つの実施形態において、このキットの組み合わせオリゴマーの全ては独立して検出可能であり、独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマーであることを含む。必要に応じて、組み合わせオリゴマーは、酵素切断部位を含むリンカーを含み得る。さらに、組み合わせオリゴマーは、支持体に結合され得るか、または支持体に結合された組み合わせオリゴマーを生成するためにこのキットの１つ以上の構成成分と組み合わせて使用され得る。
【０１５９】
示されるように、このキットは、必要に応じて１つ以上のさらなるオリゴマー、試薬または酵素を含み得る。１つの実施形態において、１つ以上のさらなるオリゴマーは、核酸増幅反応を実行するのに適したプライマーである。例示的な核酸増幅プロセスは、本明細書において前に記載している。このキットはまた、緩衝液、１つ以上のヌクレオチド三リン酸、ポリメラーゼ酵素および／または核酸増幅マスターミックス（例えば、ＰＣＲのために代表的に使用されるもの）を含み得る。１つの実施形態において、このキットは、以下の実施例５に記載されるように、２つ以上の独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマー（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ）、および１つ以上のＳＮＰを決定するための試薬を含み得る。
【０１６０】
（本発明の組み合わせオリゴマーセット）
なお別の実施形態において、本発明は、２つ以上の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーのセットに関する。この組み合わせオリゴマーのセットは、各々、第１オリゴマーブロック、および第２オリゴマーブロックを含み、これらは各々、独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。これらのオリゴマーブロックは、少なくとも３原子長であるリンカーによって、互いに共有結合される。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々において、第１オリゴマーブロックおよび第２オリゴマーブロックは、一緒になってプローブ化核酸塩基配列をコードし、このプローブ化核酸塩基配列は、標的配列の連続核酸塩基に特異的にハイブリダイズする配列に対して設計され、それによって、二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成する。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々におけるプローブ化核酸塩基配列は、そのセットの他方の独立して検出可能な組み合わせオリゴマーのプローブ化核酸塩基配列と少なくとも１核酸塩基異なる。独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々は、少なくとも１つの独立して検出可能な標識を含む。このセットは、２つ以上の独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマーを含み得、ここで、独立して検出可能な組み合わせオリゴマーの各々は、少なくとも１つのエネルギー移動セットの標識を含み、その結果、エネルギー移動セットの少なくとも１つのアクセプター部分が組み合わせオリゴマーの一方の連結されたオリゴマーブロックに連結され、一方で、そのエネルギー移動セットの少なくとも１つのドナー部分がその組み合わせの他方の連結されたオリゴマーブロックに連結され、ここで、その組み合わせオリゴマーがハイブリダイズしていない状態の場合と比較して、その組み合わせオリゴマーが標的配列にハイブリダイズした場合に少なくとも１つの標識の検出可能なシグナルにおける変化を促進する位置で、このセットの標識は、そのオリゴマーブロックに連結される。
【０１６１】
本発明に従って、組み合わせオリゴマーのセットのオリゴマーブロックは、全てペプチド核酸であり得る。組み合わせオリゴマーのセットは、さらに、１つ以上の保護官能基もしくは保護されていない官能基、または１つ以上のさらなるレポーター部分を含み得る。さらに、この組み合わせオリゴマーのセットは、酵素に対する切断部位を含むリンカーを含み得る。さらに、この組み合わせオリゴマーのセットは、支持体に結合され得るか、またはそのキットの１つ以上の成分と組み合わせて使用されて、支持体に結合した組み合わせオリゴマーまたは支持体に結合した組み合わせオリゴマーのアレイを生成し得る。
【０１６２】
（化合物ライブラリーおよびそれらの調製方法）
なお別の実施において、本発明は、化合物ライブラリーに関する。１つの局面において、本発明は、少なくとも２セットのオリゴマーブロック（例えば、少なくとも１セットの末端オリゴマーブロックのおよび少なくとも１セットの縮合オリゴマーブロック）を含む１つ以上の化合物ライブラリーに関することが想定されるが、オリゴマーブロックの単一セット（オリゴマーブロックの二官能性単一セットライブラリー）の各メンバーが、そのオリゴマーが連結前に予備処理される方法（これは、必要とされる末端ブロックまたは縮合ブロックのいずれかを生成するために使用され得る）に依存して適切に保護される場合、末端オリゴマーブロックおよび縮合オリゴマーブロックが同じ化合物ライブラリーから生成され得ることもまた想定される。後者の方法は、ライブラリーに必要とされるオリゴマーの絶対数を制限するので、後者のアプローチが有利であり得るが、この方法はまた、組み合わせオリゴマーの調製に対して１つ以上の更なる工程を加える。従って、本発明は、１つ以上の二官能性単一セットライブラリーならびに２つ以上のオリゴマーブロックセットを含む１つ以上のライブラリーの両方に関する。
【０１６３】
本発明はまた、二官能性単一セットライブラリーから末端オリゴマーブロックおよび縮合オリゴマーブロックを形成するための方法に関する。この方法は、少なくとも２つのオリゴマーブロックの二官能性単一セットライブラリーを提供する工程を包含する。この二官能性単一セットライブラリーの１つのオリゴマーブロックは、処理され、それによって、１つ以上の保護基が除去され、それによって末端オリゴマーを生成する。二官能性単一セットライブラリーの１つのオリゴマーブロックはまた、末端オリゴマーブロックを生成するための保護基と比較して、１つ以上の異なる保護基を除去するように処理され、それによって縮合オリゴマーブロックを生成する。
【０１６４】
本発明に従って、二官能性単一セットライブラリーのオリゴマーブロックの種々の官能基は、直交し得、それによってこれらは、他の基を脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ）することなく選択的に除去され得る。このような直交保護スキームの例は、ペプチド化学、核酸化学およびＰＮＡ化学において周知である。例えば、ＰＮＡモノマーは、代表的に、酸不安定性ベンズヒドロキシカルボニル（Ｂｈｏｃ）を使用して、ＰＮＡモノマーの核酸塩基を保護し、一方、塩基不安定性フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を使用して、ＰＮＡモノマーのアミンを保護する。当業者は、単なる慣用的な実験を用いて以前に記載された方法において、使用に適した直交で保護されたオリゴマーを調製し得ることが、理解されるべきである。
【０１６５】
従って、本発明はまた、オリゴマーブロックの二官能性単一セットを含む化合物ライブラリーに関する。このオリゴマーブロックのセットは、特定の保護基の除去によって、末端オリゴマーブロックおよび縮合オリゴマーブロックの両方を生成するために使用され得る。二官能性セットのオリゴマーブロックは、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。オリゴマーブロックの二官能性セットは、末端オリゴマーブロックが縮合オリゴマーブロックで縮合される場合、少なくとも３原子長のリンカーを形成する官能基部分を含むように選択される。さらに、このオリゴマーブロックは、支持体に結合されず、そして核酸塩基保護基を含まない。
【０１６６】
なお別の実施形態において、本発明は、別の化合物ライブラリーに関する。本発明に従って、この化合物ライブラリーは、少なくとも１セットの末端オリゴマーブロックおよび少なくとも１セットの縮合オリゴマーブロックを含み、ここで、このブロックセットの各々は、２つ以上の異なるオリゴマーを含み、このオリゴマーブロックは、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラおよびＰＮＡ組み合わせオリゴマーからなる群より選択される。オリゴマーブロックは、末端オリゴマーブロックが縮合オリゴマーブロックで縮合される場合、少なくとも３原子長のリンカーを形成する官能基部分を含むように選択される。さらに、オリゴマーブロックは、支持体に結合されず、そしてオリゴマーブロックは、核酸塩基保護基を含まない。本発明の化合物ライブラリーが、１セットまたは２セットのブロックオリゴマーに制限されないことが、理解されるべきである。非限定的な例として、このライブラリーは、３つ以上のセットのオリゴマーブロックを含み得る。
【０１６７】
従って、なお別の実施形態において、本発明は、別の化合物ライブラリーに関する。この化合物ライブラリーは、少なくとも１セットの末端オリゴマーブロックおよび少なくとも２セットの縮合オリゴマーブロックを含む。本発明に従って、オリゴマーブロックのセットの各々は、２つ以上の異なるオリゴマーを含み、そして各セットのオリゴマーブロックは、独立して、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラまたはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。オリゴマーブロックは、末端オリゴマーブロックが縮合オリゴマーブロックで縮合される場合に、これらのオリゴマーブロックを共有結合的に連結する少なくとも３原子長のリンカーを形成する官能基部分を含むように選択される。さらに、オリゴマーブロックは、支持体に結合されず、そしてオリゴマーブロックは、核酸塩基保護基を含まない。さらに、縮合オリゴマーブロックのセットのオリゴマーブロックの全てが、同じ独立して検出可能なレポーター部分を含み、ここで、異なるセットの縮合オリゴマーブロックは、異なる独立して検出可能な標識を含む。少なくとも１セットの末端オリゴマーブロックのオリゴマーブロックの全てが、同じ非蛍光クエンチャー部分を含む。
【０１６８】
この構成の化合物ライブラリーは、独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマー対の産生に特に有用である。例えば、独立して検出可能なオリゴマーブロック対の各々からの１つの末端オリゴマーブロックは、非蛍光クエンチャー部分を含む、同じ末端オリゴマーブロックまたは異なる末端オリゴマーブロックに連結され得る。このような独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマー対は、ＳＢＰ分析において使用され得る。さらに、このライブラリーは、実施例５に記載されるようなＳＮＰ分析のための組み合わせオリゴマー対を生成するために使用され得る。
【０１６９】
ライブラリーのオリゴマーブロックの長さが、限定されないことは理解されるべきである。例えば、ライブラリーのオリゴマーブロックは、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、またはオクタマーであるように独立して選択され得る。さらに、オリゴマーブロックのセットは、全てが同じ長さのである必要も、同じ標識構成などである必要もない。オリゴマーブロックのセットは、核酸塩基の可変領域および定常領域の両方を含み得る。ライブラリーのオリゴマーブロックが、支持体に結合され得ることもまた、理解されるべきである。必要に応じて、このライブラリーは、それ自体がブロックオリゴマーのアレイとして存在し得、このアレイは、それに対して１つ以上のオリゴマーブロックを連結／縮合するプロセスによって組み合わせオリゴマーを形成するために使用され得る。
【０１７０】
１つの実施形態に従って、ライブラリーの末端オリゴマーブロックは、同じライブラリーまたは別のライブラリーの縮合オリゴマーブロックを用いて縮合され得、それによって所望の核酸塩基配列の組み合わせオリゴマーを形成し得る。従って、本発明のオリゴマーブロックの連結／縮合は、少なくとも３原子長であり、かつ２つのオリゴマーブロックを連結するリンカーを生成する。リンカーは、酵素に対する切断部位を含み得る。可能なリンカーは、本明細書中の前に記載されている。オリゴマーブロックの連結／縮合によって組み合わせオリゴマーを形成するための非限定的な方法は、本明細書中の前に記載されている。このような方法は、本明細書中に記載されるライブラリーと組み合わせて使用され得る。このオリゴマーブロックの核酸塩基が、その連結プロセス／縮合プロセスにおいて有用であるために保護される必要がないことが、有利である。
【０１７１】
本発明に従って、末端オリゴマーブロックの核酸塩基配列および縮合オリゴマーブロックの核酸塩基配列は、オリゴマーブロックのライブラリーセットから選択され得、それによって、選択された適用に適切な組み合わせオリゴマーの迅速で、有効なそして／または適切な規模の合成を可能にする。従って、オリゴマーブロックのライブラリーの保有は、異なるが既知の核酸塩基配列の多数の組み合わせオリゴマーの、迅速で、有効なそして／または適切な規模の合成を容易にし得、ここで、ライブラリーから作製され得る可能性のある異なる核酸塩基配列の潜在的な組み合わせオリゴマーの数は、末端オリゴマーブロックセットおよび縮合オリゴマーブロックセットの多様性（または、適切である場合、単一オリゴマーブロックセットの多様性）によって決定され、ここで、セットの多様性は、そのセット中の異なる核酸塩基配列のオリゴマーの数に依存する。
【０１７２】
オリゴマーブロックセットの多様性は、可変部位の数を乗じた、位置の可能な可変の数によって決定される。例えば、ペンタマーブロックのセット（ここで、５個のサブユニットの各々は、可変であり得、そして可能なバリエーションとしては、４つの天然の核酸塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）が挙げられる）は、全てを含めて４５＝１０２４個のペンタマーのセットを生成する。しかし、末端オリゴマーブロックのセットおよび縮合オリゴマーブロックのセットの一方または両方の、いくつかのオリゴマーブロックまたは全てのオリゴマーブロックは、定常核酸塩基配列の領域および可変核酸塩基配列の領域の両方を含み得る。従って、４つの天然の核酸塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のみからなるオリゴマーブロックの完全なセットは、４ｎであり、ここで、ｎは、可変核酸塩基位置の数のみを示す数全部である。しかし、本発明のライブラリーがブロックオリゴマーの完全なセットを含む必要も、ライブラリーのブロックオリゴマーのセットが、全て同じ長さまたは同じ多様性である必要もない。従って、特定の実施形態において、ライブラリーは、以下を含み得る：１）４つ全てではない天然の核酸塩基が存在する、オリゴマーブロック；２）４つ全ての天然の核酸塩基が存在する、オリゴマーブロック；３）１つ以上の天然に存在しない核酸塩基をさらに含む、１）または２）のいずれか；あるいは４）天然に存在しない核酸塩基のみを含むオリゴマーブロック。
【０１７３】
実際に、以下の天然に存在しない核酸塩基の使用が特に意図される：５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、偽イソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）。これらの核酸塩基に対する結合対モチーフもまた、本明細書中の前に記載されている。
【０１７４】
１つの実施形態において、ブロックオリゴマーセット中の可変位置（サブユニットを含む可変核酸塩基）の数は、３〜８であり、この結果、完全なセット中のオリゴマーの数は（核酸塩基としてＡ、Ｃ、ＧおよびＴ）、それぞれ、６４、２５６、１０２４、４０９６、１６３８４、および６５５３６である。
【０１７５】
１つの実施形態において、定常核酸塩基配列の領域は、そのセットのオリゴマーが一般的な有用性を有する場合、存在し得、ここで、バリエーションは、所望の実験または調査を実行するためのサブセクションにのみ必要とされる。例えば、定常領域は、サブユニットを含む１〜１０核酸塩基の範囲であり得る。
【０１７６】
１つの実施形態において、末端オリゴマーブロックのセットは、Ｃ末端アミドおよびＮ末端天然アミノ酸を有するペプチド核酸オリゴマーであり得る。例えば、そのＮ末端アミノ酸は、以下からなる群より選択され得る：リジン、シスチン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸。別の実施形態において、Ｎ末端天然アミノ酸は、グリシンである。
【０１７７】
別の実施形態において、末端オリゴマーブロックのセットは、Ｃ末端アミドおよびＮ末端反応性部分（例えば、アミノオキシアセチル、２−チオアセチル、３−チオプロピニル、マレイミド（ｍａｌｉｍｉｄｅ）およびハロアセチルおよびビニル）を有するペプチド核酸である。以前に考察された連結化学／縮合化学を考慮して、これらの官能基の操作の例示については図２９〜３１を参照のこと。
【０１７８】
なお別の実施形態において、縮合オリゴマーブロックのセットは、Ｃ末端天然アミノ酸部分およびキャップされたかまたは保護されたＮ末端（例えば、標識された）を有するペプチド核酸である。Ｃ末端アミノ酸は、以下からなる群より選択され得る：リジン、シスチン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸。別の実施形態において、Ｃ末端アミノ酸は、グリシンである。
【０１７９】
なお別の実施形態において、末端オリゴマーブロックのセットは、キャップされたかまたは保護されたＮ末端およびＣ末端反応部分（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ハロアセチルまたはアルデヒド部分または以下：クロロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチル、グリシンおよびβ−アリナル（ａｌｉｎａｌ）からなる群より選択される官能基）を有するペプチド核酸である。以前に考察された連結化学／縮合化学を考慮して、これらの官能基の操作の例示については図２９〜３１を参照のこと。
【０１８０】
（ライブラリーセットの非限定的な例）
例示的なライブラリーは、オリゴマーブロックの３つ以上のセットを含み得、ここで、少なくとも２つのセットが、標識の性質以外は実質的に同一であり得、その結果、２つ以上の異なる標識スキームによって（１つの標識スキームは、そのオリゴマーブロックの各個々のセットに対して共通である）、オリゴマーブロックの各セットを独立して検出可能にする。２つ以上の独立して検出可能なオリゴマーブロックセットは、末端オリゴマーブロックまたは縮合オリゴマーブロックのセットであり得る。結合される独立して検出可能な標識の性質以外は本質的に同一であるオリゴマーブロックの２つのセットを生成することによって、独立して検出可能な組み合わせオリゴマー対を調製することが可能である。
【０１８１】
本発明に従って、独立して検出可能な標識を含む少なくとも２つのオリゴマーブロックが、例えば、アクセプター部分またはクエンチャー部分で標識された、同じオリゴマーブロックまたは異なるオリゴマーブロックに連結され得る。例えば、この標識は、異なる独立して検出可能な標識の各々の検出可能性を実質的に消失させるに適した、非蛍光クエンチャー部分であり得、その結果、そのオリゴマーブロックが連結されて組み合わせオリゴマーを形成する場合、独立して検出可能な自己指示プローブの対は、連結のためにライブラリーから選択されたオリゴマーブロックの性質に基づいて形成され得る。本明細書の実施例６は、標識オリゴマーブロックへの連結を例示し、それによってＳＮＰ遺伝子型決定における使用に適した独立して検出可能な組み合わせオリゴマープローブの対を生成する。
【０１８２】
アクセプター部分またはクエンチャー部分が、独立して検出可能なブロックが連結されるオリゴマーブロック上に存在しない場合、連結によって形成される組み合わせオリゴマーは、標識された組み合わせオリゴマーであり、ここで、標識の選択は、以前に記載された、独立して検出可能な標識オリゴマーブロックの２つ以上のセットの多様性によってのみ制限される。そのライブラリーは、必要なものに依存してオリゴマーブロックの未標識のセットならびに連結されたアクセプター部分またはクエンチャー部分を含むオリゴマーブロックのセットの両方を必要に応じて含み得、蛍光標識された独立して検出可能な組み合わせオリゴマーまたは自己指示組み合わせオリゴマーのいずれかが、連結反応から調製され得ることにも留意すること。
【０１８３】
別の好ましい実施形態において、上記のセットはさらに、標識されていないこと以外は独立して検出可能な標識を含むセットに実質的に同一である、未標識オリゴマーのさらなるセットを含み得る。よって、未標識のオリゴマーブロックの他方のセットからのオリゴマーと連結を介して合わされる場合、完全には標識されていない組み合わせオリゴマーが調製され得る。このような非標識オリゴマーは、例えば、ブロッキングプローブとして使用されるか（例えば、ＵＳ６，１１０，６７６を参照のこと）、捕捉プローブとして使用されるか、検出プローブとして使用されるか（ここで、標識抗体がハイブリッドを検出するために使用される）（例えば、ＵＳ５，６１２，４５８を参照のこと）；または未標識の組み合わせオリゴマーのアレイを生成するために使用され得る。
【０１８４】
【表１】
0004408628.tif 000006
上記の説明に従って、表１は、可能なライブラリーのオリゴマーブロックのセットを作製するための種々の可能性、ならびにそれらの連結によって調製された組み合わせオリゴマーの性質を要約する。当然、表１は、網羅的な可能性を意図するものではなく、そして本明細書中に考察されるように、結合する標識以外は本質的に同一のオリゴマーを含むオリゴマーブロックセットが、本発明の重要な局面であり得、そしてライブラリーの利用を拡大する。オリゴマーブロックの１つ以上のセットはまた、必要に応じて、末端でそのオリゴマーブロックに連結されるか、またはそのオリゴマーブロックの内側の位置で連結された、保護官能基または保護されていない官能基を含み得る（または、連結される場合、組み合わせオリゴマーのリンカーに対して重要な位置で）。これに関して、オリゴマーブロックは、実施者の希望および利用可能な供給源に依存して、連結前または連結後のいずれかで標識され得るか、あるいは、その官能基が、オリゴマーブロックを結合するために使用され得るか、もしくは表面に組み合わせオリゴマーを形成し得る。
【０１８５】
（組み合わせオリゴマーのアレイおよびそれらの調製方法）
核酸、ペプチド核酸またはキメラを含むアレイが、文献中に記載されている。一般的に、核酸またはペプチド核酸は、支持体上でオリゴマーを合成することによってか、さもなくば事前に形成されたオリゴマーを固定することによってかのいずれかで、アレイに対して固定され得る。例えば、縮合オリゴマーブロックは、支持体に結合した末端オリゴマーブロックの１つ以上に対して連結され得、それによって所望の適用の実行に適した組み合わせオリゴマーのアレイを形成し得る。あるいは、予備形成された組み合わせオリゴマーが、アレイの一部と反応し、これによって組み合わせオリゴマーを結合させ得る。
【０１８６】
各支持体に結合したオリゴマーの位置および配列は既知であるので、アレイは、サンプル中の１つ以上の標的配列の存在または量を同時に検出、同定および／または定量するために使用され得る。例えば、標的配列は、アレイ表面上で相補的な組み合わせオリゴマーによって捕捉され得、次いで、プローブ／標的配列複合体が検出される。組み合わせオリゴマーの組成は、そのアレイの表面上の位置で既知であるので（なぜなら、そのオリゴマーは合成されるかまたはアレイのその位置に結合されたからである）、標的配列の組成は、アレイ上に生成される検出可能なシグナルの位置を決定することによって、直接検出、同定および／または定量され得る。従って、アレイは、診断適用または治療有用性を示し得るリード化合物のスクリーニングにおいて有用であり得る。
【０１８７】
なお別の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの組み合わせオリゴマーのアレイに関し、ここで、少なくとも１つの組み合わせオリゴマーが、式Ａ−Ｂ−Ｃを有するセグメントを含む。本発明に従って、オリゴマーブロックＡおよびオリゴマーブロックＣは、各々独立して、ペプチド核酸、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーであり、そして必要に応じて他の部分に連結される。このリンカーＢは、少なくとも３原子長であり、そしてオリゴマーブロックＡをオリゴマーブロックＣに共有結合的に連結する。オリゴマーブロックＡおよびオリゴマーブロックＣは、標識されていないか、または１つ以上のレポーター部分で標識されるか、またはそれらに連結される１つ以上の保護された官能基もしくは１つ以上の保護されていない官能基を含み得る。オリゴマーブロックＡおよびオリゴマーブロックＣは、一緒になって、プローブ化核酸塩基配列をコードし、この配列は、連続核酸塩基の標的配列に特異的にハイブリダイズする配列に対して設計され、それによって二本鎖標的配列／組み合わせオリゴマー複合体を形成する。
【０１８８】
なお別の実施形態において、本発明は、組み合わせオリゴマーのアレイを形成するための方法に関する。１つの実施形態において、この方法は、固体キャリア上の部位で、縮合条件下で、第１オリゴマーブロック、第２オリゴマーブロックおよび必要に応じて縮合試薬を反応させ、それによって第１オリゴマーブロックを第２オリゴマーブロックに共有結合的に連結する少なくとも３原子長のリンカーを有する、組み合わせオリゴマーを形成することを含む。本発明に従って、この２つのオリゴマーブロックのうちの一方は、支持体に結合している。さらに、この第１オリゴマーブロックおよび第２オリゴマーブロックは、各々独立して、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。さらに、一方または両方のオリゴマーブロックは、核酸塩基保護基を含まず、そしてその組み合わせオリゴマーは、鋳型の非存在下で形成される。この方法はさらに、組み合わせオリゴマーの所望のアレイが構築されるまで、１つ以上の異なる部位において１つ以上の異なるオリゴマーブロックを用いてこの方法を繰り返すことを含む。
【０１８９】
なお別の実施形態において、本発明は、組み合わせオリゴマーのアレイを形成するための別の方法に関する。この方法は、固体キャリア上の部位で、第１オリゴマーブロックを第２オリゴマーブロックに共有結合的に連結する少なくとも３原子長のリンカーを有する組み合わせオリゴマーブロックの官能基を、表面官能基を有すると反応させて、それによってその組み合わせオリゴマーを表面に共有結合的に結合させることを含む。本発明に従って、この組み合わせオリゴマーの第１オリゴマーブロックおよび第２オリゴマーブロックは、各々独立して、ペプチド核酸オリゴマー、ＰＮＡキメラ、またはＰＮＡ組み合わせオリゴマーである。さらに、一方または両方のオリゴマーブロックは、核酸塩基保護基を含まない。この方法はさらに、組み合わせオリゴマーの所望のアレイが構築されるまで、１つ以上の異なる部位で、その組み合わせオリゴマーを１つ以上の異なる組み合わせオリゴマーと結合させるための方法を繰り返すことを含む。
【０１９０】
（発明を実行するための様式）
本発明は、ここで、いかなるようにも限定されることを意図されない以下の実施例によって例示される。
【０１９１】
（ＰＮＡおよびＤＮＡ合成／オリゴマーに関する一般的な情報）
全てのＰＮＡオリゴマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから得た市販の試薬および装置から、製造業者の公開した手順、他の周知の手順または公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９９／２１８８１、ＷＯ９９／２２０１８およびＷＯ９９／４９２９３に開示される手順を用いて調製した。
【０１９２】
標的配列として使用した全ての核酸（ＤＮＡ）オリゴマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから得た市販の試薬および装置から製造業者の公開した手順を用いて調製するか、またはカスタムオリゴヌクレオチドの商業的な業者から得た。
【０１９３】
（実施例１：組み合わせオリゴマーの評価）
（序論および目的）
一連のＰＮＡオリゴマー（これは、同じヌクレオチド配列（ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の可変領域をコードする）を含んでいたが、ネイティブ（非修飾）であったか、または種々のリンカー部分により中心が連結された２つのオリゴマーブロック（「組み合わせオリゴヌクレオチド」）を含んでいた）を、ハイブリダイゼーション特性を評価する目的で設計および合成した（表２を参照のこと）。このオリゴマーを、任意の連結工程を用いることなく、標準的な方法論を用いて合成した。評価される重大な因子としては、以下が挙げられた：１）標的配列にハイブリダイズさせる場合に、ギャップがオリゴマーブロックの間に存在するべきであるか否か；２）組み合わせオリゴマーに付着させた標識が、（ｉ）ハイブリダイゼーション特性に影響するか、または（ｉｉ）これらが典型的に設計される様式で効率的に機能する（例えば、エネルギー移動セットが、ハイブリダイズしないオリゴマーと比較して、検出可能なシグナルにおける変化を示すことによる、オリゴマーハイブリダイゼーションの決定を可能にする）かのいずれかであるか否か；３）さもなければ、どのように、組み合わせオリゴマーのハイブリダイゼーション特性を、ネイティブオリゴマーと比較するのか；および４）組み合わせオリゴマーについての好ましい実施形態は存在するのか否か。ネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーのハイブリダイゼーション特性を評価するために、一連の完全にまたは部分的に相補的な核酸（ＤＮＡ）標的配列を、同様に得た（表３を参照のこと）。
【０１９４】
（表２および３の説明）
表２に関して、評価されるネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーの全てを、ＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｌとして特定する（Ｉ列）。各プローブの完全配列をＩＩ列に示す。ＩＩＩ列に特定のリンカー型を特定し、そしてＩＶ列において、レポーター部分の存在または非存在を特定する。
【０１９５】
再度、表２に関して、ネイティブオリゴマーは、ＰＮＡ  ＦおよびＰＮＡ  Ｌである。ネイティブとは、本発明者らは、核酸塩基配列が、２つの成分オリゴマーブロックの２つの骨格サブユニットを連結するリンカーを含むことなく、連続していることを意味する。この例として、ポリマーに対してネイティブである骨格は、中断することなく連続している。ＰＮＡ  Ｆは、以下の点でＰＮＡ  Ｌと異なる：ＰＮＡ  Ｌは、ＷＯ９９／２１８８１に記載されるような発蛍光団部分およびクエンチャー部分を用いて標識されている（すなわち、これは自己指示オリゴマープローブである）が、ＰＮＡ  Ｆは標識されていない。この点で、オリゴマーＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｅは、同様に、ＰＮＡ  Ｇ〜ＰＮＡ  Ｋと異なることが注目される。従って、ＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｆは、それぞれ、レポーター部分の非存在または存在においてのみ、ＰＮＡ  Ｇ〜ＰＮＡ  Ｌと異なる。ＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｅは、異なるリンカーを含む組み合わせオリゴマーである。ＰＮＡ  Ｇ〜ＰＮＡ  Ｋは、それぞれ、ＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｅと同じリンカーを含む。
【０１９６】
（表２：調製されたネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーの表）
【０１９７】
【表２】
0004408628.tif 000007
表１に関して、全てのＰＮＡ配列を、ペプチド配列の図示に用いられる慣例に従って、アミン末端からカルボキシ末端（左から右）に書く。他の略語は、以下である：Ｆ＝５−（６）−カルボキシフルオレセイン、Ｄ＝４−（（４−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル）、ＯまたはＯリンカー＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；Ｋ＝アミノ酸Ｌ−リジン、Ｇｌｕ＝アミノ酸Ｌ−グルタミン酸、Ｇｌｙ＝アミノ酸グリシン、ＥまたはＥリンカー＝米国特許第６，３２６，４７９号において「Ｅ」と言及される部分、およびＸまたはＸリンカー＝米国特許第６，３２６，４７９号において「＋」と言及される部分；ＳＩ＝自己指示。
【０１９８】
表３に関して、表２のネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーに潜在的に結合するいくつかの核酸標的配列（可能性のある結合パートナー）の核酸塩基配列を示す。異なる核酸オリゴマーを、Ｉ列に特定する。異なる核酸オリゴマーのヌクレオチド配列を、ＩＩ列に特定する。核酸塩基の性質の記載は、ＩＩＩ列に提供される。ＩＶ列は、割り当てた配列番号（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．）を単に示す。
【０１９９】
核酸オリゴマーＤＮＡ  ＰおよびＤＮＡ  Ｑは、イタリック体にし、かつ下線を付した
【０２００】
【化１４】
0004408628.tif 000008
残基（ＤＮＡ  Ｐ）の包含により異なる。この残基は、「ギャップ塩基」または「ギャップ」を表す。「ギャップ塩基」または「ギャップ」は、ネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーを標的配列へハイブリダイズさせる場合に、存在するように設計されている。しかし、ネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーが核酸オリゴマーＤＮＡ  Ｑ〜Ｖにハイブリダイズする場合、このギャップ塩基は存在しないので、「ギャップ」は存在しない（図１を参照のこと）。核酸オリゴマーＤＮＡ  Ｑは、表１のネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーに完全な相補性を表す。核酸オリゴマーＤＮＡ  Ｒ〜Ｔは、完全に相補的なオリゴマーＤＮＡ  Ｑと比較した場合、ミスマッチ（太字で強調される）を含み、ここで、このミスマッチは、５マーのオリゴマーブロックの１つに関して、中央に位置付けられる。核酸オリゴマーＤＮＡ  ＵおよびＤＮＡ  Ｖは、完全に相補的なオリゴマーＤＮＡ  Ｑと比較した場合、ミスマッチ（太字で強調される）を含み、ここで、このミスマッチは、５マーのオリゴマーブロックの１つに関して、中央には位置付けられていない。
【０２０１】
（表３：標的配列の表）
【０２０２】
【表３】
0004408628.tif 000009
（核酸標的配列にハイブリダイズした組み合わせオリゴマーを用いるＴｍ実験）
熱融解実験において、２つのポリマー鎖の間のハイブリッドを、加熱によって、その成分オリゴマーへと融解する。ハイブリットの解離が生じる温度は、特定のハイブリッドの特徴である熱力学的性質の関数である。ハイブリッドの半分が二本鎖のままであり、残りの半分を一本鎖として有する温度は、一般に、ハイブリッドのＴｍといわれる。
【０２０３】
Ｔｍ実験を実施するために、石英キュベット中の２．５ｍＬのＴｍ緩衝液（１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．１）中で０．５μＭのネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーの各々を特定の核酸標的配列（表３）と混合することにより、サンプルを調製した。ネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーをまた、組み合わせオリゴマーが自己アニーリングまたは自己相補性であったか否かを決定するための手段として、標的配列の非存在下（「ＤＮＡなし」コントロール）で試験した。いかなる場合も、標的配列の非存在下でＴｍは存在せず、これにより、このことは、ネイティブポリマーおよび組み合わせポリマーが自己アニーリングも自己ハイブリダイズもしないことを示す。Ｔｍ分析を、機器製造元（Ｖａｒｉａｎ）により供給される「Ｔｈｅｒｍａｌ」プログラムを用いて、Ｃａｒｙ１００分光光度計を使用して実施した。全ての吸光度測定を、緩衝液を含むブランクを参照して記録した。全ての分析を、デュアルビーム様式（ｄｕａｌ  ｂｅａｍ  ｍｏｄｅ）で実施した。
【０２０４】
各測定の前に、サンプルを９５℃にて２分間加熱することにより変性させ、次いで、２５℃に冷却した。全てのＴｍ決定について、サンプルを加熱し、次いで、０．５℃／分の速度で冷却した。各融解についての開始点および終点を、予備融解の間に観察されたＴｍに応じて、各実行の前に経験的に決定した。実験の全体にわたって、吸光度データを、０．５℃区切りで記録した。次いで、Ｔｍ値を、機器ソフトウェア、および１０．５℃（２１のデータポイント（０．５℃あたり１ポイント）に対応する）にわたって得られた移動平均を用いて計算した。種々の実験についてのＴｍデータを、表４および表５に示す。表したＴｍ値の全ては、加熱工程および冷却工程から得られた値の平均である。
【０２０５】
（データ表４の考察；最適なプローブ設計の決定）
（表４：最適なプローブ設計を決定するためのＴｍの表）
【０２０６】
【表４】
0004408628.tif 000010
表４は、ネイティブオリゴマーＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｌおよび組み合わせオリゴマーＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｌの全ての、ギャップ核酸標的配列かまたはギャップなしの核酸標的配列のいずれかであるＤＮＡ  ＰおよびＤＮＡ  ＱのそれぞれとのハイブリダイゼーションについてのＴｍデータを要約する（図１を参照のこと）。表４に関して、Ｔｍを決定するために用いたネイティブオリゴマーまたは組み合わせオリゴマーを、Ｉ列に特定する。ＩＩ列において、核酸標的配列ＤＮＡ  Ｐを用いて形成された全てのハイブリッドについてのＴｍ（℃）を記録する。ＩＩＩ列において、核酸標的配列ＤＮＡ  Ｑを用いて形成された全てのハイブリッドについてのＴｍを記録する。ＩＶ列において、Ｔｍの差異（ΔＴｍ  Ｐ−Ｑ（℃））を、ＤＮＡ  Ｐ対ＤＮＡ  Ｑを用いるハイブリッドのそれぞれについて記録する。
【０２０７】
再度、表４に関して、全てのハイブリッドについてＤＮＡ  Ｑが用いられる場合、Ｔｍ値は、ＤＮＡ  Ｐと比較してより高い。ネイティブオリゴマーまたは組み合わせオリゴマーについてのＴｍの絶対的な差異は、ＩＶ列において見られる。ＤＮＡ  ＰとＤＮＡ  Ｑとの間の差異は、それぞれ、ギャップの存在またはギャップの非存在であるので、ブロックオリゴマーが、標的配列の近傍にハイブリダイズし、その結果ギャップが存在しない場合に、より安定なハイブリッドが常に形成されることは明らかである。さらに、Ｔｍ（６．４〜１７．９℃）における実質的差異は、これが、ギャップを含むハイブリッドと比較した場合、実質的に好ましいハイブリッドであることを示す。
【０２０８】
再度、表４に関して、ＰＮＡ  Ａ〜ＰＮＡ  Ｆについてのデータは、それぞれ、ＰＮＡ  Ｇ〜ＰＮＡ  Ｌについてのデータと実質的に同じであることが明らかである。等価な標識したＰＮＡと比較した場合、標識されていないＰＮＡの各々についてのデータにおける強い類似性は、標識が、種々のネイティブオリゴマーおよび組み合わせオリゴマーのハイブリダイゼーション特性に実質的に影響しないことを示す。
【０２０９】
（データ表５の考察；プローブ識別能／選択性の決定）
ＰＮＡ  Ｃは、最も好ましいリンカーを有すると考えられるので、本発明者らは、ネイティブオリゴマーＰＮＡ  Ｆとのさらなる比較のための組み合わせオリゴマーＰＮＡ  Ｃを選択した。表５は、ＰＮＡ  ＣおよびＰＮＡ  Ｆの各々の、核酸標的配列ＤＮＡ  Ｑ〜ＤＮＡ  Ｖの各々とのハイブリダイゼーションについてのＴｍデータを要約する；ここで、全ての場合において、ハイブリッドは、ギャップを含まない。表５に関して、Ｔｍを決定するために用いた核酸標的配列をＩ列に特定する。ＩＩ列において、ＰＮＡ  Ｃを用いて形成された全てのハイブリッドについてのＴｍ（℃）を記録する。ＩＩＩ列において、ＰＮＡ  Ｆを用いて形成された全てのハイブリッドのＴｍを記録する。ＩＶ列において、完全な相補体（ＤＮＡ  Ｑ対ＰＮＡ  Ｃ）の間のハイブリダイゼーションについてのＴｍの差異（ΔＴｍ（℃））、ならびにミスマッチ（一ヌクレオチド多型の点変異）およびＰＮＡ  Ｃを含む特定の核酸標的について記録したＴｍを記録する。Ｖ列において、完全な相補体（ＤＮＡ  Ｑ対ＰＮＡ  Ｆ）の間のハイブリダイゼーションについてのＴｍの差異（ΔＴｍ（℃））、ならびにミスマッチ（一ヌクレオチド多型の点変異）およびＰＮＡ  Ｆを含む特定の核酸標的について記録したＴｍを記録する。ＶＩ列において、Ｖ列と比較したＩＶ列における値の絶対的な差異（ΔＣ−ΔＦ）を記録する。
【０２１０】
（表５：プローブ識別能／選択性の決定についてのＴｍの表）
【０２１１】
【表５】
0004408628.tif 000011
完全に相補的なハイブリッドのみが、ＤＮＡ  Ｑを用いて形成されるので、核酸標的配列を含むミスマッチに対してハイブリダイズする異なるＰＮＡの各々についての全てのデータを、ＤＮＡ  Ｑと比較する。このような理由により、ＤＮＡ  ＱについてＩＶ列〜ＶＩ列のデータは存在しない。
【０２１２】
表５のＩＶ列に関して、ＤＮＡ  ＲからＤＮＡ  ＴについてのΔＣ値は、２０．５〜２２．０℃である。このことは、組み合わせオリゴマーのブロックオリゴマーの１つにおいて中間に位置付けられるミスマッチは、ハイブリッドに対する実質的な不安定化効果を与えることを示す。比較すると、ＤＮＡ  Ｒ〜ＤＮＡ  ＴについてのΔＦ値は、１７．１〜１９．１℃である（Ｖ列を参照のこと）。このことは、ネイティブオリゴマーおよび標的配列から形成されたハイブリッドの同じ位置におけるミスマッチが、組み合わせオリゴマー（ｇｌｙ−ｇｌｙダイマーリンカーを有する；ＶＩ列を参照のこと）および標的配列を用いて形成されたほぼ等価なハイブリッドと比べた場合に、より低い不安定化効果を与えることを示す。ミスマッチを形成する特定の核酸塩基の性質の結果として生じるΔＴｍにおける小さな差異が明らかに存在するが、このデータは、全ての可能な天然のミスマッチの組み合わせを含む。このデータは、全ての場合において、不安定化効果が、ネイティブのオリゴマーと比較した場合に、組み合わせオリゴマーについてより高いことを示す（ＶＩ列を参照のこと）。
【０２１３】
表５のＩＶ列に関して、ＤＮＡ  ＵについてのΔＣ値は、２１．２℃である。比較すると、ＤＮＡ  ＵについてのΔＦ値は、１８．１℃である（Ｖ列を参照のこと）。このことは、組み合わせオリゴマーのブロックオリゴマーの１つが中心に位置付けられていないミスマッチが、ネイティブオリゴマーおよび同一の標的配列を用いるハイブリッドにおける同一のミスマッチの包含から生じる不安定化効果と比較した場合、同様により有意であるハイブリッドに対する実質的な不安定化効果を与えることを示す（ＶＩ列を参照のこと）。このデータは、このミスマッチが、ネイティブオリゴマーと比較した場合、有益な識別能／選択性を達成するために、組み合わせオリゴマーのオリゴマーブロック内の中心に位置付けられる必要がないことを示す。
【０２１４】
表５のＩＶ列に関して、ＤＮＡ  ＶについてのΔＣ値は１９．７℃である。比較すると、ＤＮＡ  ＵについてのΔＦ値は、２１．１℃である（Ｖ列を参照のこと）。このことは、組み合わせオリゴマーのブロックオリゴマーの１つが末端に位置付けられていないミスマッチが、ネイティブオリゴマーおよび同一の標的配列を用いるハイブリッドにおける同一のミスマッチの包含から生じる不安定化効果と比較した場合、ハイブリッドに対するより低い不安定化効果を与えることを示す（ＶＩ列を参照のこと）。このデータは、組み合わせオリゴマーのオリゴマーブロックの末端に位置付けられたミスマッチが、ネイティブオリゴマーと比較した場合、改善された識別能／選択性を生じないことを示唆する。
【０２１５】
（自己指示組み合わせオリゴマーを用いる蛍光実験）
自己指示組み合わせオリゴマー（ＰＮＡ  Ｇ〜Ｌ）が、（標識立体配置に基づいて）予想される様式で作用し得るか否かを評価するために、これらを、相補的な核酸であるＤＮＡ  Ｑにハイブリダイズさせ、そして各サンプルの得られた蛍光を測定した。
【０２１６】
自己指示組み合わせオリゴマーを、１００μＬのＴｍ緩衝液中、１．０μＭの最終濃度まで希釈し、そして９６ウェルポリエチレンマイクロタイタープレートの個々のウェルに配置した。次いで、各自己指示組み合わせオリゴマーの蛍光を、フルオレセインの蛍光を検出するために最適化されているフィルターセットを用いる、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ蛍光プレートリーダーを使用して決定した。各自己指示組み合わせオリゴマーについてのこのベースライン値を記録した後、３５μＭ  ＤＮＡ  Ｑを含む３μＬのアリコートを、各ウェルに添加し、それにより、１．０μＭの最終濃度を得た。次いで、各ウェル中のサンプルを混合し、そしてハイブリダイゼーションを１０分間進行させた。コントロールとして、非相補的標的を、別の完全なセットの自己指示組み合わせオリゴマーに、類似の方法で添加した。全ての場合において、各自己指示組み合わせオリゴマーについての蛍光値は、相補的ＤＮＡを添加した場合、有意に増加したが、非相補的ＤＮＡの存在下で認められるほどの増加はなかった。
【０２１７】
（要約）
要約すれば、このデータは、以下の結論を支持する：１）標的配列にハイブリダイズさせる場合、オリゴマーブロックの間にギャップが存在しないことが好ましい。なぜならば、この実施形態は、最も安定なハイブリッドを生じ、そしてこのようなオリゴマーについて観察された、改善された選択性／識別が存在するからである；２）標識を組み合わせオリゴマーに付着させる場合、これらは、（ｉ）ハイブリダイゼーション特性に実質的に影響することも、（ｉｉ）これらが典型的に設計される様式と異なる様式で機能することも考えられない；３）組み合わせオリゴマーのＴｍは、ネイティブオリゴマーよりも低くなる傾向があるが、組み合わせオリゴマーは、ネイティブオリゴマーと比較した場合、有意に増大した選択性／識別能を示すように設計され得る；ならびに４）組み合わせオリゴマーについて最も好ましい実施形態は、アミノ酸ダイマー、および特にｇｌｙ−ｇｌｙダイマーを含むオリゴマーであると考えられる。
【０２１８】
（実施例２：Ａテンプレートの非存在下でのブロック連結）
（序論および目的）
先の実施例は、組み合わせオリゴマーが、例えば、標的核酸配列を検出するために用いられるハイブリダイゼーション反応に有用であり得ることを示した。この実施例では、目的は、テンプレートの非存在下（すなわち、非テンプレート指向性連結）で、２つのオリゴマーブロックを効率的に連結して、それにより、組み合わせオリゴマーを形成することが可能であるか否かを決定することである。この連結反応は、ｇｌｙ−ｇｌｙダイマーリンカーを生成することが意図される。
【０２１９】
（試薬溶液）
・  ０．５Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液；ｐＨ４．５。
・  ＨＯＡｔ溶液：２１．４ｍｇの１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を、２ｍＬの１：１、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．５と混合することにより調製した。
・  ＥＤＣ溶液を、１０ｍｇ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を、１００μＬの０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液に添加することにより調製した（この溶液は使用の直前に調製される）。
・  クエンチング溶液を、１０ｍｇのグリシンアミド−ＨＣｌを、１００μＬの１Ｍ  炭酸水素ナトリウム溶液（非緩衝化）に添加することにより、調製した。
【０２２０】
（一般的反応条件）
最終反応条件は、一般に、連結される各オリゴマーブロック中７５０μＭであった反応混合物中、１０当量のＨＯＡｔおよび５００当量のＥＤＣである。これらの実験において、テンプレートを使用しなかったことが注目される。
【０２２１】
（実験１）
各ＰＮＡオリゴマー（連結されるオリゴマーブロック）の約１９．１ｎｍｏｌを、単一の０．５ｍＬマイクロ遠心チューブに添加し、そして引き続いて乾燥した。乾燥したＰＮＡオリゴマー混合物に、４．８μＬの１：１  ＤＭＦ：水を添加した。この溶液を、ボルテックスにより混合し、次いで、２．４３μＬのＨＯＡｔ溶液および１８．３μＬのＥＤＣ溶液を添加した。５分後、１０μＬの反応混合物を取り出し、そして１０μＬのクエンチング溶液でクエンチした。次いで、生成物を、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析およびＨＰＬＣにより分析した。１時間後、１０μＬの残りの反応混合物を同じ方法でクエンチし、そして、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析およびＨＰＬＣにより分析した。反応混合物の残りの５．５μＬを、３０％水酸化アンモニウム水溶液でクエンチし、そしてＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析およびＨＰＬＣにより分析した。
【０２２２】
（実験２）
約９５．６ｎｍｏｌの各ＰＮＡオリゴマー（連結されるオリゴマーブロック）を、単一の０．５ｍＬエッペンドルフチューブに添加し、引き続いて乾燥した。乾燥したＰＮＡオリゴマーに、２３．７μＬの１：１  ＤＭＦ：水を添加した。溶液をボルテックスにより混合し、次いで、１２．２μＬのＨＯＡｔ溶液を添加した後、９１．６μＬのＥＤＣ溶液を添加した。反応を、１時間後に、１２７．５μＬのクエンチング溶液でクエンチした。次いで、生成物を、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析およびＨＰＬＣにより分析した。
【０２２３】
（結果）
（表６：連結結果の表）
【０２２４】
【表６】
0004408628.tif 000012
両方の実験について、縮合ブロックをアセチル部分でキャップした。具体的には、縮合ブロック（ＰＮＡ）は、Ａｃ−ＡＣＣ−ＡＧ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨであり、そして末端ブロックは、Ｈ−Ｇｌｙ−ＴＣＣ−ＡＡ−ＮＨ２であった（ここで、Ａｃはアセチルキャップを表し、Ｇｌｙはアミノ酸グリシンを表し、そして他の略語は、ペプチド化学の分野において周知である）。
【０２２５】
表６に関して、連結反応の完了の割合を、生成物のＨＰＬＣ分析のピーク面積（ＨＯＡｔを表すピークを除く）の積分に基づいて測定した。結果は、２つのＰＮＡオリゴマーブロックが、テンプレートの非存在下で、５分以内に７０％を超える収率で、首尾良く連結され得ることを実証するが、反応時間が長くなると、より高い割合の生成物形成を導くことも示している。実験番号２（表６）として生じる反応を、生成物を分取用ＨＰＬＣにより精製し得るように、５分目に分析しなかった。それにもかかわらず、結果は、２つのＰＮＡオリゴマーブロック（一方は、Ｎ末端アミン基を含むＮ末端グリシンを有し、そして他方はカルボン酸官能基を有するＣ末端グリシンを含む）が、ＨＯＡｔおよびＥＤＣの混合物と、迅速かつ効率的に連結され得、それにより、２つのＰＮＡオリゴマーブロックを連結する非修飾ｇｌｙ−ｇｌｙダイマーを生成することを実証する。連結反応の生成物は、Ａｃ−ＡＣＣ−ＡＧ−ｇｙｌ−ｇｌｙ−ＴＣＣ−ＡＡ−ＮＨ２であった。これを、最終生成物のＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析により確認した。
【０２２６】
（実施例３：ＰＮＡ−ＦＩＳＨ）
（序論および目的）
出願人により実施された先の実験は、特定のプローブが機能的アッセイにおける単一の点変異を断定的に区別しないことを決定した。例えば、ＰＮＡオリゴマーＦｌｕ−１は、これらの２つの生物のｒＲＮＡに存在する単一の点変異（一塩基多型すなわちＳＮＰ）の存在にもかかわらず、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｓ．Ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓが血液型亜型である）とＳ．ｂｏｎｇｏｒｉとの間を断定的に区別しない。
【０２２７】
（表７：組み合わせオリゴマーおよびプローブの表）
【０２２８】
【表７】
0004408628.tif 000013
全ての略号は、以前に定義されるとおりである（表２を参照のこと）。このアッセイにおいて区別される、ｒＲＮＡ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種におけるミスマッチ（単一の点変異）の位置は、太字である。シグナル対ノイズ比を、８つの細菌由来のシグナルに基づく平均を用いて得た。
【０２２９】
（ＰＮＡ−ＦＩＳＨ手順）
細菌の個々の３ｍＬ培養物を、Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）中で、３０℃にて一晩培養した。次いで、このブロスを、６００ｎｍの吸光度について分析し、次いで、６００ｎｍの吸光度が０．５ＯＤ／ｍＬとなるまで、新鮮なＴＳＢ中に希釈した。次いで、これらの希釈した培養物ストックを、収集の前に、３〜４倍に増やした。２０ｍＬ培養物由来の細胞を、１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離によりペレット化し、２０ｍＬ  ＰＢＳ中に懸濁し、再度ペレット化し、そして固定緩衝液（ＰＢＳ（７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１３０ｍＭ  ＮａＣｌ）中の４％パラホルムアルデヒド）に再懸濁した。細菌を室温で３０〜６０分インキュベートした後、これらを再度ペレット化（１０，０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離）した。固定溶液の除去後、細胞を２０ｍＬの５０％エタノール水溶液に再懸濁した。次いで、固定した細菌を、３０分のインキュベーションの後に使用するか、または、必要に応じて、実験で使用する前に−２０℃にて数週間まで保存した。
【０２３０】
調製した各サンプルについて、５０％エタノール水溶液中、１００μＬの固定した細胞を、取り出し、そして１０，０００Ｒ．Ｐ．Ｍ．で２分間遠心分離した。次いで、エタノールをサンプルから取り出し、そしてペレットを、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、そして１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により、再度ペレット化した。
【０２３１】
次いで、ＰＢＳをペレットから取り出し、そして細胞を、４０ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度で適切なプローブ（例えば、Ｆｌｕ−１〜Ｆｌｕ−４）を含んだ、１００μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％ＳＤＳ）中に再懸濁した。ハイブリダイゼーションを５５℃にて３０分間実行した。
【０２３２】
次いで、サンプルを、１０，０００Ｒ．Ｐ．Ｍ．で２分間遠心分離した。ハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、そして細胞を５００μＬ  滅菌ＴＥ−９．０（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。溶液を、５５℃にて５分間静置した。次いで、サンプルを、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、ＴＥ−９．０をペレットから取り出した。次いで、ＴＥ−９．０洗浄を２回以上繰り返した。
【０２３３】
最終洗浄後、細胞を１００μＬ  ＰＢＳに再懸濁した。細胞のこの懸濁液の２μＬのアリコートを、スライドガラスに置き、薄く塗り、そして乾燥させた。次いで、１〜２μＬのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐ／Ｎ  Ｈ−１０００）およびＤＡＰＩ対比染色液を、乾燥した細胞上に沈着させた。カバーガラスをこのスライドに加え、そしてその位置を、２滴のマニキュア液を用いて固定した。２つの異なる細菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉ）の各々を、上記のプロトコルに従って、固定し、そしてプローブＦｌｕ−１〜Ｆｌｕ−４の各々とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、各株を、スポットし、そして顕微鏡スライド（上記を参照のこと）上に設置し、そして６０×液浸油系対物レンズ、１０×接眼レンズ（総倍率は６００倍である）、およびＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ＸＦ２２フィルターを備える、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を使用して試験した。
【０２３４】
図２中のパネルは、２秒の曝露時間を使用して、顕微鏡を備えたＣＣＤカメラで撮影したカラー画像である。図２を参照すると、パネルＡ１〜Ｄ１は、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａの血清型亜型）およびＰＮＡプローブまたはオリゴマーＦｌｕ−１〜Ｆｌｕ−４の組み合わせをそれぞれ使用するＰＮＡ−ＦＩＳＨ実験で撮影した画像である。同様に、パネルＡ２〜Ｄ２は、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉおよびＰＮＡプローブまたはオリゴマーＦｌｕ−１〜Ｆｌｕ−４の組み合わせをそれぞれ使用するＰＮＡ−ＦＩＳＨ実験で撮影した画像である。
【０２３５】
図２を参照すると、パネルＡ１とＡ２との比較により、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓのシグナルが極めて強いが、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉは、強くポジティブというほどではないにしても、同様に検出可能であることが示される。従って、この結果は、プローブＦｌｕ−１が、２種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｒＲＮＡ中に１つの点変異が存在するにもかかわらず、所望されるほどには識別性が高くないことを示す。デジタル画像に加えて、シグナル  対  ノイズ比は、２．１とスコア付けされた（表７）。
【０２３６】
プローブＦｌｕ−２を使用する場合、ミスマッチの配置を、中心に位置しているものと比較して、より末端側に位置するように再配置した。このプローブはまた、１５マーから１４マー（核酸塩基配列）に大きさを減少させた。繰り返すと、パネルＢ１およびＢ２を参照すると、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓのシグナルが極めて強い一方、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉのシグナルは弱いがなお検出可能ではあることが明らかである。デジタル画像に加えて、シグナル  対  ノイズ比は５．３とスコア付けされた（表７）。まとめると、このデータは、ミスマッチをより末端側の位置に動かすことは、アッセイの識別性を改善することを示す。
【０２３７】
オリゴマーＦｌｕ−３とＦｌｕ−４の組み合わせは、Ｆｌｕ−２で利用したものと同じミスマッチの配置を利用し、位置以外は、リンカーの性質のみが互いに異なる；組み合わせオリゴマーＦｌｕ−３は、１つのＯ−リンカー架橋を有する一方で、組み合わせオリゴマーＦｌｕ−４は、好ましいｇｌｙ−ｇｌｙダイマー架橋を有する。Ｄ１とＤ２とを組み合わせて、パネルＣ１およびＣ２を参照すると、同一の条件下ではシグナルがより弱いが、組み合わせオリゴマー（Ｆｌｕ−３およびＦｌｕ−４）を用いると、識別レベルが、ネイティブなオリゴマープローブＦｌｕ−２と比較した場合、改善されることがさらに明らかである。さらに、シグナル  対  ノイズレベルは、非常に高く、計数すべき非特異的シグナル（ノイズ）は全く認められず、ゼロで除することは意味がないので、決定できなかった。
【０２３８】
（まとめ：）
Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  血清型亜型ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓおよびＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ間の識別性は、プローブＦｌｕ−２、Ｆｌｕ−３およびＦｌｕ−４を使用するとより大きかった。一般に、プローブＦｌｕ−２、Ｆｌｕ−３およびＦｌｕ−４は、２種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの間で優れた識別性を示した。しかし、組み合わせオリゴマー（例えば、Ｆｌｕ−３およびＦｌｕ−４）の使用を導入することにより、ネイティブのオリゴマーと比較して、１つの点変異のさらに優れた識別が可能であった。従って、これらの結果は、組み合わせオリゴマーが、ネイティブなオリゴマーと比較して、より大きなバイナリ様式（ハイブリダイズされるかまたはハイブリダイズされないかのいずれか）にて作用することを実証する。
【０２３９】
（実施例４：切断アッセイ）
（緒言および目的：）
本実験を、酵素の基質である切断部位を含む組み合わせオリゴマーが、多かれ少なかれその結合パートナーに結合したか否かに依存して、酵素の働きにより切断される傾向があるか否かを決定するために行った。Ｌｉｎｅａｒ  Ｂｅａｃｏｎとして標識される組み合わせオリゴマーを、両方のハイブリダイゼーションおよび切断データが決定され得ると予測されたので、使用した。
【０２４０】
（材料：）
以下のＰＮＡ組み合わせオリゴマーを、市販の試薬および機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して合成した。これらのプローブを、ハイブリダイズしない状態で低い蛍光を有し、ハイブリダイズした状態で中間の蛍光を有し、切断された上体で最も大きな蛍光を有するように設計した。
【０２４１】
【化１５】
0004408628.tif 000014
（略語は、上記に規定されている；表１を参照のこと）
プローブを逆相クロマトグラフィーにより精製し、産物画分を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定により同定し、産物画分を合わせて、凍結乾燥した。乾燥した物質を、約５０  ＡＵ  ２６０ユニット／ｍＬの濃度にて５０％水性ＤＭＦ中に溶解した。
【０２４２】
オリゴヌクレオチド標的（実施例１のＤＮＡ  Ｑ）を、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手し、３６５μＭの濃度にて水中に溶解した。プロテアーゼを、Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、以下のように処方した：
Ｇｌｕ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１４２０３９９）を、０．１μｇ／μＬの濃度にてＧｌｕ−Ｃ緩衝液中に溶解した。Ｇｌｕ−Ｃ緩衝液は、２５ｍＭ  炭酸アンモニウム，ｐＨ７．８（５％  ｖ／ｖ  アセトニトリル含有）であった。
Ｌｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１４２０４２９）を、０．１μｇ／μＬの濃度にてＬｙｓ−Ｃ緩衝液中に溶解した。Ｌｙｓ−Ｃ緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５（５％  ｖ／ｖ  アセトニトリル含有）であった。
トリプシン（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１４１８４７５）を、０．１μｇ／μＬの濃度にてトリプシン緩衝液中に溶解した。トリプシン緩衝液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５（５％  ｖ／ｖ  アセトニトリル含有）であった。
【０２４３】
（方法：）
反応系を、マイクロタイタープレートにおいて以下のように設定した：
ＰＮＡ−Ｇｌｕを、Ｇｌｕ−Ｃ緩衝液中に１：２０００希釈した。マイクロタイタープレートのウェル中のこの溶液の１００μＬのアリコートに、以下を添加した：
・ＰＮＡ−Ｇｌｕのみ
・１μＬのＤＮＡ  Ｑ
・２μＬのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ
・１μＬのＤＮＡ  Ｒ、２μＬのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ。
【０２４４】
添加のタイミングおよび順序は、最初にＧｌｕ−Ｃ緩衝液中のＰＮＡ−Ｇｌｕ（全てのウェルＡ〜Ｄ）、続いてＤＮＡ  Ｑ（ウェルＢおよびＤ）、次いで、５分間待ち、次いで、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ（ウェルＣおよびＤ）であった。各々を添加した後、反応系を激しく混合した。次いで、反応物の蛍光を、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、５２０ｎｍにて測定した。蛍光を、時間ゼロ（最後の添加の後）および２時間後に測定した。
【０２４５】
Ｌｙｓ−Ｃ緩衝液およびトリプシン緩衝液をＧｌｕ−Ｃ緩衝液で置き換え、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼおよびトリプシンプロテアーゼを、それぞれＧｌｕ−Ｃプロテアーゼで置き換えたことを除いて、同一の反応系を、ＰＮＡ−Ｌｙｓについて設定した。
【０２４６】
（結果：）
結果を、図３にグラフとして示す。ＤＮＡ標的の非存在下では、各プロテアーゼは、そのそれぞれのＰＮＡ基質を加水分解することができた(各セットについてＡとＣを比較のこと)のに対して、標的（ＤＮＡ  Ｑ）の存在下では、ＰＮＡは、プロテアーゼによる消化から保護された（各セットにおいてＢとＤを比較のこと）。従って、組み合わせオリゴマーが標的配列に結合しなかった場合にのみ、酵素が切断部位を切断するので、プロテアーゼの存在下でハイブリダイズするＰＮＡ組み合わせオリゴマーと、ハイブリダイズしないＰＮＡ組み合わせオリゴマーとの間を識別する能力が確立された。
【０２４７】
（実施例５：独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマーおよびエンドポイント分析を用いたＳＮＰスコア付け）
（材料および方法）
ＳＮＰ選択。ＳＮＰ標的に関する情報、ヒトゲノム配列情報、ヒトゲノムＤＮＡサンプル、ＰＣＲプライマー設計、およびＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を介して得たＳＮＰ試験結果は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）により提供された。提供された情報を考慮して、９つのＳＮＰ標的（６８７４、６８０２、６８０６、６８３４、６８３７、６８４８、６８７６、６８７９および６８８５として設計した）を、評価のために選択した。
【０２４８】
ＤＮＡサンプル。ＣＥＰＨ／Ｕｔａｈ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅｓ  １３３１、１３３３、および１３４１（本明細書中以降、「Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ」または「Ｐｅｄｉｇｒｅｅ」という）（関連個体の精製ヒトゲノムＤＮＡサンプルからなる）を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から購入した。Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３１は、Ｆ０１、Ｍ０２、Ｄ０３、Ｓ０４、Ｄ０５、Ｄ０６、Ｄ０７、Ｄ０８、Ｓ０９、Ｓ１０、Ｓ１１、ＦＦ１２、ＦＭ１３、ＭＦ１４、ＭＭ１５、Ｄ１６、およびＳ１７と称される１７のＤＮＡサンプルを含んだ。Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３は、Ｆ０１、Ｍ０２、Ｓ０３、Ｓ０４、Ｓ０５、Ｄ０６、Ｓ０７、Ｓ０８、Ｓ０９、Ｓ１０、ＦＦ１１、ＦＭ１２、ＭＦ１３、ＭＭ１４、およびＤ１５と称される１５のＤＮＡサンプルを含んだ。Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１は、Ｆ０１、Ｍ０２、Ｄ０３、Ｄ０４、Ｄ０５、Ｄ０６、Ｓ０７、Ｄ０８、Ｄ０９、Ｓ１０、ＦＦ１１、ＦＭ１２、ＭＦ１３、およびＭＭ１４と称される１４のＤＮＡサンプルを含んだ。Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより供給されたこれらのＤＮＡサンプルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中で２５ｎｇ／μＬに希釈し、４℃で保存した。
【０２４９】
ＰＣＲプライマー。Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより提供されるＰＣＲプライマー設計を、配列欠失、配列付加、ならびに／または５’末端におけるグアニン塩基および／もしくはシトシン塩基の付加により全て改変した。プライマーの改変を、等しくないＴｍ値（２００ｎＭ濃度にて予想される場合、このセットの２つのプライマーについて約６６℃および８０℃）が得られるように行った。その結果、ＰＣＲプロトコルにより、二本鎖および一本鎖両方のＤＮＡアンプリコンが生じ、それぞれ、より低いアニーリング温度およびより高いアニーリング温度を有する。
【０２５０】
プライマー設計のためのＴｍ予測を、ＳａｎｔａＬｕｃｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：３５５５−３５６２（１９９６）により発表されたように、二重鎖安定性を予測するためのＤＮＡ最近接パラメーターに基づく独自のソフトウェア（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して行った。
【０２５１】
一旦設計すると、全てのプライマーを、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から購入した。Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓから受け取ったこれらのプライマーを、1×ＴＥ，ｐＨ８．０（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で約２００μＭに希釈し、４℃にて保存した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０およびＥＤＴＡ  二ナトリウム塩二水和物（保存緩衝液を作製するために使用した）を、それぞれ、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。９つのプライマーセットの特性を、表８に示す。
【０２５２】
【表８】
0004408628.tif 000015
ＰＮＡプローブ。全てのＰＮＡオリゴマーを、標識試薬および/またはリンカー（これらは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給されるかまたはそうでなければ他の箇所で記載されるように調製される（出願番号０９１１７９．２８９号に基づく米国特許第６，３５５，４２１号；本明細書中に参考として援用される、を参照のこと）かのいずれかである）を除いて、市販の試薬および機器を使用して合成した。これらのＰＮＡプローブは、「染料−ＮＮＮＮＮ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＮＮＮＮ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｃｙｌ）」という設計であった。ここで染料は、フルオレセイン（Ｆｌｕ）、（Ｔａｍ（Ｔａｍｒａの略語））、染料１または染料２（染料１および染料２の構造は、図３３に例示される；染料２は、米国特許第６，２２１，６０４号（本明細書中に参考として援用される）にも記載される）のいずれかであった。この構成において、特定のＳＮＰを決定するためのＰＮＡオリゴマーのセットは、独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマーであった（表９を参照のこと）。
【０２５３】
Ｆｌｕ標識およびＴａｍ標識ＰＮＡオリゴマーを、新たに合成したのに対し、染料１標識ＰＮＡオリゴマープローブおよび染料２標識ＰＮＡオリゴマープローブを、各々、２つの５マーのオリゴマーブロックとして合成した。これらのオリゴマーブロックを、引き続いて、縮合/連結して、それにより１０マーのＰＮＡ組み合わせオリゴマープローブを作製した。各セットのプローブについて、ＳＮＰ標的に指向されるその核酸塩基を、Ｎ末端の５マーまたはＣ末端の５マーのいずれかの中間に位置させた。Ｆｌｕ標識プローブおよびＴａｍ標識プローブを、５０％水性ＤＭＦ中で約４００μＭに希釈したのに対し、染料１標識プローブおよび染料２標識プローブを、５０％水性ＮＭＰ中で５０μＭに希釈した。ＤＭＦおよびＮＭＰは、それぞれ、ＪＴ  Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。１０のＰＮＡプローブセットを、表９に記載する。全ての場合において、１セットのプローブは、独立して検出可能であった。
【０２５４】
【表９】
0004408628.tif 000016
ＰＣＲプロトコル。ＰＣＲを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して各サンプルについて三連で行った。標的なしコントロール（ＮＴＣ）（ヒトゲノムＤＮＡ標的がない)もまた、試験した各ＳＮＰについて行った。ＰＣＲ混合物は、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１×Ｇｏｌｄ緩衝液、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＴＴＰ含有）、０．０４Ｕ／μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭの各ＰＮＡプローブ、および０．５ｎｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡ標的を含んだ。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を、ＰＣＲ混合物希釈液として使用した。この処方物に対する１つの例外としては、ＳＮＰ  ６８３４についてのＰＣＲ混合物が挙げられ、このＰＣＲ混合物は、より高いＴｍ値を有する２０００ｎＭのプライマーを含んだ。このことは、ＰＣＲによる一本鎖ＤＮＡアンプリコンのさらなる生成を可能にする。次いで、５０μＬの各サンプルを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ９６ウェル反応プレートに負荷し、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｃｏｖｅｒで覆った。ＭｇＣｌ２、Ｇｏｌｄ緩衝液、ｄＮＴＰ（ｄＴＴＰ含有）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ９６ウェル反応プレート、およびＯｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｃｏｖｅｒを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。サーモサイクリングは、以下からなった：１回の酵素活性化（９５℃、１０分）；変性（９５℃，１５秒）、アニーリング（６０℃，３０秒）、および伸長（７５℃，１５秒）を３０回；ならびに変性（９５℃，１５秒）、アニーリング（７０℃，３０秒）、および伸長（７５℃，１５秒）を１５回。より低いアニーリング温度およびより高いアニーリング温度は、プライマーＴｍ値が等しくないので、それぞれ、二本鎖ＤＮＡアンプリコンおよび一本鎖ＤＮＡアンプリコンの生成に都合がよかった。ＰＣＲの後に、一本鎖ＤＮＡアンプリコンを、ＰＮＡプローブについての標的として供した。
【０２５５】
蛍光の検出。ＰＣＲの後に、５０μＬのサンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）から購入した９６ウェルの２５０μＬ黒色ポリスチレンＶ底Ｕｎｉｐｌａｔｅに移した。次いで、各サンプル中の染料標識したＰＮＡプローブの蛍光を、Ｆｌｕ、Ｃｙ３、染料１、および染料２のフィルターセット（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を備えたＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒで室温にて測定した。Ｃｙ３フィルターセットは、Ｔａｍ蛍光の測定に適切であった。染料１フィルターセットは、４６０−４０励起フィルターおよび５１０−１０発光フィルターからなったのに対し、染料２フィルターセットは、５３０−２５励起フィルターおよび５９０−２０発光フィルター（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ）からなった。
【０２５６】
データ分析。ＮＴＣの蛍光シグナルを各サンプルの蛍光シグナルから差し引くことにより、棒グラフを作成した；次いで、ＮＴＣをゼロのシグナルとして提供した。対立遺伝子分布プロット（散乱プロット）を、ＮＴＣの蛍光シグナルを各サンプルの蛍光シグナルから差し引くことにより作成した；その結果、ＮＴＣを、１の比として提供した。この比を、シグナル／ノイズ比と称した。
【０２５７】
（結果）
新たに合成したＦｌｕ標識ＰＮＡプローブおよびＴａｍ標識ＰＮＡプローブを用いたＳＮＰ分析。各ＳＮＰについての棒グラフおよび対立遺伝子分布プロットを評価し、図４〜２５に示した。一方の染料の高いシグナルおよび他方の染料の無視できるシグナルを示したＤＮＡサンプルを、ホモ接合体と記載した。次いで、ホモ接合体のＳＮＰ改変体を、高いシグナルを示した染料により決定した。例えば、ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３のＤＮＡサンプルＭ０２は、高いＦｌｕシグナルおよび無視できるＴａｍシグナルを示したので、ＳＮＰ  ６８０２についてのホモ接合体とみなした（図６および７）。その標的のＳＮＰ部位もまた、Ｆｌｕ標識ＰＮＡプローブがＳＮＰ部位にて核酸塩基チミンを含んでいたので、核酸塩基アデニンを含むとみなした（表９）。対照的に、ホモ接合性の他の状態は、プローブが、ＳＮＰ部位にて核酸塩基シトシンを含むので、核酸塩基グアニンを含む標的についてであり、この状態は、Ｔａｍｒａ標識プローブ（６８０２−２−Ｇ−Ｔａｍ）が顕著なシグナルを生成した場合に決定された（表９を参照のこと）。
【０２５８】
ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３のＤＮＡサンプルＳ０３は、ＳＮＰ  ６８０６についてあいまいな結果を提供した（図８および９を参照のこと）。しかし、試験した三連のうちの１つの複製は、低いシグナルを提供した（データは示さず）。このアウトライアーが除去されると、ＳＮＰ結果を、Ｔａｍ標識ＰＮＡプローブにより検出されたホモ接合体とみなし、そのように記載する。
【０２５９】
およそ等価な強度の両染料のシグナルを示したＤＮＡサンプルを、ヘテロ接合体と記載した。例えば、ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３のＤＮＡサンプルＦ０１を、ＦｌｕシグナルおよびＴａｍシグナルがおよそ等しく強かった（図６および７）ので、ＳＮＰ  ６８０２についてのヘテロ接合体とみなした。それらの標的のＳＮＰ部位はまた、Ｆｌｕ標識ＰＮＡプローブおよびＴａｍ標識ＰＮＡプローブが、それぞれＳＮＰ部位にて核酸塩基チミンおよびシトシンを含んだ（表９）ので、核酸塩基アデニンおよびグアニンを含むとみなした。
【０２６０】
ＳＮＰ結果を表１０にまとめる。ホモ接合性ＤＮＡサンプルを、同じＳＮＰ標的核酸塩基項目下で２つの隣接する＋記号により示した。それに対し、ヘテロ接合性ＤＮＡサンプルを、両方のＳＮＰ標的核酸塩基項目下で１つの＋記号により示した。この研究において得られた結果は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡのＴａｑＭａｎアッセイを用いて分析したサンプルについて、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより提供されたデータと完全に一致した（表１０の影をつけた列を参照のこと）。
【０２６１】
（連結した染料１標識ＰＮＡプローブおよび染料２標識ＰＮＡプローブを使用したＳＮＰ分析）
ＳＮＰ  ６８８５についての染料１標識ＰＮＡプローブおよび染料２標識ＰＮＡプローブの配列は、それぞれ、それらのＴａｍ標識対応部分およびＦｌｕ標識対応部分に相当する（表１０）。評価のために選択したＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１は、予測された接合性を示し（図２６および２７）、これらの結果は、Ｆｌｕ標識ＰＮＡプローブおよびＴａｍ標識ＰＮＡプローブを使用して生成された結果と完全に一致した（図２４、２５および表１０）。従って、染料１および染料２の発蛍光団は、アッセイとの適合性および標的に対するハイブリダイゼーションの際のシグナルを提供した。さらに、記録された結果は、縮合/連結プロセスがプローブの機能に有害な結果を課さなかったことを実証する。
【０２６２】
【表１０】
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（実施例６：２つの標識オリゴマーブロックを使用したテンプレートの非存在下での連結）
（緒言および目的）
実施例２において、非標識オリゴマーブロックの連結が可能であることを実証した。この実施例は、２つの標識ブロックオリゴマーを連結することが可能であり、それにより独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマーを生成するか否かを確認することを、意図した。
【０２６３】
（試薬溶液：）
・０．７５Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液；ｐＨ６．０
・３５ｍＭ  ＨＯＢｔ溶液：２３．７ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と４．４２ｍＬの０．７５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を混合することにより調製
・ＥＤＣ溶液を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を秤量し、次いで、上記のように調製した、１容積のＨＯＢｔ溶液を添加することにより調製した。その結果、最終溶液は、０．８ｍｇ  ＥＤＣ／１５μＬのこの溶液を達成する（従って、ＥＤＣ溶液は０．２７８Ｍである）
・クエンチ溶液を、０．５ｍｌのトリフルオロ酢酸を４９．５ｍＬの脱イオン水に添加することにより調製した。
・ＰＮＡ溶液を、５０％のアセトニトリル：５０％の０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中に、ＰＮＡオリゴマーブロックを、染料標識ブロックについて濃度２６２５μＭまで、およびＤａｂｃｙｌ標識ブロックについて濃度３０００μＭまで溶解することにより調製した。
【０２６４】
（一般的反応条件：）
最終反応条件は、一般的に、反応混合物中の１０当量のＨＯＢｔおよび約１６０当量のＥＤＣであった。反応混合物は、連結される各染料標識オリゴマーブロックが約７５０μＭであった。これらの実験において、テンプレートは使用しなかったことに注意のこと（すなわち、非テンプレート指向連結（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ））。
【０２６５】
（実験１：）
各ＰＮＡオリゴマーブロック(連結される２つのオリゴマーブロック)のＰＮＡ溶液、約５μＬを、一本の０．５ｍＬ  微小遠心分離にチューブに添加した。このＰＮＡオリゴマー混合物に、上記のように調製したＥＤＣ溶液７．５μＬを添加した。この溶液を、ボルテックスで混合し、次いで、８０℃に維持されたヒートブロック中に入れた。６０分後、２０μＬのクエンチ溶液を添加した。次いで、生成物を、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析法およびＨＰＬＣにより分析した。
【０２６６】
（実験２：）
各ＰＮＡオリゴマーブロック(連結される２つのオリゴマーブロック)のＰＮＡ溶液、各約５μＬを、一本の０．５ｍＬ  微小遠心分離にチューブに添加した。このＰＮＡオリゴマー混合物に、上記のように調製したＥＤＣ溶液７．５μＬを添加した。この溶液を、ボルテックスで混合し、次いで、８０℃に維持されたヒートブロック中に入れた。６０分後、２０μＬのクエンチ溶液を添加した。次いで、生成物を、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析法およびＨＰＬＣにより分析した。
【０２６７】
（結果：）
【０２６８】
【表１１】
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両方の実験のために、アミン末端ブロック（縮合ブロック）を染料（染料１または染料２）で標識し、カルボキシ末端ブロック（末端ブロック）を、ｄａｂｃｙｌで標識した。具体的には、縮合ブロック（ＰＮＡ）は、染料１−ＴＧＧ−ＴＣ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨであり、末端ブロックは、Ｈ−Ｇｌｙ−ＡＡＡ−ＧＡ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｃｙｌ）−ＮＨ２（実験１）および末端ブロックＧｌｙ−ＡＡＧ−ＧＡ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｃｙｌ）−ＮＨ２を有する染料２−ＴＧＧ−ＴＣ−Ｇｌｙ（実験２）であった。ここで、Ｌｙｓ（Ｄａｂｃｙｌ）は、アミノ酸リジンのγアミンに結合したＤａｂｃｙｌ部分を示し、Ｇｌｙは、そのアミノ酸グリシンを示し、他の略語は、ペプチド化学の分野で周知である
表１１を参照すると、連結反応の完了％を、生成物のＨＰＬＣ分析のピーク面積の積分に基づいて測定した（ＨＯＢｔを示すピークは除く）。その結果により、２つのＰＮＡオリゴマーブロックが、テンプレートの非存在下で、１時間以内に５０％を超える収率にて首尾よく連結され得ることが実証された。この結果は、２つのＰＮＡオリゴマーブロック（一方は、Ｎ末端グリシンが遊離Ｎ末端アミン基を含み、他方は、カルボン酸官能基を有するＣ末端グリシンを含む）が、ＨＯＢｔおよびＥＤＣの混合物を使用して迅速かつ効率的に連結され、それにより、２つのＰＮＡオリゴマーブロックを連結する非改変ｇｌｙ−ｇｌｙダイマーを生成し得ることを実証する。連結反応の生成物は、染料１−ＴＧＧ−ＴＣ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ＡＡＡ−ＧＡ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｃｙｌ）−ＮＨ２および染料２−ＴＧＧ−ＴＣ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ＡＡＧ−ＧＡ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｃｙｌ）−ＮＨ２であった。このことは、最終生成物のＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分光測定分析により確認された。従って、この実施例は、ライブラリーアプローチを使用して、２つの標識オリゴマーブロックを連結して、それにより独立して検出可能な自己指示組み合わせオリゴマーを生成することが可能であることを確認する。
【０２６９】
本発明の好ましい実施形態を記載してきたが、本発明の概念を組み込んだ他の実施形態を使用し得ることはいまや当業者に明らかである。従って、これら実施形態が、開示された実施形態に限定されるべきでなく、むしろ本発明の趣旨および範囲により限定されるべきであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】図１は、「ギャップ」または「塩基ギャップ」を含むか、または「ギャップ」も「塩基ギャップ」も含まない（すなわち、この組み合わせオリゴマーのオリゴマーブロックは、標的配列の連続核酸塩基にハイブリダイズするか、またはハイブリダイズしない）、実施例１に記載されるような、組み合わせオリゴマーと標的配列とから形成されるハイブリットの例証である。
【図２】図２は、実施例３に記載されるような、サルモネラ細菌のＰＮＡ−ＦＩＳＨ分析のためのＣＣＤカメラが装備された顕微鏡を用いて撮影したデジタル画像のカラー複写である。
【図３】図３は、実施例４の酵素切断アッセイに関連したデータの図表である。
【図４】図４は、ＳＮＰ  ６７８４およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの棒グラフである。
【図５】図５は、ＳＮＰ  ６７８４およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図６】図６は、ＳＮＰ  ６８０２およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの棒グラフである。
【図７】図７は、ＳＮＰ  ６８０２およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図８】図８は、ＳＮＰ  ６８０６およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの棒グラフである。
【図９】図９は、ＳＮＰ  ６８０６およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図１０】図１０は、ＳＮＰ  ６８３４およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３１について得たデータの棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＳＮＰ  ６８３４およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３１について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図１２】図１２は、ＳＮＰ  ６８３７およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの棒グラフである。
【図１３】図１３は、ＳＮＰ  ６８３７およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図１４】図１４は、ＳＮＰ  ６８４８およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３１について得たデータの棒グラフである。
【図１５】図１５は、ＳＮＰ  ６８４８およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３１について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図１６】図１６は、ＳＮＰ  ６８７６およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの棒グラフである。
【図１７】図１７は、ＳＮＰ  ６８７６およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図１８】図１８は、ＳＮＰ  ６８７６およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの棒グラフである。
【図１９】図１９は、ＳＮＰ  ６８７６およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図２０】図２０は、ＳＮＰ  ６８７９およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３１について得たデータの棒グラフである。
【図２１】図２１は、ＳＮＰ  ６８７９およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３１について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図２２】図２２は、ＳＮＰ  ６８８５およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの棒グラフである。
【図２３】図２３は、ＳＮＰ  ６８８５およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３３３について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図２４】図２４は、ＳＮＰ  ６８８５およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの棒グラフである。
【図２５】図２５は、ＳＮＰ  ６８８５およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図２６】図２６は、２つの連結した組み合わせオリゴマーを用いたＳＮＰ  ６８８５およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの棒グラフである。
【図２７】図２７は、２つの連結した組み合わせオリゴマーを用いたＳＮＰ  ６８８５およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  １３４１について得たデータの対立遺伝子分布プロットである。
【図２８】図２８ａおよび図２８ｂは、１つのオリゴマーブロックが第２オリゴマーブロックのカルボン酸基にカップリングするアミノ基を含む、可能な連結反応の図解である。
【図２９】図２９ａ、図２９ｂ、および図２９ｃは、水素化ホウ素還元を含む可能な連結反応の図解である。
【図３０】図３０ａおよび図３０ｂは、水素化ホウ素還元を含むさらなる可能な連結反応の図解である。
【図３１】図３１ａ、図３１ｂ、および図３１ｃは、チオール反応基を含む可能な連結反応の図解である。
【図３２】図３２は、標準的でない塩基対形成モチーフを生成するために本発明のオリゴマーブロックまたは組み合わせオリゴマーに使用され得る、天然に存在しない核酸塩基の図解を含む。
【図３３】図３３は、色素１および色素２の両方の図解を含む。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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