(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ1のポンプ光の光源と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ2のイレース光の光源と、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段とを備えており、重ね手段を介してポンプ光およびイレース光を試料に照射することにより、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域を一部分抑制する二重共鳴吸収顕微鏡において、イレース光光源がコヒーレント光源であり、このコヒーレント光源からのイレース光から、そのビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下となっている領域のみを取り出すビーム領域限定手段が備えられており、このビーム領域限定手段により、イレース光はそのビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下であるものとされていることを特徴とする二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２】
試料は、基底状態を含め少なくとも三つの電子状態を有する蛍光ラベラー分子により染色されており、前記試料分子はこの蛍光ラベラー分子である請求項１の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項３】
前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光に対してそのビーム断面内において空間的位相分布を与える位相変調素子が備えられている請求項２の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項４】
前記位相変調素子は、前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光の光軸を中心とした光軸周りにπの位相差を与えるものである請求項３の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項５】
前記位相変調素子は、前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光の断面内において、同心円上に空間的位相分布を与えるものである請求項３の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項６】
前記位相変調素子は、前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光の断面内において、円形領域とこの円形領域の外周の円環領域にπの位相差を有する空間的位相分布を与えるものである請求項３の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項７】
前記位相変調素子は、イレース光に対してオプティカルフラットな平行基板に、所定の厚み分布をもつ光学薄膜が被膜されてなる請求項３ないし６のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項８】
前記位相変調素子は、イレース光に対してオプティカルフラットな平行基板に、エッチングが施されてなる請求項３ないし６のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項９】
光電子変換面、マイクロチャネルプレート、フォスファースクリーン、光ファイバーカップラー、およびＣＣＤ検出器から構成される蛍光検出手投が備えられている請求項１ないし８のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１０】
前記蛍光検出手投は、蛍光信号からポンプ光またはイレース光もしくはその両方を除去する分光素子または波長分散素子を光電子変換面の前方に有している請求項９の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１１】
試料面から前記蛍光検出手段までの光路上にスリットまたはピンホールが備えられている請求項９または１０の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１２】
前記スリットまたはピンホールは、光電変換面の直前に備えられている請求項１１の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１３】
前記光電子変換面、マイクロチャネルプレート、フォスファースクリーン、およびＣＣＤ検出器それぞれの電極への印加電圧を時間制御する時間制御手段が備えられている請求項９ないし１２のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１４】
前記時間制御手段は、スイッチングにより印加電圧を時間制御し、そのスイッチング応答時間が試料分子の蛍光時間より短く設定されている請求項１３の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１５】
前記時間制御手段は、電圧印加時間を試料分子の蛍光時間よりも長くなるように制御する請求項１３の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１６】
蛍光信号からポンプ光またはイレース光もしくはその両方を除去する分光素子または波長分散素子が備えられている請求項１ないし８のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１７】
イレース光のパルス幅がポンプ光のパルス幅よりも長く設定されており、且つポンプ光の照射時間がイレース光の照射時間と完全にオーバーラップするように設定されている請求項１ないし１６のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１８】
イレース光のパルス幅がポンプ光のパルス幅よりも長くなるように、イレース光のパルス幅を広げるパルス幅調整手段が備えられている請求項１７の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項１９】
前記パルス幅調整手段として、分光を行うハーフミラーと、このハーフミラーを光路上に含むループ光路を形成する反射光学系とから構成されるパルスストレッチャー光学系が備えられている請求項１８の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２０】
ポンプ光の照射時間がイレース光の照射時間と完全にオーパーラップするように、イレース光およびポンプ光の試料への到達時間を調整する照射タイミング調整手段が備えられている請求項１７の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２１】
前記照射タイミング調整手段は、ポンプ光およびイレース光の光路差を調整することにより、ポンプ光およびイレース光の試料への到達時間を調整する請求項２０の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２２】
前記照射タイミング調整手段は、ポンプ光光源およびイレース光光源がそれぞれ独立したパルスレーザーである場合において、各パルスレーザーのＱスイッチを調整することにより、ポンプ光およびイレース光の試料への到達時間を調整する請求項２０の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２３】
ポンプ光およびイレース光に対して透明な基板に、ポンプ光およびイレース光のいずれでも励起可能な分子が均一に塗布されてなる標準試料が用いられ、この標準試料にポンプ光およびイレース光を同時に照射したときの前記分子からの発光の面積が最小、発光の輝度が最大となるように、ポンプ光およびイレース光の光軸が調整されたものとなっている請求項１ないし２２のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２４】
少なくともナノメートルオーダーでのポンプ光およびイレース光の走査あるいは試料の走査を行う機構を有している請求項１ないし２３のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２５】
試料の走査機構として、電磁モータまたはピエゾ圧電素子により二次元移動可能とされた試料ステージ機構が備えられている請求項２４の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２６】
ポンプ光およびイレース光の走査機構として、揺動ミラー機構が備えられている請求項２４の二重共鳴吸収顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、二重共鳴吸収過程を用いて超解像性を実現する二重共鳴吸収顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、レーザー技術や電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩にともない、様々なタイプの高性能かつ多機能な顕微鏡が開発されてきている。本願発明の発明者も、その一つとして、複数波長の光を試料に照明することによって発生する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラスト制御および試料の化学分析を可能とする顕微鏡（以下、二重共鳴吸収顕微鏡と呼ぶ）をすでに提案している（特願平６−３２９１６５参照）。
【０００３】
この二重共鳴吸収顕微鏡では、二重共鳴吸収過程を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測することができる。その原理を説明すると、まず、基底状態（Ｓ0状態：図１）の試料分子（つまり、試料を構成する分子）が持つ価電子軌道の電子を、レーザー光などの共鳴波長λ1光により第一電子励起状態へ励起させ（Ｓ1状態：図２）、続いて共鳴波長λ2光により第二電子励起状態またはさらに高位の励起状態へ励起させる（Ｓ2状態：図３）。分子は、この励起状態から蛍光あるいは燐光を発光したりして基底状態に戻る（図４）。そして、図２に示した吸収や図４に示した蛍光や燐光の発光を用いて吸収像や発光像を観察する。
【０００４】
Ｓ1状態への励起過程においては、単位体積内のＳ1状態の分子数は照射する光の強度が増加するにしたがって増加する。線吸収係数は、分子一個当たりの吸収断面積と単位体積当たりの分子数の積で与えられるので、Ｓ2状態への励起過程においては続いて照射する共鳴波長λ2に対する線吸収係数は最初に照射した共鳴波長λ1の光の強度に依存する。すなわち、共鳴波長λ2（以下、波長λ2と略称）に対する線吸収係数は共鳴波長λ1（以下、波長λ1と略称）の光の強度で制御できる。このことは、波長λ1および波長λ2の２波長の光で試料を照射し、波長λ2による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストを波長λ1の光で完全に制御できることを示している。また、Ｓ2状態からの蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ1状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００５】
また、この二重共鳴吸収顕微鏡は、コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。図１に示される最外穀価電子軌道は個々の分子に固有なエネルギー準位をもつので、波長λ1は分子によって異なる。同時に波長λ2も分子固有のものとなる。単一波長で照明・観察を行う従来の顕微鏡においても、ある程度は特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能ではあるが、一般にはいくつかの分子の吸収帯の波長領域は重複するため、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。これに対し、二重共鳴吸収顕微鏡では波長λ1および波長λ2の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来技術よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルを持つ光のみが強く吸収されるので、波長λ1および波長λ2の偏光方向を決めて、吸収像または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定をも行うことができる。
【０００６】
本願発明の発明者はさらに、回折限界を越える高い空間分解能の二重共鳴吸収顕微鏡をも提案している（特願平８−３０２２３２参照）。二重共鳴吸収過程については、図５に例示したようにＳ2状態からの蛍光が極めて弱くなるある種の分子が存在する。このような光学的性質を持つ分子に対しては、以下のような極めて興味深い現象が起きる。図６は、図５と同じく二重共鳴吸収過程の概念図であるが、横紬にＸ軸を設けて空間的距離の広がりを表現しており、波長λ1光および波長λ2光が照射されている空間領域Ａ1（＝蛍光抑制領域）と、波長λ1光のみが照射されて波長λ2光が照射されていない空間領域Ａ0（＝蛍光領域）について示している。空間領域Ａ0では波長λ1光による励起によってＳ1状態の分子が多数生成される。このとき空間領域Ａ0からは波長λ3で発光する蛍光が見られる。しかし空間領域Ａ1では、波長λ2光が照射されるので、Ｓ1状態の分子が即座に高位のＳ2状態へと励起され、Ｓ1状態の分子は存在しなくなる。このため空間領域Ａ1においては、波長λ3の蛍光は全く発生せず、しかもＳ2状態からの蛍光はもともとないので、完全に蛍光自体が抑制されることとなる。すなわち蛍光が発生するのは空間領域Ａ0のみとなる。このような現象の発生が数種類の分子において確認されている。
【０００７】
したがって、従来の走査型レーザー顕微鏡などでは、レーザー光を集光して観察試料上に形成されるマイクロビームのサイズが集光レンズの開口数と波長による回折限界で決まるので、それ以上の空間分解能が原理的に期待できないにの対し、図６で示した現象によれば波長λ1光と波長λ2光を空間的に一部分重ね合わせることで、波長λ2光の照射で蛍光領域が抑制されるため、たとえば波長λ1光の照射領域に着目すると、蛍光領域は集光レンズの開口数と波長とで決まるビームのサイズよりも狭くなっており、実質的に空間分解能の向上が図られている。
本願発明者による二重共鳴吸収顕微鏡（特願平８−３０２２３２参照）は、この原理を用いて、回折限界を越える超解像顕微鏡を実現しているのである。
【０００８】
そして本願発明の発明者は、この二重共鳴吸収顕微鏡の超解像性をさらに高めるべく、その機能を十分に活かすための試料の調整や波長λ1光・波長λ2光の試料への照射タイミングなどをもすでに提案している（特願平９−２５５４４４）。より具体的には、試料を染色分子により染色する。この染色分子として、基底状態を含め少なくとも３つの量子状態（Ｓ0状態，Ｓ1状態，Ｓ2状態・・・）を有し、且つＳ1状態を除く高位の量子状態から基底状態へ脱励起するときの遷移において蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程が支配的である各種分子（以下、蛍光ラベラー分子と呼ぶ）を用いるのである。このような蛍光ラベラー分子と生化学的な染色技術を施した生体分子とを化学結合させてなる試料に、波長λ1光を照射して蛍光ラベラー分子をＳ1状態に励起させ、続いて即座に波長λ2光を照射して蛍光ラベラー分子をより高位の量子準位に励起させることで、Ｓ1状態からの蛍光を効果的に抑制できるようになる。この際に、上述したような空間的な蛍光領域の人為的な抑制を行うことにより、空間分解能のさらなる向上が実現される。
【０００９】
上記の蛍光ラベラー分子の光学的性質は、以下のように量子化学的な見地から説明できる。一般に、分子はそれを構成する各原子のσまたはπ結合によって結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道はσ分子軌道またはπ分子軌道をもっていて、これらの分子軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は、各原子を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を決める。これに対して、π分子軌道の電子は、各原子の結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極めて弱い力で束縛される。
【００１０】
多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で励起させると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解離を含む大きな構造変化が起こる。その結果として、原子の運動エネルギーや構造変化するために光が分子に与えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに形を変える。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態で消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速におこるので（たとえばピコ秒より短い）、その過程で仮に蛍光が起きても極めて蛍光寿命が短い。しかしそれに対して、π分子軌道の電子が励起しても、分子の構造自体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時間とどまり、ナノ秒のオーダーで蛍光を放出して脱励起する性質を持つ。
【００１１】
量子化学よれば、分子がπ分子軌道を持つことと、二重結合を持つこととは同等であり、用いる蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富に持つ分子を選定することが必要条件となる。そして、二重結合を持つ分子でもベンゼンやビラジンなどの６員環分子においては、Ｓ２状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられている（例えば、M..Fujii et.al., Chem. Phys. Lett. 171 (1990) 341）。したがって、ベンゼンやビラジンなどの６員環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定すればＳ１状態からの蛍光寿命が長くなり、しかも光照射によりＳ1状態からＳ2状態に励起させることで分子からの蛍光を容易に抑制でき、上述の二重共鳴吸収顕微鏡の超解像性を効果的に利用することができるようになる。
【００１２】
すなわち、これらの蛍光ラベラー分子により試料を染色して観察を行えば、高空間分解能の蛍光像を取得することができるだけでなく、その蛍光ラベラー分子の側鎖の化学基を調整することにより生体試料の特定の化学組織のみを選択的に染色でき、試料の詳細な化学組成までも分析可能となる。
【００１３】
一般に、二重共鳴吸収過程は二つの光の波長や偏光状態等が特定の条件を満たす場合のみに起こるので、これを用いることで非常に詳細な分子の構造を知ることが可能となる。すなわち、光の偏光方向と分子の配向方向とは強い相関関係があり、二波長光それぞれの偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなすとき二重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、二波長光を試料に照射して、各光の偏光方向を回転することにより、蛍光の消失の程度が変化するので、その様子から観察しようとする組織の空間配向の情報も得られる。さらに、二つの波長の光を調整させることでもこのことが可能である。
【００１４】
他方、波長λ1光と波長λ2光の照射タイミングを適当なものに調整することにより（特願平９−２５５４４４参照）、蛍光像のＳ／Ｎを改善し、且つ蛍光抑制をさらに効果的に起こすことも可能となっている。
【００１５】
また、本願発明の発明者により、波長λ1光と波長λ2光の照射タイミングのさらなる工夫により、Ｓ／Ｎおよび蛍光抑制のさらなる向上を実現することも提案されている（特願平１０―９７９２４参照）
ところで、前述した波長λ1光の照射領域の一部分への波長λ2光の照射領域の重ね合わせは、波長λ2光を中空ビーム化して、つまり中央部（軸近傍領域）がゼロ強度であり、且つ軸対象な強度分布を有する中空ビーム光にして、波長λ1光の一部分と空間的に重ね合わせ、試料上に集光することで実現できる。図７は、この重合せおよびそれによる蛍光抑制を例示した概念図である。波長λ2光は位相板により中空ビーム化されとり、この中空ビーム化された波長λ2光と波長λ1光の重ね合わせにより、波長λ2光の強度がゼロとなる光軸近傍の領域以外では蛍光は抑制され、波長λ1光の広がりよりも狭い領域に存在する蛍光ラベラー分子（または試料分子）の蛍光のみが観察される。その結果、超解像性が発現する。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
さて、以上のように本願発明の発明者によってこれまで開発されてきた二重共鳴吸収顕微鏡は、その超解像性と分析能力において際立った有用性と技術的優位性を示しているものの、未だに以下に示すような改良すべき点が残されているのが実情である。なおここからは、試料分子（＝試料を構成する分子）をＳ0状態からＳ1状態へ励起させる波長λ1光をポンプ光、Ｓ1状態の分子をＳ2状態へ励起させる波長λ2光をイレース光と呼ぶこととする。また、Ｓ0状態からＳ1状態への励起はＳ0→Ｓ1励起、Ｓ1状態からＳ2状態への励起はＳ1→Ｓ2励起と略称する。また、超解像性の実現をより効果的なものとすべく、蛍光ラベラー分子を用いて試料を染色する場合には、試料分子とはこの蛍光ラベラー分子のこととなる。
【００１７】
まず第１に、ポンプ光およびイレース光の照射領域の一部重合せによる蛍光領域の抑制によって理論通りの超解像度を実現するためには、中空イレース光が期待どおりのの中空ビーム形状となっている必要がある。この中空ビーム形状の乱れ、つまり強度分布の乱れはそのまま顕微鏡画像の劣化を招いてしまう。
【００１８】
イレース光の光源としてはレーザーがしばしば用いられるが、イレース光を期待通りの中空ビームに成形するためには、その大前提としてレーザ光のビームプロファイルが整っている必要がある。すなわち、ビームの強度分布が光軸軸対称であることが必要となる。しかしながら、たとえば色素レーザーでは、そのビーム形状が三角形に近く、強度分布も一様でないことから、期待する中空ビームを得ることが難しい場合がある。このため、試料上で集光したビーム形状が崩れたビームパターンとなり、顕微鏡画像の解像度劣化や画質低下の原因となっている。
【００１９】
また、輪帯アパーチャーを介して中空イレース光を取得することが提案されてはいる。しかしながら、輪体アパーチャーを利用すると、光紬合わせや焦点合わせなどが難しく、良好な画像を得るまでの調整時間や手間が非常に多くなり、且つそのための熟達技能も必要となる。実用上好ましいものではない。
【００２０】
さらにまた、中空イレース光として理想的なビームプロファイルを持つ一次のベッセルビームも提案されてはいる。しかしながら、実際にはレーザー光は、そのビーム面内で完全に位相面が揃っているわけではなく、ビーム中央部から外れるに従って位相面が乱れてくるため、一次ベッセルビームを形成する際、この位相面の乱れに起因して、電場の相殺が不完全となり、ビーム中央部の強度が完全にゼロとならない不完全な一次ベッセルビームができてしまう。これでは二重共鳴吸収顕微鏡にとって理想的な中空イレース光とはいえない。
【００２１】
また第２には、二重共鳴吸収顕微鏡においても、他の顕微鏡と同様に、当然のことながらより良好な操作性や保守性が求められている。前述した二重共鳴吸収顕微鏡の技術は、色素レーザーやオプティカルバラメトリックオシレータ（ＯＰＯ）等の波長可変レーザーを光源として用いることにより、多種の蛍光ラベラー分子の共鳴条件に対して適用可能となる。しかし、従来の色素レーザーは、色素の劣化による光量の低下および頻繁で煩雑な色素交換が伴い、実用上好ましいものではない。またＯＰＯは、便利ではあるが、非常に精密な光学システムであるために湿度や温度の管理が厳しく、また使用する非線形光学結晶は寿命が短い上に高価である。システム全体としても高価なので、ユーザーにとっては保守管理の負担の大きい光源であるといえる。
【００２２】
この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来の二重共鳴吸収顕微鏡を改良し、超解像性をより効果的に発現することができ、且つ、光源に対する操作性および保守性が優れたものとなっている、新しい二重共鳴吸収顕微鏡を提供することを課題としている。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、試料分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ1のポンプ光の光源と、第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い励起状態へ励起させる波長λ2のイレース光の光源と、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段とを備えており、重ね手段を介してポンプ光およびイレース光を試料に照射することにより、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域を一部分抑制する二重共鳴吸収顕微鏡において、イレース光光源がコヒーレント光源であり、このコヒーレント光源からのイレース光から、そのビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下となっている領域のみを取り出すビーム領域限定手段が備えられており、このビーム領域限定手段により、イレース光はそのビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下であるものとされていることを特徴とする二重共鳴吸収顕微鏡（請求項１）を提供する。
【００２４】
また、この出願の発明は、上記の二重共鳴吸収顕微鏡において、試料が、基底状態を含め少なくとも三つの電子状態を有する蛍光ラベラー分子により染色されており、前記試料分子はこの蛍光ラベラー分子であること（請求項２）を一態様としている。さらには、前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光に対してそのビーム断面内において空間的位相分布を与える位相変調素子が備えられていること(請求項３）や、この位相変調素子が、前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光の光軸を中心とした光軸周りにπの位相差を与えるもの、あるいは、前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光の断面内において、同心円上に空間的位相分布を与えるもの、前記ビーム領域限定手段を通過したイレース光の断面内において、円形領域とこの円形領域の外周の円環領域にπの位相差を有する空間的位相分布を与えるものであること（請求項４）（請求項５）(請求項６）や、これらの位相変調素子が、イレース光に対してオプティカルフラットな平行基板に、所定の厚み分布をもつ光学薄膜が被膜されてなる、あるいは、イレース光に対してオプティカルフラットな平行基板に、エッチングが施されてなること（請求項７）（請求項８）もその態様として提供する。さらにまた、光電子変換面、マイクロチャネルプレート、フォスファースクリーン、光ファイバーカップラー、およびＣＣＤ検出器から構成される蛍光検出手投が備えられていること（請求項９）や、この蛍光検出手投は、蛍光信号からポンプ光またはイレース光もしくはその両方を除去する分光素子または波長分散素子を光電子変換面の前方に有していること（請求項１０）や、試料面から前記蛍光検出手段までの光路上にスリットまたはピンホールが備えられていること（請求項１１）や、前記スリットまたはピンホールは、光電変換面の直前に備えられていること（請求項１２）をもその態様として提供する。さらにまた、前記光電子変換面、マイクロチャネルプレート、フォスファースクリーン、およびＣＣＤ検出器それぞれの電極への印加電圧を時間制御する時間制御手段が備えられていること（請求項１３）や、この時間制御手段は、スイッチングにより印加電圧を時間制御し、そのスイッチング応答時間が試料分子の蛍光時間より短く設定されていること、あるいは、電圧印加時間を試料分子の蛍光時間よりも長くなるように制御すること（請求項１４）（請求項１５）をもその態様として提供する。さらにまた、蛍光信号からポンプ光またはイレース光もしくはその両方を除去する分光素子または波長分散素子が備えられていること（請求項１６）をもその一態様として提供する。さらにまた、イレース光のパルス幅がポンプ光のパルス幅よりも長く設定されており、且つポンプ光の照射時間がイレース光の照射時間と完全にオーバーラップするように設定されていること（請求項１７）や、イレース光のパルス幅がポンプ光のパルス幅よりも長くなるように、イレース光のパルス幅を広げるパルス幅調整手段が備えられていること（請求項１８）や、このパルス幅調整手段として、分光を行うハーフミラーと、このハーフミラーを光路上に含むループ光路を形成する反射光学系とから構成されるパルスストレッチャー光学系が備えられていること(請求項１９）や、ポンプ光の照射時間がイレース光の照射時間と完全にオーパーラップするように、イレース光およびポンプ光の試料への到達時間を調整する照射タイミング調整手段が備えられていること（請求項２０）や、この照射タイミング調整手段は、ポンプ光およびイレース光の光路差を調整することにより、ポンプ光およびイレース光の試料への到達時間を調整すること、あるいは、請ポンプ光光源およびイレース光光源がそれぞれ独立したパルスレーザーである場合において、各パルスレーザーのＱスイッチを調整することにより、ポンプ光およびイレース光の試料への到達時間を調整すること（請求項２１）（請求項２２）をもその態様として提供する。さらにまた、ポンプ光およびイレース光に対して透明な基板に、ポンプ光およびイレース光のいずれでも励起可能な分子が均一に塗布されてなる標準試料が用いられ、この標準試料にポンプ光およびイレース光を同時に照射したときの前記分子からの発光の面積が最小、発光の輝度が最大となるように、ポンプ光およびイレース光の光軸が調整されたものとなっていること（請求項２３）をもその一態様として提供する。あらにまた、少なくともナノメートルオーダーでのポンプ光およびイレース光の走査あるいは試料の走査を行う機構を有していること（請求項２４）や、試料の走査機構として、電磁モータまたはピエゾ圧電素子により二次元移動可能とされた試料ステージ機構が備えられていること（請求項２５）や、ポンプ光およびイレース光の走査機構として、揺動ミラー機構が備えられてこと（請求項２６）をもその態様としている。
【００２５】
この出願の発明では、少なくとも二つ以上の量子準位を持つ色素分子を分散させてなる固体レーザー媒質、およびこの固体レーザー媒質を励起させる短パルスレーザーを有している固体色素レーザーをも用いることができる。この固体色素レーザーにおいて、固体レーザー媒質が、前記色素分子が分散された無機溶液または有機溶液に対してゾルゲル法を用いることにより生成されたものや、固体レーザー媒質は、前記色素分子が分散された固体有機材料に対して溶融加熱法を用いることにより生成されたものや、色素分子が二重結合またはベンゼン環を有する分子であるものや、その色素分子が、
2,2"-Dimethyl-p-terphenyl:
P-terphenyl(PTP):
3,3',2",3"-Tetramethyl-P-quaterphenyl:
2,2'''-Dimethyl-P-quaterphenyl:
2-Methyl-5-t-butyl-p-quaterphenyl:
2-(4-Biphenylyl)-5-(4-t-butylphenyl)-1,3,4-oxiazol(BPBD-365):
2-(4-Biphenylyl)-phenyl-1,3,4-oxadiazol:
2,5,2''''5,''''-Tetramethyl-p-quinquephenyl:
3,5,3''''5,''''-Tetra-t-butyl-p-quinquephenyl:
2,5-Diphenyloxazol:
2,5-Diphenylfuran:
PQP(p-Quanterphenyl):
2,5-Bis-(4-biphenylyl)-1,3,4-oxadiazol:
p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfonicacid Disodiumsalt:
p-Quaterphenyl-4-4'''-disulfonicacid Dipotassiumsalt:
4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)-p-quanterphenyl:
3,5,3''''5,''''-Tetra-t-butyl-p-sexiphenyl:
2-(1-Naphthyl)-5-phenyloxazol:
2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazotetrasulfonicacid Potassium Salt:
2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3:
4,4'-Diphenylstilbene:
[1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic acid, 4,4"-1,2-ethene-diylbis-,dipotassium salt:
2,5-Bis-(4-biphenylyl)-oxazol:
2,2'-([1,1'-Biphenyl]-4,4'-diyldi-2,1-ethenediyl)-bis-benzenesulfonic acid Disodium Salt:
7-Amino-4-methylcarbostyryl:
1,4-Di[2-(5-phenyloxazoly)]benzene:
7-Hydroxy-4-methylcoumarin:
p-Bis(o-methylstyryl)-benzene:
Benzofuran,2,2'-[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic-acid:
7-Dimethylamino-4-methylquinolom-2:
7-Amino-4-methylcoumarin:
2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyridylmethyl Iodide:
7-Diethylaminocoumarun:
7-Diethylamino-4-methylcoumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-methylqinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin:
7-Diethylamino-4-trifluormethylcoumarin:
7-Dimethylamino-4-trifluormethylcoumarin:
7-Amino-4-trifluormethylcoumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin:
7-Ethylamino-6-methyl-4-trifluormethylcoumarin:
7-Ethylamino-4-trifluormethylcoumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-carboethoxyquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-(3-pyridyl)-quinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin:
3-(2'-N-Methylbenzimidazolyl)-7-n,n-diethylaminocoumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-acetylquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin:
N-Methyl-4-trifluormethylpiperidino-[3,2-g]-coumarin:
2-(p-Dimethylaminostyryl)-benzothiazolylethyl Iodide:
3-(2'-Benzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminocoumarin:
Brillantsulfaflavin:
3-(2'-Benzothiazolyl)-7-diethylaminocoumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-trifluormethylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin:
3,3'-Diethyloxacarbocyanine Iodide:
3,3'-Dimethyl-9-ethylthiacarbocyanine Iodide:
Disodium Fluorescein (Uranin):
9-(o-Carboxyphenyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on2,7-Dichlorofluorescien・Fluorescein 548:
Fluorol 555 (Fluorol 7GA):
o-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)-benzonic acid (Rhodamine 560):
BenzoicAcid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3H-xanthen9-yl],perchlorate(Rhodamine 575):
Benzonic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3X-xanthen-9-yl]- ethylester,monohydrochloride (Rhodamine 590):
1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyloxacarbocyanine Iodide:
1,1'-Diethyl-2,2'-carbocyanine Iodid:
2-[6-(diethylamino)-3-(diethylimino)-3H-xanthen-9-yl] benzonic acid(Rhodamine 610):
Ethanaminium,N-[(6-diethylamino)-9-(2,4-disulfophenyl)-3H-xanthen-3-ylidene]-N- ethylhydroxid,inner salt,sodium salt:
Malachit Green:
3,3'-Diethylthiacarbocyanine Iodide:
1,3'-Diethyl-4,2'-quinolylthiacarbocyanine Iodide:
8-(2-Carboxyphenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9a',1-hi]xanthylium Perchlorate(Rhodamine640):
4-Dicyanmethylene-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran:
3,3'-Diethyloxadicarbocyanine Iodide:
8-(2,4-Disulfophenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino [9,9a,1-bc:9',1-hi]xanthene (Sulforhodamine 640):
5,9-Diaminobenzo[a]phenoxazonium Perchorate:
9-Diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazin-5-one:
5-Amino-9-diethylimino(a)phenoxazonium Perchlorate:
3-Ethylamino-7-ethylimino-2,8-dimethylphenoxazin-5-ium Perchorate:
8-(Trifluoromethyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:
9',9a,1-hi]xanthylium Perchlorate:
1-Ethyl-2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-pyridinium Perchlorate:
Carbazine 122:
9-Ethylamino-5-ethylimino-10-methyl-5H-benzo(a)phenoxazoniumPerchlorate:
3-Diethylamino-7-diethyliminophenoxazonium Perchlorate:
3-Diethylthiadicarbocyanine Iodide:
Oxazine 750:
1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-pyridininum Perchlorate:
1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindodicarbocyanine Iodide:
1,1'-Diethyl-4,4'-carbocyanine Iodide:
2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-1,3,3-trimethyl-3H-indoliumPerchlorate:
2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-3-ethylbenzothoazolium Perchlorate:
1,1'-Diethyl-2,2'-dicarbocyanine Iodide:
1-Ethyl-4-(4-(9-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolinozinium))-1,3-buta dienyl)-pyridinium Perchlorate:
3,3'-DimethyloxatricarbocyanineIodide:
1-Ethyl-4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-buta dienyl)-quinolinium Perchlorate:
8-Cyano-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9a',1-hi]xanthylium Perchlorate (Rhodamine800]:
2-(6-(4-Dimethylaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5)-3-methylbenzothiazoliumPerchlorate:
1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyanine Iodide:
IR125 :
3,3'-Diethylthiatricarbocyanine Iodide :
IR144 :
2-(6-(9-(2,3,6,7,-Tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5-hexatrienyl)-3-methyllbenzothiazolium Perchlorate:
3,3'-Diethyl-9,11-neopentylenethiatricarbocyanine Iodide:
1,1',3,3,3',3'-Hexamethyl-4,4',5,5'-dibenzo-2,2'-indotricarbocyanine Iodide:
3,3'-Diethyl-4,4',5,5'-dibenzothiatricarbocyanine Iodide:
1,2'-Diethyl-4,4'-dicarbocyanine Iodide:
IR140:
2-(8-(4-p-Dimethyhlaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate:
IR132 :
2-(8-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)chinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate:
IR26:
IR 5
のうちのいずれかであるものや、短パルスレーザーからのパルスレーザー光が１０ｎｓｅｃ以下のパルス幅を有しているものや、光学系を変更することなく固体レーザー媒質を交換可能に構成されているものや、レーザー発振波長を制御するためのオプティカルグレーティングが備えられているものや、励起光とプリズムの空間的位置制御による波長走査が可能とされているものを用いることができる。
【００２６】
そして、この出願の発明では、上記の二重共鳴吸収顕微鏡において、上記の固体色素レーザーが、イレース光光源またはポンプ光光源もしくはその両方として備えられているものも使用することができる。
【００２７】
【００２８】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴を持つものであり、ポンプ光光源、イレース光光源、および重ね手段を基本構成として備え持つ二重共鳴吸収顕微鏡において、超解像性をより効果的に発現させるべく、中空ビーム形成、蛍光信号検出、ポンプ光・イレース光照射について改善している。また、ポンプ光光源およびイレース光光源としてレーザーを用い、レーザー走査型顕微鏡の構成態様とした場合におけるレーザー走査についても改善している。またさらに、色素レーザーについても顕微鏡に適した光源として有用なものを実現しており、この色素レーザーを用いることで二重共鳴吸収顕微鏡の光源に関する機能性や操作性をより一層向上させることができる。以下に、［中空ビーム形成］［蛍光信号検出］［ポンプ光・イレース光照射］［レーザー走査］［色素レーザー］として説明する。
【００２９】
［中空ビーム形成］
この出願の発明の二重共鳴吸収顕微鏡は、超解像性を発現させるのに必要となるイレース光の中空ビーム化を、イレース光光源としてコヒーレント光源を用い、このコヒーレント光源からのイレース光としてのコヒーレント光をそのドーム面内での位相の乱れがλ2／２以下になるものとすることにより、イレース光光源の位相の乱れとそれが引き起こすイレース光のビームプロファイルの歪みを解消して、実現している。
【００３０】
光学の回折理論によれば、無収差の光学系で平行レーザー光を集光したときの強度プロファイルＩ（ｘ，ｙ，ｚ）は次式で与えられる。
【００３１】
【数１】
0004551528.tif 000002
【００３２】
この数１において、
ｆ＝光学系の焦点距離
λ＝集光する光の波長
点（ｘ，ｙ，ｚ）＝観測点
（ξ，ζ，η）＝積分変数
積分領域＝光学系瞳面の全体
φ＝瞳面上の光軸を中心とした角度
である。
【００３３】
この数１で、瞳面が軸対称の境界条件をもち、ｍ＝１とすれば集光した一次のベッセルビームの強度プロファイルであり、また、ｍ＝０とすれば通常のレーザービームの集光した強度プロファイルに対応する。図８に例示したように、一次のベッセルビームは、光紬を中心にして１周すると位相が２π変化する。理論上は、光軸に関して軸対称な点ではお互いの位相がπずれることから、軸上では電場が完全に相殺されてゼロとなる。しかし、実際にレーザービームの波面が一様でない場合には相殺が不完全となり、光軸上に電界強度成分が現れるため、一次のベッセルビームにおいてもレーザービームの波面が一様でない場合には、二重共鳴吸収顕微鏡にとって理想的なイレース光とはいえない。特に、レーザービーム面内で、且つ光軸に関して軸対称な点で、位相にλ／2以上の波面の乱れがあると、電場強度の符号が同じになる可能性があることから、理想的な中空ビームの形成が困難となる。
【００３４】
したがって、超解像性の発現に適した中空イレース光を形成するためには、少なくともレーザービーム面内での波面の乱れをλ／２以下に限定する必要がある。言い換えると、レーザーなどのコヒーレント光源をイレース光光源として用い、そのコヒーレント光源からのイレース光をそのビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下になるものとすることで、ビームプロファイルの歪みが解消され、超解像性の実現に最適な中空ビーム状のイレース光を得ることができるようになる。
【００３５】
コヒーレント光源からのイレース光をそのビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下となるようにするには、たとえば、コヒーレント光における位相波面の乱れがλ2／２よりも大きい領域を削除し、それ以外の領域のみを取り出せばよい。取り出した領域のビームはイレース光として利用される。このように限定した領域の取出しは、たとえば、幅が調整可能なスリットや径が調整可能なアパーチャーなどを有するビーム領域限定手段を、イレース光の光路上に設けることで実現できる。すなわち、スリットの幅やアパーチャーの径を調整することにより、それを通過するイレース光における必要領域のみを取り出す。調整範囲は、用いるコヒーレント光源によって決まってくる。
【００３６】
たとえば、コヒーレント光源として、共振器にガウシアンミラーが用いられているレーザーを用いた場合、ガウシアンミラーは、光軸中心部におけるレーザービームの位相波面は極めて良く揃っているが、中心部から外れるにつれて位相波面の乱れが大きくなるといった光学特性を有しているので、位相波面の乱れたビーム周縁部をカットしてレーザービームの中心部のみを利用する。これにより、ビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下になるコヒーレント光が実現され、良好なビームプロファイルを持つイレース光として利用することができる。
【００３７】
図９は、上述のようなイレース光を実現する光学系の一例を示した概略図である。この図９の例では、虹彩絞りやピンホールプレートなどのビーム領域限定手段（１０２）が、コヒーレント光源（１０１）の出射側に設けられており、虹彩やピンホール径を調整することにより、イレース光からその位相の乱れがλ2／２以下の領域のみを取り出す。
【００３８】
図９ではさらに、イレース光の光路上にビーム径拡大用光学素子（１０３）および位相変調素子（１０４）が設けられている。この場合、ビーム領域限定手段（１０２）を通過したイレース光は、ビーム径拡大用光学素子（１０３）によりそのビーム径が拡大され、さらに位相変調素子（１０４）によりその位相面が変調される。
【００３９】
より具体的には、ビーム径拡大用光学素子（１０３）としては、たとえばテレスコープを用いることができる。他方、位相変調素子（１０４）は、イレース光に対してそのビーム断面内において空間的位相分布を与えるものである。このような位相変調素子（１０４）の一つとしては、たとえば、イレース光に対しその光軸を中心とした光軸周りにπだけ位相差を与える、すなわち光軸に対して軸対称となる点でコヒーレント光の位相をπずらすものを用いることができる。この場合の位相変調素子（１０４）は、たとえば図１０に例示したような位相板とすることができる。この図１０に例示した位相板は、光軸の周りを四等分割して、各領域が位相をπ／２ずつずらす構成を有しており、光軸を中心に位相を周回して２πずらす働きをする構成を簡素化したものである。そして、テレスコープなどのビーム径拡大用光学素子（１０３）によってこの位相板に対して適当なサイズにビーム径が拡大されたイレース光は、位相板を通過することで一次ベッセルビームとなる。この一次ベッセルビームは、上述したようにビーム領域限定手段（１０２）によってビーム面内における位相の乱れがλ2／２以下となった良好なビームプロファイルのイレース光から生成されたものなので、二重共鳴吸収顕微鏡の超解像性を実現する中空イレース光として最適なものとなっている。
【００４０】
なお、この位相変調素子（１０４）は、たとえば、イレース光に対してオプティカルフラットな平行基板（透明であることも好ましい一態様である）上に、イレース光に対してその光軸を中心とした光軸周りにπだけ位相差を与え得る厚み分布をもつ光学薄膜が被膜されてなるものや、同様な平行基板に、イレース光に対してその光軸を中心とした光軸周りにπだけ位相差を与え得るエッチングが施されてなるものとすることができる。図１０の位相板は、そのように各領域毎に異なる厚み分布を持つ光学薄膜が被膜されたあるいはエッチングが施された構造となっている。
【００４１】
また、上述した位相変調素子（１０４）の他にも、たとえば、ビーム領域限定手段（１０２）を通過したイレース光に対し、その断面内において、同心円上に空間的位相分布を与える位相変調素子（１０４）や、たとえば図１１に例示したように、円形領域とこの円形領域の外周の円環領域にπの位相差を有する空間的位相分布を与える位相変調素子（１０４）を用いることもできる。この場合でも、二重共鳴吸収顕微鏡に最適な中空ビーム状のイレース光を実現できる。すなわち、内側円内の位相と外側輪帯の部分の位相が反転するため、このビームをレンズで集光すると中央で電場が相殺されて、良好な中空ビームが形成できるのである。なお良好な中空ビーム化には、内側の円の面積と外側の輪帯の面積の比率を調整する必要がある。
【００４２】
この場合の位相変調素子（１０４）は、たとえば、イレース光に対してオプティカルフラットな平行基板（透明であることも好ましい一態様である。）上に、イレース光に対してそのビーム断面内において同心円上に空間的位相分布を与え得る、あるいは円形領域とこの円形領域の外周の円環領域にπの位相差を有する空間的位相分布を与え得る厚み分布をもつ光学薄膜が被膜されてなるもの（たとえば位相板）や、同様な平行基板に、イレース光に対してそのビーム断面内において同心円上に空間的位相分布を与え得る、あるいは円形領域とこの円形領域の外周の円環領域にπの位相差を有する空間的位相分布を与え得るエッチングが施されてなるもの（たとえば位相板）とすることができる。
［蛍光信号検出］
この発明の二重共鳴吸収顕微鏡においては、上記のように極めて良好な中空ビーム形状のイレース光とポンプ光との重ね合わせにより蛍光領域の一部抑制が行われ、超解像性が発現する。しかしながら、この場合、蛍光領域、つまり観察領域はたとえば数１０ｎｍ以下という非常に狭い範囲に限定されることとなるため、極小の観察領域内に拡散した蛍光分子数は極端に少なくなり、蛍光発光強度が弱くなってしまう。このため、高感度の蛍光検出技術が必要となる。また、試料分子（あるいは蛍光ラベラー分子）によってはポンプ光やイレース光の波長が蛍光帯域に重なる場合があり、ポンプ光やイレース光の迷光が蛍光信号に混入することがある。もちろん他の染色分子以外からの蛍光も混入する場合もある。このため、Ｓ／Ｎの良好な顕微像を得るには、不要な光を蛍光信号から分離する技術も必要となる。
【００４３】
そこで、この発明の二重共鳴吸収顕微鏡では、高感度検出および高Ｓ／Ｎを可能とする、二重共鳴吸収顕微鏡に適した蛍光検出手段を使用することが望ましい。図１２は、その蛍光検出手段の一例を示したものである。たとえばこの図１２に例示した蛍光検出手段は、光電子変換面（２０１）、マイクロチャネルプレート（２０２）、フォスファースクリーン（２０３）、光ファイバーカップラー（２０４）、およびＣＣＤ検出器（２０５）を有し、いわゆるＩＣＣＤ（I Charge-Coupled Device）カメラを構成している。
【００４４】
まず、光（光子）が光電変換面（２０１）に入射すると、光電変換面（２０１）は、入射光子数に応じて背面より光電子を高い効率で放出する［光→電子変換］。放出された光電子は電界によりマイクロチャネルプレート（２０２）に引き込まれる。マイクロチャネルプレート（２０２）は、数１０μｍ程度のファイバーを束ねてプレート状にしたもであり、各ファイバーの両端面に高電圧が印加されている。光電子がファイバー面に当たると二次電子が放出され、ファイバー面内を衝突する毎に二次電子を発生させるので、マイクロチャネルプレートの出口からは非常に膨大な量の二次電子が放出される。この二次電子はフォスファースクリーン（２０３）を叩き、蛍光発光させる［電子→光変換］。この時点で、入射した１光子は膨大な光子数に増幅されたことになる。そして、フォスファースクリーン（２０３）からの増幅光子は、光ファイバーカップラー（２０４）によってＣＣＤ検出器（２０５）に導かれ、２次元像として検出される。
【００４５】
このようなＩＣＣＤカメラは、入射光子が１つでも検出できるので、極めて高感度な蛍光検出を実現でき、上述したように厳しい蛍光発生条件の二重共鳴吸収顕微鏡に有用である。なお、この蛍光検出手段としてのＩＣＣＤカメラの構成は、図１２に例示したものが基本構成となるが、この他にもリレーレンズなどのレンズ系や結像系などを有する場合があることは言うまでもない。
【００４６】
他方、高Ｓ／Ｎを実現するには、ＩＣＣＤカメラの前方において、蛍光の光路上に分光フィルターなどの分光素子や回折格子などの波長分散素子を設置する。
分光フィルターとしては、たとえばポンプ光およびイレース光や試料分子以外からの蛍光をカットするノッチフィルター、バンドパスフィルタ、シャープカットフィルターなどが可能である。この分光素子または波長分散素子とＩＣＣＤカメラとからなる蛍光検出手段により、ポンプ光またはイレース光もしくはその両方を蛍光信号から波長分離し、必要な蛍光強度のみを的確に測定することが可能となる。また、回折格子を用いた場合では、直接、レーザー１ショット毎の発光スペクトルを得ることができるので、コンピュータ等の計算機のソフトウェア上でデータ処理を施せば、不要波長光の除去が可能となる。
【００４７】
もちろん、必ずしも上記ＩＣＣＤカメラと分光素子・波長分散素子とを組み合わせた蛍光検出手段を用いる必要はない。たとえば、通常の蛍光検出器の前に分光素子または波長分散素子のみを設けるようにしても、不要波長光の除去は可能である。
【００４８】
なお、試料面から蛍光検出手段までの光路上にはスリットまたはピンホールを設置してもよい。この場合、特に光電変換面（２０１）の直前に設置することが好ましい。
【００４９】
さらにまた、光電子変換面（２０１）、マイクロチャネルプレート（２０２）、フォスファースクリーン（２０３）、ＣＣＤ検出器（２０５）の電極への印加電圧を時間制御する手段を備えておく態様も可能である。この場合、印加電圧の時間制御は、たとえばｏｎ／ｏｆｆスイッチングにより行うことができ、そのスイッチング応答時間は試料分子（または蛍光ラベラー分子）の蛍光時間より短いこと、また電圧印加時間は試料分子（または蛍光ラベラー分子）の蛍光時間より長いことなどの設定が好ましい。
【００５０】
［ポンプ光・イレース光照射：パルス幅・照射タイミング調整］
この発明の二重共鳴吸収顕微鏡において、ポンプ光光源およびイレース光光源として色素レーザーを用いる場合、一般に色素レーザーでは、ポンプ光のパルス幅よりも、波長変換されたイレース光のパルス幅の方が若干短くなる。また、光路等の調整が行われないと、ポンプ光とイレース光のパルスが試料面に到達する時刻も異なってしまう。したがって、観察に必要でない領域に関しては、蛍光を極力抑制したいにもかかわらず、イレース光の照射時間の短さや、ポンプ光とイレース光の照射時間のオーバーラップが不完全であるため、蛍光抑制が不十分になってしまう恐れがある。
【００５１】
このため、この発明の二重共鳴吸収顕微鏡では、より効果的に蛍光抑制を発現させるべく、ポンプ光およびイレース光のパルス幅を、たとえば図１３に示したように設定することが好ましい照射態様である。
【００５２】
具体的には、イレース光のパルス幅をポンプ光のそれより長くし、且つ完全にポンプ光の照射時間がイレース光のそれとオーバーラップするように設定する。
これにより、ポンプ光の照射領域の一部にイレース光の照射領域を重ねて、重なった領域におけるＳ1状態の試料分子を確実にＳ2状態へ励起させることができ、蛍光抑制効果を向上させることができる。
【００５３】
これらの設定を行う具体的態様について説明する。まず、図１４は、イレース光のパルス幅がポンプ光のパルス幅よりも長くなるように、イレース光のパルス幅を調整するパルス幅調整手段の一例を示したものである。この図１４に例示したパルス幅調整手段は、分光を行う一つのハーフミラー（３０１）と、このハーフミラー（３０１）を光路上に含むループ光路を形成する反射光学系としての複数のプリズム（３０２）とを有するパルスストレッチャー光学系を構成している。この場合、入射光は、まずハーフミラー（３０１）により第一透過光と第一反射光に分離される。第一反射光は、各プリズム（３０２）で光路が変更されて、ハーフミラー（３０１）へ戻り、第二透過光と第二反射光に分離される。第二反射光は第一透過光と同じ光路を通過し、第二透過光は各プリズム（３０２）を介して同じループ光路を通過してハーフミラー（３０１）で第三透過光と第三反射光に分離される。このようにしてハーフミラー（３０１）による分光およびプリズム（３０２）によるループが繰り返される。したがって、イレース光をこのパルスストレッチャー光学系に入射させることで、ループ光路の分だけ遅延したパルスが次々と発生し、結果的にループ光路を抜け出たパルスの時間幅は等価的に広がることになる。その結果、ポンプ光のそれよりも長いパルス幅のイレース光を容易に生成することができる。
【００５４】
また、このようにパルス幅が拡大されたイレース光とポンプ光との照射時間の完全オーバーラップは、両光の試料への到達時間を調整することで可能となる。
この調整は、たとえばポンプ光およびイレース光の光路差の調整により実現できる。すなわち、光は大気中で１ｎｓｅｃに約３０ｃｍだけ進むので、その比でポンプ光とイレース光の光路に差を与えれば、これら２つのパルス光が試料表面に到達する時間を任意に調節できる。このような光路調整による照射タイミング調整手段としては、たとえば、直線移動ステージおよびそれに搭載されたプリズムまたはミラーなどからなる遅延光学系を用いることができる。この場合、直線移動ステージを移動させて、プリズムまたはミラーを介した入射光の光路距離を調整することで、両光の到達時間の調整が可能となる。
【００５５】
また、ポンプ光とイレース光が、それぞれ独立したパルスレーザー（たとえば２台のＮｄ：ＹＡＧパルスレーザー）から発振される場合には、各パルスレーザーのＱスイッチ信号を電気的に調整する、つまりＱスイッチ信号の発生時間を相対的にずらすことによっても、両光の試料到達時間を調整できる。たとえば、パルスジェネレーターを用い、時間差をもつ二つのトリガーパルスを発生させ、それらを各パルスレーザーに与えることで、Ｑスイッチを制御できる。
【００５６】
［ポンプ光・イレース光照射：光軸調整］
この発明の二重共鳴吸収顕微鏡においては、超解像性を十分に引き出すべく、ポンプ光およびイレース光の光軸を一致させることが望ましい。この光軸アライメントは、実際の試料観察の前に、標準試料を用いて、その標準試料の蛍光像を観察することで可能となる。
【００５７】
より具体的には、まず、ポンプ光励起およびイレース光励起のいずれでも蛍光可能な分子を、ポンプ光およびイレース光の両方に対して透明な基板に均一に塗布することにより作成された標準試料を用いる。そして、この標準試料にポンプ光およびイレース光を同時照射して、そのときの蛍光像の面積と輝度を測定する。
もし、ポンプ光とイレース光との重なりが完全であれば、すなわちポンプ光とイレース光の光軸が一致していれば、面積は最小となり、かつ輝度が最大となる。
したがって、この場合の蛍光像面積が最小、輝度が最大となるように光軸調整することで、完全な光軸アライメントが実現できる。
【００５８】
なお、蛍光像を撮像する手投が前述のＩＣＣＤカメラであれば、弱いレーザー光で励起した微弱な蛍光像であっても観察できる。このため、ポンプ光やイレース光の迷光が背景光として蛍光像に混入したとしても、微弱であるので、面積・輝度測定に重要な影響を及ぼすことはなく、精度の高い光軸調整が可能となる。
また、迷光の影響をさらに減少させたければ、前述したように分光素子や波長分散素子を光路上に設ければよい。
【００５９】
［レーザー走査］
この発明の二重共鳴吸収顕微鏡は、空間分解能が非常に高く、１画素に対応する観察領域の１辺が１００ｎｍ以下となり得る。逆に言うと、このような超空間分解能を確実に発現させるには、たとえばこの二重共鳴吸収顕微鏡をレーザー走査型顕微鏡として用いた場合、ポンプ光およびイレース光の試料に対する走査も高精度なものとする必要がある。レーザー走査型顕微鏡では、集光点と試料を相対的に平面移動させて一点毎の蛍光信号を測定し、情報処理技術を組合せて、蛍光信号を二次元画像化している。
【００６０】
そこで、この発明の二重共鳴吸収顕微鏡では、そのナノメートルオーダーの空間分解能に対応させるために、ナノメートルオーダーでのポンプ光およびイレース光の走査あるいは試料の移動が可能な機構を有していることが望ましい。ポンプ光・イレース光の走査機構としては、たとえば、ポンプ光・イレース光の光路上のミラーを揺動させることで微細走査を可能とした揺動ミラー機構を用いることができる。また、試料の移動機構としては、たとえば、電磁モータやピエゾ圧電素子（圧電振動子とも呼ぶ）により二次元移動可能とされた試料ステージ機構を用いることができる。もちろん、前述したようにポンプ光とイレース光を同軸にアライメントすることにより、ナノメートルオーダーの微小移動・走査がより確実なものとなる。
【００６１】
［色素レーザー］
さて、この出願の発明は、前述したような従来の色素レーザーの問題点を解消すべく、機能性・保守性・経済性に優れた新しい色素レーザーをも提供する。この発明の色素レーザーは、少なくとも二つ以上の量子準位を持つ分子を色素として分散させてなる固体レーザー媒質、およびこの固体レーザー媒質を励起させる短パルスレーザーを有していることを特徴とするものである（以下、固体色素レーザーと呼ぶこととする）。
【００６２】
この固体色素レーザーでは、まず、そのレーザー媒質は色素分子を含んだ固体媒質となっているので、従来の色素レーザーの液体媒質とは全くことなる。このため、たとえば、ワンタッチ交換が可能なカートリッジ型の固体色素レーザー媒質が可能となるなど、他の光学系を変更することなく、極めて簡単な媒質交換を実現でき、メンテナンス等の負担を緩和することができる。
【００６３】
固体レーザー媒質の生成には、たとえばゾルゲル法を用いることができる。無機溶液または有機溶液に上記色素分子を分散させておき、その溶液をゾルゲル法により固体化させるのである。生成される固体は、破損レーザー強度閾値が極めて高いことから、無機ガラスまたはＰＭＭＡなどが好ましい。ゾルゲル法によれば様々な形状の固体を生成できるので、レーザーに適当な形状の固体レーザー媒質を容易に実現することもできる。ゾルゲル法の出発溶液や各種条件などは、無機ガラスまたはＰＭＭＡなどのようにレーザー媒質として適した固体を生成できればよいので、特に限定されない。
【００６４】
また、ＰＭＭＡを初めとする固体有機材料を媒質として色素を分散させる場合には、ゾルゲル法だけでなく、溶融加熱法によっても固定レーザー媒質を生成することができる。この場合では、ＰＭＭＡなどの固体有機材料を溶融加熱し、その中に色素を添加して冷却する。これにより簡単に、優れた量産性で固体レーザー媒質を製造できる。
【００６５】
色素分子としては、たとえば二重結合またはベンゼン環を含むものを用いることができる。具体的には、たとえば前記に列挙した分子などを用いることができる。
【００６６】
他方、この固体色素レーザーでは、短パルスレーザー励起を利用しているので、二重共鳴吸収顕微鏡におけるポンプ光光源やイレース光光源として用いることで、超解像性の実現に極めて有用なものとなる。具体的には、二重共鳴吸収顕微鏡において蛍光抑制を実現するには、多くの試料分子（特に蛍光ラベラー分子）の蛍光寿命がナノオーダーという極めて短いものであるために、ポンプ光およびイレース光のパルス幅も極短である必要がある。そこで、上記の固体色素レーザーを用いれば、短パルスレーザー励起によって、試料分子（または蛍光ラベラー分子）の蛍光寿命よりも短いナノオーダー（たとえば１０ｎｓｅｃ以下、さらには１ｎｓｅｃ以下）のパルスポンプ光およびパルスイレース光を発振させることができ、蛍光抑制を効果的に実現できるのである。
【００６７】
また、ナノオーダの極短パルス幅で固体色素レーザーの色素分子を励起させると、色素分子がレーザー発振に寄与しない３重項準位に留まることがないため、レーザー発振効率を高くすることも可能となる。
【００６８】
またさらに、この固体色素レーザーは、従来の液体色素レーザーでは不可能であった、容易な波長変換をも可能ならしめる。たとえば図１５に例示したように、周期的な光強度分布をもつ色素励起光（４０２）を短パルスレーザー（４０１）から、ハーフミラー（４０４）や反射ミラー（４０５）などを介して、固体レーザー媒質（４０３）の１面に対し異なる２方向から照射すると、色素励起光（４０２）の波長オーダーの干渉パターン（４０６）が形成される。この場合、固体レーザー媒質（４０３）内には周期的な構造をもつ反転分布が形成され、その周期にマッチングした波長で色素励起光（４０２）の照射面と平行な方向にレーザー光（４０７）が発振される。したがって、色素励起光（４０２）の照射方向を変えることによって干渉パターンの周期間隔が異なることから、レーザー光（４０７）の波長を変化させることが可能となる。すなわち、色素励起光（４０２）の照射方向を変えるだけで、試料分子（または蛍光ラベラー分子）に合わせた波長λ1のポンプ光や波長λ2のイレース光を発振できるのである。また、短パルスレーザー（４０１）からのレーザー光を波長λ1のポンプ光として用い、固体レーザー媒質（４０３）からのレーザー光を波長λ2のイレース光として用いることで、一つの固体色素レーザーのみでポンプ光光源およびイレース光光源の両方を実現することができる。
【００６９】
なお、レーザー発振波長はオプティカルグレーティングを用いて制御されるように構成されていてもよい。さらにまた、波長走査を励起光とプリズムの空間的位置制御により行う機構が付加されていてもよい。
【００７０】
以上のように、この発明の固体媒質レーザーは、機能性・保守性・経済性に優れたものであり、二重共鳴吸収顕微鏡の各光源として用いた場合、顕微鏡システムとしての保守性・経済性等を向上させるだけでなく、超解像性の実現をより確実、且つより容易ならしめることができる。二重共鳴吸収顕微鏡に極めて有用なレーザーなのである。もちろん、二重共鳴吸収顕微鏡以外の蛍光顕微鏡などにおいても用いることができるのは言うまでもない。
【００７１】
この出願の発明は、以上のとおりの特徴を持つものであるが、以下に実施例を示し、さらに具体的に説明する。
【００７２】
【実施例】
［実施例１］
図１６は、この発明の二重共鳴吸収顕微鏡の一実施例を示した概略図である。
この図１６に例示した二重共鳴吸収顕微鏡は、レーザー走査型蛍光顕微鏡を構成しており、ポンプ光およびイレース光を集光してスポット化し、試料（５２３）をそのスポットと相対的に走査させながら蛍光を検出し、蛍光信号をコンピュータ（５０１）を用いて画像化するシステムとなっている。
【００７３】
このシステム全体は、コンピュータ（５０１）により制御される。コンピュータ（５０１）は、レーザーコントローラー（５０２）を介して、基本光源であるＮｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）の発振のタイミングを制御する。それと同時に、試料ステージコントローラー（５０３）を介して、試料ステージ（５２４）の移動をレーザー発振のタイミングと同期させながら制御し、試料（５２３）を二次元走査する。また、同様にレーザー発振と同期させてカメラコントローラー（５０４）を介して、ＩＣＣＤカメラ（５４０）から試料（５２３）の蛍光信号を取得する。
【００７４】
本実施例では、試料（５２３）は蛍光ラベラー分子により染色されたものとし、その蛍光ラベラー分子としてはローダミン系分子を想定する。図１７は、ローダミン系分子の一つであるローダミン６Ｇの分光データを例示したものである。
この１６に例示したように、Ｓ0→Ｓ1励起に相当する吸収バンドが５３０ｎｍ前後に存在し、Ｓ1→Ｓ2励起および蛍光発光帯域が６００ｎｍ前後に存在する。したがって、波長λ1＝５３２ｎｍのポンプ光でＳ0→Ｓ1励起させ、波長λ2＝５９９ｎｍのイレース光でＳ1→Ｓ2励起させることで、二重共鳴吸収過程と誘導放出過程により、５９９ｎｍ以外の波長の蛍光は消失する。
【００７５】
波長５３２ｎｍ光は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）の基本波（波長１０６４ｎｍ）をＢＢＯ結晶やＫＴＰ結晶などからなる波長変調素子（５０７）により２倍波変調することで生成できる。波長５９９ｎｍ光は、Ｂａ（ＮＯ3）2等のラマンシフター（５１２）で波長５３２ｎｍを５９９ｎｍに変換することで生成できる。波長変調素子（５０７）からの波長５３２ｎｍ光は、ハーフミラー（５０８）により分光され、その透過光は、テレスコープ（５０９）により適正サイズの平行光に拡大されて、ポンプ光として利用される。他方、反射光は、ラマンシフター（５１２）によって波長５９９ｎｍ光に変調されて、イレース光として利用される。
【００７６】
一般にＮｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）は、共振器にガウシアンミラーを用いているため、前述したとおり、ビームの光軸近傍の中央部の波面は比較的揃っているが、ビーム周縁部は波面の乱れが多くなり、中央部と比較すると位相差が生じる。このため、ビームプロファイルの良好なレーザー光を取得すべく、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）からのレーザー光をピンホールプレート（５０６）を通すことで、その光軸近傍の中央部のみを取り出すようにする。このレーザー光ビームを、上記のように波長変調素子（５０７）やラマンシフター（５１２）を通すことで、二重共鳴吸収顕微鏡に最適な、波面が揃った良好なポンプ光およびイレース光を生成することができる。
【００７７】
このように良好なビームプロファイルをもつイレース光は、テレスコープ（５１３）で適正サイズの平行光に拡大された後、位相板（５１４）に入射する。本実施例では、イレース光の波長λ2は５９９ｎｍであるので、位相板（５１４）として、図１８に例示したようにガラス基板をエッチングしたものを利用した。
ガラスの屈折率は１．４６（波長５９９ｎｍ）であるため、イレース光の１／４波長はガラス基板の厚み３２５．５ｎｍに対応する。したがって、図１８に例示したように、位相板（５１４）の領域を4分割し、隣接する各領域で位相差が１／４波長ずつになるように厚さを設定してエッチングしておけば、イレース光を理想的に中空ビーム化させることができる。すなわち、イレース光を、その光軸と位相板（５１４）の中心とを一致させるようにして位相板（５１４）を通過させることで、位相板（５１４）の中心部分で対向した各領域を通るイレース光の光軸付近領域の位相が反転するため、その光軸付近領域の電場強度はゼロとなる。これにより、蛍光抑制による超解像性の発現に理想的な中空ビーム形状をもつイレース光が得られるのである。このように中空ビーム化されたイレース光は、一次ベッセルビームとなっている。
【００７８】
なお、位相板（５１４）としては、エッチングの代わりに弗化マグネシウム等の薄膜を位相差を与えるものとして基板上に蒸著したものを用いてもよい。また、理想的な中空ビーム・イレース光が得られる限り、ピンホールプレート（５０６）、ラマンシフター（５１２）、テレスコープ（５１３）、位相板（５１４）の順序は変更してもよいことは言うまでもない。
【００７９】
ポンプ光およびイレース光は、各々、反射ミラー（５１０）および反射ミラー（５１５）を介してビームコンバイナー（５１１）に入射され、同軸光となる。
もちろん両光はテレスコープ（５０９）（５１３）によって同一サイズとされている。同軸光とされたポンプ光およびイレース光は、一種のテレスコープ光学系であるビームリデューサー（５２０）によって、集光対物レンズ（５２２）の開口一杯に両光を取り込むべく、集光対物レンズ（５２２）の口径と等しいサイズに調整される。そして、集光対物レンズ（５２２）により試料（５２３）面上に集光される。
【００８０】
本実施例では、前述の図１３に例示したように、イレース光のパルス幅をポンプ光のそれよりも長くし、且つ試料（５２３）に対するポンプ光の照射時間がイレース光のそれと完全にオーバーラップするような照射設定を実現すべく、イレース光に対するパルス幅調整手段としてのパルスストレッチャー光学系（図示していないが、前述の図１４に例示した構成を有するもの）が反射ミラー（５１５）および反射ミラー（５１６）の間に備えられており、且つ、照射タイミング調整手段として、直線移動ステージ（５１８）およびそれに搭載されたプリズム（５１９）からなる遅延光学系が反射ミラー（５１６）による反射光路側に備えられている。
【００８１】
この場合、図１４に例示したパルスストレッチャー光学系によって、前述したように、パルス幅がポンプ光のそれよりも長くなるように拡大されたイレース光は、続いて、遅延光学系のプリズム（５１９）に入射される。このとき、直線移動ステージ（５１８）を、イレース光のポンプ光に対する遅延距離だけ移動させ、プリズム（５１９）を介したイレース光の折り返し距離を調整する。遅延距離は、到達時間差１ｎｓｅｃに対して３０ｃｍとなる。この遅延距離は、たとえばマイクロメーター等を用いて測定でき、その測定結果を直線移動ステージ（５１８）の移動距離に反映させればよい。これにより、イレース光のパルス幅をポンプ光のそれよりも長く、且つ完全にポンプ光の照射時間がイレース光のそれとオーバーラップする、蛍光抑制の発現に最適な照射が可能となる。
【００８２】
さて、このようにしてポンプ光およびイレース光が試料（５２３）に照射されると、ポンプ光の照射領域の一部に中空イレース光が重なっていることで、両光が重なり合っている照射領域は蛍光抑制領域Ａ1となり、中空イレース光の中空部分であるポンプ光のみの照射領域は蛍光領域Ａ0となり（図６参照)、この蛍光領域Ａ0（＝観察領域）のみからローダミン系分子の蛍光が発生する。
【００８３】
この蛍光は、再び集光対物レンズ（５２２）を通過し、接眼レンズ（５３８）から分光器（５３９）へ入射する。分光器（５３９）は、たとえば図１９に例示したように、コリメータ球面鏡（５３９１）、フォーカシング球面鏡（５３９２）、および機械的に切り替え可能な回折格子（５３９３）を基本光学系として備えている。入射スリット（５３９５）を通過した蛍光は、反射ミラー（５３９４）でコリメータ球面鏡（５３９１）に入射され、コリメータ球面鏡（５３９１）で回折格子（５３９３）上へ集光される。そして、回折格子（５３９３）上で波長分解された蛍光は、フォーカシング球面鏡（５３９２）でＩＣＣＤカメラ（５４０）のＣＣＤ素子上に結像される。
【００８４】
このときのＩＣＣＤカメラ（５４０）で得られる信号は、レーザー１ショット当りの蛍光スペクトルである。レーザー１ショットに同期させて試料ステージ（５２４）を二次元移動させて、そのときの蛍光スペクトルをコンピュータ（５０１）により積算画像化することで、試料（５２３）の二次元蛍光像を構築することができる。また、前述したように蛍光信号にポンプ光およびイレース光が混在している場合には、コンピュータ（５０１）による画像生成において、ポンプ光およびイレース光の波長成分の信号を取り除き、本来の蛍光波長成分のみの信号を用いて画像化すれば、十分な超解像性が発現し、且つ高いＳ／Ｎの蛍光像を得ることができる。
【００８５】
また、超解像性をさらに向上すべく、分光器（５３９）の前に、ポンプ光波長をカットするノッチフィルター（５３６）およびイレース光波長をカットするノッチフィルター（５３７）を挿入しておいてもよい（図１６中では、分光器（５３９）への接眼レンズ（５３８）の前に挿入されている）。これにより、分光器（５３９）に入射する前にポンプ光およびイレース光を蛍光信号から分離して、本来の蛍光成分のみをスペクトル分析することができ、蛍光信号のいわゆる純度を高め、より効果的に超解像性を発現させることができる。もちろん、ノッチフィルター（５３６）（５３７）以外にも、必要に応じてバンドパスフィルターやシャープカットフィルターを挿入し、蛍光ラベラー分子からの蛍光以外の不要な波長成分をカットするようにしてもよい。
【００８６】
なお、仮に分光器（５３９）の入射スリット（５３９５）を開いて、回折格子（５３９３）のゼロ次光をＩＣＣＤカメラ（５４０）のＣＣＤ素子上に結像すれば、試料（５２３）面からの蛍光像そのものとなる。特にこの場合では、Ｓ／Ｎ向上のため、上記のノッチフィルター（５３６）（５３７）や、バンドパスフィルターあるいはシャープカットフィルターを挿入しておくことが好ましい。
【００８７】
次に、本実施例の試料移動機構について説明する。前記のようにコンピュータ制御される試料ステージ（５２４）は、ＸＹＺφθ方向への５次元移動ステージとなっている。
【００８８】
まず、光軸方向であるＺ方向への移動には、たとえば、ピエゾ圧電素子の一種を用いたインチワームステージ機構を用いることができ、ローターリーエンコーダーでその絶対位置をモニターできるように構成されていることが好ましい。
【００８９】
一般に、開口数の大きい対物レンズで集光すると、焦点深度は非常に浅くなり、その焦点位置の探索が非常に困難である。たとえば、開口数ＮＡのレンズで集光したときの、焦点からδｚだけ離れた点における集光ビームの広がりｄは、以下の式で与えられる。
【００９０】
【数２】
0004551528.tif 000003
【００９１】
ここで仮にδｚが６００ｎｍであるとすると、ｄは約４００ｎｍ程度となる。
これは、ポンプ光を回折限界まで絞ったサイズと同等であり、基本的には１μｍ以下の精度で位置制御を行なう必要があることを意味している。そのため、ピエソ圧電素子の一種を用いたインチワームステージは、サブμｍでの位置制御が可能なために、超解像性を発現するこの発明の二重共鳴吸収顕微鏡に適したステージである。また、絶対位置をモニターすることで、試料（５２３）を交換したとしても、迅速に観察領域を発見できる。
【００９２】
図２０は、試料ステージ（５２４）のＸＹ方向の二次元移動機構の一例を示したものである。この図２０に例示したＸＹ二次元移動機構は、板バネ（６０１）および二つの積層型ピエゾ圧電素子（６０２）（６０３）から構成されており、積層型ピエゾ圧電素子（６０２）（６０３）で板バネ（６０１）を駆動し、一方の積層型ピエゾ圧電素子（６０２）でＸ軸方向へ、他方の積層型ピエゾ圧電素子（６０３）でＹ軸方向へ、試料ステージ（５２４）を光軸と直交する面内において二次元移動させる。また、図２１に例示したように、直接、積層型ピエゾ圧電（６０２）（６０３）を試料ステージ（５２４）に取り付けた移動機構を用いることもできるが、図２０のように板バネ（６０１）を介した機構の方が、走査面の歪みによる画質劣化の発生をより効果的に抑制することができる。
【００９３】
また、試料ステージ（５２４）にはθφ方向の駆動機構をも設けているが、これらは試料（５２３）表面とポンプ光およびイレース光の光軸とを正確に直交させるために付加されたものである。
【００９４】
以上の五次元移動機構による試料ステージ（５２４）は、試料（５２３）に対するメカニカルスキャンを前提としている場合のものであるが、たとえば、揺動するガルバノミラーを光路上に設けて、レーザービーム自体を走査することもできる。
【００９５】
さてここで、ポンプ光およびイレース光の光軸調整の一例について説明する。
光軸調整用の標準試料としては、ポンプ光およびイレース光の両光に対して透明な薄膜にローダミンＢを分散させてなるものを用いる。ローダミンＢは、ポンプ光およびイレース光の両光によって高い確率でＳ0→Ｓ1励起が起きるため、十分な量の蛍光を観測することが可能となる。この標準試料としての薄膜は、たとえば、溶液状態のＰＭＭＡにローダミンＢを分散させて、スライドガラスの上に厚さ数μｍでスピンコートすることで製作される。
【００９６】
光軸調整の手順としては、上記標準試料にポンプ光およびイレース光を同時照射し、発生される蛍光をＩＣＣＤカメラ（５４０）を介してコンピュータ（５０１）で観察しながら、ポンプ光の集光点とイレース光の集光点が一致するように、ポンプ光の光路上にある反射ミラー（５１０）またはイレース光の光路上にある反射ミラー（５１５）の傾きなどを調節して集光点の位置を移動させる。このとき、ポンプ光およびイレース光の集光点が一致するときの蛍光像は、発光面積が最小となり、且つ、発光輝度が最大となるので、そのような蛍光像が得られるように光学系を調整すれば、ポンプ光およびイレース光の光軸一致が実現される。
【００９７】
なお、図１６において、（５３３）はハーフミラー、（５３４）は照明光用レンズ、（５３５）は照明光源であり、これらは光軸調整のために用いられる光学系である。
【００９８】
また、図１６に例示したように、光軸調整のための別の顕微鏡光学系を、試料（５２３）の後側に設けておいてもよい。図１６において、（５２５）は透過光用レンズ、（５２６）はハーフミラー、（５２７）は照明光用レンズ、（５２８）は照明光源、（５２９）（５３０）はポンプ光およびイレース光をカットするノッチフィルター、（５３１）は接眼レンズ、（５３２）はＩＣＣＤカメラであり、これらによって光軸調整用の顕微鏡光学系が構成されている。
【００９９】
以下に、上述したシステム全体の制御について説明する。
【０１００】
本実施例の顕微鏡システムは、電気的制御を行うユニットとして、ＩＣＣＤカメラ（５４０）（上記光軸用顕微鏡光学系を併せ備えた場合にはＩＣＣＤ（５３２）も）を制御するカメラコントローラー（５０４）と、試料ステージ（５２４）を制御する試料ステージコントローラー（５０３）と、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）を制御するレーザーコントローラー（５０２）とを有しており、これらのコントローラーはコンピュータ（５０１）により集中管理される。
【０１０１】
ＩＣＣＤカメラ（５４０）に対しては蛍光信号の検出時間を決めるゲートパルスの発生と取得された蛍光信号のコンピュータ（５０１）ヘの送信、試料ステージ（５２４）に対してはピエゾ圧電素子（６０２）（６０３）（図２０、図２１参照）のステップ移動、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）に対してはＱスイッチ信号の制御がそれぞれ行われる。システムの処理シーケンスとしては、
１．Ｎｄ：ＹＡＧレーザーの発振
２．ＩＣＣＤカメラのゲートパルス発生
３．データ取り込み
４．ピエゾ圧電素子のステップ移動
というサイクルを、取得する画像の画素数分だけ繰り返すことになる。ＩＣＣＤカメラ（５４０）からの各画素毎の蛍光スペクトルは、コンピュータ（５０１）にて数値データとして取り込まれ、全画素分のデータを取得後、数値演算処理によって、バックグラウンド信号として混在しているポンプ光およびイレース光の波長成分を除去し、その他の波長成分の積分値を１画素の画像信号とする。このようにして得られた画像データは必要に応じて、ＣＲＴやプリンター等の外部出力装置に出力されたり、ＨＤＤやＦＤＤ等の記憶装置に記憶される。
【０１０２】
［実施例２］
図２２は、波長変換自在なこの発明の固体色素レーザーの一実施例を示した概略図である。
【０１０３】
この図２１に例示した固体色素レーザーでは、固体レーザー媒質（７０３）の励起面に、それに密着してプリズム（７０５）が設置されている。この場合、励起光源としての短パルスレーザー（７０１）より色素励起光（７０２）を、固体レーザー媒質（７０３）の励起面へ斜め方向から入射すると、プリズム（７０５）と固体レーザー媒質（７０３）の境界面において直接透過光とプリズム内部で反射した光とによる干渉が起こり、干渉縞（７０６）のピッチで固体レーザー媒質（７０３）内に周期的な反転分布が形成される。このとき、固体レーザー媒質（７０３）内での定在波の波長が反転分布のピッチで決定するフラッグ条件を満たすとき、その波長が共振条件を満たすことになりレーザー光（７０４）が発振される。干渉縞（７０６）のピッチは色素励起光（７０２）の入射角により変化することを利用して、干渉縞（７０６）のピッチを任意に設定し、固体レーザー媒質（７０３）からの発振波長を変化させることが可能である。
【０１０４】
したがって、この固体色素レーザーによって、固体レーザー媒質（７０３）の波長チューニングレンジ内で波長変換が実現するのである。発振波長領域を変えたい場合には、別の色素分子を分散させた固体レーザー媒質（７０３）を交換すればよく、この交換も固体であるので簡単に行うことができる。なおこのとき、色素分子の濃度は共振条件が変わらない様に調整しておく。
【０１０５】
また、図２２では、エンドミラー（７０７）で共振器を構成しているが、このときのレーザー発振条件は、エンドミラー（７０７）、固体レーザー媒質（７０３）の加工精度、プリズム（７０５）の仕様で決まる。つまり、発振されるレーザー光の波面は、短パルスレーザー（７０１）からの色素励起光（７０２）の波面の質には依存しないこととなる。したがって、固体色素レーザーの共振器を確実に構成することで、波面が均一なレーザー光を発振させることができる。このレーザー光を前述したような位相板（図１０および図１１参照）を通すことで、蛍光抑制に最適な中空ビーム形状を持つイレース光を生成することができる。
【０１０６】
ここで、この図２２の固体色素レーザーにおいて、具体的に以下のような固定レーザー媒質（７０３）および短パルスレーザー（７０１）を用いた場合について説明する。なお、試料は、蛍光ラベラー分子としてのローダミン６Ｇで染色した生体試料であるとする。
【０１０７】
まず、固体レーザー媒質（７０３）としては、ローダミンＢを濃度１ｍｍｏｌ／ｌでＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）に分散させてなるブロック状（５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ）のものを用いる。この固体レーザー媒質（７０３）のレーザー発振面と色素励起光入射面はほぼオプティカルフラットで研磨されているとする。
【０１０８】
短パルスレーザー（７０１）としては、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザーを用いる。この場合、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザーの第二高調波（５３２ｎｍ）による励起によって、上記の固体レーザー媒質（７０３）からの発振波長が５９０ｎｍ前後で変換効率が最大となる。この波長帯域はローダミン６ＧのＳ1→Ｓ2励起に必要な波長λ2を含んでいる。また、この第二高調波（５３２ｎｍ）は、ローダミン６ＧのＳ0→Ｓ1励起に必要なポンプ光の波長λ1と同じである。したがって、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザーからの第二高調波（５３２ｎｍ）はそのまま色素励起光およびポンプ光として用いることができ、それにより固体レーザー媒質（７０３）から発振されるレーザー光（７０４）はイレース光として用いることができる。なお、一台のＮｄ：ＹＡＧパルスレーザーからの第二高調波を色素励起光およびポンプ光として用いる場合には、第二高調波を分光させるハーフミラーなどの分光素子を第二高調波の光路上に挿入すればよい。
【０１０９】
図２３は、この発明の固体色素レーザーの別の一実施例を示した概略図である。この図２２に示した例では、固体レーザー媒質（７０３）からの発振波長の制御を、外部共振器である回折格子（７０８）で行うようになっている。この場合、回折格子（７０８）を回転することで発振波長を選択することができる。
【０１１０】
以上の固体色素レーザーをこの発明の二重共鳴吸収顕微鏡においてポンプ光光源またはイレース光光源もしくはその両方として用いることにより、ポンプ光またはイレース光の容易な発生が実現でき、二重共鳴吸収・蛍光抑制を様々な試料分子（または蛍光ラベラー分子）に容易に適応させることができるようになる。
また、前述したように、励起光源がサブナノ秒パルスレーザーが可能な短パルスレーザー（７０１）であるので、二重共鳴吸収・蛍光抑制のさらに確実な発現を図ることができる。分散した色素分子が３重項状態に蓄積されることがないので、高効率でのレーザー発振が可能でもある。
【０１１１】
この固体色素レーザーの固体レーザー媒質は、前述したようにたとえばゾルゲル法を用いて製造することができる。以下に、ゾルゲル法を用いいた場合の一例について説明する。
【０１１２】
ゾルゲル法では、たとえばまず、金属アルコキシド−水−アルコール酸からなる溶液を適温で攪拌することで、加水分解、宿重合が生じ、金属酸化物のコロイド状の粒子が生成したゾルに変化する。さらに反応を進行させると全体がゲルとなる。このゾル→ゲル変化の間に任意形状の整形が可能であり、たとえばディップ法によるコーディング膜状、紡糸によるファイバー状、あるいはバルク状、粉末状、粒状など様々な加工が可能である。次いで、必要条件を選択してゲルを乾燥すると、多孔質の乾燥ゲルが得られる。この乾燥ゲルを、適温にゆっくり加熱すると、さらに重合が進み金属化合物が得られる。
【０１１３】
このようなゾルゲル法を用いて、たとえば、予めガラス溶液中に色素分子を分散させ、上述の過程によってガラス媒質に色素分子がドープされた固体色素を生成することができる。また、有機分子を無機化合物の端末基に化学重合させることで、固体色素の媒質に有機と無機によるハイブリット分子構造を持たせることも可能である。
【０１１４】
この発明は以上の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【０１１５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したように、この出願の発明の二重共鳴吸収顕微鏡により、両光なビームプロファイルの中空ビーム・イレース光の実現や、優れた蛍光信号検出の実現や、ポンプ光およびイレース光の優れた照射態様の実現などによって、超解像性のより効果的、且つ確実な発現が可能である。また、煩雑な色素交換が解消された固体色素レーザーが実現され、これをポンプ光・イレース光光源として用いることで、二重共鳴吸収顕微鏡の操作性・保守性等の向上が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】基底状態の試料分子の電子配置を例示した図である。
【図２】Ｓ1状態に励起された試料分子の電子配置を例示した図である。
【図３】Ｓ2状態に励起された試料分子の電子配置を例示した図である。
【図４】脱励起した試料分子の電子配置を例示した図である。
【図５】二重共鳴吸収過程を例示した概念図である。
【図６】二重共鳴吸収過程を空間的に例示した概念図である。
【図７】ポンプ光およびイレース光の一部重合せおよびそれによる蛍光抑制を例示した概念図である。
【図８】光紬を原点とした一次ベッセルビームの断面の位相分布を例示した概念図である。
【図９】イレース光の中空ビーム化（一次ベッセルビーム）の一例を示した概略図である。
【図１０】位相変調素子としての位相板の一例を示した概略図である。
【図１１】位相変調素子としての位相板の別の一例を示した概略図である。
【図１２】ＩＣＣＤカメラの一例を示した概略図である。
【図１３】ポンプ光およびイレース光の照射態様を例示した図である。
【図１４】パルスストレッチャー光学系の一例を示した概略図である。
【図１５】この発明の固体色素レーザーの一例を示した概略図である。
【図１６】この発明の一実施例である二重共鳴吸収顕微鏡を用いたレーザー走査型蛍光顕微鏡システムを例示した概略図である。
【図１７】ローダミン６Ｇの吸収特性（実線）および蛍光特性（点線）を例示した図である。
【図１８】ガラス基板のエッチングによる位相板の一例を示した概略図である。
【図１９】図１６の顕微鏡システムにおける分光器の内部構造を例示した概略図である。
【図２０】図１６の顕微鏡システムにおける試料ステージのＸＹ二次元移動機構の一例を示した概略図である。
【図２１】試料ステージのＸＹ二次元移動機構の別の一例を示した概略図である。
【図２２】この発明の一実施例である固体色素レーザーを例示した概略図である。
【図２３】この発明の別の一実施例である固体色素レーザーを例示した概略図である。
【符号の説明】
１０１  コヒーレント光源
１０２  ビーム領域限定手段
１０３  ビーム径拡大用光学素子
１０４  位相変調素子
２０１  光電子変換面
２０２  マイクロチャネルプレート
２０３  フォスファースクリーン
２０４  光ファイバーカップラー
２０５  リレーレンズ
２０６  ＣＣＤ検出器
３０１  ハーフミラー
３０２  プリズム
４０１  短パルス半導体レーザー
４０２  色素励起光
４０３  固体レーザー媒質
４０４  ハーフミラー
４０５  反射ミラー
４０６  干渉パターン
４０７  レーザー光
５０１  コンピュータ
５０２  レーザーコントローラー
５０３  試料ステージコントローラー
５０４  カメラコントローラー
５０５  Ｎｄ：ＹＡＧレーザー
５０６  ピンホールプレート
５０７  波長変調素子
５０８  ハーフミラー
５０９  テレスコープ
５１０  反射ミラー
５１１  ビームコンバイナー
５１２  ラマンシフター
５１３  テレスコープ
５１４  位相板
５１５，５１６，５１７  反射ミラー
５１８  直線移動ステージ
５１９  プリズム
５２０  ビームリデューサー
５２１  ハーフミラー
５２２  集光対物レンズ
５２３  試料
５２４  試料ステージ
５２５  透過光用レンズ
５２６  ハーフミラー
５２７  照明光用レンズ
５２８  照明光源
５２９，５３０  ノッチフィルター
５３１  接眼レンズ
５３２  ＩＣＣＤカメラ
５３３  ハーフミラー
５３４  照明光用レンズ
５３５  照明光源
５３６，５３７  ノッチフィルター
５３８  接眼レンズ
５３９  分光器
５３９１  コリメータ球面鏡
５３９２  フォーカシング球面鏡
５３９３  回折格子
５３９４  反射ミラー
５３９５  スリット
５４０  ＩＣＣＤカメラ
６０１  板バネ
６０２，６０３  積層型エピゾ圧電素子
７０１  短パルスレーザー
７０２  色素励起光
７０３  固体レーザー媒質
７０４  レーザー光
７０５  プリズム
７０６  干渉縞
７０７  エンドミラー
７０８  回折格子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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