(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）分子であって、該Ｆｎ３は、野生型Ｆｎ３分子（図２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基において安定化変異を含み、ここで、該安定化変異が不利な静電気相互作用に関与する少なくとも１つのアミノ酸残基の置換であり、該分子における該安定化変異が、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９またはＡｓｐ２３の少なくとも１つの中性または正に荷電したアミノ酸残基への置換である、Ｆｎ３分子。
【請求項２】
前記安定化変異が、（ａ）Ａｓｐ７もしくはＡｓｐ２３またはこれら両方の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；（ｂ）Ｇｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；ならびに（ｃ）Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換からなる群より選択される、不利な静電気相互作用に関与する置換を有する、請求項１に記載のＦｎ３分子。
【請求項３】
Ａｓｐ７もしくはＡｓｐ２３またはこれら両方が、アスパラギン（Ａｓｎ）残基またはリジン（Ｌｙｓ）残基で置換されている、請求項１に記載のＦｎ３分子。
【請求項４】
Ｇｌｕ９が、アスパラギン（Ａｓｎ）残基またはリジン（Ｌｙｓ）残基で置換されている、請求項１に記載のＦｎ３分子。
【請求項５】
ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）ポリペプチドモノボディであって、複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列を含み、ここで、
１以上の該モノボディループ領域の配列が、野生型のＦｎ３（図２）の対応するループ領域の配列とは、少なくとも２アミノ酸の欠失、挿入または置換によって異なり；
該Ｆｎ３が、野生型Ｆｎ３分子（図２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基において安定化変異を含み、ここで、該安定化変異が不利な静電気相互作用に関与する少なくとも１つのアミノ酸残基の置換であり、該分子における該安定化変異が、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９またはＡｓｐ２３の少なくとも１つの中性または正に荷電したアミノ酸残基への置換であり、
少なくとも１つのループ領域が、特異的結合パートナー（ＳＢＰ）と結合して、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体を形成する
Ｆｎ３ポリペプチドモノボディ。
【請求項６】
請求項５に記載のＦｎ３ポリペプチドモノボディであって、前記安定化変異が、（ａ）Ａｓｐ７もしくはＡｓｐ２３またはこれら両方の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；（ｂ）Ｇｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；ならびに（ｃ）Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換からなる群より選択される、不利な静電気相互作用に関与する置換を有し；そして
前記１以上のモノボディループ領域がＦＧループに含まれるアミノ酸残基７６〜８７を含み、そして、以下の図：
【化１】
0004578768.tif 000067
に示す変異のうち１つを含むか；または
前記１以上のループ領域がＢＣループに含まれるアミノ酸残基２２〜３０およびＦＧループに含まれるアミノ酸残基７６〜８７を含み、そして、以下の図：
【化２】
0004578768.tif 000068
【化３】
0004578768.tif 000069
に示す変異のうち１つを含む、Ｆｎ３ポリペプチドモノボディ。
【請求項７】
請求項１に記載のＦｎ３分子をコードする、単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子に作動可能に連結された発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
前記ポリペプチド：ＳＢＰ複合体は、１０−６モル／リットル未満の解離定数を有する、請求項５に記載のモノボディ。
【請求項１１】
少なくとも１つのループ領域が、Ｋｃａｔ／Ｋｕｎｃａｔの比が１０より大きくなるように、触媒速度定数（Ｋｃａｔ）および非触媒速度定数（Ｋｕｎｃａｔ）で化学反応の遷移状態を結合および安定化し得る、請求項５に記載のモノボディ。
【請求項１２】
請求項５に記載のモノボディであって、前記ループ領域の１以上が、以下のアミノ酸残基：
ｉ）ＡＢループに含まれる、１５〜１６；
ｉｉ）ＢＣループに含まれる、２２〜３０；
ｉｉｉ）ＣＤループに含まれる、３９〜４５；
ｉｖ）ＤＥループに含まれる、５１〜５５；
ｖ）ＥＦループに含まれる、６０〜６６；および
ｖｉ）ＦＧループに含まれる、７６〜８７；
を含む、モノボディ。
【請求項１３】
前記１以上のモノボディループ領域がＦＧループに含まれるアミノ酸残基７６〜８７を含む、請求項５に記載のモノボディ。
【請求項１４】
前記１以上のモノボディループ領域が、ＢＣループに含まれるアミノ酸残基２２〜３０およびＦＧループに含まれるアミノ酸残基７６〜８７を含む、請求項５に記載のモノボディ。
【請求項１５】
前記モノボディループ領域の配列が、少なくとも２アミノ酸の欠失または置換によって、前記野生型のＦｎ３ループ領域の配列とは異なる、請求項５に記載のモノボディ。
【請求項１６】
前記モノボディループ領域の配列が、３〜２５アミノ酸の挿入によって、前記野生型のＦｎ３ループ領域の配列とは異なる、請求項５に記載のモノボディ。
【請求項１７】
請求項５に記載のポリペプチドモノボディをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子に作動可能に連結された発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項１９】
前記発現ベクターが、Ｍ１３ファージベースのプラスミドである、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項５に記載のＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）ポリペプチドモノボディを調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列をコードするＤＮＡ配列を提供する工程であって、少なくとも１つのループ領域が、特有の制限酵素部位を含み、そして該複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列の少なくとも１つが、中性のｐＨで野生型のＦｎ３よりも安定である、工程；
ｂ）該特有の制限部位で該ＤＮＡ配列を切断する工程；
ｃ）特異的結合パートナー（ＳＢＰ）または遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）と結合し得るペプチドをコードすることが既知のＤＮＡセグメントを、該制限部位に挿入して、該挿入物および工程（ａ）のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を得る工程；ならびに
ｄ）該ＤＮＡ分子を発現して、ポリペプチドモノボディを得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項５に記載のＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）ポリペプチドモノボディを調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列をコードする複製可能なＤＮＡ配列を提供する工程であって、少なくとも１つのループ領域のヌクレオチド配列が、既知であり、そして該複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列の少なくとも１つが、中性のｐＨで野生型のＦｎ３よりも安定である、工程；
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件下でハイブリダイズ可能であるように、該既知のループ配列に十分相補的なＰＣＲプライマーを調製する工程であって、少なくとも１つの該プライマーが、該ＤＮＡに挿入される改変核酸配列を含む、工程；
（ｃ）工程（ａ）のＤＮＡ配列および工程（ｂ）のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の反応産物をアニーリングおよび伸長させて、ＤＮＡ産物を得る工程；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）のＤＮＡ産物によってコードされる該ポリペプチドモノボディを発現する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項５に記載のＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）ポリペプチドモノボディを調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列をコードする複製可能なＤＮＡ配列を提供する工程であって、少なくとも１つのループ領域のヌクレオチド配列が、既知であり、そして該複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列の少なくとも１つが、中性のｐＨで野生型のＦｎ３よりも安定である、工程；
ｂ）少なくとも１つのループ領域の部位特異的変異誘発を実施して、挿入変異を含むＤＮＡ配列を作製する工程；ならびに
ｃ）該挿入変異を含む該ＤＮＡ配列によってコードされる該ポリペプチドモノボディを発現する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットは、複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列をコードする複製可能なＤＮＡを含む、キット。
【請求項２５】
各々が複数のループ領域を含む複数の核酸種を含むＦｎ３ポリペプチドモノボディをコードする、多様化核酸ライブラリーであって、該種が、複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列をコードし、ここで、
１以上の該ループ領域の配列が、野生型のＦｎ３（図２）の対応するループ領域の配列とは、少なくとも２アミノ酸の欠失、挿入または置換によって異なり；
該Ｆｎ３が、野生型Ｆｎ３分子（図２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基において安定化変異を含み、ここで、該安定化変異が不利な静電気相互作用に関与する少なくとも１つのアミノ酸残基の置換であり、該安定化変異が、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９またはＡｓｐ２３の少なくとも１つの別のアミノ酸残基への置換である、多様化核酸ライブラリー。
【請求項２６】
請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリーであって、前記安定化変異が、（ａ）Ａｓｐ７もしくはＡｓｐ２３またはこれら両方の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；（ｂ）Ｇｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；ならびに（ｃ）Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換からなる群より選択される、不利な静電気相互作用に関与する置換を有し；そして
前記１以上のループ領域が残基７６〜８７を含むＦＧアミノ酸ループをコードし、そして、以下の図：
【化４】
0004578768.tif 000070
に示す変異のうち１つを含むか；または
前記１以上のループ領域が残基２２〜３０を含むＢＣアミノ酸ループおよび残基７６〜８７を含むＦＧアミノ酸ループをコードし、そして、以下の図：
【化５】
0004578768.tif 000071
【化６】
0004578768.tif 000072
に示す変異のうち１つを含む、多様化核酸ライブラリー。
【請求項２７】
請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリーであって、前記ループ領域の１以上が、以下：
ｉ）残基１５〜１６を含むＡＢアミノ酸ループ；
ｉｉ）残基２２〜３０を含むＢＣアミノ酸ループ；
ｉｉｉ）残基３９〜４５を含むＣＤアミノ酸ループ；
ｉｖ）残基５１〜５５を含むＤＥアミノ酸ループ；
ｖ）残基６０〜６６を含むＥＦアミノ酸ループ；および
ｖｉ）残基７６〜８７を含むＦＧアミノ酸ループ；
をコードする、多様化核酸ライブラリー。
【請求項２８】
前記１以上のループ領域がＦＧアミノ酸ループの残基７６〜８７をコードする、請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項２９】
前記１以上のループ領域が、残基２２〜３０を含むＢＣアミノ酸ループおよび残基７６〜８７を含むＦＧアミノ酸ループをコードする、請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３０】
前記ループ領域の配列が、少なくとも２アミノ酸の欠失または置換によって、前記野生型のＦｎ３ループ領域の配列とは異なる、請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３１】
前記モノボディループ領域の配列が、３〜２５アミノ酸の挿入によって、前記野生型のＦｎ３ループ領域の配列とは異なる、請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３２】
多様化核酸配列が、前記種の前記ループ領域のいずれか１つに挿入される６〜７５核酸塩基を含む、請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３３】
前記多様化配列が、システインまたは終止コドンをコードするコドンからなる群より選択される１以上のコドンを回避するように構築される、請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３４】
前記多様化核酸配列が、ＢＣループ内に位置する、請求項２７に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３５】
前記多様化核酸配列が、ＤＥループ内に位置する、請求項２７に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３６】
前記多様化核酸配列が、ＦＧループ内に位置する、請求項２７に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３７】
前記多様化核酸配列が、ＡＢループ内に位置する、請求項２７に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３８】
前記多様化核酸配列が、ＣＤループ内に位置する、請求項２７に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項３９】
前記多様化核酸配列が、ＥＦループ内に位置する、請求項２７に記載の多様化核酸ライブラリー。
【請求項４０】
請求項２５に記載の多様化核酸ライブラリーに由来する、ペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４１】
前記ペプチドが、バクテリオファージまたはウイルスの表面に提示される、請求項４０に記載のペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４２】
前記バクテリオファージが、Ｍ１３またはｆｄである、請求項４１に記載のペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４３】
特異的結合パートナー（ＳＢＰ）と結合して、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体を形成し得るポリペプチド分子のアミノ酸配列を同定する方法であって、該ポリペプチド：ＳＢＰ複合体の解離定数は、１０−６モル／リットル未満であり、該方法は、以下の工程：
ａ）請求項４１に記載のペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程；
ｂ）工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーを、固定化ＳＢＰまたは分離可能なＳＢＰと接触させる工程；
ｃ）該ペプチド：ＳＢＰ複合体を、遊離ペプチドから分離する工程；
ｄ）工程（ｃ）の分離されたペプチドの複製を引き起こして、より低い多様性を有し、かつ該ＳＢＰを結合し得る提示されたペプチドが豊富であることによって、工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーと区別される、新規のペプチドディスプレイライブラリーを生じる工程；
ｅ）工程（ｄ）の新規ライブラリーを用いて、必要に応じて、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程；ならびに
ｆ）工程（ｄ）由来の種の提示されたペプチドをコードする領域の核酸配列を決定し、そして該ＳＢＰに結合し得るペプチド配列を推測する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
請求項２５に記載のＦｎ３ポリペプチドモノボディをコードする、多様化核酸ライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）予め決定された配列を有するＦｎ３ポリペプチドモノボディを調製する工程；
ｂ）該ポリペプチドを特異的結合パートナー（ＳＢＰ）と接触させて、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体を形成させる工程であって、該ポリペプチド：ＳＢＰ複合体の解離定数が１０−６モル／リットル未満である、工程；
ｃ）核磁気共鳴分光法またはＸ線結晶学によって、該ポリペプチド：ＳＢＰ複合体の結合構造を決定する工程；ならびに
ｄ）該多様化核酸ライブラリーを調製する工程であって、該多様化が、工程（ｃ）で提供される情報から、該ＳＢＰに対する改善された結合を有する１以上のポリペプチドを生じる核酸配列中の位置で実施される、工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
ｋｃａｔ／ｋｕｎｃａｔの比が１０より大きくなるように、触媒速度定数（ｋｃａｔ）および非触媒速度定数（ｋｕｎｃａｔ）で化学反応の遷移状態に結合しそして安定化する能力を有するポリペプチド分子のアミノ酸配列を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項４１に記載のペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程；
ｂ）工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーを、該化学反応の適切な分子遷移状態を示す、固定化された遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）または分離可能な遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）と接触させる工程；
ｃ）ペプチド：ＴＳＡＣ複合体を、遊離ペプチドから分離する工程；
ｄ）工程（ｃ）の分離されたペプチドの複製を引き起こして、より低い多様性を有し、かつ該ＴＳＡＣを結合し得る提示されたペプチドが豊富であることによって、工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーと区別される、新規のペプチドディスプレイライブラリーを生じる工程；
ｅ）工程（ｄ）の新規ライブラリーを用いて、必要に応じて、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程；ならびに
ｆ）工程（ｄ）由来の種の提示されたペプチドをコードする領域の核酸配列を決定し、それによって、該ペプチド配列を推測する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
請求項２５に記載のＦｎ３ポリペプチドモノボディをコードする、多様化核酸ライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）予め決定された配列を有するＦｎ３ポリペプチドモノボディを調製する工程であって、該ポリペプチドは、ｋｃａｔ／ｋｕｎｃａｔの比が１０より大きくなるように、触媒速度定数（ｋｃａｔ）および非触媒速度定数（ｋｕｎｃａｔ）で化学反応の遷移状態に結合しそして安定化する能力を有する、工程；
ｂ）該ポリペプチドを、該化学反応の適切な分子遷移状態を示す、固定化された遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）または分離可能な遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）と接触させる工程；
ｃ）核磁気共鳴分光法またはＸ線結晶学によって、該ポリペプチド：ＴＳＡＣ複合体の結合構造を決定する工程；ならびに
ｄ）該多様化核酸ライブラリーを調製する工程であって、該多様化が、工程（ｃ）で提供される情報から、該ＴＳＡＣに対する改善された結合または該ＴＳＡＣの安定化を有する１以上のポリペプチドを生じる核酸配列中の位置で実施される、工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
特異的結合パートナー（ＳＢＰ）と結合して、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体を形成し得るポリペプチド分子のアミノ酸配列を同定するためのキットであって、該ポリペプチド：ＳＢＰ複合体の解離定数は、１０−６モル／リットル未満であり、該キットは、請求項４１に記載のペプチドディスプレイライブラリーを含む、キット。
【請求項４８】
ｋｃａｔ／ｋｕｎｃａｔの比が１０より大きくなるように、触媒速度定数（ｋｃａｔ）および非触媒速度定数（ｋｕｎｃａｔ）で化学反応の遷移状態に結合しそして安定化する能力を有するポリペプチド分子のアミノ酸配列を同定するためのキットであって、該キットは、請求項４１に記載のペプチドディスプレイライブラリーを含む、キット。
【請求項４９】
請求項１に記載のＦｎ３分子であって、前記安定化変異は、前記Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３またはＧｌｕ９の、中性アミノ酸の残基での少なくとも１つの置換である、Ｆｎ３分子。
【請求項５０】
前記安定化変異が、（ａ）Ａｓｐ７もしくはＡｓｐ２３またはこれら両方の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；（ｂ）Ｇｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；ならびに（ｃ）Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９の、中性アミノ酸残基での置換からなる群より選択される置換である、請求項１に記載のＦｎ３分子。
【請求項５１】
請求項１に記載のＦｎ３分子であって、前記安定化変異は、前記Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３またはＧｌｕ９の、正に荷電したアミノ酸の残基での少なくとも１つの置換である、Ｆｎ３分子。
【請求項５２】
前記安定化変異が、（ａ）Ａｓｐ７もしくはＡｓｐ２３またはこれら両方の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；（ｂ）Ｇｌｕ９の、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基での置換；ならびに（ｃ）Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９の、正に荷電したアミノ酸残基での置換からなる群より選択される置換である、請求項１に記載のＦｎ３分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の一部は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの助成（助成番号ＧＭ５５０４２）を通じた米国政府の補助により行なわれた。従って、米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、該して、分子生物学の方法による結合ポリペプチドおよび触媒ポリペプチドの産生および選択の分野に関する。本発明は特に、改変されたＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）分子の分子的足場をコードする核酸ライブラリーおよびポリペプチドライブラリーの両方の作製に関する。本発明はまた、「人工ミニ抗体」または「モノボディ」、すなわち、種々の異なる分子構造（例えば、抗体結合部位）に結合し得るループ領域が移植されたＦｎ３足場を含むポリペプチドに関する。
【０００３】
（発明の背景）
（抗体構造）
標準的な抗体（Ａｂ）は、２つの同一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖および２つの同一の軽鎖からなる四量体構造である。Ａｂの重鎖および軽鎖は、異なるドメインからなる。各々の軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有するが、各々の重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つまたは４つの可変ドメイン（ＣＨ）を有する（Ａｌｚａｒｉら、１９８８）。約１１０アミノ酸残基からなる各々のドメインは、互いに対してパックされた２つのβ−シートから形成される特徴的なβ−サンドイッチ構造（免疫グロブリンフォールド）に折り畳まれる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインの各々は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）を有し、これらはこのドメインの１つの末端のβ鎖に連結されたループまたはターンである（図１：Ａ、Ｃ）。軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、一般的に、抗原の特異性に寄与するが、特異性に対する個々の鎖の寄与は、必ずしも同じではない。抗体分子は、６つの無作為化ループ（ＣＤＲ）を使用することにより、多くの分子に結合するよう進化する。しかし、抗体の大きさおよび６つのループの複雑さは、最終結果が比較的小さなペプチドリガンドである場合、大きな設計上の障害となる。
【０００４】
（抗体構造）
Ａｂの機能的構造は、タンパク質分解および組換え方法により調製され得る。機能的構造として、Ｆａｂフラグメント（単一の鎖間ジスルフィド結合により連結された重鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメインおよび軽鎖のＶＬ−ＣＬ１ドメインを含む）およびＦｖフラグメント（ＶＨドメインおよびＶＬドメインのみを含む）が挙げられる。いくつかの場合、単一のＶＨドメインが、大きな親和性を保持する（Ｗａｒｄら、１９８９）。特定の単量体κ軽鎖が、その同族抗原に特異的に結合することもまた示された（Ｌ．Ｍａｓａｔら、１９９４）。分離された軽鎖または重鎖は、しばしば、ある程度の抗原結合活性を保持することが見出された（Ｗａｒｄら、１９８９）。これらの抗体フラグメントは、それらの大きさ、低可溶性、またはコンフォメーションの低安定性に起因して、ＮＭＲスペクトルを用いた構造分析に適さない。
【０００５】
別の機能的構造は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーにより共有結合した免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域からなる（Ｓ−ｚ  Ｈｕら、１９９６）。これらの小さい（Ｍｒ２５，０００）タンパク質は、一般的に、単一のポリペプチド中の抗原に対する特異性および親和性を保持し、そしてより大きな抗原特異的分子に対する便利なビルディングブロックを提供し得る。いくつかのグループは、種々の腫瘍抗原に対して反応性のｓｃＦｖを用いた、異種移植された胸腺欠損マウスにおける体内分布研究を報告した。これらの研究において、特異的な腫瘍局在化が観察された。しかし、循環におけるｓｃＦｖの短い持続性は、腫瘍細胞のｓｃＦｖへの曝露を制限し、取り込みのレベルを制限する。結果として、動物研究におけるｓｃＦｖによる腫瘍の取り込みは、一般的に、インタクトな抗体（３０〜４０％ＩＤ／ｇで腫瘍に局在し得、そして６０〜７０％ＩＤ／ｇに相当するレベルに達する）と対照的に、わずか１〜５％ＩＤ／ｇであった。
【０００６】
「ミニボディ」と呼ばれる小さなタンパク質の足場を、テンプレートとしてＩｇ  ＶＨドメインの一部を用いて設計した（Ｐｅｓｓｉら、１９９３）。インターロイキン６に対する高い親和性（解離定数（Ｋｄ）約１０−７Ｍ）を有するミニボディを、ＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に対応するループを無作為化し、次いでファージディスプレイ法を用いて変異体を選択することにより同定した（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４）。これらの実験は、Ａｂ機能の本質が、より小さな系に移行され得ることを実証した。しかし、このミニボディは、ＶＨドメインの限定された可溶性を受け継いだ（Ｂｉａｎｃｈｉら、１９９４）。
【０００７】
ラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）は、それらの血清由来のＩｇＧ様物質が分析され、それにより十分な抗体特異性および抗体親和性がＶＨドメイン（３つのＣＤＲループ）のみに由来し得ることが示唆される場合、可変軽鎖ドメインをしばしば欠損していることが報告されている。ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎは、近年、高い親和性（Ｋｄ約１０−７Ｍ）および高い特異性を有する「ラクダ化」ＶＨドメインが、ＣＤＲ３のみを無作為化することにより作製され得ることを実証した。可溶性を改善し、非特異的結合を抑制するために、３つの変異をフレームワーク領域に導入した（Ｄａｖｉｅｓ  ＆  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９５）。しかし、ラクダ化は、一般的にＶＨの可溶性および安定性を改善するために用いられ得ることが、明確に示されていない。
【０００８】
「ミニボディ」の代替物は、「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」である。ダイアボディは、小さな二価および二特異的な抗体フラグメントである（すなわち、それらは、２つの抗原結合部位を有する）。このフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）上の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重−軽可変ドメイン（ＶＨ）を含む。ダイアボディは、大きさにおいて、Ｆａｂフラグメントと類似する。同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、このドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を作製する。これらの二量体抗体フラグメントまたは「ダイアボディ」は、二価であり、二特異的である（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９９３）。
【０００９】
モノクローナル抗体技術の発展により、複合体化された状態および／または遊離の状態における多くのＡｂフラグメントの３Ｄ構造が、Ｘ線結晶学により解読された（Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９９４；Ｗｉｌｓｏｎ  ＆  Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ、１９９４）。Ａｂ構造の分析により、６つのＣＤＲのうちの５つが、限定的な数のペプチド骨格コンフォメーションを有し、それによっていわゆる標準構造を用いてＣＤＲの骨格コンフォメーションを推定することを可能にすることが明らかにされた（Ｌｅｓｋ  ＆  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、１９９２；Ｒｅｅｓら、１９９４）。また、この分析により、ＶＨドメインのＣＤＲ３（ＶＨ−ＣＤＲ３）は、通常、最も大きな接触表面を有すること、およびそのコンフォメーションは、規定された標準構造に対して多様すぎることが明らかにされた；ＶＨ−ＣＤＲ３はまた、長さにおいても大きなバリエーションを有することが知られている（Ｗｕら、１９９３）。従って、Ａｂ−抗原界面の標準的領域の構造はなお、実験的に決定される必要がある。
【００１０】
遊離状態と複合体化状態の間の結晶構造の比較により、いくつかの型のコンフォメーションの再配列が明らかにされた。それらの再配列として、側鎖の再配列、セグメントの移動、ＶＨ−ＣＤＲ３の大きな再配列、およびＶＨドメインおよびＶＬドメインの相対的な位置の変化が挙げられる（Ｗｉｌｓｏｎ  ＆  Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ、１９９３）。遊離状態において、ＣＤＲ（特に、結合の際に大きなコンフォメーションの変化を起こすＣＤＲ）は、可撓性であると考えられる。Ｘ線結晶学は、分子の可撓性部分の特徴付けに適さないので、この溶液状態における構造研究は、抗原結合部位のコンフォメーションの動的な描画を提供できなかった。
【００１１】
（抗体結合部位の模倣）
ＣＤＲペプチドおよび有機ＣＤＲ模倣物が作製された（Ｄｏｕｇａｌｌら、１９９４）。ＣＤＲペプチドは、抗体のＣＤＲループのアミノ酸配列に対応する短い（代表的に環状の）ペプチドである。ＣＤＲループは、抗体−抗原相互作用に関与する。有機ＣＤＲ模倣物は、足場（例えば、小さい有機化合物）に取り付けられた、ＣＤＲループに対応するペプチドである。
【００１２】
ＣＤＲペプチドおよび有機ＣＤＲ模倣物は、ある程度の結合親和性を保持することが示されている（Ｓｍｙｔｈ  ＆  ｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ、１９９４）。しかし、予想通り、それらは十分な親和性および特異性を維持するには小さすぎるし可撓性でありすぎる。マウスＣＤＲは、親和性を喪失することなく、ヒトＩｇフレームワークに移植された（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）が、この「ヒト化」は、溶液研究に特有の上述の問題を解決しない。
【００１３】
（Ａｂの自然選択プロセスの模倣）
免疫系において、特定のＡｂが、大ライブラリーから選択および増幅される（親和性成熟）。このプロセスは、コンビナトリアルライブラリー技術を用いてインビトロで再現され得る。バクテリオファージの表面上でのＡｂフラグメントの好適なディスプレイは、多くのＣＤＲ変異体の生成およびスクリーニングを可能にする（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０；Ｂａｒｂａｓら、１９９１；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４）。ますます多くのＦａｂおよびＦｖ（ならびにそれらの誘導体）が、この技術により生成され、構造研究のための豊富な供給源を提供している。コンビナトリアル技術は、Ａｂ模倣物と組み合わされ得る。
【００１４】
潜在的にタンパク質足場として機能し得る多くのタンパク質ドメインは、ファージキャプシドタンパク質との融合物として発現されていた（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ＆  Ｗｅｌｌｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１７３−１８４（１９９４）において総説されている）。実際、これらのタンパク質ドメインのうちのいくつかは、ランダムペプチド配列（ウシ膵臓トリプシンインヒビター（Ｒｏｂｅｒｔｓら、ＰＮＡＳ  ８９：２４２９−２４３３（１９９２））、ヒト成長ホルモン（Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１）；Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：７０−７５（１９９４））、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩｇＧ結合ドメイン（Ｏ’Ｎｅｉｌら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖ（Ｃｒａｂｂ，Ｌ，．編）５１７−５２４頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９４））が挙げられる）を提示するための足場としてすでに使用されている。これらの足場は、単一の無作為化されたループまたは領域を提示する。
【００１５】
研究者は、糸状ファージＭ１３における提示用足場として、小さな７４アミノ酸のα−アミラーゼインヒビターＴｅｎｄａｍｉｓｔａｔを使用していた（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌおよびＨｏｅｓｓ、１９９５）。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｄａｅ由来のβ−シートタンパク質である。このタンパク質は、このタンパク質をペプチドのための魅力的な足場にする多くの特徴（その小さな大きさ、安定性、および高分解能ＮＭＲおよびＸ線構造データの利用可能性が挙げられる）を有する。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔの全体的なトポロジーは、免疫グロブリンドメインのトポロジーと類似し、一連のループにより２つのβ−シートが接続されている。免疫グロブリンドメインと対照的に、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのβ−シートは、１つのジスルフィド結合ではなく２つのジスルフィド結合により一つに保持されており、これがこのタンパク質の大きな安定性の要因となっている。免疫グロブリンにおいて見出されるＣＤＲループとの相似性により、このループとＴｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、類似の機能を発揮し得、そしてインビトロでの変異誘発により容易に無作為化され得る。
【００１６】
しかし、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｄａｅから獲得される。従って、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、ヒトにおいて抗原性であり得るが、その小さい大きさは、その抗原性を減少または阻害し得る。また、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔの安定性は、不確定である。さらに、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔに関して報告されているその安定性は、２つのジスルフィド結合の存在に起因する。しかし、ジスルフィド結合は、還元性条件下で分解され得、そして有用なタンパク質構造を有するために適切に形成されなければならない点で、このような分子に対する大きな短所である。さらに、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ中のループの大きさは比較的小さく、従って、足場に含まれ得る挿入の大きさを制限する。さらに、新規に合成されるタンパク質において正確なジスルフィド結合を形成することは簡単ではないことが、周知である。タンパク質が、タンパク質の過剰発現についての最も一般的な宿主細菌であるＥ．ｃｏｌｉの細胞質空間で発現される場合、通常、ジスルフィド結合は形成されず、大量の操作された分子を調製することを潜在的に困難にする。
【００１７】
従って、種々の治療適用、診断適用、および触媒適用のための小さな単鎖の人工抗体に対する必要性が存在し続けている。特に、中性ｐＨにおいて構造的に安定な人工抗体に対する必要性が存在し続けている。
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、安定な変異を含む、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）分子を提供する。安定な変異は、この変更を含まない同一な分子と比較して、融点が０．１℃より大きく上昇したＦｎ３分子のアミノ酸配列における改変または変更（例えば、１つのアミノ酸の、別のアミノ酸への置換）として、本明細書で規定される。あるいは、この変更は、０．５℃より大きくまたは１．０℃より大きくさえも融点を上昇させ得る。Ｆｎ３分子の融点を決定するための方法を、以下の実施例１９に与える。
【００１９】
Ｆｎ３は、欠失されたかまたは少なくとも１つの他のアミノ酸残基で置換された、少なくとも１つのアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基および／または少なくとも１つのグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基を有し得る。例えば、Ａｓｐ７および／もしくはＡｓｐ２３ならびに／またはＧｌｕ９は、欠失され得るかまたは少なくとも１つの他のアミノ酸残基と置換され得る。Ａｓｐ７、Ａｓｐ２３、またはＧｌｕ９は、アスパラギン（Ａｓｎ）残基またはリジン（Ｌｙｓ）残基と置換され得る。本発明はさらに、単離された核酸分子および安定な変異を含むＦｎ３分子をコードする発現ベクターを提供する。
【００２０】
本発明は、複数のループ領域配列に連結された複数のＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）β−鎖配列を含むＦｎ３ポリペプチドモノボディを提供する。ここで、このＦｎ３は安定な変異を含む。Ｆｎ３ポリペプチドの１つ以上のモノボディループ領域配列は、野生型Ｆｎ３における対応するループ領域配列由来の少なくとも２つのアミノ酸の欠失、挿入、または置換により変化する。このモノボディのβ−鎖ドメインは、野生型Ｆｎ３のβ−鎖ドメイン配列の対応するアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の総アミノ酸配列の相同性を有する。好ましくは、このモノボディの１つ以上のループ領域は、以下のアミノ酸残基を含む：
ｉ）ＡＢループに含まれる１５〜１６；
ｉｉ）ＢＣループに含まれる２２〜３０；
ｉｉｉ）ＣＤループに含まれる３９〜４５；
ｉｖ）ＤＥループに含まれる５１〜５５；
ｖ）ＥＦループに含まれる６０〜６６；および
ｖｉ）ＦＧループに含まれる７６〜８７。
【００２１】
本発明はまた、安定な変異を含むＦｎ３ポリペプチドモノボディをコードする核酸分子、ならびにこの核酸分子を含む発現ベクターおよびこのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、安定な変異を含むＦｎ３ポリペプチドモノボディを調製する方法を提供する。この方法は、複数のループ領域配列に連結された複数のＦｎ３β−鎖ドメイン配列をコードするＤＮＡ配列を提供する工程（ここで、この配列の１つのループ領域は、固有の制限酵素部位を含む）を包含する。このＤＮＡ配列は、その固有の制限部位で切断される。次いで、前選択されたＤＮＡセグメントが、この制限部位に挿入される。前選択されたＤＮＡセグメントは、特異的な結合パートナー（ＳＢＰ）または遷移状態相似化合物（ＴＳＡＣ）に結合し得るペプチドをコードする。前選択されたＤＮＡセグメントのこのＤＮＡ配列への挿入は、挿入物を有するポリペプチドモノボディをコードするＤＮＡ分子を生成する。次いで、このＤＮＡ分子は、このポリペプチドモノボディを生成するように発現される。
【００２３】
安定な変異を含むＦｎ３ポリペプチドモノボディを調製する方法であって、複数のループ領域配列に連結された複数のＦｎ３β−鎖ドメイン配列をコードする複製可能なＤＮＡ配列を提供する工程を包含する方法（ここで、少なくとも１つのループ領域のヌクレオチド配列が既知である）もまた、提供される。この既知のループ配列に十分に相補的であり、その結果、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件下でハイブリダイズ可能なＰＣＲプライマーが、提供または調製される。ここで、このプライマーの少なくとも１つが、ＤＮＡ配列に挿入される改変された核酸配列を含む。ＰＣＲは、複製可能なＤＮＡ配列およびこのプライマーを用いて実施される。次いで、ＰＣＲの反応産物が発現されて、ポリペプチドモノボディが生成される。
【００２４】
本発明は、安定化変異を含むＦｎ３ポリペプチドモノボディを調製するさらなる方法を提供する。この方法は、複数のループ領域配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメイン配列をコードする複製可能なＤＮＡ配列を提供する工程を包含し、ここで、少なくとも１つのループ領域のヌクレオチド配列が既知である。挿入変異を作製するように少なくとも１つのループ領域の部位指向型変異誘発を実行する。このようにして、挿入変異を含む生じるＤＮＡが発現される。
【００２５】
複数のループ領域配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメイン配列をコードする複数の核酸種を含む、Ｆｎ３ポリペプチドモノボディをコードする多様化核酸ライブラリーが、さらに提供され、ここで、１つの以上のモノボディループ領域配列は、野生型Ｆｎ３中の対応するループ領域由来の少なくとも２つのアミノ酸の欠失、挿入または置換によって変化し、ここで、モノボディのβ鎖ドメインは、野生型Ｆｎ３のβ鎖ドメイン配列の対応するアミノ酸配列に、総アミノ酸配列の少なくとも５０％が相同性であり、ここで、Ｆｎ３は、安定化変異を含む。本発明はまた、本発明の多様化核酸ライブラリーから誘導されるペプチドディスプレイライブラリーを提供する。好ましくは、ペプチドディスプレイライブラリーのペプチドは、バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３バクテリオファージまたはｆｄバクテリオファージ）またはウイルスの表面に提示される。
【００２６】
本発明はまた、特異的結合パートナー（ＳＢＰ）と結合して、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体を形成し得るポリペプチド分子のアミノ酸配列を同定する方法を提供し、ここで、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体の解離定数は、１０−６モル／リットル未満である。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）本発明のペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程；
ｂ）工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーを、固定化ＳＢＰまたは分離可能なＳＢＰと接触させる工程；
ｃ）ペプチド：ＳＢＰ複合体を、遊離ペプチドから分離する工程；
ｄ）工程（ｃ）の分離されたペプチドの複製を引き起こして、より低い多様性を有し、かつ該ＳＢＰを結合し得る提示されたペプチドが豊富であることによって、工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーと区別される、新規のペプチドディスプレイライブラリーを生じる工程；
ｅ）工程（ｄ）の新規ライブラリーを用いて、必要に応じて、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程；ならびに
ｆ）工程（ｄ）由来の種の提示されたペプチドをコードする領域の核酸配列を決定し、それによってＳＢＰに結合し得るペプチド配列を推測する工程。
【００２７】
本発明はまた、各々が複数のループ領域を含む複数の核酸種を有する、Ｆｎ３ポリペプチドモノボディをコードする多様化核酸ライブラリーを調製する方法を提供し、ここで、種は、複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列をコードし、１つ以上のループ領域配列は、野生型Ｆｎ３中の対応するループ領域配列由来の少なくとも２つのアミノ酸の欠失、挿入または置換によって変化し、モノボディのβ鎖ドメイン配列は、野生型Ｆｎ３のβ鎖ドメイン配列の対応するアミノ酸配列に、総アミノ酸配列の少なくとも５０％が相同性であり、ここで、Ｆｎ３は、安定化変異を含む。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）予め決定された配列を有するＦｎ３ポリペプチドモノボディを調製する工程；
ｂ）ポリペプチドを特異的結合パートナー（ＳＢＰ）と接触させて、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体を形成させる工程であって、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体の解離定数が１０−６モル／リットル未満である、工程；
ｃ）核磁気共鳴分光法またはＸ線結晶学によって、ポリペプチド：ＳＢＰ複合体の結合構造を決定する工程；ならびに
ｄ）多様化核酸ライブラリーを調製する工程であって、この多様化は、工程（ｃ）で提供される情報から、ＳＢＰに対する結合が改善された１以上のポリペプチドを生じる核酸配列中の位置で実施される、工程。
【００２８】
ｋｃａｔ／ｋｕｎｃａｔの比が１０より大きくなるような触媒速度定数（ｋｃａｔ）および未触媒速度定数（ｋｕｎｃａｔ）で、化学反応を触媒し得るポリペプチド分子のアミノ酸配列を同定する方法もまた、提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）本発明のペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程；
ｂ）工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーを、化学反応の適切な分子遷移状態を示す、固定化遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）または分離可能な遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）と接触させる工程；
ｃ）ペプチド：ＴＳＡＣ複合体を、遊離ペプチドから分離する工程；
ｄ）工程（ｃ）の分離されたペプチドの複製を引き起こして、より低い多様性を有し、かつＴＳＡＣを結合し得る提示されたペプチドが豊富であることによって、工程（ａ）のペプチドディスプレイライブラリーと区別される、新規のペプチドディスプレイライブラリーを生じる工程；
ｅ）工程（ｄ）の新規ライブラリーを用いて、必要に応じて、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程；ならびに
ｆ）工程（ｄ）由来の種の提示されたペプチドをコードする領域の核酸配列を決定し、それによって、ペプチド配列を推測する工程。
【００２９】
本発明はまた、各々が複数のループ領域を含む複数の核酸種を有する、Ｆｎ３ポリペプチドモノボディをコードする多様化核酸ライブラリーを調製する方法を提供し、ここで、種は、複数のループ領域の配列に連結された複数のＦｎ３  β鎖ドメインの配列をコードし、１つ以上のループ領域配列は、野生型Ｆｎ３中の対応するループ領域配列由来の少なくとも２つのアミノ酸の欠失、挿入または置換によって変化し、モノボディのβ鎖ドメイン配列は、野生型Ｆｎ３のβ鎖ドメイン配列の対応するアミノ酸配列に、総アミノ酸配列の少なくとも５０％が相同性であり、ここで、Ｆｎ３は、安定化変異を含む。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）予め決定された配列を有するＦｎ３ポリペプチドモノボディを調製する工程であって、このポリペプチドは、ｋｃａｔ／ｋｕｎｃａｔの比が１０より大きくなるような触媒速度定数（ｋｃａｔ）および未触媒速度定数（ｋｕｎｃａｔ）で、化学反応を触媒し得る、工程；
ｂ）ポリペプチドを、化学反応の適切な分子遷移状態を示す、固定化遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）または分離可能な遷移状態アナログ化合物（ＴＳＡＣ）と接触させる工程；
ｃ）核磁気共鳴分光法またはＸ線結晶学によって、ポリペプチド：ＴＳＡＣ複合体の結合構造を決定する工程；ならびに
ｄ）多様化核酸ライブラリーを調製する工程であって、多様化は、工程（ｃ）で提供される情報から、ＴＳＡＣに対する結合またはＴＳＡＣの安定化が改善された１以上のポリペプチドを生じる核酸配列中の位置で実施される、工程。
【００３０】
本発明はまた、本発明の方法のいずれかの実行のためのキットを提供する。本発明はさらに、例えば、本発明のキットの使用によって調製されるポリペプチドまたは本発明の方法のいずれかによって同定されるポリペプチドのような組成物を提供する。
【００３１】
以下の略語は、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質を記載する場合に使用される：ＡｌａまたはＡ、アラニン；ＡｒｇまたはＲ、アルギニン；ＡｓｎまたはＮ、アスパラギン；ＡｓｐまたはＤ、アスパラギン酸；ＣｙｓまたはＣ、システイン；ＧｌｎまたはＱ、グルタミン；ＧｌｕまたはＥ、グルタミン酸；ＧｌｙまたはＧ、グリシン；ＨｉｓまたはＨ、ヒスチジン；ＩｌｅまたはＩ、イソロイシン；ＬｅｕまたはＬ、ロイシン；ＬｙｓまたはＫ、リジン；ＭｅｔまたはＭ、メチオニン；ＰｈｅまたはＦ、フェニルアラニン；ＰｒｏまたはＰ、プロリン；ＳｅｒまたはＳ、セリン；ＴｈｒまたはＴ、トレオニン；ＴｒｐまたはＷ、トリプトファン；ＴｙｒまたはＹ、チロシン；ＶａｌまたはＶ、バリン。
【００３２】
以下の略語は、核酸、ＤＡＮ、またはＲＮＡを記載する場合に使用される：Ａ、アデノシン；Ｔ、チミジン；Ｇ、グアノシン；Ｃ、シトシン。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
過去１０年間にわたって、免疫系は、デノボの触媒の豊富な供給源として、利用されてきた。触媒性抗体は、化学選択性、エナンチオ選択性、大きな割合の加速、および化学反応の経路を変更する能力さえも有することが示された。ほとんどの場合において、これらの抗体は、遷移状態アナログ（ＴＳＡ）ハプテンに対して惹起された。これらのＴＳＡハプテンは、エネルギー的に不安定な遷移状態種（これは、反応物と生成物との間の反応経路に沿って、短時間（およその半減期１０−１３秒）出現する）の構造を模倣するように設計された、安定な低分子量の化合物である。抗ＴＳＡ抗体は、天然の酵素と同様に、遷移状態を選択的に結合し、そして安定化させ、これによって、反応物から生成物への経過を容易にすると考えられる。従って、結合の際に、この抗体は、実際の遷移状態のエネルギーを低下させ、そして反応速度を増加させる。これらの触媒は、遷移状態の幾何学的特徴および静電特徴に結び付くようプログラムされ得、その結果、その反応経路は、望ましくない電荷を中和すること、エントロピー障壁に打ち克つこと、およびその反応の静電的特徴に影響を与えることによって、制御され得る。この手段によって、触媒されなければ非常に望ましくない反応でさえも、触媒された（Ｊａｎｄａら、１９９７）。さらに、多くの例において、触媒は、既知の天然酵素も人工酵素も存在しない反応のために、作製された。
【００３４】
任意のコンビナトリアルケミストリーシステムの、特定の機能を得る際の成功は、ライブラリーの大きさおよびそのメンバーに接近する能力に依存する。最もしばしば、反応の遷移状態を模倣するハプテンに対して動物において作製される抗体が、このハプテンへの結合について最初にスクリーニングされ、次いで、触媒活性について再度スクリーニングされる。改善された方法は、ファージにおける抗体ライブラリーからの触媒の直接的な選択を可能にし、これによって、化学と複製とを結び付ける。
【００３５】
抗体フラグメントのライブラリーは、無作為化抗体遺伝子をそのファージのコートタンパク質をコードする遺伝子に添加することによって、線維状ファージウイルスの表面に作製され得る。次いで、各ファージは、単一の抗体フラグメントの複数のコピーを、その表面に発現し、そしてディスプレイする。各ファージが、表面にディスプレイされる抗体フラグメントとそのフラグメントをコードするＤＮＡとの両方を保有するので、標的に結合する抗体フラグメントは、関連するＤＮＡを増幅することによって、同定され得る。
【００３６】
免疫化学者は、抗原として、可能な限り低い化学反応性を有する物質を使用する。最終的な抗体がネイティブな構造と相互作用することを望むことは、ほとんど常にそうである。反応性の免疫においては、この概念は全く逆になる。高度に反応性である化合物で免疫し、その結果、誘導プロセスの間のこの抗体分子への結合の際に、化学反応が起こる。後に、この同じ化学反応は、触媒事象の機構の一部となる。特定の場合においては、物質それ自体ではなく、化学反応で免疫する。反応性の免疫原は、酵素学者が使用する、機構に基づくインヒビターの類似物として考慮され得る。但しこれらは、これらが機構を阻害するのではなく機構を誘導する点において、逆の様式で使用される。
【００３７】
人工の触媒性抗体は、多くの異なる適用において、かなりの商業的可能性を有する。触媒性抗体に基づく生成物が、治療用途（例えば、プロドラッグの活性化およびコカインの不活性化）ならびに非治療用途（例えば、バイオセンサおよび有機合成）における原型の実験において、首尾よく使用された。
【００３８】
触媒性抗体は、理論的には、治療剤として、非触媒性抗体より魅力的である。なぜなら、触媒であるので、これらはより低い用量で使用され得るからであり、そしてまた、これらの効果が異常に不可逆であるからである（例えば、結合よりむしろペプチド結合の切断）。治療において、精製された触媒性抗体は、患者に直接投与され得るか、あるいはその患者自身の触媒性抗体応答が、適切なハプテンでの免疫によって惹起され得る。触媒性抗体はまた、臨床的な診断ツールとして、またはファインケミカルの合成における位置選択的触媒もしくは立体選択的触媒として、使用され得る。
【００３９】
（Ｉ．Ｆｎ３ループの変異およびＦｎ３へのＡｂループの移植）
ＣＤＲ移植のための理想的な足場は、高度に可溶性かつ安定である。これは、構造分析のためには十分に小さいが、緊密な結合および／または高い選択性を達成するために、複数のＣＤＲに適合するために十分に大きい。
【００４０】
既存の非Ａｂタンパク質の骨格で人工Ａｂ系を生じさせるための新規のストラテジーが開発された。Ａｂ足場の最小化より優れたこのアプローチの利点は、Ａｂの所望でない特性の遺伝を回避し得ることである。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）が、足場として使用された。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの形成および細胞−細胞相互作用において必須の役割を果たす、大きなタンパク質である；このタンパク質は、３つの型（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）の小さなドメインの多くの反復から構成される（Ｂａｒｏｎら、１９９１）。Ｆｎ３自体が、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の大きなサブファミリー（Ｆｎ３ファミリーまたはｓ型Ｉｇファミリー）の典型である。Ｆｎ３ファミリーは、細胞接着分子、細胞表面ホルモンおよびサイトカインレセプター、シャペロニン、ならびに炭水化物結合ドメインを含む（総説については、Ｂｏｒｋ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９９２；Ｊｏｎｅｓ，１９９３；Ｂｏｒｋら、１９９４；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＆  Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ，１９９４；Ｈａｒｐｅｚ  ＆  Ｃｈｏｔｈｉａ，１９９４を参照のこと）。
【００４１】
最近、結晶学的研究により、転写因子ＮＦ−ｋＢのＤＮＡ結合ドメインの構造もまた、Ｆｎ３の折り畳みに密接に関連することが明らかとなった（Ｇｈｏｓｈら、１９９５；Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９９５）。これらのタンパク質は、全て、特異的な分子認識に関与し、そしてほとんどの場合において、リガンド結合部位は、表面ループによって形成され、このことは、Ｆｎ３足場が、特異的に結合するタンパク質を構築するための優れた骨格であることを示唆する。Ｆｎ３の三次元構造が、ＮＭＲ（Ｍａｉｎら、１９９２）およびＸ線結晶学（Ｌｅａｈｙら、１９９２；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、１９９４）によって決定された。その構造は、Ｆｎ３が９つではなく７つのβ鎖を有すること（図１）を除いて、Ａｂ  ＶＨドメインのものと類似のβサンドイッチであると、最良に記載される。Ｆｎ３の各末端には、３つのループが存在する；ＢＣ、ＤＥおよびＦＧのループの位置は、それぞれＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の位置におおよそ対応する（図１Ｃ、Ｄ）。
【００４２】
Ｆｎ３は、小さく（約９５残基）、モノマーであり、可溶性であり、そして安定である。これは、ジスルフィド結合を有さない、ＩｇＳＦの数少ないメンバーの１つである；ＶＨは、鎖間ジスルフィド結合を有し（図１Ａ）、そして還元条件下でわずかな安定性を有する。Ｆｎ３は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された（Ａｕｋｈｉｌら、１９９３）。さらに、１７のＦｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンのみに存在し、保存された残基（これらはしばしば安定性および折り畳みのために重要である）に関する重要な情報を提供する（例えば、配列整列；Ｍａｉｎら、１９９２およびＤｉｃｋｉｎｓｏｎら、１９９４を参照のこと）。配列分析から、ＢＣループおよびＦＧループにおいて大きな変化が見られ、このことは、これらのループが安定性のために重要ではないことを示唆する。ＮＭＲ研究によって、ＦＧループが高度に可撓性であることが明らかとなった；この可撓性は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを介する、第１０のＦｎ３のα５β１インテグリンへの特異的結合に関連する。ヒト成長ホルモン−レセプター複合体の結晶構造（ｄｅ  Ｖｏｓら、１９９２）において、このレセプターの第２のＦｎ３ドメインは、ＦＧループおよびＢＣループを介してホルモンと相互作用し、このことは、これら２つのループを使用して結合部位を構築することが都合がよいことを示唆する。
【００４３】
フィブロネクチンの第１０のＩＩＩ型モジュールは、免疫グロブリンドメインの折り畳みと類似の折り畳みを有し、７つのβ鎖が、２つの逆平行βシートを形成しており、これらのβシートは、互いを包んでいる（Ｍａｉｎら、１９９２）。ＩＩ型モジュールの構造は、７つのβ鎖から構成され、これらのβ鎖は、２つの逆平行βシートのサンドイッチを形成しており、一方のβシートは３つの鎖（ＡＢＥ）を含み、そして他方のβシートは４つの鎖（Ｃ’ＣＦＧ）を含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９８８）。三本鎖βシートは、残基Ｇｌｕ−９−Ｔｈｒ−１４（Ａ）、Ｓｅｒ−１７−Ａｓｐ−２３（Ｂ）、およびＴｈｒ−５６−Ｓｅｒ−６０（Ｅ）から構成される。保存された残基の大部分は、疎水性コアに寄与し、ここで変異していない疎水性残基であるＴｒｐ−２２およびＴｒｙ−６８は、それぞれこのコアのＮ末端およびＣ末端の近くに位置する。これらのβ鎖の可撓性はかなり低く、そして機能的な可撓性ループが構築される剛性の骨格を提供するようである。そのトポロジーは、免疫グロブリンＣドメインのトポロジーと類似している。
【００４４】
（遺伝子構築および突然変異誘発）
ヒトフィブロネクチンの第１０のＦｎ３に対する合成遺伝子（図２）が設計された。これは、突然変異誘発を容易にするための好都合な制限部位を含み、そして高レベルのタンパク質発現のために、特定のコドンを使用する（Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８４）。
【００４５】
この遺伝子は、以下のように構築された：（１）遺伝子配列が、設計された制限部位を境界として、５つの部分に分割された（図２）；（２）各部分に対して、逆の鎖をコードし、そして約１５塩基の相補的重なりを有する、一対のオリゴヌクレオチドが合成された；（３）これら２つのオリゴヌクレオチドがアニーリングされ、そして一本鎖領域が、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを使用して充填された；（４）二本鎖オリゴヌクレオチドが、フラグメントの末端における制限酵素部位を使用してｐＥＴ３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングされ、そしてその配列が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡシークエンサーによって、製造元により提供されるジデオキシ終結プロトコルを使用して、確認された；（５）工程２〜４が繰り返されて、遺伝子全体（プラスミドｐＡＳ２５）（図７）が得られた。
【００４６】
本発明の方法には、遺伝子を組み立てるために、１工程のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｎｄｈｕら、１９９２）より長い時間がかかるが、この遺伝子において変異が起こらない。変異は、Ｔａｑポリメラーゼによる低い忠実度の複製によって導入されたようであり、そして時間を浪費する遺伝子の編集を必要とした。この遺伝子はまた、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクター（ｐＥＷ１）にクローニングされた。両方のベクターが、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下で、Ｆｎ３遺伝子を発現した（Ｓｔｕｄｌｅｒら、１９９０）；ｐＡＳ２５は、９６残基のＦｎ３タンパク質のみを発現し、一方でｐＥＷ１は、ポリヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）との融合タンパク質として、Ｆｎ３を発現した。他に言及されない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、組換えＤＮＡ操作が実施された。
【００４７】
変異は、Ｆｎ３遺伝子に、カセット突然変異誘発技術またはオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発技術のいずれかを使用して、導入された（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，１９９２）。カセット突然変異誘発は、上記遺伝子構築についてと同じプロトコルを使用して、実施された；新たな配列をコードする二本鎖ＤＮＡフラグメントを、発現ベクター（ｐＡＳ２５および／またはｐＥＷ１）にクローニングした。新たに合成された鎖（変異をコードする）と、この遺伝子合成のために使用されるオリゴヌクレオチドとを組み合わせることによって、多くの変異がなされる。得られた遺伝子を配列決定して、突然変異誘発反応によって、設計された変異が導入され、そして他の変異は導入されなかったことを確認した。
【００４８】
（抗体ＣＤＲを含むＦｎ３変異体の設計および合成）
２つの候補ループ（ＦＧおよびＢＣ）が、移植のために同定された。Ｆｎ３に移植されるループの供給源の候補を同定するために、既知の結晶構造を有する抗体が試験された。抗ニワトリ卵リボザイム（ＨＥＬ）抗体Ｄ１．３（Ｂｈａｔら、１９９４）が、ＣＤＲループの供給源として選択された。この選択の理由は以下であった：（１）遊離状態および複合体化状態の、高分解能結晶構造が利用可能である（図４Ａ；Ｂｈａｔら、１９９４）、（２）結合反応についての熱力学的データが利用可能である（Ｔｅｌｌｏら、１９９３）、（３）Ｄ１．３は、Ａｂの構造的分析およびＡｂの操作のための原型として使用されている（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０）、（４）部位特異的突然変異誘発の実験により、重鎖のＣＤＲ３（ＶＨ−ＣＤＲ３）が他のＣＤＲより大きく親和性に寄与することが示されている（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９３）、および（５）結合アッセイが、容易に実施され得る。この試行の目的は、Ｄ１．３のＶＨ−ＣＤＲ３を、安定性を有意に損失することなくＦｎ３足場に移植することであった。
【００４９】
Ｄ１．３構造の分析（図４）により、残基９９〜１０２（「ＲＤＹＲ」）（配列番号１２０）のみが、ニワトリ卵白リボザイム（ＨＥＬ）と直接接触することが明らかとなった（図４Ｂ）が、ＶＨ−ＣＤＲ３の方が長いと定義される（Ｂｈａｔら、１９９４）。ＶＨ−ＣＤＲ３のＣ末端の半分（残基１０１〜１０４）が、ＶＬドメインと有意に接触することが、注目されるべきである（図４Ｂ）。Ｄ１．３  ＶＨ−ＣＤＲ３（図４Ｃ）は、Ｆｎ３のＦＧループ（図４Ｄ）より短いターンを、Ｆ鎖とＧ鎖との間に有することもまた、明らかとなった。従って、変異体の配列は、Ｄ１．３のＲＤＹＲ（９９〜１０２）（配列番号１２０）をコアとして使用することによって設計され、そして異なる境界およびループ長さを作製した（表１）。より短いループは、より良好にＤ１．３  ＣＤＲ３のコンホメーションを模倣し、これによってより高い親和性を生じ得るが、これらはまた、Ｆｎ３の野生型相互作用を除去することによって、安定性が有意に低減し得る。
【００５０】
【表１】
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さらに、ＶＨ８と称される抗ＨＥＬ単鎖ＶＨドメイン（Ｗａｒｄら、１９８９）が、テンプレートとして選択された。ＶＨ８は、ライブラリースクリーニングによって選択され、そしてＶＬドメインを欠くにもかかわらず、ＶＨ８は、２７ｎＭのＨＥＬに対して親和性を有する（おそらく、そのより長いＶＨ−ＣＤＲ３（表１）に起因する）。従って、そのＶＨ−ＣＤＲ３が、Ｆｎ３に移植された。より長いループは、Ｆｎ３骨格において有利であり得る。なぜなら、より長いループは、より高い親和性を提供し得、そしてまた、野生型Ｆｎ３のループ長さに近いからである。ＶＨ８の三次元構造は未知であり、従って、ＶＨ８  ＣＤＲ３配列は、Ｄ１．３  ＶＨ−ＣＤＲ３の配列と整列された；２つのループが設計された（表１）。
【００５１】
（変異体の構築および生成）
設計された配列を得るために、部位特異的変異誘発実験を行なった。２つの変異体Ｆｎ３、Ｄ１．３−１およびＤ１．３−４（表１）を得、そして両方を可溶性Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現した。Ｄ１．３−４を精製し、そしてＨｉｓタグ部分を、トロンビン切断によって除去した。Ｄ１．３−４は、ｐＨ７．２において少なくとも１ｍＭまで可溶性である。タンパク質の凝集は、サンプル調製およびＮＭＲデータ獲得の間に観察されなかった。
【００５２】
（タンパク質の発現および精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、野生型または変異体についての遺伝子を含む発現ベクター（ｐＡＳ２５、ｐＥＷ１およびこれらの誘導体）で形質転換した。細胞を、Ｍ９最小培地およびアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）を含むバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）を補充したＭ９培地で増殖させた。同位体標識について、１５Ｎ  ＮＨ４Ｃｌおよび／または１３Ｃグルコースは、未標識の成分を交換した。２リットルバッフルフラスコ中の５００ｍｌ培地を、１０ｍｌの一晩の培養物で播種し、そして３７℃で撹拌した。イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭの最終濃度で添加し、ＯＤ（６００ｎｍ）が１に達するときにタンパク質発現を開始する。細胞を、ＩＰＴＧの添加３時間後に遠心分離によって収穫し、そして使用まで−７０℃で凍結した。
【００５３】
Ｈｉｓタグを有さないＦｎ３を以下のように精製した。細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；１ｍＭ）およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（１ｍＭ）を含む５ｍｌ／（ｇ細胞）のＴｒｉｓ（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）に懸濁した。ＨＥＬを、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、氷上で３０秒間、３回超音波処理した。細胞残渣を遠心分離によって除去した。硫酸アンモニウムを溶液に添加し、そして沈澱を遠心分離によって回収した。ペレットを、５〜１０ｍｌの酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ４．６）中で溶解し、そして不溶性物質を遠心分離によって除去した。溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液中に平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。次いで、Ｆｎ３を含む画分を、酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ４．６）中で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＳカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、そして塩化ナトリウムの直線勾配（０〜０．５Ｍ）で溶出した。プロトコルは、異なる表面電荷特性を有する変異タンパク質を精製するために調整され得る。
【００５４】
Ｈｉｓタグを有するＦｎ３を以下のように精製した。この可溶性画分を、塩化ナトリウム（１００ｍＭ）を含むリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）をＴｒｉｓ緩衝液と交換したことを除き、上記のように調製した。この溶液を、ニッケルで前充填しそしてリン酸緩衝液中で平衡化したＨｉ−Ｔｒａｐキレートカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。緩衝液でのカラムの洗浄後、ＨｉｓタグＦｎ３を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液中で溶出した。Ｈｉｓタグ−Ｆｎ３を含む画分をプールし、そしてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００−ＨＲカラムに適用し、高度に純粋なタンパク質を得た。Ｈｉｓタグ部分を、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供されるプロトコルを使用して、トロンビンで融合タンパク質を処理することによって切断した。Ｆｎ３を、上のプロトコルを使用して、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳカラムによってＨｉｓタグペプチドおよびトロンビンから分離した。
【００５５】
今までに調査された野生型および２つの変異タンパク質は、可溶性タンパク質として発現される。変異体が封入体（不溶性凝集物）として発現される場合、より低い温度（例えば、２５〜３０℃）において可溶性タンパク質として発現され得るか否かが最初に調査される。これが可能でない場合、封入体は、上記のように、細胞溶解後の低速遠心分離によって回収される。ペレットを緩衝液で洗浄し、超音波処理し、そして遠心分離する。封入体を、塩化グアジニウム（ＧｄｎＣｌ、６Ｍ）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で可溶化し、そしてＨｉ−Ｔｒａｐキレートカラムに充填する。タンパク質をＧｄｎＣｌおよび５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液で溶出する。
【００５６】
（変異体Ｆｎ３、Ｄ１．３−４のコンホメーション）
ＨｉｓタグＤ１．３−４融合タンパク質の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、野生型の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルと密接に類似し、この変異体は、野生型のコンホメーションと同様のコンホメーションで折り畳まれていることを示唆する。Ｈｉｓタグペプチドの除去後のＤ１．３−４のスペクトルは、大きいスペクトル分散を示した。大きい分散のアミドプロトン（７〜９．５ｐｐｍ）および多数の低磁場（５．０〜６．５ｐｐｍ）Ｃαプロトンは、βシートタンパク質に特徴的である（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，１９８６）。
【００５７】
Ｄ１．３−４の２Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルは、保存されたコンホメーションについてさらなる証拠を提供した。スペクトルの領域は、高磁場メチルプロトン（＜０．５ｐｐｍ）とメチル−メチレンプロトンとの間の相互作用を示した。Ｖａｌ７２γメチル共鳴を、野生型スペクトル（−０．０７および０．３７ｐｐｍ；（Ｂａｒｏｎら、１９９２））において十分に分離した。２つのメチルプロトンに対応する共鳴は、Ｄ１．３−４スペクトル（−０．０７および０．４４ｐｐｍ）において存在する。これらの２つの共鳴間の交差ピークおよび他の保存された交差ピークは、Ｄ１．３−４スペクトルにおける２つの共鳴がＶａｌ７２の共鳴である可能性が非常に高く、そして他のメチルプロトンが野生型Ｆｎ３の共鳴に対する環境とほとんど同一であることを示す。２つのスペクトル間の重要でない差異は、変異に起因する小さな構造的かく乱におそらく起因している。Ｖａｌ７２は、Ｆ鎖に存在し、ここで、これは、Ｆｎ３の中央疎水性コアの一部を形成する（Ｍａｉｎら、１９９２）。Ｖａｌ７２は、ＦＧループの変異残基からたった４残基のみ離れている（表１）。結果は顕著である。なぜなら、ループ中に７つの変異および３つの欠失が存在するにも関わらず（総残基の１０％を超える；図１２、表２）、Ｄ１．３−４は、野生型の３Ｄ構造と実質的に同一の３Ｄ構造を保持する（変異したループを除く）。従って、この結果は、ＦＧループがＦｎ３分子の折り畳みおよび安定性に有意に寄与しておらず、従ってＦＧループは広範に変異され得るという強力な支持を提供する。
【００５８】
【表２】
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制限酵素部位を下線で示す。ＮおよびＫは、それぞれ、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの等モル混合物ならびにＧおよびＴの等モル混合物を示す。
【００５９】
（構造および安定性の測定）
Ａｂｓの構造を、ＡｂｓおよびＦｎ３の鎖−ループ−鎖構造を重ね合わせるために、定量的方法（例えば、ＤＳＳＰ（ＫａｂｓｃｈおよびＳａｎｄｅｒ，１９８３）およびＰＤＢｆｉｔ（Ｄ．ＭｃＲｅｅ，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｉｔｉｔｕｔｅ））ならびにコンピューターグラフィックス（例えば、Ｑｕａｎｔａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）およびＷｈａｔ  ｉｆ（Ｇ．Ｖｒｉｅｎｄ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））を使用して分析した。
【００６０】
モノボディー（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）の安定性を、温度および化学的な変性剤誘導性アンフォールディング反応を測定することによって決定した（Ｐａｃｅら、１９８９）。温度誘導性アンフォールディング反応を、円偏光二色性（ＣＤ）偏光計を使用して測定した。サンプル温度がゆっくりと上昇させるにつれて、２２２および２１５ｎｍにおける楕円率を、記録した。１０〜５０μＭの間のサンプル濃度を使用した。アンフォールディング基線が確立された後、アンフォールディング反応の可逆性を調査するために温度を低下させた。アンフォールディングの自由エネルギーを、二状態転移（ｔｗｏ−ｓｔａｔｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の式に適合させることによって決定した（ＢｅｃｋｔｅｌおよびＳｃｈｅｌｌｍａｎ，１９８７；Ｐａｃｅら、１９８９）。非線形の最小二乗適合を、マッキントッシュコンピューター上でプログラムＩｇｏｒ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ）を使用して行なった。
【００６１】
２つの選択された変異体Ｆｎ３の構造および安定性を研究した；第１の変異体はＤ１．３−４であり（表２）、そして第２の変異体は、ＢＣループ中に４つの変異（Ａ２６Ｖ２７Ｔ２８Ｖ２９→ＴＱＲＱ）を含むＡＳ４０と呼ばれる変異体であった。ＡＳ４０は、上記のＢＣループライブラリーからランダムに選択された。両方の変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で可溶性タンパク質として発現され、そして少なくとも１ｍＭに濃縮され、ＮＭＲ研究を可能にする。
【００６２】
両方の変異体についての熱変性の中間点は、野生型タンパク質の約７９℃と比較して、約６９℃であった。結果は、２つの表面ループにおける広範な変異は、Ｆｎ３の安定性を劇的に減少させないことを示し、従って両方のループに多数の変異を導入する可能性を実証した。
【００６３】
安定性はまた、塩化グアニジウム（ＧｄｎＣｌ）アンフォールディング反応および尿素誘導性アンフォールディング反応によって決定された。予備的なアンフォールディング曲線を、モーター駆動のシリンジを備えた蛍光光度計を使用して記録した；ＧｄｎＣｌまたは尿素を、キュベット中のタンパク質溶液に連続的に添加した。予備的なアンフォールディング曲線に基づいて、種々の濃度の変性剤を含む別々のサンプルを調製し、そして蛍光（２９０ｎｍにおける励起、３００〜４００ｎｍにおける発光）またはＣＤ（２２２および２１５ｎｍにおける楕円率）を、サンプルを少なくとも１時間測定温度で平衡化した後、測定した。曲線は、二状態モデルの式に最小二乗法を適合させた（ＳａｎｔｏｒｏおよびＢｏｌｅｎ，１９８８；Ｋｏｉｄｅら、１９９３）。タンパク質濃度における変化を、必要な場合補正した。
【００６４】
一旦、熱アンフォールディング反応の可逆性が確立されると、このアンフォールディング反応は、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  ＭＣ−２示差的走査カロリーメーター（ＤＳＣ）によって測定される。セル（約１．３ｍｌ）を、ＦｎＡｂ溶液（０．１〜１ｍＭ）で満たし、そしてΔＣｐ（＝ΔＨ／ΔＴ）を、温度がゆっくり上昇するにつれて記録する。Ｔｍ（アンフォールディングの中点）、アンフォールディングのΔＨおよびアンフォールディングのΔＧを、Ｍｉｃｒｏｃａｌによって提供されたＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて移行曲線を適合することによって決定する（ＰｒｉｖａｌｏｖおよびＲｏｔｅｋｈｉｎ，１９８６）。
【００６５】
（熱アンフォールディング）
Ｆｎ３に関する温度誘導性アンフォールディング実験を、二次構造における変化をモニターするために、円偏光二色性（ＣＤ）分光法を使用して行なった。ネイティブなＦｎ３のＣＤスペクトルは、２２２ｎｍに近く弱いシグナルを示し（図３Ａ）、このことは、Ｆｎ３の優勢なβ構造と一致する（Ｐｅｒｃｚｅｌら、１９９２）。共同的なアンフォールディング移行は、８０〜９０℃で観察され、これは、Ｆｎ３の高い安定性を示す（図３Ｂ）。アンフォールディングの自由エネルギーは、移行後基線の欠如に起因して決定され得ない。結果は、ヒトフィブロネクチンの第１のＦｎ３ドメインの高い安定性と一致しており（Ｌｉｔｖｉｎｏｖｉｃｈら、１９９２）、従ってＦｎ３ドメインが一般に高度に安定性であることを示す。
【００６６】
（結合アッセイ）
モノボディーの結合反応を、等温性滴定熱量計（ＩＴＣ）および蛍光分光法を使用して定量的に特徴付けた。
【００６７】
結合のエンタルピー変化（ΔＨ）を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｏｍｅｇａ  ＩＴＣ（Ｗｉｓｅｍａｎら、１９８９）を使用して測定した。サンプルセル（約１．３ｍｌ）をモノボディー溶液（≦１００μＭ、Ｋｄに従って変化する）で満たし、そして参照セルを、蒸留水で満たした；システムを、安定な基線が得られるまで、所定の温度で平衡化した；５〜２０μｌのリガンド溶液（≦２ｍＭ）を、平衡化の遅延（４分）後に続く短い期間（２０秒）内で、モーター駆動シリンジによって注射した；注射を繰り返し、そして各注射について熱生成／熱吸収を測定した。リガンドの濃度の関数としての観察された熱変化における変化より、ΔＨおよびＫｄを決定した（Ｗｉｓｅｍａｎら、１９８９）。結合反応のΔＧおよびΔＳを、２つの直接測定したパラメーターより推定した。理論的曲線からの逸脱を、非特異的（複数部位）結合を評価するために、調査した。実験をまた、リガンドをセル中に配置しそしてＦｎＡｂで力価決定することによって、行なった。ＩＴＣのみがΔＨの直接的な測定を与え、それにより、結合エネルギーに対するエンタルピーおよびエントロピーの寄与を評価することを可能にすることが強調されるべきである。ＩＴＣを首尾良く使用して、Ｄ１．３Ａｂの結合反応をモニターする（Ｔｅｌｌｏら、１９９３；Ｂｈａｔら、１９９４）。
【００６８】
内因性の蛍光をモニターして、ＩＴＣによるＫｄの決定が困難である、μＭ範囲以下のＫｄを有する結合反応を測定する。Ｆｎ３変異体溶液（≦１０μＭ）はリガンド溶液（≦１００μＭ）で滴定されるので、Ｔｒｐ蛍光（約２９０ｎｍにおける励起、３００〜３５０ｎｍにおける発光）およびＴｙｒ蛍光（約２６０ｎｍにおける励起、約３０３ｎｍにおける発光）を、モニターする。反応のＫｄを、二分子結合式の非線形最小二乗適合によって決定する。二次結合部位の存在は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって調査される。全ての結合アッセイにおいて、コントロール実験は、目的のモノボディーの代わりに野生型Ｆｎ３（または無関係のモノボディー）を使用することによって行う。
【００６９】
（ＩＩ．高い親和性および高い特異性を有するＦｎ３変異体の生成）
（モノボディー）
特異的なリガンドに結合するモノボディーを選択するために、ライブラリースクリーニングを行なった。これは、上に記載されたモデリングアプローチに対して相補的である。コンビナトリアルスクリーニングの利点は、多数の改変体（≧１０８）を容易に生成およびスクリーニングし得ることであり、これは、特異的な変異誘発（「合理的設計」）アプローチを用いて可能ではない。ファージディスプレイ技術（Ｓｍｉｔｈ，１９８５；Ｏ’ＮｅｉｌおよびＨｏｅｓｓ，１９９５）を使用して、スクリーニングプロセスを行なう。Ｆｎ３をファージコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合し、そして糸状ファージの表面上に提示する。これらのファージは、Ｆｎ３融合タンパク質をコードする遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡゲノムを保有する。規定の領域のＦｎ３のアミノ酸配列を、縮重ヌクレオチド配列を使用してランダム化し、それによりライブラリーを構築する。所望の結合能力を有するＦｎ３変異体を提示するファージを、インビトロで選択し、回収し、そして増幅する。選択されたクローンのアミノ酸配列は、選択されたファージのＦｎ３遺伝子を配列決定することによって容易に同定され得る。Ｓｍｉｔｈのプロトコル（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ，１９９３）は、少しの改変を伴う。
【００７０】
この目的は、小さいタンパク質リガンドに対して高い親和性を有するモノボディを生成することであった。ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌのプロテインＧ（本明細書において以降はプロテインＧと呼ぶ）のＨＥＬおよびＢ１ドメインをリガンドとして用いた。プロテインＧは、小さく（５６アミノ酸）そして高度に安定である（Ｍｉｎｏｒ＆Ｋｉｍ，１９９４；Ｓｍｉｔｈら、１９９４）。その構造は、４つのβシート鎖に対してパックされたヘリックスであることが、ＮＭＲ分光光度計（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎら、１９９１）によって、決定された。得られたＦｎＡｂ−プロテインＧ複合体（約１５０残基）は、直接ＮＭＲ方法の十分に範囲内で、今日までに生成された最小のタンパク質−タンパク質複合体のうちの１つである。両方の成分のこの小さいサイズ、高い安定性および可溶性、ならびに安定な同位体（１３Ｃおよび１５Ｎ；プロテインＧについて以下を参照のこと）で各々を標識する能力によって、この複合体は、タンパク質−タンパク質相互作用に対するＮＭＲ研究のために理想的なモデル系になる。
【００７１】
Ｆｎ３の首尾よいループ置換体（変異体Ｄ１．３−４）は、少なくとも１０の残基が、全体的な折り畳みの損失なしに変異され得ることを実証する。これに基づいて、ＦＧループにおける最初の残基が無作為化されているライブラリーを、最初に構築した。ＢＣループにおけるループ置換実験の結果が得られた後、ＢＣループおよび他の部位を含む変異部位を伸ばした。
【００７２】
（Ｆｎ３ファージディスプレイシステムの構築）
Ｍ１３ファージに基づく発現ベクターｐＡＳＭ１を、以下のとおり構築した：ＯｍｐＴのシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをＦｎ３遺伝子の５’末端でクローニングした；Ｍ１３ｐＩＩＩのＣ末端ドメインをコードする遺伝子フラグメントを、ＰＣＲを用いてＭ１３ｍｐ１８の野生型遺伝子ＩＩＩ遺伝子から調製し（Ｃｏｒｅｙら、１９９３）、そしてこのフラグメントをＯｍｐＴ−Ｆｎ３遺伝子の３’末端に挿入した；スペーサー配列をＦｎ３とｐＩＩＩとの間に挿入した。得られたフラグメント（ＯｍｐＴ−Ｆｎ３−ｐＩＩＩ）をＭ１３ｍｐ１８のマルチクローニング部位にクローニングした。ここでこの融合遺伝子は、ｌａｃプロモーターの制御下である。このシステムは、Ｆｎ３−ｐＩＩＩ融合タンパク質ならびに野生型ｐＩＩＩタンパク質を生成する。野生型ｐＩＩＩの同時発現は、融合ｐＩＩＩタンパク質の数を減らし、これによってファージの感染性を増大することが期待される（Ｃｏｒｅｙら、１９９３）（ｐＩＩＩの５つのコピーが、ファージ粒子に存在する）。さらに、より少数の融合ｐＩＩＩタンパク質が、緊密に結合するタンパク質を選択するのに有利であり得る。なぜなら、マルチクローニング部位に起因するキレート化効果は、融合ｐＩＩＩの５つ全てのコピーの効果よりも小さいはずであるからである（Ｂａｓｓら、１９９０）。このシステムは、セリンプロテアーゼトリプシンを首尾よく提示した（Ｃｏｒｅｙら、１９９３）。ファージ粒子を第二ポリエチレングリコール沈殿および酸沈殿によって精製した以外は、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ９１ｋａｎ（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ，１９９３）を用いてファージを生成して精製した。
【００７３】
融合ファージ上でのＦｎ３の首尾よい提示は、フィブロネクチンに対するＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＥＬＩＳＡによって確認した。これによって、このシステムが、このシステムを用いてライブラリーを構築するために適していることが示される。
【００７４】
ｆＵＳＥ５を用いる別のシステム（Ｐａｒｍｌｅｙ＆Ｓｍｉｔｈ，１９８８）がまた用いられ得る。Ｆｎ３遺伝子を、Ｆｎ３遺伝子ＰＣＲの５’末端および３’末端に導入されたＳｆｉＩ制限部位を用いてｆＵＳＥ５に挿入する。このシステムは、ファージの表面上で融合ｐＩＩＩタンパク質のみ（５コピーまで）しか提示しない。ファージは、記載のように（Ｓｍｉｔｈ＆Ｓｃｏｔｔ，１９９３）、生成され、そして精製される。このシステムは、多くのタンパク質を提示するために用いられており、そして強力である。ｆＵＳＥ５の利点は、毒性が低いことである。これは、宿主において複製形態（ＲＦ）のコピー数が低いことに起因する。これによって、次に、ライブラリー構築のために十分な量のＲＦを調製することが困難になる（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ，１９９３）。
【００７５】
（ライブラリーの構築）
最初のライブラリーは、Ｍ１３ファージの表面において提示されたＦｎドメインから構築された。ここで、ＦＧループにおける７つの残基（７７〜８３）（図４Ｄ）を無作為化した。縮重したヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの使用によって無作為化を達成する。二本鎖オリゴヌクレオチドを、一本の鎖が変異部位で（ＮＮＫ）６（ＮＮＧ）配列を有すること以外は、遺伝子合成（上記参照）についてと同じプロトコールによって調製した。ここでは、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの等モル混合物に相当し、そしてＫは、ＧおよびＴの等モル混合物に相当する。残基８３の（ＮＮＧ）コドンは、ＳａｃＩ制限部位（図２）を保存するために必要であった。この（ＮＮＫ）コドンは、２０のアミノ酸全てをコードするが、ＮＮＧコドンは１４をコードする。従って、このライブラリーは、約１０９の独立した配列を含んでいた。このライブラリーは、二本鎖ヌクレオチドを野生型ファージベクターであるｐＡＳＭ１に連結すること、およびエレクトロポレーションを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をトランスフェクトすることによって構築された。ＸＬ１ブルーは、ｌａｃＩｑ表現型を有し、従ってｌａｃ誘導物質の非存在においてＦｎ３−ｐＩＩＩ融合タンパク質の発現を抑制する。毒性のＦｎ３−ｐＩＩＩクローンに対する選択を回避するために最初のライブラリーをこの方法で増殖させた。宿主としてＫ９１ｋａｎを有するファージを増殖することによって、無作為化されたＦｎ３−ｐＩＩＩ融合タンパク質を提示するライブラリーを調製した。Ｋ９１ｋａｎは、ｌａｃＩｑを有さないので、融合タンパク質の生成を抑制しない。ＢＣループ（残基２６−２０）が無作為化された別のライブラリーがまた生成される。
【００７６】
（提示されたモノボディの選択）
Ｆｎ３ファージライブラリーのスクリーニングをバイオパンニングプロトコールを用いて実施した（Ｓｍｉｔｈ＆Ｓｃｏｔｔ，１９９３）；リガンドをビオチン化して強力なビオチン−ストレプトアビジン相互作用を用いてストレプトアビジンでコートしたディッシュ上にリガンドを固定した。実験は室温で実施した（約２２℃）。ライブラリーからのファージの最初の回収のために、１０μｇのビオチン化リガンドをストレプトアビジンでコートしたポリスチレンのディッシュ（３５ｍｍ，Ｆａｌｃｏｎ  １００８）上に固定し、次いでファージ溶液（約１０１１ｐｆｕ（プラーク形成単位）を含有）を添加した。適切な緩衝液（代表的には、ＴＢＳＴ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）およびＴｗｅｅｎ２０（０．５％））でこのディッシュを洗浄した後、結合したファージを以下の条件の１つまたは組み合わせによって溶出した：低ｐＨ、遊離のリガンドの添加、尿素（６Ｍまで）、そして、抗プロテインＧモノボディの場合、トロンビンによるプロテインＧ−ビオチンリンカーの切断。宿主としてＫ９１ｋａｎを用いる標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて、回収されたファージを増幅した。選択プロセスを、３〜５回反復して陽性のクローンを濃縮した。二回目から、リガンドの量を徐々に減少させ（〜約１μｇまで）、そしてビオチニル化リガンドを、ディッシュへ移す前に、ファージ溶液と混合した（Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，私信）。最終回の後、１０〜２０のクローンをピックアップし、そしてそれらのＤＮＡ配列を決定する。このクローンのリガンド親和性をファージＥＬＩＳＡ方法によって最初に測定した（以下参照）。
【００７７】
リガンドに対するＦｎ３フレームワークの潜在的な結合（バックグラウンド結合）を抑制するため、野生型Ｆｎ３を緩衝液中の競合物として添加し得る。さらに、関連のないタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、チトクロムｃおよびＲＮａｓｅＡ）を、高度に特異的なモノボディを選択するための競合物として使用し得る。
【００７８】
（結合アッセイ）
ファージ表面上のモノボディの結合親和性は、ファージＥＬＩＳＡ技術を用いて半定量的に特徴付けられる（Ｌｉら、１９９５）。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを、リガンドタンパク質（またはストレプトアビジンその後のビオチン化リガンドの結合によって）でコートし、そしてＢｌｏｔｔｏ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロックする。単一プラーク（Ｍ１３）／コロニー（ｆＵＳＥ５）に由来する精製ファージ（約１０１０ｐｆｕ）を、各ウェルに添加し、そして４℃で一晩インキュベートする。適切な緩衝液でのウェルの洗浄後（上記参照）、抗Ｍ１３Ａｂ（ウサギ、Ｓｉｇｍａ）および抗ウサギＩｇペルオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、または抗Ｍ１３Ａｂ−ペルオキシダーゼ結合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールによって、結合したファージを検出する。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、比色アッセイを実施する。免疫グロブリンに対するプロテインＧの高い親和性は、特別な問題を呈す；Ａｂは、検出において用いられ得ない。従って、抗プロテインＧモノボディを検出するため、融合ファージをウェル中に固定し、次いで、ビオチン化プロテインＧ、続いてストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合体を用いた検出によって結合を測定する。
【００７９】
（可溶性モノボディの生成）
ファージＥＬＩＳＡを用いる変異Ｆｎ３の予備的な特徴付けの後、変異体遺伝子を発現ベクターｐＥＷ１にサブクローニングする。変異タンパク質をＨｉｓ・ｔａｇ融合タンパク質として生成して、精製しそしてそのコンフォメーション、安定性、およびリガンド親和性を特徴付ける。
【００８０】
（ＩＩＩ．Ｆｎ３足場の安定性の増大）
タンパク質の「さらに高い安定性」の定義は、タンパク質がさらに高温（熱分解の場合）での、およびさらに高濃度の変性化学試薬（例えば、塩酸グアニジン）の存在下での機能に必要な３次元構造を保持する能力である。このタイプの「安定性」は、一般に「コンフォメーション的な（立体配座的な）安定性」と呼ばれる。コンフォメーション的な安定性は、タンパク質分解性変性（すなわち、身体中のタンパク質の崩壊）に対する耐性に関連することが示されている（Ｋａｍｔｅｋａｒら、１９９３）。
【００８１】
コンフォメーション的な安定性を改善することは、タンパク質操作の主要な目的である。ここで、変異は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）の安定性を増強する本発明者らによって開発された。本発明者らは、Ｆｎ３が人工的な結合タンパク質を操作するための足場として用いられる技術を開発した（Ｋｏｉｄｅら、１９９８）。Ｆｎ３の表面ループ領域における多くの残基はＦｎ３分子の全体的構造を破壊することなく変異され得ること、および新規の結合機能を有するＦｎ３の改変体はコンビナトリアルライブラリースクリーニングを用いて操作され得ることが示されている（Ｋｏｉｄｅら、１９９８）。本発明者らは、Ｆｎ３は優れた足場であるが、多数の変異体を含むＦｎ３改変体は、野生型Ｆｎ３タンパク質に比べて、化学的変性に対して不安定であることを見出した（Ｋｏｉｄｅら、１９９８）。従って、変異した位置の数が、新しい結合機能を操作するために変異される場合、このようなＦｎ３改変体の安定性はさらに減少し、最終的にわずかに安定なタンパク質をもたらす。人工的な結合タンパク質は、その３次元構造が機能的であるように維持しなければならないので、安定性は、この足場に導入され得る変異の数を制限する。従って、安定性を増大するＦｎ３足場の改変は、有用である。すなわち、その改変によって、さらによい機能のためにさらに変異を導入することが可能になり、そしてさらに広い範囲の適用においてＦｎ３に基づいて操作されたタンパク質を用いることが可能になる。
【００８２】
本発明者らは、野生型Ｆｎ３が中性のｐＨよりも酸性のｐＨでさらに安定であることを見出した（Ｋｏｉｄｅら、１９９８）。Ｆｎ３安定性のｐＨ依存性は、図１８で特徴付けられる。このｐＨ依存性曲線は、ｐＨ４付近で見かけの遷移中点を有する（図１８）。これらの結果は、Ｆｎ３おける不安定化相互作用の同定および除去によって、中性のｐＨでのＦｎ３の安定性を改善することが可能であることを示唆する。操作されたＦｎ３のほとんどの適用（例えば、診断、治療、および触媒）は、中性付近のｐＨで用いられると予期され、従って中性のｐＨで安定性を改善することが重要であることに注目すべきである。他の研究者らによる研究によって、表面静電特性の至適化が、タンパク質安定性における実質的な増大を導きうることが実証された（Ｐｅｒｌら、２０００，Ｓｐｅｃｔｏｒら、１９９９、Ｌｏｌａｄｚｅら、１９９９，Ｇｒｉｍｓｌｅｙら、１９９９）。
【００８３】
Ｆｎ３安定性のｐＨ依存性は、４付近のｐＫａを有するアミノ酸が、観察された遷移に関与していることを示唆する。アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）のカルボキシル基は、この範囲のｐＫａを有する（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．１９９３）。カルボキシル基がタンパク質中で望ましくない（すなわち、不安定化する）相互作用を有する場合、そのｐＫａは、その標準的な落ち着いた値からより高値にシフトする（ＹａｎｇおよびＨｏｎｉｇ  １９９２）。従って、以下に示すように、異常なｐＫａを有するカルボキシル基を同定するため、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光光度計を用いて、Ｆｎ３中の全てのカルボキシル基のｐＫａ値を決定した。
【００８４】
第一に、各ＡｓｐおよびＧｌｕ残基のカルボキシル炭素の１３Ｃ共鳴を割り当てた（図１９）。次に、これらの群について１３Ｃ共鳴のｐＨ滴定を実施した（図２０）。これらの残基についてのｐＫａを表３に列挙する。
【００８５】
【表３】
0004578768.tif 000005
これらの結果は、Ａｓｐ７および２３、ならびにＧｌｕ９が、その落ち着いたｐＫａ（約４．０）に関して上方に偏向したｐＫａを有していることを示す。このことは、これらの残基が望ましくない相互作用に関与していることを示す。対照的に、他のＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基は、それぞれの落ち着いた値に近いｐＫａを有する。このことは、これらの残基のカルボキシル基がＦｎ３の安定性に有意に寄与しないことを示す。
【００８６】
Ｆｎ３の３次元構造において（Ｍａｉｎら、１９９２）、Ａｓｐ７および２３、ならびにＧｌｕ９は、表面上にパッチを形成し（図２１）、ここでＡｓｐ７はこのパッチの中央に位置する。これらの負に荷電した残基の空間的近接によって、これらの残基がＦｎ３において好ましくない相互作用を有する理由が説明される。これらの残基がプロトン化および中性化される低いｐＨでは、好ましくない相互作用はほとんど緩和されることが期待される。同時に、この構造は、中性のｐＨでのＦｎ３の安定性が、これらの３つの残基の間の静電的反発力が除去される場合、改善され得ることを示唆する。Ａｓｐ７は、３つの残基のなかの中心に位置するので、それはＡｓｐ７を変異することが決定された。２つの変異体、Ｄ７ＮおよびＤ７Ｋ（すなわち、アミノ酸残基数７のアスパラギン酸を、それぞれアスパラギン残基またはリジン残基で置換したもの）を調製した。前者は、事実上同じサイズの中性の残基で負の電荷を置換している。後者は残基７に正の電荷を配置している。
【００８７】
変異タンパク質の安定性の程度を温度および化学の変性測定において特徴付けた。熱変性測定において、Ｆｎ３タンパク質の変性を、２２７ｎｍの波長で環状二色性分光光度計を用いてモニターした。全てのタンパク質は、協同的遷移を受けた（図２２）。遷移曲線から、野生型、Ｄ７ＮおよびＤ７Ｋについての遷移の中点（Ｔｍ）は、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび６．２Ｍ尿素を含有する０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、６２℃、６９℃および７０℃であることが決定された。従って、この変異は、野生型Ｆｎ３のＴｍを７〜８℃上昇させた。
【００８８】
Ｆｎ３タンパク質の化学的変性を、Ｆｎ３の単一Ｔｒｐ残基からの蛍光発光を用いてモニタリングした（図２３）。グアニジンＨＣｌの非存在下におけるアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｇｉｎｇ）の自由エネルギー（ΔＧ０）を、野生型、Ｄ７ＮおよびＤ７Ｋについてそれぞれ、７．４、８．１および８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌと決定した（より大きいΔＧ０がより高い安定性を示す）。再度、これら２つの変異が、野生型タンパク質よりも安定であることを見出した。
【００８９】
これらの結果は、表面上の点変異が、Ｆｎ３の安定性を有意に増加させ得ることを示している。これらの変異は表面上に存在するので、それらは、Ｆｎ３の構造を最小限にしか変更させず、そしてそれらは、他の操作されたＦｎ３タンパク質に容易に導入され得る。さらに、Ｇｌｕ９および／またはＡｓｐ２３における変異もまた、Ｆｎ３の安定性を増加させる。さらに、これら３つの残基の１つ以上における変異は、組み合わされ得る。
【００９０】
従って、Ｆｎ３は、単量体免疫グロブリン様骨格の４つ目の例であり、この骨格は、結合タンパク質を操作するために使用され得る。新規の結合タンパク質の首尾よい選択はまた、ミニボディ、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）および「ラクダ化」免疫グロブリンＶＨドメイン骨格に基づいている（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４；Ｄａｖｉｅｓ  ＆  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９５；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ＆  Ｈｏｅｓｓ，１９９５）。Ｆｎ３骨格は、これらのシステムに対して有益である。Ｂｉａｎｃｈｉらは、ミニボディの安定性が２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、Ｕｂｉ４−Ｋの安定性よりも有意に低いことを報告している。ミニボディの詳細な構造特性は、今のところ報告されていない。テンダミスタットおよびＶＨドメインは、ジスルフィド結合を含み、従って、正確に折り畳まれたタンパク質の調製は、困難であり得る。ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎは、それらのラクダ化ＶＨドメインの収率が培地１リットルあたり１ｍｇ未満であることを報告した（Ｄａｖｉｅｓ  ＆  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９６）。
【００９１】
従って、Ｆｎ３のフレームワークは、分子認識のための骨格として使用され得る。その小さいサイズ、安定性および十分に特徴付けられた構造は、Ｆｎ３を魅力的なシステムにしている。リガンド結合に関与する、広範な種々の天然タンパク質におけるＦｎ３の遍在的な存在を考慮して、標的の異なるクラスに対して、Ｆｎ３に基づく結合タンパク質を操作し得る。
【００９２】
以下の実施例は、例示することを意図するが、本発明を限定することを意図しない。
【００９３】
（実施例Ｉ）
（Ｆｎ３遺伝子の構築）
フィブロネクチンの１０番目のＦｎ３（図１）についての合成遺伝子を、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸残基１４１６〜１５０９（Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、１９８５）およびそれら３つの三次元構造（Ｍａｉｎら、１９９２）に基づいて設計した。この遺伝子を、変異誘発のために都合のよい制限部位を含むように操作し、そして高いレベルのタンパク質発現のための、いわゆる「優先コドン」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８４）を使用した。さらに、グルタミン残基を、Ｎ末端メチオニンの後に挿入し、しばしばＮＭＲスペクトルを分解するＮ末端メチオニンの部分プロセシングを回避した（Ｓｍｉｔｈら、１９９４）。化学試薬は、分析用等級以上のものであり、そして他に記載が無ければ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣｏｍｐａｎｙおよびＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。組換えＤＮＡ手順を、他に記載が無ければ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載されるように行った。カスタムオリゴヌクレオチドを、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。制限酵素および改変酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。
【００９４】
遺伝子を、以下の様式において構築した。最初に、遺伝子配列（図５）を、設計した制限部位における境界を用いて、５つの部分に分けた：フラグメント１、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ（オリゴヌクレオチドＦＮ１ＦおよびＦＮ１Ｒ（表２））；フラグメント２、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ（ＦＮ２ＦおよびＦＮ２Ｒ）；フラグメント３、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ（ＦＮ３ＦおよびＦＮ３Ｒ）；フラグメント４、ＳａｌＩ−ＳａｃＩ（ＦＮ４ＦおよびＦＮ４Ｒ）；フラグメント５、ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ（ＦＮ５ＦおよびＦＮ５Ｒ）。第二に、各部分について、向かい合う鎖をコードし、かつ約１５塩基の相補的な重複を有するオリゴヌクレオチドの対を合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、ＦＮ１Ｆ−ＦＮ５Ｒと表し、表２に示す。第三に、各対（例えば、ＦＮ１ＦおよびＦＮ１Ｒ）をアニールし、そして一本鎖領域を、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して、充填した。第四に、二本鎖オリゴヌクレオチドを、フラグメントの末端において、関連する制限酵素で消化し、フラグメントのために使用されるものと同じ酵素で消化されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫプラスミド（Ｓｒｔａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。挿入したフラグメントのＤＮＡ配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡシーケンサーおよび製造業者によって提供されるジデオキシ末端プロトコルを使用するＤＮＡ配列決定によって確認した。最後に、工程２〜４を遺伝子全体が得られるまで繰り返した。
【００９５】
この遺伝子をまた、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクター中にクローニングした（それぞれ、ｐＡＳ４５およびｐＡＳ２５）。プラスミドのマップを図６および７に示す。これらのベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下でＦｎ３遺伝子を発現した（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９９０）；ｐＡＳ２４は、９６残基のＦｎ３タンパク質のみを発現するが、ｐＡＳ４５は、ポリ−ヒスチジンペプチド（Ｈｉｓ・タグ）を有する融合タンパク質としてＦｎ３を発現する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける、Ｆｎ３タンパク質およびその誘導体の高い発現レベルを、ＣＢＢで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、強力なバンドとして検出した。
【００９６】
モノボディの結合反応は、精製した可溶性モノボディを使用する蛍光分光器によって定量的に特徴付けられる。
【００９７】
内因性蛍光をモニタリングして、結合反応を測定した。Ｔｒｐ蛍光（約２９０ｎｍで励起、３００〜３５０ｎｍで発光）およびＴｙｒ蛍光（約２６０ｎｍで励起、約３０３ｎｍで発光）を、Ｆｎ３変異溶液（≦１００μＭ）をリガンド溶液で滴定しながら、モニタリングした。リガンドが蛍光（例えば、フルオレセイン）である場合、リガンドからの蛍光を使用し得る。この反応のＫｄを、二分子結合式の非線形最小自乗フィッティングによって決定した。
【００９８】
内因性蛍光を使用して結合反応をモニタリングすることが出来ない場合、モノボディを、フルオレセイン−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識化し、そして蛍光分極を使用して結合反応をモニタリングする（Ｂｕｒｋｅら、１９９６）。
【００９９】
（実施例ＩＩ）
（Ｆｎ３遺伝子において制限部位を含むための改変）
制限部位を、アミノ酸配列Ｆｎ３を変化することなく合成Ｆｎ３遺伝子に組み込んだ。遺伝子構築を、長いオリゴヌクレオチド（＞６０塩基）を合成することなく完了し得、そして２つのループ領域を、カセット変異誘発方法（すなわち、変異を含む別の合成フラグメントでフラグメントをスワッピングする）によって変異させ得る（無作為化を含む）ように制限部位の位置を選択した。さらに、ファージディスプレイのために、ほとんどの部位がベクター中で特有であるように、制限部位を選択した。特有な制限部位によって、大きな配列空間を供給するために、すでに選択されたモノボディクローンを組換えることが可能になった。
【０１００】
（実施例ＩＩＩ）
（Ｍ１３ファージディスプレイライブラリーの構築）
ファージディスプレイのためのベクターであるｐＡＳ３８（そのマップについては、図８参照）を、以下のように構築した。ＯｍｐＴのシグナルペプチドをコードするｐＥＴ１２ａのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、Ｆｎ３遺伝子の５’末端にクローニングした。Ｆｎ３遺伝子のＣ末端領域（ＦＮ５ＦおよびＦＮ５Ｒオリゴヌクレオチド由来、表２参照）を、ＦＮ５ＦおよびＦＮ５Ｒ’オリゴヌクレオチド（表２）からなる新規のフラグメントで置き換えた。このオリゴヌクレオチドは、バクテリオファージＭ１３のｐＩＩＩタンパク質との融合タンパク質を作製するために、ＭｌｕＩ部位およびリンカー配列を導入する。Ｍ１３  ｐＩＩＩのＣ末端ドメインをコードする遺伝子フラグメントを、ＰＣＲを使用してＭ１３ｍｐ１８の野生型遺伝子ＩＩＩから調製し（Ｃｏｒｅｙら、１９９３）、そしてこのフラグメントをＭｌｕＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用して、ＯｍｐＴ−Ｆｎ３融合遺伝子の３’末端に挿入した。
【０１０１】
ファージ分子が二次ポリエチレングリコール沈殿によって精製されるのを除いては、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、ヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７）を使用して、ファージを生成および精製した。融合ファージ上のＦｎ３の首尾よいディスプレイを、フィブロネクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ）およびカスタム抗−Ｆｎ３抗体（Ｃｏｃａｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用するＥＬＩＳＡによって確認した（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，１９８８）。
【０１０２】
（実施例ＩＶ）
（ＡＢループにおけるループ多様化（ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）を含むライブラリー）
ＡＢループにおける多様化を有する核酸ファージディスプレイライブラリーを、以下の方法によって調製した。無作為化を、縮退したヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することによって行った。多様化されるべき残基を、Ｆｎ３のＸ線構造およびＮＭＲ構造（それぞれ、タンパク質データバンク登録番号、１ＦＮＡおよび１ＴＴＦ）を試験することによって同定した。多様化した残基についてＮＮＫ（本明細書中で、ＮおよびＫは、それぞれ、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの等モル混合物、ならびにＧおよびＴの等モル混合物を示す）を含むオリゴヌクレオチドを合成した（例えば、表２における、オリゴヌクレオチドＢＣ３、ＦＧ２、ＦＧ３およびＦＧ４を参照のこと）。ＮＮＫ混合物は、２０個のアミノ酸全ておよび１つの停止コドン（ＴＡＧ）をコードする。しかし、ＴＡＧは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  ｂｌｕｅにおいて抑制される。ｐＡＳ３８の一本鎖ＤＮＡ（およびその誘導体）を、標準的なプロトコルを使用して調製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【０１０３】
部位特異的変異誘発を、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅキット（ＢｉｏＲａｄ）を使用する、公開された方法に従って行った（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５を参照のこと）。ライブラリーを、ＢＴＸエレクトロセルマニピュレータＥＣＭ  ３９５  １ｍｍギャップキュベットを使用して、１μｇのプラスミドＤＮＡを用いる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅエレクトロポーションコンピテント細胞（２００μｌ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のエレクトロポーションによって構築した。形質転換した細胞の一部を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にプレートして、形質転換の効率を決定した。代表的には、３×１０８の形質転換体を、１μｇのＤＮＡにより得た。従って、ライブラリーは、１０８〜１０９の独立したクローンを含む。ファージミド粒子を上記のように調製した。
【０１０４】
（実施例Ｖ）
（ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦまたはＦＧループにおけるループ多様化）
ＢＣループにおいて５つの多様化残基（残基番号２６〜３０）を有する核酸ファージディスプレイライブラリー、およびＦＧループにおいて７つの多様化残基（残基番号７８〜８４）を有する核酸ファージディスプレイライブラリーを、上記実施例ＩＶにおいて記載される方法を使用して調製した。ＣＤ、ＤＥ、ＥＦループにおいて多様化を有する他の核酸ファージディスプレイライブラリーを、類似の方法によって調整し得る。
【０１０５】
（実施例ＶＩ）
（ＦＧおよびＢＣループにおけるループ多様化）
ＦＧループにおいて７つの多様化残基（残基番号７８〜８４）を有し、そしてＢＣループにおいて５つの多様化残基（残基番号２６〜３０）を有する、核酸ファージディスプレイライブラリーを調製した。ＢＣループにおける多様化を、表１において記載されるＢＣ３オリゴヌクレオチドを使用して、部位特異的変異誘発によって調製した（Ｋｕｎｋｅｌら）。ＦＧループにおける多様化を、出発材料としてＢＣループライブラリーを使用して、部位特異的変異誘発を使用して導入し、それによって、ＢＣおよびＦＧループの両方における多様化を含むライブラリーを生じた。オリゴヌクレオチドＦＧ２は、多様化残基７８〜８４を有し、オリゴヌクレオチドＦＧ４は、多様化残基７７〜８１および残基８２〜８４の欠失を有する。
【０１０６】
ＦＧループにおいて５つの多様化残基（残基７８〜８４）、ＦＧループにおいて３つの残基欠失（残基８２〜８４）、およびＢＣループにおいて５つの多様化残基（残基番号２６〜３０）を有する核酸ファージディスプレイライブラリーを、調製した。より短いＦＧループを、ＦＧループの可動性を減少する試みにおいて作製した；このループは、Ｍａｉｎら（１９９２）のＮＭＲ研究により、Ｆｎ３において高度に可動性であることが示された。高度に可動性のループは、高い親和性を有する結合部位を形成するのに不利であり得る（大きなエントロピー損失がリガンド結合において予測される。なぜなら、可動性ループがより剛性でなければならないからである）。さらに、（ヒトに加えて）他のＦｎ３ドメインは、より短いＦＧループを有する（配列整列について、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら（１９９４）における図１２を参照のこと）。
【０１０７】
無作為化を、縮退したヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することによって行った（ＢＣループを多様化するためのオリゴヌクレオチドＢＣ３、ならびにＦＧループを多様化するためのオリゴヌクレオチドＦＧ２およびＦＧ４）。
【０１０８】
部位特異的変異誘発を、公開された方法に従って行った（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５を参照のこと）。ライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を電気形質転換することによって構築した。代表的には、ライブラリーは、１０８〜１０９の独立したクローンを含む。ライブラリー２は、ＢＣループにおいて５つの多様化残基、およびＦＧループにおいて７つの多様化残基を含む。ライブラリー４は、ＢＣおよびＦＧループの各々において５つの多様化残基を含み、そしてＦＧループの長さは、３残基だけ短い。
【０１０９】
（実施例ＶＩＩ）
（ループ多様化を用いて構築されたｆｄファージディスプレイライブラリー）
ファージディスプレイライブラリーを、遺伝子ベクターとしてｆｄファージを使用して構築した。Ｆｎ３遺伝子を、ＰＣＲを使用してＦｎ３遺伝子の５’末端および３’末端に導入されたＳｆｉＩ制限部位を使用して、ｆＵＳＥ５に挿入した（Ｐａｒｍｌｅｙ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，１９８８）。このファージの発現は、ｆｄファージの表面上の融合ｐＩＩＩタンパク質のディスプレイを生じる。Ｆｎ３ループにおける多様化を、本明細書上記のような部位特異的変異誘発を使用するか、またはＭ１３ファージにおいてｆＵＳＥ５ベクター中に構築されたＦｎ３ライブラリーをサブクローニングすることによって、導入した。
【０１１０】
（実施例ＶＩＩＩ）
（他のファージディスプレイライブラリー）
Ｔ７ファージライブラリー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および細菌線毛発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もまた、Ｆｎ３遺伝子を発現するのに有用である。
【０１１１】
（実施例ＩＸ）
（高分子構造に結合するポリペプチドの単離）
ファージディスプレイしたモノボディの選択を、Ｂａｒｂａｓおよび共同研究者のプロトコルに従って行った（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＆  Ｂａｒｂａｓ，１９９５）。簡潔には、炭酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）中の約１μｇの標的分子（「抗原」）を、４℃にて気密容器内で一晩インキュベートすることによって、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）のウェル中に固定化した。この溶液を除去した後、次いでウェルを、３７℃にて１時間プレートをインキュベートすることによって、ＴＢＳ中のＢＳＡの３％溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）でブロックした。約１０１２のファージミドのコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を含むファージミドライブラリー溶液（５０μｌ）を、３７℃にて１時間各ウェルに吸収させた。次いで、このウェルを、適切な緩衝液（代表的には、ＴＢＳＴ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回（最初のラウウンドに１回）洗浄した。結合したファージを、酸性溶液（代表的には、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２；５０μｌ）によって溶出し、回収したファージを、３μｌのＴｒｉｓ溶液を用いて直ちに中和した。あるいは、結合したファージを、抗原（１〜１０μＭ）を含む５０μｌのＴＢＳと共にウェルをインキュベートすることによって溶出した。回収したファージを、宿主としてＸＬ  １  Ｂｌｕｅ細胞を用いる標準的なプロトコルを使用して増幅した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。選択プロセスを、５〜６回繰返して、ポジティブなクローンを濃縮した。最終ラウンドの後、個々のクローンを拾い上げ、それらの結合親和性およびＤＮＡ配列を決定した。
【０１１２】
ファージ表面におけるモノボディの結合親和性を、ファージＥＬＩＳＡ技術（Ｌｉら，１９９５）を使用して特徴付けた。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを、抗原で被覆し、そしてＢＳＡでブロックした。単一のコロニー起源の精製したファージ（１０８〜１０１１ｃｆｕ）を、各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。適切な緩衝液（上記を参照のこと）でウェルを洗浄した後に、結合したファージを、抗Ｍ１３抗体（ウサギ、Ｓｉｇｍａ）および抗ウサギＩｇ−ペルオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用する標準的なＥＬＩＳＡプロトコルによって検出した。比色分析アッセイを、Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン，Ｐｉｅｒｃｅ）を基質として使用して実施した。
【０１１３】
このファージ表面におけるモノボディの結合親和性を、競合的ＥＬＩＳＡ法（Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅら，１９９６）を使用してさらに特徴付けた。この実験において、ファージＥＬＩＳＡを、上記と同じ様式で実施した。但し、このファージ溶液は、様々な濃度でリガンドを含んでいる。このファージ溶液を、マイクロタイタープレートウェル中で固定化したリガンドの結合の前に、４℃で、１時間インキュベートした。ファージディスプレイされたモノボディの親和性を、遊離リガンド濃度が増加するにつれて、ＥＬＩＳＡシグナルが減少することによって評価する。
【０１１４】
ファージＥＬＩＳＡを使用する、ファージの表面にディスプレイされたモノボディの主要な特徴づけ後に、陽性クローンについての遺伝子を、発現ベクターｐＡＳ４５にサブクローン化した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、発現ベクター（ｐＡＳ４５およびその誘導体）で形質転換した。細胞を、Ｍ９最小培地およびアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する、Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）を補充したＭ９培地において増殖させた。同位体標識のために、１５Ｎ  ＮＨ４Ｃｌおよび／または１３Ｃグルコースで非標識成分を置換した。適切な同位体をＩｓｏｔｅｃ  ａｎｄ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓから購入した。２リットルバッフルフラスコ中の５００ｍｌの培地に、１０ｍｌの一晩の培養物を播種し、そして約１４０ｒｐｍ、３７℃で攪拌した。ＯＤ（６００ｎｍ）が約１．０に達したときに、ＩＰＴＧを、最終濃度１ｍＭで添加し、タンパク質発現を誘導した。この細胞を、ＩＰＴＧ添加して３時間後に、遠心分離によって収集し、そして使用するまで−７０℃で凍結させておいた。
【０１１５】
Ｆｎ３およびヒスチジンタグを有するモノボディを、以下のように精製した。細胞を、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）の５ｍｌ／（ｇ細胞）中に懸濁した。ＨＥＬ（Ｓｉｇｍａ，３×結晶化）を、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌで添加した。この溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後に、これを、細胞破壊を生じるように氷上で３０秒間で３回、超音波処理した。細胞残屑を、ＳＳ−３４ローターを使用するＳｏｒｖａｌ  ＲＣ−２Ｂ遠心分離機中で１５，０００ｒｐｍの遠心分離によって除去した。濃縮した塩化ナトリウムをこの溶液に添加し、最終濃度０．５Ｍとした。次いで、この溶液を、塩化ニッケル（０．１Ｍ，１ｍｌ）をプレロードした１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＴＭキレート化カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、そして０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有するＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）中で平衡化した。この緩衝液でカラムを洗浄後、この結合したタンパク質を０．５Ｍイミダゾールを含有するＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）で溶出した。このヒスチジンタグ部分を、必要である場合、この融合タンパク質を、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供されたプロトコルを使用してトロンビンで処理することによって、切り離した。Ｆｎ３を、ヒスチジンタグペプチドおよびトロンビンから分離し、酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ５．０）中の塩化ナトリウム（０〜０．５Ｍ）の線形勾配を使用するＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって分離した。
【０１１６】
少量の可溶性モノボディを、以下のように調製した。ｐＡＳ３８誘導体（Ｆｎ３−ｐＩＩＩ融合タンパク質をコードするプラスミド）を含むＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を、ＯＤ（６００ｎｍ）が約１．０に到達するまで激しく振盪しながら３７℃にてＬＢ培地で増殖した；ＩＰＴＧを、最終濃度が１ｍＭとなるまでこの培養物に添加し、そしてこの細胞を、３７℃でさらに一晩増殖した。細胞を、遠心分離によってこの培地から取り出し、そしてこの上清を、リガンドで被覆したマイクロタイターウェルに適用した。ｐＡＳ３８およびその誘導体を含むＸＬ−ｌ  Ｂｌｕｅ細胞は、ＦＮ３−ｐＩＩＩ融合タンパク質を発現するが、可溶性タンパク質はまた、Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質分解活性によって、Ｆｎ３領域とｐＩＩＩ領域との間のリンカーの切断に起因して産生される（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＆  Ｂａｒｂａｓ，１９９５）。このリガンドに対するモノボディの結合を、Ｆｎ３に対するカスタム抗体（Ｃｏｃａｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｒｅａｍｓｔｏｗｎ，ＰＡから購入した）を使用して標準的なＥＬＩＳＡプロトコルによって調べた。標準的な浸透圧ショック法を使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラスム画分から得られた可溶性モノボディをまた、使用した。
【０１１７】
（実施例Ｘ）
（ユビキチン結合モノボディ）
ユビキチンは、真核生物の分解経路に関与する小さな（７６残基）タンパク質である。これは、単一ドメインの球状タンパク質である。酵母ユビキチンを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、そしてさらなる精製をすることなしに使用した。
【０１１８】
上記の実施例ＶＩに記載のライブラリー２およびライブラリー４を使用して、ユビキチン結合モノボディを選択した。ユビキチン（５０μｌ炭酸水素ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）中に１μｇ）を、マイクロタイタープレート中のウェルの中に固定化し、その後ＢＳＡ（ＴＢＳ中３％）でブロックした。上記のように、パニングを実施した。最初の２ラウンドにおいて、１μｇのユビキチンを、ウェル毎に固定し、そして結合したファージを酸性溶液で溶出した。第３から第６のラウンドまで、０．１μｇのユビキチンをウェル毎に固定し、そしてこのファージを、酸性溶液または１０μＭのユビキチン含有するＴＢＳのいずれかを使用することによって溶出した。
【０１１９】
選択されたクローンの結合を、ポリクローナル様式で（すなわち、個々のクローンを単離する前に）最初に選択した。全てのライブラリーから選択されたクローンは、ユビキチンに対する有意な結合を示した。これらの結果を、図９に示す。このクローンの固定化されたユビキチンに対する結合を、競合ＥＬＩＳＡ実験において３０μＭ未満の可溶性ユビキチンによってほとんど完全に阻害した（図１０を参照のこと）。ユビキチン結合モノボディのＢＣループおよびＦＧループの配列を、表４に示す。
【０１２０】
【表４】
0004578768.tif 000006
４１１クローン（これは、最も富化されたクローンである）を、ファージＥＬＩＳＡを使用して特徴付けた。この４１１クローンは、溶液中の約１０μＭのユビキチンの存在下で、選択的な結合および結合の阻害を示した（図１１）。
【０１２１】
（実施例ＸＩ）
（低分子の固定化のための方法）
標的分子を、本明細書中の以下に記載のように、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）のウェル中に固定化し、そしてこのウェルをＢＳＡでブロックした。以下に記載のような、キャリアタンパク質の使用に加え、ビオチンと標的分子の結合体を、作製し得る。次いで、ビオチン化リガンドを、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートウェルに固定化し得る。
【０１２２】
以下に記載のような、キャリアタンパク質の使用に加え、標的分子とビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）との結合体を作製し得、そしてビオチン化リガンドを、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートウェルに固定化し得る（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９３）。
【０１２３】
低分子は、キャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ））と結合し得、そして、マイクロタイタープレートウェルに受動的に吸着される。あるいは、化学結合体化の方法をまた、使用し得る。さらに、マイクロタイタープレート以外の固相支持体を、容易に使用し得る。
【０１２４】
（実施例ＸＩＩ）
（フルオレセイン結合モノボディ）
フルオレセインを、コンビナトリアルライブラリーからの抗体選択のための標的として使用し得た（Ｂａｒｂａｓら、１９９２）。ＮＨＳ−フルオレセインを、Ｐｉｅｒｃｅから入手し、そして、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）との結合体を調製する際に、製造者指示書に従って使用した。２つの型のフルオレセイン−ＢＳＡ結合体を、おおよその分子量比（１７（フルオレセイン）対１（ＢＳＡ））で調製した。
【０１２５】
この選択プロセスを、５〜６回反復し、陽性クローンを濃縮した。この実験において、このファージライブラリーを、リガンドで被覆したウェルに添加する前に、タンパク質混合物（ＢＳＡ，シトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ，ウマ）およびＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ，ウシ），各々１ｍｇ／ｍｌ）と共に、室温で３０分間インキュベートした。結合したファージを、酸溶出液の代わりに、１０μＭの可溶性フルオレセインを含有するＴＢＳで溶出した。最終ラウンド後に、個々のクローンを、選別し、そして結合親和性（以下を参照のこと）およびＤＮＡ配列を、決定した。
【０１２６】
【表５】
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選択されたクローンの結合親和性の予備的な特徴づけを、ファージＥＬＩＳＡおよび競合ファージＥＬＩＳＡを使用して実施した（図１２（フルオレセイン−１）および図１３（フルオレセイン−２）を参照のこと）。試験された４つのクローンは、リガンド被覆ウェルに対する特異的な結合を示し、そしてこの結合反応は、可溶性フルオレセインによって阻害される（図１３を参照のこと）。
【０１２７】
（実施例ＸＩＩＩ）
（ジゴキシゲニン結合モノボディ）
ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチル−カルボニル−ε−アミノカプロン酸−ＮＨＳ（Ｂｏｅｎｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、ジゴキシゲニン−ＢＳＡ結合体を調製する。このカップリング反応を、製造者指示書に従って実施する。このジゴキシゲニン−ＢＳＡ結合体を、マイクロタイタープレートのウェルにおいて固定化し、そしてパニングのために使用する。パニングを、５〜６回反復し、結合クローンを富化する。ジゴキシゲニンが、水溶液にはやや溶けにくいので、結合したファージを、酸性溶液を使用してウェルから溶出する。実施例ＸＩＶを参照のこと。
【０１２８】
（実施例ＸＩＶ）
（ＴＳＡＣ（遷移状態アナログ化合物）結合モノボディ）
カーボネート加水分解モノボディを、以下のように選択する。カーボネート加水分解についての遷移状態アナログ（４−ニトロフェニルホスホネート）を、以前に記載されたように（ＪａｃｏｂｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ，１９８７）Ａｒｂｕｚｏｖ反応によって合成する。次いで、このホスホネートを、カルボジイミドを使用してキャリアタンパク質（ＢＳＡ）とカップリングし、続いて徹底的な透析を行う（ＪａｃｏｂｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ，１９８７）。ハプテン−ＢＳＡ結合体を、マイクロタイタープレートのウェル中に固定し、そしてモノボディ選択を上記のように行う。選択されたモノボディの触媒活性を、基質として４−ニトロフェニルカーボネートを使用して試験する。
【０１２９】
触媒的モノボディを生成するために有用な他のハプテンは、Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ（１９９４）およびＮ．Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ（１９９４）に要約される。
【０１３０】
（実施例ＸＶ）
（Ｆｎ３のＮＭＲ特徴付け、および酵母によって分泌されるＦｎ３とＥ．ｃｏｌｉによって分泌されるＦｎ３との比較）
核磁気共鳴（ＮＭＲ）実験を、ＦｎＡｂと標的分子（例えば、フルオレセイン、ユビキチン、ＲＮａｓｅＡおよびジゴキシゲニンの可溶性誘導体に対するモノボディ）との間の接触表面を同定するために行う。次いで、この情報を、このモノボディの親和性および特異性を改善するために使用する。精製したモノボディサンプルを、ＹＭ−３膜を備えるＡｍｉｃｏｎ限外濾過セルを使用して、ＮＭＲ分光法のための適切な緩衝液中に溶解する。緩衝液を、９０％Ｈ２Ｏ／１０％Ｄ２Ｏ（蒸留等級、Ｉｓｏｔｅｃ）または１００％Ｄ２Ｏを用いて作製する。重水素化した化合物（例えば、アセテート）を、それらからの強力なシグナルを除去するために使用する。
【０１３１】
ＮＭＲ実験を、４つのＲＦチャネルおよびパルスフィールド勾配能力を有する三重共鳴プローブを備えるＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ＩＮＯＶＡ６００分光計で行う。ＮＭＲスペクトルを、ＵＮＩＸ（登録商標）ワークステーション上で、Ｆｅｌｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）、ｎｍｒＰｉｐｅ、ＰＩＰＰ、およびＣＡＰＰ（Ｇａｒｒｅｔｔら、１９９１；Ｄｅｌａｇｌｉｏら、１９９５）のような処理プログラムを使用して分析する。三重共鳴実験のセット（ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨおよびＨＮＣＡＣＢ）を使用し、十分に確立されたストラテジーを使用して、配列特異的共鳴の割当てを行う（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ＆Ｂａｘ，１９９２；Ｗｉｔｔｅｎｋｉｎｄ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ，１９９３）。
【０１３２】
約５Åよりも近い１Ｈ核間に、核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）が観察され、これにより、プロトン間距離の情報を入手することが可能である。一連の二重共鳴実験および三重共鳴実験（表６；これらの技術の最近の総説については、Ｂａｘ＆Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，１９９３およびＫａｙ，１９９５を参照のこと）を行い、距離（すなわち、ＮＯＥ）および二面角（Ｊカップリング）束縛を得る。同位体フィルタした実験を行って、結合したリガンドの共鳴割当てを決定し、そしてリガンド内の距離束縛およびＦｎＡｂとこのリガンドとの間の距離束縛を得る。配列特異的共鳴の割当ておよびＮＯＥピークの割当ての詳細は、他で詳細に記載されている（Ｃｌｏｒｅ＆Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，１９９１；Ｐａｓｃａｌら，１９９４ｂ；Ｍｅｔｚｌｅｒら，１９９６）。
【０１３３】
【表６】
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モノボディについての骨格の１Ｈ、１５Ｎおよび１３Ｃ共鳴割当てを、この変異体における構造的変化を評価するために、野生型Ｆｎ３の共鳴割当てと比較する。一旦、この変異体が全体的構造を保持することをこれらのデータが証明すると、構造の洗練は、実験的ＮＯＥデータを使用して行われる。モノボディの構造的差異はわずかであることが予想されるので、野生型の構造は、アミノ酸配列の改変後の最初のモデルとして使用され得る。これらの変異は、相互作用的分子モデリングによって野生型構造へと導入され、次いでこの構造は、Ｑｕａｎｔａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）のような分子モデリングプログラムを使用してエネルギー最小化される。溶液の構造を、プログラムＸ−ＰＬＯＲ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，１９９２）において、動力学的シュミレートアニーリング（Ｎｉｌｇｅｓら，１９８８）のサイクルを使用して洗練する。代表的には、５０の構造の集合が計算される。洗練された構造の正当性を、ＹＡＳＡＰプロトコル（Ｎｉｌｇｅｓら，１９９１）を使用して、Ｘ−ＰＬＯＲにおいてランダムに生成された最初の構造から少数の構造を計算することによって確認する。モノボディ−リガンド複合体の構造を、まず、分子内ＮＯＥを使用して両方の成分を個別に洗練し、次いで分子間ＮＯＥを使用してこの２つをドッキングすることによって、計算する。
【０１３４】
例えば、フルオレセイン結合モノボディＬＢ２５．５についての１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを、図１４に示す。このスペクトルは、良好な分散を示し（ピークが広がっている）、これはＬＢ２５．５が球状の構造に折り畳まれていることを示す。さらに、このスペクトルは、野生型Ｆｎ３についてのスペクトルと似ており、ＬＢ２５．５の全体的な構造がＦｎ３の構造と同様であることを示す。これらの結果は、リガンド結合モノボディが、Ｆｎ３骨格の全体的な折り畳みを変化することなく獲得され得ることを実証する。
【０１３５】
同位体標識したＦｎＡｂと非標識リガンドとの間に複合体を形成することによって、化学シフトの摂動実験を行う。化学量論的な複合体の形成後、ＨＳＱＣスペクトルを記録する。化学シフトが核の環境に極度に感受性であるため、複合体の形成は、通常、界面におけるアミノ酸残基の共鳴についてのかなりの化学シフト変化を生じる。同位体変更したＮＭＲ実験（２Ｄ  ＨＳＱＣおよび３Ｄ  ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ）を使用して、この複合体の標識された成分（すなわち、モノボディ）において摂動された共鳴を同定する。長距離の構造変化に起因する人為的な結果の可能性を常に考慮しなければならないが、連続的な表面上でクラスター形成した残基についての実質的な差異は、おそらく直接的な接触から生じる（Ｃｈｅｎら，１９９３；Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ＆Ｃｌｏｒｅ，１９９３）。
【０１３６】
相互作用面をマッピングするための代替的な方法は、アミド水素交換（ＨＸ）測定を利用する。各アミドプロトンについてのＨＸの割合を、遊離およびリガンドと複合体化した１５Ｎ標識したモノボディの両方について測定する。リガンドの結合は、２つのタンパク質の間の界面におけるモノボディ残基についてのアミドＨＸの割合を減少すると予期され、従って、結合面を同定する。この複合体におけるモノボディについてのＨＸの割合を、この複合体をＤ２Ｏへと移した後に、種々の時間にわたってＨＸを生じさせることによって、測定する；この複合体は、ｐＨを低下することによって解離し、そしてアミドＨＸが遅い低ｐＨでＨＳＱＣスペクトルが記録される。Ｆｎ３は、低ｐＨで安定かつ可溶性であり、この実験についての必要条件を満たす。
【０１３７】
（実施例ＸＶＩ）
（ユビキチンに特異的なＦｎ３ディスプレー系の構築および分析）
Ｆｎ３ディスプレー系を設計および合成し、ユビキチン結合クローンを単離し、そしてこれらのクローン中の主要なＦｎ３変異体を生物物理学的に特徴付けた。
【０１３８】
Ｆｎ３の遺伝子構築およびファージディスプレーを、上記の実施例ＩおよびＩＩのように行った。このＦｎ３ファージｐＩＩＩ融合タンパク質をファージミドディスプレーベクターから発現させ、その間、Ｍ１３ファージの他の成分（野生型ｐＩＩＩを含む）を、ヘルパーファージを使用して生成した（Ｂａｓｓら，１９９０）。したがって、この系によって生成されるファージは、表面上に提示されるＦｎ３の１つ未満のコピーを含むはずである。ファージ上でのＦｎ３の表面提示を、抗Ｆｎ３抗体を使用してＥＬＩＳＡによって検出した。Ｆｎ３−ｐＩＩＩ融合ベクターを含むファージのみが、この抗体と反応した。
【０１３９】
このファージ表面がＦｎ３を提示することを確認した後、Ｆｎ３のファージディスプレーライブラリーを実施例ＩＩＩにおけるように構築した。ランダムな配列をＢＣおよびＦＧループに導入した。最初のライブラリーにおいて、５残基（７７〜８１）を無作為化し、そして３残基（８２〜８４）をＦＧループから欠失させた。この欠失は、可撓性を減少し、そしてＦＧループの結合親和性を改善することが意図された。標的分子とのより大きな接触面を提供するために、５残基（２６〜３０）をまた、ＢＣループにおいて無作為化した。従って、得られるライブラリーは、ＢＣおよびＦＧループの各々において５つの無作為化残基を含む（表７）。このライブラリーは、約１０８の独立したクローンを含んだ。
【０１４０】
（ライブラリーのスクリーニング）
標的分子としてユビキチンを使用して、ライブラリーのスクリーニングを行った。パニングの各回において、ユビキチンでコーティングした表面にＦｎ３−ファージを吸収させ、そして結合したファージを可溶性ユビキチンと競合的に溶出した。回収率は、第２回目での４．３×１０−７から第５回目での４．５×１０−６へと改善し、結合したクローンの富化を示唆する。５回のパニングの後、個々のクローンのアミノ酸配列を決定した（表７）。
【０１４１】
（表７．富化したクローンの変化したループにおける配列）
【０１４２】
【表７】
0004578768.tif 000010
ａＮは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの等モル混合物を示す；Ｋは、ＧおよびＴの等モル混合物を示す。
【０１４３】
Ｕｂｉ４とよばれるクローンは、Ｆｎ３改変体の富化プールにおいて優勢であった。従って、さらなる調査をこのＵｂｉ４クローンに集中させた。Ｕｂｉ４は、ＢＣループに４つの変異（ＢＣループのＡｒｇ３０が保存された）、ならびにＦＧループにおける５つの変異および３つの欠失を含む。従って、残基のうち１３％（９４のうち１２）が、Ｕｂｉ４において野生型の配列から変化した。
【０１４４】
図１５は、Ｕｂｉ４のファージＥＬＩＳＡ分析を示す。Ｕｂｉ４ファージは、標的分子であるユビキチンに、有意な親和性で結合し、一方、野生型Ｆｎ３ドメインを示すファージまたは示された分子を有さないファージは、ユビキチンに対する検出可能な結合をほとんど示さない（図１５ａ）。さらに、Ｕｂｉ４ファージは、ユビキチンコーティングを欠くコントロール表面に対する幾分か上昇したレベルのバックグラウンド結合を示した。競合ＥＬＩＳＡ実験は、結合反応のＩＣ５０（結合の５０％の阻害を生じる遊離リガンドの濃度）は、約５μＭであることを示す（図１５ｂ）。ＢＳＡ（ウシリボヌクレアーゼＡ）およびシトクロムＣは、Ｕｂｉ４−ユビキチン結合反応の阻害をほとんど示さず（図１５ｃ）、このことは、ユビキチンへのＵｂｉ４の結合反応が特異的結合から生じることを示す。
【０１４５】
（変異Ｆｎ３タンパク質の特徴付け）
発現系は、培養物１ｌあたり５０〜１００ｍｇのＦｎ３タンパク質を生じた。同様のレベルのタンパク質発現は、Ｕｂｉ４クローンおよび他の変異Ｆｎ３タンパク質について観察された。
【０１４６】
Ｕｂｉ４−Ｆｎ３は、独立性タンパク質として発現された。Ｕｂｉ４の大部分は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶性タンパク質として発現されたが、その溶解度は、野生型Ｆｎ３の溶解度と比較して有意に減少していることが見出された。Ｕｂｉ４は、低いｐＨにおいて約２０μＭまで可溶性であり、中性のｐＨにおいてより低い溶解度を有した。この溶解度は、ＮＭＲ分光法またはＸ線結晶学を使用する詳細な構造的特徴付けのためにそれほど十分に高くはなかった。
【０１４７】
Ｕｂｉ４タンパク質の溶解度を、溶解度テール、ＧＫＫＧＫ（配列番号１０９）をＣ末端伸長物として添加することによって改善した。Ｕｂｉ４−Ｆｎ３の遺伝子を、ＰＣＲを使用して、発現ベクターｐＡＳ４５にサブクローニングした。Ｃ末端可溶化タグ、ＧＫＫＧＫ（配列番号１０９）を、この工程で組み込んだ。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、発現ベクター（ｐＡＳｓ４５およびその誘導体）で形質転換した。細胞を、Ｍ９最小培地およびアンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）を含むＢａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）を補充したＭ９培地中で増殖させた。同位体標識のために、１５Ｎ  ＮＨ４Ｃｌを、この培地中の未標識のＮＨ４Ｃｌと置換した。２ｌのバッフルフラスコ中の５００ｍｌの培地を、１０ｍｌの一晩培養物と共にインキュベートし、そして３７℃で撹拌した。ＯＤ（６００ｎｍ）が１に達した時に、ＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度で添加して、タンパク質発現を開始させた。ＩＰＴＧの添加の３時間後に遠心分離によってこの細胞を収集し、そして使用するまで−７０℃で凍結保存した。
【０１４８】
タンパク質を以下のように精製した。細胞を、フッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）を含むＴｒｉｓ（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）５ｍｌ／（ｇ細胞）に懸濁した。鶏卵リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加した。この溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、氷上で３０秒間、３回超音波処理した。細胞細片を遠心分離によって除去した。濃塩化ナトリウムを、０．５Ｍの最終濃度までこの溶液に添加した。この溶液を、ニッケルを予め負荷し、そして塩化ナトリウム（０．５Ｍ）を含むＴｒｉｓ緩衝液中で平衡化したＨｉ−Ｔｒａｐキレートカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。このカラムを緩衝液で洗浄した後、ヒスタグ−Ｆｎ３を、５００ｍＭ  イミダゾールを含む緩衝液で溶出した。このタンパク質を、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ４．６）中のＮａＣｌ勾配を用いて、さらに精製した。
【０１４９】
ＧＫＫＧＫ（配列番号１０９）テールを用いる場合、Ｕｂｉ４タンパク質の溶解度は、低いｐＨにおいて、１ｍＭを越え、そして中性のｐＨにおいては、約５０μＭまで増加した。従って、このＣ末端伸長を有するＵｂｉ４（本明細書中以下でＵｂｉ４−Ｋと呼ぶ）について、さらなる分析を行った。ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）の溶解度は、Ｎ末端またはＣ末端に３つのＬｙｓ残基を付加することによって、有意に改善され得ることが報告されている（Ｂｉａｎｃｈｉら、１９９４）。タンパク質Ｒｏｐの場合において、非構造的Ｃ末端テールは、その溶解度の維持において重要である（Ｓｍｉｔｈら、１９９５）。
【０１５０】
Ｕｂｉ４タンパク質のオリゴマー化状態を、サイズ排除カラムを使用して決定した。野生型Ｆｎ３タンパク質は、低いｐＨおよび中性のｐＨにおいて、モノマーであった。しかし、Ｕｂｉ４−Ｋタンパク質のピークは、野生型Ｆｎ３のピークより有意に幅広く、そして野生型タンパク質の後に溶出した。このことは、Ｕｂｉ４−Ｋとカラム材料との間の相互作用を示唆し、Ｕｂｉ４のオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィーの使用を不可能にする。ＮＭＲ研究は、このタンパク質が、低いｐＨにおいてモノマーであることを示唆する。
【０１５１】
Ｕｂｉ４−Ｋタンパク質は、ＥＬＩＳＡによって判断されるように、ユビキチンに対する結合親和性を保持した（図１５ｄ）。しかし、バイオセンサ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）を使用して解離定数を決定する試みは、センサマトリクスに対するＵｂｉ４−Ｋ−Ｆｎ３の高いバックグラウンド結合のために、失敗した。このマトリクスは、主にデキストランからなり、Ｕｂｉ４−Ｋが、サイズ排除カラムの架橋デキストランと相互作用するという観察と一致する。
【０１５２】
（実施例ＸＶＩＩ）
（モノボディーの安定性の測定）
グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）誘導性のアンフォールディング反応および再折り畳み反応を、トリプトファン蛍光を測定することによって追跡した。モーター駆動式シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ．）を備えたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＡＢ−２分光蛍光計で、実験を行った。キュベットの温度を、３０℃に保った。この分光蛍光計およびシリンジを、手製のインターフェースを使用して１つのコンピューターによって制御した。このシステムは、ＧｕＨＣｌ滴定後に一連のスペクトルを、自動的に記録する。実験は、５μＭのタンパク質を含む１．５ｍｌの緩衝溶液を用いて開始した。発光スペクトル（３００〜４００ｎｍ；２９０ｎｍで励起）を、ＧｕＨＣｌを含む緩衝溶液の各注入（５０μｌまたは１００μｌ）後の遅れ（３〜５分）に続いて記録した。これらの工程を、溶液の容積がキュベットの全容量（３．０ｍｌ）に達するまで繰り返した。蛍光強度を、別個の実験で決定した等蛍光点（ｉｓｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）における強度に対する割合として正規化した。アンフォールディング曲線を、非線形最小２乗ルーチンを使用して、２状態モデルにフィッティングした（Ｓａｎｔｏｒｏ  ＆  Ｂｏｌｅｎ，１９８８）。２分および１０分の遅れ時間（注入とスペクトル取得の開始との間）を用いる実験の間に、有意な差違は観察されず、このことは、アンフォールディング／再折り畳み反応が、使用した遅れ時間内の各濃度点において、平衡に近づいたことを示す。
【０１５３】
Ｕｂｉ４−Ｋの構造的安定性を、上記のＧｕＨＣｌ誘導性アンフォールディング方法を使用して測定した。この測定は、以下の２セットの条件下で行った：第１に、３００ｍＭ  塩化ナトリウムの存在下、ｐＨ３．３（ここで、Ｕｂｉ４−Ｋは、非常に可溶性である）、および第２に、ＴＢＳ中（これは、ライブラフィーのスクリーニングのために使用した）。両方の条件下で、アンフォールディング反応は可逆性であり、そして本発明者らは、凝集の徴候も不可逆性のアンフォールディングの徴候も検出しなかった。図１６は、Ｕｂｉ４−Ｋ、ならびにＮ末端（ｈｉｓ）６タグおよびＣ末端溶解性タグを有する野生型Ｆｎ３のアンフォールディング遷移を示す。野生型Ｆｎ３の溶解度は、これらのタグの付加に有意には影響されなかった。アンフォールディング遷移を特徴付けるパラメーターを、表８に列挙する。
【０１５４】
（表８．ＧｕＨＣｌ誘導性アンフォールディングにより決定される、Ｕｂｉ４および野生型Ｆｎ３の安定性パラメーター）
【０１５５】
【表８】
0004578768.tif 000011
ΔＧ０は、変性剤の非存在下におけるアンフォールディングの自由エネルギーである；ｍＧは、ＧｕＨＣｌ濃度に対するアンフォールディングの自由エネルギーの依存性である。溶液の条件については、図４の説明文を参照のこと。
【０１５６】
２つのループ内の導入された変異は、野生型Ｆｎ３に対するＵｂｉ４−Ｋの安定性を確かに減少したが、Ｕｂｉ４の安定性は、「代表的な」球状タンパク質の安定性に匹敵したままである。野生型およびＵｂｉ４−Ｋタンパク質の安定性は、ｐＨ７．５におけるよりｐＨ３．３におけるほうが大きかったことに留意しなければならない。
【０１５７】
Ｕｂｉ４タンパク質は、野生型Ｆｎ３の溶解度と比較して有意に減少した溶解度を有するが、この溶解度は、溶解性テールの付加によって改善された。２つの変異ループは、野生型とＵｂｉ４タンパク質との間の差異のみを含むが、これらのループは、減少した溶解度の原因であるに違いない。現時点で、Ｕｂｉ４−Ｋの凝集が、これらのループ間の相互作用によって引き起こされるのか、ループとＦｎ３骨格の不変領域との間の作用によって引き起こされるのかは明らかではない。
【０１５８】
Ｕｂｉ４−Ｋタンパク質は、Ｆｎ３の折り畳み全体を維持し、このことは、この骨格が、試験された２つのループにおける多数の変異に適応し得ることを示す。Ｕｂｉ４−Ｋタンパク質の安定性は、野生型Ｆｎ３タンパク質の安定性より有意に低いが、Ｕｂｉ４タンパク質はなお、小さな球状タンパク質の安定性に匹敵する構造安定性を有する。骨格として非常に安定なドメインを使用することは、この骨格の折り畳み全体に影響を与えることなく、変異を導入するために明らかに有利である。さらに、Ｕｂｉ４タンパク質のＧｕＨＣｌ誘導性アンフォールディングは、ほとんど完全に可逆性である。これにより、Ｆｎ３変異体が、封入体の場合のように、誤って折り畳まれた形態で発現される場合でさえ、正しく折り畳まれたタンパク質の調製が可能となる。ライブラリーのスクリーニングのために使用される条件におけるＵｂｉ４の穏やかな安定性は、Ｆｎ３改変体がファージ表面上で折り畳まれることを示す。このことは、Ｆｎ３クローンが、変性形態ではなく、折り畳まれた形態で、その結合親和性によって選択されることを示す。Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎらは、ＢＣループ中のＶａｌ２９およびＡｒｇ３０が、Ｆｎ３を安定化することを提唱した。Ｖａｌ２９は、疎水性コアと接触し、そしてＡｒｇ３０は、Ｇｌｙ５２およびＶａｌ７５と水素結合を形成する。Ｕｂｉ４−Ｆｎ３において、Ｖａｌ２９は、Ａｒｇで置換され、一方、Ａｒｇ３０は保存される。ＦＧループはまた、ライブラリーにおいて変異された。このループは、野生型構造において可撓性であり、そしてヒトＦｎ３ドメインの間で長さの大きな変動を示す（Ｍａｉｎら、１９９２）。これらの観察は、ＦＧループにおける変異が、安定性に対する影響をそれほど有し得ないことを示唆する。さらに、Ｆｎ３のＮ末端テールは、ＢＣループおよびＦＧループによって形成される分子表面に隣接し（図１および１７）、そして十分に規定された構造を形成しない。Ｎ末端テールにおける変異は、安定性に対する強力な悪影響を有さないと予測された。従って、Ｎ末端テール中の残基は、さらなる変異の導入のために良好な部位であり得る。
【０１５９】
（実施例ＸＶＩＩＩ）
（Ｕｂｉ４−Ｆｎ３のＮＭＲ分光法）
Ｕｂｉ４−Ｆｎ３を、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）を含む［２Ｈ］−Ｇｌｙ  ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ３．３）に溶解した。タンパク質の最終濃度は、１ｍＭであった。パルスフィールド勾配を有する三重共鳴プローブを備えるＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ＩＮＯＶＡ  ６００分光計を用いて、ＮＭＲ実験を行った。プローブ温度は、３０℃に設定した。ＨＳＱＣ、ＴＯＣＳＹ−ＨＳＱＣおよびＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルを、公開された手順（Ｋａｙら、１９９２；Ｚｈａｎｇら、１９９４）を使用して記録した。ＮＭＲスペクトルを処理し、そしてＮＭＲＰｉｐｅおよびＮＭＲＶｉｅｗソフトウエア（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｂｌｅｖｉｎｓ、１９９４；Ｄｅｌａｇｌｉｏら、１９９５）を使用して、ＵＮＩＸ（登録商標）ワークステーションで分析した。配列特異的共鳴アサインメントを、標準的な手順（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，１９８６；ＣｌｏｒｅおよびＧｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、１９９１）を使用して行った。野生型Ｆｎ３についてのアサインメント（Ｂａｒｏｎら、１９９２）を、３０℃の酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．６）中に溶解した１５Ｎ標識タンパク質を使用して確認した。
【０１６０】
Ｕｂｉ４−Ｋの三次元構造を、この異核ＮＭＲ分光法を使用して特徴付けた。低いｐＨにおいて、１５Ｎ標識Ｕｂｉ４（図１７ａ）の１ｍＭ溶液について、良質のスペクトルを収集し得た。Ｕｂｉ４−Ｋのアミドピークの線幅は、野生型Ｆｎ３の線幅と類似しており、このことは、Ｕｂｉ４−Ｋが使用した条件下でモノマーであることを示唆する。骨格１Ｈ核および１５Ｎ核の完全なアサインメントを、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグ中の一列のＨｉｓ残基を除いて、標準的な１Ｈ，１５Ｎ二重共鳴技術を使用して達成した。ＨＳＱＣスペクトル中に数個の弱いピークが存在し、これはＮ末端Ｍｅｔ残基を含む小数の種由来であると考えられる。質量分光分析は、大部分のＵｂｉ４−Ｋは、Ｎ末端Ｍｅｔ残基を含まないことを示した。図１７は、Ｕｂｉ４−Ｋと野生型Ｆｎ３との間の、１ＨＮおよび１５Ｎの化学シフトにおける差違を示す。変異ＢＣループおよびＦＧループの中またはその付近を除く化学シフトにおいて、小さな差異のみが観察される。これらの結果は、２つのループにおける広範な変異にもかかわらず、Ｕｂｉ４−Ｋが、Ｆｎ３の折り畳み全体を保持することを明確に示す。Ｎ末端領域中の数個の残基（これは、２つの変異ループに接近している）はまた、２つのタンパク質間の有意な化学的差異を示す。ＨＳＱＣスペクトルをまた、ＴＢＳ中のＵｂｉ４−Ｋの５０μＭのサンプルについて記録した。このスペクトルは、低いｐＨにおいて収集したスペクトルと類似しており、このことは、Ｕｂｉ４の構造全体が、ｐＨ７．５とｐＨ３．３との間で維持されていることを示す。
【０１６１】
（実施例ＸＩＸ）
（タンパク質表面上の不利な静電的相互作用を除去することによる、Ｆｎ３ドメインの安定化）
（導入）
変異によるタンパク質の構造安定性の増加は、タンパク質設計およびバイオテクノロジーにおいて大きな関心がもたれる。タンパク質の三次元構造は、異なる型の力の組み合わせによって安定化される。疎水性効果、ファンデルワールス相互作用、および水素結合は、折り畳まれた状態のタンパク質の安定化に寄与することが知られている（Ｋａｕｚｍａｎｎ，Ｗ．（１９５９）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．１４，１−６３；Ｄｉｌｌ，Ｋ．Ａ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，７１３３−７１５５；Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．，Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ｂ．Ａ．，ＭｃＮｕｔｔ，Ｍ．＆  Ｇａｊｉｗａｌａ，Ｋ．（１９９６）Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １０，７５−８３）。これらの安定化力は、主に、タンパク質中に十分に充填されている残基（例えば、疎水性コアを構成する残基）に由来する。タンパク質コアにおける変化は、隣接する部分の再配置を誘導するため、大量計算なしでこれらの力を増大することによってタンパク質の安定性を改善することは困難である（Ｍａｌａｋａｕｓｋａｓ，Ｓ．Ｍ．およびＭａｙｏ，Ｓ．Ｌ．（１９９８）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５，４７０−４７５）。荷電基間のイオン対は、通常、タンパク質表面上に見出され（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、イオン対は、小さな構造的摂動を伴ってタンパク質に導入され得た。しかし、多数の研究は、タンパク質表面における誘引性静電相互作用（例えば、イオン対）の導入は、安定性に対して小さな影響を有することを実証した（Ｄａｏ−ｐｉｎ，Ｓ．，Ｓａｕｅｒ，Ｕ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｈ．およびＭａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，７１４２−７１５３；Ｓａｌｉ，Ｄ．，Ｂｙｃｒｏｆｔ，Ｍ．およびＦｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０，７７９−７８８）。大きな脱溶媒和ペナルティーおよびアミノ酸側鎖の構造エントロピーの損失は、有利な静電的寄与に対抗する（Ｙａｎｇ，Ａ．−Ｓ．およびＨｏｎｉｇ，Ｂ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，４０−４５；Ｈｅｎｄｓｃｈ，Ｚ．Ｓ．およびＴｉｄｏｒ，Ｂ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３，２１１−２２６）。最近の研究により、タンパク質表面上の斥力的静電相互作用は、対照的に、タンパク質を有意に不安定化し得ること、および表面静電相互作用を最適化することによってタンパク質の安定性を改善することが可能であることが実証された（Ｌｏｌａｄｚｅ，Ｖ．Ｖ．，Ｉｂａｒｒａ−Ｍｏｌｅｒｏ，Ｂ．，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，Ｊ．Ｍ．およびＭａｋｈａｔａｄｚｅ，Ｇ．Ｉ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，１６４１９−１６４２３；Ｐｅｒｌ，Ｄ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕ．，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．およびＳｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．（２０００）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ７，３８０−３８３；Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｃａｒｐ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｂｂｌｅｅ，Ｊ．，Ｈｅｎｄｓｃｈ，Ｚ．Ｓ．，Ｆａｉｒｍａｎ，Ｒ．，Ｔｉｄｏｒ，Ｂ．およびＲ��ｌｅｉｇｈ，Ｄ．Ｐ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，８７２−８７９；Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，Ｇ．Ｒ．Ｓｈａｗ，Ｋ．Ｌ．，Ｆｅｅ，Ｌ．Ｒ．，Ａｌｓｔｏｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｙｇｈｕｅｓ−Ｄｅｓｐｏｉｎｔｅｓ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｈｕｒｌｋｉｌｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｃｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．およびＰａｃｅ，Ｃ．Ｎ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８，１８４３−１８４９）。現在の実験において、本発明者らは、表面静電相互作用を改変することによって、タンパク質の安定性を改善した。
【０１６２】
モノボディーの特徴付けをしている間に、これらのタンパク質（ならびに野生型ＦＮｆｎ１０）が、低ｐＨにおいて、中性ｐＨよりも有意に安定であることが見出された（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１）。これらの観察は、ＦＮｆｎ１０中のいくつかの部分のイオン化状態の変化が、そのタンパク質のコンホメーションの安定性を調整することを示し、そして中性ｐＨでそのタンパク質の静電的特性を調節することによって、ＦＮｆｎ１０のコンホメーションの安定性を増強することが可能であり得ることを示唆する。ＦＮｆｎ１０のコンホメーションの安定性を改善することはまた、バイオテクノロジーへの応用における足場としてのＦＮｆｎ１０の使用における実践的な重要性を有する。
【０１６３】
以下に記載するのは、ＦＮｆｎ１０の安定性のｐＨ依存性の特徴付けを詳述し、側鎖カルボキシル基の間の望ましくない相互作用を同定し、そして表面上での点変異によるＦＮｆｎ１０のコンホメーションの安定性を改善した実験である。その結果は、表面の静電相互作用が、タンパク質の安定性に有意に寄与すること、およびこれらの相互作用を合理的に調整することによってタンパク質の安定性を増強することが可能であることを示す。
【０１６４】
（実験手順）
（タンパク質発現および精製）
ＮＭＲ研究のために使用される野生型タンパク質は、ＦＮｆｎ１０の残基１〜９４（残基の番号付けは、Ｋｏｉｄｅら（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１）の図２（ａ）に従う）、およびＮ末端でのさらなる２つの残基（Ｍｅｔ−Ｇｌｎ）（これらの２つの残基は、−２および−１とそれぞれ番号付けされる）を含んでいた。そのタンパク質をコードする遺伝子を、ｐＥＴ３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＷＩ）に挿入した。発現ベクターで形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１３Ｃグルコースおよび１５Ｎ塩化アンモニウム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）をそれぞれ単独の炭素および窒素源として補充したＭ９最小培地において増殖した。タンパク質発現を、以前に記載されたように（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１）誘導した。遠心分離によってこれらの細胞を回収した後、その細胞を記載されたように（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１）溶解した。遠心分離後、上清を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析し、そしてそのタンパク質溶液をＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にかけ、そしてＦＮ３を塩化ナトリウムの勾配によって溶出した。そのタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器を使用し、ＹＭ−３メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。
【０１６５】
安定性測定のために使用される野生型タンパク質は、Ｎ−末端のｈｉｓｔａｇ（ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ）（配列番号１１４）およびＦＮｆｎ１０の残基２〜９４を含んでいた。上記のＦＮ３の遺伝子を、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した。そのタンパク質を、記載されるように（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１）発現し、そして精製した。図２２に示されるｐＨ依存性の測定のために使用されるその野生型タンパク質は、Ａｒｇ６のＴｈｒへの変異を含んでおり、これは元々、二次トロンビン切断部位を除去するために導入された（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１）。Ａｓｐ７（これはＡｒｇ６の隣にある）が、（結果）のところに詳述されるようにＦＮ３の安定性のｐＨ依存性に重要であることが見出されたため、その後の研究を、野生型のＡｒｇ６バックグラウンドを使用して行った。Ｄ７ＮおよびＤ７Ｋ変異体についての遺伝子を、標準的なポリメラーゼ連鎖反応を使用して構築し、そしてｐＥＴ１５ｂに挿入した。これらのタンパク質を、野生型タンパク質についてと同じ様式で調製した。ｐＫａ測定のための１３Ｃ、１５Ｎ標識タンパク質を、上記のように調製し、そしてｈｉｓｔａｇ部分はこれらのタンパク質からは除去しなかった。
【０１６６】
（化学的変性測定）
タンパク質を、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する種々のｐＨの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液中、５μＭの最終濃度まで溶解した。グアニジンＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）誘導アンフォールディング実験を、以前に記載されたように行った（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１；Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．，Ｂｕ，Ｚ．，Ｒｉｓａｌ，Ｄ．，Ｐｈａｍ，Ｔ．−Ｎ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．，Ｔａｍｕｒａ，Ａ．＆Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，４７５７−４７６７）。ＧｕＨＣｌ濃度を、記載されたように（Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．＆Ｓｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，編）Ｖｏｌ．ｐｐ２９９−３２１，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、Ａｂｂｅ屈折計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して決定した。データを２状態モデルに従って、記載されたように（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｍ．Ｍ．＆Ｂｏｌｅｎ，Ｄ．Ｗ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７，８０６３−８０６８）分析した。
【０１６７】
（熱変性測定）
タンパク質を、０．１Ｍもしくは１Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、または０．１Ｍもしくは１Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭグリシンＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．４）中、５μＭの最終濃度まで溶解した。さらに６．３Ｍの尿素を、全ての溶液に含め、熱変性反応の可逆性を確実にした。尿素の非存在下では、変性ＦＮｆｎ１０がクウォーツ表面に接着すること、および熱変性反応が非可逆的であることが見出された。円偏光２色性測定を、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度制御装置（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたＭｏｄｅｌ  ２０２分光光度計を使用して行った。０．５ｃｍの光路長のキュベットを使用した。２２７ｎｍでの楕円率を、サンプルの温度が１分間当たり約１℃の割合で上昇するにつれ、測定した。高温での尿素の分解のため、タンパク質溶液のｐＨは、実験の間に上方にシフトする傾向があった。タンパク質溶液のｐＨを、各熱変性測定の前および後に測定し、各測定において生じるシフトが０．２ｐＨ単位を超えてシフトしないことを確実にした。ｐＨ２．４において、熱変性曲線の２つの部分（３０〜６５℃および６０〜９５℃）を、別々のサンプルから取得し、大きなｐＨシフトを回避した。熱変性データを、標準的な２状態モデル（Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．＆Ｓｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，編）Ｖｏｌ．ｐｐ２９９−３２１，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ））：
【０１６８】
【数１】
0004578768.tif 000012
（ここで、ΔＧ（Ｔ）は、温度Ｔでのアンフォールディングのギブスの自由エネルギー、ΔＨｍは、遷移の中点Ｔｍでのアンフォールディングの際のエンタルピー変化であり、そしてΔＣｐは、アンフォールディングの際の熱容量変化である。）にフィットさせた。ΔＣｐの値を、Ｍｙｅｒｓら（Ｍｙｅｒｓ，Ｊ．Ｋ．，Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．＆Ｓｃｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．４，２１３８−２１４８）の近似にしたがって、１．７４ｋｃａｌｍｏｌ−１Ｋ−１に固定した。１Ｍ  ＮａＣｌの存在下で取得したデータセットのほとんどは、アンフォールディング状態についての十分な基線を有しておらず、したがって、１Ｍ  ＮａＣｌの存在下でのアンフォールディングした基線の勾配は、０．１Ｍ  ＮａＣｌの存在下で決定されたものと同一であると仮定した。
【０１６９】
（ＮＭＲ分光法）
ＮＭＲ実験を３０℃でＩＮＯＶＡ６００分光光度計（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で行った。Ｃ（ＣＯ）ＮＨ実験（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ、Ｓ．Ａｎｇｌｉｓｔｅｒ，Ｊ．＆Ｂａｘ，Ａ．（１９９３）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｂ１０１，１１４−１１９）およびＣＢＣＡＣＯＨＡ実験（Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，２０５５−２０５７）を、５％（ｖ/ｖ）重水を含有する５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）中に溶解した［１３Ｃ，１５Ｎ］−野生型ＦＮｆｎ１０サンプル（１ｍＭ）上に、Ｖａｒｉａｎの５ｍｍ三重共鳴プローブを、パルスフィールド勾配を用いて使用して回収した。カルボキシル１３Ｃ共鳴を、ＦＮｆｎ１０のバックボーンの１Ｈ、１３Ｃ、および１５Ｎ共鳴割当（Ｂａｒｏｎ，Ｍ．，Ｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｐ．Ｃ．，Ｍａｒｄｏｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｂｏｙｄ，Ｊ．＆Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，２０６８−２０７３）に基づいて、割り当てた。カルボキシル共鳴のｐＨ滴定を、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび５％（ｖ／ｖ）重水を含有する１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム中に溶解した０．３ｍＭのＦＮｆｎ１０サンプル上で行った。８ｍｍの三重共鳴、パルスフィールド勾配プローブ（Ｎａｎｏｌａｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ｐＨ滴定のために使用した。２次元Ｈ（Ｃ）ＣＯスペクトルを、以前に記載されたＣＢＣＡＣＯＨＡパルス配列（ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｌ．Ｐ．，Ｈａｎｄ，Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｍ．Ｄ．，Ｋｏｅｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｐｌｅｓｎｉａｋ，Ｌ．Ａ．，Ｚｉｓｅｒ，Ｌ．，Ｗａｋａｒｃｈｕｋ，Ｗ．Ｗ．＆Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，９９５８−９９６６）を使用して回収した。サンプルｐＨを、塩酸の小アリコートを添加することによって変化させ、そしてｐＨをＮＭＲデータをとる前および後に測定した。１Ｈ、１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを以前に記載されたように取得した（Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｋｅｉｆｅｒ，Ｐ．＆Ｓａａｒｉｎｅｎ，Ｔ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１０６６３−１０６６５）。ＮＭＲデータを、ＮＭＲＰｉｐｅパッケージ（Ｄｅｌａｇｌｉｏ，Ｆ．，Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，Ｖｕｉｓｔｅｒ，Ｇ．Ｗ．，Ｚｈｕ，Ｇ．，Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｊ．＆Ｂａｘ，Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ６，２７７−２９３）を使用して処理し、そしてＮＭＲＶｉｅｗソフトウェア（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ａ．＆Ｂｌｅｖｉｎｓ，Ｒ．Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ４，６０３−６１４）を使用して分析した。
【０１７０】
カルボキシル１３Ｃ共鳴のＮＭＲ滴定曲線を、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式にフィットさせて、ｐＫａ’ｓを決定した：
【０１７１】
【数２】
0004578768.tif 000013
ここで、δは、測定した化学シフトであり、δ酸は、プロトン化した状態に関連する化学シフトであり、δ塩基は、脱プロトン化した状態に関連する化学シフトであり、そしてｐＫａは、その残基のｐＫａ値である。データはまた、２つのイオン化可能基を有する式：
【０１７２】
【数３】
0004578768.tif 000014
にフィットさせた。ここで、δＡＨ２、δＡＨおよびδＡは、完全にプロトン化した状態、単数だけプロトン化した状態および脱プロトン化した状態にそれぞれ関連する化学シフトであり、そしてｐＫａ１およびｐＫａ２は、２つのイオン化段階に関連するｐＫａである。データのフィッティングを、マッキントッシュコンピュータ上でＩｇｏｒ  Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｘ、ＯＲ）プログラムにおける非線形最小２乗回帰分析法を使用して行った。
【０１７３】
（結果）
（ＦＮｆｎ１０安定性のｐＨ依存性）
以前に、ＦＮｆｎ１０が酸性ｐＨで中性ｐＨよりも安定であることが見出された（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．＆Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１１４１−１１５１）。本実験において、その安定性のｐＨ依存性は、さらに特徴付けられた。その高い安定性のために、ＦＮｆｎ１０は、尿素中で３０℃で十分に変性され得なかった。したがって、ＧｕＨＣｌ誘導性化学変性（図１８）を使用した。その変性反応は、試験された全ての条件下で完全に可逆的であった。外挿により生じた誤差を最小化するために、４Ｍ  ＧｕＨＣｌでのアンフォールディングのその自由エネルギーを比較のために使用した（図１８）。その安定性はｐＨが低下するにつれて増大し、ｐＨ範囲の両端で見かけ上プラトーになった。ｐＨ依存性曲線は、ｐＨ４付近に見かけ上の遷移中点を有する。さらに、ｍ値（アンフォールディング自由エネルギーの変性物濃度に対する依存性）の漸増が観察された。Ｐａｃｅらは、ｂａｒｎａｓｅについてのｍ値の同様のｐＨ依存性を報告した（Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．，Ｌａｕｒｅｎｔｓ，Ｄ．Ｖ．＆Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，２７２８−２７３４）。これらの結果は、ＦＮｆｎ１０が、低ｐＨでタンパク質を安定化させる相互作用、または中性ｐＨでそれを不安定化させる相互作用を含むことを示す。その結果はまた、ｐＨ依存性を生じる相互作用を同定および変化させることによって、当業者が、中性ｐＨで、低ｐＨで見出される安定性と同様な程度までＦＮｆｎ１０の安定性を改善し得ることを示唆する。
【０１７４】
（野生型ＦＮｆｎ１０における側鎖カルボキシル基のｐＫａの決定）
ＦＮｆｎ１０安定性のｐＨ依存性は、４付近のｐＫａを有するアミノ酸が、観察された遷移に関与することを示唆する。ＡｓｐおよびＧｌｕのカルボキシル基は、一般に、この範囲でｐＫａを有する（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。カルボキシル基が、折り畳まれた状態で不利な（すなわち、不安定化する）相互作用を有する場合、そのｐＫａは、その非摂動値からより高い値にシフトすることは周知である（Ｙａｎｇ，Ａ．-Ｓ．＆Ｈｏｎｉｇ，Ｂ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，４０−４５）。カルボキシル基が、折り畳まれた状態において有利な相互作用を有する場合、それは、より低いｐＫａを有する。したがって、異核ＮＭＲ分光法を使用したＦＮｆｎ１０における全てのカルボン酸塩のｐＫａ値を、カルボキシル基を包含する安定化および不安定化相互作用を同定するために決定した。
【０１７５】
第１に、ＦＮ３における各ＡｓｐおよびＧｌｕ残基のカルボキシルの炭素についての１３Ｃ共鳴を、割り当てた（図１９）。次に、これらの基についての１３Ｃ共鳴のｐＨ滴定を行った（図２０）。Ａｓｐ３、６７、８０、およびＧｌｕ３８および４７についての滴定曲線は、単一のｐＫａを用いてＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式と良くフィットし得た。これらの残基についてのｐＫａ値（表９）は、それらのそれぞれの非摂動値に近いかまたはそれよりわずかに低いかのいずれかであり（Ａｓｐについて３．８〜４．１、そしてＧｌｕについて４．１〜４．６（Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｂ．，Ｌｕｉｓｉ，Ｄ．Ｌ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．＆Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｄ．Ｐ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，４８９６−４９０３））、これは、これらのカルボキシル基が、折り畳まれた状態で、中性かまたはわずかに有利な静電相互作用に関与していることを示す。
【０１７６】
【表９】
0004578768.tif 000015
Ａｓｐ７および２３、ならびにＧｌｕ９についての滴定曲線は、２つのｐＫａ値を使用してＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式とより良くフィットし、そして各々についての２つのｐＫａ値のうちの１つは、それぞれの非摂動値よりも高くシフトした（図１９Ｂ）。これらのカルボキシル基の見かけのｐＫａ値を有するその滴定曲線は、近傍のイオン化基の影響に起因し得る。ＦＮｆｎ１０の三次元構造（Ｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｈａｒｖｅｙ，Ｔ．Ｓ．，Ｂａｒｏｎ，Ｍ．、Ｂｏｙｄ，Ｊ．＆Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，６７１−６７８）において、Ａｓｐ７および２３、ならびにＧｌｕ９は、表面上にパッチを形成し（図２１）、Ａｓｐ７は、パッチの中央に位置している。したがって、これらの残基が互いのイオン化プロフィールに影響を及ぼすことが予想されることは合理的である。３つの残基のどれが高度にシフトしていないｐＫａを有するかを同定するために、次いで、ｐＨ＊５．０（ｐＨメーターの直接の読み）での９９％Ｄ２Ｏ緩衝液中のそのタンパク質のＨ（Ｃ）ＣＯスペクトルを回収した。Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９は、Ａｓｐ７（０．１８ｐｐｍ）よりも大きい重水同位体のシフトを示した（それぞれ、０．３３および０．３２ｐｐｍ）。これらの結果は、Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９が、Ａｓｐ７よりも大きい程度までプロトン化していることを示す。したがって、本発明者らは、Ａｓｐ２３およびＧｌｕ９が、Ａｓｐ７の強い影響のために高度にシフトしたｐＫａを有すると結論した。
【０１７７】
（変異分析）
Ａｓｐ７およびＡｓｐ２３、ならびにＧｌｕ９の空間的な近さによって、この研究において同定された、ＦＮｆｎ１０における不利な静電気的相互作用が説明される。これらの残基がプロトン化され、そして中性である低いｐＨにおいて、反発的な相互作用が、最も開放されると期待される。従って、これら３つの残基の間の静電気的反発を除去することによって、中性のｐＨでＦＮｆｎ１０の安定性を改善することが可能であるはずである。Ａｓｐ７は３つの残基の間で中心に配置されるので、Ａｓｐ７を変異させることが決定された。二つの変異体、Ｄ７ＮおよびＤ７Ｋが調製された。前者は、実質的に同じサイズの残基で陰性の荷電を中和する。後者は、残基７に陽性の荷電を配置し、そして側鎖のサイズを増加する。
【０１７８】
２つの変異タンパク質の１Ｈ、１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルは、野生型タンパク質のスペクトルとほぼ同じであり、これは、これらの変異が、大きな構造的混乱を引き起こさなかったことを示す（データは示さない）。次いで、変異タンパク質の安定性の程度は、熱的および化学的変性の測定を使用して特徴付けられた。熱変性の測定は、最初に、１００ｍＭ塩化ナトリウムで実行され、そして６．３Ｍ尿素を、可逆な変性を保証し、そして熱遷移の温度を減少させるために含んだ。全てのタンパク質が、６．３Ｍ尿素中、室温で優勢に折り畳まれた。全てのタンパク質が協同的な遷移を起こし、そして２つの変異体が、中性のｐＨで野生型よりも有意に安定であることが見出された（図２２および表１０）。さらに、これらの変異は、ＦＮｆｎ１０のコンフォメーションの安定性のｐＨ依存性をほとんど除去した。これらの結果は、中性のｐＨにおける野生型ＦＮｆｎ１０のＡｓｐ７に関係する不安定化の相互作用が、ｐＨ依存性の主な原因であることを確認した。
【０１７９】
【表１０】
0004578768.tif 000016
０．１Ｍ  ＮａＣｌデータについての中点の誤差は、±０．５℃である。１Ｍ  ＮａＣｌデータの大部分が変性状態について十分なベースラインを有さなかったので、これらのデータについての中点の誤差は、±２℃と推定した。
【０１８０】
野生型タンパク質および２つの変異タンパク質のコンフォメーションの安定性に対する、増加した塩化ナトリウム濃度の効果を次に調査した。全てのタンパク質が、０．１Ｍの塩化ナトリウムにおけるよりも１Ｍの塩化ナトリウムにおいてより安定であった（図２２）。塩化ナトリウム濃度の増加は、酸性のｐＨおよび中性のｐＨの両方において、約１０℃、変異タンパク質のＴｍを上昇させた（表１０）顕著に、野生型タンパク質がまた両方のｐＨにおいて等しく安定であった。しかし、野生型タンパク質が、中性ｐＨにおいてカルボキシ基間に不利な相互作用を含むが、酸性ｐＨでは含まない。
【０１８１】
Ｆｎｆｎ１０タンパク質の化学的変性は、ＦＮｆｎ１０の単一のＴｒｐ残基からの蛍光放出を使用してモニターされた（図２３）。ｐＨ６．０および４Ｍ  ＧｕＨＣｌで広がる（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）自由エネルギーは、野生型、Ｄ７ＮおよびＤ７Ｋについて、それぞれ、１．１（±０．３）、１．７（±０．２）および１．４（±０．１）ｋｃａｌ／ｍｏｌであることを決定した。これは、２つの変異体がまた、化学的な変性に対してコンフォメーショナルな安定性を増加したことを示す。
【０１８２】
（変異タンパク質における側鎖カルボニル基のｐＫａの決定）
２つの変異体タンパク質におけるカルボキシル基のイオン化特性を調査した。ｐＨ滴定の高い端および低い端（それぞれ、ｐＨ約７および約１．５）における変異タンパク質の２Ｄ  Ｈ（Ｃ）ＣＯスペクトルは、Ａｓｐ７についての交差ピークの損失を除いて、野生型のそれぞれのスペクトルとほぼ同一であった（データは示さない）。この類似性は、野生型ＦＮｆｎ１０のアサインメントに基づいて、変異体の共鳴の明白なアサインメントを可能にする。ｐＨ滴定実験は、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３を除いて、ＡｓｐおよびＧｌｕカルボキシル基の挙動が、野生型タンパク質のそれらの対応物に非常に近いことを明かにし（図２４パネルＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ、ならびに表９）、これは、２つの変異がこれらのカルボキシレートに対して静電気的環境に対して周縁の（ｍａｒｇｉｎａｌ）効果を有することを示す。対照的に、Ｅ９およびＤ２３についての滴定曲線は、変異についての有意な変化を示す（図２４パネルＢおよびＥ）。Ｄ２３のｐＫａは、Ｄ７ＮおよびＤ７Ｋ変異体において、それぞれ、１．６および１．４より大きなｐＨ単位で低下した。これらの結果は、明らかに、Ｄ７とＤ２３との間の反発性の相互作用が野生型タンパク質におけるＡｓｐ２３のｐＫａにおける増加に寄与すること、そしてこれは、残基７における陰性の電荷の中和によって除去されたことを示す。Ｇｌｕ９のｐＫａは、Ｄ７Ｎ変異体によって０．４ｐＨ単位だけ減少し、一方、Ｄ７Ｋ変異体では０．８ｐＨ単位だけ減少した。Ｄ７Ｋ変異体によるＧｌｕ９のｐＫａのより大きな減少は、この変異タンパク質におけるＬｙｓ７とＧｌｕ９との間に好ましい相互作用があることを示唆する。
【０１８３】
（考察）
本発明者らは、ＦＮｆｎ１０における不利な静電気的相互作用を同定し、そしてタンパク質表面の変異によってそのコンフォメーショナルな安定性を改善した。この結果は、タンパク質表面上の類似の電荷の間の反発的な相互作用がタンパク質を有意に不安定化することを示す。この結果はまた、他のグループ（Ｌｏｌａｄｚｅ，Ｖ．Ｖ．，Ｉｂａｒｒａ−Ｍｏｌｅｒｏ，Ｂ．，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｍａｋｈａｔａｄｚｅ，Ｇ．１．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，１６４１９−１６４２３；Ｐｅｒｌ，Ｄ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕ．，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．＆  Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．（２０００）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ７，３８０−３８３；Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｃａｒｐ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｂｂｌｅｅ，Ｊ．，Ｈｅｎｄｓｃｈ，Ｚ．Ｓ．，Ｆａｉｒｍａｎ，Ｒ．，Ｔｉｄｏｒ，Ｂ．＆  Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｄ．Ｐ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，８７２−８７９；Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，Ｇ．Ｒ．，Ｓｈａｗ，Ｋ．Ｌ．，Ｆｅｅ，Ｌ．Ｒ．，Ａｌｓｔｏｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｙｇｈｕｅｓ−Ｄｅｓｐｏｉｎｔｅｓ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｈｕｒｌｋｉｌｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｃｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８，１８４３−１８４９）による最近の報告と一致し、ここで、タンパク質の安定性は、表面上の不利な静電気的相互作用を除くことによって改善された。これらの研究において、変異の候補は、静電気的計算によって（Ｌｏｌａｄｚｅ，Ｖ．Ｖ．，Ｉｂａｒｒａ−Ｍｏｌｅｒｏ，Ｂ．，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｍａｋｈａｔａｄｚｅ，Ｇ．Ｉ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，１６４１９−１６４２３；Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｃａｒｐ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｂｂｌｅｅ，Ｊ．，Ｈｅｎｄｓｃｈ，Ｚ．Ｓ．，Ｆａｉｒｍａｎ，Ｒ．，Ｔｉｄｏｒ，Ｂ．＆  Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｄ．Ｐ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，８７２−８７９；Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，Ｇ．Ｒ．，Ｓｈａｗ，Ｋ．Ｌ．，Ｆｅｅ，Ｌ．Ｒ．，Ａｌｓｔｏｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｙｇｈｕｅｓ−Ｄｅｓｐｏｉｎｔｅｓ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｈｕｒｌｋｉｌｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｃｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｉ  ８，１８４３−１８４９）か、または異なる安定性を有する相同なタンパク質の配列比較によって（Ｐｅｒｌ，Ｄ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕ．，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．＆Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．（２０００）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ７，３８０−３８３）、同定された。ＮＭＲを使用するｐＫａ決定を使用する本戦略は、他の戦略に対して利益および不利益の両方を有する。本方法は、タンパク質を不安定化する残基を直接的に同定する。また、本方法は、目的のタンパク質の高い解像度の構造の入手可能性に依存しない。静電気的計算は、表面におけるアミノ酸側鎖の可動性、タンパク質表面およびタンパク質内部における比誘電率の不確実さに起因して大きな誤差を有し得る。例えば、ＦＮｆｎ１０のＮＭＲ構造において（Ｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｈａｒｖｅｙ，Ｔ．Ｓ．，Ｂａｒｏｎ，Ｍ．，Ｂｏｙｄ，Ｊ．＆  Ｃａｍｐ���ｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，６７１−６７８）、Ｇｌｕ残基のＯε原子についての１６のモデル構造の間の根二乗平均偏差は、１．２〜２．４Åであり、そしてＬｙｓ  Ｎζ原子についての根二乗平均偏差は、１．５〜３．１Åである。原子位置のこの不確かさは、計算結果における大きな差異を潜在的に生じ得る。他方、本戦略は、カルボキシル残基についてのＮＭＲアサインメント、および幅広いｐＨ範囲にわたるＮＭＲ測定を必要とする。ＮＭＲスペクトロスコピーにおける最近の進歩が、小さなタンパク質についての共鳴アサインメントを得ることを簡単にしているが、いくつかのタンパク質が、所望のｐＨ範囲にわたって十分に可能性でなくあり得る。さらに、変性状態におけるイオン化可能な基のｐＫａ値の知識が、個々の残基の安定性に対する寄与を正確に評価するのに必要である（Ｙａｎｇ，Ａ．−Ｓ．＆  Ｈｏｎｉｇ，Ｂ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ  ２，４０−４５）。Ｋｕｈｌｍａｎら（Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｂ．，Ｌｕｉｓｉ，Ｄ．Ｌ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．＆  Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｄ．Ｐ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，４８９６−４９０３）は、変性状態のカルボキシレートのｐＫａが、小さなモデル化合物から得られるｐＫａよりもかなり大きな範囲を有することを示した。これらの限定にも関わらず、本方法は、多くのタンパク質に適用可能である。
【０１８４】
本発明者らは、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３のカルボキシル基に関係する不利な相互作用は、これらの基が低いｐＨでプロトン化される場合、またはＡｓｐ７がＡｓｎまたはＬｙｓで置換された場合、もはや存在しなかったことを示した。低いｐＨにおける変異体および野生型の測定される安定性における類似性（表１０）は、ＦＮｆｎ１０安定性のｐＨ依存性に有意に寄与する他の因子がないこと、そしてその変異が最小の構造的混乱を引き起こしたことを示唆する。構造的混乱がほとんどないことが期待される。なぜなら、これら３つの残基のカルボキシル基は、ＮＭＲ構造における溶媒アクセス可能表面領域計算に基づいて、溶媒に少なくとも５０％曝露されるからである（Ｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｈａｒｖｅｙ，Ｔ．Ｓ．，Ｂａｒｏｎ，Ｍ．，Ｂｏｙｄ，Ｊ．＆  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，６７１−６７８）。
【０１８５】
酸性ｐＨと中性ｐＨとの間の野生型タンパク質の熱的安定性における差異が、１Ｍ塩化ナトリウムにおいて持続する（表１０）。同様に、野生型タンパク質は、４Ｍ  ＧｕＨＣｌにおいて、安定性について大きなｐＨ依存性を示した（図１８）。さらに、０．１〜１．０Ｍへの塩化ナトリウム濃度の増加において、野生型タンパク質および変異タンパク質のＴｍは、すべて約１０℃増加し、これは、ｐＨシフトによる野生型のＴｍにおける変化と同じ大きさである。これらのデータは、本研究において同定された不利な相互作用が、１Ｍ  ＮａＣｌまたは４Ｍ  ＧｕＨＣｌにおいて効果的に遮蔽されなかったことを示す。増加した塩化ナトリウム濃度の効果が均一であったので、この塩化ナトリウムの安定化効果は、同様に、非特異的な塩析効果に起因する（Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ．Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，３５−３９）。他のグループはまた、静電気的相互作用に対して塩の効果をほとんど遮蔽しないことを報告した（Ｐｅｒｕｔｚ，Ｍ．Ｆ．，Ｇｒｏｎｅｎｂｏｍ，Ａ．Ｍ．，Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．，Ｆｏｇｇ，Ｊ．Ｈ．＆  Ｓｈｉｈ，Ｄ．Ｔ．（１９８５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８３，４９１−４９８；Ｈｅｎｄｓｃｈ，Ｚ．Ｓ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｔ．，Ｓａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．＆  Ｔｉｄｏｒ，Ｂ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，７６２１−７６２５）。静電気的相互作用は、しばしば、特に相互作用の部位が高度に露出される場合、イオン強度の増加とともに減少すると考えられる。従って、野生型と変異体との間の塩感受性において差を示さない中性ｐＨの本データ（表１０）は、Ａｓｐ７が静電気的相互作用を不安定化することの原因ではないと解釈される。この塩の不感受性についての理由はまだ明かではないが、本結果は、塩濃度依存性にのみに基づいて、静電気的相互作用の存在および非存在を結論づける際に警告的な注記を提供する。
【０１８６】
３つ組みのカルボキシル（Ａｓｐ７およびＡｓｐ２３、ならびにＧｌｕ９）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）におけるタンパク質配列データバンクにおいて入手可能であった９つの異なる生物由来のＦｎｆｎ１０において、高度に保存されている。これらのＦＮｆｎ１０配列において、Ａｓｐ９は、Ａｓｎに置換された一例を除いて保存され、そしてＧｌｕ９は、完全に保存される。位置２３は、ＡｓｐまたはＧｌｕのいずれかであり、陰性の電荷を保存する。本研究において発見されたように、これらの残基の間の相互作用は、不安定化している。従って、それらの高い保存は、それらの安定性に対する負の効果にも関わらず、これらの残基が、フィブロネクチンの生物学において機能的な重要性を有することを示唆する。ヒトフィブロネクチンの４つのＦＮ３セグメントの構造（Ｌｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．，Ａｕｋｈｉｌ，Ｉ．＆  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｈ．Ｐ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８４，１５５−１６４）において、これらの残基は、隣接ドメインとの相互作用に直接関与しない、また、これらの残基は、ＦＧループのインテグリン結合ＲＧＤ配列からＦＮｆｎ１０の反対面に位置する（図２１）。従って、なぜこれらの不安定化残基がＦＮｆｎ１０においてほとんど完全に保存されるか明かではない。対照的に、ヒトフィブロネクチンにおける他のＦＮ３ドメインは、この３つ組みのカルボキシルを有さない（配列アライメントについて、参考文献、Ｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｈａｒｖｅｙ，Ｔ．Ｓ．，Ｂａｒｏｎ，Ｍ．，Ｂｏｙｄ，Ｊ．＆  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，６７１−６７８を参照のこと）。ＦＮｆｎ１０の３つ組みのカルボキシルは、現在同定されていない重要な相互作用に関与し得る。
【０１８７】
Ｃｌａｒｋｅら（Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．，Ｈａｍｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７０，７７１−７７８）は、ヒトテネイシンの第３のＦＮ３（ＴＮｆｎ３）の安定性が、ｐＨが７から５に減少するときに増加することを報告した。これらは、タンパク質凝集に起因して、ｐＨ５より下で安定性の測定を実行し得なかったけれども、ＴＮｆｎ３のｐＨ依存性は、図１８に示されるＦＮｆｎ１０のｐＨ依存性に似ている。ＴＮｆｎ３は、位置７、９および２３に３つ組みのカルボキシレートを含まず（Ｌｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｗ．Ａ．，Ａｕｋｈｉｌ，Ｉ．＆  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｈ．Ｐ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，９８７−９９１）、これは、中性ｐＨにおいてＴＮｆｎ３の不安定化が、ＦＮｆｎ１０の不安定化とは異なる機構によって引き起こされることを示す。ＴＮｆｎ３構造の視覚的検査によって、これが多数のカルボキシル基を有し、そしてＧｌｕ８３４およびＡｓｐ８５０（参考文献、Ｌｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｗ．Ａ．，Ａｕｋｈｉｌ，Ｉ．＆Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｈ．Ｐ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，９８７−９９１に従う、番号付け）が、交差鎖対を形成することを明かにした。この対を変更することがＴＮｆｎ３の安定性を増加し得るか否かを試験することは興味深い。
【０１８８】
結論として、タンパク質表面の不利な静電気的相互作用を実験的に同定し、そしてこのような相互作用を軽減することによってタンパク質安定性を改善する戦略が記載された。本結果は、カルボキシル基間に反発的相互作用を形成することが、タンパク質を有意に不安定化することを実証した。これは、溶媒に露出されるイオン対を形成する小さな寄与とは対照的である。表面における不利な静電気的相互作用は、天然のタンパク質において非常に一般的であるようである。従って、表面の静電気的特性の最適化は、タンパク質安定性を増加するための一般的に適用可能な戦略を提供する（Ｌｏｌａｄｚｅ，Ｖ．Ｖ．，Ｉｂａｒｒａ−Ｍｏｌｅｒｏ，Ｂ．，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｍａｋｈａｔａｄｚｅ，Ｇ．Ｉ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，１６４１９−１６４２３；Ｐｅｒｌ，Ｄ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕ．，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．＆  Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．（２０００）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ７，３８０−３８３；Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｃａｒｐ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｂｂｌｅｅ，Ｊ．，Ｈｅｎｄｓｃｈ，Ｚ．Ｓ．，Ｆａｉｒｍａｎ，Ｒ．，Ｔｉｄｏｒ，Ｂ．＆Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｄ．Ｐ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，８７２−８７９；Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，Ｇ．Ｒ．，Ｓｈａｗ，Ｋ．Ｌ．，Ｆｅｅ，Ｌ．Ｒ．，Ａｌｓｔｏｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｙｇｈｕｅｓ−Ｄｅｓｐｏｉｎｔｅｓ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｈｕｒｌｋｉｌｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｃｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８，１８４３−１８４９）。さらに、カルボキシレート間の反発的相互作用は、タンパク質設計において望ましくない代替のコンフォメーション不安定化するために開発され得る（「ネガティブ設計」）。
【０１８９】
（実施例ＸＸ）
（モノボディー足場のカルボキシル末端の伸長）
安定性測定に使用される野生型タンパク質は、実施例１９に記載される。モノボディー足場のカルボキシル末端は、４つのアミノ酸残基（すなわち、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号１１９））によって伸長され、これは、ヒトフィブロネクチンのＦＮｆｎ１０にすぐに続く残基である。標準的ＰＣＲ方法を使用してＦＮｆｎ１０遺伝子に伸長が導入される。安定性の測定は、実施例１９に記載されるように実施された。伸長されたタンパク質を広げる自由エネルギーは、ｐＨ６．０および３０℃で７．４ｋｃａｌｍｏｌ−１であり、野生型タンパク質の自由エネルギー（７．７ｋｃａｌｍｏｌ−１）と非常に近い。これらの結果は、モノボディー足場のＣ末端がその安定性を減少することなく伸長されることを実証した。
【０１９０】
本明細書中に引用される全ての特許、特許文書および刊行物の完全な開示は、個々に組み込まれるかのように、参考として援用される。上記の詳細な説明および実施例は、理解を明瞭するためのみに与えられた。それらから不必要な制限が理解されるべきではない。本発明は、示され、そして記載された実際の詳細に制限されず、当業者に明らかな変更は、特許請求の範囲によって規定される本発明に含まれる。
【０１９１】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  抗リゾチーム免疫グロブリンＤ１．３（Ａ、Ｃ；Ｂｈａｔら、１９９４）およびヒトフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン（Ｂ、Ｄ；Ｍａｉｎら、１９９２）の、β鎖およびループトポロジー（Ａ、Ｂ）およびＭＯＬＳＣＲＩＰＴ表示（Ｃ、Ｄ；Ｋｒａｕｌｉｓ、１９９１）。相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域）およびインテグリン結合Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列の位置を示す。
【図２】  合成Ｆｎ３遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１１０）および制限部位。残基の番号付けは、Ｍａｉｎら（１９９２）に従う。設計した制限酵素部位を、アミノ酸配列の上部に示す。β鎖を、下線で示す。Ｎ末端「ｍｑ」配列は、発現ベクターへの引続くクローニングのために添加した。Ｈｉｓ・ｔａｇ（Ｎｏｖａｇｅｎ）融合タンパク質は、上記に示されるＦｎ３配列の前に、さらなる配列（ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ（配列番号１４））を有する。
【図３】  Ａ、２５℃および９０℃での野生型Ｆｎ３のＦａｒ  ＵＶ  ＣＤスペクトル。Ｆｎ３（５０μＭ）を、酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ４．６）に溶解した。Ｂ、２１５ｎｍにおいてモニターした、Ｆｎ３の熱変性。温度は、１℃／分の速度で上昇させた。
【図４】  Ａ、リゾチーム（ＨＥＬ）および抗鶏卵白色リゾチーム（抗ＨＥＬ）抗体Ｄ１．３のＦｖフラグメントの複合体の結晶構造のＣαトレース（Ｂｈａｔら、１９９４）。ＶＨ  ＣＤＲ３の残基９９〜１０２の側鎖（ＨＥＬと接触する）もまた、示す。Ｂ、Ｄ１．３  ＶＨの残基数に対してプロットした、Ｄ１．３  ＶＨ−ＨＥＬおよびＶＨ−ＶＬ相互作用の各残基についての接触表面積。表面積および二次構造を、プログラムＤＳＳＰ（ＫａｂｓｈおよびＳａｎｄｅｒ、１９８３）を用いて決定した。ＣおよびＤ、Ｄ１．３  ＶＨ（Ｃ）およびＦｎ３（Ｄ）の、Ｆ鎖−ループ−Ｇ鎖部分のβシート構造の模式図。四角は、β鎖中の残基を示し、そして楕円型は、鎖の中にない残基を示す。影をつけた四角は、側鎖が有意に埋没している残基を示す。破線は、水素結合を示す。
【図５】  ＤＮＡ配列（配列番号１１１）およびアミノ酸配列（配列番号１１２）を示す、設計されたＦｎ３遺伝子。アミノ酸の番号付けは、Ｍａｉｎら（１９９２）に従う。コンビナトリアルライブラリー中で無作為化された２つのループを、四角で囲む。
【図６】  プラスミドｐＡＳ４５のマップ。プラスミドｐＡＳ４５は、Ｈｉｓ・ｔａｇ−Ｆｎ３の発現ベクターである。
【図７】  プラスミドｐＡＳ２５のマップ。プラスミドｐＡＳ２５は、Ｆｎ３の発現ベクターである。
【図８】  プラスミドｐＡＳ３８のマップ。ｐＡＳ３８は、Ｆｎ３の表面提示のためのファージミドベクターである。
【図９】  （ユビキチン−１）ファージ酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた、富化されたクローンのリガンド特異的結合の特徴付け。マイクロタイタープレートのウェルを、ユビキチン（１μｇ／ウェル；「リガンド（＋）」）でコーティングし、次いで、ＢＳＡを用いてブロックした。約１０１０のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を含むＴＢＳ中のファージ溶液を、ウェルに添加し、そしてＴＢＳを用いて洗浄した。結合したファージを、Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を基質として抗ファージ抗体−ＰＯＤ結合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出した。吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ２５０マイクロプレート分光光度計を用いて測定した。コントロールについて、リガンドを固定化させないウェルを使用した。２−１および２−２は、それぞれ、遊離のリガンドおよび酸を用いて溶出したライブラリー２からの富化されたクローンを示す。４−１および４−２は、それぞれ、遊離のリガンドおよび酸を用いて溶出したライブラリー４からの富化されたクローンを示す。
【図１０】  （ユビキチン−２）富化されたクローンの競合ファージＥＬＩＳＡ。約１０１０ｃｆｕを含むファージ溶液を、リガンドでコーティングしたウェルに結合させる前に、、遊離のユビキチンと共に４℃で１時間まずインキュベートした。ウェルを洗浄し、そしてファージを上記のように検出した。
【図１１】  ユビキチン結合モノボディ４１１の競合ファージＥＬＩＳＡ。実験条件は、上記のユビキチンについて記載した条件と同じである。結合溶液中、遊離のユビキチンの存在下で、ＥＬＩＳＡを実行した。実験を、同じクローンの４つの異なる調製物を用いて実行した。
【図１２】  （フルオレセイン−１）４つのクローン（Ｐｌｂ２５．１（配列番号１１５を含む）、Ｐｌｂ２５．４（配列番号１１６を含む）、ｐＬＢ２４．１（配列番号１１７を含む）およびｐＬＢ２４．３（配列番号１１８を含む））のファージＥＬＩＳＡ。実験条件は、上記のユビキチン−１について記載した条件と同じである。
【図１３】    （フルオレセイン−２）４つのクローンの競合ＥＬＩＳＡ。実験条件は、上記のユビキチン−２について記載した条件と同じである。
【図１４】  蛍光結合モノボディＬＢ２５．５の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトル。約２０μＭのタンパク質を、１００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した。スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ＩＮＯＶＡ  ６００  ＮＭＲ分光計で３０℃において収集した。
【図１５】  標的であるユビキチンに対するＵｂｉ４−Ｆｎ３の結合反応の特徴付け。
（ａ）ユビキチンに対するＵｂｉ４−Ｆｎ３結合のファージＥＬＩＳＡ分析。ユビキチンでコーティングされたウェルに対するＵｂｉ４−ファージの結合を測定した。コントロール実験を、ユビキチンを含まないウェルを用いて実行した。
（ｂ）Ｕｂｉ４−Ｆｎ３の競合ファージＥＬＩＳＡ。Ｕｂｉ４−Ｆｎ３−ファージを、示された濃度の可溶性ユビキチンとともにプレインキュベーションさせ、次いで、ユビキチンコーティングしたウェル中でファージＥＬＩＳＡ検出を行った。
（ｃ）Ｕｂｉ４クローンの特異性を試験する競合ファージＥＬＩＳＡ。Ｕｂｉ４ファージを、２５０μｇ／ｍｌの可溶性タンパク質とともにプレインキュベーションさせ、次いで、（ｂ）のようにファージＥＬＩＳＡを行った。
（ｄ）遊離タンパク質を用いるＥＬＩＳＡ。
【図１６】  Ｕｂｉ４−Ｆｎ３（黒い符号）および野生型Ｆｎ３（白い符号）についての平衡未フォールディング曲線。四角は、ＴＢＳ（ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５））中で測定したデータを示す。丸は、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）を含むＧｌｙ  ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ３．３）中で測定したデータを示す。曲線は、２状態モデルに基づく転移曲線のベストフィットを示す。転移を特徴付けるパラメーターを、表８に列挙する。
【図１７】  （ａ）［１５Ｎ］−Ｕｂｉ４−Ｋ  Ｆｎ３の１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトル。（ｂ）残基数に対してプロットした、１Ｈ（ｂ）および１５Ｎ（ｃ）化学シフトの差異（δｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ−δＵｂｉ４）。Ｕｂｉ４−Ｋで欠失する残基８２〜８４（黒丸で示す）の値を、０に設定する。白丸は、Ｕｂｉ４−Ｋタンパク質中で変異される残基を示す。β鎖の位置を、矢印で示す。
【図１８】  （Ａ）Ｔｒｐ蛍光によってモニターした、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）で誘導されたＦＮｆｎ１０の変性。３５５ｎｍにおける蛍光発光強度を、ＧｕＨＣｌ濃度の関数として示す。線は、２状態変移モデルに対するデータのベストフィットを示す。（Ｂ）ｐＨの関数としてプロットした、４Ｍ  ＧｕＨＣｌにおけるＦＮ３の安定性。（Ｃ）ｍ値のｐＨ依存性。
【図１９】  それぞれ、カルボキシル炭素の１３Ｃ化学シフト（縦軸）およびＡｓｐの１Ｈβの１Ｈシフト（横軸）、またはカルボキシル炭素の１３Ｃ化学シフト（縦軸）およびＧｌｕの１Ｈγの１Ｈシフト（横軸）を示す、ＦＮｆｎ１０の二次元Ｈ（Ｃ）ＣＯスペクトル。交差するピークを、それぞれの残基数と共に標識する。
【図２０】  ＦＮｆｎ１０中のＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基のカルボキシル炭素の１３Ｃ化学シフトのｐＨ依存性シフト。パネルＡは、Ａｓｐ３、６７および８０、ならびにＧｌｕ３８および４７についてのデータを示す。線は、１つのイオン化基を用いたＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式（ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｌ．Ｐ．，Ｈａｎｄ，Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｍ．Ｄ．，Ｋｏｅｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｐｌｅｓｎｉａｋ，Ｌ．Ａ．，Ｚｉｓｅｒ，Ｌ．，Ｗａｋａｒｃｈｕｋ，Ｗ．Ｗ．＆  Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，９９５８−９９６６）に対するデータのベストフィットである。パネルＢは、Ａｓｐ７および２３ならびにＧｌｕ９についてのデータを示す。連続線は、２つのイオン化基を用いたＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式に対するベストフィットを示すが、点線は、単一のイオン化基を用いたこの式に対するベストフィットを示す。
【図２１】  （Ａ）そのトポロジーに従って示されるＦＮｆｎ１０（配列番号１２１）のアミノ酸配列（Ｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｈａｒｖｅｙ，Ｔ．Ｓ．，Ｂａｒｏｎ，Ｍ．，Ｂｏｙｄ，Ｊ．，＆  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，６７１−６７８）。Ａｓｐ残基およびＧｌｕ残基を灰色の丸を用いて強調する。丸につながる細い線および矢印は、バックボーン水素結合を示す。（Ｂ）Ａｓｐ７および２３ならびにＧｌｕ９の位置を示すＦＮ３のＣＰＫモデル。
【図２２】  ６．３Ｍ  尿素および０．１Ｍまたは１．０Ｍ  ＮａＣｌの存在下、ｐＨ７．０およびｐＨ２．４における、野生型ＦＮｆｎ１０および変異ＦＮｆｎ１０の熱変性。２２７ｎｍにおける円偏光二色性シグナルを、温度の関数としてプロットする。黒丸は、１Ｍ  ＮａＣｌの存在下でのデータを示し、そして白丸は、０．１Ｍ  ＮａＣｌの存在下でのデータである。左の列は、ｐＨ２．４で取ったデータを示し、右の列はｐＨ７．０でのデータを示す。タンパク質の同一性を、パネル中で示す。
【図２３】  蛍光を用いてモニターした、ＦＮｆｎ１０変異体のＧｕＨＣｌ誘導変性。蛍光データを、２状態転移モデル（Ｌｏｌａｄｚｅ，Ｖ．Ｖ．，Ｉｂａｒｒａ−Ｍｏｌｅｒｏ，Ｂ．，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｍａｋｈａｔａｄｚｅ，Ｇ．Ｉ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，１６４１９−１６４２３）に従って、折り畳まれていないタンパク質の分画に変換し、ＧｕＨＣｌの関数としてプロットした。
【図２４】  Ｄ７Ｎ（白丸）ＦＮｆｎ１０およびＤ７Ｋ（黒丸）ＦＮｆｎ１０におけるＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基のカルボキシル１３Ｃ共鳴のｐＨ滴定。比較のために、野生型（＋）についてもデータもまた示す。残基名を、個々のパネルに示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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