(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドおよび核酸を分離するためのクロマトグラフィー法であって、所望ペプチドまたは核酸が溶液中の少なくとも1つの物質から分離されるように、陰イオン交換体（Ｉ）が溶液中の物質と結合する条件下、ペプチドまたは核酸を含む水溶液を陰イオン交換体（Ｉ）と接触させることを含み、ここで、
0004422797.tif 000007
［式中、
ａ.−−−−−は、リガンド  アームＢがリガンドのＲ1-6基、またはＲ1-6基の何れかの水素と置き換わっていることを意味し、
ｂ.Ｍは、式（Ｉ）の陰イオン交換リガンドをさらに含むポリマーマトリクスであり、
ｃ.Ｂは、シラン、カルボン酸エステル（−ＣＯＯ−）またはカルボン酸アミド（−ＣＯＮＨ−）のようにｐＨ２−１４で加水分解的に不安定な構造を持たず、所望により１個以上の酸素および／またはアミン窒素原子（−ＮＲ’7）で中断されていてよいまたはＮ+Ｒ’8Ｒ’9Ｒ’10または１個以上の基−ＯＲ’11で置換されていてよい直線状の、分枝状のまたは環状の飽和または不飽和炭化水素基であり、
ｄ.ｎは、１または２の整数であり、
ｅ.Ｒ1-6は、水素または、所望により１個以上のアミン窒素またはエステル酸素原子（各々−ＮＲ7−および−Ｏ−）で中断されていてよい炭素鎖を有するかまたは水素がアミノ基（Ｎ+Ｒ8Ｒ9Ｒ10）または１個以上の基−ＯＲ11で置換されていてよい一価または二価である直鎖状の、分枝状のまたは環状の飽和または不飽和炭化水素基から選択されるが、
ただし、
・Ｒ1-6が２価基であるならば、これは２個のＲ1-6基からなり、式Ｉの太字で示した原子のうち少なくとも１つを伴って５員（membered）または６員の環を形成し、そして
・Ｒ5およびＲ6の両方が、メチルおよびエチルから選択できないものとし、
ｆ.Ｒ7-11およびＲ’7-11は、Ｒ1-6と同一の基から選択され、
ｇ.Ｘは、−ＯＨまたはＲ12-13がＲ1-6と同一の基から選択される−ＮＲ12Ｒ13であり、
ｈ.エポキシドによってトリエタノール  アミンをセルロースに結合させることにより製造した陰イオン交換体は、含まれない。］
である、方法。
【請求項２】
陰イオン交換体（I）の必要とされる溶出イオン強度がＱ−基（ＣＨ3）3Ｎ+−を有する第四級陰イオン交換体（II）で必要とされる溶出イオン強度より少なくとも１２５％高い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｎが１である、請求項１の方法。
【請求項４】
Ｒ1-6の炭化水素基の炭素鎖が、一つまたはそれ以上のアミノ窒素原子またはエーテル酸素原子（それぞれ−ＮＲ7−および−Ｏ−）により中断され、および／または一つまたはそれ以上の水素がアミノ基（−Ｎ+Ｒ8Ｒ9Ｒ10）または−ＯＲ11基で置換されている、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
Ｂが、Ｒ1またはＲ2を置き換えることを特徴とする請求項１から４の何れかの方法。
【請求項６】
Ｂが、直線状の、分枝状のまたは環状の飽和炭化水素鎖であることを特徴とする請求項１〜５の何れかの方法。
【請求項７】
Ｂの炭化水素鎖が、エーテル酸素原子により中断されている、請求項６の方法。
【請求項８】
Ｂの炭化水素鎖の一つまたはそれ以上の水素がヒドロキシル基で置換されている、請求項６または７の方法。
【請求項９】
Ｂが、−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）4−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−であることを特徴とする請求項１〜８の何れかの方法。
【請求項１０】
ｎが１およびＲ1-4が水素であることを特徴とする請求項１〜９の何れかの方法。
【請求項１１】
Ｒ5および／またはＲ6が水素であることを特徴とする請求項１〜１０の何れかの方法。
【請求項１２】
Ｘが、ヒドロキシル基であることを特徴とする請求項１〜１１の何れかの方法。
【請求項１３】
Ｒ5-6の内少なくとも1つには、Ｒ5-6が結合する窒素原子から２炭素原子離れた位置にある−Ｎ+Ｒ8Ｒ9Ｒ10または−ＯＲ11基を含む［式中、Ｒ8-11をＲ1、Ｒ2、Ｒ5およびＲ6と同様な基から選択される］ことを特徴とする請求項１〜１２の何れかの方法。
【請求項１４】
Ｒ8-11が水素または低級アルキル（１−６炭素原子）から選択される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
リガンドが、
-CHOHCH2NH2;-CHOHCH2NH（CH2）3NH（CH2）3NH2;-CHOHCH2N［（CH2）3NH2］2;-
CHOHCH2NH［C（CH3）3］;-CHOHCH2NHCH2CH2OH;-CHOHCH2N（CH2CH2OH）2;-
CHOHCH2NHC（CH2OH）3;-CHOHCH2NHCH（CH2OH）2;-CHOHCH2NHCH2CH2CH3;-
CHOHCH2NHCH2CHOHCH2OH;-CHOHCH2NHC（CH3）（CH2OH）2;-CHOHCH2NHCH2（CHOH）4CH2OH;-
CHOHCH2N［C（CH2OH）3］（CH2）3NHC（CH2OH）3
から選択されることを特徴とする請求項１〜１４の何れかの方法。
【請求項１６】
ペプチドが分離され、陰イオン交換体が
-CHOHCH2NH2;-CHOHCH2NH（CH2）3NH（CH2）3NH2;-CHOHCH2NHCH2CH2OH;
-CHOHCH2NHCH（CH2OH）2;-CHOHCH2NHCH2CHOHCH2OH;-CHOHCH2NHC（CH3）（CH2OH）2;
-CHOHCH2NHC（CH2OH）3;-CHOHCH2N［C（CH2OH）3］（CH2）3NHC（CH2OH）3
から選択されるリガンドであることを特徴とする請求項１〜１５の何れかの方法。
【請求項１７】
陰イオン交換体への吸着によりペプチドを分離し、吸着したペプチドは、
ａ.水素結合開裂試薬、例えば尿素またはグアニジン、および／または
ｂ.塩、および／または
ｃ.pＨの変化
により溶出することを特徴とする請求項１〜１６の何れかの方法。
【請求項１８】
ペプチドが分離され、そのペプチドをイオン強度≧１５ｍＳ／ｃｍの溶液中で陰イオン交換体に適用することを特徴とする請求項１〜１７の何れかの方法。
【請求項１９】
核酸が分離され、陰イオン交換体が
-CHOHCH2NH［C（CH3）3］;-CHOHCH2NHCH（CH2OH）2;-CHOHCH2NHC（CH2OH）3;-
CHOHCH2NHCH2CH2OH;-CH2CHOHCH2NHCH2CH2CH3
から選択されるリガンドであることを特徴とする請求項１〜１５の何れかの方法。
【請求項２０】
イオン交換体への吸着により核酸を分離し、吸着した核酸は、その後
ａ.水素結合破壊試薬、例えば尿素またはグアニジン、および／または
ｂ.塩、および／または
ｃ.リガンドが完全にまたは部分的に無負荷となるようpＨを増加させる
ことにより溶出することを特徴とする請求項１〜１５および１８の何れかの方法。
【請求項２１】
核酸が合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１５および１９〜２０の何れかの方法。
【請求項２２】
0004422797.tif 000008
［式中、
ａ.−−−−−は、リガンド  アームＢがリガンドのＲ1-6基またはＲ1-6基の何れかの水素と置き換わっていることを意味し、
ｂ.Ｍは、陰イオン交換リガンドをさらに含むポリマーマトリクスであり、
ｃ.Ｂは、シラン、カルボン酸エステル（−ＣＯＯ−）またはカルボン酸アミド（−ＣＯＮＨ−）のような加水分解的不安定構造を有さず、所望により１個以上の酸素および／またはアミン窒素原子（−ＮＲ’7）で中断されていてよいまたはＮ+Ｒ’8Ｒ’9Ｒ’10または−ＯＲ’11の１個以上の基で置換されていてよい直線状の、分枝状のまたは環状の飽和または不飽和炭化水素基であり、
ｄ.ｎは、１または２の整数であり、
ｅ.ｉ.Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、水素および一価または二価である直鎖状の、分枝状のまたは環状の飽和または不飽和炭化水素基から選択されるが、
ただし、
・Ｒ1〜Ｒ4で示される何れかの炭化水素基が２価基であるならば、これは２個のＲ1-6基からなり、式Ｉの太字で示した原子のうち少なくとも1つを伴って５員（membered）または６員の環を形成し、
ｉｉ.Ｒ5およびＲ6は、Ｒ1-4と同一基から選択されるが、
ただし、
・Ｒ5およびＲ6の１つまたは２つが、１つまたはそれ以上の窒素原子を含むならば、それらの基のうちの少なくとも１つは、１つまたはそれ以上の酸素原子（−ＯＲ11、式中Ｒ11は、以下の段落ｆ.にしたがう）を含み、
・Ｒ5およびＲ6の両方が、同時にメチルおよびエチルから選択できず、
ｆ.Ｒ’7-11およびＲ11は、Ｒ1-4と同一の基から選択され、
ｇ.Ｘは、−ＯＨまたは−ＮＲ12Ｒ13であり［式中、Ｒ12およびＲ13はＲ1-6と同一の基から選択される］、
ｈ.エポキシドによるトリエタノール  アミンとセルロースとの結合により製造した陰イオン交換体は含まない。］
の構造を持つことを特徴とする陰イオン交換体。
【請求項２３】
ｎが１である、請求項２２の陰イオン交換体。
【請求項２４】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の炭化水素基が一つまたはそれ以上のアミノ窒素原子またはエーテル酸素原子（それぞれ−ＮＲ7−および−Ｏ−）により中断され、および／またはアミノ基（−Ｎ+Ｒ8Ｒ9Ｒ10）または−ＯＲ11基に置換された一つまたはそれ以上の水素を有しており、ここで、Ｒ7-11がＲ1-4と同一の基から選択される、請求項２２または２３のイオン交換体。
【請求項２５】
Ｒ7-11が低級非置換基アルキル（Ｃ1-6）および水素から選択される、請求項２４の陰イオン交換体。
【請求項２６】
ＢがＲ1またはＲ2に置き換わることを特徴とする請求項２２〜２５の何れかの陰イオン交換体。
【請求項２７】
Ｂが、直線状の、分枝状のまたは環状の飽和炭化水素鎖であることを特徴とする請求項２２〜２６の何れかの陰イオン交換体。
【請求項２８】
炭化水素鎖がエーテル酸素原子により中断されている、請求項２７の陰イオン交換体。
【請求項２９】
炭化水素鎖がヒドロキシル基により置換される一つまたはそれ以上の水素を保持する、請求項２７または２８の陰イオン交換体。
【請求項３０】
Ｂが、
-CH2CHOHCH2-O-CH2-;-CH2CHOHCH2-O-（CH2）4-O-CH2-;または-CH2-
であることを特徴とする請求項２２〜２９の何れかの陰イオン交換体。
【請求項３１】
ｎが、１およびＲ1-4が水素であることを特徴とする請求項２２〜３０の何れかの陰イオン交換体。
【請求項３２】
Ｒ5および／またはＲ6が水素であることを特徴とする請求項２２〜３１の何れかの陰イオン交換体。
【請求項３３】
リガンドが
-CHOHCH2NH2;-CHOHCH2N［（CH2）3NH2］2;-CHOHCH2NH［C（CH3）3］;-CHOHCH2NHCH2CH2OH;-
CHOHCH2N（CH2CH2OH）2;-CHOHCH2NHC（CH2OH）3;-CHOHCH2NHCH（CH2OH）2;-
CHOHCH2NHCH2CHOHCH2OH;-CHOHCH2NHC（CH3）（CH2OH）2;-CHOHCH2NHCH2（CHOH）4CH2OH;-
CHOHCH2N［C（CH2OH）3］（CH2）3NHC（CH2OH）3;-CHOHCH2NHCH2CH2CH3
から選択されることを特徴とする請求項２２〜３２の何れかの陰イオン交換体。
【発明の詳細な説明】
発明および定義の分野
本発明は、弱陰イオン交換体に関係する。それは、陰イオン交換リガンドとして第一級、第二級、第三級アミノのプロトン化された形態を持ち得るイオン交換体である。本発明は、リガンドの弱陰イオン交換基の窒素から２〜３原子の距離に水素結合性原子を有するとき、この種類の陰イオン交換体はペプチドまたは核酸への結合特性が高まるという我々の発見に基づく。この結合は、グアニジンまたは尿素で開裂されるので、ペプチド／核酸と陰イオン交換リガンドの間に水素結合があると解釈される。
我々の発見は、核酸またはペプチドの新規な分離法、およびその方法において使用できる新規なイオン交換吸着剤（イオン交換マトリクス）の両方に結びついた。
アミノ基という語は（構造および表現の何れの場合でも）、別途説明しない限り、プロトン化および非プロトン化の第一級、第二級、第三級アミノ基および第四級アンモニウム基を意味する。
“分離”という表現は、物質の各種複合混合物から一つまたはそれ以上の核酸／ペプチドを取り出し、または分離すること意味する。分離は、核酸／ペプチドの単離、精製および分析と関係して実施される。分離は、陰イオン交換体であるリガンドと物質との相互作用より実現される。この相互作用は、異なる物質ごとに異なり、そのことにより分離が行われる。
核酸という語は、ＲＮＡまたはＤＮＡの両方を意味する。それには、一本鎖および二本鎖またはそれらの修飾物、例えば保護基および標識（アイソトープ、ビオチン、ハプテン等）であるホスホチオネート体を含める。核酸はオリゴヌクレオチドまたはポリ−ヌクレオチドである。塩基および塩基対（それぞれオリゴヌクレオチドである）の数は、典型的には２００以下である。本発明は、合成的に製造されたオリゴヌクレオチドの単離と精製に好ましくは応用される。
ペプチドという語は、ポリペプチド構造をもつ化合物を意味する。すなわちリポタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン等のタンパク質およびオリゴヌクレオチド（すなわち２−１０アミノ酸を有するペプチド）である。
先行技術
ＥＰ276,138およびＤＥ3,935,098に、イオン交換基の窒素から２炭素原子離れたところにヒドロキシル基がある弱陰イオン交換基を有する陰イオン交換体が記載されている。このイオン交換基は、二官能性試薬を用いて導入され、シラン基を介してガラスマトリクスに結合し、エポキシドによって第一級または第二級アミノと結合している。
glass-O-Si-（CH2）3-O-CH2CHOHCH2-NH-（CH2）2-OH
シラン構造は比較的不安定であり、利用可能となるpＨ値の範囲は限られたものとなる。ＥＰ276,138には、マトリクスが有機ポリマーであることも提唱されている。しかしながら、有機マトリクスについては、十分安定な製品がその方法により得られるかどうかは定かではない。いずれの刊行物もポリヌクレオチドの分離に関係している。ＤＥ3,935,098では、変性剤の尿素を含む溶離液をも使用する。それ以上の詳しい説明はなされていない。
ＥＰ167,488は、窒素原子から２炭素原子離れたところにヒドロキシル基をもつ弱イオン交換基のあるイオン交換体について記載している。イオン交換基は、アミドを通じてマトリクスと結合している。ペプチドまたは核酸の分離についての記載はない。
ＥＰ276,138の発明者らは、結合能が強すぎることを理由に、我々のリガンドを回避している。この説明は誤りであり、そのことがまた我々の新規リガンドの強い結合能（水素結合）に基づく一般的特性の利用を理解していないことの理由であろう。恐らく、彼らは、高いイオン強度での結合性の必要性さえも理解していない。
核酸の精製については、ＥＣＴＥＯＬＡセルロースについての比較的広範囲の文献がある。ＥＣＴＥＯＬＡセルロースは、エポキシドを使ってトリエタノールアミンＮ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）3とセルロースとのカップリングにより製造されている。その結果生じる基は、−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）3であると考えられている。すなわち、ＥＣＴＥＯＬＡセルロースは強イオン交換体である。しかしながら、ＥＣＴＥＯＬＡセルロースの商業化されている製品には、pＨ７−１０において比較的高い緩衝能があり、それは弱イオン交換基の存在を示唆するものであり、これらのことはトリエタノール アミンのヒドロキシル基がセルロースとの結合に使用されていることを意味することが示されている。エポキシドとの反応によってセルロースに結合しているトリエタノール アミンからなるイオン交換体は、本発明の新規マトリクスの範囲内には含まれない。
アミノ基に関して多価性であるリガンドを有する弱イオン交換体は、従来からクロマトフォーカシングに使用されてきた。このタイプのクロマトグラフィーでは、内部pＨ勾配がカラム上で生じる。吸着および溶出は、緩衝液内の塩によって結合されている物質が置換されるのを避けるため弱いイオン強度のもので行う。現在、吸着に使用されているイオン強度は５０mＭ ＮａＣｌ未満であり、特に３０mＭ未満である。溶出させるためのイオン強度は、さらに低いものとなっている（５倍低い）。Ｓluyterman et al.,“Ｔen years of chromatofocusing:a discussion”（Ｊ,.Ｃhromatog.470（2）（1989）417-426）参照。この定義によるクロマトフォーカシングは、本発明の方法の範囲内には入らない。
本発明の要旨
クロマトグラフィーには、ペプチドおよび核酸分離のために改善された方法を得る一般的な必要性がある。発酵および他の細胞培養から得た上清からのタンパク質の精製が特に対象となる。これらの培地は、高濃度の塩
0004422797.tif 000002
を含み、従来のイオン交換体へ直接適用することを困難にしている。例えば、脱塩または希釈による前処理をしなければならず、そのためコストのより高い方法となる。高いイオン強度、好ましくは伝導率
0004422797.tif 000003
に相当するイオン強度において、吸着し、低イオン強度、例えば単なるｐＨ調整、によって脱離が可能となるイオン交換吸着剤が必要とされている。
合成的に生産したオリゴヌクレオチドは、しばしばイオン交換体で精製される。生産しようとしたオリゴヌクレオチドの他に、この合成ではより短い副産物が生産される。得られたオリゴヌクレオチドでは通常末端に保護基が残ったままとなっている。これにより、精製および処理が困難になる。クロマトグラフィーおよび脱保護を同時に行うことが好ましい。改良したイオン交換法にまた望まれることは、ペプチドおよび核酸の精製および単離のために改良されたダイナミクス、改良された処理能力および工程数の削減である。
本発明
最初に記載した高められた結合特性の発見が、タンパク質および核酸において優れたダイナミクスを示す陰イオン交換体（Ｉ）の提供を可能にした。このことは、ｐH２−１４範囲における陰イオン交換体（I）の最大溶出イオン強度は実験部分（Ｆｉｇ．３）に記載したタンパク質、トランスフェリン、オボアルブミン１、オボアルブミン２、β−ラクトグロブリン１、β−ラクトグロブリン２のうち、少なくとも１タンパク質の脱離において、イオン交換基（ＣＨ3）3Ｎ+−（＝Ｑ−基；同じマトリクス、四級窒素からマトリクスへの同じカップリング基、陰イオン交換体（Ｉ）に関する同一リガンド濃度、および同一pＨにおける測定）を有する第四級陰イオン交換体（II）に対する必要溶出イオン強度の、好ましい例で１２５％以上、多くの場合１４０％以上、例えば200％以上高いという表現ができる。あるタンパク質について本発明使用の陰イオン交換体のpＨにともなう溶出イオン強度の変化を図２Ａに説明した。
本発明方法においては、分離される核酸および／またはペプチドを含む溶液を陰イオン交換体と接触させる。その交換体は、試料中の所望のひとつのタンパク質および／または核酸等をその溶液（吸着工程の）中の少なくとも１つの他の物質から分離する条件下において、ポリマー  マトリクスに共有結合し、陽性荷電したアミノ基を有するリガンドを示している陰イオン交換体である。分離されたペプチド／核酸が陰イオン交換体に吸着している場合、所望ならば、溶出液により脱離させることが可能である。この方法は以下の点で特徴的である。使用する陰イオン交換体が第一級、第二級、第三級であるアミノ基を有し、陰イオン交換基のアミノ窒素から２または３原子離れた位置の少なくとも一つの炭素原子上に、ヒドロキシル基または第一級、第二級もしくは第三級アミノ窒素を有する。この方法の特徴的な部分には以下の事項も含む。実験部分において示す少なくとも一つのタンパク質（図３；トランスフェリン、オボアルブミン１、オボアルブミン２、β−ラクトグロブリン１およびβ−ラクトグロブリン２）が上記溶出イオン強度を必要とするように陰イオン交換体（Ｉ）が選択されている。
陰イオン交換を行う溶液（溶出液を含む）は、典型的には水からなる水性であり、例えばエタノール、メタノール、アセトニトリル、水混和性混合液等の水混和性液体を含み得る。この溶液は、上記有機溶媒のうちの何れかであってもよい。この溶液、特に溶出液には、塩、緩衝物質、水素結合を開裂させる物質などがしばしば含まれる。
核酸／ペプチドを含む溶液は、細胞培養の上清であり得るし、おそらく部分的に処理された合成混合液、または抽出液でもあり得る。溶液のイオン強度は、イオン交換体に所望の結合／吸着をさせ得るようなものでなければならない。イオン交換基ならびに吸着するタンパク質またはオリゴ−／ポリ−ヌクレオチドに依存して、イオン強度／伝導率は１５−２０ｍＳ／ｃｍより高くまたは低くなり得る。
本発明の方法により使用する陰イオン交換体
好ましい陰イオン交換体を式Ｉで示す。それらのうち幾つかは、新規である。当業者は、実験部分（実施例２）において示すような簡単な実験により、溶出イオン強度に対し上記の基準に一致するいずれかのイオン交換体を決定できる。
0004422797.tif 000004
−−−−−は、リガンドアームがリガンドのＲ1-6基またはＲ1-6の何れかの基の水素と置き換わることを意味する。好ましくは、リガンドアームはＲ1またはＲ5またはＲ6と置き換わる。
リガンドはしばしば１０００以下の分子量である。
Ｍはマトリクスであり、他に典型的には式Ｉのイオン交換リガンドを含む。
ｎは整数であり、１または２、典型的には１である。
Ｒ1-6は、水素および直鎖状の、分枝状のまたは環状の飽和または不飽和炭化水素（それは一価または二価となり得る）の中から選ばれる。二価基は、二つの連結したＲ1-6基からなり、太字で記された式Ｉ中の何れかの原子とともに５または６員（membered）環が形成される。二価基を形成するＲ1-6の組の典型的な例は、Ｒ5とＲ6、Ｒ1とＲ5あるいはＲ1とＲ6である。意図されている炭化水素基において、一つまたはそれ以上のアミノ窒素原子またはエーテル酸素原子（それぞれ−ＮＲ7−および−Ｏ−）により炭素鎖が中断され、および／または一つまたはそれ以上の水素がアミノ基（−Ｎ+Ｒ8Ｒ9Ｒ10）または−ＯＲ11基に置換され得る。あるひとつの炭素原子は、炭素および水素に対する結合とは別に、典型的には最大１つの酸素原子または窒素原子と結合する。意図されている炭素鎖は（中断されている場合の酸素原子または窒素原子を含めて）、通常１０原子以下の長さであり、好ましくは６またはそれ以下の原子の長さである。Ｒ1-6は、Ｒ5とＲ6が結合している窒素原子から２または３原子の距離に一つまたはそれ以上のエーテル酸素原子、ヒドロキシル基またはアミノ窒素原子を持ち得る。（Ｒ5Ｒ6における上記すべて）。
Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は好ましくは水素である。ｎ＝２の場合、ある炭素原子上のＲ3およびＲ4は、他の炭素原子のものとは異なり得る。
Ｒ5およびＲ6のうち何れか、または両方とも水素であり得る。もしＲ5およびＲ6の何れかが、水素であるならば、他が置換されないアルキル（ＣnＨ2n+1またはそれに対応する環状のＣnＨ2n−；ｎは整数であり、通常１−１０である）であるのが好ましい。Ｒ5およびＲ6が、メチルまたはエチルから同時に選択されることはない。
Ｒ1-6の例は、−Ｎ+Ｒ8Ｒ9Ｒ10基または−ＯＲ11基で置換されている対応する形態を含むメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルおよびイソブチル等の低級アルキル（１−６炭素原子をもつ）である。置換された形態の代表例には、ヒドロキシルメチル；−ヒドロキシルエチル；２−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル；１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシエチル；２−ヒドロキシブチル；１−（ヒドロキシメチル）プロピル；１−メチル−２−ヒドロキシプロピル；２−ヒドロキシ−１，１−ジ（ヒドロキシメチル）エチル；１，１−ジ（ヒドロキシメチル）エチル；１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル；１，１−ジ（ヒドロキシメチル）プロピル−；２，３−ジヒドロキシプロピル；２，３，４−トリヒドロキシブチル；２，３，４，５−テトラヒドロキシペンチルおよび２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシル−ならびに例えば−ＮＨ2が一つまたはそれ以上の−ＯＨを置換する場合の対応するアミノ基がある。
Ｒ7-11は、Ｒ1-6と同一の基から選択され、好ましくはＲ7-11の１つ、２つ、３つまたは４つが水素または低級アルキルＣ1-6である。すべてのＲ8-10がアルキル基である場合、−Ｎ+Ｒ8Ｒ9Ｒ10は、第四級アンモニウム基である。
Ｒ1-6基の対により形成できる二価炭化水素基は、例えば−ＣＨ2ＣＨ2−および−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2−；−ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2−；−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2ＣＨ2−および−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ［Ｎ+（ＣＨ3）3］ＣＨ2ＣＨ2−である。
Ｘは−ＯＨまたは−ＮＲ12Ｒ13であり、Ｒ12-13はＲ1、Ｒ3、Ｒ5およびＲ6と同一の基の中から選択される。通常、Ｒ12-13の少なくとも一つは水素である。すなわち−ＮＨＲ12または−ＮＨＲ13である。
リガンド アームは、通常の陰イオン交換クロマトグラフィーの利用において使用される通常のpＨ条件の下、すなわち、pＨ２−１４では、加水分解に安定した有機構造体である。リガンド  アームは、典型的にはシラン、カルボン酸エステル（−ＣＯＯ−）またはカルボン酸アミド（−ＣＯＮＨ−）のような加水分解に不安定な構造を含まない。リガンドアームは、好ましくは直鎖状、分枝状または環状、飽和または不飽和炭化水素鎖であり、それは一つまたはそれ以上のエーテル酸素−および／またはアミノ窒素原子（−ＮＲ’7−）で中断され、または一つまたはそれ以上の−Ｎ+Ｒ’8Ｒ’9Ｒ’10基または−ＯＲ’11により置換される。Ｒ’7-11はＲ7-11と同一の方法により選択される。通常、Ｒ’7およびＲ’11および、Ｒ’8-10のうち少なくとも一つは、水素であり、好ましくは二つまたは三つが水素である。水素ではないＲ’7-11は典型的には低級アルキル（１−６の炭素原子）である。リガンド  アームのひとつのおよび同一の炭素原子は、炭素原子および水素原子とは別に典型的に殆どの場合一つの酸素原子または窒素原子に結合する。
好ましいリガンド  アームＢは、しばしば０−２０原子の長さである。リガンド  アームＢは、エポキシドまたは−ＣＨ2Ｘ’（Ｘ’はハロゲンであり、それは、トシレート等の、機能的に同等な他の基に置換できる。）およびアンモニア、第一級、第二級アミノ（ＮＨＲ5Ｒ6、Ｒ5およびＲ6は上記に従う）またはアルコール性ヒドロキシルの間の反応に含まれるカップリングによってしばしば得られる。−ＣＨ2Ｘ’は、ハロヒドリン、アルキル ハライド、隣接ジハライド等に含まれ得る。エポキシド、ハロヒドリンおよび隣接ジハライドは、それら自体がアミノ基に対しβ位（２炭素原子離れた位置において）にヒドロキシル基を形成するので、好ましいカップリングが、それらによって実現される。エポキシド、ハロヒドリンおよび隣接ジハライドを経たカップリングは、式Ｉで、ｎ＝１、Ｘ＝ＯＨおよびＲ3-4＝Ｈ、すなわちＮＲ5Ｒ6に最も近い構造が−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−となることを意味する。このタイプのカップリングの結果として得られる好ましい構造−Ｂ−ＣＨＸＣＲ3Ｒ4−は、−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−等である。すなわちＢは、−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−；−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）4−Ｏ−ＣＨ2−；−ＣＨ2−である。エポキシド−／隣接ジハライド−／ハロヒドリン基は、ヒドロキシル基を含むポリマーのアリレーションによる既知の方法で導入できる。それは、例えばアリルグリシジルエーテルと反応させ、その後ハロゲン化する反応である。例えばＮochumsson Ｓ（ＥＰ87995）およびＬindgren Ｇ（ＷＯ9404192）参照。
リガンド  アームＢは、エーテル構造（エーテル酸素はマトリクスのヒドロキシルに由来する）を介してマトリクスＭに典型的に結合する。
チオエーテル（−Ｓ−）およびスルホンアミド（−ＳＯ2ＮＨ−）は、エーテルに匹敵する加水分解安定性を有しており、リガンド  アームまたはＲ1-13またはＲ’7-11基においてエーテルと等価的に置換できる。
もし、エポキシド／ハロハリド／隣接ジハライドを結合しているマトリクスと下記化合物とを反応させると、好ましいリガンドが作られる：
0004422797.tif 000005
ここに示したリガンドは、アミノ窒素によるカップリングで生成された。また、カップリングをヒドロキシ基で実施すると他の式Ｉのリガンドを与える。これは、本発明のひとつのおよび同一の陰イオン交換体が式Ｉの1つまたはそれ以上のリガンドを有することを意味するものである。カップリング反応は、それがアミノ窒素またはヒドロキシ酸素のいずれかにおいて、多かれ少なかれ選択的に起こるように調節され得る。リガンドには、マトリクスと結合させる化合物およびカップリングに利用される反応基の両方由来の原子を含み得ることが分かる。
優先権主張日当時、マトリクスに結合する隣接ジハライド、ハロヒドリンまたはエポキシドをｔ−ブチルアミン、２−アミノ−１，３−ジヒドロキシプロパン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、エタノールアミンまたはｎ−プロピルアミンと反応させて得られたものが、核酸の分離に最も好ましいリガンドであった。
ペプチド分離に好ましい陰イオン交換体は、実験部分（Ｆｉｇ．３）で得られるタンパク質のうち少なくともひとつを脱離するためにＱ−基をともなう第四級イオン交換体に必要とされる溶出イオン強度の、典型的には１２５％以上、多くの場合は１４０％以上、例えば２００％以上の溶出イオン強度を必要とする。
本発明のマトリクスＭは、通常水に不溶性である親水性ポリマーであり、それは親水性となるように誘導体化した疎水性ポリマーも含む。実例は、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン等のポリサッカライド、ならびにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ（ヒドロキシアルキル ビニル エタノール）、ポリ（ヒドロキシアルキル アクリレートおよび対応するポリメタクリレート、ポリビニル アルコール等の精製した合成ポリマーといったポリヒドロキシ ポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、および対応するモノマーを含むコポリマーからなるポリマーである。例えば架橋により、または吸着もしくは共有結合によって不溶体に結合させることにより、水に可溶性のポリマーを不溶性にできる。親水性基は、ＯＨに変換できる基をもつモノマーと共に重合反応を実施することにより、または例えば親水性ポリマー等の適当な化合物の吸着による最終ポリマーの親水性化により、疎水性ポリマー（例えば、スチレン−ＤＶＢ−コポリマー）へ導入することができる。マトリクスは、周囲の液体と接触する表面を増大させるために、しばしば多孔性である。ポリマーアーム（触手）は、マトリクスに含まれ得るので、各アームは、式ＩのリガンドアームＢを介して結合した、一つまたはそれ以上のリガンドを有する。
好ましいマトリクスは、シラン基、エステル基およびアミド基等の加水分解に不安定な基を有しない。
本発明のイオン交換体の、および本発明の方法において使用できるイオン交換体内の式Ｉによるリガンドレベルは、通常、水で飽和したマトリクスmlあたり、0.001-4mmol、好ましくは0.01-1mmolの範囲である。可能であり、好ましい範囲は、マトリクスの構造によって決まる。アガロース・ベースのマトリクスの場合、リガンドレベルは通常膨潤したマトリクス（ゲル）mlあたり0.1-0.3mmolの範囲である。デキストラン・ベースのマトリクスの場合、範囲は、膨潤したマトリクス（ゲル）mlあたり0.5-0.6mmolまで拡大され得る。意図するリガンドレベルは、実験部分に示した方法により決定できる。
本発明の新規陰イオン交換体
R5基およびR6基のうち１つまたは2つが1つまたはそれ以上の窒素原子を含むならば、それらの基のうち少なくとも1つが、1つまたはそれ以上の酸素原子（−ＯＲ11、式中Ｒ11は、上記によるものである）を含むという付加的条件をともなう式Iで表される陰イオン交換体である。Ｒ5およびＲ6はいずれも同時にメチルおよびエチルから選択できない。本発明のイオン交換体の好ましい形態は、上記溶出イオン強度を示す。エポキシドとの反応によってトリエタノールアミンを結合させることにより合成された陰イオン交換体は、ここでいう本発明の構成（新規陰イオン交換体）とは異なる。−−−−−−−，Ｂ，Ｍ，Ｘ，Ｒ1-4およびＲ7-11およびＲ’7-11は、式Ｉと同様である。
本方法の工程
本発明の方法による吸着は上記方法で実施される。
吸着工程の後、場合によっては中間洗浄の後、水性溶出液のイオン強度の上昇により、および／または変性剤の添加により、および／またはpＨを変えることにより、吸着させた物質、例えばペプチドおよび核酸を既知の方法で脱離させ、溶出液中の精製された所望の物質を回収することが可能となる。イオン強度、変性剤の添加量およびpＨの変化は徐々に（１度またはそれ以上の段階において）、または連続的な勾配の形で実施される。
特にペプチドの場合の脱離は、上記のＱ−基を有する第四級イオン交換体から同一物質の脱離に必要とされるものよりも高イオン強度において行うことができる。
水素結合を開裂させる典型的な試薬（変性剤）は、グアニジンまたは尿素である。水素結合開裂試薬に関する情報については、Ｌevine et al.,Ｂiochemistry 2（1963）168-175を参照。脱離させるべき物質のリガンドとの結合の強固さおよび水素結合開裂試薬の選択によって、水素結合開裂試薬の濃度を０Ｍからそれぞれの試薬の溶解度まで変化させることができる。水素結合開裂試薬の典型的な濃度は、0.1Ｍから5Ｍまでの範囲である。脱離により水素結合を開裂する試薬のために、イオン交換マトリクスのリガンドはまた遊離形または下式の同類化合物の形で使用され得る
0004422797.tif 000006
［式中、Ｒ1-6、ｎおよびＸは、式Ｉの場合と同一の意義を有する。］
pＨの変化それ自体が水素結合の開裂を起こし得る。
変性試薬／水素結合開裂試薬の利用は、なかでも核酸の分離に利用可能であり、塩勾配（＝伝導率勾配）またはpＨの変化と簡単に組み合わせ得る。
一般的に言うと、吸着が、水素結合の主要な部分に関与するならば、水素結合開裂試薬（例えば遊離リガンド）が、脱離溶液内に含まれるときは、比較的低イオン強度において、またはリガンドを開放しまたは水素結合を減ずるようなpＨの上昇により脱離が行われ得る。
塩脱離（おそらく勾配の形態）は、ペプチドおよび核酸にいずれにも利用でき、塩濃度（イオン強度）が上昇することを意図する。その上昇は、0Ｍからそれぞれの塩の溶解度まで変化し得る。その上昇は、しばしば0.01-4Ｍの範囲である。
最初に添加する水性溶液および溶出液のpＨは変化し得る。主としてイオン性の相互作用によって吸着剤と結合するペプチドでは、弱陰イオン交換基が陽性電荷を帯び、分離されるべきペプチドが陰性電荷を帯びるpＨにおいて、異なるタンパク質に対し溶出液イオン強度に最大の違いが得られる。これは、高すぎるpＨ値（＞１０）および低すぎるpＨ値は避けるべきであることを一般的に意味する。水素結合の特性による相互作用は、本発明のタイプの陰イオン交換体が弱陽性電荷のタンパク質（Ｆｉｇ．２Ａ参照）にも結合できることを意味する。
吸着した核酸／ペプチドの脱離に使用する溶出液のpＨは、緩衝成分（それらは陽性に電荷を帯びている）が、陰イオン交換体のリガンドと結合できないように好ましくは調節する。適当な緩衝成分は、アミン等の陽イオン性塩基および酸ならびに双性イオン体である。利用する溶出液の緩衝成分は、典型的には10-50mＭの濃度範囲である。
上記発明の方法は、上記クロマトフォーカシングおよびＥＣＴＥＯＬＡ−セルロースによる分離を含まない条件をともなう上記分離用陰イオン交換体の使用として理解され得る。
本発明は、カラム内に充填され、流動床としたもの、バッチ法の吸着操作等による従来のクロマトグラフィー用に利用され得る。マトリクスは、粒子（ビーズ）、モノリシック（monolitic）の形態、または表面（例えばセンサーにおいて）の形態となり得る。
図
Ｉ．タンパク質のクロマトグラフィーの結果
Ｆｉｇ．１：上記（式Ｉ＝（ＨＯＣＨ2）3ＣＨ2ＮＣＨ2ＣＨＯＨ−のリガンド、リガンドアーム−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−）記載のトリス−リガンドおよびＱ−リガンド（リガンド＝（ＣＨ3）3Ｎ+ＣＨ2ＣＨＯＨ−、リガンドアーム−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−）をともなうアガロースゲルと比較のクロマトグラフィー。破線のクロマトグラムは、Ｑ−リガンド（Ｑ−セファロース（商標登録）ＨＰ，Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ,Ｕppsala,Ｓweden）である。実線のクロマトグラムは、トリス−リガンドである。
Ｆｉｇ．２Ａおよび２Ｂ：トリス−リガンド（２Ａ）およびＱ−基（２Ｂ）それぞれをともなう上記アガロースゲルにおける蛋白についての溶出溶液イオン強度のｐＨの依存性
Ｆｉｇ．３：溶出イオン強度−以下の異なる陰イオン交換リガンドの比較：
Ａ−Ｃ．Ｑ−リガンドそれぞれ0.03,0.11,0.17mmol/ml
Ｄ．アンモニア0.10mmole/g；
Ｅ．ビスアミノプロピルアミン0.31mmole/g；
Ｆ．プロピルアミン0.13mmole/g；
Ｇ．ｔ−ブチルアミン0.15mmole/g；
Ｈ．エタノールアミン0.14mmole/g；
Ｉ．ジエタノールアミン0.15mmole/g；
Ｊ．トリエタノールアミン0.06mmole／g；
Ｋ．２−アミノ−１，３−プロパンジオール0.14mmole/g；
Ｌ．３−アミノ−１，２−プロパンジオール0.14mmole/g；
Ｍ．２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール0.15mmole/g；
Ｎ．トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン0.12mmol/g
Ｏ．ビストリスプロパン0.11mmole/g；
Ｐ．アミノソルビトール0.11mmole/g；
Ｑ．メチルモルホリン0.12mmole/g；
Ｒ．モルホリン0.28mmole/g
II．核酸のクロマトグラフィーの結果
Ｆｉｇ．４：実験１．pＨ7の塩溶液による溶出後、尿素溶液による溶出
Ｆｉｇ．５：実験２．pＨ7の尿素溶液による溶出の後、塩溶液による溶出
Ｆｉｇ．６：実験３．pＨ7の塩溶液の勾配による溶出
Ｆｉｇ．７：実験４．pＨ9の塩溶液による溶出  ロードするサンプルがpＨ8.2
Ｆｉｇ．８Ａ：実験５．ロードするサンプルがpＨ6.8  塩溶液による溶出後、塩に尿素を付加した溶液による溶出
Ｆｉｇ．８Ｂ：実験６．ロードするサンプルがpＨ9.0  塩溶液による溶出
実験部分
１．イオン交換体の合成
Ａ．標準的方法（本発明のイオン交換体）
Ｐorathら．（Ｊ．Ｃhromatog.60（1971）167-77およびＵ．Ｓ．3,959,251）に従いＮａＯＨ存在の下、エピクロルヒドリンおよびアガロース間の反応によりつくられるクロスリンクアガロース（30μパーティクル）を、0.18-0.22mmole/mlのアリルレベル（ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−）となるように塩基ＮaＯＨとアリルグリシジル  エーテルと反応させた。水で洗浄したクロスリンクし、アリル化したアガロース４０ｇを、吊り下げたマグネットスターラーを備えた４００ｍｌビーカーに１６０ｍｌ蒸留水および９．２ｇ硫酸ナトリウムと一緒に添加した。その後、黄色色素が消えなくなるまで臭素水を加えた。過剰の臭素の還元は、ギ酸ナトリウムで実施した。その後、ゲルを蒸留水（＞５倍ベッド容積）で洗浄し、１５−３０秒間、吸引乾燥する。その後、臭素化したゲルを６０ｍｌ蒸留水および６０ｇトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（＝トリス、式Ｉのリガンド（ＨＯＣＨ2）3ＣＨ2ＮＣＨ2ＣＨＯＨ−を与え、ここでは以後、このリガンドをトリス−リガンドと呼び、イオン交換体をトリス−イオン交換体と呼ぶ）を吊り下げたマグネットバーをともなう３−頚  １００ｍｌ  ベルコ−フラスコに一緒に添加した。最初は、pＨ１０．９であった。反応は、４０℃において一夜（２３ｈｒ）行った。完全に反応時間が経過した後のpＨは、１０．０であった。その後、ゲルを徹底的に蒸留水（＞１０ベッド体積）で洗浄し、可能な保存は２３％（ｗ／ｗ）エタノールを含む蒸留水で行った。
ＮａＯＨ−溶液で置換マトリクスの直接滴定による変曲点は0.13mmole/g吸引乾燥ゲルのリガンドレベルを与えた。
上記のクロスリンクしたアリルヒドロキシプロピル  アガロースから始まって、アンモニア（0.10mmole/g）、ビスアミノプロピルアミン（0.31mmole/g）、プロピルアミン（0.13mmole/g）、ｔ−ブチルアミン（0.15mmole/g）、エタノールアミン（0.14mmole/g）、ジエタノールアミン（0.15mmole/g）、トリエタノールアミン（0.06mmole/g）、２−アミノ−１，３−プロパンジオール（0.14mmole/g）、３−アミノ−１，２−プロパンジオール（0.14mmole/g）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（0.15mmole/g）、ビストリスプロパン（0.11mmole/g）、アミノソルビトール（0.11mmole/g）、メチルモルホリン（0.12mmole/g）を同様の方法によりカップリングした。イオン交換の許容量は、各完成イオン交換体のカッコ内に示している。
Ｂ．第四級イオン交換体（Ｑ−イオン交換体；比較用イオン交換体）
これらは前もって決定したイオン交換許容量に相当する量のアリル基で置換した、上記に従い作られたクロスリンクアガロースから製造された。アリル化したアガロースを臭素で処理し、トリメチルアミンと反応させた。三許容量のあるイオン交換体が準備された（0.03mmole/l、0.11mmole/lおよび0.17mmole/l）。
Ｃ．リガンドレベルの決定
弱イオン交換体においてpＨ２−１１範囲でイオン交換体に直接的平衡コンディション条件下の変曲点滴定。強イオン交換体をＣl-で飽和し、過剰量は蒸留水で洗浄し、その後、吸着したクロライドイオンをＡｃＯ-溶液で溶出させ、溶出のＡgＮＯ3滴定により決定した。
２．クロマトグラフィー（タンパク質）
Ａ．トリスリガンドおよびＱ−リガンドをともなう上記アガロースゲルのクロマトグラフィーの比較
許容量0.17±0.3mmole/mlであるＱ−セファロース（商標登録）（Ｐharmacia Ｂiotech,Ｕppsala,Ｓweden）および実験１Ｂと同様であるカップリング化学およびマトリクス。
上記ゲルをバックプレッシャー約５バールであり５−６ｃｍの高さであるＨＲ5/5カラム（Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）に詰めた。
サンプル：トランスフェリン1mg/ml、オバルブミン2mg/ml、
ラクトグロブリン2mg/ml、ループボリューム50μl
緩衝液Ａ：ピペラジン20mＭ、pＨ6.0
緩衝液Ｂ：ピペラジン20mＭ、pＨ6.0
流速：0.2ml/min
勾配容積：40ml
ＵＶ−検出器：280nm 0.05AU
伝導率検出器最大値＝100mS/cm
結果：トリス−イオン交換体は、第四級イオン交換体と比べたとき、かなり高いダイナミクスが得られた。Ｆｉｇ．１参照。
Ｂ．トリス−リガンドおよびＱ−リガンドをそれぞれともなう上記アガロースゲルにおける各タンパク質に対する溶出イオン強度のpＨ依存性
２Ａのカラムおよびゲル。流速1ml/min。勾配：0.5Ｍ ＮａＣlに対し20ml（適当な場合には、1.0Ｍ ＮaＣlに対し40ml）。サンプルは、Ｆｉｇ．２ＡおよびＦｉｇ．２Ｂから明らかである。
各pＨによる緩衝液
pＨ４ヘペス20mＭ-ＨＣl
pＨ4.6ピペラジン20mＭ-ＨＣl
pＨ5ピペラジン20mＭ-ＨＣl
pＨ5.5ピペラジン20mＭ-ＨＣl
pＨ6ピペラジン20mＭ-ＨＣl
pＨ7ベス20mＭ
pＨ7.5ヘペス20mＭ-ＮaＯＨ
pＨ8.0ヘペス20mＭ-ＮaＯＨ
pＨ8.2トリス20mＭ-ＨＣl
pＨ9タウリン20mＭ-ＮaＯＨ
結果：Ｆｉｇ．２Ａおよび２Ｂ参照。それは、伝導率の一番高い点をpＨに対してプロットしたものである。Ｆｉｇ．２Ａは、第四級イオン交換体における異なる溶出イオン強度を示し、Ｆｉｇ．２Ｂは、トリス−イオン交換体について示したものである。pＨ６±１の範囲でトリス−イオン交換体の溶出イオン強度は第四級イオン交換体よりも相当高いことは、明白である。さらに、ゲルに対して結合力の強いタンパク質のイオン強度と結合力の弱いタンパク質のイオン強度の差は、第四級イオン交換体の場合よりもトリス−イオン交換体の場合のほうが大きい（pＨ約７．５まで）。これにより、本発明の弱イオン交換体の利用により分離（イオン強度のより高い範囲において）のダイナミクスが上昇する可能性があることを示す。
Ｃ．上記のクロス連結アガロースゲルと結合する異なる陰イオン交換リガンド間における比較
２Ａのカラム。１Ａのゲル。
サンプル：トランスフェリン（1mg/ml）、オバルブミン（1mg/ml）、β−ラクトグロブリン（1mg/ml）
緩衝液Ａ：ピペラジン20mＭ pＨ6.0
緩衝液Ｂ：ピペラジン20mＭ、ＮaＣl 1.0Ｍまたは0.5Ｍ、pＨ6.0
勾配容積：それぞれ40ml（1Ｍまで）および20ml（0.5Ｍまで）
他のパラメーターは上記記載。
結果：Ｆｉｇ．３は、研究モデルタンパク質用に用意したイオン交換体の、pＨ6.0における溶出イオン強度をmS/cmで示す。これから、水素結合基から２炭素原子離れた第一級または第二級アミノ基があるイオン交換体が、研究モデルタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーの手段により互いに分離する能力について第四級リガンドとは区別されることが明白となる。
３．クロマトグラフィー（核酸）
材料
リガンド：実験は、タンパク質と同じリガンドで行った。トリス−イオン交換体の結果のみ記載する。
カラム：約１ｍｌのベッド容積をパックしたＨＲ５／５カラム。
緩衝液：
Ａ．20mＭ リン酸ナトリウム、pＨ7.0
Ｂ．2Ｍ ＮaＣlを含む緩衝液Ａ、pＨ7.0
Ｃ．2Ｍ ＮaＣlおよび4Ｍ尿素を含む緩衝液Ａ、pＨ7.0
Ｄ．4Ｍ尿素を含む緩衝液Ａ、pＨ7.0
Ｅ．20mＭ Ｇly/ＮaＯＨ、pＨ9.0
Ｆ．２Ｍ ＮaＣlを含む緩衝液Ｅ、pＨ9.0
サンプル：除去保護基（トリチル）のあるホスホロチオエート化２５ｍｅｒオリゴヌクレオチド（モル重量７５００ダルトン）の合成。濃度は1.08mmole/ml（8.1mg/ml）であり、伝導率は約2mS/cmであった。合成およびトリチル基の脱保護の後、サンプルを回転蒸発させ（アンモニアを除去するため）、脱イオン水に溶解した。パックしたカラム（ＨＲ5/5、ベッド体積１ｍｌ）に適用する前に溶液のpＨを典型的には８．２に調節した。
結果をともなうテストプロトコール
緩衝液ＡまたはＥで未結合の内容物を洗浄し、緩衝液ＡまたはＥで前平衡化したカラム（ＨＲ5/5、Ｖt＝1ml）にサンプル（合成オリゴヌクレオチド16mgを含む2ml、合計Ａ260＝440）を適用した。溶出は緩衝液Ｂおよび緩衝液Ｃ（pＨ7.0で行うため）で、または緩衝液Ｆ（pＨ9.0で行うため）で行った（溶出速度153cm/h、温度２１℃）。溶出液は画分ＡＢＣのように回収した。各画分について260nm吸収を測定した。カラムに適用した合計吸収に関するパーセント分布を各画分について計算した。回収した画分を脱イオン水で平衡化したセファデックス（商標登録）Ｇ−２５で脱塩した。各画分の適当な体積を純度を決定する毛管電気泳動により検討した。
実験１  pＨ７での溶出：
溶出コースは、Ｆｉｇ．４参照。サンプルは緩衝液Ａで平衡化したカラムに添加した。平衡緩衝液で非結合の材料（画分Ａ）を溶出させたのち、結合材料を緩衝液Ｂ（画分Ｂ）に続いて緩衝液Ｃ（画分Ｃ）で溶出させた。Ａ260での吸収測定をもとにすると、オリゴヌクレオチドの分布は：画分Ａ ６％、画分Ｂ ３２％および画分Ｃ ６２％であった。画分ＢおよびＣの毛管ゾーン電気泳動の分析から、画分Ｂはほとんど低分子混入物であったが画分Ｃは少なくとも９０％の純度である25-merであることが示された。この画分が２Ｍ ＮａＣｌおよび４Ｍ尿素を含む緩衝液で溶出したという事実から、pＨ７におけるオリゴヌクレオチドと弱陰イオン交換体との結合にはイオン結合および水素結合が含まれていることを示唆している。
実験はサンプルを２倍量にして行った（32mg 25-mer）。その結果は前述と同様であり、陰イオン交換体はこのタイプのオリゴヌクレオチドに対し高い吸着許容量を示す。画分Ｃに相当する画分は高い純度を示した。それは、最も強く結合する内容物の純度を向上するサンプル−サンプル置換であること示す（25-merの場合）。
実験２  尿素の効果、pＨ７における溶出
溶出パターンはＦｉｇ．５から明らかである。この実験では、平衡緩衝液で洗浄後、カラムを緩衝液Ｄ（４Ｍ尿素）および緩衝液Ｃで最初に溶出させること以外は実験１の繰り返しであった。Ｆｉｇ．４から、少量の非結合材料は平衡緩衝液（緩衝液Ａ）で洗浄され、結合しない構成物は緩衝液Ｄのみ溶出するが、第四級の溶出は緩衝液Ｃ（画分Ｂ）から得られることが明らかである。その結果は、弱陰イオン交換体との結合はイオン結合と水素結合の相互作用を通して影響をうけることを支持する。画分間のパーセント分布は−画分Ａ ６％、画分Ｂ ９３％であった。毛管電気泳動の分析より、画分Ｂはいくらかの低分子ピークをともなう７８％の純粋25-merであることが分かった。２Ｍ ＮaＣl（緩衝液Ｂ、実験１参照）でカラムを中間洗浄した結果、画分Ｃに多量の低分子構成物および高純度の25-merが溶出することを証明する。
実験３  pＨ７における勾配溶出
溶出パターンはＦｉｇ．６から明らかである。この実験では、平衡緩衝液で洗浄後、カラムを緩衝液Ａから緩衝液Ｃ（ＮaＣlおよび尿素濃度は同時におよび直線的に増加する）へのまたは緩衝液Ｄから緩衝液Ｃへの直線勾配で溶出させる以外は実験１の繰り返しであった。後の場合では、４Ｍ尿素を含む緩衝液でカラムを平衡化するため最初に緩衝液Ｄで洗浄した。いずれの実験においても、結合材料の溶出は、幾つかのショルダーのあるブロードピーク（特に前部において）となった。このピークを二つの画分として回収した（画分Ｂおよび画分Ｃ、画分Ａは平衡緩衝液で洗浄直後の物質）。毛管ゾーン電気泳動の分析より、前部には約４０％純度の25-merとともに多量の低分子混入物を含むことが判明した。溶出カーブの後部（画分Ｃ）には、およそ９４％純度の25-merオリゴヌクレオチドをほとんど排他的に含んでいた。
実験４  pＨ９における溶出
オリゴヌクレオチド混合物の吸着および溶出を緩衝液ＥおよびＦを用いpＨ９で行う以外は、実験１の繰り返しであった。サンプルのpＨはpＨ8.2に調節し、２ｍｌ（16.2mgオリゴヌクレオチド）を緩衝液Ｅで平衡化したカラムに適用した。緩衝液Ｅでの非結合画分（Ａ）の溶出後、結合構成物（画分Ｂ）を緩衝液Ｆで溶出した。画分ＡおよびＢについてＡ260をもとに、パーセント分布を計算すると画分Ａは４７％、画分Ｂは４９％となった。溶出パターンはＦｉｇ．７に示す。得られた結果を以下に示す：
１．pＨ７における溶出結果とは反対に、結合構成物は２Ｍ ＮaＣlで完全に溶出した（緩衝液Ｆ）。このpＨにおけるオリゴヌクレオチドは、水素結合では全くなくイオン性相互作用のみにより結合していると思われた。
２．毛管電気泳動の分析より、非結合構成物（画分Ａ）には混入物が含まれ、画分Ｂは少なくとも６０％の純度であることがわかった。緩衝液Ｅから緩衝液Ｆへの直線勾配で溶出させたならば、画分Ｂの純度は約９０％まで増大した。
実験５および６（サンプルpＨの重要性）
pＨ９におけるオリゴヌクレオチドの分離は再現できないことに注目した。これは、原理的にはカラムに適用するサンプルのpＨが違う為であり、それは、Ｆｉｇ．８Ａおよび８Ｂの溶出パターンに見られ得る。実験は上記実験４と同じである。
Ｆｉｇ．８Ａは、適用するサンプルのpＨが６．８であったときの溶出パターンである。結合構成物のおよそ７５％は緩衝液Ｆで溶出したが、より少ない部分（画分Ｃ、適用したＡ260の１０％）は明らかにしっかりと結合しているため溶出には緩衝液Ｆを必要とする。その結果は実験１で得られたものに類似し、適用したオリゴヌクレオチドはイオン結合力および水素結合力により陰イオン交換体と結合することを示す。これは、オリゴヌクレオチドには高密度に電荷を帯びた基があるためであり、それは次にそれらにオリゴヌクレオチドに高緩衝許容量を与える。ヌクレオチド溶液（pＨ6.8に調節した）が同所を通過するとき、陰イオン交換体は実際には平衡-pＨよりも低くなるとの結果となるであろう。この仮説は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンがpＨ９において僅かに分離するため有望である。溶出緩衝液のpＨが実験を通して９．０であるにも拘わらず、結合画分（Ｂ）のpＨが8.2であるのに対し非結合画分（画分Ａ）のpＨが８．９であることから、我々の結果はこの仮説を支持する。
Ｆｉｇ．８Ｂは、ロードしたサンプルのpＨが9.0であったときに得られた溶出パターンを示す。この場合、ロードしたサンプルのほとんどが非結合（８８％）であり、約１０％が緩衝液Ｆで溶出した。これはＦｉｇ．８Ａの結果とは明らかに反対であり、オリゴヌクレオチドだけがイオン力を通して陰イオン交換体と結合すること示す。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンがこのpＨにおいて若干しかイオン化されていないため、陰イオン交換体の結合許容量は著しく低くなる。
実験５で得られた結果から、使用したトリス−イオン交換体におけるオリゴヌクレオチドの分離は陰イオン交換体およびサンプルのpＨの影響を受けることが分かる。pＨ値は、合成的生産オリゴヌクレオチドの混合液を含む粗生産物の精製を最適化するためにpＨ７と９の間で変化し得る。
実験７  直線状pＨ勾配による溶出
非結合画分Ａの溶出の後、マトリクスに結合したオリゴヌクレオチドを緩衝液Ａ（pＨ7.0）から緩衝液Ｆ（pＨ9.0）への直線状勾配（１０ベッド体積）により溶出したこと以外、実験１の繰り返しであった。その結果は、流出液のpＨが約8.5になったとき、結合オリゴヌクレオチドがマトリクスから溶出し始めることを示した。溶出したピークはブロードとなり、強固に結合する構成物の純度は上記実験３で得られたものに匹敵した。その結果は、合成オリゴヌクレオチド（25-mer）はpＨ8.5まではイオン結合および水素結合の組み合わせにより、それ上のpＨではイオン性の相互作用でのみマトリクスと結合していることを示している。
実験８  Ｔris-ＨＣl緩衝液による競合溶出
この実験の目的は、高濃度のＴris-ＨＣl緩衝液（１Ｍ、pＨ7.0）によりマトリクスと結合するオリゴヌクレオチドを置換し得るかどうか調べることであった。カラムは、50mＭ Ｔris-ＨＣl緩衝液により平衡化され（pＨ７．０（緩衝液Ｉ））、２ｍｌのサンプルを平衡化カラムに適用した（上記実験１を比較のこと）。平衡緩衝液による非結合画分（Ａ）の溶出の後、カラムを以下の順番に以下の緩衝液で洗浄した。
緩衝液ＩＩ：３Ｍ ＮaＣlを含む平衡緩衝液（緩衝液Ｉ）
緩衝液ＩＩＩ：１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液、pＨ7.0、および
緩衝液ＩＶ：２Ｍ ＮaＣl、１Ｍ Ｔris-ＨＣl、pＨ7.0
その結果から、ロードした材料において
１．１２．５％はカラムに結合しなかった。
２．４３％は緩衝液ＩＩにより溶出した。
３．３４％は緩衝液ＩＩＩにより溶出した。
４．１１％は緩衝液ＩＶにより溶出した。
ということが判明した。
大部分の強固に結合するオリゴヌクレオチドが１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液、pＨ7.0で溶出することは明らかである。この最も可能性のある説明は、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンおよびカウンターイオンＣl-の組み合わせによりリガンドおよび結合オリゴヌクレオチド間の水素結合およびイオン結合がそれぞれ弱まるというものである。この説明は、トリス−リガンドおよびその類似体とオリゴヌクレオチドの吸着における提唱機構と一致している。この結果は、より高いイオン強度（緩衝液ＩＶ参照）が最も強固に結合する画分の溶出に必要であるということも示す。これはさらに、pＨ7.0における合成オリゴヌクレオチドとマトリクスとの結合（トリス−リガンドを示す）は、水素結合を通してかなり増強したイオン性相互作用の結果であるという我々の仮説を支持するものである。
実験９  “トリチル−オフ”合成オリゴヌクレオチドから“トリチル−オン”合成オリゴヌクレオチドの分離
この実験はpＨ9.0で行い、上記実験４の手順に従った。粗サンプルには、“トリチル−オン”合成オリゴヌクレオチドおよび“トリチル−オフ”合成オリゴヌクレオチドの混合液を含んだ。1ml脱イオン水中のおよそ16mgのサンプルをカラムに適用し、実験は実験４に従って行った。緩衝液Ｅ（２Ｍ ＮaＣlを含む20mＭ Ｇly/ＮaＯＨ緩衝液、pＨ9.0）での溶出により十分に分離された２つの画分となった（ＢおよびＣと命名）。プール画分における材料の260nmでの吸収（Ａ260）によるパーセント分布は、画分Ａ＝１４％、画分Ｂ＝４５％および画分Ｃ＝４４％であった。毛管ゾーン電気泳動の分析より、画分Ａは排他的に低分子混入物を含み、画分Ｂには純度８０％の合成オリゴヌクレオチドの“トリチル−オフ”変異体を主に含み、さらに最も遅延する画分Ｃは少なくとも８０％の純度であり、25-merオリゴヌクレオチドの“トリチル−オン”変異体を含むことが分かった。
前述とともに、この結果は、高収率・高純度で合成オリゴヌクレオチドを簡単に精製するクロマトグラフィー法として本発明に大きな可能性があることを明らかに示すものである。吸着過程の最適pＨ条件を選ぶことにより、使用するマトリクスのオリゴヌクレオチド許容量は20mg/ml吸着剤よりも高くなり得る。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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