(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料，試薬などの溶液を収容するためのスペースにより形成される核酸分析のための反応層の少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための核酸増幅用区画と、生成された増幅核酸を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための複数の核酸検出用区画とを、互いに独立した温度制御が可能になるよう形成し、前記核酸増幅用区画は、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備え、複数の前記核酸検出用区画は、種別ごとの関心のある核酸増幅物をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするための核酸検出用プローブを備え、前記反応層に試料又は試薬の溶液を収容して、前記核酸増幅用区画では、逆転写のため、又はＰＣＲによる核酸増幅の温度サイクル制御のため、前記核酸検出用区画では、前記核酸増幅用区画で行われる逆転写の間にハイブリダイゼーションを起こさないため、又は、前記核酸増幅用区画で生成された関心ある核酸増幅物を捕捉するために、それぞれの区画ごとに適した温度制御を行うことにより、単一の反応層にて核酸の増幅と検出を行うことを特徴とする核酸分析方法。
【請求項２】
請求項１の核酸分析方法において、前記反応層で核酸の増幅と検出とを並行させる核酸分析方法。
【請求項３】
請求項１の核酸分析方法において、前記核酸検出用区画には、前記核酸増幅用区画から乖離した蛍光標識付きの核酸増幅物を捕捉する核酸検出用プローブが固定され、この検出用プローブに捕捉された蛍光標識付き増幅物を検出する励起光としてエバネッセント光を用いる核酸分析方法。
【請求項４】
請求項１の核酸分析方法において、前記核酸増幅用区画を複数形成し、それぞれに、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備える核酸分析方法。
【請求項５】
試料，試薬などの溶液を収容するためのスペースにより形成される核酸分析のための反応層を有し、
この反応層を形成する少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための核酸増幅用区画と、生成された増幅核酸を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための複数の核酸検出用区画とが形成され、前記核酸増幅用区画は、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備え、複数の前記核酸検出用区画は、種別ごとの関心のある核酸増幅物をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするための核酸検出用プローブを備え、前記核酸増幅用区画及び前記核酸検出用区画が、それぞれのプローブに応じて区画ごとに独立した温度制御が可能になるよう形成してなることを特徴とする核酸分析用セル。
【請求項６】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画の表面には、ｍＲＮＡのポリＡ配列と相補的な配列をなすポリＴ配列のプローブが固定されている核酸分析用セル。
【請求項７】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画の表面には、関心のあるｍＲＮＡが特異的にハイブリダイズ可能な核酸増幅用プローブが固定されている核酸分析用セル。
【請求項８】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画が複数形成され、それぞれに、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブが固定されている核酸分析用セル。
【請求項９】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、前記核酸増幅用区画と前記核酸検出用区画とは少なくとも前記基板の一面に併設されている核酸分析用セル。
【請求項１０】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、前記反応層の厚みが０．０５ｍｍ〜１ｍｍ及び前記シートの厚みが０．０１ｍｍ〜１ｍｍの少なくとも一つの条件を満たしている核酸分析用セル。
【請求項１１】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、
前記核酸増幅用区画は、前記基板の一面に形成され、
前記核酸検出用区画は、前記基板と前記シート間の対向する面に、関心ある核酸増幅物を捕捉する核酸検出用プローブを有する核酸検出機能と前記核酸増幅物を捕捉するのに適した温度制御を行うヒーター機能とが分けて形成され、前記ヒーター機能は前記基板側の対向面に設けられ、前記核酸検出機能は前記シート側の対向面に設けられている核酸分析用セル。
【請求項１２】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記核酸増幅用区画の両側或いは周囲に前記核酸検出用区画が複数配設される核酸分析用セル。
【請求項１３】
請求項５の核酸分析用セルにおいて、前記核酸検出用区画のすべてが、前記核酸増幅用区画と等しい距離で配置されている核酸分析用セル。
【請求項１４】
試料，試薬などの溶液を収容するためのスペースにより形成される核酸分析のための反応層を有し、この反応層を形成する少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための核酸増幅用区画と、生成された核酸増幅物を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための複数の核酸検出用区画とが形成され、前記核酸増幅用区画は、核酸増幅用プローブ又は逆転写時のプライマーとなるプローブを備え、複数の前記核酸検出用区画は、種別ごとの関心のある蛍光標識付き核酸増幅物をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするための核酸検出用プローブを備え、前記核酸増幅用区画及び前記核酸検出用区画が、それぞれのプローブに応じて区画ごとに独立した温度制御が可能になるよう形成してなる核酸分析用セルと、
前記核酸増幅用区画の核酸増幅又は逆転写のための温度制御を行う温度制御手段と、
複数の前記核酸検出用区画で、区画ごとに関心のある核酸増幅物の種別に応じたハイブリダイゼーションによる特異的な捕捉に適した設定温度制御を行う温度制御手段と、
前記核酸検出用区画で捕捉された前記蛍光核酸増幅物を光学的に検出する検出手段と、
を備えることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１５】
請求項１４の核酸分析装置において、前記反応層は、基板とそれに対向して配置された光透過性を有するシートとの間に形成され、
前記核酸増幅用区画は、前記基板の一面に形成され、
前記核酸検出用区画は、前記基板と前記シートとの対向する面に、関心ある核酸増幅物を捕捉する核酸検出用プローブを有する核酸検出機能と前記核酸増幅物を捕捉するのに適した温度制御を行うヒーター機能とが分けて形成され、前記ヒーター機能は前記基板側の対向面に設けられ、前記核酸検出機能は前記シート側の対向面に設けられ、
前記核酸検出用プローブには、蛍光標識付きの核酸増幅産物が捕捉されるようにし、その蛍光量の検出手段として、前記シートの内面にしみ出すように設定したエバネッセント光を用いる核酸分析装置。
【請求項１６】
請求項１４の核酸分析装置において、前記セルは、核酸増幅用区画を複数有し、それぞれの核酸増幅用区画で異なる温度サイクル制御を行う核酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＤＮＡ，ｍＲＮＡなどの核酸（ポリヌクレオチド）の分析方法、核酸分析用セル、および核酸分析装置に関する。
【背景技術】  サンプル中に存在するＤＮＡ或いはｍＲＮＡの種類を測定する技術として、ＤＮＡチップが知られている。ＤＮＡチップは、遺伝子などの関心のある核酸（標的核酸）をハイブリダイゼーション（相補鎖結合）により相補的に結合（捕捉），合成するために、種々の一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを、基板上に高密度に整列固定してなる。代表的なものとしては、アフィメトリックス社（米国）のＤＮＡチップのように、フォトリソグラフィ技術を用いて半導体チップ上に標的核酸を捕捉するためにオリゴヌクレオチドプローブを高密度に整列固定するものが周知である。また、関心のあるｍＲＮＡの発現量を定量計測する技術として、リアルタイムＰＣＲ法、及びＴａｑＭａｎプローブ法などが周知である。
さらに、従来の生化学反応装置では、特開平５−３１７０３０号公報に開示されるように、二次元平面上に配列された多数の孔（チャンバ）を持つ生化学反応装置（マイクロマルチチャンバ）において、各々のチャンバに温度調節機能を組み込んで、チャンバごとに温度を独立して制御可能にした技術が開示されている。
また、同公報には、このようなマイクロマルチチャンバを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ法）による核酸増幅反応を行う技術が記載されている。この技術は、それぞれのチャンバに微少容量の種々のＰＣＲ用の反応液（生化学的試料）を与え、チャンバ毎に反応液に応じた温度サイクル制御を行うことにより、同時の多種，多数のＰＣＲを可能にしている。チャンバ母材は、例えばシリコンが用いられ、異方性エッチングによってチャンバとなる孔が掘られ、チャンバ内に温度調節手段として、半導体ペルティエ素子を形成している。
一方、特開２０００−３４２２６４号公報、特開２００１−２３５４６９号公報、特開２００１−２３５４７４号公報においては、核酸検出用チップにおいて、一つの基板上に複数の独立した温度条件を設定することが可能な区域（区画）を設ける技術が開示されている。この従来技術は、ＤＮＡ，ｍＲＮＡ等の核酸（ポリヌクレオチド）をハイブリダイゼーションにより検出（捕捉）することを目的としている。また、独立した温度制御が可能な複数の区画については、区画ごとに異なるオリゴヌクレオチドプローブ（核酸検出用プローブ）が固定されること、標的核酸を含む試料溶液の種類は各区画に共通の試料であり、その試料が基板上（チップ表面）に添加されること、各区画は各核酸検出用プローブのハイブリダイゼーションに適した温度に設定されることが述べられている。
上記したように、従来の技術には、種々の一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを、基板上に高密度に整列固定するＤＮＡチップや、多種，多数の試料を、一つの基板上の複数のチャンバで個別に温度制御して核酸増幅する技術や、一つの基板上で種別ごとの核酸検出用プローブ（オリゴヌクレオチドプローブ）を、独立して温度制御が可能な区画に固定する技術が開示されている。これらの技術では、ＤＮＡ，ｍＲＮＡなどの関心のある核酸（標的核酸）を専ら増幅或いは検出するために用いるものとして開示されている。しかしながら、多種，多数の核酸を同時に増幅・検出可能にする技術については開示されていない。
ところで、遺伝子発現が創薬分野などで重要となるに従い、１０〜２０ないし１００種類の限定した関心のある遺伝子に関して、その発現量を定量評価することが求められている。従来の技術では、発現の増減などは、ＤＮＡチップを用いることにより評価することが可能であったが、定量性に乏しく、また標的核酸の増幅手順を外部で行うため、煩雑である問題があった。また、核酸の増幅においては、最適な温度制御に種類差が存在するため、一度に増幅が可能な種類数も限られていた。
一方、発現量の定量評価を行う技術であるリアルタイムＰＣＲやＴａｑＭａｎ法は、増幅と同時に検出が行えるため、検出の精度が良く、簡便である。しかし、１チューブで１種類の遺伝子しか検討できないため、関心のある遺伝子が複数ある場合は、その分リアクションが増加し、コストと煩雑さが激増する。さらに、測定サンプルを分注により小分けする必要があり、１リアクションあたりのサンプル量が減少してしまう。一般に、遺伝子発現で検討を行うサンプルは、微量であることがほとんどであり、小分けによる検出能の低下は、大きな問題である。
【発明の開示】
本発明の目的は、関心のある遺伝子などの核酸（標的核酸）が１０〜２０ないし１００種類程度存在する場合であっても、それらの標的核酸（ＤＮＡ，ｍＲＮＡなど）を同時に増幅し、一括で定量検定することが可能となる核酸分析方法の提供に関する。
本発明は、基本的には、次のように構成する。試料，試薬などの溶液を収容するためのスペース（反応層）を形成する少なくとも一面に、核酸を増幅により生成するための区画（核酸増幅用区画）と、生成された増幅核酸を乖離後にハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための区画（核酸検出用区画）とを、互いに独立した温度制御が可能になるよう形成する。そして、核酸増幅用区画では、核酸増幅のための温度サイクル制御を、核酸検出用区画では、特異的な捕捉に適した設定温度制御を行うことにより、単一の反応層にて核酸の増幅と検出を行う。
各区画は、温度センサーとヒーターのセットを個々に有し、それぞれ独立に制御することが可能である。
核酸増幅用区画は、核酸増幅用のプローブを備え、かつ少なくとも１以上形成される。例えば、標的核酸がｍＲＮＡである場合には、核酸増幅用区画の表面には、ｍＲＮＡの末端の特徴的配列であるポリＡ配列と相補的な、ポリＴ配列のプローブが固定されている。
核酸検出用区画は、複数形成され、各核酸検出用区画には、２種以上の関心のある標的核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉可能にするために２種以上の検出用プローブ（オリゴヌクレオチドプローブ）が種別ごとに各核酸検出用区画に固定される。
それぞれの核酸検出用区画では、核酸検出用プローブとそれに相補的に結合するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの熱安定性を保証するために、核酸検出プローブの種別ごとにハイブリダイゼーション温度が設定される。核酸検出には標識化プライマーを用いた増幅物を利用する。
さらに、核酸検出において、チップ上部の板に励起レーザーを入射し、その励起光の界面しみだし現象であるエバネッセント光を利用する装置も提案する。
以下、上記およびその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。なお、図面はもっぱら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本発明の第１の実施例に用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）におけるチップ（基板）の上面図。第２図は、第１実施例のチップに配設される温度制御可能な区画の一つを取り出して示す詳細構造図。第３図は、第２図の温度制御可能な区画を等価回路で示した図。第４図は、第２図に示す区画の温度制御系を示す基本回路図。第５図は、第２図の区画に設けられる温度検出用ダイオードの温度特性例を示す図。第６図は、本発明の温度制御を行うシステムの全体構成図。第７図は、本発明の第１の実施例に係る核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）の断面図。第８図は、本発明の第１の実施例に用いる核酸増幅・検出セルと検出システムの概略図。第９図は、本発明の第１の実施例における検出手順のフローを示す図。第１０図は、本発明の第１の実施例における検出手順の温度条件を示す図。第１１図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、初期状態を示している。第１２図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、増幅用のポリＴプローブに、ｍＲＮＡがハイブリダイズ状態を示している。第１３図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、逆転写反応（ＲＴ反応）によりｍＲＮＡの相補鎖伸張物が合成されている状態を示している。第１４図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図で、ｍＲＮＡの相補鎖伸張物の１本鎖の状態を示している。第１５図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、ｍＲＮＡの相補鎖伸張物の１本鎖に増幅用プライマーがハイブリダイズしている状態を示している。第１６図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、増幅用プライマーの伸張により、蛍光標識化した検出用増幅物が合成されている状態を示している。第１７図は、本発明の第１の実施例おける核酸増幅・検出方法を説明する図であり、蛍光標識化した検出用増幅物が、検出区画のプローブに特異的にハイブリダイズしている状態を示している。第１８図は、本発明の第２の実施例に用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）の模式図（断面図）。第１９図は、本発明の第２の実施例のセルに、エバネッセント光による励起を利用する例を示す模式図。第２０図は、本発明の第３の実施例に用いる核酸増幅・検出用チップの初期状態において、核酸増幅用区画には、標的核酸（目的遺伝子）に特異的なリバースプライマーが固定されている例を示す鳥瞰図。第２１図は、本発明の第３の実施例において、核酸増幅用プライマー（リバースプライマー）にｍＲＮＡがハイブリダイズし、相補鎖伸張合成が行われる例を示す鳥瞰図。第２２図は、本発明の第３の実施例において、リバースプライマーの伸張した部分に、蛍光標識付フォワードプライマーがハイブリダイズしている例を示す鳥瞰図。第２３図は、本発明の第３の実施例において、蛍光標識付フォワードプライマーが伸張されて、蛍光標識化した検出用増幅物となる例を示す図。第２４図は、本発明の第５実施例に係るに用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）にお���るチップ（基板）の上面図。
【発明を実施するための最良の形態】（第１の実施例）
本発明の第１の実施例として、遺伝子発現解析を実施した例を以下に示す。
図１は、本実施例に用いる核酸増幅・検出セル（例えば遺伝子発現解析用検出セル）におけるチップ（基板）の上面図である。
本実施例におけるチップ（基板）１１は、例えば試料，試薬などの溶液を収容するスペース（以下、「反応層」と称する）１２を有し、また、その溶液などの導入口１３−１及び排出口１３−２を有する。
チップ１１における反応層１２の一面には、複数の区画１４および１５−１〜１５−８が形成されている。それぞれの区画には、独立して作動する温度センサーとヒーターの組みが設けられている。温度センサーおよびヒーターの一例については、図２によって後述する。
複数の区画のうち、あるものは、核酸増幅用区画として機能し、あるものは核酸検出用として機能する。図１では、チップ１１において、区画１４が核酸増幅用区画であり、区画１５−１〜１５−８が核酸検出用区画である。本実施例では、核酸増幅用区画１４の両側或いは周囲に複数の核酸検出用区画１５−１〜１５−８を配設することによって、核酸検出用区画１５−１〜１５−８のすべてが、核酸増幅用区画１４に対して等しい距離で配置されている。なお、図１では、核酸増幅用区画１４は、一つ、核酸検出用区画１５は８つものを例示しているが、実際は、この数に限定されるものではなく、また、核酸検出用区画については、数十、数百のオーダとなる。
図２は、図１で示した区画のうち、１つの区画の構造を説明する図である。各区画は、全て同様の構造を有する。各区画は、半導体製造技術を用いて作製される。
温度を検出する温度センサーは、Ｐ型拡散層２１とＮ型拡散層２２の接合で形成されたダイオードであり、その抵抗値の温度依存性を用いてセンサーとして利用する。また、このダイオードは、Ｐ型拡散層２３を保護層として用い、ダイオード部分の電位を制御している。区画全体のチップ基板２４はＮ型基板を用いており、その電位はＮ型拡散層２５により決められる。
チップ２４の電位即ちＮ型拡散層２５の電位を、ダイオードのＰ型拡散層２１の電位と等しくすることによって、保護層２３とチップ基板２４とがＰＮ接合であっても、温度センサーから保護層２３外部にセンサー電流が流出することを防ぐことが可能となる。また、チップ基板２４側からみれば、チップ基板２４と保護層２３は、ＮＰ接合となるので、保護層の外部から温度センサーにノイズ電流が流入することを防止できる。
本実施例では、ヒーターはＮ拡散層２６で形成されている。Ｎ型拡散層２６は、Ｐ型拡散層の保護層２７で囲まれている。保護層２７の電位は、Ｐ型拡散層２８で決まる。
Ｎ型拡散層２６の一端を保護層２７と同電位（−）とし、他端を正極（＋）とすると、Ｎ型拡散層２６と保護層２７はＮＰ接合となるため、ヒーター電流が保護層へリークしない。そのため、Ｎ型拡散層２６は、電熱線の構造と等価となる。このヒーター２６に流れる電流を制御することにより、加熱を制御することができる。センサーと回路の接続は、正極側をＳ（＋）、負極側をＳ（−）と表す。また、ヒーターと回路の接続は、正極側をＲ（＋）、負極側をＲ（−）と表す。これらの構造を、等価回路で表すと、図３となる。温度センサーは、ダイオード３１であり、ヒーターは３２で表される。
区画の温度を制御する基本回路の概略およびチップ上の区画との接続を図４に示す。これは、１つの区画について、温度を検出し、加熱を制御する回路の１例である。
温度センサーのダイオード３１には、定電流回路が接続する。この回路は、抵抗４１が、ダイオードの抵抗値が無視できる程大きい場合、抵抗４１で決まるほぼ一定の電流が流れる定電流回路となる。ダイオード３１における電圧降下は、電圧計４２で測定し、その値は制御部４３に送られる。
制御部４３は、予め設定された電圧値（設定値Ｖｓ）と、電圧計４２における測定値（Ｖｘ）を比較し、Ｖｓ＜Ｖｘの場合はゲート４４をＯＮ、Ｖｓ＞Ｖｘの場合はゲート４４をＯＦＦとする制御を行う。ヒーター側回路は、ゲートＯＮ時に両端に電圧４５が印加され、ＯＦＦ時には電圧印加が切れる。この基本回路を用いる制御について、以下に説明する。
ダイオード３１両端の電圧降下とチップの区画温度との関係（１例）を、図５に示した。以下、この例を用いて説明する。図５に示すとおり、チップの温度（Ｔ［摂氏度］）と電圧降下（Ｖｘ［ｍＶ］）は、直線性を示し、その傾きは、本例では約−２ｍＶ／度である。そのため、以下の近似式（１）で示される。
Ｖｘ＝−２Ｔ＋５６０                …（１）
つまりチップの区画温度が１度上昇すると、電圧降下が約２ｍＶ減少する。予め、この関係式を測定しておくことにより、電圧降下からチップ温度を計算することが可能となる。なお、傾きの値は、測定条件等により異なる。また、本特許では説明しないが、ダイオードの抵抗値の温度依存性を、定電圧条件や、その他の条件を用いて関係式を求めることも可能であることは言うまでもない。
図５で示した通り、本例では、温度上昇は、電圧降下の低下で観測される。そこで、チップ内における任意の区画の温度を、以下の通りに制御することが可能である。
例えば、ある区画を、Ｔ＝摂氏５０度で制御する場合を説明する。区画の温度が、所望の温度条件である摂氏５０度より低い場合、センサーにおける電圧降下は、摂氏５０度における電圧降下量４６０ｍＶより大きい。設定値Ｖｓを、Ｖｓ＝４６０とすると、Ｖｘ＞Ｖｓの条件が成り立つため、ゲート４４がＯＮ制御となり、本回路はＶｘ＜Ｖｓとなるまでヒーター回路に電流が流れ、区画は加熱される。加熱により区画の温度が上昇し、Ｖｘ＜Ｖｓが達成されると、ゲートがＯＦＦとなり、加熱が停止するため、それ以上の温度上昇は発生しない。熱拡散により、区画の温度が下がり、再度Ｖｘ＞Ｖｓとなると、ゲートは再度ＯＮとなり、加熱が再開する。この制御により、区画の温度は摂氏５０度に維持される。
本実施例では、この基本回路をチップの全ての区画に、それぞれ１回路ずつ接続し、その各設定値を独立に制御することにより、各区画の温度を独立に制御することが可能となる。すなわち、単一のチップ（基板）１１に、核酸を増幅するための区画１４と、増幅された核酸をハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉するための区画１５−１〜１５−８とが、互いに独立して温度制御が可能なヒーターを伴って形成される。
図６は、本実施例のシステム全体を示す図である。６１および６２−１〜６２−８は、区画１４および区画１５−１〜１５−８に接続する基本回路の制御部を示している。コンピューター６３は、システム全体を制御し、予めプログラムされた温度制御を行い、インターフェース６４は、コンピューター６３と全部の制御部６１、６２−１〜６２−８を接続する。
コンピューター６３には、各区画の時刻ごとの設定温度或いは、それに対応する設定電圧値が、予めプログラムされている。コンピューター６３は、そのプログラムに則り、インターフェース６４を介し、各基本回路の制御部６１、６２−１〜６２−８へ、設定された温度或いはそれに対応する電圧値を、その時刻ごとの設定値Ｖｓとして入力する。この結果、各区画はプログラムされた温度シーケンスを忠実に実現することができる。以上が本発明のチップにおける、区画の構造、並びにその区画に接続する回路およびシステムの概要である。
つぎに、チップの構造について説明する。図１において、核酸増幅用区画１４には、その表面に、サンプル中の発現遺伝子（標的核酸例えばｍＲＮＡ）を捕捉するポリＴプローブが、配列末端５’側を区画表面側に向けて固定されている。ポリＴプローブは、配列番号１で示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであり、発現遺伝子が末端に有するポリＡ領域に、特異的にハイブリザイズする機能を有する。ここでは、配列長として２０ｍｅｒのものを採用した。しかし、ポリＴプローブとしては、長さとして８〜２００ｍｅｒの範囲のポリＴオリゴヌクレオチドを利用できる。８ｍｅｒより短い物では、ハイブリダイズ時の安定性に欠ける。また、２００ｍｅｒより長い物の場合、機能としては充分であるが、製造のコストがかかる短所がある。また、ポリＴオリゴの５’末端側に、Ｔ以外も並ぶ領域を任意に付加する場合もある。これは、固相表面からの距離を大きくする効果があり、ハイブリダイゼーションの効率が高まる。
0004426528.tif 000002
核酸検出用区画１５−１〜１５−８は、その表面に、目的の遺伝子に対応する増幅物に、特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブが固定されている。このプローブは、目的の遺伝子ごとに、最適な配列のものが選択される。本実施例では、ＧＡＰＤＨとＰ５３の２種類のｍＲＮＡについて、その発現量を測定することを試みた。ＧＡＰＤＨ及びＰ５３のｍＲＮＡを検出するプローブの配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号３である。
0004426528.tif 000003
これらの配列は、それぞれ、区画１５−１及び区画１５−５に固定されているとする。固定化の方法は、アミノシラン化処理を行ったチップ表面に対し、リンカーとして、１，４−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ  Ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅを用い、３’末端をアミノ修飾した上記オリゴプローブを固定する方法が、もっとも簡便である。ここで、特に、３’側をチップ表面に固定することが重要である。これにより、このプローブにおいて、ポリメラーゼによる伸張反応が発生しない。同様の目的には、５’末端側を固定側とする場合において、プローブの３’側末端塩基を、伸張反応が発生しないように化学処理することも有効である。
これらの核酸検出用区画に、目的とする遺伝子に対応した増幅物がハイブリダイズするため、その量を検出することにより、目的遺伝子の量が決定できる。その詳細は、後述する。
本発明で用いる核酸増幅・検出セルは、図７に示すように、既述した核酸増幅用区画１４及び核酸検出用区画１５−１〜１５−８を有するチップ１１と、そのチップ１１の面上に、チップ面と対向するように配置された透明なシート（上部板）７２とを有し、このチップ１１と上部板７２とにより挟まれる空間１２にサンプル（試料，試薬などの溶液）７２を保有する。ここでは、チップ１１と、上部板７２とを合わせたものを「セル」と称する。
図１では、上部板７２を外した状態でチップ１１を見ているものであり、図７は、図１において、区画１５−１と１５−５を通る断面図である。
チップ（基板）１１及び上部板７２との間の層状の空間が、サンプルを収容する反応層１２となり、基板１７をリソグラフィにより加工することにより形成される。なお、チップ１１と上部７２とをシートにより形成し、その間にスペーサを介在することで反応層１２を形成することも可能である。
上部板７２は、厚さは、０．０１ｍｍ〜１ｍｍが最適である。材質は、ガラス、各種のプラスチックなどが利用できるが、その内部に蛍光物質をなるべく含まないことが重要である。また、厚さ１ｍｍを越える材料を用いることも可能であるが、上部板が熱伝達物質として働いてしまうため、本発明の目的である、チップ内の温度独立性を保つことが、難しくなる。一方、０．０１ｍｍ以下では、強度に問題がある。サンプルの層７３は、０．０５ｍｍ〜１ｍｍが好適である。１ｍｍを越えると、チップ内のサンプル溶液において、熱による対流が発生するため、熱の独立性が劣化する。
核酸増幅用区画１４と核酸検出用区画１５−１〜１５−８との間及び核酸検出用区画間は、熱の独立性を保つための薄膜状の構造が重要である。これは、シリコン酸化膜を用いることが工業的に有効であるが、そのほか、プラスチックやポリイミドフィルムに代表される様な、他の有機材料フィルムを用いることも可能である。また、このチップは、平面的なため、上下方法への熱拡散効率が高い。そのため、検知温度が高い場合は、単にヒーターをｏｆｆ条件とすることにより、冷却機能を設けずに、所定の温度まで下げることが可能である。
チップ表面上の核酸検出用区１５−１〜１５−８で捕捉した蛍光標識付き核酸増幅産物の量は、蛍光量として検出される（蛍光標識付き増幅産物の生成については後述する）。図８にその検出系を、セルに付加した状態を示す。
本実施例では、蛍光検出系は、共焦点顕微鏡と同様な構成で行う。他の検出方法に関しては、後述の実施例で説明する。
蛍光検出系は、レンズ８１を用いるより、光検出器８２と、励起レーザー８３は、セル表面に対して共焦点関係８４にあり、レーザー８３で励起された反応層１２中の各検出用区画における蛍光標識（蛍光量）が光検出器８２により測定される。
検出器８２、レーザー８３、レンズ８１はユニットとして一体に組み立てられており、それ全体で水平方向（図中矢印で表示）に移動して、セル表面のスキャニングを行う。
次に、本実施例のチップを用いた核酸増幅の前処理、核酸増幅および検出の操作手順と、チップ上（セル内）で生成される生成物の変遷について、図９〜図１７を用いて説明する。
サンプルは、一例として体細胞より抽出した全ＲＮＡである。また、今回の標的核酸（ターゲット）は、ＧＡＰＤＨとＰ５３の２種類のｍＲＮＡである。
図９は、本実施例の操作手順をまとめたものである。図１０は、それぞれの手順における、核酸増幅用区画、核酸検出用区画１５−１の温度制御条件をまとめたものである。
図１１は、チップ１１の表面を模式的に説明する鳥瞰図である。図１１に示すように、チップ表面の初期状態では、核酸増幅用区画１４の表面にポリＴプローブ１１１（配列番号１）が、ＧＡＰＤＨ用核酸検出用区画１５−１にはＧＡＰＤＨ用プローブ１１２（配列番号２）が固定されている。
全ＲＮＡを含むサンプル溶液をチップ１１の反応層１２内に注入し、その後、図１０に示す温度条件（１）に設定する。この温度条件は、増幅用区画１４がハイブリダイズに適した３５℃、核酸増幅用区画１５−１〜１５−８は、それよりもはるかに高温の７５℃である。その結果、サンプル中のｍＲＮＡは、核酸増幅用区画１４のポリＴプローブ１１１とハイブリダイズして固定される。
図１２は、ｍＲＮＡが、核酸増幅用区画１４にポリＴプローブ１１１によって捕捉された様子を模式的に示す鳥瞰図である。ここでは、全てのｍＲＮＡが、種類を問わずに捕捉される。例えば、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ１２１、ｐ５３のｍＲＮＡ１２２及びそれ以外のｍＲＮＡ１２３が捕捉される。一方、核酸検出用区画１５−１は、高温条件のため、ハイブリダイズは生じない。
次に、不要物を洗浄し、逆転写用試薬（ＲＴ試薬）を導入して、図１０に示す温度条件（２）とすると、核酸増幅用区画において、逆転写が生じる。このときは、増幅用区画１４の温度は、逆転写に適した温度４２℃に設定される。核酸検出用区画１５−１は、引き続き７５℃の高温条件に維持される。
図１３は、逆転写により、ポリＴプローブ１１１が伸張された様子を示す図である。ここで、伸張したプローブは、ｍＲＮＡの存在量を忠実に再現していることが肝要である。つまり、ここでは、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡによる伸張物１３１と、Ｐ５３のｍＲＮＡによる伸張物１３２、及びそれ以外のｍＲＮＡによる伸張物１３３が存在する。
つぎに、図１０の温度条件（３）とし、チップ内を洗浄すると、ｍＲＮＡは全て排出され、核酸増幅用区画１４内には、図１４の通り、伸張したプローブ（逆転写産物）１３１〜１３３の１本鎖のみとなる。
以上の過程が標的核酸を増幅するためのリバースプローブを形成する前処理であり、この前処理では、既述のように核酸検出用区画に固定された標的核酸検出用のプローブが前処理中にハイブリダイゼーション動作を起こさない温度（例えば７５℃の高温条件）に制御される。
次に、反応層１２に核酸増幅試薬を導入し、温度条件を図１０の（４）の温度に設定する。このときの温度条件は、増幅用区画１４が６０℃、検出用区画１５−１が６５度である。
この温度条件の下では、図１５に示す動作がなされる。すなわち、核酸増幅試薬中には、５’末端に蛍光標識を有するＧＡＰＤＨ用のプライマー１５１とｐ５３のプライマー１５２とがあるため、これらのプライマーが伸張した増幅用プローブの１本鎖の所定の配列にハイブリダイズすることができる。ここでは、ＧＡＰＤＨ用のプライマー１５１は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡによる伸張物１３１にハイブリダイズし、Ｐ５３用のプライマー１５２は、Ｐ５３のｍＲＮＡによる伸張物１３２にハイブリダイズする。
ここで、温度条件（５）として、増幅区画１４ではサーマルサイクルとすると、増幅区画において、ＧＡＰＤＨとＰ５３のそれぞれの伸張物から、リニア増幅により蛍光標識付き増幅物１６１、１６２が生成される。
図１６は、それぞれの蛍光標識付き増幅物１６１、１６２が合成された様子を示している。一方、核酸検出用区画１５−１及び１５−５は、それぞれのプローブがハイブリダイズするために最適な温度条件に設定されている。そのため、リニア増幅された増幅物が各プローブに特異的にハイブリダイズする（図１７）。この量を、増幅と並行して、リアルタイムで検出すると、増幅サイクルＮ回に対し、本来のｍＲＮＡ量の２Ｎ倍の信号が検出できる。
本実施例では、説明を簡単にするため、２種類のｍＲＮＡの検出について説明したが、本発明ではそれ以上の複数種類のｍＲＮＡを、核酸検出用区画の数だけ同時に測定することが可能である。
以上より、本実施例によれば、１つのチップ内において、増幅と検出を並行して行うことが可能であり、１サンプル中の複数種類のｍＲＮＡ発現量を、同時に、迅速で簡便に測定することが可能である。
（第２の実施例）
第２の実施例として、第１の実施例の検出性能をさらに向上させた核酸増幅・検出用セルについて、図１８及び図１９を用いて説明する。
図１８は、チップ１１とこれと対向する上部板１８２との間に反応層（サンプル層）７３を介在させた模式図（断面図）である。チップ１１には、第１の実施例と同様に核酸増幅用区画と核酸検出用区画とを配設しているが、ここでは、図の便宜上、核酸検出用区画の一つである１５−１のみを誇張して表示している。
本実施例では、核酸検出用のプローブ１８１（第１実施例のプローブ１１２に相当するもの）は、核酸検出用区画のヒーター表面ではなく、それと向かい面、すなわち上部板部分（透明シート）１８２に固定されている。上部板１８２は、第１実施例の上部板７２に相当するものである。換言すれば、核酸検出用区画で標的核酸を捕捉する検出用プローブ１８１は、温度制御可能な区画１５１−１…１５１−ｎなどのヒーター面と対向する面に固定されている。
すなわち、本実施例における核酸検出用区画は、基板１１とシート１８２間の対向する面に機能を分けて形成され、基板１１側の対向面には核酸検出用区画の温度サイクル制御を区画ごとに行うヒーター機能が設けられ、シート１８２側の対向面には、核酸検出用プローブ１８１が固定されて核酸検出機能が与えられている。
本実施例のセルにおいて、反応層７３の厚さが１．０ｍｍ以下の条件では、区画（１５１−１…１５１−ｎ）の温度とそれに対向する上部板１８２表面の温度は、ほぼ等しい。
そのため、本実施例の構造においても、プローブ固定領域の温度を、それぞれのハイブリダイゼーション条件に制御することが可能である。そのため、プローブ１８１にハイブリダイズした測定対象物は、上部板表面に固定される。
核酸増幅と並行に検出用プローブ１８１に増幅産物（増幅用プローブから乖離した蛍光標識付き増幅産物）が捕捉されている過程において、図１９に示すように、上部板１８２には、上部板１８２の側方に配置したレーザー光源１９１から横方向に励起レーザー１９２が入射される。図１９は、上部板１８２へ励起レーザー１９２を入射させた場合を模式的に表している。
この励起レーザーは、上部板１８２内を全反射しながら進行し、上部板１８２の外部には射出されない角度に制御してある。すると、上部板１８２の近傍にだけ、エバネッセント光として、励起レーザー１９２の漏れだしが発生する。その結果、上部板表面に存在する蛍光標識付き増幅産物１９３だけが励起され、サンプル層中程に浮遊する蛍光標識付き増幅産物１９４は、励起されない。したがって、本実施例によれば、第１の実施例の効果に加えて、反応溶液中に存在するプライマーは蛍光発光に寄与しないため、蛍光検出のバックグラウンドが著しく減少し、測定Ｓ／Ｎが向上する。
（第３の実施例）
次に本発明の第３実施例について、図２０〜図２３を用いて説明する。本実施例と第１実施例との相違点は、核酸増幅用区画１４に固定されるオリゴヌクレオチドプローブの配列構造である。核酸検出用区画については変わらない。
本実施例では、核酸増幅用区画に固定するプローブとして、第１実施例のような前処理を施すことなく、目的のｍＲＮＡを相補的かつ特異的にとらえるリバースプライマーを用いる例を示す。先と実施例と同様に、標的核酸としては、ＧＡＰＤＨとＰ５３の２種類のｍＲＮＡを例として説明する。これらの２種類のｍＲＮＡに、それぞれ特異的なプライマーとして、配列４〜配列７を用意する。
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ここで、配列４と配列５は、ＧＡＰＤＨに対するフォワード及びリバースであり、配列６と配列７は、Ｐ５３に対するフォワード及びリバースである。リバースプライマーは、核酸増幅用区画の表面に符号２０１，２０２に示すように固定されている。一方、フォワードプライマーは、５’末端部に蛍光標識を有する。これらを用いて、核酸増幅を行う。核酸増幅用区画における反応を、以下に説明する。
図２０は、チップ内部の鳥瞰図である。チップ１１の反応層にサンプルとして、全ＲＮＡを注入すると、そのうち、固定されているリバースプライマー２０１及びプライマー２０２に特異的な物、即ちＧＡＰＤＨ及びＰ５３のみ、対応するリバースプライマーにハイブリダイズする（図２１）。伸張反応により、リバースプライマー２１１、２１２は伸張し、ｍＲＮＡと相補的な配列となる。この核酸増幅におけるサーマルサイクルにより、乖離したｍＲＮＡは別のリバースプライマーに再びハイブリダイズする。一方、フリーのフォワードプライマーは、伸張したリバースプライマーと相補的に結合し（ハイブリダイズ）し、伸張する（図２２）。
以上を繰り返すと、固定している伸張リバースプライマーと、伸張したフリーなフォワードプライマー（蛍光標識付き）が、初期のｍＲＮＡ量の２のＮ乗倍で生成される（図２３）。伸張したフリーなフォワードプライマーは、核酸検出用区画のプライマーと相補的配列であるため、第１及び第２の実施例と同様に、検出区画において検出される。本方法は、増幅率が著しく大きいため、微量のターゲットも検出することが可能である。
なお、本実施例は、２種類のプライマーセットの温度サイクルを、それぞれ最適な条件とする必要がある。そのため、アニーリング温度を配列ごとに、個別に設定する方が精度が良い。その場合、核酸増幅用区画を複数個準備すれば、チップ内で複数種類の温度サイクルを同時に実現することが可能である。即ち、ＧＡＰＤＨに対する核酸増幅用区画と、Ｐ５３に対する核酸増幅用区画を、それぞれ別々に設ける。本実施例では、それぞれのリバースプライマーが、区画表面に固定されているため、それぞれの増幅反応は、対応する区画内でのみ発生させることが可能である。
（第４の実施例）
以上の各実施例では、核酸の増幅と検出を同時に行っていた。そのため、第１の実施例のように、サンプル中にフリーのプライマーが存在するため、バックグラウンドが高くなる場合がある。この場合、増幅と同時の検出は、信号量の概算評価とし、精密の評価に際しては、フリー成分を洗浄する行程を行うことが、精度向上に有効である。
（第５実施例）
図２４は、核酸増幅用区画として、２４１−１及び２４１−２の２個が１反応層内に設けられている実施例である。その他の構成は、第１実施例〜第４実施例のいずれかの構成が採用される。２４２−１〜２４２−ｎは核酸検出用区画である。
核酸増幅の温度サイクルは、仕様する核酸増幅用のプライマーの配列により、最適条件が異なる。第一の実施例では、図１０に示したとおり、温度サイクルとして（９５℃：５秒→５５℃：１５秒→７２℃：１５秒）を利用した。しかし、プライマーのＧＣ率が大きい場合は、偽ハイブリダイズによる偽物合成があるため、プライマーのハイブリ温度を５５℃よりも、５度高い６０℃とすることが有効な場合もある。また、生成物の塩基長が長い場合は、伸張合成時間である１５秒を、さらに長くする必要もある。本発明の目的である核酸解析の精度向上のためには、これらの温度サイクルを、ターゲットとする核酸ごとに最適化することが有効である。その実現には、反応層内に核酸増幅用区画を複数設け、異なる温度サイクルで制御する必要があり、図２４の構成が有効である。
上記各実施例によれば、単一サンプル内の複数種類のターゲットに対し、その増幅と個々の検出を同時に行うことにより、簡便・安価で、高精度の遺伝子発現解析方法を提供することができる。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、例えば、関心のある核酸（例えば遺伝子）が１０〜２０ないし１００種類程度存在する場合に、それらの遺伝子を同時に増幅し、一括で定量検定できる。また、単一反応層内で行うため、サンプルの小分けによる微量化の問題が生じず、従来より高感度の検出が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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