(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能な１，３−連結フコシルおよび１，２−連結キシロシル残基を伴わない修飾されたＮ−連結グリカンをもたらすフコシルトランスフェラーゼおよびキシロシルトランスフェラーゼのダブルノックアウトからなる形質転換されたコケ細胞。
【請求項２】
前記細胞は前記コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含んでなり、ここで、前記ヌクレオチド配列は、コケ細胞において発現されるグリコシル化ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の形質転換されたコケ細胞。
【請求項３】
前記グリコシル化ポリペプチドは動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項２に記載の形質転換されたコケ細胞。
【請求項４】
前記グリコシル化ポリペプチドは哺乳動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項３に記載の形質転換されたコケ細胞。
【請求項５】
前記コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含んでなり、ここで、前記ヌクレオチド配列は、コケ細胞において発現される機能的哺乳動物ガラクトース転移酵素をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換されたコケ細胞。
【請求項６】
発現される哺乳動物ガラクトース転移酵素はβ−１，４ｇａｌＴである、請求項５に記載の形質転換されたコケ細胞。
【請求項７】
発現される哺乳動物ガラクトース転移酵素はヒトβ−１，４ｇａｌＴである、請求項６に記載の形質転換されたコケ細胞。
【請求項８】
コケ細胞はフィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、フナリア（Ｆｕｎａｒｉａ）、スファグヌム（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、セラトドン（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、マーチャンティア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）およびスファエロカルポス（Ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）属の種から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコケ細胞。
【請求項９】
コケ細胞はフィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）から選択される、請求項８に記載のコケ細胞。
【請求項１０】
コケ細胞はヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）由来である、請求項９に記載のコケ細胞。
【請求項１１】
グリコシル化ポリペプチドは、ヒトグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳動物グリコシル化タンパク質の一次アミノ酸配列、抗体またはその活性なフラグメントの一次アミノ酸配列、ならびに／あるいは非哺乳動物グリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる群から選択される、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のコケ細胞。
【請求項１２】
グリコシル化ポリペプチドはヒトポリペプチドである、請求項１１に記載のコケ細胞。
【請求項１３】
グリコシル化ポリペプチドは、ヒトインスリン、プレプロインスリン、ＶＥＧＦ、プロインスリン、グルカゴン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロン、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩ、および第ＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンを含む生殖ホルモン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子を含む増殖因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびβ−グルコセレブロシダーゼなどの酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、ならびにコラーゲンよりなる群から選択される、請求項１１または１２に記載のコケ細胞。
【請求項１４】
検出可能な１，３−連結フコシルおよび１，２−連結キシロシル残基を伴わない修飾されたＮ−連結グリカンをもたらすフコシルトランスフェラーゼおよびキシロシルトランスフェラーゼのダブルノックアウトからなるコケ細胞を生成する方法であって、ｉ）内因性フコース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第１の核酸配列を前記細胞に導入することおよびｉｉ）内因性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第２の核酸配列を前記細胞に導入することを含んでなる、上記方法。
【請求項１５】
前記形質転換されたコケ細胞は、前記コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含んでなり、ここで、前記ヌクレオチド配列は、コケ細胞において発現されるグリコシル化ポリペプチドをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコシル化ポリペプチドは動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコシル化ポリペプチドは哺乳動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結された核酸を含んでなる単離された核酸配列を、前記細胞に導入することをさらに含んでなり、ここで、前記核酸は機能的哺乳動物ガラクトース転移酵素ポリペプチドをコードする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ガラクトース転移酵素ヌクレオチド配列はβ−１，４ガラクトース転移酵素（β−１，４ｇａｌＴ）ヌクレオチド配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ガラクトース転移酵素ヌクレオチド配列はヒトβ−１，４ガラクトース転移酵素（β−１，４ｇａｌＴ）ヌクレオチド配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
グリコシル化ポリペプチドは、ヒトタンパク質の一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳動物タンパク質の一次アミノ酸配列、抗体またはその活性なフラグメントの一次アミノ酸配列、ならびに／あるいは非哺乳動物タンパク質の一次アミノ酸配列を有するタンパク質を含んでなる群から選択される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
グリコシル化ポリペプチドは、ヒトインスリン、プレプロインスリン、プロインスリン、グルカゴン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロン、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩ、および第ＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンを含む生殖ホルモン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子を含む増殖因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびβ−グルコセレブロシダーゼなどの酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、コラーゲン、ならびにアミダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、ペプシン、ペプチダーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、カゼイン、乳清タンパク質、大豆タンパク質、グルテンならびに卵アルブミンよりなる群から選択される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
コケ細胞はフィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、フナリア（Ｆｕｎａｒｉａ）、スファグヌム（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、セラトドン（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、マーチャンティア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）およびスファエロカルポス（Ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）属の種から選択される、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
コケ細胞はフィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
コケ細胞はヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
グリコシル化ポリペプチドは、ヒトグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳動物グリコシル化タンパク質の一次アミノ酸配列、抗体またはその活性なフラグメントの一次アミノ酸配列、ならびに／あるいは非哺乳動物グリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる群から選択される、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
グリコシル化ポリペプチドはヒトポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
グリコシル化ポリペプチドは、ヒトインスリン、プレプロインスリン、ＶＥＧＦ、プロインスリン、グルカゴン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロン、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩ、および第ＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンを含む生殖ホルモン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子を含む増殖因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびβ−グルコセレブロシダーゼなどの酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、ならびにコラーゲンよりなる群から選択される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
外因性プロモーターは、誘導性、化学調節型、構成性または細胞特異的プロモーターから選択される、請求項１５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
検出可能な１，３−連結フコシルおよび１，２−連結キシロシル残基を伴わない修飾されたＮ−連結グリカンをもたらすフコシルトランスフェラーゼおよびキシロシルトランスフェラーゼのダブルノックアウトからなる形質転換されたコケ細胞を生成するのに適切な核酸ベクターの組であって、ｉ）内因性フコース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第１の核酸配列およびｉｉ）内因性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第２の核酸配列を含んでなる、上記核酸ベクターの組。
【請求項３１】
グリコシル化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項３０に記載の核酸ベクターの組。
【請求項３２】
請求項１５〜２９のいずれか１項に記載の方法における使用のための機能的哺乳動物糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３０または３１に記載の核酸ベクターの組。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドは哺乳動物ガラクトース転移酵素をコードする、請求項３２に記載の核酸ベクターの組。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドはヒトβ−１，４ガラクトース転移酵素をコードする、請求項３３に記載の核酸ベクターの組。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の核酸ベクターの組を含有する宿主細胞。
【請求項３６】
コケ細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
原核細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の宿主細胞を生成する方法であって、形質転換により前記核酸ベクターの組を細胞に組み入れることを含む、上記方法。
【請求項３９】
トランスジェニックコケ細胞の生成における請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の核酸ベクターの組の使用。
【請求項４０】
コケ、またはコケ部、またはコケの抽出物または誘導体あるいはコケ細胞培養物に含まれる請求項３５または３６に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
請求項１〜１３、３６および４０のいずれか１項に記載のコケ細胞を含んでなるコケ植物またはコケ組織。
【請求項４２】
コケ植物を生成する方法であって、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の核酸ベクターの組をコケ細胞に組み入れることおよび前記細胞からコケを再生することを含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養物中の形質転換されたヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ細胞において異種グリコシル化タンパク質を産生させるための方法に関する。特に、該方法は、ヒトを含む哺乳動物における使用のための製薬タンパク質などの動物のグリコシル化パターンを含んでなるグリコシル化タンパク質を、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ細胞において産生させるための方法、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのその必要とされる遺伝子材料、ベクター、宿主細胞、それらへの遺伝子材料の導入の方法、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去において、細菌、酵母などの菌類、昆虫、植物または哺乳動物細胞株から誘導される系などの様々な形質転換細胞系を使用して、異種タンパク質が産生されている（クドウＴ．（Ｋｕｄｏ  Ｔ．）１９９４：Ｙ．ムロオカ（Ｙ．Ｍｕｒｏｏｋａ）およびＴ．アマナカ（Ｔ．Ａｍａｎａｋａ）（編）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２９１〜２９９頁、マーシャル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ハラシマＳ．（Ｈａｒａｓｈｉｍａ  Ｓ．）Ｂｉｏｐｒｏｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，１９：１３７−１５８；アーチャーＤ．Ｂ．（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄ．Ｂ．）１９９４：Ｙ．ムロオカ（Ｙ．Ｍｕｒｏｏｋａ）およびＴ．アマナカ（Ｔ．Ａｍａｎａｋａ）（編）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３７３〜３９３頁、マーシャル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；グーセンＭ．Ｆ．Ａ．（Ｇｏｏｓｅｎ  Ｍ．Ｆ．Ａ．）１９９３：Ｍ．Ｆ．Ａ．グーセン（Ｍ．Ｆ．Ａ．Ｇｏｏｓｅｎ）、Ａ．バウグリス（Ａ．Ｂａｕｇｕｌｉｓ）およびＰ．フォークナー（Ｐ．Ｆａｕｌｋｎｅｒ）（編）Ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１〜１６頁、マーシャル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ハッセＦ．（Ｈｅｓｓｅ  Ｆ．）およびワーグナーＲ．（Ｗａｇｎｅｒ  Ｒ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１８（４）：１７３−１８０）。
【０００３】
原核生物体において産生されるタンパク質は、真核生物系において産生される真核生物タンパク質と類似の様式での翻訳後修飾は受け得ず、例えば、それらは、アスパラギン酸（Ｎ）残基などの特定のアミノ酸残基での適切な糖によるグリコシル化（Ｎ−連結グリコシル化）を受け得ない。さらに、例えば、細菌はシステインジスルフィド架橋を形成することができないため、細菌から産生される真核生物タンパク質のホールディングは不適切であり得る。さらに、細菌から産生される組換えタンパク質は、しばしば、凝集し、不溶性の封入体として蓄積する。
【０００４】
真核細胞系は産生されたタンパク質のグリコシル化などの翻訳後修飾を生じ得るため、ヒトなどの多様な真核生物体において見出されるグリコシル化タンパク質の酸性のための真核細胞系がより良好に研究されている。しかし、例えば、製薬としての使用に予定されたタンパク質配列の産生に適切な異種遺伝子で形質転換される真核細胞系において直面する問題は、そのようなタンパク質上のグリコシル化パターンは、しばしば、即ち、タンパク質が産生されている真核細胞系の生来のパターンを獲得することであり：非動物のグリコシル化パターンを含んでなるグリコシル化タンパク質が産生され、次いで、これらは、ヒトを含む動物に適用される場合、免疫原性および／またはアレルギー性であり得る。
【０００５】
高等植物により産生される組換え糖タンパク質の使用は、そのようなタンパク質上において獲得される植物特異的Ｎ−グリコシル化によって制限される。哺乳動物由来の糖タンパク質と比較すると、高等植物特異的糖タンパク質は、２個のさらなる残基を含有する。さらに、高等植物糖タンパク質では、末端のβ１，４−ガラクトース残基は認められず、このことは、β１，４−ガラクトース転移酵素が植物には存在しないことを示す。タバコ植物（バッカー（Ｂａｋｋｅｒ）ら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９８，２８９９−２９０４）ならびにタバコＢＹ２細胞（パラクパク（Ｐａｌａｃｐａｃ）ら（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９６，４６９２−４６９７）におけるこの酵素の安定な組み込みおよび発現が記載されている。組換えヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素は機能的であり、トランスジェニック材料から単離されたタンパク質は、末端のβ１，４−ガラクトース残基を示した。それにもかかわらず、高等植物では、β１，２−キシロース転移酵素およびα１，３−フコース転移酵素の活性を抑制することが可能であるとは思われず、該２つの酵素は、さらなる植物特異的残基を転移することを担うと考えられる。これらの残基は、ヒトに対してアレルギー性であると考えられる（ガルシア−カサッダ（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｓｓａｄｏ）ら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６，４７１−４７７；バン・リー（ｖａｎ  Ｒｅｅ）ら、２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，Ｎｏ．１５，１１４５１−１１４５８）。植物特異的Ｎ−グリコシル化に関するすべてのデータは、高等植物による研究において作成されている。
【０００６】
半数体の維管束を欠く陸上植物であるコケ、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）もまた、組換えタンパク質の産生のために使用することができる（国際公開第０１／２５４５６号パンフレット）。
【０００７】
コケの生活環は、光独立栄養配偶体の世代が大半を占める。該生活環は、高等植物のそれとは完全に異なり、ここで、胞子体が主な世代であり、高等植物とコケとの間には極めて多くの差異が観察される。
【０００８】
コケの配偶体は、２つの異なる発達段階によって特徴付けられる。頂端生長を介して発達する糸状体は、ただ２つのみの細胞タイプ（クロロネマおよびカウロネマ細胞）の糸状ネットワークに成長する。茎葉体と呼ばれる第２の段階は、幼茎生長（ｃａｕｌｉｎａｒｙ  ｇｒｏｗｔｈ）により簡単な頂端系から分化する。両方の段階とも光独立栄養的に活性である。より複雑な茎葉体への分化を伴わない糸状体の培養については、フラスコ中の懸濁培養物ならびにバイオリアクター培養物で明らかにされている（国際公開第０１／２５４５６号パンフレット）。ただ数種の細胞タイプのみを含有する十分に分化し、光独立栄養的に活性である多細胞組織については、高等植物では記載されていない。コケ細胞系の遺伝子安定性は、植物細胞培養物よりも重要な利点を提供し、光独立栄養的に活性なコケ培養物の安定性が確認されている（リエック（Ｒｉｅｃｋ）１９９６，Ｓｔｒｕｋｔｕｒ−ａｕｆｋｌａｅｒｕｎｇ  ｕｎｄ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ  ｖｏｎ  Ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅｎ  ａｌｓ  Ｉｎｈａｌｔｓｓｔｏｆｆｅ  ａｅｔｈｅｒｉｓｃｈｅｒ  Ｏｅｌｅ．Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。高等植物の細胞培養物では、二次代謝がさらに分化し、この結果、二次代謝物プロフィールの細胞溶解物が生じる。
【０００９】
さらに、生化学的レベルで、コケと高等植物との間にはいくつかの重要な差異が存在する。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）における硫酸同化は、高等植物とは有意に異なる。高等植物における硫酸同化の重要な酵素は、アデノシン５'−ホスホ硫酸還元酵素である。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）では、ホスホアデノシン５'−ホスホ硫酸還元酵素を介する代替的経路が共存する（コプリボバ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３２１９５−３２２０１）。この経路については、高等植物では特徴付けされていない。
【００１０】
さらに、コケの多くのメンバー、藻類およびシダ科は、広範な多不飽和脂肪酸を生じる（デンビトスキー（Ｄｅｍｂｉｔｓｋｙ）（１９９３）Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３２，２８１−３５６）。例えば、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸は、下等植物によってのみ産生され、高等植物によっては産生されないと考えられている。多不飽和脂肪酸の代謝のいくつかの酵素（δ６−アシル基デサチュラーゼ）（ジルケ（Ｇｉｒｋｅ）ら（１９９８），Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１５，３９−４８）およびδ６エロンガーゼの成分（ザンク（Ｚａｎｋ）ら（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３１，２５５−２６８）は、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）からクローニングされている。高等植物では、対応する遺伝子は見つかっていない。この事実から、生化学的レベルで高等植物と下等植物との間に本質的な差異が存在することが確認されるようである。
【００１１】
さらなる差異は、細胞壁の再生に反映される。高等植物から誘導されるプロトプラストは、培養培地に依存することなく、迅速な様式で新たな細胞壁を再生する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介する高等植物のプロトプラストへのＤＮＡの直接伝達は、４〜１０℃でのプレインキュベーションを必要とし、細胞壁再生のプロセスを遅延させる（米国特許第５５０８１８４号明細書）。対照的に、フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）の糸状体から誘導されるプロトプラストの細胞壁再生は、培養培地に依存する。プロトプラストは、長期間にわたって、細胞壁の再生を伴わずに培養することができる。理論的に結びつける意図はないが、細胞壁再生およびタンパク質グリコシル化に不可欠であるコケプロトプラストの分泌装置は、高等植物とは異なるようである。さらに、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）は、核ＤＮＡにおいて高度に効率的な相同組換えを示し、植物にとって独特な特徴であり、指向された遺伝子の崩壊を可能にし（ジルケ（Ｇｉｒｋｅ）ら（１９９８），Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１５，３９−４８；ストレップ（Ｓｔｒｅｐｐ）ら（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，４３６８−４３７３；コプリボバ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３２１９５−３２２０１；レスキ（Ｒｅｓｋｉ）（１９９９）Ｐｌａｎｔａ  ２０８，３０１−３０９による再検討；シャエファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）およびザイド（Ｚｒｙｄ）（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ  １２７，１４３０−１４３８；シャエファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５３，４７７−５０１）、高等植物に対する根本的な差異を例示する。しかし、グリコシル化パターンを変更するこのような装置を使用することは、本明細書の実施例に示されるように、問題があることが証明されている。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧＮＴ１）を破壊すると、特異的な転写は消失したが、Ｎ−グリコシル化パターンのわずかな差異しか生じなかった。これらの結果は、フォン・スケベン（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｅｗｅｎ）ら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０２，１１０９−１１１８によって観察された、ＧＮＴ１を欠くシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物におけるゴルジ修飾された複雑なグリカンの消失とは正反対である。従って、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のノックアウトは、Ｎ−グリコシル化パターンの予想される修飾を生じなかった。
【００１２】
ノックアウトストラテジーはＧＮＴ１に対して成功しなかったが、本発明者らは、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のβ１，２−キシロース−転移酵素（ＸｙｌＴ）およびα１，３−フコース転移酵素（ＦｕｃＴ）をノックアウトすることを試みた。得られた植物において特定の転写物を検出することはできなかった。驚くべきことに、トランスジェニック植物から単離されたＮ−連結グリカンは、所望される様式で修飾されることが見出された。ＦｕｃＴノックアウト植物のＮ−連結グリカン上に１，３連結フコシル残基を検出することはできず、また、ＸｙｌＴノックアウト植物のＮ−連結グリカン上に１，２連結キシロシル残基を検出することはできなかった。単離されたトランスジェニック株は正常な増殖を示したが、驚くべきことに、植物特異的グリコシル化は高度に保存され、従って、機能的に重要であると考えられている。従って、二重ノックアウトはコケの増殖に有害な効果を及ぼしたと予想されている。さらに、補完することは予想はされたが、驚くべきことに、明白ではなかった。さらに、ＦｕｃＴおよびＸｙｌＴの二重ノックアウトは、検出可能な１，３連結フコシルおよび１，２連結キシロシル残基を伴わない修飾されたＮ−連結グリカンを生じた。
【００１３】
ヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素の二重ノックアウトヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）植物のゲノムへの組み込みは、植物特異的フコシルおよびキシロシル残基を伴わず、哺乳動物様末端１，４ガラクトシル残基を伴う哺乳動物様Ｎ−連結グリコシル化パターンを生じた。ガラクトース転移酵素は活性であることが見出された。Ｎ−グリコシル化は極めて複雑であり、良好に調節されるため、活力の消失を伴わないＮ−連結グリカンのそのような修飾は予想されなかった。それは、発達段階に依存する（植物について：エルバート（Ｅｌｂｅｒｓ）ら（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ  １２６，１３１４−１３２２）だけではなく、培養条件にも依存する（哺乳動物細胞培養について：ヒルズ（Ｈｉｌｌｓ）ら（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５，２３９−２５１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、動物のグリコシル化パターンを含んでなる動物タンパク質、特に、ヒトグリコシル化パターンを含んでなるグリコシル化ヒトタンパク質を産生させるより効率的な方法を提供することである。さらなる目的は、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）などのコケにおける動物のグリコシル化パターンを含んでなる異種動物タンパク質、特に、ヒトグリコシル化パターンを含んでなるヒトタンパク質の産生のための効率的なプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
これらおよび他の目的は、本明細書において提供される以下の説明および実施例から明らかとなろう。
【００１６】
本発明に従えば、ｉ）機能不全性フコース転移酵素ヌクレオチド配列およびｉｉ）機能不全性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列を含んでなる形質転換されたコケ細胞が提供される。
【００１７】
本発明のコケ細胞は、フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、フナリア（Ｆｕｎａｒｉａ）、スファグヌム（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、セラトドン（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、マーチャンティア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）およびスファエロカルポス（Ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）属の種のタイ類を含むコケ群から選択されるコケ由来の細胞である。コケ細胞は、好ましくはヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）由来である。
【００１８】
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）細胞などのコケ細胞は、本明細書に記載の本発明の方法に従う形質転換に適切な任意の細胞であり得、コケプロトプラスト細胞、糸状体組織において見出される細胞または他の細胞タイプであってもよい。実際、当業者であれば、形質転換された糸状体組織などの本発明に従う形質転換されたコケ細胞の集団を含んでなるコケ植物組織もまた、本発明の局面を形成することを理解するであろう。
【００１９】
本明細書において使用される「機能不全性」とは、フコース転移酵素（ｆｕｃＴ）およびキシロース転移酵素（ｘｙｌＴ）の指定された転移酵素のヌクレオチド配列の少なくとも一部を人為的に改変することによって、１，３連結フコシルおよび１，２連結キシロシル残基を含んでなる植物様グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）パターンで植物Ｎ−連結グリカンを修飾することが可能である機能的ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴタンパク質をコードするｍＲＮＡを実質的にコードすることができないことを意味する。好適には、機能不全性ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ植物転移酵素ヌクレオチド配列は、（真に生来のコケゲノムが、他の核酸配列が人為的に予め形質転換されていないコケ細胞内に存在するか、または核酸配列挿入物が所望される核酸配列から予め作製されている形質転換された核のコケゲノム内に存在するかにかかわらず）核のコケゲノムに含まれる内因性（即ち、ゲノムの）生来のｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ遺伝子への外因性ヌクレオチド配列の標的化された挿入物を含んでなり、これは、機能的ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ転移酵素活性をコードするｍＲＮＡの転写を阻害または抑制する。
【００２０】
さらに好適には、機能不全性ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ植物転移酵素ヌクレオチド配列は、それらのすべてもしくは実質的にすべての内因性遺伝子配列の標的化された欠失、または実際には、ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴヌクレオチド配列の標的化された部分的欠失を含んでなることができ、従って、本発明の範囲内でそのような配列を機能不全にする。
【００２１】
本発明のコケ細胞またはそれらの先祖は、本明細書に記載のように、哺乳動物グリコシル化パターンでグリコシル化される目的のタンパク質の一次配列をコードする目的の異種遺伝子で予め形質転換されている任意のものであり得る。好ましくは、グリコシル化パターンはヒト型のものである。あるいは、コケ細胞は、本明細書に記載の本発明の方法に従ってそれらの上に配置されるべき哺乳動物グリコシル化パターンを必要とするヒトまたはウシ、ヒツジ、ウマおよびブタ種を含む家畜種などの哺乳動物における使用のための少なくとも、目的の一次タンパク質配列、典型的に、少なくとも、目的の製薬タンパク質をコードするヌクレオチド配列で、別々に、即ち、同時にまたは経時的に、形質転換することができる。ヒトを含む哺乳動物における使用のためのそのような製薬糖タンパク質としては、インスリン、プレプロインスリン、ＶＥＧＦ、プロインスリン、グルカゴン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロン、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩ、および第ＸＩＩ因子から選択される血液凝固因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンを含む生殖ホルモン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子などを含む増殖因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、β−グルコセレブロシダーゼなどの酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、コラーゲン、ＴＮＦα受容体リガンド結合ドメインとＩｇＧのＦｃ部分などとの融合タンパク質などの融合タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、特異的モノクローナル抗体またはそれらの活性フラグメントなどの抗体の産生のために、本発明の方法を使用することができる。
【００２２】
好適には、ｉ）機能不全性フコース転移酵素ヌクレオチド配列およびｉｉ）機能不全性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列およびｉｉｉ）コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列であって、ここで、前記ヌクレオチド配列は、コケ細胞において発現される機能的哺乳動物ガラクトース転移酵素をコードする、上記ヌクレオチド配列を含んでなる形質転換されたコケ細胞が提供される。
【００２３】
さらに好適には、哺乳動物ガラクトース転移酵素ヌクレオチド配列は、β−１，４ガラクトース転移酵素（β−１，４ｇａｌＴ）であり、最も好ましくは、ヒトβ−１，４ガラクトース転移酵素ヌクレオチド配列である。当業者であれば、β−１，４ｇａｌＴヌクレオチド配列はｃＤＮＡ配列であってもまたはゲノムＤＮＡ配列であってもよく、本発明の形質転換されたコケ細胞またはコケ組織において産生される任意の所望されるグリコシル化外因性タンパク質上のＮ−グリカングリコシル化パターンが、パターンにおいて完全には哺乳動物でないとしても実質的にパターンにおいて哺乳動物であり、最も好ましくは、適切である場合、パターンにおいてヒトである限り、変性性の等価なヌクレオチドβ−１，４ｇａｌＴ配列を含んでなり得ることを理解するであろう。
【００２４】
バイオリアクターにおけるナシゴケ（Ｌｅｐｔｏｂｒｙｕｍ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ）およびムラサキミズゴケ（Ｓｐｈａｇｎｕｍ  ｍａｇｅｌｌａｎｉｃｕｍ）などの本発明における使用に適切であるコケの培養に関する詳細な情報については、先行技術において公知である（例えば、Ｅ．ウィルバート（Ｅ．Ｗｉｌｂｅｒｔ）、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｓｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｉｎｚ（１９９１）；Ｈ．ルドルフ（Ｈ．Ｒｕｄｏｌｐｈ）およびＳ．ラムッセン（Ｓ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）、Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｓｐｈａｇｎｕｍ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ，  Ｃｒｙｐｔ．Ｂｏｔ．，３，６７〜７３頁（１９９２）を参照のこと）。分子生物学的技術が本生物体において実践されるため、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）の使用が本発明の目的に特に好適である（再検討については、Ｒ．レスキ（Ｒ．Ｒｅｓｋｉ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｏｓｓｅｓ，Ｂｏｔ．Ａｃｔａ，１１１，１〜１５頁（１９９８）を参照のこと）。
【００２５】
異種タンパク質の産生のためのフィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）の生物工学的活用のための適切な形質転換系が開発されている。例えば、パーティクルガンを使用する糸状体組織への直接ＤＮＡ伝達によって、形質転換が首尾よく行われている。コケプロトプラストへのＰＥＧ仲介ＤＮＡ伝達もまた、首尾よく達成されている。ＰＥＧ仲介形質転換方法は、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）について多数の記述がされており、一過性および安定形質転換の両方がもたらされる（例えば、Ｋ．ロイター（Ｋ．Ｒｅｕｔｔｅｒ）およびＲ．レスキ（Ｒ．Ｒｅｓｋｉ）、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｍｏｓｓ  ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２，１４２〜１４７頁（１９９６）を参照のこと）。
【００２６】
本発明のさらなる実施態様では、ｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ活性が実質的に減少した少なくともコケ細胞を生成する方法であって、ｉ）内因性フコース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第１の核酸配列およびｉｉ）内因性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第２の核酸配列を前記細胞に導入することを含んでなる上記方法が提供される。
【００２７】
当業者であれば、コケ細胞への前記第１および第２の転移酵素核酸配列の導入のオーダーは重要ではなく：それは任意のオーダーで実施することができることを理解するであろう。第１および第２の核酸配列は、例えば、本明細書に提供されるような実施例に従い、その特定の制限酵素部位によって規定されるコケ細胞の核ゲノムに位置する内因性、生来のｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ遺伝子の特定の部分に標的化することができる。目的の標的の生来の転移酵素遺伝子を特異低に組み入れるヌクレオチド配列で生来のｆｕｃＴおよびｘｙｌＴ転移酵素遺伝子の配列を特異的に標的化することにより、前記配列の発現は、完全には破壊されないにしても、実質的に減損される。
【００２８】
本発明の好適な実施態様では、形質転換されたコケ細胞において、少なくとも異種または外因性のグリコシル化哺乳動物タンパク質を産生させる方法であって、
ｉ）内因性フコース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第１の核酸配列を含んでなる第１の単離された核酸を前記細胞に導入すること；および
ｉｉ）内因性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第２の核酸配列を前記細胞に導入すること；および
ｉｉｉ）コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結された核酸を含んでなる第３の単離された核酸配列を前記細胞に導入することであって、ここで、前記核酸は少なくとも１つの哺乳動物ガラクトース転移酵素ポリペプチドをコードする、
を含んでなる上記方法が提供される。
【００２９】
本発明のこの実施態様では、少なくとも１つの哺乳動物ガラクトース転移酵素ポリペプチドは、好ましくは、β−１，４ガラクトース転移酵素（β−１，４ｇａｌＴ）であり、最も好ましくは、ヒトβ−１，４ガラクトース転移酵素ヌクレオチド配列である。
【００３０】
好ましくは、上記のすべてのグリコシル化哺乳動物タンパク質はヒト型である。本発明における産生のために考慮される他のタンパク質は、獣医学的管理における使用のためのタンパク質を含み、本明細書に記載のヒトタンパク質の動物相同物に相当し得る。
【００３１】
外因性プロモーターは、目的の核酸配列の前に導入され、それと操作可能に関連するプロモーターを示すプロモーターである。従って、外因性プロモーターは、本明細書において規定される選択された核酸成分の前に配置されており、野生型環境において見出されるような目的の核酸成分に通常関連する天然または生来のプロモーターよりならないプロモーターである。従って、プロモーターは、目的のコケ細胞に対して生来のものであってもよいが、野生型のコケ細胞において目的の核酸と前方で操作可能に関連していなくてもよい。典型的に、外因性プロモーターは、宿主細胞以外の供給源由来の宿主コケ細胞に伝達されるプロモーターである。
【００３２】
本明細書に記載のｇａｌＴタンパク質、グリコシル化および哺乳動物タンパク質をコードするｃＤＮＡは、コケ細胞において操作可能である少なくとも１つのタイプのプロモーター、例えば、ｇａｌＴ核酸配列および／または本明細書において規定され、本発明により提供されるようなグリコシル化哺乳動物タンパク質のための第２の核酸配列に操作可能に連結された誘導性あるいは構成性プロモーターを含有する。考察されるように、これは、遺伝子の発現の制御を可能にする。
【００３３】
プロモーターに適用される用語「誘導性」は当業者に良好に理解されている。本質的には、誘導性プロモーターの制御下における発現は、適用された刺激（細胞内で発生するかもしくは外的に提供される）に応答して、「スイッチがオンになる」または増加する。刺激の性質は、プロモーター間で変動する。いくつかの誘導性プロモーターは、適切な刺激の非存在下では、ほとんど認められないかもしくは検出不能なレベルの発現しか生じない（または発現がまったく認められない）。他の誘導性プロモーターは、刺激の非存在下で検出可能な構成性発現を生じる。刺激の非存在下でどのような発現レベルであっても、正確な刺激下では、いずれの誘導性プロモーター由来の発現も増加する。好適な状況とは、発現のレベルが、表現型特徴を変更するのに有効な量で適切な刺激を適用する時に増加するような状況である。従って、レベルが低くて所望される表現型を生じることができない（および事実上ゼロであり得る）ような刺激の非存在下で、基本的な発現レベルを生じる（または「切り換え可能な」）プロモーターを使用してもよい。刺激の適用時は、発現は、所望される表現型を生じるレベルにまで増加する（またはスイッチがオンにされる）。
【００３４】
本明細書において言及されるように、コケの発現系も当業者に公知である。コケのプロモーター、特に、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）プロモーターは、宿主ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの（３'）下流の転写を開始することが可能な任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５'末端付近に通常配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。コケのプロモーターもまた、上流活性化配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、存在するならば、通常、構造遺伝子に対して遠位である。ＵＡＳは、調節型（誘導性）発現を可能にする。構成性発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節型発現は、ポジティブかまたはネガティブかのいずれかであり得、従って、いずれかは、転写を増強もしくは減少する。
【００３５】
当業者であれば、コケの代謝経路において酵素コードするコケのプロモーター配列は、特に有用なプロモーター配列を提供することができることを理解するであろう。
【００３６】
さらに、天然には存在しない合成プロモーターもまた、コケのプロモーターとして機能することができる。例えば、１つのコケのプロモーターのＵＡＳ配列を、別のコケのプロモーターの転写活性化領域に接続し、合成ハイブリッドプロモーターを作製してもよい。適切なプロモーターの例は、ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら（１９９６）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，１９９−２０５によるヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のためのＴＯＰ１０発現系において使用されるプロモーターである。さらに、コケのプロモーターは、コケのＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始する能力を有する非コケ由来の天然に存在するプロモーターを含むことができる。そのようなプロモーターの例として、記載のプロモーター、とりわけ、イネＰ−アクチン１プロモーターおよびクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）ＲｂｃＳプロモーターが挙げられる（ザイドラー（Ｚｅｉｄｌｅｒ）ら（１９９９）Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５４，６４１−６５０）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：１０７８，１９８０；ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２８３：８３５，１９８１；ホーエンベルグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、「Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」：Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ティムス（Ｋ．Ｎ．Ｔｉｍｍｓ）およびＡ．プーラー（Ａ．Ｐｕｈｌｅｒ）編），１９７９；マーセロイ−ピュイガロン（Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ，ｌ  ｌ：１６３，１９８０；パンティアー（Ｐａｎｔｈｉｅｒ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２：１０９，１９８０。
【００３７】
コケにおいて、細胞内でＤＮＡ分子を発現させてもよい。組換えタンパク質のＮ末端側の第１のアミノ酸が常に、ｍＲＮＡ上でＡＵＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである場合、プロモーター配列をＤＮＡ分子に直接連結させてもよい。所望であれば、Ｎ末端側のメチオニンは、臭化シアンによってインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断することができる。
【００３８】
あるいは、外来性タンパク質のコケ細胞内側または外側への分泌を提供するリーダー配列フラグメントよりなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、外来性タンパク質をコケ細胞から増殖培地へ分泌させることができる。好ましくは、リーダーフラグメントと外来性遺伝子との間でコードされる、インビボまたはインビトロのいずれかで切断することができるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸よりなるシグナルペプチドをコードする。
【００３９】
コケ細胞においても分泌を提供し得るＶＥＧＦリーダーなどの非コケ由来のリーダーが存在するように、適切なシグナル配列をコードするＤＮＡを、分泌型コケタンパク質に対する遺伝子から送達することができる。
【００４０】
コケ細胞によって認識され、かつ該細胞において機能的である転写終了配列は、翻訳終止コドン３'に位置する調節領域であり、従って、プロモーターと共にコーディング配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指令する。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）において作用する適切な終了配列の例は、カリフラワー（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ）モザイクウイルスの終了領域である。
【００４１】
典型的に、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転写終了配列を含んでなる成分は、本発明の発現構築物に統合される。発現構築物は、しばしば、細菌などの宿主における安定な維持が可能な染色体外エレメントであるＤＮＡプラスミドに維持される。ＤＮＡプラスミドは、２つの複製開始点を有し得、従って、例えば、発現のためのコケならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において該プラスミドを維持することを可能にする。一般的に言えば、プラスミドは、原核宿主細胞においてクローニングおよび増幅のための１つの複製開始点を有すれば、十分である。さらに、ＤＮＡプラスミドは、高または低コピー数のいずれのプラスミドであってもよい。高コピー数のプラスミドは、一般に、約５〜約２００、通常、約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、より好ましくは、少なくとも約２０を有する。宿主に対するベクターおよび外来性タンパク質の効果に依存して、高または低コピー数のいずれのプラスミドを選択してもよい（例えば、ブレイク（Ｂｒａｋｅ）ら、上掲を参照のこと）。
【００４２】
あるいは、発現構築物を、組み込みベクターによりコケのゲノムに組み込むことができる。組み込みベクターは、通常、ベクターを組み込み可能にするコケの染色体に相同な少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含有する。組み込みベクターは、本明細書に記載され、例示されるようなベクターにおける封入のための適切な相同配列を選択することによって、コケの特定の座位に指向され得る。１つもしくはそれ以上の発現構築物が組み込むことができる。ベクターに封入される染色体配列は、ベクター全体の組み込みを生じるベクター中の単一のセグメント、または発現構築物のみの安定な組み込みを生じ得る染色体中の近傍セグメントに相同であり、ベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメントのいずれかとして、生じることができる。
【００４３】
通常、染色体外および組み込み発現構築物は、形質転換されているコケ細胞の選択を可能にする選択マーカーを含有することができる。
【００４４】
選択マーカーは、コケ細胞にそれぞれＧ４１８およびハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するＧ４１８またはハイグロマイシンＢ耐性遺伝子などのコケ宿主において発現され得る生合成遺伝子を含むことができる。さらに、適切な選択マーカーはまた、コケ細胞に、金属などの毒性化合物の存在下で増殖する能力を提供することができる。
【００４５】
あるいは、上記の成分のいくつかを形質転換ベクターに統合することができる。形質転換ベクターは、通常、上記のように、ＤＮＡプラスミドにおいて維持されるかまたは組み込みベクターに発達した選択マーカーよりなる。
【００４６】
コケ細胞に外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野において周知であり、とりわけ、スケファーＤ．Ｇ．（ＳｃｈａｅｆｅｒＤ．Ｇ．）「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｓｓ  Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ」（２００１年５月）インスティテュート・オブ・エコロジー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）、ラボラトリー・オブ・プラント・セル・ジェネティクス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ユニバーシティー・オブ・ローザンヌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌａｕｓａｎｎｅ）Ｄｉｄｉｅｒ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ＠ｉｅ−ｐｃ．ｕｎｉｌ．ｃｈ；ロイターＫ．（Ｒｅｕｔｔｅｒ  Ｋ．）およびレスキＲ．（Ｒｅｓｋｉ  Ｒ．）Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６年９月、第２巻、第３号；ザイドラーＭ（Ｚｅｉｄｌｅｒ  Ｍ）ら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３０：１９９−２０５に記載されている。
【００４７】
当業者であれば、ベクターを構築し、上記のような組換え核酸配列または遺伝子発現のためのプロトコルを設計することが十分に可能である。プロモーター配列、終了フラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切であれば他の配列を含む適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択するかまたは構築することができる。さらに詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ｌ９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の解析における核酸の操作のための多くの既知の技術およびプロトコルについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョン・ウィレイ＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９２に詳細に記載されている。サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らおよびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの開示内容は、本明細書において参考として援用される。
【００４８】
もちろん、当業者であれば、適切なｇａｌＴおよびグリコシル化しようとするポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列は、それ自体の外因性プロモーターおよびターミネーターの調節制御下にあることを理解するであろう。２つもしくはそれ以上の標的タンパク質が、単一のキャリアＲＮＡから産生されるように予め定められている場合、例えば、コケ細胞細胞培養系の回収相において、異なるタンパク質特異的抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）に対して結合させることによって、それらを容易に分離することが可能であれば、好適である。
【００４９】
上記のように、選択可能な遺伝子マーカーは、トランスジェニックコケ細胞の選択を容易にすることができ、これらは、本明細書において言及されるように、選択可能な表現型を付与するキメラ遺伝子よりなり得る。
【００５０】
選択された糖転移酵素核酸配列およびポリペプチド配列をグリコシル化のためにコケ細胞に導入する場合、当業者に周知の所定の配慮をしなければならない。挿入しようとする核酸は、転写を駆動する有効な調節エレメントを含有する構築物内に集成されなければならない。構築物を細胞に輸送する方法は利用可能でなければならない。一旦、構築物が細胞膜内に存在すると、内因性染色体材料への組み込みが生じたりまたは生じなかったりする。
【００５１】
本発明は、上記のベクターもしくは構築物で形質転換された宿主細胞、特に、コケまたは微生物細胞をさらに包含する。従って、本明細書において示されるように、本発明のヌクレオチド配列を含むコケ細胞などの宿主細胞が提供される。細胞内では、ヌクレオチド配列は染色体内に組み入れられ得る。
【００５２】
また、本発明に従えば、本発明によって提供されるように、本明細書に記載の発現の制御のための調節配列の有効な制御下で、そのゲノムに、少なくともヌクレオチド配列、特に、異種ヌクレオチド配列が組み入れられているコケ細胞が提供される。コーディング配列は、その（それらの）発現のために核酸配列と天然に関連しないような、本発明において用いられる核酸配列に対して異種または外来性であり得る１つもしくはそれ以上の調節配列に操作可能に連結され得る。本発明に従うヌクレオチド配列は、発現を使用者の制御下に配置するための外部からの誘導性プロモーターの制御下に配置することができる。本発明のさらなる局面は、本発明における使用のために考慮される核酸配列または本発明における使用のために考慮される配列を含む少なくとも適切なベクターのコケ細胞への導入に関与し、ベクターとコケ細胞ゲノムとの間の組換えを引き起こすかもしくは可能にして、前記配列をゲノム導入するようなコケ細胞、特に、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）細胞を提供する。本発明は、コケ細胞、特に、ＧａｌＴヌクレオチドおよび／または哺乳動物グリコシル化パターンの付加が予め定められ、先祖細胞へのヌクレオチド配列の導入の結果として、本発明の使用に適切なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有するヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）細胞に及ぶ。
【００５３】
用語「異種」は、遺伝子工学を使用して、即ち、人的介入により、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列が、コケ細胞またはそれらの先祖に導入されていることを示すために使用され得る。トランスジェニックコケ細胞（即ち、問題のヌクレオチド配列に対してトランスジェニックである）が提供され得る。導入遺伝子は、ゲノム外のベクターに存在するかまたは好ましくは、ゲノムに安定に組み入れられ得る。異種遺伝子は、内因性の等価な遺伝子、即ち、同じもしくは類似の機能を正常に実施する遺伝子と入れ代わってもよく、または挿入された配列を、内因性遺伝子もしくは他の遺伝子に追加してもよい。異種遺伝子の導入の利点は、選好に従って発現に影響を及ぼすことが可能であるために、配列の発現を好適なプロモーターの制御下に配置する能力である。コケ細胞に対して異種、または外因性もしくは外来性のヌクレオチド配列は、該タイプの細胞、株または種において天然には存在し得ない。従って、ヌクレオチド配列は、異なるタイプまたは種のコケ細胞の場合についてみると、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）細胞などの特定のタイプのコケ細胞のコーディング配列または該細胞から誘導されるコーディング配列を含むことができる。さらなる可能性は、ヌクレオチド配列がコケ細胞内に配置されることであって、該配列または相同物は該細胞内で天然に見出されるが、しかし、ここで、ヌクレオチド配列は、細胞、あるいは該タイプの細胞または種もしくは株内で天然には存在しない核酸に連結されるおよび／または近傍にあり、発現の制御のためのプロモーター配列などの１つもしくはそれ以上の調節配列に操作可能に連結される。コケまたは他の宿主細胞内の配列は、同一性を確認できる異種、外因性または外来性であり得る。
【００５４】
本発明はまた、本明細書において開示されたかまたは本明細書における情報および示唆により入手可能である本発明に従う核酸の組み合わせの所望されるポリペプチド発現産物を包含する。また、適切な宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における適切な条件下でのヌクレオチド配列からの発現によって、そのような発現産物を作製する方法も提供される。当業者であれば、ベクターを構築し、組換え遺伝子発現の産物の発現および回収のためのプロトコルならびに系を設計することが十分に可能である。
【００５５】
本発明に従うポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドの対立遺伝子、変異型、フラグメント、誘導体、変異体または相同物であってもよい。対立遺伝子、変異型、フラグメント、誘導体、変異体または相同物は、上記で言及し、本明細書において示されたようなポリペプチドの同じ機能を実質的に有してもよく、もしくはその機能的変異体であってもよい。ヒトにおける使用のための本明細書に記載の製薬タンパク質に関して、当業者であれば、そのようなタンパク質の一次配列およびそれらのグリコシル化パターンは、ヒトにおいて見出されるそれを模倣するかまたは好ましくは同一であることを理解するであろう。
【００５６】
本発明のアミノ酸配列に関連する「相同性」は、同一性または類似性、好ましくは、同一性を指すために使用することができる。上記で既に述べたように、高レベルのアミノ酸同一性は、機能的に重要なドメインまたは領域、例えば、本明細書において同定された任意のドメインに限定され得る。
【００５７】
特に、本明細書において提供される特定のコケ由来のポリペプチド配列の相同物が本発明によって提供され、そのような相同物の変異体、変異型、フラグメントおよび誘導体である。そのような相同物は、本明細書における開示内容の使用によって容易に入手することができる。もちろん、当業者であれば、遺伝子コードの縮重により目的の哺乳動物タンパク質、特に、目的のヒトタンパク質の真のコピー（即ち、１００％同一）であるアミノ酸配列を生じる相同物以外のグリコシル化タンパク質配列自体も本発明内に包含されることを理解するであろう。従って、本発明はまた、本明細書において規定され、本明細書において提供される配列情報を使用して入手可能であるようなＧａｌＴ機能を伴うアミノ酸配列を含むポリペプチドにまで及ぶ。ＧａｌＴ相同物は、アミノ酸レベルで、本明細書において記載されているような先行技術において記載されている、即ち、実施例のセクションにおいて提供されるデータベース受託番号下のアミノ酸配列との相同性、即ち、同一性を有し、好ましくは、少なくとも約５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％相同性、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約８８％相同性、あるいは少なくとも約９０％相同性、最も好ましくは、少なくとも約９５％もしくはそれ以上の相同性を有するが、但し、そのようなタンパク質は、本発明内に当てはまるＧａｌＴ活性を有する。
【００５８】
特定の実施態様では、特定の配列の対立遺伝子、変異型、誘導体、変異誘導体、変異体または相同物は、特定の配列と全体的に小さな相同性、即ち、約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％または約４５％を示し得る。しかし、機能的に重要なドメインまたは領域では、アミノ酸相同性はかなりより高くあり得る。推定的な機能的に重要なドメインまたは領域は、相同物の配列の比較を含むバイオインフォマティクスのプロセスを使用して、同定することができる。
【００５９】
異なるポリペプチドの機能的に重要なドメインまたは領域は、融合タンパク質として、コードしている核酸からの発現のために、組み合わせることができる。例えば、ＧａｌＴ機能を伴う得られる発現産物が、適切であれば、多様な親タンパク質のフラグメントを含み得るように、異なる相同物の特に有利または所望の特性を、ハイブリッドタンパク質において組み合わせることができる。
【００６０】
アミノ酸配列の類似性は、当該分野において標準的に使用されているアルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＴＢＬＡＳＴＮプログラムによって規定され決定される通りであり得る。特に、ＴＢＬＡＳＴＮ２．０は、マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）ＢＬＯＳＵＭ６２およびＧＡＰペナルティ：存在：１１、伸張：１と共に使用することができる。使用することができる別の標準的プログラムは、ベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）であり、これは、ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８、１９９４年９月（ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）５７５サイエンス・ドライブ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ）、米国ウィスコンシン州マディソン、ウィスコンシン５３７１１（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１１））の部分である。ベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）は、２つの配列間の類似性の最良のセグメントの最適なアラインメントを作成する。最適なアラインメントは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）の局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９）を使用し、ギャップを挿入して、一致数を最大にすることによって、見出される。他のアルゴリズムは、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴィンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用して、一致数を最大にし、ギャップ数を最小にする２つの完全な配列を整列するＧＡＰを含む。任意のアルゴリズムについては、一般に、デフォルトパラメータを使用し、ＧＡＰについての該パラメータは、ギャップ開始ペナルティ＝１２およびギャップ伸張ペナルティ＝４である。あるいは、３のギャップ開始ペナルティおよび０．１のギャップ伸張ペナルティを使用してもよい。アルゴリズムＦＡＳＴＡ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：２４４４−２４４８の方法を使用する）はさらなる代替物である。
【００６１】
本発明における用語「相同性」および「相同物」のいずれかの使用は、比較した配列間の任意の必然的な進化上の関係を意味するものではなく、例えば、２つのヌクレオチド配列が適切な条件下で組換えるために、十分に類似していることを単に必要とする「相同組換え」などの用語の標準的な使用に準じる。
【００６２】
本明細書において引用したすべての参考文献の教示は、本明細書の教示に組み入れられることを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
実施例
方法および材料
植物材料
レスキ（Ｒｅｓｋｉ）ら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｓｓ  Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４４，３５２−３５９によって特徴付けられたヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）  （Ｈｅｄｗ．）  Ｂ．Ｓ．Ｇ．の野生型株を使用した。該株は、英国、ハンティンドンシャー、グランスデン・ウッド（Ｇｒａｎｓｄｅｎ  Ｗｏｏｄ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のＨ．Ｌ．Ｋ．ホワイトハウス（Ｈ．Ｌ．Ｋ．Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ）によって回収され、エンゲル（Ｅｎｇｅｌ）（１９６８）Ａｍ  Ｊ  Ｂｏｔ５５，４３８−４４６によって、増殖された株１６／１４の継代培養物であった。
【００６４】
ｐＲＴ１０１ＶＥＧＦ  Ｃ３の構築
リーダー配列を伴わないヒト血管内皮増殖因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）ｃＤＮＡを、ｐＣＹＴＥＸＰ−ＶＥＧＦ１２１（ＧＢＦ、独国ブラウンシュバイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手可能）からＮｄｅＩ−ＳａｌＩフラグメントとして切り出した。このフラグメントを、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）反応により平滑末端化し、ＳｍａＩ制限部位でｐＲＴ１０１（トファー（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら（１９８７）ＮＡＲ  １５，５８９）に導入して、プラスミドｐＲＴ１０１ＶＥＧＦ  Ｃ３を形成した。この構築物では、リーダー配列を伴わないＶＥＧＦ１２１ｃＤＮＡをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に配置し、ＣａＭＶターミネーター（ゴル（Ｇｏｒｒ）（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｎｕｔｚｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ  （Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．．Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で終結させた。
【００６５】
ｐＲＴ１０１ＴＰＶＥＧＦ  Ｃ３の構築
ＶＥＧＦシグナルペプチド（分泌のためのソーティングシグナル）の配列を、ｐＲＴ１０１ＶＥＧＦ  Ｃ３にクローニングした。ＸｈｏＩ制限部位含有する５'プライマーＭｏＢ３２３  ５'−ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＧＧ−３'（配列番号１）およびＮｃｏＩ制限部位を含有する３'プライマーＭｏＢ３４９  ５'−ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴＧ    ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＡＣ−３'（配列番号  ２）を使用して、プラスミドｐＲＴ１０１Ｐ２１（ゴル（Ｇｏｒｒ）（１９９９）、上掲）からシグナルペプチドｃＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡをＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで消化し、ｐＲＴ１０１ＶＥＧＦ  Ｃ３（ＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ消化）に連結して、ｐＲＴ１０１ＴＰＶＥＧＦ  Ｃ３を得た。得られたプラスミドは、ＶＥＧＦシグナルペプチドおよびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でフレーム内にＶＥＧＦ１２１のコーディング配列を含有した。
【００６６】
標準的な培養条件
植物は、植物用無機液体改変クノップ（Ｋｎｏｐ）培地（１０００ｍｇ／ｌ  Ｃａ（ＮＯ３）２×４Ｈ２Ｏ  ２５０ｍｇ／ｌ  ＫＣｌ、２５０ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏおよび１２．５ｍｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ；ｐＨ５．８（レスキ（Ｒｅｓｋｉ）およびアベル（Ａｂｅｌ）（１９８５）Ｐｌａｎｔａ  １６５，３５４−３５８）において、滅菌条件下で、無菌的に培養した。植物を、２００ｍｌの培養培地を含有する５００ｍｌの三角フラスコ中で増殖させ、フラスコを、１２０ｒｐｍに設定したセルトマット（Ｃｅｒｔｏｍａｔ）Ｒシェーカー（Ｂ．ブラウン（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ））上で振盪させた。増殖チャンバの条件２５＋／−３℃および１６：８の明暗リズムであった。フラスコは、３５ｍｉｃｒｏｍｏｌｓ−１ｍ−２を提供する２本の蛍光管（オスラム（Ｏｓｒａｍ）Ｌ  ５８Ｗ／２５）で上方から光照射した。培養物を、ウルトラ−ツラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）ホモジナイザー（ＩＫＡ、独国スタウフェン（Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用する破壊および１００  ｍｌの新鮮クノップ（Ｋｎｏｐ）培地を含有する２つの新たな５００ｍｌの三角フラスコへの播種により、１週間に１回継代培養した。
【００６７】
プロトプラストの単離
ろ過後、コケ糸状体を０．５Ｍマンニトール中でプレインキュベートした。３０分後、４％ドリセラーゼ（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、独国ディゼンフォフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を懸濁液に添加した。０．５Ｍマンニトール（ｐＨ５．６〜５．８）中にドリセラーゼ（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）を溶解し、３６００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、０．２２ミクロンフィルター（ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＰ、ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国（ＵＳＡ））への通過によって滅菌した。１％ドリセラーゼ（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）（最終濃度）を含有する懸濁液を、暗所、ＲＴでインキュベートし、緩徐に撹拌した（２時間のインキュベーション後、最良の収率のプロトプラストが達成される）（スケファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｓｓ  Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ」（２００１年５月）インスティテュート・オブ・エコロジー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）、ラボラトリー・オブ・プラント・セル・ジェネティクス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ユニバーシティー・オブ・ローザンヌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌａｕｓａｎｎｅ）Ｄｉｄｉｅｒ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ＠ｉｅ−ｐｃ．ｕｎｉｌ．ｃｈ）。懸濁液を、１００ミクロンおよび５０ミクロンのポアサイズの篩（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、ＣＬＦ、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ））に通過させた。懸濁液を滅菌遠心管中で遠心分離し、プロトプラストを、ＲＴ、１０分間、５５ｇで沈殿させた（３の加速；３で減速；マルチヒュージ（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ）３Ｓ−Ｒ、独国ケンドロ（Ｋｅｎｄｒｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ））（スケファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）、上掲）。プロトプラストをＷ５培地（１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ；５．５ｍＭグルコース；１０ｍＭ  ＫＣｌ；ｐＨ５．６；６６０〜６８０ｍＯｓｍ；滅菌ろ過）に緩徐に再懸濁した。懸濁液を、再度、ＲＴ、１０分間、５５ｇで遠心分離した（３の加速；３で減速；マルチヒュージ（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ）３Ｓ−Ｒ、独国ケンドロ（Ｋｅｎｄｒｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。プロトプラストをＷ５培地に緩徐に再懸濁した（ロザラ（Ｒｏｔｈｅｒ）ら（１９９４）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４３，７２−７７）。プロトプラストを計数し、小容積の懸濁液をフックスローゼンタール（Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）チャンバに移した。
【００６８】
形質転換プロトコル
形質転換のために、プロトプラストを、氷上、暗所で３０分間、インキュベートした。続いて、ＲＴ、１０分間、５５ｇの遠心分離によって、プロトプラストを沈殿させた（３の加速；３で減速；マルチヒュージ（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ）３Ｓ−Ｒ、ケンドロ（Ｋｅｎｄｒｏ））。プロトプラストを、３Ｍ培地（１５ｍＭ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ；０．１％ＭＥＳ；０．４８Ｍマンニトール；ｐＨ５．６；５４０ｍＯｓｍ；滅菌ろ過、スケファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）ら（１９９１）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２２６，４１８−４２４）に、１．２×１０６プロトプラスト／ｍｌの濃度で再懸濁した（ロイター（Ｒｅｕｔｔｅｒ）およびレスキ（Ｒｅｓｋｉ）（１９９６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｍｏｓｓ  ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２，１４２〜１４７頁）。このプロトプラスト懸濁液の２５０マイクロリットルを新しい滅菌遠心管に分配し、５０マイクロリットルのＤＮＡ溶液（Ｈ２Ｏ中カラム精製ＤＮＡ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、独国ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；１０〜１００マイクロリットル；６０マイクログラムの至適ＤＮＡ量）を添加し、最後に、２５０マイクロリットルのＰＥＧ−溶液（４０％ＰＥＧ４０００；０．４Ｍマンニトール；０．１ＭＣａ（ＮＯ３）２；オートクレイブ後ｐＨ６）を添加した。懸濁液を直ちに、しかし緩徐に混合し、次いで、６分間ＲＴで、時々緩徐にかき混ぜながらインキュベートした。１、２、３および４ｍｌの３Ｍ培地を添加することによって、懸濁液を漸次希釈した。懸濁液を、２０℃、１０分間、５５ｇで遠心分離した（３の加速；３で減速；マルチヒュージ（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ）３Ｓ−Ｒ、ケンドロ（Ｋｅｎｄｒｏ））。
【００６９】
ペレットを以下のために再懸濁した。
ａ）３００マイクロリットルまたは４００マイクロリットル３Ｍ培地における一過性形質転換実験のため。形質転換されたプロトプラストの培養を９６ウェルプレート（３００マイクロリットル、ヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）、ヌンク（Ｎｕｎｃ）ＧｍｂＨ、独国ビースバーデン（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））または４８ウェルプレート（４００マイクロリットル、セルスター（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）、ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、独国フリッケンハオゼン（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で実施した；
ｂ）３ｍｌの再生培地（改変クノップ（Ｋｎｏｐ）培地；５％グルコース；３％マンニトール；５４０ｍＯｓｍ；ｐＨ５．６〜５．８）における安定形質転換のため。再生および選択は、ストレップ（Ｓｔｒｅｐｐ）ら（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，４３６８−４３７３により記載の通りに実施した。選択のために、クノップ（Ｋｎｏｐ）培地を、５０マイクログラム／ｍｌのＧ４１８または３０マイクログラム／ｍｌのハイグロマイシンＢで補充した。
【００７０】
プロトプラストへのそれぞれのノックアウトおよび／または組み込み構築物の１０マイクログラムの線状化されたＤＮＡと共に、選択マーカーとしてｎｐｔＩＩ遺伝子を含有する１０マイクログラムの未消化ｐＲＴ９９（トファー（Ｔｏｅｐｆｅｒ）らＶｅｒｓａｔｉｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．ＮＡＲ１６，８７２５）とを移すことによって、共形質転換を実施した。
【００７１】
コケグリカンのＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ  ＭＳ
植物材料を液体培養中で培養し、ろ過によって単離し、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。タンパク質のバンドを、クマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切り出した。材料をドライアイス下で搬送した。Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｆ．アルトマン（Ｆ．Ａｌｔｍａｎｎ）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  ｆｕｅｒ  Ｂｏｄｅｎｋｕｌｔｕｒ、オーストリア、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）の研究所において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を行った。
【００７２】
０．２〜９ｇの新鮮重量のヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）をペプシンで消化した。ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）による記載の通り、消化物からＮ−グリカンを入手した。本質的に、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＡでの処置により、グリカンを遊離させ、ＤＹＮＡＭＯ（テルモ・バイオアナライシス（Ｔｈｅｒｍｏ  ＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ）、ニューメキシコ州サンタフェ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ，ＮＭ））上でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって解析した。
【００７３】
オリゴヌクレオチドの合成
合成オリゴヌクレオチドの設計のために、ヌクレオチドに対する標準的なコードを使用した。変性プライマーの設計のために、標準的なコードを使用した：
Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｙ＝Ｔ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ；Ｓ＝Ｃ、Ｇ；Ｍ＝Ａ、Ｃ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ；Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｂ＝Ｇ、Ｃ、Ｔ；Ｖ＝Ｇ、Ａ、Ｃ；Ｄ＝Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ
【実施例】
【００７４】
１．ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）由来の１，２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉのクローニングおよびノックアウト植物の解析
１．１  ＧＮＴＩのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニング
ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）ＷＴ由来のｃＤＮＡに対して変性プライマーによる２ラウンドのＰＣＲを実施することによって、ＧＮＴＩに対するｃＤＮＡのフラグメントを得た。これらのプライマーは、植物由来の既知のＧＮＴＩのタンパク質アラインメントに基づいて作製した。第１ラウンドでは、プライマーＧＮＴ（ｄ）１（５'−ＧＴＮＧＣＮＧＣＮＧＴＮＧＴＮＧＴＮＡＴＧＧＣ−３'、配列番号３）およびＧＴＮ（ｄ）３（５'−ＣＣＹＴＴＲＴＡＮＧＣＮＧＣＮＣ（ＴＧ）ＮＧＧＮＡＣＮＣＣ−３'、配列番号４）を使用し、次いで、このＰＣＲからの産物を、プライマーＧＴＮ（ｄ）２（５'−ＴＡＹＡＡＲＡＴＮ（ＣＡ）ＧＮ−ＣＡＹＴＡＹＡＡＲＴＧＧ−３'、配列番号５）およびＧＴＮ（ｄ）４（５'−ＡＲＲＴＡＹＴＧＹＴＴＲＡＡＲＡＡ−ＹＴＧＮＣＣ−３'、配列番号６）による以後のＰＣＲに供した。ＰＣＲは、５００ｂｐの産物を生じ、これをｐＣＲ４ＴＯＰＯにクローニングして、両末端から配列決定した。
【００７５】
５'末端を欠くｃＤＮＡを得るために、プライマー：５ＲＡＣＥＧ３（５'−ＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧ−３'、配列番号７）、５ＲＡＣＥＧ４（５'−ＧＴＣＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＣ−３'、配列番号８）、５ＲＡＣＥＧ５（５'−ＣＴＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＧＧ−３'、配列番号９）による５'ＲＡＣＥを実施し、さらなる３００ｂｐフラグメントのｃＤＮＡを付与したが、しかしなお、開始Ｍｅｔは伴わなかった。従って、新たな配列に基づいて、プライマー：５ＲＡＣＥ６（５'−ＣＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧ−３'、配列番号１０）、５ＲＡＣＥ７（５'−ＡＧＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＡＣＧ−３'、配列番号１１）、および５ＲＡＣＥ８（５'−ＡＡＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＴＧＣＡＡＧＣＣ−３'、配列番号１２）による別のラウンドの５'ＲＡＣＥを実施し、開始コドンを含有するさらなる４００ｂｐフラグメントを付与した。
【００７６】
３'末端を欠くｃＤＮＡを得るために、対応して、プライマー：３ＲＡＣＥＧ１（５'−ＴＴＡＴＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣ−３'、配列番号１３）、３ＲＡＣＥＧ２（５'−ＧＡＣＣＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣ−３'、配列番号１４）による３'ＲＡＣＥを実施し、終止コドンを伴う約４５０ｂｐのフラグメントを生じ、最終的に、ＧＮＴＩに対する完全１４１６ｂｐのｃＤＮＡが生じた（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）：ＡＪ４２９１４３）。
【００７７】
特異的プライマー：ＧＮＴ５Ｆ（５'−ＴＧＧＧＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＴ−３'、配列番号１５）およびＧＴＮ６Ｒ（５'−ＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧ−３'、配列番号１６）、ＧＮＴ２１Ｆ（５'−ＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＴＣＧＡＴＴＧ−３'、配列番号１７）および５ＲＡＣＥＧ５（５'−ＣＴＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＧＧ−３'、配列番号９）、３ＲＡＣＥＧ１（５'−ＴＴＡＴＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣ−３'、配列番号１３）およびＧＮＴ１５Ｒ（５'−ＡＧＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＡＴＣＴＡＡＣＴＧＣ−３'、配列番号１８）でのＷＴヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲにより、３つの断片でＧＮＴＩ遺伝子をクローニングすることによって、対応する５７８８ｂｐのゲノム配列を得、プライマーウォーキングによって配列決定した。
【００７８】
１．２  ＧＮＴＩに対するノックアウト構築物を作製する
ノックアウト構築物を作製するために、構築物の５'末端に対するプライマー：ＧＮＴＨＴ７（５'−ＧＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＧＧ−３'、配列番号１９）およびＧＮＴＥＴ７（５'−ＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴ−３'、配列番号２０）ならびに対応する３'末端に対するプライマーＧＮＴＨＴ３（５'−ＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＴＧＧＣ−３'、配列番号２１）およびＧＮＴＰＴ３（５'−ＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＡＡＣＧ−３'、配列番号２２）によるゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって、２つのフラグメントを合成した。このようにして得られたゲノムＤＮＡの４６９ｂｐおよび８３５ｂｐのフラグメントを、まず、ＴＯＰＯ−ｐＣＲプラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。次いで、それぞれＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって、このベクターからフラグメントを切り出し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＣＲＩＩベクターにクローニングした。得られたプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ制限酵素での消化によってベクターｐＲＴ１０１ｎｅｏ（ギルケ（Ｇｉｒｋｅ）ら、１９９８）から得たｎｐｔＩＩ選択カセットを導入した。
【００７９】
形質転換のために、ノックアウトプラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｕＩ制限酵素で消化し、３０マイクログラムを形質転換に使用した。
【００８０】
１．３  トランスジェニック植物のプレスクリーニング
耐性植物のプレスクリーニングのために、茎葉体の小片（１〜５ｍｇ）を３０分間、４５℃、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有する７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中で処理し、３マイクロリットルのこの抽出物を、以下の４対のプライマーによるＰＣＲに使用した：本来のｇｎｔＩ遺伝子の破壊を検出するためのＧＮＴ７Ｆ（５'−ＧＴＴＣＳＡＴＧＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ−３'、配列番号２３）およびＧＮＴ８Ｒ（５'−ＧＣＧＡＣＣＴＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＣ−３'、配列番号２４）、ｎｐｔＩＩカセットの存在を検出するためのＮ１（５'−ＴＡＣＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧ−３'、配列番号２５）およびＮ２（５'−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧ−３'、配列番号２６）、５'末端での導入遺伝子の組み込みを制御するためのＧＮＴ５Ｆ（５'−ＴＧＧＧＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＴ−３'、配列番号２７）およびＮ３（５'−ＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴ−３'、配列番号２８）、ならびに３'末端での組み込みを制御するためのＮ４（５'−ＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣ−３'、配列番号２９）およびＧＮＴ１０Ｒ（５'−ＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＡＧＡＣ−３'、配列番号３０）。すべての４つのＰＣＲ反応において予想されるフラグメントを付与する植物は推定ノックアウトとみなし、さらなる解析のために選択した。
【００８１】
最終的に、９つのトランスジェニック植物を、さらなる分子および生化学的解析のために選択した。
【００８２】
１．４  ノーザン解析
ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ））により、コケ組織から全ＲＮＡを単離した。ノーザン解析のために、５マイクログラムの全ＲＮＡを、１２０Ｖでホルムアルデヒド−アガロース上での電気泳動に供し、ハイボンドＮ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）ナイロンメンブレン（アメルシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に移し、ノックアウトに使用される相同領域の部分およびノックアウト構築物上には存在しないｃＤＮＡの部分を含む３'ｇｎｔＩｃＤＮＡに対応する３２Ｐ標識ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。メンブレンを、異なる濃度のＳＳＣで４回洗浄（最終洗浄工程は、６５℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである）し、Ｘ線フィルム（コダック・バイオ−マックス（Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏ−Ｍａｘ）ＭＳ）に−８０℃で２〜３日間、暴露した。
【００８３】
プローブ［プライマー：３ＲＡＣＥＧ１（５'−ＴＴＡＴＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣ−３'、配列番号１３）およびＧＮＴ１５Ｒ（５'−ＡＧＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＡＴＣＴＡＡＣＴＧＣ−３'、配列番号１８）でのｃＤＮＡに対するＰＣＲによって得た］によるノーザン解析により、野生型のみに正しいＧＮＴＩ転写物が検出された。ノックアウト植物では正しい転写物を欠くことにより、ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）におけるｇｎｔＩ遺伝子の破壊が補強される。
【００８４】
制御遺伝子Ｌ２１の発現は、形質転換体において影響を受けなかった。
【００８５】
１．５．トランスジェニック植物のサザン解析
サザンブロット解析のために、５マイクログラムのゲノムＤＮＡを使用した。ｎｐｔＩＩカセットの組み込み部位の数を検出するために、ｎｐｔＩＩカセットを２つのフラグメントに切断するＰｖｕＩＩでゲノムＤＮＡを消化し、プローブとしてのｎｐｔＩＩカセットにハイブリダイズさせた。この解析は、いくつかの植物が極めて多数の組み組まれた選択カセットを有する一方、植物番号６は単一の組み込み事象を有することを示した。植物番号４および８はまた、少数の組み込み：植物あたり４〜５を有する。
【００８６】
第２のサザン解析では、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ノックアウト構築物を作製するのに使用された領域外の遺伝子の３'末端上に位置するｇｎｔＩプローブとハイブリダイズさせた。この場合、トランスジェニック植物は、ｎｐｔＩＩカセットのサイズ（１５００ｂｐ）についてＷＴより大きいバンドを有することが予想された。ＷＴは、４５００ｂｐで単一のシグナルを有する一方、トランスジェニック植物は、６０００ｂｐ以上のバンドを有するが、ＷＴバンドを含有せず、ＷＴ座位の破壊が確認される。
【００８７】
１．６  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）ＷＴのＮ−グリカンは、例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１，２６１−２７４）において記載のような植物Ｎ−グリカン、即ち、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ１，２−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａエピトープ（ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，４−フコシルおよびβ１，３−ガラクトシル残基）の典型的な構造的特徴を示す（表１）。３つのＧＮＴｉノックアウト植物について解析した。ＧＮＴＩノックアウト植物のＮ−グリカンは、ＷＴと比較して同じ構造を示し（表１）、ノックアウトは分子レベルでのみ成功し、生化学的レベルでは成功しなかったことが確認された。従って、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）にはもう１つのＧＮＴＩが存在すると想定される。
【００８８】
２．ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）由来のα１，３−フコース転移酵素のクローニングおよびノックアウト植物の解析
２．１．α１，３−フコース転移酵素（α１，３−ＦＴ）のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニング
ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）ＷＴ由来のｃＤＮＡに対して変性プライマーによる２ラウンドのＰＣＲを実施することによって、α１，３−ＦＴに対するｃＤＮＡの部分を得た。これらのプライマーは、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の既知のα１，３−ＦＴのタンパク質アラインメントに基づいて作製した。第１ラウンドでは、プライマーＦＤ４Ｆ（５'−ＴＧＧＧＣＮＧＡＲＴＡＹＧＡＹＡＴＧＡＴＧ−３'、配列番号３１）およびＦＤＲ１（５'−ＴＧＮＧＴＮＡ−ＲＮＣＣＮＡＤＮＧＧＲＴＡＤＡＴ−３'、配列番号３２）を使用し、次いで、このＰＣＲからの産物を、プライマーＦＤ４ＦおよびＦＤ５Ｒ（５'−ＴＧＮＡＣＮＧＣＮＧＣＣＡＴＲＴＣ−３'、配列番号３３）による以後のＰＣＲに供した。第２のＰＣＲにより、５１０ｂｐの産物を生じ、これをｐＣＲ４ＴＯＰＯにクローニングして、両末端から配列決定した。
【００８９】
５'末端を欠くｃＤＮＡを得るために、プライマー：５ＦＴ４（５'−ＧＴＡＡＣＡＴＴＣＧＣＡＴＡＡＴＧＧ−３'、配列番号３４）、５ＦＴ５（５'−ＣＧＡＴＣＡＴＴＡＴＧＣＧＣＡＣＣＡＣ−３'、配列番号３５）、および５ＦＴ６（５'−ＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣ−３'、配列番号３６）による５'ＲＡＣＥを実施し、さらなる２００ｂｐのｃＤＮＡを付与したが、しかしなお、開始Ｍｅｔは伴わなかった。従って、新たな配列に基づいて、プライマー：５ＦＴ７（５'−ＡＧＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＡＧＣＣ−３'、配列番号３７）、５ＦＴ８（５'−ＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＣＡＣＣ−３'、配列番号３８）、および５ＦＴ９（５'−ＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＴＧＧＣ−３'、配列番号３９）による第２のラウンドの５'ＲＡＣＥを実施し、さらなる１５０ｂｐのフラグメントを付与したが、しかしなお、開始コドンは伴わなかった。最後に、プライマー：５ＦＴ９、５ＦＴ１０（５'−ＣＧＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧ−３'、配列番号４０）、および５ＦＴ１１（５'−ＣＴＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣ−３'、配列番号４１）による第３のラウンドを実施し、開始コドンを含有するさらなる４００ｂｐの配列を付与した。
【００９０】
３'末端を欠くｃＤＮＡを得るために、対応して、プライマー：３ＦＴ１（５'−ＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣ−３'、配列番号４２）および３ＦＴ２（５'−ＴＣＧＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＴＡＧＡＣ−３'、配列番号４３）による３'ＲＡＣＥを実施し、終止コドンを伴う約５５０ｂｐのフラグメントを生じ、最終的に、α１，３−ＦＴに対する完全１７１１ｂｐのｃＤＮＡが生じた（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）：ＡＪ４２９１４５）。
【００９１】
特異的プライマー：ＦＴＡ９Ｆ（５'−ＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣ−３'、配列番号４４）およびＦＴＡ１０Ｒ（５'−ＴＧＴＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＣＧ−３'、配列番号４５）、ＦＴ１８Ｆ（５'−ＴＡＧＧＧＡＧＴＡＡＡＴＡＴＧ−ＡＡＧＧＧ−３'、配列番号４６）および５ＦＴ５（５'−ＣＧＡＴＣＡＴＴＡＴＧＣＧＣＡＣＣＡＣ−３'、配列番号３５）、３ＦＴ１（５'−ＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣ−３'、配列番号４２）およびＦＴＡ１２Ｒ（５'−ＴＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧ−３'、配列番号４７）でのＷＴヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲにより、３つの断片でα１，３−ＦＴ遺伝子をクローニングすることによって、対応する３０８３ｂｐのゲノム配列を得、プライマーウォーキングによって配列決定した。
【００９２】
２．２．α１，３−ＦＴに対するノックアウト構築物を作製する
ノックアウト構築物を作製するために、プライマー：ＦＴ１５Ｆ（５'−ＡＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＴＧＣＧ−３'、配列番号４８）およびＦＴ１６Ｒ（５'−ＴＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧ−３'、配列番号４９）によって、ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを実施した。このようにして得られた２１５６ｂｐのフラグメントをｐＣＲ４ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））ベクターにクローニングした。プライマー：ＮｄｅＩ制限部位を作製するためのｎｐｔＩＩ／ＮｄｅＩ−Ｆ（５'−ＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＡＣ−３'、配列番号５０）およびＢｓｔＺ１７Ｉ部位を作製するためのｎｐｔＩＩ／ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｒ（５'−ＧＣＡＴＧＴＡＴＡＣＧＣＡＴ−ＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧ−３'、配列番号５１）によるｐＲＴ１０１ｎｅｏベクター（ギルケ（Ｇｉｒｋｅ）ら、１９９８）に対するプルーフリーディングポリメラーゼでのＰＣＲにより、ＮｐｔＩＩカセットを合成した。また、ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。両方のプラスミドをＮｄｅＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で消化した。この制限化によって、第４のイントロンの部分および第５のエキソンの部分を含有する１９５ｂｐフラグメントを、α１，３−ＦＴゲノムフラグメントから切り出し、ｎｐｔＩＩカセットによって置き換えた。
【００９３】
ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）の形質転換を得るために、ノックアウト構築物を、ＮｏｔＩおよびＭｓｓＩ制限酵素で消化し、２５マイクログラムを形質転換に使用した。
【００９４】
２．３．トランスジェニック植物のプレスクリーニング
耐性植物のプレスクリーニングのために、茎葉体の小片（１〜５ｍｇ）を３０分間、４５℃、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有する７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中で処理し、３マイクロリットルのこの抽出物を、以下の４対のプライマーによるＰＣＲに使用した：本来のｆｔ遺伝子の破壊を検出するためのＦＴ１４Ｆ（５'−ＡＣＡＡＡＧＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＧＣＧ−３'、配列番号５２）およびＦＴＡ１２Ｒ（５'−ＴＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧ−３'、配列番号４７）、ｎｐｔＩＩカセットの存在を検出するためのＮ１（５'−ＴＡＣＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧ−３'、配列番号２５）およびＮ２（５'−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧ−３'、配列番号２６）、５'末端での導入遺伝子の組み込みを制御するためのＦＴ１４Ｆ（５'−ＡＣＡＡＡＧＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＧＣＧ−３'、配列番号５２）およびＮ３（５'−ＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴ−３'、配列番号２８）、３'末端での組み込みを制御するためのＦＴＡ１２Ｒ（５'−ＴＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡ−ＧＡＣＡＡＧＧ−３'、配列番号４７）およびＮ４（５'−ＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣ−３'、配列番号２９）。すべての４つのＰＣＲ反応において予想されるフラグメントを付与する植物は推定ノックアウトとみなし、さらなる解析のために選択した。
【００９５】
最終的に、９つの植物を、さらなる分子および生化学的解析のために選択した。
【００９６】
２．４．ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ））により、コケ組織から全ＲＮＡを単離した。標準的なプロトコルに従って、逆転写ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲプライマーでは、α１，３−ＦＴのｃＤＮＡの中央領域に位置するＦＴＡ９Ｆ（５'−ＡＴＧＣＴＣＣＣ−ＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣ−３'、配列番号４４）およびＦＴＡ１０Ｒ（５'−ＴＧＴＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡ−ＡＡＣＧ−３'、配列番号４５）を使用した。これらのプライマーを使用して、４７５ｂｐ転写物はＷＴのみに検出されたが、すべてのトランスジェニック植物は、いずれのＰＣＲも生じなかった。組み込まれたｎｐｔＩＩカセットの両方の部位に位置するプライマーでは検出可能な転写物が認められないことから、解析したすべての植物はノックアウトであることが確認される。
【００９７】
コントロールとして、ＡＰＳ還元酵素に対するプライマー（コプリボバ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３２１９５−３２２０１）：Ｒ１０（５'−ＴＣＴＴＴＣＡＣＴＡＴＴＣＧＧＴＧＡＣＧ−３'、配列番号５３）およびＲ１１（５'−ＣＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣ−３'、配列番号５４）によりＲＴ−ＰＣＲを実施し、すべての植物から９００ｂｐのフラグメントを増幅した。
【００９８】
２．５  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）ＷＴのＮ−グリカンは、例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）、上掲において記載のような植物Ｎ−グリカン、即ち、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ１，２−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａエピトープ（ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，４−フコシルおよびβ１，３−ガラクトシル残基）の典型的な構造的特徴を示す（表１）。３つのα  １，３ＦＴノックアウト植物について解析した。α１，３ＦＴノックアウト植物のＮ−グリカン上では、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，３フコース残基を検出することができなかったことから、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のα１，３フコース転移酵素のノックアウトは完全に成功したことが確認された。
【００９９】
２Ａ．ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）由来のα１，３−フコース転移酵素フランキング領域のクローニングおよびノックアウト構築物の構築
２Ａ．１．α１，３−フコース転移酵素（α１，３−ＦＴ）遺伝子に対応するフランキングＤＮＡのクローニング
ＳａｃＩＩ制限部位を含有するプライマーＭｏＢ５５８（５'−ＧＴＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＡ−ＧＴＧＴＡＴＴ−３'、配列番号８４）およびＳｎａＢＩおよびＳａｃＩ部位を含有するプライマーＭｏＢ５５７（５'−ＴＴＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡ−３'、配列番号８５）を使用して、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のα１，３−フコース転移酵素遺伝子に対応する３'−フランキングＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物（５'−ＧＴＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣ−ＡＴＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＣＧＣＧＡＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＣＧＡＴＧＡＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＧＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＡＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡＣＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡ−３'、配列番号８６）を、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩで消化し、プラスミドｐＢＳ（ＳａｃＩ／ＳａｃＩＩ消化）にクローニングした。
【０１００】
ＨｉｎｃＩＩ制限部位を含有するプライマーＭｏＢ５５５（５'−ＣＧＣＧＴＴＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＣ−ＴＣＴＧＴＧＴＴＧＣＧ−３'、配列番号８７）およびＥｃｏＲＩ部位を含有するプライマーＭｏＢ５５６（５'−ＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＣＣＴ−３'、配列番号８８）を使用して、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のα１，３−フコース転移酵素遺伝子に対応する５'−フランキングＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物（５'−ＣＧＣＧＴＴＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＣＧＴＴＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＴＧＴＡＴＴＧＣＧＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＧＴＧＣＡＴＧＴＡＧＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＴＡＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＧＧＴＴＴＣＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＧＡＴＡＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＴＣＣＧＧＴＡＴＴＣＧＴＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＴＣＧＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＴＴＧＴＧＴＴＧＣＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＡＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＧＡＡＴＧＡＣＧＳＡＣＡＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＧＴＴＡＡＴＴＧＧＴＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＡＡＴＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＡＣＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＡＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＣＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＡＡＴＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＣＣＡＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＧ−３'、配列番号８９）を、ＨｉｎｃＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のα１，３−フコース転移酵素遺伝子に対応する３'−フランキングＤＮＡを含有するプラスミドｐＢＳ（ＨｉｎｃＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化）にクローニングした。
【０１０１】
２Ａ．２．α１，３−ＦＴ遺伝子の置換のためのノックアウト構築物を作製する
ノックアウト構築物を作製するために、３５Ｓプロモーター、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のＦｔｓＺ１クロロプラストトランジットペプチドをコードする２９７ｂｐのｆｔｓＺ１  ｃＤＮＡフラグメント、ＧＦＰのコーディング配列およびｎｏｓターミネーターを含有する発現カセット（キースリング（Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ）ら（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５１，９４５−９５０）を使用した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによるｐＦｔｓＺ１（１−９３）−ＧＦＰの消化ならびにＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＺＥＲＯへのクローニングによって、発現カセットをｐＺＥＲＯにサブクローニングし、プラスミドｐＺＥＲＯｆｔｓｚＧＦＰを生じた。ＨｉｎｄＩＩＩによる消化、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントによる平滑化、続いてＥｃｏＲＩによる消化によってｐＺＥＲＯｆｔｓｚＧＦＰから発現カセットを切り出した。ノックアウト構築物を作製するために、消化した発現カセットを２Ａ．１に記載のベクターにクローニングし、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
【０１０２】
最終プラスミドをＫｐｎＩ／ＳｎａＢＩで消化し、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のα１，３−フコース転移酵素遺伝子に対応する３'−フランキングＤＮＡ、３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターの制御下にあるＴＰｆｔｓＺＧＦＰ融合遺伝子ならびにヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のα１，３−フコース転移酵素遺伝子に対応する５'−フランキングＤＮＡを含有する線状化ＤＮＡを生じた。この線状化プラスミドは、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のα１，３−フコース転移酵素遺伝子のノックアウトに使用した。
【０１０３】
２Ａ．３．α１，３フコース転移酵素およびβ１，２キシロース転移酵素ノックアウトを伴う植物を作製する
α１，３−フコシルおよびβ１，２−キシロシル残基を伴わない植物を作製するために、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）糸状体由来のプロトプラストを、第２Ａおよび３章に記載の構築物で形質転換した。続けて、形質転換を実施することが可能であり、ならびに両構築物による共形質転換も可能である。この場合、α１，３−フコース転移酵素遺伝子のノックアウトは、遺伝子破壊だけではなく、遺伝子置換によっても実施した。以後の形質転換手順におけるさらなる選択マーカーとして、ハイグロマイシン耐性を担う遺伝子を含有するプラスミド（ｐＣａｍｂｉａ１３０５）を、共形質転換に使用した。
【０１０４】
２Ａ．４  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）ＷＴのＮ−グリカンは、例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）、上掲において記載のような植物Ｎ−グリカン、即ち、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ１，２−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａエピトープ（ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，４−フコシルおよびβ１，３−ガラクトシル残基）の典型的な構造的特徴を示す（表１）。１つのトランスジェニック植物を解析した。これらの植物のＮ−グリカン上では、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，３フコース残基も、またβ１，２−キシロシル残基も検出することができなかった。
【０１０５】
３．ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）由来のβ１，２−キシロース転移酵素のクローニングおよびノックアウト植物の解析
３．１．β１，２−キシロース−転移酵素（β１，２ＸＴ）のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニング
ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）ＷＴ由来のｃＤＮＡに対して変性プライマーによる２ラウンドのＰＣＲを実施することによって、β１，２−ＸＴに対するｃＤＮＡの部分を得た。これらのプライマーは、植物由来の既知のβ１，２−ＸＴのタンパク質アラインメントに基づいて作製した。第１ラウンドでは、プライマーＸＤＦ１（５'−ＴＧＹＧＡＲＧＳＮＴＡＹＴＴＹＧＧＮＡＡＹＧＧ−３'、配列番号５５）およびＸＤＲ１（５'−ＧＣＮＣＫＮＡＹＣＡＴＹＴＣＮＣＣＲＡＡＹＴＣ−３'、配列番号５６）を使用し、次いで、このＰＣＲからの産物を、プライマーＸＤＦ２（５'−ＧＧＮＧＧＮＧＡＲＡＡＲＹＴＮＧＡＲＲＡＮＧＴ−３'、配列番号５７）およびＸＤＲ１による以後のＰＣＲに供した。第２のＰＣＲにより、６１０ｂｐの産物を生じ、これをｐＣＲ４ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングして、両末端から配列決定した。
【０１０６】
５'末端を欠くｃＤＮＡを得るために、プライマー：５ＸＴ１（５'−ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣ−３'、配列番号５８）、５ＸＴ２（５'−ＡＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＴＧＧ−３'、配列番号５９）および５ＸＴ３（５'−ＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＧＴＣＣＣ−３'、配列番号８３）による５'ＲＡＣＥを実施し、さらなる３６０ｂｐのｃＤＮＡを付与したが、しかしなお、開始Ｍｅｔは伴わなかった。従って、新たな配列に基づいて、プライマー：５ＸＴ４（５'−ＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＡＣ−３'、配列番号６０）、５ＸＴ５（５'−ＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＣＣ−３'、配列番号６１）および５ＸＴ６（５'−ＡＡＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＧＣＣ−３'、配列番号６２）による第２のラウンドの５'ＲＡＣＥを実施し、開始コドンを含有するさらなる３９０ｂｐのフラグメントを付与した。
【０１０７】
３'末端を欠くｃＤＮＡを得るために、対応して、プライマー：３ＸＴ１（５'−ＧＣＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡＣＧＧＧＴＴＧ−３'、配列番号６３）および３ＸＴ２（５'−ＧＧＡＣＡＴＴＣＣＡＡＡＴＡＡＴＣＣＣ−３'、配列番号６４）による３'ＲＡＣＥを実施し、終止コドンを伴う約９４０ｂｐのフラグメントを生じ、最終的に、β１，２−ＸＴに対する完全２３００ｂｐのｃＤＮＡが生じた（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）：コーディング領域に対応する１７８８ｂｐ：ＡＪ４２９１４４）。特異的プライマー：ＸＴ１４Ｆ（５'−ＴＴＡＣＧＡＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＧＣ−３'、配列番号８２）およびＸＴ１５Ｒ（５'−ＧＴＣＣＴＧＴＴＡＡ−ＡＴＧＣＣＴＴＧＣ−３'、配列番号６５）、ＸＴ−Ｍ１Ｆ（５'−ＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＣ−３'、配列番号６６）ならびに５ＸＴ２、３ＸＴ１およびＸＴ１１Ｒ（５'−ＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＣＣ−３'、配列番号６７）でのＷＴヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲにより、３つの断片でβ１，２−ＸＴ遺伝子をクローニングすることによって、２３８８ｂｐのゲノム配列を得、プライマーウォーキングによって配列決定した。
【０１０８】
３．２．β  １，２−ＸＴに対するノックアウト構築物を作製する
ノックアウト構築物を作製するために、プライマー：ＸＴ１２Ｆ（５'−ＴＧＴＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣ−３'、配列番号６８）およびＸＴ１１Ｒ（５'−ＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＣＣ−３'、配列番号６７）によって、ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを実施した。このようにして得られた２０６６ｂｐのフラグメントをｐＣＲ４ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。プライマー：ＳａｌＩ制限部位を作製するためのｎｐｔＩＩ／ＳａｌＩ−Ｆ（５'−ＡＴＧＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧ−３'．配列番号６９）およびＮｄｅＩ部位を作製するためのｎｐｔＩＩ／ＮｄｅＩ−Ｒ（５'−ＧＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＴ−ＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＧＧ−３'、配列番号７０）でのプルーフリーディングポリメラーゼによるｐＲＴ１０１ｎｅｏプラスミド（ギルケ（Ｇｉｒｋｅ）ら、１９９８）に対するＰＣＲにより、ｎｐｔＩＩカセットを合成した。また、ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。両方のプラスミドをＮｄｅＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化した。ゲノムＤＮＡを伴うプラスミドから、第２のエキソンの部分および第２のイントロンの部分を含有する３８０ｂｐのフラグメントを切り出し、ｎｐｔＩＩカセットによって置き換え、導入した。
【０１０９】
ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）の形質転換を得るために、ノックアウト構築物を、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で消化し、２５マイクログラムを形質転換に使用した。
【０１１０】
３．３．トランスジェニック植物のプレスクリーニング
耐性植物のプレスクリーニングのために、茎葉体の小片（１〜５ｍｇ）を３０分間、４５℃、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有する７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中で処理し、３マイクロリットルのこの抽出物を、以下の４対のプライマーによるＰＣＲに使用した：本来のｘｔ遺伝子の破壊を検出するためのＸＴ−Ｍ１Ｆ（５'−ＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＣ−３'、配列番号６６）およびＸＴ１３Ｒ（５'−ＡＣＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣ−３'、配列番号７１）、ｎｐｔＩＩカセットの存在を検出するためのＮ１（５'−ＴＡＣＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧ−３'、配列番号２５）およびＮ２（５'−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧ−３'、配列番号２６）、５'末端での導入遺伝子の組み込みを制御するためのＸＴ−Ｍ１Ｆ（５'−ＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＣ−３'、配列番号６６）およびＮ３（５'−ＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴ−３'、配列番号２８）、３'末端での組み込みを制御するためのＸＴ１３Ｒ（５'−ＡＣＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣ−３'、配列番号７１）およびＮ４（５'−ＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡ−ＴＡＡＧＡＡＡＣ−３'、配列番号２９）。すべての４つのＰＣＲ反応において予想されるフラグメントを付与する植物は推定ノックアウトとみなし、さらなる解析のために選択した。
【０１１１】
最終的に、９つの植物を、さらなる分子および生化学的解析のために選択した。
【０１１２】
３．４．ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ））により、コケ組織から全ＲＮＡを単離した。標準的なプロトコルに従って、逆転写ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲプライマーでは、β１，２−ＸＴのｃＤＮＡの中央領域およびｎｐｔＩＩカセットの両方の部位に位置するＸＴ１４Ｆ（５'−ＴＴＡＣＧＡＡ−ＧＣＡＣＡＣＣＡＴＧＣ−３'、配列番号８２）およびＸＴ１５Ｒ（５'−ＧＴＣＣＴＧＴＴＡＡＡＴＧＣＣＴＧＣ−３'、配列番号６５）を使用した。これらのプライマーを使用して、２９０ｂｐ転写物はＷＴのみに検出されたが、すべてのトランスジェニック植物は、いずれのＰＣＲも生じなかった。組み込まれたｎｐｔＩＩカセットの両方の部位に位置するプライマーでは転写物が認められないことから、解析したすべての植物はノックアウトであることが確認される。
【０１１３】
コントロールとして、ＡＰＳ還元酵素に対するプライマー（コプリボバ（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａ）ら、２００２、上掲）：Ｒ１０（５'−ＴＣＴＴＴＣＡＣＴＡＴＴＣＧＧＴＧＡＣＧ−３'、配列番号５３）およびＲ１１（５'−ＣＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣ−３'、配列番号５４）によりＲＴ−ＰＣＲを実施し、すべての植物から９００ｂｐのフラグメントを増幅した。
【０１１４】
３．５  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）ＷＴのＮ−グリカンは、例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）、上掲において記載のような植物Ｎ−グリカン、即ち、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ１，２−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａエピトープ（ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，４−フコシルおよびβ１，３−ガラクトシル残基）の典型的な構造的特徴を示す（表１）。３つのβ１，２ＸＴノックアウト植物について解析した。β１，２ＸＴノックアウト植物のＮ−グリカン上では、β−マンノシル残基に連結したβ１，２キシロシル残基を検出することができなかった（表１）ことから、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のβ１，２キシロース転移酵素のノックアウトは完全に成功したことが確認された。
【０１１５】
４．ヒトβ−１，４−ガラクトース転移酵素に対するｃＤＮＡのクローニング
ヒト肝臓由来のｃＤＮＡ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））を、β１，４−ガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）：Ｘ５５４１５）ｃＤＮＡの単離のために使用した。エロンガーゼ（Ｅｌｏｎｇａｓｅ）酵素（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））を伴うＰＣＲのためにＸｈｏＩ制限部位を含有する５'プライマーＧａｌＴＸｈ−Ｆ（５'−ＴＴＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣ  −３'、配列番号７２）およびＸｂａＩ制限部位を含有する３'プライマーＧａｌＴＸｂ−Ｒ（５'−ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣ−３'、配列番号７３）を使用することによって、１．２ｋｂＤＮＡフラグメントを増幅した。１．２ｋｂフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。フラグメントを、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩでこのベクターから切り出し、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化したｐＲＴ１０１（トファー（Ｔｏｅｐｆｅｒ）ら（１９８７）ＮＡＲ  １５，５８９０）にクローニングした。得られたプラスミドｐＲＴ１０１−ＧａｌＴは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶターミネーターの制御下のヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素のｃＤＮＡを含有した。
【０１１６】
５．β１，２−キシロース転移酵素に対するノックアウト構築物を作製することおよびヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素の組み込み
プライマーＸＴＢ−Ｆ（５'−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＣＧＡＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＧＣ−３'、配列番号７４）およびプライマーＸＴＢ−Ｒ（５'−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＧ−３'、配列番号７５）（両プライマーともＢａｍＨＩ制限部位を導入した）を使用することによって、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のゲノムＤＮＡから、β１，２−キシロース転移酵素遺伝子の１．５６ｋｂフラグメントを増幅した。増幅産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。クローニングしたβ１，２−キシロース転移酵素遺伝子フラグメントは、単一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有した。このＨｉｎｄＩＩＩ制限部位には、連結によって、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶターミネーターの制御下にあるβ１，４−ガラクトース転移酵素のｃＤＮＡが導入され、プラスミドｐＣＲ４−ＸＴｋｏ−ＧａｌＴｋｉが生じる。ｐＣＲ４−ＸＴｋｏ−ＧａｌＴｋｉをＢａｍＨＩで消化すると、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のβ１，２−キシロース転移酵素遺伝子に相同な配列によって５'および３'に隣接されたＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶターミネーターの制御下にあるβ１，４−ガラクトース転移酵素のｃＤＮＡを含有するフラグメントを生じた。このフラグメントは、ノックアウト実験のために使用した。
【０１１７】
５．１  ＰＣＲ
ＰＣＲ解析のために、推定ノックアウト植物から単離されたゲノムＤＮＡを使用した。プライマーＭｏＢ５２１（５'−ＴＴＧＣＣＧＣＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＣＴＡＡＣＧＴ−３'、配列番号７６）およびＭｏＢ５７５（５'−ＴＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＡＡＴＣＴＴ−３'、配列番号７７）を、β１，４−ガラクトース転移酵素カセットの両方の部位上にあるβ１，２−キシロース転移酵素に相同な配列上に配置した。予想されるβ１，２−キシロース転移酵素配列に対応する３３９ｂｐのフラグメントをＷＴから増幅した。ノックアウト植物から、導入されたβ１，４−ガラクトース転移酵素カセットに対応する２．１ｋｂｐのフラグメントを増幅したところ、３３９ｂｐのフラグメントを検出することができなかったことから、β１，２−キシロース転移酵素のノックアウトならびにβ１，４−ガラクトース転移酵素カセットの組み込みを確認した。
【０１１８】
５．２  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）ＷＴのＮ−グリカンは、例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）、上掲において記載のような植物Ｎ−グリカン、即ち、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ１，２−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａエピトープ（ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，４−フコシルおよびβ１，３−ガラクトシル残基）の典型的な構造的特徴を示す（表１）。３つのβ１，２ＸＴノックアウト、β１，４ＧＴ組み込み植物について解析した。これらの植物のＮ−グリカン上では、β−マンノシル残基に連結したβ１，２キシロシル残基を検出することができなかった。ＷＴにおいて、２２３５でのピークが認められたことから、トランスジェニック植物のＮ−グリカンパターンにおいて（ＧＦ）（ＧＦ）ＸＦ構造が移動したことが説明され、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）においてヒトβ１，４ガラクトース転移酵素の活性が確認された。
【０１１９】
６．α１，３−フコース転移酵素に対するノックアウト構築物を作製することおよびヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素の組み込み
プライマーＦＴＢ−Ｆ（５'−ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＡＴＧＧ−３'，配列番号７８）およびプライマーＦＴＢ−Ｒ（５'−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＣ−３'，配列番号７９）（両プライマーともＢａｍＨＩ制限部位を導入した）を使用することによって、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のゲノムＤＮＡから、α１，３−フコース転移酵素の２．６６ｋｂフラグメントを増幅した。増幅産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。クローニングしたα１，３−フコース転移酵素遺伝子フラグメントは、２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有した。これらのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位には、連結によって、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶターミネーターの制御下にあるβ１，４−ガラクトース転移酵素のｃＤＮＡが導入され、プラスミドｐＣＲ４−ＦＴｋｏ−ＧａｌＴｋｉが生じる。ｐＣＲ４−ＦＴｋｏ−ＧａｌＴｋｉをＢａｍＨＩで消化すると、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のβ１，３−フコース転移酵素遺伝子に相同な配列によって５'および３'に隣接されたＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶターミネーターの制御下にあるβ１，４−ガラクトース転移酵素のｃＤＮＡを含有するフラグメントを生じた。このフラグメントは、ノックアウト実験のために使用した。
【０１２０】
６．１  ＰＣＲ
ＰＣＲ解析のために、推定ノックアウト植物から単離されたゲノムＤＮＡを使用した。プライマーＭｏＢ４３５（５'−ＴＣＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＧ−３'、配列番号８０）およびＭｏＢ４９５（５'−ＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴＧ−３'、配列番号８１）を、β１，４−ガラクトース転移酵素カセットの両方の部位上にあるα１，３−フコース転移酵素に相同な配列上に配置した。予想されるα１，３−フコース転移酵素配列に対応する２ｋｂｐのフラグメントをＷＴから増幅した。ノックアウト植物から、導入されたβ１，４−ガラクトース転移酵素カセットに対応する２．８ｋｂｐのフラグメントを増幅したところ、２ｋｂｐのフラグメントを検出することができなかったことから、α１，３−フコース転移酵素のノックアウトならびにβ１，４−ガラクトース転移酵素カセットの組み込みを確認した。
【０１２１】
６．２  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）ＷＴのＮ−グリカンは、例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）、上掲において記載のような植物Ｎ−グリカン、即ち、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ１，２−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａエピトープ（ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，４−フコシルおよびβ１，３−ガラクトシル残基）の典型的な構造的特徴を示す（表１）。３つのα１，３ＦＴノックアウト、β１，４ＧＴ組み込み植物について解析した。これらの植物のＮ−グリカン上では、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，３フコシル残基を検出することができなかった。ＷＴにおいて、２２３５でのピークが認められたことから、トランスジェニック植物のＮ−グリカンパターンにおいて（ＧＦ）（ＧＦ）ＸＦ構造が移動したことが説明され、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）においてヒトβ１，４ガラクトース転移酵素の活性が確認された。
【０１２２】
７．α１，３フコース転移酵素およびβ１，２キシロース転移酵素ノックアウトならびにβ１，４ガラクトース転移酵素の組み込みを伴う植物を作製する
α１，３−フコシルおよびβ１，２−キシロシル残基を伴わない植物を作製するために、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）糸状体由来のプロトプラストを、第５および６章に記載の構築物で形質転換した。続けて、形質転換を実施することが可能であり、ならびに両構築物による共形質転換も可能である。
【０１２３】
７．１  ＰＣＲ
ＰＣＲ解析については、５．１および６．１に記載の手順と同じ手順を実施した。
【０１２４】
７．２  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）ＷＴのＮ−グリカンは、例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（２００１）、上掲において記載のような植物Ｎ−グリカン、即ち、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ１，２−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａエピトープ（ＧｌｃＮＡｃに連結したα１，４−フコシルおよびβ１，３−ガラクトシル残基）の典型的な構造的特徴を示す（表１）。３つのトランスジェニック植物について解析した。これらの植物のＮ−グリカン上では、Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃにに連結したα１，３フコシル残基も、またβ１，２−キシロシル残基も検出することができなかった。ＷＴにおいて、２２３５でのピークが認められたことから、トランスジェニック植物のＮ−グリカンパターンにおいて（ＧＦ）（ＧＦ）ＸＦ構造が移動したことが説明され、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）においてヒトβ１，４ガラクトース転移酵素の活性ならびに１，３連結フコシルおよび１，２連結キシロシル残基の消失が確認された。
【０１２５】
８．１  一過的に形質転換されたフィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）プロトプラストにおける組換えヒトＶＥＧＦ１２１の精製および解析
ヒトβ１，４ガラクトース転移酵素を含有し、かつα１，３フコース転移酵素も、またβ１，２キシロース転移酵素（７．２）も含有しないトランスジェニックフィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）植物の糸状体から誘導されたプロトプラストを、ｐＲＴ１０１ＴＰＶＥＧＦ  Ｃ３で形質転換した。発現したＶＥＧＦ１２１を培地に分泌させた。２、３および４日後、培養培地を回収し、新鮮培地に置き換えた。サンプルを、０．２２ミクロンミッレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＰフィルターユニット（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を介してろ過した。ＳＰ−セファロース（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムを使用するＦＰＬＣ（アクタエクスポーラー（Ａｅｋｔａｅｘｐｌｏｒｅｒ）１００、アマシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、独国（Ｇｅｒｍａｎｙ））によって、組換えＶＥＧＦ１２１を精製した。２５ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０中塩化ナトリウムで溶出を実施した。アミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）フィルターデバイス（カットオフ値：１０．０００）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用する遠心分離によって、溶出した画分を濃縮した。
【０１２６】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥ充填緩衝液をサンプルに添加し、１５％アクリルアミドおよび０．４％ビスアクリルアミドを含有するＳＤＳ／ＰＡＧＥ上でタンパク質を分画した。ゲルを、クマシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０で染色した。ＶＥＧＦ１２１のバンドを、クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥから切り出し、配列決定用トリプシンで消化した。ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＡでの処置により、グリカンを遊離させ、ＤＹＮＡＭＯ（テルモ・バイオアナライシス（Ｔｈｅｒｍｏ  ＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ）、ニューメキシコ州サンタフェ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ，ＮＭ））上でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって解析した。
【０１２７】
分泌型組換えＶＥＧＦ１２１の検出されたＮ−グリカンパターンは、トランスジェニック（ＦｕｃＴおよびＸｙｌＴのノックアウトを伴う、７．２を参照のこと）植物において観察されるパターンに類似しており、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）においてヒトβ１，４ガラクトース転移酵素の活性ならびに１，３連結フコシルおよび１，２連結キシロシル残基の消失が確認された。
【０１２８】
以下の表１は、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）野生型（ｗｔ）およびノックアウト植物のＮ−グリカン構造を示す。Ｎ−グリカンは、同じ条件（５００ｍｌフラスコ、改変クノップ（Ｋｎｏｐ）培地）下で増殖させた植物材料から単離した。Ｆ＝フコシル残基、Ｇ＝ガラクトシル残基、Ｇｎ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル残基、Ｍ／Ｍａｎ＝マンノシル残基、Ｘ＝キシロシル残基。（ＧＦ）（ＧＦ）ＸＦは、ルイスａフォーメーションと呼ばれる最も複雑なタイプのＮ−グリカンを示す。
【０１２９】
【表１】
0004559358.tif 000002
【配列表】
0004559358000001.app