(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも３０％の架橋モノマー単位を含む支持体樹脂粒子を有する成分Ａ
ｂ）各陰イオン交換官能基が少なくとも第１及び第２窒素基を有し、当該第１窒素基が第四級アミンであり、当該第２窒素基が第四級アミン及びトリエチレンジアミンからなる群から選ばれる、陰イオン交換官能基を含むポリマー
を有する陰イオン交換組成物において、当該陰イオン交換官能基を含むポリマーが、成分Ａに直接又は間接的に保持されていることを特徴とする陰イオン交換組成物。
【請求項２】
陰イオン交換官能基を含む当該ポリマーが成分Ｂ樹脂粒子を有し、成分Ａが少なくとも当該成分Ｂの有効部位を引きつける有効表面上に負に荷電した部位を有する、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項３】
陰イオン交換官能基を含む当該ポリマーが成分Ｂ樹脂粒子を有し、成分Ａと成分Ｂが、互いに分散剤によって保持されている、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項４】
当該陰イオン交換官能基を含むポリマーが、成分Ａと共有結合的に結合されている、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項５】
当該陰イオン交換官能基を含むポリマーが、成分Ａ上に被覆物を形成している、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項６】
当該陰イオン交換官能基が、それぞれ第１及び第２窒素基を有する、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項７】
当該陰イオン交換官能基が、それぞれ第１、第２及び第３窒素基を有する、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項８】
当該全ての窒素基が、第四級アミンである、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項９】
当該第１及び第２窒素基が、第四級アミンである、請求項６に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項１０】
当該第２窒素基が、トリエチレンジアミンである、請求項１に記載の陰イオン交換組成物。
【請求項１１】
クロマトグラフィ分析カラムであって、
ａ）少なくとも３０％の架橋モノマー単位を含む支持樹脂粒子を有する成分Ａ
ｂ）各陰イオン交換官能基が少なくとも第１及び第２窒素基を有し、当該第１窒素基が第四級アミンであり、当該第２窒素基が第四級アミン及びトリエチレンジアミンからなる群から選ばれる、陰イオン交換官能基を含むポリマー
を有する陰イオン交換クロマトグラフ充填物の充填床を含むカラムにおいて、当該陰イオン交換官能基を含む当該ポリマーが、成分Ａ上に直接又は間接的に保持されていることを特徴とするカラム。
【請求項１２】
炭水化物のクロマトグラフ分離方法であって、以下の工程を有することを特徴とする方法。
ｉ）前記炭水化物を有する液体溶液を、請求項１に記載の陰イオン交換組成物を含む床に通す工程；
ii）吸着された炭水化物を当該床から差動的に除去する溶離剤で当該床を溶離する工程。
【請求項１３】
当該樹脂粒子が、少なくとも55％の架橋モノマー単位を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
当該架橋モノマーが、ジビニルベンゼンである、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、少なくとも第１及び第２窒素基を含有する陰イオン交換官能基を含む陰イオン交換組成物を提供するものである。第１窒素基は第四級アミであり、第２窒素基は、第一級、第二級、第三級または第四級アミンからなる群から選ばれる。この組成物の製造方法及び使用方法も提供される。
発明の背景
グルコースやマンノースのような炭水化物は、高ｐＨで陰イオンにイオン化され、その後、水酸化ナトリウム溶離剤入りの陰イオン交換クロマトグラフィカラムで分離される。
公知陰イオン交換組成物は、一般にいくつかのカテゴリーに分類される。より伝統的な陰イオン交換系において、一般に負電荷を有する合成支持体樹脂の粒子は、正電荷の陰イオン交換官能基、即ち陰イオン交換部位を有するより小さな合成樹脂粒子の層で覆われている。このより小さな粒子は、静電引力によってより大きな支持体粒子に保持される。この支持体樹脂は、種々の形態で得られる。例えば、米国特許第4,101,460、4,383,047、4,252,644、4,351,909及び4,101,460号明細書を参照されたい。
さらに最近の開発では、陰イオン交換官能基を含有し、互いに分散剤で保持されている荷電されていない支持体樹脂及びより小さなラテックス粒子を利用する（米国特許5,324,752号明細書参照）。
さらに、小さなラテックス粒子を全て排除する方法が開発された。例えば、陰イオン交換官能基を、種々のポリマー基体に、グラフト又は共有結合的に結合する（米国特許5,006,784号明細書参照）。あるいは、陰イオン交換官能基を、支持体樹脂粒子と、共有結合的に結合するのではなく、静電気的又はその他の方法でしっかり結合する（米国特許4,927,539号明細書参照）。
標準状態で中性の陰イオン交換体に保持されない多くの炭水化物は、固定相のｐＨが十分高ければ、保持及び分離され得る。12〜14の溶離剤ｐＨは、解離定数に基づいて、炭水化物が少なくとも部分的にイオン化されることを保証するのに必要である。固定相のｐＨは、水酸化物濃度の関数である。伝統的に、固定相における水酸化物濃度は、４つの方法のうちの１つによって調節されるが、すべてに重大な欠点がある。
１．溶離剤組成物
炭水化物クロマトグラフィ用に、溶離剤は、通常水酸化物を含む。水酸化物のみの溶離剤系は、可能な限り高い固定相ｐＨを与える。アセテートのような第２アニオンを溶離剤に添加すると、固定相ｐＨが低下する。
２．固定相の架橋
架橋は、水中における固定相の膨潤範囲を直接制御して固定相の含水量を制御するので、水酸化物含有溶離剤系を使用する場合には、架橋は固定相ｐＨも制御する。固定相の含水量が低いほど、固定相の官能基の水による「希釈度」が低下する。これは、固定相ｐＨの上昇になる。このｐＨ上昇法の限界は、固定相における物質輸送が、５％レベルをはるかに超えて架橋を上昇することにより緩やかになるところである。従って、これは、架橋の制御に基づく固定相ｐＨの上限を意味する。さらに架橋が増加すると、クロマトグラフの性能に悪影響を及ぼす。
３．官能基の大きさ
イオン交換部位における官能基の大きさは、水酸化物含有溶離剤系を使用するときに固定相ｐＨに影響し得る適度な範囲にある。官能基の実寸を変えて、固定相ｐＨを希釈剤効果により微調整できる。官能基の大きさが増加するにつれて、全固定相容積は、官能基に占められたより大きな容積によって「希釈」される。このやり方には、２つの問題がある。第１は、固定相ｐＨに重大な影響を与えるために、官能基の量は、固定相の作成に使用したモノマーの量と比較して大きくなければならない。このような条件下では、一般に、この大きな官能基の立体効果による固定相の物質輸送の問題がある。第２に、できるだけ小さい官能基（即ち、ビニルベンジルクロライド（ＶＢＣ）とトリメチルアミンの反応に由来する第四級イオン交換部位）が、一般にイオン交換部位の調製に使用されるので、このやり方は、固定相ｐＨの低下にのみ有用である。従って、この制御メカニズムの選択のみが、官能基の大きさを増加して、固定相ｐＨを低下させる効果を有する。
４．官能基のモノマーの画分
固定相ポリマーの総量の種々の官能基のモノマーの画分は、固定相ｐＨの制御に使用される。例えば、水酸化物含有溶離剤系を使用するときに、ラテックス粒子中のＶＢＣの画分が増加すると、固定相ｐＨが更に高くなる。しかしながら、これは、ラテックス中のいくらかの他のモノマーの画分量の減少によって達成されるだけである。概して、ラテックスの含有量は、既に95％がＶＢＣであるため、ラテックスのＶＢＣ含有量がさらに増加しても、固定相ｐＨには取るに足らない効果しかない。さらに、炭水化物用高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィに使用される、典型的なラテックス粒子中のモノマーの画分の残部は、架橋モノマーのジビニルベンゼン（ＤＶＢ）である。前記の通り、ラテックスのＶＢＣ含有量を増加させるためにラテックス粒子の架橋レベルを低下することは、実際、固定相ｐＨに悪影響となる。より低いＤＶＢ含有量によって増加した膨潤は、ＶＢＣのわずかに高いモノマー画分によるわずかなｐＨの増加を相殺して余りある。従って、官能基化モノマーの画分の変化が固定相ｐＨの制御方法に有用である一方、現行のポリマー製剤は、既にこの制御メカニズムによって、可能な限り最大の固定相ｐＨを提供している。
従って、本発明の目的は、効果的な固定相ｐＨを上昇できるイオン交換クロマトグラフィにおいて使用する組成物を提供し、広範な種類の炭水化物の分離を改善することにある。さらに、そのような組成物を作るための方法を提供し、炭水化物の分離における組成物の使用方法を提供することを目的とする。
発明の概要
前記で概略した目的に従って、本発明は、支持体樹脂粒子を有する成分Ａと、陰イオン交換官能基を含むポリマーを有する陰イオン交換組成物を提供する。各陰イオン交換官能基は、少なくとも第１及び第２窒素基を含む。第１窒素基は、第四級アミンであり、第２窒素基は、第一級、第二級、第三級又は第四級アミンからなる群から選ばれる。陰イオン交換官能基は、成分Ａに直接又は間接的に保持される。
さらに、有効表面に陰イオン交換官能基を含むポリマーを有する合成樹脂の粒子を有する成分Ｂを有する陰イオン交換組成物も提供する。成分Ａは、少なくとも成分Ｂの粒子の有効部位を引きつける有効表面において、負に帯電した部位を有する。
さらに、本発明の陰イオン交換クロマトグラフ充填組成物の充填床を含むクロマトグラフ分析カラムを提供する。
さらに、炭水化物を含む液体溶液を本発明の陰イオン交換組成物を含む床に通すことを特徴とする炭水化物、アルジトール及びアミノ酸のクロマトグラフ分離方法を提供する。
加えて、官能基とモノマーが結合できる条件下で、官能基化モノマーと陰イオン交換官能基とを接触させることを含む陰イオン交換クロマトグラフィで使用する陰イオン交換組成物の調製方法を提供する。陰イオン交換官能基を含むモノマーは、陰イオン交換官能基を加えて陰イオン交換基を含むポリマーを作る前あるいは後に重合される。陰イオン交換官能基を含むポリマーは、陰イオン交換組成物に組み込まれる。
さらに、少なくとも約30％の架橋モノマー単位を含む支持体樹脂粒子を有する成分Ａを有するモノサッカライドのクロマトグラフ分離用の組成物を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、新規で強力な固定相ｐＨの上昇方法であって、炭水化物のクロマトグラフ分離に特に有意なものに関する。この方法は、各官能基を有する陰イオン交換部位の数の上昇による固定相ｐＨの制御を含む。炭水化物の分離に使用するような水酸化物含有溶離剤系を使用すれば、２以上の陰イオン交換部位を官能基化モノマーにつけて、固定相における水酸化物濃度、つまり固定相ｐＨを実質的に増加できる。
一つの態様として、本発明は、支持体樹脂粒子である成分Ａ及び陰イオン交換官能基を含むポリマーを有する陰イオン交換組成物を提供する。各陰イオン交換官能基は、少なくとも２種の窒素基を有する。少なくとも１つの窒素基は、第四級アミンであり、他の窒素基は、第一級、第二級、第三級又は第四級アミンのいずれかである。これら官能基は、成分Ａに直接的あるいは間接的に保持される。
ここで言う「成分Ａ」の語は、不溶性の合成支持体樹脂粒子を意味し、当該技術分野で公知である。成分Ａは、当該技術分野で概して「基体」と呼ばれる。広範な種類の適当な成分Ａ物質は、公知のもので、限定されることはないが、ポリ（フェノールホルムアルデヒド）、ポリアクリル酸若しくはニトリル、ポリメタクリル酸若しくはニトリル、アミン−エピクロロヒドリンコポリマー、ポリエチレン又はポリプロピレンにおけるスチレンのグラフトポリマー、ポリ（2-クロロメチル-1,3-ブタジエン）、又はスチレン、アルファ−メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン、ビニルピリジンから得られるようなポリ（ビニル芳香族）樹脂、又はメタクリル酸の相当するエステル、スチレン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン、及び類似する不飽和モノマー、モノビニリデン環を含む窒素複素環式化合物をはじめとするモノビニリデンモノマー、及び上記モノマーのコポリマーを含む。
加えて、成分Ａの樹脂粒子は、懸濁重合技術で調製されるような巨大多孔質（macroporous）であり（米国特許第5,324,752号明細書、及びそこで引用された参考文献を参照）、当該特許明細書及びその参考文献に列挙されたいかなる物質から作られてもよい。
好ましい態様として、基体ポリマーは、カラムの酸素保持を最大にするように選択される。酸素保持は、炭水化物の検出が一般に金電極上のパルス電流測定検出により行われるので重要である（S.Hughes and D.C.Johnson、Anal.Chim.Acta.132、11〜12頁、1981年に記載）。炭水化物のパルス電流測定検出は、使用中に電極に生じる金酸化物層上で現れる。即ち、パルス波形において、３つの電位が約１秒以内に電極に加えられる。この電位は、それぞれ当該秒の一部に対して加えられる。第１の電位Ｅ１は、電流を検出のために集めたときの電圧である。第２の電位は、さらに高く、残留している物質をより完全に酸化して電極を掃除するために使用される。第３の電位Ｅ３は、更に負であり、Ｅ１で検出するための物質を吸着できる。この検出スキームは、炭水化物の酸化から電子の流れを生み出す。溶離剤及び／又は試料からの溶解酸素が電極を通過するとき、電流の減少が観測される。この減少は、酸素を保持するカラムが炭水化物の分離に使用されるときに、クロマトグラフのベースラインの降下として観測され得る。酸素が炭水化物の付近で又は炭水化物と共に溶離すれば、炭水化物からの電流が酸素によって効果的に減少されるために、炭水化物の定量化は損なわれる。CarboPac PA1のような炭水化物を分離する陰イオン交換カラムも同じ時間の枠内で酸素を保持するので、酸素の妨害が問題になっていた。
従来、この定量化の問題を最小にする試みは、使用できる信号対雑音比で炭水化物を検出する間、酸素の信号の大きさを最小にするために、検出器のパルス配列中の電位を最適化することに集中した。これは、酸素の吸収が炭水化物と比べて最小化されるときの電位を選んで行われる。このやり方は定量化を改善したが、問題は、完全には解決しなかった。
酸素の保持は、ラテックスに抗して、カラム充填の成分Ａ部分に生じる。本発明者は、酸素に対する保持容量がスルホン化の程度と樹脂のジビニルベンゼン容量に影響されることを発見した。
従って、好ましい態様として、支持体樹脂粒子は、約30重量％〜約100重量％のジビニルベンゼンモノマーを含む、スチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンのコポリマーのような、架橋ポリマー又はコポリマーのビーズを含む。好ましくは、支持体樹脂は、少なくとも30％、より好ましくは約40％、最も好ましくは約55％のジビニルベンゼン含有量を有する。
好ましい支持体樹脂粒子は、55％のジビニルベンゼンを有するスチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンのコポリマーを含む。他の好ましい支持体樹脂は、スチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン及びビニルトルエン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンのようなジビニルベンゼンを含む、他のスチレンコポリマー及びターポリマーを含む。
成分Ａ支持体樹脂粒子の大きさは、系の他の成分に依存して変化する。一般に、成分Ａ粒子は、約2500超〜約140メッシュ（約３〜約105ミクロン）であり、約５〜約25ミクロンが好ましく、約８〜約13ミクロンが特に好ましい。成分Ａ粒子は、単分散であっても、巨大多孔質であってもよい。成分Ａ粒子は、当該技術で公知であり、例えば、ここに参考として組み込まれるものとして米国特許第4,101,460、4,383,047、4,252,644、4,351,909、4,101,460、5,324,752号明細書を参照されたい。
好ましい態様として、例えば、成分Ｂ粒子が存在するとき、又は陰イオン交換官能基を含むポリマーが支持体樹脂粒子に直接保持されるとき、成分Ａ支持体樹脂粒子は、少なくとも粒子の有効表面上に負に帯電した部位を有する。これら負帯電部位（「陽イオン交換部位」とも言える）は、一般にスルホン酸官能基であり、当該技術分野で認識されているが、カルボキシル官能基又はアミノカルボン酸基のようなキレート部位であってもよく、これらは、配位錯体に誘引され又は陰イオン交換官能基と配位錯体を形成する。スルホン化度を選択して最小の要求量を調製し、酸素保持が有意になる点までスルホン化レベルが増加することなく、逆帯電交換陰イオン交換官能基の良好な保持を達成する。逆帯電交換陰イオン交換官能基の保持の許容レベルは、炭水化物のような興味対象の分析物を保持し、分離するために必要なイオン交換容量として定義される。分析物対酸素の容量は、慎重にバランスがとられているので、炭水化物は良好に分離されるが、酸素は最後の炭水化物の後でも溶離する。スルホン化レベルは、陽イオン交換容量に特徴づけられる。樹脂の陽イオン交換容量は、一般に約0.05〜約５ミリ当量／ｇ、約0.20〜3.0ミリ当量／ｇが好ましく、約0.8〜約1.9ミリ当量／ｇが最も好ましい。スルホン化の一般的方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ここに参考として組み込まれるものとして米国特許第4,101,460、4,383,047、4,252,644、4,251,909、4,101,460及び5,324,752号明細書を参照されたい。
ここで使用される「有効表面」の語は、他の樹脂粒子又は溶離剤と接触する樹脂の表面を意味する。例えば、成分Ａの有効表面は、もし存在すれば成分Ｂの粒子、又は例えば炭水化物のような分離される分析物を含む溶離剤と接触する表面である。成分Ａは、ゲル型樹脂のビーズで作られ、有効表面は、本質的にそのようなビーズの外側表面であって、任意に存在してもよい巨大細孔の表面を含む。同様に、成分Ｂの有効表面は、もし存在すれば成分Ａと、又は溶離剤と接触する表面である。
ここで「陰イオン交換官能基」は、正味の正電荷を有し、陰イオン交換組成物の陰イオン交換部位として働く当該組成物の一部分を意味する。伝統的な陰イオン交換樹脂は、単一の窒素基、即ち、トリメチルアミン基又はジメチルエチルアミン基のような第三級アミンから由来する第四級アミンを、陰イオン交換官能基として利用する。本発明の陰イオン交換官能基は、少なくとも第１及び第２窒素基を有する。少なくとも１種の窒素基、即ち第１窒素基は正に電荷した第四級アミンである。付加的な窒素基は、第一級、第二級、第三級又は第四級アミン基からなる群から選ばれる。
好ましい態様として、陰イオン交換官能基は、２〜10種の窒素基、好ましくは２〜６、特に好ましくは２及び３種の窒素基を有する。
ここで「窒素基」は、第一級（Ｘ−ＮＨ2）、第二級（Ｘ−ＮＨＲ）、第三級（Ｘ−ＮＲＲ’）又は、第四級（Ｘ−ＮＲＲ’Ｒ”+）アミン基（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ”は、約１〜10、好ましくは２〜５、特に好ましくは２〜３の炭素から成る直鎖又は分岐鎖のアルキル基）を意味する。以下に概略するように、第三級又は第四級アミンの場合、２種のＲ基が共にシクロアルキル基を形成し、又は２種のＲ基が、Ｘと共にシクロアルキルアミン成分を形成することができる。Ｘは、少なくとも１種の付加的窒素基とアルキルリンカーを有する陰イオン交換官能基の残部を意味する。
好ましい態様として２種の窒素基は、アルキル「リンカー」基に分離される。アルキルリンカーは、約１〜約10、好ましくは約２〜５、特に好ましくは約２〜３の炭素原子からなる直鎖又は分岐鎖アルキル基を有する。好ましい態様として当該リンカーは、第２窒素基が適当な条件下で、第四級アミンを作ることができるような、少なくとも２種の炭素鎖アルキル基である（例えば、メチルアイオダイドやジメチルスルフェートのようなアルキル化剤で処理）。
ある態様では、陰イオン交換官能基は、鎖に沿って間隔を置いた窒素基を有する長いアルキル鎖を有する。例えば、陰イオン交換官能基は、交互に炭素原子をおいた第一級アミンを有する炭素鎖を有し、第四級アミンまで官能基になり得る。この態様におけるアルキル鎖は、非常に長くてもよい。
当該技術分野で認識されているように、陰イオン交換官能基は、アルコール成分又はエーテル結合を含む。例えば、エタノールアミン誘導体が使用される。同様に、ＮＲＲ’Ｒ”+−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＲＲ’Ｒ”+のような基が使用される。一般に、炭素原子以外の原子は、窒素基の窒素原子と直ちに結合されるべきではない。好ましくは、窒素基の窒素原子とヘテロ原子との間に少なくとも１種の炭素原子、好ましくは２つの炭素原子があることが好ましい。
好ましい態様として、窒素基が第三級、又は第四級アミンであるとき、２種のＲ基（例えばＲとＲ’）は、シクロアルキル基を生成する。即ち、窒素基の窒素原子とＲ及びＲ’基は、シクロアルキルアミン、例えば、ピロリジン、ピペリジン又はピペラジンを形成する。
好ましい態様として、２以上の陰イオン交換官能基の窒素基は、シクロアルキルアミン基を形成する。例えば、好ましい態様として、２種の窒素基は、トリエチレンジアミン基（1,4-ジアザビシクロ[2,2,2]オクタン）を形成する。ビニルベンジルクロライド（ＶＢＣ）のような官能基のモノマーについて付け加えると、トリエチレンジアミンの窒素基の一つは、第四級アミンであり、他は第三級アミンであり、要求すれば、当該技術で公知のメチルアイオダイド、ジメチルスルフェートのようなアルキル化剤を使用して、容易に第四級になる。好ましい態様として、２種の窒素基は、ピペリジンを形成する。
好ましい態様として、以下により完全に説明されているように、陰イオン交換官能基を選択して２種の官能基化モノマー間で架橋する程度を最小になる。従って、トリエチレンジアミンによって、架橋の程度は最小になる。
好ましい態様として、陰イオン交換官能基の全ての窒素基は、第四級アミンである。従って、例えば、好ましい態様としてトリエチレンジアミンは、２種の窒素基を含む官能基前駆体であり、ＶＢＣに結合した後でメチルアイオダイドで処理すると、１つの陰イオン交換官能基に対して２つの第四級アミンを与える。同様に、陰イオン交換官能基が３以上の窒素基を有するとき、好ましい態様として、全ての窒素基は、少なくとも２種の炭素原子のアルキル鎖で窒素基の分離が必要な第四級になる。
更なる態様として、複数の窒素基の少なくとも１種は、第一級、第二級又は第三級アミンであり、第三級が好ましい。例えば、窒素基がトリエチレンジアミンを有し、窒素のただ１つが第四級化されているような、半分が第四級化された（half-quaternized）二官能性の陰イオン交換体の弱い塩基性は、以下に述べられているように、アミノ糖とモノサッカライドとの良好な分離ギャップを与える。
エナミン基（−Ｃ＝Ｎ−）、アミジン基（構造式１）、又はグアニジン基（構造式２）は、ここで定義されている窒素基ではないことが理解される。窒素原子が炭素原子と二重結合で結合する配列は、このような基とは完全に異なる性質を与える。特に、このような基は、化学的安定性を低下し、ならびにイオン化（例えば、窒素部位に電位を作る）が窒素と炭素原子間に単結合しか含まないアミンと比較して非常に困難になる傾向がある。従って、例えば、アミジン基は、遊離塩基の形で乏しい化学的安定性しか有さない。エナミン、アミジン又はグアニジン基が存在すると、陰イオン交換官能基は、ここで定義された少なくとも２種の付加的窒素基を含むことが必要である。
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陰イオン交換官能基は、官能基化モノマーに結合され、ポリマーに取り込まれる。これは、以下で概略するような合成樹脂と結合される陰イオン交換官能基を含むポリマーである。従って、２以上の窒素基を有する陰イオン交換官能基は、単一の第四級アミンを含む陰イオン交換部位として当該技術分野で公知のポリマーの、モノマーサブユニットに結合される。好ましい態様として、ポリマーのモノマーサブユニットの少なくとも約50％は、陰イオン官能基が結合したものを有する。好ましい態様として、約75％を超えるものがより好ましく、約92〜95％のものが特に好ましい。
一般に、陰イオン官能基を含むポリマーが成分Ａを直接保持するとき、ポリマーは、平均して長さで約20モノマー単位、好ましくは約５〜約40、特に好ましくは約15〜約25モノマー単位である。
「官能基化モノマー」は、陰イオン交換官能基と結合できる少なくとも１種の官能基重合可能なモノマーを含む、公知の重合可能なモノマーである。適当な官能基化モノマーは、本発明の陰イオン交換組成物の製造に使用するポリマーであって、限定はされないが、ビニルベンジルクロライド（ＶＢＣ）、ビニルベンジルブロマイド、ビニルベンジルアイオダイド、グリシジルアクリレート、及びグリシジルメタクリレートのような商業的に入手できるモノマー、並びにビニルベンジルグリシジルエーテル、Ω−ハロアルキルアクリレート、メタアクリレート、又はアクリルアミド若しくはメタアクリルアミドのような一般に入手可能でない官能基化モノマーが含まれる。
以下に概略したように、陰イオン交換官能基は、モノマーのどこにでも結合する。即ち、例えばＶＢＣが、陰イオン交換官能基のアタッチメント用モノマーとして使用されるとき、例えば陰イオン交換官能基は、塩化物と置換してモノマーと結合する窒素基の窒素原子の１つ、陰イオン交換官能基の炭素原子、又はアルコール基のいずれかと結合する。好ましい態様として、陰イオン交換官能基は、モノマーと、第三級窒素基の窒素原子を介して結合し、第四級アミンを形成する。
「成分Ａに直接保持」又はこれと文法上同等のものは、陰イオン交換官能基を含むポリマーが支持体樹脂粒子上に不可逆的に保持されることを意味する。従って、例えば、陰イオン交換官能基を含むポリマーがグラフト又は共有結合的に支持体樹脂粒子に直接結合すること、即ち介在する中間体なしで結合することであり、米国特許第5,066,784号明細書に一般的に記載されている。同様に、陰イオン交換官能基を含むポリマーは、非共有性のアタッチメントを経由して支持体樹脂の粒子上に被覆を形成する。このアタッチメントは、非共有性にもかかわらず、不可逆的と考えられる。この「不可逆的」は、陰イオン交換官能基を含むかなりの数のポリマーが、通常のクロマトグラフの条件下、例えば、強電解質又は多価電解質の溶液による条件では、樹脂の有効表面から置換されないことを意味する。液体を通常条件下で陰イオン交換カラムを通すときに、ポリマーが衝突するような剪断力では、ポリマーを置換することはない。
好ましい態様として、この被覆は、静電力を媒介として成分Ａの支持体樹脂粒子の有効表面上に保持され、これは、ここで参考として取り入れた米国特許第4,927,539号明細書に一般的に記載されている。この態様において、成分Ａは、少なくとも陰イオン交換官能基を含むポリマーを結合する粒子の有効表面上の負に荷電した部位を有するので、陰イオン交換官能基を含むポリマーは、直接保持される。
更なる態様として、この被覆は、水素結合や局所的な疎水的相互作用のような他の形式の力を通じて不可逆的に結合される。
「成分Ａに間接的に保持」又はこれと文法上同等のものは、陰イオン交換官能基を含むポリマーが第２の介在する中間体によって成分Ａから分離され、及び中間体に結合されてもよく、これは次々に成分Ａに直接保持される。例えば、ここで参考として取り入れた、米国特許第4,101,460、4,383,047、4,252,644、4,351,909、4,101,460及び5,324,752号明細書を参照されたい。
このように、好ましい態様として、本発明の陰イオン交換組成物はさらに粒子の有効表面上に陰イオン交換部位を有する合成樹脂の粒子であるような成分Ｂを有する。成分Ｂは、しばしば当該技術分野で「ラテックス」、「層状粒子」、又は「単層」と呼ばれ、前記で定義されたように、成分として官能基化モノマーを有する架橋ポリマーを有する。成分Ｂ粒子は、前記成分Ａ粒子で定義されたように、スチレン−ジビニルベンゼンのコポリマー、ジビニルベンゼン−ビニルベンジルクロライドのコポリマー、又はメタクリレート−ビニルベンジルクロライドのコポリマーのような、ポリ（ビニル芳香環）樹脂の架橋ポリマーを有する、周知の合成樹脂から生成される。成分Ｂ粒子は、普通、ラテックスエマルジョンから得られる。成分Ｂ物質及び方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ここで参考として取り入れた米国特許第4,101,460、4,383,047、4,252,644、4,351,909、4,101,460及び5,324,752号明細書を参照されたい。
成分Ａと成分Ｂの大きさの比は変化でき、このことは一般に当該技術分野で周知である。前記の通り、成分Ａ粒子は、普通約３〜約50ミクロンの範囲にあり、成分Ｂ粒子は、約20〜約600ナノメーター、好ましくは約100〜約500ナノメーター、特に好ましくは約300〜約450ナノメーターの範囲にある。
成分Ｂ樹脂は、陰イオン交換官能基を結合するために官能基化モノマー単位のいくらかの画分を含む。一般に、成分Ｂ樹脂は、少なくとも約50％の官能基化モノマーを有し、より好ましくは少なくとも約75％の官能基化モノマーを有し、最も好ましくは少なくとも約90〜95％の官能基化モノマーを有し、約99％が特に好ましい。好ましい態様として、成分Ｂ樹脂は、約１〜約50％のジビニルベンゼンのような架橋モノマーを含み、約１〜約10％が好ましく、約１〜約５％が好ましい。架橋モノマーがないと、得られるポリマーは過剰に膨潤し、本発明において重大な電荷密度の損失を招く。更なる態様として、成分Ｂ樹脂は、スチレンのような疎水性モノマー又はビニルベンジルアルコールのような親水性モノマーと共重合される。
官能基化モノマーを含むポリマーは、樹脂粒子を作り、その後陰イオン交換官能基と反応して陰イオン交換官能基を含むポリマーを形成する。これとは別に、以下で概略するように、陰イオン交換官能基は、官能基化モノマーを重合前に成分Ｂ樹脂粒子中に加えられる。
これは、少なくとも有効表面上に、陰イオン交換官能基を含むポリマーを有する成分Ｂ樹脂粒子になる。一般に、前記で概略したように、少なくとも約50％の成分Ｂ樹脂粒子のモノマーサブユニットは、陰イオン交換官能基を含み、少なくとも約90％に含まれることが好ましい。
本発明のポリマーは、米国特許第4,101,460号明細書に記載されているように、エチレンジアミンを架橋剤として使用することで他のポリマーと区別できる。これら先行技術では、ポリマーは、１％のエチレンジアミンを架橋剤として使用した。３つの別のビニルベンジルクロライドモノマーが単一の窒素原子を攻撃して第四級アンモニウム部位を形成することはほとんどないので、これでは、大した量の第四級アミンにはならない。たとえ存在するとしても、この反応で生成した多くの第四級アミンは、ここで概略した条件下の固定相ｐＨでそれほど上昇しないだろう。
好ましい態様として、成分Ｂ樹脂粒子は、成分Ａ粒子上に静電力によって保持される。この態様で、成分Ａ支持体樹脂粒子は、少なくともその粒子の有効表面上に負の電荷部位を有する。成分Ｂ粒子は、成分Ａ上の有効負電荷部位に結合される有効表面上の陰イオン交換官能基を含むポリマーを有し、２つの成分が静電相互作用によって結合されている。この相互作用は、通常のクロマトグラフの条件下で不可逆的であると考えられる。
他の態様として、成分Ｂ樹脂粒子は、分散剤の使用によって成分Ａ粒子上に保持され、これは、ここで参考として取り入れた米国特許第5,324,752号明細書に記載されている。この態様において、成分Ａ粒子は、その粒子の有効表面に負の電荷部位を有する必要はない。どちらかといえば、成分Ａ粒子は、適当な分散剤の存在下で懸濁重合によって生成し、不可逆的に結合した分散剤を有する支持体樹脂粒子の形成を引き起こす。支持体樹脂粒子−分散剤の錯体は、陰イオン交換官能基に含まれるポリマーを有する成分Ｂ粒子と接触させる。適当な反応条件下で、成分Ｂは不可逆的に結合し、成分Ａ粒子−分散剤−成分Ｂ粒子の錯体を形成する。
本発明の陰イオン交換組成物は、単糖類、アルジトール及びアミノ酸の伝統的な単一の窒素基組成物と比較して、増加した容量及び良好な分離を有する。一般に、２種の窒素基を含む陰イオン交換官能基を有する陰イオン交換組成物は、少なくとも単一の窒素基を超えて約50％に増加した容量を有し、さらに可能であれば約60〜75％を有する。例えば、付加的窒素基を含むラテックスは、増加したポリマーの水和のためラテックスを含む単一の窒素に相当する以上に膨潤し、従って容積で100％に増加することはない。
加えて、本発明の陰イオン交換組成物は、公知樹脂と比較して、モノサッカライド、アルジトール及びアミノ酸の改善された分離を示す。例えば、公知の樹脂と方法は、２種の重要な糖アルコールである、ソルビトールとズルシトールを分離できない。これは、固定相ｐＨが、いかなる有意な範囲でも、ソルビトール又はズルシトールのいずれかをイオン化するには不十分な高さであることによる。これと比較して、実施例で概略するように、本発明の陰イオン交換樹脂は、少なくとも約0.25のピーク比、可能であれば少なくとも約0.50、0.60及び0.70のピーク比で変化して、ソルビトール及びズルシトールを分離できる。
本発明の陰イオン交換組成物は、以下のようにして作られる。成分Ａ支持体樹脂粒子は、当該技術で知られているような一般的な重合技術を使用して作られる。ここで参考として組み込まれた米国特許第4,101,460、4,383,047、4,252,644、4,351,909、4,101,460及び5,324,752号明細書を参照されたい。
陰イオン交換官能基を含むモノマーは、以下の、ＶＢＣを例示的な官能基化モノマーとして使用する、反応１〜６に示すような、官能基化モノマーから作られる。
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反応１及び２は、テトラメチルエチレンジアミンを２種の窒素基＋アルキルリンカーとして使用する。しかしながら、更なる操作がなければ、反応３に示すような望ましくない架橋反応が起こる。
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反応３は、２つの理由から望ましくない。つまり、モノマー単位当たり１より多い陰イオン交換部位になる結果に陥り、さらに重要なことは、固定相の架橋が増加することである。前記で概略したように、架橋の上昇は、固定相の物質輸送速度に悪影響とならない限られた範囲までしか使用できない。反応３は、態様によっては好ましいけれども、許容範囲外の量の架橋が作られるような割合で行われる傾向がある。
この問題は、反応４〜７に示すように、合成中のブロッキング又は保護基の使用により回避され得る。これらの反応では、他の保護基も使用されるが、ホルミル保護基を使用して架橋を回避する。Greeneら、Protective Groups in Organic Synthesis、第２版、Wiley & Sons、1991年を参照。
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反応８〜11は、３つの官能基の陰イオン交換官能基における保護基の使用について示す。
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好ましい態様として、陰イオン交換官能基は、反応12及び13で示されるようにトリエチレンジアミンである。反応13の生成物は、できるだけ小さい二官能性の陰イオン交換部位、及びできるだけ高い固定相ｐＨを作る点で特に有利である。トリエチレンジアミンの態様は、実質的に架橋が生じない点で明らかに有利である（反応14）。
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成分Ａ上の陰イオン交換官能基を含むポリマーの直接保持は、いくつかの方法で達成されている。ある態様では、官能基化モノマーを含むポリマーは、前記のごとく成分Ａ粒子上へグラフトされる。成分Ａ粒子に付加させるとすぐに、官能基化モノマーは、陰イオン交換官能基と反応させる。これとは別に、陰イオン交換官能基は、重合前に官能基化モノマーに加えられる。重合後、陰イオン交換官能基を含むポリマーは、公知化学反応を使用して成分Ａ粒子にグラフトされる。
官能基化モノマーを含むポリマーが共有結合的に結合するのではなく成分Ａ粒子上に被膜を形成するとき、陰イオン交換組成物は、陰イオン交換官能基を含むポリマーの添加によって作られる。即ち、官能基化モノマーを重合し、ポリマーは陰イオン交換官能基と反応させる。その後、ポリマーは、静電気的に又は他の方法によって成分Ａ粒子と結合させる。
陰イオン交換官能基を成分Ｂ粒子に添加することは、同様の方法で達成でき、いくつかの方法でなし得る。ある態様では、一回分のラテックスは、官能基化モノマーを成分として使用する伝統的な方法で合成される（ここで参考として取り入れた米国特許第4,101,460、4,383,047、4,252,644、4,351,909、4,101,460及び5,324,752号明細書を参照）。ラテックスは、陰イオン交換樹脂官能基と結合され、保護基であってもなくても、陰イオン交換官能基を含むポリマーを有する成分Ｂ粒子を作る。成分Ｂ粒子は成分Ａ粒子上に凝集させ、必要に応じて脱保護し、メチルアイオダイド又はジメチルスルフェートのような適当なアルキル化剤と反応させる。
これとは別に、官能基化モノマーを陰イオン交換官能基と反応し、保護されていてもなくても、他の適当なモノマーと混合し、官能基化モノマーを含むポリマーに重合する。当該ポリマーは、必要であれば脱保護され、適当なアルキル化剤と反応させる。
作るとすぐに、陰イオン交換組成物は、クロマトグラフカラムに充填される。
作るとすぐに、本発明の陰イオン交換組成物は、数多くの用途を見いだした。
最も幅広い態様として、陰イオン交換組成物は、陰イオン交換クロマトグラフ製造において現在の陰イオン交換組成物に代わって使用される。
好ましい態様として、陰イオン交換組成物は、炭水化物分離用クロマトグラフカラムに使用される。
好ましい態様として、本発明の陰イオン交換組成物は、糖アルコールの分離に使用される。糖アルコールは、通常の炭水化物と比較して非常に弱い酸である。その結果、糖アルコールは、保持に乏しい傾向があり、伝統的な陰イオン交換相上で乏しい選択性を示す。２つの重要な糖アルコールであるソルビトール及びズルシトールの分離は、炭水化物の分離用に設計されたラテックスベースのセパレーター（CarboPac PA1及びCarboPac PA100、Dionex製、ラテックス上にモノ第四級アンモニウム官能基を共に使用）でもすることができない。これは、固定相ｐＨが、いかなる有意な範囲でも、ソルビトール又はズルシトールのいずれかをイオン化するには不十分な高さであることによる。従って、糖アルコールを分離する以前から知られた実行可能な方法は、CarboPac MA1カラム（Dionex）を使用することだった。CarboPac MA1充填において、充填は完全に官能基化し且つ巨大多孔質の陰イオン交換樹脂を、CarboPac PA1カラムの15倍のカラム容量で行う。この樹脂はCarboPac PA1及びPA100カラムのラテックスの３倍の架橋を有する。容量が高いほど、より濃縮した溶離剤が使用され（CarboPac Pカラムの0.15MＮａＯＨに対して0.5MＮａＯＨ）、これは、移動相の糖アルコールの更なるイオン化になる。CarboPac MA1カラムのより高い架橋は、固定相における糖アルコールのイオン化の限度を増加する固定相ｐＨを上昇する。これら２つの要因の組み合わせで、糖アルコールの分離ができるが、この容量に対する犠牲は、CarboPac MA1の乏しいカラム安定性、遅い分離、大規模生産の困難性である。
しかしながら、容量又は樹脂の架橋を増加せずに、固定相ｐＨを以前達成できたレベル以上に上げる能力は、伝統的なラテックスベース固定相上で、速度、でこぼこ及び容易に生産という現存する長所を持って、ソルビトール及びズルシトールのような糖アルコールの分離をすることができる。
更なる態様として、陰イオン交換組成物は、優れたリジン−モノサッカライド選択性を有するクロマトグラフカラム及び装置を生み出すために使用される。CarboPac PA1又はCarboPac PA100カラムのような伝統的なラテックスベース陰イオン交換体は、いくつかのモノサッカライドの定量に悪影響であるリジンとモノサッカライドの分離の問題がある。本発明の陰イオン交換組成物は、リジンの保持をのばしてリジンのピークをモノサッカライドのピークから移動し、伝統的なラテックスベースの陰イオン交換体の主要な問題を排除する。
更なる好ましい態様として、陰イオン交換組成物は、１価と２価のイオンを分離するために使用される。二、三又はポリ官能性の陰イオン交換官能基を使用すると、等級として１価のイオンに対する２価のイオンの十分高い分離係数を達成できる。従って、この成分は、１価イオンが大過剰に存在する中で微量の２価イオンを測定したり、これとは別に、２価イオンが大過剰に存在する中で微量の１価イオンを測定するときに特に使用される。
加えて、半分、又は部分的に第四級の形態の場合（即ち、陰イオン交換官能基の少なくとも１個の窒素が第四級でない）、本発明の陰イオン交換組成物は優れたモノサッカライド選択性を与えるために使用される。モノ官能基の陰イオン交換体の一般的問題は、ガラクトース、グルコース及びマンノースの光学分離を提供する溶離剤の条件が、グルコサミン及びガラクトースの限界分離に帰着することである。部分的に第四級化した二又はポリ官能性の陰イオン交換官能基の高い塩基度は、アミノ糖（ガラクトサミン及びグルコサミン）及びモノサッカライド（ガラクトース、グルコース及びマンノース）の間の良好な分離ギャップを与える。
以下の実施例は、上記発明で使用した方法をより完全に記載するものであって、同時に本発明の種々の局面を実行するために最もよい方法を熟慮したものである。これら実施例は、本発明の真の範囲を何ら限定するものではなく、例証目的にすぎない。ここで引用した全ての参考は、参考文献として取り入れられる。
実施例
実施例１
炭水化物分離用標準ラテックスの合成
液相は、水200g、界面活性剤1g、１％炭酸水素ナトリウム1g、Ｋ2Ｓ2Ｏ81g及びＫ2Ｓ2Ｏ50.6gを混合して調製した。有機相は、55％ジビニルベンゼン3gとビニルベンジルクロライド47gを混合して調製した。相は、窒素雰囲気下で20分混合した。反応容器をプロセッサーに移し、６rpm、32℃で18時間回転した。この工程で、直径約205nmの生ラテックスが生成した。
実施例２
実施例１のラテックス11gに、１molトリエチレンジアミン10gを18時間連続添加して反応させて官能基化した。この工程で、直径約420nm、多分散0.04のラテックスが生成した。
実施例３
実施例２のラテックスを、アセトニトリル中１％メチルアイオダイドで、６時間85℃でジ第四級化した。このラテックスは、単位当たり２つの第四級窒素を有している。
実施例４
55％ジビニルベンゼンの10μｍ樹脂を、50℃で３時間、硫酸でスルホン化した。この樹脂のイオン交換容量は、1.7mEq/gだった。
実施例５
２％ジビニルベンゼンの10μｍ樹脂を、50℃で３時間、硫酸でスルホン化した。この樹脂は、約1.2mEq/gのイオン交換容量を有していた。
実施例６
実施例２のラテックスを実施例４の樹脂上に凝集し、４×250mmカラムに充填した。0.018M水酸化ナトリウムの溶離剤を用い、酸素を17分で、マンノースを約14分で溶離した。同一の溶離剤で、ズルシトール及びソルビトールは、ピークの谷と山の比0.27で分離した。
実施例８
実施例３のラテックスを実施例４の樹脂上に凝集し、４×250mmカラムに充填した。0.018M水酸化ナトリウムの溶離剤を用い、ズルシトール及びソルビトールは、ピークの谷と山の比0.67で分離した。