(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子を細胞の細胞質内に導入する方法が、インビトロまたは生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で細胞に実施され、該細胞と光増感剤とを接触させること、該細胞と導入される分子（移送分子）とを接触させること、ならびに該光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することを含み、
その照射が、該分子の細胞取り込みの前に行われ、
該移送分子が、細胞膜を容易に透過しない、および／または
該光増感剤および該移送分子の一方または両方が、１つ以上の担体分子、ターゲティング分子またはベクターに結合しているか、または付随している
ことを特徴とする、分子を細胞の細胞質内に導入する方法。
【請求項２】
分子を細胞の細胞質内に導入する方法が、インビトロまたは生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で細胞に実施され、該細胞と光増感剤とを接触させること、該光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射すること、ならびにその照射と同時にまたは照射後のある時点で、該細胞と導入される分子（移送分子）とを接触させることを含み、
該移送分子が、細胞膜を容易に透過しない、および／または
該光増感剤および該移送分子の一方または両方が、１つ以上の担体分子、ターゲティング分子またはベクターに結合しているか、または付随している
ことを特徴とする、分子を細胞の細胞質内に導入する方法。
【請求項３】
照射が、前記移送分子の細胞取り込みの前に行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、照射が行われた後のある時点で該移送分子と接触させられることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、照射が行われた０〜４時間後に、該移送分子と接触させられることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、照射と同時に該移送分子と接触させられることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記移送分子が、該細胞と３０分間〜６時間接触させられることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記移送分子が、タン白質、ペプチド、抗体または抗原、あるいはそれらのフラグメントであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記移送分子、またはそれらの一部もしくはフラグメントが、細胞表面に提示または発現されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が抗原提示細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記移送分子が細胞毒性薬剤であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記移送分子が核酸分子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が、ベクター分子に組み込まれることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクター分子が、アデノウィルスであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記光増感剤が、TPPS4、TPPS2a、AlPcS2aおよび他の両親媒性の光増感剤からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記光増感剤が、5-アミノレブリン酸または5-アミノレブリン酸エステルまたは製薬的に許容されるそれらの塩の化合物であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記光増感剤が、該細胞と照射前に４〜２４時間接触させられることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記光増感剤が、該細胞と照射直前に４〜２４時間接触させられることを特徴とする請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記光増感剤が、該細胞と照射前に１〜４時間接触して後、除去されることを特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記の移送分子が結合しているか、または付随している担体分子、ターゲティング分子またはベクターが、アデノウィルス、ポリカチオン、カチオン性脂質またはペプチドあるいは標的ベクターであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記移送分子はベクターに結合しているか、または付随しており、かつ、前記ベクターが担体分子またはターゲティング分子に結合しているか、または付随していることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターが、アデノウィルスであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリカチオンが、ポリ−L−リジン、ポリ−D−リジンまたはカチオン性デンドリマーであることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記カチオン性脂質がDOTAPであることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記担体分子が、リポソームまたは脂質系の構築物であることを特徴とする請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記リポソームまたは前記脂質系の構築物が、少なくとも１種のカチオン性脂質を含む構築物であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記分子が導入される前記細胞の少なくとも５０％が殺傷されないことを特徴とする請求項１〜１０または１２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記照射段階が1〜10分間であることを特徴とする請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに規定された方法に従って調製された細胞を含む、患者の疾患、障害または感染を治療するまたは予防するために用いられる医薬の製造における、光増感剤および移送分子の使用。
【請求項３０】
患者の疾患、障害または感染を治療するまたは予防するために用いられる医薬を製造するための、請求項１、２、８、１１〜１６、２０〜２６のいずれかに記載の移送分子および／または光増感剤の使用であって、該光増感剤および移送分子は別個に、患者の細胞または組織と接触させるためのものであり、その細胞は、該光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で照射されることとなり、その照射は、該移送分子の細胞取り込みの前に行われることとなることを特徴とする、移送分子および／または光増感剤の使用。
【請求項３１】
前記細胞取り込みの方法が、請求項１〜７、１７、１８、１９、２７または２８のいずれかに規定されているように行われる請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
ワクチン接種のためであり、前記移送分子が抗原分子であり、かつ該移送分子またはその一部もしくはフラグメントが細胞表面に提示されまたは発現されることを特徴とする、請求項２９〜３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
前記医薬が、遺伝子治療、免疫応答の刺激、またはガンの治療もしくは予防のためのものである、請求項２９〜３２のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感剤を使用し、その光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で細胞を照射して、分子類を細胞の細胞質内に導入するための改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大半の分子は、細胞膜を容易に通過することができない。生きている細胞の細胞質内に分子を導入する方法は、生物学的プロセスを扱い研究するための有用な手段である。今日、最も一般に利用されている方法の中には、マイクロインジェクション、赤血球ゴースト媒介融合およびリポソーム融合、ピノソームの浸透溶解、スクレープ負荷（scrape loadi
ng）、エレクトロポレーション（電気穿孔法）、リン酸カルシウムおよびウィルス媒介トランスフェクションがある。これらの技術は、多くの場合、非実用的で、時間を浪費し、非効率的であるか、あるいは重大な細胞死を引き起こすこともあるが、培養中の細胞を調べるのには有用である。かくしてこのような技術は、生物学的または医学的研究における使用、あるいは、細胞が生存しおよび／または機能し続けることが要求される治療における使用にとって最善のものではない。
【０００３】
ポルフィリンおよび他の多くの光増感化合物が、細胞および組織に対し、細胞毒性作用を引き起こすことがあることはよく知られている。これらの作用は、光増感化合物を光にさらすことにより、毒性となるか、または、細胞膜および細胞構造を含む細胞物質または生体分子に損傷を及ぼす一重項酸素または他の酸化ラジカルのような毒性物質を放出するに違いない事実、ならびにこのような細胞または膜の損傷が最終的に細胞を殺すに違いない事実を根拠にしている。これらの作用は、特に腫瘍性疾患を含む、さまざまな異常または疾患の治療に利用されてきた。この治療は、光力学的治療（PDT）と名づけられており
、身体の患部に光増感（光化学治療）剤を投与し、次いで、光増感剤を活性化し、これらを細胞毒性型に変換させるために、活性化光線にさらす段階を含んでおり、このことにより、病変細胞が殺され、あるいはその増殖能力が低減される。光増感剤は、優先的に、あるいは選択的に、所望の標的部位、具体的には腫瘍または他の病変に局在化するであろうことが知られている。
【０００４】
光増感剤の範囲は知られており、例えば、著名なソラーレン、ポルフィリン、クロリンおよびフタロシアニンが挙げられる。このような薬剤は、光に曝された時に毒性となる。
【０００５】
光増感薬剤は、さまざまな機構によって直接的または間接的に、その作用を発揮することができる。したがって例えば、ある種の光増感剤は光によって活性化されると、直接的に毒性となるのに対して、他の種のものは、脂質、タン白質および核酸などの細胞の物質および生体分子に対して極度に破壊的である毒性化学種、例えば一重項酸素または酸素由来のフリーラジカルといった酸化剤を生成するように作用する。
【０００６】
ポルフィリン光増感剤は、毒性酸素種の生成により間接的に作用し、PDTのために特に
好ましい候補として認識されている。ポルフィリンは、ヘム合成の際、自然界に生じる前駆体である。特に、ヘムは、酵素フェロケラターゼの作用により、プロトポルフィリン（PpIX）に鉄（Fe3+）が組み込まれたときに造られる。PpIXは、非常に強力な増感剤であるが、ヘムは光増感作用を有しない。当該分野では、ポルフィリンを主体とした、またはポルフィリン関連のさまざまな光増感剤が知られており、文献に記載されている。
【０００７】
PDTに用いられる大半の光増感剤の細胞毒性作用は、主に、光増感剤を光に曝すことに
よって形成される一重項酸素の形成を通じて媒介される。この反応中間体は、細胞中では存在期間が非常に短い（＜0.04μs）。したがって、PDTの最初の細胞毒性作用は、光照射の間に、1O2の形成部位の極めて近傍で達成される。1O2は、タンパク質（ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、システイン、チロシン）、DNA（グアニン）、不飽和脂肪酸
およびコレステロールと反応し、酸化する。PDTの利点の一つとしては、光に曝されない
組織は影響されないまま残ることができることである。すなわち、選択的なPDT効果を得
ることができることである。例えば腫瘍細胞などの望まない細胞集団を破壊するための、PDTの利用に関する多くの文献がある。特許文献には、多くの光力学的化合物が、単独に
、あるいは、例えば、より細胞特異的な複合体とすべく腫瘍細胞レセプター決定因子に向けられる免疫グロブリンなどの標的試薬との複合体形成も記載されている。ヘマトポルフィリン誘導体のような、ある種の光化学的化合物は、さらに、有害な細胞に局在化する固有の能力を有している。このような方法および化合物は、ノルウェー特許No.173319号、
ノルウェー特許出願No.900731号、176645号、176947号、180742号、176786号、301981号
、300499号、および891491号に記載されている。
【０００８】
WO93/14142には、共重合体の担体に付いた光励起性薬剤(photoactivatable agent)（すなわち、光増感剤）および抗悪性腫瘍剤を含む薬剤送達システムが記載されている。この複合体は投与されると、ピノサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって細胞内部に入り込み、エンドソームおよびリソソームの内部に落ち着く。リソソームにおいて、抗悪性腫瘍剤と重合体との間の結合は加水分解され、前者はリソソーム膜を通過して細胞質中へ受動的に拡散することができる。したがって、この方法の有用性は、リソソーム膜を透過して拡散することができる小さい分子化合物のみに限定される。拡散のための時間的ずれを持たせた後、適当な波長およびエネルギーの光源を適用して、光励起性の化合物を活性化させる。これら抗ガン剤と光励起性薬剤との複合効果が、細胞を破壊する。したがって上記のようなPDT方法は、細胞死に至る細胞構造物の破壊に向けられている。
【０００９】
他方、WO 96/07432およびWO 00/54802は、必ずしも広範な細胞破壊もしくは細胞死とはならない様式で、細胞の細胞質中へ膜−非透過性分子を別な方法で導入する機作として、光線力学効果を使用する方法に関するものである。これらの方法において、内在化される分子および光増感化合物は、細胞に対し同時にまたは次々と適用され、次いで光増感化合物および該分子はエンドサイトーシスされ、あるいは他の方法でエンドソーム、 リソソ
ームまたは細胞内の膜で仕切られた他のコンパートメント内に転位される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
細胞の細胞内コンパートメント内に転位される分子および光増感化合物は、細胞に一緒にまたは順番に適用され、これらはともに細胞により同じ細胞内コンパートメント中に（すなわち同時転位（co-translocated）される）取り込まれる。細胞内に内在化される分
子は、光増感化合物を活性化させるのに適切な波長の光に細胞を曝すことにより、放出される。該化合物の活性化は、ここでは細胞内コンパートメント膜の破壊をもたらし、次いで光増感剤と同一のコンパートメント内に局在している該分子が細胞質内に放出されることとなる。この方法は、「光化学的内在化（photochemical internalisation）」またはP
CIと表されている。よってこれらの方法の最終段階である細胞を光にさらすことは、問題の分子が光増感剤と同じ細胞内コンパートメントから放出されて細胞質に存在する結果となる。
【００１１】
この方法が有効となるためには、光増感化合物および細胞質内に放出される該分子が、照射が行なわれる際に、ともに同じ細胞内コンパートメント内に存在することが必須であると信じられた。
【００１２】
驚くべきことに、細胞の光への曝露が必ずしも最終の段階ではないことを除けば類似のPCI法によって分子が細胞の細胞質中に導入され得ることが今や見出されている。しかも
該方法は、光への曝露の際に、分子および光増感剤が同一の細胞内コンパートメント内に局在することに依存しない。かかる方法において、内在化され、かくして細胞質に送達される分子が細胞と接触することとなる前に、光増感剤は細胞と接触し、さらに照射により活性化されてもよい。よって光への曝露の際に、内在化される分子および光増感剤は必ずしも同じ細胞内コンパートメントに局在している必要はないという事実にもかかわらず、分子は依然細胞に入り、しかも細胞質へ送達される。これらの結果は、極めて驚くべきことであり、かかる方法は、光照射が最終段階であるとする方法に対して顕著な優位性を示す。
【００１３】
したがって、最も一般的なこととして、本発明は、分子を細胞の細胞質内に導入する方法を提供するものであり、その方法は、該細胞と光増感剤とを接触させること、該細胞を導入される分子と接触させること、ならびに光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することを含み、該照射は該光増感剤を含んでいる細胞内コンパートメント内への該分子の細胞取り込みの前に、好ましくは任意の細胞内コンパートメント内への該分子の細胞取り込みの前に行われることを特徴とする。
【００１４】
よって別の態様では、内在化される該分子および該光増感剤が、光への曝露の際に同一の分子内コンパートメント内に局在していないことを前提として、該照射は、細胞内コンパートメント内への該分子の細胞取り込みの後に行うことができる。しかしながら、好ましい態様においては、照射は、内在化される分子の細胞取り込みの前に行われる。
【００１５】
本明細書で使用される「内在化」は、分子の細胞質への送達をいう。本ケースでは、かくして「内在化（internalisation）」は、細胞内の/膜結合のコンパートメントから細胞の細胞質内への分子の放出段階を含むものである。
【００１６】
本明細書で使用する「細胞の取り込み」または「転位（translocation）」とは、内在化の諸段階の一つであり、細胞膜の外側の分子は細胞内に取り込まれ、その結果外側に位置する細胞膜に対して内側に見いだされることをいう。具体的には「エンドサイトーシス」または他の適当な取り込み機構により、例えば細胞内の膜で仕切られたコンパートメント、例えば小胞体、ゴルジ体、リソソーム、エンドソームなどの内部に、あるいはそれに付随して見出されることである。
【００１７】
特に、好ましい観点から見ると本発明は、細胞の細胞質内に分子を導入する方法を提供し、その方法は、該細胞と光増感剤とを接触させること、その光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射すること、ならびにその照射と実質的に同時であるか、または照射後のある時点で、該細胞と導入される分子とを接触させることを含む。
【００１８】
好ましくは、細胞は、照射が行われた後のある時点で、導入されるまたは内在化される分子（以降、移送分子（transfer molecule）という。）と接触させられる、言い換える
と、細胞と光増感剤とを接触させ、次いで照射することによる細胞の光化学的処置は、分子が細胞に添加される前に実施される。この態様において、細胞質内に導入される分子は、該処置が行なわれた後の任意の時点で、光化学的処置に供された細胞と接触させることができる。これは移送分子が細胞内に取り込まれることが依然として可能であることを前提とする。分子を該細胞と接触させることができ、しかもなお細胞内に取り込むことができる時間枠（time window）は、様々な因子、例えば細胞のタイプ、問題の特定分子、使
用される特定の光増感剤、および光処置の持続期間などに依存するかもしれない。この時間枠は、必要であれば、特別の条件の組について決定することができる。しかしながら、
細胞質に移送される分子は、光化学的処置の後、比較的速やかに細胞に接触させることが好ましい。例えば、光化学的処置後２４時間以内、より好ましくは光化学的処置後の最初の１０時間以内、具体的には、最初の５時間、より好ましくは最初の１時間以内である。例えば、インビトロまたは生体外（ex vivo）において、移送分子は、照射後直ちにまた
はその若干後で投与を開始してから一定のある時間、例えば３０分〜２４時間、好ましくは１〜２時間投与してもよく、具体的には、照射の終了を開始時点とすれば、移送分子は０分〜２４時間、例えば０〜４時間で適用することができる。
【００１９】
たとえ移送分子が、照射後かなりの時間が経って細胞と接触させても、細胞内への内在化は依然として可能であることが観察された。したがって、例えば移送分子を、照射後１時間を超える時点、例えば、照射後２、４、８、１０または１２時間さえも超える時点で適用してもよい。
【００２０】
したがって、好ましい態様において、該細胞を、照射の後０〜４時間して、１〜２もしくは３時間またはそれ以上の時間、例えば少なくとも０．５時間〜３時間、該移送分子と接触させる。移送分子が投与される時点は、該方法がインビトロまたはインビボのいずれで実施されるかによって変化するであろう。インビトロの方法では、移送分子は一般に標的細胞全部と同時に接触させることができるため、例えば、もし細胞がインビトロの培養で成育しているのであれば、分子を適当な時点で該細胞と接触させることは比較的容易である。しかしながらインビボでは、標的細胞と移送分子とを接触させる段階は明らかにより複雑であり、投与様式および標的細胞の場所に依存するであろう。例えば、移送分子が標的細胞に、例えば局所注射によって、直接的に投与され得る場合には、移送分子は比較的速やかに、具体的には投与後、およそ数分または数時間で標的細胞（または少なくともそれらの一部）と接触するに至るであろう。他方、もし移送分子が、遠方の標的に向けて、静脈注射によって投与されるのであれば、これらの分子が標的細胞と接触するには、かなり長い時間を要するかもしれない。例えば、それらが投与後、標的細胞に到達するまで２４〜９６時間かかるかもしれない。この「行旅時間(journey time)」は、光増感剤の投与および照射時間に関連して移送分子を投与する適切な時間を決定する際に、考慮に入れなければならない。
【００２１】
本発明の別の態様では、移送分子を、照射を行った後に細胞に接触させるというよりは、照射と実質的に同時に細胞と接触させることができる。本明細書で用いられる「実質的に同時に」とは、厳密に同時（すなわちsimultaneously）を含むだけでなく、照射の少し前、例えば照射の１時間または２時間前に分子を細胞に添加することまでも含む。もっともこれは、移送分子の細胞取り込みが、照射のときに生じずに照射の後ではあるが生じる場合、あるいは移送分子の細胞取り込みが生じても、このとき移送分子および光増感剤が、光照射の際に同じ細胞内コンパートメントに局在していないと仮定してのことである。
【００２２】
上述したように、移送分子および光増感剤の添加の正確なタイミング、ならびに上記作用を達成するための照射のタイミングは、処置される細胞、用いられる薬剤および分子、および細胞の環境を含む様々な因子を考慮に入れる必要がある。特にインビトロまたはインビボの系が問題となるかどうかに関して考慮する必要がある。これらを考慮すれば、適切なタイミングを容易に決定することができる。
【００２３】
一般原則として、照射段階が移送分子の細胞取り込みの前（光増感剤自体が細胞内コンパートメント内に取り込まれると仮定した場合）、あるいは移送分子の細胞取り込み後（移送分子および光増感剤が、光照射の際に同一の細胞内コンパートメントに局在していないと仮定した場合）のどちらかで行われるように適切な条件が決定される。この後者の筋書きでは、明らかに移送分子は、照射が行われる前のある時点で細胞と接触するに至るであろう。これは本発明の好ましい態様の１つを与える。
【００２４】
移送分子および光増感剤が照射前に細胞に添加されることを特徴とする、以前に開示された光化学的内在化の方法は、光照射前に問題の分子が同じ細胞内コンパートメント内に局在することに依存していたため、光増感剤の光活性化によるこれらのコンパートメントの溶解は、分子および光増感剤の両方を細胞質内に放出するという結果になった。このことを示す概念図が、図７に示されている。
【００２５】
本方法では細胞質に導入される光増感剤および移送分子は、光照射の際に同一の細胞内コンパートメント内には、明らかに存在しない。なぜなら、移送分子は、細胞が光に曝される直前または直後にはじめて細胞に添加されるからである。
【００２６】
本方法の作用機構はまだ知られておらず、実際この方法がとにかく使えるという事実は驚くことである。理論に拘泥することを望むわけではないが、これらの驚くべき知見の理由は、光化学的に損傷を受けた小胞と、新たに形成されたエンドサイトーシス性小胞との融合が起こり、次いで新たにエンドサイトーシスされた分子の細胞質への放出が続くということかもしれない。このことを説明する概念図を図７に示す。あるいは、リソソーム酵素またはリソソーム酵素を含む小胞、例えば後期のエンドソームに対する光化学的損傷は、内在化される分子の細胞内分解の速度を低下させるかもしれない。これは、リソソーム酵素を含む小胞への輸送（transport）の減少あるいはより低い加水分解活性を含むエン
ドサイトーシス性小胞への輸送によるものかもしれない。このようにして、これらの分子は、リソソーム分解経路が活性な場合よりも、エンドサイトーシスによる区画化（compar
tmentalization）を逃れるために、より多くの時間を持てるであろう。さらに別の説明として、細胞の光化学的処置は、細胞の原形質膜に対する少ない損傷だけで済み、その結果、細胞膜を通した高分子の透過の増加をもたらしうることである。しかしながら、行われた実験（図７参照）からは、これはおそらくそういう理由ではないことを示唆している。
【００２７】
したがって、本発明は、生きている細胞の細胞質内に、任意の分子をインビトロ（すなわち培養で）またはインビボで輸送もしくはトランスフェクトする方法に関するもので、その後該分子は細胞質中で利用されるだろう。
【００２８】
このような方法は、分子（またはその一部もしくはフラグメント）を細胞内部に移送するためだけではなく、ある状況では、細胞表面にそれらを提示もしくは発現させるためにも用いることができる。したがって、本発明の方法により移送分子の細胞質中への輸送および放出に続いて、問題の細胞が、例えば抗原提示細胞のような特殊な細胞であれば、分子またはフラグメントは、細胞の表面に輸送され、そこで細胞の外側、すなわち細胞表面に提示されるかもしれない。このような方法は、特にワクチン接種の分野で特に有効であり、免疫応答を誘発、促進または増大するために、ワクチン成分、すなわち抗原もしくは免疫原を、細胞表面での提示のために、その細胞に導入してもよいことを特徴とする。細胞表面に分子を発現させることができる有用性に関するさらなる詳細は、WO 00/54802に
記載されている。本発明の方法を用いて、細胞の細胞質内に導入させる移送分子は、細胞膜を容易に透過しない分子を含む。また、本発明は、細胞膜または細胞内小胞の膜を、わずかしか透過することができない分子の細胞質送達および活性を増加することができる。移送分子は、有機化合物、タン白質またはタン白質のフラグメント、例えばペプチド、抗体もしくは抗原、またはそれらのフラグメント等でもよい。本発明により用いられる移送分子の別の種類として、細胞毒性薬剤、例えばタン白質毒素または細胞毒性有機化合物、具体的にはブレオマイシンなどである。適当な移送分子のさらに別の種類として、核酸がある。
【００２９】
核酸としては、例えば治療上のタン白質、アンチセンスRNA分子、リボザイム、RNAアプ
タマーまたは３重体（triplex）形成オリゴヌクレオチドをコードする遺伝子の形態で用
いられる。あるいは、核酸は、例えば合成のDNAもしくはRNAアンチセンス分子、リボザイム、アプタマー、３重体形成オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、転写因子「デ
コイ（decoy）」DNAまたは患者の特異的な突然変異を修復するキメラ（chimeric）オリゴヌクレオチドなどの非コード分子の形態で用いてもよい。適当であれば、該核酸分子は、遺伝子全体、または必要に応じてベクターである分子もしくは実体、例えばプラスミドベクターまたはウィルス粒子またはバクテリオファージに組み込まれる核酸フラグメントの形態でもよい。後者の形態は、移送分子が遺伝子治療の方法に用いられることになっている場合には、特に適用可能性を有する。
【００３０】
本発明によって使用される光増感剤は、細胞内コンパートメント、とりわけエンドソームもしくはリソソームに局在化するものであれば何でもよい。そのような光増感剤の範囲は当業界で知られており、WO96／07432を含む文献に記載されている。この点につき、培
養細胞のエンドソームもしくはリソソームに存在することが示されているジ‐およびテトラスルホン化アルミニウムフタロシアニン（例えばAlPcS2a）、スルホン化テトラフェニ
ルポルフィリン（TPPSn）、ナイルブルー、クロリンｅ6誘導体、ウロポルフィリンI、フ
ィロエリスリン、ヘマトポルフィリンおよびメチレンブルーを挙げることができる。これはほとんどの場合、光増感剤のエンドサイトーシス取り込みによるものである。よって光増感剤は、エンドソームもしくはリソソームのコンパートメント内部に取り込まれる物質が好ましい。しかし、他の細胞内コンパートメント、例えば小胞体もしくはゴルジ体に局在する他の光増感剤もまた使用することができる。光化学的処置の作用が細胞の他の成分（すなわち膜で仕切られたコンパートメント以外の成分）に及ぶといった機構が働くことも考えられることである。よって、例えば光化学的処置が細胞内輸送または小胞融合にとり重要な分子を破壊することは、あり得ることの一つである。そうした分子は必ずしも膜に仕切られたコンパートメントに存在するとは限らないが、それにもかかわらず、このような分子の光化学的損傷は、移送分子の光化学的内在化をもたらすかもしれない。つまりこれは、例えば、このような分子への光化学的作用が、リソソームのような分解系小胞への内在化される分子（すなわち、移送分子）の輸送の減少を招くに至る機構によるものである。その結果、内在化される分子が分解される前に細胞質に逃れることができる。このような必ずしも膜に仕切られたコンパートメントに存在するとは限らない分子の例としては、ダイネイン（dynein）およびダイナクチン（dynactin）のいくつかの成分のような微小管(microtubular)送達系のいくつかの分子があり、例えば、rab5、rab7、N−エチルマ
レイミド感受性因子（NSF）、可溶性NSF結合タン白質（SNAP）などである。
【００３１】
したがって言及すべき適切な光増感剤の種類は、ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリンおよびリソソーム向性の弱塩基またはそれらの誘導体を含むものである（Bergら、J. Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403-409）。他の適当な光増感剤と
して、テキサフィリン（texaphyrins）、フェオフォルビド（pheophorbides）、ポルフィセン（porphycenes）、バクテリオクロリン（bacteriochlorins）、ケトクロリン（ keto
chlorins）、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）誘導体、およびそれらの誘導体、
５−アミノレブリン酸およびその誘導体により誘導される内因性光増感剤、光増感剤間の二量体または他の結合体などが挙げられる。
【００３２】
上記光増感剤は他の何らかの高分子と共役していない、つまり遊離の形態にあることが好ましい。しかしながら光増感剤は、あるいは、後述する担体または他の分子に付随しているか、結合しているかまたは共役しているものでもよく、例えばターゲティング抗体に結合しているか、またはポリリジンといった担体に結合していてもよい。
【００３３】
好ましい光増感剤はTPPS4、TPPS2a、AlPcS2aおよび他の両親媒性光増感剤を含むものである。好ましい見方から、本発明は、使用できる光増感剤が５−アミノレブリン酸、５−アミノレブリン酸のエステル、または製薬上許容されるそれらの塩である方法を提供する。
【００３４】
上記エステルで、５−アミノ基は置換されていてもいなくてもよく、後者の場合、ＡＬＡエステルである。
【００３５】
さらに具体的には、本発明で使用されるＡＬＡエステルは、５−アミノレブリン酸の任意に置換されていてもよいアルカノールとのエステル、例えばアルキルエステルまたは置換アルキルエステルである。
【００３６】
利便上、使用できるＡＬＡエステルは、式Iの化合物：
R22N-CH2COCH2-CH2CO-OR1              (I)
（式中、R1は、必要に応じてヒドロキシル基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、アリール基、オキソ基またはフルオロ基により置換され、ならびに酸素、窒素、イオウ、またはリン原子により任意に介在されていてもよいアルキル基を表し；およびR2は、それぞれ同一でも異なってもよい各々が水素原子またはR1
を表す）またはその塩である。
【００３７】
上記置換アルキルR1基は、一置換でも多置換であってもよい。よって適切なR1には、例えば非置換アルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、ポリヒドロキシアルキル、ヒドロキシポリアルキレンオキシアルキルなどが挙げられる。本明細書で用いられる「アシル」という用語は、カルボキシレート基およびカルボネート基の両方を含み、したがって、アシルオキシ置換アルキル基として、例えばアルキルカルボニルオキシアルキルが挙げられる。このような基において、任意のアルキレン部分は、好ましくはアルキル基に対して下記で定義した炭素原子の含有量を有する。好ましいアリール基としては、フェニルおよび単環の５〜７員複素芳香環、特にフェニル基が挙げられ、ならびにそうした基自体が、必要に応じて置換されていてもよい。
【００３８】
代表的な置換アルキル基R1としてアルコキシメチル基、アルコキシエチル基およびアルコキシプロピル基、またはアシロキシメチル基、アシロキシエチル基およびアシロキシプロピル基、例えばピバロイルオキシメチル基が挙げられる。
【００３９】
本発明の光増感剤として用いられる好ましいＡＬＡエステルとして、R1が非置換アルキル基および／または各R2基が水素原子を表すエステルが挙げられる。
【００４０】
本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、任意の長鎖または短鎖の、直鎖状または分岐状の脂肪族である飽和または不飽和の炭化水素基を含む。不飽和アルキル基は、モノ不飽和でもポリ不飽和でもよく、アルケニル基およびアルキニル基の両者を含む。このような基は最大４０個の原子を含んでよい。しかしながら、最大１０、好ましくは最大８、特に好ましくは最大６、とりわけ好ましくは最大４個の炭素原子を含むアルキル基が望ましい。
【００４１】
本発明で使用される好ましい光増感剤を表すものとして、ALA-メチルエステル、ALA-エチルエステル、ALA-プロピルエステル、ALA-ヘキシルエステル、ALA-ヘプチルエステルおよびALA-オクチルエステルおよびそれらの塩が特に言及される。
【００４２】
必然的に、光増感剤は照射の前に細胞と接触させられる。しかしながら、移送分子と異
なり、照射の充分前に、この増感剤は投与されるべきであり、その結果照射により該剤は細胞内コンパートメントに取り込まれる。よって好適には照射の1〜72時間前、具体的に
は照射の4〜48時間前、例えば4 〜24時間前である。再び、移送分子を細胞と接触させる
段階に関連して上で論じたように、照射時点に関連して、標的細胞との接触を果たさせるための光増感剤投与のタイミングは、光増感剤が標的細胞に到達し、それらに取り込まれるのにかかる時間によるであろう。その時間はインビトロまたはインビボで該方法が実施されるか、ならびに投与が標的組織に直接向けられるか、または近接部位であるかに依存して変化するかもしれない。あらゆる場合において重要なことは、光増感剤は照射が起こる前に標的細胞によってすでに取り込まれているということである。該剤は照射に至るまでに、具体的には1もしくは 4〜72時間、 好ましくは 4 〜24時間、例えば12〜20時間、
該細胞とじかに接触したままでいることであり、あるいは具体的には5分間以上、例えば1
0分間〜8時間、例えば１時間〜4時間、該剤フリーの培地において、照射の直前に接触か
ら解除してもよい。
【００４３】
必要に応じ、細胞内に導入される光増感剤および移送分子の一つまたは他方または両方は、１つ以上の担体分子、ターゲティング分子またはベクターに結合しているか、付随しているかまたは共役していてもよい。これらの分子等は、光増感剤または移送分子の取り込みを促進し、または増大するように作用することができ、あるいはこれらの実体を特定の細胞タイプ、組織または細胞内コンパートメントに向けるか送達するように作用することができる。担体系の例としてポリリジンまたは他のポリカチオン、硫酸デキストラン（dextransulphate）、別種カチオン脂質、リポソーム、再構成したLDL-粒子、立体的に安定化したリポソーム、またはアデノウィルス粒子が挙げられる。これらの担体系は一般に、移送分子および／または光増感剤の薬剤動態（pharmacokinetics）を改善し、該剤の細胞取り込みを増大させ、ならびに光化学的内在化を達成するのにとりわけ有益である細胞内コンパートメントに、移送分子および／または光増感剤を向けるようにすることができる。しかしその担体系は、通常、特定細胞（例えばガン細胞）または組織に狙って移送分子および／または光増感剤を集中させる能力は有しない。しかしながら、このような担体分子、移送分子および/または光増感剤の特異的または選択的なターゲティングを達成するには、移送分子の所望する細胞または組織中への特定の細胞取り込みを助長するような特定ターゲティング分子に、これらのものが付随するか、または共役することができる。そのようなターゲティング分子は、光化学的内在化を達成するのにとりわけ有益である細胞内コンパートメントに移送分子を差し向けることもできる。
【００４４】
多くの異なるターゲティング分子を用いることができる。例えばCuriel, D. T. (1999)
, Ann. New York Acad. Sci. 886,158-171; Bilbao, G.ら (1998), in Gene Therapy of
Cancer (Walden ら, eds., Plenum Press, New York), Peng K. W. および Russell S.
J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10,454-457, Wickham T. J. (2000), Gene Ther.
7,110-114に記載されている。
【００４５】
担体分子および／またはターゲティング分子は、移送分子に、光増感剤にまたは両方に付随し、結合しまたは共役してもよく、ならびに同一または異なる担体またはターゲティング分子を使用してもよい。例えば、アデノウィルス粒子が担体として使用されるのであれば、移送分子はアデノウィルス内に取り込まれてもよい。例えば、問題の移送分子がタン白質またはRNA分子をコードするDNA分子であれば、該DNAはウィルスベクター中に取り込まれ、光化学的内在化の後、該DNA分子は正しい細胞内の位置に存在して、その結果コードされた分子の発現が生じることができる。
【００４６】
このような分子の発現は、よく知られ記載された方法によってベクターを設計することにより制御することができる。例えば、組織特異的もしくは疾患特異的な、または調節可能な発現を得るためには、組織特異的なまたは調節可能なプロモーターのような調節性エレメントを使用することができる。具体的には、組織特異的なプロモーター、メラノーマ特異的なチロシナーゼ・プロモーターを用いることができる。テトラサイクリン調節性プロモーターのような調節性のプロモーターがよく知られている。本発明に用いることができる特異的なまたは調節性のプロモーターの例は、Hart, I. R., 1996, Semin. Oncol. 2
3,154-158; Hallahan, D. E. ら, 1995, Nature Med. 1,786-791; Luna, M. C. ら, 2000
, Cancer Res. 60,1637-1644; Miller, N. および Whelan, J., 1997, Hum. Gene Ther.
; Wickham, T. J, 2000, Gene Ther. 7,110-114; Nettelbeck D. M.および Muller; J. V
., 2000, Trends Genet. 16,174-181; Clackson, T., 2000, Gene Ther. 7,120-125; Fre
undlieb, S, ら, 1999, J. Gene Med. 1,4-12; Spear M. A., 1998, Anticancer Res. 18
, 3223-31, Harvey, D. M. および Caskey C. T., 1998, Curr. Opin. Chem. Biol. 2,51
2-518; Clary, B. M. および Lyerly, H. K., 1998, Surg．Oncol. Clin. North Am. 7,
565-574. Luna, MCら, Cancer Res. 60,1637-1644;およびそれらの中にある文献において見出し得る。
【００４７】
上述したように、１つよりも多くの担体および／またはターゲティング分子もしくはベクターを同時に使用してもよい。例えば、ベクターは担体中で供給することができ、具体的には、アデノウィルスのようなウィルスのベクターを、例えばリポソームもしくはポリカチオン構造体の中で担持させることができる。
【００４８】
本発明、特に移送分子とともに用いられる好ましい担体およびベクターとしては、アデノウィルス；ポリリジン（具体的には、ポリ‐Ｌ-リジンまたはポリ-Ｄ-リジン）、ポリ
エチレンイミンまたはデンドリマー（具体的には、SuperFectTMのようなカチオン性デン
ドリマー）などのポリカチオン；DOTAPまたはリポフェクチン（Lipofectin）のようなカ
チオン性脂質；ペプチドおよび標的ベクター、例えばトランスフェリン ポリリジンまた
は標的アデノウィルスベクターが挙げられる。本発明の特に好ましい態様では、担体はアデノウィルスである。
【００４９】
上述したこのようなターゲティング分子または担体は、移送分子を、特定の細胞内コンパートメント、とりわけPCIの使用に有益であるコンパートメント、例えばリソソームま
たはエンドソームに差し向けるために使用することもできる。
【００５０】
細胞内の膜で仕切られたコンパートメントは、細胞内に存在するものであればどのようなコンパートメントであってもよい。好ましくは、そのようなコンパートメントは、膜小胞、とりわけエンドソームまたはリソソームであろう。しかしながら、細胞内コンパートメントは、ゴルジ体または小胞体を含んでもよい。
【００５１】
光増感剤を活性化するための光照射段階は、従来技術上、公知の技術および手順に従って起こしてもよい。例えば、光の波長および強度は、使用する光増感剤に応じて選択する
ことができる。適切な光源は、従来技術において公知である。本発明の方法において、細胞が光により曝される時間は変動する。移送分子の細胞質中への内在化の効率は、光への曝露の増加とともに上昇するようである。照射段階の時間の好ましい長さは、光増感剤、標的細胞または組織に蓄積された光増感剤の量、および光増感剤の吸収スペクトルと光源の発光スペクトルとの間の重複に依存するものである。
【００５２】
一般には、照射段階の時間の長さは、数分間から数時間のオーダーにあり、好ましくは60分間まで、具体的には0.5もしくは1分間から30分間、例えば 0.5〜3分間または 1〜5分間または1〜10分間、具体的には3〜7分間ならびに好ましくはおおよそ3分間、例えば2.5
〜3.5分間である。適切な光線用量は、当業者によって選択され得るが、これもまた、光
増感剤、標的細胞または組織に蓄積された光増感剤の量に依存する。
【００５３】
例えば、光増感剤のホトフリン（Photofrin）およびプロトポルフィリン前駆体の 5-アミノレブリン酸を使用するガンの光線力学治療に使用される典型的な光線量は、高熱症を避けるために、200 mW/cm2未満のフルエンス範囲で 50〜150 J/cm2の範囲にある。可視スペクトルの赤領域において
より高い吸光係数を有する光増感剤を使用する場合、光線量はずっと低い。しかしながら、より少なく蓄積された光増感剤を用いる非ガン組織の治療には、必要とされる光の総線量はガン治療用よりもはるかに高い。
【００５４】
本発明の方法において使用される標的分子の適切な用量を決定することは、当業者にとって通常のことがらである。移送分子がタン白質またはペプチドである場合、インビトロでの適用については、移送分子は5mg/ml未満（例えば、0.1〜5mg/ml）の量で一般的に使用され、インビボでの適用については、移送分子は5mg/kg未満（例えば、0.1〜5mg/kg）の量で一般的に使用される。移送分子が核酸である場合、インビトロでの適用については、移送分子の典型的な用量は、104細胞当たりおおよそ0.1〜50μgの核酸であり、インビボでの適用については、ヒトへの一回注射当たりおおよそ10-6〜1gの核酸である。移送分子がアデノウィルス担体に付随している場合、インビトロでの適用について典型的な用量は、細胞当たり1〜1×105の物質性(physical)ウィルス粒子、例えば1×103〜1×105粒子であり、インビボでの適用については、アデノウィルス担体と結合した導入分子は、インビボで使用される最終組成物におけるウィルス粒子の濃度で1×10-9〜50％（w/w）、例えば3×10-6〜50％（w/w）、具体的には0.003〜30％（w/w）、0.2〜10％（w/w）で存在する。ここでw/wは、最終組成物の重量に対して、導入される分子に加えたウィルス担体の重量のことをいう。1mlの注射に使用されれば、これはおおよそ105〜1015の物質性ウィルス粒子の用量に相当する。
【００５５】
本発明の方法は、光化学的処置のために、すなわち光増感剤の作用により不可避的に殺細胞が多少生起するであろう。しかし、この細胞死は問題となることはなく、多数の応用（例えばガン治療）については、実際には有利であり、また本発明の方法は、光増感剤の濃度に関連して光量を選択することにより、生存する細胞の比率または割合を調整するように修飾することもできる。またそのような技法は、当業界では公知である。純粋に光化学的処置により誘導された細胞死の量に関係なく、PCI効果が出現するような個体の細胞
群のあるものが、純粋な光化学的処置によっては殺されないように光線量を調節することは重要である（もっともそれらの細胞は結果的にPCI効果のために殺されるかもしれない
）。
【００５６】
ある応用では、PCI治療後に大多数の生存細胞を保持することが適切であろう。例えば
、ワクチン接種およびある遺伝子治療の方法では、抗原の提示またはタン白質の発現をもたらす生存細胞が重要である。そのような応用において、複数の細胞または細胞の集団、
実質上すべての細胞、あるいは著しく大多数（具体的には、細胞の少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60、70、80もしくは90％）が殺されないですむことが適当である。このことは、もちろん、特にPCIが細胞毒性の移送分子を導入するために使用され、さら
に殺細胞が不利ではない場合には必ずしも望ましくない。しかし細胞毒性効果は、例えば治療遺伝子が本発明の方法により腫瘍細胞内に内在化させられ、その結果、これらの細胞は、残りの腫瘍細胞を殺傷する局部免疫を誘導する免疫活性物質か、あるいは腫瘍細胞に対し全身的な免疫応答を誘導する免疫活性物質を産生するであろうという遺伝子治療を用いることにより達成することもできる。このような場合、明らかにPCI処置後に、ある割
合の生存細胞が求められる。
【００５７】
本発明の方法および処置段階の手順、特に光照射段階の後、移送分子が細胞に添加される態様は、上述した方法と比較して、以下の有利なことがある。
a) 移送分子に対する光化学的損傷が減少する;
b) 光化学的治療以降に手術と組み合わせて内部病巣のPCI治療の単純化は、病巣の外科的曝露（surgical exposure）、次いで移送分子の腫瘍内注射または他の局所的投与の後に
達成できる; 
c) 該方法は、照射（illumination）の時点に関して、処置の正確なタイミング、すなわ
ち細胞により取りこまれる分子を添加するタイミングは、より依存しない。このことは、処置のより大きい「時間枠（time window）」があることを意味する。このことは次の理
由から重要である。様々な臨床的状況において治療用分子の取り込みは大幅に変化し、さらにある臨床状況において個々の病巣につきその取り込みを見積もることは困難である。このことから、時間枠をより大きくすることは、大変な利点となるからである; 
d)  移送分子の細胞質への急速な転位が起こり、それによりリソソームによる移送分子分解の可能性が実質的に減少する。
【００５８】
分子自体を内在化させるPCI法に関係したこれらの利点に加えて、以下の利点が加わる
；すなわち、
1）分子が標的細胞によりエンドサイトーシスされ得るかぎり、細胞質に内在化および移
送される分子のサイズに制限を付さない；2) 該方法は、細胞増殖に依存しない；3) 該方法は、光に曝される部分のみが影響を受ける意味において部位特異的である；4) 腫瘍形
成性ではない。
【００５９】
細胞を光増感剤にそして移送分子に「接触させる」段階は、任意の好都合なまたは所望のやり方で行ってもよい。よって、その接触させる工程がインビトロで行なわれる場合、該細胞は、便宜上水性の培地、例えば適当な細胞培養培地に維持されていてもよく、適当な時点で、光増感剤または移送分子を、適切な条件下、例えば適当な濃度で適切な長さの時間をかけて単にその培地に加えるだけである。
【００６０】
光増感剤は、適当な濃度で適切な長さの時間をかけて、該細胞と接触させる。それらの条件は、いつもの技術を用いて当業者により容易に決定されるが、使用する光増感剤および細胞の型に依存するであろう。光増感剤の濃度は、一旦細胞内に取り込まれ、具体的にはその細胞内コンパートメントの１つ以上の中に取り込まれ、またはそれに付随し、照射により活性化されると、１つ以上の細胞構造は破壊され、具体的には１以上の細胞内コンパートメントが溶解され、または分解されるような濃度でなければならない。例えば本明細書での実施例で使用される光増感剤は、例えば10〜50μg/ml濃度で使用することができる。インビトロでの使用では、その範囲はもっと広くなり得て、具体的には0.05〜500μg/mlである。インビボでのヒトの治療では、光増感剤は、全身投与で0.05〜20mg/kg体重の範囲で使用することができ、あるいは局所投与については、溶媒中0.1〜20％濃度で使用できる。より小さい動物では、濃度範囲は異なり、適宜調節することができる。
【００６１】
細胞と光増感剤とのインキュベーション時間（すなわち「接触」時間）は、数分間から数時間、具体的には48時間まで、またはそれ以上と変わり得る。インキュベーション時間は、光増感剤が適当な細胞により取り込まれるような時間であるべきである。
【００６２】
細胞と光増感剤とのインキュベーションは、細胞が光に曝されるか、または移送分子が添加される前に、必要に応じて光増感剤フリーの培地とのインキュベーション期間がそのあとに続いてもよい。
【００６３】
移送分子は、上記の任意の分子であり得るが、適当な濃度および適切な長さの時間をかけて、細胞と接触させられる。驚くべきことに、その接触は照射後数時間でようやく開始してもよいことが見出されている。適当な濃度は、問題とする分子が問題の細胞へ取り込まれる効率ならびに該細胞においてあるべき最終濃度に依存して、決定され得る。よって、「トランスフェクション時間」または「細胞への取り込み時間」、すなわち細胞との該分子の接触時間として、数分間または数時間まであり得る。例えばトランスフェクション時間は、10分間から24時間まで、 例えば30分間から10時間まで、あるいは例えば30分か
ら2時間もしくは6時間まで用い得る。増大したトランスフェクション時間は、普通、問題の分子の取り込みの増加となり得る。しかしながら、より短いインキュベーション時間、例えば30分間〜1時間は、分子の取り込みの特異性を向上するように思われる。よって、
任意の方法に対してトランスフェクション時間を選択する際に、分子の充分な取り込みを得る一方、取り込みの充分な特異性を維持することとの間で、適当なバランスを取る必要がある。
【００６４】
インビボにおいて、移送分子および光増感剤が標的細胞と接触するためのインキュベーションの適当な方法および時間は、投与様式ならびに移送分子および光増感剤のタイプに依存するであろう。例えば、移送分子が治療される腫瘍内に注入されれば、注入点近くの細胞は、より遅い時点およびより低濃度で接触する可能性が高い注入点からはるかに遠い位置の細胞よりも、早く移送分子と接触し移送分子を取り込む傾向にある。さらに、静脈注射によって与えられる移送分子は、標的細胞に到着するまで多少時間がかかることにより、充分な量または最適な量の移送分子が標的の細胞または組織に蓄積するために、より長い投与後の時間、例えば数日がかかるかもしれない。同様の考えが、当然ながら光増感剤の細胞内への取り込みに要求される投与の時間にも当てはまる。したがって、インビボでの個々の細胞に対して要求される投与の時間は、これらおよび他のパラメーターに依存して変化する可能性が高い。
【００６５】
それにもかかわらず、インビボの状況はインビトロよりもさらに複雑であるけれども、本発明の根底にある概念は依然同一である。すなわち分子が標的細胞と接触するようになる時間は、照射が起こる前に光増感剤の適当な量が標的細胞にすでに取り込まれており、しかも次のいずれかであるような時間でなければならない。すなわち(i)照射の前もしく
はその間に、移送分子が細胞に取り込まれているか、または標的細胞との充分な接触の後で、異なる細胞内コンパートメント中に取り込まれるであろう。あるいは(ii)照射後、移送分子は該細胞と、該細胞内へその取り込みを許容するのに充分な時間、接触している。たとえ移送分子が光増感剤と異なる細胞内コンパートメントに取り込まれても、移送分子を照射前または後に取り込むことができる。
【００６６】
本明細書で使用する用語「細胞」には、あらゆる真核細胞（昆虫細胞および菌類の細胞を含む）が含まれる。かくして代表的な 「細胞」として、あらゆるタイプの哺乳類の動
物細胞および非哺乳類の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞および原生動物が挙げられる。
【００６７】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボ、その場での処置（例えば、ターゲティング部位を利用することによる処置）あるいは生体外で処置し、その後に該処置細胞を身体に投与するものであってもよい。
【００６８】
本発明の方法は、例えばガンの治療に用いることができる。いくつかの光増感剤は腫瘍組織に優先的に蓄積し、周囲の組織に対する腫瘍への選択性は通常2〜3のファクターであるが、このファクターはあるケースにおいて、例えば脳組織においては、はるかに高くなり、すなわち30までなるかもしれない。あるいは、特定の光増感剤を、上記の方法で特定の腫瘍に向けた標的とすることもよい。さらに、ガンの治療上、臨床的な関心を呼ぶものの、細胞質内への取り込みが低いか、ないために制限されている分子は、本発明の方法によって細胞質内に導入させ、特異的な細胞を標的にさせることができる。以下に説明するように、ゲロニン（Gelonin）はこのような分子の一例である。他の分子でも単独で、あ
るいは特定細胞を標的に、内在化させる分子を向ける別の分子（例えば、抗体、トランスフェリン、光増感剤、再構成したLDL-粒子上のapoB）と結合した他の分子を用いることができる。このような複合処置の利点は、1）低い光線量および亜毒性（subtoxic）の光線
量がリソソームおよびエンドソームの破壊に対して充分であるため、腫瘍組織の深層部への細胞毒性効果を高める；2）PCIが腫瘍範囲にのみ与えられるために処置の特異性を高める。
【００６９】
本発明の方法は、細胞内に導入される分子の選択によって決定されるように、様々な他の障害、例えば、慢性関節リウマチ、関節硬化症（artherosclerosis）および他の心血管疾患、ウィルスおよび他の感染、乾癬（psoriasis）、日光角化症（solar keratosis）、外傷治療、骨折治療、小隆起（warts）、および嚢胞性線維症（cystic fibrosis）、ゴーリン（Gorlin）症候群、毛細管拡張性運動失調（ataxia telangiectasia）などの継承さ
れる遺伝疾患を治療するのに使用してもよい。
【００７０】
本発明の方法は遺伝子治療、すなわち患者の細胞への治療的な遺伝子の移送に用いてもよい。遺伝子治療は、多くの疾患、例えばガン、心血管疾患、ウィルス感染、嚢胞性線維症などの単一遺伝子による障害、および上記したような他の多くの病態を治療する方法として期待されている。今日の遺伝子治療における一つの重要な課題は、インビボで実現しなければならない遺伝子移送の高い効率性と特異性である。現行の方法において、多くの様々な担体またはベクターが、遺伝子治療において遺伝子の移送を達成するために用いられている。例えばポリカチオン性化合物、カチオン性脂質、およびウィルス系を言及することができるが、今のところインビボ遺伝子治療では、ほとんど成功を収めてこなかった。
【００７１】
現行の方法において知られた多くの欠陥の中には、ベクターの血清中での低い安定性、遺伝子送達の限定された特異性、遺伝子送達の低い効率などがある。本発明のPCI方法は
、遺伝子治療において現在採用されている多くの遺伝子送達方法の効率性および特異性の両者を充分に向上する手段を提供する。これは、合成遺伝子送達用の多くのベクターおよびいくつかのウィルス系の両方に対し、効率限定であり得るエンドソーム放出の段階を改善することによるものである。また、PCI方法に固有の光処置も身体で遺伝子移送の増強
が生じる箇所を正確に限定することを可能とする。これは遺伝子移送効率の増加が照射範囲にしか起こらないためである。トランスフェクションはインビトロ、インビボまたは生体外（適切に患者に投与される細胞または組織とともに）実施してもよい。トランスフェクションに適切な担体およびベクターとしては、好ましくはアデノウィルス、ポリリジン（例えば、ポリ‐D-リジンまたはポリ-L-リジン）などのポリカチオン、SuperFectTM、ポリエチレンイミンまたはデンドリマー；DOTAPまたはリポフェクチン（Lipofectin）のよ
うなカチオン性脂質またはDOPEのような「ヘルパー脂質」で編成したカチオン性脂質；例えばトランスフェリン ポリリジンまたは標的アデノウィルスベクターのようなペプチド
および標的ベクターおよびが挙げられる。本発明の好ましい態様において、治療遺伝子に用いられる担体は、アデノウィルスである。
【００７２】
本発明の別の好ましい観点は、例えばペプチドおよびカチオン性脂質を含むカチオン性ポリマーのような非ウィルス担体の系を使用することである。典型的なポリマーとして、例えばポリアミン、塩基性ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸、合成および天然のカチオン性糖ポリマー（sugar polymer）、メタクリレートポリマー、デンドリマー、ポリアルキ
レンイミン（polyalkylenemines）および薬剤送達に有用な公知の他のポリマー；とりわ
け遺伝子送達に有用なポリマーが挙げられる。本発明に有用な典型的なポリマーとしては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ‐L-グルタミン酸、ポリビニルピリジン、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ(2-ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ヒストン、プ
ロタミン、ポリ(L-オルチニン）、アビデン（aviden）、スペルミン、スペルミジンおよ
びそれらの任意の誘導体が挙げられる。本発明の好ましい観点において、ここに記載したポリマーは、他のポリマーと結合させるか、または他の遺伝子送達系と組み合わせてもよい。本発明に有用な非ウィルス性遺伝子送達系は、例えばR. I. Mahatoら, Advances in
Genetics (Eds J. C. Hallら) (1999), 41, 95-156に記載されている。さらに、カチオン性ポリマーは、M. C. Garnett, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System
s (1999), 16,147-207、K. A. Howardら, Biochimica et Biophysica Acta (2000), 1475
, 245-255、 H. K. Nguyenら, Gene Therapy (2000), 7, 126-138、A. Bragonziら, J. C
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2000), 17, 113-126および R. I. Mahoto, J. Drug Targeting (1999), 7, 249-268に記
載されている。
【００７３】
本発明の別の観点は、非ウィルス担体系としてリポソームまたは他の脂質系構築物の使用を含む。リポソームはpH-感受性リポソームでもpH-非感受性リポソームでもよい。pH-
感受性リポソームは、リポソーム膜中に少なくとも一つのpH-感受性成分からなる。典型
的な化合物として、オレイン酸のような脂肪酸、パルミトイルホモシステイン、コレステロール、ヘミコハク酸モルホリン塩およびジオレオイルスクシニルグリセロール（dieloy
lsuccinylglyecerol）が挙げられる。pH-感受性成分に加えて、上記リポソームは、ジオ
レオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）および／または他の類似リン脂質からなってもよい。
【００７４】
リポソームまたは他の脂質系送達システムは、好ましくは少なくとも一つのカチオン性脂質を含む。
【００７５】
脂質系の送達システムは様々なタイプの水性製剤に存在してもよい。これらの製剤には様々な用語が文献に用いられている：例えば、マルチラメラ・リポソーム（multilamella
r liposomes）、ユニラメラ・リポソーム（unilamellar liposomes）、pH-感受性リポソ
ーム、ナノエマルジョン、ナノ粒子、プロテオリポソーム（proteoliposomes）、ウィロ
ソーム（virosomes）、キメラソーム（chimerasomes）、コキレート（cochelates）、リ
ポフェクチン（lipofectinTM）およびリポプレックス（lipoplex）などである。遺伝子移送におけるカチオン性脂質の使用についての文献としては、P. L. Felgnerら, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1987), 84, 7413-7417、D. D. Lasicら, Adv. Drug Del Rev (1996)
, 20, 221-266、L. G. Barronら, Gene Therapy (1999), 6, 1179-1183、S. Kawakamiら,
Pharmaceutical Research (2000), 17, 306-313、N. S. Templetonら, Molecular Biote
chnology (1999), 11, 175-180、Y. Zouら, Cancer Gene Therapy (2000), 7, 683-696、D. D. Stuartら, Biochemistry et Biophysica Acta (2000), 1463, 219-229、R. I. Mah
atoら, Drug Deliv (1997), 4, 151および R. J. Leeら, Crit Rev Drug Carrier Syst (
1997), 14, 173が挙げられる。
【００７６】
本発明に有用な脂質としては、例えばUS 6,120,751, US 6,056,938, US 6,093,816, US
6,039,936, US 6,034,137, US 6,034,135, US 6,020,526, US 5,980,935, US 5,958,935
, US 5,935,936, US 5,877,220, US 5,830,430, US 5,777,153, US 5,705,693, US 5,459
,127, US 5,334,761, US 5,264,618 およびそれらの中の文献に記載されている。
【００７７】
カチオン性脂質の典型例としては、N [1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル-N,N,N-トリメチル-アンモニウムクロリド（DOTMA）、1,2-ジミリスチル-オキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（DMRIE）、1,2-ビス (オレオイルオキシ)-3-(
トリメチルアミノ)プロパン（DOTAP）、3β(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル-コレステロール（DC-Chol）、2,3-ジオレイル-オキシ-N [2-スペルミンカルボキシル-アミド]エチル-N,N-ジメチル-l-プロパンアミニウム(propanaminium)トリフルオロアセテート（DOS PA）、3-β(N4-スペルミンカルバモイル)-コレステロール、3-β(N4-スペルミジンカルバモイル)-コレステロールおよび ジオクタデシルアミドグリルスペルミン（DOGS
）が挙げられる。
【００７８】
上述したように本発明の好ましい態様の一つにおいて、担体はカチオン性脂質である。光化学的処置は、光が移送分子の後に与えられる場合、カチオン性脂質によって媒介されるトランスフェクションに対して、阻害作用を及ぼすことが以前に報告されている（Pras
mickaiteら(2000), J.Gene Med. 6, 印刷中）。しかしながら、移送分子の前に光が与え
られれば、PCIはカチオン性脂質によるトランスフェクションに対して、刺激的作用を有
するということが、現在示されたことは非常に驚くべきことである（実施例９参照）。
【００７９】
したがって、本発明のさらなる観点は、移送分子および光増感剤を含む治療用組成物を提供する。必要に応じて、該組成物中の移送分子および／または光増感剤は、上述したような担体分子に付随してもよい。好ましくは、その組成物はガン治療または遺伝子治療に使用される。遺伝子治療にとって好ましい担体分子はアデノウィルスである。他の好ましい担体はカチオン性脂質である。
【００８０】
かくして、さらなる観点において本発明は、治療に使用する医薬の製造のための、本明細書で記載したような移送分子および光増感剤の使用を提供する。ここで、該光増感剤および該移送分子は、患者の細胞もしくは組織と別個に接触させるためのものであり、その細胞は、光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で照射されることとなる。そしてその照射は、該光増感剤を含む細胞内コンパートメント内への該移送分子の細胞取り込みの前、好ましくは任意の細胞内コンパートメント内への該移送分子の細胞取り込みの前に行われることとなる。このような方法を含む治療方法は、本発明の別の観点を形成する。
【００８１】
よって本発明は、患者の疾患、障害または感染を治療するまたは予防する方法を提供する。該方法は、移送分子を１以上の細胞中に、インビトロ、インビボまたは生体外で、上記に記載の方法に従って導入することを含み、必要であれば（すなわち、トランスフェクションがインビトロまたは生体外（ex vivo)で実施される場合）、該患者に該細胞を投与する。
【００８２】
本明細書で定義される「治療」は、治療前の症状に関して、治療される１以上の疾患、
障害 または感染の症状を軽減し、緩和しまたは取り除くことをいう。「予防」は、疾
患、障害または感染の症状の始まりを遅らせる、または防止することをいう。
【００８３】
前述したように、このような方法はワクチン接種の方法への適用も有する。したがって、本発明のさらなる観点は、抗原分子（移送分子）またはその一部を細胞、好ましくは抗原提示細胞の表面に発現または提示する方法を提供する。該方法は、上述したような諸段階を含む。
【００８４】
本明細書で使用する「発現」または「提示」は、前記分子の少なくとも一部が前記細胞を取り巻く環境に曝され、接近できるように、該細胞の表面に、該分子またはその一部が存在することをいう。「表面」での発現は、発現させる分子が、細胞膜および／または（その細胞膜に存在するか、存在することとなった）成分と接触している状態で達成されるかもしれない。
【００８５】
この方法は、インビトロまたはインビボで行ってもよい。しかしながら好ましくは、このような抗原提示は、有利な面として結果的に免疫応答を刺激し、好ましくは該抗原分子またはその一部を構成するか含む実体による次の攻撃に対する防御を与える免疫応答を刺激することとなり、その結果本発明はワクチン接種の方法として特別な有用性を見出す。それゆえ好ましくは、本発明は上述したような方法を含むワクチン接種の方法を提供する。
【００８６】
本発明のこの観点において、ここで定義される移送分子は「抗原分子」のことをいう。抗原分子は、適切な方式で免疫システムに提示されるときに該分子またはその一部が免疫応答を刺激することができるなら、いずれの分子であってもよい。それゆえ、抗原分子はワクチン抗原またはワクチン成分、例えばポリペプチドを含む実体であることが有利である。
【００８７】
このような抗原または抗原性ワクチン成分の多数はすでに知られており、あらゆる種類の細菌性もしくはウィルス性の抗原、あるいは実際、原生動物もしくは高等生物を含む任意の病原性種の抗原または抗原性成分を含む。伝統的にワクチンの抗原成分は、生物まるごと（生きているか、死んでいるか、弱っている）、すなわち全細胞のワクチンを含んでいたけれども、加えてサブユニット（sub-unit）ワクチン、すなわち生物の特定の抗原成分、例えばタン白質もしくはペプチド、または炭水化物に基づくワクチンは広く研究され、文献に報告されている。このような任意の「サブユニット」ベースのワクチン成分は、本発明の抗原分子として使用してもよい。
【００８８】
しかしながら、本発明はペプチドワクチンの分野において特別の有用性を見出す。よって、本発明の好ましい抗原分子はペプチドである（本明細書で定義するペプチドは、長さの短いものおよび長いものの両方のペプチド、すなわち、ペプチド、オリゴペプチドまた
はポリペプチドならびにタン白質分子またはそのフラグメント、例えば5〜500アミノ酸、具体的には10〜250アミノ酸、例えば15〜75アミノ酸、あるいは8〜25アミノ酸のペプチドを含む）。提示されまたは発現される抗原分子の部分は、好ましくは抗原プロセッシング機構によって細胞内に生成される部分を含む。しかしながら、部分としては適当な抗原設計（例えば、pH感受バンド）または他の細胞プロセッシング手段によって達成される他の手段によって生成されてもよい。利便上、このような部分は免疫応答を生起するために充分なサイズ、例えばペプチドの場合、5アミノ酸を超えるサイズ、具体的には10または20
アミノ酸を超えるサイズである。
【００８９】
膨大な数のペプチドワクチン候補物質が、文献に、例えばAIDS/HIV感染またはインフルエンザ、イヌのパルボウィルス（parvovirus）、ウシの白血病ウィルス、肝炎などのウィルス性疾患および感染の治療についての文献に提案されている（例えば、Phanuphakら, A
sian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997,15(1), 41-8 ; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi
1994,69 (4), 811-20; Casalら, J. Virol., 1995,69 (11), 7274-7; Belyakovら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1998,95 (4), 1709-14; Naruseら, Proc. Natl. Sci. USA, 199
4 91 (20), 9588- 92; Kabeyaら, Vaccine 1996,14 (12), 1118-22; Itohら, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA, 1986,83 (23) 9174-8参照）。同様に、バクテリアペプチドを、実際
に他の生物または生物種から誘導されるペプチド抗原と同様に使用してもよい。
【００９０】
病原性生物に起源を持つ抗原に加えて、ペプチドは、ガンまたは多発性硬化症のような他の疾患に対するワクチンとしての使用が提案されている。例えば、突然変異型ガン遺伝子ペプチドは、細胞傷害性T-リンパ細胞の刺激における抗原を演じるため、ガン・ワクチンとして大きな期待を担っている（Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Cli
nical Oncology 1995,121,443-451; Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Respo
nse Modifiers,. 1997,17,316-327）。合成ペプチドワクチンもまた、転移メラノーマの
治療について評価されている（Rosenbergら, Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7）。多発性硬化症の治療のためのT-細胞受容体ペプチドワクチンは、Wilsonら, J. Neuroimmunol. 199
7,76 (1-2), 15-28に記載されている。このようなペプチドワクチン成分のいずれも、実
際に文献のペプチドワクチンとして記載されまたは提案されている任意のペプチドがそうであるように、本発明の抗原分子として使用してもよい。よってペプチドは合成されたもの、あるいは生物から単離され、さもなくば生物に由来するものでもよい。
【００９１】
本発明のこの観点の方法、使用などに供される細胞は、投与されまたは細胞質に移送される分子をその表面上に発現または提示することができる任意の細胞でよい。
【００９２】
本発明のこの観点の主要な有用性は、抗原提示またはワクチン接種にあるため、細胞は、免疫エフェクター細胞、すなわち免疫応答に関わる細胞であることが都合がよい。しかしながら、他の細胞もまた免疫システムに抗原を提示するかも知れず、これらもこの観点からの本発明の範囲内にある。よって、この観点による細胞は、優越的に抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、液性免疫および細胞仲介免疫の両方を含め、免疫応答のいかなる局面または「武器（arm）」に関わってもよく、例えば抗体産生の刺激、または細胞傷害
性細胞もしくはキラー細胞（これらは細胞表面に「外来」抗原を発現する細胞を認識し破
壊する（もしくは取り除く））の刺激である。よって、「免疫応答を刺激する」という用語は、あらゆる型の免疫応答ならびにそれらを刺激する機構を含む。
【００９３】
細胞傷害性細胞または抗体産生細胞の刺激は、抗原提示細胞による特定の様式、例えば、MHCクラスI提示によって刺激される細胞に対して、抗原が提示されることを要求する（具体的には、CD8+細胞傷害性T-細胞の活性化は、MHC-1抗原提示を要求する）。
【００９４】
抗原提示細胞は当業界で公知であり、文献に記載されており、これには例えば、リンパ球（TおよびBの両細胞）、樹状細胞、マクロファージなどが挙げられる。他のものとしては、例えばガン細胞、具体的にはメラノーマ細胞が挙げられる。
【００９５】
細胞傷害性T-細胞（CTL)に対する抗原提示細胞による抗原提示のためには、抗原分子が抗原提示細胞の細胞質に入る必要がある（Germain, Cell, 1994, 76, 287-299）。本発明は、抗原分子を細胞質内に送達する効率的な手段を提供する。
【００９６】
抗原分子はいったん光化学的内在化の方法によって細胞の細胞質内に放出されると、細胞の抗原プロセッシング機構によって処理され、適当な方法、例えばクラスI MHCによっ
て細胞表面に提示されるかもしれない。このプロセッシングは、抗原の分解、例えばタン白質またはポリペプチドのペプチドへの分解を伴い、次いで該ペプチドは提示のためにMH
Cの分子と複合化される。よって、本発明に基づき細胞の表面に発現または提示される抗
原分子は、細胞に取り込まれる抗原分子の一部またはフラグメントであってもよい。
【００９７】
抗原はエンドサイトーシスによって抗原提示細胞に取り込まれ、エンドサイトーシス性小胞内でペプチドに分解されるだろう。これらのペプチドは、エンドソーム中でMHCクラ
スII分子に結合して細胞表面に輸送させられ、そこでペプチド-MHCクラスII複合体がCD4+
T ヘルパー細胞によって認識され、免疫応答を引き起こすこととなる。あるいは、細胞
質中のタン白質が例えばプロテアソームによってそれらの部分に分解され、TAP（transpo
rter associated with antigen presentation；抗原提示に関係する輸送体）の手段によ
って小胞体内に輸送されてもよい。そこにおいて、ペプチドはMHC クラスI分子に結合し
、図１に示したように細胞表面に輸送させられる（Yewdell および Bennink, 1992, Adv.
Immunol. 52 : 1-123）。ペプチドが外来の抗原起源のものであれば、ペプチド-MHCクラスI複合体はCD8+細胞傷害性T-細胞（CTL）によって認識されるであろう。CTLは、ペプチ
ド-MHC(HLA)クラスI複合体に結合し、それにより活性化され、増殖し始めてCTLのクロー
ンを形成するであろう。標的細胞および細胞表面に同じペプチド-MHCクラスI複合体を有
する他の標的細胞は、CTLクローンによって殺されるかもしれない。外来抗原に対する免
疫は、充分な量のその抗原を細胞質内に導入することができれば、確立させることができる（Yewdell および Bennink, 1992, 上記; Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137
）。このことはとりわけガン・ワクチンの開発の基礎となる。実用化への最も大きい課題の一つは、充分な量の抗原（または抗原の一部）を細胞質内に導入することである。これはPCIによる本発明の方法によって解決することができる。
【００９８】
本発明の組成物は、治療、とりわけガン治療、遺伝子治療およびワクチン接種に利用されるために、本発明の方法により細胞質に内在化される移送分子を含有する細胞もまた含んでもよい。
【００９９】
したがって、本発明の別の観点は、細胞の細胞質内に内在化された移送分子を含有する細胞または細胞集団を提供し、その細胞は本発明の方法によって得られる。
【０１００】
本発明のさらに別の観点は、治療、好ましくはガン治療、遺伝子治療またはワクチン接種に使用される組成物もしくは医薬の製造のために、そうした細胞または細胞集団の使用方法を提供する。
【０１０１】
本発明はさらに、患者に本発明の細胞または組成物を投与することを含む、患者の治療方法を提供する。すなわち、上述したように細胞内に分子を導入し、このように調製された該細胞を患者に投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、該方法は、遺伝子治療で、またはワクチンによってガンを治療するために用いられる。
【０１０２】
当業界で共通であるか標準である任意のインビボ投与様式、例えば、身体の内部および外部表面などに対する注射、注入、または局所投与が使用できる。インビボでの使用について、本発明は、光増感剤および移送分子をそこに局在化させる細胞を含む任意の組織、固形組織ばかりでなく体液の存在場所を含めて、任意の組織に関して使用することができる。標的細胞により光増感剤が取りこまれ、ならびに光が適切に届き得る限り、あらゆる組織を処置することができる。
【０１０３】
かくして、本発明の組成物は、製薬業界において公知である技術および操作に基づく任意の便法、例えば、１種類以上の製薬的に許容される担体または賦型剤を用いて、製剤することができる。本明細書における「製薬的に許容される」とは、投与される者が生理的に受容できるばかりでなく、組成物の他の成分と共存できる成分のことをいう。本組成物の性状、および担体または賦型剤の材料、用量などは、選択ならびに所望する投与経路、治療目的などに応じて通常の方式で選択することができる。用量も同様で、通常の方式により決定することができ、分子の性状、治療目的、患者の年齢、投与様式などに依存する。光増感剤に関しては、照射に基づき膜を破壊する可能性/能力もまた考慮に入れなけれ
ばならない。
実施例
本発明を、添付する図面に参照しながら、本発明を限定するものと解されるべきでない以下の実施例を示し、更に詳細に説明する。
材料および方法
細胞系
ヒト・メラノーマ細胞系ＴＨＸは、ノルウェー・ラジウム病院において、転移性悪性メラノーマを治療された患者から得られた腫瘍組織から確立され（Aamdalら, 1986, Int. J
. Cancer, 37, 579）、そして10％FCS(Gibco-BRL)および2mMグルタミン（Gibco-BRL）を
補充したRMPI 1640 (Gibco-BRL)中で増殖させた。ヒト結腸ガン細胞系HCT 116は、「米国菌培養収集所」（ATCC no. CCL-247）により入手し、10%仔牛胎児血清、100 U/mlペニシ
リン、100 mg/mlストレプトマイシンおよび2 mMグルタミン（いずれもGibco BRL、Paisle
y、英国）を補充したRPMI 1640 培地中で増殖させた。
照射
細胞の処理のために、いずれも4本の蛍光管からなる一そろいの二組の異なる光源が使用
された。TPPS4、TPPS2a、および3-THPP（Porphyry Products、Logan, UT）で処理された
細胞は、細胞到達の際1.5mW/cm2の光強度で青色光（モデル3026; Appl. Photophysics, 
ロンドン、英国）に曝露され、他方AlPcS2a（Porphyrin Products、Logan, UT）で処理された細胞は、細胞到達の際1.35 mW/cm2の光強度でCinemoid 35により濾光された赤色光（Philips TL 20W/09）に曝露された。
蛍光顕微鏡法
細胞は、Berg. K.ら, Biochim. Biophys. Acta., 1370: 317-324,1998に記載された蛍
光顕微鏡法により分析された。フルオレセイン標識分子の分析のため、該顕微鏡は450-49
0 nmの励起フィルター、510 nmの二色性ビームスプリッターおよび 510-540 nm 帯域通過エミッション・フィルターを備えた。
プラスミド-pLys複合体の調製および細胞の処理
プラスミド-pLys複合体（チャージ比率1.7 、Berg ら (1999) Cancer Res. 59: 1180-8
3に記載による）は、HBS75μl中の 5 μgのプラスミド（pEGFP-N1; Clontech Laboratori
es, Inc., Palo Alto, CA）と、HBS75μl中の 5.3 μg pLys（MW 20,700; Sigma, St. Lo
uis, MO）とを穏やかに混合して調製した。この溶液を、30分間室温でインキュベートし
、培養培地で希釈してから細胞に加えた。
【０１０４】
THX細胞は、20μg/mlのAlPcS2aとともに37℃で18時間インキュベートし、洗浄してから、増感剤フリー培地中で3時間インキュベートし、次いでプラスミド−pLys複合体と1時間インキュベーションしてから、続いて露光した。あるいは代わりにAlPcS2aインキュベー
ションの後、細胞を洗浄し、次いで増感剤フリー培地中で4時間インキュベートしてから
露光し、続いてプラスミド−pLys複合体とともに1時間インキュベーションした。細胞は
、フローサイトメトリー法によるGFP発現分析の前に、37℃で2日間、培養した。
【０１０５】
HCT-116細胞は、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間インキュベートし、露光前に、AlPc
S2aの非存在下で洗浄し、4時間インキュベートした。この細胞は、露光の直前もしくは直後に、pEGFP-N1 ポリリジン複合体とともに4時間処理した。37℃で2日間の培養後、GFP 
発現をフローサイトメトリー法により調べた。
フローサイトメトリー分析
細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、培養培地400μl中に再懸濁し、50μmメッシュ
のナイロンフィルターを通じてろ過した。その後、細胞をFACS-Calibur (Becton Dickins
on) フローサイトメーターにより分析した。各サンプルについて、10,000 事象を集めた
。フルオレセイン蛍光（例えば緑色蛍光タン白質（GFP））は、488 nmで調整したアルゴ
ンレーザー(200 mW)で励起した後、510-530 nmフィルターを通して測定した。AlPcS2aは
、635 nmで調整したダイオードレーザー(50 mW) で励起した後、670 nm通過フィルターを通して測定した。セルダブレット（cell doublets）および死細胞は、ゲーティングによ
り生存能力のある単一細胞から区別された。
【実施例１】
【０１０６】
光投与量の関数としての光誘導トランスフェクション
THX細胞は、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間処理し洗浄して、増感剤フリー培地中で3時間インキュベートし、続いて1、2、3または4分間の露光の前に、5μgのpEGFP-N1/ポリリジン複合体とともに1時間インキュベートした。その代わりに図1に示すように、AlPcS2
aインキュベーションの後、細胞を洗浄し、増感剤フリー培地中で4時間インキュベートし、その後1、2、3または4分間の光処理に続いてpEGFP-N1/ポリリジン複合体とともに1時間インキュベーションした。GFP発現は、露光の48時間後に、フローサイトメトリー法によ
り分析した。pEGFP-N1/ポリリジン複合体のチャージ比率は1.7であった。
【０１０７】
この結果は図1に示され、これより、GFPトランスフェクションが、効果として、プラス
ミド-pLys複合体（例えば、pEGFP-N1/pLys）が露光の前よりもむしろ露光後に細胞に加えられた場合でも、同等に有効的であることがわかる。またこれより、どちらの処理でも、トランスフェクションした細胞の割合は、細胞が露光される時間の長さに依存し、そのパーセンテージは2分間程度で最大レベルに到達し、そしてその後は横ばいになることがわ
かる。
【実施例２】
【０１０８】
HCT-116 細胞中でのGFPの発現
HCT-116 細胞を、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間、続いて露光前にAlPcS2a非存在下で4時間インキュベートした。この細胞を、図2に示すように、露光の直前または直後に、pEGFP-N1/ポリリジン複合体とともに4時間処理した。このGFPの発現は、露光の2日後にフローサイトメトリーにより測定した。
【０１０９】
この結果は図2に示され、これより実施例1におけるTHX細胞のトランスフェクションと
同様であり、GFPのトランスフェクションは、プラスミド-pLys複合体（例えば、pEGFP-N1
/pLys）が露光の前よりもむしろ後に細胞に加えられた場合でも同等に有効であることが
わかる。また、トランスフェクションした細胞の割合は、細胞を露光した時間に依存して変化する。
【実施例３】
【０１１０】
光化学処理前後のゲロニン添加の相乗効果
ゲロニンは、細胞の細胞質中に存在する場合、タン白質合成を効果的に阻害する植物毒素である。THX細胞を、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間、続いて露光前に光増感剤フリー培地中で4時間インキュベートした。図3に示すように、この細胞は、AlPcS2aおよび1μg/mlのゲロニンの両方とともに処理するか、あるいは培地からそれが除去された後の18時間の露光直後に、ゲロニン（1μg/ml）を培地に加えた。タン白質合成は、露光の24時間
後に測定した。
【０１１１】
この結果は図3に示され、これより、ゲロニンが存在しなくても光化学処理そのものは
タン白質合成をいくらか減少に導くが、ゲロニンの存在下では、光化学処理の前であっても後であっても、有意に大きなタン白質合成阻害を誘導することがわかる。このデータは、ゲロニンが光化学処理の前あるいは後で細胞と接触しても、ゲロニンが細胞内に吸収されることを示す。
【実施例４】
【０１１２】
光誘導トランスフェクションにおける追跡時間（chase time）の効果
THX細胞は、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間処理し、洗浄して、3分間の光処理の前
に、増感剤フリー培地中で4時間インキュベートした。この細胞を、pEGFP-N1/ポリリジン複合体（チャージ比率1.7）との1時間の処理の前に、成長培地中で図4に示す時間インキ
ュベートした。GFP発現は、露光48時間後にフローサイトメトリーにより分析した。
【０１１３】
この結果は図4に示され、これより、pEGFP-N1とのトランスフェクションが露光後約5時間の半減期で減少することから、最良の結果を得るために内在化される分子は、光化学処理の後比較的速やかに細胞に曝さらされるべきであることがわかる。
【実施例５】
【０１１４】
照射に関し、トランスフェクション・パルスの関数としてのトランスフェクション効率
THX細胞は、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間処理し洗浄して、増感剤フリー培地中でインキュベートした。細胞は、3分間の露光の前（負の横軸座標値）または後（正の横軸
座標値）のいずれかで、pEGFP-N1/ポリリジン複合体を用いる処理のパルス（0.5または1
時間、処理の開始および終了を反映する図5の棒の幅）を受けた。GFP発現は、露光48時間後に、フローサイトメトリーにより分析した。数回の試験からのデータは、露光の直前または直後にトランスフェクションが実施される場合のトランスフェクション効率を100％
として扱って標準化した。
【０１１５】
この結果は図5に示され、これより、最良のトランスフェクション効率のためには、細
胞は、露光のちょっと前または後のいずれかで、内在化される分子に曝されるべきであることがわかる. 
【実施例６】
【０１１６】
光誘導トランスフェクション−pEGFP-N1/ポリリジン複合体とのインキュベーション時間
依存
THX細胞は、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間処理し洗浄して、光増感剤フリー培地中で4時間インキュベートしてから露光、続いて図6Ａに示されるように、pEGFP-N1/ポリリ
ジン複合体（チャージ比率 1.7）とともに、6時間までインキュベーションした。GFP発現は、露光48時間後に、フローサイトメトリーにより分析した。これらの処理の後におけるGFP-発現細胞の数を図6Bに示し、異なる処理の特異性を図6Cに示す。
【０１１７】
この結果は図6に示され、これより、pEGFP-N1/ポリリジン複合体とのインキュベーション時間が増加するにつれてトランスフェクションされた細胞数が増加するけれども(図6B)
、トランスフェクションの最も高い特異性は、最も短いインキュベーション時間の後に生じることがわかる(図6C)。
【実施例７】
【０１１８】
0℃におけるpEGFP-N1/ポリリジン複合体との処理
この実験は、光化学処理が細胞膜に軽い損傷を与え、それにより光処置後に細胞と接触したプラスミドが原形質膜を通じて漏れ得るのかどうかを検証するために設計された。
【０１１９】
THX 細胞は、20μg/mlのAlPcS2aとともに18時間処理して洗浄し、露光前に増感剤フリ
ー培地中で4時間インキュベートし、次いで露光直後にpEGFP-N1/ポリリジン複合体（チャージ比率 1.7）とともに、0℃で45分間のインキュベーションを行なった。この細胞は、
その後、A) 37℃に移す前に、トリプシン消化されおよびすべて播種されるか、あるいは
B) トリプシン処理なしに37℃に移すかのどちらかを行った。この細胞を図8に示すように露光した。GFP 発現は、露光48時間後に、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１２０】
上記細胞をpEGFP-N1/ポリリジン複合体とともに0℃で45分間インキュベーションした後、この複合体は細胞内に取り込みされず、細胞表面に付着するであろう。このTHX細胞は
、その後、プラスミド・フリー培地内において37℃でインキュベートするか（図8B）、またはこの表面からプラスミドを除去し、新しい皿に37℃ですべて播種するためにトリプシン処理した（図8A）。これらの実験は、光化学処理の後にプラスミド/ポリリジン複合体
が原形質膜を通じて漏れないことを意味する。
【実施例８】
【０１２１】
pEGFP-N1/ポリリジン複合体を用いる処理と3-THPPおよび光との組み合わせ
THX 細胞は、0.25μg/mlの3THPPとともに18時間処理し洗浄して、露光前に増感剤フリ
ー培地中で4時間インキュベートし、次いで露光直後にpEGFP-N1/ポリリジン複合体（チャージ比率 1.7）とともに1時間インキュベーションをした。細胞は図9に示すように露光さ
れ、GFP発現を露光48時間後にフローサイトメトリーで分析した。
【０１２２】
3-THPPは、主たる存在場所がエンドソームまたはリゾソームにない光増感剤である。この結果は図9に示され、光増感剤AlPcS2aを用いた前述の実施例に示された結果と比較すると、照射前の3-THPPとの細胞の処理は、GFP発現を僅かな増加を誘導するのみである。こ
のことはエンドソームおよびリゾソームに存在する光増感剤が有利であろうことを示す。
【実施例９】
【０１２３】
カチオン性脂質を用いた細胞のトランスフェクションを可能にする光増感剤と光前処理との組み合わせ  
HCT 116細胞を、実験の1日前にウェル(well)当たり75, 000 細胞の密度で12穴プレート中にすべて播種した。この細胞は、光増感剤AlPcS2a（0.20μg/ml）とともに18時間イン
キュベートし、次いで光増感剤フリー培地中で7時間追処理し、7分間赤色光に曝露した。次いでこの細胞を、プラスミドpEGFP-Nl を有するDOTAP（DOTAPはBoehringer社より購入
）−複合体（5: 1 DOTAP/ プラスミド, 1 μg/ml pEGFP-Nl ）とともに3時間インキュベ
ートし、成長培地で洗浄してから、EGFP発現を下記の「材料および方法」に記載されるようにフローサイトメトリーにより測定する前に37℃で21時間培養した。コントロール細胞は、露光しないことの他は同一の処理をした。
【０１２４】
この結果は図10に示され、これよりPCI処理が、DOTAP/プラスミド複合体を用いるトラ
ンスフェクション効率を約4倍に増加することがわかる。
【実施例１０】
【０１２５】
THX 細胞のアデノウィルス・トランスフェクションに対するPCIの効果
材料
フルオレセイン ジ-β-D-ガラクトピラノシド（FDG）はMolecular Probes (F-1179)よ
り購入した。その粉末をDMSO/エタノールの1：1混合物中に溶解することにより20 mM貯蔵溶液を調製した。この混合物を、8: 1: 1 の水/DMSO/エタノール溶液を調製するために、適切な容量の冷水に徐々に添加した。
【０１２６】
組換え体ウィルスAdCA17lacZが作成され、このものは、10％FCS、100 U/mlペニシリン
（Gibco-BRL）、0.1 mg/mlストレプトマイシン（Gibco-BRL）および2mMグルタミンを添加したMEM  F-11 培地中において維持されたAd E1‐形質転換胚性腎臓細胞系である、ヒト
細胞系 293中で増殖させた。
組換え体ウィルスの構成
ヒトCMVプロモーターの調節下で、大腸菌 lacZ 遺伝子をコードする組換え体アデノウ
ィルスAdCA17lacZ は、293細胞中でpJM17システムを用いて相同組換え（homologous reco
mbination）により得た（Addisonら, 1997, J. Gen. Virol., 78,  1653-  1661）。組換え体ベクターはプラーク精製し、293細胞中で高タイターになるまで増殖させ、前述した
ように塩化セシウム結合法（cesium chloride banding）により精製した（Hittら, 1995,
Methods in Mol. Genetics., 7,15-30）。
細胞の感作
THX細胞（4×105 細胞）は、6cm皿中に播種し、一晩成長させた。約60％の集密度で、
該成長培地を、20μg/mlのAlPcS2aを添加した2mlの成長培地で交換し、その皿をインキュベーター中に16〜18時間戻し置いた。次いで、その増感剤含有培地を吸い取って除き、該細胞を光処理およびウィルス感染の前に、通常の成長培地中で少なくとも4時間インキュ
ベートした。
細胞の感染
3つの皿から細胞を遊離させるためにトリプシン-EDTAを使用し、各皿における平均細胞数をBurcher区画計数器により計算した。アデノウィルス希釈液を、感染させる細胞数に
応じて、0.68 mM CaCl2 および 0.5 mM MgCl2を含むPBS中で調製した。通常、細胞は1お
よび10のm.o.i.（感染効率）で感染させられた。
【０１２７】
ウィルスの添加前に、上記細胞を赤色光（Philips TL 20W/09、細胞到達の際1.35 mW/c
m2の光強度でCinemoid 35フィルターによって濾光された）に3分間露光した。次いでその培地を吸い取って除き、200μlのウィルス懸濁液（または、ウィルス処理しない対照の場合、0.68 mM CaCl2 および 0.5 mM MgCl2を含むPBS）を各皿に添加した。37℃で30分間のインキュベーション後、通常の成長培地5mlを添加し、その細胞を48時間成長させた。
β−ガラクトシダーゼアッセイ
細胞をトリプシン-EDTAで遊離させ、5mlの成長培地中に再懸濁した。5分間1000rpmの遠心分離の後、その培地を吸い取って除き、その細胞ペレットを50μl成長培地中に再懸濁
し、その遠心チューブを37℃の水浴中に5分間静置した。
【０１２８】
次いで、37℃に予熱した2mMのFDG-溶液50μlを添加し、そのチューブを水浴中に1分間
戻し置いた。最後に、900μlの成長培地を加え、サンプルを上述したフローサイトメトリーにより分析する前に、上記チューブを30〜60分間氷上でインキュベートした。
【０１２９】
THX細胞は、AlPcS2a（図11でPSとして示す）およびアデノウィルス（図11で"ウィルス"
として示す）とともに処理して3または4分間露光し、「材料および方法」において記載したようにβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）活性をフローサイトメトリー法により測定し
た。β−gal総活性は、β−gal陽性細胞とそれらのβ−gal活性を積算することにより定
量した。β−gal陽性細胞数およびβ−gal平均活性は、いずれもPCI処理により増加した
。
【０１３０】
これらの結果から、細胞をウィルスだけ、またはウィルスおよび光増感剤とともにインキュベートした場合、THX細胞の最少の感染が生じるが、光化学処理、すなわち該光増感
剤に光を添加すると、細胞の形質導入を著しく強化することがわかる (β−gal活性の増
加により示される)。
【実施例１１】
【０１３１】
エンドサイトーシス・マーカー分子の細胞内局在化に対する光化学処理の効果
THX細胞を、Falcon 3001 皿中に播種し（2.5×104 細胞／皿）、その翌日20μg/mlのAl
PcS2aとともに18時間処理し、AlPcS2aから洗浄してAlPcS2aフリー培地中で4時間インキュベートした。その後、上記細胞を、エンドサイトーシス・マーカーであるFITC−デキストラン5mg/mlとともに3時間インキュベートする前に、4分間露光した。非照射細胞は、露光のほかは同じ方法で処理した。固定化していない細胞におけるFITC−デキストランの細胞内局在化は、倍率63倍の対物レンズ、450〜490 nm帯域通過励起フィルターおよび510〜54
0 帯域通過エミッション・フィルターを用いて、Zeiss  Axioplan 蛍光顕微鏡（Oberkoch
en,ドイツ）で観察した。蛍光顕微鏡写真は、冷却した電荷結合素子(CCD)カメラ（Photom
etrics Inc., Tucson, AZ）を用いて記録した。
【０１３２】
この結果（図12）より、蛍光性エンドサイトーシス・マーカーであるFITC-デキストラ
ンの前に与えられた光を伴うPCIは、このマーカーの局在をエンドサイトーシス小胞（パ
ネルAで非照射細胞について示される点）から細胞質（パネルBで照射細胞に見られる拡散した蛍光）へとシフトさせることがわかる。このようにして、その光処理は、該高分子が内在化される前に行われるとき、この高分子は細胞質へ頗る急速に転移してリソソームによる該高分子の分解の可能性は充分減少する。
【実施例１２】
【０１３３】
THX-およびHCT 116細胞中においてゲロニン毒性に及ぼす光化学処理の効果
ゲロニンは、細胞の細胞質中に存在する場合に、タン白質合成を効果的に阻害する植物毒素であるが、それ自身だけでは細胞質に到達できず、このため無傷な細胞に対しては全く非毒性である。ゲロニンを用いる処理のために、ウェル当たり25×103細胞を24穴プレ
ート（Nunc,デンマーク）に播種した。その翌日、20μg/mlのAlPcS2aを加え、その細胞を18時間37℃でインキュベートした。AlPcS2a添加以降の全工程の操作は、抑制した光の下
で行った。「光照射が前」方策（strategy）のために、細胞をAlPcS2aから洗浄し、AlPcS
2aフリー培地中で4時間インキュベートした。その後、その細胞は、1μg/mlゲロニンとの18時間の処理の前に、（図中に示すように）露光した。
【０１３４】
「光照射が後」方策（strategy）のために、細胞は、20μg/mlのAlPcS2aおよび1μg/ml
ゲロニンとともに、18時間同時にインキュベートし、図中に示すように露光前に洗浄した。
【０１３５】
非照射細胞は、光照射を除き同じ方法で処理した。処理した細胞は、培養培地で一度洗浄し、新しい培地を添加した後、更なる分析前に37℃でインキュベートした。タン白質合成の阻害は、露光後24時間してタン白質中への[3H]-ロイシン取り込みをアッセイした。
照射は、4本の光源管（Philips TL 20W/09）および550〜600 nmでのカットオフ（cut-off
）を有するロングパス・フィルターを備えた台から行った。細胞到達の際の光強度は13.5
W/m2であった。
【０１３６】
本実施例より、THX-（図13A）および HCT 116（図13B）細胞はいずれも、「光照射が前」方策（strategy）が、「光照射が後」方策（strategy）よりもよく作用することがわかる。このため、THX-細胞では、最も高い光照射量において、タン白質合成阻害は「光照射が前」の方が「光照射が後」よりも約３倍強かった。これより両方の細胞系において、ゲロニン自体は、PCI処理がないと毒性作用を何ら示さず、光化学処理により発現され得る
毒性効果の誘導においては、強度および特異性を発揮することがわかる。
【実施例１３】
【０１３７】
アデノウィルス-媒介遺伝子導入の光化学刺激
5×104 THX細胞／穴を6穴プレートに播種した。その翌日、20μg/mlのAlPcS2aを加え、その細胞を18時間37℃でインキュベートした。AlPcS2a添加以降の全工程の操作は、抑制
した光の下で行った。「光照射が前」方策（strategy）のために、細胞をAlPcS2aから洗
浄し、AlPcS2aフリー培地中で4時間インキュベートした。その後、その細胞を、アデノウィルス性ベクターであるAdHCMV-lacZ（実施例10においてはAdCA171acZとして記載）を用
いて1の感染効率（MOI）での30分間の処理の前に、3分間露光した。このベクターは、そ
の発現がフローサイトメトリー（下記参照）により分析することができるβ-ガラクトシ
ダーゼ・レポーター遺伝子を含む。
【０１３８】
「光照射が後」方策（strategy）のために、AlPcS2a処理しおよび洗浄をした細胞は、
まず上述したのと同じ濃度および同じ時間でアデノウィルスとともに処理し、洗浄して新しい培養培地を添加した後に露光した。非照射細胞は、照射以外は同じ方法で処理した。
【０１３９】
処理した細胞は、培養培地で一度洗浄し、新しい培地を添加した後は更なる分析の前に37℃でインキュベートした。β-ガラクトシダーゼ発現は、露光2日後にフローサイトメトリーにより分析した。このウィルス構築物（AdHCMV-lacZ またはAdCA17lacZのいずれかで言及されている）を調製する詳細な方法、細胞の処理、照射およびβ-ガラクトシダーゼ
発現の分析は、実施例10に記載した。
【０１４０】
この結果（図14）より、「光照射が前」法を用いた光化学処理（図14の右側の棒により示される）は、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞の割合を、これらの実験条件の
下で2.5％から15％と、約6倍に増加させたことがわかる。また、「光照射が前」操作法による効果は、「光照射が後」法（図14の左側の棒により示される）で得られた効果とほぼ同様であることも見うけられる。
【実施例１４】
【０１４１】
光誘導トランスフェクションの能力におけるインキュベーション時間の効果
ウェル当たり5×104 THX細胞またはウェル当たり7.5×104 HCT 116細胞を、それぞれ6
穴および12穴のプレートに播種した。その翌日、20μg/mlのAlPcS2aを添加し、それらの
細胞を37℃で18時間インキュベートした。AlPcS2a添加後の全工程操作は、抑制した光の
下で行った。それらの細胞をAlPcS2aから洗浄し、AlPcS2aフリー培地中で4時間インキュ
ベートした。次いでpEGFP-N1/ポリリジン（5μg/ml pEGFP-N1）複合体で図15に示す時間
だけ処理する前に、該細胞を露光した（THX 細胞には3分間、またはHCT 116 細胞に7分間）。非照射細胞は、照射のほかは同じ方法で処理した。処理した細胞は、培養培地で一度洗浄して新しい培地を添加してから、37℃で2日間培養した後フローサイトメトリー（「
材料および方法」参照）によるEGFP発現の分析をした。照射は、4本の光源管（Philips T
L 20W/09）および550〜600nmでのカットオフを有するロングパス・フィルター（long pas
s filter）を備えた台から行った。細胞到達の際の光強度は13.5W/m2であった。pEGFP-N1
/ポリリジン複合体（チャージ比率1.7）は、別々に用意したプラスミドとポリリジンの溶液（5μg pEGEP-N1プラスミドは75μlの水に希釈、5.3μg ポリリジンは75μlの水に希釈）を穏やかに混合して調製した。これらの溶液は、混合して30分間室温でインキュベートし、培養培地で1mlに希釈して細胞に加えた。
【０１４２】
その結果（図15）より、THXおよびHCT 116細胞の両方において、DNA/ポリリジン複合体によるトランスフェクションは「光照射が前」光化学処理により強く誘導され得ることがわかる。トランスフェクションの刺激は、DNAとの短時間のインキュベーションの後で、
少なくとも30分インキュベーション時間まではすでに効果的であることがわかる。光誘導トランスフェクションは、インキュベーション時間とともに増加するが、DNAとの約2時間のインキュベーションの後は、見かけ上横ばいになる。
【実施例１５】
【０１４３】
光増感剤としてTPPS2aを用いてポリ−L−リジンにより媒介されたTHX 細胞のトランスフ
ェクションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果  
テトラフェニルポルフィリン ジスルホン酸塩（TPPS2a）、ロット#04197は、Porphyrin
Products（UT、米国）により製造された。TPPS2aはDMSO中に溶解した。
【０１４４】
プラスミド pEGFP-N1は、Clontech Laboratories Inc.から購入した（CA, 米国;カタログ番号 6085-1）。用いられたこのバッチ（ロット# EGFP-N1-1002）は、ELIM Biopharmac
euticals, Inc. (CA, 米国)により製造され、無菌水中5 mg/mlの濃度で供給された。0.5
mg/mlの貯蔵溶液は、無菌TE-緩衝液 pH 7.4（1 mM Tris-HC1、1 mM EDTA）で作られ、−2
0℃で保存された。
【０１４５】
THXヒト・メラノーマ細胞は、10％ FCS（仔牛胎児血清）、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびL-グルタミンを添加したRPMI 1640 培地中で培養した。抑制した光中で、その培地を除去し、2μg/mlのTPPS2aを含む培地を添加した。この細胞（光から保護して）を
、37℃で18時間インキュベートした。この細胞を、培地で3回洗浄し、PLL-L（「光照射が後」）サンプルについては、pEGFP-Nl/ポリ-L-リジン複合体を含む培地1 mlを添加した。この複合体は5μgのpEGFP-NIを含み、DNAに対するポリ-L-リジン（PLL）のチャージ比率
は1.7であった。さらに暗所にて37℃で4時間インキュベーションした後、培地を除去し、その細胞を培地で1回洗浄した。1 mlの培地を添加して、図16の記載と「材料および方法
」に記載したように、その細胞を青色光に露光した。L-PLL（「光照射が前」）サンプル
については、pEGFP-NL/PLL複合体フリー培地中で最初の4時間のインキュベーションを行
い、その複合体を光照射後に直ちに添加し、さらに4時間のインキュベーションの後に除
去した。その細胞を、フローサイトメトリーによるEGFP発現分析の前に2日間培養した（
光から依然保護して）。この分析のために、細胞をトリプシン消化処理し（トリプシン-E
DTA、Sigma, MO, 米国）、400μlのRPMI培地に再懸濁し、50μmメッシュのナイロンフィ
ルターを通してろ過してから、FACS-Caliburフローサイトメーター(Becton Dickinson, C
A, 米国)での分析を行った。EGFPは、488 nmでの励起の後、510〜540nmフィルターを通じて測定した。ヨウ化プロピダム（Propidum iodide;1μm/ml）を、生細胞から死細胞を区
別するために用い、単一細胞から細胞二重体（cell doublet）を区別するためにパルス処理を行った。各サンプルで10,000事象を集めてデータをCELLQuestソフトウエア（Becton
Dickinson, CA, 米国）を用いて分析した。
結果
図16に見られるように、THX 細胞のポリ-L-リジン媒介トランスフェクションについて
は、TPPS2a 光増感剤を用いた場合、「光照射が前」の移送分子添加アプローチは、「光
照射が後」アプローチと同様に作用する。
【実施例１６】
【０１４６】
光増感剤としてTPPS4を用いて、ポリ-L-リジンにより媒介されたTHX 細胞のトランスフェクションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果
TPPS2aの代わりにTPPS4 光増感剤（75μg/ml）を用いたことの他は、実施例15に記載のようにして、THX 細胞を育成しおよび処理した。
結果
図17より、ポリ-L-リジン媒介のTHX-細胞トランスフェクションについては、TPPS4光増感剤を用いた場合、「光照射が前」法は「光照射が後」法より少し良好に作用するが、いずれの方法でもやはりトランスフェクションを達成することは明らかである。
【実施例１７】
【０１４７】
光増感剤としてTPPS2aを用いて、ポリ-L-リジンにより媒介されたHCT 116細胞のトランス
フェクションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果
HCT 116 細胞を、実施例15に記載のように育成および処理した。
結果
図18より、ポリ-L-リジン媒介のHCT 116細胞のトランスフェクションについては、TPPS
2a 光増感剤を用いた場合、「光照射が前」法は、「光照射が後」法と同様に作用するこ
とがわかる。
【実施例１８】
【０１４８】
光増感剤としてTPPS4を用いて、ポリ-L-リジンにより媒介されたHCT 116細胞のトランス
フェクションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果
TPPS2aを用いる代わりに、TPPS4 光増感剤（75μg/ml）を用いたことの他は、実施例15
に記載のようにして、THX 細胞を育成しおよび処理した。
結果
図19より、ポリ-L-リジン媒介のHCT 116細胞のトランスフェクションについては、TPPS
4 光増感剤を用いた場合、「光照射前」法は、「光照射後」法と同様に作用することがわかる。
【実施例１９】
【０１４９】
光増感剤としてTPPS4を用いて、DOTAPにより媒介されたトランスフェクションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果
HCT 116細胞を、10％FCS（仔牛胎児血清）、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび L-
グルタミンを添加したRPMI 1640培地中で培養した。抑制した光の中で、該培地を除去し
、75μg/mlのTPPS4を含有する培地を加えた。その細胞（光から保護）を、37℃で18時間
インキュベートした。細胞を培地で3回洗浄し、DOTAP-L（「光照射が後」）サンプルについては、1μgのpEGFP-Nlおよび5μg のDOTAP の複合体を含む培地1 mlを添加した。さら
に暗所にて37℃で4時間インキュベーションした後、培地を除去し、その細胞を培地で1回洗浄した。1 mlの培地を添加して、図20に示され「材料および方法」に記載したように、その細胞を青色光に露光した。L-DOTAP（「光照射が前」）サンプルについては、最初にp
EGFP−N1/DOTAP複合体フリーの培地中で4時間のインキュベーションを行い、光照射後に
直ちにその複合体を添加して、さらに4時間のインキュベーションの後除去した。その細
胞を、実施例15に記載したフローサイトメトリーによるEGFP発現分析の前に、1日間（依
然として光から保護して）インキュベートした。
結果
図20より、カチオン性脂質であるDOTAPにより媒介されたHCT 116細胞のトランスフェクションでは、TPPS4 光増感剤を用いた場合、「光照射が前」法は「光照射が後」法よりも充分良好に作用することが観察される。「光照射が前」法は、カチオン性脂質に媒介されたトランスフェクションには、特に有利であると思われる。
【実施例２０】
【０１５０】
光増感剤としてTPPS2aを用いて、SuperFect（登録商標）により媒介されたトランスフェ
クションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果
SuperFect（登録商標）は、QIAGEN  AGより購入した。
プラスミド/SuperFect（R）複合体の調製
プラスミド/ SuperFect（R）複合体は、以下のようにして調製した：(i) pEGFP-NlをRP
MI 1640 培地（血清、タン白質および抗生物質フリー）で希釈した、(ii) SuperFect （2
μl/μg DNA）をプラスミド溶液に添加し、内容物を10秒間、渦流（vortexing）により混合した、(iii) 複合体が生成するように、その溶液を室温で10〜20分間インキュベートした、 (iv) 400μlの細胞成長培地（血清および抗生物質を含む）をトランスフェクション複合体の入った試験管に添加し、その内容物をピペットで2回上下して混合し、全量を直
ちに細胞へ移した。
細胞の処理
HCT 116細胞（ウェル当たり75,000 細胞、1 ml/穴）を、12穴プレート(Costar Corning
, NY, 米国)に播種し、6時間付着させておいた。0.7μg/mlのTPPS2aを含む培地1 mlを添
加し、その細胞を18時間（5％ V/V CO2、37℃）インキュベートした。その細胞を培地で3
回洗浄し、血清含有培地中で4時間（37℃、5％ V/V CO2）インキュベートした。その細胞を、420nm付近に最高フルエンスを有する4本の蛍光管一そろい（Osram 18W/67）に曝すことにより光照射した。その露光後直ちに上記プラスミド/SuperFect（R）複合体を添加し
、その細胞を複合体とともに1または4時間インキュベートした。次いで細胞はRPMI 1640
培地で4回洗浄し、1mlの培地を加えてさらに２日間培養した。その後、実施例15に記載したフローサイトメトリーによりEGFPの発現を分析した。
結果
図21に見られるように、試験したいずれの条件においても、例えば、0.75μg DNA、1時間のトランスフェクション時間では9倍の向上が見られ、一方0.75μg DNA および 4時間
のトランスフェクション時間では10倍の増大が観察され、PCIはSuperFect（登録商標）トランスフェクションを充分向上させたことがわかる。
【実施例２１】
【０１５１】
光増感剤としてのTPPS2aを用いて、アデノウィルスにより媒介されたHCT 116細胞の遺伝
子トランスフェクションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果  
HCT 116細胞を、10％FCS（仔牛胎児血清）、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびL-
グルタミンを添加したRPMI 1640培地中で培養した。抑制した光中で、その培地を除去し
、1μg/mlのTPPS2aを含む培地を各ウェルに添加した。該細胞（光から保護）を、37℃で1
8時間インキュベートした。細胞を培地で3回洗浄し、次いで光照射（光増感剤を除去していつも4時間後）の前または後の種々異なる時点でAd-HCMV-LacZ アデノウィルスで感染させた。その後細胞をさらに2日間インキュベート（依然として光から保護）してから、実
施例10（「材料および方法」）に記載したようにフローサイトメトリーによりβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。
結果
図22は、アデノウィルス媒介の遺伝子導入に及ぼすPCI効果への、ウィルス送達に関連
する光処置のタイミングの効果を示す。これより「光照射が前」アプローチ（Y軸の右側
）については、PCI光照射が少なくとも13 時間効果的であり、このためウィルスを光照射後、少なくとも13時間までは投与でき、遺伝子導入へのPCIの積極的な効果が保持されて
いることがわかる。このことは、臨床的立場からは極めて重要なことである。なぜなら治療の策定ならびに患者が受けるであろう他の治療、例えば手術手順との調整において少なからぬ融通性を医師に与えるからである。
【実施例２２】
【０１５２】
光増感剤としてAlPcS2a を用いて、ポリ-D-リジンにより媒介されたHCT 116細胞のトランスフェクションに対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果
HCT 116細胞を、pEGFP-Nlとの複合体を作成する際に、ポリ-L-リジンの代わりにポリ-D
-リジンを用いたことの他は、実施例15に記載のとおり、育成、処理および分析した。
結果
図23より、トランスフェクション剤としてポリカチオンのポリ-D-リジンを用いた場合
にも、「光照射が前」処理プロトコルを用いるPCIが良好に作用することが観察される。
【実施例２３】
【０１５３】
光増感剤としてTPPS2aを用いて、細胞増殖抑制剤ブレオマイシンによる細胞殺滅に対する、前に光照射するPCIストラテジーの効果
テトラフェニルポルフィリン ジスルホン酸塩（TPPS2a）、ロット#04197は、Porphyrin
Products（UT、米国）により製造された。TPPS2aはDMSO中に溶解した。
【０１５４】
チャイニーズハムスターの肺線維芽細胞系 V-79をこの研究に用いた。
【０１５５】
Sigma（MO, 米国;カタログ番号M2128）からのMTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物）を、5 mg/ml 濃度となるようにPBSに溶解し、
無菌ろ過し、4℃で保存した。
【０１５６】
ブレオマイシン（ASTA Medica）15 000 IE/KYをノルウェー・ラジウム病院の薬局から
入手した。1 IEは、ブレオマイシン1mgに対応する。ブレオマイシン粉末は、無菌0.9％Na
Cl溶液中に溶解し、最終濃度2 mMとした。
細胞培養
V-79 細胞は、10％仔牛胎児血清、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2 mMグルタミン（すべてGibco BRL, Paisley, スコットランド）を添加したRPMI 1
640 培地（Gibco）中で、37℃、5％CO2、湿った環境下で培養した。
細胞の処理
前記細胞（ウェル当たり75,000 細胞、1 ml/穴）を、12穴プレート（Costar Corning,
NY, 米国）に播種し、6時間付着させておいた。いくつかの穴に0.7μg/mlのTPPS2aを含む培地1 mlを添加し（表1参照）、その細胞を18時間（5％ V/V CO2、37℃）インキュベートした。細胞を培地で3回洗浄し、その後該細胞を血清含有培地中で4時間インキュベートした。その培地を除去し、新しい培地を添加して、前記細胞を、420nm付近に最高フルエン
スを有する一そろいの4本の蛍光管（Osram 18W/67）を有する箱からの光に曝すことによ
り光照射した。
【０１５７】
異なる投与量のブレオマイシンを直ちに添加した。ブレオマイシンとともに1または4時間インキュベートした後、その細胞をRPMI培地で一回洗浄し、培地1 mlを添加し、3日間
のインキュベーションをした後、MTTアッセイにより生存細胞数を測定した。この方法は
、生存して代謝的に活性のある細胞中に存在するミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ類により、水溶性テトラゾリウム塩（MTT）が還元されて不溶性の紫色ホルマザン生成物にな
ることに基づく。0.25μgのMTTを含む培地1mlをその細胞に加え、続いて4時間インキュベーション（37℃、5％ V/V CO2）した。結果として生じたホルマザン結晶を、1ウェルあたり200μlのイソプロパノール（Sigma, MO, 米国）を加えて溶解した。その溶液を96穴プ
レートに移し、570 nmのバンドパス フィルターを有するMultiskan EX マイクロプレートリーダー（Labsystems,フィンランド）により読み取った。生存細胞数は、光処理を受け
ていない対照細胞に対する割合として計算した。
結果
図24は、「光照射が前」法を用いるPCIは、臨床的に承認された低分子量の化学療法
剤（ブレオマイシン）による生物学的効果もまた増強し得ることを示す。したがって100
μMのブレオマイシン投与量で、ブレオマイシンによる細胞毒性における光誘導された著
しい増加が観察される（図24中の■および●）。ブレオマイシン投与量が最も低い場合（図24中の◆）での効果の欠如は、この細胞毒性の増加は光化学処理自体の結果ではないことを示す。このサンプルシリーズは、100μMブレオマイシンのシリーズと同じ光化学処理を受けたが、細胞生存率への光誘導効果が観察されなかったためである。
【実施例２４】
【０１５８】
インビボモデルのマウスにおける腫瘍治療のためのゲロニン併用のPCI
動物
Balb/c (nu/nu) 雌性無毛マウスは、癌研究所（Institute for Cancer Research）の動物部門で繁殖された。マウスは、特異的病原体のない（spf）条件下に維持された。水お
よび食物は自由に与えた。マウスに関わる処置はすべて、国家倫理委員会の動物保護ガイドラインによるコントロールの下で、ノルウェー・ラジウム病院の動物飼育委員会に是認されたプロトコルと合致させながら遂行した。実験開始時において、マウスは平均20〜25
g（5-8週齢）であり、実験群ごとに少なくとも5匹のマウスを用いた。本研究で用いたWi
Dr ヒト腺癌は、Balb/c （nu/nu）マウス中への逐次移植により増殖させた。その腫瘍は
、外科用メスで細かく刻んで均一にし、各マウスの右尻皮下にその溶液20μlを注射した
。その腫瘍の大きさは、二つの直交する直径を測定することにより、週に２回もしくは3
回測定した。腫瘍体積は次式を用いて計算した：
V = （W2 × L）/2
ここでWは測定した腫瘍の幅、Lは直径の長さである。
処置
マウスは、表1および図25に示される異なる群に無作為に割り当てた。AlPcS2a の貯蔵
溶液を、PBSで1.25 mg/mlに希釈し、腫瘍が約100mm3の体積に到達したときに10 mg/kgの
最終濃度となるように、腹腔内に注射した。AlPcS2aの注射から48時間後に、腫瘍を16分
間赤色光（下記参照）に曝らした。露光後直ちに、ゲロニン（2 mg/ml 溶液での総量が50
μg、すなわち25μl）を腫瘍内に注射した。これらのマウスはAlPcS2aの注射の後1週間暗所に保持した。
光処置
腫瘍を、580 nm ロングパスおよび700nm ショートパスフィルターでフィルターされ、1
50mW/cm2放出の、150Wハロゲンランプ（Xenophot HLX64640）で光照射した。動物は、腫
瘍の直径よりも2mm大きい直径を有する穴を箔上に設けたアルミ箔で、その腫瘍領域以外
が覆われた。腫瘍は145 J/cm2の光に曝された。腫瘍体積は上記のように週に2回または3
回測定した。腫瘍の直径が約20mmに到達したときにマウスを犠死させた。光照射30日後の腫瘍のないマウスの割合を記録し（表1）、各処置群の平均腫瘍体積を記録した（図25）
。
結果
【０１５９】
【表１】
0004578770.tif 000002
【０１６０】
表1より、「光照射が前」法を用いたゲロニン併用のPCI（グループ8）では、80％（4/5
）のマウスが腫瘍から治癒されたことがわかる。対照的に、ゲロニンのみでは、追加の光処置（AlPcS2aなし）があっても（グループ4）、あるいはなくても（グループ3）いずれ
においても効果が見られなかった。AlPcS2aとゲロニンとを組み合わせても、光処置なし
（グループ6）で行うと何ら効果が見られなかった。非処置のグループ（グループ1）では、おそらく自発的に消失した腫瘍のために、治癒が低い割合で見られる。低い割合での治癒は、AlPcS2aおよび光処理を受けた動物（グループ7）にも見られた。これは、ゲロニンの存在には依存せず、光線力学治療（PDT）の効果によるものである。しかしながら、こ
のPDT処置効果（18％治癒）は、ゲロニン併用のPCI処置（80％、グループ8）で見られる
効果よりも著しく低い。ゲロニンそれ自体には少しも効果がなかったことから、PCIグル
ープにおける高い治癒割合について、たとえPDTとゲロニンとの相加的効果により説明す
ることができなくとも、PCI処置がゲロニンの毒性能力を発揮させる相乗的効果によるに
違いない。
【０１６１】
図25には、いくつかの処置グループにおける平均腫瘍体積に対するPCI処置の効果が示
される。これより、ゲロニン処置のみを受けた群では（△）、腫瘍の成長は、光照射とリン酸緩衝化食塩水（PBS）注射のプラシーボ処置を組み合わせた動物（■）と同程度に早
く腫瘍が成長したことがわかる。光化学処置のみを受け、ゲロニン処置なしの動物では（◇）、腫瘍成長は遅くなるが、その腫瘍は照射から約15日後に再び成長を開始した。対照的に、完全なゲロニンPCI処置を受けた動物では（●）、平均腫瘍体積に増加がないこと
は、光照射から33日後でさえも見られた。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、pEGFP-N1ポリリジン複合体を用いるTHX細胞の光誘導トランスフェクションを示し、該細胞は、図中に示されているように光に曝される前または後に、pEGFP-N1ポリリジン複合体と接触させている。
【図２】図２は、pEGFP-N1ポリリジン複合体を用いるHCT-116細胞の光誘導トランスフェクションを示し、該細胞は、図中に示されているように光に曝される前または後に、pEGFP-N1ポリリジン複合体と接触させている。
【図３】図３は、ゲロニンを用いるTHX細胞の光誘導処置およびタン白質合成の減少を示し、該細胞は、図中に示されているように光に曝される前または後に、ゲロニン分子と接触させている。
【図４】図４は、光曝露の直後および光曝露後の後の時点で、THX細胞とpEGFP-N1ポリリジン複合体とを接触させることによる、THX細胞の光誘導トランスフェクション効率への効果を示す。
【図５】図５は、光曝露の前後の様々な時点で、THX細胞とpEGFP-N1ポリリジン複合体とを接触させた場合のTHX細胞の光誘導トランスフェクション効率への効果を示す。
【図６】図６は、光曝露後に様々な長さの時間、THX細胞をpEGFP-N1ポリリジン複合体と接触させた場合のTHX細胞の光誘導トランスフェクションへの効果を示す。
【図７】図７は、これにより本発明が機能する、ある想定モデルの模式図を示す。  A.  光増感剤Sがエンドサイトーシスされ(I)、最後は細胞内小胞中に落ち着く（II)。これらの        小胞は光に曝されると分解する（III)。  B.  Aで記載した光化学的処置後、細胞は、エンドサイトーシスされ細胞内小胞に存在する分子Mで処置される。これらの小胞は光化学的に損傷した小胞と融合し、分子Mが細胞質内に放出される。
【図８】図８は、細胞を０℃でpEGFP-N1ポリリジン複合体を用いて処置したことのトランスフェクションへの効果を示す。
【図９】図９は、主にエンドサイトーシス性小胞に局在していない3‐THPPを光増感剤として用いた場合のpEGFP-N1ポリリジン複合体の光誘導トランスフェクションを示す。
【図１０】図１０は、カチオン性脂質を用いる細胞のトランスフェクションに対する光増感剤および光前処理の組み合わせの効果を示す。
【図１１】図１１は、THX細胞のアデノウィルス形質導入に対する光化学的処置の効果を示す。
【図１２】図１２は、FITC‐デキストランの細胞内局在化への光化学的処置の効果を示す。THX細胞は、20μg/ml AlPcS2aで18時間インキュベートした後、AlPcS2a‐フリー培地中で４時間インキュベーションした。次いで該細胞は、5 mg/ml FITC-デキストランで３時間インキュベーションする前に、４分間光に曝すか（Ｂ，Ｄ）または暗所に保存した（Ａ，Ｃ）。蛍光顕微鏡写真（Ａ，Ｂ）および位相差顕微鏡写真（Ｃ，Ｄ）。
【図１３】図１３は、THXおよびHCT 116細胞におけるゲロニン毒性に対する、光化学的処置の効果を示す。「光照射が前（light before）」の方策（strategy）として、まず細胞を20μg/ml のAlPcS2aで１８時間インキュベートし、次いで図に示しているように、光に曝す前にAlPcS2a‐フリー培地中でさらに４時間インキュベートした。照射後に1μg/mlのゲロニンを添加し、細胞を１８時間インキュベートした。「光照射が後（light after）」の方策として、細胞を、図に示しているように光に曝す前に、20μg/ml のAlPcS2aおよび1μg/mlのゲロニンとともに、１８時間同時にインキュベートした。対照細胞は1μg/mlのゲロニンのみで１８時間処理し、光に曝した；あるいは20μg/ml のAlPcS2aのみで１８時間処理し、AlPcS2a‐フリー培地中に４時間引き続き処理してから光に曝した。[3H]-ロイシンのタン白質への取り込みは、光処置した次の日に測定し、相対的タン白質合成として表した。データの各点は、３つの測定の平均値±標準誤差（S.E.）で表している。
【図１４】図１４は、AdHCMV-lacZに感染したＴＨＸ細胞におけるβ‐ガラクトシダーゼ発現に対する、光化学的処置の効果を示す。「光照射が前」の方策として、AlPcS2a‐前処理した細胞を、３分間の光曝露前にAlPcS2a‐フリー培地中にさらに４時間インキュベートした。照射後に、該細胞をAdHCMV-lacZ（MOI 1で）で３０分間３７℃にて感染させた。次いで、2mlの培地を添加し、細胞をβ‐ガラクトシダーゼ発現を分析する前に、２日間培養した。「光照射が後」の方策として、AlPcS2a‐処理した細胞を、AdHCMV-lacZ で３０分間の感染前に、AlPcS2a‐フリー培地中で３時間インキュベートした。2mlの培養培地を添加した後に、該細胞を、３分間の照射前にさらに３０分間インキュベートし、２日後にβ‐ガラクトシダーゼの発現を分析した。
【図１５】図１５は、THX細胞およびHCT 116細胞において、pEGFP/ポリリジンを用いる光誘導トランスフェクションの効率に対する、インキュベーション時間の効果を示す。AlPcS2a‐前処理した細胞を洗浄し、３分間（THX細胞）または７分間（HCT細胞）光曝露する前に、AlPcS2a‐フリー培地中で４時間インキュベートした。照射後、pEGFP-N1/ポリリジン複合体（5μg/mlプラスミド）を添加し、該細胞を図中に示されている様々な時間でインキュベートした。複合体を除去した後、新鮮な複合体フリー培地を添加し、該細胞を、EGFP発現の分析前に２日間培養した。
【図１６】図１６は、光増感剤としてTPPS2aを用いてポリ‐L‐リジンによって媒介されたTHX細胞のトランスフェクションに対して、光照射を後にする方策と比較した、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。この場合様々な照射時間を用いた。PLL-L：pEGFP-N1/PLL複合体後の照射。L-PLL：pEGFP-N1/PLL複合体前の照射。白抜きの棒‐光なし、影付きの棒‐７０秒間照射、黒塗りの棒‐１００秒照射。
【図１７】図１７は、光増感剤としてTPPS4を用いてポリ‐L‐リジンによって媒介されたTHX細胞のトランスフェクションに対して、光照射を後にする方策と比較した、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。この場合様々な照射時間を用いた。PLL-L：pEGFP-N1/PLL複合体後の照射。L-PLL：pEGFP-N1/PLL複合体前の照射。白抜きの棒‐光なし、水平に影を付した棒‐５０秒間照射、垂直に影を付した棒‐７０秒間照射、黒塗りの棒‐１００秒間照射。
【図１８】図１８は、光増感剤としてTPPS2aを用いてポリ‐L‐リジンによって媒介されたHCT 116細胞のトランスフェクションに対して、光照射を後にする方策と比較した、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。この場合様々な照射時間を用いた。PLL-L：pEGFP-N1/PLL複合体後の照射。L-PLL：pEGFP-N1/PLL複合体前の照射。白抜きの棒‐光なし、影付きの棒‐７０秒間照射、黒塗りの棒‐１００秒間照射。
【図１９】図１９は、光増感剤としてTPPS4を用いて、ポリ‐L‐リジンによって媒介されたHCT 116細胞のトランスフェクションに対する光照射を先にするPCI方策の効果を示す。PLL-L：pEGFP-N1/PLL複合体後の照射。L-PLL：pEGFP-N1/PLL複合体前の照射。白抜きの棒‐光なし、水平な影付きの棒‐１．５分間照射、垂直な影付きの棒‐２分間照射、黒塗りの棒‐３分間照射。
【図２０】図２０は、光増感剤としてTPPS4を用いてDOTAPによって媒介されたHCT 116細胞のトランスフェクションに対して、光照射を後にする方策と比較した、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。この場合様々な照射時間を用いた。DOTAP-L：pEGFP-N1/ DOTAP複合体後の光照射。L-DOTAP：pEGFP-N1/ DOTAP 複合体前の光照射。白抜きの棒‐光なし、影付きの棒‐７０秒間照射、黒塗りの棒‐１００秒間照射。
【図２１】図２１は、光増感剤としてTPPS2aを用いてSuperFectTMによって媒介されたトランスフェクションに対する、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。図において、様々な照射時間およびトランスフェクション時間を用い、トランスフェクションに対するDNA量を変化させている。■−0.75μgのDNAで１時間トランスフェクション；▲−0.75μgのDNAで４時間トランスフェクション；○−1.5μgのDNAで１時間トランスフェクション。
【図２２】図２２は、光増感剤としてAlPcS2aを用いて、HCT 116細胞のアデノウィルスにより媒介された遺伝子導入に対する、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。図において、ウィルスは様々な時間に添加している。ウィルスを異なる時点で添加した時の遺伝子導入された細胞の割合を、実施例に記載したフローサイトメトリーによって分析した。ウィルス複合体の添加時点が図に示されている。Y軸の左側にある時点は照射前に添加したウィルスを表し、右側の時点は照射後のウィルスの添加を表す。■−１分間照射；□−照射なし。
【図２３】図２３は、光増感剤としてAlPcS2aを用いて、ポリ‐D‐リジンによって媒介されたHCT 116細胞のトランスフェクションに対する、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。照射時間を変化させている。
【図２４】図２４は、光増感剤としてTPPS2aを用いて、細胞増殖抑制剤のブレオマイシンによる細胞殺傷に対する、光照射を先にするPCI方策の効果を示す。この場合ブレオマイシンの量、照射時間およびトランスフェクション時間を変化させている。◇− 5 TPPS-、1h＝5μMブレオマイシン、TPPS2aなし、1hインキュベーション；◆− 5 TPPS+、1h＝5μMブレオマイシン、TPPS2aあり、1hインキュベーション；△− 25 TPPS-、1h＝25μMブレオマイシン、TPPS2aなし、1hインキュベーション；▲− 25 TPPS+、1h＝25μMブレオマイシン、TPPS2aあり、1hインキュベーション；□− 100 TPPS-、1h＝100μMブレオマイシン、TPPS2aなし、1hインキュベーション；■− 100 TPPS+、1h＝100μMブレオマイシン、TPPS2aあり、1hインキュベーション；○− 100 TPPS-、4h＝100μMブレオマイシン、TPPS2aなし、4hインキュベーション；●− 100 TPPS+、4h＝100μMブレオマイシン、TPPS2aあり、4hインキュベーション。
【図２５】図２５は、マウスのインビボモデルにおける腫瘍治療のために、ゲロニンを用いるPCIの効果を示す。処置グループは以下の通りである：（△）ゲロニンのみ(Gel,only)；（■）照射と組み合わせたリン酸緩衝化食塩水（PBS)注射のプラシーボ処置(PBS+light)；（◇）光化学的処置（すなわち、AlPcS2a+light(光)）のみでゲロニンなし；（●）ゲロニンPCIフル処置（すなわち、AlPcS2a+ゲロニン+光）。
【図１】
0004578770.tif 000003
【図２】
0004578770.tif 000004
【図３】
0004578770.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
0004578770.tif 000008
【図７】
0004578770.tif 000009
【図８】
0004578770.tif 000010
【図９】
0004578770.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0004578770.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
0004578770.tif 000019
【図１８】
0004578770.tif 000020
【図１９】
0004578770.tif 000021
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
0004578770.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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