(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
最初にRNAを消化することなく染色体外DNAをRNAから分離する方法であって、
i）染色体外DNAを含む細胞を溶解してライゼートを作成する工程、
ii) 工程(i)により得られたライゼートを塩化カルシウム沈降させる工程、
iii）工程(ii)により得られたライゼートを清澄化する工程、及び
iv) ライゼート中に存在するRNAの大部分がメンブレンを通過するようにする一方、染色体外DNAの大部分が捕捉されるような条件下で、工程(iii)により得られた清澄化したライゼートをタンジェンシャルフロー限外濾過にロードする工程を含む、
上記方法。
【請求項２】
清澄化したライゼートを、10mS未満の伝導率を有する濾過透析バッファーで処理する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
濾過透析バッファーが5mS未満の伝導率を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
濾過透析バッファーが2mS未満の伝導率を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
濾過透析バッファーが1mS未満の伝導率を有する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
濾過透析バッファーがpH6〜10のバッファーである、請求項２、３、４又は５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
濾過透析バッファーがTrisバッファーである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
濾過透析バッファーが10倍を超える交換量で使用される、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
濾過透析バッファーが20倍を超える交換量で使用される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
濾過透析バッファーが30倍を超える交換量で使用される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
濾過透析バッファーが40倍を超える交換量で使用される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
濾過透析バッファーが50〜100倍体積の交換量で使用される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
塩化カルシウムの不在下において、メンブレンが100KDa〜1000KDaの分子量カットオフを有し、かつ染色体外DNAが2Kb〜200Kbである、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
メンブレンが300KDa〜500KDaの分子量カットオフを有し、及び染色体外DNAが2Kb〜50Kbである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
塩化カルシウムの存在下において、メンブレンが500KDa未満の分子量カットオフを有し、及び染色体外DNAが2Kb〜200Kbである、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
メンブレンが300KDa未満、より好ましくは約100kDaの分子量カットオフを有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
メンブレンが、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリアミド、変性PES、ポリビニリジンピロリジン、ポリフッ化ビニリジン（PVDF）、ニトロセルロース及び三酢酸セルロースからなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
メンブレンがポリエーテルスルホンメンブレンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
メンブレンがスクリーンチャンネルと一緒に用いられる、請求項１〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
スクリーンチャンネルがTスクリーンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
膜間圧力差10psi未満で行われる、請求項１〜２０のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
500Kメンブレンの場合は100mg/ft2未満及び300Kメンブレンの場合は30mg/ft2未満の量で染色体外DNAがメンブレンにロードされる、請求項１〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
得られるDNAがライゼート中に存在するRNAの50重量％未満である、請求項１〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
得られるDNAがライゼート中に存在するRNAの10重量％未満である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
得られるDNAがライゼート中に存在するRNAの5重量％未満である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
得られるDNAがライゼート中に存在するRNAの2重量％未満である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
得られるDNAがライゼート中に存在するRNAの1重量％未満である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
限外濾過工程と組み合わせて１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程が用いられる、請求項１〜２７のいずれか記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上の精製もしくは仕上工程が限外濾過工程の前に行われる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上の精製もしくは仕上工程が限外濾過工程の後に行われる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程が、内毒素、タンパク質、ゲノムDNA及びRNAのうちの１種以上を除去するためのものである、請求項２８、２９又は３０のいずれか記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程がクロマトグラフィー工程を含む、請求項２８、２９、３０又は３１のいずれか記載の方法。
【請求項３３】
クロマトグラフィー工程がイオン交換もしくはヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィー工程である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
クロマトグラフィー工程がイオン交換クロマトグラフィー工程である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
クロマトグラフィー工程がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程がpH7.3〜8.3で行われる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程がpH7.6〜8.0で行われる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ヒドロキシアパタイトがBioRad MicroPrep Ceramicである、請求項３５又は３６記載の方法。
【請求項３９】
染色体外DNAをRNAから分離するために2種類のバッファーを用いたシステムが用いられる、請求項３５〜３８のいずれか記載の方法。
【請求項４０】
2バッファー系がRNA溶出用のNa2HPO4及び染色体外DNA溶出用のK2HPO4を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
限外濾過の後に行われる１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程が塩化カルシウム沈降工程を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項４２】
塩化カルシウム沈降工程を含む追加的な精製もしくは仕上工程の後に、さらなる限外濾過工程、脱塩工程、又は逆相クロマトグラフィー工程が行われる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
さらなる限外濾過工程、脱塩工程、又は逆相クロマトグラフィー工程の後に、クロマトグラフィー工程が行われる、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
クロマトグラフィー工程がイオン交換である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
塩化カルシウム沈降工程で形成される沈殿物をメッシュまたはふるいで除去する、請求項２８記載の方法。
【請求項４６】
塩化カルシウム沈降工程で形成される沈殿物をメッシュまたはふるいで細胞破片と一緒に除去する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
塩化カルシウム沈降工程により高分子量のRNA及びゲノムDNAを除去する、請求項２８〜４６のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、染色体外DNAを他の細胞成分（例えばRNA、ゲノムDNA、タンパク質及び内毒素等）から分離する方法に関する。より詳細には、本発明は、染色体外DNAをRNA消化にかけることなく医薬品質（pharmaceutical quality）の染色体外DNAを生成する方法に関する。また本発明は、本発明の方法により生成される染色体外DNA及びこのような染色体外DNAから誘導される医薬（例えばDNAワクチンや遺伝子療法用の生成物（product）等）にも関する。また本発明は、高純度且つ高収率で染色体外DNAを生成する方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
例えばプラスミドDNA等の染色体外DNAはそれ自体が、生物薬品（biopharmaceutical）として次第に重要になってきている。その結果、このような染色体外DNAを大量に、高純度且つ高収率で生成する必要がある。
【０００３】
大量の可燃性有機溶媒（例えばエタノールやイソプロパノール等）及び有毒化学物質（例えば臭化エチジウム、フェノール及びクロロホルム等）を使用する精製方法、又は超遠心分離法及び「回転カラム」等の技法は、少量の研究材料を生成するには適しているが、一般には、生物薬品に応用するのに必要な量の材料を生成するのには適していない。
【０００４】
さらに、多くの現行のプラスミド精製手法では、RNアーゼ（典型的にはウシ起源のもの）が加えられる。ウシ由来の材料は、ウシの海綿状脳症（BSE）について心配されることから、製薬業界では次第に望ましくないものとなってきている。
【０００５】
一般に、プラスミド精製法は、以下の２つの特徴的な段階を含むと考えてよい：
プラスミドDNAを細胞から放出させてライゼートを作製する第１段階；及び
プラスミドDNAをライゼートの他の細胞成分から分離及び精製する第２段階。
【０００６】
第１段階（図１aを参照されたい）を実施する最も一般的な方法は、
i）煮沸すること、または
ii）細菌の細胞メンブレンをアルカリ性pH及び洗浄剤を用いて可溶化すること
によりプラスミドDNAを放出させるものである。
【０００７】
第２段階（図１bを参照されたい）は、典型的には、細胞破片等の不溶性粒子を除去する清澄化工程の後に、例えばゲノムDNA、RNA、タンパク質及び内毒素等の可溶性細胞成分を除去する複数の精製もしくは仕上工程を行うものである。従って典型的な精製法は、例えば
塩化セシウム（caesium chloride）勾配による超遠心分離法、
選択的沈降法（selective precipitation）、
イオン交換クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、及び
２相分離法
等の異なる精製工程を組み合わせたものであってもよい。
【０００８】
DNAを精製するために用いられる１つの技法は、タンジェンシャルフロー限外濾過法である。国際特許出願番号PCT/US97/13494は、ゲル層を含む限外濾過ユニットに溶液を通過させて濾過することにより透過溶液（permeate solution）及び捕捉溶液（retentate solution）を得る、溶液からの核酸の精製法について教示している。核酸は捕捉溶液中に保持される。RNAを除去するために、ライゼートをまずRNアーゼで処理して、分離可能なサイズになるまで消化する。分離は例えばイオン交換クロマトグラフィーにより行われる。
【０００９】
詳細な処理条件を以下に挙げる。
【００１０】
１．pH8.5の（ただし濃度の規定はない）Tris-HCl濾過透析バッファー（diafiltration buffer）の使用。ただし、捕捉物は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を詰めたクロマトグラフィーカラムに充填されるので、濾過透析バッファーは典型的な10〜50mSの塩濃度を有すると想定される。これは、遺伝子療法で使用するためにDNAを脂質担体と複合体形成させる場合、好ましくは濾過透析によってDNAを低伝導率（low conductivity）のバッファー中に入れ替えることが望ましいというコメントによって支持される。低伝導率のバッファーは、10mS未満、好ましくは1mS未満のバッファーを含むと言われている。
【００１１】
２．約50倍体積の交換量（50 volume exchanges）の濾過透析バッファーの使用。
【００１２】
３．孔径300Kのオープンチャンネル（open channel）カセットの使用。
【００１３】
４．核酸100mg /メンブレンft2のプラスミドロード量。
【００１４】
この方法には、RNAをプラスミドDNAから分離することができるようにRNAを消化するためにRNアーゼを必要とするという欠点がある。
【００１５】
より最近になって、Kahnら（Biotechnology and Engineering, Vol 60, No. 1, July 5 2000）は、RNアーゼを使わないプラスミド精製のためのタンジェンシャルフロープロセスについて開示している。しかし、RNAを除去するために、さらに24時間延長してアルカリ溶解を行ってRNAをまず消化しなければならなかった。
【００１６】
このプロセスには以下に挙げる２つの主な欠点がある：
１．第１に、このプロセスを行うのにかかる全体的な時間が非常に長くなり、事実上、速度が制限された工程となる可能性があること；及び
２．第２に、溶解時間が長くなることによって、染色体外DNA自体にダメージを与える危険性があること。
【００１７】
上記報告書によると、プラスミドDNAは以下の条件下でタンジェンシャルフローによって調製された：
１．バッファーは20mM Tris-HClバッファー（pH7.6）であった；
２．このプロセスは8〜10倍体積の交換量の濾過透析バッファーを使用した；
３．メンブレンは500K又は1000Kの孔径を有するものであった；及び
４．プラスミドのロード量は、細胞10〜15g/メンブレン0.5 ft2であった（ft2あたり約16mg）。
【００１８】
注目すべき他の点としては、500KDaの孔径を有するメンブレンではプラスミドのサイズは5.6Kb〜7.9Kbであり、1000KDaの孔径を有するメンブレンではプラスミドのサイズは10.0Kbであった、という事実が挙げられる。
【００１９】
いずれの方法においても、タンジェンシャルフロー限外濾過法によりRNAを染色体外DNAから分離することができるように、まずRNAを消化する必要がある。
【００２０】
本発明の目的は、RNアーゼを用いることなくDNAをRNAから分離する、簡単でスケール調節が容易に可能であり、且つKahn等のプロセスに伴う欠点を持たない方法を提供することである。
【００２１】
発明の概要
本発明者等は、タンジェンシャルフロー限外濾過を用いて操作条件のうちの１つ以上を慎重に制御することによって、RNAを実質的に含まないDNA（例えば染色体外DNA等）を簡単且つスケール調節が容易に可能なように得ることができると結論づけた。
【００２２】
多くの操作条件を慎重に制御することによって最も良い結果が得られるが、操作条件のうちの任意の１つ以上を最適化することにより、RNAをかなり除去することができるので、最適化された各条件は、各々独立して、または他の操作条件の他の１つ以上と組み合わせて、特許請求の範囲に記載されることを認識されたい。
【００２３】
このように、本発明者等は、当技術により示唆されていることに反して、限外濾過プロセスの操作条件のうちの１つ以上を慎重に制御することによって、RNアーゼによる処理により又は時間を延長して溶解を行うことによりまずRNAを消化することを必要とせずに、染色体外DNAをRNAから分離することが可能であると結論づけた。
【００２４】
これらの条件としては以下に挙げるものが含まれるが、これらに限定されない：
１．バッファーのイオン強度（その伝導率に置き換えて定義することができる）を基準にバッファーを選択する；
２．RNAをメンブレン透過させて洗浄するのに十分な交換量の濾過透析バッファーを供給する；
３．染色体外DNAを精製するのに適した孔径を有する適当なメンブレンを選択する；
４．適当な膜間圧力差（transmembrane pressure：メンブレンを介する圧力差）を選択する；及び、
５．ロード量を制御する。
【００２５】
より具体的には、イオン強度を最適化し且つ十分な交換量の濾過透析バッファーを提供することにより、そして好ましくはさらに、染色体外DNAを精製するのに適した孔径を有する適当なメンブレンを選択することにより、RNアーゼによる消化や溶解時間の延長を必要とすることなく、実質的なRNAの除去を行うことが可能である。
【００２６】
さらに、このプロセスの結果として、所望のレベルの精製を達成するのに必要な工程の数または複雑性を減らすことができる。このように精製工程の数または複雑さを減らせば、処理の時間及びコストならびにプラスミドの損失が減るので、明らかに有益なものである。
【００２７】
本発明の第１の態様に従って、まずRNAを消化することなく染色体外DNAをRNAから分離する方法であって、
i）染色体外DNAを含む細胞を溶解してライゼートを作成する工程、
ii）ライゼートを清澄化する工程、及び
iii）ライゼート中に存在するRNAの大部分がメンブレンを通過できるようにする一方で、染色体外DNAの大部分が捕捉されるような条件下で、清澄化したライゼートをタンジェンシャルフロー限外濾過にロードする工程を含む、
上記方法が提供される。
【００２８】
「大部分」とは、50％を超える、より好ましくは90％を超える、さらに好ましくは95％を超える、及び最も好ましくは98％を超える、という意味である。
【００２９】
「限外濾過工程により行われる実質的なRNAの除去」とは、さらなる精製もしくは仕上工程をたった１回行っただけで医薬品質の染色体外DNAが得られる、という意味である。
【００３０】
限外濾過工程の前及び/又は後に１以上の追加的な精製もしくは仕上工程を行うことができる。これらの工程とは、さらなるRNAまたは他の細胞成分（例えば内毒素、タンパク質及びゲノムDNA等）を除去するためのものである。もちろん、限外濾過プロセス中にも、これらの他の細胞成分のうちのかなりの部分が除去されることを理解されたい。１つの実施形態（図１b、ルートA）では、タンジェンシャルフロー限外濾過工程の後に、高分子量RNAを特異的に除去するように設計されたクロマトグラフィー工程（例えばヒドロキシアパタイト式等）を行う。高分子量RNAとは、RNAから分離しようとする染色体外DNAの分子量に近い分子量を有するRNAを意味する。
【００３１】
さらに他の実施形態（図１b、ルートB）では、さらなるRNA除去工程は、限外濾過工程の後に行われる。好ましくは、これは、高分子量RNAを特異的に除去するよう設計されたCaCl2沈降工程である。
【００３２】
CaCl2沈降工程の後に、さらなる限外濾過工程及び/又は脱塩工程及び/又は逆相クロマトグラフィー工程を行っても良く、その後に、例えばイオン交換式又はヒドロキシアパタイト式等のクロマトグラフィー工程を行っても良い。
【００３３】
さらに他の実施形態（図１b、ルートC）では、RNA除去工程（例えばCaCl2沈降工程）は、限外濾過工程の前に行われる。この実施形態において、CaCl2沈降工程の後に限外濾過工程が行われた後、例えばイオン交換式又はヒドロキシアパタイト式等のクロマトグラフィー工程を行うことができる。
【００３４】
抗カオトロピック塩（antichaotropic salt）（例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カルシウム、酢酸アンモニウム、又は酢酸カリウム等、ただし特に塩化カルシウム）の使用は、限外濾過用のメンブレンの選択に影響を及ぼし得る。
【００３５】
RNAを実質的に除去する条件としては、以下が挙げられる：
１．イオン強度の低いバッファーの選択。この選択は、RNA除去を最大限に行うのに不可欠であることが分かった。イオン強度が低いほど、多くのRNAが除去される。「イオン強度が低い」とは一般に、10mS未満、より好ましくは5mS未満、さらに好ましくは2mS未満、最も好ましくは1mS未満の伝導率を有する、ということを意味する。好適なバッファーは、Tris-HClバッファーまたはリン酸ナトリウムバッファーであるが、pH6〜10で機能する他のバッファーが適している場合もある。他のこのようなバッファーの例としては、炭酸ナトリウム/CO2；イミダゾール；2,4,6-トリメチルピリジン；MOPS；ジエチルバルビツール酸ナトリウム；N-エチルモルホリン；HEPES；TRICINE；EPPS；2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール；BICINE；ホウ酸ナトリウム及びグリシンが挙げられる。好適なpHは、約7.5〜8.5である。
【００３６】
２．濾過透析中にRNAがメンブレンを通って洗浄されるように十分な倍数の体積分のバッファー交換量の使用。好ましくは、少なくとも20倍、より好ましくは少なくとも30倍、さらに好ましくは少なくとも40倍、及び最も好ましくは50倍以上（例えば50〜100倍）のバッファー交換量である。
【００３７】
３．適当なメンブレンの選択。300KDa〜500KDaの孔径を有するポリエーテルスルホンメンブレン（polyethersulphone）を選択するのが好ましいが、他の好適なメンブレン（酢酸セルロース、ポリスルホン（polysulphone）、ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリアミド、変性PES（modified PES）、ポリビニリジンピロリジン（polyvinylidine pyrrolidine）、ポリフッ化ビニリジン（polyvinylidine fluoride, PVDF）、ニトロセルロース、及び3酢酸セルロースを含む）を用いても良い。
【００３８】
大き過ぎる孔径を選択するとプラスミドがメンブレンを通って失われ、また小さ過ぎる孔径を選択するとRNAがメンブレンを通過することができないので、孔径の選択は重要である。したがって、実際の孔径は、染色体外DNAが特に大きいか小さいかによって、50KDa〜1000KDa、より典型的には100KDa〜1000KDaの範囲で異なる。従って、実際の選択はプラスミドのサイズ及び操作条件によって異なる。
【００３９】
驚くべきことに、塩化カルシウムを使用する場合、所与の大きささのプラスミドについて通常予測されるサイズよりも小さい孔径を有するメンブレンを使用することが必要であることが分かった。
【００４０】
従って、5.9kbp及び7.7kbpのプラスミドの場合、100Kの孔径を有するメンブレンが特に効果的であることが分かった。
【００４１】
４．また出発膜間圧力差（TMP）も、高いプラスミド収率を達成するのに重要であることが分かった。好ましくは、出発TMPは10psi未満、より好ましくは8psi未満、さらに好ましくは6psi未満、及び最も好ましくは約5psiである。この圧力を15psi以下、最も好ましくは10psi以下に維持することが好ましい。
【００４２】
５．またプラスミドのロード量も、収率に大きな影響を及ぼすことが分かった。ロード量が以下の範囲の下限であれば好ましい：
300Kメンブレンの場合、核酸の総ロード量は200〜1000mg/ft2（10〜50mg/ft2のプラスミド）であった。従って、300Kメンブレンの場合、好適なロード量は30mg/ft2未満のプラスミド、より好ましくは20mg/ft2未満のプラスミドである；
500Kメンブレンの場合、核酸の総ロード量は1000〜3000mg/ft2（50〜150mg/ft2のプラスミド）であった。従って、500Kメンブレンの場合、好適なロード量は100mg/ft2未満のプラスミド、より好ましくは75mg/ft2未満のプラスミドであった。
【００４３】
塩化カルシウムの存在下では、ロードレベルは100Kメンブレンに対してそれほど影響を及ぼさないようであった。
【００４４】
上記観察結果1〜3を得た実験では、TMPをだいたい10〜20psiの範囲に維持し、クロスフロー流量（cross flow rate）をだいたい0.5〜1.0L/min/ft2に維持した。この組合せにより、16〜26L/h/m2の透過流量が得られた。上記4に記載したように、これにより、TMPが低いほどプラスミド収率が高くなることが分かった。
【００４５】
プラスミド収率を最大にするためには（ゲル層を形成するのに十分な時間、透過液ライン（permeate line）を循環させることによって）メンブレンを分極する必要があると考えられていたが、予想に反し、RNアーゼを用いないプロセスでは特に第１段階の限外濾過工程UF1においてこの動作は必要ではないことが分かった。
【００４６】
本発明の第２の態様に従って、タンジェンシャルフロー限外濾過プロセスにおいて高純度且つ高収率で染色体外DNAを生成する方法が提供される。この方法は、限外濾過装置の捕捉物チャンネル（retentate channel）の中に乱流を生じるよう設計されたスクリーンを利用するものである。
【００４７】
RNAのCaCl2沈降法は、RNA及びゲノムDNA汚染物質をプラスミド溶液から除去する簡単且つ効果的な方法であるが、CaCl2が存在すると、タンジェンシャルフロー限外濾過によってプラスミド溶液を濃縮又は濾過透析するときにプラスミドが失われる結果となる。
【００４８】
CaCl2はプラスミドをコンパクトにするので限外濾過メンブレンを通る時にプラスミドが失われることになると考えられる。
【００４９】
好適なマトリックス及びイオン対生成剤（ion pairing agent）を用いてCaCl2（RNAも）を除去することにより、後の逆相クロマトグラフィー工程が特に効果的な（高純度且つ高プラスミド収率の）分離を行うことが分かった。
【００５０】
本発明の第３の態様に従って、CaCl2沈降工程を含む精製プロセスにおいて高純度の染色体外DNAを高収率で生成する方法が提供される。この方法は、逆相クロマトグラフィー工程がCaCl2沈降工程の後に行われることを特徴とする。
【００５１】
CaCl2沈降工程の後に逆相カラムクロマトグラフィー工程を行うことによって、このプロセスは、CaCl2工程後の工程を１つに減らすことができる。
【００５２】
本発明の第４の態様に従って、DNAを他の細胞成分から精製する方法であって、DNAがpH7.3〜8.3でヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分離されることを特徴とする上記方法が提供される。
【００５３】
本発明のさらなる態様に従って、特許請求の範囲に記載された発明のいずれかの方法によって得られる、精製された染色体外DNA、医薬組成物、DNAワクチン、または遺伝子療法用の生成物が提供される。
【００５４】
本発明のさらに他の態様に従って、
BCAキットを用いてテストしたときに0.13重量％未満のタンパク質；
Q-PCR法を用いてテストしたときに0.11重量％未満のゲノムDNA；
LALテストを用いてテストしたときに5EU/mg未満の内毒素；及び
HPLCアッセイを用いてテストしたときに1.0重量％未満の残留RNA；
を含む、精製された染色体外DNAが提供される。
【００５５】
本発明について、単なる例として、以下の詳細な説明及び実施例を参照しながらこれから説明する。
【００５６】
好適な実施形態の詳細な説明
予期せぬことに、まずRNA消化を行うことなくタンジェンシャルフロー限外濾過プロセスにおいてRNAをDNAから分離することができることが分かったので、基本的なプロトコールを考案し、細胞成分（特にRNA）の除去に対してどの要因が大きな影響を及ぼすかを決定するために１つ以上の要因を変更した。
【００５７】
幾つかの他の分離ルート（１A、１Bおよび１C）を示す図を図１a及び図１bに記載し、さらに十分なプロセスの詳細を以下により詳しく説明する。
【００５８】
RNアーゼを用いないプラスミド精製プロトコール：300gスケール
１．細胞の再懸濁
再懸濁バッファー（2.5L）（25mM Tris/10mM EDTA/55mMデキストロースpH8.0）を細胞ペースト（300g）に加えて細胞を再懸濁した。
【００５９】
２．アルカリ溶解
リシスバッファー（4.17L 0.96% NaOH, 830ml 6% SDS）を細胞懸濁液に加えて均質化するまで混ぜ、ライゼートを作製した。
【００６０】
３．酢酸カリウム沈降
3M酢酸カリウム（2.5L）をライゼートに加え、25〜35分間攪拌し、4600RPMで20分間遠心分離した。Miraclothの2重層に通して上清を別の容器に移した。細胞ペレットの重さを量り、捨てた。1x1.2μm Sartopure PP及び1x0.45/0.2μm Sartobran Pフィルタに上清を通過させた。濾液は清澄化ライゼートである。
【００６１】
４．限外濾過
材料：
3x5sq ft 300K PESを備えたMillipore装置（Omega Centrasette、オープンチャンネルメンブレン）。
【００６２】
これは、操作の合間には0.1M NaOH中に保存される。
【００６３】
Millipore Masterflex蠕動ポンプ。
【００６４】
濾過透析バッファー：20mM Tris pH7.5
調製システム：
透過液ラインの中のメンブレンカセット及び容器の中身を空にする。
【００６５】
容器に濾過透析バッファー（2L）を充填し、透過液ラインを閉じたまま捕捉物ラインに循環させる。
【００６６】
透過液ラインの中のメンブレンカセット及び容器の中身を空にする。
【００６７】
容器に濾過透析バッファー（2L）を充填し、バッファーのボトルを容器に接続し、濾過透析バッファー（5L）を透過液ラインに一気に流す。透過液のpHをチェックする。
【００６８】
ゲル層の形成：
システムを空にする。
【００６９】
容器に約1.8Lの清澄化ライゼートを充填し、ライゼートの入った樽をシステムに接続する。
【００７０】
出発圧力10psiで30分間、ゲル層が形成されるように、透過液ラインをライゼート容器に戻しながら循環させる。
【００７１】
捕捉物圧（retentate pressure）は急激に上昇するので、これを監視する。捕捉物圧は20psiを越えてはならない。超えたら20psiに下げる。
【００７２】
濃度：
ライゼートを500mlに濃縮する。濃縮透過液を回収する。
【００７３】
濾過透析：
約50倍量の濾過透析バッファー（25L）を用いて20psiで濾過透析を行う。連続濾過透析モードを用いる。その際、同じ速度で濾液を新しいバッファーに取り替える。濾過透析透過液を容積5Lのボトル5本に回収する。体積、pH及び伝導率を記録する。
【００７４】
回収：
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開いて透過液ラインを閉じ、容器及びカセットの中身を30分間循環させる。UF装置の中身を容積500mLのボトルに排出する（UF1-D透過液）。
【００７５】
新しい濾過透析バッファー（500ml）を容器に加え、30分間循環を行う。装置の中身を容積500mLのボトルに排出する（UF1-D透過洗浄液1（permeate wash 1））。
【００７６】
上記動作を繰り返す（UF1-D透過洗浄液2）。
【００７７】
UF1-D透過液、透過洗浄液1及び透過洗浄液2をプールしておく。
【００７８】
1xGelman Science 0.45μmフィルタ（及び必要であれば1xN66 Ultipor 0.2um）で捕捉物のプールを濾過する。
【００７９】
このプロトコールの操作条件の1つ以上を変更したときの影響を、以下の実施例１〜１０を参照しながら記載し、実施例１１〜１５はさらにバリエーションを表す。
【００８０】
実施例１（イオン強度の影響-パートI）
10mM Tris+0.45M NaCl濾過透析バッファー（pH8.5、伝導率41.3mS）を0.1M Tris濾過透析バッファー（pH8.5、伝導率6.89mS）に取り替えたところ、非常に重要な成果が得られた。
【００８１】
この低イオン強度バッファーを使用したとき、大量のRNAの除去が観察された。これは、イオン交換HPLCによってライゼートにはRNA及びプラスミドの両方が存在していた（図２a）が濾過透析透過液サンプルにはRNAが存在しプラスミドは存在しなかった（図２b）ことにより、明らかであった。捕捉物のプールも、ライゼートに比べてRNAが除去されていた（図２c）。
【００８２】
上記結果は、逆相HPLCによりRNAアッセイを実施することによって確認及び定量された。これらの結果は、ライゼート中に見られるRNAの32％が濾過透析透過液中に存在したこと、ライゼート中に見られるRNAの43.7％が捕捉物のプール中に存在したこと、及びRNAの0.9％が濃縮透過液中に見られたことを示した。
【００８３】
本発明者は、理論によって限定したいわけではないが、これらの結果は、低分子量RNAが初めはゲル層の中に含まれているが、濾過透析バッファーによって再び可溶化され、限外濾過メンブレンを通過することができるようになることを示唆している。
【００８４】
実施例２（イオン強度の影響-パートII）
RNA除去に対するイオン強度の重要性を決定するために、さらなる実験を行った。異なるイオン強度の3つのTrisバッファーを比較した。全てのTrisバッファーはpH7.5であったが、以下に記載するように異なる濃度のものであった：
500mM（伝導率25.3）
100mM（伝導率6.89）
10mM（伝導率0.33）。
【００８５】
HPLCトレース（ライゼートと捕捉物のプール）を比較したところ、イオン強度が低いほど、より多くのRNAが除去されることが分かった（図３a〜３f）。
【００８６】
実施例３（pHの影響）
RNA除去に対してイオン強度が影響を及ぼすと推定されたので、RNA除去に対するpHの影響を調査した。調査は、pH6、7.5及び9で10mM Trisバッファーに対して行った。ここでも、HPLCトレース（ライゼートと捕捉物のプール）を比較することによって、pH6に比べてpH7.5〜9の方がRNAをより多く除去したが、pH9の結果はpH7.5に比べて良くはないことが分かった（図４a〜４d及び図３e、３f）。
【００８７】
実施例４（透過流束及び膜間圧力差に対するイオン強度の影響）
濾過透析バッファーのイオン濃度は、RNAの除去に影響を及ぼすだけでなく、透過流束及び膜間圧力差（TMP）にも影響を及ぼすことが分かった。従って、透過流束は濾過透析の開始時はだいたい40L/m2/hであったが、バッファーをどんどん交換していくにつれ、この流束は変化した。500mMバッファーの場合、透過流束は約30L/m2/hまで低下したが、100mMバッファーの場合は約70L/m2/hまで上昇し、及び10mMバッファーの場合は約140L/m2/hまで上昇した。これらの知見は、イオン強度の低いバッファーでは5倍もの早い速度で処理を行うことができることを示す、という点で重要である。これらの結果を図５にグラフで示す。
【００８８】
また、TMPは出発圧力（約20）から、100mMバッファーの場合は約17に低下し、10mMバッファーの場合は約10に低下した。これは、TMPが一定に保たれた500mMバッファーとは対照的である。これらの結果を図６に示す。
【００８９】
実施例５（交換量の影響）
驚いたことに、10mMバッファーの場合、かなりの量のRNAは、バッファーを32回交換した後でもなおメンブレンを通過したことが分かった。続いて、RNAの溶出がいつ止まったかを測定するためにさらに実験を行った。
【００９０】
20℃保存から清澄化ライゼート（500ml）を-取り出し、解凍し、0.22μmフィルタで濾過した。濾過したライゼート150mlを、TFF装置を備えた容器に入れ、クロスフロー流量550ml/min/ft2でポンプでシステムの回りに流した。TFF装置の捕捉物バルブを部分的に閉じることによって、TMPを0.6バールに設定した。ライゼートを20分間循環させてメンブレンを分極した。容器の内容物を約25mlに濃縮した後、濾過透析バッファー（1600ml）に対して濾過透析した。
【００９１】
濾過透析の終了時に、透過液ラインを閉じ、捕捉物バルブを開いて、TMPをなくした。次に、捕捉物を10分間循環させてメンブレンを洗浄した後、きれいなボトルに回収した。さらに30mlの濾過透析バッファーを10分間ポンプでシステムの回りに流してメンブレンを洗浄した後、回収した。合計で２回洗浄を行った。プロセス中ずっとTMP及び透過流束を測定し、RNA除去の指標としてイオン交換HPLC用にサンプルを取った。
【００９２】
濾過透析時間をさらに延長すると、ライゼート中に存在するRNAの2％を除く全てを除去することができることが分かった（図７a及び７b）。さらに図７bからは、残留RNAピークがプラスミドピークのすぐ下にあることは明らかであり、このことは、残留RNAが全て高分子量RNAであることを示している。このデータは、サンプルから全てのRNAを除去するために、高分子量RNAの除去に効果的なプロセス（例えばCaCl2沈降法等）と平行してこのプロセスを用いることができることを示している。
【００９３】
実施例６（プラスミドロード量の影響）
本発明者は、思いがけず、メンブレンについたプラスミドの量を減らすことによって、プラスミドDNAからRNAをさらに多く分離することができる、という結果に行きついた。実際に、300KDaメンブレンへのプラスミドロード量を22.2mgプラスミド/ft2から11.1mg/ft2に減らしたところ、かなり低いレベルのRNAを含むプラスミドDNAを得ることができた。
【００９４】
結果を図８a〜８iに示す。
【００９５】
説明のために、一般的なプロトコールに従って、300Kメンブレンで7.6Kbpプラスミドを50倍量の20mM Tris pH7.5に対して透析した。メンブレンft2あたり11.1mgの割合でロードしたサンプルのIE HPLCクロマトグラフを、図８a〜８hに示す。
【００９６】
図８aは、ライゼートである。
【００９７】
図８bは、濃縮透過液である。
【００９８】
図８cは、プールした濾過透析透過液（diafiltration permeate）（1〜10倍量）である。
【００９９】
図８dは、プールした濾過透析透過液（11〜20倍量）である。
【０１００】
図８eは、プールした濾過透析透過液（21〜30倍量）である。
【０１０１】
図８fは、プールした濾過透析透過液（31〜40倍量）である。
【０１０２】
図８gは、プールした濾過透析透過液（41〜50倍量）である。
【０１０３】
図８hは、捕捉物のプールである。
【０１０４】
比較として、図８iは、メンブレンサンプルft2あたりプラスミド22.2mgの捕捉物のプールである。
【０１０５】
これらの結果が示すことは、ロード量が低いほど、プラスミドはRNAを含まないということである（図８hを図８iと比較されたい）。
【０１０６】
またIE HPLCクロマトグラフは、RNAが濾過透析量の増加とともにどのように除去されるかも示す（図８c〜図８g、そして図８a及び図８bを比較されたい）。従って、ライゼート中において（図８a）、左側の第一のピーク（タンパク質）の後に広いRNAピークが見られ、プラスミドピーク8.057及び8.356も目立っている。2つのプラスミドピークはそれぞれ開環状DNA及びスーパーコイル構造のDNAのピークである。濃縮透過液中において（図８b）、タンパク質ピークは見られるが、RNAピークは非常にわずかしか見られない。このことは、RNAが最初はゲル層の中に含まれることを示している。加えられる濾過透析バッファーの量が増えるに従い、溶出されるRNAの量は大きく変化する。10倍量を加えた後では（図８c）、メンブレンを通して低レベルのRNAしか除去されず、20倍量を加えた後では、pH及び伝導率の低下により証明されるように濾過透析バッファーが本当に効力を発揮し、メンブレンを通るRNAのピークはなくなる（cleared）（図８d）。30〜50倍量では、RNAレベルは次第に低くなり、50倍量がメンブレンを通過したころには、RNAレベルは殆ど無い状態となり、濾過を止めることができる。捕捉物のプール（図８h）は、純粋なプラスミドを示し、RNAを含んでいなかった。
【０１０７】
本発明者は、思いがけないことに、より大きな孔径を有するメンブレンを用いれば、プラスミドロード量をより大きくすることができる、という結論に行きついた。例えば、500KDaメンブレンを用いた場合は、150mgプラスミド/ft2もの非常に高いロード量を用いることができる。実際には、初期の結果は、メンブレンの面積が広いほど使用することができるプラスミドのロード量が大きくなることを示唆しているので、メンブレンの総面積自体が重要である。
【０１０８】
実施例７（追加的な仕上工程）
イオン強度の低いバッファーを十分な交換量で用いると（10mM、Tris pH7.5及び60倍体積の交換量）、溶解直後に存在していたRNAの98.6％を除去することができたが、本発明者等は、第２の他の技法により、RNAが検出不能になるレベルにまで残留RNA（特に高分子量RNA）を除去することができるか否かを調べた。
【０１０９】
本発明者等は、限外濾過工程の後に、クロマトグラフィーをベースとした手法を行った。テストしたクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシアパタイト工程であった。従って、RNAが流動中に除去されると同時にプラスミド結合が最大となるように、RNAの結合を防ぐ条件（0.3M Na2HPO4 pH7.8）下で、捕捉物のプールをヒドロキシアパタイトカラム（Bio-Rad MacroPrep Ceramic Type II、ビーズ径=20μM）に充填した。次に、プラスミドを溶出したところ、93.4％の回収率であった。イオン交換HPLCによって、RNAは検出されなかった。
【０１１０】
また興味深いことに、本発明者等は、RNAをプラスミドDNAから分離するためのヒドロキシアパタイトの効果的な使用にとってpHが非常に重要である、という結論に達した。プラスミドDNAからのRNAの分離に対してpHが及ぼす影響を示すこれらの結果を実施例１０に示す。実施例１０は、分離プロセスにおいて2種類のバッファーを用いたシステムを用いることの利点を示す。
【０１１１】
実施例８（チャンネルの影響）
オープンチャンネルが、ゲル層（プラスミドDNAがメンブレンを通過して透過液中に入るのを防ぐ）をより形成させやすくすることは、一般に受け入れられている。実際に、オープンチャンネルカセットの使用は、このプロセスを首尾良く操作するのに大変重要である、とさえ言われていた。
【０１１２】
本発明者らは、限外濾過工程終了時にメンブレンからプラスミドを回収するが難しかったが、ひどく汚れたメンブレンが核酸消化によって修繕することができる、ということを見出したので、ゲル層に結合した核酸は実際にはメンブレンに不可逆的に結合していると推定した。この結合を破壊することができるか否かを確かめる努力を行っている際に、捕捉物チャンネルの中に乱流を生じさせるよう設計されたスクリーンを用いた。このプロトコールの他の点は以下に記載する通りであり、T型スクリーンチャンネル（T-screened channel）「Omega」メンブレンを用いた。
【０１１３】
清澄化ライゼート（RNアーゼで処理したもの）180mlを、Minimシステムの容器の中に入れた。ポンプのスイッチをオンにして、100ml/分のクロスフロー流量を与えた。捕捉物バルブをやや閉じて、TMPを0.8バールとした（入口圧1.5バール、出口圧0.1バール）。このシステムを20分の間、全体循環モードで操作し、ゲル層を形成させた。透過液及び容器から、HPLC分析用にサンプルを取った。透過液ラインをきれいなボトルに入れ、ライゼートを濃縮して最終体積を30mlとした。次にこの濃縮物を20倍量（600ml）の10mM Tris/0.45M NaCl pH8.5に対して濾過透析した。透過液サンプル（各150ml）を、濾過透析中に4つ及び濃縮中に1つ回収し、HPLCにより分析した。捕捉物バルブを開き、透過液ラインをしっかり締めてTMPを除去した。このシステムを10分間放置してゲル層を溶解させ、プラスミドを回収した。10分後、容器から捕捉物を回収して、30mlの濾過透析バッファーと取り替えた。これを上記のように10分間循環させ、別の容器の中に回収して、「洗浄液１」とラベルした。洗浄工程を繰り返した。捕捉物回収物（retentate harvest）、洗浄液１、及び洗浄液２の量を測定して、HPLC分析用にサンプルを取った。260nm及び280nmでの吸光度も測定し、260/280比を計算した。
【０１１４】
スクリーンチャンネルを用いた影響を測定するために、2つの基準を用いた。それは、プロセスからのプラスミドの回収、及びHPLCクロマトグラムの目視検査による汚染物の除去である。
【０１１５】
クロマトグラムから、幾つかの結論が導き出された。20分間循環を行った後、プラスミドはほとんどメンブレンを通過しなくなった（図９a）。容器中のプラスミドの合計量は、出発材料中では16.33mgであったのに対し、12.78mgであった（図９b及び９c）。従って、3.55mgのプラスミドがゲル層中に含まれると推測することができる。
【０１１６】
透過液サンプルの目視検査（図９d〜９h）により、汚染物質はメンブレンを通過するがプラスミドは通過しないことがわかった。捕捉物回収物及び洗浄液からのクロマトグラム（図９i〜９k）は、汚染物質が良好に除去されたことを示している。
【０１１７】
プラスミド全体のうち82％が捕捉物回収物中で回収され、13.7％は洗浄液中で回収された。これは、捕捉物回収物及び洗浄液を組み合わせると、オープンチャンネルカセットで見られる回収率（典型的には70〜80％）に比べてかなり高かった。
【０１１８】
一般的なプロトコールで既に記載されたようなRNアーゼを用いないプロセスにこのプロセスを適用した場合も、高いプラスミド収率が得られた。
【０１１９】
プラスミド収率を上げるためのスクリーンチャンネルの使用は、あらゆる限外濾過プロセスにだいたい応用できることは明らかであり、本願発明の独立した態様である。
【０１２０】
実施例９（追加的なクロマトグラフィー工程の影響）
記載されたRNアーゼを用いないプロセスは、低分子量RNAを除去するのに特に効果的であるので、本発明者等は、他のRNA除去プロセス（特に高分子量RNAを除去することが分かっているもの）を、RNアーゼを用いないプロセスと組み合わせて、限外濾過工程の前又は後の工程として用いることができるか否かを決定しようと考えた（図１bを参照されたい）。そこで、本発明者等は、限外濾過後に塩化カルシウム沈降工程を行った場合の影響を測定するために以下の実験を行った。
【０１２１】
限外濾過中に低分子量RNAを除去するために、既に記載された一般的なプロトコール（100mM Tris pH7.5バッファーを用いた）に従ってロードする材料を調製した。この後に、塩化カルシウム沈降工程を行った（1.4M pH7.5）。
【０１２２】
体積１の捕捉物のプールに、体積１の2.8M塩化カルシウムの100mM Tris（pH7.5）に加えた。この混合物を室温にて10分間攪拌およびインキュベートした。沈殿した物質を0.22μmフィルタで濾過して除去した。
【０１２３】
塩化カルシウム塩は、タンジェンシャルフロー濾過及びイオン交換クロマトグラフィーの両方の邪魔になることが知られている。従って、組み合わせたプロセスを満足のいくものにしたいなら、塩化カルシウムの除去を行うことが必要となる。本発明者等は、逆相クロマトグラフィーを用いてプラスミドDNAを塩化カルシウム塩から分離することができるだけでなく、適当なイオン対生成剤を選択することによって、RNA及び塩化カルシウム塩の両方を除去することを見い出した。
【０１２４】
クロマトグラフィーに影響を及ぼす様々な要因を調査することによって、イオン対形成剤及びマトリックス（matrix）がRNAからのプラスミドDNAの分離にとって重要であることが分かった。
【０１２５】
ただし、塩化カルシウム塩のみを除去したい場合は、より簡単なシステムを使用することができる。
【０１２６】
2つの逆相培地（reversed medium）が、塩化テトラブチルアンモニウムと組み合わせるのに適していることが分かった。それらは、
Puresynより供給されるPolyflow（粒径55μm、非多孔性の有標ポリマーである）、及び
Porosにより供給されるPoros 50R1（粒径50μm、多孔性のポリスチレンジビニルベンゼンポリマーである）。
【０１２７】
塩化テトラブチルアンモニウム（TBAC）の好適な濃度は2mMであった。
【０１２８】
これら2つのマトリックスのための好適な溶出条件は異なる。
【０１２９】
Polyflowの場合、RNA除去は10％エタノール及び2mM TBACを用いて行い、プラスミド溶出は30％エタノールを用いて行った。
【０１３０】
Poros 50R1の場合、RNA除去は25％エタノール及び2mM TBACを用いて行い、プラスミド溶出は40％エタノールを用いて行った。
【０１３１】
いずれのケースでも、プラスミド回収率は高く（約80％）、非常に低レベルのRNAしか検出されなかった。
【０１３２】
最も良い結果は低いロード量で得られた。
【０１３３】
逆相クロマトグラフィーの適用は、それ自体が、塩化カルシウム沈降法と組み合わせて、RNA分離技法として（本発明のタンジェンシャルフロー限外濾過法と組み合わせて用いるか否かに関係なく）、及びプラスミドの収率を上げる手段としての可能性を持つことを明らかに示す。
【０１３４】
実施例１０（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの使用）
多くのヒドロキシアパタイト媒体を調べて、染色体外DNAからRNAを分離するこれらの能力を測定した。pH、バッファーのタイプ、溶出プロトコール、カラムの許容量、及び流量が及ぼす影響を全て調査した。方法論は単純なものであり、所与の流量でバッファーを用いてヒドロキシアパタイトカラムを平衡化し、捕捉物のプール（バッファーで希釈したもの）をカラムに入れ、バッファーで洗浄し、一次勾配上で泳動させ、カラムを再利用するものである。
【０１３５】
これらの実験から得た大きな知見は、以下の通りである。
【０１３６】
pHは、染色体外DNA及びRNAを首尾良く分離するのに非常に重要であることが分かった。MacroPrepセラミックヒドロキシアパタイトII型40μm（Bio Rad）の場合、最適pHは7.8であり（図１０cを参照されたい）、0.2pH単位というわずかな差が分離に影響を及ぼした。このように、pH6.8（図１０a）及びpH8.8（図１０d）では分離は見られず、pH7.6（図１０b）では、分解能（resolution）は大きく低下した。
【０１３７】
また、バッファーのタイプも重要であることが判明し、リン酸二ナトリウムの方が、可溶性の高いリン酸二カリウムバッファーに比べてパフォーマンスが良かった。実際には、リン酸二ナトリウムの分離特性をリン酸二カリウムの高い可溶性と組み合わせた２重溶出工程を用いることにより、最良の結果が得られた。ヒドロキシアパタイトカラムをpH7.8の10mMリン酸二ナトリウムで平衡化及び洗浄した後、pH7.8の0.35Mリン酸二ナトリウムでRNAを溶出した。プラスミドDNAをpH7.8の0.2Mリン酸二カリウムで溶出したところ、回収率は78.6％であった（以下の表１を参照したい）。
【０１３８】
【表１】
0004422406.tif 000002
【０１３９】
RNA溶出バッファーをpH7.8の0.3Mリン酸二ナトリウムと取り替えたところ、同様のプラスミド回収率（76.2％）が得られたが、RNA除去はそれほど効率良く行われなかった。プラスミド溶出バッファーをpH7.8の0.6mMリン酸二ナトリウムバッファーと取り替えたところ、プラスミドの回収率は低かった（65.7％）。
【０１４０】
表１に記載した溶出工程条件を用いてカラムmlあたり合計0.5mgを超える核酸をカラムにロードしたところ、RNAの溶出ピークにおいて56〜58％のプラスミドが損失した。
【０１４１】
また、0.5mg/mlの合計核酸ロード許容量において、流量を2ml/分としたところ、RNA溶出画分において7.7％の大量のプラスミド損失につながった。
【０１４２】
最適な条件は以下の通りであった：
１．pH7.8の10mM Na2HPO4でカラムを平衡化及び洗浄、
２．pH7.8の0.35M Na2HPO4でRNAを溶出、
３．pH7.8の0.2M K2HPO4でプラスミドDNAを溶出、
４．流量0.5ml/分、
５．カラム1mlあたりの合計核酸量0.5mgまたはカラム1mlあたりのプラスミド25.4mgのカラム許容量。
【０１４３】
これらの条件によって、プラスミド回収率は78.6％となり、生成物はRNAを含まないようであった（イオン交換クロマトグラフィーを使用）。
【０１４４】
Merckのヒドロキシアパタイトを用いたところ、最適pHが7.5でありNa2HPO4バッファーは0.25Mで最良であるという以外は、同様の結果が得られた。目的は、カラム許容量を大きくするためにプラスミドの結合を最大化することである。RNAはカラムに結合して大量に存在するので、RNAはヒドロキシアパタイトの結合許容量の大部分を占める。しかし、RNAはプラスミドに比べてカラムへの親和性が低いので、高リン酸塩条件を用いて、カラムへのRNAの結合を防ぎ、その結果、プラスミド結合を最大化する。これらの条件は、BioRadの場合はpH7.8の0.35M Na2HPO4及びMerckの場合はpH7.5の0.25M Na2HPO4である。これらの条件下において、300〜500μg/mlの許容量を達成することができる。
【０１４５】
図１bを参照して例示される他のルートでは、異なる純度及び異なる収率のプラスミドDNAが得られる。
【０１４６】
このように、例えばルートBとして示すプロセスでは、最大96％の内毒素を除去し、最大99.89％のゲノムDNAを除去したが、ルートCとして示すプロセスでは最大99.97％のゲノムDNAを除去した。
【０１４７】
従って、多くの要因に基づいて、特定のプロセスが選択される。
【０１４８】
これまでの実施例では限外濾過工程は、RNアーゼを用いないプラスミド精製プロトコール（前に概説した300gスケール）に従って行われ、30分間循環を行うことによるゲル層の形成を含むものであったが、本発明は、循環が不要であることを見出した。これを以下の実施例１１に示す。
【０１４９】
実施例１１（UF、循環なし）
a)対照（RNアーゼを用いる）
アルカリ溶解中にRNアーゼを加え、循環を行わずに限外濾過メンブレンに清澄化ライゼートをロードした。
【０１５０】
構築物＝7.8kbプラスミド
メンブレン＝300K
プラスミドロード量＝183mg/ft2
TMP＝10psi
濾過透析バッファー＝50倍量の10mM Tris pH8
結果：  プラスミド回収率＝52％
濃縮/濾過透析中のプラスミドの損失＝38％
b)比較（RNアーゼを用いないプロセス）
構築物、メンブレン、及び濾過透析バッファーは対照のところで記載したものを使用した。プラスミドロード量は異なり（記載）、また5psi及び10psiのTMPの両方において結果を得た。以下の表２を参照されたい。
【０１５１】
【表２】
0004422406.tif 000003
【０１５２】
a）対照とb)RNアーゼを用いない比較プロセスとではプラスミド損失率に大きな差があることは、RNアーゼを用いないプロセスにおいて循環が不要であることを示している。
【０１５３】
理論によって限定したいわけではないが、RNアーゼを用いないプロセスにおいて高レベルのRNAが存在すると、おそらくこの高レベルのRNAによって、「即席の」ゲル層が形成される可能性がある。この点において、RNアーゼを用いないプロセスにおけるライゼートはおよそ98重量％RNAに対しおよそ2重量％の染色体外DNAを含むことに注目されたい。
【０１５４】
実際に、この仮説は、以下の実施例１２（プラスミドロード濃度の影響を調べた）で得られた結果によって支持される。
【０１５５】
実施例１２（ロード濃度の影響）
この実施例において、プラスミドロード量を減らすことによる影響を調べた。これらの結果を以下の表３に示す。
【０１５６】
【表３】
0004422406.tif 000004
【０１５７】
これらの結果から明らかなのは、ライゼートロード物中のプラスミド及びRNAの両方を希釈することによって、プラスミド損失は増加するが、プラスミド回収率は高いままであることである。
【０１５８】
実施例１１及び１２で得た結果を見て、本発明者等は、2回目の限外濾過（UF2）（すなわちRNAの大分部が既に除去されたもの）において循環が必要であるか否かを調査することにした。プロトコール及び結果を以下の実施例１３に記載する。
【０１５９】
実施例１３（2回目のUF工程での循環）
この実施例では、
i）出発材料中のプラスミドの濃度、
ii）TMP、及び
iii）プラスミドのサイズ
の影響を調べ、これらがプラスミド回収率にどのような影響を及ぼすかを測定した。
【０１６０】
UF2を用いて、TMAE後のプール（すなわちクロマトグラフィーを用いた精製工程を行ったもの）の体積を減らした。
【０１６１】
材料を以下に列挙する。
【０１６２】
材料
2〜8℃で保存した50mM Tris/0.74M NaCl pH8.5中にプラスミド（7.7Kbp）を含むTMAE後のプール。
【０１６３】
2〜8℃で保存した50mM Tris/0.74M NaCl pH8.5中にプラスミド（5.5Kbp）を含むTMAE後のプール。
【０１６４】
希釈剤として用いたバッファーは50mM Tris/0.74M NaCl（pH8.5）であった。
【０１６５】
0.5M NaOHを用いて限外濾過カセットを洗浄し、製造業社の指示に従って0.1M NaOH中で保存した。
【０１６６】
[実験]
50mM Tris/0.74M NaCl（pH8.5）を用いて、TMAE溶出液を必要な濃度にまで希釈した。HPLC分析（Dionex）及びA260測定用にサンプルを取った。容器の中に500mlを入れ、残りは、その500ml容器に接続されたボトルに入れた。ポンプのスイッチをオンにして、900ml/分のクロスフロー流量（QR）を与えた。捕捉物バルブをやや閉じて、必要な膜間圧力差（TMP）とした。透過液ラインをきれいなボトルに入れ、ライゼートを濃縮して最終体積を250mlとした。全部で4画分の透過液を回収した（体積は出発材料のプラスミド濃度によって異なる）。HPLC分析（Dionex）及びA260測定用にサンプルを取った。
【０１６７】
捕捉物バルブを開き、透過液ラインをしっかり締めてTMPをなくした。システムを10分間循環させたままにしてメンブレンに結合したプラスミドを溶解し、プラスミドを回収した。10分後、UF2捕捉物を容器から回収して、100mlの50mM Tris/0.74M NaCl（pH8.5）に交換した。これを前と同様に10分間循環させ、別の容器の中に回収して、「洗浄液１」とラベルした。洗浄工程を2回繰返し、回収物を「洗浄物2」及び「洗浄物3」とラベルした。UF2捕捉物、洗浄液１、洗浄液２、及び洗浄液３の体積を測定し、HPLC分析（Dionex）及びA260測定用にサンプルを取った。
【０１６８】
以下の表４に記載した条件下で、実験を行った。
【０１６９】
【表４】
0004422406.tif 000005
【０１７０】
結果を以下の表５に記載する。
【０１７１】
【表５】
0004422406.tif 000006
【０１７２】
これらの結果は、限外濾過メンブレンの分極は不要であることを示唆している。
【０１７３】
RNアーゼを用いない染色体外DNA精製プロセスにおいて、アルカリ溶解後に残るRNAのレベルは特に高い（プラスミドDNAに比べて重量比で約20倍）ので、本発明者等は、限外濾過前にRNAレベルを低下させる方法を考察した。
【０１７４】
図１ｂのcを参照すると、本発明者等が限外濾過工程の前にCaCl2を用いることを既に提案していたことは明らかであろう。この工程は、かなりの量のRNAを除去したので、塩化カルシウムの存在下で限外濾過工程を最適化するためにさらに調査した。これらの調査を実施例１４に記載する。
【０１７５】
実施例１４（CaCl2及び孔径）
CaCl2を用いたこれまでの実験は300Kメンブレンを介してかなりの量のプラスミドが失われたことを示唆するので、本発明者等は、CaCl2がプラスミドを「凝縮している（condensing）」という仮説を立てた。そのため、より小さな孔径（100K）を有するメンブレンを用いて試した。しかし、これだけでは、予想よりも低いプラスミド回収率となった。これを、低いTMPを用いて矯正した（5psi対10psi）。
【０１７６】
a）遠心分離を用い、及び
b）ふるいを用いて、
細胞破片の分離を行った。
【０１７７】
循環を行った又は行わない比較実験を以下に表す：
a）塩化カルシウム沈降後のライゼートをUF1にロードする（循環あり）
50gの調製物中でのアルカリ溶解によって、清澄化ライゼートを作製した。
【０１７８】
体積１の2M CaCl2ストック溶液を体積１の清澄化ライゼートに攪拌しながら加えた。この混合物を室温にて10分間インキュベートした。沈殿物を5000rpmにて10分間、遠心分離した。上清を0.45/0.2μm Sartobran300フィルタに通した。
【０１７９】
Pall Filtron Centramate装置に1ft2 100K Omega Centramateオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を除去して空にし、10mM Tris pH8.5で洗浄した。
【０１８０】
容器に50g調製物から得た清澄化ライゼート約400mlを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。透過液ラインを容器に接続することによって、循環を行った。Watson Marlowポンプを158rpmに設定し（クロスフロー流量1L/分/ft2）、TMPが5psiとなるように捕捉物バルブを調節した。循環を20分間続け、その間、TMPが10psiを超えないようにした。
【０１８１】
透過液ラインを2Lボトルに接続することによって、清澄化ライゼートを75mlにまで濃縮した（濃縮透過液）。
【０１８２】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーに交換されるように容器を10mM Tris pH8.5溶液のボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析透過液を5x1 Lボトル中に回収した。30倍量（3L）の10mM Tris pH8.5を加えた後、20倍量（2L）の50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5を加えた。
【０１８３】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉鎖して、UFシステムの中身を30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０１８４】
容器に100mlの50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5を充填し、30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０１８５】
UF1捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、0.45/0.2μm Sartobran 300フィルタに通した。
【０１８６】
次に、300mlの0.5M NaOHを30分間循環させることによって、UF1系から不要なものを取り除いた。
【０１８７】
UF1系を0.1M NaOH中で保存した。
【０１８８】
2x50g調製物から得た清澄化ライゼートをプールし、塩化カルシウムで沈殿させ、UF1で処理して、UF1ロード量が2倍になるようにして実験を繰り返した。
【０１８９】
b）塩化カルシウム沈降後のライゼートをUF1にロードする（循環なし）
i）遠心分離を用いて細胞破片を除去する
100g調製物中でのアルカリ溶解によって清澄化ライゼートを作製した。
【０１９０】
体積１の2M CaCl2ストック溶液を体積１の清澄化ライゼートに攪拌しながら加えた。この混合物を室温にて10分間インキュベートした。沈殿物を4600rpmにて20分間、遠心分離した。上清を5μm Sartopure PP2に通した後、0.45/0.2μm Sartobran Pフィルタに通した。
【０１９１】
Pall Filtron Centramate装置に1ft2 100K Omega Centramateオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、10mM Tris pH8.5で洗浄した。
【０１９２】
容器に100g調製物から得た清澄化ライゼート約400mlを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。Watson Marlowポンプを158rpmに設定し（クロスフロー流量1L/分/ft2）、TMPが5psiとなるように捕捉物バルブを調節した。清澄化ライゼートを75mlにまで濃縮し、濃縮透過液を容積2Lの容器に回収した。TMPが10psiを超えないようにした。
【０１９３】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーで交換されるように容器を10mM Tris pH8.0バッファーのボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析透過液を5x1 Lボトル中に回収した。30倍量（3L）の10mM Tris pH8.0を加えた後、20倍量（2L）の50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5を加えた。
【０１９４】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、UFシステムの中身を30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０１９５】
容器に75mlの50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5を充填し、30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０１９６】
UF1捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、0.45/0.2μm Sartobran 300に通した。
【０１９７】
次に、300mlの0.5M NaOHを30分間循環させることによって、UF1系から不要なものを取り除いた。
【０１９８】
UF1系を0.1M NaOH中で保存した。
【０１９９】
ii）濾過を用いて細胞破片を除去する
プラスミド構築物：5.9kbp大腸菌宿主細胞系：
-70℃で保存した細菌細胞ペースト100gを木槌で砕いて小片にした。室温で、再懸濁バッファー500mlをBellco再懸濁容器に加えた。砕いた細胞ペーストを容器に加え、電磁撹拌機（設定8）で室温にて1時間攪拌した。
【０２００】
溶解する直前に、冷室の中で、6% SDS（166ml）に冷たい0.96％ NaOH（834ml）を加えた。Heidolphオーバーヘッド攪拌機を備えた容積4Lのビーカーに細胞懸濁液を移し、冷室に入れた。この細胞再懸濁液に溶解混合物を加え、40rpmにて30分間攪拌した。
【０２０１】
ライゼートに3M酢酸カリウム（500ml）を加え、60rpm、4℃にて30分間攪拌した。
【０２０２】
ライゼートの20mlサンプルを取り、MSE Mistral 2000で、2500rpmにて10分間遠心分離を行った。上清は清澄化ライゼートであった。
【０２０３】
体積１のライゼートに、体積0.66の3M CaCl2ストック溶液を攪拌しながら加えた。この混合物を室温にて10分間静置した。
【０２０４】
混合物を再び攪拌し、メッシュフィルタ（直径350mm、孔径200μm）を設置したPlastokホルダに注いだ。重力下で容積5Lのビーカー中に濾液を回収した。
【０２０５】
メッシュに通した濾液をポンプでMillipore CE15 奥底フィルタ（depth filter）カートリッジに通し、濾液を容積5Lのビーカー中に回収した。
【０２０６】
奥底フィルタに通した濾液をポンプで0.45/0.2μm Sartobran Pフィルタに通した。この物質を、塩化カルシウム沈降後のライゼートと呼んだ。
【０２０７】
塩化カルシウム沈降後のライゼートを先述のようなUF1で処理した。ただし、濾過透析は35倍量の10mM Tris pH8.0に対して行った後、15倍体積分の10mM Tris + 0.45M NaCl pH8.5に対して行った。
【０２０８】
塩化カルシウム溶液を加える前にUF1濃縮透過液でライゼートを２倍希釈して実験を繰り返した。
【０２０９】
[脱塩]
塩化カルシウム塩を含む全てのサンプル（塩化カルシウム沈降後のライゼート、UF1濃縮透過液、及びUF1濾過透析透過液を含む）を、HPLCにより分析する前に脱塩した。
【０２１０】
サンプル2mlを、50mM Tris pH8.5で平衡化した2x5ml HiTrap脱塩カラムに連続して流量5ml/分で注入し、4.5mlの脱塩物（254nmでの吸光度ピーク）が得られた。
【０２１１】
[HPLCによる分析]
イオン交換HPLCによってDionex DNAPacカラム上でプラスミド濃度を測定した。
【０２１２】
サイズ排除HPLCによってG3000SWXLカラムに連結したTosoHaas TSKゲルG-DNA-PWでRNAピーク面積を測定した。流出バッファー（running buffer）：0.1M Tris + 0.3M NaCl + 1mM EDTA pH7.5。流量=0.3ml/分。RNA含有量は、核酸のパーセンテージで表したRNAの量である。
【０２１３】
[結果]
a）塩化カルシウム沈降後のライゼートをUF1にロードする（循環あり）
以下の表６に結果を表す。表６は、塩化カルシウム沈降後のUF1のパフォーマンスに対して核酸ロード量の増量が及ぼす影響を表す。
【０２１４】
【表６】
0004422406.tif 000007
【０２１５】
低容量（low volume）のCentramate 0.1ft2 300K Omegaメンブレンを設置したMillipore Labscale TFFシステムで行ったこれまでの実験は、塩化カルシウム塩の存在下において、メンブレンを通してかなりの量のプラスミドが失われることを示唆している。従って、100Kメンブレンを代わりに用いたところ、大きなプラスミド損失は起こらなかった。ただし、プラスミド回収率は予想していたものよりも低かったが、これは、出発TMPを10psiではなく、それ低い5psiとすることによって改正した。RNA除去は、塩化カルシウムを用いないUF1と同様に、低イオン強度の濾過透析バッファーを用いることによって、最大となった。
【０２１６】
1ft2 Centramateシステムを用いて、1M塩化カルシウム塩の存在下で１フィート四方のメンブレンあたりプラスミド60.0mgをロードして、Labscaleの結果を確認した。プラスミド回収率は、100％超と高くなり、またRNA除去は非常に効率良く行われ、UF1捕捉物中のRNA含有量はたった2.61％であった（表６）。塩化カルシウムを用いないUF1とは対照的に、濃縮中及び最初の10倍体積分の濾過透析中に、RNAが除去された。
【０２１７】
次に、メンブレンロード量を108mgプラスミド/ft2に増やしたところ、プラスミド回収率（>100%）及びRNA除去（UF1捕捉物中の含有量4.51％）共に同様の結果が得られた。
【０２１８】
濾過透析は、2つの工程で行った。最初の工程は30倍体積分の10mM Tris pH8.5を用いてRNA除去を最大とした。この後に、20倍体積分の50mM Tris + 0.54M NaCl pH8.5でプラスミドのバッファー交換を行い、Fractogel TMAEカラムに直接充填するためにこれを調製した。
【０２１９】
b）塩化カルシウム沈降後のライゼートをUF1にロードする（循環なし）
塩化カルシウムで処理したライゼートを用いて、ゲル層を形成するための循環を行わないUF1を行った。透過液中にはごく少量のプラスミドしか検出されず（0.2％）、プラスミド回収率は非常に高かった（100％超）。UF1捕捉物中のRNA含有量は4.64％であった（表７）。表７は、ロード物中の核酸濃度が、塩化カルシウムの存在下で循環を行わないUF1のパフォーマンスに及ぼす影響を示す。
【０２２０】
【表７】
0004422406.tif 000008
中和後の細胞破片除去工程及び塩化カルシウム沈殿物除去工程を組み合わせた。3Mの塩化カルシウムストック溶液を用いて、処理量を最小にした。体積0.66のストック溶液を体積１の中和後のライゼートに直接加えた。この混合物をメッシュフィルタに通して細胞破片を除去した後、奥底フィルタに通してより小さな粒子を除去した。このプロセスは遠心分離よりも処理が速く、また含めるのがより簡単である。2回目の濾過透析バッファーも、0.54M NaClを含むものから0.45M NaClを含むものに変更した。プラスミド構築物をより小さいサイズに変更した（7.7Kbpから5.9Kbpへ）。
【０２２１】
濃縮透過液中のプラスミド損失は1.3％と比較的高く、これはプラスミドサイズが小さいことによるためであろう。プラスミドの回収率は90.5％であり、UF1捕捉物中にはRNAは検出されなかった（表７）。
【０２２２】
次に、UF1ロード物中のプラスミド濃度が60.7μg/mlから36μg/mlに低下するように、塩化カルシウムを加える前の操作から得た濃縮透過液で、ライゼートを2倍に希釈した。濃縮透過液中のプラスミド損失は5.9％へと大きく増え、プラスミド回収率は82.7％と比較的低かった。これは、低産生宿主株から得たより小さなプラスミドは、UF1段階での回収率が低いことを示している。
【０２２３】
実施例１４に概説された実験結果から幾つかの結論を導き出すことができる。
【０２２４】
１．RNAは、循環中にゲル層に含まれしており、濃縮中にメンブレンを介して低レベルしか除去されないようであった。
【０２２５】
２．濾過透析バッファーのイオン強度は、RNAの除去において最も重要な要因であった。伝導率が低いと濾過透析中にメンブレンを通過するRNAが大きく増加したが、正確なメカニズムは理解されていない。
【０２２６】
３．RNAの完全な除去を行うには50倍体積分の濾過透析が推奨される。
【０２２７】
４．5Kbp以上のプラスミドサイズにはメンブレン孔径300Kが推奨される。
【０２２８】
５．RNAの除去における他の重要な要因は核酸のロード量であった。ロード量が低いほど、除去率が高かった。
【０２２９】
６．RNAを沈殿させるために塩化カルシウムをライゼートに加えるには、UF1工程で使用される条件の変更が必要であった。
【０２３０】
i）プラスミドの損失を防ぐためにはより孔径の小さな（例えば100K）メンブレンが必要であった。
【０２３１】
ii）またプラスミドの回収率を上げるためには低いTMP(5psi)が望ましかった。
【０２３２】
塩化カルシウムでの沈降後は、低分子量RNAのみが残り、これは、限外濾過工程によって効率良く除去された。
【０２３３】
７．メンブレンを分極するための循環は、塩化カルシウムの存在下もしくは不在下でのRNアーゼを用いないプロセスでは必要ないことが分かった。これは、濃縮開始時にすぐに分極する大量のRNAの存在によるものであろう。しかし、核酸ロード量を減らすと、溶解中にRNアーゼを加えた時に観察されるプラスミドの損失を生じなかったので、循環を行わなかった。塩化カルシウムの存在下で、より小さなプラスミド構築物を通常濃度の半分でUF1で処理したところ、メンブレンを介したプラスミド損失はごく僅かなレベルしかなかった。これは、循環を行わない塩化カルシウムの存在下でのUF1工程の堅実さ（robustness）を示している。
【０２３４】
上記知見にかんがみて、本発明者等は、抗カオトロピック塩の一例としてCaCl2を用いたプロセスをさらに最適化できるか否かを検証し続けた。3つの代替的な体制（regime）を研究した。これらの調査結果を以下の実施例１５に示す。
【０２３５】
実施例１５
以下の3つの体制を研究した：
<オプション2>
清澄化ライゼート→UF1→CaCl2沈降→Fractogel TMAE
<オプション3>
清澄化ライゼート→UF1→CaCl2沈降→UF2→Fractogel TMAE
<オプション4>
ライゼート→CaCl2沈降→清澄化→UF1→Fractogel TMAE
[方法]
[溶解]
-70℃で保存した細菌細胞ペースト100gをマレットで砕いて小片にした。室温で、再懸濁バッファー500mlをBellco再懸濁容器に加えた。砕いた細胞ペーストを容器に加え、電磁撹拌機（設定8）で室温にて1時間攪拌した。
【０２３６】
溶解する直前に、冷室の中で、6% SDS（166ml）に冷たい0.96％ NaOH（834ml）を加えた。Heidolphオーバーヘッド攪拌機を備えた容積3Lのビーカーに細胞懸濁液を移し、冷室に入れた。この細胞再懸濁液に溶解混合物を加え、40rpmにて30分間攪拌した。
【０２３７】
ライゼートに3M酢酸カリウム（500ml）を加え、80rpm、4℃にて30分間攪拌した。
【０２３８】
ライゼートをSorvall RC5C Plus遠心分離装置で8000rpmにて10分間遠心分離を行った。上清をMiraclothの二重層で濾過した後、5μm Sartopure PP2フィルタに通し、その後、0.45/0.2μm Sartobran Pに通した。この物質を清澄化ライゼートと呼んだ。
【０２３９】
[UF1]
Pall Filtron Centramate装置に1ft2 300K Omega Centramateオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、濾過透析バッファー（10mM Tris pH8.0）で洗浄した。
【０２４０】
容器に約500mlの清澄化ライゼートを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。透過液ラインを容器に接続することによって、循環を行った。Watson Marlowポンプを155rpmに設定し（クロスフロー流量1L/分/ft2）、TMPを5psiに設定した。循環を20分間続け、その間、TMPが10psiを超えないようにした。
【０２４１】
透過液ラインを2Lボトルに接続することによって、清澄化ライゼートを75mlにまで濃縮した（濃縮透過液）。
【０２４２】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーに交換されるように容器を濾過透析バッファーのボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析透過液を5x1 Lボトル中に回収した。50倍体積分（5L）の濾過透析バッファーを用いた。
【０２４３】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、UFシステムの中身を30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０２４４】
容器に75mlの新しい濾過透析バッファーを充填し、30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０２４５】
UF1捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、Gelman Science 0.45μmフィルタに通した。
【０２４６】
次に、500mlの0.5M NaOHを1時間循環させることによって、UF1システムから不要なものを取り除いた。
【０２４７】
このUF1系を0.1M NaOH中で保存した。
【０２４８】
塩化カルシウム沈降
体積1のUF1捕捉物に、体積0.12の2.8M CaCl2の0.1M Tris pH8.0溶液を加えて、最終塩化カルシウム濃度を0.3Mとした。この混合物を室温にて10分間インキュベートした。
【０２４９】
次にこの混合物を、0.1M Tris pH8.5で2倍に希釈して塩化カルシウムの最終濃度を0.15Mとした。次に3x25CEフィルタ、次に4x40CEフィルタ、そして最後に2x0.45/0.2μm Sartobran Pフィルタに通して、沈殿物を濾過した。
【０２５０】
この物質を、塩化カルシウム沈降後のUF1と呼んだ。
【０２５１】
[Fractogel TMAE陰イオン交換クロマトグラフィー]
容積20mlのFractogel TMAEカラム（1.6x10cm）を、カラム容積の10倍の50mM Tris pH8.5で、流量5.1ml/分（152cm/h）で平衡化した。
【０２５２】
カラムに、カラム容積mlあたり約2.5mgのプラスミドの割合で、塩化カルシウム沈降後の希釈したUF1をロードした。このカラムを、カラム容積の2倍の50mM Tris pH8.5、次にカラム容積の5倍の50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5で洗浄した。
【０２５３】
カラム容積の10倍の0.54〜3M NaClの50mM Tris pH8.5溶液の勾配で、プラスミドを溶出した。
【０２５４】
カラム容積の4倍の50mM Tris+3M NaCl pH8.5でカラムを再利用した（regenerate）。
【０２５５】
カラム容積の5倍の50mM Tris pH8.5でカラムを再び平衡化した。
【０２５６】
[UF2]
Millipore Labscaleシステムに0.1ft2 100K Omega Centramateオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、限外濾過バッファー（10mM Tris pH8.0）で洗浄した。
【０２５７】
容器に、塩化カルシウム後の希釈していないUF1物質を充填した。透過液ラインを容器に接続して、循環を行った。ポンプを4（クロスフロー流量1L/分/ft2）に設定し、TMPを5psiに設定した。循環を20分間続け、その間、TMPが10psiを超えないようにした。
【０２５８】
透過液ラインを容積500mlのボトルに接続して、塩化カルシウム後のUF1を35mlに濃縮した（濃縮透過液）。
【０２５９】
濾液の損失分が同じ流量で新しいバッファーに交換されるように、10mM Tris pH8.0バッファーのボトルに容器を接続することにより、濾過透析を開始した。濾過透析は、40倍体積分の10mM Tris pH8.0、次に10倍体積分の50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5に対して行った。濾過透析透過液を4x500mLボトル中に回収した。
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、UFシステムの中身を30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF2濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０２６０】
容器に50mlの50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5を充填し、30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０２６１】
UF1捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、Sterivex GVフィルタに通した。
【０２６２】
次に、100mlの0.5M NaOHを1時間循環させることによって、UF1システムから不要なものを取り除いた。
【０２６３】
このUF1系を0.1M NaOH中で保存した。
【０２６４】
[プロセスオプション2]
上述のようにアルカリ溶解を行った後、上述のようにUF1を行い、上述のように塩化カルシウム沈降を行った。塩化カルシウム沈降後のUF1（237ml）をFractogel TMAEカラムに入れた。240mlの漏出物（breakthrough）/洗浄液（ピーク1）、及び75mlの溶出物（ピーク2）が回収された。
【０２６５】
UF1捕捉物280mlが生成されたが、濾過後には210mlしか回収されなかった。物質の一部はフィルタ上で失われ、一部は漏洩して失われた。
【０２６６】
塩化カルシウム沈降後の希釈したUF1捕捉物（482ml）を作製した。濾過後には400mlしか回収されなかった。
【０２６７】
[プロセスオプション3]
このオプションは、塩化カルシウム沈降後のUF1捕捉物を希釈しない、という点以外は、アルカリ溶解を行った後にUF1及び塩化カルシウム沈降を行うという意味で、オプション2と似ている。
【０２６８】
塩化カルシウム塩（除去しないとクロマトグラフィーカラムの邪魔になる）を除去するために、限外濾過工程（UF2）を導入した。
【０２６９】
UF2捕捉物（90ml）を上記のように容積20mlのFractogel TMAEカラムに入れた。ただし、カラム容積の10倍量の勾配は、0.54〜1M NaClの50mM Tris pH8.5溶液であった。
【０２７０】
UF1捕捉物（315ml）が生成されたが、濾過後は295mlしか回収されなかった。
【０２７１】
塩化カルシウム沈降後のUF1（330ml）が生成されたが、濾過後は320mlしか回収されなかった。
【０２７２】
[プロセスオプション4]
溶解
溶解工程は、先述のような遠心分離は行わない点以外は、先述のものと同じであった。そのかわり、以下に記載するように、ライゼートを塩化カルシウム沈降にロードし、細胞破片の除去を行った。
【０２７３】
塩化カルシウム沈降及び細胞破片の除去
ライゼートの20mlサンプルを、MSE Mistral 2000で2500rpmにて10分間、遠心分離にロードした。上清を、清澄化ライゼートと呼んだ。
【０２７４】
ライゼート2100mlに、1960mlの2M CaCl2溶液を攪拌しながら加えた後、室温にて10分間静置した。
【０２７５】
この混合物を、350mm, 200μmメッシュフィルタを設置したPlastokホルダに注いで細胞破片を除去し、重量下で濾液を容積5Lのビーカーに回収した。次に濾液を、Millistak 15CEカートリッジ奥底フィルタ、次に0.45/0.2μm Sartobran Pフィルタに通した。この濾液を、塩化カルシウム後のライゼートと呼んだ（体積=3350ml）。
【０２７６】
[UF1]
Pall Filtron Centramate装置に1ft2 100K Omega Centramateオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、10mM Tris pH8.0濾過透析バッファーで洗浄した。
【０２７７】
容器に塩化カルシウム後のライゼート約500mlを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。透過液ラインを容器に接続することによって、循環を行った。Watson Marlowポンプを155rpmに設定し（クロスフロー流量1L/分/ft2）、TMPを5psiに設定した。循環を20分間続け、その間、TMPが10psiを超えないようにした。
【０２７８】
透過液ラインを2Lボトルに接続することによって、清澄化ライゼートを75mlにまで濃縮した（濃縮透過液）。
【０２７９】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーに交換されるように、容器を10mM Tris pH8.0バッファーのボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析は、35倍体積分の10mM Tris pH8.0の後に、15倍体積分の50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5を用いて行った。濾過透析透過液の5x1Lサンプルを回収した。
【０２８０】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、UFシステムの中身を30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０２８１】
容器に100mlの50mM Tris+0.54M NaCl pH8.5を充填し、30分間循環させた。捕捉物ラインを開いてUF1濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０２８２】
UF1捕捉物回収物及び２つの洗浄液（体積=290ml）をプールし、Gelman Science 0.45μmフィルタで濾過した（最終体積=270ml）。
【０２８３】
Fractogel TMAE陰イオン交換クロマトグラフィー
これは、カラム容積の10倍の勾配が0.54〜1M NaClの50mM Tris pH8.5溶液である以外は、先述のとおりであった。
【０２８４】
UF1捕捉物（125ml）をカラムに入れた。135mlの漏出物/洗浄液（ピーク1）及び135mlの溶出物（ピーク2）を回収した。
【０２８５】
サンプルを以下に記載するように分析にロードした。
【０２８６】
サンプル分析
イオン交換HPLC
Dionex DNAPac PA-100 4x250mmカラムの陰イオン交換HPLCによって標準的なプロトコールに従ってプラスミド濃度を測定した。RNアーゼでサンプルを消化してRNAの干渉を除いた。ウシ膵臓RNアーゼ（2μl）を100μlのサンプルに加えた。
【０２８７】
陰イオン交換HPLCによってTSK DNA-NPR 4.6mmx7.5cm、2.5μmカラムで標準的なプロトコールに従ってプラスミドのトポロジーを測定した。
【０２８８】
RNAアッセイ
逆相HPLCベースのアッセイを用いたBADにより、RNA濃度を測定した。
【０２８９】
TSK G3000 SWXL 7.8mmx30cm、5μmカラムに接続したTSK G-DNA-PW 7.8mmx30cm、10μmカラムでのサイズ排除HPLCにより、プラスミド/RNA比を測定した。移動相（mobile phase）は0.1M Tris+0.3M NaCl+1mM EDTA pH7.5であった。流量は0.3ml/分であった。サンプル投入量は100μlであった。
【０２９０】
タンパク質アッセイ
Pierce社のMicro BCAタンパク質アッセイ試薬キットを用いてタンパク質濃度を測定した。0.625〜20μg/mlのBSA溶液を用いて標準曲線をプロットした。PBSでサンプルを適度に希釈して、BSA標準の範囲内に入るようにした。
【０２９１】
内毒素アッセイ
標準的なLALアッセイを用いてPharmaceutical Microbiologyにより内毒素濃度を測定した。
【０２９２】
ゲノムDNAアッセイ
定量的PCRアッセイを用いてBADによりゲノムDNA濃度を測定した。
【０２９３】
脱塩
分析する前に、高レベルの塩化カルシウム塩を含むサンプル（塩化カルシウム沈降後のライゼート、UF1濃縮透過液、UF1濾過透析透過液）を脱塩した。低濃度であればアッセイを妨げなかったので、塩化カルシウム塩を含むプロセス2及び3のサンプルは脱塩しなかった。
【０２９４】
サンプル（2ml）を、50mM Tris pH8.5で平衡化した連結2x5ml HiTrap脱塩カラムに流量5ml/分で注入したところ、4.5mlの脱塩物（254nmでの吸光度ピーク）が回収された。
【０２９５】
[結果及び考察]
全ての計算に用いた体積は、濾過中に生じた損失について補正した（corrected）。これによって、各オプション間の比較がよりし易くなる。
【０２９６】
プロセスオプションの選択：オプション2
RNAの除去を最大にするために、清澄化ライゼートを、改変したUF1工程にロードして処理した。この工程は、50倍体積分のイオン強度の低いバッファーで濾過透析し、出発TMP=5psiを用いるものである。1ft2の300K PESメンブレンにロードされるプラスミドは、平方フィートあたりプラスミド136.4mgであった。次に、残ったRNAを0.3塩化カルシウムで室温にて10分間沈殿させた。この混合物を1対1で希釈して、塩化カルシウム塩濃度を0.15Mとし、濾過により沈殿物を除去した。次に、Fractogel TMAE陰イオン交換カラム上に濾液を直接充填した。塩化カルシウム塩がカラムへのプラスミドの結合を妨げるのを防ぐためには、希釈が必要であった。カラムに、カラム容積mlあたり2.47mgのプラスミドをロードし、50mM Trisで洗浄して初期のプラスミドが溶出されるのを防ぎ、その後、50mM Tris+0.54M NaClで残りのRNAを溶出した。プラスミドを塩勾配で溶出した。
【０２９７】
全プラスミド回収率は89.2％と高かった（以下の表８を参照されたい）。
【０２９８】
【表８】
0004422406.tif 000009
【０２９９】
UF1工程の回収率は78.3％であったが、塩化カルシウム沈降工程の回収率は100％を超えた。クロマトグラフィー工程全体の回収率は91.1％であった。
【０３００】
全RNA除去率は99.84％であった（以下の表９を参照されたい）。
【０３０１】
【表９】
0004422406.tif 000010
【０３０２】
改良したUF1工程では、74.9％のRNA除去率が得られた。RNAの大部分が濾過透析中に除去されること、および残りのRNAの殆どは高分子量のものであることは、RNAが最初はゲル相の中に含まれるが、のちにイオン強度の低い濾過透析バッファーにより「再び可溶化され」、小さなサイズとなるためメンブレンを透過することができるようになることを示唆している。次に、UF1捕捉物中に回収されたRNAの99.44％は、塩化カルシウムでの処理によって沈殿した。塩化カルシウムが高分子量RNAの特に強力な沈殿剤であることは周知である。しかし陰イオン交換カラムはRNAをさらに除去することはなかったが、RNAはカラムの漏出物中に検出された。RNAアッセイの結果に矛盾があるようである。
【０３０３】
サイズ排除HPLCによる分析は、塩化カルシウムでの処理の影響を表す。プラスミド/RNA比は、UF1捕捉物中において16.11％であったものが、塩化カルシウムでの沈降後に89.76％に上昇した（以下の表１０を参照されたい）。
【０３０４】
【表１０】
0004422406.tif 000011
【０３０５】
このプロセスの終了時のRNA含有量はたったの1.05％であった。
【０３０６】
イオン交換HPLCによるプラスミドのトポロジーの分析結果は、このプロセスがプラスミドのアイソフォームのレベルに影響を及ぼさなかったことを示している。プロセス全体で、プラスミドの約96％がスーパーコイル構造を形成し、約3.4％が多量体を形成した（以下の表１１を参照されたい）。
【０３０７】
【表１１】
0004422406.tif 000012
【０３０８】
UF1工程により、タンパク質の99.87％が除去された（以下の表１２を参照されたい）。
【０３０９】
【表１２】
0004422406.tif 000013
【０３１０】
タンパク質は300Kメンブレンを介して効率良く除去されるほど小さい。プロセスの終了時には、Fractogel TMAE溶出物中にタンパク質を検出することができなかった。
【０３１１】
全体的な内毒素除去率は、99.94％超と高かった（以下の表１３を参照されたい）。
【０３１２】
【表１３】
0004422406.tif 000014
【０３１３】
塩化カルシウム工程により、89.4％を超える高い内毒素除去率が得られた。陰イオン交換工程も、内毒素を除去したが、正確な数字を計算することはできなかった。UF1工程は内毒素レベルに大きな影響を及ぼさなかった。この段階では17.6％しか除去されなかった。
【０３１４】
ゲノムDNAレベルは、工程を組み合わせることによって低下した：UF1工程では55％、塩化カルシウム工程では77.6％、及び陰イオン交換工程では66.1％の低下（以下の表１４を参照されたい。表１４は、塩化カルシウムの存在下で循環を行わない場合の、UF1のパフォーマンスに対してロード物中の核酸濃度が及ぼす影響を表す）。
【０３１５】
【表１４】
0004422406.tif 000015
【０３１６】
全体的な除去率は96.6％であった。塩化カルシウム工程は、予想したほどのインパクトを持たなかった。これはおそらく0.3Mという低い濃度を用いたためであると思われる。
【０３１７】
プロセスオプション選択：オプション３
オプション３は、陰イオン交換カラムに入れる前に塩化カルシウム塩を除去するために第2のUF工程が導入される以外は、オプション2に非常に良く似ている。UF2工程で用いたメンブレンは、塩化カルシウム塩の存在下でプラスミドの損失を防ぐために、低分子量100Kのカットオフを有するものであった。RNAの除去を促進するために濾過透析開始時にはイオン強度の低いバッファーを用い、その後、クロマトグラフィーカラムに充填する前に、50mM Tris+0.54M NaClでバッファー交換を行った。プラスミドの回収率を上げるために、5psiという低い初期TMPを選択した。メンブレンロード量は、メンブレンの平方フィートあたりプラスミド909mgであった。残ったRNAの大部分は濃縮及び初期濾過透析中に除去された。陰イオン交換工程は、オプション2で記載したように行った。
【０３１８】
UF1工程全体のプラスミド回収率は74.5％であり、その後、塩化カルシウム沈降工程全体では100％を超え、UF2工程では71.1％であった（以下の表１５を参照されたい）。
【０３１９】
【表１５】
0004422406.tif 000016
【０３２０】
Fractogel TMAEカラムの漏出物中に吸光度のピークが検出された。漏出物中でプラスミドの37％が失われ、溶出物中で41.3％が回収された。これらの分画を合わせた全体的な回収率は48.8％であった。カラムロード量は、カラム容積mlあたりプラスミド2.86mg（オプション2よりわずかに高い）であったが、これが観察された大量のプラスミド損失を説明するものであるかは疑問である。充填するバッファーも異なるものであった。カラムに、オプション3では50mM Tris+0.54M NaClを充填したのに比べ、オプション2では0.15M塩化カルシウム及び0.1M Trisを充填したので、充填するバッファーのイオン強度が高すぎたかもしれない。
【０３２１】
全体的なRNA回収率は99.985％と非常に高かった（以下の表１６を参照されたい）。
【０３２２】
【表１６】
0004422406.tif 000017
【０３２３】
RNA除去率は、UF1工程では77.2％、塩化カルシウム沈降工程では98.8％、UF2工程では74.9％、及びクロマトグラフィーカラムでは78％であった。これらの結果は、UF2工程によって行われる追加的な除去を除けば、プロセス2で得られるものに非常に良く似ている。
【０３２４】
サイズ排除HPLCによる分析は、プラスミド/RNA比が、UF1捕捉物中で17.02％であったのが塩化カルシウムでの沈降後は92.25％に、UF2捕捉物中では95.24％であったのが陰イオン交換クロマトグラフィー工程後には98.91％に増加することを表している（表１７を参照されたい）。
【０３２５】
【表１７】
0004422406.tif 000018
【０３２６】
イオン交換HPLCによるプラスミドトポロジーの分析は、UF1捕捉物段階及び塩化カルシウムでの沈降後には、プラスミドの約96％がスーパーコイル構造を形成し、3.5％が多量体を形成することを表している（以下の表18を参照されたい）。
【０３２７】
【表１８】
0004422406.tif 000019
【０３２８】
UF2工程後では、プラスミドの22.73％は開環状であり、スーパーコイル状のものは75.5％しかない。UF2工程で使用したLabscale UFシステム上のポンプは適切ではなく、プラスミドをせん断したため、開環状のプラスミドが高レベルとなった可能性がある。この段階でのこれまでの実験から、UF2工程自体が不適切であるとは考えられない。しかしこの知見は、クロマトグラフィー工程の漏出物中における高いプラスミドレベルを説明するものと思われる。50mM Tris+0.54M NaClの洗浄バッファーが開環状プラスミドを溶出するように設計された可能性が極めて高い。このバッファー中において、カラムに充填された開環状プラスミドは、そのあと結合を妨げることになるであろう。
【０３２９】
UF1段階でのタンパク質除去率は99.86％であり、全体的な除去率は99.997％となった（以下の表１９を参照されたい）。
【０３３０】
【表１９】
0004422406.tif 000020
【０３３１】
*塩化カルシウム塩の存在によって形成された混濁沈殿物
内毒素の除去率は、UF1段階ではたったの27.9％であったが、塩化カルシウム沈降工程全体では90％であった（以下の表２０を参照されたい）。
【０３３２】
【表２０】
0004422406.tif 000021
【０３３３】
またUF2工程では、36.8％という低い除去率であった。これは、限外濾過が内毒素除去工程として重要ではないことを確認するものである。しかし、Fractogel TMAEでのクロマトグラフィー工程では、99.3％を超える残りの内毒素が除去され、全体的な除去率は99.97％を超えた。
【０３３４】
ゲノムDNA除去率は主に、塩化カルシウム沈降工程の結果であった。94％の除去率が観察された（表２１を参照されたい）。
【０３３５】
【表２１】
0004422406.tif 000022
【０３３６】
他の工程除去率の数字は、UF1工程では0％、UF2工程では72.5％、及びクロマトグラフィー工程では59.6％であった。全体的なDNA除去率は99.2％であった
プロセスオプション選択：オプション４
アルカリ溶解後の細胞破片除去工程を、塩化カルシウム沈殿物除去工程と組み合わせた。酢酸カリウムで中和した後に、塩化カルシウムの最終濃度が1Mとなるようにライゼートに2Mの塩化カルシウムストック溶液を加えた。次に、200μmの孔を有するふるい型フィルタ（sieve filter）により細胞破片を除去した後、奥底フィルタでの濾過によって、より小さな粒子を取り除いた。100K、1ft2 PESメンブレンでUF1工程を行い、塩化カルシウム塩の存在下でのプラスミド損失を防いだ。RNA除去率を最大にするために濾過透析開始時にはイオン強度の低いバッファーを使用し、その後、陰イオン交換カラムに入れる前に50mM Tris+0.54M NaClをバッファー交換に使用した。出発TMPを5psiに下げ、プラスミド回収率を上げた。メンブレンロード量は、メンブレン平方フィートあたりプラスミド240mgであった。カラム容積mlあたりプラスミド2.83mgの割合でロードして、Fractogel TMAE上での陰イオン交換クロマトグラフィーを前記のように行った。
【０３３７】
プラスミド回収率は、塩化カルシウム工程全体では100％を超え、UF1工程全体では50.8％であった（表２２を参照されたい）。
【０３３８】
【表２２】
0004422406.tif 000023
【０３３９】
ロードしたプラスミドの15.9％は漏出物中で失われ、81.5％が溶出された。2.83mg/mlでは、カラムへのロード量が多すぎたのかもしれない。これらの2つの分画を組み合わせた全体的なプラスミド回収率は72.8％であった。
【０３４０】
全体的なRNA除去率は99.9％であった（表２３を参照されたい）。
【０３４１】
【表２３】
0004422406.tif 000024
【０３４２】
除去されたRNAうちの84.6％（主に高分子量RNA）は、塩化カルシウム沈降工程により除去されたものである。次に、UF1工程によって低分子量RNAが容易に除去された（除去率97.7％）。クロマトグラフィーカラム全体のRNA除去率は72.2％であった。
【０３４３】
サイズ排除HPLCによる分析により、UF1捕捉物中のプラスミドレベルが97.7％であり、Fractogel TMAE溶出液中では98.62％に増加していたことが分かった（表２４を参照されたい）。
【０３４４】
【表２４】
0004422406.tif 000025
【０３４５】
イオン交換HPLCによるプラスミドトポロジーの分析により、塩化カルシウム沈降後のライゼートはスーパーコイル状のプラスミドを84.44％及び開環状のプラスミドを14％含んでいたことが分かった（表２５を参照されたい）。
【０３４６】
【表２５】
0004422406.tif 000026
【０３４７】
スーパーコイル状の割合は、Fractogel TMAE溶出液中では94.76％に増加し、開環状の割合は2.16％、及び多量体の割合は3.08％であった。
【０３４８】
Fractogel TMAE溶出液中にタンパク質は検出されなかった。塩化カルシウム沈降工程では、タンパク質の95.8％が除去され、UF1工程では残りのうち99.7％が除去された（以下の表２６を参照されたい）。
【０３４９】
【表２６】
0004422406.tif 000027
【０３５０】
内毒素の全体的な除去率は99.5％を超えていた（表２７を参照されたい）。
【０３５１】
【表２７】
0004422406.tif 000028
【０３５２】
これらのアッセイ結果の除去率にどの工程が貢献していたかを決定することは不可能であったが、Fractogel TMAEカラムでの除去率は98.9％を超えていた。
【０３５３】
全体的なゲノムDNA除去率は99.8％を超えていた（以下の表２８を参照されたい）。
【０３５４】
【表２８】
0004422406.tif 000029
【０３５５】
塩化カルシウム沈降段階ではゲノムDNAの98％が除去され、UF1工程により74％、及びクロマトグラフィー工程では75％であった。
【０３５６】
これらの代替的なプロセスの利点は、以下の表２９において最も簡単に比較することができる。
【０３５７】
【表２９】
0004422406.tif 000030
【０３５８】
全体的なプラスミド回収率は、オプション3（ピークの合計が48.8％）に比べてオプション2（89.2％）及び4（ピークの合計が72.8％）の方が高かった。いずれの単独工程も、低いプラスミド回収率となることはなかった。オプション3の全体的なプラスミド回収率が低いのは、主に追加的なUF工程を導入したためである。
【０３５９】
3つのオプション全てにおいてRNA除去率は高かった（99.84〜99.985％）。オプション3は、プラスミドの重量あたりRNA含有量は1.37重量％であった。しかし、オプション2及び4は、RNA含有量がそれぞれ3.65％及び3.13％となった。限外濾過及び塩化カルシウム工程はいずれも効率良く機能し、実際に、限外濾過工程は低分子量RNAを除去し、塩化カルシウムは高分子量RNAを沈殿させたので、良い組合せであった。オプション3及び4では、それぞれ96.6％及び94.8％で好適なレベルのスーパーコイル状プラスミドが得られた。しかしオプション3は、高い割合の開環状プラスミドを生成することになったので、スーパーコイル状プラスミドは結果的に78.5％しかなかった。これは、UF2で用いた限外濾過システムによるものであり、このオプションを除外すべきではない。
【０３６０】
3つのオプション全てについてタンパク質除去率は高く、オプション3及び4では検出不可能なレベルであった。オプション3のタンパク質重量比が0.96％であったのは、BCAアッセイが、タンパク質レベルを正確に表すものではなく、むしろ混入により誤った結果が得られる傾向があるためであろう。オプション2に比べて、精製工程が1つ追加されたオプション3でより高いタンパク質レベルを予期する理由はない。UF1工程及び塩化カルシウム工程はいずれも、タンパク質不純物の除去において非常に効率的であった。
【０３６１】
内毒素の除去率は非常に高く、3つのオプション全ての最終的な物質中において、アッセイの検出限界未満のレベルであった。
【０３６２】
塩化カルシウム沈降工程及び陰イオン交換工程はいずれも高い内毒素除去率であった。
【０３６３】
最後に、ゲノムDNAレベルは特にオプション3及び4について非常に低かった。高いゲノムDNA除去率は、高い塩化カルシウムレベルと関係があるようであった。
【０３６４】
全てのデータを注意深く評価したところ、3つのオプション全ては不純物の除去を良好に行ったので、不純物の除去を基準に考えると、これら3つのオプションはいずれも、除外する理由は無いように思われた。オプション3はプラスミド回収率が最も低かったが、RNA除去率は最も良かった。オプション4は、精製工程数が少なく、スケールを拡大するのが最も簡単なオプションであるため、オプション4が好ましかった。
【０３６５】
結論
これら3つのオプションの異なる点は、塩化カルシウム沈降工程をどこに導入するか（溶解後又はUF1工程後）ということ、及びクロマトグラフィーの前に塩化カルシウム塩を除去するために第2の限外濾過工程が必要か否か、ということだけであった。結果は、3つのオプション全てが実行可能であり、50％を超えるプラスミド回収率及び良好な不純物除去が得られることを示した。
【０３６６】
低いレベル（1.2mgプラスミド/ml）でプラスミドをクロマトグラフィーカラムにロードすること、及び勾配溶出を用いることによって、RNA除去率は上昇した。実際に、右側の溶出勾配及びピークカット（peak cutting）を用いると、最終RNAレベルは、アッセイの検出限界未満となる程非常に低かった。
【０３６７】
塩化カルシウムは、RNA、タンパク質、内毒素及びゲノムDNAのレベルを低下させるのに非常に大きな効果をもたらした。その結果、内毒素及びゲノムDNAの最終レベルは、RNアーゼを用いるプロセスにおけるものよりも低かった。
【０３６８】
本願（本明細書及び特許請求の範囲はその一部をなす）は、あらゆる後続出願に関して優先権の基礎として使用され得る。このような後続出願の特許請求の範囲に記載される発明は、本明細書中に記載される任意の特徴またはその組み合わせに関するものであってもよい。これらの発明は、生成物、組成物、プロセス又は用法に関する発明であってもよく、例として（ただし限定するわけではない）、本願の特許請求の範囲に記載された発明の1つ以上を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１aは、ライゼートを得るために行われる処理工程を表す図であり、図１bは、本発明のプロセスを用いて医薬品質の染色体外DNAを得るための3つの他のルートを表す図である。
【図２】  図２aは、実施例１のライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図２bは、実施例１の濾過透析の透過液のイオン交換HPLCトレースであり、図２cは、実施例１の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースである。
【図３】  図３aは、実施例２の500mMバッファー（pH7.5）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図３bは、実施例２の500mMバッファー（pH7.5）を用いて得た捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースであり、図３cは、実施例２の100mMバッファー（pH7.5）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図３dは、実施例２の100mMバッファー（pH7.5）の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースであり、図３eは、実施例２の10mMバッファー（pH7.5）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図３fは、実施例２の10mMバッファー（pH7.5）の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースである。
【図４】  図４aは、実施例3の10mMバッファー（pH6.0）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図４bは、実施例３の10mMバッファー（pH6.0）の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースであり、図４cは、実施例3の10mMバッファー（pH9.0）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図４dは、実施例３の10mMバッファー（pH9.0）の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースである。
【図５】  図５は、実施例４のバッファーについての透過流束と濾過透析量との関係を表す図である。
【図６】  図６は、実施例４のバッファーについてのTMPと濾過透析量との関係を表す図である。
【図７】  図７aは、実施例５のライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図７bは、実施例５の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースである。
【図８】  図８aは、実施例６のライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図８bは、実施例６の濃縮透過液のイオン交換HPLCトレースであり、図８cは、実施例６の濾過透析透過液（10倍量）のイオン交換HPLCトレースであり、図８dは、実施例６の濾過透析透過液（20倍量）のイオン交換HPLCトレースであり、図８eは、実施例６の濾過透析透過液（30倍量）のイオン交換HPLCトレースであり、図８fは、実施例６の濾過透析透過液（40倍量）のイオン交換HPLCトレースであり、図８gは、実施例６の濾過透析透過液（50倍量）のイオン交換HPLCトレースであり、図８hは、実施例６の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースであり、図８iは、図８hと比べて2倍のロード量での実施例６の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースである。
【図９】  図９aは、20分循環させた後の実施例８の透過液のイオン交換HPLCトレースであり、図９bは、実施例８のライゼートのイオン交換HPLCトレースであり、図９cは、20分循環させた後の実施例８の捕捉物のイオン交換HPLCトレースであり、図９dは、実施例８の濃縮中の透過液のイオン交換HPLCトレースであり、図９eは、実施例８の濾過透析中の透過液（１回目の150ml）のイオン交換HPLCトレースであり、図９fは、実施例８の濾過透析中の透過液（２回目の150ml）のイオン交換HPLCトレースであり、図９gは、実施例８の濾過透析中の透過液（３回目の150ml）のイオン交換HPLCトレースであり、図９hは、実施例８の濾過透析中の透過液（４回目の150ml）のイオン交換HPLCトレースであり、図９iは、濃縮及び濾過透析後の実施例８の捕捉物のプールのイオン交換HPLCトレースであり、図９jは、実施例８の洗浄液１のイオン交換HPLCトレースであり、図９kは、実施例８の洗浄液２のイオン交換HPLCトレースである。
【図１０】  図１０aは、pH6.8で10〜500mM Na2HPO4を用いたプラスミドDNA分離を表す溶出プロフィールであり、図１０bは、pH7.6で10〜500mM Na2HPO4を用いたプラスミドDNA分離を表す溶出プロフィールであり、図１０cは、pH7.8で10〜500mM Na2HPO4を用いたプラスミドDNA分離を表す溶出プロフィールであり、図１０dは、pH8.8で10〜500mM Na2HPO4を用いたプラスミドDNA分離を表す溶出プロフィールである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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