(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に固定された窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基の検出方法であって、ミラージュ効果法によって標識せずに前記核酸または前記窒素塩基を検出することからなる方法。
【請求項２】
支持体上に固定された窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基のための定量化方法であって、ミラージュ効果法によって標識せずに前記核酸または前記窒素塩基を定量化することからなる方法。
【請求項３】
支持体上に固定された窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基のためのマッピング方法であって、ミラージュ効果法によって標識せずに前記核酸または窒素塩基をマッピングすることからなる方法。
【請求項４】
原位置にて合成された少なくとも一の核酸がその表面に固定された支持体から、特に形成される核酸バイオチップの製造方法であって、少なくとも一の合成及び分析のサイクルを含み、特に、第一に支持体表面に固定された前記核酸の原位置合成のための窒素塩基のカップリング及び、第二に前記窒素塩基のカップリングを検査するための分析を含み、前記分析が、請求項１に記載の検出方法、請求項２に記載の定量化方法、または請求項３に記載のマッピング方法を利用して行われる方法。
【請求項５】
ミラージュ効果法が、輻射熱偏位法である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基が、励起源より発せられるポンプビームによって照明され、前記励起源から発せられる光の、核酸による、または窒素塩基による吸収、偏位、または反射を、プローブビームを使用して検出または測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポンプビームが、干渉性の光である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブビーム及びポンプビームが、交差する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブビーム及びポンプビームが、直交配置または一直線上配置である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
吸収が、２００乃至３００nmのスペクトル範囲内で検出または測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポンプビームとして、波長２７５nmのアルゴンレーザー、または波長２６６nmの固体レーザーのいずれかが選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記励起源が、干渉性でない放射源である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出、定量化、マッピング、または分析が、前記支持体表面に存在する核酸の極性化において行われる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は特に、支持体上に固定された窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基の特徴付け、定量化、及びマッピングのための方法に関する。これはまた、特に少なくとも一の核酸がその表面に固定された支持体上に、核酸を有するバイオチップを製造する方法、及び本発明による方法を実施するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、本発明は、配列決定及び遺伝子発現の研究のために使用される、化学的または生物学的分析システムの分野における応用のために使用される。
【０００３】
例えば、これらの装置は、同一または相違する分子プローブのセット、例えば支持体の小型化表面またはミクロ表面上に固定された核酸から構成されてもよい。これらは通常バイオチップ、あるいは核酸がデオキシリボ核酸である場合にはＤＮＡチップ、核酸がリボ核酸である場合にはＲＮＡチップと呼称されるものを形成する。支持体ミクロ表面上に固定された全ての核酸は、プローブ基質を形成する。
【０００４】
ＤＮＡチップを使用して試料を分析する間に、抽出物の標的核酸は、標識され、プローブ基質上に付着する。ハイブリダイゼーション、換言すれば相補的核酸の分子同士の相同性、プローブと標識された標的との間の相同性を使用し、分析される試料中に存在する核酸の配列を標識し、同定する。
【０００５】
バイオチップの製造のための数多くの方法が、近年開示及び開発されており、チップ上の分析部位は、さらに小型化され、性能もしくは密度を改善されている。
【０００６】
これらの中には、構造化基質上におけるプローブ核酸の原位置合成からなるものがある。前記合成方法は、二つの異なるアドレッシング・モード；手動アドレッシング・モードもしくは機械的アドレッシング・モード、または光化学アドレッシング・モードまたはリソグラフィ技術を使用する方式のいずれかを使用して基質を構成する。
【０００７】
第一のアドレッシング・モードは、ミクロロボットを使用する、または基質構造に連結させた自動合成装置を使用する、手動アドレッシング・モードである。例えば、このアドレッシング・モードは、文献Southern EM, Nucleic Acid research, April 25 1994, 22(8):1368-1373に開示されている。
【０００８】
ミクロロボットを使用するミクロピペット法またはジェットプリント法による、付着技術の著しい改善により、化学合成法を使用するプローブの工業的製造方法を提供することが可能となっている。文献ＷＯ-Ａ-９４２７７１９(by PROTOGENE LAB INC. and A.P. Blanchard, R. J Kaiser, L.E. Hood, Biosensors and Bioelectronics, vol 11, No. 6/7, pages 687 to 690, 1996）には、ジェットプリント技術の使用して、ＤＮＡの四つの塩基性活性化ヌクレオチド及びカップリング試薬を、ＤＮＡバイオチップの異なる部位上に分配することが開示されている。
【０００９】
光化学アドレッシング技術及びリソグラフィ技術を含む第二のアドレッシング・モードは、例えば、Affymetrix, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, Nov. 26; 93(24), 13555-60に開示されている。
【００１０】
これら二つのアドレッシング・モードにおいては、前記合成は、注意深く保護されたヌクレオシドの連続縮合のためにホスホアミダイトまたはホスファイトを利用し、従来のカップリング反応を使用する。Caruthersの文献（Science, Oct. 85, page 281）には、脱保護、カップリング、キャッピング、及び酸化の工程を含む合成サイクルが開示されている。このサイクルは、微量のヌクレオチドを支持体表面から成長させてバイオチップを形成する手段である。
【００１１】
微量のヌクレオチドが予備合成されており、このため固体支持体上にグラフト結合される前に精製され、適性化されているような幾つかのアドレッシング・モードとは異なり、上述のアドレッシング・モードは、各ヌクレオチドカップリング工程の後に、合成された核酸の特徴付けを必要とするが、これは精製が、合成後には不可能なためである。
【００１２】
例えば、数nlの試薬量から出発する、固体支持体上の（１００×１００）μm2の部位における合成には、出来る限り１００％に近いカップリング有効性を得るために合成方法の最適化が必要である。ハイブリダイゼーションの質は、合成されたプローブの純度に依存するであろう。したがって、各合成工程を適性化すること及び合成された配列を検査できることが必要である。
【００１３】
さらにまた、微量のヌクレオチド合成を実行した後、プローブ密度及び基質表面におけるこの密度の均一性の検査を行わねばならない。
【００１４】
各工程についての有効性算出のために最も頻繁に使用される方法は、ヌクレオシドの脱保護の後に、５００nmにてジメトキシトリチルカチオンの吸収を測定することである。例えば、この方法は、Tetrahedron Letters, vol. 25, No. 4, pages 375 to 378, 1984に記載されている。
【００１５】
測定しようとする吸収は、合成されたプローブの量に依存して０．２乃至１０-3の範囲で変化しうる。この吸収は、通常、０．１％のオーダーの絶対精度をもって、複光束分光計によって測定される。原位置合成のために必要な特徴付け用機器には感度の問題がある。吸収測定が充分に正確（＜１０-3）であれば、有効性は、各工程について算出可能である。この測定が塩基に対して特異的でなく、したがって合成された遺伝子配列について、いかなる情報も提供できない。トリチルカチオンの割合は、基質全体について包括的であり、各基質について平均プローブ密度を算出するために使用することができるが、その均一性については何らの情報も提供していない。
【００１６】
Pease A. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, May 1994, vol. 91, pages 5022 to 5026には、配列決定に使用される合成プローブと等量の、標識したプローブを用いたハイブリダイゼーションの後の蛍光を測定することが開示されている。しかしながら、この測定は、プローブが完全に合成された後に行われており、工程毎の有効性について何の情報も与えることができない。
【００１７】
この技術の改善が、Affymetrixによって提案されたばかりである（in Glen Mac Gall, J. Org. Chem., 1998, 63, pages 241 to 246）。この技術は、合成における各工程について、有効性を示すことができる。核酸の長さが変異する領域をリトグラフィによって定義し、合成終了時には、異なる長さの全プローブ上において、蛍光を含むホスホアミダイトとカップリングを行う。
【００１８】
この方法は、固体支持体上における合成方法の開発に使用可能であるが、様々な微量ヌクレオチドの合成が完了する前には、微量ヌクレオチドのグラフト化における連続工程を特徴付けすることは不可能である。
【００１９】
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight）技術(Little P. D., Anal. Chem. 1997, 69, pages 4540 to 4546に開示)は、ＤＮＡプローブを含むバイオチップの分析に使用されている。これが、現在のところ、上限２．５フェントモルの量を分析するためには、最良の解決を提供する技術である。残念ながら、これは破壊的であり、特別な実施を必要とする。プローブは合成の終点において化学的に裂開可能でなければならず、使用したレーザーを吸収することのできる物質と共結晶化しなければならない。
【００２０】
また別の技術は、合成の後プローブを裂開することからなる。これらはその後、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）により分析することができる。この方法は固体支持体上における合成方法の発展を助けはするが、構造化基質上における原位置合成の特徴付けのためには、決して使用できない。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特にバイオチップの合成における各工程を適性化し、支持体上に合成される核酸の配列、及びこれらの密度及び均一性を確認するために使用される方法を提供することであり、前記方法は、従来の技術が遭遇した上述の問題を解消し、特に核酸を備えたバイオチップの造成を検査するためのものである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明による方法は、支持体上に固定された窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基の特徴付け、定量化、及びマッピングのために使用可能である。これは、ミラージュ効果法による、前記核酸または前記窒素塩基の特徴付け、定量化、及びマッピングからなることを特徴とする。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下の記載を単純化するため、「試料」なる語は、支持体上に固定された、窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基を示すために使用する。
例えば、「Biochimie Generale」(General Biochemistry)と題される本（J. H. WELL. 6th edition, MASSON, pages 279-288）には、核酸及び窒素塩基が開示されている。
【００２４】
本明細書及び添付の請求項中に使用した核酸なる語は、３’−５’ホスホジエステル結合によって互いに結合したヌクレオチドの鎖を示す。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルであり、ヌクレオシドは、プリンまたはピリミジンの窒素塩基の、リボースまたはデオキシリボースとの間の結合から誘導される。核酸は、ヌクレオチドがリボースを含む核酸を形成している場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）であり、ヌクレオチドがデオキシリボース含む核酸を形成している場合にはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。窒素塩基は、核酸がＲＮＡである場合、通常はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、及びシトシン（Ｃ）であり、核酸がＤＮＡである場合には、アデニン、グアニン、及びチミン（Ｔ）及びシトシンである。
【００２５】
本発明による方法は、ＤＮＡまたはＤＮＡ核酸、及びこれらの窒素塩基並びにこれらの誘導体の、特徴付け、定量化、及びマッピングのために使用することができる。
【００２６】
例えば、誘導体とは、異常塩基とも呼称される、上記の窒素塩基の誘導体、例えばシトシンから誘導される５-ヒドロキシメチルシトシンを含む核酸を示す。
【００２７】
本発明はまた、原位置で合成された少なくとも一の核酸がその表面に固定された、固体支持体から特に形成される核酸バイオチップの製造方法を記載しており、前記方法は、少なくとも一の合成及び分析のサイクルを含み、とりわけ、第一に、支持体上に固定された前記核酸の原位置合成のための窒素塩基のカップリング、及び第二に、前記窒素塩基のカップリングを制御するための分析を含み、前記分析は、本発明による特徴付け、定量化、及びマッピングの方法を使用して行われるものである。
【００２８】
核酸の原位置合成のための技術は、特に、バイオチップの製造を開示する上記の本、例えば、Cauthers, Science, October 1985, 281頁以降に記載されている。明らかに、窒素塩基のカップリングは、合成された核酸とカップリングしようとする窒素塩基を含むヌクレオチドとの間に、上述の３’−５’ホスホジエステル結合を形成することに相当する。
【００２９】
薄い核酸層が、通常は非吸収性であると考えられているというのは重要な点である。このことは、特に"Ellispsometric and interferometric characterization of DNA probes immobilized on a combination assay", Gray et al., Lngmuir 1997, 13, 2833-2842に開示されている。
【００３０】
これにも関わらず、本発明者らは、輻射熱法とも呼称される、ミラージュ効果法に興味をもってきた。
【００３１】
これら全ての方法は、通常は所定の周波数でレーザー変調され、ポンプビームと呼称される放射源を、その吸収を測定しようとする試料の励起のために使用する。入射光エネルギーの一部は、試料によって吸収される。吸収されたエネルギーの割合は、当該試料についての吸収スペクトル及び励起源の発光スペクトルによって固定されている。吸収されたエネルギーの一部は、指数勾配を発生させる、局所温度勾配を発生させる。
【００３２】
輻射熱方法は、この指数勾配を検出することからなる。
【００３３】
本発明者らは、独創的にも、輻射熱偏位法が、輻射熱法またはミラージュ効果法の一つであり、これが本発明に使用可能であることを示した。
【００３４】
輻射熱偏位法は、指数勾配が位置する領域を通過する、プローブビームと呼称される光線の偏位を測定することからなる。換言すれば、これは、ポンプビームにより吸収体試料において温度が上昇することに起因する、プローブビームの偏位を測定することからなる。この輻射熱偏位技術は、吸収マッピング、熱パラメータ映像などの表面分析に応用されたが、支持体上に固定された核酸または核酸の窒素塩基の特徴付け、定量化、及びマッピングのためには使用されていない。
【００３５】
本発明の実施に充分な、輻射熱法の完全な提示は、例えば"Photothermal Spectroscopy Methods for Chemical Analysis, S. E. Bialkowski, vol. 134 in Chemical Analysis: a Series of Monographs on Analytical Chemistry and its Applications, Wiley"と題される本に見いだされる。
【００３６】
したがって、輻射熱偏位法の場合には、核酸または核酸の窒素塩基が、励起源から発せられる光によって照明され、前記励起源から発せられる光の、核酸による、または窒素塩基による吸収、偏位、または反射を検出または測定するためにプローブビームが使用される。
【００３７】
添付の図１には、本発明による方法のための測定波長を決定するために、波長の関数としてのＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、及びＵ塩基の吸収係数の変化を示すグラフが含まれる。この図においては、横座標軸は波長λ（nm）を表し、縦座標軸はモル吸収係数（M.A.C.）（×１０-3）を表す。参照番号６０は、アデニン（Ａ）の吸収スペクトルを示し、参照番号６２、６４、６６、及び６８はチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びウラシル（Ｕ）の吸収スペクトルをそれぞれ示す。これらのスペクトルはまた、ＤＮＡまたはＲＮＡの最適な感度長を選択するために使用することができる。
【００３８】
本発明によれば、励起源は、例えば干渉性の放射源または非干渉性の放射源であってよい。
【００３９】
ポンプビームの役割は、上述の通りである。例えばこれは、パルスレーザーから発せられても、またはその放出波長が核酸の吸収バンド内にある、連続的に強度変調されたレーザーから発せられてもよい。核酸の場合には、層厚さの大小のオーダーは、通常数ナノメーターである。
【００４０】
したがって、本発明によれば、ポンプビームは干渉性の光であってもよく、例えば波長２７０nmのアルゴンレーザー、または固体レーザー、例えば波長２６６nmの四重ＹＡＧから選択されるレーザー光線であってよい。本発明によれば、吸収は、２００乃至３００nmのスペクトル範囲内で検出又は測定することができる。
【００４１】
本発明によれば、放射源の発光スペクトルが検出のために充分強いシグナルを提供できるならば、ポンプビームは、非干渉性の光、例えば多色光であってもよい。例えば、非干渉性の光は、水銀灯から発生しうる。
【００４２】
プローブビームは、好ましくは、ポンプビームによって照明される試料の一部の近傍に向けられる。さらにまた、プローブビームは、ポンプビームと同一であっても、または相違してもよい。
【００４３】
本発明によれば、プローブビームは、好ましくは基質によって、及び存在する核酸によっても、吸収されない波長を有する。プローブビームは、好ましくはレーザー光線である。例えば、これは４００乃至７００nmの波長を有してよい。これは、波長が可視領域に入るため、試料についてアラインメントを促進する。例えば、これは、６３３nmにてヘリウム−ネオンレーザーから誘導されてもよい。
【００４４】
プローブビームとポンプビームとの総体位置は、使用する配置を決定する。例えば、プローブビームは以下の媒体の一以上を通過してよい−核酸、固体支持体、または環境媒体、例えば液体または空気。ポンプビームに対するプローブビームの配向は、所望により、例えば機械的サイズの関数として、及び／または、吸収を最大にする試みにおいて感度を最適化するために、入射角の関数として、選択してよい。
【００４５】
本発明によれば、プローブビーム及びポンプビームは、交差してもよい。交差の位置は、もしあるならば、所望によって、特に感度を最適化する試みの関数として、固定されてもよい。一般的に、交差点は、熱勾配の最大値に位置する。
【００４６】
本発明によれば、プローブビーム及びポンプビームは、直交配置におかれても、またはおよそ直線状に配置されてもよい。直交配置においては、プローブビーム及びポンプビームは、交差し、互いに垂直となる。この配置は、添付の図２に図式的に示される。およそ直線状の配置においては、プローブビームとポンプビームとが交差はするがほとんど直線状にある。添付の図３は、直線状配置の図式的表示である。
【００４７】
これらの図においては、参照番号１はポンプビームを示し、参照番号３は直交位置にあるプローブビームであり、参照番号３はおよそ直線状に配置されたプローブビームを示し、参照番号７はレーザーを示し、参照番号９は検出器、例えば四の象限を有する検出器であり、さらに参照番号１１はその表面に核酸が固定された固体支持体からなる試料を示す。
【００４８】
プローブビームの反射及び屈折は、多元素光ダイオード、例えば、二または四の象限、ストリップまたはマトリックスを備えた検出器を使用して、あるいは、カッシェもしくはブレードによって部分的に、もしくはプローブビームを受容可能な部分のみを覆った、単純な光ダイオードを使用して、検出してよい。
【００４９】
単純な光ダイオードの場合は、別の検出器により、ポンプビームのパワーにおける変化から、核酸の吸収における変化を、もしあればだが分離させる必要があるかもしれない。
【００５０】
図４は、プローブビームの偏位の検出のための、様々な配置を図示して示すものである；この図においては、-Ａ-は図式的に二象限検出器１３及び該検出器上にプローブビームによって形成される点１５を示し、-Ｂ-は四象限検出器を表し、-Ｃ-はマトリックス検出器を表し、-Ｄ-は部分的にカッシェによって覆われた単純な光ダイオードを表し、また-Ｅ-は偏心光検出器（off-centered photo detector)を表す。
【００５１】
十分な感度を得るために、核酸または核酸の窒素塩基によって誘発されるプローブビームの偏位は、好ましくは媒体に起因する寄生的変化（parasite variation）、例えば実験室の温度変化から区別される。これを達成するために、ポンプビームは、連続的であれば変調によって、あるいはそのパルス操作によって、いずれ標識されてもよい。変調周波数または参照シグナルを得る可能性の制御は、ポンプビームの部分的吸収によって引き起こされる温度上昇に起因する反射を、好ましく検出する手段である。
【００５２】
使用する光線の配置によらず、得られる情報は局所的であり、微量核酸または窒素塩基表面におけるポンプビームの衝突点の周辺領域に適用される。
【００５３】
この領域のサイズは、実験パラメーター、例えば試料表面の衝突点におけるポンプビームのサイズまたはその変調周波数などによって、並びに支持体、試料、及び周辺媒体の熱反応によって、固定されても良い。これは特に、様々な媒体中における熱の分布による。
【００５４】
前記情報が局所的であるため、検出機器は支持体移動システムに接合されていて、該システムの表面にポンプビームに対して拡散が固定されていてもよい。この装置は、プローブビームの偏位値を異なる位置間で比較するために使用することができ、特にシグナルをマップの形態で表してよい。
【００５５】
必要であればいつでも、例えば、参照試料またはコントロール試料を用いて、偏位シグナルは吸収値に換算してよい。このコントロール試料は、その吸収が既知で安定であり、核酸または窒素塩基について同様の実験条件下における輻射熱偏位測定の対象としてもよい。例えば、得られる値は、吸収レベルにて測定される電気シグナルについての変換係数の算出のために使用することができる。
【００５６】
プローブビームとポンプビームとの相関関係のモデルは、試料の吸収によって損失を測定可能であることを示す。既に見てきたように、該機器には、事前にその吸収が既知である参照試料の偏位シグナルを測定することによって、目盛り定めをすることができる。吸収が低ければ、これは、輻射熱偏位シグナルが試料の吸収に比例しうることを示している。したがって、参照資料について、相関させて作業することが可能である。
【００５７】
本発明による方法では、数ppm（10-6）の吸収による損失が算出可能である。「損失」なる語は、物質において吸収されるパワーと入射光のパワーとの間の比率を意味する。本発明の一つの有利な実施態様は、検出感度を最適化するために、Ｐ偏光における、換言すれば、微量核酸の入射の平面と平行の、ポンプビームの吸収を使用することである。場合により、Ｐ偏光中における吸収は基質のブリュースター角での極大、例えばガラスについては56.6°を通過する。
【００５８】
各塩基は特定の吸収スペクトルを有しており、これを使用することができる。本発明に従い、塩基の数の関数としての光偏位シグナルの変化を追うこととする。
【００５９】
まず最初に、基本層の吸収係数は下記のように表す。
【数１】
0004494694.tif 000002
[式中、Ａは基本層の吸収を示し、αは吸収係数を示し、ｅは機械的厚さを示し、ｋは薄層吸光係数を示し、λはポンプビームの波長である]
【００６０】
Ｎ塩基ｉの成長後、得られるのは単に下記のとおりである。
【数２】
0004494694.tif 000003
【００６１】
生物学領域においては、この係数はまた以下の形態でも表すことができる。
【数３】
0004494694.tif 000004
ε1及びｃ1は、モル吸光係数（1.mol-1.cm-1）及び濃度（mol-1.l-1）を、それぞれ各塩基について示す。
【００６２】
手引きとしては、吸光係数は10-2から10-3のオーダーであり、測定可能な吸収は数百ppmのオーダーである。したがって、これらは弱い光学シグナルである。
【００６３】
最も重要なこととしては、ｉの工程は前の工程への追加である。したがって、シグナルは容易に分析され、微量ヌクレオチドの原位置合成のための工程に伴う塩基の成長の変化を観察するために使用することができる。
【００６４】
本発明によれば、支持体は、例えばガラス、酸化ケイ素、プラスチック、またはゲル製であってよい。例えば、この支持体は平面支持体であってよく、あるいは微小空洞、例えば微小な窪みを含むものであって良い。
【００６５】
本発明によれば、最初のヌクレオチドは原位置合成のために、第一には支持体に依存して、第二には好ましい支持体上にヌクレオチドが共有結合によって固定されるように選択される従来の化学反応によって、支持体上に固定される。これらの化学反応は、例えば、Chemical Letterts, 1998, p. ２５７−２５８及びAnalytical Biochemistry 247, p. 96-101, １９９７に開示されている。
【００６６】
本発明はまた、本発明による方法、特に前記方法が輻射熱偏位法である場合に、該方法の実施のための装置を提供する。
【００６７】
前記装置は、以下の部品：
・その表面に核酸が固定された支持体を含む試料を配置する手段、
・前記試料を照明する手段、
・前記照明手段によって照明される場合、前記試料による光の吸収、偏位、または反射を、検出及び／または測定する手段、
・前記照明手段及び前記検出及び／または測定手段を配置する手段、
を含む。
【００６８】
本発明によれば、試料を配置する手段は、マイクロメーター移動及び回転プレートに正確に取って代わる、いかなる既知の手段であってもよく、例えばMicroControleまたはSpinder Hoyer製のものがある。これらの手段は、自動化を可能にするために、特にマッピングのために、モーター駆動であってよい。
【００６９】
本発明によれば、試料を照明し、光の吸収を検出する手段は、特に支持体及び検出しようとする核酸の関数として選択してよい。試料を照明するための手段は、例えば上述のとおりポンプビームからなっていても良い。吸収を検出するための手段は、プローブビーム及びプローブビームの屈折及び反射を検出するための手段を含んでよい。これらの手段は、以下に、また下記の実施例に説明される。
【００７０】
本発明によれば、上記の設置手段並びに照明及び検出手段は、試料を設置することについて上述したような手段であってよい。
【００７１】
したがって、本発明は、支持体上に固定された窒素塩基、核酸、または核酸の窒素塩基の特徴づけ、定量化、及びマッピングのために、輻射熱技術が使用されたことはないという事実によって、特に革新的である。さらに一般的には、支持体上でのこのタイプの分析のために、吸収変化の測定に基づいて使用された方法はこれまでなかった。
【００７２】
特に、本発明による方法は、いかなる標識工程も、標識も必要としないという利点を有する。例えば、これは核酸バイオチップの製造のために有利に使用してもよい。各窒素塩基の、例えばＤＮＡバイオチップまたはＲＮＡバイオチップの各原位置合成工程における特徴づけ、定量化、及びマッピングは、前記合成の各工程を正確に観察し、ひいては製造されるバイオチップの密度、密度の均一性、及び品質を制御し、おそらくは前記合成中に起こるいかなる過失をも補正するために使用することができる。
【００７３】
これは、従来の技術においては不可能であった。本発明による方法を使用して得られるバイオチップは、正確で均一であり、容易に再生産可能である。
【００７４】
本発明による方法は、バイオチップの製造のための微量核酸の原位置合成方法を最適化するために、また100％と同等または近傍のカップリング有効性を得るために、使用することができる。この使用は、以下の実施例中に詳説される。
【００７５】
本発明の別の要素及び利点は、添付の図面を参照して以下の記載及び実施例を読むにつれ、明らかになるであろう。これらは明らかに、詳説を目的としており、制限的なものでは全くない。
【００７６】
本発明の別の特徴及び利点は、添付の図面を参照して以下の記載を読むにつれ、明らかになるであろう。
【００７７】
【実施例】
（実施例１：測定方法）
本発明によるこの実施例において使用されるシステムは、直交配置における輻射熱偏位に基づく。
【００７８】
添付の図５は、本発明による輻射熱偏位方法によって支持体上に固定された、核酸または核酸の窒素塩基を含む試料の吸収の測定の原理を示す図式的説明である。
【００７９】
この図には、ポンプビーム１９は、２７５nmにおける連続的アルゴンレーザー光線（COHERENT INOVA 40）（商品名）(図示なし)から誘導され、球状鏡（図示なし）を用いて試料１１上に集中させられ、点（図示なし）の直径は、試料１１の表面にて約７０ミクロンであったことが示される。ポンプビームの波長は、核酸の検出が可能になるように選択される。ポンプビームのパワーはレーザー出口において３００mWであった。
【００８０】
プローブビーム２１は、６３３nmにおけるヘリウム-ネオンレーザーからのプローブビームである。このプローブビームの波長は、問題ではない。本発明によれば、ポンプビームの波長と非常に異なる波長が、より良いシグナルをノイズ比に与えることができる。
【００８１】
プローブビーム２１の偏位を、四象限検出器-Ｂ-（図３参照）を用い、次いで増幅及び減算電子機器（図示なし）を用いて検出した。参照番号２１ａは、輻射熱偏位によって偏光したプローブビームを示す。角度θは、法線２０から試料（点鎖線で図示）までのポンプビーム１９の入射の角度を示し、参照番号１９ａは、試料上に反射したポンプビーム１９を示す。
【００８２】
プローブビームの波長を選択する干渉フィルター（図示なし）を四象限検出器の正面に設置し、変調したポンプビームから生じる寄生的光の影響を避けても良い。
【００８３】
本発明による装置においては、プローブレーザー、四象限検出器、及び関連の電子機器は、市販の測定セル、例えばALIS社製のものなどの、必須の部分を形成しうる。このセルからの出力シグナルは、同時検出のために送出される。
【００８４】
ポンプビームは、以下に機械的チョッパとも呼称される、機械的スリットを備えたディスクを使用して変調されてもよく、その周波数は調製可能である。チョッパ制御シグナルは、同時検出のための基準として用いられる。該周波数は１５７Hzである。測定したシグナルは、同時検出（ポンプビーム変調周波数における偏位シグナルの増幅）からのアウトプットにて得られる。
【００８５】
試料及び二つの光線は、マイクロメーター移動及び回転プレート（MicroControle社製）によって互いに関連して設置されるが、前記プレートには、例えばバイオチップのマッピングを、調整の段階において自動化することができるようにモーター駆動である。調整は、プローブビームを含む試料に直交する平面中の偏位シグナルを最大化するように自動的に行われる。マッピングの間、必要であれば、マッピング走査軸に対して直交方向に調整的な転置を行い、マッピングの間相対的な位置が正確に維持されることを確実にする。この調整的転置は、予備的測定工程において自動的に決定される。法線から試料に対するポンプビームの入射角及び試料に対するセルの方向は、調整可能である。プローブビーム及びポンプビームの相対位置及び方向もまた、個別に調整可能である。
【００８６】
本発明による装置の図は、添付の図６に示される。この図においては、シャッター（図中に図示無し）は、転置段階の間にポンプビームを遮断し、転置後に設定が定常状態に達するように選択される待ち時間の後の、明確に規定される時間の間、これをもとに戻す。参照番号２３は、２７５nmのアルゴンレーザー光線を示し、参照番号２５はレーザー光線を配置する鏡を示し、参照番号２７は機械的チョッパを示し、参照番号２９はチョッパを通過した後のレーザー光線を示し、参照番号３１は集束鏡を示し、参照番号３５は測定試料を示し、参照番号３６はプローブヘリウム−ネオンビームを示し、参照番号３７は四象限光ダイオードを示す。
【００８７】
例えば、試料の配置は、図中には示されていない自己コリメーター照準具（self collimating sight）によって反復的に行ってもよい。全測定装置は、二つの直交方向において転置を制御し、偏位シグナルを捕捉するワークステーションによって制御してもよい。
【００８８】
この実施態様においては、偏位は、試料の平面に平行な方向に沿って、またこれに直交する方向に沿って、測定される。この第二の方向が有用なシグナルを形成する。同時検出によって提供される電気シグナルは、それ自体、試料上の様々な位置間の比較によって使用してよい。
【００８９】
これはまた、経時的にレーザー流束の下で安定であると見なされる試料上において参照測定を行うことによって、吸収値に変換することも可能であり、その吸収は、分光計を用いて測定可能であって、輻射熱偏位測定ベンチの直線性範囲中に配置される。
【００９０】
（実施例２：シリカ基質上におけるオリゴヌクレオチドの原位置合成）
使用したシリカ基質は、Suprasilタイプ（SESO社）のものであり、これらは５０mmの直径及び３mmの厚さを有していた。
【００９１】
１−表面ヒドロキシル化
２gのソーダＮａＯＨ／６mlの脱塩水／８mlの９５％エタノールを含有する溶液を調製し、基質をその中で２時間インキュベートした。その後試料を脱塩水で濯ぎ、窒素ブロワを用いて乾燥させた。この工程により、シリカの表面にヒドロキシル基の造成が行われた（下式（Ｉ）参照）。
【００９２】
２−シラン化
２mlの３-グルシドキシプロピルトリメトキシシラン（９８％）を、７mlのトルエン及び０．６mlのトリエチルアミン中の溶液とした。該試料をこの溶液中に入れて８０℃にて一晩おいた。これらを、ブロワを用いてアセトン及び窒素で乾燥させ、１１０℃にて３時間焼鈍した。化学シラン化反応は、下記のように図式的に示してもよい。
【化１】
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【００９３】
３−エポキシド官能基の開裂
３０mlのヘキサエチレングリコール及び１８μmの硫酸を含む溶液を使用して、エポキシド結合の開列を可能にし、よってヘキサエチレングリコールを固定した。エポキシド官能基の開裂は、下記のように図式的に示してもよい。
【化２】
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【００９４】
４−オリゴヌクレオチドの合成
ホスホアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成は、文献Caruthers, Science, Oct. 85, page 281に開示されており、これは以下の工程：脱トリチル化、カップリング、キャッピング、及び酸化を含む。
【００９５】
脱トリチル化：
試料を、３％のトリクロロ酢酸をジクロロメタン中に含有する、２mlの溶液（DMT removal batch 2257-1 Roth）中に入れて２分間撹拌した。これをジクロロメタン中で、その後アセトニトリル中で濯ぎ、加圧窒素ジェット下で乾燥させた。
【００９６】
カップリング：
２５mgの２’-デオキシ-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-３’-Ｏ-（βシアノエチル-Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルアミノ）ホスホアミダイトを含有する、２mlの溶液を、１５０μlのテトラゾールと混合した。試料をこの溶液中に入れ、アルゴン下で１０分間撹拌した。これをアセトニトリル中で濯ぎ、加圧窒素ジェット下で乾燥させた。
【００９７】
キャッピング：１lのＣＡＰ及び１mlのＣＡＰ２を含有する溶液を調製した（ＣＡＰ１＝無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ、ＣＡＰ２＝１-メチルイミダゾール／ＴＨＦ）。試料をこの溶液中に２分間入れた。その後これはアセトニトリル中で濯ぎ、加圧窒素ジェット下で乾燥させた。
【００９８】
酸化：
試料を、４mlのReagent Oxidationの溶液（ヨード／水／ピリジン／ＴＨＦ batch 2254.2 Roth）中に入れて撹拌しつつ１分間おいた。これをジクロロメタン中のアセトニトリル中で濯ぎ、その後アセトニトリル中で濯ぎ、加圧窒素ジェット下で乾燥させた。
【００９９】
これらの工程をＮ回繰り返し、ここでＮは、合成しようとするオリゴヌクレオチドの量体数である。カップリング工程は、各ヌクレオチドの塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵ）の性質を決定する。
【０１００】
（実施例３：様々な長さのオリゴマーについての吸収測定）
この実施例は、実施例２で調製したようにシリカ支持体上に造成され、１量体、２量体、及び８量体を含む厚さを備え、またＴ塩基のみを含む配列を有するものとした。
【０１０１】
この実施例の目的は、本発明による方法が、オリゴヌクレオチドの成長を塩基毎に識別するために使用可能であることを示すことである。
【０１０２】
発明者らは、上述の方法を用いて、試料１乃至試料４と呼称される四つの異なる試料を調製した。これらの試料は下記の通り：
試料１：シリカ／ＮａＯＨ処理／シラン化／ＨＥＧ、
試料２：シリカ／ＮａＯＨ処理／シラン化／ＨＥＧ／Ｔ塩基を含むモノマーの合成、
試料３：シリカ／ＮａＯＨ処理／シラン化／ＨＥＧ／各ヌクレオチド上にＴ塩基を含むダイマーの合成、
試料４：シリカ／ＮａＯＨ処理／シラン化／ＨＥＧ／各ヌクレオチド上にＴ塩基を含むオクトマーの合成。
【０１０３】
１）測定パラメーター：
測定は、アルゴンレーザーを使用して行った。
波長２７５mm；１４０mWの標本パワー；チョップ周波数Ｆ＝１５７Hz；入射角４５°；二象限における検出。
【０１０４】
２）測定：
０．１mm目盛りで、試料の中心１mm2にマッピングした。
各点Ｘ、Ｙについて、吸収の捕捉＝ｆ（ｔ）、式中、約１００msの時間工程中、０≦ｔ≦４秒である。捕捉は以下のとおり行った：
０≦ｔ≦１秒については、ミラージュ効果によって：シャッターは閉じておいた。
ｔ＝１秒において、シャッターを開き、
１≦ｔ≦４秒については、吸収を測定した。
結果を以下の表１にまとめた。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
添付の図９は、グリコールヘキサエチレン（ＨＥＧ）、Ｔ塩基一つを有する１量体（ＨＥＧ＋Ｔ）、Ｔ塩基二つを有する２量体（ＨＥＧ＋２Ｔ）、及びＴ塩基八つを有する８量体（ＨＥＧ＋８Ｔ）を含むシリカ基質上に得られる、輻射熱シグナルの変化を、時間の関数として示す。
【０１０７】
これらの曲線は、基準（窒素塩基無し）、Ｔ塩基一つについての、Ｔ塩基二つについての、及びＴ塩基八つについてのシグナルをそれぞれ示す。
【０１０８】
（実施例４：オリゴヌクレオチドの合成における、各工程での映像の決定）
各合成工程の「映像」を、前の工程との比較により決定した。添付の図７及び８は、試験構造物を図式的に示す。これらの図において、試験構造物は、例えば１００×１００μm2の領域に相当する四角またはパッドによって図式的に示され、ここでは光学反応を、基質（基準）、基質にグラフト化した四つの塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）を別個に、最終的なオリゴヌクレオチド（ＡＴ、ＡＣ、．．．、ＴＴ）における様々に可能な配列に相当するグラフト化２量体について測定した。
【０１０９】
これらの基準パッドについて、発明者らは、測定波長を知るため、各塩基の吸収の兆候を測定した。これらの吸収測定と共に、オリゴヌクレオチドプローブ中に存在するＧ、Ｃ、Ｔ、Ａ塩基の数を、図７に示される単純な減算によって測定した。
【０１１０】
図８に示されるように、各塩基のシグナルは、連続的な減算を行うことにより、その環境によらず算出された。こうして、参照番号８０の最初の列において、Ａのシグナルは、それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴに対して決定され、参照番号８２の第二列においては、ＣのシグナルがそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴに対して決定され、参照番号８４の第三列においては、ＧのシグナルがそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴに対して決定され、参照番号８６の第四列においては、ＴのシグナルがそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴに対して決定された。
【０１１１】
（実施例５：本発明によるバイオチップの合成方法）
詳細な説明及び上記の実施例に示したように、本発明は、構造化基質上におけるオリゴヌクレオチドの原位置合成における、各カップリング工程の分析のための方法を提供することを企図する。
【０１１２】
該分析は、非破壊的である。
しかしながら、発明者らは、試料に送達されるパワーが１kW/cm2のオーダーの所定のパワー密度を越えると、試料が破壊されうることを観察している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＡのモル吸収係数の変化を、波長の関数として示すグラフである。
【図２】  図２は、本発明の方法を使用して試験しようとする試料の分析のための直交配置における輻射熱偏位を示す図である。
【図３】  図３は、本発明の方法を使用して試験しようとする試料の分析のための一直線状配置における輻射熱偏位を示す図である。
【図４】  図４は、プローブビームの偏光の検出のための様々な配置を示す図である。
【図５】  図５は、本発明による直行配置における輻射熱偏位法を使用して試料の吸収の測定を示す図である。
【図６】  図６は、本発明による方法の実施のための装置を示す図である。
【図７】  図７は、本発明による方法を使用するプローブの合成における各工程の後、「映像」を決定する方法を図式的に示す。
【図８】  図８は、本発明による方法を使用するプローブの合成における各工程の後、「映像」を決定する方法を図式的に示す。
【図９】  図９は、本発明によるシリカ基質上に得られる、輻射熱シグナルの経時的変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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