(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎被膜コラーゲンを含んでなる、組織移植片プロテーゼであって、前記組織移植片プロテーゼは、温血脊椎動物由来の単離され、脱細胞化された腎被膜組織を含み、ここで前記単離され、脱細胞化された腎被膜組織は、グラムあたり１２エンドトキシン単位未満のエンドトキシンレベル、２マイクログラム／ミリグラム未満の核酸含量、グラムあたり２コロニー形成単位未満の生物負荷（bioburden）レベル、及びグラムあたり１プラーク形成単位未満のウイルスレベルを有し、また前記単離され、脱細胞化された腎被膜組織は、線維芽細胞増殖因子２及び血管内皮増殖因子を含有する組成上残留する生物活性タンパク質を含有し、そして宿主に移植されたときに内因性の組織増殖を誘発するのに有効である、前記組織移植片プロテーゼ。
【請求項２】
前記腎被膜コラーゲンが温血脊椎動物に由来する、請求項１の組織移植片プロテーゼ。
【請求項３】
腎被膜コラーゲンのシートを含んでなる、請求項２の組織移植片プロテーゼ。
【請求項４】
腎被膜コラーゲンの前記シートが少なくとも約４ＭＰａの引張強度を示す、請求項３の組織移植片プロテーゼ。
【請求項５】
腎被膜コラーゲンの前記シートがグラムあたり５エンドトキシン単位未満のエンドトキシンレベルを有する、請求項３の組織移植片プロテーゼ。
【請求項６】
腎被膜コラーゲンの前記シートがグラムあたり１コロニー形成単位未満の生物負荷（bioburden）レベルを有する、請求項５の組織移植片プロテーゼ。
【請求項７】
前記移植片プロテーゼが粉末である、請求項１の組織移植片プロテーゼ。
【請求項８】
前記移植片プロテーゼが管である、請求項１の組織移植片プロテーゼ。
【請求項９】
前記移植片プロテーゼが本質的に平面のシートである、請求項１の組織移植片プロテーゼ。
【請求項１０】
請求項１記載の組織移植片プロテーゼと該組織移植片プロテーゼを含有する無菌包装を含んでなる、製品。
【請求項１１】
前記腎被膜コラーゲンが乾燥している、請求項１０の製品。
【請求項１２】
前記腎被膜コラーゲンが水和型である、請求項１０の製品。
【請求項１３】
前記腎被膜コラーゲンがシート型である、請求項１０の製品。
【請求項１４】
前記腎被膜コラーゲンが粉末型である、請求項１０の製品。
【請求項１５】
前記腎被膜コラーゲンが管状型である、請求項１０の製品。
【請求項１６】
前記腎被膜コラーゲンが流動型である、請求項１０の製品。
【請求項１７】
細胞外マトリックス組成物を調製する方法であって：
温血脊椎動物由来の腎被膜組織のシートを脱細胞化して細胞外マトリックス組成物をシートとして形成し、そして細胞外マトリックス組成物を、グラムあたり１２エンドトキシン単位未満のエンドトキシンレベル、２マイクログラム／ミリグラム未満の核酸含量、グラムあたり２コロニー形成単位未満の生物負荷レベル、及びグラムあたり１プラーク形成単位未満のウイルスレベルを有するように精製することを含んでなる方法であり、また前記精製された細胞外マトリックス組成物は、線維芽細胞増殖因子２及び血管内皮増殖因子を含有する組成上残留する生物活性タンパク質を含有し、そして宿主に移植されたときに内因性の組織増殖を誘発するのに有効である、前記方法。
【請求項１８】
前記腎被膜組織が温血脊椎動物に由来する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記温血脊椎動物が、ブタ、ウシ、及びヒツジからなる群より選択される、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記温血脊椎動物がブタである、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記脱細胞化が前記腎被膜組織を脱細胞化剤へ曝露することを含む、請求項１７の方法。
【請求項２２】
前記剤が酸化剤である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記剤がペルオキシ化合物である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記ペルオキシ化合物が過酢酸である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記細胞外マトリックス組成物のシートが少なくとも約４ＭＰａの引張強度を有する、請求項１７の方法。
【請求項２６】
前記細胞外マトリックス組成物のシートを粉末にすることをさらに含んでなる、請求項１７の方法。
【請求項２７】
前記細胞外マトリックス組成物のシートを酵素消化により流動化させることをさらに含んでなる、請求項１７の方法。
【請求項２８】
前記剤が高張の塩溶液である、請求項２１の方法。
【請求項２９】
温血脊椎動物がヒツジである、請求項１記載の組織移植片プロテーゼ。
【請求項３０】
温血脊椎動物がウシである、請求項１記載の組織移植片プロテーゼ。
【請求項３１】
温血脊椎動物がブタである、請求項１記載の組織移植片プロテーゼ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、２００１年６月２８日に出願された「腎被膜コラーゲンを含有する移植片プロテーゼ用具」と題する、本明細書にそのまま援用される、米国仮特許出願第６０／３０１，６７１号の利益を特許請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、移植片プロテーゼ用具に概して関し、より特定すると、細胞外マトリックスに由来するコラーゲンを含んでなるそうした用具に関する。
【０００３】
発明の背景
組織移植片材料は、今日かなりの臨床及び経済上の意義を獲得している。温血脊椎動物に由来するコラーゲンベースの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が組織移植片材料として有利に使用可能であることは今やよく知られている。米国特許第４，９０２，５０８号及び５，２８１，４２２号と国際特許公開公報第ＷＯ９８／２５６３６号及び９８／２２１５８号を参照のこと。コラーゲンベースのＥＣＭは、動物組織がその上で増殖し得る骨組として役立ち得ることが見出されてきた。また、その材料ならば、創傷治癒を亢進させ、内因性組織増殖を促進し、細胞増殖を刺激し、細胞分化を誘導するということも見出されてきた。さらに、コラーゲンベースのＥＣＭから作製されるインプラントは、やがて身体により吸収され、いったん適用したならば、除去する必要がない。上記の特許及び公報に記載されるコラーゲンベースのＥＣＭはまた、血管移植片及び結合組織移植片の構築体へ有益に使用されることを可能にする、優れた機械特性と有効な多孔性指数を特徴とする。さらに、コラーゲンベースのＥＣＭは、その明らかに陽性の細胞増殖促進特性を失うことなく、粉砕及び／又は酵素消化によって流動化させることができる。
【０００４】
現行では、コラーゲンベースのＥＣＭ材料は、２、３の例を挙げれば、損傷又は罹病した血管、靭帯、腱、皮膚、及び尿路に置き換わるか又はそれを修復するためのインプラント及び移植片へ形成され、それとして使用されている。さらに、流動化ＥＣＭについては、注射用組織移植片や局所適用も提案されてきた。米国特許第５，２７５，８２６号と国際特許公開公報第ＷＯ９８／２２１５８号を参照のこと。さらに、コラーゲンベースのＥＣＭは、真核細胞を in vitro で増殖させるための細胞増殖基質として利用することが可能であると示唆されている。
【０００５】
コラーゲンベースのＥＣＭは、温血脊椎動物の様々な組織から採取されている。今日までに、コラーゲンベースのＥＣＭについて様々な供給源が確認されていて、脊椎動物の腸管、消化管、気管、尿路、生殖管、及び胃の粘膜下組織と肝臓の基底膜が含まれる。上記の供給源では、コラーゲン細胞外成分が組織／臓器の内層又は緊密結合層のいずれかであるので、コラーゲンベースのＥＣＭを単離しなければならない。米国特許第４，９５６，１７８号と国際特許公開公報第ＷＯ９８／２５６３７号及びＷＯ９８／２５６３６号を参照のこと。一般に、単離工程は、脱層状化又は細胞解離のいずれかを伴い、これは調製法を複雑にし、細胞外成分のネーティブ構造の破壊を招くリスクもある。
【０００６】
この技術領域の背景に照らし、容易に単離されて、組織移植、細胞増殖、及び潜在的に他の領域における適用に有益な特性を示すコラーゲンベースの細胞外マトリックス材料へのニーズが存在する。本発明はこれらのニーズに対処する。
【０００７】
発明の要約
本発明の１つの特徴は、コラーゲン性の臓器被膜組織に由来する細胞外マトリックスを使用して形成される新しい組織移植片プロテーゼ用具の発見及び提供に関する。本発明の好ましい組織移植片用具には、温血脊椎動物の腎被膜に由来するコラーゲンが含まれる。本発明に利用される被膜組織は、単離され、それが単離される動物の細胞を実質的に含まないようにして、有益な医療及び他の使用を有する細胞外マトリックス材料を生じるように処理することができる。
【０００８】
別の側面において、本発明は、組織移植片材料を生成するための調製法に関し、該方法には、単離された腎被膜組織を提供する工程、該組織を脱細胞化して組織移植片材料を提供する工程が含まれる。好ましい方法は、脱細胞化剤、例えば細胞溶解液と該組織を接触させることを伴う。引き続き、脱細胞化剤と他の処理剤は、例えば、濯ぎ及び／又は抽出溶媒との接触により除去することができる。調製法は、望ましくは、細胞増殖を支援するのに有効である精製された被膜材料をもたらす。
【０００９】
本発明の１つの目的は、新しい組織移植片組成物及びプロテーゼ用具とそれらの調製法を提供することである。
本発明の別の目的は、組織移植の新しい方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、細胞増殖を in vivo 及び in vitro で支援するのに有用な新しい細胞外マトリックス材料を提供することである。
本発明の関連した目的及び利点は、以下の記載から明らかになろう。
【００１１】
好ましい態様の説明
本発明の原理の理解を高めるために、その特定の態様へ言及し、特定の術語を使用してそれを記載する。それでも、それにより本発明の範囲を制限することは意図されていないと理解されよう。記載の態様における改変やさらなる変更と、本発明が関連する当該技術分野の当業者ならば普通に思いつくと考えられる、本明細書に例示される本発明の原理のさらなる応用も本発明に含まれる。
【００１２】
本発明は、被膜組織、そして特に温血脊椎動物の腎被膜に由来するコラーゲン含有細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に基づいた新しい移植片プロテーゼ用具を概して提供する。さらに本発明は、被膜ＥＣＭを入手し、精製し、それから様々な組織移植片を製造する方法を提供する。
【００１３】
腎被膜又は腎臓の被膜は、腎臓を囲む外側のカバーである。この被膜は、以下の層からなる：中皮、コラーゲン層及び弾性網を含有する密な結合組織、及び厚い基底板により結合組織から分離された扁平細胞の１以上のシート。R. E. Bulger,「ラット腎被膜：ユニークな扁平細胞層の存在（Rat Renal Capsule: Presence of Layers of Unique Squamous Cells）」Anatomical Record, 1973; 177: 393-408 を参照のこと。この被膜は緊密に覆われ、弛緩した結合組織の数多くの微細突起と小さな血管により臓器へ結合する。
【００１４】
本発明によるコラーゲンベースのＥＣＭの派生に好ましい腎被膜は、哺乳動物のような温血動物から、好ましくはブタ、ウシ、又はヒツジから、より好ましくは成体のブタから、そして最も好ましくは、約３５０ポンドより多くの目方がある成熟成体のブタから採取する。これらの腎被膜は、トランスジェニック動物、又は非トランスジェニック動物、例えば食肉生産用に飼育された動物から採取してもよい。従って、本発明による組織移植片組成物の調製に使用の腎被膜には廉価な商業上の供給源がある。
【００１５】
被膜材料は、臓器から容易に単離することができる。本発明の１つの態様によれば、腎被膜を含む腎臓を、新たに屠殺したブタから入手する。被膜組織へ付着した脂肪組織は、鈍的剥離道具を使用して除去してよい。被膜は、たとえ腎臓を包んでいても、離れた数箇所で腎臓に付着し、かなり弛緩している。慎重に剥離すれば、付着部位での被膜の破裂を防ぐことができる。１つの採取様式において、腎盂周囲の腎臓の長軸に沿って被膜に１つのスリットを入れ、腎組織と付着した腸間膜組織から被膜を剥離することができる。この縦方向カットはより均一な寸法の腎被膜フィルムを生じるので、好ましい。しかしながら、本発明の範囲から逸脱することなく、他の剥離方向を選択してよい。分離した腎被膜組織は半透明であり、肉眼的には、コラーゲンベースの細胞外マトリックスの単一フィルムとして見える。単離腎被膜のサイズは動物ごとに、そして種ごとに変動するが、成体ブタから取ったブタ腎被膜は、典型的には、長さ約５〜１５ｃｍ、幅約１０〜２５ｃｍ、そしてより典型的には幅１０〜２０ｃｍのコラーゲン性シートとして入手可能である。
【００１６】
この被膜フィルムを脱細胞化し、滅菌するか、他のやり方で処理して、精製された腎被膜ＥＣＭのシートを得て、例えば医学的に受容されるか又は研究目的に適した技術用グレードの材料に達する。当業者は、単離腎被膜を脱細胞化するには、多くの慣用の細胞溶解技術や他の細胞除去技術が使用可能であることを理解されよう。機械強度に影響を及ぼさず、腎被膜ＥＣＭの有利な細胞増殖促進特性を保持する脱細胞化技術が好ましい。
【００１７】
本発明の好ましい脱細胞化法及び／又は他の精製法は、適切な薬剤若しくは薬剤群と腎被膜組織を接触させることを伴う。例えば、そして制限されないが、これには、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドでのなめし法、１．０Ｎ生理食塩水又はＥＤＴＡ又は塩化アンモニウムのような塩洗浄、キレート剤、酸、塩基、及び／又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＴＷＥＥＮ洗浄剤、又はドデシル硫酸ナトリウムのようなイオン性若しくは非イオン性洗浄剤との接触、ホスホリパーゼ又はディスパーゼのような酵素での処理、酸化化合物での処理、ガスプラズマ滅菌、γ線照射、及びこれらの組合せが含まれる。この点で、本発明の望ましい方法は、単離腎被膜組織を、１以上の酸化剤、好ましくはペルオキシ化合物、より好ましくは有機ペルオキシ化合物、そして最も好ましくは過酸へ曝露することを伴う。過酸を使用するとき、それは、望ましくは、過酢酸、過プロピオン酸、及び過安息香酸からなる群より選択される。過酢酸が最も好ましい。他のペルオキシ消毒剤、例えば、過酸化水素水も使用に適している。なお他の好適なペルオキシ化合物は、「消毒、滅菌、及び保存（Disinfection, Sterilization and Preservation）」S. Block 監修、第４版、フィラデルフィア、Lea & Febiger, 167-181 頁，1991 中「過酸素化合物（Peroxygen Compounds）」S. Block; 及び、「産業用生物致死剤（Industrial Biocides）」K. Payne 監修、ニューヨーク、ジョンウィリー・アンド・サンズ、91-116 頁，1988 中「過酸素を用いた消毒（Disinfection with peroxygens）」M. G. C. Baldry 及び J. A. L. Fraser に記載されている。ペルオキシ化合物が好ましいが、他の酸化剤、例えばクロルヘキシジン（１，６−ジ（４−クロロフェニルジグアニド）へキサン）のジグルコン酸型のような塩素剤も使用してよい。多くの他の好適な塩素剤が「消毒、滅菌、及び保存（Disinfection, Sterilization and Preservation）」S. Block 監修、第４版、フィラデルフィア、Lea & Febiger, 274-289 頁，1991 中「クロルヘキシジン（Chlorhexidine）」G. W. Denton に記載されている。
【００１８】
酸化剤を希釈するのに好ましい溶媒は、水性アルコールである。好ましくは、そのアルコール含量は、溶液の約１容量％〜約３０容量％であり、そしてより好ましくは、アルコール含量は、約２容量％〜約１０容量％の間である。多くのアルコールがこの水性アルコール溶液を生成するのに使用可能であると考えられる。しかしながら、該アルコールは、１〜約６個の炭素原子を含有することが好ましく；アルコールは、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、変性アルコール、及びブタノールからなる群より選択されることがより好ましく；そして、アルコールは、エタノール又は変性アルコールのいずれかであることが最も好ましい。さらに、該溶液は、好ましくは約１．５〜約１０のｐＨ、より好ましくは約２〜約６のｐＨ、そして最も好ましくは約２〜約４のｐＨを有する。必須ではないが、慣用の緩衝液を使用してｐＨを調整してよく、緩衝液の選択は、当業者の知識内にある。
【００１９】
単離腎被膜組織を、脱細胞化剤又は他の処理剤へ好適な時間の間曝露する。一般に、曝露は、単離腎被膜を溶液へ揺動下に浸すことを伴う。曝露時間は、典型的には少なくとも約５分、例えば約１５分〜約４０時間の範囲、そしてより典型的には約０．５時間〜約８時間の範囲である。また、好ましくは、腎被膜組織は、処理溶液へ曝露する前に、溶媒、例えば滅菌水で予め濯いでおく。
【００２０】
本発明の１つの好ましい精製法は、腎被膜フィルムを希過酢酸へ曝露することである。約２容量％〜約１０容量％のアルコールを含有する水性アルコール溶液で過酢酸を希釈する。過酢酸の濃度は、例えば、約０．０５容量％〜約１．０容量％に及んでよい。最も好ましくは、過酢酸の濃度が約０．１容量％〜約０．３容量％である。過酢酸含量が約０．２％であるとき、腎被膜フィルムは、約２時間の間曝露することができる。当然ながら、曝露時間は、使用する特定の薬剤、その濃度、及び、当業者の視野内にある他の要因に応じて、より長くてもより短くてもよい。
【００２１】
本発明の別の好ましい精製法は、単離腎被膜を希過プロピオン酸へ曝露することを伴う。過プロピオン酸は、水、又は約２容量％〜約３０容量％のアルコールの水溶液に希釈する。最も好ましくは、該アルコールがエタノールである。過プロピオン酸の濃度は、約０．１容量％〜１０容量％に及んでよい。より好ましくは、過プロピオン酸濃度が約０．１容量％〜１容量％であり、最も好ましくは、約０．２容量％〜０．５容量％である。曝露時間は、典型的には、０．５時間〜８時間の範囲にある。過プロピオン酸の規定される濃度内であれば、ｐＨ調整は必要でない。
【００２２】
本発明のなお別の好ましい方法は、腎被膜を希過酸化水素水へ曝露することである。過酸化水素水は、水、又は約２容量％〜約３０容量％のアルコールの水性アルコール溶液に希釈してよい。最も好ましくは、アルコールがエタノールである。過酸化水素水の濃度は、約０．０５容量％〜３０容量％に及んでよい。より好ましくは、過酸化水素水濃度が約１容量％〜１０容量％であり、最も好ましくは、約２容量％〜５容量％である。この溶液を約５〜９のｐＨへ緩衝化してもしなくてもよく、より好ましくは、溶液を約６〜７．５のｐＨへ緩衝化する。溶液温度は約１５〜５０℃に及んでよい。より好ましくは、溶液温度が約２０〜４０℃である。最も好ましくは、溶液温度が約３２〜３７℃である。曝露時間は、約１０〜４００分に及んでよい。好ましくは、曝露時間が約１２０〜２４０分である。より好ましくは、曝露時間が１８０〜２１０分である。過酸化水素を利用するとき、該マトリックスは、全体として、より高い酸素含量だけでなくより大きい多孔性を有する。
【００２３】
さらに別の精製法は、腎被膜をクロルヘキシジン（１，６−ジ−（４−クロロフェニルジグアニド）へキサン）のジグルコン酸型へ曝露することである。ジグルコン酸クロルヘキシジンの濃度は、約０．１重量％〜１５重量％に及んでよい。より好ましくは、ジグルコン酸クロルヘキシジン濃度が約０．１重量％〜２重量％であり、最も好ましくは約０．２重量％〜５重量％である。溶媒は、水、又は約２容量％〜約２０容量％のアルコールを含有する水性アルコール溶液であってよい。最も好ましくは、アルコールがエタノールであり、約５％〜１０％の濃度である。この溶液は、約５〜８のｐＨへ緩衝化してもしなくてもよい。より好ましくは、ｐＨが約５．５〜７である。溶液温度は約１５〜３０℃に及んでよい。曝露時間は、約１０〜４００分に及んでよい。より好ましくは、曝露時間が約３０〜６０分である。
【００２４】
腎被膜を精製するなお別の方法は、該組織を、高張の脱細胞化溶液、例えば、約１．０Ｎの生理食塩水又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のいずれかと、約１０分〜４時間に及ぶ時間の間接触させることを伴う。この溶液は、約５〜８のｐＨへ緩衝化してもしなくてもよい。より好ましくは、ｐＨが約５．５〜７である。溶液温度は、組織処理に適したどの温度でもよく、例示すると、約４〜３０℃に及んでよい。
【００２５】
精製法に関する変更には、以下の１つ又は組み合わせも含めてよい：
１．  ０．２％過酢酸及び５％アルコール（例えば、エタノール又は変性アルコール）を含有する溶液に腎被膜を激しい揺動下で２時間浸すこと。溶液対腎被膜の比は重量で１０：１である。この溶液は２．６のｐＨを有する。
【００２６】
２．  １％過酢酸及び２５％エタノール若しくは変性アルコールを含有する溶液に腎被膜を激しい揺動下で１時間浸すこと。溶液対腎被膜の比は重量で５：１である。この溶液は２のｐＨを有する。
【００２７】
３．  １％過酢酸、１５％エタノール若しくは変性アルコール、及び１０％過酸化水素水を含有する溶液に腎被膜を激しい揺動下で１時間浸すこと。溶液対腎被膜の比は重量で５：１である。
【００２８】
４．  腎被膜を、４回交換する高純度の水に交換ごとに１５分間浸すこと。次いで、この腎被膜を１．５  ＭＲＡＤ電子ビーム照射にかける。
５．  腎被膜を、４回交換する高純度の水に交換ごとに１５分間浸すこと。次いで、この腎被膜を高強度パルス光にかける。
【００２９】
６．  １．０Ｎ生理食塩水を含有する溶液に腎被膜材料を激しい揺動下で２時間浸すこと。次いで、この腎被膜を２％過酸化水素水及び５％アルコール含有溶液に激しい揺動下で３時間処理する。溶液対腎被膜の比は重量で１０：１である。
【００３０】
さらに、好ましい組織処理技術を使用して、細胞及び細胞残滓だけでなく、あり得る内因性のウイルス、プリオン因子、及び、腎被膜組織の採取の間に持ち込まれるあらゆる汚染物質を除去する。例示すると、水酸化ナトリウム処理を使用して、プリオンの不活性化を行うことができる。適切にも、存在するプリオンを不活性化するのに十分な時間の間、該組織を水酸化ナトリウムの溶液と接触させてよい。接触の時間は、当然ながら、水酸化ナトリウムの濃度や、関連技術分野の当業者に知られた潜在的に他の要因に応じて変動するものである。例示すると、該組織は、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液と５分〜５時間の間、より好ましくは１０分〜２時間の間、そして最も好ましくは１５〜６０分の間接触させてよい。あるいは、より濃い水酸化ナトリウムの溶液を使用してよく、例えば、該組織を１．０Ｎ水酸化ナトリウムと約１５〜６０分の間接触させる。なお他のプリオン不活性化処理が知られていて使用可能であり、例えば、圧力下での蒸気滅菌の使用、次亜塩素酸ナトリウム溶液（例えば２．５％）との接触、等が含まれる。
【００３１】
正常な哺乳動物組織由来の被膜組織をさらに処理して、ガラクトシル−α（１，３）ガラクトースエピトープ（Ｇａｌエピトープ）、細胞表面成分のグリコシル修飾物、並びに、ヒトと旧世界霊長動物を除くすべての哺乳動物にある血清タンパク質を除去することができる。Ｇａｌエピトープ修飾組織の調製についての一般的な方法論は、その開示が本明細書に特に援用される米国特許第６，３３１，３１９号に記載されている。
【００３２】
脱細胞化剤や他の処理剤は、望ましくは、腎被膜ＥＣＭから除去される。例えば、医療適用を含むいくつかの適用では、精製された腎被膜細胞外マトリックスが、乾燥重量の１００ｐｐｍ未満の脱細胞化剤や他の処理化学品の濃度を示すことが好ましい。１つの態様において、脱細胞化剤及び／又は他の処理化学品は、抽出溶媒の数回の交換において、消毒された腎被膜組織の浸漬により抽出される。好ましい抽出溶媒は、処理剤への親和性を有し、ＥＣＭに対して実質的な分解効果を有さない。そのような溶媒の例には、限定されないが、水性アルコール、生理食塩水、滅菌水が含まれ、とりわけ、滅菌水が最も好ましい。水性アルコールを使用する場合、好ましくは、それは消毒溶液において使用されるのと同じ水性アルコール溶媒である。典型的には、全浸漬時間は少なくとも約６０分であり、より好ましくは、それは約６０分〜約５時間の範囲にある。必要な溶媒交換の回数は、消毒剤及び処理剤の濃度に依存し、概して約３回〜１０回に及ぶ。本発明の方法の１つの態様において、抽出溶媒の５回の交換を使用する。さらに、懸濁液は、浸漬時間の間、好ましくは絶えず揺り動かされる。
【００３３】
上記の精製法より生じる精製された腎被膜ＥＣＭは即時使用に供しても、将来の使用のために保存してもよい。精製ＥＣＭは、水和状態で冷蔵若しくは冷凍保存しても、又は乾燥させて保存してもよい。凍結／融解サイクルがＥＣＭ組織に対して実質的に有害な効果を引き起こすとは考えられない。同様に、腎被膜ＥＣＭの有益な特性は、乾燥、例えば凍結乾燥して、その後で再水和しても保持される。１例として、腎被膜ＥＣＭの乾燥シートは、精製ＥＣＭフィルムを平らな表面に広げ、そのシートを一晩凍結乾燥させることによって得ることができる。凍結乾燥による乾燥が好ましいが、腎被膜ＥＣＭの三次元構造を保存することができる他の方法も使用してよい。その後、乾燥された構造は、使用前に水性媒体で復元してよく、あるいはまた、それを移植するか、また他の方法では、乾燥状態でそれを使用してもよい。
【００３４】
腎被膜を成体ブタより採取して過酢酸で処理する１つの特定の態様において、精製ＥＣＭは、その水和状態で、約８０μｍの厚さと測定される。この精製腎被膜フィルムは、対応するネーティブの未処理皮膜フィルムよりやや薄い。さらに、精製ＥＣＭフィルムは、ネーティブ被膜の外面に対応するより密な面とその内面に対応するより多孔性の面という、２つの特徴的な面を示す。さらに、好ましい処理済ＥＣＭシートは、引張り強さ試験により測定されるとき、少なくとも約２ＭＰａ、より好ましくは少なくとも約４ＭＰａ、及び典型的には約４〜２０ＭＰａの引張強度を示す。
【００３５】
好ましい精製腎被膜由来のＥＣＭは、ほとんど完全にコラーゲンから構成される、実質的に無細胞性の材料である。フェルヘッフ染色を利用するこれまでのアッセイでは、弾性線維も観察されている。さらに、好ましい精製腎被膜組織は、約２マイクログラム／ミリグラム未満、より好ましくは１マイクログラム／ミリグラム未満の核酸含量；２コロニー形成単位／グラム湿重量未満、より好ましくは１コロニー形成単位／グラム未満の生物負荷レベル；約２０ＥＵ／ｇ湿重量未満、より好ましくは約１２ＥＵ／ｇ未満、なおより好ましくは約５ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシンレベル；並びに、１ＰＦＵ／ｇ湿重量、より好ましくは１ｘ１０−３ＰＦＵ／ｇ未満のウイルスレベルを有する。約１ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシンレベルと約１ｘ１０−６ＰＦＵ／ｇ未満のウイルスレベルを有する精製腎被膜組織が、特に医療適用には、最も好ましいだろう。
【００３６】
このように、本発明の好ましい調製法は、優れた機械強度を保有し、例えば組織移植片プロテーゼ用具における使用のために、医学的に受容される腎被膜ＥＣＭのシートを生じる。こういった用具の例を以下に論じるが、記載される用具は例示であって、当業者は、本発明の腎被膜ＥＣＭを医療使用の様々な配置及び形態へ採用することができると理解されよう。
【００３７】
本発明のある態様において、本発明の精製腎被膜ＥＣＭを、粉末、流動化組成物、シート、管、子袋、複式構築体、単式構築体、並びに、ステント、弁、カテーテル、縫合糸、ステープル、バルーン、金属コイル、合成メッシュ、生物分解性ポリマー、不活性ポリマー、非生物分解性ポリマー、他のコラーゲン性マトリックス、幹細胞、前駆細胞、確立細胞系、一次細胞（予定の移植片レシピエントに対して自己、同種、及び異種の細胞を含む）のような細胞、遺伝子デリバリー用のベクター、他の天然に存在する、合成又は組換えの生物活性分子と組み合わせた構築体、又はこれら医療用具若しくは手段（implements）の他の組合せと組み合わせた構築体の形態をとる組織移植片へ成型することができると考えられる。例えば、腎被膜の膜組織は、血管構造や他の身体の経路に使用されるステントの内側及び外側のカバーに使用可能である。腎被膜の膜組織はまた、ステント弁用具の製造にも使用可能である。例示すると、図２に示すのは、腎被膜の膜組織（２２）が付いた多面ステント（２１）を含み、ＷＯ０１５６５００の記載に類似した２小葉ステント弁を形成する、ステント弁用具である。ＷＯ０１５６５００、ＷＯ１５４６２５、及びＷＯ９８５５４５の記載に類似した、上記や他の腎被膜の膜ステントカバー及びステント弁用具の配置は、本発明の一部として考慮される。
【００３８】
本発明の精製腎被膜ＥＣＭは、粉末の組織移植片組成物へ成型してよい。腎被膜ＥＣＭは、望ましくは、その開示が特に本明細書に援用される、米国特許第５，２７５，８２６号、国際特許公開公報第ＷＯ９６／３２１４６号、ＷＯ９８／２２１５８号、及びＷＯ９８／２５６３６号における他のコラーゲンベースのＥＣＭについての記載に類似したやり方で、引裂き、切断、粉砕、せん断、等により細分することができて、凍結してもしなくてもよい。凍結若しくは凍結乾燥状態で腎被膜ＥＣＭを粉砕することが有利であるが、腎被膜ＥＣＭの切片の懸濁液を高速ブレンダー中での処理にかけ、そして必要ならば遠心分離して過剰の老廃物をデカントすることにより脱水処理することによっても良好な結果を得ることができる。次いで、細分された腎被膜ＥＣＭを乾燥させ、例えば凍結乾燥させて、粉末とすることができる。
【００３９】
１つの例示の調製では、本明細書に記載のように調製した腎被膜ＥＣＭを（例えば、切断により）小片にしてから、液体窒素で速やかに凍結し、液体窒素下で細分して粗い粉末とする。こうした処理は、例えば、筒状の真鋳鋳型を凍結腎被膜組織の上に置いて、手動のアーバ・プレスを用いて行ってよい。鋳型は、組織とプレスの心棒の間の界面として役立つ。液体窒素は、組織が凍結状態のままであることを確実にするために、腎被膜組織へ周期的に加えてよい。予冷した乳棒及び乳鉢を使用して粗い粉末をさらに粉砕し、均一のより細かく分割された生成物を生じる。再び、必要に応じて液体窒素を使用し、最終粉砕の間、固形の凍結粒子を維持する。
【００４０】
その後、所望されるならば、この粉末を水又は緩衝化生理食塩水、及び場合により他の製剤的に許容される賦形剤に懸濁し、例えば、２５℃で約２〜約３００，０００ｃｐｓの粘度を有する流体組織移植片組成物としてよい。より高い粘度の移植片組成物は、ゲル若しくはペーストの軟度を有する場合がある。あるいは、この粒子組成物を一晩凍結乾燥させて滅菌し、固形の実質的に無水の粒子状複合材としてよい。
【００４１】
整形外科の適用において、本発明の腎被膜ＥＣＭ粉末は、例えば、米国特許第５，６４１，５１８号に記載の一般的な技術を使用して骨組織を修復するために使用可能である。このように、腎被膜ＥＣＭの粉末型は、損傷又は罹病した骨領域中へ修復のために移植することができる。腎被膜ＥＣＭは、単独で使用しても、又は生理学的に適合する無機質、増殖因子、抗生物質、化学療法剤、抗原、抗体、酵素、遺伝子デリバリー用ベクター、及びホルモンのような１以上の追加の生物活性剤と組み合わせて使用してもよい。好ましくは、粉末型インプラントは、予め決定された三次元の形状へ圧縮され、これは骨領域へ移植されると、該移植片が内因性組織に置き換わる間、その形状を実質的に保持するだろう。
【００４２】
本発明の精製腎被膜ＥＣＭは、その開示が本明細書に援用される、米国特許第５，２７５，８２６号に記載されるような技術に従って、流動化させてよい。一般に、腎被膜ＥＣＭの流動型は、トリプシン又はペプシンのようなプロテアーゼ、又はコラゲナーゼ、グリコサミノグリカナーゼ、又はヒアルロニダーゼのような他の適切な酵素の使用、又は酵素の混合物の使用を含む酵素消化による、組織を可溶化して実質的に均質な溶液とするのに十分な時間の間の可溶化によって調製される。流動化組成物は細分された組織の酵素消化から生成してよいが、機械的な細分をせずに酵素消化のみを伴う手順も使用可能である。
【００４３】
腎被膜ＥＣＭの流動化組成物を調製する１つの例示の態様では、上記のように調製した腎被膜ＥＣＭ粉末をワイヤメッシュに通して篩いにかけ、採取し、１ｍｇ／ｍｌのペプシン（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）及び０．１Ｍ酢酸（ＨＣｌでｐＨ＝２．５へ調整）を用いた、室温で４８時間にわたるタンパク分解消化にかけると、実質的に均質な溶液を生じる。この処理の後、反応媒体を水酸化ナトリウムで中和し、ペプシン活性を止める。次いで、可溶化した腎被膜ＥＣＭを塩沈殿により濃縮する。沈殿を凍結乾燥させて、流動化粉末とすることができる。
【００４４】
腎被膜ＥＣＭはシート構築体へ成型することができる。例えば、精製腎被膜ＥＣＭをそのネーティブなシート型へ広げ、所望されるならば寸法に合わせて切り、そして凍結乾燥させてよい。２以上のそうしたシートを互いの上に直に積み重ねて含む、多層シート構築体をつくることができる。この点に関し、これらの構築体は、例えば、脱水条件の下でシートを圧縮すること、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）のような架橋剤の使用、又は他の適切な手段によりコラーゲンシートを一緒に接着させることによって安定化し得る。本明細書に記載の上記及び他の多層構築体において、腎被膜ＥＣＭシート若しくは小片は、それらの内面が互いに接触するように、又はそれらの外面が互いに接触するように、及び／又は、あるＥＣＭシートの内面が別のＥＣＭシートの外面に接触するように、積み重ねるか又は配置してよい。このように、腎被膜ＥＣＭの内側の（より多孔な）面からそれぞれ生じる外面、腎被膜ＥＣＭの外側の（より密な）面からそれぞれ生じる外面、又は腎被膜ＥＣＭの内面から生じる１つの外面と腎被膜ＥＣＭの外面から生じる別の外面を提示する、包括（overall）多層構築体を加工することができる。なおさらに、積み重なるＥＣＭ切片が必ずしも正確に接触しない場合、この包括多重構築体の外面の一方又は両方は、腎被膜ＥＣＭの内面及び外面の両方を提示する場合がある。
【００４５】
より大きな範囲のシート構築体は、いくつかの小さな範囲のシートを積み重ねて一緒に融合することによって調製可能である。より小さな範囲のシートから大きな範囲のシートを構築することが米国特許第５，１２７，９０３号、国際特許公開公報第ＷＯ９６／３２１４６号、ASAIO Journal, 2000, 46: 268-272 に記載され、これらの開示は特に本明細書に援用される。１つの態様において、小さな範囲のシートは、これらシートの重なった端を脱水条件下で圧縮することによって一緒に融合される。別の態様において、このシートは、光触媒染料の存在下で光架橋形成させることによって結びつけられる。縫合糸、架橋剤、接着剤、及びペーストの使用を含む、当業者に知られた他の標準的な組織結合技術も使用してよい。
【００４６】
腎被膜由来マトリックスは、様々な寸法及び厚さの管の中へ配置して、例えば、血管及び尿路の置換に有用な管状組織移植片を提供することができる。管状移植片をコラーゲン性シートからつくる技術は、その開示が特に本明細書に援用される、米国特許第２，１２７，９０３号及び４，９０２，５０８号と国際特許公開公報第９８／２２１５８号に概ね記載されている。例示すると、管状移植片は、腎被膜ＥＣＭのシートを操作して管及び縫合、結合部分を規定するか、又は他のやり方で縦の継ぎ目を確保して管腔を有する適正な寸法の管状移植片を成型することによって構築してよい。さらに、管は、腎被膜ＥＣＭの外側の（より密な）面、及び／又は腎被膜ＥＣＭの内側の（より多孔な）面からなる内腔又は最外の面を呈するように成型してよい。１つの態様において、管状構築体は、移植されるレシピエント血管に近似した外径を有する無菌の棒若しくは軸をおおって成型される。好ましくは、本発明の腎被膜ＥＣＭの少なくとも１つのシート層は、棒の回りにラップされ、積み重なる継ぎ目となる。積み重なる継ぎ目は、縫合、光架橋形成、化学架橋形成、酵素的手段による架橋形成、放射線架橋形成、圧縮及び脱水下での融合、又は接着、等のような慣用法のいずれかにより一緒に結びつけてよい。さらに、管状移植片は多層の精製腎被膜ＥＣＭから構築することが可能であり、使用する層の数は、特別な適用の強度要求性に概して依存すると理解される。あるいは、多層の移植片は、腸、子宮、膀胱、又は胃から得られる粘膜下組織、心膜組織、等のような他の供給源由来の他のコラーゲンをベースとする材料と組み合わせて層状にした、精製腎被膜ＥＣＭの層から構成されてもよい。例えば、血管移植片は、典型的には、多層のＥＣＭシートで構築され、その移植環境の一定の脈圧に耐え得ることを確実にする。血管、尿路、又は他の身体の管腔への適用では、本発明の腎被膜ＥＣＭをステントのような支持構造体の外部、内部、又は他のカバーとして使用してよい。これらの適用には、例えば、概して生体適合性カバーとなり、並びに弁構造ともなる、自己伸長性又は他のやり方で伸長可能なステントとの使用が含まれる（例えば、１９９９年１２月９日公開のＷＯ９９６２４３１と２００１年３月２２日公開のＷＯ１１９２８５を参照のこと。これらはいずれも本明細書に援用される）。弁構造を生じる１つの形式において、腎被膜ＥＣＭは、片方の流れにより抵抗する、１、２、又はそれより多い小葉、尖端、嚢、又は類似の構造を生じるやり方でステントへ付けることが可能である。そのような用具の特定の適用において、血管弁として構築されたそのような用具は、例えば肢において発生する、ヒトの静脈不全を治療するために移植される。代わりのアプローチにおいて、上記や他の弁欠損症を治療するための弁は、ステントや他の支持構造体を使用せずに外科的に創出される場合がある。
【００４７】
腎被膜細胞外由来マトリックスは、場合により、整形外科適用に予め調節してよい。整形外科用移植片の調製は、その開示が特に本明細書に援用される、米国特許第２，１２７，９０３号；５，２８１，４２２号；５，２７５，８２６号；及び５，３５２，４６３号に概して記載されている。調整により、ネーティブなＥＣＭシートに固有の粘弾特性が改変され、張りが低下する。腎被膜ＥＣＭは、引き伸ばし、化学処理、酵素処理、又は該組織を他の環境因子へ曝露すること、あるいは当該技術分野で知られた他の方法により調節してよい。好ましくは、ＥＣＭは、予め引き伸ばされた長さの予め決定された比率まで荷重下で引き伸ばすことによって調節される。例えば、腎被膜ＥＣＭは、ＥＣＭシートの切片に、該切片の約１０％〜約２０％伸長が可能になるのに十分な時間の間、錘をかけることによって調節してよい。次いで、この腎被膜ＥＣＭ切片を、単独でか又は他の切片と組み合わせて、整形外科移植片として役立つ様々な形状へ成型することができる。
【００４８】
整形外科使用の１つの領域において、本発明の腎被膜ＥＣＭは、結合組織の修復及び／又は置換に使用可能である。本発明の目的のための結合組織には、骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯、並びに、皮膚の内皮層を含む線維組織が含まれる。例えば、腎被膜由来ＥＣＭは、靭帯又は腱の置換物として、又は破損したか又は重症の腱又は靭帯へのパッチとして役立つ場合がある。他の天然由来若しくは合成の移植片材料へ適用されたことがあり、米国特許第２，１２７，９０３号；５，２８１，４２２号；５，２７５，８２６号；及び５，３５２，４６３号に概して記載される結合組織修復技術は、腎被膜ＥＣＭ切片を使用して行うことができる。
【００４９】
腎被膜ＥＣＭ切片は、外科的に受容される技術を使用して、骨、腱、靭帯、軟骨、及び筋肉を含む既存の生理学的構造へ外科的に付着させるために成型することができる。そのような結合組織移植片の適用では、望ましくは単層若しくは多層の配置をとるように切片が成型され、少なくとも反対端部分及び／又は反対側面部分が移植片材料の多重層を有するように成型され、生理学的構造への付着の強化をもたらす。靭帯置換の適用では、反対端が第一及び第二の骨へそれぞれ付き、骨は、典型的には、膝関節の場合のように関節結合する。腱置換の適用では、移植片構築体の第一の端が骨へ付き、第二の端が筋肉へ付く。
【００５０】
上記に示されるように、結合組織適用においては、付着部分での移植片剥離の可能性を低下させるやり方で、移植片構築体の端部分が例えば骨構造へ付くように成型、操作、又は造形することが有利であろう。これらの目的のために、調節された腎被膜ＥＣＭ材料は、折り畳むか又は一部裏返して、例えばスパイクワッシャー若しくはステープルでつかむための多重層を提供してよい。あるいは、腎被膜ＥＣＭ切片は、その上で折り畳んで端部分を結びつけ、第一の結合部分が例えば第一の骨へ付き、中間部分の曲がり目が第一の骨に関して関節結合した第二の骨へ付く第二の結合部分となるようにしてもよい。例えば、腎被膜ＥＣＭ移植片の端部分の一方が、例えば大腿骨中のトンネルを通して引っ張られてそれへ付くように適応されるのに対し、端部分の他方は脛骨中のトンネルを通して引っ張られてそれへ付くように適応されて天然の十字靭帯の代用品となることが可能であり、該切片は、トンネル間の緊張下に置かれるように適応され、靭帯機能、即ち正常な靭帯が提供する緊張及び姿勢機能を提供する。
【００５１】
さらに、本発明の腎被膜ＥＣＭシートはまた、骨折した骨の断片を一緒に、身体中の適切な方向に保つための結合組織としての使用への整形外科用移植片を提供するために使用してよく、該組織切片は、骨折した骨の切片付近の骨折ラップとして役立ち、骨へ付くように成型される。
【００５２】
上記のように、整形外科適用に指定される組織移植片は、典型的には多層構築体である。多重構築体を成型する方法は当該技術分野で概ね知られている。例えば、単純な多層構築体は、２以上の腎被膜ＥＣＭシートを重ねて、それらの端部分を一緒に結びつけることによって成型可能である。二重壁の管は、一方の管状切片を他方の管状切片の内側に引き入れて、末端を結びつけることによって成型可能である。多層構築体はまた、編み配置、例えば菱形若しくは吊編みの編み配置において、又は隣のループへ相互連結する多重ループを含むメッシュ配置で腎被膜ＥＣＭの１つの切片若しくは小片を編むことによって成型してもよい。
【００５３】
本発明の組織移植片組成物は、心臓血管組織を治療又は修復するために使用してよい。例えば、本発明の組織移植片組成物は、中隔欠損症を含む心臓の欠損症を治療するために使用してよい。
【００５４】
調製される移植片の構築体及び組成物は、保存と消費者への出荷のために構築体の純度を保護するように包装することができる。１つの態様では、乾燥した移植片構築体を、滅菌済みバッグに包装してから、真空密封及び／又は加熱密封する。これらの包装品は室温で保存及び出荷してよい。別の態様では、水和状態にある移植片構築体を滅菌済みバッグに包装してから真空密封及び／又は加熱密封する。水和したサンプルは、凍結して保存及び出荷してよい。好ましくは、滅菌済みバッグは、湿気や酸素を通さない材料、例えばＰＥＴＥから成型される。構築体の純度が保存前に維持されることをさらに保証するには、製造の間に構築体の表面に偶然集まった病原体を一掃するために、密封包装品へ照射してよい。なお別の態様において、乾燥した移植片構築体は、非滅菌のガス透過性バッグに包装してから真空密封及び／又は加熱密封してよい。次いで、包装した構築体を、酸化エチレンガスを使用するガス透過性包装で滅菌する。当該技術分野の当業者の知識内にある滅菌についてのなお他の慣用技術も使用可能であると考えられる。
【００５５】
好ましい精製腎被膜由来ＥＣＭ材料は、組成上残留する生物活性タンパク質を含有する。例えば、こうしたＥＣＭ材料のこれまでの分析は、それらが線維芽細胞増殖因子２（塩基性ＦＧＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含有することを示した。本発明の好ましい精製ＥＣＭ材料は、例えば、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、プロテオグリカン、サイトカイン、及び／又は増殖因子の１以上を含む、追加の生物活性タンパク質を含有する場合があることも予期される。
【００５６】
腎被膜ＥＣＭを含む組織移植片組成物は、損傷又は罹病した組織の存在によりそれを必要とする宿主の部位において内因性の組織増殖を誘発するのに有効な量で脊椎動物宿主へ投与することができる。脊椎動物宿主は、腎被膜ＥＣＭを採取した動物に対して異種であることを企図している。腎被膜ＥＣＭ組成物は、固形若しくはシート型において、単独でか又は他の当該技術分野で認知された移植組成物と組み合わせた外科移植により、又は流動型において注射により、宿主へ投与することができる。
【００５７】
潜在的な適用には、限定されないが、血管移植片、整形外科用柔組織インプラント、創傷包帯剤、尿生殖系や他の体壁の修復剤が含まれる。さらに、腎由来ＥＣＭは、真核細胞の in vitro 培養の細胞増殖基質として、研究用に、又は移植用の細胞接種移植片用具を産生するために利用可能であると期待される。上記の適用は、他の天然由来ＥＣＭや合成移植片材料へ適用されたことのある当該技術分野の技術を利用し、本発明の精製腎被膜由来ＥＣＭを使用して行うことができる。
【００５８】
本発明の流動化腎被膜ＥＣＭは、多くの整形外科適用、例えば組織の置換、補強、及び／又は修復を見出すだろう。本発明の流動化腎被膜ＥＣＭは、注射用異種移植片として使用することを企図している。組織欠損症の場所へ、例えば修復又は補強の必要な骨又は柔組織に有効量の流動化腎被膜ＥＣＭ組成物を注射することによって、腎被膜ＥＣＭの向生物（biotropic）特性を容易に利用することができる。さらに、流動化組成物は、有利にも、インプラント構築体の充填剤として、例えば美容又は外傷治療の外科的方法において使用することを企図している。
【００５９】
本発明の腎被膜ＥＣＭは、Ann. Plast. Surg., 1995, 35: 374-380; 及び J. Surg. Res., 1996, 60: 107-114 の記載に類似した技術を使用する、例えばヘルニアのような腹壁欠損症の修復を含む、体壁修復にも使用可能である。そうした適用において、本発明の好ましい腎被膜ＥＣＭ組織移植片は、再構築される組織において好ましい組織化、血管分布、及び軟度を増進させる。
【００６０】
皮膚科の適用において、本発明の腎被膜ＥＣＭは、当該技術分野と文献に知られている一般的な移植技術を使用する、部分的又は全体的に厚い創傷の修復と皮膚の補強に使用可能である（例えば、Annals of Plastic Surgery 1995, 35: 381-388 を参照のこと）。さらに、熱傷治療の分野では、皮膚代用物を提供し、その上に培養表皮移植片（好ましくは、培養表皮自己移植片、又はＣＥＡ）を移植することが一般に知られている。そのような培養移植片は、典型的には、角化細胞及び／又は線維芽細胞を皮膚代用物の上に移植することを伴ってきた。本発明によれば、精製腎被膜ＥＣＭを、例えばシート型において皮膚代用物として使用し、それによりＣＥＡをこの腎被膜ＥＣＭの上に移植してよい。本発明のこの側面を実施する１つの態様において、角化細胞は、例えば腎被膜ＥＣＭシートのより密な面上に角化細胞シートを接種又は移入することによって移植することができ、線維芽細胞はまた、腎被膜ＥＣＭシートのより多孔な面上に移植することができる。
【００６１】
本発明の腎被膜ＥＣＭはまた、尿生殖系への適用のための組織移植片において使用可能である。例えば、大きな範囲の腎被膜ＥＣＭシートを膀胱の修復に使用してよく、ここで腎被膜ＥＣＭシートは、膀胱組織再生の骨組を提供する。膀胱修復の技術は、米国特許第５，６４５，８６０号；Urology, 1995, 46: 396-400; 及び J. Urology, 1996, 155: 2098 に概して記載され、その開示は特に本明細書に援用される。
【００６２】
さらに本発明者は、腎被膜ＥＣＭを含む管状移植片が尿路の修復及び置換に使用することを企図している。その作製についてはすでに記載した、特定の直径及び強度の管状移植片を、標準的な外科技術により、損傷又は罹患した尿路の代用とすることが外科的に可能である。尿路置換の技術については、ASAIO Journal 2000, p.268 中、Xie et al., による「再構築された小腸粘膜下組織の尿路置換への使用（Use of Reconstructed Small Intestine Submucosa for Urinary Tract Replacement）」に概して記載されていて、この開示は特に本明細書に援用される。小腸粘膜下組織に由来する細胞外マトリックスから構築され、切除された尿管の切片に置換するためにブタへ移植された管状移植片が生体再構築を誘発することが示された。移植から２週間後、線維芽細胞と単核細胞が移植片に浸潤し、血管新生が起きていた。本発明者は、腎被膜細胞外マトリックスから調製される組織移植片も同様の生体再構築を誘発すると考える。
【００６３】
流動型において、本発明の腎被膜ＥＣＭはまた、膀胱尿管還流を適正化する内視鏡注射法に使用を見出す場合がある。そのような適用では、例えば、患者の尿道口下の領域に粘膜下組織の注射を行って、注射部位で平滑筋増殖とコラーゲン形成を誘発させることができる。
【００６４】
本発明の腎被膜ＥＣＭとともに成型される組織移植片構築体は、神経系の適用に使用することを企図している。例えば、外傷、腫瘍切除、又は減圧法による欠損を修復するために硬膜代用物を必要とする技術においてである。また、本発明の腎被膜ＥＣＭは、外科適用における接着障壁として使用することを企図している。
【００６５】
本発明の腎被膜ＥＣＭは、in vitro で培養される真核細胞の増殖を支援し、分化を誘導するために使用することができる。細胞の in vitro 培養にコラーゲンベースのＥＣＭを利用する手順が、その開示が特に本明細書に援用される、国際特許公開公報第ＷＯ９６／２４６６１号に記載されている。一般に、この方法には、真核細胞、例えば内皮、線維芽、胎児皮膚、骨肉腫、及び腺癌の細胞を真核細胞の増殖を導く条件下で腎被膜ＥＣＭの組成物へ in vitro で導入する工程が含まれる。シート、ペースト、又はゲル型の腎被膜ＥＣＭが使用可能である。典型的には、特別の細胞型にとって重要であることが当該技術分野で知られている様々な栄養素、増殖因子、無機質、及び塩類と腎被膜ＥＣＭ組成物を組み合わせる。さらに、現在利用可能な細胞培養基と腎被膜ＥＣＭを組み合わせて、様々な細胞型の成長、増殖、及び分化を誘導するそうした培地の有効性を高めることができる。
【００６６】
本発明の腎被膜ＥＣＭはまた、形質転換細胞を産生するための組成物においてコラーゲン性マトリックスとして役立つ場合がある。細胞形質転換についての技術は国際特許公開公報第ＷＯ９６／２５１７９号及びＷＯ９５／２２６１１号に記載され、これらの開示は特に本明細書に援用される。好ましくは、in vitro 又は in vivo の標的細胞を遺伝学的に形質転換する核酸配列を含有する組換えベクター（例、プラスミド）と組み合わせた細胞形質転換組成物に、本発明の精製腎被膜ＥＣＭを、例えば流動型又はペースト型において含める。形質転換の標的とされる細胞には、例えば、骨前駆細胞が含まれる場合がある。
【００６７】
本発明とその特徴及び利点のさらなる理解を高めるために、以下の特定の実施例を提供する。これらの特定の実施例は本発明の例示であって、それを限定しないことを理解されたい。
【００６８】
実施例１
本発明の組織移植片材料を以下の工程に従って調製する：
屠殺したばかりの成体ブタの腎被膜を含む腎臓を入手し、実験室での処置に先立って氷上に保存する。皮膜はかなり弛緩しているが、離れた数箇所で腎臓へ付着している。はじめに、被膜組織へ付いている脂肪組織を鈍的剥離道具で除去する。腎盂を通る腎臓の長軸に沿って被膜に１つのスリットを入れ、腎臓と被膜の間の付着部分を切り取り、被膜を腎臓から剥離する。皮膜へ依然として付着している残余の脂肪組織を慎重に除去する。単離した腎被膜組織は半透明である。
【００６９】
単離被膜を滅菌水で数回濯いでから、それを水性エタノール過酢酸溶液中に、激しい揺動下で２時間浸すことによって消毒する。過酢酸溶液は０．２容量％の過酢酸、５容量％のエタノールを含有し、２．６のｐＨを有する。消毒溶液のその中に置く腎被膜に対する重量比は、約１０：１である。
【００７０】
消毒処理に続き、過酢酸と他の処理化学品を腎被膜組織から滅菌水で抽出する。腎被膜を、それぞれ１５分の間、激しい揺動下で滅菌水に浸し、これを５回交換する。水和した被膜組織材料を冷蔵保存する。
【００７１】
過酢酸処理（精製）腎被膜材料は、ネーティブな材料より薄く、細胞がより少ないことがわかる。その水和状態で、組織は約８０μｍと測定される。さらに、この材料には密な面とより多孔な面があり、非精製腎被膜と比べると細胞残滓及び核が実質的に消失している。
【００７２】
実施例２
実施例１で調製した精製組織の試料を、ゴモリ三色（Gomori's Trichrome）染色を使用して染色する。この材料が主にコラーゲン性であることがわかる。
【００７３】
実施例３
実施例１で調製した精製組織の試料を、フェルヘッフ染色を使用して染色する。組織学的試験により、精製腎被膜組織中に弾性線維の存在が明らかになり、このことは単離腎被膜組織が周囲の腸間膜組織から分離したことを示唆する。
【００７４】
実施例４
腎被膜由来ＥＣＭの機械特性を、標準的な卓上（bench top）張力試験器を使用して評価した。この試験は、乾燥ＥＣＭ片の両端を機器の対峙する締金の間に置くことを伴う。締金を一定の速度で反対の方向に機械的に離してゆき、それにより標本を破損の点まで引き離す。長さについて補正した、引張速度を維持するのに必要な荷重が材料の引張強度を示す。
【００７５】
実施例１で調製した精製組織の標本を冷蔵保存から取り出し、シート型へ広げ、凍結乾燥させる。それぞれ約１ｃｍの幅と約４〜４．５ｃｍの長さの試験片を乾燥ＥＣＭ標本から切り出す。試験片の両端を折り畳んだファイルフォルダー部品の間に置き、挟まれた試験片を機器の爪の間で締め、安定にする。締金を約１０．００ｍｍ／分の速度で反対方向に動かして離してゆく。腎被膜由来ＥＣＭの単一標本の３つの別個の試験片から蓄積したデータを表１に示す。試験片の長さに対する、引張速度を維持するのに必要とされる荷重を図１にプロットする。
【００７６】
【表１】
0004426285.tif 000002
【００７７】
実施例５
本実施例では、ブタの腎被膜（ＲＣＭ）について標準的なＥＬＩＳＡ／吸光度アッセイにより線維芽細胞増殖因子２及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を分析した。生の腎被膜の膜試料と実施例１のように処理した消毒済み腎被膜の膜を、２．５ｍｇ／ｍｌ  ヘパリンを含有する２Ｍ尿素において抽出した。抽出した凍結乾燥品を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌水に再懸濁させた。標準品と抽出物の試料のＥＬＩＳＡ／吸光度分析により、以下のようにＦＧＦ−２及びＶＥＧＦの存在を明らかにした：
【００７８】
【表２】
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【００７９】
実施例６
実施例１の記載のように消毒したブタ腎被膜の試料について、マウスにおける急性全身毒性を評価した。特に、０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ溶液及び綿実油、ＮＦにおいて試料を抽出した。これらの抽出物について、「国際標準化機構１０９９３：医療用具の生物学的評価、パート１１：急性全身毒性試験」の必要条件に従って全身毒性を評価した。適切な試験品抽出物の単回用量を、静脈内又は腹腔内の経路により、抽出物あたり５匹のマウスにそれぞれ注射した。同様に、５匹のマウスにそれぞれ対応する試薬の対照を投薬した。直ちに、そして４、２４、４８、及び７２時間目に動物を観察した。この抽出物については死亡も全身毒性の証拠も観察されず、本試験の必要条件を満たした。
【００８０】
実施例７
実施例１のように消毒したブタ腎被膜の試料を、「国際標準化機構１０９９３：医療用具の生物学的評価、パート５：細胞毒性試験：in vitro 法ガイドライン」に基づいた in vitro 生体適合性試験にかけ、細胞毒性の潜在性を決定した。５％血清と２％抗生物質を補充した単一力価（single strength）最少必須培地を使用して、試験試料の単一抽出物を調製した。この試験抽出物を、５％  ＣＯ２において増殖させたＬ−９２９マウス線維芽細胞の３つの個別の集密単層上に入れた。試薬の対照、陰性対照、及び陽性対照についても３つの個別単層を調製した。すべての単層を５％  ＣＯ２の存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間目に試験品、試薬対照、陰性対照、及び陽性対照のウェルの単層を顕微鏡により検査し、細胞の形態における変化を判定した。
【００８１】
本試験の細胞条件下で、１Ｘ  ＭＥＭ試験抽出物は、細胞溶解や毒性を引き起こす証拠を示さなかった。１Ｘ  ＭＥＭ試験抽出物は、そのグレードが２未満（軽度の反応性）であったので、本試験の必要条件を満たした。試薬対照、陰性対照、及び陽性対照は、予測した通りの成績であった。
【００８２】
実施例８
消毒済みのブタ腎被膜の試料を以下のように溶血アッセイにかけた。試料を生理食塩水へ加えた。生理食塩液中の試料へ希釈したウサギ血液を加えた。この組合せを評価して、試験品との直接的な接触が in vitro で赤血球溶血を引き起こすかどうかを決定した。
【００８３】
３匹のウサギから血液を入手し、プールし、希釈し、試験品／生理食塩水の同一２検体の試験管へ加えた。陰性対照及び陽性対照を同様に調製した。それぞれの試験管を穏やかに反転させ、血液と内容物を均一に混合した。次いで、試験管を３７℃で４時間、静置位置に保った。インキュベーションの後で、この懸濁液を穏やかに混合し、コニカル試験管へ移し、遠心分離した。生じた上清をＤｒａｂｋｉｎ試薬へ加えた。抽出物の透過率を５４０ｎｍの波長で分光光度法により測定した。
【００８４】
本試験の条件下で、生理食塩水中の試料の平均溶血指数は０％であった。試料は非溶血性であった。陰性対照、及び陽性対照は、予測した通りの成績であった。
実施例９
腎被膜の膜（ＲＣＭ）とポリプロピレンメッシュ（ＰＰＭ）を、ラット全厚筋肉／腹側腹膜の体壁修復モデルにおいて比較した。外科手術の間に完全厚のラット腹壁を除去し、この欠損部分をＲＣＭ又はＰＰＭのいずれかで修復した。大網はそのまま残すか、又は外科手術の間に除去し、４週後、この４群を組織学的に比較した。
【００８５】
４週後、ＲＣＭ移植片は、線維血管性組織の広範な浸潤を伴い、高度に血管形成されていた。この生物材料に対する全般的な応答は、厚い、中等度に細胞性の線維血管層がこの生物材料の皮下及び中皮の両面に発達したことである；この線維性結合組織は、この生物材料に浸潤し、置き換わった。リンパ球及び形質細胞の流入が明らかであり、主にこの材料の皮下面に、ヘモジデリンを担うマクロファージが時折凝集していた（外科手術部位での出血への応答）。
【００８６】
ポリプロピレンメッシュに対する宿主の反応はＲＣＭ生物材料への反応とはまったく異なっていた。ＰＰＭの存在下での反応は、異物への肉芽腫様の炎症応答を特徴とし、網の周囲で、メッシュの空間を満たす疎らな脂肪組織中に初期の線維症が発生していた。線維性結合組織が皮下組織から発達し、欠損部分を覆うように見えたが、それはほとんどインプラントに浸潤していなかった。これは、線維性結合組織が天然の創傷治癒プロセスにより一致したやり方で生物材料に浸潤してそれに置き換わる、ＲＣＭ群で見られた反応と著しく対照的であった。
【００８７】
実施例１０
皮下移植のモデルにおいて腎被膜マトリックスを評価した。ＲＣＭのシートをラットの背に創出した嚢中へ移植し、１４日間再構築させた。どのラットも合併症の徴候を示さななかった。１４日後に組織を外植し、組織学的に評価した。ＲＣＭには大量の細胞性浸潤物が多く存在し、広範囲の血管分布の証拠を含んでいた。浸潤物は本質的にほとんどが単核性であり、巨大細胞の形成や他の免疫拒絶の徴候の証拠はなかった。
【００８８】
実施例１１
実施例１のように調製した腎被膜マトリックスをアキレス腱修復の整形外科モデルにおいて評価した。２０匹のラットにアキレス腱の５ｍｍ切片の外科的切除を施した。このラットの１０匹において、腱断端を近づけ、緩やかに一緒に縫合し、欠損部分は詰めないままにした。他の１０匹のラットでは腱の末端を腎被膜マトリックス移植片でしっかりと結びつけた。両群において、手術後にラットを回復させ、その肢を使わせた。４週間の間、実験的に操作した肢を使用する能力について、それらを臨床的に観察した。４週後、動物をすべて安楽死させ、腱を採取し、固定し、修復の証拠について組織学的に検査した。
【００８９】
臨床観察により、腎被膜マトリックス移植片を移植したラットがほぼ１０日後にその歩行に観察し得る欠損がなく歩くことができるのに対し、移植片を入れなかったラットは、術後の試験期間の間、その肢を使用することができないことが明らかになった。２８日後の組織学的評価は、腎被膜マトリックス移植片に宿主由来の細胞が多く存在し、腱の長軸に沿ってコラーゲン性の修復材料が定着しはじめたことを明らかにした。腎被膜マトリックスを移植しなかったラットは、組織化されたコラーゲンの沈着を示さなかったが、非組織化の瘢痕組織材料で修復されていた。
【００９０】
本発明を上記の記載において詳しく説明してきたが、これは例示であって、制限しないものとみなすべきであり、好ましい態様だけが示されて記載されたのであって、本発明の精神の内に入るあらゆる変更及び修飾は保護されることが望ましいと理解されるべきである。さらに、本明細書に引用されたあらゆる公表物は当業者により保有される技量を示すものとみなされ、そのような公表物はいずれもそのまま本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、試験片の長さに対する、引張速度を維持するのに必要とされる荷重をグラフにしたものである。
【図１】
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