(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ベクターとトランスフェクション率を増大させる調製剤とを有する共凍結乾燥された複合体であって、
核酸ベクターを有する溶液と調製剤を有する溶液とが混合されて、共凍結乾燥の前に凍結乾燥溶液が形成され、また、前記調製剤は核酸と混合される前に中性のｐＨを有するポリビニルピロリドンである複合体。
【請求項２】
前記核酸ベクター及び前記ポリビニルピロリドンは、１：１７の重量対重量比で前記共凍結乾燥された複合体内に存在している請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記凍結乾燥溶液が、３．５から９のｐＨを有している請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記核酸ベクター及び前記調製剤が、再水和溶液の添加によって医薬上許容しうる配合物をもたらす単一バイアル配合物内で共凍結乾燥される請求項１から３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
再水和溶液が０．９％のＮａＣｌを有する請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
再水和溶液は医薬上許容しうる配合物にトランスフェクション最適化ｐＨを付与するバッファを有する請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
前記再水和溶液は３−４のｐＨを有する請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記バッファは医薬上許容しうる配合物に酸性のｐＨを付与する請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
前記医薬上許容しうる配合物は５％のポリビニルピロリドンと、４のｐＨを有する２５ｍＭのＮａ−シトラートバッファとを有する請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
一つ又は複数の以下の追加成分、すなわち、抗菌剤、塩、酸化防止剤及び凍結防止剤をさらに有する請求項１から８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記抗菌剤が塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀及びアセテートから成る群から選択される請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記酸化防止剤がアスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、システイン、硫酸水素ナトリウム及びグルタチオンから成る群から選択される請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
前記バッファが酢酸及び塩、琥珀酸及びホウ酸ナトリウム、ホルマート及びＨＣｌ、及びＮａ−シトラートバッファから成る群から選択される請求項８に記載の複合体。
【請求項１４】
前記凍結防止剤が乳糖、ショ糖、マンニトール、トレハロース及びポリビニルピロリドンから成る群から選択される請求項１０に記載の複合体。
【請求項１５】
前記核酸ベクターがｈＧＨ、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ＩＧＦ−１、ＴＰＯ、ファクターＩＸ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２及びＩＬ−１２から成る群から選択されるタンパク質をコード化している請求項１から１４のいずれか一項に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序
本発明は、所望の物理的および投与特徴を有する単一バイアル凍結乾燥核酸／配合剤複合体の製造に有用な生成物および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ここに提供される情報はいずれも本発明に対する先行技術と認められるものではなく、読み手の理解を助けるためにのみ供される。
遺伝子療法は、医薬開発における研究の主要領域になってきた。いっそう実際的で、そして有効な遺伝子送達方法は、十分な量で標的細胞に生成物を送達することが一般に予測される、遺伝子療法の臨床および／または市販用途の利点を援助し続ける。
【０００３】
過去に、従来の投与形態に核酸を組込むことは、投与前に核酸の化学的分解または物理的凝集により難題であった。核酸複合体を投与する好ましい方法は、液体形態であり、それにより過去の方法は、別個のバイアル中に核酸を保存すること、そして投与の直前に必要な成分を合せることを含んだ。これは、一般的に、有効な方法であったが、しかし、それは、比較的高価であり、製造が困難であり、そして投与がある程度困難であるむしろ不安定な生成物を製造した。凍結防御物質化合物を添加し、そして生じる配合物方を凍結乾燥させることによるポリヌクレオチド複合体の安定化は、１９９６年１２月２７日に刊行され、「ポリヌクレオチド複合体の乾燥粉末配合物(Dry powder Formulations of Polynucleotide Complexes)」という名称のスゾーカ(Szoka)外の国際特許公開第ＷＯ９６／４１８７３号に記述され、すべての図面を含むその全体がここにおいて文献援用される。
【０００４】
核酸配合物を作る先の試みで、混合の方法は、一般に、ＤＮＡ複合体と配合剤との従来のゆっくりとした（しかし制御されていない）混合であった。結果は、比較的大きなサイズ（およそ１５０ナノメーター）の粒子を有する不均質な複合体であった。ＤＮＡ複合体を投与するのを容易にするために、小型でそしていっそう均一な粒子サイズを示すことが望ましい。したがって、上記にもかかわらず、比較的小型で均一な粒子サイズの単一バイアル均質化核酸配合物、特に、分解から保護され、そして非配合核酸に関連のある細胞を形質移入する能力が増加しているもの、並びに製造および保存の容易な方法の必要性が残っている。
【０００５】
発明の要旨
本発明は、その生物学的活性の明らかな減少なしに、従来の投与形態で、単離され、濃縮されるかまたは精製された核酸、好ましくはＤＮＡプラスミドの費用的に有効な製造の組成物および方法に特徴がある。したがって、本発明は、生じる複合体が、保存のために凍結乾燥され、そして投与のために再水和される場合、インライン混合によって作り出される単一バイアルの均質化複合体を提供する。インライン混合は、混合装置に導き、そして核酸および配合剤の混合物を生成する役割を果す２つの管を利用するのが好ましい。本発明における複合体は、単一バイアルで配合されるが、好ましい物理特性および効力を維持する。この単一バイアル配合物の使用によって、（１）減少した製造費用、（２）製造および品質管理試験の容易さ、（３）製造安定性、および（４）医師／患者の応諾及び投与の相対的容易性が向上する。これらの属性、および続く詳細は、先に使用された配合物を超えて利点を供する。
【０００６】
したがって、１つの態様では、本発明は、単離され、濃縮され、または精製された液体核酸分子の制限流動システムを含むインライン混合装置を特徴とする。「インライン混合装置」によって、互いに接触すべき液体を通過させ、そして連続的または半バッチ操作のために使用される装置が意味される。その混合装置としては、管を包含でき、そして液体と一緒に、制限流動システムを形成する。混合装置中の液体の容積は、混合装置のサイズおよび形状によってのみ限定される。混合装置は、機械的曝気を利用しうるが、機械的曝気が使用されない場合、ジェット混合装置、注入装置、オリフィス、混合ノズル、弁およびポンプのような他の方法も使用可能である。多くのインライン混合装置が、石油蒸留物の処理で、植物油精製で、ある種の金属抽出および他の用途でのような化学的および化学工業の用途で市販で使用される。多くのタイプのこれらの混合装置が、化学的および化学工業の用途で市販で入手可能であるので、当業者であれば、ここに記述される核酸を処理するのにさらに適したわずかな変更を加えて、他のインライン混合装置を容易に設計および作製できるであろう。
【０００７】
インライン混合装置は、交点で連結して、単独の出口を形成するＹ型形態の２つの入口から作られるのが好ましい。本発明の１つの実施の形態では、インライン混合装置は、Ｙ型交点後に静電混合装置を含む。
「核酸分子」により、ポリヌクレオチド、すなわち、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の高分子が意味され、そしてそれは、裸のＤＮＡ、核酸カセット、裸のＲＮＡ、ベクターまたはウイルスに含まれる核酸が挙げられ、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたは縮合核酸、陽イオン性脂質と配合された核酸、ペプチドと配合された核酸、アンチセンス分子、陽イオン性物質、ＲＮＡまたはｍＲＮＡが挙げられる。適切な核酸分子の例としては、１９９６年１２月２７日に公開された国際特許公開第ＷＯ９６／４１８７３号に対応するスゾーカ外の国際出願「ポリヌクレオチド複合体の乾燥粉末配合物」、および、１９９６年７月１８日に公開された「配合核酸組成物および遺伝子療法にそのものを投与する方法(Formulated Nucleic Acid Compositions and Methods of Administering the Same for Gene Therapy)」と題するローランド(Rolland)外の国際特許公開第ＷＯ９６／２１４７０号（ＬｙｏｎおよびＬｙｏｎの整理番号２１０／１９０号）に記述されるものが挙げられ、そしてそれらは、すべての図面を含めてその全体がここに文献援用される。これらは、単に例であって、そして限定されることは意図されない。さらに、核酸分子は、１つまたはそれ以上の治療用分子を発現する真核生物のプロモーターを有する１つまたはそれ以上のプラスミドでありうる。ある種の態様および実施の形態では、核酸分子は、詳細な説明のセクションＩ．Ｄ．において以下に定義されるとおり、単離、精製または濃縮される。
【０００８】
核酸分子は、ｃＤＮＡクローニングまたは実質的ハイブリダイゼーションによる天然の源から単離するか、または手動で合成しうる。核酸分子は、トリエステル合成法によるか、または自動的ＤＮＡ合成装置を用いることによって手動で合成することができる。
語句「ｃＤＮＡクローニング」は、ゲノムｃＤＮＡに、プローブである小型の核酸分子をハイブリッド形成することに該当する。プローブはｃＤＮＡの相補的配列にハイブリッド形成（結合）する。
語句「相補的」は、互いに多重の好ましい相互作用を形成できる２つのヌクレオチドを説明する。例えば、アデニンは、それらが、２つの水素結合を形成できる場合にチミンに相補的である。同様に、グアニンおよびシトシンはそれらが３つの水素結合を形成できるので相補的である。したがって、核酸配列が、塩基チミン、アデニン、グアニンおよびシトシンの以下の配列を含む場合、この核酸分子の「相補性」は、チミンの代わりにアデニン、アデニンの代わりにチミン、グアニンの代わりにシトシン、およびシトシンの代わりにグアニンを含む分子である。相補性は、親の核酸分子と最適な相補作用を形成する核酸配列を含有できるので、このような相補性は、それの親の分子に高いアフィニティーで結合できる。
【０００９】
好ましい実施の形態では、投与される核酸は、「ベクター」を含むプラスミドＤＮＡである。その核酸は、それに限定されないが、例えばｈＧＨ、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ＩＧＦ−１、ＴＰＯ、ファクターＩＸ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２または同等物のような強力な治療作用を有するタンパク質を発現する真核生物のプロモーターを有するプラスミドＤＮＡベクターでありうる。ここに使用される場合、語句「プラスミド」は、遺伝材料（すなわち、核酸）から作られる構築物に該当する。それは、挿入コーディング配列が、真核生物の細胞に転写されうるように配列された遺伝要素を包含する。したがって、プラスミドは、好ましくは、染色体ＤＮＡから独立に複製されうるＤＮＡの環状二本鎖から構成される染色体外の遺伝要素である。プラスミドは、その手段によりＤＮＡ断片が宿主生物に導入されうるベヒクルのように、遺伝子転移に使用され、そして抗体耐性の転移に関連する。
【００１０】
ここに使用される場合、語句「ベクター」は、標的細胞の直接形質転換に設計される遺伝材料から構成される構築に該当する。ベクターは、多重遺伝材料、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡの隣接断片、例えばプラスミド、コスミド、ファスミド、またはバクテリオファージから誘導されるか、または化学的または酵素的手段によって合成され、核酸が転写されうるように位置的および配列的に他の必要な要素に配向され、そして必要な場合、形質移入された細胞中で翻訳されたＤＮＡを含む。そのベクターは、この目的のために１つまたはそれ以上の特徴的な制限部位を含むことができ、そしてクローン化された配列が再生されるように定義された宿主または生物中で自律複製する能力がありうる。ベクターは、線状、環状またはスーパーコイル状形態を示す可能性があり、そして、特定の目的のための他のベクターまたは他の材料と複合されうる。ベクターの構成要素としては、それに限定されないが、（１）治療または所望の生成物をコードする配列；および（２）転写、翻訳、ＲＮＡ安定性および複製のための制御要素を組込むＤＮＡ分子が挙げられる。
【００１１】
本発明では、好ましいベクターは、機能的発現を可能にする適切な距離で、連続して連結した以下の要素を包含する：プロモーター、５’ｍＲＮＡリーダー配列、翻訳開始部位、発現されるべき配列を含む核酸カセット、３’ｍＲＮＡ未翻訳領域、およびポリアデニル化シグナル配列。ここに使用される場合、語句「発現ベクター」は、異種細胞中の組換えタンパク質を産生するのに必要な情報の全てを含むＤＮＡベクターに該当する。
さらに、ここで使用される場合、語句「ベクター」は、非ウイルス性ベクターが好ましいが、ウイルス性ベクターを含むこともできる。この点で、「ウイルス性ベクター」は、ベクター内のウイルス性ゲノムの一部、例えば封入シグナルを挿入することによって、ウイルス粒子中に物理的に組込まれるものであり、そして単にＤＮＡであるだけでなく、ウイルス性核酸の部分から取られた設置遺伝子でもある。したがって、ウイルス性ゲノムの一部が、本発明のベクターに存在できる場合、その部分は、ウイルス粒子へのベクターの組込みを引起さず、したがって、感染性ウイルス粒子を産生できない。
【００１２】
ここに使用される場合、ベクターは、ＤＮＡの染色体外の（エピソームの）複製を可能にするＤＮＡ配列要素も包含しうる。エピソームの複製をする能力のあるベクターは、染色体外の分子として維持され、そして複製できる。これらのベクターは、簡単な分解によっては排出されず、コピー作製し続ける。これらの要素は、ウイルス性または哺乳類のゲノムから由来する可能性がある。これらは、以下に記述されるとおり長期化または「永続性」発現を提供する。
ここに使用される場合、語句「永続性発現」は、エピソームの（すなわち、染色体外の）複製を可能にする遺伝要素と一緒に、細胞への遺伝子の導入に該当する。これは、宿主細胞の染色体への新規遺伝材料の組込みなしに、細胞の明らかに安定な形質転換に至りうる。
【００１３】
ここに使用される場合、語句「安定な発現」は、それが、その細胞中の遺伝材料の永久的構成要素になる場合に、標的細胞の染色体への遺伝材料の組込みに関連する。安定な組込みの後の遺伝子発現は、細胞および複製によって生じるその子孫の特性を永久に変化させて、それにより安定な形質転換に至りうる。
ベクターは、組織中の核酸配列の発現を提供するために使用しうる。本発明では、この発現は、核酸から得られるｍＲＮＡ転写物に対する安定性、および／または治療用タンパク質の分泌を提供することによって増強されるのが好ましい。発現は、ベクター内の挿入遺伝子または核酸配列の十分な転写を包含する。発現産物は、それに限定されないが、純粋なタンパク質（ポリペプチド）、糖タンパク質、脂質タンパク質、リン酸タンパク質、または核タンパク質を含むタンパク質が挙げられる。発現産物は、ＲＮＡでもありうる。核酸配列は、核酸カセット内に含まれる。核酸の発現は、継続的であるか、または内因性または外因性刺激によって制御されうる。
【００１４】
ここに使用される場合、語句「制御」または「制御された」は、治療効果が得られるような十分に高いレベルで遺伝子産物（タンパク質またはＲＮＡ）の発現に関する。治療効果に十分であるレベルは、毒性レベルより低い。選択された組織内での治療効果についての発現のレベルは、取込の再生可能な速度論、細胞からの排出、後期翻訳プロセシング、および遺伝子発現のレベルに、そしてある種の例では、ある種の内因性または外因性刺激（例えば、ホルモン、薬）に対する反応での制御された発現に対応する。
ここに使用される場合、語句「核酸カセット」は、タンパク質またはＲＮＡをコードする目的の遺伝材料に該当する。核酸カセットは、カセット内の核酸が、ＲＮＡに転写され、そして必要な場合、形質転換組織または細胞内でタンパク質に翻訳されうるような、ベクター内で、位置的に、そして順次配向される。好ましくは、カセットは、ベクターへの既成の挿入に適合した３’および５’末端を有し、例えば、それは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。
【００１５】
ここに使用される場合、語句「組織」は、特に機能を働かすために特化された細胞の集合に該当するか、または単層細胞を包含しうる。細胞は、同じタイプのものであっても、異なるタイプのものであってもよい。
好ましい実施の形態では、核酸は、転写制御配列に転写作用的に連結したコーディング領域を含有する。
この意味あいで、「転写作用的に連結した」は、転写に適切なシステムで、転写が、制御配列の指示の下に開始し、その制御配列（類）と転写可能に連結している配列を通して進行することを意味する。好ましくは、生じる翻訳産物を変化させるような、生じる転写産物でなされる突然変異はない。
【００１６】
語句「コーディング領域」または「コーディング配列」は、正常な塩基対およびコドン用法関係にしたがって、その発現が望まれる特定の遺伝子産物をコードする核酸配列に該当する。したがって、コーディング配列は、適切な長さの転写産物が産生される転写制御配列（おそらく、制御要素および翻訳開始および終止コドンを含めた）に対してこのような関係で配置されるに違いなく、そして機能的に所望される産物を産生する適切な読取枠での翻訳を生じる。
語句「転写制御配列」は、転写作用的に連結されたコーディング領域の転写の速度を制御する配列に該当する。したがって、その語句は、プロモーター、オペレーターおよびエンハンサーのような要素を包含しうる。特定の転写単位について、転写制御配列は、少なくともプロモーター配列を包含する。
好ましい実施の形態では、プラスミドは、好ましくはヒト成長ホルモン遺伝子から得られる成長ホルモン３’未翻訳領域をも含有しうる。
【００１７】
「成長ホルモン３’未翻訳領域」は、材料ポリペプチドをコードする領域の下流（すなわち、３’）に配置され、そして成長ホルモン遺伝子、好ましくはヒト成長ホルモン遺伝子から得られる天然の３’ＵＴＲ／ポリ（ａ）シグナルの少なくとも一部の配列を含めた配列である。この領域は、一般に転写されるが、しかし翻訳されていない。真核生物の細胞での発現については、ポリＡ尾部の付加の信号を発する配列を包含することが一般に好ましい。他の合成遺伝要素と同様に、合成３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルは、自然に生じるＵＴＲ要素と異なる配列を有する。配列は、例えば、ＡＬＵ繰返し配列の欠失によって修飾されうる。このようなＡＬＵ繰返し配列の欠失は、形質移入細胞での発現カセットとゲノム材料の間の相同な組換えの可能性を減じるために作用する。
プラスミドは、好ましくはプロモーター、ＴＡＴＡボックス、Ｃａｐ部位および最初のイントロンおよびコーディング配列の発現についての適切な関係でのイントロン／エキソン境界を包含する。プラスミドは、プロモーターとコーディング配列との間に挿入された５’ｍＲＮＡリーダー配列および／またはニワトリの骨格α−アクチン遺伝子から得られるイントロン／５’ＵＴＲも包含されうる。さらに、プラスミドはここに記述されるプラスミドの内の任意のプラスミドのヌクレオチド配列と同じものであるヌクレオチド配列を有しうる。
【００１８】
プラスミドは、（ａ）第一の５’−未翻訳領域、第一のイントロン、第一のコーディング配列および第一の３’−未翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルに転写作用的に連結した第一の転写制御配列を含む第一の転写単位、および（ｂ）第二の５’−未翻訳領域、第二のイントロン、第二のコーディング配列および第二の３’−未翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルに転写作用的に連結した第二の転写制御配列を含む第二の転写単位も包含しうる。ここで、第一のイントロンは制御配列と第一のコーディング配列との間にあり、第二のイントロンは制御配列と第二のコーディング配列との間にある。
さらに、インライン混合装置は、その内の少なくとも１つが、配合剤である１つまたはそれ以上の他の液体を含みうる。配合剤は、好ましくは、液体、ペプチド、高分子またはユーロピウムのような小型分子である。一実施の形態においては、配合剤は、保護的で相互作用性の非縮合化合物でもある。
【００１９】
好ましい実施の形態では、配合剤は、非縮合高分子、油および界面活性剤である。これらは、核酸の局在化生物利用性を長期化する化合物としての用途に適しうる：ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルコール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ポリビニルアセテート；ポロキサマー（プルロニックス(Pluronics)）（ポリエチレンオキシドとエチレンオキシドとのブロック・コポリマー、２つのサブユニットの相対量は、様々なポロキサマーで変化しうる）；ポロキサミン（テトロニックス(Techronics)）；エチレンビニルアセテート；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースの塩を含めたセルロース；ヒアルロネートの塩；アルギネートの塩；ヘテロポリサッカライド（ペクチン）；ホスファチジルコリン（レシチン）；ミグリオール；ポリ乳酸；ポリヒドロキシ酪酸。さらに好ましくは、これらの化合物のいくつかは、保護的な相互作用性非縮合化合物（ＰＩＮＣ）として、そして他方は、持続性放出化合物として使用でき、そして考えられる一方で、あるものは、個々に適切な条件下で、いずれかの方法で使用されうる。
【００２０】
「核酸の局在化生物的利用能を長期化する」によって、配合剤を含む組成物中で生物に投与される核酸が、そのような化合物なしの組成物中で投与される場合、例えば生理食塩溶液中で投与される場合より長い期間、細胞による取込に利用可能であることが意味される。細胞に対する核酸のこの利用能の増大は、例えば、核酸を含む組成物と細胞との間の接触の期間が増加されたことによるか、またはヌクレアーゼによる攻撃からの核酸の保護により生じえたはずである。核酸の局在化生物利用性を長期化する化合物は、内部投与に適している。
「内部投与に適している」によって、化合物が、生物の組織内に、例えば筋肉内にまたは関節空間内に、表皮に、皮内にまたは皮下に投与されることに適していることが意味される。化合物を内部投与に適切にさせる特性としては、例えば、全体として生物に対して高濃度の毒性の不在が挙げられる。
【００２１】
別の実施の形態では、陽イオン性脂質、ペプチドまたはリポペプチドのような陽イオン縮合剤、または例えば、デキストラン、キトサン、デンドリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリリシンは核酸分子と合体でき、そして形質移入を促進しうる。
ＰＩＮＣは生体内での哺乳類細胞への核酸分子の送達を増強し、そして好ましくは、核酸分子としては、細胞中で発現されるべき遺伝子産物についてのコーディング配列が挙げられる。多くの場合に、関連遺伝子産物は、ポリペプチドまたはタンパク質である。好ましくは、ＰＩＮＣは、その結果ＰＩＮＣが、ゲルを形成しないか、またはゲル形態が約３０−４０℃での投与のときに存在しないような条件下で使用される。したがって、これらの組成物で、ＰＩＮＣは、３０％（ｗ／ｖ）またはそれ未満の濃度で存在する。特定の好ましい実施の形態では、ＰＩＮＣ濃度は、いっそう低く、例えば２０％またはそれ未満、１０％またはそれ未満、５％またはそれ未満、または１％またはそれ未満である。したがって、これらの組成物は、化合物濃度および機能効果の点で、これらまたは類似の化合物の使用と異なる。こうした化合物は、例えば、植物原形質体のエチレングリコール依存性形質移入、または薬または核酸送達のためのゲルの形成において高い濃度で使用される。一般に、その化合物のあるものは、ある種の条件下でゲルを形成しうるが、ＰＩＮＣはそれらがＰＩＮＣとして使用される条件でゲル形態でない。
【００２２】
保護的で相互作用性の非縮合化合物と関連して、語句「非縮合」は合体核酸が縮合されないか、組成物に使用される濃度でＰＩＮＣとの相互作用により破壊されることを意味する。したがって、ＰＩＮＣは、タイプおよび／または濃度の点で、このような縮合高分子と異なる。一般に使用される縮合高分子の例としては、ポリリシンおよびカスケード高分子（球形ポリチオン）が挙げられる。
ここに使用される場合、語句「保護する」または「保護的」または「保護」は、このような化合物と核酸の分解速度が特定の環境で減少され、それにより核酸分子の局在化生物利用性を長期化するような核酸との間の相互作用の効果に該当する。このような分解は多様な様々の因子による可能性があり、そしてそれは、特に、ヌクレアーゼの酵素的作用が挙げられる。保護的作用は、例えば、ヌクレアーゼ分子の排除によるか、または水の排除により異なる方法で供されうる。
【００２３】
ここに使用される場合、語句「相互作用性」は、ＰＩＮＣと核酸分子とおよび／または細胞壁構成要素との間の相互作用に該当する。好ましくは、ＰＩＮＣ高分子は、核酸分子部分および／または細胞壁構成要素の一部と直接相互作用する能力がある。これらの相互作用は、例えば、ＰＩＮＣと、細胞壁との間の生化学的相互作用の結果として、核酸分子−ＰＩＮＣ複合体を細胞壁と密接に合体させるのを助けることにより、トランスフェクションを促進でき、そしてそれによりトランスフェクションを実現する。これらの相互作用は、核酸分子と密接に合体することによって、ヌクレアーゼからの保護を供すこともできる。
さらに、このような化合物および合体した核酸分子との関連で、語句「送達を増強する」は、少なくともＰＩＮＣおよび核酸の量が最適にされるような条件で、生理食塩水中の核酸の送達で得られるより多くの生物学的効果が得られることを意味する。したがって、核酸によってコードされた遺伝子産物の発現が望まれる場合に、ＰＩＮＣ：核酸組成物で得られる発現のレベルは特定のＰＩＮＣ／コーディング配列の組合せに適切な方法による送達について生理食塩水中の核酸の同じ量で得られる発現より大きい。
【００２４】
上の組成物の好ましい実施の形態では、ＰＩＮＣは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰＶＰ−ＰＶＡコポリマー、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭ２Ｐ）、エチレングリコールまたはプロピレングリコールである。ポロキシマー（プルロニックス）が使用される組成物では、核酸はウイルス性ベクターでないことが好ましく、すなわち、核酸は非ウイルス性ベクターである。
他の好ましい実施の形態では、ＰＩＮＣが標的リガンドと結合される。このような標的リガンドとしては、多様な様々のタイプのものがあり、限定的ではないが、ガラクトシル残基、フコサル残基、マンノシル残基、カルンチチン(carntitine)誘導体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ペプチドリガンドおよびＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。標的リガンドは、抗原存在細胞、肝細胞、筋細胞、表皮細胞、内皮細胞および癌細胞のような細胞でレセプターと結合しうる。
【００２５】
標的リガンドとＰＩＮＣとの合体と関連して、語句「と結合した」は、物理的合体が熱動的に好まれるように成分が互いに相互作用を示し、それによりその合体について自由エネルギー機能で少なくとも局在の最低限度が表されることを意味する。このような相互作用は、共有結合またはイオン及び水素結合、ファンデンワールス相互作用、疎水性相互作用およびそのような相互作用の組合せのような非共有相互作用を含む。
標的リガンドが、種々のタイプのものでありうる一方で、１つの実施の形態では、リガンドは抗体である。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が利用できる。
【００２６】
核酸は、種々の形態で存在もしうる。好ましくは、核酸は、物理形態を変化させる化合物(類)と合体されないが、しかし、他の実施の形態では、核酸は縮合され（縮合高分子とのように）、陽イオン脂質と配合され、ペプチドと配合されるか、または陽イオン高分子と配合される。
好ましい実施の形態では、保護的な相互作用性の非縮合化合物は、ポリビニルピロリドンであり、および／またはプラスミドは０．５％と５０％の間のＰＶＰ、さらに好ましくは約５％ＰＶＰを有する溶液中にある。ＤＮＡは、好ましくは、少なくとも約８０％のスーパーコイル状であり、さらに好ましくは少なくとも約９０％のスーパーコイル状であり、そして最も好ましくは少なくとも９５％のスーパーコイル状である。
【００２７】
配合剤は、核酸を凍結から保護もし、そして形質移入速度を増加させうる。これらの２つの能力における配合剤の効果は、例えば、溶液を解かせた後に行われる核酸単独と配合剤との両方のゲル電気泳動の結果の比較で見ることができる。配合剤を伴う核酸から得られるゲルは、スーパーコイル状プラスミドの含有率が非常に高いことを示す。したがって、スーパーコイル状プラスミドのこの高い含有率で形質移入速度が高くなる。
【００２８】
ここに使用される場合、語句「配合剤」は核酸と複合体を形成する剤に該当する。この分子複合体は共有結合または非共有結合手段のいずれかで核酸分子と合体する。配合剤は安定な状態で核酸分子を輸送し、そして細胞内部に結合した核酸分子を放出する能力があるべきである。ＤＮＡ抽出法、免疫蛍光の方法または例えばＣＡＴ、またはＬａｃＺ含有プラスミドのようなよく知られたレポーター遺伝子方法は、形質移入効率を決定するために使用できた。配合剤は核酸分子と合体され、そして凍結または凍結乾燥および送達前に再水和される能力もあるべきである。
【００２９】
さらに、配合剤は、エンドソーム溶解により核酸分子のリソソーム分解を防止できる。さらに、配合剤は、細胞の細胞質を通しての核膜への、そして核への核酸分子の効果的な輸送に対処し、そして保護を供しうる。
好ましい実施の形態では、配合剤は所望の遺伝子の発現の期間および／または強度を増強する。
「期間」により、所望の遺伝子が測定されるときに発現される時間の量が意味され、例えば数ヶ月、数週、数日、数時間、数分および／または数秒である。
「強度」により、所望の遺伝子が発現される速度、例えば時間によって分割された質量または容積が意味される。
「発現」により、好ましくは所望の遺伝子または核酸配列の転写および翻訳によってコードされた産物の産生が意味される。
「所望の遺伝子」により、配合された核酸複合体を使用して個体により所望される産物をコードするあらゆる遺伝子または核酸配列に該当することが意味される。所望の遺伝子の例としては、ＣＡＴおよびＩＬ−２および全ての他のサイトカインのような治療剤（疾病の１つまたはそれ以上の徴候を少なくとも部分的に減少または防止する能力のある）並びに細胞内タンパク質（例えば、チマジンキナーゼ）が挙げられる。
【００３０】
語句「サイトカイン」は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γのような免疫原性タンパク質の従来認識された群に該当することが意味される。
配合剤は、１つまたはそれ以上のポリビニルピロリドン、１つまたはそれ以上の陽イオン性脂質、天然の共脂質を有する１つまたはそれ以上の陽イオン性脂質、１つまたはそれ以上のリポソーム、１つまたはそれ以上のペプチド、および１つまたはそれ以上のリポペプチドから構成される群から選択されるのが好ましい。
【００３１】
好ましくは、陽イオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、そして天然の共脂質はコレステロール（ｃｈｏｌ）である。ＤＯＴＭＡは、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパンであり、そしてそれは、１９９０年１月２０日に特許されたエプシュタイン(Eppstein)外の米国特許第４，８９７，３５５号に記載および検討されている。この特許はここにおいて文献援用される。しかし、他の脂質および脂質の組合せは、他の実施の形態で使用しうる。多様なこのような脂質は、ガオ（Gao)およびハング(Huang)のGene Therapy  ２巻：７１０−７２２頁、１９９５年に記述されている。この文献はここにおいて文献援用されている。他の陽イオン性脂質送達技術は、１９９７年１０月１４日に特許された、「外来遺伝子に機能発揮させる生体内の送達の方法(Method of In Vivo Delivery of Functioning Foreign Genes)」という名称のブリガム(Brigham)の米国特許第５，６７６，９５４号（Lyon & Lyonの整理番号216/012号)に記述されている。この特許は全ての図面を含めてその全体がここにおいて文献援用されている。
【００３２】
陽イオン性脂質およびＤＮＡの荷電比も、際立った因子である場合、好ましい実施の形態では、ＤＮＡおよび陽イオン性脂質は陽荷電に対する陰荷電比が、１：０．１と１：１０の間、好ましくは１：０．３と１：６の間、さらに好ましくは約１：３であるような量で存在する。好ましい場合、その比が１：３であることは必要でない。したがって、好ましくは、組成物についての荷電比は約１：０．１と１：１０の間、さらに好ましくは約１：０．３と１：６の間である。
語句「陽イオン性脂質」は生理学的ｐＨで総陽荷電を示し、そして好ましくはそのようなｐＨで陰荷電を担持しない脂質に該当する。このような脂質の例は、ＤＯＴＭＡである。同様に、「天然の共脂質」は生理学的ｐＨで通常に荷電されていない脂質に該当する。このような脂質の例はコレステロールである。
【００３３】
したがって、ＤＮＡおよび陽イオン性脂質についての「陰対陽荷電比」は、陽イオン性脂質における総陽荷電に比べたＤＮＡにおける総陰荷電の間の比に該当する。
ＤＮＡの形態が発現効率に影響を及ぼす場合、ＤＮＡは、好ましくは、少なくとも約８０％スーパーコイル状、さらに好ましくは少なくとも９０％スーパーコイル状、そして最も好ましくは少なくとも９５％スーパーコイル状である。好ましくは、組成物としては基本的に約１０％ラクトースから構成される等張炭化水素溶液のような等張炭化水素溶液が挙げられる。好ましい実施の形態では、陽イオン性脂質および天然の共脂質がリポソームとして製造される組成物は２００と９００ナノメーター、さらに好ましくは約８００ナノメーターの排除サイズを示す。好ましくは、リポソームは約２０と８００ｎｍの間、さらに好ましくは約５０と４００ｎｍの間、さらにいっそう好ましくは約７５と２００ｎｍの間、そして最も好ましくは約１００ｎｍの平均直径を示すように製造される。微細流動化は、リポソームの製造の好ましい方法である。
【００３４】
第二の態様では、本発明は、上に記述されるように核酸分子を含むインライン混合装置を作る方法を特徴とする。方法はインライン混合装置に核酸分子を添加する段階を包含する。
２つの入口の間の角度は、好ましくは、４５と３００度の間、さらに好ましくは９０と２４０度の間、そして最も好ましくは１２０と１８０度の間である。
【００３５】
第三の態様では、本発明は、好ましくは、液体が継続して混合されるインライン混合装置中で核酸分子を１つまたはそれ以上の他の脂質（エマルジョン、コロイド性懸濁液および他の溶液）と混合する段階に関与するインライン混合装置を使用する方法を特徴とする。液体が混合されるとき、それらは、好ましくは、連続のシリンジ様手段で液体を添加しながら、ポンプを介してＹ型形状に加えられるべきである。液体は、配合物の凝集を最適に防止するために、特定のレイノルド数で、好ましくは３７３より大きく、さらに好ましくは５６０より大きく、最も好ましくは７４６より大きい数で添加されうる。非ニュートンのフロー（混合で作りだされた撹乱で１，０００より大きなレイノルド数）が可能でありうる。
「レイノルド数」により、装置での内部力を装置内での粘性力によって割った商であることが意味される。
【００３６】
好ましい実施の形態では、液体は、好ましくは１００ｎｍより小さいかまたは等しい、さらに好ましくは７５ｎｍより小さいかまたは等しい、最も好ましくは５０ｎｍより小さいかまたは等しい、好ましい均一サイズの粒子を有する実質的に均一な混合物を生成する条件下で混ぜうる。
「均一サイズ」によって、複合体中の粒子の大半はおよそ同じサイズであり、そして特定の値より小さいことが意味される。均一サイズのものであるために、粒子は同一のサイズである必要はないが、しかし予測サイズより均一に小さい。別の実施の形態では、核酸分子の液体を、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の他の液体と混合しうる。
【００３７】
第四の態様では、本発明は、ベクター中の核酸を凍結から核酸分子を保護する配合剤と同時凍結乾燥することによって生成された同時凍結乾燥複合体を特徴とし、そして形質移入速度は増大される。
「同時凍結乾燥」によって、それにより、２つまたはそれ以上の液体の混合物が溶液での核酸の不安定性に対して保護するために凍結乾燥される過程であることが意味される。脱水は、好ましくは、生成物が、凍結状態で、そして真空下であるときに起こる。他の材料の凍結乾燥に関する基本的理論、設備および方法論はよく知られており、したがって当業者は、有効な凍結乾燥のための適切なパラメーターを容易に選択できるであろう。ＦＴＳシステムズ、冷凍乾燥／凍結乾燥の基本的理論、製品支援情報、会報番号１番：１−１９；ナイル(Nail)外、Develop.Biol.Standard.、７４巻、１３７−１５１頁（１９９１年）；ジェニングス(Jennings)外、Ｄ＆Ｃｌ、４３−５２頁（１９８０年）；Ｒｅｉｔｅｒ、アメリカン・ラボラトリー、「実験室／研究用の凍結乾燥装置における際だった設計変更(Significant Design Changes in Laboratory/Research Freeze Dryers)」（１９９１年）；トンプソン(Thompson)外、InTech、「凍結乾燥のための革新的装置(Evolving Instrumentation for Freeze-Drying)」、（１９９５年）；ジェニングス、Journal of Parenteral Science and Technology、４２巻：１１８−１２１頁（１９８８年）；ジェニングス、ＭＤ＆ＤＩ、４９−５６頁（１９８０年）；リブゼイ（Livesey)外、Journal of Parenteral Science & Technology、４１巻、５号：１６９−１７１頁（１９８７年）；ジェニングス、Journal of Parenteral Science & Technology、９５−９７巻頁（１９８６年）；レブロン(Leebron)外、Journal of Parenteral Science & Technology、３５巻、３号：１００−１０５頁（１９８１年）；ウィリアムズ(Williams)外、Journal of Parenteral Science & Technology、４０巻、４号：１３５−１４１頁（１９８６年）；ロイ(Roy)外、Research Article、４３巻、２号：６０−６６頁（１９８９年）；アームストロング(Armstrong)、Journal of Parenteral Drug Association、３４巻、６号：４７３−４８３頁（１９８０年）；ジェニングス、Journal of Parenteral Drug Association、３４巻、１号：６２−６９頁（１９８０年）、参照。これらの文献は全ての図面を含めてそれらの全体がここに文献援用される。
【００３８】
好ましい実施の形態では、配合剤は保護的で相互作用性の非縮合化合物でありうる。特に好ましい実施の形態では、配合剤は、好ましくは、少なくとも２．５％の濃度または少なくとも８０ｋＤａの分子量で予め中和したポリビニルピロリドンでありうる。配合剤は約１対１７の配合剤と重量対重量比で存在するポリビニルアルコールでもありうる。好ましい実施の形態では、複合体は、核酸配列を最大限にするために、好ましくは３．５から９．０、さらに好ましくは６．５から８．０のｐＨを示す溶液で存在する。
他の好ましい実施の形態では、複合体は、抗微生物剤、抗酸化剤、緩衝液または凍結防御物質も包含しうる。
【００３９】
「抗微生物剤」によって、微生物の成長を破壊または阻害する能力のあるあらゆる化学品または化合物が意味される。好ましい実施の形態では、抗微生物剤は塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、オラセテートでありうる。
「抗酸化剤」によって、酸化を阻害する化学的化合物または物質が意味される。好ましい実施の形態では、抗酸化剤はアスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、システイン、亜硫酸水素ナトリウムまたはグルタチオンでありうる。
「緩衝液」によって、酸または塩基がその溶液に添加されるときに溶液のｐＨにおける変化を最小限にする物質が意味される。好ましい実施の形態では、緩衝液は、酢酸および塩、コハク酸およびボラックス、ホルメートおよびＨＣｌ、またはクエン酸Ｎａ緩衝液でありうる。
「凍結防御物質」によって、凍結中に物質を保護する役割を果すあらゆる化学品または化合物が意味される。好ましい実施の形態では、凍結防御物質は、ラクトース、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはポリビニルピロリドンでありうる。
【００４０】
第五の態様では、本発明は、好ましくは、核酸分子の液体と液体配合剤とを混ぜることによって作られる同時凍結乾燥複合体の作製を特徴とする。好ましくは、２つの液体にインライン混合装置を通過させ、そして継続して混合する。液体は、配合物の凝集の最適な防止のために、特定のレイノルド数で、好ましくは３７３より大きな、さらに好ましくは５６０より大きな、最も好ましくは７４６より大きなレイノルド数で添加されうる。好ましい実施の形態では、液体は、好ましくは１００ｎｍより小さいかまたは等しい、さらに好ましくは７５ｎｍより小さいかまたは等しい、最も好ましくは５０ｎｍより小さいかまたは等しい、好ましい均一サイズの粒子を有する実質的に均質な混合物を生成する条件下で混ぜることができる。別の実施の形態では、核酸分子の液体を１つ、２つ、３つまたはそれ以上の他の液体と合せることができる。
【００４１】
第六の態様では、本発明は、再水和によって、インライン混合から得られる複合体を使用する方法を特徴とする。
「再水和」によって、複合体に、液体、好ましくは等張生理食塩水、緩衝液または他の溶液のような医薬上許容しうる溶液を取込ませることが意味される。
【００４２】
第七の態様では、本発明は、上の形態のいずれかで、そのような治療の必要である患者に複合体を投与することによって、障害の治療または防止において複合体を使用する方法を特徴とする。
「投与」によって、体にＤＮＡのベクターまたは担体を導入する経路が意味される。投与は、静脈、筋肉内、局所、経口または遺伝子ガンまたはハイポスプレー器具によりうる。それは、標的組織に直接または全身送達を通してでありうる。投与としては、リポソームによる皮膚への直接遺伝子転移、プロテオリポソーム、リン酸カルシウム共沈殿ＤＮＡ、巨大分子複合体に結合したＤＮＡ、ＤＮＡ輸送媒体、微細推進体にコードされたＤＮＡ、コード化プラスミド、直接微細注射並びに皮膚移植片のような多様な方法が挙げられる。ベクターの直接遺伝子転移を、直接微細注射、針なし注入（参照、バリー(Barry)外、「配合された核酸分子の針なし注入(Needle-Free Injection of Formulated Nucleic Acid Molecules)」、１９９７年１２月６日に出願された米国特許出願第６０／０６９，７５４号、Lyon & Lyonの整理番号２２８／２３０号、すべての図面を含めてその全体がここにおいて文献援用される）、音波穿刺、電気穿刺（参照、マクローリン(MaClaughlin)外、「電気穿刺のための配合物(Formulations for Electroporation)」、１９９８年６月８日に出願された米国特許出願第６０／０８８，６９１号、Lyon & Lyonの整理番号２３４／１４３号、すべての図面を含めてその全体がここにおいて文献援用されている）、リポソーム、プロテオリポソーム、リン酸カルシウム共沈殿、皮膚移植片、レトルウイルス性ベクター、巨大分子複合体に結合したＤＮＡ、ＤＮＡ輸送媒体および微細推進体によって投与できる。投与の経路としては、筋肉内、エアロゾル、経口、局所、全身、眼、腹腔内および／または鞘内のものが挙げられる。例えば、ウー（Woo)外、「ＤＮＡ輸送媒体システムおよび使用の方法(A DNA Transporter System and Method of Use)」（Lyon & Lyonの整理番号２０４／０１５号）という名称の１９９３年３月１９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２７２５号、１９９３年９月３０日に公開された国際公開番号ＷＯ９３／１８７５９号、参照。あらゆる図面および以下の詳細な説明のセクションにおける管理セクションをふくめて、その全体がここで文献援用される。
【００４３】
「治療」により、細胞または組織による核酸の発現の目的のために、所望の核酸を細胞または組織に送達することにより、ここに記述されるとおりの核酸の投与が意味される。目的の細胞または組織型としては、それに限定されないが、肝臓、筋肉、肺、内皮、関節、皮膚、骨、腫瘍および血液が挙げられる。
「防止する」によって、そのような障害を発現することに至る作用を細胞が競合することを阻害する、障害が、細胞への核酸の送達である有害な作用により起こることを停止または阻止することが意味される。
好ましい実施の形態では、方法は治療上有効な量の複合体を提供することに関与する。
【００４４】
組成物の「治療上有効な量」は、疾病または症状の徴候または指標において少なくとも一過的な開放または改善を引起すのに十分である量である。したがって、その量は製薬学的効果を起すのにも十分である。組成物の量は全ての徴候または指標の永続的改善または改善を起さない必要がある。治療上有効な量の癌療法剤は転移性疾病（すなわち、転移の数またはそれらのサイズ）の症例にかけられた全体の腫瘍を減少させるもの、または局在癌における腫瘍の質量を減少させるものである。
治療されるべき障害は、局在または全身性疾病または症状でありうる。
「局在」疾病または症状は、体の定義され、そして限定された領域に対する特定の神経または筋肉損傷または萎縮があるものに該当する。特別の例は、非活動性萎縮である。
「全身性」疾病または症状は体の内の全ての生物に関連するか、または多数の位置で広範に配分されるものに該当する。例としては、成長障害、神経細胞障害および筋ジストロフィーが挙げられる。
【００４５】
第八の態様では、本発明は、上の形態の内のいずれかで、生物、好ましくは動物に投与することによって複合体を送達する方法を特徴とする。
「送達」または「送達すること」によって、所望の細胞または任意の細胞への核酸分子の送達が意味される。核酸分子は所望の標的を含めて複数のセルラインに送達されうる。送達で、核酸分子は細胞表面、細胞膜、細胞エンドソームと、細胞膜内に、核と、または形質移入が、それに限定されないが、腫瘍細胞、表皮細胞、ランゲルハンス細胞、ラングハンス細胞、沿岸細胞、角膜細胞、樹状細胞、マクロファージ細胞、クップファー細胞、筋肉細胞、リンパ球、リンパ節を含むことができる多様なセルライン内で起こりうる任意の他の所望の領域内に接触を生じるようになる。
【００４６】
好ましくは、ベクターは投与後に所望の標的細胞と接触の状態になってくる。上に特記されたとおり投与は、細胞への針注入、流動空間、または血管、電気穿刺、形質移入、ハイポスプレー、イオン電気導入法、粒子衝撃、または半ビボ(ex vivo)で遺伝的に修飾された細胞の移殖に関与しうる。投与の例としては、静脈内、筋肉内、エアロゾル、経口、局所、全身性、眼、腹腔内および／または鞘内が挙げられる。
上記のベクターの投与のための好ましい手段は、遺伝子発現が生じうる標的細胞の核へのベクターの侵入を増強する脂質、タンパク質、炭化水素、合成有機化合物、または無機化合物のような要素とベクターが合体する標的細胞への送達のための配合物の使用に関与する。特定の例は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【００４７】
ここで使用される場合、語句「配合物」は、組織へのベクターの送達、組織内の細胞による取込、核への膜、エンドソームまたは細胞質を通した細胞内の輸送、細胞外または細胞内区分でのベクターの安定性、および／または細胞による遺伝材料の発現を増強する溶液、懸濁液、またはコロイド中でベクターと混合される非遺伝材料に該当する。
【００４８】
本発明の好ましい実施の形態では、ベクターおよび配合物は懸濁液またはコロイドとして投与されるナノ粒子を包含する。配合物としては、脂質、タンパク質、炭化水素、合成有機化合物、または無機化合物が挙げられる。配合物に含まれる要素の例は、標的細胞の表面でリポソーム、陽イオン性脂質、親水性高分子、ポリ陽イオン（例えば、プロタミン、ポリブライン、スパミジン、ポリリシン）、ペプチド、または合成リガンド認識レセプターを形成する能力のある脂質、エンドソーム溶解を誘導する能力のあるペプチドまたは合成リガンド、核、ゲル、遅延放出マトリックス、塩、炭化水素、栄養、または溶解性または不溶性粒子に対する材料を標的にする能力のあるペプチドまたは合成リガンド、並びにそのような要素の類似体または誘導体である。これは、細胞への遺伝材料の送達、取込、安定性および／または発現を増強する配合要素を包含する。このリストは、例示のみのために含まれ、そしていかなる方法にも制限されることが意図されない。
【００４９】
ここで使用される場合、語句「生物」は、当業界で通常の技術を有する者による一般的用法に該当する。生物としては、酵母または細菌のような微生物、植物、鳥類、爬虫類、魚類または哺乳類を挙げることができる。生物は、付添い動物または家畜でありうる。好ましくは、生物は、哺乳類であり、したがって、任意の温血生物である。さらに好ましくは、哺乳類はヒトである。
ここで使用される場合、語句「付添い動物」は、例えばイヌ、ネコ、ウマ、トリ、爬虫類、マウス、ウサギ、ハムスターおよび同等物のような「ペット」として伝統的に見なされるような動物に該当する。
ここで使用される場合、語句「家畜」は、「付添い動物」と考えられるもののような動物が、ブタ、ニワトリ、カモ、ウシ、ヤギ、ラムおよび同等物のような動物と共に含まれる飼いならされたと伝統的に考えられるような動物に該当する。
【００５０】
別の具体例では、方法は、核酸分子によってコードされたタンパク質産物について標的にされる、例えば抗体応答のような免疫応答、好ましくは体液性免疫応答を生じる。他の状況で、免疫応答は、好ましくは、細胞毒性Ｔリンパ球応答である。
ここで使用される場合、語句「免疫応答」は、外来材料が内在化されるときに起こりうる哺乳類の自然防御機構に該当する。免疫応答は、それらの全体として免疫系構成要素に関与する全体的免疫応答である。好ましくは、免疫応答は、配合された核酸分子によってコードされるタンパク質産物から生じる。免疫応答は、それに限定されないが、抗体産生、Ｔ細胞増殖／分化、細胞毒性Ｔリンパ球の活性化、および／またはナチュラルキラー細胞の活性化でありうる。好ましくは、免疫応答は、体液性免疫応答である。しかし、上に特記されるとおり、他の状況で、免疫応答は、好ましくは、細胞毒性Ｔリンパ球応答である。
【００５１】
語句「体液性免疫応答」は、内在化外来材料に応答した抗体の産生に該当する。好ましくは、外来材料は、配合された核酸分子によってコードされたタンパク質産物である。
好ましい具体例では、その方法は、細胞のトランスフェクションが増強されることを生じる。増強されたトランスフェクションは、例えばＣＡＴ遺伝子産物活性、またはＬａｃＺ遺伝子産物活性、および同等物についてのアッセイのような当業界で一般に知られるトランスフェクションレポーター法によって測定できる。
【００５２】
ここで使用される場合、語句「有効量」は、ヒト、動物または組織培養に投与されて、適切な濃度のタンパク質またはＲＮＡを産生するのに十分なベクターに該当する。当業者は、適切な濃度のタンパク質またはＲＮＡが、特定のベクターの使用に依存することを認識する。これらの濃度は、投与および治療またはワクチン接種のタイプに依存して異なる。
ここに開示されるとおり疾病を治療する方法としては、治療されるべき疾病が、タンパク質に、全般的循環から体じゅうに循環させることを要求する、生物学的産物（特に、上に定義されたとおりのタンパク質）を用いた治療が挙げられる。例えば、本発明によって治療されうる疾病としては、ＧＨＲＨまたはその結合タンパク質の発現による骨粗鬆症が挙げられる。種々の疾病を治療するための適切なタンパク質の選択は、当業者に明らかである。
疾病を治療する上で、本発明は、（１）治療効果を得るために十分に高い濃度の特定のタンパク質；（２）利用効果のために十分であり、そして毒性濃度より低い制御された発現；（３）再生可能な薬物動態学および遺伝子発現の濃度を得るために、特定の組織における制御された発現；および（４）遺伝子操作され、および選択された細胞の移殖よりむしろ臨床的にそして医薬上許容しうる投与および配合の手段を用いた送出を達成するための手段を提供する。
【００５３】
第九の態様で、本発明は、各複合体が、実質的に均一サイズの粒子を有する上で特定された複合体の内のいずれかの複数である均質な混合物を特徴とする。好ましい具体例では、その複合体の各々は、およそ球形であり、そして好ましくは５００ｎｍまたはそれ未満、さらに好ましくは２００ｎｍまたはそれ未満、最も好ましくは１００ｎｍまたはそれ未満の直径を示す粒子を有する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、キットを特徴とする。キットとしては、好ましくは容器中の、および／またはどのように配合核酸分子を送出するかを説明する指示と共に本発明の配合核酸複合体が挙げられる。
したがって、「容器」は、当業界で通常の技術を有する者が、配合核酸分子を使用するのを可能にするために、与えられる指示を含みうる。その指示は、配合核酸分子を使用する段階を与える。さらに、指示は、配合核酸分子が損傷を受けるかどうかの証明を必要とする配合核酸分子を試験する方法を包含しうる。キットは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が認可した用途および指示の通知をも含みうる。
【００５５】
別の態様では、本発明は、キットを作製する方法を特徴とする。好ましくは、その方法は、配合剤と配合された核酸と、容器を合せる段階および／または指示を含む。
別の態様では、本発明は、本発明の配合核酸複合体でトランスフェクションまたはトランスフォームした細胞、およびそのものを作製および使用する方法を特徴とする。
ここで使用される場合、語句「トランスフェクション（形質移入）」は、ＤＮＡ（例えば、配合されたＤＮＡ発現ベクター）を細胞に導入し、それにより細胞の形質転換を可能にする過程に該当する。細胞に入ることに続いて、トランスフェクションされたＤＮＡは、（１）宿主のものとの組換え；（２）プラスミドまたは鋳型ファージとして独立に複製するか；または（３）排出の前に複製なしにエピソームとして維持されうる。
ここで使用される場合、語句「トランスフォーム（形質転換）」は、その細胞によるベクターの取込によって誘導される細胞の特徴（発現された表現型）における一過性または永久的変化に関する。遺伝材料は、それが特定の遺伝子産物を発現するか、または内在遺伝子産物の発現または効果を改変させる形態で細胞内に導入される。
【００５６】
細胞の形質転換は、タンパク質およびＲＮＡを含む多様な遺伝子産物の産生に関連しうる。これらの産物は、細胞内または細胞外の構造要素、リガンド、ホルモン、神経伝達物質、成長制御因子、酵素、化学走性、血清タンパク質、レセプター、小型分子量化合物のための担体、医薬、免疫調節剤、癌遺伝子、サイトカイン、腫瘍抑制剤、毒素、腫瘍抗原、抗原、アンチセンス阻害剤、三重鎖形成阻害剤、リボザイム、またはそれらの活性を修飾する目的のための細胞の構造におけるリガンド認識特異的構造決定基として機能しうる。このリストは、単なる例であり、そして限定するべき手段ではない。
上に記述される本発明の要旨は、限定されず、そして本発明の他の特徴および利点は、好ましい具体例の以下の詳細な説明から、並びに請求項から明らかである。
図面は、必然的に目盛りをつけることはない。本発明の特定の特性は、規模で過大視されるか、または明瞭さおよび簡潔さの目的で模式図形態で示されうる。
【００５７】
【好ましい実施形態の詳細な説明】
本発明は上記のように、概略としてプラスミドの便宜的な投薬形態への組み込みに関し、さらに詳しくは所望の物理的特性を有するシングル・バイアル均質化プラスミド／ポリマー複合体の生成に関する。このような複合体を作製し、貯蔵しそして利用する方法もまた提供されており、以下に詳細に説明する。このような生成物と方法は化学的な分解及び／もしくはその組成物の物理的な凝集を阻止され、比較的容易な投与をもたらす、より便宜的でコスト的に有効な複合体を提供するものである。つまり、本発明はプラスミドの配送とこのプラスミドの便宜的な投薬形態への組み込みとについてより有効な複合体を提供するものである。
【００５８】
Ｉ．配合物の調製
Ａ．イン・ライン(In-Line)混合
混合方法は一般にここで記載するようにして行われるのが好ましい。ＤＮＡ／脂質配合物のような複合体の混合は多くの方法で行うことができる。旧来的あるいは便宜的にはこれら２つの単に互いに混合することで行われる。これはこれら２つを混合するには有効ではあるが、複合他が様々なサイズの粒子を有することとなる。つまり、イン・ライン混合を利用した混合ではより均一なさいずの粒子を有するより均質な混合物が有られるのである。
【００５９】
イン・ライン混合装置には多くのタイプのものが有り、これらの殆どは混合する２つの液体が短時間で互いに接触するという事実において一般的に特徴付けられている。液体がイン・ラインで混合されている時の液体の添加は多くの様々な方法で行われる。ジェット混合装置では、液体の一方が他方の液体の流れのストリームに送り出され、液体は両者とも送り出されたものである。インジェクタにおいては、一方の液体の流れは他方の液体の流れによってもたらされるものであり、多数派側の液体だけが比較的大きな速度で送り出されるだけである。別のタイプのイン・ライン混合ポンプでは両液体がパイプ内の狭窄部を通され、その圧力降下がディスパージョンを作るのに部分的に利用される。これらの狭窄部は単一や一連でのオリフィスやノズルであることができる。バルブを利用することによってオリフィス式混合装置を調節可能とすることができる。一般に、イン・ライン混合においては、液体は送り出されるものである。最も広範に利用されているのは遠心ポンプであり、そこでは流体はポンプの吸入側に供給される。Perry’s Chemical Engineers’ Handbook, section 21, 第５７〜５９頁（１９８４年第６版）を参照されたい。
【００６０】
本発明におけるイン・ライン混合装置は２つの液体を混合するために互いに合流するＹ−字形の２つの入口を備えた装置を有している。液体はこれらの入口で加えられ、２つの液体が合流するとこれらはその後すぐさま好ましくは静的混合によって混合される。静的混合を利用する理由は、それが制御可能であり、計測可能であり、かつ再現性が有るからである。便宜的なバッチ供給式の混合では連続的ないしは計測可能な結果は生じ得ない。
【００６１】
Ｂ．核酸配合物
核酸分子の配合物はここで開示するようにして調製され、一般にはプラスミドと配合剤との重量比が（１：３０）と（１：１）の間、好ましくは１：２０と１：７の間、さらに好ましくは約１：１７もしくは約１：１０のものが利用される。例えば食塩水での多くの配合物における核酸の搬送と発現は、例えばヌクレアーゼのような器官の細胞構成物による核酸の分解によって制限される。つまり、生体内で搬送される際に核酸を保護することによって、生じるところの発現を著しく高め、それによって、所望の薬理学的或いは治療学的効果を高めることとなる。溶液中において核酸（例えばＤＮＡ）と相互作用はするが核酸を凝結させないような或る種の化合物によって、核酸に対する生体内保護が与えられ、それによって、コード化された遺伝子生成物の発現を高めることが見出された。これらの化合物のいくつかは、”Nucleic Acid Transporters for Delivery of Nucleic Acids into a Cell”と題する、１９９５年６月７日に出願されたSmith et al.によるアメリカ合衆国特許出願第08/484,777号(Lyon & Lyon Docket No. 211/270)；”Nucleic Acid Transporters for Delivery of Nucleic Acids into a Cell”と題する、１９９６年４月２３日に出願されたSmith et al.による国際特許出願第PCT/US96/05679号、(Lyon & Lyon Docket No. 211/270 PCT)；及び”Transporters for Specific Delivery of Macromolecules to Cells”と題する、１９９７年５月２日に出願された、Wadwah et el.によるアメリカ合衆国特許出願第60/045,295号(Lyon & Lyon Docket No. 225/003)が有り、これらは全てあらゆる図面を含み引用によってここに導入する。
【００６２】
プラスミドと相互作用を行いそいてプラスミドを急速な細胞外ヌクレアーゼ分解から保護するように設計された搬送システムの利用はMumper, R.J., et al., 1996, Pharm. Res. 13:701-709に記載されている。そのＰＩＮＣシステムの特徴はプラスミドがそのフレキシビリティーを保ちかつ筋肉を通じて自由に拡散し、一方でヌクレアーゼ分解から保護されることを可能とする、非凝結システムであるということである。このＰＩＮＣシステムについては主に以下で説明するけれども、カチオン脂質をベースとするシステムやＰＩＮＣ及びカチオン脂質の両方を利用したシステムも本発明の範囲内のものであることが理解されよう。
【００６３】
ＰＩＮＣシステムの一般的な構造成分は親水性部分と疎水性部分の両方を有する両親媒性分子である。ＰＩＮＣの親水性部分があることは（水素結合アクセプタ或いはドナー基による）水素結合、ファンデルワールス相互作用及び／もしくはイオン性相互作用によってプラスミドと相互作用を行うことを意味する。例えばＰＶＰ及びＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭ２Ｐ）は水素結合アクセプタであり、ＰＶＡ及びプロピレングリコール（ＰＧ）は水素結合ドナーである。
【００６４】
これら４つの分子は全て様々な（ポリ）アニオン分子との複合体を形成することが報告されている[Buhler V., BASF Aktiengescellshaft Feinchemie, Ludwigshafen, 39-42頁；Galaev Y, et al., J. Chrom. A. 684:45-54 (1994); Tarantino R, et al. J. Pharm. Sci. 83:1213-1216 (1994); Zia, H., et al., Pharm. Res. 8:502-504 (1991)]。ＰＩＮＣシステムの疎水性部分はプラスミドを覆ってその表面をより疎水性にするように設計されている。Kabanov et al.は先にプラスミドの疎水性を高めてプラスミドをヌクレアーゼ分解から保護し、そして生物学的膜に対する親和性を増加させるためのカチオンポリビニル派生物の利用について述べている[Kabanov, A.V., 及びKabanov, V.A., 1995, Bioconj. Chem. 6:7-20; Kabanov, A.V., et al., 1991, Biopolymers 31:1437-1443; Yaroslavov, A.A., et al., 1996, FEBS Letters 384:177-180]。
【００６５】
１．ＰＩＮＣポリマー（ＰＶＰ）とプラスミドとの間の相互作用の概要
上記で説明したような発現システムは適当な場所に搬送された場合の発現についての可能性を提供する一方で、搬送とコンストラクトの分子取込との両方を補助できるのが有益である。つまり、本発明は１つもしくはそれ以上の発現システムコンストラクト（例えば上記のよなＤＮＡプラスミド）と、保護及び相互作用を行う非凝結化合物とを含む特定の配合物をも提供するものである。
【００６６】
プラスミドコンストラクトに関するもう一つの重要な要因は開環(open circular)（ＯＳ）形態よりもむしろスーパーコイル（ＳＣ）形態でのプラスミドのパーセンテージである。
【００６７】
分子モデル化によって、実施例のＰＩＮＣポリマーすなわちＰＶＰはその大部分の溝（groove）内においてプラスミドの基対と水素結合を形成し、ＰＶＰのバックボーンによってプラスミドに疎水性表面を生じさせることが示された。この相互作用はＰＶＰによるプラスミドのζ電位の変調さらには複合プラスミドへの臭化エチジウム介入の抑制とによって裏付けられている。ＰＶＰとプラスミドとの間の明らかな結合はpHと食塩水濃度と相関しており、プラスミド／ＰＶＰ複合体の筋肉内注射の後のβ―ｇａｌ発現に対するこれらのパラメータの影響が示された[Gene Therapyに提出されたMumper, R.J., et al., 1997]。プラスミド／ＰＶＰ複合体の物理化学的特性のまとめが以下の表Ｉに挙げられている。
【表１】
0004538150.tif 000002
【００６８】
２．筋肉内発現の組織学
スライド操作技法を利用したβ−ｇａｌに対する免疫組織化学によりラットの脛側筋肉の全断面にわたるβ−ｇａｌ発現箇所の均一な分布が明らかにされた。ＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミドを食塩水中で組成した時には、非常に局所的な領域がβ−ｇａｌに対して陽性に変色された。プラスミドを食塩水中で注射したときには特に針の管のまわりにβ−ｇａｌ陽性細胞が観察された。これは先に発表された結果と一致している[Wolff, J.A., et al., 1990, Science 247:1465-68; Davis, H.L., et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4-151-9; Davis, H.L., et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4:733-40]。
【００６９】
これと対照的に、１５０mMの食塩中のＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミド／ＰＶＰ複合体（１：１７  w/w）を筋肉内注射した後にはβ−ｇａｌに対する免疫反応が筋肉組織の広範な領域で観察された。陽性筋肉繊維の大部分は筋肉束の縁部に位置していたものと思われる。つまり、ラットの筋肉内におけるβ−ｇａｌに対する変色によって、プラスミド／ＰＶＰ複合体を利用すると、β−ｇａｌに対して変色した筋肉繊維の数が食塩組成物を利用したときに見出される場合よりも約８倍大きいことが示された。また、プラスミド／ＰＶＰ複合体を利用すると、陽性に変色した筋肉繊維がまた筋肉組織の一層大きな領域に亘って観察され、これは筋肉内注射の後に注射したプラスミドが広範に分散した証拠である。
【００７０】
ラットの骨格筋肉内における高められたプラスミドの分配及び発現は、複合による細胞外ヌクレアーゼ分解からの保護と、プラスミド／ＰＶＰ複合体の高浸透圧効果との両方による結果であったというのが一つの結論である。しかしながら、Dowty及びWolff et al.は生理学的容量オスモル濃度の２倍までの容量オスモル濃度は筋肉内における遺伝子発現に大きな影響は与えないということを論証している[Dowty, M.E. 及びWolff, J.A. In: J.A. Wolff (Ed.), 1994, Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer.  Birkhauser, Boston, 82-98頁]。これによって、ＰＶＰ複合によるプラスミドの高められた発現はおそらくはヌクレアーゼ保護によるものであり、浸透圧による効果によるものではまずないということが示唆されている。さらにＰＶＰによるプラスミドの表面の変更（例えば増加した疎水性と減少した負の表面電荷）はまた筋肉細胞によるプラスミドの取り込みを容易にするものである。
【００７１】
３．ＰＩＮＣポリマーの構造−活性関係
ビニルピロリドンとビニルアセテートの一連のコーポリマーの構造とラット筋肉中における遺伝子発現のレベルとの間の直線的な関係が見出されている。また、ＰＶＰにおけるいくつかのビニルピロリドンモノマーを酢酸ビニルモノマーと置換すると、コーポリマーにおいてプラスミドとの水素結合を形成する能力が減少する結果となる。相互作用が減少すると、筋肉内注射の後におけるラット筋肉内の遺伝子発現レベルの減少に至る。コーポリマーにおけるビニルピロリドンモノマー（ＶＰＭ）成分の範囲が減少するに伴い、β−ｇａｌの発現は直線性を減少させた（Ｒ＝０．９７）。
【００７２】
これらのデータによって、pHと粘度とはプラスミドの筋肉細胞への搬送に影響するような最も重要なパラメーターではないことが示されており、その理由はこれらの値は複合体の全てに対して同等なものだからである。これらのデータによりＰＩＮＣポリマーのプラスミドへの結合が高められることによって、筋肉中におけるプラスミドの保護と生物学的利用能とが高められるということが示唆されている。
【００７３】
４．付加的ＰＩＮＣシステム
上記した構造−活性関係は、プラスミドとの相互作用をも高められた新規なコーポリマーの設計に利用することができる。“契機についての相互作用ウィンドウ(an interactive window of oportunity)”が存在することが予測され、それによって、ＰＩＮＣシステムの高められた結合親和力が、プラスミドのヌクレアーゼ分解からのより大きな保護によって、筋肉内注射の後における遺伝子発現をさらに高める結果となる。それ以外ではプラスミドの凝結が生じたり“トリプレックス(triplex)”タイプの形成が生じて、筋肉内における生物学的利用能が減少しひいては遺伝子発現が減少するような理想的な相互作用が存在するものと予測される。
【００７４】
上記で指摘したように、ＰＩＮＣ化合物は一般には疎水性部分と親水性部分との両方を有する両親媒性の化合物である。多くの場合疎水性部分は極性グループによって与えられる。従来技術ではこのような極性グループはピロリドン、アルコール、アセテート、アミンのグループ、或いはCRC Handbook of Chemistry and Physics (第７２版)、編集者David R. Lide、の2-73及び2-74頁、に示されたような異頂環式化合物グループによって与えられることが認識されており、この異頂環式化合物グループにはピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、ジチオール、オキサゾール、（イソ）チアゾール、オキサジアゾール、オキサトリアゾール、ジアオキサゾール、オキサチオール、ピロン、ダイオキシン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、（イソ）オキサジン、インドール、インダゾール、カルパゾール（carpazole）及びプリンさらにこれらのグループの派生物が有り、引用によってここに導入するが、これらに限られる訳ではない。
【００７５】
化合物には疎水性グループがまた含まれ、これらはポリマーの場合には、一般には分子のバックボーン内に含まれているが、非重合分子の一部であっても良い。このような疎水性バックボーングループには例えば、ビニール、エチル、アクリレート、アクリルアミド、エステル、セルロース、アミド、ヒドリド、エーテル、カーボネート、ホスファゼン（phosphazene）、スルホン、プロピレン及びこれらのグループの派生物が含まれるがこれらに限られる訳ではない。様々なグループの極性特性は、例えばあらゆる初級の有機化学の教科書における極性に関する論述によって説明されているように、当業者には極めて周知のものである。
【００７６】
このような分子の核酸との相互作用能力もまた当業者により理解されているものであり、このような分子間相互作用をモデル化したコンピュータープログラムの利用によって予測できるものである。このようなモデル化に代えて、或いはそれに加えて、１）ヌクレアーゼ消化率の抑制の決定、２）ＤＮＡのコーティングを示すＤＮＡのζポテンシャルの変化、或いは３）臭化エチジウムのようなＤＮＡに介入する介入剤の能力の抑制、のような１もしくはそれ以上のテストを利用して、有効な化合物をすぐに決定することができる。
【００７７】
５．標的リガンド
核酸配列の搬送及び発現のための上記の核酸／ＰＩＮＣ複合体に加えて、特定の実施形態においては、特に組織、細胞或いは細胞領域もしくは細胞区画における発現を優先的に得るために、標的リガンドを提供することも有用である。
【００７８】
このような標的を定められたＰＩＮＣ複合体はプラスミド（もしくはその他の核酸分子）と複合されたＰＩＮＣシステム（モノマー或いはポリマーのＰＩＮＣ化合物）を有している。このＰＩＮＣシステムは共有結合もしくは非共有結合により標的リガンド（ＴＬ）に付けられた（結合された）ものであり、標的リガンドは該リガンドに対する親和性を有するレセプターと結合されている。このようなレセプターは細胞区画の表面或いは内部に有るものである。このような標的リガンドによって核酸の取り込みすなわち細胞内取り込みが高められる。
【００７９】
標的リガンドにはガラクトシル残留物、フコサル（fucosal）残留物、マンノシル（mannosyl）残留物、カルニチン派生物、単クローン抗体、多クローン抗体、ペプチドリガンド、及びＤＮＡ結合プロテインが含まれるが、これらに限られる訳ではない。標的とすることができる有益な細胞の例としては抗原提供細胞、肝細胞、筋細胞、上皮細胞、内皮細胞及び癌細胞が有るが、これらに限られる訳ではない。
【００８０】
このように標的が定められた複合体の形成はＰＩＮＣシステムに共有結合により取り付けられた標的リガンド（ＴＬ）については以下の例により示される。
ＴＬ−ＰＩＮＣ＋プラスミド ----------> ＴＬ−ＰＩＮＣ::::::プラスミド
【００８１】
このように標的が定められた複合体の形成はまた非ＰＩＮＣシステムに共有結合により取り付けられた標的リガンド（ＴＬ）については以下の例により示される。
ＴＬ::::::ＰＩＮＣ＋プラスミド --------> ＴＬ::::::ＰＩＮＣ::::::プラスミド、或いはそれに代えて、
ＰＩＮＣ＋プラスミド ------------> ＰＩＮＣ:::::::プラスミド＋ＴＬ ------------> ＴＬ::::::ＰＩＮＣ:::::::プラスミド
【００８２】
これらの例において、::::::::はイオン性、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用或いはこれらの相互作用の組合せのような非共有結合相互作用を示す。
【００８３】
細胞毒性剤に対する標的方法はSubramanian et al.による国際特許出願第PCT/US96/08852号、国際公開公報第WO 96/39124号に記載されており、参照によってここに引用する。この出願にはジップ（zip）ポリマーすなわち相互作用するポリマー対を用いた二段階標的方法を使って細胞毒材料に標的を定めるためのポリマー親和システムの利用が記載されている。これらの相互作用ポリマーの一方に付いた抗体が細胞標的に結合する。このポリマーは次いで細胞毒剤に付けられた第２のポリマーの標的として働く。Subramanian et al.において言及されているように、毒性剤を搬送するためのその他の二段階（或いは多段階）システムも記載されている。
【００８４】
別の側面においては、ＰＩＮＣシステム或いはＰＩＮＣ−標的リガンド複合体の非天然標的を用いた２段階アプローチを利用して、核酸コード化配列を搬送し発現させることができる。つまり、例えば、ＰＩＮＣ−プラスミド複合体は結合対体に標的を定めることができ、この結合対体は細胞標的（例えばMAB）に結合されたリガンドにそれ自身が付けられたものである。ここでは化合物の或るものについての結合対はSubramanian et al.で定められているようにＰＩＮＣ化合物と定める。これに代えて、ＰＩＮＣは例えば抗体のような標的リガンドに対して複合させることができる。この抗体は非天然標的に標的を定めることができ、この非天然標的は例えば第２の抗体に結合される。
【００８５】
Ｃ．生じたプラスミド／ＰＩＮＣ複合体の貯蔵
プラスミド／ＰＩＮＣ複合体を投与のずっと前に作っておく必要がしばしば有る。プラスミドの生物学的活性の減少を最小となるようなかたちで複合体を貯蔵するのに凍結乾燥が利用できる。
【００８６】
凍結乾燥のプロセス、特にその凍結−乾燥のプロセスにおいて、複合体は低圧にさらされ、この圧力では溶液の蒸発点がまた低下し、液体は低温で除去される。凍結乾燥プロセスについてのさらなる詳細は上記の発明の概要のセクションにおいて参照によって引用した参考文献に見出すことができる。
【００８７】
Ｄ．核酸の性質
或る側面及び実施形態において、核酸分子は遊離され、純粋化され、濃縮されている。
【００８８】
核酸についての“遊離された”とは、天然源から遊離された、すなわち合成された、ＤＮＡ或いはＲＮＡを含む、互いに接合された１４，１７，２１もしくはそれ以上のヌクレオチドからなるポリマーであることを意味する。本発明の遊離された核酸は、天然において純粋すなわち分離した状態では見出されないという意味において独特のものである。用語“遊離され”は自然に生じる配列がその正常な細胞（すなわち染色体）環境から取り除かれていることを示すのに利用されている。つまり、配列は細胞遊離溶液であり得、或いは別の細胞環境に置かれたものであり得る。この用語は配列が存在するヌクレオチド配列そのものだけであることを意味するものではなく、それに自然に結合した非ヌクレオチド材料が本質的にない（少なくとも約９０〜９５％の純度）ものを意味するものであり、したがって、遊離染色体から区別されるものを意味するものである。
【００８９】
核酸についての“濃縮された”とは、特定のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列が、正常な或いは疾患細胞もしくは配列が取り出された細胞内におけるよりも、関心の有る細胞或いは溶液中に存在するトータルのＤＮＡ或いはＲＮＡのうちの著しく大きな割合（２〜５倍）を占めるということを意味するものである。これは存在するその他のＤＮＡ或いはＲＮＡの量を優先的に減少させること、或いは特定のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の量を優先的に増加させること、もしくはこれらの両方を組合せることによって、人が生じさせることができる。しかしながら、“濃縮された”とは他のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列が存在しないということを意味するものではなく、関心の有る配列の相対的な量が著しく増加したということを意味するにすぎない。
【００９０】
ここでの用語“著しく”は、増加レベルがこのような増加を行おうとする人にとって有益であることを示すのに利用されており、一般には、その他の核酸に対する少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも５〜１０倍或いはそれ以上の増加を意味するものである。この用語はまた、その他のソースからのＤＮＡ或いはＲＮＡがないことを意味するものではない。その他のソースからのＤＮＡには例えばイーストやバクテリアゲノム、或いはｐＵＣ１９のようなクローニングベクターからのＤＮＡが含まれる。この用語はその配列を、一つのｍＲＮＡが他の種のｍＲＮＡに対して自然に増加するウイルス感染や腫瘍タイプの成長のような自然に生じる濃縮事象から区別するものである。つまり、この用語は人が所望の核酸の割合を高めるために介入したような状況のみをカバーすることを意味するものである。
【００９１】
いくつかの目的のためにはヌクレオチド配列が純粋化されたかたちのものであるのがまた有利である。核酸についての用語“純粋化された”は均質調製のような絶対的な純粋化を要するものであるが、それよりむしろ、配列が自然環境におけるよりも比較的純粋であるということを表すものである（このレベルは自然レベルと比較して、例えばmg/mLで、少なくとも２〜５倍高いレベルでなければならない）。ｃＤＮＡライブラリから遊離した個々のクローンは電気泳動均質性に向けて純粋化されることができる。これらのクローンから得られる要求されたＤＮＡ分子はトータルのＤＮＡから或いはトータルのＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは自然に生じたものではなく、むしろ部分的に純粋化された自然発生物（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得られるものであるのが好ましい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築には合成物（ｃＤＮＡ）の創造が伴われ、純粋な個々のｃＤＮＡクローンはｃＤＮＡライブラリを持つ細胞のクローン選択によって合成ライブラリから遊離することができる。かくて、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築と、異なるｃＤＮＡクローンの遊離とを含むプロセスは元のメッセージの約１０6倍の純粋化をもたらすものである。つまり、少なくとも１のオーダーの規模、好ましくは２もしくは３のオーダー、より好ましくは４もしくは５のオーダーの規模の純粋化が予測されること明らかである。この用語はまた、既存のものではあるがクローンのライブラリにおいて他のクローンから遊離したものではないクローンを区別するように選ばれたものである。
【００９２】
IV．本発明の好ましいプラスミド及びベクターの特徴
本発明はここで述べるベクターと核酸分子とを有する組換えＤＮＡ分子に関するものである。上記の分子は遊離され及び／もしくは純粋化されたＤＮＡ分子である。
【００９３】
本発明はまたここで述べるコード化配列に連結され、それによってペプチドを発現可能なプロモータにも関する。ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するように変性された細胞から純粋化されたものである。細胞が遺伝子操作により、通常は生成しないプロテインを生成し、或いは細胞が通常的により低いレベルでプロテインを与える場合に、細胞が“所望のポリペプチドを発現するために変性された”と称される。当業者はゲノム、ｃＤＮＡ或いは合成配列のいずれかを真核細胞或いは原核細胞に導入して発現させる処置を即座に適用することができる。
【００９４】
ＤＮＡのような核酸分子は、それが或る転写及び翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含んでおり、これらの配列がポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に“作用可能に配列している”場合に、“ポリペプチドを発現可能”と称する。作用可能配列とは、調節ＤＮＡと発現が求められているＤＮＡ配列とが、遺伝子配列発現を許容するように連結された配列のことである。遺伝子配列の発現に必要な調節領域の正確な性質は有機体毎に変わり得るが、一般には、（ＤＮＡ転写を開始させる）プロモータさらにはＲＮＡに転写されたときに合成開始を知らせるＤＮＡ配列の両方を原核細胞に含んでいるプロモータ領域を有している。このような領域にはＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＴＴ配列等のような、転写及び翻訳の開始に付随する５‘非コード化配列が通常含まれる。
【００９５】
所望により、所望の遺伝子をコード化する配列に対する非コード化領域３‘を上記のクローニング方法によって得ることができる。この領域は停止およびポリアデニレーションのような、その転写停止調節配列のために保有され得る。つまり、所望の遺伝子をコード化するＤＮＡ配列に自然的に隣接する３’領域を保有することによって、転写停止信号を提供することができる。発現ホスト細胞内において転写停止信号が十分に機能しない場合、ホスト細胞内において機能する３‘領域を置き換えることができる。
【００９６】
（プロモータ領域配列及び所望の配列のような）２つのＤＮＡ配列は、これら２つのＤＮＡ配列の間の配列の必然として作用可能に配列していると称されるものであり、（１）フレームシフト突然変異を呼ぶ結果とならず、（２）所望の遺伝子配列の転写を仕向けるためのプロモータ領域配列の能力の妨げとならず、或いは（３）プロモータ領域配列により転写されるべき所望の遺伝子の能力の妨げとならないものであってはならない。つまり、プロモータ領域がＤＮＡ配列に作用可能に配列されているのはプロモータがＤＮＡ配列の転写を行うことができた場合のことである。したがって、所望の遺伝子を発現させるには、適当なホストによって認識される転写及び翻訳信号が必要である。
【００９７】
本発明は真核細胞或いは原核細胞のいずれにおいても所望の遺伝子（或いはその機能的派生物）の発現をもたらすものである。原核ホストは組換えプロテインの生成のために非常に有効でかつ便宜的なものであり、したがって、所望の遺伝子のための好ましい発現システムの一つのタイプである。原核細胞は様々なトランスの大腸菌によってもっともしばしば代表されるものである。しかしながらその他のバクテリア菌株を含む他の微生物菌株も利用することができる。
【００９８】
原核細胞システムにおいては、再現サイトと、ホストと和合性の有る種から派生した制御配列とを含むプラスミドベクターが利用できる。適当なプラスミドベクターの例にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ、適当なファージすなわちバクテリオファージベクターにはλｇｔ１０，λｇｔ１１等が含まれ、適当なウイルスベクターにはｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ等が含まれる。本発明の選択されたベクターは選択したホスト細胞において再現する能力を有しているのが好ましい。
【００９９】
認識されている原核細胞ホストには大腸菌のようなバクテリアや、バチルス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属等のような広範囲からのものが含まれる。しかしながら、このような条件下では、ポリペプチドは糖化されない。原核細胞ホストは発現プラスミドの再現及び制御配列と和合性のあるものでなければならない。
【０１００】
原核細胞内において所望の遺伝子（或いはその機能的派生物）を発現させるためには所望の配列を、本発明の変形ＣＭＶプロモータのような、機能的原核細胞プロモータと作用的に配列させる必要が有る。
【０１０１】
原核細胞内における適正な発現にはまた遺伝子配列−コード化配列の上流側にリボソーム結合サイトの存在が必要である。このようなリボソーム結合サイトは例えばGold et al.（Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404, 1981）により開示されている。制御配列、発現ベクター、転換方法等の選択は遺伝子の発現に利用されるホスト細胞のタイプに依存する。
【０１０２】
ここで用いる“細胞”、“細胞株”及び“細胞培養”は互換的に用いられているものであり、これらの名称は全て子孫を含むものである。つまり、“形質転換株”或いは“転換された細胞”の用語は一次被検細胞と、転換の数にかかわりなく、そこからの培養とを含むものである。意図的な或いは不慮の変異のために、子孫の全てがＤＮＡ内容において正確に同一とはならないことも理解されたい。しかしながら、規定されるように、突然変異種の子孫は元の転換された細胞のものと同じ機能性を有している。
【０１０３】
本発明の発現システムにおいて利用できるホスト細胞は、関心のあるペプチドの発現における利用に適しているものであれば、厳密には制限されない。適当なホストは真核細胞を有するのがしばしばである。好ましい真核細胞ホストには例えばイースト、真菌、昆虫細胞、哺乳類細胞が有り、これらには生体内のものでも組織培養でのものでもが含まれる。ホストとして有用な哺乳類細胞にはＨｅＬａ細胞、ＶＥＲＯ、３Ｔ３或いはＣＨＯ−Ｋ１のような繊維芽細胞を起始とする細胞、リンパ系を起始とする細胞（例えば３２Ｄ細胞）及びそれらの派生物が含まれる。好ましい哺乳類ホスト細胞にはＳＰ２／０及びＪ５５８Ｌ、さらには正しい後翻訳のためのより良好な能力を与えることができる、ＩＭＲ３３２やＰＣ１２のような神経腫細胞株が含まれる。
【０１０４】
加えて、植物細胞も、ホストとして利用できるものであり、植物細胞に対応するコントロール配列も利用できる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓや１９Ｓ、オパリン合成酵素プロモーターとポリアデニル化シグナル配列である。もう一つの好ましいホストは、昆虫細胞である。例えば、ショウジョウバエの幼生である。ホストとして昆虫細胞を使用すると、ショウジョウバエのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが使用される。（Ｒｕｂｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４５３−１４５９）。また，バキュロウイルスベクターも、昆虫細胞で所望のペプチドやタンパク質を大量に発現させるように操作できる(Jasny, Science 238:1653, 1987); Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J.K., et al., eds., Plenum, Vol. 8, pp. 277-297)。
【０１０５】
グルコースリッチの培地中で酵母が増殖するときに大量に製造される解糖系酵素をコードする配列であって活発に発現される遺伝子配列からプロモーターとターミネーション因子とを取り込んだ酵母の遺伝子配列発現システムは、いずれでも使用できる。公知の解糖系の遺伝子配列は、非常に有効な転写制御信号を提供する。酵母は、翻訳後のペプチド修飾を実行でいるという点において本質的な利点を提供する。いくつかの組換えＤＮＡ戦略は、強力なプロモーター配列と高コピー数のプラスミドを使用して、酵母で所望のタンパク質を製造する。酵母は、クローン化された哺乳類の遺伝子配列の産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチドを分泌する（例えば、プレペプチドである）。哺乳類ホストについては、いくつかの可能性あるベクターシステムが所望の遺伝子の発現に利用できる。
【０１０６】
多様な種類の転写及び翻訳の調節配列が、ホストの性質に基づいて採用される。転写及び翻訳調節シグナルは、アデノウイルス、牛パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス等のウイルス起源でもよく、これらの調節シグナルは、高い発現レベルを有する特定の配列を伴っている。また、アクチン、コラーゲン、ミオシン等の哺乳類の発現産物由来のプロモーターも採用できる。抑制あるいは活性化を許容する転写開始調節シグナルが、遺伝子配列の発現が調節されるように選択される。所望の調節シグナルが、温度によって、発現が抑制されあるいは開始されるように、あるいは、化学的な（代謝のような）調節にさらされるように、温度感受性である。
【０１０７】
真核生物のｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコードするコドンにおいて開始される。これにより、プロモーターと所望のペプチドあるいはタンパク質をコードするＤＮＡ配列との間の連結鎖には、メチオニンをコードしうるコドン（例えば、ＡＵＧ）を介在させないようにすることが好ましい。このようなコドンの存在により、融合タンパク質（そのＡＵＧコドンが所望のコーディング配列とおなじリーディングフレーム内にある場合）を生成するか、あるいは、フレームシフト変異（そのＡＵＧコドンが、所望のコーディング配列と同じリーディングフレーム内にない場合）を生成するかのいずれかである。
【０１０８】
所望の核酸分子と、作用可能にリンクさせたプロモーターとは、原核性あるいは真核性の受容細胞へ、非複製ＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）として導入されるが、線状分子でもよいが、好ましくは、閉じて共有結合された環状分子（プラスミド）である。そのような分子は、自律的には複製できないので、その遺伝子の発現は、導入された配列の一過性発現として発生する。また、恒常的な発現あるいは安定的な発現は、導入されたＤＮＡ配列のホストの染色体への組込みを介して発生する。
【０１０９】
ベクターは、所望の遺伝子配列をホスト染色体に組込み可能なものを採用できる。その染色体に導入ＤＮＡを安定して組み込んでいる細胞は、一またはそれ以上のその発現ベクターを保有するホスト細胞を選択するためのマーカーも導入することによって選択される。そのマーカーは、栄養要求性のあるホストに原栄養性を提供し、あるいは、例えば、抗生物質、銅のような重金属等の殺生物剤耐性を提供する。選択マーカー遺伝子配列は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよいし、同時トランスフェクションによって導入してもよい。他のエレメントとして、単鎖結合性タンパク質ｍＲＮＡの最適な合成のために必要とされる。これらのエレメントは、スプライスシグナルの他、転写プロモーター、エンハンサー、及びターミネーションシグナルである。このようなエレメントを保有するは、オカヤマ、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３：２８０（１９８３）に記載されている。
【０１１０】
導入される核酸分子は、受容ホストで自律的に複製可能なプラスミドあるいはウイルスベクターへ組み込まれる。この目的のｔまえに、各種のベクターのうち任意のものが採用される。特定のプラスミドあるいはウイルスベクターを選択する場合の重要な因子は、以下の事項である。すなわち、そのベクターを保有する受容細胞が、そのベクターを保有しない受容細胞から認識され選別されうること、そのベクターのコピー数が特定のホストにおいて好ましいものであること、異なる種のホスト細胞間でそのベクターを「シャトル」できることが好ましいかどうかである。
【０１１１】
好ましい原核細胞性のベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製可能なプラスミドを含む（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ １８４、ｐＶＸである。このようなプラスミドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ(. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” second edition, edited by Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)参照)に記載されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドは、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７等を含む。このようなプラスミドは、 The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329に開示されている。適切なＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓプラスミドは、ｐＩＪ１０１(Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987), と、ｆｃ３１(Chater et al., In: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54)等のｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓバクテリオファージを含む。シュードモナスプラスミドは、Ｊｏｈｎらによって解説されている(Rev._Infect. Dis. 8:693-704, 1986), and Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978)。
【０１１２】
好ましい真核細胞性ベクターは、例えば、ＢＰＶ、種痘ウイルス、ＳＶ４０、２−ミクロンサークル等、あるいは、その誘導体を包含する。そのようなプラスミドは、当該分野で周知である(Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19:265-274, 1982); Broach, In: “The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p. 445-470 (1981); Broach, Cell 28:203-204, 1982); Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48, 1980); Maniatis, In : Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980)。
【０１１３】
一旦、そのコンストラクトを含むベクターあるいは核酸分子が発現のために作製されたら、そのＤＮＡコンストラクトは、適当なホスト細胞に、トランスフォーメーションやトランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、導入される。ベクターの導入後、受容細胞は、選択培地で培養され、培地は、ベクター含有細胞の増殖を選択する。クローン化された遺伝子分子の発現は、所望のペプチドあるいはタンパク質の生成に帰結する。これは、形質転換細胞それ自体において実施されるか、あるいはこれらの細胞を分化誘導後に実施される（例えば、神経芽細胞腫細胞等にブロモデオキシウラシルを投与することによって）。各種の培養条件が、本発明のペプチドを形成するのに使用されうる。最も好ましい条件は生理学的条件に擬似した条件である。
【０１１４】
ここに記載される製剤方法は、 Ralston ら., 米国特許出願番号. 09/012,366, "IL-2 Gene Expression and Delivery Systems and Uses", 1998年1月２３日出願(Lyon & Lyon Docket No.230/214); Nordstromら, 米国特許出願番号 08/949,160, "IL-12 Gene Expression and Delivery Systems and Uses", １９９７年１０月１日出願 (Lyon & Lyon Docket No 226/285); Nordstromら, 米国特許出願番号60/078,654, "Interferon Alpha and Delivery Systems, and Methods of Making and Using the Same", １９９８年3月１９日出願(Lyon & Lyon Docket No. 232/273); 及びColemanら.、米国特許出願番号 08/974,572, entitled “IGF-I Expression System and Methods of Use”,１９９７年１１月１９日出願（ Lyon & Lyon Docket No. 230/185）に、それぞれに記載されるように、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、インターフェロンアルファ、及びＩＧＦ−１を含む、各種遺伝子及びプラスミドの使用に適切であろう。これらのすべては、その図面を含む全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０１１５】
ＶＩ．投与
本明細書において用いられる投与は、ベクターあるいはＤＮＡのキャリアを身体へ導入するルートをいう。投与は、直接に標的組織を指向していてもよいし、全身投与後に標的組織への標的送達によって達成されてもよい。特に、本発明は、遺伝子治療に使用するレベルでの組織内における任意の特定の核酸配列の制御された発現を確立するために身体へベクターを投与することによって疾患を治療するのに使用される。
【０１１６】
ベクターの好ましい投与手段及び送達のための製剤の使用の好ましいものは、前述されている。好ましい形態は、針管注射あるいはハイポスプレーである。
【０１１７】
任意の選択されたベクターコンストラクトの投与ルートは、発現ベクターの特定の使用に依存する。一般的に、それぞれのベクターコンストラクトに特定の処方は、特定の標的組織についてのベクターの取り込み−それは効力の提示によりフォローされるのであるが−に焦点をあてている。取り込みに関する研究は、ベクターの細胞への取り込みを評価する取り込みアッセイと選択した組織特異的なＤＮＡの発現とを包含している。そのようなアッセイは、取り込み後の標的ＤＮＡの局在状態を決定することができ、発現タンパク質の定常状態濃度維持のための要求性を確立することができる。効能と細胞毒性とは、その後、テストされる。毒性は、細胞活性のみならず細胞機能も含むであろう。
【０１１８】
筋肉細胞は、筋肉へ、ＤＮＡ粒子の溶液、サスペンジョン、あるいはコロイドとしての単純な注射後の細胞外空間からのＤＮＡの取り込む特異な能力を有している。この方法によるＤＮＡの発現は、数ヶ月にわたり維持されうる。
【０１１９】
処方されたＤＮＡベクターの送達は、巨大分子複合体へのＤＮＡの取り込みを伴い、この複合体は、標的細胞によるエンドサイトーシスをうける。このような複合体は、脂質、タンパク質、炭水化物、合成有機化合物、あるいは無機化合物を含む。ベクターとともに形成された複合隊の特徴（サイズ、電荷、表面特性、組成）は、身体内における生物学的利用能を決定する。処方の他の要素が、細胞の表面あるいは内部にある特定のレセプターと相互作用するリガンドとして機能する。処方の他の要素は、細胞への侵入、エンドソームからの解放、及び核への取り込みを促進する。
【０１２０】
送達は、ＤＮＡトランスポーターの使用を介しても可能である。ＤＮＡトランスポーターとは、ＤＮＡベクターに結合し、表皮細胞によって取り込まれうる分子をいう。ＤＮＡトランスポーターは、ＤＮＡに対して非共有結合的に結合可能で、細胞膜を介して効率的にＤＮＡを輸送可能な分子複合体を含む。トランスポーターは、核膜を介してＤＮＡを輸送することが好ましい。以下の出願は、その図面を含む全体が参照により本明細書に取り込まれる：(1) Woo ら, 米国特許出願番号 07/855,389,出願日1992年3月２０日、 “A DNA Transporter System and Method of Use (Lyon & Lyon Docket No. 204/015),放棄されている; (2) Wooら, PCT/US93/02725 、出願日１９９３年３月１９日,国際公開番号 WO93/18759,“A DNA Transporter System and method of Use”, (指定国 米国及びその他) (Lyon & Lyon Docket No. 204/015 PCT); (3) Ｗｏｏらの一部継続出願、米国特許出願番号 08/167,641, 出願日１９９３年１２月１４日、“Nucleic Acid Transporter Systems and Methods of Use” (Lyon & Lyon Docket No. 205/012); (4) Szokaら、米国特許出願番号. 07/913,669, 出願日１９９２年７月１４日、“Self-Assembling Polynucleotide Delivery System”; 及び(5) Szokaら, PCT/US93/03406, 出願日１９９３年４月５日、国際公開番号 WO93/19768、“Self-Assembling Polynucleotide Delivery System”, (指定国 米国及びその他)
【０１２１】
筋肉への直接的な遺伝子の導入は、非常に効果的である。実験は、ＤＮＡの筋肉細胞への直接注射による投与は、注射した領域での遺伝子の発現を起こすということを示している。ＧＨＲＨを含むプラスミドの注射は、相対的に一定のレベルでの数ヶ月の遺伝子発現を起こした。注入されたＤＮＡは、組み込まれていない染色体外状態に維持されていた。この導入手段は、好ましい実施形態を構成する。
【０１２２】
もう一つの送達の好ましい方法は、ＤＮＡトランスポーターシステムである。ＤＮＡトランスポーターシステムは、複数の要素を含む粒子からなり、それぞれの要素は、独立に、非共有結合適にＤＮＡに結合している。各要素は、特定のレセプターあるいは、ＤＮＡに結合するカチオン性基と複合化されたタンパク質のような機能性グループを認識するリガンドを有している。使用されるカチオンの例としては、スペルミン、スペルミン誘導体、非すなわち、とん、カチオン性ペプチド及びポリリジンである。ある要素は、ＤＮＡベクターと標的細胞の細胞表面レセプターに結合できる。このような要素の例としては、アシアログリコプロテインレセプター、葉酸レセプター、マンノース−６−リン酸レセプターあるいはカルニチンレセプターと相互作用する有機化合物である。第２の要素は、ＤＮＡベクターと核膜のレセプターとの双方に結合できる。核リガンドは、核膜を介してトランスポーターシステムを認識し輸送することができる。そのようなリガンドの例としては、ＳＶ４０のラージＴ抗原あるいはヒストンからの核標的配列である。第３の要素は、ＤＮＡベクターとエピソームの分解を誘導する要素との双方に結合できる。このような例は、アデノウイルスのような不活性化ウイルス、インフルエンザウイルス赤血球凝集素に関連するペプチド、あるいは先に引用したＳｋｏｋａの特許に記載されるＧＡＬＡペプチドを含む。
【０１２３】
投与は、脂質を伴うことができる。脂質は、中空の球状小胞であるリポソームを形成できる。リポソームは、単層、２層、あるいは多層形態に配列された脂質で構成されており、ＤＮＡなど、０．０５から数ミクロンの直径の水溶性化合物を捕捉できる内部水性空間を備えている。脂質は、リポソームを形成しなくても、有用である。特定の実施例は、カチオン性脂質と、ＤＮＡと細胞内へＤＮＡを侵入させやすくするために細胞膜とに相互作用する複合体の使用を含んでいる。
【０１２４】
遺伝子の送達は、遺伝子操作された細胞を移植することによっても達成される。例えば、ミオブラストと言われる未熟な筋肉細胞が筋繊維に遺伝子を運ぶのに使用される。組換えヒト成長ホルモンを発現するように遺伝子操作されたミオブラストは、動物の血中に成長ホルモンを分泌する。取り込まれた遺伝子による分泌は、３ヶ月まで維持されうる。
【０１２５】
ミオブラストは、最終的に分化し、存在している筋肉組織に融合する。その細胞は、現存する構造体に取り込まれるため、寛容されはしないが、栄養補給される。ミオブラストは、遺伝子治療を必要とする患者から筋肉組織を採取することによって容易に得られ、遺伝子操作された細胞は、患者の筋肉に障害を与えることなく、戻しいれることができる。同様に、ケラチノサイトも組織に遺伝子を送達するのに利用される。大量のケラチノサイトが、少しのバイオプシーの培養から創成される。細胞培養は、積層されたシートとして調製され、ヒトに移植されたときには、皮膚を創生して、多数年にわたって組織的な品質において向上する。ケラチノサイトは、その培養中において、ケラチノサイトを適当なベクターでトランスフェクトすることによって遺伝子操作される。ケラチノサイトは、表皮と真皮とを区画する基底膜によって血流から分離されているが、ヒトケラチノサイトは、タンパク質産物を血流中に分泌できる。
【０１２６】
送達は、ウイルスベクターの使用も伴い得る。例えば、アデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムのＥ１領域を、プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び核酸カセットを含む、この発明におけるベクター要素で置換し、この組換えゲノムをこれを感染性ウイルス粒子に組み入れる２９３細胞に導入することによって構築される。この細胞からのウイルスは、その後、細胞外あるいは細胞内で組織を感染させるのに使用され、組織にベクターが導入され、その核酸カセット中の遺伝子が発現される。
【０１２７】
ＶＩＩ．細胞のトランスフェクション及びトランスフォーメーション
ここに、トランスフォーメーションとは、好ましくは、遺伝子産物を発現する遺伝子の作用によって細胞の表現型の特性における変化をいう。表現型における特性変化をもたらす遺伝子は、細胞へトランスフェクトされる。
【０１２８】
トランスフェクションの語は、ここに、好ましくは細胞あるいは生物体によるＤＮＡの取り込みを伴う遺伝子転移のメカニズムをいう。細胞への侵入に引き続いて、トランスフォームするＤＮＡは、ホストの染色体に生理的に取り込まれることによって、ホストのＤＮＡと組換えされるか、エピソーム要素として一過的に維持されるか、あるいは、独立にプラスミドとして複製するか、である。好ましくは、トランスフォームするＤＮＡは、染色体に組み込まれない。
【０１２９】
トランスフェクションは、以下に示すようなインビボ技術、あるいは選択マーカーを含むベクターとともに細胞がコトランスフェクションされる細胞外技術によって達成される。選択マーカーは、トランスフォームされた細胞を選択するのに用いられる。当業者においては、トランスフェクション／トランスフォーメーションの研究に使用される選択マーカーのタイプは周知である。そのようなマーカーの入り例は、ｎｅｏ遺伝子であり、ネオマイシン／カナマイシン耐性を提供する。
【０１３０】
トランスフェクション／トランスフォーメーションは、組織特異的でありうる。すなわち、選択した組織で優勢的に核酸カセットを発現させる筋原性の特異的ベクターを伴う。特に、組織特異性は、筋原組織発現に特異的なプロモーター、および／または３’ＵＴＲおよび／または３’ＮＣＲ配列を使用することによって筋原細胞を指向するようにされる。
【０１３１】
本発明の一つの側面は、上記したベクターによってトランスフェクトされた細胞を含む。一旦、細胞がトランスフェクトされると、トランスフォームされた細胞は、その核酸カセットにコードされたタンパク質やＲＮＡを発現する。タンパク質の例としては、ポリペプチド、グリコプロテイン、リポプロテイン、ホスフォプロテイン、あるいは核タンパク質を含むが、これに限定されるものではない。
【０１３２】
所望の遺伝子材料を含む核酸カセットは、そのベクター内で適切な位置で連続して配向されており、その核酸カセット中の核酸がＲＮＡに転写され、必要なときには、トランスフォームされた細胞でタンパク質やポリペプチドに翻訳されるようになっている。
【０１３３】
各種のタンパク質が、トランスフォームされた細胞中の核酸カセットの配列によって発現される。発現されるこれらのタンパク質は、細胞質、核、膜（プラズマラメラ、核膜、小胞体あるいは内在する膜区画を含む）に、あるいは、細胞器官（ミトコンドリア、ペルオキシソーム、リソソーム、エンドソーム、あるいは他の細胞器官を含む）に、局在されるか、あるいは分泌される。これらのタンパク質は、細胞内あるいは細胞外の構造体要素、リガンド、ホルモン、神経伝達物質、成長調節因子、分化因子、遺伝子発現調節因子、ＤＮＡ付随タンパク質、酵素、血清タンパク質、受容体、低分子量有機あるいは無機化合物のキャリヤ、薬剤、免疫調節因子、オンコジーン、腫瘍サプレッサー、毒素、腫瘍抗原、あるいは抗原として機能する。これらのタンパク質は、その生物学的活性を増強し、阻害し，調節し、消去する天然の配列あるいは変異した配列を有する。
【０１３４】
加えて、核酸カセットは、ＲＮＡをコードすることもできる。ＲＮＡは、翻訳のための鋳型として、遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとして、遺伝子発現の三重鎖形成阻害剤として、酵素（リボザイム）として、あるいは、その活性を修飾するための細胞の構造体上の特異的構造決定要素を認識するリガンドとして、機能する。特定の実施例は、プロスタグランディン合成酵素、リポキシゲナーゼ、組織適合性抗原（クラスＩあるいはクラスＩＩ）、細胞接着分子、亜酸化窒素合成酵素、β2ミクログロブリン、オンコジーン、および成長因子の発現あるいは機能を阻害するＲＮＡ分子を含んでいる。
【０１３５】
取り込まれ得る化合物は、取り込まれるべき、タンパク質あるいはポリペプチドの核酸配列の利用性によって制限されない。当業者は、たくさんのタンパク質やポリペプチドが同定されてきているので、これらが本発明のベクターシステムに組み込まれて動物あるいはヒトの組織で発現されることを容易に認識するであろう。
【０１３６】
トランスフェクションは、生体内あるいは生体外技術のずれによっても達成される。例えば、筋肉細胞は、細胞培養中で増殖され、トランスフォームする遺伝子でトランスフェクトされ、そして筋肉組織へ移植される。また、ベクターが、上記した方法によってその細胞に投与される。
【０１３７】
各種のタンパク質やその遺伝子配列、ともに変異したおよび変異してないものが、遺伝子治療に使用できる（Ｍｉｌｌｅｒによって総説されている、 Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０、（１９９２））。ミラーは、ポジティブな初期結果を示しているヒトの遺伝子治療における実際のアプローチにおける進捗状況を示している。遺伝子治療の基本の科学は、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１、（１９９３）に記載されている。
【０１３８】
一つの好ましい実施形態では、コード配列を含む発現ベクターが細胞に挿入され、細胞は、インビトロで増殖し、患者に大量に注入された。もう一つの好ましい実施形態では選択したプロモーター（例えば、強力なプロモーター）を含むＤＮＡ断片が、内在性の所望の遺伝子を含む細胞に転移され、そのプロモーター領域がその内在性の所望の遺伝子の発現を増強するようにする（例えば、そのプロモーター領域がその内在性遺伝子に直接連結されるように転移される）。
【０１３９】
遺伝子治療は、適切な細胞タイプを標的とする所望の遺伝子のｃＤＮＡを含むアデノウイルス、操作された細胞の移植による全身的な所望の遺伝子の増幅、所望の遺伝子のウイルスの注入、あるいは、例えばニューロンなど、適切な細胞あるいは組織への所望の裸の遺伝子ＤＮＡの注入の使用を伴うこともできる。
【０１４０】
レトロウイルス、種痘ウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、ヘルペスウイルス、いくつかのＲＮＡウイルス、あるいは牛パピローマウイルスのようなウイルス由来の発現ベクターが、標的細胞（例えば、腫瘍細胞あるいはニューロン）へ組換えタンパク質をコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）の送達に用いられる。当業者に周知の方法が、コーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築するのに使用される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））及び、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｏａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）にこのような技術が記載されている。
【０１４１】
また、タンパク質配列をコードする組換え核酸分子は、裸のＤＮＡとして使用され、あるいは、例えばリポソームなどの再構成システムや他の標的細胞への送達のための脂質システムに使用される（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８，１９８９を参照）。プラスミドＤＮＡの細胞への直接的な転移のためのいくつかの方法は、ヒトの遺伝子治療に用いられ、また、プラスミドＤＮＡをタンパク質と複合化させることにより、細胞上の受容体をそのＤＮＡの標的とすることを伴う（Ｍｉｌｌｅｒを参照）。
【０１４２】
その最も単純な形態では、遺伝子転移は、マイクロインジェクションのプロセスを介して、少量のＤＮＡを細胞の核に単に注入することによって達成される（Ｃａｐｅｃｃｈｉ ＭＲ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８、（１９８０））。一旦、組換え遺伝子が細胞に導入されたら、転写及び翻訳のための細胞の通常のメカニズムによって認識されて、遺伝子産物が発現されるであろう。他の方法もまた、細胞に大量のＤＮＡを導入するために試みられている。これらの方法は、トランスフェクション、ＤＮＡはＣａＰＯ4によって沈殿され、食細胞作用によって細胞に取り込まれる(Chen C. and Okayama H, Mol. Cell Biol. 7:2745-52, 1987)；エレクトロポレーション、細胞は大きな電圧パルスにさらされて、膜への導入用の孔が形成される(Chu G., et al., Nucleic Acids Res., 15:1311-26, 1987)；リポフェクション／リポソーム融合、ＤＮＡは、親油性の小胞に封入され、標的細胞に融合する(Felgner PL., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413-7, 1987)；小さな発射体に結合させたＤＮＡを用いるパーティクル砲撃(Yang N.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87:9568-72, 1990)を含んでいる。細胞へＤＮＡを導入する他の方法は、ＤＮＡを化学的に修飾されたタンパク質と結合させることである。
【０１４３】
アデノウイルスタンパク質が、エンドソームを不安定化し、細胞へのＤＮＡの取り込みを増強できることが知られている。ＤＮＡ複合物を含む液体とアデノウイルスの混合物、あるいは、タンパク質の架橋剤を使用してアデノウイルスに共有結合で固定されたポリリジンへのＤＮＡの結合は、組換えＤＮＡの取り込みと発現とを本質的に改善する（Ｃｕｒｉｅｌ Ｄ．Ｔ．ら Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２４７−５２，１９９２）。
【０１４４】
ここに、遺伝子転移とは、外来の核酸分子を細胞へ導入するプロセスをいう。遺伝子転移は、一般的に、遺伝子によってコードされる特定の産物を発現を可能とするために達成される。その産物は、タンパク質，ポリペプチド、アンチ−センスＤＮＡあるいはＲＮＡ、あるいは酵素活性のあるＲＮＡを含む。遺伝子転移は、培養細胞においても、動物への直接の投与によっても達成される。一般的に、遺伝子転移は、非特異的あるいは受容体介在性相互作用による核酸と標的細胞との接触、細胞膜を介してあるいはエンドサイトーシスによる核酸の細胞への取り込み、プラズマ膜あるいはエンドソームからの細胞質への核酸の解放、というプロセスを含んでいる。加えて、発現には、その細胞の核への移動と、転写のための核の因子との結合とを要するかもしれない。
【０１４５】
好ましい他の実施形態においては、所望のタンパク質をコードする核酸配列を有するベクターは、その核酸配列が、特定の組織でのみ発現するように提供される。組織特異的遺伝子発現を達成する方法は、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、国際出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９３５３、国際公開番号ＷＯ９３／０９２３６、１９９２年１１月３日出願、１９９３年５月１３日公開、筋原細胞ベクターシステム（Ｌｙｏｎ ＆ Ｌｙｏｎ  Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２０４／０１４）に開示されている。
【０１４６】
上述したすべての前記ベクターにおいて、本発明のさらなる側面は、このベクター中に含まれる核酸配列は、すでに定義したように、核酸配列の一部分あるいは全部に対する付加、欠失、修飾を含む。
【０１４７】
さらに好ましいもう一つの実施形態では、遺伝子置換法が開示される。遺伝子置換は、ここに、動物にインビボで発現されうる核酸配列を提供し、それにより、その動物で欠失あるいは欠損した内在性の遺伝子の機能を提供しあるいは増大させることをいう。
【０１４８】
ＶＩＩＩ．治療及び複合体の使用
本発明は、ベクターを選択することによって、広範囲の疾病の治療に使用できる。異なる疾病の治療には、以下にリストアップしたように、異なるベクターが対応する。以下のリストはいかなる場合にも発明を制限するものではない。
【０１４９】
【表２】
0004538150.tif 000003
【０１５０】
状態すなわち疾病は、好ましくは、ガンであり、たとえば、アデノーマ及びアデノカルチノーマを含む上皮腺ガン、ポリープ、パピローマ、扁平上皮細胞及び移行細胞カルチノーマを含む扁平上皮及び移行性ガン、組織型のポジティブな肉腫その他の腫瘍を含む結合組織ガン、リンパ腫、白血病及びホジキン病を含む造血系及びリンパ球生成系ガン、神経腫、肉腫、神経繊維腫及び芽腫を含む神経組織ガン、奇形腫及び奇形ガンを含む原発性ガンの混合組織である。治療に供し得る他のガン性状態としては、次のいずれかのガンがある。すなわち、副腎腺、肛門、胆管、膀胱、脳腫瘍：成人、原発部位不明の乳がん、胃腸管のカルチノイド、頚部、小児ガン、結腸及び直腸、食道、胆嚢、頭、首、膵島細胞及び他の膵ガン、カポシ肉腫、腎臓、白血病、肝臓、肺：非小細胞、肺：小細胞、リンパ腫：エイズ関連、リンパ腫：ホジキン病、リンパ腫：非ホジキン病、黒色腫、中皮腫、転移性ガン、多発骨髄腫、卵巣、卵巣生殖細胞腫、膵臓、副甲状腺、ペニス、下垂体、前立腺、骨及び軟組織の肉腫、皮膚、小腸、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、栄養膜疾患、子宮：子宮内膜ガン、子宮：子宮肉腫、膣又は外陰部である。
ＳＹＢＲのグリーンＩＩで、およそ２０分間染色し、そしておよそ３０分間蒸留水で染料を落とした。商標イメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）のソフトウエアを用いて分析したフルオロイメージャーでゲルを走査した。
【０１５１】
ゲル電気泳動による非塩基性損傷：
２．５ｍＬのＷＦＩ、２６．６μＬのＤＭＥＤ溶液、２０μＬの濃酢酸を添加することによって、１００ｍＭ  ＤＭＥＤ溶液を作製した。最終ｐＨは、７．３と７．４の間であった。試験サンプルを、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の１００μｇ／ｍＬに希釈した。１９μＬの２０ｍＭトリスに１μＬのサンプルを添加することによって、先の希釈からサンプルを作製した。これは、対照サンプルである。１９μＬのＤＭＥＤ溶液に１μＬのサンプルを添加することによって、試験サンプルを作製した。これらの反応液を、３０分間、３７℃でインキュベートした。その後、２μＬの１０×負荷染料をそのサンプルに添加した。５μＬのサンプルを、０．４％ゲルにかけた。そのゲルをＳＹＢＲのグリーンＩＩで染色し、そしてその後、プラスミドのバンドが定量されるフルオロイメージャーで走査した。以下の公式は、プラスミドの分子当たり非塩基性部位を決定するのに使用した。
プラスミド当たりの非塩基性部位＝Ｌｎ  ＳＣプラスミド含有率（％）／ＳＣプラスミド含有率（％）［ＤＭＥＤで処理された］
【０１５２】
粘度：
プラスミド／ＰＶＡ複合体の粘度を、ブル−クフィールドのモデルＤＶ−ＩＩＩ粘度計を用いて測定した。各シリーズのサンプル測定の前に粘度標準を測定した。各複合体の粘度は、この試験に必要とされるサンプルサイズにより一回のみ測定した。粘度結果は、センチポワズ（ｃＰ）で記録される。
【０１５３】
実施例１−プラスミド／ＰＶＰの例：
ｐＨ：
４℃で保存された配合物について、４バイアルの配合物は、そのｐＨをおよそ４に維持し、そしてそれは、生体内での効力に最適であると決定された。再水和後、３バイアルの配合物は、およそ４．３の平均ｐＨ値を示し、個々のｐＨ値は、０．３ｐＨ単位まで変化する。再水和後、１バイアルの配合物は、０．３ｐＨ単位の変動で、４．１の平均ｐＨを示した。クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で再水和した１バイアル（ＰＮ）配合物は、緩衝液のｐＨになんら変動を示さなかった。ｐＨ値における保存温度の影響はないようであった。
重量オスモラル濃度：
４℃で保存された配合物の内、４バイアルおよび３バイアルの配合物の両方が、１バイアルの配合物よりいっそう高張であり、そして１バイアル配合が、中程度の高張度のみを示した。３バイアルの配合物は、２００μＬの１Ｍ  ＮａＣｌが、最終容量１．１ｍＬを示す複合体に添加されるので、さらに高張性である。これは、最終ＮａＣｌ濃度を１８１．８ｍＭにするのに対して、４バイアル、１バイアル、および１バイアル（ＰＮ）は、１５０ｍＭのＮａＣｌの最終濃度になる。１バイアル（ＰＮ）配合物は、２７０ｍＯｓｍの平均値をともない、わずかに低張であった。保存条件は、配合物の重量オスモラル濃度における明らかな影響は示さなかった。
【０１５４】
ゲル電気泳動によるスーパーコイル状プラスミド：
４バイアル：保存温度の影響は、４バイアルの配合物中のスーパーコイル状プラスミドの量に明らかな影響を示した。わずか３日後、３７℃で保存された配合物に残るスーパーコイル状プラスミドはなかった。２５℃で保存された配合物について、スーパーコイル状形態の５０％は、３日目までに失われ、そして４月目まで、残りのスーパーコイル状のものはないのが明らかであった。４℃で保存された配合物は、それらのスーパーコイル状を、２週間まで維持し、１月目までに明らかな激減を伴った。６月目までに、１０％未満のスーパーコイル状プラスミドが、４バイアルの配合物に残った。安定性のこの欠如は、プラスミドが、凍結防御物質の不在下で凍結乾燥された事実にもっともよりそうである。
３バイアル：３バイアルの配合物は、３つの保存条件全てでそれのスーパーコイル状プラスミドを１月まで維持した。１月後、３７℃で保存した材料は、残りのＳＣプラスミドを有さず、そして２５℃の材料は、ＳＣプラスミドがもはや明らかでない１２月までにそのＳＣを失い始めた。４℃の材料は、試験の過程を通して、それのＳＣプラスミドを維持した。
１バイアル：３７℃で保存した配合物は、１３日目までにそのスーパーコイル状プラスミドの全てを失い、そして２５℃で保存した配合物は、４月目までに残るＳＣプラスミドはないことを示した。その１バイアルの配合物についてのＳＣプラスミドは、１２ヶ月を越えてわずか（２０％損失）であることを示す４℃で保存された材料についてのみ維持された。
１バイアル（ＰＮ）：１バイアル（ＰＮ）の配合物について、データは、１月目までは、いくらかのＳＣプラスミドを維持した３７℃保存材料である１バイアルの配合物と非常に類似していた。さらに、４℃で保存した材料は、全体的１２ヶ月間それのＳＣプラスミドのほとんどを維持した。
４℃における全期間にわたり、４バイアル、３バイアル、１バイアル、および１バイアル（ＰＮ）のスーパーコイル状プラスミドを比較すると、ほとんどのそれらのスーパーコイル状形態を保持する３バイアルおよび１バイアル（ＰＮ）は、１バイアルおよび４バイアルよりいっそう安定であることを示す。４バイアルの配合物は、６ヶ月で１０％未満のスーパーコイル状形態を示す。
４℃で、１バイアル（ＰＮ）配合物を、凍結乾燥したプラスミドと比較して、１バイアル（ＰＮ）配合物は、スーパーコイル状形態の点でプラスミドが分解から保護することを示す。１バイアル（ＰＮ）配合物は、全期間にわたってスーパーコイル状形態をある程度、すなわち、１２ヶ月かけて４１％、損失するが、凍結乾燥したプラスミドは、全期間でスーパーコイル状形態のいっそう大きな損失、すなわち、４ヶ月後に７５％損失、そして１２ヶ月後に１００％損失を示す。２５℃で保存されたプラスミドは、プラスミドの安定性が促進されたことを示す。データは、４℃でのデータと基本的に同じである。水中で保存された両方のプラスミドは、凍結乾燥したプラスミドよりいっそう安定である。
４℃における期間にわたり、２つの異なる濃度で水中で保存されたプラスミドと、凍結乾燥されたプラスミドとのスーパーコイル状プラスミドの含有率を比較すると、その液体プラスミドの両方が、全期間にわたり非常に安定であり、そしてそれらのスーパーコイル状形態のほとんどを保持するが、凍結乾燥されたプラスミドは、それが、そのスーパーコイル状形態を一週間後に失いはじめ、一ヶ月までに、９０〜１００％のスーパーコイル状形態を失ったことがわかる。
【０１５５】
水中のプラスミド、凍結乾燥プラスミド、および１バイアル（ＰＮ）配合物におけるスーパーコイル状プラスミドの比較も行われた。このデータは、水溶液で保存されたプラスミドが、凍結乾燥プラスミドよりよりいっそう安定であること、および１バイアル（ＰＮ）配合物が、凍結乾燥プロセスの間じゅう、単独で凍結乾燥したプラスミドによって被った同じような分解からプラスミドを保護することを示す。
【０１５６】
ゲル電気泳動によるプラスミド分子当たりの非塩基性部位：
アッセイを、安定性試験の１ヶ月についてのみ完了し、そして、水性プラスミド、凍結乾燥したプラスミド、および４つの異なるプラスミド／ＰＶＰ（１：１７ｗ／ｗ）処方についての非塩基性損傷を示した。非塩基性損傷の規定として付与されうる真の数値はなく、したがって、付与された値は、互いに比較されるべきである。
【０１５７】
生体外の効力
４℃で保存した後の４つの配合物についてのＣ2Ｃ12細胞の生体外のトランスフェクション後のＩＧＦ−Ｉの発現は、アッセイで特定量の変動を示したが、しかしその４つの配合物の内のいずれかの間のトランスフェクション効率に差異はないようであった。
【０１５８】
生体内の効力
４℃で保存された安定な配合物の筋肉内投与の後、マウスの腓腹筋でのＣＭＶ−ＣＡＴの発現で際立った差異は、１月まではその４つの配合物の内のいずれかに現れたものはなかった。次の試験時点である６ヶ月で、１バイアル（ＰＮ）および３バイアルの配合物のみが、任意の発現を示し、そしてこれは、０日目に見られる発現に匹敵した。
ｐＨ３．０−４．０の配合物で注射された動物は、５．５−６．０および７．０−７．５のｐＨで注射された動物より、生体内でのプラスミド／５％ＰＶＰ配合物のβ−ｇａｌ発現レベルが４倍高いことを示した。
【０１５９】
実施例２−プラスミド／ＰＶＡ結果
ｐＨ結果
異なるプラスミド／ＰＶＰ複合体のｐＨ結果は、互いにまったく異なっている。液体、凍結、または凍結乾燥したアルドリッチの複合体のｐＨは、およそ５．０であり、そして互いに非常に類似する。登録商標モウィオール複合体は、液体および凍結複合体が、およそ５．５であるのに対して、凍結乾燥複合体のｐＨが約５．０である点で異なる。スペクトラムのＰＶＡ複合体のｐＨも、液体および凍結複合体のｐＨが、５．５と６．０の間であるが、しかし凍結乾燥複合体が、４．２５と４．５の間である点で他のものと異なる。これは、各種保存条件の間で最も大きな差異である。スペクトラムのＰＶＡは、液体および凍結ｐＨが高く、そしてプラスミドが、このｐＨでいっそう安定であるので、他の製造物より有利である。
【０１６０】
重量オスモラル濃度の結果
プラスミド／ＰＶＡ複合体の重量オスモラル濃度は、目立たない。アルドリッチの複合体の重量オスモラル濃度は、およそ３２０ｍＯｓｍであり、登録商標モウィオール複合体も、およそ３２０ｍＯｓｍであり、そしてスペクトラムの複合体は、平均およそ３１０ｍＯｓｍであった。
【０１６１】
ゲル電気泳動の結果
異なるプラスミド／ＰＶＡ複合体のゲル電気泳動の結果は、互いに非常に類似する。アルドリッチ、登録商標モウィオール、およびスペクトラムの液体および凍結複合体は、全て、６０−８０％のスーパーコイル状プラスミドであった。製造業者らの各々についての凍結乾燥複合体は、液体および凍結の複合体のものより明らかに低く、４０−６０％のスーパーコイル状プラスミドであり、それにより凍結乾燥した複合体は、液体および凍結複合体より安定性が低いことが示された。
【０１６２】
ゲル電気泳動によるプラスミド分子当たりの非塩基性部位
プラスミド／ＰＶＡ複合体の非塩基性損傷について明らかな傾向はない。
粘度の結果
アルドリッチおよび登録商標モウィオールの液体および凍結の複合体の粘度は、およそ７−８ｃＰであり、そして互いに類似する。アルドリッチおよび登録商標モウィオールの凍結乾燥複合体の粘度は、様々の時点で、５．５−１１ｃＰで変動して非常に一貫しなかった。スペクトラムの凍結乾燥複合体は、各時点で、８−１４ｃＰで変動して非常に一貫しないので、他の材料と類似している。しかし、スペクトラムの材料の粘度は、アルドリッチおよび登録商標モウィオールの材料より本質的に高く、それで液体および凍結の複合体は、平均およそ９ｃＰである。凍結乾燥した複合体は、凍結乾燥するのが困難であり、そして再水和時間の４時間後でさえ、ある程度の固体が、バイアルに見られた。一貫しない粘度測定は、再水和での困難さに最もよるようである。
【０１６３】
生体内の結果
これらのデータは、プラスミド／ＰＶＡ複合体（１；１０ｗ／ｗ）が、同じ用量でプラスミド単独より腫瘍におけるＣＡＴ発現のレベルのおよそ２倍を示す。
当業者は、本発明が、目的を達成し、そして明記された結果および利点の他、発明に固有のものを得るのに十分に適していることを容易に認める。ここに記述される分子複合体および方法、手段、治療、分子、特定の化合物は、好ましい具体例の現在の代表例であり、例示であって、本発明の範囲における限定として意図されない。そこにおける変化およびその他の用途は、本発明の概念の内に包含されるものが、請求項の範囲によって定義されることが当業者に思い出される。
置換および修飾を変動することが、本発明の範囲および概念から逸脱することなしに、ここに開示される発明になされうることは当業者に十分に明らかである。
本明細書に明記される全ての特許および刊行物は、本発明が関連する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、個々の刊行物が、参照して組込まれるべきであると特別にそして個別にしめされた場合と同じ範囲で参照してここに組込まれる。
【０１６４】
ここに例示的に記述される発明は、いずれかの要素または複数の要素、制限またはここに特に開示されない制限の不在下で適切に実施されうる。したがって、例えば、ここにある各例で、語句「を含む」、「から非塩基性に構成される」および「から構成される」の内のいずれもは、他の２つの語句のいずれかと交換しうる。使用された語句および表現は、説明の語句として使用され、制限のものではなく、そして示されそして記述される任意の特性の等価物、またはその部分を排除するこのような語句および表現の使用において意図はないが、しかし様々の修飾が、主張される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい具体例および任意の特性によって特に開示されたが、ここに開示される概念の修飾および多様化は、当業者によって求められうること、そしてそのような修飾および多様化は、付随の請求項によって定義されるとおり本発明の範囲内にあると考えられることと理解すべきである。
さらに、本発明の特性または態様が、マーカッシュ群の語句で記述される場合、当業者は、本発明が、それにより、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素またはサブグループの語句で記述されもすることを認識する。例えば、Ｘが臭素、塩素およびヨウ素から構成される群から選択されると記述される場合、Ｘが臭素である請求項、およびＸが臭素および塩素である請求項が、十分に表示される。「を含む」によって、それに限定されないが、言葉「を含む」に続くものはなんでも含むことが意味される。したがって、語句「を含む」の使用は、列記された要素が、必要とされるか、または強制的であるが、他の要素は、都合により、そして存在しなくてもしてもよいことを示す。「から構成される」により、それに限定されないが、語句「から構成される」に続くものはなんでも含むことが意味される。したがって、語句「から構成される」の使用は、列記された要素が、必要とされるか、または強制的であるが、他の要素で、存在しうるものはないことを示す。「から非塩基性に構成される」により、それに限定されないが、その語句の後に列記される任意の要素を含むことが意味され、そして列記される要素についての開示に特定された活性または作用に干渉しないか、または貢献する他の要素に限定される。したがって、語句「から実質的に構成される」は、列記される要素が、必要とされるかまたは強制的であるが、他の要素は、都合により、そしてそれらが、列記される要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかによって、存在しても、存在しなくてもしてもよいことを示す。
他の具体例は、以下の請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明におけるインライン混合装置のための好ましい設定の例示である。２つの液体は、入口まで供給され、そして「Ｙ接続部」までポンプによって駆動される。いったん２つの液体が、接触したら、それらは、静電混合装置を通して起動して、およそ均一なサイズの粒子を有する均質な複合体を生成する。
【図２】  図２は、実施例で規定されるとおり、プラスミド／ＰＩＮＣ複合体からプラスミド含有投与量を作り出す異なるタイプの多バイアル反応を比較する略図である。４バイアル複合体では、投与量は、投与の直前にＷＦＩ、プラスミド、２５％ＰＶＰおよびＮａＣｌの４つの要素を合せることによって作ることができる。３バイアル複合体では、投与の直前にプラスミドの要素およびＮａＣｌを、凍結乾燥ＰＶＰと合せる。１バイアル複合体では、ＮａＣｌを、投与の前に、同時凍結乾燥したプラスミド／ＰＶＰ複合体に添加して、それを再水和する。１バイアルの予じめ中和された複合体では、ｐＨ４のクエン酸Ｎａ緩衝液を、投与の直前に、添加して、同時凍結乾燥したｐＨ７のプラスミド／ＰＶＰ複合体を再水和する。
【図１】
0004538150.tif 000004
【図２】
0004538150.tif 000005