(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中の低分子量夾雑物から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を分離する方法であって、当該方法が、
（ａ）ベースマトリックスに結合したアニオン交換リガンドからなる分離媒体を準備する工程、及び
（ｂ）上記液体を分離媒体と接触させてリガンドにｒＨＳＡを吸着させる工程、
を含んでおり、上記分離媒体のリガンド密度が１６０μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上であり、上記リガンドが式−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2）n-1ＣＨ3（ただし、ｎは１〜８の整数である）のものである、方法。
【請求項２】
前記リガンドの官能基が、弱陰イオン交換基である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが次式の構造のものである、請求項１記載の方法。
【化１】
0004559216.tif 000003
【請求項４】
工程（ｂ）で、０．１５Ｍの塩濃度を有する緩衝液を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ベースマトリックスが多孔性の球状の多糖類粒子からなる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記低分子量夾雑物がＨＳＡ分解生成物である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記低分子量夾雑物が分子量６７ｋＤａ未満の夾雑物である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
リガンドからｒＨＳＡを解離させる溶液の添加によって分離媒体からｒＨＳＡを溶出する後工程を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
吸着工程と溶出工程の間に、緩衝液で媒体を洗浄する中間工程を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記液体が培養ブロスである、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を含む培養ブロスを脱色する方法であって、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法の工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の調製、さらに具体的には培養ブロス中のある種の夾雑物からｒＨＳＡを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、血漿中に最も豊富に存在するタンパク質であり、その役割は浸透圧の維持に寄与するとともに、栄養物及び代謝物に結合してその輸送を可能にすることである。ＨＳＡには、例えばアルブミン欠乏又はアルブミン合成の低下、出血性ショックなどによる低アルブミン血症の治療薬として、多大な医薬及び科学的な関心がもたれている。利用可能な最古の方法では、ＨＳＡは血液から精製されている。しかし、こうした方法には、例えば血液供給が散発的であること、経済的に不利であること、並びに肝炎ウイルス及び特にＡＩＤＳウイルスのような望ましくない物質の混入を引き起こす等の問題がある。こうした問題を避けるため、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）を生産するための組換えＤＮＡ技術に基づく代替法が最近開発されている。多数の組換え方法が示唆されており、発酵ブロスからのｒＨＳＡの精製がこのプロセスの成功に重要な工程であることが示されている。
【０００３】
例えば、欧州特許出願公開第０６１２７６１号（株式会社ミドリ十字）には、非抗原性夾雑物を含まない高純度組換えヒト血清アルブミンの生産法が開示されている。この方法では、特定の条件下での疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、ホウ酸又はその塩を用いた処理とその後の限外濾過、及び熱処理のような他の工程と組み合わせて利用する。イオン交換工程に関して、ヒト血清アルブミンが非吸着画分から回収されるｐＨ及び塩濃度での陰イオン交換が示唆されている。示唆された精製スキームでは、ＨＳＡの脱色工程を含んでいてもよく、好ましくは最終工程である。こうした脱色は、Ｎ−メチルグルカミン基で例示されるような特定のリガンド基が存在するキレート樹脂にＨＳＡを接触させることによって実施される。
【０００４】
さらに、欧州特許出願公開第０５７０９１６号（三菱ウェルファーマ株式会社）には、遺伝子操作によって組換えヒト血清アルブミンを生産する代替法が開示されており、その精製は複数の工程の組合せによる。さらに具体的には、培養上清を、限外濾過、熱処理、酸処理及び再度の限外濾過に付した後、陽イオン交換体、疎水性クロマトグラフィー媒体及び陰イオン交換体で処理する。用いられる陰イオン交換体処理は、ＨＳＡが吸着されずにカラムを通過する条件下で使用されたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）で例示される。陰イオン交換体処理又は塩析処理後、産生宿主関連物質として規定された着色成分の量を低減するためのキレート樹脂処理の工程を設けてもよい。好ましくは、この工程で用いるキレート樹脂の担体部分は、例えばＮ−メチルグルカミン基、イミノ基、アミノ基及びエチレンイミノ基のようなポリオール基で例示されるように疎水性である。さらに、ＨＳＡ生産のため原料から誘導された脂肪酸及びそのエステルも、示唆されたキレート樹脂処理によって除去されることが示唆されている。
【０００５】
米国特許第５７１０２５３号（株式会社ミドリ十字）に開示されているように、脱色は、精製プロセスに際して組換えヒト血清アルブミンを還元剤で処理することによっても達成できる。具体的には、還元剤は、システイン、システアミン、シスタミン、アミノプロパンチオール、メチオニン、エチオニン及びグルタチオンからなる群から選択されるＳＨ基を含む低分子量化合物、又は亜硫酸、次亜硫酸、ピロ硫酸、亜リン酸、亜硫酸、亜リン酸、ピロ硫酸、亜硫酸、ピロリン酸、アスコルビン酸、もしくはそれらの塩である。着色を抑制することが知られているアミン化合物を、還元剤と併用してもよい。還元剤は、最初の精製工程又は後段の高度精製工程のいずれかで添加される。
【０００６】
最後に、欧州特許出願公開第０６９９６８７号（株式会社ミドリ十字）には、流動床に懸濁した吸着材粒子との接触による組換えヒト血清アルブミンの精製法が開示されている。しかし、こうした拡大床吸着に常用される酸性条件下では、培地に含まれるｒＨＳＡがプロテアーゼによって急速に分解され、そのため製品の収率が低下する。この欧州特許では、分解の問題を解消すべく、流動層との接触の前に培地を熱処理してプロテアーゼを不活性化することが示唆されている。溶出液は、次いで限外濾過、ＨＩＣ及び陰イオン交換クロマトグラフィーに付してもよい。
【０００７】
しかし、ｒＨＳＡ標品からｒＨＳＡ分解生成物及び色素のような低分子量夾雑物を効率的に除去するための改良法が当分野では依然として必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の一つの目的は、培養ブロスにみられるｒＨＳＡ分解生成物のような低分子量夾雑物からのｒＨＳＡの効率的精製を可能にする分離媒体を提供することである。
【０００９】
本発明の具体的な目的物は、ｒＨＳＡ分解生成物のような低分子量夾雑物からｒＨＳＡを精製する方法であって、添加剤を必要とせずに夾雑物を除去できる方法である。
【００１０】
本発明の別の目的は、分解生成物のような低分子量夾雑物からｒＨＳＡを精製する方法であって、塩の存在（すなわち適度に高い伝導率）に比較的鈍感な方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、低分子量分解生成物のような低分子量夾雑物からｒＨＳＡを精製する方法であって、従来技術の方法よりも堅牢な方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、分離媒体へのｒＨＳＡの吸着によって、分解生成物のような低分子量夾雑物からｒＨＳＡを精製するクロマトグラフィーの方法であって、一定組成溶出法で低分子量夾雑物を除去することができる方法を提供することである。
【００１３】
上述の１以上の目的は、特許請求の範囲に規定されるようにして達成できる。本発明のその他の目的及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第一の態様では、本発明は、液体中の低分子量夾雑物から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を分離する方法であって、
（ａ）ベースマトリックスに結合したアニオン交換リガンドからなる分離媒体を準備する工程、及び
（ｂ）上記液体を分離媒体と接触させてリガンドにｒＨＳＡを吸着させる工程、
を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
従って、工程（ｂ）では、夾雑物は分離媒体に吸着されない。好適な実施形態では、当ギア方法はクロマトグラフィー方法であり、夾雑物又はその少なくとも一部を液体と共にカラムに流す。一実施形態では、媒体を適当な溶液又は緩衝液で洗浄して、吸着されずに保持されている夾雑物を除去する。好ましい実施形態では、当該方法は、続いて、リガンドからｒＨＳＡを解離させる溶液を添加することによって、分離媒体からｒＨＳＡを溶出する工程を含む。こうした溶液は溶出液として知られており、大抵は、塩の濃度勾配を含む緩衝液である。
【００１６】
従って、本発明は、ｒＨＳＡが陰イオン交換体に吸着されるという点で上記で引用した従来技術とは異なる。従前、陰イオン交換体はｒＨＳＡ精製プロセスの一工程として利用されているが、ｒＨＳＡがカラムを通過するが、夾雑物は結合及び／又は保持されるような条件下で用いられている。本発明では、媒体にｒＨＳＡを吸着させことによって、低分子量夾雑物からのｒＨＳＡの極めて効率的な分離、ひいてはサンプルの効率的な脱色が達成できるという予想外の知見が得られた。さらに、本発明の吸着材は吸着ｒＨＳＡの効率的な洗浄が可能となる十分な強さをもつことが判明しており、生成物を高収率で得るのに有利である。以下で詳しく説明する通り、本発明の方法は最も好適にはｒＨＳＡ精製プロセスにおける高度精製工程として用いられる。
【００１７】
好適な実施形態では、リガンドの官能基は、弱陰イオン交換基、好ましくは第二アミンである。一実施形態では、リガンドは脂肪族であり、１個以上のヒドロキシル基及び好ましくはエーテル基も含む。本発明の方法で好適に利用されるリガンド構造の例としては、市販品のＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）があり、以下のように模式的に示される。
【００１８】
【化１】
0004559216.tif 000002
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、上記に示すような吸着材で、アミンの右側（つまりアミンからみてＯＨ基とは反対側）の炭素鎖は長鎖炭素鎖からなる。つまり、吸着材は、例えば、．．．．．Ｎ−（ＣＨ2）n-1ＣＨ3（ただし、ｎは１〜８の整数である）を末端とするものであってもよい。
【００２０】
さらに、ベースマトリックスに結合した高密度リガンドで有利な結果が得られることが判明した。この点に関して、「高」とは、上記Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）よりもリガンド密度が高いことを意味する。従って、本発明の方法の一実施形態では、分離媒体のリガンド密度は約５０μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上、好ましくは約１００μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上、最も好ましくは約１６０μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上である。以下の実験の項で示す通り、プロトタイプの第二アミンを含む高リガンド密度陰イオン交換分離媒体を用いる本発明の高度精製工程を、ジエチルアミノエチルの形態の第三アミン基を含む市販の弱陰イオン交換媒体ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）と対比する。このプロトタイプで脱色及び堅牢性に優れる方法が得られることが判明したが、これは、ｒＨＳＡがすべて又は実質的にすべて吸着されること、つまりプロトタイプ陰イオン交換体に結合されるのに対して、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を用いた場合には、ｒＨＳＡが非結合ではあるが非常に遅いた画分から回収されるためであると考えられる。その結果、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を高度精製に使用するには、再現性のある結果を得るための注意深いサンプル調製手順が必要とされる。
【００２１】
本発明の別の利点は、非一定組成法を用いることである。従って、本発明は再現性が高い。さらに、リガンド密度の高いプロトタイプ弱陰イオン交換体は、従来の方法よりも耐塩性が高いことが判明した。従って、塩濃度が比較的高いことがある培養ブロスを実質的に希釈せずに直接用いることができる。そのため、処理体積を比較的低く保つことができるので、特に大規模処理では実質的な節約が可能となる。
【００２２】
リガンドが結合したベースマトリックスは、有機ポリマー（天然のものでも合成品でもよい）、シリカのような無機材料などの、常用されるいかなる材料のものであってもよい。ベースマトリックスは、粒子、モノリス、表面、フィルターなど、適当ないかなる形態のものであってもよい。
【００２３】
一実施形態では、高分子ベースマトリックスは、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ジェラン、アルギン酸塩のような架橋炭水化物材料からなる。かかるベースマトリックスは、逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２）、３９３〜３９８（１９６４））のような常法で容易に調製できる。別法として、ベースマトリックスは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））のような市販品である。従って、一実施形態では、本発明で用いるベースマトリックスは、アガロース粒子のような多孔性の実質的に球状の多糖類粒子からなる。
【００２４】
別の実施形態では、ベースマトリックスは、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの架橋合成ポリマーからなる。かかるポリマーは常法で容易に合成される。例えば、  “Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），  ７０−７５  （１９８８））参照。別法として、例えば、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））のような市販品を本発明で用いることもできる。
【００２５】
上述のいずれかのベースマトリックスへの陰イオン交換リガンドの結合は、周知の標準法で当業者が容易に実施できる。例えば、Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ及びＴ．Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ著：ＴＨＥ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，第１巻、第３版（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ＆Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ編）Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ＆  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９７５）９５〜１７７頁参照。
【００２６】
本発明において、「夾雑物」という用語は、最終ｒＨＳＡ標品に望ましくないあらゆる物質又は化合物に用いる。周知の通り、ｒＨＳＡ標品は、原料に含まれる又は宿主微生物の培養時に微生物から分泌されるある種の着色成分で汚染されることが多々あり、こうした夾雑物はｒＨＳＡに結合してその着色を起こす。脱色はｒＨＳＡの分解生成物によっても生じるが、そうした分解は培養ブロス中に存在する分解プロテアーゼによって起こる。そこで、本発明の方法は、ｒＨＳＡを含む培養ブロスの脱色法として定義することができる。例えば、一実施形態では、本発明を用いて生成物（ｒＨＳＡ）から分離される低分子量夾雑物はｒＨＳＡ分解生成物である。別の実施形態では、低分子量夾雑物は分子量６７ｋＤａ未満（例えば０〜６７又は０〜５０ｋＤａ）のものである。一実施形態では、低分子量夾雑物は、分子量約１０〜４６ｋＤａのｒＨＳＡ分解生成物である。
【００２７】
以上から明らかな通り、本発明の一般的な実施形態では、分離媒体に付される液体は培養ブロスである。本願に関して、「培養ブロス」という用語は、ｒＨＳＡ産生組換え微生物が培養される発酵ブロスを意味する。
【００２８】
以上から明らかな通り、組換え技術によるｒＨＳＡの生産は当技術分野で周知であり、発現に適した菌株及び適当な培養条件は当業者が容易に選択することできる。簡単に説明すると、宿主は、様々な刊行物で既に報告されている宿主から選択することができる。宿主の代表例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、各種の酵母、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような、ＨＳＡ産生株とした微生物細胞並びに動物細胞が挙げられる。特に好ましい宿主は酵母種、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのようなＰｉｃｈｉａ属、又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属するものが挙げられる。また、栄養要求性株又は抗生物質感受性株を用いてもよい。
【００２９】
ＨＳＡ産生宿主の調製、宿主の培養によるＨＳＡ産生、得られた培養ブロスからのＨＳＡの単離及び回収は、公知の技術又はその改変法を用いて達成し得る。例えば、ＨＳＡ産生宿主（又はＨＳＡ産生株）の調製は、天然又は改変ヒト血清アルブミン遺伝子を用いるプロセスで実施し得る。ＨＳＡ産生宿主の培養、並びにＨＳＡの初期単離及び回収は、例えば、上述の引用文献に開示されているような公知のプロセスを用いて実施できる。本発明によるｒＨＳＡ精製のための一連の工程の例では、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））のような従来の陽イオン交換体を用いる最初の吸着工程、次いでＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））のような疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる精製工程、次いで本発明に記載の弱陰イオン交換体を用いる高度精製工程を含む。
【００３０】
第二の態様では、本発明は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を含む培養ブロス中の低分子量夾雑物の量を減らすための陰イオン交換分離媒体の使用に関する。
【００３１】
一実施形態では、ｒＨＳＡを含む培養ブロスを陰イオン交換分離媒体を用いて脱色する。好適な実施形態では、陰イオン交換分離媒体は弱陰イオン交換基を含むもので、これにｒＨＳＡを吸着させる。本発明の使用の最も好ましい実施形態では、陰イオン交換分離媒体のリガンド密度は、約５０μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上、好ましくは約１００μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上、最も好ましくは約１６０μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上である。さらに、本発明の使用に関するこれ以上の詳細は、例えば本発明の第一の態様に関して上記で説明した通りである。
【００３２】
第三の態様では、本発明は、ｒＨＳＡを含む培養液の脱色用キットであって、ベースマトリックスに結合した弱陰イオン交換基が存在する陰イオン交換分離媒体と、媒体からｒＨＳＡを解離させることができる溶液とを別々の容器に、その使用解説書と共に、備えるキットに関する。好適な実施形態では、陰イオン交換分離媒体は、例えば実験室規模での作業用に、クロマトグラフィーカラム内に存在する。本発明のキットの最も好適な実施形態では、陰イオン交換分離媒体のリガンド密度は、約５０μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上、好ましくは約１００μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上、最も好ましくは約１６０μｍｏｌ／ｍｌ媒体以上である。この陰イオン交換分離媒体及びその使用に関するこれ以上の詳細は、例えば上記で説明した通りである。
【００３３】
図面の詳細な説明
図１では、発酵槽で増殖させた酵母細胞の細胞培養上清からのｒＨＳＡの精製に用いられる下流精製プロセスをまとめた表１を示す。具体的には、表１には、高耐塩性の吸着材を用いて実施し得る陽イオン交換クロマトグラフィー工程、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、最後に本発明による陰イオン交換クロマトグラフィー工程が規定されている。この順序の工程で、純度９９％超のような高純度の精製ｒＨＳＡ画分が得られる。
【００３４】
図２は、本発明の弱陰イオン交換体を用いて、ｒＨＳＡの最終第３クロマトグラフィー精製工程で得られた溶出プロフィールを示す（表１参照）。精製ｒＨＳＡは画分１Ｂにある。
【００３５】
図３は、表１に示す３段階精製法で得た主な画分のネイティブＰＡＧＥ（８〜２５％）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜１５％）の分析結果を示す。最終段階の第３工程は本発明で用いる方法である。銀染色した非変性ＰＡＧＥ（図２Ａ）では、１スポット当たり約３．３μｇのタンパク質を添加した。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２Ｂ）では、１スポット当たり約２μｇのタンパク質を添加した。クマーシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２Ｃ）では、１スポット当たり約１０μｇのタンパク質を添加した。
（１）：清澄化した細胞培養上清（ＣＣＳ）；（２）：工程１の非結合画分；（３）：工程１の結合画分（ｒＨＳＡを含む）；（４）工程２の非結合画分（ｒＨＳＡを含む）；（５）工程２の結合画分；（６）：工程３の非結合画分；（７）工程３の結合画分（ｒＨＳＡを含む）；（８）精製血漿ＨＳＡ（対照）。
【００３６】
図４は、市販の陰イオン交換体並びに本発明で用いる高リガンド密度の弱陰イオン交換体への精製ＨＳＡの結合に対するｐＨの影響を示す。
【実施例】
【００３７】
実験
以下の実施例は、例示のみを目的とするものであり、特許請求の範囲によって規定すべき本発明を限定するものではない。本明細書で引用する文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００３８】
実施例１：以下に用いられる弱陰イオン交換体ゲルの調製
１：１．アリルグリシジルエーテルを用いたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦの活性化
これは、アリルグリシジルエーテルをアルカリ条件下でＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦと反応させることによって実施する。
【００３９】
適当な反応容器中で、１００ｇのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦを、４５ｍＬの５０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液、０．５ｇのＮａＢＨ4及び１３ｇのＮａ2ＳＯ4と混合した。混合物を５０℃で１時間撹拌して、１００ｍＬのアリルグリシジルエーテルを添加した。懸濁液を５０℃でさらに１８時間撹拌した。混合物を濾過して、ゲルを５００ｍＬの脱イオン水、５００ｍＬのエタノール、２００ｍＬの脱イオン水、２００ｍＬの０．２Ｍ酢酸、５００ｍＬの脱イオン水を用いて逐次洗浄した。
【００４０】
滴定分析の結果、０．２３ｍｍｏｌアリル基／ｍｌゲルという置換度が得られた。以下、このアリル誘導体化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦを「生成物Ｉ」という。
【００４１】
１：２．生成物Ｉ（アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ）の活性化
典型的手順では、１００ｍＬの生成物Ｉと４ｇの酢酸ナトリウムと１００ｍＬの脱イオン水の撹拌懸濁液に、持続的な黄色が得られるまで臭素水を添加した。過剰臭素の低減は、黄色味が消失するまでギ酸ナトリウムを懸濁液に添加することによって達成した。反応混合物を濾過して、アリル誘導体化ゲルを５００ｍＬの脱イオン水で洗浄した。
【００４２】
１：３．活性化生成物ＩへのＮブチルアミンのカップリング
活性化ゲル（生成物Ｉ）を、反応容器に移し、次いで５０ｍＬのＮ−ブチルアミンを添加した。懸濁液を６０℃で１８時間撹拌した後、濾過した。ゲルを５００ｍＬの脱イオン水で洗浄し、そのアミン基含量を滴定で決定した。その結果、約０．２ｍｍｏｌ／ｍｌゲルというブチルアミン基の置換度が得られた。
【００４３】
実施例２：ｒＨＳＡの精製
以下に示す実施例では、ｒＨＳＡを含む細胞培養上清（ＣＣＳ）を以下のクロマトグラフィー工程に付す３段階精製プロセスを開示する。
（ａ）バイモーダル高耐塩性マトリックスでの陽イオン交換、
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及び
（ｃ）本発明による陰イオン交換クロマトグラフィー。
【００４４】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）の開示は、工程（ｃ）で例示される本発明の方法に先だって行うことができるサンプル処理の方法を例示するものにすぎない。本発明は、出発材料として、あらゆるサンプル、好ましくは同様の吸着及び精製工程に付したものを使用できる。
【００４５】
材料及び方法
ｒＨＳＡを含む細胞培養上清（ＣＣＳ）は、遺伝子改変Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を２週間以上発酵した後、濾過で細胞を分離して調製した。ＣＣＳは緑色であり、これを約２００ｍｌのアリコートに分けて、使用時まで−２０℃で保存した。ＣＣＳの品質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））の分析カラムでのゲル濾過で確認した。この分析で、ＣＣＳ中の高分子量（ＨＭＷ）不純物と低分子量（ＬＭＷ）不純物の相対量、並びに単量体型ｒＨＳＡの大まかな含有量を得た。
【００４６】
カプリル酸ナトリウム（オクタン酸Ｎａ塩）及びＬ−システインは、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。ヒト血漿からクロマトグラフィー法で精製したＨＳＡは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）の血漿処理部門のＩ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ氏から入手した。各種サンプル中のタンパク濃度はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法として知られる）を用いて決定した。標準曲線の作成にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。紫外／可視吸光度測定は島津ＵＶ−１６０Ａ自記分光光度計（株式会社島津製作所）を用いて行った。その他使用したすべての化学物質は分析又は試薬グレードであった。
【００４７】
分析用電気泳動は、ＰｈａｓｔＧｅｌ電気泳動システムと適当なＰｈａｓｔＧｅｌ媒体及び緩衝液Ｓｔｒｉｐｓ（すべてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて実施した。電気泳動分析はネイティブＰＡＧＥ（８〜２５％）又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、１０〜１５％）ゲルを製造業者の推奨通り用いて実施した。１スポット当たりのサンプル添加量は以下の通りであった。非変性サンプルでは約３．３μｇ、ＳＤＳ処理サンプルでは２μｇであり、いずれもＳｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））で染色した。クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色したＳＤＳ処理サンプルでは１０μｇであった。
【００４８】
質量分析（精製ｒＨＳＡ及び血漿由来ＨＳＡの質量を求めることを目的）はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて行った。天然ＨＳＡ及び組換えＨＳＡのトリプシン消化ペプチドマッピングもこの装置を用いて行った。後者の解析で得られた結果は、精製ＨＳＡから得たトリプシンペプチドの公知の配列と対照して、ｒＨＳＡの最も可能性の高い一次配列を得るのに用いた。
【００４９】
マトリックス及びクロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー実験は、ＵＮＩＣＯＲＮ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１）ソフトウェアで制御したＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて室温（約２３℃）で実施した。工程（ｂ）で用いた分離マトリックスは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）の定番商品であるＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）である。工程（ｃ）では、市販ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））又は改質マトリックスのいずれかを用いた。この改質マトリックスは、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を、市販品（２０〜４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）よりも高いリガンド密度（バッチ番号Ｕ２３８０２５：１６０μｍｏｌ／ｍｌ）で製造したものである。この改質マトリックスを、本明細書では「改質Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」という。さらに、工程（ａ）では、高耐塩性型のプロトタイプ陽イオン交換体を用いた。この媒体を２０％エタノール中の濃厚懸濁液としてＸＫ２６／２０ガラスカラムに充填して、４０ｍｌのベッド体積を得た。３００ｃｍ／ｈの線流速を用いた。充填カラムを約２ベッド体積の脱イオン水を用いて洗浄して、大半のエタノールを溶出し、次いでサンプル添加前に適当な緩衝液で平衡化した。
【００５０】
緩衝液
緩衝液Ａ：２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５
２５ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウムと４０ｍＬの１Ｍ酢酸を混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：室温（ＲＴ）で約２ｍＳ／ｃｍ。
【００５１】
緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭカプリル酸ナトリウム、ｐＨ７．０
１５５ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4と９５ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と５．８ｇのＮａＣｌと１．６６ｇのカプリル酸ナトリウムを混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：ＲＴで約１６ｍＳ／ｃｍ。
【００５２】
緩衝液Ｃ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
２１２ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と３８ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4と５．８ｇのＮａＣｌを混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：ＲＴで１４ｍＳ／ｃｍ。
【００５３】
緩衝液Ｄ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
２１２ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と３８ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4と１１．７ｇのＮａＣｌを混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：ＲＴで２２ｍＳ／ｃｍ。
【００５４】
緩衝液Ｅ：現場洗浄（ＣＩＰ）液
３０％イソプロパノールを１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に溶解
細胞培養上清（ＣＣＳ）の熱処理
陽イオン交換クロマトグラフィー工程の前に、まずＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの発酵時に産生したタンパク分解性酵素を不活性化すべくＣＣＳを熱処理した。これは以下の通り実施した。
【００５５】
ＣＣＳの凍結サンプルを融解し、１０ｍＭカプリル酸Ｎａを溶解した。ｐＨを６．０に調整し、水浴（サーモスタットで６８℃に維持）中で３０分間加熱した。サンプルを室温に冷却し、そのｐＨを４．５に調整した。
【００５６】
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓのような従来の陽イオン交換媒体を工程（ａ）に用いる場合、伝導率が約５〜１０ｍＳ／ｃｍ（塩濃度約０．１Ｍ）となるように脱イオン水を用いてＣＣＳを２〜８倍（溶液の元の伝導率による）に希釈する必要がある。
【００５７】
これに対して、本発明で用いるＨＳＬ型媒体は高い塩濃度に格段に耐性があり、通常は、熱処理ＣＣＳを、その伝導率が約３０ｍＳ／ｃｍ未満である限り、それ以上希釈せずに工程（ａ）に用いることができる。
【００５８】
工程（ａ）の陽イオン交換工程で得られた部分精製ｒＨＳＡ（すなわち、ＨＳＬ型媒体に結合した画分）も、以下の通り、工程（ｂ）の前に熱処理した。サンプルのｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで６．０に調整し、還元剤として機能させるためシステインを５ｍＭ濃度となるように溶解した。この溶液を次いで６０℃に維持した水浴中で６０分間加熱した。この操作の主な目的は、ＨＩＣ媒体による着色物質の除去を容易にすることである。
【００５９】
実施例２（ａ）：陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた吸着
陽イオン交換媒体を、ＸＫ１６／２０カラム（充填ベッド体積２０ｍＬ）に充填し、平衡化のため２カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａで洗浄した。熱処理ＣＣＳを、１５０ｍＬ  Ｓｕｐｅｒｌｏｏｐ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））によって流速３００ｍＬ／ｈ（１５０ｃｍ／ｈ）でカラムにかけた。ｒＨＳＡの添加量は約１ｇ（すなわち、５０ｍｇ  ｒＨＳＡ／ｍｌ充填ゲル）であった。サンプル添加後、非結合物を３ＣＶの緩衝液Ａで溶出した後、５ＣＶの緩衝液Ｂで結合ｒＨＳＡを溶出した。両画分を別々にプールし、１ＭのＮａＯＨ溶液で結合画分のｐＨを６．０に調整した。この溶液を次いで上述の通り加熱し、室温に冷却し、さらに後述の通りＨＩＣカラムで精製した。プールした各画分の１ｍＬアリコートは、分析用（すなわち、タンパク量、Ａ350／Ａ280比の測定及び電気泳動分析のため）保存した。
【００６０】
再生：カラムは、強く結合した物質を溶出させ、ゲルの機能を回復させるため２ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄した。カラムを同じ溶液中に一晩放置し、次いで４ＣＶの脱イオン水で洗浄してＮａＯＨ及びイソプロパノールの大半を溶出させた。再生カラムを、次回の吸着／脱離プロセスに用いる前に、４ＣＶの緩衝液Ａで再度平衡化した。
【００６１】
実施例２（ｂ）：ＨＩＣを用いた精製工程
上記工程で得たｒＨＳＡ含有画分を、１５０ｍＬのＳｕｐｅｒｌｏｏｐ（商標）に移し、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）を充填したＸＫ２６／２０カラム（充填ベッド体積４０ｍＬ）にかけた。カラムは予め３ＣＶの緩衝液Ｃで平衡化しておいた。サンプル添加後、カラムを２ＣＶの緩衝液Ｃで洗浄し、ｒＨＳＡを含む非結合物を溶出させた。結合物（主にｒＨＳＡの４５ｋＤａ分解物を含む）は２ＣＶの脱イオン水で溶出させた。
【００６２】
再生：上記と同じ手順。
【００６３】
実施例２（ｃ）：弱陰イオン交換体を用いた本発明の高度精製工程
前段のＨＩＣ工程で得た２つの画分をプールして各々の１ｍＬアリコートを分析用（上記参照）に保存した。カラム（ＸＫ２６／２０）にＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ又は又は本発明の弱陰イオン交換体（高度に置換したＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を充填して、４０ｍＬの充填ベッド体積を得た。各充填媒体を２ＣＶの脱イオン水で洗浄し、次いで約５ＣＶの緩衝液Ｃで平衡化した。ＨＩＣ工程で得られた非結合画分を１５０ｍＬのＳｕｐｅｒｌｏｏｐに移して、上記の２つのカラムのいずれかに加えた。非結合画分は６ＣＶの緩衝液Ｃで（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムから）、又は改質Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから２ＣＶで溶出した。結合画分は、ＤＥＡＥカラムでは２ＣＶの２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で、又は本発明の弱陰イオン交換体を充填したカラムでは５ＣＶの緩衝液Ｄで溶出した。流速は、全体を通して９０ｃｍ／ｈに維持した。
【００６４】
結果
得られたクロマトグラフィー溶出プロフィールを図１に示す。この実験（工程３）で得られた各画分のＰｈａｓｔＧｅｌ（商標）グラジエント電気泳動分析の結果を図２に示す。この結果から、本発明の弱陰イオン交換体を使用すると、非結合画分中に一群として溶出するＬＭＷ不純物が効率的に除去されることが分かる。さらに、このＩＥＣ媒体を用いて得られた精製画分（図１の画分１Ｂ参照）のＡ350／Ａ280比は、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ媒体を用いて得られたものよりも低かった。
【００６５】
再生：上記と同じ手順。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】発酵ブロス中で増殖した形質転換酵母細胞で産生したｒＨＳＡに適合させた基本的に３段階精製プロセスである表１を示す。
【図２】ｒＨＳＡの最終第３精製工程で得られたクロマトグラフィーの溶出プロフィールを示す（表１参照）。この最終高度精製工程で用いられる陰イオン交換体は、本発明に記載されるものである。精製ｒＨＳＡは画分１Ｂに溶出される。
【図３】表１に示す３段階精製プロセスを用いて得られる主画分の電気泳動分析の結果を示し、その最終工程は本発明による高度精製法である。８つのレーンからなる最初の群（Ａ）ではネイティブＰＡＧＥ／銀染色を用い、第二の群（Ｂ）ではＳＤＳ  ＰＡＧＥ／銀染色を用い、最後の群（Ｃ）ではＳＤＳ  ＰＡＧＥ／クマーシーＢＢを用いる。
【図４】幾つかの市販陰イオン交換体並びに本発明で用いる弱陰イオン交換体への精製ＨＳＡの結合に対するｐＨの影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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