(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）テトラサイクリン調節系のトランス作用因子（ｔＴＡ）をコードする核酸をＰＧＫ遺伝子のプロモーターのコントロール下に含む第一領域と、
（ｂ）所望の核酸をｔＴＡ感受性プロモーターのコントロール下に含む第二領域と、
（ｃ）２つの領域（ａ）及び（ｂ）の間に配置されており、転写終結因子としてＵＭＳ配列を含む第三領域を含んで成り、
２つの領域（ａ）及び（ｂ）が同一転写方向に配置されていることを特徴とする核酸。
【請求項２】
領域（ｂ）の所望の核酸が所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
所望のタンパク質またはポリペプチドが神経伝達物質またはそれらの前駆体またはそれらの合成酵素及び栄養因子から選択されることを特徴とする請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
（ａ）テトラサイクリン調節系のトランス作用因子（ｔＴＡ）をコードする核酸をＰＧＫ遺伝子のプロモーターのコントロール下に含む第一領域と、
（ｂ）ヒトのチロシンヒドロキシラーゼをコードする核酸を１−１０個のｔｅｔＯｐ配列を含むように修飾されたＣＭＶ最小プロモーターのコントロール下に含む第二領域と、
（ｃ）ＵＭＳ配列を含む第三領域とを含んで成り、
２つの領域（ａ）及び（ｂ）が同一転写方向に配置されていることを特徴とする核酸。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターを含むウイルスベクターから選択されることを特徴とする請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸または請求項５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
ヒト細胞を含む哺乳類細胞から選択されることを特徴とする請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
神経細胞であることを特徴とする請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項４に記載の核酸を含む組換えアデノウイルスによって遺伝子修飾された神経細胞。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸を含む組換えアデノウイルスによって遺伝子修飾された神経細胞を含む組成物であって、領域（ｂ）の所望の核酸がヒト  チロシンヒドロキシラーゼをコードする前記組成物。
【請求項１２】
ヒト  チロシンヒドロキシラーゼをｉｎ  ｖｉｖｏの神経系中で発現させる組成物を製造するための、請求項４に記載の核酸を含む組換えアデノウイルス、または、請求項１１に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞内の核酸の発現をコントロールするための新規な組成物及び方法に関する。より特定的には本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの神経細胞内で核酸の発現をコントロールするために特に好適である。
【０００２】
細胞内の核酸の発現をコントロールすることは、生物工学のすべての分野で最も待ち望まれている技術である。細胞内の核酸の発現をコントロールすることができれば、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、組換えタンパク質の発現条件の改善、遺伝子の機能または調節の研究、ウイルス粒子の産生、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植用細胞の調製、などを行うことが可能になる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、動物モデルの特性の改良、化合物の生体内利用率もしくは毒性のより詳細な研究、遺伝子の機能のより詳細な研究が可能になり、あるいは、例えば治療もしくはワクチン製造を目的とする化合物の産生のより有効なコントロールが可能になる。本発明の組成物及び方法はこのように生物工学のすべての分野で役立つ。
【０００３】
遺伝子の発現をコントロールすることを試みた種々の方法が従来技術に記載されている。これらの方法は特に、組織特異的な転写プロモーターまたはベクターの使用から成る。しかしながら、記載された系は、特にｉｎ  ｖｉｖｏでは、期待通りの特異性レベルを必ずしも示さない。また、発現を一時的にコントロールすることができない。
【０００４】
Ｇｏｓｓｅｎら（ＰＮＡＳ  ８９（１９９２）５５４７；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８（１９９５）１７６６）は、一方でテトラサイクリンによってコントロールされるトランス作用因子ｔＴＡを使用し、他方でｔＴＡ感受性プロモーターを使用する複合系を記載している。該系は発現の一時的調節に関して利点を与えることはできるが、現在までに記載された限りではまだ幾つかの欠点を有しており、これらの欠点によってその利用が限られている。これらの欠点は、細胞毒性や発現低下が観察されること、２つのベクターを使用する必要があること、などである。
【０００５】
本発明はここに、従来技術の系に比較して卓越した安定性、特異性及び操作性などの特性を有している新規な調節的発現系を提供する。
【０００６】
従って本発明の第一の目的は、遺伝子発現の厳密なコントロールを確保する特別な種類及び編成の要素から構成された遺伝子構築物に関する。
【０００７】
本発明の別の目的は、これらの遺伝子構築物を組込んだベクター、特にウイルスベクターに関する。
【０００８】
従って本発明の別の目的は、本発明の遺伝子構築物またはベクターによって遺伝子修飾された細胞、このような細胞を含む組成物、及び、目的とする所望の物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生するためのこのような細胞及び組成物の使用に関する。
【０００９】
本発明の別の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞内、より特定的には神経細胞内で核酸を調節的に発現させる方法及び組成物に関する。本発明の別の目的はまた、本発明の構築物またはベクターによって遺伝子修飾された細胞（特に神経前駆細胞）のｉｎ  ｖｉｖｏ接種（または移植）から成る、核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ導入及び調節的発現方法に関する。
【００１０】
より特定的には本発明は、ｔＴＡの使用に基づいた改良特性を示す新規な調節的発現系を記載している。この系はアデノウイルスに含まれているときに特に有効であり、特に神経系ではｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの双方で効率的な調節的発現を示し得る。
【００１１】
より特定的には、本発明の第一の目的は、
（ａ）テトラサイクリン調節系のトランス作用因子（ｔＴＡ）をコードする核酸を中等度プロモーターのコントロール下に含む第一領域と、
（ｂ）所望の核酸をｔＴＡ感受性プロモーターのコントロール下に含む第二領域とから成り、
２つの領域（ａ）及び（ｂ）が同一転写方向に配置されていることを特徴とする核酸に関する。
【００１２】
より好ましくは、本発明の核酸は更に、２つの領域即ち領域（ａ）と領域（ｂ）との間に配置されており領域（ａ）と領域（ｂ）との間の転写干渉を制限する第三領域（ｃ）を含む。
【００１３】
本発明は、このような構築物が特に神経細胞内のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子発現をコントロールするために有利な特性を有しているという知見から得られた。本発明はまた、これらの構築物の有利な特性が部分的には種々の遺伝子要素の選択及び編成に由来することを示す。
【００１４】
例えば、本発明の核酸の領域（ａ）において、ｔＴＡトランス作用因子の遺伝子の発現をコントロールするために使用されるプロモーターは中等度プロモーターである。本文中で使用された“中等度プロモーター”なる用語は、その活性レベルが中等である、即ち強いプロモーターの活性レベルよりも低いと当業者が考えるようなプロモーターを意味する。より特定的には、本文中で使用された中等度プロモーターなる用語は、生理的レベルの発現を許容する非ウイルスプロモーターを意味する。
【００１５】
従って、強いウイルスプロモーター（特にｈＣＭＶ）をプロモーターとして使用する既刊の文献（Ｇｏｓｓｅｎら，ＰＮＡＳ  ８９（１９９２）５５４７）に記載された系と違って、本発明の構築物は、ｔＴＡトランス作用因子を哺乳類細胞に毒性でないレベルで構成的に合成し得る。出願人はここに、細胞内でｔＴＡが中等レベルに維持されるとき、特に神経細胞内で遺伝子発現がより精密にかつより正確に調節され得ることを知見した。
【００１６】
より好ましくは、使用されるプロモーターは細胞プロモーター、即ち、細胞内で発現される遺伝子に由来するプロモーターである。遺伝子構築物を導入する予定の細胞と同種の生物の細胞に由来する（または誘導される）プロモーターが有利である。従って、本発明の構築物を動物体内への核酸導入に使用するとき、使用される中等度細胞プロモーターは同種の動物または類縁の動物また近縁の動物の細胞から誘導されるのが好ましい。異なる生物に由来するプロモーターを使用することも勿論可能であり、例えば、使用されたプロモーターが機能する限りヒトの体内で発現させるためにネズミのプロモーターを使用してもよい。
【００１７】
より好ましくはまた、使用されるプロモーターは中等度の構成性細胞プロモーターである。従って本出願では、本発明の系の最良特性は構成性プロモーターを使用するときにのみ得られること、即ち、このときに細胞内で安定なレベルのｔＴＡの存在及び維持が確保されることを証明する。
【００１８】
本発明に適合する中程度の構成性細胞プロモーターの特定例は特に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）または延長因子１α（ＥＦ１α）の“ハウスキーピング”遺伝子のプロモーターのような遍在性プロモーターである。本発明の範囲内で使用できる別の中等度細胞プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、グリア細胞特異的ＧＦＡＰ（“Ｇｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（グリア細胞特異的原線維酸性タンパク質）”の遺伝子、ニューロン特異的ＮＳＥ（“ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ（ニューロン特異的エノラーゼ）”の遺伝子、β−アクチン遺伝子、β−グロビン遺伝子、心筋細胞特異的ＭＨＣα（“ｍｙｏｓｉｓ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  α”の遺伝子のプロモーター、あるいは、例えばＮＲＳＥ−ＰＧＫ型の複合プロモーターがある。
【００１９】
従って、本文中で使用された中等度プロモーターなる用語は好ましくは、遍在性の構成性発現または特定の組織もしくは細胞型に限局された構成性発現を確保し、好ましくは生理的発現レベルを得ることが可能な細胞プロモーターを意味する。ＰＧＫプロモーター（または該プロモーターの変異体）の使用は本発明の好ましい実施態様を表す。例えば、後出の実施例は、該プロモーターの使用によって構築物導入後の少なくとも１カ月間は所望の核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を維持し得ることを示す。即ちこの期間中には所望の核酸を発現している細胞の数の減少が全く観察されなかった。このような発現安定性は、従来技術の系に比較して卓越した本発明の重要な利点の１つを表す。例えば、強いプロモーター（ＲＳＶウイルスのＬＴＲのプロモーター）のコントロール下のβ−ガラクトシダーゼをコードしているアデノウイルスを感染させた神経前駆細胞の移植組織では、移植後１カ月以内に発現レベルの明らかな低下が観察される。これは安定性に関する本発明の有利な特性を示しており、これらの特性は、ｔＴＡ遺伝子の発現を指令するために中等度プロモーターを使用したことに伴って予想外に得られたものである。
【００２０】
本発明の構築物の別の重要な特徴は、２つの領域、即ち領域（ａ）と領域（ｂ）との配置にある。即ち、有利な配置ではこれらの２つの領域が、（ｉ）同一転写方向に配置されており、（ｉｉ）転写干渉を制限する領域（ｃ）によって隔てられている。
【００２１】
本出願はまず、本発明の系の効率を改善するために（即ち、発現のコントロールを改善するために）、２つのカセット（ａ）及び（ｂ）を同一転写方向に配置することが特に有利であることを示す。２つのカセットを逆向きに配置したときに発現コントロールの改善がしばしば観察されていただけに、この結果はむしろ意外である。逆平行配置を有する構築物の場合に発現低下が報告されていたにもかかわらず（Ｋｏｊｉｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  ２３８（１９９７）５６９）、本発明の条件では対照的に、同一方向に配置されたカセットがアデノウイルスに含まれているときにも発現低下は全く生じない。。
【００２２】
他方で、本発明の構築物の特性を更に改良するために、上記の領域（ａ）と領域（ｂ）との間に、（ａ）と（ｂ）との間の転写干渉を制限する第三の領域（ｃ）を導入するのが特に有利である。“転写干渉”という表現は、領域（ｂ）の核酸の転写に対する領域（ａ）のプロモーターの影響または効果あるいはその逆を意味する。より詳細には、“転写干渉”という表現は、単離状態で含まれているときの領域（ｂ）の発現と領域（ａ）に機能的に結合したときの領域（ｂ）の発現との間に存在し得る差異を意味する。このような領域（ｃ）は、好ましくは転写終結因子から成り、好ましくはＵＭＳ配列を含む。ＵＭＳ配列（“ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｍｏｕｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（上流マウス配列）”）は、ネズミのｃ−ｍｏｓ遺伝子の上流で同定されたゲノム配列である（ＭｃＧｅａｄｙら，ＤＮＡ  ５（１９８６）２８９）。この配列は、転写終結因子として挙動する。本発明はここに、これらの配列が、より特定的にはアデノウイルスに含まれているときに、特に神経系内での遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を有効にコントロールする目的で有利に使用できることを示す。
【００２３】
従って本発明の系は、同一の核酸中に２つのカセット（領域）が共存することに基づく。一方のカセットは、第二カセットの所望の核酸の発現を活性化し得る転写因子を調節可能な条件下で発現させる。従ってこの第二カセット（領域ｂ）では、本発明の遺伝子構築物に適合した転写プロモーターを選択することが重要である。即ち領域（ｂ）で使用されるプロモーターはｔＴＡトランス作用因子に感受性のプロモーター、即ち、該トランス作用因子の存在下で活性が増加するプロモーターである。従って構造的な見地から、該プロモーターは、その配列中にまたはその配列から機能性距離を隔てて、少なくとも１つのｔＴＡ因子結合部位を含むプロモーターである（Ｇｏｓｓｅｎら，１９９２）。この結合部位またはオペレーター領域（ＯｐまたはｔｅｔＯｐ）は例えば、図６に示す配列または該配列の機能性変異体を有し得る。１つの変異体は例えば、１つまたは複数の塩基対の突然変異、欠失または付加によって遺伝子修飾されているがｔＴＡトランス作用因子に結合する能力を保存している配列に対応し得る。好ましくは、修飾は図６に示す配列の１０％未満に関連する。更に、領域（ｂ）に存在するＯｐ配列は、１つまたは複数のコピー、例えば１−１０コピー、好ましくは３−１０コピー、更に好ましくは３−８コピーで存在し得る。特定実施態様では、（ｂ）に使用されるプロモーターは、７個のオペレーター配列を含む。より好ましくは、所望の核酸の発現の実質的なコントロールを確保するために、（ｂ）に使用されるプロモーターは、基底活性が零ではないにしても極めて弱い基底活性を有しているのが望ましい。その結果として、このプロモーターはｔＴＡの存在下でのみ活性であることが観察され、従って調節が極めて厳密である。好ましくは、（ｂ）に使用されるプロモーターがｔＴＡトランス作用因子に感受性の最小プロモーターである。最小という特性は、基底活性が零ではないにしても極めて弱い基底活性を有しているプロモーターを意味する。このようなプロモーターは一般に、転写プロモーターの機能に必須の最小要素（例えばＴＡＴＡボックス）を含んでおり、例えばプロモーターの強さまたはプロモーターの調節に天然に関与する他の領域は欠如している。このようなプロモーターは、様々な種類のプロモーターから要素の欠失及び／または付加（“サイレンサー”）によって調製され得る。（ｂ）の好ましいプロモーターは、哺乳類細胞中で機能性であり、ｔＴＡの非存在下で本質的に不活性であり、ｔＴＡトランス作用因子の存在下で刺激されるプロモーターである。“本質的に不活性の”という用語は、慣用の技術、特に酵素アッセイ、免疫組織化学、微量透析またはＨＰＬＣなどの技術によって検出できる発現産物（ポリペプチド）が全く存在しないことを意味する。しかしながらこの用語は、ＰＣＲまたはその他の極めて高感度の検出技術によって検出可能であるが濃度レベルが実質的に有意でないｍＲＮＡ分子の存在を排除しない。
【００２４】
（ｂ）に使用され得るプロモーターは、多様な種類、多様な起原であり多様な特性を有し得る。使用されるプロモーターの選択は特に、所望の用途及び目的とする遺伝子に依存する。従って、プロモーターは強いプロモーターもしくは弱いプロモーターに由来してもよく、または、遍在性プロモーターもしくは組織／細胞特異的プロモーターに由来してもよい。あるいは、生理学的状態または病態生理学的状態に特異的なプロモーター（細胞分化の状態または細胞周期の幾つかの段階に依存する活性をもつプロモーター）に由来してもよい。プロモーターの起原は、真核細胞、原核細胞、ウイルス細胞、動物細胞、植物細胞、人工細胞またはヒト細胞などでよい。プロモーターの特定例は、ＣＭＶ、ＴＫ、ＧＨ、ＥＦ１−α、ＡＰＯなどの前初期遺伝子のプロモーター、または人工プロモーターである。本発明に使用するためには、これらのプロモーターを“最小”にする、即ち、ｔＴＡの存在に依存性にするのが好ましい。このために、出発プロモーターを酵素で消化し、好ましくは１つまたは複数のＯｐ配列に機能的に結合した後で、プロモーターの活性を試験する。ｔｅｔＯｐ配列の数、及び、該配列から選択プロモーターまでの距離は、該プロモーターの発現が厳密にｔＴＡ依存性になるように当業者によって適宜調節される。好ましくは、（ｂ）に使用されるプロモーターは、Ｃｏｒｔｉら（Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ７（１９９６）１６５５）に記載されているようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、好ましくはヒトのサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の遺伝子の前初期プロモーターである。該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００２５】
本発明は、所望の用途に応じた種々の所望の核酸を発現させるために使用され得る。従って、領域（ｂ）の所望の核酸は好ましくは、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸である。本発明の意味に含まれる所望の産物の特定例は、酵素、血液誘導体、成長ホルモンのようなホルモン、サイトカイン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン及びＴＮＦなど（フランス特許第９２０３１２０号）、増殖因子、例えばＶＥＧＦまたはＦＧＦのような血管新生促進因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体またはそれらの合成酵素（チロシンヒドロキシラーゼ：ＴＨ）、栄養因子、特に、神経変性疾患、神経系傷害を生じた外傷性全身障害または網膜変性を治療するための神経栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、あるいは、骨成長因子、造血因子、など、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（フランス特許第９１１１９４７号）、凝血に関与する因子：ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ｐ２１のような細胞周期に関与するタンパク質、あるいは、依存性キナーゼを阻害するその他のタンパク質、Ｒｂ、Ｇａｓ−１、Ｇａｓ−６、Ｇａｓ−３、Ｇａｄ  ４５、Ｇａｄ  １５３、サイクリンＡ、Ｂ、Ｄ、あるいは、平滑筋中の細胞増殖を制限するＧＡＸタンパク質（再発狭窄症の治療）、アポトーシスを誘発するタンパク質、または、ｐ５３、Ｂａｘ、ＢｃｌＸ−ｓ、Ｂａｄのようなその他の腫瘍抑制タンパク質、または、Ｂｃｌ２及びＢｃｌＸ−１のその他のアンタゴニスト、ヘモグロビンの遺伝子またはその他の輸送タンパク質の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びアポ（ａ）から選択されたアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタンパク質に対応する遺伝子、リポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、７−アルファ−コレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジル酸ホスファターゼのような代謝酵素、あるいは、コレステロールエステル輸送タンパク質、リン脂質輸送タンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質のような脂質輸送タンパク質、あるいは、ＬＤＬ受容体、キロミクロンレムナント受容体及びスカベンジャー受容体から選択される受容体、などがある。
【００２６】
所望の産物のうちでも特に重要な産物は、抗体、一本鎖の可変抗体フラグメント（ＳｃＦｖ）、または、免疫治療に役立つ認識能力を有している他の任意の抗体フラグメントである。抗体フラグメントによる治療の対象は、例えば感染性疾患、腫瘍（抗ＲＡＳ抗体、抗ｐ５３抗体または抗ＧＡＰ抗体）、または、多発性硬化症のような自己免疫疾患（抗イディオタイプ抗体）である。
【００２７】
別の所望のタンパク質の非限定例は、可溶性受容体、例えば抗ＨＩＶ治療の場合の可溶性ＣＤ４受容体もしくは可溶性ＴＮＦ受容体または筋無力症治療の場合の可溶性アセチルコリン受容体；酵素の基質またはインヒビターとなるペプチド、あるいは、例えば、喘息、血栓症または再発狭窄症の治療の場合のような受容体または接着タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとなるペプチド：人工タンパク質、キメラタンパク質または一部欠失タンパク質、などである。所望の必須ホルモンとしては、糖尿病に対するインスリン、成長ホルモン及びカルシトニンがある。
【００２８】
核酸はまた、ターゲット細胞中で発現することによって遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写をコントロールし得る遺伝子またはアンチセンス配列でもよい。このような配列は例えば、欧州特許第１４０３０８号に記載の技術に従ってターゲット細胞中に細胞性ｍＲＮＡの相補ＲＮＡとして転写され細胞性ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻止し得る。治療用遺伝子はまた、ターゲットＲＮＡを選択的に破壊し得るリボザイムをコードする配列を含む（欧州特許第３２１２０１号）。
【００２９】
核酸はまた、ヒトまたは動物の体内で免疫応答を生じさせ得る抗原性ペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み得る。従ってこの特定実施態様では、特に微生物、ウイルスまたは癌を対象としたヒト用または動物用のワクチンまたは免疫治療薬の開発に本発明を使用し得る。このようなペプチドは特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂ型ウイルス（欧州特許第１８５５７３号）、偽狂犬病ウイルス、“シンシチウム形成ウイルス”及びその他のウイルスに特異的な抗原性ペプチドでもよく、あるいは、ＭＡＧＥタンパク質のような腫瘍特異的抗原（欧州特許第２５９２１２号）でもよい。
【００３０】
核酸はまた、細胞に対して毒性の産物、特に条件的毒性を示す産物（即ち、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、など）をコードし得る。
【００３１】
その他の所望の遺伝子は特に、Ｍｃ  Ｋｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ（Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｎ，ｃａｔａｌｏｇｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ，ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ，ａｎｄ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ，Ｅｉｇｈｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８））、及びＳｔａｎｄｂｕｒｙ，Ｊ．Ｂ．ら（Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９８３））に記載されている。所望の遺伝子は、アミノ酸、脂質及びその他の細胞構成成分の代謝に関与するタンパク質を包含する。
【００３２】
他方で、領域（ｂ）はまた、所望の核酸の３′に位置している転写終結因子を含み得る。最後に、核酸は、ＩＲＥＳによって適宜に隔てられている複数のコーディング領域を含むことができ、これによって複数の有益産物を産生し得る。
【００３３】
本発明の構築物は神経系における発現の調節に特に好適であるため、所望の核酸はより特定的に、神経伝達物質またはそれらの前駆体またはそれらの合成酵素（チロシンヒドロキシラーゼ：ＴＨ）、または、栄養因子、特に神経変性疾患、神経系損傷を生じた外傷性全身障害または網膜変性を治療するための神経栄養因子をコードしている。
【００３４】
特定実施態様によれば、本発明は、
（ａ）テトラサイクリン調節系のトランス作用因子（ｔＴＡ）をコードする核酸をＰＧＫ遺伝子のプロモーターのコントロール下に含む第一領域と、
（ｂ）特にヒトのチロシンヒドロキシラーゼをコードする核酸を１−１０個、好ましくは３−８個、特に７個のｔｅｔＯｐ配列を含むように修飾されたＣＭＶ最小プロモーターのコントロール下に含む第二領域と、
（ｃ）ＵＭＳ配列を含む第三領域とから成り、
２つの領域（ａ）及び（ｂ）が同一転写方向に配置されていることを特徴とする核酸に関する。
【００３５】
本発明の核酸はＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。より特定的には、本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。本発明の核酸は、実施例に示すような例えば核酸の合成、ライブラリーのスクリーニング、結合、酵素による切断、増幅、クローニング、などを含む当業者に公知の技術によって作製できる（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）。従って、異なる領域（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を別々に作製し、次いで機能的に組立てる。即ち、同じ転写方向で組立てる。領域（ａ）と領域（ｂ）との間の間隔は本発明の構築物の有効性を損なわない範囲で調節可能である。従ってこれらの領域間の距離は、例えば０−３０００ｂｐ、より普遍的には０−１０００ｂｐ、好ましくは５００ｂｐ未満である。領域（ａ）と（ｂ）との間のこの距離は一般に領域（ｃ）の長さ（領域（ｃ）が存在する場合）及び使用されるベクターのクローニング能力によって決定される。当業者はこの距離を容易に調節できる。本発明の核酸は種々の起原の要素、特に、原核細胞、真核細胞（動物、植物、ウイルス、など）、合成または半合成の核酸に由来の種々の要素を含み得る。
【００３６】
本発明はまた、上記に定義のような核酸を含む任意のベクターに関する。本発明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＨＡＣ、トランスポゾン、エピソーム、ウイルス、などのような当業者に公知の任意のベクターでよい。本発明の好ましいベクターの種類は、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはある種のレトロウイルス（特にレンチウイルス）のようなウイルスベクターによって代表される。本発明のウイルスはより好ましくは、神経細胞、特に神経細胞の前駆体に向性を有するウイルスである。この観点から本発明に含まれる特に好ましいベクターはアデノウイルスである。
【００３７】
本発明を実施するために使用されるアデノウイルスは好ましくは、組換え欠陥アデノウイルス、即ち、そのゲノムがヘテロロガス核酸を含み細胞中で自律複製できないアデノウイルスである。より好ましくは、本発明のアデノウイルスは少なくともＥ１及びＥ３領域の全部または一部に欠陥を有している。
【００３８】
組換え欠陥アデノウイルスはまた、第三世代の組換え欠陥アデノウイルス、即ち、領域Ｅ１及びＥ４の全部または一部と任意に領域Ｅ３に欠陥を有しているアデノウイルスでもよい。
【００３９】
本発明の特定実施態様は、以下の領域の全部またはその機能部分に関わる欠失を含むアデノウイルスの使用から成る：
−Ｅ１、Ｅ４及びＥ３、
−Ｅ１、Ｅ４及びＥ２、
−Ｅ１、Ｅ４、Ｅ２及びＥ３、
−上記領域とアデノウイルスの後期機能をコードする遺伝子（Ｌ１−Ｌ５）の全部または一部、あるいは、
−ウイルスのコーディング領域全部。
【００４０】
アデノウイルスのゲノム構造は文献に広く記載されている。この点で、アデノウイルスＡｄ５のゲノムは完全に配列決定され、データベースでアクセスできる（特に、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｍ７３２６０参照）。同様に、別のアデノウイルス（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１３、イヌのアデノウイルスＣＡＶ−２、など）もそのゲノムの全部ではないまでも一部が配列決定されている。更に、組換え欠陥アデノウイルスの構築も文献に記載されている。従って、例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７及びＷＯ９６／２２３７８は、領域Ｅ１及びＥ４の種々の欠失を記載している。また、国際出願ＷＯ９６／１００８８は、Ｉｖａ２遺伝子の処に修飾を含むベクターを記載しており、国際出願ＷＯ９４／２６９１４は動物起原のアデノウイルスを記載しており、国際出願ＷＯ９５／２９９９３はアデノウイルスの領域Ｅ２に関する欠失を記載している。
【００４１】
本発明の範囲内で有利に使用される組換えアデノウイルスは、そのゲノムの領域Ｅ１に欠失を含み、この欠失は領域Ｅ１ａ及びＥ１ｂに関係する。特定例として欠失は、（Ａｄ５のゲノムを基準として）ヌクレオチド４５４−３３２８、３８２−３４４６または３５７−４０２０に関係する。
【００４２】
他方で、国際出願ＷＯ９５／１２６９７及びＷＯ９６／２２３７８に記載されているように、領域Ｅ４中の欠失は好ましくは読取り枠全体に関係し、例えば３３４６６−３５５３５もしくは３３０９３−３５５３５の欠失または領域Ｅ４の一部分だけ（例えばＯＲＦ６またはＯＲＦ３）が欠失している。引用したこれらの特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００４３】
更に、後期機能を喪失したアデノウイルス（“最小”ベクター）またはコーディング領域全部が欠失したアデノウイルス（“ｇｕｔｌｅｓｓ”ベクター）の構築が、例えばＰａｒｋｓら，ＰＮＡＳ  ９３（１９９６）ｐ．１３５６５及びＬｉｅｂｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）ｐ．８９４４によって記載されている。
【００４４】
本発明の核酸は組換えアデノウイルスゲノムの種々の部位に挿入できる。該核酸は、領域Ｅ１、Ｅ３またはＥ４の処に欠失配列に置換してまたは付加配列として挿入できる。該核酸はまた、ウイルスの産生に必要なシス位置の配列（ＩＴＲ配列及びキャプシド形成配列）以外の別の任意の部位に挿入できる。
【００４５】
更に、組換えアデノウイルスは、ヒト起原でも動物起原でもよい。ヒト起原の好ましいアデノウイルスは、グループＣのクラスのアデノウイルス、特に、２型（Ａｄ２）及び５型（Ａｄ５）のアデノウイルスまたは７型（Ａｄ７）もしくは１２型（Ａｄ１２）のアデノウイルスである。動物起原の種々のアデノウイルスのうちでは、イヌ起原のアデノウイルス、特に、アデノウイルスＣＡＶ２のすべての菌株が好ましい〔マンハッタン株またはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）〕。動物起原の別のアデノウイルスは特に、国際出願ＷＯ９４／２６９１４に引用されている。該特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００４６】
組換えアデノウイルスは、キャプシド形成細胞系、即ち、組換えアデノウイルスのゲノムに欠失している１つまたは複数の機能をトランス位置で相補し得る細胞系において産生される。当業者に公知のキャプシド形成系の一例は、アデノウイルスのゲノムの一部分が組込まれた２９３細胞系である。より詳細には、２９３細胞系は、左側ＩＴＲを含むアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１−１２％）と、キャプシド形成領域と、Ｅ１ａとＥ１ｂとを含む領域Ｅ１と、ｐＩＸタンパク質をコードする領域と、ｐＩＶａ２をコードする領域の一部分とを含むヒトの腎胚細胞系である。この細胞系は、領域Ｅ１に欠陥をもつ組換え欠陥アデノウイルス、即ち、領域Ｅ１の全部または一部が欠失した組換え欠陥アデノウイルスをトランス相補し、高い力価をもつウイルス予製液を産生し得る。この細胞系はまた許容温度（３２℃）で、温度感受性Ｅ２突然変異を更に含むウイルス予製液を産生し得る。領域Ｅ１を相補し得る別の細胞系、特に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９（国際特許ＷＯ９４／２８１５２）またはヒト網膜芽腫（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）に基づく細胞系も記載されている。更に、アデノウイルスの複数の機能をトランス相補し得る細胞系も記載されている。特に、領域Ｅ１及びＥ４を相補する細胞系（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｖｏｌ．７０（１９９６）ｐｐ．５５９−５６５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２（１９９５）３２２；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）、及び、領域Ｅ１及びＥ２を相補する細胞系（国際特許ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／２７０７１）、または、上記の細胞系から誘導され、特にこのようなウイルスの構築に関与する部位特異的リコンビナーゼ活性を更に発現するので最小アデノウイルスを産生するために使用できる系が記載されている。
【００４７】
通常の作製手順では、ウイルスＤＮＡをキャプシド形成細胞系に導入し、次いで（アデノウイルスのサイクル速度は２４−３６時間なので）約２−３日後に細胞を溶解させることによって組換えアデノウイルスを作製する。この方法を実施するために導入されるウイルスＤＮＡは、細菌中（国際特許ＷＯ９６／２５５０６）または酵母中（国際特許ＷＯ９５／０３４００）で適宜構築され、次いで細胞にトランスフェクトされ得る組換えウイルスの完全ゲノムでよい。ウイルスＤＮＡはまた、キャプシド形成細胞系の感染に使用される組換えウイルスの形態でもよい。ウイルスＤＮＡはまた、組換えウイルスゲノムの一部分と相同領域とを各々が含むフラグメントの形態で導入されてもよく、フラグメントがキャプシド形成細胞に導入された後、種々のフラグメント間の相同的組換えによって組換えウイルスゲノムが再構築され得る。
【００４８】
細胞の溶解後、塩化セシウム勾配遠心またはクロマトグラフィーのような公知の任意の技術によって組換えウイルス粒子を単離し得る。代替方法は特にフランス特許出願ＦＲ９６０８１６４に記載されている。該特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００４９】
本発明は更に、上記に定義のようなベクターを含む組成物、好ましくは上記に定義のような組換え欠陥アデノウイルスを含む組成物に関する。この実施態様においては本発明の組成物が可変量の組換えアデノウイルスを含み得る。該量は所望の用途（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）に応じて当業者が容易に調整し得る。組成物は組換えアデノウイルスを、一般的には１０５−１０１５ｖ．ｐ．のオーダ、好ましくは１０７−１０１２ｖ．ｐ．のオーダで含んでいる。ｖ．ｐ．なる用語は、組成物中に存在するウイルス粒子の数に相当する。
【００５０】
本発明のベクター及び組成物は、細胞内に核酸を導入して調節的に発現させるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで直接使用されてもよく、または、ｉｎ  ｖｉｖｏ接種（または移植）予定の細胞に核酸を導入するために使用されてもよい。
【００５１】
本発明はまた、上記に定義のような核酸またはベクターを含む任意の細胞に関する。これらの細胞は好ましくは、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。特に好ましい実施態様では、細胞が神経細胞、特に神経前駆細胞である。このような細胞集団は例えば、Ｂｕｃら（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２（１９９５）３７）に記載されているようなヒトの神経前駆細胞である。
【００５２】
これに関連した本発明の特定実施態様は、上記に定義のような核酸を含む組換えアデノウイルスによって遺伝子修飾された神経細胞を含む。
【００５３】
本発明はまた、上記に定義のような細胞を含む任意の組成物に関する。
【００５４】
本発明は更に、所望の核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる目的で使用される組成物を製造するための、上記に定義のような核酸またはベクターまたは組成物の使用に関する。
【００５５】
本発明はまた、所望の核酸をｉｎ  ｖｉｖｏ神経系で発現させる目的で使用される組成物を製造するための、上記に定義のような核酸またはベクターまたは組成物の使用に関する。
【００５６】
特定実施態様では、本発明は、上記に定義のような細胞を患者の神経系に移植し、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を患者に投与することによって該細胞の発現をコントロールする核酸の調節的発現方法に関する。
【００５７】
本発明の組成物は、溶液、ゲル、粉末、などの多様な形態を有し得る。組成物は一般に、好ましくは無菌の溶液、例えば無菌の等張性生理的塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこれらの塩の混合物）の形態であるか、または、必要に応じて滅菌水もしくは生理的血清の添加によって溶液に復元し得る乾燥組成物、特に、凍結乾燥組成物の形態である。ヒドロゲルのような別の賦形剤も使用できる。このヒドロゲルは、細胞毒性でなく生体親和性である任意のポリマー（ホモポリマーまたはヘテロポリマー）から調製できる。このようなポリマーは例えば、国際出願ＷＯ９３／０８８４５に記載されている。更に、本発明の組成物は、瓶、管、アンプル、袋、シリンジ、小フラスコ（ｂａｌｌｏｎｅｔ）などのような任意の適当な型の容器に包装できる。
【００５８】
上記に指摘したように、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用できる。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで使用するためには、適当な任意の容器（プレート、皿、袋、など）内で、上記に定義のようなベクター組成物の存在下で細胞をインキュベートするだけでよい。この種の用途の場合、アデノウイルスを含む組成物は、細胞１個あたり、例えば１０−５０００ｖ．ｐ．の感染多重度（ＭＯＩ）、好ましくは１００−２０００ｖ．ｐ．の感染多重度で使用され得る。
【００６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のためには、本発明の組成物を、外用、経口、非経口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、腫瘍内、などの経路で投与できるように製剤化し得る。この用途で使用される組成物は、特に細胞性組成物の場合、１０４−１０６個の細胞、より好ましくは１０５−１０６個の細胞を含むのが有利である。更に、移植された組成物は好ましくは、細胞を高密度（約１０５−１０６細胞／μｌ）で含む。実際、実施例に示した結果は、高密度細胞を使用すると移植物がより容易に取込まれ、移植細胞の生存率が向上することを示す。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植細胞の生存率を更に向上させるために、１種または複数の免疫抑制化合物または免疫抑制治療薬を、必ずしも移植後でなく移植と同時にまたは移植よりも前に投与することが可能である（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７８（１９９７）６８５）。
【００６１】
この点で、本発明はまた、上記に定義のような組成物の投与から成る核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ導入方法に関する。本発明は例えば、動物体内で病理学的モデルを作製するためまたはヒト体内で遺伝子の調節などを研究するため、あるいはまた、標識試験もしくは生体内利用率試験のためまたは医療目的で使用される。
【００６２】
発現調節のためには、本発明の組成物がテトラサイクリンを含むかまたはｔＴＡトランス作用因子の活性に作用し得る任意のテトラサイクリン類似体を含むのが有利である。このような類似体の一例はドキシサイクリンである（Ｋｉｓｔｎｅｒら，ＰＮＡＳ  ９３（１９９６）１０９３３）。本発明で使用可能な他の類似体は例えばＡｌｖａｒｅｚら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４（１９９７）９９３）によって記載されている。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。類似体の用量は、類似体の種類及び使用される構築物に従って当業者が容易に調整し得る。一例として、本発明の構築物中の核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を完全に阻止するために十分なドキシサイクリンの用量は０．１ｎｇ／ｍｌである。
【００６３】
本発明は、特に、パーキンソン病（ＰＤ）のような神経変性疾患の治療（即ち、部分的または全面的な軽減）に特に適している。ＰＤは黒質中のドーパミン作動性ニューロンの進行性消失を特徴とする疾患である。病気の症状をコントロールするためにＬ−ＤＯＰＡによる治療が試みられたが、治療効果は病気の進行に伴って低下する。本出願は、ドーパミンのｉｎ  ｖｉｖｏ合成に関与する遺伝子（チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＨ）の導入によってこの病気を治療するという有利な代替方法を提供する。ドーパミン作動性化合物で長期間の薬理学的処置を行った試験では、これらの処置が調節されない全身的作用を誘発し、殆どの場合に、運動ニューロン応答が波動性を示すという極めて好ましくない結果を生じる。本発明はこの種の状況に特に好適である。何故なら、本発明によればＬ−ＤＯＰＡ合成を精密にかつ局所的にコントロールすることが可能であり、この種のコントロールはドーパミン作動性刺激の複合メカニズムを生理的に再現する運動応答を得るために必須であると考えられるからである。
【００６４】
本発明を以下の実施例に基づいてより詳細に説明する。実施例は本発明の代表例であるが本発明はこれらの実施例に限定されないことを理解されたい。
【００６５】
（図面の簡単な説明）
図１：本発明の核酸を含むアデノウイルスのゲノムの構造を表す概略図。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）とキャプシド形成配列（ψ）とが示されている。ｐＩＸはアデノウイルスのタンパク質ＩＸをコードする配列を表す。
【００６６】
図２：パネル（ａ）：アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１を種々のＭＯＩで感染させたヒト神経前駆細胞を示す。示した値は４つの試験の平均値である。
【００６７】
パネル（ｂ）及び（ｃ）：ＭＯＩ＝１４０で感染させた７日後に免疫組織化学によって測定したｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト神経前駆細胞中のＴＨの産生を示す。パネル（ｂ）は非処理、パネル（ｃ）は感染直後から７日目までドキシサイクリン（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で処理。倍率はパネル（ｂ）で３６０倍、パネル（ｃ）で２２０倍。
【００６８】
図３：アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ１を感染（ＭＯＩ＝４０）させた培養物中のｈＴＨ活性の消失速度（ａ）及び回復速度（ｂ）。０日目（感染の５．５日後）にドキシサイクリン（５ｎｇ／ｍｌ）を添加（ａ）または除去（ｂ）。非処理培養物中の０日目のｈＴＨ活性を１００％とした。（ｃ）は感染１１日後に測定したｈＴＨの発現に対する種々の用量のドキシサイクリンの効果を示す。数値は少なくとも４回の試験の平均値である。
【００６９】
図４は、アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１（ＭＯＩ＝４０）を感染させたヒト神経前駆細胞を線条体内に移植し、この移植細胞中のＴＨに対する免疫反応性を示す。免疫反応性は、（ａ）非処理動物、及び、（ｂ）ドキシサイクリンで毎日処理した動物から採取した１５μｍの凍結乾燥脳切片〔ｌａｃｕｎａ〕に対する抗ＴＨ免疫組織化学によって測定した。バイオレット染色（ａ）（ｂ）は、細胞をアルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベーションし次に特異的基質で染色することによって、ジゴキシゲニン標識ａｌｕプローブとハイブリダイズするヒト細胞の存在を検出する。倍率１１０。
【００７０】
図５は、アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１（ＭＯＩ＝４０）に感染させたヒト神経前駆細胞移植物中のＴＨ免疫反応性を示す。免疫反応性は、（ａ）非処理動物、及び、（ｂ）ドキシサイクリンで毎日処理した動物から採取した１５μｍの凍結乾燥脳切片に対して抗ＴＨ免疫組織化学、及び、３５イオウ標識ＨＴＨ−１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うことによって測定した。これらの切片をクレジルバイオレットで対比染色した。倍率４５０。
【００７１】
図６は、ｔＴＡ遺伝子（Ａ）；ＵＭＳ配列（Ｂ）；Ｏｐ配列（Ｃ）；ＣＭＶ最小プロモーター（Ｄ）のヌクレオチド配列を示す。
【００７２】
実施例
Ｉ−材料と方法
１．アデノウイルスＡｄＰＧＫ．Ｔｅｔ．ＨＴＨ−１の構築
テトラサイクリン調節系のトランス作用因子（ｔＴＡ）及びヒトサイトメガロウイルスの最小プロモーター（ＰｈＣＭＶ）をコードする配列を含むＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＵＭＳ−ｌｕｃ（Ｃｏｒｔｉら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ７（１９９６）１６５５）から、酵素ＸｈｏＩ及びＳｃａＩで消化することによって切除し、酵素ＢｇｌＩＩ／ＣｌａＩによって消化しておいたシャトルプラスミドｐＣＭＶｌｕｃＩＸ（Ｍ．Ｃ．Ｇｅｏｆｆｒｏｙから提供）に挿入した。このようにしてベクターｐｔｅｔＩＸが得られた。ヒトチロシンヒドロキシラーゼＩ（ｈＴＨ−１）のｃＤＮＡ（Ｇｒｉｍａ  Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８７，３２６：７０７−７１１）とＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナルとを順次に含むＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをベクターｐｔｅｔＩＸのＣｌａＩ部位とＥｃｏＲＶ部位との間に挿入し、これによってベクターｐｔｅｔＩＸｈＴＨ−１を作製した。ベクターｐｔｅｔＩＸｈＴＨ中のｔＴＡの発現をコントロールするヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーター（ｈＣＭＶｐ）をホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のネズミの遍在性プロモーターの遺伝子（Ａｄｒａら，Ｇｅｎｅ  １９８７；６０−６５）で置換した。ＰＧＫプロモーターを含むＸｈｏＩ／ＳｐｌＩフラグメントをベクターｐｔｅｔＩＸｈＴＨ−１のＳｐｅＩ部位とＳｐｌＩ部位との間に挿入することによってプラスミドｐＰＧＫｔｅｔＩＸｈＴＨ−１を作製した。相同的組換えのために（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２）６２６）、ベクターｐＰＧＫｔｅｔＩＸｈＴＨ−１をＸｍｎＩで直鎖化し、アデノウイルスＡｄβｇａｌの大きいＣｌａＩフラグメントと共に、領域Ｅ１をトランス相補する２９３細胞系にコトランスフェクトした。組換えアデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１をプラークアッセイによって２回精製した。２９３細胞系で増幅し、塩化セシウム勾配及びセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムで順次精製することによってウイルス予製液が得られた。２９３細胞系のプラーク滴定によって測定したウイルス価は３．５×１０１０ｐｆｕ／ｍｌである。
【００７３】
２．ヒト神経前駆細胞の作製及び培養
ヒト胚脳の一次培養物を採取し、既刊の文献（Ｂｕｃら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０（１９９５）３７）に記載されているように、塩基性ＦＧＦを補充した無血清培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖させた。
【００７４】
３．ヒト神経前駆細胞の感染
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために、１２ウェルの組織培養プレートに１ウェルあたり６−７×１０５細胞の密度で細胞を播種し、選択した感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスと共に４００μｌの無血清規定培地（ＤＳ−ＦＭ）中でインキュベートした。６時間後、上清を除去し、同量のＤＳ−ＦＭで置換した。感染後の種々の時点で、細胞を採取し、遠心し（４０００  ＲＰＭ，５分）、ペレットを−８０℃で凍結させ、酵素アッセイを行った（Ｒｅｉｎｈａｒｄｔら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９８６）２１−８５）。
【００７５】
移植のために、６ｃｍ直径の組織培養プレートに細胞をプレートあたり５×１０６細胞の密度で播種し、１細胞あたり４０ｐｆｕのＭＯＩのウイルスＡｄＰＧＫ．ｔ．ｔｈＴＨ−１と共に６時間インキュベートした。感染の翌日、既刊の文献（Ｓａｂａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９（１９９５）２５６）に記載の手順で細胞を採取し、ＤＳ−ＦＭ培地に１μｌあたり４×１０５細胞の密度で再懸濁させ、移植処理中を通じて氷上に保存した。
【００７６】
４．病変及び脳内移植
脳内移植の５〜６週間前に、既刊の文献（Ｈｏｒｅｌｌｏｕら，Ｎｅｕｒｏｎ  ５（１９９０），３９３）に記載の手順で、スプレーグドーリーネズミ（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ）の成体の左上行中線条体ドーパミン作動性経路に、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を定位固定的に注入した。１ｋｇあたり８００μｌのケタミン（ＵＶＡ）とロンプン（Ｂａｙｅｒ）との１：１比の混合物で麻酔にかけた１６匹のラットに移植処理を行った。１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用し、傷付けた線条体の２つの部位の各々に１μｌの細胞懸濁液を以下の定位固定座標に注入した：ブレグマ（ＡＢ）の＋０．７前方，中央線（ＬＭ）の＋２．５側方，硬膜面（Ｖ）の５腹側、及び、＋１．５ＡＢ，−２．５ＬＭ，５Ｖ（出発線を０に設定）。動物に体重１ｋｇあたり１０ｍｇのシクロスポリンを毎日注入した。。
【００７７】
５．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び免疫組織化学
移植の４週後、既刊の文献（Ｓａｂａｔｅら、前出）に記載の手順で動物を潅流した。脳を摘出し、４％ｐｆａ中で固定し、２０％ショ糖を含むＰＢＳ培地中に保存した。次いで、１５μｍの切片を作製した。
【００７８】
ジゴキシゲニン標識（タグ）を付けたヌクレオチドで標識したヒト細胞に特異的なａｌｕプライマー（５′−ＸＴＴｇＣＡｇＴｇＡｇＣＣｇＡｇＡＴＣｇＣｇＣＣ−３′）を使用したハイブリダイゼーションによってヒト細胞を検出した。初期変性段階（９５％ホルムアミド、０．１×ＳＳＣ中で撹拌下に７５℃で２０分間）後、切片を既刊の文献（Ｄｕｍａｓら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．５（１９９２）１１）に記載の手順で処理した。移植組織中のヒトＴＨ−１  ＲＮＡをヒトＴＨのエキソン１に逆向きの３５イオウ標識オリゴヌクレオチド（５′−ＴｇＣＣＴｇＣＴＴｇｇＣｇＴＣＣＡｇＣＴＣＡｇＡＣＡ−３′）と共にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出した。ハイブリダイゼーション条件は、Ｌａｎｉｅｃｅらによって記載された条件に等しい（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６（１９６６）１８１９）。免疫組織化学のために、切片を標準技術によって処理した。
【００７９】
ＩＩ−結果
１．本発明による調節系のコントロール下のヒトＴＨ−１をコードするアデノウイルス（ＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１）の作製
単一アデノウイルスベクターからｈＴＨ−１トランスジーンの調節的発現を得るために、最初は２つのベクターの使用に基づいたテトラサイクリン依存性の負の調節系ｔｅｔ−ｏｆｆを修飾した。テトラサイクリン感受性のｔＴＡトランス作用因子とヒトＴＨ−１  ｃＤＮＡとを、領域Ｅ１及びＥ３が欠失したアデノウイルスＡｄ５の主鎖に挿入した。ベクターＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１中で、ｔＴＡの発現はネズミのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子の遍在性プロモーターのコントロール下にあり、ヒトＴＨの転写はｔＴＡ感受性最小プロモーター（ＣＭＶプロモーター）によってコントロールされている。２つの転写ユニット間の転写干渉を制限するためにｔＴＡとＣＭＶプロモーターとの間にＵＭＳ配列を挿入した。
【００８０】
２．ヒト神経前駆細胞に対するＡｄＰＧＫ．ｔｅ．ｈＴＨ−１の感染：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ調節発現
アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１がヒト神経前駆細胞中で活性ＴＨを合成できるか否かを判定するために、細胞を種々の感染多重度で感染させた（図２ａ）。得られた結果は、感染細胞中のＴＨ活性がベクターの使用用量の関数として増加することを示す。これは、アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１が機能性であることを示す。
【００８１】
ドキシサイクリンによるｈＴＨ−１遺伝子の発現コントロールの可能性をアデノウイルス感染細胞中で試験した。感染直後に培養培地にこの抗生物質を添加すると（１０ｎｇ／ｍｌ）、ウイルスの使用用量が最大のときにもＴＨ活性はいかなる時点でも全く観察されなかった。更に、ＴＨ免疫反応性を示す細胞は全く同定されなかった（図２ｂ及び２ｃ）。
【００８２】
次に、既にトランスジーンを発現している細胞中でその後の遺伝子発現が阻止されるか否かを試験した。このために、細胞が既に検出可能なＴＨ活性を有している感染後５．５日目に培養培地にドキシサイクリンを添加した。得られた結果は、酵素活性が次第に減少し、ドキシサイクリン添加の５．５日後にはほぼ完全に消滅することを示す（図３ａ）。従って、ヒト神経前駆細胞に本発明の条件下でＴＨ−１遺伝子を転写すると、極めて有効な負の調節が得られる。
【００８３】
トランスジーンの活性を再度誘発することが可能であるか否かを試験するために、感染細胞の培養培地からドキシサイクリンを除去した後でＴＨ活性をモニターした（図３ｄ）。得られた結果は、細胞中のＴＨ活性が次第に増加することを示す。これはドキシサイクリンによるトランスジーンの阻害が可逆的であることを表す。
【００８４】
次に、遺伝子の発現を阻害するために必要な抗生物質の最小用量を決定するために、感染直後の細胞を種々の濃度のドキシサイクリンと共にインキュベートした（図３ｃ）。０．０１ｎｇ／ｍｌの用量ではＴＨ活性が検出可能であるが、０．１ｎｇ／ｍｌの濃度はＴＨ活性の出現を阻止するために十分である。
【００８５】
３．アデノウイルスＡｄＰＧＫｔｅｔ．ｈＴＨ−１を感染させたヒト神経前駆細胞の脳内移植：ｉｎ  ｖｉｖｏ発現のコントロール
この実施例は、本発明の系、特にアデノウイルスを感染させたヒト神経前駆細胞がヒトＴＨのｉｎ  ｖｉｖｏ発現に介在する能力、及び、本発明の系がこのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を特にドキシサイクリンを使用して調節する能力を証明する。細胞にアデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１を感染させ、次いで、毒素６−ＯＨＤＡを注入してドーパミン作動性経路に片側性病変を生じさせたネズミの線条体に移植した。移植物の取込みを容易にするために、高密度（４×１０５／μｌ）に懸濁させた多数の細胞（８×１０５）を各動物に移植した。移植後、動物を非処理（ｎ＝８）で維持するかまたはドキシサイクリン（１ｇ／ｍｌの水溶液）で毎日処理（ｎ＝８）した。移植の４週後に、ラットを殺し、脳のＴＨ発現を分析した。
【００８６】
ヒト特異的ａｌｕ反復配列に逆向きのオリゴヌクレオチドプローブと共にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うことによって測定すると、試験した全部の脳がヒト細胞の生存移植組織を含んでいた（図４ａ）。ドキシサイクリン処理動物と非処理動物との間に移植組織のサイズ及び見かけの差異は全く観察されなかった。
【００８７】
非処理動物体内の移植組織は、高いＴＨ免疫反応性を示す（図４ａ）。移植組織中でＴＨを発現している細胞の数は５−１０％であると推定された。移植後に無血清培地中で６日間再培養した細胞では同様のパーセントの細胞がＴＨ免疫反応性を示す。これらの結果は、遺伝子の発現がｉｎｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも同じ条件下であることをはっきりと示す。
【００８８】
これに反して、ドキシサイクリンを投与した移植動物ではＴＨ免疫反応性を示す細胞は全く観察されなかった（図４ｂ）。これは、ドキシサイクリンが移植組織内で、免疫組織化学によって十分に検出し得る量のＴＨの発現を有効に阻害することを表す。
【００８９】
ドキシサイクリンの効果が転写レベルにおける遺伝子発現の厳密なコントロールを表しているか否かを確認するために、ＴＨ−１のメッセンジャーＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを使用して切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーシヨンを行った。非処理動物の移植組織はかなりの程度に標識されていた。標識は免疫反応性細胞と共存していた（図５ａ）。これに反して、処理動物の移植組織では特異的標識は全く検出されなかった（図５ｂ）。
【００９０】
結論として、ドキシサイクリンは、移植ヒト神経前駆細胞によって導入されたアデノウイルスに含まれている本発明の系のトランスジーンの転写を有効に阻害すると言うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の核酸を含むアデノウイルスのゲノムの構造を表す概略図。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）とキャプシド形成配列（ψ）とが示されている。ｐＩＸはアデノウイルスのタンパク質ＩＸをコードする配列を表す。
【図２Ａ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１を種々のＭＯＩで感染させたヒト神経前駆細胞を示す。示した値は４つの試験の平均である。
【図２Ｂ】  ＭＯＩ＝１４０で感染させた７日後に免疫組織化学によって測定したｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト神経前駆細胞中のＴＨの産生を示す。非処理。倍率は３６０倍。
【図２Ｃ】  ＭＯＩ＝１４０で感染させた７日後に免疫組織化学によって測定したｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト神経前駆細胞中のＴＨの産生を示す。感染直後から７日目までドキシサイクリン（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で処理。倍率は２２０倍。
【図３Ａ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ１を感染（ＭＯＩ＝４０）させた培養物中のｈＴＨ活性の消失速度。０日目（感染の５．５日後）にドキシサイクリン（５ｎｇ／ｍｌ）を添加。非処理培養物中の０日目のｈＴＨ活性を１００％とした。数値は少なくとも４回の試験の平均値である。
【図３Ｂ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ１を感染（ＭＯＩ＝４０）させた培養物中のｈＴＨ活性の回復速度。０日目（感染の５．５日後）にドキシサイクリン（５ｎｇ／ｍｌ）を除去。非処理培養物中の０日目のｈＴＨ活性を１００％とした。数値は少なくとも４回の試験の平均値である。
【図３Ｃ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ１を感染（ＭＯＩ＝４０）させた培養物中のｈＴＨ活性。感染１１日後に測定したｈＴＨの発現に対する種々の用量のドキシサイクリンの効果を示す。数値は少なくとも４回の試験の平均値である。
【図４Ａ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１（ＭＯＩ＝４０）を感染させたヒト神経前駆細胞を線条体内に移植し、移植細胞中のＴＨに対する免疫反応性を示す。免疫反応性は、非処理動物から採取した１５μｍの凍結乾燥脳切片〔ｌａｃｕｎａ〕に対する抗ＴＨ免疫組織化学によって測定した。バイオレット染色は、細胞をアルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベーションし次に特異的基質で染色することによって、ジゴキシゲニン標識ａｌｕプローブとハイブリダイズするヒト細胞の存在を検出する。倍率１１０。
【図４Ｂ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１（ＭＯＩ＝４０）を感染させたヒト神経前駆細胞を線条体内に移植し、移植細胞中のＴＨに対する免疫反応性を示す。免疫反応性は、ドキシサイクリンで毎日処理した動物から採取した１５μｍの凍結乾燥脳切片〔ｌａｃｕｎａ〕に対する抗ＴＨ免疫組織化学によって測定した。バイオレット染色は、細胞をアルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベーションし次に特異的基質で染色することによって、ジゴキシゲニン標識ａｌｕプローブとハイブリダイズするヒト細胞の存在を検出する。倍率１１０。
【図５Ａ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１（ＭＯＩ＝４０）に感染させたヒト神経前駆細胞移植物中のＴＨ免疫反応性を示す。免疫反応性は、非処理動物から採取した１５μｍの凍結乾燥脳切片に対して抗ＴＨ免疫組織化学、及び、３５イオウ標識ＨＴＨ−１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うことによって測定した。これらの切片をクレジルバイオレットで対比染色した。倍率４５０。
【図５Ｂ】  アデノウイルスＡｄＰＧＫ．ｔｅｔ．ｈＴＨ−１（ＭＯＩ＝４０）に感染させたヒト神経前駆細胞移植物中のＴＨ免疫反応性を示す。免疫反応性は、ドキシサイクリンで毎日処理した動物から採取した１５μｍの凍結乾燥脳切片に対して抗ＴＨ免疫組織化学、及び、３５イオウ標識ＨＴＨ−１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うことによって測定した。これらの切片をクレジルバイオレットで対比染色した。倍率４５０。
【図６】  ｔＴＡ遺伝子（Ａ）；ＵＭＳ配列（Ｂ）；Ｏｐ配列（Ｃ）；ＣＭＶ最小プロモーター（Ｄ）のヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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