(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤に対する耐性が野生型大腸菌の700倍以上である大腸菌dnaQ49株を作成する方法であって、
（a）大腸菌dnaQ49株を所定の温度で培養することによって、そのゲノムDNAに変異を導入する工程、
（b）当該薬剤に対する耐性を有する大腸菌dnaQ49株を選択する工程、および
（c）当該薬剤に対する大腸菌dnaQ49株の耐性が野生型大腸菌の700倍以上に増加するまで前記工程（a）および前記工程（b）を繰り返す工程、
を含み、前記工程（b）の2回目以降はその前の工程（b）よりも高い薬剤濃度で行い、前記工程（a）の2回目以降は直前の工程（b）と同一の薬剤濃度で行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法で作成され、6,000μg/mlの濃度のアンピシリン存在下で増殖する大腸菌dnaQ49株。
【請求項３】
請求項１の方法で作成され、500μg/mlの濃度のオフロキサシン存在下で増殖する大腸菌dnaQ49株。
【請求項４】
請求項１の方法で作成され、7000μg/mlの濃度のナリジキ酸存在下で増殖する大腸菌dnaQ49株。
【請求項５】
請求項１の方法で作成され、26,000μg/mlの濃度のストレプトマイシン存在下で増殖する大腸菌dnaQ49株。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、細胞または生物個体に効率良く突然変異を導入でき、かつ、処理細胞や処理個体群の絶滅の危険性を低減できる、有効かつ効果の高いランダム突然変異導入方法と、この方法によって得られる変異体および変異表現型遺伝子に関するものである。
背景技術
細胞や生物個体を遺伝的に改変する技術には、細胞や生物個体に紫外線、放射線、変異原物質等の変異原を作用させて遺伝子にランダム突然変異を誘発させる方法、細胞や生物個体に外来の遺伝子を導入して遺伝子工学的に改変する方法等がある。また、特定の遺伝子に突然変異を誘発させる場合にはＰＣＲ増幅技術を利用してＤＮＡに複製ミスを蓄積させるインビトロ突然変異誘発や部位特異的突然変異誘発などの遺伝子工学的手法を利用する方法も知られている。
一般に、改変したい遺伝子や変異を導入する部位などが明らかとなっている場合は遺伝子工学的手法が有効な場合があるが、改変したい表現型やその遺伝子についての知識が不十分な場合においては、遺伝子にランダムに突然変異を導入し、得られる変異体から目的とする変異表現型を有する細胞や生物個体を選択するランダム突然変異誘発を利用する方法が有効である。このランダム突然変異誘発には細胞や生物個体に紫外線やＸ線、あるいは、放射線を照射して突然変異を誘発させる方法、ナイトロジェン・マスタードやニトロソグアニジンなどの変異原物質を作用させて突然変異を誘発させる方法がある。
従来のランダム突然変異の導入技術においては、紫外線や変異原などにより誘発される突然変異率が処理の効率や効果に重要な影響を及ぼしている。すなわち、誘発される突然変異率が至適な範囲内においてはＤＮＡに有効な量の突然変異が蓄積されるが、至適量より少なければ導入された突然変異がＤＮＡの修復機構等により修復されることがあり、効率よく突然変異を導入できない。また、至適量を超えた場合は、導入される突然変異による生物体への致死効果が強くなり、目的の変異体を得る前に突然変異導入処理群が絶滅し、目的とする変異体が得られない結果となる。
また、至適量は一回の処理あたりの量のみならず、より有用性の高い変異体を得るために変異導入処理と変異体の選択を複数回交互に継続して行う場合も同様で、注意深く至適量を決定しなければ効率が悪いか、または変異導入処理群の絶滅によって、結果的に有用性の高い変異体を得ることができない。さらに、ランダム突然変異導入によって改変したい細胞や生物個体の表現型が単一の遺伝子に複数の突然変異を導入する必要がある場合や、複数の遺伝子に突然変異を導入する必要がある場合などは、これらの遺伝子に好ましい変異が蓄積されるまでランダム突然変異を挿入する必要があるが、多数の突然変異の蓄積は生存に必要な遺伝子にも致死的な変異が導入される危険が高くなり、突然変異率を高くすればするほど処理した細胞や生物個体の絶滅の危険性が高まり、効率的に有用な突然変異体を得ることが期待できなくなる。
また、最近、細胞や生物個体を遺伝的に改変する目的ではないが、それぞれ、ＤＮＡ塩基対のミスペアの校正機能、Ａ／Ｔ−Ｇ／Ｃトランスバージョン、ＤＮＡのミスマッチ修復等に係わるミューテーター遺伝子であるｍｕｔＤ、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＴを同時に持つ大腸菌変異株の突然変異率が野生株の５千倍であることを利用し、この菌株内でプラスミドに挿入した遺伝子に効率よくランダム突然変異を導入する方法も開発されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１８９−１９５，１９９７）。この方法によると２４世代、約１日の培養でプラスミド上の遺伝子に１，０００塩基対当たり１個の突然変異を導入できる。しかしながら、このような高い突然変異率は変異を導入したい遺伝子の変異誘発の確率を増加させるが、同時に生存に必要な遺伝子など他の遺伝子にも変異を導入する危険性を高める。このため、突然変異を導入したいＤＮＡ領域の長さが１００塩基対以下である場合や何カ所にも突然変異を入れたい場合は、増殖世代数が増大し実際的でないという理由でＰＣＲ法が推奨されている。また、突然変異率が高いために本菌株の長期的な培養は菌自体やその遺伝子型が影響を受けるので注意が必要であることも指摘されている。従って、この方法は宿主に導入したプラスミド上の遺伝子に突然変異を導入するには適していても、宿主自体を遺伝的に改変することには適していない。
以上のとおり、従来の細胞や生物個体へのランダム突然変異導入方法においては、多くの突然変異導入と変異導入処理群の絶滅回避とは二律背反の要件であって、多様かつ有用な変異体を高率よく得ることは困難であった。
この出願の発明は、以上の事情に鑑みてなされたものであって、細胞や生物個体に高い突然変異率でランダム突然変異を導入しつつ、同時に処理群の絶滅の危険性を低減し、効率よく有用かつ多様な突然変異体を得る方法を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決する発明として、細胞または生物個体の二重鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖に他方よりも多く点突然変異を導入することを特徴とする遺伝子への突然変異導入方法を提供する。
この発明の突然変異導入方法における第１の好ましい態様は、二重鎖ゲノムＤＮＡを構成する４種の塩基に対してランダムに点突然変異を導入する突然変異導入方法である。
第２の好ましい態様は、細胞または生物個体が、突然変異修復機構遺伝子群にミューテーター遺伝子を有する変異細胞株または変異生物個体である突然変異導入方法である。なお、この変異細胞株または変異生物個体は、ミューテーター遺伝子を本来的に有するものでもよく、あるいは外来性のミューテーター遺伝子を導入されたものでもよい。
第３の好ましい態様は、上記方法において、ミューテーター遺伝子が、ｄｎａＱ、ｄｎａＥ、ｍｕｔＬ、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＨ、ｕｖｒＤ、ｄａｍからなる群より選択される１種または２種以上のミューテーター遺伝子である突然変異導入方法である。
第４の好ましい態様は、上記方法において、ミューテーター遺伝子が、所定の条件下で突然変異修復機構の欠損を生じさせる遺伝子である突然変異導入方法である。
第５の好ましい態様は、上記方法において、突然変異修復機構の欠損条件が所定の温度である突然変異導入方法である。
第６の好ましい態様は、上記方法において、所定の条件下でゲノムＤＮＡへ突然変異を導入する工程と、突然変異を導入しない選択圧条件で変異体を選択する工程を繰り返すことを特徴とする突然変異導入方法である。
第７の好ましい態様は、前記態様において、第２回目以降の突然変異導入工程を、直前の変異体選択工程と同一の選択圧下で行う突然変異導入方法である。
この出願はまた、別の発明として、上記の突然変異導入方法のいずれかによってゲノムＤＮＡに突然変異が導入された細胞または生物個体の突然変異体、およびこの突然変異体より単離された変異遺伝子を提供する。
発明を実施するための最良の形態
自然突然変異は次の様な経緯で固定される。まず、染色体ＤＮＡに物理的、化学的に影響を与える生体内代謝産物や酸素ラジカルなどにより損傷が発生したり、ＤＮＡ複製のエラーなどにより誤った塩基対が生じる。このような染色体ＤＮＡに生じる損傷や複製エラーは前変異損傷と呼ばれ、この前変異損傷が次回のＤＮＡ複製の際に修復されないと染色体ＤＮＡに突然変異として固定される。自然突然変異における前変異損傷発生の原因の殆どは複製エラーであり、物理的、化学的な影響による染色体ＤＮＡの損傷の割合は少ない（ＣＲＣ，１（３）：１４０−１４８，１９９２）。複製エラーはＤＮＡ合成の際に４種の塩基の互変異性に基づく誤った塩基対の形成によって起こり、その頻度は１０−４から１０−５である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈ  Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ  ＆  Ｌｏｎｄｏｎ  ２２４−２２５，１９８３）。一方、細胞には種々の突然変異修復機能があり、ＤＮＡ合成酵素の持つ校正機能やミスマッチ修復系などによってそれぞれ１０−３程度ずつ前変異損傷は修復され、最終的に塩基置換による点突然変異が固定される頻度は１塩基あたり１０−１０から１０−１１まで低下する（ＣＲＣ，１（３）：１４０−１４８，１９９２）。この他にも、塩基の挿入、欠失によるフレームシフト突然変異があるが、その頻度は非常に小さい。
従来のランダム突然変異誘発処理は、放射線、紫外線などのエネルギー線照射や変異原物質処理による物理的、化学的な影響を強めて染色体ＤＮＡに前変異損傷を増加させ、その変異が固定化される確率を高めるものである。変異原の種類と誘発される前変異損傷にはそれぞれ特徴があり、例えば、紫外線では点突然変異と欠失突然変異が同程度誘発されるが点突然変異ではＧ／Ｃ−Ａ／Ｔ方向のトランジション変異がよく起こるとされている。また、Ｘ線ではＤＮＡ鎖の二本鎖の一方のみが切断される１本鎖切断と両方が切断される２本鎖切断があり、その結果、点突然変異や欠失突然変異が引き起こされるが欠失突然変異が点突然変異よりも１０倍起こりやすい（分子放射線生物学、近藤宗平著、東京大学出版会、１３８−１３９、１９７２年）。
一方、複製エラーや突然変異の修復に関係し、突然変異を増加させるミューテーター遺伝子には様々なものが知られており、その機能別に５つに分類することができる（ＣＲＣ，１（３）：１４０−１４８，１９９２）。第１は、ＤＮＡ複製エラーの制御系に係わるＤＮＡ合成酵素のαサブユニットの変異である。現在までに知られているのはｄｎａＥ遺伝子であり、このミューテーター遺伝子は突然変異を千倍から１０万倍増加させる。第２は、ミスペアを即座に取り除く校正機能に関与するＤＮＡ合成酵素のεサブユニットの変異である。このミューテーター遺伝子としてはｄｎａＱ（ｍｕｔＤ）が知られており、これも千倍から１０万倍突然変異を増加させる。第３は、校正機能が修正し損なったミスペアを除去修復するミスマッチ修復に係わるもので、ｍｕｔＬ、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＨ、ｕｖｒＤ、ｄａｍ、ｍｕｔＹ、ｍｕｔＭ、ｕｎｇが知られており、それぞれ１０倍から千倍突然変異を増加させる。第４は、ＤＮＡ原料となるヌクレオチドプールの浄化機能に関するもので、Ａ／Ｔ−Ｇ／Ｃトランスバージョンのみを増加させるｍｕｔＴが知られている。このミューテーター遺伝子を持つ細胞は増殖に伴ってＤＮＡ中のＧＣ含量を増加させていき、千倍から一万倍の変異を誘発する。最後のグループにはｍｕｔＡ、ｍｕｔＣが属し、これらは全てのタイプのトランスバージョンを１０倍程度増加させるが、その機能については良く知られていない。
このように突然変異の原因となる前変異損傷の成因と誘発される突然変異は変異原によって異なっており、このことはランダム突然変異誘発にどのような変異原を用いるかによって、その効果が異なる可能性があることを示唆している。また、ランダム突然変異の効果を高めるためには、塩基の挿入や欠失によるフレームシフト突然変異や特定の塩基対のトランスバージョンの頻度を増加させるより、全ての塩基に対してランダムに点突然変異を導入することが有効である。
この出願の発明者らは、二重鎖ＤＮＡの両方のＤＮＡ鎖に均等に突然変異が入った場合（パリティ）と一方のＤＮＡ鎖に突然変異が不均衡に蓄積された場合（ディスパリティ）の突然変異数とその分布に関するシュミレーションを行っている。その結果、ゲノムあたり一回の分裂で一カ所の突然変異が入る条件（パリティ）では、１０世代後の突然変異の分布は１２回のシュミレーションの全てで突然変異数のモードが１０個付近にあり、その分布は２個から２０個となること、また、世代を重ねると概ね世代数が突然変異数のモードとなり、同様の分布がシフトする傾向があることを示している。一方、全体の突然変異率は同じでも二重鎖ＤＮＡの片方の鎖にもう片方の１００倍以上の確率で突然変異が入る条件（ディスパリティ）では、１０世代後の突然変異数のモードは１０個であるがその分布は０個から２４個となることを見出している。このことは、総突然変異数が同じでも、ＤＮＡ鎖の一方に多く突然変異が蓄積される場合は世代経過後の突然変異数の分布が異なることを示している（Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５７，１２７−１３３，１９９２）。
発明者らによるこれらの知見はランダム突然変異を導入する際に重要である。前変異損傷を起こさせる原因として放射線、紫外線などのエネルギー線や変異原物質を用いた場合には、二重鎖ＤＮＡの両方の鎖にランダムに前変異損傷が誘起されると考えられる。この場合の突然変異数の分布は上述のパリティの場合と同様である。一方、ミューテーター遺伝子の多くは前変異損傷を修復する機能に関係しているので、結果として固定される突然変異数の分布は次の様に理解される。ｍｕｔＴはＡ／Ｔ−Ｇ／Ｃの塩基特異的な修復機能に関係するので、突然変異はＧＣ塩基対増加的である。これに対し、ｍｕｔＹ、ｍｕｔＭ、ｕｎｇはｍｕｔＴとは逆の塩基依存性であり、同様にＡＴ塩基対増加的である。ｄｎａＥ、ｄｎａＱは二重鎖ＤＮＡのラギング鎖での複製エラーの制御、校正機能に関与しているためにＤＮＡ鎖依存性である。ｍｕｔＬ、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＨやｕｖｒＤ、ｄａｍはミスマッチ修復に関与しているが、塩基やＤＮＡ鎖に対して特異性はないので、前変異損傷の状態を反映すると考えられる。同様にｍｕｔＡおよびｍｕｔＣも塩基やＤＮＡ鎖に対する特異性はなく、全てのタイプのトランスバージョン修復に関与する。
ところで、実際の突然変異の効果は、致死的効果を持つもの、遺伝子機能に影響を与えないか殆ど与えない中立的なもの、機能に何らかの変更が加わるものに分けられる。一般に致死的効果を示さない突然変異が保存される可能性がある。また、突然変異のランダム性についてはミューテーター遺伝子の機能を考えると、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＹ、ｍｕｔＭ、ｕｎｇは特定の塩基対を増加させる傾向がある。また、変異原の中にもチミジンダイマーを形成させるなど特定の前変異損傷を増加させるものがある。このようなタイプの突然変異誘発はランダム性に関して充分でないことが予想され、これらを突然変異誘発に用いると特定の変異が蓄積されることとなり、生物体の遺伝的改良効果に制限が生じる可能性がある。
一方、ＤＮＡ合成の際には４種の塩基の互変異性に基づく誤った塩基対の形成は４種の塩基に対してランダムに起こり、これに基づく前変異損傷が修復されなければ染色体ＤＮＡにランダムな突然変異を導入することができると考えられる。これらを可能にするのはｄｎａＥやｄｎａＱなどＤＮＡ校正機能に係るミューテーター遺伝子である。
さらに、この出願の発明者らは、温度感受性変異性のミューテーター遺伝子であるｄｎａＱ４９を持つ大腸菌に挿入したプラスミドにおいて、数回の複製後、ラギング鎖のほうがリーディング鎖よりも数倍から百倍、突然変異率が高いことを見いだしている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５１：６５７−６６４，１９９６）。そしてさらに、この出願の発明者らは、実施例４に示したように、ｄｎａＱ４９株のゲノムＤＮＡにおいても、リーディング鎖よりもラギング鎖に多くの変異が生じることを見出している。二重鎖ＤＮＡに不均衡に突然変異が蓄積されることは均衡に蓄積される場合と異なり、突然変異の多様性が高まると推察される。
細胞または生物個体に絶滅の危険性を低下させつつ効率的、効果的に突然変異を導入するためには、処理群に存在する細胞や生物個体の遺伝的多様性を大きくすることが必要であり、そのためには４種の塩基にランダムに点突然変異を導入しつつ、二重鎖ＤＮＡに不均衡に点突然変異を分布させることが重要である。
この出願の発明者らは、これらの知見に基づき、ＤＮＡ鎖の一方に他方より多くのランダムな点突然変異を多く蓄積させることにより、突然変異率を上げつつ変異処理細胞や生物個体の絶滅の危険性を低下させて効率的、効果的に突然変異体を得る方法を開発した。具体的には、例えば、遺伝的に改変または改良を行いたい細胞や生物個体に校正機能に係るミューテーター遺伝子を導入し、ＤＮＡ鎖の一方に他方より多くランダムな点突然変異を蓄積させる条件で突然変異誘発処理を行う。また、ミューテーター遺伝子に温度感受性などの条件発現的ミューテーター遺伝子を利用することも好ましい。このようなミューテーター遺伝子を用いた場合には、温度条件等の操作によって、突然変異の導入と変異体の固定を任意に設定することが可能となる。誘発させる突然変異率は好ましくは自然突然変異の１００倍から１０万倍の範囲で、一方のＤＮＡ鎖が他方に対して数倍から１００倍以上の突然変異を蓄積する条件が適当である。
なお、ミューテーター遺伝子を持つ細胞や生物個体は公知の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３、１３６１−１３６７，１９８３）によって得ることができる。また、遺伝子工学的にミューテーター遺伝子を導入することも可能である。
さらに、突然変異を導入する工程と変異体を選択する工程を別個に行い、突然変異を誘発する工程では選択圧をかけない条件で行い、処理個体群を一定の数まで増殖させた後、変異体を固定、選択する工程を行い、２回目以降、同様の操作を繰り返すことにより効率的、効果的に目的とする突然変異体を得ることができる。
以下、実施例を示し、この出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１
温度感受性のミューテーター遺伝子（ｄｎａＱ）を持つＫＨ１３６６（ｄｎａＱ４９）株およびＫＨ１３７０（ｄｎａＱ＋）株（奈良先端科学技術大学院大学の真木寿治教授より入手）を培養し、各々のアンピシリン耐性の程度を測定した。
なお、ｄｎａＱ４９株は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのεサブユニットが変異しており、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのプルーフリーディング機能に欠陥がある。このためＤＮＡ複製エラーを校正できず、全ての塩基置換による変異が発生する。この変異は温度感受性であるために培養温度が２４℃から３７℃にシフトすることにより、突然変異率が１０−９から１０−４に増加する。一方、ｄｎａＱ＋株はｄｎａＱ４９株の復帰突然変異によりＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのεサブユニットが正常になった株である。このｄｎａＱ＋株はｄｎａＱ４９株の野生型として用いた（以下、ｄｎａＱ＋株を野生型と記載することがある）。
まず、突然変異を誘発していないｄｎａＱ４９株および野生型を種々の濃度のアンピシリンを含む寒天培地に播種し、２４℃で２日間培養してコロニーを形成させ、ｄｎａＱ４９株および野生株のアンピシリン濃度−生残曲線を作成した。Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ，Ａ−９５１８）は精製水に溶解して原液とし、培養液に望む希釈濃度になるよう加えた。また、濃度−生残曲線の作成には培養液の５５０ｎｍに於ける吸光度測定により行った。
結果は第１図に示したとおりであり、ｄｎａＱ４９株のほうが野生型よりもわずかにアンピシリン耐性が強いことが確認された。
次いで、ｄｎａＱ４９株および野生型を、各々、５ｍｌのＬ−ｂｒｏｔｈ培地に２，０００個／ｍｌの密度で播種し、変異導入温度である３７℃で２４時間培養した。なお、野生型には、公知の変異原物質である１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＭＮＮＧ；Ａｌｄｒｉｃｈ  １２，９９４−１）を０〜６０μｇ／ｍｌ培地の濃度で培地に加えた。
２４時間培養後に増殖してきた菌を回収し、様々なアンピシリン濃度の培地で２４℃で４８時間培養し、各大腸菌の生残率をコロニー形成法により決定した。
第２図は、３７℃で２４時間変異させたｄｎａＱ４９株、野生型およびＭＮＮＧ野生型のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。ｄｎａＱ４９株のアンピシリン耐性最大濃度は３０μｇ／ｍｌであり、野生型およびＭＮＮＧ野生型（３〜６μｇ／ｍｌ）に比べ有意に高いことが確認された。なお、６０μｌ／ｍｇ濃度のＭＮＮＧ存在下で培養した野生型は全く増殖しなかったことから、高濃度のＭＮＮＧは生存に必要な遺伝子にも変異を生じさせ、その結果として絶滅したものであると考えられる。
次いで、上記２４℃の培養において生育した最大濃度のアンピシリン含有培地のコロニーを用い、第２回目の突然変異導入を行った。すなわち、ｄｎａＱ４９株は３０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有培地で、ＭＮＮＧ  １０μｇ／ｍｌ処理群はアンピシリン６μｇ／ｍｌ含有培地で、その他のＭＮＮＧ処理群は３μｇ／ｍｌアンピシリン含有培地でそれぞれ２４℃で培養し、増殖した菌を洗浄後、２０００個／ｍｌの密度に調整し、３７℃で２４時間培養した。次いで、菌を洗浄した後、種々のアンピシリン濃度の培地に播種し、２４℃で２−３日間培養し、コロニーを形成させ、各大腸菌の生残率を測定した。なお、ＭＮＮＧ処理群は実施例２と同様の濃度のＭＮＮＧを処理した。
第３図は、２回目の変異導入を行ったｄｎａＱ４９株、野生型および各ＭＮＮＧ処理群のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。ｄｎａＱ４９株のアンピシリン耐性最大濃度は３００μｇ／ｍｌであり、野生型およびＭＮＮＧ野生型（６〜３０μｇ／ｍｌ）に比べ有意に高いことが確認された。なお、第３図に結果を示していないＭＮＮＧ処理群は絶滅したことを示している。
以下、同様の操作を繰り返し、５回目まで変異導入を行った。２４℃での増殖におけるアンピシリン濃度（前のコロニー形成時におけるアンピシリン耐性最大濃度）および２４℃でのコロニー形成日数は表１に示したとおりである。また、図４〜６はそれぞれ第３〜５回目の変異導入後のアンピシリン濃度−生残曲線である。
これらの結果から明らかなように、５回目までの変異誘発処理によって、約６，０００μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下でも増殖するｄｎａＱ４９株が得られた。また、同様の変異導入操作を別のｄｎａＱ４９株で実施したところ、５回の変異誘発処理によって約１０，０００μｇ／ｍｌまでのアンピシリン耐性菌株が得られた（図７）。なお、このような操作の過程で絶滅したｄｎａＱ４９株は無かった。この菌体内にはプラスミドは存在せず、この耐性能がゲノム遺伝子の変異によるものであることが示された。
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また、このアンピシリン耐性ｄｎａＱ４９株に対する種々の抗生物質の最小増殖阻止濃度（ＭＩＣ）を調べたところ、アンピシリンと同様のβ−ラクタム系抗生物質であるセフオタキシムに対しても強い耐性を示したが、アンピシリンとは作用機序の異なる抗生物質に対しては耐性能を獲得していなかった（表２）。なお、これまで報告されているアンピシリン耐性大腸菌の耐性濃度は１，５００μｇ／ｍｌであるが、この耐性能はプラスミドによるものである。また、アンピシリンを加えずに３７℃で変異誘発を行った場合には、１０回の操作でもアンピシリン耐性菌を得ることは出来なかった。
これらの結果、変異原を用いたコントロールおよびこれまで報告されている耐性菌に比べ、高濃度のアンピシリンに耐性を示す耐性菌を短期間に獲得することができた。一方、ＭＮＮＧ処理群では、高濃度処理では菌の絶滅が起こり、低濃度処理では３００μｇ／ｍｌの耐性菌しか得られなかった。
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実施例２
実施例１と同様にしてｄｎａＱ４９株に変異を導入し、オフロキサシン、ナリジキ酸、ストレプトマイシンの各々に対する薬剤耐性菌を作製した。その結果、表３〜５に示したとおり、５００μｇ／ｍｌまでのオフロキサシン耐性菌、７，０００μｇ／ｍｌのナリジキ酸に対する耐性菌、２６，０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンに対する耐性菌を得た。
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また、オフロキサシン耐性菌において、菌の耐性獲得に関連する酵素の変異を解析したところ、耐性度の低い菌（１〜３０μｇ／ｍｌ）ではジャイレースＡの８３位のセリンがロイシンに変異していた。また、耐性度１００μｇ／ｍｌの菌はジャイレースＡの８３位のセリンがロイシンに変異しているのに加え、耐性増加に必要な他の酵素であるトポイソメラーゼＩＶの８０位のセリンがアルギニンに変異していた（表６）。この結果から、この発明の方法によって、複数の遺伝子に効率よく変異導入が可能であることが示された。また、導入された変異は臨床的に観察された耐性菌の変異と同じものであり、耐性能が上昇するにつれて固定される変異が増加する耐性獲得のメカニズムも同じものであった（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３：１２８−１３８，１９９７）。
以上の結果は、この発明の方法が、種々の生物機能の発現に関連する複数の遺伝子を一度に改変することが可能であること、そして、そのような遺伝子の多様な改変により、薬剤耐性菌など新たな変異体の出現予測やそのメカニズムの解明などに利用できることを示している。
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実施例３
実施例１と同様にしてｄｎａＱ４９株に変異を導入し、アルカリ耐性菌を作製した。その結果、表７に示したとおり、１２回の突然変異誘発によりｐＨ９．８までの耐性菌を得た。
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実施例４
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉのａｍｐＣ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０１６１１，Ｊ０１５８３）の４２４９−４２５１位のコドン”ａｔｔ”は、”ｔｔｔ”に変異しやすいことが知られている。そこで、この部位の変異がリーディング鎖の変異に起因するか、それともラギング鎖の変異に起因するかを検討した。
１．方法
Ｅ．ｃｏｌｉのａｍｐＣ遺伝子はラギング鎖として合成されることが知られているので、４２６０−４２１２位の−鎖プラス付加配列（配列番号１）をラギング鎖のｆｉｄｅｌｉｔｙ測定用のプローブとした。また、４２３５−４２８１位の＋鎖プラス付加配列（配列番号２）をリーディング鎖のｆｉｄｅｌｉｔｙ測定用プローブとした。
さらに、配列番号３のオリゴヌクレオチドをラギング鎖およびリーディング鎖のｆｉｄｅｌｉｔｙ測定用のリンカーＤＮＡとした。
先ず、ｄｎａＱ４９を１世代時間（菌浮遊液のＯＤ５５０が２倍になるのに要する時間）、３７℃で培養した後、ゲノムＤＮＡを精製し、制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩおよびＭｓｐＩで処理してａｍｐＣ遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ断片（４２１２−４２７９位）を得た。
得られたＤＮＡ断片、ラギング鎖のｆｌｄｅｌｉｔｙ測定用プローブおよびリンカーＤＮＡをハイブリダイズさせた。同様に、ＤＮＡ断片、リーディング鎖のｆｉｄｅｌｉｔｙ測定用プローブおよびリンカーＤＮＡをハイブリダイズさせた。
各々のプローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片とリンカーＤＮＡとをＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションさせ、ＤＮＡを精製した後、”ａａｔｔ”を認識する制限酵素ＴＳＰＥＩで処理した。
次いで、ラギング鎖のｆｉｄｅｌｉｔｙ測定用プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を、配列番号４の塩基配列（４２７９−４２５９位の−鎖）を有するオリゴヌクレオチドとリンカーＤＮＡ（配列番号２）をそれぞれプライマーとしてＰＣＲ増幅した。また、リーディング鎖のｆｉｄｅｌｉｔｙ測定用プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を、配列番号５の塩基配列（４２１２−４２３２位の＋鎖）を有するオリゴヌクレオチドとリンカーＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ増幅した。
なお、コントロールとして、野生型ｄｎａＱ＋株のａｍｐＣ遺伝子についても、同様の手続によりラギング鎖およびリーディング鎖の変異を検討した。
２．  結果
ＰＣＲ増幅の結果は第８図に示したとおりである。この第８図は、各々のＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で解析した結果であり、レーン１はマーカー、レーン２および３は、ｄｎａＱ＋株ａｍｐＣ遺伝子由来のＤＮＡ断片のＰＣＲ産物を電気泳動した結果である。このレーン２および３のバンドから明らかなように、ラギング鎖測定用プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片（レーン２）、およびリーディング鎖測定用プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片（レーン３）においては１００ｂｐあたりのバンドは観察されなかった。このことは、ｄｎａＱ＋株のａｍｐＣ遺伝子には、ラギング鎖、リーディング鎖ともに変異が生じていないことを意味する。すなわち、いずれのＤＮＡ断片もコドン”ａｔｔ”が変異していないために、ＰＣＲ前の制限酵素ＴＳＰＥＩ処理によって切断され、その結果、ＰＣＲ増幅されなかった。
一方、レーン４および５は、ｄｎａＱ４９株ａｍｐＣ遺伝子由来のＤＮＡ断片のＰＣＲ産物を電気泳動した結果である。このレーン４および５に示した結果から明らかなように、リーディング鎖測定用プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片（レーン５）には１００ｂｐのＰＣＲ産物の存在を示すバンドは観察されないが（すなわち、リーディング鎖には変異が生じていない）、ラギング鎖測定用プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片（レーン４）の場合には、１００ｂｐのＰＣＲ産物の存在を示すバンドが観察された。
以上の結果から、大腸菌ｄｎａＱ４９株の場合には、ゲノムＤＮＡのレベルにおいてもリーディング鎖よりもラギング鎖のほうがより多くの変異を蓄積することが確認された。
産業上の利用可能性
この出願の発明によって、微生物や細胞、または生物個体の多様かつ有用な変異体を効率的、効果的に作製することができる。また、遺伝子の変異の状況を解析することにより、薬剤耐性のメカニズムの解明、新規な耐性菌の発生予測やその対応薬剤の開発への利用やガン遺伝子の変異と転移や悪性度の増加のメカニズムの解析とその治療法の開発等が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、変異導入前のｄｎａＱ４９株および野生株のアンピシリン濃度−生残曲線である。
第２図は、第１回目の変異導入後のｄｎａＱ４９株、野生型およびＭＮＮＧ野生型のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。
第３図は、第２回目の変異導入後のｄｎａＱ４９株、野生型およびＭＮＮＧ野生型のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。
第４図は、第３回目の変異導入後のｄｎａＱ４９株、野生型およびＭＮＮＧ野生型のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。
第６図は、第４回目の変異導入後のｄｎａＱ４９株、野生型およびＭＮＮＧ野生型のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。
第６図は、第５回目の変異導入後のｄｎａＱ４９株、野生型およびＭＮＮＧ野生型のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。
第７図は、別のｄｎａＱ４９株における第５回目の変異導入後のアンピシリン感受性を示すアンピシリン濃度−生残曲線である。
第８図は、野生型ｄｎａＱ＋株およびｄｎａＱ４９株のそれぞれのａｍｐＣ遺伝子由来のＤＮＡ断片のアガロース電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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