(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ) アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその一部をコードし、少なくともＡβペプチドの配列から始まり、ＡＰＰのＣ末端アミノ酸で終わるＡＰＰのＣ末端の１００個のアミノ酸（Ｃ100断片）をコードするヌクレオチド配列を含み、
（ｂ−１）一つ以上のコードおよび／または非コードヌクレオチド配列をさらに含み、あるいは、
（ｂ−２）一つ以上のコードおよび／または非コードヌクレオチド配列をさらに含まず、および、
(ｃ) 線虫 Caenorhabditis elegans（シーエレガンス）の細胞で発現するプロモーターを含み、  
ここで、当該コードヌクレオチド配列はシグナルペプチドをコードし、当該非コードヌクレオチド配列は配列SEQ ID NO.:４に示されるＡＰＰ遺伝子の４２bpイントロンである、トランスジーン。
【請求項２】
SEQ ID NO.１のヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載のトランスジーン。
【請求項３】
シグナルペプチドをコードし、ＡＰＰまたはその一部をコードし、少なくともＡβペプチドの配列から始まり、ＡＰＰのＣ末端アミノ酸で終わるＡＰＰのＣ末端の１００個のアミノ酸（Ｃ100断片）をコードするヌクレオチド配列の５′末端に位置する、コード化ヌクレオチド配列を含有する、請求項１または２に記載のトランスジーン。
【請求項４】
コード化ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO.:９のアミノ酸配列からなるＡＰＰシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項５】
SEQ ID NO.:２のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項６】
SEQ ID NO.:３のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項７】
配列SEQ ID NO.:４に示されるＡＰＰ遺伝子の４２bpイントロンである非コード化ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項８】
SEQ ID NO.:５のヌクレオチド配列を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項９】
構成性プロモーターまたは制御可能なプロモーターを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項１０】
プロモーターがシーエレガンスの神経組織、筋肉組織もしくは皮膚組織で活性化されるか、またはシーエレガンスの随所で活性化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項１１】
シーエレガンスのプロモーターであるunc−54、hsp16−2、unc−119、Ｇ0Ａ１およびsel−12の群から選択されるプロモーターを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項１２】
SEQ ID NO.:６のヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項１３】
SEQ ID NO.:７のヌクレオチド配列からなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む発現ベクター。
【請求項１５】
細胞が非ヒト生物の一部となりうる、トランスジェニック細胞を作製するための請求項１４に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１６】
細胞が非ヒト生物の一部となりうる、トランスジェニック細胞を作製するための請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジーンの使用。
【請求項１７】
細胞がシーエレガンス細胞である、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む、トランスジェニックシーエレガンス。
【請求項１９】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む、トランスジェニックシーエレガンス。
【請求項２０】
マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む付加的な発現ベクターを包含する、請求項１８または１９に記載のトランスジェニックシーエレガンス。
【請求項２１】
マーカーが温度感受性マーカーまたは表現型マーカーのいずれかである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンス。
【請求項２２】
マーカーが視覚性表現型または行動性表現型マーカーである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンス。
【請求項２３】
マーカーがＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、優性のＲｏl6突然変異またはUnc−22のアンチセンスＲＮＡである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンス。
【請求項２４】
その生殖細胞および／または体細胞の中に、１コピー以上の請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジーンおよび／または請求項１４に記載の発現ベクターが存在する、トランスジェニックシーエレガンス。
【請求項２５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジーンおよび／または請求項１４に記載の発現ベクターが、マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む付加的な発現ベクターの存在下又は不在下において、シーエレガンスの生殖細胞にマイクロインジェクションされる、トランスジェニックシーエレガンスを作製する方法。
【請求項２６】
ＳＰ−Ｃ100融合タンパク質の発現のための、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンスの使用。
【請求項２７】
SEQ ID NO.:10のアミノ酸配列からなるＳp−Ｃ100融合タンパク質。
【請求項２８】
γ−セクレターゼ活性を同定するための、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンスの使用。
【請求項２９】
γ−セクレターゼの活性を阻害する基質の同定および／または特徴づけのための方法における請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンスの使用。
【請求項３０】
α−セクレターゼの活性を増加する物質を同定および／または特徴付ける方法における、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンスの使用。
【請求項３１】
γ−セクレターゼ活性を確認する方法における、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のトランスジェニックシーエレガンスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその一部を発現するトランスジェニックシーエレガンス（C．elegans）および、そのトランスジーンそれ自身、およびそのトランスジーンによってコードされるタンパク質、並びに、トランスジェニックシーエレガンスの作製方法、およびその使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病は、細胞レベルでは、辺縁系および大脳皮質の大量のニューロンの損失を伴う脳の神経変性障害である。分子レベルでは、脳の患部にタンパク質の沈着、いわゆるプラークを検出することが可能である。そしてその沈着がアルツハイマー病の重要な特徴となる。最も頻繁にこれらのプラークで生じるタンパク質は、大きさにして４０から４２個のアミノ酸のペプチドで、Ａβペプチドと呼ばれる。このペプチドは６９５から７５１個のアミノ酸の実質的により大きなタンパク質の切断産物で、いわゆるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）である。
【０００３】
ＡＰＰは、脂質二重層を一度横断している、必要不可欠な膜貫通のタンパク質である。圧倒的大部分のタンパク質は細胞外に存在している。しかしながら、より短いＣ末端のドメインは細胞質へ向かっている（図１）。Ａβペプチドは、図１中、濃い灰色で示されている。Ａβペプチドのおよそ2/3はＡＰＰの細胞外ドメイン由来であり、およそ1/3は膜貫通のドメイン由来である。
【０００４】
膜に存在しているＡＰＰに加えて、アミロイド前駆体タンパク質の分泌型を検出することも可能である。そして、その型は、ＡＰＰの広域の外部ドメインからなり、ＡＰＰsec（分泌型ＡＰＰ）と呼ばれる。ＡＰＰsecは、α−セクレターゼによって行われるタンパク質分解性の切断によって、ＡＰＰから形成される。タンパク質分解性切断は、Ａβペプチドのアミノ酸配列内にあるＡＰＰのアミノ酸配列内の部位で生じる（Ａβペプチドの１６アミノ酸残基後ろ）。α−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解は、その結果、Ａβペプチドが形成される可能性を妨げる。Ａβペプチドは、したがって、もう一つの進行経路によってＡＰＰから形成されるだけである。二つのさらなるプロテアーゼがこの進行経路に関与することが仮定される。そのうちの一つのプロテアーゼ、これはβ−セクレターゼと呼ばれ、ＡβペプチドのN末端でＡＰＰを切断する。二番目のプロテアーゼ、これはγ−セクレターゼと呼ばれ、ＡβペプチドのC末端をはずす（Kang, J. et al., Nature, 325, 733）（図１）。
【０００５】
三つのセクレターゼまたはプロテアーゼ（α−セクレターゼ、β−セクレターゼおよび、γ−セクレターゼ）のいずれかを同定することは、今までのところでは可能ではない。しかしながら、セクレターゼについての知識は非常に興味深い。特に、アルツハイマー病に関して、および含まれるタンパク質の同定に関する研究に関連しているところが興味深い。そして、そのタンパク質は、その後、追跡研究において今度はターゲットとして使用されている。一方、β−セクレターゼの阻害、および特にγ−セクレターゼの阻害はＡβペプチド生成の減少を導き、その一方で、α−セクレターゼの活性化が、ＡＰＰのＡＰＰsec への進行を増加させ、それゆえ、同時にＡβペプチドの生成を減少させる。
【０００６】
Ａβペプチドがアルツハイマー病の発生における決定的な要因であるという証拠はたくさんある。とりわけ、Ａβ原繊維は、細胞培養で神経毒と仮定されている（Yankner, B.A. et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA, 87, 9020）さらには、アルツハイマー病の特性を示している神経病変が、ダウン症候群の患者において３０歳の時にすでに現れている。そして、この患者は、ＡＰＰの一つの余分なコピーを持っている。この場合、ＡＰＰのオーバーエクスプレッションは、Ａβペプチドへの転換の増大に伴うものと仮定されている（Rumble, B. et al., (1989), N. Engl. J. Med., 320, 1446）。
【０００７】
アルツハイマー病の家族性の型は、おそらくＡβペプチドの中心的役割の最も有力な証拠となるものの性質を持っている。これらの形の中には、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの切断部位の領域あたりのＡＰＰ遺伝子、あるいは、細胞培養中で、たくさんのＡβ生成の増加を引き出す二つのさらなるＡＤ−関連遺伝子（プレセニリン）の突然変異がある（Scheuner, D. et al.,(1996), Nature Medicine, 2, 864）。
【０００８】
シーエレガンス（C. elegans）はすでにアルツハイマー病のモデル生物として用いられているけれども、これらの研究はＡＰＰのＡβペプチドへの進行は関係づけられていない。この研究のうち、いくつかは、二つの他のアルツハイマー関連タンパク質、すなわち、プレセニリンに関連している。プレセニリンは、膜を６〜８回横断している膜貫通タンパク質である。これらは、プレセニリン遺伝子における特異的な突然変異が、アルツハイマー病を引き起こすので、アルツハイマーの家族性の場合大いに重要である。これに関連して、ヒトのプレセニリンのホモログ（sel−12、spe−４、および hop−１）がヒトと線虫で保存されているプレセニリンの機能を持って、シーエレガンスに存在している（Levitan D., Greemwald I. (1995) Nature 377, 351; Levitan et al. (1996) Pro Natl Acad Sci USA, 93, 14940; Baumeister R. (1997) Genes & Function 1, 149; Xiajun Li and Iva Greenwald (1997) Pro Natl Acad Sci USA,94, 12204）。
【０００９】
他の研究はシーエレガンスにおけるＡＰＰホモログ（それはApl−１と呼ばれる）およびシーエレガンスにおけるＡβペプチドの発現について扱っている。しかしながら、Apl−１は、Ａβペプチドのアミノ酸配列とホモログである部分を全く持っていない。それゆえ、シーエレガンスは、内生のＡβペプチドを全く持っていないということになる（Daigle I., Li C. (1993) Pro Natl Acad Sci USA,90 (24), 12045）。
【００１０】
C.D. Linkは、Pro Natl Acad Sci USA (1995) 92, 9368において、シーエレガンスにおけるＡβペプチドの発現（しかし、Ａβ前駆体タンパク質の発現ではない）について述べている。これらの研究は、合成シグナルペプチドと共に筋肉特異的プロモーター、unc 54 の制御下において、融合タンパク質としてＡβ１−42ペプチド（４２個のアミノ酸からなるＡβペプチド）を発現するトランスジェニック線虫の作製を含んでいる。抗β−アミロイド抗体と反応する筋肉特異的タンパク質の沈着はその研究において検出された。
【００１１】
他の研究（例えば、C. Linkらの個人的文書）は、シーエレガンスのモデル系におけるＡβペプチドの凝集と毒性の研究に関連している。
【００１２】
【発明の概要】
トランスジェニックシーエレガンス系統は、Ａβペプチドの生成に関与するシーエレガンスにおいてプロセッシング機構の存在を研究するために、および、この線虫における潜在的セクレターゼを同定するために、本研究において確立された。
【００１３】
本発明は以下を含むトランスジーンに関する。
ａ) アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）または、その一部をコードするヌクレオチド配列：
そのヌクレオチド配列は、完全なＡβペプチドまたはＡβペプチドの一部をコードするＡＰＰヌクレオチド配列のある部分からなり、そして、
そのヌクレオチド配列は、完全なＡβペプチドをコードするＡＰＰヌクレオチド配列のある部分と同一ではない、
ｂ) 場合によっては、一つまたは二つ以上のさらなるコードしているおよび／またはコードしていないヌクレオチド配列、および、
ｃ) 線虫 Caenorhaboditis elegans（シーエレガンス）の細胞で発現するプロモーター。
【００１４】
そのヌクレオチド配列は、好ましくは１００個のＡＰＰのカルボキシル基末端のアミノ酸をコードしている。そしてこのアミノ酸は、Ａβペプチドの配列で始まり、ＡＰＰのカルボキシル基末端のアミノ酸（Ｃ100断片）で終わる。ＡＰＰは、好ましくは、ＡＰＰ695（６９５個のアミノ酸）、ＡＰＰ751（７５１個のアミノ酸）、ＡＰＰ770（770個のアミノ酸）および、Ｌ−ＡＰＰのアイソフォームのうちの一つである。そのアイソフォームすべては、第二スプライシング（alternative splicing）によって同じＡＰＰ遺伝子から形成される。ＡＰＰ695においては、エクソン７および８は、スプライシングによって取り除かれている。ところが、ＡＰＰ751では、エクソン８のみが欠けており、またＡＰＰ770では、エクソン７と８が存在する。これに加えてＡＰＰの他のスプライシングの形がスプライシングで取り除かれてしまったエクソン15に存在する。これらの形はＬ−ＡＰＰと呼ばれ、同じくエクソン７と８に関してスプライシングされている形で存在している。
【００１５】
本発明の一つの特別な態様では、トランスジーンは、SEQ ID NO.１またはその一部のヌクレオチド配列を含んでいる。
トランスジーンは、好ましくはＡＰＰまたはその一部をコードするヌクレオチド配列の５′末端に位置する付加的なコードしているヌクレオチド配列を含んでいる。本発明の一つの特別な態様では、付加的なヌクレオチド配列は、シグナルペプチドまたはその一部をコードしている。たとえば、ＡＰＰのシグナルペプチド（ＳＰ）は、SEQ ID NO.９または、その一部のアミノ酸配列を持っている。
【００１６】
ＡβペプチドのＮ末端からＡＰＰのＣ末端までの配列は９９個のアミノ酸からなる。ＡＰＰのシグナルペプチドは１７個のアミノ酸からなる。ＡβペプチドのＮ末端からＡＰＰのＣ末端とＡＰＰシグナルペプチドからなる融合生成物がクローン化されるとき、一つまたは二つ以上のスペーサーアミノ酸は、好ましくは、これら二つの部分の間に挿入され、たとえば、ロイシンといった、一つのアミノ酸を挿入することが優先される。Ｃ末端の断片はこれゆえ、異なった名称となる。すなわち、Ｃ１００（Ｃは、Ｃ末端)、ＬＣ（Ｌはロイシン)、ＬＣ１−99、Ｃ99 、またはＳＰＡ４ＣＴ（ＳＰはシグナルペプチド、Ａ４はＡβペプチド、そしてＣＴはＣ末端）である。
【００１７】
本発明の一つの特別な態様では、トランスジーンはSEQ ID NO.２またはその一部および／または、SEQ ID NO.３またはその一部のヌクレオチド配列を含む。
これに加えて、トランスジーンはまた、一つまたは二つ以上の加非コーディングおよび／または一つまたは二つ以上の加的コーディングをしているヌクレオチド配列を含んでいる。
【００１８】
たとえば、トランスジーンは、加非コーディングヌクレオチド配列として、ＡＰＰ遺伝子の一つのイントロンからの配列を含みうる。すなわち、ＡＰＰ遺伝子の４２塩基対のイントロン由来の配列であり、SEQ ID NO.４の配列を示す。SEQ ID NO.５のヌクレオチド配列を含むトランスジーンは、本発明の要旨の一部分である。
【００１９】
トランスジーンは、また好ましくは、一つまたは二つ以上のコードされたタンパク質の発現を制御するための遺伝子制御配列、好ましくは、構造プロモーターまたは調節し得るプロモーターを含んでいる。たとえばそのプロモーターは、シーエレガンスの神経、筋肉または皮膚組織において活性化できるか、またはシーエレガンスで偏在的に活性化できることである。プロモーターは、たとえば、シーエレガンスのプロモーターであるunc−54、hsp16−２、unc−119、goa−１および sel−12のグループから選択される。本発明の一つの特別な態様では、トランスジーンはSEQ ID NO.６のヌクレオチド配列を持っているプロモーターを含んでいる。一つの特別な態様では、トランスジーンは、SEQ ID NO.７のヌクレオチド配列を含んでいる。
【００２０】
トランスジーンは、たとえば発現ベクターといったベクター内で存在できる。たとえば、組み換え発現ベクターはSEQ ID NO.８のヌクレオチド配列を含むことが可能である。
【００２１】
本発明はまた、トランスジーンが既知の方法に従って、ベクターに組み込まれている発現ベクターの作製にも関する。特に、本発明は、トランスジェニック細胞を作製するための発現ベクターの使用に関する。そして、この細胞がヒトではない生物、例えばシーエレガンスの一部となることが可能である。
【００２２】
本発明はまた、適切な部分配列が適切な順序で正しいリーディングフレームで結合され、そしてまた適宜リンカーを挿入しているトランスジーンの作製にも関する。特に本発明はトランスジーンの使用に関する、たとえば、このトランスジェニック細胞の作製のための使用に関し、そしてこの細胞がヒトではない生物の一部となることが可能である。
【００２３】
本発明の一つの特別な態様は、トランスジーンを含むトランスジェニックシーエレガンスに関する。トランスジーンはまた、発現ベクター内でシーエレガンスに存在できる。トランスジーンは、シーエレガンスの染色体内および／または染色体外に存在できる。一つまたは二つ以上のトランスジーンまたはトランスジーンを含む発現ベクターは染色体内および／または染色体外に長いタンデムアレイとして存在することが可能である。トランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物は、好ましくは他の発現ベクターもさらに持っている。そのベクターは、マーカーをコードしているヌクレオチド配列を含み、このマーカーは温度感受性マーカーかあるいは表現型マーカーのどちらかである。たとえば、マーカーは、視覚的マーカーかあるいは行動的に表現型マーカーでありうる。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）あるいは、ＥＧＦＰ（増強された緑色蛍光性タンパク質）のような蛍光マーカー、優性のＲｏl6突然変異のような特定のタンパク質の優性突然変異型コードするマーカー遺伝子、または Unc−22のアンチセンスＲＮＡといった、アンチセンスＲＮＡをコードするマーカー配列がその例である。
【００２４】
トランスジーンおよび／または発現ベクターならびに適切な場合には、加的な発現ベクターの一つまたは二つ以上のコピーが好ましくは、トランスジェニックシーエレガンスの生殖細胞および／または体細胞に存在する。
本発明はまた、トランスジーンおよび／または発現ベクターと共に、トランスジェニックシーエレガンスの作製の方法にも関する。場合によっては、マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む加的な発現ベクターの存在下で、シーエレガンスの生殖細胞へマイクロインジェクションされる。ニューロン特異的プロモーターの制御下においてＳＰ−Ｃ100（ＳＰ；シグナルペプチド）を発現するＤＮＡコンストラクトを、たとえば、トランスジェニックシーエレガンス系統を作製するために用いることができる（図２）。Ｃ100は、Ａβペプチド配列とＡＰＰのＣ末端から構成されるので、γ-セクレターゼの切断のみがＣ100からＡβペプチドを放出するために必要とされる。C100は、また、γ-セクレターゼの基質でもある。
【００２５】
本発明はまた、たとえばＳＰ−Ｃ１００融合タンパク質の発現のためのトランスジェニックシーエレガンスの使用にも関する。SEQ ID NO.10 のアミノ酸配列を持つＳＰ−Ｃ100融合タンパク質は、本発明の要旨の一部である。
特に、本発明は、シーエレガンスにおけるγ-セクレターゼの活性および／またはα-セクレターゼの活性を同定するためのトランスジェニックシーエレガンスの使用、γ-セクレターゼの活性を抑制する物質の同定および／または特徴づけのための方法におけるその使用、α−セクレターゼの活性を上昇させる物質の同定および／または特徴づけのための方法におけるその使用、およびアルツハイマー病の治療および／または予防のための活性化化合物として利用できる物質の同定および／または特徴づけのための方法におけるその使用に関する。
【００２６】
本研究において、線虫、Caenorhabditis elegans (C. elegans)は、ＡＰＰをＡβペプチドにプロセッシングすることに関わるセクレターゼを同定するためのモデル生物として選択された。この線虫は、遺伝的な研究に非常に向いていて、これゆえ、従来、プログラムされた細胞死、神経誘導、およびＲＡＳ／ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達のような重要な過程を広く研究するために多くの場合用いられてきた（Riddle, D. L. et al.(1997)）。
【００２７】
シーエレガンスが特にこのような研究に適するようになった重要な点には以下のことが含まれる（C. Kenyon, Science(1988) 240, 1448; P. E. Kuwabara (1997), TIG, 13, 454）。
・  その小さいゲノム。それは、およそ１９,０００の遺伝子または、９７Mbから構成される。そして、1998年12月に完全に配列決定された（The  C. elegans Sequencing Consortium, Science (1998), 282, 2012)。
・  自家受精によるその生殖。シーエレガンスの二つの性の場合、雄と雌雄同体の間に差異が生じる。すなわち、卵を産む前に自身でその卵を受精するものが雌雄同体動物である。このタイプの生殖における決定的な利点は、トランスジーンを胚系統に導入した後、雌雄同体は、自動的にホモ接合的なトランスジェニック子孫を産生することができることである。これゆえ、たとえばショウジョウバエの場合におけるトランスジェニック系統を作製するためのような、さらなる交雑の段階の必要がない。
【００２８】
・  その小さい大きさ（およそ１mmの長さ）ゆえの研究室において取り扱うことの簡便性およびその比較的要求の少ない生育条件。結果として、多数の線虫を研究室で日常的に取り扱うことが可能となる。
・  ３日という短い世代。それは、非常に短い時間内に解析のための多量の生物学的材料を得ることを可能にしている。
・  シーエレガンスの発生および解剖学に関する完全な細胞の記述が利用できる。
・  シーエレガンスの詳しい遺伝子地図および遺伝的解析のための方法が利用できる。
・  ノックアウト動物を作製する技術が利用できる。同様に、シーエレガンスゲノムに突然変異を誘発する技術が存在する（トランスポゾン突然変異およびメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）突然変異）。
【００２９】
以下はトランスジェニックシーエレガンス系統の可能な使用についてである。１．突然変異のアプローチを使ったシーエレガンスにおけるγ−セクレターゼ様の活性の同定。γ−セクレターゼ様の活性を破壊するトランスポゾン突然変異が行われなければならないこと、および、もはやこの活性を持っていない線虫を検出することによって対応する遺伝子を探さなくてはいけないことが計画されている。そのようなスクリーニング法は、Korswagen H. C. et al., (1996), 93, 14680 Proc Natl Acad Sce USAの文献に詳述されている。
【００３０】
別のアプローチは、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）さもなければ、アンチセンスＲＮＡアプローチを使った突然変異である。後者の場合は、すべてのシーエレガンスのプロテアーゼに共通しているモチーフを見つけ、そして、これらのモチーフに対して向けられたアンチセンスRNAを使って特異的にこれらのプロテアーゼの活性を減少させるという試みを行うことが可能である。その後、Ａβペプチドのスクリーニングは、プロテアーゼの一つがＡβペプチド生成に関係しているかどうかを示すことが可能である。
【００３１】
２．シーエレガンスにおけるγ−セクレターゼ様の活性の同定。ことによると、アイテム１で述べたものと同様の方法による。
３．シーエレガンスにおけるγ−セクレターゼ活性またはγ−セクレターゼ様の活性の知識を携えて、ホモロジーの比較という手段によってヒトのγ−セクレターゼ活性またはγ-セクレターゼ様の活性を検索することが可能となる。
【００３２】
４．薬物の同定。その薬物とは、
・  直接、アミロイド前駆体タンパク質からＡβペプチド生成を阻害するためにγ−セクレターゼの活性を阻害する。
・  γ−セクレターゼを活性化し、そしてこれによってＡＰＰsecの生成の増加によってＡβペプチドの形成を間接的に阻害する。
このアプローチはシーエレガンスが９６穴のプレートで懸濁液で維持されているので９６穴のフォーマットでできる。
スクリーニングは、全生物において行われるので、非特異的な毒性の効果を持つ薬物を大部分除外することが可能である。
【００３３】
５．凝集の性質、可能な神経毒の影響、およびシーエレガンスにおけるＡβペプチドの研究。Ａβペプチドの凝集を抑制する薬物のスクリーニング。
６．他のタンパク質（プレセニリンあるいはＡpoＥ）による、過剰発現またはノックアウトの結果として、ＡＰＰのプロセッシングの調節についての研究。プレセニリンはアルツハイマー関連タンパク質であり、ＡpoＥは、アルツハイマー病におけるリスク要因であるので、これらのタンパク質はＡβペプチドの形成に効果を有し、結果として、ＡＰＰプロセッシング経路におけるそれらの役割が研究できる。
７. 適切な場合には、当業者に周知の他の実験的アプローチを用いて見い出されたα−セクレターゼおよび／またはγ−セクレターゼの活性の確証。
【００３４】
【実施例】
実施例１：トランスジーンを含む発現ベクターの作製
二つのベクター、pSKLC1-99、これは、SP-C100をコードしている、およびpBY103、そしてこれはunc-119プロモーターを含む。この二つのベクターは、クローニングに用いられた。SP-C100をコードしているＤＮＡは、unc-119プロモーターの後にpBY103ベクターにクローン化された。基盤となるベクターpBY103は、ベクターpPD49.26を土台として構成されている。そしてこれは、“Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organisum”（1995）Ed. Epstein et al., Vol 48, pp. 473, に述べられており、unc-119プロモーター（Maduro et al. Genetics (1995), 141, p. 977）は、そのベクター中のHind III／Bam HI部位にクローン化されている。プラスミドunc-119-SP-C100は、KpnＩ／SacＩで切断され、引き続いてpSKLC1-99（Shoji et al. (1992)）からのLC99断片をpBY103へクローン化して作製された。
【００３５】
実施例２：トランスジェニックシーエレガンス系統の作製
マイクロインジェクションの方法をトランスジェニックシーエレガンスを作製するために使用した（Mello et al., (1991) EMBO J. 10 (12) 3959; C. Mello and A. Fire, Methods in Cell Biology, Academic Press Vol. 48, pp. 451, 1995; C. D. Link, Proc Nathl Acad Sci USA (1995) 92, 9368）。
二つの異なったシーエレガンスの株、野生型N2とhim-8（high incidence of males: 雄の高い発生率）が用いられた。Unc-119-SP-C100コンストラクトは、若い線虫の成体にマイクロインジェクション器具を用いてマイクロインジェクションされた。ＤＮＡの濃度はおよそ２０ng／μｌであった。
【００３６】
マーカーとなるプラスミドはunc-119-SP-C100コンストラクトと一緒にインジェクションされた。このマーカープラスミドは、プラスミドttx3-GFPで、これはttx3プロモーターの制御下において緑色蛍光タンパク質をコードしている。ttx3プロモーターの活性は、シーエレガンスの頭のある特別なニューロンに特異的で、いわゆる、ＡＩＹニューロンと呼ばれ、線虫の熱走性の役割を持っている。
【００３７】
プラスミドＤＮＡがマイクロインジェクションされるとき、長いタンデムアレイ、これは、プラスミドDNA（本発明の場合、ttx3-GFPプラスミドおよびunc-119-SP-C100プラスミドである）の数多くのコピーから構成されるが、組み換えによって形成されると想定される。これらのアレイのいくらかのパーセンテージはシーエレガンスのゲノムに組み込まれている。しかしながら、そのアレイは、むしろ染色体外に存在しているようである。
うまくインジェクションされた線虫は、およそ４８０nmの波長の光で刺激されたとき、頭の部分のＡＩＹニューロンにおいて緑色蛍光を示す。そのような線虫を検出することができた。
【００３８】
実施例３：Ｃ100トランスジェニックシーエレガンス系統についての記述
１．表現型の特徴。
４８０nmの波長の光による刺激に従って、C-100トランスジェニック線虫は頭部のAIYニューロンで緑色蛍光を示す。その線虫の子孫においても、もう一度頭部のニューロンで緑色蛍光を検出できたので、そのプラスミドが生殖系列を通じて代々伝わることができると考えられる。しかしながら、浸透度は１００％ではなく、これは、ttx3-GFPマーカーＤＮＡおよびunc-119-SP-C100を構成している長いタンデムアレイがゲノムに組み込まれているというよりむしろ、染色体外に存在していると結論することができる。
【００３９】
実施例４：ブロットでＣ100発現を検出する。
六つの異なったトランスジェニック Ｃ100 シーエレガンス系統（三つは N2 wtバックグラウンドに、三つはhim ８バックグラウンドに導入されている）は、ＡＰＰのＣ末端に対して作られるポリクローナル抗血清を用いてＣ100断片の発現をウェスタンブロットで調べた。およそ１０kDaの適切な分子量を持つバンドが六つの系統全部で検出された。
【００４０】
実施例５：ＥＬＩＳＡによるＣ100の検出。
ＡβサンドウィッチELISAにおいて、バックグラウンドレベル以上および、二つの事例において統計学的に有意であったシグナルがトランスジェニック動物からの細胞抽出液で検出された。これは、シーエレガンスがγ−セクレターゼ様の活性を持つことを示している。
ＡβサンドウィッチELISA解析では、最初に９６穴のプレート全部がモノクローナル抗体６Ｅ１０（SENETEK PLC., MO, USA）と共にインキュベートされる。それは、Ａβペプチド（アミノ酸１−１７）と特異的に反応し、それからトランスジェニック線虫あるいは対照となる線虫からの抽出液でコーティングする。Ａβペプチドは、モノクローナルＡβ抗体４Ｇ８（SENETEK PLC., MO, USA）を用いて検出される。それは、Ａβペプチドのアミノ酸１７−２４を認識し、ビオチンでラベルされているものである。検出はビオチンに対して作られる適切な抗体を用いたアルカリフォスファターゼ反応で行われる。線虫の破壊は、界面活性剤処理、窒素ショック凍結、超音波処理およびガラスビーズを用いた細胞破砕を含む。
【００４１】
上述した実験から得たELISAシグナルは、Ａβペプチドの弱い発現または、Ｃ100前駆体タンパク質の発現のどちらかが基盤となっている。なぜなら、適切なエピトープが二つのタンパク質に存在しているからである。
Ａβペプチドの発現は、たとえば、類似の方法でも特異的に検出が可能である。このためには、Ｃ100前駆体と反応しないＡβ特異的抗体がＡβサンドウィッチELISAに使用されなければならない。Ａβ特異的抗体は、たとえば、ＡβのＣ−末端を特異的に認識するモノクローナル抗体となりうる。そしてそれは、４０個あるいは４２個のアミノ酸から構成される。同時に、Ａβペプチドは、モノクローナル抗体４Ｇ８および６Ｅ１０を用いたウェスタンブロットで検出される。そして、その４kDの分子量によって大きいＣ100前駆体と区別される。
【００４２】
ベクターは、pPD49.26および、ＬＣ99（アミロイド前駆体タンパク質）の場合、そして、それは、ATCC番号106372で寄託されていて、Andrew Fire（Departmente of Embryology, Carnegie Institution of Washington, Baltimore, Maryland 21210, USA）から得ることができる。unc-54およびunc-16.2プロモーターはAndrew Fireから得られ、またunc-119プロモーターは、Maduro, M (Department of Biological Science, Universitiy of Alberta Edmonton, Canada)から得ることができる。
【００４３】
SEQ ID NO.１：Ｃ100のヌクレオチド配列
CTGGATGCAG AATTCCGACA TGACTCAGGA TATGAAGTTC ATCATCAAAA ATTGGTGTTC
TTTGCAGAAG ATGTGGGTTC AAACAAAGGT GCAATCATTG GACTCATGGT GGGCGGTGTT
GTCATAGCGA CAGTGATCGT CATCACCTTG GTGATGCTGA AGAAGAAACA GTACACATCC
ATTCATCATG GTGTGGTGGA GGTTGACGCC GCTGTCACCC CAGAGGAGCG CCACCTGTCC
AAGATGCAGC AGAACGGCTA CGAAAATCCA ACCTACAAGT TCTTTGAGCA GATGCAGAAC
TAG
【００４４】
SEQ ID NO.２：ＳＰのヌクレオチド配列
ATGCTGCCCG GTTTGGCACT GTTCCTGCTG GCCGCCTGGA CGGCTCGGGC G
【００４５】
SEQ ID NO.３：ＳＰ＋Ｃ100のヌクレオチド配列
ATGCTGCCCG GTTTGGCACT GTTCCTGCTG GCCGCCTGGA CGGCTCGGGC GCTGGATGCA
GAATTCCGAC ATGACTCAGG ATATGAAGTT CATCATCAAA AATTGGTGTT CTTTGCAGAA
GATGTGGGTT CAAACAAAGG TGCAATCATT GGACTCATGG TGGGCGGTGT TGTCATAGCG
ACAGTGATCG TCATCACCTT GGTGATGCTG AAGAAGAAAC AGTACACATC CATTCATCAT
GGTGTGGTGG AGGTTGACGC CGCTGTCACC CCAGAGGAGC GCCACCTGTC CAAGATGCAG
CAGAACGGCT ACGAAAATCC AACCTACAAG TTCTTTGAGC AGATGCAGAA CTAG
【００４６】
SEQ ID NO.４：４２bpイントロンのヌクレオチド配列
GTATGTTTCG AATGATACTA ACATAACATA GAACATTTTC AG
【００４７】
SEQ ID NO.５：イントロン＋ＳＰ＋Ｃ100のヌクレオチド配列
GTATGTTTCG AATGATACTA ACATAACATA GAACATTTTC AGGAGGACCC TTGGCTAGCG
TCGACGGTAC CGGGCCCCCC CTCGAGGTCG ACGGTATCGA TAACCTTCAC AGCAGCGCAC
TCGGTGCCCC GCGCAGGGTC GCGATGCTGC CCGGTTTGGC ACTGTTCCTG CTGGCCGCCT
GGACGGCTCG GGCGCTGGAT GCAGAATTCC GAATGACTCA GGATATGAAG TCATCATCAA
AAATTGGTGT TCTTTGCAGA AGATGTGGGT TCAAACAAAG GTGCAATCAT TGGACTCATG
GTGGGCGGTG TTGTCATAGC GACAGTGATC GTCATCACCT TGGTGATGCT GAAGAAGAAA
CAGTACACAT CCATTCATCA TGGTGTGGTG GAGGTTGACG CCGCTGTCAC CCCAGAGGAG
CGCCACCTGT CCAAGATGCA GCAGAACGGC TACGAAAATC CAACCTACAA GTTCTTTGAG
CAGATGCAGA ACTAG
【００４８】
SEQ ID NO.６：unc-119のヌクレオチド配列
AAGCTTCAGT AAAAGAAGTA GAATTTTATA GTTTTTTTTC TGTTTGAAAA ATTCTCCCCA
TCAATGTTCT TTCAAATAAA TACATCACTA ATGCAAAGTA TTCTATAACC TCATATCTAA
ATTCTTCAAA ATCTTAACAT ATCTTATCAT TGCTTTAAGT CAACGTAACA TTAAAAAAAA
TGTTTTGGAA AATGTGTCAA GTCTCTCAAA ATTCAGTTTT TTAAACCACT CCTATAGTCC
TATAGTCCTA TAGTTACCCA TGAAATCCTT ATATATTACT GTAAAATGTT TCAAAAACCA
TTGGCAAATT GCCAGAACTG AAAATTTCCG GCAAATTGGG GAACCGGCAA ATTGCCAATT
TGCTGAATTT GCCGGAAACG GTAATTGCCG AAAGTTTTTG ACACGAAAAT GGCAAATTGT
GGTTTTAAAA TTTTTTTTTT TGGAAATTTC AGAATTTCAA TTTTAATCGG CAAAACTGTA
GGCATCCTAA GAATGTTCCT ACATCTATTT TGAAAAGTAA GCGAATTAAT TCTATGAAAA
TGTCTAAAGA AAATGGGGAA ACAATTTCAA AAAGGCACAG TTTCAATGGT TTCCGAATTA
TACTAAATCC CTCTAAAAAC TTCCGGCAAA TTGATATCCG TAAAAGAGCA AATCCGCATT
TTTGCCGAAA ATTAAAATTT CCGACAAATC GGCAAACCGG CAATTTGGCG AAATTTGCCG
GAACGATTGC CGCCCACCCC TGTTCCAGAG GTTCAAACTG GTAGCAAAGC TCAAAATTTC
TCAAATTCTC CAATTTTTTT TTGAATTTTG GCAGTGTACC AAAATGACAT TCAGTCATAT
TGGTTTATTA TAGATTTATT TAGATAAAAT CCTAAATGAT TCTACCTTTA AAGATGCCCA
CTTTAAAAGT AATGACTCAA ACTTCAAATT GCTCTAAGAT TCTATTGAAT TACCATCTTT
TCCTCTCATT TTCTCTCACT GTCTATTTCA TCACAAATTC ATCCCTCTCT CCTCTCTTCT
CTCTCCCTCT CTCTCTCTTT CTCTTTGCTC ATCATCTGTC ATTTTGTCCG TTCCTCTCTC
TGCGCCCTCA GCGTTCCCCA CACTCTCTCG CTTCTCTTTT CCTAGACGTC TTCTTTTTTC
ATCTTCTTCA GCCTTTTTCG CCATTTTCCA TCTCTGTCAA TCATTACGGA CGACCCCCAT
TATCGAT
【００４９】
SEQ ID NO.７：unc-119＋イントロン＋ＳＰ＋Ｃ100のヌクレオチド配列
AAGCTTCAGT AAAAGAAGTA GAATTTTATA GTTTTTTTTC TGTTTGAAAA ATTCTCCCCA
TCAATGTTCT TTCAAATAAA TACATCACTA ATGCAAAGTA TTCTATAACC TCATATCTAA
ATTCTTCAAA ATCTTAACAT ATCTTATCAT TGCTTTAAGT CAACGTAACA TTAAAAAAAA
TGTTTTGGAA AATGTGTCAA GTCTCTCAAA ATTCAGTTTT TTAAACCACT CCTATAGTCC
TATAGTCCTA TAGTTACCCA TGAAATCCTT ATATATTACT GTAAAATGTT TCAAAAACCA
TTGGCAAATT GCCAGAACTG AAAATTTCCG GCAAATTGGG GAACCGGCAA ATTGCCAATT
TGCTGAATTT GCCGGAAACG GTAATTGCCG AAAGTTTTTG ACACGAAAAT GGCAAATTGT
GGTTTTAAAA TTTTTTTTTT TGGAAATTTC AGAATTTCAA TTTTAATCGG CAAAACTGTA
GGCATCCTAA GAATGTTCCT ACATCTATTT TGAAAAGTAA GCGAATTAAT TCTATGAAAA
TGTCTAAAGA AAATGGGGAA ACAATTTCAA AAAGGCACAG TTTCAATGGT TTCCGAATTA
TACTAAATCC CTCTAAAAAC TTCCGGCAAA TTGATATCCG TAAAAGAGCA AATCCGCATT
TTTGCCGAAA ATTAAAATTT CCGACAAATC GGCAAACCGG CAATTTGGCG AAATTTGCCG
GAACGATTGC CGCCCACCCC TGTTCCAGAG GTTCAAACTG GTAGCAAAGC TCAAAATTTC
TCAAATTCTC CAATTTTTTT TTGAATTTTG GCAGTGTACC AAAATGACAT TCAGTCATAT
TGGTTTATTA TAGATTTATT TAGATAAAAT CCTAAATGAT TCTACCTTTA AAGATGCCCA
CTTTAAAAGT AATGACTCAA ACTTCAAATT GCTCTAAGAT TCTATTGAAT TACCATCTTT
TCCTCTCATT TTCTCTCACT GTCTATTTCA TCACAAATTC ATCCCTCTCT CCTCTCTTCT
CTCTCCCTCT CTCTCTCTTT CTCTTTGCTC ATCATCTGTC ATTTTGTCCG TTCCTCTCTC
TGCGCCCTCA GCGTTCCCCA CACTCTCTCG CTTCTCTTTT CCTAGACGTC TTCTTTTTTC
ATCTTCTTCA GCCTTTTTCG CCATTTTCCA TCTCTGTCAA TCATTACGGA CGACCCCCAT
TATCGATAAG ATCTCCACGG TGGCCGCGAA TTCCTGCAGC CCGGGGGATC CCCGGGATTG
GCCAAAGGAC CCAAAGGTAT GTTTCGAATG ATACTAACAT AACATAGAAC ATTTTCAGGA
GGACCCTTGG CTAGCGTCGA CGGTACCGGG CCCCCCCTCG AGGTCGACGG TATCGATAAC
CTTCACAGCA GCGCACTCGG TGCCCCGCGC AGGGTCGCGA TGCTGCCCGG TTTGGCACTG
TTCCTGCTGG CCGCCTGGAC GGCTCGGGCG CTGGATGCAG AATTCCGACA TGACTCAGGA
TATGAAGTTC ATCATCAAAA ATTGGTGTTC TTTGCAGAAG ATGTGGGTTC AAACAAAGGT
GCAATCATTG GACTCATGGT GGGCGGTGTT GTCATAGCGA CAGTGATCGT CATCACCTTG
GTGATGCTGA AGAAGAAACA GTACACATCC ATTCATCATG GTGTGGTGGA GGTTGACGCC
GCTGTCACCC CAGAGGAGCG CCACCTGTCC AAGATGCAGC AGAACGGCTA CGAAAATCCA
ACCTACAAGT TCTTTGAGCA GATGCAGAAC TAG
【００５０】
SEQ ID NO.８：発現ベクターのヌクレオチド配列
ACCCCCGCCA CAGCAGCCTC TGAAGTTGGA CACGGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGCCGCC
ACCGCGGTGG AGCTCCGCAT CGGCCGCTGT CATCAGATCG CCATCTCGCG CCCGTGCCTC
TGACTTCTAA GTCCAATTAC TCTTCAACAT CCCTACATGC TCTTTCTCCC TGTGCTCCCA
CCCCCTATTT TTGTTATTAT CAAAAAAACT TCTTCTTAAT TTCTTTGTTT TTTAGCTTCT
TTTAAGTCAC CTCTAACAAT GAAATTGTGT AGATTCAAAA ATAGAATTAA TTCGTAATAA
AAAGTCGAAA AAAATTGTGC TCCCTCCCCC CATTAATAAT AATTCTATCC CAAAATCTAC
ACAATGTTCT GTGTACACTT CTTATGTTTT TTTTACTTCT GATAAATTTT TTTTGAAACA
TCATAGAAAA AACCGCACAC AAAATACCTT ATCATATGTT ACGTTTCAGT TTATGACCGC
AATTTTTATT TCTTCGCACG TCTGGGCCTC TCATGACGTC AAATCATGCT CATCGTGAAA
AAGTTTTGGA GTATTTTTGG AATTTTTCAA TCAAGTGAAA GTTTATGAAA TTAATTTTCC
TGCTTTTGCT TTTTGGGGGT TTCCCCTATT GTTTGTCAAG AGTTTCGAGG ACGGCGTTTT
TCTTGCTAAA ATCACAAGTA TTGATGAGCA CGATGCAAGA AAGATCGGAA GAAGGTTTGG
GTTTGAGGCT CAGTGGAAGG TGAGTAGAAG TTGATAATTT GAAAGTGGAG TAGTGTCTAT
GGGGTTTTTG CCTTAAATGA CAGAATACAT TCCCAATATA CCAAACATAA CTGTTTCCTA
CTAGTCGGCC GTACGGGCCC TTTCGTCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT
GACACATGCA GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC
AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCTGGCTT AACTATGCGG
CATCAGAGCA GATTGTACTG AGAGTGCACC ATATGCGGTG TGAAATACCG CACAGATGCG
TAAGGAGAAA ATACCGCATC AGGCGGCCTT AAGGGCCTCG TGATACGCCT ATTTTTATAG
GTTAATGTCA TGATAATAAT GGTTTCTTAG ACGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG
CGCGGAACCC CTATTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA
CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG TATTCAACAT
TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTT TGCTCACCCA
GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC
GAACTGGATC TCAACAGCGG TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA
ATGATGAGCA CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT TGACGCCGGG
CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA GTACTCACCA
GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG AATTATGCAG TGCTGCCATA
ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGATCGGAGG ACCGAAGGAG
CTAACCGCTT TTTTGCACAA CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGAACCG
GAGCTGAATG AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT AGCAATGGCA
ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG GCAACAATTA
ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT
GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATTGCA
GCACTGGGCC AGATGGTAAG CCCTCCCGTA TCGTAGTTAT CTACACGACG GGGAGTCAGG
CAACTATGGA TGAACGAAAT AGACAGATCG CTGAGATAGG TGCCTCACTG ATTAAGCATT
GGTAACTGTC AGACCAAGTT TACTCATATA TACTTTAGAT TGATTTAAAA CTTCATTTTT
AATTTAAAAG GATCTAGGTG AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA ATCCCTTAAC
GTGAGTTTTC GTTCCACTGA GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA TCTTCTTGAG
ATCCTTTTTT TCTGCGCGTA ATCTGCTGCT TGCAAACAAA AAAACCACCG CTACCAGCGG
TGGTTTGTTT GCCGGATCAA GAGCTACCAA CTCTTTTTCC GAAGGTAACT GGCTTCAGCA
GAGCGCAGAT ACCAAATACT GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC CACTTCAAGA
ACTCTGTAGC ACCGCCTACA TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG GCTGCTGCCA
GTGGCGATAA GTCGTGTCTT ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG GATAAGGCGC
AGCGGTCGGG CTGAACGGGG GGTTCGTGCA CACAGCCCAG CTTGGAGCGA ACGACCTACA
CCGAACTGAG ATACCTACAG CGTGAGCATT GAGAAAGCGC CACGCTTCCC GAAGGGAGAA
AGGCGGACAG GTATCCGGTA AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG AGGGAGCTTC
CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC TGACTTGAGC
GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC AGCAACGCGG
CCTTTTTACG GTTCCTGGCC TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA CATGTTCTTT CCTGCGTTAT
CCCCTGATTC TGTGGATAAC CGTATTACCG CCTTTGAGTG AGCTGATACC GCTCGCCGCA
GCCGAACGAC CGAGCGCAGC GAGTCAGTGA GCGAGGAAGC GGAAGAGCGC CCAATACGCA
AACCGCCTCT CCCCGCGCGT TGGCCGATTC ATTAATGCAG CTGGCACGAC AGGTTTCCCG
ACTGGAAAGC GGGCAGTGAG CGCAACGCAA TTAATGTGAG TTAGCTCACT CATTAGGCAC
CCCAGGCTTT ACACTTTATG CTTCCGGCTC GTATGTTGTG TGGAATTGTG AGCGGATAAC
AATTTCACAC AGGAAACAGC TATGACCATG ATTACGCCAA GCTT
【００５１】
SEQ ID NO.９：ＳＰのアミノ酸配列
MLPGLALFLL AAWTARA
【００５２】
SEQ ID NO.10：融合タンパク質のアミノ酸配列
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII GLMVGGVVIA
TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQ QNGYENPTYK FFEQMQN
【００５３】
SEQ ID NO.11：ベクター unc-119-SP-C100のヌクレオチド配列
ATGACCATGA TTACGCCAAG CTTCAGTAAA AGAAGTAGAA TTTTATAGTT TTTTTTCTGT
TTGAAAAATT CTCCCCATCA ATGTTCTTTC AAATAAATAC ATCACTAATG CAAAGTATTC
TATAACCTCA TATCTAAATT CTTCAAAATC TTAACATATC TTATCATTGC TTTAAGTCAA
CGTAACATTA AAAAAAATGT TTTGGAAAAT GTGTCAAGTC TCTCAAAATT CAGTTTTTTA
AACCACTCCT ATAGTCCTAT AGTCCTATAG TTACCCATGA AATCCTTATA TATTACTGTA
AAATGTTTCA AAAACCATTG GCAAATTGCC AGAACTGAAA ATTTCCGGCA AATTGGGGAA
CCGGCAAATT GCCAATTTGC TGAATTTGCC GGAAACGGTA ATTGCCGAAA GTTTTTGACA
CGAAAATGGC AAATTGTGGT TTTAAAATTT TTTTTTTTGG AAATTTCAGA ATTTCAATTT
TAATCGGCAA AACTGTAGGC ATCCTAAGAA TGTTCCTACA TCTATTTTGA AAAGTAAGCG
AATTAATTCT ATGAAAATGT CTAAAGAAAA TGGGGAAACA ATTTCAAAAA GGCACAGTTT
CAATGGTTTC CGAATTATAC TAAATCCCTC TAAAAACTTC CGGCAAATTG ATATCCGTAA
AAGAGCAAAT CCGCATTTTT GCCGAAAATT AAAATTTCCG ACAAATCGGC AAACCGGCAA
TTTGGCGAAA TTTGCCGGAA CGATTGCCGC CCACCCCTGT TCCAGAGGTT CAAACTGGTA
GCAAAGCTCA AAATTTCTCA AATTCTCCAA TTTTTTTTTG AATTTTGGCA GTGTACCAAA
ATGACATTCA GTCATATTGG TTTATTATAG ATTTATTTAG ATAAAATCCT AAATGATTCT
ACCTTTAAAG ATGCCCACTT TAAAAGTAAT GACTCAAACT TCAAATTGCT CTAAGATTCT
ATTGAATTAC CATCTTTTCC TCTCATTTTC TCTCACTGTC TATTTCATCA CAAATTCATC
CCTCTCTCCT CTCTTCTCTC TCCCTCTCTC TCTCTTTCTC TTTGCTCATC ATCTGTCATT
TTGTCCGTTC CTCTCTCTGC GCCCTCAGCG TTCCCCACAC TCTCTCGCTT CTCTTTTCCT
AGACGTCTTC TTTTTTCATC TTCTTCAGCC TTTTTCGCCA TTTTCCATCT CTGTCAATCA
TTACGGACGA CCCCCATTAT CGATAAGATC TCCACGGTGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG
GGGGATCCCC GGGATTGGCC AAAGGACCCA AAGGTATGTT TCGAATGATA CTAACATAAC
ATAGAACATT TTCAGGAGGA CCCTTGGCTA GCGTCGACGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG
TCGACGGTAT CGATAACCTT CACAGCAGCG CACTCGGTGC CCCGCGCAGG GTCGCGATGC
TGCCCGGTTT GGCACTGTTC CTGCTGGCCG CCTGGACGGC TCGGGCGCTG GATGCAGAAT
TCCGACATGA CTCAGGATAT GAAGTTCATC ATCAAAAATT GGTGTTCTTT GCAGAAGATG
TGGGTTCAAA CAAAGGTGCA ATCATTGGAC TCATGGTGGG CGGTGTTGTC ATAGCGACAG
TGATCGTCAT CACCTTGGTG ATGCTGAAGA AGAAACAGTA CACATCCATT CATCATGGTG
TGGTGGAGGT TGACGCCGCT GTCACCCCAG AGGAGCGCCA CCTGTCCAAG ATGCAGCAGA
ACGGCTACGA AAATCCAACC TACAATTCTT TGAGCAGATG CAGAACTAGA CCCCCGCCAC
AGCAGCCTCT GAAGTTGGAC ACGGATCCAC TAGTTCTAGA GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA
GCTCCGCATC GGCCGCTGTC ATCAGATCGC CATCTCGCGC CCGTGCCTCT GACTTCTAAG
TCCAATTACT CTTCAACATC CCTACATGCT CTTTCTCCCT GTGCTCCCAC CCCCTATTTT
TGTTATTATC AAAAAAACTT CTTCTTAATT TCTTTGTTTT TAGCTTCTTT TAAGTCACCT
CTAACAATGA AATTGTGTAG ATTCAAAAAT AGAATTAATT CGTAATAAAA AGTCGAAAAA
AATTGTGCTC CCTCCCCCCA TTAATAATAA TTCTATCCCA AAATCTACAC AATGTTCTGT
GTACACTTCT TATGTTTTTT TTACTTCTGA TAAATTTTTT TTGAAACATC ATAGAAAAAA
CCGCACACAA AATACCTTAT CATATGTTAC GTTTCAGTTT ATGACCGCAA TTTTTATTTC
TTCGCACGTC TGGGCCTCTC ATGACGTCAA ATCATGCTCA TCGTGAAAAA GTTTTGGAGT
ATTTTTGGAA TTTTTCAATC AAGTGAAAGT TTATGAAATT AATTTTCCTG CTTTTGCTTT
TTGGGGGTTT CCCCTATTGT TTGTCAAGAG TTTCGAGGAC GGCGTTTTTC TTGCTAAAAT
CACAAGTATT GATGAGCACG ATGCAAGAAA GATCGGAAGA AGGTTTGGGT TTGAGGCTCA
GTGGAAGGTG AGTAGAAGTT GATAATTTGA AAGTGGAGTA GTGTCTATGG GGTTTTTGCC
TTAAATGACA GAATACATTC CCAATATACC AAACATAACT GTTTCCTACT AGTCGGCCGT
ACGGGCCCTT TCGTCTCGCG CGTTTCGGTG ATGACGGTGA AAACCTCTGA CACATGCAGC
TCCCGGAGAC GGTCACAGCT TGTCTGTAAG CGGATGCCGG GAGCAGACAA GCCCGTCAGG
GCGCGTCAGC GGGTGTTGGC GGGTGTCGGG GCTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA
TTGTACTGAG AGTGCACCAT ATGCGGTGTG AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT
ACCGCATCAG GCGGCCTTAA GGGCCTCGTG ATACGCCTAT TTTTATAGGT TAATGTCATG
ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT
ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA
TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC
CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGGTG
AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC
AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT
TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTATTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC
GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG
CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTGAT
AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT
TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA
GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGTAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC
AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG
GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT
GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA
GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT
GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTGTCA
GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG
ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACT GAGTTTTCGT
TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC
TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC
CGGATCAAGA GCTACCAACT CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC
CAAATACTGT CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC
CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT
CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT
GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT
ACCTACAGCG TGAGCATTGA GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT
ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG
CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC GCCACCTCTG ACTTGAGCGT CGATTTTTGT
GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT
TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG
TGGATAACCG TATTACCGCC TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG
AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC GAGGAAGCGG AAGAGCGCCC AATACGCAAA CCGCCTCTCC
CCGCGCGTTG GCCGATTCAT TAATGCAGCT GGCACGACAG GTTTCCCGAC TGGAAAGCGG
GCAGTGAGCG CAACGCAATT AATGTGAGTT AGCTCACTCA TTAGGCACCC CAGGCTTTAC
ACTTTATGCT TCCGGCTCGT ATGTTGTGTG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTTCACACAG
GAAACAGCT
【００５４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ695 アイソフォームおよびＡＰＰ770 ならびにＡＰＰ751 アイソフォーム）およびセクレターゼによる切断産物を示している。
【図２】  トランスジェニックベクター、“Unc-119-SP-C100”の構造を示している。そして、これは unc-119プロモーター、ＡＰＰシグナルペプチドおよび、ＡＰＰからのＣ100断片を含む。“unc-119”は、ニューロン特異的なシーエレガンスのプロモーターであり、ＡＰＰシグナルペプチドは、ＡＰＰの１から２４のアミノ酸に対応しており、Ｃ100は、ＡＰＰの１００個のＣ末端のアミノ酸（＝Ｃ100）と対応している。Ｃ100は、Ａβ配列およびＡＰＰのＣ末端から構成される（Shoji, M. et al., (1992) Science 258, 126)。ベクター Unc-119-SP-C100は、５１１２個の塩基対を持っている。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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