(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）全血試料と界面活性剤とを混合して混合物を得、
（ｂ）該混合物を、該全血試料中の白血球を溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させるのに十分な時間放置し、
（ｃ）該混合物中の放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を測定し、そして
（ｄ）該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度から該全血試料中の白血球数を定量する、
ことを包含する全血試料の白血球数の定量方法。
【請求項２】
上記工程（ｃ）において、該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を測定する際に、更に全血試料に含まれるＣ反応性蛋白濃度も測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記工程（ｃ）において、該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を、免疫学的手法を用いて測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記工程（ｃ）において、該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度と該Ｃ反応性蛋白濃度を、免疫学的手法を用いて測定することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該免疫学的手法が酵素免疫測定法であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
該免疫学的手法が光学的イムノアッセイ法であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
該界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
該非イオン性界面活性剤の親水性・親脂性バランス（ＨＬＢ）値が１２〜１４であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該非イオン性界面活性剤が、飽和または不飽和炭化水素が結合したポリエチレンオキシド化合物であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
該非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル骨格を有する非イオン性界面活性剤、不飽和脂肪族炭化水素が結合したポリエチレンオキシド化合物である非イオン性界面活性剤、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル骨格を有する非イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１つの非イオン性界面活性剤であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該非イオン性界面活性剤が、TritonTM X-114、TritonTM X-100、IgepalTM CA630、Nissan Nonion NS-208.5、Nissan Dispanol TOC、BrijTM 97、及び BrijTM 56からなる群より選ばれる少なくとも１つの非イオン性界面活性剤であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該界面活性剤が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムブロミド、１−ラウリルピリジニウムクロリド、及びテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドからなる群より選ばれる少なくとも１つの陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項１３】
該全血試料と混合する該界面活性剤の量が、該混合物中の濃度として０．２〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記工程（ｂ）において、該混合物を放置する時間が１時間以内であることを特徴とする、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
該白血球数が好中球数であることを特徴とする、請求項１〜１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全血試料に含まれる白血球数の定量方法に関する。更に詳細には、全血試料と界面活性剤とを混合して混合物を得、該混合物を、該全血試料中の白血球を溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させるのに十分な時間放置し、該混合物中の放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を測定し、該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度から該全血試料中の白血球数を定量することを包含する全血試料の白血球数の定量方法に関する。本発明の白血球数の定量方法を用いると、全血中の血液細胞を分離する必要がなく、容易且つ迅速に全血試料中の白血球数及び／又は好中球数を定量することが可能となる。又、本発明の定量方法を用いると、全血試料の白血球数と共に、全血試料に含まれるＣ反応性蛋白濃度も同じ試料を用いて定量することができるので、感染症の有無や炎症の重傷度を迅速、簡便かつ安価に診断することが可能になる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、患者の初期診断において細菌感染症か否かを判断する検査項目として、白血球数とＣ反応性蛋白（C-reactive protein； 以下、屡々“ＣＲＰ”と略す）の定量が行われている。その際、医師が抗生物質の投与など適切な処置ができるように、迅速、簡便かつ低コストでそれらの結果が得られる定量手法が望まれている。
【０００３】
通常、白血球数の計測には、電気抵抗法を原理とする、COULTER COUNTERTM（米国、COULTER ELECTRONICS, INC.社製）に代表される市販の自動血球計測装置が用いられている。しかしながら、このような装置では、血漿蛋白であるＣＲＰを定量することはできない。
【０００４】
最近では、山尾泰生、奥成博、Henri CHAMPEIX： Readout、 16、 11-15 (1998)に記載されているような、電気抵抗法を原理とする血球計測装置にラテックス免疫比濁rate法によるＣＲＰ測定機能を加えた、白血球数とＣＲＰを共に定量するための装置が市販されている。しかしながら、このような装置においては、白血球以外の血球成分である赤血球を溶血させた後に白血球数を電気抵抗法により計測し、更にＣＲＰの測定に際しては、溶血した検体と、抗ＣＲＰ抗体を結合させたラテックスビーズとを一定時間反応させた後、ラテックス免疫比濁rate法によってＣＲＰを計測する。従って、白血球数の定量とＣＲＰの定量は原理が異なるため、それぞれ異なった操作を行わなければならない。このように従来の方法は非常に煩雑な操作を必要とし、さらに、定量のための試薬類が多くなるのでコストがかさむという欠点がある。又、装置のメンテナンスにも多大な時間とコストが必要である。これらの欠点が障害となり、開業医等の初期診療を担う一般病院においては、自動血球計測装置はいまだほとんどの施設において導入されておらず、医療のニーズを満たしていないのが現状である。
【０００３】
上記の問題点を解決する手段として、白血球数とＣＲＰを同じ原理に基づいて定量する方法が考えられる。具体的には、１つの試料でＣＲＰと共に白血球数を免疫学的手法によって計測する方法が考えられる。免疫学的に白血球数を計測するためには、白血球に特異的に存在する蛋白質を測定すればよい。
【０００５】
一般的に細菌感染症や炎症を起こした場合には、白血球成分の中で存在比率が最も大きい好中球の数が増大することが知られている。従って、好中球数を定量すれば、白血球数の増減を知ることができ、細菌感染症の有無や、炎症の重傷度を判定することが可能となる。
【０００６】
炎症を起こした組織部位の好中球数あるいは全血中の白血球数や顆粒球数を定量する方法としては、例えば、Peter P. Bradley, Dennis A. Priebat, Robert D. Christensen and Gerald Rothstein: J. Invest. Dermatol., 78, 206-209 (1982)に記載の方法が挙げられる。この方法では、予めFicoll試薬を用いて全血から分離した好中球や、炎症を起こした皮膚組織を０．５％のHexadecyltrimethylammonium bromide（ＨＴＡＢ）を含む５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー溶液（ｐＨ６．０）でホモジナイズし、超音波処理後、抽出したミエロペルオキシダーゼの酵素活性を測定している。
【０００７】
又、Rita Cramer, Maria Rosa Soranzo, Pietro Dri, Renzo Menegazzi, Anna Pitotti, Giuliano Zabucchi and Pierluigi Patriarca: Journal of immunological Methods, 70, 119-125 (1984)の方法では、抗凝固剤であるＡＣＤ（acid citrate dextrose）溶液を含む血液にデキストラン（MW 200,000）溶液を加えて赤血球を除去し、次いでFicoll試薬を用いて顆粒球を遠心分離する。次に２×１０4個の顆粒球を１３ｍＭ guaiacolと０．０２％ cetyltrimethylammonium bromideを含む０．１Ｍリン酸バッファー溶液（ｐＨ７．０）とを混合した後、そこに１μｍｏｌのＨ2Ｏ2を加えてペルオキシダーゼ活性を測定している。
【０００８】
W. M. Kuebler, C. Abels, L. Schuerer and A. E. Goetz: Int. J. Microcirc., 16, 89-97(1996)においては、予めFicoll試薬を用いて全血から分離した多核白血球を０．５％ＨＴＡＢを含む５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー溶液（ｐＨ６．０）を用いて溶解（lyse）し、そこに含まれるミエロペルオキシダーゼの酵素活性を測定している。更に、この文献においては、ラット脳やウサギ肺組織を、氷冷した１ｍｌの０．０２Ｍリン酸カリウムバッファー溶液（ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、更に１ｍｌの０．０２Ｍリン酸カリウムバッファー溶液（ｐＨ７．４）を加えて４℃、２０００ｒｐｍで１５分間の遠心操作を行い、得られた上清に含まれるミエロペルオキシダーゼの酵素活性を測定している。また、遠心分離の残さについては、６０℃で２時間インキュベートし、続いて０．５％のＨＴＡＢを含む５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー溶液（ｐＨ６．０）でホモジナイズし、超音波処理後、４℃、２００００ｒｐｍで１５分間の遠心処理を行ない、得られた上清に含まれるミエロペルオキシダーゼの酵素活性を測定している。
【０００９】
国際出願公開ＷＯ９３／０１３０６号公報に記載の方法においては、一定量の血液をシリンジ内にセットされたガラスフィルター（glass microfiber filter）の上にのせ、顆粒球計測を阻害する成分を予め除去するために、血液中の顆粒球を破壊しないように水を加えて赤血球を溶血し、次にサンプル血液内の溶血成分を吸引洗浄（pressure wash）する。その後、溶解されなかった顆粒球を含むガラスフィルターを乾燥し、０．００５％ TritonTM X-100、３０ｍＭ 3-amino-1,2,4 triazole、０．０００５％ Ｈ2Ｏ2及び０．５ｍｇ／ｍｌ o-tolidineを含む５０ｍＭリン酸バッファー溶液をガラスフィルターに滴下し、顆粒球から溶出したミエロペルオキシダーゼの作用によって青色に染色したスポットを顆粒球として計測する。
【００１０】
特開平８−３０８５９３号公報（ＥＰ７４３５１９号公報及び米国特許第５６３９６３０号公報に対応）に記載の方法においては、全血中の赤血球を溶血してヘモグロビンを溶出させるが、白血球細胞は破壊しない濃度の非イオン性のpolyethoxylate界面活性剤、アニオン性イオン性界面活性剤、又は両性イオン性界面活性剤と、白血球細胞を化学的に架橋するが赤血球は架橋しない濃度のホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒドと、リンパ球の検出を増強するための糖又は糖アルコールと、反応液のｐＨを約ｐＨ６．８〜８．０の中性もしくは中性付近にするためのバッファー溶液とからなる溶液を全血と混合する。その後、得られた混合溶液を約６０〜７５℃に暖めて赤血球を溶血し、且つ白血球を架橋させる。白血球の一部について、内在するペルオキシダーゼ活性に基づく染色を施し、吸光度や光散乱法を用いて電気光学的に白血球の異なる細胞種を計測する。
【００１１】
しかしながら、これらの方法には次のような問題がある。皮膚、脳、肺組織に存在する好中球からミエロペルオキシダーゼを十分溶出させて酵素活性を測定するため、ＨＴＡＢ存在下でのホモジナイズ処理や遠心処理操作などの極めて煩雑な操作と時間が必要である。更に、全血中の白血球数を計測するためには、ミエロペルオキシダーゼの測定を妨害する物質を除去するために予め白血球をFicoll試薬等を用い全血から分離する操作が必要である。従って、この方法においては、測定阻害物質の除去操作や、白血球を固定化するための反応などが必要なため、操作が煩雑となり、多くの試薬類や専用の装置も用意しなければならない。
【００１２】
又、後藤明子、内田壱夫、富田仁：臨床検査、４０、８５９−８６３（１９９６）や、特開平８−１４５９９３号公報、特開平９−７２９０６号公報、特開平９−１９６９１９号公報及び特開平１１−３２７９３号公報には、尿路感染症の患者の尿検体中に漏洩した白血球数を定量する方法が開示されている。具体的には、尿検体を０．０５％ TritonTM X-100にて処理し、尿検体中に漏洩した白血球（９５％が好中球）から溶出したミエロペルオキシダーゼの量を酵素免疫的に測定する方法が開示されている。
【００１３】
尿検体は全血と比較して極めて細胞成分が少ないため、そこに含まれるミエロペルオキシダーゼの測定を妨害する物質の量は少ない。従って、上記の方法においては、尿検体をTritonTM X-100で処理するだけで尿中の好中球に内在するミエロペルオキシダーゼを測定しているが、全血は白血球以外の細胞成分であるところの赤血球、血小板および血漿蛋白が混合した極めて濃厚かつ不均質な生体成分の混在した系であり、尿検体に適した方法を全血にも応用できるとは考えられなかった。
【００１４】
また、全血を溶解処理に付し、全血中に存在する好中球からデフェンシン（defensin）というペプチドを溶出させて定量し、デフェンシンと白血球数や好中球数との相関を調べた報告もある（Toshihiko Ihi, Masamitsu Nakazato, Hiroshi Mukae and Shigeru Matsukura： Clinical Infection Diseases, 25, 1134-1140 (1997)を参照）。しかし、ここで用いられる方法では、全血を１Ｍ酢酸に加えてpolytron homogenizerでホモジナイズし、次に２０００×ｇ、４℃で３０分間遠心処理に付してペプチドを抽出するという煩雑な操作が必要である。従って、この方法は、医療現場において迅速かつ簡便に白血球数を定量するための血液検体処理法としては全く使用することができない。
【００１５】
上記したように、従来の方法においては、白血球成分由来物質を免疫学的に測定するためには、全血中から白血球成分を分離するための操作、白血球成分を十分に溶出させるための極めて過激な溶解処理条件、長時間の処理操作などの多量の操作と煩雑な操作手順が必要である。更に、測定値と実際の白血球数との相関が必ずしも良くないという欠点がある。
【００１６】
又、本願の基礎出願の出願後に公開された国際出願公開ＷＯ９９／４６５９９号公報（特開平１１−２５８２３１号公報に対応）には、界面活性剤を使用して全血試料中の顆粒球内部のエラスターゼを放出させ、次に、エラスターゼのインヒビターであるα1-アンチトリプシンインヒビターを用いた免疫測定によって、放出されたエラスターゼを測定し、白血球数を定量するという方法が開示されている。しかしながら、この発明においても、顆粒球エラスターゼを測定するためにα1-アンチトリプシンインヒビターを加えるという操作が必要なため、操作性及び経済性の面で欠点がある。また、顆粒球エラスターゼと白血球数との相関性は良好であるものの、白血球数が１０、０００個／μｌ以上の試料、即ち、非健常人から得た全血試料についての測定結果はない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、従来用いられている方法では、全血から白血球成分を分離することなしに、迅速、簡便かつ効率よく白血球に内在する物質を免疫学的に測定し、白血球数を正確に定量することはできない。又、白血球数と共にＣＲＰを迅速、且つ、簡便に定量することもできない。
【００１８】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、驚くべきことに、全血試料と界面活性剤とを混合して効率よく白血球を溶解し、白血球から内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させて測定したミエロペルオキシダーゼ濃度は、従来の電気抵抗法による白血球計測の値と極めて良好な相関性を示すことを知見し、ミエロペルオキシダーゼ濃度から白血球数を定量できることを見出した。更に、ミエロペルオキシダーゼ濃度の測定を行なうと共に、全血試料に含まれるＣ反応性蛋白の濃度も定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
従って、本発明は、迅速、簡便かつ安価に全血試料中の白血球数を定量する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の上記及びその他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、添付の図面を参照しながら行う以下の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
【００２１】
本発明によれば、（ａ）全血試料と界面活性剤とを混合して混合物を得、
（ｂ）該混合物を、該全血試料中の白血球を溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させるのに十分な時間放置し、
（ｃ）該混合物中の放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を測定し、そして
（ｄ）該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度から該全血試料中の白血球数を定量する、
ことを包含する全血試料の白血球数の定量方法が提供される。
【００２２】
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
【００２３】
１．（ａ）全血試料と界面活性剤とを混合して混合物を得、
（ｂ）該混合物を、該全血試料中の白血球を溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させるのに十分な時間放置し、
（ｃ）該混合物中の放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を測定し、そして
（ｄ）該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度から該全血試料中の白血球数を定量する、
ことを包含する全血試料の白血球数の定量方法。
【００２４】
２．上記工程（ｃ）において、該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を測定する際に、更に全血試料に含まれるＣ反応性蛋白濃度も測定することを特徴とする、前項１に記載の方法。
【００２５】
３．上記工程（ｃ）において、該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を、免疫学的手法を用いて測定することを特徴とする、前項１に記載の方法。
【００２６】
４．上記工程（ｃ）において、該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度と該Ｃ反応性蛋白濃度を、免疫学的手法を用いて測定することを特徴とする、前項２に記載の方法。
【００２７】
５．該免疫学的手法が酵素免疫測定法であることを特徴とする、前項３又は４に記載の方法。
【００２８】
６．該免疫学的手法が光学的イムノアッセイ法であることを特徴とする、前項３又は４に記載の方法。
【００２９】
７．該界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であることを特徴とする前項１〜６に記載の方法。
【００３０】
８．該非イオン性界面活性剤の親水性・親脂性バランス（ＨＬＢ）値が１２〜１４であることを特徴とする、前項７に記載の方法。
【００３１】
９．該非イオン性界面活性剤が、飽和または不飽和炭化水素が結合したポリエチレンオキシド化合物であることを特徴とする、前項７に記載の方法。
【００３２】
１０．該非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル骨格を有する非イオン性界面活性剤、不飽和脂肪族炭化水素が結合したポリエチレンオキシド化合物である非イオン性界面活性剤、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル骨格を有する非イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１つの非イオン性界面活性剤であることを特徴とする、前項９に記載の方法。
【００３３】
１１．該非イオン性界面活性剤が、TritonTM X-114、TritonTM X-100、IgepalTM CA630、Nissan Nonion NS-208.5、Nissan Dispanol TOC、BrijTM 97、及び BrijTM 56からなる群より選ばれる少なくとも１つの非イオン性界面活性剤であることを特徴とする、前項１０に記載の方法。
【００３４】
１２．該界面活性剤が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムブロミド、１−ラウリルピリジニウムクロリド、及びテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドからなる群より選ばれる少なくとも１つの陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする、前項１〜６に記載の方法。
【００３５】
１３．該全血試料と混合する該界面活性剤の量が、該混合物中の濃度として０．２〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内であることを特徴とする、前項１〜１２に記載の方法。
【００３６】
１４．上記工程（ｂ）において、該混合物を放置する時間が１時間以内であることを特徴とする、前項１〜１３に記載の方法。
【００３７】
１５．該白血球数が好中球数であることを特徴とする、前項１〜１４に記載の方法。
【００３８】
本発明において「全血」とは、赤血球、白血球、血小板、血漿などの全ての血液成分を含んだ血液を意味し、「白血球」とは、好中球、単球、好塩基球、好酸球、リンパ球を意味する。また、「白血球の溶解」とは、白血球の細胞膜を破壊し、細胞内容物を細胞外に溶出させることを意味する。
【００３９】
初めに、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明に包含される技術的特徴について説明する。
【００４０】
好中球に存在する物質としては、Borregaard, N. et al.
“Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocytes”： Blood, 89, 3503-3251(1997)に記載の如く、アズール（一次）顆粒、特殊（ニ次）顆粒、ゼラチナーゼ（三次）顆粒、及び分泌小胞に存在する物質が挙げられる。
【００４１】
具体的には、アズール（一次）顆粒中に存在する物質としては、ＣＤ６３、ＣＤ６８、Ｖ型Ｈ+ＡＴＰアーゼ、酸性β−グリセロホスファターゼ、酸性ムコ多糖、α1−アンチトリプシン、α1−マンノーシダーゼ、アズロサイジン／ＣＡＰ３７／ヘパリン結合蛋白、殺菌性／膜透過性亢進蛋白（ＢＰＩ）、β−グリセロホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、カテプシン、デフェンシン、好中球エラスターゼ、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、プロテイナーゼ、シアリダーゼ、ユビキチン蛋白等が挙げられる。
【００４２】
特殊（二次）顆粒に存在する物質としては、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５抗原、ＣＤ６６、ＣＤ６７、シトクロムｂ558、ｆＭＬＰレセプター、フィブロネクチンレセプター、Ｇ蛋白質αサブユニット、ラミニンレセプター、ＮＢ−１抗原、１９−ｋＤ蛋白質、１５５−ｋＤ蛋白質、Ｒａｐ１、Ｒａｐ２、ＳＣＡＭＰ、トロンボスポンディンレセプター、ＴＮＦレセプター、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプター、ＶＡＭＰ−２、ビトロネクチンレセプター、β2−ミクログロブリン、コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、ｈＣＡＰ−１８、ヒスタミナーゼ、ヘパリナーゼ、ラクトフェリン、リゾチーム、ＮＧＡＬ、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプターシアリダーゼ、ＳＧＰ２８、ビタミンＢ12結合蛋白質等が挙げられる。
【００４３】
ゼラチナーゼ（三次）顆粒に存在する物質としては、ＣＤ１１ｂ、シトクロムｂ558、ジアシルグリセロール−脱アシル酵素、ｆＭＬＰレセプター、ＳＣＡＭＰ、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプター、ＶＡＭＰ−２、Ｖ型Ｈ+ＡＴＰアーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、β2−ミクログロブリン、ゲラチナーゼ、リゾチーム等が挙げられる。
【００４４】
分泌小胞に存在する物質としては、アルカリホスファターゼ、補体レセプター、シトクロムｂ558、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ｆＭＬＰレセプター、ＳＣＡＭＰ、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプター、ＶＡＭＰ−２、Ｖ型Ｈ+ＡＴＰアーゼ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４５、Ｃ１ｑレセプター、ＤＡＦ（補体崩壊促進因子）、血漿蛋白（テトラネクチン含む）等が挙げられる。
【００４５】
本発明者らは、白血球数の定量を目的として測定する物質は、全血を界面活性剤で処理した際に酵素免疫的に測定しうる十分な量が溶出される物質であり、且つ、感染症以外の原疾患によってその存在量が大きく変化しないものが好ましいと考えた。このような観点から検討した結果、アズール（一次）顆粒や特殊（二次）顆粒中に存在する物質が望ましく、その中でも特にミエロペルオキシダーゼ（以下、屡々、“ＭＰＯ”と略す）、好中球エラスターゼ（以下、屡々、“ＥＬＴ”と略す）及びラクトフェリン（以下、屡々、“ＬＴＦ”と略す）が好ましいと考えた。
【００４６】
本発明者らが、白血球数が１０、０００個／μｌ未満の健常人（健常人群）の全血と、白血球数が１０、０００個／μｌ以上の非健常人の全血（非健常人群）について、ＭＰＯ、ＥＬＴ、ＬＴＦのそれぞれの濃度と白血球数との相関関係を調べた結果、健常人群においては、ＭＰＯと白血球数との相関係数は、Ｒ＝０．９３３６と極めて高く、ＬＴＦやＥＬＴと白血球数との相関係数よりも高いことが判明した。従って、健常人群において白血球数を正確に定量するためには、ＭＰＯの測定が最も正確であることを見出した。
【００４７】
更に、非健常人群においてもＭＰＯ、ＬＴＦ及びＥＬＴのそれぞれの濃度について、白血球数との相関をあらわす回帰式の傾きを比較した。その結果、ＭＰＯと白血球数の相関を示す回帰式の傾きは０．００１９であり、健常人群における回帰式の傾き（０．００２１）とそれほど大きな変化はなかった。一方、非健常人群におけるＬＴＦと白血球数との相関を示す回帰式の傾きは０．０００７であるのに対し、健常人における回帰式の傾きは０．００１６であり、非健常人群における傾きは約２．３倍程度低下していることが判明した。また、非健常人群におけるＥＬＴと白血球数との相関を示す回帰式の傾きは０．００３１であるのに対し、健常人群における回帰式の傾きは０．００１７であり、非健常人群における傾きは約１．８倍程度上昇していた。さらに、急性膵炎患者の場合には、ＥＬＴの測定値はＭＰＯやＬＴＦと比べて極端に高い値を示し、ＥＬＴ濃度と白血球数の相関を表す回帰直線から大きくはずれていた。このような結果の理由は不明であるが、何らかの原因によって白血球数が１０、０００個／μｌ以上になるような疾患の場合に、白血球に内在するＭＰＯの量に大きな変化はないものの、内因性ＬＴＦの量は減少し、内因性ＥＬＴの量は増大する傾向が認められた。
【００４８】
正確な白血球数を得るためには、回帰式の傾きが、白血球数が１０、０００個／μｌ未満の健常人血液であろうと、白血球数が１０、０００個／μｌ以上の非健常人血液であろうと変化しないことが重要である。従って、上記の測定値を考慮した結果、白血球数を正確に定量するためには、全血試料中のミエロペルオキシダーゼを測定することが最も適切であると結論された。
【００４９】
以上のような鋭意研究の結果、本発明者らは、ミエロペルオキシダーゼの量が白血球数の指標として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【００５０】
本発明は、全血試料と界面活性剤とを混合して白血球を溶解し、放出した内因性のミエロペルオキシダーゼの濃度を測定することを包含する白血球数の定量方法を提供する。具体的には、（ａ）全血試料と界面活性剤とを混合して混合物を得、
（ｂ）該混合物を、該全血試料中の白血球を溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させるのに十分な時間放置し、
（ｃ）該混合物中の放出したミエロペルオキシダーゼの濃度を測定し、そして
（ｄ）該放出したミエロペルオキシダーゼの濃度から該全血試料中の白血球数を定量する、
ことを包含する全血試料の白血球数の定量方法である。
【００５１】
本発明においては、全血試料と界面活性剤とを混合して混合物を得、得られた混合物を放置することによって、全血試料中の白血球、赤血球、血小板などを溶解する。
【００５２】
本発明において「界面活性剤」とは、１分子の中に親水性部分と親油性部分を共有している化合物を意味し、特に断らない限り、水溶性界面活性剤を示す。
【００５３】
一般的に界面活性剤は、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤に大別される。本発明において全血試料と混合して白血球を溶解するために用いる界面活性剤は、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤のいずれも用いることができる。
【００５４】
イオン性界面活性剤は、更に、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤と両性界面活性剤に大別することができる。
【００５５】
陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５６】
陽イオン性界面活性剤としては、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、オクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムブロミド、１−ラウリルピリジニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド等が挙げられる。
【００５７】
両性界面活性剤としては、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル−Ｎ−ベタイン、ドデシル−β−アラニン等が挙げられる。
【００５８】
非イオン性界面活性剤としては、オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル等が挙げられる。
【００５９】
本発明で使用する界面活性剤は、白血球に内在するＭＰＯをなるべく変性させずに溶出させるという観点から、界面活性作用の強いイオン性界面活性剤よりも非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００６０】
界面活性剤の性質を示すパラメーターの1つに親水性・親脂性バランス（Hydrophile-Lipophile Balance；ＨＬＢ）がある。ＨＬＢ値とは、界面活性剤の分子中の親水基と親油基のバランスを示す指標であり、この概念はGriffinによって提唱されたものである。ＨＬＢ値は界面活性剤の乳化力を比較して実験的に定められるものであるが、簡単な計算式で求めることができる（例えば、吉田時行、進藤信一、大垣忠義、山中樹好編「新版 界面活性剤ハンドブック」日本国、工学図書株式会社（１９８７）を参照）。 本発明に用いることのできる界面活性剤のＨＬＢ値を以下に例示する。
【００６１】
0004485070.tif 000002
【００６２】
本発明に用いる非イオン性界面活性剤は、ＨＬＢ値が１２〜１４のものが好ましい。ＨＬＢ値が１２〜１４である非イオン性界面活性剤は、全血試料中の白血球に内在するＭＰＯの溶出効率が高い。一方、非イオン性界面活性剤のＨＬＢが１４より大きいと、全血試料中の白血球に内在するＭＰＯの溶出効率が著しく低下する。また、ＨＬＢ値が１２より小さいと、界面活性剤自身が水に溶けにくくなり、溶出効率の低下と共に取り扱いが難しくなる。尚、本明細書中に記載のＨＬＢ値は、特にことわりのない限り、Michael and Irene Ash編“HANDBOOK OF INDUSTRIAL SURFACTANTS”第２版、英国、Gower Publishing Limited (1997)に記載の数値を用いた。
【００６３】
測定の対象である白血球内因性ＭＰＯを効率よく溶出させるためには、非イオン性界面活性剤の中でも、飽和または不飽和炭化水素が結合したポリエチレンオキシド化合物である非イオン性界面活性剤が好ましい。更に、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル骨格を有する非イオン性界面活性剤（例えば、TritonTM X-114（日本国、ナカライテスク株式会社製）、TritonTM X-100（米国、SIGMAR）、IgepalTM CA630（米国、SIGMAR）やNissan Nonion NS-208.5（日本国、日本油脂社製））；不飽和脂肪族炭化水素が結合したポリエチレンオキシド化合物（例えば、BrijTM 97（米国、SIGMAR））やポリオキシエチレンアルキルエーテル骨格を有する非イオン性界面活性剤（例えば、Nissan Dispanol TOC（日本国、日本油脂社製）やBrijTM 56（米国、SIGMAR））の使用が好ましい。又、全血試料中の白血球から内因性のＭＰＯを溶出させる効果が高く、感度の高いＭＰＯ測定が可能になるという点では、TritonTM X-114が更に好ましい。
【００６４】
尚、商品名で記載した界面活性剤について、そのＣＴＦＡ(The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Assoc.)表記及び／又はＩＵＰＡＣ表記を以下の表にまとめた。
【００６５】
0004485070.tif 000003
【００６６】
本発明においては、全血試料中の白血球を溶解して内因性のＭＰＯを溶出させるために、陽イオン性界面活性剤を用いることもできる。本発明者らは、実験結果から、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムブロミド、１−ラウリルピリジニウムクロリド及びテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドは、ＭＰＯを白血球から溶出させるのに適していることを見出した。
【００６７】
本発明の方法において、全血試料と混合する界面活性剤の量は、混合物中の濃度として０．２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。界面活性剤の濃度が０．２％（ｗ／ｖ）未満であると、白血球に内在するＭＰＯの十分な溶出が望めない。また、界面活性剤の濃度が高いと、界面活性剤の使用量の増加に伴うコストの増加が生じ、且つ、混合物などの取り扱い性も低下する。これらの条件を考慮すると、使用する界面活性剤の量は、混合物中の濃度として０．２〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましく、より好ましくは０．２〜５．０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．２〜２．０％（ｗ／ｖ）である。
本発明においては、全血試料と界面活性剤を混合する方法に特に限定はないが、全血試料と界面活性剤とを混合して混合物を得、得られた混合物を放置することによって全血試料中の白血球を溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させることができなければならない。例えば、界面活性剤の水溶液を作製し、この界面活性剤の水溶液を全血試料に添加することができる。この場合、界面活性剤の添加後に攪拌操作を行ってもよいし、攪拌を行わなくとも良い。また、あらかじめ混合槽に微粒子状の界面活性剤を塗布しておき、そこに全血試料を添加する方法も挙げられる。この方法においても、界面活性剤が全血試料と混合していく過程で白血球が溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼが放出される。また、この方法においても、界面活性剤と全血試料からなる混合物の攪拌操作は行ってもよいし、行わなくてもよい。
【００６８】
全血試料と界面活性剤とを混合して得た混合物を放置する時間は、全血試料中の白血球を溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させるのに十分な時間であれば特に限定はない。しかし、本発明においては、混合物を放置する時間が１時間以内であることが好ましく、通常、放置時間は約１分〜１時間の範囲内である。感染症患者の初期診断に際しては、投薬などの適切な処置を可能な限り早く行う必要があるので、白血球数（及びＣＲＰ）の定量には迅速性が要求される。従って、定量に要する時間を短縮するためにも、混合物を放置する時間は短いほうが好ましい。
【００６９】
又、本発明においては、全血試料と界面活性剤とからなる混合物を放置する温度に特に限定はない。しかし、白血球の溶解および内因性のミエロペルオキシダーゼの放出が水を含む分散系（エマルジョン）で行われるので、凍結する温度に冷却させることは望ましくない。また、ＭＰＯの抗原性が変性してしまうような高温も免疫反応を阻害するので望ましくない。従って、本発明においては、混合物を０℃から室温（約２５℃）の範囲に放置し、白血球の溶解して内因性のミエロペルオキシダーゼを放出させることが好ましい。更に、感染症等の診断が通常の診療所で行われることを考慮すると、室温に放置することがより好ましい。
【００７０】
本発明においては、界面活性剤で処理した全血試料を用いて、白血球から放出されたＭＰＯの濃度を測定すると共にＣ反応性蛋白濃度も測定することができる。健常者のＣＲＰ値（基準範囲）については、以下に示すように諸家により報告されている：６０．３μｇ／ｄｌ以下（山岸保子ら：臨床病理３２：１３８９−１３９４、１９８４）；３００μｇ／ｄｌ以下（西田 陽：北里医学１６：３９３−４０１、１９８６）；及び４．０〜２３５．３μｇ／ｄｌ（〆谷直人ら：北里医学２４：９７−１０３、１９９４）。また、臨床検査値に関するハンドブック、例えば「臨床に役立つ検査値の読み方・考え方」（河野均也、西崎統 監修、総合医学社、２３６頁、１９９７年）には、基準値は０．３ｍｇ／ｄｌ（＝３μｇ／ｍｌ）以下（定量法によって若干異なる）との記載がある。炎症や癌などの組織障害によって活性化された単球／マクロファージはインターロイキン６、インターロイキン１やＴＮＦαなどを分泌し、その結果、肝細胞におけるＣＲＰをはじめとする急性期反応蛋白（acute phase protein）の産生が誘導されて、血中濃度が上昇する。血清ＣＲＰ濃度の上昇は非特異的な反応ではあるが、組織損傷に対して敏感に反応することから、最も広く利用されている炎症マーカーである。また、癌の進展に伴っても上昇するので、広義の腫瘍マーカーとしても有用である。又、感染症の場合においては、細菌感染症の場合の方が、ウィルス感染症の場合よりも高いＣＲＰ濃度が検出されることから、白血球数と共にＣＲＰも計ることによってより高精度の診断が可能になる。例えば、ＣＲＰの値と病態については以下の関係が知られている。
【００７１】
0004485070.tif 000004
【００７２】
本発明において白血球から放出されたＭＰＯの濃度を測定する方法に特に限定はなく、種々の方法で測定することができる。具体的には、ＭＰＯの酵素活性の測定、液体クロマトグラフィー、免疫学的測定法などの手法を用いてＭＰＯ濃度を求めることができる。しかし、高い定量の感度や特異性を有し、更にはＣＲＰ濃度の測定も可能であることから、免疫学的手法を用いることが好ましい。
【００７３】
本発明において「免疫学的手法」とは、酵素活性や放射活性をマーカーとして抗原または抗体の量を測定する方法；抗原抗体反応によって形成した免疫複合体を検出して抗原または抗体の量を測定する方法；ラテックスビーズや金コロイドなどの担体に抗原や抗体を結合させたものとの凝集反応から抗原抗体反応の程度を知り、そこから抗原または抗体の量を測定する方法などを包含する。
【００７４】
本発明の方法に用いる免疫学的手法に特に限定はないが、安全性の面から、放射活性をマーカーとする方法は望ましくない。
【００７５】
具体的な方法としては、当業者が蛋白質などの測定に用いるイムノクロマト法、９６穴プレートを利用した酵素免疫測定法や、国際出願公開ＷＯ９１／０４４９１号公報、ＷＯ９２／１４１３６号公報、ＷＯ９２／１４１４７号公報、ＷＯ９２／１６８２６号公報、及びＷＯ９４／０３７７４号公報などに記載の測定法（米国、BioStar社の光学的イムノアッセイ法）等が挙げられる。
【００７６】
イムノクロマト法を用いたＭＰＯ濃度の測定法について具体的に説明する。セルロース、ニトロセルロースもしくは、表面を化学修飾したセルロース（アミノ基、ジエチルアミノエチル基のようなカチオン性の官能基やカルボキシル基のようなアニオン性の官能基を持つように化学修飾したセルロース）からなる膜等の基材に、抗ヒトＭＰＯ抗体を吸着や化学的な手法により固定化する。抗体を固定化した基材を牛血清アルブミンなどを含むバッファー溶液に浸してブロッキング反応を行い、その後、乾燥させることでＭＰＯ測定用のイムノクロマト用チップを作製する。
【００７７】
上記のイムノクロマト用チップの作製の際に、抗ヒトＭＰＯ抗体と共に抗ヒトＣＲＰ抗体を基材に固定化する（この際、２つの抗体を一つの基材上に位置を変えて固定化したり、もしくは並列した二つの基材上に抗体をそれぞれ固定化する）と、ＣＲＰをＭＰＯと共に測定するためのイムノクロマト用チップを作製することができる。
【００７８】
ＭＰＯ（及びＣＲＰ）の検出は、金コロイドやラテックスビーズなどで標識した抗ヒトＭＰＯ抗体（および抗ヒトＣＲＰ抗体）を用いて検出することができる。具体的には、標識した抗体と溶血した全血試料溶液を混合して上記のイムノクロマト用チップの基材に滴下し、そこに適当な展開用バッファーを添加すると、滴下した液が上記のチップの基材を伝わって展開移動する。全血試料溶液は必要な程度に希釈して用いることもできる。展開移動の間に標識した抗体とＭＰＯ（及びＣＲＰ）の抗原抗体複合体が、固相化抗体に捕捉され発色する。その発色度合いの評価とか、光学測定機器等を用いたＭＰＯ（及びＣＲＰ）の定量を行うことができる。
【００７９】
次に、９６穴プレートを用いた酵素免疫測定法によるＭＰＯ濃度とＣＲＰ濃度の測定方法を説明する。初めに市販の９６穴プレートの基材上に１次抗体として抗ヒトＭＰＯ抗体及び抗ヒトＣＲＰ抗体を固定化し、このプレートに、界面活性剤で処理した全血試料を２０００倍もしくは４０００倍に希釈したものを添加し、基材上に固定した抗体と希釈した試料に含まれるＭＰＯ又はＣＲＰとの抗原抗体反応を行なう。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ等の酵素で標識した抗ヒトＭＰＯ抗体溶液及び抗ヒトＣＲＰ抗体（２次抗体）溶液をプレートに添加して２次抗体による抗原抗体反応を行う。その後、ＨＲＰの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とＨ2Ｏ2を含む溶液、もしくはアルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェノールリン酸を含む溶液を添加して発色させ、一定時間後に１Ｎの硫酸や水酸化ナトリウム溶液を添加し反応を停止させる。発色した溶液の吸光度を測定することによって、試料に含まれるＭＰＯ及びＣＲＰを測定することができる。
【００８０】
又、光学的イムノアッセイによるＭＰＯ濃度とＣＲＰ濃度の測定方法については、Covalciuc KA, Webb KH and Carlson CA: Journal of Clinical Microbiology 12:3971-3974 (1999)に記載の方法で行うことができる。具体的には、シリコン基板の表面に、シリコン基板とは異なる屈折率を有するポリシロキサン等のポリマーやダイヤモンドライクカーボン等の薄膜を形成し、そこに１次抗体として抗ヒトＭＰＯ抗体及び抗ヒトＣＲＰ抗体を固定化する。次に、界面活性剤で処理した全血試料を１００倍もしくは２００倍に希釈したものと、ＨＲＰで標識した抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体又は抗ヒトＣＲＰ抗体溶液を混合して上記基板の表面に添加し、基板上に固定した抗体と希釈した試料に含まれるＭＰＯやＣＲＰとの抗原抗体反応を行なう。その後、ＴＭＢ沈殿基質である“TMB fast”（米国、Kirkegaad & Perry Laboratories Inc.社製）を添加して一定時間をおくと、基板表面上に沈殿層が形成される。基板表面上に形成された沈殿層の厚みに起因する干渉色の変化によって試料に含まれるＭＰＯ又はＣＲＰの濃度を評価することができる。又、薄膜上に形成された沈殿層の厚みをエリプソメーターを用いて計測すれば、試料に含まれるＭＰＯ及びＣＲＰを定量することもできる。
【００８１】
本発明の方法においては、上記のようにして測定したＭＰＯ濃度から全血試料中の白血球数を定量する。白血球数を定量するための方法に特に限定はなく、一般的に当業者が用いる方法を採用することができる。具体的には本明細書の実施例１０において行ったように、白血球数とＭＰＯ濃度の相関を表す回帰式から求めることができる。
【００８２】
更に、本発明においては、本発明の方法によって得られる全血試料中の白血球数が好中球数であることが好ましい。「好中球」とは、白血球において最も存在比率が大きい細胞であり、炎症や感染時にはその数が増加することが知られている。従って、診断時に細菌感染症か否か、又は炎症の重傷度を判定するためには、好中球数を測定することが好ましい。本明細書の実施例７、９や１０に記載したように、全血試料と界面活性剤とを混合することによって白血球から放出されるＭＰＯの濃度は、白血球数のみならず、好中球数とも高い相関性を示す。従って、本発明の方法によって、全血試料中の白血球数と同様に好中球数を定量することができる。
【００８３】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、これらの実施例及び比較例のみに限定されるものではない。
【００８４】
【実施例１】
白血球の溶解に必要な時間の検討
健常人血液１０ｍｌを１０ｍｇのＥＤＴＡ−２Ｋ（日本国、（株）同仁化学研究所製）を含む試験管に採取し、十分攪拌した後にそこから１ｍｌを分取した。分取した全血に１１％のTritonTM X-100（米国、SIGMAR）の水溶液を１００μｌ加えて十分に混和し、室温にて１分、５分、３０分又は６０分放置して白血球を溶解した。
【００８５】
所定の時間の後、BIOXYTECTM MPO Enzyme Immunoassayキット（米国、OXIS International, Inc.社製）に添付のSample diluting buffer（０．１％牛血清アルブミン及び０．２％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）を用いて、白血球を溶解した全血試料を２０００倍に希釈し、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）測定用サンプルとした。
【００８６】
サンプル及び検量線用に用意した標準ＭＰＯ溶液（上記のバッファーに市販のＭＰＯを溶解したもの）に含まれるＭＰＯの濃度は、BIOXYTECTM MPO Enzyme Immunoassayキット（米国、OXIS International, Inc.社製）を用い、添付の操作手順に従って測定した。
【００８７】
又、サンプル中のＭＰＯ量については、サンプルに終濃度が５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌになるようにＭＰＯ（米国、Elastin Products Co., INC.社製）を添加し、それらのＭＰＯ濃度をそれぞれ測定した。得られた測定値からサンプル毎の検量線を求め、標準ＭＰＯの検量線との関係から補正して、全血中のＭＰＯ濃度を求めた。尚、測定数は３とし、平均±標準偏差を求めた。結果を表１に示した。
【００８８】
【表１】
0004485070.tif 000005
【００８９】
TritonTM X-100による処理は、６０分以内でも十分にＭＰＯを溶出させることが確認された。
【００９０】
【実施例２】
界面活性剤濃度とＭＰＯ溶出量
健常人より１０ｍｌの血液を採取し、即座に血液１ｍｌあたり１ｍｇのＥＤＴＡ−２Ｋ（日本国、（株）同仁化学研究所製）と混合し、採血後１時間以内に下記に示す各種測定に供した。
【００９１】
ミエロペルオキシダーゼ濃度は次に示す方法で求めた。
５００μｌの血液を２ｍｌのエッペンドルフチューブに測り取り、そこに濃度が０．１、０．２、０．４、０．６、１、２、４、１０又は２０％（ｗ／ｖ）の界面活性剤水溶液を等量添加して混合溶液を得、Vortexミキサーにて２秒間攪拌した。次いで、氷上で６０分間放置して白血球を溶解した。界面活性剤にはTritonTM X-114（日本国、ナカライテスク株式会社製）、TritonTM X-100、IgepalTM CA630（いずれも米国、SIGMAR）の３種を用いた。白血球の溶解後に、１００μｌの混合溶液を測り取り、１％ＢＳＡ（商品名：“Sigma fraction V”）（米国、SIGMAR）を溶解したＰＢＳ溶液９００μｌに添加した。これをVortexミキサーにて攪拌後、そこから１０μｌを測り取り、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液にて２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡに供した。
【００９２】
ＥＬＩＳＡの概要を以下に示す。ＰＢＳに溶解した５μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体（米国、Calbiochem-Novabiochem Corporation社製）（以下、屡々、「抗ＭＰＯ抗体」という）を１００μｌずつNunc Immuno Plate（デンマーク国、Nalge Nunc International社製）の各ウェルに分注し、シールした後、４℃で１８時間反応させて１次抗体を固定化した。ウェルを洗浄液（０．０５％ TweenTM 20／ＰＢＳ）にて洗浄後、２００μｌのブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロッキングし、さらに洗浄液を用いて２回洗浄した。続いて界面活性剤で処理した後に希釈した血液サンプルを１００μｌずつ分注し、室温にて２時間反応させた。洗浄液にて３回洗浄後、５μｇ／ｍｌの濃度の西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰ）標識抗ＭＰＯ抗体１００μｌを各ウエルに添加し、室温で１時間反応させた。ＨＲＰ標識抗ＭＰＯ抗体としては、HRP Grade IV（米国、SigmaR社製）を用いて標識した抗ヒトＭＰＯ抗体（米国、Calbiochem-Novabiochem Corporation社製））を用いた。標識の方法はAnalytical Biochemistry. 132, 68-73(1983) に記載の方法に従った。ウェルを洗浄液にて５回洗浄後、調製した直後のＴＭＢ溶液（米国、Kirkegaad & Perry Laboratories社製）を１００μｌ添加して発色させた。２分後に１Ｎ硫酸溶液（日本国、ナカライテスク株式会社製）１００μｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（米国、Bio-Rad Laboratories社製）にて測定した。尚、測定数は３とし、平均±標準偏差を求めた。結果を表２に示した。
【００９３】
【表２】
0004485070.tif 000006
【００９４】
TritonTM X-100、TritonTM X-114、IgepalTM CA630のいずれにおいても、その濃度が０．２〜１０．０％（ｗ／ｖ）の範囲内において、内因性のＭＰＯは全血試料中に十分に溶出されることが判明した。
【００９５】
【実施例３】
各種界面活性剤のＭＰＯ溶出効果
２８Ｇの翼付静注針（日本国、テルモ社製）を用いて、健常人より１０ｍｌの血液を採血し、即座に血液１ｍｌあたり１ｍｇのＥＤＴＡ−２Ｋ（日本国、（株）同仁化学研究所製）と混合し、１時間以内に各種測定に供した。
【００９６】
ミエロペルオキシダーゼ濃度は次に示す方法で求めた。
５００μｌの血液を２ｍｌのエッペンドルフチューブに測り取り、そこに等量の１％（ｗ／ｖ）界面活性剤水溶液を添加して混合溶液を得、Vortexミキサーにて２秒間攪拌した。次いで、その後、氷上で６０分間放置して白血球を溶解した。白血球を溶解した後に１００μｌの混合溶液を測り取り、１％ＢＳＡ（商品名：”Sigma fraction V”）（米国、SIGMAR）を溶解したＰＢＳ溶液９００μｌに添加した。これをVortexミキサーにて攪拌後、そこから１０μｌを測り取り、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液にて２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡに供した。
【００９７】
ＥＬＩＳＡの概要を以下に示す。ＰＢＳに溶解した５μｇ／ｍｌの抗ＭＰＯ抗体を１００μｌずつNunc Immuno Plate（デンマーク国、Nalge Nunc International社製）の各ウェルに分注し、シールした後、４℃で１８時間反応させて１次抗体を固定化した。ウェルを洗浄液（０．０５％ Tween 20／ＰＢＳ）にて洗浄後、２００μｌのブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロッキングし、さらに洗浄液を用いて２回洗浄した。続いて界面活性剤で処理した後に希釈した血液サンプルを１００μｌずつ分注し、室温にて２時間反応させた。洗浄液にて３回洗浄後、５μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＭＰＯ抗体（実施例２と同様に作成したＨＲＰ標識抗ＭＰＯ抗体）１００μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。ウェルを洗浄液にて５回洗浄後、調製した直後のＴＭＢ溶液（米国、Kirkegaad & Perry Laboratories社製）を１００μｌ添加して発色させた。２分後に１Ｎ硫酸溶液（日本国、ナカライテスク株式会社製）１００μｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（米国、Bio-Rad Laboratories社製）にて測定した。
【００９８】
又、サンプル中のＭＰＯ量については、サンプルに終濃度が５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌになるようにＭＰＯ（米国、Elastin Products Co., INC.社製）を添加し、それらのＭＰＯ濃度をそれぞれ測定した。得られた測定値からサンプル毎の検量線を求め、標準ＭＰＯの検量線との関係から補正して、全血中のＭＰＯ濃度を求めた。尚、測定数は３とし、平均±標準偏差を求めた。
【００９９】
試験した界面活性剤を以下に示す。Hexadecyltrimethyl-ammonium Bromide（ＨＴＡＢ）（日本国、和光純薬工業製）、TritonTM X-114（日本国、ナカライテスク株式会社製）TritonTM X-100、TritonTM DF-12、BrijTM 56、BrijTM 97、IgepalTM CA630（いずれも米国、SIGMAR）、Nissan Nonion NS-208.5、Nissan Dispanol TOC（いずれも日本国、日本油脂製）。これら界面活性剤を精製水（日本国、共栄製薬社製）に溶解して１０％または２％（w/v）の水溶液を調製し、試験に用いる１５時間以内にそれを用いて１％（w/v）溶液を調製した。又、対照としては、精製水（日本国、共栄製薬社製）を用いた。
結果を表３に示した。
【０１００】
【表３】
0004485070.tif 000007
【０１０１】
いずれの界面活性剤も、内因性のＭＰＯを全血試料中に効率良く溶出させることが明らかとなった。
【０１０２】
【実施例４】
各種界面活性剤のＭＰＯ溶出効果
実施例３と同様の方法を用いて、以下の界面活性剤の全血試料におけるＭＰＯ溶出度を求めた。試験した界面活性剤は、Hexadecylpyridinium Chloride Monohydrate（ＨＰＣ）、Hexadecylpyridinium Bromide Monohydrate（ＨＰＢ）、Hexadecyltrimethylammonium Chloride（ＨＴＡＣ）、n‐Dodecyltrimethylammonium Bromide（ＤＴＡＢ）、Hexadecyltrimethylammonium Bromide（ＨＴＡＢ）、1-Laurylpyridinium Chloride（ＬＰＣ）、Tetradecyltri-methylammonium Bromide（ＴＴＡＢ）（以上、日本国、和光純薬工業製）である。これら界面活性剤を精製水（日本国、共栄製薬社製）に溶解して１０％または２％（w/v）の水溶液を調製し、試験に用いる１５時間以内にそれを用いて１％（w/v）溶液を調製した。又、対照としては、精製水（日本国、共栄製薬社製）を用いた。結果を表４に示した。
【０１０３】
【表４】
0004485070.tif 000008
【０１０４】
いずれの陽イオン界面活性剤も、全血試料中に内因性のＭＰＯを十分に溶出させることが明らかとなった。
【０１０５】
【実施例５】
各種界面活性剤のＭＰＯ溶出効果
実施例３と同様の方法を用いて、以下の界面活性剤の全血におけるＭＰＯ溶出度を求めた。試験した界面活性剤は、Hexadecylpyridinium Chloride Monohydrate（ＨＰＣ）、Hexadecylpyridinium Bromide Monohydrate（ＨＰＢ）、Hexadecyltrimethylammonium Chloride（ＨＴＡＣ）、n‐Dodecyltrimethylammonium Bromide（ＤＴＡＢ）、Hexa-decyltrimethylammonium Bromide（ＨＴＡＢ）、1-Laurylpyridinium Chloride（ＬＰＣ）、Tetradecyltri-methylammonium Bromide（ＴＴＡＢ）（以上、日本国、和光純薬工業製）、Didecyldimethylammonium Chloride（ＤＤＡＣ）、Octadecyltrimethylammonium Chloride（ＯＴＡＣ）（以上、日本国、日本油脂製）である。これらの界面活性剤を精製水（日本国、共栄製薬社製）に溶解して１０％または２％（w/v）の水溶液を調製し、試験に用いる１５時間以内にそれを用いて１％（w/v）溶液を調製した。又、対照としては、精製水（日本国、共栄製薬社製）を用いた。結果を表５に示した。
【０１０６】
【表５】
0004485070.tif 000009
【０１０７】
いずれの陽イオン界面活性剤も、全血試料中に内因性のＭＰＯを十分に溶出させることが明らかとなった。
【０１０８】
【実施例６】
ＭＰＯ溶出度とＨＬＢ値との関係
実施例３と同様に、採血、界面活性剤処理及びＥＬＩＳＡを行い、各種界面活性剤のＭＰＯ溶出効果を検討した。
【０１０９】
非イオン性界面活性剤として、NonidetTM-P40、TritonTM X-114（いずれも日本国、ナカライテスク株式会社製）、TritonTM X-100、TritonTM X-207、TritonTM X-305、BrijTM35、BrijTM 56、BrijTM 58、BrijTM 97、BrijTM 98、IgepalTM CA630、TweenTM 65、TweenTM 85（いずれも米国、SIGMAR）、TweenTM 20（米国、Bio-Rad Laboratories社製）、TritonTM X-45（スイス国、Fluka社製)を用いた。各界面活性剤を精製水（日本国、共栄製薬社製）に溶解して１０％または２％（w/v）の水溶液を調製し、試験に用いる１５時間以内にそれを用いて１％（w/v）溶液を調製した。又、対照としては、精製水（日本国、共栄製薬社製）を用いた。
【０１１０】
図１に示すように、全血中のＭＰＯの溶出度は界面活性剤のＨＬＢ値によって異なり、ＨＬＢ値が１２〜１４の範囲内にある界面活性剤が至適なＭＰＯの溶出条件であることが示された。
【０１１１】
【実施例７及び比較例１と２】
全血中のミエロペルオキシダーゼ、ラクトフェリン、エラスターゼと白血球数及び好中球数との関係
実施例７及び比較例１と２においては、１３人の健常人から得た血液（Ａ群）と疾患名のわかっている１４人の非健常者から得た血液（Ｂ群）を用いた。全血試料１０ｍｌを１０ｍｇのＥＤＴＡ−２Ｋ（日本国、（株）同仁化学研究所製）を含む試験管に採取し、十分攪拌した。ＥＤＴＡを加えた全血の一部について、白血球数と好中球数をそれぞれCELL-DYNETM3500（米国、DAINABOT社製）にて計測した。更に、ＥＤＴＡを加えた全血を１ｍｌ分取し、そこに１１％（w/v）のTritonTM X-100（米国、SIGMAR）の水溶液１００μｌを加えて十分に混和した後、室温にて１時間放置し、白血球を溶解した。
【０１１２】
（１）ミエロペルオキシダーゼの測定（実施例７）
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の測定は、上記の界面活性剤で処理した全血試料をBIOXYTECTM MPO Enzyme Immunoassayキット（米国、OXIS International,Inc.社製）に添付のSample diluting buffer（０．１％牛血清アルブミン及び０．２％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）で２０００倍に希釈し、ＭＰＯ測定用サンプルとした。
【０１１３】
サンプル及び検量線用に用意した標準ＭＰＯ溶液（上記のバッファーに市販のＭＰＯを溶解したもの）に含まれるミエロペルオキシダーゼの濃度は、BIOXYTECTM MPO Enzyme Immunoassayキット（米国、OXIS International, Inc.社製）を用い、添付の操作手順に従って測定した。又、サンプル中のＭＰＯ量については、サンプルに終濃度が５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌになるようにＭＰＯ（米国、Elastin Products Co., INC.社製）を添加し、それらのＭＰＯ濃度をそれぞれ測定した。得られた測定値からサンプル毎の検量線を求め、標準ＭＰＯの検量線との関係から補正して、全血中のＭＰＯ濃度を求めた。尚、測定数は３とし、平均値を求めた。
【０１１４】
（２）ラクトフェリンの測定（比較例１）
ラクトフェリン（ＬＴＦ）の測定は、上記の界面活性剤で処理した全血試料をBIOXYTECTM Lactof Enzyme Immunoassayキット（米国、OXIS International, Inc.社製）に添付のSample diluting buffer（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、０．１％ TweenTM-20及び０．０１％ merthiolateを含む２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）で２０００倍に希釈し、ＬＴＦ測定用サンプルとした。
【０１１５】
サンプル及び検量線用に用意した標準ＬＴＦ溶液（上記のバッファーに市販のＬＴＦを溶解したもの）に含まれるＬＴＦの濃度は、BIOXYTECTM Lactof Enzyme Immunoassayキット（米国、OXIS International, Inc.社製）を用い、その添付の操作手順に従い測定した。又、サンプル中のＬＴＦ量については、サンプルに終濃度が５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌになるようにＬＴＦ（米国、ICN Pharmaceuticals, Inc.社製）を添加し、それらのＬＴＦ濃度をそれぞれ測定した。得られた測定値からサンプル毎の検量線を求め、標準ＬＴＦの検量線との関係から補正して、全血中のＬＴＦ濃度を求めた。尚、測定数は３とし、平均値を求めた。
【０１１６】
（３）エラスターゼの測定（比較例２）
エラスターゼ（ＥＬＴ）の測定は、上記の界面活性剤で処理した全血試料をPMN Elastaseキット（米国、MERCK社製）に添付のSample diluting buffer（０．１％牛血清アルブミン及び０．２％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）で２０００倍に希釈し、ＥＬＴ測定用サンプルとした。
【０１１７】
サンプル及び検量線用に用意した標準ＥＬＴ溶液（上記のバッファーに市販のＥＬＴを溶解したもの）に含まれる顆粒球エラスターゼ濃度は、PMN Elastaseキット（米国、MERCK社製）を用い、添付の操作手順に従い測定した。又、サンプル中のＥＬＴ量については、サンプルに終濃度が５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌになるようにキット添付のＥＬＴを添加し、それらのＥＬＴ濃度をそれぞれ測定した。得られた測定値からサンプル毎の検量線を求め、標準ＥＬＴの検量線との関係から補正して、全血中のＥＬＴ濃度を求めた。尚、測定数は３とし、平均値を求めた。
【０１１８】
実施例７、比較例１及び比較例２の結果（健常人血液および非健常人血液におけるＭＰＯ濃度、ＬＴＦ濃度とＥＬＴ濃度）を血液に含まれる白血球数と好中球数と共に表６に示した。
【０１１９】
【表６】
0004485070.tif 000010
【０１２０】
更に、健常人血液群（Ａ群）と非健常人血液群（Ｂ群）を総合した結果について、白血球数と各内因性物質濃度との相関を示すグラフを図２（ａ）〜（ｃ）に示し、好中球数と各内因性物質濃度との相関を示すグラフを図３（ａ）〜（ｃ）に示した。
図２と３に示したように、各内因性物質と白血球数又は好中球数は以下のような相関関係を示した。
【０１２１】
ＭＰＯ濃度と白血球数との相関を示す回帰式は、
y = 0.0019x + 0.6981 (r = 0.9034) であり、
ＭＰＯ濃度と好中球数との相関を示す回帰式は、
y = 0.0018x + 5.5395 (r = 0.9088) であった。
ＬＴＦ濃度と白血球数との相関を示す回帰式は、
y = 0.0014x + 1.6278 (r = 0.8275)であり、
ＬＴＦ濃度と好中球数との相関を示す回帰式は、
y = 0.0013x + 5.3757 (r = 0.8190) であった。
ＥＬＴ濃度と白血球数との相関を示す回帰式は、
y = 0.0032x - 8.4464 (r = 0.8076)であり、
ＥＬＴ濃度と好中球数との相関を示す回帰式は、
y = 0.0032x - 1.0451 (r = 0.8367)であった。
従って、白血球数と好中球数のいずれにおいても、ＭＰＯと最も高い相関関係を示すことが明らかとなった。
【０１２２】
【実施例８及び比較例３と４】
健常人血液群および非健常人血液群におけるＭＰＯ、ＬＴＦ、ＥＬＴと白血球数との相関の解析
実施例７及び比較例１と２で得られたデータについて、白血球数が１０、０００個／μｌ未満の健常人血液群（Ａ群）と白血球数が１０、０００個／μｌ以上の非健常人血液群（Ｂ群）に層別し、それぞれのＭＰＯ、ＬＴＦ、ＥＬＴと白血球数との相関を解析した。結果を図４（ａ）〜（ｃ）と図５（ａ）〜（ｃ）に示した。
【０１２３】
解析の結果、Ａ群において、ＭＰＯと白血球数の相関係数はＲ＝０．９３３６（y = 0.0021x - 0.2414）と極めて高く、ＬＴＦと白血球数との相関係数（R = 0.7929; y = 0.0016x - 0.7488）及びＥＬＴと白血球数との相関係数（R = 0.8676; y = 0.0017x - 1.33）のいずれよりも高いことが判明した。従って、健常人血液の白血球数を定量する際には、全血中のＭＰＯを測定することによって最も正確な定量値が得られることが確認された。
【０１２４】
又、Ｂ群においても、ＭＰＯと白血球数の相関係数がＲ＝０．７３１８と最も高かった。さらに、Ｂ群におけるＭＰＯ、ＬＴＦとＥＬＴのそれぞれと白血球数との相関をあらわす回帰式の傾きを比較すると、ＭＰＯと白血球数の相関を示す回帰式の傾きは０．００１９（y = 0.0019x + 0.5678）であり、Ａ群における回帰式の傾きの０．００２１とそれほど大きな変化は見られなかった。一方、Ｂ群におけるＬＴＦと白血球数の相関を示す回帰式の傾きは０．０００７（y = 0.0007x + 13.447）であるのに対して、Ａ群における回帰式の傾きは、０．００１６であり、Ｂ群における傾きは健常人の約２．３倍程度に低下していることが示された。一方、Ｂ群におけるＥＬＴと白血球数の相関を示す回帰式の傾きは、０．００３１（y = 0.0031x - 5.4788）であるのに対して、Ａ群における回帰式の傾きは０．００１７であり、Ｂ群における傾きは約１．８倍程度上昇していた。さらに、閉塞性黄疸、急性膵炎、急性胆のう炎に罹患した患者においては、ＥＬＴの測定値はＭＰＯやＬＴＦに比べて極端に高値を示し、ＥＬＴ濃度と白血球数の相関を表す回帰直線から大きくはずれてしまうケースがあることが判明した。
【０１２５】
従って、非健常人血液群についても、白血球数の定量は、全血中に溶出されたＭＰＯを測定することによって最も正確な定量値が得られることが確認された。
【０１２６】
【実施例９】
白血球数１０、０００個／μｌ以上の検体を含む全血試料におけるＭＰＯ濃度と白血球数又は好中球数との相関関係
外来患者から得た全血試料４６例を試験の対象とした。白血球の溶解に用いる界面活性剤としては、TritonTM X-100、TritonTM X-114、及びIgepalTM CA630の３種を用い、実施例１と同様に界面活性剤処理を行ない、ＭＰＯ濃度は実施例２と同様にして求めた。白血球数及び好中球数はCoulter GEN・S System（米国、COULTER ELECTRONICS, INC.社製）により計測し、ＭＰＯ濃度との相関係数を求めた。尚、測定数は３とし、平均±標準偏差を求めた。
【０１２７】
その結果を図６に示した。ＭＰＯ濃度と白血球数との相関係数は、TritonTM X-114でR＝０．８４３０ (p < 0.0001) (y = 0.0022x + 3.324)、
TritonTM X-100でR＝０．９０６６ (p < 0.0001) (y = 0.002x + 2.1757)、
IgepalTM CA630でR＝０．９０６１ (p < 0.0001) (y = 0.0019x + 2.4259)
であり、非常に良好な相関関係が認められた。従って、白血球数１０、０００個／μｌ以上の検体を含む全血試料からなる群においても、ＭＰＯ濃度は白血球数を示す正確な指標となることが判明した。
【０１２８】
又、ＭＰＯ濃度と好中球数との相関関係を図７に示した。相関係数は、TritonTM X-114でR＝０．８７８９ (p < 0.0001)(y = 0.0025x + 7.4089)、
TritonTM X-100でR＝０．９３６４ (p < 0.0001) (y = 0.0023x + 5.9748)、IgepalTM CA630でR＝０．９４０５ (p < 0.0001) (y = 0.0022x + 6.0951)と非常に良好な相関関係を示し、すべての相関係数は白血球数との相関係数よりも高値を示した。図７に示すように、白血球数が１０、０００個／μｌ以上の検体を含む全血試料からなる群においても、ＭＰＯ濃度は好中球数と非常に良好な相関関係を示し、ＭＰＯ濃度は好中球数を示す正確な指標となることが判明した。
【０１２９】
【実施例１０】
ＭＰＯ濃度に基づく白血球数／好中球数と、血球計数装置によって計測される白血球数／好中球数との相関関係
実施例９で用いた外来患者から得た全血試料４６例を試験の対象とした。各全血試料のＭＰＯ濃度を実施例９と同様に測定した。白血球の溶解にはTritonTM X-100を用い、ＭＰＯ濃度は、実施例２と同様にして求めた。得られたＭＰＯ濃度を実施例７で得た、白血球数と全血中のＭＰＯ濃度の相関を表す回帰式(y = 0.0019x + 0.6981)（図２（ａ））に代入し、白血球数を算出した。ＭＰＯ濃度に基づく白血球数と、Coulter GEN・S System（米国、COULTER ELECTRONICS, INC.社製）を用いて計測した白血球数との相関を図８（ａ）に示した。
【０１３０】
図８（ａ）から明らかなように、本発明の方法によって得られた白血球数と血球計数装置によって計測された白血球数は、白血球数１０、０００個／μｌ以上の検体を含む全血試料からなる群においても良好な相関（y = 1.0333x + 777.69; R = 0.907）を示すことが確認された。従って、全血中のＭＰＯ濃度と白血球数との相関を表す回帰式を予め求めておけば、全血試料中のＭＰＯ濃度を測定するだけで、血球計数装置によって計測される白血球数と良好な相関を示す白血球数を得ることができ、白血球数１００００個／μｌ以上の検体を含む全血試料中の白血球数を定量する場合においても正確な値を得ることができる。
【０１３１】
更に、各全血試料のＭＰＯ濃度について、実施例７で得た、好中球数と全血中のＭＰＯ濃度の相関を表す回帰式 (y = 0.0018x + 5.5395)（図３（ａ））に代入し、好中球数を算出した。ＭＰＯ濃度に基づく好中球数と、Coulter GEN・S System（米国、COULTER ELECTRONICS, INC.社製）を用いて計測された好中球数との相関を図８（ｂ）に示した。
【０１３２】
同様に、図８（ｂ）から明らかなように、本発明の方法によって得られた好中球数と血球計数装置によって計測される好中球数は、白血球数１０、０００個／μｌ以上の検体を含む全血試料からなる群においても良好な相関（y = 1.2542x + 241.85; R = 0.936）を示すことが確認された。従って、全血中のＭＰＯ濃度と好中球数との相関を表す回帰式を予め求めておけば、全血試料中のＭＰＯ濃度を測定するだけで血球計数装置によって計測される好中球数と良好な相関を示す好中球数を得ることができ、白血球数１００００個／μｌ以上の検体を含む全血試料中の好中球数を定量する場合においても正確な値を得ることができる。
【０１３３】
【実施例１１】
同一試料を用いたＭＰＯとＣＲＰの測定
白血球数が４８００個／μｌである健常人血液１０ｍｌに１１％（w/v）のTritonTM X-100（米国、SIGMAR）の水溶液を１ｍｌ加えて十分混和した後、室温にて６０分放置して白血球を溶解した。得られた全血試料をサンプルＡとした。サンプルＡの一部を取り、そこにＭＰＯ（米国、Elastin Products Co., INC.社製）とＣＲＰ（日本国、オリエンタル酵母社製）をそれぞれの終濃度が１０μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌになるように添加し、サンプルＢとした。又、サンプルＡの一部にＭＰＯとＣＲＰをそれぞれの終濃度が２０μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌになるように添加し、サンプルＣとした。又、サンプルＡの一部にＭＰＯとＣＲＰをそれぞれの終濃度が３０μｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌになるように添加し、サンプルＤとした。
【０１３４】
国際出願公開ＷＯ９４／０３７７４号公報に記載の、表面がポリシロキサンポリマーでコーティングされたシリコン基板（米国、BioStar社製）を、１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＭＰＯ抗体（米国、Calbiochem-Novabiochem Corporation社製）の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）溶液、または１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＣＲＰ抗体（日本国、オリエンタル酵母社製）の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）溶液に２４時間、４℃で浸漬させて、抗ＭＰＯ抗体と抗ＣＲＰ抗体をそれぞれポリシロキサンでコーティングされたシリコン基板表面上に吸着させた。抗体を吸着したシリコン基板を水洗し、窒素ガスを用いて水滴を取り除き、その後、風乾した。
【０１３５】
上記で調製したサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄをそれぞれ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）溶液で１００倍に希釈し、希釈した溶液から１０μｌずつ取り出し、３０μｌのＨＲＰ結合抗ＭＰＯ抗体溶液又は３０μｌのＨＲＰ結合抗ＣＲＰ抗体溶液（ＨＲＰによる抗体の標識は実施例２と同様に行った）とエッペンドルフチューブ内で混合し、１０分間室温にて反応させた。
【０１３６】
各反応溶液を３０μｌ取り、上記の抗ＭＰＯ抗体又は抗ＣＲＰ抗体を吸着したシリコン基板上にのせ、１０分間室温にて放置した。次にこのシリコン基板を水洗し、窒素ガスにて水滴を取り除いた後に風乾し、直ちにTMB fast（米国、Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.社製）３０μｌを上記のシリコン基板上にのせて５分間反応させ、沈殿層を形成した。反応後にシリコン基板を水洗し、窒素ガスにて水滴を取り除いた後に風乾し、基板上の抗体に結合した蛋白質を視覚化したシリコン基板を得た。視覚化された蛋白質の染色の度合いを、目視にて弱い順に“−”、“±”、“＋”、“＋＋”、“＋＋＋”と評価した。その結果を表７に示した。
【０１３７】
【表７】
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【０１３８】
表７から明らかなように、全血試料を界面活性剤で処理したサンプルを用いて、ＭＰＯとＣＲＰの両方の測定が可能である。
【０１３９】
【実施例１２】
実施例１１で得られた、基板上に沈殿層を形成したシリコン基板について、沈殿層の厚みを、偏光板が固定されたエリプソメーター（入射角度７０°、入射側偏光板角度２０°、検出側偏光板角度１０°、Ｈｅ／Ｎｅレーザー）（日本国、シグマ光機社製）を用いて測定し、サンプル中に含まれる蛋白質の量を定量した。尚、測定は１０回行い、平均値を求めた。結果を表８に示した。
【０１４０】
【表８】
0004485070.tif 000012
【０１４１】
表８から明らかなように、全血試料を界面活性剤で処理したサンプルを用いて、ＭＰＯとＣＲＰの両方の測定が可能である。
【０１４２】
【発明の効果】
本発明の白血球数の定量方法を用いると、全血試料から血液細胞を分離する必要がなく、容易且つ迅速に全血試料中の白血球数及び／又は好中球数を定量することが可能となる。又、本発明の方法を用いると、全血試料の白血球数と共にＣ反応性蛋白も同じ試料を用いて定量することができる。従って、本発明の方法によって、感染症の有無や炎症の重傷度を迅速、簡便かつ安価に診断することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＬＢ値とミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）溶出度（吸光度）との関系を示す図である。
【図２】  （ａ）は、健常人と非健常人から得た全血試料中のＭＰＯ濃度と白血球数との相関を示す図であり、（ｂ）は、健常人と非健常人から得た全血試料中のラクトフェリン（ＬＴＦ）濃度と白血球数との相関を示す図であり、（ｃ）は、健常人と非健常人から得た全血試料中のエラスターゼ（ＥＬＴ）濃度と白血球数との相関を示す図である。
【図３】  （ａ）は、健常人と非健常人から得た全血試料中のＭＰＯ濃度と好中球数との相関を示す図であり、（ｂ）は、健常人と非健常人から得た全血試料中のＬＴＦ濃度と好中球数との相関を示す図であり、（ｃ）は、健常人と非健常人から得た全血試料中のＥＬＴ濃度と好中球数との相関を示す図。
【図４】  （ａ）は、健常人から得た全血試料中のＭＰＯ濃度と白血球数との相関を示す図であり、（ｂ）は、健常人から得た全血試料中のＬＴＦ濃度と白血球数との相関を示す図であり、（ｃ）は、健常人から得た全血試料中のＥＬＴ濃度と白血球数との相関を示す図である。
【図５】  （ａ）は、非健常人から得た全血試料中のＭＰＯ濃度と白血球数との相関を示す図であり、（ｂ）は、非健常人から得た全血試料中のＬＴＦ濃度と白血球数との相関を示す図であり、（ｃ）は、非健常人から得た全血試料中のＥＬＴ濃度と白血球数との相関を示す図である。
【図６】  白血球数１０、０００個／μｌ以上の検体を含む全血試料中のＭＰＯ濃度と白血球数との相関を示す図である。
【図７】  白血球数１０、０００個／μｌ以上の検体を含む全血試料中のＭＰＯ濃度と好中球数の相関を示す図である。
【図８】  （ａ）は、ＭＰＯ濃度に基づく白血球数と血球計数装置を用いて計測した白血球数との相関を示す図であり、（ｂ）は、ＭＰＯ濃度に基づく好中球数と血球計数装置を用いて計測した好中球数との相関を示す図である。
【図１】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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【図６】
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【図７】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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