(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系腫瘍細胞を治療するための薬剤の製造における、シクロホスファミドまたはイホスファミドから選択される化学療法剤と組み合わせる、シトクロムＰ４５０遺伝子を含むウイルスベクターの上記薬剤中の有効成分としての使用であって、腫瘍細胞をウイルスベクターで感染させてシトクロムＰ４５０遺伝子を導入し、該腫瘍細胞によるシトクロムＰ４５０遺伝子の導入により、該腫瘍内で化学療法剤を酵素的にその細胞毒性形態に変換せしめ、中枢神経系腫瘍細胞を該腫瘍細胞の細胞周期に依存することなく該細胞毒性形態に変換された化学療法剤に選択的に感受性とせしめるための、使用。
【請求項２】
悪性腫瘍を治療するための薬剤の製造における、シクロホスファミドまたはイホスファミドから選択される化学療法剤と組み合わせる、シトクロムＰ４５０遺伝子を含むウイルスベクターの上記薬剤中の有効成分としての使用であって、腫瘍細胞をウイルスベクターで感染させてシトクロムＰ４５０遺伝子を導入し、該腫瘍細胞によるシトクロムＰ４５０遺伝子の導入により、該腫瘍内で化学療法剤を酵素的にその細胞毒性形態に変換せしめ、該化学療法剤を細胞毒性形態に活性化させる、使用。
【請求項３】
末梢腫瘍を治療するための薬剤の製造における、シクロホスファミドまたはイホスファミドから選択される化学療法剤と組み合わせる、シトクロムＰ４５０遺伝子を含むウイルスベクターの上記薬剤中の有効成分としての使用であって、腫瘍細胞をウイルスベクターで感染させてシトクロムＰ４５０遺伝子を導入し、該腫瘍細胞によるシトクロムＰ４５０遺伝子の導入により、該腫瘍内で化学療法剤を酵素的にその細胞毒性形態に変換せしめ、末梢腫瘍を該腫瘍細胞の細胞周期に依存することなく該細胞毒性形態に変換された化学療法剤に選択的に感受性とせしめるための、使用。
【請求項４】
該シトクロム遺伝子が、Ｐ４５０ ２Ｂ１、Ｐ４５０ ２Ｂ６、Ｐ４５０ ２Ａ６、Ｐ４５０ ２Ｃ６、Ｐ４５０ ２Ｃ８、Ｐ４５０ ２Ｃ９、Ｐ４５０ ２Ｃ１１、またはＰ４５０ ３Ａ４である請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
該シトクロム遺伝子が、Ｐ４５０ ２Ｂ１である請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該化学療法剤がシクロホスファミドである請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
該ウイルスベクターがレトロウイルスである請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
該中枢神経系腫瘍細胞が、星状細胞腫、寡突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、上衣腫、神経鞘腫、または神経線維肉腫である請求項１、４〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
該悪性腫瘍が中枢神経系に位置する請求項２、４〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
該末梢腫瘍細胞が乳房腫瘍細胞である請求項３〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
ウイルスベクターが化学療法剤の前に投与される請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
中枢神経系腫瘍細胞の治療のための、シトクロムＰ４５０遺伝子を含む有効成分としてのウイルスベクターおよびシクロホスファミドまたはイホスファミドから選択される化学療法剤を含む、同時または順次の使用のための組合せ製剤としての医薬組成物であって、腫瘍細胞をウイルスベクターで感染させてシトクロムＰ４５０遺伝子を導入し、該腫瘍細胞によるシトクロムＰ４５０遺伝子の導入により、該腫瘍内で化学療法剤を酵素的にその細胞毒性形態に変換せしめ、中枢神経系腫瘍細胞を該腫瘍細胞の細胞周期に依存することなく該細胞毒性形態に変換された化学療法剤に選択的に感受性とせしめる、組成物。
【請求項１３】
悪性腫瘍治療のための、シトクロムＰ４５０遺伝子を含む有効成分としてのウイルスベクターおよびシクロホスファミドまたはイホスファミドから選択される化学療法剤を含む、同時または順次の使用のための組合せ製剤としての医薬組成物であって、腫瘍細胞をウイルスベクターで感染させてシトクロムＰ４５０遺伝子を導入し、該腫瘍細胞によるシトクロムＰ４５０遺伝子の導入により、該腫瘍内で化学療法剤を酵素的にその細胞毒性形態に変換せしめ、該化学療法剤を細胞毒性形態に活性化させる、組成物。
【請求項１４】
末梢腫瘍の治療のための、シトクロムＰ４５０遺伝子を含む有効成分としてのウイルスベクターおよびシクロホスファミドまたはイホスファミドから選択される化学療法剤を含む、同時または順次の使用のための組合せ製剤としての医薬組成物であって、腫瘍細胞をウイルスベクターで感染させてシトクロムＰ４５０遺伝子を導入し、該腫瘍細胞によるシトクロムＰ４５０遺伝子の導入により、該腫瘍内で化学療法剤を酵素的にその細胞毒性形態に変換せしめ、末梢腫瘍細胞を該腫瘍細胞の細胞周期に依存することなく該細胞毒性形態に変換された化学療法剤に選択的に感受性とせしめる、組成物。
【請求項１５】
該中枢神経系腫瘍細胞が、星状細胞腫、寡突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、上衣腫、神経鞘腫、または神経線維肉腫である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
該悪性腫瘍が中枢神経系に位置する請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
該末梢腫瘍細胞が乳房腫瘍細胞である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項４〜７のいずれかに記載の特徴により改変された請求項１２〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
シトクロムＰ４５０発現腫瘍細胞および非シトクロムＰ４５０発現腫瘍細胞がともに化学療法剤に感受性となる、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
シトクロムＰ４５０発現腫瘍細胞および非シトクロムＰ４５０発現腫瘍細胞がともに化学療法剤に感受性となる、請求項１２〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
連邦後援の研究および開発の下でなされた発明の権利に関する陳述
米国政府は本発明において支払い済みの認可および、国立衛生保健機関によって付与された認可番号ＮＳ−２４２７９およびＣＡ−４９２４８の条件によって提供されたように、合理的な条件他人に認可を与えるため特許権者に必要な限定条件における権利を有する。
発明の背景
発明の技術分野
本発明はウイルスベクターを利用した腫瘍細胞の破壊に関する。より詳しくは、本発明は薬剤−条件的な『殺害』機能を有する遺伝子を運搬するウイルスベクターを利用した腫瘍細胞の破壊に関する。
関連技術の記載
新生（Ｎeoplasia）は細胞の増殖および分化を調節する正常の制御メカニズムが損なわれることによって増殖が亢進する作用である。この制御の欠如は腫瘍を亢進的に増殖させ、大きくしついで身体の活力ある部分に場所を占めるようにさせる。もし該腫瘍が周囲の組織を侵し、離れた部位に転移されるなら、この腫瘍の傾向が固体の死という結果となるであろう。
米国の全ての人の３分の１が癌になるであろう（１９９０年のアメリカン・キャンサー・ソサイエティー・イヤーリー・アウトルック（Ａmerican Ｃancer Ｓociety Ｏutlook））。これらの患者の５年生存率は、該疾患の進歩的そして初期の診断および治療法の結果、殆ど５０％にまで上昇した（１９９０年のアメリカン・キャンサー・ソサイエティー・イヤーリー・アウトルック）。しかしながら、癌は、いまだこの国における死因として、心臓疾患に続く第２位のままである（１９９０年のアメリカン・キャンサー・ソサイエティー・イヤーリー・アウトルック）。今年亡くなるであろう全ての米国人のうちの殆ど２０％が癌で死亡するであろう（１９９０年のアメリカン・キャンサー・ソサイエティー・イヤーリー・アウトルック）。これらの死のうちの半分は３つの最もありふれたタイプの癌；肺癌、乳癌および結腸癌によるであろう。
近年、癌治療法の急速な発展がある。たとえ新治療法が開発されるとしても、必要性はなお、癌のたいていのタイプの改良された治療法のために存在する。
正常細胞に有害な効果を及ぼさずに癌細胞を優先的に殺すことが癌治療における望ましい目的である。過去に、これは多様な手法を用いて果たされている。これらの手法には化学薬品の投与、化学療法、放射線、放射線療法および外科手術を含む。
放射線療法は局部癌の制御に使用される治療法の局部形態である（デビタ（Ｄevita, Ｖ.Ｔ.）、ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インターナル・メディシン（Ｈarrison’s Ｐrinciples of Ｉnternal Ｍedicine）中、ブラウンォルド（Ｂraunwald）ら、編、マックグロウ・ヒル・インク（ＭcＧraw-Ｈill Ｉnc.）、ニューヨーク、１９８７、４３１−４４６ページ参照）。放射線療法はいくらかの悪性疾患が放射線照射によって損傷を一層受け易いという事実に依存している。この受け易さにおける相違は、腫瘍細胞より正常細胞が細胞内修復の高い能力を有することおよび正常な器官が部分的に損傷を受ける場合、該器官のうまく機能し続ける能力に依存する。周辺組織が所定の腫瘍の照射量の２倍を耐えることができるならば、該腫瘍は放射線感受性である。他方、腫瘍のうちの幾分かは放射線療法で治療することができない。両肺に広範にかかわる癌は、周辺の肺組織の一層高い放射線感受性のために。放射線療法で効果的に治療されることができない（デビタ、ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インターナル・メディシン中、ブラウンォルド（Ｂraunwald）ら、編、マックグロウ・ヒル・インク、ニューヨーク、１９８７、４３１−４４６ページ参照）。
外科手術は最も初期の癌の主な治療法であるといまなお考えられている（上記）。しかしながら、殆どの癌は手術可能ではあるが、完全には切除できない。切除可能なようにみえる腫瘍のいくらかは腫瘍範囲外に微小転移（micrometastatic）疾患を有する。この結果により、該癌の最初の発生部位の近くに再発する。転移のレベルを示す癌は、効果的には外科手術によって治療されることはできない。
局所療法（全身的ではない）の他のタイプが調査されている。これらの局所的な低温（サロマン（Ｓaloman）ら、Ｊ. Ｎeuro-Ｏncol. １：２２５−２３６（１９８３））、光熱動学療法（photodynamic therapy）（チェン（Ｃheng）ら、Ｓurg. Ｎeurol. ２５：４２３−４３５（１９８６））および組織内照射（interstitial radiation）（グチン（Ｇutin）ら、Ｊ. Ｎeurosurgery ６７：８６４−１８７３（１９８７））を含む。現在まで、これらの療法は制限されて成功している。
放射線療法および外科手術は、外科手術の技術または放射線療法の高投与によって利用することができる身体の特定の領域にある腫瘍の大きさを減じる方法を提供する。殆どの癌患者において特徴的に存在する広く分布するかまたは循環する腫瘍細胞の破壊に応用できるものはない。これは化学療法などの癌の身体的な治療法の発展の刺激である。
癌化学療法剤の使用は、たとえ広く使用されていても、殆どのタイプの癌の治療に限られた効果を提供する。いくらかの特殊なタイプの腫瘍（例えば、幼年性白血病）の治療において顕著な成功が従来の化学療法で達成されているが、固形腫瘍の治療においてはより限られた成功しか得られない。この失敗は、主に多くの抗癌剤の低い治療指針のため、ならびに腫瘍細胞をしばしば特徴付ける本来のまた後天的な薬剤耐性のためである。他の癌治療のための細胞毒性薬剤の使用における欠点は、それらの深刻な副作用である。これには、悪心、嘔吐、ＣＮＳ抑圧、局所痛、骨髄抑圧、出血、腎障害、低および高血糖症および過敏性反応（hypersensitivity reactions）を含む。他の欠点は、それらが急速に分裂する細胞に対してのみ有効であるということである。
器官依存性化学療法は延長された期間、一層高い濃度である薬剤を運搬するため複数モデルの治療法の構成要素として約束守る。しかしながら、現在、このような持続的な抗癌剤の静脈注射は何の明らかな利益も示さない。
一層現代的な化学療法のアプローチは癌細胞自身に対して毒性の薬剤に向けられる。これは化学療法剤を抗体または正常細胞より腫瘍細胞に高いアフィニティーを有する毒性分子に結合させることによって実験的に達成される。これらの指示された毒性の小球はなお開発の初期臨床段階にあり、市販されていない。
明らかに、新しいアプローチが化学療法剤が悪性腫瘍細胞を殺すことができ、同時に全身的毒性を回避することができる効果を増強するために必要である。
あるタイプの癌（例えば、ヒト脳において発生する最も一般的な主な腫瘍である神経膠腫）は現在の治療様式を受けつけない。外科手術、化学療法および放射線療法にもかかわらず、神経膠腫の最もありふれたものである多形性膠芽腫は殆ど例外なく致命的である（ショーエンバーグ（Ｓhoenberg, Ｂ.Ｓ.）、『オンコロジー・オブ・ザ・ナーバス・システム（Ｏncology of the Ｎervus Ｓystem）』中の『ザ・エピデミオロジー・オブ・ナーバス・システム・チューマーズ（Ｔhe epidemiology of nervous system tumors）』、ウォーカー（Ｍ.Ｄ.Ｗalker）、編、ボストン、マサチューセッツ、マルチナス・ニジョフ（Ｍartinus Ｎijhoff）（１９８３）；レビン（Ｌevin）ら、『ネオプラズムズ・オブ・ザ・セントラル・ナーバス・システム（Ｎeoplasms of the Ｃentral Ｎervous Ｓystem）、第４６章、キャンサー（Ｃancer）：プリンシプルズ・アンド・プラクティス・オブ・オンコロジー（Ｐrinciples and Ｐractice of Ｏncology）、第２巻、第３版、デ・ビタ（Ｄe Ｖita）ら、編、リピンコット・プレス（Ｌippincott Ｐress）、フィラデルフィア（１９８９）、１５５７−１６１１ページ）。
神経膠腫はすべての原発的脳腫瘍のほぼ４０％を代表し、多形性膠芽腫は最も悪性の形態を構築する（ショーエンバーグ、『オンコロジー・オブ・ザ・ナーバス・システム』中の『ザ・エピデミオロジー・オブ・ナーバス・システム・チューマーズ』、ウォーカー、編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８３））。この高いグレードのタイプのアストロサイトーマを有する人の５年生存率は、外科手術、放射線療法、および／または化学療法の現在の治療様式を与えられた５％より低い（マハリー（Ｍahaley）ら、Ｎeurosurgery ７１：８２６−８３６（１９８９）：ショーエンバーグ、『オンコロジー・オブ・ザ・ナーバス・システム』中の『ザ・エピデミオロジー・オブ・ナーバス・システム・チューマーズ』、ウォーカー、編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８３）；キム（Ｋim）ら、Ｊ. Ｎeurosurg. ７４：２７−３７（１９９１）、ダウマス・デュポート（Ｄaumas-Ｄuport）ら、Ｃancer ６２：２１５２−２１６５（１９８８））。
神経膠細胞の現在の化学療法に対する抵抗性は、この腫瘍のタイプの増殖の特徴を反映していてよく、低いグレードのアストロサイトーマおよび中枢神経系（ＣＮＳ）における他のタイプの転移性腫瘍の間に存在する（ナガシマ（Ｎagashima）およびホシノ（Ｈoshino）、Ａcta Ｎeuropathol. ６６：１２−１７（１９８５））。ブロモデオキシウリジン標識指針（任意の与えられた瞬間にＳ期にある細胞のパーセントを測定する）は膠芽腫において７.３％であり、低いグレードのアストロサイトーマにおいてより２から７倍高く、転移性腫瘍においてよりは低い（ナガシマおよびホシノ、上記）。
現在の治療様式に対する相対的な膠芽腫の抵抗性を評価するのに有用である関連媒介変数は成長分画、または任意の時点で腫瘍において増殖している細胞の相対的な比率である。この腫瘍のタイプにおける成長分画は３０％にすぎず、残りの細胞の７０％はＧo、休息期（Ｇo期におる細胞は死んでいるか、活性細胞周期に再び入るかもしれない；ヨシイ（Ｙoshii）ら、Ｊ. Ｎeurosurg. ６５：６５９−６６３（１９８６））にある一方、活発に分裂している膠芽腫細胞の３０％はこの腫瘍の致死への進行に貢献し、活動していない７０％は、活発に増殖している細胞を標的化する複数の化学療法剤に対するこれらの腫瘍の抵抗性を担っている。
さらに、膠芽腫の外科手術様式は、腫瘍とその周辺実質の間の顕著な境界の欠如および初期の部位から進展する白質索（tracts）における腫瘍細胞の転移によって妨害され（バーガー（Ｂurger）ら、Ｊ. Ｎeurosurg. ５８：１５９−１６０（１９８３））、その完全な除去を不可能にする。
放射線療法はまた、これらの腫瘍における低い増殖分画ならびに近隣の正常組織の放射線感受性のために限られた成功しか有さなかった（ウォウラ（Ｗowra）ら、Ａcta Ｎeurochir.（ウイーン（Ｗien）９９：１０４−１０８（１９８９））；ザモラノ（Ｚamorano）ら、Ａcta Ｎeurochir. Ｓuppl.（ウイーン ４６：９０−９３（１９８９））。
新しいアプローチが脳腫瘍を治療するのに必要である。
薬剤条件的な（drug-conditional）『殺す』機能を有する遺伝子を腫瘍治療するのに使用するという提案がある。これは共に出願中の米国特許第０７／８９５,３６４の内容であり、その全体を参照のため本明細書に包含する。特に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の増殖細胞内での発現は、デオキシヌクレオシド類似体、ガンシクロビル（ganciclovir）のために、細胞の感受性を敏感にさせるという提案がある（ムールテン（Ｍoolten）ら、Ｃancer Ｒes. ４６：５２７６−５２８１（１９８６）；ムールテンら、Ｈum.Ｇene Ｔher. １：１２５−１３４（１９９０）；ムールテンら、Ｊ. Ｎatl.Ｃancer Ｉnst.８２：２９７−３００（１９９０）；ショート（Ｓhort）ら、Ｊ. Ｎeurosci. Ｒes. ２７：４２７−４３３（１９９０）；エッゼジン（Ｅzzedine）ら、Ｎew Ｂiol. ３：６０８−６１４（１９９１）；フリーマン（Ｆreeman）ら、Ｊ. Ｃell Ｂiochem. １６Ｆ：４７（１９９２）；クルバー（Ｃulver）ら、Ｓcience ２５６：１５５０−１５５２（１９９２）；タカミヤ（Ｔakamiya）ら、Ｊ. Ｎeurosci. Ｒes. ３３：４９３−５０３（１９９２）；ヤマダ（Ｙamada）ら、Ｊ. Ｃancer Ｒes. ８３：１２４４−１２４７（１９９２）；ラム（Ｒam）ら、Ｃancer Ｒes. ５３：８３−８８（１９９３）；オールドフィールド（Ｏldfield）ら、Ｈum. Ｇene Ｔher. ４：３９−６９（１９９３）；タカミヤら、Ｊ. Ｎeurosurg. ７９：１０４−１１０（１９９３）；カルソ（Ｃaruso）ら、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci.ＵＳＡ  ９０：７０２４−７０２８（１９９３）；ボヴァイアツシス（Ｂoviatsis）ら、Ｈum. Ｇene  Ｔher. ５：１８３−１９１（１９９４）；チオッカ（Ｃhiocca）ら、『ジーン・セラピューティックス（Ｇene Ｔherapeutics）中、『バイラス−メディエーティッド・ジェネティック・トリートメント・オブ・ローデント・グリオーマズ（Ｖirus-Ｍediated Ｇenetic Ｔreatment of Ｒodent Ｇliomas）』、ウォルフ（Ｗolff, Ｊ.Ａ.）、編、ビルクハウザー・パブリッシャーズ（Ｂirkhauser Ｐublishers）、ボストン、マサチューセッツ（１９９４）、２４５−２６２ページ）。ＨＳＶ−ＴＫは細胞周期の中でのＤＮＡ複製（Ｓ期）の間に、鎖の終結および細胞死に導く、ＤＮＡ鎖へ組み込まれるガンシクロビルのリン酸化を媒体する（エリオン（Ｅlion, Ｇ.Ｂ.）、Ｊ. Ａntimicr. Ｃhemother. １２, sup. Ｂ：９−１７（１９８３）。
しかしながら、効果的ではあるが、薬剤にさらしている間のＤＮＡ複製への遺伝子療法のこのタイプの依存性は、潜在的にその治療効果を制限してよい。例えば、ヒト悪性脳腫瘍における細胞の多数は任意の一時にＧo（休息期）にある（ナガシマら、Ａcta Ｎeuropathol. ６６：１２−１７（１９８５）：ヨシイら、Ｊ. Ｎeurosurg. ６５：６５９−６６３（１９８６））。さらに、ガンシクロビルはもともとはヘルペスウイルス感染の臨床治療に導入された（スミス（Ｓmith）ら、Ａntimicrob. Ａgents Ｃhemother. ２２：５５−６１（１９８２）；スミー（Ｓmee）ら、Ａntimicrob. Ａgents Ｃhemother. ２３：６７６−６８２（１９８０）；それゆえ、癌治療におけるガンシクロビルの応用に関する詳細な生化学的または薬理学的な研究が殆どない。
薬剤条件的な『殺す』機能を有する遺伝子の第２の例は、細菌シトシンデアミナーゼ遺伝子であり、相対的に非毒性５−蛍光ウラシル前駆体５−蛍光シトシンに化学的感受性を与える（ミュレン（Ｍullen）ら、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ  ８９：３３−３７（１９９２）；フーバー（Ｈuber）ら、Ｃancer Ｒes. ５３：４６１９−４６２６（１９９３）；ミュレンら、Ｃancer Ｒes. ５４：１５０３−１５０６（１９９４））。５−蛍光シトシンは、潜在的には癌遺伝子療法に有用であるが、抗菌剤である（ベネット（Ｂennett, Ｊ.Ｅ.）、『グッドマン・アンド・ギルマンズ・ザ・ファーマコロジカル・ベーシス・オブ・セラピューティックス（Ｇoodman and Ｇilman’s Ｔhe Ｐharmacological Ｂasis of Ｔherapeutics）中の『アンチミクロバイアル・エージェンツ（Ａntimicrobial Ａgents）：アンチフュンガル・エージェンツ（Ａntifungal Ａgents）』、ギルマンら、編、第８巻、ペルガモン・プレス（Ｐergamon Ｐress）、ニューヨーク（１９９０）、１１６５−１１８１ページ）。従って、癌治療におけるこの薬剤の適用に関しての詳細な薬理学的な研究は殆ど報告されていない。
シクロホスファミド（ＣＰＡ）およびそのイソ型類似体イフォスファミド（ifosphamide）（ＩＦＡ）はいくつかのタイプの腫瘍の癌化学療法の大黒柱である（コルビン（Ｃolvin, Ｏ.Ｍ.）、『キャンサー・メディシン』中の『アルキレーティング・エージェンツ・アンド・プラチナム・コンパウンズ（Ａlkylating Ａgents and Ｐlutinum Ｃompounds）、ホランド（Ｈolland）ら、リー・アンド・フェビガー・（Ｌea and Ｆebiger）、フィラデルフィア、ペンシルベニア（１９９３）、７３３−７３４ページ）。これらの治療学的に不活性なプロドラッグはシトクロムＰ４５０ファミリーの肝臓特異的酵素によって生物活性化（bioactivation）を必要とする。これらの酵素のうちの１つである、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１は、フェノバルビタールによって誘発され、ＣＰＡおよびＩＦＡを高い効率で活性化する（クラーク（Ｃlarke）ら、Ｃancer Ｒes. ４９：２３４４−２３５０（１９８９）；ウェーバー（Ｗeber）およびワックスマン（Ｗaxman）、Ｂiochemical Ｐharmacology ４５：１６８５−１６９４（１９９３））。ＣＰＡおよびＩＦＡはシトクロムＰ４５０によって、それぞれ一次代謝物である４−ヒドロキシシクロホスファミドまたは４−ヒドロキシイフォスファミドを産生するようヒドロキシル化される。これらの一次代謝物は不安定で細胞毒性化合物に自発的に分解される：アクロレイン（acrolein）およびホスホルアミド（またはイフォスホルアミド）マスタード（コルビン（Ｃolvin）ら、Ｃancer Ｔreat Ｒep. ６５：８９−９５（１９８１）；スラデック（Ｓladek, Ｎ.Ｅ.）、『メタボリズム・アンド・アクション・オブ・アンチキャンサー・ドラッグス（Ｍetabolism and Ａction of Ａnticancer Ｄrugs）』中の『オキサザホスホリンズ（Ｏxazaphosphorines）』、ポウィス（Ｐowis）ら、編、テイラー・アンド・フランシス（Ｔaylor and Ｆrancis）、ニューヨーク（１９８７）、４８−９０ページ）。後者は、細胞周期の時期にかかわらずＤＮＡ中で鎖間の架橋を引き起こす。最大の細胞毒性は、鎖の破壊のため細胞周期の続くＳ期および分裂期（Ｍ）において得られる（コルビンら、（１９９３）、上記）。これらのオキサザホスホリン抗癌剤の治療効率は、肝臓において形成された活性化された薬剤代謝物の全身の分布から得られる宿主の毒性によって限られる。
残念なことに、シクロホスファミドは主に血液脳関門を通過する活性化された代謝物の輸送が貧弱なため、中枢神経系および細胞内への腫瘍を治療するには効果がなく（ジェンカ（Ｇenka）ら、Ｃancer Ｃhemother. Ｐharmacol. ２７：１−７（１９９０））、および脳および腫瘍細胞におけるシトクロムＰ４５０が非常に低レベルによって効果が殆どない（ホドグソン（Ｈodgson）ら、Ｍol. Ｃell. Ｂiochem. １２０：１７１−１７９（１９９３））。
非ＣＮＳの悪性腫瘍の多くの場合（肝臓由来の活性のある薬剤代謝物に容易に接近できる）でさえ、患者の身体毒性およびおそらくは死を引き起こさずに該腫瘍を効果的に殺すため十分に高いレベルの薬剤を投与することができない。該化学療法剤に対する悪性腫瘍の感受性を選択的に増強する新しいアプローチが必要である。
従って、前記より、その作用が、細胞周期の特異的な時期に限られない、または該薬剤を活性化させるのに必要である遺伝子産物の低レベルのため限られることができ、正常細胞を節約し、腫瘍細胞を選択的に破壊するために、化学療法剤に対する悪性腫瘍の感受性を増強する治療方法の必要性がある。
発明の概要
従って、本発明は選択的に神経系の腫瘍細胞を殺す方法を提供することによって従来技術の不利な点を克服し、該方法は、
（ａ）該腫瘍細胞をウイルスベクター（遺伝子産物の発現が該腫瘍細胞を該腫瘍細胞の細胞周期と独立して化学療法剤に敏感にさせるシトクロムＰ４５０遺伝子を運搬する該ベクター）に感染させ；
（ｂ）該腫瘍細胞と薬剤を接触させ；
（ｃ）該腫瘍細胞を選択的に殺す、よりなる。
さらに、本発明は末梢腫瘍細胞の選択的な破壊方法を開示し、該方法は、
（ａ）該腫瘍細胞をウイルスベクター（遺伝子産物の発現が該腫瘍細胞を該腫瘍細胞の細胞周期と独立して化学療法剤に敏感にさせるシトクロムＰ４５０遺伝子を運搬する該ベクター）に感染させ；
（ｂ）腫瘍細胞と該薬剤を接触させ；
（ｃ）選択的に該腫瘍細胞を殺す、よりなる。
さらに、本発明は、悪性腫瘍の治療における化学療法剤の治療学的効果を増強する方法を提供し、該方法は、
（ａ）悪性腫瘍をシトクロムＰ４５０遺伝子を運搬するウイルスベクターに感染させ、
（ｂ）該腫瘍をシトクロムＰ４５０遺伝子産物にさらすと細胞毒性的な代謝物に活性化されるであろう化学療法剤に接触させ；
（ｃ）化学療法剤の治療学的効果を改良するのに十分な腫瘍自身内での高レベルな細胞毒性代謝物を生み出す
よりなる。
本発明はまた、該シトクロム遺伝子がＰ４５０ ２Ｂ１、Ｐ４５０ ２Ｂ６、Ｐ４５０ ２Ａ６、Ｐ４５０ ２Ｃ６、Ｐ４５０ ２Ｃ８、Ｐ４５０ ２Ｃ９、Ｐ４５０ ２Ｃ１１またはＰ４５０ ３Ａ４であり、該化学療法剤がシクロホスファミドまたはイフォスファミドである前記方法の好ましい態様もまた提供する。
本発明はまた、該シトクロム遺伝子がＰ４５０ ２Ｂ１であり該化学療法剤がシクロホスファミドである前記方法の特に好ましい態様もまた提供する。
従って、本願発明者らはシトクロムＰ４５０遺伝子を腫瘍細胞に導入することによって、抗癌剤の治療学的に活性な化合物への酵素的変換の細胞のおよび解剖学的な位置は腫瘍の部位を効果的に制限し、それによって腫瘍細胞が殺され、同時に正常細胞にとっての望ましくない副作用を最小限にして効果を増強するということを見いだした。
前記の一般的な記述および以下の詳細な記述の両者は模範的および解説的であること、およびクレームされている発明のさらなる説明を提供することを意図していることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
図１は、ガンシクロビルのイン・ビボ実験を示すグラフである。
図２は、ガンシクロビル感受性アッセイを示すグラフである。
図３は、培養におけるＣ６−由来細胞のガンシクロビル感受性を示すグラフである。ガンシクロビルによるＣ６ＶＩＫ、Ｃ６ＶＩＫＷＴ、Ｃ６ＢＵ１、Ｃ６ＢＡＧ、Ｃ６ＢＢＡＧ、Ｃ６ＢＡＧＷＴおよびＣ６ＢＷＴ細胞の増殖抑制は、処理がプレーティングの１日後に開始した時であった。細胞の数はプレーティング４日後に決定された。細胞の増殖は、処理なし（１００％）の細胞の数に比較して、処理した細胞のパーセントとして表現する。棒は平均の標準誤差を示す。
図４は、培養におけるＣ６−由来細胞のガンシクロビル感受性を示すグラフである。ガンシクロビル処理はコロニー形成のガンシクロビル感受性を決定するためこれらの同様の細胞株をプレーティングした７日後に開始した。ガンシクロビル処理を９−１２日間続け、ついでコロニーを染色し、数を数えた。生存コロニーを処理なしのコロニーの数（１００％）に比較したパーセンテージとして表している。実験は３度０.５％の変異性未満で行った。
図５は、Ｃ６ＢＡＧ細胞の、他のＣ６−由来細胞と遅れて共に培養した後のガンシクロビル感受性を示すグラフである。Ｃ６ＢＡＧ細胞受容体がプレーティングされた数日後に、Ｃ６ＢＵ１、Ｃ６ＢＷＴ、Ｃ６ＶＩＫまたはＣ６ＶＩＫＷＴ細胞（供与体）を１：２の割合でプレーティングした。ガンシクロビル処理を３日後から開始し、９−１２日間続けた。ついで細胞をベータ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色し、陽性コロニーのみを数えた。コロニーの数は、ガンシクロビルなしの対応培養に見られる数のパーセントとして表わす。ベータ−ガラクトシダーゼ陽性コロニーの生存コロニーのみを数えた。実験は３度０.５％の変異性未満で行った。
図６は、Ｃ６ＢＡＧ細胞の、他のＣ６−由来細胞と遅れて共に培養した後のガンシクロビル感受性を示すグラフである。この分析をＣ６ＢＢＡＧ（内在性のＴＫを欠如しており、Ｃ６ＢＡＧの代わりに使用した）を除いて図５同様に行った。実験は３度、０.５％の変異性未満で行った。
図７は、Ｃ６ＢＡＧ細胞の、他のＣ６−由来細胞と同時に共に培養した後のガンシクロビル感受性を示すグラフである。受容体としてＣ６ＢＡＧ細胞と供与体（１：１００）としてのＣ６ＶＩＫおよびＣ６ＶＩＫＷＴ細胞を同時に共に培養する実験を行った。ガンシクロビル処理をプレーティング７日後から開始し、１４日間続けた。ベータ−ガラクトシダーゼ陽性コロニーのみを数えた（図５および図６参照）。実験は３度、０.５％の変異性未満で行った。
図８は、Ｃ６ＢＡＧ細胞の、他のＣ６−由来細胞と同時に共に培養した後のガンシクロビル感受性を示すグラフである。Ｃ６ＢＢＡＧ細胞と同時に共に培養する実験を図７におけるように行った。実験は３度、０.５％の変異性未満で行った。
図９は、受容体細胞Ｃ６ＢＡＧに対する供与体Ｃ６ＶＩＫＷＴの割合を変化させての同時に共に培養する実験を示すグラフである。実験を図７および８の説明文に記載されたように行った。実験は３度、０.５％の変異性未満で行った。
図１０は、ヌードマウスにおける皮下性Ｃ６ＶＩＫＷＴ腫瘍の増殖を示すグラフである。処理を腫瘍の大きさが直径１ｃｍ（０日）に達した後に開始し、１４日間持続した。腫瘍増殖割合（％）を最初の容量（０日で１００％）と比較して計算した。腫瘍をＰＢＳ（実線）または５０ｍｇ／ｋｇ／日のガンシクロビル（点線）で処理した。棒線は平均の標準誤差を示す。
図１１は、ヌードマウスにおける腫瘍細胞の組合せの増殖を示すグラフである。腫瘍細胞を１から１０の割合（受容体（Ｃ６ＢＡＧ）対供与体Ｃ６ＢＵ１（ｎ＝９）、Ｃ６ＶＩＫ（ｎ＝９）またはＣ６ＶＩＫＷＴ（ｎ＝７））で種々の組合せで同時に接種した。腫瘍の直径が１ｃｍに達した後、動物をＰＢＳで１４日間処理し、ついでさらに４日間無処理で維持した。棒線は平均の標準誤差を示す。
図１２は、ヌードマウスにおける腫瘍細胞の組合せの増殖を示すグラフである。図１１同様の細胞の組合せを１４日間、５０ｍｇ／ｋｇ／日のガンシクロビル処理と同時に行った。＊＝ｐ＜０.０１である。棒線は平均の標準誤差を示す。
図１３は、腫瘍細胞へのＣ６ＶＩＫＷＴの効果を示す模式図である。成体脳において、最も正常な細胞は分裂しておらず、従ってレトロウイルスの組み込みおよび毒性ガンシクロビル代謝物に抵抗性である。分裂している腫瘍細胞への移植されたＣ６ＶＩＫＷＴ細胞の毒性効果には：１）野生型ＭｏＭＬＶ（ヘキサゴン）の複製感染の衰弱させる効果（〜＞）；２）細胞へのウイルス抗原（†）（宿主の抗体または他の免疫機構（λ）による拒絶を誘発する）の発現；３）ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を産生するレトロウイルスベクター（△）の組み込みおよびガンシクロビル（Ｇ）のＤＮＡ複製を企てる細胞を殺す毒性代謝物（Ｘ）への変換；および４）細胞接触により感染腫瘍細胞から非感染腫瘍細胞へのＸの移転、を含む。
図１４は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子をラットＣ６神経膠腫細胞にトランスフェクションした後のＣＰＡの感受性の獲得を示すグラフである。
増殖の割合は各細胞株に関して、ＣＰＡなしで生存した細胞の数によって分割された決められたＣＰＡ濃度で生存した細胞の数である。
図１５は、ＣＰＡ感受性Ｃ４５０−８およびＣＰＡ非感受性Ｃ６、ＣＮＥＯ−１およびＣ４５０−１９におけるシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１酵素の免疫細胞化学分析の写真である。
免疫応答性タンパク質はＣ４５０−８細胞（図１５ａ）においてレースのようなパターンにおいて黒い沈澱として出現するが、ＣＮＥＯ−１細胞（図１５ｂ）において染色は存在していない。
図１６はＣ４５０−８細胞からのミクロソーム分画（２０μｇタンパク質／レーン）のウエスタンブロット分析である。ウエスタンブロットはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１（シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１と称する）に対応する単一の免疫応答種（レーン５）の存在を確証する。フェノビタール誘発ラット肝臓から単離した肝臓ミクロソーム（ＰＢ肝臓、２μｇタンパク質／レーン）をレーン１および６におけるポジティブコントロールとして含む。Ｃ６（レーン２）、ＣＮＥＯ−１（レーン３）およびＣ４５０−１９細胞（レーン４）からのミクロソーム分画をネガティブコントロールとして含んだ。
図１７は、ＣＰＡ療法を行ったおよび行っていないヌードマウスにおけるＣ６およびＣ４５０−８腫瘍の皮下の増殖を示すグラフである。
Ｃ６またはＣ４５０−８細胞（２００μｌ中１０6細胞）をヌードマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍（１群当たり５動物）を生理食塩水（図１７Ａ）またはＣＰＡ（図１７Ｂ）と共に３日および１４日で注射した。平均的な腫瘍容量および標準偏差を各群に関して示す。Ｙ軸の目盛りが図ＡとＢで異なることに注意。
図１８は、レトロウイルスプロデューサー線維芽細胞およびＣＰＡを注入したマウス脳におけるＣ６神経膠腫の髄膜新生を示す写真である。
図１８ａは、ラットＣ６神経膠腫細胞を播種し、ついでＣＰＡの腫瘍内投与が続く脳および髄膜領域にlacＺ-発現マウス細胞（ＣＲＥＬacＺ）の定位注入による処理を行ったコントロールヌードマウスの脳からの組織病理学的冠状断切片を示す。髄膜への腫瘍組織の広範な浸潤を黒い矢印で示す。図１８ｂは、ラットＣ６神経膠腫細胞を播種し、ついでＣＰＡの腫瘍内投与が続く脳および髄膜領域にシトクロムＰ４５０ ２Ｂ−１発現マウス細胞（Ｒ４５０−２）の定位注入による処理を行ったヌードマウスの脳からの組織病理学的冠状断切片を示す。
図１９は、ＣＲＥＬacＺまたはＲ450−2細胞を、ついで続いてＣＰＡの脊髄内／腫瘍内投与と共に移植した動物からの実質脳腫瘍を示す顕微鏡写真である。
図１９ａは、ＣＲＥ−ＬａｃＺ細胞、ついでＣＰＡで処理したマウスの脳腫瘍からの冠状断切片を示す。この特定の切片は顕微鏡写真の左側にある正常脳と右側にある腫瘍（Ｔ）との間に余白を示す。図１９ｂは、Ｒ４５０−２細胞、ついでＣＰＡで処理したマウスの脳腫瘍からの冠状断切片を示す。この特定の切片は顕微鏡写真の左側にある正常脳と右側にある空洞（その砕け易さにために固定できなかった壊死性腫瘍をもともと含む）との間に余白を示す。壊死性腫瘍細胞（広範な核分断を示す）の中には、正常脳の近隣になお見ることができるものがある。倍率は１００×である。
図２０は、Ｃ６、Ｃ６−ＮｅｏおよびＣ６−Ｐ４５０の細胞増殖アッセイを示すグラフである。パネルＡにおいて、Ｃ６、Ｃ６−ＮｅｏおよびＣ６−Ｐ４５０の細胞の増殖の割合を１０日コースを越え、ＣＰＡの不在下で示す。パネルＢでは、ＣＰＡ（０.５ｍＭ）の存在下で同様の実験を行った。空白の四角：Ｃ６−Ｐ４５０細胞；中心部に点のある四角：Ｃ６細胞；塗りつぶした三角：Ｃ６−Ｎｅｏ細胞である。２×１０5 Ｃ６またはＣ４５０−８細胞を１０ｃｍの皿それぞれ３枚ずつにプレーティングした。翌日に、すべての皿に０.５ｍＭ ＣＰＡまたは培地を添加した。各回に示すように、細胞をトリプシン処理し、数えた。平均細胞数が得られた（平均±ＳＥＭ）。
図２１は、分泌効果を示す棒線グラフである。パネルＡには、Ｃ６細胞（３．５×１０5細胞）を、０.５ｍＭ ＣＰＡの存在下で０.４５μフィルター（ＦＡＬＣＯＮによる『インサート（insert）』系）によって分離された皿上にＣ６（３.５×１０5細胞；塗りつぶした棒；カラム１）、Ｃ６−Ｎｅｏ（３.５×１０5細胞；縞の棒；カラム２）またはＣ６−Ｐ４５０（３.５×１０5細胞；斜線の棒；カラム３）と共に培養した。５日後、Ｃ６細胞の数をクルターカウンティング（Ｃoulter counting）によって決定した。パネルＢには、以前の実験で生存しているＣ６細胞をトリプシン処理し、ついで１皿当たり２×１０5細胞の密度で再びプレーティングした。ついで９日後にＣ６の細胞数を数えた。
図２２は、ＣＰＡ処理したＣ６−Ｐ４５０細胞のヌクレオソームのラダリング（laddering）を表わす１％ アガロースゲル電気泳動の写真である。ＣＰＡにさらしたＣ６−Ｐ４５０（パネルＡ）またはＣ６（パネルＢ）細胞からのゲノムＤＮＡ（１μｇ）を指示された時間で精製し、ついで電気泳動によって１％ アガロースゲル上で単離した。
図２３は、細胞媒体効果を示す棒グラフである。パネルＡにおいて、Ｃ６細胞の増殖を、細胞の０、１０、５０、９０および１００％がＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を含む場合に、０.５ｍＭ ＣＰＡの存在下でアッセイした。実験の出発時点で、皿当たりの細胞総数は２×１０6細胞であった。各皿からの細胞を５日後に数えた。最終の値を３つのプレートからの平均で表わす（平均±ＳＥ）。パネルＢにおいて、Ｃ６細胞をそれだけで（２×１０6細胞）（バー１）、Ｎeo遺伝子を発現するＣ６細胞（バー２）と、放射線照射したＣ６細胞（バー３）と、放射線照射したＣ６−Ｎeo細胞（バー４）と、Ｐ４５０遺伝子を発現する放射線照射したＣ６細胞（バー５）と一緒に培養した。全ての場合において、１皿当たりの総数は２×１０6であり、Ｃ６細胞は実験の出発点で皿にある細胞の９０％を占めた。全ての細胞は４日間０.５ｍＭ ＣＰＡの存在下で増殖した。
図２４は、細胞媒体と分泌効果の間の効率を殺す比較を示す棒グラフである。図２３Ａに示される各４日齢の共培養アッセイから条件付けされた培地を回収し、濾過し、ついで２×１０6 Ｃ６細胞に添加した。ついで５日後に、Ｃ６細胞の数を測定した。その数は３枚のプレートからの平均（±ＳＥ）を表わす。
図２５は、安定にシトクロムＰ４５０を発現する親株９Ｌ細胞および９Ｌ細胞におけるシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１のウエスタンブロット分析である。培養した細胞（２０μｇタンパク質／レーン）から調製したミクロソームタンパク質を１０％ ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースにトランスファーし、ついで方法に記載したようにウサギポリクローナル抗シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１抗体でプローブ化した。９Ｌ−ＺＰ１（レーン２）は９Ｌ−ＺＰとしての同様の選択から由来した第２クローンに対応する。それはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現しついで９Ｌ−ＺＰと非常に類似したオキサザホスホリン感受性を示す。フェノバルビタール誘発ラット肝臓ミクロソーム（それぞれ０.５または１μｇ、レーン５および６）をシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１（レーン５および６における二重の低い方のバンド）の基準として使用した。
図２６は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１ネガティブ細胞（親株９Ｌおよび９Ｌ−Ｚ）およびシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１−ポジティブ細胞（９Ｌ−ＺＰおよびＬ４５０−２）に対するオキサザホスホリンの細胞毒性を示すグラフである。３０ｍｍの組織培養皿２枚ずつプレーティングした細胞（１×１０5）を指示された濃度のシクロホスファミド（ＣＰＡ）、イフォスファミド（ＩＦＡ）または４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド（４ＨＣ）（それぞれパネルＡ−Ｃ）で処理した。方法に記載したように薬剤処理を開始してから５日後に生存細胞を数えた。細胞生存に及ぼす薬剤の効果を増殖の割合（％）（すなわち、薬剤なしのコントロールに対応するパーセントとして、薬剤を含むプレートにおける細胞数（平均±２つの決定要因の範囲））として表わす。薬剤なしのコントロールにおける最終細胞数（×１０4）は、１４０±８（９Ｌ）、１３５±７（９Ｌ−Ｚ）、１４０±１０（９Ｌ−ＺＰ）、１３０±６（Ｌ４５０−２）（それぞれ指示された細胞株）である。
図２７は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１酵素インヒビターメチラポン（ＭＴＰ）は、シクロホスファミド（ＣＰＡ）およびイフォスファミド（ＩＦＡ）（４−ヒドロペルオキシシクロスファミド（４ＨＣ）を除く）のＰ４５０ ２Ｂ１発現細胞に関して細胞毒性効果を阻害することを棒グラフで示す。９Ｌ−Ｚおよび９Ｌ−ＺＰ細胞（１×１０5）を指示どおり、１０μＭのメチラポンの存在下または不在下で１ｍＭ  シクロホスファミド、２ｍＭ イフォスファミドまたは１０μＭ ４−ヒドロペルオキシシクロホスファミドで処理した。コントロールは薬剤処理を全く受けなかった。細胞数は薬剤処理を開始してから５日後に決定した。データ（平均±２つの決定要因の範囲）を薬剤なしのコントロールに比較して増殖の割合として表す。
図２８は９Ｌおよび９Ｌ−ＺＰ細胞の混合培養に対するオキサザホスホリンの毒性を示す棒グラフである。同数の親株９Ｌ細胞と９Ｌ−ＺＰ細胞を混合した（最初の総細胞数＝１×１０5／３０ｍｍ組織培養皿）。１０μＭ メチラポン（ＭＴＰ）の存在または不在下で、指示どおり、細胞を１ｍＭ シクロホスファミド（ＣＰＡ）か２ｍＭ イフォスファミドなどの処理するかまたはしなかった。細胞の数を薬剤処理を開始した５日後に決定した。データ（平均±２つずつの範囲）を薬剤なしのコントロールに比較しての増殖の割合（％）として表わす。コントロール実験において、シクロホスファミドは９Ｌおよび９Ｌ−Ｚ細胞の混合培養に対する細胞毒性を何ら示さなかった（データ示さず）。
図２９は、混合細胞集団におけるlac ＺでマークしたシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１ポジティブ細胞およびマークしていないシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１ネガティブ細胞の組織化学分析である。同数の親株９Ｌ細胞（１×１０5）とlac ＺマークしたシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現９Ｌ−ＺＰ細胞（『９Ｌ／lacＺ／２ＢＩ』）（パネルＡ）と混合し、シクロホスファミド（ＣＰＡ）（パネルＢ）またはメチラポン（ＭＴＰ）を有するシクロホスファミド（パネルＣ）の生存細胞に及ぼす効果を図２３においてのようにアッセイした。細胞を薬剤処理開始５日間０．５％グルタルアルデヒドに固定し、９Ｌ−ＺＰ細胞を可視化するために４時間Ｘ-galで染色し、ここには暗染色で示している。
図３０は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１−ネガティブ細胞に対するシクロホスファミドの傍観者的な細胞毒性に関与する可溶性要因を示す２つのグラフよりなる。パネルＡにおいて、親株９Ｌ細胞（１×１０5）を３０ｍｍの培養皿の底のウエルにおいてプレーティングした。ファルコン（Ｆalcon）培養インサートの上部のチャンバー（Ｃhamber）に指示どおり、９Ｌ−Ｚまたは９Ｌ−ＺＰ細胞（１×１０6）を播種した。従って、０.４５μｍの細穴サイズのメンブレン（２つの細胞集団の直接の接触を防ぐ）によって２つの細胞集団を分離した。細胞を１０μＭ メチラポン（ＭＴＰ）とともにまたはなしで１ｍＭ シクロホスファミド（ＣＰＡ）で処理するか、またはコントロールとして薬剤処理を全くしなかった。細胞数を処理を開始してから５日後に決定した。パネルＢにおいて、実験系は上部のチャンバー（Ｘ軸に示す）における９Ｌ−ＺＰ細胞の最初の数が１０4〜１０6（すなわち底のチャンバーにおける９Ｌ細胞の最初の数に比較して０.１〜１０の割合）であるのを除いてパネルＡと同様である。ｙ軸には１ｍＭ シクロホスファミドの存在下で増殖５日後の底のチャンバーにおける９Ｌ細胞の最終の数を示す。データ（平均±２つの範囲）を薬剤なしのコントロールに比較しての増殖の割合（％）として示す。
図３１は、イン・ビボにおいて増殖した９Ｌ−Ｚおよび９Ｌ−ＺＰ腫瘍に対するシクロホスファミドの増殖抑制効果を示すグラフである。メスフィッシャー（Ｆisher）３４４ラットに２×１０6 ９Ｌ−Ｚまたは９Ｌ−ＺＰ細胞を大腿部外側に（９Ｌ−Ｚ細胞を右大腿におよび９Ｌ−ＺＰ細胞を左大腿に）皮下注射することによって接種した。腫瘍移植の７日後に各ラットは１回のシクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内投与またはコントロールとして生理食塩水の腹腔内投与を受けた。腫瘍領域をラットがと殺されるまで測定した。示すデータは１群当たりｎ＝５腫瘍に関して平均±ＳＥＭである。
図３２は、培養におけるシクロホスファミドに対する６つのシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１−発現 ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株の敏感性を示すグラフである。実験計画は図２６に記載したのと同様である。
図３３は、４つのＰ４５０ ＭＣＦ−７発現腫瘍（Ｐ３、Ｐ２、Ｐ９およびＰ２６）で得られたイン・ビボにおける腫瘍細胞破壊をベータガラクトシダーゼを発現するコントロール腫瘍 ＭＣＦ−７ Ｚ３と比較したグラフである。メスホモ接合性ヌードアシミック（athymic）スイス・マウス（nu+/nu+）、２０−２５ｇに図３２に示すＭＣＦ−７またはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現腫瘍の個々それぞれを大腿部外側に、１×１０7細胞を皮下注入によって接種した。０日および２日で腹腔内注射によって、シクロホスファミド（ＣＰＡ）の１００ｍｇ／ｋｇ体重×２で与えられたシクロホスファミドで処理した動物において増殖した腫瘍に及ぼす効果を示す。
好ましい態様の記載
本発明は腫瘍細胞の選択的な破壊、とりわけ神経系の選択的な破壊に関する。遺伝子産物が選択的な細胞死に関して腫瘍細胞を標的化することができる遺伝子を運搬するウイルスベクターを利用する。
腫瘍細胞は分裂細胞、通常は急速に分裂する細胞を意図する。本発明の目的のため、腫瘍細胞は、腫瘍、悪性新生物、癌、肉腫、白血病、リンパ腫などのようなものの細胞を含む。とりわけ興味深いのは神経系の腫瘍である。これらにはアストロサイトーマ、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、脳室上衣腫、シュワノーマ（Ｓchwannoma）、神経線維肉腫、膠芽腫などを含む。本発明に特に関係のある腫瘍細胞は脳腫瘍の細胞である。成体脳腫瘍は本質的に分裂しない細胞の背景内で分裂する細胞の集団を形成する点で独特である。それゆえ、本発明は腫瘍細胞の選択的な破壊への標的化したアプローチの開発のためにこれらの代謝の相違を利用する。
本発明はまた、末梢ならびに脳における良性および悪性腫瘍細胞両者を選択的に破壊するために利用することができる。本明細書で使用する末梢という語は、脳以外の身体の他の部分すべてを意味する。従って、末梢の腫瘍は脳以外の身体の部分の腫瘍を意味する。
ウイルスベクターとはＤＮＡウイルス（アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびエプスタイン・バールウイルスなどのヘルペスウイルス、ＭｏＭＬＶなどのレトロウイルスなど）を意味する。利益的には、本発明のレトロウイルスベクターは分裂細胞のゲノムにのみ組み込むことができる。従って、該ベクターは分裂細胞の選択的な標的化に関する有用なビヒクルを提供する。レトロウイルスベクターはさらに宿主の範囲に制限がなく、これらのベクターはすでに多くの種々のタイプの細胞を上手に感染させるのに使用されているというような利点を提供する。例えば、セプコ（Ｃepco, Ｃ.）Ｎeuromethods １６中、『リーニエッジ・アナリシス・アンド・イモータライゼーション・オブ・ニュートラル・セルズ・ビア・レトロウイルス・ベクターズ（Ｌineage analysis and immortalization of neutral cells via retrovirus vectors）』、ザ・ヒューマン・プレス（Ｔhe Ｈuman Ｐress）、クリフトン、ニュージャージー（１９８９）、１７７−２１９ページ；ギボア（Ｇiboa, Ｅ.）、ＢioＥssays ５（６）：２５２−２５７（１９８７）；フリードマン（Ｆriedman, Ｔ.）、Ｓcience ２４４：１２７５−１２８１（１９８９）を参照。しかしながらレトロウイルスベクターの１つの欠点は、該レトロウイルスの産生力価が低いことである。
概して、レトロウイルスベクターは当該技術分野においてよく知られている。ブレックフィールド（Ｂreakfield）ら、Ｍolec. Ｎeuro. Ｂiol. １：３３９（１９８７）およびシー（Ｓhih）ら、Ｖaccines ８５中、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８５）１７７−１８０ページ。さらに共に出願中である米国特許出願第０７／３０４,６１９号および０７／５０８,７３１号は単純ヘルペスウイルス発現ベクターに関する。これらの出願の開示を参照のため本明細書に包含する。これらの出願はさらにレトロウイルスベクターの構築および使用に関する情報を提供する。
上記に示したように、一般的に、本発明のレトロウイルスベクターは複製が不完全であり、自身のＲＮＡをパッケージすることができないレトロウイルスＲＮＡのパッケージングに必要なタンパク質をコードするレトロウイルス配列を含む、トランスフェクションした細胞株によって、感染性のレトロウイルス粒子にパッケージされる。マン（Ｍann）ら、Ｃell ３３：１５３−１５９（１９８３）；ダノス（Ｄanos）およびミュリガン（Ｍulligan）、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４（１９８８）。レトロウイルスおよびそれら由来のベクターは宿主細胞のゲノムを組み込むので、該配列は全ての娘細胞に伝授される。このレトロウイルスの特徴は将来、例えば、神経系における細胞株を追跡することにうまく使用される（プリンスら（Ｐrince）、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８４：１５６−１６０（１９８７）；ラスキン（Ｌuskin）ら、Ｎeuron １：６３５−６４７（１９８８）；ウォルシュ（Ｗalsch）およびセプコ、Ｓcience ２４１：１３４２−１３４５（１９８８））。
レトロウイルスベクターによる腫瘍細胞へのトランスファーに関する遺伝子は、宿主の腫瘍細胞における遺伝子産物の発現によって通常宿主細胞を標的化するものから選択される。『遺伝子産物』とは、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質に広くあてはまる。しかしながら、本発明の目的のため、遺伝子産物は該遺伝子の転写産物、特にアンチセンスＲＮＡとして使用するものを含む。本ベクターによって標的化される宿主は、ウイルスが所望の遺伝子産物を感染し発現するものである。従って、該宿主細胞はレトロウイルスベクターによって感染された腫瘍細胞を構築する。
遺伝子産物が宿主細胞を同定するために機能する遺伝子を選択し、宿主を化学療法剤により一層敏感にするために、および／または該産物が細胞死に関する宿主を標的化するため、細胞増殖をゆっくりにさせるか一時的に刺激する。細胞死は遺伝子産物を含む宿主細胞と続く処理（物理的または化学的処理）とを接触させることによって達成されることができる。別法として遺伝子産物自身は宿主細胞を殺すかまたは細胞増殖をゆっくりにするのに役立ってもよい。例えば、一時的に細胞増殖を刺激する遺伝子産物には、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの成長因子を含む。
この点において、有用な遺伝子産物の１つの例は、腫瘍部位の特定に使用し得るイメージング化合物を包含する。レトロウイルスは、新生物の増殖の部位と程度を診断する手段として用いられる。例えば、Glatsteinら, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 11：299−314（1985）を参照されたい。
また、その遺伝子産物自身が選択的に細胞を殺傷するような遺伝子も選択される。例えば、この遺伝子産物は、必須の細胞タンパク質、例えば複製タンパク質に対するアンチセンス核酸を包含する。このようなアンチセンス核酸は、宿主細胞のさらなる増殖や分裂を不可能にする。アンチセンス調節については、Rosenbergら, Nature, 313：703−706（1985）；Preissら, Nature, 313：27−32（1985）；Melton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82：144−148（1985）；Izant及びWeintraub, Science, 229：34５−352（1985）；Kim及びWald, Cell, 42：129−138（1985）；Pestkaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：7525−7528（1984）；Colemanら, Cell, 37：683−691（1984）；及びMcGarry及びLindquist, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83：399−403（1986）に記載されている。
細胞増殖を遅らせるために使用される他の遺伝子には、腫瘍抑制遺伝子、細胞増殖を抑制する複製因子をコードする遺伝子、細胞によって放出される毒性タンパク質などが含まれる。例えば、ＥＧＦリガンドに結合した毒物を有する融合タンパク質について記載しているHeinbrookら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：4697（1990）を参照されたい。毒性遺伝子は、例えば、Barkerら, Gene, 86：285−290（1990）；Itoら, Microb. Pathog., 8：47−60, （1990）；Gannonら, J. Gen. Microbiol, 136：1125−1136（1990）にも記載されている。細胞増殖の特徴を変化させたり、細胞増殖を調節し得る遺伝子を挿入することもできる。例えば、網膜芽腫におけるＲb遺伝子（Bakerら, Science, 242：1563−1566（1988））又は結腸癌におけるｐ５３遺伝子（Bakerら, Science, 249：912−915（1980））等の腫瘍抑制遺伝子であるが、その他の抑制又は調節遺伝子もまた使用し得る。
その遺伝子産物が宿主細胞をより抗原性にするような遺伝子もまた、本発明で使用し得る。この抗原性作用は、新規の抗原を、宿主細胞の表面に導入することによって達成し得、このようにして、腫瘍を外来体として認識する免疫系を増強する。新規の抗原の宿主細胞表面への導入は、細胞の異種化と呼ばれている（Austinら, Ad. in Cancer Res., 30：301−345（1979）；Kobayashiら, Ad. in Cancer Res., 30：279−299（1979））。Arakiら, Gene, 89：195−202（1990）；Takleら, Mol. Biochem. Parasitol., 37：57−64（1989）；Raneyら, J. Virol., 63：3919−3925（1989）；Tondravi, Ｍ. Ｍ., Curr. Genet., 14：617−626（1988）；及びMiyanoharaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80：1−5（1983）に記載されている抗原を含むいづれの非ヒト表面抗原も使用し得る。
腫瘍細胞における非ヒト又は特異な表面抗原の発現もまた、標識した抗体をその後で結合させることにより、このような腫瘍細胞の部位を特定するのに使用できる。例えば、Le Doussalら, Cancer Res., 50：3445−3452（1990）；Palabrcaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：1036−1040（1989）；Berendsら, Cancer Immunol. Immunother., 26：243−249, （1988）；及びWeltら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84：4200−4204（1987）を参照されたい。
別の態様では、その遺伝子産物が分裂する細胞に対する条件的殺傷機構をもたらす様な、遺伝子又はコード配列を選択し得る。この方法では、特定のタンパク質の発現、それに続く処置は、腫瘍細胞の殺傷に効果的である。その後の処置は、化学的及び物理的処置を包含する。化学的処置のための試薬は、宿主細胞を殺傷するために遺伝子産物と反応する酵素又は他の化合物の使用を包含する。物理的処置は、細胞を紫外線等の放射線に付することである。
例えば、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子は、分裂する細胞に対するこのような条件的殺傷機構をもたらす。ＨＳＶ−Ｉ−ＴＫの使用を選択する利点は、哺乳類ＴＫに比べて、その酵素が、アシクロビル、ガンシクロビル、及びＦＩＡＵ等のある種のヌクレオシドアナログに対する高い親和性を有することによる（McLarenら, in Herpes Virus and Virus Chemotherapy, R. Kono編, Elsevier, Amassterdam, （1985）, pp. 57−61）。これらの薬物をヌクレオチド様前駆体に変換し、複製細胞のＤＮＡに組み入れることによって、ゲノムの完全性を破壊し、結果的に細胞死に導く。幾つかの研究は、トランスジェニックマウスの開発研究において（Borrelliら, Nature, 339：538−541（1989）；Heymanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：2698−2702（1989））、培養細胞における非ホモローガスな組み換え現象に対する選択可能なマーカーとして（Capecchi, Ｍ. Ｒ., Trends in Genetics 5（3）：70−76（1989））、野生型ヘルペスウイルスを含んでいる細胞を殺傷するために（Coreyら, Ｎ. Engl. J. Med., 314：686−691（1986）：Coreyら, Ｎ. Engl. J. Med., 314：749−756（1986）及びＴＫ活性を欠くヘルペスウイルス変異体の選択において（Coenら, Science, 234：53−59（1986））、ＴＫの条件的毒性をうまく使用してきた。
好ましい態様において、シトクロムＰ４５０遺伝子を、１又はそれ以上のシトクロムＰ４５０遺伝子によって活性化される化学治療用試薬の細胞毒性効果に対して腫瘍細胞を感受性にするのに使用する。本明細書におけるシトクロムＰ４５０なる語は、Ｐ４５０ ２Ｂ１、Ｐ４５０ ２Ｂ６、Ｐ４５０ ２Ａ６、Ｐ４５０ ２Ｃ６、Ｐ４５０ ２Ｃ８、Ｐ４５０ ２Ｃ９、Ｐ４５０ ２Ｃ１１、又はＰ４５０ ３Ａ４等の哺乳類シトクロムＰ４５０遺伝子を意味する。これら遺伝子はそれぞれ、抗癌剤シクロホスホファミド又はイホスファミドの活性化に関連しており（Clarkeら, Cancer Res. 49:2344-2350（1989）; Changら, Cancer Res. 53:5629-5637（1993）；WeberおよびWaxman,Biochemical Pharmacology 45:1685-1694（1993））、これら遺伝子のｃＤＮＡ配列もまた頒布されている（Nelsonら, DNA and Cell Biology 12:1-51（1993）及びその参考文献; Yamanoら, Biochem. 29:1322-1329（1990）; Yamanoら, Biochem. 28:7340-7348（1989））。当業者は、シトクロムＰ４５０酵素群のいづれかによって活性化される多数の他の抗癌剤とともに（（LeBlancおよびWaxman, Drug Metab. Rev. 20:395-439（1989））、並びにシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１、Ｐ４５０ ２Ｂ６、Ｐ４５０ ２Ａ６、Ｐ４５０ ２Ｃ６、Ｐ４５０ ２Ｃ８、Ｐ４５０ ２Ｃ９、Ｐ４５０ ２Ｃ１１、又はＰ４５０ ３Ａ４とホモローガスであり、そのｃＤＮＡ配列が既知の、他の種（例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、イヌなど）に由来する薬物−代謝シトクロムＰ４５０遺伝子とともに（Nelsonら, DNA and Cell Biology 12:1-51（1993））本発明の方法を使用することができる。
特に好ましい態様では、シクロホスファミド（ＣＰＡ）の細胞毒性作用に対して中枢神経腫瘍細胞を感受性にするために、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を使用する。中枢神経系の多くの悪性腫瘍は、化学療法に十分に応答しない。抗癌剤シクロホスホファミド（ＣＰＡ）は、そのＤＮＡをアルキル化する細胞毒性代謝物質への変換が主として肝臓に限定されており、これらの代謝物質は容易に血液−脳関門を通過しないので、中枢神経系にはほとんど効果がない。不活性なプロドラッグＣＰＡを活性化する働きのある肝酵素シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１の導入により、培養及びイン・ビボの両方において、脳腫瘍細胞を、ＣＰＡの細胞毒性作用に対して、感受性にし得るということが、本発明により証明された。ラットＣ６神経膠腫細胞のＰ４５０２Ｂ１遺伝子による安定なトランスフェクションにより、この培養腫瘍細胞はＣＰＡに対して感受性となった。さらに、この遺伝子を有するＣ６細胞は、無胸腺マウスの横腹で皮下増殖させたとき、ＣＰＡの細胞毒性作用に対して母細胞よりも感受性であった。そこで、Ｐ４５０ ２Ｂ１をコードしているレトロウイルスベクターを産生し、この酵素を発現するネズミ繊維芽細胞を調製し、ラットＣ６膠腫を接種した無胸腺マウスの脳に移植した。ＣＰＡの鞘内投与は、髄膜新生物の発達を阻止し、実質腫瘍塊の部分的退行をもたらした。これに反して、Ｅ. coli lacＺ遺伝子を発現する繊維芽細胞に続いてＣＰＡを与えたＣ６膠腫を有する対照マウスでは、広範な髄膜腫瘍と実質固形脳腫瘍の両方が現れた。
まとめれば、Ｃ６膠腫細胞におけるシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子の発現は、培養において及び無胸腺マウスの皮下腫瘍においてＣＰＡ処置後、腫瘍細胞破壊をもたらすことが分かった。さらに、マウスにおける実験的脳腫瘍は、Ｐ４５０２Ｂ１を発現するレトロウイルス産生繊維芽細胞を該腫瘍塊へ移植した後、ＣＰＡに対して感受性となった。過去の報告もまた、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子で安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞が、シクロホスファミド、イフォスファミド、及びアフラトキシンＢ１に対する化学的感受性を獲得し、これら試薬の毒性に関する分析に使用し得ることを示している（Doehmerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5769-5773（1988）; Doehmerら, Environ. Health Prospect 88:63-65（1990））。過去の報告はまた、Ｐ４５０遺伝子を発現するトランスジェニックDroosophila幼態は、シクロホオスファミドに対して過敏であることを示しており（Jowettら, EMBO J 10:1075-1081（1991））、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ６又はＰ４５０ ２Ａ６を安定に発現するヒトリンパ芽球細胞系がシクロホオスファミド及びイフォスファミドに対して化学的感受性であることを示している（Changら, Cancer Res. 53:5629-5637（1993））。本発明者の発見により、腫瘍遺伝子治療及び負の選択機構が必要とされる様々な方法への新規な応用によって、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子が分裂細胞に対する有効な薬物条件的殺傷遺伝子であるということがここに示された。
シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１によるイン・シツ活性化は、脳腫瘍遺伝子治療だけでなく、他の特定の細胞集団の負の薬物−条件的選択への新規のアプローチを提供するものである。したがって、別の好ましい態様では、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を、ＣＰＡの細胞毒性作用に対し、末梢性腫瘍を感受性にするのに使用する。
これに関して、本発明は、安定にトランスフェクトしてシトクロムＰ４５０  ２Ｂ１を発現する９Ｌ神経膠肉腫細胞を使用して、癌遺伝子治療のためのシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／オキサザホスフォリン系を評価した。９Ｌ細胞の母細胞のＣＰＡ感受性をシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現している９Ｌ腫瘍細胞のＣＰＡ感受性と比較する、イン・ビトロの実験及びイン・ビボの腫瘍増殖実験により、腫瘍内プロドラッグ活性化がシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子の正常な発現によって達成し得る場合において、皮下の固形腫瘍がオキサザホスフォリン処置に対して非常に過敏になり得るということが示された。さらに、本発明者は、トランスフェクトしてシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現したＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞が、培養及びヌードマウスモデルにおいてシクロホスファミドに対して感受性にされたということを示した。
本発明の方法により、同じ薬物濃度でのさらに高い腫瘍毒性が可能であり、よって、正常な細胞に対する毒性を増加させることなく、より高い腫瘍投与量が可能となると考えるのが合理的である。さらに、増加した効力という長所によって、より低い投与量の薬物が可能となり得るので、全身の腫瘍集団の化学治療的処置もまた、本発明の方法を用いることによって改善し得る。
本発明の遺伝子産物はまた、宿主細胞を放射線感受性にし、その結果放射線による殺傷に対してより敏感にする化学物質及びタンパク質をコードするものであってよい。従って、その後、放射線に付することによって、宿主細胞が選択的に殺傷される。例えば、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子とガンシクロビルの組み合わせが使用し得る。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有する細胞は、その代謝物がＤＮＡ合成と同じくＤＮＡ修復を妨害するので、ガンシクロビルの存在下で放射線に対して増加した感受性を示す。Snydermanら, Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 112:1147-1150（1986）;およびSealyら, Cancer 54:1535-1540（1984）参照。他の方法には、化学療法剤の標的化を改善するための腫瘍特異的免疫コンジュゲートの開発と関連した細胞表面抗原マーカーの選択的転移が含まれる。Reisfeld, R.A., in Molecular Probes Technology and Medical Applications, Albertiniら, Raven Press, New York（1989）参照。
当業者に既知のいづれの方法によっても、目的の遺伝子を改変し得る。例えば、遺伝子を、ウイルスプロモーター、腫瘍性細胞若しくは腫瘍に特異的なプロモーターの使用を含むヘテロローガスな調節領域又は制御エレメントの制御下に置くことができる。例えば、ヒトの大多数の乳癌において発現するＤＦ３遺伝子は、乳癌細胞における“自殺遺伝子”の直接発現に使用できる（Manomeら, Cancer Res. 54:5408-5413（1994））。これらの方法は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／ＣＰＡ遺伝子治療の本明細書に開示した例に容易に応用し得る。この方法で、遺伝子産物をさらに特定の細胞種に標的化する。このような発現ベクターの構築方法は当業者には、既知である。
一般に、目的の細胞にレトロウイルスを感染させる方法は既知である。ウイルスを、宿主中の新生物増殖の部位又は近傍に導入し得る。多くの場合においては、ウイルスを標的細胞に感染し殺傷するための治療上効果的な量で与える。一般に、約１０1〜約１０10プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲の濃度でウイルスを注入する。一般的には約５×１０4〜約１×１０6ＰＦＵ、さらに一般的には約１×１０5〜約４×１０5ＰＦＵで与えるが、範囲は変えてもよい。しかし、より典型的には、パッケージング細胞系を腫瘍の近傍又は中へ移植してより長い永続的ウイルス源を提供し得る。近年、レトロウイルスベクターが水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質でパッケージングすることに成功した。これらのベクターはより安定であり、直接導入でき、また高いウイルス力価を達成する（Burnsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037（1993））。
レトロウイルスの選択的殺傷及び毒性遺伝子の輸送は、ヘルパーウイルスとの同時導入により増強することができる。すなわち、ヘルパーウイルスは、遺伝子輸送を増強する。この方法においては、レトロウイルスベクターのウイルス粒子をつくるためのパッケージング細胞系がヘルパーと同時に感染し得る。次に、パッケージング細胞又はウイルス接種物を、宿主の感染部位又はその近傍に導入する（Cepko, C. （1989）, supra; Rosenbergら, Science 242:1575-1578（1988）;及びMannら, Cell 33:153-159（1983）参照）。このようなヘルパーウイルスには、エコトロピック（ecotropic）野生型レトロウイルスが含まれる。例えば、ＭｏＭＬＶ（Danosら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464（1988）; Cepko, C., in Neuromethods, vol.16, Molecular Neurobiological Techniques, Boultonら, eds., The Humana Press, Inc., Clifton, NJ（1989）;およびMannら, Cell 33:153-159（1983）参照）である。
ヘルパーウイルスを使用するために、パッケージング系又はレトロウイルスベクター感染系を培養し、野生型ウイルスにより感染し、これらの細胞を移植し得る（Rosenbergら, Science 242:1575-1578（1988）およびWolffら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014（1989）参照）。パッケージング細胞は、約０．１〜約２０の範囲のＭＯＩのヘルパーとともに感染する。
毒性試薬に対する腫瘍細胞の感受性は、ヘルパーウイルスを用いることにより高まる。ヘルパーウイルスはレトロウイルスベクターで感染された細胞をパッケージング細胞系に変える。この結果は、ヘルパーウイルスによる同時感染によって本発明のレトロウイルスベクターは多くの腫瘍細胞、特に、腫瘍塊から離れた腫瘍細胞でさえ、標的化できることを示している。さらに、ヘルパーウイルスを用いた場合、腫瘍細胞はより速く殺傷され、毒性試薬に対するより高い感受性を示す。
本発明は、神経膠肉腫の治療における特定の使用を提供するものである。神経膠肉腫は、すべての初期脳腫瘍の約３０％又は５０％を示し、手術、化学治療、及び放射線治療にもかかわらず、ほぼ致命的なものである。平均の生存期間は１年に満たらず、５年生存率は、３％〜５％に過ぎない。処置後、この病気の再発が、元の部位の２センチメートル以内によくみられる。転移の率は非常に高い；神経学的な機能障害と死は、局所的成長と脳が侵されることによるものである。従って、局所的（非全身的）処置の考え得る効能が探求されてきた。これらの内の２、３には局所的低体温麻酔、光力学療法、及び組織内照射が含まれる。しかし、本発明以前に、悪性神経膠腫を有する患者の成り行きに実質的な劇的効果を与えた治療様式はなかった。
以下の実施例を、例示のために提示するが、限定を意味するものではない。
実験
実施例１
原発ヒト脳腫瘍（悪性神経膠腫）は被包性ではなく、従って外科的に完全に切除することは困難である。これらの腫瘍の多くは非転移性であり、この時点では、組織の周囲２、３センチメートルだけを侵す。しかし、外科手術、放射線療法及び化学療法は、患者の総罹患率と総死亡率に対する僅かな効果を有するに過ぎない。悪性神経膠腫の処置に対する新規の標的化のアプローチは、研究に値するものである。
脳腫瘍は、本質的に非分裂細胞のバックグランドに分裂細胞の塊を構成する点において特異なものである。これらの代謝的な相違が、治療のための標的化のアプローチの開発で研究され得る。レトロウイルスベクターは、（１）分裂細胞のゲノム中へのみ組み込むことができ；（２）宿主の領域内で制限を全く受けず；そして（３）これらのベクターは、すでに多くの様々な細胞種の感染の使用に成功している（Cepko, C., in Neuromethods, vol.16, Molecular Neurobiological Techniques, Boultonら, eds., The Humana Press, Clifton, N.J.（1989）, pp. 177-218; Gilboa, E., BioEssays 5:252-257（1987）; Friedmann, T., Science 244:1275-1281（1989）参照）ので、選択的標的化のための有用なビヒクルを提供するものである。レトロウイルスベクターは複製欠損であり、レトロウイルスＲＮＡのパッケージングのために必要なタンパク質をコードするレトロウイルス配列を含んでいるが、それ自身のＲＮＡはパッケージングできないトランスフェクトされた細胞系により、感染性のレトロウイルス粒子にパッケージングできる（e.g., Mannら, Cell 33:153-159（1983））; Danosら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464（1988））。レトロウイルス及びそれに由来するベクターは、宿主細胞ゲノムへ組み込まれるので、その配列はすべての娘細胞に伝達される。レトロウイルスのこの特徴が、例えば神経系における細胞の連結をたどるためにうまく用いられてきた（Priceら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160（1987）; Luskinら, Neuron 1:635-647（1988）;Walshら, Science 241:1342-1345（1988）。
単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子は、分裂細胞に対する条件的殺傷機作をもたらす。ＨＳＶ−１−ＴＫの使用を選択する利点は、この酵素が、ガンシクロビル等のある種のヌクレオシドアナログに高い親和性を有するという事実によるものである。これらの薬物をヌクレオチド様前駆体に変換し、複製を行う細胞のＤＮＡに組み入れ、よって、ゲノムの完全性を破壊し、結果的に細胞死に導く。
この研究において、ラットＣ６神経膠腫細胞をモデル原発脳腫瘍タイプとして使用した。Ｃ６細胞は、成体ラットＣＮＳ中へ導入後、非被包性、非転移性腫瘍をすぐに形成する。さらに、外因性ＴＫ活性を欠いている細胞系（Ｃ６−ＢＵＩ）又はlacＺ遺伝子（Ｃ６−ＢＡＧ）を有する細胞系（Ｃ６−ＢＡＧ）等の、実験的に有用である誘導細胞系が利用可能である。ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子が強力な、構成性レトロウイルスＬＴＲプロモーターによって調節されるレトロウイルスベクターを作成した。Ｃ６−ＢＵＩ細胞をこのベクターで感染させ、ＨＡＴ培地における増殖によって、ＴＫ活性について選択した。母細胞及び感染細胞を、ガンシクロビルに対するそれら細胞の薬物依存的な感受性について、培養及びラット腎嚢下への接種後のイン・ビボにおいて試験した。
実験材料及び実験方法
ベクター構築：完全長コード配列を含む２．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片と、２kｂのＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子（プラスミドｐＢＲＴＫに由来）の３’−非コード領域（ポリＡ付加部位を含んでいる）を、レトロウイルスプラスミドｐＬ（Ｘ）ＲＮＬのＢａｍＨＩ部位へクローニングした。得られたプラスミドをｐＬＴＫＲＮＬと命名した。ｐＬ（Ｘ）ＲＮＬプラスミドはサルマウス白血病レトロウイルス（ＭｏＭＬＶ）及びサルマウス肉腫レトロウイルス（ＭｏＭＳＶ）より得られ、以下のエレメントを含んでいる：レトロウイルスパッケージング配列、psi；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの転写制御下に置かれているトランスポゾンＴn５に由来するネオマイシン耐性（neoR）遺伝子；colＥ１細菌複製起点；及び細菌アンピシリン耐性遺伝子。このプラスミドは、neoRを働かせるためにＲＳＶを使用すること以外は、基本的にWolffら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014（1989）; Shortら, Devel. Neurosci. 12:34-45（1990）;およびPriceら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160（1987）において報告されているものと同様である。
ＢＡＧレトロウイルスベクターは、レトロウイルスＬＴＲプロモーターの転写制御下にEscherichia coli lacＺ遺伝子を含み、ＳＶ４０初期プロモータエンハンサーエレメントの転写制御下にトランスポゾンＴn５neoR遺伝子、そして上記のその他の特徴を含んでいる（Priceら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160（1987））。
培養細胞：マウス繊維芽細胞系より得たエコトロピック（ecotropic）レトロウイルスパッケージング系、psi２（Mannら, Cell 33:153-159（1983））を使用した。使用したＣ６ラット神経膠腫誘導細胞系は：外因性のチミジンキナーゼ活性の欠失についてＢＵｄＲにおいて選択された細胞系、Ｃ６−ＢＵＩ（Amanoら, Exp. Cell Res. 85:399-408（1974））、及びＢＡＧウイルスによる感染後にβ−ガラクトシダーゼ活性を発現するＣ６−ＢＵＩの誘導体、Ｃ６−ＢＵＩ−ＢＡＧであった。psi２誘導系psi２−ＢＡＧ−２−１４（Shortら, Dev. Neurosci. 12:34-45（1990））をＢＡＧウイルスを得るために使用した。細胞系はすべて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳブランド）、ペニシリン１００units、及び１ｍLあたりストレプトマイシン１００μgを含むDulbeccoの修飾Eagle培地（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。ネオマイシン耐性細胞を選択し、Ｇ４１８（ネオマイシンアナログ、ＧＩＢＣＯ）１ｍg／ｍLを添加した同じ培地中に維持した。ＨＳＶ−１−ＴＫを発現している細胞を、培地中にＨＡＴ（ヒポキサンチンアミノプテリン−チミジン、ＧＩＢＣＯ）を含有させることによって選択した。
トランスフェクション、ウイルス作出及び感染：複製欠損を作出するために、ＨＳＶ−１−ＴＫを有するレトロウイルスベクター（ｖ−ＴＫ）、ｐＬＴＫＲＮＬプラスミドＤＮＡ１０μgを、標準的な方法によるグリセリンストックを用いるリン酸カルシウム共沈殿法によって、psi２細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクトされたpsi２コロニーをＧ４１８を含む培地中で選択した。ウイルスストックを作成するために、培養細胞を、それらが８０％集密に達するまでＧ４１８を添加した培地中で維持し、次いで、それらにＧ４１８を添加していない培地を加え、２４時間後、ウイルスを含んでいる（“条件的”）培地を除き、孔サイズ０．４５μｍのフィルターによって濾過し、−７０℃で保存した。
感染はすべて、受容細胞の１００ｍｍの組織培養ディッシュの培地をポリブレン（Sigma）４μg／ｍLと種々の量のウイルスストックを含む培地２ｍLに交換することにより行った。
psi２−ｖ−ＴＫ系のウイルス力価を、Ｃ６−ＢＵＩ細胞を感染し、ウイルスストックの単位体積あたり得られたＨＡＴ耐性コロニーの数を計測することにより測定した。２つのＨＡＴ耐性コロニー、Ｃ６ＴＫ−ｖＴＫ１及び３を、さらなる実験に使用した。psi２−ＢＡＧ系については、ウイルス力価をＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用し、Ｇ４１８耐性について選択することにより、同様に測定した。
β−ガラクトシダーゼに関する組織学的染色：β−ガラクトシダーゼ発現を目視可能にするため、pＨ７．３の、リン酸で緩衝化した生理食塩水中の０．５％グルタルアルデヒド中、細胞を室温にて５分間固定した後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドで３０分〜４時間、３７℃にて染色した。（Turner及びCepko, Nature 328：131−136（1987））。
培養細胞におけるガンシクロビル感受性分析：以下の細胞系：Ｃ６、ＣＣ６−ＢＵＩ、Ｃ６−ＶＩＫ１及び３を核酸アナログガンシクロビル（Cytovene、Burroughs Wellcome）の用量依存的毒性について分析した。細胞を各１００ｍｍディッシュに１００の集密度に培養した。７２時間後、ガンシクロビルを各ディッシュに種々の濃度で加え、ガンシクロビルを含む培地を３日毎に変えながらインキュベーションを９日間継続した。試験したガンシクロビルの濃度は以下の通りである：０、３、１０、３０、１００、及び３００μｍ、各３つ一組。９日目に培地を除き、ディッシュをＰＢＳで洗浄し、１００％メタノールで１０分間固定し、さらに蒸留水中の１：１０希釈のGiemsa（Fisher）で１０分間染色し、水で再び洗浄した後乾燥した（Freshney, R.I., Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique, 2nd ed., New York, Alan R. Liss, Inc.（1987））。コロニー数を計測し、ガンシクロビルを含まないディッシュ上の数は１００％生存とした。
結果
ベクター構築：プラスミドｐＬＴＫＲＮＬにおけるＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子の完全性と方向性を制限マッピングにより確認した。ＢａｍＨＩによる開裂により、約２．８ｋｂと６．７ｋｂの２本のバンドが得られ、これはＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子とｐＬ（Ｘ）ＲＮＬベクターのそれぞれの大きさから予想されるものに相当する。ＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子の配列（McKnight, S.L., Nucleic Acids Res. 8（24）:5949-5964（1980））に基づき、予想される大きさの断片もまた制限エンドヌクレアーゼＰstＩ及びＳmaＩによる開裂により得られた。ＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子をｐＬ（Ｘ）ＲＮＬベクターのＢａｍＨＩ部位へ挿入することによって、ＭｏＭＬＶＬＴＲプロモーターの制御下に置いた。
トランスフェクション、感染：パッケージング系、psi２−ＴＫを１０4cfu／ｍL調製した。このクローンによって産生したヘルパーウイルスは、検出できなかった。psi２−ＴＫ由来のウイルスをＣ６誘導（Ｃ６−ｖＴＫ）細胞系の構築に使用した。この細胞系は、ＨＡＴ培地で増殖した。
培養細胞におけるガンシクロビル感受性：感受性分析において比較した細胞系は、Ｃ６、Ｃ６−ＢＵＩ及びＣ６ＶＩＫ−１及び−３であった。
イン・ビボにおけるガンシクロビル感受性：９匹のラットの腎嚢下にＣ６ＶＩＫ細胞を移植した。この操作で生き残った４匹をさらなる実験に付した。腫瘍は、移植後５日目に測定された。２匹の動物をガンシクロビル（毎日２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）、そして生理食塩水を毎日投与した２匹を試験した。腫瘍の大きさを１６日間隔で再評価した。２匹の対照の腫瘍は、４〜１２倍に増殖した。反対に、ガンシクロビルで処置した２匹は、処置した後では以前よりも小さくなっていた。
考察
これらの実施例で、ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を有するレトロウイルスが、培養及びイン・ビボで、Ｃ６神経膠腫に対する薬物感受性を与えるために使用し得るということが示された。これは、活性なＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を有する、記載された最初のレトロウイルスベクターである。多くの可能性のある使用があろう。第一に、以下に詳述するように、選択的にこの“殺傷”遺伝子を脳内の腫瘍細胞に輸送するのに有用であることが分かるであろう。他の毒性遺伝子産物と比較したときのＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子の際立った利点は、細胞死を起こすために、第２の打撃、即ちヌクレオシドアナログによる処置を要求する点である。さらに、毒性のためには細胞のＤＮＡ複製が必要であるため、分裂する細胞だけを殺傷し得る。第二に、ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を、移植に使用される遺伝的に改変された細胞中へ組み入れるために、このレトロウイルスベクターを使用することもできよう（e.g., Rosenbergら, Science 242:1575-1578（1988）。そうすれば、周囲の組織に対するこれらの細胞の効果を評価するために、実験において所定の時点で移植された細胞の除去が可能となろう。第三に、このベクターは、先祖の胚細胞を感染させて、後の時期に、発生及び生涯にわたって、その子孫の性質と機能を評価するのに有用であろう。さらに、このベクターは、培養及びイン・ビボで分裂細胞を能率的に感染させるための手段及び、薬物の適用により、所定の時間でそれを殺傷又はその子孫を殺傷するのに使用し得る遺伝子をそのゲノム中へ挿入するための手段を提供する。
米国では、毎年約１２，０００人の患者が新たに原発脳腫瘍を患う。原発脳腫瘍の２５％は、利用可能なすべての治療形態に対して一時的に応答性であるか又は全体的に耐性である神経膠肉腫である。神経膠肉腫は、ほとんど致命的なものである。治癒率は、診断後５年生存する患者は３％〜５％に過ぎないという逸話から脱していない。しかし、神経膠肉腫からの転移の率は非常に高い。神経膠肉腫は局所的な増殖により死をもたらし、多くの場合、照射又は化学療法により処置され、腫瘍は元の部位の２センチメートル以内に再発する。この発見は、幾つかの腫瘍は、局所的に、標的化した治療的アプローチで処置し得ることを示唆するものである。光力学療法（Salcmanら, J. Neuro. Virol. 1:225-236（1983））、局所低体温麻酔（Chengら, Surg. Neurol. 28:423-435））、組織内放射性同位体移植による焦点照射（focal irradiation）（Ortinら, J.Neurosurg. 67:864-873（1987））を含む局所的治療における様々な試みが行われて来た。現在まで、これらの技術はすべて、神経膠肉腫の処置において、限られた成功をみたに過ぎず、僅かな効果をもたらしたに過ぎない。
この限られた成功のために、レトロウイルスベクターが可能な治療の新たな手段として研究された。悪性神経膠腫が成体の脳を構成する分裂しない細胞集団内の分裂細胞集団であるという事実を、レトロウイルスは利用する。したがって、レトロウイルスは毒性遺伝子を脳腫瘍細胞に輸送することによって、脳腫瘍細胞に対して選択性の機作を与えるものである。３種類の毒性遺伝子産物が、トランスジェニックマウスにおいて切除の研究に使用されてきた（BernsteinおよびBreitman, Mol. Biol. Med. 6:523-530（1989））。このうちの２種は、リシンとジフテリア毒素であるが、神経系に放出されれば脳、血管、骨髄又は他の組織に対して毒性を引き起こすことがあり、それを含む細胞を不捻にできなくなる。この理由のために、我々は、それ自身は有害ではないが、ガンシクロビル等の外的に投与された薬物に対して細胞を感受性にするＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子の使用という、腫瘍細胞を破壊する方法を研究のために選択した。この方法においては、細胞の破壊を制御し得る。
ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子をラットＣ６神経膠腫細胞中へ挿入でき、これにより、これらの細胞をガンシクロビルに対して感受性にするということが示された。ＨＳＶ−１−ＴＫ遺伝子を発現するＣ６神経膠腫細胞をイン・ビボで殺傷できることを示すために、腫瘍量の直接的な測定が可能で、微小な（１ｍｍ未満）量の変化の検出が可能であり、腫瘍の血管新生が観察可能で、非経口投与された医薬の導入が可能であるためにラットにおける腎嚢下分析系を使用した。このモデルは、脳内腫瘍移植片の大きさを直接観察できないという問題、無損傷の血液脳関門を通過するガンシクロビルの輸送についての問題を克服する。この腎嚢下モデルについては、腹腔内投与されたガンシクロビルが、増殖するＣ６神経膠腫を殺傷し得るということが示された。
実施例２
グリア芽細胞腫（神経膠芽細胞腫）は成人の原発性脳腫瘍の約３０％に現れる（Ｓchoenberg, Ｂ.Ｓ., in Ｏncology of the Ｎervous Ｓystem, Ｗalker, Ｍ.Ｄ., ed., Ｍartinus Ｎijhoff, Ｂoston, ＭＡ（1983））。グリア芽細胞腫は侵略的、悪性かつ通常の薬剤処置では治療できないので、実質的に治療不可能だと考えられている（ＤeＶita et al., Ｃancer: Ｐrinciples and Ｐractice of Ｏncology, vol. 2, 3rd ed., Ｌippincott Ｐress, Ｐhiladelphia（1989）; Ｓhapiro et al., Ｊ. Ｎeurosurg. 71-: 1-9（1989）; Ｏnoyama et al., Ａm. Ｊ. Ｒoentgenol. 126: 481-492（1976）; Ｓalazar et al., Ｉnt. Ｊ. Ｒad. Ｏncol. Ｂiol. Ｐhys. 5: 1733-1740（1979）; Ｗalker et al., Ｎ. Ｅngl. Ｊ. Ｍed. 303: 1323-1329（1980））。元の部位の２ｃｍ内にしばしば再発する（Ｈochberg et al., Ｎeurol. 30: 907-911（1980））。多面的な治療にもかかわらず診断後１年以下の生存者が半分であり、５年後の生存患者は５％しかない（Ｍahaley et al., Ｊ. Ｎeurosurg. 71: 826-836（1989）; Ｓchoenberg, Ｂ.Ｓ., in Ｏncology of the Ｎervous Ｓystem, Ｗalker, Ｍ.Ｄ. ed., Ｂoston, ＭＡ: Ｍartinus Ｎijhoff（1983）; Ｋim et al., Ｊ. Ｎeurosurg. （in press）; Ｄaumas-Ｄuport et al., Ｃancer 62: 2152-2165（1988））。新規な治療法に対する要請は誇張されたものでない。
１つの方法はグリオーマ細胞を破壊するように調節された外来遺伝子を送達するウイルス性ベクターの使用である。レトロウイルスのみが分裂細胞中のゲノム中に集積することができ、ほとんどの成人脳細胞は細胞成長の静止および非受容的段階にあるから、レトロウイルスは成人脳中の腫瘍細胞に選択的に感染する強力な手段である（レトロウイルスの概説に関して、Ｖaumus, Ｈ., Ｓcience 240: 1427-1435（1988）参照）。これらのＲＮＡウイルスは培養および胎芽中の分裂細胞に遺伝子を送達するためのベクターとして広く用いられてきた（概説に関して、Ｃepko, Ｃ., in Ｎeuromethods, vol. 16, Ｍolecular Ｎeurobiological Ｔechniques, Ｂoulton et al., eds., Ｔhe Ｈumana Ｐress, Ｃlifton, ＮＪ（1989）; Ｇilboa et al., ＢioＴechniques 4: 504-512（1986）参照）。外来の遺伝子およびプロモーター成分はレトロウイルスゲノムのプラスミドＤＮＡ均等物中に挿入され得、パッケージングシグナル、ｐｓｉを保持している。ついで、これらのプラスミドはパッケージング細胞株に形質転換され、ビリオン粒子中にそれら自身のＲＮＡのパッケージングに必要なｐｓｉ成分を欠いている野生型レトロウイルスの配列を担持する（Ｃone et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 81: 6349-6353（1984）; Ｍiller et al., Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 6: 2895-2902（1986）; Ｍann et al., Ｃell 33: 153-159（1983））。パッケージング株は、外来遺伝子−保持レトロウイルス配列中にコードされたｐｓｉ−保持ＲＮＡをビリオン粒子中に挿入することができる。ついで、これらの株は、外来遺伝子配列および非複製成分ビリオンを含む複製欠陥ビリオンのみを培地中に放出する。これらの複製欠陥ビリオンは効果的に他の分裂細胞に感染し、それらのゲノム中に外来遺伝子を挿入することができる。
組織化学的マーカーである、lacＺ（Ｐrice et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 84: 156-160（1987））、神経成長因子（Ｗolf et al., Ｍol. Ｂiol. Ｍed. 5: 43-59（1988）; Ｒosenberg et al., Ｓcience 242: 1575-1578（1988））、チロシンヒドロキシラーゼ（Ｗolff et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 86: 9011-9014（1989）; Ｈorellou et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 86: 7233-7237（1989））およびその他の蛋白（Ｆredericksen et al., Ｎeuron 1: 439-448（1988）; Ｃepko, Ｃ., in Ｎeuromethods, vol. 16, Ｍolecular Ｎeurobiological Ｔechniques, Ｂoulton et al., eds., Ｔhe Ｈumana Ｐress, Ｃlifton, ＮＪ（1989）; Ｃepko, Ｃ., Ａnn. Ｒev. Ｎeurosci. 12: 47-65（1989））、の遺伝子を担持するものを含む多数のレトロウイルスベクターが神経科学的利用のために開発されてきた。インビボにおけるlacＺ保持レトロウイルス（例えば、ＢＡＧ）の胎芽組織への直接導入は神経細胞およびそれらの分化娘細胞、観察されているように、例えば、乳首、網膜および大脳皮質、中に遺伝子送達を生ぜしめ得る（Ｇray, Ｇ.Ｅ., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 85: 7356-7360（1988）; Ｔurner et al., Ｎature（Ｌond.）328: 131-136（1987）; Ｗalsh et al., Ｓcience 241: 1342-1345（1988）; Ｌuskin et al., Ｎeuron 1: 635-647（1988））。これらの細胞の低い有糸分裂指標およびレトロウイルスの比較的短い半減期（培地中４時間；Ｃepko, Ｃ., in Ｎeuromethods, vol. 16, Ｍolecular Ｎeurobiological Ｔechniques, Ｂoulton et al., eds., Ｔhe Ｈumana Ｐress, Ｃlifton, ＮＪ（1989））から想像されるように、この種のベクターの成人神経組織中の注入についての細胞の標識については報告されていない。培地中の分裂細胞に感染させ、ついでこれらの遺伝学的に修飾された細胞を脳中に移植することによって、成熟げっ歯類脳中に間接的な「遺伝子送達」のためにこれらのレトロウイルスベクターの使用が可能なことは幾つかの研究で示されている（Ｇage et al., Ｎeuroscience 23: 795-807（1987））。この手法が、移植ラットＣ６グリオノーマ細胞および線維芽細胞の運命を観察するためにlacＺベクターに用いられた（Ｓhimohama et al., Ｍol. Ｂrain Ｒes, . 5: 271-278（1989））。ＮＧＦベクターおよびＴＨ−保持ベクターを感染させたラット線維芽細胞株、ＮＧＦベクターで感染させたラット褐色腫細胞およびＴIIベクターで感染させたマウス下垂体株が、成熟ラット脳の領域に生物学的に活性なＮＧＦおよび／またはＬ−ドーパおよびドーパミンを送達するのに使用された（Ｒosenberg et al., Ｓcience 242: 1575-1578（1988）; Ｗolff et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 86: 9011-9014（1989）; Ｈorellou et al., Ｅur. Ｊ. Ｎeurosci. 2: 116-119（1990））。ｍｙｃおよびＳＶ４０Ｔ腫瘍遺伝子を保持するレトロウイルスベクターでの感染について幾つかの新規な多能力的神経細胞株が開発されてきた（Ｓnyder et al., Ｎeurosci. Ａbst. 9: 9（1989）; Lendahl et al., Ｃell 60: 585-595（1990）; Ｒyder et al., Ｊ. Ｎeurobiol. 21: 356-375（1990））。
げっ歯類グリオノーマモデルが、インビボにおける腫瘍細胞への外来遺伝子の送達のためのレトロウイルスベクターの使用の可能性を検討するために使用された。ＢＡＧレトロウイルスベクターが、成熟ラット脳中に移植されたラットグリオノーマ細胞中にレポーター遺伝子ｌacＺを送達するために使用された。この発明者らは、ＢＡＧレトロウイルスの直接注入またはこのウイルス性ベクターを放出するｐｓｉ２−ＢＡＧパッケージング株の移植後の内因性脳細胞およびＣ６グリオノーマ細胞の注入を評価した。培養された細胞および組織片は、遺伝子送達の成功の指標としての細菌性ベータ−ガラクトシダーゼの組織化学的染色によって、およびグリオノーマ細胞および星状細胞のマーカーとしてのグリア原線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）およびＳ１００の免疫染色（Ｂignami et al., Ｂrain Ｒes. 43: 429-435（1972））、および線維芽細胞−誘導パッケージング株のマーカーとしてのフィブロネクチンの免疫染色によって評価した。
材料および方法
細胞培養、レトロウイルス感染およびベータ−ガラクトシダーゼ染色：
自己指向性レトロウイルス産生株、ｐｓｉ２−ＢＡＧ２−１４、をＣ．セプコ（ハーバード医学校）からＭ．ローゼンバーグ（ＵＣＳＤ）を通じて得た（Ｐrice et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 84: 156-160（1987）; Ｓhort et al., Ｄev. Ｎeurosci. 12: 34-45（1990））が、これをダルベコ修正イーグル培地、１０％胎子ウシ血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン（Ｄ１０Ｐ／Ｓ）１００μｇ／ｍＬおよびネオマイシン類似体、Ｇ４１８、５００μｇ／ｍＬ中で生長させた。培養材料はすべてＧＩＢＣＯから入手した。ウイルスは、ほぼ融合した培養物の上薄層培地をＧ４１８を含まない量を減らした新鮮培地で置換して採取した。ウイルス粒子を含むこの調整培地はを２４−２８時間後に除去し、セルロースアセテート膜（孔径０.４５μｍ、Nalgene）で濾過し、−７０℃で保存した。Ｇ４１８の存在下３Ｔ３細胞上のコロニー形成単位（ｃｆｕ）としてウイルス力価を測定した。ウイルス力価は１−３×１０4ｃｆｕ／ｍＬであった。機つかの例では、ウイルスストックは遠心分離により１−３×１０5ｃｆｕ／ｍＬに濃縮した（Ｐrice et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 84: 156-160（1987））。
ラットグリオノーマ細胞株、Ｃ６（Ｂenda et al., Ｓcience 161: 370-371（1968））はＤ１０Ｐ／Ｓ中で生長させた。Ｃ６−ＢＡＧ株はＣ６グリオノーマ細胞をＢＡＧベクターで感染させ、Ｃ４１８選択のもと単一の細胞サブクローンを分離して調製した。細胞は、組織化学的分析によってベータ−ガラクトシダーゼを検定した（Ｐrice et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 84: 156-160（1987））。少なくとも６継代後９９％の細胞がベータ−ガラクトシダーゼ陽性であるサブクローン（Ｃ６−ＢＡＧ  Ｂ２−１０）を、継代２または３における次の実験に使用した。
成熟ラット脳中への細胞移植およびレトロウイルス接種：
体重１５１−１７５ｇの成熟フィッシャーラットをエキセシンの腹腔内注射によって麻酔した（Ｓhort, Ｃ., Ｐrinciples and Ｐractice of Ｖeterinary Ｍedicine, Ｗilliams and Ｗilkins, Ｂaltimore, ＭＤ（1987））。各実験群につきラット２〜５匹を使用し、実験は少なくとも２回行われた。大脳注射の定位座標は成熟ラットの定位地図から決定した（Ｐaxinos et al., in Ｒat Ｂrain in Ｓtereotoxic Ｃoordinates, 2nd ed., Ａcademic Ｐress, Ｎew Ｙork（1986））。細胞およびウイルスは８μｇ／ｍＬポリブレンで注入するか、または斜めの２５ゲージ針の１０μｌハミルトンシリンジを用いて調整媒体で注入した。注入（５μｌ）は５分間隔で行われ、針は除去前さらに２分間その場所に保持された。動物は殆どが外科的手術に耐えたが、ほんの数匹が麻酔中に死亡した。
移植実験では、融合培養物を、Ｃa++およびＭg++を含まないダルベコリン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）で濯ぎ、０.０５％トリプシンでインキュベートした。細胞をＤ１０に懸濁させ、５分間１２００×ｇで遠心分離してペレットにした。細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、遠心分離により集めた。最終細胞懸濁液を完全ＰＢＳ（ＰＢＳ、このＰＢＳはＭgＣl2およびＣaＣl2を各１μｇ／ｍＬ、０.１％グルコースおよび５％ラット血清を含む（ＧＩＢＣＯ））中密度１０5細胞／μｌに調整し、移植まで４℃にて保存した。
組織調製：
かん流前に、ラットをエキセシンで麻酔した（Ｓhort, Ｃ., Ｐrinciples and Ｐractice of Ｖeterinary Ｍedicine, Ｗilliams and Ｗilkins, Ｂaltimore, ＭＤ（1987））。かん流は、ヘパリンナトリウム１０,０００単位／ｍＬを含む冷ＰＢＳ５０ｍＬで、ついでＰＢＳ中冷３％パラホルムアルデヒド２５０ｍＬを用いて上行大動脈を通過させて行った。４℃にて一夜ポスト固定後、脳は浸漬までスクロースのパーセントを増加させながら（１５、２０、３０）４℃にて維持した。脳をドライアイスで凍結させ、切片にするまで−８０℃にて維持した。切片は凍結ミクロトーム上で４０μｍに切断し、０.１％アジ化ナトリウムを含む０.５Ｍトリス−ＨＣl、pＨ７.４中、または３３％ポリエチレングリコール中で染色まで維持するか；または、低温槽中で１０−１５μｍに切断し、ゼラチン−代替スライド（フィッシャー；１００ブルーム）上に直接のせ、染色まで乾燥させて４℃にて保存するかのいずれかにした。
組織学：
組織のベータ−ガラクトシダーゼについては、ターナーおよびセプコ（Ｔurner et al., Ｎature（Ｌondon）328: 131-136（1987））の変法を用いた。要約すれば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ガル、ベーリンガー・マンハイム）をＤＭＳＯ中４％貯蔵液として調製した。浮遊またはスライド上の切片（または、組織培養皿上の細胞）を２μＭ ＭgＣl2、３５μＭ Ｋ3Ｆe（ＣＮ）6、３５μＭ Ｋ4Ｆe（ＣＮ）6、０.０１％デオキシコリン酸ナトリウムを含むＰＢＳの溶液中で３７℃にてインキュベートしたが、インキュベートの直前に０.０２％ＮＰ４Ｏ，pＨ７.３；０.１％Ｘ−ガルを添加した。３７℃にて一夜インキュベートした後、培養された細胞を直接観察し、切片をＰＢＳで濯ぎ、代替スライド上にのせ、ついでヘマトキシリンおよびエオシンまたは中性レッドでカウンター染色した。ついで、水で濯ぎ、濃度を高くしながらアルコールに通し、水中に放置して、水性カバー液、クリスタルマウント（バイオメディア）、でカバースリップするか、またはキシレン中に放置して、パーマウント（フィッシャー）でカバースリップした。
切片の幾つかはＧＦＡＰ、Ｓ１００またはフィブロネクチンを同定するために免疫細胞化学的に染色された。これらの切片はＰＢＳ中で濯ぎ、３０分間ブロッキング血清でインキュベートし、ついで、室温で一夜下記の抗体とともにインキュベートした：ヒトＧＦＡＰに対するマウスモノクローナル抗体（ベーリンガー・マンハイム）、１：３希釈；ウシＳ１００に対するウサギポリクローナル抗体（デイコ）、１：７５０希釈；または、ヒトフィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体（カペル）、１：８０希釈；これらすべてはそれぞれのラットの抗原と交差反応する。抗体を、０.９％ＮaＣl、０.２５％トリトン−Ｘ−１００および３％ブロッキング血清を含む１０μＭリン酸緩衝液、pＨ７.４で希釈した。完全に濯いだ後、切片をビオチニル化ウマ抗マウスＩgＧ、ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩgＧ、またはウサギ抗ヤギＩgＧ（ベクタステイン）、１：２００同緩衝液希釈、のいずれかとともに２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで数回濯いだ。ついで、切片をアビジンとビオチニル化セイヨウワサビペルオキシダーゼの複合体（ベクタステイン、ＡＢＣエリートキット）、１.５：１００同緩衝液希釈、とともに３０分間インキュベートした。このペルオキシダーゼを、５０μＭトリス−ＨＣl、pＨ７.３、中０.０５％３,３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、０.０４％ＮiＣl2および０.０１％Ｈ2Ｏ2とともに５−１０分間室温にて反応させて可視化した。幾つかの例では、切片を最初にベータ−ガラクトシダーゼ活性について組織化学的に染色し、ついで、ＧＦＡＰについて免疫染色した。別の例では、一連の切片を別法にベータ−ガラクトシダーゼおよびＧＦＡＰまたはＳ１００について染色した。
結果
培養物中のpsi ２−ＢＡＧ細胞の組織化学的染色では、採用した中性条件下、ベータ−ガラクトシダーゼに対してほぼ１００％が染色陽性であり、ＧＦＡＰに対しては染色されず、一方、Ｃ６細胞の大多数がＧＦＡＰ抗原に対して陽性に染色され、全部がベータ−ガラクトシダーゼに対して陰性であった。psi ２−ＢＡＧ細胞の、Ｃ６細胞に感染し得るＢＡＧウイルス放出能力はこれら２つの細胞型のそれぞれを含有するカバースリップ（coverslip）を同じ培養皿内の離れた位置に置くことにより証明された。psi ２−ＢＡＧ細胞の存在下、Ｃ６細胞を担持するカバースリップ上で常に増える細胞部分は（パーセンテージ）は、９６時間にわたってベータ−ガラクトシダーゼに対して陽性に染色された。基本的には、グリオーマカバースリップ上の全細胞がＧＦＡＰにも陽性であった。これはpsi２−ＢＡＧ細胞によって放出されたＢＡＧウイルスがグリオーマ細胞ゲノムに成功裏に組み込まれたことと一致する。
インビボでの内因性脳細胞への遺伝子転移の効率を、５μｌのＢＡＧレトロウイルスベクター（９０−９００cfu）を成熟ラット海馬又は尾状核に直接接種することにより試験した。対照動物には同時に完全ＰＢＳを接種した。動物を注射後７日目に殺した。ウイルスを直接注射された動物では、対照動物でおけると同様、実質中に、ベータ−ガラクトシダーゼに対して陽性に染色される細胞は認めなかった。以前に知られているように（Shimohama et al., Mol.Brain Res., 5: 271-278（1989））、両群からの幾つかの切片（セクション）では、脈絡膜叢内でベータ−ガラクトシダーゼに対する僅かな陽性染色が認められた。これらの対照切片では、陽性に染色される細胞が腫瘍塊中に存在する動物の場合と、染色は質的に異なっていた。（下記参照）
グリオーマ細胞には、接種後の増殖ラグがあるかもしれず、従って最初はウイルスの組み込みに適した、細胞分割段階でないかもしれないと仮定して、腫瘍細胞の脳への直接注射の効率を、Ｃ６細胞の移植からウイルス注射までの間隔を様々に変化させて試験した。移植及び感染の部位は右前頭葉である。グリオーマ細胞とＢＡＧウイルスの同時注射のために、Ｃ６細胞（５ｘ１０5）をウイルスストック（９０−９００cfu）５μｌに懸濁した。他の動物は、既にＣ６細胞が移植された部位に、遅れてウイルスストック注射を受けた。ウイルスストック５μｌづつを、３及び５日前に、それを用いてＣ６細胞を移植した定位固定性（立体空間的）コオーディネート（stereostatic coordinate）と同じものを用いて注射した。対照動物にはウイルス不在で、Ｃ６又はＣ６−ＢＡＧ細胞を移植した。最後のウイルス注射から７〜１０日後に全動物を殺した。Ｃ６細胞とＢＡＧウイルスの同時注射では、数個の腫瘍細胞（０.１％以下）のみがベータ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色された。染色された内皮細胞が、腫瘍塊の内部又は周囲の血管内にも認められる例もあった。腫瘍移植から遅延してウイルス注射された動物の場合にも、少しの細胞のみが陽性であった。ウイルス注射を遅れさせた動物と、Ｃ６とＢＡＧウイルスを同時注射した動物において、陽性に染色された細胞の数には注目すべき差はなかった。Ｃ６及びＣ６ＢＡＧ細胞の注射で、同様の大きさの腫瘍が発現した。ウイルス不在でのＣ６細胞注射では、青色細胞（blue cells）は認められなかった。Ｃ６ＢＡＧ注射では、既知のごとく（Shimohama et al., Mol.Brain Res., 5: 271-278（1989））、全腫瘍細胞がベータ−ガラクトシダーゼ陽性であった。
psi ２−ＢＡＧパッケージング細胞の移植片の運命を調べるために、動物の右前頭葉にpsi２−ＢＡＧ細胞（５ｘ１０5細胞）を注射し、対照として、同じ数のpsi２細胞を左前頭葉に注射した。移植後の様々な時期に動物を殺した。１日後、右前頭葉の注射部位に、ベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞がぎっしり詰まった塊が見られた。第１日には、左前頭葉には陽性に染色される細胞は見られず、移植後、第５、９、１４及び２１日後に殺された動物から得た切片には、どちらの側にも陽性に染色された細胞は見られなかった。この期間を通して、脳における腫瘍の形成又は他の破壊的変化の証拠はなかった。
次いで、パッケージングライン、psi２−ＢＡＧの共−移植（co-graft）による、lacＺ遺伝子のＣ６へのin situ遺伝子転移の効率を試験した。同時の共-移植のための細胞懸濁液は、psi  ２−ＢＡＧ細胞５個に対してＣ６細胞１個の細胞混合物を含有していた。移植の部位は、再び右前頭葉であった。遅延注射のためには、動物にＣ６細胞（２×１０5細胞）を１日目に与え、次いでpsi２−ＢＡＧ細胞（５×１０5細胞）５μlを第３及び７日目に注射した。全ての場合、psi２−ＢＡＧ細胞の移植の７日後に動物を殺した。対照として他の動物にpsi２−ＢＡＧ及びＣ６単独を並行して注射した。Ｃ６及びpsi２−ＢＡＧ細胞の同時共−移植を受けた動物由来の組織学的に染色された切片には、青色及び非−青色細胞の両方が腫瘍塊中に認められた。これらのベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のあるものは、ＧＦＡＰ又はＳ１００に対して共−染色され、それらがＣ６グリオーマ細胞であることを示していた。腫瘍細胞塊内には、ベータ−ガラクトシダーゼ陽性でない、ＧＦＡＰ又はＳ１００陽性細胞も多数存在した。他のベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のあるものは、ＧＦＡＰ、又はＳ１００を発現しないか、発現が低いＣ６細胞かもしれない。実際、脳に単独で移植されたＣ６細胞の内、得られた腫瘍塊中の約半数の細胞のみが、Ｓ１００陽性であり、さらに少数がＧＦＡＰ陽性であった。幾つかのベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞も、脳実質に比較して腫瘍塊中でより長く生存しうる、psi２−ＢＡＧ細胞かもしれない。しかしながら、フィブロネクチンに対する免疫染色で、７日目の共−移植片中にはpsi２−ＢＡＧ細胞が無いことが分かった。これら腫瘍の連続的な切片を検査し、多くの切片がベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞を含まず、psi２−ＢＡＧ細胞とＣ６細胞とを同時に注射された動物で、腫瘍中の高々約１％の細胞が、lacＺ遺伝子を発現したと見積ることができた。対照的に、パッケージングラインの腫瘍塊への遅れた注射を受けた動物から得た切片は、腫瘍全体を通した切片の全てにベータ−ガラクトシダーゼに対して陽性に染色される多数の細胞を含んでおり、１０％もの細胞が陽性であり、大多数の陽性細胞は腫瘍周辺にあった。グリア特異的抗原Ｓ１００とベータ−ガラクトシダーゼに対する共−染色で、腫瘍内の多くの細胞がグリアから誘導され、ベータ−ガラクトシダーゼ活性に陽性の細胞もあることが分かった。このように、腫瘍細胞は、腫瘍とパッケージングラインを同時に注射した場合よりも、腫瘍細胞の樹立後にパッケージングラインを移植した場合の方が、効率よく感染されるようである、注射間の遅延が３日の場合には、７日の場合と対照的に、動物間になんらの有意な差異はないと思われる。
考察
この研究では、我々はリポーター遺伝子、lacＺの、培養物中及びラット脳内の、ラットグリオーマ細胞へのデリバリー（到達）おける、複製欠如（replication defective）−レトロウイルスベクターの有効性を証明した。培養物中では、psi２−ＢＡＧ細胞から放出されたＢＡＧレトロウイルスベクターは成功裏に、同一皿内のＣ６細胞に感染し、それはベータ−ガラクトシダーゼ活性に対する染色により証明された。形態学とＧＦＡＰとの免疫反応性によりベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞をグリオーマ細胞である同定した。次いで、lacＺ遺伝子の内因性脳細胞又はＣ６細胞へのインビボ転移の効率を、２つの方法で比較した：ＢＡＧウイルスの直接注射又はウイルスを放出するパッケージングラインの移植である。インビボでの最高効率はレトロウイルスパッケージングラインのＣ６腫瘍細胞の樹立されたベッドへの移植により得られた。
ウイルスを正常な成熟ラットの脳の実質に直接注射することでリポーター遺伝子を到達させる当初の試みでは、実質上、ベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞は得られなかった。これらの動物では、完全なＰＢＳを接種された対照におけると同様、実質でなく脈絡膜叢内に僅かに陽性の染色が認められた。このリソソームベータ−ガラクトシダーゼの内因性陽性染色は以前に報告されており（Shimohama et al., Mol.Brain Res., 5: 271-278（1989））、切片をニュートラルレッドで対比染色するとマスクされた。成熟ラット、及び出生直後の若い動物でさえ、における細胞の大多数が後期−有糸分裂（post mitotic）であり、レトロウイルスの組み込みには細胞分裂が必要であるという理由から、ウイルスベクターによる直接到達の失敗は驚くべきことではない。接種部位としての海馬は、該領域の細胞において出生後の分割が最後に終わるとの理由で、組み込みの成功の可能性を増すために選択された（Das et al., Brain Research 22: 122-127（1970））。グリオーマ細胞と一緒に、又はグリオーマ移植の後遅れて、ＢＡＧウイルスを接種された動物では、ごく僅かの単離された腫瘍細胞が感染した。これは、多分、レトロウイルスのインビボでの半減期がかなり短いこと、及びグリオーマ細胞の分裂状態を反映している。僅かのベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の大部分が有糸分裂活性が最も高いと考えられている腫瘍の端の部分で見出された。時たま染色された内皮細胞が観察されたが、これは、内皮細胞は血管や脳、特に血管形成した腫瘍ベッドで連続的に分裂するので、予想しうることである。
ウイルス力価及び接種物の容量の両方が、直接的なウイルス注射を用いてより高い組み込み成功率を達成することを大きく制限している。遠心によりウイルス力価を増大する試みでは、力価は１０−１００倍にしか増大しなかった。５μｌの１０4−１０6cfu／mlのレトロウイルスストックと一緒にグリア腫瘍を接種（約１０5細胞から始める）すると、ウイルスの細胞に対する割合は１：１よりもはるかに低い（感染の多重度ＭＯＩ≦０.０１）。我々の側では、培養中で迅速に分裂しているＣ６細胞のＢＡＧレトロウイルスベクターによる感染効率はＭＯＩ３で約３０％であった。このように、インビボでの腫瘍の直接接種が非効率的であることは、驚くことではない。
パッケージングラインの移植により、長期間にわたって腫瘍内にウイルスを放出することによる直接接種における制限の幾つかが克服されるように思える。この実施例は、パッケージングライン、psi ２−ＢＡＧ及びグリオーマ細胞の共−移植（co-grafting）で、直接的なウイルス接種よりも、リセプター遺伝子、lacＺをこれら腫瘍細胞に効率よく到達させることを示す。これら２つの細胞型を同時に移植する場合に比較して、psi２−ＢＡＧ細胞の移植の３日又は７日前にグリオーマ細胞を移植された動物では、一層効率が高かった。遅れた注射を受けた動物の脳の切片の組織化学的な分析により、腫瘍が広範囲に感染されたことが分かった。psi２−ＢＡＧ細胞を単独で移植した別の実験では５日後に検出されなかったので、psi２−ＢＡＧ移植の１週間後に脳を検査した。さらに、７日後に共−移植片を免疫染色すると、フィブロネクチン陽性の細胞は認められなかった。このことは、psi２−ＢＡＧ移植片が、ラット系統の相違により免疫的に拒絶されたか、又はもし存在するとすれば、レトロウイルスにコードされている遺伝子が発現されなかったかのいずれかであることを示唆している（Plamer et al., personal communication）。免疫細胞化学により、我々は、ベータ−ガラクトシダーゼ活性及びＧＦＡＰの両者又はＳ１００抗原に染色する腫瘍内の細胞のあるものを樹立し、psi２−ＢＡＧ細胞から放出されたＢＡＧウイルスにグリオーマ細胞が成功裏に感染したことを確認した。しかしながら、腫瘍内にはベータ−ガラクトシダーゼ陰性であってＧＦＡＰ−及びＳ１００陽性の細胞があり、腫瘍細胞の感染が不完全であることを示唆していた。
脳内のグリオーマ細胞の、レトロウイルスパッケージングラインの共−移植による感染効率を増大する幾つかの方法が考えられる。１つの方法は、長期間にわたって腫瘍ベッド内にウイルスを放出する細胞の数を増加するためにパッケージングラインを連続的に注射することにより行われる。他のレトロウイルス放出の量と期間を増加する方法は、宿主と免疫適合性であり、移植後長期間生存しうるパッケージングラインを開発することである。腫瘍周辺の脳実質を含む広範な領域への放出も、星状細胞から導かれたパッケージングラインを用いて達成することができるだろう。移植された新生の、又は胚性星状細胞はそれが注射された元の位置から５mmも移動することができることが知られており、グリア腫瘍細胞に到達し侵入することでは線維芽細胞よりも優れていることが示唆されている（Jaque et al., Dev.Neurosci. 8:142-149（1986）; Zhou et al., J.Comp.Neurol. 292:320-330（1990）; Hatton et al., Soc. for Neurosci. Abstracts 15:1369（1989））。加えて、内因性脳細胞であるグリアから誘導されたグリア-誘導パッケージングラインは生存性が高く、in situの合図に対してより高い反応性を有するかもしれない。突発性脳腫瘍の場合、腫瘍塊が除去されて、その部位に幾つかの腫瘍細胞が残存しており、そしてパッケージングラインを患部に直接移植するという構図を想像することができる。これは、移植されうるパッケージング細胞の数を増加し、腫瘍細胞に対するパッケージング細胞の数を増加し、かくして腫瘍細胞への感染の能力を増加することになる。
本実施例は、治療能力を有する遺伝子を中枢神経系（ＣＮＳ）の悪性グリア腫瘍へのデリバリーに有用なモデル系を表しており、現時点で腫瘍学におけるユニーク取り組みを提示している。腫瘍細胞は正常な脳内に浸潤しているので、外科的な完全摘出は不可能である。正常な脳の照射損傷に対する感受性から、放射線照射療法には限界がある。化学療法は血液脳関門の存在で、この関門を横切って浸潤性腫瘍細胞に到達しえない薬物の有用性を減少することにより妨げられている。レトロウイルスは腫瘍細胞に遺伝的な感受性を与える潜在的治療剤である。１例として単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を含有するビリオンを放出するレトロウイルスパッケージングラインがある（Moolten et al., J.Natl.Cancer Inst.82:297-300（1990））。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子は、哺乳動物の細胞ゲノムに取り込まれると、ヌクレオシド類似体、acyclovir、ganciclovir、FIAUのような化学療法剤に対する感受性を付与する。細胞培養研究により、このレトロウイルスに感染したＣ６グリオーマ細胞及び他の細胞は、非感染細胞を殺すのに必要なganciclovir量の１００分の１の濃度で死滅することが示された（Moolten et al., J.Natl.Cancer Inst.82:297-300（1990））。
後のＨＳＶ−ＴＫウイルスパッケージングラインの共-移植し、動物をヌクレオシド類似体で処理することによってもＣ６グリオーマ細胞を殺すことは可能かもしれない。さらに、腫瘍血管をＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を用いる提案の死滅系の標的としてもよい。
実施例３
レトロウイルスベクターを、遺伝子を分裂中の細胞のゲノムに転移するために用いることができる。遺伝子デリバリー及びganciclovirによる死滅の効率を高めるために、Ｃ６ＶＩＫ細胞に外生の野生型レトロウイルス（ＭｏＭＬＶ）を感染させることにより、新しいパッケージングライン（Ｃ６ＶＩＫ−ＷＴ）が開発された。Mann et al., Cell 33:153-159（1993）; Price et al., Proc.Natl. Acad.Sci.USA 84:156-160（1987）; 及びCepko,C., in Neuromethods, vol.16, Molecular Neurobiological Techniques, Boulton et al., eds., The Humana Press, Clifton, NJ（1989）, pp. 177-219参照。腫瘍細胞は脳実質深くに移行しうるので、それらは腫瘍塊から離れた腫瘍細胞にベクターをデリバリーできなければならない。培養中では、５０％のＣ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞が０.０２４μＭ  ＧＣＶで死滅したが、５０％のＣ６ＶＩＫ細胞を死滅させるには７.３μＭ  ＧＣＶが必要であった。これは、Ｃ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞が、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の複数の組み込みにより、又はＣ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞のＧＣＶ毒性産物への感受性が増大していることにより、Ｃ６ＶＩＫ細胞よりもＨＳＶ−ＴＫ活性が高いことを示している。Ｃ６ＢＡＧ細胞（lacＺ遺伝子で標識されており、従ってベータガラクトシダーゼで組織化学的検出可能）と、Ｃ６ＶＩＫ細胞及びＣ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞を培養し、次いでＧＣＶ処理すると、Ｃ６ＶＩＫ細胞よりもＣ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞と一緒に培養した場合の方が、実質上、より多くのＣ６ＢＡＧ細胞が死滅した。恐らくＣ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞は野生型レトロウイルスとＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターの両方（そのいずれもＣ６ＶＩＫ細胞により産生されない）を産生し、Ｃ６ＢＡＧ細胞の死は、レトロウイルス感染及び／又は自己生成したＧＣＶ毒性生産物を介するのかもしれない。Ｃ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞の皮下接種、又はＣ６ＶＩＫ−ＷＴ細胞とＣ６ＢＡＧ細胞の同時皮下接種（Ｃ６ＢＡＧ細胞単独でなく）を受けたヌードマウスの大多数が、インビボのＧＣＶ処理で腫瘍の緩解を示した。これらの所見は、レトロウイルスを介する遺伝子デリバリーの効率及び腫瘍細胞の毒性物質への感受性が、レトロウイルスベクターに感染した細胞をパッケージングセルラインに変化させるヘルパーウイルスを用いることで、増大されることを示している。
遺伝子デリバリーにおけるレトロウイルスベクターの使用は必ずしも腫瘍破壊のために設計された遺伝子系に限定されない。腫瘍発生又は腫瘍調節に関連した遺伝子デリバリーは、探求する上で有用な戦略でもある。グリア腫瘍内での、第１７及び１０染色体、及びあまり一般的でないが、第２２染色体上のＤＮＡマーカーに関する異型接合性の欠如は、腫瘍サプレッサー遺伝子がこれらの染色体領域に存在することを示唆している（Bigner et al., Hereditas 101: 103-113（1984）; Bigner et al., Cancer Res.88: 405-411（1988）; James et al., Cancer Res. 48:5546-5551（1988）;El-Azouzi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:7186-7190（1989）。網膜芽腫遺伝子機能の回復により、培養中の網膜芽腫及び骨肉腫細胞の増殖が阻害されることが示された（Huang et al., Science 242:1563-1566（1988））。
実施例４
受容腫瘍細胞に、治療上有用なレベルで化学感受性を移すために、野生型Moloneyネズミ白血病ウイルス（ＷＴ  ＭｏＭＬＶ）を感染したＣ６ＶＩＫグリオーマラインをベクター生産セルライン又は「ドナー」セルラインとして用いた。グリオーマ細胞は、新生物性なので、インビボで長期間持続し他の腫瘍細胞と混じる。さらに、欠損ヘルパーよりも、野生型ヘルパーウイルスの方が、ＶＩＫベクターを用いる「受容（recipient）」腫瘍細胞のより広範な感染を仲介する。感染したセルライン（Ｃ６ＢＶＩＫＷＴ）は複製欠失ＶＩＫベクターと野生型ウイルスの両方を放出する。Ｃ６ＢＶＩＫＷＴ細胞は、受容Ｃ６ＢＡＧ腫瘍細胞を培養中及びインビボの両方で、ganciclvir治療感受性にする。
方法
レトロウイルス：ＶＩＫレトロウイルスベクターは、レトロウイルスプラスミドｐＬＲＮＬのＢamＨＩ部位にクローンされたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の全コード配列と２kbの３’非コード領域（polyA付加部位を含む）を含む２.８kb ＢamＨＩフラグメントを含有する（Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614, 1991）。ＢＡＧレトロウイルスベクターは５’ＬＴＲから転写されたlacＺ及びＳＶ４０プロモーター−エンハンサーエレメントから転写されたｎｅｏR遺伝子を担持している（Price et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:156-160（1987））。感染性野生型ＭｏＭＬＶを放出するプロデューサーセルライン「ｓｕｐ」を用いた（Reik et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:1141-1145（1985））。
細胞培養及び感染：ラットＣ６グリオーマラインをニトロソメチルウレアで誘発した脳腫瘍（Benda et al., Science 161:370-371 1969）から誘導した。Ｃ６ＢＡＧセルラインは、Ｃ６グリオーマ細胞（Bendaら、1969）にＢＡＧレトロウイルスを感染し、Ｇ４１８選択の下でクローニングすることで生成させた（以下参照）。このクローン中の細胞は均一にＥ.coliベータガラクトシダーゼを発現する（Shimohama et al., Mol.Brain. Res. 5:271-278, 1989）。
Ｃ６ＢＵ１セルラインはラットＣ６グリオーマ細胞から、突然変異誘発及びブロモデオキシウリジン中で内因性ＴＫ活性の喪失に関して選択することにより誘導された（Amano et al., Exp.Cell.Res.85:399-408, 1974）。Ｃ６ＢＵ１細胞を、レトロウイルスベクター、ＶＩＫ（Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614, 1991）、又はpsi-2プロデューサーラインにより、生産されたレトロウイルスベクター、ＢＡＧ（Price et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:156-160、1987）のいずれかに感染させ、それぞれ、ＨＡＴ（１０mＭヒポキサンチンナトリウム、４０μＭアミノプテリン、及び１１６mＭチミジン、ＧＩＢＣＯ）又はネオマイシン類似体、Ｇ４１８（１mg／ml、ＧＩＢＣＯ）の存在下、選択してクローニングし、ラインＣ６ＢＶＩＫ及びＣ６ＢＢＡＧを得た。Ｃ６ＢＵＩ及びＣ６ＶＩＫ細胞をプロデューサーライン「sup」から放出された野生型ＭｏＭＬＶウイルス（ＷＴ）に感染し、それぞれ、Ｃ６ＢＷＴ及びＣ６ＶＩＫＷＴ細胞を製造した。研究に用いた他のセルラインはＮＩＨ３Ｔ３及びＴＫ−陰性ＮＩＨ３Ｔ３である。
全セルラインを１０％ウシ胎児血清（GIBCO）、１００units/mlペニシリン、及び１００μg／mlストレプトマイシンを含有するダルベッコの改良イーグル培地（３２０−１９６５、ＧＩＢＣＯ）中で培養した。全感染はポリブレン（Sigma）の存在下、記載に従って行った（Mann et al.,Cell 33:153-159（1983））。
ウイルスストックは、選択培地でほぼ８０％全面成長した培養物から得、次いでＧ４１８又はＨＡＴを含有しない培地で２４時間維持した。培養培地を除き、０.４５μmフィルター（Nalgene）でろ過し、−７０℃で保存した（ウイルスストック）。
プロデューサーセルラインのウイルス力価を、ＮＩＨ３Ｔ３（ＴＫ−）又はＮＩＨ３Ｔ３細胞にウイルスストックを感染させ、それぞれ、ストック単位量当たりのＨＡＴ耐性又はＧ４１８耐性細胞の数を決定することで、測定した。Ｃ６ＶＩＫ細胞からの培養培地は、ここで用いたと同じ経過で、ヘルパーウイルス活性を持たないことが示された（Ezzedine et al., New Biol. 3:608-614, 1991）。
培養中でのganciclovir感受性アッセイ：単離した細胞の感受性を測定するために、細胞を２４−ウエルプレートに１０4細胞／ウエルの密度でプレートした。翌日、培地を種々の濃度（０−１μＭ）（４重）のganciclovir（Cytovene, Burroughs Wellcome）を含有する培地で置換した。４日後、細胞をトリプシンで収穫し、セルカウンター（Coulter Electronics Ltd., Luton, 英国）により計数した。未処理細胞の数（１００％）に対する細胞の割合（％）で細胞増殖を表した。
コロニー形成におけるganciclovir感受性を測定するために、細胞を２５cm2培養フラスコ当たり500細胞の密度で、細胞をプレートした（２重）。７日後、種々の濃度（０,０.１,０.５,１,１０,５０,１００,３００μＭ）のganciclovirを加え（４重）、３−５日ごとに培地を交換しながら、９−１２日間インキュベートした。次いで、細胞を１００％メタノールで固定化し、Giemsa（Freshney,R.I.,”Culture of Animal Cells”in; A Manual of Bssic Techniques, 2d. ed., New York, Alan R.Liss, 170-171（1987）、及び直径が≧２mmであるコロニーを数えた。
共−培養実験：遅延的共培養実験のために２組、Ｃ６ＢＡＧまたはＣ６ＢＢＡＧ細胞（受容体）を、２５cm2培養フラスコ当り１０3細胞の密度で植え付け、７日間培養し、その時点でサンプリングすると細胞数が、フラスコ当り５×１０4細胞に増加していた。供給体Ｃ６ＶＩＫまたはＣ６ＶＩＫＷＴ細胞を培地に１：２の比率（５×１０4受容体細胞：１０5供給体細胞）で加える。対照培地は、Ｃ６ＢＡＧまたはＣ６ＢＢＡＧ細胞のみ、または、上記のように遅延させた後、“供給体”Ｃ６ＢＵ１またはＣ６ＢＷＴ細胞と共に植えたＣ６ＢＡＧまたはＣ６ＢＢＡＧ細胞で形成していた。１０日後ガンシクロビルを種々の濃度（０−３００μＭ）で加え、そして細胞を薬剤と共にさらに９−１２日間インキュベートする。次いで、（Ｐrice et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：1141-1145（1987））記載のように、細胞を０.５％グルタルアルデヒドで固定し、β−ガラクトシダーゼ活性のために組織化学的に染色し、コロニーを計数した。
同時的共−培養実験のために２組、１０3受容体細胞Ｃ６ＢＡＧまたはＣ６ＢＢＡＧを１０5供給体細胞Ｃ６ＶＩＫまたはＣ６ＶＩＫＷＴと共に植えた。対照は同じ比率（１：１００）でＣ６ＢＵ１細胞と共に植えたＣ６ＢＡＧまたはＣ６ＢＢＡＧであった。７日後、ガンシクロビルを種々の濃度（０−３００μＭ）で加え、培養を上記のように進行せしめた。受容体細胞に対する供給体細胞の比率効果を検定するために、同時的共培養実験も受容体細胞Ｃ６ＢＡＧに対する供給体細胞Ｃ６ＶＩＫＷＴの比率を０.１−１００で変えて行われた。
毒性検定：ガンシクロビルで処置したＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有する細胞からの自然型ウイルスおよび／または毒性代謝体で感染せしめた供給体細胞からの分散型サイトトキシンの世代について検定するために、培地をＣ６ＢＡＧおよびＣ６ＶＩＫＷＴ細胞の共培養から、７日間のガンシクロビル３００μＭ処置の前と間に取得した。対照培地はＣ６ＢＡＧ細胞から取得した。培地物を濾過し（上記のように）、２組の２５cm2培養フラスコ当り１０4細胞で植えた純真Ｃ６ＢＵ１細胞に対する細胞毒性を検定した。培地の容積は、全量４mＬ／フラスコにおいて０.１−１mＬの範囲にあった。７日後、細胞を１００％メタノールで固定し、ギエムサ染色を行い、コロニーを計数した。
インビボでの腫瘍のガンシクロビル感受性：Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞（２００μl培地中５×１０5細胞）を雌ヌードマウスの腹部に皮下注射した（ＮＣr／Ｓed, nu／nu；ＭＧＨ breeding colony）（Ｅzzedine et al., Ｎew Ｂiol. ３：６０８−６１４（1991））。３処置群であった；２５mg／kgガンシクロビル腹腔内  １日２回、１４日間、ｎ＝５；２５mg／kgガンシクロビル腹腔内  １日１回、１４日間、ｎ＝４；１２.５mg／kgガンシクロビル腹腔内  １日２回、１４日間、ｎ＝４。ガンシクロビル治療は、１４日間の１日２５mg／kgまでの腹腔内注射により、カリパスで測定して腫瘍の大きさが直径１cmに達したときに、開始した。対照群には、１４日間、リン酸緩衝液（ＰＢＳ，３１０−４２００ＡＪ，ＧＩＢＣＯ）を同様の量で腹腔内投与された。腫瘍の容量は２４日を越える処置期間中、隔週ごとに測定され、処置が開始された時点での容量と比較した％で表された。
同じ注射場所で１０6Ｃ６ＢＵ１細胞、Ｃ６ＶＩＫ細胞またはＣ６ＶＩＫＷＴ細胞投与後直ちに１０5Ｃ６ＢＡＧ細胞を注射することが各組合せで上記２０匹用いたように行われた。腫瘍が直径１cmに達した後、ガンシクロビル処置が始まり、１４日間、各群の半分は２５mg／kg１日２回腹腔内投与、他の半分は対照としてＰＢＳが腹腔内された。腫瘍容積は、１７日間を通して、処置開始時の容積より増加した％として検定された。
結果
１．培養研究
ガンシクロビル感受性：ガンシクロビルに対する種々の細胞系の用量依存感受性を細胞増殖およびコロニー形成検定で調べた。２つのＨＳＶ−ＴＫ保持系について、Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞は増殖検定において、Ｃ６ＶＩＫよりもガンシクロビルに対して感受性が高かった（図３）。４日間以上の５０％生長抑制は、Ｃ６ＶＩＫ細胞は１０nＭで、Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞は０.３nＭで認められた。Ｃ６ＢＵ１（ＨＳＶ−ＴＫマイナス）、Ｃ６ＢＡＧ、Ｃ６ＢＷＴ、Ｃ６ＢＢＡＧまたはＣ６ＢＡＧＷＴ細胞では、１０００nＭガンシクロビルにおいても、実質的な生長抑制が見られなかった。コロニーの生存については、薬物療法が植え込み後７日で始まり、７−１２日後に生存コロニーを計数した。細胞系Ｃ６ＶＩＫＷＴは、５０％生存コロニーのレベルで検定したとき、親系Ｃ６ＶＩＫよりもガンシクロビルの毒性効力に対して３００倍感受性が高かった（図４）。Ｃ６ＶＩＫ細胞に比してＣ６ＶＩＫＷＴの非常に大きい感受性は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の存在に関係する。何故なら、Ｃ６ＢＡＧＷＴとＣ６ＢＷＴ系の感受性において、自然型ウイルスに同様に感染せしめ、非感染のＣ６ＢＡＧおよびＣ６ＢＵ１細胞と比較したとき、顕著な差異がないからである（図４）。
共培養実験は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を保有するガンシクロビル感受性“供給体”細胞がＨＳＶ−ＴＫマイナス“受容体”細胞に薬剤感受性を転移できるかどうかを決定するために行われた。受容体細胞の感受性は、Ｃ６ＶＩＫまたはＣ６ＶＩＫＷＴとの共培養（比率１：２）後に認められたが（図５）、後者がより効果的であり、生存β−ガラクトシダーゼ−ポジティブコロニーの％での検定によると、受容体細胞のほとんど完全な剥離となった。平行した対照実験において、Ｃ６ＢＡＧ細胞をＣ６ＢＵ１またはＣ６ＢＷＴのいずれかの細胞と共培養（比率１：２）したとき、ガンシクロビルに対する顕著な感受性は認められなかった。同様の実験で、受容体Ｃ６ＢＢＡＧ細胞は、Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞と共培養したときＣ６ＶＩＫ細胞に比して、比較的より高いガンシクロビル感受性を示した。しかし、Ｃ６ＢＢＡＧ細胞によるコロニー形成を抑制するのに要するガンシクロビルの量は、Ｃ６ＢＡＧ細胞よりも高かった（図６）。例えば、Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞との共培養において、ガンシクロビル３μＭの存在でＣ６ＢＡＧ細胞の５０％が生長し、一方、ガンシクロビル３０μＭで５０％のＣ６ＢＢＡＧ細胞が生長した。このＣ６ＢＡＧ細胞のより高い感受性はチミジンキナーゼ活性によるものであり、これはＣ６ＢＢＡＧ細胞では欠けている。
受容体Ｃ６ＢＡＧ細胞（図７）またはＣ６ＢＢＡＧ細胞（図８）を供給体Ｃ６ＶＩＫまたはＣ６ＶＩＫＷＴ細胞と同時に植えた共培養実験（比率１：１００）において、ガンシクロビルに対してＣ６ＢＡＧ細胞のより大きい感受性がＣ６ＶＩＫＷＴ細胞の存在でＣ６ＶＩＫ細胞に比して認められた（図７）。これらの同時に植えた共培養においてＣ６ＢＡＧ細胞のガンシクロビル感受性は、遅延的共培養におけるよりも１０倍大きいようである。これは、受容体細胞に対する供給体細胞の比率が５０倍大きいことを反映しているのかも知れない。細胞比率効果は受容体細胞（Ｃ６ＢＡＧ）に対する供給体細胞（Ｃ６ＶＩＫＷＴ）の割合を変えることにより検討された。比率０.１および１における１００μＭガンシクロビルでは、Ｃ６ＢＡＧ細胞のガンシクロビル感受性は、Ｃ６ＢＡＧ細胞単独培養に比して顕著な差異がなかった。比率１０および１００においては、Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞数の増加と共にＣ６ＢＡＧ細胞の１００μＭガンシクロビルに対するより大きい感受性の“用量依存”曲線があった（図９）。連続インビボ実験において、供給体細胞：受容体細胞について、比率１０：１が用いられた。
遺伝子転移検定：自然型−感染系、Ｃ６ＶＩＫＷＴからの培地をＨＳＶ−ＴＫ遺伝子のＮＩＨ３Ｔ３（ＴＫ-）細胞への転移およびネオR遺伝子のＮＩＨ３Ｔ３細胞への転移を測定するために用いた。Ｇ４１８抵抗力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で５×１０5cfu／mＬであった。ＬＭＴＫ細胞のＨＡＴ抵抗により検定でＴＫ遺伝子転移力価は３.２×１０3cfu／mＬであった。ベクターが生じるＧ４１８抵抗のより高い力価は、ＨＡＴ抵抗の力価に比して、この検定のより大きい感受性および／またはネオR遺伝子のより大きい発現を反映している。この高い力価は、直接的には検定しなかったＷＴウイルスがＣ６ＶＩＫＷＴ細胞中で複製していたことを示唆している。
毒性試験：Ｃ６ＶＩＫＷＴの培養から得られた条件付培地を３００μＭガンシクロビル処置の前および間に、純真Ｃ６ＢＵ１細胞でコロニー生存方法により検定した。明らかな生長抑制は認められず、もし毒性物質が培地中に放出されていても、これらの純真細胞に対して効果がないことを示唆している。
２．インビトロの実験
Ｃ６ＶＩＫＷＴのガンシクロビル感受性：Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞のヌードマウスへの側面への皮下注入は、２４日の期間の間に平均して２７倍以上体積が増加する腫瘍塊を生成した（図１０）。増殖速度は感染していないＣ６ＶＩＫ細胞について以前に観測されたものより、野生型のウイルスの感染した細胞の場合遅かった（Ｅzzedine等、Ｎew Ｂiol. 3：608-614（1991））。腫瘍が直径１ｃｍの大きさに達した後に始まる、Ｃ６ＶＩＫＷＴ腫瘍のガンシクロビルによる１４日間の処理は、その後の増殖を完全に抑制した（図１０）。試験した３つのガンシクロビルのレジメ、すなわち、１日当たり２回注入における５０ｍｇ／ｋｇ／日ガンシクロビル、１日当たり１回注入における５０ｍｇ／ｋｇ／日、または１日当たり２回注入における２５ｍｇ／ｋｇ／日、において抑制動力学に明らかな相違はなかった（データ示さず）。ガンシクロビル処置を１４日後中止したすべての１３匹の動物において、腫瘍のゆっくりした再増殖が次の２週間にわたって起こった（データ示さず）。
異なった組み合わせの細胞を試験した場合、Ｃ６ＢＡＧおよびＣ６ＢＵ１細胞、またはＣ６ＢＡＧおよびＣ６ＶＩＫ細胞を、ＰＢＳによる１４日の処置の間に受けた動物において腫瘍体積の有意な相異はなかった（図１１）。しかしながらＣ６ＢＡＧおよびＣ６ＶＩＫＷＴ細胞の組み合わせ（１：１０）を表す腫瘍はこの期間中のすべての時点でより小さかった。平行してそのような腫瘍を有する動物は１４日のコースのガンシクロビル処置を受けた。この期間にわたってＣ６ＢＡＧおよびＣ６ＢＵ１細胞を含むものと比べて、Ｃ６ＢＡＧおよびＣ６ＢＶＩＫ細胞よりなるものの腫瘍体積の有意な減少があり、Ｃ６ＢＡＧおよびＣ６ＶＩＫＷＴ腫瘍の大きさにより大きい減少があった（図１２）。１７日目における後の腫瘍の組織学的検査により広範な壊死が明らかとなり、残存している腫瘍細胞の同一性を決定することは不可能であった。後の２週間の期間にわたってこの後者の腫瘍細胞の組み合わせのゆっくりした再増殖があり、この再増殖はもう２週間のガンシクロビル治療により防止されなかった。生き残った腫瘍は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を受け取らなかったＣ６ＢＡＧ細胞、またはその発現が「シャットアウト」されたこの遺伝子を有するＣ６由来細胞よりなるかもしれない。
議論
レトロウイルス媒介遺伝子移入の有効性およびヌクレオシドアナログ、ガンシクロビルの化学感受性は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有するレトロウイルスベクターおよび野性型のＭｏＭＬＶの組み合わせた感染により、グリオーム細胞中で増加させ得ることが示された。この処置は培養およびインビボの両方で腫瘍細胞を殺すのに効果的である。
遺伝子治療は、癌及び他の障害の処置への、新しい力強いアプローチである（Ｇansbacher等、Ｃancer Ｒes. 50：7820-7825（1990）；Ｒosenberg、Ｃancer Ｒes. 51：5074s-5079（1991）；Ｇilboa, Ｅ.,“Ｒetroviral Ｇene Ｔransfer：Ａpplications to Ｈuman Ｔherapy”、Ｂiology of Ｈematopoiesis中、Ｗiley-Ｌiss Ｉnc. 301-311頁（1990））。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有するレトロウイルスベクターに感染した腫瘍細胞はガンシクロビルの投与により根絶できる（Ｍooten、Ｃancer Ｒes. 46：5276-5281（1986））；Ｍoolten等、Ｈuman Ｇene Ｔher. 1：125-134（1990）；ＭoolteおよびＷells、Ｊ. Ｎatl. Ｃancer Ｉnst. 82：297-300（1990）；Ｐlautz等、Ｎew Ｂiol. 3：709-715（1991））。レトロウイルス感染は細胞分裂を必要とし、正常な成体ＣＮＳにおける標的細胞はグリアおよび内皮細胞であると報告されている（Ｋay等、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ, 88：1281-1285（1991））。ニューロンは神経芽細胞が活発に分裂する、出生前の時期に感染できるのみである（Ｓharpe等、Ｎature 346：181-183（1990））。脳の腫瘍は、大部分は非分裂の宿主細胞のバックグラウンド内部で分裂細胞の塊を構成し、レトロウイルスベクターによる標的遺伝子治療の理想的な候補者であろう。類似のレトロウイルスベクター、ＶＩＫを用いる、培養およびインビボにおけるラットのグリオーム細胞の選択的な化学的増感が報告されている（Ｅzzedine等、Ｎew Ｂiol. 3：608-614（1991））。このベクターが感染し、培養Ｃ６ＶＩＫ細胞にクローンしたラットＣ６グリオーム細胞をヌードマウス中に皮下で導入した。その動物のガンシクロビルによる後の処理によりＣ６ＶＩＫの腫瘍増殖は抑止されたが、親のＣ６細胞の腫瘍増殖に影響しなかった。
ヌクレオシドアナログ、ガンシクロビルに対する化学感受性は、グリオーム細胞において、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有するレトロウイルスとの、および野性型ＭｏＭＬＶと組み合わせた感染により増加させることができることが示された。この処置は培養およびインビボの両方でＣ６腫瘍細胞を殺すのに効果的であった。より著しいのはこの効果を「ナイーブ」な（すなわち感染していない）Ｃ６グリオーム細胞に移すことができることである。
実際の腫瘍を処置するためには、遺伝子の移入はインビボで起こる必要がある。以前、レポーターレトロウイルスベクター、ＢＡＧを放出するプロデューサーセルライン（マウス繊維芽細胞由来）を成体のラット脳中のＣ６グリオーム細胞の腫瘍床近くに移植した。これは約１０％の腫瘍細胞への遺伝子移入レベルを生じた。しかしながら遺伝子運搬の期間はベクター産生ラインの免疫拒絶により短縮された。
腫瘍細胞へのベクター媒介遺伝子運搬の期間は２つの方法で延長された。第１に、Ｃ６ＶＩＫグリオーム細胞を「ヘルパー」野生型ＭｏＭＬＶで重感染させた。これらのＣ６ＶＩＫＷＴ細胞は、野性型ウイルスおよびＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含む複製欠陥のあるウイルスベクターの両方を放出し、後者が増殖的に活性であるなら、この両者は近隣の腫瘍細胞に感染できる。増殖はレトロウイルス組み込みの必要条件である（Ｍiller等、Ｍol. Ｃell Ｂiol. 10：4239-4242（1990））。
近隣の細胞がそのベクターまたは野性型ベクターに連続的にまたは同時に感染した場合、それらは、更なる細胞に野性型ウイルスおよびそのベクターの両方を放出できる「プロデューサー」細胞となることができる。これらは脳において腫瘍細胞を分裂させることによりベクター生産の拡張を可能にし、レトロウイルスＤＮＡをゲノム中に組み込むことができる。これらのグリオーム由来「プロデューサー」細胞は、グリオーム細胞（Ｂurger等、Ｊ. Ｎeurosurg. 58：159-169（1983））及び星状細胞（Ｊacque等、Ｄev. Ｎeurosci, 8：142-149（1986）；Ｚhou等、Ｊ. Ｃomp. Ｎewrol. 292：320-330（1990）；Ｈatton等、Ｓoc. for Ｎeurosci. Ａbstracts 15：1369（1989））と同様、成体の脳中で移動し、他の腫瘍細胞と混合させることができる。
グリア細胞への遺伝子移入の効率を改良する他の方法は、腫瘍が移植され、または発生した同じ株からのグリア由来パッケジングラインの発生を含む。そのような細胞はＣＮＳ内部の寿命を増加させ、ＷＴウイルスの必要をなくであろう。ＷＴウイルスの欠如は治療の安全性を増加させるであろう。それはベクターによる受容細胞の一般的な感染に対する可能性のある障壁を除去するであろう。何故なら野性型ウイルスの感染した細胞は、それらの表面におけるエンベロープグリコプロテインの発現により、野性型ウイルスまたはそのベクターのいずれかによる後の感染に対して耐性であるからである（Ｋabat, Ｄ., Ｃurr. Ｔop. Ｍicrobiol. Immunol. 148：1-42（1989））。
Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞（ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有するＣ６グリオーム細胞、ＭoＭＬＶウイルスが重感染）は、親のＣ６ＶＩＫ細胞よりガンシクロビルに対し有意に感受性であった。この効果はＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の存在に特異的である。何故ならＭｏＭＬＶの感染したＣ６ＢＵ１細胞は、親のセルライン、Ｃ６ＢＵ１より大きい感受性を示さなかったからである。Ｃ６ＶＩＫおよびＣ６ＶＩＫＷＴ細胞間の感受性におけるこの相違はコロニー分析により評価した場合より大きい。これらの２つの分析を用いて認められる感受性の相違は、コロニー中の細胞と比較して、単離した細胞のより低い感受性を表す。コロニーにおける細胞内部の密接な細胞接触はＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の移入を増加させ、細胞あたりの多数の組込みを可能にし、またはガンシクロビルまたはそれに由来する毒性の代謝産物の細胞内濃度を増加させ得る。Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞の有効性は、ガンシクロビルに対して受容細胞を感受性にするそれらの能力においても明らかであり、lacＺ遺伝子で標識した受容細胞を、Ｃ６ＢＡＧまたはＣ６ＢＢＡＧ細胞、および供与細胞Ｃ６ＶＩＫまたはＣ６ＶＩＫＷＴと共培養することにより証明される。Ｃ６ＢＵＩおよびＣ６ＢＷＴ細胞のガンシクロビル感受性に有意な相違はなかったので、野性型ウイルス単独ではなく、野性型ウイルスの存在下でのＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の移入がこの殺生効果の原因である。しかしながら受容細胞へのガンシクロビル感受性のある移転はＣ６ＶＩＫドナーにおいて（すなわちＷＴウイルス不存在下においてさえ）見られた。結果として、いくつかの分析を行って、ガンシクロビルに対する受容細胞の感受性の増加が、ＴＫ遺伝子の移入、野性型レトロウイルの感染および／または毒性の代謝産物の放出によるかどうか決定した。共培養からの培地をＶＩＫレトロウイルについて力価測定し、ナイーブ細胞に対する毒性を試験した。Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞から培地により媒介される遺伝子移入についての分析はネオマイシン耐性遺伝子およびＴＫ遺伝子を有するベクターの存在を証明した。ナイーブＣ６ＢＵ１細胞を、ガンシクロビル処理のある場合またはない場合、Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞の培養物からの培地にさらした場合、毒性は認められなかった。これはＷＴウイルス不存在下の感受性が、供与細胞による受容細胞への細胞−細胞接触による直接移転により媒介されるという可能性を排除せず、これらの代謝産物は培地を介して交換されないということを示唆する。
ガンシクロビルに対するＣ６ＶＩＫＷＴ細胞の異常な化学感受性は、培養中と同様インビボンでも明らかであった。皮下のＣ６ＶＩＫＷＴ腫瘍のガンシクロビルによる処理が腫瘍増殖を完全に抑制したので、野性型ウイルスの存在はこれらの細胞の感受性に寄与し、一方、以前の研究においてガンシクロビルで処理したＣ６ＶＩＫ腫瘍は低速度で増殖し続けた（Ｅzzedine等、Ｎew Ｂiol. 3：608-614（1991））。Ｃ６ＶＩＫＷＴ腫瘍はＣ６ＶＩＫ腫瘍よりゆっくり増殖し、野性型レトロウイル自体が腫瘍細胞の増殖のじゃまをし得ることを示唆する。しかしながら、ＷＴＭｏＭＬＶの皮下のＣ６腫瘍への注入は腫瘍増殖に効果を有しないらしい（Y.Takamiya, 未公開データ）。野性型レトロウイルス感染は培養されたヒトのグリオームセルラインの分化した表現型に影響し得ることが示されたが（Ｍacchi等、Ａcta Ｎeuropathol. 81：670-674（1991））、これがこれらの細胞の腫瘍形成性を変化させるかどうか明らかでない。Ｃ６ＢＡＧおよびＣ６ＶＩＫＷＴ細胞の共注入とその後のガンシクロビルによる処理により、Ｃ６ＢＡＧと、Ｃ６ＢＵ１またはＣ６ＶＩＫ細胞との組合せと比較して、腫瘍増殖速度の著しい減少が明らかとなり、残存腫瘍細胞は治療後組織学的に見られなかった。この結果は、隣接Ｃ６ＶＩＫＷＴ細胞によるＶＩＫベクターの産生により媒介されるＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の受容Ｃ６ＢＡＧ腫瘍への移転と矛盾しない。
野性型のＭｏＭＬＶは若いマウスにおいて白血病およびニューロパシー効果を起こすが（Ｓharpe等、Ｎature 346：181-183（1990）；Ｋay等、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88：1281-1285（1991））、免疫応答性の成体マウスは、このウイルスの病原性に対し全く抵抗性である。ここに報告した現在のin vivoデータは、免疫無防備状態であるヌードマウスを用いて得られたが（Ｇullino等、Ｉnstitute Ｌab Ａnimal Ｒesources（ＩＬＡＲ）Ｎews 19：Ｍ1-Ｍ20（1976））、この研究では動物におけるすべての病原性は脳における腫瘍増殖に関係するようであった。
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有するレトロウイルスベクターおよび野性型ＭｏＭＬＶウイルの両方の感染したグリオーム細胞のガンシクロビル感受性、並びにそれらの近辺において「ナイーブ」細胞へ感受性を移転するそれらの能力は、図１３に図式化するいくつかの要因により媒介され得るであろう。これらには、野性型レトロウイルス感染の細胞性の衰弱させる効果；ウイルスおよび腫瘍抗原に応答した抗体の宿主産生（免疫応答性動物の場合）；細胞がガンシクロビルから毒性の代謝産物を作り出すことを可能にする、腫瘍細胞におけるＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の組込みと発現；および、これらの毒性の代謝産物の隣接細胞への可能性のある移転がある。したがってこのシステムを用いる遺伝子治療戦略は、腫瘍細胞を殺す４つの別の、そして更なる手段を提供し、そのすべては内生の脳細胞に影響を及ぼさない。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を有する細胞は、ガンシクロビルの存在下に放射に対する感受性を増す。何故ならその代謝産物がＤＮＡ修復およびＤＮＡ合成のじゃまをするであろうからである。殺生の更なる拡張は、腫瘍細胞の増殖を選択的に殺しまたは阻害する分泌可能なタンパク質についての遺伝子、または腫瘍細胞の免疫拒絶を刺激する表面タンパク質についての遺伝子を有するベクターを作ることにより達成し得る。このように、いくつかの異なったベクターを、より伝統的な治療と協力し、組合わせて用いることができるであろう。
実施例５
方法
プラスミドの構築：ラットシトクロムＰ４５０２Ｂ１の全長コーディング配列を含むラットｃＤＮＡを、ＮcoＩおよびＥcoＲＩで切断することによって、プラスミドｐＳＲ−Ｐ４５０ヴァレットらNucl.Acid.Res.,17:723ー733（1989）］（ＮＹＵメディカル・スクールのミルトン・アデスニック博士の提供による）から単離した。この断片をＭｏＭＬＶ ＬＴＲの下流においてｐＭＦＧプラスミド［ドラノフらProc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3539-3543（1993）］（ＭＩＴのリチャード・ミュリガン博士の提供による）に挿入し、次いでＥcoＲＩ−ＢamＨＩダプター（ニュー・イングランド・バイオラブズ製）を用いてＮcoＩおよびＢamＨＩで切断した。得られるプラスミドはｐＭ４５０である。
細胞の培養、トランスフェクションおよびシトクロムＰ４５０２Ｂ発現細胞の単離：５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、高グルコースのダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）（カタログ番号１０−０１３−ＬＭ、ＣＥＬＬＧＲＯ）に、１０％ウシ胎児血清、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリンおよび１０mg/Ｌのストレプトマイシン（シグマ製）を加えて細胞を成長させた。説明書（ギブコ）にしたがってＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮを用いて、１０：１のモル比で、ｐＭ４５０構築物をラットＣ６グリオームおよびΨＣＲＥ細胞［ダノスらProc.Natl.Acad.Sci.USA,85:6460ー6464（1988）］の両方にｐＲＳＶneo（ネオマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドである）（ＭＧＨのマイケル・コーム博士のご提供による）とともにトランスフェクトした。安定なトランスフェクション物を１mg/mＬのＧ４１８（ギブコ製）における選択下においてクローニングした。１００mmディッシュ当たり２×１０5細胞の密度で植えた２４時間後に、５００μＭのシクロホスファミド（ＣＰＡ）を加え、その存在下における成長によって、ネオマイシン耐性Ｃ６グリオームおよびＣＲＥ細胞クローンのシトクロムＰ４５０２Ｂ１活性を評価した。４日後、ひとつのＣ６誘導クローン（Ｃ４５０−８）およびひとつのΨＣＲＥ誘導クローン（Ｒ４５０−２）において、この濃度のプロドラッグで完全に破壊された。これらのクローンを用いてさらに実験を行った。他のＣＰＡ耐性クローン、ＣＮＥＯ−１およびＣ４５０−１９をコントロールとして用いた。レトロウイルス上清［オースベルら編、セプコ，Ｃのカレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー，9.11.1ー9.11.12,ウイリー・アンド・サンズ,ニューヨーク（１９９２）］に感染させた後に薬物耐性クローンを計数することによって予め力価決定されたＭＦＧレトロウイルスベクター中に選択可能なマーカーが欠けているために、レトロウイルス産生の力価は決定されなかった。予備実験から、レトロウイルスの力価が、未経験細胞をＲ４５０−２上清にさらすことによりＣＰＡ感受性が獲得されることを利用することによって定量できることが示唆された。
シクロホスファミド用量−応答アッセイ：用量−応答曲線を得るために、１００mmディッシュ（コーニング製）当たり２×１０5細胞の密度で、５倍数で細胞を植えた。２日後、最終濃度０〜１０００μＭになるようにＣＰＡを加えた。植えてから５日後、死亡細胞を除去するために、ハンクの緩衝生理的食塩水（ギブコ製）で単層を２回濯いだ。該単層をトリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコ製）を用いて分散し、クールター・カウンター（クールター・エレクトロニクス・インコーポレイテッド製）で細胞数を定量した。
免疫細胞化学およびウエスタン・ブロッティング：ラットＰ４５０２Ｂ１に接触させたウサギポリクローナル抗血清［ワックスマン，Ｄ.Ｊ., J.Biol.Chem.,259:15481-15490（1984）;ワックスマンらのJ.Biol.Chem.,257:10446-10457（1982）］を用い、ベクタスタチン試薬キット（ネクター・ラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア）を使用して、アルカリホスファターゼ法による免疫細胞化学的研究を行った。ウエスタン・ブロッティング分析は、培養細胞：Ｃ４５０−８、Ｃ６、ＣＮＥＯ−１およびＣ４５０−１９から単離したミクロソーム画分（２０μｇタンパク質／レーン）において行った。フェノバルビタール誘発ラット肝臓から単離した肝臓ミクロソーム（２μｇ／レーン）では、正の調節が起こった。タンパク質を、１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分解し、ニトロセルロースに移し、ウサギ抗Ｐ４５０２Ｂ１抗体（ワックスマン,Ｄ.Ｊ.（１９８４），上記）でプローブした。
シトクロムＰ４５０２Ｂ１活性の測定：ワックスマンＤ.Ｊ.のメソッズ・イン・エンザイモロジー，206:249ー267（1991）;ワックスマンらのJ.Biol.Chem.,258:11937-11947（1983）の記載にしたがって、［４−14Ｃ］アンドロステンジオン（６mＣi／ミリモル：アマーシャム製）の１６β−ヒドロキシル化をアッセイすることによって、各クローン系において酵素活性を測定した。簡述すると、まず、単層上で成長させた細胞を採取し、ミクロソームを調製するまで細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。酵素アッセイは、総量２００μl中、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ＡＭ14Ｃ標識アンドロステンジオン、１００μｇのミクロソームタンパク質および１ｍＭ ＮＡＤＰＨにて、３７℃で３０分間行った。混合物を酢酸エチルで２回抽出し、シリカゲルの薄層クロマトグラフィープレートに載せ、マルチ溶媒系［ワックスマン，Ｄ．Ｊ．（１９９１），上記］で順次展開した。代謝物をオートラジオグラフィーにて局在化し、次いで、液体シンチレーションカウンターにて定量した。
動物実験：動物に注射するために、増殖期の培養細胞を再度植えてから２４時間後に採取し、トリプシン処理し、低速度で遠心分離し、ハンクの緩衝生理的食塩水に再懸濁させることにより１回洗浄し、遠心分離し、次いで無血清ＤＭＥＭに５×１０6細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。２００μl中の１０6のＣ４５０−８またはＣ６細胞を無胸腺マウス［ＮＣＹ／Ｓｅｄ，ｎｕ／ｎｕ；ＭＧＨブリーディングコロニー；１グループ５匹］の側腹に皮下注射で注入した。３日後、腫瘍は約０．０１ｃｍ3になり（外用キャリパーで測定）［リーらのNeueosurgery,26:598-605（1990）］、１４日後に、ＣＰＡ（シグマ）２０ｍｇ／食塩水ｍｌを１００μlあるいは食塩水１００μlのいずれかを、腫瘍塊に直接再注射した。１７日目に動物を安楽死により屠殺した。
大脳内注射を行うために、マウスにケタミン（１００ｍｇ／体重ｋｇ）（アルケ・デイビス，ニュージャージー）およびキシラジン（２０ｍｇ／体重ｋｇ）（モベイ・コーポレイション、ＫＳ）の腹腔内注射を行って麻酔した。外科手術は滅菌状態で行った。定位装置（Ｋｏｐｆ）に該動物を固定した後、頭蓋上の皮膚を小さく切開した。ハミルトンシリンジにて、およそブレグマの前面０．５ｍｍおよび右側部０．５ｍｍの位置に、Ｃ６グリオーム細胞（１０3細胞／２μl）を定位的に接種した。接種時間は針を引き抜く時間２分間を含めて５分間であった。３日後、同じ頭蓋穴に、ＤＭＥＭ２５μl中の５×１０6個のＣＲＥＬａｃＺ細胞（ＭＩＴのＲ．ミュリガン博士のご提供による細胞系）または５×１０6個のＲ４５０−２細胞を定位移植した。４日、８日および１１日後に、この最後の注射、ＣＰＡ（３ｍｇ／５μl）を同じ頭蓋開口部からＣＲＥＬａｃＺとＲ４５０−２グループの両方のマウスの腫瘍と脳髄膜間に定位的に投与した。注射は針を引き抜く時間５分間を含めて１０分間、定位的に行った。最後のドラッグ投与から１０日後に、ｐＨ７．３、０．９％塩化ナトリウム中の１００ｍＭリン酸ナトリウム約３〜５ｍｌ、次いでｐＨ７．３、１００ｍＭリン酸ナトリウム中の４％パラホルムアルデヒドで左心室を灌流して動物を屠殺した。動物の頭蓋および顎から脳を注意深く切除した後、ｐＨ７．３、１００ｍＭリン酸ナトリウム中の４％パラホルムアルデヒドに一夜漬けた。低温保存するために、ｐＨ７．３、１００ｍＭリン酸ナトリウム中の２０％グリセロール／１０％ジメチルスルホキシドの溶液に脳を浸し、次いで鋭いミクロトームで５０ミクロンの切片に切断した。すべて６番目の切片をゼラチン塗布スライドに載せ、クレジルバイオレットで染色した。脳腫瘍の体積を測定するために、コンピューター化したイメージアナライザーを用いて各切片の腫瘍領域を走査した。この分析はブラインド様式で行った。正常脳細胞から腫瘍を区別するのは、手動的あるいは自動的手順で行った。すべての脳切片の平均腫瘍領域に、各切片間の距離（０．３ｍｍ）を掛けることによって腫瘍の体積を得た。
結果
培養におけるＣ６グリオーム細胞のシクロホスファミド感受性：ラットＰ４５０２Ｂ１（バレットら、前述）のｃＤＮＡをＭＦＧレトロウイルスベクター（ドラノフら、前述）のプラスミド配列に挿入した。次いで、得られるプラスミド（Ｍ４５０）を、ラットＣ６グリオーム細胞［ベンダらのJ.Neurosurg.34:310-323（1971）］に、ネオマイシン（neo）耐性遺伝子を産生する発現ベクターとともにトランスフェクトした。２つの安定にトランスフェクトされたネオマイシン耐性クローンを次なる実験のために選択した。すなわち、１）Ｃ４５０−８細胞（ＣＰＡに対する最大の感受性を示す）および２）ＣＮＥＯ−１細胞（親のＣ６細胞と同様に、比較的この薬物に対して不感性であるのようにおもわれる）である。細胞増殖アッセイにおける用量−応答曲線から、２７μＭのＣＰＡが、Ｃ４５０−８細胞の吸うを５０％まで減少させることが示された（図１４）。逆にいうと、少なくとも８０％のＣ６およびＣＮＥＯ−１細胞が、１ｍＭ以下のＣＰＡとともにインキュベートしても生き残ることになる。したがって、プロドラッグＣＰＡに対する化学的感受性をＣ６グリオーム細胞が獲得するのは、シトクロムＰ４５０２Ｂ１発現プラスミドによってトランスフェクトされた後であった。
Ｃ４５０−８細胞におけるシトクロムＰ４５０２Ｂ１の発現およびミクロソーム的位置：シトクロムＰ４５０２Ｂ１は、肝細胞小胞体の膜内在性タンパク質である［モニアらのJ.Cell.Biol.、107:457−470（1988）］。シトクロムＰ４５０２Ｂ１［ワックスマン，Ｄ.Ｊ.（４９８４），前述］に接触させたウサギポリクローナル抗血清を用いて、ＣＰＡ感受性の獲得がＰ４５０２Ｂ１の発現に関連するかどうかを確認した。免疫応答性タンパク質は、Ｃ４５０−８には存在した（図１５ａ）が、ＣＮＥＯ−１細胞（図１５ｂ）には存在しなかった。Ｃ４５０−８細胞におけるレース様の網目パターンから、この免疫応答性タンパク質が正確に小胞体に関連することを示唆された［モニアら、前述］。さらに、ウエスタンブロット分析によって、Ｃ４５０−８から調製されたミクロソーム画分中には単一の免疫応答性タンパク質が存在するが、Ｃ６あるいはＣＮＥＯ−１細胞には存在しないことが確認された（図１６）。
酵素シトクロムＰ４５０２Ｂ１に対して特異的なＮＡＤＰＨ依存性アンドロステンジオン１６β−ヒドロキシラーゼ活性［ワックスマン、Ｄ.Ｊ.,（１９９１）、前述］を、これらの細胞のミクロソーム調製物において試験した。この活性はＣ６および／またはＣＮＥＯ−１細胞では検出できなかったが、Ｃ４５０−８細胞では、このＰ４５０体を非常に多く含むフェノバルビタール誘発ラット肝臓ミクロソーム（図１６参照）の活性は約１％であった（表１）。外来性の精製ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ［ワックスマンら（１９８２），前述］に加えて、ＮＡＤＰＨからすべてのミクロソームＰ４５０酵素への不可避電子伝達を触媒するミクロソームフラボノエンザイムが、Ｃ４５０−８細胞における酵素活性を約２倍に増加した。これらの結果から、Ｃ４５０−８細胞が、小胞体内に存在するとおもわれる酵素的に活性なシトクロムＰ４５０２Ｂ１を発現したことが示される。
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皮下Ｃ６グリオーム腫瘍のシクロホスファミド感受性：ヌードマウスの側腹における皮下成長によって、Ｃ６またはＣ４５０−８細胞によって形成された腫瘍のＣＰＡ感受性を評価した（図１７）。皮下腫瘍の創設の３日および１４日後に、動物の腫瘍に生理的食塩水または２ｍｇのＣＰＡを注射した。最後の投与から３日後（腫瘍の創設から１７日後）、食塩水で処理したＣ６およびＣ４５０−８腫瘍の体積には統計的に有意な差異は現れなかった（Ｃ６腫瘍＝０．７４７±０．３２５ｃｍ3；Ｃ４５０−８腫瘍＝０．４４７±０．２１３ｃｍ3；ｐ＞０．１）。それとは逆に、ＣＰＡで処理したＣ６およびＣ４５０−８腫瘍の体積には統計的に有意な差異が認められた（Ｃ６腫瘍＝０．０９３±０．０３５ｃｍ3；Ｃ４５０−８腫瘍＝０．０１６±０．００３ｃｍ3；ｐ＞０．０１）。生理的食塩水処理したＣ４５０−８腫瘍に対してＣＰＡ処理腫瘍を平均体積について比較したときの差異も有意である（０．１２４対０．０３５；ｐ＜０．０５）。Ｃ６腫瘍よりもＣ４５０−８腫瘍の方がＣＰＡに対する感受性が増加することは、ＣＰＡが腫瘍内部の活性代謝物ならびに肝臓による活性代謝物に変換されたことを示唆する。
インビボにおける脳腫瘍によるシクロホスファミド感受性の獲得：マウスΨＣＲＥ繊維芽細胞をプラスミドｐＭ４５０およびｐＰＳＶｎｅｏの両方にトランスフェクトさせた。Ｒ４５０−２と称するひとつのネオ耐性クローンを、そのＣＰＡに対する化学感受性および親のΨＣＲＥ繊維芽細胞と比較して高いＰ４５０２Ｂ１依存性アンドロステンジオン１６β−ヒドロキシラーゼ活性に基づいて選択した［ワックスマン、Ｄ.Ｊ.,（１９９１），前述；ワックスマンら（１９８２），前述）］（表１）。次いで、これらの細胞を脳腫瘍モデルにおいて試験した。
Ｃ６グリオーム細胞を無胸腺マウスに定位的に接種し、３日後、大腸菌のＣＲＥＬａｃＺ細胞由来のｌａｃＺ遺伝子を発現しているマウス繊維芽細胞またはＲ４５０−２細胞を定位的に接種した。４日、８日または１１日後、同じ頭蓋開口部を介して、ＣＲＥＬａｃＺおよびＲ４５０−２グループの両方に、ＣＰＡを腫瘍と脳髄膜間隙に注入した。プロドラッグの最後の投与注射から１０日後に動物を屠殺した。Ｃ６＋ＣＲＥＬａｃＺ細胞を注射され、次いでＣＰＡを投与された８匹の動物の全部の脳の脳髄膜に、広範囲にわたる脆い腫瘍が、認められた（図１８ａ）。動物の頭蓋およびあごから腫瘍を切除することは困難であったので、脳髄膜腫瘍の量を測定することはできなかった。組織の切片作成／顕微鏡検査を行ったところ、脳髄膜腫瘍組織が脆いための損失が多かった。対照的に、Ｃ６＋Ｒ４５０−２細胞を注射され、次いでＣＰＡを投与された動物８匹のうち７匹においては、脳髄膜腫瘍は現れず（図１８ｂ）、１匹において小さな残留塊が認められた。この結果は、隣接する繊維芽細胞による、およびおそらくＰ４５０２Ｂ１レトロウイルスベクターに感染した腫瘍細胞による、常温常圧におけるＣＰＡのその活性代謝物への変換が、プロドラッグをクモ膜下的／腫瘍内に投与することによって、脳髄膜腫瘍の拡張が劇的に阻害されたことを示している。
前記Ｃ６腫瘍細胞の定位的注射もまた、脳内質に硬質腫瘍を形成した。各グループからの６つの脳の組織病原分析によって、コントロール、ＣＲＥＬａｃＺ処理動物においては腫瘍性壊死が本質的に発生しない（図１９ａ）が、Ｒ４５０−２繊維芽細胞を処置されたグループの６個のうち３個の脳には広範囲にわたる腫瘍性壊死がみられることがわかった（図１９ｂ）。腫瘍性退化の範囲の定量的な結果を得るために、コンピューター化イメージ分析法を用いて、一連の組織切片から脳内質の硬質Ｃ６グリオームの体積を計算した。表ＩＩは、Ｒ４５０−２レトロウイルスプロデューサー細胞を処置された３匹の動物の脳腫瘍の体積が、ｌａｃＺレトロウイルスプロデューサー細胞を処置されたラットの平均脳腫瘍の体積の１／２０，１／５および１／２であることを示している。他の３匹のＲ４５０−２処置動物は、コントロール動物と同じ大きさの範囲内の腫瘍ができた。この結果から、シトクロムＰ４５０２Ｂ１発現プロデューサー細胞とクモ膜下／腫瘍内ＣＰＡ投与の組み合わせもまた、脳腫瘍の脳内質硬質部分の減少に効果があることが示唆される。
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検討
ここ２，３年の間に行われた治療的遺伝子の発現を含む幾つかの実験的アプローチが、インビボにおける実験的脳腫瘍の退行を媒介することがわかった［モールテンらCancer.Res.46:5276-5281（1986）;モールテンらのHum.Gene.Ther.1:125-134（1990）;モールテンらのJ,Natl.Cancer.Inst.82:297-300（1990）;ショートらのJ.Neurosci.Res.27:427-423（1990）;エッツエダインらのNew.Biol.3:608-614（1991）;カルバーらのScience256:1550-1552（1992）;タカミヤらのJ.Neurosci.Res.33:493-503（1992）;ヤマダらのJ.Cancer.Res.83:1244-1247（1992）;ラムらのCancer.Res.53:83-88（1993）;オールドフィールドらのHum.Gene.Ther.4:39-69（1993）;タカミヤらのJ.Neurosurg.79:104-110（1993）;カルソらのProc.Natl.Acad.Sci.USA90:702-7028（1993）;ボビアスチスらのHum.Gene.Ther.5:183-191（1994）;キオッカらの「Virus-mediated Genetic Treatment of Rodent Gliomas」,Gene Therapeutics,Wolff,J.A.編，バークホイザー・パブリッシャーズ、ボストンＭA（1994）,pp245-262;トロージャンらのScience259:94-97（1993）;ユーらのCancer.Res.53:3125-3128（1993）］。
本実施例では、発明者らは、中枢神経系の新生物の遺伝子治療のために、ＣＰＡに対する細胞感受性をもつキラー遺伝子、すなわちシトクロムＰ４５０２Ｂ１を用いた。Ｐ４５０２Ｂ１の薬物調節性破壊作用は、必ずしも中枢神経系の新生物の遺伝子治療に限定されるとはかぎらず、培養あるいはインビボにおける他の細胞集団の負の選択にも適用できる。さらに、ここで提示される治療例がＣＰＡを伴ったシトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子の用途と制限するものではない。このようなアプローチは、他の化学治療剤による生体形質転換に関係する他のシトクロムＰ４５０酵素にも適用できる［ルブランクおよびワックスマンDrug Metab.Rev.20:395-439（1989）］。
Ｐ４５０２Ｂ１／ＣＰＡ遺伝子治療アプローチは、シクロホスファミドの薬理学的類縁体である４−ヒドロキシペルオキシシクロホスファミド（４−ＨＣ）を利用する現在行われている治療アプローチよりも、より大きな利点があるという特徴をもつように思われる。
この類縁体は自発的に分解して４−ヒドロキシシクロホスファミドになり、次いで、酵素による生体活性化を必要とすることなくホスホルアミドマスタード（ＰＭ）を製造する［ピーターらのCan.Treat.Rep.60:429-435（1976）;コルビンらの（1981）前述;フリードマンらのCancer Res.46:2827-2833（1986）;スラデク,K.E.,前述;フリードマンらのCancer Res.48:4189-4195（1988）］。４−ＨＣは、脳髄膜新生物の動物モデル［アーンツらのCancer Res.47:5932ー5934（1987）;フッチスらのCancer Res.50:1954ー1959（1990）;フィリップスらのCancer Res.52:6168-6174（1992）;フリードマンらのProc.Amer.Assoc.Cancer Res.34:269（1993）］および脳内質硬質脳腫瘍［シャスターらのCancer Res.53:2338ー2343（1993a）;シャスターらのProc.Amer.Assoc.Cancer Res.34:269（1993b）］において治療上の効果性を示すけれども、その細胞毒性代謝物への変換が解剖学的または細胞学的選択性をもたないので、それに付随する神経毒性も高い［シャスターらの（1993aおよびb），前述］。
対照的に、ここで記載した治療処方では、その強力な抗ガン効果を作動させるために酵素的変換を必要とする安定で不活性な、親油性プロドラッグ（ＣＰＡ）を用いる。Ｐ４５０２Ｂ１遺伝子の腫瘍細胞への導入を介して、ＣＰＡの酵素的変換の細胞的および解剖学的位置が、新生物を効果的に制限し、それによって脳および末梢神経の正常細胞に対する望ましくない副作用を最小にするであろうという仮説を立てることができる。
この実施例記載したアプローチにおいては、遺伝子的に加工処理された細胞を使用するということは、ＢＣＮＵおよび４−ＨＣなどの活性化された抗ガン剤のデリバリーを位置的にコントロールするための生体分解性移植可能ポリマーの使用に類似した特徴をもっている［ブレムらのJ.Neurosurg.80:283-290（1994）;ビュアヒンらのPolymer.Adv.Tech,3:311-316（1992）;タマーゴらのCancer Res.53:329-333（1933）］。該ポリマー法および遺伝子加工細胞法は、両者とも、全身的およびＣＮＳ毒性を最小化しつつ、腫瘍内に、徐放性、高活性および局在的に活性化薬物濃度を維持する。さらに、遺伝子加工細胞由来のレトロウイルスベクターの産生は、化学治療剤に対する感受性をもつ腫瘍細胞の解剖学的範囲を広げることにより、移植可能なポリマーアプローチと比べてさらなる治療的促進効果を提供する。他の遺伝子の授与する薬物調節的致死性（すなわち、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、大腸菌サイトカインデアミナーゼ遺伝子）［ミュレンらのProc.Natl.Aca.Sci.USA89:33-37（1992）;ヒューバーらのCancer Res.53:4619-4626（1993）］および大腸菌gpt遺伝子［ムロツらのHum.Gene.Ther.4:589-595（1993）］）と比べて、Ｐ４５０２Ｂ１遺伝子による腫瘍殺傷は、ＤＮＡ内でのインターストランド架橋による活性ＣＰＡ誘導代謝物である“マーク”細胞なので、細胞周期相を考慮しなくてもよい。最大細胞毒性は、マークされた腫瘍細胞がそのＤＮＡを複製するときに生じ、それは薬物処置時あるいはそれに続いて発生する。このことは、細胞毒性の影響によるＤＮＡ鎖の複製をともなわなければならない代謝物を用いる遺伝子治療例と比べて、利点を提供する。たとえば、ＨＳＶ−ＴＫは、ヌクレオチド類縁体として作用し、ＤＮＡ鎖複製を伴うホスホリル化ガンシクロビル（またはアシクロビル）分子を生産する［ファイフらのJ.Biol.Chem.253:8721-8727（1978）］。これらのヌクレオチドは、相対的に短い半減期をもつので、細胞周期のＳ期に発生した腫瘍細胞に対して最も効果的である［エリオン，Ｇ．Ｂ．，前述］。悪性脳腫瘍における細胞の大部分は、Ｓ期ではなく［ナガシマら，前述；ヨシイら、前述］、したがってＨＳＶ−ＴＫ／ガンシクロビル遺伝子治療の理想的な標的にはならない。シトクロムＰ４５０遺伝子が、ＤＮＡに対して強く結合するＣＰＡのその代謝物において“記憶”要素をもち、薬物処置後の後日に該遺伝子が複製をしようとするときにすべてが死亡するであろうということも考えられる。さらに、細胞破壊のＰ４５０／ＣＰＡメカニズムは、ＨＳＶ−ＴＫ／ガンシクロビルおよび他の治療遺伝子のメカニズムとは異なっているので［トロージャンら，前述；ユーら，前述］、これらを組み合わせて付加的効果が得られる可能性がある。別の手段として、遺伝子発現においてＤＮＡの複製を要求しないウイルスベクターを使用しても、活発には分裂しない脳腫瘍細胞を感染させることができる。腫瘍内への複数の化学感受性遺伝子のデリバリーによる治療について、現在のヒト腫瘍に対する化学療法の臨床処方には、さらになお改良を加える余地がある。
我々の実験に用いたマウスの繊維芽細胞系（Ｒ４５０−２）はＰ４５０２Ｂ１活性を発現する。該細胞が、シトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子を産生する不完全なレトロウイルスベクターを生み出すことも想定される。腫瘍内へのこれらの細胞の移植による腫瘍退化が、Ｐ４５０２Ｂ１発現繊維芽細胞由来の毒性ＣＰＡ代謝物の放出によって起こるかどうか、および／または隣接する腫瘍細胞へのレトロウイルス媒介性Ｐ４５０２Ｂ１遺伝子伝達によって起こるかどうかはこの時点では、明確ではない。おそらく、腫瘍細胞は、活性代謝物の取り込みあるいはこれらの代謝物の細胞内産生のいずれかによって殺されるのであろう。いずれの場合においても、ウイルスおよび非ウイルスベクター両方の使用によって種々の末梢神経および大脳腫瘍へシトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子を伝達することが可能である［ショートら，前述；ボバイアチスら，前述；キオッカら，前述］。ＣＰＡ活性代謝物の細胞内産生は、非常に活性のある腫瘍“破壊”効果を生み出すと考えられる；ＨＳＶ−ＴＫにみられる“傍観者（バイスタンダー）”効果と類似した仕方において、Ｐ４５０２Ｂ１発現細胞内におけるＣＰＡの活性化が、細胞毒性を隣接する細胞に伝達しうることは、実施例５において説明したとおりである［モールテンら，（１９９０），前述；エツエダインら，前述；タカミヤら，（１９９２），前述；フリーマンらJ.Biochem.16F:47（1992）およびフリーマンらCacer Res.53:5274-5283（1993）:カルバーら,前述;リ・ビらHum.Gene.Ther.4:725-731（1933）］。
マウス脳においては、脳内質グリオーム腫瘍にシトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子を発現する繊維芽細胞を導入することが、脳髄膜新生物に対して最も効果的であった。末端器官（黒色腫、肺および乳癌）、血液（白血病）およびグリア（脳室上衣細胞腫およびグリア芽細胞腫）などの腫瘍細胞が脳髄膜に拡散すると、急速な致死性の癌、いわゆる脳髄膜新生物および／または癌腫症になる［ビアマン,Ｗ.Ｆ.JAMA,58:1437-1439（1912）;オルソンらArch.Neurol.30:122-137（1974）］。脳内質硬質腫瘍の成長は、外科手術および／または放射線治療によって一時的に縮減することができるが、脳髄膜への腫瘍の拡散は、これらの治療方式では充分にコントロールすることはできない。組織および中枢神経系毒性、血液脳関門および細胞耐性の進行のために、薬物療法の成功にも限界がある［ヘンセンら「脳髄膜癌腫症」,Cancer Medicine,ホランドら編,リー・アンド・フェビガー，フィラデルフィア，ペンシルバニア（1993）,2268-2286］。無胸腺マウスの脳内質へ単独で移植されたＣＲＥＬａｃＺ繊維芽細胞が腫瘍を形成しない（未公表結果）という理由から、動物モデルにおいて発達した脳腫瘍を、第１にＣ６グリオームからなる我々の実験で用いた。我々の実験における、ＣＰＡの、脳内質脳腫瘍の退化能力と比べた場合の、脳髄膜腫瘍の退化能力における相対的差異は、おそらく次の２つのファクターによるものであろう。すなわち、１）脳を覆っている軟膜、クモ膜および２層の脳髄膜に包含される液体充満および解放空間が、繊維芽細胞を含む腫瘍細胞、レトロウイルスベクター、ＣＰＡ，および／または分泌されたシクロホスファミド代謝物間に、より効果的な相互作用を起こさせること；および２）上昇した脳内質脳腫瘍内の間隙圧が、プロデューサー細胞およびプロドラッグのデリバリーを妨害することである。動脈経由投与などの方法で、交互モードでＣＰＡを投与すると、より効果的な脳内質硬質脳腫瘍の治療結果が得られる。腫瘍細胞とプロデューサー細胞の、よりよい“混合”は、硬質腫瘍塊の外科的縮減あるいはウイルスベクターの対流デリバリーによって達成される。
癌の遺伝子療法における調節性キラー遺伝子としてシトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子を使用することは、腫瘍細胞内で生産される細胞毒性代謝物を高濃度にし、他の細胞内で生産される細胞毒性代謝物を最小にすることになり、それによってＣＰＡの治療効果が強化される。このアプローチは、患者がプロドラッグ代謝物の全身的毒性さらされるのを最小化するように、肝臓シトクロムＰ４５０が触媒するＣＰＡ活性化の阻害と組み合わせることができる。さらに、治療時に分割されない腫瘍細胞を殺すことにおいて、現在使用されているＨＳＶ−ＴＫ遺伝子よりも有効である。
実施例６
この実施例では、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）およびＣＰＡ／シトクロムＰ４５０２ｂ１遺伝子で処理された培養Ｃ６グリオーム細胞における付加的細胞毒性効果の範囲の関係という治療例を評価した。結果から、ＣＰＡがシトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子を発現する細胞のＰＣＤを導くことが示される。毒性は、ＣＰＡ活性化Ｐ４５０２Ｂ１遺伝子産物を発現しない隣接するＣ６グリオーム細胞にも生じる。この細胞毒性“バイスタンダー”効果は、２つのメカニズムに起因するものである。すなわち、１）Ｐ４５０発現細胞とナイーブ腫瘍細胞の近接性を必要とする”細胞媒介”メカニズム；および２）Ｐ４５０発現細胞からナイーブ腫瘍細胞へ媒体を介して伝達される”分泌”メカニズムである。
さらに、ホスホルアミド・マスタード（ＰＭ）またはアクロレインのいずれかに変換されるＣＰＡの薬理学的類縁体を使用することによって、ＰＭ産生経路が、細胞近接性によって媒介される細胞毒性の主たる貢献者であり、一方、アクロレイン産生経路は、媒体への分泌によって媒介される細胞毒性に対して一次的に応答可能あることがわかった。
実験材料および方法
薬品および細胞系：シクロホスファミド（ＣＰＡ）はシグマ社から購入した。ＣＰＡ類縁体、トランス−４−フェニルシクロホスファミド（Ｔ４Ｐ）およびジデクロロホスファミド（ＤＣＰＡ）［コックスらBiochem.Pharmacol.628:2045-2049（1979）;プローチャークらToxicol.Appl.Pharmacol.107:472-481（1991）］はスーザン・エム・フードマン博士（ジョンズ・ホプキンス・オンコロジー・センター，バルチモア，メリーランド）のご提供であった。細胞系、Ｃ６−Ｎｅｏ（実施例５においてＣＮＥＯ−１と称したもの）およびＣ６−Ｐ４５０（実施例５においてＣ４５０−８と称したもの）は、実施例５で述べたように、ラットＣ６グリオーム細胞［ベンダらScience,161:370-371（1969）］に、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびラットシトクロムＰ４５０２Ｂ１のｃＤＮＡをもつプラスミドをトランスフェクトさせて作成した。このシトクロムＰ４５０は、試験した１１種の他のラット肝臓Ｐ４５０のなかで、酵素ＣＰＡの代謝活性が最も高い［クラークらCancer Res.49:2344-2350（1989）］。細胞は、５％ＣＯ2インキュベーター中にて、１０％ウシ胎児血清、１００，０００Ｕ．Ｌ．のペニシリンおよび１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（シグマ製）を含む高濃度グルコース（カタログ番号１０ー０１３−ＬＭ，ＣＥＬＬＧＲＯ登録商標）を加えたダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて成長させた。
コロニー形成アッセイ：コロニー形成アッセイを行うために、細胞を１０００個の細胞／１０ｃｍ皿の密度で３個ずつ植えた。クローニング形成効率はコントロール培養物に対して約２５％であった。翌日０．５ｍＭのＣＰＡを加え、６日間インキュベートした。次いで、細胞を一度ハンクス緩衝生理的食塩水（ギブコ）で濯ぎ、Ｇｉｅｍｓａ（Fisher Diagnostics）で染色し、直径１ｍｍ以上の大きさのコロニーを計数した。
細胞増殖アッセイ：細胞増殖アッセイを行うために、細胞を１０ｃｍの皿に植えた（他に特記されない限り、２×１０5個／皿の密度）。２４時間後、ＣＰＡ、Ｔ４ＰあるいはＤＣＰＡを最終濃度が０．５ｍＭになるように加えた。４日間インキュベートし、トリプシンＥＤＴＡ中で採取して、細胞数をクールター・カウンター（クールター・エレクトロニクス・インコーポレイテッド製）を用いてアッセイした。
トリプシン処理および再コロニー形成アッセイ：ＣＰＡ媒介性細胞毒の一時的動力学を測定するために、２×１０6個の細胞を１０ｃｍの皿に植えた。２４時間後、０．５ｍＭのＣＰＡを加え、細胞を各図面に示す時間だけインキュベートした。次いで、細胞とトリプシン処理し、２×１０5細胞／１０ｃｍ皿の密度で再度植えた。９日後、細胞数をクールター・カウンターで計数した。
分泌効果アッセイ：調整培地の効果を評価するために、“挿入”システム（ファルコン）を用いて細胞を皿中で共培養した。これは、上部室と下部室に植えられた細胞集団を物理的に分離するが、培地成分の交換は行われるような微孔膜（孔径＝０．４５μm）を含む組織培養皿（直径３．５ｃｍ）から構成される。培地の総体積が５ｍＬとなるようにして、Ｃ６細胞（３．４×１０5個の細胞）を底室に植え、Ｃ６−Ｐ４５０（３．４×１０5個の細胞）あるいはＣ６−Ｎｅｏ細胞（３．４×１０5個の細胞）を上部室（フィルターの頂上）に植えた。一夜インキュベートした後、０．５ｍＭのＣＰＡをこの培地に加えた。４日後、Ｃ６−Ｐ４５０あるいはＣ６−Ｎｅｏ細胞が成長した膜を除去し、次いで下部室におけるＣ６グリオーム細胞の数をクールター・カウンターで計数した。次いで、生残しているＣ６細胞を２×１０5個の細胞／１０ｃｍ皿の密度でＣＰＡなしで再度植えた。９日後、これらの細胞をトリプシン処理し、クールター・カウンターで計数した。
共培養アッセイ：細胞の総数が２×１０6個／１０ｃｍ皿となるように、Ｃ６−Ｐ４５０とＣ６細胞を異なる割合［０，１０，５０，９０および１００％のＣ６−Ｐ４５０細胞］で３個ずつ共培養した。２４時間後、０．５ｍＭのＣ６−Ｐ４５０を加え、４日後、細胞数を前述の方法で計数した。細胞接触によって達成された細胞破壊と、調整培地への曝露によって得られた細胞破壊を比較するために、各共培養物から上清を採取し、０．４５μm膜フィルターで濾過し、新鮮な５ｍＬの培地とともに１：１の比率で混合し、Ｃ６細胞の一夜培養物に加えた（２×１０6細胞／１０ｃｍ皿，３個ずつ）。４日後、Ｃ６細胞を洗浄し、採取し、計数した。共培養アッセイから得られた細胞媒介性細胞破壊効果の特異性を測定するために、Ｃ６細胞を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｃ６−Ｎｅｏ）を発現するＣ６細胞、放射線処理Ｃ６細胞、放射線処理Ｃ６−Ｎｅｏおよび放射線処理Ｃ６−Ｐ４５０細胞とともに一夜インキュベートした。γ線照射は、51クロミウム源から放射される総量６０００ラドの放射線に細胞をさらすことによって行った。このレベルの放射線に曝露された細胞は、増殖しないが、７日間組織培養皿に付着残存した後に脱離して死滅した。
ゲノムＤＮＡ分析：市販の適当なキット（Ｎucleon登録商標,Scot Lab）を用いて、種々の時間ＣＰＡ処理をしたＣ６およびＣ６−Ｐ４５０細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。付着する細胞ならびに死滅した細胞からＤＮＡを単離し、上清に浮かべた。各時点のＤＮＡ（１μｇ）を１％寒天ゲル上での電気泳動によって分析した。
統計試験：すべての試験の有意性はシグマスタット・ソフトウエア（ジャンデル・コーポレイション，サンラファエル、カリフォルニア）を用いて行った。
結果
シトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子を発現するＣ６細胞の増殖におけるＣＰＡの効果：細胞系Ｃ６−Ｐ４５０（前記Ｃ４５０−８）およびＣ６−Ｎｅｏ（前記ＣＮｅｏ−１）の作成が記載されている［ワイらのHum.Gene Ther.5:969ー978（1994）］。これらの細胞系は、ラットシトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子およネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をそれぞれ安定にトランスフェクトされたＣ６グリオーム細胞から誘導した。図２０Ａは、Ｃ６，Ｃ６−Ｐ４５０およびＣ６−Ｎｅｏグリオーム細胞が、ＣＰＡがない条件下では、同じような割合で増殖することを示している。しかし、０．５ｍＭのＣＰＡが存在すると、１０日間にわたるＣ６−Ｐ４５０の選択的完全成長阻害が現れた。
シトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子を発現する細胞の死亡がＣＰＡの接触時間中に起こる：ＣＰＡの細胞破壊作用の時間経過を研究するために、トリプシン処理および再コロニー形成アッセイを行った。２×１０6個の細胞を、時間を変えて０．５ｍＭＣＰＡで処理した。次いで、細胞を洗浄し、トリプシン処理してプロドラッグおよび／または代謝物を除去し、２×１０5細胞／１０ｃｍ皿の密度で再度植えた。表ＩＩＩは、再コロニー形成したＣ６−Ｐ４５０細胞の成長を完全に阻害するためには、３時間ＣＰＡで処理すればよいことを示している。再度植えられた親のＣ６グリオーム細胞の増殖は、９６時間のＣＰＡ処理の後でさえも、影響を受けなかった。細胞におけるＣＰＡの細胞破壊効果が３時間以内に完了するというこの事実は、ＣＰＡがＣ６−Ｐ４５０内で急速にその細胞毒性代謝物に変換されることを示している。
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Ｃ６−Ｐ４５０細胞から採取された培地を介するナイーブＣ６細胞への細胞毒性代謝物の伝達：毒性代謝物の生成は、隣接する細胞に細胞毒性効果をもたらす。したがって、発明者らは、Ｃ６−Ｐ４５０細胞によって親のＣ６細胞に代謝されたＣＰＡの細胞毒性効果を調整培地が伝達しうるかどうかを決定しようとした。表ＩＶに示した時間だけＣＰＡ処理を行ったＣ６またはＣ６−Ｐ４５０細胞から調整培地を採取し、次いで、Ｃ６グリオーム細胞に加えてそれらのコロニー形成能力を評価した。表ＩＶの結果は、Ｃ６細胞を加えたときに、そのクローニング効率をおよそ４５％に減少させる調整培地を作成するには、Ｃ６−Ｐ４５０細胞をＣＰＡで３時間処理することで十分であることを示している。この調整培地の阻害能力は、Ｃ６−Ｐ４５０をＣＰＡに接触させる時間にともなって増加する。ＣＰＡに２４時間接触させたＣ６−Ｐ４５０細胞から採取した培地とともにインキュベートすることによって、Ｃ６細胞のコロニー形成の完全な阻害が達成された（表ＩＶ）。これは、ＣＰＡ処理Ｃ６−Ｐ４５０細胞が、培地に蓄積される可溶性の毒性代謝物を分泌することを示している。ＣＰＡ代謝物であるＰＭの細胞膜を通る拡散は、効率的ではないので［ゲンカらCancer Chemother.Pharmanol.27:1-7（1990）］、この調整培地中の活性代謝物は拡散可能な代謝物、すなわち４−ＣＨＣＰＡおよび／またはアクロレインであると思われる。ＣＰＡ処理Ｃ６−Ｐ４５０細胞によって調整された培地によるＣ６細胞の細胞破壊作用をここで“分泌効果”と称する。
0004509221.tif 000005
分泌された細胞毒性代謝物の存在をさらに明らかにするために、Ｃ６およびＣ６−Ｐ４５０細胞（１：１の比率）を、微孔フィルターを使用することによって２種類の細胞が物理的に分離されるが、その上清の拡散は行えるという、ファルコン共培養インサートを用いて培養した。コントロールとしてＣ６およびＣ６−Ｎｅｏ細胞（１：１の比率）を用いて同様に培養した。培養培地にＣＰＡを加え、下部培養室におけるＣ６細胞の数を４日後に測定した。このような培養条件下では、ＣＰＡの存在下でＣ６−Ｐ４５０細胞と共培養されたＣ６細胞の数において、ＣＰＡ不在下でＣ６−Ｐ４５０と共培養されたＣ６細胞あるいはＣ６−Ｎｅｏ細胞と共培養されたＣ６細胞と比べたとき、およそ５０％減少した。このようなＣ６細胞をトリプシン処理および再コロニー形成によって増殖を刺激したとき、Ｃ６−Ｐ４５０細胞によって生産されたＣＰＡ代謝物の毒性効果は、強化され、結果的に約９０％のＣ６細胞数の減少がみられる。したがって、小さい可溶性細胞毒ファクターあるいは代謝物は、Ｐ４５０ポジティブからＰ４５０ネガティブ腫瘍細胞へ、培養培地を介して伝達されうる。
ＣＰＡ処理されたＣ６−Ｐ４５０細胞におけるエンドヌクレオ分解的切断：本発明者らは、次に、プログラム細胞死（ＰＣＤ）が、ＣＰＡ／シトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子療法の成長阻害効果に寄与するかどうかを決定しようとした。ＰＣＤの証拠のひとつは、染色体ＤＮＡのエンドヌクレオ分解的切断である［ワイル，Ａ.Ｈ.Nature284:555-556（1980）］。種々の時間においてＣＰＡ処理されたＣ６またはＣ６−Ｐ４５０細胞からゲノムＤＮＡを単離した。図２２Ａは、ＣＰＡ処理の７２時間後に、Ｃ６−Ｐ４５０細胞由来のＤＮＡが、ＰＣＤに特徴的なヌクレオソームラダリングを呈したことを示す。それとは対照的に、Ｃ６細胞由来のゲノムＤＮＡは、ＣＰＡ処理の４日後でさえも、完全なままであった。したがって、ＰＣＤは、ＣＰＡ／シトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子療法に見られる細胞死に関連すると考えられる。
細胞媒介性効果もまた細胞毒性に寄与する：本発明者らは、細胞媒介性効果がＣＰＡ／シトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子療法に寄与するかどうかの決定を試みた。図２３Ａは、皿上の細胞の１０％がＰ４５０遺伝子を発現するように、Ｃ６およびＣ６−Ｐ４５０細胞を共培養したときに、４日間のＣＰＡ処理に応答して、Ｃ６細胞の増殖が７５％減少（２８×１０6個から８×１０6個へ）したことを示す。Ｐ４５０遺伝子を含む共培養細胞の数を５０％増加したとき、それに比例して、ＣＰＡに応答してＣ６細胞の増殖が低下し、約８５％になった（２８×１０6個から２×１０6個）。Ｃ６−Ｐ４５０細胞の数を、皿上の９０％になるようにさらに増加すると、ＣＰＡで４日間処理した後のＣ６細胞の増殖は完全に阻止された。本発明者らは、互いに隣接状態において２つの細胞集団を成長させることが、ＣＰＡ／シトクロムＰ４５０２Ｂ１遺伝子療法における細胞間毒性の強力な媒介因子であると結論する。
コントロール実験において、皿注のＣ６細胞は９０％を占めたが、残りの１０％の細胞は、ａ）Ｃ６−Ｎｅｏ細胞、ｂ）放射線処理Ｃ６細胞、ｃ）放射線処理Ｃ６−Ｎｅｏ細胞、またはｄ）放射線処理Ｃ６−Ｐ４５０細胞からなるものであった（図２３Ｂ）。Ｃ６−Ｎｅｏ細胞とともに共培養しても、Ｃ６細胞の増殖が影響を受けないことは明らかであった（コラム２）、放射線照射によってＣ６細胞を破壊すると、残りのナイーブＣ６細胞上に毒性が媒介されないことも明らかであった。放射線処理Ｃ６−Ｎｅｏ細胞とともに共培養されたＣ６細胞の増殖において、小さく、統計的には有意ではない減少がみとめられた（ｐ＞０．１，シスチューデントｔ試験）（コラム４）。しかし、放射線処理Ｃ６−Ｐ４５０細胞とともに共培養されたＣ６細胞の増殖において、統計的に有意な減少がみとめられた（３０％）（ｐ＜０．０１，スチューデントｔ試験）（コラム５）。この結果は、放射線処理Ｃ６−Ｐ４５０細胞が、隣接Ｃ６細胞へ毒性を媒介するに十分な濃度までＣＰＡを活性化しうることを示唆する。
細胞媒介性破壊が行われた上清は毒性がある：図２３Ａに示した共培養物の培地に毒性代謝物が存在するかどうかを調べるために、各共培養物由来の上清を、ＣＰＡ処理の４日後に採取し、ナイーブＣ６細胞（２×１０6個の細胞）に加えた。図２４は、０，５または５０％の細胞がＰ４５０２Ｂ１遺伝子を含む共培養アッセイから採取した調整培地で処理されたＣ６細胞の増殖において阻害が見られなかったことを示す。９０または１００％の細胞がＰ４５０遺伝子を含むアッセイから採取された調整培地で処理されたＣ６細胞の増殖において約３０％の減少があった（ｐ＜０．０５），スチューデントｔ試験。これらの発見は、Ｃ６−Ｐ４５０細胞が大部分を占める共培養アッセイ培地中に細胞毒性因子が存在し、かつ、ＣＰＡ処理の４日後に、分泌された細胞毒性代謝物が、細胞媒介性のＣ６細胞死に寄与していたことを示す。一方、皿上の細胞の９０％がＣ６−Ｐ４５０細胞である場合のみにこの培地が毒性をもつという発見は、２つの細胞集団を隣接状態で４日間成長させると、ナイーブＣ６細胞のＣＰＡ媒介性細胞破壊の効率が、より良くなることを示す。表ＩＶおよび図２１の結果と比較して、図２４の結果に述べられた分泌効果の成長−阻害強度における変動は、培地中に分泌される４−ＨＣＰＡおよびアクロレインの相対的不安定度によって、説明することができる。表ＩＶおよび図２１に示した実験においては、これらの代謝物は、Ｐ４５０２Ｂ１ポジティブ腫瘍細胞によって新たに生産され、調整培地は、Ｐ４５０２Ｂ１ネガティブ腫瘍細胞に対して、より大きな毒性を提供するようであった。このパラグラフで述べた実験においては、調整培地は４日間培養物から採取したものであり、大部分の代謝物は、おそらく分解されており、分泌効果の及ぶ範囲は縮小されていると考えられる。
個となるＣＰＡ生体活性化経路の特徴：シトクロムＰ４５０２Ｂ１によるＣＰＡの生体活性化によって、親の薬物よりも親油性の低い不安定な化合物である４−ヒドロキシシクロホスファミド（４−ＨＣＰＡ）が生産される。次いで、４−ＨＣＰＡが分解してアクロレインとホスホルアミド・マスタード（ＰＭ）が生成される。ＣＰＡ細胞媒介性毒性および分泌毒性におけるアクロレインおよびＰＭ生産経路の相対的寄与を調査するために、我々は、生体活性化して、ただひとつ、あるいは他の毒性代謝物を生産するＣＰＡ類縁体を用いた。Ｔ４Ｐは、アクロレインを形成することなくＰＭに代謝されるが、一方ＰＣＰＡはＰＭを形成することなくアクロレインに変換される［コックス，Ｐ．Ｊ．Biochem.Pharmacol.28:2045-2049（1979）；プロウチャークおよびマチソンTaxicol.Appl.Pharmacol.107:472ー481（1991）］。細胞増殖アッセイにおいて、Ｔ４ＰはＣ６グリオーム細胞に細胞毒性を与えた（非処理Ｃ６細胞と比べて細胞増殖を２０％阻害；表Ｖ−Ａ欄；ｐ＜０．０５，スチューデントｔ試験）が、一方ＣＰＡおよびＤＣＰＡは、Ｃ６細胞の増殖に影響を与えなかった。ところが、Ｔ４ＰはＣ６−ｐ４５０細胞に対し、一層大きな影響を与え、未処理Ｃ６−Ｐ４５０細胞と比べて、それらの増殖を７９％阻害した（ｐ＜０．００１，スチューデントｔ試験）。ＤＣＰＡはＣ６−Ｐ４５０細胞の増殖に影響を与えなかったが、ＣＰＡは、細胞増殖を完全に阻害したわけではないが、細胞数を実質的に減少させ、より大きな影響を与えた（２×１０6個から１．１５×１０6個へ）。
Ｔ４ＰおよびＣＰＡの成長阻害効果をさらに確認するために、トリプシン処理および再コロニー形成アッセイを行った（表Ｖ−Ｂ欄）。これらの化合物で処理したＣ６細胞の増殖には有意な差異は認められなかった。この結果とは対照的に、ＣＰＡあるいはＴ４Ｐで処理したＣ６−Ｐ４５０細胞の増殖は完全に阻害された。ＤＣＰＡはこのような条件下では効果はなかった。
コロニー形成アッセイを利用して分泌効果を調べた（表Ｖ−Ｃ欄）。各処理グループから得た調整培地（表Ｖ−Ａ欄）をＣ６細胞に加えた。９日後、Ｃ６コロニーの数を数えると、ＤＣＰＡまたはＣＰＡで処理したＣ６−Ｐ４５０細胞から採取した調整培地がＣ６細胞の成長において毒性が高いことがわかった。この結果とは対照的に、Ｔ４Ｐで処理したＣ６−Ｐ４５０細胞から採取した調整培地は、Ｃ６細胞のコロニー形成において最小の影響しか与えなかった。これらの結果から、まず分泌効果においてアクロレイン生成経路（ＤＣＰＡで代表される）が関与し、ＰＭ生成経路（Ｔ４Ｐで代表される）は最小のかかわりしかないことが示される。ところが、細胞間がコロニー形成アッセイよりも、より接近している細胞増殖アッセイにおいては、ＰＭ活性化経路が、成長阻害の作動メカニズムにおいて、より有意に関係する。このことは、後者の経路が、ＣＰＡの細胞媒介性細胞毒性において重要な関与因子であることを示唆する。
0004509221.tif 000006
検討
癌のためのシトクロムＰ４５０ ２Ｂ／ＣＰＡ遺伝子療法：
本発明者らは、ラットシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１導入遺伝子を腫瘍細胞中に挿入することにより該細胞をシクロホスファミドの抗腫瘍作用に対して感受性にさせることが、腫瘍に対する新たな治療戦略として有望であることを見いだした。実施例５は、上記遺伝子を有するレトロウイルスベクターを産生すべく遺伝子操作した線維芽細胞が末梢および脳腫瘍の動物モデルにおいて腫瘍寛解を引き起こすであろうことを示す。
この実施例において本発明者らは、この遺伝子療法戦略の有効性を担う細胞毒性メカニズムを解明しようとした。この研究の主要な目的は、（ａ）Ｐ４５０  ２Ｂ１陽性の腫瘍細胞のシクロホスファミド誘発毒性がプログラミングされた細胞死と関連があるかどうかを決定すること、（ｂ）腫瘍細胞におけるＰ４５０  ２Ｂ１遺伝子の発現がＰ４５０ ２Ｂ１陰性の腫瘍細胞をもシクロホスファミドに対して感受性にするか否かを評価すること（「傍観者（bystander）」効果）、および（ｃ）この「傍観者」感作を担うＣＰＡ活性化経路を特徴付けることであった。その結果は、細胞毒性がならし培地（「分泌」効果）および近接増殖（「細胞媒体」効果）の両経路で未感受の（naive）腫瘍細胞に移されること、および該毒性が究極的にＰＣＤと関連していることを示している。近年の遺伝子療法技術は治療遺伝子をすべての腫瘍細胞中に導入することはできないので、この報告の知見はシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／ＣＰＡパラダイムを用いた遺伝子療法の支持を付与するものである。
これらメカニズムを解明するために３つの細胞増殖アッセイ、すなわち細胞増殖アッセイ、コロニー形成アッセイ、およびトリプシン処理再プレーティングアッセイを使用した。第一のアッセイは、おそらく最も感度が低いであろう。というのは腫瘍細胞を比較的高密度でプレーティングし、２〜４日以内にコンフルエンシーに達し、細胞毒性能が細胞分裂の間に示される薬剤に対して有効な抗腫瘍作用を付与する時間をほとんど与えないからである。第二のアッセイはもっと感度が高いが、それは細胞を極めて低密度（１０ｃｍディッシュ当たり１００細胞）でプレーティングし、コロニーを形成するために個々の細胞が薬剤の細胞毒性作用に抗して数日間増殖および抵抗しなければならないからである。第三のアッセイでは細胞をプロドラッグに短時間さらし、ついで該プロドラッグの不在下で低密度で再プレーティングすることにより、処理細胞が薬剤の細胞毒性作用から回復する能力を測定できるようにする。
細胞媒体毒性：
ＣＰＡの毒性は細胞接触（細胞媒体効果）および培地（分泌効果）の両者によりシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現しない腫瘍細胞に移され得る。細胞媒体効果とは、未感受腫瘍細胞をプロドラッグ代謝性の細胞と近接させて増殖させたときに得られる死滅効果として定義される。分泌効果とは、未感受腫瘍細胞の純粋な集団をプロドラッグ代謝性の細胞によってならされた培地にさらすことによって得られる死滅効果として定義される。
幾つかの特性が細胞媒体効果を規定すると思われる。この効果はシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子の発現を必要とするが、それは放射線処理したＣ６またはＣ６−Ｎｅｏ細胞をＣＰＡの存在下で同時培養しても細胞毒性は伝達されないからである。細胞媒体効果は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を発現する細胞のパーセントを増加させることによって細胞増殖を完全に抑制し腫瘍細胞数を減少することができる点で増大性（incremental）である。この効果はまた、短いパルスのＣＰＡを与えた後に洗浄および再プレーティングして過剰のプロドラッグを除去しても細胞が死滅し続けるという点で不可逆的である。
分泌効果：
分泌効果の存在は、ガンシクロビル／単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子療法戦略（ムールテン（Ｍoolten,Ｆ.Ｌ.）、Ｃancer  Ｒes.４６：５２５７−５２８１（１９８６）；フリーマン（Ｆreeman）ら、Ｃancer Ｒes.５３：５２４７−５２８２（１９９３）；エッゼディン（Ｅzzeddine）ら、Ｎew Ｂiol.３：６０８−６１４（１９９１））などの他のタイプのものからＣＰＡ／シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子療法パラダイムを違ったものにしている。後者の遺伝子療法戦略の場合では、毒性の代謝産物は細胞接触によっては伝達されるものの（リ・ビ（Ｌi Ｂi）ら、Ｈum.Ｇene Ｔher.４：７２５−７３１（１９９３））、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含有するガンシクロビル処理腫瘍細胞からのならし培地は未処理の未感受腫瘍細胞に対して細胞毒性を示さない（タカミヤ（Ｔakamiya）ら、Ｊ.Ｎeurosci.Ｒes.３３：４９３−４５０（１９９２））。本発明者らはＣＰＡ／シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子療法における分泌された細胞毒性代謝産物の形成が腫瘍に対する治療学的後押しを提供するであろうと仮定している。分泌された代謝産物は正常な細胞に対しても若干の望ましくない毒性を引き起こしはするであろうが、指定された遺伝子送達によって毒性を腫瘍細胞内のみに生じさせることは腫瘍細胞の死滅を最大にするとともに正常細胞に対する有害作用を最小にするに違いない。
細胞媒体効果と分泌効果との比較：
分泌効果は細胞媒体効果の細胞毒性に一部寄与することが明らかである。後者は１０％の腫瘍細胞がＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を含有するときに高密度同時培養において活性であるのに対し、前者は殆どの腫瘍細胞がＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子を発現する場合に培地中で明らかとなる。細胞媒体効果は、わずか３時間ＣＰＡにさらした後でさえも（表III参照）細胞増殖アッセイにおいて細胞増殖の完全な抑制をもたらす（図２０Ｂおよび表Ｖ（Ａ）参照）。分泌効果は一層感度の高いコロニー形成アッセイにおいてのみ明らかであり、細胞増殖の完全な抑制はＣＰＡ処理したＣ６−Ｐ４５０細胞からの培地に細胞を２４時間以上さらすことによって達成することができる（表IV参照）。さらに、Ｃ６細胞とＣ６−Ｐ４５０細胞とをフィルターで分離した環境中で同時培養することによってならし培地に対する暴露を最大にした場合でさえも、４日間にわたるＣ６細胞の増殖において５０％の抑制しか認められなかった（図２１Ａ参照）。細胞媒体効果は腫瘍細胞死滅のより一般的なメカニズムであり、分泌効果はこの細胞媒体された細胞毒性効果に部分的に貢献するものと結論された。
最終的に、プロドラッグの活性な薬剤への細胞内変換を可能とする遺伝子の送達により腫瘍学的化学療法を促進しうることは、腫瘍細胞に対しては最大の細胞毒性を得、正常細胞に対しては最小の効果とする目的を達成するに違いない。異なる作用様式の幾つかのプロドラッグ−遺伝子療法システム（たとえば、Ｓ−相にあるガンシクロビル／ＨＳＶ−ＴＫ標的細胞、シクロホスファミド／シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１標的細胞では全ての相のもの）、並びにインターロイキン−４（ユー（Ｙu）ら、Ｃancer Ｒes.５３：３１２５−３１２８（１９９３））、ＧＭ−ＣＳＦ（ドラノフ（Ｄranoff）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ９０：３５３９−３５４３（１９９３））などの免疫応答を拡張するサイトカインの発現、および腫瘍細胞の代謝を変えてしまうＩＧＦ−２（トロジャン（Ｔrojan）ら、Ｓcience２５９：９４−９７（１９９３））などのアンチセンスＲＮＡの組み合わせは、癌遺伝子療法の抗腫瘍効果を拡張するに違いない。
実施例７
この実施例では、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を安定に発現するようにトランスフェクションしたラット９Ｌ腫瘍細胞のシクロホスファミド（ＣＰＡ）感受性を培地中で調べ、皮下移植の後にはフィッシャーラットの外大腿部での固形腫瘍の増殖をも調べた。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現する腫瘍をＣＰＡ処理すると腫瘍増殖が完全に抑制された。この結果は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子の腫瘍発現によって腫瘍内プロドラッグ活性化が達成される場合には末梢で増殖している全身性の固形腫瘍がオキサザホスホリン（oxazaphosphorine）処理に対してインビボで高度に感受性にされ得ることを示している。
材料および方法
略語：
９Ｌ−Ｚ：大腸菌β−ガラクトシダーゼを安定に発現する９Ｌ細胞；９Ｌ−ＺＰ：大腸菌βガラクトシダーゼおよびラットシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を安定に発現する９Ｌ細胞；Ｌ４５０−２：ラットシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を安定に発現する９Ｌ細胞。
化学物質：
シクロホスファミドおよびイホスファミド（ifosphamide）はナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｎational Ｃancer Ｉnstitute）（ベセスダ、メリーランド）の医薬合成および化学部から得た。４−ヒドロペルオキシシクロホスファミドはノバ・ファーマシューティカル・コーポレーション（Ｎova Ｐharmaceutical Ｃorporation）（ボルチモア、メリーランド）から得た。メチラポンはアルドリッチ・ケミカル（Ａldrich Ｃhemical Ｃo.）（ミルウォーキー、ウイスコンシン）から購入した。
９Ｌ細胞の安定なトランスフェクション：
ラット９Ｌ神経膠肉腫細胞（バーカー（Ｂarker）ら、Ｃancer Ｒes.３３：９７６−９８６（１９７３））を、１０％ウシ胎児血清、１０単位／ｍＬペニシリンおよび１０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するアルファ最小必須培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ,Ｉnc.）中で増殖させた。細胞を５％ＣＯ2／９５％空気の湿潤雰囲気下に維持した。９Ｌ細胞を製造業者の指示に従ってリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ,Ｉnc.）を用い、ラットシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現プラスミド（ＮＹＵメディカルスクールのミルトン・アデスニク（Ｍiton Ａdesnik）およびアリソン・レイス（Ａllison Ｒeiss）両博士により提供されたｐＭＴ２−cytochromeＰ４５０ ２Ｂ１）およびプラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌ.Ｎｅｏ（ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティチュート（Ｄana Ｆarber Ｃancer Ｉnstitute）のリー（Ｈ.Ｌi）博士より贈呈）で１：１０の比率にてコトランスフェクションした。プラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌ.ＮＥＯは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８に対する耐性を付与する）および大腸菌のｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子（コントロールとして働き、都合のよい細胞マーカーを付与する）を含有する。安定なトランスフェクション体を１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ,Ｉnc.）中での選択下でクローニングした。Ｇ４１８に耐性の細胞株をクローニングし、増殖させ、評価した。他のシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現性の９Ｌ神経膠肉腫由来細胞株であるＬ４５０−２も同様の方法で調製した。
薬剤感受性を試験するため、１×１０5細胞を３０ｍｍ組織培養プレート（ファルコン３０４６）中に２つずつプレーティングした。播種の１８〜２４時間後に薬剤を加えた。薬剤処理の５日後までの時間範囲にわたり細胞を増殖させ、ついで最終の細胞数を決定した。細胞をリン酸緩衝食塩水かまたはハンクの緩衝食塩水で濯ぎ、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ,Ｉnc.）を用いて分散させ、ついで赤血球計を用いてカウントした。結果を増殖比、すなわち対応する薬剤不含の対照のパーセントとしての薬剤含有プレート中での細胞数（２つの測定の平均±範囲）として表した。
同時培養実験：
親の９Ｌ細胞を培養プレート（ファルコン３５０２）の底部ウエルにプレーティングし、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性の細胞またはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性の細胞を２５ｍｍ細胞培養インサート（０.４５μｍ孔径、ファルコン３０９０）中にプレーティングした。培地を１８〜２４時間後に吸引除去した。薬剤なしの培地（１.０ｍＬ）を底部ウエルに加え、薬剤を含有する１.０ｍＬの培地を上部細胞培養インサートに加えた。５日後に細胞数を上記のようにして決定した。
腫瘍増殖の遅延研究：
９Ｌ細胞を固形腫瘍として雌フィッシャー３４４ラット中で皮下（s.c.）増殖させた。成体雌フィッシャー３４４ラット（１２０〜１５０ｇ）に２×１０6細胞／皮下部位を接種した；シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性の細胞（親の９Ｌ細胞または９Ｌ−Ｚ細胞）を一方の大腿部に注入し、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性の細胞（９Ｌ−ＺＰ細胞またはＬ４５０−２細胞）を他方の大腿部に注入した。このような方法を採用したのは、９Ｌ腫瘍の皮下増殖が肝臓のシトクロムＰ４５０依存性のシクロホスファミド活性化作用を有するという潜在的な効果を制御するためであった。薬剤処理は腫瘍移植の７日後に開始した。ラットを無作為化し、２つのグループに分けた。一つのグループは１００ｍｇ／ｋｇ体重のシクロホスファミドで１回の腹腔内注射することにより処理した。他のグループは対照として食塩水を注射した。腫瘍のサイズを７〜８週までの時間範囲でカリパス測定によりモニターし、この時点で動物を屠殺した。
ウエスタンブロットおよびシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１活性分析：
培養した９Ｌ細胞から分別遠心分離により調製したミクロソームタンパク質を１０％ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ（２０μｇタンパク質／レーン）、ニトロセルロースに移し、ついでポリクローナルウサギ抗シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１抗体（ワックスマン（Ｗaxman）およびウォルシュ（Ｗalsh）、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５７：１０４４６−１０４５７（１９８２）；ワックスマン（Ｗaxman,Ｄ.Ｊ.）、Ｍethods Ｅnzymol.２０６：２４９−２６７（１９９１））でプローブした。フェノバルビタール誘発した肝臓ミクロソーム（１μｇ）を正の対照として用いた。単離した９Ｌミクロソームフラクション中の７−エトキシクマリンのＯ−脱エチル化（ワックスマンおよびウォルシュ、Ｂiochemistry２２：４８４６−４８５５（１９８３））およびテストステロンの１６βヒドロキシル化（ワックスマン、Ｍethods Ｅnzymol.２０６：２４９−２６７（１９９１））をモニターすることにより、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１依存性の酵素活性を測定した。
結果
９Ｌ神経膠肉腫細胞でのシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子の安定な発現：
９Ｌ細胞をラットシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１をコードする発現プラスミドおよびネオマイシン耐性遺伝子を含有するβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドで１０：１のモル比にてコトランスフェクションした。Ｇ４１８に耐性の細胞株を選択し、クローニングした。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１に特異的なウサギポリクローナル抗体を用いた単離９Ｌ細胞ミクロソームのウエスタンブロット分析は、９Ｌ−ＺＰおよびＬ４５０−２と称するクローニング細胞株から調製した試料において精製シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１の分子量に対応する約５２ｋＤの単一のタンパク質バンドを示した。親の９Ｌ細胞または９Ｌ−Ｚ細胞ではシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１タンパク質は検出されず、これら細胞はβ−ガラクトシダーゼを発現したが（ｘ−ｇａｌ染色）シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１は発現しなかった（図２５）。これらクローニング細胞株９Ｌ、９Ｌ−Ｚ、９Ｌ−ＺＰおよびＬ４５０−２をさらに研究するために用いた。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１依存性の酵素活性の分析（方法を参照）により、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１形質転換体９Ｌ−ＺＰおよびＬ４５０−２はともにシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を酵素的に活性な形態にてフェノバルビタール誘発ラット肝臓の〜１−２％に対応するレベルで発現したが、親の９Ｌ細胞または９Ｌ−Ｚ細胞ではシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１活性（テストステロンの１６βヒドロキシル化）は検出できないことが確かめられた。
培養した９Ｌ細胞および９Ｌ−Ｚ細胞に対するオキサザホスホリンの効果：
本発明者らは、まず、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現する９Ｌ細胞がシクロホスファミドおよびイホスファミドの細胞毒性効果に対して感受性か否かを試験した。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性の細胞（９Ｌ−ＺＰおよびＬ４５０−２）およびシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性の細胞（親の９Ｌおよび９Ｌ−Ｚ）を種々の濃度のシクロホスファミドおよびイホスファミドとともに培養した。ついで、薬剤処理の５日後に存在する生存細胞数を決定した。図２６Ａに示すように、シクロホスファミドはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞の増殖を濃度に依存した仕方で抑制した（ＩＣ50〜７０μＭ）。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞の増殖はまたイホスファミドによっても抑制されたが、この場合は若干高濃度（ＩＣ50〜１４５μＭ）の薬剤を必要とした（図２６Ｂ）。これら知見は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１がイホスファミドをシクロホスファミドに比べて３〜４倍低い効率（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）で活性化するという以前の観察と一致するものである（ウェーバー（Ｗeber）およびワックスマン、Ｂiochem.Ｐharmacol.４５：１６８５−９４（１９９３））。対照的に、親の９Ｌ細胞および９Ｌ−Ｚ細胞はミリモル濃度のシクロホスファミドまたはイホスファミドの存在下で増殖させた場合でも有害作用を示さなかった。対照実験においてシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞およびシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞はともに活性化シクロホスファミド（これは、４−ヒドロペルオキシシクロホスファミドの形態で細胞上に提示される）に対して本来感受性であることが確立された（図２６Ｃ）。
シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性の９Ｌ細胞のオキサザホスホリン感受性に対するＰ４５０酵素抑制の効果：
シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１の発現それ自体がシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞のシクロホスファミドおよびイホスファミドに対する化学療法剤感受性の原因であることを確かめるため、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１に選択的な酵素阻害剤であるメチラポン（ワックスマンおよびウォルシュ、Ｂiochemistry２２：４８４６−４８５５（１９８３））を用いて細胞性のシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１活性を抑制させた。１０μＭメチラポンの存在下では９Ｌ−ＺＰ細胞に対するシクロホスファミドおよびイホスファミドの細胞毒性効果はほとんど除かれた（図２７）。対照的に、メチラポンは化学的に活性な誘導体である４−ヒドロペルオキシシクロホスファミドの細胞毒性は阻止しなかったが（図２７）、これはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１により触媒されたオキサザホスホリン活性化の抑制によるメチラポン保護と一致する知見である。それゆえ、シクロホスファミドおよびイホスファミドに対するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現細胞の化学療法剤感受性は、これら細胞内の機能性のシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１酵素の存在に依存する。
「傍観者」細胞毒性効果の分析：
本発明者らは、つぎに、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性の９Ｌ細胞をシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現腫瘍細胞とともに同時培養したときにシクロホスファミド細胞毒性に感受性とされ得るか否かを調べた。これらの実験には親の９Ｌ細胞およびシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性９Ｌ−ＺＰ細胞を用いたが、それは、これら細胞が培養において同様の倍加時間を有するからである。等しい細胞数の９Ｌ細胞および９Ｌ−ＺＰ細胞を混合し、ついで混合した培養液をシクロホスファミドで処理した。もしもシクロホスファミド細胞毒性がシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性の細胞に限られるものであるならば、混合した細胞集団の半分を占める９Ｌ−ＺＰ細胞に対するシクロホスファミドの細胞毒性が選択的だが殆ど完全（＞９０％）であることから予測されるように、全細胞数は薬剤不含の対照に比べて約５０％減少するであろうと思われた。一方、もしもシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞が近接するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞を化学療法剤に対して感受性にするならば、シクロホスファミドとの同時培養の後に両方の細胞型が排除されるに違いない。
図２８に示すように、混合培養液をシクロホスファミドで処理したときに全細胞集団の８０％近くが根絶された。さらに、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１酵素阻害剤であるメチラポンは、この効果を殆ど排除することができた。混合培養液中の細胞は、若干高い薬剤濃度においてではあるもののイホスファミドに対して同様の感受性パターンを示した。対照的に、９Ｌ−Ｚ細胞を親の９Ｌ細胞と混合した場合には、いずれの細胞集団においても死滅は認められなかった。これら研究は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞がシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１酵素活性が関与するメカニズムにより近接するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞に傍観者殺傷効果を付与することを示している。
つぎに、混合細胞集団内でのシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞およびシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞の両者に対するシクロホスファミド処理の効果をモニターした。培養中の２つのタイプの細胞を識別するため、ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）でマーキングした細胞を用いた（この細胞はβ−ガラクトシダーゼの基質であるｘ−ｇａｌで培養液を染色したときに青色の細胞として同定できる）。等しい細胞数の親９Ｌ細胞をｌａｃＺ−マーキングしたシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞、９Ｌ−ＺＰと混合した。シクロホスファミド処理後、細胞を固定し、ｘ−ｇａｌで染色してこれら２つの細胞集団に対するシクロホスファミドの細胞毒性を明らかにした。図２９に示すように、シクロホスファミドはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞（青く染まった細胞）の増殖を劇的に抑制した。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞（染まらなかった細胞）の増殖も若干低いものの実質的な抑制が観察された。幾つかの残留細胞が顕著な形態学的異常を示し、これら残留細胞の生存性は疑問であった。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１阻害剤であるメチラポンは両タイプの細胞をシクロホスファミド死滅から保護した。しかしながら、顕微鏡観察では幾つかのシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞では形態学的な歪曲が明らかとなったが、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞では観察されなかった。これら知見は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現する９Ｌ細胞が腫瘍細胞内で起こるプロドラッグ活性化の結果としてシクロホスファミド細胞毒性に対して一層感受性であるが、近接するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞に対する実質的な細胞毒性もまた生じることを示している。
つぎに、本発明者らは、ＨＳＫ−ＴＫ陽性並びにＨＳＫ−ＴＫ陰性腫瘍細胞およびガンシクロビル処理の場合（ラム（Ｒam）ら、Ｃancer Ｒes.５３：８３−８８（１９９３）；カルバー（Ｃulver）ら、Ｓcience２５６：１５５０−１５５２（１９９２）；フリーマン（Ｆreeman）ら、Ｃancer Ｒes.５３：５２７４−５２８３（１９９３）；ビー（Ｂi）ら、Ｈuman Ｇene Ｔherapy４：７２５−７３１（１９９３））から類推されるように、このような近接シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞によるシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞の傍観者死滅が直接的な細胞−細胞接触を必要とするのか否かを評価した。これら実験のため、親の９Ｌ細胞をファルコン同時培養インサートの底部チャンバ中に播種し、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞（９Ｌ−ＺＰ）かまたはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞（９Ｌ−Ｚ）のいずれかを該同時培養インサートの上部チャンバに入れた。これら２つの細胞集団を同時培養系において物理的に隔離したが、同じ培地を使用した。
図３０Ａに示すように、５日間シクロホスファミド処理すると上部チャンバ中のシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性の９Ｌ細胞のみならず底部チャンバ中で培養した親９Ｌ細胞も死滅した。両細胞集団の死滅はシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１阻害剤であるメチラポンにより有効に阻止できる。対照的に、９Ｌ−Ｚ細胞を親９Ｌ細胞と同時培養した場合にはいずれの細胞集団も死滅しなかった。
同時培養したシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞の傍観者死滅が同時培養したシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞の細胞数に依存するか否かを評価するため、種々の数の９Ｌ−ＺＰ細胞（１０4から１０6細胞の範囲）をファルコン細胞インサートに入れ、１０5の親９Ｌ細胞とともに同時培養した。図３０Ｂは、底部培養チャンバ中の９Ｌ細胞に対するシクロホスファミドの細胞毒性（ｙ軸上に示す）が上部チャンバ中の９Ｌ−ＺＰ細胞の初期細胞数（ｘ軸）と正の相関関係を有することを示している。それゆえ、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／シクロホスファミドの場合には、傍観者死滅効果は少なくとも一部は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１により触媒された薬剤代謝により生成された可溶性の細胞毒性代謝産物のシトクロムＰ４５０非発現細胞への移動によるものである。それゆえ、この傍観者効果は、傍観者細胞毒性を生じるためには緊密な細胞−細胞接触が必要なＨＳＫ−ＴＫ／ガンシクロビル系のもの（フリーマンら、Ｃancer Ｒes.５３：５２７４−５２８３（１９９３）；ビーら、Ｈuman Ｇene Ｔherapy４：７２５−７３１（１９９３））とは区別されるものである。
インビボでの９Ｌ腫瘍のシクロホスファミド感受性に対するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現の効果：
上記に記載した研究は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現するように安定にトランスフェクションした９Ｌ神経膠肉腫細胞がシクロホスファミドおよびイホスファミドの細胞毒性に対して高度に感受性となることを確立するものである。本発明者らは、つぎに、これら細胞をエクスビボ遺伝子移動モデルとして用い、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／オキサザホスホリン系を癌遺伝子療法に使用することのインビボでの実行可能性を評価した。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現９Ｌ腫瘍のシクロホスファミド感受性に対するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性９Ｌ腫瘍のシクロホスファミド感受性を比較するためにインビボ腫瘍増殖遅延研究を行った。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞（９Ｌおよび９Ｌ−Ｚ）およびシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現細胞（９Ｌ−ＺＰおよびＬ４５０−２）を雌フィッシャー３４４ラットで固形腫瘍として皮下増殖させた。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現腫瘍をシクロホスファミド処理すると腫瘍増殖が完全に抑制された（表VIおよび図３１）。９Ｌ腫瘍はシクロホスファミド処理後に若干の増殖遅延を示したが、この抗腫瘍効果は短時間のものであり、最終的に攻撃的な腫瘍増殖が復帰した。この親９Ｌ腫瘍の一時的な増殖遅延は肝臓中に存在するシトクロムＰ４５０によるシクロホスファミドの活性化によるものであり、これは成体雌ラットの場合には主としてシトクロムＰ４５０形２Ｃ６によって触媒される（クラーク（Ｃlarke）およびワックスマン、Ｃancer Ｒes.４９：２３４４−５０（１９８９））。これらインビボ腫瘍モデル研究は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子の腫瘍内での発現、およびそれに伴うプロドラッグの腫瘍内活性化が末梢固形腫瘍をオキサザホスホリンのインビボ処理に対して高度に感受性にしうることを確立するものである。
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検討
公知の確立された癌化学療法剤を活性化する薬剤代謝性酵素の遺伝子を導入することによる腫瘍の化学療法剤感受性付与パラダイムとしてのシトクロムＰ４５０遺伝子移動の有用性を評価するためのモデルとしてラット９Ｌ神経膠肉腫細胞を用いた。９Ｌ細胞はラット脳腫瘍に由来するが（バーカーら、Ｃancer Ｒes.３３：９７６−９８６（１９７３））、培地で増殖させることができ、フィッシャー３４４ラットに皮下または頭蓋内のいずれかに移植することができる。９Ｌ細胞はシトクロムＰ４５０レダクターゼ（すべてのミクロソームシトクロムＰ４５０依存性酵素反応に必要な電子を伝達する）を発現するが、内生のＰ４５０酵素活性は殆どまたは全く含まず、このことが９Ｌ細胞をしてシトクロムＰ４５０遺伝子移動を含む実験のための受容細胞株として充分に適したものとしている。本研究の主要な目的は、（ａ）この腫瘍細胞株におけるシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１の発現がオキサザホスホリンに対して腫瘍細胞を感受性にするか否かを評価すること、（ｂ）近接するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１不含腫瘍細胞が「傍観者効果」によって薬剤感受性となるか否かを確立すること、および（ｃ）このインビトロでの化学療法剤感受性付与が、末梢腫瘍の場合に完全な肝臓系（腫瘍自体のものを大きく上回る速度にてオキサザホスホリン活性化を触媒する）の文脈においてインビボで治療学的利点となり得るか否かを確かめることにあった。オキサザホスホリンを活性化するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子の９Ｌ腫瘍細胞中への導入は、インビトロおよびインビボの両方において実際に該細胞をシクロホスファミドおよびイホスファミドに対して優先的に感受性とし、それゆえ癌療法に適用するのが有用であると思われる。
ＨＳＶ−ＴＫ／ガンシクロビル系のインビトロおよびインビボ研究は、ＨＳＶ−ＴＫ形質導入されガンシクロビル処理した細胞が該細胞に接触したＨＳＶ−ＴＫ未形質導入細胞を「傍観者死滅」させることを示している（ラムら、Ｃancer Ｒes.５３：８３−８８（１９９３）；カルバーら、Ｓcience２５６：１５５０−１５５２（１９９２）；フリーマンら、Ｃancer Ｒes.５３：５２７４−５２８３（１９９３）；ビーら、Ｈuman Ｇene Ｔherapy４：７２５−７３１（１９９３））。この傍観者死滅効果の正確なメカニズムの基礎は未だ不明であるが、活性化されたガンシクロビルの代謝産物または他の毒性物質が細胞−細胞接触により伝達されることが関与していると思われる。この傍観者効果は治療学的に極めて意義が大きいが、それは腫瘍細胞集団の亜集団のみが薬剤感受性遺伝子で有効に形質導入された場合でさえも原則として腫瘍を撲滅することが可能であることを示しているからである。
従って、シトクロムＰ４５０遺伝子移動が傍観者効果を伴うか否か、すなわちシトクロムＰ４５０発現腫瘍細胞がシクロホスファミドに対して近接腫瘍細胞を感受性にさせるか否かを決定するために実験を行った。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陽性細胞は酵素的に活性なシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を必要とするメカニズムによりシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞の傍観者死滅を付与することが観察された。９Ｌ−ＺＰ細胞から親９Ｌ細胞への化学療法剤に対する感受性の付与がこれら２つの細胞集団間での接触が妨げられた場合でさえも行われたことにより示されるように、この傍観者死滅効果には、少なくとも部分的に、細胞間での可溶性の細胞毒性代謝産物の移動が関与している。考えられるところでは、この観察された傍観者死滅には細胞−細胞接触メカニズムも同様に関与している。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１により生成した４−ヒドロキシシクロホスファミドは細胞膜を容易に拡散しうると思われ（スラデク（Ｓladek,Ｎ.Ｅ.）、Ｐharmacolo Ｔher.３７：３０１−３５５（１９８８））、この主要な代謝産物、またはおそらくその細胞毒性分解産物であるホスホラミドマスタードおよびアクロレインが隣接シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性細胞に対するシクロホスファミドの致死作用をもたらしていると思われる。死につつある９Ｌ−ＺＰ細胞から９Ｌ細胞へのアポトーシス（apoptotic）シグナルの伝達もまた何らかの役割を果たしているかもしれない。
シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／シクロホスファミド傍観者細胞毒性を達成するのに細胞−細胞接触を必要としないことは、活性化薬剤の腫瘍塊内での一層広範な分布をもたらすことにより、ＨＳＶ−ＴＫ／ガンシクロビル系に比べてシトクロムＰ４５０遺伝子療法の重要な治療学的利点である。さらに、細胞毒性が細胞周期のＤＮＡ合成期（Ｓ相）にある細胞に限られる活性化代謝産物を生成するＨＳＶ−ＴＫ／ガンシクロビルとは異なり、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／オキサザホスホリン系では細胞周期に依存しない仕方で腫瘍細胞を有効に死滅させる代謝産物を生成する。それゆえ、腫瘍細胞に対するホスホラミドマスタード由来の鎖間ＤＮＡ架橋の毒性は腫瘍細胞が増殖を開始するあらゆる時点で明白となり、その結果、一層高いフラクションの腫瘍細胞が死滅することになる。
シトクロムＰ４５０ベースの癌遺伝子療法の他の可能な利点は、全身的なプロドラッグ活性化に関与する肝臓シトクロムＰ４５０酵素の選択的な阻害とあいまって、シトクロムＰ４５０遺伝子移動により、薬剤の局所的抗腫瘍作用が増大する可能性があることである。ヒト肝臓におけるオキサザホスホリン活性化のシトクロムＰ４５０触媒（チャング（Ｃhang）ら、Ｃancer Ｒes.５３：５６２９−５６３７（１９９３））はラットシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１とは生化学的に異なるので、適当なシトクロムＰ４５０イソ形に選択的な阻害剤を用いることによって肝臓シトクロムＰ４５０を阻害することが可能である（チャングら、Ｃancer Ｒes.５３：５６２９−５６３７（１９９３）；グエンゲリッチ（Ｇuengerich）ら、Ｃhem.Ｒes.Ｔoxicol.４：３９１−４０７（１９９１）；チャングら、Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophy.３１１：４３７−４４２（１９９４））。このことは、活性化代謝産物に肝臓シトクロムＰ４５０を介して全身的にさらされることからくる宿主組織の毒性（従来の化学療法では必ず生じる）を最小にすることにより、有意な治療学的利点を提供するものである。
一つの重要な知見は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１／シクロホスファミドが末梢部に増殖する固形腫瘍の場合にインビボでの化学療法的可能性に関して非常に有効であり、それゆえ癌遺伝子療法の標的としてさらなる前臨床開発のための優れた候補であることである。シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１の腫瘍内発現によりもたらされる衝撃的な治療学的利点（図３１および表VI）は幾つかの理由で驚くべきことであり、本願出願中いたるところで引用した脳腫瘍遺伝子療法研究の知見からは予測しえなかったことである。
第一に、シクロホスファミド代謝において活性な内生のシトクロムＰ４５０酵素はすでに肝臓組織において高レベルで発現されている。さらに、腫瘍移植の７日後というシクロホスファミド治療の時点では、本研究の９Ｌ腫瘍はやっと触診しうる程度であり、それゆえ肝臓に比べるとサイズが小さかった。加えて、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１トランスフェクションした腫瘍細胞中のシトクロムＰ４５０タンパク質の特定含量は肝臓に比べて低い（図２５参照）。それゆえ、９Ｌ−ＺＰおよびＬ４５０−２腫瘍を有するラットで循環している活性化シクロホスファミドの大部分は疑いもなく腫瘍由来ではなく肝臓由来である。にもかかわらず、シクロホスファミド処置後の完全な腫瘍寛解がこれら９Ｌ／シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１腫瘍の両者において観察されたが、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１陰性の９Ｌおよび９Ｌ−Ｚ腫瘍では観察されなかった。このことは、腫瘍内シクロホスファミド活性化の場合には非常に実質的な「近接効果」が存在するかもしれないことを示している。このことは、主要な代謝産物である４−ヒドロキシシクロホスファミド／アルドホスファミドあるいはおそらくその血漿タンパク質安定化スルフヒドロ付加物（ホホースト（Ｈohorst）ら、Ａdv.Ｅnzyme Ｒegul.２５：９９−１２２（１９８６））が、以前の研究（スラデク、Ｐharmacolo Ｔher.３７：３０１−３５５（１９８８）；ホング（Ｈong）ら、Ｄrug Ｍetab.Ｄispos.１９：１−７（１９９１））に基づいて予想されるよりも腫瘍脈管構造に接近しにくいか、または肝臓で生成したときに細胞膜透過性が一層低いことを示しているかもしれない。さらに考えられることは、４−ヒドロキシシクロホスファミドの本来の半減期が短いため［ｔ1/2＝ラットおよびヒトでそれぞれ５.２分および３.３分；上掲文献］、この主要な代謝産物が肝臓での生成部位から腫瘍に到達する前にかなり分解されてしまうのかもしれない。それゆえ、これらラットにおいて肝臓の方が本来的に代謝能がはるかに高いにもかかわらず、アルキル化代謝産物の有効な腫瘍内濃度はシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１非発現性の９Ｌ腫瘍の場合に比べてシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現性の９Ｌ腫瘍の場合の方が実質的に高いのかもしれない。
別の可能性としては、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現性９Ｌ腫瘍に対するシクロホスファミドの実質的に促進された細胞毒性が、タンパク質アルキル化代謝産物であるアクロレインによるホスホラミドマスタード、主要なＤＮＡアルキル化代謝産物に対して腫瘍細胞が感受性になる結果であることが挙げられる。４−ヒドロキシシクロホスファミド／アルドホスファミドから化学的分解によって生じるアクロレインはホスホラミドマスタードと等量で生成し、シクロホスファミド処置後の血清テストステロンレベルの枯渇や肝臓シトクロムＰ４５０およびステロイド代謝性酵素プロフィルの変調によって示されるように（チャングおよびワックスマン、Ｃancer Ｒes.５３：２４９０−２４９７（１９９３））、シクロホスファミドに付随する心臓毒性（フリードマン（Ｆriedman）ら、Ｃancer Ｒes.５０：２４５５−２４６２（１９９０））やシクロホスファミドが有しうる内分泌毒性に貢献する重要な因子である。肝臓のシクロホスファミド活性化から生じるアクロレインは親薬剤の抗腫瘍活性を媒体はしないが（スラデク（１９８８）、上掲文献）、本発明者らのシトクロムＰ４５０遺伝子移動／腫瘍内シクロホスファミド活性化モデルにおいては、生成したアクロレインがおそらくグルタチオン枯渇メカニズムによってホスホラミドマスタードの細胞毒性作用を局所的に高めることが考えられる（フリードマンら、Ｃancer Ｒes.５０：２４５５−２４６２（１９９０）；ガートゥー（Ｇurtoo）ら、Ｃancer Ｒes.４１：３５８４−３５９１（１９８１）参照）。
結論として、本実施例は、オキサザホスホリンを活性化するシトクロムＰ４５０遺伝子を末梢腫瘍細胞中に導入することの治療学的有用性を示すものである。これら研究は、腫瘍細胞集団の亜集団のみが薬剤活性化シトクロムＰ４５０遺伝子で有効にトランスフェクションされた場合であっても末梢腫瘍細胞の死滅が効率的な仕方で進行しうることを示す。それゆえ、シクロホスファミドまたはイホスファミド並びにＮ,Ｎ’,Ｎ”−トリエチレンチオホスホラミド（チオ−ＴＥＰＡ）、プロカルバジン、ダカルバジンおよびこのシトクロムＰ４５０遺伝子や他のシトクロムＰ４５０遺伝子により活性化される他の抗腫瘍剤（ルブランク（ＬeＢlanc）およびワックスマン、Ｄrug Ｍetab.Ｒev.２０：３９５−４３９（１９８９）；ング（Ｎg）およびワックスマン、Ｉnternational Ｊournal of Ｏncology２：７３１−７３８（１９９３）；ングおよびワックスマン、Ｃancer Ｒes.５１：２３４０−２３４５（１９９１）；ングおよびワックスマン、Ｃancer Ｒesearch ５０：４６４−４７１（１９９０））をシトクロムＰ４５０遺伝子移動と組み合わせた場合には、これら薬剤の末梢腫瘍に対する治療学的活性の実質的な改善が期待される。このことは、ウイルスベクターや腫瘍特異的なプロモーターＤＮＡ配列の使用を含む他の新規な遺伝子移動法を用いることによって達成しうるシトクロムＰ４５０遺伝子移動の効率が腫瘍細胞における遺伝子形質導入に関して１００％未満である場合であっても予想される。それゆえ、本発明の有用性には、これら薬剤の使用に際して従来付随していた全身的な毒性を最小にしながら、抗癌剤の特異性および選択性を高めることによって一層最適な薬剤効能を達成することが含まれる。
最後に、本発明において展開した化学療法剤／遺伝子療法の概念および戦略は、おそらく、他の確立された癌化学療法剤（ルブランクおよびワックスマン、Ｄrug Ｍetab.Ｒev.２０：３９５−４３９（１９８９）；ングおよびワックスマン、Ｉnternational Ｊournal of Ｏncology２：７３１−７３８（１９９３）；ングおよびワックスマン、Ｃancer Ｒes.５１：２３４０−２３４５（１９９１）；ングおよびワックスマン、Ｃancer Ｒesearch ５０：４６４−４７１（１９９０））や他のシトクロムＰ４５０遺伝子（ネルソンら、ＤＮＡ Ｃell Ｂiol.１２：１−５１（１９９３））に対しても拡張しうる。
実施例８
ラット９Ｌ神経膠肉腫細胞の場合にシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子発現によって付与されるシクロホスファミドに対する感受性が他の腫瘍細胞型においても治療学的活性の増大となるか否かを決定するため、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を安定に発現するＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株のパネルを調製し、ついでヌードマウスモデルを用いてインビトロおよびインビボの両方においてシクロホスファミドに対する感受性を評価した。
方法
ＭＣＦ−７は、閉経後の未経産婦人の胸膜産出液から開始したヒト乳癌細胞株である。このヒト腫瘍細胞株は細胞培養およびヌードマウス中（固形腫瘍として増殖する）の両方で増殖および継代することができる。これはヒト乳癌のために広く研究されたモデルであり、当業者にはよく知られている（スール（Ｓoule）ら、Ｊ.Ｎatl.Ｃancer Ｉnst.５１：１４０９−１４１３（１９７３））。
ＭＣＦ−７細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００単位のペニシリン／ｍＬ、１００μｇのストレプトマイシン／ｍＬ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０.２５単位のインスリン／ｍＬを含むダルベッコ変性イーグル培地中で単層として増殖させた。
シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現プラスミドによるＭＣＦ−７細胞のトランスフェクション、ネオマイシン耐性クローンの選択、発現されたシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１タンパク質の特徴付け、および薬剤に対する細胞株の感受性を、９ＬシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現細胞株についての実施例７の記載と同様にして行った。
雌ホモ接合（nu+＼nu+）ヌード無胸腺スイスマウス（スールら、Ｃancer Ｌetters１０：１７７−１８９（１９８０））（２０−２５ｇ）をタコニック（Ｔaconic Ｉnc.）（ジャーマンタウン、ニューヨーク）から得た。
ＭＣＦ−７細胞またはシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１もしくは大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を発現する安定なＭＣＦ−７細胞形質転換体を細胞培養にて増殖させた。対数期にある細胞を回収し、ついでヌードマウスの脇腹に皮下注射した（０.２ｍＬ中に１×１０7細胞）。腫瘍を接種する１日前に単一の１７β−エストラジオールペレット（１.７ｍｇホルモン／６０日放出ペレット、イノバティブ・リサーチ（Ｉnnovative Ｒesearch）、トレド、オハイオ）を移植した。腫瘍接種の１カ月後、ノギスを使って各腫瘍のサイズを測定した。
ついで、ヌードマウスに０日目および２日目に再び腹腔内注射により１００ｍｇ／ｋｇ体重×２にてシクロホスファミド処理した。ついで、再びノギスを用いて腫瘍サイズの測定を行い、最初のシクロホスファミド（ＣＰＡ）注射の０日目からの腫瘍サイズの比としてデータを表してある。
結果
図３２は、親のＭＣＦ−７細胞および細菌酵素β−ガラクトシダーゼを発現するＭＣＦ−７トランスフェクション対照細胞株ＭＣＦ−７−Ｚ３がともに高濃度のシクロホスファミドに対して非感受性であることを示している。対照的に、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１を発現する６つの個々のＭＣＦ−７細胞株（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ８、Ｐ９およびＰ２６と称する）は、それぞれシクロホスファミド細胞毒性に対して高度に感受性であった。さらに、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１発現性のＭＣＦ−７細胞をヌードマウス腫瘍モデルにおいて皮下でインビボ増殖させたところ、Ｐ４５０発現細胞はシクロホスファミド処理の後に優先的に死滅した。
図３３は、４つのＰ４５０発現性ＭＣＦ−７腫瘍（Ｐ３、Ｐ２、Ｐ９およびＰ２６と称する）で得られたインビボ腫瘍細胞死滅を、親ＭＣＦ−７腫瘍のものとは区別できない穏やかなシクロホスファミド感受性のみを示した対照の腫瘍ＭＣＦ−７Ｚ３のインビボ腫瘍細胞死滅と比較したものである。
検討
これら実験は、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１遺伝子移動の治療学的利点が９ＬまたはＣ６モデル系に限られるものではなく、非中枢神経系由来の他の腫瘍においても観察されることを確立するものである。さらに、この実施例における結果は、シトクロムＰ４５０／ＣＰＡ癌療法パラダイムを用いて観察される細胞毒性効果が齧歯類の腫瘍で観察されるのみならずインビボで増殖したヒト腫瘍においても観察されるものであることを示している。最後に、これら実験はまた、シトクロムＰ４５０／ＣＰＡ系が中枢神経系腫瘍のみならず末梢腫瘍または末梢転移腫瘍に対しても癌遺伝子療法に使用できることを示している。
医学、分子生物学、免疫学、ハイブリドーマ法、薬学および／または関連分野における当業者に明らかな本発明を行うに際しての上記態様の変更は下記請求の範囲内に包含されることを意図するものである。
本明細書中に引用したすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願がそれぞれ詳細にかつ個別に参照のために引用されるのと同じ程度に本明細書中に参照のために引用される。
上記発明を理解されやすくするために説明および実施例により若干詳細に記載したが、添付の請求の範囲の範囲内である種の改変ないし変更を行うことができることが明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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