(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養上清から組換えヒトエリトロポイエチンを精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）示差的生理食塩水沈降；
（ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー；
（ｃ）濃縮およびダイアフィルトレーション；
（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
（ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィー；
（ｆ）濃縮およびダイアフィルトレーション；
（ｇ）分子排除クロマトグラフィー
の組み合わせによる工程を包含する、方法。
【請求項２】
工程ａ）から工程ｇ）を、以下の順：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）から工程ｇ）を、以下の順：（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｂ）、（ｆ）、および（ｇ）で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）が、前記培養上清に硫酸アンモニウムを添加し、続いて遠心分離する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、疎水的相互作用マトリクスを使用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
使用される前記疎水的相互作用マトリクスが、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｄ）が、陰イオン交換マトリクスを使用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記陰イオン交換マトリクスが、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｅ）が、陽イオン交換マトリクスを使用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記陽イオン交換マトリクスが、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｇ）が、分子排除マトリクスを使用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
使用される前記分子排除マトリクスが、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）  Ｓ−２００  ＨＰである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
示差的沈降、疎水的相互作用、陰イオン交換、陽イオン交換、および分子排除液体クロマトグラフィーを包含する一連の縦列した別々の工程により特徴付けられる、組換えヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）を得るための方法。従って、この方法を使用することによって得られるＥＰＯが記載される。
【０００２】
（背景情報）
ＥＰＯは骨髄における赤芽球の分化を刺激する糖タンパク質であり、従って、循環する血液の赤血球の数を増加させる。ヒトにおける赤血球の平均寿命は１２０日であり、従って、ヒトは毎日１／１２０の赤血球を失う。この損失は、適正なレベルの赤血球を維持するために、連続的に回復されなければならない。
【０００３】
ＥＰＯの存在は、世紀の変わり目で初めて仮定され、それは５０年代初期にＲｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖによって明確に立証された。Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ）１４３：３８４−６（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｆｒａｎｃｅ），１４３：４３２−５（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔら、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１１１：３４４−６（１９０６）；Ｃａｒｎｏｔ、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１１１：４６３−５（１９０６）；Ｒｅｉｓｓｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ、１９５０、５：３７２−８０（１９５０）およびＥｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，８：３４９−５７（１９５３）を参照のこと。ＲｅｉｓｓｍａｎおよびＥｒｓｌｅｖの実験は、他の研究者によって即座に確認された。Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ，９：２９９−３０９（１９５４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，８６：２５５−８（１９５４）；およびＢｏｒｓｏｏｋら、Ｂｌｏｏｄ，９：７３４−４２（１９５４）を参照のこと。
【０００４】
生物におけるＥＰＯ産生部位の同定は議論の論点であった。連続的な実験によって、腎臓を主要な器官として、そして管周囲の間細胞を合成部位として同定した。Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１７９：６３３−４（１９５７）；Ｋｕｒａｔｏｗｓｋａら、Ｂｌｏｏｄ，１８：５２７−３４（１９６１）；Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｃｔａ  Ｈｅｍａｔｏｌ．，２６：２２４−３２（１９６１）；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２０５：６１１−２（１９６５）；Ｆｒｅｎｋｅｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１４９１：２９２−３（１９６８）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１３７，１：３２７−３０（１９７１）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌ、Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），４７４：２３８−４２（１９７２）；Ｅｒｓｌｅｖ、Ｂｌｏｏｄ，４４１：７７−８５（１９７４）；Ｋａｚａｌ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，５，２：９８−１０９（１９７５）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，９９，２：５０４−１０（１９７６）；Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２８：１０１−２２（１９８８）；Ｊｅｌｋｍａｎｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１，７：５８１−８（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８０，１３：４００８−１１（１９８３）；Ｃａｒｏら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０３，６：９２２−３１（１９８４）；Ｃａｒｏら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１２：３５７（１９８４）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７０，１：３１６−８（１９８６）；Ｂｏｎｄｕｒａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６，７：２７３１−３（１９８６）；Ｂｏｎｄｕｒａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６，７：２７３１−３（１９８６）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７１，２：５２４−７（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７１，２：５２４−７（１９８８）；Ｌａｃｏｍｂｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１，２：６２０−３（１９８８）；Ｋｏｕｒｙら、Ｂｌｏｏｄ，７４，２：６４５−５１（１９８９）を参照のこと。
【０００５】
総ＥＰＯの１０％〜１５％の範囲のより小さな割合は、成体の肝臓により産生される。Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１２，３：２２７−４２（１９７９）；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１５，２：１２１−３２（１９８０）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１１，１：３７−４６（１９８１）；Ｄｉｎｋｅｌａａｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，９，７：７９６−８０３（１９８１）；Ｃａｒｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４４：５（１９８３）；Ｄｏｒｎｆｅｓｔら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０２，２：２７４−８５（１９８３）；Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１３，５：４３２−８（１９８３）；Ｊａｃｏｂｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３，６００５：８０６−１０（１９８５）；Ｅｒｓｌｅｖら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕｍｏｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３，３−４：１５９−１６４（１９８６）を参照のこと。産生されたＥＰＯは、組織の低酸素およびＥＰＯ産生細胞数の増加によって起こるその発現の程度に正比例する。
【０００６】
ＥＰＯは、貧血、特に腎不全に由来する貧血の処置において卓越した有効性を示した。Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．，３１６，２：７３−７８（１９８７）；Ｋｒａｎｅ、Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３１，３：１７７−１８１（１９８３）を参照のこと。しかし、大量に産生する方法が利用できないことに起因して、その治療的な有用性は制限されてきた。公知の抽出システムによって得られるＥＰＯの量および質は不充分であった。近年、組換えＤＮＡ技術の使用によって大量のタンパク質を得る事が可能となった。これらの技術の真核生物細胞への応用は、大規模なＥＰＯの産生を可能にした。米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ）、同第５，５４７，９３３号（Ｌｉｎ）、同第５，７５６，３４９号（Ｌｉｎ）、同第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）、および同第４，６７７，１９５（Ｈｅｗｉｃｋら）を参照のこと。
【０００７】
ＥＰＯのような糖タンパク質の分離について、いくつかの技術が現在利用可能である。限外濾過、カラム焦点電気泳動、平床電気泳動、ゲル濾過、電気泳動および等速電気泳動、ならびにいくつかの他のクロマトグラフィー方法が、糖タンパク質の精製のために利用されている。最も広範に使用されるクロマトグラフィー技術は、イオン交換クロマトグラフィーおよび吸着クロマトグラフィーであった。
【０００８】
イオン交換方法は、溶液の成分を、それらの異なる正味の電荷に従って識別し、そして異なるイオン強度またはｐＨの溶離液を用いて、ステージにおいてかまたは連続勾配の適用を通してのいずれかで溶出することよって単離する分離技術である。この方法は、反対の電荷を有する成分の結合または静電気的吸着を誘導するために、正電荷または負電荷のいずれかのゲルまたは樹脂マトリクスを使用する。脱着または溶出の間、サンプル成分は、溶出させるために使用される溶液または緩衝液中に存在するイオン、または目的の分子の正味の電荷を変更するｐＨの変化によって交換される。
【０００９】
逆相吸着クロマトグラフィーは、サンプル成分を、それらの異なる極性に従って分離する工程を包含する。サンプル成分は、非共有結合により有機ポリマーで被覆したシリカマトリクスから構成される樹脂を通して吸着される。成分の選択的な脱着は、溶離液を含む非極性溶媒での溶出での後で生じる。
【００１０】
上記の分離技術は、最初は、比較的小さな疎水性または親水性の分子を分離するために利用された。より大きな分子（例えば、タンパク質、そして特に、複合体タンパク質（例えば、リポタンパク質、核タンパク質、および糖タンパク質））の精製へのこれらの適用は、より近年のことである。多数の刊行物が、タンパク質分離においてこれまでに達成された技術水準を例証する。
【００１１】
Ｓｏｆｅｒｅｔら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９７）；Ｏｌｓｏｎ編、「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、１９９５）；Ｆｒａｎｋｓ編、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９３）：Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１８２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９１）；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら編、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）；Ｈａｒｒｉａら編、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９９０）；Ｂｒｏｗｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９９、１−２１、１９７９；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、「ＶＤＹＡＣ  ＴＭ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ＨＰＬＣ」、第１−２２頁（Ｔｈｅ  Ｓｅｐ／Ａ／Ｒａ／Ｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐｓ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９８４）を参照のこと。目的のタンパク質に対して惹起されたモノクローナル抗体の使用は、別の公知なタンパク質回収方法である。
【００１２】
組換えＥＰＯを分離するためのいくつかの特定の方法が、近年報告された。これらの方法のうちの１つは、選択的プロテアーゼ排除による陰イオン交換クロマトグラフィー、次いで、逆相クロマトグラフィーおよび濾過によるタンパク質精製にある。米国特許第４，６６７，０１６号（Ｌａｉらに対する）を参照のこと。この技術は、未知の比活性および純度のうちの１６％のＥＰＯの収率を主張する。
【００１３】
組換えＥＰＯの分離のために提案される別の方法は、部分的に精製されたタンパク質を含む溶液に対する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の適用にある。米国特許第４，６６７，１９５号（Ｈｅｗｉｃｋらに対する）を参照のこと。この方法は、実施において再現不能であることが見出された。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣによるタンパク質およびポリペプチドの分離のために一般的に使用されるかまたは推奨される非極性溶媒は、目的のタンパク質から除去することが困難でありかつヒトに対して潜在的に毒性である、アセトニトリルのような試薬を含む。Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１４、６、２２２３−７（１９８４）を参照のこと。しかし、タンパク質溶出のためのエタノールおよび蟻酸水溶液もまた使用されていることに留意すべきである。Ｔａｋａｇａｋｉら、Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５，４，１５３６−４１（１９８０）を参照のこと。
【００１４】
組換えヒトＥＰＯの産生に関する豊富な情報が存在するとしても、ヒトにおけるその利用について適したＥＰＯを産出する精製方法は、いまだ記載されていない。適切なタンパク質精製方法は、９９％を超える純度で、かつ凝集体化物質、ｂ）分解された物質、ｃ）擬似（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）タンパク質、およびｄ）プロテアーゼのような夾雑物を含まないＥＰＯを産出すべきである。９９％未満の純度のタンパク質または上述の任意の夾雑物の存在は、ヒトに対して毒性であり得る。
【００１５】
他方で、ＥＰＯ精製のために提案される方法の多くは、産業的規模でのタンパク質産生に適用される場合に、効率的ではない。ＲＰ−ＨＰＬＣ方法は大量の有機溶媒を使用し、これは精製コストを増加させる。さらに、有機溶媒は取り扱うのがより困難であり、そして環境に対する汚染物質である。提案される他の精製方法は、実施において再現不可能であるか、または低収率を有する。
【００１６】
（発明の要旨）
本発明の新規の方法は、詳細には、ＥＰＯ精製のための系を記載する。これにより、高純度かつ高品質の産物の高回収が達成される。この産物は、ヒト医薬における使用のための注射可能産物として、薬学的化合物を処方するために、さらなる精製を伴わずに使用され得る。
【００１７】
本願発明の利点は、凝集体、分解された物質、または予期されない等電点値の分子のような、任意の所望されない分子改変体を伴わない、プロテアーゼを含まないＥＰＯの達成である。本願発明により得られるＥＰＯは９９％を超える純度であり、そして任意のさらなる精製工程を伴わずに、ヒトへの投与に適切な薬学的処方物を調製するために、利用され得る。本願発明により得られるＥＰＯは、３．０と４．５との間の範囲である等電点を有する５〜８個のアイソフォーム、および59Ｆｅ取り込み−超低酸素赤血球増加症マウスアッセイ（59Ｆｅ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｘ−ｈｙｐｏｘｉｃ  ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｍｉｃｅ  ａｓｓａｙ）および２８０ｎｍでのＥＰＯ総質量分析アッセイによって測定されて、１００，０００  ＩＵ／ｍｇタンパク質を超えるインビボの特異的生物学的活性を含む微小異種タンパク質である。
【００１８】
本願発明のさらなる利点は、その環境的影響の低さである。本願方法は、ＲＰ−ＨＰＬＣ技術に基づく分離工程を使用せず、従って、環境に対して有害であり得る有機溶媒の使用を回避する、クリーンなプロセスである。
【００１９】
本願発明のさらに別の利点は、ストリンジェントな温度条件、有害な有機溶媒、またはその生物学的活性に影響し得るかもしくはヒト用途に対して不適切な毒性化合物を生じ得る他の溶液に対して、ＥＰＯが曝露されないことである。
【００２０】
以下の詳細な説明および実施例は、本願方法において実施される分離工程を例証する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＥＰＯを精製する方法に関する。この方法は、以下の工程：示差的沈降、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および分子排除クロマトグラフィーの組み合わせによって、ＥＰＯを含む細胞培養上清を処理する工程を包含する。
【００２２】
好ましいＥＰＯ産生組換え細胞は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ウイルス性プロモーターおよびウイルス性ターミネーターを含むベクターを含む。好ましい細胞は、メトトレキサートおよびネオマイシン誘導化抗生物質の両方に対する耐性を付与するベクターを含む。好ましくは、ＥＰＯ核酸分子は、Ｌｉｎ、「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ」（米国特許第４，７０３，００８号）に記載される核酸分子を含む。好ましくは、ウイルス性プロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーターである。
【００２３】
組換え細胞からＥＰＯを得る好ましい方法は、インシュリンを含有する培地中で培養することである。詳細には、このような培養する工程は、本発明の宿主細胞からＥＰＯおよびインシュリンを含む上清を分離する工程、この上清を濃縮する工程、そしてこの濃縮した産物を凍結する工程を包含する。好ましくは、培養培地は、培養培地１リットルあたり０．５ｍｇと２０ｍｇとの間のインシュリンを含む。
【００２４】
本発明はさらに、ＥＰＯを含む細胞培養上清を、順に以下の工程によって処理する工程を包含する、ＥＰＯを精製する方法に関する：（ａ）示差的沈降、（ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー、（ｃ）ダイアフィルトレーション、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィー、および（ｆ）分子排除クロマトグラフィー。本発明は、以下の工程：示差的沈降、疎水的相互作用クロマトグラフィー、２ダイアフィルトレーション工程、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび分子排除クロマトグラフィーの組み合わせによって、ＥＰＯを含む細胞培養上清を処理する工程を包含する、ＥＰＯを精製する方法に関する。
【００２５】
本発明はさらに、ＥＰＯを含む細胞培養上清を、順に以下の工程によって処理する工程を包含する、ＥＰＯを精製する方法に関する：（ａ）示差的沈降、（ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー、（ｃ）ダイアフィルトレーション、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）陽イオン交換クロマトグラフィー、（ｅ’）ダイアフィルトレーション、および（ｆ）分子排除クロマトグラフィー。
【００２６】
上記および以下に記載される方法および組成物の示差的沈降工程は、この上清に硫酸アンモニウムを添加し、続いて遠心分離する工程を包含する。
【００２７】
上記および以下に記載される方法および組成物の疎水的相互作用クロマトグラフィー工程は、疎水的相互作用マトリクスを使用する工程を包含する。好ましくは、この相互作用マトリクスは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである。
【００２８】
上記および以下に記載される方法および組成物の陰イオン交換工程は、陰イオン交換マトリクスを使用する工程を包含する。好ましくは、この陰イオン交換マトリクスは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを含む。
【００２９】
上記および以下に記載される方法および組成物の陽イオン交換工程は、陽イオン交換マトリクスを使用する工程を包含する。好ましくは、この陽イオン交換マトリクスは、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを含む。
【００３０】
上記および以下に記載される方法および組成物の分子排除工程は、分子排除マトリクスを使用する工程を包含する。好ましくは、この分子排除マトリクスは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＰである。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、実質的に純粋なＥＰＯを提供する。好ましくは、このＥＰＯは、以下の工程の組み合わせによって産生される：示差的沈降、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および分子排除クロマトグラフィー。より好ましくは、このＥＰＯは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって決定される場合に、９９％より高い純度を有する。
【００３２】
本発明の精製されたＥＰＯを使用する好ましい方法は、疾患の処置のためのヒトへの注射に適切な形態に凍結乾燥することを含む。詳細には、好ましい凍結乾燥手順は、以下を包含する：薬学的組成物中にＥＰＯを配置する工程、第１のＥＰＯ組成物を容器内にロードする工程であって、ここでこの容器は−３０℃以下の温度である、工程；大気圧の下で、４時間以上の間、−３０℃以下の温度にてこのＥＰＯ組成物をインキュベートする工程；１時間以上の間、３０絶対ミクロン（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｍｉｃｒｏｎ）以下の圧力でこの組成物をインキュベートする工程；および、５絶対ミクロン以下の圧力値を維持しつつ、少なくとも２５℃に達するまで、１時間あたり３℃以下の温度を上昇させる工程。
【００３３】
凍結乾燥のための好ましい薬学的組成物は、ＥＰＯ、糖、塩、およびヒトアルブミンを含む。凍結乾燥のための特に好ましい組成物は、ＥＰＯ、マンニトール、ＮａＣｌ、ＮａＨ2ＰＯ4、およびＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを含む。
【００３４】
本発明を、以下の非限定的な実施例において、さらに詳細に記載する。
【００３５】
（実施例）
（実施例１  回収）
７，９２０ｇの硫酸アンモニウムを、ＥＰＯを産生する培養中のＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞から得られる滅菌濃縮溶液３０リットル中に溶解した。硫酸アンモニウムの添加後、この溶液を、４℃で２４時間貯蔵した。多くの夾雑タンパク質が沈降したが、ＥＰＯは溶液中に残存した。この産物を、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機（ＨＧ４Ｌローターを使用）で、１０分間、５，０００ＲＰＭで遠心分離した。
【００３６】
（実施例２  疎水的相互作用クロマトグラフィー）
先の工程から得られた物質を、以下のパラメーターに従って、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｌｏｗ  ｓｕｂ．−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用し、クロマトグラフする。
１．装備：
Ａ．プレカラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）：
１）直径：１４ｃｍ
２）ベッド高：１９ｃｍ
３）マトリクス：
ａ）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ）容量：３，０００ｍｌ
Ｂ．カラム：
１）直径：２０ｃｍ
２）ベッド高：１９ｃｍ
３）マトリクス：
ａ）Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｌｏｗ  ｓｕｂ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ）容量：６，０００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．緩衝液Ａ：１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２
Ｂ．緩衝液Ｆ：１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１．８Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．２
Ｃ．緩衝液Ｇ：１５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２
Ｄ．２０％イソプロピルアルコール
Ｅ．０．５Ｎ  ＮａＯＨ
３．クロマトグラフされる物質：
Ａ．先の実施例から生じた硫酸アンモニウム上清
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：３０，０００ｍｌ
２）伝導率：１９０〜２１０ｍＳｉ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．２。
【００３７】
プレカラムを平衡化および衛生化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液または緩衝液を、プレカラムを通して連続的に通過させた：１．０カラム容量（「ｖｃ」）（３ｌ）のＨ2Ｏ；１．０ｖｃ（３ｌ）のＮａＯＨ（０．５Ｎ）；１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ｇ、そして最後に１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｆ。
【００３８】
カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液または緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０ｖｃ（６ｌ）のＨ2Ｏ；１．０ｖｃ（６ｌ）の２０％イソプロピルアルコール；１．０ｖｃ（６ｌ）のＨ2Ｏ；１．０ｖｃ（６ｌ）の０．５Ｎ  ＮａＯＨ；１．０ｖｃ（６ｌ）のＨ2Ｏ；１．０ｖｃ（６ｌ）の緩衝液Ｇ、そして最後に１．５ｖｃ（９ｌ）の緩衝液Ｆ。
【００３９】
一旦、プレカラムおよびカラムを平衡化すると、このカラムをプレカラムの後に接続し、そしてクロマトグラフされる物質をロードした。このロードする工程を、１９ｃｍ／時間流で４℃にて実施した。その後、同じ流速であるが室温で溶出を実施し、そして本明細書中以後に詳述される溶液および緩衝液を、以下の量および順序でカラムを通して通過させた：２．５ｖｃ（１５ｌ）の緩衝液Ｆ（一旦、この緩衝液を通過させれば、プレカラムを除去した）。一旦、プレカラムを除去すると、クロマトグラフィーをＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで実施した。このＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムには、緩衝液Ｆ−緩衝液Ａの勾配を、総容量１０ｖｃ（６０ｌ）でこれらの緩衝液の５０：５０の比率が達成されるまで、これらの緩衝液の８５：１５の比率から開始してアプライした。
【００４０】
勾配が完成すると、３０：７０の比率にある１．５ｖｃ（９ｌ）の緩衝液Ｆ−緩衝液Ａを、カラムを通して通過させ、そして最後に１．５ｖｃ（９ｌ）のＨ2Ｏを通過させた。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して滅菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。
【００４１】
（実施例３  濃縮およびダイアフィルトレーション）
先の実施例から生じた画分を、以下に記載される条件に従って、濃縮およびダイアフィルトレーションした：
１．装備：
Ａ．蠕動ポンプ：Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ−Ｃａｔ．ＮO３０２Ｓ
Ｂ．チュービング：Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ−Ｃａｔ．ＮO０６４０２−１８
Ｃ．濃縮機：Ｐｒｅｐ  Ｓｃａｌｅ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣＤＵ  Ｆ００６ＬＣ２．溶液および緩衝液：
Ａ．１０ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
Ｂ．１ｍＭ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
Ｃ．０．１Ｎ  ＮａＯＨ
Ｄ．Ｈ2Ｏ
Ｅ．緩衝液Ａ：１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２
３．処理される物質：
Ａ．先の実施例から生じた選択された画分
Ｂ．サンプル条件：
１．容量：１５，０００〜３０，０００ｍｌ
２．伝導率：１３０〜１７０ｍＳｉ／ｃｍ
３．ｐＨ：７．２。
【００４２】
装備を最初に、清掃、衛生化、および平衡化し、そして以下の順序の溶液および緩衝液を、この装備を通して流した：１０ｌの１０ｍＭ  ＳＤＳ；４０ｌのＨ2Ｏ；１０ｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４０ｌのＨ2Ｏ；１０ｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ；４０ｌのＨ2Ｏ、そして最後に５ｌの緩衝液Ａ。次いで、この装備を、通常の方法論に従う、選択された画分における緩衝液Ａに対する濃縮およびダイアフィルトレーションのために使用されるように準備した。
【００４３】
濃縮した産物の最終容量は、２，０００〜３，０００ｍｌの間であり、その伝導率は１，１００〜１，５５０μｍＳｉ／ｃｍであり、そしてそのｐＨは７．２であった。
【００４４】
（実施例４  陰イオン交換クロマトグラフィー）
先の実施例から生じる物質を、以下のように、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してクロマトグラフした。
１．装備：
Ａ．カラム：
１）直径：１４ｃｍ
２）ベッド高：１９ｃｍ
３）マトリクス
ａ）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ）容量：３，０００ｍｌ
２．溶液および緩衝液
Ａ．緩衝液Ａ：１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２
Ｂ．緩衝液Ｇ：１５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２
Ｃ．緩衝液Ｎ：５０ｍＭ酢酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
Ｄ．緩衝液Ｓ：５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．０
Ｅ．０．５Ｎ  ＮａＯＨ
３．クロマトグラフされる物質：
Ａ．適正に濃縮およびダイアフィルトレーションされた、疎水的相互作用工程から選択される画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：２，０００〜３，０００ｍｌ
２）伝導率：１，１００〜１，５５０μＳｉ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．２。
【００４５】
カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液または緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０ｖｃ（３ｌ）のＨ2Ｏ；１．０ｖｃ（３ｌ）の０．５Ｎ  ＮａＯＨ；１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ｎ；２．０ｖｃ（６ｌ）の緩衝液Ｓ；３．０ｖｃ（９ｌ）の緩衝液Ｇ；そして最後に、２．０ｖｃ（６ｌ）の緩衝液Ａ。
【００４６】
一旦、カラムを平衡化すると、クロマトグラフされる物質をロードした。このロードする工程を、３９ｃｍ／時間で室温にて実施した。その後、同じ流速および温度で溶出を実施し、そして本明細書中以後に詳述される溶液および緩衝液を、以下の順序で通過させた：１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ａおよび４．０ｖｃ（１２ｌ）の緩衝液Ｓ。その後、総容量１．５ｖｃ（４．５ｌ）中における緩衝液Ｓ−緩衝液Ｎの工程（５０：５０）を実施した。
【００４７】
一旦、この工程が完了すると、１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｎをこのカラムに通過させた。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して滅菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。
【００４８】
（実施例５  陽イオン交換クロマトグラフィー）
先の実施例から生じた物質を、以下のように、陽イオン交換マトリクスを使用してクロマトグラフした。
１．装備：
Ａ．カラム：
１）直径：１４ｃｍ
２）ベッド高：１９ｃｍ
３）マトリクス
ａ）ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）  ｂ）容量：３，０００ｍｌ
２．溶液および緩衝液
Ａ．緩衝液Ｄ：１２．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、４ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０
Ｂ．緩衝液Ｅ：１２．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、４ｍＭクエン酸、０．５Ｍ  Ｎ    ａＣｌ、ｐＨ６．０
Ｃ．０．５Ｎ  ＮａＯＨ
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．ＮａＯＨｃｃでｐＨ６．０に調整され、そして４，８００μＳｉ／ｃｍの伝導率（９３．５：６．５の比率にある緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅと等しい伝導率）に達するまで希釈された、先の実施例から選択される画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：５，０００ｍｌ
２）伝導率：４，８００μＳｉ／ｃｍ（９３．５：６．５の比率にある緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅと等しい）
３）ｐＨ：６．０。
【００４９】
カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液または緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０ｖｃ（３ｌ）のＨ2Ｏ；１．０ｖｃ（３ｌ）の０．５Ｎ  ＮａＯＨ；１．０ｖｃ（３ｌ）の緩衝液Ｅ、そして最後に、９３．５：６．５の比率にある１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅ。
【００５０】
一旦、カラムを平衡化すると、クロマトグラフされる物質をロードした。このロードする工程を、３９ｃｍ／時間で室温にて実施した。その後、同じ流速および温度で溶出を実施し、そして本明細書中以後に詳述される溶液および緩衝液を、以下の順序でカラムを通して通過させた：９３．５：６．５の比率にある１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅ。その後、緩衝液Ｄ−緩衝液Ｅの勾配を、総容量２．０ｖｃ（６ｌ）でこれらの緩衝液の５０：５０の比率が達成されるまで、これらの緩衝液の９３．５：６．５の比率から開始してアプライした。一旦、勾配が完成すると、１．５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｅを、カラムを通して通過させた。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して滅菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。
【００５１】
（実施例６  濃縮およびダイアフィルトレーション）
先の実施例から生じた画分を、以下のパラメーターおよび条件に従って、濃縮およびダイアフィルトレーションした。
１．装備：
Ａ．蠕動ポンプ：Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ−Ｃａｔ．ＮO３０２Ｓ
Ｂ．チュービング：Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ−Ｃａｔ．ＮO０６４０２−１８
Ｃ．濃縮機：Ｐｒｅｐ  Ｓｃａｌｅ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣＤＵ  Ｆ００２ＬＣ２．溶液および緩衝液：
Ａ．１０ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
Ｂ．１ｍＭ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
Ｃ．０．１Ｎ  ＮａＯＨ
Ｄ．Ｈ2Ｏ
Ｅ．緩衝液Ｂ：１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５ｍ    ｇ／ｍｌラクトース、ｐＨ７．２
３．処理される物質：
Ａ．先の実施例から生じた選択された画分
Ｂ．サンプル条件：
１．容量：６，０００ｍｌ
２．伝導率：５，０００〜８，０００ｍＳｉ／ｃｍ
３．ｐＨ：６．０。
【００５２】
装備を最初に、清掃、衛生化、および平衡化し、以下の順序の溶液および緩衝液を、この装備を通して通過させた：１０ｌの１０ｍＭ  ＳＤＳ；４０ｌのＨ2Ｏ；１０ｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４０ｌのＨ2Ｏ；１０ｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ；４０ｌのＨ2Ｏ、そして最後に５ｌの緩衝液Ｂ。このようにして、この装備を、通常の方法論に従う、選択された画分における緩衝液Ｂに対する濃縮およびダイアフィルトレーション手順のために使用されるように準備した。
【００５３】
濃縮した産物の最終容量は、３５０〜６００ｍｌであり、その伝導率は１５，５００〜１９，０００ｍＳｉ／ｃｍであり、ｐＨは７．２であった。そしてこの溶液を、４℃にて保存した。
【００５４】
（実施例７  分子排除クロマトグラフィー）
先の実施例から生じた物質を、以下のように、分子排除マトリクスを使用してクロマトグラフした。
１．装備：
Ａ．カラム：
１）直径：１０ｃｍ
２）ベッド高：７６ｃｍ
３）マトリクス
ａ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ）容量：６，０００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．緩衝液Ｂ：１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５ｍ    ｇ／ｍｌラクトース、ｐＨ７．２
Ｂ．０．５Ｎ  ＮａＯＨ
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．濃縮された、先の実施例から選択された画分
Ｂ．サンプル条件：
１．容量：３５０〜６００ｍｌ
２．伝導率：１５，５００〜１９，０００μＳｉ／ｃｍ
３．ｐＨ：７．２。
【００５５】
カラムを平衡化するために、本明細書中以後に詳述される量の以下の溶液または緩衝液を、カラムを通して連続的に通過させた：１．０カラム容量（「ｖｃ」）（６ｌ）のＨ2Ｏ；１．５ｖｃ（９ｌ）の０．５Ｎ  ＮａＯＨ、そして最後に３．０ｖｃ（１８ｌ）の緩衝液Ｂ。一旦、カラムを平衡化すると、クロマトグラフされる物質から１００ｍｌをロードした。このロードする工程を、２７ｃｍ／時間で室温にて実施した。その後、同じ流速および温度率で溶出を実施し、そして０．７５ｖｃ（４．５ｌ）の緩衝液Ｂを、カラムを通して通過させた。この手順を、４〜６回（すなわち、クロマトグラフされる物質が完全に利用されるまで）繰り返した。選択されたＥＰＯを含む画分を、０．２２μｍ孔の膜を通して滅菌条件下で濾過し、そして４℃で保存した。
【００５６】
この工程をもって精製プロセスを終結した。得られたＥＰＯは、９９％より優れた程度の純度を有し、そしてこの精製プロセス全体で、約３０％の全体的な収率を有した。
【００５７】
（実施例８  ＥＰＯアッセイ）
先の実施例で得られたＥＰＯを、以下のプロトコルに従って、正体および生物学的活性についてアッセイした。
【００５８】
変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、ＥＰＯは、ＥＰＯについて予期されたような分子量の広範なバンドとして同定された。図１を参照のこと。このバンドは、ウェスタンブロットアッセイにおいて、ＥＰＯについて予期されたように、ヒトＥＰＯに対して惹起されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体により認識された。図２を参照のこと。グリカナーゼでの処理により、ＥＰＯについて予期されたような程度およびサイズでのグリコシド鎖の存在が証明された。図３を参照のこと。産生されたＥＰＯは、ＥＰＯについて予期されたように、３．０〜４．５の等電点を示す一連の種から構成されることが示された。図４を参照のこと。
【００５９】
トランスフェクトされた細胞株の培養上清から精製された、単離されたタンパク質の完全なアミノ酸配列は、天然のヒトエリトロポイエチンとの全くの相同性を示した。この天然のヒトエリトロポイエチンの１６５個のアミノ酸配列は、以下（配列番号１）の通りである。
【００６０】
【化１】
0004516692.tif 000002
１６５個のアミノ酸鎖における４つのグリコシル化部位、ならびに複合体炭水化物構造、そして特に、シアル酸末端残基（これは、ＥＰＯを特徴付ける）の存在が確認された。これらの結果は、国際的なＥＰＯ基準との完全な一致を示した超低酸素赤血球増加症マウス試験による、産生タンパク質の生物学的アッセイによって、さらに支持された。
【００６１】
本願方法に従って得られたＥＰＯサンプルを、逆相および分子排除高速液体クロマトグラフィー分析に供した。両方のアッセイにおいて、９９％を超える純度が証明された。図５および６を参照のこと。
【００６２】
以下の表は、本願手順に対応する、各分離工程の回収率を例証する。
【００６３】
【表１】
0004516692.tif 000003
以下の表は、請求項２に特許請求される精製配列の累積回収率を例証する。
【００６４】
【表２】
0004516692.tif 000004
本明細書中の上記で言及された全ての刊行物を、それらの全体において、本明細書中で参考として援用する。
【００６５】
上述の本発明は、明確化および理解の目的ために幾分詳細に記載されたが、形態および詳細において、種々の変更が、本発明および添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、この開示を読んで当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、精製後に、記載された方法に従って得られたＥＰＯサンプルの、ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を例証する。レーン１、４、および７では、分子量マーカーをロードした。レーン２、３、５、および６では、本願手順に従って得られた種々の量の純粋なＥＰＯを泳動した。得られた産物の純度および３４ｋＤａを超える見かけの分子量は、明らかに観察され得るように、ヒト泌尿器ＥＰＯについて報告されたものと一致する。
【図２】  図２は、記載される方法に従って得られたＥＰＯサンプルの、ウェスタンブロット分析を例証する。産生されたＥＰＯの正体を評価する（なぜなら、これは、ヒトＥＰＯに対するモノクローナル抗体により認識されるため）。レーン１および２では、それぞれヒトＥＰＯ標準および分子量マーカーをロードした。本願方法に従って得られたＥＰＯサンプルを、レーン３〜５にロードした。
【図３】  図３は、記載される方法に従って得られ、グリカナーゼ（ｇｌｙｃａｎａｓｅ）で処理された、純粋なＥＰＯサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分子量マーカーを、レーン１、４、および８にロードした。レーン２および７は、未処理ＥＰＯに対応する。レーン３では、Ｏ−グリカナーゼ処理したＥＰＯをロードした（；Ｏ−グリコシル化部位の存在を確証する）。レーン５では、Ｎ−グリカナーゼで部分的に消化したＥＰＯをロードした。ＥＰＯについて予期されるような分子量を有する３Ｎ−グリコシル化分子の存在が確認され得る。レーン６は、Ｎ−グリカナーゼで消化したＥＰＯをロードし、そして完全に脱グリコシル化したタンパク質について予期される分子量が得られた。
【図４】  図４は、記載される方法に従って産生された、純粋なＥＰＯサンプルにおける等電点の調査を例証する。ＥＰＯサンプルをレーン２、３、および４において泳動し、等電点マーカーをレーン１および５において泳動した。ＥＰＯに対応するアイソフォームの存在が確認され、これは、３．０〜４．５の範囲の等電点を示す。
【図５】  図５は、逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、本明細書中に記載される方法に従って産生されたＥＰＯサンプルの純度を示す。
【図６】  図６は、分子排除高速液体クロマトグラフィーを使用して、本明細書中に記載される方法に従って産生されたＥＰＯサンプルの純度を示す。
【配列表】
0004516692.tif 000005
0004516692.tif 000006
【図１】
0004516692.tif 000007
【図２】
0004516692.tif 000008
【図３】
0004516692.tif 000009
【図４】
0004516692.tif 000010
【図５】
0004516692.tif 000011
【図６】
0004516692.tif 000012