(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患に罹患している哺乳動物において、Ｔ細胞免疫反応を調節するための医薬組成物であって、配列番号２のアミノ酸３９−３７４を含むポリペプチドを含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
個体においてナチュラルキラー細胞を生成するための医薬組成物であって、配列番号２のアミノ酸３９−３７４を含むポリペプチドを含む、前記医薬組成物。
【請求項３】
個体において感染性疾患またはウイルス感染を治療するための医薬組成物であって、配列番号２のアミノ酸３９−３７４を含むポリペプチドを含む、前記医薬組成物。
【請求項４】
それを必要とする個体において腫瘍細胞を殺すための医薬組成物であって、配列番号２のアミノ酸３９−３７４を含むポリペプチドを含む、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞機能を調節する、または改変することが可能な、ＬＤＣＡＭと称される新規ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、Ｔ細胞表面分子と相互作用して情報伝達を改変し、それ自体に結合し、そしてＢ７Ｌ−１と称される別の新規ポリペプチドに結合し、そしてナチュラルキラー細胞集団の増加を生じる新規ポリペプチドを含む。本発明は、ＬＤＣＡＭ分子、ＬＤＣＡＭ分子をコードするＤＮＡ、組換えＬＤＣＡＭポリペプチドを産生するための方法、およびこうしたＬＤＣＡＭポリペプチドを含む薬剤組成物を含む。
【０００２】
関連技術の説明
接着分子は、免疫系および他の細胞系内の細胞情報伝達において、重要な役割を果たす。Ｔ細胞受容体複合体により送達される抗原特異的シグナルに加え、Ｔ細胞による免疫反応の形態および種類は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の接着分子により仲介される、共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）シグナルに応じる。こうした共刺激情報伝達の１つは、接着分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）を伴い、前記分子は、そのＴ細胞表面受容体、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）を通じ、重要なシグナルを送る。Ｂ７−１は、ＣＤ２８と相互作用し、サイトカイン産生、細胞増殖、およびエフェクターおよび記憶Ｔ細胞の生成を情報伝達する。ＣＤ２８を通じたシグナルが遮断されると、Ｔ細胞アネルギーまたは免疫偏向が起こり、非常に抑圧されたまたは改変された免疫反応を生じる可能性がある。
【０００３】
Ｂ７−１はまた、Ｔ細胞ＣＴＬＡ４受容体とも相互作用する。その情報伝達は複雑であるが、１つの構成要素は、負のフィードバックシグナルを提供し、Ｔ細胞のＣＤ２８シグナルを減弱させる。本シグナルの非存在下では、激しいＴ細胞増殖およびエフェクター細胞活性化が続く。本フィードバック制御が正しく働かないと、自己免疫疾患およびリンパ球増殖が生じる可能性がある。例えば、ＣＤ２８およびＢ７−１（およびＢ７−２）相互作用が、抗ＣＴＬＡ４抗体で遮断された際、腫瘍免疫の増加およびリンパ球増殖が観察されてきている。
【０００４】
Ｂ７−２は、Ｂ７−１のものとは異なる細胞上で、そしてＡＰＣ活性化の異なる段階で発現されるが、本分子もまた、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４を通じ、Ｔ細胞に共刺激シグナルを送達する。Ｂ７−２シグナルは、Ｂ７−１情報伝達から生じる免疫反応と同一の、または異なる免疫反応を導く可能性がある。Ｂ７−２情報伝達の性質は、細胞の背景および共刺激のタイミング次第である。
【０００５】
Ｂ７−１およびＢ７−２は、同じ細胞受容体に結合するが、アミノ酸レベルで、弱くしか関連していない。しかし、どちらも、伸長された免疫グロブリンドメインを含むスーパーファミリーのメンバーであり、そしてそれらの共有される配列相同性の多くは、Ｉｇ−ドメインサブファミリーに特徴的である、共通のＩｇドメインによる共有される特定の残基のためである。
【０００６】
抗原に対するＴ細胞反応に、他の接着分子が重要であることを示唆する証拠がある。例えば、抗原によるＴ細胞受容体の結合に反応して起こるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生は、特定の疾患ではＣＤ２８の非存在下で起こる可能性がある。増殖およびサイトカイン産生はまた、ＣＤ２８の非存在下での記憶反応、およびＣＤ２８が遺伝的に除去されている系において起こる可能性もある。いくつかの場合、Ｔ細胞増殖は、ＣＤ４８またはＩＣＡＭ／ＬＦＡ系内での相互作用に依存する。さらに、ＡＬＣＡＭとして知られる接着分子は、そのＴ細胞リガンド、ＣＤ６と相互作用し、ＣＤ３シグナルを調節する。
【０００７】
明らかに、Ｔ細胞表面受容体を通じた情報伝達は、免疫系のバランスを維持するのに重要な役割を果たす。活性化シグナル、例えばＣＤ２８およびＢ７−１の間の共刺激情報伝達が主である系は、自己免疫および炎症を導く可能性がある。阻害性シグナル、例えばＣＴＬＡ４の間の共刺激情報伝達が主である免疫系は、感染細胞または癌細胞を攻撃する能力がより低い。Ｔ細胞情報伝達に関与する新規分子を単離することは、その受容体を介し伝達される生物学的シグナル（類）を研究するのに、非常に望ましい。さらに、こうした分子の同定は、自己免疫、炎症および感染に関連する疾患状態を制御しそして治療する手段を提供する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＬＤＣＡＭと称される哺乳動物ポリペプチドを提供する。ＬＤＣＡＭは、リンパ由来樹状細胞上に見出され、そしてＢ７−１を含む接着分子に限定された相同性を示すため、こう名付けられた。本明細書に記載されるＬＤＣＡＭ分子は、それ自体に結合し、Ｂ７Ｌ−１（１９９８年８月７日に提出された同時係属出願Ｓ／Ｎ  ６０／０９５，６６３（本明細書に援用される）に記載される）と限定された相同性を有し、そしてこれに対し、Ｂ７−Ｌ１が結合タンパク質である、単離または均質タンパク質を含む。本発明はさらに、ＬＤＣＡＭをコードする単離ＤＮＡおよび哺乳動物ＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含む。本発明の範囲内に、ＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞、およびこうした宿主細胞を、ＬＤＣＡＭの発現を導く条件下で培養することにより、ＬＤＣＡＭを産生するための方法がある。さらに本発明の範囲内にあるのは、ＬＤＣＡＭ分子の可溶性型を含む薬剤組成物、および該薬剤組成物を投与することにより、Ｔ細胞免疫反応を調節するための方法である。本発明に含まれるさらなる方法には、個体に薬剤組成物を投与することにより、またはｅｘ  ｖｉｖｏでＬＤＣＡＭおよびナチュラルキラー細胞前駆細胞を合わせることにより、ナチュラルキラー細胞を生成することが含まれる。
【０００９】
発明の詳細な説明
ＬＤＣＡＭと称される新規タンパク質が本明細書に提供される。さらに提供されるのは、ＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡ、ＬＤＣＡＭを含む組換え発現ベクター、およびＬＤＣＡＭを発現するのに適した条件下で、発現ベクターで形質転換されている宿主細胞を培養し、そして発現されたＬＤＣＡＭを回収することを含む、組換えＬＤＣＡＭポリペプチドを産生するための方法である。
【００１０】
Ｂ７−１に対し配列類似性を有し、１９９８年８月７日に提出された同時係属出願Ｓ／Ｎ  ６０／０９５，６６３号に記載される分子であるＢ７Ｌ−１は、本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドの結合タンパク質である。Ｂ７Ｌ−１は、ＬＤＣＡＭ結合タンパク質であるため、そしてＢ７Ｌ−１およびＬＤＣＡＭは、バンド４．１およびＰＤＺファミリーメンバーの潜在的な結合部位を含む細胞内ドメインで相同性を示し、そして多くの同一の細胞種上に見られるため、これらの細胞結合型は、結合された際、同様のシグナルを送達する可能性がある。したがって、これらは共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）または対構造（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）と称される。ヒトＢ７Ｌ−１の長または短細胞外型をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７および配列番号９に示される。配列番号７および配列番号９のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８および配列番号１０に開示される。
【００１１】
Ｂ７Ｌ−１が結合する細胞株を同定するため、そして続いてＢ７Ｌ−１が結合するタンパク質を単離するため、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を実施例１に記載されるように調製し、そして実施例２に記載される結合研究を行った。実施例３は、Ｂ７Ｌ−１が結合する細胞株であるＷＩ−２６から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして全長ＬＤＣＡＭヒトクローンを同定することを記載する。実施例３に記載されるように単離されたヒトＬＤＣＡＭをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、そしてそれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に示される。配列番号２に記載される、コードされるヒトＬＤＣＡＭアミノ酸配列は、１−３８の３８アミノ酸のリーダー配列を含む３７４アミノ酸の予測される細胞外ドメイン；２１アミノ酸（３７５−３９５）の膜貫通ドメインおよびアミノ酸の細胞質ドメイン（３９６−４４２）を有する。
【００１２】
実施例５および６は、ヒトＬＤＣＡＭ／Ｆｃを作成し、そして結合研究に用い、ヒトＬＤＣＡＭが結合する細胞株を同定することを記載する。細胞株の中で陽性に同定されたのは、Ｓ４９．１細胞およびＦｌｔ３−Ｌ処理マウスの脾臓およびリンパ節由来のリンパ性樹状細胞であった。実施例７は、発現ライブラリーのプールをスクリーニングし、ネズミＬＤＣＡＭクローンを同定することを記載する。単離ネズミＬＤＣＡＭ  ＤＮＡ配列は、配列番号３に開示される。配列番号３のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列は、配列番号４に開示される。コードされるネズミＬＤＣＡＭアミノ酸配列（配列番号４）は、３５６アミノ酸（残基１−３５６）の予測される細胞外ドメイン；２１アミノ酸（３５７−３７７）の膜貫通ドメイン；およびアミノ酸残基３７８−４２３を含む細胞質ドメインを有する。配列番号３および配列番号４は、全長成熟ネズミＬＤＣＡＭ配列を記載する。ヒトＬＤＣＡＭ配列に比較すると、シグナル配列は、完全には記載されていない。
【００１３】
本明細書に記載される精製哺乳動物ＬＤＣＡＭ分子は、Ｂ７−１および他の細胞接着分子に、限定された全体的な相同性を有する、Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＬＤＣＡＭはＢ７Ｌ−１の細胞質領域に高い相同性を有する。以下の実施例６に記載されるように、ＬＤＣＡＭタンパク質は、広範囲の発現を示す。特に、ヒトＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡは、乳房、網膜、胎児肝臓、脾臓、胎児心臓、肺、筋肉、胎盤、甲状腺、および肺癌腫で見出される。ＬＤＣＡＭメッセージを有する細胞株にはＷｉ−２６が含まれる。マウスＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡは、全胚、精巣、三重ネガティブ細胞ネズミ脾臓およびリンパ節ＣＤ８+、Ｓ４９．１および樹状細胞上で見出される。
【００１４】
配列番号１および３に開示されるＤＮＡ配列の発見により、ヒトおよびマウスＬＤＣＡＭタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクター；該発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞；均質なタンパク質としての生物学的に活性があるＬＤＣＡＭ；およびＬＤＣＡＭと免疫反応性である抗体の構築が可能になる。
【００１５】
Ｂ７Ｌ−１同様、ＬＤＣＡＭは、ポリオウイルス受容体、デルタオポイド（ｏｐｏｉｄ）結合タンパク質および接着分子に対し、限定された相同性を有する。さらに、実施例１３に記載されるように、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡおよびＰＨＡにより引き起こされるＴ細胞増殖を遮断し、ＬＤＣＡＭがＴ細胞仲介免疫反応を調節するのに有用であることが示唆される。ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ  ｍＡｂ誘導Ｔ細胞増殖を阻害せず、マイトジェン誘導Ｔ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの阻害効果は、ＩＬ−２などのサイトカイン分泌の阻害のためであるか、またはＬＤＣＡＭ結合パートナーの活性化および発現の増加後のＴ細胞の下流反応制御のためであることが示唆される。こうしたものに限定されないが、ＬＤＣＡＭ分子の特定の使用が以下に記載される。
【００１６】
本明細書において、ＬＤＣＡＭという用語は、配列番号２のアミノ酸配列１−４４２および配列番号４のアミノ酸配列１−４２３を有するポリペプチドを含む。さらに、ＬＤＣＡＭは、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列と高い度合いの類似性または高い度合いの同一性を有し、そして生物学的に活性がある、ポリペプチドを含む。「ＬＤＣＡＭ」という用語は、それ自体と結合しそして複合体を形成するポリペプチド、Ｂ７Ｌ−１が結合タンパク質であるポリペプチド、並びに抗原およびマイトジェンに反応し、Ｔ細胞シグナルを改変するポリペプチドの種類を指す。
【００１７】
「ネズミＬＤＣＡＭ」という用語は、配列番号３のＤＮＡの生物学的に活性がある遺伝子産物を指し、そして「ヒトＬＤＣＡＭ」という用語は、配列番号１のＤＮＡの生物学的に活性がある遺伝子産物を指す。用語「ＬＤＣＡＭ」にさらに含まれるのは、主に、該タンパク質のＢ７Ｌ−１共結合（ｃｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）部分を含み、生物学的活性を保持し、そして分泌されることが可能である、可溶性または一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質である。こうした可溶性タンパク質の特定の例は、配列番号２のアミノ酸１−３７４の配列を含むもの、および配列番号４のアミノ酸１−３５６の配列を含むものである。あるいは、こうした可溶性タンパク質は、リーダー配列を除いてもよく、そしてしたがって、配列番号２のアミノ酸３９−３７４を含んでもよい。
【００１８】
ＬＤＣＡＭを指す場合、「生物学的に活性がある」という用語は、該ＬＤＣＡＭがマイトジェンに反応したＴ細胞シグナルを改変することが可能であることを意味する。
【００１９】
「単離されている」は、ＬＤＣＡＭが、例えば組換え宿主細胞培養の精製産物のように、または精製抽出物のように、他のタンパク質またはポリペプチドと関連していないことを意味する。
【００２０】
本明細書において、「ＬＤＣＡＭ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、天然ＬＤＣＡＭと実質的に相同であるが、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、天然ＬＤＣＡＭ（ヒト、ネズミまたは他の哺乳動物種）のものと異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを意味する。変異体アミノ酸配列は、好ましくは、天然ＬＤＣＡＭアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９０％同一である。同一性パーセントは、例えばＤｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７，  １９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，  １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５，  １９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。変異体は、保存的置換配列を含んでもよく、つまり既定のアミノ酸残基を、同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの、あるいはＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換が含まれる。他のこうした保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。天然発生ＬＤＣＡＭ変異体または対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）もまた、本発明に含まれる。こうした変異体の例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはＬＤＣＡＭタンパク質のタンパク質分解切断から生じるものであり、ここでＬＤＣＡＭ結合特性は保持される。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、一部切除されているが生物学的に活性があるＬＤＣＡＭを生じる可能性があり、例えば該タンパク質の天然発生可溶性型などがある。タンパク質分解に起因すると考えられる変動には、例えば、異なる種類の宿主細胞における発現に際しての、ＬＤＣＡＭタンパク質からの１つまたはそれ以上の末端アミノ酸（一般的に１−５末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去によるＮまたはＣ末端の相違が含まれる。
【００２１】
実施例９は、ＬＤＣＡＭ結合研究および該分子の機能的特性を調べることに向けられる研究に利用してもよい、新規ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質の構築を記載する。実施例に記載されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に関し、他の抗体Ｆｃ領域を置換してもよい。他の適切なＦｃ領域は、プロテインＡまたはプロテインＧに高親和性で結合することが可能なもの、あるいは、ヒトまたはネズミＩｇＧ１  Ｆｃ領域の断片、例えば鎖間ジスルフィド結合が形成されるであろうような、少なくともヒンジ領域を含む断片を含むものである。ＬＤＣＡＭ融合タンパク質は、容易に精製される利点を提供する。さらに、２つの別個の融合タンパク質鎖のＦｃ領域間にジスルフィド結合が形成され、二量体を生じる。
【００２２】
上に記載されるように、本発明の一つの側面は、可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドである。可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドは、天然ＬＤＣＡＭの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含むが、細胞膜上へのポリペプチドの保持を生じるであろうシグナルを欠く。可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドは、最初に合成される際、好都合に、天然（または異種性）シグナルペプチドを含み、分泌を促進するが、シグナルペプチドは、細胞からのＬＤＣＡＭの分泌に際し、切断される。本発明に含まれる可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドは、Ｂ７Ｌ−１に結合する能力、またはそれ自体に結合する能力を保持する。あるいは、本発明の可溶性ＬＤＣＡＭは、Ｔ細胞反応を改変する能力を保持する。可溶性ＬＤＣＡＭは、該可溶性ＬＤＣＡＭタンパク質が分泌されることが可能である限り、シグナルの一部または細胞質ドメインの一部またはその他の配列を含んでもよい。
【００２３】
可溶性ＬＤＣＡＭは、望ましいタンパク質を発現する損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を、例えば遠心分離により、培地から分離し、そして望ましいタンパク質の存在に関し、培地または上清をアッセイすることにより同定し（そしてその非可溶性膜結合型から区別し）てもよい。培地におけるＬＤＣＡＭの存在は、該タンパク質が細胞から分泌され、そしてしたがって、望ましいタンパク質の可溶性型であることを示す。
【００２４】
ＬＤＣＡＭの可溶性型は、天然結合ＬＤＣＡＭタンパク質より、多くの利点を持つ。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのタンパク質の精製が容易になる。さらに、可溶性タンパク質は、一般的に、静脈内投与に、より適している。
【００２５】
可溶性ＬＤＣＡＭポリペプチドの例には、天然ＬＤＣＡＭタンパク質の細胞外ドメインの実質的な部分を含むものが含まれる。例えば、可溶性ヒトＬＤＣＡＭタンパク質は、配列番号２のアミノ酸３８−３７４または１−３７４を含み、そして可溶性ネズミＬＤＣＡＭは、配列番号４のアミノ酸１−３５６を含む。さらに、全細胞外ドメインより少ないものを含む一部切除可溶性ＬＤＣＡＭタンパク質が、本発明に含まれる。宿主細胞で最初に発現される際、可溶性ＬＤＣＡＭは、使用される宿主細胞内で機能する、以下に記載される、異種性シグナルペプチドの１つを含んでもよい。あるいは、該タンパク質は天然シグナルペプチドを含んでもよい。本発明の１つの態様において、可溶性ＬＤＣＡＭは、（ＮからＣ末端に）酵母α−因子シグナルペプチド、以下に、そして米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、および配列番号２のアミノ酸３９−３７４または配列番号４の２１−３５６からなる可溶性ＬＤＣＡＭを含む融合タンパク質として、発現させてもよい。本組換え融合タンパク質は、酵母細胞で発現され、そして該細胞から分泌される。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドは、タンパク質の精製を容易にし、そして続いて、ウシ粘膜エンテロキナーゼを用い、可溶性ＬＤＣＡＭから切断することが可能である。可溶性ＬＤＣＡＭタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列が、本発明に含まれる。
【００２６】
可溶性ポリペプチドを含む、一部切除ＬＤＣＡＭは、いくつかの慣用的技術のいずれにより、調製してもよい。望ましいＤＮＡ配列は、それ自体知られる技術を用い、化学的に合成してもよい。ＤＮＡ断片はまた、全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化により産生し、そしてアガロースゲル上の電気泳動により単離してもよい。単数または複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むリンカーを使用し、望ましいＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入してもよいし、または断片を、天然に存在する切断部位で消化してもよい。周知のポリメラーゼ連鎖反応法もまた使用し、望ましいタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を増幅してもよい。さらなる代替法として、既知の突然変異誘発技術を使用し、望ましい点、例えば受容体結合ドメインの最後のアミノ酸のコドンのすぐ下流に、停止コドンを挿入してもよい。
【００２７】
上述のように、本発明は、組換えおよび非組換え両方の、単離されたまたは均質なＬＤＣＡＭポリペプチドを提供する。さらに、本発明の範囲内にあるのは、望ましい生物学的活性を保持する天然ＬＤＣＡＭタンパク質の変異体および誘導体である。こうした活性は、ＬＤＣＡＭがそれ自体に結合する能力、またはＢ７Ｌ−１に結合する能力、またはＴ細胞情報伝達を改変する能力を含む。ＬＤＣＡＭ変異体および誘導体は、天然ＬＤＣＡＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得てもよい。天然アミノ酸配列の改変は、いくつかの慣用法のいずれにより達成してもよい。天然配列断片への連結を可能にする制限部位が隣接する、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に突然変異を導入してもよい。連結後、生じた再構築配列は、望ましいアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体（ａｎａｌｏｇ）をコードする。
【００２８】
あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発法を使用し、あらかじめ決定されたコドンが置換、欠失または挿入により改変されている可能性がある、改変遺伝子を提供してもよい。上述の改変を作成する典型的な例は、すべて本明細書に援用される、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，  １９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，  １９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，  １２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ,  １９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８，  １９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７，  １９８７）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に開示されている。
【００２９】
他の化学部分、例えばグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと共有または凝集結合体を形成することにより、ＬＤＣＡＭを修飾し、ＬＤＣＡＭ誘導体を生成してもよい。ＬＤＣＡＭの共有誘導体は、ＬＤＣＡＭアミノ酸側鎖上の、あるいはＬＤＣＡＭポリペプチドのＮ末端またはＣ末端、またはその細胞外ドメインの、官能基上に、化学部分を連結することにより、調製してもよい。本発明の範囲内の他のＬＤＣＡＭ誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体としての組換え培養中の合成によるなど、ＬＤＣＡＭまたはその断片と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体が含まれる。例えば、結合体は、ＬＤＣＡＭポリペプチドのＮ末端にシグナルまたはリーダーポリペプチド配列（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のα−因子リーダー）を含んでもよい。シグナルまたはリーダーペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に、合成部位から細胞膜または細胞壁の内部または外部の部位への、結合体の運搬を指示する。
【００３０】
ＬＤＣＡＭポリペプチド融合体は、ＬＤＣＡＭの精製および同定を容易にするため添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリＨｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。
【００３１】
本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないＬＤＣＡＭポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−７細胞）で発現されたＬＤＣＡＭは、発現系の選択に基づき、分子量および糖鎖付加パターンにおいて、天然ＬＤＣＡＭポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。細菌発現系、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）でのＬＤＣＡＭポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。
【００３２】
アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは生物学的活性または結合に必要とされない末端または内部残基または配列の欠失をコードする同等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）ＤＮＡ構築物が、本発明に含まれる。例えば、ＬＤＣＡＭ細胞外ドメインのＮ糖鎖付加部位を修飾し、糖鎖付加を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ糖鎖付加部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。配列番号２のヒトＬＤＣＡＭポリペプチドは、アミノ酸６７−６９、１０１−１０３、１１３−１１５、１６５−１６７、３０４−３０６、および３０８−３１０にこうしたトリプレットを６つ含む。同様に、配列番号４のネズミＬＤＣＡＭポリペプチドは、アミノ酸４９−５１、８３−８５、９５−９７、１４７−１４９、２８６−２８８および２９０−２９２にこうしたトリプレットを６つ含む。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止を生じるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎ糖鎖付加部位を不活性化するのに十分である。タンパク質のＮ糖鎖付加部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。
【００３３】
別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を改変し、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で置換されるようにし、再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを妨げてもよい。他の同等物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を亢進させるため、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される。ＥＰ  ２１２，９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩基性残基の発生を除去するため、残基を欠失、付加、または置換することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ２切断にかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する保存的なそして好ましいアプローチを代表する。
【００３４】
本発明の範囲内にある核酸配列には、中程度のまたは非常にストリンジェントな条件下で、本明細書に開示されるＬＤＣＡＭヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そして生物学的に活性があるＬＤＣＡＭをコードする、単離ＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。中程度にストリンジェントな条件には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ  １０１−１０４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に定義されるように、５  Ｘ  ＳＳＣ、０．５%  ＳＤＳ、１．０  ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）の前洗浄溶液の使用および約５５℃、５  Ｘ  ＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件が含まれる。非常にストリンジェントな条件には、より高温度のハイブリダイゼーションおよび洗浄が含まれる。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、核酸分子の長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。
【００３５】
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性がある、遺伝暗号の既知の縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号１および３に示されるものと異なり、そしてなお、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＤＣＡＭタンパク質をコードする可能性がある。こうした変異体ＤＮＡ配列は、沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００３６】
本発明は、生物学的に活性があるＬＤＣＡＭをコードする同等の単離ＤＮＡ配列であって：（ａ）配列番号１および配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズすることが可能であり、そして生物学的に活性があるＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡ；および（ｃ）遺伝暗号の結果として、（ａ）、または（ｂ）に定義されるＤＮＡに対し縮重しており、そして生物学的に活性があるＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡ、より選択される、前記ＤＮＡ配列を提供する。こうしたＤＮＡ同等配列にコードされるＬＤＣＡＭタンパク質が、本発明に含まれる。
【００３７】
配列番号１および配列番号３のＤＮＡ配列に同等であるＤＮＡは、配列番号２および配列番号４を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、中程度および非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするであろう。こうしたＤＮＡにコードされるＬＤＣＡＭタンパク質の例には、限定されるわけではないが、ＬＤＣＡＭ断片（可溶性断片を含む）および上述のような、単数または複数の不活性化Ｎ糖鎖付加部位、不活性化ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位、または保存的アミノ酸置換を含むＬＤＣＡＭタンパク質が含まれる。他の哺乳動物種由来のＤＮＡにコードされるＬＤＣＡＭタンパク質であって、そして該ＤＮＡが配列番号１または配列番号３のｃＤＮＡにハイブリダイズするであろう前記タンパク質もまた、本発明に含まれる。
【００３８】
Ｂ７Ｌ−１に結合する能力を有する変異体は、いかなる適切なアッセイにより同定してもよい。ＬＤＣＡＭの生物学的活性は、例えば、Ｂ７Ｌ−１の結合ドメインへの結合に関する競合（すなわち競合的結合アッセイ）により、測定してもよい。
【００３９】
ＬＤＣＡＭポリペプチドに関する競合的結合アッセイの1つの種類は、放射標識可溶性ＬＤＣＡＭ、並びにＢ７Ｌ−１を発現している損なわれていない細胞を用いる。損なわれていない細胞の代わりに、可溶性Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質、例えばプロテインＡ、プロテインＧあるいは該分子のＢ７Ｌ−１またはＦｃ部分に対する抗体と、該融合タンパク質のＦｃ部分との相互作用を通して、固相に結合しているＢ７Ｌ−１／Ｆｃを代用してもよい。競合的結合アッセイの別の種類は、放射標識可溶性ＬＤＣＡＭ受容体、およびＬＤＣＡＭを発現している損なわれていない細胞を利用する。
【００４０】
競合的結合アッセイは、慣用的方法論にしたがい、行ってもよい。例えば、放射標識ＬＤＣＡＭを、推定上のＬＤＣＡＭ相同体と競合させるのに用い、Ｂ７Ｌ−１または表面結合ＬＤＣＡＭ受容体に対する結合活性に関し、アッセイしてもよい。定性的結果は、競合的オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより得てもよく、またはスキャッチャードプロットを利用して定量的結果を生成してもよい。
【００４１】
あるいは、ＬＤＣＡＭ結合タンパク質、例えばＢ７Ｌ−１および抗ＬＤＣＡＭ抗体などを、表面上にＬＤＣＡＭを発現する細胞を同定し、分離し、または精製するのに適した、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の支持体などの固相に結合させてもよい。ＬＤＣＡＭ結合タンパク質の、固相接触表面への結合は、いかなる手段により達成してもよく、例えば、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を構築し、そしてこうしたものをプロテインＡまたはプロテインＧの相互作用を通じ固相に結合させることによってもよい。タンパク質を固相に固定するための多様な他の手段が当業に周知であり、そして本発明での使用に適している。例えば、磁気微小球体をＢ７Ｌ−１で被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。ＬＤＣＡＭ発現細胞を含む細胞混合物の懸濁物を、その上にＢ７Ｌ−１ポリペプチドを有する固相と接触させる。その表面上にＬＤＣＡＭを有する細胞は、固定されたＢ７Ｌ−１に結合し、そして非結合細胞をその後洗い流す。このアフィニティー結合法は、こうしたＬＤＣＡＭ発現細胞を溶液から精製し、スクリーニングし、または分離するのに有用である。陽性に選択された細胞を固相から遊離させる方法は当業に知られ、そして例えば、酵素の使用を含む。こうした酵素は、好ましくは、細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは、細胞表面結合パートナーを切断することに向けられる。Ｂ７Ｌ−１：ＬＤＣＡＭ相互作用の場合、酵素は、好ましくは、生じた細胞懸濁物をＬＤＣＡＭ成分から遊離させる。精製細胞集団は、特に胎児組織から得た場合、その後、成熟（成体）組織に再定着させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）のに用いてもよい。
【００４２】
あるいは、ＬＤＣＡＭ+細胞を含むと疑われる細胞混合物をまず、ビオチン化Ｂ７Ｌ−１とインキュベーションしてもよい。インキュベーション期間は、典型的には、ＬＤＣＡＭへの十分な結合を確実にするため、少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを充填したカラムに通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高親和性が、ビーズへの細胞の結合を提供する。アビジン被覆ビーズの使用は当業に知られる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。非結合成分の洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用いて行う。
【００４３】
上述のように、Ｂ７Ｌ−１はＬＤＣＡＭを発現している細胞を分離するのに用いてもよい。代替法において、ＬＤＣＡＭあるいはその細胞外ドメインまたは断片を、Ｂ７Ｌ−１発現細胞を検出するため、125Ｉなどの検出可能部分と結合させてもよい。125Ｉでの放射標識は、高比放射能に標識されている機能する125Ｉ−ＬＤＣＡＭ分子を生じるいくつかの標準的方法論のいずれにより行ってもよい。あるいは該分子のＢ７Ｌ−１領域またはＦｃ領域に対するヨウ素化またはビオチン化抗体を用いてもよい。比色または蛍光分光反応を触媒することが可能な酵素、ビオチン、あるいはアビジンなどの別の検出可能部分を用いてもよい。Ｂ７Ｌ−１発現に関し試験すべき細胞を標識ＬＤＣＡＭポリペプチドと接触させてもよい。インキュベーション後、非結合標識ＬＤＣＡＭを除去し、そして検出可能部分を用い、結合を測定する。
【００４４】
ＬＤＣＡＭ（変異体を含む）の結合特性はまた、上述のものと類似の競合アッセイにおいて、結合体化可溶性ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ（例えば、125Ｉ−ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ）を用い、決定してもよい。しかしこの場合、固体支持体に結合している、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃを発現している損なわれていない細胞を用い、推定上のＬＤＣＡＭ変異体を含む試料が、ＬＤＣＡＭの結合体化可溶性結合パートナーとの結合に関し競合する度合いを測定する。
【００４５】
ＬＤＣＡＭに関しアッセイする他の手段には、抗ＬＤＣＡＭ抗体、ＬＤＣＡＭに反応し増殖する細胞株、またはＬＤＣＡＭの存在下で増殖する組換え細胞株の使用が含まれる。
【００４６】
本明細書に開示されるＬＤＣＡＭタンパク質はまた、ＬＤＣＡＭに対する結合親和性という点で、Ｂ７Ｌ−１または他のＬＤＣＡＭ結合タンパク質の生物学的活性を測定するのに、使用してもよい。１つの例として、Ｂ７Ｌ−１の修飾（例えば化学的修飾、一部切除、突然変異など）後、生物学的活性が保持されているかを測定するのにＬＤＣＡＭを用いてもよい。このように、Ｂ７Ｌ−１タンパク質の生物学的活性を、例えば、調査研究、またはおそらく臨床に用いる前に、確定することが可能である。
【００４７】
ＬＤＣＡＭタンパク質は、例えば異なる条件下でのＢ７Ｌ−１または他のＬＤＣＡＭ結合タンパク質の貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品質保証」研究を行うものにより、使用されてもよい試薬としての使用を見出す。例えば、ＬＤＣＡＭを結合親和性研究に使用し、異なる温度で保存されている、または異なる細胞種で産生されたＢ７Ｌ−１タンパク質の生物学的活性を測定してもよい。修飾Ｂ７Ｌ−１タンパク質のＬＤＣＡＭに対する結合親和性を、非修飾Ｂ７Ｌ−１タンパク質のものと比較し、Ｂ７Ｌ−１の生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。同様に、ＬＤＣＡＭタンパク質の生物学的活性を、Ｂ７Ｌ−１を用い、評価してもよい。
【００４８】
ＬＤＣＡＭポリペプチドはまた、結合している剤を、Ｂ７Ｌ−１またはＬＤＣＡＭを持つＴ細胞または他の細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。ＬＤＣＡＭタンパク質を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、これらの細胞に診断または治療剤を搬送してもよい。実施例５に記載されるように、ＬＤＣＡＭは、ＥＢＶ形質転換細胞株である、ＰＡＥ８１ＢＭ細胞株上に見られる。したがって、こうしたキャリアー使用の１つの例は、本細胞を治療剤／ＬＤＣＡＭ結合体に曝露し、いかなるものでもよいＥＢＶ癌に対し、該剤が細胞傷害性を示すかどうか評価することである。さらに、ＬＤＣＡＭは抗原提示に重要である樹上細胞およびＣＤ４０Ｌ活性化Ｂ細胞上に発現されるため、ＬＤＣＡＭは、これらの細胞を標的化し、同定し、そして精製するのに有用なキャリアーである。また、ＬＤＣＡＭ／診断剤結合体を使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、樹状細胞およびＢ細胞の存在を検出してもよい。実施例６は、ヒトＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡ、転写物が、ヒト乳房、網膜、胎児肝臓、脾臓、胎児心臓、肺、胎盤、甲状腺および肺癌腫に見られることを示す。マウスＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡ発現に関する同様の研究により、マウスＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡが全胚、精巣、リンパ由来樹上細胞および三重ネガティブ細胞に見られることが示された。ＬＤＣＡＭはそれ自体に結合するため、ＬＤＣＡＭを用い、これらの組織におけるその機能上の役割を研究することが可能である。
【００４９】
ＬＤＣＡＭに結合しているいくつかの異なる治療剤または他の機能するマーカーを、アッセイにおいて、結合体中で用い、細胞に対する該剤の細胞傷害性効果を検出し、そして比較し、または組織および細胞におけるＬＤＣＡＭの役割を研究してもよい。ＬＤＣＡＭポリペプチドに結合させてもよい診断および治療剤には、限定されるわけではないが、薬剤、毒素、放射性核種、発色団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素、およびそれらに匹敵するものが、意図される適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。薬剤の例には、多様な型の癌を治療するのに用いられるもの、例えばL−フェニルアラニンナイトロジェンマスタードなどのナイトロジェンマスタードまたはシクロホスファミド、シス−ジアミノジクロロ白金などの挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗物質、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、およびブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなどの抗生物質、並びにそれらの誘導体が含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、123Ｉ、131Ｉ、99mＴｃ、111Ｉｎ、および76Ｂｒがある。治療使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、131Ｉ、211Ａｔ、77Ｂｒ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、212Ｐｂ、212Ｂｉ、109Ｐｄ、64Ｃｕ、および67Ｃｕがある。
【００５０】
こうした剤は、いかなる適切な慣用法により、ＬＤＣＡＭに結合させてもよい。ＬＤＣＡＭはタンパク質であり、例えば、望ましい剤の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質または剤を誘導体化し、望ましい反応性官能基を生成し、または結合させてもよい。誘導体化には、多様な分子をタンパク質に結合させるのに入手可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの結合を伴ってもよい。タンパク質を放射標識するためのいくつかの技術が知られる。放射性核種金属を、例えば適切な二官能性キレート剤を用いることにより、ＬＤＣＡＭに結合させてもよい。
【００５１】
ＬＤＣＡＭおよび適切な診断または治療剤を含む（好ましくは共有結合している）結合体をこのように調製する。該結合体を投与し、またはそうでなければ特定の適用に適した量で使用してもよい。
【００５２】
上述のように、ＬＤＣＡＭはＣｏｎＡおよびＰＨＡにより引き起こされるＴ細胞増殖を遮断し、そしてＴＣＲ  ｍＡｂ誘導Ｔ細胞増殖を阻害しないため、マイトジェン誘導Ｔ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの阻害効果は、サイトカイン、例えばＩＬ−２分泌の阻害のためである可能性がある。したがって、本発明のＬＤＣＡＭの別の使用は、Ｔ細胞において、ＩＬ−２産生にＬＤＣＡＭが果たす役割を研究するための研究ツールとしてのものである。本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドはまた、Ｂ７Ｌ−１の検出またはその相互作用の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいても、使用してもよい。
【００５３】
本発明の１つの態様は、免疫系の機能不全と関連する障害の治療法に向けられる。より詳細には、ＬＤＣＡＭはＣｏｎＡ刺激Ｔ細胞およびＰＨＡ刺激Ｔ細胞を遮断することが知られているため、ＬＤＣＡＭはＴ細胞反応により仲介される炎症および自己免疫障害を治療するのに有用である可能性がある。ＬＤＣＡＭタンパク質、好ましくは可溶性ポリペプチド、および薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーを含む組成物を哺乳動物に投与し、こうした炎症または自己免疫障害を治療してもよい。
【００５４】
ＬＤＣＡＭ／Ｆｃの形の可溶性ＬＤＣＡＭを注射されているＳＣＩＤマウスは、脾臓細胞性の増加を経験する。この増加は一部、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）としても知られる、ＤＸ−５+細胞の増加のためである。ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ、およびＮＫ細胞増殖因子であるＩＬ−１５を注射されると、ＳＣＩＤマウスは、ＮＫ細胞の累積的な増加を示す。これはさらに、ＬＤＣＡＭ、ＬＤＣＡＭ断片、および可溶性ＬＤＣＡＭが、ＮＫ細胞を生成する能力の証拠となる。この発見を考慮し、本発明の別の態様は、個体に、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、またはＬＤＣＡＭ断片を含む、本発明の薬剤組成物を投与することにより、個体においてＮＫ細胞の数を増加させるための方法を含む。別の態様において、ＮＫ細胞をＬＤＣＡＭまたはＬＤＣＡＭの可溶性型と接触させ、ＮＫ細胞の増殖を可能にすることにより、ｅｘ  ｖｉｖｏでＮＫ細胞を増殖させてもよい。同様に、ＬＤＣＡＭまたはＬＤＣＡＭの可溶性型を、さらなるサイトカイン類または増殖因子類と組み合わせて投与することにより、直前で記載したように、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＮＫ細胞を生成してもよい。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＮＫ細胞を生成するための本方法は、さらに、ＬＤＣＡＭと連続して、または同時に組み合わせ、有効量のサイトカインを使用することを含んでもよい。こうしたサイトカインには、限定されるわけではないが、インターロイキン（「ＩＬ」）ＩＬ−１５、ＩＬ−３およびＩＬ−４、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体からなる群より選択されるコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、あるいは他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＣＤ４０結合タンパク質（例えばＣＤ４０−Ｌ）、４−１ＢＢアンタゴニスト（例えば４−１ＢＢおよび４−１ＢＢ−Ｌと免疫反応性である抗体）またはｃ−ｋｉｔリガンドが含まれる。
【００５５】
ＮＫ細胞は、巨大顆粒リンパ球であり、ＴまたはＢリンパ球とは形態および機能が異なる。ＮＫ細胞は、非ＭＨＣ制限方式で、特定の腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の殺傷を仲介する。さらに、ＮＫ細胞は、骨髄移植レシピエントによるドナー細胞の拒絶に関与する。ＬＤＣＡＭはＮＫ細胞数を増加させるため、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、またはＬＤＣＡＭ断片は、ウイルス感染細胞および感染性疾患と戦うのに有用である。同様に、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、およびＬＤＣＡＭ断片は、腫瘍細胞を殺すのに有用である。したがって、本発明の範囲内に、感染性疾患を治療するための方法、および腫瘍に罹患している個体を治療するための方法がある。こうした治療法は、腫瘍細胞を殺すため、または感染性疾患と戦う能力を亢進させるため、ＬＤＣＡＭ、ＬＤＣＡＭの可溶性型、またはＬＤＣＡＭ断片を、ＮＫ細胞数を増加させる必要がある個体に投与することを伴う。同様に、ＬＤＣＡＭ、可溶性ＬＤＣＡＭ、例えばＬＤＣＡＭ融合タンパク質、またはＬＤＣＡＭ断片を、連続して、または同時にサイトカインと組み合わせて投与し、本発明の治療法を実行してもよい。こうしたサイトカインには、限定されるわけではないが、インターロイキン（「ＩＬ」）ＩＬ−１５、ＩＬ−３およびＩＬ−４、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合体からなる群より選択されるコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、あるいは他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＣＤ４０結合タンパク質（例えばＣＤ４０−Ｌ）、４−１ＢＢアンタゴニスト（例えば４−１ＢＢおよび４−１ＢＢ−Ｌと免疫反応性である抗体）またはｃ−ｋｉｔリガンドが含まれる。
【００５６】
さらに本発明の範囲内には、移植のレシピエントによる、器官および骨髄移植拒絶を予防するまたはその影響を減少させるための方法がある。こうした方法は、ＬＤＣＡＭ阻害剤を含む組成物でレシピエントを処置し、こうしてＮＫ細胞集団の増加を阻害し、そしてＮＫ細胞が移植片を拒絶する能力を減少させることを伴う。
【００５７】
本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドを、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがい処方してもよい。ＬＤＣＡＭは、単一の活性成分として、または他の既知の活性成分と共に、薬学的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせてもよい。適切なキャリアーおよびそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  １９８０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載されている。さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化している、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物に取り込まれている、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれているＬＤＣＡＭを含んでもよい。こうした組成物は、ＬＤＣＡＭの物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響するであろう。ＬＤＣＡＭはまた、組織特異的受容体、リガンドまたは抗原に対する抗体に結合していてもよいし、または組織特異的受容体のリガンドにカップリングしていてもよい。ＬＤＣＡＭ結合タンパク質が腫瘍細胞上に見られる場合、ＬＤＣＡＭを毒素と結合し、それによりＬＤＣＡＭを用い、特定の部位に毒素を搬送してもよいし、あるいはＬＤＣＡＭを用い、こうした腫瘍細胞を続いて投与される剤に感受性にしてもよい。
【００５８】
ＬＤＣＡＭは、局所、非経口、または吸入によるなどで、投与してもよい。「非経口」という用語には、皮下注射、静脈内、筋内、槽内注射、または注入技術が含まれる。これらの組成物は、典型的には、ＬＤＣＡＭの有効量を、単独でまたは他のいかなる活性成分であってもよいものの有効量と組み合わせ、含むであろう。組成物に含まれるこうした投薬量および望ましい薬剤濃度は、意図される使用、患者の体重および年齢、並びに投与経路を含む、多くの要因に応じ変化する可能性がある。予備的用量は動物試験にしたがい決定してもよく、そしてヒト投与のための投薬量の見積もりを、当業に認められる実施にしたがい、行ってもよい。
【００５９】
ＬＤＣＡＭポリペプチドは、共有結合もしくは非共有結合している二量体または三量体などの、オリゴマーとして存在してもよい。オリゴマーは、異なるＬＤＣＡＭポリペプチド上のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により連結されていてもよい。本発明の１つの態様において、ＬＤＣＡＭ二量体は、Ｔ細胞、Ｂ７Ｌ−１またはそれ自体へのＬＤＣＡＭの結合に干渉しない方式で、ＬＤＣＡＭを抗体（例えばＩｇＧ１）のＦｃ領域に、融合させることにより、生成される。Ｆｃポリペプチドは、好ましくは、可溶性ＬＤＣＡＭ（リガンド結合部分のみを含む）のＣ末端に融合される。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している異種性ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的な調製は、例えば、本明細書に援用される、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１）およびＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，  １９９０）に記載されてきている。ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ融合タンパク質を、抗体分子によく似た形で集合するのを可能にし、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成され、二価ＬＤＣＡＭを生じる。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものＬＤＣＡＭ細胞外領域を持つＬＤＣＡＭオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、２つの可溶性ＬＤＣＡＭドメインをペプチドリンカーで連結してもよい。
【００６０】
ＬＤＣＡＭポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高次の真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング用および発現用ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ニューヨーク州エルセビア（１９８５）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、ＬＤＣＡＭポリペプチドを産生するのに使用してもよい。
【００６１】
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が含まれる。形質転換に適した原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にするため、ＬＤＣＡＭポリペプチドがＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。Ｎ末端メチオニンは、発現された組換えＬＤＣＡＭポリペプチドから切断されてもよい。
【００６２】
ＬＤＣＡＭポリペプチドは、好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の、酵母宿主細胞において発現されてもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）またはクロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使用してもよい。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３，  １９８０）あるいは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．  ７：１４９，  １９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７：４９００，  １９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ，  ＥＰＡ−７３，６５７またはＦｌｅｅｒら，  Ｇｅｎｅ，  １０７：２８５−１９５（１９９１）；およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：１３５−１３９（１９９０）にさらに記載されている。他の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：２６７４，  １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，  １９８２）に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌両方において複製可能なシャトルベクターは、大腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することにより、構築してもよい。
【００６３】
酵母α−因子リーダー配列を使用し、ＬＤＣＡＭポリペプチドを直接分泌させてもよい。α−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３，  １９８２；Ｂｉｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：５３３０，  １９８４；米国特許第４，５４６，０８２号；およびＥＰ  ３２４，２７４を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列が当業者に知られる。リーダー配列を、その３'端近傍に、１つまたはそれ以上の制限部位を含むよう修飾してもよい。これは、リーダー配列の構造遺伝子への融合を容易にするであろう。
【００６４】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨｉｎｎｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１９２９，  １９７８に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒｐ+形質転換体を選択培地中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸，２％グルコース，１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００６５】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換されている酵母宿主細胞は、発現を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【００６６】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えＬＤＣＡＭポリペプチドを発現するのに使用してもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系がＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７  （１９８８）に概説されている。哺乳動物起源の樹立細胞株もまた、使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるようなアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来のＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株が含まれる。
【００６７】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列を、ウイルスゲノムより切り出してもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用い、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供してもよい。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含む可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，  １９７８）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位からＢｇｌ  Ｉ部位に渡るおよそ２５０  ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた用いてもよい。
【００６８】
哺乳動物宿主細胞において用いるのに典型的な発現ベクターを、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８０，  １９８３）に開示されるように構築してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５，  １９８６）に実質的に記載されるように構築してもよい。Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，  １９８４に記載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ  ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、および１９９１年５月１６日に提出された米国特許出願第０７／７０１，４１５号に記載されている。ベクターはレトロウイルス由来であってもよい。天然シグナル配列の代わりに、そしてイニシエーターメチオニンに加え、異種性シグナル配列、例えば、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるＩＬ−７のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されるＩＬ−２受容体のシグナル配列；ＥＰ  ３６７，５６６に記載されるＩＬ−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ  ４６０，８４６に記載されるＩＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチドを添加してもよい。
【００６９】
本発明にしたがった、単離され、精製されているまたは均質なタンパク質としてのＬＤＣＡＭは、上述のように組換え発現系により産生してもよいし、または天然発生細胞から精製してもよい。ＬＤＣＡＭは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均質に精製することが可能である。
【００７０】
ＬＤＣＡＭを産生するための1つの方法は、ＬＤＣＡＭをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換されている宿主細胞を、ＬＤＣＡＭの発現を促進するのに十分な条件下で培養することを含む。ＬＤＣＡＭを次いで、使用される発現系に応じ、培地または細胞抽出物から回収する。当業者に知られるように、組換えタンパク質を精製するための方法は、使用される宿主細胞および組換えタンパク質が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがい、変化するであろう。
【００７１】
例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を使用する場合、培地をまず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用い、濃縮してもよい。濃縮段階に続き、濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側鎖を有するマトリックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常使用される他の種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用してもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む多様な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えば、側鎖（ｐｅｎｄａｎｔ）メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つまたはそれ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を使用し、ＬＤＣＡＭをさらに精製してもよい。前記の精製段階のいくつかまたはすべてを多様な組み合わせで用いる方法が周知であり、そして実質的に均質な組換えタンパク質を提供するのに使用されうる。
【００７２】
発現されたＬＤＣＡＭポリペプチドをアフィニティー精製するのに、ＬＤＣＡＭ結合タンパク質のリガンド結合ドメインを含むアフィニティーカラムを利用することが可能である。ＬＤＣＡＭポリペプチドは、慣用的技術を用いて、例えば、高塩溶出緩衝液中、そしてその後、使用のためより低塩緩衝液中に透析することによって、あるいは利用されたアフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨまたは他の構成要素を変化させることによって、アフィニティーカラムから除去してもよい。あるいは、アフィニティーカラムはＬＤＣＡＭに結合する抗体を含んでもよい。実施例５は、本発明のＬＤＣＡＭを、ＬＤＣＡＭに対して向けられるモノクローナル抗体を生成するのに使用するための方法を記載する。
【００７３】
細菌培養において産生される組換えタンパク質を、最初に宿主細胞を破壊し、遠心分離し、不溶性ポリペプチドであれば細胞沈澱から、または可溶性ポリペプチドであれば上清流体から抽出し、その後１つまたはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー段階を行うことにより単離してもよい。最後に、最終精製段階に、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用してもよい。微生物細胞を、凍結融解サイクル、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、いかなる簡便な方法により破壊してもよい。
【００７４】
形質転換酵母宿主細胞は、好ましくは、精製を単純にするため、分泌ポリペプチドとしてＬＤＣＡＭを発現するよう使用される。酵母宿主細胞発酵から分泌される組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．  ２９６：１７１，  １９８４）に開示されるものと類似の方法により精製してもよい。Ｕｒｄａｌらは、分離用ＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＩＬ−２精製のための、２つの連続する逆相ＨＰＬＣ段階を記載する。
【００７５】
ＬＤＣＡＭ核酸の有用な断片には、標的ＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡ（センス）またはＬＤＣＡＭ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することが可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明にしたがい、ＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡのコード領域の断片を含む。こうした断片は一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４ないし約３０ヌクレオチドを含む。既定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６５９，  １９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，  １９８８）に記載されている。
【００７６】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、二重鎖の亢進した分解、転写または翻訳の未成熟な終結、または他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つにより、標的配列の転写または翻訳を遮断する二重鎖の形成を生じる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、ＬＤＣＡＭタンパク質の発現を遮断してもよい。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾糖−ホスホジエステル骨格（または、ＷＯ  ９１／０６６２９に記載されるものなど、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そしてこのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。こうした耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可能である）が、標的ヌクレオチド配列に結合することが可能な配列特異性を保持する。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるものなどの有機部分、およびポリ（Ｌ−リジン）などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤、およびアルキル化剤または金属錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
【００７７】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ4仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む、いかなる遺伝子トランスファー法により、またはエプスタイン・バーウイルスなどの遺伝子トランスファーベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入されてもよい。好ましくは、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに該アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを挿入し、その後、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで該挿入配列を含む該レトロウイルスベクターと接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。適切なレトロウイルスベクターには、限定されるわけではないが、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）由来のもの、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称される二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ  ９０／０２６５６を参照されたい）が含まれる。
【００７８】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ  ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入されてもよい。適切なリガンド結合分子には、限定されるわけではないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合体化は、リガンド結合分子がその対応する分子または受容体に結合する能力に実質的に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体型が細胞内に入るのを遮断しない。あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞に導入されてもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼにより、細胞内で分離される。
【００７９】
上記に加え、以下の例は、特定の態様を例示するため提供され、そして本発明の範囲を限定するためではない。
【００８０】
【実施例】
実施例１
Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質の調製
以下は、Ｂ７Ｌ−１が結合する細胞を同定するのに用いた、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃタンパク質の生成を記載する。該融合タンパク質は、ヒトＢ７Ｌ−１の可溶性細胞外領域および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）ヒトＦｃ領域を含み、そしてまず、Ｂ７Ｌ−１の細胞外領域に隣接するプライマーを用い、ヒトＢ７Ｌ−１の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを単離することにより調製した（米国特許第５，０１１，９１２号を参照されたい）。
【００８１】
Ｂ７Ｌ−１の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド（１９９８年８月７日に提出された同時係属出願Ｓ／Ｎ  ６０／０９５，６６３号の配列番号１のヌクレオチド１０８−１２４９）を単離するため、Ｂ７Ｌ−１の細胞外領域に隣接するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして用い、反応のテンプレートであったクローン＃４４９０４からＰＣＲ産物を得た。生じたＰＣＲ産物を、プライマーにより取りこまれたＳａｌ１およびＢｇｌＩＩ部位で、Ｓａｌ１およびＢｇｌＩＩ制限酵素を用い、消化した。より低いＦｃ受容体結合のため突然変異しているヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む発現ベクター（ｐＤＣ４０９）に、生じた断片を連結した。
【００８２】
生じたＤＮＡ構築物をサル腎臓細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡに（ｐｓｖ３ｎｅｏの共トランスフェクションと共に）トランスフェクションした。０．５％低免疫グロブリンウシ血清を含む培地で７日間培養した後、０．２％アジ化物溶液を上清に添加し、そして０．２２μｍフィルターを通し上清を濾過した。その後、およそ１ｌの培養上清を、１０  ｍｌ／分で、４．６  ｘ  １００  ｍｍプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａ）を用い、ＢｉｏＣａｄ  プロテインＡ  ＨＰＬＣタンパク質精製系を通過させた。プロテインＡカラムは、上清中の融合タンパク質のＦｃ部分に結合し、融合タンパク質を固定し、そして上清中の他の構成要素がカラムを通過するのを可能にする。カラムを３０ｍｌのＰＢＳ溶液で洗浄し、そして結合している融合タンパク質をｐＨ３．０に調整したクエン酸でＨＰＬＣカラムから溶出させた。溶出した精製融合タンパク質は、溶出の際、ｐＨ７．４の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を用い、中和した。
【００８３】
実施例２
Ｂ７Ｌ−１結合研究
実施例１に記載されるように調製したＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を用い、標準的フローサイトメトリー方法論にしたがい、定量的結合研究を用い、Ｂ７Ｌ−１結合に関し、細胞株をスクリーニングした。スクリーニングする各細胞に関し、該方法は、細胞をインキュベーションし、ＰＢＳ中の２％  ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、５％正常ヤギ血清および５％ウサギ血清で１時間ブロッキングすることを含んだ。その後、ブロッキングされた細胞をＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質５μｇ／ｍｌと、ＰＢＳ中の２％  ＦＣＳ、５％ヤギ血清および５％ウサギ血清中でインキュベーションした。インキュベーション後、試料をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％  ＦＣＳ）で２回洗浄し、そしてその後、マウス抗ヒトＦｃ／ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入）およびＳＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入したストレプトアビジン−フィコエリトリン）で処理した。この処理は、抗ヒトＦｃ／ビオチンをすべての結合しているＢ７Ｌ−１／Ｆｃに結合させ、そしてＳＡＰＥを抗ヒトＦｃ／ビオチンに結合させ、細胞に結合しているＢ７Ｌ−１／Ｆｃ上に蛍光同定標識を生じさせる。蛍光検出フローサイトメトリーを用い、すべての結合しているタンパク質に関し細胞を解析した。結果により、ヒトＢ７Ｌ−１は、ヒト肺上皮細胞株（ＷＩ−２８）、ヒトＢリンパ芽球株（ＤａｕｄｉおよびＰＡＥ８ＬＢＭ１）、ヒト新鮮扁桃腺Ｂ細胞、ｆｌｔ３−Ｌ処理動物の脾臓／リンパ節由来のネズミＣＤ８+樹状細胞およびネズミＴ細胞リンパ腫Ｓ４９．１によく結合することが示された。
【００８４】
実施例３
Ｂ７−１対受容体に関するＷＩ−２６発現ライブラリーのスクリーニング
以下は、実施例１に記載されるように調製したＢ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を用いた発現クローニングライブラリーのスクリーニングを記載する。発現ライブラリーは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１，（１９８７）に記載される方法を用い、ヒト細胞株ＷＩ−２６から調製した。標準的間接結合法を用い、スライドオートラジオグラフィーにより、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション単層を、放射ヨウ素化Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質を用い、Ｂ７Ｌ−１対受容体の発現に関し、アッセイした。対受容体を発現している細胞を示す陽性スライドを同定し、そしておよそ２，０００の個々のクローンを含む１つのプールを、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃ融合タンパク質の結合に関し、潜在的に陽性と同定した。
【００８５】
プールの力価を測定し、そしてその後、掻きとって、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションするためのプールされたプラスミドＤＮＡを提供した。より小さいプールをスクリーニングした後、１つのプールが、Ｂ７Ｌ−１／Ｆｃに結合することが可能な発現遺伝子産物の存在により示されるように、Ｂ７Ｌ−１対受容体に関し、陽性のクローンを含んだ。陽性プールの力価を測定し、そして蒔いて個々のコロニーを得た。潜在的な候補クローン各々からＤＮＡを単離し、再トランスフェクションし、そして再スクリーニングした。生じた陽性クローンは、１５３５ヌクレオチドのｃＤＮＡ挿入物を含んだ。Ｂ７Ｌ−１対受容体（ＬＤＣＡＭ）のｃＤＮＡコード領域は、配列番号１に開示されるものに対応する。配列番号１にコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に開示される。
【００８６】
実施例４
ヒトＬＤＣＡＭの発現
以下は、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞における全長膜結合ヒトＬＤＣＡＭの発現を記載する。ヒトＬＤＣＡＭを発現するためのベクター構築物は、配列番号１のコード領域をｐＤＣ４０９発現ベクターに連結することにより、調製した。発現ベクターをその後、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションし、そしてＭｃＭａｈａｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１に記載される技術を用い、ＬＤＣＡＭを発現した。
【００８７】
細胞にショックを与え、そして数日インキュベーションした後、膜結合ＬＤＣＡＭを有する細胞を回収し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、そしてその損なわれていない形で用いた。
【００８８】
配列番号１のヌクレオチド８ないし１１３０にコードされるＬＤＣＡＭ細胞外領域を含むＬＤＣＡＭの可溶性型を発現させるため、配列番号１の細胞外コード領域を、ｐＤＣ４０９発現ベクターに連結することにより、ベクター構築物を調製する。該ベクターをＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションする。
【００８９】
新鮮な培地中の３日のインキュベーション期間後、可溶性型を含むＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞上清を回収し、そしてＨＰＬＣ技術またはアフィニティークロマトグラフィー技術を用い、ＬＤＣＡＭを単離することにより、可溶性ＬＤＣＡＭを回収する。
【００９０】
実施例５
ＬＤＣＡＭ結合研究
ＬＤＣＡＭが結合する細胞株を同定するため、以下の実施例９に記載されるＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質を調製し、そして細胞結合およびＦＡＣＳアッセイに用いた。標準的細胞結合およびＦＡＣＳ方法論を用いると、ＬＤＣＡＭはＢリンパ芽球細胞株、ＤＡＵＤＩおよびＰＡＥ８ＬＢＭ１、ヒトＢ７Ｌ−１でトランスフェクションされた細胞、ＬＤＣＡＭでトランスフェクションされた細胞、Ｓ４９．１細胞、およびＦｌｔ３−Ｌ処理マウスの脾臓およびリンパ節由来のリンパ性ＤＣに結合することが見出された。
【００９１】
実施例６
ＬＤＣＡＭを発現している組織の同定
標準的ＲＴ−ＰＣＲ方法論、ノーザン解析およびＥＳＴデータベース（ＧＥＮＢＡＮＫ）配列マッチングを用い、ヒトＬＤＣＡＭおよびマウスＬＤＣＡＭのｍＲＮＡ発現に関し、いくつかの細胞株を調べた。結果により、ＬＤＣＡＭは広範囲の組織分布を有することが立証された。ヒトＬＤＣＡＭの発現は、乳房、網膜、胎児肝臓、脾臓、胎児心臓、肺、筋肉、胎盤、甲状腺、および肺癌腫に見出された。マウスＬＤＣＡＭ  ｍＲＮＡは、全胚、精巣、および三重ネガティブ細胞で見出された。
【００９２】
実施例７
ネズミＬＤＣＡＭの単離
可溶性Ｂ７Ｌ−１がネズミリンパ腫Ｓ４９．１（実施例２）への結合を示したため、ネズミＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡクローンに関し、Ｓ４９．１発現ライブラリーをスクリーニングした。該方法は、Ｓ４９．１細胞株ＲＮＡ並びに配列番号７および配列番号８に記載されるプライマーを用いた、ＲＴ−ＰＣＲ方法論を伴った。これらのプライマーは、データベース中に発見され、そしてヒトＬＤＣＡＭに相同性を有する、ネズミＥＳＴに基づく。ｃＤＮＡを、該プライマーを用い、ＰＣＲにより増幅し、ネズミＬＤＣＡＭがＳ４９．１細胞に存在することを確認した。
【００９３】
増幅産物をクローニング用ベクターにクローン化し、そしてＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡ挿入物を含むクローンを、ヒトＬＤＣＡＭコード領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションにより、検出した。ヒトＬＤＣＡＭに比較し、５’伸長を含むｃＤＮＡを検出するため、コード領域の５’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびｃＤＮＡ挿入物に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用い、ｃＤＮＡクローンの５’領域が増幅されるように、アンカーＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動により調べ、そしてその長さを、ヒトＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡから同様に得た増幅産物と比較した。より長い５’ＰＣＲ産物を提供するクローンのｃＤＮＡ挿入物を配列決定し、ヒトＬＤＣＡＭと比べ、最初の４アミノ酸以外すべてをコードするネズミＬＤＣＡＭ  ｃＤＮＡを得た。ネズミＬＤＣＡＭのヌクレオチド配列は、配列番号３に示される。配列番号３のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列は、配列番号４に提供される。
【００９４】
実施例８
ネズミＬＤＣＡＭポリペプチドの発現
ネズミ細胞外Ｂ７Ｌ−１を発現するためのベクター構築物を調製するため、配列番号３のコード領域をｐＤＣ４０９発現ベクターに連結した。発現ベクターをその後、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションし、そしてＭｃＭａｈａｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１に記載される技術を用い、ＬＤＣＡＭを発現した。
【００９５】
細胞にショックを与え、そして数日インキュベーションした後、可溶性ネズミＬＤＣＡＭを含む細胞上清を集め、そしてＨＰＬＣ技術を用い、タンパク質を回収した。
【００９６】
実施例９
ＬＤＣＡＭ／融合タンパク質の調製
以下は、ＬＤＣＡＭが結合する細胞を同定するのに用いた、ヒトＬＤＣＡＭ／Ｆｃタンパク質の生成を記載する。該融合タンパク質は、ヒトＬＤＣＡＭの可溶性細胞外領域および突然変異タンパク質ヒトＦｃ領域を含み、そしてまず、ＬＤＣＡＭの細胞外領域に隣接するプライマーを用い、ヒトＬＤＣＡＭの細胞外領域をコードするｃＤＮＡを単離することにより調製した（米国特許第５，０１１，９１２号を参照されたい）。
【００９７】
ＬＤＣＡＭの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド、配列番号１のヌクレオチド１６−１１３７を単離するため、ＬＤＣＡＭの細胞外領域に隣接するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして用い、ＷＩ−２６クローンからＰＣＲ産物を得た。プライマーは配列番号５および配列番号６に示される。生じたＰＣＲ産物を、プライマーにより取りこまれたＳａｌ１およびＢｇｌＩＩ部位で、Ｓａｌ１およびＢｇｌＩＩ制限酵素を用い、消化した。より低いＦｃ受容体結合のため突然変異しているヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む発現ベクター（ｐＤＣ４０９）に、生じた断片を連結した。
【００９８】
生じたＤＮＡ構築物をサル腎臓細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡにトランスフェクションした。０．５％低免疫グロブリンウシ血清を含む培地で７日間培養した後、０．２％アジ化物溶液を上清に添加し、そして０．２２μｍフィルターを通し上清を濾過した。その後、およそ１ｌの培養上清を、１０  ｍｌ／分で、４．６  ｘ  １００  ｍｍプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａ）を用い、ＢｉｏＣａｄ  プロテインＡ  ＨＰＬＣタンパク質精製系を通過させた。プロテインＡカラムは、上清中の融合タンパク質のＦｃ部分に結合し、融合タンパク質を固定し、そして上清中の他の構成要素がカラムを通過するのを可能にする。カラムを３０ｍｌのＰＢＳ溶液で洗浄し、そして結合している融合タンパク質をｐＨ３．０に調整したクエン酸でＨＰＬＣカラムから溶出させた。溶出した精製融合タンパク質は、溶出の際、ｐＨ７．４の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を用い、中和した。
【００９９】
実施例１０
ＬＤＣＡＭに対するモノクローナル抗体
本実施例は、ＬＤＣＡＭに対するモノクローナル抗体を調製するための方法を例示する。精製ＬＤＣＡＭ、細胞外ドメインなどのその断片、合成ペプチドまたはＬＤＣＡＭを発現する細胞を用い、慣用的な技術、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載される技術を用い、ＬＤＣＡＭに対するモノクローナル抗体を生成してもよい。簡潔には、ＬＤＣＡＭを免疫原として、完全フロイントアジュバント中に乳化し、そして１０−１００μｇの範囲の量を皮下または腹腔内注射し、マウスを免疫する。１０ないし１２日後、不完全フロイントアジュバント中に乳化した、さらなるＬＤＣＡＭで、免疫動物に追加免疫する。その後、毎週ないし隔週の免疫スケジュールで、マウスに定期的に追加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除により、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により、ＬＤＣＡＭ抗体に関し試験する。
【０１００】
適切な抗体力価の検出後、陽性動物に最後に一度、生理食塩水中のＢ７Ｌ−１を静脈内注射する。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、これを非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するため、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択培地中の多重マイクロタイタープレート中に蒔く。
【０１０１】
ハイブリドーマ細胞をＥｎｇｖａｌｌら，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  ８：８７１，  １９７１、および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術を適合させることにより、精製Ｂ７Ｌ−１に対する反応性に関し、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術はＢｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４：４２１２，  １９９０）に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、高濃度の抗Ｂ７Ｌ−１−Ｌモノクローナル抗体を含む腹水を産生してもよい。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によりフラスコまたは回転ビン（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。マウス腹水中に産生されたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈澱に続くゲル排除クロマトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、抗体がプロテインＡまたはプロテインＧに結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィーも用いてもよく、Ｂ７Ｌ−１に結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィーも用いてもよい。
【０１０２】
実施例１１
ノーザンブロット解析によるＬＤＣＡＭ発現の検出
以下は、本発明のＬＤＣＡＭポリペプチドを発現する組織および細胞種を同定するために行った、ノーザンブロット実験を記載する。
【０１０３】
総ＲＮＡ  ５μｇないし１０μｇを、１．２％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分画し、そして該ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）上にブロットすることにより、ノーザンブロットを生成した。Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載されるような標準的ノーザンブロット生成法を用いた。いくつかの異なる供給源由来のｍＲＮＡ  １μｇを含むポリＡ＋多数組織ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。
【０１０４】
ＬＤＣＡＭのコード領域を含むリボプローブは、製造者の指示にしたがい、ＰｒｏｍｅｇａのＲｉｂｏｐｒｏｂｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用い、生成した。ノーザンブロットの探査（ｐｒｏｂｉｎｇ）および陽性結合プローブに関する、生じたｘ線フィルムの視覚化の結果、ネズミＬＤＣＡＭに関し、５．０ｋＢのハイブリダイズしているｍＲＮＡが、肺、肝臓、脳、精巣および脾臓樹状細胞に検出された。異なる大きさを有する、ハイブリダイズしているさらなるｍＲＮＡには、肺および精巣におけるおよそ１．９ｋＢのｍＲＮＡ；ＬＰＳ刺激骨髄マクロファージ、肺および精巣におけるおよそ３．０ｋＢのｍＲＮＡ；抗Ｔ細胞受容体抗体刺激脾臓Ｔ細胞、ＬＰＳ刺激骨髄マクロファージ、および精巣におけるおよそ７．０ｋＢのハイブリダイズしているｍＲＮＡが含まれ；そしておよそ９．０ｋＢのハイブリダイズしているｍＲＮＡが、胸腺および抗Ｔ細胞受容体抗体刺激脾臓Ｔ細胞で検出された。
【０１０５】
実施例１２
免疫系細胞結合研究
以下は、ＬＤＣＡＭが特定の活性化免疫系細胞に結合することを立証する、ＦＡＣＳ細胞結合実験を記載する。研究および比較目的のため、Ｂ７Ｌ−１の結合特性もまた、含まれる。研究された細胞は、ネズミＴ細胞、ヒトＴ細胞、ネズミＢ細胞、ネズミＮＫ細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト腫瘍細胞株を含んだ。
【０１０６】
ネズミＴ細胞結合を研究するため、ＢＡＬＢ／ｃネズミリンパ節（ＬＮ）細胞を、培地単独で、および異なる刺激の存在下で、１８−２０時間培養した。培養細胞を採取し、そしてＢ７Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質およびコントロールＦｃタンパク質を用いた結合研究のため調製した。一晩培養した後、ＢＡＬＢ／ｃネズミＬＮ細胞は、典型的には＞９０％  ＣＤ３＋である。フローサイトメトリー解析を用い、結合タンパク質を検出した。表Ｉに示される結果は、未刺激Ｔ細胞（培地）および（刺激による）刺激Ｔ細胞の平均蛍光強度単位（ＭＦＩ）として表された、観察された結合を示す。
【０１０７】
表Ｉ
【０１０８】
【表１】
0004426724.tif 000002
【０１０９】
Ｔ細胞サブセットにより解析すると、ＬＮ  ＣＤ４＋ネズミＴ細胞の７５−８０％が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ＴＣＲ刺激後、検出可能なＬＤＣＡＭ結合を示した。ＬＮ  ＣＤ８＋ネズミＴ細胞の約５０％は、検出可能な結合を示す。さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ネズミＴ細胞が示すより、高いレベルのＬＤＣＡＭ結合を示す。結果により、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃが低いレベルで未処置（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞に結合することが示される。しかし、ポリクローナル刺激で一晩活性化した後、結合は、刺激に応じ、５−２０倍増加した。研究した刺激のうち、ＰＭＡは、少なくともネズミＴ細胞に対するＬＤＣＡＭ結合を誘導し、そして抗ＴＣＲは最も高い結合を誘導する。
【０１１０】
ＬＤＣＡＭおよびその対構造Ｂ７Ｌ１に対するヒトＴ細胞結合を研究するため、ヒト末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞を、培地単独で、または異なる刺激の存在下で、１８−２０時間培養した。培養細胞を採取し、そしてＢ７Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質およびコントロールＦｃタンパク質のいずれかを用いた結合研究のため調製した。ヒトＰＢ  Ｔ細胞上の結合タンパク質は、フローサイトメトリー解析を用い、検出した。表ＩＩは、未刺激Ｔ細胞（培地）および（刺激による）刺激Ｔ細胞のＭＦＩとして表された、観察された結合を示す。
【０１１１】
表ＩＩ
【０１１２】
【表２】
0004426724.tif 000003
【０１１３】
結果は、ＰＭＡが、ネズミＴ細胞に対するよりも、ヒトＴ細胞に対し、より強いＬＤＣＡＭ結合を誘導することを示す。Ｂ７Ｌ１結合の非存在下で、ネズミおよびヒトＴ細胞両方に対し、ＬＤＣＡＭの特異的な結合が存在することにより、ＬＤＣＡＭがＢ７Ｌ１、または異なる分子に結合し、それ自体に結合しないことが示唆される。研究により、Ｔ細胞はほとんどまたはまったくＢ７Ｌ１を発現しないことが示されているため、ＬＤＣＡＭは別の結合パートナーを有する可能性がある。
【０１１４】
上に記載されるものと同様の研究を行い、ネズミ脾臓Ｂ細胞に対するＬＤＣＡＭおよびＢ７Ｌ１結合を評価した。Ｂ７Ｌ１またはＬＤＣＡＭ結合のどちらも、未刺激ネズミＢ細胞上で検出されなかった。ｍｕＣＤ４０ＬまたはＬＰＳを用い、ネズミ脾臓Ｂ細胞を培養すると、低レベルのＬＤＣＡＭ結合が誘導されたが、認識できるレベルのＢ７Ｌ１結合は検出されなかった。
【０１１５】
ネズミＮＫ細胞に対する結合を研究するため、ＩＬ−１５処理ＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスから脾臓を除去し、そして非常に濃縮されそして活性化されたネズミＮＫ細胞の供給源として用いた。ＩＬ−１５処理ＳＣＩＤマウスから単離された脾臓細胞は、６０−８０％がＤＸ−５陽性である。ＤＸ−５は、多くの異なる系統のマウス由来のＮＫ細胞上で発現されている全（ｐａｎ）ＮＫマーカーである。上述のようにフローサイトメトリー解析を行い、ＤＸ−５＋のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−１５活性化ネズミＮＫ細胞に対するＢ７Ｌ１およびＬＤＣＡＭ結合を検出した。表ＩＩＩはネズミＮＫ細胞結合研究の結合の結果を示す。
【０１１６】
表ＩＩＩ
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
ネズミおよびヒトＴ細胞上で観察されたものと対照的に、ＬＤＣＡＭおよびＢ７Ｌ１結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性化ネズミＮＫ細胞上で検出することが可能であった。
【０１１９】
ヒト内皮細胞に対するＢ７Ｌ１およびＬＤＣＡＭ結合を研究することに向けられた実験の結果、異なるドナー由来のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対し、いかなる結合も示されなかった。しかし、１人のドナー由来の１つのＨＵＶＥＣでは、コントロールＦｃに比べ、Ｂ７Ｌ１が低レベルでＣＤ６２ＥおよびＣＤ１０６を誘導した。
【０１２０】
表ＩＶは、ヒト腫瘍細胞株に対するＢ７Ｌ１およびＬＤＣＡＭ結合を評価することに向けられる実験の結果を詳細に示す。結果は、ＬＤＣＡＭまたはＢ７Ｌ１に結合している細胞のパーセンテージとして表す。
【０１２１】
表ＩＶ
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
**コントロールＦｃの結合は引かれているため、これはバックグラウンド上の正味％＋細胞結合である。
結果により、卵巣癌腫細胞株および２つのヒトＢ細胞腫瘍株（ＭＰ−１および扁桃腺Ｇ）に対する有意なＬＤＣＡＭ結合が示される。これらの結果は、ＬＤＣＡＭが特定の種類のＢ細胞リンパ腫または異なる種類の癌腫のマーカーであることを示す。さらに、ＬＤＣＡＭまたはＢ７Ｌ１により仲介される生物学的情報伝達は、これらの種類の腫瘍に対し、機能する抗腫瘍効果を仲介する可能性がある。
【０１２４】
実施例１３
Ｔ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの影響
以下の議論は、ポリクローナル刺激により誘導されるネズミおよびヒトＴ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭの影響を評価するのに行った実験を記載する。
【０１２５】
ＬＤＣＡＭ／Ｆｃ融合タンパク質およびＢ７Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏネズミＴ細胞増殖の標準的なモデルにおいて、評価した。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスからリンパ節（ＬＮ）細胞を得て、そして培地中の培養に置いた。多様な量のコントロールＦｃ、Ｂ７Ｌ１／ＦｃおよびＬＤＣＡＭ／Ｆｃを単独で、またはＣｏｎＡ、ＰＨＡまたは固定ＴＣＲ  ｍＡｂを含むＴ細胞の異なるポリクローナル刺激の存在下で、培地中に置いた。
【０１２６】
これらの実験の結果により、ＬＤＣＡＭがＣｏｎＡ誘導ネズミＴ細胞増殖を強く阻害し（〜０．６２５μｇ／ｍｌで５０％阻害）、ＰＨＡ誘導増殖を中程度に阻害し（〜５μｇ／ｍｌで５０％阻害）、そして固定ＴＣＲ  ｍＡｂで誘導された増殖には影響を与えないことが立証された。ヒト末梢血Ｔ細胞増殖アッセイでは、ＬＤＣＡＭはＣｏｎＡ誘導増殖を阻害するが、ＰＨＡまたはＯＫＴ３誘導増殖を有効には阻害しない。Ｂ７Ｌ１／Ｆｃは、ネズミまたはヒトＴ細胞の増殖反応には影響を与えない。
【０１２７】
結果により、マイトジェン誘導ネズミおよびヒトＴ細胞増殖に対するＬＤＣＡＭ／Ｆｃの阻害効果は、サイトカイン（特にＩＬ−２）分泌の阻害のため、または活性化後のＴ細胞の下流反応の制御およびＬＤＣＡＭ結合パートナーの発現増加のためであることが示唆される。ＬＤＣＡＭはまた、Ｔ細胞、Ｔ細胞およびＡＰＣまたはＴ細胞およびＮＫ細胞の間の細胞から細胞への相互作用も調節する可能性がある。ＬＤＣＡＭがＴＣＲ  ｍＡｂ誘導増殖を阻害することができなかったことにより、ＣｏｎＡおよびＰＨＡにより誘導された増殖は非常にサイトカイン依存性である一方、抗ＴＣＲ  ｍＡｂに誘導されるものはより依存しないため、サイトカイン異常制御が起こっていることが示唆される。
【０１２８】
実施例１４
ネズミＴ細胞サイトカイン産生に対するＬＤＣＡＭの影響
以下は、ＰＨＡ、ＣｏｎＡおよびＴＣＲ  ｍＡｂでのＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化後の、ネズミＬＮ細胞または精製Ｔ細胞サイトカイン分泌に対するＬＤＣＡＭの影響に関し、ＬＤＣＡＭを評価するために行った実験を記載する。結果を表Ｖに示す。検出されたサイトカインレベルは、ｐｇ／ｍｌで表す。
【０１２９】
表Ｖ
【０１３０】
【表５】
0004426724.tif 000006
【０１３１】
結果により、ＬＤＣＡＭ／Ｆｃが、ＣｏｎＡおよびＰＨＡにより誘導されるネズミＬＮ  Ｔ細胞  ＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマ産生を有意に阻害することが示される。固定抗ＴＣＲ  ｍＡｂを用い、ネズミＴ細胞からのサイトカイン産生を誘導した場合、サイトカイン産生に対し、ＬＤＣＡＭの、より明白でない影響が観察された。ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ活性化後のＩＦＮ−ガンマ産生を減少させた。対照的に、ＴＣＲ活性化後のＩＬ−２産生は、減少しなかった。これらの実験において、Ｔ細胞により非常に少量のＩＬ−４しか生成されなかったため、ＩＬ−４または他のさらなるサイトカイン／ケモカインのＴ細胞産生に対し、ＬＤＣＡＭが影響を与えているかどうかは評価しなかった。
【０１３２】
実施例１５
ネズミ混合細胞活性化アッセイに対するＬＤＣＡＭの影響
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合細胞アッセイを開発し、Ｔ細胞がＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用を通じ、Ｂ細胞を活性化する能力を調べた。該アッセイは、脾臓細胞およびＬＮ細胞を、抗ＴＣＲ  ｍＡｂと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３６時間培養した後、Ｔ細胞が活性化され、そしてＢ細胞／ＡＰＣと相互作用した後に起こるＴおよびＢ細胞／ＡＰＣ細胞活性化をフローサイトメトリー解析することを伴う。
【０１３３】
脾臓細胞を抗ＴＣＲ  ｍＡｂ、ＣｏｎＡ、ＰＨＡと、または培地単独で、コントロールＦｃまたはＬＤＣＡＭ／Ｆｃと３６時間培養した。２色染色およびフローサイトメトリー解析を用い、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ５４、ＣＤ４５Ｒｂ、ＣＤ４４、ＣＤ２８、ＣＤ２３、ＣＤ８６およびＣＤ１５２の細胞表面発現を調べることにより、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞およびＣＤ３＋  Ｔ細胞活性化を追った。
【０１３４】
結果により、ＰＨＡまたはＣｏｎＡでの活性化後、ＣＤ６９、ＣＤ５４、およびＣＤ２５の発現は、培養中のＴ細胞およびＢ細胞上で、数倍増加することが立証された。これらの増加にほとんど影響を持たないコントロールＦｃと比べ、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡでの活性化を介し、本培養系において、両方の細胞種上で誘導されるＣＤ６９、ＣＤ５４およびＣＤ２５の発現を有意に（非活性化Ｔ細胞とほとんど同じレベルまで）減少させた。ＣｏｎＡは、表面上に活性化分子（例えばＣＤ４０Ｌ）を発現するＴ細胞を活性化する。活性化分子は、Ｂ細胞の表面上の受容体に結合し、そしてＢ細胞を活性化し、細胞表面上に多様な活性化関連タンパク質を発現する。ＰＨＡ活性化ＴおよびＢ細胞の阻害は、ＣｏｎＡでの活性化後に観察されるものより、穏やかな度合いで起こった。
【０１３５】
さらに、ＬＤＣＡＭは、ＣｏｎＡと培養した脾臓細胞におけるＣＤ３＋およびＣＤ３−両方の細胞上に発現されるＣＤ４５ＲＢのレベルを減少させた。ＣＤ４５ＲＢレベルの減少に対するこの効果は、ＬＤＣＡＭを、ＴＣＲ  ｍＡｂで刺激された脾臓細胞と培養した際、より顕著であり、そして刺激としてＰＨＡを用いた場合、または細胞を培地単独で培養した場合、観察されなかった。
【０１３６】
ＴＣＲ  ｍＡｂを用い、コントロールＦｃまたはＬＤＣＡＭ／Ｆｃの存在下で培養脾臓細胞を刺激すると、本刺激によりＴ細胞およびＢ細胞上に誘導されたＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＣＤ２５のレベルは、ＬＤＣＡＭにより影響を受けないことが示された。しかし、ＬＤＣＡＭは、ＣＤ３＋  Ｔ細胞および非Ｔ細胞両方の細胞上のＣＤ２８の発現を増加させた。１つの実験において、増加は５−１０倍であり、そして他の実験では増加は５０％だった。これはまた、ＴＣＲ  ｍＡｂに加え、ＣｏｎＡを刺激として用いた１つの実験でも観察された。ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ  ｍＡｂ活性化後のＢ細胞（５０％減少）およびＴ細胞（２０−３０％減少）上のＣＤ４５ＲＢ発現強度の中程度の減少を引き起こした。
【０１３７】
興味深いことに、ＬＤＣＡＭは、脾臓細胞がポリクローナルＴ細胞刺激の非存在下で培養された場合、該脾臓細胞上のＣＤ４５ＲＢ発現に影響を与えない。げっ歯類におけるＣＤ４５ＲＢ発現は、Ｔ細胞が未処理細胞から記憶細胞に進行するにつれ、減少すると報告されてきている。また、異なるＣＤ４＋  Ｔ細胞亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）は、高いまたは低いレベルのＣＤ４５ＲＢを発現し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで別個の免疫機能を仲介する。
【０１３８】
上に論じられる結果により、特定の免疫刺激条件下、ＣｏｎＡおよびＰＨＡによる特定の刺激下で、ＬＤＣＡＭは、混合細胞アッセイにおいて、細胞レベルでＴ細胞活性化を阻害し、そしてＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマ産生を減少させることにより、少なくとも部分的にこれらのマイトジェンにより誘導されたＴ細胞増殖を阻害することが示唆される。
【０１３９】
ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ  ｍＡｂ誘導活性化により誘導されたＩＦＮガンマ産生を、穏やかに下方制御するが、本系においてＩＬ−２産生にほとんど影響を与えず、そして固定ＴＣＲ  ｍＡｂにより誘導されるネズミＴ細胞増殖に影響を与えない。ＬＤＣＡＭは、ＴＣＲ  ｍＡｂが活性化するＴ細胞およびＢ細胞のＣＤ２８発現の増加およびＣＤ４５ＲＢ発現の減少を引き起こす。これらのデータに基づき、ＬＤＣＡＭまたはＴ細胞上のその結合パートナーは、限定されるわけではないが、抗腫瘍免疫反応、ＤＴＨ反応、およびＴ細胞依存抗感染性疾患免疫反応を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏのＴ細胞エフェクター依存免疫反応を制御する（増加させる、減少させるまたは向けなおす（ｒｅｄｉｒｅｃｔ））可能性がある。
【０１４０】
上の結果により、ＬＤＣＡＭが、Ｔ細胞活性化経路を調節するのに有用であり、そして自己免疫疾患および炎症を治療するのに用いることが可能であることが示唆される。
【０１４１】
実施例１６
ＬＤＣＡＭ．ＦｃはネズミＮＫ細胞に結合し、そしてＮＫ細胞増殖を引き起こす
以下は、ＬＤＣＡＭが脾臓ＮＫ細胞表面に恒常的に結合し、そしてＩＬ−１５でのこれらの細胞の活性化がＬＤＣＡＭ結合レベルを増加させたことを立証する実験を記載する。該実験はまた、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスへのＬＤＣＡＭ：Ｆｃの投与およびＮＫ細胞増殖および脾臓における活性化に対する投与の影響も記載する。
【０１４２】
１２の年齢一致雌ＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスを４群に分け、１群あたり３匹の動物を用いた。第０日、第１日および第２日に、群Ｉ、群ＩＩ、群ＩＩＩおよび群ＩＶに、以下のタンパク質をＩＰ投与した：群Ｉのマウスに、１０μｇのヒトＩｇＧを投与し；群ＩＩのマウスに、１０μｇのヒトＩＬ−１５を投与し；群ＩＩＩのマウスに、１０μｇのヒトＬＤＣＡＭ：Ｆｃ（Ｉｍｍｕｎｅｘのロット＃７４８８−１６）を投与し；そして、群ＩＶに、各１０μｇのヒトＬＤＣＡＭ：ＦｃおよびヒトＩＬ−１５を投与した。
【０１４３】
第３日（実験の４日目）、マウスを安楽死させ、そして脾臓を除去した。各脾臓を別個に数え、そしてその後、フローサイトメトリーのため、共にプールした。各処理群の脾臓中のＮＫ細胞の数は、全ネズミＮＫ細胞マーカーとしてＤＸ−５抗体を用いたフローサイトメトリーにより、測定した。さらに、ＣＤ６９およびＣＤ５４発現を含むＮＫ細胞活性化の他の測定値を評価した。
【０１４４】
実験の結果を表ＶＩに示す。ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ単独の投与（群ＩＩＩ）は、ヒトＩｇＧコントロール群（群Ｉ）より、約５倍、回収された総脾臓細胞数を増加させた。ヒトＩＬ−１５単独の投与（群ＩＩ）は、コントロール群（群Ｉ）より、約９倍、回収された総脾臓細胞数を増加させた。ＩＬ−１５およびＬＤＣＡＭの組み合わせ処置は、脾臓細胞数を累積的に増加させた。
【０１４５】
脾臓から回収されたＮＫ細胞の数は、脾臓における総細胞回収と相関した。より詳細には、ＬＤＣＡＭは、回収ＮＫ細胞において約５倍の増加を誘導し；ＩＬ−１５は、回収ＮＫ細胞において約９倍の増加を引き起こし；そしてＬＤＣＡＭおよびＩＬ−１５の組み合わせは、処理マウスの脾臓から回収されたＮＫ細胞の数において約１３倍の増加を誘導した。ＬＤＣＡＭはまた、脾臓において、ＣＤ６９およびＣＤ５４を発現するＮＫ細胞の数も増加させた。この増加は、ＬＤＣＡＭ：Ｆｃ投与後の、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＫ細胞上のＣＤ６９またはＣＤ５４の発現の特異的増加よりむしろ、総ＮＫ細胞増殖のためであった。
【０１４６】
表ＶＩ
【０１４７】
【表６】
0004426724.tif 000007
【配列表】
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