(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコノストック属メセントロイデス種に分類される乳酸菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００（受託番号））又はロイコノストック属メセントロイデス種に分類される乳酸菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１（受託番号））を含有する飲料。
【請求項２】
前記乳酸菌が発酵して製造される請求項１記載の飲料。
【請求項３】
ロイコノストック属メセントロイデス種に分類される乳酸菌株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００）。
【請求項４】
ロイコノストック属メセントロイデス種に分類される乳酸菌株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌及びその乳酸菌を利用した飲料に関し、更に詳しくは、免疫賦活作用の高い乳酸菌及びその乳酸菌を利用した飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウイルス活性を有する分子量約２０，０００の蛋白質の総称である。ＩＦＮにはα、β、γの３種の型が存在し、生物活性として、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫応答調節作用等が知られている。なかでもＩＦＮ−γはマクロファージ、ナチュラルキラー細胞、細胞障害性Ｔ細胞などの免疫担当細胞の分化誘導・活性化に重要な役割を果たす。
【０００３】
現在、遺伝子組み換え型ＩＦＮや、精製ＩＦＮがウイルス感染、ウイルス性肝炎、癌に対する治療薬等として使用されているが、ＩＦＮを生体内へ直接投与するような治療法では多様な副作用が生じる。
【０００４】
そのため、生体内でのＩＦＮ−γ産生を増強させることによって、ウイルス感染の防御や、癌等の改善・治療を図るための多くの物質や組成物が開発されている。
【０００５】
下記の特許文献１には、エンテロコッカス属に属する微生物の菌体が、インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を増強させる作用を有することが開示されている。この特許文献１に記載されている菌種は、健常者の腸内およびサイレージから分離された乳酸菌の一種であるため、副作用の無い安全な菌種である。
【特許文献１】特開平８−２５９４５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記の特許文献１の菌体は、ＩＦＮ−γの産生を増強させる作用を有することが知られているが、未だ効果が不充分である。このため、更に産生を増強させる作用を有する菌体の開発が望まれている。
【０００７】
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、生体のＩＦＮ−γ産生増強作用を有する新規の乳酸菌及び新規乳酸菌を利用した飲料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ロイコノストック（ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、特に、メセントロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）に分類される菌体又はその処理物がＩＦＮ−γの産生増強作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【０００９】
（１）  ロイコノストック属に分類される乳酸菌を含有する飲料。
【００１０】
本発明の飲料によれば、ロイコノストック属に分類される乳酸菌が、生体内のＩＦＮ−γ産生を増強する効果を有するため、これを含有する飲料についても、ＩＦＮ−γを増強する効果がある。また、使用される乳酸菌は、漬け物から分離された菌種であるため、副作用の無い安全な菌種である。
【００１１】
（２）  前記乳酸菌が発酵して製造される（１）記載の飲料。
【００１２】
（３）  前記乳酸菌が、ロイコノストック属メセントロイデス種に分類される乳酸菌である（１）又は（２）記載の飲料。
【００１３】
（４）  前記乳酸菌が、ＦＥＲＭ（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、以下同じ）  Ｐ−２０５００（受託番号）である（１）から（３）いずれか記載の飲料。
【００１４】
（５）  前記乳酸菌が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１（受託番号）である（１）から（３）いずれか記載の飲料。
【００１５】
（６）  受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００である乳酸菌株。
【００１６】
（７）  受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１である乳酸菌株。
【００１７】
なお、本発明における「飲料」には、乳酸菌を含有する飲料（以下、「乳酸菌含有飲料」という）、および乳酸菌により発酵させた飲料（以下、「乳酸菌発酵飲料」という）が含まれる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、生体内のＩＦＮ−γ産生増強作用を有する新規の乳酸菌を提供し、更に、感染防御、アレルギー改善作用を有する飲料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００２０】
＜乳酸菌含有飲料の製造＞
本発明に係る乳酸菌含有飲料は、果実、果汁、糖類、酸味料、水等の原料を所定量調合した調合液に、ロイコノストック属に分類される乳酸菌を含有させ、製造することができる。
【００２１】
＜乳酸菌発酵飲料の製造＞
また、乳酸菌発酵飲料は、果実、果汁、乳製品、豆乳などを単独、または２種以上を調合して製造することができ、乳酸菌による発酵は、原料を調合した後、行うことができ、また、調合する前に行うこともできる。また、原料の一部を調合し、発酵させた後、残りの原料を調合することもできる。更に、乳酸菌発酵飲料を製造後、新たに乳酸菌を添加し製造することもできる。
【００２２】
発酵は、発酵温度が２０℃以上４０℃以下、好ましくは２５℃以上３７℃以下であり、発酵時間は、５時間以上１２０時間以下、好ましくは１２時間以上６０時間以下で行う。
【００２３】
本発明においてはロイコノストック属に分類される種々の乳酸菌を用いることができるが、特に、高いＩＦＮ−γ産生増強作用を有するため、メセントロイデス種を用いることが好ましく、更に、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００である乳酸菌株、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１である乳酸菌株が好ましく用いられる。乳酸菌は、調合液１ｍｌあたり１０４個以上１０８個以下添加するのが好ましい。
【００２４】
以下に、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００である乳酸菌株、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１である乳酸菌株の分離手段及び菌学的、生理学的性質を示す。
【００２５】
＜受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００の分離手段＞
漬け物１０ｇに生理食塩水９０ｍｌを加え混合し、更に生理食塩水で段階的に希釈して乳酸菌選択培地（５％馬脱繊維素血液添加ＢＬ寒天培地、１．５％寒天含有ＭＲＳ培地、ＰＥＳ培地、Ｍ−Ｅ培地、Ｍｍａ−ＬＢＳ培地）に塗末し培養した。培養条件は嫌気条件下にて２０℃〜３７℃とした。菌の集落が形成されたら、別の同種の平板培地に画線塗布し同様に培養した。更に同じ操作を繰り返し、単一集落を形成する乳酸菌を分離した。
【００２６】
＜受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１の分離手段＞
上記ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１と同様の方法により分離を行った。
【００２７】
＜菌学的性質及び生理学的性質＞
本発明の乳酸菌である受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００である乳酸菌株の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１である乳酸菌株の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。既知微生物の塩基配列のデータベース上で、これらの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列について相同性検索を行ったところ、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００である乳酸菌株、及び受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１の乳酸菌株はいずれも、既知のロイコノストック・メセントロイデスに属する微生物の塩基配列と９９％の相同性を有していた。従って、本発明の乳酸菌はいずれもロイコノストック・メセントロイデスに属する微生物と同定された。
【００２８】
また、相同性が９９％であり、完全に一致している既知微生物が検索されなかったことから、新規な乳酸菌であることが確認された。
【００２９】
本発明で使用する野菜果汁は、特に限定されないが、人参、カボチャ、キャベツ、セロリ、ブロッコリー、ケール、トマト、ピーマン、アスパラガス、ホウレンソウ、カリフラワーなどを挙げることができる。これらは、１種類の野菜果汁であってもよいが、２種類以上の野菜果汁の混合液であってもよい。特に、官能的に相性がよいため、人参、カボチャ、キャベツ、ケール、トマトが、好ましく用いられる。また、これらは、１種類の野菜果汁であってもよいが、２種類以上の野菜果汁の混合液であってもよい。
【００３０】
また、果実としては、特に限定されないが、オレンジ、みかん、グレープフルーツ、レモン、ポンカン、デコポン、リンゴ、ぶどう、メロン、キウイ、イチゴ、ブルーベリー、パイナップル、バナナ、マンゴー、洋ナシ、桃などを挙げることができ、特にオレンジ、みかん、グレープフルーツ、レモン、リンゴ、洋ナシ、桃が好ましく用いられる。また、これらは、１種類の果実であってもよいが、２種類以上の果実の混合液であってもよい。また、発酵を促進するため、発酵前にｐＨ調整剤を添加することもある。
【００３１】
また、乳製品としては、特に限定されないが、牛乳、低脂肪乳、脱脂乳、濃縮乳、加工乳、脱脂粉乳、全粉乳、生クリーム、バター、乳蛋白濃縮物、ホエー、植物性クリームなどを挙げることができ、特に牛乳、低脂肪乳、脱脂乳、濃縮乳、加工乳、脱脂粉乳、全粉乳、生クリームが好ましく用いられる。また、これらは、１種類の乳製品であってもよいが、２種類以上の乳製品の混合液であってもよい。
【００３２】
これらは、野菜果汁、果実、乳製品、豆乳を単独で用いることもでき、２種以上を併用することもできる。また、本発明にかかる飲料は、粉砕物（果肉等）や砂のう等の組織や繊維素等の不溶性の固形分を含んでいてもよい。
【００３３】
また、本発明にかかる飲料には、上記の乳酸菌が、充分なＩＦＮ−γ産生を増強させる効果を奏するために、酸化防止剤、香料、各種エステル類、有機酸類、有機酸塩類、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、酸味料、果汁エキス類、野菜エキス類、花蜜エキス類、ｐＨ調整剤、品質安定剤、ビタミン類などの添加剤を単独、あるいは併用して配合してもよい。
【００３４】
例えば甘味料としては、砂糖、ぶどう糖、果糖、異性化液糖、グリチルリチン、ステビア、アスパルテーム、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、スクラロース、アセスルファムカリウム、水あめ等が挙げられる。酸味料としては、天然成分から抽出した果汁類のほか、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、リン酸が挙げられる。クエン酸もしくはリンゴ酸を飲料中に０．１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは０．５〜２ｇ／Ｌ含有するのがよい。酸化防止剤としては、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、が挙げられる。飲料中に、０．００５〜０．５質量％、好ましくは０．０１〜０．１質量％含有するのがよい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３６】
＜試験例１：乳酸菌の属・種間でのＩＦＮ−γ産生増強作用の比較＞
［乳酸菌死菌体の調製］
表１に示す各菌種を代表的培地としてＭＲＳ培地に接種し、２０〜３７℃で一夜培養（前培養）した。この前培養した溶液を波長６６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６０）が１．０となるように調製し、ＭＲＳ培地に１／１００（Ｖ／Ｖ）（菌数：１０６個／ｍＬ）の割合で接種した。２０〜３７℃で１０時間以上培養（本培養）し、生菌数約１０７〜１０９個／ｍＬの培養液を得た。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ（約１０，０００×ｇ）で２０分間の遠心分離をして集菌し、これを蒸留水で２回洗浄して菌体を得た。この菌体を、用いた液体培地量の１／１００量の蒸留水で懸濁し、１１０℃で１０分間加熱して死菌体懸濁液を得た。次に、凍結乾燥により乾燥処理し、死菌体菌末を得た。
【００３７】
【表１】
0004426506.tif 000002
【００３８】
［試験方法］
脾臓を１２週齢の雄・ＢＡＬＢ／ｃマウスから摘出し、培養液によって洗浄・濾過した後、細胞浮遊液を調製（１×１０７細胞数／ｍＬ）した。この細胞浮遊液を９６穴平底プレートに２００μＬ／ウェルまき、上記で得た乳酸菌死菌体（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）の存在下で３７℃、４８時間培養した。培養終了後、培養上清中のＩＦＮ−γ量を酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法により測定した。結果を図１に示す。
【００３９】
乳酸菌無添加区のＩＦＮ−γ産生量を１として、各乳酸菌属、種間での比較を行った。図中の相対ＩＦＮ−γ産生量は、下記式（１）により計算した。
【００４０】
相対ＩＦＮ−γ産生量＝（各乳酸菌株無添加区のＩＦＮ−γ濃度）／（無添加区のＩＦＮ−γ濃度）・・・（１）
【００４１】
属間の比較では、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ属）は相対ＩＦＮ−γ産生量の属内平均値が１〜３の値を示したのに対して、ロイコノストック属は約９と最も高いＩＦＮ−γ産生増強能を示した。さらにロイコノストック属の中でも、メセントロイデス種に分類される受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００である乳酸菌株、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１である乳酸菌株には、特に高いＩＦＮ−γ産生増強作用が認められた。
【００４２】
＜実施例１、２＞
［野菜発酵汁の調製］
人参混濁濃縮汁（Ｂｘ４２、濃縮率７倍）を、水を用いてＢｘ２０になるように調製した。この調整液を、１０５℃で３０分間処理した後、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５００（実施例１）、又は、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５０１（実施例２）により発酵させた。この発酵は、乳酸菌培養用培地で培養したものをスターターとし、１０６〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように接種した後、静置培養をすることにより行った（発酵温度は３０℃、発酵時間は４８時間）。そして、実施例１、２の野菜発酵汁を得た。
【００４３】
＜試験例２：乳酸菌野菜発酵汁の免疫賦活作用の検討＞
６週齢の雄・Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて検討した。実施例１、２の野菜発酵汁をそれぞれマウスに１０ｍＬ／ｋｇの用量で経口投与した。野菜発酵汁の投与期間は２回／日の頻度で１週間行った。投与終了後、免疫抑制処理として１２時間の拘束ストレスをマウスに負荷した後、脾細胞のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図２に示す。
【００４４】
ニンジンエキスのみを投与した対照群１００％として、実施例１、実施例２の比較を行った。対照群と比較し、実施例１、実施例２の野菜発酵汁を投与したマウスは、ＩＦＮ−γ産生能が有意に増強されていることが確認できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】試験例１の結果を示す図である。
【図２】試験例２の結果を示す図である。
【図１】
0004426506.tif 000003
【図２】
0004426506.tif 000004
【配列表】
0004426506000001.app