(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号１に示したアミノ酸配列で規定される、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacteriumlongum）が産生する、抱合胆汁酸脱抱合酵素(Bilesalthydrolase；ＢＳＨ)活性を有するＢＳＨタンパク質。
【請求項２】
ＢＳＨタンパク質産生能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacteriumlongum）の菌体抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーで順次処理して請求項１に記載のＢＳＨタンパク質を分離、精製することを特徴とするＢＳＨタンパク質の製造法。
【請求項３】
ＢＳＨタンパク質産生能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacteriumlongum）が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacteriumlongum）SBT−2933R（FERMP−8743）またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacteriumlongum）SBT−2928（FERMP−10657）である請求項２に記載のＢＳＨタンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産生する新規な抱合胆汁酸脱抱合酵素(Bile salt hydrolase；ＢＳＨ）活性を有するＢＳＨタンパク質に関する。
また、本発明は、ＢＳＨタンパク質産生能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体抽出液からＢＳＨタンパク質を分離、精製する上記ＢＳＨタンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヒト腸内細菌が産生するＢＳＨタンパク質には、ヒトの血清脂質代謝、特にコレステロール代謝に対する作用が示唆されている。すなわち、ヒト腸管内に存在する抱合胆汁酸をＢＳＨタンパク質の触媒作用によって脱抱合胆汁酸に変換することでヒト血清コレステロール濃度が低下するという、いわゆるＢＳＨ説がそれである (例えば、Smetらの報告 (Microbial Ecology in Health and Disease, vol.7, pp.315-329, 1994))。
【０００３】
ＢＳＨ説の作用機序は、次の２通りの機構から形成されている。第一に、十二指腸から分泌される胆汁酸は抱合胆汁酸であり、脂質の吸収に大きく関与する複合ミセルの形成能力が脱抱合胆汁酸よりも抱合胆汁酸の方が高いので、腸内の抱合胆汁酸を脱抱合胆汁酸に変換すればするほど、経口的に摂取したコレステロールを含む脂質類の腸管からの吸収量が減少し、これによって血清コレステロール濃度が低下する要因となる (例えば、Sanders の報告 (Advance in Food and Nutri. Res., vol.37, pp.67-130, 1993))。
【０００４】
第二に、腸管内に分泌された抱合胆汁酸は、抱合胆汁酸に特異的な受容体を介しての能動輸送により主に小腸下部から再吸収されて肝臓に運ばれるが、特異的な受容体を介しての脱抱合胆汁酸に対する能動輸送系は腸管内には存在しておらず、腸管からの脱抱合胆汁酸の再吸収は、もっぱら受動輸送のみに依っている。したがって、脱抱合胆汁酸の方が抱合胆汁酸に比べて腸管からの再吸収の割合が低く、また、腸管から再吸収されない胆汁酸は糞便中に排泄されるので、糞便中に排泄される胆汁酸の総量が増加する。体外に排泄される胆汁酸量が増加すると胆汁酸の体内での生合成量、つまり肝臓におけるコレステロールから胆汁酸への異化作用が亢進し、同時に肝臓ではＬＤＬレセプターを介しての血液中からのＬＤＬの取り込みが亢進し、これが血清コレステロールを低下させる要因となる (例えば、Huisらの報告 (TIBTECH, vol.12, pp.6-8, 1994)) 。
【０００５】
上述のＢＳＨ説の検証に関する報告の中で、ある報告ではＢＳＨが働いて血清コレステロール濃度が低下すること (例えば、Smetらの報告 (British J. Nutrition, vol.79, pp.185-194, 1998))を結論としている一方で、また、ある報告はＢＳＨは機能せず、したがって、ＢＳＨは血清コレステロール濃度に影響を与えないこと (例えば、Pearceの報告 (Int. Dairy Sci., vol.6, pp.661-672))を結論としている。
【０００６】
ところで、ＢＳＨの血清コレステロール濃度に対する影響に関するこれまでの研究報告は、全てマウス、ラット、あるいはブタといった実験動物を対象としたものである (例えば、Smetの報告 (British J. Nutri., vol.79, pp.185-194, 1998)) 。コレステロール代謝及び胆汁酸代謝の様式は、同じ哺乳動物とはいえ動物種によって大きく異なっていることが知られているので、ヒトにおけるＢＳＨの効果を確認するためにはヒトを用いた実験が必須であるが、現在までのところ、ヒトでの実験は試みられていない。
【０００７】
したがって、現在のところ、ＢＳＨ説、すなわち、ヒト腸管内でＢＳＨタンパク質によって抱合胆汁酸を脱抱合胆汁酸に変換することが血清コレステロール濃度の低下につながる可能性に関しては、一定の結論を得ていないものの、その可能性が十分に期待されているという状況にある。
【０００８】
なお、これまでに、ラクトバチルス(Lactobacillus) 属菌、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属菌、エンテロコッカス (Enterococcus) 属菌、クロストリジウム(Clostridium) 属菌、バクテロイデス(Bacteroides) 属菌等にＢＳＨタンパク質の存在が知られており、精製、遺伝子構造、酵素の性状等に関する報告がなされており、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属菌に関しては、Grill らがビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) BB536 に由来するＢＳＨタンパク質の精製とその性状について報告している (Appl. Environ. Microbiol., vol.61, pp.2577-2582, 1995)。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産生する新規な抱合胆汁酸脱抱合酵素（ＢＳＨ）タンパク質及びその製造法を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明のＢＳＨタンパク質は、後述するように前記ＢＳＨ説の検証に好都合な酵素学的性質を有し、この用途に使用されるばかりではなく、その酵素的特徴から化学試薬としても有用である。また、ヒトの血清コレステロール濃度を調節する機能を有する飲食品や医薬等の素材としても有用である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト腸管に存在する抱合胆汁酸を脱抱合することのできるＢＳＨタンパク質を探索している過程で、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が、他の乳酸菌に比べてＢＳＨタンパク質を多量に産生し、かつヒトに存在する６種類の抱合胆汁酸を幅広く脱抱合する能力を有することを見出し、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産生するＢＳＨタンパク質の精製を行なった。そして、得られたＢＳＨタンパク質が、 Grillらが報告しているビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) BB536 が産生するＢＳＨタンパク質の性状とは異なる性状を有する新規なＢＳＨタンパク質であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明のＢＳＨタンパク質を産生するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌株としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) 、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) 等を例示することができる。
【００１３】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産生する、次の性質を有する新規なＢＳＨタンパク質であり、また、配列表配列番号１に示したアミノ酸配列で規定されるものである。
(1) 分子量：変性状態での分子量 (サブユニットの分子量) が37,000±2,000 及び非変性状態での分子量 (生理条件下での分子量) が130,000 ±10,000である。
なお、変性状態での分子量はSDS-PAGE法で、また、非変性状態での分子量はゲル濾過法で測定される。
(2) 基質特異性：グリシン抱合型胆汁酸に対する脱抱合活性がタウリン抱合型胆汁酸に対する脱抱合活性よりも約２倍高い。
(3) 活性剤：ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、塩化ナトリウム。
(4) 阻害剤：ＳＨ酵素の阻害剤、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム。
(5) 至適pH及びpH安定性：至適pHは６であり、酵素活性はpH 4.5〜 7.6の範囲で安定である。
(6) 至適温度及び温度安定性：至適温度は40℃であり、酵素活性は４〜37℃の範囲で安定である。
また、本発明は、ＢＳＨタンパク質産生能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーで順次処理してＢＳＨタンパク質を分離、精製する上記ＢＳＨタンパク質の製造法である。
【００１４】
なお、本発明の例えばビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928(FERM P-10657)が産生するＢＳＨタンパク質の性状は、 Grillらが報告しているビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) BB536 が産生するＢＳＨタンパク質の性状とは異なっている。
すなわち、本発明のＢＳＨタンパク質と公知のＢＳＨタンパク質（ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum  ＢＢ536 株由来の酵素 (以下、ＢＢ536 酵素という)(Appl.Environ.Microbiol.,vol.61,pp.2577-2582,1995) との性質の相違は次のとおりである。
【００１５】
(1) 基質特異性:
本発明のＢＳＨタンパク質は、グリシン型抱合胆汁酸に対する脱抱合活性がタウリン型抱合胆汁酸に対する脱抱合活性よりも約２倍高い。
これに対し、ＢＢ536 酵素は、グリシン型抱合胆汁酸に対する脱抱合活性がタウリン型抱合胆汁酸に対する脱抱合活性と同等である。
(2) 分子量:
本発明のＢＳＨタンパク質は非変性状態での分子量は約 130,000、変性状態での分子量は約37,000である。
これに対し、ＢＢ536 酵素は、非変性状態での分子量は約 250,000、変性状態での分子量は約40,000である。
(3) 変性剤の存在下での安定性:
本発明のＢＳＨタンパク質は、前記変性状態及び非変性状態での分子量の相違からみて４量体であると考えられ、非変性状態では４量体で安定的に存在している。これに対し、ＢＢ536 酵素は、前記の変性状態及び非変性状態での分子量の相違からみて６量体であると考えられる。しかも、この６量体の非変性状態において酵素は不安定であり、酵素は単量体として存在する。
(4) 酵素阻害剤及び酵素活性剤に対する感受性:
本発明のＢＳＨタンパク質の酵素阻害剤としては塩化カルシウム、酵素活性剤としては塩化ナトリウム、システィン、アスコルビン酸等が挙げられる。これに対し、ＢＢ536 酵素は塩化カルシウムでは活性が阻害されず、また、酵素活性剤は不明である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のＢＳＨタンパク質は、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産生し、前記のような性質を有し、また、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
このＢＳＨタンパク質は、上述したＢＳＨ説の検証に好都合な性質を有している。つまり、他の細菌が産生するＢＳＨタンパク質に比べ比活性が遙かに高く、ヒト腸内に存在する６種類の抱合胆汁酸を全て脱抱合する能力を有しているからである。また、グリシン抱合型胆汁酸に対する特異性は、ヒト胆汁中の抱合胆汁酸を効率良く脱抱合する用途に適している。なぜなら、ヒト胆汁中の抱合胆汁酸の構成比はグリシン抱合型胆汁酸：タウリン抱合型胆汁酸＝２：１であるが、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) が産生するＢＳＨタンパク質は、グリシン抱合型胆汁酸をタウリン抱合型胆汁酸よりも約２倍高い割合で脱抱合するからである。さらに、本発明のＢＳＨタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列から通常の遺伝子操作によって、ＢＳＨ活性のみを欠損させた変異体を作出できるので、ＢＳＨ説を検証する際に必須となる陰性対照株を容易に作出することもできる。
【００１７】
なお、本発明のＢＳＨタンパク質を産生するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) は、ヒトの腸内菌叢の主要な構成菌種であり、ヒトの腸内に定着して生息しているので、ヒトに与える影響の潜在的な能力が高いことが考えられ、また、従来よりヨーグルト等の発酵乳製品に幅広く使用されている乳酸菌であるので、安全性という点からも何ら問題はない。
【００１８】
本発明では、ＢＳＨタンパク質産生能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) を嫌気条件下で培養した後、菌体抽出液からＢＳＨタンパク質を分離、精製する。
【００１９】
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 菌体を培養するに際しては、嫌気性細菌用の培地であればどのような培地をも使用することができ、例えば、市販のＴＰＹ培地、Ｍ−17培地、ＭＲＳ培地、Briggs Liver液体培地等を使用して菌体を培養すれば良い。なお、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 菌体の培養は、嫌気条件下で行うことが好ましいので、市販の酸素吸着材で培養器内を嫌気条件にしたり、あるいは培養器内の酸素を強制的に窒素ガスや炭酸ガスに置換して、嫌気的な環境とすれば良い。また、培養は30〜37℃の温度範囲で10〜30時間培養すれば良い。
【００２０】
培養後の菌体を、中性領域に緩衝能を有する緩衝液を用いて洗浄し、培地成分を菌体成分から十分に除去する。洗浄後の菌体については再び緩衝液に懸濁して、適当な濃度の菌体懸濁液を調製する。菌体懸濁液については次に超音波処理等を行って、菌体抽出液（粗酵素画分）を調製する。菌体抽出液の調製方法には、超音波処理装置を用いる方法の他に、フレンチプレスを用いる方法、凍結融解による方法、リゾチーム(Lysozyme)等の酵素処理による方法等が挙げられるが、超音波処理が好ましい。
【００２１】
以上のようにして調製した粗酵素画分を、第一に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画する。陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムとしては、Pharmacia 社製のMonoQ カラム、また、DEAE-Sepharoseカラム等を使用することができる。本クロマトグラフィーはpH 7付近で実施することが好ましく、この時、ＢＳＨ活性画分は陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに吸着される。一旦カラムに吸着されたＢＳＨ活性画分は、その後、0.25〜0.35 M食塩を含む緩衝液によって当該カラムから溶出させることができる。
【００２２】
陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画されたＢＳＨ活性画分を、次に陽イオン交換クロマトグラフィーで分画することによって、ＢＳＨタンパク質を完全に精製することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、Pharmacia 社製のMonoS カラム、また、CM-Sepharoseカラム等を使用することができる。本クロマトグラフィーはpH4.5 〜６の間で実施することが好ましい。緩衝液のpHが６を超えると本クロマトグラフィーによる精製効果を期待することができず、また、緩衝液のpHを 4.5未満にすると酵素が失活し酵素活性の消失を招くことになる。
【００２３】
上記の条件下における陽イオン交換クロマトグラフィーでは、ＢＳＨ活性画分はカラムに保持されずに素通りして溶出される。それに対して、夾雑タンパク質の殆ど全てがカラムに保持され、したがって、ＢＳＨタンパク質を、ほぼ純粋なタンパク質として分離、精製することができる。
【００２４】
以上、説明したように、本発明においては、２種類のイオン交換クロマトグラフィーによる分画操作を組み合わせることによって、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) 、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) 等が産生するＢＳＨタンパク質を容易に分離、精製することができる。
【００２５】
また、本発明では、上述の方法で精製されるタンパク質がＢＳＨ活性を示すことを確認するために、次の２種類の試験を実施した。
一つは、部分精製酵素画分をＢＳＨ活性染色法に供する方法であり、もう一つはＮ末端アミノ酸配列分析による方法である。その結果、実施例で示すように、本発明で得られるタンパク質がＢＳＨ活性を有するＢＳＨタンパク質であることが明らかとなった。
【００２６】
さらに、本発明によって明らかにしたビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) 、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) 等が産生するＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を配列相同性分析に供した結果、本発明で明らかにしたビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) 、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) 等が産生するＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、他の細菌が産生するＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に対して29〜58％の相同性を示すものの、この配列は、これまでにいずれの学術論文、特許明細書等の文献、あるいは、EMBL、GenBank 、また、Swiss-PlotといったＤＮＡ、タンパク質の配列情報データベースにも登録されていない新規な配列であった。
【００２７】
以下に、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928(FERM P-10657)及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) が産生するＢＳＨタンパク質に関する実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。また、その他のＢＳＨタンパク質産生能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 菌株についても、以下の実施例に従って処理することにより、ＢＳＨタンパク質を同様に分離、精製することができる。
【００２８】
酵素活性の測定
本発明では、以下の２通りの方法を用いてＢＳＨ活性を測定した。
第１の方法では、酵素試料と抱合胆汁酸とを反応させた後、抱合胆汁酸から遊離したアミノ酸を、遊離アミノ基に対する修飾試薬であるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いて比色定量することでＢＳＨ活性を測定した。反応液は、0.18mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)、0.01mlの基質溶液(200mM抱合胆汁酸混合溶液) 、及び0.01mlの酵素試料から構成されている。緩衝液と基質溶液とを混合した後、酵素試料を添加することで反応を開始させ、37℃で10分間反応させた後、反応液の0.05mlをサンプリングし、ここに0.05mlの15％(w/v) トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液を加えて反応を停止させた。反応液の残りの0.15mlは、さらに37℃で反応を継続させ、30分間反応させた後、反応液の0.05mlをサンプリングし、ここに0.05mlの15％ＴＣＡ溶液を加えて反応を停止させた。このようにして得られた２つの試料中の遊離アミノ酸量をＴＮＢＳ法(Barret,D. and Edwards,B.F., Methods Enzymol., vol.45, pp.354-373, 1976)で測定し、反応開始後10〜30分の20分間に抱合胆汁酸から遊離したアミノ酸量を計算した。
【００２９】
遊離アミノ酸量の測定は、以下の手順で行った。0.60mlの試料溶液に対し、0.30mlの４％(w/v) 炭酸水素ナトリウム溶液、及び0.40mlの 0.1％(w/v) ＴＮＢＳ溶液を加えて反応を開始し、暗所中、50℃で20分間インキュべートした。反応後、0.25mlの２％(w/v) ＳＤＳ溶液、及び0.25mlの1N塩酸溶液を加えて反応を停止させた。反応停止後１時間以内に、反応液の340 nmにおける吸光度を測定した。なお、標準物質として、10〜40n moles のグリシンを使用した。
【００３０】
上記の反応条件において、１分間に１μmoleのアミノ酸を遊離するのに必要な酵素活性量を１単位(1 unit)と定義した。また、200mM 抱合胆汁酸混合溶液はタウロコール酸ナトリウム(12.9mg/ml) 、タウロデオキシコール酸ナトリウム(8.4mg/ml)、タンロケノデオキシコール酸ナトリウム(12.5mg/ml) 、グリココール酸ナトリウム（22.4mg/ml)、グリコデオキシコール酸ナトリウム (15.1mg/ml)、及びグリコケノデオキシコール酸ナトリウム(21.7mg/ml) から構成されている。
ＴＮＢＳ法では、ＤＴＴの存在下で酵素反応を行った試料中のアミノ酸量を測定することができなかった（ＤＴＴがＴＮＢＳと反応し、バックグラウンドが上昇するため）。
【００３１】
そこで第２の方法では、ニンヒドリンによる比色定量法(Lee,Y.P. and Takahashi,T., Anal. Biochem., vol.14, pp.71-77, 1966) を用いることによって、ＤＴＴを含む試料中のアミノ酸量を定量した。
0.1 mlの試料に1.9 mlのニンヒドリン試薬を加えた試験管を十分撹拌した後、沸騰水(100℃) 中で14分間反応させた。反応後、試験管を水道水中で３分間保持して反応液を冷却した後、１時間以内に反応液の570 nmにおける吸光度を測定した。標準試料には、10〜40n moles のグリシンを使用した。なお、試料がＴＣＡ及びＤＴＴを含む場合は、標準試料にも同量のＴＣＡ及びＤＴＴを加えた。
【００３２】
上記の反応条件において、１分間に１μmoleのアミノ酸を遊離するのに必要な酵素活性量を１単位(1 unit)と定義した。また、ニンヒドリン試薬(1.9ml) は、0.5 mlの１％(w/v) ニンヒドリン溶液を含む0.5Mクエン酸緩衝液(pH 5.5)、 1.2mlのグリセロール、及び 0.2mlの0.5Mクエン酸緩衝液(pH 5.5)から構成されている。
【００３３】
【実施例１】
ＢＳＨタンパク質の精製
市販のＭ-17 培地を用いてビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT2928(FERM P-10657) の菌体を37℃で１夜、嫌気培養した。Ｍ-17 培地には、さらにアスコルビン酸(5g/リットル) とシステイン(0.3g/リットル) を添加した。また、嫌気培養は、市販の酵素吸着剤（AnaeroGen, OXOID社製) を用いて行った。１夜培養後の培養液の濁度（600nm における吸光度) は２から３の範囲であった。
菌体を培養後、培養液を遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)で洗浄した後、再び遠心分離して菌体を回収した。この洗浄操作を２回行った後、菌体を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)に再懸濁し、菌体懸濁液のＡ600 値を15に調整した。
【００３４】
次に、菌体懸濁液を氷上で超音波処理し、菌体抽出液を調製した。菌体破砕条件は、装置(Model VC375；Sonics and Materials Inc.)の出力が５、Duty cycleが50％、処理時間は３分とした。破砕後の菌体懸濁液を25,000×g で10分間遠心分離し、上清を菌体抽出液とした。この菌体抽出液は、使用前まで−20℃で保存した。
【００３５】
ＢＳＨタンパク質を精製する最初のステップとして、Mono Qカラム(0.5×5cm; Pharmacia社製）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。緩衝液には、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)を使用した。また、カラムに吸着したタンパク質の溶出には、上記の緩衝液に1.0M塩化ナトリウムを加えた緩衝液を使用した。流速は1.0ml/分とした。
菌体抽出液をカラムに添加した後、10mlの緩衝液でカラムを洗浄した。次に、溶出用の緩衝液を用いて塩化ナトリウムの濃度勾配を形成し、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。ＢＳＨ活性画分は、約0.3M塩化ナトリウムを含む緩衝液によってMono Qカラムから溶出された。
【００３６】
陰イオン交換クロマトグラフィーで得られたＢＳＨ活性画分を、次にMono Sカラム(0.5×5cm; Pharmacia社製) を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。緩衝液には、0.05M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)を使用した。また、カラムに吸着したタンパク質の溶出には、上記の緩衝液に1.0M塩化ナトリウムを加えた緩衝液を用いた。流速は1.0ml/分とした。
【００３７】
Mono Qクロマトグラフィーで得られたＢＳＨ活性画分を９倍量の緩衝液(0.05M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)) で希釈した後、0.05M 酢酸溶液を用いて溶液のpHを 5.0に調整してカラムに添加する試料とした。試料をカラムに添加した後、10mlの緩衝液でカラムを洗浄した。次に、溶出用の緩衝液を用いて塩化ナトリウムの濃度勾配を作成し、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。この条件において、ＢＳＨ活性画分はMono Sカラムに吸着されずに素通りした。
【００３８】
以上のように、洗浄菌体を超音波処理して得た菌体抽出液を２種類のイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画することにより、比較的容易にＢＳＨタンパク質を分離、精製することができた。それぞれ600 mlの培養液から精製を開始し、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928(FERM P-10657)の菌体の場合は 1.0mg及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) の菌体の場合は 1.7mgの精製酵素を得た。活性回収率はそれぞれ17％及び24％であり、最終精製酵素標品の比活性はそれぞれ21U/mg及び63U/mgであった。
【００３９】
【試験例１】
実施例１で精製したタンパク質がＢＳＨタンパク質であることの確認：SDS-PAGE活性染色法
対象試料に含まれるタンパク質をSDS-PAGE法で分離した後、Coleman and Hudsonの方法 (Appl. Environ. Microbiol., vol.61, pp.2514-2520, 1995)により、ゲル上でＢＳＨタンパク質のみを活性染色した。この方法は、SDS-PAGEにより変性した酵素タンパク質をTriton X-100処理により再構成し、その後、ゲルを抱合胆汁酸溶液を含む酸性緩衝液中でインキュべートすることにより、ＢＳＨタンパク質バンド上に白色沈澱（脱抱合胆汁酸の沈澱）を形成させる方法である。
【００４０】
12.5％アクリルアミドゲルを用いて試料中のタンパク質をSDS-PAGE法で分離した後、ゲルを再構成緩衝液中で室温、一夜インキュべートした。その後、ゲルを基質溶液に移し、室温で１時間から数時間インキュべートした。再構成緩衝液の組成は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)、１％(v/v) Triton X-100、及び10mM DTTであり、また、基質溶液の組成は0.5M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5)、10mM DTT、1mM EDTA、及び10mMグリコデオキシコール酸ナトリウムである。  Mono Qクロマトグラフィー後の部分精製画分をSDS-PAGEした後、活性染色法に供した結果、精製されたタンパク質とSDS-PAGE上の移動度が同一のタンパク質バンド上に白色沈澱が形成された。この結果から、本発明で精製したタンパク質がＢＳＨ活性を有することが確認された。
【００４１】
【試験例２】
実施例１で精製したタンパク質がＢＳＨタンパク質であることの確認：Ｎ末端アミノ酸配列分析
精製したＢＳＨタンパク質をSDS-PAGEで処理した後、Matsudairaの方法 (J. Biol. Chem., vol.262, pp.10035-10038, 1987)に従ってゲル内のＢＳＨタンパク質をPVDF膜に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析用の試料とした。転写の際にはTowbin緩衝液を使用し、150Vの定圧条件下で１時間30分通電した。
【００４２】
転写操作後のPVDF膜をCBB 染色し、目的のＢＳＨタンパク質バンドを切り出した。この試料を直接、Applied Biosystem 社のProtein Sequencer Model 476Aで分析した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)SBT-2928(FERM P-10657) の菌体、及び Bifidobacterium longum SBT-2933R(FERM P-8743) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、以下のように決定した。両菌体に由来するＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は同一のものであった。
Xaa-Thr-Gly-Val-Arg-Phe-Xaa-Asp-Asp-Glu-Gly-Asn-Thr-Tyr-Phe-Gly-Arg-Asn-Leu-Asp-Trp-Ser-Phe-Ser-Tyr-Gly-Glu-Thr-Ile-Leu-Val-Thr-Pro-Arg-Gly-Tyr-His-（Xaa は未同定のアミノ酸)(配列表配列番号2)。
【００４３】
今回決定したＮ末端アミノ酸配列をもとに、GenBank 及びEMBLのＤＮＡデータベース、及びSwiss-Plotのタンパク質データベースに対してホモロジー検索を実施した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)SBT-2928(FERM P-10657) の菌体、及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)SBT-2933R(FERM P-8743) の菌体由来のＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、ＤＮＡデーターベースに登録されている Lactobacillus johnsonii のＢＳＨ遺伝子から推定されるＮ末端アミノ酸配列（NCBI Accession No. AF054971)に対して62％の相同性を示した。また、ＤＮＡデーターベースに登録されている Lactobacillus acidophilus のＢＳＨ遺伝子から推定されるＮ末端アミノ酸配列（NCBI Accession No. AF091248)に対しても60％の相同性を示した。さらに、これまでに報告されている Lactobacillus plantarum のＢＳＨ遺伝子から推定されるＮ末端アミノ酸配列（NCBI Accession No. S51638,（Christiaens, H., Leer, R. J., Pouwels, P. H. and Verstraete, W. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3792-3798, 1992)) に対しては56％の相同性を示し、また、 Clostridium perfringens のＢＳＨ遺伝子から推定されるＮ末端アミノ酸配列（NCBI Accession No. U20191)に対しては34％の相同性を示した。
【００４４】
以上のＮ末端アミノ酸配列分析、及びホモロジー検索の結果から、本発明のＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列が、これまでに報告されている他のＢＳＨタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に相同性を示すことが明らかとなった。よって、本発明のタンパク質がＢＳＨタンパク質であることが確認できた。
【００４５】
【試験例３】
ＢＳＨタンパク質の分子量の測定
10％アクリルアミドゲルを用いた通常のSDS-PAGE処理により、変性状態でのＢＳＨタンパク質の分子量を測定した。これによると、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質の分子量は、共に37 kDa±2 kDa と測定された。
【００４６】
次に、通常のゲル濾過法を用いてビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質の非変性状態での分子量を測定した。ゲル濾過の条件は、カラムにはSupelco 社製のSigma Chrom GFC-1300カラムを使用して、移動相は0.15M 塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)とし、流速は0.5ml/分とした。分子量測定の標準物質には、Sigma 社製の分子量測定キット(MW-1000) を使用した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質の非変性状態での分子量は、共に130 kDa ±10 kDaと測定された。
【００４７】
【試験例４】
ＢＳＨタンパク質の基質特異性
基質飽和の条件下（基質の最終濃度は10mM）にて、ヒトの主要６種類の抱合胆汁酸及びタウロウルソデオキシコール酸とタウロヒオデオキシコール酸に対するビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質の基質特異性を検討した。なお、ＢＳＨ活性の測定は、 10mM ＤＴＴ存在下で、先に説明したニンヒドリンによる比色測定法により行った。結果を表１に示す。
【００４８】
表１は、グリコケノデオキシコール酸に対する活性値を 100とした場合の相対活性値で示した。
【表１】
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【００４９】
両者共、極めて類似した基質特異性を示し、グリシン抱合型胆汁酸に対する活性値がタウリン抱合型胆汁酸に対する活性値よりも約２倍高かった。また、両者とも、ケノデオキシコール酸に対する活性値がコール酸及びデオキシコール酸に対する活性値よりも高かった。
さらに、これらのＢＳＨタンパク質はヒト腸内からは検出されないタウロウルソデオキシコール酸及びタウロヒオデオキシコール酸に対しても脱抱合活性を示すことが明らかとなった。
【００５０】
【試験例５】
ＢＳＨタンパク質のKm値
ヒト腸内にみられる６種類の抱合胆汁酸に対して、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質のKm値を測定した。また、ヒト腸内にみられる３種類の抱合胆汁酸に対して、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2933R (FERM P-8743) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質のKm値を測定した。Km値は、異なる基質濃度条件下における反応初期速度を基に測定する際に通常用いられる方法によって測定した。結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
Km値からも、グリシン抱合型胆汁酸に対する親和性が、タウリン抱合型胆汁酸に対する親和性よりも高いことが明らかになった。また、ケノデオキシコール酸に対する親和性がコール酸及びデオキシコール酸に対する親和性よりも高いことが明らかになった。
【００５３】
【試験例６】
酵素阻害剤の影響
ＢＳＨ活性に対する酵素阻害剤の影響及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928(FERM P-10657)の菌体が産生するＢＳＨタンパク質に対する種々の酵素阻害剤の影響を検討した。酵素活性の測定は、一定濃度の酵素阻害剤を反応混合液に加えた以外は、先に説明した方法で実施した。結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
本発明のＢＳＨタンパク質は、ＳＨ酵素の阻害剤であるヨード酢酸、過ヨウ素酸、Ｎ−エチルマレイミド、塩化水銀、p-chloromercuribenzoic acid(ｐＣＭＢＡ) によって、酵素活性が60〜 100％の範囲で阻害された。なお、塩化水銀による酵素活性の阻害は、 10mM ＤＴＴの添加によって酵素活性が完全に回復した。金属イオン類では、塩化銅、塩化カルシウムが酵素活性を阻害した。また、硫酸マグネシウムが酵素活性を阻害したものの、塩化マグネシウムは酵素活性を阻害しなかったことから、硫酸マグネシウムの阻害活性はマグネシウムイオンに由来するものではなく、硫酸イオンに由来するものであることが考えられた。
金属イオン依存性酵素の阻害剤であるＥＤＴＡ及びセリンプロテアーゼ阻害剤のＰＭＳＦは、本酵素活性に対して弱い阻害活性を示した。
【００５６】
【試験例７】
ＢＳＨ活性に対するＳＨ試薬の影響
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質に対するＳＨ試薬の影響を検討した。本試験例では、ＳＨ試薬としてＤＴＴを使用した。酵素活性に対するＤＴＴの影響は、酵素抽出時、及び酵素活性測定時の２点に関して検討を実施した。
10mMＤＴＴ存在下、あるいは非存在下でＢＳＨ活性画分を超音波処理（実施例１で説明した方法による）によって抽出した後、10mMＤＴＴの存在下、あるいは非存在下で、先に説明した方法により酵素活性を測定した。結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
ＤＴＴ非存在下で酵素を抽出した場合、酵素活性測定時にＤＴＴを添加することによって酵素活性値が約８倍上昇した。一方、ＤＴＴ存在下で酵素を抽出した場合は、酵素活性測定時のＤＴＴ添加の有無に関わらず、一定（ＤＴＴ非存在下で酵素を抽出し、ＤＴＴ存在下で酵素活性を測定した場合に得られる活性値の約 2.7倍）の酵素活性値を得た。これらの結果から、ＤＴＴには超音波処理に起因する酵素の酸化を抑制する作用、及び超音波処理時に酸化変性したＢＳＨタンパク質を還元することで酵素活性を再活性化する作用のあることが明らかになった。
なお、ＤＴＴ以外のＳＨ試薬としては、メルカプトエタノールが同様な効果を示した。
【００５９】
【試験例８】
ＢＳＨ活性に対する塩化ナトリウムの影響
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質に対する塩化ナトリウムの影響を検討した。ＢＳＨ活性測定用の反応液に、最終濃度が50mM、100mM 、500mM となるように塩化ナトリウムを添加した後、ＢＳＨ活性を先に説明した方法で測定した。その結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
いずれの濃度においても、塩化ナトリウムはＢＳＨ活性を約 1.5倍活性化した。
【００６２】
【試験例９】
ＢＳＨ活性に対するpH及び温度の影響
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体が産生するＢＳＨタンパク質のＢＳＨ活性に対するpH及び温度の影響を調べた。酵素活性は、先に説明した方法で測定した。その結果、図１及び２に示すように、本発明のＢＳＨタンパク質のＢＳＨ活性の至適pHは６付近に存在し、ＢＳＨ活性はpH 4.5〜 7.6の範囲で安定であった。また、図３及び４に示すように、本発明のＢＳＨタンパク質のＢＳＨ活性の至適温度は40℃付近に存在し、ＢＳＨ活性は４〜37℃の範囲で安定であった。
なお、温度安定性はpH６の条件で酵素溶液を30分間保存した後に残存する酵素活性量を測定することで評価し、また、pH安定性は、各pH条件に酵素溶液を30分間保存した後に残存する酵素活性量を測定することで評価した。
【００６３】
【試験例１０】
ＢＳＨタンパク質をコードする遺伝子の取得と遺伝子配列分析
定法に従ってビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) の菌体の染色体ＤＮＡを調製した後、制限酵素(Sau3A) を用いてＤＮＡを断片化し、平均ＤＮＡ長が 3kbであるようなＤＮＡバンクを調製した。その後、定法に従ってＤＮＡ断片を大腸菌に組み込み、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERMP-10657) の菌体の染色体ＤＮＡ断片が組み込まれた大腸菌を多数取得した。
【００６４】
次に、抱合胆汁酸を含有させた寒天培地によるスクリーニング法(Appl.Environ, Microbiol.,vol.58, pp.3792-3798,1992)で、ＢＳＨタンパク質をコードしているＤＮＡ断片が組み込まれた大腸菌を選択した。当該ＤＮＡ断片が組み込まれた大腸菌は、この寒天培地上で生育し、コロニーの周辺に脱抱合胆汁酸の結晶からなるハローを形成するので、このハローの形成を指標としてＢＳＨ遺伝子断片が組み込まれた大腸菌を選択した。
選択された大腸菌に組み込まれたＤＮＡ断片を、さらに、定法に従って大腸菌から単離、増幅した後、遺伝子配列分析を実施した。その結果、配列表配列番号１に示した遺伝子配列、及び遺伝子配列から推測されるアミノ酸配列を得た。
【００６５】
【発明の効果】
本発明により新規な抱合胆汁酸脱抱合酵素（ＢＳＨ）タンパク質が提供される。本発明のタンパク質はＢＳＨ説の検証に好都合な酵素学的性質を有し、化学試薬として、あるいはヒト血清コレステロール濃度を調節する機能を有する飲食品や医薬等の素材として用いられる。
従来、ヒト胆汁中のグリシン抱合型胆汁酸に対するタウリン抱合型胆汁酸の比は２：１であることが知られている。従って、本発明のＢＳＨタンパク質は、その脱抱合性からみて、他の抱合胆汁酸脱抱合酵素（ＢＳＨ）、特にＢＢ536 酵素よりもヒト胆汁を効率的に脱抱合することができ、ヒトに投与する場合その投与量を最小限にすることができる。
【００６６】
また、本発明のＢＳＨタンパク質は、多量体において安定性が高い。酵素精製の過程において、ＢＢ536 酵素は多量体が不安定であるので単量体に変換されてしまうのに対し、本発明のＢＳＨタンパク質は生理条件下で存在すると考えられる４量体の構造を維持し、精製の前後で酵素の性質に大きな差異はみられない。このような酵素精製時及び酵素保存時における酵素タンパク質の安定性が高いことは、酵素の製造上、及び実験上の取り扱いを容易とするものであり、性質の安定した酵素標品を製造し、種々の生命科学の実験に使用することができる。
【００６７】
さらに、本発明のＢＳＨタンパク質は、その酵素活性が塩化カルシウムで阻害されるので、食品添加物として認められている物質を用いて酵素活性を抑制できる。これに対し、ＢＢ536 酵素は、このような物質で酵素活性を阻害することができない。
本発明のＢＳＨタンパク質のこのような塩化カルシウムに対する感受性は、この酵素タンパク質を食品等に利用する場合、その用途、及び使用方法を拡大する上で有用である。
【００６８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】試験例９のＢＳＨタンパク質のＢＳＨ活性の至適pHを示す。
【図２】試験例９のＢＳＨタンパク質のＢＳＨ活性のpH安定性を示す。
【図３】試験例９のＢＳＨタンパク質のＢＳＨ活性の至適温度示す。
【図４】試験例９のＢＳＨタンパク質のＢＳＨ活性の温度安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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