(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨芽細胞の活性を反映するマーカーおよび破骨細胞の作用を反映するマーカーを用いることを特徴とする悪性腫瘍の骨転移の改善または悪化を判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、骨芽細胞の活性を反映するマーカーとして、
（１）ＰＩＣＰもしくはＰＩＮＰおよびオステオカルシン、あるいは
（２）ＢＡＬＰおよびオステオカルシン
を用い、破骨細胞の作用を反映するマーカーとしてＩＣＴＰを用い、オステオカルシンとＰＩＣＰもしくはＰＩＮＰとの比（クロスオーバーインデックス）の値、およびＩＣＴＰの測定値に基づくか、あるいは、オステオカルシンとＢＡＬＰとのクロスオーバーインデックスの値、およびＩＣＴＰの測定値に基づく前記判定方法。
【請求項２】
癌患者における薬剤の影響による悪性腫瘍の骨転移の改善または悪化を判定するための請求項１記載の方法。
【請求項３】
薬剤が、抗癌性化学療法剤、骨吸収抑制剤、または内分泌療法剤である、請求項１または２記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、乳癌、前立腺癌、肺癌等に伴う骨転移を診断する方法、これらの疾患を治療するための薬剤の治療効果を判定する方法に関する。
背景技術
癌による骨転移の診断は、従来より臨床症状、単純Ｘ線、骨シンチグラフィ、ＣＴ、ＭＲＩなどの画像診断により行われている。画像的には、骨転移は溶骨型、骨硬化型、混合型に分類されるが、骨転移の部分での溶骨と造骨のバランスをみているわけである。画像診断法は診断能は高く有用であるが、概して高額でありスクリーニングや経過観察には適していない。
近年、骨代謝学の進歩により様々な骨代謝マーカーの開発がなされている。表１に骨形成マーカーと骨吸収マーカーを示した。これらの骨代謝マーカーでの癌の骨転移診断の試みが行われている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｅｓ（骨転移における骨代謝マーカー）；Ｊ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２１：５４２〜５４８，１９９５）。
0004420565.tif 000002
骨代謝マーカーのうち多くのものは、骨基質の９０％を占めるＩ型コラーゲンの形成、吸収過程で血液中および尿中に放出された代謝産物を測定することにより成り立っている。すなわち、骨形成に伴い合成されるＩ型プロコラーゲンがＩ型コラーゲンへと変換される際に放出されるＣ端、Ｎ端プロペプチドは、骨形成のマーカーとなる。また、骨吸収の過程では、骨基質中のＩ型コラーゲンが代謝を受け血液中や尿中に放出される。これらを測定することにより骨吸収のマーカーにしようとするものである。
骨形成は、骨芽細胞の増殖、分化の過程で大きく分けて３つの相に分かれることが知られている。すなわち、骨芽細胞増殖期およびマトリックス形成期、マトリックス成熟期、および石灰化期であり、各々の相で現れるマーカーが異なることが知られている（Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（骨芽細胞分化の過程における組織特異的遺伝子発現の調節に対する細胞成長の関係）；ＦＡＳＥＢ  Ｊ，４：３１１１〜３１２３，１９９０）。
骨芽細胞増殖期およびマトリックス形成期ではＩ型コラーゲンが盛んに形成され、Ｃ端、Ｎ端のプロペプチドが血中に現れる。マトリックス成熟期には、骨でのアルカリホスファターゼ（ＢＡＬＰ）の生成が盛んになり、この時期には血液中にＢＡＬＰが分泌される。石灰化期には、オステオカルシン（ＯＣ）が出現する。このＯＣを欠損させたマウスでは骨形成が亢進し、ＯＣが骨形成の抑制物質として働くことを示唆する（Ｄｕｃｙ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（オステオカルシン欠乏マウスにおける骨形成増大）；Ｎａｔｕｒｅ，３８２：４４８〜４５２，１９９６）。
なお、表１の骨形成マーカーの欄において、▲１▼のｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが骨芽細胞増殖期およびマトリックス形成期に、▲２▼のｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒｍａ  ｔｉｏｎがマトリックス成熟期に、▲３▼のｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎが石灰化期にそれぞれ対応する。
骨形成のマーカーは前述のごとく様々あるが、病態により挙動が異なることがあり、各マーカーがどの相で現れるかを理解しておくことが重要である。
骨吸収マーカーには様々なものがあるが、最近注目されているものはやはりＩ型コラーゲンの代謝産物である。Ｉ型コラーゲンは三重鎖構造をもつコラーゲンがピリジノリンおよびデオキシピリジノリンにより架橋された形で存在するため、骨吸収によりＩ型コラーゲンが破壊された時に、様々な大きさのＮ端およびＣ端の終末アミノ酸のついたピリジノリンおよびデオキシピリジノリン架橋部が血液中に放出される。
骨吸収のマーカーとして測定されているものには、架橋部のみを測定するもの（尿中ピリジノリンおよびデオキシピリジノリン；遊離しているもののみを測定する）、Ｃ端のアミノ酸を含めた部分を測定するもの（ＣＴｘやＩＣＴＰ）、Ｎ端のアミノ酸を含めた部分を測定するもの（ＮＴｘ）などがある。骨代謝マーカーの一般的な詳細については、Ｃａｌｖｏらの総説（Ｃａｌｖｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ（骨ターンオーバーの生物学的マーカーの分子的基礎および臨床応用）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，１７：３３３〜３６８，１９９６）に詳しく記載されている。
骨転移における骨代謝マーカーは、骨粗鬆症などの代謝性の骨疾患とやや異なる動きをする。骨形成マーカーでは、ＰＩＣＰ、ＢＡＬＰの上昇が骨硬化型の骨転移の代表である前立腺癌骨転移でみられるが、骨粗鬆症などで上昇するオステオカルシンはあまり増加しない。その機序については現在不明である。混合型の骨転移を呈する乳癌においては、骨形成マーカーの上昇はみられるが、前立腺癌ほどではない。溶骨型の骨転移の多い肺癌においては、骨形成マーカーはあまり増加しない。
骨吸収マーカーでは、ＩＣＴＰは他の骨代謝マーカーと異なり閉経ではあまり変化しないが、癌の骨転移では増加することが判明している。骨転移検出の観点からはＩＣＴＰは閉経期の骨吸収亢進の影響を受けないよいマーカーといえよう。骨吸収マーカーは、溶骨型の多い肺癌骨転移で増加するだけでなく、混合型の多い乳癌、さらには骨硬化型の前立腺癌においても増加する。
発明の開示
骨代謝マーカーの分野の研究は進歩が著しいが、マーカーの十分な比較検討はなされていないのが現状であり、様々な骨吸収と骨形成マーカーがあり、骨転移の診断において現時点でどのマーカーが最もよいかは断定できない。
また、骨転移の臨床診断においてどのマーカーを用いるかは各医師の判断に委ねられているため、骨転移を総合的にモニターしていく手法は未だ確立されていない。
本発明の目的は、骨転移を総合的にモニターしていくツールを提供する点にある。
本発明者らは、このような状況に鑑み、骨転移を総合的にモニターしていくツールを開発すべく鋭意研究を重ねた結果、骨芽細胞の活性を反映するマーカー（骨形成マーカー）および破骨細胞の作用を反映するマーカー（骨吸収マーカー）を組み合わせることによって上記目的を達成することができることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、骨芽細胞の活性を反映するマーカーおよび破骨細胞の作用を反映するマーカーを用いることを特徴とする悪性腫瘍の骨転移を診断する方法を提供する。
また、本発明は、骨芽細胞の活性を反映するマーカーおよび破骨細胞の作用を反映するマーカーを用いて薬剤の治療効果を判定する方法を提供する。
発明を実施実施するための最良の形態
以下に本発明を完成するための基礎となった知見について記載する。
（１）骨芽細胞から産生される骨形成マーカー：
図１に示すように、骨芽細胞の分化に伴い、マーカーの発現はＰＩＣＰおよびＰＩＮＰ（タイプＩプロコラーゲンペプチド）からＢＡＬＰ（骨アルカリホスファターゼ）へ、さらにオステオカルシンへと変化する（Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．；ＦＡＳＥＢ  Ｊ，４：３１１１〜３１２３，１９９０）。
（２）骨転移を有する前立腺癌患者および乳癌患者における化学療法に対するＢＡＬＰおよびオステオカルシンの反応：
骨転移の状態によって（１）の２つの骨形成マーカーのレベルが異なることを以下の２つの実施例によって確認した。
実施例１
１９９４年１０月から１９９６年４月の間に、骨転移を有する前立腺癌患者４３名、骨転移なしの前立腺癌患者４６名を対象として、骨形成マーカーのレベルを調べた。明らかに骨転移なしの前立腺癌患者４６名のうち、２９名は前立腺切除または放射線治療を受けた経験があり、その他の１７名は新たに診断を受けた患者であり、骨シンチと血清サンプリングの後で前立腺切除または放射線治療を受けた。骨転移なしの患者の平均年齢は６９歳（年齢範囲４７歳−８５歳）であった。これらの患者の癌の進行度合は、４名の患者がステージＡ、１４名の患者がステージＢ、１９名の患者がステージＣ、９名の患者がステージＤ１であった。一方、骨転移を有する患者４３名のうち、９名は新たに診断を受けて、骨シンチと血清サンプリングの後でホルモン療法を受けていた。その他の３４名の患者はホルモン療法および／または化学療法による積極的な治療をこれらの療法の開始時から種々の間隔で受けていた。骨転移を有する患者の平均年齢は６９歳（年齢範囲５３歳−８３歳）であった。
すべての患者に関して、インフォームドコンセントが得られた後、骨シンチの際に採血して血清を分離し、分析を行うまで−４０℃で冷凍保存した。血清中のＢＡＬＰをアルクファーゼ−Ｂキット（ＡＬＫＰＨＡＳＥ−Ｂ  ｋｉｔ，Ｍｅｔｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたエンザイムイムノアッセイ（免疫測定法）で測定した。また、血清中のオステオカルシンは三菱ＢＧＰ−ＩＲＭＡキット（三菱化学）を用いたイムノラジオメトリックアッセイ（放射免疫測定法）で測定した。
結果を図２に示す。図２において、Ｚ値とは（測定値−骨転移がない患者の平均値）／（骨転移がない患者の標準偏差値）で定義される値である。また、図２においてＣＲ、ｆｌａｒｅ、ＮＣ、ＩＭＰ、ｎｅｗ、ＰＤはそれぞれ下記の意味を有する。
・ＣＲ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ（完全寛解）。
・ｆｌａｒｅ：ｆｌａｒｅ  ｕｐ（実際には治療が有効であったにもかかわらず
、ｂｏｎｅ  ｓｃａｎ（骨シンチ）の画像上で
骨転移が進行した様にみられたもの）。
・ＮＣ：ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ（変化が認められなかったもの）。
・ＩＭＰ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ（改善の兆候が認められたもの）。
・ｎｅｗ：新たに骨転移ありと診断されたもの。
・ＰＤ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ（疾患の進行がみられ
たもの）。
ＢＡＬＰおよびオステオカルシンについての上記各群におけるＺ値は以下の通りであった。
ＢＡＬＰのＺ値
ＣＲ：          ２．１８
ｆｌａｒｅ：３．４０
ＮＣ：          ８．２３
ＩＭＰ：２．３９
ｎｅｗ：        １．８２
ＰＤ：        ２４．５０
オステオカルシンのＺ値
ＣＲ：          １．３０
ｆｌａｒｅ：−０．１８
ＮＣ：          ０．０４
ＩＭＰ：１．２５
ｎｅｗ：        ０．０８
ＰＤ：          ０．０５
これらの値を用いてオステオカルシンとＢＡＬＰとの各群におけるクロスオーバーインデックスを算出した。
クロスオーバーインデックス
ＣＲ：          ０．５９６
ｆｌａｒｅ：−０．０５３
ＮＣ：          ０．００５
ＩＭＰ：０．５２３
ｎｅｗ：        ０．０４４
ＰＤ：          ０．００２
上記から明らかなように、ＢＡＬＰについては治療をして効果があったＣＲではＺ値が低く（２．１８）、悪化したＰＤではＺ値が高い（２４．５０）ことが分かった。一方、オステオカルシンについては治療をして効果があったＣＲではＺ値が高く（１．３０）、悪化したＰＤではＺ値が低い（０．０５）ことが分かった。ＣＲのクロスオーバーインデックスは０．５９６であるのに対して、ＰＤのクロスオーバーインデックスは０．００２であることから、両者は著しい差を有することが認められた。このことから、クロスオーバーインデックスにより骨転移の進行度合および薬剤による治療効果の程度を診断することが可能である。
実施例２
実施例１と同様にして、骨転移を有する乳癌患者６４４例、骨転移なしの乳癌患者２０６例、合計８５０例の乳癌患者を対象として、骨形成マーカー（ＢＡＬＰおよびオステオカルシン）のレベルを調べた。骨転移を有する患者においては、骨転移部位への化学療法または内分泌療法の治療効果により、ＣＲ、ＮＣ、ＩＭＰ、ｎｅｗ、ＰＤ群に分類し、それぞれの群のＢＡＬＰのＺ値およびオステオカルシンのＺ値を求めた。さらに、これらのＺ値から各々の群についてクロスオーバーインデックスを算出した。
すべての患者に関して、インフォームドコンセントを得た後、骨シンチの際に採血して血清を分離し、測定を行うまで−４０℃で冷凍保存した。血清中のＢＡＬＰはアルクファーゼ−Ｂキット（ＡＬＫＰＨＡＳＥ−Ｂ  ｋｉｔ，Ｍｅｔｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたエンザイムイムノアッセイ（免疫測定法）で測定した。また、血清中のオステオカルシンは、三菱ＢＧＰ−ＩＲＭＡキット（三菱化学）を用いたイムノラジオメトリックアッセイ（放射免疫測定法）で測定した。結果を以下に示す。
ＢＡＬＰのＺ値
ＣＲ：０．７４１
ＮＣ：１．５１４
ＩＭＰ：    ０．７３５
ｎｅｗ：２．０２１
ＰＤ：５．０４１
オステオカルシンのＺ値
ＣＲ：      ０．２６７
ＮＣ：０．２３７
ＩＭＰ：０．０３９
ｎｅｗ：−０．１６７
ＰＤ：０．５１６
クロスオーバーインデックス
ＣＲ：      ０．３６０
ＮＣ：      ０．１５７
ＩＭＰ：    ０．０５３
ｎｅｗ：  −０．０８３
ＰＤ：      ０．１０２
図３にＣＲ，ＮＣ、ＩＭＰ、ｎｅｗおよびＰＤにおけるクロスオーバーインデックスをグラフで示す。
図３から明らかなように、治療をして効果があったＣＲのクロスオーバーインデックスは０．３６０であるのに対して、悪化したＰＤのクロスオーバーインデックスは０．１０２であることから、両者は著しい差を有することが認められた。このことから、乳癌の場合もクロスオーバーインデックスにより骨転移の進行度合および薬剤による治療効果の程度を診断することが可能である。
上記実施例１および２の結果により、骨転移があり、薬剤による治療効果がある場合（ＣＲ）はクロスオーバーインデックスが高く、効果がなく悪化している場合（ＰＤ）はクロスオーバーインデックスが低いことが示された。したがって、骨転移の改善度合（治療効果）を見るには骨芽細胞のマーカーによるクロスオーバーインデックスが極めて有効であることが裏付けられた。
一方、前立腺癌においてはＣＲとＩＭＰ、ＮＣとＰＤのクロスオーバーインデックスが近接しており、造骨性が主体となる前立腺癌の骨転移に対する治療効果を反映している。しかしながら、乳癌においては、ＮＣとＰＤは近接しているものの、ＣＲとＩＭＰは近接しておらず、前立腺癌とは若干異なる結果である。このことは乳癌が造骨性素因もあるものの、溶骨性素因が強い骨転移像を呈することからこのような差が生じたものと考えられる。したがって、骨転移の進行度合（増悪度合）をより正確に診断するためには、骨形成マーカーだけではなく、骨吸収マーカーの測定も必要と考えられる。
上記実施例１および２においては石灰化期に関連するマーカーであるオステオカルシンとマトリックス成熟期に関連するマーカーであるＢＡＬＰとのクロスオーバーインデックスを測定することによって、悪性腫瘍の骨転移の進行度合および薬剤による治療効果の程度についての診断を行った。さらに、本発明者らは、石灰化期に関連するマーカーであるオステオカルシンと骨芽細胞増殖期およびマトリックス形成期に関連するマーカーであるＰＩＣＰまたはＰＩＮＰとのクロスオーバーインデックスを測定することによっても悪性腫瘍の骨転移の進行度合および薬剤による治療効果の程度についての診断を行うことが可能であることを確認している。石灰化期に関連するマーカーであればオステオカルシン以外のマーカーも用いることができ、骨芽細胞増殖期およびマトリックス形成期に関連するマーカーであればＰＩＣＰおよびＰＩＮＰ以外のマーカーも用いることができ、マトリックス成熟期に関連するマーカーであればＢＡＬＰ以外のマーカーも用いることができることは言うまでもない。
これまでに、骨形成マーカーは幾つか同定され、個々別々に測定されてきており、骨芽細胞の分化・成熟に従って、産生される時期が異なることは知られていた。しかし、骨転移の指標として、どの骨形成マーカーに限定して測定したら、「骨芽細胞の分化・成熟が癌の骨転移によって抑制される」ことを反映するのかは、明確にされていなかった。上記クロスオーバーインデックスという指標から骨転移の進行度合および薬剤による治療効果の程度を把握するということは従来技術からは予測し得ないことであった。
一方、癌転移による骨破壊は、破骨細胞によって行われる。その際の骨吸収マーカーとしては、幾つかが知られているが、骨転移の程度（悪性度）および治療による骨破壊の抑制効果は、ＩＣＴＰ（タイプＩコラーゲンカルボキシ末端テロペプチド）という比較的大きな分子量のコラーゲン代謝物を同定することにより明確となり、ＩＣＴＰがマーカーとして優れている（例えば、Ｔｈｅ  Ｂｏｎｅ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３，ｐ．１１１〜１１８，１９９６を参照）。以下に、ＩＣＴＰを利用した骨転移の程度および治療による骨破壊の抑制効果に関する実施例を示す。
実施例３：乳癌治療におけるＩＣＴＰのレベル
骨転移に対する化学療法剤の併用療法（シクロホスファミド、ドキソルピシンおよび５−フルオロウラシル：ＣＡＦ）を受けた２３名の乳癌患者についてＩＣＴＰのレベルを測定した。なお、補助療法としてＣＡＦを受けた骨転移のない９名の乳癌患者を対照群とした。
すべての患者からインフォームドコンセントを得た後、骨形成および骨吸収を示す骨代謝マーカーを測定した。ＣＡＦ治療開始時およびＣＡＦ治療が終わるまで毎月１回骨シンチの際に採血して血清を分離した。分離した血清は分析を行うまで−４０℃で冷凍保存した。骨形成マーカーとしてＢＡＬＰをエンザイムイムノアッセイ（ＡＬＫＰＨＡＳＥ−Ｂ  ｋｉｔ，Ｍｅｔｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。骨吸収マーカーとしてＩＣＴＰをラジオイムノアッセイ（Ｏｒｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）によって測定した。また、血清中のＣＡ  １５−３をイムノラジオメトリックアッセイ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）によって測定した。得られた測定値（平均およびＳＥ（標準誤差）で表した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて有意差検定を行った。
結果を図４に示す。図４から、ＰＲ（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）およびＮＣの患者のＩＣＴＰ値と比較してＰＤの患者のＩＣＴＰ値は有意に上昇した。フレア（ｆｌａｒｅ）の患者のＩＣＴＰ値はＰＤの患者の場合よりも有意に低下し、ＮＣ患者およびｆｌａｒｅ−ｕｐなしのＰＲ患者のＩＣＴＰ値と相違しなかった。なお、図４における、ＰＤ，フレア（ｆｌａｒｅ）およびＮＣは実施例１の場合と同じ意味を有する。ＰＲとは、部分的に治療効果の認められたものを意味する。
なお、ＢＡＬＰおよびＣＡ  １５−３の値はいずれも統計学的な有意差を示さなかった。
したがって、ＩＣＴＰのレベルを測定することにより癌の骨転移の増悪度合を判定することができる。
実施例１〜３によって得られた知見により、骨転移の改善度合（治療効果）を見るには骨芽細胞のマーカーを、骨転移の増悪度合を見るには破骨細胞のマーカーをそれぞれ用いて、双方のマーカーをモニターすることにより的確な診断を下すことができると言える。
産業上の利用の可能性
上述のように、本発明によれば、乳癌、前立腺癌、肺癌等によってもたらされる骨転移およびかかる骨転移を惹起する癌に対する薬剤の治療効果を従来方法よりもはるかに的確に診断することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
図１は、骨芽細胞の分化に伴う種々のマーカーの発現を示す図である。
図２は、骨転移を伴う前立腺癌患者に対する化学療法剤の効果とＰＩＣＰ、ＢＡＬＰおよびオステオカルシンとの関係を示すグラフである。
図３は、乳癌患者におけるＢＡＬＰおよびオステオカルシンのクロスオーバーインデックスを表すグラフである。
図４は、乳癌の治療過程におけるＩＣＴＰ値の変化を示すグラフである。
【図１】
0004420565.tif 000003
【図２】
0004420565.tif 000004
【図３】
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【図４】
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