(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）ポリペプチド、Ｓｍａｃポリペプチド、ｃＩＡＰ１ポリペプチド、およびＴＲＡＦ２ポリペプチドを含む、精製された複合体。
【請求項２】
前記ＬＴβＲポリペプチドが、ＬＴβＲリガンドに結合されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＬＴβＲリガンドが、ＬＩＧＨＴポリペプチド複合体である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記ＬＴβＲリガンドが、Ｌｔα１β２である、請求項２に記載の複合体。
【請求項５】
前記ｃＩＡＰ１ポリペプチドが、ヒトｃＩＡＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記ＴＲＡＦ２ポリペプチドが、ヒトＴＲＡＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
ＴＲＡＦ３ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記ＴＲＡＦ３ポリペプチドが、ヒトＴＲＡＦ３ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
原始的なホモログのエンハンサー（ＥＲＨ）ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
以下：
リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）ポリペプチド；
ＬＴβＲリガンド；
ＴＲＡＦ２ポリペプチド；
ＴＲＡＦ３ポリペプチド；
ｃＩＡＰ１ポリペプチド；および
Ｓｍａｃポリペプチド；
ＥＲＨポリペプチド
を含む、精製された複合体。
【請求項１１】
前記ＬＴβＲリガンドが、ＬＩＧＨＴポリペプチド複合体である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記ＬＴβＲリガンドが、Ｌｔα１β２ポリペプチド複合体である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）複合体シグナル伝達経路の調節因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
ＬＴβＲポリペプチドを発現している細胞と試験因子とを接触させる工程、ならびに
該細胞において該試験因子がＳｍａｃポリペプチドの活性または発現を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
ＬＴβＲ複合体シグナル伝達経路の調節因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
Ｓｍａｃポリペプチドと試験因子とを接触させる工程；および
該試験因子が、該Ｓｍａｃポリペプチドの活性を阻害するか否かを決定し、それによってＬＴβＲ複合体シグナル伝達経路のインヒビターを同定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫応答の調節因子を同定するための組成物および方法に関し、より詳細には、リンフォトキシン−βレセプター（ＬＴβＲ）複合体のメンバーを使用して、免疫応答の調節因子を同定するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
リンフォトキシン−βレセプター（ＬＴβＲ）（腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーの非デスドメイン含有レセプター）は、二次的リンパ様組織の器官発生において重要な役割を果たすことが報告される。ＬＴβＲに対する２つのレセプターの型が、記載される。これらは、ヘテロトリマー（ＬＴα１β２）およびホモトリマー（ＬＩＧＨＴ）として同定された。
【０００３】
ＬＴβＲシグナル伝達は、リガンドの結合の際に、レセプターの細胞内ドメインに入れられるシグナル伝達分子によって媒介されると考えられる。ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーと同様に、複数のシグナル伝達経路（アポトーシス、ＮＦκＢおよびＪＮＫ経路の活性化を含む）は、リガンド−ＬＴβＲ複合体によって活性化される。
【０００４】
アポトーシス、またはプログラム細胞死は、正常な細胞自殺機能である。アポトーシスの２つの主要なシグナル伝達経路（デスレセプター経路およびミトコンドリア経路）が存在する。両方の経路からのシグナルは、カスパーゼの共通のカスケードの活性化を導き、これは、続いて、膨大な数の細胞性タンパク質を切断し、細胞死を導く。デスドメイン含有レセプターのほとんどは、ＦＡＤＤのリクルートおよびカスパーゼ８の活性化によってアポトーシスを誘導する。対照的に、ＬＴβＲは、デスドメイン配列を欠損し、従って、ＦＡＤＤと相互作用しない。さらに、ＬＴβＲによって誘導される細胞死は、遅いアポトーシスプロセスの特徴を有し、インターフェロンγに依存性である。従って、ＬＴβＲ誘発アポトーシスは、デスドメイン依存性機構と異なる機構によって活性化されると考えられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）複合体シグナル伝達経路に関連するポリペプチドの発見に一部基づく。ポリペプチドＳｍａｃ、ｃＩＡＰ１、およびＴＲＡＦ２、ならびに原始的なホモログのエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ：ＥＲＨ）は、これらの新規に同定されたＬＴβＲの成分に含まれる。ＬＴβＲ複合体と結合することが以前に示されたＴＲＡＦ３もまた、同定される。Ｓｍａｃは、ミトコンドリア媒介性アポトーシス経路に関与することが報告された。
【０００６】
従って、１つの局面において、本発明は、（ＬＴβＲ）ポリペプチドおよびＳｍａｃポリペプチドを含む精製された複合体を提供する。好ましい実施形態において、ＬＴβＲポリペプチドは、ＬＴβＲリガンドに結合される。ＬＴβＲリガンドは、ＬＩＧＨＴポリペプチドまたはＬｔα１β２ポリペプチドのいずれかであり得る。複合体はまた、ｃＩＡＰ１ポリペプチド、ＴＲＡＦ３ポリペプチド、およびＴＲＡＦ２ポリペプチドを含み得る。これらのポリペプチド由来のアミノ酸配列は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、または別の真核生物（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））由来のアミノ酸配列であり得る。好ましい実施形態において、これらのポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列を有する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、ＬＴβＲポリペプチド、ＬＴβＲリガンド、ＴＲＡＦ２ポリペプチド、ＴＲＡＦ３ポリペプチド、ｃＩＡＰ１ポリペプチド、およびＳｍａｃポリペプチドを含む精製複合体を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ＴＮＦＲファミリーメンバーを発現する細胞を、試験薬剤と接触させ、そしてこの試験薬剤が細胞中のミトコンドリア媒介性アポトーシスを調節するかどうかを決定することによって、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーシグナル伝達経路の調節因子を同定する方法を包含する。好ましい実施形態において、ＴＮＦＲファミリーメンバーは、デスドメインを含まない。別の実施形態において、ＴＮＦＲファミリーメンバーは、ＬＴβＲポリペプチドである。別の好ましい実施形態において、ＬＴβＲ複合体は、ＬβＴＲ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１、およびＳｍａｃポリペプチドを含む。試験薬剤は、ＬＴβＲシグナル伝達活性を阻害するか、または活性化するかのいずれかであり得る。好ましい実施形態において、調節因子は、細胞内のＳｍａｃポリペプチドの活性または発現を決定することによって、あるいは、ｃＩＡＰ１ポリペプチドまたはＴＲＡＦ２ポリペプチドのＳｍａｃポリペプチドとの相互作用を決定することによって同定される。
【０００９】
本発明は、ＬＴβＲポリペプチドを発現する細胞を試験薬剤と接触させ、この試験薬剤が、細胞中におけるＳｍａｃポリペプチドの活性または発現を調節するかどうかを決定することによって、リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）複合体のシグナル伝達経路の調節因子を同定する方法をさらに提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、ＬＴβＲを発現する細胞を試験薬剤と接触させ、この試験薬剤が、細胞中におけるｃＩＡＰ１ポリペプチドの活性または発現を調節するかどうかを決定することによって、ＬＴβＲ複合体のシグナル伝達経路の調節因子を同定する方法を提供する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ＬＴβＲを発現する細胞を試験薬剤と接触させ、試験薬剤が、細胞中におけるＴＲＡＦ２ポリペプチドの活性または発現を調節するかどうかを決定することによって、ＬＴβＲ複合体のシグナル伝達経路の調節因子を同定する方法を提供する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、試験薬剤をＴＲＡＦ２ポリペプチド、ｃＩＡＰポリペプチド、またはＳｍａｃポリペプチドと接触させ、この試験薬剤が、ポリペプチドの活性を調節するかどうかを決定し、それによって、ＬＴβＲ活性の調節因子を同定することによって、ＬＴβＲ活性の調節因子を同定する方法を提供する。好ましい実施形態において、本方法は、試験薬剤がポリペプチドに直接結合するかどうか、および試験薬剤がポリペプチドの活性または発現に影響するかどうかを決定する工程をさらに包含する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、Ｓｍａｃポリペプチドを試験薬剤と接触させ；そして、この試験薬剤がＳｍａｃポリペプチドの活性を阻害するかどうかを決定し、それによってＬＴβＲ複合体のシグナル伝達経路のインヒビターを同定することによって、ＬＴβＲ複合体のシグナル伝達経路の調節因子を同定する方法を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ＴＮＦＲファミリーメンバーを発現する細胞を試験薬剤と接触させ、そしてこの試験薬剤が細胞におけるミトコンドリア−媒介性アポトーシスを調節するかどうかを決定し、それによって、免疫障害を処置するかまたは予防するための薬剤を同定することによって免疫障害を処置するかまたは予防するための薬剤を同定するための方法を包含する。好ましい実施形態において、ＴＮＦＲファミリーメンバーは、デスドメインを含まず、リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）ポリペプチドである。本発明は、免疫障害を処置するために有用な薬剤を同定するために使用され得、この免疫障害は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、強皮症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎および皮膚筋炎、悪性貧血、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、脈管炎またはＩ型糖尿病から選択されるが、これらに限定されない。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、ＴＮＦＲファミリーメンバーを発現する細胞を試験薬剤と接触させ、この試験薬剤が、細胞におけるミトコンドリア媒介性アポトーシスを調節するかどうかを決定し、それによって癌を処置または予防するための薬剤を同定することによって、癌を処置または予防するための薬剤を同定するための方法を提供する。
【００１６】
上記スクリーニング法によって同定される調節因子もまた、本発明の範囲内であり、そしてこれらのインヒビターを使用して、免疫応答を調節する方法は、本発明の範囲内である。
【００１７】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価である方法および材料は、本発明の実施および試験において使用され得、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合において、定義を含む本明細書が、制御する。さらに、材料、方法および実施例は、例示のみであり限定することを意図しない。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、リンフォトキシン−βレセプター（ＬＴβＲ）調節因子を同定するための方法を提供し、この調節因子は、ＬＴβＲシグナル伝達を活性化または阻害し得る。ＬＴβＲまたは複合体のメンバー（本明細書中で新規に同定されたメンバーを含む）は、薬剤として使用され得るか、または薬剤に対する標的として働き、これは、ミトコンドリアアポトーシスを阻害するかまたはミトコンドリアアポトーシスのＬＴβＲ媒介性阻害を刺激するために使用され得、例えば、異常な細胞増殖をブロックするかまたは培養中の細胞増殖を継続する。本明細書中で同定される調節因子は、免疫状態および癌を含む種々の徴候を処置するために使用され得る。好ましい徴候は、慢性関節リウマチである。
【００２０】
以下の用語は、これらが本明細書中で使用される以下の一般的な意味を有することが意図される。
【００２１】
用語「アポトーシス」は、プログラム細胞死のプロセスをいう。
【００２２】
用語「サイトカイン」は、細胞間の相互作用を媒介する分子をいう。「リンフォカイン」は、リンパ球によって放出されるサイトカインである。
【００２３】
用語「ＬＴβＲ調節因子」は、ＬＴβＲに対するリガンド結合、細胞表面ＬＴβＲクラスター化またはＬＴβＲシグナル伝達を活性化または阻害し得る任意の薬剤あるいはＬＴβＲシグナルが細胞内で解釈される方法に影響し得る任意の薬剤をいう。ＬＴβＲ活性化剤の例としては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、可溶性抗−ＬＴβＲ抗体、架橋された抗ＬＴβＲ抗体および多価抗−ＬＴβＲ抗体、可溶性ＬＩＧＨＴポリペプチドまたは可溶性Ｌｔα１β２ポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
用語「ＬＴβＲシグナル伝達」は、ＬＴβＲ経路およびそこから生じる続いての分子反応に関連する分子反応をいう。
【００２５】
用語「実質的に純粋な」ポリペプチドは、天然にそれと共に存在する成分から分離されたポリペプチドまたはポリペプチド複合体を意味する。代表的には、天然に関連するタンパク質および天然に存在する有機分子を、少なくとも６０重量％含まない場合、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、実質的に純粋である。好ましくは、調製物の純度は、少なくとも７５重量％であり、より好ましくは少なくとも９０重量％であり、そして最も好ましくは少なくとも９９重量％である。
【００２６】
（リンフォトキシン−βレセプター関連ポリペプチド）
本発明は、リンフォトキシン−βレセプター複合体の成分として同定されたポリペプチドを包含する。ＬＴｂＲ複合体のこれらの新たに同定されたメンバーとしては、ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１、およびＳｍａｃが挙げられる。
【００２７】
Ｓｍａｃは、ミトコンドリアタンパク質であるが、アポトーシスの間に、シトクロムｃの放出と同時に細胞質ゾルに放出される。次いで、細胞質ゾルＳｍａｃは、ｃＩＡＰ１との相互作用を介してレセプターに動員され、そしてｃＩＡＰ１によるアポトーシスの阻害を軽減する。ｃＩＡＰ１は、カスパーゼの活性を阻害することによって、アポトーシスを阻害すると報告されている。
【００２８】
これらのポリペプチドのアミノ酸配列が、以下に提供される。ＴＲＡＦ２およびＳｍａｃの核酸配列については、さらに提供される。
【００２９】
ＴＲＡＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列が、以下に提供される：
【００３０】
【化１】
0004429726.tif 000002
開示されるＴＲＡＦ２アミノ酸配列をコードする核酸配列が、以下に提供される：
【００３１】
【化２】
0004429726.tif 000003
ＩＡＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列が、以下に示される：
【００３２】
【化３】
0004429726.tif 000004
Ｓｍａｃポリペプチドのアミノ酸配列が、以下に示される：
【００３３】
【化４】
0004429726.tif 000005
開示されるＳｍａｃポリペプチドをコードする核酸配列が、以下に示される：
【００３４】
【化５】
0004429726.tif 000006
見出された原始的なホモログのエンハンサー（ＥＲＨ）ポリペプチドのアミノ酸配列が、以下に示される：
【００３５】
【化６】
0004429726.tif 000007
開示されるＥＲＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、以下に示される：
【００３６】
【化７】
0004429726.tif 000008
本発明のタンパク質複合体は、上で開示した２つ以上のポリペプチドを、種々の実施形態において、ＬＴβＲレセプター、ＬＴβＲリガンド（例えば、ＬＩＧＨＴ）、およびＴＲＡＦ３ポリペプチドと共に含む。好ましいＬＴβＲ複合体としては、ＬＴβＲレセプター、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１、ＥＲＨ、およびＴＲＡＦ３が挙げられる。複合体は、例えば、天然の供給源からの抽出によってか、この複合体のメンバーをコードする組換え核酸の発現によってか、ポリペプチドフラグメント融合タンパク質の発現によってか、またはキメラ合成によって得られ得る。化学的に合成されたポリペプチド、または天然に存在する細胞とは異なる細胞系において産生されたポリペプチドは、定義によれば、そのポリペプチドが天然に付随する成分を実質的に含まない。従って、実質的に純粋なポリペプチドとしては、真核生物由来であるがＥ．ｃｏｌｉまたは他の原核生物の組換え細胞内で合成されたポリペプチドが挙げられる。純度は、任意の適切な方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析）によって測定され得る。
【００３７】
（ＬＴβＲシグナル伝達の調節）
本発明は、リンフォトキシン（ｌｙｍｐｈｏｘｉｎ）βレセプターシグナル伝達を調節する薬剤を同定する方法をさらに提供する。この方法としては、上で開示される１つ以上のＬＴβＲ複合体ポリペプチドの存在およびまたは活性に依存する方法が挙げられる。
【００３８】
ＬＴβＲ複合体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−レセプターのメンバーである。ＴＮＦ関連サイトカインは、宿主の防御および免疫調節の多面発現性媒介物質の大きいファミリーとして出現した。このファミリーのメンバーは、細胞−細胞接触を介して局所的に作用する、膜結合形態で存在するか、または離れた標的に作用し得る分泌タンパク質として存在する。ＴＮＦ関連レセプターの平行なファミリーは、これらのサイトカインと反応し、そして種々の経路（細胞死、細胞増殖、組織分化および炎症誘発応答が挙げられる）を誘発する。
【００３９】
非腫瘍形成性細胞において、ＴＮＦおよびＴＮＦファミリーリガンド−レセプター相互作用の多くは、免疫系の発達および種々の免疫チャレンジに対する応答に影響を与える。ＬＴβＲ（レセプターのＴＮＦファミリーのメンバー）は、表面ＬＴリガンドに特異的に結合する。ＬＴβＲによるシグナル伝達は、末梢リンパ様器官の発達および体液性免疫応答において、役割を果たし得る。ＬＴβＲシグナル伝達もまた、ＴＮＦ−Ｒシグナル伝達と同様に、抗増殖効果を有し、そして腫瘍細胞に対して細胞傷害性であり得る。ＬＴβＲ  ｍＲＮＡは、ヒトの脾臓、胸腺および他の主要な器官において見出され、ＬＴβＲ発現パターンは、ＬＴβＲが、末梢血Ｔ細胞およびＴ細胞株を欠くことを示す。従って、本明細書中に記載されるスクリーニング方法において同定される薬剤は、種々の適応症を処置するために使用され得る。
【００４０】
１つの局面において、ＬＴβＲシグナル伝達を調節し得る薬剤は、ミトコンドリア媒介性アポトーシスのブロックによって、それらの能力に基づいて選択される。ＬＴβＲシグナル伝達経路の調節因子は、ＬＴβＲを発現する細胞を試験薬剤と接触させ、そしてこの試験薬剤がこの細胞においてミトコンドリア媒介性アポトーシスを媒介するか否かを決定することによって、同定される。あるいは、薬剤は、この薬剤が細胞においてｃＩＡＰ１、ＴＲＡＦ２、またはＳｍａｃポリペプチドの活性または発現を調節するか否かを決定することによって、選択され得る。
【００４１】
一般に、任意の化合物が、試験薬剤として使用され得る。適切な試験薬剤としては、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、または低分子が挙げられる。例えば、試験薬剤は、当該分野において公知であるコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを使用して、得られ得る。このライブラリーとしては、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行な固相もしくは溶液相のライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、一方で他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子の化合物のライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  １２：１４５）。
【００４２】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば、以下において見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９：Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３７：１２３３。
【００４３】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ’４０９）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ、上記）に存在し得る。
【００４４】
一般に、当該分野において認識されるアッセイは、ミトコンドリア媒介性アポトーシスを評価するために使用され得る。このようなアッセイは、例えば、米国特許第５，９３５，９３７号に記載されている。１つの例は、以下である：（１）腫瘍細胞（例えば、ＨＴ２９細胞またはＭＣＦ−７細胞）が、３〜４日間、培地および少なくとも１つのＬＴβＲ活性化剤を含む一連の組織培養ウェル中で、試験される薬剤の一連の希釈物の存在下または非存在下で培養される；（２）ミトコンドリア機能（例えば、ＭＴＴ）を測定するウイルス色素染色が腫瘍細胞混合物に添加され、そして数時間反応される；（３）各ウェル中の混合物の光学密度が定量される。光学密度は、ＬＴβＲ活性化剤および試験ＬＴβＲブロッキング剤の存在下で各ウェル内に残っている腫瘍細胞の数に比例する。
【００４５】
本発明は、既知または推定のＬＴβＲ調節活性化薬剤をさらに使用し得る。ＬＴβＲシグナル伝達（例えば、可溶性ＬＴβＲフラグメントまたは抗ＬＴβＲモノクローナル抗体、およびその改変形態の活性化）を誘導する薬剤は、上記腫瘍細胞アッセイを使用して、ミトコンドリア媒介性アポトーシスを介して腫瘍細胞細胞傷害性を相乗する、単独でかまたは他の薬剤（例えば、ｃＩＡＰ１とのＳｍａｃの相互作用）と組み合わせたそれらの能力に基づいて選択され得る。
【００４６】
ＬＴβＲ調節薬剤を選択するための別の方法は、推定薬剤がＬＴβＲ−リガンド結合に直接する能力をモニタリングすることである。リガンド−レセプター結合の強度を測定する多数のアッセイのいずれかを使用して、推定ＬＴβＲブロッキング薬剤との競合アッセイを実施し得る。レセプターとリガンドとの間の結合の強度は、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して、測定され得る。特異的結合はまた、抗体−抗原複合体を蛍光標識し、そして蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を実施することによって、または他のこのような免疫検出方法を実施することによって測定され得る。これらの全ては、当該分野において周知の技術である。
【００４７】
リガンド−レセプター結合相互作用はまた、プラスモン共鳴検出を利用する、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて測定され得る（Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，８１９３−９８頁（１９９３）；ＦａｅｇｅｒｓｔｒａｍおよびＯ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ「Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２２９−５２頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））。
【００４８】
レセプター−リガンド相互作用を測定するための、これらまたは他の技術のいずれかを用いて、ＬＴβＲブロッキング剤が、単独でかまたは他の薬剤と組み合わせて、表面ＬＴリガンドまたは可溶性ＬＴリガンドの、表面ＬＴβＲ分子または可溶性ＬＴβＲ分子への結合を阻害する能力を評価し得る。このようなアッセイはまた、ＬＴβＲブロッキング剤またはこのような薬剤の誘導体（例えば、融合物、キメラ、変異体、および化学的に変更された形態）を、単独でかまたは組み合わせて試験し、その変更された薬剤がＬＴβＲ活性化をブロックする能力を最適にするために使用され得る。
【００４９】
本発明は、以下の非限定的な実施例にさらに記載される。
【実施例】
【００５０】
（実施例１  材料および方法）
以下の実施例において使用される材料および方法は、以下を含んだ。
【００５１】
（細胞培養、抗体および試薬）
Ｕ９３７細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＭＣＦ７細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、そしてそれぞれ０．０１％のインスリンを含有する、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ＤＭＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、およびＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中で培養した。全ての培地に、１０％ＦＢＳを補充した。ＴＲＡＦ２抗体およびＴＲＡＦ３抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ｃＩＡＰ１抗体を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体およびアフィニティービーズを、Ｓｉｇｍａから入手した。ＨＡ抗体（３Ｆ１０）を、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｓｍａｃ抗体を、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。全ての化学試薬は、他に特定されない限り、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００５２】
（プラスミド構築物）
ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２ベクター（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｃｏ．）中のＮ末端ＦＬＡＧタグ化全長ＬＴ  Ｒは、Ｓｈｉｅ−Ｌｉａｎｇ  Ｈｓｉｅｈ博士から親切にも提供された（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１８６８−７３、１９９もまた参照のこと）。Ｃ末端ＨＡタグを有するＳｍａｃの全長およびΔ７６欠失変異体を、ヒト卵巣ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ反応によって増幅した。次いで、ＰＣＲフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に、ＮｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位においてクローニングした。
【００５３】
（内因性ＬＩＧＨＴレセプター複合体の精製）
１×１０１０個のＵ９３７細胞を、加温したＰＢＳ（３７℃）で２回洗浄し、そして１×１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＦｌａｇ−ＬＩＧＨＴ（Ａｌｅｘｉｓ）で、３７℃で１０分間処理するか、または未処理のままにした。次いで、細胞を、５０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＶＯ４およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ））中に溶解し、そして４℃で３０分間穏やかに振盪した。細胞細片を、１０，０００ｇで３０分間、２回遠心分離することによって除去した。溶解物を、Ｇａｍｍａ  Ｂｉｎｄｉｎｇビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に１時間インキュベートすることによって予備浄化した。得られた溶解物を、０．２ｍｌのＭ２−アフィニティービーズ（Ｓｉｇｍａ）のミニカラム（ＢｉｏＲａｄ）に２回適用した。このビーズを、高塩（１Ｍ  ＮａＣｌ）溶解緩衝液で２回洗浄し、溶解緩衝液でさらに３回洗浄し、次いで、エッペンドルフチューブに移した。免疫複合体を、初めに、２ｍｇ／ｍｌの濃度のＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）で溶出した。残留している結合タンパク質を、次いで、８Ｍ  尿素でさらに溶出した。２分の１のペプチドで溶出したタンパク質または１／１０の８Ｍ  尿素で溶出したタンパク質を、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、そしてＴＲＡＦ３抗体を使用して、ウエスタンブロッドのためのニトロセルロース膜に移した。これらのサンプルをまた、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、そして銀染色によって可視化した。
【００５４】
（質量分析法およびタンパク質の同定）
目的のタンパク質バンドを、ゲルから手で切り出し、ヨードアセトアミドで還元しそしてアルキル化し、次いで、Ｈｏｕｔｈａｅｖｅら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：３４３−４８，１９９７に記載されるように、自動化消化ロボット（ＡＢＩＭＥＤ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してトリプシンでインサイチュで消化した。次いで、このペプチド消化物を、マイクロエレクトロスプレイ逆相液体クロマトグラフィーインターフェースを備えるハイスループットタンデム質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  ＬＣＱ−ＤＥＣＡ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）を使用して、配列決定した。データを、ＬＣＱを備えるデータ取得ソフトウェアを使用して自動化ＭＳ／ＭＳモードで取得し、ペプチドがカラムから溶出されると、各ペプチドを検出しそして配列決定した。動的除去機能および同位体除去機能を用いて、分析されたペプチドイオンの数を増加させた。ＬＳ−ＭＳ／ＭＳ実行の間、代表的に１０００を超える断片化スペクトルを、各サンプルから収集し、そしてＳｅｑｕｅｓｔソフトウェアパッケージ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ）を使用して、非冗長データベース（ＮＣＢＩ）に対して一致させた。
【００５５】
（免疫沈降およびウエスタン分析）
免疫沈降について、１×１０８のＵ９３７細胞を、異なる時間、２０ｎｇ／ｍｌのＦＬＡＧ−ＬＩＧＨＴで処理するか、または未処理のままにした。次いで、細胞を収集し、そして４ｍｌの溶解緩衝液（上記を参照のこと）中に溶解した。細胞細片を、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって除去し、そして得られた溶解物を、Ｇａｍｍａ  Ｂｉｎｄｉｎｇビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて４℃で１時間予備浄化した。次いで、２０  ｌのＭ２ビーズを、この細胞溶解物に添加し、そして４℃で３時間インキュベートした。結合後、ビーズを、溶解緩衝液で５回洗浄した。このビーズに結合した免疫複合体を、サンプル緩衝液で溶出し、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、そしてＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３またはｃＩＡＰ１抗体でプローブした。シグナルを、ＨＲＰ結合体化二次抗体およびＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出した。ＨＥＫ  ２９３細胞の免疫沈降について、４μｇのｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２−ＬＴβＲ、ｐｃＤＮＡ３−Ｓｍａｃ−ＨＡまたはｐｃＤＮＡ３−Δ７６Ｓｍａｃ−ＨＡを、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用し、製造者の指示書に従って、１００ｍｍディッシュ上で細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、細胞リフターを用いて収集し、そして０．５ｍｌの溶解緩衝液中に溶解した。ＬＴ  ＲについてＭ２ビーズを用いて、またはＳｍａｃまたはΔ７６  ＳｍａｃについてＨＡモノクローナル抗体を用いてのいずれかで、Ｕ９３７細胞と同じ様式で、免疫沈降を実施した。次いで、免疫複合体中のＳｍａｃ、ＬＴβＲ、ＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰ１の存在を、ウエスタンブロットによって分析した。
【００５６】
（アポトーシスアッセイ）
ＭＣＦ７細胞（５×１０５細胞／ウェル）を、トランスフェクションの１日前に、６ウェルプレート中のカバーガラス上に播種した。各ウェル中の細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、１μｇのｐｃＤＮＡ３ベクター、ｐｃＤＮＡ３−Ｓｍａｃ−ＨＡまたはｐｃＤＮＡ３−Δ７６Ｓｍａｃ−ＨＡ発現構築物を、ｐＥＭＣ−βＧａｌと共に用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＰＢＳ（コントロール）、ＬＩＧＨＴ（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＬＴα１β２（２０ｎｇ／ｍｌ）で６時間処理し、次いで、固定し、そしてＸ−ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。アポトーシスを、形態学分析によって評価し、そしてトランスフェクトされた全ての青色細胞中のアポトーシス（丸く、かつ分離されている）細胞の割合として表した。
【００５７】
（実施例２：ＬＴβＲ複合体におけるポリペプチドの同定）
ＬＩＧＨＴは、ＬＴβＲおよびＴＲ２／ＨＶＥＭの両方に結合する。Ｕ９３７細胞において、ＬＴβＲは、構成的に発現され、一方、ＴＲ２／ＨＶＥＭの発現は、分化因子によって誘導される。この現象は、特異的リガンド−ＬＴβＲ複合体を形成するために開発された。未分化のＵ９３７細胞を、Ｆｌａｇタグ化ＬＩＧＨＴで１０分間処理して、ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体を形成した。内因性レセプター複合体を、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）結合体化ビーズでアフィニティー精製し、次いで、Ｆｌａｇペプチドで溶出した。溶出したタンパク質を、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、そして銀染色によって可視化した。
【００５８】
約８のタンパク質バンドは、ＬＩＧＨＴで処理したサンプルにおいてのみ存在し、コントロールには存在しないことが見出された。ＴＲＡＦ３は、ＴＲＡＦ３に対するポリクローナル抗体を使用して、ＬＩＧＨＴで処理したサンプルにおいて検出された。
【００５９】
この複合体中のさらなるタンパク質を同定するために、８つのバンド（これらを、１〜８番と割り当てた）を、ゲルから切り出し、そして液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。予想通り、ＬＩＧＨＴが、バンド６において検出された（表１もまた参照のこと）。ポリペプチドＴＲＡＦ２由来のいくつかのペプチドが、バンド３において検出された。他のバンドのいずれかのタンパク質は、スペクトルの質の悪さに起因して検出できなかったか、または後に、非特異的結合タンパク質（例えば、バンド１におけるＨｓｐ  ９０およびバンド４におけるアクチン）であることが分かった。
【００６０】
バンド３の推定位置におけるＴＲＡＦ３に対応するペプチドも、レセプターポリペプチドに対応するペプチドも検出できなかった。１つの可能性は、ＴＲＡＦ３およびレセプター（存在する場合）の量が、質量分析法の検出限界より下であるということであった。ＴＲＡＦ３のウエスタンブロットによって示されるように、Ｆｌａｇペプチドは、ビーズ上の全ＴＲＡＦ３タンパク質の１０分の１しか溶出しなかった。この低効率は、おそらく、抗体とリガンドレセプター複合体との間の多量体の高親和性相互作用に起因していた。
【００６１】
これらのビーズからのタンパク質の回収を増加させるために、これらのビーズを、８Ｍ  尿素で処理した。次いで、サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、そしてＴＲＡＦ３の推定位置におけるバンドを切り出し、そして質量分析法によって分析した。ＴＲＡＦ３由来の３つのペプチド（表１）が、ＬＩＧＨＴで処理したサンプルにおいて検出された。これらのペプチドは、ＬＩＧＨＴ処理をしていないサンプルには存在しなかった。
【００６２】
（表１．ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体において同定されたタンパク質のリスト。表に列挙されるタンパク質は、ＬＩＧＨＴで処理したサンプルにおいてのみ検出され、コントロールサンプルでは検出されなかった。＊Ｆは、ＦＬＡＧで溶出したサンプルにおけるバンドを表し、そしてＵは、８Ｍの尿素で溶出したサンプルにおけるバンドを表す。数字は、図１に示される数字に対応する。
【００６３】
【表１】
0004429726.tif 000009
0004429726.tif 000010
次いで、ＬＩＧＨＴで処理したサンプルおよびコントロールサンプルの両方におけるバンドの全てを、８Ｍの尿素で処理したが、８Ｍの尿素もまた、ビーズに非特異的に結合したタンパク質を溶出し、ＬＩＧＨＴで処理したサンプルとコントロールサンプルとの間の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける識別不可能なパターンを生じた。タンパク質の同定後、コントロールサンプル中の非特異的結合タンパク質を、ＬＩＧＨＴで処理したサンプル中の非特異的結合タンパク質から引き、ＬＩＧＨＴ−レセプター複合体に特異的に結合するタンパク質を生成した。表１は、検出されたペプチドおよびその帰属されたタンパク質を要約する。合計５種のタンパク質を同定し、このタンパク質は、上で列挙した４つのタンパク質およびＥＲＨを含んだ。
【００６４】
予測されるように、ＬＴβＲは、複合体中のレセプターとして検出された（表１）。複合体中のＬＩＧＨＴおよびｌｔ
βＲの検出は、ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体の首尾良い単離をさらに確証した。ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３もまた、検出された（表１）。さらに、バンド２の位置におけるｃＩＡＰ１由来の４種のペプチド、およびバンド６の位置におけるＳｍａｃ由来の２種のペプチドが、検出された（表１）。図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、ｃＩＡＰ１由来ペプチドおよびＳＭＡＣ由来ペプチドの２つの代表的な質量スペクトルを示す。
【００６５】
ＴＲＡＦ４ポリペプチドも、ＴＲＡＦ５ポリペプチドも、ＮＩＫポリペプチドも、質量分析法またはウエスタンブロット分析のいずれによっても検出されなかったが、その役割は、ＬＴβＲシグナル伝達において示唆されている。このことは、タンパク質の少ない存在量およびサンプルの高い複雑性に起因し得る。
【００６６】
これらのタンパク質とＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体との会合を確認するために、Ｕ９３７細胞を、種々の時間にわたって、Ｆｌａｇ−ＬＩＧＨＴで処理した。次いで、細胞を、Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、続いてＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３またはｃＩＡＰ１に対する抗体を使用してウエスタンブロット分析した。
【００６７】
内因性ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびｃＩＡＰ１のＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体へのリクルートが、時間依存的であることが見出された。ｃＩＡＰ１のリクルートは、１５分以内に徐々に増加した。類似のパターンが、ＴＲＡＦ３について観察された。ＴＲＡＦ２のリクルートは、より迅速であるようであり、そして５分と１０分との間にピークに達するようである。リクルートの反応速度は、ＴＲＡＦ２がＴＲＡＦ３およびｃＩＡＰ１より先にレセプターにリクルートされることを示唆する。ＴＲＡＦ３のＬＴβＲの細胞内ドメインとの直接的な相互作用は、精製タンパク質を使用して証明され（Ｆｏｒｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０８３５−４０，１９９７）、そしてＴＲＡＦ２とＴＲＡＦ３との間の相互作用の証拠は存在しない（例えば、Ｗａｊａｎｔら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １０：１５−２６，１９９９を参照のこと）。従って、ＴＲＡＦ３は、ＬＩＧＨＴの処理の際に、ＬＴβＲに直接リクルートする可能性が高い。逆に、ｃＩＡＰ１からＬＴβＲへのリクルートは、おそらく、ＴＲＡＦ２とのその相互作用を介して生じる。なぜなら、ｃＩＡＰ１−ＴＲＡＦ２相互作用は、インビトロで示されており、そしてｃＩＡＰ１とレセプターまたはＴＲＡＦ３との間の相互作用の証拠が存在しないからである。
【００６８】
興味深いことに、ｃＩＡＰ１のＣ末端に対するポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ８１８）により認識される複合体中のｃＩＡＰ１は、約６０ｋＤａであり、これは細胞溶解物中の全長ｃＩＡＰ１（約７０ｋＤａ）より小さい。この６０ｋＤａバンドは、ｃＩＡＰ１のＢＩＲ１ドメインにおけるペプチドに対する別の抗体（ｓｃ−１８６７，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，これは細胞溶解物中の７０ｋＤａ−ｃＩＡＰ１を認識する）によって検出されなかった。これらの観察は、複合体中のｃＩＡＰ１のＮ末端が切断されることを示す。
【００６９】
ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体におけるＳｍａｃ由来の２つのペプチドを、質量分析によって検出したが、内因性の結合は、Ｓｍａｃ抗体（Ａｌｅｘｉｓ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓまたはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用しても検出されなかった。この結果は、Ｓｍａｃ抗体の低感受性に起因するものであり得る。従って、ＳｍａｃとＬＴβＲとの結合は、内因性ＬＴβＲおよびＨＶＥＭを有さないＨＥＫ２９３細胞において、過剰発現によって調査された（Ｚｈａｉら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１１４２〜５１，１９９８）。Ｓｍａｃは、Ｃ末端ＨＡタグ化融合タンパク質として発現し、ウェスタンブロットでは２８ｋＤａおよび２３ｋＤａの二重線として現われた。これらのサイズは、Ｎ末端ミトコンドリア局在化シグナルペプチド（アミノ酸１〜５５）を有する全長Ｓｍａｃおよびそのシグナルペプチドを有さない成熟Ｓｍａｃに一致した（Ｄｕら，Ｃｅｌｌ  １０２：３３〜４２，２０００）。両方の形態を、Ｆｌａｇタグ化ＬＴβＲにより共免疫沈降した。細胞質ゾルおよびミトコンドリアを分画した場合、全ての全長Ｓｍａｃが、ミトコンドリア画分中に存在することを見出し、成熟Ｓｍａｃのかなりの量（約３分の１）は、細胞質ゾル画分中にあった。従って、これらのデータは、Ｓｍａｃの細胞質ゾル成熟形態が、ＬＴβＲと相互作用するＳｍａｃの生理学的形態であることを示唆する。全長Ｓｍａｃが、ＬＴβＲとともに共免疫沈降されたという観察は、アーティフィシャルなものであり得、これは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によるミトコンドリア膜の破壊に起因する。
【００７０】
ＬＩＧＨＴにより刺激された場合、Ｓｍａｃリクルートはさらに増加しなかった（データは示さず）。これは、過剰発現から生じるＬＴβＲの凝集および活性化に起因する可能性がある。ＨＡ抗体を使用するＳｍａｃの相互免疫沈降において、ＬＴβＲが検出され、このことにより、結合をさらに確認する。Ｕ９３７細胞（上述）における観察によると、内因性ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１（６０ｋＤａ）およびＴＲＡＦ３はまた、ＨＥＫ２９３細胞において過剰発現されたＬＴβＲに対してリクルートされたことが見出された。さらに、内因性ＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰ１を、Ｓｍａｃの相互免疫沈降において検出した。このことは、ＬＴβＲ−ＴＲＡＦ２−ｃＩＡＰ１−Ｓｍａｃの複合体の形成を示す。まとめると、これらのデータは、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ｃＩＡＰ１、およびＳｍａｃと、ＬＴβＲとの生理学的結合を強く支持する。
【００７１】
全長Ｓｍａｃとは対照的に、ｃＩＡＰ１結合部位（アミノ酸５６〜７５）およびミトコンドリア局在化シグナルの両方を欠くＳｍａｃの欠失変異体（Δ７６Ｓｍａｃ）は、ＬＴβＲに結合する能力を喪失している。このことは、ＳｍａｃのｃＩＡＰ１結合部位が、そのレセプターへのリクルートに重要であることを示唆する。ＳｍａｃのＮ末端とＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメインとの間の相互作用は、Ｘ線結晶構造分析および突然変異分析によって実証された（Ｃｈａｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：８５５〜８６２，２０００；Ｗｕら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：１００８〜１２，２０００）。公知のＩＡＰポリペプチドは、高度に相同性であるので、Ｓｍａｃのリクルートは、そのｃＩＡＰ１のＢＩＲ３ドメインとの相互作用によって媒介されている可能性がある。全長ＳｍａｃとＳｍａｃの欠失変異体との間の相違にも関わらず、ＬＴβＲに対するｃＩＡＰ１、ＴＲＡＦ２、およびＴＲＡＦ３のレベルは、同じレベルのままであり、このことは、Ｓｍａｃのリクルートが、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびｃＩＡＰ１のリクルート後に生じることを示唆する。
【００７２】
（実施例３．ＳｍａｃはＬＴβＲ誘発アポトーシスを増強する）
Ｓｍａｃは、ＵＶ照射のようないくつかの刺激（ミトコンドリア媒介性アポトーシス経路を引き起こす）に応答してアポトーシスを促進することが示されている（Ｄｕら、Ｃｅｌｌ  １０２：３３〜４２、２０００）。ＭＣＦ７細胞を、β−ガラクトシダーゼ（ｐＥＭＣ−βｇａｌ）およびＳｍａｃ−ＨＡ、Δ７６  Ｓｍａｃ−ＨＡまたは空のベクターを発現するプラスミドを用いて同時トランスフェクトした。２４時間後、細胞を、ＰＢＳ、ＬＩＧＨＴ（２０ｎｇ／ｍｌ）、またはＬＴα１β２（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、それぞれ６時間処理し、次いで固定して、Ｘ−ｇａｌで染色した。アポトーシスを、βｇａｌ発現細胞の形態学的分析によって評価した（詳細については、実施例１を参照のこと）。
【００７３】
これらの結果を、図２に示す。アポトーシスを、形態学的分析によって評価し、トランスフェクトされた青い細胞の全てにおけるアポトーシス細胞（丸みを帯びた細胞および剥離した細胞）の割合として示した。バーは、３回の別個の実験において繰り返したサンプルの平均を示す。各実験において、１０００個より多くの細胞を計数した。
【００７４】
全長Ｓｍａｃの過剰発現は、ＭＣＦ７細胞においてアポトーシスを増強し、そしてＬＩＧＨＴの刺激はさらにアポトーシスを増加させる。同様の効果が、ＬＴα１β２刺激細胞において観察された。興味深いことに、変異体Δ７６Ｓｍａｃ（これは、レセプターへのリクルートする能力を喪失している）は、依然として、全長Ｓｍａｃと同じ程度までＬＴβＲ媒介性アポトーシスを増強する。この結果は、ＳｍａｃのＣ末端がまた、アポトーシス促進活性も保持し、かつｃＩＡＰ１との相互作用から独立していることを示唆する。
【００７５】
理論に束縛されることを意図しないが、ＬＴβＲ誘発アポトーシスについてのモデルを、図３に図示する。ＬＩＧＨＴがＬＴβＲへ結合する際、ＴＲＡＦ２はまず、レセプターにリクルートされ、次いでｃＩＡＰ１のＢＩＲ１ドメインが切断される間、ＴＲＡＦ３およびｃＩＡＰ１にリクルートされる。レセプター上のｃＩＡＰ１は、カスパーゼと直接相互作用することによってアポトーシスを阻害する。最初のＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体はまた、ミトコンドリアからのＳｍａｃの放出を誘導する未知のメカニズムによって、ミトコンドリア媒介性アポトーシス経路を引き起こす。細胞質ゾルのＳｍａｃ（これは、Ｎ末端ミトコンドリア局在化シグナルを欠く）は、次いで、ｃＩＡＰ１との相互作用を介してレセプターにリクルートされる。ＳｍａｃのＮ末端とｃＩＡＰ１との相互作用は、カスパーゼに関するｃＩＡＰ１の阻害を開放し、一方、ＳｍａｃのＣ末端は、Ｎ末端と共同して作用し、未だ同定されていないメカニズムによってアポトーシスを促進する。ＬＴβＲ誘発アポトーシスは、ＩＦＮγの付加を必要とすることが報告されている（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７〜７８、１９９６）。このモデルにおいて提案されたＳｍａｃの役割と一致して、ＩＦＮγは、ＷＥＨＩ２７９細胞においてＳｍａｃのデノボ合成を誘導することが示された（Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、１６７：２４８７〜９５、２００１）。ＴＲＡＦ３は、ミトコンドリアからのＳｍａｃの放出を引き起こすことによってｃＩＡＰ１−Ｓｍａｃ経路を促進することが可能である。
【００７６】
これらの説明は、例示を意図しているが、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】図１Ａは、ｃＩＡＰ１に由来するとして同定されたペプチドの代表的なフラグメントイオンスペクトルである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＳＭＡＣに由来するとして同定されたペプチドの代表的なフラグメントイオンスペクトルである。
【図２】図２は、ＳｍａｃおよびΔ７６  ＳｍａｃのＬＩＧＨＴ誘発アポトーシスに対する効果を示すヒストグラムである。
【図３】図３は、ＬＴβＲ媒介性アポトーシスのモデルである。
【図１Ａ】
0004429726.tif 000011
【図１Ｂ】
0004429726.tif 000012
【図２】
0004429726.tif 000013
【図３】
0004429726.tif 000014
【配列表】
0004429726000001.app