(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５の軽鎖および配列番号６の重鎖を含む、ＧＤ２に特異的に結合し免疫機能を刺激するｈｕ１４．１８−ＩＬ２として示されるヒト化抗体−ＩＬ２融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む配列番号４のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３】
請求項１の融合タンパク質と調剤用担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４】
ＧＤ２陽性であるがん患者における、病気の進行を安定化させるための薬剤の製造のための、請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項５】
ＧＤ２陽性であるがん患者における、ＡＤＣＣおよびＮＫ−分解を増加するための薬剤の製造のための、請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して改変抗体に関する。より詳細には、本発明は、ヒト細胞表面スフィンゴ糖脂質であるＧＤ２に特異的に結合する、免疫原性が減弱されている改変抗体、およびその治療薬としての使用に関する。
【０００２】
(発明の背景)
ここ何年かの間に、抗体をベースにした治療の開発に著しい進歩がある。例えば、試験者は、様々な癌特異的マーカーだけではなく、それらのマーカーに特異的に結合する様々な抗体も同定した。抗体は、選択的に癌細胞を殺す目的で、マーカーを発現する癌細胞に、ある特定の分子、例えば毒素または免疫刺激性部分、例えばサイトカインを送達するのに用いることができる。
【０００３】
１４．１８抗体は、細胞表面スフィンゴ糖脂質であるＧＤ２に対して産生されたマウス由来のモノクローナル抗体である。ＧＤ２は、通常、神経細胞の細胞膜外面のみで、かなりのレベルまで発現されるジシアロガングリオシドであるが、神経細胞では、免疫系への曝露が血液脳関門によって制限されている。
【０００４】
対照的に、多くの腫瘍細胞では、細胞表面にスフィンゴ糖脂質が異常なレベルにまで発現されている。例えば、ＧＤ２は、神経芽細胞腫、髄芽腫、星状細胞腫、黒色腫細胞株、小細胞肺癌、骨肉腫、および他の軟組織肉腫を含めた、広範囲の腫瘍細胞の表面に発現される。したがって、ＧＤ２は、腫瘍細胞に対して効果的な免疫応答を引き起こし、腫瘍細胞を破壊する目的で、腫瘍細胞を免疫刺激性タンパク質ドメインの標的にするための好都合な腫瘍特異的マーカーである。１４．１８マウス抗体(ｍ１４．１８抗体）は、腫瘍細胞をこれらの免疫刺激性タンパク質ドメインの標的にする補助となり得るが、マウス由来のアミノ酸配列によって所望の治療効果が損なわれることがある。
【０００５】
患者に投与した際、抗体は、宿主哺乳動物内で付随免疫原性(associated immunogenicity)を有することがある。これは、抗体が自家抗体ではないときには、一層起こりやすくなる。この結果、抗体をベースにした治療の有効性が治療抗体に対する免疫原性反応によって制限されることがしばしばある。通常、この免疫原性反応は、その抗体の全部または一部が宿主哺乳動物とは異なる哺乳動物に由来する場合、例えばその抗体がマウスに由来し、かつ受容者がヒトである場合に増強される。
【０００６】
ヒトにおける臨床使用では、マウス由来の抗体の免疫原性を減弱させるか、または最小にするために、マウス由来の抗体をヒト抗体により類似するように改変することが有用であり得る。マウス由来の抗体が有する免疫原性は、ヒト抗体の定常部がマウス可変ドメインに融合したキメラ抗体を生成することで減弱させることができる。しかし、残存しているマウス可変ドメインは、通常、依然としてヒトでの免疫原性を有し、したがって、抗体をベースにした治療の有効性を損ない得るものである。
【０００７】
「ベニアリング(veneering)」および「ヒト化」など、免疫原性を減弱させる一部のアプローチでは、多数のアミノ酸置換の導入が行われ、抗原に対する抗体の結合が破壊されることがある。ｍ１４．１８抗体は、ＧＤ２に中程度の親和性で結合する。したがって、ｍ１４．１８の、ＧＤ２に対する親和性を有意に低下させる変異は、ヒトを治療する目的におけるこの抗体の有効性を低下させることが予想される。したがって、当技術分野では、ＧＤ２を効果的に標的にすることができ、かつ、ヒトに投与した際の免疫原性が減弱されている治療抗体が必要とされている。
【０００８】
(発明の概要)
概括すれば、本発明は、ヒトにおける免疫原性が減弱されているが、ｍ１４．１８が有するヒトＧＤ２に対する結合親和力をなお保持している改変型ｍ１４．１８抗体を提供するものである。
【０００９】
より詳細には、本発明は、ヒトにおける免疫原性を減弱させるために、１つまたは複数のフレームワーク領域にあるいくつかのマウス特異的アミノ酸を、別のアミノ酸で置換したヒト化型ｍ１４．１８抗体(ｈｕｌ４．１８抗体）を提供する。本発明は、ターゲット免疫療法の効果を増強させるために、１つまたは複数の非免疫グロブリン部分と連結させたｈｕ１４．１８抗体の融合タンパク質も提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域(ＶL領域)を定義する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含めた抗体可変領域を提供する。別の態様では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＶH領域）を定義する配列番号２に記載のアミノ酸配列を含めた抗体可変領域に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列および配列番号２に記載のアミノ酸配列が連結した抗体可変領域を提供する。これらのアミノ酸配列は、ジスルフィド結合またはペプチド結合などによって連結することができる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、少なくとも配列番号１のアミノ酸１〜23、配列番号２のアミノ酸１〜25、または配列番号２のアミノ酸67〜98を含む、ＧＤ２に特異的に結合する抗体可変領域に関する。これらの配列は、ｈｕ１４．１８抗体の免疫グロブリン可変領域中のフレームワーク領域を定義する。フレームワーク領域に関しては、以下により詳細に記載する。
【００１２】
本発明の一態様は、表面にＧＤ２を有する細胞を標的にする方法であって、本発明の抗体可変領域を患者に投与することを含む方法に関する。一実施形態では、標的細胞が腫瘍細胞である。本発明のさらに別の態様は、上記抗体可変領域をコードする核酸、またはこの核酸を含有する細胞を含むが、これらのうちいずれを患者に投与することも、また、生体外タンパク質生産に使用することもできる。
【００１３】
本発明は、本発明の抗体可変領域と、少なくともＣＨ２ドメイン１つを含むＦｃ部分とを含むポリペプチド、上記ポリペプチドをコードする核酸、上記核酸を含む細胞、ならびに、上記ポリペプチド、上記核酸、または上記細胞を患者に投与することによって、表面にＧＤ２を有する細胞を標的にする方法を提供する。本発明のある実施形態では、上記Ｆｃ部分がＩｇＧ１に由来する。
【００１４】
上記抗体可変領域は、Ｆｃ部分を介して、またはＦｃ部分の介在なしで非免疫グロブリン部分に連結することができる。具体的には、上記非免疫グロブリン部分は、インターロイキン、造血因子、リンフォカイン、インターフェロン、またはケモカインなどのサイトカインであり得る。上記インターロイキンは、例えば、インターロイキン−２またはインターロイキン−12であり得る。上記造血因子および上記リンフォカインは、例えばそれぞれ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)およびリンフォトキシンであり得る。上記インターフェロンは、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、またはインターフェロンγであり得る。本発明のある実施形態では、上記融合タンパク質が第２のサイトカインなどの第２の非免疫グロブリン部分を含む。特定の一実施例では、上記融合タンパク質が上記抗体可変領域、ＩＬ−２、およびＩＬ−12を含む。
【００１５】
本明細書に記載された様々な実施形態の諸特徴は、相互に排他的なものではなく、様々な組合せおよび順列で存在し得ることを理解されたい。
【００１６】
(図面の説明)
図１Ａは、本発明による免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００１７】
図１Ｂは、本発明による免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００１８】
図２Ａ〜Ｄは、本発明による、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖−ＩＬ−２融合タンパク質をコードする核酸構築体を含む発現ベクターのヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
図３Ａは、本発明による免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【００２０】
図３Ｂは、本発明による免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
(発明の詳細な説明)
本発明は、ヒトでの免疫原性が減弱されているが、依然としてヒトＧＤ２に特異的に結合することができる改変型ｍ１４．１８抗体を提供する。免疫原性の減弱は、免疫グロブリン可変ドメインにおける、１つまたは複数のアミノ酸配列の改変によって提供される。この抗体は、特にサイトカインまたは他の免疫変調因子に融合された場合に、ＧＤ２陽性腫瘍を治療するのに有用である。
【００２２】
本明細書において、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、(i)完全な抗体(例えば、モノクローナル抗体またはポリクロナール抗体)、(ii)例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、(Ｆａｂ')2フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体結合部位、およびｓＦｖを含めた、その抗原結合性部分、(iii)二重特異性抗体およびその抗原結合性部分、ならびに(iv)多重特異性抗体およびその抗原結合性部分を意味すると理解される。
【００２３】
本明細書において、「特異的に結合する」および「特異的な結合」という用語は、その抗体が特定の抗原に対して少なくとも約１０6Ｍ-1、より好ましくは少なくとも約１０7Ｍ-1、より好ましくは少なくともおよそ１０8Ｍ-1、そして最も好ましくは少なくとも約１０10Ｍ-1の結合親和性を有することを意味すると理解される。
【００２４】
本明細書において、「フレームワーク領域」および「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン可変領域における、相補性決定領域(ＣＤＲ)に隣接した領域を意味すると理解される。ＣＤＲは、免疫グロブリン可変領域における、主として抗原と相互作用する部分である。図１に示すように、ＶH領域およびＶL領域は、両方とも４つのＦＲを含有し、これらは、アミノ酸配列中の四角で囲まれた部分に位置している。
【００２５】
詳細には、軽鎖ＦＲは、図１Ａ(配列番号１)に示すアミノ酸配列を参照して、Ａｓｐ１からＣｙｓ２３まで(ｈｕＶLＦＲ１)、Ｈｉｓ３９からＨｉｓ５４まで(ｈｕＶLＦＲ２)、Ｇｌｙ６２からＣｙｓ９３まで(ｈｕＶLＦＲ３)、そしてＰｈｅ１０４からＬｙｓ１１３まで(ｈｕＶLＦＲ４)のアミノ酸配列によって定義される。重鎖ＦＲは、図１Ｂ(配列番号２)に示すアミノ酸配列を参照して、Ｇｌｕ１からＳｅｒ２５(ｈｕＶHＦＲ１)まで、Ｔｒｐ３６からＧ１ｙ４９まで(ｈｕＶHＦＲ２)、Ａｒｇ６７からＳｅｒ９８まで(ｈｕＶHＦＲ３)、そしてＴｒｐ１０３からＳｅｒ１１３まで(ｈｕＶHＦＲ４)のアミノ酸配列によって定義される。
【００２６】
本発明のタンパク質配列
本発明は、ヒト細胞表面スフィンゴ糖脂質ＧＤ２に、好ましくは特異的に、結合する抗体であって、ｍ１４．１８抗体に由来する改変領域を有する抗体を主題とする。ＶHまたはＶLアミノ酸配列(あるいはこれら両方)は、ヒトに投与された際の免疫原性を減弱させるために、改変またはヒト化されている。本発明によれば、例えば、deimmunization法を用いることで、ｍ１４．１８抗体をヒト化することができる。この方法では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチドエピトープの結合を減弱させる変異を導入することよって、潜在的なＴ細胞エピトープの除去または減弱を行う(例えば国際公開第WO98/52976号および第WO00/34317号を参照)。別法では、非ヒトＴ細胞エピトープに変異を導入し、それらがヒト抗体内に存在するヒト自己エピトープに相当するようにする(例えば米国特許第5712120号を参照）。本発明は、少なくとも１つのヒト化されたＦＲ配列を含み、それによって、ヒトに投与された際の免疫原性が減弱されているＶL領域およびＶH領域を有するＧＤ２抗体を提供する。
【００２７】
I．重鎖および軽鎖可変部
上述のように、ｈｕ１４．１８は、ｍ１４．１８抗体に由来するヒト化された可変部であって、ヒトＧＤ２抗原に対する特異的結合性を保持する可変部を含む。本発明のある実施形態では、ｈｕ１４．１８抗体のＶL領域は、次のポリペプチドを含む。
【００２８】
【化１】
0004494977.tif 000002
【００２９】
特定の実施形態では、ｈｕ１４．１８抗体は、配列番号１の残基１〜２３、すなわち、Ｄ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｔ−Ｑ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ｔ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｉ−Ｓ−Ｃ(ｈｕＶLＦＲ１）によって定義される軽鎖ＦＲ１を含む。
【００３０】
本発明の他の実施形態では、ｈｕ１４．１８抗体のＶH領域は、次のポリペプチドを含む。
【００３１】
【化２】
0004494977.tif 000003
【００３２】
特定の実施形態では、ｈｕ１４．１８抗体は、配列番号２の残基１〜２５、すなわち、Ｅ−Ｖ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｖ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ａ−Ｓ(ｈｕＶHＦＲ１)によって定義される重鎖ＦＲ１を含む。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態では、ｈｕ１４．１８抗体は、配列番号２の残基６７〜９８、すなわち、Ｒ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｄ−Ｋ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｅ−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ｖ−Ｓ(ｈｕＶHＦＲ３)によって表される重鎖ＦＲ３を含む。
【００３４】
以上の実施形態の様々な組合せも、本発明の範囲内にある。例えば、ｈｕ１４．１８抗体は、配列番号１に記載のＶL配列と、配列番号２に記載のＶH配列とを含んでもよい。これらのＶL領域およびＶH領域は、それらの核酸配列がどのように構築されるかに応じて、ジスルフィド結合またはペプチド結合で連結することができる。通常、Ｖ領域は、それらの配列が別々のＤＮＡ構築体でコードされる場合には、ジスルフィド結合によって連結される。これに対して、Ｖ領域は、それらの配列が一本鎖ＤＮＡ構築体でコードされる場合には、通常、ペプチド結合によって連結される。
【００３５】
本発明は、ＧＤ２に特異的に結合する抗体であって、ヒト化されたＶ領域の少なくとも一部を含む抗体も企図する。例えば、ｈｕ１４．１８抗体は、配列番号１によって定義されるＶL領域と、ｈｕＶHＦＲ１およびｈｕＶHＦＲ２などのヒト化したＦＲを少なくとも１つ有するＶH領域とを含むことができる。別法として、本発明の抗体は、配列番号２によって定義されるＶH領域と、ｈｕＶLＦＲ１などのヒト化したＦＲを少なくとも１つ有するＶL領域とを含むことができる。ｈｕ１４．１８抗体は、少なくとも１つのヒト化したＦＲを含むＶH領域、および／または、少なくとも１つのヒト化したＦＲを含むＶL領域を含むこともできる。
【００３６】
本発明の特定の実施形態では、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、それぞれ、免疫グロブリンの軽鎖定常領域および重鎖定常領域に結合させることができる。免疫グロブリン軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖と名付けられた定常領域を有する。本発明の特定の実施形態では、軽鎖定常領域がカッパ鎖である。重鎖定常領域と、その様々な改変および組合せとに関しては、以下に詳細に論ずる。
【００３７】
II．Ｆｃ部分
本発明の抗体可変領域は、任意選択でＦｃ部分に融合される。本明細書において、Ｆｃ部分は、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域に由来するドメインを包含するものであり、これには上記定常領域のフラグメント、類似体、変種、変異体、または誘導体も含まれる。免疫グロブリン重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、および、重鎖のクラスによってはＣＨ４ドメインを含めた、重鎖Ｃ末端領域の少なくとも一部に相同性を有する天然存在のポリペプチド、または合成によって生成されたポリペプチドと定義される。「ヒンジ」領域は、ＣＨ１ドメインをＦｃ部分のＣＨ２−ＣＨ３領域に連結する。全哺乳動物の免疫グロブリン重鎖定常領域は、アミノ酸配列における広範な相同性を示す。これら免疫グロブリン領域のＤＮＡ塩基配列は当技術分野で周知である(例えば、Gilliesら(1989年)、J.Immunol.Meth.第125巻、191頁参照)。
【００３８】
本発明において、Ｆｃ部分は、通常、少なくともＣＨ２ドメインを含む。例えば、Ｆｃ部分は、免疫グロブリン重鎖定常領域全体(ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含むことができる。別法として、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの全部または一部を含むことができる。
【００３９】
免疫グロブリンの定常領域は、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)結合および補体結合を含めた、多くの重要な抗体エフェクター機能を担っている。重鎖定常領域には、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭと分類される５つの主要なクラスがあり、それぞれがイソタイプによって指定される独特のエフェクター機能を有する。
【００４０】
例えば、ＩｇＧは、４種のγイソタイプ、すなわちγ１、γ２、γ３、およびγ４に分かれており、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４としても知られている。ＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的な３クラスのＦｃγ受容体(ＦｃγＲ）、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを含めた複数のクラスの細胞受容体と相互作用できる。ＩｇＧがＦｃγＲ受容体に結合するのに重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインにあると報告されている。
【００４１】
抗体の血清中半減期は、その抗体がＦｃ受容体(ＦｃＲ)に結合する能力に影響される。同様に、免疫グロブリン融合タンパク質の血清中半減期も、これらの受容体に結合する能力の欠如に影響を受ける(Gilliesら、Cancer Research(1999年)、第59巻、2159〜66頁)。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１におけるそれらのドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が検出不可能であるか、または減弱している。したがって、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４イソタイプに由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを用いることによって、主題の抗体の血清中半減期を延長することができる。別法として、抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を減少させるために、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３由来の、ドメイン内に１つまたは複数のアミノ酸の改変を有するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含み得る(例えば、米国特許出願公開第2003-0105294-A1号として公開された米国特許出願第09/256156号を参照)。
【００４２】
Ｆｃ部分のヒンジ領域は、重鎖定常領域ＣＨ１ドメインのＣ末端に隣接している。ヒンジは、本発明のタンパク質に含まれる場合、天然に存在する免疫グロブリン領域に相同であり、通常、天然の免疫グロブリンと同様に、ジスルフィド結合を介して２本の重鎖を連結するシステイン残基を含む。ヒト免疫グロブリンおよびマウス免疫グロブリンにおけるヒンジ領域の代表的な配列は、ANTIBODY ENGINEERING, a PRACTICAL GUIDE、(Borrebaeck編集、W.H.Freeman and Co.、1992年)に見いだすことができる。
【００４３】
本発明に適したヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、および他の免疫グロブリンイソタイプに由来することができる。ＩｇＧ１イソタイプは、ヒンジ領域に２対のジスルフィド結合を有し、効果的かつ定常的なジスルフィド結合形成が可能となっている。したがって、本発明の好ましいヒンジ領域は、ＩｇＧ１に由来するものである。任意選択で、ＩｇＧ１ヒンジにおける最初の、最もＮ末端にあるシステインに変異を導入し、本発明の抗体または抗体融合タンパク質の発現および構築を促進する(例えば、米国特許出願公開第2003-0044423-A1号として公開された米国特許出願第10/093958号を参照)。
【００４４】
ＩｇＧ１とは対照的に、ＩｇＧ４のヒンジ領域は鎖間ジスルフィド結合の形成効率が悪いことが知られている(Angalら(1993年)、Mol.Immunol.第30巻、105〜8頁)。また、ＩｇＧ２ヒンジ領域は、組換え型システムでの分泌中に、オリゴマー形成と、場合によっては不正確なジスルフィドとを促進する傾向にある４対のジスルフィド結合を有す。本発明に適したヒンジ領域の１つは、重鎖由来部分相互の正しいジスルフィド結合形成を促進する変異を優先的に含有するＩｇＧ４ヒンジ領域から得ることもできる(Angalら(1993年)、Mol.Immunol.第30巻(1)、105〜8頁)。別の好ましいヒンジ領域は、最初の２つのシステインがそれぞれ別のアミノ酸、すなわち、一般的な優先度の順で、セリン、アラニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはセレノシステインなどに変異しているＩｇＧ２ヒンジに由来するものである(例えば、米国特許出願公開第2003-0044423-A1号を参照)。
【００４５】
本発明の抗体可変領域に融合したＦｃ部分は、異なった抗体イソタイプに由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域を含有し得る。例えばＦｃ部分は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインと、ＩｇＧ１のヒンジ領域とを含有し得る。そのようなハイブリッドＦｃ部分の構築は、米国特許出願公開第2003-0044423-A1号に記載されている。
【００４６】
Ｆｃ部分は、本発明の抗体可変領域に融合される場合、Ｆｃ融合タンパク質の血清中半減期を通常延長する１つまたは複数のアミノ酸改変を含有することが好ましい。そのようなアミノ酸改変には、Ｆｃ受容体結合性または相補体固定活性を、実質上、低減または除去する変異が含まれる。例えば、そのような変異の１タイプは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分におけるグリコシル化部位を除去する。ＩｇＧ１では、グリコシル化部位はＡｓｎ２９７である(例えば、米国特許出願公開第2003-0166163-A1号として公開された米国特許出願第10/310719号を参照)。
【００４７】
III．融合接合領域
本発明の抗体可変領域は、任意選択で、非免疫グロブリン部分に直接的に、または、リンカーペプチド(例えば、(Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ)3(配列番号３))を介して間接的に連結または融合させることができる。開示された融合タンパク質の免疫原性は、米国特許出願公開第2003-0166877-A1号に記載されるように、融合接合部または接合部エピトープの、Ｔ細胞受容体と相互作用する能力を損なうことによって減弱させることができる。２つのヒトタンパク質、例えば、ヒトＦｃおよびヒトＩＬ−２の間の融合においてさえ、融合接合部または接合部エピトープ周囲の領域は、通常はヒト体内に存在しないペプチド配列、したがって、免疫原性であり得るペプチド配列を含有する。例えば、接合部エピトープの免疫原性は、融合接合部近傍に１つまたは複数のグリコシル化部位を導入することによって、または、米国特許出願公開第2003-0166877-A1号に記載にされるように、接合部にまたがるＴ細胞エピトープ候補を同定し、接合部近傍のアミノ酸を改変してＴ細胞エピトープ候補の、Ｔ細胞受容体と相互作用する能力を低減させることによって、減弱させることができる。
【００４８】
タンパク質の血清中半減期は、融合接合領域に変異を導入することで延長することもできる。例えば、非免疫グロブリン部分に融合したＣＨ３ドメインを含むタンパク質中では、ＣＨ３ドメインのＣ末端リジンをアラニンなどの別のアミノ酸に改変することができ、これにより、結果として得られた融合タンパク質における血清中半減期の実質的な増加が提供され得る。
【００４９】
特定の実施形態では、融合接合部におけるタンパク質分解性切断が望ましい。したがって、遺伝子間領域は、タンパク質分解性切断部位をコードするヌクレオチド配列を含み得る。免疫グロブリンとサイトカインとの間に挿入されるこの部位は、標的部位におけるタンパク分解によってサイトカインの放出が提供されるように設計することができる。例えば、プラスミンおよびトリプシンが、これらのプロテアーゼの接近可能な部位におけるリジン残基およびアルギニン残基の後で切断を行うことが周知である。他の部位特異的エンドプロテアーゼおよびそれらが認識するアミノ酸配列も周知である。
【００５０】
IV．ｈｕ１４．１８抗体融合タンパク質を用いたヒト疾患の治療
本発明の抗体可変領域は、診断用薬および／または治療薬に結合させることができる。これら薬剤を抗体に融合させて、融合タンパク質を生成することができる。別法として、これらの薬剤を抗体に化学的に結合させて、免疫複合体を生成することもできる。このような薬剤は、例えば、毒素、放射性標識、イメージング剤、免疫活性化部分、または同様のものであり得る。
【００５１】
本発明の抗体可変領域をサイトカインに結合することができる。好ましいサイトカインには、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−10、ＩＬ−12、ＩＬ−13、ＩＬ−14、ＩＬ−15、ＩＬ−16、およびＩＬ−18などのインターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、およびエリスロポエチンなどの造血因子、ＴＮＦなどの腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、リンフォトキシンなどのリンフォカイン、レプチンなどの代謝過程調節因子、ならびに、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、およびケモカインなどのインターフェロンが含まれる。抗体−サイトカイン融合タンパク質または免疫複合体は、サイトカイン生物活性を示すことが好ましい。一実施形態では、抗体可変領域はＩＬ−２に融合する。米国特許出願公開第2003-0166163-A1号に記載されるように、毒性を減少させるために、ＩＬ−２部分内の数個のアミノ酸を変異させることが好ましい。
【００５２】
例えば、図３Ａおよび３Ｂは、本発明による抗体融合タンパク質の、特定の実施形態におけるアミノ酸配列を示す。具体的には、図３Ａは、可変領域および定常領域を含むヒト化された免疫グロブリン軽鎖のペプチド配列を示す。図３Ｂは、ＩＬ−２に連結されたヒト化された免疫グロブリン重鎖のペプチド配列を示す。これらのポリペプチドは、ＧＤ２に特異的に結合して、免疫系を刺激することができるヒト化された抗体融合タンパク質を提供する。
【００５３】
任意選択で、タンパク質複合体は、第２のサイトカインなどの第２の薬剤をさらに含み得る。一実施形態では、ｈｕ１４．１８抗体融合タンパク質はＩＬ−12およびＩＬ−２を含む。免疫グロブリンドメインおよび２つの異なったサイトカインを含有するタンパク質複合体の構築に関する詳細が米国特許第6617135号に記載されている。
【００５４】
本発明の融合タンパク質は、癌などのヒト疾患の治療に有用である。ヒト腫瘍を治療する際には、本発明のＶ領域を含む抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を、0.1から100ミリグラム/メーター2/患者の用量を用いて、注入または皮下注射で投与するのが特に有用である。好ましい実施形態では、本発明のＶ領域を含む抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を、１から10ミリグラム/メーター2/患者の用量を用いて、より好ましくは約３から６ミリグラム/メーター2/患者の用量を用いて、注入または皮下注射で投与するのが特に有用である。
【００５５】
ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２は、この融合タンパク質の投与後も、ＩＬ−２受容体を介してＩＬ−２反応性細胞を活性化する能力を保持し、また、ＧＤ２陽性腫瘍細胞に結合して、ＩＬ−２をそれらの表面に送達する能力も保持していることが臨床試験によって示されている。さらに、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質を癌患者に投与したところ、驚くほど多数の患者で疾病進行の安定化がもたらされた(実施例１を参照）。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、例えば、丸薬、カプセル、粉末薬、液体、懸濁液、またはこれらに同様のものなど、固形、半固体、または液体剤形の形態で、好ましくは正確な用量の投与に適した単位剤形で使用され得る。この組成物は、従来の調剤用担体または賦形剤を含み、さらに、他の医薬品、薬剤、担体、アジュバントなどを含み得る。そのような賦形剤には、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿タンパク質などの他のタンパク質も含まれ得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、公知であるか、または当業者にとって自明なものであろう。投与される組成物または製剤は、いずれの場合でも、治療される対象において期待される効果を発揮するための有効量となる活性成分量を含有しているだろう。
【００５７】
本発明の組成物の投与は、そのような活性を示す薬剤に是認されている投与方法のいずれを介して行うこともできる。そのような方法には、経口投与、非経口投与、または局所投与、および他の方法による全身性の形態が含まれる。薬学的に許容される担体中での静脈内注入は、好ましい投与方法である(実施例１を参照）。
【００５８】
投与される有効化合物の量は、当然ながら、治療される対象、病気の重篤度、投与方法、および処方を行う医師の判断に依存するだろう。
【００５９】
本発明の核酸
Ｉ．ｈｕ１４．１８抗体構築体
本発明は、上記タイプのタンパク質それぞれを発現することができる核酸も主題とする。これらには、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列；配列番号２に記載のアミノ酸配列；ｈｕＶLＦＲ１アミノ酸配列を含むｈｕ１４．１８抗体ＶL領域；ｈｕＶHＦＲ１アミノ酸配列を含むｈｕ１４．１８抗体ＶH領域；ｈｕＶHＦＲ３アミノ酸配列を含むｈｕ１４．１８抗体ＶH領域；ならびに上記のヒト化されたＦＲ配列を少なくとも１つを含むｈｕ１４．１８抗体と、１つまたは複数の治療薬とを含む融合タンパク質をコードする核酸が含まれる。
【００６０】
本発明のｈｕ１４．１８抗体は、遺伝子工学技法によって、すなわち、本発明の望ましいＦＲを含有するＧＤ２特異的抗体をコードする核酸構築体を構築することによって生成できる。一実施形態では、主題の抗体をコードする遺伝子構築体は、５'から３'の方向に、少なくとも１つのヒト化されたＦＲをその中に含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、重鎖定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む。別の実施形態では、サイトカインをコードする別のＤＮＡセグメントが重鎖定常領域をコードするＤＮＡセグメントの３'末端に融合している。異なった実施形態では、この遺伝子構築体は、５'から３'の方向に、少なくとも１つのヒト化されたＦＲを含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、サイトカインをコードするＤＮＡセグメントとを含む。別法として、本発明の核酸は、５'から３'の方向に、少なくとも１つのヒト化されたＦＲをその中に含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、サイトカインをコードするＤＮＡセグメントとを含み得る。ある実施形態では、サイトカインをコードする核酸が定常領域をコードする遺伝子(例えば、ＣＨ３エキソン)の３'末端に、直接的にまたは遺伝子間領域を介して(例えば、(Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ)3(配列番号３)をコードするＤＮＡなどの適切なリンカーによって)、インフレームに連結される。
【００６１】
II．ｈｕ１４．１８抗体構築体の発現
本発明のタンパク質をコードする核酸は、それが発現される適切な受容細胞内に導入するために、１つまたは複数の発現ベクターに構築または挿入することができる。発現ベクターへの核酸の導入は、標準的な分子生物学技法で実行できる。好ましい発現ベクターには、コードされているタンパク質を細菌または哺乳類のいずれかの細胞内で、それから発現できるベクターが含まれる。
【００６２】
本発明によれば、抗体可変領域の重鎖は、対応する軽鎖と同じ細胞で同時発現されることが好ましい。複数のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質には、複数の発現ベクターを用いることができる。例えば２つの発現ベクターを用いた同時形質移入法では、両方のベクターが１つの標的細胞に送達されることが頻繁にある。別法として、同一細胞内での同時発現を行うのに、複数のポリペプチドをコードする単一ベクターを用いるのが有用であるときもある。
【００６３】
例えば、図２Ａ〜Ｄは、本発明による免疫グロブリンの重鎖および軽鎖両方をコードする単一ベクターの核酸配列を示す。このベクターは、免疫グロブリン重鎖の３'末端に融合したＩＬ−２をコードする核酸も含む。したがって、細胞に導入された際、このベクターのみで、ＧＤ２に特異的に結合して免疫機能を刺激するヒト化抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を提供することができる。
【００６４】
さらに、本発明のタンパク質は、一本鎖分子として発現するのが好都合である場合もある。例えば、抗体可変領域は、一本鎖抗体またはｓＦｙとして、任意選択で非免疫グロブリンタンパク質と融合させて、発現させることができる。別の実施形態では、重鎖(サイトカインの融合有り、または無し)を対応する軽鎖(または重鎖)(サイトカインの融合有り、または無し)に結合して、１価および２価の免疫複合体を形成させる。
【００６５】
受容細胞系は、骨髄腫(または、ハイブリドーマ)などのリンパ系細胞が好ましい。骨髄腫は、形質移入された遺伝子によってコードされた免疫グロブリンを、合成、構築、および分泌することができ、かつ、タンパク質をグリコシル化することもできる。特に好ましい受容細胞はＳｐ２/０骨髄腫である。Ｓｐ２/０骨髄腫は、通常、内在性免疫グロブリンの生成を行わない。この細胞は、形質移入された場合には、形質移入された遺伝子構築体によってコードされた免疫グロブリンのみを生成するだろう。形質移入された骨髄腫は、培養またはマウスの腹膜で増殖させることができる。マウスの腹膜では、分泌された免疫複合体を腹水液から回収することができる。Ｂリンパ球などの他のリンパ球系細胞も受容細胞として用いることができる。
【００６６】
キメラＩｇ鎖をコードする核酸構築体を含有するベクターでリンパ系細胞に形質移入を行う方法がいくつかある。リンパ系細胞にベクターを導入する好ましい方法は、スフェロプラスト融合によるものである(例えば、Gilliesら(1989年)、Biotechnol 第７巻、798〜804頁)。別法には、エレクトロポレーション法またはリン酸カルシウム沈殿法が含まれる。免疫複合体を生成する他の有用な方法には、上記構築体をコードするＲＮＡ配列を調製して、それを適切な生体内または生体外システムで翻訳することが含まれる。一度発現されれば、標準的なタンパク質精製方法で本発明のタンパク質を収集することができる(例えば、米国特許第5650150号参照)。
【００６７】
III．遺伝子療法による癌の治療
本発明の核酸は、癌と、特定の細胞型を免疫系の標的にすることが望ましい他の疾患とを治療するための遺伝子療法薬として用いることができる。例えば、ヒトまたは動物から細胞を取り出すことが可能であり、それらの細胞内に本発明の抗体をコードする１つまたは複数の核酸を形質移入することができる。細胞は、その後ヒトまたは動物に再導入される。形質移入される細胞は、正常細胞であることも、癌細胞であることもある。別法として、核酸は生体内原位置(in situ)で細胞内に導入することもできる。ヒトまたは動物は、その後、癌細胞に対して免疫応答を引き起こし、それによって、癌が治癒されるか、またはその重篤度が軽減され得る。本発明の抗体可変領域は、哺乳類細胞内で発現を促進する適切な調節エレメントに結合され、リン酸カルシウム、「遺伝子銃」、アデノウイルスベクター、カチオン性リポソーム、レトロウイルスベクター、または他のいかなる効率的形質移入法も含めた様々な技法のいずれによっても細胞内に形質移入することができる。
【００６８】
本発明の特定の実施形態では、ｈｕ１４．１８抗体は、局所炎症反応、Ｔ細胞増殖および活性化の刺激、またはＡＤＣＣ活性などの局在化された生物学作用をサイトカインが及ぼすことができるように、生体内でサイトカインを選択的に標的細胞に送達するのに用いられる。この抗体の治療有効量が、標的細胞を内部に有する対象の循環系に投与される。
【００６９】
本発明を、非限定実施例によってさらに例証する。
【００７０】
実施例
実施例１
ｈｕ１４．１８−ＩＬ２の精製および製剤
１つの試験では、ｈｕ１４．１８−ＩＬ２をＮＳ／０細胞から発現させ、組織培養上清を収集し、Ａｂｘ混合樹脂カラムクロマトグラフィー、組換え型プロテインＡクロマトグラフィー、およびＱセファロースカラムクロマトグラフィーを順序通りに用いてｈｕ１４．１８−ＩＬ２タンパク質を精製し、続いてペリコン２接線流ダイアフィルトレーションで製剤緩衝液に緩衝液交換を行った。これらの精製ステップの詳細を以下に記載する。ウイルス不活性化ステップおよび排除ステップは、以下に記載するように、これらのステップの間に組み入れた。ウイルス不活性化ステップおよび排除ステップは、精製それ自体には必要なかったが、規定の要件を満たすために用いられた。
【００７１】
ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２を含有するＮＳ／０組織培養上清２リットルを１Ｍ 酢酸でｐＨ5.9に調整し、Ａｂｘカラム(J.T.Baker社)にかけ；10ｍＭ ＭＥＳ、100ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ6.2で洗浄し；500ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ７で溶出した。この物質を組換え型プロテインＡカラム(Pharmacia社)に添加し；100ｍＭリン酸ナトリウム、150ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７で洗浄し；100ｍＭリン酸ナトリウム、150ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６で洗浄し；10ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７で洗浄し；100ｍＭリン酸ナトリウム、150ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ3.5で溶出した。溶出した物質のｐＨは4.2であった。ウイルス不活性化を促進するために、このｐＨを3.8まで低下させ、試料を30分間インキュベートし、その後、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７に中和した。核酸を除去するために、この物質をＱセファロースカラム(Pharmacia社)に添加し、100ｍＭリン酸ナトリウム、150ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７で洗浄した。核酸はカラムに結合し、一方、タンパク質は、フロースルーおよび洗浄液中に見られた。Ａ２８０がベースラインに戻るまで、これを反復した。ｈｕ１４．１８−ＩＬ２の最終物質が以下の製剤中に含まれるように、ペリコン２ダイアフィルトレーション(Millipore社)をメーカーの指示に従って行った。
１．マンニトール  ４％
２．塩酸アルギニンＵＳＰ／ＮＦ  １００ｍＭ
３．クエン酸ＵＳＰ−ＦＣＣ    ５ｍＭ
４．ポリソルベート８０      ０．０１％（ｗ．ｖ）
製剤緩衝液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで７に調整した。
【００７２】
最終ステップとして、この製剤を、180000ダルトンの分子量カットオフを有するViresolve(登録商標)180膜(Millipore社)を通して濾過した。これには、この物質を「ポリッシュ」する効果があり、その結果、凝集した二量体および高次オリゴマーが除去された。
【００７３】
実施例２
第Ｉ相臨床試験で観測されたｈｕ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質の抗腫瘍活性
ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２の安全および有効性を評価するために、第Ｉ相臨床試験を行った。適格患者は、外科的および医学的に不治であると考えられメラノーマを有することが組織学的に確認されていた。これらの患者は測定可能または評価可能な転移性疾患を有してもよく、また、遠隔転移または領域再発疾患の外科切除後に疾患の証跡が無くてもよかった。複数(２つ以上)の局所または領域再発を伴う患者は、患者にリンパ節関与の以前の証跡があり、かつ各再発が少なくとも２カ月までの期間内に分離された場合にのみ含まれた。すべての患者は、適切な骨髄機能(総白血球(ＷＢＣ)＞3500/ｍｌ、または総顆粒球＞2000/ｍｌ、血小板＞100000/ｍｌ、およびヘモグロビン＞10.0ｇ/ｄｌで定義する)、適切な肝機能[アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)＜３ｘ正常値、および総ビリルビン＜2.0ｍｇ/ｄｌで定義する]、および適切な腎臓機能(血清クレアチニン＜2.0ｍｇ/ｄｌ、またはクレアチニンクリアランス＞60ｍｌ/分間で定義する)を有する必要があった。すべての患者は、皮質脳波検査(ＥＣＯＧ)パフォーマンスステータスが０または１であり、少なくとも12週間の平均余命があった。試験前４週間以内に事前に化学療法、放射線治療、または他の免疫抑制療法を受けた患者は除外した。患者は、試験を開始する前に少なくとも４週間治療され、安定している場合には、以前に中枢神経系(ＣＮＳ）転移があってもよかった。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。
【００７４】
この第Ｉ相試行は、非盲検非ランダム化用量増大試験として設計され、この検査では、３〜６人の患者グループに、次の用量レベル、すなわち、0.8、1.6、3.2、4.8、6.0または7.5ｍｇ/ｍ2/日のｈｕ１４．１８−ＩＬ−２を投与した。ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２は、入院患者ベースで投与し、各コース第１週中に３日間連続して４時間の静脈内(ＩＶ)注入を行った。ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質は、４％マンニトール、100ｍＭアルギニンＨＣｌ、５ｍＭクエン酸、および0.01％ Ｔｗｅｅｎ８０ ｐＨ７を含む製剤中で患者に投与した。患者は、第３の注入終了後約24時間安定であった場合には退院させた。有害事象および毒性は、ＩＬ−２に関するＮＣＩ共通毒性規準(ＮＣＩ Common Toxicity Criteria)(バージョン2.0)およびウィスコンシン大学総合癌センター毒性評価基準(University of Wisconsin Comprehensive Cancer Center Toxicity Grading Scale)(パフォーマンスステータス、体重増、および体温)に従ってグレード付けした。用量制限毒性(ＤＬＴ)は、グレード３のリンパ球減少、高ビリルビン血症、低リン酸血症、または高血糖以外のグレード３またはグレード４の毒性の発生と定義した。最大耐量(ＭＴＤ)は、コース１で６人の患者のうちの２人がＤＬＴを有する用量レベルと定義した。グレード３の治療関連毒性を有した患者は、コース２で50％用量低減での治療が再開可能となる前に、少なくともグレード１にまで回復している必要があった。≧25％の疾病進行を有した患者は試験から除外した。コース２の投与は、疾患が安定していた患者に実施した。
【００７５】
ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２の薬物動態特性をこれらの患者で評価した。最初の４時間注入を行った直後(１日、コース１)にｈｕ１４．１８−ＩＬ−２レベルを33人の患者すべてからの連続試料で評価した際、半減期が3.7時間であることが判明した(＋/−0.9時間のＳＤ)。これは２成分の半減期(ＩＬ−２の約45分間、およびキメラｍ１４．１８抗体の３日間)の間の中間であり、マウスで観測されたキメラｍ１４．１８−ＩＬ−２の半減期に匹敵する値である。これらの患者の血清からｈｕ１４．１８−ＩＬ−２が除去された後には、ＩＬ−２成分もｈｕ１４．１８抗体成分も検出できなかった。コース１におけるピーク血清および曲線下面積(ＡＵＣ)は、用量依存性の増加を有意に示した(ｐ＜0.001)。
【００７６】
33人の患者をこの試験で治療した。表１に臨床転帰を記載する。２人の患者(６％)は、コース１の３日間のうち最初の２日間のみを終了した。これらの患者(用量レベル３)のうち１人は、治療２日目にグレード３の高ビリルビン血症を有し、もう１人の患者(用量レベル６)は、グレード３の低酸素症と治療の留保を必要とする低血圧を有した。これらの患者は両者とも疾患の進行があり、治療の第２コースを受けなかった。19人の患者(58％)は、治療の第１コースの後、疾患が安定しており、治療の第２コースを受けた。５人の患者(全患者の15％)は、コース１における有害事象によりコース２で、50％の用量低減を必要とした。17人の患者(全患者の52％)は、コース２を終了した。１人の患者(用量レベル４)は、コース２で最終注入を受けるのを拒絶し、１人の患者(用量レベル６)は、コース２における最終注入が低血圧のため留保された。８人の患者(全患者の24％)は、２コースの治療後でも疾患が安定していた。この結果は、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２が驚くほど多数の患者で疾病進行の安定化を引き起こしたことを示す。
【００７７】
33人の患者のうちの８人が２コースの治療後でも疾患の安定を維持しており、これら８人の患者のうちの４人は、プロトコール治療終了以来20〜52カ月の間、進行性疾患の証拠は認められないままである(1人は安定した疾患を有し、３人は疾患に関して証拠がない)。
【００７８】
33人の患者のうち５人は、再発または転移の外科切除後、測定可能な疾患がない状態で試験に参加した。これらの５人の患者のうち２人は疾病進行を有したが、残りの３人の患者は疾患の証拠は認められないままであった(20〜52カ月）。これらの結果は、免疫療法による介入から臨床利益を得る可能性が最も高いのは、全身腫瘍組織量が低い患者であるという仮説と一致するものである。さらにもう１人の患者が、２コースの治療後、肺小節で目標とする減少に達したが、総合的な疾患応答は、遠位結節の成長によって、疾病進行として評点された。ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２治療の後、その結節は切除され、患者は、３年間以上、疾病進行がない状態のままでいた。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
第Ｉ相臨床試験におけるｈｕ１４．１８−ＩＬ−２による生体内免疫刺激
ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２で治療された患者に関して、免疫刺激の指標も検査した。末梢血リンパ球減少が２〜４日目に起こり、この後、５〜22日目には反跳性リンパ球増多症が起こった。これらの変化は両方とも用量依存性であった(それぞれ、ｐ＜0.01およびｐ＜0.05)。５、８、15および22日目におけるリンパ球数は、コース１のベースラインより有意に大きかった。コース２のベースラインリンパ球数(コース１の29日目)は、コース１のベースラインリンパ球数より増加しており、これは第１コースの治療の効果が29日目でもまだ存在していることを示す。さらに、これら12人の患者の、コース２における５、８および15日目のリンパ球数は、コース１における５、８、および15日目の対応する値より大きかった。
【００８１】
リンパ球細胞表面表現型は、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２治療第１週後にＣＤ１６＋およびＣＤ５６＋リンパ球(ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞マーカー)の拡張を示した。この効果は、コース１の29日目(コース２、１日目)でもなお残っていた。患者19〜33(4.8〜7.5ｍｇ/ｍ2/日の投与を受けた)では、リンパ球細胞表面表現型を１および８日目に加えて、15および22日目にも測定した。この分析は、ＣＤ５６細胞およびＣＤ５６/ＣＤ１６同時発現細胞の増加が、８、15および22日目にも有意に上昇した(ｐ＜0.01)状態のままであったことを実証した。
【００８２】
免疫活性化の尺度として、患者13〜33におけるＣ反応性タンパク質(ＣＲＰ)レベルと、コース１を終了した31人の患者における可溶性ＩＬ−２受容体(ｓＩＬ−２Ｒ)レベルとを得た。各コースでのベースラインと比較して、コース１およびコース２の両方で、治療３〜５日目に平均ＣＲＰの有意な増大があった。ＣＲＰにおけるこの増大は、各治療コースにおける８日目までにベースラインレベルまで戻っていた。ｓＩＬ−２Ｒレベルは、コース１およびコース２の両方で、ベースラインより有意に増大していた。この増大は、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２注入の２４時間後に開始し、８日目の後まで持続した。ｓＩＬ−２Ｒの増大は用量依存性(ｐ＝0.014)であることが判明した。両コースで同じ用量を受けた患者の、コース２における１〜５日目のｓＩＬ−２Ｒ値は、コース１における対応する値と比較して増大していた(ｐ＜0.05)。
【００８３】
ＧＤ２を発現し、かつｈｕ１４．１８−ＩＬ−２に結合するＬＡ−Ｎ−５神経芽腫細胞系を、コース１を終了した31人の患者から得た末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)における、ＩＬ−２で活性化されたＮＫ機能と、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)とを評価するのに用いた。リンパ球に媒介された殺作用は、これらの２つのアッセイにおける１日目と比較して、８日目から有意に増大した。コース２でコース１と同じ用量を受けた12人の患者は、コース１で得られた結果と極めて同様のＡＤＣＣ結果を示した。コース２でコース１と異なっていることが判明した唯一のパラメータは、１日目におけるＩＬ−２の存在下で増大している殺作用であるが、これは、このアッセイで増大した殺作用が29日目(コース２、１日目)でも高いまま残っていたことを示すものである。
【００８４】
ＬＡ−Ｎ−５標的は、新たなＮＫ細胞に比較的抵抗力があるので、ＩＬ−２によって増大した殺作用およびＡＤＣＣを測定するのに有用である。しかし、培養液(生体外ＩＬ−２の増補なし)中の新たなＰＢＭＣによって媒介された、ＬＡ−Ｎ−５に対する弱い殺作用は、８日目でも１日目と比べて有意に大きくはなかった。
【００８５】
ＮＫに対する感受性を有するＫ５６２標的細胞系を用いて、１、８、15および22日目に、患者19〜33の標準的なＮＫアッセイを行った。培養液中、またはＩＬ−２の存在下でテストした際、ＮＫによるＫ５６２標的細胞の溶解が、１日目と比較して８および２２日目に有意に増大していることが観測された。選択された患者から得た血清試料は、機能的ＩＬ−２活性および機能的抗ＧＤ２抗体を測定するためにも評価された。
【００８６】
ＩＬ−２反応性のＴｆ−１ｂ細胞系は、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２注入後に得た患者血清によって、ＩＬ−２−誘発増殖を示した。４時間の注入後、最初の４時間では、増殖における進行性の増大が見られた。この注入の16時間後までに、値はベースラインに戻った。これは、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２の血清中半減期が約４時間であることと一致している。これらのタイムポイントから得た血清試料は、フローサイトメトリーでもそのＩＬ−２成分およびその抗ＧＤ２抗体活性を保持する完全なｈｕ１４．１８−ＩＬ−２免疫サイトカイン(ＩＣ)が存在するかどうか検査した。Ｍ２１細胞系(ＧＤ２陽性)に結合可能なｈｕ１４．１８−ＩＬ−２が、ＩＣ注入後の患者血清試料の中で検出可能であった。Ｍ２１に結合可能なＩＣの量は、４時間の注入後、最初の４時間では増加し、その後減少した。これは再度、半減期が約４時間であることと一致しているものである。最後に、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２の投与によって、ＡＤＣＣを実現するのに必要である条件と一致した条件が生体内でもたらされるかどうかを判定するために、患者から得た被検物を用いて生体外分析を行った。８日目に得たＰＢＭＣは、細胞障害性アッセイにｈｕ１４．１８−ＩＬ−２を添加した際の、ＧＤ２＋標的細胞に対するＡＤＣＣの増大を示す。この同じＡＤＣＣアッセイを８日目に得たＰＢＭＣを用いて行ったが、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２をアッセイに添加する代わりに、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２投与の前または後に得た患者からの血清を添加した。コース２の８日目の患者から得たＰＢＭＣは、ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２投与後に得られた血清の存在下で、注入前に得た血清で観測された殺作用と比べて増大した、ＬＡ−Ｎ−５細胞系に対する殺作用を媒介することが可能であった。したがって、ＩＶ投与後に患者体内で循環しているｈｕ１４．１８−ＩＬ−２は、同じ患者からのｈｕ１４．１８−ＩＬ−２によって生体内で活性化されたＰＢＭＣでＡＤＣＣを促進することが可能であった。
【００８７】
要約すれば、これらの結果は、このｈｕ１４．１８−ＩＬ−２療法に付随して、リンパ球数の増加、ＣＤ１６＋およびＣＤ５６＋ＰＢＭＣの比率増大、ＮＫ溶解の増大、およびＡＤＣＣの増大を含めた免疫変化があったことを示す。免疫活性化の追加証拠には、ＣＲＰおよびｓＩＬ−２Ｒの血清中レベルの増大が含まれていた。血清およびＰＢＭＣの実験室分析は、ＩＶ投与後における患者の血清中で循環するｈｕ１４．１８−ＩＬ−２分子が、ＩＬ−２受容体を介してＩＬ−２反応性細胞を活性化する能力を保持し、かつ、フローサイトメトリーで検出されるように、ＧＤ２陽性腫瘍細胞に結合して、ＩＬ−２をそれらの細胞表面に送達する能力を保持していることを示した。ｈｕ１４．１８−ＩＬ−２分子がＮＫおよびＡＤＣＣ機能を生体外で媒介する能力に基づいて、ＮＫ細胞は生体内でも活性化される。その上、これらの患者に投与されたｈｕ１４．１８−ＩＬ−２によって生体内で活性化されたＮＫ細胞は、同じ患者の血清中を循環するｈｕ１４．１８−ＩＬ−２によって促進されたＡＤＣＣを媒介することが可能であった。したがって、免疫活性化を実現する条件は、この試験中の全患者で実現された。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】本発明による、免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】本発明による、免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】本発明による、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖−ＩＬ−２融合タンパク質をコードする核酸構築体を含む発現ベクターのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｂ】本発明による、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖−ＩＬ−２融合タンパク質をコードする核酸構築体を含む発現ベクターのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｃ】本発明による、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖−ＩＬ−２融合タンパク質をコードする核酸構築体を含む発現ベクターのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｄ】本発明による、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖−ＩＬ−２融合タンパク質をコードする核酸構築体を含む発現ベクターのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ａ】本発明による免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】本発明による免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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