(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの一本鎖抗体（ｓｃ−Ａｂ）へ、第一ペプチドリンカー配列を介して共有結合した、少なくとも１つの可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター（ｓｃ−ＴＣＲ）を含む一本鎖両特異的結合タンパク質において、ｓｃ−ＴＣＲが第二ペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖に共有結合したＶ−α鎖を含み、ｓｃ−Ａｂが第三ペプチドリンカー配列によって共有結合している軽鎖可変領域（ＶＬ鎖）および重鎖可変領域（ＶＨ鎖）を含むことを特徴とする、可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質。
【請求項２】
ｓｃ−ＴＣＲにおいて、Ｖ−α鎖のＣ−末端が第二ペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖のＮ−末端に共有結合した、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
ｓｃ−ＴＣＲにおいて、Ｖ−β鎖のＣ−末端が第二ペプチドリンカー配列によってＶ−α鎖のＮ−末端に共有結合した、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
さらに、Ｖ−β鎖のＣ−末端と第一ペプチドリンカー配列のＮ−末端との間が共有結合したＣ−β鎖または長さ５０〜１２６アミノ酸であるその断片を含む、請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
さらに、Ｖ−α鎖のＣ−末端と第二ペプチドリンカー配列のＮ−末端との間が共有結合したＣ−α鎖または長さ５〜２５アミノ酸であるその断片を含む、請求項２または４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
第一および第二ペプチドリンカー配列が、それぞれ独立に、長さにして２〜２５の間のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項７】
ＶＬ鎖のＣ−末端が第三ペプチドリンカー配列によってＶＨ鎖のＮ−末端に共有結合した、請求項１〜６のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ＶＨ鎖のＣ−末端が第三ペプチドリンカー配列によってＶＬ鎖のＮ−末端に共有結合した、請求項１〜６のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項９】
第三ペプチドリンカー配列が長さにして２〜２５の間のアミノ酸である、請求項７又は８に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β鎖のＣ−末端が、配列がＶＨまたはＶＬ鎖のＮ−末端に結合した第一ポリペプチドリンカー配列に共有結合した、請求項７〜９のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β鎖のＣ−末端が、配列がＶＨまたはＶＬ鎖のＮ−末端に結合した第一ポリペプチドリンカー配列に共有結合した鎖であるＣ−β鎖に共有結合した、請求項７〜９のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
さらに、共有結合したタンパク質タグの少なくとも１つを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
タンパク質タグが診断またはイメージング研究のために好適である検出可能な標識化分子である、請求項１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲがヒト化させたタンパク質のｓｃ−ＴＣＲを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
ｓｃ−ＴＣＲおよび一本鎖抗体領域がヒト化された、請求項１〜１４のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
ｓｃ−ＴＣＲがＨＬＡ分子によって制限されたｐ５３ペプチド断片「ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ」を認識する、ｐ１４９  ｓｃ−ＴＣＲである、請求項１〜１５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドがさらに、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび両特異的結合分子をコードしている第一配列に実施可能に結合したリーダー配列を含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
プロモーターがｐｈｏＡであり、リーダーが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｐｅｌＢであり、かつ、リボソーム結合部位をさらに含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー成分に実施可能に結合したＣＭＶプロモーターであり、リーダーがマウスカッパ鎖リーダーである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれかのポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれかに記載された少なくとも１つの可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質および前記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれかに記載の可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質を作製する方法であって、
ａ）宿主細胞に、対象とする可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質をコードしているＤＮＡベクターを導入すること、
ｂ）宿主細胞を、細胞内または培地内に可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質を発現させるのに十分な条件下で、培地内で培養すること、及び、
ｃ）宿主細胞または培地から可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質を精製すること、
を含む方法。
【請求項２４】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球関連抗原（ＨＬＡ）と共に、当該ＭＨＣまたはＨＬＡに制限された標的細胞特異的なペプチドを含む、インビトロで標的細胞を殺すための方法であって、
ａ）請求項１〜１６のいずれかに記載の可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質のｓｃＴＣＲ領域が前記ＭＨＣまたはＨＬＡによって制限された標的細胞特異的なペプチドを認識可能であり、かつｓｃ−Ａｂ領域が免疫細胞表面の活性化分子（マーカー）を認識可能である可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質を用意し、
ｂ）免疫細胞および前記特異的なペプチドを提示するＭＨＣまたはＨＬＡを含む標的細胞を含んだ多数の細胞に接触させ、
ｃ）標的細胞上のＭＨＣまたはＨＬＡに制限された標的細胞特異的なペプチドと、免疫細胞上の活性化分子（マーカー）との間に特異的結合複合体（橋）を形成させて、
ｄ）活性化された免疫細胞で標的細胞を殺すこと、
を含む方法。
【請求項２５】
標的細胞が、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージである、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
免疫細胞が、ｐ５３、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ２８およびＨｅｒ２−Ｎｅｕからなる群より選択した抗原（マーカー）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の可溶性一本鎖両特異的結合タンパク質を有効成分として含む癌の予防又は治療用医薬組成物であって、癌がＨＬＡ−発現
腫瘍細胞であることを特徴とする、癌の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連明細書の相互参照）
本明細書は、参考文献として本明細書に組み込まれている、１９９８年１０月２１日に交付された米国特許仮明細書番号第６０／１０５，１６４号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多重特異的結合分子、およびそのような分子を作製し、使用する方法に関する。一つの観点において、本発明は標的細胞に傷害を与え、または破壊することができる一本鎖多重特異的結合分子を特徴とする。本発明は、Ｔ細胞レセプターまたは抗体結合領域を発現する関連細胞内での使用を含むさまざまな適用に有用である。
【０００３】
（発明の背景）
免疫系細胞およびとりわけ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）が腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）を検出するのに使用できるという認識が存在してきた。たとえば、メラノーマ由来のＣＴＬｓはさまざまなメラノーマ特異的抗原を同定するのに使用されてきた。たとえば、Ｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９１），２５４：１６４３；  Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，（１９９４），１７９：１００５、およびＹａｎｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９３），５３，３２５７を参照のこと。
【０００４】
いくつかの抗腫瘍治療は癌のような疾患を処置するためにＣＴＬｓを使用することを試みた。１つのアプローチにおいて、抗腫瘍ＣＴＬｓを患者よりとり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やし、ついで腫瘍を処理するために患者に戻した。しかしながら、このアプローチは有意な傷害を受ける。たとえば、十分な量の患者からのＣＴＬｓを単離することはいつも簡単なわけではない。さらに、少なくともいくつかのＣＴＬｓはさらなる合併症を導きうる自己寛容に耐える特異性を持つ可能性がある。たとえばＢｒｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９２）４，６１３；  Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９２），２５８：１７９５、およびＧｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９４），１５２，１８０２を参照のこと。
【０００５】
類似している抗体のような組換え体免疫分子を作製し、使用することによってこれらの、そして他の欠陥を和らげることが取り組まれてきた。抗体は免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含む認識される構造を持つ。重鎖および軽鎖にはＮ−末端可変領域（Ｖ）およびＣ−末端不変領域（Ｃ）が含まれる。重鎖可変領域はしばしば「ＶＨ」と呼ばれ、軽鎖可変領域は「ＶＬ」領域と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬ鎖はＦ（Ｖ）と呼ばれている結合ポケットを形成する。一般的にＤａｖｉｓ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９８５），３：５３７；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｐａｕｌ  Ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＴＤ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。
【０００６】
組換え体抗体分子は開示されてきている。たとえば、いくつかの組換え体両特異性抗体（ｂｓＦｖ）分子が報告された。ほとんどのｂｓＦｖ分子には、一本鎖としてＦ（ｖ）携帯（Ｓｃ−Ｆｖ）が含まれる。さらにとりわけｓｃ−Ｆｖ分子はペプチドリンカー配列を介してＶＬに連結したＶＨが含まれる。たとえばＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），（１９８８），８５：５８７９；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８），２４２：４２３；第ＷＯ  ９４／２９３５０号、および米国特許第５，４５５，０３０号を参照のこと。
【０００７】
さらなるｂｓＦｖ分子が開示された。たとえば、いくつかのｂｓＦｖ分子が、「ＣＤ３」と呼ばれるＴ細胞タンパク質およびＴＡＡに結合することが報告された。ｂｓＦｖの結合が免疫軽応答を促進するとの認識がある。たとえば、Ｊｏｓｔ，Ｃ．Ｒ．（１９９６）  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：２１１；  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｂｌｏｏｄ，８８：４６５１；  Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ，４：５７１を参照のこと。
【０００８】
両特異性抗体分子を作製する簡単な方法を発展させることが試みられてきた。しかしながら、これらの試みの多くは問題を抱えていた。たとえば、多くの分子がとりわけ微生物発現系内で不溶性であることが報告されている。たとえば、Ｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１１２８を参照のこと。
【０００９】
他の組換え体免疫分子を作製する試みが報告された。たとえば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）をあやつることが特に試みられた。ＴＣＲは、免疫グロブリン可変（Ｖ）および不変（Ｃ）領域に類似したαおよびβ鎖を含む膜結合ヘテロダイマーである。ＴＣＲα鎖は共有結合したＶ−αおよびＣ−α鎖を含む。ＴＣＲβ鎖は、Ｃ−β鎖に共有結合したＶ−β鎖を含む。一般的に上記Ｄａｖｉｓを参照のこと。
【００１０】
組換え体ＤＮＡ技術によってＴＣＲを取り扱う特定の努力がされた。たとえば、一つのアプローチにおいて、ＴＣＲがＴＣＲ  Ｖ領域（ｓｃ−ＴＣＲ）を含む一本鎖融合タンパク質として設定された。ｓｃ−ＴＣＲ分子がさまざまな重要な使用法を持つと報告された。たとえば、Ｈｏｏ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９，４７５９（１９９２）；  Ｗｕｌｆｉｎｇ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，６５５（１９９４）；  Ｋｕｒｕｃｚ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ９０  ３８３０  （１９９３）；ＰＣＴ  第ＷＯ９６／１３５９３号；第ＷＯ９６／１８１０５号およびＳｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６，８５９（１９９６）を参照のこと。
【００１１】
先行技術の組換え体免疫分子は明らかな欠点を持つと信じられている。
【００１２】
たとえば、多くの腫瘍抗原が細胞より「殺され」、したがって非特異的免疫分子結合に対する部位が提供されるという認識があった。とりわけ、多くのｂｓＦｖ分子が偶然にこの殺された抗原と相互作用し、したがって腫瘍細胞殺傷効果が減少することが提唱されてきた。
【００１３】
先行技術の免疫分子はさらなる欠点を持っている。たとえば、多くのｂｓＦｖ分子は腫瘍細胞の表面上のあるペプチドのような潜在的標的抗原に結合できないという認識が存在してきた。例証のように、腫瘍関連タンパク質ｐ５３は通常、完全なタンパク質として腫瘍細胞上に発現されない。その代わりに、ｐ５３は細胞表面クラス１またはクラス２分子と関連してペプチドとして処理され、提示されると報告されてきた。したがって、特定の細胞表面ペプチドへの結合が必要である場合には、ｂｓＦｖ分子に関しては難しいか不可能である。
【００１４】
さらに、いくつかのｂｓＦｖ分子を明らかな単離および／またはリフォールディング工程なしに単離することは難しかった。たとえば、上記Ｊｏｓｔ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．およびそこに引用された参考文献を参照のこと。
【００１５】
多くのｓｃ−ＴＣＲｓの調製および使用にもまた問題があった。たとえば、ｓｃ−ＴＣＲｓを作製するためのいくつかの先行技術が、不溶性および誤って折り畳まれた分子を産出した。いくつかの戦略がｓｃ−ＴＣＲ収量を改善する取り組みで発展してきた。しかしながら、これらの方法によって産出されたｓｃ−ＴＣＲｓはしばしば、十分適度な量のタンパク質を得るために、時間を消費する手順を必要とする。たとえば、上記Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．；上記Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．；および発行されたＰＣＴ明細書第ＷＯ９６／１８１０５号および第ＷＯ９６／１３５９３号を参照のこと。
【００１６】
したがって、組換え体免疫分子およびとりわけｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞に傷害を与え、または除去する（殺す）ことのできる一本鎖多重特異的結合分子に対する必要性が存在する。最小限の困難な調製工程で多重特異的結合分子を作製するための方法を持つことが望ましい。
【００１７】
（本発明の要約）
本発明は新規免疫分子、とりわけ望ましい標的細胞に傷害を与え、または除去する（殺す）一本鎖多重特異的結合タンパク質に関する。一本鎖多重特異的結合タンパク質には、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球関連抗原（ＨＬＡ）へ結合（負荷）したペプチドに特異的に結合することができる少なくとも１つのレセプター領域、および抗原に結合することのできる少なくとも１つの抗体領域が含まれる。本一本鎖多重特異的結合分子は完全に可溶性であり、最小の困難な調製工程によってあきらかな量で単離できる。また、望ましい細胞へ結合する能力に関して一本鎖多重特異的結合タンパク質をスクリーニングするための方法および組成物も提供する。
【００１８】
本発明者らは、広範囲の有用な活性を特徴とする新規な多重特異的結合分子を作製した。たとえば、一本鎖多重特異的結合分子は、ペプチドの結合した（負荷した）ＭＨＣ（ＨＬＡ）を発現している細胞を抗原を発現している細胞に関連できる。ほとんどの例において、ＭＨＣ（ＨＬＡ）および抗原は別々の細胞上にある。本発明にしたがった細胞の関連は、好ましくペプチドの結合（負荷）したＭＨＣ（ＨＬＡ）複合体を発現している細胞に傷害を与え、または殺傷することのできる免疫応答を促進する。本発明は、特定の癌およびウイルス感染の処置での使用を含む広いスペクトルの有用な適用を持つ。
【００１９】
さらにとりわけ、本発明は、少なくとも１つの一本鎖Ｔ鎖細胞レセプター（ｓｃ−ＴＣＲ）またはＭＨＣ（ＨＬＡ）へ結合（負荷）している特定のペプチドに結合するのに十分なその機能的断片を含む一本鎖多重特異的結合タンパク質を特徴とする。ペプチド結合（負荷）ＭＨＣまたはＨＬＡを発現している細胞はしばしば本明細書で「標的細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）」または同様の語句で呼ぶ。多重特異的結合タンパク質はさらに、少なくとも１つの抗原結合部位、とくに  一本鎖抗体またはその機能的断片を含み、抗体結合領域は抗原を結合するのに十分である。ほとんどの実施様態において、抗体結合領域によって結合した抗原は細胞表面上、通常免疫細胞表面上に発現する可能性がある。特定の実施様態において、抗原は免疫細胞に対して選択的であり得る。さらに好ましい本発明の一本鎖多重特異的結合分子は、標的細胞上のペプチド結合（負荷）ＭＨＣまたはＨＬＡと免疫細胞上の抗原間の特異的結合複合体（「橋（ｂｒｉｄｇｅ）」）を形成することが可能である。理論に結びつけることを望むことなしに、本発明にしたがった橋の形成が、標的細胞に傷害を与えるかまたは殺すことのできる免疫応答を促進すると信じられている。
【００２０】
本発明の好ましい多重特異的結合分子は特異的にＭＨＣまたはＨＬＡ複合体に結合する。他に特定しない限り、本明細書で使用されたような語句ＭＨＣおよびＨＬＡは、特定のペプチドが結合（負荷）する複合体を意味する。いくつかの例において、ＭＨＣ（ＨＬＡ）複合体は、ペプチド結合（負荷）を意味するために「ｐＭＨＣ」、「ｐＨＬＡ」または類似の語句で引用する。したがって、多重特異的結合分子はＭＨＣおよびＨＬＡ複合体の結合、およびこれらの複合体の望ましい抗原を発現している免疫細胞への結合に対して有用である。いくつかの例において、特定の多重特異的結合分子によって結合した免疫細胞抗原は、多重特異的分子による結合に続く免疫細胞の好ましい活性化を表すために、「活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」分子またはマーカーと呼ぶ。
【００２１】
したがって、１つの観点において、本発明は、少なくとも１つの一本鎖抗体（ｓｃ−Ａｂ）に共有結合（すなわち融合）した少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲを含む一本鎖多重特異的結合タンパク質を特徴とする。一本鎖多重特異的分子が１つのｓｃ−ＴＣＲおよび１つのｓｃ−Ａｂを含む実施様態において、好適な（第一）ペプチドリンカー配列を介して互いにｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ａｂを分離することが一般的に好ましいけれども、前記ｓｃ−ＴＣＲおよび前記ｓｃ−Ａｂ分子は直接一緒に融合してよい。あるいは、ｓｃ−ＴＣＲおよび／またはｓｃ−Ａｂ分子の機能的断片はタンパク質中で使用してよい。好ましい実施様態において、多重特異的結合タンパク質には、第一ペプチドリンカー配列を介してｓｃ−Ａｂへ結合したｓｃ−ＴＣＲが含まれる可能性がある。
【００２２】
さらにとりわけ、ｓｃ−ＴＣＲは好ましく一本鎖Ｖ鎖である。Ｖ鎖は典型的に、Ｖ−α鎖がＶ−β鎖へ融合するＶα、β配列を含む可能性がある。特定の実施様態において、この融合は（第二）ペプチドリンカー配列を介した分子の共有結合によって行われる。前記融合産物はさらにＶ−αまたはＶ−β鎖を介して、免疫グロブリン不変鎖（Ｉｇ−ＣＬ）またはもし望むのであればその断片へ共有結合してよい。
【００２３】
さらに特定の実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−α鎖のＣ−末端は第二ペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖のＮ−末端に共有結合する。あるいは、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β鎖のＣ−末端は第二ペプチドリンカー配列によってＶ−α鎖のＮ−末端へ共有結合できる。
【００２４】
他の実施様態において、ＴＣＲ  Ｃ−β鎖またはその断片は、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β鎖のＣ−末端と第一ペプチドリンカー配列のＮ−末端の間で共有結合する。あるいは、ＴＣＲ  Ｖ−β鎖または断片は、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−α鎖のＣ−末端と第一ペプチドリンカー配列のＮ−末端の間で共有結合してよい。
【００２５】
他の実施様態において、ＴＣＲ  Ｃ−α鎖またはその断片は、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−α鎖のＣ−末端とＶ−β配列に融合した第二ペプチドリンカー配列のＮ−末端の間で共有結合する。あるいは、Ｃ−α鎖または断片は、Ｖ−β鎖のＣ−末端と、Ｖ−α配列へ融合した第二ペプチドリンカーのＮ−末端間で共有結合できる。
【００２６】
特定の実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲには、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−α鎖のＣ−末端とｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β配列へ融合した第二ペプチドリンカー配列のＮ−末端の間で共有結合したＴＣＲ  Ｃ−α鎖または断片が含まれる。さらに、前記ＴＣＲ  Ｃ−β鎖または断片は、Ｖ−β鎖のＣ−末端と第一ペプチドリンカー配列のＮ−末端の間で共有結合する。
【００２７】
議論したように、本発明の多重特異的結合分子には少なくとも１つのｓｃ−Ａｂが含まれる。特定の実施様態において、抗体結合領域には少なくとも１つのｓｃ−Ｆｖが含まれる。さらに好ましい一本鎖多重特異的結合タンパク質には、１つのｓｃ−Ｆｖまたはその機能的断片が含まれる。典型的なｓｃ−Ｆｖには少なくとも２つのイムノグロブリン鎖、とりわけ２つの免疫グロブリン可変鎖、たとえば重鎖（ＶＨ）と融合した軽鎖（ＶＬ）が含まれる。この実施様態において、（第三）ペプチドリンカー配列を介して鎖が共有結合することが一般的に好ましいけれども、ＶＬおよびＶＨ鎖が互いに融合してもよい。
【００２８】
特定の実施様態において、ＶＬ鎖のＣ−末端は第三ペプチドリンカー配列によってＶＨ鎖のＮ−末端に共有結合する。他の実施様態において、ＶＨ鎖のＣ−末端は第三ペプチドリンカーによってＶＬ鎖のＮ−末端に共有結合する。
【００２９】
さらに特定の実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β鎖のＣ−末端は、配列がさらにＶＨ鎖のＮ−末端に結合する第三ポリペプチドリンカー配列へ共有結合する。あるいは、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−βのＣ−末端は、ポリペプチド配列がさらにＶＬ鎖のＮ−末端に結合することを除いて、論議したように第三ポリペプチドリンカー配列に共有結合する。他の実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β鎖のＣ−末端は、配列がＶＨ鎖のＮ−末端に結合する第三ポリペプチドリンカー配列へ共有結合するＣ−β鎖に共有結合する。あるいはｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ−β鎖のＣ−末端が、ＶＬ鎖のＮ−末端に結合している第三ポリペプチド配列に共有結合するＣ−β鎖に共有結合する。
【００３０】
好ましい実施様態において、本発明は、適切なペプチドリンカー配列を介して一緒に共有結合する、少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲ（またはその断片）および少なくとも１つのｓｃ−Ｆｖ（またはその断片）を含む一本鎖「両特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」結合タンパク質を提供する。１つ以上のｓｃ−ＴＣＲおよび／またはｓｃ−Ｆｖを使用する例において、ｓｃ−ＴＣＲｓおよびｓｃ−Ｆｖｓが好ましくは同一である。一本鎖両特異的結合タンパク質は時々本明細書で、「両特異的ハイブリッド分子（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」または「ｓｃ−ＴＣＲ／ｓｃＦｖ  ハイブリッド分子（ｓｃ−ＴＣＲ／ｓｃＦｖ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」または同様の語句で表す。本発明の両特異的ハイブリッド分子はタンパク質タグのようなさらなるアミノ酸配列を含んでよい。さらに好ましい両得的結合タンパク質は以下のように論議される。
【００３１】
たとえば、１つの実施様態において、両特異的結合分子は配列内に共有結合した、１）対象のｓｃ−ＴＣＲまたはその機能的断片、２）適切なペプチドリンカー配列、３）ｓｃ−Ｆｖまたはその機能的断片の共有結合を含んでいる。さらに特定の実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲはさらに配列内に共有結合した、４）Ｖ−α鎖、５）適切なペプチドリンカー配列、６）Ｖ−β鎖および７）任意のＣ−β鎖断片を含む。あるいは、ｓｃ−ＴＣＲは配列内に、共有結合した、４）Ｖ−β鎖、５）リンカー配列、６）Ｖ−α鎖、および７）任意のＣ−β鎖またはその断片を含むことができる。他の特異的な実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲはさらに、Ｖ−α鎖と、Ｖ−β鎖に融合したペプチドリンカー配列の間で共有結合したＣ−α鎖またはその断片を含む。
【００３２】
他の特異的な実施様態において、両特異的結合分子は、配列中に共有結合した８）ＶＨ鎖、９）適切なポリペプチドリンカー配列および１０）ＶＬ鎖をふくむｓｃ−Ｆｖを含む。他の実施様態において、ｓｃ−Ｆｖは配列内に共有結合した、８）ＶＬ鎖、９）ポリペプチドリンカー配列および１０）ＶＨ鎖を含む。
【００３３】
本発明の一本鎖多重特異的結合タンパク質はさらに、それと共有結合している少なくとも１つのタンパク質タグ、好ましくはそのようなタグ１〜３個を含んでよい。好ましくは、Ｎ−末端へのいくつかの適用融合がより好ましい可能性があるが、タンパク質タグは望ましい結合分子のＣ−末端へ融合する。
【００３４】
さらに特異的な実施様態において、一本鎖多重特異的結合タンパク質は配列内に共有結合した、１）ＴＣＲ  Ｖ−α鎖、２）ペプチドリンカー配列、３）Ｃ−β鎖断片に共有結合したＴＣＲ  Ｖ−β鎖、４）ペプチドリンカー配列、５）ＶＬ鎖、５）ペプチドリンカー配列、および６）ＶＨ鎖を含む。他の実施様態において、一本鎖多重特異的結合タンパク質は配列内に共有結合した、１）ＴＣＲ  Ｖ−α鎖、２）ペプチドリンカー配列、３）Ｃ−β鎖断片に共有結合するＴＣＲ  Ｖ−β鎖、４）ペプチドリンカー配列、５）ＶＨ鎖、５）ポリペプチドリンカー配列および６）ＶＬ鎖を含む。
【００３５】
意義深いことに、本発明は順応性がある。すなわち、本発明はさまざまなｓｃ−ＴＣＲおよびｓｖ−ＦＶ成分を含むことのできる多重特異的結合分子を特徴とする。評価されるであろうように、成分を作製しまたは組み立てる順番は、望ましい結合および活性化特性が遂行される限りは通常重要ではない。
【００３６】
他の実施様態において、本発明は、少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲ（その機能的断片）および少なくとも１つの存在可能である抗体結合領域、たとえばＦ（ｖ）またはｓｃ−Ｆｖを含む多重鎖多重特異的結合タンパク質を特徴とする。結合分子はより特に、ｓｃ−ＴＣＲおよび抗体結合領域に結合するための少なくとも１つの「連結分子（ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」を含む。より完全に以下で議論されるであろうように、連結分子はｓｃ−ＴＣＲ、抗体結合領域または両方に共有的または非共有的に結合する可能性がある。たとえば、１つの好ましい実施様態において、２つの親和性のある連結分子が互いに独立してｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖへ融合する。
【００３７】
語句「連結分子」は、共有的にまたは非共有的に第二アミノ酸配列へ特異的に結合することのできるアミノ酸配列を意味する。時折、第二アミノ酸配列は、特異的結合対を形成する能力を意味するために、「同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）」配列として表す。第二配列はまた、時折本明細書で第二連結分子として表し、第二連結分子は（第一）連結分子と同様であるか、または異なる形であり得る。さらに特異的な連結分子には、免疫グロブリン鎖、特に定常鎖（ＨまたはＬ）、またはその適切な断片、コイル化したコイルモチーフおよびヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを含む。さらに特異的な連結分子の例は以下に開示する。
【００３８】
いくつかの例において、連結分子がまた結果としてタンパク質タグとして役に立つこととなることが議論より明らかになるであろう。
【００３９】
さらに特異的な多重鎖多重特異的結合分子には、１つ以上の連結分子、好ましくは２つのそのような連結分子が含まれる。さらに特異的な実施様態において、１つのｓｃ−ＴＣＲは第一連結分子に融合する。第一連結分子は、さらに抗体結合領域に結合した第二連結分子へ共有的にまたは非共有的どちらかで結合できる。しかしながら、第一および第二連結分子が適切な免疫グロブリン鎖であるようないくつかの実施様態において、共有結合と非共有結合の組み合わせは、第一および第二連結分子を介したｓｃ−ＴＣＲおよび抗体結合領域の結合のために使用される可能性がある。
【００４０】
例示のように、特定の多重鎖多重特異的結合タンパク質は、少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲ、好ましくは１つのｓｃ−ＴＣＲ、免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ−ＣＨ）または機能的断片への共有結合を含む。時折この構造は本明細書で「ｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ融合タンパク質（ｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ」または同様の語句で表す。ｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖部分は以上で定義したような、そして以下で論議する連結分子の１つの型の代表例であることが認識されるであろう。さらに特異的な実施様態において、結合分子はさらに、第二連結分子を含み、それは好ましくは結合複合体を形成することが可能な適切な免疫グロブリン重鎖である。免疫グロブリン鎖のアイソタイプは異なる可能性があるが、しかし好ましくは結合を促進するように同一である。第二連結分子は、好ましくはＦ（ｖ）、とりわけｓｃ−Ｆｖである抗体結合領域へ結合する。他の実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲはさらに免疫グロブリン可変鎖、好ましくは可変軽鎖へ共有的または非共有的に結合してよい。
【００４１】
本明細書で開示された一本鎖および多重鎖多重特異的結合タンパク質は、好ましくはＴＣＲ  Ｖ−αおよび細胞障害性Ｔ細胞上に存在するＴ細胞レセプターＶ鎖と少なくとも９０％同一であるＶ−β鎖を含む。好ましくは、少なくともタンパク質のｓｃ−ＴＣＲ部分は、患者の適合性を増強するためにヒト化され、好ましくは全結合タンパク質がヒト化された。そのような実施様態において、少なくとも１つの可能なタンパク質タグ、たとえば診断またはイメージング研究に好適な検出可能な標識化分子を含むことが望ましい。
【００４２】
以下に記述されるであろうように、本多重特異的結合分子は未修飾でありえ、または望むのならば望ましい分子、たとえば薬物、毒素、酵素または放射活性基質に、結合したペプチドリンカー配列を介して共有結合できる。
【００４３】
本発明の多重特異的結合分子はさまざまな明らかな利点を提供する。
【００４４】
たとえば、好ましく、多重特異的結合タンパク質は、ＭＨＣ−発現標的細胞および免疫細胞に結合することができる。すなわち、本結合タンパク質は好ましく、免疫細胞をＭＨＣ−またはＨＬＡ−発現細胞に連結する橋を形成する。述べたように、結合は認識を増強し、標的細胞への障害または殺傷を促進すると考えられている。反対に、ほとんどの先行技術の免疫系分子、とりわけｂｓＦｖ分子はｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ複合体へ結合するように最適化されていない。したがって、本分子は、ｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ分子を発現している標的細胞を殺傷するための効果的な方法を提供する。
【００４５】
さらに、本多重特異的結合タンパク質の使用は、多くの先行技術免疫分子と比較した場合、関連している逆活性はより少ないと信じられている。例示したように、多くの先行技術ｂｓＦｖ分子はＴＡＡｓを殺すために結合すると報告されてきた。反対に、本発明の好ましい多重特異的結合分子は、ＭＨＣまたはＨＬＡ分子に関連してとりわけＴＡＡｓに結合し、したがって、殺された残骸への非特異的な結合を本質的に減少させ、または総合的に除去する。あきらかに、任意のＭＨＣおよびＨＬＡ殺傷に関連した領域ではほとんど関心がなかった。
【００４６】
さらに、本明細書で開示された多重特異的結合分子は、ほとんどの先行技術の組換え体免疫分子よりも明らかにより広いスペクトルの分子を結合できる。とりわけ、標的可能な抗原がしばしば認識を形成し、結合を困難にするよう細胞内に隠されると理解されてきた。これらの隠された抗原に特異的に結合する結合分子を提供することが本発明の目的である。たとえば、多重特異的結合分子は、ＭＨＣまたはＨＬＡに関連した抗原に結合できるｓｃ−ＴＣＲ（または機能的断片）を少なくとも１つ含む。したがって、本結合分子は広くさまざまな、通常細胞内に隠された抗原に結合することが可能である。反対に、ほとんどの先行技術の組換え体免疫系分子はＭＨＣ−またはＨＬＡ−提示抗原に効果的に結合することはできない。
【００４７】
本発明はまたさらなる利点を提供する。たとえば、先行する実施は一般的に、十分な量のタンパク質をえることができる前に、大量のＴＣＲ−関連タンパク質（たとえばＴＣＲレセプター、ＴＣＲヘテロダイマー、ｓｃ−ＴＣＲｓ）の操作を必要とする。反対に、本発明の多重特異的結合分子は完全に可溶性であり、有効な量で単離することができる。さらに、幅広いさまざまな多重特異的結合分子は、スーパー抗原またはＡＰＣｓのようなさまざまな免疫系成分との相互作用に対して提示されうる。
【００４８】
さらに、一本鎖および多重鎖多重特異的結合分子は、標準の免疫学的方法によって簡単に単離される免疫グロブリンを含む。これらの鎖の存在は通常、以下で論議するような結合分子の検出、解析および単離を促進することができる。
【００４９】
他の観点において、本発明は、一本鎖または多重鎖多重特異的結合タンパク質をコードしている配列を含むかまたはそれらからなるポリヌクレオチド（ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらのキメラ）に関連する。一つの実施様態において、ポリヌクレオチドには、たとえば結合タンパク質が一本鎖構造である場合のように、本質的にすべての結合タンパク質をコードしている配列が含まれる。
【００５０】
他の実施様態において、ポリヌクレオチドには多重特異的結合タンパク質の一部分、とりわけ以下で議論する特定の多重鎖結合タンパク質の部分をコードする配列が含まれる。たとえば、本発明の特定のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖または好適なその断片（たとえばｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ分子）をコードしている可能性がある。この実施様態において、多重特異的結合タンパク質の残りの部分は様々な方法で提供されうる。たとえば、抗体結合領域のような抗体分子を合成することのできる細胞またはその抽出物によって提供されうる。この抗体または抗体結合領域は細胞ゲノムによってコードされている可能性があり、または導入ＤＮＡ区画によってコードされている可能性がある。好ましくは、細胞はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞であろう。あるいは、結合タンパク質の残りの部分は、ＤＮＡ区画を含む第二ポリヌクレオチド配列によって提供される。この実施様態において、結合タンパク質は好ましくは、コードされたタンパク質部分を望ましい結合タンパク質の形成に引き起こす条件下で一緒に接触させることで構築される。以下で議論するであろうように、本発明の多重特異的結合タンパク質は、細胞、ゲノムおよび化学的方法を含む１つの戦略、またはその組み合わせによって連結されうる。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドを含むか、それらからなるＤＮＡベクターが好ましく企画される。例示的なＤＮＡベクターは、従来の原核または真核生物タンパク質発現系に適合性のある物を含む。さらに特異的な例がポリヌクレオチドおよびＤＮＡベクターである。
【００５２】
本利点のポリヌクレオチドは重要な利点を提供する。たとえば以下の開示によって明らかになってくるであろうように、本発明の好ましいポリヌクレオチドには、共有結合したｓｃＴＣＲおよびｓｃ−Ａｂ分子をコードしているＤＮＡ区画が含まれる。このＤＮＡ区画は好ましくは、ｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ａｂをコードしている区画が他のｓｃＴＣＲまたはｓｃ−Ａｂをコードしている区画で、望むように切り替えらうるように「カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」形式で形成される。
【００５３】
他の観点において、本発明は多重特異的結合タンパク質を選別するための組成物および方法を提供する。さらにとりわけ、この組成物および方法は望ましい特徴を持つｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ａｂを選別するのに使用でき、したがってこれらの分子を含む多重特異的結合タンパク質の製造および使用を促進する。
【００５４】
１つの実施様態において、本発明は、融合タンパク質として少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲ（または機能的断片）および少なくとも１つのｓｃ−Ｆｖ（または機能的断片）を含む組換え体バクテリオファージを提供する。議論されるであろうように、バクテリオファージは、たとえばｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ分子を望ましい結合特性に関して選別するために使用できる。両特異的バクテリオファージが好ましい。この組換え体バクテリオファージは時折、ｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質による結合を意味するために「多重機能的（ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」または「多重特異的（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）」として本明細書で表す。組換え体バクテリオファージは、関連したファージがいくつかの場合に使用されてよいが、よく公知のフィラメンタス「ｆｄ」ファージより由来しうる。
【００５５】
さらにとりわけ、本発明の組換え体バクテリオファージは、それぞれ、１）第一バクテリオファージコートタンパク質へ融合している、少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲまたはその機能的断片、または２）第一バクテリオファージコートタンパク質と同一かまたは異なる第二バクテリオファージコートタンパク質に融合した、少なくとも１つのｓｃ−Ａｂまたはその機能的断片を含む多数の融合タンパク質を含む。好ましいバクテリオファージコートタンパク質は本質的に全長であるか、または断片が融合分子を提示するのに十分である場合その断片であってもよい。「提示（ｄｉｓｐｌａｙ）」によって、タンパク質融合はバクテリオファージコートの部分であり、以下に記述するような標準のスクリーニング技術によってバクテリオファージ上で簡単に検出可能であることを意味する。
【００５６】
関連する観点において、本発明は、それぞれのバクテリオファージがそれぞれタンパク質融合としてバクテリオファージコートタンパク質へ共有結合する多数の一本鎖多重特異的結合タンパク質を含むような、多数の組換え体バクテリオファージを含む組換え体バクテリオファージライブラリーを提供し、そこで、それぞれの一本鎖結合タンパク質は、１）第一バクテリオファージコートタンパク質または断片に融合した、１つのｓｃ−ＴＣＲまたはその機能的断片、または２）第二バクテリオファージコートタンパク質または断片に融合する、１つのｓｃ−Ａｂまたはその機能的断片を含む。さらに好ましい組換え体バクテリオファージライブラリーには、両特異的結合タンパク質を提示しているバクテリオファージが含まれる。
【００５７】
組換え体バクテリオファージライブラリーは、さまざまなＴＣＲ  Ｖ鎖および／または免疫グロブリン可変鎖を含むように設定しうる。したがって、ライブラリーは望ましいｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ａｂ分子を提示する組換え体バクテリオファージを選別するために使用できる。
【００５８】
本発明の組換え体バクテリオファージはさまざまな従来の技術によって単離できる。１つの実施様態において、その方法に少なくとも１つの、好ましくはすべての以下の工程をが含まれるような組換え体バクテリオファージを単離するための方法が提供される。
ａ）宿主細胞に、第一バクテリオファージコートタンパク質または断片に共有結合したｓｃ−ＴＣＲを含む第一融合タンパク質をコードしている配列を含む第一ポリヌクレオチドを導入すること、
ｂ）宿主細胞に、第二バクテリオファージコートタンパク質または断片と共有結合したｓｃ−Ｆｖを含む第二融合タンパク質をコードしている配列を含む第二ポリヌクレオチドを導入すること、
ｃ）宿主細胞を、バクテリオファージの増殖と融合タンパク質の提示を許容する条件下で溶媒中で培養すること、および
ｄ）宿主細胞または培養液より組換え体バクテリオファージを単離すること。
【００５９】
特定の実施様態において、方法にはさらに、宿主細胞の抽出物または培養した培地を、融合タンパク質の１つと特異的に結合可能な合成マトリックスと接触させること、およびバクテリオファージを単離するために合成マトリックスから組換え体バクテリオファージを精製することが含まれる。さらに特定の実施様態において、合成マトリックスには、組換え体バクテリオファージに特異的に結合することのできる抗体断片が含まれる。さらに特定のバクテリオファージ単離技術は以下で議論する。
【００６０】
本組換え体バクテリオファージを含むキットがさらに本発明によって提供され、キットはまたバクテリオファージの増殖のための好適な原核生物細胞とこのキットを使用するための指示を含んでもよい。以上で論議したバクテリオファージライブラリーを含むキットもまた提供される。
【００６１】
本発明の組換え体バクテリオファージはさらなる使用および利点を持つ。たとえば、このバクテリオファージは、望ましい多重特異的結合分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの解析を促進するために標準のスクリーニング技術にしたがって使用することができる。さらにとりわけ、本組換え体バクテリオファージは、ｓｃ−Ｆｖのような特定のｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ａｂが対象である標的細胞の認識、結合および／または殺傷することが可能であるかどうかを査定するために使用できる。さらなる利点として、両特異的ｓｃ−ＴＣＲ／ｓｃ−Ａｂ分子を作製し試験するための相対的に素早く、直接的な手段、短く簡便な精製工程、および大量の異なるハイブリッド分子の、標的細胞に傷害を与え、または殺傷する（たとえば腫瘍殺傷）効率について試験するための迅速な方法が含まれる。
【００６２】
本発明の一本鎖および多重鎖多重特異的結合タンパク質は、１つの方法または方法の組合せによって完全に機能的な、可溶性のタンパク質として作ることができる。一般的に、この方法には、細胞技術、組換え体ＤＮＡ技術および化学的技術およびこれらの組合せが含まれる。
【００６３】
たとえば、１つの実施様態において、少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲまたはその機能的断片、および少なくとも１つのｓｃ−Ａｂおよび特にｓｃ−Ｆｖ、またはその機能的断片を含む一本鎖多重特異的結合タンパク質を作成するための方法が提供される。この方法には少なくとも１つ、好ましくはすべての以下の工程が含まれる。
ａ）宿主細胞に対象である一本鎖多重特異的結合タンパク質をコードしているＤＮＡベクターを導入すること、
ｂ）宿主細胞を、細胞または培地内で一本鎖多重特異的結合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地内で培養すること、
ｃ）細胞または培地から一本鎖多重特異的結合タンパク質を単離すること。
【００６４】
さらに、少なくともｓｃ−ＴＣＲまたはその機能的断片および抗体結合領域または機能的断片を含む多重鎖多重特異的結合タンパク質を作製するための方法が提供される。本方法の１つの実施様態において、抗体結合領域はＦ（ｖ）である。とりわけ、細胞または細胞抽出物は少なくとも多重鎖結合タンパク質の部分を形成するのに使用される。さらにとりわけ、ハイブリドーマのような抗体産生細胞が使用される。１つの実施様態において、本方法には少なくとも１つ、好ましくはすべての以下の工程が含まれる。
ａ）ハイブリドーマ細胞内に、少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲ、好ましくは免疫グロブリン不変重鎖またはその断片に共有結合した１つのｓｃ−ＴＣＲ（または機能的断片）をコードしているＤＮＡ断片を導入すること、
ｂ）ハイブリドーマ細胞を、ＤＮＡベクターによってコードされた免疫グロブリン不変重鎖または断片とハイブリドーマによって産出された免疫グロブリン鎖間の特異的結合複合体を形成することを導く条件下で培地内で培養すること、
ｃ）多重鎖多重特異的結合タンパク質をハイブリドーマ細胞または培地から精製すること。
【００６５】
さらに特定の実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲに共有結合している免疫グロブリン可変軽鎖を含む多重鎖多重特異的結合タンパク質、すなわち両特異的結合タンパク質に対して方法が提供される。
【００６６】
本発明は、多重鎖多重特異的結合タンパク質を作製するためのさらなる方法を提供する。たとえば、１つの実施様態において、望ましい結合タンパク質のそれぞれの鎖は独立に、たとえば組換え体ＤＮＡまたは化学的方法によって作製する。好ましくは、結合タンパク質はさらに少なくとも１つの連結分子、好ましくは同一または異なる１つの連結分子を含む。特定の実施様態において、本方法は少なくとも１つの、好ましくはすべての以下の段階を含む。
ａ）第一連結分子に共有結合する少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲまたはその機能的断片を含む第一配列を提供すること、
ｂ）第一配列を、第二連結分子に結合する少なくとも１つのｓｃ−Ｆｖまたはその機能的断片を含む第二配列と接触させることであって、その接触させることは第一と第二連結分子間の特異的結合複合体を形成するのに十分な条件下であること、
ｃ）多重鎖多重特異的結合タンパク質を形成すること。
好ましくは多重鎖多重特異的結合タンパク質は両特異性である。
【００６７】
多重鎖多重特異的結合タンパク質を作製するためのさらに特定の組換え体ＤＮＡおよび化学的方法は以下に記述する。
【００６８】
議論したように、本多重特異的結合タンパク質はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで重要に使用される。たとえば、結合タンパク質はある免疫細胞の特異性を転送する、たとえば、ウイルス感染または腫瘍細胞のような標的細胞を除去するのに使用できる。いくつかの例で、腫瘍細胞はまたウイルス感染している可能性もある。議論したように、本結合分子の好ましい使用は標的細胞の傷害または除去を増加させることができる。したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、標的細胞に対する免疫系活性化を増強することによってそれらの標的細胞を殺すのに使用できる。好ましいｉｎ  ｖｉｖｏでの本多重特異的結合分子の使用には齧歯類、霊長類または家畜動物、とりわけヒト患者のような哺乳動物での使用が含まれる。
【００６９】
したがって、１つの観点において、本発明は対象のＭＨＣまたはＨＬＡを含む標的細胞に傷害を与え、または好ましくは殺傷するための方法を提供する。１つの実施様態において、方法には少なくとも１つの、好ましくはすべての以下の工程が含まれる。
ａ）多数の細胞を多重特異的結合タンパク質と接触させることであって、この多数の細胞には、抗原を含む免疫細胞およびＭＨＣまたはＨＬＡを含む標的細胞が含まれる。
ｂ）標的細胞上のＭＨＣまたはＨＬＡと免疫細胞上の抗原間の特異的結合複合体（橋）を、免疫細胞を活性化するのに十分に形成させること、
ｃ）活性化した免疫細胞にて標的細胞を殺傷すること。「活性化した（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」の語句が免疫細胞が、たとえば以下で記述するようなサイトカインおよび細胞傷害性アッセイによって決めたように、標的細胞に傷害を与え、殺傷することができることを意味することが認識されるであろう。
【００７０】
望むのならば、上述した方法は細胞培養ディッシュ内のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏで構成されてよい。
【００７１】
本発明の一本鎖および多重鎖多重特異的結合タンパク質はさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用される。
【００７２】
たとえば、本発明の好ましい多重特異的結合分子は、標的細胞と免疫細胞間の橋を検出し、好ましくは形成するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用できる。橋の形成は望ましいＭＨＣ、ＨＬＡまたは抗原マーカーを発現している細胞を単離するのに使用できる。
【００７３】
本多重特異的結合タンパク質はまた、ＭＨＣまたはＨＬＡ分子および細胞表面抗原の検出および解析での使用が明らかである。本結合タンパク質はまた、、病原性特性を持つ免疫系細胞、とりわけＴ細胞の検出のためのような診断目的で使用できる。本結合分子はさらに、機能的な細胞アッセイおよび分子アッセイ、およびＸ線結晶学、核磁気共鳴イメージング、コンピュータグラフィックディスプレイのようなコンピュータ的技術を含む構造解析で使用できる。
【００７４】
他の観点において、本発明はさらに、哺乳動物における標的細胞の存在の減少または除去のための処置方法を提供する。とりわけ、この方法には薬理学的に許容可能な処方での本発明の多重特異的結合分子の投与が含まれる。もし望むならば、特定の多重特異的結合分子のｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ａｇ部分は特定の処置方法を促進するために投与の前または間に取り除くことができる。
【００７５】
さらに特定の実施様態において、この処置方法は癌およびウイルス感染を処置するために使用される。とりわけ、この方法には、薬理学的に効果的な量の本方法の少なくとも１つの多重特異的結合タンパク質を、哺乳動物、とりわけヒト患者に投与することが含まれる。好ましくはこの量は癌および／またはウイルス感染を処置するのに十分である。この方法は、現存する条件の処置に使用してよく、または必要なように予防的に使用してよい。本処置方法はそれ自身で、またはもし望むなら他の治療との組合せで使用してよい。
【００７６】
本発明の好ましい処置方法は、哺乳動物、とりわけ齧歯類またはヒトのような霊長類内の特定の標的細胞の存在を減少させ、または除去する。１つの実施様態において、処置方法には、（たとえばプロテアーゼ処理によって）多重特異的結合分子よりｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ａｂを得ることが含まれる。そうやって入手したｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ａｂは多重特異的結合分子の代わりにまたはそれと一緒に哺乳動物に投与してよい。動物の使用を含むほとんどの適用に対して、たとえば使用している動物と適合性のハプロタイプの免疫グロブリン鎖を使用することによって、本結合分子に対する望ましくない免疫応答を最小化することが好ましいであろう。
【００７７】
（発明の詳細な記述）
以上で要約したように、本発明は、１つの観点において、一本鎖多重特異的結合タンパク質およびそのタンパク質を作製し使用するための方法を特徴とする。本結合分子の好ましい使用には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＨＣ−発現標的細胞に傷害をあたえ、除去（殺傷）させることが含まれる。さらに、より有用である組換え体バクテリオファージ、および望ましい結合分子に対する選別に使用することのできる同様の物を使用する方法を提供する。
【００７８】
本明細書で使用するところの、語句「多重特異的結合タンパク質（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または同様の語句は、好ましくは、１）ＭＨＣまたはＨＬＡ複合体、好ましくはｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ（またはその部分）を発現している細胞標的に結合することが可能な結合領域、２）抗原標的、好ましくは免疫細胞表面上に発現している抗原およびそのエピトープ部分に結合することのできる抗体結合領域を含む一本鎖または多重鎖分子を意味する。好ましくはｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ部分は、ＴＣＲによって特異的に結合することができ、抗原部分は抗体によって特異的に結合できる。好ましい実施様態において、抗原は免疫細胞を示す細胞表面抗原である。さらに好ましい実施様態において、それぞれの結合領域は、異なる時間または同時にｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ、および抗原標的に結合するのに十分である。本明細書で論議したように、結合領域は同一の鎖上（すなわち一本鎖上）に存在してよく、または結合領域は１つ以上の鎖（すなわち多重鎖およびとりわけ２から４鎖であり、２鎖が好ましい）上に存在してよい。
【００７９】
語句「抗体結合領域（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」は抗原またはそのエピトープに特異的に結合することのできる、少なくとも１つ、好ましくは２つの免疫グロブリン不変鎖を含む抗体結合部位を意味する。たとえば、好ましい実施様態において、抗体結合領域は一本鎖構造（ｓｃ−Ａｂ）であり、単一免疫グロブリン不変領域（ＶＬまたはＶＨ）、２つかまたはそれ以上の可変領域（ＶＬ＋ＶＨ；ＶＬ＋ＶＬ；またはＶＨ＋ＶＨ）、またはその相補的な決定領域を含む。好適なｓｃ−Ａｂ抗体結合領域のさらに特定の例は、ｓｃ−Ｆｖ分子である。他の実施様態において、抗体結合領域はさらに、免疫グロブリン不変軽鎖（Ｉｇ−ＣＬ）および／または免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ−ＣＨ）を含む。好ましい例には、Ｆａｂ、Ｆ（ｖ）、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２分子が含まれるが、これに限定はされない。さらに特定の抗体結合領域は以下に議論する。
【００８０】
さらに特定の実施様態において、多重特異的結合タンパク質は、少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲ（または機能的断片）および少なくとも１つのｓｃ−Ａｂ、およびとりわけｓｃ−Ｆｖ（またはその断片）を含む一本鎖構造である。一本鎖多重特異的結合タンパク質には、約１〜５のｓｃ−ＴＣＲ分子および／または約１〜５のｓｃ−Ｆｖ分子が含まれえ、１つのｓｃ−ＴＣＲおよび１つのｓｃ−Ｆｖが一般的にほとんどの適用で好ましい。結合タンパク質が少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖを含むような実施様態において、分子は繰り返しで結合してよく、好ましくは好適なペプチドリンカー配列によって互いに分離される。
【００８１】
本発明のさらに特定の多重特異的結合分子は両特異的結合分子であり、１つのｓｃ−ＴＣＲおよび１つのｓｃ−Ａｂおよびとりわけ１つのｓｃ−Ｆｖ分子を含む。この実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖは好適なペプチドリンカー配列によって分離される。
【００８２】
一般的に、本多重特異的結合タンパク質には前決定された結合特異性が含まれる。すなわち、特定のｓｃ−ＴＣＲまたは抗体結合領域の選択は、意図した対象の使用および標的細胞および免疫細胞のような認識されたパラメータによって導かれる。ほとんどの例において、結合特異性は以下で記述した特定の結合アッセイによって決定されるように異なるであろう。しかしながら、いくつかの実施様態において、同様か、または近く関連した結合特異性によって結合領域を選別するのに有用であろう。望ましい結合領域を選別し、好ましいｓｃ−ＴＣＲおよびsｃ−Ａｂ分子を選択するための方法を以下に記述する。
【００８３】
議論したように、１つの実施様態において、本多重特異的結合タンパク質には、ｐＭＨＣ−またはｐＨＬＡ−発現標的細胞に結合するｓｃＴＣＲまたはその断片が含まれる。さらなる特定の実施様態において、ｓｃＴＣＲは標的細胞上のクラス１またはクラス２  ｐＭＨＣ分子（またはｐＨＬＡ抗原）に特異的に結合するように選択される。分子を作製し使用するための方法を含むｓｃ−ＴＣＲ分子に関連したさらに特定の開示は、１９９７年３月７日に提出された係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号、および１９９７年１０月２日に提出された第０８／９４３，０８６号で開示された。係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号は参考文献として本明細書に組み込む。
【００８４】
本明細書で使用するところの、語句ｓｃ−ＴＣＲ「機能的断片（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、全長ｓｃ−ＴＣＲと比較したときに、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％、そして１００％までかそれ以上のＭＨＣまたはＨＬＡに特異的に結合できる全長ｓｃ−ＴＣＲの部分（すなわち全長Ｖ鎖を含む）を意味する。全長ｓｃ−ＴＣＲは全長Ｖ−αおよびＶ−β鎖を持つ分子と定義する。特異的結合を検出するためのアッセイは以下に論議し、フローサイトメトリーおよびＢｉａＣｏｒｅが含まれる。
【００８５】
すでに言及したように、ｓｃ−ＴＣＲには好適なペプチドリンカー配列を介して共有結合したＴＣＲ  Ｖ−αおよびＶ−β鎖が含まれる。たとえば、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ−末端およびＶ−β鎖のＮ−末端に融合した好適なペプチドリンカー配列を介してＶ−β鎖に共有結合できる。ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質のＶ−αおよびＶ−β鎖は一般的に長さにして２００〜４００のヌクレオチド、好ましくは長さにして約３００〜３５０ヌクレオチドの核酸によってコードされ、天然に存在するＴＣＲのＶ−α鎖およびＶ−β鎖と少なくとも９０％、このましくは１００％同一である。語句「同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は、Ｖ−αまたはＶ−β鎖が相当する天然に存在するＴＣＲ  Ｖ−β鎖またはＶ−α鎖と１００％相同性があることを意味する。ｓｃ−ＴＣＲ  Ｖ鎖に関連しているより特異的な開示について、以下の実施例１〜３、および係眼中米国特許明細書番号第０８／８１３，９８１号および第０８／９４３，０８６号を参照のこと。
【００８６】
すでに言及したように、ｓｃ−ＴＣＲ分子のＶ−α鎖はさらにＶ−β鎖のＣ−末端に融合したＴＣＲ  Ｃ−β鎖またはその断片を含むことができる。さらに、Ｖ−α鎖にはＶ−α鎖のＣ−末端およびペプチドリンカー配列のＮ−末端に融合したＴＣＲ  Ｃ−α鎖またはその断片を含むことができる。一般的に、Ｃ−β鎖断片を含むこれらのｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質内で、断片はおよそ５０〜１２６アミノ酸の長さを持ち、通常位置１２７での最後のシステイン残基を含まない。Ｃ−α鎖を含むこれらの融合タンパク質に関して、長さは、およそ１〜９０アミノ酸の間で変化可能である（すなわち、Ｃ−α鎖は最終システインまでであるが、含まない）。たとえば、１つの実施様態において、融合タンパク質には、アミノ酸１〜７２で始まる約１〜７２のアミノ酸間のＣ−α鎖断片が含まれる。他の実施様態において、Ｃ−α鎖断片は第一アミノ酸から２２（ロイシン）までで始まる約１〜２２アミノ酸間である。Ｃ−α鎖断片は典型的には、２つのシステイン残基を含むＣ∝ ９０バリアントを除いてシステイン残基を含まない。ほとんどの場合、ＣαおよびＣβ鎖長の選択は、特定の多重特異的結合タンパク質の使用を選別し、意図した特定のＶ鎖を含むさまざまなパラメータによって導かれる。ｓｃ−ＴＣＲ  Ｃ−βおよびＣ−α鎖に関連したさらに特定の開示について、以下の議論および以下の実施例１〜２を参照のこと。また係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号を参照のこと。
【００８７】
係願中の米国特許明細書番号第０８／９４３，０８６号で開示されたように、Ｉｇ−ＣＬ鎖またはその適切なＩｇ−ＣＬ断片を加えることによって完全に可溶性で機能的なｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の発現を促進することが可能である。さらに特に、Ｉｇ−ＣＬ鎖または鎖断片はｓｃ−ＴＣＲ分子へ、たとえばＶ−β鎖またはＣ−β鎖のＣ−末端へ共有結合する。一般的には好ましくはないけれども、Ｉｇ−ＣＬまたはその断片はＶ−α鎖のＮ−末端へ共有結合できる。もし望むのならば、Ｉｇ−ＣＬ鎖は多重特異的結合分子内へ組み込む前に取り除くことができる。
【００８８】
以上で議論したように、多重特異的結合タンパク質のｓｃ−ＴＣＲは、さまざまな好適な形式で提供されてよい。たとえば、ｓｃ−ＴＣＲは、２つのペプチドレンカー配列で提供されてよく、そこで、第一ペプチドリンカー配列はＶ−α鎖のＣ−末端とＶ−β鎖のＮ−末端間で融合する。Ｖ−β鎖のＣ−末端はもし望むならばＣ−β鎖のＮ−末端に融合することができる。ついで第二ペプチドリンカーはＶ−β鎖またはＣ−β鎖断片のＣ−末端およびたとえばエフェクターまたはタンパク質タグのＮ−末端に融合する。
【００８９】
他の例示的な実施様態において、多重特異的結合分子のｓｃ−ＴＣＲには、そのＶ−β鎖またはＣ−β鎖断片のＣ−末端およびＶ−α鎖のＮ−末端が共有結合する、好適なペプチドリンカーを介したＶ−α鎖に融合したＶ−β鎖が含まれる。
【００９０】
前記ｓｃ−ＴＣＲ分子はさらに、配列が一般的にさらに対象の抗体結合領域に共有結合するペプチドリンカー配列に融合する。好ましい一本鎖多重特異的結合タンパク質には、配列内に共有結合したｓｃ−ＴＣＲ、ペプチドリンカー配列およびｓｃ−Ｆｖのようなｓｃ−Ａｂが含まれる。
【００９１】
係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号に開示されたように、さまざまなｓｃ−ＴＣＲ分子を作製し、使用することは可能である。とりわけ、ｓｃ−ＴＣＲに、全長または本質的に全長をコードしている配列が簡単に入手できるためのＶα、βが含まれることが一般的に好ましい。細胞源からの全長ＴＣＲ  Ｖ鎖配列を得るための方法は公知である。あるいは、Ｖα、β鎖領域は公に入手できるＶα、β鎖のＰＣＲ増幅によって入手することができる。典型的なＶβ遺伝子配列にはＶβ８．１、Ｖβ６．１、Ｖβ５．１、Ｖβ５．２、Ｖβ５．３、Ｖβ２．１およびＶβ２．３遺伝子配列が含まれる。Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：４０６６；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３）；ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：１８８；Ｌａｈｅｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１５０：４１２５；Ｋｏｔｚｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９１）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：９１６１；Ｕｅｍａｔｓｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８５３４を参考のこと。また、さらなるＴＣＲ  Ｖ−β、Ｖα鎖配列に関して、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  Ｅｄ．）  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＩＨおよびＣｈｏｔｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３７４５を参照のこと。
【００９２】
さらに、以下の実施例１〜３は特異的なＶ−αおよびＶ−β鎖を増幅するＰＣＲに関するオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。また、ＴＣＲ  Ｖ鎖を単離するのに使用できるオリゴヌクレオチドプライマーの例として図２１〜図２６も参照のこと。
【００９３】
生物学的供給源よりＴＣＲ  Ｖ鎖を得ることが望まれる場合、望ましいＴＣＲは、ＴＣＲ  Ｖ領域のエピトープに大部分は結合し、好ましくは特異的であるＴＣＲ−特異的抗体の使用を含む従来の免疫学的方法によって同定できる。一般的に、表面発現は蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーまたは免疫化学のような公知の技術を使用することで検出できる。特異的にＴＣＲ可変領域に結合する多くの抗体が公知である。たとえば発行されたＰＣＴ明細書第ＷＯ９０／０６７５８号を参照のこと。
【００９４】
検出したＴＣＲのＤＮＡまたはＲＮＡは直接的に、または好ましくはＰＣＲ増幅の後に、本技術分野でよく公知のハイブリッド形成方法を使用して、さまざまなＴＣＲ遺伝子ファミリーに対するオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリッド形成することでプローブできる。一般的に、高い厳重さの核酸ハイブリッド形成条件が行われる。本明細書で使用されるところの語句「高い厳重さハイブリッド形成（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」は、０．１×ＳＳＣ中でおよそ６５℃の核酸インキュベーション条件を意味する。欠きＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．を参照のこと。ＴＣＲ  ＤＮＡ配列またはその望ましい部分は、増幅したＤＮＡまたはＲＮＡから直接入手でき、望むように好適なベクター内にサブクローン化できる。
【００９５】
他の方法もＴＣＲ  Ｖ領域ＤＮＡを入手するために公知である。たとえば、Ｖ領域遺伝子を含んでいる望ましいＴＣＲは、ＴＣＲまたは好ましくはＶ領域に相当するその部分を配列決定することによって同定できる。ＤＮＡ配列は、たとえば本技術分野で公知のように好適な配列決定ベクター内にＤＮＡをクローン化した後に、または少なくともＴＣＲの部分のタンパク質配列をまず決定し、ＤＮＡ配列を決定することによって決定できる。当業者に公知の他のものと同様に上述した取り扱いは、望ましいＴＣＲをうまく同定することおよび一本鎖Ｖαβ構造が作製できるようにそのＴＣＲよりＶ領域遺伝子を入手するために使用できることが、本分野の当業者に簡単に明らかであろう。
【００９６】
さらにとりわけ、生物学的供給源よりＴＣＲ  Ｖ領域ＤＮＡを得ることが望ましい場合、望ましいＶ−αおよびＶ−β鎖をコードしているＤＮＡ区画はＴ細胞ハイブリドーマまたは細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）のような細胞から入手することができる。Ｔ細胞（たとえばＴｓ、ＴｃまたはＴＨ細胞）はｉｎ  ｖｉｖｏで入手でき、またはＴ細胞は培養Ｔ細胞ハイブリドーマ（類）であってよい（たとえばＤ１０またはＢ１２細胞株）。以下の実施例１−３および係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号を参照のこと。ＣＴＬｓは非誘導であり得、または齧歯類（たとえばマウス、ラット、ウサギ）または霊長類（たとえばヒトまたはチンパンジー）での病原性の免疫系応答に関連しうる。たとえば、ＣＴＬｓまたは他のＴ細胞は、ライム病、川崎病、らい病、癌（すなわちＣＥＡなどの腫瘍関連抗原に対する免疫応答）または自己免疫疾患、とりわけ移植拒絶に関連したもの、多発性硬化症、インスリン依存糖尿病、リウマチ様関節炎およびアレルギー、または感染疾患、とりわけＲＮＡまたはＤＮＡウイルスを含む感染性疾患を患っているか、持っていると推測される患者から由来してよい。対象の特定のウイルスにはヒト先天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、肝炎、ポックスウイルス、エプスタインバー、アデノウイルスまたはポリオーマウイルスが含まれる。ＣＴＬｓの典型的な供給源は、確立したカルシノーマおよびメラノーマの患者から単離した抗原特異的ＣＴＬｓおよびＴＩＬｓである（たとえば、Ｃｏｘ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６４：７１６；  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８８）３１９：１６７６；  Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１８０：３４７）；  Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（１９９４）９１：６４５８を参照のこと）。
【００９７】
細胞源からＶ−αおよびＶ−β鎖を得ることに関してすでに言及したように、さまざまな異なる手順がそれらから単離された核酸を調製するために使用されてよい。さらにとりわけ、Ｖ−αおよびＶ−β鎖ＤＮＡを調製するためにｍＲＮＡを望ましいＴＣＲ結合特異性を表している細胞より単離する。そのような方法は一般的に、ｍＲＮＡから作製した第一鎖ｃＤＮＡ鋳型を使用した好適なＰＣＲプロトコールの使用を含む。ついで標準の組換え体技術を、望ましいαおよびβ鎖を作製するのに使用できる。次いで望ましいＶ−αおよびＶ−β鎖をコードしているＤＮＡ区画を、望むのならば好適なペプチドリンカー配列およびタンパク質タグを含むように改変する。
【００９８】
一般的に、ＰＣＲ方法での使用のためのＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは長さにして約１２〜５０ヌクレオチド、好ましくは長さにして約２０〜２５ヌクレオチドであり得る。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは好適には、たとえばライゲーション部位を導入するために、必要なように特定の制限酵素開裂部位をＰＣＲ産物に加えるために制限部位を含んでよい。典型的なプライマーは以下の実施例および図にて提供される。産出されたＰＣＲ産物には、増幅したＶ−αおよびＶ−β鎖配列が含まれ、望むように、融合タンパク質の最適な発現のためのリボソーム結合、リーダーおよびプロモーター配列が含まれるように改変できる。
【００９９】
望ましいｓｃ−ＴＣＲ分子をコードしているＤＮＡ区画は、以下および係願中の米国特許明細書番号第０８／９４３，０８６号で開示された方法にしたがって、かなりの量（グラム細胞あたりミリグラム量）作製できる。
【０１００】
本多重特異的結合タンパク質を作製するのに使用するさらに特定のｓｃ−ＴＣＲｓには、哺乳動物由来のＶ−αおよびＶ−β鎖を持つｓｃ−ＴＣＲが含まれる。例には、霊長類、とりわけヒトおよびチンパンジー、齧歯類、たとえばヌードマウスのような免疫学的にナイーブなマウスまたはＨＬＡ−Ａ２抗原複合体を発現することのできるトランスジーンを含むマウス（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，（１９９１）１７５，１００２）が含まれる。対象の特定のヒトには、自己免疫疾患のようなすでに言及した任意の病原を患っているヒトが含まれる。異なる哺乳動物から由来したＶ−αおよびＶ−β  ＤＮＡ配列を含むキメラの構造は、公知の方法に従って構築でき、また本発明の意図の範囲内でもある。
【０１０１】
使用したペプチドリンカー配列を、リガンド結合ポケットを形成するためにＶ−αおよびＶ−β鎖の効果的な配置を可能にするｓｃ−ＴＣＲを作製するために使用することが好ましい。したがって、ｓｃ−ＴＣＲは、好ましくはＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体または小さな分子に関連したスーパー抗原またはペプチド抗原のような望ましいリガンドに特異的に結合することができる。本発明のいくつかの実施様態において、多重特異的結合分子はＴ細胞の表面上の天然に存在するＴＣＲｓと競合させるために使用してよい。「競合する（ｃｏｍｐｅｔｅ）」は、可溶性の融合タンパク質が、同一のリガンドに対するＴＣＲの特異的結合親和性と同等、またはいくつかの例ではそれ以上のレベルでリガンドに結合できることを意味する。たとえば、以下および係願中の米国特許明細書番号第０８／９４３，０８６号に記述された方法に従って、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質（またはそれより由来したｓｃ−ＴＣＲ分子）は、天然に存在するＴＣＲに比べて同等か、またはおよそ２〜１０倍まで高い結合親和性を示すことができる。典型的な結合アッセイは本明細書で開示され、以下および係願中の米国特許明細書で開示された標準のウエスタンブロッティングアッセイおよび表面プラズモン共鳴アッセイが含まれる。
【０１０２】
一般的に、本明細書で開示されたペプチドリンカー配列（ときおり、ポリペプチドリンカー、スペーサー配列、ペプチドリンカーまたは関連した語で表されたもの）が特定の多重特異的結合分子とその結合標的または標的群との間の結合相互作用を最大にするために選択される。たとえば、ｓｃ−ＴＣＲに好適なペプチドリンカー配列は好ましくは、ｓｃ−ＴＣＲが天然に存在するＴＣＲ  Ｖ−αおよびＶ−β鎖のそれとにている特異的結合部位を形成するように選択される。ｓｃ−Ａｂ分子を作製するのに使用されるようなさらなるペプチドリンカー配列もまた、特定の抗原に対する結合を最適化するために選択される。一本鎖構造において、ｓｃ−ＴＣＲをｓｃ−Ａｂに融合しているペプチドリンカー配列は典型的にｓｃ−ＴＣＲ、ｓｃ−Ａｂおよびそれらの結合ユニットの応答性標的の間の相互作用を最大化するように選択される。
【０１０３】
さらにとりわけ、ｓｃ−ＴＣＲのＶαβ鎖を分離しているペプチドリンカー配列は、特異的にリガンドに結合できるポケット内でＶ−鎖を好ましくは自由に配置する。この例における好ましいリガンドは抗原であり、とりわけＭＨＣに関連して提示されたペプチドリガンドである。さらに完全に以下で説明されるであろうように、ｓｃ−ＴＣＲに結合している以下のリガンドは、以下に記述した特定のアッセイによって決定されたようにＴ細胞活性化を調節するのに使用できる。そのようなアッセイの例には、ＴＣＲを発現しているＴ細胞を培養すること、ＴＣＲとリガンドの間の結合を可能にする条件下でｓｃ−ＴＣＲタンパク質（またはそれらから得られたｓｃ−ＴＣＲ）とＴ細胞を接触させること、および次いで可溶性結合タンパク質がＴ細胞の活性を調節できるかどうか評価することの連続した工程を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを含む。
【０１０４】
さらに特定の実施様態において、ポリペプチドリンカー配列には約７〜２５のアミノ酸、さらに好ましくは１０〜２０アミノ酸、またさらに好ましくは約１２〜２０アミノ酸が含まれる。リンカー配列は典型的には、ペプチド抗原のような望ましいリガンドの特異的結合を提供する形態でＶ−αおよびＶ−β鎖を配置するように融合タンパク質内に順応性に配置する。リンカーは好ましくは最適な順応性を提供するために、主にグリシン、アラニンおよびセリンのような小さな側鎖を持つアミノ酸を含む。好ましくは、約８０または９０パーセントかまたはそれ以上のリンカー配列は、グリシン、アラニンまたはセリン残基、とりわけグリシンおよびセリン残基を含む。好ましくは、リンカー配列は、柔軟性を阻害することのできるプロリン残基は含まない。リンカー配列は適切には、Ｖ−α鎖のＣ−末端および融合タンパク質のＶ−β鎖のＮ−末端に結合する。特定のペプチドリンカー配列を作製し、使用することに関連した開示について、以下の実施例１〜３および５を参照のこと。
【０１０５】
さらにとりわけ、本発明に関した好適なペプチドリンカ配列には、（ＧＧＧＧＳ）４配列（すなわちＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のような５〜２５アミノ酸が含まれる。好ましくは、選択したペプチドリンカー配列はＶ−α鎖のＣ−末端残基とｓｃ−ＴＣＲのＶ−β鎖の第一アミノ酸間で共有結合する。さまざまなリンカー配列が、抗体可変領域に結合することで使用するのに適合可能なように開示された（Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：９７−１０５（１９９１））。それらの報告されたペプチドリンカーの多くはｓｃ−ＴＣＲを作製するのに使用できる。
【０１０６】
あるいは、他の好適なリンカー配列が経験的に簡単に同定できる。たとえば、リンカー配列を含む融合タンパク質をコードしているＤＮＡ区画を含んでいるＤＮＡベクターはクローン化し、発現させることができ、分子が抗原を結合できるかどうかを決定するためにその融合分子を試験する。典型的なアッセイは、上記Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅで開示されたような従来の抗原結合アッセイである。あるいは、リンカー配列を含む発現融合タンパク質は、本明細書で開示したアッセイによって決定したようにＴ細胞の活性を調節する能力について試験した。リンカー配列の好適な大きさおよび配列はまた、融合タンパク質の予想された大きさと形に基づいた従来のコンピュータモデリング技術によって決定できる。典型的なペプチドリンカー配列は、ＶαとＶ−β鎖の間のポリペプチドリンカー配列の末端に好適な制限部位（たとえばＸｈｏ１およびＳｐｅ１）を含むようなものである。
【０１０７】
前述の議論が好適なｓｃ−ＴＣＲペプチドリンカー配列の選別に焦点を当てているけれども、同様の考慮が本発明の多重特異的結合分子を作製するために有用な他のペプチドリンカー配列を選別するのに使用できることが理解されるであろう。さらなるペプチドリンカー配列には、ｓｃ−Ａｂを一本鎖構造でｓｃ−ＴＣＲに結合するのに使用したペプチドリンカー配列と同様に、特定の抗体結合領域、とりわけｓｃ−Ａｂを作製するのに使用できる物が含まれる。
【０１０８】
とりわけ、ｓｃ−Ａｂ分子、特にｓｃ−Ｆｖ分子を作製するための好ましいペプチドリンカーは通常構造がらせんである。一般的にそのようなペプチドリンカー配列は、ｓｃ−Ｆｖの適切な折り畳みを促進し、ｓｃ−Ｆｖおよび多重特異的結合タンパク質の溶解度を増強することができる。さらに好ましいペプチドリンカー配列は、約５〜２５アミノ酸、好ましくは約１０〜２５アミノ酸を含む。好適なｓｃ−Ｆｖペプチドリンカー配列に関するさらに特定の開示は、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，６３７，４８１号に見ることができ、その明細書は参考文献に組み入れる。
【０１０９】
さらに好ましいｓｃ−Ｆｖペプチドリンカー配列には以下のペプチド配列が含まれる。（Ｇ４Ｓ）３（すなわち、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）および（Ｇ４ＳＡＰＧ４Ｓ）（すなわち、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）。以下の図１Ｃ〜Ｄおよび実施例４、５を参照のこと。
【０１１０】
ｓｃ−ＴＣＲをｓｃ−Ｆｖに結合させるための好ましいペプチドリンカー配列に含まれるものには、ｓｃ−ＴＣＲを作製するのに使用するペプチドリンカー配列と同一かまたは非常に関連した物がありうる。さらに好ましいのは、以下の配列を持っているペプチドリンカー配列である。（Ｇ４Ｓ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）およびＶＮＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＥＰＶＳＧＳＳＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）。以下の図６および実施例７を参照のこと。
【０１１１】
本結合分子のｓｃ−ＴＣＲは、以上で議論したように調製でき、また以下の実施例のように調製できる。また係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号を参照のこと。一般的に、望ましいＶ−αまたはＶ−β鎖をコードしているＤＮＡはＴ細胞、Ｔ細胞ハイブリドーマ株またはすでに議論したような公的に入手可能なＶ−αおよびＶ−β鎖配列から入手することができる。ＤＮＡはＰＣＲ、クローニングまたは他の好適な方法によって増幅できる。たとえば、望ましいＶ−α鎖をコードしているＤＮＡは好適なベクター内へクローン化でき、ついで望ましいＶ−β鎖および好適な一本鎖リンカー配列をコードしているＤＮＡを、望ましいｓｃ−ＴＣＲを産出するためにクローニングできる。すでに開示したように、いくつかの場合、ｓｃ−ＴＣＲはＣ−αおよび／またはＣ−β鎖断片をコードしているＤＮＡを含む可能性がある。いくつかの例において、Ｉｇ−ＣＬ鎖または断片をｓｃ−ＴＣＲへさらに融合させるのに、たとえばネズミまたはヒトＣκ鎖または好適なＣκ鎖断片に有用である可能性がある。すでに記述したように、Ｃκ鎖をコードしているＤＮＡはＰＣＲ増幅でき、ｓｃ−ＴＣＲをコードしているＤＮＡにライゲーションできる。あるいは、Ｃκ鎖は、欠きＮｅａｒ，ｅｔ  ａｌ．によって開示されたもののようなＤＮＡベクター内に含まれ得る。そこで融合タンパク質をコードしているＤＮＡ区画はＤＮＡベクター内に導入される。そしてＤＮＡベクターを宿主細胞内に発現させ、融合タンパク質を回収し、望むのならば精製する。
【０１１２】
典型的なｓｃ−ＴＣＲは一般的に、配列内に共有結合した、プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖、Ｃ−β鎖断片；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖、Ｃ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖／Ｃκ鎖；またはプロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖、Ｃ−α鎖断片／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖、Ｃ−β鎖断片を含むＤＮＡ区画によってコードされる。さらなるｓｃ−ＴＣＲ分子はＣκ鎖がＤＮＡ区画に融合することを除いて上述したようなものである。ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードしているＤＮＡベクターは、融合タンパク質の可溶性発現のために、本明細書で開示した特定の発現系のようなものを含む望ましい細胞に導入する。
【０１１３】
議論したように、本結合分子の一本鎖可変領域はほぼ任意の好適なＴＣＲまたは免疫グロブリン可変領域より由来しうる。本結合分子のＴＣＲ部分に関しては、好適なＶα、β鎖が、遺伝子発現そして免疫学的誘導が増加するようなものであり得る。ＴＣＲ  Ｖ鎖発現の増加をアッセイするための方法は公知である（たとえば、Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１３１３（１９８８）およびＭａｎｔｇａｚｚａ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３，４３１（１９９０）を参照のこと）。
【０１１４】
さらに特定のｓｃ−ＴＣＲ分子には、公知であるかまだ発見すべきＴＡＡｓに結合することができる分子を含む。典型的なＴＡＡｓにはｐ５３およびＨｅｒ−２  Ｎｅｕが含まれる。
【０１１５】
また議論したように、本多重特異的結合分子はまた、ｓｃ−Ａｂ、とりわけｓｃ−Ｆｖまたはその機能的断片のような抗体結合領域を含む。また議論したように、さまざまなｓｃ−Ｆｖ分子を作製し、利用する方法が開示された。たとえば米国特許第５，６３７，４８１号、上記Ｊｏｓｔ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌおよび上記Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）を参照のこと。
【０１１６】
さらに特定のｓｃ−Ａｂ分子は一般的に、特異的に抗原に結合できる免疫グロブリン鎖を含む。免疫グロブリン鎖は、全長免疫グロブリン鎖、たとえば全長ＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含んでもよく、または１つまたは両方の全長免疫グロブリン鎖の機能的断片を含んでもよい。ｓｃ−Ａｂに関連して使用されるような語句「機能的断片（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、全長免疫グロブリン鎖と比較したときに、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、９０％または９５％または約１００％まで特異的に結合することができるｓｃ−Ａｂを作製する全長免疫グロブリン鎖の部分を意味する。特異的な結合は、ウエスタンブロットや以下に記述のような他の好適な抗体結合アッセイのようなさまざまな技術によって定量できる。
【０１１７】
本発明に関する抗体結合領域のさらなる特定の例には、（１）抗体の単一可変領域（ＶＬまたはＶＨ）、（２）２つまたはそれ以上の一本鎖可変領域（たとえばＶＬ＋ＶＨ：ＶＬ＋ＶＬまたはＶＨ＋ＶＨ）またはその相補的な決定領域（ＣＤＲ）が含まれるが、限定はされない。それぞれの可変領域断片（ＶＬまたはＶＨ）は好ましくはＶＬ＋ＪＬによって、またはＶＨ＋ＤＨ＋ＪＨ配列によってコードされ、およそ１００アミノ酸からなる。これらの配列内で、抗体の連結部位に配列するアミノ酸を含むことが明らかである相補性決定領域（ＣＤＲ）の３つの超可変領域が存在する。ＣＤＲｓはフレーム枠領域（ＦＲ）と呼ばれる可変性が低い４つの領域内に散在する。
【０１１８】
１つの実施様態において、多重特異的結合分子の抗体結合領域は、β−シート構造内へのＶＬおよびＶＨポリペプチドの結合によって形成されえ、ＣＤＲ領域は鎖間のループに、またはその近くに含まれる。時折、ＶＬ＋ＶＬ対またはＶＨ＋ＶＨ対またはＶＬまたはＶＨのみが抗原に結合できる。
【０１１９】
さらに好ましい実施様態において、抗体結合領域はｓｃ−Ａｂ、とりわけ少なくとも１つ、好ましくは１つの以下の、（１）ＶＬ鎖およびＶＨ鎖、（２）ＶＬ鎖およびＶＬ鎖、（３）ＶＨ鎖およびＶＨ鎖、（４）単一ＶＬ鎖または（５）単一ＶＨ鎖を含むｓｃ−Ｆｖである。結合領域には任意の好適なアイソタイプ、たとえばＩｇＧまたはＩｇＭの免疫グロブリン鎖が含まれてよい。
【０１２０】
多重特異的結合領域がｓｃ−Ｆｖのような一本鎖タンパク質として結合した２つの可変領域（たとえばＶＬ＋ＶＨ；ＶＬ＋ＶＬ；ＶＨ−ＶＨ）として存在する抗体結合領域を含む実施様態において、一本鎖タンパク質は、好ましくは２つの可変領域に一緒に結合するためにポリペプチドリンカー配列を含む可能性がある。さまざまなペプチドリンカーがｓｃ−Ｆｖ構造を作製するのに好適であると知られている。たとえば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．（１９８８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９、およびＰｌｕｃｋｔｈｏｒｎ，Ａ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．１０３：１５１を参照のこと。とりわけ好ましいリンカーは以下の一般式、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎをもち、そこでｎは約２〜５であり好ましくは約３である。
【０１２１】
さまざまな免疫グロブリンＶＨおよびＶＬ鎖は核酸およびタンパク質レベルで記述されてきた。たとえば上記のＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９３）でのＤａｖｉｓ、上記Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．、米国特許第５，６３７，４８１号、上記Ｊｏｓｔ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．およびＬｉｎｄｈｏｆｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）およびｔｈｅ  Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｐｔ．Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）を参照のこと。
【０１２２】
すでに言及したように、さまざまなｓｃ−Ｆｖ構造が報告されてきた。この構造は、広いスペクトルの多重特異的結合タンパク質を作製するために、本明細書にしたがって使用できる。一般的に、一本鎖抗体を作製し使用することに関連した開示について、Ｐａｓｔａｎ，Ｉ  ａｎｄ  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｄ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１１７３、Ｗｅｂｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５），３２：２４９および発行されたＰＣＴ明細書番号第ＷＯ９６／０５２２８号および第ＷＯ９７／２８１９１号を参照のこと。
【０１２３】
さらに特定のＳｃ−Ｆｖ分子は、糖タンパク質およびリポタンパク質のような細胞表面に特異的に結合することが可能なものである。特定の糖タンパク質の例には、ＣＤ３／ＴｃＲおよびＣＤ２８が含まれるが、限定はされない。これらの分子または他の表面分子に結合するｓｃ−Ｆｖ分子を生成し、特性化することに関連した開示としてＧｉｌｌｉｌａｎｄ  Ｌ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７：１を参照のこと。さらなる特定のｓｃ−Ｆｖ構造は、Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１９１およびＹｏｋｏｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：３４０２に開示された。
【０１２４】
特定のｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ａｂ鎖に関連した追加的な配列情報は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３８Ａ，８Ｎ０５，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４にあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）−Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（Ｇｅｎｂａｎｋ）より入手可能である。Ｇｅｎｂａｎｋはまた、インターネット上で、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．にて入手可能でもある。Ｇｅｎｂａｎｋの説明に関して、Ｂｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：１を参照のこと。
【０１２５】
本発明の多重特異的結合タンパク質のＩｇ−ＣＬ鎖はκまたはλ−型免疫グロブリン軽鎖領域である。κ−型免疫グロブリン軽鎖定常領域はしばしば本明細書で「Ｃｋ鎖（Ｃκ  ｃｈａｉｎ）」と表し、一方λ−型免疫グロブリン定常鎖軽鎖領域はよく「Ｃλ鎖（Ｃλ  ｃｈａｉｎ）」として表す。たとえばＩｇ−ＣＬ鎖は、Ｃκまたは以下に開示したもののようなそれらの好適な断片であり得る。さらに、多重特異的結合タンパク質のＩｇ−ＣＨ鎖は望まれるようにμ、δ、γ、α、ε型でありうる。好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は公知である。
【０１２６】
表したように、本多重特異的結合分子は完全に機能的であり、可溶性である。語句「完全に機能的（ｆｕｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」または同様の語句は、結合分子が、結合することを意図したものである他の分子に特異的に結合できることを意味する。さらにとりわけ、本発明の結合分子は、もしこの分子のｓｃ−ＴＣＲ部分がｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ（またはその部分）に特異的に結合できる場合に完全に機能的である。この語句はまた、結合分子のｓｃ−Ｆｖ部分が、抗原またはその部分に特異的に結合できることを意味する。対象の多重特異的結合分子とｐＭＨＣ（ｐＨＬＡ）または抗原間の特異的な結合を検出するためのアッセイには、ウエスタンブロットおよび以下に記述したような他の標準のアッセイが含まれる。
【０１２７】
語句「特異的な結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」または類似の語句は、他の分子に結合する、したがって特異的結合対を形成する本明細書で開示した分子を意味する。しかしながら、この分子はたとえばウエスタンブロッティングＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、移動度シフトアッセイ、酵素−免疫アッセイ、コンペティティブアッセイ、飽和アッセイまたは本技術分野で公知の他のタンパク質結合アッセイによって決定されたように他の分子を認識し、または結合できない。一般的に、分子間の特異的結合を検出するための方法の例として、以下のＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．、以下のＳｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．、上記のＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅおよびそこに引用された参考文献を参照のこと。
【０１２８】
語句「完全に可溶性（ｆｕｌｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ）」または類似の語句によって、融合タンパク質は、水溶性緩衝液、たとえば細胞培地から低Ｇ力遠心下で簡単に沈降しないことを意味する。さらに、本発明の特定の多重特異的結合分子は、もし低濃度の陽イオンまたは非イオン界面活性剤の存在下またはない条件で、約５〜３７℃より高い温度、および中性ｐＨ付近にて水溶性の溶液内に残ることができれば可溶性である。これらの条件下、可溶性タンパク質はしばしば低沈降値を持ち、たとえば約１０〜５０スヴェードベリ単位より小さい。本明細書で参考として引用した水溶性の溶液は、典型的にはｐＨを確定するための緩衝化合物を持ち、典型的には約５〜９のｐＨ範囲内であり、約２ｍＭ〜５００ｍＭの間のイオン強度範囲である。時折、プロテアーゼインヒビターまたは穏やかな非イオン性界面活性剤を加え、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質を望む場合に数ｍｇ／ｍｌまで加えてよい。典型的な水溶性の緩衝液には、標準のリン酸緩衝液食塩水、トリス緩衝食塩水、または他の公知の緩衝液および細胞培地調製物が含まれる。
【０１２９】
従来通りに、細胞、遺伝的、化学的および生化学的方法を含む、本明細書で開示した多重特異的結合分子を結合するための様々な方法がある。評価されるであろうように、本発明の特定の多重特異的結合分子は化学的架橋、ジスルフィド結合による天然の架橋、ジスルフィド結合なしの天然の結合によって結合（架橋）でき、また遺伝的にコードされたペプチドリンカーによって連結できる（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：上記Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）たとえば、望ましい多重特異的結合分子間の結合には一般的に、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−ＤａｙのＭｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ．（１９７４）で記述されたもののような標準のタンパク質共役反応が含まれる。Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  ＰｒｅｓｓのＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）も参照のこと。
【０１３０】
さらに、本発明の多重特異的結合複合体は意図する使用に適するためにさまざまなよく公知の方法で改変できることが認識されるであろう。たとえば、複合体は発行されたＰＣＴ明細書番号第ＷＯ／２９３５０号にみられる公知の方法に従ってジスルフィド安定化が可能である。
【０１３１】
本結合分子はまた、デンドリマーと呼ばれる不活性ポリマーを使用することによって作製できる。さらに特定の実施様態において、特定のデンドリマー、ジャニス（Ｊａｎｉｃｅ）表面デンドリマーとして知られるものは、本結合分子の部分と一緒に連結または共役するのに使用できる。本発明の１つの特定の実施様態において、ｓｃ−Ｆｖ分子は、抗体をとりわけジスルフィド結合を介してデンドリマーへ架橋するのに使用できるＣ−末端システイン残基を含むように作製できる。そしてｓｃＴＣＲは遊離アミノ基を介してデンドリマーへ共役する。好ましい得られた産物は、安定多機能デンドリマー分子である。以下実施例１９を参照のこと。
【０１３２】
以上で議論したように、本発明は少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲおよび抗体結合領域を含む多重鎖多重特異的結合タンパク質を特徴とする。１つの実施様態において、結合タンパク質は以下の一般式によって表され、
0004467188.tif 000002
式中
ａ）Ａは抗体結合領域またはその機能的断片を表す。
ｂ）Ｂ１、Ｂ２はそれぞれ独立して同一のまたは異なる連結分子である。
ｃ）Ｃ１、Ｃ２はそれぞれ独立して−Ｈまたはタンパク質タグである。
ｄ）Ｄは少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲ分子またはその機能的断片を表す。
【０１３３】
上記式に関して、一本線は共有結合（たとえばペプチド結合）を表し、一方二本線は１つまたはそれ以上の共有結合、たとえば免疫グロブリン重鎖を結合するもののようなジスルフィド結合を表し、または二重線は水素結合を表す。角形括弧は角形括弧の分子（すなわちサブユニット）の配列的な配置での柔軟性を指し示す。したがって、サブユニットの順番は、それぞれのサブユニットが意図するような機能を発揮する限りは、重要ではない。
【０１３４】
以上で示した式において、サブユニットＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、およびＤはそれぞれ独立して、好ましくは１つまたは多数の分子を表す。ＡまたはＤが多数の分子を表す例において、それぞれの分子は好ましくは同一の型の分子に結合する可能性がある（たとえば他のｓｃ−ＴＣＲに融合したｓｃ−ＴＣＲ、他のｓｃ−Ｆｖに融合したｓｃ−Ｆｖ）。好ましくは多数のそれぞれの分子は好適なペプチドリンカー配列によって他より間隔があく。結合した分子の数は意図した使用に依存して変化してよく、しかし、一般的に２〜１０、好ましくは２〜５、さらに好ましくは２のそれぞれの分子であり、最も好ましくは１分子である。以上で記述したそれぞれのサブユニットは直接的に他のサブユニットに結合でき、または、たとえば柔軟性または結合親和性を増強するために、それらより好適なペプチドリンカーによって間隔があいてよい。
【０１３５】
以上で表した多重鎖多重特異的結合分子の特定の実施様態において、ＡはＦ（ｖ）またはｓｃ−Ｆｖ分子を表し、Ｄはｓｃ−ＴＣＲ分子を表し、Ｃ１およびＣ２それぞれは−Ｈである。
【０１３６】
さまざまな連結分子が本発明にしたがって使用することができる。たとえば、１つの実施様態において、上記式中のＢ１、Ｂ２はそれぞれ、たとえば、ＲＩＡ、ウエスタンブロッティングまたは他の好適な結合アッセイによって決定したように、特定の結合複合体を形成することのできる免疫グロブリン鎖または好適なその断片を表すことができる。より特定の実施様態において、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ、免疫グロブリン重鎖から全体または部分的に由来する。この実施様態において、この連結分子は、もしこの分子が特定の結合対を形成できるならば、同一または異なるクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥクラス）であり得る。さらに、キメラ免疫グロブリン重鎖からなる連結分子は本発明の範囲内である。好ましい連結分子には、全長免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ−ＣＨ）またはＣＨ１、ＣＨ１−ＣＨ２、ＣＨ１−ＣＨ３およびＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨＨ３のようなその断片が含まれる。さらに好ましい断片は他の好適な免疫グロブリン鎖または断片との少なくとも１つのジスルフィド結合を形成することができる。とりわけ好ましい連結分子の対はＩｇＧアイソタイプを持っている免疫グロブリン重鎖の対である。
【０１３７】
他の実施様態において、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ、その軽鎖がＲＩＡ、ウエスタン免疫ブロットまたは他の好適な結合アッセイによって決定したような特定の結合対を形成することができるならば、同一または異なる免疫グロブリン軽鎖である。好適な免疫グロブリン軽鎖連結分子は全長またはその断片であってよく、κまたはλ型であり得る。評価されるであろうように、結合分子の好適な断片は、本明細書で記述したアッセイによって決定したように特異的結合対を形成することができるものである可能性があり。
【０１３８】
さらに、本発明にしたがった免疫グロブリン連結分子は、動物（たとえばマウスまたはラットのような齧歯類）、またはヒト由来であってよく、またはキメラまたはヒト化してよい（たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８１，６８５１（１９８４）；  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２（１９８６）を参照のこと）。典型的な連結分子には、以下に記述した坑−イデオタイプ抗体、同様に商業的に入手可能な坑−イデオタイプ抗体によって特異的に結合されることができるものが含まれる。たとえば、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（４０  Ｇｌｅｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４９４１）およびｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ  ２０８５２を参照のこと。
【０１３９】
多重鎖多重特異的結合タンパク質のさらに特定の例を図７Ａに表す。この図において、結合タンパク質には、第一免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ−ＣＨ）に結合したｓｃ−ＴＣＲが含まれる。第一Ｉｇ−ＣＨは第二Ｉｇ−ＣＨに結合し、特異的結合対を形成する。第二Ｉｇ−ＣＨは、第一免疫グロブリン重鎖のような同一のアイソタイプ（ＩｇＧ）であり、さらにハイブリドーマ細胞によって産出されたＦ（ｖ）に結合する。ｓｃ−ＴＣＲはさらにハイブリドーマ細胞が産出した免疫グロブリン軽鎖に結合する。さらなる多重鎖多重特異的結合複合体（ときおり「キメラ両特異的（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」分子または抗体として表す）は、他のハイブリドーマ細胞または他のｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ分子を用いて作製できる。
【０１４０】
すでに言及したように、本発明はまた、非免疫グロブリン連結分子を含む多重特異的結合タンパク質を特徴とする。たとえば、以上で示した式中のＢ１およびＢ２はそれぞれ、たとえばヘリックス−ターン−ヘリックスまたはロイシンジッパーモチーフのようなタンパク質−タンパク質結合モチーフを含む（またはからなる）ポリペプチドであり得る。これらの結合モチーフの多くの例は、記述されてきており、本技術分野で公知である。たとえばＨｏｒｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１；  Ｋａｍｔｅｋａｒ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１６８０；  Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２３６：１３５６を参照のこと。
【０１４１】
さらにとりわけ、Ｂ１およびＢ２のそれぞれは、特異的結合対を形成することのできるタンパク質−タンパク質結合モチーフからなるポリペプチドでありうる。たとえばＢ１およびＢ２はそれぞれ、ｆｏｓまたはｊｕｎのような転写因子のタンパク質−タンパク質結合モチーフであり得る。タンパク質−タンパク質結合モチーフのさらに特定の例には、ｂｉｒＡ（ＬＸＬＩＦＥＡＱＫＩＥＷＲ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）、アビジン（ＡＲＫＣＳＬＴＧＫＷＴＮＤＬＧＳＮＭＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）、ＥＥ（ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）、６ＸＨＩＳ（ＧＭＡＨＨＨＨＨＨ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）、ｆｏｓ／ｊｕｎおよび（ＴＰＰＰＥＰＥＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９）が含まれる。Ｒｈｉｎｄ，Ｓ．Ｋ．（１９９２）米国特許第５，３５４，５５４号、Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９４、Ｓｈａｔｚ，Ｐ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１１３８を参照のこと。また以下の実施例１−３も参照のこと。
【０１４２】
議論したように、本発明は、一本鎖および多重鎖多重特異的結合タンパク質（またはその部分）をコードしているポリヌクレオチドを提供する。１つの実施様態において、多重特異的結合タンパク質は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらのキメラであり得るポリヌクレオチドによってコードされている。典型的には、ポリヌクレオチドには結合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列（区画）を含みまたはそれらからなる可能性がある。
【０１４３】
たとえば本発明にしたがったポリヌクレオチドには、典型的には、望まし細胞処理シグナルを産出するために駆動可能な結合リーダー配列が含まれる。このリーダー配列は、ｓｃ−ＴＣＲ分子をコードしているＤＮＡ配列の５’末端に融合できる。特に、リーダーはＶ−α鎖、またはいくつかの実施様態ではｓｃ−ＴＣＲのＶ−β鎖をコードしているＤＮＡ配列の５’末端に共有結合できる。他の実施様態において、リーダーはｓｃ−Ａｂ、とりわけｓｃ−Ｆｖに融合する可能性がある。さらに特定の実施様態において、リーダー配列は、ｓｃ−ＦｖのＶＨ鎖またはＶＬ鎖に融合できる。しかしながら、特定のリーダー配列は特定のｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖ配列に結合するけれども、リーダー配列はしばしば、融合タンパク質の処理の有害な効果なしで組換え体技術を用いて変更できる。したがって１つの実施様態において、Ｖ−α鎖の５’末端は好適なリーダー配列の３’末端に共有結合する。
【０１４４】
さまざまな特定のリーダー配列がポリヌクレオチドと共に使用できる。１つの実施様態において、リーダー配列は長さにして約１２〜２６アミノ酸残基である。特定の実施様態において、微生物発現ベクター内への挿入のために設計したＤＮＡ配列にはＰｅｌ  Ｂリーダー配列を含みうる。あるいは、哺乳動物発現ベクター内への挿入に対するＤＮＡ区画には、哺乳動物Ｃκリーダー配列のようなＩｇ−ＣＬリーダーが含まれてよい。典型的なＣκリーダーは以下に提供される。
【０１４５】
さらに、少なくとも１つの多重特異的結合タンパク質の部分、とりわけ以上で示した式にて表したある多重鎖多重特異的結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが提供される。さらに特定の実施様態において、部分は少なくともＡ−Ｂ１またはＤ−Ｂ２サブユニットをコードするのに十分である。以下の実施例８、９および１２を参照のこと。
【０１４６】
本発明にしたがったさらなるポリヌクレオチドには、本発明の一本鎖多重特異的結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。さらにとりわけ、ポリヌクレオチドは通常、プロモーター、転写開始シグナルおよび駆動可能に配列に結合したリーダー配列が含まれる可能性がある。微生物宿主内での最適な発現のために、プロモーターは好ましくはｐｈｏＡであり、リーダーは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｐｅｌＢである。もし望むのならば、ＤＮＡ配列はさらに、遺伝子１０配列からのリボソーム結合部位を含む。真核生物宿主内での最適な発現に対して、プロモーターは好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー成分に駆動可能に結合したＣＭＶプロモーターであり、リーダーはマウスカッパ鎖リーダーである。語句「駆動可能に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、駆動可能に（すなわち機能的に）ポリヌクレオチド、または与えられた区画または配列から上流（５’）または下流（３’）に結合した遺伝的配列を意味する。
【０１４７】
本発明にしたがったさらなるポリヌクレオチドは、それぞれ独立して、好適なバクテリオファージコートタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に融合した少なくとも１つのｓｃ−ＴＣＲおよび少なくとも１つのｓｃ−Ｆｖをコードする。好ましくは、バクテリオファージコートタンパク質は遺伝子８または遺伝子３タンパク質である。ポリヌクレオチドを作製し、使用するための方法は係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号に記載された。またバクテリオファージ融合タンパク質の構築および使用に関連した開示について、米国特許第５，７５９，８１７号も参照のこと。
【０１４８】
本発明のさらに特定のポリヌクレオチドには、好適なペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖のＮ−末端に共有結合したＶ−α鎖を含むｓｃ−ＴＣＲをコードしているＤＮＡ配列が含まれる。好ましくは、このＤＮＡ配列はさらに抗体結合領域、特に好適なペプチドリンカー配列によってｓｃ−ＴＣＲより分離した以上で議論したｓｃ−Ｆｖをコードする。
【０１４９】
本多重特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、公的に入手可能なＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含むさまざまな供給源より入手できる。１つの実施様態において、ポリヌクレオチドは好適な原核または真核細胞発現系内で分子を発現できるＤＮＡベクター内で提供される。議論したように、本発明のポリヌクレオチドはプロモーター、リーダーおよび望ましい細胞発現系でｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現を駆動するのに最適なエンハンサー配列のような駆動可能に結合した転写成分を含んでよい。あるいは、ＤＮＡベクターは制御成分のいくつかまたはすべてを提供するように選択してよい。
【０１５０】
本明細書で使用するところの語句「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、典型的に結果として対象の核酸区画、たとえば本明細書で記述したような多重特異的結合分子をコードしているポリヌクレオチドの発現となる宿主細胞内への組み込みおよび複製されうる核酸配列を意味する。ベクターには、たとえば直線核酸区画または配列、プラスミド、コスミド、酵母人工クロモソーム（ＹＡＣｓ）、ファージミドおよび特別クロモソームＤＮＡが含まれうる。とりわけ、ベクターは組換え体ＤＮＡであり得る。また本明細書で使用するところの「発現（ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ）」または「遺伝子発現（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、ＤＮＡの転写およびＲＮＡ転写物の翻訳を含む対象の核酸配列のタンパク質産物の産出を表すことを意味する。典型的に、本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をコードしているＤＮＡ区画はベクター、好ましくはＤＮＡベクター内に挿入され、好適な宿主細胞内でＤＮＡ区画を複製する。
【０１５１】
本発明のさらに特定のＤＮＡベクターには、意図した宿主内での発現を最適化するために選別した調節成分が含まれる可能性がある。たとえば、微生物宿主での使用のためのＤＮＡベクターには、ｔｒｐオペロンプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃプロモーター、ｌａｃｕｖｓまたはｐｈｏＡプロモーターのようなプロモーターが含まれうる。典型的なプロモーターは、およそ数時間（たとえば２〜１０時間）持続したゆっくりとした誘導条件の間の強力な、制御された発現を提供するｐｈｏＡのようなものである。好適な培養条件下、最も強力なプロモーターは、総宿主細胞タンパク質のおよそ１０％まで、またはそれを超えたレベルで可溶性の融合タンパク質を提供することができる。微生物細胞内でｓｃ−ＴＣＲを含む融合タンパク質の発現のための好ましい条件に関するさらなる開示について、係願中の米国特許明細書第０８／８１３，７８１号を参照のこと。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施様態において、対象の多重特異的結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、望ましいＤＮＡベクター内へ組換え的に作製される可能性がある。たとえば、望ましいＴＣＲまたは免疫グロブリン鎖をＰＣＲ増幅させる実施様態において、オリゴヌクレオチドプライマーには通常、ポリヌクレオチドがもう１つの望ましいＤＮＡで置換されうるように、プライマーの両末端に好適な制限部位を設定する。したがって、本発明の好適なＤＮＡベクターは、望ましい結合分子が簡便にベクター内に挿入できるものである。時折、ｓｃ−ＴＣＲ／ＩｇＧ、またはｓｃ−ＴＣＲまたは免疫グロブリン重鎖またはその断片間の融合が望ましい場合のように、Ｉｇ−ＣＬ鎖または鎖断片がベクターによってコードされる可能性があり、ライゲーションによってＤＮＡ区画へ融合する可能性がある。他の場合、Ｉｇ−ＣＬ鎖または断片は、ベクターへのライゲーションの前に、ＤＮＡ区画へ融合する可能性がある。
【０１５３】
一般的に、本多重特異的結合タンパク質の調製は、本明細書に開示された特定の手順および認識されている組換え体ＤＮＡ技術によって遂行できる。たとえば、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素でのＤＮＡ開裂、ＤＮＡのライゲーション、ＤＮＡの細胞内への導入、細胞の培養、および発現したタンパク質の単離と精製は公知の技術である。一般的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．１９８９）のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１５４】
さらに特定の戦略が、本明細書で記述した多重特異的結合分子を発現するために使用できる。たとえば、ひとつのアプローチで、本対象の多重特異的結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、ベクターを先に決めておいた部位で制限処理するために酵素を使用し、次いでＤＮＡをベクター内にライゲーションすることによるような公知の方法にてＤＮＡベクター内へ組み込むことができる。次いでＤＮＡ配列を含んでいるベクターを結合タンパク質の可溶性発現のために好適な宿主内へ導入する。好適なベクターの選別は経験的にクローニングプロトコールに関連する因子に基づく。たとえば、ベクターは使用している宿主細胞に適応可能であり、適切なレプリコンを持っているべきである。さらに、ベクターは発現させるべきタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に適応できなければならない。ベクターはたとえばＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎより入手可能なｐＣＤＮＡ３などの、宿主細胞内で可溶性タンパク質を発現することが可能なものである。また哺乳動物、細胞での使用のための他の好適なベクターに関して上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．および上記Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．も参照のこと。典型的に、微生物での発現のために設計したおよび可溶性融合タンパク質をコードしているＤＮＡベクターは、これらの配列がＲＮＡスプライシングが可能な哺乳動物細胞での発現のために設計した、ベクター内に含まれてよいが、全長ＣλまたはＣκイントロンは含まない可能性がある。
【０１５５】
さらに好ましいＤＮＡベクターは真核細胞、とりわけ哺乳動物細胞内で多重特異的結合タンパク質を発現するように設計する。このＤＮＡベクターは、もしのぞむのならば、好適な量のＤＮＡベクターを入手することのできるように、微生物宿主内での複製のために設計できる。たとえば、ＤＮＡベクターには通常（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での複製開始（Ｏｒｉ）機能、（ｉｉ）選別可能な抗生物質耐性遺伝子（たとえばＡｍｐ、Ｔｅｔ、ＮｅｏまたはＫａｎ耐性）、（ｉｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような強力なウイルスプロモーターおよび最適なＣＭＶエンハンサー成分、（ｉｖ）Ｉｇ−ＣＬリーダー配列、（ｖ）対象のｓｃ−ＴＣＲ分子、（ｖｉ）Ｉｇ−ＣＬエクソンに結合した全長Ｉｇ−ＣＬイントロン、（ｖｉｉ）たとえばウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）ポリＡ配列のような成長ホルモンポリアデニル化配列、（ｖｉｉｉ）抗生物質耐性遺伝子に結合し、ウイルスポリアデニル化配列（たとえばＳＶ４０ポリＡ配列）に融合した強力なウイルスプロモーター（たとえば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターのような）選別可能真核生物マーカーをコードしているＤＮＡが含まれる可能性がある。あるいは、ＤＮＡベクターは、（ｖｉ）のＩｇ−ＣＬエクソンに結合した全長Ｉｇ−ＣＬイントロンをのぞき、上記（ｉ）−（ｖ）および（ｖｉｉ）−（ｖｉｉｉ）のすべてを含みうる。典型的なＩｇ−ＣＬリーダー配列はマウスカッパリーダーである。全長Ｉｇ−ＣＬイントロンおよびエクソンの例は全長Ｃκ遺伝子である。
【０１５６】
本一本鎖多重特異的結合タンパク質を哺乳動物細胞内で発現するための特に好ましいＤＮＡベクターの例は図５で図示したｐＳＵＮ２７ベクターである。ｐＳＵＮ２７ベクターの構造および使用は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号ですでに記述された。ｐＳＵＮ２７ベクターは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９でのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にブタベスト条約にしたがって寄託された。このＤＮＡベクターは１９９７年９月１７日にＡＴＣＣに寄託され、指定受け入れ番号は２０９２７６であった。ｐＳＵＮ２７ベクターにはＣＭＶプロモーター、ネズミ軽鎖リーダー配列、コザック共通配列およびネズミＣκ遺伝子イントロンおよびエキソン配列が含まれる。また、ネズミ重鎖配列に関連したより特別の開示に対して、Ｎｅａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９０）も参照のこと。
【０１５７】
さらに好適なのは、望ましいｓｃ−ＴＣＲまたは機能的断片を免疫グロブリン重鎖または断片に結合するために好適であるＤＮＡベクターである。たとえば、１つの実施様態において、ＤＮＡベクターは望むのであれば、微生物宿主内で複製できる。とりわけ、ＤＮＡベクターには通常（Ｉ）大腸菌内の複製開始（Ｏｒｉ）機能、（ｉｉ）選別可能な抗生物質耐性遺伝子（Ａｍｐ、Ｔｅｔ、ＮｅｏまたはＫａｎ）、（ｉｉｉ）ＣＭＶプロモーターのような強力なウイルスプロモーターおよび最適なＣＭＶエンハンサー成分、（ｉｖ）ＶＨ鎖または断片、（ｖ）ＣＨ鎖、（ｖｉ）たとえばｂｇｈポリＡ配列のような成長ホルモンポリアデニル化配列、（ｖｉｉ）抗生物質耐性遺伝子に結合し、ウイルスポリアデニル化配列（たとえばＳＶ４０ポリＡ配列）に融合した強力なウイルスプロモーター（たとえば、ＳＶ４０プロモーター）が含まれる可能性がある。
【０１５８】
望ましいｓｃ−ＴＣＲを免疫グロブリン鎖に結合するための特に好ましいＤＮＡベクターの例は図８で示したｐＳＵＮ７である。
【０１５９】
本発明のＤＮＡベクターは、哺乳動物細胞での発現を最適化するために従来の技術にしたがって改変できる。たとえば、上記のｐＳＵＮ２７またはｐＳＵＮ７のネオマイシン耐性遺伝子をコードしている真核生物マーカーは、ＴＫ−（ＴＫ欠損）哺乳動物細胞内でのｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の発現を促進するためにチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードしているＤＮＡで置換できる。ＤＮＡベクターは本技術分野でよく公知の他の方法（たとえば、望ましい哺乳動物細胞でのｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質発現を最適化するためのプロモーター、抗生物質耐性遺伝子の変更、ＣＭＶプロモーターの免疫グロブリン、ＳＶ４０、アデノウイルスから得られるプロモーターまたはパピローマウイルスプロモーターでの置換）で改変できる。あるいは、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、望ましいように酵母または昆虫細胞での発現に好適な公知のベクター内へ挿入できる。たとえば、上記Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．および下記Ｓｕｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈを参照のこと。
【０１６０】
微生物内での望ましい結合タンパク質の複製および発現ためにとりわけ設計されたＤＮＡベクターには、たとえば、（ｉ）大腸菌内での、たとえばｐＢＲ３２２より、好ましくはよく公知のｐＵＣ１９ベクターから由来する複製機能の開始点、（ｉｉ）たとえばアンピシリンおよび／またはネオマイシン耐性遺伝子のような選別可能な抗生物質耐性遺伝子、（ｉｉｉ）たとえば、大腸菌ｔｒｐオペロンの終止領域のような、転写終止領域、（ｉｖ）たとえばｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｔａｃ−ｌａｃ、ｌａｃＺ、ｌａｃｕｖｓ、Ｔ７またはＴ３プロモーターのような転写プロモーター、（ｖ）たとえばｐｅｌＢまたはｏｍｐＡリーダーのようなリーダー配列、（ｖｉ）好適なペプチドリンカー配列を介して望ましいｓｃ−Ｆｖに融合したｓｃ−ＴＣＲをコードしているＤＮＡ配列、（ｖｉｉ）たとえば、大腸菌のリボソームＲＮＡ座からのＴ１Ｔ２配列のような転写ターミネーターが含まれる。あるいは、ベクターは、ｓｃ−ＴＣＲがＩｇ−ＣＬ鎖または断片に融合するように提供されることを除き、上記（ｉ）−（ｖｉｉ）を含みうる。
【０１６１】
好適な宿主細胞は、レトロウイルス転送、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、カルシウム−、リポソーム−またはポリブレン−仲介トランスフェクション、バイオリスティック転送、または本分野で公知の他の技術を含む様々な方法によって形質転換できる。
【０１６２】
すでに言及したように、いくつかの場合、非哺乳動物細胞での多重特異的結合タンパク質を発現することが望ましい可能性がある。たとえば、微生物での融合タンパク質の発現に対する好適な宿主細胞には、簡単に形質転換でき、すばやく培養培地内で増殖を示すことができる細胞が含まれる。とりわけ好ましい宿主細胞には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが含まれる。他の宿主細胞には、たとえばＳ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞発現のための典型的な細胞は、Ｓｆ９細胞のようなバキュロウイルスによって感染可能なものである。また、Ｓｕｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９８８）  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓも参照のこと。
【０１６３】
以下の例で、哺乳動物起源の細胞を使用するが、原則として、任意の真核細胞が本目的発明の実施で有用である。例には初代細胞、たとえば繊維芽細胞のようなヒト細胞およびヒツジ、ブタ、ネズミ、およびウシ細胞のような他の動物からの細胞が含まれる。哺乳動物細胞の特定の例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞が含まれる。
【０１６４】
一般的に、細胞培養条件は、安定に形質導入またはトランスフェクトした細胞株が、たとえば公的な細胞選別マーカーをベクター内へ組み込むこと（たとえば、抗生物質耐性遺伝子またはＧ４１８）によって選別されるように使用される。本発明の望ましい多重特異的結合タンパク質を発現する細胞は、たとえば特異的に望ましい部位で結合分子に結合する市販され入手可能なモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイによってのような、公知の手順によって決定できる。そのような部位の例には、ｓｃ−ＴＣＲのＶ−αまたはＶ−βまたは抗体結合部位の可変鎖、たとえばｓｃ−ＦｖのＶＨまたはＶＬ鎖が含まれる。あるいは、多重特異的結合分子に免疫グロブリン重鎖、たとえはｓｃ−ＴＣＲ／ＩｇＧ分子が含まれる実施様態において、モノクローナル抗体は特異的にＣκまたはＣλ鎖（または断片）に結合するものを選択できる。モノクローナル抗体および好適なアッセイの例は、以下の実施例にて提供される。
【０１６５】
もし含まれるのであれば、ＤＮＡベクター内のリーダー配列は、好適には宿主細胞膜または宿主細胞培地への結合タンパク質の発現を指向し、たとえば対象のＶ−α鎖をコードしているＤＮＡがこの構造と共有結合できる制限部位を含むように設計できる。好適には、制限部位は、ときおり連結配列として本明細書で表す、たとえば長さにして約２〜１０コドンのリーダー配列の３’末端内へ挿入し、Ｖ−α鎖に対するコドン領域が典型的にＶ−αコドン領域の第一アミノ酸であるように、Ｖ−α鎖に結合する。あるいは、リーダー配列はｓｃ−Ｆｖ鎖のＶＨまたはＶＬコドン領域に結合できる。ベクター構造内へのＶ−α鎖の簡便な挿入を増加させるために、他の開裂部位はＶ−α鎖コード領域前に挿入できるけれども、たとえば、１つの制限部位はＳｆｉ１部位である。以上で議論したように、第二制限部位との組合せでのそのような制限部位の使用は、典型的にＶ−α鎖のはじめに位置し、広い範囲のＶ−α鎖またはＶ−α、Ｃ−α鎖をコードしている配列のすばやく、簡単な挿入を可能にする。好ましいリーダー配列は強力な転写開始部位を含み、ときおり、そのｍＲＮＡの３’−末端にキャップ部位を含むことができる。以上で言及したように、典型的なリーダー配列には、微生物発現に対してｐｅｌＢおよびＯｍｐＡ、哺乳動物発現に対してＣκマウスカッパ鎖リーダー配列を含む。
【０１６６】
本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは同様のものをコードしているベクターを単離するための方法を含む。一般的に、この方法には、ベクターまたはポリヌクレオチドを望ましい宿主細胞へ導入すること、細胞を培養すること、およびコードされた多重特異的結合分子（またはその部分）を宿主細胞から精製し、本質的に純粋なタンパク質を得ることが含まれる。ベクターまたはポリヌクレオチドはまた、標準の方法によって本質的に純粋な形態で単離されうる。典型的に、ベクターまたはポリヌクレオチドはほとんどの組換え体操作に対してＤＮＡである可能性がある。
【０１６７】
いくつかの例において、本発明の多重特異的結合タンパク質には１つまたはそれ以上の融合タンパク質タグ（典型的には１つまたは２つ）が含まれる。たとえば、タンパク質タグは、典型的には融合タンパク質に付随する天然に存在する細胞成分からタンパク質を精製するのを助けるために使用できる。他の例では、タンパク質タグは先に決定した化学的またはタンパク質分解的開裂部位を可溶性融合タンパク質内へ導入するために使用できる。とりわけ、たとえば、ｓｃＴＣＲ分子をもし望むならばＩｇ−ＣＬ鎖または断片から開裂（すなわち分離）できるように、可溶性融合タンパク質をコードしている配列と、Ｉｇ−ＣＬ鎖または好適な断片間にＤＮＡベクター内へ可溶性タンパク質タグをコードしている区画を導入することが行われる。
【０１６８】
タンパク質タグを含む多重特異的結合分子は、必要なように遺伝的または化学的操作によって分子を融合したそのタグを持つことができる。１つの実施様態において、結合分子には、タンパク質のＣ−末端に融合した１つのタンパク質タグが含まれる。あるいはタンパク質タグは、結合タンパク質のＮ−末端へ融合することができる。他の実施様態において、タンパク質タグは、多重特異的結合タンパク質のｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ａｂ分子間に融合する。
【０１６９】
本発明の多重特異的結合タンパク質は、さまざまな従来の技術によって精製できる。たとえば、すでに言及したように、本結合タンパク質は、化学的またはプロテアーゼ開裂部位を含むタグを含む少なくとも１つのタンパク質タグ（同一のものまたは異なるもの）を含むことができる。とりわけ、タンパク質タグは、６×ＨＩＳのような生理学的ｐＨで電荷を持つポリペプチドであり得る。この実施様態において、好適な合成マトリックスが、このタンパク質を精製するのに使用できる。さらにとりわけ、合成マトリックスは、たとえばＮｉ−セファロースのような商業的に入手可能なセファロースマトリックス、または約ｐＨ６〜９にて６×ＨＩＳタグに結合可能なそのような好適なマトリックスでありうる。他の好適なタグには、商業的に入手可能なモノクローナル抗体によって特異的に結合されるＥＥまたはＭＹＣエピトープが含まれる。一般的に、抗体、たとえばモノクローナル抗体によって特異的に結合されうる幅広いさまざまなエピトープはタンパク質タグとして役に立ちうる。他の好適な合成マトリックスには、本ｓｃ−ＴＣＲタンパク質に特異的に結合することが可能な結合抗体を持つものが含まれる。典型的なタンパク質タグには、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ヘビ毒素またはトロンビン開裂部位を持つものが含まれる。たとえば発行されたＰＣＴ明細書第ＷＯ９６／１３５９３号を参照のこと。また以下の実施例６〜７も参照のこと。
【０１７０】
発現された多重特異的結合分子は、免疫アフィニティカラムクロマトグラフィー、免疫吸収、免疫沈降および類似のものを含む公知の方法にて単離し、精製することができる。重要なことに、この調製手順は通常、融合タンパク質のあきらかな収量を得るために単離工程の延長を必要とはしない。さらに完全以下で記述するタンパク質精製方法に従って、ほとんどの多重特異的結合タンパク質の収量はリットルあたり約２〜６ミリグラムの範囲である。
【０１７１】
議論したように、本発明の多重特異的結合タンパク質は、１つの戦術またはその組合せによって発現、および精製できる。１つのアプローチでは、一本鎖融合タンパク質のような多重特異的結合タンパク質は好適な細胞内に発現する。好ましくは結合タンパク質は細胞または細胞培地内に発現する。細胞抽出物または宿主細胞培養培地を得、次いで遠心する。得られた上清をアフィニティーまたは免疫アフィニティークロマトグラフィー、たとえばプロテイン−Ａまたはプロテイン−Ｇアフィニティクロマトグラフィーまたは結合タンパク質に特異的に結合する抗体の使用を含む、免疫アフィニティープロトコールによって精製できる。そのような抗体の例は、ｓｃ−ＴＣＲ、ｓｃ−Ｆｖ、またはタンパク質タグまたは免疫グロブリン重鎖部分のような結合分子の他の部分に特異的に結合することができる商業的に入手可能なモノクローナル抗体である。好適なモノクローナル抗体のさらに特異的な例は、ｓｃ−ＴＣＲのＶ−αまたはＶ−β鎖に結合することのできるもの、たとえばＨ５７、Ｂ２０．１、ＭＲ５−２、およびＦ２３．１（Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）である。そのような抗体の特異的な例は、以下の実施例でのような坑イデオタイプ抗体である。
【０１７２】
以上で議論したように、本発明の多重特異的結合分子は可溶性で提供され、完全に機能的な形態で提供される。したがって、１つの実施様態において、結合分子は、細胞培地内に安定に分泌され、ＴＣＲ抗原またはその結合分子に結合可能な部分のような対象のリガンドに特異的に結合できる。多重特異的結合分子が一本鎖として存在する本発明の実施様態において、分子は好ましくは、本質的にまたは完全に界面活性剤または類似のもののようなカオトロピック剤が存在しない生理学的条件下で安定である。したがって、結合分子は通常、ＴＣＲ膜貫通領域内でみられるアミノ酸のような疎水性アミノ酸が豊富な領域を含まない。
【０１７３】
本明細書で提供された多重特異的結合分子は、さまざまな共有結合タンパク質タグ（エフェクター）を含むように標準の方法にて改変できる。たとえば、１つまたはそれ以上のエフェクターまたはタグを、結合細胞間の橋を視覚化するためおよび／または免疫細胞による認識、傷害、殺傷を増強するために結合分子へ加えることができる。エフェクターまたはタグを加える潜在的部位には、ｓｃ−ＴＣＲ、ｓｃ−Ｆｖまたは（もし存在すれば）免疫グロブリン重鎖部分が含まれる。好ましいタグは一般的に望ましい生物学的、化学的および物理的性質を導入する。さらに特定のエフェクターまたはタグは係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号に記述された。
【０１７４】
好適なタンパク質タグのさらなる例には、たとえば６×ＨＩＳのような生理学的ｐＨで電荷を持つポリペプチド配列が含まれる。この例において、多重特異的結合複合体を精製するための好適な合成マトリックスは、たとえば、Ｎｉ−セファロースのような商業的に入手可能な金属セファロース、または約ｐＨ６〜９で６×ＨＩＳに結合可能な他のそのような好適なマトリックスである可能性がある。ＥＥエピトープおよびｍｙｃエピトープはさらに好適なタンパク質タグの例であり、エピトープは１つまたはそれ以上の商業的に入手可能なモノクローナル抗体によって特異的に結合されうる。エフェクター分子は、たとえばＳＰＤＰカルボジイミドまたは類似のもののようなヘテロ両機能性タンパク質架橋剤の方法によって多重特異的結合複合体へ共役してよい。上記Ｍｅａｎｙ  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙおよび上記Ｗｏｎｇを参照のこと。
【０１７５】
非遺伝的方法によって本発明の多重特異的結合複合体を非組換え的に改変することがいくつかの適用に対して有用である。たとえば、結合複合体は、上述したものに加えて、薬剤、酵素、ホルモン、結合可能なキレート剤、たとえば放射ヌクレオチド、同様に、疾病の診断または処置に有用な他のタンパク質およびポリペプチドのような、さまざまな薬理学的試薬を含みうる。診断の目的のために、多重特異的結合分子は、標識されうるか、または標識され得ないかどちらかである。たとえば、放射ヌクレオチド、蛍光、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、たとえばハプテンのようなリガンドおよびその類似のもののような広い範囲のさまざまな標識を好適に使用してよい。
【０１７６】
いくつかの適用において、融合ペプチドリンカー配列を含むことによって多重特異的結合分子を配置することが望ましい。いくつかの好適なペプチドリンカーおよび同様のものを試験する方法が記述されてきた。いくつかの場合、試薬をよく公知の技術にしたがって融合ペプチドリンカーへ加えるのに使用してよい。有用な薬剤の例には、たとえば、色素または蛍光のような測光的に検出可能な標識、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素で、測光的に検出可能な色素を形成することが可能なもの）が含まれる。一般的に、好適な測光的に検出可能な標識について、米国特許第５，４３４，０５１号を参照のこと。あるいは、薬剤は、ペプチドリンカーを含まない、さまざまな他の方法で直接本明細書で開示した多重特異的結合分子へ結合でき、いくつかは方法が開示される。
【０１７７】
さらに、本発明の多重特異的結合分子は、もしのぞむのならば、たとえば糖鎖または脂肪酸添加によって翻訳後修飾できる。たとえば、結合分子は糖鎖付加によって修飾できる。タンパク質上の糖鎖付加位置は本術分野で公知であり、典型的にはＮ−結合型（アスパラギン結合型）、またはＯ−結合型（セリン−またはスレオニン−結合型）のどちらかである。そのような糖鎖付加部位は、タンパク質配列検査によって簡単に同定できる。本結合分子は、たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって証明されるように、好適な真核細胞によって糖鎖付加されうる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動および他の関連する方法は、たとえば酵素的消化のような従来の生化学的技術と組合せ、本発明の多重特異的結合分子に結合した糖鎖を検出することができる。好ましい消化酵素の例には、たとえばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ）より入手可能なエンドグリコシダーゼ、およびエキソグリコシダーゼが含まれる。したがって、本発明の多重特異的結合分子は、糖鎖群、とりわけオリゴサッカライド群の存在について簡単に解析できる。
【０１７８】
いくつかの例において、糖鎖付加形態で、本質的に純粋な本発明の多重特異的結合分子を入手することが有用である可能性がある。とりわけ、そのような糖鎖付加分子は、治療薬剤として投与した場合ｉｎ  ｖｉｖｏでほとんど崩壊を示さず、したがって循環半減期が増加する（たとえばＧｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：６７（１９８８）を参照のこと。）
【０１７９】
とりわけ、本多重特異的結合分子はまた、診断およびイメージング適用およびＨＬＡ型決定を含むさまざまなｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの使用にも好適である。たとえばＡ．Ｋ．Ａｂｂａｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ページ３２８（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．１９９１）を参照のこと。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング適用に関して、本発明の多重特異的結合タンパク質は、１２５Ｉ、３２Ｐ、９９Ｔｃまたは他の検出可能タグの添加によって検出可能に標識化できる。次いで標識化した多重特異的結合分子は動物に投与でき、公知の手順によって対象をスキャンする。そのような哺乳動物の解析は、たとえば免疫系疾患をともなったＡＰＣｓの望ましくない発現を含む、多くの疾患の診断および処置を補助できる。
【０１８０】
本多重特異的結合分子の分子量は、特定の結合分子が１つかまたはそれ以上のｓｃ−ＴＣＲを含むかどうか、どんな特異的な結合分子領域が含まれるか、全長ＣκまたはＣλ鎖が存在するかどうか、または１つまたはそれ以上のタンパク質タグが使用されているかどうかを含む、多くの因子に依存して変化する可能性がある。一般的に、多重特異的結合分子が一本鎖として存在する実施様態において、結合分子は約８０〜１１０ｋＤＡの分子量を持ち、とりわけ約９０〜１００ｋＤＡの分子量を持つ。この実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲのＶ−αおよびＶ−β鎖は約１６ｋＤＡより大きな、さらに一般的には約１２〜約２０ｋＤＡの分子量を持つ。さらに、ｓｃ−ＦｖがＶＨおよびＶＬ鎖を含む実施様態において、この鎖は約１８より大きい、さらに一般的には約１２〜約２０ｋＤＡの分子量を持つ。特異的結合分子の分子量は、存在するｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖ分子の数を含むさまざまなパラメータに依存する。
【０１８１】
議論したように、いくつかの本発明の多重特異的結合分子は多重鎖分子であり、とりわけ両特異的キメラ抗体である。図７Ａおよび７Ｂを参照のこと。典型的に、多重鎖分子は約１５０〜約２５０ｋＤＡまたは、たとえば存在するｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖ分子の量に依存してそれ以上の分子量を持つ。すべての以上で言及した分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動または遠心のような従来の分子サイズ実験によって決定する。一般的に上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．、上記Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、上記Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと。
【０１８２】
いくつかの設定において、特定の多重特異的結合分子の価数を増加させることが有用であり得る。たとえば、多重特異的結合分子の価数を増加させる１つの方法は、たとえば標準のビオチン−ストレプトアビジン標識技術を使用して、またはラテックスビーズのような好適な固相支持体に結合することによって、（同一または異なる）１〜４の結合分子を一緒に共有結合することである。化学的に架橋したタンパク質（たとえばデンドリマーに架橋したもの）はまた好適な多価種である。たとえば、タンパク質はＣｙｓまたはＨｉｓのような化学的反応側鎖を持つアミノ酸をコードしている配列を含むことによって修飾できる。そのような化学的に反応性の側鎖を持ったアミノ酸は、融合タンパク質内でさまざまな部位、好ましくはｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖの結合領域から遠くに位置してよい。
【０１８３】
特定の例として、多重特異的結合分子のＣ−末端はタンパク質精製タグまたはそのような反応性アミノ酸を含む他の融合タンパク質に共有結合できる。好適な側鎖には、多価分子を得るために、好適なデンドリマー粒子へ２つまたはそれ以上の融合タンパク質を化学的に結合することが含まれうる。デンドリマーは、その表面上に多くの異なる官能基の任意の１つを持ちうる合成化学ポリマーである。（Ｄ．Ｔｏｍａｌｉａ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２６：９１：１０１（１９９３））。本発明にしたがった使用に関する典型的なデンドリマーには、たとえば、システイン残基に結合できるＥ９星状ポリアミンデンドリマーおよびＥ９クシ状ポリアミンデンドリマーが含まれる。
【０１８４】
とても有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞結合アッセイは、発行されたＰＣＴ明細書番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４号およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および係願中の米国特許明細書番号第０８／３８２，４５４号、第０８／５９６，３８７号および第０８／９４３，０８６号に開示された。開示されたＴ細胞結合アッセイは、本発明の多重特異的結合タンパク質の機能を試験することに、必要であるならば使用できまたは簡単に適応できる。前記発行されたＰＣＴ明細書番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号および係願中の米国特許明細書番号第０８／３８２，４５４号、第０８／５９６，３８７号の開示はそれぞれ本明細書に参考文献として組み込まれる。
【０１８５】
本発明の多重特異的結合タンパク質の免疫細胞、とりわけＴ細胞の活性を調節する（すなわち増殖のようなＴ細胞の活性の原因となるかまたは誘導する）能力は、前記発行されたＰＣＴ明細書番号、第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および前記係願中の米国特許明細書第０８／３８２，４５４号、第０８／５９６，３８７号および第０８／９４３，０８６号に開示されたアッセイ、およびアッセイを行うための材料にしたがって簡単に決定できる。またＭａｔｓｕｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９９４）９１：１２８６２も参照のこと。
【０１８６】
さらにとりわけ、前記発行されたＰＣＴ明細書番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および前記係願中の米国特許明細書第０８／３８２，４５４号、第０８／５９６，３８７号および第０８／９４３，０８６号に開示されたように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、分子がＴ細胞活性を調節することが可能であるかどうかを決定するのに行いうる。そのようなアッセイは、多重特異的結合タンパク質の機能性を決定するために改変できる。一般的に典型的なアッセイは以下の連続工程１−４によって、以下のように構築される。Ｔ細胞は好ましくは、アッセイすることができ、Ｔ細胞活性化または活性化の後のＴ細胞活性の調節を指し示すマーカーを発現する。したがって、先行技術の明細書で開示されたように、活性化において、ネズミＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０発現インターロイキン−２（ＩＬ−２）を使用することができる。ＩＬ−１２濃度を、特定のｓｃ−ＴＣＲ融合分子がＴ細胞ハイブリドーマの活性を調節すること（たとえばＩＬ−２産出を増加させること）が可能であるかどうか決定するために測定できる。そのような好適なアッセイの一般的な例は、以下の連続的工程によって構築される。
１．好適なＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を入手する。
２．次いでＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を増殖を可能にする条件下で培養する。
３．次いで増殖しているＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、１つまたはそれ以上の多重特異的結合タンパク質に接触させる。細胞は典型的には、多重特異的結合タンパク質を好適な標的細胞と一緒に加えるまで、増殖しない（すなわち休止している）。
４．ナイーブＴ細胞のような非ハイブリドーマＴ細胞を使用する場合、活性化に必要なシグナルを提供するように好適な共刺激因子を加えることが有用である可能性がある。Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を次いでマーカー対してアッセイし、たとえばＩＬ−２産出を測定する。両特異的分子を使用する実施様態において、ＩＬ−２の産出は、両特異的分子がＴ細胞応答を調節できる程度を評価するための１つの方法である。細胞結合を提供し、好適な対象（すなわち未刺激Ｔ細胞）に比べて約２から約３倍のＩＬ−２の増加を促進する両特異的分子が好ましい。さらに、免疫細胞を加えることなしに使用した場合、以上で言及した一般的なアッセイによって測定したように、結果として刺激および明らかなＩＬ−２産出とはならない両特異的分子が好ましい。すなわち、標的細胞の添加を行わない多重特異的結合分子の添加が結果として有意なＴ細胞刺激（すなわちＩＬ−２産出）とはならない可能性がある。さらに特定のアッセイに関して以下の実施例１４を参照のこと。
【０１８７】
前記発行されたＰＣＴ明細書番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および前記係願中の米国特許明細書第０８／３８２，４５４号、第０８／５９６，３８７号および第０８／９４３，０８６号ですでに開示されたように、アッセイで使用したＴ細胞は通常増殖に好適な条件下でインキュベートする。たとえば、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマは、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよび５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０）内で約３７℃で５％ＣＯ２にて好適にインキュベートする。融合タンパク質の連続希釈系列をＴ細胞培養培地内へ、典型的には１０−８から１０−５Ｍの範囲での濃度で加えうる。Ｔ細胞活性化シグナルは好ましくは、好ましい抗原を負荷した抗原提示細胞によって提供される。
【０１８８】
前記発行されたＰＣＴ明細書番号、第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および前記係願中の米国特許明細書第０８／３８２，４５４号、第０８／５９６，３８７号および第０８／９４３，０８６号ですでに開示されたように、ＩＬ−２のような発現したタンパク質の測定よりも、Ｔ細胞活性化の調節が、本技術分野で認識されたような放射標識化技術によって測定するような抗原依存Ｔ細胞増殖の変化によって好適に決定することができる。たとえば、検出可能に標識化した（たとえばトリチウム化した）ヌクレオチドを、アッセイ培養培地内へ導入してよい。そのようなタグ化したヌクレオチドのＤＮＡ内への導入は、Ｔ細胞増殖の測定として役に立つ。本アッセイは、たとえばＴ細胞ハイブリドーマのような増幅に抗原提示を必要としないＴ細胞には好適ではない。これは、哺乳動物から単離した未形質転換Ｔ細胞に対するＴ細胞活性化の調節の測定に好適である。（ペプチド／ＭＨＣ標的細胞の存在下のみでの）融合タンパク質との接触の後のＴ細胞増殖は、この分子がＴ細胞の活性を調節し、免疫応答を抑制することができることを指し示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖アッセイは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞コロニーの広がりにおける抗原特異的変化における融合タンパク質の効果を測定するために好ましい。ＩＬ−２産出またはＴ細胞増殖の測定は、多重特異的結合タンパク質がＴ細胞活性を調節することができるかどうか決定するために使用できる。
【０１８９】
さらに好ましい両特異的結合分子には、従来のクロミウム（Ｃｒ５１）放出アッセイのような細胞傷害性アッセイによって決定したように、望ましい標的細胞のＣＴＬ殺傷を調節することが可能なものが含まれる。特定の実施様態において、クロミウム放出アッセイがＣＴＬ殺傷を測定するのに使用される。細胞殺傷は、もしのぞむならば、放出されたクロミウムを測定することを含む多くの好適な方法によってモニタし、定量できる。クロミウム放出アッセイは、本明細書で開示したほとんど任意の多重特異的結合分子と好適な腫瘍細胞標的の使用に簡単に適用可能である。好適な対照細胞からの自発的な放出に関連して少なくとも約１０〜１５％の溶解を放出することが可能である両特異的結合分子が好ましい。クロミウム放出アッセイに関するさらに特定の情報について、以下の実施例１８を参照のこと。
【０１９０】
一般的に、アッセイに関する好適なＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマのような形質転換したＴ細胞株または哺乳動物から単離したＴ細胞、たとえば、ヒトから、またはマウス、ラットのような齧歯類、またはウサギからのような初代細胞より提供される。他の好適なＴ細胞には、１）公的に入手可能であり、または公知の方法にて調製できるＴ細胞ハイブリドーマ、２）Ｔヘルパー細胞、３）Ｔ細胞傷害性細胞、好ましくは細胞傷害性ＣＤ８＋細胞が含まれる。Ｔ細胞は公知の方法にて哺乳動物から単離できる。たとえば、Ｒ．Ｓｈｉｍｏｎｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，（１９８３）１５８：３０３を参照のこと。
【０１９１】
ｓｃ−ＴＣＲ分子を試験するための関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイは、前記発行されたＰＣＴ明細書番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４号、第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７号、および前記係願中の米国特許明細書第０８／３８２，４５４号、第０８／５９６，３８７号および第０８／９４３，０８６号に記述された。そのようなアッセイは必要なように本多重特異的結合分子と一緒に使用するのに簡単に適応できる。
【０１９２】
好ましい両特異的ハイブリッド分子を使用した、とりわけ好ましいＴハイブリドーマ細胞の刺激を検出するためのアッセイに関して、以下の実施例１４を参照のこと。
【０１９３】
本発明は、本明細書で開示した一本鎖および重鎖多重特異的結合タンパク質を試験するためのさらなる方法を提供する。たとえば、ｓｃ−ＴＣＲまたは結合分子の抗体結合部分の機能性は、さまざまな特異的な結合アッセイによって簡単に説明できる。好ましい結合アッセイは、抗体結合部分および望ましい細胞表面タンパク質間の特異的な結合をモニタし、好ましくは定量する。好ましい特異的な結合アッセイにはウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、移動度シフトアッセイ、酵素免疫アッセイ、コンペティティブアッセイ、飽和アッセイ、サイトメトリックアッセイまたは本技術分野で公知の他のタンパク質結合アッセイが含まれる。細胞表面タンパク質、たとえばＴＣＲ、糖タンパク質または他の好適な分子を検出することが可能であるアッセイが好ましい。
【０１９４】
本多重特異的結合分子の解析のための１つの好ましいアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。たとえば、１つの実施様態において、望ましい両特異的ハイブリッド分子を発現している好適な宿主細胞を、特異的にハイブリッド分子に結合することが可能な抗体を使用するＥＬＩＳＡ設定で選別する。ＥＥ−タグ化分子のようなタンパク質タグを含む両特異的ハイブリッド分子が好ましい。この例では、タグ化した分子は、タグに特異的に結合する商業的に入手可能な抗体を使用してプローブ化できる。結合した抗体は、たとえばＥＥ−タグを認識する抗体に結合する第二検出可能標識化抗体によって、標準のＥＬＩＳＡを使用して簡便に検出することができる。あるいは、両特異的ハイブリッド分子は、ｓｃ−ＴＣＲまたは抗体結合領域、とりわけｓｃ−Ｆｖに特異的に結合する抗体でプローブ化してよい。
【０１９５】
上述したＥＬＩＳＡアッセイは、ほぼ任意の本明細書で開示した多重特異的結合タンパク質を検出し、特性化するために使用できる。さらに、ＥＬＩＳＡアッセイは、望ましい多重特異的結合タンパク質を発現する能力に関して細胞を選別するのに使用できる。例示的なＥＬＩＳＡアッセイの結果に関して、実施例３および図９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、１０Ｂおよび１１を参照のこと。
【０１９６】
本多重特異的結合タンパク質を解析するためのさらに好ましいアッセイにはウエスタン免疫ブロットが含まれる。簡単に記すと、両特異的ハイブリッド分子のような特定の多重特異的結合タンパク質は従来のゲル電気泳動によって分離でき、好適な支持体培地へ移すことができる。ついで移したブロットをｓｃ−ＴＣＲまたは抗体結合領域、たとえばｓｃ−Ｆｖに特異的に結合するもののような広い範囲のさまざまな抗体でプローブ化できる。結合した抗体は標準の検出方法によって視覚化できる。以下の実施例および図１２を参照のこと。
【０１９７】
本多重特異的結合タンパク質を解析するためのさらに好ましいアッセイにはフローサイトメトリー解析が含まれる。たとえば、ｓｃ−ＴＣＲまたは両特異的ハイブリッドタンパク質のｓｃ−Ｆｖ部分と糖タンパク質または他の細胞上に発現した好適なマーカー間の特異的結合はフローサイトメトリー解析によって決定できる。より特定の例において、Ｔハイブリドーマ細胞または、ＣＤ３分子を発現している他の好適な細胞を、特異的な結合複合体を形成することに導く条件下で両特異的ハイブリッド分子と接触させる。ついで、細胞を洗浄し、ｓｃ−ＴＣＲのＶ鎖または両特異的ハイブリッド分子に結合したタンパク質タグ（たとえばＥＥタグ）に特異的な検出可能標識化抗体（たとえばビオチン化）したものと接触させる。ついで標準の発色アッセイを、標識化ストレプトアビジンおよび分光光度検出方法を用いて行う。ｓｃ−Ｆｖの機能性は、Ｔハイブリドーマ細胞の染色によって決定できる。非特異的染色は、ＣＤ３分子を発現していないＴハイブリドーマ細胞の使用を含む様々な方法によって検出することができる。いくつかの適用において、細胞へ結合するための両特異的ハイブリッドタンパク質と競合できる好適な抗体を含むことによって結合特異性を確認することは有用であり得る。好ましい両特異的結合タンパク質は、好適な対照と比較したときに、約５〜１０００、好ましくは約１０〜１００倍、シトクロームの増加を示す可能性がある。フローサイトメトリー解析の結果について、実施例１５および図１７−１９を参照のこと。
【０１９８】
議論したように、本発明はまた、好適なバクテリオファージタンパク質またはその断片に融合するｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖ分子を含む融合タンパク質を含む、組換え体バクテリオファージを特徴とする。議論したように、バクテリオファージコートタンパク質を含むｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質は本技術分野で公知である。バクテリオファージコートタンパク質を含むｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を作製し、使用するための方法は係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号に開示された。また米国特許第５，７５９，８１７号を参照のこと。開示された方法が、必要なように、本組換え体バクテリオファージの製造を促進するのに適応できることが実施例より明らかになる。
【０１９９】
さらにとりわけ、本組換え体バクテリオファージは、それぞれがバクテリオファージコートタンパク質または断片に結合したｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖを含む融合タンパク質を提示する。本発明の好ましい組換え体バクテリオファージは両特異的であり、ｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質の結合特異性を特徴とする。係願中の米国特許明細書番号第０８／９４３，０８６号で開示されたように、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は一般的に、好ましくは柔軟なペプチドリンカー配列を介してＶ−β鎖に融合したＶ−α鎖に共有結合したバクテリオファージコートタンパク質またはその断片を含む。好ましくは、バクテリオファージコートタンパク質はバクテリオファージ遺伝子３または遺伝子８タンパク質である。ｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質は典型的に、好ましくは柔軟なペプチドリンカータンパク質を介してＶＨまたはＶＬ鎖に共有結合したバクテリオファージコートタンパク質またはその断片を含む。
【０２００】
本明細書で使用するところの「バクテリオファージコートタンパク質（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」には全長コートタンパク質が含まれる。そのようなコートタンパク質の好適な断片は、ｓｃＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖのパッケージングおよびバクテリオファージコートの融合タンパク質成分としてｓｃＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖを提示することを促進することができる。首尾よいパッケージングは、感染粒子の産出を定量するプラークアッセイを含む様々な方法で明らかにできる。バクテリオファージを作製し使用する方法に関連したさらに特定の開示は、以下の実施例２１、２４、２６〜２８で見ることができる。
【０２０１】
１つの実施様態において、本発明の組換え体バクテリオファージは、それぞれが任意に１つまたはそれ以上の融合したタンパク質タグ（一般的には１つまたは２つ）を含む、ｓｃＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質を提示する。少なくとも１つのタンパク質タグの接着は、付随する可能性のある細胞成分からバクテリオファージを精製する簡単な方法を提供することを含むさまざまな利点を持つ。以下に記述する特定のタグのようなバクテリオファージの化学的または免疫学的認識を促進するタンパク質タグが好ましい。とりわけ好ましいタグはＥＥ配列である。
【０２０２】
とりわけ、本発明の組換え体バクテリオファージのｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質は、本明細書で記述したほぼ任意のｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖを含みうる。たとえば、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は配列中に共有結合した、１）Ｖ−α鎖、２）好適なペプチドリンカー配列、３）Ｖ−β鎖、４）Ｃβ−鎖および５）第一バクテリオファージコートタンパク質または断片を含みうる。ｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質は、配列内で共有結合した、１）ＶＨ鎖、２）好適なペプチドリンカー配列、３）ＶＬ鎖および４）第二バクテリオファージコートタンパク質または断片を含む。第一および第二バクテリオファージコートタンパク質は、たとえば望ましい提示の量または質に依存しながら同一であるかまたは異なる。
【０２０３】
組換え体バクテリオファージが、それぞれｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質からなる融合タンパク質を含む実施様態において、そのようなバクテリオファージは、本明細書で「両特異的バクテリオファージ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）」または簡単に「両特異的ファージ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ）」として本明細書で時折表される。そのような両特異的ファージの典型例には、バクテリオファージ遺伝子８タンパク質に融合した望ましいｓｃ−ＴＣＲおよび遺伝子３タンパク質に融合したｓｃ−Ｆｖを提示するものが含まれる。しかしながら、いくつかの場合、遺伝子３タンパク質に融合するｓｃ−ＴＣＲおよび遺伝子８タンパク質に融合するｓｃ−Ｆｖを提示する組換え体両特異的バクテリオファージを作製することが有用である可能性がある。
【０２０４】
議論したように、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の構築および使用に関連したさらなる開示は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号で見ることができる。とりわけ、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号は、Ｖ−β鎖のＣ−末端とバクテリオファージ３タンパク質のＮ−末端間で共有結合したＣ−β鎖断片を含むｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を開示する。任意に、タンパク質タグがＣ−β断片のＣ−末端およびバクテリオファージ遺伝子３タンパク質のＮ−末端に共有結合できる。また、Ｖ−β鎖のＣ−末端とバクテリオファージ遺伝子３タンパク質のＮ−末端の間で共有結合した第一タンパク質タグ、および融合タンパク質のＣ−末端に共有結合した第二タンパク質タグを含むｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質が開示される。
【０２０５】
さらに、配列内で共有結合した、１）Ｖ−α鎖、２）ペプチドリンカー配列、３）Ｃ−β鎖断片に共有結合したＶ−β鎖、および４）バクテリオファージ遺伝子８タンパク質を含むｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質が係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号で開示された。また、配列内で共有結合した、１）Ｃ−α鎖断片に共有結合したＶ−α鎖、２）ペプチドリンカー配列、３）Ｃ−β鎖に共有結合したＶ−β鎖、および４）バクテリオファージ遺伝子８タンパク質を含むｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質が説かれた。この実施様態において、ｓｃ−ＴＣＲはさらに、Ｖ−β鎖のＣ−末端および遺伝子８タンパク質のＮ−末端に共有結合した第一タンパク質タグ、および融合タンパク質のＣ−末端に共有結合した第二タンパク質タグを含んでよい。さらに、タンパク質タグは、Ｃ−β鎖断片のＣ−末端および遺伝子８タンパク質のＮ−末端へ共有結合してよい。
【０２０６】
望むのならば、本組換え体バクテリオファージは約２〜１０の、好ましくは約２〜３の価数を持つように操作してよい。すなわち、このバクテリオファージは、１）約２〜３のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質、２）約２〜３のｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質、３）約２〜３のｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質を含むように設計できる。そのような多重特異的バクテリオファージは、たとえばバクテリオファージ上で提示したｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質の親和力または結合親和性を増加することが好ましい場合にとても有用である。
【０２０７】
本発明はまた、本明細書で記述した組換え体多重特異的バクテリオファージを作成するための方法を提供する。たとえば、１つの実施様態において、微生物宿主細胞に、ｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖが好適なバクテリオファージコートタンパク質または断片に融合したようなｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖをコードしたポリヌクレオチドをトランスフェクトする。また、ｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖの機能的断片をコードするポリヌクレオチドが企画される。また、多重コピー（すなわち約２〜５）のｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖをコードするポリヌクレオチドも構想される。好適なバクテリオファージコートタンパク質または断片に融合したｓｃ−ＴＣＲをコードしているポリヌクレオチドを作製し、使用することに関連したさらに特定の開示は、係願中の米国特許第０８／８１３，７８１号に見ることができる。
【０２０８】
本組換え体バクテリオファージは、１つの戦略または戦略の組合せで産出できる。バクテリオファージの増殖を導く大腸菌のような細菌宿主細胞を使用する方法が好ましい。特定の実施様態において、宿主細胞に、バクテリオファージコートまたはカプシドの部分として同一のものを提示するのに十分な条件下で、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする。宿主細胞に、またカプシド上にｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質を提示することを導く条件下でｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを、同時に、または後にトランスフェクトする。多重特異的バクテリオファージの産出は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン免疫ブロットおよびアフィニティクロマトグラフィーのようなさまざまな従来の方法によって、検出でき、望むのならば定量できる。
【０２０９】
他の実施様態において、本発明の組換え体多重特異的バクテリオファージは、好適な宿主細胞に本明細書で記述したｓｃ−ＴＣＲまたはｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質を独立してもつ「単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」組換え体バクテリオファージを感染させることによって作製する。そのようなバクテリオファージに関連するさらに特定の開示は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号に見ることができる。また米国特許第５，７５９，８１７号も参照のこと。たとえば、さらに特定の実施様態において、多重特異的バクテリオファージは、まず好適な微生物宿主細胞に単一特異的バクテリオファージを感染させ、次いで同一の宿主細胞に他の単一特異的バクテリオファージを感染させることによって作製できる。あるいは、感染は、両方の単一特異的バクテリオファージの共感染によって構築できる。
【０２１０】
組換え体多重特異的バクテリオファージを作製するための本方法はとても柔軟であることが評価されるであろう。すなわち、宿主細胞を特定のポリヌクレオチド（または組換え体バクテリオファージ）でトランスフェクト（または感染）する順番は、得られる組換え体バクテリオファージが意図した結合特異性を持つ限りは重要ではない。
【０２１１】
本発明の組換え体バクテリオファージは多くの重要な使用および利点を提供する。たとえば、バクテリオファージは好ましくは、全長またはほぼ全長のｓｃＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ分子を提示する。したがって、本バクテリオファージライブラリーの使用は、ｓｃＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ分子、とりわわけｓｃＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ結合ポケットの解析に明確に影響を与える。
【０２１２】
本組換え体バクテリオファージは好ましくは、ｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ分子の特異的結合を検出し、評価するように設計したような広いスペクトルの選別に対してとりわけ有用である。バクテリオファージはまた、抗原、抗体、小分子、スーパー抗原およびＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体のようなさまざまな結合分子を解析するのに有用でもある。重要なことに、本バクテリオファージディスプレイライブラリーは、Ｖ−αおよびＶ−β鎖との融合タンパク質を発現し、したがって融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで見られるより完全なＴＣＲｓの典型とする。
【０２１３】
さらに、本バクテリオファージは、バクテリオファージと望ましい結合分子または同等の細胞間の特異的結合複合体の形成を最大にするように操作でき、したがって、ほとんど結合しないか弱く結合する結合分子または細胞の検出が増大する。本発明のバクテリオファージは特にバイオパニング技術（たとえば細胞パニングおよび免疫パニング）に使用できる。
【０２１４】
議論したように、本発明の組換え体バクテリオファージおよびバクテリオファージライブラリーはキットの形態で提供されうる。このキットには、単一型のｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖを提示する組換え体バクテリオファージが含まれる。または、このキットには、ライブラリーが好ましくはさまざまな異なるｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質を含む可能性のあるような組換え体バクテリオファージライブラリーを含んでよい。さらに特定のキットはさらに、適切な宿主細胞および／またはたとえば抗体のようなバクテリオファージを検出するための試薬およびこのキットを使用するための指示書が含まれる。
【０２１５】
本発明はまた、少なくとも１つの多重特異的結合タンパク質を哺乳動物、好ましくは齧歯類またはヒト患者のような霊長類に投与するための様々な方法も提供する。たとえば、１つの実施様態において、多重特異的結合分子、とりわけ一本鎖多重特異的結合分子をコードしているポリヌクレオチドを投与するための方法を提供する。哺乳動物内で一本鎖結合分子を発現できるポリヌクレオチドが好ましい。好ましくは、好適に強力なウイルスプロモーター（たとえばＣＭＶ）のような強力な真核生物プロモーターの制御下で、結合タンパク質のコード領域を持つＤＮＡを公知の方法に従って対象の骨格筋内へ直接注射する。プラスミドＤＮＡの投与、投与された対象の細胞によるそのＤＮＡの取り込み、およびタンパク質の発現のための方法が報告されてきた（Ｊ．Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９３）２５９：１７４５−１７４９を参照のこと）。多重結合分子を哺乳動物、特にヒトへ投与する実施様態において、この分子のアイソタイプが使用した宿主細胞に適合性であることが好ましい。
【０２１６】
すでに記したように、本発明の多重特異的結合タンパク質は治療に適用する。たとえば、議論したように、結合分子は、ウイルス感染したまたは腫瘍細胞のようなＭＨＣを発現している望ましい標的細胞を除去するために、特定の免疫細胞、とりわけＴ細胞、ＣＴＬ、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージの特異性を切り替えるために使用できる。標的細胞との免疫細胞の架橋は、標的細胞に傷害を与え、または殺すのに十分な強力な免疫応答を提供する。
【０２１７】
加えて、本明細書で記述した多重特異的結合タンパク質は、哺乳動物での免疫応答を減少させ、または除去するため、たとえば癌および感染症を患うか、またはその疑いのあるヒトのような哺乳動物を処置するために投与できる。また、たとえば心臓、腎臓、皮膚または他の臓器の移植のような移植外科手術を受けた患者のような望ましくない免疫応答を受けているか、受けていそうな対象が処置に適している。移植拒絶を含む状況に置いて、処置プロトコールは、好適には外科的手順に先だって行われてよい。
【０２１８】
本明細書で記述した多重特異的結合分子の投与は、治療的に効果的な量の融合タンパク質またはそれをコードしているポリヌクレオチドの投与ような任意の好適な方法を介してであり得る。ＤＮＡ投与が望ましいいくつかの実施様態において、両特異的ハイブリッド分子の使用が望ましいときのような、望ましい多重特異的結合タンパク質の部分をコードしている２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを提供することが助けになる可能性がある。
【０２１９】
多くの特定のアプローチが、本発明にしたがって、望ましい標的細胞を減少させ、殺すために行われうる。たとえば、標的細胞に傷害を与え、好ましくは殺すための１つの処置方法は、細胞表面抗原を発現している特定の免疫細胞とＭＨＣ複合体を発現している標的細胞を結合させるために、治療的に効果的な量の望ましい多重特異的結合分子の投与を提供する。標的細胞と免疫細胞間の関連は、標的細胞に傷害を与え、好ましくは除去する免疫反応を促進する。いくつかの実施様態において、１つ以上の多重特異的結合分子は必要なように投与してよい。いくつかの例で、Ｔ細胞増殖、分化、活性化またはＢリンパ球刺激のようなＴ細胞仲介免疫応答を選択的に制御できる。
【０２２０】
本明細書で記述した多重特異的結合分子は、哺乳動物へ、注射、たとえば腹腔内または静脈内注射によって投与できる。好ましい実施様態において、多重特異的結合タンパク質は好ましくは哺乳動物または他の好適な細胞より産出し、発熱物質を本質的にまたは完全に含まないように使用する前に精製する。与えた治療的適用に対する最適な投与量は、従来の方法にて決定でき、一般的に、投与経路、患者の体重、一般的な健康、性別および当業者によって認識されたそのような他の因子を含む多くの因子に依存して変化する可能性がある。
【０２２１】
投与は単一投与量、または日または週の間隔で分離した連続した投与量であり得る。本明細書で使用するところの語句「単一投与（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）」は、単独の投与量であり得、保持放出投与量でもあり得る。対象は哺乳動物（たとえばヒトまたは畜牛およびイヌまたはネコのようなペットなどの家畜）であり得￥え、少なくとも１つの多重特異的結合タンパク質、典型的には１つのそのようなタンパク質を含む薬理学的組成物としての処置を含む。そのような本発明の薬理学的組成物は、本技術分野で公知の手順に従って調製し、使用する。たとえば、治療に効果的な適量の結合タンパク質を含む処方は、ユニット投与量または多重投与量容器、たとえば密封したアンプルまたはバイアルで存在しいてよく、使用直前に無菌液体担体、たとえば水注射の添加のみを必要とする冷凍乾燥（凍結乾燥）条件で保存してよい。リポソーム処方もまた多くの適用に対して好ましい。他の非経口投与のための組成物がまた、好適である可能性があり、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および意図したレシピエントの血液と処方等張を示す溶質を含む可能性のある水性および非水性無菌注射溶液、および懸濁試薬および濃縮試薬を含む可能性のある水性および非水性無菌懸濁液を含む可能性がある。
【０２２２】
本発明の方法は、たとえば腫瘍またはウイルスペプチドを負荷したＭＨＣを発現している標的細胞を減少させ、除去することを含む。本方法は、より効果的な治療管理を提供するために、抗ウイルス、免疫抑制、抗癌または坑免疫治療のような他の治療と組み合わせて使用してよい。たとえば、本発明の多重特異的結合タンパク質は、レトロウイルス感染、とりわけＡＩＤＳウイルスによる感染を減少させるか、除去するのに使用するもののような特定の抗ウイルス薬剤とともに使用できうる。さらに、この多重特異的結合タンパク質は、化学治療または免疫治療のような標準の抗癌治療とともに使用できる。
【０２２３】
すでに言及したように、いくつかの例で、本明細書で記述した多重特異的結合タンパク質またはその断片に対する抗体を産出することは有用である可能性がある。抗体を作製するためのさらに特定の方法は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号に記述された。
【０２２４】
以上に言及したように、本明細書で記述した多重特異的結合分子は、結合を改善するために１つの戦略またはその組合せによって簡単に改変できる。ｓｃ−ＴＣＲ分子の結合を改善するための方法に関連したさらに特定の開示は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号で報告された。
【０２２５】
本質的に純粋な可溶性融合タンパク質または核酸は、薬理学的使用のために、少なくとも約９０−９５％純粋、好ましくは少なくとも９８％から９９％、またはそれ以上純粋である。いったん部分的に精製し、または本質的な純度まで精製したならば、可溶性融合タンパク質は（体外でを含む）治療で使用でき、または本明細書で開示したようにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの発展し、実行される。
【０２２６】
本明細書で言及したすべての文章は完全にその全体が本明細書で参考文献として組み入れる。以下の非限定的な実施例は本発明を例示する。
【０２２７】
（実施例）
実施例１−ｐ−１４９一本鎖（ｓｃ）ＴＣＲの構築
Ｔ細胞クローン、ｐ−１４９はＨＬＡ−Ａ２．１によって制限されたヒト野生型腫瘍抑制タンパク質ｐ５３のペプチド断片（ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）を認識する（Ｔｈｅｏｂａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９５を参照のこと）。Ｔ細胞レセプター遺伝子をすでに可溶性ＴＣＲおよび機能的レセプター分子を産出することが示された３領域一本鎖形式内へクローン化した（図１Ａ）。
【０２２８】
簡単に記すと、ｍＲＮＡをＴ細胞クローンより単離し、ｃＤＮＡを、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して作製した。プライマーＫＣ１７１およびＫＣ１７４を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でこのｃＤＮＡを鋳型として使用し、Ｃα鎖Ｎ−末端の最初の７つのアミノ酸を含む５’Ｓｆｉ１３’Ｓｐｅ１  Ｖα鎖断片を産出した。ついで同様のｃＤＮＡをＰＣＲ鋳型として、プライマーＫＣ１７２およびＫＣ１７６とともに使用し、５’Ｘｈｏ１−３’Ｘｍａ１  ＶベータＣベータ鎖断片を合成した。Ｃベータ鎖は全長Ｃベータ鎖のアミノ酸１２７番のシステイン残基のちょうど前で折り畳まれた。
【０２２９】
アルファおよびベータ鎖断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内へ、ＤＮＡ配列決定のためにクローン化した。正しい配列を制限消化し、発現ベクターｐＫＣ６０内へクローン化し、Ｖアルファ（Ｇ４Ｓ）４ＶベータＣベータｓｃＴＣＲ分子を作製した。ｐＫＣ６０ベクターは本明細書ではＰＳＵＮ２３と表す（図３）。ｐＫＣ６０ベクターは係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７３１号に記述された。この新規ベクターはｐＮＡＧ２と命名した（図４）。
【０２３０】
ついで、大腸菌ＤＮＡ構造物ｐＮＡＧ２をプライマーＫＣ２０３およびＫＣ２０８でのＰＣＲによって再増幅し、５’Ａｇｅ１−３’Ｈｐａ１／ＢｓｐＥ１／Ｎｒｕ１／Ｃｌａ１  ＤＮＡ断片を合成した。このｓｃＴＣＲ断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ内にクローン化した。
【０２３１】
ついでこの新規ｐＧＥＭを基礎としたベクターを、他のＤＮＡ断片を導入するための「シャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）」として使用し、両特異的ｓｃ分子を作製した。
【０２３２】
１．大腸菌内でのバリアントｐ−１４９  ｓｃＴＣＲ形態のクローニングおよび発現
さまざまな有用な構造物内でｐ−１４９  ｓｃ−ＴＣＲを提供することが可能である。たとえば、以下で記述するｐＳＵＮ２１構造物の４つの変形がｓｃＴＣＲの発現に使用できる。可溶性ｓｃＴＣＲの濃度は、ｓｃＴＣＲを図１Ｂで示したｐＳＵＮ２１  ｓｃＴＣＲ設計で発現させた場合に増加することが発見された。従って、最初のクローニングは鋳型としてこの一本鎖構造物を用いて行う。記述したように、２段階のクローニング手順をｓｃＴＣＲを発現ベクター内へ組み立てるために使用する。以上で議論したように、このレセプターの全長アルファおよびベータ鎖をコードしているｐ−１４９  ｃＤＮＡがクローン化された。関連するクローニング方法がバリアントを作製するのに使用できる。
【０２３３】
たとえば、ｐ−１４９  ＴＣＲ構造物の１つのバリアントは、ベクターｐＳＵＮ２１内へクローン化されたＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲにとてもにている可能性がある。この構造物はＶα領域、（Ｇ４Ｓ）４リンカーがつながる１０〜２５アミノ酸、Ｖβ／Ｃβ領域を含む。ＥＥタグ配列はカルボキシル末端領域に含まれる。これは免疫ブロット上の分子の検出を促進し、ｓｃＴＣＲ分子の架橋に使用できる。僅かに改変した第二構造物はカルボキシル末端にＢｉｒＡ部位（以下の実施例２４を参照のこと）をコードする。ＢｉｒＡはビオチン化配列として特性化され、ＭＨＣ分子の四量体形態を産出するのに使用された。Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，９４−９６（１９９６）を参照のこと。この部位は細胞結合およびブロッキングアッセイでｓｃＴＣＲの評価のために四量体ｓｃＴＣＲ分子を構築するために使用する。また、それぞれＢｉｒＡおよびアビジン（以下実施例２４を参照のこと）タグを持つｓｃＴＣＲを架橋することで単量体アビジンの構造が構想される。遺伝的操作を介したＢｉｒＡ部位の添加は、化学的架橋プロトコールを頼みとするさらに従来のビオチン化方法に対して利点がある。多くの例において、そのような共役試薬の使用は結果としてビオチン化のための部位を遺伝子レベルにおいてコードすることをしなくてよいタンパク質の変性となる。ＢｉｒＡ部位を持っていることの他の利点は、化学両論的にｓｃＴＣＲ：ｓｃＦｖの１：１モル比を組み立てられることである。
【０２３４】
他の例において、ｐ−１４９  ｓｃ−ＴＣＲバリアントは、ｊｕｎ配列をコードしているＤＮＡを含む可能性があるように作製できる。このことは、ｓｃＴＣＲ設計内に３’ＤＮＡ断片としてクローン化する。ｓｃＴＣＲ／ｊｕｎ融合物はｓｃＦｖ／ｆｏｓ融合物と架橋するために入手可能である。
【０２３５】
ｐ−１４９バリアントの他の例において、融合タンパク質は、Ｃβ／ＥＥ−タグのカルボキシル末端領域が遺伝的に、フィラメンタスファージの主要コートタンパク質であるｐ８に融合するような方法で作成できる。ｐ８およびｐ３タンパク質を含むバクテリオファージタンパク質からなるさまざまｓｃ−ＴＣＲ融合物は、係願中の米国特許明細書第０８／８１７，７８１号で開示された。議論したように、両特異的ファージの構造物（ｓｃ−ＴＣＲとｓｃ−Ｆｖ断片のファージ表面上での発現）はこのハイブリッド分子の１つの形態であり得る。この分子は、ＣＴＬと標的細胞間の「橋（ｂｒｉｄｇｅ）」を形成することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を殺すことを含むさまざまな重要な使用方法を持つ。ｐＳＵＮ２１ベクターはｓｃＴＣＲ／ｐ８融合物をクローン化するのに使用する。このベクターはｌａｃＺプロモーターをもち、予備的な結果の項で議論したｓｃＴＣＲ／ファージディスプレイモデルの発展で使用されてきた。これは、野生型ファージで重複感染した後にｓｃＴＣＲ／ｐ８分子を発現しているファージを産出できる改変ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターである。
【０２３６】
係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／８１３，７８１号で開示されたように、さまざまな特定のＤＮＡベクターは望ましいｓｃ−ＴＣＲをバクテリオファージコートタンパク質に融合させるのに使用できる。たとえば、この係願中の米国特許明細書は、ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）を開示している。これらのベクターはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ    Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のブタベスト条約にしたがって寄託された。ＤＮＡベクターは１９９７年２月２６日にＡＴＣＣに寄託され、指定されたｑ受け入れ番号は９７８９５（ｐＳＵＮ１８）および９７８９６（ｐＳＵＮ１９）であった。ＤＮＡベクターｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）にはｐｈｏＡプロモーター、改変ｐｅｌＢ配列、遺伝子１０リポソーム結合部位およびバクテリオファージ遺伝子８タンパク質が含まれる。ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）にはｌａｃＺプロモーター、ＥＥタグおよびバクテリオファージ遺伝子３タンパク質が含まれる。ＤＮＡベクターは、標準の方法に従って大腸菌または他の好適な宿主細胞内で増殖させることができる。
【０２３７】
ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、さまざまなＶα、Ｖβ−Ｃβおよびポリペプチドリンカー配列に適用するように設計されている。両方のＤＮＡベクターのＶα鎖はＳＦｉ１およびＳｐｅ１での制限消化によって取り除くことができる。Ｖβ−Ｃβ鎖はＸｈｏ１−Ｘｍａ１での制限消化にて取り除くことができる。さらに、このＤＮＡベクターはＳｐｅ１およびＸｈｏ１での制限消化によってペプチドリンカー配列を入れ替えることが可能である。さらに特定のｓｃ−ＴＣＲ構造物の例について図２Ａ−２Ｅを参照のこと。
【０２３８】
実施例２−ｐ−１９４  ｓｃ−ＴＣＲの精製と特性化
係願中の米国特許明細書番号第０８９４３，０８６号は、Ｄ０１１．１０  ｓｃ−ＴＣＲを含む物を含むｓｃ−ＴＣＲを精製するための様々な方法を開示している。これらの方法は、ｐ−１４９融合タンパク質を精製するのに適用できる。たとえば、ｓｃＴＣＲを精製するために、Ｖβ１１．０またはＶα２．３上の構造的エピトープに特異性を持つ抗体を、係願中の米国特許明細書で開示された株と共に使用できる。とりわけ、ｐ−１４９  ｓｃＴＣＲは以下の手順を用いて免疫アフィニティーカラム上で精製できる。
【０２３９】
発酵素より生成した細胞ペーストを抽出緩衝液内で懸濁し、つづいてＦｒｅｎｃｈプレスを通すことで細胞を機械的に溶解させることが可能である。上清から２５，０００×ｇでの遠心で不純物を除き、Ｑ−セファロースカラムにのせた。ｓｃＴＣＲをフロースルーに回収し、ついでｍＡｂ  Ｈ５７−９５に共有結合したプロテイン−Ａ−セファロースカラムにのせた。これはネズミＴＣＲｓのＣ−ベータ領域上のエピトープに特異的なハムスターｍＡｂである。この抗体は、ネズミＴＣＲｓに対してよい結合特性を示し、完全なｓｃＴＣＲ分子、および溶解物からの分解遺産物を精製するのにすでに使用されてきた。分解したかまたは正しくなく折り畳まれたレセプターを取り除くために、第二の抗体アフィニティーカラムを、分解されたｓｃＴＣＲと構造的に完全であるｓｃＴＣＲを見分けらるように使用する。結合ｓｃＴＣＲを５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ１１を用いて溶出し、このｓｃＴＣＲ調製品を１２％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で試料を流し、クーマシーブリリアントブルーで染色するかまたはウエスタンブロッティングすることで解析する。
【０２４０】
発現したタンパク質が機能的であるかどうかを決定するために、ｓｃＴＣＲを、細胞結合アッセイおよびブロッキングアッセイのような、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号で開示されたアッセイに従って試験できる。細胞結合アッセイはこの係願中の米国特許明細書で議論されたように行うことができる。あるいは、このアッセイはカルボキシル末端に単一のビオチン配列を含むｓｃＴＣＲ分子を使用して四量体を形成することで改変できる。以下の実施例２４を参照のこと。四量体は、ＰＥに共役したストレプトアビジンを加え、ついでこれらの分子を公知の腫瘍細胞とインキュベートすることで形成し、ＨＬＡ−Ａ２．１に結合した１４９ペプチドをありのままに処理し、提示する。対照には、ＨＬＡ−Ａ２．１抗原のみを発現している細胞、ＨＬＡ−Ａ２．１またはペプチドどちらも発現していない細胞が含まれる。ＨＬＡ−Ａ２．１に結合したペプチドを発現している細胞の蛍光のピークが移動することが予想される。
【０２４１】
実施例３−ＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲの構築、発現および特性化
ＤＯ１１．１０  ＴＣＲはクラス２  ＭＨＣ  ＩＡｄ分子に関連してＯＶＡペプチド（３２３−３３９）を認識する（Ｈａｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８３を参照のこと）。大腸菌ＤＮＡ構造物ｐＫＣ６０を、プライマーＫＣ１６９およびＫＣ２０８を用いたＰＣＲによって再増幅し、５’Ａｇｅ１−３’Ｈｐａ１／ＢｓｐＥ１／Ｎｒｕ１／Ｃｌａ１  ＤＮＡ断片を合成した。このｓｃＴＣＲ  ＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ内にクローン化した。ついで正しいｓｃＴＣＲ  ＤＮＡをＡｇｅ１およびＨｐａ１で制限消化し、「シャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）」内にクローン化し、先のｓｃＴＲＣ  ＤＮＡ断片と置き換えて、新規ｓｃＴＣＲ／ｓｃＳｃ−Ｆｖ両特異的ｓｃ分子を合成した。ついでＤＯ１１．１０両特異的ｓｃ分子をｐＳＵＮ２７内にクローン化し、ｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０を作製した（図６）。
【０２４２】
ｐＢＩＳＰ／ＤＰ１１．１０ベクター（ｐＳＵＮ２８）は１９９８年９月３日にＡＴＣＣでブタペスト条約にしたがって寄託し、指定受け入れ番号は２０３１８６であった。
【０２４３】
１．大腸菌内でのバリアントｓｃＴＣＲ分子の発現
ｓｃＴＣＲの設計における変更の効果はタンパク質発現のレベルで見積もった。異なるｓｃＴＣＲおよび融合構築物をコードしたベクターを大腸菌Ｋ９１細胞を形質転換するのに使用した。発現実験を形質転換したＫ９１細胞を無機リン酸塩を含む培地中で一晩増殖させることで行い、ｐｈｏＡプロモーターを活性化し、タンパク質発現を誘導することを防いだ。次の朝新規培養を一晩培養より始め、リン酸塩がなくなるまで増殖させた。誘導の期間を培養中の時間中リン酸塩の枯渇をモニタすることによって標準化した。ｓｃ−ＴＣＲ融合分子の産出に関連したさらなる開示に関して、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号を参照のこと。
【０２４４】
異なる構造物間の発現のレベルを比較するために、６００ｎｍ（１０ＯＤ／ｍｌ）で読んだ同一の吸光度で標準化した細胞溶解物からの解析のために、試料よりタンパク質を調製した。タンパク質を音波処理によって細胞より放出させ、試料より２０分間２５，０００×ｇでの遠心によって不純物を除いた。ついで試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にのせ、電気泳動後、タンパク質をナイロン膜に移し、ＴＣＲをＥＥタグに対して特異的な抗体でプローブ化することで検出した。本発明者らは、この発現実験において、ｓｃＴＣＲの基本設計の変化は、発現した可溶性タンパク質のレベルの有意な変化を起こすことができることを観察した。たとえば、合成リンカーによって連結したＶαおよびＶβ領域を含むｓｃＴＣＲ構築物ｐＳＵＮ２２は、載せた物質の濃度で可溶性画分中では検出できなかった。シグナルはｐＳＵＮ２１で見られたレベルと等しくはないけれど、５０倍以上の試料を載せることによって検出できた。これらのデータは、高レベルの可溶性ｓｃＴＣＲが構造設計を改変することによって大腸菌内で産出することができることを指し示している。
【０２４５】
２．可溶性ｓｃ−ＴＣＲの特性化
Ａ．免疫沈降
ｐＳＵＮ２３およびｐＳＵＮ１９  ＤＮＡベクターによって産出されたｓｃＴＣＲタンパク質の折り畳みの完全さを、Ｖβ８．２上の正しく折り畳まれたエピトープに対して特異性を持つ２つのｍＡｂ（ＭＲ５−２およびＦ２３．１）を使用した結合アッセイ実験を行うことによって解析した。さらに、Ｖβと正しく対になったＶα鎖を持つｓｃＴＣＲを、ＤＯ１１．１０  ＴＣＲに対して生成した坑イデオタイプｍＡｂ、ＫＪ１を使用してアッセイした。この結合アッセイ実験は係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号に記述された。このデータは、ｓｃＴＣＲタンパク質が構造的に正しいＶβ領域および正確に対になったＶαおよびＶβ領域を持つことを指し示す。
【０２４６】
Ｂ．酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを、ｓｃＴＣＲの折り畳み領域をさらに特性化するために使用した。ＥＬＩＳＡアッセイの使用は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号にさらに完全に記述されている。簡単には、異なる希釈のｓｃＴＣＲをウェル上にコートした抗ＥＥタグｍＡｂに捕獲させ、以下のｍＡｂｓ、Ｈ５７（Ｃβ）、ＭＲ５−２（Ｖβ８．２）、Ｆ２３．１（Ｖβ  ８．２）およびＫＪ１（Ｖα／Ｖβ）の１つを使用して検出した。これらのデータは正しく折り畳まれたｓｃＴＣＲの存在を支持し、ｓｃＴＣＲが高いｐＨ（１１．０）での希釈および何週間かの４℃での保存の後でさえも安定であることを指し示す。
【０２４７】
Ｃ．抗体およびスーパー抗原を用いた表面プラズモン共鳴（ＢｉｏＣｏｒｅ）結合研究
ｓｃＴＣＲ／遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質を表面プラズモン共鳴を使用して特性化した。この技術は係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号により完全に記述されている。係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号に開示されたように、データは、２つの抗ＴＣＲ  ｍＡｂｓは異なるエピトープを認識するけれども、それらは両方のｍＡｂｓの本アッセイ形態でのベータ鎖への結合を防いだステアリン酸妨害を示すことを示唆する。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質上のバクテリオファージｐ  ＶＩＩＩタンパク質の存在を明らかにするために、ｓｃＴＣＲを抗Ｍ１３抗体に結合させた。ＳＥＣ３（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔａｍｐａ  ＦＬ）として公知のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ＳＡｇのｓｃＴＣＲ／遺伝子ＶＩＩＩ融合物への結合はまた、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号で開示されている。これらのデータは抗体結合データと共に、大腸菌が産出したｓｃＴＣＲは正しく折り畳まれていることを示している。
【０２４８】
３．ＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲの精製
ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を精製するための方法は係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号および第０８／９４３，０８６号に開示された。ＤＯ１１．１０  ｓｃ−ＴＣＲは、以下の特定の方法を含む方法によって精製できる。
【０２４９】
ベクターｐＳＵＮ２３によってコードされた融合タンパク質を従来の方法に従って免疫アフィニティクロマトグラフィーによって形質転換した細胞より精製した。簡単には、精製はプロテイン−Ａコートセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌあたり４ｍｇの抗イデオタイプ抗体、ＫＪ１を共役させることによってアフィニティカラムを作製して行った。大腸菌溶解物を、６００ｍｌの可溶化緩衝液中で５０ｇの発酵由来細胞ペーストを可溶化することで調製した。再懸濁させた細胞をＦｒｅｎｃｈプレスに２回通して溶解した。不溶性物質を２７，０００ｇでの３０分間の遠心で取り除き、上清をＱ−セファロース陰イオン交換カラムにのせた。ｓｃＴＣＲタンパク質をフロースルー中で回収し、続いて抗体カラムにのせた。結合したｓｃＴＣＲを５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ１１．０で溶出し、タンパク質を含んでいる画分を特性化のために使用した。
【０２５０】
ｓｃＴＣＲタンパク質調製品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動と、それに続くクーマシーブリリアントブルー染色によって純度を評価した。タンパク質の完全さを、プローブとして抗体Ｈ５７−５９７または坑−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ）タグ抗体のどちらかを使用して免疫ブロッティングによって決定した。最終的に精製したｓｃＴＣＲのアリコートを還元または非還元条件下で電気泳動し、タンパク質を写した後、膜を坑ＥＥタグ抗体でプローブ化した。ウエスタンブロットの結果は、還元および非還元試料が両方とも４６ｋＤ分子量マーカーと共に移動したので、精製したｓｃＴＣＲは単量体として存在することを指し示している。
【０２５１】
実施例４−１４５−２Ｃ１１  ｓｃ−Ｆｖの構築
坑ネズミＣＤ３−イプシロンモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株１４５−２Ｃ１１をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｕｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した（Ｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８７を参照のこと）。抗体の可変鎖コード領域のＤＮＡ配列はワールドワイドウェブを介して入手できる。
【０２５２】
Ｓｃ−ＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨ遺伝子構造物として設計した（Ｊｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９４を参照のこと）。最初に、より短い（Ｇ４Ｓ）３リンカーを設計し、相補的なオリゴＫＣ２４５およびＫＣ２４６をアニーリングすることで作製し、５’Ｓｐｅ１−３’Ｘｈｏ１  ＤＮＡ断片を形成した。ｐＫＣ６０を好ましい制限酵素で制限消化し、先のリンカーＤＮＡ断片を抜き出し、アニールしたオリゴと共にライゲーションを可能にした。
【０２５３】
ｍＡｂのＶ領域をコードしているＤＮＡを調製するために、１０６１４５−２Ｃ１１ハイブリドーマ細胞からのＲＮＡを、製造会社の取扱説明書にしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＶＨ鎖ｃＤＮＡを、１４５−２Ｃ１１  ｍＲＮＡと共に「逆（ｂａｃｋ）」プライマーＫＣ２４４を含む混合液をインキュベーションすることで作製した。標準量のヌクレオチドおよび逆転写酵素をこの混合液に加えｃＤＮＡを形成した。ＶＨ鎖ｃＤＮＡを、「逆」プライマーＫＣ２５３をＫＣ２４４プライマーの代わりに使用したことを除いて、同様の様式で作製した。ＶＬ鎖ｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＫＣ２４３およびＫＣ２４４と共にＰＣＲ反応中で使用し、３２０ｂｐの５’Ｓｆｉ１−３’’Ｓｐｅ１  ＶＬ鎖断片を増幅した。ＶＨ鎖ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＫＣ２４７およびＫＣ２５３と共に同様の様式で使用し、３５０ｂｐの５’Ｘｈｏ１−３’’Ｘｍａ１  ＶＨ鎖断片を増幅した。
【０２５４】
ＶＬおよびＶＨ鎖断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ内にクローン化した。正しい断片を制限消化し、すでに上述のより短いリンカー配列を含むｐＫＣ６０発現ベクター内にクローン化した。
【０２５５】
いったん１４５−２Ｃ１１  Ｓｃ−Ｆｖが完成したならば、ＤＮＡ構造物をプライマーＫＣ２５０およびＫＣ２５１を用いたＰＣＲにて再増幅し、５’ＢｓｐＥ１−３’Ｎｒｕ１  ＤＮＡ断片を合成した。この断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ内にクローン化した。正しいＤＮＡを制限消化し、ｓｃＴＣＲの「シャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）」下流内にクローン化した。１４５−２Ｃ１１  ｓｃ−Ｆｖ（ＩＣ）およびＦ２３．１  ｓｃ−Ｆｖ（ＩＤ）分子の例として図１Ｃ−１Ｄを参照のこと。
【０２５６】
実施例５−ｓｃ分子リンカー配列の設計
ｓｃＴＣＲとｓｃＳｃ−Ｆｖを一緒に一本鎖融合タンパク質として連結するために、２つの異なったリンカー配列を設計した。アニールしたオリゴの１つの組、ＫＣ２０９とＫＣ２１０は、ネズミ重鎖のＣＨ１領域の部分とそれに続く標準（Ｇ４Ｓ）配列をコードした。第二のより短いリンカー配列は、アニールしたオリゴＫＣ２９５およびＫＣ２９６を使用して似たように、しかしＣＨ１領域を持たない。オリゴをアニールして５’Ｈｐａ１−３’ＢｓｐＥ１  ＤＮＡ断片を合成した。「シャトルベクター」を望ましい制限酵素で消化し、先のリンカーＤＮＡ断片を取り除き、ｓｃＴＣＲとＳｃ−Ｆｖの間の２つの新規リンカー配列のどちらかのライゲーションを可能にする。
【０２５７】
実施例６−３’ペプチドタグのｓｃ分子構造物への添加
以上で概論した「シャトルベクター」設計において、終止コドンおよびスプライス部位を、「逆」プライマーＫＣ２０８を用いてｓｃＴＣＲのＰＣＴ増幅の部分としてＮｒｕ１およびＣｌａ１制限部位の間に導入した。両特異的ｓｃタンパク質の下流精製を補助するために、アニールしたオリゴの組（ＫＣ２３７おびいＫＣ２３８）を終止コドンとスプライス部位を持つ３’ＥＥタグ（ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）を導入するよう設計した。アニールしたオリゴ対を、すでに完全な両特異的ｓｃ分子をコードしている「シャトルベクター」内へ５’Ｎｒｕ１−３’Ｃｌａ１にクローン化した。あるいは、オリゴＫＣ２３９およびＫＣ２４０（スプライス部位のみ）をアニールし、同様にクローン化して、ネズミカッパ軽鎖融合タンパク質として両特異的ｓｃ分子の発現を可能にした。
【０２５８】
実施例７−ｐ１４９  両特異的ｓｃ分子の完成
両特異的ｓｃ分子設計を完成させるための、ｓｃＴＣＲ、Ｓｃ−Ｆｖ、リンカーおよびタグＤＮＡ断片の「シャトルベクター」内へのクローニングの後、ＤＮＡを制限消化し（Ａｇｅ１−Ｃｌａ１）、哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ２７内へクローン化した（図５）（すでにｐＢＩＳＰ／１４９を作製するために係願中の米国特許明細書番号第０８／９４３，０８６号に記述された（図６））。
【０２５９】
実施例８−ｐ１４９  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合分子の構築
１４５−２Ｃ１１  ｓｃＳｃ−Ｆｖのみ、すなわち両特異的ｓｃ分子の部分としてでではない発現はとても低いという認識があった。理論に結びつける意図はないが、低いレベルのｓｃ−Ｆｖ発現が、両特異的分子の発現での制限因子である可能性がある。野生型の１４５−２Ｃ１１ハイブリドーマ細胞株を抗体供給源として使用し、細胞をネズミＩｇＧ２ｂ重鎖と融合したｓｃＴＣＲでトランスフェクトした（図７Ａ−７Ｂ）。トランスフェクトしたハイブリドーマ細胞株は、宿主のハムスターＩｇＧがネズミＩｇＧ２ｂ重鎖と効率よく対となりうるならば、いくつかの１４５−２Ｃ１１／ｓｃＴＣＲキメラ分子を分泌すべきである。
【０２６０】
ＩｇＧ融合物としてｐ１４９  ｓｃＴＣＲをクローン化するために、内部ＥｃｏＲ１制限部位をまず部位特異的変異導入によって挿入した。簡単には、相補的なオリゴヌクレオチドの対、ＫＣ２９３およびＫＣ２９４を望ましい変異を含むように設計した。ｐＮＡＧ２  ＤＮＡ構造物を、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してこのプライマーでＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物を、親ＤＮＡ鋳型を制限し、変異されたＤＮＡインタクトを残すＤｐｎ１ で制限処理した。変異ｓｃＴＣＲ  ＤＮＡを配列決定し、次いでプライマーＫＣ２７６およびＫＣ２６８でのＰＣＲによって再増幅し、５’Ｎｒｕ１−３’ＥｃｏＲ１  ＤＮＡ断片を合成した。変異ｓｃＴＣＲ  ＤＮＡをＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ内にクローン化した。正しいｓｃＴＣＲ  ＤＮＡを制限消化し、哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ７内にクローン化しｐ１４９  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合分子を合成した。
【０２６１】
実施例９−ＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合分子の構築
ｐＫＣ６０  ＤＮＡ構造物をプライマーＫＣ２７５およびＫＣ２６８を用いたＰＣＲによって再増幅し、５’Ｎｒｕ１−３’ＥｃｏＲ１  ＤＮＡ断片を生成した。ｓｃＴＣＲ断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ内にクローン化した。正しいｓｃＴＣＲ  ＤＮＡを制限消化し、哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ７内にクローン化して、ＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合分子を作製した（図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）。
【０２６２】
実施例１０−ネズミＩｇＧ２ｂ発現ベクターの構築
ネズミＩｇＧ２ｂ（重鎖）発現ベクターの構築は以下のようであった。ベクターの骨格はプラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。このプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏ１で切断し、「軽鎖ポリリンカー（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）」ＤＮＡ断片を挿入し、開始「軽鎖ベクター（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」ｐＣＤＮＡ３．ＬＣＰＬを作製した。このリンカーには、続くクローニング工程を促進するために、制限部位Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｋｐｎ１、Ｃｌａ１、Ｐｍｌ１、ＥｃｏＲ５、Ｘｍａ１、ＢａｒｎＨ１およびＸｈｏ１が含まれる。軽鎖リーダー、マウス坑ＣＫＭＢカッパ軽鎖ゲノム断片含むＳｍａ１−Ｂｃｌ１  ＤＮＡ断片および３’ＵＴＲをｐＣＤＮＡ３．ＬＰＣＬのＥｃｏＲ５−ＢａｒｎＨ１部位内にクローン化した。次いで変異導入を行い、Ｎｒｕ１  Ｍｌｕ１およびＢｓｔＢ１部位を除去し、Ｎｈｅ１およびＢａｒｎＨ１部位を導入し、プラスミドｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＬＣＰＬ．ＬＣＶＫを作製した。
【０２６３】
「重鎖ベクター（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」ｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＨＣＰＬを、軽鎖発現領域（Ｈｉｎｄ３−Ｘｈｏ１）を制限部位Ｈｐａ１、ＢｓｐＥ１、ＥｃｏＲ５、Ｋｐｎ１およびＸｈｏ１からなる「重鎖ポリリンカー（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）」で置換することでｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＬＣＰＬ．ＬＣＶＫプラスミドから構築した。このプラスミドをＥｃｏＲ５およびＫｐｎ１で消化した。次いで重鎖リーダーを含むＳｍａ１Ｋｐｎ１消化ＤＮＡ断片および坑ＣＫＭＢ  ＩｇＧ２ｂマウス重鎖ゲノム断片（Ｎｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎ．，１９９０を参照のこと）をＥｃｏＲ５−Ｋｐｎ１消化プラスミド内にライゲーションした。３’ＵＴＲおよびＳａｌ１の上流Ｎｏｔ１部位を含むＫｐｎ１−Ｓａｌ１オリゴヌクレオチド断片を続いて（Ｘｈｏ１部位をノックアウトしている）Ｋｐｎ１−Ｘｈｏ１消化プラスミド内にクローン化し、ネズミＩｇＧ２ｂ発現ベクターｐＳＵＮ７としても公知のプラスミドｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＨＣＰＬ．ＨＣＶ２ｂを作製した（図８）。
【０２６４】
実施例１１−両特異的ｓｃ分子の発現
ＣＨＯ細胞を、冷ＤＰＢＳで洗浄することによってトランスフェクションのために調製した。細胞をＤＰＢＳ内で再懸濁し、１０〜４０μｇのＰｖｕ１直線化ｐＢＩＳＰ／１４９またはｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０と混合した。氷上で５分後、細胞を、２５０ボルト、９６０μＦｄまたは０．２５μＦｄの１パルスを伝送するように設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて電気泳動した。パルスした細胞を氷上に５分間おいた。細胞を１０ｍｌの１０％  ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５０００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、５０００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン内で希釈し、Ｔ−２５ｃｍ２  ＴＣフラスコ内で、１０％ＣＯ２で３７℃にて一晩培養した。次の日、細胞をネオマイシン選択培地（１０％  ＩＭＤＭ＋０．７５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）で９６ウェルプレートに入れ、毎３〜７日に再び栄養を加えた。
【０２６５】
トランスフェクタントを、ＥＬＩＳＡアッセイ形態にて可溶性両特異的ｓｃ分子の発現について選別した。ＥＥタグ化分子を、受動的に９６ウェルプレート上に一晩コートした坑ＥＥタグ抗体を使用して検出した。アッセイの日に、プレートを１０％ＦＢＳ／ＰＢＳで１時間ブロックした。ウェルを洗浄し、トランスフェクタントからの上清をプレートに加えた。インキュベーションおよび洗浄後に、ビオチン化坑ＣベータｍＡｂ  Ｈ５７−５９７（細胞株はＡＴＣＣより購入した）をプレートに加え、続いて洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。陽性ウェルをＴＭＢ基質の添加で同定し、１Ｎ硫酸で止め、４５０ｎＭの吸光を測定した。少量の陽性クローンを増やすために選択し、限界希釈クローニングを行って安定にトランスフェクトした細胞株を確立した（図９Ａ−９Ｂ）。
【０２６６】
トランスフェクタントをまた、ｓｃＴＣＲを特異的に認識するｍＡｂｓを用いてＥＬＩＳＡアッセイ形態にて両特異的ｓｃ分子の発現に関して選別し、ビオチン化坑ＣベータｍＡｂおよびストレプトアビジン−ＨＲＰにて検出した。ｐ１４９  ｓｃＴＣＲ両特異的ｓｃ分子に関して、Ｖアルファ領域に対する配座的ｍＡｂ（Ｂ２０．１、Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）をコーティング抗体として使用した。ＤＯ１１．１０両特異的ｓｃ分子は坑イデオタイプ、坑ＤＯ１１．１０  ＴＣＲ  ｍＡｂ  ＫＪ−１を用いて検出できた（図９Ａ〜Ｂ、１０Ａ〜Ｂ）。陽性クローンを上記のように検出し、増やし、初期クローン化して安定なトランスフェクト細胞株を確立した。ｓｃＢＩＳＰ分子は哺乳動物細胞内で高レベルで発現している（１〜２ｍｇ／ｌ）ことが明らかになった。
【０２６７】
以下の情報は図９Ａ−Ｂ、１０Ａ−Ｂを理解する助けになるであろう。
図９Ａ
希釈        OD450
1：2        0.4755
ストレート  0.8545
図９Ｂ
希釈          OD450
H57    B20.1
1：2        0.206  1.21
ストレート  0.511  1.975
図１０Ａ
希釈            OD450
坑EE    KJ-1
1:4         0.0825  0.5935
1:2         0.186   0.9095
ストレート  0.3435  1.1195
図１０Ｂ
希釈              OD450
坑EE   KJ-1    F23.1
1:2         0.185  1.143   1.227
ストレート  0.381  1.1655  1.898
【０２６８】
実施例１２−キメラ両特異的分子の発現
１４５−２Ｃ１１ハイブリドーマ細胞株に、両特異的ｓｃ分子トランスフェクションに関する上述したのと同様の方法を用いて、ｐ１４９  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合ＤＮＡまたはＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合ＤＮＡのどちらかをトランスフェクトした。
【０２６９】
トランスフェクタントを、ＥＬＩＳＡアッセイ形態で可溶性キメラ両特異的分子の発現に関して選別した。９６ウェルプレートを受動的にヒツジ坑マウスＩｇＧ２ｂ（Ｃａｌｔｅｃｈ）でコートした。インキュベーションおよび洗浄工程を上述のように行った。ヒツジ坑ハムスターＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．）を使用してウェルをプローブ化した（図１１）。陽性コロニーを同定し、増やし、初期クローン化して安定トランスフェクト細胞株を確立した。
【０２７０】
以下の情報は図１１を理解する助けになるであろう。
構造              OD450
ストレート  1:2
BISP/149    0.6305      0.2985
BISP/DO1    0.964       0.6983
【０２７１】
実施例１３−両特異的ｓｃタンパク質の精製
両特異的ｓｃタンパク質を標準のアフィニティクロマトグラフィー方法を、用いてトランスフェクタント上清より精製した。ＥＥタグ化タンパク質に関して、坑ＥＥタグＣＮＢｒ共役アガロースカラムを使用し、全長ｓｃ分子に対して濃縮した。上清を１回かそれ以上カラムベッドに通した。ＰＢＳでの洗浄後、結合タンパク質を、高ｐＨ重炭酸ナトリウム／炭酸緩衝液の添加によってカラムより溶出し、２Ｍ  トリス、ｐＨ８．０の１〜１０希釈液の添加で中和した。精製したタンパク質を３０ｋＤ  ＭＷ除去濃縮ユニットを用いてＰＢＳ内で緩衝液変換した。最終タンパク質濃度はＯＤ２８０を読んで決定した。ウエスタンブロット解析（坑ＥＥタグ抗体でプローブ化）（図１２）および精製タンパク質のクーマシーブルー染色（図１３）は、全長両特異的ｓｃ分子に対する濃縮を示している。
【０２７２】
実施例１４−Ｔハイブリドーマ細胞の両特異的ｓｃ分子刺激
Ｔハイブリドーマ細胞刺激アッセイを行い、両特異的ｓｃ分子が生物学的活性を表したかどうか査定した。本発明者らは、ネズミＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４（Ｍａｔｓｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．（１９９４）９１，１２８６２）を使用してワーキングモデル系を発展させた。２Ｂ４Ｔ細胞ハイブリドーマはＶ１１．０およびＶβ３．０からなるａｎ／βＴＣＲを持ち、ＭＨＣクラス２分子ＩＥκに関連して提示されたハトシトクロームＣのアミノ酸残基８８〜１０４を認識する。ＤＯ１１．１０または１４９ＴＣＲどちらかに特異的なさまざまな異なる固定化Ａｂｓを２Ｂ４  ＴＣＲに対する交差反応性について試験し、しかし、２Ｂ４  ＴＣＲへは無反応であることを否定した。固定化Ａｂが２Ｂ４  ＴＣＲに関して交差反応性を示した場合、本発明者らは、Ｔハイブリドーマ細胞の刺激および培養上清中へのＩＬ−２の分泌を観察することを予想した可能性があった。評価したＡｂｓには１４９  ＴＣＲに対する２つの特異性、坑Ｖ２および坑Ｖβ１１、ＤＯ１１．１０  ＴＣＲに対する２つの特異性、坑Ｖβ８．０（Ｆ２３．１）および坑イデオタイプｍＡｂ（ＫＪ−１）が含まれる。また、本発明者らは固定化ＩＡｄ／ＯＶＡ（ＤＯ１１．１０  ＴＣＲに対して同種ＭＨＣ／ペプチド）を評価したが、どんな刺激も観察されなかった。本発明者らは次いで、これらの分子を固定化し、ＤＯ１１．１０および１４９両特異的ｓｃ分子の活性を評価した。ＤＯ１１．１０−２Ｃ１１  ｂｉｓｐ．ｓｃ分子を試験するために、本発明者らはウェルをＫＪ−１またはＦ２３．１のどちらかでコートした。異なる量の両得異性を用いて１０５の２Ｂ４細胞と共に一晩インキュベートした後、本発明者らは細胞刺激のよい指標であるＩＬ−２の存在に関して上清をアッセイした。図１３で示すように、固定化ＫＪ−１は効果的にハイブリドーマ細胞を活性化した。同様の応答が固定化ＩＡｄ／ＯＶＡを用いたときに起こりうるかどうかを評価するために、我々は次に２Ｂ４細胞をプレートに結合したＩＡｄ／ＯＶＡの存在下で一晩両特異的分子と共にインキュベートした。上清中のＩＬ−２の存在は、ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡアッセイでは検出されず（図１４）、このことは両得異性におけるＴＣＲが、細胞刺激に対して十分な様式でＭＨＣ／ペプチドリガンドを参加させていないことを示唆している。本発明者らは、これらの発見およびさまざまな他のものに基づいて、ＴＣＲに特異的であるが、ＭＨＣ／ペプチドへの両特異的結合を妨害しない抗体を用いた二量体化を介して両特異的ｓｃ分子の活性を改善することが必須である可能性があることを提唱した。本発明者らの実施例において、本発明者らは、Ｖβ８．２上のエピトープに対する特異性を持つＭＲ５−２  ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を選択した。これらの改変条件下でのアッセイの後、本発明者らは固定化ＩＡｄ／ＯＶＡを含むウェル内でシグナルを観察したが、ブランクウェルではシグナルを検出しなかった。さらに、ＫＪ−１  ｍＡｂでコートしたウェル中で、両特異的ｓｃ分子の架橋の効果はより高いＩＬ−２放出が産出され、このことは、両特異的ｓｃ分子の二量体化は、おそらくより強いおよび／または異なったシグナルおよび刺激を導く（図１５）。
【０２７３】
以下の情報は図１４および１５を理解する助けになるであろう。
図１４
ＢＩＳＰ
ｎｇ／ウェル    OD450
2               0.013
3.9             0.036
7.8             0.196
15.6            0.72
31.2            1.01
62.5            1.3375
125             1.746
250             2.006
図１５
構造物    BISP  BISP＋MR5
ブランク  0     0.12
Iad/OVA   0.01  0.271
【０２７４】
１４９−２Ｃ１１−ＥＥ−タグ両特異的ｓｃ分子を評価するために、本発明者らはウェルを抗Ｖ２．０または抗Ｖβ１１．０  ｍＡｂどちらかでコートした。ブランクウェルをナイーブコントロールとして使用した。これらの実験でえられた発見は、ＤＯ１１．１０−２Ｃ１１両特異的ｓｃ分子で報告された物と類似しており、１４９  ＴＣＲに特異的な固定化Ａｂが存在している時のみ、
ＩＬ−２産出が観察されることを示した（図１６）。さらに、この実施例において、本発明者らは、Ｔハイブリドーマを刺激するための両特異的なものによる架橋は、可溶性抗ＣＤ３  Ｆ（ａｂ）’２  １４５−２Ｃ１１を使用して効果的に阻害できたことを明らかにした。これらの発見は、機能的な両特異的ｓｃ分子に対して有利に賛成し、両特異的なものの抗ＣＤ３部分が、Ｔ細胞上のＣＤ３分子に直接的に結合することで働くことを示す（図１０）。
【０２７５】
以下の情報は図１６を理解するために有用であろう。
構造物                OD450
1:2    1:4   1:2/CD3  1:4／CD3
ブランク  0.01   0.01  0.01      0.01
PR3-15    1.07   1.03  0.185     0.282
B20.1     1.2    1.08  0.112      0.118
【０２７６】
実施例１５−直接細胞結合研究に対するフローサイトメトリー解析
両特異的ｓｃ分子のｓｃＳｃ−Ｆｖ部分の機能性を明らかにするために、２Ｂ４Ｔハイブリドーマ細胞を、精製したタンパク質を用いた結合研究で使用した。２Ｂ４細胞はその表面上にＣＤ３を提示し、正しく折り畳まれた１４５−２Ｃ１１  ｓｃ−ＦｖはＣＤ３εを認識するべきである。それぞれの試験試料に関して１０６  ２Ｂ４細胞を冷ＤＰＢＳで洗浄し、精製した両特異的ｓｃタンパク質を添加するか、またはせずに４０μｌの１％  ＦＢＳ／ＤＰＢＳ（再懸濁および洗浄緩衝液）中で再懸濁した。氷上でのインキュベーション後、細胞を穏やかにスピンダウンし、０．５μｇのビオチン化抗体と共に再懸濁した。（ｐＢＩＳＰ／１４９はＶａ２領域に対する抗体（Ｂ２０．１）とインキュベートし、ｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０はＶβ８領域に対する抗体（Ｆ２３．１）とインキュベートした。）試料を氷上でインキュベートし、スピンダウンし、ストレプトアビジン−サイクロム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で再懸濁した。２回洗浄後、細胞を再び再懸濁し、ついでＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用してＦＡＣＳｃａｎ器具（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）上に捕獲／解析した。
【０２７７】
２Ｂ４細胞の、ＰＢＩＳ／１４９またはｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０精製タンパク質とのインキュベーションは結果として、細胞染色における有意な移動となる
。さらに両特異的ｓｃタンパク質を加えると、蛍光の移動はよりはっきりし、このことはｓｃＳｃ−Ｆｖの、細胞表面上のＣＤ３へ結合する能力を表している（図１７−１８）。
【０２７８】
ＣＤ３結合は特異的であり、２Ｂ４細胞表面上の結合部位に対する両特異的ｓｃ分子と競合する可溶性の抗ＣＤ３の添加によって阻害できる（図１９）。
【０２７９】
図１７−１９は、以下の表Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを考えて、より完全に理解される。
【０２８０】
【表１】
0004467188.tif 000003
【０２８１】
【表２】
0004467188.tif 000004
【０２８２】
【表３】
0004467188.tif 000005
【０２８３】
実施例１６−Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｔ細胞アッセイを、ｓｃＢｉｓｐ  １４９分子が特異的Ｔ細胞活性化を仲介できたかどうかを決定するために行った。増殖アッセイは、長期培養したＴ細胞を使用して行い、アッセイで使用する前に１％パラホルムアルデヒドで固定化した、パルスしていないか、１４９ペプチドをパルスしたＴ２（２９）標的細胞の存在下で培養した。条件は、ｓｃＢｓｐ  １４９分子が、パルスしていないか、ｐ１４９ペプチドをパルスしたＴ２標的細胞と共にインキュベートしたときに増殖するようにＴ細胞を刺激することができたかどうかを試験するように選択した。アッセイを以下のように行った。簡単には、ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離した脾臓を脾臓細胞懸濁液を調製するのに使用した。ＲＢＣｓを、ゲイ溶液を使用して溶解し、ついで回復させた脾臓細胞を１０−１５日間、５０Ｕ／ｍＬのネズミｒＩＬ−２を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＢＩ）を含むＩＭＡＭ培地中で１．２５×１０６細胞／ｍＬで培養した。培地を３日ごとに交換し、非接着細胞を回収し、計数し、１．２５×１０６細胞／ｍｌにて再懸濁した。細胞を増殖アッセイで使用する前に、生細胞をフィコール−ハイパック濃度勾配上で単離した。培養液を３日間インキュベートし、Ｔ細胞増殖を製造業者の取扱説明書にしたがって、比色定量増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いて測定した。図２０で示すように、両特異的および１４９ペプチドを負荷したＴ２細胞の存在下でインキュベートしたＴ細胞のみが有意な増殖を示し、一方１４９ペプチドまたはｓｃＢｉｓｈｐ１４９分子いずれかのない状態でインキュベートした培養液は増殖を示さなかった。これらのデータは、ハイブリッドｓｃＢｉｓｐ分子形態で使用したｓｃＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２および特異的ペプチドを提示している標的細胞へのＴ細胞の応答を調節することができることが「原則の証明（ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」を示すので、有意であった。
【０２８４】
脾臓細胞をＢａｌｂ／ｃマウスから単離した脾臓から調製した。簡単には、ＲＢＣｓをゲイ溶液を用いた溶解によって取り除き、次いで回収した脾臓細胞を５０Ｕ／ｍｌのネズミｒＩＬ−２を含む１．２５×１０６細胞／ｍｌにて１０−１５日間培養した。培地を３日ごとに交換し、非接着細胞を回収し、計数し、１．２５×１０６細胞／ｍｌにて再懸濁した。増殖アッセイで細胞を使用する前に、本発明者らはフィコール−ハイパック濃度勾配上で生細胞（主としてＴ細胞）を単離した。この実施例において、本発明者らは１４９−２Ｃ１１  ｓｃ分子が、提示細胞上の同種のＭＨＣ／ペプチドを効果的に認識でき、結合できるかどうか、およびＴ細胞の架橋および活性化を促進できるかどうかを試験した。増殖アッセイを長期培養したＴ細胞を使用して行い、アッセイで使用する前に１％パラホルムアルデヒドで固定化した、パルスしていないか、１４９ペプチドをパルスしたＴ２（２９）標的細胞の存在下で培養した。この培養液を３日間インキュベートし、Ｔ細胞増殖を製造業者の取扱説明書にしたがって、比色定量増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いて測定した。３７℃での１時間インキュベーション後、１００μｌの上清を、二重波長（４５０〜６２０ｎａｒｙ）を読むのために平底プレートに移した。図１９に示すように、両特異的および１４９ペプチドを負荷したＴ２細胞の存在下でインキュベートしたＴ細胞が有意な増殖を示し、一方ｐ１４９ペプチドまたは両特異的分子のない状態でインキュベートした培養液は有意な増殖を示さなかった。これらのデータは、上述したＴハイブリドーマ刺激の結果を支持し、１４９−２Ｃ１１両特異的ｓｃ分子が生物学的に活性であることを示唆している。
【０２８５】
実施例１７−サイトカイン産出のプロファイリング
評価するための他の重要なパラメータは、両特異的ｓｃ分子のサイトカイン応答を調節する能力である。サイトカイン産出は、対象のサイトカインに特異的なＥＬＩＳＡアッセイによって検出できる。９６ウェルプレートを一晩坑サイトカイン「Ａ」で受動的にコートした。アッセイに日に、ウェルを、増殖型の実験からの上清を加える前に１時間、１０％ＦＢＳ／ＰＢＳでブロッキングした。ウェルをビオチン化坑サイトカイン「Ａ」でプローブ化し、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰと共にインキュベートした。陽性ウェルをＡＢＴＳ基質を添加し、４０５ｎＭの吸光を読み検出した。
【０２８６】
サイトカイン産出はまたサポニンペルネアビリゼーションプロトコールを細胞内で使用することで見られうる。細胞をホルムアルデヒドにて固定化し、次いで０．５％サポニンの存在下で対象のサイトカインに対して染色する。次いで試料をフローサイトメトリーを用いて解析した。
【０２８７】
実施例１８−ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害活性の測定
測定すべき最も重要なパラメータの１つは、両特異的ｓｃ分子が標的または腫瘍細胞殺傷を仲介できるかどうかである可能性がある。これらのアッセイは、標準のＣｒ５１放出ＣＴＬ殺傷アッセイを使用して行う。アッセイを以下のように行う。標的細胞（すなわち腫瘍）をまずアイソトープＣｒ５１で標識する。Ｃｒ５１は腫瘍細胞によって取り込まれ、特異的な活性化細胞傷害性Ｔ細胞による細胞溶解において培養上清内に放出される。次いで遊離または放出されたＣｒ５１を計数し、特異的細胞溶解を測定した。本発明者らはこの型のアッセイを使用し、１４９−２Ｃ１１  ｓｃ分子の標的細胞溶解を仲介する能力を評価した。本発明者らのアッセイにおいて、本発明者らは、表面ＨＬＡ−Ａ２を発現し、野生型ｐ５３の増加量を産出することが公知の腫瘍細胞株（すなわちＡＴＣＣから入手可能なＭＤＡ−２３８、ＢＴ５４９およびＭＣＦ−７）を使用する。対照にはＡ２陰性腫瘍株（Ｒａｍｏｓ）およびＡ２陽性だがｐ５３陰性細胞株（Ｓａｏｓ−２）が含まれる。
【０２８８】
実施例１９−デンドリマーへの化学的架橋を介する両特異的分子の産出
化学的架橋アプローチを使用した両特異的分子を構築するために、２Ｃ１１  ｍＡｂおよびＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲを使用した。直接的に２つの分子を架橋することの代わりに、デンドリマーを分子を接着するための足場として使用した。デンドリマーは均一に合成した陽性荷電したポリアミンである。合成の間に由来したそれぞれのデンドリマーの大きさおよび形はほとんど同一であるので、デンドリマーへのタンパク質の添加は結果として同種の分子の形成となる。デンドリマーはまた、生理学条件下では不活性および可溶性である。全長２Ｃ１１  ｍＡｂをペプチン消化し、ゲル濾過によって単離したＦ（ａｂ）’２断片を産出した。Ｆ（ａｂ）’２ピークを貯蔵し、緩衝交換し、Ｆａｂ’分子を、穏やかな還元条件下でのＦ（ａｂ）’２の調製品をインキュベートし、続いてサイズカラム上で精製することで産出した。次いで単離したＦａｂ’分子を遊離のスルフォハイドリル基を通して、１つのＦａｂ’対１つのＳＩＡＢ由来デンドリマーの比で、スルフォ−サクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルフォ−ＳＩＡＢ）へ直接共役させた。反応性アルデヒド基を、デンドリマー上の遊離アミノ基へ共役させるために、ＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲ分子の末端カルボヒドレート残基を産出した。このｓｃＴＣＲを１：１比で２Ｃ１１  Ｆａｂ’デンドリマーへ共役し、両特異的分子を産出した。この両特異的分子を、刺激アッセイでＴハイブリドーマ細胞を活性化させるその能力について評価した。ワーキングモデル系をネズミＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４を用いて発展させた。Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｂａ  Ｆｕｎｄ．Ｓｙｎｐ．（１９９７）を参照のこと。２Ｂ４  Ｔ細胞ハイブリドーマは、Ｖ１１．０およびＶβ３．０からなるａｎ／βＴＣＲを持ち、ＭＨＣクラス２分子ＩＥκに関連して発現したハトシトクロームＣのアミノ酸残基８８〜１０４を認識する。両特異的／デンドリマーを２Ｂ４  Ｔ細胞に加えたとき、高レベルのＩＬ−２が報告され、刺激が起こったを示唆している。さらなる解析は、デンドリマー複合体上の強い陽性電荷が、Ｔ細胞表面への非特異的な結合を引き起こし、結果として刺激となることを明らかにした。
【０２８９】
実施例２０−マウスモデル：ｉｎ  ｖｉｖｏでの両特異的分子の活性の評価
３つの異なる確立されたネズミモデルが、両特異的分子の潜在的な腫瘍抑制活性を評価するために確立された。第一のモデルは、正常のマウス種（すなわちＢａｌｂ／ｃマウス）を使用することおよびこのマウス内にｐＳ３／ＨＬＡ−Ａ２形質転換ＥＬ−４細胞を挿入することを含む。これらの腫瘍細胞をすぐに増殖させ、２、３日以内にマウスを殺す。以下の処理プロトコールを最初に使用する。本発明者らの両特異的分子を評価するために、マウスを０．５ｍｇの両特異的１４９−２Ｃ１１  ｓｃ分子で０日目に前処理する。次の日にマウスにｐ５３／Ａ２陽性形質転換ＥＬ−４細胞と共に、両特異的ｓｃ分子の二回目の投与を与えた。このモデルで測定する主要なパラメータは、両特異的分子を受けたマウスが対照マウス（両特異的分子を受けなかったマウス）よりも長い期間生存したかどうかである。ＥＬ−４腫瘍株は速い増殖を示すので、本発明者らは、両特異的ｓｃ分子での任意の生存時間の増加を観察するために、処理管理を改変する必要がある可能性がある。
【０２９０】
第二のモデルは、ＨＬＡ−Ａ２およびヒト野生型ｐ５３を発現するようトランスフェクトしたネズミ腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスを使用する。このモデルは通常２〜３週間行う。簡単には、腫瘍の移植の後、本発明者らは腫瘍の増殖を測定でき、次いでこれらのマウスに精製したネズミＣＤ８＋  Ｔ細胞を導入し、異なる量の両特異的分子を注射する。いくつかの場合、本発明者らはＴ細胞を前活性化する必要があり、これはｒＩＬ−２の存在下ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞をインキュベートすることによって行う。次いで本発明者らは腫瘍増殖における影響および生存時間の変化を評価し、両特異的ｓｃ分子がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を持つかどうかを決定する。
【０２９１】
第三のモデルおよびほとんど関連したものは、両特異的ｓｃ分子の、ヒト腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍殺傷を仲介する能力を評価する。ＳＣＩＤマウスにヒト乳癌細胞株（すなわちＭＤＡ−２３８、ＢＴ５４９、ＭＣｆ−７）を移植し、４〜６週間増殖させた。次いで精製したＴ細胞および阿集団をｒＩＬ−２でｉｎ  ｖｉｖｏにて前活性化し、マウスに導入する。潜在的な抗腫瘍活性を、腫瘍の減少および生存時間の増加を測定することで査定する。これらの研究は、両特異的分子の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」版を構築すべきかどうかを決定するのに使用する可能性がある。
【０２９２】
実施例２１−「ヒト化」両特異的ｓｃ分子
本発明者らの現在の両特異的ｓｃ分子で使用した抗体はネズミＣＤ３εに特異的なものであるので、本発明者らは、ヒト新生物の処置での使用のためにこれを改変しなければならない。さらに、本発明者らがハイブリドーマ技術を使用する場合、本発明者らは、「ヒト化」を行わなければならないであろうヒトＴＣＲｓまたはＣＤ３に特異的なマウスｍＡｂｓを単離することが最も適当である可能性がある。ヒト化はＣＤＲ移植を行うことではたらくであろう。このことは通常Ａｂの結合活性を減少させるネガティブな効果を持つ。ＴＣＲはまずＣベータ不変領域をヒトＣベータ不変領域に交換することで「ヒト化」できる。
【０２９３】
実施例２２−バクテリオファージ上でのｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の提示
係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号で開示されたように、さまざまなｓｃ−ＴＣＲ構造物をｆｄバクテリオファージ表面上に提示することができる。簡単には、係願中の明細書は、フィラメンタスファージの主要なコートタンパク質であるｐ８との融合タンパク質として、望ましい３領域ｓｃ−ＴＣＲを発現する方法を開示している。これに関する原理は、結果としてＭＨＣ／ペプチド複合体に対するｓｃＴＣＲ／ｐ  ＶＩＩＩの親和力の増加となるべき、ファージの表面でのｓｃＴＣＲの結合価を増加することである。係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号に開示されたように、バクテリオファージ上のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は機能的なＴＣＲを開示する。
【０２９４】
Ａ．提示されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質の特性化
１．ウエスタンブロットデータ
多くの研究が、ファージの表面上に発現したｓｃＦｖ／ｐ８融合タンパク質を示して発行された。Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９１），２２２：３０１およびＨｕｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９２）１４：２９１４を参照のこと。係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号は、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を提示する特異的組換え体バクテリオファージを作製し、使用する方法を開示する。そこで、ウエスタンブロット解析を、ファージのカプシドコート上でのｓｃＴＣＲ／ｐ８分子の提示を確かめるために使用した。簡単には、バクテリオファージを標準のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿手順の方法で精製し、続いて精製したファージのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した。ｓｃＴＣＲ／ｐ８融合物を、ＥＥ−タグ配列に対するｍＡｂで膜をプローブ化することで、組換え体ファージ中で、（ＥＥタグなしのｓｃＴＣＲを発現している対照ファージ中ではなく）検出した。ｓｃＴＣＲ融合物の破壊産物を発現しているさまざまな同様のバンドが観察されたけれども、全長α／βｓｃＴＣＲを指し示す５０ｋＤタンパク質バンドがファージカプシド内に組み込まれた。
【０２９５】
２．ＥＬＩＳＡデータ
係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号で開示されたように、ＥＬＩＳＡアッセイは、望ましいｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を含む組換え体バクテリオファージを特性化するのに使用できる。Ｖβ８．２鎖の構造的正確さを２配座依存ｍＡｂ、ＭＲ５−２およびＦ２３．１を使用して評価し、レセプターのＣＤＲ３結合ポケットを形成するＶα１３．１、ＪαＤＯ、Ｖβ８．２、Ｄβ１およびＪβ１．１領域の正確な折り畳みを抗イディオタイプｍＡｂ  ＫＪ１を使用して査定した。バックグラウンドシグナルを、ＢＳＡまたはｍＡｂ抗Ｖβ１７どちらかでコートしたウェルへ結合しているファージして考え、観察された総シグナルから差し引いた。ｓｃＴＣＲ／ｐ  ＶＩＩＩ融合物吐血後宇するファージＴＣＲと特異的に反応する４つの抗体は、適切な方向でファージ上に提示される。
【０２９６】
Ｂ．ファージパニング
抗体およびペプチドライブラリーのパニングは、上記Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄによって特異的結合分子に対する信頼性のある選別のための方法として確実に確立さている。ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を提示しているバクテリオファージをパニングする方法は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号に開示された。簡単には、この方法には標準の抗体、細胞パニングおよび発行されたＰＣＴ明細書番号第ＵＳ９５／０９８１６号および係願中の米国特許明細書番号第０８／３８２，４５４号および第０８／５９６，３８７号に開示されたｓｃ−ＭＨＣ／ペプチド複合体でのパニングが含まれる。これらの濃縮研究の結果は、他の発行された抗体パニング調査結果とよく相関する。Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１４），１２を参照のこと。
【０２９７】
Ｃ．ブロッキングアッセイ
ＴＣＲを含むファージのＭＨＣ／ペプチド結合特異性を特性化するために、競合ブロッキングアッセイを行った。競合ブロッキングアッセイは係願中の米国特許明細書番号第０８／９４３，０８６号に開示された。簡単には、本実施例の目的は、ＴＣＲを含むファージが細胞に基づいたアッセイで、ＭＨＣ／ペプチド複合体に結合することに関してＤＯ１１．１０ハイブリドーマＴ細胞上の野生型のＴＣＲと競合できたかどうかを決定することであった。結果が、ファージ上のＤＯ１１．１０レセプターが機能的であり、異なるペプチド配列を区別することができたことを示している。
【０２９８】
ＴＣＲを含むファージが、非限定的な様式でＤＯ１１．１０細胞のＩＬ−２産出におそらく影響を与えるのではないかという可能性を除去するために、ウェルを、ＩＬ−２を産出するためにＴ細胞レセプター複合体ＣＤ３分子を介して、ハイブリドーマを刺激するためにｍＡｂ  抗ＣＤ３イプシロンでコートした。これらの実験の結果は、ファージがＴハイブリドーマ細胞上で非特異的な抑制効果を持っていなかったことを示唆している。したがって、ｓｃＴＣＲｓは、特異的にＭＨＣ／ペプチド標的と相互作用できる機能的分子としてバクテリオファージの表面上に提示できる。
【０２９９】
実施例２３−Ｆ２３．１  ｓｃＦｖのクローニングおよび発現
本明細書で開示した多重特異性結合分子の好ましい構成物はＴ細胞レセプターの特定の亜集団に特異性を持つｓｃＦｖである。前述のように広いスペクトルの異なるｓｃＦＶ分子が本発明に沿って利用することができる。
【０３００】
より特異的な多特異性結合分子はネズミｍＡｂ Ｆ２３．１の一本鎖を含む両特異性分子である。そのようなｓｃ−ＦＶは標準の技術によってクローン化し、発現させることが可能である。天然のＦ２３．１抗体の特性化はよくなされており（１）、その表面上でＴＣＲを架橋することによりｖβ８．２をもつＴ細胞を活性化することが示された（Ｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（１９９１）２７８：５７３）。ｓｃＦｖは次のような一般的方法でクローン化し、発現させることができる。
【０３０１】
１．    ｃＤＮＡ合成およびＦ２３．１遺伝子の重鎖、軽鎖のクローニング
まず、１０７のＦ２３．１細胞から単離したｍＲＮＡを用いて第一ストランドｃＤＮＡの合成を行うことができる。プライマーＪＳ３００（ＧＡＡＸ１ＴＡＸ２ＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣ  Ｘ１＝Ａ、Ｇ  Ｘ２＝Ａ、Ｃ、Ｇ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）を用いて、重鎖ｃＤＮＡを合成した。このプライマーは重鎖ＣＨ１領域の最初の２つのアミノ酸をコードしている。軽鎖ｃＤＮＡも、カッパ鎖の骨組みの３´末端に特異的なプライマーＯＫＡ５７（ＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）を用いた以外は本質的に同じ方法で合成した。
【０３０２】
二本鎖ＤＮＡは次のようにｃＤＮＡを増幅させることにより作製した。重鎖はプライマー組、ＰＭＣ１８（フロント）（ＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＸ１ＡＴＧＸ２ＡＧＣＴＧＸ３ＧＴＸ４ＡＴＸ５ＣＴＣ、Ｘ１＝Ａ、Ｇ；Ｘ２＝Ｃ、Ｇ；  Ｘ３＝Ｇ、Ｔ；Ｘ４＝Ａ、Ｃ；Ｘ５＝Ｃ、Ｇ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）およびＪＳ３００を用いて増幅し、軽鎖はプライマー組、ＰＭＣ１４(フロント)（ＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＸ１ＣＡＣＡＸ２Ｘ３ＣＴＣＡＧＧＴＣ、Ｘ１およびＸ３＝Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ、Ｘ２＝Ｇ、Ｔ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４）およびＯＫＡ５７を用いて増幅した。増幅されたＰＣＲ産物をついでｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化し、ヌクレオチド配列決定に供する。次の段階は重鎖、軽鎖をｓｃＦｖ断片の発現のために一本鎖型にクローン化することである。
【０３０３】
実施例２４−一本鎖分子としてのＦ２３．１抗体のクローニングおよび発現
ｖβ８．２ＴＣＲｓを持つネズミＴ細胞上の構造決定基を認識することが明らかになっているＦ２３．１抗体の一本鎖型をクローン化することが可能である。一般的に、ＴＣＲｓのｖβ８．２ファミリーは、マウスのほとんどの系統で２０％の頻度でＴ細胞上に発現される（Ｓｔａｅｒｔｚ，Ｕ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９５）１３４、３９９４）。抗体遺伝子をクローン化した後、特性化のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でｓｃＦｖ分子を発現させることができる。
【０３０４】
Ｆ２３．１抗体が提示している全長の重鎖および軽鎖（すなわちＶ／ＣＨ；Ｖ／ＣＬ）を別々にベクターｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローン化し、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を配列決定により確認した。Ｆ２３．１抗体遺伝子はＶＨおよびＶＬドメインをコードしている遺伝子を同時にスプライシングすることにより一本鎖分子にクローン化できる。例えばひとつの方法としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｓｃＦｖ断片産生のために、発現ベクターｐＥＮ２内にクローン化することである。ｐＥＮ２ベクターは例えば、米国特許第５，７６３，２８４号に開示されている。
【０３０５】
クローニング手順は二段階ＰＣＲ増幅過程により行うことができる。一周目で、ＶＨおよびＶＬ遺伝子の“前面”、“背面”にアニ―ル化された特定のプライマー組を用いてＶＨおよびＶＬ遺伝子を別々に増幅することができる。今後の研究において、Ｔ細胞を抗体の一部、ＣＤ３、ＣＤ４、および特定のＴＣＲｓに反応する抗体として用いて腫瘍を標的にすることができるだろう。しかし、この特定の抗体は、それは例えばＴ細胞を活性化させることができ、特にＣＴＬｓを活性化できるので好ましい。ｓｃＦｖ構造物を作製するために、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を一緒にスプライシングする重複ＰＣＲ法をもちいて二段階目の増幅を行う。２つの鎖は、８塩基カッターＡｃｓ１に対する制限部位を含む１６アミノ酸リンカー（Ｇ４ＳＧ４ＡＰＧ４Ｓ）を用いて連結した。この場合どこで重複ＰＣＲが起こるかで、次のように２つのプライマーを用いることができる：ＪＳＳ３２（Ｔ）（ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）は軽鎖の５´末端上のリンカー配列で重複し、末端プライマーＪＳＳ３３（Ｂ）（ＧＣＣＴＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）はリンカー領域で重複し重鎖の３´末端に達する。重複ＰＣＲ産物をＳｆｉ１およびＳｐｅ１により消化し、試料を１％アガロ―スゲル中に流し、ｓｃＦｖバンドを摘出することにより単離する。
【０３０６】
ｓｃＦｖ遺伝子を次いでＳｆｉ１からＳｐｅ１断片としてｐＥＮ２発現ベクターにクローン化し、タンパク質の導入はｐｈｏＡプロモーターにより制御する。ｓｃＦｖのおよそ５０％が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で可溶性の機能タンパク質として発現されると考えられている。もし特定の宿主細胞あるいは培養条件で不溶性のタンパク質が産生された場合には、可溶性タンパク質を得るための通常の手法に沿ってｓｃＦｖをリフォールドさせることができる。
【０３０７】
実施例２５−バクテリオファージ上での発現のためのｓｃＦＶ／ｐ  ＩＩＩ融合の構築
議論したように、ファージカプシドのひとつの成分としてバクテリオファージ上で様々なｓｃＦｖ融合タンパク質を発現させることができる。例えば、望ましいＴ細胞レセプター上および標的腫瘍細胞上のエピトープに対する結合親和力を与える両特異性バクテリオファージを作製することができる。
【０３０８】
さらにとりわけ、両特異性ファージの例を作製するために、Ｆ２３．１抗体分子をｓｃＦｖ／遺伝子ＩＩＩ融合物としてクローン化する。係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３，７８１号で議論されているように、遺伝子３タンパク質はファージの表面上の５つのコピーとして発現される４０６アミノ酸タンパク質である。特定のｆｄ ｔｅｔバクテリオファージが、ｓｃＦｖ遺伝子をｐ  ＩＩＩ融合としてクローニングするために都合の良いＳｐｅ  １およびＮｏｔ  １部位を付加することにより改変された。Ｆ２３．１  ｓｃＦｖ遺伝子を上記実施例２３で述べたｐＥＮ２ベクターから増幅させることにより、遺伝子を野生型ｐＩＩＩタンパク質のＮ末端領域中にＳｐｅ１―Ｎｏｔ１断片としてクローン化することができる。ｓｃＦｖ／ｐ３融合の誘導がｔａｃプロモーターの制御下にあるために、発現は1ｍＭのＩＰＴＧ添加後に起こる。一般的に、ｓｃＦｖの１コピーがファージごとに遺伝子３融合として提示されることが報告されている。したがって、ファージは抗体分子の単一コピーを提示するのに使用するための魅力的なシステムを示す。このことは非特異的な相互作用を最小限にする助けとなり、ファージが、一価のｓｃＦｖ分子を提示することの理想的な構想を厳密に真似ることを可能にするだろう。特異的ｓｃ−ＴＣＲ融合成分の例は図２Ｄ−２Ｅを参照のこと。
【０３０９】
１．    特異的タグの付加によるｓｃＦｖ構造物への改変
カルボキシル末端領域タグを含むｓｃＦｖ分子を作製するために、いくつかの代替的
な方法を用いることができる。それぞれのタグの配列をコードしているＤＮＡは軽鎖遺伝子の３´末端に融合され得る。カルボキシル末端タグの挿入によりその分子が検出できる。タグの例には、ＫＴ３、ＴＰＰＰＥＰＥＴ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）；６ｘＨｉｓ、ＧＭＡＨＨＨＨＨＨ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）アビジン；ＡＲＫＣＳＬＴＧＫＷＴＮＤＬＧＳＮＭＴ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）ｆｏｓ、ＢｉｒＡ、ＬＸＬＩＦＥＡＱＫＩＥＷＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）あるいはｊｕｎが含まれる。ＫＴ３ＥＥ（ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）分子もいくつかの事例で用いることができる。Ｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｊ．，２７８，５７３ｌ；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，（１９９４），９１，７３６０；Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７１：７６３０およびＳｃｈａｔｚ，Ｐ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９３）１１，１１３８を参照のこと。
【０３１０】
実施例２６−天然および一本鎖ＴＣＲに結合するためのｓｃＦｖ２３．１の精製および分析
金属キレートクロマトグラフィーは組み換えタンパク質の精製において広く用いられる手段となってきている。この技術はｓｃＦｖ分子の精製にも用いることができる。６ｘＨｉｓタグはＮｉ２＋ＮＴＡカラム上での単一精製を可能にするためにｓｃＦｖ分子の設計内にに遺伝子工学で作り変えられた。可溶画分の調製は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストを抽出緩衝液中に懸濁し、次いで細胞をフレンチプレスに溶解することで行う。試料を次いで６ｘＨｉｓタグかされたタンパク質の結合が可能な条件下で、Ｎｉ２＋ＮＴＡカラムに通し、結合したタンパク質をｐＨ７．４でイミダゾ−ルを用いて溶出する。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルのクマシーブルー染色により純度分析できる。ウエスタンブロット分析は、ＫＴ３タグに特異的な抗体で膜をプローブすることにより、ｓｃＦｖの完全性を評価するために用いることができる。
【０３１１】
必要ならば、ｓｃ−Ｆｖの付加的な精製を以下のように行う。例えば、アフィニティーカラムを、まず初めに抗ＥＥタグｍＡｂをタンパク質Ａセファロースビーズに共有結合させることにより作ることができる。次いで抗ＥＥタグでコートされたビーズを、ｍＡｂと架橋する精製したＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲの捕獲に用いる。このカラムは、ｖβ８．２領域に対して特異性を持つので、ｓｃＦｖ（Ｆ２３．１）抗体の精製に用いられ得る。この二段階の精製機構で均質のｓｃＦｖ精製が得られる。
【０３１２】
精製したｓｃＦｖ Ｆ２３．１が機能的であるかを評価するために、ビオチン化し、チップにコートされたストレプトアビジンに結合したｓｃＴＣＲ（ＤＯ１１．１０）タンパク質に対するｓｃＦｖの結合定数を測定する方法としてプラスモン表面共鳴研究が用いられ得る。対照として、組み換え体Ｆ２３．１抗体との比較を測定できる天然のＦ２３．１抗体の結合定数を決定できる。本アッセイの実行に関連した開示に関して、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３．７８１号を参照のこと。
【０３１３】
天然および組み換え体Ｆ２３．１抗体間でのｓｃＴＣＲに対する結合プロフィールを比較することに加えて、それらの抗体の、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞上の天然ＴＣＲへの結合能を調べることが可能である。ビオチン標識した抗体の細胞上のレセプターへの結合を検出するためにフローサイトメトリー分析を用いる。それらの実験で得られたデータから、ｓｃＦｖ断片がｖβ８．２を持つレセプターの結合を通してＴ細胞を活性化する能力を予想できることが期待される。フローサイトメトリ−分析に関連した開示は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３．７８１号および第０８／９４３．０８６号で見ることができる。
【０３１４】
実施例２７−Ｆ２３．１ ｓｃＦｖのバクテリオファージの表面上の遺伝子ＩＩＩ融合としての発現
議論したように、Ｆ２３．１ ｓｃ−Ｆｖはバクテリオファージ表面上に提示するｐ  ＩＩＩ融合として発現され得る。本アプローチは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から抗体を発現させ、精製する努力を行う以前にｓｃＦｖ分子を速やかに特性化する唯一の方法を示す。記述した特性化の研究の多くを成し遂げるために、２〜５リットルの一晩培養で、膨大な量のファージを得ることができる。さらに、実施例６で記述したｓｃ−Ｆｖ分子を精製することの代替法として（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物由来のｓｃＦｖ分子の精製で記述したような複雑な親和力精製系の代わりに）、バクテリオファージの精製は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈降の二回りで容易に行うことができる。ファージをさらに精製する必要があれば、ＣｓＣｌ勾配上での濃縮が活用できる。クローニング後、可溶性ｓｃＦｖ分子の発現および精製に比べ、短い期間でｓｃＦｖを発現しているファージを産生、精製し、試験に用いることができる。ファージがｓｃＦｖ／ｐ  ＩＩＩ融合を発現しているかを試験するために細胞結合アッセイが活用できる。これは、ファージをＤＯ１１．１０  Ｔ細胞とともに培養し、ファージに特異的な、ビオチン標識した抗体を用いて結合したファージをアッセイすることにより行う。細胞結合アッセイの実行に関連したより特定の実施例は、係願中の米国特許明細書番号第０８／８１３．７８１号に記載されている。抗体標識されたファージの検出は、ストレプトアビジン−フィコエリチリン（ＰＥ）結合対の添加により分析できる。ｐ３融合として発現したｓｃＦｖ分子は通常立体構造的な活性を維持しており、多くの場合組み換え体Ｆｖ断片よりも好ましい挙動を示す。目的のひとつは機能的なｓｃＦｖ断片がファージの先端のみに表示されることを確かめることである。
【０３１５】
実施例２８−組み換え体バクテリオファージのＴ細胞活性化能
Ｆ２３．１ ｓｃ−Ｆｖ分子は好ましくＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマを刺激し、あるいは濃縮されていないネズミＴ細胞集団を活性化する能力を示す。すべての実験は、特にＴ細胞を活性化しうることが報告されてからは、ポジティブコントロールとして天然Ｆ２３．１抗体を用いる。上記Ｓｔａｅｒｚを参照のこと。最初の実験で、ｓｃＦｖ／融合を発現しているバクテリオファージがプラスチックのウェルに直接取り込まれるかあるいはファージに対する抗体に捕獲されることにより固定される。別の方法としては、ファージを懸濁液中で用いることができる。簡潔にいうと、１０５  ＤＯ１１．１０  Ｔハイブリドーマ細胞を上述のファージを含むウェルに添加できる。一晩の培養後、プレートを球粒細胞に遠心分離し、上清を単離し、抗ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−２に対するアッセイを行う。
【０３１６】
次の実験は、Ｂａｌｂ／ｃマウスより単離したＴ細胞を用いる。活性化を評価するために２つのパラメータを測定した。第一のパラメータは１０６の天然細胞を抗体ファージ存在下で培養後、ＩＬ−２レベルをアッセイすることである。第二の方法はファージとともに培養後Ｔ細胞上に同定された活性化マーカーで天然細胞を染色することである。活性化された後に発現した、あるいはアップレギュレートされた表面マーカーの数をアッセイすることが可能である。ファージの代わりに精製したｓｃＦＶを用いて比較研究を行うことができる。しかし、この場合においては、分子がｓｃＦｖ分子のカルボキシル末端領域に位置するＫＴ３タグに特異性を持つｍＡｂ似て固定されることが好ましい。これらの２つの実験から、Ｔ細胞刺激あるいは活性化にｓｃＦｖファージを用いることの有効性を評価することができる。
【０３１７】
実施例２９−両特異的ハイブリッド分子（例えば両特異性バクテリアファージ）の構築とそのｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍毒性の特性化
本発明のひとつの目的は、本多重特異的な結合分子、特にｓｃ−ＴＣＲ／ｓｃ−Ｆｖ両特異性分子がｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を殺すことができる。両特異性分子は以下の特定の方法を含め、本研究にしたがった様々な方法で作製できる。
【０３１８】
両特異性分子のひとつの作製方法はバクテリオファージを、ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖ両方を同時に提示するための担体として利用するものである。両特異性ファージはあらかじめｐＳＵＮ２６ファージミドベクターで、次いでｓｃＦｖ／ｐ３発現ファージで形質転換したＫ９１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を感染させることによって作製できる。両特異性ファージのＰＥＧ精製後、ファージをｓｃＴＣＲおよびｓｃＦＶ融合の両方を表面で発現することを確実にするように特性化できる。このことは、ウェルがＶ８．２エピトープを持つ精製したｓｃＴＣＲ（ＤＯ１１．１０）を１ｕｇ／ウェルでコートするＥＬＳＡアッセイで行うことができる。機能的なｓｃＦＶ Ｆ２３．１を発現するファージはＤＯ１１．１０  ｓｃＴＣＲに結合する。ストレプトアビジン―ＨＲＰを用いてファージの表面に提示されたｐ−１４９  ｓｃＴＣＲを検出することができる。抗Ｖ２．３または抗Ｖ１１．０ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）をストレプトアビジン―ＨＲＰの前に用いることができる。
【０３１９】
実施例３０  連結分子を用いたｓｃＴＣＲとｓｃＦｖ分子の結合戦略
議論したように、本多重特異性結合分子はひとつで、あるいは異なる連結分子との組み合わせで連結することができる。特異的な連結分子のいくつかは免疫グロブリン重鎖および特異的結合複合体を形成する能力を持つ、以上で開示したような分子を含む。
【０３２０】
例えば、連結分子のひとつの特定の型は、アビジンのビオチン結合モチーフである。この連結分子は遺伝学的にｐ−１４９  ｓｃＦｖ分子の設計中にコードされた。したがって、ｓｃＦＶ分子はビオチン結合モチーフを含むアビジンから由来したアミノ酸配列とともに発現することができる（Ｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，（１９９１），２７８，５３７−５８５を参照のこと）。目的２で記述したように、ｓｃＴＣＲはカルボキシル末端ビオチン化配列、ＢｉｒＡを含んで発現し（Ｓｃｈａｔｚ，Ｐ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１１３８−１１４３（１９９３）を参照のこと）、ビオチンリガーゼ、（上記Ｓｃｈａｔｚ，Ｐ．、ＢｉｒＡ部位にひとつのビオチンを付加できる酵素）の存在下でｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで遊離のビオチンを結合できる。一価の両特異性分子はこの方法で効果的に形成することができる。この方法を用いることの魅力はアビジンとビオチン間の強い相互作用（１０−１５Ｍ）と（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９９０）１８４，８５−１３３を参照のこと）、ホモ２量体形成（ｓｃＴＣＲ：ｓｃＴＣＲあるいはｓｃＦＶ：ｓｃＦｖ）よりもヘテロ２量体を形成する確立が高いことである。
【０３２１】
付加的な連結分子の利用が企図されている。例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎロイシンジッパーを用いることにより望ましいｓｃＴＣＲおよびｓｃＦｖに同時に結合できるという他に方法を用いることができる（例えば、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９４）９１，７３６０−７３６４およびＳｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９９１）６３６，２８８−２９４を参照のこと）。さらに、それぞれの分子は分離することができる。例えば、ｓｃＦＶはカルボキシル末端ｆｏｓ配列を持ち、ｓｃＴＣＲはカルボキシル末端ｊｕｎ配列を持つように作ることができる。相互作用の安定性を増大させるジスルフィド結合の形成を促進するために、ｆｏｓおよびｊｕｎ両側面にひとつのシステイン残基を位置させる。アビジン／ビオチンの方法と同様に、この技術もホモ２量体に比べ非常に高い頻度でヘテロ２量体を産生するという利点を持つ（上記Ｐａｔｅｌｅｔ ａｌ．）。
【０３２２】
本発明はその好ましい実施様態に関して記述してきたがしかし、本本研究の意図および範囲内で改変、改善することができることが、本開示を考慮することで当業者に高く評価されるであろう。本明細書で言及した資料はすべて証明書で組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜Ｄは、一本鎖Ｔ細胞レセプター（ｓｃ−ＴＣＲ）および一本鎖Ｆｖ（ｓｃ−Ｆｖ）ＤＮＡ構造物を示す図である。（１Ａ）ＤＯ１１．１０  ｓｃ−ＴＣＲ構造物、（１Ｂ）ｐ１４９  ｓｃ−ＴＣＲ構造物、（１Ｃ）１４５−２Ｃ１１  ｓｃ−Ｆｖ、（１Ｄ）Ｆ２３．１  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ構造物。
【図２】  図２Ａ〜Ｅはさまざまなベクターのｓｃ−ＴＣＲ挿入物を示す図である。（２Ａ）ｐＳｕｎ２２、（２Ｂ）ｐＳｕｎ２３、（２Ｃ）ｐＳｕｎ２１、（２Ｄ）ｐＳｕｎ１９、（２Ｅ）ｐＳｕｎ２０。
【図３】  図３はｐＳＵＮ２３ベクターの略図例である。
【図４】  図４はｐＮＡＧ２ベクターの略図例である。
【図５】  図５はｐＳＵＮベクターを示す略図である。
【図６】  図６は好ましい両特異的ハイブリッド分子ｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０およびｐＢＩＳＰ／１４９を示す図である。
【図７】  図７Ａはキメラ両特異的抗体分子を作製するための方法を示している図である。この方法は、細胞内でｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ融合分子（軽鎖）と結合する抗体鎖（重鎖）ハイブリドーマ発現細胞（１４５−２Ｃ１１ハイブリドーマ）を使用する。ｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ分子に関する好ましい構造は図７Ｂに図解する。
【図８】  図８はベクターｐＳＵＮ７ベクターを示している図である。
【図９】  図９Ａ及びＢは、ＢＩＳＰ／１４９融合タンパク質を検出するために使用したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しているグラフである。使用した抗体は、（９Ａ）αＥＥ（捕獲Ａｂ）およびαＶα２（Ｂ２０．１、プローブＡｂ）、（９Ｂ）αＶβ１１（ＲＲ３−１５、捕獲Ａｂ）であった。ＲＲ３−１５はαＶβ１１鎖に特異的なモノクローナル抗体である。Ｂ２０．１はαＶα２鎖に特異的なモノクローナル抗体である。プローブＡｂは図９Ｂにおいてｘ軸である。
【図１０】  図１０Ａ及びＢはＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０融合タンパク質を検出するのに使用したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しているグラフである。使用した抗体は（１０Ａ）Ｆ２３．１（プローブＡｂ）または（１０Ｂ）Ｈ５７−５９７（プローブＡｂ）であった。捕獲Ａｂは図９Ａおよび９Ｂでｘ軸上である。
【図１１】  図１１はキラル両特異的分子を検出するために使用したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しているグラフである。捕獲Ａｂはヒツジ坑マウスＩｇＧ２ｂ（ｘ軸）である。プローブＡｂはヒツジ坑ハムスターＩｇＧである。
【図１２】  図１２はＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０およびＢＩＳＰ／ｐ１４９両特異的ハイブリッド分子の発現を示しているウエスタンブロットの表示である。タンパク質の還元型も示されている（矢印）。
【図１３】  図１３はクーマシーブルーで染色したＳＤＳゲルの表示である。ゲルはＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０およびＢＩＳＰ／ｐ１４９両特異的ハイブリッド分子の発現を示している。タンパク質の還元型も示されている（矢印）。
【図１４】  図１４は機能ＫＪ−１モノクローナル抗体としてＴハイブリドーマ細胞によって発現されたＩＬ−２レベルを示しているグラフである。
【図１５】  図１５は機能ＢＩＳＰまたはＢＩＳＰ＋ＭＲ−５抗体添加としてＴハイブリドーマ細胞によって発現されたＩＬ−２を示しているグラフである。
【図１６】  図１６はモノクローナル抗体添加の機能として、Ｔハイブリドーマ細胞のいＬ−２発現を示しているグラフである。
【図１７】  図１７はｐＢｉｓｐ１４９細胞の２Ｂ４Ｔ細胞への結合をフローサイトメトリーによって示しているグラフである。
【図１８】  図１８はｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０精製タンパク質の２Ｂ４細胞Ｔ細胞間の結合を、フローサイトメトリーによって示しているグラフである。
【図１９】  図１９は可溶性α−ＣＤ３およびｐＢＩＳＰ／１４９精製タンパク質間のフローサイトメトリー研究を示しているグラフである。
【図２０】  図２０はＴ細胞増殖アッセイの結果を示しているグラフである。ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞をｒＩＬ−２で前刺激し、１０μｇ／ウェルの濃縮ｓｃＢｉｓｐ１４９分子を、パルスしていない標的細胞（Ｔ２）またはｐ１４９ペプチドをパルスしたＴ２細胞と共にインキュベートした。
【図２１】  図２１は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１６〜２０）を示す図である。
【図２２】  図２２は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２１〜２５）を示す図である。
【図２３】  図２３は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２６及び２７）を示す図である。
【図２４】  図２４は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２８〜３２）を示す図である。
【図２５】  図２５は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３３〜３９）を示す図である。
【図２６】  図２６は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４０〜４３）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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