(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネ紋枯病菌またはイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項１に記載の抗菌タンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号２の部分アミノ酸配列７６−６１８からなるポリペプチド、並びに上記アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってイネ紋枯病菌またはイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド、の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質。
【請求項４】
ホンシメジの水性抽出液から硫安７５％飽和を使用する硫酸沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけＮａＣｌ濃度０．０５Ｍから１Ｍの濃度で溶出する画分を回収する工程；
を含む、請求項１または３に記載の抗菌タンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項１または３に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する請求項５に記載の遺伝子。
【請求項７】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項５に記載の遺伝子。
【請求項８】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項５に記載の遺伝子。
【請求項９】
ホンシメジ由来の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を得るためのオリゴヌクレオチドの対であって、
配列表の配列番号１に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドの対。
【請求項１０】
配列表の配列番号７ないし９から選択されるヌクレオチド配列を有する１種のオリゴヌクレオチド、並びに、配列番号１０ないし１２から選択されるヌクレオチド配列を有する１種のオリゴヌクレオチド、からなる、請求項９に記載のオリゴヌクレオチドの対。
【請求項１１】
請求項９に記載のオリゴヌクレオチドの対を用いて、ホンシメジ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして核酸増幅反応を行い請求項１に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長ｃＤＮＡクローンを単離することを含む、請求項５に記載の遺伝子の単離方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１３】
ベクターが発現ベクターである請求項１２に記載の組換えベクター。
【請求項１４】
宿主生物に請求項１２に記載の組換えベクターを導入して得られる形質転換体。
【請求項１５】
請求項１の形質転換体を抗菌タンパク質の発現を促進する条件下で培養することを含む、請求項１または３に記載の抗菌タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によって得られた組換え抗菌タンパク質。
【請求項１７】
請求項１または３に記載の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗菌活性を有する新規なタンパク質、上記タンパク質をコードする遺伝子、並びに上記タンパク質および上記遺伝子の利用法に関する。さらに詳細には、本発明は、少なくともイネ紋枯病菌およびイネいもち病菌に対する抗菌活性を有するホンシメジ由来タンパク質、上記タンパク質をコードする遺伝子、並びに上記タンパク質および上記遺伝子の利用法に関する。
本出願は、１９９９年９月２１日に提出された日本特許出願  特願平１１−２６７２３８号を基礎とする優先権主張出願である。当該日本特許出願の内容は全て本明細書に援用される。
背景技術
植物病原菌に対して抗真菌活性あるいは抗菌活性を有する植物のタンパク質としては、キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼなどの溶菌酵素が従来から知られている。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、これらの酵素は単独でも効果があるが（Ｓｃｈｌｕｍｂａｕｍ他（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ  ３２４，ｐ．３６５−３６７；Ｂｒｏｇｌｉｅ他（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，ｐ．１１９４−１１９７）、一般には２種類以上の酵素を組み合わせて使用することにより、より高い効果が得られることが知られている（Ｍａｕｃｈ他（１９８８），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８，ｐ．９３６−９４２；Ｓｅｌａ−Ｂｕｕｒｌａｇｅ他（１９９３），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０１，ｐ．８５７−８６３）。これら溶菌酵素が糸状菌の生育を抑制する濃度は一般的には、単独の場合で数十〜数百μｇ／ｍｌ程度、組み合わせの場合でも各々の酵素当たり数μｇ／ｍｌ程度を必要とすることが知られている。しかしながら、これらの溶菌酵素の中で、イネの重要病害であるいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）に対して抗菌的に働くことが証明されたものは本発明者が知る範囲では未だ報告されていない。
一方、ディフェンシンをはじめとする小分子量ＡＦＰ（抗真菌ペプチド；Ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）も抗微生物活性を有する。このうちイネのいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）と紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）の両方に対して抗菌的に働くものとしては、Ｃａ−ＡＭＰ１（特表平８−５０５０４８）及びＣＢ−１（Ｏｉｔａ他（１９９６），Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６０，ｐ．４８１−４８３）が、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）に対して抗菌活性があるものとして、Ｒｓ−ＡＦＰ１とＲｓ−ＡＦＰ２（Ｔｅｒｒａｓ他（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，ｐ．１５３０１−１５３０９）、及びＡｃｅ−ＡＭＰ１（特表平９−５０１４２４）が報告されている。これらの低分子ペプチドは数μｇ／ｍｌ程度で上記病原菌を含む各種の植物病原菌の生育を５０％阻害する。
溶菌酵素あるいは低分子量抗菌ペプチドの遺伝子を単離して、植物に導入し、病害抵抗性植物を作出しようという試みもなされている（Ｂｒｏｇｌｉｅ他（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，ｐ．１１９４−１１９７；Ｚｈｕ他（１９９４），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，ｐ．８０７−８１２；Ｌｉｎ他，（１９９５），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，ｐ．６８６−６９１；Ｔｅｒｒａｓ他（１９９５），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７，ｐ．５７３−５８８）。しかし、現状では、必ずしも実用化レベルの抵抗性を付与された植物体が得られていないことが多い。この理由としては、導入した遺伝子の発現レベルが低いことがあげられるが、より本質的には、これまでに報告されている抗菌タンパク質自体の抗菌力が低いことによるものと考えられる。従って、従来の抗菌タンパク質よりさらに強力な抗菌タンパク質を同定して利用を図ることが望まれている。
発明の概要
本発明の目的の１つは、比較的低濃度でイネの２大病害であるいもち病菌と紋枯病菌をはじめとする様々な植物病原菌の生長を抑止できる新規な抗菌タンパク質を検索、同定することである。
本発明の別の目的は、上記の新規タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を特定することである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の遺伝子を宿主生物（微生物、動物または植物など）に導入して形質転換体を作出し、本発明の遺伝子の利用を図ることである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗菌タンパク質を含む抗菌剤を提供することである。
発明の詳細な説明
上記課題を解決することを目的として、本発明者らは、先ず、いもち病菌および紋枯病菌に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗菌活性を検定するためのアッセイ系を確立した。次いで、本発明者らは、食用キノコの一種であるホンシメジからタンパク質を抽出し、イオン交換カラムクロマトグラフィーと高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を組み合わせ、各画分を上記アッセイ系に供試することにより、抗菌タンパク質画分を同定し、抗菌タンパク質を単離・精製することに成功した。さらに本発明者らは、精製タンパク質の部分アミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するＲＴ−ＰＣＲ法により当該タンパク質をコードする部分長ｃＤＮＡを得た。次いで、本発明者らは、この部分長ｃＤＮＡをプローブとして用いてホンシメジ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、当該タンパク質をコードする完全長のｃＤＮＡを単離し、全塩基配列を決定した。上記の通り、本発明者らは、ホンシメジ由来の新規な抗菌タンパク質の単離とそれをコードするＤＮＡのクローニングに成功し、また当該タンパク質のアミノ酸配列と当該ＤＮＡの塩基配列を決定して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の第１の側面によれば、ホンシメジの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネ紋枯病菌またはイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量が前駆体型で約７０ｋＤａ、そして成熟型で約６５ｋＤａである、抗菌タンパク質が提供される。
本発明の抗菌タンパク質は、典型的には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。限定されるわけではないが、約６５ｋＤａの成熟型は、配列番号１のアミノ酸残基７６−６１８からなると推測される。
本発明の抗菌タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のみでなく、当該配列において１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネ紋枯病菌またはイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質も含む。
本発明の抗菌タンパク質は、好ましくは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の第２の側面によれば、配列表の配列番号２の部分アミノ酸配列、例えばアミノ酸残基７６−６１８、からなるポリペプチド；並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、イネ紋枯病菌またはイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド；の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質が提供される。
本発明の第２の側面による上記抗菌タンパク質に関して、各々の具体的アミノ酸配列と「５０％以上の相同性を有するタンパク質」という定義は、少なくとも５０％以上の相同性を有していればよいことを意味するが、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が意図される。
本発明の第３の側面によれば、ホンシメジの水性抽出液から硫安７５％飽和を使用する硫酸沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけＮａＣｌ濃度０．０５Ｍから１Ｍの濃度で溶出する画分を回収する工程；
を含む、本発明の抗菌タンパク質の製造方法が提供される。
本発明の第４の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の遺伝子は、典型的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する。
本発明の遺伝子は、一般的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。
本発明の第５の側面によれば、ホンシメジ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列表の配列番号１に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号７ないし１２の何れか１項に記載のヌクレオチド配列を有する。
本発明の第６の側面によれば、上記オリゴヌクレオチドの２種の組をプライマーとして用いて、ホンシメジｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして増幅反応を行い本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長ｃＤＮＡクローンを単離することを含む、本発明の遺伝子の単離方法が提供される。
本発明の第７の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。
本発明の組換えベクターにおいて、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
本発明の第８の側面によれば、宿主生物に本発明の組換えベクターを導入して得られる形質転換体が提供される。
本発明の第９の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
本発明の第一の側面によれば、植物病原菌に対して抗菌効果のあるホンシメジ由来のタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の抗菌タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
本発明のタンパク質は典型的には、配列表の配列番号２に記載の６１８個のアミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明のタンパク質は、クローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
本発明のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量が前駆体型（配列表の配列番号２の配列のうち第１番目から第６１８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相当）が約７０ｋＤａ、そして成熟型（配列表の配列番号２の配列のうち第７６番目から第６１８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相当）が約６５ｋＤａである。限定されるわけではないが、本発明の抗菌タンパク質は、典型的には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
従って、本発明によれば、配列表の配列番号２の第１番目から第６１８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；および第７６番目から第６１８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドの単独又は何れかの組み合せから成る抗菌タンパク質が提供される。なお、上記ポリペプチドには、本明細書中上記したような変異を有する相同なポリペプチドも含まれる。
本発明のタンパク質は、例えば後述の実施例に従ってホンシメジ子実体から硫安沈殿法およびイオン交換カラムクロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、本発明による配列表の配列番号１のＤＮＡ配列のうち、第８番目から第１８６１番目の配列から成るＤＮＡ配列、または第２３３番目から第１８６１番目の配列から成るＤＮＡ配列を、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
本発明のホンシメジ由来抗菌タンパク質について、ＤＤＢＪのＢＬＡＳＴによる相同性検索を行うと、最も相同性の高いものでアミノ酸配列全体同士で４５％の相同性しか有しておらず、これ以外で相同性のある配列は存在していないことから、本タンパク質は新規なタンパク質であると考えられる。本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応などの遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。上述のＢＬＡＳＴプログラムを用いて本発明のＤＮＡ配列の相同性検索を行うと、非常に短い範囲（３２塩基）で相同性（９３％）を有するものがヒットするのみである。
本発明のホンシメジ由来の抗菌タンパク質が最も高い相同性（アミノ酸配列全体同士で４５％）を有していたのは、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）のピラノースオキシダーゼであった。ピラノースオキシダーゼは、グルコースを始めとするピラノース類を酸化し、２−ケト産物を過酸化水素を生成させる酵素で、他のピラノースの測定への応用価値が述べられている。本明細書に援用される特開平８−２０５８６１参照。本発明のホンシメジ由来抗菌タンパク質は、実際にピラノースオキシダーゼ活性を示し、その比活性は非常に高く、グルコースなどに対するＫｍ値も低いことが判明した。またイオン交換カラムによる画分の抗菌活性の強さとピラノースオキシダーゼ活性の高さはよく一致した。よって、本発明において見出されたホンシメジ由来の抗菌タンパク質の抗菌活性は、ピラノースオキシダーゼに関連すると推定される。理論に縛られるわけではないが、本発明における抗菌活性の作用機序としては、アッセイ培地に含まれるグルコースが本酵素によって化される過程で生じる過酸化水素が病原菌に有害に働く可能性が考えられる。
本発明のタンパク質の精製および単離は、硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ、Ｑ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＤＥＡＥなど）などのタンパク質の精製および単離のために慣用される方法を適宜組み合わせて行うことができる。
例えば、下記の実施例において記載するように、細粉化したホンシメジを緩衝液で抽出した後、ろ過し、その上清に硫安（硫酸アンモニウム）を好適な濃度、例えば７５％飽和になるまで添加して静置することにより本発明のタンパク質を含む沈殿が得られる。この沈殿をさらに透析した後、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度のグラジェント（例えば、塩化ナトリウムで５０ｍＭから１Ｍ）で溶出し、所望のタンパク質を含む画分を回収すればよい。
本発明はまた、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子をも提供する。遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。
本発明の遺伝子は典型的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、本発明の抗菌タンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、そのような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ  ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，ｐ．１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，ｐ，１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。
本発明によればまた、ホンシメジ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列表の配列番号１に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば本発明の遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、あるいは適当な２種をプライマー対として用いたＰＣＲ等の増幅反応に用いることが可能である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号８〜１２の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する。このヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列に基づいて、各々のタンパク質をコードする遺伝子断片のクローニングのためのＰＣＲ用プライマーとして設計されたものであり、当該アミノ酸をコードすることが可能な全ての塩基をミックスしたプライマーである。
本発明の遺伝子の部分断片は、上記オリゴヌクレオチドの適切な組み合せを使用してホンシメジ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより増幅させて単離することができる。かくして得られた増幅産物をプローブとして使用してさらにｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーションなどでスクリーニングすることにより完全長のｃＤＮＡクローンを単離することができる。核酸増幅反応の手順及び条件、プラークハイブリダイゼーションの条件などは当業者に周知である。
本発明によればまた、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、Ｅ−Ｃｏｉｌ  ＴＢ１，  ＬＥ３９２  またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示されるがこれらに限定されない。
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現ベククーが有用である。発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
本発明の発現ベクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
本願発明のＤＮＡ断片を用いて病害抵抗性植物を作出する目的においては、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，  ２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，  １６５−１７４（１９９６））などが例示される。
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本願発明のＤＮＡ断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（本願発明のＤＮＡ配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。
プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。しかしながら、より好適には誘導性のプロモーターを組み入れて用いてもよい。こうすることで病害虫が形質転換植物に接触した時にのみ、当該タンパクが生産され、抵抗性となる。用いられるべき誘導性プロモーターとしてはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、チオニン、オズモチンあるいは病害虫やストレスに反応するその他の遺伝子のプロモーターが考えられる。
植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，  １２９（１９８５）、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，  ２７１−２８２（１９９４））、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））、ＰＥＧ法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，  ２７１７（１９８４））、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，２０２，  １７９（１９８６））、微小物衝突法（ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６，  ９２３（１９８８））などが挙げられるが、所望の植物に遺伝子を導入する方法であれば特に限定されない。また、宿主となる植物種も本発明の植物形質転換用ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される植物、例えば双子葉植物ではタバコ、アラビドプシス、トマト、キュウリ、ニンジン、ダイズ、バレイショ、テンサイ、カブ、ハクサイ、ナタネ、ワタ、ペチュニアなどが挙げられ、単子葉植物では、イネ、トウモロコシ、コムギなどが挙げられる。
本発明のタンパク質は極めて強力な抗菌活性をもつ。例えばイネのいもち病菌に対しては５ｎｇ／ｍｌという非常に低い濃度で胞子の発芽を完全に抑制する（後述の実施例２を参照）。この濃度においては長時間のインキュベーションの後にも胞子の発芽はみられないことから、本発明のタンパク質のいもち病菌に対する効果は、生長の部分的阻害というよりはむしろ、殺菌効果であると考えられる。このような低い濃度（ナノグラムオーダー）で、病原菌の生育を完全に抑止できる抗菌タンパク質は本発明者の知る範囲では現在までに報告されていない。後述の実施例においては、抗菌タンパク質の精製のための抗菌アッセイのための植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌と紋枯病菌を使用したが、同定したホンシメジ抗菌タンパク質が、これら以外の植物病害にも大差ないレベルで抗菌効果を有している可能性は極めて高い。このように本発明のホンシメジ由来の抗菌タンパク質は強い抗菌活性を有していることから、本発明のタンパク質は、抗菌剤や農薬などの薬剤としてそれが活性のある形で含まれるような製剤として利用することができる。この場合、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を用いれば、先述のように例えば大腸菌や酵母などで機能する発現ベクターにそのＤＮＡを組み込んで大量に製造することができる。
本発明のタンパクは、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。例えば、本発明の実施例４では大腸菌（Ｍ１５）を宿主細胞として本発明の組換え抗菌タンパク質の発現を行った。限定されるわけではないが、大腸菌での発現の場合、組換えタンパク質発現のための培養条件として、好ましくは４℃ないし４０℃の温度で培養し、０．０１ｍＭないし５．０ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を行う。
本発明のタンパクは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパクが宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０Ｍ〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパクが宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の精製、単離に供することができる。
精製・単離の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。例えば、限定するわけではないが、本明細書で後述する実施例４では、Ｎ−末端に６×ヒスチジンのタグを有する組換え抗菌タンパク質を発現させた。当該組換えタンパク質は、６×ヒスチジンに親和性を有するＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して精製した。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパクを生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
上記の通り本発明の抗菌タンパク質は、真菌類あるいは細菌が関与する植物の疾患の予防及び治療などに利用することが可能である。即ち、本発明によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。本発明の抗菌剤は通常、植物の全身または局所的に、散布することができる。
散布量は、植物の種類、生育段階、症状、散布方法、処理時間、散布するタンパク質の種類（全長のタンパク質、該タンパク質の一部を置換、欠失、挿入及び／又は付加したクンパク質など）、生育している場所の気候、生育している場所の土壌などにより異なるが、一日一回から複数回散布することができる。散布量は種々の条件により変動する。本発明の抗菌剤の散布に際しては、必要に応じて、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを混合して散布することも可能である。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば蒸留水、食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類などが挙げられる。
このような抗菌組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）などの補助剤を含んでいてもよい。
これらは、必要に応じてバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた、例えば凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物の形態で製造し、使用前に無菌の蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
このようにして得られる抗菌剤の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、乳剤等の形態により散布することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１  アッセイ系の構築
１）検定系の確立
病原菌の培養：イネいもち病菌（菌株ＴＵＳ−１、レース３３７；農林水産省東北農業試験場より分譲）はオートミル培地（Ｄｉｆｃｏ社製，１％ショ糖添加）上で培養して分生胞子を得た。胞子液は１０％グリセロールを加えて、−８０℃で保存した。
イネ紋枯病菌（菌株ＪＴ８７２）は１／２ジャガイモ煎汁培地（ＰＤ培地：Ｄｉｆｃｏ社製）で２日間培養し、５×５ｍｍ程度の菌糸塊を３個をテフロンホモジナイザーで１／２ＰＤ培地とともに軽く磨砕して得られた断片化菌糸を接種源とした。
上記の接種源を９６穴マイクロタイタープレート（コーニング社製）に１ウェル当たりいもち病菌分生胞子は約１，０００個、紋枯病菌は断片化菌糸は約３００個になる様に１００μｌの１／２ＰＤ培地とともに加え、２８℃の恒温器で培養した。菌の増殖はマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）で５９５ｎｍの吸光度を測定した。
塩、緩衝液の影響：菌の増殖に対する塩や緩衝液の影響を、培地にＮａＣｌやリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、牛血清アルブミン、ジチオスレイトールなどを一定量加えて判定した。
２）ホンシメジからのタンパク質抽出
ホンシメジ（日本産。滋賀県森林センターより入手）１０ｇをあらかじめハサミで細かく切断後、液体窒素を用いて凍結して乳鉢で細粉となるまで磨砕し、３０ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液を加えて３０分間抽出を行った。抽出液はミラクロスでろ過後、１０，０００×ｇ、２０分間の遠心を行った上清に硫安を７５％飽和になるように加えて、一晩４℃で静置した。再度、１５，０００×ｇ、２０分間の遠心で沈殿させて、沈殿物を３ｍｌの１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液，  ｐＨ７．５に溶解し、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１  ＭＷＣＯ  ６−８０００，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）またはベンゾイル化透析チューブ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析を行って、不溶物を遠心によって除去してホンシメジタンパク質試料とした。ホンシメジタンパク質試料のタンパク質濃度は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。
実施例２  抗菌タンパクの精製
１）ホンシメジ粗タンパク試料の抗菌活性
いもち病菌、紋枯病菌の培養系に培養開始直後にホンシメジの粗タンパク質抽出液試料を一定量加えて、２日間まで培養して、吸光度変化を経時的に測定して抗菌性の有無について判定した。タンパク試料は希釈系列を作成し、抗菌性に対する希釈限界点を検出した。その結果、いもち・紋枯の両病原菌に対する高い抗菌活性が見いだされた（表１）。
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いもち病菌に対する完全生長阻害濃度は、３０μｇ全抽出タンパク／ｍｌ以下と概算され、このことから、ホンシメジの抽出物の中には高い抗菌活性をもつ物質が含まれていることが明らかとなった。このタンパク抽出液の菌に対する生長阻害の様式は、濃度の高い場合は発芽の完全抑制、低い場合は菌糸の生長阻害が観察された。菌糸の伸長阻害程度は、明らかに濃度依存的であった。また、いもち病菌の細胞は、その細胞質が細胞壁から離れ、原形質分離様の様相を呈した。
２）イオン交換カラムによる精製
次に抗菌タンパク質の精製を行った。ホンシメジ７０ｇを液体窒素中で粉砕し、２００ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．０）中で３０分間タンパクを抽出した。二重のミラクロスで濾過した後、１５０００×ｇで２０分間遠心し、不純物を沈殿させた。上清を濾紙でさらに濾過し、タンパク試料とした。タンパク試料約２００ｍｌを、イオン交換体Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を充填したカラム（内径１．１ｃｍ×２０ｃｍ）にかけた。流速は２．５ｍｌ／分とし、基本緩衝液は５０ｍＭ  Ｍｅｓ  ｐＨ６．０，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ、溶出緩衝液は５０ｍＭ  Ｍｅｓ  ｐＨ６．０，  １Ｍ  ＮａＣｌを用い、グラジェント（ＮａＣｌで５０ｍＭから１Ｍ）は、試料を打った１００分後から１２０分間かけた。この後さらに溶出緩衝液を４０分間流した。画分の回収は、グラジェント開始から４０分ごとに４回行った（１００  ｍｌ／画分）。これら４種の画分（Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ）の希釈系列を作製して、イネいもち病菌に対する抗菌アッセイを行った。その結果、画分ＩＩ〜ＩＶに抗菌活性が認められた。これらの画分によって病原菌細胞には原形質分離が生じた。最も活性の高かった画分ＩＩ（０〜３３３ｍＭ  ＮａＣｌに相当）をセントリプレップ１０（Ａｍｉｃｏｎ社製、ＭＷＣＯ１０，０００）で濃縮し、イオン交換カラムＭｏｎｏＱＨＲ５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、抗菌タンパクを部分精製した。流速は１ｍｌ／分とし、基本緩衝液は５０ｍＭ  Ｍｅｓ  ｐＨ６．０，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ、溶出緩衝液は５０ｍＭ  Ｍｅｓ  ｐＨ６．０，  １Ｍ  ＮａＣｌを用い、グラジェント（ＮａＣｌで５０ｍＭから１Ｍ）は、試料を打った２０分後から４０分間かけた。各画分（１ｍｌ）の一部をいもち病菌に対する抗菌アッセイと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供試した。まず、ＨＰＬＣのチャートと抗菌性の強さとの関係を図１に示した。抗菌性はＭｏｎｏＱの各画分から５、１、０．２μｌをとり、いもち病菌に対するアッセイを行い、＋＋＋（０．２μｌまで阻害）、＋＋（１μｌまで阻害）、＋（５μｌまで阻害）、−（５μｌでも阻害しない）の４段階で表示した。その結果、Ａ２８０と、いもち菌に対する抗菌活性によりタンパクをモニターすると、ｐＨ６．０においてイオン強度（ＮａＣｌ濃度）が２５０ｍＭ付近に抗菌タンパクの溶出ピークが現れた。その後、イオン強度が高くなるにつれ、単位溶出液あたりのタンパク質の抗菌性は徐々に減少することが明らかとなった。
次に各画分から１０μｌをとり、等量の２×ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）を加え、９５℃で５分間処理した後、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）の方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。ゲルは１５％のＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用い、銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬社製）によりタンパク質を検出した。タンパクのおよその分子量と量を見積もるため、分子量マーカー（ＬＭＷ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ社製、分子量の大きい順に９４ｋＤａ、６７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０．１ｋＤａ、１４．４ｋＤａ）を１本のバンドが２０ｎｇとなるように泳動した。電気泳動像と抗菌性の強さの関係を図２に示した。各レーンの上に表示した数字は、図１の画分の番号と同じもので、抗菌性の強さも図１に準じて表示した。抗菌性とリンクすると考えられるタンパクのバンドを精査すると、約７０ｋＤａと、約６５ｋＤａの２つのバンドが候補として挙げられた（図２矢印）。これら２種のバンドの濃度と抗菌活性の度合いは正の相関関係にあるので、これらのバンドが抗菌タンパク質本体である可能性が強く示唆された。このうち、特に６５ｋＤａタンパクは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる分画においても、ＭｏｎｏＱによる分画においても、タンパクのバンドの濃度と、抗菌活性の強さとが非常によくリンクしていた。分子量マーカー（６７ｋＤａのアルブミン）から、デンシトメーターにより抗菌タンパクの量を推定し、いもち病菌に対する完全生長阻害濃度を算出すると、およそ５ｎｇ／ｍｌとなった。
３）抗菌性タンパク質のＮ末アミノ酸配列の解読
上記のｍｏｎｏＱの画分番号３６〜４４をセントリカットＶ−２０（クラボウ社製）で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。トリスを除去し、グリシンを含まない緩衝液系でＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）へ転写し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で軽く染色した後、脱色した。その後、抗菌性タンパク質であると考えられた７０ｋＤａと、６５ｋＤａのタンパクバンドを切り出した。Ｎ末端アミノ酸配列は、気相プロテインシークエンサー（ＨＰＧ１００５Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、エドマン分解法により決定した。
その結果、６５ｋＤａタンパクからは次のような３０アミノ酸
Ｎ末端−ＮＡＥＥＧＴＡＶＰＹＶＰＧＹＨＫＫＮＥＩＥＦＱＫＤＩＤＲＦＶ−Ｃ末端（配列番号３）
が決定された。
一方、７０ｋＤａタンパクは解読が不可能であった。この原因として、Ｎ末端がブロックされていることが考えられた。そこで、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼを用いて、７０ｋＤａタンパク質を部分消化し、４３ｋＤａリシルエンドペプチダーゼ消化物、４５ｋＤａＶ８プロテアーゼ消化物を得た。これらの部分消化タンパク質のアミノ酸配列を再解析した結果、前者から２４残基Ｎ末端−ＥＦＤＥＳＩＲＨＴＬＶＬＲＳＬＱＤＡＹＫＤＲＱＲ−Ｃ末端（配列番号４）
後者から２９残基
Ｎ末端−ＡＥＲＬＩＧＴＳＴＫＥＦＤＥＳＩＲＨＴＬＶＬＲＳＬＱＤＡＹ−Ｃ末端（配列番号５）
が決定された。両アミノ酸配列は大部分が重複していたので、部分分解による内部アミノ酸配列は、全体で３４残基
Ｎ末端−ＡＥＲＬＩＧＴＳＴＫＥＦＤＥＳＩＲＨＴＬＶＬＲＳＬＱＤＡＹＫＤＲＱＲ−Ｃ末端（配列番号６）
が決定されたことになる。決定されたアミノ酸配列に関して、データベースサーチを行ったところ、６５ｋＤａタンパクからの３０アミノ酸、７０ｋＤａタンパクからの３４アミノ酸は、ともにカワラタケのピラノースオキシダーゼと相同性を示した。そこで、ＭｏｎｏＱの各画分のピラノースオキシダーゼ活性を測定した。測定法は、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）の方法に準じた。その結果、ピラノースオキシダーゼ活性の高さと、抗菌活性の強さはよく一致した。従って、抗菌性は、培地中のグルコースが本酵素によって酸化される際に生じる過酸化水素に由来すると推定された。次に、６５ｋＤａと７０ｋＤａの両タンパク質のみを含む画分（図２  番号４２〜４４）を濃縮し、ピラノースオキシダーゼの諸性質を解析した。その結果、ホンシメジ由来抗菌タンパク質のピラノースオキシダーゼ活性は非常に高く、グルコースや、１，５−アンヒドログルシトールに対するＫｍ値も低いことが明らかとなった（表２）。
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＊  １Ｕ＝１μｍｏｌｅ  Ｈ２Ｏ２／分    ｐＨ７．０中、３７℃
酵素タンパク量（６５ｋＤａ＋７０ｋＤａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色により定量した。
実施例３  ｃＤＮＡの単離
１）縮重プライマーの設計
１）で決定されたアミノ酸配列を基に、考えられる全ての塩基がミックスされたプライマーを合成した（Ｔｍは５２〜５６℃、括弧内の数字は縮重度を示す）。具体的には、６５ｋＤａタンパク由来のアミノ酸配列（３０残基）から以下の３種のプライマーを合成した。
６５Ｒ１（５’−ｇａｒｇａｒｇｇｉａｃｉｇｃｉｇｔｉｃｃ−３’（４））（配列番号７）
６５Ｒ２（５’−ｇａｒｔｔｙｃａｒａａｒｇａｙａｔｈｇａｙｍｇ−３’（３８４））（配列番号８）
６５Ｒ３（５’−ｔｔｙｇｔｉａａｙｇｔｉａｔｈｔｇｙｇｇｉｇｃ−３’（２４））（配列番号９）
一方、７０ｋＤａタンパクの部分分解物由来のアミノ酸配列（３４残基）からも、以下の３種のプライマーを合成した。
７０Ｆ１（５’−ｔｇｉｃｋｄａｔｉｓｗｙｔｃｒｔｃｒａａｙｔｃ−３’（３８４））（配列番号１０）
７０Ｆ２（５’−ｔｇｉｃｋｒｔｃｙｔｔｒｔａｉｇｃｒｔｃｙｔｇ−３’（６４））（配列番号１１）
７０Ｆ３（５’−ｇｇｉｇｃｒａａｄａｔｉｃｋｙｔｇｉｃｋｒｔｃ−３’（９６））（配列番号１２）
上記プライマー中、ｒはａまたはｇを、ｙはｃまたはｔを、ｈはａまたはｃまたはｔを、ｍはａまたはｃを、ｋはｇまたはｔを、ｄはａまたはｇまたはｔを、ｓはｇまたはｃを、ｗはａまたはｔを、ｉはイノシンをそれぞれ示す。
２）ホンシメジ子実体ｃＤＮＡライブラリーの構築
ホンシメジ子実体からＳＤＳフェノール法で全核酸を抽出し、塩化リチウム沈殿により全ＲＮＡを回収した。これからｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によりホンシメジｍＲＮＡを調製した。子実体約１０ｇから２０μｇのｍＲＮＡが得られた。このうち５μｇをＺＡＰ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に供試し、ｃＤＮＡを合成した。ゲル濾過カラムにより１〜５ｋｂのｃＤＮＡを分画し、Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にライゲーションし、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）によりパッケージングを行った。全ての手順はキット添付の説明書に従った。構築したホンシメジｃＤＮＡライブラリーのタイターは、およそ３００万ｐｆｕと算出された。
３）ＲＴ−ＰＣＲによるプローブの取得
１）で合成したプライマーを用いて２）で合成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなるホンシメジタンパクの部分長ｃＤＮＡの増幅を試みた。反応条件は以下のように行った。５０μｌの反応液中に、ｃＤＮＡ  １００ｎｇ，１０×Ｅｘ  ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ，ｄＮＴＰｓ  ４μｌ，ｐｒｉｍｅｒ  １０ｐｍｏｌｅｓ／ｅａｃｈ  ｋｉｎｄ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｅｘ  ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）＋Ｔａｑ  ＳＴＡＲＴ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ社）を用いて、９４℃  ３分を１回、９４℃  １分、５０℃  １分、７２℃  １分を３５回、７２℃  ６分を１回行った。その結果、６５Ｒ１−７０Ｆ１、６５Ｒ１−７０Ｆ２、６５Ｒ２−７０Ｆ１、６５Ｒ２−７０Ｆ２、６５Ｒ２−７０Ｆ３、６５Ｒ３−７０Ｆ１のプライマー組み合わせにおいて約０．４〜０．５ｋｂの産物が増幅された。これらのうち増幅効率のより高かった６５Ｒ２−７０Ｆ１の組み合わせによる約０．４ｋｂの断片をゲル精製し、ベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、塩基配列を決定した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、２３）で決定されたアミノ酸配列の一部と同一の配列を含み、しかも配列全体に渡ってカワラタケのピラノースオキシダーゼと緩い相同性を示した。このことから、精製した７０ｋＤａと６５ｋＤａの抗菌タンパク質は、一つの遺伝子にコードされ、ＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡクローンはホンシメジ抗菌タンパク質の部分長ｃＤＮＡであることが確認された。
４）完全長ｃＤＮＡのスクリーニング
３）で得られたクローンをベクターから切り出し、これをプローブに用いて２）で構築したホンシメジｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１４×１０  ｃｍの角形シャーレにＺＡＰ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の説明書に従って、約１５０００ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行い、ＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。ハイブリダイゼーション、および洗浄の条件は、メンブレンに添付の説明書きに従って高いストリンジェンシー下で行った。１次スクリーニングで約１２０，０００ｐｆｕのファージから２０個のポジティブクローンが得られた。これらのクローンに関して、２次スクリーニング、プラークの精製を兼ねた３次スクリーニングを行い、２０個全てについてＺＡＰ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の説明書きに従って、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎを行った。その結果、１８個のクローンが、ファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫに組み込まれたｃＤＮＡとして回収された。これらのクローンの長さは１．７〜２．１ｋｂであり、制限酵素分析から非常によく似た遺伝子由来であることが示唆された。
５）塩基配列の決定
上記の１８個のｃＤＮＡクローンについて、５’および３’側の塩基配列およそ５００ｂｐを決定した。得られた塩基配列データをＧｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．９．０解析ソフト（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）を用いて解析した。その結果、ポリＡ付加部位にはクローン間で差異があるものの、全てのクローンが２３）で決定した６５ｋＤａタンパクの３０アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含んでいた。番号１３（２．１ｋｂ）のｃＤＮＡクローンが最長であったので、このクローンの全塩基配列を決定した。プライマーウォーキング法により、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅ１３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、ホンシメジ抗菌タンパクをコードするｃＤＮＡは全長２１０６塩基対からなり、１８５４塩基対のオープンリーディングフレームを含み、６１８個のアミノ酸をコードしていた（配列番号１および２）。アミノ酸配列から推定される分子量は約６８４８７、等電点は６．１２と算出された。精製タンパクから決定されたアミノ酸配列は、６５ｋＤａ由来３０アミノ酸が、配列表配列番号２のアミノ酸番号７６〜１０５に、７０ｋＤａ由来３４アミノ酸が、同２１１〜２４４にそれぞれ対応した。これは６５ｋＤａと７０ｋＤａタンパクが同じ一つの遺伝子にコードされていることを意味する。さらに推定糖鎖付加部位が７カ所（配列表配列番号２のアミノ酸番号１５４、３１９、３６０、４１２、５５８、５７３、５８３）存在していた。
以上の結果から、クローニングしたｃＤＮＡはホンシメジ抗菌タンパクをコードする遺伝子に由来すると結論された。本発明のホンシメジ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列について、データベース（ＤＤＢＪ）上で相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を実施したところ、カワラタケのピラノースオキシダーゼのアミノ酸配列と全体で４５％の同一性を有していた。これ以外で有意に相同性のある配列は存在していないことから、本遺伝子は新規なピラノースオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子であると考えられる。
実施例４．大腸菌内発現と組換えタンパク質の精製
１）発現ベクターの構築
実施例３の５）で単離した１３番のｃＤＮＡクローンには、翻訳終止コドンの約０．０６ｋｂ下流に唯一のＥｃｏＴ２２Ｉ制限部位が、また翻訳終止コドンの約０．２５ｋｂ上流に唯一のＢａｍＨＩ制限部位が存在する。またこのｃＤＮＡの５’側のベクター上のマルチクローニングサイトには、ＢａｍＨＩが存在する。そこで、まずこのｃＤＮＡが組みこまれたプラスミド（ベクターはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）を制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ（Ｔａｋａｒａ社製）で完全消化し、その後ＢａｍＨＩ（Ｔａｋａｒａ社製）で部分消化した。その結果生じた約２ｋｂのＢａｍＨＩ（ベクター上のＢａｍＨＩ）−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片を、予め制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで二重消化した大腸菌用発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ社製）へ組みこんだ（ｐＱＥＨＳＰＯｆｕｌｌと命名）。完成した構築物は、本発明のホンシメジピラノースオキシダーゼ様タンパクをコードする完全長ｃＤＮＡの最長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み（配列表の配列番号１の第８番目から第１８６４番目の塩基配列を含む。これは配列表の配列番号２の全アミノ酸配列をコードする）、発現タンパク質のＮ末端にはタグとして６個のヒスチジン残基が付加される。
２）大腸菌内発現
宿主大腸菌Ｍ１５株を用いて発現実験を行った。菌の培養方法、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）によるタンパク発現誘導方法はＱｉａｇｅｎ社の説明書に従った。抗生物質アンピシリン、カナマイシンを含むＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．５程度になるまで菌を前培養し、その後同じ培地中で各種温度、各種ＩＰＴＧ濃度にて一定時間培養し発現誘導を行った。菌体からＱｉａｇｅｎ社の説明書に従って可溶性タンパク質を抽出し、そのうちの一定量をＮｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）の方法に従ってピラノースオキシダーゼ活性を測定した。組換えタンパク質の発現結果を表３にまとめた。
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まず最初に通常の誘導条件である培養温度３７℃、ＩＰＴＧ濃度２ｍＭで誘導を試みたが、不溶性封入体は大量に発現したものの、可溶性画分のピラノースオキシダーゼ活性が検出されなかった。そこで種々の条件で発現誘導を行い、可溶性画分のピラノースオキシダーゼ活性を測定した。その結果、誘導条件を緩くするににつれ、即ち培養温度やＩＰＴＧ濃度を下げていくにつれピラノースオキシダーゼ活性が上昇した。これは誘導条件の緩和により、可溶性組換えタンパク質含量が増加したためと考えられた。一方、対照としたｐＱＥ３０（ベクターのみ）では活性は全く検出されなかった。以上の結果からクローニングしたｃＤＮＡは確かに活性のあるピラノースオキシダーゼ様タンパク質をコードしていることが明らかとなった。なお、培養温度２５℃、ＩＰＴＧ濃度０．５ｍＭでは５時間の培養に比べ、２１時間での培養は活性が下がった。これはおそらく発現タンパク質が分解されていることを示唆している。
次に発現タンパク質の精製を試みた。培養温度１６℃、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭで発現誘導した菌体由来の可溶性タンパク質画分から、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて組換えピラノースオキシダーゼ様タンパク質の精製を行った。Ｑｉａｇｅｎ社の説明書に従って、タンパク質の吸着、洗浄、溶出を行ったところ、溶出画分にのみピラノースオキシダーゼ活性が検出された。従って、組換えタンパク質のＮ末端は大腸菌内で分解されておらず、ヒスチジン残基がＮ末に結合していること、それを利用して組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースによって容易に精製出来ること、またクローニングした完全長ｃＤＮＡの全コード領域は、そのままで（タンパクのＮ末端側に相当する部分を除去しなくても）活性のあるタンパク質をコードしていることが明らかとなった。組換えタンパク質の収量は大腸菌培養液１１当たり数ｍｇと推定された。
効果
本発明の配列表の配列番号２の配列または、このうち第１番目から第７５番目の配列を除いた全配列を含むことを特徴とするタンパク質成分を有効成分として含む製剤を作出すれば、強力な抗菌剤としての利用が期待できる。また、上記タンパク質成分を有効成分として含む試薬を作出すれば、血糖など、糖の測定に利用することが出来る。本発明の配列表の配列番号１のＤＮＡ配列のうち、第８番目から第１８６４番目の配列であることを特徴とするＤＮＡ配列、または第２３３番目から第１８６４番目の配列であることを特徴とするＤＮＡ配列を、植物細胞の中で機能しうる適当な構成的、器官・時期特異的、あるいはストレスや病害虫で誘導されるプロモーター配列と、植物細胞で機能しうるターミネター配列の発現カセットに組み込み、植物細胞に導入、再生個体を得ることにより、病害虫抵抗性植物を作出できることが期待される。あるいはまた、上記のＤＮＡ配列を大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、当該タンパクを大量に安価に得ることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＭｏｎｏＱカラムによるホンシメジタンパク質の分離のチャートと抗菌性との関係を示す。
図２は、ＭｏｎｏＱカラムによるホンシメジ抗菌タンパク質の分離の電気泳動像と抗菌性との関係を示す。レーン上の番号は図１の画分番号に一致し、Ｍは分子量マーカーを示す。またレーン下の記号（−、＋、＋＋、＋＋＋）は抗菌活性の強さを示す。抗菌タンパク（７０ｋＤａと６５ｋＤａ）を矢印で示した。
【図１】
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【図２】
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