(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレシストキニンＡ受容体遺伝子の多型を解析し、解析結果に基づいて肥満の危険因子の有無を検出することを含み、遺伝子多型は配列番号１に示す塩基配列の塩基番号４５３及び５００の塩基に相当する塩基の多型であることを特徴とする肥満の危険因子を検出する方法。
【請求項２】
遺伝子多型の解析をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法においてそれぞれ配列番号２及び３に示す塩基配列を有するミスマッチプライマーを用い、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法における制限酵素消化が、塩基配列ＧＡＮＴＣ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣ）を認識する制限酵素による消化である請求項２記載の方法。
【請求項４】
コレシストキニンＡ受容体遺伝子の多型の解析結果とβ３アドレナリン受容体遺伝子の多型の解析結果とを組み合わせて肥満の危険因子の有無を検出する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肥満の危険因子の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肥満は体脂肪が著しく蓄積した状態である。肥満の成因においては、多くの遺伝的素因が関与していることが知られている。1994年にフリードマンらによって飽食因子であるレプチンが発見されて以来、脳と臓器とを結びつける食欲調節ホルモンの研究が進歩を遂げている。肥満のメカニズムが明らかになるに従って、糖尿病発症との関係から多くの遺伝子の多型が、遺伝的素因を解明するために調べられている。
【０００３】
ラットでは、コレシストキニンＡ受容体の発現のないことが肥満に関係することが報告されている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 787-796 (1995); Gene 197, 169-175 (1997)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、肥満の危険因子の検出法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これまで不明であったコレシストキニンＡ受容体（以下「CCKAR」と略す）遺伝子の転写開始部位の決定を試みたところ、それによって判明したプロモーター領域に肥満と関連している二つの塩基変化が存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、CCKAR遺伝子の多型を解析し、解析結果に基づいて肥満の危険因子の有無を検出することを含み、遺伝子多型は配列番号１に示す塩基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当する塩基の多型であることを特徴とする肥満の危険因子を検出する方法（以下、「本発明検出法」という）を提供する。
【０００７】
本発明検出法において、好ましくは、遺伝子多型の解析は、配列番号２及び３に示す塩基配列の少なくとも一部をそれぞれ有するミスマッチプライマーを用いるPCR-RFLP法で行われる。ミスマッチプライマーがそれぞれ配列番号２及び３に示す塩基配列を有し、PCR-RFLP法における制限酵素消化が、塩基配列GANTC（NはA、G、TまたはC）を認識する制限酵素による消化であることがさらに好ましい。
【０００８】
また、本発明検出法においては、CCKAR遺伝子の多型の解析結果とβ３アドレナリン受容体遺伝子の多型の解析結果とを組み合わせて肥満の危険因子の有無を検出することが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１０】
本発明の検出法は、CCKAR遺伝子の特定の多型を少なくとも解析し、解析の結果に基づいて肥満の危険因子の有無を検出することを特徴とする。
【００１１】
特定のCCKAR遺伝子多型とは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当する塩基の多型である。一般に塩基配列には個体間で遺伝子の発現に影響しない相違があり得ることが知られており、そのような相違を有する塩基配列において、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号453及び500の塩基に相当する塩基を特定することは当業者にとって容易である。以下、それぞれの塩基をNt. 453及びNt. 500ともいう。Nt. 453の多型はG/T（野生型／変異型）であり、Nt. 500の多型はA/G（野生型／変異型）である。
【００１２】
CCKAR遺伝子多型の解析の方法は、上記の多型の判別ができる限り、特に限定されない。遺伝子多型の解析方法として公知の方法を用いることができる。例えば、対象から採取した血液等の試料から、DNAを抽出し、これを鋳型として、目的とする多型を含む部分を増幅できるように設定したプライマーを用いたPCRを行い、得られたPCR産物の塩基配列を解析することによっても行うことができる。また、PCR産物の塩基配列の解析においては、必ずしも完全な塩基配列を決定する必要はなく、制限酵素を利用した方法（例えば制限断片長多型の解析）を用いても解析を行える。
【００１３】
上記のPCRを用いるCCKAR遺伝子多型を解析する方法としては、例えば、変異型であるときに塩基配列GANTC（NはA、G、TまたはC）がPCR産物の塩基配列の一部に含まれるように設計したミスマッチプライマーを用いるPCR-RFLP（制限断片長多型）法を用いることができる。ヒトCCKAR遺伝子の上流域にある２ヶ所の多型は、塩基配列GANTC（NはA、G、TまたはC）を認識する制限酵素（例えばHinfI）と、これらのプライマーとを用いることで、２ヶ所の多型を同時に、さらに対立遺伝子毎に解析することが可能となる。従って、この態様によれば、１回の制限酵素処理で２ヶ所の多型を判別でき、さらにこの多型の組み合わせまで解析することができるので有利である。すなわち、これらのプライマーを用いて増幅されたPCR産物は、塩基配列GANTC（NはA、G、TまたはC）を認識する制限酵素（例えばHinfI）で消化しアクリルアミドゲル電気泳動で分析することにより、２ヶ所の多型を対立遺伝子毎に解析することができる。
【００１４】
上記ミスマッチプライマーの設計は、ヒトCCKAR遺伝子の公知の塩基配列に基づいて行うことができる（例えば、Genbank Accession No. D85606参照）。このようなプライマーの例としては、配列番号２及び３に示す塩基配列の少なくとも一部をそれぞれ有するもの、特には、配列番号２及び３に示す塩基配列を有するものが挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号418〜452に対応し、塩基番号450の塩基がミスマッチである。配列番号３に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号520〜501に対応し、塩基番号503の塩基がミスマッチである。この例の場合、Nt. 453及びNt. 500がそれぞれ変異型のとき、PCR産物は上記制限酵素により切断される。
【００１５】
解析の結果に基づく肥満の危険因子の有無の検出は、解析により判明した遺伝子型が、Nt. 453及びNt. 500がそれぞれT及びGである遺伝子型である場合に、危険因子があると判定することによって行うことができる。
【００１６】
危険因子の有無の検出は、上記の特定の多型の解析結果とCCKAR遺伝子の他の多型や他の遺伝子の多型の解析結果との組み合わせに基づいて行ってもよい。他の遺伝子の多型としては、β３アドレナリン受容体遺伝子の多型（Codon 64, TGG(Trp)/CGG(Arg)）が挙げられる。この多型については、Trp/Trp型が正常、Arg/Trp型及びArg/Arg型が肥満リスク大と判断される（Yoshida, T., Sakane, N. et al. Lancet, 346, 1433-1434 (1995); Shuldiner, Alen, R. WO 96/36641）。
【００１７】
本発明は如何なる理論に拘束されるものではないが、ヒトCCKAR遺伝子の上流域に存在する遺伝子多型は、CCKARの遺伝子発現量に影響を及ぼし、これによって、コレシストキニンのシグナル伝達能力に差が生じ、体脂肪増加の誘因になるものと考えられる。
【００１８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００１９】
【実施例１】
ヒトCCKAR遺伝子の転写開始部位の決定及び多型の検出
インフォームドコンセントを得た膵臓の腺癌の患者から摘出された正常な胆嚢を試料として用いた。摘出後直ちに一部を組織化学的に検査し、残部を−８０℃で保存した。用いた試料は全て、組織化学的検査で異常や炎症の徴候は認められなかった。試料から全RNAを、酸−グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法におり抽出した。RNAの量及び純度を260及び280 nmの吸光度により測定した。分解の徴候のない試料を、ヒトCCKAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプローブ（New Engl. J. Med. 334, 292-295 (1999)、NIHのS.A. Wank博士より恵与）及びβ-アクチンcDNAのcDNAプローブ（和光純薬工業（株）製）を用いるノザントランスファー分析に用いた。
【００２０】
ヒトゲノムDNAライブラリー(Stratagene社製)を、ヒトCCKAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプローブを用いてスクリーニングした。標準のプラークハイブリダイゼーション条件で、約1000000のファージクローンが得られた。14の陽性クローンを単離し、サザンブロット分析及び制限マッピングによりさらに分析した。CCKAR遺伝子のコーディング領域のcDNAプローブとハイブリダイズするDNA断片をラムダH24及びラムダH14ファージクローンから単離し、ショットガン配列決定法のためにM13 mp19にサブクローニングした。得られた配列データを遺伝配列分析システム（Perkin-Elmer社製）により連結した。
【００２１】
ヒトCCKAR mRNAの転写開始部位を決定するため、キャップサイトハンティング(Capsite Hunting)法を日本ジーン社製キットを用いて製造者のプロトコルに従って以下の通り行った。5'末端m7GpppNキャップ構造を、タバコヌクレオチド酸性ピロホスファターゼのピロホスホリシス反応により除去し、配列番号４に示す塩基配列を有する35merの特異的オリゴヌクレオチド（rOligo）の3'末端でRNAリガーゼ反応により再キャッピングした。再キャッピングしたmRNAから、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素及びランダムプライマーを用いた第１鎖cDNAの合成により一本鎖cDNAライブラリーを調製した。一本鎖cDNAライブラリーからCCKARに特異的な転写物を増幅するために、ネステッドPCRを行った。第１回目のPCRには、配列番号５に示す塩基配列を有するターゲット遺伝子特異的なプライマー１（TGS-1）と、配列番号６に示す塩基配列を有する、rOligoに相補的なセンスDNAプライマー（RC1）を用いた。第２回目のPCRには、配列番号７に示す塩基配列を有するターゲット遺伝子特異的なプライマー２（TGS-2）と、配列番号８に示す塩基配列を有する、rOligoに相補的なセンスDNAプライマー（RC2）との組み合わせを用いた。第２回目のPCRの産物の単一バンドを単離し、pGEM-Tベクターにクローニングし、二つの独立したクローンの配列決定を行った。転写開始部位を、rOligoとCCKAR mRNA配列の間の境界配列を特定することにより決定した。
【００２２】
この結果、開始ATGの205bp上流（配列番号１に示す塩基配列の塩基番号581）が転写開始部位であることが判明した。
【００２３】
プロモーター領域の多型を以下の様にして調べた。白血球ゲノムDNAについて、配列番号９に示す塩基配列を有するセンスプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用いるPCRクローニング法を行った。PCR産物を単離しM13にクローニングし、10の独立したクローンを配列決定した。その結果、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号453の塩基のGからTの変化および同塩基番号500の塩基のAからGの変化の二つの配列の変化が検出された。
【００２４】
【実施例２】
ヒトCCKAR遺伝子の上流域に存在する多型の検出
抗凝固剤として50 mM EDTA2Naを含む全血よりDNA抽出キット（Qiagen）にてDNAを抽出した。次に、配列番号２と配列番号３のプライマーを用いて、抽出したDNAを鋳型にPCR反応を行った。PCRの反応液は、抽出したDNA 200μg、配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーをそれぞれ20 pmol、Taq DNAポリメラーゼ1 U、2.0 mM各dNTPを2.5μl、10×緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgCl2）を2.5μlに、滅菌超純水を加え、最終液量25μlとした。反応条件は、95℃３分間の後、94℃0.5分間、63℃0.5分間及び72℃１分間のサイクルを35サイクル行い、最後に72℃3分間とした。
【００２５】
反応終了後、制限酵素処理を行った。制限酵素処理の反応液は、PCR反応終了液を5μl、10×緩衝液（制限酵素に添付された緩衝液、ロシュダイアグノシス）を4μl、制限酵素HinfI（20 U/μl）を1μlに、滅菌超純水を加え、最終液量40μlとした。反応条件は、37℃で1.5時間とした。
【００２６】
反応終了後、反応液の一部を12％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルスター（宝酒造）染色後、対立遺伝子毎の多型解析（多型パターン解析）を行った。
【００２７】
増幅される領域内には多型が２ヶ所（Nt. 453及びNt. 500）存在するので、対立遺伝子の組み合わせも考慮すると１０通りのパターンが考えられる。多型の塩基の組み合わせとそれらに対応する泳動パターンを図１に示す。
【００２８】
【実施例３】
健常人の多型頻度解析
健常人ボランティア２２４人の末梢血由来DNAを鋳型DNAとして、実施例２の方法に従って、多型の検出を行った。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
本遺伝子の多型は、理論的には１０通りに分類されるが、健常人ボランティア２２４人の解析では、６通りのパターンが見い出された。
【００３１】
【実施例４】
CCKAR遺伝子多型と肥満との関連
インフォームドコンセントを得た被験者1316人（男646人、女650人、年齢40〜79）について、Nt. 453及びNt. 500の多型と肥満関連因子との相関を検討した。
多型の検出は実施例２の方法により実施した。体脂肪の割合は、air displacement plethysmograph（Body Composition System, Life Measurement Instruments）と二重エネルギーＸ線吸収測定法（DXA）を用いて行った。絶食時血清レプチン及びインスリンは、ラジオイムノアッセイ法（それぞれLINCO社製キット及びDinabot社製キット)で測定した。体格指数は、体重を身長の二乗で除算して算出した。その結果を表２に示す。多型の区分は、変異型のホモ接合体とそれ以外に分けて統計処理を行った。
【００３２】
【表２】
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値は平均値（括弧内は標準偏差）。２群間の比較の評価には、スチューデントt-検定を用いた。
【００３３】
表２に示される通り、ホモ接合体では、その他と比較して、体脂肪の割合と血清レプチン量及び血清インスリン量が有意（P値<0.05）に高値であった。血清インスリンの高値は、体脂肪の増加によるインスリン耐性によるものと考えられる。
【００３４】
以上より、本多型は、40才以降の脂肪の蓄積を予知する肥満（体脂肪増加）の危険因子であることが統計学的に有意であることが示された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、CCKAR遺伝子の新たな遺伝子多型に基づく、肥満の危険因子の検出法が提供される。肥満の危険因子の検出は、生活習慣病の発症予防に有用である。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】多型の塩基の組み合わせとそれらに対応するPCR-RFLP法による泳動パターンを示す。
【図１】
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