(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下でアルペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１のDNA配列を含み、親細胞にアスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子の５’−末端の1.5kbのフラグメントに由来する核酸構成体が導入されたものであり、前記第１のDNA配列はNA2-tpiプロモーター又はNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にあり、前記第１のDNA配列がNA2-tpiプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、グルコーストランスポーターのプロモーター、palB遺伝子、マンニトールリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子の上流、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの停止コドンの下流、配列番号：34及び配列番号：39から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、そして前記第１のDNA配列がNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、YHM4熱ショック遺伝子、キチンシンターゼＢ遺伝子、配列番号：63、配列番号：66、配列番号：71及び配列番号76から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、
（ii）変異体細胞及び親細胞が両方共同じ条件下で培養された場合に、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項２】
前記核酸構成体が、制限酵素により媒介される組込みによって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが組換ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが非相同ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ホルモン、ホルモン変異体、酵素、レセプタ又はその一部分、抗体又はその一部分又はリポータである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、アミノペプチターゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボスクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシターゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フイターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はキシラナーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記変異体細胞が、親細胞に比べて増大した無機補因子の摂取量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記変異体細胞が、親細胞に比べて更に望ましい形態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異体細胞が、親細胞に比べて高い収量で、１又は複数の分泌タンパク質を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異体細胞が、１又は複数の必須代謝産物を合成する能力を喪失している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異体細胞の表現型が、或る一定の条件下でのみ観察される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変異体細胞が、親細胞に比べて変化した成長率を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異体細胞の成長が、ポリペプチド又は代謝産物の高レベルの産生を誘発する条件下で成長させられた時点で、望ましいポリペプチド又は代謝産物の過剰産生によって阻害されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異体細胞が、親細胞よりも低い酸素条件を寛容することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異体細胞が、親細胞に比べ変化したプロモータの転写活性化物質の産生を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異体細胞が、親細胞のシグナル伝達経路の遺伝子のうち１又は複数のものの中に変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異体細胞が隠性イントロンを認識したり誤ってスプライシングしたりしない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下でアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１のDNA配列を含み、親細胞にアスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子の５’−末端の1.5kbのフラグメントに由来する核酸構成体が導入されたものであり、前記第１のDNA配列はNA2-tpiプロモーター又はNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にあり、前記第１のDNA配列がNA2-tpiプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、グルコーストランスポーターのプロモーター、palB遺伝子、マンニトールリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子の上流、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの停止コドンの下流、配列番号：34及び配列番号：39から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、そして前記第１のDNA配列がNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、YHM4ショック遺伝子、キチンシンターゼＢ遺伝子、配列番号：63、配列番号：66、配列番号：71及び配列番号76から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、
（ii）突然変異体細胞及び親細胞が両方共同じ条件下で培養された場合に、突然変異体細胞が親細胞よりも少ないポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項２０】
（ａ）代謝産物の産生を導く条件下でアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）前記変異体細胞は、（ａ）代謝産物の生合成経路内で第１のポリペプチドをコードする１又は複数の第１のDNA配列、（ｂ）第１のポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列、（ｃ）該条件下で第１のポリペプチドのいずれかを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列及びｄ）第２の代謝産物の第２の生合成経路内で第２のポリペプチドをコードする１又は複数の第４のDNA配列を含み、親細胞のゲノム内にアスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子の５’−末端の1.5kbのフラグメントに由来する核酸構成体が導入されたものであり、前記第１のDNA配列はNA2-tpiプロモーター又はNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にあり、前記第１のDNA配列がNA2-tpiプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、グルコーストランスポーターのプロモーター、palB遺伝子、マンニトールリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子の上流、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの停止コドンの下流、配列番号：34及び配列番号：39から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、そして前記第１のDNA配列がNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、YHM4熱ショック遺伝子、キチンシンターゼＢ遺伝子、配列番号：63、配列番号：66、配列番号：71及び配列番号76から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、ここで該生合成経路と第２の生合成経路は、同じ中間体の産生に関与し、第２のポリペプチドが中間体の産生後の段階を触媒し、
（ii）突然変異体細胞及び親細胞が両方共同じ条件下で培養された場合に、突然変異体細胞が親細胞よりも多くの代謝産物を産生する、
培養段階、及び
（ｂ）代謝産物を回収する段階、
を含んで成る、代謝産物の産生方法。
【請求項２１】
第１のポリペプチドの産生方法において
（ａ）親細胞のゲノム内にアスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子の５’−末端の1.5kbのフラグメントに由来する核酸構成体を導入することによってアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の変異体細胞を形成する段階、ここで、当該変異体細胞は該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列を含み、当該第１のDNA配列は、NA2-tpiプロモーター又はNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にあり、前記第１のDNA配列がNA2-tpiプロモーターの制御下にある場合、核酸構成体が、グルコーストランスポーターのプロモーター、palB遺伝子、マンニトールリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子の上流、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの停止コドンの下流、配列番号：34及び配列番号：39から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、そして前記第１のDNA配列がNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にある場合、核酸構成体が、YHM4熱ショック遺伝子、キチンシンターゼＢ遺伝子、配列番号：63、配列番号：66、配列番号：71及び配列番号76から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入される；
（ｂ）変異体細胞及び親細胞が両方共同じ条件下で培養された場合に親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する変異体細胞を分離する段階；
（ｃ）核酸構成体が組込まれた遺伝子領域を同定する段階；
（ｄ）対応する遺伝子領域が分断された細胞を産生する段階；
（ｅ）該条件下で細胞を培養する段階、及び
（ｆ）第１のポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２２】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下でアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）前記変異体細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１のDNA配列を含み、親細胞にアスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子の５’−末端の1.5kbのフラグメントに由来する核酸構成体が導入されたものであり、前記第１のDNA配列はNA2-tpiプロモーター又はNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にあり、前記第１のDNA配列がNA2-tpiプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、グルコーストランスポーターのプロモーター、palB遺伝子、マンニトールリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子の上流、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの停止コドンの下流、配列番号：34及び配列番号：39から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、そして前記第１のDNA配列がNA-14アルファアミラーゼプロモーターの制御下にある場合、前記核酸構成体は、YHM4熱ショック遺伝子、キチンシンターゼＢ遺伝子、配列番号：63、配列番号：66、配列番号：71及び配列番号76から成る群から選択される遺伝子領域において親細胞のゲノム内に導入されており、ここで核酸構成体の導入がポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を特異的に増強し、
（ii）変異体細胞及び親細胞が両方共同じ条件下で培養された場合に、変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチドの生産方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は細胞によるポリペプチドの生成を変更するための方法に関する。
関連技術の記載
細胞を突然変異誘発することによってポリペプチドに生成を変更するためにいくつかの方法が使用されて来た。たとえば、タンパク質の生成は、突然変異現象の頻度を高めるために突然変異誘発剤としての化学的、物理的及び生物学的物質により細胞を処理することを包含する従来の突然変異誘発により変異細胞を生成することによって変更されて来た。
タンパク質の生成はまた、１つの又は時々、いくつかの抗生物質に対する耐性を通常コードするトランスポゾンと呼ばれる、2000以上の塩基対から成る二本鎖DNAの短い断片による細胞の突然変異誘発により変更されて来た。トランスポゾンは、細菌染色体とプラスミドとの間でさえ、ゲノム内を移動し、又は飛び移ることができ、そしてそれらはゲノム上の多くの異なった部位に組込まれるようになる。構造遺伝子内へのトランスポゾンの挿入は、遺伝子の正常なヌクレオチド配列を中断し、その結果、それは正常な機能的ポリペプチドの合成のための情報をもはや供給し得なくなる（Seifertなど．，1986,Proceedings of the National Academy of Science USA 83:735-739）。挿入はまた、その遺伝子生成物が発現のために必要とされる遺伝子を破壊する（Marquez-Magafla and Chamberlin,1994,Journal of Bacteriology 176:2427-2434）。さらに、Erredeなど．（1980,Cell 22:427-436）は、過剰生成を引き起こすイソ−２−チトクロムＣをコードする構造遺伝子に隣接する転移要素の挿入を開示する。さらに、WO96/29414は、トランスポゾン及び標的化された遺伝子を調節することができるDNA配列を含む転移要素が構成され、その細胞中への導入に基づいて、転移要素が、遺伝子の発現を調節する態様で細胞のゲノム中に組込むことを開示する。
ポリペプチドの生成を高めるための広く使用される方法は、ポリペプチドをコードする遺伝子の複数のコピーを生成するための増幅である。たとえば、アメリカ特許第5,578,461号は、遺伝子とタンデムに並んで増幅可能選択マーカー遺伝子の相同組換えを通しての包含を開示し、ここで選択マーカーの増幅されたコピーを含む細胞が適切な選択剤の存在下でその細胞を培養することによって選択され得る。
さらに、ポリペプチドの生成は、１つのプロモーターを、異なったプロモーターにより、又は１つのシグナルペプチドコード領域を他の領域により置換することによって高められて来た。アメリカ特許第5,641,670号を参照のこと。
種々の調節要素をコードする遺伝子を破壊することによって遺伝子発現を変更するための方法がまた記載されている。たとえば、Tomaなど．（1986,Journal of Bacteriology 167:740-743）は、nprプロモーター領域における−156〜−90の欠失がnpr遺伝子によりコードされる中性プロテアーゼの過剰発現を引き起こしたことを示した。Pero and Sloma（1993,A.L.Sonensheim,J.A.Hoch,and R.Losick,editors,Bucillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria,pp.939-952,American Society for Microbiology,Washinton,DC）は、胞子形成遺伝子spoOAがプロテアーゼの不十分な合成をもたらし、そしてabrB遺伝子における突然変異が合成を再生することを開示する。
ポリペプチドの生成はまた、ポリペプチドを生成するための条件下で、ポリペプチドをハイブリダイズできるプロテアーゼをコードするDNA配列を破壊することによって高められて来た。
ポリペプチドの分泌はまた、分泌タンパク質の過剰生成（Ruohonenなど．，1997,Yeast,13:337-351）により、及び超−分泌性細胞の生成（アメリカ特許第5,312,735号）により変更されて来た。
代謝物の生成を高めるための方法もまた記載されている。たとえば、WO96/41886号は、セファロスポリン経路におけるＬ−リシンのＬ−α−アミノアジピン酸の転換を妨げることによる、クラバム経路の少なくとも一部及びセファロスポリン経路の少なくとも一部を有する生物により生成されるクラバムの高められた生成を開示する。WO94/13813号は、ベタイン、すなわち酵素インジューサーを分解するタンパク質をコードする遺伝子の破壊を開示する。
ポリペプチド及び代謝物の生成を変更するための新規及び改良された方法論を提供することが、本発明の目的である。
発明の簡単な要約
本発明は、細胞によるポリペプチドの生成を変更するための方法に関する。本発明の方法においては、核酸構造体が、特定のポリペプチドをコードするDNA配列を含む細胞中に導入される。その導入された核酸構造体は、変異細胞を生成するために興味あるDNA配列内に存在しない遺伝子座で宿主ゲノム中に組込む。遺伝子座中への核酸構造体の組込みが、親細胞に対する変異細胞によるポリペプチドの生成を変更する。次に、変異細胞が同定され、ここでポリペプチドの生成が親細胞に対する変異細胞により変更される。変更は、変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、ポリペプチドの生成を比較することによって決定される。
本発明の利点は、突然変異が再生され得、そして突然変異に含まないDNA配列によりコードされるポリペプチドの生成の変更を導びくことである。
【図面の簡単な説明】
図１は、pJaL292の制限地図である。
図２は、pKS6の制限地図である。
図３は、pBANe13の制限地図である。
図４は、pBANe6の制限地図である。
図５は、pMHan37の制限地図である。
図６は、pBANe8の制限地図である。
図７は、pSO2の制限地図である。
図８は、pSO122の制限地図であり、そしてpSO122からのpDSY81及びpDSY82の構成を示す。
図９は、変異体アスペルギラス  オリザエ（Aspergillus oryzae）DEBY599.3の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列である（それぞれ、配列番号９及び10）。
図10は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY10.3の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号16及び17）である。
図11は、pJaL400の制限地図である。
図12は、pMT1935の構成である。
図13は、pJaL394の制限地図である。
図14は、pMT1931の制限地図である。
図15は、pMT1936の制限地図である。
図16は、変異体アスペルギラス  オリザエDZBY932の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号25及び26）である。
図17は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY1058の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号29及び30）である。
図18は、pDSY161の制限地図である。
図19は、pDSY162の制限地図である。
図20は、変異体アスペルギラス  オリザエ1204.3.3の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号34）である。
図21は、変異体アスペルギラス  オリザエH603の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号39）である。
図22は、pGAG3の制限地図である。
図23は、pJaL389の制限地図である。
図24は、pJaL335の制限地図である。
図25は、pJaL399の制限地図である。
図26は、pDM176の制限地図である。
図27は、pHB218の制限地図である。
図28は、pSE39の制限地図である。
図29は、pDSY153の制限地図である。
図30は、pCaHj505の制限地図である。
図31は、pMStr107の制限地図である。
図32は、変異体アスペルギラス  オリザエP4-8.1の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（配列番号50及び51）である。
図33は、変異体アスペルギラス  オリザエP7-14.1の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（配列番号56及び57）である。
図34は、pMT1612の制限地図である。
図35は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY7-17.2の救援された遺伝子座の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列（配列番号63及び64）である。
図36は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY3-2.1の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号66）である。
図37は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY5-7.1の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号71）である。
図38は、変異体アスペルギラス  オリザエDEBY8-10.1の救援された遺伝子座の核酸配列（配列番号76）である。
発明の特定の記載
第１の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在せず、前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
“転写を負に調節するタンパク質”とは、DNA配列に対して相補的な一本鎖RNAを生成するためにRNAポリメラーゼによりRNA合成の工程を負に影響を及ぼすリプレッサーとして、又は細胞の生合成又は異化経路により生成される一般的な化学物質である酵素インデューサーを分解するタンパク質として本明細書において定義される。リプレッサーは、DNA−結合、転写抑制、及びインデューサー又はリプレッサー結合のために必要とされる明確なドメインから成る。
“翻訳を負に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、遺伝子の転写に由来するmRNAに含まれる情報を解読するリボソームにより実施されるタンパク質合成の工程を質に影響を及ぼすタンパク質により触媒される。たとえば、前記物質は、キャップ−依存性翻訳開始因子、たとえば、p20（Altmannなど．，1997,EMBO Journal 16:1114-1121）;又は性−致死タンパク質、たとえばmsl−２の翻訳を調節するショウジョウバエの性−致死タンパク質（Bashaw and Baker,1997,Cell 89:789-798）であり得る。
“分泌を負に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、膜を通してタンパク質分子を、（ｉ）細胞内区画、たとえば液胞又はミトコンドリア、（ii）細胞周辺腔、又は（iii）培養培地中にトランスファーする工程、及び真核細胞においては、細胞からの分泌されたタンパク質のエキソサイティク開放を究極的にもたらす小胞性輸送の工程に負の影響を及ぼすタンパク質により触媒される。前記分泌工程は、正しいタンパク質の折りたたみを監督し、そして促進し、いづれかの必要とされる翻訳修飾（たとえばグリコシル化）を仲介し、そして全体として細胞の機能と適合する割合で特定の細胞部位に対するタンパク質を分類し、プロセッシングし、そして標的化する。そのような物質は、不活性化に基づいて、分泌される異種又は変異体タンパク質のレベルを高めるCa2+−ATPアーゼ活性を有するタンパク質（たとえば、Rudolphなど．，1989,Cell 58:133-145を参照のこと）；又はアンチセンスRNAの使用により哺乳類細胞において低められる場合、変異体タンパク質の分泌レベルの３倍までの上昇をもたらす、真核細胞の小胞体に見出されるATP−依存性hsp70−クラスシャペローンである結合タンパク質BiP（Dornerなど．，1988,Molecular and Cellular Biology 8:4063-4070）を包含する。特定の態様においては、前記物質は、ATPアーゼ活性を有するタンパク質又は結合タンパク質BiPである。
第２の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞が、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNAを含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
ポリペプチドをより生成する突然変異細胞は、より多くのポリペプチドが親細胞からよりも回収される細胞として本明細書において定義される。
第３の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在せず、前記ポリペプチドの転写を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより発現し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
第４の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞が、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNAを含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより発現し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
ポリペプチドをより“発現する”突然変異細胞は、親細胞よりも、ポリペプチドをコードする機能的mRNAの増加量を細胞として本明細書において定義される。機能的mRNAの増加量とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の転写の絶対的な割合の上昇に、及び／又は後−転写プロセッシング、又は転写体の修飾、たとえばmRNAの核−細胞質輸送及び／又は細胞質安定化の変更に起因することができることが理解されるであろう。そのような突然変異体細胞は、従来の技法、たとえばノザンブロット分析、ラン−オフ転写アッセイ、及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
第５の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在せず、前記ポリペプチドの翻訳を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより合成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
第６の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞が、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNAを含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより合成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
より多くのポリペプチドを“合成する”突然変異細胞とは、親細胞よりもより多くの量のポリペプチドを蓄積する細胞として本明細書において定義される。蓄積とは、全体として、培養物における、すなわち一緒に取られる細胞内及び細胞外区画の両者におけるポリペプチドの合計量を言及する。そのような突然変異細胞は、いづれか適切な技法、たとえば放射性ラベルされたアミノ酸を用いてのパルス−ラベリング又は定状状態ラベリング；ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いての細胞及び培地画分のイムノブロット分析；生物学的活性のアッセイ；従来のクロマトグラフィー方法による分離；及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
第７の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在せず、前記ポリペプチドの分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA配列内に存在せず、そして前記条件下で前記ポリペプチドを、加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより分泌し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
第８の態様において、本発明はポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNAを含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入が、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を破壊し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより分泌し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
より多くのポリペプチドを“分泌する”突然変異細胞とは、細胞外培地中に開放されるペプチドの量が親細胞よりも高められている細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、たとえば具体化される新しく合成されたポリペプチドの割合、及び親細胞に対する突然変異細胞に開放される絶対量を定量化するために、免疫沈殿法と共にパルス−チースラベリングを用いて同定され得る。イムノブロット分析、生物学的活性アッセイ、及び物理的−化学的分離方法がまた、突然変異細胞対親細胞に開放されるポリペプチドの絶対量を定量化するためにも使用され得る。
第９の態様においては、本発明はポリペプチドの生成方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し；ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列内にも、前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第２DNA配列内にも存在しない遺伝子座で、親細胞のゲノム中への、前記遺伝子座と相同でない核酸構造体のランダム組込みにより、前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドをより生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
第10の態様においては、本発明は、ポリペプチドの生成方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し；ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、ポリペプチドをコードする第１DNA配列及びポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を正に調節するタンパク質をコードする第２DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドを低く生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
ポリペプチドを低く“生成する”突然変異細胞は、ポリペプチドの低い量が親細胞に対して回収される細胞として本明細書において定義される。
“転写を正に調節するタンパク質”とは、DNA配列に対して相補的な一本鎖RNAを生成するためにRNAポリメラーゼによりRNA合成の工程に陽性的に影響を及ぼす活性化因子又はインデューサーとして本明細書において定義される。前記活性化因子は、DNA−結合、転写活性化、及びインデューサー又はリプレッサー結合のために必要とされる異なったドメインから成る。インデューサーは一般的に、細胞の生合成又は異化経路により生成される化学物質である。特定の態様において、物質は、活性化因子又はインデューサーである。
“翻訳を正に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、遺伝子の転写に由来するmRNAに含まれる情報を解読するリボソームにより実施されるタンパク質合成の工程に陽性的に影響を及ぼすタンパク質により触媒される。特定の態様において、前記物質は開始因子又は延長因子である。
“分泌を正に調節するタンパク質”とは、タンパク質又は物質として本明細書において定義され、その生成は、膜を通してタンパク質分子を、（ｉ）細胞内区画、たとえば液胞又はミトコンドリア、（ii）細胞周辺腔、又は（iii）培養培地中にトランスファーする工程に陽性的に影響を及ぼすか、又は上記のような小胞輸送に陽性的に影響を及ぼすタンパク質により触媒される。そのような物質は、折りたたみタンパク質、たとえばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びペプチジルプロイルイソメラーゼイソフォーム；シャペローン、たとえば熱ショックタンパク質、シグナル認識粒子、PrsA,SecD,SecF及びBiP;トラスロケートする鎖−関連膜タンパク質（TRAM）；トランスロカーゼ複合体；及びプロセッシング酵素、たとえばグリコシル化酵素；シグナルペプチダーゼ；プロ領域ペプチダーゼを包含する。特定の態様において、前記物質は、折りたたみタンパク質、シアペローン、シグナル認識粒子、PrsA,SecD,SecF,BiP、トラスロケートする鎖−関連膜、トランスロカーゼ複合体又はプロセッシング酵素である。
本発明の他の態様は、第10の態様に記載されるようなポリペプチドを生成するための方法に関し、但し前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドを少なく発現し、合成し、又は分泌する。
ポリペプチドを低く“発現する”突然変異細胞は、親細胞よりも、ポリペプチドをコードする機能的mRNAの減少量を細胞として本明細書において定義される。機能的mRNAの減少量とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の転写の絶対的な割合の低下に、及び／又は後−転写プロセッシング、又は転写体の修飾、たとえばmRNAの核−細胞質輸送及び／又は細胞質安定化の変更に起因することができることが理解されるであろう。そのような突然変異体細胞は、従来の技法、たとえばノザンブロット分析、ラン−オフ転写アッセイ、及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
より少量のポリペプチドを“合成する”突然変異細胞とは、親細胞よりもより少量のポリペプチドを蓄積する細胞として本明細書において定義される。蓄積とは、全体として、培養物における、すなわち一緒に取られる細胞内及び細胞外区画の両者におけるポリペプチドの合計量を言及する。そのような突然変異細胞は、いづれか適切な技法、たとえば放射性ラベルされたアミノ酸を用いてのパルス−ラベリング又は定状状態ラベリング；ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いての細胞及び培養画分のイムノブロット分析；生物学的活性のアッセイ；従来のクロマトグラフィー方法による分離；及び同様の方法（但し、それらだけには限定されない）を用いて同定され得る。
より少量のポリペプチドを“分泌する”突然変異細胞とは、細胞外培地中に開放されるポリペプチドの量が親細胞よりも低められている細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、たとえば具体化される新しく合成されたポリペプチドの割合、及び親細胞に対する突然変異細胞に開放される絶対量を定量化するために、免疫沈殿法と共にパルス−チースラベリングを用いて同定され得る。イムノブロット分析、生物学的活性アッセイ、及び物理的−化学的分離方法がまた、突然変異細胞対親細胞に開放されるポリペプチドの絶対量を定量化するためにも使用され得る。
本発明はまた、代謝物を生成するための方法にも関し、前記方法は、
（Ａ）前記代謝物の生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、（ａ）前記代謝物の生合成経路における第１ポリペプチドをコードする第１DNA配列、（ｂ）前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節する物質をコードする第２DNA配列、（ｃ）前記条件下で前記第１ポリペプチドのいづれかを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA配列、及び（ｄ）第２代謝物の第２生合成経路における第２ポリペプチドをコードする１又は複数の第４DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、１又は複数の前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記生合成経路及び第２生合成経路は同じ中間体の生成に関与し、そして前記第２ポリペプチドは前記中間体の生成の後の段階を触媒し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも代謝物をより生成し；そして
（Ｂ）前記代謝物を回収することを含んで成る。
本発明はまた、代謝物を生成するための方法にも関し、前記方法は、
（Ａ）前記代謝物の生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、（ａ）前記代謝物の生合成経路における第１ポリペプチドをコードする第１DNA配列、（ｂ）前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA配列、及び（ｃ）第２代謝物の第２生合成経路における第２ポリペプチドをコードする１又は複数の第３DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、１又は複数の前記第１DNA配列を含んで成る親細胞に関連し、ここで前記生合成経路及び第２生合成経路は同じ中間体の生成に関与し、そして前記第２ポリペプチドは前記中間体の生成の後の段階を触媒し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも代謝物をより低く生成し；そして
（Ｂ）前記代謝物を回収することを含んで成る。
本発明の方法はまた、第１ポリペプチドを生成するための方法にも関し、前記方法は、
（ａ）前記第１DNA配列内に存在せず、前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を負に調節するタンパク質をコードする第２DNA配列内に存在せず、そして前記第１ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第３DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により突然変異細胞を形成し；
（ｂ）両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドをより生成する突然変異細胞を単離し；
（ｃ）前記核酸構造体が組込まれている遺伝子座を同定し；
（ｄ）対応する遺伝子座が破壊されている細胞を生成し；
（ｅ）前記助けとなる条件下で前記細胞を培養し；そして
（ｆ）前記第１ポリペプチドを回収することを含んで成る。
対応する遺伝子座とは、救援された遺伝子座によりコードされるポリペプチドと同じ機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子座として本明細書において定義される。
本発明はまた、ポリペプチドを生成するための方法にも関し、前記方法は、
（ａ）前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で突然変異細胞を培養し、ここで
（ｉ）前記突然変異細胞は、前記ポリペプチドをコードする第１DNA配列、及び前記条件下で前記ポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードする第２DNA配列内に存在しない遺伝子座で親細胞のゲノム中への核酸構造体の導入により、前記第１DNA DNAを含んで成る親細胞に関連し、ここで前記核酸構造体の導入は、前記ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を特異的に増強し；そして
（ii）前記突然変異細胞は、両細胞が前記条件下で培養される場合、親細胞よりも前記ポリペプチドをより多く生成し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
転写、翻訳、又は分泌の“特異的”増強とは、興味あるポリペプチドに限定され、そして細胞における他のポリペプチドに対する全体的な効果を付随しないポリペプチドの生物発生及び生成の１又は複数の観点の増強を言及するために本明細書において使用される。好ましくは、特異的増強は、少数のポリペプチド、たとえば興味あるペプチドのみに影響を及ぼす。より好ましくは、特異的増強は、興味あるポリペプチドのみに影響を及ぼす。
それらの生物発生工程の全体的な増強は、当業界において良く知られている従来の方法を用いての特定の増強とは区別され得る。たとえば、3Ｈ−ウリジンによる生合成パラス−ラベリング（続く、RNA中に組込まれる合計の放射能の定量化）は、突然変異細胞がそれが関係する親細胞よりも早いか又は遅い速度でmRNAを一般的に合成しないことを決定するために使用され得る。同様に、たとえば35Ｓ−メチオニンによるパラス−ラベリング（続く、タンパク質中に組込まれる合計の放射能の定量化）は、突然変異細胞がそれが関係する親細胞よりも早いか又は遅い速度でタンパク質を一般的に合成しないことを決定するために使用され得る。分泌の一般的な速度は、放射性アミノ酸又は糖を用いてのパルス−チェースラベリング、続く細胞外放射能対細胞内放射能の定量化により突然変異細胞と親細胞との間で比較され得る。
それらの方法はまた、限定された数の他のポリペプチドの転写、翻訳又は分泌がまた、突然変異細胞において影響され得るかどうかを決定するためにも使用され得る。たとえば、固定されたオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによる特定の放射性ラベルされたRNA転写体の捕獲は、個々の遺伝子の転写速度を評価するために使用され得る。たとえばSDS−PAGE（個々のタンパク質の免疫沈殿を伴うか又は伴わない）による放射性ラベルされた新生タンパク質の決定が、個々のタンパク質の翻訳及び／又は分泌の瞬間的な速度を比較するために使用され得る。
ポリペプチド
用語“ポリペプチド”とは、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含し、そして従って、コードされた生成物の特定の長さには限定されない。ポリペプチドは、細胞に対して生来のものであり、又は異種ポリペプチドであり得る。好ましくは、それは異種ポリペプチドである。ポリペプチドはまた、遺伝子に対して外来性の１又は複数の制御配列を含んで成る核酸配列によりコードされる、細胞に対して生来のポリペプチドである組換えポリペプチドでもあり得る。ポリペプチドは、野生型ポリペプチド又はその変異体であり得る。ポリペプチドはまた、１又は複数のポリペプチドが細胞に対して異種である、少なくとも２種の異なったポリペプチドから得られる部分的又は完全なポリペプチド配列の組合せを含むハイブリッドポリペプチドでもあり得る。
ポリペプチドはさらに、天然に存在する対立遺伝子、及び上記ポリペプチドの構築された変異体を包含する。
好ましい態様において、ポリペプチドは抗体又はその一部である。
好ましい態様において、ポリペプチドは抗原である。
好ましい態様において、ポリペプチドは凝固因子である。
好ましい態様において、ポリペプチドは酵素である。
好ましい態様において、ポリペプチドは、ホルモン又はホルモン変異体である。
好ましい態様において、ポリペプチドは受容体又はその一部である。
好ましい態様において、ポリペプチドは調節タンパク質である。
好ましい態様において、ポリペプチドは構造タンパク質である。
好ましい態様において、ポリペプチドはレポーターである。
好ましい態様において、ポリペプチドは輸送タンパク質である。
より好ましい態様において、ポリペプチドはオキシドレダクターゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはトランスフェラーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはヒドロラーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはリアーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはイソメラーゼである。
より好ましい態様において、ポリペプチドはリガーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはアミノペプチダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはアミラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはカルボヒドラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはカルボキシペプチダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはカタラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはセルラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはキチナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはクチナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはデオキシリボヌクレアーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはデキストラナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはエステラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはα−ガラクトシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはグルコアミラーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはα−グルコシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはβ−グルコシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはハロペルオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはインバーターゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはラッカーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはリパーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはマンノシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはムタナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはペクチン分解酵素である。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはペルオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはフィターゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはポリフェノールオキシダーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはタンパク質分解酵素である。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはリボヌクレアーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはトランスグルタミナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはキシラナーゼである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドは、ヒトインシュリン又はその類似体である。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはヒト成長ホルモンである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはエリトロポエチンである。
さらにより好ましい態様において、ポリペプチドはインシュリノトロピンである。
ポリペプチドはまた、特定の代謝物の生合成に関与する酵素でもあり得る。代謝物の生合成は一般的に、１又は複数の段階が速度制限性でありえる一連の酵素−触媒された化学反応段階を含む生合成、経路を包含する。本発明のこの態様においては、細胞のゲノム中への核酸構造体の組込みが、１又は複数のそれらの酵素−触媒された段階を変性することによって代謝物の生成を変性する。
代謝物は、細胞の酵素−触媒された化学反応による前駆体有機化合物の形質転換により生成された細胞のいづれかの有機化合物であり得る。代謝物は、一次代謝物又は二次代謝物であり得る。さらに、代謝物は、生合成経路中間体、又は生合成経路生成物であり得る。好ましくは、代謝物は、アルカロイド、アミノ酸、抗生物質、補因子、薬物、脂肪酸、抗菌剤、除草剤、殺昆虫剤、有機酸、人工器官グループ、殺鼠薬、甘味剤、ビタミン、デオキシ糖、界面活性剤、マイコトキシン、有機酸、糖アルコール、毒性代謝物又はトキシンである。
核酸構造体
本発明の方法に使用される核酸構造体は、“標識された核酸構造体”と呼ばれる。“標識された核酸構造体”は、１又は複数の遺伝子座で細胞のゲノム中に組込み、それにより遺伝子座を製造する同定できる核酸配列を含む核酸分子である。ゲノムは、染色体及び人工染色体DNA及び染色体外DNA、すなわち自己−複製性遺伝子要素を含む細胞の完全なDNA組である。
核酸構造体は、合成DNAであり、天然に存在する遺伝子から単離され、又は天然に存在しない態様で組合され、そして並置される核酸のセグメントを含むよう修飾されている、一本鎖又は二本鎖のいづれかの核酸分子であり得る。核酸構造体は環状又は直線状であり得る。さらに、核酸構造体は、ベクターに含まれ得、制限酵素切断された、線状化されたフラグメントであり得、又はPCR増幅された線状フラグメントであり得る。
核酸構造体は、いづれかのサイズのいづれかの核酸配列を含むことができる。１つの態様において、核酸構造体は、約10〜20,000bpの長さ、好ましくは100〜15,000bpの長さ、より好ましくは500〜15,000bpの長さ、さらにより好ましくは1,000〜15,000bpの長さ、及び最とも好ましくは1,000〜10,000bpの長さのものである。
好ましくは、核酸構造体は、その遺伝子座と、40％以下の相同性、好ましくは30％以下の相同性、より好ましくは20％以下の相同性、さらにより好ましくは10％以下の相同性を有し、及び最とも好ましくは相同性を有さない。
好ましくは、核酸構造体は、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列と、40％以下の相同性、好ましくは30％以下の同一性、より好ましくは20％以下の同一性、さらに好ましくは10％以下の同一性を有し、及び最とも好ましくは相同性を有さない。
核酸構造体は、複数の別れたフラグメントとして細胞中に導入され得る。２つのフラグメントが使用される現象においては、それらの２つのフラグメントは、１つのフラグメントの３’末端で及び他の５’末端でDNA配列相同性（オーバーラップ）を共有する。細胞中への導入に基づいて、それらの２つのフラグメントは、単一のフラグメントを形成するために相同組換えを受けることができる。次に、生成物フラグメントは、細胞配列との組換えのために適切な形で存在する。細胞配列との組換えのために適切な生成物を究極的には形成するために、お互いとの相同組換えを受けるであろうように企画された複数のフラグメントが使用され得る。
複数の核酸構造体は、フラグメントが上記のようなオーバーラップ領域を含まない、本発明の方法に使用する環状又は線状フラグメントとして細胞中に導入され得ることがさらに理解されるであろう。いくつかの生物に関して、細胞中への複数の構造体の導入が同じ遺伝子座でのそれらの組込みをもたらすことは、当業界において良く知られている。
核酸構造体は、コード又は非コードDNA配列を含むことができる。コード配列は、mRNA中に転写され得、そして適切な制御配列の制御下に置かれる場合、ポリペプチドに翻訳され得る配列である。コード配列の境界は、一般的に、５’−末端での翻訳開始コドンATG及び３’−末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、DNA,cDNA及び組換え核酸配列を包含するが；但しそれらだけには限定されない。
好ましい態様において、核酸構造体は、同定できる核酸配列として選択マーカーを含む。選択マーカーは遺伝子であり、その生成物は殺生物又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養性に対する栄養要求性、又は同様のものを提供する。宿主細胞のゲノム中への選択マーカーの組込みは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする。本発明の方法に使用するための選択マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（amdS）、５−アミノレブリン酸シンターゼ（hemA）、アントラニル酸シンターゼ（trpC）、グルホシネート耐性遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hygB）、硝酸レダクターゼ（niaD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argB）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（pyrG）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（bar）、及び硫酸アデニルトランスフェラーゼ（sC）、並びに他の種からの同等物を包含するが、但し、それらだけには限定されない。より好ましい態様において、選択マーカーは、アスペルギラス  ニジュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギラス  オリザエ（Aspergillus oryzae）のamdS遺伝子、ストレプトマイセス  ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）のbar遺伝子、アスペルギラス  オリザエのhemA遺伝子、又はアスペルギラス  ニジュランス又はアスペルギラス  オリザエのpyrG遺伝子である。本発明の方法に使用するための他の選択マーカーは、バシラス  スブチリス（Bacillus subtills）又はバシラス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）からのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばアンピシリン（amp）、カナマイシン（kan）、クロラムフェニコール（cam）又はテトラサイクリン耐性（tet）を付与するマーカーである。時おり使用される哺乳類マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（dfhr）である。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1、及びURA3である。
もう１つの好ましい態様において、構造体は、ベクター配列を単独で、又は選択マーカーと組合して含んで成り、ここで前記ベクター配列は、複製の起点、たとえばＥ．コリベクター配列、たとえばpUC19,pBR322又はpBluescriptを含む。たとえば、複製の起点を含むＥ．コリベクターは、複製のＥ．コリ起点ために、組込みの後、宿主ゲノムからの構造体の回収を促進することができる。構造体は、制限エンドヌクレアーゼによるゲノムDNAの消化、続く、回収された構造体の連結、及びＥ．コリの形質転換により宿主ゲノムから回収され得る。
好ましい態様において、核酸構造体は、ポリペプチドのためのDNA配列のコード配列又はその一部を含まない。さらに好ましい態様において、核酸構造体は、興味あるDNA配列を組込み、又は破壊することから構造体を阻止するために、ポリペプチドをコードするDNA配列に対して相同でない配列を含む。
もう１つの好ましい態様において、核酸構造体は、制御配列に操作可能に連結されるポリペプチドをコードするDNA配列の１つ又は複数のコピーを含む。この態様において、ポリペプチドの生成は、遺伝子不活性化、及びDNA配列の１又は複数のコピーの導入の両者により変更されるであろう。
もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、転移因子、たとえばトランスポゾンを含まない。トランスポゾンは、同じ細胞内の他のDNA配列における多くの異なった部位中にそれ自体挿入することができるDNAの別々の断片である。転移工程のために必要なタンパク質は、トランスポゾン内にコードされる。トランスポゾンのコピーは、転移の後、元の部位に保持され得る。トランスポゾンの末端は通常、同一であるが、しかしお互いに対して逆の配向で存在する。
さらに好ましい態様においては、核酸構造体は、１又は複数の制御配列、たとえばプロモーターを単独で、又は選択マーカーと組合して含むことができ、ここで前記制御配列は、組込みに基づいて、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列に操作可能的に連結されない。用語“操作可能的に連結される”とは、制御配列が、一次RNA転写体の生成を方向づけるようなDNA配列のコード配列に関する位置に適切に配置されている形状として本明細書において定義される。そのような制御配列は、プロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、アテニュエーター配列、及びイントロンスプライス部位配列である。個々の制御配列は、細胞又はポリペプチド−コード配列に対して生来のものであっても又はそれらに対して外来性のものであっても良い。
核酸構造体における強いプロモーターの存在は、構造遺伝子（又は機能的転写プロモーター又はmRNA終結領域）中への挿入による遺伝子不活性化の他に、追加の遺伝的効効果を可能にする。プロモーターは、その転写を増強するために構造遺伝子の上流に挿入することができる。他方では、プロモーター配列がアンチセンスRNAを生成するために、逆の遺伝子配向に挿入する場合、二倍体、又はより高い倍数性の細胞における遺伝子不活性化の可能性が存在する。同じ機構によれば、逆配向でのプロモーター配列の挿入は、遺伝子生成物活性をコードする複数遺伝子ファミリーの不活性化をもたらすことができる。
もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、プロモーター以外の制御配列を含む。
もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、制御配列を含まない。
遺伝子座
本発明の方法においては、核酸構造体は、“興味あるDNA配列内に存在しない遺伝子座”、又は核酸構造体がポリペプチド−コード配列、その制御配列及び前記コード配列内のいづれかのイントロン配列中に導入されないことを意味する“代謝物の生合成経路におけるポリペプチドをコードするDNA配列内に存在しない遺伝子座”で導入される。
制御配列は、DNA配列に操作可能的に連結され、そしてポリペプチド−コード配列の発現に関与するすべての成分を包含する。そのような制御配列は、プロモーター、シグナル配列、プロペプチド配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、アテニュエーター配列、及びイントロンスプライス部位配列である。個々の制御配列は、コード配列に対して生来のものであっても又は外来性のものであっても良い。
プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含するいづれかのプロモーター配列であり得る。
シグナルペプチドコード領域は、細胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを方向づけることができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードする。
プロペプチドコード領域は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする。その得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又はいくつかの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟活性ポリペプチドに転換され得る。
ターミネーターは、ポリペプチドコード配列の３’末端に操作可能的に連結される配列であり、そしてポリペプチドコード配列の転写を終結するために細胞により認識される。
ポリアデニル化配列は、DNA配列の３’末端に操作可能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして細胞により認識される配列である。
エンハンサー配列は、遺伝子から数キロ塩基までに位置する場合、その遺伝子からの転写を高めることができる配列である。エンハンサー配列は通常、遺伝子の上流に存在する。
アテニュエーター配列は、その転写体を含むmRNA分子が完結されているか又は否なかを決定することによって、遺伝子の発現を調節する配列である。
イントロン配列は、遺伝子のタンパク質生成物に表わされない遺伝子の配列である。イントロン配列は、RNA中に転写され、そして切除されるべきであり、そしてRNA分子が、それが翻訳される前、イントロンスプライシングと呼ばれる工程を通して再連結される。
遺伝子座は、上記配列と隣接しなくても又は隣接しても良い。好ましくは、遺伝子座は隣接しない。遺伝子座は、興味あるDNA配列のものと同じ染色体又は同じ染色体外要素上に、又はそれとは異なった染色体又は異なった染色体外要素上に存在することができる。さらに、遺伝子座は、細胞に対して生来のものであっても、又は外来性のものであっても良い。
好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるDNA配列の５’又は３’末端からの、少なくとも1,000bp、より好ましくは少なくとも2,000bp、及びさらにより好ましくは少なくとも3,000bp、さらにより好ましくは少なくとも4,000bp、さらにより好ましくは少なくとも5,000bp及び最とも好ましくは少なくとも10,000bpである。
さらに好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列よりも異なった染色体上に存在する。
本発明の種々の方法においては、核酸構造体は、生理学的条件下でポリペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードするDNA配列内に存在する遺伝子座で導入され、このことは、核酸構造体がプロテアーゼ−コード配列、その制御配列、コード配列内のいづれかのイントロン配列、及びプロテアーゼの転写、翻訳又は分泌を陽性的に調節するタンパク質をコードするいづれかのDNA配列中に導入されないことを意味する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、DNA配列によりコードされるポリペプチドとは異るポリペプチドをコードする。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はグルコーストランスポーターをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号９の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はマンニトール−１−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号25の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はキチンシンターゼをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号56の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は熱ショックタンパク質をコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号50の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座はマンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードする。好ましくは、遺伝子座は、配列番号29の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、pacC、好ましくはpalB遺伝子の活性化のために必要とされる遺伝子である。好ましくは、遺伝子座は、配列番号16の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号34の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号39の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号63の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号66の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号71の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様においては、遺伝子座は、配列番号76の核酸配列と、少なくとも60％の相同性、より好ましくは少なくとも70％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最とも好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はアミノペプチダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はアミラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はカルボヒドラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はカルボキシペプチダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はカタラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はセルラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はキチナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はクチナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はデオキシリボヌクレアーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はデキストラナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はエステラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はα−ガラクトシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はβ−ガラクトシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はグルコアミラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はα−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はβ−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はグルコアミラーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はα−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はβ−グルコシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はハロペルオキシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はインバーターゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はラッカーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はリパーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はマンノシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はムタナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はオキシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はペクチン分解酵素をコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はペルオキシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はフィターゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はポリフェノールオキシダーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はタンパク質分解酵素をコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はリボヌクレアーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はトランスグルタミナーゼをコードする。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座はキシラナーゼをコードする。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY109に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY112に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY138に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は、pDSY141に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpDSY162に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpMT1936に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpSMO1204に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座はpSMOH603に含まれる配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号９の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号16の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号25の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号29の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号34の配列である。
より好ましい態様において、遺伝子座は配列番号39の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はp4-8.1に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はp7-14.1に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpHB220に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpSMO717に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpSMO321に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpHowB571に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座はpSMO810に含まれる配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号50の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号56の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号63の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号66の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号71の配列である。
もう１つのより好ましい態様において、遺伝子座は配列番号76の配列である。
もう１つの好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるDNA配列のtrans因子をコードしない。“trans因子”は、DNA配列の転写を活性化し、又は抑制する興味あるDNA配列とは異なる遺伝子によりコードされる因子である。より好ましい態様において、遺伝子座は、興味あるDNA配列のリプレッサーをコードしない。より好ましい態様において、遺伝子座は興味あるDNA配列の活性化因子をコードしない。
細胞
本発明の方法は、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列を含むいづれかの細胞、たとえば原核細胞、たとえば細菌、又は真核細胞、たとえば哺乳類、昆虫、植物及び菌類細胞により使用され得る。DNA配列は、細胞に対して生来のものであっても、又はそれに対して外来性のものであっても良い。細胞は単細胞微生物又は非単細胞微生物であり得る。さらに、細胞は野生型又は突然変異細胞であり得る。たとえば、突然変異細胞は、従来の突然変異誘発又は遺伝子操作を受けた細胞であり得る。
有用な真核細胞は、細菌細胞、たとえばグラム陽性細菌、たとえばバシラス細胞、たとえばバシラス  アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バシラス  アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス  ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス  サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス  コーギュランス（Bacillus Coagulans）、バシラス  ラウタス（Bacillus lautus）、バシラス  レンタス（lentus）、バシラス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス  メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス  スブチリス（Bacillus subtilis）、及びバシラス  サリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）;又はストレプトミセス細胞、たとえばストレプトミセス  リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス  ムリナス（Streptmiyces murimus）、又はグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリ及びプソイドモナスsp.（Pseudamonus sp.）であるが、但しそれらだけには限定されない。好ましい態様において、細菌細胞は、バシラス  レンタス、バシラス  リケニホルミス、バシラス  ステアロサーモフィラス又はバシラス  スブチリス細胞である。
好ましい態様において、細胞は菌類細胞である。“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworthなど．，Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UKにより定義されるような）、並びにオーミコタ（Oomycota）（Hawksworthなど．，1995、前記、p171に引用されるような）、及びすべての栄養胞子性菌類（Hawksworthなど．，1995、前記）を包含する。アスコミコタの代表的なグループは、たとえばニューロスポラ（Neurospora）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）（＝ペニシリウム（Penicillium））、エメリセラ（Emericella）（＝アスペルギラス（Aspergillus））、ユーロチウム（Ewotium）（＝アスペルギラス）、及び酵母を包含する。バシジオミコタの例は、マッシュルーム、サビ菌及び黒穂病菌を包含する。キトクジオミコタの代表的なグループは、たとえばアロミセス（Allomyces）、ブラストクラジエラ（Blastocladiella）、コエロモミセス（Coelomomyces）、及び水性菌類を包含する。オーミコタの代表的なグループは、たとえばサプロレグニオミセタス水性菌類（水性カビ）、たとえばアキルヤ（Achlya）を包含する。栄養胞子性菌類の例は、アルテルナリア（Alternaria）、アスペルギラス、カンジダ（Candida）及びペニシリウムを包含する。ヅイゴミコタの代表的な例は、ムコル（Mucor）及びリゾパス（Rhizopus）を包含する。
好ましい態様において、菌類細胞は酵母細胞である。“酵母”は、本明細書において使用される場合、子ノウ胞子性酵母（エンドミセタレス（Endomycetales））、担子胞子性酵母、及び菌類インペルフェクチ（Imperfecti）に属する酵母（ブラストミセテス（Blastomycetes））を包含する。子ノウ胞子性酵母は、科スペルモフィソラセアエ（Spermophthoraceae）及びサッカロミセタセア（Saccharomycetaceae）に分けられる。後者は、４種の亜科、すなわちシゾサッカロミコイデアエ（Schizosaccharamycoideae）（たとえば属シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces））、ナドソニオイデアエ（Nadsonioideae）、リポミコイデアエ（Lipomycoideae）、及びサッカロミコイデアエ（Saccharomycoideae）（たとえば属クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）及びサッカロミセス（Saccharomyces））から成る。担子胞子性酵母は、属フィロバシジエラ（Filobasidiella）、フィロバシジウム（Filobasidium）、レウコスポリジム（Leucosporidim）、ロードスポリジウム（Rhodosporidium）及びスポリジオボラス（Sporidiobolus）を包含する。菌類インペルフェクチに属する酵母は、２種類の科、すなわちスポロボロミセタセアエ（Sporobolomycetaceae）（たとえば属ブレラ（Bullera）及びソロボロミセス（Sorobolomyces））及びクリプトコカセアエ（Cryptococcaceae）（たとえば属カンジダ（Candida））に分けられる。酵母の分類は未来においては変化するので、本発明の目的のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeast（Skinnerなど．，1980,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980）に記載のようにして定義されるであろう。酵母の生物学、及び酵母遺伝学の操作は、当業界において良く知られている（たとえば、Biochemistry and Genetics of Yeast,（Bacil,M.,Horecket,B.J.,and Stopani,A.O.M.,editors）、2nd Edition;The Yeasts（Rose,A.H.,and Hurrison,J.S.,editors）,2nd Edition,1987;及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,Strathernなど．，editors,1981）。
より好ましい態様において、酵母細胞は、カンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス、シゾサッカロミセス又はヤロウイア（Yarrowia）の種の細胞である。
最とも好ましい態様においては、酵母細胞は、サッカロミセス  カルリスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス  セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス  ジアスタリカス（Saccharomyces diastaricus）、サッカロミセス  ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス  クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス  ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス  オビホルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、酵母細胞はクルイベロミセス  ラクチス細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、酵母細胞は、ヤロウイア  リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
もう１つの好ましい態様において、菌類細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”は、ユーミコタ及びオーミコタのすべての糸状形を包含する（Huwksworthなど．，1995、前記により定義されたような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類から構成される菌糸体壁により特徴づけられる。生長は、菌子の延長であり、そして炭素異化は絶対好気性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセス  セレビシアエの生長は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素異化は発酵性であり得る。より好ましい態様において、糸状菌細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、ムコル（Mucor）、マイセリオプソラ（Myceliophthora）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム、スシタリジウム（Scytalidium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）及びトリコダーマ（Trichoderma）の種の細胞であるが、但し、それらだけには限定されない。
さらにより好ましい態様においては、糸状菌細胞は、アスペルギラス細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞は、アクレモニウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞は、フサリウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はヒューミコラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はムコル細胞である。さらにもう１つのより好ましい態様において、糸状菌細胞はマイセリオプソラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はニューロスポラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌細胞はペニシリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様において、糸状菌はチエラビア細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様において、糸状菌はトリポリラジウム細胞である。もう１つのより好ましい態様において、糸状菌細胞はトリコダーマ細胞である。
最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、アスペルギラス  アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギラス  ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギラス  ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス  ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス  ニガー（Aspergillus niger）、又はアスペルギラス  オリザエ（Aspergillus oryzae）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、フサリウム  バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム  セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム  クルックウエレンス（Fusarium crookwellense）、フサリウム  クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム  グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フサリウム  グラミニナム（Fusarium graminum）、フサリウム  ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム  ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム  レチクラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム  ロゼウム（Fusarium roseum）、フサリウム  サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フサリウム  サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム  スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム  トルロセウム（Fusarium toruloseum）、フサリウム  トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）又はフサリウム  ベネナタム（Fusarium venenatum）細胞である。最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、フサリウム  ベネナタム細胞（Nirenberg sp.nov.）である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞は、ヒューミコラ  インソレンス（Humicola insolens）細胞又はヒューミコラ  ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はムコル  ミエヘイ（Mucor miehei）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はマイセリオプソラ  サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はニューロスポラ  クラサ（Neurospora crassa）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌はペニシリウム  プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌細胞はチエラビア  テレストリス（Thielavia terrestris）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様において、糸状菌はトリコダーマ  ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコダーマ  コニンジ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ  ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコダーマ  リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコダーマ  ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
有用な哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、子供のハムスターの腎臓（BHK）細胞、COS細胞、又はたとえばAmerican Type Culture Collectionから入手できる不滅化された細胞のいづれかを包含する。
細胞中への核酸構造体の導入
核酸構造体は、当業界において知られている種々の物理的又は化学的方法、たとえばトランスフェクション又はトランスダクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微小発射物衝撃、アルカリ塩、又はプロトプラスト−仲介形質転換（但し、それらだけには限定されない）により、細胞中に導入され得る。
挿入的突然変異誘発のためへの細胞中への核酸構造体の導入は、“DNA−標識された突然変異誘発”として言及される。“DNA−標識された突然変異誘発”は、細胞のゲノムの１又は複数の遺伝子座中への核酸分子の１又は複数の挿入を導びき、それにより、核酸分子が挿入される遺伝子座を製造する、細胞中への核酸分子の導入として本明細書において定義される。DNA−標識された突然変異誘発により生成される突然変異細胞は、標識された変異体と呼ばれる。
アスペルギラス細胞の形質転換のための適切な方法は、EP238023号及びYeltonなど．，1984,Proceedings of the National Academy of Science USA 81:1470-1474に記載されている。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierなど．，1989,Gene 78:147-156により、又はWO96/00787号に記載される。酵母は、Becker and Guarente,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods of Enzymology 194:182-187;Itoなど．，1983,Journal of Bacteriology 153:163;及びHinnenなど．，1978,Proceedings of the National Academy of Science USA 75:1920により記載される方法を用いて形質転換され得る。
細菌の形質転換は、たとえばプロトプラスト形質転換（たとえば、Chang and Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115を参照のこと）により、コンピテント細胞を用いて（たとえば、Young and Spizizin,1961,Journal of Bacteriology 81:823-829、又はDubnau and Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56:209-221を参照のこと）、エレクトロポレーション（たとえば、Shigekawa and Dower,1988,Biotechnigues 6:742-751を参照のこと）により、又は接合（たとえばKoehler and Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5771-5278を参照のこと）により達成され得る。
哺乳類細胞は、Graham and Van der Eb,1978,Virology 52:546のリン酸カルシウム沈殿方法を用いて、直接的な摂取により形質転換され得る。他の方法、たとえば当業界において知られているエレクトロポレーションも使用され得る。
核酸構造体がベクターである場合、細胞のゲノム中への組込みは、選択する細胞に依存して、相同及び／又は非相同組換えによりランダムに生じる。
好ましい態様において、核酸構造体は、制限酵素−仲介の組込み（REMI）により親細胞中に導入される。Schiestl and Petes,1991,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88:7585-7589に記載されるREMIは、制限酵素により消化されたプラスミドDNAのその制限酵素と共に細胞中への導入であり、これは続いて、添加された制限酵素により特定された部位でしばしば、ゲノム中へのプラスミドDNAの組込みを導びく。REMI DNA−標識された突然変異誘発の利点は、それが分子基準で容易に同定され得る突然変異誘発を生成できることである。
核酸構造体が制限酵素切断された線状DNAフラグメントである場合、適切な制限酵素の存在下でのREMIを通しての細胞ゲノム中への構造体の挿入は、ゲノムに存在する制限部位のランダム性のためにランダムである。核酸構造体は、単一の遺伝子座又は異なった遺伝子座で単一コピーとして又は複数コピーとして細胞のゲノム中に挿入することができる。核酸構造体は、標識された遺伝子座の同定及び回収を促進するために単一コピーとして挿入することが好ましい。
突然変異細胞のスクリーニング
本発明はまた、突然変異細胞及び親細胞の両者が一定条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチド又は代謝物をより生成し、発現し、合成し、又は分泌する突然変異細胞にも関する。
細胞中への核酸構造体の導入に続いて、次の段階は、推定上の突然変異細胞の集団からポリペプチドの変更された生成を有する突然変異細胞を単離することである。突然変異細胞の単離は好ましくは、突然変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチド又は代謝物の生成の測定に依存する。
句“ポリペプチドの変更された生成”とは、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチド又は代謝物の生成における段階の変更又は変化を包含する。そのような段階は、転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾、分泌、発酵、タンパク質分解、下流プロセッシング、回収、及び精製を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
突然変異細胞は、たとえば特定のポリペプチド又は代謝物の改良された生成性を有する突然変異細胞、又は特定のポリペプチド又は代謝物をもはや生成できないか又は減じられた生成能力を有する突然変異細胞であり得る。さらに、突然変異細胞は、無機補因子の高められた摂取を有する突然変異細胞であり得る。
突然変異細胞はまた、ポリペプチド又は代謝物の生成を変更する、親細胞よりもより所望の表現型を有することもできる。用語“表現型”とは、その遺伝子型により決定され、そしてその環境により調節される細胞の観察できるか又は外面的な特徴として本明細書において定義される。所望する表現型を有するそのような突然変異細胞は、形態学的突然変異細胞、分泌突然変異細胞、栄養要求突然変異細胞、条件づけ突然変異体、親細胞に対して所望する条件下で変更された増殖速度を示す突然変異細胞、過剰発現介在の増殖阻害の除去をもたらす突然変異細胞、又は低酸素条件を耐えることができる突然変異細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
さらに、突然変異細胞は、プロモーター又は隠れたイントロン−スプライシング欠損突然変異細胞の転写活性化因子の変更された生成を有する突然変異細胞であるものとして特徴づけられ得る。
突然変異細胞の単離は、所望する表現型、及び／又は興味あるポリペプチド又は代謝物に対して特異的な、当業界において知られているスクリーニング方法を包含する。一般的に、所望する表現型が関与する場合、所望する表現型に対して特異的な方法が最初に、突然変異細胞を同定するために使用され、次にポリペプチド又は代謝物に対して特異的な方法が使用される。
突然変異細胞を生成するために生物の細胞中に核酸構造体を導入することによって得られる推定上の変異体の集団は、まず標準のプレート技法、たとえば従来の突然変異誘発に使用される技法（たとえば、Lawrence,C.W.,1991,Christine Guthrie and Gerald R.Fink,editors,Methods in Enzymology,Volume 194,p273-281,Academic Press,Inc.,San Diego）、単一孔単離、又は富化技法を用いて精製される。標準のプレート技法は好ましくは、所望する表現型及び／又はポリペプチド又は代謝物を検出する手段と組合して実施される。次の異なった富化技法が、突然変異細胞の野生型又は親同等物に比較して突然変異細胞の百分率を高めるために使用され得る：（１）変異体の増殖を非常に好む増殖条件を利用する直接的な選択；（２）親細胞を殺害する条件を用いる逆選択；（３）突然変異細胞のそれらの親細胞からの物理的分離を可能にする突然変異細胞のユニーク性質を包含する物理的選択；及び（４）所望する物質の量の直接的な測定。しかしながら、所望する表現型及び／又は興味あるポリペプチド又は代謝物に関して、突然変異細胞を同定するための手段がプレート媒体中に組込まれても、又はいなくても、精製された推定上の変異体はその変異体の正体を確認するためにさらなる特徴化を必要とする。変異体をさらに特徴づけ、そして確認するために使用される方法の例は、下記に示される。
特定のポリペプチド又は特定の代謝物の改良された生成を有する変異体は、そのポリペプチド又は代謝物に対して特異的である、当業界において知られている検出方法を用いることによって同定され得る。ポリペプチドの検出方法は、特異的抗体、酵素生成物の形成又は酵素基質の消出を測定することによる酵素活性、酵素基質を含む寒天プレート上の透明な領域、及び生物学的活性のアッセイの使用を包含するが、但しそれらだけには限定されない。代謝物の検出方法は、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分光学、生物学的活性アッセイ、バイオアッセイ、及び螢光活性化細胞ソーティングを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
好ましい態様において、特に所望の突然変異細胞は、特定のポリペプチドの改良された生成を有する突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様において、特に所望の変異体は、次の特定の代謝物の改良された生成を有する変異体である：より好ましくはアルカロイド、アミノ酸、抗生物質、補因子、薬物、脂肪酸、殺カビ剤、除草剤、殺昆虫剤、有機酸、色素、プラスチック前駆体、ポリエステル前駆体、置換基、殺そ薬、甘味剤、又はビタミン；及び最とも好ましくはクエン酸又は乳酸。
ポリペプチドの構成成分であり、そして／又は生物学的活性のために必要とされる置換基又は有機補因子は、本発明の方法に従って変異体を単離することによって過剰生成され得る。そのような変異体は、置換基又は補因子の生合成が、生物学的活性形、たとえばヘム、たとえばシトクロム、特にシトクロムP450、シトクロムｂ、シトクロムＣ1、シトクロムＣを含むヘムタンパク質；グロビン、特にヘモグロビン又はミオグロビン；オキシドレダクターゼ、特にカタラーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、又はペルオキシダーゼ；又は置換基としてヘムを含む他のポリペプチド形で、ポリペプチドの生成において速度−制限現象である場合に特に重要である。
より好ましい態様において、特に所望の突然変異細胞は、アデノシンリン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、ビオシチン、ビオチン、補酵素Ａ、補酵素Ｑ（ユビキノン）、５’−デオキシアデノシルコバラミン、フェレドキシン、フラビン補酵素、ヘム、リポ酸、ヌクレオシド二リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ホスホアデノシン、ホスホスルフェート、ピリドキサールリン酸、テトラヒドロ葉酸、チアミンピロリン酸、又はチオレドキシンを過剰生成する突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、無機補因子の高められた摂取により特徴づけられる突然変異細胞である。ポリペプチドの構成成分であり、そして／又は生物学的活性のために必要とされる無機補因子の細胞による摂取は、本発明の方法に従って変異体を単離することによって高められ得る。そのような変異体は、無機補因子の摂取が生物学的活性形でのポリペプチドの生成において速度−制限現象である場合に特に重要である。より好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、Co2+,Cu2+,Fe2+,Fe3+,Ｋ+,Mg2+,Mn2+,Mo,Ni2+,Se、又はZn2+の高められた摂取により特徴づけられる突然変異細胞である。
好ましい態様において、ポリペプチド又は代謝物は、親細胞よりも、少なくとも20％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも100％、より好ましくは少なくとも100％〜1000％、さらにより好ましくは少なくとも200％〜1000％及び最とも好ましくは少なくとも500％〜1000％高い量で突然変異細胞により生成される。
もう１つの好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、特定のポリペプチドをもはや生成できないか又は減じられた生成能力を有する突然変異細胞である。特定のポリペプチドをもはや生成できないか又は減じられた生成能力を有する突然変異細胞は、ポリペプチドについての上記の同じ方法を用いて同定され得るが、しかし生成が存在しないか又は減じられた生成が存在するかは、親細胞に対して測定される。
より好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、ポリペプチドをもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有することができる突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様においては、ポリペプチドは、親細胞よりも、少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも75％及び最とも好ましくは100％低い量で突然変異細胞により生成される。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、特定の代謝物をもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有する突然変異細胞である。特定の代謝物をもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有する突然変異細胞は、代謝物についての上記同じか又は類似する方法を用いて同定され得るが、しかし生成が存在しないか又は減じられた生成が存在するかは、親細胞に対して測定される。
より好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、デオキシ糖、界面活性剤、マイコトキシン、有機酸、糖アルコール、毒性代謝物又はトキシン；及び好ましくはα−トキシン、β−トキシン、シクロピアゾン酸、エンニアチン、フサリン、カノサミン、マンニトール、シュウ酸、サーファクチン（surfactin）、トリコセセン、ゼアラレノール、又はゼアラレノンをもはや生成できないか又はその減じられた生成能力を有する突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様において、代謝物は、親細胞よりも少なくとも20％、より好ましくは50％、さらにより好ましくは75％及び最とも好ましくは100％低い量で、突然変異細胞により生成される。
もう１つの好ましい態様において、突然変異細胞は形態学的突然変異細胞である。“形態学的突然変異細胞”は、親細胞に対する所望する形態学的を誘発する増殖培地を用いる標準のプレート技法を用いることにより、顕微鏡試験により、又は螢光活性化された細胞分類により活動的に増殖する細胞を分類することによって同定され得る。そのような形態学的変異体は、卓越した流動学的性質を有するものとして特徴づけられた変異体、たとえば高く枝分れした菌類変異体、制限されたコロニー性菌類変異体又は急速な増殖及び低い粘度成長特性を有する高く枝分れした、制限されたコロニー性菌類変異体；ペレット形に比較して、発酵の間、糸状形を有する変異体；発酵器表面のコロニー化を妨げる低い“粘性”である変異体；発酵の間、予測できる粘度を有する変異体；培養物の純度及び培養物によるポリペプチドの高い生成のモニター及び維持の助けとなる色彩変異体；たとえば細胞壁、又は構造性疎水性タンパク質、たとえばヒドロホビンを欠いている湿潤性細胞；細胞の増殖を改良する浸透応力−無感受性変異体；細胞の増殖を改良する乾燥−無感受性変異体；ポリペプチドの生成を増強する非胞子形成変異体；及び低い粘度生長を有する非粘着性生成変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
好ましくは、形態学的突然変異細胞は、色彩変異体、湿潤性突然変異細胞、卓越した流動学的性質を有するものとして特徴づけられる変異体、乾燥−無感受性変異体、非胞子形成性変異体、又は非粘着性生成変異体、及び最とも好ましくは、高く枝分れした菌類変異体、制限されたコロニー性菌類変異体又は高く枝分れした制限されたコロニー性菌類変異体である。
もう１つの好ましい態様において、突然変異細胞は分泌突然変異細胞である。“分泌突然変異細胞”とは、１又は複数の分泌されるタンパク質のより高い生産量を生成する突然変異細胞として本明細書において定義される。分泌突然変異細胞は、ポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている検出方法を用い、そして同じ時間で、１又は複数の既知の分泌されるポリペプチドに対するその生産量を比較することによって同定され得る。ポリペプチドの検出方法は、特定の抗体、酵素生成物の形成又は酵素基質の消出を測定することによる酵素活性酵素基質を含む寒天プレート上の透明な領域、生物学的活性アッセイ；及び螢光活性化細胞の分類の使用を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は栄養要求突然変異細胞である。“栄養要求突然変異細胞”とは、１又は複数の必須代謝物を合成するその能力又は１又は複数の代謝物を代謝するその能力を失なっている突然変異細胞として本明細書において定義され、そしてその突然変異細胞によりポリペプチドの生成が変更化される。すべての栄養要求突然変異細胞は、必須代謝物の不在及び存在下で、推定上の変異体を増殖することによって標準のプレート技法を用いて同定され得る。栄養要求変異体は必須代謝物の不在下で増殖しないであろう。栄養要求変異体は、興味ある特定のポリペプチドを生成する変異体を選択的にスクリーンするために都合良く使用され得る。
より好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は１又は複数のアミノ酸、脂肪酸、有機酸、ピリミジン、プリン又は糖；及びより好ましくは５−アミノレブリン酸、ビオチン、グルコース、ラクトース又はマルトースを代謝し又は合成することができない栄養要求突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、条件突然変異細胞である。“条件突然変異細胞”は、その表現型が一定の条件下で単に観察される１又は複数の突然変異を含み、そしてその突然変異細胞によりポリペプチド又は代謝物の生成を変更する突然変異細胞として本明細書において定義される。条件突然変異は、実質的にすべての遺伝子、たとえば高分子合成、変性、及び超分子構造へのアセンブリーにおける段階を制御する遺伝子において生じ得る。条件突然変異細胞は、許容できる及び制限条件下で推定上の変異体を増殖することによって標準のプレート技法を用いて同定され得る。たとえば、窒素制限された条件下で所望しないタンパク質分解活性を生成しない変異体株が、窒素制限された条件下でタンパク質分解活性を生成する親株に比較される。追加の例は、アルカリ性pHで増殖しないが、しかし所望するポリペプチドの生成を高めることも又は低めることもできるアルカリ性pH感受性変異体である。さらなる例は、特定の増殖条件下で増殖し得ない変異体である。
より好ましい態様においては、条件突然変異細胞は、感温性、酸性pH感受性、アルカリ性pH感受性、抗生物質耐性、抗生物質感受性、トキシン耐性、トキシン感受性、ウィルス耐性、又はパラコート感受性細胞；及び最とも好ましくは、アルカリ性pH感受性突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、親細胞に対して変更された増殖速度を示す突然変異細胞である。“変更された増殖速度を示す突然変異細胞”とは、親細胞の倍加時間とは異なる倍加時間を有する突然変異細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、調節された発酵条件下で突然変異細胞及び親細胞の増殖を比較することによって同定され得る。そのような突然変異体細胞は、改良された発酵特徴、たとえば生産性を高めるためのより短い発酵時間、又は培養物の酸素要求を、調節するためのより長い発酵時間を有することができる。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、過剰発現介在の増殖阻害の除去をもたらす突然変異細胞である。“過剰発現介在の増殖阻害の除去をもたらす突然変異細胞”とは、ポリペプチド又は代謝物の高レベル生成を誘発する条件下で増殖される場合、所望するポリペプチド又は代謝物の過剰生成により、その増殖が阻害されない突然変異細胞として、本明細書において定義される。そのような変異体は、誘発性炭素源、たとえばマルトースを有するプレート上での標準のプレート技法により同定され得る。変異体はその誘発性炭素源上で良く増殖できるが、ところが親細胞はあまり増殖しない。そのような変異体は、ポリペプチドの過剰発現が細胞に対して毒性であることがいくつかの細胞において知られているので、有用である。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、低酸素条件を耐えることができる突然変異細胞である。“低酸素条件を耐えることができる突然変異細胞”とは、溶解された酸素濃度が低い増殖条件下で所望するポリペプチド又は代謝物を増殖し、そして生成することができる突然変異細胞として本明細書において定義される。そのような突然変異細胞は、高い細胞密度の生産性が酸素移行により低下する発酵に関して特に好都合である。低酸素耐性変異体は好ましくは、低レベルの酸素の存在下で固体又は液体培地において、親細胞に対する突然変異細胞を増殖することによって検出される。
より好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、約０〜約50％の飽和、好ましくは約０〜約40％の飽和、さらにより好ましくは約０〜約30％の飽和、より好ましくは約０〜約20％の飽和、最とも好ましくは約０〜約10％の飽和、及びさらに最とも好ましくは約０〜約５％の飽和の低い酸素条件を耐えることができる突然変異細胞である。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、シグナルトランスダクション経路突然変異細胞である。“シグナルトランスダクション経路突然変異細胞”とは、興味あるDNA配列によりコードされるポリペプチドの生成を変更する経路の１又は複数の遺伝子における突然変異を有する突然変異細胞として本明細書において定義される。用語“シグナルトランスダクション経路”とは、もう１つのシグナルポリペプチドの活性化又は不活性化のためにすべて必要とされるポリペプチドをコードする遺伝子のカスケードとして本明細書において定義される。その経路は、シグナルを検知し、そして遺伝子のカスケードを通して、シグナルがトランスダクトされ、そして１又は複数のポリペプチドの活性化又は不活性化を導びく。そのような変異体は、好ましくは、興味あるポリペプチドの生成を変更する所望する表現型に対して特異的である方法を用いて検出される。
より好ましい態様において、シグナルトランスダクション経路突然変異細胞は、グルコース輸送シグナルトランスダクション経路変異体又はpHシグナルトランスダクション経路変異体、さらにより好ましくは、pacCの活性化のために必要とされる遺伝子が破壊されている変異体、及び最とも好ましくはgluT遺伝子変異体又はpalB遺伝子変異体である。
もう１つの好ましい態様においては、特に所望する突然変異細胞は、プロモーターの転写活性化因子の変更された生成を示す突然変異細胞である。プロモーターの“転写活性化因子の変更された生成を示す突然変異細胞”とは、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列のプロモーターを“ターン−アップ”又は“ターン−ダウン”する転写活性化因子をコードする遺伝子における突然変異を有する突然変異細胞として本明細書において定義される。
細菌細胞におけるそのようなプロモーターの例は、バシラス  アミロリクエファシエンス  α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス  リケニホルミス  α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バシラス  リケニホルミス  ペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バシラス  ステアロサーモフィラス  マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（amyM）、バシラス  スブチリス  レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス  スブチリスxylA及びxylB遺伝子、Ｅ．コリlacオペロン、ストレプトミセス  コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、及び原核β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター（Villa-Kamaroffなど．，1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731）、及びtaCプロモーター（DeBoerなど．，1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25）である。さらなるプロモーターは、“Useful Proteins from recombinant bacteria”、Scientobic American,1980,242:74-94;及びJ.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New Yorkに記載される。
糸状菌細胞におけるそのようなプロモーターの例は、アスペルギラス  ニジュランス  アセトアミダーゼ、アスペルギラス  ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス  ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス  アワモリ又はアスペルギラス  ニガー  グルコアミラーゼ（glaA）、アスペルギラス  オリザエ  アルカリプロテアーゼ、アスペルギラス  オリザエ  TAKAアミラーゼ、アスペルギラス  オリザエ  トリオースリン酸イソメラーゼ、フサリウム  オキシスポラム  トリプシン−様プロテアーゼ（引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第4,288,627号に記載されるような）、リゾムコル  ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテアーゼ、リゾムコル  ミエヘイ  リパーゼをコードする遺伝子のプロモーター、及びそれらの突然変異、切断された、及びハイブリッドプロモーターである。糸状菌細胞における特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA２−tpi（アスペルギラス  ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス  オリザエ  トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）及びglaAプロモーターである。
酵母細胞におけるそのようなプロモーターの例は、サッカロミセス  セレビシアエ  エノラーゼ（ENO−１）遺伝子、サッカロミセス  セレビシアエ  ガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）、サッカロミセス  セレビシアエアルコール  デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2／GAP）、及びサッカロミセス  セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子をフードする遺伝子のプロモーターである。他の酵母プロモーターは、Romanosなど．，1992,Yeast 8:423-488に記載されている。
哺乳類細胞におけるそのようなプロモーターの例は、ウィルスプロモーター、たとえばシミアンウィルス40（SV40）、ラウス肉腫ウィルス（RSV）、アデノウィルス、及びウシ乳頭腫ウィルス（BPV）のプロモーターである。
より好ましい態様において、突然変異細胞は、TAKA,TAKA／NA２、フサリウム  オキシスポラム  トリプシン−様プロテアーゼ、又はグルコアミラーゼプロモーターの転写活性化因子の変更された生成を示す。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する突然変異細胞は、隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞である。“隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞”とは、mRNA合成の間、真のイントロンとして隠れたイントロンをもはや認識しないか及び誤ってスプライスする突然変異細胞として本明細書において定義される。隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞は、生物学的活性物質が生成されるよう、一次転写体からの誤った隠れた核プレーmRNAイントロンの切除又はスプライシングを阻止するために特に有用である。この情況下で、隠れたイントロンは、コード配列の実際的な部分であり、そして従って、真のイントロンではないが、しかしそれ自体誤って認識され、そしてmRNA合成の間、誤ってスプライスされ、そして親細胞によりプロセッシングされる。親細胞、たとえば菌類宿主細胞、特に糸状菌宿主細胞中への異種ポリペプチドをコードするDNA配列の導入は、コード配列の誤った又は正道をはずれたスプライシングのこのタイプをもたらす。隠れたイントロン−スプライシング−欠損突然変異細胞は、ポリペプチドの生成をほとんど又はまったく誘導しない隠れたイントロンを有することが知られているDNA配列によりコードされるポリペプチドの高められた生成をスクリーニングすることによって同定され得る。
もう１つの好ましい態様において、特に所望する変異体は、上記の複数の突然変異を含む変異体であり得る。
本発明の突然変異細胞の同定
本発明者は、親細胞における一定の遺伝子座が破壊される場合、その得られる突然変異細胞はポリペプチドの変更された生成を有することを発見した。上記のように、核酸構造体自体は、ポリペプチドの生成に対して効果を有することができる。たとえば、核酸構造体は、ポリペプチドをコードする核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成ることができる。さらに、核酸構造体は、プロモーター、転写活性化因子、及びリプレッサ、等を含むことができる。
核酸構造体自体が、本発明の突然変異細胞が生成されているかどうかを決定するために、生成され、発現され、合成され、又は分泌されるポリペプチドの量に対する効果を有する場合、下記のような遺伝子座を救援し、そして同じ遺伝子座に、効果を有さないもう１つの核酸構造体、たとえば選択マーカーを導入すべきである。同じ遺伝子座に他の核酸構造体を導入することによって生成される突然変異細胞が生成され、発現され、合成され又は分泌されるポリペプチドの量に対して効果を有する場合、元の突然変異細胞は本発明の突然変異細胞である。
挿入された核酸構造体による遺伝子座の救援及び標的化構造体の使用
本発明はさらに、同定された突然変異細胞から、（ｉ）核酸構造体、及び（ii）核酸構造体が組込まれているゲノムの遺伝子座の３’及び５’フランキング領域を単離し；そしてその遺伝子座の３’及び５’フランキング領域を同定することを含んで成る、挿入された核酸構造体により遺伝子座を救援するための方法にも関する。
核酸構造体及びフランキング領域は、当業界において良く知られている方法、たとえば制限酵素による切断及び続くＥ．コリの連結及び形質転換、逆PCR、ランダムプライムされたウォーキングPCR、又は標識された変異体のライブラリーのプローピングにより単離又は救援され得る。３’及び５’フランキング領域のいづれか又は両者を有する単離された核酸構造体は、“標的化構造体”として本明細書において定義される。
標的化構造体は、核酸構造体の組込み部位の上流及び／又は下流の100〜9,000bp、好ましくは200〜9,000bp、より好ましくは500〜7,000bp、さらにより好ましくは1,000〜7,000bp及び最とも好ましくは1,000〜3,000bp間を含む。
本発明の標的化構造体は、元の細胞において修飾されたポリペプチドに類似するか又は同一の又はそれとは完全に異なるポリペプチドの生成を変更するために異なった細胞中に導入され得る。他の細胞は、元の細胞と同じか又は異なった種又は異なった属のものであり得る。その元の細胞が菌類細胞である場合、他の細胞は好ましくは、菌類細胞である。その元の細胞が細菌細胞である場合、他の細胞は好ましくは細菌細胞である。元の細胞が哺乳類細胞である場合、他の細胞は好ましくは哺乳類細胞である。
細胞が異なった細胞である場合、標的化構造体の組込みは好ましくは、標的化構造体が得られる元の細胞の遺伝子座配列に対して相同であり、すなわち標的化配列及び細胞DNAが所望する突然変異を生成するために相同組換えを受けることができるよう同一であるか又は十分に類似する標的遺伝子座で生じる。従って、標的化構造体の配列は好ましくは、相同組込みが生じる細胞染色体DNAの予備選択された部位に対して相同である。しかしながら、標的遺伝子座で再挿入する標的化構造体の傾向は、相同組換え頻度は、酵母サッカロミセス  セレビシアエにおいてほとんど100％〜アスペルギラスにおいて１％ほどまでの範囲であるので、細胞に依存するであろうことが、当業者により理解されるであろう。標的化構造体は、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列内に存在しないが、しかしポリペプチドの生成の変更をもたらす非標的遺伝子座での非相同組換えにより組込むことができる。
好ましくは、標的遺伝子座は、その標的化構造体のフランキング配列と、40％以上の相同性、好ましくは60％以上の相同性、より好ましくは70％以上の相同性、さらにより好ましくは80％以上の相同性、及び最とも好ましくは90％以上の相同性を有するDNA配列を含む。
標的化構造体は、一回の交差又は置換が所望されるかどうかに依存して３’及び５’領域のいづれか又は両者を含むことができる。さらに、標的化構造体は、始め救援された遺伝子座で、細胞のゲノム中への元の核酸構造体の導入及び組込みの間に生じる、いづれかの誤った現象、たとえば転移、反復、欠失、又は挿入を正すために修飾され得る。
上記の標的化構造体は、すなわち制限酵素切断された線状ヌクレオチド配列として使用され得、又は環状化され、又は適切なベクター中に挿入され得る。たとえば、環状プラスミド又はDNAフラグメントは好ましくは、一本の標的化配列を用いる。線状プラスミド又はDNAフラグメントは好ましくは、２本の標的化配列を用いる。興味あるポリペプチドをコードするDNA配列を含んで成る細胞中への導入に基づいてのその標的化構造体、標的遺伝子座で、又は非標的遺伝子座で、しかし好ましくは、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列内に存在しない標的遺伝子座で細胞のゲノム中に組込む。標的遺伝子座は、興味あるDNA配列のものと同じ染色体又は同じ染色体外要素上に、又は異なった染色体又は異なった染色体要素上に存在することができる。その組込みが、突然変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチド又は代謝物の生成を変更する。好ましい態様において、その標的化構造体は選択マーカーを含む。
任意には、標的化構造体は、複数の別々のフラグメントとして細胞中に導入され得る。２つのフラグメントが使用されるその現象においては、フラグメントは、１つのフラグメントの３’末端及び他のフラグメントの５’末端でDNA配列相同性（オーバ−ラップ）を共有し、そして１つは第１の標的化配列を担持し、そして他は第２の標的化配列を担持する。細胞中への導入に基づいて、２つのフラグメントは、２つの元のフラグメント間のオーバ−ラップの領域を端に有する第１及び第２標的化配列を有する第１フラグメントを形成するために相同組換えを受けることができる。次に、その生成物フラグメントは、細胞標的配列との相同組換えのために適切な形で存在する。複数のフラグメントが、それらが細胞標的配列との相同組換えのために適切な生成物を究極的に形成するために、お互いとの相同組換えを受けるであろうよう、使用され、企画され得る。
細胞中への標的化構造体の導入に基づいて、その標的化構造体は、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含む細胞が適切な選択マーカーの存在下でその細胞を培養することによって選択され得る性質を有する増幅できる選択マーカー遺伝子の包含によりさらに増幅され得る。
特定の態様において、その標的化構造体は、SplＩにより線状化されたpDSY109,HpaＩにより線状化されたpDSY112,AsnＩ／PvuＩにより線状化されたpMT1936,NdeＩにより線状化されたpDSY138,AsnＩ／PvuＩにより線状化されたpDSY162,BglIIにより線状化されたp4-8.1,BglIIにより線状化されたp4-8.1,NarＩにより線状化されたp7-14.1,BglIIにより線状化されたpSMO717,BglIIにより線状化されたpSMO321,NdeＩにより線状化されたpHowB571又はNdeＩにより線状化されたpSMO810である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY109である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY112である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpMT1936である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY138である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY162である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY163である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpDSY141である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO1204である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMOH603である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はp4-8.1である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はp7-14.1である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpHB220である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO717である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO321である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpHowB571である。
最とも好ましい態様において、核酸構造体はpSMO810である。
好ましい態様において、１又は複数の標的化構造体は、標的遺伝子座中に導入される。もう１つの好ましい態様において、個々の標的化構造体は、異なったポリペプチド、又は異なった代謝物、又はそれらの組合せの生成を変更し、又は異なったポリペプチド、又は異なった代謝物又はそれらの組合せの生成を変更する異なった表現型をもたらす。もう１つの態様において、複数の標的化構造体は、標的遺伝子座中に導入される場合、ポリペプチド又は代謝物の生成を変更するために付加的に又は相剰的に作用する。
突然変異細胞からの所望するポリペプチド又は代謝物の生成方法
本発明はさらに、宿主細胞として所望する表現型を有する突然変異細胞に関する。所望するポリペプチド又は代謝物の高められた生成のために選択された突然変異細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチド又は代謝物の生成のために適切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、ポリペプチド又は代謝物の発現及び／又は単離を可能にする適切な培地において、及び条件下で実施される実験室又は産業発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給物−バッチ、又は固体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、当業界において知られている方法（たとえば、細菌及び酵母についての引用文献；Bennett,J.W.and LaSure,L.,editors,More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991を参照のこと）を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において生じる。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開されている組成（たとえば、American Type Culture Collectionのカタログにおけるような）に従って調製され得る。ポリペプチド又は代謝物が栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチド又は代謝物が分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。
ポリペプチド及び代謝物は、ポリペプチド及び代謝物に対して特異的である、当業界において知られている方法、たとえば前記記載された方法及び例に記載される方法を用いて検出され得る。
得られるポリペプチド又は代謝物は、当業界において知られている方法により回収され得る。たとえば、ポリペプチド又は代謝物は、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿方法（但し、それらだけには限定されない）により栄養培地から回収され得る。
本発明のポリペプチド及び代謝物は、当業界において知られている種々の方法、たとえばクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（たとえば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（たとえば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（たとえば、Protein Puridication,J.C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989を参照のこと）（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る。
実施例
種々の構築物を作り、本発明の方法を実施する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために下記の実施例を記載するが、これらの実施例は本発明者らが発明と見なす範囲を限定しない。特記しない限り、部は重量部であり、温度はセ氏であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。使用した数（例えば、ＤＮＡ配列の長さ、分子量、量、特定の成分、およびその他）に関する正確度を保証しようと努力されたが、多少の変動は説明されるであろう。
実施例１：菌株および材料
出発菌株は下記の通りである：ｐｙｒＧ−マイナスのアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）HowB425、pyrG-マイナスのアスペルギルス・オリゼHowB101、アスペルギルス・オリゼJaL250、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）JRoy3（pyrG△）、大腸菌（E.coli）DH5α（GIBCO-BRL、マリイランド州ガイザーバーグ）、および大腸菌HB101（GIBCO-BRL、マリイランド州ガイザーバーグ）。
ＰＤＡプレートは３９ｇ／ｌのジャガイモデキストロース寒天（Difco）を含有し、特記しない限り、pyrG栄養要求性のための１０ｍＭのウリジンが補充されていた。
ＭＹ２５培地、ｐＨ６．５は、１リットル当たり、２５ｇのマルトース、２．０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇのｋＨ2ＰＯ4、２．０ｇのクエン酸、１０ｇの酵母エキス、２．０ｇのＫ2ＳＯ4、２．０ｇの尿素、および０．５ｍｌの微量金属溶液から構成されていた。ＭＹ２５震盪フラスコの培地を、マイクロタイター成長実験において使用するためにガラス蒸留水で１：１００または１：１０００に希釈した（ＭＹ２５／１００またはＭＹ２５／１０００）。培養物を３４℃において成長させた。
２×ＭＹ塩ｐＨ６．５溶液は、１リットル当たり、４ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、４ｇのＫ2ＳＯ4、２０ｇのＫＨ2ＰＯ4、４ｇのクエン酸、１ｍｌの微量金属、および２ｍｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（１００ｇ／ｌ貯蔵液）から構成されていた。
最小培地の形質転換プレートは、１リットル当たり、６ｇのＮａＮＯ3、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｍｌの微量金属溶液、１ｇのグルコース、５００ｍｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３４２．３ｇのスクロースおよび２０ｇのノーブル（Noble）寒天／ｌ（ｐＨ６．５）から構成されていた。最小培地の転移プレート（ｐＨ６．５）は、１リットル当たり、６ｇのＮａＮＯ3、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｍｌの微量元素、１ｇのグルコース、５００ｍｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および２０ｇのノーブル寒天から構成されていた。
微量金属溶液（１０００×）は、１リットル当たり、２２ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１１ｇのＨ3ＢＯ3、５ｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、５ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．６ｇのＣｏＣｌ2・５Ｈ2Ｏ、１．６ｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24、および５０ｇのＮａ4ＥＤＴＡから構成されていた。
ＣＯＶＥプレートは、１リットル当たり、３４３．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍのアセトアミド、１０ｍｌの３ＭのＣｓＣｌ、および２５ｇのノーブル寒天から構成されていた。ＣＯＶＥ塩（５０×）溶液は、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4、および５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液から構成されていた。ＣＯＶＥ微量金属溶液は下記の成分から構成されていた（／ｌ）：０．０４ｇのＮａＢ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．０４０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．７０ｇのＦｅＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．８０ｇのＮａ2ＭｏＯ2・２Ｈ2Ｏ、およびＺｎＳＯ4。
ＹＥＧ培地は、１リットル当たり、５ｇの酵母エキスおよび２０ｇのデキストロースから構成されていた。
ＣＭ−１寒天平板、ｐＨ６．５は、１リットル当たり、０．２５ｇのＮａＣｌ、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．９ｇのＫ2ＨＰＯ4、３．６ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．１ｍｌの微量金属溶液、３０ｇのＢａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ）、ｐＨ６．５、１１ｍｌの１０％の尿素、および６７ｍｌの３０％のマルトースから構成されていた。
ＣＤ培地は、１リットル当たり、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇのＫ2ＳＯ4、１５ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．２５ｍｌの微量金属溶液、０．７ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇのベータ−シクロデキストリン（Sigma C-4767）、３ｍｌの５０％の尿素、および２ｍｌの１５％のＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏから構成されていた。
G1-gly培地は、１リットル当たり、１８ｇの酵母エキス（Difco）、８０ｇの７５％のグリセロール、および０．５ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏから構成されていた。
ＯＬ−１培地（ｐＨ７．０）は、１リットル当たり、１５ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇのＫ2ＳＯ4、０．２５ｍｌの微量金属溶液、０．３ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（別々にオートクレーブ処理された）、２ｇのディフコ（Difco）酵母エキス（Difco）、０．５ｇの尿素（別々にオートクレーブ処理された）、および１０ｇのグルコースから構成されていた。
ＯＬ−６培地（ｐＨ７．０）は、１リットル当たり、１５ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏ、１ｇのＫ2ＳＯ4、０．２５ｍｌの微量金属溶液、０．３ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（別々にオートクレーブ処理された）、２ｇのディフコ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、３ｇの尿素（別々にオートクレーブ処理された）、および６０ｇのグルコースから構成されていた。
ＹＰＭ培地を５００ｍｌの水中に溶解した１０ｇのバクトペプトンおよび５ｇの酵母エキスから構成し、オートクレーブ処理し、これに５０ｍｌの滅菌した２０％のマルトース溶液を添加した。
MTBCDUYは、１リットル当たり、０．３ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｇのＫ2ＳＯ4、５ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．０１３ｇの尿素、０．０１ｇの酵母エキス、０．１ｇのマルトース、４．８８ｇのウリジン、および０．２５ｍｌの微量金属溶液１（ｐＨ６．５）から構成されていた。
４×MTBCDUYは、１リットル当たり、０．３ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｇのＫ2ＳＯ4、５ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．０５２ｇの尿素、０．０４ｇの酵母エキス、０．４ｇのマルトース、４．８８ｇのウリジン、および０．２５ｍｌの微量金属溶液１から構成されていた。
MDU1Bは、１リットル当たり、４５ｇのマルトデキストリンＭＤ０１、１．０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．０ｇのＮａＣｌ、２．０ｇのＫ2ＳＯ4、１２．０ｇのＫＨ2ＰＯ4、７．０ｇの酵母エキス、０．５ｍｌの微量金属溶液、および０．１ｍｌのプルロン酸から構成されていた。微量金属溶液は、１３．９ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．４５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ2、６．８ｇのＺｎＣｌ2、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、および３ｇのクエン酸から成っていた。震盪フラスコの培地のｐＨを、オートクレーブ処理の前に、５．０に調節した。
１／５MDU2BPは、１リットル当たり、９ｇのマルトース、０．２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｇのＫ2ＳＯ4、０．２ｇのＮａＣｌ、２．４ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇの尿素、１．４ｇの酵母エキス、および１．０ｍｌの微量金属溶液１から構成されていた。
微量金属溶液１は、１リットル当たり、１３．８ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１４．３ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、および３．０ｇのクエン酸から構成されていた。
ＹＰＧプレートは、１リットル当たり、４．０ｇの酵母エキス、１．０ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１５．０ｇのデキストロース、および２０．０ｇの寒天から構成されていた。
実施例２：アスペルギルス・オリゼHowB430の構築
フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）からのリパーゼ遺伝子（LIPOLASETM遺伝子、Novo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバード）を含有するように、アスペルギルス・オリゼHowB430を構築した。
後述するように、TAKA/NA2-tpiリーダーハイブリッドプロモーター、フミコラ・ラヌギノサからのリパーゼ遺伝子、ＡＭＧターミネーター、および選択可能なマーカーとして全長のアスペルギルス・ニヅランス（Aspergillus nidulans）のamdS遺伝子を含有するようにpBANe8を構築した。
ＰＣＲにより、下記のプライマー１および２を使用してpToC90（Christensen et al.、1988、Biotechnology 6:1419-1422）の完全なａｍｄＳ遺伝子をフランクするＮｓｉＩ部位を挿入し、そして下記のプライマー３および４を使用してpJaL292（第１図）のNA2-tpiリーダーハイブリッドプロモーターの５’末端にＥｃｏＲＩ部位および３’末端にＳｗａＩ部位を挿入した。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して、プライマーを合成した。
0004436934.tif 000002
鋳型としてほぼ０．２μｇのpToC90またはpJaL292を使用して、増幅反応物（１００μｌ）を調製した。各反応物は下記の成分を含有した：０．２μｇのプラスミドＤＮＡ、４８．４ｐｍｏｌの前方プライマー、４８．４ｐｍｏｌの逆プライマー、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp.、ニュージャージイ州ブランチバーグ）。反応物を次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー（Ericomp Thermal Cycler）中でインキュベートした：１サイクル、９５℃、５分間、次いで３０サイクル、各々９５℃、１分間、５５℃、１分間、および７２℃、２分間。
ＰＣＲ生成物を１％のアガロースゲル上で電気泳動させて、２．７ｋｂのａｍｄＳフラグメントおよび０．６ｋｇのＮＡ２−ｔｐｉフラグメントの存在を確証した。
引き続いて、製造業者の使用説明書に従いＴＡクローニングキット（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、ＰＣＲ生成物をｐＣＲＩＩの中にサブクローニングした。製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州チャッツワース）を使用して、形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、プラスミドＤＮＡをＮｓｉＩまたはＥｃｏＲＩ／ＳｗａＩで制限消化し、次いでアガロース電気泳動により、ＮｓｉＩのａｍｄＳフラグメントおよびＳｗａＩ／ＥｃｏＲＩのＮＡ２−ｔｐｉフラグメントについての正しい大きさ、それぞれ、２．７ｋｂおよび０．６ｋｂのフラグメントの存在を確証することによって、形質転換体をスクリーニングした。ＰＣＲ生成物を確証するために、生成物をアプライド・バイオシステムスの３７３Ａ型自動化ＤＮＡ配列決定装置（Applied Biosystems,Inc.、米国カリフォルニア州フォスターシティー）により双方の鎖について色素ターミネーター化学を用いるプライマーウォーキング技術（Giesecke et al.、1992、Journal of Virol.Methods 38:47-60）に従いＭ１３逆（−４８）およびＭ１３前方（−２０）プライマー（New England Biolabs、マサチュセッツ州ベバーリイ）および配列決定するＤＮＡに対してユニークなプライマーを使用して配列決定した。次いで正しい形質転換体からのプラスミドを、プラスミドの消化に使用した制限酵素で消化し、１％のアガロースゲル上で分離し、製造業者の使用説明書に従いＦＭＣのSpinBindキット（ＦＭＣ、メイン州ロックランド）を使用して精製した。
ｐＫＳ６（第２図）は、ＴＡＫＡプロモーター、ポリリンカー、ＡＭＧターミネーター、およびアスペルギルス・ニヅランスのｐｙｒＧ遺伝子を含有し、これをＥｃｏＲＩおよびＳｗａＩで消化して、TAKAプロモーターの一部分を除去した。この領域をNA2-tpiPCR生成物で置換して、pBANe13を生成した（第３図）。
pBANe13をＮｓｉＩで消化して、アスペルギルス・ニヅランスのpyrG遺伝子を除去した。次いで、この領域を前述の全長のａｍｄＳ遺伝子のＰＣＲ生成物で置換して、ｐＢＡＮｅ６（第４図）。
ＰＣＲにより、下記のプライマー５および６を使用して、pMHan37の全長のフミコラ・ラヌギノサのリパーゼ遺伝子上にＳｗａＩおよびＰａｃＩフランキング部位を挿入した。前述したように、プライマー５および６を合成した。
0004436934.tif 000003
増幅反応物（１００μｌ）は下記の成分を含有した：０．２μｇのｐＭＨａｎ３７、４８．４ｐｍｏｌのプライマー５、４８．４ｐｍｏｌのプライマー６、１ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、９５℃、５分間、次いで３０サイクル、各々９５℃、１分間、５５℃、１分間、および７２℃、２分間。２μｌの反応物をアガロースゲル上で電気泳動させて、ほぼ９００ｂｐのリパーゼ遺伝子産物の増幅を確証した。
次いで、ＰＣＲ増幅されたリパーゼ遺伝子産物をＴＡクローニングキットを使用してｐＣＲＩＩの中にサブクローニングした。ＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキットを使用して、形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、プラスミドＤＮＡをＳｗａＩ／ＰａｃＩで制限消化し、前述の方法に従いＤＮＡを配列決定してＰＣＲ生成物を確証することによって、形質転換体をスクリーニングした。
リパーゼ遺伝子をＳｗａＩおよびＰａｃＩで消化してｐＣＲＩＩプラスミドから切除し、引き続いてＳｗａＩ／ＰａｃＩ消化したｐＢＡＮｅ６の中にサブクローニングしてpBANe8（第６図）を生産した。
ｐＢＡＮｅ８をＰｍｅＩで消化し、そしてＮＡ２−ｔｐｉプロモーター、フミコラ・ラヌギノサからのリパーゼ遺伝子、およびＡＭＧターミネーターを含有する直鎖状ＰｍｅＩフラグメントを調製用アガロース電気泳動により、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩−１ｍＭ）のＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液を使用して単離した。
下記の手順に従いアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２５を直鎖状ＰｍｅＩフラグメントで形質転換することによって、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０を発生させた。
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２５を１００ｍｌの１％の酵母エキス−２％のペプトン−１％のグルコース中で３２℃において１６〜１８時間撹拌しながら１５０ｒｐｍで成長させた。フィルター上にほぼ１０ｍｌが残留するまで、０．４５μｍのフィルターを通す濾過により菌糸体を回収し、２５ｍｌの１．０〜１．２ＭのＭｇＳＯ4−１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５で洗浄し、前述したように濾過し、前述したように１０ｍｌが残留するまで再び洗浄し、次いで１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で１．２ＭのＭｇＳＯ4−１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５（０．４５μｍで濾過した）中の１０ｍｌの５ｍｇ／ｍｌのNOVOZYM234TM（Novo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバード）の中に再懸濁させた。懸濁液をおだやかに震盪しながら５０ｒｐｍでほぼ１時間３７℃においてインキュベートして、プロトプラストを発生させた。１０ｍｌの体積のプロトプラスト／菌糸体の調製物を３０ｍｌのコレックス（Ｃｏｒｅｘ）遠心管に添加し、５ｍｌの０．６Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５をオーバーレイし、揺動バケットローター中の３６００×ｇで１５分間遠心してプロトプラストを回収した。プロトプラストを緩衝液の界面からパスツールピペットで回収した。次いでプロトプラストをＳＴＣの中で２×１０7プロトプラスト／ｍｌの最終濃度に再懸濁させた。
２×１０7プロトプラスト／ｍｌの濃度においてプロトプラストを使用して、ａｍｄＳ選択のためのアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２５の形質転換を実施した。１０μｇのＤＮＡを１００μｌのプロトプラストに添加した。次いで２５０μｌのＰＥＧ溶液（６０％のＰＥＧ４０００−１０ｍＭのＣａＣｌ2−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を添加し、そして混合物を３７℃において３０分間配置した。３ｍｌの１Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＣａＣｌ2−１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５（ＳＴＣ）を添加し、ａｍｄＳについて選択するために、この混合物をＣｏｖｅプレート上にプレートした。プレートを３４℃において７〜１０日間インキュベートした。形質転換体を同一培地のプレートに移し、３７℃において３〜５日間インキュベートした。同一条件下にスクロースを含まない同一培地の同一プレートを使用して、胞子をストリークし、隔離されたコロニーを取り上げることによって、形質転換体を精製した。
実施例３：アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２７の構築
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２５をｐＭＨａｎ３７およびｐＳＯ２（第７図）で共形質転換して、ＴＡＫＡプロモーターの背後にリパーゼ遺伝子を含有するアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２７を構築した。
ｐＳＯ２（第７図）をアスペルギルス・オリゼ１５６０のゲノムのライブラリーから構築した。まずアスペルギルス・オリゼ１５６０のゲノムのＤＮＡをＳａｕ３Ａ（New England Biolabs、マサチュセッツ州ベバーリイ）で部分的に消化することによって、アスペルギルス・オリゼ１５６０のゲノムのライブラリーを構築した。製造業者により推奨される条件を使用して、４単位のＳａｕ３Ａを使用して１０μｇのアスペルギルス・オリゼ１５６０のゲノムのＤＮＡを消化した。反応を６５℃において実施し、試料を５分の間隔で（０から５０分まで）採った。反応物を氷上に配置し、ＥＤＴＡを１０ｍＭに添加することによって反応を停止させた。次いでこれらの消化物を臭化エチジウムを含む１％のアガロースゲル上で実施し、３ｋｂ〜９ｋｂのＤＮＡを含有するゲルの領域を切除した。次いで、製造業者（New England Biolabs、マサチュセッツ州ベバーリイ）により提供されるプロトコールに従いベータ−アガロースＩを使用して、ＤＮＡをゲルスライスから精製した。次いで、製造業者の使用説明書に従い（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）製造業者により推奨される条件下に１６℃において一夜、大きさで選択したＤＮＡをEMBL4アームの中に結合した。製造業者のプロトコールに従いGigapack IIパッケージングキット（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）を使用して、結合反応物をパッケージし、力価決定した。合計１６，０００の組換えプラークが得られ、そしてライブラリーを製造業者により提供されるプロトコールに従い増幅した。
ＥＭＢＬ４アームとともに提供されるプロトコールに記載されているように、ゲノムのライブラリーを適当に希釈して７０００プラーク／１５０ｍｍのペトリプレートを得た。標準的プロトコール（Sambrook et al.、1989、前掲）に従い、プラークをHybond-Nプラス円形フィルター（Amersham、オハイオ州クレブランド）にリフトした。フィルターをＵＶ架橋により固定し、４２℃において前ハイブリダイゼーションした（５×ＳＳＰＥ、３５％のホルムアミド）。ランダムプライムＤＮＡ標識キット（Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポリス）を使用して32Ｐで標識化されたアスペルギルス・ニガーのｐｙｒＧ遺伝子から成る５００ｂｐのフラグメントで、ゲノムのライブラリーを低いストリンジェンシイ（３５％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、４２℃）においてプローブした。３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを１つのファージから単離し、ｐＵＣ１１８クローニングベクターの中にサブクローニングしてｐＳＯ２を生成した。
実施例２に記載する手順に従いアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２５の共形質転換を実施したが、ただし選択を最小培地の形質転換プレート上で行った。形質転換体を最小培地の形質転換プレートに移し、３７℃において３〜５日間インキュベートした。次いで同一培地の同一転移プレートを使用して、胞子をストリークし、隔離されたコロニーを取り上げることによって、形質転換体を精製した。
実施例４：プラスミドｐＳＯ１２２、ｐＤＳＹ８１およびｐＤＳＹ８２の構築
後述するように、アスペルギルス・オリゼのｐｙｒＧ遺伝子の１．５ｋｂのフラグメントを含有するｐＳＯ１２２を構築した。
ＰＣＲにより、下に示すプライマー７および８を使用して、ｐＳＯ２のｐｙｒＧ遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を導入することによって、ｐＳＯ１２２を発生させた。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムスの３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により、プライマー７および８を合成した。
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増幅反応物（５０μｌ）は下記の成分を含有した：２ｎｇのｐＳＯ２、４８．４ｐｍｏｌの前方プライマー、４８．４ｐｍｏｌの逆プライマー、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、および２．５ＵのTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp.、ニュージャージイ州ブランチバーグ）。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、９５℃、５分間、次いで３０サイクル、各々９５℃、１分間、５５℃、１分間、および７２℃、２分間。ＰＣＲ生成物を１％のアガロースゲル上の電気泳動により単離した。
単離したＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩで消化し、pBluescript SK-（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）のＢａｍＨＩ部位の中にクローニングしてｐＳＯ１２２を生成した（第８図）。実施例２に記載するようにｐｙｒＧフラグメントの残部はアスペルギルス・オリゼHowB430から欠失されたので、アスペルギルス・オリゼのHowB430およびpSO122のゲノムの間の唯一の相同性はpyrGインサートの５’末端の中に存在した。
ゲノム中のこの相同領域にターゲッティングする頻度を減少するために、ｐＳＯ１２２は２つのＢａｍＨＩ部位を含有するので、ＢａｍＨＩ部位の１つが破壊された、ｐＳＯ１２２、ｐＤＳＹ８１およびｐＤＳＹ８２の２つの誘導体（第８図）を構築した。ｐＳＯ１２２をＢａｍＨＩで部分的に消化し、５’オーバーハングの中にクレノー断片を充填し、結合によりプラスミドを閉じ、引き続いて大腸菌ＤＨ５αの中に形質転換することによって、プラスミドｐＤＳＹ８１およびｐＤＳＹ８２を構築した（Sambrook et al.、1989、前掲）。次いで、QIAwell-8プラスミドキットを使用して、形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで制限消化して、ＢａｍＨＩ部位の１つが破壊されたかどうかを決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。ＢａｍＨＩ部位の１つが破壊されたプラスミドをＮｓｉＩ／ＢａｍＨＩで消化して、どのＢａｍＨＩ部位が破壊したかを決定した。
実施例５：ｐＳＯ１２２、ｐＤＳＹ８１またはｐＤＳＹ８２を使用するアスペルギルス・オリゼHowB430の形質転換
実施例２に記載されているように、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のプロトプラストを調製した。ＤＮＡの５〜１５μｌのアリコート（円形ｐＳＯ１２２、４〜１２ＵのＥｃｏＲＩで線状化したｐＤＳＹ８１、または１５ＵのＢａｍＨＩで線状化したｐＤＳＹ８２）を、１４ｍｌのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）ポリプロピレン管の中の０．１ｍｌのプロトプラストに２×１０7プロトプラスト／ｍｌの濃度で添加し、次いで２５０μｌの６０％のＰＥＧ４０００−１０ｍＭのＣａＣｌ2−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７を添加し、おだやかに混合し、３７℃において３０分間インキュベートした。５μｇの円形ｐＳＯ１２２、６μｇの線状化ｐＤＳＹ８１、または６μｇの線状化ｐＤＳＹ８２を使用して、形質転換を実施した。次いで３ｍｌのＳＰＴＣ（１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＣａＣｌ2−１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８）を添加し、懸濁液をおだやかに混合した。懸濁液を１２ｍｌの溶融オーバーレイ寒天（１×ＣＯＶＥ塩、１％のＮＺアミン、０．８Ｍのスクロース、０．６％のノーブル寒天）または３ｍｌのＳＴＣ培地と混合し、懸濁液を最小培地のプレート上に注いだ。プレートを３７℃において３〜５日間インキュベートした。
円形ｐＳＯ１２２の形質転換の形質転換頻度は、約１００〜２００形質転換体／μｇの範囲であった。アスペルギルス・オリゼHowB430の約１２０，０００ＤＮＡ標識化形質転換体のライブラリーが得られた。
ＥｃｏＲＩ  ＲＥＭＩ  ｐＤＳＹ８１の形質転換の形質転換頻度は、約６０〜１００形質転換体／μｇの範囲であった。アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０の約２８，０００ＤＮＡ標識化形質転換体のＥｃｏＲＩ  ＲＥＭＩライブラリーが発生した。
ＢａｍＨＩ  ＲＥＭＩ  ｐＤＳＹ８２の形質転換の形質転換頻度は、約８０〜１１０形質転換体／μｇの範囲であった。アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０の約２７，０００ＤＮＡ標識化形質転換体のＢａｍＨＩ  ＲＥＭＩライブラリーが得られた。
また、前述したように、ｐＤＳＹ８１を使用して、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のＨｉｎｄＩＩおよびＳａｌＩ  ＲＥＭＩライブラリーを調製した。
ＨｉｎｄＩＩ  ＲＥＭＩ  ｐＤＳＹ８１の形質転換の形質転換頻度は、約８０〜１２０／μｇの範囲であった。アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０の約３５，０００ＤＮＡ標識化形質転換体のＨｉｎｄＩＩ  ＲＥＭＩライブラリーが発生した。
ＳａｌＩ  ＲＥＭＩ  ｐＤＳＹ８１の形質転換の形質転換頻度は、約８０〜１２０／μｇの範囲であった。アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０の約２５，０００ＤＮＡ標識化形質転換体のＳａｌＩ  ＲＥＭＩライブラリーが発生した。
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０標識化突然変異株のライブラリーのプールをｐＳＯ１２２について「ｈ」；ＥｃｏＲＩで消化し、引き続いてＥｃｏＲＩの存在において形質転換したｐＤＳＹ８１について「ｅ」；ＢａｍＨＩで消化し、引き続いてＢａｍＨＩの存在において形質転換したｐＤＳＹ８２について「ｂ」；ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、引き続いてＨｉｎｄＩＩＩの存在において形質転換したｐＤＳＹ８１について「ｈＩＩＩ」；そしてＳａｌＩで消化し、引き続いてＳａｌＩの存在において形質転換したｐＤＳＹ８１について「ｓ」と表示する。１２３「ｈ」プール、２８「ｅ」プール、２３「ｃ」プール、５５「ｈＩＩＩ」プール、および２５「ｓ」プールが存在した。
前述のライブラリーを約１０００形質転換体のグループにプールし、−８０℃において１０％のグリセロールの中に貯蔵した。
実施例６：「ＲＥＭＩ」アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０形質転換体における組込み事象の特性決定
下記の手順に従い、実施例５に記載する２６のＥｃｏＲＩ  ＲＥＭＩ形質転換体（「ｅ」プール）から、ゲノムＤＮＡを単離した。各形質転換体を小さいペトリプレート中の５ｍｌのＹＥＧ培地中で３７℃において２４時間成長させた。次いでワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙Ｎｏ．１（Whatman、英国スプリングフィールドミル）を通して濾過することによって、菌糸体を各培養物から収集し、１．７ｍｌの遠心管の中に移した。菌糸体調製物をドライアイス中で凍結させ、SpeedVac（Savant Instruments、Inc.、ニューヨーク州ファーミングデイル）中で一夜室温において乾燥した。凍結した菌糸体調製物を予備のスパチュラで微細粉末に粉砕し、次いで粉砕した菌糸体を０．５ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１％のトリトン−Ｘ１００、５０ｍＭのグアニジン、ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ）の中に再懸濁させた。ＲＮアーゼを各調製物に２０μｇ／ｍｌの最終濃度に添加し、調製物を３７℃において３０分間インキュベートした。次いでプロテアーゼＫを各調製物に０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に添加し、調製物を５０℃において１時間インキュベートした。調製物を１３，０００×ｇにおいて１５分間遠心し、上清をＱＩＡｐｒｅｐ−８−ウェルのストリップ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州テャツワース）に適用した。製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州テャツワース）により供給されたＰＢの０．５ｍｌおよびＰＥの０．７５ｍｌで、ウェルを１回洗浄した。各ウェルから過剰のＰＥを形成し、２００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）の中にＤＮＡをウェルから溶離した。
Sambrook et al.、1989、前掲に記載されている手順に従うサザンハイブリダイゼーションにより、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化してＥｃｏＲＩ部位の中への組込みが起こったかどうかを決定するか、あるいはＳｎａＢＩで消化して組込み事象がランダムであるか否かを決定した。製造業者の使用説明書に従いジェニウス・キット（Genius Kit）を使用してジオキシゲニンで標識化したｐＳＯ１２２（第８図）から得られた１．６ｋｂのＮｈｅＩ  ｐｙｒＧフラグメントで、消化物のサザンブロットをプローブした。ブロットを２時間前ハイブリダイゼーションし、ＤＩＧイージイ（Ｅａｓｙ）Ｈｙｂ中で４２℃において一夜ハイブリダイゼーションした。製造業者が推奨するように、ブロットを洗浄し、プロセシングした。
サザンブロットにより、２６の形質転換体のうちの１３において、ＥｃｏＲＩ線状化ｐＤＳＹ８１はゲノム中のＥｃｏＲＩ部位の中に組込まれ、そして組込み事象の分布はランダムであることが証明された。２６の形質転換体のうちの２０において、プラスミドの単一のコピーのみが組込まれたが、形質転換体のうちの６において、少なくとも２つのコピーが同一遺伝子座に組込まれた。ＥｃｏＲＩ部位における組込みに向かうバイアス（５０％の）がＲＥＭＩのためであるかどうかを決定するために、ゲノムＤＮＡを前述したように１６アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２５形質転換体（ここでＥｃｏＲＩ酵素は実施例５に記載されている手順に従いＥｃｏＲＩ線状化ｐＤＳＹ８１で形質転換する前に熱不活性化されている）から単離し、前述したようにサザンブロット分析に付した。これらの形質転換体のサザン分析において、形質転換体のいずれにおいても、プラスミドはゲノムの中のＥｃｏＲＩ部位に組込まれなかったことが証明された。
実施例７：リパーゼの発現のスクリーニング
実施例５に記載されているアスペルギルス・オリゼHowB430標識化突然変異株のライブラリー「ｈ」、「ｅ」、および「ｂ」プールをリパーゼの発現についてアッセイした。
９６ウェルのプレートのスクリーンについて、等しい体積の無菌の水および２×ＭＹ塩ｐＨ６．５溶液から調製された希釈剤で、ＭＹ２５培地を１０００倍に希釈した。２４ウェルのプレートの方法について、等しい体積の無菌の水および２×ＭＹ塩ｐＨ６．５溶液から調製された希釈剤で、ＭＹ２５培地を１００倍に希釈した。
一次的９６ウェルのプレートのスクリーンは、５０μｌの培地ウェルの中に分配したとき、平均１胞子／ウェルが接種されるように、明確なプールからの胞子をＭＹ２５／１０００に希釈することを含んだ。接種後、９６ウェルのプレートを静的条件下に３４℃において７日間成長させた。次いで後述するように、培養物をリパーゼ活性についてアッセイした。ＭＹ２５／１００を含有する２４ウェルのプレートの中に問題の突然変異株を直接接種し、３７℃において７日間成長させた。次いで後述するように、培養物をリパーゼ活性についてアッセイした。次いで、問題の突然変異株をＣＯＶＥプレート上にプレートして胞子を生産し、ＰＤＡプレート上に広げて単一のコロニーを生産し、次いで各分離株からの４つの単一のコロニーを前述の２４ウェルのプレートの方法で試験した。
使用直前にＭＣ緩衝液（４ｍＭのＣａＣｌ2−１００ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．５）の中にｎ−ニトロフェニルブチレート貯蔵基質（２１μｌのｎ−ニトロフェニルブチレート／ｍｌのＤＭＳＯ）を１：５０に希釈することによって、リパーゼアッセイ基質を調製した。４０ＬＵ／ｍｌの０．０２％のアルファ−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）洗浄剤を含有するＭＣ緩衝液を含有する、標準的リパーゼ（ＬＩＰＬＡＳＥTM、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ、デンマーク国バグスバード）を調製した。使用するまで、標準を４℃において貯蔵した。使用直前に、標準的リパーゼをＭＣ緩衝液中で１／４０に希釈した。０．０２％のＡＯＳを含有するＭＣ緩衝液中のブロス試料を希釈し、２０μｌのアリコートを９６ウェルのプレートの各ウェルに分配し、次いで２００μｌの希釈した基質を分配した。プレートリーダーを使用して、ほぼ１分の間隔において取った２つの読みの差として、４０５ｎｍにおける吸収を記録した。
それ以上の評価のために、９６ウェルのスクリーンおよび引き続く２４ウェルのスクリーンの結果はｐＳＯ１２２形質転換体からの５３の形質転換体およびｐＤＳＹ８１またはｐＤＳＹ８２のＲＥＭＩ形質転換体からの４４の形質転換体を同定した。これらの同定された形質転換体は、対照の株アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２７またはアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０よりも高いレベルのリパーゼを生産した。
実施例８：震盪フラスコおよび発酵の評価
次いで、実施例７に記載する最高のリパーゼ産生ＤＮＡ標識化突然変異株をＣＯＶＥプレート上に配置して、震盪フラスコおよび発酵の評価のための胞子を生産した。
３００〜５００μｌの胞子懸濁液（０．０２％のツイーン８０＋ＣＯＶＥプレートからの胞子）を１２５ｍｌの震盪フラスコ中の２５ｍｌのＭＹ２５培地の中にｐＨ６．５において接種することによって、震盪フラスコの評価を実施した。震盪フラスコを３４℃において２００ｒｐｍで３日間インキュベートした。試料を第２日および第３日に採り、リパーゼ活性を実施例７に記載するように測定した。
ヌトリオース（Ｎｕｔｒｉｏｓｅ）、酵母エキス、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、クエン酸、Ｋ2ＳＯ4、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ、および微量金属溶液から構成された培地を含有する２リットルの実験室用発酵槽中で、同一ＤＮＡ標識化突然変異株を３４℃、ｐＨ７、１０００〜１２００ｒｐｍにおいて８日間成長させた。実施例７に記載するように、リパーゼ活性を測定した。
得られた結果を下表１に示し、ここで対照としてアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２７またはアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のリパーゼ収量が１．０に正規化されている。
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表１に示すように、突然変異株は、震盪フラスコ中で成長させたとき、対照株アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２７よりもほぼ２〜４倍多いリパーゼを生産し、そして対照株アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０よりもほぼ３〜６倍多いリパーゼを生産した。突然変異株は、また、発酵槽中で成長させたとき、対照株アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４２７よりもほぼ２〜５倍多いリパーゼを生産した。
実施例９：高いリパーゼを発現する突然変異株からのプラスミドＤＮＡおよびフランキングＤＮＡのレスキュー
プラスミドＤＮＡ（ｐＳＯ１２２、ｐＤＳＹ８１またはｐＤＳＹ８２）およびゲノムのフランキング遺伝子座を、突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３、ＤＥＢＹ５９９．３、ＤＥＢＹ９３２、ＤＥＢＹ１０５８、ＤＥＢＹ１２０４．３．３およびＨＩＮ６０３から単離した。
下記の手順に従い、ゲノムＤＮＡを突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３、ＤＥＢＹ５９９．３、ＤＥＢＹ９３２、ＤＥＢＹ１０５８、ＤＥＢＹ１２０４．３．３およびＨＩＮ６０３から単離した。各突然変異株の胞子の系統を１５０ｍｌのＹＥＧ培地の中に接種し、３７℃および２５０ｒｐｍにおいて一夜成長させた。ミラクロス（Miracloth）（Calbiochem、カリフォルニア州ラジョラ）を通す濾過により、菌糸体を各培養物から収集し、ＴＥで２回すすいだ。次いで菌糸体調製物を液体窒素中で急速凍結し、乳鉢および乳棒により微粉末に粉砕した。粉末化菌糸体調製物の各々を５０ｍｌの管に移し、２０ｍｌの溶解緩衝液を添加した。ＲＮアーゼを各調製物に２０μｇ／ｍｌの最終濃度に添加し、調製物を３７℃において３０分間インキュベートした。次いでプロテアーゼＫを各調製物に０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に添加し、調製物を５０℃において１時間インキュベートした。次いで調製物を１５，０００×ｇで２０分間インキュベートして、不溶性物質を沈降させた。製造業者により提供されるＱＢＴと平衡化したクイアデン（Ｑｉａｇｅｎ）ＭＡＸＩカラム（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州テャツワース）に、各上清を適用した。次いで製造業者により提供されるＱＣの３０ｍｌで、ＤＮＡを各カラムから溶離し、次いで０．７体積のイソプロパノールで沈降させ、１５，０００×ｇにおいて２０分間遠心することによって回収した。ペレットを最後に５μｌの７０％のエタノールで洗浄し、空気乾燥し、２００μｌのＴＥ中に溶解した。
アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３、ＤＥＢＹ５９９．３、ＤＥＢＹ９３２、ＤＥＢＹ１０５８、ＤＥＢＹ１２０４．３．３およびＨＩＮ６０３のゲノムＤＮＡ調製物の各々の２μｌのアリコートを、別々に、ＢｇｌＩＩ、ＨｐａＩ、ＮａｒＩ，ＳｐｈＩおよびＳｔｕＩで消化した。制限エンドヌクレアーゼはｐＤＳＹ８２を切断せず、これは組込まれたプラスミドおよびフランキングゲノムＤＮＡの単離を可能とした。次いで消化されたゲノムＤＮＡを２０μｌの反応物中でＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。
結合したＤＮＡ調製物の各々を大腸菌ＨＢ１０１または大腸菌ＤＨ５αの中に形質転換した。次いで、形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、インサートを制限消化して、それらがｐＤＳＹ８２から誘導されたことを確証し、前述の方法に従いｐＤＳＹ８２に対して特異的なプライマーを使用してインサートを配列決定した。
形質転換体大腸菌ＨＢ１０１−ｐＤＳＹ１１２は、突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３からのＨｐａＩレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌ＨＢ１０１−ｐＤＳＹ１０９は、突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３からのＳｐｈＩレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌ＨＢ１０１−ｐＤＳＹ１３８は、突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２からのＮｄｅＩレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌ＨＢ１０１−ｐＤＳＹ１４１は、突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８からのＢｇｌＩＩレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌ＤＨ５α−ｐＳＭＯ１２０４は、突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１２０４．３．３からのＢｇｌＩＩレスキュード遺伝子座を含有した。形質転換体大腸菌ＤＨ５α−ｐＳＭＯＨ６０３は、突然変異株アスペルギルス・オリゼＨＩＮ６０３からのＢｇｌＩＩレスキュード遺伝子座を含有した。
実施例１０：アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３レスキュード遺伝子座ｐＤＳＹ１１２の特性決定
１６２５ｂｐを含有するアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３レスキュード遺伝子座ｐＤＳＹ１１２を、実施例２に記載する方法に従い配列決定した。核酸配列（配列識別ＮＯ：９）および推定されたアミノ酸配列（配列識別ＮＯ：１０）を第９図に示す。核酸配列は、ＡＴＧ開始コドンの約１５０ｂｐ上流のグルコーストランスポーターのプロモーター内に組込みが起こったことを示唆した。オープンリーディングフレームはイントロンにより句読を切られていた。予測されたタンパク質（配列識別ＮＯ：１０）は、それぞれ、酵母（配列識別ＮＯ：１１）およびヒト（配列識別ＮＯ：１２）からのグルコーストランスポーターと３１．６％および２４．８％の同一性を共有し、そして酵母（配列識別ＮＯ：１３）からのイノシトールトランスポーターと２０．１％の同一性を共有した。グルコーストランスポーターは、１２の膜スパニングドメインをもつ、非常に独特な予測された二次構造を有する。アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３レスキュード遺伝子座のカイト・ドーリトル（Kyte-Doolittle）プロットは、酵母およびヒトのグルコーストランスポーターに類似する１２の膜スパニングドメインを予測した。
レスキュードフランキングＤＮＡがアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３において分裂された遺伝子であることを確証するために、実施例６に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ１０１およびアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３のＢｇｌＩＩで消化したゲノムＤＮＡ調製物のサザンブロットを調製し、分析した。ＤＩＧイージイＨｙｂ中で４２℃において、ブロットをアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３レスキュードフランキングＤＮＡでプローブした。次いでブロットを洗浄し、ゲニウス・キットとともに提供されるプロトコールによりプロセシングした。
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ１０１からの２．７ｋｂのＢｇｌＩＩバンドはプローブとハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３からの約８ｋｂのＢｇｌＩＩバンドはプローブに対してハイブリダイゼーションした。大きさの差はＲＥＭＩの間に組込まれたプラスミドの長さに対応し、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３からレスキューされたＤＮＡが挿入をフランクしていることを確証した。
実施例１１：ＨｐａＩ線状化ｐＤＳＹ１１２を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼの発現のスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０をＨｐａＩ線状化ｐＤＳＹ１１２で形質転換し、形質転換体を回収した。合計、２１６の形質転換体を２４ウェルのプレートにおいて１／１００強度のＭＹ２５培地中で成長させた。実施例７に記載するように、試料を第４日および第６日に採り、リパーゼ活性についてアッセイした。等しい数の低い、平均のおよび高い生産性のリパーゼ形質転換体を胞子精製し、前述したように、２４ウェルのマイクロタイタープレートの培養において再試験した。実施例８に記載するように、これらの精製された形質転換体を、また、震盪フラスコにおいて完全強度のＭＹ２５培地中で再試験した。実施例７に記載するように、リパーゼ活性を測定した。
得られた結果を下表２に示し、ここでアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のリパーゼ収量を１．０に正規化した。
0004436934.tif 000006
発酵条件下に成長させたとき、すべての５つの形質転換体はもとの標識化株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３とほぼ同一レベルのリパーゼ活性を生産した。ｐＤＳＹ１１２がゲノム中の同一の相同遺伝子座に組込まれたかどうかを決定するために、実施例６に記載する手順に従い、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３およびｐＤＳＹ１１２形質転換体のＢｇｌＩＩで消化したＤＮＡ調製物のサザンブロットを調製し、分析した。ＤＩＧイージイＨｙｂ中で４２℃において、ブロットをアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３レスキュードフランキングＤＮＡでプローブした。次いでブロットを洗浄し、ゲニウス・キットとともに提供されるプロトコールによりプロセシングした。
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０からの２．７ｋｂのＢｇｌＩＩバンドはプローブとハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３からの約８ｋｂのＢｇｌＩＩバンドはプローブに対してハイブリダイゼーションした。２．７ｋｂの野生型ＢｇｌＩＩバンドおよび形質転換するＤＮＡに対応する第２バンドは、形質転換体のすべてのにおいてプローブにハイブリダイゼーションした。したがって、形質転換体のいずれも正確な遺伝子の置換をもたなかった。
実施例１２：アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３レスキュード遺伝子座ｐＤＳＹ１０９の特性決定
実施例２に記載する手順に従い、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３レスキュード遺伝子座ｐＤＳＹ１０９の組込みの事象の両側の３．４および２．２ｋｂの領域を配列決定した。核酸配列は、ｐａｌＢ遺伝子のオープンリーディングフレーム内で組込みの事象が起こったことを示唆した。ｐａｌＢ遺伝子は、周囲ｐＨをシグナルするシグナル形質導入経路に関係するシステインプロテアーゼをコードする。
まずＴｓｐ５０９Ｉでアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡを部分的に消化することによって、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のゲノムのライブラリーを構築した。製造業者が推奨する条件下に、４単位のＴｓｐ５０９を使用して３．５μｇのアスペルギルス・オリゼHowB430ゲノムＤＮＡを消化した。反応を６５℃において実施し、試料を５分間隔（０から５０分まで）で採った。反応物を氷上に配置し、ＥＤＴＡを１０ｍＭに添加することによって反応を停止させた。次いでこれらの消化物を臭化エチジウムを含む１％のアガロースゲル上で実施し、３ｋｂ〜９ｋｂのＤＮＡを含有するゲルの領域を切除した。次いで、製造業者（New England Biolabs、マサチュセッツ州ベバーリイ）により提供されるプロトコールに従いベータ−アガロースＩを使用して、ＤＮＡをゲルスライスから精製した。次いで、製造業者の使用説明書に従い製造業者により推奨される条件下に１６℃において一夜、大きさで選択したＤＮＡをラムダＺｉｐＬｏｘのＥｃｏＲＩアームの中に結合した。製造業者のプロトコールに従いGigapack GoldIIIパッケージングキットを使用して、結合反応物をパッケージし、力価決定した。８×１０6の組換えプラークが得られ、そしてライブラリーを製造業者により提供されるプロトコールに従い増幅した。
ゲノムのライブラリーをスクリーニングして、ｐａｌＢのゲノムのクローンを得た。ラムダＺｉｐＬｏｘのＥｃｏＲＩアームとともに提供されるプロトコールに記載されているように、ゲノムのライブラリーを適当に希釈して７０００プラーク／１５０ｍｍのペトリプレートを得た。標準的プロトコール（Sambrook et al.、1989、前掲）に従い、プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎプラス円形フィルターにリフトした。フィルターをＵＶ架橋により固定し、ＤＩＧイージイＨｙｂ中で４２℃において前ハイブリダイゼーションした。フィルターをＤＩＧ標識化０．２５ｋｂのｐａｌＢプローブとハイブリダイゼーションさせた。プローブをゲニウス・キットによりジオキシゲニンで標識化し、そして製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムスの３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により合成した下記のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した：
0004436934.tif 000007
ＰＣＲのパラメーターは実施例２に記載する通りである。フィルターを洗浄し、ゲニウス・キットとともに提供されるプロトコールに従い、ハイブリダイゼーション後、プロセシングした。標準的プロトコール（Sambrook et al.、1989、前掲）に従い、いくつかの陽性のプラークを同定し、均質に精製した。
実施例２に記載する手順に従い、ヌクレオチド配列をｐａｌＢ遺伝子について決定した。核酸配列（配列識別ＮＯ：１６）および推定されたアミノ酸配列（配列識別ＮＯ：１７）を第１０図に示す。オープンリーディングフレームは３つのイントロンで中断されている。アスペルギルス・オリゼＰａｌＢタンパク質（配列識別ＮＯ：１７）は、アスペルギルス・ニヅランスＰａｌＢタンパク質（配列識別ＮＯ：１８）と６６．４％の同一性を共有した。挿入部位は、また、３７アミノ酸（配列識別ＮＯ：１９）の高度に保存されたドメインを含有し、このドメインは、多分大腸菌における形質転換またはレスキューの間に挿入されたミトコンドリアのＤＮＡの片である、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼから誘導されたもの（配列識別ＮＯ：２０）に類似した。
実施例６に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３およびアスペルギルス・オリゼHowB101のＢｇｌＩＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットを調製した。ブロットをアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３レスキュードフランキングＤＮＡでプローブして、レスキュードフランキングＤＮＡがアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３における分裂した遺伝子であることを確証した。
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ１０１からの約７．５ｋｂの野生型ＢｇｌＩＩバンドはプローブとハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３からの１２ｋｂのバンドはプローブに対してハイブリダイゼーションした。大きさの差は組込れる１つのプラスミドのコピーについて期待された大きさであり、レスキューされた遺伝子座がアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３において分裂されていることを確証した。
アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３における組込みの事象は非機能的ＰａｌＢタンパク質に導いたので、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３をｐＨ８．０およびｐＨ６．５における成長について試験した。アスペルギルス・ニヅランスｐａｌＢマイナス株ｐＨ８．０において成長することができないが、ｐＨ６．５において成長することができる。１０ｍＭのウリジンを含む最小培地中でｐＨ８．０またはｐＨ６．５において、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０およびアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３を成長させた。予測されたように、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３はｐＨ８．０において成長することができなかった。
実施例１３：ｐＭＴ１９３６の構築
製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムスの３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により合成した下記のプライマーを使用して、ｐａｌＢの分裂カセットを含有するｐＭＴ１９３６を構築した。
0004436934.tif 000008
実施例２に記載する方法に従い得られたアスペルギルス・オリゼＡ１５６０から、アスペルギルス・オリゼｐａｌＢ５’フランキング配列およびｐａｌＢ産物のＮ−末端部分をコードする配列をＰＣＲ増幅した。ほぼ０．０５μｇのＤＮＡ鋳型および５ｐｍｏｌの２つのプライマー１００７５５および１００７５４の各々を使用した。製造業者（Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポリス）が記載するように、ポリメラーゼＰｗｏを使用して増幅を実施した。４０サイクルを通して、増幅を進行させた。反応生成物の一部分をフェノール抽出し、エタノール沈降させた、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ほぼ１．０５ｋｂのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。
前述したように、アスペルギルス・オリゼｐａｌＢ３’フランキング配列およびｐａｌＢ遺伝子産物のＣ−末端部分をコードする配列を得たが、プライマー１００７５３および１００７５２を増幅に使用し、ＰＣＲ生成物を制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化した後、ゲル電気泳動にかけてほぼ１．５０ｋｂのフラグメントを回収した。
前述の２つの消化し、精製したＰＣＲフラグメントを、２つの部分の結合において、ベクターｐＪａＬ４００（第１１図）から精製された２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントと結合して、ｐＭＴ１９３５（第１２図）を生成した。ＰＣＲプライマー１００７５４および１００７５３を介して導入されたＢｓｓＨＩＩ，ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ部位により、ｐＭＴ１９３５のｐａｌＢ５’および３’フランクを分離した。
ｐＭＴ１９３５のｐａｌＢ５’フランクおよび３’フランクの間にアスペルギルス・オリゼｐｙｒＧ遺伝子を挿入するために、ＨｉｎｄＩＩＩ切断し、脱リン酸化し、精製したpBluescript II SK（-）の中に、反復フランクドｐｙｒＧ遺伝子を含有するｐＪａＬ３９４（第１３図）の３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをクローニングした。いずれかの向きにインサートを有するプラスミドが得られた。１つのプラスミド、ｐＭＴ１９３１（第１４図）を選択し、このプラスミドにおいて、pBluescriptポリリンカーのＳｐｅＩ部位はｐｙｒＧ遺伝子の下流に存在し、そしてＸｈｏＩ部位はｐｙｒＧ遺伝子の上流に存在した。ｐｙｒＧ遺伝子は３．５ｋｂのＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして単離し、そしてＳｐｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、精製したｐＭＴ１９３５の中に挿入して、分裂プラスミドｐＭＴ１９３６（第１５図）を生成した。
ｐｙｒＧ選択可能なｐａｌＢ分裂カセットをｐＭＴ１９３６から、６．２ｋｂのＮｏｔＩフラグメント（ポリリンカーにおけるＮｏｔＩ切断）として、あるいは５．５ｋｂのＡｓｅＩ−ＰｖｕＩフラグメント（実際のｐａｌＢ５’および３’フランキング配列内のＡｓｅＩおよびＰｖｕＩ切断）として単離することができる。
実施例１４：ｐＭＴ１９３６からのＡｓｅＩ／ＰｖｕＩｐａｌＢ分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼのスクリーニング
実施例５に記載する同一の形質転換手順に従い、ｐＭＴ１９３６から得られた５．５ｋｂのＡｓｅＩ／ＰｖｕＩフラグメントを使用して、アスペルギルス・オリゼHowB430を形質転換した。製造業者の使用説明書に従いＱＩＡクエンチゲル抽出キットにより、ｐＭＴ１９３６をＡｓｅＩおよびＰｖｕＩで消化し、１％のアガロースゲル上で分離することによって、形質転換のための線状フラグメントを単離した。次いで、ｐＨ６．５またはｐＨ８．０における最小培地のプレート上の成長について、形質転換体を試験した。
これらの結果が示すように、試験した１２８形質転換体のうちの１３は、ｐＨ８．０において成長することができず、ｐａｌＢマイナス表現型を有した。１３のｐａｌＢマイナス株およびｐＨ８．０において成長することができる１３の形質転換体を胞子精製し、次いで、それぞれ、実施例７および８に記載する方法に従い、２４ウェルのプレートおよび震盪フラスコの培養においてリパーゼの生産について評価した。結果を下表３に示す。
アスペルギルス・オリゼｐａｌＢマイナス突然変異株、アスペルギルス・オリゼｐａｌＢプラス株およびアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０からのゲノムＤＮＡのサザンブロットを実施して、ＡｓｎＩ／ＰｖｕＩ形質転換ＤＮＡフラグメントがｐａｌＢ遺伝子座の中への完全な置換として組込まれたかどうかを決定した。実施例９に記載する手順に従い、ゲノムＤＮＡを調製し、ＰｖｕＩで消化し、０．８％のアガロースゲル上で電気泳動させた。０．４Ｎ  ＮａＯＨおよび毛管作用を使用して、ＤＮＡをハイボンド（Hybond）Ｎ+膜に移した。ブロットをＵＶ架橋した後、RapidHyb中で６５℃において前ハイブリダイゼーションした。次いでブロットをｐＭＴ１９３６からの０．９ｋｂのＡｓｎＩ／ＳｐｅＩフラグメントでプローブした。１％のアガロースゲル上の電気泳動後、ＱｉａＱｕｉｃｋスピンカラムを使用して、アガロースゲルのスライスから０．９ｋｂのフラグメントを単離した。ビストラ（Ｖｉｓｔｒａ）ＥＣＦランダムプライム標識化キットを使用して、フラグメントを標識化した。ブロットを前ハイブリダイゼーションし、６５℃においてＲａｐｉｄ  Ｈｙｂ（Amersham、オハイオ州クレブランド）中でハイブリダイゼーションし、次いで６５℃において２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５分間２回洗浄し、６５℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。洗浄後、ブロットを検出のためにビストラＥＣＦランダムプライム標識化キット（Amersham、オハイオ州クレブランド）およびSTORM860映像システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニイベイル）によりプロセシングした。
サザンブロットの結果により、プローブはアスペルギルス・オリゼHowB430からの６ｋｂのバンドにハイブリダイゼーションすることが証明された。完全な分裂物は約８ｋｂのＰｖｕＩバンドにハイブリダイゼーションすることが期待されるであろう。サザンブロットの結果がさらに示すように、ｐａｌＢマイナス株のあるものは完全な分裂を有したが、他のものはもたなかった。サザンブロットの結果を表３に要約する。
また、３つのｐａｌＢマイナス株を実施例８に記載する手順に従い発酵条件下に成長させた。得られた結果を表３に示し、ここでアスペルギルス・オリゼHowB430のリパーゼ収量を１．０に正規化した。３つのｐａｌＢマイナス株は、もとの標識化突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０．３と同一のものよりも優れるか、あるいはそれに密接した性能を有した。
0004436934.tif 000009
実施例１５：アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２レスキュード遺伝子座ｐＤＳＹ１３８の特性決定
実施例２に記載する方法に従い、１６２５ｂｐを含有するアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２レスキュード遺伝子座ｐＤＳＹ１３８を合成した。核酸配列（配列識別ＮＯ：２５）および推定されたアミノ酸配列（配列識別ＮＯ：２６）を第１６図に示す。核酸配列が示すように、ＲＥＭＩ組込みのＥｃｏＲＩ部位はオープンリーディングフレームについてＡＴＧ開始コドンの８１０ｂｐ上流に存在し、そして推定されたアミノ酸配列（配列識別ＮＯ：２６）は大腸菌およびバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）からのマンニトール−１−リン酸塩デヒドロゲナーゼに対して有意な同一性を有した。オープンリーディングフレームは３１９アミノ酸の予測されたタンパク質をコードし、そして、それぞれ、大腸菌（配列識別ＮＯ：２７）およびバシラス・サチリス（配列識別ＮＯ：２８）のマンニトール−１−リン酸塩デヒドロゲナーゼと１３．３％および３４．７％の同一性を共有した。
実施例１４に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２およびアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のＮｄｅＩで消化したゲノムＤＮＡ調製物のサザンブロットを調製し、分析した。ブロットをアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２レスキュードＤＮＡでプローブして、レスキュードフランキングＤＮＡがＤＥＢＹ９３２において分裂された遺伝子であることを確証した。
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０からのほぼ５ｋｂのＮｄｅＩバンドはレスキュード遺伝子座にハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２からのほぼ１０ｋｂのバンドはプローブにハイブリダイゼーションして、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２における分裂した遺伝子座であることを確証した。
実施例１６：ＮｄｅＩ線状化ｐＤＳＹ１３８を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼの発現のスクリーニング
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０をＮｄｅＩ消化ｐＤＳＹ１３８で形質転換し、形質転換体を実施例５に記載する方法に従い回収した。合計して、１８０の回収された形質転換体を２４ウェルのマイクロタイタープレート中の１／１００強度のＭＹ２５中で成長させ、試料を実施例７に記載するようにリパーゼアッセイのために第４日および第６日に採った。上部の１１の最高のリパーゼ産生形質転換体および１つの平均のリパーゼ産生形質転換体を胞子精製し、２４ウェルのマイクロタイター培養において再試験した。実施例８に記載するように、これらの精製した形質転換体を、また、震盪フラスコにおいて完全な強度のＭＹ２５中の評価した。実施例８に記載するように、上部の２つの生産株をまた２リットルの発酵槽中で成長させた。実施例７に記載するように、リパーゼ活性を測定した。
得られた結果を下表４に示し、ここでアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のリパーゼ収量を１．０に正規化した。上部の２つの生産株は、もとの標識化突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２と本質的に同一量のリパーゼ活性を生産した。
0004436934.tif 000010
実施例１４に記載するように、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０およびｐＤＳＹ１３８のＮｄｅＩで消化したゲノムＤＮＡ調製物のサザンブロットを調製し、分析して、プローブとしてアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２レスキュードフランキングＤＮＡを使用して形質転換体における相同遺伝子座産生遺伝子置換において組込まれたかどうかを決定した。
アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０からのほぼ５ｋｂのＮｄｅＩバンドはレスキュード遺伝子座にハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２からのほぼ１０ｋｂのバンドはプローブにハイブリダイゼーションしたことを、サザンブロットは示した。表４において、サザン結果と表示する列は、形質転換体が親株のアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０において観測された大きさの野生型ＮｄｅＩフラグメントを有したかどうかを示すか、あるいは形質転換体がアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２において観測された分裂した大きさに対応するバンドを有したかどうかを示した。
実施例１７：アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８レスキュードｐＤＳＹ１４１の特性決定
実施例２に記載する方法に従い、ほぼ１ｋｂを含有するアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８レスキュードｐＤＳＹ１４１を配列決定した。核酸配列は、レスキュード遺伝子座がＢａｍＨＩ  ＲＥＭＩの組込みの事象のただ１つの側からのフランキングＤＮＡを含有し、そしてｐＤＳＹ１４１配列が再配列されたことを証明した。
実施例１４に記載するように、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８のＢａｍＨＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットをアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８レスキュードフランキングＤＮＡ調製物でプローブし、分析して、レスキュードフランキングＤＮＡがアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８における分裂した遺伝子であることを確証した。
サザンブロット分析は、ｐＤＳＹ８２ＤＮＡがＢａｍＨＩ部位にＲＥＭＩ事象として組込まれたが、ｐＤＳＹ８２の１つのコピーが組込まれたことを示し、これはレスキュードプラスミドが再配列され、フランキングＤＮＡの１つの側のみを含有する理由を示唆した。
他のフランキング片を得るために、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８からのレスキュードゲノムＤＮＡの32Ｐ標識化０．５ｋｂのフラグメントを使用して、実施例６に記載するように調製した、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０ゲノムのライブラリーから、ゲノムクローン（ｐＤＳＹ１６３）を単離した。製造業者の使用説明書に従い（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットを使用して、プローブを標識化した。ほぼ７０００プラークの５つのプレートをプレートし、実施例１２に記載するように、プラークをHybond-N+にリフトした。フィルターを４２℃において５０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳおよび２００μｇ／ｍｌの剪断、変性されたサケ精子ＤＮＡ中で１時間前ハイブリダイゼーションした。変性されたプローブを添加し、フィルターを４２℃において一夜ハイブリダイゼーションした。フィルターを１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で６５℃において５分間２回洗浄し、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の６５℃において１５分間２回洗浄し、２×ＳＳＣ中の室温において１０分間洗浄した。フィルターをＸ線フィルムに対して露出し、標準的プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、前掲）を使用して１２の陽性プラークを取り上げ、精製した。ラムダＺｉｐＬｏｘ  ＥｃｏＲＩアームキットとともに提供される切除プロトコールを使用して、精製したゲノムのクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。
実施例２に記載するように、ゲノムのクローンの３．６ｋｂのヌクレオチド配列を決定した。核酸配列（配列識別ＮＯ：２９）および推定されたアミノ酸配列（配列識別ＮＯ：３０）を第１７図に示す。核酸配列は、突然変異株における組込みのＢａｍＨＩ部位がタンパク質（配列識別ＮＯ：３０）をコードするオープンリーディングフレームの停止コドンの２５０ｂｐ下流に存在することを示し、前記タンパク質はサッカロミセス・セレビシエからのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（配列識別ＮＯ：３１）と有意な同一性を共有した。
アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８における組込み部位はマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の停止コドンの２５０ｂｐ下流に存在したので、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現に対するこの組込みの効果を決定した。機能的マンガンスーパーオキシドジスムターゼを欠如するサッカロミセス・セレビシエ株は、酸素が存在するとき、パラクアットに対して感受性である。アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８およびアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０を、２４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、１０ｍＭのウリジンおよび０、２、４、６、８、１０または２０ｍＭのパラクアットを補充した１ｍｌのＹＥＧ培地中で３４℃において震盪しながら成長させた。アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０は８ｍＭまでのパラクアットの濃度において成長したが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８の成長は２ｍＭのパラクアットにより阻害された。データが示すように、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１０５８におけるマンガンスーパーオキシドジスムターゼの停止コドンの２５０ｂｐ下流の組込みの事象はマンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現を減少させた。
実施例１８：ｐＤＳＹ１６２の構築
製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して合成された下記のプライマーを使用して、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの３１７９ｂｐのＸｂａＩ／ＫｐｎＩフラグメントのＰＣＲ増幅により、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットを含有するｐＤＳＹ１６２を構築した。
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増幅反応物（１００μｌ）は下記の成分を含有した：０．２μｇのｐＤＳＹ１６３、４８．４ｐｍｏｌのプライマー９７０７３８、４８．４ｐｍｏｌのプライマー９７９７３９、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、９５℃、５分間、次いで３０サイクル、各々９５℃、１分間、５５℃、１分間、および７２℃、２分間。２μｌの反応物をアガロースゲル上で電気泳動させて、ほぼ３１７９ｂｐのＰＣＲ生成物の増幅を確証した。
ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、ＰＣＲ生成物をｐＣＲRＴＯＰＯの中にサブクローニングした。次いで、製造業者の使用説明書に従いQIAwell-8プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩを使用してプラスミドＤＮＡを制限消化して、正しい大きさのフラグメントの存在を確証し、そして実施例２に記載する方法に従いＤＮＡを配列決定してＰＣＲ生成物を確証することによって、形質転換体をスクリーニングした。
マンガンスーパーオキシドジスムターゼのインサートを含有するプラスミドをＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化し、１％のアガロースゲル上で分離した。製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キットを使用して、３．１ｋｂのマンガンスーパーオキシドジスムターゼのフラグメントを精製した。精製したフラグメントを、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫと結合して、ｐＤＳＹ１６１（第１８図）を生成した。結合反応物を使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
次いで、製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、どのクローンが正しいかを決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。
ｐＤＳＹ１６１をＨｉｎｄＩＩＩで消化して６００ｂｐのフラグメントを除去し、消化物を１％のアガロースゲル上で電気泳動させた。製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キットを使用して、５．４ｋｂのベクターフラグメントを単離し、ｐｙｒＧ遺伝子反復を含有するｐＪａＬ３９４（第１３図）からの３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに結合してｐＤＳＹ１６２（第１９図）を生成した。結合反応物を使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
次いで、製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、それらをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、どのプラスミドがｐＤＳＹ１６２中の期待する３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有するかを決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。
実施例１９：ＡｓｎＩ／ＰｖｕＩマンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびリパーゼのスクリーニング
実施例５に記載する同一の形質転換手順に従い、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットを含有する５．８ｋｂのＡｓｅＩ／ＰｖｕＩフラグメントで、アスペルギルス・オリゼHowB430で形質転換した。ｐＤＳＹ１６２をＡｓｅＩおよびＰｖｕＩで消化し、そして製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キットを使用して１％のアガロースゲル上で分離することによって、形質転換のための線状フラグメントを単離した。次いで、ｐＨ６．５において最小培地のプレート上の成長について形質転換体を試験した。
実施例１７に記載するように、６つの形質転換体を調製し、パラクアットに対する感受性について試験した。６つの形質転換体のうちの４つはパラクアット感受性であり、マンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂マイナスを示したが、４つのパラクアット感受性株はパラクアットに対して等しく感受性ではなかった。下表５に示すように、ダッシュはパラクアットに対して非感受性であることを意味し、＋＋は中間レベルのパラクアットに対して感受性であることを意味し、そして＋＋＋は２ｍＭのパラクアットによってさえ阻害されることを意味する。実施例７および８に記載する手順に従い、すべての形質転換体を胞子精製し、２４ウェルおよび震盪フラスコの培養においてリパーゼの生産について試験した。下表５に記載する結果が示すように、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０をマンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂カセットで形質転換した後、パラクアットに対して感受性である形質転換体は平均してアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０より高いＬＩＰＯＬＡＳＥTMレベルを生成した。
実施例１４に記載するように、マンガンスーパーオキシドジスムターゼがマイナスのアスペルギルス・オリゼの突然変異株、マンガンスーパーオキシドジスムターゼがプラスのアスペルギルス・オリゼの株、およびアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０からのゲノムＤＮＡのサザンブロットを実施して、ＡｓｎＩ／ＰｖｕＩ形質転換ＤＮＡフラグメントがマンガンスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子座の中に完全な置換体として組込まれたかどうかを決定した。
サザンブロットの結果（表５）が示すように、２ｍＭのパラクアットに対してさえ感受性の株はマンガンスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子座において分裂したが、中間レベルのパラクアットに対して感受性の株は野生型遺伝子座および分裂カセットの遺伝子座の双方を有する。サザンブロットおよびＬＩＰＯＬＡＳＥTMの収量の結果が総合して示すように、同一細胞における全長全およびトランケートの双方のマンガンスーパーオキシドジスムターゼの発現は、パラクアットに対する中間の感受性およびＬＩＰＯＬＡＳＥTM産生の増加に導く。これは下記の事実により説明される。すなわち、マンガンスーパーオキシドジスムターゼはホモダイマーであるので、それぞれ、野生型および分裂カセットによりコードされる野生型およびトランケートの形態の発現は、非機能的であるか、あるいは部分的に機能的であるヘテロダイマーに導く。
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実施例２０：アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１２０４．３．３レスキュード遺伝子座ｐＳＭＯ１２０４の特性決定
実施例２に記載する手順に従い、２．０ｋｂを含有するアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１２０４．３．３レスキュード遺伝子座ｐＳＭＯ１２０４を配列決定した。第２０図に示す核酸配列（配列識別ＮＯ：３４）は、発表された配列に対する相同性をもたなかった。
サザン分析およびゲノムのクローンの配列決定を使用して、標識化突然変異株を発生させたとき、欠失が起こらなかったことを確証した。実施例１４に記載するように、種々の制限エンドヌクレアーゼ（ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩ）で消化したアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡのサザンブロットを調製し、分析した。下記のプライマーを使用するＰＣＲにより、レスキュードプラスミドの両端からのプローブを発生させた。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して、プライマーを合成した。
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プライマー９７００５２および９７００５３を使用するＰＣＲにより、レスキュード遺伝子座の１端から、プローブ１を発生させた。プライマー９７００５４および９７００５５を使用するＰＣＲにより、レスキュード遺伝子座の他端から、プローブ２を発生させた。増幅／標識化反応物（５０μｌ）は下記の成分を含有した：１０ｎｇのレスキュードプラスミドｐＳＭＯ１２０４、プローブ１について５０ｐｍｏｌのプライマー９７００５２および９７００５３ので各またはプライマー２について５０ｐｍｏｌのプライマー９７００５４および９７００５５ので各、１×ＤＩＧ標識化混合物（Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポリス）、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ。次のようにプログラミングされたエリコンプ・サーマル・サイクラー中で、反応物をインキュベートした：１サイクル、９５℃、５分間、次いで３０サイクル、各々９５℃、１分間、５８℃、１分間、および７２℃、１．５分間。
実施例１４に記載する手順に従い、種々の制限酵素で消化したアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡのサザンブロットを調製し、分析した。ブロットを独立にプローブ１およびプローブ２にハイブリダイゼーションさせた。双方のプローブを有する消化物の同一のバンディングパターンは、欠失が起こらなかったことを示唆する。サザン分析の条件は下記の通りであった：ブロットをＥａｓｙ  Ｈｙｂ中で４２℃において１時間前ハイブリダイゼーションさせ、一夜ハイブリダイゼーションさせた。ブロットを２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の室温において各１５分間２回洗浄し、次いで２回６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で各１５分間洗浄した。ベーリンガー・マンヘイムのＤＩＧ洗浄ブロック緩衝液系からの緩衝液および試薬を使用して、検出を続けた。ＣＤＰスター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インジアナポリス）を使用して、化学発光反応を検出した。フィルムをほぼ１時間露出した。
サザンブロットの結果は、異なる消化物を使用して同一のバンディングパターンを示し、標識化プラスミドの直接的挿入を示唆した。実施例１２に記載するように得られたアスペルギルス・オリゼＺｉｐｌｏｘライブラリーを標識化突然変異株アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ１２０４からのプローブでプローブすることによって、ゲノムのクローンを得た。アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０のＺｉｐｌｏｘライブラリーをプローブ１でスクリーニングした。ゲノムのクローンを単離し、配列決定して（実施例２）標識化事象の間に欠失が起こらなかったことおよび標識化プラスミドがＥｃｏＲＩ部位の中に挿入されたことを確証した。
実施例２１：アスペルギルス・オリゼ突然変異株ＨＩＮ６０３レスキュード遺伝子座ｐＳＭＯ６０３の構築
実施例２に記載する手順に従い、１．０ｋｂを含有するアスペルギルス・オリゼＨＩＮ６０３レスキュード遺伝子座ｐＳＭＯ６０３を配列決定した。第２１図に示す核酸配列（配列識別ＮＯ：３９）は、発表された配列に対する相同性を示さなかった。
制限酵素ＳｐｈＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化したアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡのサザンブロットを、レスキュードプラスミドの両端から作ったプローブにハイブリダイゼーションさせた。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により合成した下に示すプライマー９７０８５８およびプライマー９７０８５９を使用するＰＣＲにより、プローブ３を発生させた。プライマー９７０８６０およびプライマー９７０８６１を使用するＰＣＲにより、プローブ４を発生させた。５０μｌのＰＣＲ標識化反応の鋳型は、１０ｎｇのレスキュードプラスミドｐＳＭＯＨ６０３であった。ＰＣＲサイクルおよび条件は実施例２０に記載する通りであった。サザン条件は実施例２０に記載する通りであった。
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サザン上の異なるバンディングパターンは、標識化が起こったところで欠失が起こったことを示唆した。５００ｎｇのアスペルギルス・オリゼHowB430ゲノムＤＮＡをプライマー０９０８５８および０９０８６０を使用するＰＣＲ反応において鋳型として使用したとき、３ｋｂの生成物が適用され、２．５ｋｂの欠失が起こったことを示唆した。標識化アスペルギルス・オリゼＨＩＮ６０３株から調製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アスペルギルス・オリゼｐｙｒＧからのＮｈｅＩフラグメントでプローブした、ゲノムＤＮＡのサザン分析は、標識化突然変異株がＲＥＭＩ事象により発生しなかったことを示唆した。
実施例２２：アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２の構築
ＮＡ２−ｔｐｉプロモーター、フミコラ・ラヌギノサからのセルラーゼ遺伝子（CAREZYMETM、Novo Nordisk A/S、デンマーク国  バグスバード）およびプラスミドｐＧＡＧ３（第２２図）から得られたＡＭＧターミネーターを含有する線状フラグメントでアスペルギルス・オリゼＪａＬ２５０を形質転換することによって、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２を発生させた。
アスペルギルス・オリゼＪａＬ１４２（Christensen et al.、1988、Bio/Technology 6:1419-1422）から中性プロテアーゼＩ遺伝子（ｎｐＩ）を欠失することによって、アスペルギルス・オリゼＪａＬ２５０を構築した。ｎｐＩ遺伝子をコードする５．５ｋｂのＳａｃＩゲノムフラグメントを含有するプラスミドｐＪａＬ３８９（第２３図）中のｎｐＩ遺伝子に中央部分をコードする１．１ｋｂのＢａｌＩフラグメントを、反復によりフランクされたｐｙｒＧ遺伝子を含有するｐＪａＬ３３５（第２４図）からの３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを交換し、これによりプラスミドｐＪａＬ３９９（第２５図）をつくることによって、ｎｐＩ欠失プラスミドを構築した。アスペルギルス・オリゼＪａＬ１４２を７．９ｋｂのＳａｃＩフラグメントで形質転換した。最小培地のプレート上のウリジン要件の緩和により、形質転換体を選択した。実施例１４に記載するサザン分析および標準的方法に従うＩＥＦプロテアーゼプロフィル分析により、形質転換体を分析した。
３５の形質転換体のうちの２つは親株に比較して変更したサザンプロフィルを有し、ＩＥＦにより中性のプロテアーゼＩ活性を示さなかった。さらに、サザン分析は２つの形質転換体のうちの１つはｎｐＩ遺伝子の完全な欠失を有することを示し、これをアスペルギルス・オリゼＪａＬ２２８と表示した。
０．１％の５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）および１０ｍＭのウリジンを補充した最小培地のプレート上に、アスペルギルス・オリゼＪａＬ２２８の合計２．３×１０7の分生子を広げた。８つのＦＯＡ耐性コロニーが得られた。８つのコロニーからのＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットを４０１ｂｐのｐｙｒＧ反復領域でプローブして、ｐｙｒＧ遺伝子が反復領域における組換えにより切除されていることが証明された。アスペルギルス・オリゼＪａＬ２２８は、反復領域の２コピーから由来する２．７および３．１ｋｂの期待された大きさの２つのバンドを示した。反復領域の間の組換えによりｐｙｒＧ遺伝子が喪失された場合、３．１ｋｂのバンドは消失し、２．７ｋｂのみが残ったであろう。すべての８つのＦＯＡ耐性コロニーは、バンドのこのパターンを示した。８つのコロニーの中に残留するｎｐＩ遺伝子と４０１反復のコピーとの間の結合部をカバーするＰＣＲフラグメントの配列決定は、ｐｙｒＧ遺伝子が反復の間の組換えにより切除されたことを確証した。コロニーの１つをアスペルギルス・オリゼＪａＬ２５０と表示した。
ｐＤＭ１７６（第２６図）からフミコラ・ラヌギノサのセルラーゼ遺伝子を含有するＳｗａＩ／ＰａｃＩフラグメントを単離し、このフラグメントをＳｗａＩ／ＰａｃＩ消化ｐＢＡＮｅ６の中に結合することによって、ｐＧＡＧ３を構築した。ｐＤＭ１７６からのＳｗａＩ／ＰａｃＩフラグメントおよびＳｗａＩ／ＰａｃＩ消化ｐＢＡＮｅ６を１％のアガロースゲル上で分離し、製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州チャッツワース）を使用して単離した。結合を使用して大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、次いで製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｗｅｌｌ−８プラスミドキットを使用して形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、実施例２に記載する方法に従い、プラスミドＤＮＡを制限消化して、正しい大きさのフラグメントの存在を確証し、ＤＮＡを配列決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。
次いでｐＧＡＧ３をＰｍｅＩで消化し、ＴＡＥ緩衝液を使用する調製用アガロース電気泳動により、線状発現カセットを単離した。次いで線状カセットを使用してアスペルギルス・オリゼＪａＬ２５０を形質転換した。
実施例２に記載するように調製した２×１０7プロトプラスト／ｍｌの濃度のプロトプラストを使用して、アスペルギルス・オリゼＪａＬ２５０の形質転換体をａｍｄＳについて選択した。１０μｇの前述の線状フラグメントを１００μｌのプロトプラストに添加した。次いで２５０μｌの体積のＰＥＧ（６０％のＰＥＧ４０００−１０ｍＭのＣａＣｌ2−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を添加し、この混合物を３７℃において３０分間配置した。３ｍｌのＳＴＣ培地を添加し、この混合物をａｍｄＳの選択のために１０ｍＭのウリジンを補充したＣｏｖｅプレート上にプレートした。プレートを３４℃において７〜１０日間インキュベートした。次いで形質転換体を同一培地のプレートに移し、３７℃において３〜５日間インキュベートした。スクロースを含まない同一培地のプレートを使用して、胞子をストリークし、分離したコロニーを取り上げることによって、形質転換体を精製した。
実施例２３：ＨｐａＩ線状化ｐＤＳＹ１１２を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼ発現のスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２をＨｐａＩ消化ｐＤＳＹ１１２で形質転換し、形質転換体を回収した。全体的に、１０４の回収される形質転換体を２４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて１／４強度のＭＹ２５中で成長させた。試料を第５日および第７日に採り、後述するようにセルラーゼ活性についてアッセイした。
要求に応じてNovo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバードから入手可能であるNovo Nordisk法AF302.1/1-GBから誘導される、下記のプロトコールに従い、セルラーゼ活性を測定した。アゾカルボキシメチルセルロースを１００ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、緩衝液の中に８０℃において１０分間溶解することによって、２％のアゾカルボキシメチルセルロースを含有する基質溶液を調製した。CAREZYMETM（Novo Nordisk A/S、デンマーク国バグスバード）を標準として使用し、対応して１００ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、緩衝液の中に希釈することによって、２．５〜２５ＥＣＵ／ｍｌの貯蔵液を調製して標準曲線を構成した。標準および試料（震盪フラスコおよび発酵のために希釈した）の５μｌのアリコートを、９６ウェルのプレートの個々のウェルの中にピペットで入れた。６５μｌの体積の２％のアゾカルボキシメチルセルロース溶液をウェルの各々の中にピペットで入れ、混合した。反応物を４５℃において３０分間インキュベートし、次いで２１５μｌの停止試薬を添加し、次いで混合して反応を停止させた。まず０．２ｇのＺｎＣｌ2を２０ｍｌの２５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０の中に懸濁させ、この懸濁液を８０ｍｌの１．１ｍｌの濃ＨＣｌ／リットルのエタノールを含有する酸性化エタノールに添加することによって、停止試薬を調製した。次いで、停止された反応を含有するプレートを３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。各懸濁液の１００μｌのアリコートを９６ウェルのプレートの中にピペットで入れ、６００ｎｍにおける吸収を測定した。線形回帰を使用して、勾配、交差、および相関係数を標準および試料について決定した。
２４ウェルのプレートからの上部の１０の形質転換体生産するセルラーゼを胞子精製し、前述したように２４ウェルの培養において再成長させ、セルラーゼ活性についてアッセイした。また、精製した株を１２５ｍｌの震盪フラスコにおいてＭＹ２５  ｐＨ６．５中で３４℃において成長させ、セルラーゼのアッセイのために第３日および第５日に試料を採った。また、アスペルギルス・オリゼHowB432  ｐＤＳＹ１１２  ８４−１−１およびアスペルギルス・オリゼHowB432  ｐＤＳＹ１１２  ９４−１−１を実施例８に記載するように発酵槽（２リットル）中で成長させた。前述したように、セルラーゼ活性を測定した。
２４ウェルおよび震盪フラスコの培養からの結果を表６に記載し、ここでアスペルギルス・オリゼHowB432のセルラーゼ収量を１．０に正規化した。
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実施例１４に記載するように、ＢｇｌＩＩで消化したアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３およびｐＤＳＹ１１２の形質転換体のゲノムＤＮＡのサザンブロットを調製し、分析して、プローブとしてアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３レスキュードフランキングＤＮＡを使用して、ゲノム中の相同遺伝子座においてｐＤＳＹ１１２が組込まれたかどかを決定した。
アスペルギルス・オリゼHowB432からの２．７ｋｂのＢｇｌＩＩバンドはプローブにハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３からの約８ｋｂのＢｇｌＩＩバンドはプローブにハイブリダイゼーションした。すべての形質転換体において、２．７ｋｂの野生型ＢｇｌＩＩバンドおよび形質転換ＤＮＡに対応する第２バンドはプローブにハイブリダイゼーションした。したがって、形質転換体のいずれも正確な置換をもたなかった。
実施例２４：ＮｄｅＩ線状化ｐＤＳＹ１３８を使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼ発現のスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼHowB432をＮｄｅＩ消化ｐＤＳＹ１３８で形質転換した。合計２４０の形質転換体が回収され、これらを実施例８に記載するように２４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて１／４強度のＭＹ２５中で成長させたが、ただし実施例２３に記載するようにセルラーゼ活性のアッセイのために第３日および第５日に試料を採った。上部の２０のセルラーゼ産生形質転換体を胞子精製し、２４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて再試験した。上部の８つのセルラーゼを産生する１回精製した形質転換体を第２回の胞子精製に付し、実施例８に記載するように、震盪フラスコにおいて完全強度のＭＹ２５中で試験した。また、実施例８に記載するように、上部の２つの産生株を２リットルの発酵槽中で成長させた。実施例２３に記載するように、セルラーゼ活性を測定した。
得られた結果を表７に記載し、ここでアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２のセルラーゼ収量を１．０に正規化する。
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実施例１４に記載するように、ＮｄｅＩで消化したアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２およびｐＤＳＹ１１２の形質転換体のゲノムＤＮＡのサザンブロットを調製し、分析して、プローブとしてアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２レスキュードフランキングＤＮＡを使用して、ゲノム中の相同遺伝子座においてｐＤＳＹ１３８ＤＮＡが組込まれたかどかを決定した。
サザンブロットの結果が証明するように、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２からのほぼ５ｋｂのＮｄｅＩバンドはレスキュード遺伝子座にハイブリダイゼーションしたが、アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２からのほぼ１０ｋｂのバンドはプローブにハイブリダイゼーションした。表７において、サザンの結果と表示する列は、親株アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２において観測された大きさの野生型ＮｄｅＩフラグメントを有するかどうかを示すか、あるいはアスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ９３２において観測された分裂した大きさに対応するバンドを形質転換体が有するかどうかを示した。
実施例２５：ｐＭＴ１９３６からのＡｓｅＩ／ＰｖｕＩ  ｐａｌＢ分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼのスクリーニング
実施例５に記載する同一の形質転換体手順に従い、ｐａｌＢ分裂カセットを含有するＡｓｅＩ／ＰｖｕＩフラグメントでアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２を形質転換体した。ｐＭＴ１９３６をＡｓｅＩおよびＰｖｕＩで消化し、製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キットを使用して１％のアガロースゲル上で分離することによって、形質転換のための線状フラグメントを単離した。次いで、得られた形質転換体を最小培地のプレート上でｐＨ６．５またはｐＨ８．０において成長について評価した。
これらの結果が示すように、３１２の形質転換体のうちの１０はｐＨ８．０において成長することができず、ｐａｌＢマイナスの表現型を示した。１０のｐａｌＢマイナス形質転換体およびｐＨ８．０において成長することができた１０の形質転換体を胞子精製し、実施例２３に記載する手順に従いセルラーゼの生産について２４ウェルおよび震盪フラスコの培養において試験した。下表８に記載する結果が示すように、ｐａｌＢマイナス株はｐａｌＢプラス株よりもすぐれたセルラーゼ生産株であった。
実施例１４に記載するように、アスペルギルス・オリゼｐａｌＢマイナス突然変異株、アスペルギルス・オリゼｐａｌＢプラス株、およびアスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２からのゲノムＤＮＡのサザンブロットを実施して、ＡｓｅＩ／ＰｖｕＩ形質転換ＤＮＡフラグメントが完全な置換としてｐａｌＢ遺伝子座の中に組込まれたかどうかを決定した。
サザンブロットの結果（表８）が証明するように、ｐａｌＢマイナス株のいくつかは完全な分裂を有したが、他の株はもたなかった。
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実施例２６：ＡｓｎＩ／ＰｖｕＩマンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットを使用するアスペルギルス・オリゼの形質転換およびセルラーゼのスクリーニング
実施例５に記載する同一手順に従い、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットを含有する５．８ｋｂのＡｓｎＩ／ＰｖｕＩフラグメントを使用して、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２を形質転換した。
実施例１７に記載するように、２４の形質転換体を調製し、パラクアットに対する感受性について試験した。２０の形質転換体のうちの７つはマンガンスーパーオキシドジスムターゼマイナス表現型を示すパラクアット感受性であったが、それらは下表９に示すように異なるレベルのパラクアットに対して感受性である。パラクアット感受性について＋＋＋として示すものは２ｍＭ程度に低いパラクアットに対して感受性であるが、−および＋＋と表示するものは、それぞれ、パラクアットに対して感受性でなく、そして中間レベルのパラクアットに対して感受性である。形質転換体のすべてを胞子精製し、実施例２３に記載するように、２４ウェルの培養においてセルラーゼの生産について試験した。実施例２３に記載するように、また、株を１２５ｍｌの震盪フラスコの培養において試験した。結果を下表９に示す。パラクアット感受性である株は、パラクアット感受性ではない株よりも、平均して、より多いCAREZYMETMを生産する。
実施例１４に記載するように、形質転換体およびアスペルギルス・オリゼHowB432のサザンブロットを調製し、分析して、ＡｓｎＩ／ＰｖｕＩマンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットが組込まれて、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ分裂カセットの遺伝子座の中への完全な置換を与えたかどうかを決定した。
すべき９に記載するサザンブロットの結果が示すように、２ｍＭのパラクアットに対して感受性の株はマンガンスーパーオキシドジスムターゼの分裂した遺伝子座のみを有するが、中間レベルのパラクアットに対して感受性である株は野生型遺伝子座および分裂カセットの双方を有する。パラクアットに対して中間の感受性は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼがホモダイマーであり、そして分裂カセットによりコードされる野生型およびトランケートのマンガンスーパーオキシドジスムターゼが多分機能的ではないヘテロダイマーを産生するであろうという事実により説明することができる。
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実施例２７：グルコーストランスポーター遺伝子を過度に発現するプラスミドｐＨＢ２１８およびｐＤＳＹ１５３および停止制御プラスミドｐＤＳＹ１５２およびｐＤＳＹ１５５の構築
アスペルギルス・オリゼＤＥＢＹ５９９．３からのグルコーストランスポーターレスキュード遺伝子座を過度に発現するプラスミドを構築して、グルコーストランスポーターの過度の発現がフミコラ・ラヌギノサのリパーゼおよびセルラーゼの収量の増加に導くかどうかを決定した。グルコーストランスポーターのオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅して、それぞれ、５’および３’末端においてＳｗａＩおよびＰａｃＩ部位を配置した。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステムス３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で合成した下記のプライマーを、増幅において０．２μｇのｐＤＳＹ１１２と組み合わせて使用した：
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増幅のために使用した条件およびパラメーターは実施例２に記載する通りであった。１０μｇのＰＣＲ反応物をアガロースゲル上で電気泳動させ、そして期待されるように１．５ｋｂの生成物が得られた。製造業者のプロトコールに従いpPCR-ScripTMキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョラ）を使用して、ＰＣＲ生成物をクローニングした。結合反応物を使用して大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、QIAwell-8プラスミドキットを使用して、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、どのクローンが１．５ｋｂのインサートを有するかを決定した。分析した１１のクローンのうちの６つは、アガロースゲル上の電気泳動により、正しい大きさのインサートを有することが決定された。クローンの１つのｐＤＳＹ１１９をＰａｃＩおよびＳｗａＩで消化し、消化物をアガロースゲル上で展開させた。１．５ｋｂのＳｗａＩ／ＰａｃＩバンドをゲルから切除し、QIAquick Gel抽出キットを使用してゲルのスライスから精製した。標準的条件（Sambrook et al.、1989、前掲）下に、１．５ｋｂのフラグメントをＳｗａＩ／ＰａｃＩ切断ｐＢＡＮｅ１３（第３図）と結合した。結合物を使用して大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、形質転換体のいくつかからプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドをＳｗａＩ／ＰａｃＩで消化して、どのクローンが期待した１．５ｋｂのインサートを有するかを決定した。最終プラスミドをpHB218（第２７図）と表示した。
過度の発現の対照として、停止コドンがグルコーストランスポーターのオープンリーディングフレーム中のアミノ酸９に挿入されているｐＨＢ２１８の誘導体を部位特異的突然変異誘発により調製した。ＭＯＲＰＨTM部位特異的プラスミドＤＮＡ突然変異誘発キット５プライム→３プライムを突然変異誘発のために使用し、キットとともに提供されるプロトコールに従った。反応物は鋳型としてｐＨＢ２１８を含有し、使用した突然変異誘発プライマーは下記の通りであった：
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プロトコールに従っていくつかの大腸菌のコロニーが得られ、QIAwell-8プラスミドキットを使用してコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。突然変異誘発のためのマーカーとして働くＰａｃＩ部位を突然変異誘発プライマーが導入したので、プラスミドをＰａｃＩで消化した。成功した突然変異誘発を示す余分のＰａｃＩ部位を有するプラスミドの２つを実施例２に記載するように配列決定して、ＯＲＦ中のアミノ酸９における停止コドンの存在を確証した。アミノ酸９に停止コドンを有するｐＨＢ２１８誘導体をｐＤＳＹ１５２と表示した。
ｐｙｒＧプラスである株の形質転換のために、選択可能なマーカーがｂａｒ遺伝子であるｐＨＢ２１８およびｐＤＳＹ１５２の変異型を構築した。ｐＨＢ２１８およびｐＤＳＹ１５２からのＳｗａＩ／ＰａｃＩインサートを制限消化により単離し、アガロースゲル上で電気泳動させ、QIAquick Gel抽出キットを使用して精製した。インサートをｐＳＥ３９（第２８図）の中に結合し、ＳｗａＩ／ＰａｃＩで消化した。結合反応物を使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、前述したように、プラスミドＤＮＡをコロニーから単離した。プラスミドをＳｗａＩ／ＰａｃＩで消化して、どのクローンが期待する１．５ｋｂのインサートを含有するかを決定した。プラスミドを実施例２に記載するように配列決定して、それぞれ、ｐＤＳＹ１５５およびｐＤＳＹ１５３（第２９図）中のアミノ酸９における停止コドンの存在または非存在を確証した。ｐＤＳＹ１５５およびｐＤＳＹ１５３の間の唯一の差は、ｐＤＳＹ１５５中のＯＲＦのアミノ酸９における停止コドンであった。
実施例２８：ｐＨＢ２１８およびｐＤＳＹ１５２を使用するアスペルギルス・オリゼHowB430およびアスペルギルス・オリゼHowB432の形質転換および、それぞれ、リパーゼおよびセルラーゼのスクリーニング
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３０をｐＨＢ２１８またはｐＤＳＹ１５２で形質転換し、形質転換体を回収した。各々がｐＨＢ２１８およびｐＤＳＹ１５２を有する１２０の形質転換体が回収され、これらを２４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて１／１００強度のＭＹ２５中で成長させ、実施例８に記載するように、３および５日後にリパーゼ活性についてアッセイした。アッセイの結果が示すように、ｐＤＳＹ１５２の形質転換体に対してｐＨＢ２１８の形質転換体においてリパーゼ生産のより高い方に向かうシフトが存在し、グルコーストランスポーターの過度の発現がリパーゼの発現に対して陽性の作用を有するという考えを支持した。
実施例５に記載する方法に従い、アスペルギルス・オリゼＨｏｗＢ４３２をｐＨＢ２１８およびｐＤＳＹ１５２で形質転換し、形質転換体を回収した。各々がｐＨＢ２１８およびｐＤＳＹ１５２を有する１００の形質転換体が回収され、これらを２４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて１／４強度のＭＹ２５中で成長させ、実施例２３に記載するように、３および５日後にリパーゼ活性についてアッセイした。アッセイの結果が示すように、ｐＤＳＹ１５２の形質転換体に対してｐＨＢ２１８の形質転換体においてセルラーゼ生産のより高い方に向かうシフトが存在し、グルコーストランスポーターの過度の発現がセルラーゼの発現に対して陽性の作用を有することを示した。
例２９．ｐＤＳＹ１５３及びｐＤＳＹ１５５を用いたＡspergillus oryzae ＤＥＢＹ１０．３の形質転換及びリパーゼスクリーニング
Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ１０．３を、ｐＤＳＹ１５３及びｐＤＳＹ１５５で形質転換し、形質転換体を例５で記述した方法を用いて回収した。ｐＤＳＹ１５３及びｐＤＳＹ１５５でそれぞれ２１６及び１４４の形質転換体を回収し、1/100強度のＭＹ２５中で、２４ウェルのマイクロタイター平板内で成長させ、例８で記述した通りに４日目と６日目にリパーゼ活性について検定した。ｐＤＳＹ１５３形質転換体内ではｐＤＳＹ１５５形質転換体に比べて高いリパーゼ産生に向かってのシフトが存在し、このことはグルコース輸送体の過剰発現がリパーゼ産生の増加を導いたことを表わし、又、paＩＢマイナス効果とグルコース輸送体の過剰発現が相加的であることを示唆していた。
例３０．Ａspergillus oryzae ＨowＬ７９５内のタグ付けされた事象の同定
例９に従って、Ａspergillus oryzae ＨowＬ７９５からゲノミックＤＮＡを調製した、ＳnaＢ１又はＮsiＩのいずれかを用いて１μｇのＤＮＡを消化した。両方の酵素共、タグ付け構成体上に含まれたpyrＧ遺伝子内で分割する。その後、ＤＮＡを４ｎｇ／μｌまで希釈し、１８時間２２℃でＴ４リガーゼを用いて再度環状化した。その後、メーカーの指示事項に従ってＡpplied Biosystemsの３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成した以下に示すプライマを使用して、再環状化されたＤＮＡ約５００ｎｇを用いて逆ＰＣＲを行なった。両方のプライマ共、ＮsiＩ及びＳnaＢＩ部位の下流に位置づけされていた。
0004436934.tif 000021
逆ＰＣＲ増幅反応は、以下の構成成分を含んでいた：５００ｎｇの再環状化されたＤＮＡ，１５０p molesのプライマｘ，１５０p molesのプライマｙ、各々１ｍＭずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，及びｄＴＴＰ，１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液、及び２．５ＵのＴaqポリメラーゼ。以下のようにプログラミングされたEricomp Thermal Cyclerの中で反応をインキュベートした：５分間９５℃で１サイクル、それに続いて各々１分間９５℃，１分間５５℃，及び２分間７２℃で３０サイクル。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
再連結されたＳnaＢＩ  ＤＮＡのＰＣＲは、４ｋｂのフラグメントを増幅させたのに対し、再連結されたＮsiＩＤＮＡは、２ｋｂのフラグメントを増幅させた。ＰＣＲは、より大きいＳnaＢＩフラグメント内により小さいＮsiＩフラグメントが含まれていることを確認した。
プライマＡを用いて例２に記述されている手順に従ってＤＮＡ配列分析を行なった。この分析は、プラスミドｐＢＡＮｅ８内に含まれたamdＳ遺伝子の３’未翻訳領域内でｐＳＯ１２２の挿入が起こることを同定した。
例３１：Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７の構築
ｐＭＳtr１５からのＤＮＡフラグメントを用いてＡspergillus oryzae How Ｂ１０１を形質転換することにより、未縮重アルファアミラーゼ（TAKA）遺伝子（FUNGAMYLTM遺伝子、Ｎovo ＮordiskＡ／Ｓ．Ｂagsvaerd.デンマーク）のうちの１つの遺伝子の追加コピーを含むように、Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７を構築した。ｐＭＳtr１５を、以下で記述するように、ｐＣａＨｊ５０５及びｐＴＡＫＡ１７から構築した。指摘がある場合を除き、標準的方法（Sambrook et al.,１９８９，前出）を利用した。
以下のフラグメントから、Ａspergillus oryzae ＮＡ−１４アルファアミラーゼ（ＴＡＫＡ）プロモータ，Ａspergillus nigerグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）ターミネータ及びＡspergillus nidulans amd Ｓ遺伝子を含むように、ｐＣａＨｊ５０５（図３０）を構築した：
ａ）ＥcoＲＩ及びＸbaＩで消化したベクターｐＴｏＣ６５（Ｗ０９１／１７２４３）：
ｂ）amd Ｓ遺伝子を支持するＡspergillus nidulansからの２．７ｋｂのＸbaＩフラグメント（Ｃorrick et al.,１９８７．Ｇene５３：６３−７１）。真菌形質転換においては、選択性マーカーとしてamdＳ遺伝子を用いた。amdＳ遺伝子は、この遺伝子内に通常存在するＢamＨＩ部位が破壊されるような形で修飾された。これは、AGAAATCGGGTATCCTTTCAG（配列番号４９）を用いて、沈黙点突然変異を導入することによって行なわれた。
ｃ）Ａspergillus oryzae ＮＡ−１４アルファアミラーゼプロモータを支持する０．６ｋｂのＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメント、
ｄ）Ａspergillus’nigerグルコアミラーゼ転写ターミネータを支持する６７５ｂｐのＸbaＩフラグメント。プラスミドｐＩＣＡＭＧ／Ｔerm（ＥＰ２３８０２３）からフラグメントを分離した。フラグメントｃのＢamＨＩ部位を、ｐＩＣ１９Ｒリンク（ＢamＨＩからＸbaＩ）を介して、フラグメントｄ上の転写ターミネータの前のＸbaＩ部位を連結させた（Boehringer Mannheim,Indianapolis.ＩＮ）。
Ａspergillus oryzae ＮＡ−１４アルファアミラーゼプロモータ、遺伝子及びターミネータ、及びＡspergillus nidulans amd Ｓ遺伝子を含むように、ｐＭＳtr１５（図３１）を構築した。プロモータ及びターミネータを伴うアルファアミラーゼ遺伝子を、２．９ｋｂのＥcoＲＩ−Ｈind IIIフラグメントとしてＰＴＡＫＡ１７から切除し（欧州特許０２３８０２３号）、ベクターｐＣａＨｊ５０５内でＥcoＲＩ−ＸbaＩプロモータ／ターミネータフラグメントを置換することによって、このベクターｐＣａＨｊ５０５内のamdＳ遺伝子に隣接してクローニングさせた。クローニングを容易にするため、Ｈind III及びＸbaＩ消化によって生成された陥凹３’末端を充てんした。
ＮotＩでｐＭＳtr１５を消化し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクター及びインサート配列を分解させ、ゲルから適切なＤＮＡバンドを切除し、メーカーの指示（Supelco,Bellefonte,ＰＡ）に従ってGen EluteTMアガローススピンカラムを用いてアガロースからＤＮＡを精製することによって、アルファアミラーゼ遺伝子及びamdＳ遺伝子の両方を含む単一の線形ＤＮＡフラグメントを得た。例２で記述した形質転換プロトコル及び選択培地を用いて、Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７を構築するよう、Ａspergillus oryzae ＨowＢ１０１を形質転換するべく、この５．６ｋｂのＮotＩフラグメントを用いた。付加的なスクリーンを行なう前に、０．１％のトリトンＸ１００を伴うＣＯＶＥ培地上で連続２回、単集落から形質転換体を増殖させた。
Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７は、Ａspergillus oryzae ＨowＢ１０１よりも多くのアルファアミラーゼを産生するその能力に基づいて、形質転換体の中から選択された。アルファアミラーゼを産生する形質転換体の能力は、３０℃で４日間１０ｍｌのＹＰＭ培地内でそれらを振とうさせながら培養し、標準的方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより５μｌの培地を分解することによって決定された。これらの条件下で大部分のアルファアミラーゼを産生する菌株をＡspergillus oryzae ＭＳtr１０７として選択し、３リットルの発酵培地内でＡspergillus oryzae ＨowＢ１０１と比較した。培地は、マルトースシロップ、酵母エキス、ＫＨ2ＰＯ4，Ｋ2ＳＯ4，（ＮＨ4）2ＳＯ4，クエン酸、ＭｇＳＯ4，極微量の金属及びウリジンで構成されていた。これらの条件下で、Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７は、３６０％のＡspergillus oryzae ＨowＢ１０１を産生した。
例３２：線形化されたｐＤＳＹ８２でのＡspergillus oryzae Ｍstr１０７形質転換
例２に記述されている通りに、Ａspergillus oryzae Ｍstr１０７の原形質体を調製した。１．２５ＵのＸbaＩで線形化されたｐＤＳＹ８２（６μｇ）の５〜１５μｌのアリコートを、１４ｍｌ入りＦalconポリプロピレン試験管内で１ｍｌあたり２×１０7個の原形質体という濃度で、０．１ｍｌの原形質体に添加し、その後、６０％のＰＥＧ４０００−１０ｍＭのＣａＣｌ2−１０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７を２５０μｌ加え、穏やかに混合し、３０分間３７℃でインキュベートした。その後、３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、懸濁液を穏やかに混合した。１２ｍｌの融解したオーバーレイ寒天（１×ＣＯＶＥ塩、１％のＮＺアミン、０．８Ｍのスクロース、０．６％のノーブル寒天）又は３ｍｌのＳＴＣ培地と懸濁液を混合し、最小培地平板上に注ぎ込んだ。平板を３〜５日間、３７℃でインキュベートした。
ｐＤＳＹ８２及びＸbaＩを用いたＡspergillus oryzae ＭＳｔ１０７の形質転換頻度は、ＤＮＡ１μｇにつき約２００の形質転換体であった。約３００００の形質転換体のライブラリが得られた。各プール内に約４００の形質転換体を伴う７０プールからの胞子を収集し、２０％のグリセロール、０．１％のTween８０中で−８０℃で保存した。これらのライブラリからプール及び形質転換体は、「Ｘ」という文字で示されている。
例３３：「ＲＥＭＩ」Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７形質転換体中の組込み事象の特徴づけ
例６に記述されているとおりに、ｐＤＳＹ８２及びＸbaＩでのＡspergillus oryzae ＭＳtr１０７の形質転換体（ライブラリ「Ｘ」）を分析した。プール（Ｘ１５）から２０，２０のさまざまなプールから２０の合計４０の形質転換体から、ゲノミックＤＮＡを分離した。ＤＮＡ標本をＨind IIIで切断し、分解し、ブロットし、放射標識付けしたｐＤＳＹ８２でプローブ探査した。４０のうち３３が、見かけ上新規のバンドパターンを表わし、プラスミドの組込みがゲノム内の異なる部位に分散していること示唆していた。４０の形質転換体のうち１９について、バンドパターンは、ゲノム内にｐＤＳＹ８２のコピーがわずか１つしか組込まれなかったことを示唆しており、一方残りの２１の形質転換体内には複数のコピーが見られた。さまざまなプールからとられた２０の形質転換体からのＤＮＡも同様に、例６で記述したとおり、ＸbaＩで切断し、分解し、ブロットし、放射標識づけしたｐＤＳＹ８２でプローブ探査した。単一のプラスミドサイズのバンドが観察され、ＲＥＭＩが９つの形質転換体の中でＸbaＩ部位で起こったことを示していた。
例３４：ＦＵＮＧＡＭＹＬTM発現スクリーニング
例３２で記述されたＡspergillus oryzaeのＭＳtr１０７でタグ付けされた突然変異体ライブラリ「Ｘ」プールを、ＦＵＮＧＡＭＹＬTM発現について検定した。
９６ウェルの平板スクリーンについて、ＭＴＢ−ＣＤＹＵ培地を使用した。２４ウェル平板方法については、４×ＭＴＢＣＤＹＵ培地を使用した。
一次９６ウェル平板スクリーンには、ウェル内に１００μｌの培地が送り出された時点で１ウェルあたり平均１つの胞子が接種されるような形で、ＭＴＢＣＤＹＵ内への異なるプールからの胞子の希釈が関与していた。接種の後、９６ウェルの平板を３〜４日間３４℃の静的条件下で成長させた。その後、以下に記述する通り、ＦＵＮＧＡＭＹＬTM活性について培養を検定した。問題の突然変異体を、ＹＰＧ又はＣove平板上で２度分離させ、単集落をＣove寒天斜面に移した。Ｃove斜面からの胞子を、ウェルあたり約１０3個の胞子を伴う４×ＭＴＢＣＤＹＵを含む２４ウェル平板の中に接種し、３４℃で４日間静的条件下で成長させた。その後培養を、以下で記述する通り、ＦＵＮＧＡＭＹＬTM活性について検定した。
メーカー（Boehringer Mannheim,Indianapolis,ＩＮ）により与えられた指示事項との関係において、1/2の強度の溶液としてＦＵＮＧＡＭＹＬTM検定基質（４−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−マルトヘプタシド−４．６−０−エチリデン、ＥＰＳ）を調製した。ＨＥＰＥＳｐＨ７．０の緩衝液の中で基質を調製した。ＨＥＰＥＳｐＨ７．０の緩衝液中に２ＦＡＵ／ｍｌを含有するように、ＦＵＮＧＡ−ＭＹＬTM標準（ＦＵＮＧＡＭＹＬTM，Ｎovo Nordisk Ａ／Ｓ，Bagsvaerd,Denmark）を調製した。使用するまでこの標準を−２０℃で保存した。使用直前に０．０２〜０．２ＦＡＵ／ｍｌの標準系列を得るべく、ＦＵＮＧＡＭＹＬTM株を適切に希釈させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液中で肉汁標本を希釈させ、２５μｌのアリコートを９６ウェル平板内のウェルに送り出し、その後１８０μｌの希釈した基質を送り出した。平板読取り装置を用いて、４０５ｎｍでの吸収度を約１分の間隔で読みとった２つの値の差として記録した。ＦＵＮＧＡＭＹＬTM標準溶液との関係においてＦＵＮＧＡＭＹＬTM単位／ｍｌ（ＦＡＵ／ｍｌ）を計算した。
９６ウェルスクリーンとそれに続く２４ウェルスクリーンの結果から、ｐＤＳＹ８２及びＸＢａＩ形質転換からの５１の形質転換体がさらなる評価のために同定された。これらの同定された形質転換体は、対照株Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７よりも高いレベルのＦＵＮＧＡＭＹＬTMを産生した。
例３５：振とうフラスコ及び発酵評価
例３４中に記述されているＦＵＮＧＡＭＹＬTMを最高に産生するＤＮＡタグ付き突然変異体を、振とうフラスコ及び発酵装置内で評価した。
振とうフラスコ評価は、５００ｍｌ入り振とうフラスコ内でｐＨ７．０のＧｌ−gly培地１００ｍｌの中に、０．０２％のＴＷＥＥＮ−８０を含む適量の無菌水内で懸濁させたＣＯＶＥ斜面の胞子含有量の半分を接種することによって行なわれた。Ｇｌ−gly振とうフラスコを、２７０ｒｐｍで１日間３４℃でインキュベートした。次に、５ｍｌのＧ１−gly培地を、５００ｍｌ入り振とうフラスコ内で１００ｍｌのｐＨ６．５の1/5ＭＤＵ２ＢＰ内に接種した。３日目に標本を採取し、例３４で記述したとおりにＦＵＮＧＡＭＹＬTM活性を測定した。
Nutriose,酵母エキス、ＭｇＳＯ4，ＫＨ2ＰＯ4，クエン酸，Ｋ2ＳＯ4，（ＮＨ4）2ＳＯ4及び超微量金属の溶液から成る培地を含む３リットルの１ab発酵装置の中で、ＤＮＡタグ付き突然変異体Ｘ７０−２５及び２５７Ｄ１１を成長させた。３４℃の温度、ｐＨ７で発酵を行ない、１０００〜１２００ｒｐｍの間で５日間撹拌を維持した。ＥＰＳからＧ2及びＧ3誘導体（Ｇ＝グルコース）への部分的分解により、ＦＵＮＧＡＭＹＬTM活性を測定した。その後、余剰のアルファ−グルコシダーゼを添加することによって、Ｇ2及びＧ3誘導体をグルコース及び黄色がかったｐ−ニトロフェノレート陰イオンへと分解した。２．５分間の予備インキュベーションの後、３７℃及びｐＨ７．１で、単位時間（３分）あたり４０５ｎｍでの吸収度の変化として分析出力を決定した。ＦＵＮＧＡＭＹＬTMを標準として用いた。
得られた結果は、対照としてのＡspergillus oryzae ＭＳtr１０７のＦＵＮＧＡＭＹＬTM収量が１．０に正規化された下表１０に示されている。
0004436934.tif 000022
表１０に示されている通り突然変異体は、２４ウェル平板中で成長させられたとき及び振とうフラスコ内で成長させられたとき、対照菌株Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７におけるよりも約３０〜６０％多くＦＵＮＧＡＭＹＬTMを産生した。突然変異体Ａspergillus oryzae Ｘ７０−２５は、発酵装置内で成長させられたとき、対照菌株Ａspergillus oryzae ＭＳtr１０７よりも約２０％多くＦＵＮＧＡＭＹＬTMを産生した。
例３６：形態突然変異体についてのスクリーニング
例５に記述された５つの「ｅ」プール及び５つの「ｂ」プールを、ＣＭ−１寒天上で平板固定し３４℃で４日間インキュベートすることによって、変化した形態についてスクリーニングした。
変化した平板形態を有しプール内の形態的変動を網羅する２４のコロニーを新鮮なＣＭ−１  平板内に移し、単集落分離のため３４℃で５日間インキュベートした。平板上の各々の形態（大部分の場合１）を単集落からＣＭ−１平板及びＰＤＡ平板の中心まで移し、６〜８日間３４℃でインキュベートし、その後、形態すなわち直径及び外観を評価した。合計２１８の形態突然変異体をＣＯＶＥ平板に移し、１，２週間３４℃でインキュベートして胞子を生成させた。
例３７：形態突然変異体の評価
例３６で分離された形態突然変異体を、例７に記述されている手順に従ってリパーゼ産生のため、２４ウェルの平板内で評価した。収量が最も多い突然変異体を、ＣＭ−１寒天上の平板形態との関係において比較し、観察された形態的変異を網羅する２３の突然変異体を、ＣＤ培地を含む振とうフラスコ内でさらにテストしてリパーゼ産生を評価した。
１２５ｍｌ入りＰＰフラスコ内の２５ｍｌのＧ１−gly培地の中に、ＣＭ−１平板からの約０．２５ｍｌの胞子懸濁液を接種し、２４時間３４℃でインキュベートした。その後、１２５ｍｌ入りのＰＰフラスコの中で１．０μｌのＦＵＮＧＡＭＹＬTM８００Ｌ（Novo NordiskＡ／Ｓ,Bagvaerd,Denmark）を補足した５０ｍｌのＣＤ培地に、０．５ｍｌの２４時間の種子フラスコを移し、２００rpm，３４℃でインキュベートした。２〜３日後に、培地を標本採取し、図７に記述された通りに、リパーゼ活性について検定した。
分離した突然変異体は又、酵素が制限された培地内で以下の要領でテストされた。すなわち、Ａspergillus oryzae Ｈow  Ｌ５３６．３が野生型形態をもち成長のためにウリジンを必要としなかったことから、これを対照として使用した。２５ｍｌのＯＬ−１培地を含む１２５ｍｌ入りの振とうフラスコ内に約２５０μｌの胞子懸濁液を接種し、ＤＩＡＳＴＩＸTM（Bayer,Ｅｌｋhart,ＩＮ）を用いて測定した残留グルコースが、１ｇ／ｌ未満となるまで２００rpm，３４℃でインキュベートした。その後、７５ｍｌのＯＬ−６培地を各フラスコに添加し、Ａspergillus oryzae ＨowＬ５３６．３フラスコ内の残りのグルコースが約５ｇ／ｌとなるまで約２５時間２００rpm，３４℃でさらにインキュベートした。この時点で、残りのグリコースについて全てのフラスコを検定し、著しく低いグルコース（０〜２ｇ／ｌ）を伴うフラスコを陽性とみなした。大部分のフラスコは、平均５〜１０ｇ／ｌ前後であった。
平均より速くグルコースを転換させる２０の突然変異体を、通気が比較的容易となりうるものとみなし、リパーゼ発現を評価するため上述の通りＣＤ培地の入った振とうフラスコ内でさらにテストした。
これらのテストに基づいて、１４の突然変異体を同定し、例８で記述した手順に従って、実験室用発酵装置内でさらにこれを評価した。下表１１に列挙した形態突然変異体が同定された：
0004436934.tif 000023
例３８：形態突然変異体からのプラスミドＤＮＡ及びフランキングＤＮＡの救援
制限エンドヌクレアーゼが使用されるという点を除いて、例９に記述された手順を用いて、突然変異体Ａspergillus oryzae Ｐ４−８．１及びＰ７−１４．１からプラスミドＤＮＡ及びゲノミックフランキング遺伝子座を分離した。形質転換体Ｅ.coli ＨＢ１０１Ｐ４−８．１は、突然変異体Ａspergillus oryzae Ｐ４−８．１からのＢgl II救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体Ｅ.coli ＨＢ１０１Ｐ７−１４．１は、突然変異体Ａspergillus oryzae Ｐ７−１４．１からのＮarＩ救援遺伝子座を含んでいた。
プラスミドＤＮＡ及びゲノミックフランキング遺伝子座を突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ７−１７．２，ＤＥＢＹ３−２．１，ＤＥＢＹ５−７．１，及びＤＥＢＹ８−１０．１から分離した。救援されたプラスミドは、救援されたｐＳＭＯ７１７，ｐＳＭＯ３２１，ｐＨowＢ５７１，及びｐＳＭＯ８１０が形質転換されたＥ.coli ＤＨ５α細胞から分離されたという点を除いて、例９で前述した通りに生成された。
形質転換体Ｅ．coliＤＨ５αｐＳＭＯ７１７は、突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ７−１７．２からのＢgl II救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体Ｅ.coli ＤＨ５αｐＳＭＯ３２１は、突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ３−２．１からのＢgl II救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体Ｅ.coli ＤＨ５αｐＨowＢ５７１は、突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ５−７．１からのＮdeＩ救援遺伝子座を含んでいた。形質転換体Ｅ.coli ＤＨ５αｐＳＭＯ８１０は、突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ８−１０．１からのＮdeＩ救援遺伝子座を含んでいた。
例３９：形態突然変異体Ａspergillus oryzae Ｐ４−８．１救援遺伝子座ｐ４−８．１の特徴づけ
組込み事象のいずれかの側に９１５及び６６５ｂｐの領域を含むＡspergillus oryzae Ｐ４−８．１救援遺伝子座ｐ４−８．１を、例２に記述された手順に従って配列決定した。図３２には、核酸配列（配列番号５０）及び演繹されたアミノ酸配列（配列５１）が示されている。核酸配列は、組込み事象が、Saccharomyces cerevisiae  ＹＨＭ４熱ショックタンパク質遺伝子の相同体について読取り枠内で発生したことを示唆している。演繹されたアミノ酸配外（配列番号５１）は、Saccharomyces cerevisiae  ＹＨＭ４熱ショックタンパク質（配列番号５２）に対する４０．２％の同一性と、Schizzosaccharomyces pompe熱ショックタンパク質７０（配列番号５３）に対する４１．８％の同一性を示した。
例４０：Ｂgl IIで線形化されたＰ４−８．１でのＡspergillus oryzaeの形質転換及び形態スクリーニング
Ａspergillus oryzae Ｐ４−８．１について観察された平板形態と救援されたゲノミック遺伝子座の間のリンクを確認するため、例５に記述した手順を用いて、Ａspergillus oryzae Ｐ４−８．１のＢgl II線形化救援遺伝子座Ｐ４−８．１を用いて、Ａspergillus oryzae Ｈow  Ｂ４３０を形質転換した。
６６の形質転換体が得られ、これをＣＭ−１寒天に移し、形態を評価するため３〜４日間３４℃でインキュベートした。正しい平板形態をもつ１６の形質転換体を、中心コロニーとして新鮮なＣＭ−１平板に移し、３４℃で４日間の後平板形態を維持している１２の形質転換体を、プローブとして救援された遺伝子座のＰＣＲ増幅された３００ｂｐのフラグメントを用いてサザンブロット分析によって分析した。メーカーの指示事項に従ってＡpplied Biosystems ３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で合成された以下のプライマを用いて、フラグメントをＰＣＲ増幅した。
0004436934.tif 000024
増幅反応（５０μｌ）は、以下の構成成分を含有していた：０．２ｎｇのｐ４−８．１，５０p molのプライマＨＳＰ−１，５０p molのプライマＨＳＰ−３ｒ，各々０．２５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ，１ｘＴaqポリメラーゼ緩衝液及び２．５ＵのＴaqポリメラーゼ。以下のようにプログラミングされたEricomp Thermal Cyclerの中で反応をインキュベートした：３分間９５℃で１サイクル；各々１分間９５℃，１分間５８℃，及び１．５分間７２℃で３０サイクル、そして５分間７２℃で１サイクル。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
例９に記述した方法に従って得られた１２の形質転換体の各々から、ゲノミックＤＮＡの標本を得た。ゲノミックＤＮＡをＢgl IIで消化し、例１４に記述されている手順に従ってサザン分析に付した。
１２の形質転換体全てが、救援された遺伝子で割当てられ、この遺伝子座と観察された平板形態の間の関わり合いを示唆していた。
例４１：形態突然変異体Ａspergillus oryzae
Ｐ７−１４．１の救援遺伝子座ｐ７−１４．１の特徴づけ
組込み事象のいずれかの側に１０４０及び５２０ｂｐの領域を含むＡspergillus oryzae Ｐ７−１４．１の救援遺伝子座ｐ７−１４．１を、例２で記述した手順に従って配列決定した。図３３には、核酸配列（配列番号５６）及び演繹されたアミノ酸配列（配列５７）が示されている。核酸配列は、組込み事象が、Ａspergillus nidulansキチンシンターゼＢ（chs Ｂ）遺伝子及びＡspergillus fumiganusキチンシンターゼＧ（chs Ｇ）遺伝子の相同体について読取り枠内で発生したということを示唆している。救援された遺伝子座の両側の演繹されたアミノ酸配列（配列番号５７），chs Ｂ遺伝子（配列番号５８）及びchs Ｇ遺伝子（配列番号５９）を比較すると、９４％及び８０％の同一性が発見された。
Ａspergillus nidulans内のchsＢ遺伝子の分断は、形態を大幅に変えることが知られており（Ｙanai et al.,１９９４，Biosci,Biotech,Biochem.５８：１８２８−１８３５），Ａspergillus fumigatus内では、chs Ｇ遺伝子の分断が、Ａspergillus oryzae Ｐ７−１４．１の観察された表現型であるコロニー状の形態をひき起こすことがわかっている（Mellado et al.,１９９６，Molecular Microbiology２０；６６７〜６７９）。
例４２：線形chsフラグメントでのＡspergillus oryzaeの形質転換及び形態スクリーニング
例６で記述されている通りに調製したＡspergillus oryzae How Ｂ４３０ゲノミックＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲにより１．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを生成した。救援されたchsＡspergillus oryzae相同体から、プライマＡ，５’−ＣＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＧＴＣ−３’（配列番号６０）を誘導した。Ａspergillus fumigarus chsＧ及びＡspergillus nidulanns chsＢ遺伝子のコンセンサス配列に基づいて、プライマ５，５’−ＧＧＩＣＣＩＴＴＹＧＡＹＧＡＹＣＣＩＣＡ−３’（配列番号６１）を縮重したものであった。増幅反応（５０μｌ）には、以下の構成成分が含まれていた：１０ｎｇのｐＨＢ２２０，４８．４p molの各プライマ、各々１ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，及びｄＴＴＰ及びAdvantage−ＧＣTMＴth Polymerase Mix（Clon tech,Palo Alto,CA）。以下のようにプログラミングされたEricomp Thermal Cyclerの中で反応をインキュベートした：３分間９５℃で１サイクル；各々１分間９５℃，１分間５８℃，及び３分間７２℃で３０サイクル、及び５分間７２℃で１サイクル。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ−ブラントクローニングベクター（Invitrogen,San Diego,ＣＡ）へとクローニングした。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充てんすることにより、マルチクローニング部位内のHind III部位を破壊した。Bialaphosに対する耐性を付与するBasta遺伝子を含む２ｋｂのHind III−ＥcoＲＩフラグメントをｐＭＴ１６１２（図３４）から得、chsフラグメントの中で約０．７ｋｂのところに位置づけされたchs Hind III部位の中に挿入した。結果として得られたプラスミドをｐＨＢ２２０と標識づけした。
鋳型としてｐＨＢ２２０を用い、プライマＡ及び5’-GGGCCGTTTGACAATCCGCAT-3’（配列番号６２）を使用して、４ｋｂのＰＣＲフラグメントを生成した。増幅反応は、以下のようにプログラミングされたEricomp Thermal Cyclerの中で反応をインキュベートしたという点を除き、上述の通りに実施した：３分間９５℃で１サイクル；各々１分間９５℃、１分間５８℃，及び６分間７２℃で３０サイクル、及び５分間７２℃で１サイクル。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離した。
次に、例５に記述された手順に従ってＡspergillus oryzae ＨowＬ７９５から調製された原形質体を形質転換するために、直接ＰＣＲフラグメントを使用した。１００個の形質転換体のうち、３つが、最小培地平板及びＰＤＡ平板上で「コロニー状の」平板形態を有すると思われた。
２ｋｂのＤＩＧ標識づけされたchsフラグメントをプローブとして用いて、対照としてのＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０と３つの形質転換体について、サザン分析を行なった。例９に記述されている通りに、３つの菌株及び対照菌株からゲノミックＤＮＡを調製した。Hind IIIで消化した３つの形質転換体の各々からのゲノミックＤＮＡの標本を、例１４に記述した手順に従ってサザン分析に付した。
サザン分析は、３つの形質転換体の各々が、chs/basta構成体を野生型chs遺伝子と置換する遺伝子置換を受けていたことを示した。結果は、chsでタグ付けされた菌株Ａspergillus oryzae Ｐ７−１４．１内で観察されたコロニー形態がchs遺伝子の突然変異と関連性をもつことを確認するものであった。
例８に記述されたとおりに行なわれたＭＹ２５培地を含む振とうフラスコ培養の中に、コロニー形態に対するchs遺伝子の明白な効果が観察された。肉汁の中のコロニーの沈殿物質量は、Ａspergillus oryzae How Ｌ７９５に比べてＡspergillus oryzae How Ｌ７９５のchs突然変異体において密度が低いと思われた。
chs遺伝子の遺伝子分断を含むＡspergillus oryzae How Ｌ７９５の２つの誘導体について、例８で記述された通りに発酵も行なった。両方の菌株内のリパーゼ収量は、Ａspergillus oryzae How Ｌ７９５よりも約２１％多いものであった。酵素産生の反応速度は、発酵の後方段階においてchs突然変異体で速くなったと思われ、このことはこれらの菌株がより最適なタンク形態を示したことを示唆していた。
例４３：形態突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ７−１７．２の救援遺伝子座ｐＳＭＯ７１７の特徴づけ
例２で記述した方法に従って、４００ｂｐを含んだＡspergillus oryzae ＤＥＢＹ７−１７．２救援遺伝子座ｐＳＭＯ７１７を配列決定した。核酸配列（配列番号６３）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号６４）は図３５に示されている。演繹されたアミノ酸配列（配列番号６４）は、Ａspergillus nidulans（ＡＣ０００１３３）のＯＲＦの演繹されたアミノ酸配列（配列番号６５）に対する４４％の同一性を示した。
例４４：形質突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ３−２．１の救援遺伝子座ｐＳＭＯ３２１の特徴づけ
１．０ｋｂを含むＡspergillus oryzae ＤＥＢＹ３−２．１の救援遺伝子座ｐＳＭＯ３２１を、例２で記述した方法に従って配列決定した。図３６に示した核酸配列（配列番号６６）は、公表されたいずれの配列に対しても全く相同性を示さなかった。
救援プラスミドｐＳＭＯ３２１のいずれかの末端からのプローブをＰＣＲにより生成した。以下に示すプライマ９７０８５０及び９７０８５１を用いてプローブ５を生成した。以下に示すプライマ９７０８５２及びプライマ９７０８５３を用いてプローブ６を生成した。メーカーの指示事項に従ってＡpplied Biosystemsの３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いてこれらのプライマを合成した。５０μｌのＰＣＲ標識付け反応のための鋳型は１０ｎｇの救援プラスミドｐＳＭＯ３２１であった。ＰＣＲのサイクル及び条件は、例２０で記した通りであった。
0004436934.tif 000025
ＳphＩ，ＳalＩ及びＢamＨＩで消化されたＡspergillus oryzae How Ｂ４３０ゲノミックＤＮＡのサザンブロットを、例１４に記述した方法に従って調製し分析した。ブロットを、救援プラスミドの末端から作られたプローブ５及び６に対し独立してハイブリッド形成させた。
サザンブロットの分析は、いかなる欠失も発生しなかったことを示唆していた。プライマ０９０８５０及び０９０８５２を用いてＡspergillus oryzae How Ｂ４３０から５００ｎｇのゲノミックＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった時点で、予測通り、５００ｂｐの産物が増幅され、いかなる欠失も起こらなかったことを確認した。
例９に記述した通りタグ付けされた突然変異体菌株Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ３−２．１からゲノミックＤＮＡを調製し、ＲＥＭＩのために用いた制限酵素（Bam ＨＩ）で消化し、ブロットし、Ａspergillus oryzae pyr ＧからＮheＩフラグメントでプローブ探査した。このブロットのサザン分析は、タグ付けされたプラスミドが、ゲノム内のBamＨＩ部位内に挿入されたことを示唆していた。
例４５：形態突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ５−７．１の救援遺伝子座ｐＨowＢ５７１の特徴づけ
例２に記述した方法に従って、６００ｂｐを含むＡspergillus oryzae ＤＥＢＹ５−７．１の救援遺伝子座ｐＨowＢ５７１を配列決定した。図３７に示された核酸配列（配列番号７１）は、公表されているいずれかの配列に対しても全く相同性を示さなかった。
タグ付け中に欠失が発生したか否かをテストするために、ＳphＩ，ＳalＩ及びＢamＨＩで消化させたＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０からのゲノミックＤＮＡを用いて例１４で記述した方法に従ってサザンブロットを調製し分析した。ＰＣＲにより、救援されたタグ付きプラスミドｐＳＭＯ５７１のいずれかの末端からのプローブを生成した。以下に示すプライマ９７０９３６及びプライマ９７０９３７でプローブ７を生成した。以下に示すプライマ９７０９３８及びプライマ９７０９３９でプローブ８を生成した。これらのプライマは、メーカーの指示事項に従い、Ａpplied Biosystems ３９４型のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成した。ＰＣＲ標識付け反応のための鋳型は、１０ｎｇのｐＳＭＯ５７１であった。ＰＣＲのサイクル及び条件は、例２０に記した通りであった。
0004436934.tif 000026
結果は、両方のプローブからの同一の横縞模様を示し、いかなる欠失も発生しなかったことを示唆していた。例２０に記述した方法を用いて、いかなる欠失も発生しなかったことを確認するためＰＣＲを使用した。プライマ９７０９３６及びプライマ９７０９３９と共に鋳型としてＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０からの合計５００ｎｇのゲノミックＤＮＡを使用した。予測通り、５５０ｂｐの産物を増幅した。pyr ＧのＮheＩフラグメントに対しハイブリッド形成させられた、ＢamＨＩで消化させたタグ付き突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ５−７．１から得たゲノミックＤＮＡからのサザンのデータは、タグ付きプラスミドがゲノム内でＢamＨＩ部位内に挿入されたことを示唆していた。サザンブロット条件は以上で記述した通りである。
サザン及びＰＣＲ分析は、タグ付きプラスミドがＢamＨＩ部位内に直接挿入されたことを立証した。Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ５−７．１の救援末端からのプライマでＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０ゲノミックＤＮＡを用いて生成されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯｐＣＲ１１ベクターでクローニングしその後例２に従って配列決定することで、この結果が確認された。
例４６：形態突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ８−１０．１  ｐＳＭＯ８１０の特徴づけ
７５０ｂｐを含むＡspergillus oryzae ＤＥＢＹ８−１０．１の救援遺伝子座ｐＳＭＯ８１０を、例２に記した方法に従って配列決定した。図３８に示された核酸配列（配列番号７６）は、公表されているいずれの配列に対しても全て相同性を示さなかった。
ＰＣＲにより、救援されたタグ付きプラスミドｐＳＭＯ８１０のいずれかの末端からのプローブを生成した。以下に示すプライマ９７０８５４及びプライマ９７０８５５でプローブ９を生成した。以下に示すプライマ９７０８５６及びプライマ９７０８５７でプローブ１０を生成した。これらのプライマは、メーカーの指示事項に従い、Ａpplied Biosystems ３９４型のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成した。ＰＣＲ標識付け反応のための鋳型は、１０ｎｇのｐＳＭＯ８１０であった。ＰＣＲのサイクル及び条件は、例２０に記した通りであった。
0004436934.tif 000027
サザン分析を、例１４に記述した通りに行なった。プローブ９及び１０で独立してハイブリッド形成されたＳphＩ，ＳalＩ及びＢamＨＩで消化されたＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０からのゲノミックＤＮＡのサザン分析は、タグ付きプラスミドの挿入中いかなる欠失も発生しなかったこと示唆していた。プライマ９７０８５４及びプライマ９７０８５６と共に鋳型としてＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０のゲノミックＤＮＡを合計５００ｎｇ使用したＰＣＲは、欠失無しで、予測通り５５０ｂｐの産物を増幅した。突然変異体Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ８−１０．１から調製され、ＥcoＲＩで消化されpyrＧのＮheＩフラグメントに対しプローブ探査されたゲノミックＤＮＡのサザン分析は、プラスミドがゲノム内でＥcoＲＩ部位内に組込まれたことを示唆していた。Ａspergillus oryzae ＤＥＢＹ８−１０．１の救援末端からのプライマでＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０ゲノミックＤＮＡを用いて生成されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯｐＣＲ１１ベクターでクローニングしその後例２に従って配列決定することで、この結果が確認された。
例４７：高産生体についての低炭素供給原上でのスクリーニング
Ｈind IIIの存在下でＨind III消化されたｐＤＳＹ８１で生成されたもの１１個とＳalＩの存在下でＳalＩで消化されたｐＤＳＹ８１で生成されたもの７個の計１８のＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０形質転換体（例５参照）を、高いリパーゼ産生体であった突然変異体を同定するべく、低炭素供給源上でスクリーニングした。グリセロール上ではリパーゼの発現が非常に低いことから低炭素供給源としてグリセロールが使用されたが、例えばキシロース、スクロース及びマンニトールやソルビトールといったポリオールなどの数多くのその他の炭素供給源も類似の要素で使用することができる。
例７に記した通りに一次９６ウェル平板スクリーンを実施したが、ここでは、５０倍に希釈した１リットルあたり２％の尿素１００ｍｌ，２５％のグリセロール１００ｍｌ，１０％の酵母エキス１００ｍｌから成るＧＬＹ２５培地を用いた。例７で記述した通り、リパーゼ検定を行なった。
次に、問題の突然変異体を、以上のものと同じ培地を含む２４ウェルの平板内に直接接種し、６日間３４℃１００rpmで成長させた。次に、例７に記述した通りリパーゼ活性について培養を検定し、問題の突然変異体をＣＯＶＥ平板上に固定し、ＰＤＡ平板上に展延させて単集落を生成させ、次にＣＭ−グリセロール寒天（ＣＭ−１寒天と同様、ただし炭素供給源としてグリセロールがマルトースに置換わった）上で各々の突然変異体の４つの単一分離株を成長させて、上述のとおりの２４ウェル平板の接種のための胞子を産生させた。
２４ウェル平板の後、振とうフラスコの中でのさらなる評価のため、１０個の形質転換体を同定した。振とうフラスコには、１ｇのＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ，１ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4，１５ｇのｋＨ2ＰＯ4，０．２５ｍｌの超微量金属溶液、０．７ｇの酵母エキス、３ｍｌの５０％尿素、２ｍｌの１５％ＣａＣｌ2−２Ｈ2Ｏ及び２％の炭素供給源（マルトース、グルコース、スクロース又はグリセロールのいずれか）から成るｐＨ６．５の培地が５０ｍｌ入っていた。１２５ＰＰ入りフラスコ内に５０ｍｌの培地が入った振とうフラスコに、０．５ｍｌのＧｌ−glyの一晩経過した培養を接種し、３４℃，２００rpmでインキュベートし、２〜３日後に標本採取した。上述のとおりにリパーゼ活性を測定した。
炭素供給源としてのグリセロール上で成長させられたＡspergillus oryzae ＨowＢ４３０によるリパーゼ産生が１．０に正規化されている表１２の中に、結果が示されている。
0004436934.tif 000028
リパーゼの相対的発現は、異なる炭素供給源に対し異なる形で応答しており、リパーゼ発現の調節がこれらの形質転換体の中で変調させられたことを示唆していた。
例４８：α−シクロピアゾン酸突然変異体についてのスクリーニング
α−シクロピアゾン酸陰性菌株についてのスクリーニングにおいては、例５で記述されたＥcoＲ１ライブラリからのプールｅ１−ｅ２６を使用した。血球計において該当する希釈溶液を計数することによって、異なるプールを含むバイアル中の胞子数を決定し、約３０〜５０の胞子誘導型コロニーが９cmのスクリーニング平板毎に存在するような形で希釈系列を構築した。スクリーニング培地は１リットルあたり、３０ｇのマンニトール、１０ｇのグルコース、１０ｇのコハク酸、３ｇのカザミノ酸、１ｇのＫＨ2ＰＯ4，０．３ｇのＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ，０．２ｇのＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ，１００μｌのトリトンＸ１００及び２０ｇのＤifcoＢacto寒天で構成されていた。オートクレーブに付す前に、ｐＨを１４％のＮＨ4ＯＨで５．６に調整した。第１鉄イオンは、α−シクロピアゾン酸と赤色錯体を形成する。この錯体は、コロニーの逆側に見られる。
各プールから約２０００〜２５００のコロニーをスクリーニングした。３４℃で７日間のインキュベーションの後、逆側が全く赤色に着色していないコロニーをスクリーニング培地上で再度分離し、７日間３４℃でインキュベートした。６つの異なるプールに由来する１０個のコロニーは、赤色でない逆着色を示し、ひきつづき以下の通りに作られたＣove−Ｎ斜面上に接種された：すなわち、２０ｍｌのＣove塩溶液、４．２ｇのＮａＮＯ3及び６０ｇのグルコースを脱イオン水の中に溶解させ、体積を１０００ｍｌにした。培地を２％のＤifco  Ｂacto寒天で凝固させた。
０．０１％の水性Tween ８０を１０ｍｌ添加してＣove斜面から作られた胞子懸濁液５ｍｌを、１００ｍｌのＭＤＵ１Ｂ振とうフラスコ培地を含む５００ｍｌのバッフル付き振とうフラスコ内に接種した。接種時点で１．３ｍｌの５０％の無菌ろ過済み尿素を各振とうフラスコに添加した。５日間３４℃、２５０rmpで振とうフラスコをインキュベートした。
作製後５日経った振とうフラスコ培養から得られた１０μｌの上清を、２０cm×２０cmのＴＬＣ平板（Merck Silica Gel６０）の反対側縁部に適用した。次に平板を、クロロホルム：アセトン：プロパン−２−オン（８５：１５：２０）溶媒系（ＣＡＰ）の中で１５分間走らせ、乾燥させ、反転させ、反対側をトルエン：酢酸エチル：蟻酸（５：４：１）溶媒系（ＴＥＦ）の中で１５分間走らせた。エールリッヒ試薬（９６％エタノール８５ｍｌと３７％塩酸１５ｍｌ中の２ｇの４−ジメチルアミノベンズアルデヒド）での噴霧の前に、平板を煙霧フード内で１時間徹底的に乾燥させた。α−シクロピアゾン酸は、ＣＡＰ溶媒系（中性系）の中で標準的に低いＲｆ値をもつ青紫色のキノコ形の斑点として見え、一方ＴＥＦ溶媒系は、標準的に高いＲｆ値の長いしみを生み出した。標準としては、エタノール、メタノール及びクロロホルムの１：１：１溶液中の３０．１５及び７．５ppmのα−シクロピアゾン酸溶液（Ｓigma Chemical Co.,St.Louis,ＭＯ）を使用した。
１０個の推定上のα−シクロピアゾン酸を含まない形質転換体のＴＬＣ分析は、α−シクロピアゾン酸のいかなる非候も示さなかった。振とうフラスコの残りの内容物を、Miraclothを通してろ過し、各ろ液６０ｍｌに対し１０ｍｌの０．１Ｍ塩酸を添加した。酸性化したろ液を次に３〜５分間５０ｍｌのクロロホルムと共に勢いよく振とうさせた。底部相（約２５ｍｌ）を各々、相分離（３時間）の後３００ｍｌ入りビーカーに移し、クロロホルムを蒸発させた。残渣を各々、３００μｌのクロロホルム中に再度溶解させ、各濃縮物１０μｌずつを上述の通りＴＬＣにより分析した。
１０の菌株抽出物のうちいずれも、検出可能なα−シクロピアゾン酸を含有していなかった。
生物学的材料の寄託
ブダペスト条約に従って、以下の菌株をAgricultural Research Service Patent Culture Collection（ＮＲＲＬ），北部地方研究所、１８１５ University Street,Peovia,Illinois６１６０４，ＵＳＡに寄託した：
0004436934.tif 000029
これらの菌株は、本特許出願の係属中、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２の下でその権限が付与される特許、商標局長によって決定された者が培養にアクセスできるようにする条件の下で寄託されている。これらの寄託は、各々の寄託された菌株の実質的に純粋な培養を表わしている。寄託物は、主題となる出願の対応物又はその後代が提供されている外国において当該国の特許法により要求される場合に利用可能である。ただし、１つの寄託物の利用可能性は、政府の行為により付与される特許権を侵害して主題となる発明をを実施すことの許諾を構成するものではない。
本書で開示されている特定の実施形態は、本発明のいくつかの側面の例示として意図されていることから、本書で記述され請求されている本発明は、これらの実施形態により制限されるものではない。等価のあらゆる実施形態が本発明の範囲内に入るものと考えられる。実際、本書で示され記述されているものに加えて本発明のさまざまな修正が、当業者にとって、以上の記述から明白となるだろう。かかる修正は、添付のクレームの範囲内に入るものと意図されている。
本書で記載されている全ての刊行物は、それが引用された目的である特定の情報を記述し開示するため、本書に参考として内含される。上述の刊行物は、単に本出願の提出日以前のその開示に関してのみ提供されている。本書中の何も、以前の発明のためにかかる開示を実際以前の日に設定する権利を発明人がもたないということを容認するものとみなされるべきではない。
記述された特定の方法及び組成物は当然変動しうることから、本発明がこれらの方法及び組成物に制限されるものではないということを理解すべきである。又、本発明の範囲は添付のクレームによってのみ制限されることから、本書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述するためのものであって、制限的意味をもたない、ということも理解すべきである。
相反する規定のないかぎり、本書で用いられている全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては本書に記述されるものと類似又は等価のあらゆる材料又は方法を使用することができるが、ここでは好ましい方法及び材料が記述されている。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ノボ  ノルディスク  バイオテク  インコーポレイティド
（ii）発明の名称：ポリペプチドの製造を変更する方法
（iii）配列の数：80
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0004436934.tif 000030
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0004436934.tif 000031
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0004436934.tif 000032
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0004436934.tif 000033
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：５：
0004436934.tif 000034
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：６：
0004436934.tif 000035
（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：７：
0004436934.tif 000036
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：８：
0004436934.tif 000037
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：3000塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：９：
0004436934.tif 000038
0004436934.tif 000039
（２）配列番号：10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：488アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：10：
0004436934.tif 000040
0004436934.tif 000041
（２）配列番号：11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：488アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：11：
0004436934.tif 000042
0004436934.tif 000043
（２）配列番号：12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：524アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：12：
0004436934.tif 000044
0004436934.tif 000045
（２）配列番号：13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：584アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：13：
0004436934.tif 000046
0004436934.tif 000047
0004436934.tif 000048
（２）配列番号：14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：14：
0004436934.tif 000049
（２）配列番号：15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：15：
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（２）配列番号：16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：4700塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：16：
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（２）配列番号：17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：854アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：17：
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（２）配列番号：18の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：842アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：18：
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（２）配列番号：19の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：38アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：19：
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（２）配列番号：20の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：371アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：20：
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（２）配列番号：21の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：36塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：21：
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（２）配列番号：22の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：40塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：22：
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（２）配列番号：23の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：41塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：23：
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（２）配列番号：24の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：42塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：24：
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（２）配列番号：25の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：6800塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：cDNA
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（２）配列番号：26の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：391アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
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（２）配列番号：27の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：195アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
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（２）配列番号：28の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：366アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：28：
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（２）配列番号：29の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：3300塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
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（２）配列番号：30の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：230アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
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（２）配列番号：31の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：233アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：31：
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（２）配列番号：32の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：36塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：32：
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（２）配列番号：33の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：36塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：33：
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（２）配列番号：34の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：346塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：34：
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（２）配列番号：35の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：35：
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（２）配列番号：36の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：36：
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（２）配列番号：37の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：37：
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（２）配列番号：38の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：38：
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（２）配列番号：39の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：188塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：39：
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（２）配列番号：40の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：40：
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（２）配列番号：41の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：41：
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（２）配列番号：42の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：42：
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（２）配列番号：43の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：43：
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（２）配列番号：44の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：27塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：44：
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（２）配列番号：45の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：45：
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（２）配列番号：46の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：39塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：46：
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（２）配列番号：47の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：47：
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（２）配列番号：48の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：48：
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（２）配列番号：49の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：49：
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（２）配列番号：50の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1132塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：50：
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（２）配列番号：51の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：374アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：51：
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（２）配列番号：52の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：339アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：52：
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（２）配列番号：53の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：560アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：53：
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（２）配列番号：54の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：54：
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（２）配列番号：55の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：55：
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（２）配列番号：56の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：501塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：56：
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（２）配列番号：57の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：178アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：57：
0004436934.tif 000112
（２）配列番号：58の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：916アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：58：
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（２）配列番号：59の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：911アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：59：
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（２）配列番号：60の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：60：
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（２）配列番号：61の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：61：
0004436934.tif 000121
（２）配列番号：62の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：62：
0004436934.tif 000122
（２）配列番号：63の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：251塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：63：
0004436934.tif 000123
（２）配列番号：64の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：83アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：64：
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（２）配列番号：65の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：83アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：なし
（xi）配列の記載：配列番号：65：
0004436934.tif 000125
（２）配列番号：66の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：214塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：66：
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（２）配列番号：67の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：67：
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（２）配列番号：68の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：68：
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（２）配列番号：69の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：69：
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（２）配列番号：70の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：70：
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（２）配列番号：71の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：336塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：71：
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（２）配列番号：72の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：72：
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（２）配列番号：73の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：73：
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（２）配列番号：74の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：74：
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（２）配列番号：75の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：75：
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（２）配列番号：76の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：281塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：76：
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（２）配列番号：77の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：77：
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（２）配列番号：78の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：78：
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（２）配列番号：79の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：79：
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（２）配列番号：80の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：80：
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【図１】
0004436934.tif 000141
【図２】
0004436934.tif 000142
【図３】
0004436934.tif 000143
【図４】
0004436934.tif 000144
【図５】
0004436934.tif 000145
【図６】
0004436934.tif 000146
【図７】
0004436934.tif 000147
【図８】
0004436934.tif 000148
【図９】
0004436934.tif 000149
【図１０】
0004436934.tif 000150
【図１１】
0004436934.tif 000151
【図１２】
0004436934.tif 000152
【図１３】
0004436934.tif 000153
【図１４】
0004436934.tif 000154
【図１５】
0004436934.tif 000155
【図１６】
0004436934.tif 000156
【図１７】
0004436934.tif 000157
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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