(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親αアミラーゼの変異体であって、ここで該親αアミラーゼは（ｉ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するか、あるいは（ｉｉ）１又は複数の上記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を示し、そしてここで該変異体は親αアミラーゼと比べてｐＨ８〜１０．５において向上したＣａ2+安定性を示し、かつ該変異体はαアミラーゼ活性を有し、そして該変異体は位置１８３及び１８４におけるアミノ酸残基の欠失、ならびに変異Ｎ１９５Ｆを含むことを特徴とする、変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡ構築物を保有する組換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡ構築物又は請求項３に記載のベクターによって形質転換された細胞。
【請求項５】
微生物である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
細菌又は真菌である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
グラム陽性細菌である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
洗浄及び／又は食器洗浄のための、請求項１に記載のαアミラーゼ変異体の使用。
【請求項９】
請求項１に記載のαアミラーゼ変異体を含んでなる、洗剤添加剤。
【請求項１０】
非粉末化顆粒、安定化液又は保護化酵素の形態における、請求項９に記載の洗剤添加剤。
【請求項１１】
更に、別の酵素を含んでなる、請求項９に記載の洗剤添加剤。
【請求項１２】
請求項１に記載のαアミラーゼ変異体を含んでなる、洗剤組成物。
【請求項１３】
更に、別の酵素を含んでなる、請求項１２に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のαアミラーゼ変異体を含んでなる、手動又は自動食器洗浄用洗剤組成物。
【請求項１５】
更に、別の酵素を含んでなる、請求項１４に記載の食器洗浄用洗剤組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載のαアミラーゼ変異体を含んでなる、手動又は自動洗濯洗浄用組成物。
【請求項１７】
更に、別の酵素を含んでなる、請求項１６に記載の洗濯洗浄用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、Termamyl様αアミラーゼを親酵素とし、中温及び／又は高pHでより高い活性を有する変異体に関する。
〔発明の背景〕
αアミラーゼ（α-1,4- グルカン-4- グルカノヒドロラーゼ、EC3.2.1.1)は、でんぷん並びに直鎖状及び分鎖状の1,4-グルコシド性の少糖及び多糖の加水分解を触媒する一群の酵素から成る。
【０００２】
この工業的にとても重要な酵素群に関する多数の特許及び科学文献が存在する。いくつかのαアミラーゼ、例えばTermamyl様αアミラーゼの変異体は、例えばWO90/11352, WO95/10603, WO95/26397, WO96/23873及びWO96/23874に記載されている。
αアミラーゼに関する最近の文献の中で、WO96/23874には、Termamyl様αアミラーゼの３次元Ｘ線結晶構造解析のデータが報告されている。このαアミラーゼは、B. amyloliquefaciensのαアミラーゼ（BAN(登録商標））のＮ末端の300 アミノ酸残基、及びB. licheniformisのαアミラーゼ（市販品Termamyl（登録商標））のＣ末端アミノ酸301-483 から成り、従って工業的に重要なバチルス菌αアミラーゼ（これは、本文中では、用語「Termamyl様αアミラーゼ」に含まれ、特にB. licheniformis，B. amyloliquefaciens（BAN)及びB. stearothermophilus (BSG（登録商標))のαアミラーゼを含む）と近縁である。更にWO96/23874は、親のTermamyl様αアミラーゼの構造分析に基づいて、親酵素と比べて特性が変化したTermamyl様αアミラーゼの変異体を設計する方法論が記載されている。
〔発明の簡単な説明〕
本発明は、高pH及び中温で（親酵素に比べて）活性が向上した、Termamyl様αアミラーゼに由来するαアミロース分解性変異体に関する。
【０００３】
用語「中温」は、本明細書中では、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃を意味する。
用語「高pH」は、今日洗浄の際に用いられるアルカリpHを意味し、特には約８〜10.5である。
本明細書中では、「低温αアミラーゼ」は、０〜30℃の温度範囲で相対的に至適な活性を示すαアミラーゼを意味する。
【０００４】
本明細書中では、「中温αアミラーゼ」は、30〜60℃の温度範囲で至適活性を示すαアミラーゼを意味する。例えばSP690 及びSP722 のαアミラーゼは、各々「中温αアミラーゼ」である。
本明細書中では、「高温αアミラーゼ」は、60〜110 ℃の温度範囲で至適活性を示すαアミラーゼを意味する。例えばTermamylは「高温αアミラーゼ」である。
【０００５】
本発明の変異体において達成され得る特性変化は、以下の特性に関する変化である：pH８〜10.5での酵素安定性、及び／又は、pH８〜10.5でのCa2+安定性、及び／又は、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃での比活性。
相対至適温度は、しばしば、使用した特定のpHに依存することに注意すべきである。すなわち、例えばpH８で決定された相対至適温度は、pH10で決定されたものとは実質的に異なり得る。
酵素活性に対する温度の影響
活性部位及びその周囲における動態は、温度及びアミノ酸組成に依存し、酵素の相対至適温度にとってとても重要である。中温αアミラーゼと高温αアミラーゼの動態を比較することによって、中温における高温αアミラーゼの機能にとって重要な領域を決定できる。SP722 αアミラーゼ（配列番号２）及びB. licheniformisαアミラーゼ（市販品Termamyl、Novo Nordisk) （配列番号４）の温度活性曲線を図２に示す。
【０００６】
SP722 の相対至適温度、すなわち中温域（30〜60℃）において、その絶対活性は、相同酵素であるB. licheniformisαアミラーゼより高い。後者は、約60〜100 ℃で至適活性を示す。この曲線は、主に、温度安定性、及び活性部位残基とその周囲の動態に依存する。更に、この活性曲線は、使用したpHと活性部位残基のpKa に依存する。
【０００７】
本発明の第１点目は、Termamyl様αアミラーゼを親とし、αアミラーゼ活性を有する変異体であって、配列番号２のアミノ酸配列中の以下の変異に相当する変異を１つ以上含んでいる変異体に関する：T141, K142, F143, D144, F145, P146, G147, R148, G149, Q174, R181, G182, D183, G184, K185, A186, W189, S193, N195, H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, S170, R171, Q172, F173, F267, W268, K269, N270, D271, L272, G273, A274, L275, K311, E346, K385, G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463。
【０００８】
本発明の変異体は、以下の置換又は欠失を１つ以上有する：
T141A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V;
K142A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F143A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
D144A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F145A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
P146A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V;
G147A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
R148A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G149A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
R181* , A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G182* , A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
D183* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G184* , A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K185A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
W189A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V;
S193A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V;
N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
H107A, D, R, N, C, E, Q, G, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K108A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G109A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
D166A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
W167A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V;
D168A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
Q169A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
S170A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V;
R171A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
Q172A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F173A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
Q174* , A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F267A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
W268A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V;
K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
D271A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
L272A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G273A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
A274D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
L275A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K311A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
E346A, D, R, N, C, Q, G, H, I, K, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K385A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G456A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
N457A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V;
G460A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V;
V462A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;
T463A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
【０００９】
以下の置換又は欠失を１つ以上有する変異体が好ましい：K142R; S193P; N195F; K269R, Q; N270Y, R, D; K311R; E346Q; K385R; K458R; P459T; T461P; Q174* ; R181Q, N, S; G182T, S, N; D183* ; G184* ; K185A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V, R; 189T, S, N, Q。
D183及びG184の位置の欠失、そして更に１つ以上の下記の置換又は欠失を有する変異体が特に好ましい：K142R; S193P; N195F; K269R, Q; N270Y, R, D; K311R; E346Q; K385R; K458R; P459T; T461P; Q174* ; R181Q, N, S; G182T, S, N; K185A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V, R; W189T, S, N, Q 。
【００１０】
前記の本発明の変異体は、親のαアミラーゼに比べて以下の特性を少くとも１つ呈する改変を有する：
ｉ）pH８〜10.5におけるpH安定性の向上；及び／又は
ii）pH８〜10.5におけるCa2+安定性の向上；及び／又は
iii ）10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃の温度での比活性の増加。
更に、この詳細を以下に記す。
【００１１】
更に本発明は、本発明の変異体をコードするDNA 構成体；本発明の変異体の調製方法；及び、様々な工業製品又は方法において、例えば洗剤又はでんぷんの融解において、単独で又は他酵素と共に、本発明の変異体を使用することに関する。
本発明の最後の点は、至適pHの変化、及び／又は至適温度の変化、及び／又は安定性の向上を伴ったαアミラーゼを提供する方法に関する。
命名法
本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基の通常の１文字表記及び３文字表記を使用する。参照を容易にするために、本発明のαアミラーゼ変異体を、以下の規則で命名記載する：元のアミノ酸：位置：置換アミノ酸。
【００１２】
この命名法に従えば、例えばアスパラギンによる位置30のアラニンの置換を、Ala30Asn又はA30Nと表し、同位置のアラニンの欠失を、 Ala30* 又は A30* と表し、そして、追加アミノ酸の挿入を、Ala30AlaLys 又はA30AK と表す。
連続したアミノ酸の欠失、例えばアミノ酸30〜33の欠失は、（30〜33）* 又はΔ（A30-N33)と表す。
【００１３】
特定のαアミラーゼが、他のαアミラーゼと比べて「欠失」を有していて、その位置に挿入があった場合、例えば位置36にアスパラギン酸が挿入された場合、 *36Asp 又は *36D と表す。
複数の変異は、＋で分け、例えば位置30と34でアラニンとグルタミン酸が、アスパラギンとセリンに各々置換した変異は、Ala30Asp＋Glu34Ser又はA30N＋E34Sと表す。
【００１４】
ある位置に１つ以上のアミノ酸が互換的に挿入される場合、A30N, E 又はA30N or A30Eと表す。
修飾に適する位置が、修飾が特定されずに示されている場合、その位置のアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換され得ることを示す。従って、位置30のアラニンの修飾が、特定されずに記載されている場合、そのアラニンが欠失しているか、又は、任意の他のアミノ酸、すなわち、R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, Vの中のいずれかで置換され得ることを示す。
〔発明の詳細な説明〕
Termamyl様αアミラーゼ
バチルス菌種によって生産されるαアミラーゼは、アミノ酸レベルで高い相同性を有することが知られている。例えば、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るB. licheniformisαアミラーゼ（市販品Termamyl）は、配列番号５のアミノ酸配列を含んで成るB. amyloliquefacien αアミラーゼに対して約89％相同であり、配列番号３のアミノ酸配列を含んで成るB. stearothermophilus αアミラーゼに対して約79％相同である。その他の相同なαアミラーゼには、バチルス菌種の菌株NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513又はDSM 9375に由来するαアミラーゼが含まれ、これらは全てWO95/26397に詳細に記載されており、更にTsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31に記載されているαアミラーゼ（配列番号６参照）が含まれる。
【００１５】
更に、相同なαアミラーゼには、EP 0252666に記載されているB. licheniformisの菌株（ATCC 27811) によって生産されるαアミラーゼ、及びWO91/00353とWO94/18314に記載されているαアミラーゼも含まれる。その他の市販されているTermamyl様のB. licheniformisαアミラーゼには、製品 Optitherm（登録商標）と Takatherm（登録商標）（Solvay社製）、 Maxamyl（登録商標）（Gist-brocades/Genencor社製) 、 Spezym AA（登録商標）とSpezyme Delta AA（登録商標）（Genencor社製）、及びKeistase（登録商標）（Daiwa 社製）が含まれる。
【００１６】
これらのαアミラーゼは、実質的に相同なので、αアミラーゼの同一群、すなわち「Termamyl様αアミラーゼ」群に属すると考えられる。
従って、本明細書では、用語「Termamyl様αアミラーゼ」は、アミノ酸レベルにおいて、Termamyl、すなわち配列番号４のアミノ酸配列を有するB. licheniformisαアミラーゼ、に対して実質的に相同なαアミラーゼを意味する。すなわち、配列番号１，２，３，４，５，６，７又は８のアミノ酸配列、あるいは、WO95/26397に記載の配列番号１又は２のアミノ酸配列（各々本明細書の配列番号７又は８のアミノ酸配列に等しい）、又は、Tsukamoto et al., 1988に記載のアミノ酸配列（本明細書の配列番号６のアミノ酸配列に等しい）を有する前記全てのαアミラーゼが、「Termamyl様αアミラーゼ」と考えられる。その他のTermamyl様αアミラーゼは、
ｉ）配列番号１〜８のいずれかのアミノ酸配列に対して、少くとも60％、例えば少くとも70％、例えば少くとも75％、又は、少くとも80％、例えば少くとも85％、少くとも90％、又は、少くとも95％の相同性を示す、及び／又は、
ii）前記αアミラーゼの少くとも１つに対して作られた抗体と免疫交差反応する、及び／又は、
iii ）本明細書の配列番号９，10, 11又は12（各々配列番号１，２，３，４及び５のアミノ酸配列をコードするDNA 配列）、WO95/26397の配列番号４（停止コドンTAA と合わせて、本明細書の配列番号13のDNA 配列に等しく、本明細書の配列番号８のアミノ酸配列をコードするDNA 配列）、及びWO95/26397の配列番号５（本明細書の配列番号14に等しい）から明らかである前記特定のαアミラーゼをコードするDNA 配列にハイブリダイズするDNA 配列によってコードされる、
αアミラーゼである。
【００１７】
ｉ）の特性に関連して、「相同性」は、任意の通常のアルゴリズム、好ましくは、GCG パッケージ、バージョン 7.3（1993年６月）の中のGAP プログラムを用いて、その場合、GAP ペナルティのデフォルト値、すなわちGAP クリエーションペナルティ3.0 及びGAP エクステンションペナルティ0.1 において、決定され得る（Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version, 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) 。
【００１８】
Termamyl（配列番号４）とTermamyl様αアミラーゼとの間の構造整列によって、その他のTermamyl様αアミラーゼにおける等価／対応位置を同定できる。この構造整列を得る１つの方法は、デフォルトのgap ペナルティ値、すなわちgap クリエーションペナルティ3.0 及びgap エクステンションペナルティ0.1 において、GCG パッケージのPile Up プログラムを用いることである。その他の構造整列する方法には、疎水性クラスター分析（Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155)及びリバーススレッディング（Huber, T ; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1, No. 1 pp. 142-149 (1998) がある。
【００１９】
前記のαアミラーゼの特性ii）、すなわち免疫交差反応性は、関連するTermamyl様αアミラーゼの少くとも１つのエピトープに対して作られた抗体、又はそのエピトープと反応する抗体を用いて検査され得る。モノクローナル又はポリクローナル抗体は、ともに、当業界の既存の方法、例えばHudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publicationsに記載の方法によって作成され得る。免疫交差反応性は、当業界の既存の検査法、例えば、Hudson et al., 1989 に記載されている通り、ウエスタンブロッティング法又は放射状免疫拡散法によって決定され得る。この様にして、配列番号１，２，３，４，５，６，７又は８のアミノ酸配列を有するαアミラーゼ間で、各々免疫交差反応性が認められた。
【００２０】
前記特性 iii）に従ってTermamyl様αアミラーゼを評価する際に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、問題とするαアミラーゼの完全又は部分ヌクレオチド又はアミノ酸配列を基にして適切に調製され得る。
検査ハイブリダイゼーションのための適当な条件は、５×SSC 中での予備浸漬；20％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8 、及び50mg変性超音波処理子牛胸腺DNA から成る溶液中で40℃で１時間のプレハイブリダイゼーション；その後100mM ATP を補充した同上溶液中で〜40℃で18時間のハイブリダイゼーション；その後２×SSC 、 0.2％ SDS中で、40℃で（低ストリンジェント性）、好ましくは50℃で（中ストリンジェント性）、より好ましくは65℃で（高ストリンジェント性）、さらに好ましくは〜75℃で（超高ストリンジェント性）、30分間３回の当フィルターの洗浄を含む。ハイブリダイゼーション法に関する詳細は、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 に記載されている。
【００２１】
本明細書中で、「から得られる、に由来する」は、問題とする生物株によって生産された、又は生産され得るαアミラーゼだけでなく、その株から単離されたDNA 配列によってコードされるαアミラーゼ、そして、そのDNA 配列によって形質転換された宿主細胞によって生産されたαアミラーゼをも含む様な意味である。最後に、当用語は、合成及び／又はcDNA起源のDNA 配列によってコードされ、そして問題とするαアミラーゼの同定特性を有するαアミラーゼを含んで意味する。また当用語は、親のαアミラーゼが、天然に存在するαアミラーゼの変異体、すなわち、天然のαアミラーゼの１つ以上のアミノ酸残基が修飾（挿入、置換、欠失）された結果の変異体であり得ることも意味する。
親のハイブリッドαアミラーゼ
親のαアミラーゼ（すなわち基幹体αアミラーゼ）は、ハイブリッドαアミラーゼ、すなわち少くとも２つのαアミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合せを含んで成るαアミラーゼであってよい。
【００２２】
親のハイブリッドαアミラーゼは、アミノ酸相同性及び／又は免疫交差反応性及び／又はDNA ハイブリダイゼーション（前記通り）に基づいて、Termamyl様αアミラーゼ群に属することが決定され得るものでよい。この場合、そのハイブリッドαアミラーゼは、典型的には、Termamyl様αアミラーゼの少くとも１つの部分と、微生物（細菌又は真菌）及び／又は哺乳動物起源のTermamyl様αアミラーゼ又は非Termamyl様αアミラーゼから選ばれた１つ以上の他のαアミラーゼの部分とを含んで成る。
【００２３】
従って、親のハイブリッドαアミラーゼは、少くとも２つのTermamyl様αアミラーゼに由来する部分アミノ酸の組合せ、少くとも１つのTermamyl様αアミラーゼと少くとも１つの非Termamyl様の細菌αアミラーゼとに由来する部分アミノ酸の組合せ、あるいは、少くとも１つのTermamyl様αアミラーゼと少くとも１つの真菌αアミラーゼとに由来する部分アミノ酸の組合せを含んで成り得る。この部分アミノ酸の由来であるTermamyl様αアミラーゼは、例えば、本明細書中に参照された前記の特定のTermamyl様αアミラーゼのいずれかであってよい。
【００２４】
例えば、親のαアミラーゼは、B. licheniformisの菌株に由来するαアミラーゼのＣ末端と、B. amyloliquefaciens又はB. stearothermophilus の菌株に由来するαアミラーゼのＮ末端部分とを含んで成り得る。例えば、親のαアミラーゼは、B. licheniformisαアミラーゼのＣ末端部分の少くとも430 アミノ酸を含んでよく、例えば、ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するB. amyloliquefaciensαアミラーゼのＮ末端の37アミノ酸残基に相当するアミノ酸部分、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するB. licheniformisαアミラーゼのＣ末端の445 アミノ酸残基に相当するアミノ酸部分を含むものでよく、あるいは、ハイブリッドのTermamyl様αアミラーゼは、その成熟タンパク質のＮ末端の35アミノ酸残基が、BAN （成熟タンパク質）、すなわち配列番号５のB. amyloliquefaciensαアミラーゼのＮ末端の33残基によって置換されていること以外は、Termamylの配列、すなわち配列番号４のB. licheniformisαアミラーゼの配列に等しいものでよく、あるいは、ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するB. stearothermophilus αアミラーゼのＮ末端の68アミノ酸残基に相当するアミノ酸部分、及び、配列番号４のアミノ酸配列を有するB. licheniformisαアミラーゼのＣ末端の415 アミノ酸残基に相当するアミノ酸部分を含むものでよい。
【００２５】
別の適当な親のハイブリッドαアミラーゼは、WO96/23874 (Novo Nordisk) に記載されたもので、BAN(B. amyloliquefaciensαアミラーゼ）のＮ末端（成熟タンパク質のアミノ酸１〜300 ）及びTermamylのＣ末端（成熟タンパク質のアミノ酸 301〜483 ）を含むものである。このハイブリッドαアミラーゼ（BAN : 1-300/Termamyl : 301-483) の下記の１つ以上の位置を置換することによって、その活性が増加した：Q360, F290及びN102。特に興味深い置換は、下記の１つ以上の置換である：Q36E, D; F290A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T; N102D, E 。
【００２６】
配列番号２に示したSP722 αアミラーゼ上の対応位置は、S365, Y295及びN106である。配列番号２のαアミラーゼにおける特に興味深い対応する置換は、下記の１つ以上の置換である：S365D, E; Y295 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T;及びN106D, E。
配列番号１に示したSP690 αアミラーゼ上の対応位置は、S365, Y295, N106である。これの特に興味深い対応する置換は、下記の１つ以上の置換である：S365D, E; Y295 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T; N106D, E 。
【００２７】
前記の非Termamyl様αアミラーゼは、例えば、真菌のαアミラーゼ、哺乳動物又は植物のαアミラーゼ、あるいは細菌のαアミラーゼ（Termamyl様αアミラーゼとは異なるもの）である。この様なαアミラーゼの特定の例には、Aspergillus oryzae TAKA αアミラーゼ A. niger 酸性αアミラーゼ、Bacillus subtilis αアミラーゼ、ブタ膵臓αアミラーゼ及び大麦αアミラーゼが含まれる。これら全てのαアミラーゼは、本明細書中に参照した典型的なTermamyl様αアミラーゼの構造とは著しく異なった構造を有することが解明されている。
【００２８】
前記の真菌αアミラーゼ、すなわちA. niger及びA. oryzae 由来のものは、アミノ酸レベルで高度に相同であり、一般に、同一αアミラーゼ群に属すると考えられる。A. oryzae 由来の真菌αアミラーゼは、商品名Fungamyl（登録商標）として市販されている。
更に、Termamyl様αアミラーゼの特定の変異体（本発明の変異体）を、通常の様式で、特定のTermamyl様αアミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の修飾（例えば欠失又は置換）を参照して言及する場合には、相当する位置において修飾された別のTermamyl様αアミラーゼの変異体も本発明に含まれると解釈する（相当する位置は、各アミノ酸配列間の考えられる最良のアミノ酸配列の整列に基づいて決定される）。
【００２９】
本発明の好ましい態様では、このαアミラーゼ基幹体は、（親のTermamyl様αアミラーゼとして）B. licheniformisに由来するものであり、前記参照例の１つ、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するB. licheniformisαアミラーゼである。
本発明の変異体の変更された特性
本発明の変異体に存在する変異と、それに帰因する特性の変化（親のTermamyl様αアミラーゼに対する変化）との間の関係を、以下に考察する。
pH８〜10.5での安定性の向上
本発明では、高pH（すなわちpH８〜10.5）での安定性の向上の獲得に関して重要な変異（アミノ酸置換を含む）には、（配列番号２のアミノ酸配列を有する）SP722 αアミラーゼにおける１つ以上の下記の位置の変異に相当する変異が含まれる：T141, K142, F143, D144, F145, P146, G147, R148, G149, R181, A186, S193, N195, K269, N270, K311, K458, P459, T461。
【００３０】
本発明のこの変異体は、（配列番号２のアミノ酸番号に従い）下記の１つ以上の置換を有する：
T141A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V;
K142A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F143A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
D144A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F145A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
P146A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V;
G147A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
R148A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G149A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K181A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, P, K, M, F, S, T, W, Y, V;
S193A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V;
N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K311A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V;
T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
【００３１】
好ましい高pH安定性変異体は、SP722 αアミラーゼ（配列番号２のアミノ酸配列）における下記の１つ以上の置換を有するものが含まれる：K142R, R181S, A186T, S193P, N195F, K269R, N270Y, K311R, K458R, P459T及びT461P 。
特定の態様では、配列番号１の配列を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミラーゼ、又は配列番号３の配列を有するB. stearothermophilus のαアミラーゼ、又は配列番号４の配列を有するB. licheniformisのαアミラーゼ、又は配列番号５の配列を有するB. amyloliquefaciensのαアミラーゼを、基幹体、すなわち親のTermamyl様αアミラーゼとして、前記の修飾のために使用する。
【００３２】
図１の整列から分かる通り、B. stearothermophilus αアミラーゼでは、SP722 のN270に対応する位置が既にチロシンである。更に、バチルス菌株NCIB 12512のαアミラーゼ、B. stearothermophilus αアミラーゼ、B. licheniformisαアミラーゼ及びB. amyloliquefaciensαアミラーゼでは、SP722 のK458に対応する位置が既にアルギニンである。更に、B. licheniformisαアミラーゼでは、SP722 のT461に対応する位置が既にプロリンである。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。
【００３３】
高pHで安定性が向上したαアミラーゼ変異体を、実施例２に記した分子動態シュミレーションによって見出した領域において置換を行うことによって、作ることができる。このシュミレーションによって、中pHに比べて、高pH（pH８〜10.5）で、より高い柔軟性又は運動性を有する領域が示めされる。
WO96/23874 (Novo Nordisk) の付表に開示されている3D構造を有するTermamyl様αアミラーゼ(BA2) に相同な（下記参照）任意の細菌αアミラーゼの構造を利用することによって、その様なαアミラーゼの構造をモデル化すること、そしてそれに対して分子動態シュミレーションを施すことが可能となる。前記の細菌αアミラーゼの相同性は、前記Termamyl様αアミラーゼ(BA2) に対して、少くとも60％、好ましくは70％超、より好ましくは80％超、最も好ましくは90％超であってよく、ただしこれは、GCG パッケージ、バージョン 7.3（1993年６月）の中のUWGCG GAP プログラムを、デフォルトのGAP ペナルティ値で使用して測定される（Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 ）。
【００３４】
好ましくない残基を別の残基に置換することも適用可能であろう。
pH８〜10.5でのCa2+安定性の向上
Ca2+安定性の向上は、Ca2+除去時の酵素安定性が向上することを意味する。本発明では、高pHでのCa2+安定性の向上の獲得に関して重要な変異（アミノ酸置換を含む）には、配列番号２のアミノ酸配列を有するSP722 αアミラーゼ中の下記の位置に対応する１つ以上の位置での変異又は欠失が含まれる：R181, G182, D183, G184, K185, A186, W189, N195, N270, E346, K385, K458, P459。
【００３５】
本発明のこの変異体は、１つ以上の下記の置換又は欠失を有する：
R181* , A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G182* , A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
D183* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G184* , A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K185A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
A186D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
W189A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V;
N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
N270A, R, D, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
E346A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K385A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K458A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
P459A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V 。
【００３６】
１つ以上の下記の置換又は欠失を有する変異体が好ましい：R181Q, N; G182T, S, N;  D183* ; G184* ; K185A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V; W189T, S, N, Q; N195F; N270R, D; E346Q; K385R; K458R; P459T 。
特定の態様では、配列番号１の配列を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミラーゼ、又は配列番号５の配列を有するB. amyloliquefaciensαアミラーゼ、又は配列番号４の配列を有するB. licheniformisαアミラーゼを、前記変異のための基幹体として使用する。
【００３７】
図１の整列から分かる通り、前記B. licheniformisαアミラーゼでは、SP722 のD183及びG184に対応する位置が欠失している。従って、このαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。
好ましい態様では、この変異体は、D183及びG184の欠失、そして更に下記の１つの置換を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミラーゼである：R181Q, N及び／又はG182T, S, N 及び／又はD183* ; G184* 及び／又はK185A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, P, S, T, W, Y, V 及び／又はA186T, S, N, I, V 及び／又はW189T, S, N, Q及び／又はN195F 及び／又はN270R, D及び／又はE346Q 及び／又はK385R 及び／又はK458R 及び／又はP459T 。
中温での比活性の増加
本発明の別の点として、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特には30〜40℃の温度で比活性が増加する変異体を獲得することに関する重要な変異には、配列番号２のアミノ酸配列を有するSP722 αアミラーゼの下記の１つ以上の位置に対応する変異が含まれる：H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, S170, R171, Q172, F173, Q174, D183, G184, N195, F267, W268, K269, N270, D271, L272, G273, A274, L275, G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463。
【００３８】
本発明のこの変異体は、１つ以上の下記の置換を有する：
H107A, D, R, N, C, E, Q, G, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K108A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G109A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
D166A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
W167A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V;
D168A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
Q169A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
S170A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, V;
R171A, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
Q172A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F173A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
Q174* , A, D, R, N, C, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
D183* , A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V;
G184* , A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
N195A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
F267A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V;
W268A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y, V;
K269A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
N270A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
D271A, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
L272A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G273A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
A274D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
L275A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
G456A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
N457A, D, R, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
K458A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;
P459A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y, V;
G460A, D, R, N, C, E, Q, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;
T461A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V;
V462A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;
T463A, D, R, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y, V 。
【００３９】
好ましい変異体は、１つ以上の下記の置換又は欠失を有する：Q174* , D183* , G184* , K269S 。
特定の態様では、配列番号４の配列を有するB. licheniformisαアミラーゼを、それらの変異の基幹体として用いる。
本発明の変異体における一般的変異：中温での比活性の増加
特に興味深いアミノ酸置換は、当酵素の活性部位周辺の運動性を増加させるものである。これは、活性部位の近傍、すなわち活性部位を構成する任意の残基から、好ましくは10Å又は８Å又は６Å又は４Å以内の安定な相互作用を壊す変化によって達成される。
【００４０】
この変異の例には、側鎖の大きさを減少させる変異、例えば下記のものがある：
Ala からGly へ
Val からAla 又はGly へ
Ile 又はLeu からVal, Ala又はGly へ
Thr からSer へ。
【００４１】
この様な変異は、腔の導入又は当変異によって残された空間を満たす構造的再構築によって、活性部位領域の柔軟性を増加することが期待される。
本発明の変異は、好ましくは、上記概説した変異に加えて、１つ以上の修飾を含み得る。従って、有利には、修飾される当αアミラーゼ変異体のその部分に存在する１つ以上のプロリン残基が、天然の任意の可能な非プロリン残基、好ましくはアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン又はロイシンによって置換され得る。
【００４２】
同様にして、好ましくは、修飾される親のαアミラーゼのアミノ酸残基中に存在する１つ以上のシステイン残基が、非システイン残基、例えばセリン、アラニン、スレオニン、グリシン、バリン又はロイシンによって置換され得る。
更に、本発明の変異体では、配列番号４のアミノ酸断片 185〜209 に対応するアミノ酸断片中に存在する１つ以上のAsp 及び／又はGlu が、各々Asu 及び／又はGln によって、単独で、又は上記概説した修飾のいずれかと共に、置換され得る。また、Termamyl様αアミラーゼでは、配列番号４のアミノ酸断片 185〜209 に対応するアミノ酸断片中に存在する１つ以上のLys 残基の、Arg による置換も注目される。
【００４３】
本発明には、２つ以上の上記概説した修飾を組込んだ変異体が含まれると解釈される。
更に、本明細書中に記載した任意の変異体において、点突然変異を導入することも有利であろう。
活性部位周辺の運動性が増加したαアミラーゼ変異体
本発明のαアミラーゼ変異体の運動性は、基質部位の近傍の１つ以上の位置で１つ以上のアミノ酸を置換することによって増加し得る。この様な位置は、（配列番号２のSP722 αアミラーゼの番号に従い）V56, K108, D168, Q169, Q172, L201, K269, L272, L275, K446, P459 である。
【００４４】
従って、本発明の１つの点は、１つ以上の前記位置に変異を有する変異体に関する。
好ましい置換は、下記の１つ以上の置換である：
V56A, G, S, T;
K108A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, S, T, V;
D168A, G, I, V, N, S, T;
Q169A, D, G, H, I, L, M, N, S, T, V;
Q172A, D, G, H, I, L, M, N, S, T, V;
L201A, G, I, V, S, T;
K269A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, S, T, V;
L272A, G, I, V, S, T;
L275A, G, I, V, S, T;
Y295A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, F, S, T, V;
K446A, D, E, Q, G, H, I, L, M, N, S, T, V;
P459A, G, I, L, S, T, V 。
【００４５】
特定の態様では、配列番号１の配列を有するバチルス菌株NCIB 12512のαアミラーゼ、配列番号３の配列を有するB. stearothermophilus αアミラーゼ、配列番号４の配列を有するB. licheniformisαアミラーゼ、又は配列番号５の配列を有するB. amyloliquefaciensαアミラーゼを、これらの変異の基幹体として用いる。
【００４６】
図１の整列から分かる通り、B. licheniformisαアミラーゼ及びB. amyloliquefaciensαアミラーゼは、SP722 のK269に対応する位置にグルタミンを有する。更に、B. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のK269に対応する位置にセリンを有する。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当ではない。
【００４７】
更に、図１の整列から分かる通り、B. amyloliquefaciensαアミラーゼは、SP722 のL272に対応する位置にアラニンを有し、B. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のL272に対応する位置にイソロイシンを有する。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。
図１の整列から分かる通り、バチルス菌株12512 のαアミラーゼは、SP722 のL275に対応する位置にイソロイシンを有する。従って、このαアミラーゼにおいては、その置換は適当でない。
【００４８】
図１の整列から分かる通り、B. amyloliquefaciensαアミラーゼは、SP722 のY295に対応する位置にフェニルアラニンを有する。更に、B. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のY295に対応する位置にアスパラギンを有する。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。
図１の整列から分かる通り、B. licheniformisαアミラーゼ及びB. amyloliquefaciensαアミラーゼは、SP722 のK446に対応する位置にアスパラギンを有する。更に、B. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のK446に対応する位置にヒスチジンを有する。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。
【００４９】
図１の整列から分かる通り、B. licheniformisαアミラーゼ、B. amyloliquefaciensαアミラーゼ、及びB. stearothermophilus αアミラーゼは、SP722 のP459に対応する位置にセリンを有する。更に、バチルス菌株NCIB 12512のαアミラーゼは、SP722 のP459に対応する位置にスレオニンを有する。従って、これらのαアミラーゼにおいては、それらの置換は適当でない。
中温で高活性を有する酵素の安定化
別の態様では、本発明は、低温αアミラーゼ（例えばAsteromonas haloplanctisのもの (Feller et al., (1994), Eur. J. Biochem. 222 : 441-447)) 、及び中温で活性を有する中温αアミラーゼ（例えばSP722 及びSP690)、すなわち一般的に好冷性及び好中温性酵素として知られている酵素の安定性の改良に関する。この特定の酵素群における安定性は、温度安定性、又はカルシウム欠失条件下での安定性として解釈され得る。
【００５０】
典型的には、中温で高活性を示す酵素は、酵素にストレスを与える条件、例えば温度又はカルシウム欠失において深刻な問題を露呈する。
従って、本発明の対象は、少しばかり負荷のかかった条件下で、その活性を失うことなく、同時に中温での希望する高活性を示す酵素を提供することである。
中温で測定される当安定化変異体の活性は、酵素安定化前の特定温度における元々の活性の、好ましくは 100％以上から50％まで、より好ましくは 100％以上から70％まで、そして最も好ましくは 100％以上から85％までであるべきであろう。そして生成した酵素は、野生型酵素に比べて、負荷のかかった条件下でより長いインキュベーションに耐え得る必要がある。
【００５１】
考え得る酵素には、例えば細菌又は真菌由来のαアミラーゼが含まれる。
その様な低温αアミラーゼの例には、Alteromonas haloplanctisから単離されたものがある (Feller et al., (1994), Eur. J. Biochem. 222 : 441-447)。このαアミラーゼの結晶構造が解明されている（Aghajari et al., (1988), Protein Science 7 : 564-572) 。
【００５２】
このA. haloplanctis αアミラーゼ（AHA)（図４の整列中の第５番）は、ブタ膵臓αアミラーゼ（PPA)（図４の整列中の第３番）に対して約66％の相同性を示す。PPA の３Ｄ構造は知られており、Brookhavenデータベースから1OSE又は1DHKの名称で得ることができる。その他のより安定なαアミラーゼに対する相同性に基づいて、Alteromonas haloplanctisαアミラーゼに由来する「低温高活性酵素」の安定化は、中温での希望する高活性の維持と同時に、得ることができる。
【００５３】
図４は、５つのαアミラーゼの配列整列を示すもので、AHA 及びPPA のαアミラーゼを含んでいる。Alteromonas haloplanctisαアミラーゼの安定性を改良する特定の変異は、T66P, Q69P, R155P, Q177R, A205P, A232P, L243R, V295P, S315R である。
αアミラーゼ変異体の調製方法
遺伝子に変異を導入するいくつかの方法が、当業界に知られている。αアミラーゼをコードするDNA 配列のクローニングを簡単に検討した後、そのαアミラーゼのコード配列中の特定部位に変異を発生する方法を説明する。
αアミラーゼをコードするDNA 配列のクローニング
親のαアミラーゼをコードするDNA 配列を、当業界に周知の種々の方法によって、そのαアミラーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離し得る。最初に、ゲノムDNA 及び／又はcDNAのライブラリーを、研究対象のαアミラーゼを生産する生物体に由来する染色体DNA 又はメッセンジャーRNA を用いて構築する必要がある。次に、そのαアミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、相同の標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを用いて、問題とする生物体から調製したゲノムライブラリーから、αアミラーゼをコードするクローンを同定し得る。あるいは、既知のαアミラーゼ遺伝子に相同な配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、より低いストリンジェント性条件下でのハイブリダイゼーション及び洗浄によって、αアミラーゼをコードするクローンを同定し得る。
【００５４】
αアミラーゼをコードするクローンを同定する更に別の方法は、ゲノムDNA の断片を、発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、できたゲノムDNA ライブラリーによってαアミラーゼ陰性の細菌を形質転換し、αアミラーゼの基質を含有するアガープレートに、形質転換した細菌をまき、それによって、同定する対象のαアミラーゼを発現するクローンを得ること、を含んで成る。
【００５５】
あるいは、当酵素をコードするDNA 配列を、確立した標準的な方法、例えばS.L. Beaucage and M.H. Caruthers (1981) に記載されたホスホロアミダイト法又はMatthes et al. (1984) に記載された方法によって、合成調製してもよい。ホスホロアミダイト法では、例えば自動DNA 合成装置によって、オリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニールし、適当なベクター中に連結して、クローン化する。
【００５６】
最後に、当DNA 配列は、ゲノム由来と合成由来の混合物、合成由来とcDNA由来の混合物、又はゲノム由来とcDNA由来の混合物であってよく、これらは、合成由来、ゲノム由来又はcDNA由来の断片（完全な当DNA 配列の種々の部域に対応する適当な断片としてのもの）を、標準的な方法に従って連結することによって調製され得る。当DNA 配列を、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR) によって、例えばUS 4,683,202又は R.K. Saiki et al. (1988) に記載されている通りに、調製してもよい。
αアミラーゼ変異体の発現
本発明では、上記方法又は当業界で既知の代替方法によって作成された変異体をコードするDNA 配列を、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び、場合によってリプレッサー遺伝子又は種々のアクチベーター遺伝子を含んだ発現ベクターを用いて、酵素の形で発現させることができる。
【００５７】
本発明のαアミラーゼ変異体をコードするDNA 配列を運搬する組換え発現ベクターは、DNA 組換え技術を簡便に施すことが可能な任意のベクターであってよく、当ベクターの選択は、それを導入する宿主細胞にしばしば依存する。従って、当ベクターは、自律複製するベクター、すなわち染色体外に全体が存在して、染色体複製とは独立に複製するベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体であり得る。あるいは、当ベクターは、宿主細胞内に導入された場合、その宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そして組込まれた染色体と共に複製するベクターであり得る。
【００５８】
ベクター内では、当DNA 配列は、適当なプロモーター配列に作用可能に連結される必要がある。このプロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA 配列であり、その宿主細胞に対して同種性又は異種性のタンパク質をコードする遺伝子から得られるものでよい。本発明のαアミラーゼ変異体をコードするDNA 配列の転写を指令するために適したプロモーターの例は、選択した宿主細胞において転写活性を示し、その宿主細胞に対して同種性又は異種性のタンパク質をコードする遺伝子から得られ得る配列である。本発明のαアミラーゼ変異体をコードするDNA 配列の転写を指令するために適したプロモーターの、特に細菌宿主における例は、E. coli のlac オペロン、Streptomyces coelicolor のアガラーゼ遺伝子dagAのプロモーター、Bacillus licheniformisαアミラーゼ遺伝子（amyL) のプロモーター、Bacillus stearothermophilus マルトース生成アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、Bacillus amyloliquefaciensαアミラーゼ（amyQ）のプロモーター、Bacillus subtilis xylA及びxylB遺伝子のプロモーターなどである。真菌宿主での転写に有用なプロモーターの例は、A. oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor miehei アスパラギン酸プロテイナーゼ、A. niger中性αアミラーゼ、A. niger酸安定性αアミラーゼ、A. nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor miehei リパーゼ、A. oryzae アルカリプロテアーゼ、A. oryzae トリオースリン酸イソメラーゼ、又はA. nidulans アセトアミダーゼ、をコードする遺伝子に由来するものである。
【００５９】
本発明の発現ベクターは、適当な転写ターミネーター、そして真核生物の場合には、ポリアデニル化配列を含み得、これらは、本発明のαアミラーゼ変異体をコードするDNA 配列に作用可能に連結される。この停止配列及びポリアデニル化配列を、プロモーターと同一の起源から適切に得ることができる。
当ベクターは、更に、問題の宿主細胞中で当ベクターを複製可能にするDNA 配列を含んでよい。その様な配列の例は、プラスミドpUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 及びpIJ702内の複製起点である。
【００６０】
当ベクターは、更に、選択マーカー、例えば、宿主細胞内の欠損を補完する産物の遺伝子、例えば、B. subtilis 又はB. licheniformis由来のdal 遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリンなどの抗生物質への耐性を付与する遺伝子、を含んでもよい。更に、当ベクターは、アスペルギルス菌の選択マーカー、例えばamdS, argB, niaD及びsC、すなわちハイグロマイシン耐性を付与するマーカーを含んでもよいし、あるいは、例えばWO91/17243に記載の通り、共（同時）形質転換を介して選択を行ってもよい。
【００６１】
ある観点で、例えば宿主細胞として細菌を用いる場合、細胞内発現が有利であるかもしれないが、一般的には、細胞外発現が好ましい。一般に、本明細書に記載されているバチルス菌αアミラーゼは、培地中に発現プロテアーゼを分泌させる前領域を含む。希望する場合、この前領域を、異なる前領域又はシグナル配列によって置換してもよい。これは、各々の前領域をコードするDNA 配列の置換によって簡便に達成される。
【００６２】
αアミラーゼ変異体をコードする本発明のDNA 構成体、プロモーター、ターミネーター及びその他の要素を各々連結する方法、並びに、それらを、複製に必要な情報を含有する適当なベクターに挿入する方法は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboraotry Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989)。
【００６３】
前記通りの本発明のDNA 構成体又は発現ベクターのいずれかを含んでいる本発明の細胞を、本発明のαアミラーゼ変異体の組換え生産において、宿主細胞として使用することが有利である。この細胞は、本変異体をコードする本発明のDNA 構成体によって形質転換され得る。これは、宿主染色体に、そのDNA 構成体を（１以上のコピー数で）組込むことによって簡便になされる。この組込みは、そのDNA 配列が細胞内で安定に維持される可能性がより高いので、一般に有利であるだろう。宿主染色体へのDNA 構成体の組込みは、従来の方法に従い、例えば相同又は非相同組換えによって、行なわれ得る。あるいは、異なるタイプの宿主細胞において、前記の発現ベクターによって細胞を形質転換してもよい。
【００６４】
適当な細菌の例は、グラム陽性菌、例えばBacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis 、又はStreptomyces lividans 若しくはStreptomyces murinus、あるいはグラム陰性菌、例えばE. coli である。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト又はコンピテント細胞を用いて、既知の方法に従って行われ得る。
【００６５】
酵母菌を、好ましくはSaccharomyces 又はSchizosaccharomyces の菌種、例えばSaccharomyces cerevisiaeから選択し得る。糸状真菌は、アスペルギルス菌種、例えばA. oryzae 又はA. nigerが有利であろう。真菌の形質転換は、既知の方法に従い、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、そして細胞壁の再生を含んで成る方法で行われ得る。アスペルギルス菌宿主細胞の形質転換に適する方法が、EP 238023 に記載されている。
【００６６】
更に別の点として、本発明は、本発明のαアミラーゼ変異体を生産する方法に関し、この方法は、その変異体の生産を誘導する条件下で前記宿主細胞を培養すること、そしてその細胞及び／又は培地から当変異体を回収することを含んで成る。
当細胞を培養する培地は、問題の宿主細胞を増殖させて、そして本発明のαアミラーゼ変異体を発現させるために適した任意の通常の培地でよい。適当な培地を、業者から購入できるし、又は報告された組成（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログに記載されたもの）に従って調製してもよい。
【００６７】
その宿主細胞から分泌されたαアミラーゼ変異体を、その培地から周知の方法によって簡便に回収することができ、その方法には、遠心又は濾過による培地からの細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによる培地中タンパク質成分の沈殿、そしてクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーなどの使用が含まれる。
産業上の利用性
本発明のαアミラーゼ変異体は、産業において様々に利用されるための貴重な特性を有する。特に、本発明の酵素変異体は、洗浄用、食器洗浄用及び硬質表面洗浄用の洗浄組成物における成分として使用可能である。
【００６８】
多数の変異体が、でんぷんからの甘味料及びエタノール生産、及び／又は繊維品の糊抜きのために、特に有用である。通常のでんぷん変換、例えばでんぷんの液化及び／又は糖化、の条件が、例えばUS 3,912,590、並びにEP特許公報 252,730及び63,909に記載されている。
洗浄組成物
前記通り、本発明の変異体を、適当に洗浄組成物中に組込むことができる。洗浄組成物（例えば洗濯用又は食器用洗剤）中の適当な成分、その様な洗浄組成物に本変異体を配合する適当な方法に関して、そして適当な種類の洗浄組成物の例に関して、例えばWO96/23874及びWO97/07202を参照する。
【００６９】
本発明の変異体を含有する洗浄組成物は、更に、１種以上の他の酵素、例えばリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ又はラッカーゼ、及び／又はその他のαアミラーゼを含んでよい。
本発明のαアミラーゼ変異体を、通常使用される濃度になる様に、洗浄組成物中に組込み得る。現在、本発明の変異体を、洗剤の通常の添加レベルに従って、洗浄／食器洗浄液１リッターあたり 0.00001〜１mg（純粋な活性酵素タンパク質として）に相当する量で組込み得ると考えられる。
【００７０】
本発明は、また、１）至適pHが変化した、及び／又は、２）至適温度が変化した、及び／又は、３）安定性が向上した、αアミラーゼを提供する方法に関し、本方法は、以下の過程を含んで成る：
ｉ）pH、温度及び／又は安定性の実質的に異なる特性を有する２つ以上のαアミラーゼの３Ｄ構造の分子動態を比較することによって、そのαアミラーゼの変異のための標的位置及び／又は領域を同定すること；
ii）それらの同定された位置及び／又は領域において、１つ以上のアミノ酸を置換、付加及び／又は欠損すること。
【００７１】
本発明の態様では、中温αアミラーゼを、高温αアミラーゼと比較する。別の態様では、低温αアミラーゼを、中温又は高温αアミラーゼのいずれかと比較する。
比較するαアミラーゼは、相互に、好ましくは少くとも70％、好ましくは80％、90％まで、例えば95％まで、特には95％相同である必要がある。
【００７２】
比較するαアミラーゼは、前記通り、Termamyl様αアミラーゼでよい。特定の態様では、比較するαアミラーゼは、配列番号１〜８に示すαアミラーゼである。
別の態様では、比較する問題のαアミラーゼの安定性の特性は、Ca2+依存的な特性である。
〔材料と方法〕
酵素
SP722 （配列番号２、Novo Nordiskから購入可）
Termamyl（配列番号４、Novo Nordiskから購入可）
SP690 （配列番号１、Novo Nordiskから購入可）
バチルス・ズブチリスSHA273 : WO95/10603 参照
プラスミド
pJE1は、SP722 αアミラーゼの変異体、すなわち、その成熟タンパク質のアミノ酸D183−G184に対応する６ヌクレオチドが欠失した変異体をコードする遺伝子を含む。そのJE1 遺伝子の転写は、amyLプロモーターに支配される。このプラスミドは、更に、プラスミドpUB110 (Gryczan, TJ et al. (1978) J. Bact. 134 : 318-329) に由来する複製起点、及びカナマイシン耐性を付与するcat 遺伝子を含む。
＜方法＞
ライブラリーベクターpDorK101の構築
大腸菌中でαアミラーゼを発現させることなく変異を導入し、そしてバチルス菌中でαアミラーゼが活性を示す様に修飾するために、大腸菌／バチルス菌シャトルベクターpDorK101（下記）を使用し得る。このベクターを下記の様に構築した。pJE1において、大腸菌の複製起点を含有する 1.2kb断片によって、配列番号２の５’コード領域にあるPstI部位のところで遺伝子を中断することによって、JE1 コード遺伝子（D183−G184を欠失したSP722)を不活性化した。順方向プライマー：5'-gacctgcagtcaggcaacta-3'及び逆方向プライマー：5'-tagagtcgacctgcaggcat-3'を用いて、pUC19 (GenBankアクセスNo. X02514) から、PCR によって前記断片を増幅した。PCR 増幅断片及びpJE1ベクターを、PstIによって37℃で２時間消化した。そのpJE1ベクター断片とPCR 断片とを、室温で１時間連結し、それによって大腸菌を電気的な方法で形質転換した。できたベクターをpDorK101と称する。
フィルタースクリーニング検査
この検査法を用いて、親酵素に比べて高pHにおいて安定性が向上したTermamyl様αアミラーゼ変異体を、並びに、スクリーニング時の設定温度に応じて、親酵素に比べて高pH及び中温において安定性が向上したTermamyl様αアミラーゼ変異体をスクリーニングし得る。
高pHフィルター検査
バチルス菌ライブラリーを、カナマイシン10μｇ／mlを含有するTYアガープレート上の酢酸セルロースフィルター（OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) とニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) とのサンドイッチフィルター上にまき、少くとも21時間37℃でインキュベーションする。酢酸セルロース層をTYアガープレートにのせる。
【００７３】
プレートにまいた後、フィルター上で陽性変異体の位置を決めるために、インキュベーション前に、各サンドイッチフィルターに針で目印を付ける。変異体が結合したニトロセルロースフィルターを、グリシン／NaOH緩衝液（pH8.6 〜10.6）が入った容器に移し、そして15分間室温で（10〜60℃の範囲で変更可能）インキュベーションする。コロニーが結合した酢酸セルロースフィルターを、使用するまで、室温でTYプレート上で保存する。インキュベーション後、１％アガロース、 0.2％でんぷん及びグリシン／NaOH緩衝液（pH8.6 〜10.6）を含んで成るプレート上で、残存する活性を検出する。そのニトロセルロースフィルターをのせた検査用プレートに、前記サンドイッチフィルターの場合と同様に、目印を付け、そして２時間室温でインキュベーションする。フィルターを除いた後、その検査用プレートを、10％ Lugol溶液で染色する。でんぷんを分解する変異体を、暗青色の背景に白点として検出し、そして保存プレート上で同定する。陽性変異体を、１回目のスクリーニング法と同一条件で、２度再スクリーニングする。
低カルシウムフィルター検査
バチルス菌ライブラリーを、適当な抗生物質、例えばカナマイシン又はクロラムフェニコールを含有するTYアガープレート上の酢酸セルロースフィルター（OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) とニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) とのサンドイッチフィルター上にまき、少くとも21時間37℃でインキュベーションする。酢酸セルロース層をTYアガープレートにのせる。
【００７４】
プレートにまいた後、フィルター上で陽性変異体の位置を決めるために、インキュベーション前に、各サンドイッチフィルターに針で目印を付ける。変異体が結合したニトロセルロースフィルターを、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH8.5 〜10）及び異なった濃度の EDTA (0.001mM〜100mM)が入った容器に移す。そのフィルターを１時間室温でインキュベーションする。コロニーが結合した酢酸セルロースフィルターを、使用するまで、室温でTYプレート上で保存する。インキュベーション後、１％アガロース、 0.2％でんぷん及び炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH8.5 〜10）を含んで成るプレート上で、残存する活性を検出する。そのニトロセルロースフィルターをのせた検査用プレートに、前記サンドイッチフィルターの場合と同様に、目印を付け、そして２時間室温でインキュベーションする。フィルターを除いた後、その検査用プレートを、10％ Lugol溶液で染色する。でんぷんを分解する変異体を、暗青色の背景に白点として検出し、そして保存プレート上で同定する。陽性変異体を、１回目のスクリーニング法と同一条件で、２度再スクリーニングする。
注目する領域を得る方法
３つの細菌αアミラーゼの３Ｄ構造が既知である。その中に、２つのB. licheniformisαアミラーゼ、Brookhavenデータベースの1BPL (Machius et al. (1995), J. Mol. Biol. 246, p. 545-559) 及び1VJS (Song et al. (1996), Enzymes for Carbohydrate 163 Engineering (Prog. Biotechnol. V 12) ）がある。これらの２つの構造では、２つのカルシウムイオン及び１つのナトリウムイオンの結合部位の周辺領域において、いわゆるＢドメインから構造内の重要な断片が欠失している。従って、本発明者は、αアミラーゼ BA2 (WO96/23874 ; BAN（配列番号５）とB. licheniformisαアミラーゼ（配列番号４）とのハイブリッド）の３Ｄ構造を用いた。その構造を基にして、B. licheniformisαアミラーゼ及びSP722 αアミラーゼのモデルを構築した。
αアミラーゼ変異体の発酵と精製
当業界に周知の方法によって、発酵と精製を行い得る。
安定性の決定
全ての安定性試験を、同一の設定で行う。その方法を以下に示す。適当な条件下（１〜４）で、当酵素をインキュベーションする。種々の時点で、例えば０，５，10，15及び30分後に試料を採取し、検査用緩衝液(0.1Ｍ 50mM Britton 緩衝液pH7.3)中に25倍希釈する。 pH7.3, 37℃の標準条件下でPhadebas検査(Pharmacia) によって、活性を測定する。
【００７５】
インキュベーション前（０分時）に測定した活性を、参照値(100％）として用いる。減少％を、インキュベーション時間の関数として計算する。表では、例えばインキュベーション30分後の残存活性を示す。
比活性の決定
Phadebas検査(Pharmacia) を用いて、活性／mg酵素として比活性を決定する。その製造業者の取扱説明に従う（次の「αアミラーゼ活性の検査」を参照する）。
αアミラーゼ活性の検査
１．Phadebas検査
基質としてPhadebas（登録商標）錠剤を用いる方法によって、αアミラーゼ活性を決定する。Phadebas錠剤（Phadebas Amylase Test, Pharmacia Diagnostic)は、ウシ血清アルブミン及び緩衝剤と混合した架橋不溶性青色でんぷんポリマーを含んだ錠剤である。
【００７６】
１回の測定毎に、１錠を、５mlの50mM Britton-Robinson 緩衝液（50mM酢酸、50mMリン酸、50mMホウ酸、0.1mM CaCl2 、そしてNaOHでpHを設定値に合わせる）を含んだ試験管に懸濁する。設定温度の水浴中で検査を行う。検査する対象のαアミラーゼを、ｘmlの50mM Britton-Robinson 緩衝液中に希釈する。このαアミラーゼ溶液１mlを、５mlの50mM Britton-Robinson 緩衝液に加える。でんぷんがαアミラーゼによって加水分解され、可溶性青色断片が生じる。生じた青色溶液を 620nmで分光光度計で測定した吸光度が、αアミラーゼ活性の関数である。
【００７７】
インキュベーション10分又は15分後（検査時間）に測定した 620nmの吸光度が、 0.2〜２吸光単位の範囲にあることが重要である。この吸光度の範囲において、活性と吸光度との間に比例関係が存在する（ランベルト・ベールの法則）。従って、この基準に合う様に、酵素の希釈を調整する必要がある。特定の条件設定（温度、pH、反応時間、緩衝液条件）下で、あるαアミラーゼ１mgが、一定量の基質を加水分解し、そして青色が生じる。この色の強度を 620nmで測定する。一定の条件設定下では、測定された吸光度は、問題のαアミラーゼの比活性（活性／mg純粋αアミラーゼタンパク質）に正比例する。
２．代替方法
PNP-G7を基質として使用する方法によって、αアミラーゼ活性を決定する。PNP-G7（p-ニトロフェニル- α, D-マルトヘプタオシドの略称）は、エンドアミラーゼによって切断され得る保護化オリゴ糖である。切断後、キットに含まれるαグルコシダーゼによって、その基質が消化されて、遊離のPNP 分子が放出される。この分子は黄色であり、波長 405nm（400 〜420nm)の可視分光光度計によって測定される。PNP-G7基質及びαグルコシダーゼを含有するキットが、Boehringer-Mannheim 社（カタログ番号1054635)から製造販売されている。
【００７８】
その基質を調製するために、基質１ボトル（BM 1442309) を５ml緩衝液（BM 1442309) に加える。αグルコシダーゼを調製するために、αグルコシダーゼ１ボトル（BM 1462309) を45ml緩衝液（BM 1442309) に加える。このαグルコシダーゼ溶液５mlと基質溶液 0.5mlとを混合して、作業溶液を作る。
この検査では、酵素溶液20μｌを96ウェルマイクロタイタープレートに加え、25℃でインキュベーションする。25℃の作業溶液 200mlを追加する。この溶液を混合し、１分間インキュベーションしてから、 405nmの吸光度を、３分間に亘って15秒毎に測定する。
【００７９】
一定の条件設定下では、その吸光度の時間変化曲線の傾きは、問題のαアミラーゼの比活性（活性／mg酵素）に正比例する。
DOPEプログラムを用いたランダム変異誘発の一般方法
以下の過程に従って、ランダム変異誘発を行い得る：
１．親酵素において、修飾のための注目領域を選択する；
２．選択領域において、変異部位と非変異部位を決定する；
３．誘発する変異の種類を、例えば、構築する変異体の希望する安定性及び／又は性能に応じて、決定する；
４．構造的に合理的な変異を選択する；
５．過程４に応じて過程３に従って選択される残基を調整する；
６．適当なdopeアルゴリズムに従って、ヌクレオチド分布を分析する；
７．必要がある場合には、必要とされる残基を遺伝子コードの実際に合わせる（例えば、（例えば停止コドンの導入を避けるために）遺伝子コードから生じる制約を考慮する）（あるコドンの組合せが実際には使用できないことが当業者に知られており、従って調整が必要となる）；
８．プライマーを作る；
９．そのプライマーを用いて、ランダム変異誘発を行う；
10．希望する特性の向上をスクリーニングすることによって、生じたαアミラーゼ変異体を選択する。
【００８０】
過程６で使用するために適したdopeアルゴリズムは、当業界に周知である。１つのアルゴリズムが、Tomandl, D. et al., Journal of Computer-Aided Molecular Design, 11 (1997), pp. 29-38) に記載されている。もう１つのアルゴリズムDOPEについて、以下に記す。
dopeプログラム
「DOPE」プログラムは、必要とされるアミノ酸分布に最も近似するアミノ酸分布をコードする様に、三連コドンのヌクレオチド組成を最適化するために有用なコンピュータプログラムである。可能な分布のうちのいずれが、必要とされるアミノ酸分布に最も近似しているかを評価するために、評価関数が必要である。「DOPE」プログラムでは、以下の関数が適すると認められた：
【００８１】
【数１】
0004426094.tif 000002
【００８２】
式中、ｘi は、当プログラムによって計算して得られた、アミノ酸及びアミノ酸の基の量であり、ｙi は、当プログラムの使用者によって決められた、アミノ酸及びアミノ酸の基の必要とされる量であり（例えば、通常の20アミノ酸又は停止コドンのうちのいずれが、例えばある割合（例えば90％ Ala, ３％ Ile, ７％ Val) にて、導入されることが必要とされるかを特定する）、そしてｗi は、当プログラムの使用者によって決められた、割当の荷重係数である（例えば、問題の位置に挿入される特定のアミノ酸残基を有することの重要性に依存する）。Ｎは、当プログラムの使用者によって決められたアミノ酸基の数＋21である。この関数のために、０0 を１とする。
【００８３】
この関数の最大値を見い出すために、Monte-Carlo アルゴリズム（１つの例が、Valleau, J.P. & Whittington, S.G. (1977) A guide to Mont Carlo for statistical mechanics : 1 Highways 。In“Stastistical Mechanics, Part A”Equlibrium Techniqeues ed. B.J. Berne, New York : Plenumに記載されている）を用いる。各反復において、以下の過程が行われる：
１．各塩基において、新しいランダムなヌクレオチド組成が選択され、その場合、その時の組成と新しい組成との間の絶対差が、当コドンの３つの全ての位置が、４つのヌクレオチドＧ，Ａ，Ｔ，Ｃの各々である場合のｄよりも小さいか、又は等しい（ｄの定義は下記参照のこと）。
２．新しい組成の評価点と、その時の組成の評価点とを、前記の関数ｓを用いて比較する。新しい評価点が、その時の評価点よりも大きいか、又は等しい場合には、新しい組成を保持し、その時の組成を新しい組成に変える。新しい評価点がより小さい場合には、新しい組成を保持する確率は、exp [1000  [新しい評価点−その時の評価点]]である。
【００８４】
１サイクルは、標準的には、前記の反復過程1000回から成り、その場合、ｄは、１から０へ直線的に減少する。最適化においては、 100回以上のサイクルを行う。最高の評価点を得たヌクレオチド組成が、最後に提示される。
〔実施例〕
実施例１：
Termamylの相同性構築の例
B. licheniformisαアミラーゼ（以下Termamylとする）の、その他のTermamyl様αアミラーゼに対する総体的な相同性は高く、そしてその相似率は極端に高い。GCG プログラム（University of Wisconsin Genetics Computer Group's program)を用いて計算された、 BSG（配列番号３を有するB. stearothermophilus αアミラーゼ）、及び BAN（配列番号５を有するB. awyloliquefaciensαアミラーゼ）に対するTermamylの相似率は、各々89％及び78％であった。Termamylは、BAN 及びBSG と比べて、残基G180とK181との間の２残基が欠失している。BSG は、BAN 及びTermamylと比べて、G371とI372との間の３残基が欠失している。Ｎ末端において、BSG と比べて、BAN は２残基少く、そしてTermamylは１残基少い。
【００８５】
B. licheniformisαアミラーゼ（Termamyl）及びB. awyloliquefaciensαアミラーゼ(BAN) の各構造のモデルが、WO96/23974の付表１に開示されている構造に基づいて構築された。他のTermamyl様αアミラーゼ（例えば本明細書に開示したもの）の構造も、同様なやり方で構築し得る。
構造を解明するために用いられるαアミラーゼと比べて、Termamylは、 178〜182 付近の２つの残基が欠失している点で、異なっている。モデル構造において、これを補うために、BIOSYMのHOMOLOGYプログラムを用いて、欠失点を除いて、当構造の相当する位置（構造的に保存された領域だけでなく）における残基を置換した。Termamyl（BAN)におけるG179 (G177) とK180 (K180) との間でペプチド結合を成立させた。解明された構造とモデル構造との間の構造上の密接な関係（従って後者の有効性）が、モデルにおいて相互にあまりに近接していることが判明した原子が、非常にほんの少ししか存在しないことから指摘される。
【００８６】
次にINSIGHT プログラムによって、この非常に粗いTermamylの構造に、解明された構造の場合（WO96/23874の付表１参照）と同じ座標で、その解明された構造に由来する全ての水(605個）及びイオン（４カルシウムと１ナトリウム）を付け加えた。この場合、ほんの少しの重複しか認められず、すなわち非常に良好な適合が認められた。次に、このモデル構造を、200 過程の急勾配降下（Steepest descent) 及び600 過程の共役勾配（Conjugated gradient)によって最小化した（Brooks et al., 1983, J. Computational Chemistry 4, p. 187-217)。次に、この最小化構造に分子動力学を適用し、35psを超えて 200psの平衡まで、５psの加熱を行った。この動力学は、Verletアルゴリズムに従って運用され、Behrendsenによる水環境との共役（Berendsen et al., 1984, J. Chemical Physics 81, p. 3684-3690) に従って平衡温度 300Ｋを維持した。ピコ秒毎に回転と並進を取り出した。
実施例２：
pH安定性の向上及び温度依存的な活性の変化を示すαアミラーゼ変異体を同定するために重要な領域を導き出す方法
注目の酵素、ここではSP722 とTermamyl、のＸ線解析構造及び／又はモデル構築構造に対して、分子動力学的シュミレーションを行う。この分子動力学的シュミレーションを、CHARMM (Molecular simulations (MSI））プログラム又はその他の適当なプログラム、例えば DISCOVER (MSI) によって行う。この分子動力学的分析を、孤立状態、あるいは、より好ましくは、結晶水を含んだ状態、又は、水中に、例えば水球若しくは水箱中に埋め込まれた状態、の酵素に対して行う。このシュミレーションを、 300ピコ秒（ps）又はそれ以上、例えば 300〜1200psの期間運用する。前記構造のＣα炭素に関して、等方性振動を取り出し、前記構造間で比較する。一方の配列中に欠失及び／又は挿入がある場合、他方の構造に由来する等方性振動をはめ込み、等方性変動の差を０にする。等方性振動の説明に関して、CHARMMの使用説明書（MSI から入手できる）を参照すること。
【００８７】
荷電性アミノ酸に対する標準的な荷電に従って、この分子動力学的シュミレーションを行うことができる。すなわち、Asp 及びGlu は陰性荷電され、そしてLys 及びArg は陽性荷電される。この条件は、約７の中性pHを近似する。より高い又は低いpHで分析するために、標準滴定可能な残基の変化したpKa を通常pH２〜10の範囲内で得て、当分子の滴定を行うことができる。この様な残基は、Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr 及びHis である。また、Set, Thr及びCys は滴定可能であるが、ここでは考慮しない。ここで、pHのために変化した荷電に関して、高pHでは、Asp 及びGlu は陰性であり、Arg 及びLys は非荷電である。これは、約10〜11のpHを近似していて、この場合、Lys 及びArg の標準pKa が約９〜11であるとして、これらの残基の滴定を開始する。
１．高pH安定性を有するαアミラーゼ変異体を同定するために重要な領域を導き出すために用いる方法：
pH安定性が改良された変異体を構築するために重要な領域は、極端なpHにおいて最良の運動性を示す領域、すなわち最大の等方性振動を有する領域である。
【００８８】
この様な領域は、以下の２つの分子動力学シュミレーションを行うことによって同定される：ｉ）塩基性アミノ酸Lys 及びArg が中性であり（すなわちプロトン化されていない）、そして酸性アミノ酸Asp 及びGlu が荷電（−１）を有する高pHでの運用、並びに、ii）塩基性アミノ酸Lys 及びArg が正味の荷電（＋１）を有し、そして前記酸性アミノ酸が荷電（−１）を有する中性pHでの運用。
【００８９】
この２つの運用を比較して、中性pHに比べて高pHにて相対的により高い運動性を示す領域を同定した。
一般的な安定性、例えば水素結合、を向上させる残基、その領域をより硬直にする（例えば、グリシン残基のプロリン置換などの変異による）残基、あるいは、荷電又は残基間相互作用を向上させる残基を導入することによって、当酵素の高pH安定性が向上する。
２．中温での活性が増加したαアミラーゼ変異体を同定するための領域を取り出す方法：
中温での活性が増加した変異体を構築するために重要な領域を、SP722 とTermamylとの等方性振動の差、すなわちSP722 でのＣαの等方性振動からTermamylでのものを引いた差から、見い出した。その等方性振動の運動性が最大である領域を選択した。この様な領域及びそこの残基が、中温での活性を増加させると期待された。それらの残基に適切な運動性が存在する場合には、αアミラーゼの活性が発現するだけである。それらの残基の運動性があまりに低い場合、活性は低下又は消滅する。
実施例３：
局所的ランダムdope変異誘発法による、親酵素と比べて中温でのCa2+安定性が向上したTermamyl様αアミラーゼの構築
低カルシウム濃度におけるαアミラーゼの安定性を改良するために、予じめ選択した領域で、ランダム変異誘発を行った。
領域：SAI
残基：R181-W189
停止コドンの量を最小化する様に、SAI 領域において示唆された各変異のための導入（spiked）コドンを決定するために、DOPEプログラム（「材料と方法」参照）を用いた（表１）。示唆された一群のアミノ酸変異を得るために、そのコドンの３つの位置において、ヌクレオチドの正確な分布を計算した。希望の残基にする確率を高くするために、指示された位置において特異的に対象領域を処理したが、それでもなお他の可能性もあり得る。
表１：
各位置におけるアミノ酸残基の分布
0004426094.tif 000003
表２に、得られた処理済みオリゴヌクレオチド鎖をセンス鎖として示し、それと共に、野生型のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びに各処理位置におけるヌクレオチド分布も示す。
表２：
0004426094.tif 000004
ランダム変異誘発
表２から明白な導入（spiked）オリゴヌクレオチド（FSA とする）及びSAI 領域のための逆方向プライマーRSA 、並びにSacII 部位からDraII 部位までのSP722 （配列番号２）特異的プライマーを用いて、21塩基対の重複による重複伸長方法（Horton et al., Gene 77 (1989), pp. 61-68) によって、PCR ライブラリー断片を作成する。このPCR の鋳型は、プラスミドpJE1である。このPCR 断片を、大腸菌／バチルス菌シャトルベクターpDorK101にクローン化する（「材料と方法」参照）ことで、大腸菌で変異誘発し、即座にバチルス・ズブチリスで発現させることが可能となり、従って大腸菌内でのアミラーゼの致死的な集積を回避する。大腸菌内でクローン化PCR 断片を確立した後、そのプラスミドから修飾されたpUC19 断片を切り出し、そしてプロモーターと、変異Termamyl遺伝子とを自然に連結し、その様にしてバチルス菌内での発現が可能となる。
スクリーニング
「材料と方法」で記載した通り、このライブラリーを低カルシウムフィルター検査でスクリーニングし得る。
実施例４：
配列番号１のアミラーゼ(SP690) の変異体の構築
配列番号１のアミラーゼをコードする遺伝子は、WO96/23873に記載されているプラスミドpTVB106 中に存在する。バチルス・ズブチリス内で、この構成体のamyLプロモーターから、そのアミラーゼを発現させる。
【００９０】
当タンパク質の１つの変異体は、デルタ（T183−G184）＋Y243F ＋Q391E ＋K444Q である。この変異体の構築は、WO96/23873に記載されている。
Sarkar and Sommer, (1990), BioTechniques 8 : 404-407に記載されたメガプライマー法によるデルタ（T183−G184) ＋N195F の構築を以下に示す。
遺伝子特異的プライマーＢ１（配列番号17）及び変異生成プライマー101458（配列番号19）を用いて、pTVB106 様プラスミド（配列番号１のアミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（T183−G184）変異を有するもの）から、約 645bpのDNA 断片を、PCR によって増幅した。
【００９１】
この 645bp断片をアガロースゲルから精製し、これをメガプライマーとして、プライマーＹ２（配列番号18）と共に用いて、同一の鋳型に対して２回目のPCR を行った。
生じた約1080bpの断片を、制限酵素BstEIIとAflIIIとで切断し、生じた約 510bpのDNA 断片を精製し、同酵素で切断したpTVB106 様プラスミド（配列番号１のアミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（T183−G184）変異を有するもの）に連結した。この連結物によって、コンピテントなバチルス・ズブチリスSHA273細胞を形質転換し、そのクロラムフェニコール耐性の形質転換体を、DNA 配列決定によって検査して、プラスミド上に適切な変異が存在することを確認した。
プライマーＢ１：（配列番号17）
5' CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG 3'
プライマーＹ２：（配列番号18）
5' CTT GTT CCC TTG TCA GAA CCA ATG 3'
プライマー101458：（配列番号19）：
5' GT CAT AGT TGC CGA AAT CTG TAT CGA CTT C 3'
変異体デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T を、変異生成プライマー101638を用いること以外は、先と同様にして構築した。
プライマー101638：（配列番号20）
5' CC CAG TCC CAC GTA CGT CCC CTG AAT TTA TAT ATT TTG 3'
変異体：デルタ（T183−G184）＋A186T 、デルタ（T183−G184）＋A186I 、デルタ（T183−G184）＋A186S 、デルタ（T183−G184）＋A186N を、pTVB106 様プラスミド（変異体デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T を有する）を鋳型及びクローニングベクターとして用いること以外は、先と同様にして構築する。そのための変異生成オリゴヌクレオチド（オリゴ１）は、
5' CC CAG TCC CAG NTCTTT CCC CTG AAT TTA TAT ATT TTG 3' （配列番号21）
である。
【００９２】
Ｎは、この変異生成オリゴヌクレオチドの合成時に、４つの塩基：Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴの混合物を使用したことを意味する。形質転換体のDNA 配列決定によって、その成熟タンパク質のアミノ酸位置186 における適正なコドンを確認する。
変異体デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T ＋N195F を以下の様にして構築する。
【００９３】
pTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T の変異を有するもの）に対してプライマーｘ２（配列番号22）及びプライマー101458（配列番号19）を用いてPCR を行う。できたDNA 断片をメガプライマーとして、プライマーＹ２（配列番号18）と共に用いて、pTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋N195F の変異を有するもの）に対してPCR を行う。この２回目のPCR 産物を、制限エンドヌクレアーゼAcc65I及びAflIIIによって切断し、同酵素によって切断したpTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋N195F)中にクローン化した。
プライマーｘ２：（配列番号22）
5' GCG TGG ACA AAG TTT GAT TTT CCT G 3'
変異体：デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T ＋N195F ＋Y243F ＋Q391E ＋K444Q を以下の様にして構築する。
【００９４】
pTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋K185R ＋A186T の変異を有するもの）に対してプライマーｘ２及びプライマー101458を用いて、PCR を行う。できたDNA 断片をメガプライマーとして、プライマーＹ２と共に用いて、pTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋Y243F ＋Q391E ＋K444Q)の変異を有するもの）に対してPCR を行う。この２回目のPCR 産物を、制限エンドヌクレアーゼAcc65I及びAflIIIによって切断し、同酵素によって切断したpTVB106 様プラスミド（デルタ（T183−G184）＋Y243F ＋Q391E ＋K444Q)中にクローン化した。
実施例５
親酵素SP722 αアミラーゼ（配列番号２）における部位特異的αアミラーゼ変異体の構築
配列番号２のアミラーゼ(SP722）の変異体を以下の様にして構築する。
【００９５】
配列番号２のアミラーゼをコードする遺伝子は、WO96/23873に記載のプラスミドpTVB112 中に存在する。このアミラーゼは、バチルス・ズブチリス内で、この構成体のamyLプロモーターから発現される。
Sarkar and Sommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407) に記載されたメガプライマー法によるデルタ（D183−G184）＋V56Iの構築を以下に示す。
【００９６】
遺伝子特異的プライマーDA03及びメガプライマーDA07を用いて、pTVB112 様プラスミド（配列番号２のαアミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（D183−G184）の変異を有するもの）から、約 820bpのDNA 断片をPCR によって増幅する。
この 820bp断片をアガロースゲルから精製し、これをメガプライマーとして、プライマーDA01と共に用いて、同一の鋳型に対して２回目のPCR を行う。
【００９７】
生じた約 920bpの断片を、制限酵素NgoMI 及びAatII によって切断し、生じた約 170bpのDNA 断片を精製し、同酵素で切断したpTVB112 様プラスミド（配列番号２のアミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（D183−G184）変異を有するもの）に連結する。この連結物によって、コンピテントなバチルス・ズブチリスSHA273細胞（低アミラーゼ及び低プロテアーゼ）を形質転換し、そのクロラムフェニコール耐性の形質転換体を、DNA 配列決定によって検査して、プラスミド上に適切な変異が存在することを確認する。
プライマーDA01：（配列番号23）
5' CCTAATGATGGGAATCACTGG 3'
プライマーDA03：（配列番号24）
5' GCATTGGATGCTTTTGAACAACCG 3'
プライマーDA07：（配列番号25）
5' CGCAAAATGATATCGGGTATGGAGCC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋K108L 、デルタ（D183−G184）＋K108Q 、デルタ（D183−G184）＋K108E 、デルタ（D183−G184）＋K108V を、Sarkar and Sommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407) に記載されたメガプライマー法によって構築した。
【００９８】
プライマーDA03及び変異生成プライマーDA20を用いてpTVB112 様プラスミド（デルタ（D183−G184）の変異を有するもの）に対してPCR を行う。生じたDNA 断片をメガプライマーとして、プライマーDA01と共に用いて、pTVB112 様プラスミド（デルタ（D183−G184）の変異を有するもの）に対してPCR を行う。２回目のPCR で生じた約 920bpの断片を、制限酵素AatII 及びMluIによって切断し、同酵素で切断したpTVB112 様プラスミド（デルタ（D183−G184）変異を有するもの）に連結する。
プライマーDA20：（配列番号26）：
5' GTGATGAACCACSWAGGTGGAGCTGATGC 3'
Ｓは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ｃ及びＧの混合物を用いること、そしてＷは、その際に、２つの塩基Ａ及びＴの混合物を用いることを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位置108 に適切なコドンが存在することを確認する。
【００９９】
変異体：デルタ（D183−G184）＋D168A 、デルタ（D183−G184）＋D168I 、デルタ（D183−G184）＋D168V 、デルタ（D183−G184）＋D168T を、変異生成プライマーDA14を用いること以外は同様にして、構築する。
プライマーDA14（配列番号27）：
5' GATGGTGTATGGRYCAATCACGACAATTCC 3'
Ｒは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＧの混合物を用いること、そしてＹは、その際に、２つの塩基Ｃ及びＴの混合物を用いることを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位置168 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１００】
変異体：デルタ（D183−G184）＋Q169N を、変異生成プライマーDA15を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA15（配列番号28）：
5' GGTGTATGGGATAACTCACGACAATTCC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋Q169L を、変異生成プライマーDA16を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA16（配列番号29）：
5' GGTGTATGGGATCTCTCACGACAATTCC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋Q172N を、変異生成プライマーDA17を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA17（配列番号30）：
5' GGGATCAATCACGAAATTTCCAAAATCGTATC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋Q172L を、変異生成プライマーDA18を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA18（配列番号31）：
5' GGGATCAATCACGACTCTTCCAAAATCGTATC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋L201I を、変異生成プライマーDA06を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA06（配列番号32）：
5' GGAAATTATGATTATATCATGTATGCAGATGTAG 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋K269S を、変異生成プライマーDA09を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA09（配列番号33）：
5' GCTGAATTTTGGTCGAATGATTTAGGTGCC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋K269Q を、変異生成プライマーDA11を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA11（配列番号34）：
5' GCTGAATTTTGGTCGAATGATTTAGGTGCC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋N270Y を、変異生成プライマーDA21を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA21（配列番号35）：
5' GAATTTTGGAAGTACGATTTAGGTCGG 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋L272A 、デルタ（D183−G184）＋L272I 、デルタ（D183−G184）＋L272V 、デルタ（D183−G184）＋L272T を、変異生成プライマーDA12を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA12（配列番号36）：
5' GGAAAAACGATRYCGGTGCCTTGGAGAAC 3'
Ｒは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＧの混合物を用いること、そしてＹは、その際に、２つの塩基Ｃ及びＴの混合物を用いることを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位置272 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１０１】
変異体：デルタ（D183−G184）＋L275A 、デルタ（D183−G184）＋L275I 、デルタ（D183−G184）＋L275V 、デルタ（D183−G184）＋L275T を、変異生成プライマーDA13を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA13（配列番号37）：
5' GATTTAGGTGCCTRYCAGAACTATTTA 3'
Ｒは、変異生成オリゴヌクレオチドを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＧの混合物を用いること、そしてＹは、その際に、２つの塩基Ｃ及びＴの混合物を用いることを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位置275 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１０２】
変異体：デルタ（D183−G184）＋Y295E を、変異生成プライマーDA08を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA08（配列番号38）：
5' CCCCCTTCATGAGAATCTTTATAACG 3'
Sarkar and Sommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407) に記載されたメガプライマー法によるデルタ（D183−G184）＋K446Q の構築を以下に示す。
【０１０３】
停止コドンの下流 214〜231bp にアニールする遺伝子特異的プライマーDA04及び変異生成プライマーDA10を用いて、pTVB112 様プラスミド（配列番号２のアミラーゼをコードする遺伝子中にデルタ（D183−G184）の変異を有するもの）から、約 350bpのDNA 断片をPCR によって増幅した。
生じたDNA 断片をメガプライマーとして、プライマーDA05と共に用いて、pTVB112 様プラスミド（デルタ（D183−G184）の変異を有するもの）に対してPCR を行う。この２回目のPCR による約 460bpの産物を、制限酵素SnaBI 及びNotIによって切断し、そして同酵素によって切断されたpTVB112 様プラスミド（デルタ（D183−G184））中にクローン化する。
プライマーDA04（配列番号39）：
5' GAATCCGAACCTCATTACACATTCG 3'
プライマーDA05（配列番号40）：
5' CGGATGGACTCGAGAAGGAAATACCACG 3'
プライマーDA10（配列番号41）：
5' CGTAGGGCAAAATCAGGCCGGTCAAGTTTGG 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋K458R を、変異生成プライマーDA22を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA22（配列番号42）：
5' CATAACTGGAAATCGCCCGGGAACAGTTACG 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋P459S 及びデルタ（D183−G184）＋P459T を、変異生成プライマーDA19を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA19（配列番号43）：
5' CTGGAAATAAAWCCGGAACAGTTACG 3'
Ｗは、変異生成プライマーを合成する際に、２つの塩基Ａ及びＴの混合物を用いることを意味する。形質転換体の配列決定によって、成熟アミラーゼのアミノ酸位置459 に適切なコドンが存在することを確認する。
【０１０４】
変異体：デルタ（D183−G184）＋T461P を、変異生成プライマーDA23を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA23（配列番号44）：
5' GGAAATAAACCAGGACCCGTTACGATCAATGC 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋K142R を、変異生成プライマーDA32を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA32（配列番号45）：
5' GAGGCTTGGACTAGGTTTGATTTTCCAG 3'
変異体：デルタ（D183−G184）＋K269R を、変異生成プライマーDA31を用いること以外は同様にして構築する。
プライマーDA31（配列番号46）：
5' GCTGAATTTTGGCGCAATGATTTAGGTGCC 3'
実施例６
親のTermamylαアミラーゼ（配列番号４）における部位特異的αアミラーゼ変異体の構築
TermamylαアミラーゼをコードするamyL遺伝子は、WO95/10603 (Novo Nordisk) に記載されたプラスミドpDN1528 中に存在する。この親に各々が由来する置換変異体N265R 及びN265D を、WO97/41213に記載の方法又は前記の「メガプライマー」法によって構築する。変異生成プライマーは、以下の通りである：
N265R 置換のためのプライマーｂ11：
5' PCC AGC GCG CCT AGG TCA CGC TGC CAA TAT TCA G (配列番号56）
N265D 置換のためのプライマーｂ12：
5' PCC AGC GCG CCT AGG TCA TCC TGC CAA TAT TCA G (配列番号57）
Ｐはリン酸基を表す。
実施例７
配列番号２のアミノ酸配列を有する親αアミラーゼに由来する変異体におけるアルカリpHでのpH安定性の決定
この一連の分析では、精製酵素試料を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液を75℃でインキュベーションした。
【０１０５】
20分及び30分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（「材料と方法」参照）によって残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定した。高pH及び75℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。
以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の関数として、それに対する比率％を示している。
【０１０６】
0004426094.tif 000005
もう１つの一連の分析では、培養上清を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液を80℃でインキュベーションした。
【０１０７】
30分間インキュベーションした後、Phadebas検査（「材料と方法」参照）によって、残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定した。高pH及び80℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。
以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の関数として、それに対する比率％を示している。
【０１０８】
0004426094.tif 000006
実施例８
配列番号１，２及び４のアミノ酸配列を有する親αアミラーゼに由来する変異体におけるアルカリpHでのカルシウム安定性の決定
Ａ．配列番号１の配列の変異体におけるカルシウム安定性
pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液に（ｔ＝０時点で）終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた。この溶液を50℃でインキュベーションした。
【０１０９】
20分及び30分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（前記）によって、残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定した。高pH及び50℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。
以下の表では、親酵素（配列番号１）及び問題の変異体において、初期活性の関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１０】
0004426094.tif 000007
n.d.＝未決定
Ｂ．配列番号２の配列の変異体におけるカルシウム安定性
この一連の分析では、精製酵素試料を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液に（ｔ＝０時点で）終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた。この溶液を50℃でインキュベーションした。
【０１１１】
20分及び30分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（前記）によって、残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定した。高pH及び50℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。
以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１２】
0004426094.tif 000008
もう１つの一連の分析では、培養上清を用いた。pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液に（ｔ＝０時点で）終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた。この溶液を50℃でインキュベーションした。
【０１１３】
30分間インキュベーションした後、前記のPhadebas検査によって、残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定した。高pH及び50℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。
以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、初期活性の関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１４】
0004426094.tif 000009
Ｃ．配列番号４の配列の変異体におけるカルシウム安定性
pH10.5に合わせた100mM CAPS緩衝液による各変異体溶液を用いて、測定を行った。この溶液に（ｔ＝０時点で）終濃度 2400ppmになる様にポリリン酸を加えた。この溶液を60℃でインキュベーションした。
【０１１５】
20分間インキュベーションした後、PNP-G7検査（前記）によって、残存活性を測定した。試料中の残存活性を、Britton Robinson緩衝液(pH7.3) を用いて測定した。高pH及び60℃でインキュベーションしなかった同酵素の対応参照溶液の０分時点と比較して、残存活性の減少を測定した。
以下の表では、親酵素（配列番号４）及び問題の変異体において、初期活性の関数として、それに対する比率％を示している。
【０１１６】
0004426094.tif 000010
実施例９
配列番号１のアミノ酸配列を有するαアミラーゼにおける中温での活性の測定
Ａ．配列番号１の配列の変異体におけるαアミラーゼ活性
pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて、前記のPhadebas検査によって測定を行った。試料中の活性を、50mM Britton Robinson 緩衝液(pH7.3) を用いて37℃で、そして50mM CAPS 緩衝液（pH10.5) を用いて25℃で測定した。
【０１１７】
以下の表では、親酵素（配列番号１）及び問題の変異体において、温度依存的な活性、並びに、37℃での活性に対する25℃での活性の比率％を示している。
0004426094.tif 000011
pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて、前記のPhadebas検査によってもう１つの測定を行った。試料中の活性を、50mM Britton Robinson 緩衝液(pH7.3) を用いて37℃及び50℃で測定した。
【０１１８】
以下の表では、親酵素（配列番号１）及び問題の変異体において、温度依存的な活性、並びに、50℃での活性に対する37℃での活性の比率％を示している。
0004426094.tif 000012
Ｂ．配列番号２の配列の変異体におけるαアミラーゼ活性
pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて、前記のPhadebas検査によって測定を行った。試料中の活性を、50mM Britton Robinson 緩衝液(pH7.3) を用いて25℃及び37℃で測定した。
【０１１９】
以下の表では、親酵素（配列番号２）及び問題の変異体において、温度依存的な活性、並びに、37℃での活性に対する25℃での活性の比率％を示している。
0004426094.tif 000013
Ｃ．配列番号４の配列の変異体におけるαアミラーゼ活性
pH7.3 に合わせた50mM Britton Robinson 緩衝液による各変異体溶液を用いて、前記のPhadebas検査によって測定を行った。試料中の活性を、50mM Britton Robinson 緩衝液(pH7.3) を用いて37℃で、そして50mM CAPS 緩衝液（pH10.5) を用いて60℃で測定した。
【０１２０】
以下の表では、親酵素（配列番号４）及び問題の変異体において、温度依存的な活性、並びに、60℃での活性に対する37℃での活性の比率％を示している。
0004426094.tif 000014
実施例10
BAN:1-300/Termamyl:301-483から成る親のハイブリッドαアミラーゼに由来する変異体の構築
プラスミドpTVB191 は、BAN:1-300/Termamyl:301-483からなるハイブリッドαアミラーゼをコードする遺伝子と共に、バチルス・ズブチリス内で機能する複製起点、及びクロラムフェニコール耐性を付与するcat 遺伝子を含んでいる。
【０１２１】
変異体BM4 (F290E) を、プラスミドpTVB191 を鋳型としてメガプライマー法（Sarkar and Sommer, 1990)によって構築した。
プライマーｐ１（配列番号52）及び変異生成オリゴヌクレオチドbm4 （配列番号47）を用いて標準条件下でPCR を行って、 444bp断片を増幅した。この断片をアガロースゲルから精製して、これをメガプライマーとして、プライマーｐ２（配列番号53）と共に用いて２回目のPCR を行い、 531bp断片を得た。この断片を制限エンドヌクレアーゼHindIII 及びTth111I によって切断した。これによって生じた 389bp断片を、同酵素で切断したプラスミドpTVB191 内に連結した。できたプラスミドによってバチルス・ズブチリスSHA273を形質転換した。クロラムフェニコール及び不溶性でんぷんを含有したプレート上で増殖させることによって、クロラムフェニコール耐性クローンを選択した。そのプレートをヨウ素蒸気で染色した後、染色輪を形成したクローンを選択することによって、活性αアミラーゼを発現するクローンを単離した。DNA 配列の決定によって、導入された変異の存在を確認した。
【０１２２】
変異体BM5 (F290K), BM6 (F290A), BM8 (Q360E) 及びBM11 (N102D)を同様にして構築した。それらの構築の詳細を以下に記す。
変異体：BM5 (F290K)
変異生成オリゴヌクレオチド：bm5 （配列番号48）
プライマー（１回目 PCR) ：ｐ１（配列番号52）
生成断片サイズ： 444bp
プライマー（２回目 PCR) ：ｐ２（配列番号53）
制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, Tth111I
切断断片サイズ： 389bp
【０１２３】
変異体：BM6 (F290A)
変異生成オリゴヌクレオチド：bm6 （配列番号49）
プライマー（１回目 PCR) ：ｐ１（配列番号52）
生成断片サイズ： 444bp
プライマー（２回目 PCR) ：ｐ２（配列番号53）
制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, Tth111I
切断断片サイズ： 389bp
【０１２４】
変異体：BM8 (Q360E)
変異生成オリゴヌクレオチド：bm8 （配列番号50）
プライマー（１回目 PCR) ：ｐ１（配列番号52）
生成断片サイズ： 230bp
プライマー（２回目 PCR) ：ｐ２（配列番号53）
制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, Tth111I
切断断片サイズ： 389bp
【０１２５】
変異体：BM11 (N102D)
変異生成オリゴヌクレオチド：bm11（配列番号51）
プライマー（１回目 PCR) ：ｐ３（配列番号54）
生成断片サイズ： 577
プライマー（２回目 PCR) ：ｐ４（配列番号55）
制限エンドヌクレアーゼ：HinDIII, PvuI
切断断片サイズ： 576
変異生成オリゴヌクレオチド
bm4 （配列番号47）：F290E
プライマー 5' GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT GAG AAT TTA CAG G
bm5 （配列番号48）：F290K
プライマー 5' GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT AAG AAT TTA CAG G
bm6 （配列番号49）：F290A
プライマー 5' GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT GCC AAT TTA CAG G
bm8 （配列番号50）：Q360E
プライマー 5' AGG GAA TCC GGA TAC CCT GAG GTT TTC TAC GG
bm11（配列番号51）：N102D
プライマー 5'     GAT GTG GTT TTG GAT CAT AAG GCC GGC GCT GAT G
その他のプライマー
ｐ１： 5' CTG TTA TTA ATG CCG CCA AAC C （配列番号52）
ｐ２： 5' G GAA AAG AAA TGT TTA CGG TTG CG（配列番号53）
ｐ３： 5' G AAA TGA AGC GGA ACA TCA AAC ACG （配列番号54）
ｐ４： 5' GTA TGA TTT AGG AGA ATT CC (配列番号55）
実施例11
BAN:1-300/Termamyl:301-483から成る親のハイブリッドαアミラーゼに由来する変異体におけるアルカリpHでのαアミラーゼ活性
各酵素溶液を用いて、Phadebas検査（前記）によって測定を行った。NaOHによって指示したpHに合わせた50mM Britton-Robinson 緩衝液中で30℃にて15分間インキュベーションした後に、活性を測定した。
NU／mg酵素
pH       wt        Q360E     F290A     F290K     F290E     N102D
8.0      5300      7800      8300      4200      6600      6200
9.0      1600      2700      3400      2100      1900      1900
【０１２６】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ６つの親のTermamyl様αアミラーゼのアミノ酸配列の整列を示す。左端の数字は、以下の通り、各アミノ酸配列を示す：
１：配列番号２
２：Kaoamyl
３：配列番号１
４：配列番号５
５：配列番号４
６：配列番号３
【図２】  SP722 （配列番号２）（pH９における）、及びB. licheniformisαアミラーゼ（配列番号４）（pH7.3 における）の温度活性曲線を示す。
【図３】  SP690 （配列番号１）、SP722 （配列番号２）、及びB. licheniformisαアミラーゼ（配列番号４）の、pH10における温度活性曲線を示す。
【図４】  ５つのαアミラーゼのアミノ酸配列の整列を示す。左端の数字は、以下の通り、各アミノ酸配列を示す：
１：マウスαアミラーゼ（amyp mouse）
２：ラットαアミラーゼ（amyp rat）
３：ブタ膵臓αアミラーゼ（PPA)（amyp pig）
４：ヒトαアミラーゼ（amyp human）
５：A. haloplanctis αアミラーゼ（AHA)（amy altha)
【配列表】
0004426094.tif 000015
0004426094.tif 000016
0004426094.tif 000017
0004426094.tif 000018
0004426094.tif 000019
0004426094.tif 000020
0004426094.tif 000021
0004426094.tif 000022
0004426094.tif 000023
0004426094.tif 000024
0004426094.tif 000025
0004426094.tif 000026
0004426094.tif 000027
0004426094.tif 000028
0004426094.tif 000029
0004426094.tif 000030
0004426094.tif 000031
0004426094.tif 000032
0004426094.tif 000033
0004426094.tif 000034
0004426094.tif 000035
0004426094.tif 000036
0004426094.tif 000037
0004426094.tif 000038
0004426094.tif 000039
0004426094.tif 000040
0004426094.tif 000041
0004426094.tif 000042
0004426094.tif 000043
0004426094.tif 000044
0004426094.tif 000045
0004426094.tif 000046
0004426094.tif 000047
0004426094.tif 000048
【図１】
0004426094.tif 000049
0004426094.tif 000050
0004426094.tif 000051
0004426094.tif 000052
【図２】
0004426094.tif 000053
【図３】
0004426094.tif 000054
【図４】
0004426094.tif 000055
0004426094.tif 000056
0004426094.tif 000057