(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
扁平上皮癌抗原２（ＳＣＣＡ２）遺伝子のエキソン８に扁平上皮癌抗原１（ＳＣＣＡ１）遺伝子のエキソン２〜７が、ＳＣＣＡ１遺伝子のエキソン２〜７にＳＣＣＡ２遺伝子のエキソン８がエキソン番号順に続く順番で融合した融合遺伝子、またはＳＣＣＡ１遺伝子のエキソン８にＳＣＣＡ２遺伝子のエキソン２〜７が、ＳＣＣＡ２遺伝子のエキソン２〜７にＳＣＣＡ１遺伝子のエキソン８がエキソン番号順に続く順番で融合した融合遺伝子の転写物である、８０％より高い相同性を有する二つの異なる遺伝子間で相同交差してなる遺伝子の融合転写物であって、該融合転写物がin vivoで扁平上皮癌に発現するものであることを特徴とする融合転写物。
【請求項２】
頚部、肺、咽頭の扁平上皮癌で発現するものであることを特徴とする請求項１記載の融合転写物。
【請求項３】
下記のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの転写物である請求項１記載の融合転写物。
MNSLSEANTK FMFDLFQQFR KSKENNIFYS PISITSALGM VLLGAKDNTA QQIKKVLHFD QVTENTTGKA
ATYHVDRSGN VHHQFQKLLTE FNKSTDAYE LKIANKLFGE KTYLFLQEYL DAIKKFYQTS VESVDFANAP
EESRKKINSW VESQTNEKIK NLIPEGNIGS NTTLVLVNAI YFKGQWEKKF NKEDTKEEKF WPNKNTYKSI
QMMRQYTSFH FASLEDVQAK VLEIPYKGKD LSMIVLLPNE IDGLQKLEEK LTAEKLMEWT SLQNMRETCV
DLHLPRFKME ESYDLKDTLR TMGMVNIFNG DADLSGMTWS HGLSVSKVLH KAFVEVTEEG VEAAAATAVV
VVELSSPSTN EEFCCNHPFL FFIRQNKTNS ILFYGRFSSP
【請求項４】
下記のヌクレオチド配列からなるＤＮＡの転写物である請求項１記載の融合転写物。
ATGAATTCAC TCAGTGAAGC CAACACCAAG TTCATGTTCG ACCTGTTCCA ACAGTTCAGA AAATCAAAAG
AGAACAACAT CTTCTATTCC CCTATCAGCA TCACATCAGC ATTAGGGATG GTCCTCTTAG GAGCCAAAGA
CAACACTGCA CAACAGATTA AGAAGGTTCT TCACTTTGAT CAAGTCACAG AGAACACCAC AGGAAAAGCT
GCAACATATC ATGTTGATAG GTCAGGAAAT GTTCATCACC AGTTTCAAAA GCTTCTGACT GAATTCAACA
AATCCACTGA TGCATATGAG CTGAAGATCG CCAACAAGCT CTTCGGAGAA AAAACGTATC TATTTTTACA
GGAATATTTA GATGCCATCA AGAAATTTTA CCAGACCAGT GTGGAATCTG TTGATTTTGC AAATGCTCCA
GAAGAAAGTC GAAAGAAGAT TAACTCCTGG GTGGAAAGTC AAACGAATGA AAAAATTAAA AACCTAATTC
CTGAAGGTAA TATTGGCAGC AATACCACAT TGGTTCTTGT GAACGCAATC TATTTCAAAG GGCAGTGGGA
GAAGAAATTT AATAAAGAAG ATACTAAAGA GGAAAAATTT TGGCCAAACA AGAATACATA CAAGTCCATA
CAGATGATGA GGCAATACAC ATCTTTTCAT TTTGCCTCGC TGGAGGATGT ACAGGCCAAG GTCCTGGAAA
TACCATACAA AGGCAAAGAT CTAAGCATGA TTGTGTTGCT GCCAAATGAA ATCGATGGTC TCCAGAAGCT
TGAAGAGAAA CTCACTGCTG AGAAATTGAT GGAATGGACA AGTTTGCAGA ATATGAGAGA GACATGTGTC
GATTTACACT TACCTCGGTT CAAAATGGAA GAGAGCTATG ACCTCAAGGA CACGTTGAGA ACCATGGGAA
TGGTGAATAT CTTCAATGGG GATGCAGACC TCTCAGGCAT GACCTGGAGC CACGGTCTCT CAGTATCTAA
AGTCCTACAC AAGGCCTTTG TGGAGGTCAC TGAGGAGGGA GTGGAAGCTG CAGCTGCCAC CGCTGTAGTA
GTAGTCGAAT TATCATCTCC TTCAACTAAT GAAGAGTTCT GTTGTAATCA CCCTTTCCTA TTCTTCATAA
GGCAAAATAA GACCAACAGC ATCCTCTTCT ATGGCAGATT CTCATCCCCA TAG
【請求項５】
請求項４記載のヌクレオチド配列を含み、かつ寄託番号ＥＣＡＣＣ０１０３１３１５でＥＣＡＣＣに寄託されたプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質の生産のための融合タンパク質転写物、扁平上皮癌に見出された融合遺伝子、転位の検出、およびＳＣＣＡ１、ＳＣＣＡ１／Ａ２、ＳＣＣＡ２／Ａ１及びＳＣＣＡ２に特異的なモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
扁平上皮癌抗原(SCCA)は子宮の頚部、肺、頭および首、外陰および食道の扁平上皮癌(SCC)のための血清学的マーカーである(1、2)。これは、もともとヒトの頚部の扁平上皮癌からのTA-4複合体から、42-48 kDaの分子量で精製された(1、3)。この抗原は10個より多いタンパク質からなり、該抗原の等電点電気泳動により、2つのサブフラクション、酸性(pI<6.25)および中性(pI∃6.25)アイソホーム(4)が明らかにされる。分子量の差は恐らく修飾による(5)。
【０００３】
ＳＣＣＡのｃＤＮＡのクローニングにより、これがセリンプロテアーゼインヒビター（セルピンズ）のファミリーに属することが示される（６）。染色体１８ｑ２１．３上のゲノム領域のさらなるクローニングにより、２つのタンデムに配列された遺伝子が明らかになった(7)。よりテロメリック(telomeric)なオリジナルのＳＣＣＡをＳＣＣＡ１と呼び、よりセントロメリック（centromeric）なものをＳＣＣＡ２と呼ぶ（図１Ａ−Ｃ）。それらはいずれも８つのエキソンを含み、推定上のイントロン−エキソン境界、スプライス部位、開始コドンおよびターミナルのコドンが同一である。これらは、ヌクレオチドレベルで９８％（図２）、アミノ酸レベルで９２％（図３）の同一性を有する。推定されたｐＩ値は、ＳＣＣＡ１が中性アイソホームをコードし、ＳＣＣＡ２が酸性アイソホームをコードすることを示す。さもなければ、両方の遺伝子からスプライスされた変異ｍＲＮＡが、５０及び２１アミノ酸短いタンパク質を生じることが見出されている（５）。
【０００４】
ヒトでは、セルピンズが１個または２個の染色体のクラスタにマッピングされる。ＰＩ６、ＰＩ９およびＥＬＮＡＨ２は６ｐ２５にマッピングされ、ＰＩ８、ボマピン（Bomapin）、ＰＡＩ２、ＳＣＣＡ１、ＳＣＣＡ２、ヘッドピン（Headpin）およびマスピン（Maspin）は、１８ｑ２１．３にマッピングされる（図１Ｂ）（７−１２）。これらのクラスタは、２つの独立した染色体間の複製および何回かの染色体間重複によって発生したと考えられる（９）。染色体領域１８ｑは、高頻度の転位領域としてしばしば報告されてきた（９、１３−１６）。セルピンズの標的および機能は完全には理解されていない。大部分については、主要な機能は、凝固、繊維素溶解、アポトーシスおよび炎症に関連したタンパク質分解の調節であるが、ホルモン輸送および血圧調節のような別の機能も報告されている（１７−２４）。
【０００５】
ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２はほとんど同一であるが、反応部位ループが異なる（図２及び３）。ＳＣＣＡ１はパパイン様のシステイン・プロテイナーゼ・カテプシンＳ、ＫおよびＬを阻害し（２５、２６）、ＳＣＣＡ２はキモトリプシン様のセリンプロテイナーゼ・カテプシンＧ及び肥満細胞キマーゼ（２７）を阻害する。ＳＣＣＡ１の反応部位ループ（ＲＳＬ）に関する研究により、ＲＳＬがシステインプロテイナーゼ阻害（２８）に不可欠であることが示された。ＲＳＬの可変部分は、ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２のＲＳＬ交換突然変異体および単一の突然変異体（２８、２９）によって示される標的プロテイナーゼの特異性を必要とする。セリンおよびシステインプロテイナーゼの両方を阻害するために、セルピンズが共通のＲＳＬ依存のメカニズムを利用することが考えられる。
【０００６】
ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ２の生物学の役割は完全には理解されていない。それらは抑制セルピンズであると考えられる。データは、ＳＣＣＡ１がアポトーシスに関係し、発現がアポトーシスの阻害によって癌細胞をいくつかの殺すメカニズムに対して耐性にするということを提案する（３０）。癌細胞におけるＳＣＣＡ２発現の役割はまだ不明瞭である。正常な組織では、ＳＣＣＡ抗原は表皮の成熟中にある種の特定の役割を持っているかもしれない（５）。
【０００７】
識別可能なモノクローナル抗体およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した最近の研究により、ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ２のいずれも、舌、扁桃腺、食道、子宮の頚部および膣、胸腺のハッサルの(Hassall's)小体、皮膚のある領域の重層扁平上皮の基底上層で、また誘導気道（３１）の階層化された円柱上皮中で発現することが示された。肺および頭、および首の扁平上皮癌では、ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２は中程度に共発現され、よく区別される腫瘍である。非差別的な抗体を使用する従来の研究とは対照的に、これらのデータは、正常組織及び悪性組織でＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の間に異なる発現がなかったことを示す。以前の結果は、腫瘍の周辺の部分ではＳＣＣＡ２のみが検出されることを示した（３２）。この不一致は、免疫組織化学の技術と抗体特異性の差によるかもしれない（３１）。分析操作の間に唾液または汗による汚染によって誤って肯定的な結果が出ることが多いであろうという報告がなされた(1)。カタルテペ（Cataltepe）らは、唾液中のＳＣＣＡが上部の消化管の粘膜の表面に並ぶ扁平上皮細胞に由来することを提案する（３１）。
【０００８】
通常は、ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２は、循環でではなく（３３）扁平上皮細胞の細胞質で（３１）検出される。  ＳＣＣの患者の血清に現われる抗原は、腫瘍細胞によるＳＣＣＡの過剰生産およびそれらの正常なターンオーバーの機能であるかもしれない（３４）。抗体ラジオイムノアッセーあるいはＲＴ−ＰＣＲを使用することにより血清に検出されるＳＣＣＡは、主としてＳＣＣＡ２であることが報告されている（１、３５、３６）。しかし、ＰＣＲを使用する他の研究は、患者の試料中で両方の抗原が増幅され、検出され得ることを示す（３７）。
ＳＣＣの患者の血清中の濃度は、臨床的段階および腫瘍の組織学的差異の程度に関連づけられる（１）。子宮頸癌については、いくつかの研究が、前処理値と臨床の結果の間の相関性を示している（１、３８−４３）。研究により、高いＳＣＣＡレベルと腫瘍の体積のさらに高い相関性が示される。臨床的に証明されるより数か月前に再発あるいは進行性の疾病を検出することができるかもしれない（３９）。同様の結果は、肺、外陰、頭および首、および食道（１、２、４４および４５）の扁平上皮癌にも見られる。これらのすべての研究において、総ＳＣＣＡレベルが測定された。近年、ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ２を識別可能な抗体を使用して新しいｓＥＬＩＳＡが開発された（３３）。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は融合タンパク質を提供するための異なる遺伝子の融合タンパク質転写物、ｍＲＮＡに関し、特にＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の部分からなる融合遺伝子の検出を提供する。そのような融合遺伝子は、今回、異なる起源（頚部、肺および咽頭）のＳＣＣ細胞系で見出された。本発明は、さらに、融合タンパク質の測定／検出のための特異的な免疫学的試薬の確立のための方法を提供する。
【００１０】
融合タンパク質の一つは、下記のＤＮＡ配列：
ATGAATTCAC TCAGTGAAGC CAACACCAAG TTCATGTTCG ACCTGTTCCA ACAGTTCAGA AAATCAAAAG
AGAACAACAT CTTCTATTCC CCTATCAGCA TCACATCAGC  ATTAGGGATG GTCCTCTTAG GAGCCAAAGA
CAACACTGCA CAACAGATTA AGAAGGTTCT TCACTTTGAT CAAGTCACAG AGAACACCAC AGGAAAAGCT
GCAACATATC ATGTTGATAG GTCAGGAAAT GTTCATCACC AGTTTCAAAA GCTTCTGACT GAATTCAACA
AATCCACTGA TGCATATGAG CTGAAGATCG CCAACAAGCT CTTCGGAGAA AAAACGTATC TATTTTTACA
GGAATATTTA GATGCCATCA AGAAATTTTA CCAGACCAGT GTGGAATCTG TTGATTTTGC AAATGCTCCA
GAAGAAAGTC GAAAGAAGAT TAACTCCTGG GTGGAAAGTC AAACGAATGA AAAAATTAAA AACCTAATTC
CTGAAGGTAA TATTGGCAGC AATACCACAT TGGTTCTTGT GAACGCAATC TATTTCAAAG GGCAGTGGGA
GAAGAAATTT AATAAAGAAG ATACTAAAGA GGAAAAATTT TGGCCAAACA AGAATACATA CAAGTCCATA
CAGATGATGA GGCAATACAC ATCTTTTCAT TTTGCCTCGC TGGAGGATGT ACAGGCCAAG GTCCTGGAAA
TACCATACAA AGGCAAAGAT CTAAGCATGA TTGTGTTGCT GCCAAATGAA ATCGATGGTC TCCAGAAGCT
TGAAGAGAAA CTCACTGCTG AGAAATTGAT GGAATGGACA AGTTTGCAGA ATATGAGAGA GACATGTGTC
GATTTACACT TACCTCGGTT CAAAATGGAA GAGAGCTATG ACCTCAAGGA CACGTTGAGA ACCATGGGAA
TGGTGAATAT CTTCAATGGG GATGCAGACC TCTCAGGCAT GACCTGGAGC CACGGTCTCT CAGTATCTAA
AGTCCTACAC AAGGCCTTTG TGGAGGTCAC TGAGGAGGGA GTGGAAGCTG CAGCTGCCAC CGCTGTAGTA
GTAGTCGAAT TATCATCTCC TTCAACTAAT GAAGAGTTCT GTTGTAATCA CCCTTTCCTA TTCTTCATAA
GGCAAAATAA GACCAACAGC ATCCTCTTCT ATGGCAGATT CTCATCCCCA TAG
に基づく、下記のアミノ酸配列：
MNSLSEANTK FMFDLFWQQFR KSKENNIFYS PISITSALGM VLLGAKDNTA QQIKKVLHFD QVTENTTGKA
ATYHVDRSGN VHHQFQKLLTE FNKSTDAYE LKIANKLFGE KTYLFLQEYL DAIKKFYQTS VESVDFANAP
EESRKKINSW VESQTNEKIK NLIPEGNIGS NTTLVLVNAI YFKGQWEKKF NKEDTKEEKF WPNKNTYKSI
QMMRQYTSFH FASLEDVQAK VLEIPYKGKD LSMIVLLPNE IDGLQKLEEK LTAEKLMEWT SLQNMRETCV
DLHLPRFKME ESYDLKDTLR TMGMVNIFNG DADLSGMTWS HGLSVSKVLH KAFVEVTEEG VEAAAATAVV
VVELSSPSTN EEFCCNHPFL FFIRQNKTNS ILFYGRFSSP
により定められる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
一つの融合遺伝子（図４）はＳＣＣ細胞系からのｃＤＮＡのシーケンシングにより見出された。
細胞系            起源       ＳＣＣＡ１   ＳＣＣＡ２  
ＣａＳｋｉ         頚部         正常  Ａ１／Ａ２  
Ｃ４Ｉ             頚部         正常  正常
Ａ５４９           肺           Ｎ．Ａ． Ａ１／Ａ２
ＣａＬｕ３         肺           正常  正常
ＳｋＭＥＳ         肺           正常  正常
ＲＰＭＩ２６５０   咽頭         Ｎ．Ａ． Ａ１／Ａ２
【００１２】
ＳＣＣＡ１からＳＣＣＡ２の配列の移行によると、ＤＮＡ破壊点はイントロン７（図２）にあるであろう。従って、該遺伝子は、ＳＣＣＡ１のプロモーター領域により制御されるが、ＳＣＣＡ２特異性を備えたタンパク質を生産しているであろう。
【００１３】
さらに調べることにより、ＳＣＣＡ１／Ａ２あるいはＳＣＣＡ２／Ａ１を見出し、融合タンパク質転写物が異なる部位で生じること、すなわち、これらの抗原の異なる遺伝子が１つの遺伝子のプロモーター領域および別の遺伝子の反応部位ループを有するクロスオーバー転写物を提供することが示された。
【００１４】
これにより、ある領域、クロスオーバー反応領域において、少なくとも８０％相同のヌクレオチドを有する二つの異なる遺伝子の融合タンパク質転写物に関する基礎的な発明が導かれる。
【００１５】
この融合遺伝子は、クローニングされ、プラスミド構築物として保持され、異なる大腸菌株に形質転換されている。
【００１６】
この融合遺伝子を含むプラスミド、ｐＧＥＸ６Ｐ−３  ＳＣＣＡ１／Ａ２は、寄託番号ＥＣＡＣＣ  ０１０３１３１５として２００１年３月１４日に欧州細胞カルチャーコレクション(European Collection of Cell Culture)に寄託された。
【００１７】
融合タンパク質が生産され、複合結合の研究は、カテプシンＬではなくカテプシンＧに融合遺伝子が結合する基質を示す（図７）。
【００１８】
該融合遺伝子は腫瘍ＤＮＡのサザンブロット分析により検出することができる（図６）。該融合遺伝子は、ＰＣＲ分析、ならびにｃＤＮＡクローニングおよびシーケンシングにより検出することもできる。
【００１９】
実施例１  ＳＣＣＡのクローニング。
【００２０】
１．１  ＰＣＲ増幅
細胞系Ｃａｓｋｉ（頚部）、Ｃ４−Ｉ（頚部）、Ａ５４９（肺）、ＣａＬｕ３（肺）、ＳｋＭｅｓ（肺）およびＲＰＭＩ２６５０（咽頭）からのｍＲＮＡを、クイックプレップマイクロ（QuickPrep Micro）ｍＲＮＡ精製キット（ファーマシア（Pharmacia））を使用して調製し、ｃＤＮＡをファースト−ストランド（First-Strand）ｃＤＮＡ合成キット（ファーマシア）を使用して調製した。ＳＣＣＡのコード配列をカバーする１２１８ｂｐのＤＮＡ断片を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．８５、２５ｍＭのＫＣＩ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  のＭｇＳＯ４（ボエリンガー（Boehringer)）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（ファーマシア）、１０μＭのＳＣＣＡ１−７Ｆ（すべてのプライマーのＤＮＡ配列は表１中に示す）、１０μＭのＳＣＣＡ  ３９１−３９７Ｂ、２μlのｃＤＮＡ及び２．５ＵのＰｗｏ−ポリメラーゼ（Pwo-polymerase)（ボエリンガー）を含む１００μｌの反応中でのＰＣＲによって増幅した。試料を９６℃で５分間変性させた後に、９６℃で１５秒の変性、６０℃で１５秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸張からなるサイクルを合計３０サイクル行い、最終的な伸張を７２℃で１０分間行い、ＰＣＲ反応を完了した。
【００２１】
表１  ＰＣＲプライマー
プライマーの名前                      配列
１．ＳＣＣＡ  １−７Ｆ              5'-CGGGATCCATGAATTCACTCAGTGAAGCC-3'
２．ＳＣＣＡ  ３９１−３９７Ｂ     5‘-GAGCTCGAGTCTCATCAGTGACAGACTAATTGCATCTA-3'
３．ＳＣＣＡ  ２６６−２７３Ｆ     5'-TGGAATGGACAAGTTTGCAG-3'
４．ＳＣＣＡ１  ３２３−３２９Ｂ    5'-GTAGGACTCCAGATAGCAC-3'
５．ＳＣＣＡ２  ３１９−３２４Ｆ    5'-TGGAGCCACGGTCTCTCAG-3'
６．ＳＣＣＡ２  ３５７−３６３Ｂ    5'-ATTAGTTGAAGGAGATGATAATTC-3'
７．ＳＣＣＡ１  ｅｘ７              5'-AATACATACAAGTCCA-3'
８．ＳＣＣＡ２  ｅｘ８              5'-GGACTTTAGATACTGA-3'
【００２２】
１．２．  ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の検出
ＰＣＲ生成物中のＳＣＣＡ１の存在は、各々２４５および９７３ｂｐの二つの断片を生じる制限酵素ＳａｃＩＩによる開裂により、または、標準のＰＣＲ反応（７５ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ  ８．８、２０ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％のトゥイーン(Tween)２０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０μＭの各プライマー、鋳型、０．０２５Ｕ／μｌの反応Ｔａｑポリメラーゼ；試料を９６℃で５分間変性させた後に、９６℃で１５秒の変性、最適アニーリング温度で１５秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸張からなるサイクルを合計３０サイクル行い、最終的な伸張を７２℃で１０分間行い、ＰＣＲ反応を完了した。）でプライマーＳＣＣＡ１−７ＦおよびＳＣＣＡ１  ３２３−３２９Ｂを使用するＳＣＣＡ１特異的ＰＣＲにより検出され、Ｔａ＝５０℃、９９７ｂｐの断片を得た。ＳＣＣＡ２の存在は、ＳＣＣＡ  １−７ＦおよびＳＣＣＡ２に特異的なプライマー（ＳＣＣＡ２  ３５７−３６３Ｂ）を使用して、標準のＰＣＲによって検出された、Ｔａ＝６０℃で、１０９０ｂｐの断片が得られた。
【００２３】
１．３．  クローニング
ＰＣＲ生成物はＰＣＲスクリプト（Script）Ａｍｐクローニングキット（ストラタジーン（Stratagene））を使用してクローニングした。コロニースクリーニングは、上記の１．２に記載したＰＣＲによって行われた。ウィザードプラスミニプレップス（Wizard Plus Minipreps）ＤＮＡ精製システム（プロメガ（Promega））を使用して、選択されたＳＣＣＡ１あるいはＳＣＣＡ２を含むクローンからプラスミドＤＮＡを調製した。
【００２４】
１．４．  ＤＮＡシーケンシング
クローンはＡＢＩプリズムビッグダイターミネイターサイクルシーケンシング（ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing）（ＰＥバイオシステムズ（PE Biosystems））を使用してシーケンシングした。試料はＡＢＩプリズム（ABI Prism）３１０上でランオンした。
【００２５】
１．５．  再クローニング
選択されたクローンを、発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−３（ファーマシア）に再クローニングした。断片はＢａｍＨＩとＸｈｏＩを使用してＰＣＲスクリプトアンプ・ベクターから切り出し、１ｘＯＰＡ、１ｍＭのＡＴＰ、５０ｎｇの開裂ベクター、１：５−１：８の挿入比のモルオブエンドベクターに対応するＳＣＣＡ挿入物及び７．５−１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全てファーマシア製）を含有する１０μｌの反応物中で発現ベクターにリゲート(ligate)した。反応管を、１０℃で一晩インキュベート(incubate)し、６５℃で１０分間不活性化し、この反応物２−４μｌで大腸菌ＪＭ１０９（４６）を形質転換した。その後、選択されたクローンからのプラスミドＤＮＡで、タンパク質発現用の大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。
【００２６】
１．  ６．  クローン化された遺伝子の維持
１０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０緩衝液中のプラスミドＤＮＡ（ＳＣＣＡ１／Ａ２融合遺伝子を含むｐＧＥＸ−６Ｐ−３）を、−８０℃で保存する。タンパク質発現の再開のために、プラスミドＤＮＡでサムブルック（Sambrook）ら（参考文献４５のｐ  １．８２−１．８４）によるコンピテントな大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。より多くのプラスミドＤＮＡの調製のためには、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換が好ましい。
【００２７】
実施例２  タンパク質の発現および精製
【００２８】
２．１タンパク質の発現
発現条件は小規模調製により決定した。大規模発現のためには、５００ｍｌの２ｘＹＴおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの培地中に、一晩培養した培養液５ｍｌを接種し、３７℃で増殖させた。タンパク質発現はＯＤ６００＝０．５−１．３で、最終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えることにより誘導した。
【００２９】
ＳＣＣ１を生産する培養物は、４−１６時間培養した。ＳＣＣＡ１／Ａ２については１６−１８時間培養した。ＳＣＣＡ２タンパク質を生産する培養物は、ＯＤ６００＝１．２−１．４で誘導され、２−３時間培養した。
【００３０】
２．２．  タンパク質の精製
細胞を２０００ｇで１０分間遠心分離することによって収穫し、５０ｍｌのＴＥ  ｐＨ  ８．０で洗浄し、３ｍｌＴＥ／ｇ細菌ペレットに溶解した。リゾチームを、８００μｇ／ｇペレットの最終濃度となるように添加し、この混合物を３０−６０分間の氷上でインキュベートし、その後、−７０℃で一晩凍結した。塩化マグネシウムおよびＤＮアーゼを、各々１２ｍＭおよび２０μｇ／ｇペレットの最終濃度となるように添加した。３０分間氷上でインキュベートした後に、試料を４００００ｇで３０分間遠心分離した。各上清に５０％のグルタチオンセファロース（ファーマシア）を０．５ｍｌ添加し、穏やかに攪拌しながら室温で３０分間−２時間インキュベートした。このスラリーを、１ｘＰＢＳで５−７回洗浄した。０．５−１ｍｌの還元グルタチオン（ファーマシア）を使用してＧＳＴ−ＳＣＣＡ融合タンパク質を溶離し、室温で３０−６０分間、４℃で一晩、全て穏やかに攪拌しながらインキュベートした。ＳＣＣＡタンパク質は、ＧＳＴとＳＣＣＡの間の開裂によって溶出された。０．４８ｍｌの開裂バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）および２０μｌのプレシジョン（PreScission）プロテアーゼを添加し、試料を４℃で穏やかに攪拌しながら４時間または一晩インキュベートした。タンパク質はファスト（Phast）システム（ファーマシア）によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００３１】
２  ３．  複合結合
ＳＣＣＡの基質への複合結合は、総容量４．５μｌの１ｘＰＢＳバッファー中、２μｇのＳＣＣＡタンパク質を、０．５μｇのカテプシンＧ（バイオデザイン  インターナショナル（Biodesign Int））または０．５μｇのＳＣＣＡタンパク質を０．９μｇのカテプシンＬ（カルバイオケム（Calbiochem））と混合することにより行われた。試料は３０分間３７℃でインキュベートした。各試料に、１０ｘコンプレックス（Complex）−バッファー（２０％のＳＤＳ、１４０ｍＭのメルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）０．５μｌを添加した。試料を９５℃で３分間インキュベートし、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。ＳＣＣＡ１／Ａ２融合タンパク質は、カテプシンＧと複合体を形成したが、カテプシンＬとは形成しなかった。これは、この融合タンパク質が機能的であり、ＳＣＣＡ２の基質特異性を有することを示す（図６）。
【００３２】
実施例３  ＤＮＡ分析
【００３３】
３．１サザンブロット分析
ＳＣＣ細胞系から並びに正常な健康なボランティアの血液試料から調製されたＤＮＡ約１０μｇを、制限酵素ＰｓｔＩまたはＢａｍＨＩで消化した。消化されたＤＮＡを、０．８％のアガロース上で分離し、薄膜（ハイボンドＮ（Hybond N）＋、ファーマシア）に転写した。フィルタを、５ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、５％の硫酸デキストラン、１：２０に希釈したリキッドブロック（LiquidBlock）（ファーマシア）およびサケ精液ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを含む溶液２０ｍｌ中、１時間プレハイブリダイズ(prehybridize)し、６０℃で一晩ハイブリダイズ(hybridize)した。ハイブリダイズ中のプローブ濃度は１０ｎｇ／ｍｌであった。ハイブリダイズ後、フィルタを、ｌｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分間、０．２ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で１５分間、いずれも６０℃でストリンジェントに洗浄した。プローブハイブリダイゼーションは、遺伝子像（Gene Images）ＣＤＰ−Ｓｔａｒ検出モジュール（ファーマシア）をマイナーな変更を加えて使用し、検出した。フィルタは１：７．５に希釈したリキッドブロック液体のブロックを含む溶液中、室温で１時間ブロッキングした。その後、それらを、１：６８００に希釈した抗フルオレセインＨＲＰ接合体を添加する前に加える前に、バッファーＡ（０．１Ｍトリス、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ９．５）／０．５％のＢＳＡ中、１５分間インキュベートし、その後さらに４５分間インキュベートした。フィルタを、検出試薬を加える前に、バッファーＡ／０．３％トゥイーン２０中、３ｘ１０分間洗浄した。フィルタを２分間でインキュベートし、２ｘＳＣＣの中で短時間洗浄し、プラスチックフィルムでラップした。ハイパーフィルム（Hyperfilm）ＭＰを３５分で露出した。
【００３４】
３．２．  ハイブリダイゼーションプローブ
プローブは、各々６０μｍのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、２４μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのフルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ、２ｍＭの  ＭｇＣｌ２、３μＭのフォワードプライマー、３μＭのバックワードプライマー、１５ｎｇのＤＮＡ鋳型（ＳＣＣＡ２を含むプラスミド）、１ＵのＴａｑポリメラーゼ及び１ｘＰＣＲバッファー（アドバンスドバイオテクノロジーズ（Advanced Biotechnologies））を含有する反応物でのＰＣＲにより生成し、標識された。
プローブＩ：エキソン８の３９３ｂｐ断片（ヌクレオチド８０２−１１９４）、プライマーＳＣＣＡ  ２６６−２７３ＦおよびＳＣＣＡ  ３９１−３９７Ｂ、Ｔａ＝５０℃；プローブＩＩ：エキソン８の１２６ｂｐ断片（ヌクレオチド９５７−１０８２）、プライマーＳＣＣＡ２  ３１９−３２４ＦおよびＳＣＣＡ２  ３５７−３６３Ｂ、Ｔａ＝５０℃；プローブＩＩＩ：コード配列をカバーする１１９４ｂｐ断片、および遺伝子の３’−末端の２２のヌクレオチド、プライマーＳＣＣＡ  １−７ＦおよびＳＣＣＡ  ３９１−３９７Ｂ、Ｔａ＝６０℃。
【００３５】
プローブＩとハイブリダイズしたＰｓｔＩ消化ＤＮＡのサザンブロットは、正常なコントロールＤＮＡ（図７）のそれと比較して、ＳＣＣ細胞系からの異なるバンド・パターンのＤＮＡを示す。ＢａｍＨＩで消化されたＤＮＡも正常なコントロールＤＮＡと比較して、異常なバンドを示す。
【００３６】
３．３．  ＰＣＲ分析
標準のＰＣＲ反応においてプライマー７および８（表１を参照）により分析されたサンプルから常法により単離されたＤＮＡは、融合遺伝子を含むサンプルにおいて唯一の生成物を示す。
【００３７】
実施例４  ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体
【００３８】
４．１  ハイブリドーマの確立、および、ＳＣＣＡ１／Ａ２、ＳＣＣＡ２、およびＳＣＣＡ１と反応するモノクローナル抗体の生産
【００３９】
組換えＳＣＣ抗原によるウサギの皮下免疫および標準的な操作による免疫血清の回収によりＳＣＣ抗原と反応するポリクローナル抗血清を得た。ポリクローナル抗血清の力価は、ストレプトアビジンプレート（ラブシステムズ  オーワイ（Labsystems Oy）、ヘルシンキ（フィンランド））、図６に固定されたビオチニル化されたＳＣＣＡ１／Ａ２およびＳＣＣＡ１と抗血清との反応性の測定によって試験した。組換えＳＣＣＡ１／Ａ２およびＳＣＣＡ１は、標準的な方法によりビオチン（Biotin）Ｎ−スクシンイミドカプロン酸塩エステルでビオチニル化された。
【００４０】
ＳＣＣＡ１／Ａ２およびＳＣＣＡ２と反応するモノクローナル抗体は、Ｒｉｂｉアジュバント中の１０−５０μｇの組換えＳＣＣＡ１／Ａ２で、Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹腔内免疫することにより確立された。免疫及び６０−９０日の間で２−４回のブースターの後に、免疫化したマウスから得た脾細胞を記載されているように（４７）Ｐ３ｘ６３Ａｇ８ミエローマ細胞と融合した。
【００４１】
ＳＣＣＡ１／Ａ２と反応する抗体を生産するハイブリドーマを、マウス免疫グロブリンＩｇＧ＋Ｍに対するアフィニティ精製されたポリクローナル抗血清（ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓ  Ｌａｂ），米国）をコートしたマイクロタイターウェル中のハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡスクリーニングにより選択した。その後、ウェルをＳＣＣＡ１／Ａ２抗原と共にインキュベートし、洗浄後、結合抗原をポリクローナルウサギ抗ＳＣＣ及びＨＲＰ標識ブタ抗ウサギＩｇ（ダコ  エイエス（Ｄａｋｏ  ＡＳ）、コペンハーゲン、デンマーク）と共にインキュベートすることにより検出した。
【００４２】
４．２．  ＳＣＣ抗原と選択されたハイブリドーマの反応性
確立したハイブリドーマの反応性は、ＥＬＩＳＡスクリーニング法と類似のＥＬＩＳＡにより試験された。簡潔に言えば、このハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体を、マウス免疫グロブリンＩｇＧ＋Ｍに対するアフィニティ精製されたポリクローナル抗血清（ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラボラトリーズ，米国）をコートしたマイクロタイターウェルに固定した。その後、ウェルをＰＢＳ１％ＢＳＡ中の異なる組換えＳＣＣ抗原５０μｌと１時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で１／５０００に希釈したラビット抗ＳＣＣ１００μｌとインキュベートし、さらに１時間インキュベートした。
【００４３】
その後、結合したウサギ抗ＳＣＣを、ＨＲＰ−ブタ抗ウサギＩｇとインキュベートし、ＯＰＤ基質で可視化し、４５０ｎｍでＯＤを測定することにより検出した。
【００４４】
図７に、選択されたハイブリドーマの反応性を示す。ＳＣＣ１０６、ＳＣＣ１１４、ＳＣＣ１１５はＳＣＣＡ１／Ａ２とのみ反応し、これはそれらがＳＣＣＡ１／Ａ２融合タンパク質に特異的であることを示す。ＳＣＣ１００、ＳＣＣ１０３およびＳＣＣ１０９は、ＳＣＣＡ２およびＳＣＣＡ１／Ａ２と反応したがＳＣＣＡ１とは反応せず、これらはＳＣＣＡ２に特異的であることが示された。ＳＣＣ１１０、ＳＣＣ１１１およびＳＣＣ１２４は、ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ１／Ａ２と反応したが、ＳＣＣＡ２とは反応せず、それらがＳＣＣＡ１に特異的であることが示唆された。
【００４５】
ＳＣＣ１０７、ＳＣＣ１１９およびＳＣＣ１２８は、すべてのＳＣＣ抗原と反応した。これにより、それらがＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の共通のエピトープを認識することが示唆される。
【００４６】
２回限界希釈法により、ＳＣＣＡ１／Ａ２と反応するがＳＣＣＡ１とは反応しない抗体を産生するクローンがクローニングされた。
【００４７】
モノクローナル抗体は、ローラー・ボトル中のＤＭＥＭ、５％ウシ胎児血清中の１０４個の細胞／ｍｌの接種によるハイブリドーマ・クローンの生体外培養によって生産され、１０−１４日間培養した。その後、モノクローナル抗体を、プロテインＡ（バイオプロセシングリミテッド（Bioprocessing Ltd.）ダーラム、英国）アフィニティークロマトグラフィー(affinity chromatography)により、生産者の推奨に従って培地から精製した。
【００４８】
実施例５
確立されたモノクローナル抗体および組換えタンパク質を使用して、ＳＣＣＡ１／Ａ２融合タンパク質を特異的に測定するためのイムノアッセー及びＳＣＣＡ２とＳＣＣＡ１の各々に特異的なアッセーを開発することができた。
【００４９】
５．１  ＳＣＣＡ１／Ａ２融合タンパク質の測定のためのイムノアッセー(Immunoassays)
ＳＣＣＡ１／Ａ”融合タンパク質に特異的だが、ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２には本質的に非反応するアッセーを、ＳＣＣ１０７、ＳＣＣ１１９あるいはＳＣＣ１２８の抗体と組み合わせて、ＳＣＣ１０６、ＳＣＣＣ１１４あるいはＳＣＣ１１５の抗体を使用することにより設計した。図参照。
【００５０】
好ましい構成の抗体においては、ＳＣＣ１０７を捕獲抗体（catching antibody）として、ＳＣＣ１０６を検出抗体（detecting antibody）として使用した。
【００５１】
ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはビオチンＮＨＲＳカプロン酸エステル、シグマケミカル  コーポレイション（Sigma Chemical Co），米国を用いて標準の操作を使用してビオチニル化し、捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０６  ＭＡｂは、、ナコネ（Ｎａｋｏｎｅ）操作の改変によりＨＲＰと結合した。
【００５２】
ビオチニル化されたＳＣＣ１０７  ＭＡｂおよびＨＲＰ結合ＳＣＣ１０６  ＭＡｂを、下記のプロトコルによる２部位ＥＩＡ（two-site EIA）に使用した。
【００５３】
アッセー(assay)操作
１．  ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート、ラブシステムズ  オーワイ、ヘルシンキ（フィンランド）に、５０μｌのＳＣＣＡ組換え抗原（ＰＢＳ中０−１００μｇ／ｌ、６０ｇ／ｌのＢＳＡ、ｐＨ  ７．２）＋１００μｌのビオチンＳＣＣ１０７  ＭＡｂ（アッセーバッファー中２μｇ／ｍｌ）を添加する。
２．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．  ５ｍＭのトリス緩衝液、０．０５％のトゥイーン４０、ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．  アッセーバッファー中、２μｇ／ｍｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０６  ＭＡｂを１００μｌ加える。
５．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．  ５ｍＭのトリス緩衝液、０．０５％のトゥイーン４０、ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．  １００μLのＴＭＢ、エリサテクノロジー（ELISA Technology）、米国を加える。
８．  ３０分間±５分間インキュベートする。
９．  ＥＬＩＳＡリーダ中でＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５４】
ＳＣＣＡ１、ＳＣＣＡ２およびＳＣＣＡ１／Ａ２抗原のための用量−応答曲線により、このアッセーがＳＣＣＡ１／Ａ２組換え抗原に特異的であり、ＳＣＣＡ１またはＳＣＣＡ２との交差反応性が５％未満であることを明らかにした。
【００５５】
５．２  ＳＣＣＡ２の特異的測定のためのアッセー
ＳＣＣＡ１／Ａ２およびＳＣＣＡ１とは顕著な反応性がなく、ＳＣＣＡ２に特異的なアッセーを、ＳＣＣ１０７、ＳＣＣ１１９あるいはＳＣＣ１２８の抗体と組み合わせてＳＣＣＣ１００、ＳＣＣ１０３あるいはＳＣＣ１０９の抗体を使用することにより設計した。好ましい構成においては、ＳＣＣ１０７  ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、ＳＣＣ１０３を検出抗体として使用した。
【００５６】
ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはビオチンＮＨＲＳカプロン酸エステル（シグマケミカル  コーポレイション，米国）を用いて標準の操作を使用してビオチニル化し、捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０３  ＭＡｂは、ナコネ操作の改変によりＨＲＰ，タイプＶ（Type V）（シグマケミカル  コーポレイション，米国）と結合した。
【００５７】
ビオチニル化されたＳＣＣ１０７  ＭＡｂおよびＨＲＰ結合ＳＣＣ１０３  ＭＡｂを、下記のプロトコルによる２部位ＥＩＡに使用した。
【００５８】
アッセー操作
１．  ５０μLのＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０−１００μｇ／L、６０ｇ／ｌのＢＳＡ、ｐＨ  ７．２）＋１００μLを添加する。
２．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．  ５ｍＭのトリス緩衝液、０．０５％のトゥイーン４０、ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．  アッセーバッファー中、２μｇ／ｍLのＨＲＰ  ＳＣＣ１０３  ＭＡｂを１００μL加える。
５．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．  ５ｍＭのトリス緩衝液、０．０５％のトゥイーン４０、ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．  １００μLのＴＭＢ、エリサテクノロジー、米国を加える。
８．  ３０分間±５分間インキュベートする。
９．  ＥＬＩＳＡリーダ中でＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５９】
ＳＣＣＡ２、ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ１／Ａ２抗原のための用量−応答曲線により、実施例５．２によるアッセーがＳＣＣＡ２抗原に特異的であり、ＳＣＣＡ１またはＳＣＣＡ１／Ａ２との交差反応性が５％未満であるという結論に達した。
【００６０】
５．３  ＳＣＣＡ１の特異的測定のためのアッセー
ＳＣＣＡ２およびＳＣＣＡ１／Ａ２とは顕著な反応性がなく、ＳＣＣＡ１に特異的なアッセーを、ＳＣＣ１０７、ＳＣＣ１１９あるいはＳＣＣ１２８の抗体と組み合わせてＳＣＣＣ１１０、ＳＣＣ１１１あるいはＳＣＣ１２４の抗体を使用することにより設計した。好ましい構成においては、ＳＣＣ１０７ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、ＳＣＣ１２４  ＭＡｂを検出抗体として使用した。
【００６１】
ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはビオチンＮＨＲＳカプロン酸エステル（シグマケミカル  コーポレイション，米国）を用いて標準の操作を使用してビオチニル化し、捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１２４  ＭＡｂは、ナコネ操作の改変によりＨＲＰ，タイプＶ（シグマケミカル  コーポレイション，米国）と結合した。
【００６２】
ビオチニル化されたＳＣＣ１０７  ＭＡｂおよびＨＲＰ結合ＳＣＣ１２４  ＭＡｂを、下記のプロトコルによる２部位ＥＩＡに使用した。
【００６３】
アッセー操作
１．    ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート、ラブシステムズ  オーワイ、ヘルシンキ（フィンランド）に、５０μｌのＳＣＣ抗原（ＰＢＳ中０−１００μｇ／L、６０ｇ／LのＢＳＡ、ｐＨ  ７．２）＋１００μｌのビオチンＳＣＣ１０７  ＭＡｂ（アッセーバッファー中２μｇ／ｍL）を添加する。
２．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．  ５ｍＭのトリス緩衝液、０．０５％のトゥイーン４０、ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．  アッセーバッファーに、２μｇ／ｍLのＨＲＰ  ＳＣＣ１２４  ＭＡｂを１００μL加える。
５．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．  ５ｍＭのトリス緩衝液、０．０５％のトゥイーン４０、ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．  １００μＬのＴＭＢ、（エリサテクノロジー、米国）を加える。
８．  ３０分間±５分間インキュベートする。
９．  ＥＬＩＳＡリーダ中でＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００６４】
５．３による抗体に基づき、ＳＣＣＡ１に特異的で、ＳＣＣＡ２またはＳＣＣＡ１／Ａ２抗原との交差反応性が１０％未満であるイムノアッセーが設計され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】染色体１８転位
【図２】ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ２のコードＤＮＡ領域、エキソン２−８のアラインメント。イントロン位置は−Ｉｘ−で示した。遺伝子間の違いは太字で示す。反応部位ループをコードする領域は小文字で示す。下線はプライマー（表１）位置を示す。
【図３】ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２のタンパク質配列のアラインメント。イントロン位置は点線で示す。タンパク質間の違いは下線で示す。囲みは反応部位ループを示す。
【図４】転位されたＳＣＣＡ１／ＳＣＣＡ２ののコードＤＮＡ領域、エキソン２−８のヌクレオチド。ＳＣＣＡ１に由来する配列は通常のスタイルで示し、ＳＣＣＡ２に由来する配列は太字で示す。イントロン位置は−Ｉｘで示す。遺伝子間の違いは下線で示す。反応部位ループをコードする領域は小文字で示す。
【図５】ＳＣＣＡ１／ＳＣＣＡ２融合タンパク質のタンパク質配列。ＳＣＣＡ１に由来するアミノ酸は、通常の文字で示す。ＳＣＣＡ２に由来するアミノ酸は、太字で示す。イントロン位置は点線で示す。タンパク質間の違いは下線で示す。反応部位ループはボックスで示す。
【図６】ＳＣＣ抗原へのｐＡｂの力価。
【図７】異なるＳＣＣ抗原と確立したハイブリドーマの反応性。
【図１】
0004436044.tif 000002
【図２】
0004436044.tif 000003
【図３】
0004436044.tif 000004
【図４】
0004436044.tif 000005
【図５】
0004436044.tif 000006
【図６】
0004436044.tif 000007
【図７】
0004436044.tif 000008