(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列の６３３位においてセリンからプロリンへのアミノ酸変化を有しているように変異しているＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
ヌクレオチド配列の第１８９７位においてＴ→Ｃ変異を有し、その結果、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の第６３３位においてセリンからプロリンへのアミノ酸変化がおきていることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項２または３に記載の遺伝子および適当な発現調節配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換され、変異ＲＮＡポリメラーゼを発現し得る細胞。
【請求項６】
等温的な転写に基く核酸増幅反応における請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項７】
等温的な転写に基く増幅反応において使用するための酵素混合物であって、
−  請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼ、
−  逆転写酵素活性および必要に応じてＲｎａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素
を含むことを特徴とする上記酵素混合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、例えば、高温条件下での増大した安定性を有する、バクテリオファージから得られる変異型ＲＮＡポリメラーゼに関する。バクテリオファージによってコードされるＲＮＡポリメラーゼの一例がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７は、大腸菌細胞に感染し得るバクテリオファージである。大腸菌に感染する他のＴ７様バクテリオファージの例には、Ｔ３、φＩ、φＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、ｃｒｏＣ２１、Ｃ２２およびＣ２３がある。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに感染するバクテリオファージの例がＳＰ６である。
【０００２】
バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼは、自身のプロモーター配列に対する高い選択性を有している。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列には結合するが、それ以外のバクテリオファージのプロモーター配列のいずれとも結合しない。この高いプロモーター特異性により、バクテリオファージの転写反応が、宿主のゲノムに対してではなく、自身のゲノムに対して確実に向けられている。Ｔ７バクテリオファージの全ヌクレオチド配列は知られており、このファージのＲＮＡポリメラーゼはＴ７遺伝子１によってコードされている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと類似する他のＲＮＡポリメラーゼには、バクテリオファージＳＰ６およびバクテリオファージＴ３のＲＮＡポリメラーゼがある。Ｔ３ＲＮＡＰはＴ７ＲＮＡＰと約８０％の相同性を示す。
【０００３】
Ｔ７遺伝子１はクローニングされ、細菌において発現され、酵素の大量製造が可能になっている（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、米国特許第４９５２４９６号）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、分子量が９８．６Ｋｄａである８８３アミノ酸の単鎖タンパク質である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、正確な転写のために何らかの補助因子を必要としない。この酵素は単独で、そのプロモーターを認識して、転写を開始させ、ＲＮＡ転写物を伸長させ、かつ転写を終結させることができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、自身のプロモーターからＤＮＡを転写させることが非常に効率的であり、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼと比較して５倍早くＲＮＡを伸長させる。完全な転写物を産生させるその選択性、活性および能力により、バクテリオファージから得られるポリメラーゼは様々な目的に関して非常に役立つ。
【０００４】
本発明は、Ｔ７様バクテリオファージの変異させたＲＮＡポリメラーゼに関する。
【０００５】
Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼのいくつかの具体的な変異体が記載されている。例えば、国際特許公開ＷＯ９１／０５８６６には、別の発現システムが記載されている。このシステムは、クローニングされた遺伝子を細菌において転写させるためにバクテリオファージのＴ７ＲＮＡプロモーターを使用しようとするものである。このシステムは短縮型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用し、その遺伝子は、ヌクレオチド（野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基３８０９および塩基３８７７に対応する１つまたは２つ以上の塩基）を欠失させることによって変異している。この欠失はフレームシフトを生じさせ、その結果、新しい翻訳停止コドンが作出される。米国特許第５３８５８３４号には、変異型のＴ７ＲＮＡＰもまた記載されている。米国特許第５３８５８３４号に記載されている変異体は、グルタミン酸（２２２）をリシンに変換するＴ７遺伝子１のヌクレオチド６６４におけるＧからＡへのトランジションである。この変異体は、変化したプロモーター認識を示している。従って、この変異体は、通常は不活性であるＴ７プロモーターの点変異部から転写を開始させることができる。
【０００６】
Ｉｋｅｄａ他（Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：９０７３〜９０８０、１９９２；およびＩｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２０：２５１７〜２５２４、１９９２）は、変異型Ｔ７ＲＮＡＰの遺伝子配列およびプロモーター配列の活性をスクリーニングするために使用できる２つの適合性プラスミドを記載している。第１のプラスミドは、大腸菌のｔａｃプロモーターに連結されたＴ７遺伝子１（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子）を有し、第２のプラスミドは、Ｔ７プロモーターに連結されたＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を有する。これらの２つのプラスミドを有する大腸菌細胞は、Ｔ７ポリメラーゼがＴ７プロモーターと相互作用して、ＣＡＴ遺伝子が第２のプラスミドから転写された場合にＣＡＭ（クロラムフェニコール）耐性になる。Ｔ７プロモーターまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかが不活性である場合、ＣＡＴ遺伝子は転写されず、従って、大腸菌細胞はｃａｍ感受性である。Ｉｋｅｄａ他はこれらのプラスミドを使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの活性に対するいくつかの変異の影響を調べた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子１が好適なプロモーターの制御下で一方のプラスミドに存在し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＣＡＴのような耐性遺伝子を制御する別のプラスミドに存在するＩｋｅｄａ他により記載されたシステムのようなプラスミドシステムを用いて、変異型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ自体をその活性について同様にスクリーニングすることができる。
【０００７】
バクテリオファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を利用したインビトロ転写は分子生物学で広く適用される手段になっている。自身に対するインビトロ転写と並んで、ＲＮＡポリメラーゼは、所要量のＲＮＡバクテリオファージを短時間で作製する手段として核酸増幅反応の一部になっている。そのような方法は、例えば、ＮＡＳＢＡ、３ＲＳおよびＴＭＡである。インビトロ転写はまた、ＰＣＲ増幅後のさらなる線形増幅工程としてＰＣＲとの組合せで記載されている。
【０００８】
上記の適用のすべてに関して、等温的な増幅方法（ＮＡＳＢＡ、３ＲＳおよびＴＭＡ）がより高い温度で実施できることは、反応温度を高くすることができ、その結果、転写反応の速度論がより良好になり、かつより重要になる場合には好都合である。等温的な増幅反応のインキュベーション温度をこのように高くすることは、構造化したＲＮＡの増幅をより効率的にすることができる。このことが重要である適用は、長いＲＮＡ配列（＞５００ヌクレオチド）の増幅であり、多重反応（すなわち、１つの反応混合物中における多数のＲＮＡ配列の増幅）である。
【０００９】
本発明は、Ｔ７様バクテリファージに由来し、増大した安定性を有するＲＮＡポリメラーゼの変異体に関する。
【００１０】
無作為に変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の分析により、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼタンパク質に対する安定化作用を有し、かつ通常（通常とは３７℃〜４１℃である）よりも高い温度での酵素活性を可能にする多数の可能な変異が明らかにされた。無作為に変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの配列を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて、Ｉｋｅｄａ他（１９９２）に記載されているような２つのプラスミドのシステムで配列をスクリーニングすることによって分析した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞を高温（４５℃〜５０℃）で生育させた。その際、変異型のＴ７配列が、このような温度でポリメラーゼ活性を可能にするより安定なＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする場合にだけ、ＣＡＭ耐性が得られる。このＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのシステムにおいて、一方のプラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下に抗生物質耐性遺伝子（ＣＡＴ）を含み、もう一方のプラスミドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓプロモーターの制御下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの変異ライブラリーを含む。変異によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼが高い温度で機能的になり得るそのような場合に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓはＣＡＭ耐性になる。上記に記載されるシステムを使用して、４３クローンのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が見出された。この集団の中で、１２クローンをさらに詳しく分析した。すなわち、コードする遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。分析された１１クローンの集団は、アミノ酸の変化をもたらす変異とサイレントな変異との両方からなった（表１参照）。アミノ酸の変化をもたらす変異をさらに調べた。
【００１１】
【表１】
0004485066.tif 000002
【００１２】
上記の変異を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼのクローンをさらに調べ、酵素活性および熱安定性に関してこれらの変異型Ｔ７ポリメラーゼの特性を明らかにすることができる。
【００１３】
本発明による好ましい変異型ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージまたはＳＰ３バクテリオファージに由来する変異型ＲＮＡポリメラーゼである。これらの酵素間の大きな相同性のために、Ｔ７遺伝子１の配列における変異は、Ｔ３バクテリオファージの対応する遺伝子配列において同じ効果を有すると考えられる。本発明の特に好ましい実施形態は、タンパク質におけるセリンからプロリンへのアミノ酸変化をアミノ酸配列の６３３位に有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＴ３ＲＮＡポリメラーゼとの相同性は８０％であるので、Ｔ７遺伝子における６３３位のセリンからプロリンへの変異の同じ効果が、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにおける６３４位のセリンからプロリンへのアミノ酸の変異について予想され得る。
【００１４】
ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であって、野生型のタンパク質と比較したときにそのコードされるＲＮＡポリメラーゼの増大した安定性をもたらす１つまたは２以上の変異を含む遺伝子は、同様に本発明の一部である。特に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が本発明では関連する。
【００１５】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の６３３位におけるセリンからプロリンへのアミノ酸の変化は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位におけるＴからＣへの変異の結果である。
【００１６】
従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位におけるＴからＣへの変異を有する変異型Ｔ７ポリメラーゼの遺伝子は、同様に本発明の一部である。変異は、Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．［（１９８３）バクテリオファージＴ７ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列およびＴ７遺伝子エレメントの位置、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４）、４７７〜５３５］によって発表されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型配列と比較して評価される。この場合、１位はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の最初のヌクレオチドンであり、これはバクテリオファージＴ７の完全なゲノム配列におけるヌクレオチド番号３１７１である。
【００１７】
本発明はさらに、本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼを発現させるための発現ベクターに関する。
【００１８】
遺伝子を発現させるために、遺伝子は、その遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする調節配列の制御下に置かれる。通常、これは、発現させる遺伝子をそのような調節配列の下流にクローニングすることによって行われる。遺伝子または遺伝子フラグメントの発現を可能にする調節配列は、例えば、エンハンサー配列と組み合わせたプロモーター配列であってもよく、あるいはプロモーター配列はエンハンサー配列と組み合わせなくてもよい。
【００１９】
これらの配列は、その天然の形態で遺伝子に結合していることが見出されているプロモーター配列であり得る。あるいは、異種のプロモーターであり得る。異種のプロモーターを使用することの利点は、そのようなプロモーターにより、遺伝子本来のプロモーターを認識しない宿主細胞において遺伝子を発現させる可能性が得られることである。さらに、異種のプロモーターは誘導可能なプロモーターであり得る。その結果、遺伝子の発現を任意の所望するときに開始させることができる。
【００２０】
プロモーター部位は、ＲＮＡポリメラーゼが転写に先立って結合する配列である。プロモーター部位は様々なタイプで存在する。すなわち、細胞のタイプに依存して、プロモーター部位が考え出されている。様々なプロモーター配列が、原核生物、真核生物およびウイルスを起源とするプロモーターについて記載されている。上記に言及されたタイプの組換えＤＮＡ分子は、例えば、好適な制限酵素で好適なＤＮＡフラグメントを切断し、調節配列を含むフラグメントを同じ酵素で切断し、その後、発現させる核酸がプロモーター配列の制御下にあるような方法で両フラグメントを連結することによって作製することができる。有用な組換え体を作製するための多くの異なる方法がＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載されている。
【００２１】
一般に、組換え核酸配列は、いわゆるベクター分子にクローニングされる。そのときに形成された組換えベクター分子は、多くの場合、好適な宿主細胞内で自己複製することができ、クローニングされた核酸配列を細胞内に入れるために使用することができる。これは、組換えベクター分子の複製が生じる細胞であり得る。それはまた、ベクターの調節配列が認識され、その結果、本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼが発現する細胞でもあり得る。広範囲のベクターが現在知られており、これには、細菌において使用されるベクター、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５およびｐＢＲ３２８、様々なｐＵＣベクター（すなわち、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、特異的な発現ベクター；ｐＧＥＭ、ｐＧＥＸおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、バクテリオファージに基づくベクター；λ−ｇｔＷｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｍ１３由来ファージ、ＳＶ４０またはパピローマウイルスまたはアデノウイルスまたはポリオーマウイルスに基づくウイルス配列を含む真核生物における発現用ベクターが含まれる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．およびＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ．編、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８８）；Ｌｅｎｓｔｒａ他、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１１０：１〜２４（１９９０））。変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする調節配列の制御下に核酸配列を含む組換え分子はすべて本発明の一部と見なされる。
【００２２】
さらに、本発明は、変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、または変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸分子を、変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする調節配列の制御下に含む宿主細胞を含む。
【００２３】
本発明はまた、変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、または変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸分子を、変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする調節配列の制御下に含むウイルスベクターを含む宿主細胞を含む。
【００２４】
頻繁に使用される発現システムは、細菌、酵母、真菌、昆虫および哺乳動物細胞の発現システムである。そのようなシステムは当分野ではよく知られており、容易に入手することができ、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７、米国）から市販されている。
【００２５】
宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌型ベクター、またはｐＧＥＸのような細菌発現ベクター、またはバクテリオファージと組み合わせた細菌起源の細胞、例えば、大腸菌、枯草菌およびラクトバチルス種の細胞であり得る。宿主細胞はまた、真核生物起源であってもよく、例えば、酵母に特異的なベクター分子と組み合わせた酵母細胞、あるいはベクターまたは組換えバキュロウイルスと組み合わせた昆虫細胞のような高等真核生物細胞（Ｌｕｃｋｏｗ他、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：４７〜５５（１９８８））、あるいは例えばＴｉプラスミド型ベクターまたは植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．他、Ｃｅｌｌ、３２：１０３３（１９８３））、あるいは適切なベクターまたは組換えウイルスと同様に組み合わせたＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣｒａｎｄｅｌｌネコ腎臓細胞のような哺乳動物細胞である。
【００２６】
従って、本発明によるＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子と好適な発現制御配列とを含む発現ベクターは、それで形質転換された宿主細胞と同様に、同様に本発明の一部である。
【００２７】
本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼが通常使用され、そしてそのＲＮＡポリメラーゼが、例えば、高い温度で使用され、従って、改善された安定性が好都合であるすべてのプロセスにおいて使用される。
【００２８】
本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼは、核酸の増幅に関する等温的な転写に基づく増幅プロセスにおいて特に有用である。従って、等温的な転写に基づく増幅方法における本発明によるＲＮＡポリメラーゼの使用もまた本発明の一部である。
【００２９】
転写に基づく増幅技術には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを含むテンプレートから多数のＲＮＡコピーを転写することが含まれる。このような方法の場合、多数のＲＮＡコピーが、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される機能的なプロモーターを含むＤＮＡテンプレートから転写される。そのようなコピー体は、新たな量のＤＮＡテンプレートが得られる標的などとして再び使用される。そのような方法は、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による国際特許公開ＷＯ８８／１０３１５、およびＢｕｒｇ他による国際特許公開ＷＯ８９／１０５０に記載されている。等温的な転写に基づく増幅技術は、Ｄａｖｅｙ他による欧州特許ＥＰ第３２３８２２号（ＮＡＳＢＡ法に関連する）、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による欧州特許ＥＰ第３７３９６０号、およびＫａｃｉａｎ他による欧州特許ＥＰ第４０８２９５号に記載されている。転写に基づく増幅反応はまた、熱に安定な酵素を用いて行うことができる。転写に基づく増幅は、通常、約３７℃〜４１℃の温度で行われる。このような熱に安定な酵素により、反応をより高い温度（＞４１℃）で行うことができる。そのような熱に安定な酵素は、Ｔｏｙｏ  Ｂｏｓｅｋｉ  ＫＫの名で出願された欧州特許ＥＰ第６８２１２１号に記載されている。
【００３０】
欧州特許ＥＰ第３２３８２２号、同第３７３９６０号および同第４０８２９５号に記載されている方法は等温的な連続方法である。これらの方法の場合、４つの酵素活性が、増幅を達成するために必要である：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ（Ｈ）活性、およびＲＮＡポリメラーゼ活性。これらの活性のいくつかは１つの酵素で併せ持つことができ、従って、通常的には２つまたは３つの酵素が必要になるだけである。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡをＲＮＡテンプレートから合成する酵素である。従って、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡがＤＮＡテンプレートから合成される。転写に基づく増幅反応では、ＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素またはＭＭＬＶ（モロニーネズミ白血病ウイルス）逆転写酵素などの逆転写酵素がこれらの活性のために使用され得る。そのような酵素は、ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、固有のＲＮａｓｅＨ活性をも有する。さらに、大腸菌のＲＮａｓｅＨなどのＲＮａｓｅＨを転写に基づく増幅反応の反応混合物に加えることができる。
【００３１】
転写に基づく増幅方法とともに広く使用されているＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。従って、ＲＮＡの多数のコピーを転写するために使用されるテンプレートに組み込まれるプロモーターは、むしろＴ７プロモーターである。プロモーターを含むテンプレートは、通常、標的配列を含む核酸から出発して作出しなければならない。そのような核酸は、増幅反応の情報源として使用される出発材料に存在し得る。出発材料に存在する核酸には、通常、標的配列がはるかにより長い配列の一部として含まれる。さらなる核酸配列が、標的配列の３’末端および５’末端の両方に存在し得る。増幅反応は、出発材料に由来するこのような核酸、上記の活性をともに提供する適切な酵素、および少なくとも１つ（通常的には２つ）のオリゴヌクレオチドを一緒にすることによって開始させることができる。このようなオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、プロモーターの配列を含まなければならない。
【００３２】
転写に基づく増幅方法は、情報源物質が単鎖ＲＮＡである場合には特に有用である。しかし、単鎖または二本鎖のＤＮＡを情報源物質として同様に使用することができる。転写に基づく増幅方法が、標的配列の３’末端および５’末端の両方に存在するさらなる配列とともに、（「プラス」センスの）単鎖ＲＮＡを有するサンプルに対して実施される場合、先行技術に記載されている方法とともに都合よく使用される１対のオリゴヌクレオチドは、下記のオリゴヌクレオチドからなる：
・標的配列の３’末端にハイブリダイゼーションし得る第１のオリゴヌクレオチド（これは、通常、「プロモーターオリゴヌクレオチド」と呼ばれる）。そのようなオリゴヌクレオチドは、その５’末端に結合させたプロモーター（好ましくは、Ｔ７プロモーター）の配列を有する（このオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分は、情報源物質として使用されたプラスＲＮＡと逆の極性を有する）。
【００３３】
・標的配列の３’末端を含む第２のオリゴヌクレオチド（「プライマー」）（このオリゴヌクレオチドはプラスＲＮＡと同じ極性を有する）。
【００３４】
そのような１対のオリゴヌクレオチドが、適切な活性を有するすべての酵素と、必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの十分な供給量と一緒に１つの反応混合物に入れられ、適切な条件（すなわち、適切な緩衝剤条件および適切な温度）のもとで十分な時間にわたって保たれた場合、等温的な連続増幅反応が生じる。
【００３５】
本発明によるＲＮＡポリメラーゼはまた、他の核酸増幅プロセスと一緒に使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応の場合、バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列、特に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列が組み込まれているプライマーが使用されることがある。これにより、ＲＮＡをＰＣＲ反応のＤＮＡ産物から転写させることができる。再度ではあるが、本発明によるＲＮＡポリメラーゼは同様に適用することができる。
【００３６】
従って、等温的な転写に基づく増幅反応において使用される酵素混合物であって、本発明によって提供されるＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有する酵素、およびＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を含む酵素混合物は、同様に本発明の一部である。
【００３７】
図面の簡単な説明
図１は、野生型酵素および変異型酵素を比較する４６℃におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写反応を示す。ＲＮＡ産生は、反応のＲＮＡ産物に対する特異的な分子ビーコンを用いてリアルタイムで測定される。
図２は、４１℃、４３℃または４５℃で野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いた反応のＮＡＳＢＡ増幅結果を示す。
【００３８】
本発明を下記の実施例によりさらに説明する。
【００３９】
実施例１
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸位置６３３におけるセリンからプロリンへの置換を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使用して部位特異的変異誘発によって行った。全手順を、キットに同封された製造者のプロトコルに従って行った。変異を導入するために使用されたオリゴプライマーを下記に示す。
【００４０】
Ａ：５’−ＧＴＧ−ＴＧＡ−ＣＴＡ−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＧＧ−ＴＣＡ−ＴＧＡ−ＣＧＣ−ＴＧＧ−３’
Ｂ：５’−ＣＣＡ−ＧＣＧ−ＴＣＡ−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＴＡＧ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−３’
オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチドＡに対して相補的である。下線部の配列はＭｓｐＩの制限部位を示す。この制限部位は、ＴからＣへの変異をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位に有するオリゴヌクレオチド配列を得るために変異体クローンをスクリーニングするために使用される。
【００４１】
ＰＣＲ反応混合物および反応条件は下記の通りであった。
１０ｘＰｆｕ緩衝液                          ５μｌ
オリゴヌクレオチドＡ（１００ｎｇ／ｕｌ）    １．２５μｌ
オリゴＢ                                    １．２５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                          １．２５μｌ
プラスミドテンプレート＊                      １μｌ
Ｈ２Ｏ                                        ４１μｌ
合計                                          ５０μｌ。
【００４２】
プラスミドテンプレートは、その後の手順における簡便な精製を行うためのヒスチジン標識に融合させた、データベースに発表されている完全なＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型の遺伝子配列（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．（１９８３）バクテリオファージＴ７ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列およびＴ７遺伝子エレメントの位置、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４）、４７７〜５３５）を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、Ｔ７ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４９３１）をテンプレートとして使用するＰＣＲによってクローニングされた。次いで、ＰＣＲ増幅したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡを、ｐＵＣ１８のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）内に標識配列を挿入することによって事前に作製されたｐＵＣ１８（ｔａｇ）プラスミドの適切な制限部位にクローニングした。Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列を配列決定によって確認した後、Ｔａｇ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの融合遺伝子をｐＫＫ２２３−３発現プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２７−４９３５−０１）の適切な部位にサブクローニングして、Ｔａｇ−Ｔ７ＲＮＡＰ／ｐＫＫ２２３−３を作製した。
【００４３】
ＰＣＲ反応を、下記の温度サイクルプロトコルを用いて行った：
９５℃    ３０秒
５５℃    １分
６８℃    １４分  ／１８サイクル
ＰＣＲ反応後、１０ユニットのＤｐｎＩ制限酵素を加え、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、ＤｐｎＩ処理したＤＮＡの１μｌを大腸菌ＪＭ１０９の形質転換に使用した。最後に、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのクローンを、ＭｓｐＩ制限酵素を使用してプラスミドＤＮＡをスクリーニングし、制限部位、従ってＴからＣへの変異をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位に含むそのようなプラスミドを選択することによって単離した。
【００４４】
実施例２
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを、下記のプロトコルを用いて単離した：
１．ＴからＣへの変異をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位に有するＴａｇ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ／ｐＫＫ２２３−３プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９を、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３．５ｍｌの２ｘＹＴブロス（１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン、１０ｇ／Ｌのバクト酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）において３７℃で１６時間〜２４時間培養する。
２．細胞を遠心分離によって１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに集め、ペレットを一旦凍結する。
３．１ｍｌの氷冷した精製緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ）を加える。
４．細胞を４℃で１．５分間の超音波処理を行うことによって溶解する。
５．チューブを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（細胞抽出物）を新しいチューブに移す。
６．１００ｕｌのアフィニティー樹脂懸濁物（ＴＡＬＯＮ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を加え、ヒスチジン標識物を結合させる。
７．チューブを回転式振とう器によって４℃で３０分間穏やかに攪拌する。
８．樹脂を遠心分離によって集め、樹脂ペレットを０．５ｍｌの精製緩衝液で２回洗浄する。
９．３００ｕｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ、１００ｍＭのイミダゾール）を加え、樹脂を穏やかなボルテックスによって懸濁する。
１０．チューブを室温で３０秒間インキュベーションして、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
１１．上清を新しいチューブに移す。
１２．限外ろ過メンブラン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用することによって酵素を濃縮し、同時に緩衝液を２ｘ保存緩衝液（２０ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）に置換する。
１３．Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を使用することによってタンパク質濃度を測定し、濃度を２ｘ保存緩衝液で０．５ｍｇ／ｍｌに調節する。
１４．等量のグリセロールを加える。
１５．酵素溶液を−２０℃で保存する。
【００４５】
実施例３
下記のプロトコルを使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素的転写活性を測定する。
１．下記の反応混合物を調製する。
【００４６】
（１アッセイ分）  （１０アッセイ分）
１０ｘ転写緩衝液（＊２）              ５μｌ            ５０μｌ
１００ｍＭのｒＮＴＰ混合物（２５ｍＭの各ｒＮＴＰ）
０．８μｌ          ８μｌ
Ｔ７ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４９３１）（０．５ｕｇ／ｕｌ）
２μｌ              ２０μｌ
ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）              ２．５μｌ          ２５μｌ
Ｈ２Ｏ                              ３４．２μｌ        ３４２μｌ
［３Ｈ］ｒＵＴＰ（ＮＥＮ：ＮＥＴ−２８７）
０．５μｌ          ５μｌ
合計                                ４５μｌ            ４５０μｌ
２．４５μｌの上記反応混物を２ｍｌのエッペンドルフチューブに分注する。
３．混合物を３７℃で３分間インキュベーションする（プレインキュベーション）。
４．アッセイする酵素溶液の５μｌを加え、簡潔かつ十分に混合する。
５．３７℃で１０分間インキュベーションする。
６．反応を停止させるために１．５ｍｌの３．６％ＰＣＡ溶液（３．６％の過塩素酸、０．１ＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７）を加え、氷上で１０分間インキュベーションする。
７．ろ過し、標準的な方法に従って［３Ｈ］を測定する。
【００４７】
このアッセイでは、転写活性は、下記の式を使用することにより計算される：活性（ユニット／μｌ）＝［ｃｐｍ（サンプル）−ｃｐｍ（ブランク）］ｘ２４／ｃｐｍ（全体）
（１ユニットは、１ｎｍｏｌの標識されたヌクレオチド三リン酸が６０分間で酸不溶物に取り込まれることを触媒する活性として定義される）。
【００４８】
実施例４
この実施例では、種々のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの半減期Ｔ１／２が、下記のプロトコルを使用することによって測定される。
１．下記の反応混合物を調製する。
（１アッセイ分）
１０ｘ転写緩衝液                        １０μｌ
０．５Ｍ  ＫＣｌ                        １４μｌ
ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）                  １０μｌ
Ｈ２Ｏ                                  ５６μｌ
合計                                    ９０μｌ
（転写緩衝液：４００ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）、２００ｍＭのＭｇＣｌ２、および５０ｍＭのＤＴＴ）
２．アッセイする酵素溶液の１０μｌを加え、十分に混合する。
３．適切な温度でインキュベーションする。
４．５分毎または１０分毎に５μｌを取り出し、直ちに転写活性アッセイの反応混合物（実施例３）に移して（残存）活性を測定する。
５．ｌｎ［［ｃｐｍ（ｔ＝Ｔ）−ｃｐｍ（ブランク）］／［ｃｐｍ（ｔ＝０）−ｃｐｍ（ブランク）］］をＴ（インキュベーション時間）に対してプロットする。
６．Ｔ１／２（分）をｅ（＝２．７１８）／傾きとして求める。
【００４９】
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと変異型（１８９７位におけるＴからＣへの変異）との比較結果を下記の表２に示す。
【００５０】
【表２】
0004485066.tif 000003
【００５１】
実施例５
この実施例では、インビトロ転写反応を、反応時におけるリアルタイム蛍光によってＲＮＡ合成量を測定するために分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ［１９９５］、分子ビーコン：ハイブリダイゼーションしたときに蛍光を発するプローブ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０３〜３０８）を加えることによって分析した。この反応におけるテンプレートＤＮＡは、Ｔ７プロモーターの下流にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期抗原（ＩＥＡ）配列を含むプラスミドであり、分子ビーコン（５’フルオレセイン−ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧ−ダブシル３’）は、ＣＭＶ  ＲＮＡが形成されるとすぐにＣＭＶ  ＲＮＡにハイブリダイゼーションする。反応物（４０ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．５）、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのｒＡＴＰ、２ｍＭのｒＣＴＰ、２ｍＭのｒＵＴＰ、１．５ｍＭのｒＧＴＰ、０．５ｍＭのＩＴＰ、０．１μｇのプラスミドＤＮＡ、および０．１μＭの分子ビーコン）を６５℃で５分間インキュベーションし、その後、適量のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、反応物を４５℃でさらにインキュベーションした。蛍光量を５分毎に蛍光計で測定した。この結果を図１に示す。結果は、変異体７−７のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型酵素と比較して、４６℃でより大きな酵素活性を有していることを明瞭に示している。
【００５２】
実施例６
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはまた、高温でのＮＡＳＢＡ増幅反応の一部として使用された。ＮＡＳＢＡ反応では、ＨＣＶ配列の一部を、アンプリコン領域に対する２つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。ＮＡＳＢＡ反応物（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのｒＡＴＰ、２ｍＭのｒＵＴＰ、２ｍＭのｒＣＴＰ、１．５ｍＭのｒＧＴＰ、０．５ｍＭのＩＴＰ、０．７５ｍＭのＥＤＴＡ、１５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ、０．２ｍＭのオリゴヌクレオチドＨＣＰ１、０．２ｍＭのオリゴヌクレオチドＨＣＰ２、０．３７５Ｍのソルビトール）を６５℃で５分間インキュベーションし、続いて、４１℃、４３℃または４５℃で５分間インキュベーションした。次いで、酵素混合物（２．１ｍｇのＢＳＡ、０．０１ユニットのＲＮａｓｅＨ、１０ユニット〜５０ユニットの適切なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、７．５ユニットのＡＭＶ−ＲＴ）を加え、反応物を、軽くたたくことによって穏やかに混合した後、４１℃、４３℃または４５℃で９０分間インキュベーションした。適切なプローブとハイブリダイゼーションさせた後、増幅反応物の１０倍希釈物をＭａｒｋＩ装置（東洋紡（株）、大阪、日本）で分析することによって増幅産物を検出した。図２に示される結果は、変異体７−７のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する標準的な反応と比較して４５℃ではるかに良好に増幅したことを明瞭に示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  野生型酵素および変異型酵素を比較する４６℃におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写反応を示す。ＲＮＡ産生は、反応のＲＮＡ産物に対する特異的な分子ビーコンを用いてリアルタイムで測定される。
【図２】  ４１℃、４３℃または４５℃で野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いた反応のＮＡＳＢＡ増幅結果を示す。
【配列表】
0004485066.tif 000004
0004485066.tif 000005
【図１】
0004485066.tif 000006
【図２】
0004485066.tif 000007