(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、
その二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から順に１〜４個のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、
２９ヌクレオチド以下の鎖長を有する、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２】
二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が２個である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３】
さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から１１〜１３番目に位置する１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項４】
二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から１２番目に位置するヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項３に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項５】
さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから５’側に１〜３ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の３’側のヌクレオチドから５’側に１〜３ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項６】
さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから５’側に２ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の３’側のヌクレオチドから５’側に２ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項７】
細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、
その二本鎖部分におけるセンス鎖の５’末端から順に１〜４個のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、
２９ヌクレオチド以下の鎖長を有する、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項８】
二本鎖部分におけるセンス鎖の５’末端から順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が２個である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項９】
さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から順に１〜４個のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１０】
二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が２個である、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１１】
さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から１１〜１３番目に位置する１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１２】
二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から１２番目に位置するヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項１１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１３】
さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから５’側に１〜３ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の３’側のヌクレオチドから５’側に１〜３ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１４】
さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから５’側に２ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の３’側のヌクレオチドから５’側に２ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖をコードするＤＮＡおよびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡの両方を含んでなる、ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】［発明の背景］
［発明の分野］
本発明は、ＲＮＡｉ現象による遺伝子サイレンシングに関するものであり、より詳細には、改良されたｓｉＲＮＡ、およびこれを用いた標的遺伝子の発現抑制法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される配列特異的な遺伝子転写後抑制機構である。この現象は、ハエ、昆虫、原生動物、脊椎動物、高等植物などの様々な種において観察されている。ＲＮＡｉの分子レベルでの作用機序に関し、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）における多くの研究により、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ断片がＲＮＡｉにとって必須の配列特異的メディエーターであること（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，２９３−２９６，２０００；Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６，１０７７−１０８７，２０００；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３，２０００）、ならびにこのｓｉＲＮＡが長い二本鎖ＲＮＡから、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼにより生成すること（Ｂｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，３６３−３６６，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００，２００１）がわかっている。【０００３】  哺乳動物においては、当初、ＲＮＡｉは卵母細胞および着床前の胚においてのみ見られる現象と考えられていた。一般に、哺乳動物細胞は、配列非特異的ＲＮアーゼであるＲＮアーゼＬによる迅速かつ非特異的なＲＮＡ分解経路、およびインターフェロンにより誘導される二本鎖ＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）による迅速な翻訳阻害経路を有しており、これらは共に、３０ヌクレオチド以上の二本鎖ＲＮＡによって活性化される。従って、未分化細胞およびＰＫＲを欠く分化細胞などを除く哺乳動物細胞においては、３０ヌクレオチド以上の二本鎖ＲＮＡへの前記応答により、配列特異的なＲＮＡｉ活性が遮蔽されることがある。最近になって、合成した２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖が、哺乳動物細胞培養物において内因性遺伝子の発現を特異的に阻害しうることが報告されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８，２００１）。【０００４】  ＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制の原理は、次のように考えられている。まず、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、これがマルチタンパク質複合体と結合し、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）が形成される。次いで、このＲＩＳＣは標的遺伝子からのｍＲＮＡに結合し、そのヌクレアーゼ活性によりｍＲＮＡ中のｓｉＲＮＡが結合した部分を切断する。これにより、標的遺伝子によるタンパク質の発現が阻害される。【０００５】  最近では、合成ｓｉＲＮＡの細胞への導入によるＲＮＡｉ現象を用いた方法が、遺伝子発現の抑制法として注目され、利用されている。また、ｓｉＲＮＡの構成と遺伝子発現抑制効果との関係も、研究の対象となっている。【０００６】  例えば、Ｈｏｈｊｏｈ  Ｈ．の報告（Ｈｏｈｊｏｈ  Ｈ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５２１，１９５−１９９，２００２）では、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する様々な二本鎖オリゴヌクレオチドについて、哺乳動物細胞における該遺伝子の発現抑制効果が調べられている。この報告には、とりわけ、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの３’末端における２個のリボヌクレオチドのオーバーハングが好ましいこと、アンチセンス鎖の構造が重要であること、ならびに、対象とする遺伝子における標的配列の違いにより、得られる遺伝子発現抑制効果が異なることが記載されている。【０００７】  Ｈａｍａｄａ  Ｍ．らの報告（Ｈａｍａｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２，３０１−３０９，２００２）では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖においてそれぞれの３’末端以外の部分に連続しない１以上の標的配列とのミスマッチを導入したｓｉＲＮＡを用いて、その標的遺伝子の発現抑制効果が調べられている。この報告には、アンチセンス鎖における標的配列とのミスマッチによって遺伝子発現抑制効果が低減されるが、一方で、センス鎖におけるミスマッチは遺伝子発現抑制効果に影響しないことが記載されている。【０００８】［発明の概要］
本発明者は、ｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の二本鎖部分における３’末端の幾つかのヌクレオチドにおいてアンチセンス鎖に対するミスマッチを導入することにより、そのｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果が増強されることを見出した。さらに、本発明者は、ｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の二本鎖部分における５’末端の幾つかのヌクレオチドにおいてアンチセンス鎖に対するミスマッチを導入することにより、そのｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果が低減されることを見出した。本発明は、これら知見に基づくものである。【０００９】  従って、本発明は、ｓｉＲＮＡにおいてその遺伝子発現抑制効果を調節するための改良を加えた二本鎖ＲＮＡ分子、およびこれを用いた遺伝子発現抑制法を提供することを目的とする。【００１０】  そして、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から順に１以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数が、前記細胞内における両鎖のハイブリダイゼーションを可能とするものである、二本鎖ＲＮＡ分子である。【００１１】  さらに、本発明の第二の態様による二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の５’末端から順に１以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数が、前記細胞内における両鎖のハイブリダイゼーションを可能とするものである、二本鎖ＲＮＡ分子である。【００１２】  さらに、本発明による遺伝子発現抑制法は、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法である。【００１３】  本発明によれば、ＲＮＡｉ現象を利用した標的遺伝子の発現抑制法において、その発現抑制効率を調節することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、各種ｓｉＲＮＡによる、ＨｅＬａ細胞中でのホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制効果を示す、二重ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図２】図２は、各種ｓｉＲＮＡによる、ＨｅＬａ細胞中での内因性遺伝子の発現抑制効果を示すグラフである。
【図３】図３は、センス鎖３’末端にミスマッチを含むｓｉＲＮＡ分子（Ｌａ２１−３’ｍ２）またはこれを含まないｓｉＲＮＡ分子（Ｌａ２１−ｃｏｎｖ．）による、２種のプラスミドからのレポーターの発現量を示す棒グラフである。
【００１５】［発明の具体的説明］
本明細書において「二本鎖ＲＮＡ」とは、二本の一本鎖ＲＮＡ分子が、全体にわたって、または部分的にハイブリダイズして得られるＲＮＡ分子を意味する。それぞれの一本鎖ＲＮＡを構成するヌクレオチドの数は互いに異なっていてもよい。また、二本鎖ＲＮＡを構成する一方または両方のヌクレオチド鎖は、一本鎖の部分（オーバーハング）を含んでいてもよい。【００１６】  本明細書において「二本鎖部分」とは、二本鎖ＲＮＡにおいて、両鎖のヌクレオチドが対合している部分、すなわち、二本鎖ＲＮＡ中の一本鎖の部分を除いた部分を意味する。【００１７】  本明細書において、「センス鎖」とは、遺伝子のコード鎖と相同な配列を有するヌクレオチド鎖を意味し、「アンチセンス鎖」とは、遺伝子のコード鎖と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖を意味する。【００１８】  本明細書において「相補的」とは、２つのヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下において対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）との関係、およびシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係をいう。【００１９】  細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉに関して得られている知見に基づいて、当業者であれば容易に設計することができる。一般的には、まず、標的遺伝子中においてその遺伝子に特異的な領域を選択し、細胞中においてその領域に特異的にハイブリダイズしうるリボヌクレオチド鎖を前記二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖とする。ここで「特異的な領域」とは、標的遺伝子の発現抑制を行なう細胞内において、他の核酸分子には見られない配列を有する領域を意味する。また、「特異的にハイブリダイズしうる」とは、そのアンチセンス鎖が、標的遺伝子の発現抑制を行なう細胞内において、標的遺伝子およびその転写物以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。前記アンチセンス鎖は、前記特異的領域に対応する配列を含むものとされるが、前記特異的領域に完全に相補的な配列を有する必要はなく、その特異的領域に特異的にハイブリダイズしうる限り、相補的でないヌクレオチドを含んでいてもよい。しかしながら、前記アンチセンス鎖は、好ましくは完全に相補的な配列を有するものとされる。二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖は、アンチセンス鎖に完全に相補的な配列を含むものとされる。【００２０】  標的遺伝子中において選択される上記の特異的領域は、標的遺伝子におけるエクソンのみから選択することが好ましい。また、前記特異的領域は、一般に、５’末端および３’末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに翻訳開始コドンの周辺を除く部分から選択することが好ましいとされており、例えば、エクソンおよびイントロンの両方を含む配列において、翻訳開始コドンから３’側に５０ヌクレオチド以上離れた領域が好ましく、より好ましくは翻訳開始コドンから３’側に７５ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上離れた領域とされる。前記特異的領域の長さは特に制限されないが、好ましくは１５ヌクレオチド以上、より好ましくは１７ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１９ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１９〜２３ヌクレオチド、最も��ましくは１９〜２１ヌクレオチドとされる。【００２１】  前記二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、センス鎖のヌクレオチドと対合した二本鎖部分の３’末端側に一本鎖部分（オーバーハング）を有していてもよい。この一本鎖部分のヌクレオチド配列は、標的遺伝子に関連する配列または関連しない配列のどちらであってもよく、その長さも特に制限されないが、好ましくは２ヌクレオチド長の配列、より好ましくは２つのウラシル残基（ＵＵ）とされる。センス鎖もまた、同様のオーバーハングを有するものとしてもよい。【００２２】  本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子は、上述のような二本鎖ＲＮＡ分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から順に１以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされたものである。すなわち、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖は、その二本鎖部分における３’末端から順に、アンチセンス鎖との１以上のミスマッチを有するものである。これにより、標的遺伝子の発現抑制効果が増強される。ただし、このセンス鎖とアンチセンス鎖は細胞内において二本鎖の状態を保つ必要があるため、ミスマッチのヌクレオチド数は、二本鎖状態を保つのに必要とされるアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数によって制限される。従って、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数は、細胞内における両鎖のハイブリダイゼーションを可能とするものとされる。【００２３】  二本のリボヌクレオチド鎖が細胞内においてハイブリダイズするか否かは、当業者であれば容易に調べることができる。例えば、目的とする細胞内におけるハイブリダイゼーション条件をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再現し、そこに二本のリボヌクレオチド鎖を添加して、これらがハイブリダイズするか否かを調べればよい。【００２４】  本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子において、二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数は１〜４個とされ、より好ましくは２個とされる。【００２５】  細胞内で標的遺伝子の発現を効率よく抑制するためには、上記のセンス鎖の３’末端におけるミスマッチに加え、その３’末端から１１〜１３番目に位置する１つのヌクレオチドにおいてミスマッチを導入することが有利である。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子はさらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から１１〜１３番目、より好ましくは１２番目、に位置する１つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされたものである。【００２６】  二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端から１１〜１３番目に位置する１つのヌクレオチドにミスマッチを有する二本鎖ＲＮＡ分子が遺伝子発現抑制効果を増強する上で有利であることは、１９〜２０ヌクレオチド長のセンス鎖において、その３’末端の２つのヌクレオチドおよびその３’末端から１２番目のヌクレオチドにミスマッチを導入した二本鎖ＲＮＡ分子についての実験データにより確認されている。そして、このミスマッチの位置は、ＲＩＳＣによる標的遺伝子転写産物の切断位置に近接している。従って、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子において、センス鎖の二本鎖部分の３’末端におけるミスマッチの他に導入されるミスマッチは、ＲＩＳＣによる標的遺伝子転写産物の切断位置に相当するセンス鎖上の位置から５’側または３’側に１〜３ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドに導入されるものとされてもよい。ＲＩＳＣによる標的遺伝子転写産物の切断位置は、二本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる標的遺伝子の特異的領域の配列に応じて、当業者であれば容易に決定することができるが、典型的には前記特異的領域の配列の中心部分である。【００２７】  本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子において、センス鎖の二本鎖部分の３’末端におけるミスマッチの他に導入されるミスマッチは、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、中心に位置するヌクレオチドから５’側に１〜３ヌクレオチドの位置、好ましくは２ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドに導入されるものとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、中心の３’側のヌクレオチドから５’側に１〜３ヌクレオチドの位置、好ましくは２ヌクレオチドの位置にある１つのヌクレオチドに導入されるものとされる。【００２８】  本発明の第二の態様による二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の５’末端から順に１以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされたものである。すなわち、本発明の第二の態様による二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖は、その二本鎖部分における５’末端から順に、アンチセンス鎖との１以上のミスマッチを有するものである。これにより、標的遺伝子の発現抑制効果が低減される。ただし、このセンス鎖とアンチセンス鎖は細胞内において二本鎖の状態を保つ必要があるため、ミスマッチのヌクレオチド数は、二本鎖状態を保つのに必要とされるアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数によって制限される。従って、本発明の第二の態様による二本鎖ＲＮＡ分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数は、細胞内における両鎖のハイブリダイゼーションを可能とするものとされる。【００２９】  本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第二の態様による二本鎖ＲＮＡ分子において、二本鎖部分におけるセンス鎖の５’末端から順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数は１〜４個とされ、より好ましくは２個とされる。【００３０】  本発明の第二の態様による二本鎖ＲＮＡ分子は、さらに、第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子について上述したセンス鎖上のミスマッチの一部または全部を含むものとすることもできる。これにより、標的遺伝子の発現抑制効果をより微細に調節することが可能となる。【００３１】  哺乳動物の細胞に長い二本鎖ＲＮＡ分子を導入すると、二本鎖ＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼや２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵��が誘導され、ひいては細胞死につながることが知られている。従って、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、哺乳動物の細胞内において、二本鎖ＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼまたは２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素を誘導しないものであることが好ましい。この条件を満たす二本鎖ＲＮＡ分子の鎖長は、当業者には容易に理解される。一般的には、３０ヌクレオチド以上の二本鎖ＲＮＡ分子によって上記の細胞死が起こることが知られており、従って、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、好ましくは２９ヌクレオチド以下、より好ましくは２５ヌクレオチド以下の鎖長を有するものとされる。ここで用いられる「鎖長」は、二本鎖ＲＮＡ分子の二本鎖部分だけでなく、一本鎖部分をも含めた場合のヌクレオチド長を意味する。【００３２】  本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制の効力を調節しうるものであり、これは、本明細書に記載の実験データによって裏付けられている。これらの実験データによれば、ｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖３’末端にミスマッチを導入した場合にはＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制効果が増強され、逆に５’末端にミスマッチを導入した場合にはその効果が低減されることが実証されている。そして、このような遺伝子発現抑制の効力の調節は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる際の方向性を調節することによりもたらされる。すなわち、ｓｉＲＮＡのいずれかの末端に導入されたミスマッチによってその端部におけるハイブリダイゼーションが解除されると、ｓｉＲＮＡはその端部からＲＩＳＣに取り込まれ、そのときに、ｓｉＲＮＡを構成する２本の鎖のうち、５’末端から取り込まれた鎖がＲＮＡｉのメディエーター（真のアンチセンス鎖）として機能する。従って、発現を抑制しようとする標的遺伝子について設計されたｓｉＲＮＡにおいて、そのアンチセンス鎖の５’末端からＲＩＳＣに取り込まれるように該ｓｉＲＮＡを改変することにより標的遺伝子の発現抑制効果を増強することができ、一方で、そのセンス鎖の５’末端からＲＩＳＣに取り込まれるように該ｓｉＲＮＡを改変することにより標的遺伝子の発現抑制効果を低減させることができる。【００３３】  従って、本発明によれば、細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、前記二本鎖ＲＮＡ分子がそのアンチセンス鎖の５’末端側からＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体に組み込まれるように改変されてなる二本鎖ＲＮＡ分子が提供される。このような改変の具体例は、本発明の第一の態様による二本鎖ＲＮＡ分子について上述したとおりである。このような改変により、標的遺伝子の発現抑制効果が増強される。【００３４】  さらに、本発明によれば、細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、前記二本鎖ＲＮＡ分子がそのセンス鎖の５’末端側からＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体に組み込まれるように改変されてなる二本鎖ＲＮＡ分子が提供される。このような改変の具体例は、本発明の第二の態様による二本鎖ＲＮＡ分子について上述したとおりである。このような改変により、標的遺伝子の発現抑制効果が低減される。【００３５】  本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内において、標的遺伝子の発現を抑制することができる。従って、本発明によれば、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。【００３６】  細胞は、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ現象を起こすことが可能な細胞であればいかなるものであってもよく、例えば、昆虫、線虫、植物、哺乳動物などに由来する細胞が挙げられ、好ましくは哺乳動物細胞とされる。植物に由来する細胞としては、例えば、トマト、タバコ、シロイヌナズナ、イネなどに由来するものが挙げられる。哺乳動物に由来する細胞としては、例えば、マウス、ハムスター、ヒトなどに由来するものが挙げられる。また、好適な培養細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞などが挙げられる。【００３７】  本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を細胞に導入する方法は、二本鎖核酸分子を細胞中に導入しうるものであればいかなる方法であってもよく、特に制限されない。本発明による方法において、特に好適な二本鎖ＲＮＡ分子の細胞中への導入法は、リポソーム、好ましくはカチオン性リポソームを用いたトランスフェクション法であり、これは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｊｅｔＳＩトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製）などの市販のトランスフェクション試薬を用いて容易に行なうことができる。【００３８】  あるいは、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を利用した標的遺伝子の発現抑制は、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を細胞中において発現するベクターを目的とする細胞に導入することによって行なうこともできる。この方法においては、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれを発現する２種のベクターを用いてもよいし、または本発明による二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖をコードするＤＮＡおよびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡの両方を含んでなるベクターを用いてもよい。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖をコードするＤＮＡを含んでなるベクターと、該二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖をコードするＤＮＡを含んでなるベクターとの組み合わせ、または本発明による二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖をコードするＤＮＡおよびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡの両方を含んでなるベクター、を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。【００３９】  上記のベクターは、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖または両方の鎖を細胞内において発現しうるものであればよい。従って、上記のベクターは、二本鎖ＲＮＡ分子の鎖をコードするＤＮＡを、細胞内でのその転写を可能とする形で含んでなる。このようなベクターは、当業者であれば容易に構築することができ、例えば、必要に応じて、プロモーター、ターミネーターなどの要素を機能しうる形で連結することができる���プロモーターとしては、目的とする細胞内において機能しうるものであればよく、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーターなどのいずれのものを用いてもよい。また、標的遺伝子の発現を制御しているものと同じプロモーターを用いることもでき、これにより、標的遺伝子の転写産物が生成すると同時に、該転写産物を分解するための本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を生成させることができる。構築されたベクターの目的とする細胞中への導入は、当技術分野において知られている方法により、当業者であれば適切に行なうことができる。【００４０】  特に、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子の両方の鎖を発現しうる単一のベクターを用いることが好ましい。このようなベクターは、二本鎖ＲＮＡ分子の２本の鎖を独立して発現するものであっても、２本の鎖がリンカー配列によって連結されたヘアピン型二本鎖ＲＮＡとして発現するものであってもよい。本発明による二本鎖ＲＮＡ分子をヘアピン型二本ＲＮＡとして発現するベクターは、当業者であれば適宜構築することができ、例えば、文献の記載（Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１，２３５−２３８，２０００；Ｔａｖｅｒｎａｒａｋｉｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４，１８０−１８３，２０００；Ｍａｌａｇｏｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９，６３９−６４４，１９９８；Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６，１０７７−１０８７，２０００）に従って構築することもできる。【００４１】  本発明による二本鎖ＲＮＡ分子、およびこれを利用した遺伝子発現抑制法は、様々な遺伝子を標的とすることができ、例えば、細胞における機能を解析することが望まれる遺伝子を標的とすることができる。また、癌遺伝子、ウイルス遺伝子などを標的としてその発現を抑制することにより、これら遺伝子の機能を解明することができ、さらには、生体中に存在する細胞においてこれら遺伝子の発現を抑制することにより、疾患または障害の治療を行なうことも可能となる。
【実施例】
【００４２】例１：各種ｓｉＲＮＡによるＨｅＬａ細胞中でのホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制
ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する従来のｓｉＲＮＡ、およびセンス鎖の様々な箇所にアンチセンス鎖とのミスマッチを導入したｓｉＲＮＡを設計し、これらによるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果を調べた。【００４３】  設計した各種ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を下記の表１に示す。表１では、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖を上側とし、アンチセンス鎖を下側として整列させ、互いに相補的なヌクレオチドには、両鎖の間にアステリスク「＊」が付されている。また、各ｓｉＲＮＡの名称において、「Ｌａ２」および「Ｌａ２１」はホタルルシフェラーゼ遺伝子中の標的配列を表し、該遺伝子の細胞への導入に用いた発現プラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）における番号体系によれば、「Ｌａ２」は第２８２〜３００ヌクレオチドを標的とするものであり、「Ｌａ２１」は第３４０〜３５８ヌクレオチドを標的とするものである。また、「ｃｏｎｖ．」は、従来の設計基準に基づいて設計されたｓｉＲＮＡを表し、従って、これはミスマッチを含んでいない。さらに、「３’ＢＬ」は、そのｓｉＲＮＡが、センス鎖における３’末端に突出部分（オーバーハング）を含まないことを表す。【００４４】
【表１】
0004572299.tif 000002
【００４５】  上記の各オリゴリボヌクレオチドのペアを合成し、それぞれの２０μＭをアニーリング緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１００ｍＭ酢酸カリウム、および１０ｍＭ酢酸マグネシウム）中に添加し、９０℃で３分間の熱変性を行なった後、３７℃で一昼夜のアニーリングを行なった。これにより、各ｓｉＲＮＡを得た。【００４６】  ＨｅＬａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ社製）中において、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。【００４７】  トランスフェクションの前日、増殖させたＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない新鮮な培地で希釈し、２４ウエル培養プレートに播種した（培養培地０．５ｍｌ中における約０．５×１０５細胞／ウエル）。次いで、培養培地を０．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で置換し、各ウエルに、ホタルルシフェラーゼを発現するｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．２５μｇ、対照としてのウミシイタケルシフェラーゼを発現するｐｈＲＬ−ＴＫプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．０５μｇ、および０．２４μｇの各ｓｉＲＮＡを添加した。２種のレポータープラスミドおよび各ｓｉＲＮＡでの同時トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて行なった。【００４８】  その後、細胞を３７℃で４時間インキュベートし、抗生物質を含まない新鮮な培養培地０．５ｍｌを添加した後、さらに３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後に細胞溶解物を調製し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ発現アッセイを行なった。【００４９】  図１は、二重ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図１では、各ｓｉＲＮＡを用いた場合における、対照（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ活性に対する標的（ホタル）ルシフェラーゼ活性の比が示されている。この２種のルシフェラーゼ活性の比は、遺伝子発現の抑制を起こさない二本鎖ＲＮＡ（Ｍｏｃｋ）（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いた対照サンプルについて得られたものを１．０として標準化されている。各データは少なくとも４回の独立した実験からの平均値であり、また、各データに付されたエラーバーは標準偏差を表す。【００５０】  図１ａによれば、Ｌａ２−ｃｏｎｖ．は約９８％という強い遺伝子発現抑制を示したのに対し、Ｌａ２１−ｃｏｎｖ．は約５０％という中程度の遺伝子発現抑制を示すことがわかる。このＬａ２−ｃｏｎｖ．とＬａ２１−ｃｏｎｖ．との遺伝子発現抑制効果における違いは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子中の標的配列の違いによるものと考えられる。【００５１】  図１ｂは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子中のＬａ２を標的とする各種ｓｉＲＮＡを用いた場合の遺伝子発現抑制効果を示す。Ｌａ２−ｃｏｎｖ．とＬａ２−３’ｍ１、Ｌａ２−３’���２、Ｌａ２−３’ｍ３、およびＬａ２−３’ｍ４とを比較すると、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における３’末端への１〜４ヌクレオチドのミスマッチの導入により、その標的遺伝子の発現抑制効果が２〜３倍となることがわかる。そのうち、センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのミスマッチを有するｓｉＲＮＡが最も強い遺伝子発現抑制効果を示している。さらに、センス鎖の３’末端における２ヌクレオチドのミスマッチに加え、センス鎖の３’末端から１２番目のヌクレオチドにおけるミスマッチを有するｓｉＲＮＡ（Ｌａ２−３’ｍ２ｍ１２）は、さらに強い遺伝子発現抑制効果を示している。これに対し、センス鎖の５’末端に２ヌクレオチドのミスマッチを有するｓｉＲＮＡ（Ｌａ２−５’ｍ２）は、従来のｓｉＲＮＡ（Ｌａ２−ｃｏｎｖ．）よりも低い遺伝子発現抑制効果を示しており、このことは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における５’末端へのミスマッチの導入がそのｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を低減することを示している。【００５２】  図１ｃは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子中のＬａ２１を標的とする各種ｓｉＲＮＡを用いた場合の遺伝子発現抑制効果を示す。Ｌａ２１−ｃｏｎｖ．とＬａ２１−３’ｍ１、Ｌａ２１−３’ｍ２、Ｌａ２１−３’ｍ３、およびＬａ２１−３’ｍ４とを比較すると、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における３’末端への１〜４ヌクレオチドのミスマッチの導入により、その標的遺伝子の発現抑制効果が２〜３倍となることがわかる。そのうち、センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのミスマッチを有するｓｉＲＮＡが最も強い遺伝子発現抑制効果を示している。さらに、センス鎖の３’末端における２ヌクレオチドのミスマッチに加え、センス鎖の３’末端から１２番目のヌクレオチドにおけるミスマッチを有するｓｉＲＮＡ（Ｌａ２１−３’ｍ２ｍ１２）は、さらに強い遺伝子発現抑制効果を示している。これに対し、センス鎖の５’末端に２ヌクレオチドのミスマッチを有するｓｉＲＮＡ（Ｌａ２１−５’ｍ２）は、従来のｓｉＲＮＡ（Ｌａ２１−ｃｏｎｖ．）よりも低い遺伝子発現抑制効果を示しており、このことは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における５’末端へのミスマッチの導入がそのｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果を低減することを示している。これらの結果は、上述のＬａ２を標的とする各種ｓｉＲＮＡを用いた場合に一致しており、従って、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における３’末端へのミスマッチの導入、さらには３’末端から１２番目のヌクレオチドにおけるミスマッチの導入による遺伝子発現抑制の増強効果は、標的遺伝子中の標的配列の部位、標的配列のヌクレオチド配列、その標的配列に対して設計されたミスマッチの無い従来のｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効率等に依存しないことがわかる。【００５３】例２：各種ｓｉＲＮＡによるＨｅＬａ細胞中でのＬａｍｉｎＡ／Ｃ遺伝子およびＤｎｍｔ１遺伝子の発現の抑制
ＨｅＬａ細胞において発現する内因性のＬａｍｉｎＡ／Ｃ遺伝子およびＤｎｍｔ１遺伝子のそれぞれについて、これら遺伝子対する従来のｓｉＲＮＡ、およびセンス鎖の様々な箇所にアンチセンス鎖とのミスマッチを導入したｓｉＲＮＡを設計し、これらｓｉＲＮＡによる前記遺伝子の発現抑制効果を調べた。【００５４】  設計した各種ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を下記の表２に示す。表２では、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖を上側とし、アンチセンス鎖を下側として整列させ、互いに相補的なヌクレオチドには、両鎖の間にアステリスク「＊」が付されている。また、各ｓｉＲＮＡの名称において、「Ｌａｍ」および「Ｄｎ１」はそれぞれが標的とする遺伝子、すなわちＬａｍｉｎＡ／Ｃ遺伝子およびＤｎｍｔ１遺伝子を表す。各遺伝子のｍＲＮＡ配列において翻訳開始コドンの「Ａ」を１とする番号体系によれば、「Ｌａｍ」はＬａｍｉｎＡ／Ｃ遺伝子からのｍＲＮＡ中の第８２９〜８５１ヌクレオチドを標的とするものであり、「Ｄｎ１（＃１）」はＤｎｍｔ１遺伝子からのｍＲＮＡ中の第７０〜８９ヌクレオチドを標的とするものであり、「Ｄｎ１（＃２）」はＤｎｍｔ１遺伝子からのｍＲＮＡ中の第１８５〜２０３ヌクレオチドを標的とするものである。さらに、「Ｎａｔ．Ｌａｍ」はＬａｍｉｎＡ／Ｃ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを表し、その標的配列は文献に記載されている（Ｅｌｂｒａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８，２００１）。また、「ｃｏｎｖ．」は、従来の設計基準に基づいて設計されたｓｉＲＮＡを表し、従って、これはミスマッチを含んでいない。【００５５】
【表２】
0004572299.tif 000003
【００５６】  上記の各オリゴリボヌクレオチドのペアを合成し、それぞれの２０μＭをアニーリング緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１００ｍＭ酢酸カリウム、および１０ｍＭ酢酸マグネシウム）中に添加し、９０℃で３分間の熱変性を行なった後、３７℃で一昼夜のアニーリングを行なった。これにより、各ｓｉＲＮＡを得た。【００５７】  ＨｅＬａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ社製）中において、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。【００５８】  ＨｅＬａ細胞の各ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）でのトランスフェクションは、ｊｅｔＳＩトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を用いて行なった。【００５９】  トランスフェクションの４８時間後に全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を行なった。このｃＤＮＡを鋳型とするリアルタイムＰＣＲにより、標的遺伝子の発現レベルを測定した。これら一連の発現レベル測定は、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて行なった。【００６０】  図２は、各種ｓｉＲＮＡによる、ＨｅＬａ細胞中での内因性遺伝子の発現抑制効果を示す。図２では、各ｓｉＲＮＡを用いた場合における、対照遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ遺伝子）の発現レベルに対する標的遺伝子（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ遺伝子またはＤｎｍｔ１遺伝子）の発現レベルの比が示されている。この発現レベルの比は、遺伝子発現の抑制を起こさない二本鎖ＲＮＡ（Ｍｏｃｋ）（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いた対照サンプルについて得られたものを１．０として標準化されている。各データは少なくとも４回の独立した実験からの平均値であり、また、各データに付されたエラーバーは標準偏差を表す。【００６１】  図２ａおよび図２ｂによれば、センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのミスマッチを有し、さらにセンス鎖の３’末端から１２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチを有するｓｉＲＮＡが、従来のｓｉＲＮＡに比べて強い遺伝子発現抑制効果を示すことがわかる。【００６２】例３：ｓｉＲＮＡ分子を構成するセンス鎖の３’末端におけるミスマッチによるＲＩＳＣ形成への影響
ｓｉＲＮＡが細胞内に導入されると、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がＲＩＳＣ内に取り込まれる。こうして形成されたＲＩＳＣは、その中に取り込まれた鎖がハイブリダイズしたｍＲＮＡを切断すると考えられている。従って、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれがＲＩＳＣ内に取り込まれやすいかによって、標的となる遺伝子の発現抑制の効率は異なると考えられる。【００６３】  本例では、ｓｉＲＮＡ分子においてセンス鎖の３’末端にミスマッチを導入することにより、ＲＩＳＣ内に取り込まれる鎖の選択性が変化するか否かを調べることを目的として、以下の実験を行った。【００６４】  まず、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子の３’非翻訳領域に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子におけるターゲット配列「Ｌａ２１」のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれに対応する配列を挿入した２種のレポータープラスミドを作製した。コントロールプラスミドとしては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するプラスミドを用いた。ｓｉＲＮＡ分子（二量体）としては、上記の表１に示されるＬａ２１−ｃｏｎｖ．（センス鎖３’末端にミスマッチを含まない）およびＬａ２１−３’ｍ２（センス鎖３’末端に２塩基のミスマッチを含む）を用いた。【００６５】  ＨｅＬａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ社製）中において、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。【００６６】  上記レポータープラスミドのいずれか一つ、上記ｓｉＲＮＡ分子のいずれか一つ、およびコントロールプラスミドを、ＨｅＬａ細胞に共トランスフェクションした。２４時間後に、ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性の測定値をβ−ガラクトシダーゼ活性の測定値で除した値を、標準化されたレポーターの発現量として評価した。【００６７】  図３は、センス鎖３’末端にミスマッチを含むｓｉＲＮＡ分子（Ｌａ２１−３’ｍ２）またはこれを含まないｓｉＲＮＡ分子（Ｌａ２１−ｃｏｎｖ．）による、２種のプラスミドからのレポーターの発現量を示す棒グラフである。図３において、「アンチセンス−ｓｉＲＮＡ」のグラフは、ターゲット配列のセンス鎖が３’非翻訳領域に組み込まれたレポータープラスミドからの発現量を示し、従って、この発現量は、各ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖をメディエーターとするＲＮＡｉによって抑制されたものである。一方で、「センス−ｓｉＲＮＡ」のグラフは、ターゲット配列のアンチセンス鎖が３’非翻訳領域に組み込まれたレポータープラスミドからの発現量を示し、従って、この発現量は、各ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖をメディエーターとするＲＮＡｉによって抑制されたものである。【００６８】  図３によれば、センス鎖３’末端にミスマッチを含まない従来型のｓｉＲＮＡ分子（Ｌａ２１−ｃｏｎｖ．）を用いた場合では、そのセンス鎖とアンチセンス鎖がほぼ同程度の割合でＲＮＡｉメディエーターとして働くことがわかる。���方、センス鎖３’末端にミスマッチを含むｓｉＲＮＡ分子（Ｌａ２１−３’ｍ２）を用いた場合では、そのセンス鎖をメディエーターとするＲＮＡｉ活性がほとんど誘導されないのに対し、アンチセンス鎖をメディエーターとするＲＮＡｉ活性が著しく強いことがわかる。この結果によれば、ｓｉＲＮＡ分子においてセンス鎖の３’末端にミスマッチを導入することにより、そのアンチセンス鎖が優先的にＲＮＡｉメディエーターとしてＲＩＳＣ内に取り込まれることが明らかとなる。このことは、センス鎖３’末端におけるミスマッチにより、ｓｉＲＮＡ分子がそのアンチセンス鎖の５’末端側からＲＩＳＣ内に取り込まれ、その結果として、該アンチセンス鎖がＲＮＡｉメディエーターとして働くことを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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