(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式で表される、天然由来のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質。
【化１】
0004516282.tif 000008
【請求項２】
サラキア属植物から、溶媒抽出によって、下記の式で表されるα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質を製造する方法。
【化２】
0004516282.tif 000009
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病や肥満の予防または治療に有効なα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質であって、特にデチンムル科またはニシキギ科サラキア属植物からの溶媒抽出物に含まれる新規なα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生活習慣病の一つである糖尿病は、その患者数は現在も増加の一途を辿り、2025年には全世界でその患者数は3億人に達するといわれている。糖尿病には、インスリン分泌能の低下や消失を主たる原因とするI型糖尿病（インシュリン依存型糖尿病）と、肥満などからインシュリン感受性の低下により生じるII型糖尿病（インシュリン非依存型糖尿病）に大別される。我が国における糖尿病患者の大半はII型糖尿病で、多くは肥満を伴う。
II型糖尿病の治療では、血中グルコース濃度の管理が必要不可欠である。そのため、摂取した炭水化物の消化を抑え、それによって食後の血中グルコース濃度の過度の上昇を抑えることが非常に重要である。
糖尿病を発症していなくとも、欧米風の食生活様式による高カロリー食物の摂取や過食、更には運動不足を要因とする、肥満や血糖値が高めのヒトも増加してきている。このようなヒトは、「糖尿病予備軍」と呼ばれ、現在では子供にまで広まっている。前記の食後の血中グルコース濃度の過度の上昇抑制は、糖尿病患者の治療のみならず、このような糖尿病予備軍においても、肥満を解消して糖尿病を予防するために重要な対処法であると考えられる。
【０００３】
一方、人間が持つ消化酵素の一つにα−グルコシダーゼがある。この酵素は、生体高分子の生化学的な過程において、ショ糖、麦芽糖などの二糖類を、生体に吸収し易い単糖（例えば、グルコース）に分解するという重要な機能を果たす。このα−グルコシダーゼの機能を阻害または調節することによって、生体内での吸収糖質量を減少させ、その結果、食後の過度の血糖上昇を抑制することは、II型糖尿病の予防および治療、そして強いては糖尿病予備軍における肥満解消および糖尿病予防にも有効な手段であると考えられる。
【０００４】
α−グルコシダーゼの機能阻害を目的として開発されたα−グルコシダーゼ阻害薬としては、現在、商品名ベイスン（登録商標）（武田薬品工業）および商品名グルコバイ（登録商標）（バイエル薬品工業）の２種が承認されている。これらは糖尿病治療薬の市場の約15％を占める。前記α-グルコシダーゼ阻害剤は、糖尿病の治療薬としての作用以外に、過食や運動不足による肥満の解消およびダイエットにも効果を発揮する。しかしながら、これらα−グルコシダーゼ阻害薬は、稀に、肝機能障害や低血糖などの重篤な副作用を引き起こす危険性があると報告されている。そのため、医師の管理下において厳格に処方されなければならず、容易に入手および摂取できないのが現状である。
【０００５】
前記合成医薬品よりも生体に安全で、しかも副作用が比較的緩和である点から、天然物由来のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質が注目されている。このような物質の例としては、桑（Morus bombycis Koidzumi）やツユクサ（Commelina communis）に含まれるデオキシノジリマイシン[Natural Medicines, 55(5), 251-254(2001)]、およびニシキギ科サラキア属サラキア・レティキュラータ(Salacia reticulata)に含まれるサラシノール(Salacinol)（特許文献１参照）およびコタラノール(kotalanol)（特許文献２参照）、等が挙げられる。中でも、サラキア・レティキュラータには、特に高いα−グルコシダーゼ阻害活性を示す物質が含まれていると考えられている。
サラキア・レティキュラータは、主にインド南部、スリランカ北部に自生する蔓性の多年生木本植物である。その根や幹は、古来より南アジアの伝統医学であるアーユルヴェーダにおいて抗肥満や糖尿病における自覚症状（口渇）の緩和に用いられてきたことから、その中に含まれているサラシノールおよびコタラノールも生体に比較的安全な物質であると考えられる。前記サラシノールおよびコタラノールはそれぞれ、下記式で表されるチオ糖スルフォニル分子内硫酸塩構造物である。これらのα−グルコシダーゼ阻害活性はいずれも、現在販売されている合成医薬品グルコバイ（登録商標）（バイエル薬品工業製）とほぼ同等であると報告されている（前記非特許文献２）。
【化２】
0004516282.tif 000002
【０００６】
【非特許文献１】
Yoshikawa M., Tetrahedron Lett., 38, 8367-8370(1997)
【非特許文献２】
Yoshikawa M., Chem. Pharm.Bull., 46(8), 1339-1340(1998)
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、人体に対し安全性が高く、副作用の危険性が低く、しかも有効なα−グルコシダーゼ阻害活性を有する、糖尿病および肥満の予防に有効な、新規α−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質を、合成医薬品に比べて副作用が緩和な天然物から見出すことであった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記サラキア・レティキュラータが属するデチンムル科またはニシキギ科サラキア属植物からの溶媒抽出物、特にその根および幹からの溶媒抽出物についてα−グルコシダーゼ阻害活性をより詳しく調べたところ、前記サラシノールおよびコタラノール以外に、これらよりもα−グルコシダーゼ阻害活性能の高い物質が含まれているのではないかと推測した。そこで、更なる研究を重ねた結果、新規なα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質を見出すに至った。
【０００９】
したがって、本発明は、デチンムル科またはニシキギ科サラキア属植物の根および幹からの溶媒抽出物に含有される、下記の式で表されるα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質を提供する。
【化３】
0004516282.tif 000003
本発明では、前記式で表される新規なα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質を、サラキア属植物に含まれる類似構造の公知物質（サラシノールやコタラノール等）と区別するために、以降、「レティキュラノール(reticulanol)」と呼ぶ。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質「レティキュラノール」は、デチンムル科またはニシキギ科サラキア属植物の根および幹からの溶媒抽出物に含まれている。ここで、サラキア属植物は、サラキア・レティキュラータ以外に、サラキア・オブロンガ、サラキア・キネンシス（Salacia chinensis）、サラキア・マクロフィラ（Salacia macrophylla）、サラキア・エクスクルプータ（Salacia exculpta）、サラキア・プリノイデス（Salacia prinoides）、サラキア・ウンドゥラータ（Salacia undulata）などを包含する。
【００１１】
本発明のレティキュラノールは、前記サラキア属植物の溶媒抽出物に含まれている。以下に、前記溶媒抽出物の調製法およびそれからのレティキュラノールの単離精製法についての概略を説明するが、その詳細は以降の実施例に記載する。
最初に、サラキア属植物の根または幹の乾燥物の総重量に対し、約１０倍当量の抽出溶媒を加える。抽出溶媒は、水、またはメタノールを初めとするアルコール類、あるいは水とアルコール類またはアセトンなどのケトン類との混合溶媒から選択されてよい。特に好ましくは、抽出溶媒として水を用いる。
次いで、使用する溶媒の沸点付近の温度で１〜３時間加熱還流する。還流後、これらを、熱いうちにまたは冷却した後で、濾過する。次に、得られた濾液を減圧下で濃縮する。場合により、抽出残渣に新たに溶媒を加え、前記手順を更に１〜２回繰り返してよい。
得られた濾液から溶媒を留去することで、所望の溶媒抽出物が得られる。
【００１２】
この後、前記溶媒抽出物を、不要な成分を除去して精製することを目的として、ヘキサン、酢酸エチル、ｎ‐ブタノールを初めとする有機溶媒等で更に液−液分配に付してもよい。
【００１３】
次に、前記溶媒抽出物を、常套の分離精製方法、例えばカラムクロマトグラフィーなどに付すことにより、本発明の新規α−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質レティキュラノールが得られる。
【００１４】
本発明の所望のレティキュラノールは、デチンムル科またはニシキギ科サラキア属植物の根および幹からの溶媒抽出物の中でも、特に、サラキア・レティキュラータの根および幹からの水抽出物に多く含まれている。
【００１５】
本発明においてレティキュラノールは、単体で、あるいは分離前のレティキュラノールを含む前記溶媒抽出物のまま（例えば、レティキュラノールを含有するα−グルコシダーゼ阻害活性組成物として）使用されてもよい。
【００１６】
本発明は、本発明のレティキュラノールまたは前記α−グルコシダーゼ阻害活性組成物を有効成分として含有する食品も更に提供する。このような食品は、例えば、糖尿病の予防および治療のみならず、肥満の予防や解消にも有効である。
【００１７】
本発明の食品は、より好ましくは、経口摂取可能なものとして提供される。そのため、本発明の食品は、前記有効成分以外に、医薬分野において常用される既知の他の化合物、または粉末、固形剤または液剤に成型するのに必要な化合物、などを適宜包含していてよい。そのような化合物の例としては、エリスリトール、マルチトール、ヒドロキシプロピルセルロース、カオリン、タルク、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
【００１８】
本発明の食品は、本発明のレティキュラノールを、そのα−グルコシダーゼ阻害活性が有効に機能し得る量、例えば、食品の全重量に対して、レティキュラノールを少なくとも０．０００１重量％、好ましくは０．０００５〜０．０１重量％、より好ましくは０．００１〜０．００５重量％の量で含有していてよい。
【００１９】
以下の調製例および実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら調製例および実施例に限定されるものではない。
【実施例】
調製例１
サラキア・レティキュラータの根および幹からの水抽出物の調製方法
サラキア・レティキュラータの乾燥根および幹の粉砕物1500ｇに水10リットルを適当量加えて、100℃において2時間抽出した。得られた抽出液を濾別し、有効成分を含む濾液を得た。抽出残渣については、更に水を加えて、前記と同様の操作を２回繰り返し行った。
前記操作で得られた濾液を全て合わせて、減圧下、水流式アスピレーターを用いて、40℃で濃縮を行うことにより、サラキア・レティキュラータの水抽出物（202ｇ）を得た。
【００２０】
調製例２
レティキュラノールの単離
調製例１で得たサラキア・レティキュラータの根および幹からの水抽出物（202 g）に水0.6リットルを加えて室温で加温溶解した後、遠心分離（毎分1500回転、５分間）を行って、水可溶部 (135 g)と不溶部(62 g)に分けた。前記水可溶部(135 g)を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて更に５つのフラクション（以降、Fr.1〜5と略す）に分画した。カラムクロマトグラフィー分離条件およびそれにより得られた各フラクションは以下の通りである：
シリカゲル(1300 g),溶媒；CHCl3: MeOH: H2O= 60:40:10 (Fr. 1)→
55:45:10 (Fr. 2)→50:50:10 (Fr. 3)→30:70:10 (Fr. 4)→含水アセトン (Fr. 5)。
【００２１】
前記Fr. 3（17.8 g）について、ポリアミンを用いたHPLC分取 [ 検出；示差屈折光度計、カラム：YMC-pack PolyamineII (直径Φ2.0 X 25.0 cm)、流速：9.0 ml/min、溶媒：70％アセトニトリル水溶液]によって精製を行い、６つのフラクション（Fr. 3-1, Fr. 3-2, Fr. 3-3, Fr. 3-4, Fr. 3-5およびFr. 3-6）に分画した。
得られた各フラクションの定性分析を、水素核（1Ｈ）および炭素核（13Ｃ）の核磁気共鳴法（ＮＭＲ）および高速分子衝撃イオン化型質量分析（Fab-MS）により行ったところ、Fr. 3-2はサラシノール（サラキア水抽出物エキスに対し、収率0.0321％）、Fr. 3-6はコタラノール（同、収率0.0090％）であると同定された。
Fr. 3-5は、下記の各種スペクトルデータに基づき、下記構造式を有する新規物質・レティキュラノール（収率0.0142％）であることが分かった。
【化４】
0004516282.tif 000004
Fab-MS  m/z  392.8 (M-H)+
1Ｈ-ＮＭＲ(重水、500 MHz) : d 4.47 (1H, dd, J=3.5, 7.5 Hz), 4.20(1H, dd, J=3.5. 7.5Hz), 4.19-4.10 (3H, m), 3.84-3.60 (5H, m), 3.62 (2H, d, J=3.5 Hz), 3.50 (1H, dd, J=3.0, 12.0 Hz), 3.39 (1H, dd, J=6.0, 12.0 Hz).
13Ｃ-ＮＭＲ(重水、126 MHz) : d 79.0＊ (3'), 77.3＊ (3), 76.2 (2), 71.0 (5'), 69.5 (4), 68.3 (4), 66.0 (2'), 61.7 (6'), 58.6 (5), 49.8 (1'), 47.4 (1)（＊:互換性有り）。
【００２２】
実施例１：α−グルコシダーゼ阻害活性の測定
粗酵素の調製
10 mL の0.1M マレイン酸バッファー (pH 6.0) に 1 g のintestinal acetone powder rat (SIGMA社製) を懸濁した後、遠心分離 (3,000 rpm, 4℃, 20 min) した。得られた上清を分離し、粗酵素原液とした。この粗酵素原液を、以下のコントロール試料について求めた希釈倍率で希釈したものを粗酵素希釈液とし、これを後続のスクラーゼ(sucrase)阻害活性の測定に使用した。
コントロール試験：
試験管に緩衝液 50μL、74 mM sucrose 水溶液 100μLを分注し、水浴中37℃にて3分間予備加温した。この試験管中に、希釈した粗酵素原液を 50μL添加し、37℃にて30分間反応させた。反応終了後、精製水800μLを添加した。さらに80℃にて3分間加温することで酵素を失活させて反応を停止させた。反応液中のグルコース濃度を市販のキット・ムタロターゼ・グルコースオキシダーゼ法（グルコースCIIテストワコー、和光純薬工業製）を使用して定量した。その結果、粗酵素原液は、グルコース生成量が 5 mg/dL となるように、0.1M マレイン酸バッファー (pH 6.0)で３倍に希釈した。
【００２３】
被験物質のスクラーゼ阻害活性の測定
被験物質としては、前記調製例２で得た本発明のレティキュラノール、および比較用のサラシノールおよびコタラノールを使用した。試験管に、被験物質を0.1M マレイン酸バッファー (pH 6.0)に溶解させた試験試料（被験物質濃度3〜30μg/mL）50μＬを入れ、ここへ74 mM スクロース(sucrose)水溶液 100μＬをそれぞれ分注し、水浴中37℃にて3分間予備加温した。次いでここへ、前記粗酵素希釈液を50μＬずつ添加し、37℃で30分間反応させた。反応終了後、精製水800μＬをそれぞれに添加し、さらに80℃にて3分間加温することで酵素を失活させて反応を停止させた。
反応停止後、反応液中のグルコース濃度を市販の前記グルコースCIIテストワコー（和光純薬工業製）を使用して定量した。
【００２４】
別途、比較用被験物質としての前記調製例２で得たサラシノールを用い、上記と同様にして反応および定量を行った。
【００２５】
ブランク試験：
マレイン酸バッファーに溶解させた各被験物質 50μＬにスクロース水溶液 100μＬを混合した。ここへ精製水 800μＬを加え、続いて粗酵素希釈液50μＬを添加した後、直ちに80℃に加温して酵素を失活させた。この後、反応液中のグルコース濃度を上記と同様の方法によりそれぞれ測定した。
【００２６】
IC50値の算出
スクラーゼ阻害活性は、以下の式から算出した。
【数１】
スクラーゼ阻害活性（％）={(Glc0− Glcx)／Glc0}×100
式中、Glcxは、試験試料中のグルコース濃度から対応するブランク試験でのグルコース濃度を差し引いた値であり、そしてGlc0は、対応するコントロールのグルコース濃度である。
前記式より算出した阻害活性(％)を縦軸にとり、各被験物質濃度（μg/mL）を横軸にプロットして阻害曲線を作成した。この阻害曲線より、50％阻害濃度（IC50値）を算出し、スクラーゼ阻害活性とした。結果（IC50）を以下に示す。
【００２７】
前記実験に対する
【表１】
0004516282.tif 000005
この結果から、サラキア・レティキュラータの乾燥根および幹の粉砕物の水抽出物から単離されたレティキュラノール（本発明）、サラシノール（比較用）およびコタラノール（比較用）はいずれも、非常に強いα−グルコシダーゼ阻害活性を示し、しかも本発明のレティキュラノールのα−グルコシダーゼ阻害活性が、サラシノールに比べて２倍以上であることが分かる。
【００２８】
製剤例１：チュアブル錠の製造（本発明）
【表２】
0004516282.tif 000006
＊：全組成の合計重量を100重量％とする
上記組成中、香料、ｌ-メントールおよびショ糖脂肪酸エステル以外の全てを練り合わせた。ここに、l- メントールおよびショ糖脂肪酸エステルを加えて、さらに練合した後、最後に香料を加え、押し出し造粒法により顆粒を作成した。次いで、この顆粒を４０℃で乾燥した後、打錠機を用いることにより、経口摂取し易い形状のチュアブル錠を製造した。
得られたチュアブル錠は、高いα−グルコシダーゼ阻害作用を示す本発明のサラキア・レティキュラータ水抽出物を含んでいる。
【００２９】
実施例２：ドリンク剤の製造（本発明）
【表３】
0004516282.tif 000007
上記全組成を蒸留水800 mlに溶解し、蒸留水を加えて全量1000 mlとした後、0.22μmの滅菌フィルターで除菌し、100 mlずつ褐色瓶に無菌充填して、ドリンク剤を製造した。このドリンク剤には、α−グルコシダーゼ阻害作用に有効な成分として、本発明のサラキア・レティキュラータからの水溶媒抽出物が１本あたり100 mg配合されている。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の新規なα−グルコシダーゼ阻害活性を有する物質レティキュラノールは、天然植物の溶媒抽出物中に含まれており、公知の有効成分（サラシノールおよびコタラノール）と類似のチオ糖スルフォニル分子内硫酸塩構造を有する。本発明のレティキュラノールは、南アジアの伝承医学において長年使用されてきた天然植物を起源とするため、合成医薬品に比べて、生体に対する安全性が高い。
【００３１】
本発明のレティキュラノールは、例えば、食品などに配合することで、毎日摂取することができる。このような食品は、レティキュラノールのα−グルコシダーゼ阻害活性により、食後の過血糖を押さえられることから、糖尿病の予防に有効であるのみならず、糖尿病患者の症状緩和（すなわち、治療）への利用も期待され得る。
【００３２】
本発明のレティキュラノールは、優れたα−グルコシダーゼ阻害活性を示すため、今後の医薬品において、リード薬物となる可能性が高いと考えられる。これによって、レティキュラノールは、サラキア属植物の潜在的に保有する血糖値改善作用を証明する化合物の一つとなった。