(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコの細胞においてネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）の遺伝子産物を発現させるためのＤＮＡ発現構築体であって、ネコ科において作動が可能なプロモーター配列、並びに、配列番号６で示されるＦｅＬＶの構造タンパク（“ｇａｇ”）及び／又は配列番号９あるいは配列番号１０で示されるＦｅＬＶの膜タンパク（“ｅｎｖ”）をコードしている１つ以上の核酸配列を含む、構築体。
【請求項２】
“ｇａｇ”構造タンパクをコードしている配列番号５の突然変異核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１のＤＮＡ発現構築体。
【請求項３】
ｅｎｖ−ｇｐ８５膜タンパクをコードしている配列番号７の突然変異核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１のＤＮＡ発現構築体。
【請求項４】
ｅｎｖ−ｇｐ７０膜タンパクをコードしている配列番号８の突然変異核酸配列を含む特徴とする、請求項１のＤＮＡ発現構築体。
【請求項５】
前記の核酸配列がコードしている構造及び／又は膜タンパクに完全に含まれることを特徴とする、請求項１乃至４の少なくとも１の請求項に記載のＤＮＡ発現構築体。
【請求項６】
前記発現構築体がプラスミドであることを特徴とする、請求項１乃至５の少なくとも１の請求項に記載のＤＮＡ発現構築体。
【請求項７】
免疫化ポリヌクレオチド配列が直線状２本鎖領域を含む共有的に閉鎖された直線状デオキシリボヌクレオチド分子から成る発現構築体の形を取り、前記２本鎖を形成する各１本鎖はデオキシリボヌクレオチドから成る短い１本鎖ループによって結合され、及び前記２本鎖を形成する１本鎖は、ワクチン接種の対象となる動物において作動が可能なプロモーターの制御下にあるコード配列とターミネーター配列のみから成ることを特徴とする、請求項１から５の少なくとも１項によるＤＮＡ発現構築体。
【請求項８】
前記発現構築体が一つ以上のペプチドに対して共有的に結合することを特徴とする請求項１乃至７の少なくとも１請求項に記載のＤＮＡ発現構築体。
【請求項９】
前記ペプチドが３から３０個のアミノ酸から成り、その少なくとも半分がアルギニンとリジンから成るグループのメンバーであることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡ発現構築体。
【請求項１０】
前記ペプチドが配列ＰＫＫＫＲＫＶ（プロリン−リジン−リジン−リジン−アルギニン−リジン−バリン）を含むことを特徴とする、請求項９のＤＮＡ発現構築体。
【請求項１１】
ネコを含むネコ科の動物において予防的および／または治療的免疫を産生するための製薬組成物、特にワクチンであって、請求項１から１０の少なくとも１請求項に記載のＤＮＡ発現構築体を含む、ワクチンを含む製薬組成物。
【請求項１２】
配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１３】
配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１４】
配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ白血病ウィルスによる感染症に対してネコを保護することを可能にする、ＤＮＡに基づくワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）は、ネコ科集団において重篤な疾患を引き起こし、主要な死亡原因の一つとなる、ネコに特異的な世界中に蔓延するウィルスである。現在、感染率は、欧米のネコの１２％から１６％の間にある。
【０００３】
感染を克服できるネコもいるが、器官の中に生涯に渡ってウィルスが残存する可能性もある。このため潜在的に感染しているネコは、病原巣となると考えられる。
【０００４】
病気の根治をもたらすＦｅＬＶ感染症の効果的治療は現在不可能である。現在実現し得る最善の成果は、病気の進行をしばらくの間押し留めることである。いくつかの化学療法剤をネコに投与することは可能であるが、それらはヒトの医療用なので副作用が大きな問題となる。現在インターフェロン治療は実験的段階である。
【０００５】
ウィルス成長抑止剤は不活性化することはできないので、治癒と定義できる成果をもたらすことはない。
【０００６】
ＦｅＬＶ感染の効果的管理は、ただワクチン接種によってのみ予防的に実行することが可能である。
【０００７】
現在利用が可能なワクチンは、不活性化されたＦｅＬＶウィルス、組み換え法によって生産されたタンパク質、所謂サブユニットワクチン、または、遺伝学的に修飾された生ワクチンの使用の内のいずれかに基づく。しかしながら、これらのクラスのワクチンは、ワクチン接種の効果が不十分であることの他に、いくつかの不利を呈している。
【０００８】
不活性化ウィルスから得られた調剤は、ワクチン接種された動物のほんの一部にしか所望の免疫をもたらさない。これらのワクチンは必ずタンパク混合物から成り、その混合物では、免疫原性の高い抗原が、免疫系による提示を求めて多数の他のタンパクと競合しなければならない。さらに、ワクチン接種後も、アレルギー反応や自己免疫疾患のような強い副作用の起こる可能性がある。
【０００９】
最近頻用されるワクチンは、生物工学的手法によって生産されたＦｅＬＶコートタンパクに、水酸化アルミニウムおよびサポニンをアジュバントとして加えたものから構成される組み換えワクチンである。このワクチンによるワクチン療法は、８０％から９５％のネコにおいて白血病に対する保護をもたらした（ルッツ等（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．）１９９１、Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９（１０）：１４４６−５２）。
【００１０】
問題は、ワクチン接種部位に線維肉種の発生する危険性である。このワクチンのもう一つ不利な点は、惹起された免疫が主に、ウィルス中和性抗体の生産に基づくものであるということであるが、さらに新しい実験結果によれば（フリン等（Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０１，１２０−１２５）、保護的免疫の形成には、細胞性免疫反応も大きな重要性を持つことが明らかにされている。
【００１１】
生ワクチンの使用は、実効的免疫という点では効果のあることが従来から示されてはいるものの、このワクチンは、使用されるウィルス株が、突然変異または組み換えによって新規の病原性ウィルス株に変換するという内在的危険を抱えている。さらに、全てのウィルス構造を含むこのようなワクチンを用いた場合、免疫化後、動物は感染したのか、ワクチン接種を受けたのか、を区別することができないということにも留意する必要がある。上記二つの理由から、このワクチンは実施には適切ではない。
【００１２】
感染可能または再製可能のウィルスから成るもう一つのワクチンの例は、ＦｅＬＶ表面タンパクを発現する、組み換えカナリアポックスルウィルスである。実験的な感染では、動物の８３％が感染から保護された（ジャレット等（Ｊａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）１９９３、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：２３７０−２３７５）。しかしながら、このワクチンには、組み換えが予測不可能であるという点で生ワクチンの上記欠点が含まれている。その上比較的難しく、そのため、生産し、その特徴を明らかにするのに費用がかかる。
【００１３】
前述の古典的および現代的組み換えワクチンのほかに、ＤＮＡ発現構築体によってワクチン接種するという可能性が存在する。この場合、病原体の内の、ある免疫原部分の情報のみが、ＤＮＡという形でワクチン治療対象者に投与される。ワクチン接種後、ＦｅＬＶ抗原が、ワクチン接種を受けたネコの細胞によって発現され、このようにしてＦｅＬウィルスにたいする免疫反応を刺激する。
【００１４】
このように、ある抗原に対して、その抗原をコードするＤＮＡ発現構築体を注入することによって免疫反応を実現する可能性については、最初に、タンおよびウルマー（Ｔａｎｇ  ａｎｄ  Ｕｌｍｅｒ）がネズミについて報告し（タン等（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，１５２−１５４；ウルマー等（Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４９）、以来多数の動物種でその実効が証明されている。免疫原をコードする核酸によってワクチン治療を行うという一般的原理は、全ての高等動物に適用可能であると仮定してもよいと思われる。しかしながら、適当な抗原の選択、その抗原の核酸配列への符号化、および、適当なワクチン接種プログラムの選択に関しては、どのような用途の場合でもいくつかの問題を伴うものであり、その内のいくつかは当業者にとっても打ち勝ちがたいものである。このため、治験第２相または第３相試験の対象として許可されたＤＮＡワクチンはこれまで無い。
【００１５】
遺伝子ｅｎｖおよびｇａｇを発現する発現構築体によってネコにワクチン接種することが、仏国特許ＦＲ２７５１２２３号に記載されている。しかしながら、この中に概説される発明は、純粋に仮定的なもので、十分に開示的ではない。発現または免疫化実験も、あるいはその結果も示されていない。これは、純粋に思念に基づく出願である。
【００１６】
ＦｅＬＶ領域におけるＤＮＡ免疫化に関する実験は知られるが（ジャレット等（Ｊａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）２０００  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０１，１２０−１２５）、納得できる結果をもたらさなかった。この刊行論文では、ポリメラーゼ欠失を含む全ゲノムが発現構築体として接種された。このワクチン接種による臨床的成果は、ネコを感染またはウィルス血症から保護したところまでであった。前述のワクチン接種実験の実際上の不都合だけでなく、欠失変異体またはそのゲノムをワクチン接種に用いることは、欠失ウィルスと内在性または外来性ウィルス配列との組換えが起こり、新規の感染性病原体が生じる危険性が残存するという不利を有する。
【００１７】
本発明をもたらした数々の努力は、ジャレット（Ｊａｒｒｅｔｔ）による前述の研究とは逆に、単離されたＦｅＬＶ抗原のみを発現することを目標としていた。しかしながら、予備実験において、ＦｅＬＶの“ｅｎｖ”および“ｇａｇ”遺伝子をコードする、相同の野生型配列を、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の早期直近プロモーターの制御下に発現する発現構築体を接種したところ、それは、ネコにおいて、抗体反応を引き起こさないことが示された。その後の実験でも、ヒトおよびネコの細胞系統において、“ｅｎｖ”および“ｇａｇ”それぞれの配列は発現されないこと、または、ごく僅かな程度にしか発現されないことが示された。この現象は、ＨＩウィルスやその他のレンチウィルスの配列についても知られている（ワグナー等（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）２０００、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１（１７）、２４０３−２４１３）。感染細胞における野生型配列の発現は、ウィルスによってコードされたｒｅｖタンパクの先行発現に依存する。
【００１８】
このような発現制御は、レンチウィルスクラスに所属しないＦｅＬウィルスについては知られておらず、“ｒｅｖ”制御と同様の機構は、文献において全く証明も予想もされていなかった。
【００１９】
哺乳類において好んで使用されるコドンにたいして発現構築体のコドンの使用を最適化することによって、タンパク発現の大幅な増大が可能であることが知られている（グランサム等（Ｇｒａｎｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８０，９：１８９３−９１２）。この方法は、ＨＩＶ−１およびＳＩＶの、各種ウィルス構造タンパクの発現レベルを上昇させるのに既に用いられ成功を収めている。この作用は、レンチウィルスの複製サイクルにおけるこれら後期タンパクの極端にＡＴ豊富な転写物をもたらす“ｒｅｖ”依存性輸送機構を回避することに依存する。マウスにおいて、ヒトＨＩウィルスの“ｅｎｖ”および“ｇａｇ”タンパクのＤＮＡ配列のコドンを最適化することによって、野生型配列で見られるものよりも、その合成抗原に対し遥かに大きな抗体価が得られた（ハース等（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．）１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７−５０３；ワーグナー等（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００，１７：２４０３−１３）。ＨＩＶ−１に対するワクチン療法としてこのような最適化配列の合成法および用法が、ＷＯ００／０２９５６１およびＷＯ９７／４８３７０から公知である。
【００２０】
もう一つの問題は、免疫原性抗原、またはその一部をコードするＤＮＡの運用に関わる。ＤＮＡ輸送（トランスフェクション）のために現在使用されるベクターの問題点は、ウィルス起源のベクターか−この場合は安全面に関する問題を生ずる（Ｌｅｈｒｍａｎ，１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：５１７−５１８）、プラスミドのどちらかが用いられるという事実に基づく。プラスミドは細菌の醗酵によって生産されるものであるから、それは、所望の遺伝子の他に、その継代や選択にとって必要なＤＮＡ、および一般に使用される抗生物質に対する耐性遺伝子をも含む。この問題は、ＷＯ９８／２１３２２に詳細に論じられている。プラスミドＤＮＡに基づいて遺伝子発現構築体を用いる場合には、抗生物質耐性遺伝子を伝播する内在的危険性が存在することであって、これは、大規模ワクチン接種事業では特に許されないことであることに触れておかなければならない。
【００２１】
さらに別のタイプのＤＮＡベクターとして、ＥＰ０９１４３１８Ｂ１に開示されているもののような、共有的に閉鎖される最小局限ＤＮＡ構築体がある。特に、これを、ペプチド結合ＤＮＡ構築体の形で応用すると、未修飾のＤＮＡと比べて驚くほど質的に改善された免疫反応をもたらす（ＤＥ１０１５６６７９．４およびＤＥ１０１５６６７８．６をも参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
現在の遺伝子転送法によって引き起こされる不利な点は別として、ＦｅＬＶに対する効果的で安全なワクチンはまだ開発されていない。今日まで、ＦｅＬＶ感染の治療は、動物の非特異的防衛の喚起と、二次的に付随する感染の治療に限られている。現在利用が可能なワクチンは前述の副作用を含む。
【００２３】
この従来技術の現状から脱け出し、ＦｅＬＶによる感染に対するネコの保護を実現するワクチンの他に、好適な診断ツールを提供するのが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明によれば、上記目的は、コドン使用とスプライシングシグナルにおいて最適化され、構造タンパク“ｇａｇ”および、ＦｅＬＶのもっとも重要な膜タンパク“ｅｎｖ”をコードする、合成的に作製されたＤＮＡ配列から成る混合物（カクテル）によって、ネコを免疫化することによって達成される。
【００２５】
コドンとシグナル使用に関する最適化の過程で、構造タンパク（“ｇａｇ”）と、ＦｅＬＶのもっとも重要な膜タンパク（“ｅｎｖ”）において単一アミノ酸の置換をもたらす変異配列が得られた。驚くべきことに、変異アミノ酸配列を有するこれらのタンパクが本発明の利点をもたらした。この点で、本発明によるコドンとシグナル使用の最適化は、構造タンパク（“ｇａｇ”）と、ＦｅＬＶのもっとも重要な膜タンパク（“ｅｎｖ”）のアミノ酸配列を変えるための戦略である。
【００２６】
本発明で使用される場合、下記の用語は次の意味を有するものとする：
“ｅｎｖ”：ネコ白血病ウィルスの内側パッケージのコートタンパクをコードする遺伝子配列
“ｇａｇ”：ネコ白血病ウィルスの内側パッケージの構造タンパクをコードする遺伝子配列
ＦｅＬＶ：ネコ白血病ウィルス
ＷＴ：野生型
ＷＴ“ｅｎｖ”：ＮＣＢＩデータベースアクセス番号Ｍ１２５００から抽出した、野生型の“ｅｎｖ”ＤＮＡ配列
ＷＴ“ｇａｇ”：感染ネコの血液から得られた（実施例１参照）野生型“ｇａｇ”ＤＮＡ配列で、データベース配列ではないが、データベース配列と相同のもの
ＮＬＳ：核局在シグナル配列
ＯＤＮ：オリゴデオキシヌクレオチド
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖ（ＦｅＬＶｅｎｖ）：  シグナル配列を有するＦｅＬＶ“ｅｎｖ”配列
ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５）：  シグナル配列を有するＦｅＬＶ“ｅｎｖ”配列
【００２７】
遺伝子配列“ｇａｇ”は、ウィルスの内側パッケージの構造タンパクをコードし、遺伝子配列“ｅｎｖ”は、コートタンパクをコードする。“ｅｎｖ”配列によってコードされる全てのタンパク質の中でもっとも高い免疫原性を有するタンパクは、糖タンパクｇｐ７０である。ウィルス中和抗体は、ｇｐ７０に対してネコの器官の中で生産され続ける。これらの抗体は、病原体の体内侵入後最初の免疫反応を構成する。この反応は、いくつかの状況では、感染を克服するのに十分である。
【００２８】
ウィルス中和抗体を誘発するのに、膜タンパクの方が好適であるか、分泌タンパクの方が好適であるかについては議論が今でも行われている。このために、“ｅｎｖ”をコードする二つの異なる構築体が作製された。“ｅｎｖ”遺伝子配列のｐ１５配列は、抗体形成を抑制することによる免疫修飾性を有する少なくとも一つの配列長を含むことが知られている（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６１，６５４−６６６）。このために、ｇｐ７０とｐ１５（ｇｐ８５）をコードする構築体の他に、ｇｐ７０のみを含み、膜貫通領域を持たない分泌型“ｅｎｖ”タンパクの発現をもたらす別の構築体が作製された。
【００２９】
従って、ｇｐ７０に対するウィルス中和抗体、および、Ｔ細胞仲介性免疫反応の両方を誘発可能とするワクチンは、これまでに利用されたワクチンに比較して際立った改善を呈することになるから、感染ネコの治療においても採用可能と考えられる。
【００３０】
体内においてより多くの抗原を発現し、より強力な免疫反応を惹起し、結果的にＦｅＬＶ感染に対して、効果的で長期的な保護をもたらすように、“ｇａｇ”および“ｅｎｖ”の野生型配列が最適化された。最適化は、コドンの適応化と、コドン使用の最適化の両方を含む。
【００３１】
各アミノ酸は、いくつかのコドンによってコードすることが可能である。ある特定のコドンが翻訳時に読み取られる頻度は、ウィルス類、細菌類および脊椎動物の間ではっきりと分かる大きさで変動する。従って、細胞中の対応ｔＲＮＡの出現頻度もまた変動する。ウィルスゲノムは、部分的に宿主細胞と異なるコドン使用頻度を示すが、これが、ウィルスの発現制御の一要素を含むことは極めて確からしい。この配列を、宿主特異的コドン使用頻度に適応させることによって、このようなウィルス制御機構を抑えつけ、抗原発現を実質的に増大させることが可能になる。
【００３２】
このために、本実験の目的は、ウィルスの配列を、脊椎動物ゲノムにとって最適となるコドン使用を表す配列となるように編集することによって、抗原のさらに強力な発現を実現することである。この目的のために、オリゴヌクレオチドからそのような最適化ＤＮＡ配列の合成を可能とするクローニング戦略が開発された。
【００３３】
合成配列はプラスミドに挿入され、大腸菌に伝播され、制御のために配列決定され、その後、コードされたタンパクの発現を調べるために、ネコ細胞系統にトランスフェクトされた。
【００３４】
抗原の発現の証明は、ウェスタンブロットで行った。
【００３５】
ＦｅＬＶ野生型配列（ＷＴ）の“ｅｎｖ”と“ｇａｇ”から得られたタンパクの発現の証明は、ウェスタンブロットで行った。
【００３６】
“ｅｎｖ”と“ｇａｇ”の両方とも、免疫沈降でアッセイすると極めて僅かなバンドとして示されるものでしかない。驚くべきことに、コドン最適化“ｅｎｖ”配列でも同じであった。ただ“ｇａｇ”の場合にのみ、図１に示すように、コドン最適化によって、発現に顕著な改善がもたらされた。合成“ｅｎｖ”遺伝子の発現不調を説明するために、他にも沢山の仮定を試みた末に、この合成“ｅｎｖ”配列について、生物情報科学法によって予測されるスプライス部位について分析を行った。採用されたプログラム（コンプライン・ピーピーシー・マック・モーリー・テトラ（Ｃｏｍｐｌｉｇｎ  ＰＰＣ，Ｍａｃ  Ｍｏｌｌｙ  Ｔｅｔｒａ）バージョン３．１０ａ（Ｓｏｆｔｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ））によって予測されたいくつかのスプライスシグナルを、点突然変異により欠失させた。これは、上記のような構造の存在は、使用するプロモーター背景下での遺伝子発現を抑制するという仮設を証明するためであった。驚くべきことに、この方策によって、“ｅｎｖ”を、ウェスタンブロットにおいて強力なタンパクバンドとして提示することが可能となった（図２参照）。本発明による合成抗原配列は、その強力なバンドにより、抗原発現が好適に改善されていることを示した。
【００３７】
多くの所見から、発現系の発現の強度と免疫反応強度の間には、直線関係も存在しないし、発現ベクターによる必ずしも全ての処置が所望の強度の免疫を付与するものでもないことが示唆されている（フェリー等（Ｗｈｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２，１６８，ｐｐ．４４５５−４４６１）けれども、一般に、発現系の発現の強度は、その結果生じる免疫反応強度と連関すると想定されている。このため、一旦インビトロでの発現結果が得られると、コドン最適化およびシグナル最適化“ｅｎｖ”をコードする、ペプチド結合発現ベクターでマウスを免疫化した。免疫反応惹起におけるこのようなペプチド結合構築体の利点は、ＥＰ０９４１３１８Ｂ１およびＤＥ１０１５６６７８Ａ１の開示に詳細に説明されている。免疫反応惹起における、“ｅｎｖ”のｐ１５タンパクの免疫原性重要度を調べるために、本発明に従って“ｅｎｖ”をコードする両遺伝子を用いた（配列番号７，８，９および１０）。免疫化マウスの血清について、ＦｅＬＶタンパク“ｅｎｖ”に対する特異的抗体に関してウェスタンブロットを用いてアッセイした。第２免疫化後４週目の抗体レベルから、合成構築体は、体内においても、抗体形成の強力な刺激をもたらすことがはっきりと示された。それと呼応して、第４群の６匹のマウスの内５匹は、発明の抗原配列に対して強力な免疫反応を示したが、一方、ＷＴ配列（第１群）は、６匹の動物の内２匹において弱い免疫反応をもたらしただけであった（図３参照）。
【００３８】
ＤＮＡ発現構築体としてプラスミドを使用することが可能であるが、本発明によれば、免疫学的に最小限度に定義された発現構築体が好ましい。この構築体は、ＣＭＶプロモーター、イントロン、それぞれの遺伝子配列、および、ポリアデニル化配列のみから成る、直線的で、共有的に閉鎖される発現カセットである。この共有的に閉鎖される最小限ＤＮＡ構築体は、下記ではＭｉｄｇｅベクター（ＭＩＤＧＥ：ＭＩＮＩＭＡＬＩＳＴＩＣ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＬＹ  ＤＥＦＩＮＥＤ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲ）と呼ばれる。ＥＰ０９４１３１８Ｂ１を参照されたい。Ｍｉｄｇｅ構築体は、その医学的機能に必須ではない構造を回避することによって、通常の遺伝子転送システムの不利を回避できるという利点を有する。
【００３９】
トランスフェクションのためには、従来技術で既知の生物学的、化学的および／または物理学的方法を採用することが可能で、例えば、弾丸式導入によるトランスフェクションが可能である。本発明のある好ましい実施態様では、トランスフェクションは、注射器、または、注射針無しの注入装置による皮内注入によって実行される。
【００４０】
本発明は、哺乳類細胞においてＦｅＬＶ抗原の発現をもたらす発現構築体に関わる。従って、本発明は、ネコにおいて、ＦｅＬＶによる感染からの保護をもたらし、かつ安全面をも考慮するワクチンを提供する。本発明によれば、従来のアジュバントは使用されず、従って注入部位における線維肉腫形成の危険は排除される。
【００４１】
さらに別の有利な方法として、ペプチド仲介性遺伝子転送のような生物学的トランスフェクション法がある。一例を挙げるならば、本発明によって提供される、少なくとも“ｅｎｖ”と“ｇａｇ”配列とをコードするＤＮＡ発現構築体は、好ましくはシミアンウィルス４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）であるペプチドに共有的に付着される。
【００４２】
マウス実験で陽性の結果が得られた後、ネコを発現構築体で免疫化し、その抗体状態を定量した。
【００４３】
付属の配列プロトコールは、本出願および本開示の一部をなすものであるが、下記の配列を含む。
【００４４】
配列番号 配列名／特記事項
配列番号１  “ｅｎｖ”遺伝子野生型のＤＮＡ配列
配列番号２  “ｇａｇ”遺伝子野生型のＤＮＡ配列
配列番号３  “ｅｎｖ”遺伝子野生型のタンパク配列
配列番号４  “ｇａｇ”遺伝子野生型のタンパク配列
配列番号５  突然変異“ｇａｇ”遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号６  突然変異“ｇａｇ”遺伝子のタンパク配列
配列番号７  突然変異“ｅｎｖ”遺伝子（ｇｐ８５）のＤＮＡ配列。ｇｐ７０配列が、免疫原性ｐ１５タンパクをコードする配列分だけここでは延長されている。
【００４５】
配列番号８  突然変異“ｅｎｖ”遺伝子（ｇｐ７０）のＤＮＡ配列
配列番号９  突然変異“ｅｎｖ”遺伝子（ｇｐ８５）のタンパク配列
配列番号１０  突然変異“ｅｎｖ”遺伝子（ｇｐ７０）のタンパク配列
配列番号１１  “ｅｎｖ”遺伝子（ｇｐ７０）野生型のＤＮＡ配列、配列番号１から得られたもの（ＮＣＢＩデータベース、アクセス番号Ｍ１２５００）
配列番号１２から配列番号４０まで  下記の実施例によって用いられたプライマーの配列。
【００４６】
本発明によれば、ネコの細胞においてネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）の遺伝子産物発現のためのＤＮＡ発現構築体が提供される。この構築体は、ネコ科において作動が可能なプロモーター配列と、ＦｅＬＶの生得の構造タンパク（“ｇａｇ”）および／または膜タンパク（“ｅｎｖ”）をコードする野生型ヌクレオチド配列に関連する、少なくとも一つのヌクレオチド配列とから成り、ＦｅＬＶの前記ヌクレオチド配列は変異体であり、開放または隠蔽ドナーおよび／またはアクセプター配列、あるいは、それと高度に相同な部分または同一の部分を含まない。ＦｅＬＶの生得の膜タンパク（“ｅｎｖ”）に対して高度に相同ではあるが、同一ではないタンパクは、対応する野生型に対し、少なくとも９８％の相同性を示す。好ましいのは、配列番号５、７および／または８を含む発現構築体である。
【００４７】
構造または膜タンパクは、対応するヌクレオチド配列によって完全に、または部分的にコードされる。発現構築体は、プラスミドか、免疫化ポリヌクレオチド配列が発現構築体の形を取る発現構築体である。後者の構築体は、直線状２本鎖領域を含み、前記２本鎖領域を形成する１本鎖同士は、デオキシリボヌクレオチドから構成される短い１本鎖ループによって相互に結ばれ、また、前記２本鎖を形成する１本鎖同士は、ワクチン接種された動物の中で作動が可能なプロモーターによって制御されるコード配列と、ターミネーター配列のみから成る。
【００４８】
トランスフェクションを向上させるために、発現構築体を、一つ以上のペプチドに共有的に結合させることも可能である。３から３０個のアミノ酸から成り、その少なくとも半分はアルギニンとリジンから成るグループから選択されたものであるペプチド、特に、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（プロリン−リジン−リジン−リジン−アルギニン−リジン−バリン）を有するペプチドが好ましい。
【００４９】
本発明によれば、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）の生得の構造タンパク（“ｇａｇ”）に対して高度に相同なタンパク（配列番号６）、または、ＦｅＬＶの生得の膜タンパクｇｐ８５（“ｅｎｖ”）に対して高度に相同なタンパク（配列番号９）、または、ＦｅＬＶの生得の膜タンパクｇｐ７０（“ｅｎｖ”）に対して高度に相同なタンパク（配列番号１０）であるタンパク質も提供される。これらのタンパク質は次に抗体産生（モノクロナールまたはポリクロナール抗体）に使用することが可能であり、これらの抗体は次に、ネコ白血病ウィルスによるネコの感染を診断するための診断キットの一部となることが可能である。
【００５０】
本発明による発現構築体は、製薬組成物の一部として、ネコ科、特にネコにおいて、予防的および／または治療的免疫を形成するための、特にワクチンの一部として提供される。
【００５１】
本発明の、さらに別の有利な実施態様が従属請求項および説明から得られる。ＦｅＬＶ治療用ワクチンとしての本発明による製薬組成物の驚くべき作用、および本発明の方法が、図と実施例によって説明される。この背景において、略号は下記の意味を持つ。
【００５２】
Ｍｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（−）またはＭｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＦｅＬＶｇｐ８５（−）          ｐ１５含有、コドンおよびシグナル最適化“ｅｎｖ”配列（ｇｐ８５）をコードする、ＮＬＳ結合Ｍｉｄｇｅベクター
Ｍｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ７０（−）またはＭｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＦｅＬＶｇｐ７０（−）          ｐ１５非含有、コドンおよびシグナル最適化“ｅｎｖ”配列（ｇｐ７０）をコードする、ＮＬＳ結合Ｍｉｄｇｅベクター
Ｍｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＷＴ          “ｅｎｖ”遺伝子のＷＴをコードするＮＬＳ結合Ｍｉｄｇｅベクター
ｍＡＫ  ｖｓ．ｇｐ７０          ｇｐ７０に対するモノクロナール抗体
陽性コントロール          ロイコゲンワクチン
バッファー          ＰＢＳ、陰性コントロール
【実施例１】
【００５３】
野生型（ＷＴ）配列
選択された抗原の野生型配列、特に“ｇａｇ”遺伝子のものは、感染ネコの血液から得られた。“ｅｎｖ”ＷＴのＤＮＡ配列は配列番号１に示され（ＮＣＢＩデータベース、アクセス番号Ｍ１２５００）、“ｇａｇ”ＷＴのＤＮＡ配列は配列番号２に示される。対応アミノ酸配列は、配列番号３（“ｅｎｖ”）と配列番号４（“ｇａｇ”）に示される。
【００５４】
“ｇａｇ”ＷＴ用プライマー
２箇所のＥｃｏ３１Ｉ制限部位を取り除くために、下記の変異体プライマーによる３  ＰＣＲを行った：
ｇａｇ−ｍｕｔ１−ｒｎｅｕ（配列番号１２）
ＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＧ
ｇａｇ−ｍｕｔ２−ｌ（配列番号１３）
ＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＣＧ
ｇａｇ−ｍｕｔ３−ｒ（配列番号１４）
ＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣ
ｇａｇ−ｍｕｔ４−ｌ（配列番号１５）
ＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧ
得られた３種の配列の連結後、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００５５】
Ｆｅｌｖｇａｇ−ｌ（配列番号１６）：ＣＧＧＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣＣ
Ｆｅｌｖｇａｇ−ｒ（配列番号１７）：ＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴ
“ｅｎｖ”ＷＴ用プライマー
ｅｎｖｌ（配列番号１８）：ＣＧＧＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＧＴＣＣＡＣＣ
ｅｎｖｒ（配列番号１９）：ＡＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＴ
【実施例２】
【００５６】
コドンの最適化
ネコ用コドン使用テーブルを、コドン使用データベース（http://wwww.kazusa.or.jp/codon/）から入手した。二つのＷＴ配列の全てのアミノ酸について、もっとも高頻度に利用されるコドンを用いた。この規則にたいして下記の制限を用いた。
【００５７】
配列において、あるアミノ酸が３回以上出現する場合、４回目以降は、２番目に高頻度のコドンを用いた。これは、ｔＲＮＡが突然極端に枯渇することを回避することによって、転写効率を確保するためである。
【００５８】
制御不能な免疫刺激作用を避けるため、Ｃがあってすぐその後にＧの続く配列は避けた。Ｅｃｏ３１Ｉ、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩの制限部位を避けるため、塩基配列ＧＡＧＣＴＣ、ＧＧＴＡＣＣ、ＧＧＴＣＴＣおよびＧＡＧＡＣＣを、別の、同様に高頻度に利用されるコドンを選ぶことによって排除した。
【実施例３】
【００５９】
ＦｅＬＶｅｎｖのクローニング
１８から２８塩基長のオリゴヌクレオチドを購入した（ＴｉｂＭｏｌｂｉｏｌ）。合計５１本のオリゴヌクレオチドをアニーリングとライゲーションによって接合した。重複部は４塩基であった。どの重複部もただ一度きりであり、パリンドロームではないことが確認された。各単一オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖にたいしてハイブリダイズした鎖であり、これは、単一鎖（１本鎖およびアンチセンス１本鎖）をキナーゼバッファー中で約８０℃に加熱し、それからゆっくりと室温に冷却して得た。その後、ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）およびオリゴヌクレオチドを１時間リン酸化した。次に、第１工程で、配列において互いに隣り合うオリゴヌクレオチドを接触させ、連結した（オリゴヌクレオチド１＋２、オリゴヌクレオチド３＋４）。１時間のライゲーション後、オリゴヌクレオチド１＋２のライゲーション反応分液と、３＋４のライゲーション反応分液を接触させた。この最後のライゲーション反応分液を取り、両側プライマーによるＰＣＲを実行した。期待された長さのＰＣＲ産物が得られた場合には、そのＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングによってＴＯＰＯベクターｐＣＲ２．１に挿入し、配列を確認した。これを同様にして、完全遺伝子の他の全ての断片について実行した。４本の断片が得られた。個々の断片を、コントロール挿入プラスミドからＥｃｏＲＩによって切り出し、Ｅｃｏ３１Ｉによる消化後連結した。適正な長さを持つ完全ライゲーション産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩによって消化し、ゲル抽出後の、同様に調製されたベクターｐＭＣＶ１．４に挿入した。その後、配列を配列決定によって確認した。得られたプラスミドは、ｐＭＣ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖと命名した。
【００６０】
４種の接合断片のためのプライマー配列は：
断片１
左側プライマー（配列番号２０）：ＡＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣ
右側プライマー（配列番号２１）：ＡＴＴＡＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧ
断片２
左側プライマー（配列番号２２）：ＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＣＣＴ
右側プライマー（配列番号２３）：ＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＴＣＡ
断片３
左側プライマー（配列番号２４）：ＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＣ
右側プライマー（配列番号２５）：ＴＡＴＴＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧ
断片４
左側プライマー（配列番号２６）：ＡＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＧＴＧＴ
右側プライマー（配列番号２７）：ＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ
全体配列
左側プライマー（配列番号２０）：ＡＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣ
右側プライマー（配列番号２７）：ＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ
【実施例４】
【００６１】
ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖのためのクローニング戦略
“ｅｎｖ”タンパクの加工を実現するために、シグナル配列（リーダー配列）を、コドン最適化された“ｅｎｖ”配列の前に挿入した。このシグナル配列は、２２から３０ｂｐの長さを持つ８本のＯＤＮをアニーリングとライゲーションによって接合して得た。最後のライゲーション工程後、リーダー配列の増幅のためにＰＣＲを実行した。
【００６２】
完全シグナル配列のためのプライマー配列：
左側プライマー（配列番号２８）：ＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣ
右側プライマー（配列番号２９）：ＡＴＣＡＧＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＣＣＡＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＣ
【００６３】
ＰＣＲ産物の３’末端に、Ｅｃｏ３１Ｉ認識配列を作製した。このために、消化後、下記のＰＣＲ産物の同様の消化によって形成されるオーバーハングの５’末端に対して逆相補的なオーバーハングが形成された。
【００６４】
ＦｅＬＶｅｎｖのためのＰＣＲ：
配列の５’末端に、Ｅｃｏ３１Ｉ認識配列を作製した。
【００６５】
使用プライマー配列：
左側プライマー（配列番号３０）：ＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣ
右側プライマー（配列番号２７）：ＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ
【００６６】
二つのＰＣＲ産物をＥｃｏ３１Ｉによって消化した後、これらを精製し、互いに連結させた。このライゲーション産物をさらにＰＣＲ処理した。その際、５’末端にはＫｐｎＩに対する、３’末端にはＳａｃＩに対する認識配列を作製した。
【００６７】
使用プライマー配列：
左側プライマー（配列番号２８）：ＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣ
右側プライマー（配列番号２７）：ＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣ
【００６８】
このＰＣＲ産物をＫｐｎＩとＳａｃＩによって消化し、同様に消化されたベクターｐＭＣＶ１．４に挿入した。得られたプラスミドはｐＭＣＶ１．４−ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖと命名した。
【実施例５】
【００６９】
ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５のためのクローニング戦略
ｇｐ７０およびｐ１５から成る、完全な“ｅｎｖ”ポリタンパクをクローンした。このために、プラスミドｐＭＣＶ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖｐ１５由来のｐ１５ＷＴをＰＣＲにて増幅し、前述のように、ｐＭＣＶ１．４−ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖの後ろに挿入した。このｐ１５の増幅の際に、Ｅｃｏ３１Ｉ認識配列を５’末端に作製した。
【００７０】
１．ＰＣＲ：
使用プライマー配列：
左側プライマー（配列番号３１）：ＡＡＴＴＡＴＧＧＴＣＴＣＧＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣ
右側プライマー（配列番号３２）：ＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＴＣ
２．ＰＣＲ：
ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖの配列を増幅した。その際、認識部位を３’末端に作製した。
【００７１】
使用プライマー配列
左側プライマー（配列番号３３）：ＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＣ
右側プライマー（配列番号３４）：ＴＡＴＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣ
【００７２】
二つのＰＣＲ産物をＥｃｏ３１Ｉにて消化した後、これらを互いに連結した。このライゲーション産物を、下記のプライマー配列を用いてＰＣＲにて処理した。
【００７３】
左側プライマー（配列番号３３）：ＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＣ
右側プライマー（配列番号３２）：ＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＴＣ
【００７４】
このようにして、５’末端にはＫｐｎＩ認識部位が形成され、３’末端にはＳａｃＩ認識部位が形成された。このＰＣＲ産物をＫｐｎＩとＳａｃＩによって消化した後、同様に消化されたｐＭＣＶ１．４に連結し、クローンした。得られたプラスミドは、ｐＭＣＶ１．４−ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５と命名された。
【実施例６】
【００７５】
ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（−スプライス）のスプライス信号の最適化
ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖのＤＮＡ配列について、http://www.fruitfly.org/seq tools/.htmlに従って、予想されるスプライス信号配列（部位）に関して分析した。塩基１００と１４０の間に、９７％の確率を持つ部位が認識された。塩基１１９の交換後（ＡからＧへ、ＧｌｎからＡｒｇへのアミノ酸交換）、もはや予想される部位は認識されなかった（下位閾値＝４０％確率）。変異配列の作製とクローニングは下記のように実行した。
【００７６】
変異配列作製のためのＰＣＲ：
先ず、ＬｅａｄｓｙｎＦｅＬＶｅｎｖの塩基１−１２３から成る断片（１）をＰＣＲによって増幅した。用いた前進プライマーは、ＰＣＲ産物の５’末端に制限酵素ＫｐｎＩの認識部位を形成する。
【００７７】
逆行プライマーの配列は、ＰＣＲ産物が変異（塩基１１９＝Ｇ）を含むように選択された。さらに、ＰＣＲは、ＰＣＲ産物の３’末端に制限酵素Ｅｃｏ３１Ｉの認識部位を形成した。一般に、Ｅｃｏ３１Ｉは、認識部位の塩基２−５下流に４塩基の５’オーバーハングを形成する。
【００７８】
ＰＣＲ産物のＥｃｏ３１Ｉによる消化によって、断片１の末端に形成される、４塩基５’オーバーハングは、ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖ配列の塩基１２０−１２３に対応する。次に、この配列は、ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖを制限酵素ＢｇＬＩＩで消化することによって形成されるオーバーハングに対応する。なぜなら、Ｌｅａｄ−ＦｅＬＶｅｎｖの塩基１１９−１２４は、ＢｇＬＩＩの認識部位を構成しているからである。
【００７９】
塩基１−１２３を、ＫｐｎＩとＢｇＬＩＩによって、構築体ｐＭＣＶ１．４−ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖから切り出す。
【００８０】
ＫｐｎＩおよびＥｃｏ３１ＩによるＰＣＲ産物断片１（塩基１１９＝Ｇの変異を有する）の消化の後、この消化物を連結し、あらかじめＫｐｎＩおよびＢｇＬＩＩによって消化したベクターｐＭＣＶ１．４−ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖにてクローンし、精製した。得られたプラスミドをｐＭＣＶ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ７０（−スプライス）と命名した。
【００８１】
使用プライマー配列
左側プライマー（配列番号２８）：５’−ＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣ
右側プライマー（配列番号３５）：５’−ＡＴＡＴＴＡＧＧＴＣＴＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧ
【００８２】
同様に、このＰＣＲ断片１を連結し、あらかじめＫｐｎＩおよびＢｇＬＩＩで消化したベクターｐＭＣＶ１．４−ＬｅａｄＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（−スプライス）にてクローンし、精製した。得られたプラスミドをｐＭＰＣ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（−スプライス）と命名した。
【実施例７】
【００８３】
ＦｅＬＶｇａｇのためのクローニング戦略
ＦｅＬＶｇａｇのクローニングは、３に記述した過程と同様にして実行した。配列を、３種の単一断片に対してオリゴヌクレオチドをアニールし、連結することによって形成した。この配列は、合計２ｘ３１本のオリゴヌクレオチド（前進および逆行鎖）を組み合わせて得られたものである。この断片をＰＣＲにおいて鋳型として用い、下記のプライマー配列によって増幅した。
【００８４】
断片１：
左側プライマー（配列番号３６）：ＡＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧ
右側プライマー（配列番号３７）：ＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧＧＣ
断片２：
左側プライマー（配列番号３８）：ＡＴＴＡＴＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣＡＧＧＣ
右側プライマー（配列番号３９）：ＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＴＧＣＡ
断片３：
左側プライマー（配列番号３８）：ＡＴＴＡＴＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣＡＧＧＣ
右側プライマー（配列番号４０）：ＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣ
全断片用プライマー：
左側プライマー（配列番号３６）：ＡＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧ
右側プライマー（配列番号４０）：ＡＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣ
【００８５】
断片１、２および３は、中間でＴＯＰＯベクターｐＣＲ２．１．にてクローンし、次いでＥｃｏ３１Ｉで消化し、抽出した。１，２および３から得られたライゲーション産物は、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩによって消化し、ｐＣＭＶ１．４にクローンした。得られたプラスミドはｐＣＭＶ１．４−ＦｅＬＶｇａｇと命名した。
【実施例８】
【００８６】
細胞のトランスフェクション、発現の証明
ｆ３２０１細胞系統のネコ細胞を、プラスミドｐＭＣＶ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖｐ８５（−スプライス）、ｐＭＣ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ７０（−スプライス）、ＦｅＬＶｇａｇ、および、“ｅｎｖ”と“ｇａｇ”に対するＷＴ含有のプラスミドｐＭＯＫによって、２５０Ｖと１０５０μＦの電気穿孔を通じてトランスフェクトした。
【００８７】
タンパクの発現は、ウェスタンブロット法によって証明した。アッセイではマウスモノクロナール抗体を用いた。陽性コントロール：ｆ３２０１細胞系統のＦｅＬＶ  Ａ感染細胞。
【実施例９】
【００８８】
ペプチド結合Ｍｉｄｇｅの作製
プラスミドｐＭＣＶ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（−スプライス）、ｐＭＣＶ１．４−ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ７０（−スプライス）、および、ｐＭＣＶ１．４−ＦｅＬＶｇａｇを、制限酵素Ｅｃｏ３１Ｉによって３７℃で一晩消化した。この制限消化によって２本の断片が生成された。一方は、カナマイシン耐性遺伝子と、他の、そのプラスミドを細菌中で継代するのに必要な配列から成っていた。他方の断片は、ＭＩＤＧＥ−ＤＮＡの一部となるべき配列から成っていた。すなわち、強調されたＣＭＶプロモーター、キメライントロン、対応遺伝子配列、および、ＳＶ４０のポリアデニル化配列である。
【００８９】
５’リン酸化ヘアピンオリゴヌクレオチド（ＴＩＢＭｏｌＢｉｏｌ、ベルリン）、５’−ＰＨ−ＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＴ  ｘＴ  ＴＴＣＴＧＧＡＣ−３’および５’ＰＨ−ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＣ−３を、制限酵素Ｅｃｏ３１Ｉの存在下に、酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより３７℃で一晩、ＭＩＤＧＥ形成ＤＮＡ断片に対して連結した。この反応を７０℃に加熱して停止させた。得られた核酸混合物を酵素Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼによって処理した。ＭｉｄｇｅＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、イソプロパノールによって沈殿させた（ＥＰ０９４１３１８Ｂ１参照）。
【００９０】
ペプチド結合ＯＤＮの生成
ＮＬＳペプチドＰＫＫＫＲＫＶを２工程でＯＤＮに結合した。先ず、オリゴヌクレオチド修飾体５’−ＰＨ−ｄ（ＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＴ  ｘＴ  ＴＴＣＴＧＧＡＣであって、ｘＴはＣ２−アミノリンカーを有するアミノ修飾チミン塩基)（０．１ｍＭ）を、室温（ＲＴ）でＰＢＳに溶解したｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ（５ｍＭ）で活性化した。１２０分後、５０ｍＭのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンを加えて反応を停止させ、活性化ＯＤＮを、エタノール沈殿（３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．２、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７０％エタノール）、遠心、および７０％エタノールによる１回の洗浄の後、得た。このようにして得られたＯＤＮ（０．１ｍＭ）をＰＢＳに溶解し、ペプチド（０．２ｍＭ）と室温で１時間反応させた。反応は、ゲル電気泳動（３％）と臭化エチジウム染色でチェックした。得られたＮＬＳ結合ＯＤＮをＨＰＬＣにて精製し、前述のＭＩＤＧＥ−ＮＬＳ構築体の合成に用いた。
【実施例１０】
【００９１】
マウスにおける抗体アッセイ
各６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから成る五つのワクチン接種群を形成した（表１参照）。全群（コントロール群を除く）において、基本的抗原は、免疫修飾されたタンパクｐ１５を含む、または、含まない、“ｅｎｖ”タンパクの最適化配列である。コード配列、および、その配列に先行するサイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶ）を、実施例８に従って、直線状２本鎖分子として用いた。コントロールとして、バッファー、通例ワクチン（ロイコゲン）、および“ｅｎｖ”タンパクのＷＴを用いた。最初の免疫化後（５０μｇ  ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ、皮内）、２回目の免疫化（ブースト）を１５日目に行った。血液を、１４、２８および４２日目に採取した。この血液サンプルを、“ｅｎｖ”に対する特異的抗体についてアッセイした。
【表１】
0004411213.tif 000002
【００９２】
結果を図３に示す。
【実施例１１】
【００９３】
ネコの免疫化
合成配列が、ネコにおいて体液性並びに細胞性免疫反応を惹起するかどうか調べるために、下記のワクチン接種プログラムを処方した（表２）。
【表２】
0004411213.tif 000003
【００９４】
最初の２群のネコは、ＰＢＳバッファーに溶解したそれぞれ合計６００μｇのＤＮＡによって二度免疫化した。ペプチド結合発現構築体を、頚部皮内注射によって投与した。免疫反応を１２週間に渡って追跡した。２回目の免疫化を４週目に実行した。週毎に採取された血液サンプルのサイトカイン状態から、免疫反応の方向性（Ｔｈ１、Ｔｈ２）に関する手がかりが得られるものとする。ＩＬ−４はＴＨ２反応の指示薬と想定され、ＩＬ−２およびインターフェロン−ガンマは、主にＴＨ１免疫反応の指示薬と想定された。ロイコゲンワクチンは組み換え“ｅｎｖ”タンパクを含んでおり、陽性コントロールとして使用された。
【００９５】
用いた抗原に対する抗体は、ウェスタンブロットとＥＬＩＳＡによって定量した。
【００９６】
サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４およびインターフェロン・ガンマをコードするｍＲＮＡの量は、リアルタイムＰＣＲによって定量した。
【実施例１２】
【００９７】
表２に挙げたワクチン接種プログラムによるネコの免疫化後の体内結果
“ｅｎｖ”タンパクに対する抗体の半定量的アッセイをウェスタンブロットによって実行した。実験０週目および１２週目にネコから得た血漿サンプルを試験した。０週目では、予想通り“ｅｎｖ”に対する抗体は認められなかった。表３に（＋）として挙げられている弱いバンドは非特異的なものである。１２週目では、１、２および４群の全ての動物が、１匹のネコを例外として、明白な抗体反応を示した。動物患者に見られたこの結果は、マウスにおける予備実験の結果を裏付けるものである（実施例１０参照）。
【００９８】
この表における記号の意味：  ＋＋＋  極めて強いバンド
＋＋  強いバンド
＋  明瞭なバンド
（＋）  弱いバンド
バンドの強度は、免疫化されたネコの血漿における抗体濃度を表す。
【表３】
0004411213.tif 000004
【実施例１３】
【００９９】
ワクチン接種によって付与される保護の評価としての感染
達成された高度の抗体生産が、本当にＦｅＬウィルスによる感染にたいして保護を付与するものであるのかどうかを評価し、従って、本発明によるワクチン接種の効力を確認するために、次に感染による実験を行った。各１０匹のネコから成る４群に対して、それぞれの構築体を、注射針無しの注入装置を用い皮内に二度（０日目および２１日目）ワクチン接種した（表４）。発現構築体として、ＮＬＳペプチド結合Ｍｉｄｇｅベクターを用いた。最後のワクチン接種後２１、２２および２３日目に、ネコを生のウィルスによる試験感染で感染させた（Ｒｉｃｋａｒｄ株、＞１０ｅ６フォーカス形成単位／ｍｌ）。ワクチンの効力は、ネコが、この試験感染後に保護されたかどうかに従って判定した。ネコは、その血液の中にウィルス粒子を持っておらず（血清陰性ネコ）、かつ、その血球の中にウィルスＤＮＡを持っていない場合を保護されているとした。ウィルス粒子をアッセイするために、ネコの血清についてＥＬＩＳＡによって抗原ｐ２７の有無を調べた。組み込まれたウィルスＤＮＡ、所謂プロウィルスＤＮＡの量は、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲによって定量した。下記のようなワクチン接種プログラムを処方した。
【表４】
0004411213.tif 000005
【０１００】
陰性コントロールとしてＰＢＳバッファーを用いた。
【０１０１】
結果は下記のように要約される。表４は、ウィルスタンパクｐ２７の存在に関するネコの血清アッセイの結果を示す。このテストは、ＦｅＬＶウィルス血症の診断用として一般に受容されているアッセイである。平行的に、同じネコの白血球についても、プロウィルスＤＮＡの有無について分析した（データ図示せず）。ウィルスタンパク不在のネコは全てプロウィルスＤＮＡについても不在であった。
【０１０２】
上記二つの試験システムは、生体におけるウィルス発生の別々の工程を定めるものであるから、二重の否定的結果は、ウィルスはこの動物の体内では増殖できないこと、すなわち、保護と等価的であることを示す。
【０１０３】
２群および３群では、ネコの内の数匹において、ＦｅＬＶによる感染に対する保護が可能であった。
【０１０４】
２群では、１０匹のネコの内の２匹が、ウィルスタンパクに対しても、プロウィルスＤＮＡに対しても無縁であった。このワクチン保護は、本発明のワクチン（配列番号５）の投与に基づくものであった。
【０１０５】
３群では、ＦｅＬウィルスによる感染に対して、動物の４０％を本発明のワクチン（配列番号８）で保護することが可能であった。これは、１群と比較して感染ネコの有意な低下である。
【０１０６】
これらの動物では、その血清と血液サンプルにおいてウィルスタンパクも、プロウィルスＤＮＡも検出されなかった。第３群の４匹のネコにおいて保護を実現するために、１回の注射当たり５０μｇというごく僅かの用量がそのネコの保護のために十分であったことは注目に値する。これは有利である。なぜなら、投与されるＤＮＡ濃度が低いので、ワクチンの生産コストは急速に低減されるからである。
【０１０７】
１群（コントロール群）の動物は全てその血液の中にウィルス粒子を示した。すなわち、その動物は保護されず、試験感染にたいして完全に受容的であった。
【０１０８】
免疫化実験全体を通じて、注入部位における局所的刺激作用としての副作用も、実験動物の健康の一般状態を乱す干渉も観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＷＴ“ｇａｇ”タンパクとコドン最適化“ｇａｇ”タンパクのインビトロ比較である。負荷したのは、下記の構築体によってあらかじめトランスフェクトさせたネコ細胞から得られた分解液である。“ｇａｇ”前駆体は５５ｋＤのサイズを有する。
【０１１０】
レーン１＋２：“ｇａｇ”ＷＴをコードする発現構築体
レーン３：コドン最適化“ｇａｇ”をコードする発現ベクター
レーン４：非感染ネコの細胞、陰性コントロール
レーン５：ブランク
レーン６：ウィルス感染ネコの細胞、陽性コントロール
レーン７：Ｂｏａタンパクマーカー
ＷＴによる発現は極めて弱いタンパクバンドを示すが（１および２）、一方、本発明の配列によって強力な発現が達成された（３）。感染ネコの細胞を比較基準として用いた（６）。“ｇａｇ”は、感染細胞においてタンパク分解酵素によって分断されてＦｅＬＶの構造タンパクとなる前駆体タンパクを意味する。最強の免疫原は構造タンパクｐ２７であり、これは、全体ウィルスに対する抗血清によってよく認識される。レーン６において、５５ｋＤａの全体“ｇａｇ”を表すバンドと、２７ｋＤａの両方が認識される理由がこのことによって説明される。この状況とは対照的に、レーン３は、ウィルス粒子は含まないが、“ｇａｇ”遺伝子によってトランスフェクトされた細胞を含む。見かけ上は、これによって、“ｇａｇ”遺伝子産物がタンパク分解酵素によってウィルスタンパクに変性されることはなく、全前駆体タンパクが、細胞タンパク分解酵素によって非特異的変性を受けるだけである。
【図２】ＷＴ“ｅｎｖ”遺伝子と、コドン最適化“ｅｎｖ”配列（ｇｐ８５）発現のインビトロ比較である。負荷したのは、下記の構築体によってあらかじめトランスフェクトさせたネコ細胞から得られた分解液である。
【０１１１】
レーン１：Ｂｏａタンパクマーカー
レーン２：非感染ネコ細胞、陰性コントロール
レーン３：ウィルス感染ネコ細胞、陽性コントロール
レーン４：ブランク
レーン５：ウィルス感染ネコ細胞、沈殿、陽性コントロール
レーン６：非感染ネコ細胞、沈殿、陰性コントロール
レーン７：“ｅｎｖ”の特異的証明のための追加の陰性コントロール
レーン８：ブランク
レーン９：コドンおよびシグナル最適化ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（−）をコードする発現ベクター
レーン１０：ブランク
レーン１１：コドン最適化ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ７０（−）をコードする発現ベクター
レーン５のコントロールは、ｅｎｖｇｐ８５発現の陽性コントロールとして使用が可能な明瞭なタンパクバンドを与える。レーン９は、本発明の配列ＦｅＬＶｅｎｖｇｐ８５（−）が、ｇｐ８５タンパクの発現を誘発することを示す。レーン１１は、本発明のＦｅＬＶｅｎｖｇｐ７０（−）を示す。７０ｋＤａバンドが見られないことは、ｇｐ８５とは対照的に、ｅｎｖｇｐ７０は分泌タンパクであることから説明される。従って仮に、細胞分解液中にあったとしても、検出が困難である。
【図３】“ｅｎｖ”をコードする発現構築体によってマウスを免疫化した後におけるインビボ結果。略語は下記の意味を持つ。
【０１１２】
Ａ：陽性コントロール
Ｂ：バッファー
抗体測定は、第２回免疫化の４週間後に行った。第３群では、６個のマウス血清の内３個が抗体陽性であり（矢印下のレーン：Ｍｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＦｅＬＶｇｐ８５（−））、第４群では、５個の血清が強い陽性であり、１個が弱い陽性であった（矢印下のゲルレーン：Ｍｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＦｅＬＶｇｐ７０（−））。一方、第５群の、ＷＴで免疫化した動物では、僅か２例において極めて弱い陽性信号が示されただけであった（矢印下のゲルレーン：Ｍｉｄｇｅ−ＮＬＳ−ＷＴ）。本実験では、ＷＴ配列に比べて、最適化配列は、インビボにおいても遥かに改善された抗体形成をもたらすことが示され、インビトロの実験結果が確認された。
【図４】コドン最適化“ｇａｇ”遺伝子（配列番号５）に対する、野生型“ｇａｇ”遺伝子（配列番号２）のＤＮＡ配列比較。類似性：７４．５１％。
【図５】コドンおよびシグナル最適化“ｅｎｖ”遺伝子（ｇｐ７０、配列番号８）に対する、野生型“ｅｎｖ”（配列番号１のｇｐ７０領域）のＤＮＡ配列比較。類似性：７５．７５％
【図６】コドンおよびシグナル最適化“ｅｎｖ”遺伝子（ｇｐ８５）（配列番号７）に対する、野生型“ｅｎｖ”遺伝子（配列番号１）のＤＮＡ配列比較。類似性：８０．２５％
【図７】コドン最適化“ｇａｇ”タンパクのタンパク配列（配列番号６）に対する、野生型“ｇａｇ”タンパク（配列番号４）のタンパク配列比較。類似性：９８．６２％
【図８】コドンおよびシグナル最適化“ｅｎｖ”タンパク（ｇｐ７０）のタンパク配列（配列番号１０）に対する、野生型“ｅｎｖ”タンパク（配列番号３）のタンパク配列比較。類似性：９８．７５％。
【図９】コドンおよびシグナル最適化“ｅｎｖ”タンパク（ｇｐ８５）のタンパク配列（配列番号９）に対する、野生型“ｅｎｖ”タンパク（配列番号３）のタンパク配列比較。類似性：９８．６０％。
【０１１３】
結果から、ＦｅＬＶの“ｅｎｖ”と“ｇａｇ”両遺伝子のコドンおよびシグナル最適化ＤＮＡ配列は、対応する野生型に対して少なくとも７４％の相同性を示すことが明らかになった。このことから、少なくとも約９８％の相同性を持つ、“ｅｎｖ”および“ｇａｇ”タンパクから成るタンパク配列が得られる。他にも、同様の結果をもたらし、かつ元の野生型と、最適化によって得られるタンパク配列の間に高度の相同性が存在する、上記のような、ＦｅＬＶの“ｅｎｖ”および“ｇａｇ”に関するＤＮＡ配列の最適化が考えられる。このような最適化も、本発明の範囲内にあるものと理解されなければならない。
【０１１４】
配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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