(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の抗原、アルミニウム塩およびヒスチジンの混合物を含む免疫原性組成物を製造する方法であって、該方法は以下：
（ｉ）アルミニウム塩および（ｉｉ）ヒスチジンを混合して、ヒスチジン／アルミニウム塩混合物を得る第１工程；ならびに
（ｉ）該ヒスチジン／アルミニウム塩混合物および（ｉｉ）１つ以上の抗原を混合する第２工程、
を包含し、ここで、
該１つ以上の抗原が該アルミニウム塩に吸着され、
該抗原が、
−髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のタンパク質抗原；
−髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物；および、
−髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の糖類抗原
からなる群から選択される酸性の細菌抗原であり、そして、
該アルミニウム塩が、リン酸アルミニウムである、方法。
【請求項２】
前記抗原が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖類抗原が結合体化糖類抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物中のヒスチジン濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭの間である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記組成物中のヒスチジン濃度が５ｍＭ〜１０ｍＭの間である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記組成物がさらにナトリウム塩を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ナトリウム塩濃度が２．５ｍＭ〜５ｍＭの間である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物のｐＨが６〜７の間である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記組成物がさらに薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物がさらに１より多い抗原を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記１を超える抗原がアルミニウム塩に吸着される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の抗原；ジフテリア抗原；破傷風抗原；Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来の糖類抗原；不活性化ポリオウイルス；および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｃ由来の糖類抗原のうち、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物において免疫応答を惹起させるための免疫原性組成物であって、該組成物は、
（ｉ）髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のタンパク質抗原；髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の外被ベシクル（ＯＭＶ）調製物；および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の糖類抗原からなる群から選択される１つ以上の酸性の抗原、
（ｉｉ）アルミニウム塩、ならびに
（ｉｉｉ）ヒスチジン
の混合物から構成され、ここで、
該１つ以上の抗原が該アルミニウム塩に吸着される、
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により得られる組成物であって、該アルミニウム塩が、リン酸アルミニウムである、組成物。
【請求項１４】
ワクチンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
哺乳動物において前記１以上の抗原に対する免疫応答を惹起させるための医薬の製造における請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
前記医薬がワクチンである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、ワクチン処方物の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
抗原性物質を含有するのと同時に、ワクチンは、希釈剤、保存剤、安定化剤および緩衝化剤のような物質を含む。代表的には、ワクチンはまた、アジュバント（すなわち、そのワクチン抗原に応答して惹起される免疫応答を改善する物質）を含む。
【０００４】
ヒトワクチンにおいて伝統的に使用されるアジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩である。多くの他の実験的アジュバントが公知であり、そしてこれらは、例えば、参考文献１において概説される。しかし、アルミニウム塩への吸着が、依然として最も一般的なワクチンアジュバント処方物である。
【０００５】
アルミニウム塩の用途は広範囲であるが、アルミニウム塩は、特定の抗原に常に適合するわけではない。例えば、水酸化アルミニウムが、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を含む多価ワクチンにおける使用［２］またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の莢膜多糖類との使用［３］に適さないことが示唆されている。同じワクチン処方物の中にある異なる抗原は、適合性の理由から、異なるアルミニウム塩［４］に吸着されるべきであることがまた示唆されている。
【０００６】
アルミニウム塩を使用する場合、抗原適合性と同様に、ワクチンの安定性を考慮することが必要である。例えば、タンパク質吸着に対するアルミニウム塩の能力は、室温で経時的に［５］、およびオートクレーブすることに応じて［６］低下することが示されている。ミョウバン塩はまた、凍結乾燥の際に困難の原因となる［７］。さらに、水酸化アルミニウムは、低温であるとき、そして糖類抗原を加水分解し得［８］、そして抗原がキャリアタンパク質に結合化されるときでさえ、それ故に低減した有効性を導くことが見出されている。
【０００７】
一般的に、これらの問題点は、臨床用途のための抗原を処方することに注意が向けられるときにのみ発生し、抗原自体の初期研究および開発の間は認識されない。
【０００８】
アルミニウム塩を含むワクチンの安定性における改善、特にｐＨ安定性（緩衝）および種多々の温度でのアジュバント吸着における改善および／または抗原安定性における改善（例えば、加水分解の低下）を提供することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アミノ酸のヒスチジンが、アルミニウム塩アジュバントを含むワクチンの安定性を増強するという驚くべき知見に基づく。このことは、糖類抗原およびタンパク質抗原の両方において見出されている。本発明は、故に、抗原、アルミニウム塩およびヒスチジンを含む組成物を提供する。本発明はまた、この組成物を製造するためのプロセス（抗原、アルミニウム塩およびヒスチジンを混合する工程を包含する）を提供する。
【００１０】
（抗原）
この抗原は、好ましくは、タンパク質抗原または糖類抗原（必要に応じて結合体化される）である。好ましい抗原は、細菌由来であり、細菌のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が特に好ましい。
【００１１】
本発明での使用のための特定の細菌抗原としては、以下が挙げられる：
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原、例えば、参考文献９〜１５中のタンパク質抗原、タンパク質「２８７」（以下を参照のこと）および誘導体（例えば、「ΔＧ２８７」）が特に好ましい。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物、例えば、参考文献１６、１７、１８、１９などに開示されるＯＭＶ調製物。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、血清型Ａ、血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５および／または血清型Ｙ由来の糖類抗原、例えば、参考文献２０に開示される血清型Ｃ由来のオリゴ糖［参考文献２１もまた参照のこと］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖類抗原［例えば、２２、２３、２４］。
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原、例えば、（必要に応じて、ペルタクチンならびに／または凝集原２および凝集原３との組合せて）百日咳毒素（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）［例えば、参考文献２５および２６］。
−ジフテリア抗原、例えば、ジフテリア類毒素［例えば、参考文献２７の３章］、例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、２８］。
−破傷風抗原、例えば、破傷風類毒素［例えば、参考文献２７の４章］。
−ＣａｇＡ［例えば、２９］、ＶａｃＡ［例えば、２９］、ＮＡＰ［例えば、３０］、ＨｏｐＸ［例えば、３１］、ＨｏｐＹ［例えば、３１］および／またはウレアーゼのようなＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来の糖類抗原［例えば、２１］、好ましくはオリゴ糖。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、９、１０、１１］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、３９］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、４０］。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、４１］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＢ  連鎖球菌）由来の抗原［例えば、４２，４３］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（グループＡ  連鎖球菌）由来の抗原［例えば、４３，４４，４５］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、４６］。
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の抗原［例えば、４７，４８，４９］。
【００１２】
本発明での使用のための特定のウイルス抗原としては、以下が挙げられる：
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、不活性化ウイルス［例えば、５０、５１］。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、表面抗原および／またはコア抗原［例えば、５１、５２］。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原、［例えば、５３］。
−ポリオ抗原［例えば、５４、５５］、例えばＩＰＶ。
−狂犬病抗原［例えば、５６］、例えば凍結乾燥不活性化ウイルス［例えば、５７、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］。
−麻疹抗原、おたふく風邪抗原および／または風疹抗原［例えば、参考文献２７の９章、１０章および１１章］。
−インフルエンザ抗原［例えば、参考文献２７の１９章］、例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）系統のウイルス由来の抗原、例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４つの血清型、ダニ媒介性脳炎ウイルス、西ナイルウイルス由来。
−ペスチウイルス抗原、例えば、古典的なブタ熱ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｖｉｒｕｓ）、および／またはボーダー病ウイルス（ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）由来。
−パルボウイルス抗原、例えば、パルボウイルスＢ１９由来。
【００１３】
この組成物は、１つ以上のこれらの細菌抗原およびウイルス抗原を含み得る。この組成物は、ウイルス抗原を含まなくてもよい。
【００１４】
使用され得る他の抗原としては、以下が挙げられる：
−プリオンタンパク質（例えば、ＣＪＤプリオンタンパク質）
−アミロイドタンパク質、例えば、βペプチド［５８］
−癌抗原、例えば、参考文献５９の表１または参考文献６０の表３および表４に列挙される癌抗原。
【００１５】
糖類抗原または炭水化物抗原が使用される場合、それは、好ましくは、抗原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合体化される［例えば、参考文献６１〜７０］。好ましいキャリアタンパク質は、細菌の毒素または類毒素（例えば、ジフテリア類毒素または破傷風類毒素）である。ＣＲＭ１９７ジフテリア類毒素は、特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［例えば、参考文献７１］、合成ペプチド［例えば、７２、７３］、熱ショックタンパク質［例えば、７４］、百日咳タンパク質［例えば、７５、７６］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［例えば、７７］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［例えば、７８］などが挙げられる。混合物が、血清型Ａおよび血清型Ｃの両方に由来する莢膜糖類を含む場合、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の比（ｗ／ｗ）が１より大きいこと（例えば、２：１，３：１，４：１，５：１，１０：１またはそれより高い比）が好ましい。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清型由来の糖類は、同じキャリアタンパク質または異なるキャリアタンパク質に結合体化され得る。
【００１６】
任意の適切な結合反応が、（必要であれば、任意の適切なリンカーとともに）使用され得る。
【００１７】
毒性のタンパク質抗原は、必要であれば、解毒され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒［２６］）。
【００１８】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、好ましい抗原ではない（ＷＯ００／４５８４１１、ＷＯ００／５７９０６、ＷＯ０１／２８５８５を参照のこと）。
【００１９】
ジフテリア抗原が組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むことがまた好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風原を含むことがまた好ましい。細胞全体百日咳抗原（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）が使用され得る。
【００２０】
抗原は、好ましくは、アルミニウム塩に吸着される。
【００２１】
ＨＢｓＡｇが存在する場合、好ましくは、それは、アルミニウムヒドロキシホスフェートに吸着されるか、または、いかなる塩にも吸着されないかのいずれかである。水酸化アルミニウムへのＨＢｓＡｇの吸着は、好ましくは回避される。
【００２２】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ糖類抗原が存在する場合、好ましくは、それは、アルミニウムヒドロキシホスフェートに吸着されるか、または、いかなる塩にも吸着されないかのいずれかである。水酸化アルミニウムへのＨｉｂ糖類の吸着は、好ましくは回避される。
【００２３】
この組成物中の抗原は、代表的には、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的には、任意の所定の抗原の濃度は、抗原に対する免疫応答を引き起こすのに十分である。
【００２４】
本発明の組成物においてタンパク質抗原を使用する代りとして、抗原をコードする核酸が使用され得る［例えば、参考文献７９〜８７］。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えば、プラスミドの形態のＤＮＡ）によって置き換えられる。
【００２５】
（アルミニウム塩）
アルミニウム塩は、好ましくは、水酸化アルミニウム（例えば、アルミニウムオキシヒドロキシド）またはリン酸アルミニウム（例えば、アルミニウムヒドロキシホスフェートまたはアルミニウムオルトホスフェート）であるが、任意の他の適切な塩もまた使用され得る（例えば、硫酸塩など［例えば、参考文献１の８章および９章を参照のこと］）。この塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶質、非晶質をとり得る。好ましい塩は、（非晶質性）ヒドロキシホスフェートおよび（結晶質性）オキシヒドロキシド（ベーマイト）である。
【００２６】
ヒドロキシホスフェートは、沈殿によって得られ、そしてこの沈殿反応中の反応条件および反応物濃度は、塩における水酸基へのリン酸基の置換の程度に影響する。ヒドロキシホスフェートは、一般的に０．３と０．９９との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有し、そして好ましい塩は、０．８と０．９５との間（例えば、０．８８±０．０５）の比を有する。ヒドロキシホスフェート［Ａｌ（ＯＨ）ｘ（ＰＯ４）ｙ、ここでそのモル比率に合った各アニオンの価数の合計は、−３である］は、水酸基の存在によってＡｌＰＯ４と区別され得る。例えば、３１４６ｃｍ−１でのＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合）は、構造的水酸基の存在を示す。
【００２７】
アルミニウムオキシヒドロキシド［ＡｌＯ（ＯＨ）］は、ＩＲ分光法によって（特に１０７０ｃｍ−１での吸収バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での大きなショルダーによって）、Ａｌ（ＯＨ）３と区別され得る。異なるアルミニウム塩の混合物がまた、使用され得る。しかし、実質的に単一の塩を使用することが好ましい（例えば、２つの塩が使用される場合、他方に対する一方の割合は、少なくとも重量で５：１（例えば、少なくとも１０：１、１００：１、１０００：１など）である）。
【００２８】
この塩は、一般的には、Ａｌ３＋の濃度が少なくとも１μｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ）であるように存在する。
【００２９】
リン酸アルミニウム（特に、ヒドロキシフォスフェート）と組合せでのヒスチジンの使用は、酸性の抗原に特に好都合である。
【００３０】
（ヒスチジン）
ヒスチジンは、標準的なアミノ酸であり、本発明での使用に容易に利用できる。ヒスチジンは、本質的に生体適合性であるので、ヒスチジンは安全であり、故にワクチン中の成分として好都合である。
【００３１】
組成物中のヒスチジンの濃度は、代表的には、少なくとも１μＭおよび多くとも１Ｍである。この濃度は、好ましくは少なくとも１ｍＭ（例えば、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭなど）および好ましくは高くとも２５０ｍＭ（例えば、高くとも２００ｍＭ、高くとも１５０ｍＭ、高くとも１００ｍＭ、高くとも９０ｍＭ、高くとも８０ｍＭ、高くとも７０ｍＭ、高くとも６０ｍＭ、高くとも５０ｍＭ、高くとも４０ｍＭ、高くとも３０ｍＭ、高くとも２０ｍＭ、高くとも１０ｍＭなど）である。より好ましくは、組成物中のヒスチジン濃度は、２ｍＭと１０ｍＭとの間（例えば、５ｍＭと８ｍＭとの間）であり、そして最も好ましくは、組成物中のヒスチジン濃度は、約５ｍＭである。
【００３２】
このヒスチジンは、好ましくはＬ−ヒスチジンである。
【００３３】
このヒスチジンは、好ましくは、緩衝剤として作用する。ヒスチジン緩衝剤は、当業者に周知である。従って、ヒスチジンは、本発明の組成物中でイオン化され得る。
【００３４】
この組成物は、同等の組成物（ヒスチジン緩衝系が、リン酸ナトリウム緩衝系で置き換えられるか、またはいかなる緩衝系も含まれないかのいずれか）と比較された場合、好ましくは、増強されたｐＨ安定性および／または低減された抗原加水分解を有する。低減された抗原加水分解は、増強されたｐＨ安定性の結果であり得る。
【００３５】
ヒスチジンは、アミノ酸そのものの形態または塩の形態で、この組成物に添加され得る。代表的なヒスチジン塩は、モノヒドロクロリドモノヒドレートである。
【００３６】
本発明の組成物中のヒスチジンに対する言及は、組成物中のポリペプチド中の任意のヒスチジン残基（ポリペプチド（例えば、抗原）の部分であり得る）でなく「遊離」ヒスチジンをいうことが認識される。
【００３７】
（本組成物のさらなる特徴づけ）
この組成物は、好ましくは液体形態であるが、凍結乾燥されてもよい（ＷＯ０１／４１８００を参照のこと）。
【００３８】
この組成物はまた、ナトリウム塩（例えば、リン酸ナトリウムまたは塩化ナトリウム）を含み得る。ナトリウム塩の濃度は、好ましくは、少なくとも１ｍＭ（例えば、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭなど）および好ましくは、高くとも１０ｍＭ（例えば、高くとも１０ｍＭ、高くとも９ｍＭ、高くとも８ｍＭ、高くとも７ｍＭなど）である。より好ましくは、この組成物中のナトリウム塩の濃度は、１ｍＭと５ｍＭとの間（例えば、２ｍＭと３ｍＭとの間）であり、そして最も好ましくは２．５ｍＭである。
【００３９】
本発明の特定の利点は、本発明が高濃度の遊離リン酸イオン（遊離リン酸イオンは、例えば、アジュバント中のリン酸での交換のため、または残存リン酸緩衝液のために、ワクチンにおいて避けることができない）を含むワクチンにおけるｐＨおよび吸着の優れた制御を可能にすることである。残存リン酸イオンが、３ｍＭと５ｍＭとの間で存在する場合、例えば、ｐＨは、６．０と７．０との間での制御が困難であり、そしていくつかの抗原は、アジュバントから脱着する傾向があるが、５〜１０ｍＭヒスチジンの添加で、ｐＨおよび吸着は制御される（上昇した温度での保存中を含む）。
【００４０】
ヒスチジンの、遊離リン酸に対するモル比は、好ましくは、少なくとも１．２５：１（例えば、１．５：１、１．７５：１、２：１、２．２５：１、２．５：１、３：１、４：１など）である。
【００４１】
この組成物のｐＨは、好ましくは、６と７との間（例えば、６．３と７．０との間）である。ｐＨは、緩衝剤の使用によって維持され得る。これは、代表的に、組成物中のヒスチジンによって本質的に達成される。
【００４２】
この組成物は、一般的には、以下を含まない：血清（例えば、ウシ胎児血清など）または細胞培養において使用される他のこのような成分；細胞培養物から精製された抗原について１００ｐｇ／用量より高いレベルの宿主細胞ＤＮＡ；生細胞。
【００４３】
この組成物は、一般的に無菌および／または発熱物質なしである。
【００４４】
この組成物は、容器への抗原の吸着を最少にするために界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０のようなＴｗｅｅｎ）を含み得る。
【００４５】
この組成物は、好ましくは、保存剤を含まない。保存剤が存在する場合、水銀保存剤（例えば、チメロサール）が使用され得る（ＷＯ９８／３４５９４を参照のこと）。保存剤（存在しても存在しなくてもよい）は、２−フェニルーエタノール、メチルパラベン、プロピルパラベンおよびベンジルアルコール（またはそれらの混合物）である。
【００４６】
（免疫原性組成物および医薬）
本発明の組成物は、代表的にワクチン組成物である。
【００４７】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の組成物を提供する。この医薬は、好ましくは抗原に対する哺乳動物中の免疫応答を惹起し得（すなわち、この医薬は、免疫原性組成物である）、そしてより好ましくはワクチンである。
【００４８】
本発明はまた、抗原に対する哺乳動物中の免疫応答を惹起するために医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供する。この医薬は、好ましくはワクチンである。
【００４９】
本発明はまた、哺乳動物中の免疫応答を惹起ための方法（有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する）を提供する。この免疫応答は、好ましくは防御免疫である。この方法は、追加免疫応答を惹起し得る。
【００５０】
この哺乳動物は、好ましくはヒトであり、最も好ましくは小児である。
【００５１】
これらの使用および方法は、好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、中耳炎、気管支炎、肺炎，  小胞炎，  心膜円、髄膜炎など）または肺炎双球菌（例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎など）によって起こされる疾患の予防および／または処置のためである。故に、細菌性髄膜炎の予防および／または処置が好ましい。
【００５２】
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を防御するため）であっても、治療的（すなわち、感染後に疾患を処置するため）であってもよいが、代表的には予防的である。
【００５３】
（本組成物のさらなる成分）
本発明の組成物は、代表的に、上記の成分に加えて、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア（それ自体が、本組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアを含む）を含む。適切なキャリアは、代表的には、大きい、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーのアミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース（ＷＯ００／５６３６５）および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム））である。このようなキャリアは、当業者に周知である。このワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含み得る。さらに、補助的な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝物質などが存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［例えば、参考文献８８］において、利用できる。
【００５４】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原、および必要に応じて上記の成分のうちの任意の他のものを含む。「免疫学的有効量」によって、個体への、単回用量または一連の部分としてかのいずれかでのその量の投与が、処置または予防に有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康および物理的条件、年齢、処置される個体の分類学的なグループ（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系の抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置する医師の、医学的状況の評価、および他の関連性のある要因に依存して変動する。この量は、常用の試行を通して決定され得る比較的広い範囲にあることが予測される。投薬処置は、単回用量スケジュールであっても、複数用量スケジュール（例えば、追加免疫用量を含む）であってもよい。このワクチンは、他の免疫調節剤との併用で投与され得る。
【００５５】
このワクチンは、他の免疫調節剤との併用で投与され得る。
【００５６】
このワクチンは、アルミニウム塩に加えて、アジュバントを含み得る。本組成物の有効性を増強するために好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）水中油乳濁液処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌の細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を有するか、有さない）、例えば、（ａ）ＭＦ５９ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；参考文献１の１０章）、これは、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含み、（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む）ミクロフリューダイザを使用して１ミクロン未満の粒子中に処方される、（ｂ）ＳＡＦ、これは、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマー（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）Ｌ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、１ミクロン未満の乳濁液に微小流動化されるか、またはより大きな粒子サイズの乳濁液を産生するようにボルテックスされる、および（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ＭＴ）、これは、２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌の細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含む；（２）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））またはそれから製造される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）（ＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る）が使用され得る（例えば、ＷＯ００／０７６２１）；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４；（６）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油乳濁液との組合せ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００，１９，６１８−６２２；Ｋｒｉｅｇ  Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００１  ３：１５−２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，１９９７，３，８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９７，９４，１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０，８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７．２７，２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖ���ａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，１６，１２１６−１２２４，Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４，５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５７，１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５６，４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１６７，７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９−１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７．４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，５３９４−５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，４７５５−４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，５８９８−５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１］すなわち、必要に応じてシトシンの位置に用いられる５−メチルシトシンを有する、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えばＷＯ９９／５２５４９；（９）オクトキシノールと併用でのポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）あるいは少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と併用でのポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（たとえば、ＷＯ００／２１１５２）；（１０）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン、例えば、ＷＯ００／６２８００；（１１）免疫刺激剤、および金属塩の粒子、例えば、ＷＯ００／２３１０５；（１２）サポニンおよび水中油乳濁液、例えば、ＷＯ９９／１１２４１；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）、例えば、Ｗ０９８／５７６５９；（１４）キトサン；（１５）コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素、あるいはそれらの無毒化変異体［８９］；（１６）ポリ（α−ヒドロキシ）酸の微粒子、例えばＰＬＧ；（１７）本組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として働く他の物質。
【００５７】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ），Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ），Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−（２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【００５８】
一旦、処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。このワクチンは、小児およびティーンエイジャーのワクチン接種に特に有用である。
【００５９】
代表的には、この免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能であるように調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適切な個体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、増強されたアジュバント効果のために、乳化されるか、またはリポソーム中にカプセル化され得る。本組成物の直接送達は、一般的に、非経口的（例えば、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内のいずれかの注射によるか、または組織の間質の空間に送達される）による。これらの組成物はまた、病変内に投与され得る。投与の他の様式としては、経口投与および肺投与、坐薬、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、ならびに皮下噴射器が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールであっても、複数用量スケジュール（例えば、追加免疫用量を含む）であってもよい。
【００６０】
（抗原、アルミニウム塩およびヒスチジンを混合する工程）
本発明の組成物を作製するために、抗原、アルミニウム塩およびヒスチジンが混合されなければならない。抗原およびアルミニウム塩が混合される際に、ヒスチジンが存在すべきであることが好ましい。故に、ヒスチジンは、アルミニウム塩への吸着の間存在する。これは、既に存在する抗原／アルミニウム塩の組合せにヒスチジンを添加することと対照する（すなわち、このプロセスにおけるヒスチジンは、抗原とアルミニウム塩とが相互作用した後に、単に緩衝剤として添加されるのではなく、このヒスチジンは、それらの相互作用の間に存在する）。
【００６１】
従って、本発明のプロセスにおいて、抗原は、好ましくは、ヒスチジン／アルミニウム塩混合物と混合される。従って、本発明のプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）アルミニウム塩およびヒスチジンの混合物を調製する工程；ならびに（ｂ）抗原とこの混合物を混合する工程。（ａ）の混合物は、好ましくは水性であり、そして水性条件で調製され得るか、または使用前に再水和される、乾燥された混合物であり得る。
【００６２】
一旦、ヒスチジンの存在下で、１つ以上の抗原が、アルミニウム塩に吸着されると、この混合物は、他の抗原と組み合わされ得る（例えば、既存のジフテリア組成物、破傷風組成物、百日咳組成物、ポリオ組成物またはＢ型肝炎ウイルス組成物と組み合わされる）。
【００６３】
（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘだけからなるか、または何らかの付加物を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００６４】
数値ｘに関する用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００６５】
（本発明を実施するための様式）
【実施例１】
【００６６】
（実施例１−髄膜炎菌性「２８７」抗原のｐＨ安定性および吸着）
参考文献１１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の「２８７」と名付けられたタンパク質抗原を開示する。参考文献９０は、短縮されて、そのヘキサグリシン領域までのかつ個の領域を含むＮ−末端アミノ酸が除去された、この抗原の形態（「Δ２８７」）を開示する。２８７およびΔＧ２８７は、両方とも、マウスにおいて防御性免疫応答を誘発し得る。参考文献１６〜１９は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のＯＭＶ抗原を開示する。これらのＯＭＶはまた、マウスにおいて防御性免疫応答を誘発し得る。
【００６７】
これら２つの抗原を、アルミニウムオキシヒドロキシドアジュバントへの吸着により処方した。２つのアジュバント濃度（１ｍｇ／ｍｌおよび３．３ｍｇ／ｍｌ）を試験した。
【００６８】
マウスにおける免疫研究は、ワクチン免疫原性が、アジュバントに対する抗原の吸着レベルと関連することを示した。吸着レベルを評価するために、最終処方物のサンプルを１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そしてその上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、非吸着抗原の存在を検出した。適切な濃度の適切なタンパク質標準を、量的比較のために隣にロードした。
【００６９】
リン酸ナトリウム緩衝液を用いて、４週間の期間にわたり、４℃および３７℃で安定な生理学的ｐＨを維持するために、この組成物が１０ｍＭリン酸ナトリウムを必要とすることが見出された。しかしこのレベルでは、ΔＧ２８７の吸着は、たった５０％だけであった（図１、レーン５）。１００％吸着は、２．５ｍＭリン酸ナトリウムで維持され得る（図２および図３のレーン５）が、この組成物は、４℃でも３７℃でも、安定なｐＨを有さなかった。
【００７０】
従って、吸着を減少させることなくｐＨ安定性を維持する、代替的な緩衝液系を見出すことが必要であった。
【００７１】
５ｍＭヒスチジンを用いた場合（図１、図２および図３のレーン６）、そしてまた１０ｍＭヒスチジンを用いた場合（図２のレーン７）、吸着は９５〜１００％であった。従って、吸着に関しては、１ｍｇ／ｍｌ（図１および図２）または３．３ｍｇ／ｍｌ（図３）のいずれかのアルミニウムオキシヒドロキシドの存在下で、５ｍＭヒスチジンまたは１０ｍＭヒスチジンは、２．５ｍＭリン酸ナトリウムと等価であった。
【００７２】
ワクチン組成物が安定であるｐＨ範囲を規定するために、３つの開始ｐＨ値（ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）を選択し、そして、２．５ｍＭリン酸ナトリウムまたは５ｍＭヒスチジンいずれかの存在下で、４週間にわたりｐＨ安定性をモニタリングした。安定性は、４℃および３７℃の両方でモニタリングした。
【００７３】
全てのワクチン中の抗原は、３．３ｍｇ／ｍｌアルミニウムオキシヒドロキシドでアジュバント化された（ａｊｕｖａｎｔｅｄ）ΔＧ２８７（１００μｇ／ｍｌ）およびＯＭＶ（５０μｇ／ｍｌ）の組合せであった。
【００７４】
図４は、４℃でのｐＨ安定性を示し、図５は、３７℃でのｐＨ安定性を示す［ＮＢ−細菌の混入に起因して、ｐＨ６．０ヒスチジン緩衝化ワクチンは、４週間の測定が不可能であった］。
【００７５】
両方の温度で、ｐＨは、２．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で、長期にわたって増加する傾向にあったが、５ｍＭヒスチジン緩衝液存在下では安定であった。
【００７６】
従って、リン酸ナトリウム緩衝液と比較すると、ヒスチジンの使用は、吸着を減少させることなく、長期にわたってｐＨ安定性を提供する。
【実施例２】
【００７７】
（実施例２−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｃ糖類抗原の吸着）
糖結合体は、溶液（「液体」ワクチン）中に存在する場合、加水分解により分解される傾向にある［７，８］。複合体を凍結乾燥させ、これを避けることが可能である［７］が、これは、再構成する際にアジュバントが添加されることを必要とする。糖が加水分解の対象とならない液形態のワクチンを有することが好ましい。
【００７８】
これを、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質［２０］への、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  血清型Ｃオリゴ糖結合体ついて、詳細に調べた。ＣＲＭ１９７は酸性であり、従って、負電荷のリン酸アルミニウムに全く吸着しない。しかし、ヒスチジンは正電荷であり、これが負電荷をマスクし得ることが考えられた。従って、ヒスチジン緩衝液を、アルミニウムヒドロキシホスフェートに対するＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７の吸着の改善を目的に試験した。
【００７９】
抗原の吸着を、アジュバントペレットを遠心分離して分離した後、ＢＣＡタンパク質アッセイを用いてワクチン上清中のタンパク質濃度を測定することにより、ヒスチジン緩衝液の存在下および非存在下で評価した。このワクチンを、２０μｇ／ｍｌ  オリゴ糖および４５μｇ／ｍｌ  ＣＲＭ１９７タンパク質として処方した。結果は以下のようであった：
【００８０】
【表１】
0004509554.tif 000002
従って、ヒスチジンが処方物内に存在する場合、抗原の吸着が改善され：ヒスチジン非存在下では、吸着は約６％であり；５ｍＭ  ヒスチジンは、これを３６％に上昇させ；１０ｍＭ  ヒスチジンは、吸着を約５２％まで上昇させる。
【００８１】
従って、ヒスチジンは、アルミニウムヒドロキシホスフェートに対する抗原の吸着の改善に対して、有用な添加剤である。
【実施例３】
【００８２】
（実施例３−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｂ  ＮａｄＡ抗原の吸着）
血清型Ｂ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＮａｄＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ）は、参考文献１１にタンパク質「９６１」として（配列番号２９４３および配列番号２９４４）、そして参考文献１３「ＮＭＢ１９９４」（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号１１３５２９０４および７２２７２５６も参照のこと）として開示される。ＮａｄＡの対立遺伝子の形態が、参考文献９１に開示される。ＮａｄＡの好ましい形態は、Ｃ末端アンカードメインを欠いている（「９６１ｃ」）。
【００８３】
９６１ｃ（１００μｇ／ｍｌ）を、ｐＨ６．５の１０ｍＭ  ヒスチジン緩衝液の存在下で、アルミニウムオキシヒドロキシド（３ｍｇ／ｍｌ）に吸着させた。２〜８℃または３６〜３８℃のいずれかでの４週間の保存後、この抗原は、１００％の吸着を維持した（図８および図９、レーン６）。組成物のｐＨは、時間０で６．４４であり、４週間の保存後、６．４８（２〜８℃）または６．４７（３６〜３８℃）まで、非長期にわたって僅かに上昇した。
【実施例４】
【００８４】
（実施例４−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｂハイブリッド抗原の吸着）
参考文献９２および９３は、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｂ抗原のハイブリッド発現を開示する。そのようなハイブリッドは、「ΔＧ２８７ＮＺ−９５３」であり、別のハイブリッドは、「９３６−７４１」である。これら２つのハイブリッド（１００μｇ／ｍｌ）を、各々、ｐＨ６．３の１０ｍＭ  ヒスチジン緩衝液の存在下で、アルミニウムオキシヒドロキシド（３ｍｇ／ｍｌ）に吸着させた。２〜８℃または３６〜３８℃での４週間の保存後、「ΔＧ２８７ＮＺ−９５３」は、６．４４から６．５２（２〜８℃）または６．５３（３６〜３８℃）まで非常に僅かに上昇したｐＨで、１００％の吸着（図６および図７、レーン７）を維持した。「９３６−７４１」は、６．３３から６．３７（２〜８℃）または６．３８（３６〜３８℃）まで非常に僅かに上昇したｐＨで、３６〜３８℃では１００％の吸着（図９、レーン７）を維持したが、２〜８℃では約９９％の吸着（図８、レーン７）であった。
【実施例５】
【００８５】
（実施例５−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ＯＭＶの吸着）
上記で記載したように、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂ由来のＯＭＶワクチンは周知である。ＯＭＶを、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  ＢのＮｏｒｗｅｇｉａｎ株からまたはＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ株（３９４／９８）から調製した。これら２つのＯＭＶ調製物（５０μｇ／ｍｌ）を、ｐＨ６．５の１０ｍＭ  ヒスチジン緩衝液の存在下で、アルミニウムオキシヒドロキシド（３ｍｇ／ｍｌ）に吸着させた。２〜８℃または３６〜３８℃での４週間の保存後、両ＯＭＶ調製物は、１００％の吸着を維持した（図８および図９、レーン８およびレーン９）。Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  ＯＭＶについては、両方の保存温度で、ｐＨは、４週間にわたり６．３９から６．４２まで、僅かに上昇した。Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＯＭＶについては、ｐＨは、６．４０から６．４２（２〜８℃）または６．４３（３６〜３８℃）まで、僅かに上昇した。
【００８６】
Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＯＭＶを、代替的に５ｍＭ  ヒスチジンを用いて処方した。純水で開始し、１０分混合しながら、アルミニウムオキシヒドロキシドを添加し、次いでヒスチジンを添加した。次いで、ＯＭＶを添加し、１５分間混合した。次いで、ＮａＣｌを添加し、その後さらに１０分混合した。最終的な組成は、３．３ｍｇ／ｍｌ  アルミニウムオキシヒドロキシド、７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ヒスチジン、１００μｇ／ｍｌ  ＯＭＶ、ｐＨ６．４２であった。
【００８７】
２〜８℃または３６〜３６℃のいずれかでの保存の間、ｐＨおよびＯＭＶ吸着は、以下のように変化した：
【００８８】
【表２】
0004509554.tif 000003
図１０におけるレーン４およびレーン５（２〜８℃）またはレーン８およびレーン９（３６〜３８℃）の比較は、１ヶ月の保存後、ＯＭＶが吸着されたままであることを示す。
【実施例６】
【００８９】
（実施例６−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ＯＭＶおよびタンパク質抗原の混合物の吸着）
９６１ｃ、ΔＧ２８７ｎｚ−９５３および９３６−７４１を、各抗原を１００μｇ／ｍｌで混合し、その混合物を、ｐＨ６．３の１０ｍＭ  ヒスチジン緩衝液の存在下で、アルミニウムオキシヒドロキシド（３ｍｇ／ｍｌ）に吸着させた。２つのさらなる処方物において、ＯＭＶは、Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ株ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  ＢまたはＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ株ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂのいずれかの由来のＯＭＶを含んだ。
【００９０】
３つの混合物（図６および図７、レーン８〜１０）中の全ての抗原は、全ての３つの混合物において、２〜８℃で約９６％の吸着であり、そして３６〜３８℃で約９９％の吸着であった９３６−７４１を除いては、２〜８℃または３６〜３８℃のいずれかでの４週間の保存後に、１００％の吸着を示した。この３つの混合物の各々のｐＨは、各々、６．５３（時間０）から、６．６２（２〜８℃での４週間後）まで僅かに上昇した。３６〜３８℃では、この３つの混合物のｐＨは、６．７１±０．０２まで上昇した。
【００９１】
個々の抗原は、その混合物中に、それら自体のＰＢＳから、残余のリン酸イオンをもたらした。リン酸イオンは、合わせた抗原混合物において、しばしば３ｍＭと５ｍＭとの間で存在する。余剰名リン酸緩衝液の、これらの高濃度での存在下では、例え５ｍＭ  ヒスチジンを用いても、ｐＨを６．０〜７．０の範囲内に安定させることは難しかった。しかし、ヒスチジンを１０ｍＭまで増加させた場合、ｐＨは安定化された。さらに、これらの抗原は、２〜８℃または３６〜３８℃のいずれかでの１ヶ月の後であっても、吸着したままであった。
【実施例７】
【００９２】
（実施例７−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ａ糖類抗原の吸着）
参考文献９４、Ａ型血清ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ由来の莢膜オリゴ糖のＣＲＭ１９７結合体を開示する。この結合体は、完全には安定ではなく、従って、凍結乾燥形態で調製され、投薬時の再構成のために準備される。単位用量での再構成後、以下の組成を生じる成分を有するた凍結乾燥形態を調製し：
【００９３】
【表３】
0004509554.tif 000004
この組成物は、アジュバントを有さないので、その再構成のために、アジュバントを調製した：
【００９４】
【表４】
0004509554.tif 000005
＊０．８４と０．８２との間のＰＯ４／Ａｌモル比の非結晶性ヒドロキシホスフェート
【実施例８】
【００９５】
（実施例８−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｃ、Ｗ１３５およびＹ糖類抗原の吸着）
参考文献９４は、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓの血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５および血清型Ｙ由来の、莢膜糖類のＣＲＭ１９７結合体を開示する。アルミニウムオキシヒドロキシドアジュバント（２ｍｇ／ｍｌ）またはアルミニウムヒドロキシホスフェートアジュバント（０．６ｍｇ／ｍｌ  Ａｌ３＋）のいずれか一方に吸着する３つの複合体の三価の混合物を調製した。２つの三価の混合物の組成物は、以下のようであった：
【００９６】
【表５】
0004509554.tif 000006
＊０．８４と０．８２との間のＰＯ４／Ａｌモル比の非結晶性ヒドロキシホスフェート
オキシヒドロキシド／ヒスチジン処方物について、バルクの混合物中またはバイアルに充填した後の、いずれかの糖類成分の安定性は、以下のようであった：
【００９７】
【表６】
0004509554.tif 000007
従って、遊離糖類レベルは、充填の前でも後でも、２〜８℃で少なくとも１ヶ月は安定である。
【００９８】
熱ストレス条件下で、ＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹについて、遊離糖類の小さい増加が長期にわたって見られるが、ＭｅｎＣは安定なままである。
【００９９】
３０日間にわたり、バイアルおよびバルクのｐＨは、両方の保存温度で、７．１５±０．０５で安定であった。
【実施例９】
【０１００】
（実施例９−ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ａ糖類抗原、Ｃ糖類抗原、Ｗ１３５糖類抗原およびＹ糖類抗原の吸着）
実施例８の、２つの三価の組成物を希釈し、そして０．５ｍｌを、実施例７の凍結乾燥ＭｅｎＡ結合体の再構成に用いた。生じた３価混合物を、１群あたり１０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢の雌）に、０日目および２８日目に、皮下注射により投与した。この混合物は、１用量当り各々糖類を２μｇ含み、これは単回ヒト用量（ＳＨＤ）の１／５に相当する。コントロールは、生理食塩水または結合体化していない同族の多糖類であった。免疫化前に出血を実施し、次いで４２日目に出血を実施し、血清を−７０℃で保存した。
【０１０１】
使用した全ての結合体は、これらの動物において、安全でありかつ免疫原性であった。ＧＭＴ  ｐｏｓｔ−ＩＩ  ＥＬＩＳＡ力価（信頼区間９５％）は、以下のようであった：
【０１０２】
【表７】
0004509554.tif 000008
従って、代表的に、力価は、アルミニウムオキシヒドロキシド＋ヒスチジン群でより高い。一般的に、血清殺菌力価もまた、アルミニウムオキシヒドロキシド＋ヒスチジン群でより良好であった。
【０１０３】
並行実験において、マウスを上記のように免疫化したが、ワクチン組成物は、異なる比率の種々のオリゴ糖結合体を含んだ。凍結乾燥ＭｅｎＡオリゴ結合体を、全ての実験で用いた。ＥＬＩＳＡ力価は、以下のようであった：
【０１０４】
【表８】
0004509554.tif 000009
実験の第２のセットを、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについて２μｇ／ｍｌ糖類の投薬量、ＭｅｎＹについてその半分の投薬量およびＭｅｎＷ１３５について１／４の投薬量を用いて実施した。ＥＬＩＳＡ力価は、以下のようであった：
【０１０５】
【表９】
0004509554.tif 000010
従って、少なくとも血清型Ａ、血清型Ｃおよび血清型Ｗ１３５に対して、オキシヒドロキシド＋ヒスチジン処方物は、一般的に、これらの異なる抗原比率でヒドロキシホスフェートより良い力価を与えた。
【０１０６】
本発明は、実施例としてのみ記載されており、本発明の範囲および精神の範囲内で改変がなされ得ることが、理解される。
参考文献（その内容は、本明細書により、参考として援用される）
１−Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：ｓｕｂｕｎｉｔ  ＆  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ（ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ）
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３７−国際特許出願  ＷＯ００／２７９９４．
３８−国際特許出願  ＷＯ００／３７４９４．
３９−国際特許出願  ＷＯ９９／２８４７５．
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４２−Ｓｃｂｕｃｈａｔ（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ  ３５３（９１４６）：５１−６．
４３−国際特許出願  ＷＯ０２／３４７７１．
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４６−Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ  ３５７（９２６４）：１２２５−１２４０；１２１８−１２１９頁もまた参照のこと
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７１−欧州特許出願  ０３７２５０１．
７２−欧州特許出願  ０３７８８８  １．
７３−欧州特許出願  ０４２７３４７．
７４−国際特許出願  ＷＯ９３／１７７１２．
７５−国際特許出願  ＷＯ９８／５８６６８．
７６−欧州特許出願  ０４７１１７７．
７７−国際特許出願  ＷＯ００／５６３６０．
７８−国際特許出願  ＷＯ００／６１７６１．
７９−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｔｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３．
８０−Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８．
８１−Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ９：４７１−４８０．
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８４−Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（２０００）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：７２３−７３２．
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８６−Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６２（４  Ｐｔ  ２）：Ｓ１９０−１９３．
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８９−ＷＯ９３／１３２０２．
９０−国際特許出願  ＷＯ０１／６４９２２．
９１−英国特許出願０１１８４０１．９、０１２１５９１．２および０２１１０２５．２から優先権を主張する、ＣＨＩＲＯＮ  ＳｐＡ名義の代理人参照番号Ｐ０２７７９７ＷＯの下に、２００２年７月２６日に出願した国際特許。
９２−国際特許出願  ＷＯ０１／６４９２０．
９３−英国特許出願０１２１５９１．２．
９４−英国特許出願０１１５１７６０．０から優先権を主張する、ＣＨＩＲＯＮ  ＳｐＡ名義の代理人参照番号Ｐ０２７５０４ＷＯを基に、２００２年６月２０日に出願した国際特許。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、遠心分離物後の抗原性組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１は、ＭＷマーカー（２２０ｋＤａ、９７ｋＤａ、６６ｋＤａ、４６ｋＤａ、３０ｋＤａ、２１ｋＤａ、１４ｋＤａ）を含む。ＯＭＶ抗原（２μｇ）を、レーン２で用い；ΔＧ２８７抗原を、レーン３（１０μｇ）およびレーン４（０．５μｇ）で用いた。レーン５およびレーン６で用いた抗原は、１ｍｇ／ｍｌ  アルミニウムオキシヒドロキシドとの、ＯＭＶ（５０μｇ／ｍｌ）およびΔＧ２８７（１００μｇ／ｍｌ）の組合せであり；レーン５の組成物は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＰＢＳ）を含み、それに対してレーン６の組成物は、生理食塩水溶液中の５ｍＭ  ヒスチジンを含んだ。
【図２】図２もまた、遠心分離物後の抗原性組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１は、図１と同じＭＷマーカーを含む。ＯＭＶ抗原（２．５μｇ）を、レーン２で用い；ΔＧ２８７抗原を、レーン３（２μｇ）およびレーン４（０．５μｇ）で用いた。レーン５、レーン６およびレーン７で用いた抗原は、生理食塩水溶液（ｐＨ６．５）中の１ｍｇ／ｍｌ  アルミニウムオキシヒドロキシドとの、ＯＭＶ（５０μｇ／ｍｌ）およびΔＧ２８７（１００μｇ／ｍｌ）の組合せであり；レーン５の組成物は、２．５ｍＭ  リン酸ナトリウムを含み、レーン６の組成物は、５ｍＭ  ヒスチジンを含み、そしてレーン７の組成物は、１０ｍＭヒスチジンを含んだ。
【図３】図３もまた、遠心分離物後の抗原性組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１は、図１と同じＭＷマーカーを含む。ＯＭＶ抗原（２．５μｇ）を、レーン２で用い；ΔＧ２８７抗原を、レーン３（２μｇ）およびレーン４（０．５μｇ）で用いた。レーン５およびレーン６で用いた抗原は、生理食塩水溶液（ｐＨ６．５）中の３．３ｍｇ／ｍｌ  アルミニウムオキシヒドロキシドとの、ＯＭＶ（５０μｇ／ｍｌ）およびΔＧ２８７（１００μｇ／ｍｌ）の組合せであり；レーン５の組成物は、２．５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＰＢＳ）を含み、それに対してレーン６の組成物は、生理食塩水溶液中の５ｍＭ  ヒスチジンを含んだ。
【図４】図４は、４℃でのワクチン処方物のｐＨ安定性を示す。黒い記号は、５ｍＭ  ヒスチジンで緩衝化したワクチンを表し；白い記号は、２．５ｍＭリン酸ナトリウムで緩衝化したワクチンを表す。初期のｐＨは、６．０（菱形）、６．５（正方形）または７．０（三角形）であった。
【図５】図５は、３７℃での、図４と同様の内容を示す。
【図６】図６は、種々の抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１は、ＭＷマーカーを含む。レーン２〜レーン６は、以下のマーカーを含む：（２）ΔＧ２８７−９５３；（３）９６１ｃ；（４）９３６−７４１；（５）Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＯＭＶ；および（６）Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  ＯＭＶ。レーン７〜レーン１０は、２〜８℃で１ヶ月保存した後の、本発明の、遠心分離したヒスチジン処方物の上清を示す：（７）ΔＧ２８７−９５３；（８）９６１ｃ＋９３６−７４１＋ΔＧ２８７−９５３；（９）９６１ｃ＋９３６−７４１＋ΔＧ２８７−９５３＋ＯＭＶＮＺ；（１０）９６１ｃ＋９３６−７４１＋ΔＧ２８７−９５３＋ＯＭＶＮｏｒｗａｙ。
【図７】図７は、図６と同じ内容を示すが、レーン７〜レーン１０が、３６〜３８℃での保存後である。
【図８】図８は、種々の抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１は、ＭＷマーカーを含む。レーン２〜レーン５は、以下のマーカーを含む：（２）９６１ｃ；（３）９３６−７４１；（４）Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＯＭＶ；および（５）Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  ＯＭＶ。レーン６〜レーン９は、２〜８℃で１ヶ月保存した後の、本発明の遠心分離したヒスチジン処方物の上清を示す：（６）９６１ｃ；（７）９３６−７４１；（８）ＯＭＶＮＺ；（９）ＯＭＶＮｏｒｗａｙ。
【図９】図９は、図８と同じ内容を示すが、レーン６〜レーン９は、３６〜３８℃での保存後である。
【図１０】図１０は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＯＭＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１は、ＭＷマーカーを含む。レーン２、レーン３、レーン６およびレーン７は、２〜８℃（レーン２およびレーン３）または３６〜３８℃（レーン６およびレーン７）のいずれかで保存した、２μｇ（レーン２およびレーン６）または１μｇ（レーン３およびレーン７）のいずれかで存在するＯＭＶマーカーを含む。レーン４、レーン５、レーン８およびレーン９は、２〜８℃（レーン４およびレーン５）または３６〜３８℃（レーン８およびレーン９）のいずれかで３０日間保存した後の本発明のヒスチジン処方物中のＯＭＶを示す。レーン４およびレーン９は、遠心分離したＯＭＶの上清を示し、一方レーン５およびレーン８は、ペレットを示す。
【図１】
0004509554.tif 000011
【図２】
0004509554.tif 000012
【図３】
0004509554.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0004509554.tif 000019
【図１０】
0004509554.tif 000020