(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンプレート核酸において少なくとも１つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出する方法であって、以下：
（ａ）標的部位に結合したオリゴヌクレオチドを形成させる工程、ここでオリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチド中のジデオキシヌクレオチドに結合した発蛍光団を含み；および
（ｂ）蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの発蛍光団の蛍光偏光を検出する工程、
を包含し、
ここで、前記オリゴヌクレオチドは、標的部位に対して直ぐ３’側でテンプレートと結合したプライマー、および発蛍光団に共有結合したジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）から形成され、そしてｄｄＮＴＰ結合した発蛍光団は標的部位に結合し、プライマーと反応して、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドである、伸張されたプライマーを生成し、
ここで、蛍光偏光の増加は標的部位の存在を示し、該蛍光偏光の増加により標的部位の存在を検出する、
前記方法。
【請求項２】
テンプレート核酸がゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異なる蛍光分子で標識されたｄｄＮＴＰを用いて、二つのテンプレート核酸上で同時に行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発蛍光団が、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ−ｄｄＮＴＰ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ−ｄｄＮＴＰ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＭＲ−ｄｄＮＴＰ）；およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＢＴＲ−ｄｄＮＴＰ）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）は、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質の存在下で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）は、有機溶媒の存在下で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒がメタノールである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的部位に結合した蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出することを含む、テンプレート核酸における少なくとも１つのヌクレオチド標的部位の存在を検出する方法であって、
ここで、蛍光偏光の増加は、標的部位の存在を示し、これによって蛍光偏光の増加による標的部位の存在を検出し、
ここで、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド中のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）に結合した発蛍光団を含み；そして、
ここで、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、標的部位に対して直ぐ３’側でテンプレートと結合したプライマー、および発蛍光団と共有結合したｄｄＮＴＰから形成され、そしてｄｄＮＴＰ結合した発蛍光団は、標的部位に結合し、プライマーと反応して、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドである、伸張されたプライマーを生成する、
前記方法。
【請求項９】
テンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
異なる蛍光分子で標識されたｄｄＮＴＰを用いて、二つのテンプレート核酸上で同時に行われる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
発蛍光団が、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ−ｄｄＮＴＰ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ−ｄｄＮＴＰ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＭＲ−ｄｄＮＴＰ）；およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＢＴＲ−ｄｄＮＴＰ）からなる群より選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの形成は、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質の存在下で行われる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの形成は、有機溶媒の存在下で行われる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒がメタノールである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、テンプレート指向性プライマー伸長および蛍光偏光による高度に感度のよいな検出を使用するＤＮＡの分析のための、新規な診断方法および診断キットに関する。本発明はさらに、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および他のＤＮＡ配列変異を同定する方法に関する。また、本発明は、生物工学、分子遺伝学および生物医学の分野に広範に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡ分析は、遺伝性疾患の診断、感染性病原因子の検出、組織適合性についての組織分類、法医学的および起源の試験における個体の同定、ならびに農学研究における植物および動物の遺伝子構造のモニターにおいて、ますます重要になっている（Ａｌｆｏｒｄ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）５：２９−３３）。さらに、ＤＮＡ分析は、複数の遺伝的因子および環境因子に関与する一般的疾患に関連する感受性対立遺伝子を同定するための大規模な遺伝学的研究において重要である（Ｒｉｓｃｈ，Ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７３：１５１６−１５１７）。最近、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（哺乳動物ゲノムに見いだされる最も一般的なＤＮＡ配列変異）に注目が集められる（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（１９８５）６９：２０１−２０５）。ほとんどのＳＮＰは、検出可能な表現型を生じないが、これらのかなりの部分は、遺伝性疾患の原因となる疾患誘発性の変異である。ヒトゲノムのＤＮＡ配列は完全に解明されると、大規模なＤＮＡ分析は、遺伝子型（ＤＮＡ配列）と表現型（疾患および健康）との間の関係を決定する重要な役割を果たすであろう（Ｃｏｐｐｅｒ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（１９８８）７８：２９９−３１２）。いくつかのアッセイは、高スループットに対するかなりの期待を有するが、以下を含む、最近開発されたＤＮＡ診断方法は全て、特別な試薬および高価な検出装置を必要とする：対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析のための高密度チップアレイ（Ｐｅａｓｅ，Ａ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：５０２２−５０２６；Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３：４９１３−４９１８）、Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８０：１０７７−１０８１、均質５’−ヌクレアーゼ対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド切断アッセイ（ＴａｑＭａｎ  ＡＳＯ，Ｌｉｖａｋ、Ｋ．Ｌ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（１９９５）９：３４１−３４２）、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９８）４４：９１８−９２３）、ＰＣＲ増幅のための均質蛍光アッセイ：リアルタイムへのその適用、単一のチューブでの表現型決定、均質テンプレート指向性色素−ターミネーター組み込み（ＴＤＩ）アッセイ（Ｃｈｅｎ，Ｘ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３４７−３５３；Ｃｈｅｎ，Ｘ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９７）９４：１０７５６−１０７６１）、均質色素標識化オリゴヌクレオチド連結（ＤＯＬ）アッセイ（Ｃｈｅｎ，Ｘ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８）８：５４９−５５６）、および均質分子ビーコンＡＳＯアッセイ（Ｔｙａｇｉ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６：４９−５３）。
【０００３】
上記に列挙した全てのＤＮＡ診断方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の類似の増幅技術を介するアッセイの感受性および特異性を増加するための標的配列の増幅を含む。例えば、最も公知の増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと呼ばれる）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号に詳細に記載される。手短に言えば、ＰＣＲにおいては、標的配列の向かい合う相補的な鎖上の領域に相補的である２つのプライマー配列が、調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸が、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と共に反応混合物に添加される。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーは、その標的に結合し、そしてポリメラーゼは、プライマーを、ヌクレオチド上に付加することによって標的配列に沿って伸長させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、この伸長されたプライマー反応産物は、標的から解離して、新たな標的となる。過剰なプライマーは、標的および反応産物に結合し、そしてこのプロセスを繰り返す。他の技術は、鎖置換によって標的配列の増幅を生じる。これらの技術は、二本鎖ＤＮＡ認識部位に存在する２つのうちの鎖の１つの酵素的「ニック形成（ｎｉｃｋｉｎｇ）」または優先的切断、およびその標的部位を含む増幅産物の分離または検出（米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４５５，１６６号に示され、そしてこれらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を含む。
【０００４】
なお他の技術は、プライマーが標的領域にハイブリダイズした後、蛍光的に標識したこのプライマーの使用を利用し、そして蛍光または蛍光偏光を検出する。これは、米国特許第５，５９３，８６７号に提示される。米国特許第５，６４１，６３３号において、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質もまた用いられ、蛍光的に標識したプライマーの標的部位へのハイブリダイゼーションをさらに保存する。これらの方法は、蛍光的に標識したプライマーの使用および標的部位にハイブリダイズしている間のそれらの検出を必要とする。
【０００５】
テンプレート指向性のプライマー伸長は、多型性部位のすぐ上流の標的ＤＮＡにアニーリングする配列決定プライマーのすぐ３’の１塩基の性質を確認するように設計されたジデオキシ連鎖終止ＤＮＡ配列決定プロトコールである。ＤＮＡポリメラーゼおよび適切なジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の存在において、プライマーは、多型性部位の標的ＤＮＡ配列により指図されるとおり１塩基ずつ特異的に伸長される。どのｄｄＮＴＰが取り込まれるかを決定することにより、標的ＤＮＡに存在する対立遺伝子が推測され得る。この遺伝形質決定方法は多数の異なる形式で広範に用いられており、高度に感受性でかつ特異的であることが証明されている（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９０）８：６８４〜６９２；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−ＣおよびＬａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９４）３：１７２〜１７９）。
【０００６】
蛍光偏光（ＦＰ）は、蛍光分子が平面偏光により励起される場合、もしその分子が励起と発光の間で静止したままであれば、それが偏光した蛍光を固定面に放射するという観察に基づく（図１）。しかし、蛍光減衰時間の間、空間における分子回転および転倒（ｔｕｍｂｌｅ）のせいで、ＦＰは、外部検出器では完全に観察されない。蛍光種の観察されたＦＰは、Ｐｅｒｒｉｎの式により記載され、そして回転性減衰時間および蛍光存続時間の比に関する。温度および粘性が一定に保たれていれば、回転減衰時間は蛍光種の分子体積に比例する。蛍光物質の局所回転運動が最小限である場合、ＦＰは分子量に直接比例する。言い換えれば、蛍光分子およびその結合体が大きい（高分子量を有する）場合、それは、蛍光存続期間に比べて溶液中で緩徐に回転および転倒し、そしてＦＰは保存される。分子が小さい（低分子量を有する）場合、それは、より速く回転、そして転倒し、そしてＦＰはより多く失われる（脱偏光する）。ＦＰ現象は、タンパク質−ＤＮＡおよびタンパク質−タンパク質相互作用（Ｄｕｎｋａｋ，Ｋ．Ｓ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）２４３：２３４〜２４４；Ｈｅｙｄｕｋ，Ｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９６）２７４：４９２〜５０３；Ｗｕ，Ｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４９：２９〜３６）、鎖置換増幅によるＤＮＡ検出（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９６）２４：３４８〜３５３）、ならびにハイブリダイゼーションによる遺伝子型決定（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）４３：１３３６〜１３４１）を研究するために用いられてきた。５０より多い蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）が、現在市販されている。これらの多くは、生物学的液体中の、治療剤、代謝物および濫用薬物の測定のために臨床的実験室において日常的に用いられている（Ｃｈｅｏｃｏｖｉｃｈ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７５：２５４〜２５６）。
【０００７】
ＦＰは、垂直軸および水平軸において検出される蛍光の比として表現され、従って、総蛍光強度とは独立している。これは、蛍光が用いられる検出限界以上である限り、ＦＰが信頼できる指標であるという点で、他の蛍光検出方法を上回る明確な利点である。完全に結合した蛍光種と完全に結合してない蛍光種との間のＦＰの差異は、このシステムについて可能な総ダイナミックレンジを示す。低分子量種およびその複合体に付着された蛍光物の相互作用または高分子量種への取り込みにより、統計的有意差が、実験的に誘導され得る限り、ＦＰは、溶液中で生じる化学についての適切な検出スキームを表す。これは、適切なプローブを理論的に予測することを困難にする、蛍光的に標的される種において局所運動として通常、経験的に誘導される。
【０００８】
総偏光は、その波長で発出する溶液中のすべての種からのＦＰの合計を反映する。発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）が低偏光を生成する低分子量ヌクレオチドに付着し、次いで対立遺伝子部位でプローブオリゴマー中に取り込まれる系については、観察される偏光は、以下の等式によって記載される：
Ｐ＝Ｐmax［ｄｄＮＴＰ］b＋Ｐmin（［ｄｄＮＴＰ］i−［ｄｄＮＴＰ］b）
ここで、Ｐmaxは、ＴＤＩプローブ上に取り込まれた色素標識ｄｄＮＴＰについての偏光であり、Ｐminは、取り込まれなかった色素標識ｄｄＮＴＰの偏光であり、［ｄｄＮＴＰ］iは、色素標識ｄｄＮＴＰの初期濃度であり、そして［ｄｄＮＴＰ］bは、取り込まれた色素標識ｄｄＮＴＰの濃度である。シグナル中の最大変化は、ｄｄＮＴＰの１００％取り込みで生じる。従って、実験デザインにおける重要な局面は、反応に用いられる色素標識ｄｄＮＴＰの初期濃度が最小に保たれることを確実にすることである。
【０００９】
蛍光偏光とＴＤＩ技術の別々の使用が報告されているが、本明細書に開示されるようなこれら技術が一緒の有効使用は、多くの理由のため実現されていない。蛍光偏光の正確な観察を可能にする計測の感度は、過去数年に亘って有意に増加した。さらに、本発明者らは、この技術を洗練するための実験と開発を実施し、そして他者によって観察され得て、彼らを本発明から遠ざけた、初期の否定的な観察を克服した。本発明は、当該分野において先行する教示に対し、明らかに新規および非自明である。何故なら、本開示が明瞭にするように、ヌクレオチドに連結された発蛍光団を含む蛍光により標識されたオリゴヌクレオチドを標的部位で合成し、次いで宿主中で蛍光により標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出する本発明の能力のためである。
【００１０】
引用されるすべての刊行物は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明者らは、本発明者らが開発したＴＤＩアッセイのための検出戦略における改変が、ＳＮＰおよび特有の挿入／欠失を含むＤＮＡ配列変動の迅速分析を、非改変オリゴヌクレオチドプローブを用いる均一アッセイ中で可能にし、これが、特殊な試薬または高価な装置の必要性をなくすることを決定した。本発明のアプローチは、テンプレート特異的プライマー伸長反応において、ＤＮＡ配列変動である２つの対立遺伝子間の酵素的識別の特異性と、蛍光偏光の高い程度の感度とを組み合わせる。
【００１２】
本発明の方法は、ＦＰ検出によるテンプレート特異的色素ターミネーター取り込みアッセイと称され（図２に提示されるような；「ＦＰ−ＴＤＩ」アッセイ）、配列決定プライマーが、多型部位または変異部位のすぐ上流のその３’末端が改変されていないプライマーであることを提供する。対立遺伝子特異的色素標識ｄｄＮＴＰは、任意の発蛍光団で標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされたとき、ＤＮＡポリメラーゼおよび標的ＤＮＡの存在下で、ＴＤＩプライマー上に取り込まれる。多くの発蛍光団が、当業者に容易に利用可能であり、そして、例えば、ＦＡＭ（５−カルボキシ−フレオレセイン）、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴＭＲ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、およびＢＯＤＩＰＹ色素を含む。標的ＤＮＡ分子の遺伝子型は、配列決定プライマー上の色素を励起すること、およびＦＰを観察することにより、簡単に決定され得る（図２を参照のこと）。
【００１３】
本明細書でさらに開示されるように、本発明者らは、ＦＰが、均一プライマー伸長遺伝子型決定アッセイにおいて用いられ得る、簡単な、高度に感受性で、そして特異的な検出方法であることを示した。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Ｓａｉｋｉ、Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７−４９１）による増幅物を含む、一本鎖合成ＤＮＡオリゴマーおよび二本鎖ＤＮＡフラグメントの両方が、このアッセイ中でテンプレートとして用いられ得る。すべての場合に、このＦＰ−ＴＤＩアッセイは、高度に感受性かつ特異的であることがわかる。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
１つの実施態様において、本発明は、核酸において少なくとも１つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この標的部位に結合されるオリゴヌクレオチドを形成させる工程であって、ここでこのオリゴヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドに結合した発蛍光団を含む、工程；および（ｂ）蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出する工程、より好ましくは、この蛍光偏光の増加を検出する工程。より好ましい実施態様において、本発明は、上記の工程（ａ）および（ｂ）の標的部位を検出するための方法を提供し、ここで、このオリゴヌクレオチドは、この標的部位に対するこのテンプレート上の直ぐ３’側のポリヌクレオチドおよび発蛍光団に共有結合したジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）から形成され、、そしてここで、少なくとも１つのｄｄＮＴＰ結合した発蛍光団は、この標的部位に結合し、そしてこのポリヌクレオチドと反応して、このポリヌクレオチドの３’伸張物を生成する。本発明はさらに、１つより多いｄｄＮＴＰ結合した発蛍光団の使用を意図し、ここでは各発蛍光団は唯一であり、そして蛍光偏光を使用して独自に観察され得る。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、遺伝的多型（１ヌクレオチド多型および唯一の挿入／欠失を含む）を診断する方法を含む。この診断方法は、被験体由来の生物学的材料のサンプルから単離された、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡから調製されたＤＮＡをアッセイする。このアッセイは、以下の本発明の方法を利用する：（ａ）遺伝的多型について試験するための被験体から生物学的材料のサンプルを選択する方法；（ｂ）この生物学的材料からゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを単離する方法であって、ここでこのゲノムＤＮＡまたはこのＲＮＡから調製されたＤＮＡは１つ以上の標的部位を含む、そしてここで、各々の標的部位は、遺伝的多型を含む、方法；（ｃ）この標的部位に結合されるオリゴヌクレオチドを形成させる方法であって、ここでこのオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドに結合した発蛍光団を含む、方法；（ｄ）蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出する方法；ならびに（ｅ）この蛍光偏光によってこの遺伝的多型を同定する方法。この遺伝的多型は、１ヌクレオチド多型および唯一の挿入／欠失を含み得る。さらに、本発明の方法のこの実施態様は、標的部位に対するこのテンプレート上の直ぐ３’側のポリヌクレオチドおよび発蛍光団に共有結合したｄｄＮＴＰからのオリゴヌクレオチドの形成を含み、そしてここで、少なくとも１つのｄｄＮＴＰ結合した発蛍光団はこの標的部位に結合し、そしてこのポリヌクレオチドと反応して、このポリヌクレオチドの３’伸張物を生成する。より好ましい実施態様としては、蛍光偏光の増加による蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの検出が挙げられる。本発明のこの実施態様は、１つより多いｄｄＮＴＰ結合した発蛍光団の使用をさらに意図し、ここでは、各々の発蛍光団は唯一であり、そして蛍光偏光を使用して独自に観察され得る。
【００１６】
本発明のなお別の実施態様としては、核酸における少なくとも１つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出するための診断用キットが挙げられ、このキットは、以下を含む：（ａ）標的部位に対してＤＮＡテンプレート上の直ぐ３’側のこのテンプレートにハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー；（ｂ）発蛍光団に共有結合された少なくとも１つの対立遺伝子特異的ｄｄＮＴＰ；および（ｃ）このオリゴヌクレオチドプライマーおよびこのｄｄＮＴＰと反応して、ポリヌクレオチドの３’伸張物を生成するＤＮＡポリメラーゼ。本発明の好ましい実施態様は、このオリゴヌクレオチドプライマーが約５〜１００ヌクレオチドを含むことを意図する。本発明のより好ましい実施態様は、このオリゴヌクレオチドプライマーが約１０〜５０ヌクレオチドを含むことを意図する。本発明のさらに好ましい実施態様としては、１つより多い対立遺伝子特異的ｄｄＮＴＰが挙げられ、そして各々の対立遺伝子特異的ｄｄＮＴＰが、唯一の発蛍光団に共有結合されることが挙げられる。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、前述で議論された方法のいずれか１つにより検出される標的部位の遺伝子配列を含む。
【００１８】
本発明のなおさらなる実施態様は、核酸中の少なくとも１つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出するための方法を包含し、この方法は、以下の工程：（ａ）標的部位で、ヌクレオチドに連結された蛍光団を含む蛍光標識オリゴヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光を検出する工程。好ましい実施態様は、この蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光が、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質の非存在および存在下で検出される、この方法の実施を含む。別の好ましい実施態様は、この蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光が、有機溶媒の非存在および存在下で検出される、この方法の実施を提供する。
【００１９】
当然、本発明は、この蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光が、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質ならびに有機溶媒の非存在および存在下で検出される、この方法の実施をさらに意図する。
【００２０】
特定の蛍光団の選択は、当業者に容易に公知の選択を含む。用いられる蛍光団がｄｄＮＴＰに共有結合され、そして蛍光の偏光により検出可能なシグナルを生じる場合に、他の蛍光団が、引き続いて、開発および選択され得る。本発明に意図されるこのような蛍光団としては、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ−ｄｄＮＴＰ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ−ｄｄＮＴＰ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＭＲ−ｄｄＮＴＰ）；およびＢＯＤＩＰＹ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＢＴＲ−ｄｄＮＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の方法に使用され得るテンプレートおよびプライマーの選択は、十分に、当業者の範囲内である。本明細書中に提示される合成テンプレートは、単に例示のためであり、そしてＣＦ５０８−４８Ａ；ＣＦ５０８−４８Ｃ；ＣＦ５０８−４８Ｇ；およびＣＦ５０８−４８Ｔが挙げられる。任意のテンプレート、合成またはそれ以外の選択は、このテンプレートとプライマーとの間のハイブリダイゼーションの優先的な程度およびこのテンプレート上での標的部位の存在に基づき得る。
【００２２】
被検体から採取した生物学的材料のサンプルから単離された、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡから調製されたＤＮＡに対するこの方法の適用は、限定されない。ゲノムＤＮＡの単離に用いられ得る技術および単離されたＲＮＡからＤＮＡを調製する技術もまた、周知である。例えば、米国特許第５，２７０，１８４号（これは、これによってその全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡの単離のためのいくつかの技術を提示する。サンプルは、標的核酸配列を含むと疑われる任意の物質から単離され得る。動物、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒトについては、このような材料の供給源は、血液、骨髄、リンパ、硬組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、卵巣など）、痰、糞および尿を含み得る。物質の他の供給源は、植物、土壌、および生物学的生物を含むと疑われる他の材料に由来し得る。これらの材料からの核酸の単離は、多くの方法で実行され得る。このような方法は、界面活性剤での溶解物、超音波破砕、ガラスビーズおよびフレンチプレスを用いる攪拌の使用を含む。いくつかの例において、単離された核酸を精製することが有利であり得る（例えば、内因性ヌクレアーゼが存在する場合）。これらの例では、核酸の精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度依存性遠心分離によって達成され得る。一旦、この核酸が単離されると、ゲノム核酸がＤＮＡであり、かつ二本鎖であることのみが、本明細書中で例示の目的のために想定される。
【００２３】
本明細書中で使用される用語は、それらの技術分野で認識される意味に基づき、そして当業者によって明確に理解されるはずである。例えば、標的部位は、本発明の方法を使用して検出され得るＤＮＡの任意の領域を含むことが意味される。遺伝的多型は、同じ種の全ての個々の被検体における同じ遺伝子座または対立遺伝子遺伝子にマッピングされる異なる遺伝子配列または遺伝子の存在を含む。このような遺伝的バリエーションは、異なる表現型発現を生じないかもしれないが、個々の被検体間で遺伝的差異として現れる。
【００２４】
（一般的な方法論）
（簡単な説明）
ＦＰ−ＴＤＩアッセイは、４工程を包含する（図２）。第１に、ＤＮＡ標的は、ＰＣＲによって熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する供給源ＤＮＡから増幅される。第２に、過剰のＰＣＲプライマーおよびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）が、一本鎖ＤＮＡを分解する熱不安定性酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩまたはリョクトウヌクレアーゼ）およびｄＮＴＰを分解する熱不安定性酵素（エビアルカリホスファターゼまたはＨＫ熱不安定性ホスファターゼ）によってそれぞれ分解される。第３に、２つの酵素は、熱不活性化される。第４に、ＴＤＩプライマー、対立遺伝子特異的色素−標識化ｄｄＮＴＰ、および色素−標識化ターミネーター（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を取り込みことについて改善された効果を有する変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、熱サイクルによるＴＤＩ反応に添加した。
【００２５】
反応の終りに、希釈緩衝液を反応混合物に添加した後、これを、蛍光偏光プレートリーダーでの蛍光偏光の測定のためにマイクロタイタープレートに移す。例えば、疎水性色素が用いられる場合、有機溶媒（例えば、メタノール）を用いて、非特異的なバックグラウンド偏光を低下させ得る。
【００２６】
（酵素）
ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）およびＴａｑ−ＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手した。エビアルカリホスファターゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）およびＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩを、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から購入した。
【００２７】
（オリゴヌクレオチド）
用いたオリゴヌクレオチドを表１に列挙する。ＰＣＲおよびＴＤＩプライマーおよび合成テンプレートオリゴヌクレオチドは市販されている（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００２８】
（表１．ＦＰ−ＴＤＩ研究に用いた合成テンプレートおよび合成プライマー）
【００２９】
【表１】
0004420564.tif 000002
（ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸）
５−カルボキシ−フルオレセインで標識したジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ＦＡＭ−ｄｄＮＴＰ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンで標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸（ＲＯＸ−ｄｄＮＴＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミンで標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸（ＴＭＲ−ｄｄＮＴＰ）、およびＢＯＤＩＰＹ−テキサスレッド（ＢＴＲ−ｄｄＮＴＰ）で標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。非標識化ｄｄＮＴＰをＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。
【００３０】
（蛍光偏光測定）
プライマー伸長反応後、１２５μＬのＴＤＩ緩衝液を、各チューブに添加した後、これらをＦｌｕｏｒｏｌｉｔｅ  ＦＰＭ２機器（Ｊｏｌｌｅｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｒａｙｓｌａｋｅ，ＩＬ）でのＦＰ測定のためにマイクロタイタープレートに移した。蛍光偏光値を以下の式を用いて算出した：
Ｐ＝［Ｉｖｖ−Ｉｖｈ］／［Ｉｖｖ＋Ｉｖｈ］
ここで、Ｉｖｖは、励起偏光器と発光偏光器とが平行である場合に測定された発光強度であり、そしてＩｖｈは、励起偏光器と発光偏光器とをお互いを直角に方向付ける場合に測定された発光強度である。
【００３１】
（遺伝子型帰属）
平均ＦＰ値および４連の陰性コントロールサンプルの標準偏差を、実験の各セットについて決定した。次いで、４連の試験サンプル反応の平均ＦＰ値を、コントロールサンプルの平均ＦＰ値と比較した。正味の変化が、コントロールの標準偏差の５倍を超える場合、この試験サンプルを対立遺伝子について陽性として記録する。
【００３２】
（実施例）
以下の実施例は、ＦＰが、一塩基対変化のための同種プライマー伸長反応において、簡便、高感度、かつ特異的な検出法であることを示す。
【００３３】
ここでは、本発明を一般的に記載してきた。本発明は、例示の目的で提供され、そして明記されない限り本発明の限定を意図しない以下の実施例を参照することを通じてより容易に理解される。
【００３４】
（実施例１）
（合成テンプレートを用いるＦＰ−ＴＤＩアッセイによるＤＮＡの分類分け）
２３位を除いて同じ配列を有する４つの合成４８マー（ここで、４つの可能な塩基の各々は、４つの異なる合成テンプレート（ＣＦ−５０８−４８、表１中で太字の文字として示される）の各々で示された）を、調製した。各合成４８マーを、４つの別々の反応におけるテンプレートとして付与し、ここで、これを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＳ）の存在下で、２５マーのＦＰ−ＴＤＩプライマー（ＣＦ５０８−２５）、および４つのＦＡＭ標識したターミネーターのうちの１つとともにインキュベートした。この反応を、２５０ｎＭ  テンプレート、５００ｎＭ  ＦＰ−ＴＤＩプローブＣＦ５０８−２５、２５０ｎＭ  ＦＡＭ−ｄｄＮＴＰ、１．０ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ−ＦＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、８％  グリセロール、０．１％  Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ−１００を含有する２０μＬの反応容量で実施した。反応混合物を、９５℃で３０秒と４５℃で３０秒との間で２５回熱サイクル化した。ＴＤＩ反応の最後に、この反応混合物を、１２５μＬの反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、８％  グリセロール、０．１％  Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ−１００）で希釈し、そして蛍光偏光を、Ｆｌｏｕｒｏｌｉｔｅ  ＦＰＭ２（Ｊｏｌｌｅｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｙｓｌａｋｅ，ＩＬ）で測定した。
【００３５】
表２は、これらの実験の結果を示す。全ての場合において、多型性塩基に相補的なターミネーターのみが組込まれ、そして少なくとも５０ｍＰのＦＰの正味の取得（コントロールの標準偏差の９倍より大きい）を伴う有意なＦＰ変化を示した。この実施例は、蛍光偏光が、ＴＤＩプロトコルを使用して遺伝子型を検出するための手段として使用され得るという原理を実証する。
【００３６】
【表２】
0004420564.tif 000003
（実施例２）
（異なる色素を用いて標識した異なるターミネーターを用いるＦＰ−ＴＤＩアッセイ）
同じ反応における複数色検出に適切な異なる色素を同定するための試みにおいて、多くの異なる色素を、ＦＰ−ＴＤＩアッセイにおけるこれらのＦＰ特性について研究した。色素標識したｄｄＮＴＰの異なるセットを各試験色素について使用したことを除いて、実施例１に提供されるような実験的プロトコルに従った。
【００３７】
色素ターミネーターの組合せの各々を試験し、そしてターミネーターの最適なセットを、コントロールサンプルにおける最小標準偏差および陽性サンプルにおける大きな正味の変化に基づいて決定し、そして選択した。色素ターミネーターのこれらの組合せは、ＦＡＭ−ｄｄＡ、ＴＭＲ−ｄｄＣ、ＲＯＸ−ｄｄＧ、およびＢＴＲ−ｄｄＵであることを見出した（表３を参照のこと）。これらの場合の全てにおいて、ＦＰにおける正味の上昇は、コントロールサンプルの平均の標準偏差の１５倍を超えた。さらに、ＲＯＸ−ｄｄＡ、ＢＴＲ−ｄｄＣ、ＴＭＲ−ｄｄＵ、および全てのＦＡＭターミネーターもまた、十分に働くことを見出した。
【００３８】
【表３】
0004420564.tif 000004
（実施例３）
（増幅したゲノムＤＮＡに対する単色ＦＰ−ＴＤＩアッセイ）
この実施態様では、Ａ／Ｇ多型性を有する遺伝マーカーＤＸＳ１７（Ｋｏｒｎｒｅｉｃｈ，Ｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９２）１３：７０−７４）を使用して、ＰＣＲ増幅したゲノムＤＮＡフラグメントについてＦＰ−ＴＤＩ遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を試験した。
【００３９】
（ＰＣＲ増幅）
少なくとも８人の関連のない個体に由来するヒトゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１μＭの各プライマー（ｄｘｓ１７−ｐ１およびｄｘｓ１７‐ｐ２）、およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）を含有する２０μＬの反応混合物において増幅した。反応混合物を、９４℃で２分間保持し、次いで、９４℃で１０秒間、９０秒間にわたる６０℃への傾斜（ｒａｍｐｉｎｇ）、６０℃で３０秒間の保持の１０サイクル、次いで、９４℃で１０秒間、および５３℃で３０秒間の３０サイクルをした。反応の終了時に、さらなる操作に待機させるために、この反応混合物を４℃まで冷却した。
【００４０】
（プライマーおよびｄＮＴＰの分解）
ＰＣＲアッセイの終了時に、エビアルカリホスファターゼ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）中にエビアルカリホスファターゼ（２Ｕ）、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ（１Ｕ）を含有する酵素反応混液１０μＬを、このＰＣＲ産物に添加した。酵素を、９５℃にて１５分間の熱失活させる前に、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ混合物を４℃で維持し、そしてこれを、さらなる定量または特徴付けをすることなく、ＦＰ−ＴＤＩアッセイに使用した。
【００４１】
（ＦＰ−ＴＤＩアッセイによる遺伝子型決定）
ＰＣＲプライマーおよびｄＮＴＰの分解後、ＰＣＲ混合物（１０μＬ）のアリコートを、ＴＤＩプライマーであるｄｘｓ１７−Ａを用いた対立遺伝子１および対立遺伝子２の並行アッセイのために、２つの新たな反応チューブ内に分配した。ＴＤＩ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、８％グリセロール、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１．２５μＭのＴＤＩプライマー、２５ｎＭの色素標識ｄｄＡＴＰ（対立遺伝子１）またはｄｄＧＴＰ（対立遺伝子２）、および１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ−ＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する１０μＬのＴＤＩ反応混合物を、これらの２セットの各反応に添加した。次いで、反応混合物を、９３℃で１分間、次いで、９３℃で１０秒間、および５０℃で３０秒間の３５サイクルでインキュベートした。反応の終了時に、サンプルを４℃に保持した。
【００４２】
表４に示されるように、ＦＡＭ−ｄｄＡおよびＦＡＭ−ｄｄＧと共にインキュベートされた場合のサンプルのＦＰ値は、別個のカテゴリーに分類された。サンプル１〜４および７〜８は、ＦＡＭ−ｄｄＡ反応においてコントロール値の平均を超える４０ｍＰより高い（コントロールの標準偏差の２０倍より高い）ＦＰ値を有した。同様に、サンプル１、３〜６、および８は、ＦＡＭ−ｄｄＧ反応において、コントロール値の平均を超える４０ｍＰより高い（コントロールの標準偏差の８倍より高い）ＦＰ値を有した。単純に、４０ｍＰを超える正味のＦＰ変化を用いて陽性反応としてスコア付けすることによって、遺伝子型を得た。この遺伝子型は、他の手段を使用して決定された遺伝子型と全面的に一致した。
【００４３】
【表４】
0004420564.tif 000005
（実施例４）
（合成テンプレートについての二色ＦＰ−ＴＤＩアッセイ）
当業者が単一の反応においてマーカーの両方の対立遺伝子について試験し得ることを示すために、「Ａ」対立遺伝子および「Ｇ」対立遺伝子を保有する合成テンプレートＣＦ５０８−４８を試験モデルとして、ＢＴＲ−ｄｄＵターミネーターおよびＴＭＲ−ｄｄＣターミネーターとともに使用した。この実験は、実施例１に提供される研究プロトコルに従ったが、以下の差異を伴う：（１）模擬的ヘテロ接合体反応のために、テンプレートＣＦ５０８−４８ＡおよびＣＦ５０８−４８Ｇの両方を使用した；（２）各反応に、ＢＴＲ−ｄｄＵおよびＴＭＲ−ｄｄＣの両方を使用した。
【００４４】
４組の反応を実行した：「Ａ」テンプレートのみを含むサンプル、「Ｇ」テンプレートのみを含むサンプル、「Ａ」テンプレートおよび「Ｇ」テンプレートの両方を半分の濃度で含むサンプル、そしてテンプレートなし。すべての反応を４連で実施し、そして２つのＦＰ測定を各反応混合物について行って、ＢＴＲおよびＴＭＲについてのそのＦＰ値を決定した。表５は、これらの実験の結果を示す。予期される通り、ＢＴＲについての有意なＦＰ変化を、ＢＴＲ−ｄｄＵ、および「Ａ」対立遺伝子を含むテンプレートをともにインキュベートした反応（「ホモ接合Ａ」および「ヘテロ接合Ａ／Ｇ」）においてのみ、見出した。同様に、ＴＭＲについての有意なＦＰ変化を、ＴＭＲ−ｄｄＣ、および「Ｇ」対立遺伝子を含むテンプレートをともにインキュベートした反応（「ホモ接合Ｇ」および「ヘテロ接合Ａ／Ｇ」）においてのみ、見出した。色素ターミネーターがテンプレートに相補的でない反応において、ＦＰの有意な変化は観察されなかった（例えば、「ホモ接合Ａ」反応におけるＴＭＲ−ｄｄＣおよび「ホモ接合Ｇ」反応におけるＢＴＲ−ｄｄＵ）。
【００４５】
表５．合成テンプレートを用いる二色ＦＰ−ＴＤＩアッセイa
【００４６】
【表５】
0004420564.tif 000006
a使用した励起波長および発光波長については、表３の脚注を参照のこと。
bコントロールの平均に対する正味の変化
（実施例５）
（増幅されたゲノムＤＮＡについての二色ＦＰ−ＴＤＩアッセイ）
マーカーＤＸＳ１７を、同じ反応において両方の対立遺伝子について試験するために設定されたＦＰ−ＴＤＩアッセイにおいて使用した。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅、過剰なｄＮＴＰおよびＰＣＲプライマーの酵素分解を、実施例３に提供されるように実行した。酵素的除去の後、以下を含む１０μＬのＴＤＩ混合物を各チューブに添加した：ＴＤＩ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、８％グリセロール、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１．２５μＭ  ＤＸＳ１７−Ｂ、２５ｎＭ  ＴＭＲ−ｄｄＣ（対立遺伝子１）およびＢＴＲ−ｄｄＵ（対立遺伝子２）、ならびに１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ−ＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼ。反応混合物を９３℃で１分間インキュベートした後、９３℃で１０秒および５０℃で３０秒の３５サイクルを実施した。この反応の最後に、このサンプルを４℃で保持した。
【００４７】
ＴＭＲおよびＢＴＲの両方についての蛍光強度を、ＴＭＲの発光波長およびＢＴＲの発光波長で別々に測定した。ＴＭＲについてのＦｐ値およびＢＴＲについてのＦＰ値を、それぞれ算出した。これらの結果を、表６に示す。このＴＭＲ反応における陽性サンプルは、コントロールより８０ｍＰを超えて大きいＦＰ値を生じたが、一方このＢＴＲ反応における陽性サンプルは、コントロールより２５ｍＰを超えて大きいＦＰ値を生じた（これらのコントロールの標準偏差の７倍より大きい）。これらのサンプルの遺伝子型を容易に決定し、そしてこの表に列挙した。これらの結果は、他の遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）法により得られる結果と完全に一致した。
【００４８】
表６．遺伝子型マーカーＤＸＳ１７に対する、ＰＣＲ産物をテンプレートとして用いる二色ＦＰ−ＴＤＩアッセイ
【００４９】
【表６】
0004420564.tif 000007
a使用した励起波長および発光波長について、表３の脚注を参照のこと。
【００５０】
（実施例６）
（ＳＳＢタンパク質により増大されるＦＰ−ＴＤＩ遺伝子型分類）
この実施例においては、遺伝マーカーＤＸＳ１７を使用して、１本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質が蛍光偏光の変化を増大させることを実証した。この増大は、このアッセイの感度および効率を増加させることがわかった。
【００５１】
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅、エビアルカリホスファターゼおよびエキソヌクレアーゼＩ消化を、実施例３に与えるように実施した。この遺伝子型分類反応は、ＦＡＭ−ｄｄＡを使用して、１つの対立遺伝子のみを試験した。この反応の後に、この反応混合物を、前述のようにＴＤＩ反応緩衝液で希釈した。その蛍光強度を測定し、そして蛍光偏光値を算出した。次いで、１μＬの３．３μＭ  ＳＳＢタンパク質を、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。このプレートを、３０分間静置した。再度、蛍光強度を測定し、そしてＦＰ値を算出した。これらの結果を表７に与える。
【００５２】
１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、この陽性反応を特異的に増大させ、このとき陰性反応には、非常に小さな変化のみが注目された。これらの結果は、ＴＤＩ反応の伸長生成物が、１本鎖のままであることを示唆する。
【００５３】
（表７．ＦＰ−ＴＤＩのＳＳＢ増大の結果）
【００５４】
【表７】
0004420564.tif 000008
0004420564.tif 000009
（実施例７）
（メタノール含有緩衝液での希釈により増大するＦＰ−ＴＤＩ）
いくつかの蛍光色素は高度に疎水性であり、そして水溶液中では、実証可能に十分な発光スペクトルを提供しないと考えられる。従って、これらの色素のこのような水溶液は、蛍光偏光の受容不可能な高いバックグラウンドを生じ得る。この実施例は、メタノールなどの有機溶媒が、蛍光偏光の高いバックグラウンドを顕著に減少させ得ることを示す。これらの実験を、合成テンプレートＣＦ５０８セットおよびＢＯＤＩＰＹ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＢＴＲ）標識ｄｄＮＴＰを使用して、実施した。
【００５５】
実験手順を、本質的に実施例２に与えるように実施した。プライマー伸長の反応の完了に続いて、この反応混合物を、最初に１２５μＬのＴＤＩ反応緩衝液に希釈して、その蛍光強度を測定し、そしてＦＰ値を算出した。次いで、５０μＬのメタノールを、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、そして蛍光強度を再度測定した。これらの結果を、表８および表９に与える。
【００５６】
各ウェルにメタノールを添加する前には、ＢＴＲ−ｄｄＡおよびＢＴＲ−ｄｄＧを使用すると、陽性反応と陰性反応との差異は、実質的に注目されなかったが、ｄｄＣおよびｄｄＵを使用すると、いくらかの差異が観察された。各ウェルにメタノールを添加した後には、ｄｄＣおよびｄｄＵについての陽性反応と陰性反応との差異は劇的に増加し、それぞれ５９〜１４３ｍＰおよび３８〜１４５ｍＰであった。しかし、驚くべきことに、ｄｄＡおよびｄｄＧを使用した場合には、これらの陽性反応および陰性反応は、依然として顕著には異ならなかった。これらのデータは、特定の色素が、差別的な結果を生じ得ることを示唆する。しかし、熟練者は、これらの教示に容易に従って、あらゆる特定の色素についてのあらゆる差別的な結果を観察し得る。
【００５７】
【表８】
0004420564.tif 000010
【００５８】
【表９】
0004420564.tif 000011
（実施例の要約）
色素標識ジデオキシターミネーターが配列決定反応において広範に使用されており（Ｋａｉｓｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：６０８７−６１０２；Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：３３６−３４１）、そしてテンプレート指向性プライマー伸長遺伝子型分類法の感度および特異性が十分に確立されている（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７−４９１；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．Ｃ．ら；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９０）８：６８４−６９２）が、プライマー伸長反応における検出方法としてのＦＰの使用は、本研究の前に報告されていない。提供する７つの実施例は、ＦＰが、単一塩基対変化についての均質プライマー伸長反応において、単純、高感度、かつ特異的な検出方法であることを示す。実施例１において、他の点では同一のオリゴヌクレオチドの中間における１つの特定の部位に４つの可能性のあるヌクレオチドを含む４つの合成テンプレートを使用して、色素−ターミネーター取り込みのＦＰ検出の感度および特異性を確立した。第２の実施例において、いくつかの色素を、このアッセイにおけるそれらの有用性について試験した。第３のセットの実施例において、ゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物を、単色ＦＰ−ＴＤＩアッセイにおけるテンプレートとして使用して、正確な遺伝子型分類データが、このアッセイによって効率的に得られることを示した。第４の実施例において、合成テンプレートを使用して、色素−ターミネーターの正しい組合せを選択することによって、二重色ＦＰ−ＴＤＩアッセイが実施され得ることを示した。第５の実施例において、ＰＣＲ産物を、二重色ＦＰ−ＴＤＩアッセイにおけるテンプレートとして使用して、均質アッセイにおけるマーカーまたは変異の両方の対立遺伝子について正確な遺伝子型分類データが得られることを示した。第６の実施例は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、ＦＰ−ＴＤＩ遺伝子型分類における陽性結果を特異的に増強し得ることを示す。第７の実施例は、いくつかの驚くべき結果を有し、メタノールは、ＢＴＲ−ｄｄＣおよびＢＴＲ−ｄｄＵについての陽性反応と陰性反応との間の差異を増加し得たが、ＢＴＲ−ｄｄＡおよびＢＴＲ−ｄｄＧに対する効果を有さない。このことは、蛍光色素の選択だけではなくこの色素および塩基の組合せもまた、非常に重要であることを示唆する。
【００５９】
これらの研究は、ＦＰ−ＴＤＩアッセイが、プライマー伸長反応の感度および特異性を保持する一方で、その実行のために改変されたプライマーを必要としない、強固な、均質な遺伝子試験であることを実証する。非改変ＦＰ−ＴＤＩプライマーの費用は、色素標識プライマーの費用のわずか２０％であるので、この新しい検出方法は、色素標識プローブに基づく他の遺伝子型分類アッセイよりも費用効果が高い。ＤＮＡ試験（すなわち、既知のＤＮＡ多型または変異の存在または非存在についてアッセイすること）の需要は、診断、法医学および集団研究の分野において劇的に増加すると予測される。均質な遺伝子型分類アッセイ（例えば、ＦＰ−ＴＤＩアッセイ）は、大規模な遺伝子研究のために高度に適切である。なぜなら、このアッセイは、特定の反応形式に限定されず、そして高密度ＤＮＡチップを再設計または再組立する必要なく特定の適用に利用可能になるように最も良好なマーカーを使用するという柔軟性を提供するからである。さらに、ＦＰ−ＴＤＩアッセイは、セットアップ（標準的な試薬混合物をＤＮＡテンプレートに添加することによる）が単純であり、結果は、対立遺伝子識別反応を行った数分後に電子形式で得られ、そして遺伝子型は、単純なコンピュータープログラムの使用によって自動的に指定され得る。ＦＰの原理は任意の蛍光色素（赤外線領域において吸収する色素を含む）に当てはまるので、多重ＴＤＩに適切な反応条件の標準セットを生じる４つの至適な蛍光色素のセットを同定するための研究が現在進行中である。ＤＮＡ診断試験は確かに、研究用実験室ではなく臨床用実験室によってますます多く実施されるので、最小の実験室技術または手動操作を必要とする標準的なプロトコルを利用する方法（例えば、ＦＰ−ＴＤＩアッセイ）は、将来の医学の臨床的実践にとって極めて重要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、蛍光偏光検出のプロセスを例示する。
【図２】  図２は、蛍光偏光テンプレート指向性色素ターミネーター取り込み（ＦＤ−ＴＤＩ）アッセイのプロセスを例示する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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