(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水銀化合物及び／又は水銀イオンで汚染された土壌又は汚染水に、チトクロームｃオキシダーゼに水銀イオン還元能を有する水銀耐性鉄酸化細菌及び二価の鉄イオンを加え、１〜４のｐＨ範囲に保持して、該鉄酸化細菌を培養し、該鉄酸化細菌の培養と共に、２価の鉄イオンが酸化されることにより、水銀イオンを金属水銀に還元して気化させることによって水銀化合物及び／又は水銀イオンで汚染された土壌又は汚染水を浄化することを特徴とする汚染土壌又は汚染水の浄化方法。
【請求項２】
水銀化合物及び／又は水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに、チトクロームｃオキシダーゼに水銀イオン還元能を有する水銀耐性鉄酸化細菌及び二価の鉄イオンを加え、１〜４のｐＨ範囲に保持して、該鉄酸化細菌を培養することにより、該鉄酸化細菌の培養と共に、２価の鉄イオンを酸化させて、気化した水銀を測定することを特徴とする水銀の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水銀耐性鉄酸化細菌を用いた、水銀の気化方法、及び汚染土壌又は汚染水の浄化方法、並びに水銀の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
汚染水、汚染土壌の浄化のために、細菌等の微生物が利用されており、今後も安価、迅速、大量に処理するための研究が盛んに行われると考えられる。これは、微生物が、１）単位当たりの汚染物の分解或いは摂取測度が大きい、２）比増殖速度が著しく大きい、３）自動触媒的に増殖する、４）微生物は無限に存在する、等の他の生物に比べて有利な点が多いためである。
【０００３】
工場排水、工場跡地に由来する汚染物質は、ＰＣＢ、ＢＨＣ、ＤＤＴ等の難分解性有機化合物、鉄、クロム、マンガン、亜鉛、水銀等の金属イオン等多岐に渡り種々のものが存在する。微生物の利用は、有機化合物のみならず、金属に対しても研究されている（例、特開昭５９−２０９７００号公報）。
【０００４】
汚染水、汚染土壌に含まれる金属イオンの中でも、水銀イオンの浄化処理への微生物の利用は研究はまだ十分に進んでいないが、特開平２−１６７０８２号公報には、チオバルス菌属の水銀還元酵素をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた大腸菌由来の新規なプラスミドを用いて、中性のｐＨ領域で水銀イオンを水銀に還元、気化させることができる旨記載されいる。そして、これを用いて水銀イオンを無毒化、除去する方法が示唆されている。
【０００５】
しかしながら、上記の新規プラスミドの作製は、極めて煩雑で生産効率が悪いため、簡単な方法で水銀イオンを無毒化、除去する方法が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、水銀耐性鉄酸化細菌を用いた水銀イオン（Ｈｇ2+）を金属水銀（Ｈｇ0）に還元して気化する方法、及びこの方法を利用した汚染土壌又は汚染水の浄化方法、並びにこの方法を利用した水銀の検出法を提供することにある。
【０００７】
鉄酸化細菌（チオバチルス・フェロオキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans)）は、鉄や硫黄の酸化ばかりでなく、モリブデン（Ｍｏ5+）の酸化、酸化鉄の還元、モリブデン（Ｍｏ6+）の還元、銅（Ｃｕ2+）の還元、マンガン（Ｍｎ4+）の還元等の反応に触媒作用を有することを、本発明者等は既に明らかにしている。そして、本発明者は、上記鉄酸化細菌の１種である水銀耐性鉄酸化細菌を用いて、水銀イオン（Ｈｇ2+）の金属水銀（Ｈｇ0）への還元について、研究を重ねた結果、鉄酸化細菌の増殖可能な酸性のｐＨ範囲において、２価の鉄イオンの存在下に水銀イオンの還元が可能であることを見出した。また水銀耐性鉄酸化細菌は自然界に比較的多数存在しており、容易に分離できることも見出した。このような水銀イオンの還元は、後述するように、前記特開平２−１６７０８２号公報に開示されたチオバチルス菌属の水銀還元酵素のみを利用する（中性において）ものではなく、主として２価の鉄イオンの酸化を利用するものであるため、酸性領域で、即ち鉄酸化細菌の増殖領域で容易に実施でき、且つ鉄酸化細菌をそのまま利用できる点で画期的なものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、水銀耐性鉄酸化細菌、水銀イオン及び二価の鉄イオンを含む混合物を、１〜４のｐＨ範囲に保持し、該混合物中の鉄酸化細菌を培養することにより、水銀イオンを金属水銀に還元して気化させることを特徴とする水銀の気化方法により達成することができる。
【０００９】
上記水銀耐性鉄酸化細菌の培養と共に、２価の鉄イオンが酸化されることが好ましい。
【００１０】
また、水銀化合物及び／又は水銀イオンで汚染された土壌又は汚染水に、水銀耐性鉄酸化細菌及び二価の鉄イオンを加え、１〜４のｐＨ範囲に保持して、当該鉄酸化細菌を培養することにより、水銀イオンを金属水銀に還元して気化させて水銀化合物及び／又は水銀イオンで汚染された土壌又は汚染水を浄化することを特徴とする汚染土壌又は汚染水の浄化方法にもある。ここでも、前記気化方法の好適態様を適用できる。
【００１１】
本発明は、水銀化合物及び／又は水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに、水銀耐性鉄酸化細菌及び二価の鉄イオンを加え、１〜４のｐＨ範囲に保持して、鉄酸化細菌を培養することにより、気化した水銀を測定することを特徴とする水銀の検出方法にもある。ここでも、前記気化方法の好適態様を適用できる。
【００１２】
本発明は、水銀耐性鉄酸化細菌又はその細胞膜若しくはその含有酸化酵素、水銀イオン及び二価の鉄イオンを含む混合物を、１〜４のｐＨ範囲に保持することにより、水銀イオンを金属水銀に還元して気化させることを特徴とする水銀の気化方法にもある。前記のように、本発明の水銀の気化方法は、水銀耐性鉄酸化細菌の培養により行われるが、当然鉄酸化細菌から水銀の気化に有効な成分、即ち水銀耐性鉄酸化細菌の細胞膜若しくは細菌に含有される酵素（鉄酸化酵素）を用いて水銀の気化を行うことも可能である。これらの複数の使用も可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の水銀の気化方法の特徴は、二価の鉄イオンの存在下に、１〜４のｐＨ範囲内で、水銀耐性鉄酸化細菌を培養することにより、そこに含まれる水銀を気化させる点にある。即ち、鉄酸化細菌、水銀イオン及び二価の鉄イオンを含有する系（培養液、廃水等）を、ｐＨ１〜４の範囲内において培養し、主として鉄イオンの酸化を利用して、水銀イオンを還元する方法である。
【００１４】
本発明の方法で利用される水銀耐性鉄酸化細菌は、チオバチルス属細菌の中の、還元型無機硫黄化合物またはＦｅ2+をエネルギー源とする細菌、即ちチオバチルス・フェロオキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans)）の一種である。この細菌は、前述したように、鉄や硫黄の酸化ばかりでなく、モリブデンイオンの酸化、還元、酸化鉄の還元、銅イオンの還元、マンガンイオンの還元等の反応に触媒作用を有する。この細菌の生育に適したｐＨは約２〜４であり、このｐＨ範囲で水銀処理ができなければ、実用性が低い。本発明者等は、この点を考慮して水銀処理について検討を重ねた結果、ｐＨ１〜４の範囲で、Ｆｅ2+の存在下に、水銀耐性鉄酸化細菌（例えば、チオバチルス・フェロオキシダンスＳＵＧ２−２株）を培養することにより、水銀イオンが還元されて金属水銀に変化することを見出した。通常、単に金属イオンと細菌の種類の組合せにのみ注意を払いがちであるが、このような複合系において特定の金属イオンが有効に還元されることは予想できないことである。上記チオバチルス・フェロオキシダンスは、土壌中から容易に単離することができ、単離したチオバチルス・フェロオキシダンスの約２０％に水銀耐性株が含まれており、これを本発明で利用することができる。水銀耐性株は、培地に水銀を含ませることにより、鉄酸化細菌から選択することができる。チオバチルス・フェロオキシダンスＳＵＧ２−２株は、土壌中より以下に示す方法で分離したチオバチルス・フェロオキシダンス水銀耐性株である。即ち、自然界からの単離は、二価鉄を含んだ無機塩培地（ｐＨ２．５）中で集積培養後、これを、培地を含む１％ジェランガムプレートに塗布してコロニーを形成させることにより得ることができる。
【００１５】
上記二価の鉄イオンの発生源は、ＦｅＳＯ4、ＦｅＣｌ2、Ｆｅ（ＮＯ3）2、ＦｅＯ、ＦｅＳ、Ｆｅ（ＯＨ）2等を挙げることができるが、ＦｅＳＯ4が好ましい。全体の混合物（培養液）を２０ｍｌとした場合、これに対して、鉄イオンは、一般に１μモル〜１００ｍモル、好ましくは１０μモル〜１００ｍモルで使用される。
【００１６】
上記水銀イオンは通常＋２価で存在し、汚染源となる化合物はＨｇＳＯ4、ＨｇＣｌ2、Ｈｇ（ＮＯ3）2、ＨｇＯ、ＨｇＳ、Ｈｇ（ＣＨ3）2、ＦｅＦ2、ＦｅＢｒ2等を挙げることができる。
【００１７】
上記ｐＨ１〜４（好ましくは２〜４）の調整は、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸等の無機酸、或いは酢酸等の有機酸が用いられるが、通常硫酸が用いられる。さらに、ｐＨ調整のため、リン酸塩等の緩衝液が一般に使用される。
【００１８】
また、培養に適当な温度は１０〜４０℃が一般的で、２０〜３５℃が好ましい。
【００１９】
本発明の水銀の気化方法は、実験的には基本培地を用いて例えば下記のように行うことができる。
【００２０】
三角フラスコに、所定のｐＨに調整された基本培地（一般に液体）数１０ｍｌに、０．１〜１００μモルのＨｇ2+（例えば、塩化水銀を使用）及び１μモル〜１００ｍモルのＦｅ2+（例えば、硫酸鉄を使用）を添加する。これに、水銀耐性鉄酸化細菌を適量（例、ＳＵＧ２−２株の培養液を０．１〜１ｍｌ、又は洗浄細胞（休止菌体）を０．０１〜１０ｍｇ）添加する。これらを混合、懸濁させる。水銀の気化量を測定するために、フラスコ内に、２ｍｌのＫＭｎＯ4（５０ｇ／ｌ）を有する小試験管を置き、これにより気化水銀をトラップする。
【００２１】
鉄酸化細菌添加後、一定時間毎に鉄酸化細菌の生育量、培地中のＦｅ2+と水銀量を測定する。
【００２２】
この培養により、数時間〜数日で、二価の鉄イオンが酸化されてほとんど無くなり、水銀イオンのほとんどが金属水銀となり気化される。これは、二価の鉄イオンの酸化により水銀イオンが還元されたためと考えられる。上記水銀イオンの還元には、水銀耐性鉄酸化細菌が使用されるが、この水銀耐性には水銀還元酵素のみならず鉄酸化酵素の重要な構成成分の１つのチトクロームｃオキシダーゼ(cytchrome c oxidase)がＨｇ2+に耐性であるためと推定される。この点について、本発明者等が行った実験−即ちチトクロームｃオキシダーゼの活性を強く阻害するＫＣＮ（２ｍモル）、ＡｇＮＯ3（１ｍモル）、Ｎａ2ＭｏＯ4（１０ｍモル）、Ｎａ2ＷＯ4（１０ｍモル）を培養液に添加すると水銀の気化が強く阻害された−によっても窺うことができる。従って、これらの菌の細胞膜、（酸化）酵素も同様な目的で使用することができるのは当然である。
【００２３】
本発明の水銀化合物及び／又は水銀イオンで汚染された土壌又は汚染水を浄化する方法は、上記の水銀の気化方法を利用して行うことができる。
【００２４】
即ち、水銀化合物及び／又は水銀イオンで汚染された土壌又は汚染水に、上記水銀耐性鉄酸化細菌及び二価の鉄イオンを加え、１〜４のｐＨ範囲に保持して、鉄酸化細菌を培養することにより、水銀イオンを金属水銀に還元して気化させて、浄化を行うことができる。
【００２５】
実際には、汚染土壌の場合は、汚染土壌を掘削して槽に集め（土壌掘削法）、これに対して上記の材料を投入し、培養して、気化して水銀を捕獲する。あるいは、汚染土壌に水等を通すことにより、汚染物質を抽出し、その抽出液を下記の汚染水と同様に処理することもできる。汚染水は、井戸等を用いて槽に集め、これに上記の材料を投入し、培養して、気化して水銀を捕獲することができる。また、本発明の浄化方法が利用できる限り、他のどのような処理方法、例えば土壌ガス吸引法、地下水揚水法等も用いることができる。
【００２６】
また、水銀耐性鉄酸化細菌の培養を促進するため、栄養剤としてリン酸アンモニウム等Ｎ、Ｐ、Ｋ等の塩類を使用することができる。
【００２７】
本発明の水銀イオンの定量方法は、前記の水銀の気化方法を利用して行うことができる。
【００２８】
即ち、水銀化合物及び／又は水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに、水銀耐性鉄酸化細菌及び二価の鉄イオンを加え、１〜４のｐＨ範囲に保持して、鉄酸化細菌を一定期間（好ましくは約一週間）培養することにより、気化した水銀を測定することができる。また気化した水銀の量を測定することにより水銀濃度を決定することもできる。測定は迅速に行う必要があることから、二価の鉄イオンを前記範囲の高い量で使用することが好ましい。単に水銀イオンの有無を検出するのは短時間で可能であるが、定量を行う場合は、先に既知試料で濃度の検量線を作成し、一定時間の金属水銀への変換率から求めることができる。水銀の気化量は、例えば還元気化原子吸光法によって定量することができる。
【００２９】
本発明の水銀の気化方法、浄化方法及び検出方法について、ここまで、鉄酸化細菌を用いる方法のみ説明したが、鉄酸化細菌から水銀の気化に有効な成分、即ち細菌の細胞膜若しくは細菌に含有される酸化酵素（好ましくはチトクロームｃオキシダーゼ）を用いて水銀の気化を行うことも可能である。また、これらを組み合わせて使用することも可能である。
【００３０】
【実施例】
［実施例１］
（鉄酸化細菌の生育による水銀の気化）
５０ｍｌの三角フラスコに、９Ｋ基本培地（ｐＨ２．５）１９ｍｌに、０．７μモルのＨｇ2+（塩化水銀を使用）及び３％のＦｅ2+となるようにＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ添加した。これに、水銀耐性鉄酸化細菌のチオバチルス・フェロオキシダンスＦｕｎｉｓ２−１株及び水銀感受性鉄酸化細菌のチオバチルス・フェロオキシダンスＡＰ１９−３の培養液を１ｍｌを種菌として加えた。
【００３１】
培養液添加後、一定時間毎に鉄酸化細菌の生育量、培地中のＦｅ2+と水銀量を測定する。
【００３２】
水銀の気化量を測定するために、フラスコ内に、２ｍｌのＫＭｎＯ4（５０ｇ／ｌ）を有する小試験管を置き、これにより気化水銀をトラップした。
【００３３】
結果を図１に示す。
【００３４】
図１から分かるように、水銀耐性鉄酸化細菌のチオバチルス・フェロオキシダンスＦｕｎｉｓ２−１株の培養液に水銀を添加すると、細菌の生育の増加と培地中のＦｅ2+の減少に伴って、水銀の気化量が増大した。一方、水銀感受性鉄酸化細菌のチオバチルス・フェロオキシダンスＡＰ１９−３では、水銀の気化量は少なかった。従って、両株とも水銀気化作用はあるが、特に水銀耐性鉄酸化細菌であるＦｕｎｉｓ２−１株においてはその作用が大きい。即ち、鉄酸化細菌は、その生育中に水銀を還元して毒性の少ない金属水銀として気化するため、水銀の存在する培地でもＦｅ2+が存在すれば生育ができることが分かる。
【００３５】
［実施例２］
（水銀耐性鉄酸化細菌の洗浄細胞による水銀の気化における二価鉄酸化依存性）５０ｍｌの三角フラスコに、９Ｋ基本培地（ｐＨ２．５）１９ｍｌに、０．７μモルのＨｇ2+（塩化水銀を使用）及び１００μモルのＦｅ2+（硫酸鉄・７水塩を２７．８ｍｇ使用）を添加する。これに、水銀耐性鉄酸化細菌のチオバチルス・フェロオキシダンスＳＵＧ２−２株０．０６７ｍｌ（ＳＵＧ２−２株１ｍｌ中に洗浄細胞１５ｍｇ含有）を添加した。Ｆｅ2+の濃度について、１００μモル以外の、０μモル、２０μモル（硫酸鉄・７水塩５．５６ｍｇ）、５００μモル（硫酸鉄・７水塩１３９ｍｇ）についても同様に行った。
【００３６】
0004578597.tif 000002
【００３７】
水銀の気化量を測定するために、フラスコ内に、２ｍｌのＫＭｎＯ4（５０ｇ／ｌ）を有する小試験管を置き、これにより気化水銀をトラップした。
【００３８】
培養液添加後、任意の時間毎（３０分後、６０分後、１８０分後）に水銀の気化率を測定した。
【００３９】
結果を図２に示す。
【００４０】
図２から分かるように、ＳＵＧ２−２株はＦｅ2+の濃度に依存して水銀気化量が増大した。水銀の気化量は、５００μモルのＦｅ2+を培養液に添加することにより、添加しないものの約３倍となった。これにより、水銀気化の機構が二価鉄イオンの酸化に依存して行われていると考えることができる。
【００４１】
［実施例３］
（水銀耐性鉄酸化細菌の水銀の気化におけるｐＨ依存性）
５０ｍｌの三角フラスコに、９Ｋ基本培地（ｐＨ２．３）１９ｍｌに、０．７μモルのＨｇ2+（塩化水銀を使用）及び１００μモルのＦｅ2+（硫酸鉄・７水塩を２７．８ｍｇ使用）を添加し、さらにチオバチルス・フェロオキシダンスＳＵＧ２−２株０．０６７ｍｌ（洗浄細胞１ｍｇ含有）を添加して培養液を作成した。同様にしてｐＨ１〜５の範囲で種々のｐＨの培養液を作成した。
【００４２】
水銀の気化量を測定するために、フラスコ内に、２ｍｌのＫＭｎＯ4（５０ｇ／ｌ）を有する小試験管を置き、これにより気化水銀をトラップした。
【００４３】
培養液添加後、１８０分後に水銀の気化率を測定した。
【００４４】
結果を図３に示す。
【００４５】
図３から分かるように、ＳＵＧ２−２株の水銀気化活性の最適ｐＨは２．３であった。得られた活性ｐＨ範囲は、水銀耐性鉄酸化細菌の最適生育ｐＨ及び鉄酸化酵素活性の最適ｐＨと類似しており、水銀耐性鉄酸化細菌の生育、即ち鉄の酸化により水銀気化がなされるていると考えられる。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の水銀の気化方法は、水銀耐性鉄酸化細菌の増殖可能な酸性のｐＨ範囲において、２価の鉄イオンの存在下に水銀イオンの還元、気化する方法であり、従来の前記特開平２−１６７０８２号公報に開示されたチオバルス菌属の水銀還元酵素のみを利用するために、この酵素をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた大腸菌由来の新規なプラスミドを用いるという複雑、困難な方法をではなく、極めて簡便な方法で水銀イオンの処理が可能である。即ち、本発明の方法は主として２価の鉄イオンの酸化を利用するものであるため、酸性領域で、即ち水銀耐性鉄酸化細菌の増殖領域で容易に実施でき、且つ鉄酸化細菌を大腸菌等に組み込むこと無く、そのまま利用できる点で、従来にない画期的な気化方法である。
【００４７】
本発明の方法は、極めて簡便な水銀イオンの気化方法であるので、水銀化合物及び／又は水銀イオンで汚染された土壌又は汚染水の浄化に利用できるのは明らかであり、さらに水銀の検出方法にも当然利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１の実験結果（鉄酸化細菌の生育による水銀気化）のグラフである。
【図２】図２は、実施例２の実験結果（水銀耐性鉄酸化細菌の洗浄細胞による水銀気化における二価鉄酸化依存性）のグラフである。
【図３】図３は、実施例３の実験結果（水銀耐性鉄酸化細菌の水銀気化におけるｐＨ依存性）のグラフである。
【図１】
0004578597.tif 000003
【図２】
0004578597.tif 000004
【図３】
0004578597.tif 000005