(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞への核酸の移送において使用する医薬の製造のための、核酸、デキストリンおよび少なくとも１種類の二糖の溶液を含む組成物の使用であって、デキストリンの量が２％〜２０％ｗ／ｖであり、二糖の量が１〜１０％ｗ／ｖで組成物に存在し、溶液の浸透圧が２５０〜３５０ミリモル浸透圧濃度である、該使用。
【請求項２】
デキストリンの分子量が１，０００〜２００，０００の範囲内である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
デキストリンの分子量が２，０００〜５５，０００である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
デキストリンが、１２より大きい重合度のポリマーを１５％ｗ／ｖより多く含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
デキストリンが、１２より大きい重合度のポリマーを５０％ｗ／ｖより多く含む、請求項４記載の使用。
【請求項６】
デキストリンが、２０％ｗ／ｖより少ない量で前記溶液中に存在する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
デキストリンが、２％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、１１％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ、１３％ｗ／ｖ、１４％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、１６％ｗ／ｖ、１７％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、１９％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖから選ばれる量で前記溶液中に存在する、請求項１記載の使用。
【請求項８】
デキストリンが２〜５％ｗ／ｖで存在する、請求項１記載の使用。
【請求項９】
デキストリンが４％ｗ／ｖである、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
二糖が２〜５％ｗ／ｖの量である、請求項１記載の使用。
【請求項１１】
二糖がスクロースであり、スクロースの量が３％ｗ／ｖである、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
デキストリンの量が１５％ｗ／ｖであり、スクロースの量が３％ｗ／ｖである、請求項１記載の使用。
【請求項１３】
デキストリンの量が４％ｗ／ｖであり、スクロースの量が３％ｗ／ｖである、請求項１記載の使用。
【請求項１４】
前記溶液が更に２価陽イオンを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記２価陽イオンが、少なくとも０．２ｍＭの濃度で存在する、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記２価陽イオン濃度が０．２〜３．０ｍＭである、請求項１４記載の使用。
【請求項１７】
前記２価陽イオンが塩化マグネシウムにより供給され、その濃度が２．０ｍＭである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記溶液が４％ｗ／ｖのデキストリン、３％ｗ／ｖのスクロースおよび２．０ｍＭの塩化マグネシウムを含む、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記核酸分子がベクターである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ベクターが真核細胞での発現に適用される、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
前記ベクターがウィルスに基づいたものであり、以下のウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスから選ばれる、請求項１９または２０記載の使用。
【請求項２２】
前記ウィルスがアデノウィルスである、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記アデノウィルスが導入遺伝子をコードする、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記導入遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記腫瘍抑制遺伝子がｐ５３である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記ベクターが複製能力を有する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ベクターが、条件付きで複製を行う複製能力を有するベクターである、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記核酸分子が阻害的ＲＮＡである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記核酸分子がリボザイムである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
細胞への核酸の移送において使用するための、核酸、デキストリンおよび少なくとも１種類の二糖を含む溶液であって、デキストリンの量が２％〜２０％ｗ／ｖであり、二糖の量が１％〜１０％ｗ／ｖで存在し、溶液の浸透圧が２５０〜３５０ミリモル浸透圧濃度である、該溶液。
【請求項３２】
前記核酸分子がベクターである、請求項３１に記載の溶液。
【請求項３３】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項３２に記載の溶液。
【請求項３４】
前記アデノウィルスベクターが複製能力を有するベクターである、請求項３３に記載の溶液。
【請求項３５】
核酸、デキストリン、少なくとも１種類の二糖及び２価陽イオンを含む、腹腔投与用医薬溶液製剤であって、デキストリンの量が２％〜２０％ｗ／ｖであり、二糖の量が１％〜１０％ｗ／ｖで存在し、溶液の浸透圧が２５０〜３５０ミリモル浸透圧濃度である、該医薬溶液。
【請求項３６】
前記２価陽イオン濃度が０．２〜３．０ｍＭである、請求項３５に記載の医薬溶液製剤。
【請求項３７】
前記２価陽イオンが塩化マグネシウムにより供給される、請求項３５または３６に記載の医薬溶液製剤。
【請求項３８】
前記核酸分子がベクターである、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の医薬溶液製剤。
【請求項３９】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項３８に記載の医薬溶液製剤。
【請求項４０】
前記アデノウィルスベクターが複製能力を有するベクターである、請求項３９記載の医薬溶液製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、その浸透圧が細胞または組織を取り巻く生理学的浸透圧に実質的に対応している組成物を含む、限定的にではないが、特に遺伝子治療において、細胞への核酸の移送方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
この３０年に渡り、細胞内への核酸の導入を容易にするための多くの方法が開発され、中でも遺伝子発現制御の理解を大きく助けて来た。
ＤＮＡを細胞内へ導入する従来の方法は当業界で周知であり、典型的には化学試薬、カチオン性脂質、または物理的な方法の使用を含む。細胞によるＤＮＡの取り込みを容易にする化学的な方法は、ＤＥＡＥ−デキストラン（Vaheri and Pagano, Science 175:434）の使用を含む。ＤＥＡＥ−デキストランはＤＮＡと会合し、細胞内へＤＮＡを導入する。しかしながら、このことは細胞の生存能力の損失に至る可能性がある。リン酸カルシウムも一般的に用いられる化学物質であり、ＤＮＡと共沈させられる時、細胞内へそのＤＮＡを導入する（Grahamet al., Virology (1973) 52: 456）。
【０００３】
カチオン性脂質（例えばリポソーム、Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413）の使用は、上記の化学的方法で示される程度の毒性は持たないことから、一般的な方法となっている。脂質のカチオン性頭部が、導入されるべきＤＮＡの負に帯電した核酸骨格と会合する。この脂質／ＤＮＡ複合体は細胞膜と会合し、細胞と融合して、会合したＤＮＡを細胞内へ導入する。リポソームが仲介するＤＮＡ移入は、既存の方法を上回る幾つかの利点を持つ。例えば、伝統的な化学的方法に抵抗する細胞でも、リポソームが仲介する移入を用いて、より容易にトランスフェクションを受ける。
【０００４】
更に最近では、ＤＮＡを導入する物理的な方法が、再現性を伴って細胞にトランスフェクトする有効な手段となって来た。直接の微小注入は、細胞の核へＤＮＡを直接移送出来るそのような１つの方法である（Capecchi (1980) Cell, 22:p479）。これは、単独の細胞感染物の分析を可能にする。いわゆる「バイオリスティック」な方法は、ＤＮＡで覆われた高速の粒子を用いて、細胞および／またはオルガネラ内へ、ＤＮＡを物理的に挿入する（Neumann(1982) EMBO J., 1: 841）。
【０００５】
エレクトロポレーションはおそらく、ＤＮＡをトランスフェクトする最も汎用の方法である。この方法は高電圧の電荷の使用を含み、ごく短時間だけ細胞膜を透過性にし、細胞膜を巨大分子複合体に対しても透過可能にする。しかしながら、ＤＮＡを導入する物理的な方法は、細胞内の障害により、細胞の生存能力の重大な損失を導く。これらの方法はそれ故、更なる最適化を必要とし、更なる補填も必要としている。
【０００６】
更に最近では、イムノポレーションと呼ばれる方法が、細胞内への核酸の導入のための技術として認識されて来た（Bildirici et al., Nature (2000) 405, 298 参照）。この技術は、特異的な受容体に対する抗体で覆われたビーズの使用を含む。感染用混合物は、典型的にはベクターＤＮＡである核酸、抗体で覆われたビーズ、および特異的な細胞表面受容体を発現している細胞を含む。この覆われたビーズは細胞表面受容体に結合し、剪断力が細胞に加わった時には、そのビーズがその細胞表面から引き剥がされる。ビーズが取り除かれる間、核酸および／または他の生物学的分子が通過して入り得る一時的な孔が作られる。４０〜５０％のトランスフェクション効率が、用いられる核酸によっては達成可能である。
【０００７】
典型的には遺伝子治療は、疾病の治療的処置のための細胞内へ新しい遺伝情報の移入、場合によって安定な挿入を含む。レトロウィルスベクターによる移入後にマウスで首尾よく発現した遺伝子は、ヒトヒポキサンチンホスホリボース転移酵素を含む（A. Miller et al., 1984, Science 255:630）。微生物遺伝子も、微生物薬剤耐性遺伝子の形で、哺乳類細胞内へ移入されている。真核細胞用ウィルスベクターによる造血前駆細胞の薬剤耐性への形質転換も、組み換えレトロウィルスに基づいたベクター系を用いて達成されている（R.A. Hock and A. D. Miller, 1986, Nature 320:275-277; Joyner et al. (1983) Nature305:556-558; D. A. Williams et al. 1984, Nature 310:476-480; J. E. Dick et al.,1985, Cell 42:71-79; G. Keller et al., 1985, Nature 318: 149-154; M, Eglitis etal., 1985, Science 230:1395-1398）。アデノ関連ウィルスベクターは、哺乳類細胞株をネオマイシン耐性に変換するために首尾よく使われている（P.L. Hermonat and N. Muzyczka, 1984, 上記文献; J. D. Tratschin et al., 1985, Mol.Cell. Biol. 5:3251）。遺伝子移入に用いるために研究されてきた他のウィルスベクター系は、パポーバウィルスおよびワクシニアウィルスを含む（M.L. Cline (1985) Pharmac. Ther. 29:69-92 参照）。
【０００８】
遺伝子治療に関する主要な問題は、細胞への核酸の効率的な標的化、および選択された組織における導入遺伝子の高水準な発現の確立に関する。これらの要請のいずれか、または双方を容易にするという多くの方法論が開発されている。例えば、US6043339 は、核酸と融合された時に、細胞膜を横切る連結された核酸の移動を容易にし得るシグナルペプチドの使用を開示している。US6083714は、組み合わされた核酸と、インテグリン受容体に結合し、これによってインテグリン発現細胞を標的とするポリカチオンであるポリリジンを使用する標的化手段とを開示している。EP1013770は、オリゴヌクレオチドに結合した核局在化シグナル（Nuclear localisation signals、ＮＬＳ）の使用を開示している。その結合体はベクターＤＮＡと共有結合されてもよく、その複合体はしばしば細胞にトランスフェクトする。ＮＬＳ配列は、核膜を横切るベクターＤＮＡの横断を容易にするように働き、このことによって核への遺伝子移送を標的化する。
例えばベクターＤＮＡのような核酸は、消化管経由（経口、直腸、または舌下）で、または非経口（静脈内投与、皮下投与、または吸入による）を含む様々な経路で、動物内へ導入されてもよい。
【０００９】
腹膜腔内への所定の水溶液の導入が、腎不全を罹患している患者の処置において役立つ可能性があることが知られている。このような処置は、腹膜透析として知られている。この溶液は、血漿中に存在するものと同様の電解質を含む。それら電解質は、腹膜を横断しての望ましい程度の浸透圧力を作り出すのに充分な濃度で存在する浸透圧剤、通常はデキストロースも含有する。この浸透圧力の影響下では、腹膜を介して交換が起こり、その結果、正常な腎臓機能の欠如のために血中に蓄積した尿素やクレアチニンのような老廃物が血流から取り除かれる。この交換が起きている間、この溶液から血液への腹膜を介したデキストロースの正味の移入も存在し、これはこの溶液の浸透圧の低下を引き起こす。このために、その溶液が取り除かれて新鮮な溶液で置き換えられる必要が生じる前に、この溶液が適度な期間有効な透析を続けるために、この溶液の初期浸透圧を（充分高濃度のデキストロースを用いることにより）非常に高くせねばならない。
【００１０】
他の浸透圧剤も、腹膜透析での使用について提案され、ここ数年はデキストリン（スターチ加水分解グルコースポリマー）が使われて来た。腹膜腔に点滴される場合、デキストリンはリンパ系を経由して徐々に吸収され、最終的には末梢の循環血液に達する。デキストリンの構造は、アミラーゼが循環液中において、その分子をオリゴ糖に分解した結果の構造である。これらは、グルコースへの更なる代謝により、取り除かれる。
典型的には、体腔を経由して患者へ遺伝子治療物質を導入するために選ばれる溶媒は、緩衝化機能を持たせた生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でもよいだろう。
【００１１】
デキストリン溶液は、腹膜を経由して身体へ薬剤を移送するための溶媒として提案された。GB-A-2207050 では、このような溶液が、消化管投与が満足でない薬剤の腹膜投与のために提案されている。このようなアプローチは、エリスロポエチンや成長ホルモンのようなペプチド薬剤の移送に、特に有用であると述べられている。また、セファロスポリン系抗生物質にも言及されている。デキストリン溶液は、卵巣ガンの処置における化学療法剤の投与に関しても記載されている。腹膜腔での滞留期間を延長することにより、化学療法剤（特に５ＦＵ）の効果を高めるイコデキストリン製剤の使用は、J.W. Dobbie (1997) Adv. Perit.Dial. 13:162-7、及び C. S. McArdle et al. (1994) Br. J. Cancer 70(4):762-6 に充分に記載されている。
【００１２】
本発明は、細胞へ核酸を移送する能力が増強されたことを示し、トランスフェクトされた遺伝子の高レベルの発現に至るデキストリン含有溶液に向けられている。
【００１３】
（本発明の概要）
本発明は、溶液の浸透圧が生理学的浸透圧に実質的に相当する医薬製剤を提供し、この製剤は、デキストリンおよび少なくとも１種類の糖を含む溶液中に核酸を含む。
本発明は更に、細胞への核酸の移送方法を提供し、この方法では、デキストリンおよび少なくとも１種類の糖を含む、細胞を取り巻く環境の生理学的浸透圧に実質的に対応している浸透圧を有する溶液中で核酸が運ばれる。
本発明は更に、核酸を用いた哺乳類の処置方法を提供し、この方法では、デキストリンおよび少なくとも１種類の糖を含む医薬製剤中、その核酸が前記哺乳類へ投与される。
【００１４】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、デキストリンおよび少なくとも１種類の糖を含む溶液中に核酸を含み、前記溶液の浸透圧が生理学的浸透圧に実質的に相当する医薬製剤を提供する。
（デキストリン）
文言「デキストリン」は、スターチの加水分解により生成され、主にα−１，４結合により共に結合したグルコース単位にからなるグルコースポリマーを意味する。典型的には、デキストリンは小麦、米、トウモロコシ、およびタピオカのような種々の天然の生成物から得られるスターチの加水分解により生成される。α−１，４結合に加え、特定のデキストリンにはα−１，６結合の部分があってもよく、この量はスターチの出発原料に依存する。α−１，６結合の生物分解能力の割合は、典型的にはα−１，４結合に対してのそれよりも少ないので、多くの用途には、α−１，６結合の百分率は１０％未満、好ましくは約５％未満であることが好ましい。
いかなるデキストリンも、異なる鎖長のポリグルコース分子の混合物である。この結果、単一の数字では、このようなポリマーの分子量を適切に特定することはできない。従って種々の平均が用いられ、最も一般的なものは重量平均分子量（Ｍｗ）、および数平均分子量（Ｍｎ）である。Ｍｗは、ポリマーの高分子量内容物における変化に特に敏感であり、一方Ｍｎは、ポリマーの低分子量内容物における変化に大きく影響を受ける。本発明の好ましい実行では、デキストリンのＭｗが約１，０００〜２００，０００、より好ましくは約２，０００〜５５，０００の範囲である。
文言「重合度」（ＤＰ）は、ポリマー混合物に関連しても用いることができる。１種類のポリマー分子については、ＤＰはポリマー単位の数を意味する。異なるＤＰの分子の混合物については、重量平均ＤＰおよび数平均ＤＰが、ＭｗおよびＭｎに対応する。加えてＤＰは、ある特定の数値より大きいか、またはある特定の数値よりも小さいＤＰのポリマーの所定の百分率を有するポリマー混合物に言及することにより、ポリマーを特徴付けるのに用いることも可能である。本発明においてデキストリンは、１２より大きいＤＰのポリマーを約１５％より多く含み、より好ましくは、１２より大きいＤＰのポリマーを約５０％より多く含むことが好ましい。
好ましくは、デキストリンは、約２０％より少ない量で溶液中に存在する。
好ましくは、デキストリンは、約１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１１％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ、１３％ｗ／ｖ、１４％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、１６％ｗ／ｖ、１７％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、１９％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖから選ばれる量で溶液中存在する。より好ましくは、デキストリンは重量で約２〜５％、最も好ましくは、重量で約４％存在する。
【００１５】
（生理学的浸透圧）
示されたように、前記溶液は、処置されるべき細胞の生理学的環境の浸透圧と本質的に等張の浸透圧を有する。一般的に、哺乳類の体腔内で維持される生理学的浸透圧は、約３３０ミリモル浸透圧濃度であり、特定の体腔によっていくらか変わるであろう。例えば、ヒト腹膜腔での点滴用等張溶液は、約２９０〜３００ミリモル浸透圧濃度の浸透圧を持つであろう。腹膜点滴に関しての本発明の好ましい実行では、溶液は約２５０〜３５０ミリモル浸透圧濃度、より好ましくは約２７５〜３３０ミリモル浸透圧濃度の浸透圧を有するであろう。特定の生理学的環境に依存するおおよそ等張の浸透圧を維持するための調整は、当業者には容易に明らかであろう。
【００１６】
（糖）
文言「糖」とは、単糖、二糖、またはオリゴ糖のことをいう。単糖は、実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎを持ち、ここでｎは３またはこれより大きい。単糖の例は、単に例示的なだけであって、限定的であることが意図されるものではないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、フルクトースである。二糖は、グリコシド結合によって連結された２つの単糖からなる。二糖の非限定的な例はスクロース、マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトースである。典型的にはオリゴ糖は、２より多い単糖単位を伴った糖である。オリゴ糖の非限定的な例は、ラフィノースおよびメレジトースである。糖は天然から得ることができ、または工業的に製造され得る。
本発明の好ましい方法では、前記糖は二糖である。更に好ましくは、二糖の量は約１〜１０％ｗ／ｖである。好ましくは、二糖の量は約２〜５％ｗ／ｖである。本発明の好ましい実施形態では、前記二糖は、約３％ｗ／ｖで存在するスクロースである。
本発明の更なる方法では、デキストリン量が約２〜２０％ｗ／ｖで、スクロース量が約１〜１０％ｗ／ｖである。
更に理想的には、デキストリン量は約４％ｗ／ｖで、スクロース量が約３％ｗ／ｖである。
精確な組み合わせは、細胞または組織を取り巻く液体の浸透圧に依存するであろうことは明らかであろう。典型的には、前記核酸を含む溶液と細胞／組織を取り巻く液体との間に等張の平衡を維持することが望ましい。
【００１７】
（２価陽イオン）
更に好ましくは、上記溶液は、更に２価陽イオンを含む。好ましくは、その２価陽イオンは、少なくとも０．２ｍＭである。更に好ましくは、その２価陽イオン濃度は、約０．２〜３．０ｍＭである。理想的には、その２価陽イオンは塩化マグネシウムであり、その濃度は約２．０ｍＭである。あるいはその２価陽イオンは、塩化カルシウムにより供給される。
好ましくは、その溶液は約４％ｗ／ｖのデキストリン、約３％ｗ／ｖのスクロース、および約２．０ｍＭの塩化マグネシウムを含む。あるいは、デキストリン濃度は約１５％ｗ／ｖである。
核酸にコードされているポリペプチドの組み換え生成に対して、その溶液が in vitro での細胞への核酸の移送に関した有用性を持つことは、当業者には明らかであろう。本発明も、細胞への核酸の in vivo導入と、細胞への核酸の ex vivo 導入に次ぐ、遺伝子治療が必要な動物へのトランスフェクトされた細胞の導入との、両方の遺伝子治療を達成している。
【００１８】
（核酸）
好ましくは、上記核酸分子は真核細胞での発現に適合される。典型的には、上記適合は、例示であって限定ではないが、細胞／組織特異的な発現を仲介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供を含む。これらのプロモーター配列は細胞／組織特異的であり、誘導可能、または構築可能であってもよい。
【００１９】
文言「プロモーター」は、技術的に認められた用語であり、明確にするために、例示のみによって与えられる以下の特徴を含むが、限定するものではない。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位に対して５’にしばしば見い出されるcis 作動性核酸配列である（エンハンサーは、遺伝子配列に対して３’に見出されることもでき、イントロン系配列に位置することさえあり得る）。エンハンサーが連結する遺伝子の転写の速度を上昇させるよう、エンハンサーは機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているtrans 作動性転写因子（ポリペプチド）に応答する。転写因子の結合／活性は（「真核細胞の転写因子」David S. Latchman、AcademicPress Ltd., San Diego 参照）、例示であって限定ではないが、中間代謝物（例えばグルコース、脂質）、環境要因（例えば光、熱）を含む、多くの生理学的／環境的なきっかけに応答する。
【００２０】
プロモーターエレメントはまた、いわゆるＴＡＴＡボックス、および転写開始の部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択配列（ＲＩＳ）を含む。これらの配列も、中でもＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドに結合する。
適合はまた、真核細胞か原核細胞宿主のいずれかにおける上記ベクターの維持を容易にする選択可能マーカーおよび自律的複製配列の提供を含む。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターとして言及される。これらの分子は大きなＤＮＡ断片（３０〜５０ｋｂのＤＮＡ）を取り込むことができるので、エピソームベクターが望ましい。このタイプのエピソームベクターは、WO98/07876 に記載されている。
【００２１】
ベクターにコードされている遺伝子の発現を容易にする適合は、転写終結／ポリアデニル化配列の提供を含む。これはまた、２つのシストロン、または多数のシストロンの発現カセット中で調整される、ベクターにコードされた遺伝子の発現を最大化するように機能する内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の提供も含む。発現制御配列はまた、いわゆる遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）も含む。これらは、導入遺伝子構築物としてアッセイされる際、位置非依存的かつコピー数依存的な発現を、連結した遺伝子に授ける制御エレメントである。ＬＣＲは、導入遺伝子を、近接するヘテロクロマチンのサイレンサー効果から引き離す制御エレメントを含む（Grosveld et al., Cell (1987), 51:975-985）。
【００２２】
発現制御配列はまた、遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ、WO/GB00/05393 参照）も含む。ＵＣＯＥは、普遍的に発現しているハウスキーピング遺伝子だけからなる遺伝子座を横切って開放クロマチン構造の樹立を担う核酸エレメントである。これらのエレメントはＬＣＲに由来しない。ＵＣＯＥは、クロマチンを開放し、またはクロマチンを開放状態に維持するポリヌクレオチドで、少なくとも２つの異なるタイプの組織の細胞中に操作可能に連結された遺伝子の再現性ある発現を容易にする。
これらの適合は、当業界で周知である。一般的に、発現ベクター構築、および組み換えＤＮＡ技術に関する非常に多くの量の文献が出版されている。分子クローニングに関しては、Sambrook et al. (1989) A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, Cold Spring Harbour, NY およびこの中の文献、ＤＮＡクローニング技術に関しては、F. Marston(1987) A Practical Approach Vol III, IRL Press, Oxford, UK、ＤＮＡクローニングに関しては、F. M.Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,Inc. (1994) を参照のこと。
【００２３】
ベクターは、典型的にはウィルスに基づいており、アデノウィルス、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、およびバキュロウィルスを含むウィルス由来でもよい。
【００２４】
文言「治療用ウィルス」および「治療用ウィルスベクター」は、ここでは互換性を伴って用いられ、治療薬（例えば野生株ウィルス、弱毒化ウィルス）、ワクチンベクター、または治療効果を高めるためにゲノムへの修飾を含む組み換えウィルスとして用いられるウィルスのことを言う。治療薬としてのウィルスまたは「ウィルスベクター」の使用は、前に議論されたように、当業界で周知である。加えて、多くのウィルスが、外因性遺伝子の移送用ベクターとして一般的に用いられている。一般的に用いられるウィルスは、組み換え修飾された外被を有するまたは有しないＤＮＡおよびＲＮＡウィルスを含み、これらは好ましくは、baculoviridiae、parvoviridiae、picornoviridiae、herpesviridiae、poxviridiae、adenoviridiaeまたは picornnaviridiae から選ばれる。各親ベクターの性質の有利なエレメントを取り入れたキメラベクターも、用いてもよい（例えば Feng etal. (1997) Nature Biotechnology, 15:866-870 参照）。このようなウィルスベクターは、野生株であってもよく、または複製能力なし、条件により複製を行う、または複製能力を有するように、組み換えＤＮＡ技術によって修飾されてもよい。
【００２５】
好ましいベクターは、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、およびレトロウィルスゲノムに由来する。本発明の最も好ましい実行では、ベクターはヒトアデノウィルスゲノムに由来する。特に好ましいベクターは、血清型２または５のヒトアデノウィルスに由来する。このようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂコード領域における修飾または欠損によって（「複製不能」と考えられる点まで）弱められてもよい。特別な発現特性の達成、または繰り返し投与を許容し、または免疫応答をより低くするためのウィルスゲノムに対する他の修飾も好ましい。ｐ５３腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む、ヒトアデノウィルス５型ベクターが最も好ましい。ここに例示されるような、本発明の最も好ましい実行では、ベクターは１９９９年８月３日発行の Gregory et al., 米国特許 5,932,210 号（この教示の全ては、援用されて本明細書の一部とする）に記載されたような、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子A/C/N/53 をコードする、複製不能なアデノウィルスベクターである。
【００２６】
あるいは、ウィルスベクターは、条件により複製を行い、または複製能力を有していてもよい。条件により複製を行うウィルスベクターは、目的としない広いスペクトルムの感染を避けながらの、特定のタイプの細胞での選択的発現を達成するのに用いられる。条件により複製を行うベクターの例は、E. Pennisi (1996) Science 274:342-343、S. J. Russell (1994) Eur. J.of Cancer 30A(8):1165-1171 に記載されている。選択的に複製を行うベクターの追加例は、このような遺伝子の発現がない時にはそのウィルスは複製しないように、ウィルスの複製に不可欠な遺伝子が、特定の細胞のタイプまたは細胞状態においてのみ活性なプロモーターの制御下にあるようなベクターを含む。このようなベクターの例は、１９９７年１２月１６日発行のHenderson et al., 米国特許 5,698,443 号、および１９９９年２月１６日発行の Henderson et al., 米国特許5,871,726 号に記載されており、この教示の全ては、援用されて本明細書の一部とする。
【００２７】
加えて、ウィルスゲノムは、ある条件下でのみ複製または発現を達成する誘導可能なプロモーターを含むように修飾されてもよい。誘導可能なプロモーターの例は、科学文献中に知られている（例えば、Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430、Iida,et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059、Hwang, et al. (1997) J. Virol71(9):7128-7131、Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105、および Dreher,et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46);29364-29371 参照）。
【００２８】
ウィルスは、選択的に複製を行うウィルスになるようにデザインされてもよい。特に好ましい選択的複製ウィルスは、ラマチャンドラらの２０００年４月２０日公開の PCT 国際公開番号 WO 00/22137, 国際出願番号 PCT/US99/21452、J. Howe の、２０００年４月２０日公開のPCT 国際公開番号 WO WO0022136, 国際出願番号 PCT/US99/21451 に記載されている。特に好ましい選択的複製組み換えアデノウィルスは、J.Howe のものにおいてより充分に記載されているような dl01/07/309 ウィルスである。複製のために弱められたウィルスが、治療の舞台においても有用であることが示されている。例えば、Ｅ１ｂ５５Ｋ遺伝子（Bakerand Berk (1987) Virology 156: 107）における特異的欠損を含むアデノウィルス dl1520 が、ヒトにおいて治療効果を伴って用いられてきた。このようなベクターは、McCormickの１９９７年１０月１４日発行の米国特許 5,677,178 号、および McCormick の１９９８年１２月８日発行の米国特許 5,846,945 号にも記載されている。本発明の方法は、このようなベクターに対する既存のまたは誘導された液性免疫応答を最小化するために、このようなベクターの投与と組み合わせて用いられてもよい。
【００２９】
加えて、治療用ウィルスは、感染細胞における発現のために、治療用導入遺伝子を取り込んでもよい。文言「治療用導入遺伝子」は、標的細胞において、その発現が治療効果を生み出すヌクレオチド配列をいう。治療用導入遺伝子という文言には、腫瘍抑制遺伝子、抗原遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞分裂抑制遺伝子（cytostatic genes）、プロドラッグ活性化遺伝子、アポトーシス遺伝子、医薬遺伝子、または抗脈管形成遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。本発明のベクターは、ＩＲＥＳエレメントの使用を通して引き続き、または独立に制御されたプロモーターを通して、１つ以上の治療用導入遺伝子を生成するのに用いられてもよい。
【００３０】
文言「腫瘍抑制遺伝子」は、標的細胞での発現が、悪性新生物の表現型を抑制可能、および／またはアポトーシスを誘導可能なヌクレオチド配列をいう。本発明の実行において有用な腫瘍抑制遺伝子の例は、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽腫遺伝子（Lee, et al. (1987) Nature 329:642）、ＭＭＡＣ−１遺伝子、線腫様ポリープ・コリ（adenomatous polyposiscoli）タンパク質（１９９８年７月２１日発行 Albertsen, et al., 米国特許 5,783,666 号）、結腸ガンにおいて欠損した（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、3p21.3.染色体に位置する鼻咽頭癌腫瘍抑制遺伝子（Cheng,et al., 1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047）、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ１遺伝子、ＮＦ２遺伝子およびＶＨＬ遺伝子を含む。特に好ましい治療用アデノウィルスは、１９９９年８月３日発行のGregory, et al., 米国特許 5,932,210 号（この教示の全ては、援用されて本明細書の一部とする）においてより充分に記載されているように、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子をコードするA/C/N/53 ベクターである。
【００３１】
文言「抗原遺伝子」は、標的細胞におけるその発現が、免疫系によって認識可能な細胞表面抗原タンパク質の生成に至るヌクレオチド配列をいう。抗原遺伝子の例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３（１９９４年２月３日公開の A. Levine, PCT 国際公開番号 WO94/02167 に記載）を含む。免疫認識を容易にするために、抗原遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ抗原と融合されてもよい。好ましくは抗原遺伝子は、腫瘍細胞特異的抗原に由来する。理想的には、腫瘍拒絶抗原である。腫瘍拒絶抗原は当業界で周知であり、この例には、腫瘍拒絶抗原のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＤＡＧＥファミリーが含まれるが、これらに限定されない（Schulzet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, pp991-993 参照）。
何年もの間、腫瘍細胞は、そのうちの幾つかが腫瘍細胞表面に提示される多くの腫瘍細胞特異的抗原を生成することが知られてきた。これらは一般的に腫瘍拒絶抗原として呼ばれ、腫瘍拒絶抗原前駆体として呼ばれるより大きなポリペプチドに由来する。腫瘍拒絶抗原は、ＨＬＡを介して免疫系に提示される。免疫系は、これらの分子を異物として認識し、自然に選択して、これらの抗原を発現している細胞を破壊する。もし形質転換細胞が探知を逃れて樹立されると、腫瘍は発達する。腫瘍の樹立に対する予備形成防御を個人に提供するために、主要腫瘍拒絶抗原に基づいてワクチンが開発されてきた。
【００３２】
文言「細胞毒性遺伝子」は、細胞におけるその発現が、毒性効果を生じるヌクレオチド配列をいう。このような細胞毒性遺伝子の例は、pseudomonas 外毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
文言「細胞分裂抑制遺伝子」は、細胞におけるその発現が、その細胞周期における進行阻止を生じるヌクレオチド配列をいう。このような細胞分裂抑制遺伝子の例は、ｐ２１、網膜芽腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ遺伝子、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８およびｐ１９のような、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤をコードする遺伝子群、１９９７年５月９日公開の Branellec, et al., PCT 公開 WO97/16459、および１９９６年１０月３日公開の PCT 公開WO96/30385 に記載されているような、成長阻止特異的ホメオボックス（ＧＡＸ）遺伝子を含む。
【００３４】
文言「サイトカイン遺伝子」は、細胞におけるその発現がサイトカインを生成するヌクレオチド配列をいう。このようなサイトカインの例は、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（特にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、α、β、およびγサブタイプのインターフェロン、共通の（consensus）インターフェロンおよび特にインターフェロンα−２ｂ、およびインターフェロンα−２α−１のような融合体を含む。
【００３５】
文言「ケモカイン遺伝子」は、細胞におけるその発現がサイトカインを生成するヌクレオチド配列をいう。ケモカインという文言は、構造的に関連していて、分裂促進、走化性、または炎症活性を持ち、細胞によって分泌される構造的に関連した低分子量サイトカイン因子の一群をいう。それらは第一義的に、４つの保存されたシステインを有する７０〜１００アミノ酸残基のカチオン性タンパク質である。これらのタンパク質は、２つのアミノ末端システインの空間的配置に基づいて、２つの群に分類することが出来る。第１のグループでは、２つのシステインが１つの残基によって隔てられ（Ｃ−ｘ−Ｃ）、一方第２のグループでは、それらは隣接している（Ｃ−Ｃ）。「Ｃ−ｘ−Ｃ」ケモカインの一員の例は、血小板第４因子（ＰＦ４）、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、黒色腫成長刺激活性タンパク質（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症タンパク質２（ＭＩＰ−２）、マウスＭｉｇ（ｍ１１９）、ニワトリ９Ｅ３（またはｐＣＥＦ−４）、ブタ肺胞マクロファージ走化因子ＩおよびII（ＡＭＣＦ−ＩおよびII）、前Ｂ細胞成長刺激因子（ＰＢＳＦ）、およびＩＰ１０を含むがこれらに限定されない。「Ｃ−Ｃ」群の一員の例は、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質２（ＭＣＰ−２）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、単球走化性タンパク質４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１−α）、マクロファージ炎症タンパク質１β（ＭＩＰ−１−β）、マクロファージ炎症タンパク質１−γ（ＭＩＰ−１−γ）、マクロファージ炎症タンパク質３α（ＭＩＰ−３−α）、マクロファージ炎症タンパク質３β（ＭＩＰ−３−β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、マクロファージ炎症タンパク質−４（ＭＩＰ−４）、マクロファージ炎症タンパク質５（ＭＩＰ−５）、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−ε（ｐ５００）、胸腺活性化調整ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒトタンパク質ＨＣＣ−１／ＮＣＣ−２、ヒトタンパク質ＨＣＣ−３、マウスタンパク質Ｃ１０を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
文言「医薬タンパク遺伝子」は、その発現が、標的細胞において薬効を持つタンパク質の生成をもたらすヌクレオチド配列に関する。このような医薬遺伝子の例は、インシュリン前駆体遺伝子および類似体（PCT 国際特許出願番号 WO98/31397 に記載）、成長ホルモン遺伝子、ドーパミン、セロトニン、上皮成長因子、ＧＡＢＡ、ＡＣＴＨ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ（標的組織への血液の灌流を増大させ、脈管形成を誘導する。１９９８年７月３０日公開のPCT 公開 WO98/32859）、トロンボスポンジンなどを含む。また、医薬タンパク質遺伝子は、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖の抗体、および非ヒト原料由来のヒト抗体のような、免疫反応性タンパク質を含んでもよい。
【００３７】
文言「プロアポトーシス遺伝子」は、これの発現が、細胞のプログラムされた細胞死への過程を誘導する結果となるヌクレオチド配列をいう。プロアポトーシス遺伝子の例は、ｐ５３、アデノウィルス E3-11.6K（10.5K）、アデノウィルスＥ４またはｆ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、およびカスペース（caspases）をコードする遺伝子を含む。
【００３８】
文言「プロドラッグ活性化遺伝子」は、その発現が、外部因子による死に対して細胞を敏感にし、または細胞内で有毒な条件を惹起する治療用化合物に、非治療用化合物を変換する能力のあるタンパク質の生成をもたらすヌクレオチド配列をいう。プロドラッグ活性化遺伝子の例は、シトシン脱アミノ化酵素遺伝子である。シトシン脱アミノ化酵素は、５−フルオロシトシンを、潜在性抗腫瘍剤である５−フルオロウラシルへと変換する。腫瘍細胞の溶解は、腫瘍の局在する点で、５ＦＣを５ＦＵへ変換する能力のあるシトシン脱アミノ化酵素の局所的な爆発的産生をもたらし、多くの周囲の腫瘍細胞の死をもたらす。これは、これらの細胞をアデノウィルスで感染させる必要なしに、極めて多くの腫瘍細胞の死をもたらす（いわゆる「傍観者効果」）。加えて、ＴＫ遺伝子産物を発現している細胞がガンシクロビル投与による選択的な死に感受性であるチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（例えば、Woo, et al., １９９７年５月２０日発行米国特許 5,631,236 号および Freeman, et al., １９９７年２月１１日発行米国特許5,601,818 号参照）を用いてもよい。
【００３９】
文言「抗脈管形成」遺伝子は、その発現が、抗脈管形成因子の細胞外分泌をもたらすヌクレオチド配列をいう。抗脈管形成因子は、アンジオスタチン、Ｔｉｅ２（ＰＮＡＳ(USA)(1998) 95:8795-8800 に記載）のような血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、エンドスタチンを含む。
野生株タンパク質の機能性副断片をコードするための上記遺伝子に対する修飾および／または欠損が、本発明の実行における使用のために容易に適合されてもよいことは、当業者には容易に明らかであろう。例えば、ｐ５３遺伝子に関しての言及は、野生株タンパク質を含むだけでなく、修飾されたｐ５３タンパク質も含む。このような修飾されたｐ５３タンパク質の例は、核の保持を増すためのｐ５３に対する促進する修飾、カルパイン保存性開裂部位を排除するための１３〜１９番アミノ酸の欠損（Kubbutat and Vousden (1997) Mol. Cell. Biol. 17:460-468）、オリゴマー化ドメインに対する修飾（Bracco,et al. の PCT 公開出願 WO97/0492 または米国特許 5,573,925 号などに記載）を含む。
【００４０】
シグナルペプチドまたは核局在化シグナル（ＮＬＳ）のような標的部分を含むことにより、上記治療遺伝子が媒体中へ分泌され、または特定の細胞内の場所へ局在化されてもよいということは、当業者には容易に明らかであろう。治療用導入遺伝子とヘルペス単純ウィルスのタイプ１（ＨＳＶ−１）構造タンパク質ＶＰ２２との融合タンパク質もまた、治療用導入遺伝子の定義に含まれる。ＶＰ２２シグナルを有する融合タンパク質は、感染細胞内で合成された際、その感染細胞から外へ出され、約１６細胞分の広さの径内の周囲の非感染細胞に効率的に進入する。このシステムは、その融合タンパク質が効果的に周囲細胞の核へ運ばれるので、転写活性タンパク質（例えばｐ５３）と組み合わせた場合に、特に有用である。例えば、G. Elliott & P. O'Hare, Cell. 88:223-233:1997、A. Marshall &A. Castellino, Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15:205:1997、１９９７年２月１３日公開のO'Hare, et al., PCT 公開 WO97/05265 参照。ＨＩＶＴａｔタンパク質由来の類似の標的部分は、Vives, et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017 にも記載されている。
【００４１】
幾つかの例において、特定のタイプの細胞における外因性導入遺伝子の導入を達成するために、ベクターを利用したりまたはデザインすることは、価値を有するかも知れない。ある種のベクターは、ある種のタイプの組織に対して天然の走向性を示す。例えば、herpesviridiae 属由来のベクターは、神経細胞に好ましい感染をすることが示されている。組み換え修飾された herpesviridiaeベクターの例は、１９９４年７月１２日発行の米国特許 5,328,688 号において開示されている。細胞タイプ特異性、または細胞タイプによる標的化も、ウィルス外被タンパク質の修飾によって、特徴的に広い感染力を持つウィルス由来のベクターにおいて達成されてもよい。例えば、細胞を標的とすることは、独特な細胞表面受容体との特異的な相互作用を持つ、修飾されたノブ−ファイバー部位の発現を達成するためのウィルスゲノムのノブ−ファイバーをコードしている配列の選択的修飾により、アデノウィルスベクターを用いて達成されている。このような修飾の例は、Wickham,et al. (1997) J. Virol. 71(11):8221-8229（ＲＧＤペプチドのアデノウィルス線維タンパク質への取り込み）、Arnberg,et al. (1997) Virology 227:239-244（眼および生殖器官への走化性を達成するためのアデノウィルス線維遺伝子の修飾）、Harrisand Lemoine (1996) TIG 12(10):400-405、Stevenson, et al. (1997) J. Virol.71(6):4782-4790、Michael, et al. (1995) Gene Therapy 2:660-668（アデノウィルス線維タンパク質へのガストリン放出ペプチド断片の取り込み）およびOhno, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:763-767（プロテインＡ−ＩｇＧ結合ドメインの Sindbis ウィルスへの取り込み）に記載されている。細胞特異的標的化の他の方法は、外被タンパク質と抗体または抗体断片との組み合わせによって達成されている（例えば、Michael,et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869、Watkins, et al. (1997) Gene Therapy4:1004-1012、Douglas, et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1574-1578 参照）。あるいは、標的化を達成するために、特定の部分がウィルス表面と組み合わされてもよい（例えば、Nilson,et al. (1996) Gene Therapy 3:280-286（ＥＧＦのレトロウィルスタンパク質との組み合わせ）参照）。加えて、ウィルスにコードされている治療用導入遺伝子もまた、好ましくは特定のタイプの細胞でその導入遺伝子の発現が可能となる、組織特異的プロモーター領域の制御下にあってもよい。
【００４２】
ベクターは非ウィルス性であってもよいし、当業者にとって容易に入手可能な多くの商業供給元から入手できる。例えば、ベクターがエピソーム、または統合されたプラスミドでもあり得るプラスミドであってもよい。
本発明の更に好ましい実施形態では、上記核酸はアンチセンスの核酸であり、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
ここで用いられている場合、文言「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」は、つまりオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾されたオリゴリボヌクレオチド、または修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチドのことを述べており、これは生理学的条件下、特定の遺伝子を含むＤＮＡ、またはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズし、これにより、その遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する。アンチセンス分子は、その標的遺伝子とのハイブリダイゼーションの際、標的遺伝子の転写または翻訳を妨げるようにデザインされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの精確な長さおよびそれの、それの標的との相補性の度合いが、標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含む、選択された特異的標的に依存するであろうと、当業者は認識するであろう。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下でその標的と選択的に結合するように、つまり、生理学的条件下で標的細胞における、他のどの配列に対してよりも、標的配列とより実質的にハイブリダイズするように構築され、調整されることが好ましい。
阻害に関して充分に選択的であり潜在的な能力を有するためには、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的と相補的な少なくとも７つ（Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996）、より好ましくは少なくとも１５の連続した塩基を含むべきである。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補的な配列を含む。
遺伝子またはｍＲＮＡ転写物のどの領域に対してもアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選ばれてもよいが、好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳開始、転写開始、またはプロモーター部位のような、Ｎ末端または５’上流部位に対応する。加えて、３’非翻訳領域が標的とされてもよい。その３’非翻訳領域は、安定化を行うｍＲＮＡ分子に関連したタンパク質に対する結合部位として作動する cis 作動性配列を含むことが知られている。これらの cis 作動性部位は、上記安定化タンパク質と結合するように機能するヘアループ構造をしばしば形成する。この形の安定性制御のよく知られた例はヒストンｍＲＮＡによって示され、これの度合いは、少なくとも部分的には転写後に制御される。
【００４４】
文言「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、当業界でよく知られた従来のオリゴヌクレオチド合成法を in vitro で用いるか、発現ベクター構築物を用いて組み換え合成されたオリゴヌクレオチドを用いて生産される物質として、解釈されるべきである。修飾されたオリゴヌクレオチドは、以下のように解釈される。ここで用いられるような文言「修飾オリゴヌクレオチド」は、次の場合のオリゴヌクレオチドについていう。
ii）通常は核酸と関連がない化学基が、オリゴヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドに共有結合している。好ましい合成ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、ペプチド、およびカルボン酸メチルエステルである。
【００４５】
文言「修飾オリゴヌクレオチド」は、共有結合で修飾された塩基および／または糖を伴ったオリゴヌクレオチドも含む。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、３’位の水酸基以外の、および５’位のリン酸基以外の低分子量有機基と共有結合した骨格糖を持つオリゴヌクレオチドを含む。これ故、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでもよい。加えて、修飾オリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含んでもよい。修飾オリゴヌクレオチドは、５位プロピン修飾塩基のような塩基類似化合物を含むこともできる（Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996）。
【００４６】
本発明はこのように、医薬的に許容可能なキャリアー（例えばポリマー、リポソーム／カチオン性脂質）と共に、その制御が有益な治療効果をもたらすタンパク質をコードする核酸と、生理学的条件下でハイブリダイズできるように相補的な、天然および／または修飾されたアンチセンス分子を含む医薬調剤を意図するものである。
【００４７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の１部分として投与されてもよい。このような医薬組成物は、当業界で既知であるいかなる標準的な生理学的および／または医薬的に許容可能なキャリアー（例えばリポソーム）とも組み合わせて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。この組成物は無菌的であり、患者への投与について、治療に有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むべきである。文言「医薬的に許容可能」とは、活性成分の生物学的活性の効果を妨げない無毒な物質を意味する。文言「生理学的に許容可能」とは、細胞、細胞培養、組織または器官のような生物学的システムと相容れる無毒な物質をいう。
【００４８】
本発明のなお更に好ましい方法では、上記核酸は２本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡ）である。遺伝子機能を特異的に除去する技術は、また阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）としても言及される２本鎖ＲＮＡの細胞への導入を通じてのものであり、その結果ＲＮＡｉ分子に含まれる配列に対して相補的なｍＲＮＡの破壊がもたらされる。このＲＮＡｉ分子は、２本鎖ＲＮＡ分子を形成するためにお互いにアニールされた２つの相補的なＲＮＡ鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。ＲＮＡｉ分子は、典型的には、除去されるべき遺伝子のエクソン配列またはコード配列に由来する。本発明の好ましい方法では、ＲＮＡｉ分子の長さは１００塩基対〜１０００塩基対である。より好ましくは、ＲＮＡｉの長さは約１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対または１０００塩基対から選ばれる。より好ましくは、上記ＲＮＡｉは少なくとも１０００塩基対である。
本発明の更に好ましい方法では、上記ＲＮＡｉは、エクソンに由来する。
【００４９】
あるいは、上記ＲＮＡｉ分子は、遺伝子のコード／エクソン配列に並ぶイントロン配列、または５’および／または３’非コード配列に由来する。最近の研究は、コード配列由来の１００〜１０００塩基対の範囲のＲＮＡｉ分子が、遺伝子発現の有効な阻害剤であることを示唆している。驚いたことに、ほんの僅かなＲＮＡｉ分子だけが、機序が触媒的であることを示唆する遺伝子発現をブロックするのに必要とされる。ｍＲＮＡ合成またはプロセッシングの間に、僅かなＲＮＡｉでも、そのＲＮＡｉがそれの効果を及ぼすことを示す細胞の細胞質中で検出可能であれば、作用部位は核であるように思われる。
【００５０】
本発明の、なお更に好ましい方法では、上記ＲＮＡｉ分子は、修飾されたリボヌクレオチド塩基を有する。天然に存在する塩基であるシトシン、ウラシル、アデノシンおよびグアノシン同様に修飾塩基を含むことが、上記修飾塩基を有するＲＮＡｉ分子に有利な性質を付与しうることがあることは、当業者にとっては明らかであろう。例えば、修飾塩基はＲＮＡｉ分子の安定性を増加させることがあり、これによって、望まれる効果を創出するのに要求される量を減らすことが出来る。
【００５１】
この現象を説明する理論はあるのだが、ＲＮＡｉの作用の精確な機序は、まだ分かっていない。例えば、全ての器官は、外因性遺伝子発現の効果を制限する防御機序を進化させてきた。例えば、ウィルスはしばしば、感染する器官において有害な効果を引き起こす。それ故ウィルスの遺伝子発現および／または複製は、抑制される必要がある。加えて、遺伝子的形質転換の急速な発展、および遺伝子導入植物や動物の提供は、導入遺伝子も外来の核酸として認識され、抑制（Singer and Selker, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995;197:165-77）、遺伝子のサイレンシング（MatzkeandMatzke, Novartis Found Symp. 1998;214:168-80; discussion 181-6. Review）および共抑制（Stamet al., Plant J. 2000;21(1):27-42）と様々に呼ばれる現象に付されてきた。
ＲＮＡｉを用いる初期の研究は、線虫 Caenorhabditis elegans を使用した。その線虫の中へ注入されたＲＮＡｉは、そのＲＮＡｉ分子を含む遺伝子配列に対応するポリペプチドの消失という結果になった（Montgomeryet al., 1998、Fire et al., 1998）。より最近では、ＲＮＡｉ阻害の現象は、例示であって限定ではないが、植物、鞭毛虫（Shi etal., 2000）、Drosophila spp.（Kennerdell and Carthew, 2000）を含む多くの真核生物おいて示されてきた。最近の実験は、ＲＮＡｉがより高等な真核生物においても機能することがあることを示した。例えば、ＲＮＡｉはマウス卵母細胞中のc-mos 遺伝子、およびマウス着床前期胚中のＥ−カドヘリンも除去できることが示された（Wianny and Zernicka-Goetz, 2000）。
【００５２】
本発明のなお更に好ましい方法では、上記核酸はリボザイムである。リボザイムは、当業界でよく知られた触媒的ＲＮＡである。リボザイムは、基質ＲＮＡとハイブリダイズする配列に隣接して並ぶ配列を持つ触媒中心を有する。最も簡単な触媒中心は、ハンマーヘッドとして知られるＲＮＡモチーフである。触媒ＲＮＡの発見以来、ウィルスｍＲＮＡおよび疾病遺伝子ｍＲＮＡを選択的に除去できるような、標的とされた遺伝子機能を持つリボザイムをデザインしたいという要望がある。例えば、US6069007 は、ＨＩＶ１のｍＲＮＡに対して活性なリボザイム、およびそれらのＡＩＤＳ治療における使用を開示している。US6087172は、リューマチ関節炎に関連したインターロイキンであるＩＬ−１５をコードするｍＲＮＡを除去するようにデザインされたリボザイムを開示している。US6077705 は、変異遺伝子（この例ではα−１−アンチトリプシンである）の野生株タイプの複製での置き換えと組み合わせた、変異遺伝子の発現を阻害する遺伝子治療法を開示している。
【００５３】
（投与／処置方法）
本発明の製剤は、組織中への核酸の移入を促進するのに有用である。本発明による溶液は、消化管経由（経口、直腸または舌下）または非経口（静注、皮下または吸入による）を含む様々な方法で、対象動物へ導入されてもよいことは、当業者には明らかであろう。その溶液は、移植されたカテーテルにより、哺乳類へ与えられてもよい。本発明の好ましい実行では、その溶液は、周囲の組織の形質導入を容易にするために体腔内へ点滴される。その溶液が核酸の移送のために供されてもよい体腔の例は、腹膜腔、胸膜腔、眼および腹腔を含む。加えてその溶液は、脳脊髄液、関節、結腸、膀胱、胆嚢のような他の液体を有している空間で供されてもよい。その溶液が同時に（混合物として）、別々に、または続けて、動物に投与されることが可能であることも、当業者にとって明らかであろう。
【００５４】
本発明の更なる態様によれば、デキストリン、糖、２価陽イオンおよび核酸分子を有する組成物が与えられる。好ましくは、上記組成物は、遺伝子治療のための核酸の移送における使用のためのものである。本発明の好ましい実行において、この手順は、ヒトのガンの処置のための組み換えアデノウィルスによる治療と組み合わせて用いられる。従来の腫瘍学診療によれば、患者は、治療薬の最大寛容量で投与される。一連の臨床研究では、７．５ｘ１０１３個の組み換えアデノウィルス粒が、ヒト対象ではよく寛容された。ｐ５３を発現する複製不能組み換えアデノウィルスを用いた臨床治験は、最大５ヶ月まで毎月繰り返される５日間の治療期間に、約７．５ｘ１０１３個の組み換えウィルス粒を注入するという一連の治療が、ヒトにおける卵巣ガンの処置において有効であることを示唆している。
【００５５】
本発明の特に好ましい実施形態では、ｐ５３をコードする複製不能組み換えアデノウィルスを含む本発明の製剤が、卵巣ガンの処置のために腹膜中へ点滴される。この薬剤を使った典型的な一連の治療は、５日間に渡り、毎日７．５ｘ１０１３個のウィルス粒の投与を含む。A/C/N/53 ウィルスを用いる卵巣ガン処置のための典型的な臨床プロトコールは、化学療法剤であるカルボプラチンおよびパクリタキセルの投与と組み合わせて、上記の典型的な５日間の治療を含む。本発明の好ましい実行では、哺乳類とはヒトであって、休止期間を挟んで３通りまたはこれより多い一連の治療、好ましくは５〜６通りの治療を受ける。
アデノウィルス以外の治療用ウィルスについてのこの手順の修飾は、当業者にとっては容易に明らかであろう。
【００５６】
本発明の製剤は更に、追加的なキャリア、賦形剤または希釈剤を含んでもよい。この組成物は、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど、ｐＨ調整および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤などのような、およその生理学的条件に求められるような、医薬的に許容可能な補助剤を含んでもよい。その医薬製剤における本発明の組成物の濃度は、幅広く、つまり重さにして約０．１％未満から、通常では、または少なくとも約２％、２０％〜５０％くらい、またはこれ以上で変わることができ、選択された特定の投与方法に応じて、液体の体積、粘性などによって、第一義的に選択されるであろう。
【００５７】
（実施例）
以下の例は、ただ単に本発明の実行を例示しているだけであって、これによって範囲を限定することは意図されていない。
【００５８】
（実施例１）
（イコデキストリン製剤を用いたラットにおける（腹膜投与）ｒＡｄ仲介導入遺伝子発現の増幅）
組み換えアデノウィルスベクターによる導入遺伝子発現を増幅する能力を評価するため、導入遺伝子発現の相対的なレベルを比較する実験が行われた。βガラクトシダーゼ遺伝子（rAd-bgal）をコードする組み換えアデノウィルスベクターが、実質的に Gregory et al., 米国特許 5,932,210 号の教示により調製された。以下の溶液が１００ｍｌの体積で調製された。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
１０匹の雌ニュージーランド白ウサギをケタミン／キシラジンで麻酔し、上記溶液を腹膜点滴した。その溶液は、背側で１時間および腹側で１時間インキュベートされた。その動物は屠殺され、腹膜壁の生検が獲られた。獲られた組織中のウィルスＲＮＡの水準は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定された。その腹膜壁から単離された導入遺伝子特異的ＲＮＡ濃度の結果は、添付図面の図１に提示されている。提示されたデータから分かるように、ウィルス緩衝溶液に１５％イコデキストリンを加える（溶液Ａ）と、緩衝コントロール溶液のみ（溶液Ｂ）に比べて、導入遺伝子発現において著しい増加という結果になった。
【００６１】
（実施例２）
（マウス異種移植前立腺ガンモデルにおけるイコデキストリンｒＡｄ−ｐ５３製剤の効果）
組み換えアデノウィルスの製剤を含むイコデキストリンが増強された治療効果を与えることを示すために、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子（「ｒＡｄ−ｐ５３」）をコードする複製不能組み換えアデノウィルスベクターの抗腫瘍効果を比較する実験が行われた。このベクターの効果は、G. D. Paine-Murrieta et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1997, 40:209. に記載されたような、マウス異種移植前立腺ガンモデルにおいて比較された。効果の測定手段としては、生存数の増加が用いられた。
【００６２】
ＡＣＮ５３と名付けられたｒＡｄ−ｐ５３ベクターは、実質的に Gregory et al., 米国特許 No. 5,932,210 号の教えるところにより調製された。ＰＣ−３前立腺ガン細胞は、受託番号ＣＲＬ−１４３５であるM. D. Bethesda の American TypeCulture Collection から入手された。約５週齢の５１匹の雌ヌードマウスが、Harlan Laboratories から入手された。ＨＢＳＳ−ＦＢＳ（ハンクス調整塩溶液w/10% ウシ胎児血清。ＨＢＳＳは Fisher Scientific から入手され、ＦＢＳは BioWhittaker から入手された）０．２ｍＬ体積中約５ｘ１０６個のＰＣ３細胞が各動物に腹膜注入された。これらの細胞は、処置開始前の９日間、腫瘍を樹立するようにさせられた。
７種類の異なる製剤が、以下の表２によって調製された。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
それらの動物は、以下の表３においてより充分に記載されるように、最大８つの処置群に分けられた。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
処置は９日目（Ｄａｙ９）に始められた（注：ここで述べられている「Ｄａｙ」で書き表された全ての処置日は、ＰＣ−３細胞の注入日から数えられる）。処置レジメンの開始時点においては、全ての動物は健康な様相を呈していた。無処置のコントロール群１以外、各群は腫瘍細胞の注入後、９、１１、１４、１５および１８日目に、各々１．０ｍＬの適切な製剤の単回腹膜注入からなる処置からなる処置レジメンを与えられた。この処置レジメンが完了した際、動物はランダムに籠に入れられ、目に見えて明らかな体重の減少、背中の彎曲および鎮静によって特徴付けられるような病態動物に対しては、毎日（ブラインドされて）モニターされた。病態動物は屠殺され、全体を病理学的に検査された。動物数、屠殺（または死亡が発見された）日、および全体的な病理学的知見が記録された。結果が、以下の表４にまとめられている。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
注入後の生存日数は Kaplan-Meier survival を用いてプロットされ、処置群１〜４の結果を、添付図面の図２においてグラフ表示する。群間の比較はLogrank 試験 (Statview Software) を用いて行われた。ｐ＜０．０５の場合、差は有意であるとみなされた。
【００６９】
提示されたデータから分かるように、イコデキストリンを含むＡＣＮ５３製剤を用いた処置は、５ｘ１０１０個のウィルス粒のウィルス投与量でｖＰＢＳ中で製剤されたＡＣＮ５３またはコントロールと比較して、統計的に有意な生存の延長という結果になった。イコデキストリン中ウィルスの最大投与量を受けた１匹の動物は、研究の完了時（１００日目）に、腫瘍の成長の臨床的な兆候から免れていた。この動物は腹膜腔内での腫瘍の成長が最小だったが、このことは、この動物が腫瘍細胞を注入され、腫瘍が形成されても、腫瘍の成長は阻害されることを示した。
【００７０】
（実施例３）
（マウス異種移植卵巣ガンモデルにおけるイコデキストリンｒＡｄ−ｐ５３製剤の効果）
（上記表２中の製剤ＢおよびＣ）を含むアデノウィルス製剤を含むイコデキストリンの効果は、ヒト卵巣ガンのマウス腹膜異種移植モデルで評価された。４４匹の雌ヌードマウス（２０〜２５ｇ）は、０．２ｍＬ中１ｘ１０７個のヒト２７７４卵巣ガン細胞の腹膜注入を受け、腫瘍は２日間成長させられた。マウスは２、５、８および１２日目に、以下の内の１つの０．５ｍＬ腹膜注入を受ける６匹ずつの６群に分けられた。
ＰＢＳまたはイコデキストリン中、１ｘ１０１０個のｒＡｄ−ｐ５３粒子
ＰＢＳまたはイコデキストリン中、５ｘ１０９個のｒＡｄ−ｐ５３粒子
ＰＢＳまたはイコデキストリン中、１ｘ１０９個のｒＡｄ−ｐ５３粒子
残りの動物は、１つの無処置群（Ｎ＝４）、及び０．５ｍＬイコデキストリンのみで処置した１つの群（Ｎ＝４）に分けられた。マウスはランダムに籠に帰属され、マスクされた観察者により、腫瘍成長期間に渡りモニターされた。細胞注入後の生存数は、処置群間で比較された。結果を図３及び表５に提示する。
【００７１】
（実施例４）
（ヒト卵巣ガンの通常モデルにおける腫瘍性アデノウィルス（Ｋ９ＴＢ）のｖＩｃｏ促進効果）
マウスのヒト卵巣ガンモデルが、条件付きで複製を行うアデノウィルスベクター製剤を含むイコデキストリンの効果を評価するのに使われた。このモデルはヌードマウス（２０〜２５ｇ、Harlan, Indianapolis, IN から市販）において、ハンクス調整塩溶液（ＨＢＳＳ）０．５ｍＬ中の、１ｘ１０７個のＭＤＡＨ２７７４ヒト卵巣ガン細胞（受託番号ＣＲＬ−１０３０３によりAmerican Type Culture Collection から入手可能）の懸濁液の単回腹膜注入投与により樹立された。腫瘍は７日間成長を許容され、マウスは、触診可能な腫瘍の存在に関して評価された。腫瘍を証明するそれらのマウスは、処置のために群に分けられた。
Ｋ９ＴＢと名付けられ、条件付きで複製を行う組み換えアデノウィルスベクターは、実質的にラマチャンドラらの教えるところにより調製された（２０００年４月２０日公開 PCT 国際公開番号 WO00/22137）。Ｋ９ＴＢウィルスは、Ｅ１ａ領域の４〜２５番目のアミノ酸の欠損、Ｅ３領域に挿入されたＥ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質（２０００年６月１３日発行、Antelmanet al., 米国特許 6,074,850 号）の発現を司るｐ５３応答エレメントを含む、条件付きで複製を行うウィルスである。
【００７２】
以下の表６中与えられる以下の製剤が、上記腫瘍モデルにおける評価のために調製された。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
腫瘍保有動物は、処置のために以下の群に分割された。
【００７５】
【表６】
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【００７６】
各群は、腫瘍細胞の注入後、７、９、１２および１４日目に０．５ｍＬの適切な製剤の単回腹膜注入よりなる処置レジメンを与えられた。この処置レジメンが完了した際、それら動物はランダムに籠に入れられ、明らかな体重の減少、背中の彎曲および鎮静によって特徴付けられるような瀕死の動物については、毎日（ブラインドされて）モニターされた。瀕死の動物は屠殺され、全体を病理学的に検査された。動物数、屠殺（または死亡が発見された）日、および総合的な病理学的知見が記録され、その結果が以下の表８にまとめられた。
【００７７】
【表７】
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【００７８】
注入後の生存日数は、Kaplan-Meier プロットを使ってまとめられ、１〜４の処置群の結果は、添付図面の図３にグラフ提示されている。群間の比較は Logrank試験 (Statview Software) を用いて行われた。ｐ＜０．０５の場合、差は有意と見なした。
【００７９】
データのグラフ表示は、添付図面の図３に提示されている。製剤Ｈ／処置群２はｘで表され、製剤Ｉ／処置群１は４角で表され、製剤Ｊ／処置群３は丸で表され、製剤Ｌ／処置群４は３角で表されている。
提示されたデータから分かるように、ｖＩｃｏとｖＰＢＳとの両方の製剤中の組み換えアデノウィルスベクターＫ９ＴＢを用いた腫瘍保有マウスの処置は、ベヒクルコントロールと比較して生存を延長させた。しかし、ｖＩｃｏ中で製剤されたＫ９ＴＢは、ｖＰＢＳ中製剤されたＫ９ＴＢに比較して生存の延長を示した（ｐ＜０．０１、１処置群につき動物のｎ＝７）。
【００８０】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ベータガラクトシダーゼをコードする組み換えアデノウィルスベクターを、ここでの実施例１でより充分に記述されるような様々な製剤中に含む１００ｍＬ溶液の腹膜点滴後の、ウサギにおける腹膜の上皮組織でのベータガラクトシダーゼ遺伝子の発現の測定を提供するヒストグラムである。縦軸はＲＴ−ＰＣＲ法で決定される組織中のウィルスＲＮＡの水準を表す。
【図２】  図２は、ここでの実施例２に記述されているマウス異種移植前立腺ガンモデルの結果のグラフ表示である。縦軸は、生存して残っている動物のフラクションを表す。横軸は時間を日数で表している。表３にまとめられた８つの処置群が表されている。
【図３】  図３は、実施例３に記載され、表５に提示された、マウス異種移植卵巣ガンモデルの結果のグラフ表示である。
【図４】  図４は、実施例４に記載され、表６、７および８に提示されたマウス異種移植卵巣ガンモデルの結果のグラフ表示である。この例は、複製を行うアデノウィルスベクターを用いている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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