(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物血漿から血液凝固因子欠乏血漿を製造する方法において、
凝固第Ｖ因子及び凝固第ＶＩＩＩ因子を吸着する機能を有する合成吸着剤またはキレート樹脂とヒトまたは動物血漿とを混合し、前記血漿中の凝固第Ｖ因子及び凝固第ＶＩＩＩ因子を前記合成吸着剤またはキレート樹脂に吸着させる吸着工程、及び
前記吸着工程で得られた混合液から、前記凝固第Ｖ因子及び凝固第ＶＩＩＩ因子を吸着した合成吸着剤またはキレート樹脂を除去する除去工程、
を含む、血液凝固因子欠乏血漿の製造方法。
【請求項２】
前記除去工程で得られた血漿に、ヒトまたは動物由来の凝固第Ｖ因子または凝固第ＶＩＩＩ因子を添加する添加工程をさらに含む請求項１に記載の血液凝固因子欠乏血漿の製造方法。
【請求項３】
前記合成吸着剤またはキレート樹脂を、血漿容量の０．５〜５０Ｗ／Ｖ％で用いることを特徴とする請求項１または２に記載の血液凝固因子欠乏血漿の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の方法によって製造された血液凝固因子測定用の凝固因子欠乏血漿。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１に記載の方法によって製造された血液凝固因子欠乏血漿、及び、正常血漿を含む血液凝固検査の精度管理用血漿。
【請求項６】
請求項４に記載の血液凝固因子測定用凝固因子欠乏血漿を用いることを特徴とする血液凝固因子測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査診断薬の分野でとりわけ血液凝固因子測定用の凝固因子欠乏血漿の製造方法、血液凝固検査用精度管理用血漿の製造方法および血液凝固因子測定試薬に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
血液凝固検査は先天的または後天的な血液凝固異常を検査するため、広く行なわれている。先天的な凝固異常として有名な血友病は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の欠乏によって起こる疾患である。
【０００３】
血液凝固異常の原因を検査するためにはそれぞれの血液凝固因子（以下、単に「凝固因子」という。）を測定する必要がある。凝固因子の測定は各凝固因子欠乏血漿に被検血漿を加えて、凝固時間を測定することにより行なわれている。該凝固因子測定に用いる凝固因子欠乏血漿は、先天的欠乏症のヒトまたは動物の血漿を用いるか、或いは各凝固因子に対する抗体を用いた人工的な免疫吸着法で製造され提供されている。
【０００４】
この、凝固因子欠乏血漿の取得にあたり、先天的欠乏症の患者から血漿を入手することは患者に大きな負担を強いることになるという問題がある。この問題を解決するために考え出されたのが免疫吸着法であるが、免疫吸着法に使用する抗体の調製が非常に困難であったり、大量の抗体を用いて長時間の処理によって調製されるため、欠乏血漿の製造に多大な費用を要し、更に原料血漿そのものが失活するといった問題があった。また因子によっては吸着効率が悪く、欠乏度の高い欠乏血漿が製造できないといった問題もあった。特に第Ｖ因子または第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿を製造するのは困難であった。
【０００５】
【解決しようとする課題】
本発明の課題は、先天的欠乏症の患者血漿を用いることなく、また、免疫吸着法とは異なる手法を用いることにより、迅速に効率良く凝固因子欠乏血漿を製造する方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、原料血漿そのものが失活していない凝固因子欠乏血漿、凝固因子測定用凝固因子欠乏血漿もしくは精度管理用血漿、またはこれらの血漿を含む測定試薬キットを提供することである。
【０００６】
【解決する手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ヒトまたは動物の血漿に、特定の凝固因子を吸着する機能を有する合成ポリマーを混合することにより、該特定の凝固因子が効率よく吸着除去されることを見出した。さらに、かかる手段により得られた凝固因子欠乏血漿を用いることにより、凝固因子測定用凝固因子欠乏血漿もしくは精度管理用血漿を簡単に製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
１．ヒトまたは動物血漿から血液凝固因子欠乏血漿を製造する方法において、
凝固第Ｖ因子及び凝固第ＶＩＩＩ因子を吸着する機能を有する合成吸着剤またはキレート樹脂とヒトまたは動物血漿とを混合し、前記血漿中の凝固第Ｖ因子及び凝固第ＶＩＩＩ因子を前記合成吸着剤またはキレート樹脂に吸着させる吸着工程、及び
前記吸着工程で得られた混合液から、前記凝固第Ｖ因子及び凝固第ＶＩＩＩ因子を吸着した合成吸着剤またはキレート樹脂を除去する除去工程、
を含む、血液凝固因子欠乏血漿の製造方法、
２．前記除去工程で得られた血漿に、ヒトまたは動物由来の凝固第Ｖ因子または凝固第ＶＩＩＩ因子を添加する添加工程をさらに含む前項１に記載の血液凝固因子欠乏血漿の製造方法、
３．前記合成吸着剤またはキレート樹脂を、血漿容量の０．５〜５０Ｗ／Ｖ％で用いることを特徴とする前項１または２に記載の血液凝固因子欠乏血漿の製造方法。
４．前項１〜３のいずれか１に記載の方法によって製造された血液凝固因子測定用の凝固因子欠乏血漿。
５．前項１〜３のいずれか１に記載の方法によって製造された血液凝固因子欠乏血漿、及び、正常血漿を含む血液凝固検査の精度管理用血漿。
６．前項４に記載の血液凝固因子測定用凝固因子欠乏血漿を用いることを特徴とする血液凝固因子測定方法、
からなる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明における特定の凝固因子とは、例えば凝固第Ｖ因子および／または凝固第ＶＩＩＩ因子をいう。原料血漿の活性は、正常人の血漿の凝固因子活性を１００％として、その相対活性で表される。
【０００９】
本発明において、動物血漿中の特定の凝固因子を吸着する機能を有する合成ポリマーとは、該凝固因子を吸着する性質を有するものであればよく、特に限定されないが、好ましくは該凝固因子との関係において合成ポリマーの構造により少なくとも疎水性結合、イオン結合、水素結合またはＶａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅａｌｓ力のいずれか１または２以上の結合能により該凝固因子を吸着する機能を有するポリマーをいい、より好ましくは主として疎水性結合により該凝固因子を吸着する機能を有するポリマーをいう。
【００１０】
ヒトまたは動物血漿中の特定の凝固因子を吸着除去するための合成ポリマーとして、ポリスチレン、ポリジビニルベンゼン、ジビニルベンゼン−スチレン共重合体またはポリアクリル、およびこれらのポリマーの少なくとも一部に置換基を有しているものが例示される。
【００１１】
上記合成ポリマーの例として、ポリスチレンラテックス、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体ラテックス、ダイヤイオン（登録商標）HPシリーズ（HP10,HP20,HP,21,HP30,HP40,HP50）、ダイヤイオン（登録商標）SP800シリーズ（SP800,SP825,SP850,SP875）、ダイヤイオン（登録商標）SP200シリーズ（SP205,SP206,SP207）、ダイヤイオン（登録商標）HPM1G及びHP2MG、アンバーライト（登録商標）XADシリーズ（XAD-2,XAD-4,XAD-16,XAD-2000,XAD-7HP）、ムロキレート（登録商標）、ダウエックス（登録商標）A-1、アンバーライト（登録商標）CGシリーズ（CG50、CG120、CG400）、アンバーライト（登録商標）IRCシリーズ（IRC50,IRC76）、ダイヤイオン（登録商標）CRシリーズ（CR10、CR11、CR20,CRB02）、および合成高分子吸着マット等が挙げられる。
【００１２】
本発明において、ヒトまたは動物血漿中の特定の凝固因子を吸着除去するための合成ポリマーは、全血漿量に対し、好ましくは０．５〜５０Ｗ／Ｖ％、より好ましくは５〜２０Ｗ／Ｖ％で用いられる。
【００１３】
本発明によって製造される凝固因子欠乏血漿は、上記に例示されたポリマーから選ばれた１または２種類以上の合成ポリマーをヒトまたは動物血漿に混合し、該合成ポリマーに該凝固因子を吸着させたのち、ろ過または遠心除去等の方法で該合成ポリマーを除去することにより得られる。
【００１４】
本発明における凝固因子欠乏血漿とは、ヒトまたは動物血漿中の特定の凝固因子の残存率が、吸着前の該凝固因子に対して５％以下、好ましくは１％以下、より好ましくは、０．５％以下となるまで除去された血漿をいう。より具体的には凝固第Ｖ因子および／または凝固第ＶＩＩＩ因子の残存率が吸着前の各凝固因子に対し５％以下、好ましくは１％以下より好ましくは、０．５％以下となるまで除去された血漿をいう。凝固第Ｖ因子欠乏血漿または、凝固第Ｖ因子および凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿は凝固第Ｖ因子の測定に重要であり、凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿は凝固第ＶＩＩＩ因子の測定に重要である。
【００１５】
さらに、本発明は上記凝固因子欠乏血漿による凝固因子測定用試薬または凝固検査の精度管理用血漿をも含む。また、本発明はかかる凝固因子測定用試薬および／または凝固検査の精度管理用血漿を含む凝固因子測定用キットにも及ぶ。
【００１６】
本発明をより具体的に説明するために、以下の実施態様を例に詳細に説明する。
健常人から抗凝固剤として３．８％クエン酸を用いて採血された正常ヒトプール血漿に合成ポリマーであるアンバーライトXAD-2を血漿容量の０．５〜５０Ｗ／Ｖ％、より好適には５〜２０Ｗ／Ｖ％を加え、室温で３０分から３時間撹拌する。この操作により、凝固第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子の欠乏した血漿が調製できる。投入するアンバーライトXAD-2の量と処理時間を調整することにより欠乏度を任意に製造することが可能である。より高い欠乏度を求める場合には、上記の操作を複数回繰り返すことも可能である。
【００１７】
このようにして製造した血漿を凝固因子測定用試薬としての第Ｖ因子欠乏血漿として用いる場合には、調製した血漿をそのまま用いることも可能であるが、さらに適宜緩衝液、安定化剤等を加えて凍結乾燥し、第Ｖ因子欠乏血漿として保存して用いることもできる。
【００１８】
本発明により製造した第Ｖ因子欠乏血漿を用いて被検検体の第Ｖ因子活性を測定するには、第Ｖ因子欠乏血漿および５〜１０倍に生理食塩水または緩衝液で希釈した被検検体を等量混合したものに、プロトンビン時間測定試薬（例えば、市販品トロンボチェックＰＴ、国際試薬株式会社製）を加え、凝固時間を測定することにより行なう。またプロトロンビン時間測定試薬ではなく活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬（例えば、市販品トロンボチェック  ＡＰＴＴ、国際試薬株式会社製）を用いて凝固時間を測定するためには、別途調製、精製したヒトまたは動物由来の凝固第ＶＩＩＩ因子の適当量を本発明により製造した血漿に加えて第Ｖ因子欠乏血漿として利用することも可能である。
【００１９】
本発明により調製した血漿を凝固因子測定用試薬としての第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿として用いる場合には、製造した血漿に、ヒトまたは動物由来の精製第Ｖ因子を適量添加することにより製造できる。製造した第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿はそのまま用いるか、或いは適宜緩衝液、安定化剤等を加えて凍結乾燥し、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿として保存して用いることもできる。
【００２０】
本発明により製造した第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿を用いて被検検体の第ＶＩＩＩ因子活性を測定するには、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿と５〜１０倍に生理食塩水または緩衝液で希釈した被検検体を等量混合したものに、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬（例えば、市販品トロンボチェックＡＰＴＴ、国際試薬株式会社製）を加え、所定時間放置後、２０ｍＭ塩化カルシウム液を加えて凝固時間を測定することにより行なう。
【００２１】
本発明により製造した血漿を精度管理用血漿として用いる場合には、製造した血漿と正常血漿を適当に混合し、所定の凝固時間を示す精度管理用血漿として製造する。製造した血漿は、適宜緩衝液、安定化剤等を加えて凍結乾燥し精度管理用血漿として凝固検査の精度管理に用いることができる。
【００２２】
本発明により製造された凝固因子欠乏血漿または精度管理用血漿を用いて凝固因子測定キットを構成することもできる。
【００２３】
本発明を実施するために用いる合成ポリマーはポリスチレン、ポリジビニルベンゼン、ジビニルベンゼン−スチレン共重合体またはポリアクリル（これらのポリマーの少なくとも一部に置換基または官能基を有していることもある）等の骨格を有する合成ポリマー或いは合成樹脂が例示される。より具体的には、例えば、ポリスチレンラテックス、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体ラテックス、さらにはイオン交換樹脂、キレート樹脂、或いは合成吸着剤に分類される、ダイアイオンHPシリーズ（HP10,HP20,HP,21,HP30,HP40,HP50）、ダイアイオンSP800シリーズ（SP800,SP825,SP850,SP875）、ダイアイオンSP200シリーズ（SP205,SP206,SP207）、ダイアイオンHPM１G及びHP2MG、アンバーライトXADシリーズ（XAD-2,XAD-4,XAD-16,XAD-2000,XAD-7HP）、ムロキレート、ダウエックスA-1、アンバーライトCGシリーズ（CG50、CG120、CG400）アンバーライトIRCシリーズ（IRC50,IRC76）ダイヤイオンCRシリーズ（CR10、CR11、CR20,CRB02）および合成高分子吸着マット等が例示される。本発明を実施するために、例示された合成ポリマーの中から選択して、その１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２４】
上記の合成ポリマー或いは合成樹脂の処理血漿に対する投入量と処理時間及び処理回数は、目標とする因子の欠乏度に応じて適宜設定することができる。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を更に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２６】
【実施例１】
正常ヒトプール血漿１００ｍＬに１０ｇの合成ポリマーであるアンバーライトXAD−２樹脂を混和した。室温で１時間ゆっくりと混合した後、樹脂をろ過で取り除き、血漿の各凝固因子を測定した。樹脂を添加しない正常ヒトプール血漿を同様に操作し対照とした。その結果を表１に示した。
【００２７】
【表１】
0004509341.tif 000002
【００２８】
以上の結果、アンバーライトXAD-2で血漿を処理することにより凝固第Ｖ因子と第ＶＩＩＩ因子が特異的に吸着除去されることが判り、本発明の効果が確かめられた。
【００２９】
【実施例２】
実施例１で製造した吸着処理血漿を用いて、凝固第Ｖ因子欠乏血漿として第Ｖ因子の測定を試みた。対照として、市販の免疫吸着法で調製された凝固第Ｖ因子欠乏血漿（商品名、データーファイ・ファクターＶ、  デードベーリング社製）を用い、本発明の方法と対照で測定された検体の第Ｖ因子活性を比較した。
【００３０】
測定試薬は市販のプロトロンビン時間測定試薬（商品名、トロンボチェックＰＴ、国際試薬株式会社製）を用い、凝固自動測定機器コアグレックス７００（島津製作所製）で測定した。１０例の検体の測定結果を表２に示した。
【００３１】
【表２】
0004509341.tif 000003
【００３２】
以上のように、本発明による第Ｖ因子欠乏血漿と市販の免疫吸着法との測定値の比較において、ほぼ同等の測定値が得られたことから、本発明の方法により調製された第Ｖ因子欠乏血漿は第Ｖ因子測定に有用であることが判り、本発明の有用性が確かめられた。
【００３３】
【実施例３】
実施例１で製造した吸着処理血漿を用いて、凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿を製造した。予め、牛血漿より公知の方法により、牛第Ｖ因子を単離精製した牛第Ｖ因子標品を準備しておき、製造した吸着処理血漿に第Ｖ因子活性が約８０〜１００％となるように牛第Ｖ因子標品を添加し、凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿を製造し、第ＶＩＩＩ因子の測定を試みた。対照として、市販の免疫吸着法で製造された凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（商品名、データーファイ・ファクターＶＩＩＩ、  デードベーリング社製）を用い、本発明の方法と対照で測定された検体の第ＶＩＩＩ因子活性を比較した。
測定試薬は市販の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬（商品名、トロンボチェックＡＰＴＴ、国際試薬株式会社製）を用い、凝固自動測定機器コアグレックス７００（島津製作所製）で測定した。１０例の検体の測定結果を表３に示した。
【００３４】
【表３】
0004509341.tif 000004
【００３５】
以上のように、本発明による第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿と市販の免疫吸着法との測定値の比較において、ほぼ同等の測定値が得られたことから、本発明の方法により製造された第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿は第ＶＩＩＩ因子測定に有用であることが判り、本発明の有用性が確かめられた。
【００３６】
【実施例４】
実施例１で製造した吸着処理血漿に正常プール血漿を３ｖ／ｖ％及び７ｖ／ｖ％を加えそれぞれ精度管理用血漿ＩＩＩ及び精度管理用血漿ＩＩとし、安定化剤を加えて凍結乾燥処理し精度管理用血漿を製造した。その精度管理用血漿のプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定し精度管理用血漿としての有用性を確かめた。その結果を表４に示した。
【００３７】
【表４】
0004509341.tif 000005
【００３８】
以上の結果、正常プール血漿に比べて精度管理用血漿では凝固時間が延長しており、異常値域の精度管理用血漿として有用であることがわかった。さらに、正常血書の添加割合を変化させることにより、凝固時間を任意に設定できるため、目標の凝固時間を示す精度管理用血漿を人工的に製造することも可能である。したがって本発明は精度管理用血漿の製造にも有用であることが判った。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、先天的欠乏症の患者血漿を用いることなく、また、免疫吸着法とは異なる手法を用いることにより、迅速に効率良く凝固因子欠乏血漿の製造方法が提供される。さらに原料血漿そのものが失活していない凝固因子欠乏血漿、凝固因子測定用凝固因子欠乏血漿もしくは精度管理用血漿、またはこれらの血漿を含む測定試薬キットが提供される。