(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項２】
請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を、光学活性５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。
【請求項３】
請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質、および、５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
【請求項４】
下記(ii)および(iii)のうち少なくとも一方が光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素含有物であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
(i)請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質
(ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素または当該酵素含有物
(iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素または当該酵素含有物
【請求項５】
請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質と、５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加水分解する化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項６】
下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって：
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列；
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列；
前記ストリンジェントな条件が：
(e)９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件；または
(f)６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件
のいずれかであるＤＮＡ。
【請求項７】
下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項８】
請求項６または７のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【請求項９】
前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体であることを特徴とする請求項８に記載の組み換えＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項１１】
前記細胞は、エシェリヒア  コリであることを特徴とする請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法に関し、特に、ラセミ化反応を効率的に触媒する新規５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
５置換ヒダントインラセマーゼ（以下「ＨＲａｓｅ」とも記す）は、光学活性な５置換ヒダントイン化合物、すなわちＤ−またはＬ−５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質のラセミ化反応を触媒する酵素である。
【０００３】
５置換ヒダントイン化合物は、下記反応式（I）に示すように、▲１▼、▲２▼の酵素による加水分解反応を経てアミノ酸となる。
▲１▼５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素（ヒダントイナーゼ、以下「ＨＨａｓｅ」とも記す）。
▲２▼生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ、以下「ＣＨａｓｅ」とも記す。また、一般にカルバミルアミノ酸ハイドロラーゼはカルバミラーゼと略称される場合がある）。
【０００４】
【化１】
0004485734.tif 000002
【０００５】
５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、上記▲１▼ヒダントイナーゼおよび▲２▼Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。この５置換ヒダントイン化合物から、光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に重要である。
【０００６】
微生物酵素系あるいは微生物酵素系と化学反応系との組み合わせにより、ＤＬ−５置換ヒダントイン化合物の全量を光学選択的に加水分解させ、光学活性アミノ酸に変換するには、基質とならないエナンチオマーを効率的にラセミ化し、基質となるエナンチオマーに変化させる必要がある。ところが、基質とならない光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化速度がきわめて遅いものもあり、ラセミ化が律速となって効率的に光学活性アミノ酸に変換することができないといった問題があった。
【０００７】
そこで、中性条件下での光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を目的として、ＨＲａｓｅの検索がなされ、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌由来（特開昭６２−１２２５９１号公報、Ann.N.Y.Acad.Sci  ６７２巻４７８ページ、特開平６−３４３４６２号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由来(特開平４−２７１７８４号公報、J.Bacteriol.１７４巻、７９８９ページ、１９９２年)が報告されている。従来報告されている細菌由来のＨＲａｓｅの至適反応温度は、アースロバクター  エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＳＭ−３７４７株由来のものが３７℃（Ann.N.Y.Acad.Sci  ６７２巻 ４７８ページ）、同じくアースロバクター  エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＫ２００株由来のものが１０℃〜５０℃（特開昭６２−１２２５９１号公報）、またシュードモナスエスピー(Pseudomonas sp.)ＮＳ６７１由来のものが４５℃である。これらの菌株はいずれもＬ−アミノ酸生産菌である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、工業的応用の観点から、ＨＲａｓｅは有用である。従って、本発明の目的は、従来にない新規ＨＲａｓｅを単離し、当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
５置換ヒダントイン化合物からＤ−アミノ酸を生産する菌株については既に報告があるものの、Ｄ−アミノ酸生産菌の中でＨＲａｓｅ活性を有するものについては報告がなく、また、上記のようにＨＲａｓｅはＬ−アミノ酸生産菌に由来するものしか見出されていなかった。しかしながら、本発明者らは、Ｌ−アミノ酸生産菌に限らずＤ−アミノ酸生産菌についても幅広く探索を続けたところ、初めてＤ−アミノ酸生産菌の中からＨＲａｓｅ活性を有する菌を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕  下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
〔２〕 上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を、光学活性５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。
〔３〕  上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質、および、５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
〔４〕  下記(ii)および(iii)のうち少なくとも一方が光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素含有物であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
(i)上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質
(ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素または当該酵素含有物
(iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素または当該酵素含有物
〔５〕  上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質と、５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加水分解する化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
〔６〕  下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって：
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列；
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列；
前記ストリンジェントな条件が：
(e)９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件；または
(f)６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件
のいずれかであるＤＮＡ。
〔７〕  下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
〔８〕 上記〔６〕または〔７〕のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
〔９〕  前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体であることを特徴とする上記〔８〕に記載の組み換えＤＮＡ。
〔１０〕 上記〔８〕または〔９〕に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
〔１１〕  前記細胞は、エシェリヒア  コリであることを特徴とする上記〔１０〕に記載の細胞。
〔１２〕 上記〔１０〕または〔１１〕に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、
［Ｉ］ ＨＲａｓｅ
［ＩＩ］ ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、以下本明細書においては、特に断る場合を除き、「ＨＲａｓｅ」には５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を含めるものとする。
【００１２】
［Ｉ］ ＨＲａｓｅ
５置換ヒダントイン化合物から、酵素を用いてアミノ酸を製造するに際しては、上記反応式(I)に示したように２種の酵素が用いられる。したがって、ＨＲａｓｅを探索する場合、原料となる所定の光学活性５置換ヒダントイン化合物から目的の光学活性を有するアミノ酸が得られないからといってＨＲａｓｅ活性がないとは限らない。たとえＨＲａｓｅ活性が存在していたとしても、ＨＨａｓｅやＣＨａｓｅの活性不良による場合も考えられるからである。また、原料となる５置換ヒダントイン化合物自体が自発的にラセミ化するような条件下で試験をするのもＨＲａｓｅ活性の有無の検索としては不適当である。
【００１３】
そこで、本発明者らは、光学活性ベンジルヒダントインは酵素反応が行われるような中性条件下では、自発的ラセミ化がほとんど起こらないことを確認すると共に、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅの活性が十分にある実験系を確立した上で幅広くＨＲａｓｅ活性を有する菌体を探索したところ、Ｄ−アミノ酸生産菌であるフラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９株に新規ＨＲａｓｅが存在すると考えるに至った。この考えに基づき、本発明者らは、新規ＨＲａｓｅの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からＨＲａｓｅを精製単離するとともに、新規ＨＲａｓｅであることを見いだした。
【００１４】
また、本発明者らは、フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp. ）ＡＪ１１１９９株由来のＨＲａｓｅを精製し、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列を決定した。さらに、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列から演繹した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、これをプローブとして利用しフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を、フラボバクテリウム属細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離することに成功した。
【００１５】
すなわち、本発明のＨＲａｓｅをコードする代表的なＤＮＡは、特公昭５６−０２５１１９号に記載のフラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株の染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである。なお、フラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株はアルカリゲネス  アクアマリヌス(Alcaligenes aquamarinus)として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)に分類されることが判明した。現在では、フラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１６】
上記微生物について、細菌の分類学書であるバージェーズ  マニュアル  オブデターミネイティブ  バクテリオロジー  第１巻（第９版  1994年、ウイリアム  アンド  ウイルキンス社出版）に照らしあわせて生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
【００１７】
フラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９の再同定結果
グラム染色 陰性
細胞形態 桿菌
運動性 なし
硝酸塩還元 −
インドール産生 −
ブドウ糖酸性化 −
アルギニンジヒドラーゼ −
ウレアーゼ ＋
エスクリン加水分解 ＋
ゼラチン加水分解 −
β−ガラクトシダーゼ ＋
カタラーゼ ＋
オキシダーゼ ＋
基質資化能
ブドウ糖 ＋
Ｌ−アラビノース ＋
Ｄ−マンノース ＋
Ｄ−マンニトール ＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ＋
マルトース ＋
グルコン酸カリウム −
ｎ−カプリン酸 −
アジピン酸 −
ｄｌ−リンゴ酸 −
クエン酸ナトリウム −
酢酸フェニル −
【００１８】
以上の菌学的性質より、ＡＪ１１１９９菌をフラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)と同定した。
【００１９】
図１に示すように、上記菌株で見出された本発明のＨＲａｓｅは、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子とともにオペロンを形成していると考えられる。図１中、▲１▼はＳａｕ３Ａ Ｉ／Ｓａｕ３Ａ Ｉ断片であり、▲２▼はＳｐｈ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ断片である。
【００２０】
なお、添付した本発明の配列表において、上記方法によって特定された本発明のＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列番号１に示し、ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡを配列番号１２に示し、ＣＨａｓｅをコードするＤＮＡを配列番号１４に示す。また、ＨＲａｓｅ遺伝子、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子を含む構造遺伝子群をコードするＤＮＡを配列番号１１に示す。配列番号１１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３８１７〜４５４８が本発明のＨＲａｓｅをコードし、塩基番号２３４１〜３７９８がＨＨａｓｅをコードし、塩基番号３０６〜１２２０がＣＨａｓｅをコードしている。
【００２１】
これらのＤＮＡは、フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp. ）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、いずれもＤ−アミノ酸の製造に用いることができるタンパク質をコードするものである。
【００２２】
また、配列表の配列番号２に、配列表の配列番号１の塩基配列がコードするＨＲａｓｅのアミノ酸配列を示し、配列表の配列番号１３に、配列表の配列番号１２の塩基配列がコードするＨＨａｓｅのアミノ酸配列を示し、配列表の配列番号１５に、配列表の配列番号１４の塩基配列がコードするＣＨａｓｅのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列表の配列番号２に記載のＨＲａｓｅは、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅと共に用いられて、下記反応式（II）に例示するように、５−ベンジルヒダントインに代表される５置換ヒダントイン化合物から、Ｄ−フェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒する。
【００２４】
【化２】
0004485734.tif 000003
【００２５】
次に、本発明の新規ＨＲａｓｅについて、（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ、（2）ＨＲａｓｅの活性測定等、（3）ＨＲａｓｅの製造方法の順に詳細に説明する。
【００２６】
(1)ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＨＲａｓｅ遺伝子は、前述したようにフラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。配列表の配列番号１の塩基配列は、本発明をなす以前に本発明者らが既に見いだしていた、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３９１２株由来のＨＲａｓｅ（特願２００１−２７８７３９号記載）と、アミノ酸配列において４３％の相同性を示す。
【００２７】
なお、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２は、当初フラボバクテリウム  エスピー.（Flavobacterium  sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）に分類されることが判明した。さらに現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム  リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）はマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）に分類され、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２８】
次にフラボバクテリウム属細菌からＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
【００２９】
はじめに、精製されたＨＲａｓｅのアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またApplied Biosystems社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。本発明のフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅについて、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００３０】
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を、フラボバクテリウム属細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長をフラボバクテリウム属細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００３１】
ＰＣＲ法の操作については、White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
【００３２】
単離されたフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985)に記載されている。また、Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列表配列番号１に示す。
【００３３】
なお、フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡは、配列表配列番号１に示されるＤＮＡだけではない。すなわち、フラボバクテリウム属に属する細菌の種および株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
【００３４】
また、本発明のＤＮＡは単離されたＨＲａｓｅをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、フラボバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡから単離されたＨＲａｓｅをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、ＨＲａｓｅをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154 (1987)に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００３５】
また、配列表配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。即ち、９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件である。また、「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００３６】
さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡがコードするＨＲａｓｅと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわち、
（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
も本発明のＤＮＡに含まれる。「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、前述のとおり、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する活性を意味する。ただし、（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００３７】
（2）ＨＲａｓｅの活性測定等
つぎに、精製されたフラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅの活性測定等について説明する。
【００３８】
本発明のＨＲａｓｅは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、代表的には配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有し、かつ５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質も含むものである。より具体的には、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をも含むものである。さらに、配列表配列番号２のアミノ酸配列およびこれと実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、複数の酵素活性を有する複合的なタンパク質であってもよい。
【００３９】
すなわち、本発明のＨＲａｓｅは、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質である。
（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
ここで、「数個」および「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」の定義は上記（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
【００４０】
本発明のＨＲａｓｅは、５置換ヒダントイン化合物のラセミ化反応を触媒する。
【００４１】
本発明のＨＲａｓｅのＨＲａｓｅ活性の測定は、光学活性なＤ−、またはＬ−５置換ヒダントイン化合物を基質とし、ラセミ化度をこれらの旋光度の変化を測定する、または、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することにより行うことが可能である。
【００４２】
具体的には、１２０ ｍｇ／ｄｌ Ｌ−またはＤ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ mM リン酸−カリウム緩衝液（ＫＰＢ） (ｐＨ ８．０)、５ mM ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびＨＲａｓｅ酵素溶液を含む反応液を３７℃で３０分間インキュベートした後、９倍容の１．１ mM ＣｕＳＯ4、１１．１ mM Ｈ3ＰＯ4溶液を添加することにより反応を停止させる。２０，０００ｇ×１０分の遠心により沈澱を取り除いた後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量し、ラセミ化活性を見積もる。なお、酵素活性の単位として、この条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素活性をもって１Ｕと定義する。
【００４３】
ＨＰＬＣを用いた分析光学活性ＢＨの定量分析はダイセル化学ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６ｃｍφ×２５ｃｍを用いて行うことができる。分析条件の具体例は以下の通り。
移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ mM ＣｕＳＯ4
カラム温度：５０℃
流速：１．５ ml/分
検出：ＵＶ210
この条件において、Ｄ−ＢＨ (リテンションタイム４．２分)、Ｌ−ＢＨ （同５．３ 分）に溶出する。
【００４４】
（3）ＨＲａｓｅの製造方法
次に本発明のＨＲａｓｅの製造方法について説明する。本発明のＨＲａｓｅの製造方法としては、(3-1) 微生物培養によりＨＲａｓｅを生成蓄積させる方法と、(3-2)組み換えＤＮＡ技術によりＨＲａｓｅを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することにより当該タンパク質を生成蓄積させる方法の２つがある。
【００４５】
(3-1) 微生物培養により生成蓄積する方法
微生物培養により生成蓄積する方法において、ＨＲａｓｅの取得源となる微生物としてはフラボバクテリウム(Flavobacterium)属に属する微生物があげられる。好適なものとしては、フラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株などがあげられる。
【００４６】
フラボバクテリウム属に属する微生物の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。
【００４７】
通気条件としては、好気条件を採用する。培養温度としては、菌が発育し、ＨＲａｓｅが生産される範囲であればよい。従って、厳密な条件は無いが、通常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、ＨＲａｓｅが最も生産される時間まで培養すればよく、通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度である。
【００４８】
培養後菌体を遠心分離（たとえば、１０，０００×ｇ、１０分）により集菌する。当該酵素は菌体中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させることにより、酵素の可溶化を行う。菌体破砕には、超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
【００４９】
フラボバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残査を除いた方が、精製に有利である。
【００５０】
酵素の精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法等を採用することができる。その結果、より比活性が高いＨＲａｓｅ含有画分を得ることができる。
【００５１】
(3-2)組み換えＤＮＡ技術による製法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってＨＲａｓｅを製造する方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００５２】
図２は、本発明のＨＲａｓｅの製造工程のフローチャートである。先ず、本発明のＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＨＲａｓｅを生成蓄積させる(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進み、該酵素を回収・精製することによって精製ＨＲａｓｅを製造する。
【００５３】
また、ステップＳ５で生産した精製ＨＲａｓｅまたはステップＳ４のＨＲａｓｅが蓄積された培地をアミノ酸の合成に用いることで、目的とする光学活性アミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ６)。
【００５４】
なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡは、本発明のＨＲａｓｅが発現可能であればよい。
【００５５】
ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＨＲａｓｅ遺伝子としては、上述の
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
などを使用できる。
【００５６】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（inclusion body）を形成させることが好ましい。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００５７】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００５８】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００５９】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００６０】
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
【００６１】
タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌、好ましくはエシェリヒア  コリが用いられる。大腸菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてＨＲａｓｅを製造する方法を説明する。
【００６２】
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００６３】
ＨＲａｓｅを融合タンパク質封入体として生産させるためには、ＨＲａｓｅ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００６４】
これらの遺伝子とＨＲａｓｅをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【００６５】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００６６】
ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００６７】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００６８】
プロモータ、ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００６９】
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア  コリ ＪＭ１０９株，特にＪＭ１０９（ＤＥ３）株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【００７０】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ＨＲａｓｅ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてＨＲａｓｅを切り出せるようにしてもよい。
【００７１】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００７２】
ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ＨＲａｓｅあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００７３】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００７４】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００７５】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＨＲａｓｅが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００７６】
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡとして、配列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅが生産される。
【００７７】
［ＩＩ］ ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ酸の製法
次に、本発明のＨＲａｓｅを用いて、５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法について述べる。
【００７８】
光学活性アミノ酸製造反応に用いる本発明のＨＲａｓｅとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
（a）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、
（b）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列。
【００７９】
上記ＨＲａｓｅとしては、（１）フラボバクテリウム属細菌を培養して得たＨＲａｓｅを用いてもよいし、（２）組み換えＤＮＡ技術によりフラボバクテリウム属細菌由来のＨＲａｓｅを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養して得たＨＲａｓｅを用いてもよい。
【００８０】
フラボバクテリウム属細菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、ＨＲａｓｅを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からＨＲａｓｅを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、ＨＲａｓｅ活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは、溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含む。
【００８１】
本発明のＨＲａｓｅの他、
▲１▼５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒するヒダントイナーゼ（ＨＨａｓｅ）、
▲２▼生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ（ＣＨａｓｅ）、
の２つの酵素を用いることにより、光学活性アミノ酸を製造することができる。光学活性アミノ酸を製造するにあたっては、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのうち少なくとも一方に、光学選択的に基質に作用するものを用いればよい。
【００８２】
例えば、５置換ヒダントイン化合物を加水分解するＨＨａｓｅの光学選択性が高い場合には、光学選択性の高いＨＨａｓｅと本発明のＨＲａｓｅとを５置換ヒダントイン化合物に作用させることにより、高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学活性のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の一方のみを生成させることができる。この場合は、引き続きＣＨａｓｅまたは当該酵素含有物を作用させることにより光学活性を維持したまま光学活性アミノ酸を製造することができる。なお、光学選択的ＨＨａｓｅと共に光学選択的ＣＨａｓｅを用いる場合には、Ｌ−またはＤ−について同じ光学選択性を有するものを用いる。また、光学選択的ＨＨａｓｅによって生成したＮ−カルバミルアミノ酸に、亜硝酸などの化学的加水分解剤を用い、化学的に加水分解処理を施すことにより、光学活性を維持したまま、高収率で光学活性アミノ酸を製造することもできる（微生物酵素系と化学反応系との組み合わせによる方法）。なお、化学的加水分解剤というときの「化学的加水分解」とは、酵素ではない化学薬品の作用によって加水分解するという意味である。
【００８３】
５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤ−ＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス  ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)ＡＴＣＣ３１１９５等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａｓｅ含有画分を調製すればよい(Appl.Microbiol.  Biotechnol.４３巻  ２７０ページ、１９９５年)。ＡＴＣＣ３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection、住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から入手することができる。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用するＬ−ＨＨａｓｅは、例えばバチルスエスピー（Bacillus sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス  エスピー ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【００８４】
ＨＨａｓｅに光学選択的加水分解活性がなくとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ酸はＤ−もしくはＬ−の光学活性体となる。この場合、反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を選択的に分解しＬ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆にＤ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸が、それぞれ残存することが想定される。しかしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するので、ＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａｓｅの３種の酵素、もしくは３種の酵素含有物により、高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
【００８５】
光学選択性のないＨＨａｓｅは、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロバクター  オーレセンス（Arthrobacter aurescens）にその存在が知られている（J.Biotechnol.６１巻、１ページ、１９９８年）。
【００８６】
Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株にその存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公報)。再同定の結果、シュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株は、アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp. ）に属することが判明している。アグロバクテリウム  エスピー ＡＪ １１２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６４５が付与された微生物である。またＮ−カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばフラボバクテリウム  エスピー.（Flavobacterium  sp.）ＡＪ３９１２株（特公昭５６−００８７４９号公報）、バチルスエスピー.(Bacillus sp.)ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている。フラボバクテリウム  エスピー. ＡＪ３９１２株は、上述の通り現在ではマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２株（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６４３が付与された微生物である。またバチルス  エスピーＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【００８７】
ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ含有画分の基質としては、当該酵素の基質特異性においてラセミ化できる５置換ヒダントイン化合物であれば、いかなるものも使用できる。５置換ヒダントイン化合物の例としては、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−（３'−ピリジル）−メチルヒダントイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントインなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチルヒダントイン、５−（３,４−メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
【００８８】
なお、好ましいＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅの組み合わせとして、
配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、
配列表配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅ、
配列表配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅ
の組み合わせが挙げられる。これらの酵素いずれも、フラボバクテリウム  エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株由来の酵素である。
【００８９】
配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、配列表配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅおよび配列表配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅを組み合わせて用いる場合、これらのＤ−アミノ酸の製造に係わるタンパク質のすべてをコードする配列表の配列番号１１に記載の構造遺伝子群とベクターとが接続されて得られる組み換えＤＮＡを用いて形質転換された細胞を培養することによって得られたＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅからなる混成タンパク質を用いることもできる。当該混成タンパク質を用いた場合、下記反応式（II）に示すように、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼが５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが可能となる。
【００９０】
【化３】
0004485734.tif 000004
【００９１】
また、下記反応式（III）に例示するように、Ｌ−ＣＨａｓｅを用いることにより、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＬ−アミノ酸を製造することも可能である。
【化４】
0004485734.tif 000005
【００９２】
なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例えば、上記混成タンパク質に、Ｌ−又はＤ−ＣＨａｓｅの阻害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造できる。
【００９３】
フラボバクテリウム属細菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、または精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
【００９４】
また、フラボバクテリウム属細菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日培養することが好ましい。
【００９５】
生成したアミノ酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
【００９６】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例における５置換ヒダントイン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用いた。分析条件は以下のとおりである。
カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ
移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4
カラム温度：５０℃
流速：１．５ ｍｌ/分
検出：ＵＶ210
【００９７】
（実施例１）ＡＪ１１１９９菌におけるヒダントインラセマーゼ活性の検出
１．菌体の培養
フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株およびシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株（現在は、アグロバクテリウム  エスピー ＡＪ１１２２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６４５）株として寄託）を、それぞれＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これらをそれぞれ５０ｍｌの誘導培地（グルコース０．５％、硫酸アンモニウム０．５％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＦｅＳＯ4 ０．００１％、ＭｎＳＯ4 ０．００１％、ＤＬ−５−シアノエチルヒダントイン０．２％、炭酸カルシウム２．０％、ｐＨ７．０）を張り込んだ５００ ｍｌ容の坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。培養終了後、集菌、洗浄を行い、菌体をそれぞれ５ｍｌの０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁した。
【００９８】
２．洗浄菌体法によるヒダントインラセマーゼ活性の検出
上記のように調製して得られた洗浄菌体を、０．１２ｇ／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）もしくはＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）を含む０．１ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．５）に、それぞれの洗浄菌体が１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させた。反応２２時間後にサンプリングし、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた後、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルアラニンを定量した。
【００９９】
なお、上記フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株はＤ−ヒダントイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ活性を有する菌株であり、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株は、ヒダントイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ活性を有する菌株である。
【０１００】
その結果を表１に示した。この表に示されるように、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株の洗浄菌体を用いた場合には、Ｄ−５−ベンジルヒダントインからのみＤ−フェニルアラニンを生成させることができ、Ｌ−５−ベンジルヒダントインからはほとんどＤ−フェニルアラニンが生成しなかった。この結果より、自発的なベンジルヒダントインのラセミ化はごくわずかであることが示された。これに対して、フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の洗浄菌体を用いた場合には、Ｄ−５−ベンジルヒダントインからのみならず、Ｌ−５−ベンジルヒダントインからも効率良くＤ−フェニルアラニンを生成させることができた。以上の結果より、フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株がヒダントインラセマーゼ活性を有することが示された。
【０１０１】
【表１】
0004485734.tif 000006
【０１０２】
（実施例２）ＡＪ１１１９９菌由来のヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離
１．菌体の取得
フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容の坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。
【０１０３】
２．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００×ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌの５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行った。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ProteinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパクを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌの１０:１ ＴＥに溶解させた。
【０１０４】
３．ヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離
まず、フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡ２００μｇに制限酵素Ｓａｕ３Ａ  Ｉを１Ｕ添加し、３７℃にて１５分間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡからアガロース電気泳動にて３〜８ｋｂｐの断片を回収し、ここで取得された約４．１ｋｂのＳａｕ３ＡＩ断片（図１の▲１▼）に、Ｄ−ＣＨａｓｅおよびＤ−ＨＨａｓｅをコードする遺伝子が含まれることを確認した。この約４．１ｋｂの断片のうち、Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子の下流領域約２５０塩基について相同性検索を行ったところ、Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子の終止コドンより数えて１９番目の塩基からＳａｕ３Ａ  Ｉサイトまでにわたり、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ（特願２００１−２７８７３９号記載）との相同性が確認された。そこで、この配列がヒダントインラセマーゼ遺伝子の一部であると考え、この配列を用いてヒダントインラセマーゼ遺伝子全長を取得することを試みた。
【０１０５】
まず、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の全長取得のために、サザンハイブリダイゼーションを行った。フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片（約４００ｂｐ）を、プローブとして用いた。該増幅断片を約５０ｎｇ／μｌに調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Prime（Boehringer Mannheim）のプロトコールに準じて３７℃で２４ 時間インキュベートすることによりDIG標識し、プローブとした。
【０１０６】
【表２】
0004485734.tif 000007
【０１０７】
染色体ＤＮＡ １μgを各種制限酵素の組合わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim, Nylon membranes positively charged）にブロッティングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Boehringer Mannheim）を用いて行った。
【０１０８】
その結果、Ｓｐｈ Ｉの切断物（図１の▲２▼）において約２．４ｋｂの位置にバンドが検出された。そこで、該切断物より２．４ｋｂ付近の断片を回収してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にてライブラリー（４００株）を作製した後、コロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Boehringer Mannheim, Nylon membranes for colony and plaque hybridization）に転写し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行い、４２℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後に、上述のDIG標識プローブを添加し、４２℃、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleotide Detection Kitを用いて行い、２株のポジティブクローンを選抜した。
【０１０９】
選抜したクローンが保有するプラスミドをMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (１９８９)に記載される方法に従って調製し、挿入断片の塩基配列を決定した。その結果、Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子の下流に、約０．７ｋｂからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しており、ヒダントインラセマーゼ遺伝子であると推定された。ヒダントインラセマーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示した。得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子は、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ（特願２００１−２７８７３９号記載）とアミノ酸配列において４３％の相同性を示した。
【０１１０】
（実施例３）ヒダントインラセマーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．発現プラスミドの構築
取得した遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にヒダントインラセマーゼ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＨＲ１を以下のようにして構築した。まず、フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲによりヒダントインラセマーゼ遺伝子を増幅した。この断片をＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉにて処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、発現プラスミドｐＵＣＨＲ１と命名した。また、発現プラスミドｐＵＣＨＲ１を有するＥ．Ｃｏｌｉ形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵＣＨＲ１と命名した。
【０１１１】
【表３】
0004485734.tif 000008
【０１１２】
２．無細胞抽出液の調製
ｐＵＣＨＲ１を持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＪＭ１０９／ｐＵＣＨＲ１を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。一部の培地について、培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１-チオ-β-Ｄ-ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培養を行った。
培養終了後、集菌、洗浄を行い、菌体を５ｍｌの５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁し、０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分間（３０秒×６回、９０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕した。溶液を回収し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
【０１１３】
３．ヒダントインラセマーゼ活性測定
ヒダントインラセマーゼ活性の測定は、０．１２ｇ／ｄｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）もしくはＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）、５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)および酵素溶液を含む反応液を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて解析することによった。なお酵素溶液として上記のようにして得た無細胞抽出液を用いた。また、酵素活性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍｏｌのベンジルヒダントインをラセミ化する酵素活性をもって１Ｕと定義した。
【０１１４】
その結果を表４に示す。ｐＵＣＨＲ１を用いて形質転換した株においてベンジルヒダントインのラセミ化活性が確認されたことより、この遺伝子がフラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株由来のヒダントインラセマーゼ遺伝子であり、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で効率良く発現されていることを確認した。
【０１１５】
【表４】
0004485734.tif 000009
【０１１６】
（実施例４）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いたベンジルヒダントインのラセミ化反応
０．１２ｇ／ｄｌ (６．３ｍＭ) Ｄ-５-ベンジルヒダントインもしくはＬ-５-ベンジルヒダントイン、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)、０．０１ｇ／ｄｌのＪＭ１０９／ｐＵＣＨＲ１洗浄菌体を混合し、３７℃で反応させた。反応液の一部を経時的にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析した。
【０１１７】
その結果を表５に示した。この表に示されるように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、効率良くベンジルヒダントインをラセミ化させることができた。
【０１１８】
【表５】
0004485734.tif 000010
【０１１９】
（実施例５）Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼとの組み合わせによるＤ−フェニルアラニンの生産
Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子の両遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃを以下のようにして構築した。まず、フラボバクテリウム  エスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した。これらの断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラスミドｐＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃと命名した。
【０１２０】
【表６】
0004485734.tif 000011
【０１２１】
Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子搭載プラスミドｐＵＣ６３２Ｈを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＵＣ６３２Ｈ）、およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子搭載プラスミドｐＵＣ６３２Ｃを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＵ６３２Ｃ）を０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこれらのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄菌体を調製した。
また、実施例３と同様にしてＪＭ１０９／ｐＵＣＨＲ１の洗浄菌体を調製し、上記Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子発現株およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子発現株の洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベンジルヒダントインを含む０．１ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３７℃で反応させた。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルアラニンを定量した。
【０１２２】
その結果を表７に示した。この表に示されるように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、ＤＬ体のベンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニルアラニンを生成させることができた。
【０１２３】
【表７】
0004485734.tif 000012
【０１２４】
【発明の効果】
本発明によって、新規なヒダントインラセマーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大量に発現させることが可能である。このような形質転換体から該酵素を容易に調製することができ、該形質転換体やその抽出液、精製酵素等を用いることによって各種５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を効率良く行うことができる。また、各種ヒダントイナーゼ、カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼなどと組み合わせて用いることにより、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に有用なＤ−アミノ酸やＬ−アミノ酸を効率良く生産できる。
【０１２５】
【配列表】
0004485734.tif 000013
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＪ１１１９９株のＤ−ヒダントイナーゼ、Ｄ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ、およびヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子群の構造を示す図である。
【図２】本発明のヒダントインラセマーゼの製造工程を示すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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