(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示される同一または異なるモチーフの連鎖により構成される生体親和性ポリマー：
0004485058.tif 000008
ここで、
・Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は、水素原子、Ｘ、Ｙ、Ｚ、−Ｘ−Ｙ、−Ｘ−Ｚ、−Ｙ−Ｚ及び−Ｘ−Ｙ−Ｚからなる群より選ばれる少なくとも１つを表し、
−Ｘは、以下の構造式に対応するカルボキシル基を表す：
−Ｒ−ＣＯＯ−Ｒ’
ここで、Ｒは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベンジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除く１個または複数の芳香族環を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、Ｒ’は水素原子または陽イオンを表し、
−Ｙは、以下の構造式のうちの一つに対応するサルフェート基またはスルホネート基を表す：
−Ｒ−Ｏ−ＳＯ３−Ｒ’、
−Ｒ−Ｎ−ＳＯ３−Ｒ’、
−Ｒ−ＳＯ３−Ｒ’、
ここで、Ｒは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベンジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除く１個または複数の芳香族環を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、Ｒ’は水素原子または陽イオンを表し、
−Ｚは、ベンジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除く、同一の、または異なるアミノ酸、脂肪酸、または抗炎性物質、抗菌性物質、抗生物質、酵素および成長因子の中から選択されるものを表す：
・ａは、式（Ｉ）のポリマーの質量が５０００ダルトンより大きくなるようなグルコースの数を表し、
・グルコース全体のＸ基による置換率は、２０と１５０％の間の値であり、
・グルコース全体のＹ基による置換率は、３０と１５０％の間の値であり、
・グルコース全体のＺ基による置換率は、０と５０％の間の値である。
【請求項２】
ＸおよびＹ基のラジカルＲが、直鎖の、または分岐したアルキル、アリル、アリール基の中から選択されるものである請求項１に記載の生体親和性ポリマー。
【請求項３】
グルコース全体のＸ基による置換率が５０％である請求項１または２に記載の生体親和性ポリマー。
【請求項４】
グルコース全体のＹ基による置換率が１００％である請求項１から３のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマー。
【請求項５】
グルコース全体のＺ基による置換率が３０％である請求項１から４のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマー。
【請求項６】
前記Ｚ基が、共有結合以外の結合で、式（Ｉ）のポリマーに結合している請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマー。
【請求項７】
前記Ｚ基が、イオンまたは親水性の相互作用により式（Ｉ）のポリマーに結合している請求項６に記載の生体親和性ポリマー。
【請求項８】
薬学的に許容可能な担体により結合するものである請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリマーの少なくとも１つを含有することを特徴とする医薬または診断組成物。
【請求項９】
生体親和性ポリマーと薬学的に許容可能な担体が、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、眼球内、脳脊髄液内または直接に中枢神経内に、あるいは経口、骨、皮膚、皮下、器官のあらゆる体液隔室内、または場合によりこれらの組合せで局所的に投与可能な形で結合したものである請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
処置する組織の１平方センチメートル当たり０．００１〜１ｍｇのポリマー、あるいは１立方センチメートル当たり０．００５〜１ｍｇのポリマーを投与可能となるように調製されたものである請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
生理的溶解溶液１ミリリットル当たり０．０１〜１０ｍｇのポリマーを含有するものである請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１２】
血液循環系、腹腔内、眼球内、脳脊髄液内または組織内あるいは周囲のあらゆる流体内を通じて、処置するヒトまたは動物の体重１ｋｇ当たり０．１〜１００ｍｇのポリマーを投与し得るように調製されたものである請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１３】
処置するヒトまたは動物の体重１ｋｇ当たり０．２〜５００ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり１〜５０ｍｇのポリマーを筋肉内を通じて投与し得るように調製されたものである請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１４】
処置するヒトまたは動物の体重１ｋｇ当たり１〜５０００ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり１０〜５００ｍｇのポリマーを骨から投与し得るように調製されたものである請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１５】
抗凝固活性が５０ＩＵ／ｍｇ以下である請求項８〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ヘパリンとの親和性を有する成長因子の安定化および相乗作用のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項１７】
ヘパリンとの親和性を持つ成長因子をトリプシンなどのタンパク質分解剤に対して保護するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項１８】
炎症プロセスに関係するプロテアーゼ活性を抑制するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項１９】
組織または器官の病変、ならびに苦痛の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２０】
筋肉、神経組織ならびに消化器の治療および／または予防のための請求項１９に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２１】
皮膚の瘢痕形成のための請求項１９に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２２】
角膜の瘢痕形成のための請求項１９に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２３】
扁平骨の瘢痕形成のための請求項１９に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２４】
長骨の瘢痕形成のための請求項１９に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２５】
炎症の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２６】
組織および器官の、質および機能性のホメオスタシスの調整のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２７】
ｉｎ ｖｉｖｏで、組織と細胞の再生、保護、保存および老化のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項２８】
虚血、電離線および罹患時もしくはストレス時、またはさらに食品中から摂取される酸化促進生成物による有害な影響の処置および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項２９】
虚血に対する予防および保護のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３０】
低酸素症、神経疾患、ミオパシー、肝障害、心臓疾患などの細胞変性に、および脂質などの分子の過酸化に付随する病理学的処置および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３１】
組織、器官および人工器官の保存のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３２】
心臓と神経病の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３３】
細胞のランダムな成長、および血管形成に関連する病理学上のプロセスに付随する病気の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３４】
電離線の有害な影響の処置および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３５】
腺維症の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３６】
平滑筋、腺維芽細胞又は肝細胞などの間葉細胞の増殖の調整、およびそれらの分泌するコラーゲンタイプの質的調整のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３７】
肺、腎臓、肝臓、心臓、脈管、皮膚科学、移植とそれらの機能的完全性、寄生に関連した多数の病変の、病理学的に治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３８】
酸化性ストレスおよび酸化剤により誘発された病変および苦痛の、治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項３９】
必然的に抗酸化剤を含むか、または動物性あるいは植物性のスーパーオキシドジムスターゼなどの抗酸化剤が添加されている食品または直接栄養物の保存のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいは他の化合物と共にする使用。
【請求項４０】
動物性または植物性のスーパーオキシドジムスターゼと共にする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【請求項４１】
神経組織の攻撃、苦痛あるいは変性の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４２】
老化の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４３】
心臓、脳、中枢神経の苦痛の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４４】
脊髄あるいは網膜の病変の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４５】
筋ジストロフィーなど、横隔膜の衰弱に付随した呼吸不全の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４６】
糖尿病性網膜症などの糖尿病に付随する有害な影響の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４７】
ライ病の治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４８】
内毒素ショックの治療および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項４９】
ウィルス、微生物、寄生生物、プリオンなどの病原性因子の侵入の処置および／または予防のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項５０】
癌治療用の放射線療法のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項５１】
紫外線により誘発される影響の予防および／または治療のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項５２】
高血圧の予防および／または治療のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの単独であるいはスーパーオキシドジムスターゼと共にする使用。
【請求項５３】
病変組織の部位まで活性因子を運ぶための請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体親和性ポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規な生体親和性ポリマー、その調製方法およびそれを含む組成物に関する。
【０００２】
従前の技術において、カルボキシメチル、カルボキシメチルベンジルアミドおよびカルボキシメチル−ベンジルアミド−スルホン酸塩の残基が置換して得られたデキストランから誘導されるポリマーが知られている。これらのポリマーの調製方法およびそれらの特性は、フランス国特許第２４６１７２４号ならびに米国特許第４７４０５９０に記述されている。これらのポリマーの内のいくつかはヘパリン様特性を示し、またそれらの抗凝固性と抗補体性のために血漿の代用品として使用することができる。その他のものは、ＦＧＦ族の成長因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物学的活性の安定化、保護および相乗作用より成る特性であって、ヘパリンとは異なるものを示す（Tardieu等、細胞生理学ジャーナル、１９９２年、１５０、１９４〜２０３ページ）。
【０００３】
ところで、フランス国特許第２６４４０６６号は、瘢痕形成用に、ＣＭＤＢＳと指定されるデキストランのカルボメチル−ベンジルアミド−スルホン酸塩誘導体単独の、またはＦＧＦｓと結合されたものの使用を記述している。
【０００４】
最近、フランス国特許第２７１８０２３号、第２７１８０２４号および第２７１８０２６号において、消化器、神経系、筋組織それぞれの病変部の治療薬として、腺維芽細胞またはＦＧＦの成長因子、および交換成長因子−β（ＴＧＦβ）など、ヘパリンと親和性のある成長因子を保護し、安定化し、および相乗作用を発揮することのできるポリマーの使用が提案された。このＣＭＤＢＳデキストラン誘導体の保護効果を説明するため、これらの特許はＦＧＦ１、ＦＧＦ２またはＴＧＦβのトリプシンによるタンパク質分解消化の結果を報告している。ヘパリンと親和性のある成長因子のこれらの保護、安定化および相乗作用の特性は、筋、神経組織および消化器の、瘢痕形成および修復活性を持ち、且つ投与の用量において抗凝固活性のない、“ヘパリン結合成長因子保護体と増強体”としてＨＢＧＦＰＰと指定される新しいクラスのポリマーの特徴付けを可能にした。
【０００５】
さらに、上記のＨＢＧＦＰＰの用途として、フランス国特許第２７１８０２５号は、炎症の治療薬としてのこれらのポリマーの利用を提案している。この抗炎活性は、白血球エラスターゼまたはプラスミンとして炎症反応に関係するタンパク質分解酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびＣＭＤＢＳデキストラン誘導体により処置される組織内で、低い炎症性細胞反応を示す組織学的研究によるｉｎ  ｖｉｖｏでの抑制活性により説明される。
【０００６】
しかしながら、ＣＭＤＢＳデキストラン誘導体は合成するのが難しく、且つベンジルアミンなど、その有害な影響について知られる残基を塩析するリスクのある化合物である。
【０００７】
さらに、従前の技術で提案されているＨＢＧＦＰＰの用途は、特定の組織のみの修復及び瘢痕化に限定される。
【０００８】
本発明はまさに、調製しやすく、且つＨＢＧＦＰＰの特性のみならず、予想外にも、特にいくつかのタイプの器官、組織または特定の細胞に限定されない非常に広範な治療上の適用を可能にするといった新規な特性を有する生体親和性ポリマーを提供することにより、これらの課題を解決することを目的とする。
【０００９】
本発明のポリマーは、また“ReGeneraTing Agents（再生剤）”として、以下に“ＲＧＴＡ”とも指定する。
【００１０】
本発明のポリマーは５０００ダルトン以上のモル質量を有し、下記一般式（Ｉ）で表される同一または異なるモチーフ（ｍｏｔｉｆｓ）の連鎖で構成される生体親和性ポリマーである：
0004485058.tif 000002
ここで、
・Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は、水素原子、Ｘ、Ｙ、Ｚ、−Ｘ−Ｙ、−Ｘ−Ｚ、−Ｙ−Ｚ及び−Ｘ−Ｙ−Ｚからなる群より選ばれる少なくとも１つを表し、
−Ｘは、以下の構造式に対応するカルボキシル基を表す：
−Ｒ−ＣＯＯ−Ｒ’
ここで、Ｒは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベンジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除く１個または複数の芳香族環を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、Ｒ’は水素原子または陽イオンを表し、
−Ｙは、以下の構造式のうちの一つに対応するサルフェート基またはスルホネート基を表す：
−Ｒ−Ｏ−ＳＯ３−Ｒ’、
−Ｒ−Ｎ−ＳＯ３−Ｒ’、
−Ｒ−ＳＯ３−Ｒ’、
ここで、Ｒは、場合により分岐しているか、または不飽和で、且つベンジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除く１個または複数の芳香族環を有している脂肪族炭化水素結合あるいは鎖を表し、また、Ｒ’は水素原子または陽イオンを表し、
−Ｚは、ベンジルアミンとスルホン酸ベンジルアミンを除く、同一の、または異なるアミノ酸、脂肪酸、または抗炎性物質、抗菌性物質、抗生物質、酵素および成長因子の中から選択されるものを表す：
・ａは、式（Ｉ）のポリマーの質量が５０００ダルトンより大きくなるようなグルコースの数を表し、
・グルコース全体のＸ基による置換率は２０と１５０％の間の値であり、
・グルコース全体のＹ基による置換率は３０と１５０％の間の値であり、
・グルコース全体のＺ基による置換率は０と５０％の間の値である。
【００１１】
上式（Ｉ）において、ＸおよびＹ基のラジカルＲは、線形の、または分岐したアルキル、アリル、アリール基の中から選択されるものであることが好ましい。
【００１２】
上記の置換率の定義において、Ｘ基による置換率が１００％とは、本発明のポリマーの各グルコース（以下、単量体Ａということがある）が統計的に１個のＸ基を含有していることを意味する。同じく、Ｙ基による置換率が１００％とは、本発明のポリマーの各グルコースが統計的に１個のＹ基を含有していることを意味する。１００％を超える置換率は、各グルコースが考慮する種類の基を統計的に１個より多く含有していることを示し、逆に、１００％より少ない置換率は、各グルコースが考慮する種類の基を統計的に１個より少なくしか含有していないことを示す。
【００１３】
これらのポリマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで緩やかな分解性を持つという注目すべき利点を有し、このことから、ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼにより自然に且つ急速に分解される生成物である硫酸ヘパランとは異なる。さらに、本発明のポリマーはベンジルアミン基を有するＣＭＤＢＳと異なり、有害な生成物を含有することも、放出することもない。
【００１５】
グルコースの数は、本発明のポリマーの質量が５０００ダルトンを超えるように定義される。
【００１６】
ＲＧＴＡの重合構造の選択は、処置する組織や器官により使用される可能性のある種々の提示形式、あるいは可溶性、または溶液、懸濁液、ゲル、粉末、海綿、膜、加水可能か侵食可能か定着可能かの如何に拘わらず、多孔質か、半多孔質または多孔質でない高密度の造形可能な物質などとの空間的立体配座などの物理化学的性質に依存する。
【００１７】
ヘパリンまたはその弱抗凝固性のフラグメント、および天然の硫酸ヘパランとそれらのフラグメントは、本発明の範囲から除外される。何故ならば：
−それらの抗凝固活性が５０ＩＵより高い可能性がある。事実、本発明のポリマーは、有意な抗凝固活性を欠いており、１５０〜１７０ＩＵ／ｍｇ程度であるヘパリンに比較して、５０ＩＵ／ｍｇと活性が低い。
【００１８】
−本発明の一環として得られる生物学的効果を可能にすると、ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼのタイプの酵素の作用下であまりにも急速な微生物分解性を示すようになる。
【００１９】
本発明のポリマーへは、追加の生物学的または物理化学的特性を本発明のポリマーに付与することができ、ＸおよびＹとは異なるＺと指定される化学官能基を含有することができる。よって、Ｚ基は、例えば両親媒性を増加したり、血液脳関門の通過を可能にすることなど、組織へのよりよい拡散や浸透を可能にするために、より高い可溶性または脂肪親和性をＲＧＴＡに付与するのに有効である。Ｚ基の例としては、同一の、または異なるアミノ酸、脂肪酸、脂肪族アルコール、セラミド、またはそれらの誘導体、あるいはアドレス指定されたのヌクレオチド配列などが挙げられる。
【００２０】
Ｚ基はまた、例えば抗炎性物質、抗菌性物質、抗生物質など、あるいは酵素、成長因子などの治療作用または診断作用などの同一の、または異なる活性作用を現し得る。
【００２１】
グルコース全体のＺ基による置換率は、０〜５０％の間、好ましくは３０％である。
【００２２】
Ｘ、ＹおよびＺ基は、グルコースに直接結合するか、あるいは１個のみがグルコースに結合し、他は互いに結合し得る。
【００２３】
よって、Ｚ基は、共有結合により直接グルコースに結合するか、または共有結合によりＸおよび／またはＹ基に結合し得る。
【００２４】
しかし、Ｚ基はまた、グルコース、ＸおよびＹの性質により、イオンまたは親水性の相互作用など、共有以外の結合によっても上式（Ｉ）のポリマーに結合し得る。その場合、本発明のポリマーは、Ｚのベクトル化システムを構成し得る。よって、本発明のポリマーは、その用途の一環として、後述に定義する損傷を受けた部位、または病気の組織部位まで、成長因子や酵素のように、活性因子Ｚを輸送するのに有効であり得る。
【００２５】
その中でＸとＹのＲ族、またはＺ基が、直接あるいは分解後に有害な影響を誘発する可能性のあるポリマーは本発明の範囲に入らない。発明から除外されるＺ基として、突然変異原因子を構成するかあるいは発癌性であるか、またはその他の毒性を有するとして既知のものを挙げることができる。ＣＭＤＢＳ内に含まれるベンジルアミドから塩析することができ、且つその発癌性が専門家によく知られているベンジルアミンがこのケースに当たる《Wiessler等、Carcinogenesis、１９８３年；４（７）：８６７〜８７１；Singer等、J Med. Chem.１９８３年；２６（３）：３０９〜３１２》。従って、ＣＭＤＢＳは、本発明のポリマーから除外される。
【００２６】
本発明はまた、薬学的に許容可能な担体により、その組成物に結合した上記定義のポリマーの少なくとも１つを含有する医薬または診断組成物にも関する。これらの組成物は、ヒトにも動物にも使用可能である。事実、従前の技術に記述されているＨＢＧＦＰＰのように、本発明のポリマーは以下の特性を示す：
−それらは有意な抗凝固活性を持たないが、これは活性が１５０〜１７０ＩＵ／ｍｇ程度であるヘパリンのそれに比べ、５０ＩＵ／ｍｇと低活性であることを意味する。
【００２７】
−それらはヘパリンと、特に例としてＦＧＦ１および／またはＦＧＦ２、およびＴＧＦβについて親和性を示し、成長因子を安定化させ、且つ薬効に相乗作用を与える。
【００２８】
−それらはトリプシンなどのタンパク質分解剤に対し、これらの因子を保護する。
【００２９】
−それらは、例えば白血球エラスターゼやプラスミンなどの炎症プロセスに関与するプロテアーゼ活性を抑制する。
【００３０】
−それらは少なくとも上述の特許で紹介されているモデルにおいて、筋肉、神経または消化器について瘢痕形成効果を及ぼす。
【００３１】
よって、本発明のポリマーは、筋組織、神経組織および消化器の修復を助長し、また、ＣＭＤＢＳについて米国特許第５６９３６２５号に報告されているように皮膚および角膜に、あるいはBlanquaert F.等により記述されているように（Bone、１９９５年；１７（６）：４９９−５０６）扁平骨の瘢痕形成に関して特性を示す新規なクラスの因子を構成する。しかし、本発明のポリマーはＣＭＤＢＳと関連して予想外の特性も示す。例として、先験的に、長骨に移し変え不能であった頭蓋骨障害の修復に関するＣＭＤＢＳの効果を挙げることができる（Blanquaert F.等、Bone、１９９５年；１７（６）：４９９〜５０６）。扁平骨と長骨は、以下のようにまったく異なる性質である：
−それらは発生学的に由来が異なる。扁平骨は結合組織の細胞の誘導体であるのに対し、長骨は軟骨細胞の誘導体である。
【００３２】
−扁平骨は海綿質骨であり、長骨と違って髄管を持たない。
【００３３】
−扁平骨は、インカやエジプトなど先史文明に由来する頭蓋骨に瘢痕のないことが示すように、穿孔時などに物質損失がある場合には自然に瘢痕形成しない（例えば、紀元前７０００年の石器時代の頭蓋骨外科治療の跡、Nature、１９９７年、３６７、３６０）。ところが、驚くべきことに、本発明のポリマーは、ネズミの大腿骨の骨幹の長さの３分の１程度の、非常に重大な骨の欠損の修復について効果がある。骨格の修正を伴う修復のみならず、骨格が骨髄で満たされるのが観察された。すなわち、ＲＧＴＡによる治療はまさしく髄幹の修正に至るのに対し、ＲＧＴＡ無しの場合には欠陥部は単に不揃いの骨材で満たされるに過ぎない。皮膚の切開についても同じである。何故なら、この修復は事実上瘢痕が残らないほど優れたものである。
【００３４】
したがって、本発明は、有意な抗凝固活性を持たない前述の式（Ｉ）と（ＩＩ）の生体親和性ポリマーに関する。これらのポリマーは、以下のような一回のまたは週当たりの用量で、１０ＩＵ/ｍｇより低い抗凝固活性を示す：
−局部的施用の場合、１ｃｍ3当たり０．００１〜１ｍｇ、
−投与が静脈内などの血液循環系を通じて行われる場合、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、
−投与が筋肉内を通じて行われる場合、０．２〜５００ｍｇ／ｋｇ、
−骨への投与では、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｇ／ｋｇ。
【００３５】
本発明のポリマーの上述の用量での抗凝固活性は、７０ｋｇのヒトでは下記以下である：
−局部的施用では１０ＩＵ、
−静脈内の施用では１００ＩＵ、
−筋肉内の施用では５００ＩＵ。
【００３６】
注目すべきことに、本発明のポリマーは上述の用量で有意な抗凝固活性がなく、むしろ組織のホメオスタシスを保持および／または復元する能力を持つ。したがって、本発明は、中でも特に組織のホメオスタシスの機能不全の予防と治療に有益で、且つ有意な抗凝固活性を示さない医薬の調製用としての上記ポリマーの利用に関する。
【００３７】
また同じく驚くべきことに、本発明者等は、本発明のポリマーが、損傷を受けた組織部位に局部的に投与することしか想定されなかったＣＭＤＢＳについて、従前の技術において記述されているものとは別の方法で投与可能であることを証明した。このように、本発明のポリマーは、例えばその可溶性のゆえに、次の投与方法：静脈内、動脈内、腹腔内、眼球内、脳脊髄液内または血液脳関門から解放されるように直接に中枢神経系に、あるいは経口から；から適切なものを選択することが可能であり、これらのすべての投与方法が、場合により組合せたときにも、特に有効であることが判明した。
【００３８】
したがって、本発明は、本発明のポリマーが、骨を通じて、皮膚を通じて、皮下に、局所的に、筋肉内、静脈内または動脈内に、あるいは生体のあらゆる体液部分に投与可能な形で、薬学的に許容可能な担体に結合されるようなあらゆる医薬組成物に関する。本発明の一環として実施した作業により、ＲＧＴＡがそれ以外では満足すべき生物学的効果が得られない用量の範囲内で、特により大きく作用することを証明した。投与方法と病変部のタイプにより、最適な有効用量を以下に記述する。
【００３９】
好ましくは、創傷の全表面を被うように、または組織の病変部の容積を満たすように、本発明の医薬組成物を１平方センチメートル当たり０．００１〜１ｍｇの、あるいは処置する組織１立方センチメートル当たり０．００５〜１ｍｇのポリマー投与が可能なように服用量を決定する。このことから、本発明の組成物は、生理的溶解溶液１ミリリットル当たり０．０１〜１０ｍｇのポリマーを含有することが好ましい。
【００４０】
血液循環系（静脈、動脈）、腹腔内、眼球内、脳脊髄液内または組織内、あるいは周囲のあらゆる流体内への投与では、処置すべきヒトまたは動物の体重１ｋｇ当たり０．１〜１００ｍｇのポリマー投与が可能なように本発明の組成物の服用量を決定する。
【００４１】
筋肉内への投与では、処置するヒトまたは動物の体重１ｋｇ当たり０．２〜５００ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり１〜５０ｍｇのポリマー投与が可能なように本発明の組成物の服用量を決定する。
【００４２】
骨を通じた投与では、処置するヒトまたは動物の体重１ｋｇ当たり１〜５０００ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり１０〜５００ｍｇのポリマー投与が可能なように本発明の組成物の服用量を決定する。
【００４３】
さらに、前述のＨＢＧＦＰＰの特性としては、筋組織、神経組織および消化器に、瘢痕形成および修復活性を示し、また炎症治療用の医薬品に使用可能であるが、本発明者等は、本発明のポリマーがｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで、再生、保護、保存ならびに組織と細胞の老化に作用すること、さらに虚血、電離線および罹患時またはストレスの際にもたらされるか、あるいはまた食品から摂取される酸化促進生成物の有害な影響に対する抗腺維症活性を実証することにより、組織と器官の、質と機能性のホメオスタシスの調整に関するそれらの素晴らしい効果を証明した。したがって、ＲＧＴＡは、再生された組織の質、およびそれらの機能性を調整すること、またマトリックスの再編に作用すること、急性および慢性の破壊プロセスにおかれた組織と器官内で抗腺維症および瘢痕形成効果を及ぼすことから、組織のホメオスタシスの調整剤と考えられねばならない。
【００４４】
ＲＧＴＡのこれらの特性は、組織の修復の質と速度に関するユニークな効果により特徴付けられる。これらの効果は、元々（病変以前）の組織構造のほぼ完全且つ同一のものへの再形成、また特に腺維症の兆候またはその機能的完全性の喪失などの瘢痕の、ほぼ完全な消滅となって現れる。より特定的には、後述の実験部分で述べる研究作業により、以下のモデルにおいてＲＧＴＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの組織の保護と再生の特性を証明した：
−皮膚の創傷病変部、
−大腿骨を例とする長骨などの骨組織の再生、
−慢性的歯周炎モデルでの骨組織の損失に対する保護とその再編の調整、
−電離線の有害な影響に対する保護、
−その部位に関わらず、虚血の有害な影響に対する保護。
【００４５】
このように、本発明のポリマーの上記特性は、以下のように証明された：
−酸化性ストレスおよび酸化剤に関係する有害な影響に対する保護効果。本発明のポリマーは、スーパーオキシドジムスターゼ、すなわちＳＯＤのように、特に保護剤および酵素の薬効増強剤として作用する。この特性は、酸化性ストレスと酸化剤により誘発される病変部と苦痛の治療および／または予防用の医薬の調製のために、本発明のポリマーの使用を可能にする。しかし、この特性はまた、本発明のポリマーを、必然的に抗酸化剤を含むか、または動物性あるいは植物性のＳＯＤなどの抗酸化剤が添加されている食品または直接栄養物の保存のために、単独で、あるいは他の化合物と一緒に使用することも可能にする。
【００４６】
−虚血に対する予防と保護の効果。この特性は低酸素症、神経疾患、ミオパシー、肝疾患、腎疾患、心臓疾患などの細胞の変性に、および脂質などの分子の過酸化に付随する罹患時の治療および／または予防用の医薬の調製のために、本発明のポリマーの使用を可能にする。この特性はまた、組織と器官の保存、組織と器官の機能を保存するための、より特定的には、ｅｘ  ｖｉｖｏで器官の保存、器官の移動、および人工器官などの移植のための組成物に、本発明のポリマーを使用することも可能にする。
【００４７】
−カルパイン族の酵素の抑制活性。この特性は心臓病または神経病の治療および／または予防用の医薬の調製のために、本発明のポリマーの使用を可能にする。
【００４８】
−ヘパリナーゼやヘパリチナーゼなどのヘパリンや、硫酸ヘパランの変性酵素の抑制活性。この特性は細胞のランダムな成長に、および血管形成に関連する病理学的プロセスに付随する病気の治療および／または予防用の医薬の調製のために、本発明のポリマーの使用を可能にする。
【００４９】
−電離線の影響からの細胞の保護、および、細胞の存続と機能を増加させ得る例えばコラーゲンなどの細胞マトリックス成分の質的量的調整の活性。この活性は電離線の有害な影響の治療および／または予防用の医薬の調製のために本発明のポリマーの使用を、ならびに化粧品の調製においてこれらのポリマーの使用を可能にする。
【００５０】
−平滑筋細胞、腺維芽細胞または肝細胞などの間葉細胞の増殖の調整、およびそれらが分泌するコラーゲンのタイプの質に関する調整効果により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで発現する抗腺維剤の活性、ならびにこれらの細胞により、および腺維症の瘢痕後遺症の顕著な低減により合成されるコラーゲンのタイプの質に関する活性。この活性は肺、腎臓、肝臓、心臓、脈管、皮膚科学の病理学、移植およびそれらの機能的完全性、寄生関連の多数の病変の治療および／または予防用の医薬の調製のために本発明のポリマーの使用を可能にする。
【００５１】
このように、予想外にも、本発明者等はＲＧＴＡが下記の能力を持つことを発見した：
−スーパーオキシドジスムターゼ、すなわちＳＯＤの酵素活性を保護し、安定化させる、
−スーパーオキシドジスムターゼ、すなわちＳＯＤの酵素活性を高める。
【００５２】
したがって、この酵素は自然位置で、およびｉｎ  ｖｉｖｏで、あるいはｅｘ  ｖｉｖｏで保護される。よってＲＧＴＡは、内因性ＳＯＤの保護剤として、および医療又は化粧品の分野の専門家に知られている用途において、そのすべての機能について単独で、あるいはＳＯＤと一緒に使用することができる。この特性により、これらは食品や滋養剤あるいは直接栄養物の保存剤としても機能する。
【００５３】
したがって、ＲＧＴＡは組織のストレスに付随する有害な影響の保護剤および修復剤として作用する。このような場合としては、その由来の如何にかかわらず虚血の時、または例えば電離線の影響下での細胞あるいは組織の侵害への対応時、またはその性質の如何に関わらずウィルス、細菌、寄生生物、あるいはプリオンの場合のようなＥＳＳＴ（伝染性亜急性海綿状脳症）タイプの病気を引き起こすような病原性因子の進入時、または例えば、失明に至る可能性のある網膜での、あるいは運動機能やその他の機能の喪失に至る可能性のある脳内での出血のケースなど、その影響により機能の喪失を引き起こすほど有害な出血を伴う脈管の破裂時がある。
【００５４】
したがって、本発明は、ヒトおよび動物での使用分野において少なくとも１つのＲＧＴＡを含有する医薬組成物に関する。これらの組成物は医療、獣医学および化粧品分野において、または必然的に抗酸化剤を含むか、あるいは動物性または植物性のＳＯＤを添加した食品または直接栄養物として、食料品の分野において有効である。
【００５５】
内因性または外部からもたらされたＳＯＤの保護は、ＲＧＴＡにより質的に強化される。よって、ＲＧＴＡは、ＳＯＤの有効な効果が現されているすべてのケースにおいて投与可能である。
【００５６】
外因性施用のＳＯＤが有効であると証明された病気の治療では、内因性ＳＯＤの保護作用の結果である治療効果は、ＲＧＴＡの存在でより効果的に作用する可能性がある。ＲＧＴＡは間接的に抗酸化剤として作用し、外因性のものの施用を制限または回避させ得る。これらの特性の結果として、以下の治療効果が得られる：
−神経組織の攻撃、苦痛また変性に対する保護。例えば、ストレスにおいて（Shahen等、過酸化脂質抗酸化剤レベルに及ぼすストレッサーの効果、および脳内のＮａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼの活性、Experentia、１９９６年、５２、３３６〜３３９）、あるいはニューロンの変性および外因性ＳＯＤの保護活性がより効果的な治療を可能にする脈管、外傷性の偶発症候、またはパーキンソンなどの罹患時に付随するニューロン変性性の病気（Bostantjopoulos等、初期および進行したパーキンソン病でのスーパーオキシドジスムターゼの活性、Funct. Neurol.、１９９７年、１２、６３〜６８）。
【００５７】
−抗アポトーゼ効果による老化（Fernandez Novoa等、Methods find Exper Clin Pharmacol、１９９７年、９、９９〜１０６）。
【００５８】
−四肢の虚血における抗酸化剤保護。この使用法では、ＲＧＴＡは単独で投与することができる。ＳＯＤ単独での治療により得られる保護は勿論ＲＧＴＡの投与により増強される。記述された特性に照らし、ＲＧＴＡ単独で、および／またはＳＯＤの効果を記述している数多くの使用法において、ＳＯＤと一緒に投与すると有効のようである（D'AgnilloとChang、虚血のネズミの後肢モデルでのヒドロキシルラジカル生成の減少−架橋ヘモグロビンを使用した再潅流障害−スーパーオキシドジスムターゼ−カタラーゼ、Artif. Cells Blood Subsiti Immobil Biotechnol、１９９７年、２５、１６３〜８０）。
【００５９】
−ＲＧＴＡ単独の、またはＳＯＤと一緒の投与は、脊髄の病変のケースのように、心臓、脳、中枢神経系（Nakauchi等、ネズミの脊髄傷害へのレシチン化したスーパーオキシドジスムターゼの効果、神経外傷ジャーナル、１９９６年、１３、５７３〜８２）あるいは網膜の苦痛に対して有効である。
【００６０】
−横隔膜の衰弱に付随する呼吸不全の治療（Supinski等、横隔膜の衰弱に対する遊離基スキャベンジャーの効果、Am. J. Respir. Crit. Care Med.、１９９７年、１５５、６２２）。これは筋ジストロフィーに罹った病人に対し、特に興味深い可能性がある。
【００６１】
−すべての組織、特に外因性の活性ＳＯＤ率がより高いもの（肝臓、腎臓、心筋及び骨格筋、膵臓内の脈管の内皮細胞、腸、結腸、気管、食道、結合組織、軟骨の粘膜の上皮細胞）。
【００６２】
−糖尿病網膜症のような糖尿病に付随する有害な影響の治療（Szabo等、虚血/再潅流糖尿病のネズミの網膜における遊離基の直接測定、Clin. Neurosci.、１９９７年、４、２４０〜５）。
【００６３】
−ライ病の治療（多剤療法のライ患者での血清、亜鉛、銅、マグネシウム、タンパク質およびスーパーオキシドジスムターゼ−追跡研究、Indian J. Lepr.、１９９６年、６８、３２５〜３３）。
【００６４】
−内毒素ショックの治療（E. Coli、エンドトキシンにより誘発される酸化性ストレスへの肝臓の応答、Mol. Cell. Biochem.、１９９６年、１５９、１１５‐１２１）。
【００６５】
−特にエイズ・ウィルスやプリオンなどのＥＳＴＴ病理学を誘発する因子など、あらゆる種類の病原性因子の存在に起因するストレスにより誘発される病変の治療。
【００６６】
−照射に対する予防および／または治療。このことから、放射線療法の有害な影響が、ＲＧＴＡの予防および／または治療により軽減され得る。ＲＧＴＡの使用は、癌の治療条件における放射線量を低減するか（Prevention of radioinduced cystisi by orgotein；a random ranomized study、Anticancer Res.、１９９６年、１６、２０２５〜８）、または照射により誘発される染色体破壊効果の防止を可能にする。放射線療法に付随する高熱の影響は、ＳＯＤと同じようにＲＧＴＡの使用により軽減され得る（Kandasamy等、ネズミのインターロイキン１アルファによる放射線被爆の際の高熱の軽減での、スーパーオキシドジスムターゼとグルタチオンペルオキシダーゼの使用、Brain res.、１９９３年、６０６、１０６〜１０）。
【００６７】
−例えば網膜に、紫外線により発生する影響に対する保護（Oguni等、特にスーパーオキシドジスムターゼを考慮した紫外線照射による網膜への慢性的影響、Histol. Histopathol.、１９９６年、１１、６９５〜７０２）、およびぶどう膜炎の治療（Koch等、レンズ誘発のぶどう膜炎に対する種々の抗酸化剤の影響、Ger. J. Ophthalmol.、１９９６年、５、１１８５〜８）。ＲＧＴＡによる処置では単独で、またはＳＯＤと一緒に使用することができ、またその使用は医療においても、化粧品においても可能である。
【００６８】
−高血圧の治療。実際、外因性ＳＯＤの活性は高血圧患者では軽減される（Jun Ke yan等、ヒトでのスーパーオキシド陰イオンの生成、高血圧の発病学に関する可能なメカニズム、J. Hum. Hypertens.、１９９６年、１０、３０５〜３０９）。ＲＧＴＡの付与はこの活性を増加し、高血圧を軽減する効果を有するであろう。
【００６９】
−関節炎などの炎症性疾患の治療。
【００７０】
ＲＧＴＡはまた、器官や組織の保存ならびに生物学的流体の維持にも有効であり、これにより、以下の使用法が可能になる：
−例えば血液透析において、血液やその細胞成分などの生物学的流体中で。
【００７１】
−移植またはｅｘ  ｖｉｖｏ処置のケース、あるいは再潅流において器官の保存用に（Razak等、腸内虚血‐再潅流障害のネズミ・モデルに於いて架橋ヘモグロビン−スーパーオキシドジスムターゼ−カタラーゼが遊離基を補修する。、Artif. Cells Blood substiti immobil. Biotechnol.、１９９７年、２５、１８１〜１９２）。器官保存溶液にＲＧＴＡを添加することによる再潅流での投与により、これらの器官の保存を可能となる。
【００７２】
本発明は、前記に定義され、および腺維症に付随するか否かにかかわらず変性の病気で、骨粗鬆症やミオパシーのような組織の質の損失で、心・血管、神経学、皮膚科学などの分野で、皮膚下部または筋肉、骨、脳、心臓、内臓などのより深い部分の修復あるいは形成外科を必要とする外傷で起こるものなどといった、組織の病変と苦痛の治療および／または予防用である少なくとも１つのポリマーを含有する医薬組成物に関する。
【００７３】
ＲＧＴＡの注目すべき特性は、損傷を受けた組織上に固定する能力であり、これにより治療および／または診断目的での標的ベクトルとしてＲＧＴＡを使用することが可能になる。本発明のポリマーは、前記でＺ基として表した治療活性を備えた分子に、あるいは損傷のある組織の探知を容易にする分子に結合することができる。
【００７４】
本発明のその他の利点と特徴は、一方では重合の骨格構造がポリエステル・タイプであるか、あるいは多糖質であるような本発明のポリマーに関する、また他方では、本発明のポリマーの特性に関する下記の例で説明される。
【００７５】
Ａ）本発明のポリマーの調製
実施例１：非多糖性骨格構造からのポリ（βリンゴ酸）誘導体の合成
この例では、本発明のポリマーは、Ｘおよび／またはＹおよび／またはＺにより置換されたモチーフＡが、図１に示した一般式（ＩＩ）のβリンゴ酸の共重合体である。図１において：
Ａは、−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ）−，
Ｘは、−ＣＯＯＨ、または、−ＣＯＯ-Ｎａ+，
Ｙは、−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＳＯ3Ｈ、または、
−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＳＯ３-Ｎａ+，
Ｚは、−ＣＯ−ＯＣＨ3−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＨ3）−ＣＨ3，である。
【００７６】
ｘ、ｙ、およびｚは、合成する種々のポリマーにより表１に表すＸ、ＹおよびＺ基のパーセントに相当する。
【００７７】
【表１】
0004485058.tif 000003
【００７８】
Ｐｃｏｏ−は、Ｘカルボキシルまたはカルボキシレート基のみを含有するポリマーに相当する。
【００７９】
Ｐ１ＳとＰ２Ｓは、Ｘ基に加えてＹスルホン酸塩基と疎水性ブチルＺ基を含有するポリマーに相当する。
【００８０】
このポリマーの合成は、β−置換されたβ−ラクトンの調製に続いて、開環による陰イオン重合による。合成する３種のβ-ラクトンを図２に示す。
【００８１】
単量体は、図３に示すように、重合前に３段階でＤＬ−アスパラギン酸から得られる。
【００８２】
アルキルマロラクトナートの合成は、ＤＬ−アスパラギン酸から行い、ここでＲは−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5（ベンジルマロラクトナート）、または−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ3（２−ブチルマロラクトナート）、あるいは−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2（アリルマロラクトナート）である。
【００８３】
Ｉ−単量体の合成（アスパラギン酸を通じて）
１）２−ブロモコハク酸（２Ｒ，Ｓ）の合成
ブロモコハク酸（２Ｒ，Ｓ）の合成は、ＤＬ−アスパラギン酸のジアゾ化反応後に得られる。この反応のため、アミン基を持つ炭素は立体配置の２重の反転を受ける（Guerin等、光学的に活性なポリ(βリンゴ酸)、１９８５年、Polymer Bulletin、１４：１８７）。
【００８４】
ＤＬ−アスパラギン酸１００ｇ（０．７５モル）と臭化ナトリウム４１５ｇ（４．０４モル；５．５当量）を氷浴内で１６２０ミリリットルの２Ｎ硫酸に溶解した。６２ｇの亜硝酸ナトリウム（０．９モル；１．２当量）を少量ずつ攪拌しながら添加した。この添加が終了してから３０分後に、反応系を８g（０．１３モル；０．１８当量）の尿素により室温で３０分間中和した。１リットルのエチルアセテートによりブロモコハク酸を抽出し、液相を１リットルのエチルアセテートで洗浄した。有機相は硫酸マグネシウム上で乾燥し、吸引漏斗でろ過してからロータリーカルチベーター（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）でエチルアセテートを除去した。
【００８５】
それからブロモコハク酸をアセトニトリル中で４回再結晶し、吸引漏斗でろ過してから乾燥ｉｎ  ｖｉｔｒｏで真空状態、４５℃で４時間乾燥した。
性質：ＰＭ＝１９７；ｍ＝５２．８ｇ；収率３６％；Ｔｆ＝１６８℃；外観＝白色粉末。
【００８６】
２）モノエステルの合成
モノエステルの合成は、キラル中心のラセミ化なしにあらかじめ無水物を準備して行った。無水物は無水条件および窒素下で乾燥剤、無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）の作用下で、２−ブロモコハク酸（２Ｒ，Ｓ）から合成した。次の段階は、２つのモノエステルに至るアルコールによる無水物の開環であり、そのうち一つのみがラクトン化可能である。アルコールの選択は所望のラクトンにより行った。
【００８７】
ａ）ベンジルブロモコハク酸の合成
５０ｇのブロモコハク酸（０．２５モル）を、窒素気流中で２時間脱気した。氷浴内で、１２５ミリリットルのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を無水化してから、４３．４ミリリットル（０．３０モル；１．２当量）の無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）を１滴ずつ臭素用フラスコにより添加した。その溶液を攪拌しながら２時間室温に放置し、その後形成されたＴＦＡおよび過剰なＴＦＡＡをロータリーカルチベーターで除去した。得られた無水ブロモコハク酸を２時間脱気した。
【００８８】
次いで２７．７ミリリットル（０．２５モル；１当量）のベンジルアルコールを加えた。その溶液を不活性雰囲気中で１２時間、４０℃で攪拌した。こうして得られたモノエステルの混合物を、１５０ミリリットルのエステルに溶解した。エーテル相を３回、１００ミリリットルの水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、吸引漏斗でろ過した。
性質：ＰＭ＝２８７；ｍ＝７１．３ｇ；収率９５％；外観：薄黄色のオイル。
【００８９】
ｂ）アリルブロモコハク酸の合成
上記と同じ手順を実施したが、１７．８６ミリリットル（０．２５モル；１当量）のアリルアルコールを添加した。反応系を１２時間、４０℃ではなく、２２時間、６０℃の不活性雰囲気中で攪拌した。モノエステルを同じ方法で洗浄した。
性質：ＰＭ＝２３７；ｍ＝１７．６ｇ；収率７２．８％；外観：粘性オイル。
【００９０】
ｃ）２−ブチルブロモコハク酸の合成
上記の２）ｂ）と同じ手順を、１８．８ｇ（１当量）のあらかじめ蒸留した（ＲＳ）−２−ブタノールで実施した。反応系を１２時間、６０℃の不活性雰囲気中で攪拌した。
性質：ＰＭ＝２５３；ｍ＝４５ｇ；収率９０％；外観：オレンジ黄色のオイル。
【００９１】
３）ラクトンの合成
ラクトン化反応は、ラクトン化可能な方のモノエステルでのみ行うが、これは立体配置の反転を示す。これは２Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ７．２で中和後のモノエステルの混合物で直接行う。反応は、ジクロロメタン／水の２相系で起こる。ラクトンをシリカ・カラムのクロマトグラフィーにより精製する。溶離剤の性質はラクトンの性質により異なる。それからこのラクトンを、適当なカラムで蒸留する。
【００９２】
ａ）ベンジルマロラクトナートの合成
７１ｇ（その７０％、すなわち０．１７３モルがラクトン化可能なモノエステル）のモノエステル混合物を、丸底フラスコ中で３００ミリリットルのエーテルと２５０ミリリットルの水に溶解させた。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を１滴ずつｐＨ７．２まで添加してから、４５０ミリリットルのジクロロメタンを加えた。フラスコに冷却装置を取り付け、４０℃で３時間強く攪拌した。
【００９３】
デカンテーション後、有機相を２５０ミリリットルの水で２回、次いで２５０ミリリットルの塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させてからろ過した。これを、ロータリーカルチベーターで溶剤を除去した。このラクトンを、シリカ・カラムで精製し（溶離剤：ジクロロメタン／石油エーテル  ８／２）、真空で３回蒸留した。
【００９４】
性質：ＰＭ＝２０６；洗浄前のｍ＝２０．７ｇ、すなわち収率＝４０．５％；洗浄後のｍ＝３．４１ｇ、すなわち収率＝６．７％：Ｔｅ＝１１６〜１１８℃（３．１０-2ｍｂａｒｓ）；ＩＲ（ｎ、ｃｍ-1）：ｎ（ＣＯ  ラクトン）＝１８２５ｃｍ-1；ｎ(ＣＯ  エステル)＝１７４０ｃｍ-1；外観：無色のオイル。
【００９５】
ｂ）アリルマロラクトナートの合成
上記３）ａ）と同じ手順に従うが、ただし液相のｐＨは７．２ではなく７．８で行い、溶液を３時間ではなく５時間攪拌した。ラクトンをシリカ・カラムで精製し（溶離剤：石油エーテル／エチルエーテル  ４／６）、真空で３回蒸留した。
【００９６】
性質：ＰＭ＝１５６；洗浄前のｍ＝１５．３ｇ、すなわち収率＝５３．４％；洗浄後のｍ＝４ｇ、すなわち収率＝１３％：Ｔｅ＝６２〜６５℃（３．１０-2ｍｂａｒｓ）；ＩＲ（ｎ、ｃｍ-1）：ｎ（ＣＯ  ラクトン）＝１８２５ｃｍ-1；ｎ(ＣＯ  エステル)＝１７４０ｃｍ-1；外観：無色の液体。
【００９７】
ｃ）２−ブチルマロラクトナートの合成
上記３）ａ）と同じ手順に従った。ラクトンをシリカ・カラムで精製し（溶離剤：ジクロロメタン／石油エーテル  ８／２）、真空で３回蒸留した。
【００９８】
性質：ＰＭ＝１７２；洗浄前のｍ＝２６．７ｇ、すなわち収率＝５５％；洗浄後のｍ＝１４．４ｇ、すなわち収率＝２８％：Ｔｅ＝８０〜８２℃（３．１０−２ｍｂａｒｓ）；ＩＲ（ｎ、ｃｍ-1）：ｎ（ＣＯ  ラクトン）＝１８２５ｃｍ-1；ｎ(ＣＯ  エステル)＝１７４０ｃｍ-1；外観：無色の粘性液体。
【００９９】
ＩＩ−ポリマーの合成
上記のラクトンを、テトラメチルアンモニウム安息香酸（１０−３当量）の存在中で、１５日間３７℃で重合した。重合のトラッキングは、赤外線分析により１８５０ｃｍ-1でラクトン帯の分布を観察しながら行った。
【０１００】
１）ポリ（ベンジルリンゴ酸−ＣＯ−ブチルリンゴ酸−ＣＯ−アリルリンゴ酸）の合成
５ｇ（２４．２ｍｍｏｌ）のベンジルマロラクトナート、１．４ｇ（９．３ｍｍｏｌ）のアリルマロラクトナートおよび０．７ｇ（４．１ｍｍｏｌ）のブチルマロラクトナートを２時間脱気し、カニューレにより窒素気流中であらかじめ２時間脱気した８０．１０-3Ｍの重合開始剤溶液４７１ミリリットル（テトラエチルアンモニウム：１０-3当量；３７．７２．１０-6モル）の入った丸底フラスコに移した。共重合は３７℃で１５日間、不活性雰囲気中で攪拌しながら行った。それから、ポリマーを最小限のクロロホルム中に溶解した。連鎖の最後に濃塩酸を１滴追加して、そのポリマーをエタノールに沈殿させてから、真空中４８時間、４０℃で乾燥させた。
【０１０１】
性質：ｍ＝４．３７ｇ、収率＝６１．５％；Ｔｖ＝−５℃；ＩＲ（ｎ、ｃｍ−１）：ｎ（Ｃ＝Ｏ）＝１７４８ｃｍ−１；ＳＥＣ（ＴＨＦ、標準ポリスチレン）：；Ｍｎ＝６６００；Ｍｗ＝９２００；Ｉｐ＝１．４；ＭＳＥＣ＝１００００；Ｓ  １３４（ＣＨ＝）；１６８（Ｃ＝Ｏ側鎖）；１７０（Ｃ＝Ｏ主鎖）；外観：透明なガラス状のポリマー。
【０１０２】
２）ポリ（ベンジルリンゴ酸−ＣＯ−ブチルリンゴ酸−ＣＯ−アリルリンゴ酸）のエポキシ化
１．１２ｇ（不飽和単位７．９１ｍｍｏｌ）のポリマーを丸底フラスコ内の３ミリリットルの無水ジクロロメタンに溶解した。２ミリリットルのジクロロメタン中に４６６．３４ミリグラム（４．６９ｍｍｏｌ；６当量）のメタクロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）を含む溶液を、カニューレにより添加した。混合物を室温で２４時間攪拌してからろ過した。エタノールに沈殿したポリマーを、真空の乾燥器で乾燥した。
【０１０３】
性質：ｍ＝４ｇ；沈殿収率９２％；エポキシ化反応の収率＝１００％；ＭＣＰＢＡは鎖の長さを変えないため、エポキシ化後のモル量に変化はない。
【０１０４】
３）ポリ（ベンジルリンゴ酸−ＣＯ−ブチルリンゴ酸−ＣＯ−アリルリンゴ酸）の水素化分解
４ｇのポリマーを、丸底フラスコのナトリウム上で、蒸留したばかりの５ミリリットルのジオキサンに溶解した。活性炭に担持したパラジウム８００ミリグラム（質量の２０％）を加え、水素化分解を開始した。消費される水素の体積が増加しなくなった時点で（反応開始後２４時間）、水素化分解を停止した。溶液をセライト上でろ過し、ジオキサンをロータリーカルチベーターで除去した。
性質：ｍ＝２ｇ；水素化分解の効率１００％。
【０１０５】
４）ポリ（ベンジルリンゴ酸−ＣＯ−ブチルリンゴ酸−ＣＯ−アリルリンゴ酸）のスルホン化
４ｇのポリマー（すなわち、５．６４．１０−３モルのエポキシド）を２０ミリリットルの水に溶解した。これに２．１４ｇの亜硫酸ナトリウム（２当量、１１．２８．１０−３モル）を添加した。この溶液のｐＨを７．４に調製した（Housse-Ferrari、“Ｎ、Ｎ’ジメチルアクリミドの重合体と共重合体により修正されたシリカの調製と特性決定”、パリ大学の論文ＶＩ、１９９０年１月３０日）。その溶液を攪拌しながら７時間氷の中に放置してから、水に対して４℃で２４時間限外ろ過し、凍結乾燥した。
【０１０６】
図４にポリ（βリンゴ酸）誘導体の合成の諸段階を要約する。
【０１０７】
実施例２：置換グルコースモチーフで構成された多糖ポリマーの合成
Ｉ−ＣＭＤＳと指定するデキストランのカルボキシメチルサルフェートの合成  この例では、本発明のポリマーは、Ｘおよび／またはＹで置換され、およびＺ無しのグルコースＡのモチーフとして、図５に示す置換されたデキストランで構成される。種々のタイプのグラフト化を図５に示すが、ここで、
Ａはグルコースの単量体で、そのＸ、ＹおよびＺは、位置２および／または位置３および／または位置４でヒドロキシル基を介して、および／または、Ｙおよび／またはＺについてはＸ基を介して、および／またはＺについてはＹ基を介してグラフトし、
Ｘは、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、または、−ＣＨ2ＣＯＯ-Ｎａ+，
Ｙは、−ＳＯ3Ｈ、または、ＳＯ3-Ｎａ+，
Ｚは、変更可能な基であり、そのいくつかの例を後述する。
【０１０８】
Ｚ＝無しのＣＭＤＳタイプのポリマーは、複数のタイプの単量体を含有している。置換される最初のタイプの単量体は、位置２および／または３および／または４で置換されるＡ−Ｘタイプのカルボキシメチルグルコースである（図５にモチーフを紹介）。Ｙ基＝（図５にモチーフを紹介）の追加はＯ−硫酸化に相当し、Ｒ＝無しおよびＲ’＝Ｈ+またはＮａ+と共に、Ｙ＝Ｏ−ＳＯ３−Ｈ+／Ｎａ+となる。ＹがＸに結合すると、ＹのＲがＣＨ２−ＣＯとなり、失われたＸ（ＣＯＯ-）の官能価は、もはや存在するとは見なされない。この場合、これはＹの一部となり、活性基Ｙの置換パーセントとして測定される。
【０１０９】
したがって、ＣＭＤＳポリマーを構成する種々の単量体は、置換されないグルコースか、カルボキシメチルグルコースか、硫酸グルコースか、または硫酸カルボキシメチルグルコースである。種々の異性体を図５に図式化する。よって、これらのポリマーは、これらの種々の形の単量体の可能な組合せに相当し、また遊離ＸおよびＹ基の残余率により定義される。
【０１１０】
このようにして得られるポリマーは、位置２、３および／または４の硫酸グルコース、および／または硫酸カルボキシメチルグルコースである。
【０１１１】
このように、図５において、点線によって示されている基の結合は、あらゆる環状の組合せを考え得る単量体を表す。
【０１１２】
１）ＣＭnＤＳmと指定する硫酸カルボキシメチルデキストランの合成
ａ）カルボキシメチル化
デキストランのカルボキシメチル化の最初のステップは、Mauzac等により開示された手順により実施できる（Mauzac等、デキストラン誘導体の抗凝固活性  第Ｉ部：合成と特性決定、１９８４年、医用生体材料  ６／６１−６３）。これはカルボキシメチルデキストランを得るための、デキストランのグルコース残基のヒドロキシル基のエーテル化に関するものである。この反応は複数回再生可能であり、ＣＭnＤと呼ばれる生成物に至るが、ただし、ここでｎはカルボキシメチル化のステップ数を表す。ＣＭnＤと呼ばれる種々の生成物は、ＣＯＯＨの増加％により特徴付けられる。よってこの方法では、図６の表に示すように、デキストランの種々のカルボキシメチル化率を得ることができる。
【０１１３】
２５０ミリリットルの冷却した丸底フラスコ内で、Ｓｉｇｍａ社製、分子量４００００ＤのデキストランＴ４０（３７．３７ｇ、９．３４．１０-4ｍｏｌ）を４℃で溶解させた（１８２ミリリットルの蒸留水）。同じく４℃に冷却した水酸化ナトリウム溶液（７４ｇ、１２４ミリリットルの蒸留水中に１．８５ｍｏｌ）を、温度を４℃に保ちながらデキストラン溶液にゆっくり注いだ。微粒粉末にしたモノクロロ酢酸（７６．２ｇ、０．８０６ｍｏｌ）を同じ反応温度に保ちながらゆっくり添加した。しかしながら、媒質の温度は反応終了時には数分間で４℃から２１℃まで上昇した。次いで、混合物を４０分間、サーモスタット付きの油浴で５０℃まで昇温した。加熱中、反応媒質は黄色くなった。冷却後、ｐＨを氷酢酸で７．２に中和した（Takakura、１９９０）。冷えた無水エタノール中に、沈殿によりカルボキシメチルデキシトランを集めた（反応量の５〜６倍）。次いで、それを真空の低温器で乾燥させた。ポリマーＣＭ1Ｄを限外ろ過により洗浄してから、凍結乾燥した（総質量＝５６ｇ）。
【０１１４】
硝酸を使用して、逆酸・塩基滴定によりカルボキシルイオンを定量した。使用した塩基は１Ｎ水酸化ナトリウムである。結果はＣＯＯＨ基の％で表した。ＣＭ1ＤのＣＯＯＨ％＝４８．９８％。
【０１１５】
この割合は、統計的にグルコース２単位のうち約１単位がカルボキシメチル化されたことを意味する。
【０１１６】
実際には、この反応は、所望の置換率に達するまで複数回行うことができる。こうして、同じ手順を適用してＣＭ1ＤからＣＭ2Ｄを、ＣＭ2ＤからＣＭ3Ｄを合成した：ＣＭ2ＤのＣＯＯＨ％＝９１．８％、およびＣＭ3ＤのＣＯＯＨ％＝１１８．３％。
【０１１７】
ｂ）硫酸化
カルボキシメチル化ステップ後に残留するヒドロキシル基の硫酸化反応は、クロロスルホン酸で行う。これは図６の表にＣＭnＤＳmと命名している化合物になる。ただし、ｍは下記の例で定義するようなクロロスルホン酸の当量に相当する。
【０１１８】
ＣＭ1Ｄの硫酸化の例：
５００ｍｇ（ＰＭ＝７．８ｍｍｏｌ／ｇ）のカルボキシメチル1デキストラン（ＣＭ1Ｄ）を４０ミリリットルの乾燥したジクロロメタンに分散させた。硫酸化反応に関与する可能性のある遊離したヒドロキシル残基の数は、ｎＯＨ＝４．１０-3モルである。反応は１当量のクロロスルホン酸（ｎＣｌＳＯ３Ｈ＝４．１０-3モル、すなわち約０．５ｇまたは体積で０．３ミリリットル、ただし、クロロスルホン酸溶液の密度は１．７５）の存在下で実施した。０．３ミリリットルのクロロスルホン酸を４ミリリットルの脱水したジクロロメタンで希釈した。このようにして得られたＣＭ1ＤＳ1を、ｆｒｉｔｅ上で真空の反応媒質をろ過すること回収した。
【０１１９】
同じ反応を０．５、１．５、２または３当量のクロロスルホン酸、あるいは増加量のＯ−サルフェート基をグラフトするように過剰なクロロスルホン酸の存在中で行うことができる。このようにして得られるポリマーＲＧＴＡは、ＣＭnＤＳmと呼ばれ、ｎ＝１、２など、またｍ＝０．５、１、２などである。
【０１２０】
同じ原理により、およびこれらのポリマーを他の硫酸化分子と比較するため、我々はＣＭnＤＳmとの比較製品として、市販の硫酸デキストラン（Pharmacia Biotech製品、コード番号17-0270-01）、あるいはｍ当量のクロロスルホン酸の存在中で、すなわちＣＭnＤＳmが得られる条件に相当する反応条件での、デキストランＴ４０からの硫酸デキストランを考慮に入れた。
【０１２１】
滴定によるＸ基、および硫黄元素の率の元素分析によるＹの種々の定量の結果により、それぞれの合成化合物ＣＭnＤＳmについて相当するＸおよびＹ値が明らかとなる。これらの全データを図６の表に示す。他方、この図は市販の硫酸デキストランについて、およびＣＭnＤＳmと同じ条件での硫酸デキストランについて、このパーセントを明記する。
【０１２２】
２）ＣＭ2ＤＰｈＳと指定するカルボキシメチルデキストランスルホン酸フェニルと、ＣＭ２ＤＰｈＳＳと指定する硫酸デキストランカルボキシメチルスルホン酸フェニル誘導体の合成
これらのポリマーは図７に示したモチーフの連鎖で構成され、またＺ無しの図４のものに相当する。これらのポリマーは図６に示すようにＡ−Ｘ、Ａ−ＹおよびＡ−Ｚタイプのモチーフの連鎖で構成される。
【０１２３】
この例において、Ｚ基はＰｈＳと記されるスルホン酸フェニルである。図７は、それ自身が位置３と４で硫酸化されている元々のグルコースの、位置２にグラフトされたカルボキシルラジカル上にＺを結合させたＡ−Ｚ単量体を表す。
【０１２４】
ポリマーＣＭ2Ｄ（２ｇ；３．９０ｍｍｏｌ）を１３ミリリットルの蒸留水に溶解した。３Ｍの塩酸でこの溶液のｐＨを３．５に調製した。カップリング剤ＥＥＤＱ（１．９３ｇ、２当量）を４０℃で１６ミリリットルのエタノール（ＥＥＤＱ  ０．１２ｇ／ミリリットル）に溶解した。ＥＥＤＱ溶液を段階的にポリマーに添加し、反応混合を３０分間強く攪拌した。次いでフェニルスルファニル酸塩（ＮＨ２ＰｈＳＯ３Ｎａ、３．０４５ｇ、２当量）を少しずつ添加した。これを水酸化ナトリウムでｐＨを９に調製した。この混合物を室温で４時間攪拌してから、希塩酸で中和した。ここでＣＭ2ＤＰｈＳ生成物を限外ろ過し、真空で蒸発させて凍結乾燥した（１．６６ｇ）。
【０１２５】
ＣＭ2ＤＰｈＳの元素分析と酸・塩基分析の結果は次の通りである：Ｃ＝３３．９％；Ｈ＝５．２８％；Ｎ＝０．３％；Ｓ＝０．６７％；ＣＯＯＨ＝８１％。
【０１２６】
ポリマーＣＭ2ＤＰｈＳＳ*1の元素分析と酸・塩基滴定分析の結果は次の通りである：Ｃ＝２３．１６％；Ｈ＝３．７２％；Ｎ＝０．２７％；Ｓ＝９．６０％；ＣＯＯＨ＝５２％。
【０１２７】
３）硫酸カルボキシメチルデキストランＮおよびＯ誘導体の合成
これらのポリマーは図６に示すように、Ａ−Ｘ、Ａ−ＹおよびＡ−Ｚタイプのモチーフの連鎖で構成されるが、そのうちＡ−Ｚの特徴的なモチーフの一つを図８に示す。この例でＤＥと記されているエチレンジアミンであるＺ基は、それ自身が位置３と４で硫酸化される元々の単量体グルコースの、炭素２のカルボキシルラジカル上にグラフトされる。
【０１２８】
ＣＭ２ＤＥと指定する生成物に到達するため、前述と同じ手順を、最初のうちＤＥと記されているエチレンジアミンのＺ基と共に、ＣＭ2Ｄに適用した。
【０１２９】
ポリマーＣＭ2ＤＥの元素分析と酸・塩基滴定分析の結果は次の通りである：Ｃ＝３７．６７％；Ｈ＝６．２５％；Ｎ＝５．３５％；ＣＯＯＨ＝１９％。
【０１３０】
硫酸化の手順を、１当量のクロロスルホン酸を使用してこのポリマーに適用した。得られた生成物は図７に示したＣＭ2ＤＥＳ1に相当する。この場合、ＲＧＴＡの一般式に基づき、Ｚはジエチルアミンである。
【０１３１】
ポリマーＣＭ2ＤＤＥＳ1の元素分析と酸・塩基滴定分析の結果は次の通りである：Ｃ＝３６．８３％；Ｈ＝５．８２％；Ｎ＝４．６７％；Ｓ＝１．８２％；ＣＯＯＨ＝１０．７％。
【０１３２】
これらの合成は、ＣＭＤＳに、Ｏ−サルフェート基に加えてＮ−サルフェート基をグラフトすることを可能にする。これら種々のポリマーは、ＣＭ2ＤＰｈＳ化合物のＰｈＳと記したスルホン酸フェニル基、ＣＭ2ＤＰｈＳＳの硫酸塩を含有する化合物およびスルホン酸塩を含有する化合物、または化合物に対してＣＭ2ＤＥＳのＮ−サルフェートおよびＯ−サルフェート基の特殊な役割の評価を可能にする。このタイプのポリマーの中で、硫酸塩基は基本的にＲＧＴＡの特性に結びついていることが分かる。
【０１３３】
４）図９に示したＣＭ3ＤＰｈｅＳと指定する硫酸デキストランカルボキシメチルフェニルアラニンと、ＣＭ3ＤＴｙｒＳと指定する硫酸デキストランカルボキシメチルチロシンの合成
これらのポリマーは、図６に示すＡ−Ｘ、Ａ−ＹおよびＡ−Ｚタイプのモチーフの連鎖で構成されるものであり、そのうちの特徴的なモチーフを図９に示す。この例で、夫々のＺ基は、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｔｙｒはチロシンである。これらは、それ自身位置３および４で硫酸化される元々のグルコースの、位置２でグラフトされたカルボキシルラジカル上に結合される。
【０１３４】
これらのポリマーで、Ｚはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）またはチロシン（Ｔｙｒ）の付いたアミノ酸、またＹは−ＯＳＯ３-基である。
【０１３５】
これらの合成は、ＣＭＤＢＳについての従前の技術で知られているが、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用でのその塩析で、腫瘍形成リスクが発生するため有害であり得るＢと指定したベンジルアミンの代わりとして、これら二つのＰｈｅとＴｒｙアミノ酸の芳香族構造の重要性を評価するために実施した。
【０１３６】
ポリマーＣＭ3Ｄ（ＣＯＯＨ＝１３６％、０．６ｇ、３．０１４ｍｍｏｌ）を６ミリリットルの蒸留水に溶解した。溶液のｐＨを３Ｍの塩酸で３．５に調製した。カップリング剤ＥＥＤＱ（７４５ｍｇ、１当量）を４０℃で６．２ミリリットルのエタノールに溶解した。ＥＥＤＱ溶液を１滴ずつポリマーに加え、反応混合物を室温で３０分間強く攪拌した。フェニルアラニンメチルエステル（１．３ｇ、２当量）をゆっくり加えて、水酸化ナトリウムでｐＨを５〜９にした。反応を室温で４時間維持した。それから、その溶液を希塩酸で中和した。ここでポリマーＣＭ3ＤＰｈｅを限外ろ過してから、真空で蒸発させて凍結乾燥させた（５２４ｍｇ）。
【０１３７】
ポリマーＣＭ3ＤＰｈｅの元素分析と酸・塩基滴定分析の結果は次の通りである：Ｃ＝３６．９％；Ｈ＝５．０３％；Ｎ＝０．４４％；ＣＯＯＨ＝１０１．０５％。
【０１３８】
同じ手順を、チロシンメチルエステルＣＭ3ＤＴｙｒを得るために、ＣＭ3Ｄに適用した。
【０１３９】
ポリマーＣＭ3ＤＴｙｒの元素分析と酸・塩基滴定分析の結果は次の通りである：Ｃ＝３４．４１％；Ｈ＝５．１２％；Ｎ＝０．２８％；ＣＯＯＨ＝１０１．７６％。
【０１４０】
硫酸化の手順を、２当量のクロロスルホン酸を使用してこれら２ポリマーに実施した。
【０１４１】
ポリマーＣＭ3ＤＰｈｅＳ*2の元素分析と酸・塩基滴定分析の結果は次の通りである：Ｃ＝１８．０８％；Ｈ＝２．８９％；Ｎ＝０．３０％；Ｓ＝１４．７１％；ＣＯＯＨ＝２８．７９％。
【０１４２】
ポリマーＣＭ3ＤＴｙｒＳ2の元素分析と酸・塩基滴定分析の結果は次の通りである：Ｃ＝１７．９９％；Ｈ＝３．１３％；Ｎ＝０．３％；Ｓ＝１４．３５％；ＣＯＯＨ＝１９．８５％。
【０１４３】
５）脂質ポリマーの合成：図１０に示すカルボキシメチルデキストラン−硫酸オレイン酸（ＣＭ1ＤｏｌｅｉｃＳ）およびカルボキシメチルデキストラン−硫酸パルミチン酸（ＣＭ1ＤｐａｌｍＳ）の例
これらのポリマーは、図６に示すＡ-Ｘ、Ａ−Ｙ、Ａ−Ｚタイプのモチーフの連鎖で構成されるものであり、その特徴的なモチーフを図１０に示す。この例では、それぞれoleicはオレイン酸、palmはパルミチン酸であるＺ基を位置４で硫酸化されたカルボキシメチルグルコースの位置２の炭素３のヒドロキシルに結合させた。
【０１４４】
これらの化合物は、Ｙ＝−ＳＯ３-で、Ｚがオレイン酸またはパルミチン酸の上式（Ｉ）に対応する。これらの脂肪酸はそれら自身の役割に加えて、ポリマーの疎水性／親水性バランスの重要性を評価するためにグラフトした。
【０１４５】
ＤＭＳＯ（１６ミリリットル）に溶解したポリマーＣＭ1Ｄ（１ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）にトリエチルアミン（０．８ミリリットル）および１滴ずつ塩化オレイン（１．６ミリリットル）を添加した。反応混合物を室温で２時間攪拌した。得られたポリマーを１２０ミリリットルの酢酸エチル中に沈殿させ、遠心分離してから真空乾燥した。沈殿物を酢酸ナトリウム２Ｍに溶解し、形成された塩をエタノール（１６０ミリリットル）に沈殿させ、ろ過して、２０ミリリットルの蒸留水に溶解してから、最後に水に透析した。透析後（２４時間）、溶液を真空で蒸発させ、脂質デキストランＣＭ１Ｄｏｌｅｉｃ（７５１ｍｇ）が得られた。
【０１４６】
生成物ＣＭ1Ｄｏｌｅｉｃの元素分析結果：Ｃ＝３４．２５％、Ｈ＝５．９１％。
【０１４７】
同じ手順で、塩化パルミチンポリマーＣＭ1Ｄｐａｌｍを得た。
【０１４８】
ポリマーＣＭ1Ｄｐａｌｍの元素分析結果は次の通りである：Ｃ＝３５．１３％、Ｈ＝５．９６％。
【０１４９】
硫酸化の手順を、１当量のクロロスルホン酸を使用してこれら２つのポリマーに対し実施した。
【０１５０】
ポリマーＣＭ1ＤｏｌｅｉｃＳ*1の元素分析結果は次の通りである：Ｃ＝２８．２８％；Ｈ＝５．０４％；Ｓ＝５．２６％。
【０１５１】
生成物ＣＭ1ＤｐａｌｍＳ*1の元素分析結果は次の通りである：Ｃ＝２９．１７％；Ｈ＝４．８８％；Ｓ＝５．１４％。
【０１５２】
Ｚ基のグラフト化で言及した諸例の化合物について、そのいくつかの定義を下表２に示す。
【０１５３】
【表２】
0004485058.tif 000004
【０１５４】
上記の表２はＺ基１個を持つポリマーの置換パーセントを示す。
【０１５５】
６）上記の例のデキストラン各誘導体の精製ステップ
ａ）平衡透析
合成の各ステップ後に、ポリマーを固形で回収した（沈殿、またはろ過後に凍結乾燥）。それから、ポリマーを最小の体積の蒸留水で溶解しやすくしてから、切断の閾値が６０００〜８０００ｇ．ｍｏｌ−１の透析円筒部に導入した。透析は２重蒸留水（ＭｉｌｌｉＱ）に対して、５０体積の水について１体積の生成物の比率で４〜５日間、毎日水を２回交換して行った。
【０１５６】
ｂ）クロマトグラフィー
前記ステップで、精製したポリマーのモル量を決定するように分子ふるい（ＴＳＫカラム）にＨＰＬＣクロマトグラフィーを結合した。
【０１５７】
ｃ）接線限外ろ過
透析後、円筒部の内容物を切断の閾値が１００００ｇ．ｍｏｌ−１のセルロース膜上の限外ろ過セルで限外ろ過をした。精製の質は、電気伝導度測定セルを使用して管理した。セルの出口で除去される水の伝導度が、純粋な蒸留水の伝導度（２μＳ）になったら、精製を停止して、溶液を濃縮してから凍結乾燥した。
【０１５８】
７）置換パーセントの定量
上記に詳述した２つの族の例で、Ｘ基、Ｙ基および、場合によりＺ基を、以下のように定量した。
【０１５９】
ａ）ポリβリンゴ酸ポリマー（実施例１）
これらのポリマーについて、置換パーセントは、重合で付された種々のモノエステルの割合に従って、先験的に決定される。
【０１６０】
ｂ）デキストランポリマー（実施例２）
デキストランから得られるこれらのポリマーについては、Ｚ基の定義に基づいて、２つのケースを考慮しなければならない。
【０１６１】
第１は、Ｚ＝無しであるＣＭnＤＳmのケースであり、第２は、Ｚの化学的性質に依る。
【０１６２】
各グルコース残基において、３つのヒドロキシル基が反応する可能性がある。各ヒドロキシル基に５４ｇ．ｍｏｌ−１の相対モル量、すなわち、デキストランの成分残基のモル量１６２ｇ．ｍｏｌ−１の３分の１を割当てる。各ヒドロキシル基は同じ反応性を持つこと、および置換は一旦各グルコース単位に影響し、場合にっては同じ残基上に第２の置換をすることが認められている。
【０１６３】
よって、４００００ｇ．ｍｏｌ-1のデキストランＴ４０は、モル量１６２ｇ．ｍｏｌ-1のグルコース残基２４７個を含んでいる。
【０１６４】
カルボキシメチル化時に達する置換率は、自動滴定計（Tacussel）を用いて酸−塩基滴定により決定する。この定量は、ポリマー１ｇ当たりに結合した酸のモル数に相当する。
【０１６５】
よって、１個のヒドロキシル基が置換されるとき、グルコース上にモチーフ：−ＯＣＨ２ＣＯＯＮａが現れる。これらの置換されるサブユニットのそれぞれは、相対分子量２４０ｇ．ｍｏｌ-1を持つ。
【０１６６】
硫酸化後、複数のモチーフが表れる。
【０１６７】
酸塩基滴定により決定される遊離カルボキシル基率は、常に初期値Ｘ1より小さい値Ｘ2を与える。Ｘ1−Ｘ2の差はモチーフ−ＯＣＨ２ＣＯＯ−ＳＯ３Ｎａに相当する。これらの置換されるサブユニットのそれぞれが３２０ｇ．ｍｏｌ-1の分子量を持つ。
【０１６８】
ＲＭＮによる分析は、Ｓが、前反応に加えてグルコース残基の遊離ヒドロキシル基の硫酸化に相当することを示すことを可能にする。この場合、モチーフ−ＯＳＯ３Ｎａが現れる。これら硫酸化されたグルコースのサブユニットは、相対分子量２００ｇ．ｍｏｌ-1を持つ。微量分析Ｓの率は、ポリマーの質量のパーセントで与える。
【０１６９】
このようにして、合成の終了時に、それぞれ硫酸化の前と後に決定される遊離カルボキシルラジカルＸ1とＸ2のパーセントを知れば、そのポリマーが以下のものを含んでいると考えることができる：
‐質量１６２ｇの非置換グルコース残基１個、
‐質量２４０ｇの遊離カルボキシル残基Ｘ2個、
‐質量３２０ｇの硫酸カルボキシル残基Ｘ1−Ｘ2個、
‐質量２００ｇの硫酸グルコース残基Ｙ個。
【０１７０】
これらのデータから、ＸとＹ基の置換パーセントを決定することができる。
【０１７１】
よって、微量分析（Ｓ％）の結果により与えれる硫黄のパーセントから、そのポリマーにグラフトされた硫黄原子数（ΣS）を知ることができる。この原子数がΣS＝（Ｓ％×ＭＭ）／３２×１００であり、ここで３２はＳの原子量、ＭＭは合成されたポリマーのモル量である。
【０１７２】
これからＳＯ３-ラジカルのパーセントＹを、（１００×Ｓ％×ＭＭ）／２４７×３２００に等しいとして導き出すことができる。
【０１７３】
グラフトされるＺ基が例えばチロシンである第２のケースでは、元素分析の結果から与えられる窒素の値で、同じ理論が適用される。
【０１７４】
Ｂ）本発明のポリマーの特性
ＲＧＴＡとＨＢＧＦＰＰに共通の特性
１）これらは有意な抗凝固活性を備えておらず、活性が１５０〜１７０ＩＵ／ｍｇであるヘパリンと比較して、その活性は５０ＩＵ／ｍｇより小さい。
２）これらはヘパリンおよび、特に、例えばＦＧＦ１および／またはＦＧＦ２および／またはＴＧＦβについて親和性があるので、成長因子を安定化し、およびその効果を高める。
３）これらは、トリプシンなどのタンパク質分解剤に対し、これらの因子を保護する。
４）これらは、例えば白血球エラスターゼおよび／またはプラスミンなどの炎症プロセスに関係するプロテアーゼ活性を抑制する。
５）これらは、上述の特許で紹介されているモデル、すなわち筋肉、神経、または消化器の少なくとも一つで瘢痕形成効果を有する。
【０１７５】
ＲＧＴＡの新規な特性
６）これらは、例えばスーパーオキシドジムスターゼ、すなわちＳＯＤなどの酸化性ストレスに対する攻撃に関係する酵素活性を保護し、効果を高める。この特性により、これらは抗酸化剤として作用し、単独で、または治療用および／または化粧用でのＳＯＤの用途でＳＯＤと一緒に、あるいは特に食品の保護において、または栄養分などの抗酸化保存剤として使用することができる。
７）これらはカルパインなどの酵素の活性を抑制する。
８）これらはヘパリチナーゼやヘパリナーゼなどの酵素の活性を抑制する。
９）これらは、電離線を受けた細胞の寿命を延長し、また、例えばコラーゲンなど、それらのマトリックスの成分の分泌を定性的にも定量的にも調節する。
１０）これらは、平滑筋細胞、腺維芽細胞または肝細胞などの間葉細胞の成長、およびそれらが分泌するコラーゲンのタイプの質を調整し、抗腺維症剤として働く。
１１）これらは、ヘパリナーゼやヘパリチナーゼにより自然に変性される生成物である硫酸ヘパランとは異なり、緩やかな変性を行う。
１２）これらは変性後に、例えばＣＭＤＢＳを排除する理由であるＣＭＤＢＳがグラフト基Ｚ＝ベンジルアミンとで起こす可能性を有し、その毒性により知られた生成物を含有せず、また放出することもない。
１３）これらは以下の種々のモデルにおいて、組織の保護と再生の能力をｉｎ  ｖｉｖｏで持つ：
ａ）皮膚の創傷の病変部。
ｂ）例えば大腿骨などの長骨などの骨組織の再生。
ｃ）骨組織の損失に対し、および、例えば骨粗鬆症や歯周炎のケースなどでのその再編成の調節作用の保護。実際、これらは組織のホメオスタシスおよび骨や筋肉の質などの組織の質の調節剤である。
ｄ）肝臓の再生、または中枢神経系および周囲神経系の変性に対する保護。
ｅ）その部位に関係なく、虚血の有害な影響に対する保護。
【０１７６】
実施例３：実施例１および２のポリマーの抗凝固活性の測定
凝固テストは、セファリン活性化時間またはＴ．Ｃ．Ａ．の技術に基づいて行った（Biggs、１９７２年、ヒトの血液凝固、Oxford Blackwell Scientific Publications）。Ｏｗｅｎ  Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液での異なる濃度のポリマー溶液１００マイクロリットルを、血小板の少ない血漿１００マイクロリットルおよびウサギの脳のセファリン溶液１００マイクロリットルと共に、３７℃で５分間インキュベーションした。０．２５Ｍ塩化カルシウム１００マイクロリットルを追加し、血栓の発生時間を経時的に測定した。
【０１７７】
図１１に示すように、実施例１および２のポリマーは、特に対照として使用したヘパリンに比較して、５０ＩＵ／ｍｇを超える活性を示さない。ここで例として挙げた生成物の抗凝固活性はすべて１０ＩＵ／ｍｇ（生成物）であることは注目に値する。
【０１７８】
実施例４：ヘパリン、および特に例としてＦＧＦ１および／またはＦＧＦ２および／またはＴＧＦβについて親和性のある成長因子に関する実施例１および２のポリマーの安定化と相乗作用
この実施例では、ＦＧＦ１の安定化、およびＦＧＦ１とＦＧＦ２の相乗作用に対するポリマーの影響を検討した。これらの影響は、ＢＡＬＢ／ｃの細胞３Ｔ３、あるいはＣＣＬ３９の成育について評価した。これらの実験で使用した条件は、参考用として本発明に組込まれているＨＢＧＦＰＰｓに関する特許で、従前の技術として記述されているものである。
【０１７９】
１）ＦＧＦ１またはＦＧＦ２の安定化に対する本発明のポリマーの影響
図１２に、単独で、またはテストした生成物と共に保存したＦＧＦ２のインキュベーション時間の関数として、２０℃と３７℃での熱変性に対するＲＧＴＡの影響を示す。ＥＤ５０は、ＦＧＦ１のマイクログラム／ミリリットルでの濃度を表すが、ここではトリチウム化したチミジンの５０％の最大取込み率を得るため、６ナノグラム／ミリリットルを培養した腺維芽細胞、ＣＣＬ３９細胞に植種しなければならない。
【０１８０】
得られた結果は、テストした全ポリマーが、２０℃でも３７℃でも、ヘパリンと同程度の、また時にはより重大な影響を与えることを示す。
【０１８１】
２）ＦＧＦ１またはＦＧＦ２の相乗作用に対する本発明のポリマーの影響
手順は前述したものと同じであるが、一定量のポリマーに結合されるか否かを問わずＦＧＦの量は変更可能である。採用したポリマーの濃度は、ＦＧＦのマイトジェン効果を最大限に高めるものに相当する。これらのテストはＦＧＦ１とＦＧＦ２について細胞３Ｔ３に対し行った。対照は、ＥＤ５０値の各テストについての系統的研究を除き、前述したものと同じである。
【０１８２】
テストしたこれらの２ポリマー族の分子は、ＥＤ５０値がヘパリンの存在中で得られたものより低いか、同等のＦＧＦ値について得られることから、ＦＧＦ１とＦＧＦ２の作用について相乗作用がある（図１３）。
【０１８３】
実施例５：トリプシンなどのタンパク質分解剤に対する因子の保護
トリプシンは広範な作用スペクトルを有するタンパク質分解酵素であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのテストに用いられ、また消化プロセス上、最も重要な作用を有する酵素の一つである。
【０１８４】
トリプシンに対する保護のテストは以下のように行った。ヨウ素化したＦＧＦ２の１ナノグラム／ミリリットル（最終）、または５マイクログラム／ミリリットル（最終）のトリプシンを、最初は１５分間３７℃で、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、ｂｒｉｊ  ０．０３％  ｐＨ７．６の緩衝液中で異なる濃度のポリマー（０．５〜５００マイクログラム／ミリリットル）とともにインキュベーションした。その際、５マイクログラム／ミリリットル（最終）のトリプシン、または１ナノグラム／ミリリットル（最終）のヨウ素化したＦＧＦ２をそれぞれ加えた。総反応量は３０マイクロリットルであった。３７℃で２時間のインキュベーション後に、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加し、９０℃で５分間の加熱することで酵素反応を停止した（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ．Ｋ．バクテリオファージＴ４の頭部の組立て中の構造タンパク質の開裂、Nature、１９７０、２２７：６８０〜６８５）。
【０１８５】
各試料を１５％のポリアクリルアミドゲル上に載せた。氷中で１時間２００Ｖで電気泳動を行った。上記前後のゲルを８０℃で２時間乾燥させ、オートラジオグラフィフィルムの存在下、−８０℃で露出させた。バンドの強度を画像分析により測定し、変性したＦＧＦ２に対する保護されたＦＧＦ２のパーセントを計算した。
【０１８６】
ＦＧＦ１とＴＧＦβの保護
図１４に、トリプシンによる攻撃に対するＦＧＦ１、ＦＧＦ２およびＴＧＦβに関するポリβリンゴ酸ポリマーの保護効果を、保護％で表す。図１５には、トリプシンによる攻撃に対するＦＧＦ２とＴＧＦβに関するデキストラン誘導体ポリマー保護効果を、保護％で表す。
【０１８７】
これらのポリマーはそのほとんどが、対照として採用したたヘパリンのそれと同程度の保護効果を示す。
【０１８８】
実施例６：例えば、白血球エラスターゼまたはプラスミンなどの炎症プロセスに関係するプロテアーゼ活性の抑制
白血球エラスターゼおよびプラスミンは、炎症過程の定着と進行に対する、基本的なプロテアーゼである。これらのテストは、本発明のポリマーがヒトの白血球エラスターゼによる変性から成長因子を保護するか否かを測定することを目的とする。
【０１８９】
白血球エラスターゼに対する保護テストは、以下のように行った。適用した手順は、３０ナノグラム／ミリリットル（最終）のエラスターゼと、０．５〜５００マイクログラム／ミリリットル（最終）の、トリプシンと使用したものと同じポリマーである。緩衝液はトリスＨＣｌ  １００ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．１８Ｍ、０．０３％ ｂｒｉｊ  ｐＨ８である。バンドの強度を画像分析で評価し、変性のないＦＧＦ２のパーセントを計算した。これらのテスト用の対照はヘパリンである。デキストランＴ４０と硫酸デキストランを内部標準として採用した。
【０１９０】
図１６に、ＩＣ５０値で表した種々のポリマーの抑制効果を示す。
【０１９１】
実施例７：組織の再生、保護および機能回復に対するＲＧＴＡの影響例：骨格筋の再生のケース
ＲＧＴＡの瘢痕形成特性を最も効率的に評価するために採用したモデルは、フランス国特許第２７１８０２６号に定義され、紹介されている筋肉損傷モデルである。
【０１９２】
ネズミの後肢のＥＤＬ筋（Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  Ｌｏｎｇｕｓ）を切開し、切開した筋肉内に、テストする物質を含むかまたは含まない生理的血清の注入後、このように処置した筋肉を手術の８日後に回収した。重量分析に組織学的研究を組合せることにより、筋肉の再生に対するポリマーの影響を定量化することができる。結果は、同じ実験条件でポリマー無添加の生理的血清しか注入しなかった筋肉の性質に対する％で表した。図１７は、得られた結果を示したものであり、デキストランの骨格構造から誘導された新規のポリマーも、βリンゴ酸共重合体も共に、所望の効果を有することを示している。
【０１９３】
注入量が投与方法に対して適切である限り、ポリマーの自然位置での注入でも、また静脈内、動脈内又は筋肉内でも同様に、筋肉の再生効果が得られることは注目に値する。
【０１９４】
実施例８：扁平骨の再生に対するＲＧＴＡの影響
ＲＧＴＡの瘢痕形成特性を評価するのに採用したモデルは、従前の技術ですでに知られているものであり、Blanquaert F.等により記述されている（Bone、１９９５年；１７(６)：４９９〜５０６）。
【０１９５】
このモデルは、成熟ネズミの頭蓋冠に直径５ｍｍの円形穿孔を行うことよりなる。あらかじめ同じ寸法に切取り、ＲＧＴＡを含有する溶液で湿らせたか、あるいは湿らせていないコラーゲンでこの傷を埋めた。ここで紹介する例では、検討したポリマーは、ＣＭＳタイプのポリマー（ＲＧＴＡ１００５と１０１２）およびβリンゴ酸の共重合体（ＲＧＴＡ２０１１）である。処置の３５日後に行ったＸ線撮影の画像分析により測定した骨の埋戻しパーセントを、表３に示す。
【０１９６】
【表３】
0004485058.tif 000005
【０１９７】
したがって、これら２種類のポリマーは、骨の再生を活性化すると同時に、これらの条件で外皮の矢状縫合を改善することができる。
【０１９８】
実施例９：例えばスーパーオキシドジスムターゼ、すなわちＳＯＤなどの酸化性ストレスに対する攻撃に対する酵素活性の保護と相乗作用
Ｏ2-イオンと過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が生成すると、細胞への毒性、特に破壊的な影響を与えるラジカルが出現する。ＳＯＤ、すなわちスーパーオキシドジスムターゼはこれらのラジカルによる毒性の除去に関与する酵素である。これらは酸化性ストレスから生体を保護する因子である。
【０１９９】
ＲＧＴＡはＳＯＤに対し、以下の複数のタイプの活性を示す：
−これらは中性のｐＨでＳＯＤの触媒作用に対して相乗作用を持ち、また酸性および塩基性のｐＨでも安定して相乗作用を持つ。
【０２００】
−これらは、例えばトリプシンなどの酵素による変性に対し、および他方では熱処置に対してＳＯＤを保護する作用を有する。
【０２０１】
−活性化した単核細胞培養モデルに関し、これらは内因性ＳＯＤの触媒効果を刺激してスーパーオキシドイオンの生成を低減させる。
【０２０２】
すべてのケースにおいて、ＳＯＤ活性の定量は、Ｐｉｃｋの技術に基づいて行った（Freund M および Pick E、リンホカインの作用メカニズムＩＸ.リンホカインで活性化したマクロファージによる過酸化水素の生成のベース酵素、J Immunol、 １９８６年、１５；１３７（４）：１３１２〜１３１８）。この技術は、チトクロムｃの減少によるＯ2-イオンの調整に基づく。１０マイクログラム／ミリリットルの濃度でＭｎＳＯＤ（Sigma ref.  S 8151）３０Ｕ／ミリリットルを添加し、種々の濃度のＲＧＴＡ溶液にした。これらの混合物に種々の処理を行った。
【０２０３】
ＳＯＤ活性は通常の反応条件において、種々の濃度のポリマーの存在中で評価した。
【０２０４】
ＳＯＤとポリマーの混合物を室温で（実施例５の保護テストと同じ条件で）トリプシンを作用させるか、またはそれらを６０℃で３０分間熱処置した。その後、これらの混合物の触媒残留活性を、典型的な酵素技術によるか、または細胞系に関して評価した。
【０２０５】
このように処理した試料を、２００ｎＭのＰＭＡにより刺激を与えた単核細胞（２．５  １０6細胞／ミリリットル）の懸濁液中でインキュベーションした。この条件は、マクロファージで活性化された単核細胞によるスーパーオキシドアニオンの生成を誘発する。ＰＭＡで刺激すると、活性化しないときの塩基性レベルで通常生成されるスーパーオキシドイオンの生成量の増加が誘発される。対照として使用される活性ＭｎＳＯＤの添加は、生成されるスーパーオキシドイオン量を減少させた。
【０２０６】
これらの条件において、スーパーオキシドイオンの生成量が多いほど、混合物に含まれるＳＯＤの触媒残留活性は高くなった。よって、これらのテストにより、内因性ならびに外因性のＳＯＤ活性に関してポリマーの保護効果と相乗作用を評価することができる。
【０２０７】
図１８は、種々のｐＨにおける、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＯＤの触媒活性に関するＲＧＴＡの保護効果と相乗作用を、図１９は、トリプシンによる攻撃を受けたか、または熱ショック後のＳＯＤに関するＲＧＴＡの保護作用を、また図２０は、活性化されたマクロファージによるスーパーオキシドイオンの生成量に関するＳＯＤ活性の相乗作用を示す。
【０２０８】
結論：したがって、これらのポリマーは非細胞系、さらには細胞系で相乗作用と保護効果を与える。よって、種々のポリマーの添加は、細胞により内因的に生成されたＳＯＤのように、外因的に添加されたＳＯＤの触媒活性を制御する。
【０２０９】
実施例１０：ＲＧＴＡによるカルパインなどの酵素の活性の抑制
１）序論
この例では、カルパイン１（Ｓｉｇｍａ  Ｐ  ４５３３）を使用した。すなわち、０．７８Ｕの酵素（５７．２ｎＭ）を、１ミリリットルの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．４、０．０５％ Ｂｒｉｊ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭＤＴおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌでインキュベーションした。テストするＲＧＴＡ溶液を２７℃、５分間で添加した。次いで、基質《Ｓｉｇｍａ社のＮ−スクシニル−ｌｅｕ−ｔｙｒ−アミド−７メチルクマリン（Ｓ  １１５３）を２５０マイクロモル》を石英の容器にとり、その中に上記の混合物を添加した。次いで、７アミノ−４メチルクマリンの基質の変化を、３８０ｎｍでの励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）と４６０ｎｍでの蛍光を検出することにより、３〜５分ごとに測定した（１９８４年、J. Biol. Chem. ２５９、(２０) ｐ１２４８９〜１２４９４において、Sasaki、Kikuchi、Yumoto N、YoshimuraおよびMurachi Tにより記述された手順による）。
【０２１０】
得られた結果を図２１に要約する。
【０２１１】
２）結論
ＲＧＴＡによるカルパイン活性の抑制で得られる結果によれば、大脳皮質と海馬の虚血後病変部の処置でＭＤＬ２８１７０、あるいはカルパスタチンタンパク質などのカルパインの抑制効果を記述するＭａｒｋｇｒａｆ  ＣＧ等（Stroke、１９９８年、２９、１５２〜１５８）、あるいはＳａｉｄｏ等（神経科学．Letters、１９９７年、１６；２２７：７５〜７８）の発表から予想されるように、我々はＲＧＴＡが脳虚血により誘発される病変に対して保護活性を持つことが予言できる。ＲＧＴＡを局所投与、または静脈内投与すると、カルパインの抑制効果が見られ、また虚血の場合のように特に酸素の失活により損傷した神経組織の修復が可能となる。
【０２１２】
実施例１１：ＲＧＴＡによるヘパリチナーゼなどの酵素の活性の抑制
１）ヘパリナーゼとヘパリチナーゼの活性の抑制
ＲＧＴＡによるヘパリナーゼやヘパリチナーゼの抑制の測定は、硫黄３５で放射性標識したＮａ２  ３５ＳＯ４の存在下で７日間培養したた内皮細胞により合成された細胞外マトリックス中に存在する硫酸ヘパランを基質として使用することにより行った。使用した手順は、Ｉｓｈａｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉ  Ｒらにより開示されたものである（脈管内皮と細胞外マトリックスからの代表的腺維芽細胞成長因子の放出におけるヘパリンのサイズと硫酸化の重要性、Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ、１９９２年、３１(７)：２０８０〜２０８８）。次いで、内皮細胞の除去後、得られた細胞外マトリックスを、ヘパラナーゼと、０．５マイクログラム／ミリリットルのＲＧＴＡの存在下で、または非存在下、３７℃で２４時間インキュベーションした。放射性標識した硫酸ヘパランの変性を測定するため、インキュベーション媒質を回収して、Ｉｓｈａｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉに記述されている手順に従ってＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ柱上に載せた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２年；３１(７)：２０８０〜２０８８）。得られた結果を図２２示す。最初にヘパラナーゼ酵素により変性されていない物質に相当する高分子量の硫酸ヘパランが最初に溶離する（フラクション３〜２０）。ヘパリナーゼでの処理すると、このピークの消滅および変性した硫酸ヘパランの低分子量フラクションに相当するピークの出現が誘発される（フラクション２０〜４０）。実験例では、５０マイクログラム／ミリリットルのＲＧＴＡ  １００５はヘパラナーゼ活性の５０％を抑制し、１００マイクログラム／ミリリットルでは１００％を抑制した。
【０２１３】
実施例１２：電離線を受けたヒトの腸平滑筋細胞の保護に関するＲＧＴＡの影響；それらの生存と分泌されるコラーゲンの質および量を通じて評価される抗腺維症効果への影響
腺維または腺維症組織の形成は、組織の修復と再編成プロセスに付随する代表的な生理的ステップである。腺維症組織は、構造的および機能的に組織と器官を完全に保護することを目的とし、通常は過渡的な埋戻し組織である。これは細胞外マトリックスのコラーゲンの豊富化により特徴付けられる。
【０２１４】
この状態が持続するか、または進行すると、構造的および機能的に組織のホメオスタシスが乱れた病理学へと進み、腺維症を引き起こす細胞外マトリックスが異常に高く蓄積して現れる。その原因に関係なく、腺維症は以下の特徴を有する：
恒常的な炎症浸潤巣の存在、腺維芽細胞や平滑筋細胞などの結合または間葉細胞の増殖状態と静止状態の間のバランスにおける不平衡の存在、若干の、または障害があるときのみしか修復されない攻撃を受けた組織の漸進的破壊、細胞外マトリックスの合成と変性との間のバランスにおける不平衡の存在。
【０２１５】
腺維症は様々な起源の外傷性傷害（感染性、機械的、毒性など）によるか、または電離線（特にγ線）により誘発され得る。このケースは、放射線治療を受けた患者に頻繁に見られる放射線被爆による腺維症に関する。
【０２１６】
コラーゲンは正常組織においても、腺維症組織においても、細胞外マトリックスの主要な構成成分である。これらは腺維芽細胞および平滑筋細胞のように間葉細胞により合成される。腺維組織中で、量的にも質的にも、コラーゲンの合成および／または変性を促す改変、すなわち、再編成のダイナミズムゆえに、総コラーゲンが増加する。腺維症はタイプＩＩＩのコラーゲンの増加により特徴付けられ、これは放射線由来の腺維症に多い。このタイプＩＩＩのコラーゲンの増加は、より少ない頻度ではあるが、タイプＩＩＩのコラーゲンとタイプＩのコラーゲンの割合の増加をもたらす。もう一つのコラーゲンであるタイプＶのコラーゲンは、マトリックス内のコラーゲン繊維の質と組織に、すなわち、原腺維形成に関係する。腺維症組織内で、タイプＶのコラーゲン率の低下は細胞外マトリックスのコラーゲン繊維の損傷の原因となる。
【０２１７】
この例で考慮する細胞モデルは、ヒトの空腸のｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｐｒｏｐｒｉａ由来のＨＩＳＭ細胞、ヒトの腸平滑筋（米国型培養条件、Ｒｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １９２）である《Ｇｒａｈａｍ  Ｍ．、Ｄｉｅｇｅｌｍａｎｎ  Ｒ．、Ｅｌｓｏｎ  Ｃ．、Ｂｉｔａｒ  Ｋ．およびＥｈｒｌｉｃｈ  Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６（１９８４)５０３》。腺維症現象の誘発に対する放射線の影響を評価するために、この系統のヒトの腸平滑筋細胞を、細胞の維持、および正常または炎症状態、または腺維症による修復プロセスの細胞により分泌されるコラーゲンタイプの量と質を通じて分析するのに使用した。
【０２１８】
細胞は１ｇ／リットルのグルコース、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養し、５％のＣＯ2と９５％の相対湿度の飽和雰囲気下、７５ｃｍ2のフラスコ中に入れ、３７℃のインキュベータに保存した。ＨＩＳＭ細胞は、平底の２４穴プレートに穴当たりの細胞数２００００個添加した。各穴の容積を２ミリリットルの培地で埋めた。０．４〜４００マイクログラム／ミリリットルの、種々の濃度のＲＧＴＡまたはＲＧＴＡ無しで複数の成長速度を検討した。
【０２１９】
照射は、培養プレートを設置したインキュベータ内で、コバルト６０の照射源から行った。照射源から垂直に、２個のボックスに同時に照射を行い、照射表面で線量を評価した。照射装置の線量は１Ｇｙ／ｍｎである。吸収線量はボックス当たり１０分間の照射時間につき１０Ｇｙである。
【０２２０】
ＲＧＴＡを照射前、照射中あるいは照射後に添加することによる効果、すなわち、予防、治療あるいは両者同時の場合におけるＲＧＴＡの作用を評価するため、種々の手順を実施した。表４にこれらの手順を示す。
【０２２１】
【表４】
0004485058.tif 000006
【０２２２】
予防効果は、照射の４８時間前に、培地に４００マイクログラム／ミリリットルの用量でＲＧＴＡ（＋）を添加することにより評価した。治療効果は、照射の２時間後に、予防効果の場合と同量のＲＧＴＡを添加して評価した。予防と治療の同時効果については、同量のＲＧＴＡの存在下、細胞を連続培養した。
【０２２３】
照射の７２時間後に、トリリウム化したプロリン（１０マイクロＣｉ／ｍＬ）とアスコルビン酸を添加した非血清の環境下、２４時間インキュベーションした。その後、表面浮遊物を採取し、ｒｏｂｂｅｒ−ｐｏｌｉｃｅｍａｎを使用して細胞層を最終容積１８ｍＬ回収した。培地と回収した細胞層を流水（４℃で２４時間）で十分透析し（切断の閾値６〜８ｋＤａ）、巨大分子から小分子を除去する。透析後、分取できるフラクションを採取して、コラーゲンの特殊なマーカーであるヒドロキシ（3Ｈ）プロリンの放射能を測定するために加水分解した（ＨＣｌ  ６Ｍ、１０５℃、２４ｈ）。この段階で、分取できるフラクションを使用して、コラーゲンの総合成量を放射能測定により定量した。
【０２２４】
残余量を０．５Ｍ酢酸で、ペプシンとコラーゲンＩの存在下で新たに４℃で２４時間透析した。ペプシンはペプチドの形態となって透析物内に排除される非コラーゲン性汚染物質を消化する。各試料中に含まれるコラーゲンの少ない割合を増加させて酵素／基質比を１／５に近づけるため、タイプＩのコラーゲンを添加した。反応条件は以下の通りである：１ｍＬのペプシン溶液（０．５Ｍ）＋１ｍＬのコラーゲンＩ溶液（０．５Ｍ）＋０．５１４ｍＬの酢酸、使用中の１８ｍＬの酢酸の最終濃度を０．５Ｍにするためである。こうして得られた各透析物を凍結乾燥（−５０℃）し、使用するまで−２０℃で保存した。
【０２２５】
βメルカプトエタノールで還元した後、Ｌｅａｍｍｌｉの方法に従い、ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）の存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により種々のコラーゲンのα鎖を分離した。α鎖の加水分解により、特定タイプの各コラーゲン鎖に相当するゲルのバンドの切断に由来する各コラーゲンに取込まれた放射能を測定する。これらを６０℃で過酸化水素水に溶解し、溶解された諸バンドに含まれる放射能を、液体シンチレーションβ計数管で、またはゲルを直接オートラジオグラフィにより計量した。
【０２２６】
５マイクロリットルのコラーゲンＶと５０マイクロリットルの各還元試料を用い、電気泳動による分離を行った。
【０２２７】
これらのゲルは以下のように様々に使用できる：
−取込み放射能分析による諸タイプのコラーゲンの測定、
−オートラジオグラフィ後の写真濃度計分析によるこれら諸タイプのコラーゲンの定量。
【０２２８】
流水での透析後に採取された分取フラクションを密封アンプル中で加水分解したた（ＨＣｌ  ６Ｍ、１０５℃、２４ｈ）。次いで酢酸を蒸発させてから、アンプルの内容物を１ｍｌの蒸留水に再び懸濁した。ＲｏｊｋｉｎｄとＧｏｎｚａｌｅｚの方法によって、プロリンとヒドロキシプロリンを分離した（Ｒｏｊｋｉｎｄ  ＭおよびＧｏｎｚａｌｅｚ  Ｅ、コラーゲン中非コラーゲンタンパク質のプロリン−１４Ｃとヒドロキシプロリン−１４Ｃの比放射能の測定改善方法、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ、１９７４年；５７（１）：１〜７）。この原理は、プロリンとヒドロキシプロリンをクロラミンＴで酸化することにある。プロリンはトルエンに可溶性のカルボン酸ピロリンに変化するが、ヒドロキシプロリンは水溶性のカルボン酸塩に変化する。処理後、プロリンとヒドロキシプロリンの２フラクションを各試料ごとに回収し、放射能測定により定量した。
【０２２９】
ＨＩＳＭ細胞は、通常の条件では、合成コラーゲン量により（図２３）、特に定性的には、分泌コラーゲンの表現型（図２４）により特徴付けられる。
【０２３０】
通常の条件では、タイプＩのコラーゲンが過半数を占める。タイプＩＩＩとＶは少数である。タイプＶのコラーゲン量は原腺維形成の組織の質に関係する。
【０２３１】
タイプＩＩＩのコラーゲンは、理論的にはストレス応答の場合は過渡的に、しかし腺維症の場合は恒常的に合成される“警告コラーゲン”である。タイプＩのコラーゲンに対するタイプＩＩＩのコラーゲンの割合は、組織病変、ストレスまたは例えば電離線などの照射に対する応答により大きく増加する。タイプＩＩＩのコラーゲンは、急性でも慢性でも腺維症反応を示す腺維のマトリックス内で優勢となる。このコラーゲンは、腺維症反応の特徴的成分である。
【０２３２】
ＨＩＳＭ細胞をブランク条件、すなわちＲＧＴＡ無しの条件で培養すると、細胞はこれら３タイプのコラーゲンを合成する（図２４）。照射により精製されるコラーゲンの量（図２３）と質（図２４）が変化する。コラーゲンの全合成量は約５０％増加する（図２３）。タイプＩおよび、特にタイプＩＩのコラーゲンの分泌が格段に増加する（それぞれ５０％、および約５００％）。逆に、タイプＶのコラーゲンの合成は５０％以上減少する。
【０２３３】
異なるＲＧＴＡ（ＲＧＴＡ１００５およびＲＧＴＡ１０２５）が存在すると、照射によってそれらが暴露されるかかわらず細胞をほぼ同一のものに修復された。図２３は、コラーゲンの総合成量が、予防または同時（予防＋治療）処置条件では特に正常な値になることを示す。図２４から、特に同時処置の場合、標準ホメオスタシスへ修復を確認できる。タイプＩとタイプＩＩＩのコラーゲンの分泌比の値は、ブランク細胞の値に近似することから、治療処置は、予防の場合と同様の効果を及ぼす。これらのＲＧＴＡは、コラーゲンに対するＨＩＳＭ細胞の機能を回復する。
【０２３４】
これらは、細胞の生存率にも影響を及ぼす（図２５）。実際、照射により放射能を浴びた集団の５０％以上の重大な死亡率を引き起こす。ポリマーの存在により、顕著な保護作用が示され、死亡率は約２５％に低減するが、最も顕著な効果は予防＋治療の同時処置によって得られる。
【０２３５】
実施例１３：平滑筋、腺維芽細胞または肝細胞などの間葉細胞の成長、およびそれらが分泌するコラーゲン・タイプの質を調整する抗腺維症剤としての作用
前記実施例１２に述べたように、腺維症とは、間葉細胞の成長の変性を意味し、合成されたコラーゲンの量と質の修復を伴う。
【０２３６】
この実施例では別のモデルを使用したが、これは豚の大動脈の平滑筋細胞である。これらの細胞は大動脈から体外培養組織方法によって得られる。大動脈は腺維芽細胞を含む外膜（外層）、平滑筋(ＣＭＬ)を含む中間膜（中心層）および内皮細胞を含む内膜（内層）の３つの細胞層で構成されている。
【０２３７】
中間膜は採取後、小片に切り裂いた。これを、フェノール・レッドとともにＤＭＥＭ  １ｇ/Ｌのグルコースを含有し、ウシ胎児血清（ＳＶＦ）を２０％、Ｌ−グルタミンを１％、およびペニシリン−ストレプトマイシンを１％添加した２５ｃｍ2のフラスコ中で培養した。細胞をこれらの体外培養組織から分離し、培地に移植した（Ｐ０段階）。培養開始から２週間後に、細胞をＤＭＳＯ  １０％とＤＭＥＭ  ２０％  ＳＶＦに細胞数２百万の細胞密度で冷凍した。
【０２３８】
Ｍａｌａｓｓｅｚ細胞を使用した細胞の直径評価により、あらかじめ校正した自動粒子カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＺＭ、Ｃｏｕｔｒｏｎｉｃｓ）を使用し、一穴当たりの細胞数を評価することにより、成長の速度を測定した。
【０２３９】
各計数は、５００ マイクロＬ／穴のトリプシン−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）溶液を使用し、細胞が切り離された４つの穴の平均を採って行った。
【０２４０】
ＣＭＬはＨＩＳＭ細胞と同じ実験条件で入れた。成長速度は、Ｚが存在しないポリマーのときは、ＲＧＴＡ１０００から１０２５シリーズのポリマーの存在中、および存在しない場合について、またＺが存在するときは、ＲＧＴＡ１１１０から１１１５シリーズについて、ヘパリンを対照として、０．４〜４００ｍｇ／ｍＬの間の種々の濃度で測定した。
【０２４１】
増殖抑制パーセントは下式により計算した：
Ｉ％＝ １００×（１−ポリマー存在下における正味の成長）／ブランクの正味の成長）。
【０２４２】
ここで、正味の成長とは、融合時に数えた細胞の量と培養開始時に添加しなかった細胞数との差を表す。
【０２４３】
ブランクはポリマーが存在しないＣＭＬの培養に相当する。ヘパリンとＲＧＴＡは、細胞の生物学的活性を制御する可能性のある種々の奏効テストに相当する。
【０２４４】
ＨＩＳＭ細胞と同じ条件下で、ＣＭＬによるコラーゲンの合成とタイプ分けを実施した。
【０２４５】
図２６に得られた結果を表す。最初の２欄の値が示すように、ＲＧＴＡは、対照標準分子として使用したヘパリンのそれに近い平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。しかしながら、ヘパリンとは異なり、これらのポリマーはコラーゲンの分泌の表現型を修復する。事実、コラーゲンの総合成量は、ＲＧＴＡ  １００５、１０１２および１０１３の存在により有意に減少した。質的側面から見ると、これらの同じポリマーが、ヘパリンとは逆にタイプＩとタイプＩＩＩのコラーゲンの合成率を減少させる一方、これらはタイプＶのコラーゲンの分泌を増加させた。
【０２４６】
これらの効果により、本発明のポリマーによる抗腺維症特性を確認することができる。
【０２４７】
実施例１４：ネズミの皮膚再生に対するＲＧＴＡの影響
この実施例は、ネズミを用い、縫合後の皮膚の、深い瘢痕形成に対するＲＧＴＡの影響を示すものである。
【０２４８】
２５０グラムのヘアレスラットのオスに、ケタミンとＬａｒｇａｃｔｉｌのＩＭを注入して麻酔をかけた。３ｃｍの切除を２か所、背中の対称軸に対して横方向に脊柱の両側で実施した（図２７）。ＲＧＴＡ  １０１２処理を行わないブランク動物に対し、処理される動物は、切除の３０分前に１キログラム当たり１ミリグラムのＲＧＴＡ溶液、および縫合の直前に傷への局所的適用として１ミリリットル当たり１００マイクログラムで、１００マイクロリットルの溶液を筋肉内に注入した。縫合はｐｒｏｌｅｎｅ  ２−０で、真皮内連続縫合を一列のみ行った。処置したネズミと対照動物を、手術の７日目、２１日目および６０日目に拡大撮影した。これらの期間のそれぞれおいて、各実験シリーズのネズミ３匹を皮膚瘢痕採取の組織学的研究用に安楽死させた。
【０２４９】
図２７は、皮膚の瘢痕形成に対するＲＧＴＡの影響を示す：
−図２７-Ａ：脊柱の両側に長さ３ｃｍの、下層筋肉床までの深い皮膚切開。
【０２５０】
−図２７−Ｂ：連続縫合による傷の土手（ｂｅｒｇｅｓ）の縫合手術後の、動物の背中の図。
【０２５１】
−図２７−Ｃ：処理後１０日目の瘢痕の外観。Ｃ１とＣ２はＲＧＴＡ無しの生理的血清により処理処置された対照動物に相当する。Ｃ１では写真Ｃ２と異なり、抜糸しなかった。瘢痕が見え、特に縫合手術で使用した針の痕跡レベルで、凝固血液のかさぶたが依然として存在する。Ｃ３とＣ４はＲＧＴＡ  １０１２を含む生理的血清で処置した動物に相当する。同様に、瘢痕が見えない。縫合糸はＣ３では見えるが、Ｃ４では抜糸して、無い。この写真のみで、細い縁取りが元々の切開を示している。
【０２５２】
−図２７−Ｄ：組織学的分析。Ｄ１とＤ２は、６０日前に切開した皮膚の組織断面図を表す。Ｄ１はＲＧＴＡ  １０１２を含有しない生理的血清で処理した対照動物で、Ｄ２はＲＧＴＡ  １０１２含有生理的血清で処理した動物に相当する。Ｄ１では、上皮の成熟が未だ不完全な下層真皮では、正常な皮膚のものと同一の構造が見つからなかった。再編成はごく一部である。逆に、Ｄ２では全く病変していない皮膚と同じ構造の皮膚と組織が見られる。唯一の瘢痕の痕跡が真皮の深い部分で見られ、不完全な再編成の部分が有ることが分かる。この後者のケースでは、外部瘢痕はまったく存在しない。
【０２５３】
図２７の写真は、７日目には抜糸の有無（Ｃ４）（Ｃ３）に拘わらず、表面瘢痕が消滅したが、対照動物では前述の２ケース（Ｃ１およびＣ２）で瘢痕が見られる。
【０２５４】
６０日目に実施された組織分析によれば、無処理動物（Ｄ１）が全く成熟していない真皮を示すのに対し、ＲＧＴＡで処理した動物は、深い部分で軽度の真皮痕跡しか示していない。処置した動物（Ｄ２）の皮膚の組織は、如何なる瘢痕形成プロセスも受けていないブランク動物の皮膚に近い。このモデルでは、ＲＧＴＡは皮膚床の瘢痕形成を促進するのみならず、特に瘢痕組織の再編成を可能にし、腺維症の痕跡がまったく検出できない程度の再生組織にまで達する。これらは組織のホメオスタシスの特別な強力調整剤であることが分かる。
【０２５５】
実施例１５：ＲＧＴＡによる虚血に対する保護効果
ポリマーＲＧＴＡ  １００５によって示すこの実施例は、未処理器官（図２８）に比較して、器官質量の８０％の保存を可能にする組織異常に対するＲＧＴＡの保護効果を証明するものである。筋肉の虚血の結果、酸素の供給不足から誘発されたストレスにより引き起される有害な影響に対するＲＧＴＡの保護効果を、後述の実験で紹介する。
【０２５６】
使用モデルは、Ｈａｎｓｅｎ−Ｓｍｉｔｈ  Ｆ．Ｍ．、Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｂ．Ｍ．およびＩｒｗｉｎ  Ｋ．Ｌ．により記述されたモデルを参考にしている（１９８０年、ネズミの遊離移植のＥｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  Ｌｏｎｇｕｓ筋の血管の再構築、Ａｍ.Ｊ.Ａｎａｔ.、１５８、６５〜８２）。実験手順は、成熟したウィスターラット（３５０ｇ）の２本の後足のＥＤＬ筋（Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  Ｌｏｎｇｕｓ）の神経血管幹を、筋肉への入口で切断し、２つの腱を結索して虚血をもたらすことより成る。ここで、１ミリリットル当たり５０マイクログラムのＲＧＴＡ  １００５溶液１００マイクロリットルを生理的血清に入れ、これをＥＤＬ筋中に直接注入した。もう一つの対側筋には、同量のＲＧＴＡ無しの生理的血清を注入した。
【０２５７】
注入の７日後に筋肉を取り出し、組織をプレパラートにして顕微鏡で検査した。処理したもの、および未処理の各筋肉グループで、筋肉の平均直径、筋外膜、周囲ゾーンの厚み、虚血ゾーンの平均直径などのパラメータの全てを×１０のレンズとマイクロメータを使用して測定した。周囲ゾーンにおいて虚血下でも生き残った筋繊維層の数を無作為に選択した異なる３０フィールドで計数し、×２０のレンズで観察した。
【０２５８】
図２８に、ネズミの筋肉虚血モデルにおける、組織の病気に対するＲＧＴＡ（ＲＧＴＡ  １００５）の保護効果を示す。図２７−Ａと図２７−Ｂは夫々、対照ネズミ（２７−Ａ）およびＲＧＴＡで処理したネズミ（２７−Ｂ）の筋肉を、２つにカットした組織断面を示す。対照では、虚血が筋外膜と接触する周囲繊維の冠１個を除き、筋肉繊維の変性を引き起した。ＲＧＴＡ  １００５の投与により、深い部分の筋肉繊維の変性が大幅に制限されると同時に、それによって引き起こされる炎症反応と変性も、大幅に有意に減少する。よって、ＲＧＴＡ  １００１５は、虚血により引き起される有害な影響から細胞を予防する。
【０２５９】
図２８では、１週間後、無傷のブランク筋肉の直径（５．１＋／−０．２ｍｍ）に比較して、ＲＧＴＡ処理後の平均直径（５．２＋／−０．３ｍｍ）は修復されていないことが観察される。筋外膜の厚みはＲＧＴＡ処置無しの８５＋／−１０マイクロメートル比較して、ＲＧＴＡによる処理では１０＋／−５マイクロメートルであり、筋外膜内の炎症反応は、ＲＧＴＡで処置された筋肉では、大幅に有意に減少している（ｐ＜０．０１）。ＲＧＴＡ処理無しのＥＤＬ筋の虚血の中心ゾーンは、平均直径が４４０００＋／−１００マイクロメートルであり、その中の筋肉繊維は完全に失われている。このゾーンは平均して３．２＋／−０．５の筋肉層を含む２７０＋／−５０マイクロメートルの周囲ゾーンに囲まれている。ＲＧＴＡでの処置は、平均直径が３６００マイクロメートル＋／−２００（ｐ＜０．０５）の変性した中心ゾーンの大きさの顕著な減少と、厚みが７００＋／−４０（ｐ＜０．０５）マイクロメートルで８．３＋／−１．８の腺維層（ｐ＜０．０１）を含有する周囲ゾーンの増加によって特徴付けられる。
【０２６０】
実施例１６：長骨の再生に対するＲＧＴＡの影響
この実施例は、ネズミの大腿骨の骨幹部管内で行った骨の欠陥の再形成を示すが、８週間後には同程度であるが、１２週間後にはさらによく、元の状態と同じ髄管と骨折なしの骨のように成熟した皮質の再形成を示している（図２９）。
【０２６１】
２７５〜３２５グラムのオスのウィスラーラット（Ｉｃｏ：ＷＩ（ＩＯＰＳＡＦ／Ｈａｎ）、Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏ）を使用した。研究は動物に対する作業に関するＣＥＥの勧告に基づいて実施した（令８７−８４８  −１９８７年４月１９日）。ペンチオバルビタールナトリウム注入麻酔下、大腿骨に側面から着手した。骨幹部管で筋組織と骨膜をはずした。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒブローチにより高密度ポリエチレンプレートを大腿骨表面に固定した。５ミリメートルの分節傷を大腿骨幹の中央に付けた。骨の傷の場所に、組織の縫合前にインプラントを挿入した。このインプラントは、ＲＧＴＡ  １０１２を１ミリリットル当たり１００マイクログラム含有する塩水中でのインキュベーションによりこの生成物が含浸するか否かにかかわらず、Ｆ．Ｂｌａｎｑｕａｅｒｔ等（１９９５年、Ｂｏｎｅ、１７：４９９〜５０６）により記述された手順に基づき、他のネズミの大腿骨幹で準備した脱塩した他種族の骨のマトリックスに相当する。その後、動物を歩行制限せずに籠に入れておいた。安楽死前の１２週間、２週間ごとに動物の大腿骨をＸ線撮影した。その後、大腿骨を採取し、組織学的研究に必要な処置を施した。Ｘ線写真は画像分析のため、その濃度計測レベルを特に検討した。
【０２６２】
図２９は、長骨の再生に対するＲＧＴＡ  １０１５の影響を示し、特にＲＧＴＡで処理したネズミと未処理ネズミの大腿骨の組織学的、およびＸ線写真の検討を報告する。
【０２６３】
図２８−Ａは、大腿骨幹に対して行った傷モデルを示す。
【０２６４】
図２８−Ｂ、２８−Ｄ、２８−Ｆ、および２８−Ｈは、種々の実験グループでの大腿骨のＸ線写真を示す。図２８−Ｃ、２８−Ｅ、および２８−Ｇは、２８−Ｄ、２８−Ｆ、および２８−Ｈに夫々示したサンプルに相当する手術部品の組織断面である。
【０２６５】
図２８−Ｃと２８−Ｄでは、大腿骨の傷は如何なる処置も受けなかったことが観察される。１２週間後に瘢痕形成現象がなく、骨柱は再形成されていない。
【０２６６】
図２８−Ｅと２８−Ｆでは、骨の傷が脱塩した骨マトリックスで埋められているのが観察される。この場合、埋戻しは行われているが、如何なる再編成も観察されない。埋戻し構造は従来の長骨の組織を示していない。
【０２６７】
図２８−Ｇと２８−Ｈでは、骨の傷が、ＲＧＴＡ  １０１５溶液に湿された脱塩した骨マトリックスにより埋められているのが観察される。この場合、埋戻し組織の構造は正常な骨のそれに相当している。緻密質な皮層骨は傷のないゾーンと関係しており、固定ビスの痕跡が見られる。この部分は元の骨髄腔と連続する軟骨により埋められる空洞を特定する。
【０２６８】
図２８−Ｉ１、２８−Ｉ２、２８−Ｊ１、および２８−Ｊ２は、長骨の再形成速度に対するＲＧＴＡ  １０１５の影響を示す。Ｘ線写真Ｉ１とＩ２は８週間後に、Ｘ線写真Ｊ１とＪ２は１２週間後に撮影したものである。Ｉ１とＪ１は２８−Ｅと２８−Ｆで示した処置に相当し、骨の傷は単にＲＧＴＡ無しの脱塩された骨マトリックスにより埋められている。Ｉ２とＪ２は２８−Ｇと２８-Ｈに示した処置に相当し、骨の傷はＲＧＴＡ  １０１５溶液で湿された脱塩した骨マトリックスで埋められている。これらのＸ線写真は、瘢痕形成の加速、および特にＩ１とＪ１では検出できない顕著な皮質形成（Ｉ２とＪ２）中での、再形成された骨の成熟を示している。ＲＧＴＡ  １０１５は、短期間で、元の骨の構造と同一の長骨構造に再形成可能な再生剤として作用する。
【０２６９】
このように、また驚くべきことに、ポリマーなしの生理的血清に浸潤したマトリックスに比較して、脱塩した骨マトリックスに浸潤したＲＧＴＡ  １０１２は、骨の再形成と成熟のプロセスを、まさに有意に促進する。この効果は、わずか８週間後に新しい皮質の出現として表れるのに対し、対照条件ではこの現象は起こらない。１２週間後には、ＲＧＴＡ  １０１２を加えて処理した７匹の動物のうち６匹で、放射線学的検討において、厚く且つ限定された皮質の再形成との欠陥の完全な結合結果を示しているが、ＣＭ1ＤＳ2無しでは、唯一の結合が皮質形成なしの未成熟の骨の放射線画像で観察される。Ｘ線撮影の画像分析での定量的研究により、これらの観察を確認する。この検討は他方、ＲＧＴＡ  １０１２で処置した骨の形状が、実験期間の１２週間では骨の材料が比較的小さい密度であることを唯一の相違として、正常な骨の形状に近いことが明らかとなった。元々の欠陥に新しく形成された骨の密度のプロジェクションは、ポリマーＲＧＴＡ  １０１２による処置が、皮質と髄管の再形成を通じて組織の再形成を誘発することを明らかにした。
【０２７０】
組織学的検討と、放射線学的データの画像分析により確定される諸結果を相関付け、且つ確認する。これらの組織学的検討により、依然としていくつかの軟骨区域とともに高密度な骨で構成された新しい皮質の存在と、新しい軟骨で満たされた元々の骨幹と連続した髄管の存在が証明された。ＲＧＴＡ  １０１２無しで処置した大腿骨は如何なる成熟の形も見せない。再形成された骨は特別な組織を示さない。この骨は、高密度の骨と、特に部位の限定されない骨髄組織との不均質な混合で構成される。
【０２７１】
これらの結果は、長骨の修復のみならず、その質レベルで再生された組織のホメオスタシス調整潜在能力、ならびにそれらの再編成を誘発する能力についての、本発明のポリマーの骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｅｕｒｓ）効果を示している。
【０２７２】
骨組織のホメオスタシス、すなわち、組織の質、その機能性および再形成の調整剤としてのＲＧＴＡの特性は、下記の実施例１７により確認できる。
【０２７３】
実施例１７：ハムスターの急性歯周炎モデルにおける、骨質量の再編成と保護に対するＲＧＴＡの影響
この実施例で使用したモデルは、ハムスターの下顎骨の再編成に関するものである。
【０２７４】
シリアのゴールデン・ハムスター（Ｄｅｐｒｅ飼育の中心、ＨＳＭ４１／５０参照）に、超過糖質(ｈｙｐｅｒｇｕｌｃｉｄｉｑｕｅ) を２か月間摂取させた後に、歯周炎を誘発させた。投与した食餌は、蔗糖（５６％）、脱脂粉乳（２８％）、完全な小麦粉（６％）、ビール酵母（４％）、ウマゴヤシ粉末（３％）、粉末レバー（１％）および塩化ナトリウム（２％）である。
【０２７５】
動物を実験グループ別に分けた。ビスケットとクロケットをベースとする普通の食餌を与えたブランク・グループを、１４匹の動物で構成した。超過糖質の食餌を与えた実験グループを、２４匹の動物で構成した。２か月後にははっきりと慢性歯周炎が発達した。これらの実験グループには、この期間後の３週間、毎週、生理的血清緩衝液０．５ミリリットルの容積中、１キログラム当たり０．１〜１５ミリグラムの用量のＲＧＴＡ  １００５の筋肉内注入した。対照グループはＲＧＴＡ  １００５無しの生理的血清（ＳＨＡＭ）を注入した。そして、動物の体重を毎週計量した。各タイプの処置の１か月後に、動物を屠殺し、下顎骨を採取して組織学的研究に用いた。手術部品の封入は安定化したメタクリル酸メチル中で行った。
【０２７６】
この歯周炎モデルでは、半下顎骨それぞれについて、高さで２００マイクロメートルのみが使用可能である。システムは、常に舌側の第１臼歯２本の根の間の骨組織により決定され、且つ位置を探知する深さの部分と同じ断面配列を検討するように標準化した。
【０２７７】
歯周病は、臼歯レベルでは細菌板で満たされる体積を特定する歯周炎ポケットの出現により表面化する。この病気は、多くの骨溶解吸収と、付着での、すなわち骨接合フェーズでの骨表面積の減少といった特徴である歯周骨の重篤な障害を引き起こす。
【０２７８】
骨吸収は、骨と破骨細胞（Ｏｃ）の接触ゾーンを測定して定量化した。これらはトルイジンブルーにより青色に染まる巨大細胞である。付着は、破骨細胞に被われており薄青色へ変色することにより同定される骨様組織帯により特徴付けられる。ＯＣとは逆に、造骨細胞は立方体で単核の小さい細胞である。これらの現象の定量化は画像処置ソフトで支援された画像ステーションを使用して行った。
【０２７９】
図３０は、種々の実験条件で得られた定量結果を示す。病気の進行しなかったブランク動物では、吸収活性はほぼゼロに近いのに対し、付着のそれは大きい。未処理の動物（ＳＨＡＭ）では、病気が速やかに進行し、強い吸収と低付着率により特徴付けられる。ＣＭ1ＤＳ2で処理した動物、特に１キログラム当たり１．５ミリグラムで処理したものでは、吸収率が大幅に減少し、またブランクで確認された率のほぼ８０％にも達する付着率の大幅な増加を伴う。
【０２８０】
これらの影響は筋肉内注入により得られる。それらはＲＧＴＡが吸収と付着の間の再形成バランスを再平衡して骨組織の質量を調整することを示している。
【０２８１】
実施例１８：病変組織に分子を方向づけるＲＧＴＡ特性を示す薬動学データ
この実施例は、本発明のポリマーが有する病変組織部位への特定的固定、または集結能力を示すものである。
【０２８２】
実施例７で記述した損傷筋肉の再生モデルにおいて、動物の左足のＥＤＬに病変部を形成した。夫々の動物に、ＳｉｂＴｅｃｈ社（ＮＹ、米国）製のトリチウムで放射線標識した２  １０6ｃｐｍのＲＧＴＡ  １０１２を静脈注入した。このトレーサーの比活性は、１ミリグラム当たり２０ミリキューリーである。
【０２８３】
手術後の様々な時間に、左足の病変したＥＤＬ筋肉と、右足の病変のない筋肉を採取して液体窒素で凍結した。凍結状態で組織断面を作成することによって、放射線標識した生成物の、ｂｅｔａ  ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ社）で検査用組織断面部位に固定された量の測定が可能となる。下記表５に表した結果は、病変した筋肉は２４時間後には、装置のバックグラウンド放射能とほとんど変わらない非病変筋肉の標識部位より、５倍も高い放射性生成物量が集まることを示している。
【０２８４】
【表５】
0004485058.tif 000007
【０２８５】
これらの結果は、苦痛又は病変のある組織部位に特異的に集結する本発明のポリマーの、自動ターゲット設定能力を証明するものである。よって、これらのポリマーの特に興味深いひとつの特性は、医薬または診断成分の方向づけ能力にもある。
【０２８６】
実施例１９：歯周炎および骨質量へのＲＧＴＡの影響
歯周炎の分野で、ハムスターの歯周炎に関して、歯槽骨の損失の巨視的研究を行った。
【０２８７】
２か月の病気の誘発期間後に、動物（ｎ＝２０）を病気の初期原因、すなわち、細菌成分に作用することなく、ＩＭを通じてさらに２か月処置した。他の動物は処置を行わなかった（ｎ＝２０）。これらの２グループを、健康な（歯周炎のない）ハムスターと比較した（ｎ＝１２）。
【０２８８】
実験期間後に、骨損失を証明するため上顎骨を引き剥がした。第１臼歯ゾーンを標準化した方法で撮影した。各写真についてエナメル−セメントの接続部に相当する基準線を引いた。次いで、骨稜の輪郭に一致する第２の線を引いた。これらの２本の線を第１臼歯の前後で結んだ。この面積を測定した。
【０２８９】
ここで注意すべきは、ブランクでは以下に相当する根の表皮剥奪ゾーンが存在することである：
−歯茎を根に定着させる生理的な繊維挿入ゾーン、
−動物の老化に関連して発生する骨の高さの損失。
【０２９０】
この動物では、この表皮剥奪は０．９６ｍｍ2である。
【０２９１】
罹患した動物では、骨損失は１．３４ｍｍ2で、これには初期生理ゾーン（歯周炎中に破壊される）と老化による損失部分が含まれる。しかしながら、我々は、病気が０．３８ｍｍ2程度の骨損失を引起したと考えることができる（差：ｐ＜０．０００１）。
【０２９２】
処置した動物では、非圧縮ゾーンが必ず存在する（ブランクも同じ）。これらの動物での根の裸化は１．０２ｍｍ2である。よって、ブランクに比較して０．０６ｍｍ2の正味の欠損（有意的でない差）が、また処置なしのものに対しては０．３２ｍｍ2の増加が存在する（ｐ＝０．０００５）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のポリマー（βリンゴ酸共重合体）を構成するモチーフである。
【図２】  本発明で使用するβ−ラクトンである。
【図３】  本発明のポリマーの単量体であるマロラクトン酸アルキルの合成スキームである。
【図４】  ポリβリンゴ酸誘導体の合成の要約図である。
【図５】  本発明のポリマーを構成する置換グルコースモチーフである。
【図６】  タイプＣＭnＤＳmのポリマーに相当するＲＧＴＡの、ＸとＹ基の量を示す表である。
【図７】  ＣＭ2ＤＰｈＳＳ１のモチーフである。
【図８】  ＣＭ2ＤＥＳ１のモチーフである。
【図９】  ＣＭ3ＤＰｈｅＳ2およびＤＭ3ＤＴｙｒＳ2のモチーフである。
【図１０】  ＣＭ1ＤＰａｌｍＳ1およびＣＭ1ＤＯｌｅｉｃＳ1のモチーフである。
【図１１】  本発明のポリマーの抗凝固活性を示す表である。
【図１２】  ＦＧＦ１に対する本発明のポリマーの安定化効果を示す表である。
【図１３】  ＦＧＦ１とＦＧＦ２に対する本発明の相乗作用を示す表である。
【図１４】  本発明のポリマーの、トリプシン有する分解能抑制効果を示す表である。
【図１５】  本発明のポリマーの、トリプシン有する分解能抑制効果を示す表である。
【図１６】  本発明のポリマーの、白血球エラスターゼおよびプラスミンの活性抑制効果を示す表である。
【図１７】  本発明のポリマーの、筋肉再生効果を示す表である。
【図１８】  本発明のポリマーによるＳＯＤの活性の変化を示す表である。
【図１９】  本発明のポリマーの、ＳＯＤ保護効果を示す表である。
【図２０】  本発明のポリマーとＳＯＤの相乗効果を示すグラフである。
【図２１】  本発明のポリマーの、カルパインに対する抑制効果を示す表である。
【図２２】  本発明のポリマーの、ヘパラナーゼに対する抑制効果を示す表である。
【図２３】  本発明のポリマーの、電離線照射を受けたＨＩＳＭ細胞のコラーゲン分泌に対する作用を示すグラフである。
【図２４】  本発明のポリマーの、電離線照射を受けたＨＩＳＭ細胞によるコラーゲン対する作用を示すグラフである。
【図２５】  本発明のポリマーの、電離線照射を受けた細胞に対する保護効果を示すグラフである。
【図２６】  本発明のポリマーの、平滑筋細胞に対する抗腺維症作用を示す表である。
【図２７】  本発明のポリマーの、ネズミの皮膚再生に対する影響を示す写真である。
【図２８】  本発明のポリマーの、ネズミの虚血モデルでの組織保護効果を示す写真である。
【図２９】  本発明のポリマーの、ネズミの長骨再生効果を示すＸ線写真である。
【図３０】  本発明のポリマーの、慢性歯周炎に対する効果を示すグラフである。
【図１】
0004485058.tif 000009
【図２】
0004485058.tif 000010
【図３】
0004485058.tif 000011
【図４】
0004485058.tif 000012
【図５】
0004485058.tif 000013
【図６】
0004485058.tif 000014
【図７】
0004485058.tif 000015
【図８】
0004485058.tif 000016
【図９】
0004485058.tif 000017
【図１０】
0004485058.tif 000018
【図１１】
0004485058.tif 000019
【図１２】
0004485058.tif 000020
【図１３】
0004485058.tif 000021
【図１４】
0004485058.tif 000022
【図１５】
0004485058.tif 000023
【図１６】
0004485058.tif 000024
【図１７】
0004485058.tif 000025
【図１８】
0004485058.tif 000026
【図１９】
0004485058.tif 000027
【図２０】
0004485058.tif 000028
【図２１】
0004485058.tif 000029
【図２２】
0004485058.tif 000030
【図２３】
0004485058.tif 000031
【図２４】
0004485058.tif 000032
【図２５】
0004485058.tif 000033
【図２６】
0004485058.tif 000034
【図２７】
0004485058.tif 000035
【図２８】
0004485058.tif 000036
【図２９】
0004485058.tif 000037
【図３０】
0004485058.tif 000038