(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配列からなるペプチドＡまたはペプチドＢ並びにそれらの塩。
（ペプチドＡ）  Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
（ペプチドＢ）  Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
【請求項２】
Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配列からなるペプチドＡ、ペプチドＢおよびそれらの塩の少なくとも１種を有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
（ペプチドＡ）  Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
（ペプチドＢ）  Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、天然物であるワインから分離された新規ペプチドおよびそれらを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．２６）はペプチド鎖中のプロリン残基におけるカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に認識し、切断するペプチダーゼであり、記憶の固定場所とされている脳の海馬部分に高い酵素活性が観られるほか、動物臓器に広く分布することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ １７３，８２７（１９７１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１１１（１９８０）、日本農芸化学会誌 ５８，１１４７（１９８４））。また、同様の酵素がＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌からも発見されている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２５５，４７８６（１９８０））。
【０００３】
本酵素は神経伝達物質とされているサブスタンスＰやニューロテンシン、記憶に関係していると考えられるＴＨＲ（甲状腺刺激ホルモン）やステップスルー型受動的回避学習法で記憶保持活性があるとされている脳内バソプレシン（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１，１３１０（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ ３０８，２７６（１９８４））に作用し、不活性化することが知られている。バソプレシンは腎臓で水分再吸収に働くペプチドホルモンであるが、脳内においては学習、記憶の過程にも関与しており、このホルモンの分解能が不活性化されると記憶保持に障害が現われると言われている。また、痴呆症患者のバソプレシン量は、正常人のそれより少ないことが知られている（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ ４，７８８（１９８７））。従って、本酵素の活性を阻害することによる痴呆症の治療を目指す研究がなされている。
【０００４】
実際に、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＨ2Ｃｌ、Ｚ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｚ−Ｖａｌ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ等の合成されたプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が抗健忘作用を示すことが動物試験で確認され（日本農芸化学会誌 ５８，１１４７（１９８４）、化学と生物 ２５，５５４（１９８７））、その後、微生物や食品成分由来の阻害剤も報告されている（１９９０年薬学会年会講演要旨集 ３５、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．，５５，８２５（１９９１）、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４４，９５６（１９９１）、特開平５−３３１０７２号公報、特開平１０−７７３００号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有する、天然物由来の特定のペプチドおよびそれらを有効成分とする安全性の高いプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ブドウを原料とするワインに豊富なプロリンとともにアミノペプチダーゼ等の加水分解酵素が存在することに着目し、ワインには未知のペプチドが存在するものと考え、上記課題を解決するために、ワインからプロリルエンドペプチダーゼ阻害物質を鋭意検索した。その結果、ワイン中に本阻害物質の存在を認め、該物質がある種のペプチドであることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配列からなるペプチドＡまたはペプチドＢ並びにそれらの塩を提供するものである。
（ペプチドＡ）  Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
（ペプチドＢ）  Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
また本発明は、前記ペプチドＡ、ペプチドＢおよびそれらの塩の少なくとも１種を有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
【０００８】
本発明のペプチドの塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が包含され、酸付加塩としては、製薬上許容される酸（無機酸および有機酸）との塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等が例示される。また、塩基付加塩としては、製薬上許容される塩基（無機塩基および有機塩基）との塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン等）との塩等が例示される。
【０００９】
本発明のペプチドは、当該ペプチドを含有するワインから常法に準じて採取することができ、かかる方法としてはワインを限外ろ過膜、ゲルろ過、種々のクロマトグラフィー、例えば、ＳＰ−セファデックスＣ−２５（ファルマシア社製）、ＳＰ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）によるゲル濾過、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫＣ１８（資生堂社製）、ＣｏｓｍｏｓｉｌＣ１８（ナカライテスク社製）等による逆相クロマトグラフィー等、後述する方法に従い、プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を指標として実施することができる。
【００１０】
また本発明のペプチドは有機化学的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的方法等によって製造することも可能である。これまで多くのペプチド合成方法が知られており、例えば「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細に記載されている。本発明で用いるペプチドはこれらの合成法のいずれかによって、例えばいわゆる固相ペプチド合成または液相ペプチド合成によって製造することができる。
【００１１】
液相ペプチド合成は上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記載されており、それに従って、例えば本ペプチドのＣ末端に位置すべきアミノ酸であってそのカルボキシル基がベンジル基（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチル基（ｔ−Ｂｕ）等で保護されたアミノ酸とＣ末端アミノ酸に隣接して位置するべきアミノ酸であってそのα−アミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（ｚ）等で保護されたアミノ酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド等に溶解し、それらをジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の存在下室温で一夜反応させることによって行うことができる。
【００１２】
次いで生成物のアミノ保護基の常法による除去の後に得られるジペプチドをアミノ保護した第３のアミノ酸と同様に反応してアミノ保護基を除去し、次いで同様な手順を繰り返して本ペプチドを得ることができる。最終反応の終了後、これらの保護基を除去するが、これらの脱保護は常法によって、例えば上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記述されたようにして行うことができる。例えば、アミノ保護基については、Ｂｏｃはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはギ酸によって、Ｚは接触還元によって、カルボキシル保護基については、Ｂｚｌは、例えば、接触還元によって、ｔ−ＢｕはＴＦＡまたはＨＣｌ／ジオキサンによって除去することができる。
【００１３】
一方、固相ペプチド合成については、ペプチドシンセサイザー（例えばアプライドバイオシステムズ社によって生産された４３０Ａ型ペプチドシンセサイザー）を用いる合成が最近広く用いられている。すなわち、この方法においては基本的には、アミノ基がＢｏｃで保護されたα−アミノ酸（Ｂｏｃ−アミノ酸）を、出発物質としての、アミノ酸が結合したフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂（アプライドバイオシステムズ社より入手し得る）のＮ−側からアミノ酸の導入とＢｏｃの除去の繰り返しによって段階的に延長する。試薬の選定、反応条件等の具体的な実験の操作はアプライドバイオシステムズ社による４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーユーザーズマニュアルに従って行うことができる。
【００１４】
本発明のペプチドおよびそれらの塩は後述するとおり、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有し、ヒトの痴呆症の治療、予防に有効であると期待される。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。
【００１６】
実施例１：プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドの精製
赤ワイン（カベルネ・ソービニオン種：メルシャン社製）２Ｌに蒸留水８Ｌを加えたものをＣｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮカラム（ナカライテスク社製、φ４８×１５０ｍｍ）に直接吸着させ、蒸留水で洗浄後、１０％エタノールで溶出して活性画分を回収した。次いで、この活性画分をトヨパールＨＷ−４０Ｓカラム（東ソー社製、φ２６×２８０ｍｍ）に吸着させ、１００ｍＭ酢酸緩衝液で溶出して活性画分を回収した。さらにこの活性画分を０．１％トリフルオロ酢酸溶液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３０カラム（ファルマシア社製、φ１０×３００ｍｍ）に付し、同溶液にて活性画分を溶出し回収した。上記のカラムより溶出された活性画分はＳＯＵＲＣＥ ５ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０カラム（ファルマシア社製、φ４６×１５０ｍｍ）を用いたクロマトグラフィーで、１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む２〜７０％のアセトニトリルの直線濃度勾配溶出で分画し、２種の活性画分を得た。得られた画分はそれぞれ、ＳＯＵＲＣＥ ５ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０カラムにより同条件下で、再度精製し、プロリルエンドペプチダーゼ阻害を有する２種類のペプチドのピーク（保持時間、ペプチドＡ：２２分、ペプチドＢ：２５分）を得た。
【００１７】
次いで、これらの阻害ペプチドの構造をヒューレットパッカード社製プロテインシークエンサーＧ１００５Ａにより解析した。その結果、上記のペプチドＡおよびＢは、Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配列で示される構造を有していた。
（ペプチドＡ）  Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
（ペプチドＢ）  Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
【００１８】
なお、各精製工程においては、下記のプロリルエンドペプチダーゼ阻害測定法を用いた阻害活性を指標として精製を進めた。
（プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定方法）
Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来プロリルエンドペプチダーゼ（生化学工業社製）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの酵素溶液とした。また、２ｍＭ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（生化学工業社製、Ｚはベンジルオキシカルボニル基、ｐＮＡはパラニトロアニリドを示す）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、４０％ジオキサンを含む）に溶解し基質溶液とした。各種ペプチドを含むサンプルを１．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに５０μｌ入れ、これにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌ、基質溶液１００μｌを添加し、３０℃で５分間保温した後、上記プロリルエンドペプチダーゼ溶液１００μｌを加え、よく混合して、３０℃で１０分間の反応を行った。その後、１Ｎ ＨＣｌ ５００μｌを添加することにより反応を停止させ、４１０ｎｍの吸光度を測定した。阻害率（％）は次の式により算出した。
【００１９】
阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
Ａ＝阻害剤を含まない場合の４１０ｎｍの吸光度
Ｂ＝阻害剤を含む場合の４１０ｎｍの吸光度
また、阻害率５０％のときのペプチド濃度をＩＣ50値とした。
【００２０】
実施例２：プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドの合成
上記のペプチドＡとＢをペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社製、４３０Ａ型）により合成し、目的とする標記のペプチドを得た。次いで、ペプチドＡとＢのプロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活性を測定した。得られた結果は表１に示すとおりであり、ワインより精製されたものと同様の活性を示した。
【００２１】
【表１】
0004485048.tif 000002
【００２２】
【発明の効果】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドは、天然物由来であるので安全性が高く、長期間にわたって投与することも可能であり、特に痴呆症の予防、治療に有用である。
【配列表】
0004485048.tif 000003