(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カワラケツメイから得られる抽出物を有効成分とすることを特徴とする、骨粗鬆症の予防および／または治療に有効な骨吸収抑制剤。
【請求項２】
カワラケツメイから得られる抽出物が、溶媒抽出又は圧搾により得られることを特徴とする、請求項１に記載の骨吸収抑制剤。
【請求項３】
エタノール、水およびそれらの混合物から選ばれた溶媒を用いて抽出したことを特徴とする、請求項２に記載の骨吸収抑制剤。
【請求項４】
カワラケツメイから得られる抽出物が、クロマトグラフィーを用いてエタノール水溶液で溶出した画分を有効成分とすることを特徴とする、請求項２または３に記載の骨吸収抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨粗鬆症の予防または治療に有効な骨吸収抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は、骨の単位容積当りの骨量が減少する疾病であり、症状が進むと骨折の危険性が増したり、痛みを伴うこととなり、高齢者が寝たきりになる要因の１つともなっている。
【０００３】
骨は体の荷重を支え運動器官としての役割を担う生体の支持組織としての働きと、カルシウムの貯蔵庫としての働きを担う極めて重要な組織であり、その機能を維持するために、思春期に成長が停止した後も活発に代謝回転を繰り返している。すなわち、破骨細胞により古くなった骨が壊される（骨吸収という）一方で、骨芽細胞により新しい骨が作られており（骨形成という）、この骨吸収と骨形成という作用の平衡関係の下に、骨の機能が維持されている。骨吸収を担う破骨細胞と骨形成を担う骨芽細胞の間には緻密な相互応答機構が存在し、この機構には全身性ホルモンやサイトカインが深く関与している。そして、閉経や加齢がホルモンやサイトカインの分泌あるいは作用に変化をもたらすこと等が骨吸収と骨形成の間の平衡関係に破錠を来し、骨吸収が骨形成を上回り骨粗鬆症を発症することが明らかになってきた（「骨・カルシウム代謝の調節系と骨粗鬆症」，ｐ．１２，１９９４，羊土社，東京）。
【０００４】
そのような観点から、骨粗鬆症を予防・治療するには、以前から推奨されてきたカルシウム摂取量の向上だけでは限界があり、骨吸収と骨形成の平衡を維持することが重要であるということが認識されるようになってきた。
【０００５】
現在、骨粗鬆症の治療薬としては、エストロゲン製剤、カルシトニン剤、活性型ビタミンＤ３製剤、イプリフラボン製剤、ビタミンＫ２、ビスホスホネート製剤、副甲状腺ホルモン製剤、性ステロイド誘導体が用いられているが、いずれの薬剤も必ずしも期待しうる効果が得られるわけではなく、また、副作用のために使用が制限される（「骨・カルシウム代謝の調節系と骨粗鬆症」，ｐ．１５７−１６１，１９９４，羊土社，東京）。
【０００６】
また、骨粗鬆症は、その疾病にかかってしまった後で骨量を回復するには長期間を必要とするので、予防に努めることが重要であり、予防という観点から考えるとこれらの薬剤を長期にわたり投与することは好ましくない。
【０００７】
食品成分では、大豆イソフラボンやビタミンＫが骨粗鬆症に有効であると報告されているが、その効果や作用機序については、未だ不明な点も多い（特開平８−２１４７８７号公報、日本栄養・食糧学会誌，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．５，２９４−２９８，１９９８、特開平１０−５６９５９号公報）。
【０００８】
さらに、トチュウまたはオウギを含有する骨粗鬆症治療剤（特開平４−１６９５３６号公報）、バラ科、ツバキ科、あるいはクワ科植物より得られる富ポリフェノール抽出物を有効成分とする吸収性骨疾患の予防・治療剤（特開平６−１８３９８５号公報）、乳由来塩基性タンパク質画分または塩基性ペプチド画分を有効成分とする骨強化剤（特開平８−１５１３３１号公報）等の食品・植物由来成分を有効成分とする骨粗鬆症予防治療剤が開示されている。
【０００９】
カワラケツメイ（Cassia minosides L.Var.nomame Makino）は、民間伝承薬として、健胃や健腸を目的に使用され、また、古くよりマメ茶、浜茶、弘法茶等と呼ばれ、茶の代用として飲用されてきた安全性の高い植物であるが、カワラケツメイ抽出物が骨粗鬆症に有効であるとの報告は未だなされていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、骨吸収を抑制し、日常生活の中で簡単に利用でき、且つ安全で長期間にわたって摂取することができる骨粗鬆症の予防または治療に有効な骨吸収抑制剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者等は骨髄細胞及び骨組織培養法を用いて骨粗鬆症に対する予防または治療に有効な植物抽出物を探索したところ、古くから飲食品として摂取されてきたカワラケツメイから得られる抽出物が、骨吸収を担う破骨細胞の形成と骨吸収を抑制すること、そしてこの抽出物を１日当たり所定量にて摂取した場合、骨粗鬆症の予防及び治療に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、カワラケツメイから得られる抽出物を有効成分とする骨粗鬆症の予防または治療に有効な骨吸収抑制剤である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分である抽出物は、カワラケツメイ（Cassia minosides L.Var.nomame Makino）から抽出して得られる。
【００１４】
カワラケツメイは全国各地に植生するマメ科の植物である。カワラケツメイの植物体はそのままの形態で抽出に供してもよいが、抽出効率を高めるため、好ましくは裁断または粉砕して抽出に供するとよい。
【００１５】
抽出には溶媒抽出や圧搾抽出等種々の抽出方法を用いることができるが、好ましくは、溶媒抽出を用いるとよい。抽出に使用される溶媒としては、水、アルコール、エーテル、アセトン、ヘキサン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトロヒドロフラン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの溶媒の中から１種または２種以上選択して使用するが、安全性の見地から、水、エタノール、アセトン、酢酸エチル等が好ましく、さらには、飲用にも用いられている水、またはエタノールを使用することが好ましい。さらに好ましくは、水とエタノールの混合物、例えば２０〜９０％のエタノール水溶液、特に３０〜８０％のエタノール水溶液、を使用するとよい。
【００１６】
抽出の方法は、植物体１ｋｇに対して１〜５０リットル、好ましくは１０リットルの溶媒を加え、１日〜１ヶ月間室温に放置する。抽出効率を高めるために、放置の途中で攪拌してもよい。また、溶媒を加温してもよい。
【００１７】
抽出後は抽出残渣（植物体）と抽出液（溶媒）を濾過あるいは沈降法等により分離する。好ましくは、抽出残渣は同様の抽出操作を２〜４回程度繰り返すとよい。全抽出液を集めて、これを濃縮乾燥して目的とする抽出物を得る。
【００１８】
さらに、クロマトグラフィー等の方法を用いて有効成分を分画し、その純度を高めて使用してもよい。その方法としては、吸着クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、液々抽出等が例示できる。クロマトグラフィーで、３０〜８０％エタノール水溶液にて溶出された画分が好ましい。
【００１９】
上述のようにして得られるカワラケツメイから得られた抽出物は、骨粗鬆症の予防および／または治療に有効な骨吸収抑制剤として、そのまま直接使用してもよいが、種々の剤型での投与が可能であり、一般的には薬学的に許容される適当な液体担体に溶解するか若しくは分散させ、または薬学的に許容される適当な粉末担体と混合するか若しくはこれに吸着させ、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤等の経口投与剤や、座薬や点滴剤などの非経口投与剤として使用される。投与量は、患者の症状や年齢などに応じて適宜変えられるが、１日当たり、乾燥抽出物１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用いればよく、さらには乾燥抽出物５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用いるのが好ましい。
【００２０】
また、本発明の飲食品は、通常の飲食品に上記のカワラケツメイから得られた抽出物を添加することにより調製され、例えば、チョコレート、キャンデイ、ゼリー、ビスケット、チューインガム、アイスクリーム、シャーベット、氷菓、和菓子等の菓子、清涼飲料、ジュース、ウーロン茶等の飲料、畜肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、穀類加工品、冷凍食品、調味料、スプレッド等の飲食品に用いることができる。添加量は、対象の飲食品に対して重量を基準として乾燥抽出物を０．１〜５％、好ましくは０．５〜２．５％の範囲で添加するのが好ましい。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明を詳細に説明するため実施例及び試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】
カワラケツメイ抽出物の調製方法
カワラケツメイ全草を粉砕し、粉砕物０．８ｋｇに対して８リットルの４０％エタノール水溶液を添加し、時々攪拌しながら１昼夜室温に放置した。これを濾過し、濾液を濃縮乾燥後、３０％エタノール水溶液に溶解させ、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（三菱化成製）を充填したカラム（φ１０ｃｍ×３８ｃｍ）に供した。３０％エタノール水溶液１５リットルで洗浄した後、８０％エタノール水溶液１０リットルで溶出させ、溶出液を濃縮乾燥し、カワラケツメイ抽出物２８ｇを得た。
【００２３】
【試験例１】
破骨細胞形成抑制効果の測定
実施例１で得られたカワラケツメイ抽出物について、マウス脛骨から採取した骨髄細胞からの破骨細胞形成に対する抑制効果を測定した。
【００２４】
この試験方法は、骨吸収促進因子である１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、活性型ビタミンＤ３とする）の存在下で骨髄細胞を培養すると破骨細胞が形成される（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２２，１３７３−１３８２，１９８８、「研究テーマ別・動物培養細胞マニュアル」，ｐ．１９５−１９６，１９９３，共立出版，東京）という培養系に、被験試料を添加して培養を行い、被験試料の破骨細胞形成に対する抑制効果を評価するものである。なお、ポジティブコントロールとして、大豆イソフラボンを用いた。
【００２５】
具体的には、６週齢雄マウスの脛骨を取り出して軟組織を除去した後、注射器を用いて骨端から１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むαＭＥＭ培地（以下αＭＥＭ・１０％ＦＣＳとする）を注入して骨髄を洗い出した。血球計算板を用いて骨髄細胞数を計測し、４．０×１０６／ｍｌになるようにαＭＥＭ・１０％ＦＣＳで希釈した。この細胞懸濁液を２４穴マイクロプレートに０．５ｍｌ／ｗｅｌｌずつ幡種し、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で７日間培養した。培養２日目から、対照群には活性型ビタミンＤ３を、試験群には活性型ビタミンＤ３と被験試料を添加し、以後２日毎に培地交換を行った。活性型ビタミンＤ３の濃度は５．０×１０−８Ｍ、被験試料の濃度は１０μｇ／ｍｌとした。培養終了後、培地を除去し、０．５ｍｌの１０％中性ホルマリン溶液で細胞を固定し、アセトン−エタノール混合液（１：１）で洗浄して乾燥し、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色法（「骨形成と骨吸収及びそれらの調節因子  ２巻」，ｐ．２４７−２４８，平成７年，廣川書店，東京）により破骨細胞を染色した。光学顕微鏡を用いて染色された破骨細胞数を計測し、対照群と試験群の破骨細胞数から、以下の算式により被験試料の破骨細胞形成抑制率を算出した。
【００２６】
【数１】
0004426674.tif 000002
【００２７】
結果を表１に示した。カワラケツメイ抽出物は大豆イソフラボンよりも強力に破骨細胞の形成を抑制した。
【００２８】
【表１】
0004426674.tif 000003
【００２９】
【試験例２】
骨吸収抑制効果の測定
実施例１で得られたカワラケツメイ抽出物について、培養ラット大腿骨及び脛骨の骨幹部における骨吸収に対する抑制効果を測定した。
【００３０】
この試験は、４５Ｃａで標識した骨組織を液体培地中で培養し、骨吸収作用によりその培地中に溶出する４５Ｃａを液体シンチレーションカウンターを用いて測定し、骨吸収率を算出する方法（「研究テーマ別・動物培養細胞マニュアル」，ｐ．１９３−１９４，１９９３，共立出版，東京）を用い、骨吸収促進因子である副甲状腺ホルモン（以下ＰＴＨとする）により促進された骨吸収に対する、被験試料の抑制効果を評価するものである（Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ，２４，２０１−２０９，１９９４）。なお、ポジティブコントロールとして、大豆イソフラボンを用いた。
【００３１】
具体的には、妊娠１８日目のウィスター系雌ラットに５０μＣｉの４５ＣａＣｌ２（ＰＢＳ(−)溶液）を腹腔内注射し、注射の２日後に胎児脚部より４５Ｃａで標識された大腿骨及び脛骨を取り出した。付着する肉片及び両骨端部の軟骨組織を除去し、骨幹部を得た。骨幹部は、表２に示す組成のＢＧＪｂ−ＨＷ２培地１ｍｌを含む２４穴マイクロプレートに１片ずつ入れて、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下１日培養した。培養１日目は、骨組織中の４５Ｃａと培地中のＣａが物理化学的な交換反応を行い、４５Ｃａが急速に溶出してくるため、前培養とした。前培養終了後、培地を除去し、コントロール群はＢＧＪｂ−ＨＷ２培地、ＰＴＨ群はＰＴＨを含むＢＧＪｂ−ＨＷ２培地、試験群はＰＴＨと被験試料を含むＢＧＪｂ−ＨＷ２培地を新たに１ｍｌ加え、７日間培養した。ＰＴＨの濃度は２×１０−８Ｍ、被験試料の濃度は１０μｇ／ｍｌとした。培養終了後、骨吸収作用により培地中に溶出された４５Ｃａを液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。また培養終了後の骨組織を１ｍｌの１Ｎ−ＨＣｌ中に、２４時間、室温で放置して骨組織中に残存する４５Ｃａをすべて溶解し、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。まず、それぞれの群の骨吸収率を以下の算式により算出した。
【００３２】
【数２】
0004426674.tif 000004
【００３３】
次に、それぞれの群の骨吸収率から、以下の算式により被験試料の骨吸収抑制率を算出した。
【００３４】
【数３】
0004426674.tif 000005
【００３５】
結果を表３に示した。カワラケツメイ抽出物は大豆イソフラボンよりも強力に骨吸収を抑制した。
【００３６】
【表２】
0004426674.tif 000006
【００３７】
【表３】
0004426674.tif 000007
【００３８】
【実施例２】
錠剤
乳糖４０ｇ、コーンスターチ１９ｇ、実施例１の方法で調製したカワラケツメイ抽出物５０ｇ及びシュガーエステル１ｇを混合物し、混合物を押し出し造粒機により造粒した後、定法により打錠機を用いて圧縮成形し、裸錠１００錠の骨吸収抑制剤を製造した。
【００３９】
【実施例３】
チョコレート
カカオマス３．５ｋｇ、カカオバター１．５ｋｇ、全脂粉乳０．４５ｋｇ、砂糖４．５ｋｇ、および実施例１の方法で得たカワラケツメイ抽出物５０ｇを混合機に入れ、３８〜４３℃で３０分混合後、リファイナーに移し、３５〜３６℃で粒子が４０μ以下になるように均一に微細化した。次いでコンチングマシンに移し、約６０℃に加温しながら４０時間攪拌混和し、コンチング終了直前に乳化剤としてレシチン５０ｇと若干の香料を加えて均質化した後、２７〜３２℃でテンパリングを行った。これを所定のモールドに入れ冷却固化させてチョコレートを製造した。風味が良好で、骨粗鬆症予防用として日常的に摂取し得るチョコレートであった。
【００４０】
【実施例４】
チューインガム
ガムベース５００ｇ、砂糖１．２ｋｇ、水飴２００ｇ、軟化剤２０ｇ、色素２０ｇ、酸味料２０ｇ、香料２０ｇ、及び実施例１の方法で得られたカワラケツメイ抽出物２０ｇを練り合わせ、常法によりチューインガムを製造した。テクスチャー、風味ともに良好で、骨粗鬆症予防用として日常的に摂取し得るチューインガムであった。
【００４１】
【実施例５】
ビスケット
小麦粉１ｋｇ、コーンスターチ１００ｇ、砂糖２５０ｇ、マーガリン１２５ｇ、食塩５ｇ、炭酸ソーダ２５ｇ、炭酸アンモニウム８．８ｇ、大豆レシチン６．３ｇ、全卵７５ｇ、ワニラオイル６．３ｇ、実施例１の方法で得られたカワラケツメイ抽出物４１ｇ、及び水３５０ｇを用いてドウを作成し、延展後これを成形して培焼しビスケットを製造した。固さ、風味ともに良好で、骨粗鬆症予防用として日常的に摂取し得るビスケットであった。
【００４２】
【実施例６】
キャラメル
砂糖１５０ｇ、水飴１５０ｇ、練乳６０ｇ、小麦粉１８．８ｇ及び実施例１の方法で得られたカワラケツメイ抽出物２ｇを混合し１２０℃まで煮詰めた後、バター２．２ｇ、カカオバター１．６ｇ、椰子油２．２ｇ、香料１ｇを加えて攪拌後、冷却、成形してキャラメルを製造した。口溶け、風味ともに良好で、骨粗鬆症予防用として日常的に摂取し得るキャラメルであった。
【００４３】
【実施例７】
ウーロン茶
定法により製造したウーロン茶１リットルに実施例１の方法で得られたカワラケツメイエキス５ｇを添加し、骨粗鬆症予防用のウーロン茶飲料を製造した。風味が良好で、骨粗鬆症予防用として日常的に摂取し得るウーロン茶飲料であった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の有効成分であるカワラケツメイから得られる抽出物は、破骨細胞の形成の抑制と骨細胞からのカルシウムの遊離を抑制することができるので、骨粗鬆症の予防または治療に有用なものである。そして、この抽出物は、古くから民間伝承薬または茶の代用としてとして広く用いられているものであり、安全で長期にわたって使用することができる。
【００４５】
従って、本発明の骨吸収抑制剤は、骨粗鬆症の予防および／または治療に有用なものであり、それを飲食品に添加して所定量を日常的に摂取することにより、骨粗鬆症の予防および／または治療に有効な保健用食品等としても有用である。