(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖および胞子形成可能な、染色体を有するバチルス株であって、該染色体中では、
a)少なくとも１つの標的遺伝子が、別の細菌に由来する相同遺伝子で置き換えられており、
b)人為的に導入されたリポーター遺伝子が存在し、該リポーター遺伝子は、相同遺伝子の発現産物の活性レベルの変化に関連して該リポーター遺伝子の発現が増加又は低下するように発現される、
前記バチルス株であって、ここで該バチルス株中では、
A） a)spoIIIE遺伝子が、別の細菌に由来する相同体で置き換えられており、かつ、
b)それぞれプロモーターに連結し、かつ胞子形成時にσFの作用に応答する２つのリポーター遺伝子が存在し、第１のリポーター遺伝子は、spoIIIEの機能が低下するとプレスポア区画内にトラップされるDNAのセグメントに位置しており、第２のリポーター遺伝子は、該セグメントの外側に位置している；又は
B） a)細胞分裂遺伝子が、別の細菌に由来する相同体で置き換えられており、かつ、
b)２つの人為的に導入されたリポーター遺伝子が存在し、第１のリポーター遺伝子は、活性なσFまたはσE因子に依存するプロモーターを有し、第２のリポーター遺伝子は、(不活性な)σFまたはσE因子の合成を測定可能にするものである；又は
C） 該株がプレスポア染色体の移動を阻止するspoIIIE遺伝子の突然変異によって改変されており、かつ、
a)spoOJ遺伝子が別の細菌に由来する相同体で置き換えられており、
b)１つまたは２つのリポーター遺伝子が存在し、第１のリポーター遺伝子は、σF因子に依存し、かつSpoOJ機能が低下するとトラッピングが増加してプレスポアにおける発現が増加する位置に配置されたプロモーターを有し、および／または第２のリポーター遺伝子は、σF因子に依存し、かつSpoOJ機能が低下するとトラッピングが減少してプレスポアにおける発現が低下する位置に配置されたプロモーターを有するものである、
前記バチルス株。
【請求項２】
遺伝子が、DNA複製、RNA合成、タンパク質合成、細胞壁合成、輸送または細胞分裂に関与するものである、請求項１記載のバチルス株。
【請求項３】
２つの人為的に導入されたリポーター遺伝子が存在し、該リポーター遺伝子は、相同遺伝子の発現産物の活性レベルの変化に関連して一方の発現が増加し、かつ他方の発現が低下するように発現される請求項１又は２記載のバチルス株。
【請求項４】
spoIIIE遺伝子が、肺炎連鎖菌由来の相同遺伝子で置き換えられている、A）の状態における請求項1記載のバチルス株。
【請求項５】
枯草菌株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバチルス株。
【請求項６】
抗生物質としての活性について薬剤を評価する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバチルス株を薬剤の存在下でインキュベートし、リポーター遺伝子の発現を観察することを含んでなる前記方法。
【請求項７】
薬剤の存在下で、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバチルス株に胞子形成を誘導する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
薬剤がバチルス種のSpoIIIE機能を阻害するか否かを判定する方法であって、薬剤の存在下で、A）の状態における請求項１または４記載のバチルス株に胞子形成を誘導し、第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察することを含んでなる前記方法。
【請求項９】
薬剤がバチルス種の細胞分裂を阻害するか否かを判定する方法であって、薬剤の存在下で、B）の状態における請求項１記載のバチルス株に胞子形成時と同様に非対称分裂を誘導し、第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察することを含んでなる前記方法。
【請求項１０】
薬剤がバチルス種のSpoOJ機能を阻害するか否かを判定する方法であって、薬剤の存在下で、C）の状態における請求項１記載のバチルス株に胞子形成時と同様に非対称分裂を誘導し、第１および／または第２リポーター遺伝子の発現を観察することを含んでなる前記方法。
【請求項１１】
バチルス株に胞子形成を誘導し、非対称細胞分裂の直前に薬剤と接触させる、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のバチルス株のパネルであって、該パネルの異なるメンバーでは、遺伝子が、異なる細菌に由来する相同遺伝子で置き換えられている、前記パネル。
【請求項１３】
抗生物質としての活性について薬剤を評価する方法であって、請求項１２記載のパネルのメンバーを薬剤の存在下でインキュベートし、該パネルの異なるメンバーにおけるリポーター遺伝子の発現を観察することを含んでなる前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のバチルス株を薬剤の存在下でインキュベートし、１つ以上のリポーター遺伝子の発現を観察することにより、薬剤がバチルス株の増殖を抑制するとの判定を行い、該薬剤を抗生物質として使用する、ことを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
全細胞アッセイは、染色体分配と細胞分裂に関与する枯草菌(B. subtilis)タンパク質の特異的なインヒビターについて知られている。染色体分配と細胞分裂を阻害する特性は、実際のまたは潜在的な抗微生物特性の指標となる。本発明者は、このようなアッセイを３種類考案しており(WO97/00325、WO98/26087およびWO98/26088に記載)、これらのアッセイについて以下に要約および言及する。
【０００２】
あらゆる染色体分配および細胞分裂機能を阻害する新規化合物は、標的となる該機能が高度に保存されていると考えられるため、重要な病原体を含む広い範囲の細菌に対して広範な活性スペクトルを有する可能性がある。しかしながら、発見された化合物中には、枯草菌タンパク質に対して比較的特異的であると判断されるものもあると考えられ、このような場合には、有用な汎用抗微生物剤にはならない。
【０００３】
任意の微生物の特定遺伝子に対するインヒビターの全細胞アッセイにおいても、同様の問題が生じている。この問題は、特定の株または微生物の特定遺伝子に対するインヒビターが、該株に特異的であったり、あるいは、かなり広い範囲の微生物に作用する阻害特性を有していたりする点にある。本発明は、全細胞アッセイに使用する微生物の標的遺伝子を、異なる生物(例えば、より直接的な目的微生物)に由来する相同遺伝子で置き換えることにより、上記問題に取り組むものである。
【０００４】
従って本発明は、態様の１つにおいて、染色体を有する微生物を提供するものであり、該染色体中では、
a)少なくとも１つの遺伝子が、別の微生物に由来する相同遺伝子で一部または完全に置き換えられており、
b)人為的に導入されたリポーター遺伝子が存在し、該リポーター遺伝子は相同遺伝子の発現産物に関連して発現されるものである。
【０００５】
別の態様では、本発明は、抗生物質としての活性について薬剤を評価する方法を提供する。この方法は、上記微生物を薬剤の存在下でインキュベートし、リポーター遺伝子の発現を観察することを含むものである。
【０００６】
微生物は、例えば酵母であってよく、より好ましくは細菌であってよい。細菌は、適切な条件下で増殖および胞子形成可能であって、遺伝子構築物を作製し得るバチルス種であってよい。枯草菌は操作が簡便であり、かつ十分に特性決定されているため好適である。
【０００７】
相同遺伝子とは、別の微生物に由来する機能的に等価な遺伝子である。本発明の微生物では、少なくとも１つの遺伝子(標的遺伝子)が別の微生物に由来する相同遺伝子で一部または完全に置き換えられている。好ましくは、標的遺伝子は、多くの異なる細菌種または他の微生物種間で十分に保存されている遺伝子である。相同遺伝子は、in vivoで発現し得るように機能可能な形で組み込まれることが必要である。標的遺伝子が相同遺伝子で一部または完全に置き換えられている場合には、相同遺伝子が、標的遺伝子の発現産物とは幾つかの点で異なる発現産物を形成し得ることが必要である。適切な標的遺伝子は、DNA複製、RNA合成、タンパク質合成、細胞壁合成、輸送および細胞分裂に関与する遺伝子を含む。
【０００８】
枯草菌等のバチルス種である微生物の場合には、細胞分裂遺伝子としては、divIB(ftsQとも称する)、divIC、divIVA、ftsA、ftsL(mraRとも称する)、ftsZ、pbpB、並びにspoOJおよびspoIIIE、およびその他の遺伝子(既知遺伝子および今後発見される遺伝子の双方)が挙げられる。これらの細胞分裂遺伝子は、多くの細菌種間で実質的に保存されているため、これらの遺伝子工学的に作製されたバチルス株は適度な効率で増殖および胞子形成を行うものと考えられる。相同遺伝子は、他のバチルスまたはクロストリジウムやリステリアといった近縁微生物から取得することができる。より好ましくは、相同遺伝子は、ブドウ球菌や連鎖球菌等の病原性細菌から取得してもよい。枯草菌に分子遺伝学的方法を用いることで、任意の遺伝子を別の細菌に由来する相同遺伝子で簡単に置き換えることができる。
【０００９】
人為的に導入されたリポーター遺伝子は、当該株中に天然には存在しない遺伝子であり、遺伝子操作によって導入されたものである。リポーター遺伝子は、発現されると容易に検出または観察される表現型をもたらす遺伝子である。例えば、発現されるタンパク質は、基質に作用させると、例えば発色したり、化学発光したり、または蛍光を発することで容易に観察される産物をもたらす酵素である。バチルス種または他の微生物において発現可能なリポーター遺伝子は周知であり、文献に記載されている。リポーター遺伝子は好ましくは、その産物を容易かつ同時にアッセイし得るように選択する。lacZは、枯草菌において10年以上にわたって良好に使用されており、β-ガラクトシダーゼによる加水分解時に発色産物または蛍光産物を生成する有用な基質には一定の範囲がある。大腸菌のuidA遺伝子は、同様の目的で近年利用されているものであり、遺伝子産物であるβ-グルクロニダーゼ(glucoronidase)に利用できる基質の範囲はβ-ガラクトシダーゼの場合と同様である。
【００１０】
１つの例では、２つの異なる蛍光原基質を用いて、２つのリポーター遺伝子の活性を単一の反応で同時にアッセイする。
【００１１】
微生物のインキュベーション時(例えば、細胞分裂時または胞子形成時)に、相同遺伝子の発現産物(例えば、細胞分裂タンパク質)の活性に関連してリポーター遺伝子を発現させる。例えば、該タンパク質の活性低下を、リポーター遺伝子の発現増加または発現低下と関連させればよい。２つのリポーター遺伝子を用いる場合、該タンパク質の活性レベルの変化に関連して一方の発現が増加し、かつ他方の発現が低下するのが好ましい。
【００１２】
本発明の好適なアッセイ方法には、上記バチルス株に、推定抗微生物剤の存在下で胞子形成を誘導することが含まれる。好ましくは、バチルス株を非対称細胞分裂の直前に薬剤と接触させる。薬剤を大規模にスクリーニングするには、バチルス株のサンプルを消耗培地(exhaustion medium)中で培養して胞子形成を促進させればよく、その際、薬剤を添加したマイクロタイタープレートのウェル内で培養を行うか、または大量に培養してから１つ以上の異なる薬剤をそれぞれ含むマイクロタイタープレートのウェルへ分注すればよい。適切なインキュベーションを行った後、１つ以上のリポーター遺伝子の発現を観察する。例えば、２つのリポーター遺伝子の発現産物が異なる酵素である場合には、２つの酵素に対する基質をマイクロタイタープレートのウェルへ添加すればよく、酵素活性の化学発光産物または蛍光産物または発色産物等を観察する。
【００１３】
このような株を使用することにより、下記のような複数の実際的な結果が得られる：
i)親である微生物(例えば、バチルス)のタンパク質産物ではなく、病原体のタンパク質産物に作用するインヒビターが同定し得るようになる。
【００１４】
ii)細胞分裂に対するインヒビターをアッセイする場合に、インヒビターの特異標的の同定が容易になる。細胞分裂遺伝子が他の生物由来の相同体で系統的に置き換えられている一連の株に対して候補化合物をスクリーニングすることにより、阻害化合物の特異標的が明らかになる。従って、例えば、親株である枯草菌を阻害するが、ftsZの黄色ブドウ球菌(S. aureus)相同体を保有する誘導株を阻害しない化合物の検出は、FtsZタンパク質を標的とする化合物を強く示唆することになる。
【００１５】
iii)所定の標的遺伝子が他の生物由来の遺伝子で系統的に置き換えられている株のパネル(panel)からも、潜在的なインヒビターのそれぞれについて活性スペクトルに関する情報が得られる。例えば、枯草菌SpoIIIEタンパク質を阻害することが判明した化合物には、黄色ブドウ球菌相同体を有する株には作用しないものもあり、また、種に特異的な阻害は示さず、異なる生物に由来する一定範囲の遺伝子産物に対して作用するものもある。このような試験によって、新規インヒビターが広範な活性スペクトルを有することを保証するための有用な手段が提供される。
【００１６】
従って、別の態様では、本発明は上記微生物のパネルを提供する。このパネルの異なるメンバーでは、遺伝子が、異なる微生物に由来する相同遺伝子で一部または完全に置き換えられている。本発明はまた、抗生物質としての活性について薬剤を評価する方法も包含する。この方法は、該パネルのメンバーを薬剤の存在下でインキュベートし、該パネルの異なるメンバーにおけるリポーター遺伝子の発現を観察することを含むものである。また、細菌を死滅させるまたは細菌の増殖を抑制する方法も提供する。この方法は、細菌を、本発明に従う微生物の増殖を抑制する薬剤に接触させることを含むものである。
【００１７】
WO97/00325によれば、spoIIIEが不活化されると生じる特有の胞子形成表現型によって、非常に有力かつ特異的なアッセイの可能性が示される。機能的なspoIIIEが存在しない場合には、染色体がプレスポア（prespore）区画の内側に一部トラップされ、外側にも一部トラップされるが、プレスポア特異的転写因子σFは正常に活性化される。σFに依存するリポーター遺伝子は、染色体の一定の場所に位置すると発現し、その他の場所では阻止される。本発明は、それぞれプロモーターに連結し、かつ胞子形成時にσFの作用に応答する２つのリポーター遺伝子を含む染色体を有するバチルス株を提供する。第１のリポーター遺伝子は、spoIII機能が低下するとプレスポア区画内にトラップされるDNAのセグメントに位置しており、第２のリポーター遺伝子は、該セグメントの外側に位置している。バチルス株を使用したアッセイ方法も記載する。
【００１８】
枯草菌spoIIIE遺伝子は、枯草菌の胞子形成時に非対称の位置にある隔壁を通してプレスポア染色体が転座するのに必要とされるものである。これは、一見したところ非常に特殊なメカニズムのように思われるが、spoIIIE様遺伝子は細菌間で高度に保存されている。枯草菌遺伝子については、枯草菌の野生型細胞およびspoIIIE突然変異細胞を致死濃度以下のDNA複製インヒビターに暴露する実験によって、より一般的な機能が明らかにされている(SharpeおよびErrington, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8630-8634)。このような条件下では、染色体DNAが分裂隔壁に捕捉される確率が増加する。野生型細胞はこの状態から回復することが可能であったが、spoIIIE突然変異体では、染色体がトラップされたままであり、従ってこれらの突然変異体はこのようなインヒビターに対して感受性が高かった。
【００１９】
染色体DNAの分裂隔壁からの移動がSpoIIIEタンパク質の一般的な機能であって、該タンパク質の胞子形成時の作用が、まさにこの機能が顕著に表れたものであるとすると、胞子形成を行わない細菌に由来するspoIIIE様遺伝子は、枯草菌のspoIIIE突然変異体の欠陥を機能上補うことが可能であり、その胞子形成能を回復させることが可能である。
【００２０】
本発明によれば、spoIIIE遺伝子は別の細菌に由来する相同遺伝子で一部または完全に置き換えられている。肺炎連鎖菌(Streptococcus pneumoniae)由来の相同遺伝子の使用については、後述の実施例に記載する。
【００２１】
WO98/26087によれば、プレスポア染色体の配向に及ぼすspoOJ突然変異の作用と、spoIIIE突然変異体をバックグラウンドとした検出能からは、spoOJ機能に対するインヒビターの非常に特異的な全細胞アッセイの可能性が示される。プレスポア中に存在する染色体DNAの所定のセグメントはいずれも、転写因子σFで制御されるリポーター遺伝子を用いることによって検出することができ、該転写因子は、小型のプレスポア区画(染色体分配時の摂動による影響を受けない過程)においてのみ活性化されるものである。
【００２２】
このようにWO98/26087は、下記の改変を含む染色体を有するバチルス株を提供するものである：
a)プレスポア染色体の移動を阻止するspoIIIE遺伝子の突然変異、
b)spoOJ機能の喪失によって胞子形成が阻止されるのを防ぐsoj遺伝子内の突然変異、並びに
c)σF因子に依存し、かつspoOJ機能が低下するとトラッピングが増加してプレスポアからの発現が増加する位置に配置されたプロモーターを有する第１リポーター遺伝子、および／または
d)σF因子に依存し、かつspoOJ遺伝子機能が低下するとトラッピングが減少してプレスポアにおける発現が低下する位置に配置されたプロモーターを有する第２リポーター遺伝子。
【００２３】
本発明は、spoOJ遺伝子を別の細菌に由来する相同体で置き換えたこの種のバチルス株を提供する。
【００２４】
σ因子の合成は胞子形成の開始時に始まるが、その産物はまず、抗σ因子であるspoIIABの作用によって不活性状態に維持される。抑制状態から開放されるためには、少なくとも２つの他のタンパク質(SpoIIAAおよびSpoIIE)の協調的な作用が必要である。これらのタンパク質は、胞子形成細胞が非対称細胞分裂を行った後にのみσFの活性を開放し、かつσFの活性をより小型のプレスポア細胞型に制限するように作用するものである。WO98/26088によれば、σFの活性化が隔壁形成(septation)に依存することを、細胞分裂に対するインヒビターの高感度アッセイの基礎として利用する。従って、該明細書中では、２つのリポーター遺伝子、即ち、活性なσF(またはσE)に依存するプロモーターを有する第１リポーター遺伝子と、σ因子をコードする遺伝子と同様に調節されるプロモーターを有することで(不活性な)σ因子の合成を測定可能にする第２リポーター遺伝子、を有するバチルス株が提供されている。抗微生物剤を同定するための全細胞スクリーニング法には、バチルス株の使用が含まれる。
【００２５】
本発明によれば、これらの活性に関与する任意のバチルス細胞分裂遺伝子を、別の細菌に由来する相同遺伝子で一部または完全に置き換える。バチルス遺伝子は、例えば、divIB(ftsQとも称する)、divIC、divIVA、ftsA、ftsL(mraRとも称する)、ftsZ、pbpB、並びにspoOJおよびspoIIIEであってよい。
【００２６】
実施例
本発明者らは、spoIIIE遺伝子の末端アミノ酸残基310個を、肺炎連鎖菌R6株に由来する遺伝子の等価部分で順方向または逆方向のいずれかで置き換えた枯草菌の株を構築した。順方向では、該株は、枯草菌遺伝子にコードされているが完全には保存されていない膜アンカー領域と高度に保存されている肺炎連鎖菌Ｃ末端コード領域とが融合したハイブリッドタンパク質を産生するはずである。
【００２７】
宿主spoIIIE遺伝子に対して順方向または逆方向のいずれかで肺炎連鎖菌遺伝子が挿入された株に、同質遺伝子野生型株と並行して、標準的な再懸濁法によって胞子形成を誘導した。９時間後、80℃で10分間加熱し、次いで栄養寒天上で連続希釈物を平板培養することにより、形成された胞子の数を耐熱性に基づいて測定した。一晩インキュベートした後、コロニーを計数した。肺炎連鎖菌DNAが逆方向で挿入された株(従って、無傷のspoIIIE遺伝子を有さない株)では、胞子形成が完全に阻止された(培養物１ml当たりの耐熱性コロニー形成単位[cfu]は10未満)。しかしながら、肺炎連鎖菌DNAを順方向で有する場合には、耐熱性胞子が、野生型(1.3×108cfu/ml)にほぼ等しい頻度(2.0×108cfu/ml)で生じることが判明した。耐熱性胞子から新たなコロニーが増殖するには、胞子が完全な染色体を獲得していることが必要である。従って、ハイブリッド遺伝子は、胞子区画への染色体の移動を、野生型SpoIIIEタンパク質と全く同様に誘導し得るものでなければならない。